JP2990268B1 - 機能性核酸転写用発現系 - Google Patents
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Abstract
【要約】
【課題】 新規なリボザイムおよびその発現系の提供。
【解決手段】 下記の塩基配列(I) または(II)を持つヌ
クレオチド配列を含むリボザイム。 塩基配列(I): 5'-ACCGUUGGUUUCCGUAGUGUAGUGGUUAUCACGU
UCGCCUAACACGCGAAAGGUCCCCGGUUCGAAACCGGGCACUACAAACAC
AACACUGAUGAGGACCGAAAGGUCCGAAACGGGCACGUCGGAAACGGUUU
UU-3' 塩基配列(II): 5'-ACCGUUGGUUUCCGUAGUGUAGUGGUUAUCACG
UUCGCCUAACACGCGAAAGGUCCCCGGUUCGAAACCGGGCACUACAAACC
AACACACAACACUGAUGAGGACCGAAAGGUCCGAAACGGGCACGUCGGAA
ACGGUUUUU-3'
クレオチド配列を含むリボザイム。 塩基配列(I): 5'-ACCGUUGGUUUCCGUAGUGUAGUGGUUAUCACGU
UCGCCUAACACGCGAAAGGUCCCCGGUUCGAAACCGGGCACUACAAACAC
AACACUGAUGAGGACCGAAAGGUCCGAAACGGGCACGUCGGAAACGGUUU
UU-3' 塩基配列(II): 5'-ACCGUUGGUUUCCGUAGUGUAGUGGUUAUCACG
UUCGCCUAACACGCGAAAGGUCCCCGGUUCGAAACCGGGCACUACAAACC
AACACACAACACUGAUGAGGACCGAAAGGUCCGAAACGGGCACGUCGGAA
ACGGUUUUU-3'
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はリボザイムおよびそ
の発現系に関する。
の発現系に関する。
【０００２】
【従来の技術】ハンマーヘッドリボザイムは、最も小さ
い触媒性ＲＮＡ分子の１つである(Krugerら，1982; Gru
errier-Takadaら，1983)。このリボザイムはサイズが小
さく、また抗ウイルス剤として可能性があるので、作用
機構の研究 (DahmおよびUhlenbech, 1991, Dahmら，199
3; EcksteinおよびLilley, 1996; Pontiusら，1997; Lo
ttら，1998; Zhouら，1996, 1997; ZhouおよびTaira, 1
998)およびin vivoにおける利用を目指す研究 (Erickso
nおよびIzant, 1992; Murray, 1992; Rossi, 1995; Eck
steinおよびLilley, 1996; Prisleiら，1997; Turner,
1997; Scanlon,1997)が多数なされてきた。異なる生物
における遺伝子発現抑制のためのリボザイムの使用を目
指して成功した実験が多数報告されている(Sarverら, 1
990; Dropulicら，1992; Ojwangら，1992; Yuら，1993;
ZhaoおよびPick, 1993; Inokuchiら，1994; Yamada
ら，1994; Ferbeyreら，1996; Fujitaら，1997; Kawasa
kiら，1998)。しかし、in vitroにおけるリボザイムの
効力はin vivoにおける機能的活性と必ずしも相関して
いない。このin vivoにおける非有効性の理由のいくつ
かは以下の通りである。ｉ）細胞性タンパク質がリボザ
イムの標的ＲＮＡへの結合を阻害する、またはリボザイ
ムの活性なコンホメーションを破壊する可能性がある;
ii）リボザイムによって媒介される切断にとって不可欠
な金属イオンの細胞内濃度が機能的活性に十分でないか
もしれない; iii)リボザイムはRNase によって容易に攻
撃される。しかし、リボザイムのin vivo活性を決定す
るパラメーターが現在解明されつつある(Bertrandおよ
びRossi, 1996; Bertrandら，1997;Gebhardら，1997)。
in vivoでの研究は、効果的なリボザイム媒介遺伝子不
活性化にとって以下の因子が重要であることを示唆し
た。すなわち、高レベルのリボザイム発現(Yuら，199
3）；リボザイムの細胞内安定性（RossiおよびSarver,
1990; EcksteinおよびLilley, 1996）；同一細胞コンパ
ートメント(compartment)内におけるリボザイムとその
標的ＲＮＡの共局在（SullengerおよびCech, 1993;Bert
randら，1997);および転写されたリボザイムの切断活性
（Thompsonら，1995)である。最近、これらの種々の特
徴は、用いられた発現系に依存することがわかった(Ber
trandら，1997)。
い触媒性ＲＮＡ分子の１つである(Krugerら，1982; Gru
errier-Takadaら，1983)。このリボザイムはサイズが小
さく、また抗ウイルス剤として可能性があるので、作用
機構の研究 (DahmおよびUhlenbech, 1991, Dahmら，199
3; EcksteinおよびLilley, 1996; Pontiusら，1997; Lo
ttら，1998; Zhouら，1996, 1997; ZhouおよびTaira, 1
998)およびin vivoにおける利用を目指す研究 (Erickso
nおよびIzant, 1992; Murray, 1992; Rossi, 1995; Eck
steinおよびLilley, 1996; Prisleiら，1997; Turner,
1997; Scanlon,1997)が多数なされてきた。異なる生物
における遺伝子発現抑制のためのリボザイムの使用を目
指して成功した実験が多数報告されている(Sarverら, 1
990; Dropulicら，1992; Ojwangら，1992; Yuら，1993;
ZhaoおよびPick, 1993; Inokuchiら，1994; Yamada
ら，1994; Ferbeyreら，1996; Fujitaら，1997; Kawasa
kiら，1998)。しかし、in vitroにおけるリボザイムの
効力はin vivoにおける機能的活性と必ずしも相関して
いない。このin vivoにおける非有効性の理由のいくつ
かは以下の通りである。ｉ）細胞性タンパク質がリボザ
イムの標的ＲＮＡへの結合を阻害する、またはリボザイ
ムの活性なコンホメーションを破壊する可能性がある;
ii）リボザイムによって媒介される切断にとって不可欠
な金属イオンの細胞内濃度が機能的活性に十分でないか
もしれない; iii)リボザイムはRNase によって容易に攻
撃される。しかし、リボザイムのin vivo活性を決定す
るパラメーターが現在解明されつつある(Bertrandおよ
びRossi, 1996; Bertrandら，1997;Gebhardら，1997)。
in vivoでの研究は、効果的なリボザイム媒介遺伝子不
活性化にとって以下の因子が重要であることを示唆し
た。すなわち、高レベルのリボザイム発現(Yuら，199
3）；リボザイムの細胞内安定性（RossiおよびSarver,
1990; EcksteinおよびLilley, 1996）；同一細胞コンパ
ートメント(compartment)内におけるリボザイムとその
標的ＲＮＡの共局在（SullengerおよびCech, 1993;Bert
randら，1997);および転写されたリボザイムの切断活性
（Thompsonら，1995)である。最近、これらの種々の特
徴は、用いられた発現系に依存することがわかった(Ber
trandら，1997)。
【０００３】ｍＲＮＡ分子の転写のために用いられるＲ
ＮＡポリメラーゼII (pol II)系およびｔＲＮＡ、ｓｎ
ＲＮＡ等の小さいＲＮＡ分子の転写にために用いられる
ポリメラーゼIII (pol III)系が、リボザイム発現系と
して使用されてきた(Turner,1997)。pol IIプロモータ
ーによって転写が開始された転写物は、コード領域の他
に３’末端および５’末端に余分な配列を有する（例え
ば、非翻訳領域、キャップ構造、およびポリＡテイ
ル）。これらの余分な配列はin vivoにおける安定性お
よびｍＲＮＡとしての機能的認識に不可欠である。これ
らの配列が転写後トリミングされない限り、pol IIプロ
モーターによって転写が開始されたリボザイム配列を含
む転写物は、これらの配列をすべて含んでいる（Taira
ら，1991; Ohkawaら，1993)。その結果、ある場合に
は、リボザイムがその標的を認識する部位が、例えばコ
ード配列の一部によって覆われてしまうことがある。対
照的に、pol III 系は短いＲＮＡ分子の発現に適してお
り、余分な配列は非常に短いものが生成されるのみであ
る。さらに、発現レベルは少なくとも一桁、pol II系の
それよりも高い(CottenおよびBirnstiel, 1989)。した
がって、pol III系はリボザイムの発現に非常に有用で
あろうと示唆された(Yuら，1993; Perrimanら，1995)。
しかし、多くの場合、pol III系の明らかに望ましい特
徴にもかかわらず、リボザイムの期待される効果は達成
されなかった(Ilvesら，1996; Bertrandら，1997) 。
ＮＡポリメラーゼII (pol II)系およびｔＲＮＡ、ｓｎ
ＲＮＡ等の小さいＲＮＡ分子の転写にために用いられる
ポリメラーゼIII (pol III)系が、リボザイム発現系と
して使用されてきた(Turner,1997)。pol IIプロモータ
ーによって転写が開始された転写物は、コード領域の他
に３’末端および５’末端に余分な配列を有する（例え
ば、非翻訳領域、キャップ構造、およびポリＡテイ
ル）。これらの余分な配列はin vivoにおける安定性お
よびｍＲＮＡとしての機能的認識に不可欠である。これ
らの配列が転写後トリミングされない限り、pol IIプロ
モーターによって転写が開始されたリボザイム配列を含
む転写物は、これらの配列をすべて含んでいる（Taira
ら，1991; Ohkawaら，1993)。その結果、ある場合に
は、リボザイムがその標的を認識する部位が、例えばコ
ード配列の一部によって覆われてしまうことがある。対
照的に、pol III 系は短いＲＮＡ分子の発現に適してお
り、余分な配列は非常に短いものが生成されるのみであ
る。さらに、発現レベルは少なくとも一桁、pol II系の
それよりも高い(CottenおよびBirnstiel, 1989)。した
がって、pol III系はリボザイムの発現に非常に有用で
あろうと示唆された(Yuら，1993; Perrimanら，1995)。
しかし、多くの場合、pol III系の明らかに望ましい特
徴にもかかわらず、リボザイムの期待される効果は達成
されなかった(Ilvesら，1996; Bertrandら，1997) 。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、pol II
IプロモーターであるｔＲＮＡValプロモーターによって
転写が開始される、同一のリボザイム配列を有する３種
類のリボザイムを設計し、リボザイムのin vivo活性を
決定するパラメーターを検討したところ、転写物（ｔＲ
ＮＡValプロモーターの配列が付加されたリボザイム
（以下、「ｔＲＮＡVal-リボザイム」と称する。））の
全体的な構造がリボザイムの切断活性ばかりでなく細胞
内半減期をも決定することを明らかにした。細胞核にお
いて転写されたすべてのキメラｔＲＮＡVal-リボザイム
は細胞質に輸送され、かくして、リボザイムとその標的
は同じ細胞コンパートメント内に存在した。このような
条件下で、本発明者らは各ｔＲＮＡVal-リボザイムの細
胞内半減期および定常レベルがin vivoにおける機能的
活性の主要な決定要素であることを見いだした。さら
に、本発明者らは、in vivoにおいて最長の半減期をも
つように特に設計したリボザイムを発現する細胞がHIV-
1の攻撃に対してほぼ完全に耐性であることを示した。
すなわち、本発明は、下記の塩基配列(I) または(II)を
持つヌクレオチド配列を含むリボザイムを提供する。
IプロモーターであるｔＲＮＡValプロモーターによって
転写が開始される、同一のリボザイム配列を有する３種
類のリボザイムを設計し、リボザイムのin vivo活性を
決定するパラメーターを検討したところ、転写物（ｔＲ
ＮＡValプロモーターの配列が付加されたリボザイム
（以下、「ｔＲＮＡVal-リボザイム」と称する。））の
全体的な構造がリボザイムの切断活性ばかりでなく細胞
内半減期をも決定することを明らかにした。細胞核にお
いて転写されたすべてのキメラｔＲＮＡVal-リボザイム
は細胞質に輸送され、かくして、リボザイムとその標的
は同じ細胞コンパートメント内に存在した。このような
条件下で、本発明者らは各ｔＲＮＡVal-リボザイムの細
胞内半減期および定常レベルがin vivoにおける機能的
活性の主要な決定要素であることを見いだした。さら
に、本発明者らは、in vivoにおいて最長の半減期をも
つように特に設計したリボザイムを発現する細胞がHIV-
1の攻撃に対してほぼ完全に耐性であることを示した。
すなわち、本発明は、下記の塩基配列(I) または(II)を
持つヌクレオチド配列を含むリボザイムを提供する。
【０００５】塩基配列(I): 5'-ACCGUUGGUUUCCGUAGUGUAG
UGGUUAUCACGUUCGCCUAACACGCGAAAGGUCCCCGGUUCGAAACCGGG
CACUACAAACACAACACUGAUGAGGACCGAAAGGUCCGAAACGGGCACGU
CGGAAACGGUUUUU-3' （配列番号１） 塩基配列(II): 5'-ACCGUUGGUUUCCGUAGUGUAGUGGUUAUCACG
UUCGCCUAACACGCGAAAGGUCCCCGGUUCGAAACCGGGCACUACAAACC
AACACACAACACUGAUGAGGACCGAAAGGUCCGAAACGGGCACGUCGGAA
ACGGUUUUU-3'（配列番号２）
