ES2271942T3 - Poliribozima apropiada para conferir a las plantas una resistencia a los virus,y plantas resistentes que producen dicha poliribozima. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO LLAMADO "POLIRIBOCIMA" QUE TIENE UNA ACTIVIDAD DE ENDORIBONUCLEASA Y QUE ES CAPAZ DE DESACTIVAR EL GEN DE LA PROTEINA DE CAPSIDA DE UN VIRUS, CARACTERIZADO EN QUE COMPRENDE: I) UNA SECUENCIA COMPLEMENTARIA DE UNA PARTE, AL MENOS DEL GEN O DE SU TRANSCRIPCION O DE SUS INTERMEDIOS DE DUPLICACION, INCLUIDAS EN LUGARES DISTINTOS DE ESTA SECUENCIA COMPLEMENTARIA; II) UNA PLURALIDAD DE REGIONES CATALITICAS QUE PROCEDEN DE RIBOCIMAS, III) Y EVENTUALMENTE UNA O VARIAS SECUENCIAS NO COMPLEMENTARIAS DE LA TRANSCRIPCION DE DICHO GEN, ESTANDO DICHA O DICHAS SECUENCIAS NO COMPLEMENTARIAS INSERTADAS ENTRE DOS BASES CONSECUTIVAS DE LA SECUENCIA COMPLEMENTARIA.

Description

Poliribozima apropiada para conferir a las plantas una resistencia a los virus, y plantas resistentes que producen dicha poliribozima.

La presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica denominada "poliribozima" apropiada para conferir a las plantas una resistencia a los virus, así como a un procedimiento para producir plantas resistentes. La invención tiene asimismo por objeto las plantas que expresan la poliribozima.

Se han desarrollado varios enfoques para conferir a las plantas cultivadas una resistencia a los virus, integrando en el genoma de las plantas secuencias de ácidos nucleicos víricos: el gen de la proteína de envoltura, los genes de proteínas no estructurales, secuencias de ARN vírico antisentido, y ARN de virus satélites (véase, por ejemplo, Cuozzo et al., 1988, Bio/Technology 6, 549-557; Rezaian et al., 1988, Plant. Mol. Biol., 11, 463-471; Harrison et al., 1987, Nature 328, 797-802).

Estos estudios relatan la obtención de resistencias parciales o de tolerancias. Sin embargo, en la mayoría de los casos, se trata de síntomas retrasados, de síntomas atenuados pero no de resistencia total.

Además, algunas de estas técnicas, por ejemplo, las de los ARN de virus satélites, pueden dar lugar a nuevos problemas. Por ejemplo, un ARN satélite que reduce los síntomas en una especie puede ser letal en otra especie. Además, mutaciones en secuencias nucleotídicas del virus satélite introducidas en las plantas pueden aumentar la gravedad de la infección en lugar de disminuirla.

Asimismo, el uso de la proteína de envoltura para conferir una resistencia presenta inconvenientes. Por ejemplo, la proteína de envoltura de una cepa particular del virus no protege necesariamente a la planta contra una infección por otra cepa de virus. Es difícil usar el grado de homología de la secuencia de aminoácidos de la proteína de envoltura entre distintos virus o entre distintas cepas para predecir el nivel de tolerancia permitida por la expresión de la proteína. Además, la expresión de proteínas de envoltura para proteger de la infección vírica presenta el riesgo de inducir heteroencapsidaciones entre la proteína de envoltura expresada en la planta y otros virus que infectan la planta transgénica. Aunque nunca se demostró para las plantas transgénicas, esta heteroencapsidación ya se observó entre dos cepas de BYDV y entre ZYMV y PRSV.

Asimismo, se ha considerado el uso de ribozimas para conferir a las plantas una resistencia a los virus. Las ribozimas son moléculas de ARN que actúan como enzimas catalizando específicamente la ruptura del ARN diana. Se han descrito los primeros experimentos con ribozimas en células vegetales en la Solicitud de Patente EP-A-321021. Desde entonces varios autores intentaron optimizar la estructura de la ribozima y las condiciones de operación, para obtener una ruptura eficaz del ARN vírico.

Por ejemplo, Lamb y Hay (J. Gen. Virol., 1990, 71: 2257-2264) demostraron la ruptura, in vitro mediante mono-ribozimas, del ARN del virus del enrollamiento de la hoja de la patata (PLRV), en regiones que codifican la ARN-polimerasa y la proteína de envoltura. Sin embargo, la reacción de ruptura in vitro funcionó sólo a 40ºC; no se pudo observar ninguna reacción a 0ºC. Sin embargo, las plantas se cultivan generalmente entre 10 y 30ºC, según la especie. Por lo tanto, Lamb y Hay sugieren, para el uso in vivo, aumentar la longitud de los brazos complementarios. Pero, un tamaño de brazos demasiado importante puede conducir a la formación de dúplex estable entre el ARN diana y la ribozima, impidiendo la disociación de la ribozima y haciéndola incapaz de catalizar otra reacción de ruptura. Además, la ribozima en sí, en función de la longitud y de la secuencia de los brazos complementarios, puede formar estructuras secundarias que disminuyen su actividad de ruptura.

Edington y Nelson ("Gene Regulation: biology of Antisense RNA and DNA": Ed. ERICKSON e IZANT, Raven Press Ltd, Nueva-York, 1992) han descrito el uso in vitro e in vivo de mono-ribozimas para desactivar el gen de la polimerasa del virus del mosaico del tabaco (TMV). Se constató que los ribozimas tenían un comportamiento muy diferente según que estuviesen in vitro o in vivo. Por lo tanto, la actividad de una ribozima in vitro no se puede usar para prever la actividad de la misma ribozima in vivo. Por ejemplo, la ruptura in vitro parece poco eficaz y necesita una concentración de ribozima 20 veces mayor que la concentración de ARN genómico del TMV. Por el contrario, en un experimento in vivo que usa protoplastos de tabaco infectados mediante un TMV, la ribozima suprime 90% de la multiplicación del ARN vírico. Es interesante observar que el ARN antisentido usado como testigo inhibe sólo 20% de la multiplicación vírica. Estos autores se refieren igualmente a trabajos de Gerlach et al., que usan una poliribozima diana contra el gen de la polimerasa del TMV. Esta poliribozima no funcionó in vitro por culpa de la longitud del dúplex formado entre la ribozima y el ARN diana. En cambio, in vivo, esta poliribozima rompió el sustrato. Plantas transgénicas de tabaco que expresan la monoribozima o bien la poliribozima mostraron, tras infección mediante el TMV, un retraso de síntomas. No se describió una resistencia total, es decir la ausencia definitiva de síntomas. Los autores concluyen que los parámetros, tal como la longitud óptima de los brazos complementarios, la elección de la secuencia diana y la elección del promotor, que permiten superar eventuales problemas de "compartimentalización" de las ribozimas, se deben de determinar mediante el experi-
mento.

El documento EP-A-0421376 describe ribozimas dirigidas contra una secuencia de ARN no codificante del CMV. El documento WO-A-9213090 describe la desactivación del ARN de la proteína de envoltura del CMV mediante introducción, en el seno de la secuencia, de una secuencia heteróloga, usando una monoribozima de tipo "intrón del Grupo I". Ninguno de estos documentos describe la obtención de una resistencia total contra el CMV.

El problema técnico que se propone resolver la presente invención es suministrar un medio fiable y desprovisto de inconvenientes para conferir a las plantas una resistencia a los virus.

En la presente invención se ha resuelto este problema mediante la concepción y la implementación de una polirobozima dirigida contra la proteína de envoltura de un virus, esta poliribozima es capaz de desactivar el gen que codifica esta proteína, y conferirle así una resistencia total a los virus.

La eficacia de la poliribozima de la invención es sorprendente a la luz de los resultados mediocres obtenidos en la técnica anterior con las secuencias antisentido del gen de la proteína de envoltura, implicando cada una de estas técnica una desactivación del ARN correspondiente.

Tampoco se puede deducir tal eficacia de los resultados presentados por Chen et al (Nucleic Acids Research 1992, 20(17): 4581-4589) que se refieren a una poliribozima específicamente dirigida contra el ARN env del VIH-1. En efecto, la glicoproteína de envoltura del virus del VIH-1 es una lipoproteína membranaria que forma la capa más externa del virión en ciertos virus, y es una proteína distinta de las proteínas de envoltura. Además, varios autores habían desaconsejado el uso de poliribozimas que actúan en trans, porque las ribozimas no podían funcionar independientemente unas de otras, y porque las regiones catalíticas que tienen secuencias idénticas tendían, a veces, en hibridarse entre sí, lo que conducía a estructuras inactivas (véase, por ejemplo, Taira, HFSP Workschop "RNA-Editing - Plant Mitochondria", Abstract Book, Berlin, Septiembre 15-20, 1992). Los resultados obtenidos según la invención son inesperados teniendo en cuanta, por una parte, la diana elegida, es decir la proteína de envoltura y, por otra parte, el método usado para desactivar la diana, es decir una poliribozima.

A pesar de la eficacia de la desactivación, las poliribozimas de la invención presentan un cierto número de ventajas con relación a las técnicas conocidas:

-

Las ribozimas funcionan como enzimas, catalizan específicamente la ruptura de varios ARN víricos sin modificación de la estructura. Está ruptura enzimática conduce a la destrucción de todos los ARN víricos, mientras que la expresión de la proteína de envoltura que inhibe la infección vírica funciona como un inhibidor de la multiplicación del virus.

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Las ribozimas son moléculas de ARN no codificantes, que no pueden inducir heteroencapsidación o generar nuevas cepas víricas.

-

Mientras que la especificidad de la tolerancia inducida por la proteína de envoltura es difícilmente previsible, las ribozimas se pueden construir para romper específicamente una o varias cepas víricas, o varios virus relacionados si los brazos complementarios corresponden a las regiones de homologías conservadas entre las distintas cepas, o entre los distintos virus aparentados.