UGGUUAUCACGUUCGCCUAACACGCGAAAGGUCCCCGGUUCGAAACCGGG
CACUACAAACACAACACUGAUGAGGACCGAAAGGUCCGAAACGGGCACGU
CGGAAACGGUUUUU-3' （配列番号１） 塩基配列(II): 5'-ACCGUUGGUUUCCGUAGUGUAGUGGUUAUCACG
UUCGCCUAACACGCGAAAGGUCCCCGGUUCGAAACCGGGCACUACAAACC
AACACACAACACUGAUGAGGACCGAAAGGUCCGAAACGGGCACGUCGGAA
ACGGUUUUU-3'（配列番号２）
【０００６】また、本発明は、上記のリボザイムをコー
ドするＤＮＡを含む発現ベクターを提供する。さらに、
本発明は、上記のリボザイムをコードするＤＮＡを含む
発現ベクターＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡに転写するこ
とを特徴とする、リボザイムの製造方法を提供する。さ
らにまた、本発明は、上記のリボザイムまたは発現ベク
ターを有効成分として含む医薬組成物を提供する。本発
明の医薬組成物は、後天性免疫不全症候群を予防および
／または治療するのに有効である。本発明はまた、上記
のリボザイムを用いて、標的ＲＮＡを特異的に切断する
方法を提供する。標的ＲＮＡとしては、HIV-1 ＲＮＡが
効果的である。
ドするＤＮＡを含む発現ベクターを提供する。さらに、
本発明は、上記のリボザイムをコードするＤＮＡを含む
発現ベクターＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡに転写するこ
とを特徴とする、リボザイムの製造方法を提供する。さ
らにまた、本発明は、上記のリボザイムまたは発現ベク
ターを有効成分として含む医薬組成物を提供する。本発
明の医薬組成物は、後天性免疫不全症候群を予防および
／または治療するのに有効である。本発明はまた、上記
のリボザイムを用いて、標的ＲＮＡを特異的に切断する
方法を提供する。標的ＲＮＡとしては、HIV-1 ＲＮＡが
効果的である。
【０００７】
【発明の実施の形態】我々はリボザイムの転写量や安定
性、転写後の活性を考慮し、その発現系として、ポリメ
ラーゼIII 系であるヒトのｔＲＮＡVal プロモーターを
選択し、リボザイムとこのプロモーターとのつなぎ方に
よって生体内におけるリボザイム効果に差がでないかを
検討した。すなわち、生体内において有意なリボザイム
効果を得るために重要な要因の一つである、細胞内での
安定性、及び転写後の活性に着目し、リボザイムの高次
構造とこれらの要因との相関性について明らかにするこ
とを目的とした。
性、転写後の活性を考慮し、その発現系として、ポリメ
ラーゼIII 系であるヒトのｔＲＮＡVal プロモーターを
選択し、リボザイムとこのプロモーターとのつなぎ方に
よって生体内におけるリボザイム効果に差がでないかを
検討した。すなわち、生体内において有意なリボザイム
効果を得るために重要な要因の一つである、細胞内での
安定性、及び転写後の活性に着目し、リボザイムの高次
構造とこれらの要因との相関性について明らかにするこ
とを目的とした。
【０００８】まず、ＨＩＶ−１の比較的保存された配列
を標的とするハンマーヘッド型リボザイムを設計し、そ
の遺伝子を様々な配列を介してｔＲＮＡVal プロモータ
ーの下流につなぐことにより４種の発現系を構築した。
この発現系を構築するためのベクターとしては、pUC19
(Takara)を用いたが、その他にも、pGREEN LANTERN (ラ
イフテックオリエンタル株式会社製) 、pHaMDR (HUMAN
GENE THERAPY 6:905-915 (July 1995)) などのベクター
を用いてもよい。また、発現系の構築に必要なオリゴヌ
クレオチドは、DNA/RNA 合成機 (モデル394; Applied B
iosystems, Division of Perkin Elmer Co. (ABI), Fos
ter City, CA) で化学合成することができる。
を標的とするハンマーヘッド型リボザイムを設計し、そ
の遺伝子を様々な配列を介してｔＲＮＡVal プロモータ
ーの下流につなぐことにより４種の発現系を構築した。
この発現系を構築するためのベクターとしては、pUC19
(Takara)を用いたが、その他にも、pGREEN LANTERN (ラ
イフテックオリエンタル株式会社製) 、pHaMDR (HUMAN
GENE THERAPY 6:905-915 (July 1995)) などのベクター
を用いてもよい。また、発現系の構築に必要なオリゴヌ
クレオチドは、DNA/RNA 合成機 (モデル394; Applied B
iosystems, Division of Perkin Elmer Co. (ABI), Fos
ter City, CA) で化学合成することができる。
【０００９】Zuker 法を用いた予測から、ｔＲＮＡVal
プロモーターとハンマーヘッド型リボザイムのつなぎ目
の配列の違いはリボザイムの認識部位における２次構造
に大きな影響を与えると考えられた（図１参照）。この
予測図によると、全体的なリボザイムの２次構造はどれ
もほぼ同じであるのに対し、基質の結合部位における自
由度は大きく異なっていることがわかる。Ｒｚ１は基質
結合部位の両方が分子内でステム構造を形成しているの
に対し、Ｒｚ２では片方が、Ｒｚ３においては両方の結
合部位がきれいにちょうど外側へ突出していることがわ
かる。Ｒｚ３においては突出した基質結合部位がタンパ
ク質に覆われてしまう恐れもあるが、リボザイムはＲＮ
Ａ酵素であり、基質との結合しやすさが、解離のしやす
さと同時に活性における重要な因子となるため、リボザ
イムの切断能力としてはこれが一番であることが予測さ
れた。実際、細胞内において転写されたリボザイムを用
いてin vitroの系において［40mM Tris-Cl (pH8.0), 8m
M MgCl2 , 5mM DTT, 2mM Spermiidine, 2 U/μl RNase
inhibitor, 30μg total RNA ］の条件下で反応を行っ
た。この際total ＲＮＡ中に含まれるリボザイムの含有
量は一定に揃えた。In vitroで転写し、放射ラベルした
短い基質に対するリボザイムの活性はその認識部位にお
ける自由度に依存する結果となった（図２参照）。ま
た、リボザイムの安定性についても検討した。対照とな
る遺伝子の発現量を一定に揃え、それぞれのリボザイム
量を比較検討した。リボザイムの構造における違いは安
定性にも影響を与えており、“なぜ全体的にはそれほど
差のない構造がこのように影響するのか”理由は明らか
ではないが、最も安定なものとそうでないものは約25倍
もの差を示した（図３Ｂ参照）。
プロモーターとハンマーヘッド型リボザイムのつなぎ目
の配列の違いはリボザイムの認識部位における２次構造
に大きな影響を与えると考えられた（図１参照）。この
予測図によると、全体的なリボザイムの２次構造はどれ
もほぼ同じであるのに対し、基質の結合部位における自
由度は大きく異なっていることがわかる。Ｒｚ１は基質
結合部位の両方が分子内でステム構造を形成しているの
に対し、Ｒｚ２では片方が、Ｒｚ３においては両方の結
合部位がきれいにちょうど外側へ突出していることがわ
かる。Ｒｚ３においては突出した基質結合部位がタンパ
ク質に覆われてしまう恐れもあるが、リボザイムはＲＮ
Ａ酵素であり、基質との結合しやすさが、解離のしやす
さと同時に活性における重要な因子となるため、リボザ
イムの切断能力としてはこれが一番であることが予測さ
れた。実際、細胞内において転写されたリボザイムを用
いてin vitroの系において［40mM Tris-Cl (pH8.0), 8m
M MgCl2 , 5mM DTT, 2mM Spermiidine, 2 U/μl RNase
inhibitor, 30μg total RNA ］の条件下で反応を行っ
た。この際total ＲＮＡ中に含まれるリボザイムの含有
量は一定に揃えた。In vitroで転写し、放射ラベルした
短い基質に対するリボザイムの活性はその認識部位にお
ける自由度に依存する結果となった（図２参照）。ま
た、リボザイムの安定性についても検討した。対照とな
る遺伝子の発現量を一定に揃え、それぞれのリボザイム
量を比較検討した。リボザイムの構造における違いは安
定性にも影響を与えており、“なぜ全体的にはそれほど
差のない構造がこのように影響するのか”理由は明らか
ではないが、最も安定なものとそうでないものは約25倍
もの差を示した（図３Ｂ参照）。
【００１０】先にも述べたように、いまだ不明であるin
vitroの系におけるリボザイムの活性と生体内における
効果との相関性についても次に検討した。まず、レポー
ター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用い、これと
pNL4-3（HIV-1 のクローン）の配列の融合遺伝子に対し
てリボザイムを作用させ、細胞抽出液内のルシフェラー
ゼ活性を測定することで間接的に細胞内におけるリボザ
イム効果を評価する系を構築した（図３Ａ参照）。それ
ぞれのリボザイムについて比較して結果、細胞内で安定
性の最も高かったものが最も高活性を示したことから、
安定性がいかに重要であるかが示唆された（図４参
照）。
vitroの系におけるリボザイムの活性と生体内における
効果との相関性についても次に検討した。まず、レポー
ター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用い、これと
pNL4-3（HIV-1 のクローン）の配列の融合遺伝子に対し
てリボザイムを作用させ、細胞抽出液内のルシフェラー
ゼ活性を測定することで間接的に細胞内におけるリボザ
イム効果を評価する系を構築した（図３Ａ参照）。それ
ぞれのリボザイムについて比較して結果、細胞内で安定
性の最も高かったものが最も高活性を示したことから、
安定性がいかに重要であるかが示唆された（図４参
照）。
【００１１】ここまでの話は培養細胞内においてルシフ
ェラーゼ遺伝子とＨＩＶ−１の配列との人工的な融合遺
伝子に対するリボザイム効果の評価となるので、結局の
ところ、実際の生体内における結果と等しいと判断する
ことは困難である。そこで、実際のＨＩＶ−１に対する
リボザイム効果の評価を行った（図５参照）。リボザイ
ム発現系の形質転換体にＨＩＶ−１を感染させ、ウイル
スの増殖を血清中における p24 (ウイルスのコアタンパ
ク）の生産量を測定したところ、我々の培養細胞内にお
ける評価と同様な傾向を示す結果が得られた。またin v
itroで最も安定性の高かったリボザイムはこの場合にお
いても非常に高い抑制効果を示し、 p24の生産を99％抑
えていることが明らかとなった（図６Ｃ参照）。一方、
in vitroで切断活性の最も高かったリボザイム発現系は
ウイルスの増殖をほとんど抑制することができなかっ
た。
ェラーゼ遺伝子とＨＩＶ−１の配列との人工的な融合遺
伝子に対するリボザイム効果の評価となるので、結局の
ところ、実際の生体内における結果と等しいと判断する
ことは困難である。そこで、実際のＨＩＶ−１に対する
リボザイム効果の評価を行った（図５参照）。リボザイ
ム発現系の形質転換体にＨＩＶ−１を感染させ、ウイル
スの増殖を血清中における p24 (ウイルスのコアタンパ
ク）の生産量を測定したところ、我々の培養細胞内にお
ける評価と同様な傾向を示す結果が得られた。またin v
itroで最も安定性の高かったリボザイムはこの場合にお
いても非常に高い抑制効果を示し、 p24の生産を99％抑
えていることが明らかとなった（図６Ｃ参照）。一方、
in vitroで切断活性の最も高かったリボザイム発現系は
ウイルスの増殖をほとんど抑制することができなかっ
た。
【００１２】このように、ウイルスでのリボザイム効果
の評価も培養細胞内における人工的な基質における評価
と同傾向を示していることが明らかになった。よって、
今回我々が行ったような一過的な評価における結果も、
生体内におけるリボザイム効果のおおよその目安になる
と考えられる。またin vitroからウイルスを扱った実験
にわたる結果から、リボザイムの細胞内における有意な
効果を得るためには活性の高さも大事であるが、それに
も増して細胞内における安定性が重要であることが明ら
かとなった。今回のようにほとんど配列に違いのないリ
ボザイムにおいても、発現系とのつなぎ方一つで、先に
述べたような生体内における効果に大きな差が生じると
いう事実は、これについても十分考慮する必要があり、
また発現させるために付加した配列による高次構造の影
響も加味し、リボザイムに安定性を持たせるような設計
が重要であることが示唆された。
の評価も培養細胞内における人工的な基質における評価
と同傾向を示していることが明らかになった。よって、
今回我々が行ったような一過的な評価における結果も、
生体内におけるリボザイム効果のおおよその目安になる
と考えられる。またin vitroからウイルスを扱った実験
にわたる結果から、リボザイムの細胞内における有意な
効果を得るためには活性の高さも大事であるが、それに
も増して細胞内における安定性が重要であることが明ら
かとなった。今回のようにほとんど配列に違いのないリ
ボザイムにおいても、発現系とのつなぎ方一つで、先に
述べたような生体内における効果に大きな差が生じると
いう事実は、これについても十分考慮する必要があり、
また発現させるために付加した配列による高次構造の影
響も加味し、リボザイムに安定性を持たせるような設計
が重要であることが示唆された。
【００１３】本発明のtRNAval-リボザイムを用いて、標
的ＲＮＡ、特にHIV-1 ＲＮＡを特異的に切断することが
できる。本発明のtRNAval-リボザイムは、医薬、特に、
後天性免疫不全症候群を予防および／または治療するた
めの医薬として使用することができる。例えば、本発明
のtRNAval-リボザイムをリポソームに封入し、これを生
体に投与して、HIV を含む細胞に取り込ませることによ
り、HIV の転写を阻害することができる。また、本発明
のtRNAval-リボザイムをコードするＤＮＡをウイルスな
どのベクターに組み込んで、HIV を含む細胞内に導入
し、該細胞内でこのベクターを発現させ、本発明のtRNA
val-リボザイムを産生させることにより、HIV の転写を
阻害することができる。本発明のtRNAval-リボザイムの
投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性などによる
が、予防および／または治療の有効性が認められるま
で、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間に
わたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。
的ＲＮＡ、特にHIV-1 ＲＮＡを特異的に切断することが
できる。本発明のtRNAval-リボザイムは、医薬、特に、
後天性免疫不全症候群を予防および／または治療するた
めの医薬として使用することができる。例えば、本発明
のtRNAval-リボザイムをリポソームに封入し、これを生
体に投与して、HIV を含む細胞に取り込ませることによ
り、HIV の転写を阻害することができる。また、本発明
のtRNAval-リボザイムをコードするＤＮＡをウイルスな
どのベクターに組み込んで、HIV を含む細胞内に導入
し、該細胞内でこのベクターを発現させ、本発明のtRNA
val-リボザイムを産生させることにより、HIV の転写を
阻害することができる。本発明のtRNAval-リボザイムの
投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性などによる
が、予防および／または治療の有効性が認められるま
で、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間に
わたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。
【００１４】
【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに具体的に
説明する。本発明の範囲は、これらの実施例に限定され
ることはない。 〔実施例〕材料および方法 プラスミドの構築 各ｔＲＮＡVal-リボザイムを発現するプラスミド（pUCd
t-Rzシリーズ）は以下のように構築した。すなわち、ヒ
ト胎盤ｔＲＮＡVal遺伝子（pHtV1; Arnoldら，1986)に
由来するプロモーター領域の配列をコードするセンスお
よびアンチセンスオリゴヌクレオチドリンカーをアニー
ルし、pUC19のEcoRI/SalI部位に連結した。オリゴヌク
レオチドリンカーの配列は以下の通りであった：センス
5'-aattca gga cta gtc ttt tag gtc aaa aag aag aag
ctt tgt aac cgt tgg ttt ccgtag tgt agt ggt tat c
ac gtt cgc cta aca cgc gaa agg tcc ccg gtt cga ag-
3'（配列番号６）；アンチセンス 5'-tcg act tcg aac
cgg gga cct ttc gcg tgt tag gcg aac gtg ata acc ac
t aca cta cgg aaa cca acg gtt aca aag ctt ctt ctt
ctt ttt gac cta aaa gac tag tcc tg-3'（配列番号
７）。次に、ターミネーター配列をコードするセンスお
よびアンチセンスオリゴヌクレオチドリンカーをアニー
ルし、プロモーター領域の配列を含むpUC19のNspV/SalI
部位に連結した。オリゴヌクレオチドリンカーの配列
は以下の通りであった：センス 5'-cga aac cgg gca cc
c ggg gaa tat aac ctc gag cgc ttt ttt tct atc gcg
tc-3'（配列番号８）；アンチセンス 5'-tcg acg cga
tag aaa aaa agc gct cga ggttat att ccc cgg gtg ccc
ggt ttc-3' （配列番号９）。得られたプラスミド
（これはｔＲＮＡValのＡおよびＢボックス、ならびに
ターミネーターを含んでいた）をpUCdtと名付けた。
説明する。本発明の範囲は、これらの実施例に限定され
ることはない。 〔実施例〕材料および方法 プラスミドの構築 各ｔＲＮＡVal-リボザイムを発現するプラスミド（pUCd
t-Rzシリーズ）は以下のように構築した。すなわち、ヒ
ト胎盤ｔＲＮＡVal遺伝子（pHtV1; Arnoldら，1986)に
由来するプロモーター領域の配列をコードするセンスお
よびアンチセンスオリゴヌクレオチドリンカーをアニー
ルし、pUC19のEcoRI/SalI部位に連結した。オリゴヌク
レオチドリンカーの配列は以下の通りであった：センス
5'-aattca gga cta gtc ttt tag gtc aaa aag aag aag
ctt tgt aac cgt tgg ttt ccgtag tgt agt ggt tat c
ac gtt cgc cta aca cgc gaa agg tcc ccg gtt cga ag-
3'（配列番号６）；アンチセンス 5'-tcg act tcg aac
cgg gga cct ttc gcg tgt tag gcg aac gtg ata acc ac
t aca cta cgg aaa cca acg gtt aca aag ctt ctt ctt
ctt ttt gac cta aaa gac tag tcc tg-3'（配列番号
７）。次に、ターミネーター配列をコードするセンスお
よびアンチセンスオリゴヌクレオチドリンカーをアニー
ルし、プロモーター領域の配列を含むpUC19のNspV/SalI
部位に連結した。オリゴヌクレオチドリンカーの配列
は以下の通りであった：センス 5'-cga aac cgg gca cc
c ggg gaa tat aac ctc gag cgc ttt ttt tct atc gcg
tc-3'（配列番号８）；アンチセンス 5'-tcg acg cga
tag aaa aaa agc gct cga ggttat att ccc cgg gtg ccc
ggt ttc-3' （配列番号９）。得られたプラスミド
（これはｔＲＮＡValのＡおよびＢボックス、ならびに
ターミネーターを含んでいた）をpUCdtと名付けた。
【００１５】pUCdtを鋳型とし、アッパープライマー(5'
-cgc cag ggt ttc cca gtc acg ac-3')（配列番号１
０）およびリボザイムとターミネーター両方の配列を含
むロアープライマー（Ｒｚ１、5'-ctg cag gtc gac gcg
ata gaa aaa aag cgc tcg aggtgc ccg ttt cgt cct c
ac gga ctc atc agt gtt gtg tgg gtg ccc ggt ttc gaa
ccg gga cct tt-3' （配列番号１１）; Ｒｚ２、5'-ct
g cag gtc gac gcg atagaa aaa aac cgt ttc cga cgt g
cc cgt ttc ggt cct ttc ggt cct cat cag tgt tgt gt
t tgt agt gcc cgg ttt cga acc ggg gac ctt t-3' (配
列番号１２） ;Ｒｚ３、5'-ctg cag gtc gac gcg ata g
aa aaa aac cgt ttc cga cgt gcc cgt ttc ggt cct ca
t cag tgt tgt gtg ttg gtt tgt agt gcc cgg ttt cga
acc ggggac ctt t-3' (配列番号１３）を用いて、各リ
ボザイムおよびｔＲＮＡVal部分の配列をコードするＤ
ＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をEcoR
IおよびSalIで消化した後、各断片をpUC19 のEcoRI/Sal
I部位に連結し、pUCdt-Rzを得た。pUCdt およびpUCdt-R
zシリーズの配列を直接ヌクレオチド配列決定によって
確認した。ｔＲＮＡVal-リボザイム遺伝子に加え参照遺
伝子発現カセットをも含む pUC-Rrシリーズのメンバー
（図３Ａ参照）は、pUCdt のPvuII 断片を各pUCdt-Rzの
HincII部位に挿入することによって構築した。制限酵素
による消化によって挿入断片の方向を確認した。リボザ
イム導入HeLa細胞の作製に用いたpHygdt-Rzシリーズ
は、pUCdt-Rzシリーズの各PvuII-SalI断片をpHyg (Yate
sら，1984)のEcoRV/SalI部位に挿入することによって構
築した。オリゴヌクレオチドリンカーおよびＰＣＲプラ
イマーのすべては、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（392型；PE
Applied Biosystems, Foster市、CA) を用いて合成し
た。
-cgc cag ggt ttc cca gtc acg ac-3')（配列番号１
０）およびリボザイムとターミネーター両方の配列を含
むロアープライマー（Ｒｚ１、5'-ctg cag gtc gac gcg
ata gaa aaa aag cgc tcg aggtgc ccg ttt cgt cct c
ac gga ctc atc agt gtt gtg tgg gtg ccc ggt ttc gaa
ccg gga cct tt-3' （配列番号１１）; Ｒｚ２、5'-ct
g cag gtc gac gcg atagaa aaa aac cgt ttc cga cgt g
cc cgt ttc ggt cct ttc ggt cct cat cag tgt tgt gt
t tgt agt gcc cgg ttt cga acc ggg gac ctt t-3' (配
列番号１２） ;Ｒｚ３、5'-ctg cag gtc gac gcg ata g
aa aaa aac cgt ttc cga cgt gcc cgt ttc ggt cct ca
t cag tgt tgt gtg ttg gtt tgt agt gcc cgg ttt cga
acc ggggac ctt t-3' (配列番号１３）を用いて、各リ
ボザイムおよびｔＲＮＡVal部分の配列をコードするＤ
ＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をEcoR
IおよびSalIで消化した後、各断片をpUC19 のEcoRI/Sal
I部位に連結し、pUCdt-Rzを得た。pUCdt およびpUCdt-R
zシリーズの配列を直接ヌクレオチド配列決定によって
確認した。ｔＲＮＡVal-リボザイム遺伝子に加え参照遺
伝子発現カセットをも含む pUC-Rrシリーズのメンバー
（図３Ａ参照）は、pUCdt のPvuII 断片を各pUCdt-Rzの
HincII部位に挿入することによって構築した。制限酵素
による消化によって挿入断片の方向を確認した。リボザ
イム導入HeLa細胞の作製に用いたpHygdt-Rzシリーズ
は、pUCdt-Rzシリーズの各PvuII-SalI断片をpHyg (Yate
sら，1984)のEcoRV/SalI部位に挿入することによって構
築した。オリゴヌクレオチドリンカーおよびＰＣＲプラ
イマーのすべては、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（392型；PE
Applied Biosystems, Foster市、CA) を用いて合成し
た。
【００１６】組換えHIVベクタープラスミドは以下のよ
うに構築した。すなわち、pMC1 neo由来の細菌性neor
遺伝子カセットをコードする2.0 kbpのBamHI断片 (Thom
asおよびCapecchi, 1987)を、HIV-1由来ベクターのSalI
部位に挿入した（図５Ａ；Shimadaら，1991)。次に、図
５Ｂに示すように、ｔＲＮＡVal-リボザイム発現カセッ
トをTK-neorのすぐ上流でSalI部位にクローン化した。
うに構築した。すなわち、pMC1 neo由来の細菌性neor
遺伝子カセットをコードする2.0 kbpのBamHI断片 (Thom
asおよびCapecchi, 1987)を、HIV-1由来ベクターのSalI
部位に挿入した（図５Ａ；Shimadaら，1991)。次に、図
５Ｂに示すように、ｔＲＮＡVal-リボザイム発現カセッ
トをTK-neorのすぐ上流でSalI部位にクローン化した。
【００１７】細胞の培養およびトランスフェクション HeLaおよびCos細胞は、10% (v/v)ウシ胎児血清(FBS; Gi
bco BRL)および45 μg/mlゲンタマイシン(Gibco BRL)を
添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM; Gibco BR
L, Gaithersburg, MD)で培養した。リボザイム導入細胞
を選択するため、ハイグロマイシンＢを最終濃度300 μ
g/mlで用いた。Ｈ９細胞は、10% ウシ胎児血清(FCS; Gi
bco BRL)を添加したRPMI (Gibco BRL)で培養した。
bco BRL)および45 μg/mlゲンタマイシン(Gibco BRL)を
添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM; Gibco BR
L, Gaithersburg, MD)で培養した。リボザイム導入細胞
を選択するため、ハイグロマイシンＢを最終濃度300 μ
g/mlで用いた。Ｈ９細胞は、10% ウシ胎児血清(FCS; Gi
bco BRL)を添加したRPMI (Gibco BRL)で培養した。
【００１８】リポフェクチン試薬(Gibco BRL) を製造者
のプロトコールにしたがって用いて、細胞をトランスフ
ェクトした。Ｈ９細胞のトランスフェクションは、組換
えHIV-1ベクタープラスミド（図５ＢのHIVRib.N）を用
いてCaPO4共沈殿法により実施した。
のプロトコールにしたがって用いて、細胞をトランスフ
ェクトした。Ｈ９細胞のトランスフェクションは、組換
えHIV-1ベクタープラスミド（図５ＢのHIVRib.N）を用
いてCaPO4共沈殿法により実施した。
【００１９】ＲＮＡの調製 グアニジニウムチオシアネートフェノールクロロホルム
法により全ＲＮＡを抽出した。細胞質ＲＮＡおよび核Ｒ