Para tener una comprensión completa de la invención, es útil precisar algunas informaciones a propósito de las ribozimas en general. Una ribozima es una molécula de ARN que, debido a su secuencia y a su estructura secundaria, posee una actividad de endoribonucleasa que le permite, cuando se hibrida con una segunda molécula de ARN complementaria, romper este segundo ARN. Este último es por lo tanto un "sustrato" para la ribozima.

La ribozima tiene dos partes esenciales:

(i)

una secuencia, que se denominará a continuación "secuencia complementaria", y que se elige de manera que sea complementaria al sustrato que se quiere romper, lo que permite la hibridación de las dos molé- culas;

(ii)

y una región catalítica que tiene una secuencia conservada independientemente del sustrato elegido, y que no participa a la hibridación con el sustrato debido a su estructura secundaria en forma de "bucle".

Normalmente, la región catalítica se sitúa en el seno de la secuencia complementaria, encontrándose, por lo tanto, una parte de la secuencia en 5' de la región catalítica, y la otra parte en 3'. Estos fragmentos de secuencia complementaria de cada lado de la región catalítica se denominan frecuentemente "brazos hibridantes".

El objeto de la presente invención es una poliribozima. Más particularmente, es una secuencia de ácido nucleico, denominada "poliribozima", que tiene una actividad de endoribonucleasa, y que es capaz de desactivar el gen para la proteína de envoltura de un virus, caracterizada porque comprende:

i)

una secuencia complementaria a al menos una parte del gen o su transcrito o sus intermedios de replicación e, incluidos en sitios distintos en esta secuencia complementaria;

ii)

una pluralidad de regiones catalíticas que proceden de ribozimas;

iii)

y, eventualmente, una o varias secuencias no complementarias al transcrito de dicho gen, estando dicha o dichas secuencias no complementarias insertadas entre 2 bases consecutivas de la secuencia complementaria.

El término "poliribozima", en el contexto de la presente invención, significa una molécula de ARN constituida por una cadena de cabeza a cola de ribozimas, siendo la ribozima, por lo tanto, el motivo unitario de la poliribozima. En otros términos, es una serie de regiones catalíticas unidas entre sí mediante brazos hibridantes, constituyendo el conjunto de estos brazos la secuencia complementaria. La poliribozima actúa normalmente como una "unimolécula" contra un único transcrito, es decir, que los sitios de ruptura de cada una de las regiones catalíticas se encuentran en un mismo transcrito: la proteína de envoltura. La poliribozima de la invención puede igualmente comprender, además de las dos partes esenciales [(i), secuencia complementaria] y [(ii), regiones catalíticas] descritas aquí arriba, una o más secuencias (iii) no complementarias del sustrato. La naturaleza de estas secuencias no complementarias se describirá en detalle más adelante.

Entre las dos partes esenciales de la poliribozima, la secuencia complementaria es aquella que determina el sustrato. En el caso de la presente invención, es una secuencia complementaria del gen de la proteína de envoltura de un virus, o de un fragmento de este gen. Cuando se trata de un virus ARN(+), cuyos genes sirven directamente como ARNm, la secuencia complementaria es realmente complementaria al gen. En otros casos, es complementaria al transcrito del gen. Ella puede igualmente ser complementaria de un intermedio de replicación.

La secuencia complementaria se puede hibridar con la totalidad del gen de la envoltura. En este caso, la longitud total de la secuencia complementaria varía en función de la longitud del gen de la envoltura en cuestión. En este caso, la secuencia complementaria se puede hibridar solamente con un fragmento del gen. El fragmento en cuestión debe de ser suficientemente largo para poder incluir, en la secuencia correspondiente de la poliribozima, al menos dos regiones catalíticas. De manera general, la longitud de la secuencia complementaria, sin tener en cuenta las regiones catalíticas (es decir, la suma de los brazos hibridantes), puede variar desde aproximadamente 40 hasta 2000 bases. Se prefiere una longitud de 400 hasta 1000, teniendo en cuenta que numerosos virus tienen un gen de la proteína de envoltura de aproximadamente 1000 bases (por ejemplo, CMV, PLRV).

El término "complementario", en el contexto de la invención, significa un grado de complementariedad suficientemente elevado para permitir la hibridación estable entre la poliribozima y este sustrato, y la ruptura eficaz del sustrato. Cuando la poliribozima no contiene ninguna secuencia de tipo (iii), es decir "no complementaria", el grado de complementariedad es normalmente de 100%. La presencia de un cierto número de desemparejamientos, por ejemplo hasta 10%, en la secuencia se puede tolerar con la condición de que no impida la hibridación ni la ruptura del sustrato.

La parte (ii) de la poliribozima, es decir, la región catalítica, proviene de cualquier tipo de ribozima apropiada, por ejemplo "cabeza de martillo", "horquilla", o "intrón de Grupo I". Una misma poliribozima puede contener regiones catalíticas que provienen de distintos tipos de ribozimas, por ejemplo "cabeza de martillo" y "horquilla". Preferentemente, se trata de regiones catalíticas que proceden de ribozimas de tipo "cabeza de martillo", y cuya estructura de consenso se ilustra en las figuras 1A, B, C y D. Estas ribozimas se describen con detalle en la Solicitud de Patente EP-A-321021 y WO-A-9119789.

Aunque las regiones catalíticas ilustradas en la figura 1 tienen una estructura y una secuencia conservadas, se constató que algunos nucleótidos se pueden suprimir, insertar, sustituir o modificar sin perjudicar la actividad de la ribozima. La invención comprende el uso, en la poliribozima, de estas regiones catalíticas modificadas con la condición de que su actividad catalítica este conservada. Esta actividad se puede verificar usando los ensayos descritos más adelante.

Por ejemplo, uno o más nucleótidos de la región II catalítica ilustrada en la figura 1A se pueden sustituir por nucleótidos que contienen bases tales como adenina, guanina, citosina, metilcitosina, uracilo, timina, xantina, hipoxantina, inosina u otras bases metiladas. Las bases "conservadas" C-G, que juntas forman el primer par de bases del bucle catalítico, se pueden sustituir por U-A (Koizumi et al., FEBS Letts. 228, 2, 228-230, 1988).

Los nucleótidos de la región catalítica ilustrada en la figura 1 también se pueden modificar químicamente. Los nucleótidos están compuestos de una base, de un azúcar y de un grupo monofosfato. Por lo tanto, cada uno de estos grupos se puede modificar. Tales modificaciones se describen en "Principles of Nucleic Acid Structure" (Ed. Wolfram Sanger, Springer Verlag, Nueva York, 1984). Por ejemplo, las bases pueden tener sustituyentes tales como grupos halógenos, hidroxi, amino, alquilo, azido, nitro, fenilo, etc. El resto de azúcar del nucleótido también puede sufrir modificaciones, tales como la sustitución de los grupos hidroxilo secundarios por grupos halo, amino o azido, o también la metilación en 2'.

El grupo fosfato de los nucleótidos se puede modificar mediante sustitución de un oxígeno por N, S o C, dando lugar respectivamente a un fosforamidato, fosforotiato y fosfonato. Estos últimos pueden presentar propiedades farmacocinéticas interesantes.

Las bases y/o los nucleótidos de la región catalítica también pueden tener sustituyentes tales como aminoácidos, por ejemplo tirosina o histidina.

Se constató asimismo que se podían insertar nucleótidos suplementarios en ciertos sitios de la región catalítica sin perjudicar la actividad de la ribozima. Por ejemplo, una base suplementaria seleccionada de entre A, G, C o U se puede insertar después de A^{1} en la figura 1A o 1B.

Según una forma de realización de la invención, la poliribozima puede comprender, como región catalítica, una o varias estructuras tales como las ilustradas en la figura 1D. Esta estructura, denominada "minizima", se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO-A-9119789. Representa una región catalítica del tipo "cabeza de martillo", cuyo "bucle" se sustituyó por un grupo "P". P puede ser un enlace covalente entre G y ^{1}A, uno o varios nucleótidos (ARN o ADN, o una mezcla, o también derivados descritos aquí arriba) o cualquier átomo o grupo de átomos distinto a un nucleótido, que no afecte a la actividad catalítica. Cuando P representa una pluralidad de nucleótidos, éste puede contener emparejamientos de bases internos. La secuencia y el número de nucleótidos que constituyen el grupo "P" no es crítico, y puede oscilar de 1 a 20 nucleótidos, por ejemplo, preferentemente de 1 a 6. Es preferible elegir una secuencia desprovista de emparejamientos internos de tipo Watson-Crick.

La actividad catalítica de las poliribozimas de la invención se puede verificar in vitro mediante la puesta en contacto de la poliribozima, o de una secuencia que, tras la transcripción, dara lugar a la poliribozima, con el sustrato, seguido de la detección de la ruptura. Las condiciones de realización para la reacción de la ruptura in vitro son las siguientes: una temperatura comprendida entre 4 y 60ºC, preferentemente entre 20 y 55ºC, un pH comprendido entre 7,0 y 9,0 aproximadamente, en presencia de metales divalentes, tales como Mg^{2+}, a una concentración de 1 hasta 100 mM (preferentemente 1 hasta 20 mM). La poliribozima está generalmente presente en una proporción equimolar con el sustrato, o en exceso. Las reacciones de ruptura in vitro se desarrollan ventajosamente según el protocolo descrito por Lamb y Hay (J. Gen. Virol. 1990, 71, 2257-2264). Este artículo describe igualmente las condiciones apropiadas para la transcripción in vitro para la producción de ribozimas a partir de oligodesoxiribonucleótidos insertados en plásmidos.

Las condiciones in vivo son las que existen naturalmente en la célula.

Las ribozimas "cabeza de martillo" rompen el sustrato inmediatamente aguas abajo de un sitio "diana" XXX, preferentemente XUX, en el que X representa una de las 4 bases A, C, G, U, y U representa uracilo. Una secuencia diana particularmente preferida es XUY, en la que Y representa A, C o U, y X es frecuentemente G, por ejemplo GUC. Otros sitios diana son posibles, pero son menos eficaces, por ejemplo CAC, UAC y AAC. Para las ribozimas del tipo "horquilla", una secuencia diana preferida es AGUC.