ＮＡを文献(HuangおよびCarmichael, 1996)に記述され
た通り分離した。
法により全ＲＮＡを抽出した。細胞質ＲＮＡおよび核Ｒ
ＮＡを文献(HuangおよびCarmichael, 1996)に記述され
た通り分離した。
【００２０】リボザイムの定常レベルおよび半減期の測
定 各リボザイムの定常レベルの測定は以下のように実施し
た。すなわち、各pUC-Rrを用いてHeLa細胞 (1x106細胞/
10 cmプレート）をトランスフェクトした。トランスフ
ェクションの２日後に、これらの細胞から全ＲＮＡを単
離した。単離された全ＲＮＡのｔＲＮＡVal-リボザイム
の下流に位置する対照ＲＮＡの量を、対照ＲＮＡに特異
的なプローブ（5'-aaa tcg cta taa aaa gcg ctc gag g
tt atg ctc ccc ggg t-3'）（配列番号１４）を用いた
ノーザンブロット分析でまず定量した。各サンプル中の
対照ＲＮＡの量を一定値に維持した。また、全ＲＮＡの
レベルも、必要であればトランスフェクトされていない
HeLa細胞から単離したＲＮＡを添加することにより一定
に保った。最後に、リボザイムに特異的なプローブ(5'-
ctc atc tgt gtt gtg t-3') （配列番号１５）または対
照ＲＮＡに特異的なプローブを用いてハイブリダイゼー
ションを繰り返した（図３Ｂ）。
定 各リボザイムの定常レベルの測定は以下のように実施し
た。すなわち、各pUC-Rrを用いてHeLa細胞 (1x106細胞/
10 cmプレート）をトランスフェクトした。トランスフ
ェクションの２日後に、これらの細胞から全ＲＮＡを単
離した。単離された全ＲＮＡのｔＲＮＡVal-リボザイム
の下流に位置する対照ＲＮＡの量を、対照ＲＮＡに特異
的なプローブ（5'-aaa tcg cta taa aaa gcg ctc gag g
tt atg ctc ccc ggg t-3'）（配列番号１４）を用いた
ノーザンブロット分析でまず定量した。各サンプル中の
対照ＲＮＡの量を一定値に維持した。また、全ＲＮＡの
レベルも、必要であればトランスフェクトされていない
HeLa細胞から単離したＲＮＡを添加することにより一定
に保った。最後に、リボザイムに特異的なプローブ(5'-
ctc atc tgt gtt gtg t-3') （配列番号１５）または対
照ＲＮＡに特異的なプローブを用いてハイブリダイゼー
ションを繰り返した（図３Ｂ）。
【００２１】各リボザイムの半減期は、細胞を文献(Hua
ngおよびCarmichael, 1996) に記述された通りアクチノ
マイシンＤで処理した後、ノーザンブロット分析によっ
て測定した。すなわち、細胞をアクチノマイシンＤに最
終濃度5 μl/mlで０、60、120または180分間さらし、各
時点で全ＲＮＡを単離した（図３Ｃ）。単離されたＲＮ
Ａの各調製物中のリボザイムの量をノーザンブロット分
析により測定した。
ngおよびCarmichael, 1996) に記述された通りアクチノ
マイシンＤで処理した後、ノーザンブロット分析によっ
て測定した。すなわち、細胞をアクチノマイシンＤに最
終濃度5 μl/mlで０、60、120または180分間さらし、各
時点で全ＲＮＡを単離した（図３Ｃ）。単離されたＲＮ
Ａの各調製物中のリボザイムの量をノーザンブロット分
析により測定した。
【００２２】切断アッセイ 各pUCdt-RzまたはpUCdt によってトランスフェクトされ
たHeLa細胞から全ＲＮＡを抽出した。単離されたＲＮＡ
の各調製物中のリボザイムの量を、リボザイムに特異的
なプローブを用いたノーザンブロッティングにより測定
した。次に、トランスフェクトされていないHeLa細胞か
ら単離したＲＮＡを添加することにより各リボザイムの
濃度を同じ値になるように調節した。HIV-1のU5 LTR領
域をコードする基質ＲＮＡ（図２Ａ）をＴ７転写によっ
て調製し、32Pを用いて放射標識した。50μl の反応混
合物[40 mM Tris-HCl (pH 8.0), 8 mM MgCl2, 5 mM ジ
チオトレイトール (DTT)、2 mM スペルミジン、40 Uの
胎盤RNaseインヒビター、30μlの全ＲＮＡ、5 kpcmの放
射標識した基質ＲＮＡ] 中で37℃で12時間切断反応を進
行させた。6%ポリアクリルアミド/7 M尿素ゲルを用いた
電気泳動にかけて反応生成物を同定した（図２Ｂ）。
たHeLa細胞から全ＲＮＡを抽出した。単離されたＲＮＡ
の各調製物中のリボザイムの量を、リボザイムに特異的
なプローブを用いたノーザンブロッティングにより測定
した。次に、トランスフェクトされていないHeLa細胞か
ら単離したＲＮＡを添加することにより各リボザイムの
濃度を同じ値になるように調節した。HIV-1のU5 LTR領
域をコードする基質ＲＮＡ（図２Ａ）をＴ７転写によっ
て調製し、32Pを用いて放射標識した。50μl の反応混
合物[40 mM Tris-HCl (pH 8.0), 8 mM MgCl2, 5 mM ジ
チオトレイトール (DTT)、2 mM スペルミジン、40 Uの
胎盤RNaseインヒビター、30μlの全ＲＮＡ、5 kpcmの放
射標識した基質ＲＮＡ] 中で37℃で12時間切断反応を進
行させた。6%ポリアクリルアミド/7 M尿素ゲルを用いた
電気泳動にかけて反応生成物を同定した（図２Ｂ）。
【００２３】ルシフェラーゼアッセイ Dual-LuciferaseTM Reporter Assay System (Promega,
Madison, WI)を製造者のプロトコールにしたがって用い
て、ルシフェラーゼ活性を測定した。pUCdt-Rzおよび標
的発現プラスミドによってトランスフェクトされたHeLa
細胞（図４Ａ）、または標的発現プラスミドによって形
質導入されたリボザイム産生HeLa細胞（図４Ｂ）を150
μlの 1x 受動溶解緩衝液中で15分間溶解し、プレート
からこすり取った。遠心分離によって細胞破砕物を除去
した。20μl の遠心分離した溶解物を100 μlのルシフ
ェラーゼアッセイ試薬IIに添加した後、発光計(luminom
eter)(Luminant LB 9501; Berthold, Bad Wildbad, Ger
many)を用いて発光シグナルを直ちに定量化した。さら
に、ホタルルシフェラーゼの活性を標準化するため、我
々はホタルルシフェラーゼによって触媒された反応の定
量化の直後に100 μlのStop & GloTM試薬をサンプルチ
ューブに加えることによって、ウミシイタケ(Renilla)
ルシフェラーゼによって生成された発光シグナルを測定
した。ウミシイタケルシフェラーゼの活性を参照して、
ホタルルシフェラーゼ活性の記録された数値を標準化し
た（図４）。ホタルルシフェラーゼ活性の標準化した各
数値を、溶解物中のタンパク質濃度を参照してさらに標
準化した。タンパク質はブラドフォード法(Bradford's
method)に基づくProtein Assay Kit (Bio-Rad, Califor
nia, USA)を用いて定量した。
Madison, WI)を製造者のプロトコールにしたがって用い
て、ルシフェラーゼ活性を測定した。pUCdt-Rzおよび標
的発現プラスミドによってトランスフェクトされたHeLa
細胞（図４Ａ）、または標的発現プラスミドによって形
質導入されたリボザイム産生HeLa細胞（図４Ｂ）を150
μlの 1x 受動溶解緩衝液中で15分間溶解し、プレート
からこすり取った。遠心分離によって細胞破砕物を除去
した。20μl の遠心分離した溶解物を100 μlのルシフ
ェラーゼアッセイ試薬IIに添加した後、発光計(luminom
eter)(Luminant LB 9501; Berthold, Bad Wildbad, Ger
many)を用いて発光シグナルを直ちに定量化した。さら
に、ホタルルシフェラーゼの活性を標準化するため、我
々はホタルルシフェラーゼによって触媒された反応の定
量化の直後に100 μlのStop & GloTM試薬をサンプルチ
ューブに加えることによって、ウミシイタケ(Renilla)
ルシフェラーゼによって生成された発光シグナルを測定
した。ウミシイタケルシフェラーゼの活性を参照して、
ホタルルシフェラーゼ活性の記録された数値を標準化し
た（図４）。ホタルルシフェラーゼ活性の標準化した各
数値を、溶解物中のタンパク質濃度を参照してさらに標
準化した。タンパク質はブラドフォード法(Bradford's
method)に基づくProtein Assay Kit (Bio-Rad, Califor
nia, USA)を用いて定量した。
【００２４】リボザイムを安定に導入されたHeLa細胞 pHyg dtまたはpHyg dt-Rzシリーズのメンバーを用いてH
eLa細胞をトランスフェクトし、300 μg/mlのハイグロ
マイシンＢ（和光純薬、大阪、日本）を含有するDMEM中
で選択することにより、リボザイム導入細胞を得た。ト
ランスフェクションの12時間後に培地を増殖培地と交換
し、細胞をさらに48時間培養した。細胞を1:5 の希釈
で、300 μg/mlのハイグロマイシンＢを含有するDMEM
（選択培地）で継代培養した。培地は３日ごとに新鮮な
培地と交換した。ハイグロマイシンＢに耐性な細胞を、
250 μg/mlのハイグロマイシンＢを含有するDMEM中で増
殖させた。
eLa細胞をトランスフェクトし、300 μg/mlのハイグロ
マイシンＢ（和光純薬、大阪、日本）を含有するDMEM中
で選択することにより、リボザイム導入細胞を得た。ト
ランスフェクションの12時間後に培地を増殖培地と交換
し、細胞をさらに48時間培養した。細胞を1:5 の希釈
で、300 μg/mlのハイグロマイシンＢを含有するDMEM
（選択培地）で継代培養した。培地は３日ごとに新鮮な
培地と交換した。ハイグロマイシンＢに耐性な細胞を、
250 μg/mlのハイグロマイシンＢを含有するDMEM中で増
殖させた。
【００２５】ウイルスの作製およびH IV ベクターによる
リボザ イムの導入 組換えウイルスを含む上清を文献 (Shimada, 1991)に記
述されるように作製した。すなわち、Cos細胞(2 x 106
細胞/10 cmの皿）を培養し、10μg のパッケージングベ
クタープラスミドおよび10μg の組換えHIV ベクタープ
ラスミド（図５Ｂに示すHIVRib.N）を用いてトランスフ
ェクトした。48時間後に組換えウイルスを含む上清を採
取し、孔径0.22μm のフィルターで濾過した。次に、2
x 106個のＨ９細胞を、6 μg/mlのPolybreneTM (Abbott
Laboratories)を含む濾過した上清5 mlと共にインキュ
ベートした。24時間後、培地を10%FCSおよび1 mg/ml G4
18を添加したRPMIと交換した。細胞をさらに48時間培養
し、G418耐性クローンを単離した。RT-PCR分析によって
リボザイム遺伝子の導入を確認した。
リボザ イムの導入 組換えウイルスを含む上清を文献 (Shimada, 1991)に記
述されるように作製した。すなわち、Cos細胞(2 x 106
細胞/10 cmの皿）を培養し、10μg のパッケージングベ
クタープラスミドおよび10μg の組換えHIV ベクタープ
ラスミド（図５Ｂに示すHIVRib.N）を用いてトランスフ
ェクトした。48時間後に組換えウイルスを含む上清を採
取し、孔径0.22μm のフィルターで濾過した。次に、2
x 106個のＨ９細胞を、6 μg/mlのPolybreneTM (Abbott
Laboratories)を含む濾過した上清5 mlと共にインキュ
ベートした。24時間後、培地を10%FCSおよび1 mg/ml G4
18を添加したRPMIと交換した。細胞をさらに48時間培養
し、G418耐性クローンを単離した。RT-PCR分析によって
リボザイム遺伝子の導入を確認した。
【００２６】Ｈ９細胞中に産生されたｔＲＮＡ Val-リボ
ザイ ムの定量 以下のように定量的RT-PCRを実施した(Ozawaら，1990;
HambletおよびCastora, 1995)。すなわち、リボザイム
を安定に導入したＨ９細胞から全ＲＮＡを抽出した。20
μl の反応混合物 [1 μg の全ＲＮＡ、20 mM Tris-HCl
(pH 8.3)、50mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM dNTP、1 pmol
のプライマー（βアクチン用: 5'-gtggcc atc tct tgc
tcg aa-3'（配列番号１６）; リボザイム用: 5'-gac ct
t tcggtc ctc atc-3' （配列番号１７） )および0.25 U
/ml モロニーマウス白血病ウイルスRTase（宝酒造、京
都、日本)]中で42℃で30分間ｃＤＮＡを合成した。
ザイ ムの定量 以下のように定量的RT-PCRを実施した(Ozawaら，1990;
HambletおよびCastora, 1995)。すなわち、リボザイム
を安定に導入したＨ９細胞から全ＲＮＡを抽出した。20
μl の反応混合物 [1 μg の全ＲＮＡ、20 mM Tris-HCl
(pH 8.3)、50mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM dNTP、1 pmol
のプライマー（βアクチン用: 5'-gtggcc atc tct tgc
tcg aa-3'（配列番号１６）; リボザイム用: 5'-gac ct
t tcggtc ctc atc-3' （配列番号１７） )および0.25 U
/ml モロニーマウス白血病ウイルスRTase（宝酒造、京
都、日本)]中で42℃で30分間ｃＤＮＡを合成した。
【００２７】２個のオリゴヌクレオチドプライマー（ア
ッパー：5'-gac tac ctc atg aag atc ct-3'（配列番号
１８）; ロアー: 5'-gtg gcc atc tct tgc tcg aa-3'
（配列番号１９）)を用いたＰＣＲによりβアクチンの
ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲサイクルは、94℃１分間、
60℃１分間および72℃２分間を13、15または17サイクル
実施した。２個のオリゴヌクレオチドプライマー（アッ
パー：5'-gtt atc acg ttc gcc taa-3' （配列番号２
０） ;ロアー: 5'-gac ctt tcg gtc ctc atc-3'(配列番
号２１） ) を用いたＰＣＲによりリボザイムｃＤＮＡ
を増幅した。ＰＣＲサイクルは、94℃１分間、55℃１分
間および72℃２分間を13、15または17サイクル実施し
た。
ッパー：5'-gac tac ctc atg aag atc ct-3'（配列番号
１８）; ロアー: 5'-gtg gcc atc tct tgc tcg aa-3'
（配列番号１９）)を用いたＰＣＲによりβアクチンの
ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲサイクルは、94℃１分間、
60℃１分間および72℃２分間を13、15または17サイクル
実施した。２個のオリゴヌクレオチドプライマー（アッ
パー：5'-gtt atc acg ttc gcc taa-3' （配列番号２
０） ;ロアー: 5'-gac ctt tcg gtc ctc atc-3'(配列番
号２１） ) を用いたＰＣＲによりリボザイムｃＤＮＡ
を増幅した。ＰＣＲサイクルは、94℃１分間、55℃１分
間および72℃２分間を13、15または17サイクル実施し
た。
【００２８】13、15および17サイクル後のＰＣＲ産物
を、リボザイムに特異的(5'-acg cgaaag gtc ccc ggt-
3'（配列番号２２）) またはβアクチンに特異的(5'-gc
g ggaaaa tcg tgc gtg a-3'（配列番号２３）)な放射標
識プローブを用いたサザンブロッィングにより分析し
た。BAS2000 システム（富士フィルム、東京、日本）を
用いて各バンドの放射能（図６Ａおよび６Ｂ）を測定し
た。
を、リボザイムに特異的(5'-acg cgaaag gtc ccc ggt-
3'（配列番号２２）) またはβアクチンに特異的(5'-gc
g ggaaaa tcg tgc gtg a-3'（配列番号２３）)な放射標
識プローブを用いたサザンブロッィングにより分析し
た。BAS2000 システム（富士フィルム、東京、日本）を
用いて各バンドの放射能（図６Ａおよび６Ｂ）を測定し
た。
【００２９】HIV-1チャレンジアッセイ HIV ベクター(HIVRib.N ）を用いてリボザイムを導入し
たＨ９細胞およびモックを導入した対照細胞をNL432 と
共にm.o.i（感染多重度）0.01で４時間インキュベート
した。PBS で２回洗浄した後、これらの細胞を 1x105細
胞／mlの密度で、10% FCS を添加したRPMI 1640培地で
培養した。ウイルス感染後３、７および11日目に上清を
回収した。HIV-1抗原捕獲ELISA テストキット(DAINABO
T、東京、日本）を製造者の指示にしたがって用いて、
各上清におけるHIV-1のp24 抗原のレベルを測定した。
たＨ９細胞およびモックを導入した対照細胞をNL432 と
共にm.o.i（感染多重度）0.01で４時間インキュベート
した。PBS で２回洗浄した後、これらの細胞を 1x105細
胞／mlの密度で、10% FCS を添加したRPMI 1640培地で
培養した。ウイルス感染後３、７および11日目に上清を
回収した。HIV-1抗原捕獲ELISA テストキット(DAINABO
T、東京、日本）を製造者の指示にしたがって用いて、
各上清におけるHIV-1のp24 抗原のレベルを測定した。
【００３０】結果 ｔＲＮＡ Val-リボザイムの二次構造およびin vitroにお
けるそれらの切断活性 pol IIIによって転写が開始されるリボザイム発現カセ
ットを構築するため、我々はHIV-1 ＲＮＡの５’リーダ
ー配列を標的とするリボザイム配列（Adachiら，1986;
Yuら，1993)を、間に３つの短いリンカーを介して、ｔ
ＲＮＡValプロモーターに隣接してクローン化し（図１
においてリンカー配列は小文字で、またリボザイム配列
は太い大文字で示す）、一組のpUCdt-Rzプラスミドを得
た。短いリンカーの挿入は、転写物の全体的構造を変化
させ、その結果、リボザイムの認識アーム（arm)（図
中、認識アームには下線を付してある）の接近しやすさ
(accessibility)に影響を及ぼした。当然ながら、リボ
ザイムが基質ＲＮＡと共にステム(stem)構造（これは次
におこる基質の切断を確実にするものである）を形成で
きるように、リボザイムの５’側および３’側基質認識
部位の両方が基質に対して利用可能であることが重要で
ある。構造と機能的活性の関係を明らかにするため、我
々は認識アームの利用可能性(availability)の程度を変
更するリンカーを選択した。図１はコンピュータモデリ
ング(Mulfold Biocomputing Office, Biology Departme
nt, Indiana University, IN, USA)によって予測される
ｔＲＮＡVal-リボザイムの二次構造（ＡおよびＢボック
スに対応する配列に影をつけてある）を示す。ある場合
においては（図１Ａ）、ターミネーター配列の前にリン
カーが挿入され、リボザイムの３’側基質認識アームの
フレキシビリティーを制限した。さらに、５’側基質認
識アームは利用不可能であった。したがってｔＲＮＡ
Val-リボザイム１（図１ＡのＲｚ１）の場合は、５’側
および３’側基質認識アームの両方は殆どらせん構造中
に埋没していた。ｔＲＮＡVal-リボザイム２（Ｒｚ２）
は、５’側に制限された１つの基質認識アームを有す
る。対照的に、ｔＲＮＡVal-リボザイム３（Ｒｚ３）は
制限された基質認識アームを全くもたず、両方のアーム
とも基質との結合に利用可能であった。基質認識アーム
のフレキシビリティーから判断すると、Ｒｚ３の切断活
性が最も高く、次にＲｚ２およびＲｚ３がこの順番で続
くと予想されよう。なお、Ｒｚ１〜３の塩基配列は、そ
れぞれ、配列表の配列番号３、１、および２に示す。
けるそれらの切断活性 pol IIIによって転写が開始されるリボザイム発現カセ
ットを構築するため、我々はHIV-1 ＲＮＡの５’リーダ
ー配列を標的とするリボザイム配列（Adachiら，1986;
Yuら，1993)を、間に３つの短いリンカーを介して、ｔ
ＲＮＡValプロモーターに隣接してクローン化し（図１
においてリンカー配列は小文字で、またリボザイム配列
は太い大文字で示す）、一組のpUCdt-Rzプラスミドを得
た。短いリンカーの挿入は、転写物の全体的構造を変化
させ、その結果、リボザイムの認識アーム（arm)（図
中、認識アームには下線を付してある）の接近しやすさ
(accessibility)に影響を及ぼした。当然ながら、リボ
ザイムが基質ＲＮＡと共にステム(stem)構造（これは次
におこる基質の切断を確実にするものである）を形成で
きるように、リボザイムの５’側および３’側基質認識
部位の両方が基質に対して利用可能であることが重要で
ある。構造と機能的活性の関係を明らかにするため、我
々は認識アームの利用可能性(availability)の程度を変
更するリンカーを選択した。図１はコンピュータモデリ
ング(Mulfold Biocomputing Office, Biology Departme
nt, Indiana University, IN, USA)によって予測される
ｔＲＮＡVal-リボザイムの二次構造（ＡおよびＢボック
スに対応する配列に影をつけてある）を示す。ある場合
においては（図１Ａ）、ターミネーター配列の前にリン
カーが挿入され、リボザイムの３’側基質認識アームの
フレキシビリティーを制限した。さらに、５’側基質認
識アームは利用不可能であった。したがってｔＲＮＡ
Val-リボザイム１（図１ＡのＲｚ１）の場合は、５’側
および３’側基質認識アームの両方は殆どらせん構造中
に埋没していた。ｔＲＮＡVal-リボザイム２（Ｒｚ２）
は、５’側に制限された１つの基質認識アームを有す
る。対照的に、ｔＲＮＡVal-リボザイム３（Ｒｚ３）は
制限された基質認識アームを全くもたず、両方のアーム
とも基質との結合に利用可能であった。基質認識アーム
のフレキシビリティーから判断すると、Ｒｚ３の切断活
性が最も高く、次にＲｚ２およびＲｚ３がこの順番で続
くと予想されよう。なお、Ｒｚ１〜３の塩基配列は、そ
れぞれ、配列表の配列番号３、１、および２に示す。
【００３１】上記リボザイムがそれらの二次構造（図
１）から予想される通りの切断活性を有するかどうかを
調べるため、我々はまずin vitroにおける活性を比較し
た。上記リボザイム（ｔＲＮＡVal-リボザイム）をコー
ドする種々のpUCdt-Rzプラスミドを用いてトランスフェ
クトしたHeLa細胞から全ＲＮＡを単離した。我々は単離
したＲＮＡ中の各リボザイムの一定量（ノーザンブロッ
ト分析データに基づく）を放射標識した基質ＲＮＡと混
合し、切断反応を開始させた。12時間インキュベートし
た後、6%ポリアクリルアミド/7 M尿素を含むゲルを用い
て各反応の進行をモニターした（図２）。予想した通
り、両方の認識アームが利用可能であるＲｚ３の切断活
性が最も高く、次にＲｚ２が続き、他方、両方の認識ア
ームが利用できないＲｚ１の切断活性は非常に低かっ
た。したがって、in vitroにおけるｔＲＮＡVal-リボザ
イムの切断活性は、コンピュータによって作製されたそ
れらの二次構造から推定できることが明らかであった。
１）から予想される通りの切断活性を有するかどうかを
調べるため、我々はまずin vitroにおける活性を比較し
た。上記リボザイム（ｔＲＮＡVal-リボザイム）をコー
ドする種々のpUCdt-Rzプラスミドを用いてトランスフェ
クトしたHeLa細胞から全ＲＮＡを単離した。我々は単離
したＲＮＡ中の各リボザイムの一定量（ノーザンブロッ
ト分析データに基づく）を放射標識した基質ＲＮＡと混
合し、切断反応を開始させた。12時間インキュベートし
た後、6%ポリアクリルアミド/7 M尿素を含むゲルを用い
て各反応の進行をモニターした（図２）。予想した通
り、両方の認識アームが利用可能であるＲｚ３の切断活
性が最も高く、次にＲｚ２が続き、他方、両方の認識ア
ームが利用できないＲｚ１の切断活性は非常に低かっ
た。したがって、in vitroにおけるｔＲＮＡVal-リボザ
イムの切断活性は、コンピュータによって作製されたそ
れらの二次構造から推定できることが明らかであった。
【００３２】ｔＲＮＡ Val-リボザイムの定常レベルおよ
び半 減期 我々はリンカー配列の介在によって全体的な構造に小さ
い変化が生じるであろうと予想した。したがって、リン
カーはリボザイムのin vivoにおける安定性にかなりの
影響を及ぼすに相違ない。我々は２つの異なるアプロー
チを用いて、各ｔＲＮＡVal-リボザイムの細胞内安定性
を下記のように比較した。すなわち、pUC-Rr (リボザイ
ムをコードする各pUCdt-Rzプラスミドに参照遺伝子の配
列を付加してpUC-Rrを作製した；図３Ａ）を用いて一過
性にトランスフェクトしたHeLa細胞由来の各転写物の定
常レベルをノーザンブロット分析（一過性発現アッセ
イ）により比較した。参照遺伝子の転写量を調整するこ
とにより各ｔＲＮＡVal-リボザイムの発現レベルを標準
化した。参照遺伝子は同じプラスミド内にタンデムに連
結した（pUC-Rr；図３Ａ）。ｔＲＮＡVal-リボザイムを
コードする各プラスミドを用いてトランスフェクトした
HeLa細胞から我々が単離したＲＮＡの全サンプル中に、
長さが約150ヌクレオチド（これはキメラｔＲＮＡVal-
リボザイムの大きさと一致する）の転写物が検出され
た。ｔＲＮＡVal-リボザイムの定常レベルは、濃度が30
倍の範囲で異なっていた。最も高かったＲｚ２のレベル
は最も低いＲｚ１のレベルの約26倍であった。そして、
Ｒｚ３のレベルはＲｚ１のレベルの約５倍であった。各
リボザイム発現カセットのプロモーター領域には何の改
変もしていないので各場合において転写効率は同一であ
ると推定されるため、我々は転写物の定常レベルにおけ
るこれらの差は各転写物のin vivoにおける安定性の結
果であると仮定した。
び半 減期 我々はリンカー配列の介在によって全体的な構造に小さ
い変化が生じるであろうと予想した。したがって、リン
カーはリボザイムのin vivoにおける安定性にかなりの
影響を及ぼすに相違ない。我々は２つの異なるアプロー
チを用いて、各ｔＲＮＡVal-リボザイムの細胞内安定性
を下記のように比較した。すなわち、pUC-Rr (リボザイ
ムをコードする各pUCdt-Rzプラスミドに参照遺伝子の配
列を付加してpUC-Rrを作製した；図３Ａ）を用いて一過
性にトランスフェクトしたHeLa細胞由来の各転写物の定
常レベルをノーザンブロット分析（一過性発現アッセ
イ）により比較した。参照遺伝子の転写量を調整するこ
とにより各ｔＲＮＡVal-リボザイムの発現レベルを標準
化した。参照遺伝子は同じプラスミド内にタンデムに連
結した（pUC-Rr；図３Ａ）。ｔＲＮＡVal-リボザイムを
コードする各プラスミドを用いてトランスフェクトした
HeLa細胞から我々が単離したＲＮＡの全サンプル中に、
長さが約150ヌクレオチド（これはキメラｔＲＮＡVal-
リボザイムの大きさと一致する）の転写物が検出され
た。ｔＲＮＡVal-リボザイムの定常レベルは、濃度が30
倍の範囲で異なっていた。最も高かったＲｚ２のレベル
は最も低いＲｚ１のレベルの約26倍であった。そして、
Ｒｚ３のレベルはＲｚ１のレベルの約５倍であった。各
リボザイム発現カセットのプロモーター領域には何の改
変もしていないので各場合において転写効率は同一であ
ると推定されるため、我々は転写物の定常レベルにおけ
るこれらの差は各転写物のin vivoにおける安定性の結
果であると仮定した。
【００３３】第２のアプローチとして、また上記の仮説
を試験するため、我々はより自然な細胞内条件下で各転
写物の安定性を比較しようと試みた。我々は、各ｔＲＮ
ＡVal-リボザイムを産生する安定したHeLa形質転換細胞
を確立し、そしてアクチノマイシンＤを用いて細胞性転
写を妨げることによって各転写物の細胞内半減期を直接
測定した。図３Ｃに示すように、Ｒｚ２の分解速度はＲ
ｚ１およびＲｚ３のそれよりも低かった。Ｒｚ２の半減
期（100±10分）は、Ｒｚ１（35±2分）およびＲｚ３
（40±15分）の２倍以上であった。これらの結果は一過
性発現アッセイの結果と良く一致しており、転写物の定
常レベルにおける差は転写効率における何らかの差によ
るよりも、むしろ各転写物のin vivoにおける安定性に
よる、という我々の仮説を支持した。
を試験するため、我々はより自然な細胞内条件下で各転