Estas secuencias diana son importantes en la construcción y funcionamiento de las poliribozimas, no solamente porque indican las posiciones de ruptura del sustrato, sino también porque determinan la posición en la que la región catalítica debe de ser insertada en la secuencia complementaria. De hecho, cada región catalítica de la poliribozima debe de encontrarse en un sitio, en la secuencia complementaria, que corresponde a un sitio XUX del transcrito. Por ejemplo, si un sitio XUX se encuentra en la posición 108 del gen de la proteína de envoltura, y otro se encuentra en la posición 205, una región catalítica se inserta en la posición que corresponde en 108 en la secuencia complementaria, y se inserta otra en la posición 205.

El motivo XUX es un motivo que se encuentra frecuentemente en las secuencias de ARN. Por ejemplo, por término medio, existe un motivo GUC cada 64 bases en una secuencia que tiene una distribución aleatoria e igual de bases. Esto significa que el sustrato contiene normalmente una pluralidad de sitios de ruptura XUX. Tal como se indica aquí arriba, las regiones catalíticas de la poliribozima se sitúan en posiciones de la secuencia complementaria que corresponden a los sitios XUX. Sin embargo, no es necesario, para obtener una ruptura eficaz según la invención, incluir una región catalítica para cada secuencia diana XUX del sustrato. Según la invención, una ruptura eficaz se obtiene cuando la poliribozima contiene al menos 2 regiones catalíticas. El número total de regiones catalíticas incluidas en la secuencia complementaria es igual o menor que el número total de sitios XUX presentes en el gen. La poliribozima de la invención puede, por lo tanto, contener un número muy variable de regiones catalíticas. Por ejemplo, para CMV, la poliribozima puede contener de 2 hasta 11 ó 12 regiones catalíticas aproximadamente, cuando la secuencia diana es GUC. En el caso en el que se decida incluir en la secuencia complementaria un número de regiones catalíticas menor que el número de sitios XUX en el sustrato, la elección de los sitios elegidos se puede realizar respectando los siguientes criterios:

a)

la distancia entre dos sitios XUX diana y, en consecuencia, entre 2 regiones catalíticas en la poliribozima, debe de ser suficientemente larga para permitir que los brazos hibridantes de la poliribozima, situados entre las regiones catalíticas correspondientes, se hibriden con el sustrato de manera estable, y para evitar que las regiones catalíticas se hibriden entre sí. Es particularmente ventaja una distancia de al menos 8 bases, preferentemente de al menos 14 bases, por ejemplo 20 bases aproximadamente a. Bien entendido, este criterio no se debe de considerar sólo cuando el sustrato contiene sitios XUX muy próximos entre sí. De otro modo, si los sitios XUX del sustrato están separados unos de otros de más de 8 a 20 bases, este criterio de elección no tiene importancia.

b)

los sitios XUX diana se encuentran preferentemente en una parte del gen de la proteína de envoltura que no tenga una estructura secundaria importante. Esto facilita el acceso de la poliribozima al sustrato, y aumenta su eficacia.

c)

los sitios XUX diana pueden formar parte de las zonas de homología conservadas entre las distintas cepas de un mismo virus, o entre distintos virus relacionados. Las poliribozima construidas respectando este criterio pueden romper específicamente varias cepas víricas o varios virus relacionados. Por ejemplo, la región central del gen de la proteína de envoltura del PLRV está muy conservada con relación a las secuencias de las proteínas de envoltura de los virus BWYV y BYDV relacionados. Los sitios XUX, y particularmente GUX en el seno de esta región central, constituyen por lo tanto sitios preferidos para una poliribozima según esta forma de realización de la invención.

Asimismo, a título de ejemplo, el extremo 5' (sobre aproximadamente 100 bases) de la secuencia de la proteína de envoltura del CMV está muy conservado entre las cepas I17F, FNY, M, I, O, Y, D y C. Dentro de esta secuencia conservada, en la posición 84, existe un sitio GUC conservado, en todas estas cepas.

Según esta forma de realización de la invención, una poliribozima capaz de desactivar varias cepas del CMV comprende, entre sus regiones catalíticas, una región catalítica que está situada en el sitio de la secuencia complementaria correspondiente a la posición 84 (véanse los ejemplos más abajo).

d) otro criterio de selección de los sitios XUX diana es la ausencia de homología con genes endógenos de la planta a transformar. En efecto, aunque son raros, algunos virus poseen secuencias que encuentran una homología en el genoma de las plantas. Por lo tanto, es importante evitar sitios XUX que se encuentran en el seno de tal secuencia.

Según un modo de realización particularmente preferido de la invención, la poliribozima puede comprender, además de las 2 partes (i) y (ii) esenciales, descritas aquí arriba, un tercer constituyente (iii) que es una o varias secuencias no complementarias del gen de la proteína de envoltura del virus. Al igual que las regiones catalíticas, estas secuencias no complementarias se insertan en sitios distintos de la secuencia complementaria, estando la complementariedad interrumpida por la inserción. De manera sorprendente, se constató en la presente invención que la presencia de tales secuencias no complementarias en el seno de los brazos hibridantes de la poliribozima no evita la hibridación de la poliribozima con el sustrato, y en algunos casos, pueden incluso mejorar la eficacia de la reacción de ruptura.

Estas secuencias no complementarias se insertan 2 bases consecutivas de la secuencia complementaria, formando así la secuencia no complementaria una inserción colineal con la secuencia complementaria. En este caso, la poliribozima tiene la estructura:

((\text{brazo hibridante} - \text{región catalítica} - \text{brazo hibridante}) - (\text{secuencia no complementaria})_{n})_{p}

en la que n = 0 ó 1, y p > 1.

Como ejemplo de este modo de realización de la invención, se puede citar una poliribozima compuesta de una cadena de ribozimas, cuyos brazos hibridantes son complementarios de fragmentos distintos, consecutivos y contiguos, del sustrato, y que están conectados entre sí mediante secuencias no complementarias. En otros términos, en tal estructura, el conjunto de los brazos hibridantes reconstituye la secuencia complementaria del gen de la proteína de envoltura.

La presencia de secuencias no complementarias en la poliribozima significa que la distancia entre dos regiones catalíticas de la poliribozima es más grande que la distancia entre los dos sitios GUC correspondientes, en el sustrato. Según esta forma de realización de la invención, la longitud de los brazos hibridantes que se encuentran en cada lado de una región catalítica debe de ser al menos de 4 bases, preferentemente al menos de 8 bases, en cada lado y puede ser de 800 hasta 1000 bases.

La naturaleza de la o secuencias no complementarias puede ser muy variable según su función. Puede haber secuencias que tienen una función de "almohadillado", es decir que sirva para aumentar la distancia entre dos regiones catalíticas de la poliribozima, cuando los dos sitios XUX correspondientes del sustrato están relativamente cercanos entre sí. De esta manera, se puede evitar la formación de dúplex inactivos entre dos regiones catalíticas vecinas. Es posible igualmente usar, como secuencias no complementarias, secuencias que tienen una estructura secundaria determinada, lo que puede tener por efecto evitar que una poliribozima de longitud importante, por ejemplo de más de 800 bases, se repliegue sobre sí misma en una estructura secundaria inactiva. Como ejemplo de este tipo de estructura, se puede citar la región catalítica de un ribozima que se hace inactiva mediante la supresión de una o varias bases esenciales. Este modo de realización de la invención se ejemplifica mediante la poliribozima 136 descrita en los ejemplos a continuación.

La secuencia no complementaria de la poliribozima puede igualmente tener una función precisa, por ejemplo, puede estar constituida de una secuencia codificante que sirve en la selección de los transformantes, o también una secuencia que contiene una ribozima que actúa sobre un sustrato distinto de la proteína de envoltura o que actúa en cis sobre una parte de la poliribozima. De manera general, la secuencia no complementaria no codifica una proteína. La misma puede igualmente contener múltiples sitios para la clonación. La secuencia no complementaria tiene normalmente una longitud comprendida entre 2 y 500 bases, por ejemplo 20 a 100 bases. Cuando existe una pluralidad de secuencias complementarias, éstas pueden constituir juntas hasta 90% aproximadamente de la longitud de la poliribozima, por ejemplo 50%.

La poliribozima de la invención está normalmente constituida de ARN. Es posible, sin embargo, sustituir mediante ADN, ciertas partes de la poliribozima, por ejemplo los brazos hibridantes o partes de estos brazos, o también una parte de la región catalítica, en particular el "bucle", con la condición de que se mantenga la actividad catalítica (véase, por ejemplo, la sustitución del ARN por ADN descrita en la Solicitud de Patente Internacional WO-9119789).

La poliribozima de la invención se puede construir para desactivar cualquier proteína de la envoltura vírica. La proteína de envoltura es una subunidad proteica, codificada por el genoma vírico, y está destinada a ser incorporada en la estructura polimérica de la envoltura. En efecto, la envoltura está constituida de la sucesión de subunidades proteínicas, idénticas entre sí, que se agarran a lo largo del ácido nucleico. El grupo de las subunidades de envolturas puede conllevar a una arquitectura helicoidal o icosaédrica según los virus. La invención tiene por objeto poliribozimas dirigidas contra las proteínas de envoltura de virus de partículas helicoidales o de partículas icosaédricas, así como a virus de cubierta. La cubierta es una membrana lipidoproteica que rodea a la nucleocápsida.

Como ejemplo de virus apropiado, se puede citar un virus elegido entre los siguientes grupos: los Caulimovirus, por ejemplo el virus del mosaica de la coliflor (CaMV); los Geminivirus, por ejemplo el virus del estriado del maíz (MSV); los Reoviridae, por ejemplo el virus de los tumores de lesiones (WTV); los Rhabdoviridae, por ejemplo el virus del enanismo amarillo de la patata (PYDV), el virus del bronceado del tomate (TSWV), los Tabacovirus, por ejemplo el virus del mosaico del tabaco (TMV); los Potexvirus, por ejemplo el virus X de la patata (PVX); los Potyvirus, por ejemplo el virus Y de la patata (PVY); los Carlavirus, por ejemplo el virus latente del clavel (CLV); los Closterovirus, por ejemplo el virus del amarilleo de la remolacha (BYV); los Tobravirus, por ejemplo el virus del cascabel del tabaco (TRV); los Hordeivirus, por ejemplo el virus del mosaico de las estrías de la cebada; los Tymovirus, por ejemplo el virus del mosaico amarillo del nabo (TYMV); los Luteovirus, por ejemplo el virus del amarilleo del enanismo de la cebada (BYDV) o el virus de enrollamiento de las hojas de patata (PLRV); los Tombusvirus, por ejemplo el virus del achaparrado del tomate (TBSV); los Sobemovirus, por ejemplo el virus del mosaico de las judías Southern (SBMV); el virus de la necrosis del tabaco (TNV); los Nepovirus, por ejemplo el virus de la mancha anular del tabaco (TRSV); los Comovirus, por ejemplo el virus del mosaico de Vigna (CPMV); el virus del mosaico enación del guisante (PEMV); los Cucumovirus, por ejemplo el virus del mosaico del pepino (CMV); los Bromovirus, por ejemplo el virus del mosaico del bromo (BMV); los Ilarvirus, por ejemplo el virus de las estrías del tabaco (TSV). Las secuencias de estas proteínas son conocidas (véase, por ejemplo, las numerosas referencias bibliográficas citadas en el documento: "Eléments de Virologie Végétale", Pierre Cornuet, I.N.R.A. Paris, 1987, ISBN: 2-85340-808-6).

Según una variante particularmente preferida, la proteína de envoltura es aquella del virus del mosaico del pepino (CMV). El virus del mosaico del pepino es un virus que pertenece al grupo de los cucumovirus, que son de gran importancia agronómica ya que más de 750 especies de plantas pueden ser infectadas por el CMV. El CMV es un virus con varios componentes formados de partículas icosaédricas que contienen tres ARN genómicos (ARN 1 a 3) y un ARN subgenómico (ARN 4). El ARN 3 contiene una copia del gen de la proteína de la envoltura, sin embargo, el ARN 4 subgenómico, que deriva de ARN 3, sirve como matriz para la síntesis de la proteína de la envoltura. Las distintas cepas de CMV se distribuyen en dos grupos:

\bullet

el subgrupo I que comprende las cepas C, D, FNY, Y, I17F y Chi;

\bullet

el subgrupo II, al que pertenecen las cepas Q y WL.

La comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de envoltura del CMV entre las cepas de un mismo grupo muestra una homología de 95%. Entre los subgrupos I y II, las homologías de secuencia son menos importantes, del orden de 80%.

Se ha encontrado que las poliribozimas de la invención dirigidas contra la proteína de envoltura del CMV (cepa I17F) son extremadamente eficaces en la desactivación de las distintas cepas del virus CMV, y conllevaron a una resistencia total de las plantas transformadas.

Además de las poliribozimas, la invención tiene igualmente por objeto un procedimiento para producir una planta resistente a un virus, caracterizado por la introducción en la planta de una poliribozima o de una secuencia que codifica una poliribozima tal como se describe aquí arriba.

Normalmente, la introducción de la poliribozima en la planta se efectúa mediante transformación genética, estando, por lo tanto, una secuencia de ADN que codifica la poliribozima integrada de manera estable en el genoma de la planta.

Se pueden usar todos los medios conocidos para introducir ADN extraño en plantas, por ejemplo Agrobacterias, electroporación, fusión con protoplastos, bombardeo con una pistola de partículas, o penetración de ADN en células tales como polen, la microspora, la semilla y el embrión inmaduro, vectores víricos tales como los Geminivirus o los virus satélites. Agrobacterium tumefaciens y rizogenes constituyen el medio preferido. En este caso, la secuencia que codifica la poliribozima se introduce en un vector apropiado junto con todas las secuencias reguladoras necesarias, tales como promotores, terminadores, etc., así como cualquier secuencia necesaria para seleccionar los transformantes.

La invención tiene asimismo como objetivo las plantas transgénicas obtenidas mediante el procedimiento. Más particularmente, tiene como objetivo plantas transgénicas resistentes a un virus, caracterizadas porque contienen, en su genoma, una secuencia que da lugar, después de la transcripción, a un poliribozima según la invención.

En el contexto de la invención, la expresión "resistencia total" significa que hay ausencia total de síntomas; el término "tolerancia" significa que la planta está infectada, es decir, que manifiesta síntomas, pero que después, se recupera. El término "sensible" significa que la planta presenta síntomas y replica el virus. La expresión "tipo resistente" corresponde a la suma de las plantas totalmente resistentes y de las plantas tolerantes.

La naturaleza "resistente" de las plantas transgénicas de la invención se puede ensayar de la siguiente manera: una autofecundación o un cruce con un genotipo no transformado, se efectúa sobre un descendente primario para obtener T_{1}. Después, T_{1} se inocula con el virus en cuestión. Según la invención, después de la autofecundación, el 75% de las plantas T_{1} son totalmente resistentes. En el caso de un cruce con un genotipo no transformado, el 50% de la plantas son totalmente resistentes (estas cifras se obtienen, según la invención, ensayando una población entera de plantas que hayan sido objeto de un procedimiento de transformación y regeneración. Se debe de observar que sólo el 75% de estas plantas son transformadas).

La naturaleza transformada de una planta se puede verificar efectuando un análisis de "transferencia Southern", y la expresión de la secuencia introducida mediante la transformación se verifica efectuando un análisis de "transferencia Northern". Estos análisis se describen en los ejemplos siguientes.

Los métodos de transformación y regeneración de plantas conocidos en la técnica anterior se prestan perfectamente a la producción de plantas transgénicas protegidas por la poliribozima de la invención. Como ejemplo, se puede citar el método de transformación y regeneración del melón, descrito en la Solicitud de Patente nº EP-A-0412912.

Se prefieren particularmente las plantas transgénicas resistentes al CMV, por ejemplo el melón, pepino, calabacín, tomate, pimiento, judía.

En las figuras se ilustran distintos aspectos de la invención:

- la figura 1 muestra las estructuras preferidas de las regiones catalíticas de la poliribozima de la invención, estando estas regiones rodeadas, a cada lado, por una secuencia complementaria de una parte de la proteína de envoltura de un virus:

(i)

en la figura 1A: X representa A, G, C o U; siendo cada X idéntico o diferente; n + n' \geq 6, siendo n y n' idénticos o diferentes; (*) representa un enlace de hidrógeno entre ribonucleótidos complementarios; X' y X'' representan oligoribonucleótidos complementarios entre sí a lo largo de al menos una parte de su longitud, y que pueden eventualmente estar conectados entre sí mediante al menos un nucleótido, formando así un bucle. Después de A^{1} Se puede insertar un nucleótido suplementario elegido entre A, G, C o U. La región catalítica de la ribozima está representada por la parte (II) de la figura 1A, y los brazos hibridantes por la parte (I).

(ii)

en la figura 1B: X, (*), n, n' y A^{1} tienen los mismo significado que en la figura 1A. M y M' \geq 1, y son idénticos o diferentes. B representa un enlace, un par de bases, un ribonucleótido o un oligoribonucleótido que contiene al menos 2 ribonucleótidos.

(iii)

la figura 1C representa un modelo preferido de ribozimas (Haseloff y Gerlach, 1988). El sustrato de ARN puede tener cualquier secuencia (X) alrededor del sitio de ruptura GUC complementario de la ribozima. La flecha indica el sitio de ruptura. Las bases conservadas se muestran en negro.

(iv)

la figura 1D representa la estructura de un ribozima (denominada "minizima"), cuyo bucle de la región catalítica se sustituye por un elemento "P". P puede ser al menos 1 nucleótido (ribonucleótidos, desoxiribonucleótidos, derivados o una mezcla), con la condición de que, cuando las secuencias (X')_{n} y (X)_{n'} y P estén constituidas exclusivamente de ribonucleótidos, los ribonucleótidos del grupo "P" no estén emparejados entre sí mediante uniones "Watson-Crick". "P" puede ser también un enlace o cualquier átomo o grupo de átomos que no afecte a la actividad catalítica de la ribozima. X tiene el mismo significado que en la figura 1A.

- la figura 2 muestra la secuencia de la proteína de envoltura del CMV (I17F), estando los sitios GUC subrayados.

- la figura 3 representa las estructuras de los oligodeoxiribonucleótidos A, B, C, E, usados para los experimentos de mutagenesis dirigida con el objetivo de introducir el sitio catalítico del TobRSV en distintos sitios en la secuencia de la proteína de envoltura del CMV (representados en hibridación con la secuencia de matriz de ADN).

- la figura 4 ilustra la estructura de los genes construidos para inducir una resistencia al CMV:

(i)

proteína de envoltura;

(ii)

poliribozima 136: secuencia complementaria a la proteína de envoltura que lleva 2 ribozimas;

(iii)

poliribozima 161: secuencia complementaria a la proteína de envoltura que lleva 3 ribozimas;

(iv)

poliribozima 163: fragmento complementario a la proteína de envoltura que lleva 3 ribozimas;

(v)

poliribozima 165: secuencia complementaria a la proteína de envoltura que lleva 4 ribozimas.

- la figura 5 muestra el análisis de transferencia Northern de las plantas de melón transgénicas (transformantes primarios, descendientes T1 y T2 en algunos casos) que expresan la poliribozima 136:

T0:

transformante primario;

T1:

descendiente T1;

T2:

descendiente T2;

A:

línea 141.1;

NT:

testigo no transformado.