写物の安定性を比較しようと試みた。我々は、各ｔＲＮ
ＡVal-リボザイムを産生する安定したHeLa形質転換細胞
を確立し、そしてアクチノマイシンＤを用いて細胞性転
写を妨げることによって各転写物の細胞内半減期を直接
測定した。図３Ｃに示すように、Ｒｚ２の分解速度はＲ
ｚ１およびＲｚ３のそれよりも低かった。Ｒｚ２の半減
期（100±10分）は、Ｒｚ１（35±2分）およびＲｚ３
（40±15分）の２倍以上であった。これらの結果は一過
性発現アッセイの結果と良く一致しており、転写物の定
常レベルにおける差は転写効率における何らかの差によ
るよりも、むしろ各転写物のin vivoにおける安定性に
よる、という我々の仮説を支持した。
【００３４】ｔＲＮＡ Val-リボザイムの細胞内活性 ｔＲＮＡVal-リボザイムの細胞内活性を評価するため、
我々は２種類のアッセイを実施した。第１に、各ｔＲＮ
ＡVal-リボザイム発現プラスミド（pUCdt-Rz)およびHIV
-1 LTR (R-U5 領域)-ルシフェラーゼからなるキメラ遺
伝子をコードする標的遺伝子発現プラスミドを用いてHe
La細胞を同時トランスフェクションした。両遺伝子の一
過性発現の後、各細胞溶解物においてルシフェラーゼ活
性を測定することにより各ｔＲＮＡVal-リボザイムの細
胞内活性を評価した。リボザイム発現プラスミドの代わ
りに最小限のｔＲＮＡValプロモーターおよびターミネ
ーター配列を有する対照プラスミド（pUCdt)を用いた場
合に記録されたルシフェラーゼ活性を100%とした。図４
Ａに示すように、in vivoにおいて安定性が最も高かっ
たＲｚ２が最も効果的（>60%抑制）であり、Ｒｚ３が次
に効果的（>40%抑制）であった。Ｒｚ１は、in vitroに
おける低い切断活性（図２Ｂ）およびin vivoにおける
低い安定性（図３Ｂおよび３Ｃ）から予測されるよう
に、非常に効果的とは言えなかった（約10% 抑制）。
我々は２種類のアッセイを実施した。第１に、各ｔＲＮ
ＡVal-リボザイム発現プラスミド（pUCdt-Rz)およびHIV
-1 LTR (R-U5 領域)-ルシフェラーゼからなるキメラ遺
伝子をコードする標的遺伝子発現プラスミドを用いてHe
La細胞を同時トランスフェクションした。両遺伝子の一
過性発現の後、各細胞溶解物においてルシフェラーゼ活
性を測定することにより各ｔＲＮＡVal-リボザイムの細
胞内活性を評価した。リボザイム発現プラスミドの代わ
りに最小限のｔＲＮＡValプロモーターおよびターミネ
ーター配列を有する対照プラスミド（pUCdt)を用いた場
合に記録されたルシフェラーゼ活性を100%とした。図４
Ａに示すように、in vivoにおいて安定性が最も高かっ
たＲｚ２が最も効果的（>60%抑制）であり、Ｒｚ３が次
に効果的（>40%抑制）であった。Ｒｚ１は、in vitroに
おける低い切断活性（図２Ｂ）およびin vivoにおける
低い安定性（図３Ｂおよび３Ｃ）から予測されるよう
に、非常に効果的とは言えなかった（約10% 抑制）。
【００３５】第２のアッセイにおいては、標的遺伝子発
現プラスミドのみを用いて、ほぼ同一レベルのｔＲＮＡ
Val-リボザイムを発現する安定した形質転換細胞をトラ
ンスフェクトした（安定した形質転換HeLa細胞を恣意的
にピックアップし、リボザイムをほぼ同一レベルで発現
するクローンを試験用に選択した）。各リボザイムに対
して２つの独立した、安定な形質転換体を用いたこの実
験において（図４Ｂ）、我々は上の段落に記述した傾向
に類似した傾向を観察した。しかし、この場合は、おそ
らく形質転換HeLa細胞がｔＲＮＡVal-リボザイムを構成
的に産生したため、すべてのリボザイムの効果はより強
かった。Ｒｚ２は標的遺伝子の発現を有意なレベルまで
抑制し、ある場合には97%も抑制した。
現プラスミドのみを用いて、ほぼ同一レベルのｔＲＮＡ
Val-リボザイムを発現する安定した形質転換細胞をトラ
ンスフェクトした（安定した形質転換HeLa細胞を恣意的
にピックアップし、リボザイムをほぼ同一レベルで発現
するクローンを試験用に選択した）。各リボザイムに対
して２つの独立した、安定な形質転換体を用いたこの実
験において（図４Ｂ）、我々は上の段落に記述した傾向
に類似した傾向を観察した。しかし、この場合は、おそ
らく形質転換HeLa細胞がｔＲＮＡVal-リボザイムを構成
的に産生したため、すべてのリボザイムの効果はより強
かった。Ｒｚ２は標的遺伝子の発現を有意なレベルまで
抑制し、ある場合には97%も抑制した。
【００３６】Ｒｚ３はin vitroにおける切断活性が最も
高かったが、細胞環境内ではＲｚ２より効果的に作用す
ることはなかった。これらの結果は、もし転写されたリ
ボザイムが細胞内で十分安定であるならば、極めて高い
切断活性がなくてもin vivoにおいて顕著な効果をもち
うることを示唆する。
高かったが、細胞環境内ではＲｚ２より効果的に作用す
ることはなかった。これらの結果は、もし転写されたリ
ボザイムが細胞内で十分安定であるならば、極めて高い
切断活性がなくてもin vivoにおいて顕著な効果をもち
うることを示唆する。
【００３７】HIV-1の複製を抑制する能力 上記の試験は、Ｒｚ２およびＲｚ３がin vivoにおいてH
IV-1の配列に対して有意な切断活性をもつかもしれない
ことを示したので、我々はHIV-1の複製を抑制するｔＲ
ＮＡVal-リボザイムの能力を比較した。すなわち、HIV
ベクター（図５；Shimadaら，1991)を用いて、Ｒｚ２ま
たはＲｚ３を発現するＨ９細胞系の安定な形質転換体を
得た（上記の試験においてＲｚ１は不活性だったので、
Ｒｚ１を産生する安定な形質転換体を単離する試みは行
なわなかった）。HIVベクターによって形質導入され
た、リボザイム発現カセットをもたない細胞（図５Ａ）
をモック対照として用いた。以下の分析には２つの独立
した細胞系を用いた。その結果、11日間にわたって、リ
ボザイムを産生しない細胞の増殖速度（データはここに
示していない）と較べ、それら細胞系の増殖速度に何ら
明白な変化は検出されなかった。したがってリボザイム
は宿主細胞にとって有害ではなく、おそらく高い特異性
をもって標的ＲＮＡのみを切断したのであろう（Kawasa
kiら，1996, 1998)。
IV-1の配列に対して有意な切断活性をもつかもしれない
ことを示したので、我々はHIV-1の複製を抑制するｔＲ
ＮＡVal-リボザイムの能力を比較した。すなわち、HIV
ベクター（図５；Shimadaら，1991)を用いて、Ｒｚ２ま
たはＲｚ３を発現するＨ９細胞系の安定な形質転換体を
得た（上記の試験においてＲｚ１は不活性だったので、
Ｒｚ１を産生する安定な形質転換体を単離する試みは行
なわなかった）。HIVベクターによって形質導入され
た、リボザイム発現カセットをもたない細胞（図５Ａ）
をモック対照として用いた。以下の分析には２つの独立
した細胞系を用いた。その結果、11日間にわたって、リ
ボザイムを産生しない細胞の増殖速度（データはここに
示していない）と較べ、それら細胞系の増殖速度に何ら
明白な変化は検出されなかった。したがってリボザイム
は宿主細胞にとって有害ではなく、おそらく高い特異性
をもって標的ＲＮＡのみを切断したのであろう（Kawasa
kiら，1996, 1998)。
【００３８】ウイルスチャレンジアッセイに先立って、
我々は定量的RT-PCR分析により形質導入Ｈ９細胞におけ
る各ｔＲＮＡVal-リボザイムの定常レベルを測定した。
図３Ｂに示すHeLa細胞を用いた一過性発現アッセイの結
果、すなわち、Ｒｚ２とＲｚ３の定常レベルの差は約５
倍であるということが、RT-PCR分析により確認された
（図６Ａおよび６Ｂ）。明らかにＲｚ２はin vivoにお
いてＲｚ３よりも安定であった。
我々は定量的RT-PCR分析により形質導入Ｈ９細胞におけ
る各ｔＲＮＡVal-リボザイムの定常レベルを測定した。
図３Ｂに示すHeLa細胞を用いた一過性発現アッセイの結
果、すなわち、Ｒｚ２とＲｚ３の定常レベルの差は約５
倍であるということが、RT-PCR分析により確認された
（図６Ａおよび６Ｂ）。明らかにＲｚ２はin vivoにお
いてＲｚ３よりも安定であった。
【００３９】ｔＲＮＡVal-リボザイムを構成的に産生す
る安定なＨ９形質転換体をHIV-1ビリオンを用いてチャ
レンジし、感染の11日後に測定するとＲｚ２は殆ど完全
にウイルスの複製を抑制した（約99%)（図６Ｃ）。対照
的に、驚くべきことに、Ｒｚ３はこれらの実験条件下で
ウイルスの複製を全く抑制しなかった。HIV-1チャレン
ジアッセイにおいては、Ｒｚ２とＲｚ３の効果の差は顕
著であった。
る安定なＨ９形質転換体をHIV-1ビリオンを用いてチャ
レンジし、感染の11日後に測定するとＲｚ２は殆ど完全
にウイルスの複製を抑制した（約99%)（図６Ｃ）。対照
的に、驚くべきことに、Ｒｚ３はこれらの実験条件下で
ウイルスの複製を全く抑制しなかった。HIV-1チャレン
ジアッセイにおいては、Ｒｚ２とＲｚ３の効果の差は顕
著であった。
【００４０】ｔＲＮＡ Val-リボザイムの細胞内局在 リボザイムがその標的と共局在することがリボザイム効
果の明らかに重要な決定要素であるので（Sullengerお
よびCech, 1993; Bertrandら，1997)、ｔＲＮＡVal-リ
ボザイムの細胞内局在を確認することが不可欠であっ
た。Ｒｚ２発現カセットによって形質導入されたHeLa細
胞由来の全ＲＮＡを核画分および細胞質画分に分離し
た。次に、リボザイムに特異的なプローブを用いてノー
ザンブロット分析により転写されたＲｚ２を検出した。
図７Ａに示すように、Ｒｚ２は主として細胞質画分に見
いだされた。そして、核画分では有意なレベルで検出さ
れなかった。他のｔＲＮＡVal-リボザイム（Ｒｚ１およ
びＲｚ３）もまた細胞質画分に主として局在していた
（データはここに示していない）。核内に残留するＵ６
ｓｎＲＮＡは対照としてこれらの試験に含めた（図７
Ｂ）。
果の明らかに重要な決定要素であるので（Sullengerお
よびCech, 1993; Bertrandら，1997)、ｔＲＮＡVal-リ
ボザイムの細胞内局在を確認することが不可欠であっ
た。Ｒｚ２発現カセットによって形質導入されたHeLa細
胞由来の全ＲＮＡを核画分および細胞質画分に分離し
た。次に、リボザイムに特異的なプローブを用いてノー
ザンブロット分析により転写されたＲｚ２を検出した。
図７Ａに示すように、Ｒｚ２は主として細胞質画分に見
いだされた。そして、核画分では有意なレベルで検出さ
れなかった。他のｔＲＮＡVal-リボザイム（Ｒｚ１およ
びＲｚ３）もまた細胞質画分に主として局在していた
（データはここに示していない）。核内に残留するＵ６
ｓｎＲＮＡは対照としてこれらの試験に含めた（図７
Ｂ）。
【００４１】考察 リボザイムは特定の遺伝子の発現を抑制するための、可
能性のある有用な道具である。なぜなら、リボザイムは
高い特異性をもって他のＲＮＡ分子に作用するように作
製できるからである（Uhlenbeck, 1987; Hasseloffおよ
びGerlach, 1988)。多数の試みが成功をおさめたが(Eck
steinおよびLilley, 1996; Turner, 1997; Scalon, 199
7)、in vivoにおいて使用できる効果的なリボザイム発
現系を設計することは依然として困難である。治療剤ま
たは遺伝子的作用物質としてのリボザイムおよびアンチ
センスＲＮＡの使用に関連する１つの主要な挑戦は、適
切な発現ベクターの開発である（JenningsおよびMollo
y, 1987; Sullengerら，1990; Bertrandら，1994, 199
7; Thompsonら，1995)。序論に述べたように、今日まで
２種類の発現系、すなわちpol II系およびpol III系が
用いられてきた。本研究において、我々はpol III系お
よびリボザイムの転写のためにヒトｔＲＮＡVal遺伝子
のプロモーター(Yuら，1993)を用いた。このプロモータ
ーは小さいＲＮＡ分子の転写に適しているばかりでな
く、その使用はコンピュータフォールディング（foldin
g)による二次構造の予測を容易にする。より重要なこと
に、それは転写されたリボザイムの核から細胞質への輸
送を可能とし、その結果ｔＲＮＡVal-リボザイムは標的
ｍＲＮＡを見つけることができるのである。
能性のある有用な道具である。なぜなら、リボザイムは
高い特異性をもって他のＲＮＡ分子に作用するように作
製できるからである（Uhlenbeck, 1987; Hasseloffおよ
びGerlach, 1988)。多数の試みが成功をおさめたが(Eck
steinおよびLilley, 1996; Turner, 1997; Scalon, 199
7)、in vivoにおいて使用できる効果的なリボザイム発
現系を設計することは依然として困難である。治療剤ま
たは遺伝子的作用物質としてのリボザイムおよびアンチ
センスＲＮＡの使用に関連する１つの主要な挑戦は、適
切な発現ベクターの開発である（JenningsおよびMollo
y, 1987; Sullengerら，1990; Bertrandら，1994, 199
7; Thompsonら，1995)。序論に述べたように、今日まで
２種類の発現系、すなわちpol II系およびpol III系が
用いられてきた。本研究において、我々はpol III系お
よびリボザイムの転写のためにヒトｔＲＮＡVal遺伝子
のプロモーター(Yuら，1993)を用いた。このプロモータ
ーは小さいＲＮＡ分子の転写に適しているばかりでな
く、その使用はコンピュータフォールディング（foldin
g)による二次構造の予測を容易にする。より重要なこと
に、それは転写されたリボザイムの核から細胞質への輸
送を可能とし、その結果ｔＲＮＡVal-リボザイムは標的
ｍＲＮＡを見つけることができるのである。
【００４２】発現カセットの設計 標的ｍＲＮＡの二次構造は、リボザイムによって媒介さ
れる切断を受けやすいかどうかを決定する。そして、リ
ボザイムもまた最大活性を得るためには適切な二次およ
び三次構造に折り畳まれなければならない。コンピュー
タが予測する二次構造が転写後の対応する構造を本当に
表しているという保証は全くないが、本研究において予
測された構造（図１Ａ〜１Ｃ）は、in vitroにおける切
断活性と良く相関していた（図２）。発現カセットにお
いては、転写物の３’末端プロセシングをブロックする