- la figura 6 muestra el análisis de transferencia Southern de las plantas de melón transgénicas (transformantes primarios, descendientes T1 y T2 en algunos casos) que expresan la poliribozima 136:

T0:

transformante primario;

T1:

descendiente T1;

T2:

descendiente T2;

NT:

testigo no transformado.

- la figura 7 muestra el análisis de transferencia Southern de las plantas de melón transgénicas (transformantes primarios, descendientes T1 y T2 en algunos casos) que expresan el gen para la proteína de envoltura:

T0:

transformante primario;

T1:

descendiente T1;

T2:

descendiente T2;

A:

línea 88.105;

B:

línea 159.8;

C:

línea 164.23;

NT:

testigo no transformado.

- la figura 8 muestra el análisis de transferencia Western de las plantas de melón transgénicas (transformantes primarios) transformadas por pBIOS 135:

A, B, C, D y E:

transformantes primarios de 5 líneas;

NT:

testigo no transformado;

R:

reconstrucción con 20 ng de CMV.

- la figura 9 muestra el desarrollo de los síntomas del CMV a lo largo del tiempo en líneas transformadas por pBIOS 135:

D:

día;

\blacksquare:

plantas sin síntomas;

100

plantas tolerantes;

{}\hskip0.2cm:

plantas sensibles.

- la figura 10 muestra el desarrollo de los síntomas del CMV a lo largo del tiempo en líneas transformadas por pBIOS 136:

D:

día;

\blacksquare:

plantas sin síntomas;

100

plantas tolerantes;

{}\hskip0.2cm:

plantas sensibles.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes describen la construcción de 4 poliribozimas que contienen 3 ó 4 ribozimas compuestas de la estructura de consenso cabeza de martillo de 24 bases (Figura 1), y de brazos complementarios de la secuencia de la proteína de envoltura del CMV (cepa I17F) de distintos tamaños. La numeración de la secuencia nucleotídica de la proteína de envoltura mostrada en estos ejemplos corresponde a la usada en la Solicitud de Patente EP-A-0412912.

Cada una de estas ribozimas escinde una secuencia GUC diferente a lo largo de la secuencia del gen para la proteína de envoltura del CMV. La estructura de estas construcciones se ilustra en la figura 4:

-

la poliribozima 136, que tiene una longitud de 1074 bases, contiene las ribozimas A (posición 84) y B (posición 108), y la ribozima C* (posición 204), de la que se han suprimido una G y una A (posiciones 20 y 21), estando rodeadas las ribozimas por brazos complementarios que tienen una longitud de:

\bullet

82 nucleótidos del extremo 5' hasta la ribozima A;

\bullet

22 nucleótidos entre las ribozimas A y B;

\bullet

94 nucleótidos entre las ribozimas B y C*;

\bullet

y 803 nucleótidos de la ribozima C* hasta el extremo 3'.

-

La poliribozima 161, que tiene una longitud de 1076 bases, es idéntica a la poliribozima 136, con la única diferencia que la ribozima C en la posición 204 tiene la G y la A suprimidas en la ribozima C*.

-

La poliribozima 163, que tiene una longitud de 426 nucleótidos, contiene las 3 ribozimas A (posición 84), B (posición 108) y C (posición 204) rodeadas por brazos complementarios que tiene una longitud de:

\bullet

82 nucleótidos del extremo 5' hasta la ribozima A;

\bullet

22 nucleótidos entre las ribozimas A y B;

\bullet

94 nucleótidos entre las ribozimas B y C;

\bullet

y 153 nucleótidos de la ribozima C hasta el extremo 3'.

-

La poliribozima 165, que tiene una longitud de 1099 nucleótidos, contiene las 4 ribozimas A (posición 84), B (posición 108), C (posición 204) y E (posición 608) rodeadas por brazos complementarios que tienen una longitud de:

\bullet

82 nucleótidos del extremo 5' hasta la ribozima A;

\bullet

22 nucleótidos entre las ribozimas A y B;

\bullet

94 nucleótidos entre las ribozimas C y E;

\bullet

399 nucleótidos de la ribozima E hasta el extremo 3'.

Las poliribozimas no contienen las señales necesarias para su expresión y para su integración en el genoma de las planta. Se debe de colocar, en 5' de la poliribozima, un promotor constitutivo o no constitutivo (por ejemplo, un promotor vírico o bacteriano, tal como NOS, o de planta, tal como Rubisco y ubiquitina), y se debe de colocar una secuencia poli (A) en 3'. Son usables varios promotores que funcionan en las plantas; en la invención, se seleccionó el promotor 35S que deriva del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), con fama de ser el promotor constitutivo más fuerte. La señal de poliadenilación poli(A) puede ser aquella del gen 35S del CaMV, aquella de los genes aislados de plantas o la de octopina sintasa; en la presente invención se seleccionó la señal poli(A) que deriva del gen de la nopalina sintasa (tnos). Los casetes de expresión construidos se introdujeron en el vector de transformación pBIOS 4 que deriva del vector pBI 121 que contiene el gen de resistencia a kanamicina (gen neo que codifica la neomicina fosfotransferasa), y el gen iud A que codifica la glucuronidasa. El protocolo de transformación genética de cotiledones de melón y de regeneración de plantas transgénicas de melón es idéntico a aquel descrito en la Patente "melón transgénico", nº EP-A-0412912 a nombre de BIOSEM.

Ejemplo 1 Construcción de una ribozima dirigida contra el gen de la proteína de envoltura del virus del mosaico del pepino, cepa I17F

El fagémido bluescribe pBSIISK (STRATAGENE) que contiene un ADN complementario del ARN4 del CMV cepa I17F denominado pBIOS 113, cuyo procedimiento de producción se describe en la Solicitud de Patente Europea EP-A-0412912, sirvió de punto de partida para la construcción de las distintas ribozimas usadas para obtener melones transgénicos resistentes a distintas cepas de CMV.

El sitio catalítico del satélite TobRV (virus de la mancha anular del tabaco) se introdujo en distintas posiciones de la secuencia del gen para la proteína de envoltura. La secuencia del ADN complementario del ARN 4 del CMV, cepa I17F, con una longitud de 1007 pb se presenta en la figura 3 del documento EP-A-0412912; la parte que codifica la proteína de envoltura se muestra con la secuencia de aminoácidos.

Como la ribozima del tipo "cabeza de martillo" descrito por Haselhoff y Gerlach escinde preferentemente después del C de los motivos GUC, se seleccionaron 4 posiciones en la secuencia que codifica la proteína de envoltura (Figura 2):

\bullet

Posición A, nucleótido 84,

\bullet

Posición B, nucleótido 108,

\bullet

Posición C, nucleótido 204,

\bullet

Posición E, nucleótido 608.

A fin de introducir las 24 bases de la ribozima comúnmente denominada "cabeza de martillo" en ésas posiciones, se decidió usar el método de mutagenesis sobre ADN monocatenario desarrollado por KUNKEL (Proc. Nat. Acad. Sci 82: 488-492), que requiere oligodesoxiribonucleótidos de síntesis que hibridan parcialmente con el ADN que se debe de mutageneizar y que sirven de cebador en su extremo 3' para una síntesis complementaria con la ayuda de una ADN polimerasa. Se pidieron los cuatro oligonucleótidos siguientes a la compañía EUROGENTEC:

Oligo A:

5' TCGACGGTTACCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACCAGCACTGGTTG 3'

Oligo B:

5' CGGGAACCACCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGCGGACGACG 3'

Oligo C:

5' CTAATAGTTGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGACCAGCTGC 3'

Oligo E:

5' GAATACACGAGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGGCGTACTTTC 3'

Gracias a estos 4 oligonucleótidos y el kit de mutagenesis dirigida, adquerido de la compañía BIORAD (ref. 170-3576), se mutagenizó ADN monocatenario producido a partir del fagémido pBIOS 113. La figura 3 representa la hibridación de los 4 oligonucleótidos al ADN monocatenario diana, y las flechas indican la acción del ADN polimerasa que sintetiza la hebra complementaria. El análisis de algunos clones recombinantes obtenidos después de la transformación de E. coli se realizó en primer lugar mediante digestión con enzimas de restricción, para detectar un crecimiento de tamaño de algunos fragmentos. Se secuenció uno de los clones, pBIOS 116, que tenía aparentemente 3 sitios catalíticos, se secuenció con la ayuda del kit "sequenase R" versión II de la compañía United Status Biochemicals, usando un oligonucleótido de 22 bases, oligo nº 13 (posición 53 a 74). Los resultados revelaron la inserción perfecta de los sitios catalíticos A y B, y la inserción imperfecta del sitio catalítico C. Hubo una supresión de las dos bases en las posiciones 20 y 21 (G y A) del sitio catalítico. Aunque este sitio no puede ser funcional para la escición, tal como se demuestra por Lamb y Hay (Journal of General Virology, 1990, 71: 2257-2264), se decidió clonar el fragmento de ADN de aproximadamente 1100 pb (1007 bp + 21 bp x 2 + 19 pb + secuencias adyacentes en 5' y 3' del poliligador) en orientaciones opuestas en el vector de expresión pBIOS 3 (Perez et al., Plant. Mol. Biology 1989, 13: 365-373), a fin de estudiar el efecto de la presencia de secuencias no complementarias desprovistas de actividad ribozímica, en la poliribozima. Para ello, el fragmento KpnI-XbaI de pBIOS 113 se clonó en los sitios Kpn-XbaI del plásmido pGEH7 2f (+) obtenido de la compañía PROMEGA BIOTECH; esto con el objetivo de tener sitios BamHI en cualquier lado de la secuencia para la proteína de envoltura que contienen los sitios catalíticos. Después, el plásmido resultante pBIOS 151 se digiero mediante BamHI, y el fragmento en cuestión (poliribozima 136, figura 4) se introdujo en el sitio de BamHI de pBIOS 3. Se eligió y se denominó pBIOS 125 a un clon recombinante que contiene el fragmento en orientación antisentido, bajo el control del promotor constitutivo fuerte 35S del virus del mosaico de la coliflor y el terminador del gen de la nopalina sintetasa.

El fragmento EcoRI de este plásmido que contiene la ribozima (fragmento complementario con dos sitios catalíticos funcionales y uno suprimido), bajo el control de las secuencias de regulación transcripcionales citadas aquí arriba, se clonó en el sitio EcoRI del vector binario pBIOS 4. Este último deriva del vector pBI 121 (Jefferson et al., 1987; EMBO Journal 6: 3901-3907) que se modificó mediante la supresión del sitio EcoRI situado en 3' del gen que codifica \beta-glucuronidasa y la creación de un sitio EcoRI situado en 5' de este mismo gen. El vector binario resultante, pBIOS 136, sirvió para los distintos experimentos de transformación después de la conjugación triparental en la cepa desarmada de Agrobacterium tumefaciens RC58'3, que deriva de la cepa C58'3 (Mullineaux et al., Plant Science 63: 237-245 1989), y es realmente un mutante espontáneo resistente a la rifampicina.

Ejemplo 2 Construcción de distintas ribozimas dirigidas contra el gen de la proteína de envoltura del virus del mosaico del pepino, cepa I17F

Dado que la poliribozima 136 (figura 4) descrita en el ejemplo 1, no contenía el sitio catalítico dirigido contra la posición 608, y que la poliribozima dirigida contra la posición 204 estaba incompleta, se iniciaron experimentos adicionales de mutagenesis dirigida. Para ello, el fragmento EcoRI del plásmido pBIOS 125 se clonó en el fago M 13 mp 18 digerido por EcoRI, obtenido de la compañía PHARMACIA. Se caracterizó un fago recombinante que permite encapsidar la hebra codificante del gen de la proteína de envoltura que contiene los dos sitios catalíticos correctos, y sirvió de matriz para los nuevos experimentos de mutagenesis que usan los oligodesoxiribonucleótidos C y E (juntos o separadamente). Estos últimos se llevaron a cabo tal como la presentada en el ejemplo anterior, excepto que el rendimiento de matriz monocatenaria es mucho más favorable puesto que el material de partida fue un fago. Se secuenciaron diferentes clones recombinantes usando el oligonucleótido nº 13, y un oligonucleótido de 19 mers (posición 694 a posición 676), permitiendo este último secuenciar el sitio catalítico introducido en la posición 608. Los clones que contenían sitios catalíticos conformes sirvieron para la construcción de los vectores binarios pBIOS 161, pBIOS 163 y pBIOS 165 (véase la figura 4). El vector binario pBIOS 161 es idéntico al pBIOS 136 excepto que pBIOS 161 contiene el sitio catalítico C no suprimido.

En el caso de genes que codifican las ribozimas que se hibridan con la totalidad de la secuencia del gen de la proteína de envoltura y que contienen 3 sitios catalíticos funcionales A, B, C (el caso de pBIOS 161) o cuatro sitios catalíticos funcionales A, B, C, E (el caso de pBIOS 165), la clonación al sitio EcoRI del vector binario pBIOS 4 se efectúa directamente después de la purificación del fragmento EcoRI que comprende el promotor 35S, la ribozima, el terminador NOS. En el caso de la ribozima que contiene 3 sitios catalíticos A, B, C, y se hibrida con sólo los 360 primeras bases del extremo 5' del ARN 4 del CMV (el caso para pBIOS 163), se realizó, tras la digestión con la enzima de restricción Hindi, una supresión de la parte 3' que queda (las posiciones 361 en la secuencia del gen de la proteína de envoltura y del sitio HindIII situado en el borde de 3' de esta secuencia y que proviene de un poliligador). Después, el fragmento EcoRI del plásmido así suprimido se clonó en el sitio EcoRI del vector binario pBIOS 4.

Transformación y regeneración de melones que expresan las poliribozimas

Los 3 últimos vectores binarios se introdujeron en agrobacterium, y se usaron en la transformación tal como se describe en la Solicitud de Patente EP-A-0412912.

Ejemplo 3 Análisis molecular de las plantas transgénicas * Análisis de transferencia Northern

Las plantas de melones obtenidas después de la transformación con pBIOS 136 se analizaron mediante transferencia Nothern (figura 5). Se extrajeron los ARN totales a partir de hojas jóvenes de plantas transgénicas y no transgénicas, cultivadas en invernadero según el protocolo de Chandler et al. (Plant Physiology (1983) 74: 47-54).

Se sometieron a electroforesis en un gel de azarosa desnaturalizante al 1%, se transfirieron en Hybond C, y se hibridaron a la sonda constituidas de los fragmentos que resultan de una triple digestión del fragmento BamHI, que corresponde al fragmento complementario completo del gen de la proteína de envoltura, portador de las 3 ribozimas de las cuales dos son funcionales (poliribozima 136). La triple digestión favorece la hibridación entre las secuencias homólogas, y permite obtener una señal más intensa.

La homogeneidad de las cantidades de ARN totales depositados sobre el gel y la calidad de los ARN se verificaron mediante tinción de la membrana con azul de metileno. Los resultados obtenidos a nivel de la transcripción para los transformantes primarios, los descendientes T1 y T2 correspondientes, se ilustran en la figura 2, y muestran que:

-

se observa un transcrito de mayor tamaño 1,45 kb en todas las muestras que proceden de plantas transformadas, y no se observa en el testigo negativo;

-

el número de transcritos varía considerablemente según los transformantes primarios. Esto se puede explicar mediante integraciones del ADN-T o fragmentos de ADN-T en diferentes lugares del genoma vegetal, y por lo tanto mediante efectos ambientales;

-

no existe ninguna correlación entre los niveles de transcripción de los transformantes primarios y los de sus descendientes T1 y T2.

* Análisis de transferencia Southern

Las plantas de melones obtenidas después de la transformación con pBIOS 136 o pBIOS 135 se analizaron mediante transferencia Southern (figuras 6 y 7). Se extrajeron los ADN totales a partir de hojas jóvenes de plantas transgénicas (transformantes primarios, descendientes T1 y T2 en algunos casos) y no transgénicas, cultivadas en invernadero, según el protocolo de Dellaporta et al. (Plant Molecular biology Reporter (1983) 1: 19-21). Se hidrolizaron mediante EcoRI (sitio de clonación del casete de expresión del gen de interés en pBIOS 4), se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se transfirieron sobre Hybond N+, y se hibridaron con las tres sondas, gen npt II, poliribozima 136 triplemente digerida (véase análisis de transferencia Northern) y gen gus.

Los resultados obtenidos para 5 eventos de transformación con pBIOS 136 (Figura 6) muestran que:

- Líneas 146.42:

En el caso del transformante primario 146.42, su ascendiente T1 y dos descendientes T2, los perfiles de hibridación con las 3 sondas son idénticas, lo que indica que no ha habido segregación de los fragmentos del ADN-T, y que probablemente existe un único locus. La poliribozima 136 está presente en el genoma en varias copias vegetal. En efecto, se ven 4 bandas de hibridación de tamaño 1,75 Kb; 4,4 Kb; 8,3 Kb y 8,8 Kb. La banda de 1,75 Kb corresponde a la banda de tamaño teórico esperado con el par (EcoRI, poliribozima 136). La banda de 4,4 Kb se hibrida tanto con la poliribozima 136 como con el gen npt II. Además, el análisis con la pareja EcoRI/npt II no conduce a la detección de está banda, lo que indica la presencia de una sola copia del gen npt II en el genoma vegetal. Las bandas de 8,3 Kb y 8,8 Kb se hibridan con la poliribozima 136 y con el gen gus. Sólo estas dos bandas se detectan mediante el par EcoRI/gus, lo que revela la presencia de dos copias del gen y/o parte del gen gus. La hibridación de las 3 sondas a los ADN de las plantas T0, T1 y T2 digeridas con Xba I también sugiere la presencia de un solo locus.

- Línea 146.34:

En el caso del transformante primario 146.34 y de su descendiente T1, sólo subiste algunas bandas de hibridación del transformante primario en el individuo T1, lo que subraya una eliminación de algunos fragmentos del ADN-T. Para el análisis de la pareja EcoRI/poliribozima 136, 3 bandas con tamaños 1,75 Kb, 3 Kb y 5,3 Kb son comunes a las plantas T0 y T1, y 3 bandas suplementarias con tamaños 7,3 Kb, 6,8 Kb y 4,25 Kb caracterizan a la planta T0. Esto indica la presencia de al menos 3 y 6 copias de la poliribozima 136 en las plantas T1 y T0, respectivamente. En hibridación de npt II, las dos bandas EcoRI de 3 Kb y 5,3 Kb se detectan en las plantas T0, lo que muestra la presencia de dos copias del gen y/o parte del gen npt II. Sólo es visible la banda de EcoRI de 3 Kb en la planta T1, lo que indica la presencia de una sola copia del gen npt II. En la hibridación gus, las 3 bandas de EcoRI con tamaño 4,25 Kb, 5,3 Kb y 6,8 Kb se encuentran en la planta T0, mientras que sólo la banda de 5,3 Kb está presente en el descendiente T1, esto revela la presencia de 3 copias y de una copia del gen y/o parte del gen gus en las plantas T0 y T1 respectivamente. Por otra parte, la hibridación de las 3 sondas con los ADN de las plantas T0 y T1 digeridas mediante Xba I permite suponer la existencia de 2 loci.

- Líneas 146.30 y 146.28

En el caso de los transformantes primarios 146.30 y 146.28, así como sus descendientes T1 respectivos, se hicieron observaciones similares.

- Línea 141.1:

En el caso del transformante primario 141.1 y de su descendiente, los perfiles de hibridación son similares. Las bandas EcoRI de 1,75 Kb, 10 Kb y 10 Kb se revelan con las sondas de poliribozima 136, npt II y gus, respectivamente. Esto muestra la presencia de una sola copia del ADN-T integrado en el genoma vegetal.