ため、成熟ｔＲＮＡVal（図１Ｅに大文字で示す）の最
後の７個の塩基が除去されたが転写に何ら影響はなかっ
た（Adeniyi-Jonesら，1984)。これらの塩基をリンカー
（図１に小文字で示す）によって置換し、その後にリボ
ザイム（太い大文字）を続けた。リンカー配列によって
ｔＲＮＡValの配列（全配列の約２／３をしめた）と組
み合わせて安定なステム構造を形成することにより、基
質認識アームの自由度または利用可能性を調節した。し
たがって、コンピュータフォールディングによって各認
識アームの二次構造および接近可能性を予測することは
比較的容易であった。さらに、基質認識アームの配列が
変わても、全体的二次構造を予測する同じルールを用い
る限り、認識アームの接近可能性を予測することは可能
である。実際、我々は他の遺伝子の発現を抑制するため
の類似のリボザイム発現系の構築に成功した（Kawasaki
ら，1996, 1998)。図１Ａ〜１Ｃに示す我々の発現系
は、効果的なリボザイム発現カセットの設計を容易にす
る。
れる切断を受けやすいかどうかを決定する。そして、リ
ボザイムもまた最大活性を得るためには適切な二次およ
び三次構造に折り畳まれなければならない。コンピュー
タが予測する二次構造が転写後の対応する構造を本当に
表しているという保証は全くないが、本研究において予
測された構造（図１Ａ〜１Ｃ）は、in vitroにおける切
断活性と良く相関していた（図２）。発現カセットにお
いては、転写物の３’末端プロセシングをブロックする
ため、成熟ｔＲＮＡVal（図１Ｅに大文字で示す）の最
後の７個の塩基が除去されたが転写に何ら影響はなかっ
た（Adeniyi-Jonesら，1984)。これらの塩基をリンカー
（図１に小文字で示す）によって置換し、その後にリボ
ザイム（太い大文字）を続けた。リンカー配列によって
ｔＲＮＡValの配列（全配列の約２／３をしめた）と組
み合わせて安定なステム構造を形成することにより、基
質認識アームの自由度または利用可能性を調節した。し
たがって、コンピュータフォールディングによって各認
識アームの二次構造および接近可能性を予測することは
比較的容易であった。さらに、基質認識アームの配列が
変わても、全体的二次構造を予測する同じルールを用い
る限り、認識アームの接近可能性を予測することは可能
である。実際、我々は他の遺伝子の発現を抑制するため
の類似のリボザイム発現系の構築に成功した（Kawasaki
ら，1996, 1998)。図１Ａ〜１Ｃに示す我々の発現系
は、効果的なリボザイム発現カセットの設計を容易にす
る。
【００４３】ｔＲＮＡ Val-リボザイムの核から細胞質へ
の輸 送 図１Ａ〜１Ｃに示すリボザイム発現カセットは、すべて
の転写物が細胞質（ここで転写物はその標的を見いだす
ことができる）に輸送されるのを可能とした（図７
Ａ）。そして、リボザイムによる標的分子の発現の有意
な抑制が観察された（図４および６Ｃ）。以前の研究
（Bertrandら，1997)において、成熟ｔＲＮＡMetの最後
の10塩基の欠失は３’末端プロセシングをブロックした
だけでなく、転写物の細胞質への輸送を阻害した（Tobi
anら，1985)。これらの結果は、３’末端プロセシング
が細胞質への輸送と結びついている可能性があること、
および３’末端が変更された転写物は効率的に輸送され
ないことを示唆した（CottenおよびBirnstiel, 1989; B
oelensら，1995)。しかし、図７に示されるように、成
熟ｔＲＮＡValの最後の７塩基の欠失は、転写物の核か
らの輸送を抑制しなかった。
の輸 送 図１Ａ〜１Ｃに示すリボザイム発現カセットは、すべて
の転写物が細胞質（ここで転写物はその標的を見いだす
ことができる）に輸送されるのを可能とした（図７
Ａ）。そして、リボザイムによる標的分子の発現の有意
な抑制が観察された（図４および６Ｃ）。以前の研究
（Bertrandら，1997)において、成熟ｔＲＮＡMetの最後
の10塩基の欠失は３’末端プロセシングをブロックした
だけでなく、転写物の細胞質への輸送を阻害した（Tobi
anら，1985)。これらの結果は、３’末端プロセシング
が細胞質への輸送と結びついている可能性があること、
および３’末端が変更された転写物は効率的に輸送され
ないことを示唆した（CottenおよびBirnstiel, 1989; B
oelensら，1995)。しかし、図７に示されるように、成
熟ｔＲＮＡValの最後の７塩基の欠失は、転写物の核か
らの輸送を抑制しなかった。
【００４４】ｔＲＮＡを核から細胞質へ輸送するExport
in(tRNA)と称するタンパク質が最近同定された(Arts
ら，1998)。Exportin(tRNA)はｔＲＮＡの不在下でRanGT
Pと結合する。しかし、これはRanGTPの不在下ではｔＲ
ＮＡと結合しない。したがって、下記のｔＲＮＡ輸送モ
デルが提案された。すなわち、まず核内でExportin(tRN
A)がRanGTPと会合し、次にこの複合体が成熟したｔＲＮ
Ａに結合するというものである。この最終的な複合体
は、核膜孔複合体をへて細胞質に運ばれる。そこでRan
結合GTPは加水分解されてｔＲＮＡを細胞質中に放出
し、Exportin(tRNA)を核にもどしてリサイクルさせる(A
rtsら，1998)。Exportin(tRNA)によって認識されうるｔ
ＲＮＡ中の最小配列または構造はいまだに分かっていな
い。しかし、図１Ａ〜１Ｃに示すリボザイムは細胞質に
うまく輸送されたので、天然のｔＲＮＡの３’末端にお
ける欠失および変更にもかかわらず、これらリボザイム
がExportin(tRNA)によって認識され、輸送されたという
ことが考えられる。
in(tRNA)と称するタンパク質が最近同定された(Arts
ら，1998)。Exportin(tRNA)はｔＲＮＡの不在下でRanGT
Pと結合する。しかし、これはRanGTPの不在下ではｔＲ
ＮＡと結合しない。したがって、下記のｔＲＮＡ輸送モ
デルが提案された。すなわち、まず核内でExportin(tRN
A)がRanGTPと会合し、次にこの複合体が成熟したｔＲＮ
Ａに結合するというものである。この最終的な複合体
は、核膜孔複合体をへて細胞質に運ばれる。そこでRan
結合GTPは加水分解されてｔＲＮＡを細胞質中に放出
し、Exportin(tRNA)を核にもどしてリサイクルさせる(A
rtsら，1998)。Exportin(tRNA)によって認識されうるｔ
ＲＮＡ中の最小配列または構造はいまだに分かっていな
い。しかし、図１Ａ〜１Ｃに示すリボザイムは細胞質に
うまく輸送されたので、天然のｔＲＮＡの３’末端にお
ける欠失および変更にもかかわらず、これらリボザイム
がExportin(tRNA)によって認識され、輸送されたという
ことが考えられる。
【００４５】我々の研究から、３’末端変更ｔＲＮＡ転
写物はその二次構造が図１Ａ〜１Ｃに示すものと類似し
ているならば、細胞質へ効率的に輸送されうることが明
らかである。別の種類のリボザイム（図１ＤのＲｚ４
（配列番号５））をHeLa細胞で発現させようと同様の実
験を行なった際、転写物は核内に残った（図７Ｃ）。転
写物Ｒｚ１〜Ｒｚ４においてはＡおよびＢボックスプロ
モーターエレメント（図１の影をつけてある部分）のみ
ならず、ｔＲＮＡValセグメント内の残りのすべての配
列が同一であるという事実にもかかわらず、Ｒｚ４（図
１Ｄ）の二次構造は細胞質リボザイムＲｚ１、Ｒｚ２お
よびＲｚ３のそれと全く異なっている。この観察は、も
しExportin(tRNA)が実際にリボザイム転写物を認識でき
るのであれば、Exportin(tRNA)は特定のヌクレオチド配
列を認識するのではなさそうだ、ということを示唆す
る。Exportin(tRNA)はむしろｔＲＮＡの何らかの特異的
高次構造、またはそのような高次構造内の何らかの配列
を認識するのかもしれない。
写物はその二次構造が図１Ａ〜１Ｃに示すものと類似し
ているならば、細胞質へ効率的に輸送されうることが明
らかである。別の種類のリボザイム（図１ＤのＲｚ４
（配列番号５））をHeLa細胞で発現させようと同様の実
験を行なった際、転写物は核内に残った（図７Ｃ）。転
写物Ｒｚ１〜Ｒｚ４においてはＡおよびＢボックスプロ
モーターエレメント（図１の影をつけてある部分）のみ
ならず、ｔＲＮＡValセグメント内の残りのすべての配
列が同一であるという事実にもかかわらず、Ｒｚ４（図
１Ｄ）の二次構造は細胞質リボザイムＲｚ１、Ｒｚ２お
よびＲｚ３のそれと全く異なっている。この観察は、も
しExportin(tRNA)が実際にリボザイム転写物を認識でき
るのであれば、Exportin(tRNA)は特定のヌクレオチド配
列を認識するのではなさそうだ、ということを示唆す
る。Exportin(tRNA)はむしろｔＲＮＡの何らかの特異的
高次構造、またはそのような高次構造内の何らかの配列
を認識するのかもしれない。
【００４６】実際、別の目的のために構築した、二次構
造がＲｚ４のそれと類似している別のリボザイムは核内
にのみ見いだされた（データは示していない）。我々は
別の３種類の遺伝子を抑制するために、10種類以上の別
のリボザイムを構築した。構築にあたっては、それらが
細胞質へ輸送されるように、二次構造を図１のＲｚ１か
らＲｚ３の二次構造に似たものにしようと留意し、リン
カー配列を調節した。これらのリボザイムのすべては、
転写後、細胞質中に見いだされた。これらは高い活性
（＞95%抑制）のみならず、高い特異性（不活性対照に
よる抑制は＜5%）をも有していた。したがって、図１Ａ
〜１Ｃに示す設計に基づく細胞質リボザイムは非常に魅
力的に思われる(Kawasakiら，1996, 1998）。核内に残
留し、活性がそれほど高くなかった RossiのｔＲＮＡ
Met-リボザイム(Bertrandら，1997)は、リンカー配列が
異なっているため、我々の活性な二次構造とは類似して
いないということも述べておくべきであろう。それらの
構造はＲｚ４のそれに類似している（コンピュータによ
って予測された構造はここには示していない）。
造がＲｚ４のそれと類似している別のリボザイムは核内
にのみ見いだされた（データは示していない）。我々は
別の３種類の遺伝子を抑制するために、10種類以上の別
のリボザイムを構築した。構築にあたっては、それらが
細胞質へ輸送されるように、二次構造を図１のＲｚ１か
らＲｚ３の二次構造に似たものにしようと留意し、リン
カー配列を調節した。これらのリボザイムのすべては、
転写後、細胞質中に見いだされた。これらは高い活性
（＞95%抑制）のみならず、高い特異性（不活性対照に
よる抑制は＜5%）をも有していた。したがって、図１Ａ
〜１Ｃに示す設計に基づく細胞質リボザイムは非常に魅
力的に思われる(Kawasakiら，1996, 1998）。核内に残
留し、活性がそれほど高くなかった RossiのｔＲＮＡ
Met-リボザイム(Bertrandら，1997)は、リンカー配列が
異なっているため、我々の活性な二次構造とは類似して
いないということも述べておくべきであろう。それらの
構造はＲｚ４のそれに類似している（コンピュータによ
って予測された構造はここには示していない）。
【００４７】Ｒｚ４または RossiのｔＲＮＡMet-リボザ
イムのようなものではなくＲｚ１からＲｚ３のようなリ
ボザイムがRanGTPの存在下で（すなわち、輸送受容体と
その貨物の間で複合体の形成が予想されるような条件下
で）、Exportin(tRNA)と複合体を形成するかどうかを決
定することは興味深いであろう（Artsら，1998)。
イムのようなものではなくＲｚ１からＲｚ３のようなリ
ボザイムがRanGTPの存在下で（すなわち、輸送受容体と
その貨物の間で複合体の形成が予想されるような条件下
で）、Exportin(tRNA)と複合体を形成するかどうかを決
定することは興味深いであろう（Artsら，1998)。
【００４８】in vivoにおけるｔＲＮＡ Val-リボザイム
の活性 SullengerおよびCech (1993) ならびにRossiのグループ
(Bertrandら，1997)は、リボザイムのその標的の細胞内
共局在の重要性を明確に示した。１つの特定の発現カセ
ットの場合、リボザイムとその標的ＲＮＡの両方が核内
に見いだされ、そしてリボザイムによる標的の特異的切
断が検出された(Bertrandら，1994)。したがって、決定
的なパラメーターはリボザイム自体の局在ではなく、む
しろ標的と共局在するリボザイムの能力である(Bertran
dら，1997)。ｍＲＮＡの細胞内プロセシングおよび輸送
には種々のタンパク質性因子が関与しているので、そし
てそのような因子は転写直後にｍＲＮＡと迅速に結合し
うるので、このような因子は核内におけるリボザイムの
標的ＲＮＡとの結合を阻害しうるであろう。また細胞質
中においても、ポリソームがリボザイムの標的ＲＮＡと
の結合を阻害するかもしれない。さらに、核ｔＲＮＡ
Met-リボザイムは、もとは核内で産生された細胞質ｍＲ
ＮＡを不活性化しなかったので(Bertrandら，1997)、核
から細胞質へのｍＲＮＡの輸送は核ｔＲＮＡMet-リボザ
イムによる攻撃よりもはるかに迅速であるように思われ
る。in vivoにおけるリボザイムの活性を決定する最も
重要な因子の１つは、リボザイムとその標的との会合で
あると思われる。リボザイムの相当多くの部分が輸送中
および標的部位への接近中に分解されるに違いない。こ
のため、リボザイムとその標的が共局在していても、そ
れだけではリボザイムのinvivoにおける効果を保証しな
い。
の活性 SullengerおよびCech (1993) ならびにRossiのグループ
(Bertrandら，1997)は、リボザイムのその標的の細胞内
共局在の重要性を明確に示した。１つの特定の発現カセ
ットの場合、リボザイムとその標的ＲＮＡの両方が核内
に見いだされ、そしてリボザイムによる標的の特異的切
断が検出された(Bertrandら，1994)。したがって、決定
的なパラメーターはリボザイム自体の局在ではなく、む
しろ標的と共局在するリボザイムの能力である(Bertran
dら，1997)。ｍＲＮＡの細胞内プロセシングおよび輸送
には種々のタンパク質性因子が関与しているので、そし
てそのような因子は転写直後にｍＲＮＡと迅速に結合し
うるので、このような因子は核内におけるリボザイムの
標的ＲＮＡとの結合を阻害しうるであろう。また細胞質