Como resultado, la estabilidad genética se observa en el caso del transformante 146.2 y de sus descendientes (T1 y T2), y en el del transformante 141.1 y de su descendiente T1. Un número elevado de copias del ADN-T o fragmento del ADN-T caracteriza 4 de las líneas estudiadas mientras que la línea 141.1 posee sólo una copia integrada del ADN-T.

Por otra parte, también se puede observar la presencia de una copia del ADN-T y/o porción del ADN-T en las líneas transformadas con pBIOS 135 (Figura 7).

* Análisis de transferencia Western (análisis comparativo)

Las plantas de melones transgénicas transformadas con pBIOS 4 que contienen el casete de expresión del gen para la proteína de envoltura se analizaron mediante transferencia Western. La solicitud de Patente EP-A-0412912 del 11/08/1989, a nombre de BIOSEM, se refiere a la metodología usada y a los resultados obtenidos. Sin embargo, se debería de enfatizar que el nivel de expresión del gen de la proteína de envoltura varía de 0,001% y 0,4% de las proteínas totales. La figura 8 ilustra mediante algunos ejemplos está variación del porcentaje de expresión, que depende de la edad de la hoja, y probablemente de los efectos ambientales sobre el genoma vegetal.

Ejemplo 4 Ensayos de resistencia al CMV de los melones transformados con la poliribozima 136 y la proteína de envoltura (ensayo comparativo)

Las plantas de melón transgénicas (genótipo TEZIER 10) que expresan el gen de la proteína de envoltura o la poliribozima 136, se autofecundaron o se cruzaron con plantas no transformadas del genotipo TEZIER 10. Las semillas procedentes de estas autofecundaciones (generación T1) y de autofecundaciones posteriores (generación T2, etc.) se sembraron en un fitotrón (cámara climatizada con periodo de 16 h de luz).

En la etapa de 2 a 4 hojas, 23 plantas procedentes de la descendencia se inocularon mecánicamente con una preparación en polvo de hojas frescas infectadas con la cepa TL28 del CMV.

Después de 16 días de infección (periodo óptimo), se evaluaron los síntomas (mosaico, estampado del limbo, amarillamiento). Las plantas infectadas se categorizar en tres categorías:

-

las plantas resistentes (R) que no tienen síntomas;

-

las plantas sensibles (S) que tienen síntomas;

-

las plantas tolerantes (T), que son las plantas que se "recuperan", es decir, que las hojas nuevas se desarrollan sin síntomas mientras que las viejas hojas presentan síntomas.

Pueden producir varios ciclos de "recuperación". El que las hojas nuevas sanas se cambien o no en hojas infectadas depende de las condiciones climáticas.

Las plantas de tipo "resistente" comprenden a la vez las plantas sin síntomas y las plantas tolerantes.

Los testigos usados en el ensayo de resistencia a CMV son:

-

testigos sensibles: TEZIER 10 y Vedrantais;

-

testigos resistentes que poseen al menos tres genes recesivos del CMV, Virgos y Free Cucumber.

* Resistencia a la cepa TL 28 del CMV de líneas de melón en generación T1 que expresa el gen de la proteína de envoltura

Los resultados obtenidos para 20 líneas se dan en la tabla 1, y muestran que:

-

La infección con TL 28 lleva a la obtención de 3 a 30% de plantas T1 sin síntomas. El testigo no transformado TEZIER 10, inoculado con TL 28, produce 0% de plantas sin síntomas. Los testigos resistentes Virgos y Free Cucumber poseen 92 y 100% de plantas sin síntomas, respectivamente, y no presente ningún fenómeno de tolerancia.

-

El fenómeno de recuperación existe en una alta proporción de casos. Catorce líneas estudiadas muestran un porcentaje no despreciable (22 a 59%) de plantas T1 tolerantes.

-

No existe correlación entre el porcentaje de plantas T1 resistentes y tolerantes y el nivel de expresión de la proteína de envoltura. En efecto, las líneas 159.8 y 164.2, por ejemplo, que tienen un nivel de expresión de la proteína de envoltura idéntica (0,01%), presentan niveles de resistencia distintos. Los individuos T1 de la línea 159.8 son todos sensibles, mientras que los de la línea 164.2 son sin síntomas al 26% y tolerantes al 48%.

-

La mayoría de las líneas que expresan el gen de la proteína de envoltura se obtuvieron mediante autofecundación. La frecuencia teórica esperada del gen para la proteína de envoltura es de 75% en las plantas T1 inoculadas con el CMV. El porcentaje de plantas resistentes (sin síntoma y tolerantes) varía entre 25 y 82% según las líneas transgénicas.

TABLA 1 Resistencia a la cepa TL28 del CMV de plantas de melón de generación T1 que expresa el gen de la proteína de envoltura

1

* Resistencia a cepa TL 28 del CMV de líneas de melón en generación T1 que expresan el poiribozima 136

Los resultados obtenidos para 13 líneas T1, se dan en la tabla 2, e indican que:

-

en el caso de 10 líneas, después de la infección con TL 28, 30 al 87% de los individuos T1 son sin síntomas;

-

el fenómeno de "recuperación" está poco presente. Solamente 4 líneas presentan de 9 a 26% de plantas T1 tolerantes.

La mayoría de las líneas que expresan la poliribozima 136 se obtuvieron mediante cruces con la línea no transformada TZ 10. La frecuencia teórica esperada de la poliribozima 136 es de 50% en las plantas T1 inoculadas con el CMV. El porcentaje de plantas de "tipo resistente" varía entre 30 y 65%, según las líneas transgénicas.

En conclusión, en el caso de la estrategia "ribozímica", un gran número de líneas en generación T1 son sin síntomas y poseen muy pocas plantas tolerantes.

TABLA 2 Resistencia a cepa TL 28 del CMV de plantas de melón en generación T1 que expresan la poliribozima 136

2

* Sumario de los ensayos de resistencia a al cepa TL 28 del CMV, y de la evaluación de segregación mediante ensayo GUS para ciertas líneas

Los resultados presentados en la tabla 3 muestran:

- la producción de dos líneas de tipo resistentes (plantas sin síntomas y plantas tolerantes) que expresan el gen de la proteína de envoltura (líneas 88.105 y 153.8), y una línea totalmente resistente (plantas sin síntoma), que expresan la poliribozima 136 (línea 146.42).

- la obtención de dos líneas tolerantes (plantas tolerantes) que expresan la poliribozima 136 (líneas 141.1 y 146.28).

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(Tabla pasa a página siguiente)

3

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1) Estudio genético de las líneas

El porcentaje de expresión del gen gus permite determinar el tipo de segregación y el estado de homozigosidad.

Para las dos líneas 88.105 y 153.8, el nivel de expresión del gen GUS es 80% y 73% respectivamente en la generación T1 obtenida mediante autofecundación. Esto indica un tipo mendeliano de segregación de un gen dominante (3:1) con la integración del ADN-T en un único locus. Los análisis moleculares mostraron la presencia de una sola copia de ADN-T integrada en el genoma vegetal.

Por otra parte, el nivel de expresión del gen gus es de 100% en generación T2 para las dos líneas, lo que confirma el estado de homozigosidad del gen integrado.

Para la línea 146.42, el nivel de expresión del gen gus es de 77% en la generación T1 obtenida mediante autofecundación, lo que muestra un tipo mendeliano de segregación de un gen dominante con integración del ADN-T en un único locus. Los análisis moleculares han mostrado la presencia de varios ADN-T y/o fragmentos de ADN-T en un único locus del genoma vegetal.

Por otra parte, el hecho de que el nivel de expresión del gen gus sea de 90% en generación T2 enfatiza que la línea ensayada no es homozigótica para este gen integrado (tabla 3). La homozigosidad se obtuvo en T3 para la línea 146.42. Para la línea 141.1, el nivel de expresión del gen gus es de 57% en generación no transformado TEZIER 10. Esto corresponde también a un tipo mendeliano de segregación de un gen dominante (1:1) con integración del ADN-T en un único locus. Los análisis moleculares han mostrado la presencia de un único ADN-T integrado en el genoma vegetal.

Para la línea 146.28, el nivel de expresión del gen gus es de 73% en generación T1 obtenida después del cruce con el genótipo no transformado TEZIER 10. Esto indica una segregación de los genes dominantes con integración del ADN-T en varios lugares. Los análisis moleculares han mostrado la presencia de varios ADN-T y/o fragmentos de ADN-T en dos lugares del genoma vegetal.

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2) Comportamiento frente al virus

Todas las plantas de tipo resistente expresan el gen GUS. Entre las plantas sensibles algunas expresan el gen GUS (tabla 3).

Para la línea 88.105, se obtuvieron 25% de plantas del tipo resistente, y 75% de plantas sensibles en la generación T1 resultante de una autofecundación. Esto muestra un tipo mendeliano de segregación de un gen recesivo (1:3) para el gen de resistencia.

Para la línea 153.5, se obtuvieron 55% de plantas del tipo resistente y 45% de plantas sensibles en la generación T1 resultante de una autofecundación. Es difícil llegar a una conclusión con respecto al gen de resistencia.

Para la línea 141.1, se obtuvieron 40% de plantas tolerantes y 60% de plantas sensibles en la generación T1 mediante cruce con el genótipo no transformado TEZIER 10. Esto indica un tipo mendeliano de segregación de un gen dominante (1:1) para el gen de resistencia. El comportamiento de la poliribozima 136 es, por lo tanto, similar al comportamiento del gen gus.

Para la línea 146.42, se obtuvieron 79% de plantas sin síntomas y 21% de plantas sensibles en la generación T1 resultante de una autofecundación. Esto implica un tipo mendeliano de segregación de un gen dominante (3:1) para el gen de resistencia. El comportamiento de la ribozima 136 es, por lo tanto, similar al comportamiento del gen gus.

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3) Evaluación de las cantidades de virus

Las cantidades de virus detectadas mediante el ensayo ELISA son poco elevadas en las plantas sin síntoma pero, sin embargo, mayores que las en el testigo resistente Free Cucumber (Figura 10).

Las plantas tolerantes contienen cantidades de virus no despreciables.

Las plantas sensibles poseen cantidades de virus muy elevadas.

Las plantas que expresan las poliribozimas (líneas 146.2, T2 y T3) contienen una cantidad de virus menor que las plantas de tipos resistentes que expresan la proteína de envoltura (línea 153.8 T2).

Parece que hay una correlación bastante buena entre las cantidades de virus detectadas y la gravedad de los síntomas.

4) Desarrollo de los síntomas del CMV a lo largo del tiempo

Se infectaron plantas T1 de las líneas mencionadas en las figuras 1 y 2 mediante la cepa TL 28 del CMV. Se contaron los síntomas 6, 8, 12, 14, 16 y 19 días después de la inoculación. Los resultados se dan en los histogramas (figuras 9 y 10).

Los valores obtenidos después de D16 no muestran ninguna variación adicional. En el caso de las líneas de "proteína de envoltura", se observa una disminución más o menos rápida del número de plantas sin síntoma, a favor de la aparición de plantas con síntomas. Para las líneas 88-105 y 153-8 en la generación T1, en D16 y D14 respectivamente, se desarrollan plantas tolerantes caracterizadas por el fenómeno de "recuperación". Además, en la línea 88-105 en la generación T2, el 100% de las plantas sin síntoma a D8 se convierten en 100% de plantas tolerantes que subsisten hasta D19 (figura 9).

Este cambio repentino de las plantas sin síntoma en plantas tolerantes se puede explicar mediante un efecto pronunciado de las condiciones climáticas.

En la línea 153.8 en la generación T2, se observa una aparición progresiva de plantas tolerantes. A partir de D16 en adelante, el 50% de las plantas T2 son sin síntomas, y 50% son tolerantes.

En el caso de las líneas de "poliribozima", se debe de enfatizar una disminución del número de plantas T1 sin síntoma, a favor de las plantas con síntomas, en las líneas 141.1 y 146.28 (figura 10).

Además, para 141.1 se observa la presencia de 40% de plantas T1 tolerantes a partir de D16. En la línea 146.28, se desarrollan plantas T2 tolerantes a partir de D14, hasta alcanzar el 26% a D16.

Por otra parte, en la línea 146.42, las plantas T1 sin síntomas representan el 80% en D6, y permanecen casi estables a lo largo del tiempo (78% en D8, D12 y D14, 79% a partir de D16).

Las plantas T2 de la línea 146.42 tienen un comportamiento similar. Este resultado muestra un nivel muy elevado de resistencia de esta línea, y una estabilidad del gen de resistencia en la descendencia.

En conclusión, se obtuvieron dos líneas del tipo "resistente" que expresan el gen de la proteína de envoltura y una línea totalmente resistente, que expresa la poliribozima136. Para las dos líneas que expresan el gen de la proteína de envoltura, la resistencia observada se aparenta más a una tolerancia que a una resistencia total. En efecto, algunas plantas infectadas por el virus, que presentan fuertes síntomas pueden, en algunas condiciones, desarrollar nuevas hojas sanas.

Para la línea totalmente resistente que expresan la poliribozima 136, no se observa ningún fenómeno de tolerancia. Para estas dos líneas que expresan la proteína de envoltura, se observaron cantidades de virus relativamente elevadas en las plantas resistentes, mientras que, en las plantas resistentes que expresan la poliribozima 136, la cantidad de virus es prácticamente igual al testigo resistente Free Cucumber.

Ejemplo 5 Resistencia a infección mediante cepa TL 28 del CMV de líneas de melón en generación T1 que expresa la poliribozima 165

Los resultados obtenidos para 13 líneas T1, que expresan la poliribozima 165, se dan en la tabla 4, e indican que:

-

después de la infección con TL 28, el 15 al 100% de los individuos T1 son sin síntomas en el caso de 12 líneas;

-

el fenómeno de "recuperación" está sólo ligeramente presente. Sólo 5 líneas presentan de 6 a 60% de plantas tolerantes T1.

La mayoría de las líneas que expresan la poliribozima 165 se obtuvieron mediante autofecundación. La frecuencia teórica esperada de poliribozima 165 es de 75% en las plantas T1 inoculadas con CMV. El porcentaje de plantas de "tipo resistente" varía entre 15 y 100% según las líneas transgénicas.

En conclusión, al igual que con las líneas que expresan la poliribozima 136, un número elevado de líneas que expresan la poliribozima 165 son sin síntomas y tienen unas pocas plantas tolerantes. La poliribozima 165 difiere de la poliribozima 136 en 2 ribozimas funcionales suplementarias. Las 2 construcciones conducen a la obtención de resultados similares para la resistencia a la infección mediante el CMV.

TABLA 4 Resistencia de la cepa TL 28 del CMV de plantas de melón en generación T1 que expresan la poliribozima 165

4

Claims (20)

1. Poliribozima que tiene actividad de endoribonucleasa y que es capaz de desactivar el gen de la proteína de envoltura de un virus, caracterizada porque dicha poliribozima comprende una pluralidad de ribozimas, escindiendo cada uno dicho gen de proteína de envoltura, o el transcrito correspondiente, o su intermedio de replicación, comprendiendo cada ribozima una región catalítica y brazos hibridantes, en la que dichos brazos hibridantes son complementarios de un fragmento del gen de la proteína de envoltura.

2. Poliribozima según la reivindicación 1 de estructura:

[(Y_{1} - Q - Y_{2}) - (S)_{n}]_{p}

en la que Y_{1} e Y_{2} son, cada uno, los brazos hibridantes que tienen al menos 4 bases, y que son complementarios de fragmentos distintos, consecutivos y contiguos, del gen de la proteína de envoltura, del transcrito correspondiente o del intermedio de replicación que corresponde al gen de la proteína de envoltura;

Q es la región catalítica de una ribozima;

S es una secuencia que tiene una longitud de entre 2 y 500 bases, y no es complementaria al gen de la proteína de envoltura, al transcrito correspondiente, y a su intermedio de replicación;

n = 0 ó 1;

p es un número entero superior a 1.

3. Poliribozima según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque dichas regiones catalíticas proceden de ribozimas de tipo "Cabeza de martillo" (hammerhead), o de tipo "horquilla" (hairpin).

4. Poliribozima según la reivindicación 3, en la que cada ribozima tiene como diana un sitio XUX en el gen o en el transcrito correspondiente.

5. Poliribozima según la reivindicación 4, en la que el número de ribozima es igual o menor que el número total de sitios XUX presentes en el gen de la proteína de envoltura, o en el transcrito correspondiente del gen de la proteína de envoltura, o en el intermedio de replicación.

6. Poliribozima según la reivindicación 5, en la que cada ribozima tiene como diana un sitio XUX en el gen o en el transcrito correspondiente, lo que sucede en las zonas de homología conservadas entre diferentes cepas de un mismo virus, o entre diferentes virus relacionados.

7. Poliribozima según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los brazos hibridantes son complementarios del gen de la proteína de envoltura de un virus vegetal seleccionado de entre los grupos de virus siguientes: Caulimovirus, Geminivirus, Reoviridae, Rhabdoviridae, Tobamovirus, Potexvirus, Potyvirus, Carlavirus, Closterovirus, Tobravirus, Hordeivirus, Tymovirus, Luteovirus, Tombovirus, Sobemovirus, Nepovirus, Comovirus, Cucumovirus, Bromovirus y Llarvirus.

8. Poliribozima según la reivindicación 7, en la que dicho virus vegetal se selecciona de entre el grupo siguiente: el virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el virus del Streak del maíz (NSV); el virus de los tumores de lesiones (WTV); el virus del enanismo amarillo de la patata (PYDV), el virus del bronceado del tomate (TSWV), el virus del mosaico del tabaco (TMV); el virus X de la patata (PVX); el virus Y de la patata (PVY); el virus latente del clavel (CLV); el virus de amarilleo de la remolacha (BYV); el virus del cascabel del tabaco (TRV); el virus del mosaico estriada de la cebada; el virus del mosaico amarilla del nabo (TYMV); el virus del amarilleo del enanismo de la cebada (BYDV) o el virus de enrollamiento de las hojas de patata (PLRV); el virus del achaparrado del tomate (TBSV); el virus del mosaico de las judías de Southern (SBMV); el virus de la necrosis del tabaco (TNV); el virus de la mancha anular del tabaco (TRSV); el virus del mosaico de Vigna (CPMV); el virus del mosaico enación del guisante (PEMV); el virus del mosaico del pepino (CMV); el virus del mosaico del bromo (BMV); el virus del Streak del tabaco (TSV).

9. Poliribozima según la reivindicación 8, en la que los brazos hibridantes son complementarios del transcrito del gen de la proteína de envoltura del CMV.

10. Poliribozima según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, constituida por ARN.

11. Secuencia de ADN que codifica un poliribozima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Procedimiento para hacer resistente a una planta frente a un virus, que comprende la introducción, en la planta, de una poliribozima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o de una secuencia que codifica un poliribozima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la introducción, en la planta, de la poliribozima se efectúa mediante transformación genética de una parte de la planta, mediante una secuencia de ADN que codifica la poliribozima, seguido de la regeneración de una planta transgénica.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la transformación se efectúa mediante Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes.

15. Planta transgénica resistente a un virus, caracterizada porque contiene en su genoma una secuencia que da lugar, mediante transcripción, a una poliribozima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

16. Planta transgénica según la reivindicación 15, siendo dicha planta resistente a CMV.

17. Planta transgénica según la reivindicación 16, caracterizada porque se trata del melón, del pepino, del calabacín, del tomate, del pimiento o de la judía.

18. Frutas de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17.

19. Semillas de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17.

20. Células vegetales transformadas mediante la secuencia de la reivindicación 11.