中においても、ポリソームがリボザイムの標的ＲＮＡと
の結合を阻害するかもしれない。さらに、核ｔＲＮＡ
Met-リボザイムは、もとは核内で産生された細胞質ｍＲ
ＮＡを不活性化しなかったので(Bertrandら，1997)、核
から細胞質へのｍＲＮＡの輸送は核ｔＲＮＡMet-リボザ
イムによる攻撃よりもはるかに迅速であるように思われ
る。in vivoにおけるリボザイムの活性を決定する最も
重要な因子の１つは、リボザイムとその標的との会合で
あると思われる。リボザイムの相当多くの部分が輸送中
および標的部位への接近中に分解されるに違いない。こ
のため、リボザイムとその標的が共局在していても、そ
れだけではリボザイムのinvivoにおける効果を保証しな
い。
【００４９】in vivoにおいて最も安定であったリボザ
イムＲｚ２（図３Ｂ、３Ｃ、６Ａおよび６Ｂ）は、in v
itroにおいてより高い切断活性を示したＲｚ３（図２）
よりも細胞内環境においてより効果的であった（図
４）。活性におけるこの差はHIV-1チャレンジにおいて
拡大された（図６Ｃ）。より安定なＲｚ２を産生する細
胞はHIV-1の感染に対してほぼ完全に耐性であったが、
安定性のより低いＲｚ３を産生する他の細胞はHIV-1の
感染に対して対照細胞と同程度に感受性であった。Ｒｚ
２の半減期はＲｚ３のそれの約２倍であったが、どの構
造的特徴がＲｚ２をRNaseに対してより耐性にしている
のか、現在のところ不明である。Ｒｚ２に較べて、Ｒｚ
３のリンカー内には６個多いヌクレオチドが含まれてい
た。このことが高次構造に影響を及ぼしたに相違ない。
イムＲｚ２（図３Ｂ、３Ｃ、６Ａおよび６Ｂ）は、in v
itroにおいてより高い切断活性を示したＲｚ３（図２）
よりも細胞内環境においてより効果的であった（図
４）。活性におけるこの差はHIV-1チャレンジにおいて
拡大された（図６Ｃ）。より安定なＲｚ２を産生する細
胞はHIV-1の感染に対してほぼ完全に耐性であったが、
安定性のより低いＲｚ３を産生する他の細胞はHIV-1の
感染に対して対照細胞と同程度に感受性であった。Ｒｚ
２の半減期はＲｚ３のそれの約２倍であったが、どの構
造的特徴がＲｚ２をRNaseに対してより耐性にしている
のか、現在のところ不明である。Ｒｚ２に較べて、Ｒｚ
３のリンカー内には６個多いヌクレオチドが含まれてい
た。このことが高次構造に影響を及ぼしたに相違ない。
【００５０】天然のｔＲＮＡ分子の半減期は50〜60時間
であるが(SmithおよびWeinberg, 1981)、Ｒｚ２の半減
期は約100分に過ぎなかった。ｔＲＮＡ-リボザイムの半
減期を伸ばすことができるならば、より高い抑制効果が
期待できるであろう。我々は転写物のin vivoにおける
相対的安定性をいまだに予測できないのであるが、図１
に示すような二次構造を組み込むことによって細胞質に
輸送されうるリボザイムを設計することは可能である。
転写物の安定性を正確に予測することができないので、
我々は通常数個の構築体を試験する。そして、今日まで
に試験した種々の遺伝子の場合、我々は興味のある遺伝
子の発現を＞95% の効率で不活性化できるカセットを常
に得ることができた(Kawasakiら，1996, 1998）。
であるが(SmithおよびWeinberg, 1981)、Ｒｚ２の半減
期は約100分に過ぎなかった。ｔＲＮＡ-リボザイムの半
減期を伸ばすことができるならば、より高い抑制効果が
期待できるであろう。我々は転写物のin vivoにおける
相対的安定性をいまだに予測できないのであるが、図１
に示すような二次構造を組み込むことによって細胞質に
輸送されうるリボザイムを設計することは可能である。
転写物の安定性を正確に予測することができないので、
我々は通常数個の構築体を試験する。そして、今日まで
に試験した種々の遺伝子の場合、我々は興味のある遺伝
子の発現を＞95% の効率で不活性化できるカセットを常
に得ることができた(Kawasakiら，1996, 1998）。
【００５１】ｔＲＮＡVal-ベクターは、標的分子が細胞
質中に局在するリボザイム以外の機能性ＲＮＡの発現に
有用でありうる。我々の掌中で、ｔＲＮＡVal-リボザイ
ムは少なくとも培養細胞中では一貫して高い活性を有す
る。したがって適切に設計されたｔＲＮＡVal-リボザイ
ムは、分子生物学における道具として、また医学分野に
おいても役に立つ道具として有用である。
質中に局在するリボザイム以外の機能性ＲＮＡの発現に
有用でありうる。我々の掌中で、ｔＲＮＡVal-リボザイ
ムは少なくとも培養細胞中では一貫して高い活性を有す
る。したがって適切に設計されたｔＲＮＡVal-リボザイ
ムは、分子生物学における道具として、また医学分野に
おいても役に立つ道具として有用である。
【００５２】
【発明の効果】本発明により、新規なリボザイムおよび
その発現系が提供された。本発明のリボザイムはin viv
o で安定性が高く、それにより高い活性を呈する。
その発現系が提供された。本発明のリボザイムはin viv
o で安定性が高く、それにより高い活性を呈する。
【００５３】（参考文献） Adachi, A., Gendelman, H. E., Koenig, S., Folks,
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ｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｇｉ
ｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔＲＮＡ Ｍｅｔ ｂｙ
ｐｏｉｎｔｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ． Ｃｅｌｌ， ４
３， ４１５−４２２． Ｔｕｒｎｅｒ， Ｐ． Ｃ．（ｅｄ．） （１９９７）
Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ； Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，
Ｖｏｌ．７４， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ．
ｅｒｓ， Ｆ． Ｄ．， Ｍａｌｍｓｔｒｏｍ， Ａ．
Ｔ．， Ｇａｎｏｕｓｉｓ， Ｌ． Ｍ．，Ｃｈｏｗ
ｒｉｒａ， Ｍ． Ｂ．， Ｃｏｕｔｕｒｅ， Ｌ．
ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ， Ｔ． Ｄ．（１９９
５） Ｉｍｐｒｏｖｅｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａ
ｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｔＲＮＡ−ｂａｓ
ｅｄＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩＩ ｐｒｏｍ
ｏｔｅｒ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
２３， ２２５９−２２６８． Ｔｏｂｉａｎ， Ｊ． Ａ．， Ｄｒｉｎｋａｒｄ，
Ｌ． ａｎｄ Ｚａｓｅｌｏｆｆ， Ｍ．（１９８５）
ｔＲＮＡ ｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｐｏｒｔ： ｄ
ｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｇｉ
ｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔＲＮＡ Ｍｅｔ ｂｙ
ｐｏｉｎｔｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ． Ｃｅｌｌ， ４
３， ４１５−４２２． Ｔｕｒｎｅｒ， Ｐ． Ｃ．（ｅｄ．） （１９９７）
Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ； Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，
Ｖｏｌ．７４， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ．
【００７１】Uhlenbeck, O. C.(1987)A small catalyti
c oligoribonucletide. Nature, 328,596-600. Yamada, O., Kraus, G.Leavitt, M. C., Yu, M. and Wo
ng-Staal, F (1994)Activity and cleavage site speci
ficity of an anti-HIV-1 hairpinribozyme in human T
cells. Vilology, 205, 121-126. Yamada, O., Yu, M., Yee, J.-K., Kraus, G., Looney,
D. and Wong-Staal, F.(1994) Intracellular immuniz
ation of human T cells with a hairpinribozyme agai
nst human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther
apy,1, 38-45.
c oligoribonucletide. Nature, 328,596-600. Yamada, O., Kraus, G.Leavitt, M. C., Yu, M. and Wo
ng-Staal, F (1994)Activity and cleavage site speci
ficity of an anti-HIV-1 hairpinribozyme in human T
cells. Vilology, 205, 121-126. Yamada, O., Yu, M., Yee, J.-K., Kraus, G., Looney,
D. and Wong-Staal, F.(1994) Intracellular immuniz
ation of human T cells with a hairpinribozyme agai
nst human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther
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【００７２】Ｙａｔｅｓ， Ｊ．， Ｗａｒｒｅｎ，
Ｎ．， Ｒｅｉｓｍａｎ， Ｄ． ａｎｄ Ｓｕｇｄｅ
ｎ， Ｂ． （１９８４） Ａ ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ
ｅｌｅｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｅｐｓｔｅｉｎ−
Ｂａｒｒ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｔｈａｔ ｐｅ
ｒｍｉｔｓ ｓｔａｂｌｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｉｎ
ｌａｔｅｎｔｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ．
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ， ８１， ３８０６−３８１０． Ｙｕ， Ｍ．， Ｏｊｗａｎｇ， Ｊ． Ｏ．， Ｙａ
ｍａｄａ， Ｏ．， Ｈｍａｐｅｌ， Ａ．， Ｒａｐ
ｐａｐｏｒｔ， Ｊ．， Ｌｏｏｎｅｙ， Ｄ．ａｎｄ
Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ， Ｆ．（１９９３） Ａ ｈ
ａｉｒｐｉｎ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆｄｉｖｅｒｓｅ ｓｔｒａ
ｉｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉ
ｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １． Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０，
６３４０−６３４４．
Ｎ．， Ｒｅｉｓｍａｎ， Ｄ． ａｎｄ Ｓｕｇｄｅ
ｎ， Ｂ． （１９８４） Ａ ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ
ｅｌｅｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｅｐｓｔｅｉｎ−
Ｂａｒｒ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｔｈａｔ ｐｅ
ｒｍｉｔｓ ｓｔａｂｌｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｉｎ
ｌａｔｅｎｔｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ．
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ， ８１， ３８０６−３８１０． Ｙｕ， Ｍ．， Ｏｊｗａｎｇ， Ｊ． Ｏ．， Ｙａ
ｍａｄａ， Ｏ．， Ｈｍａｐｅｌ， Ａ．， Ｒａｐ
ｐａｐｏｒｔ， Ｊ．， Ｌｏｏｎｅｙ， Ｄ．ａｎｄ
Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ， Ｆ．（１９９３） Ａ ｈ
ａｉｒｐｉｎ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆｄｉｖｅｒｓｅ ｓｔｒａ
ｉｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉ
ｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １． Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０，
６３４０−６３４４．
【００７３】Ｚｈａｏ， Ｊ．Ｊ． ａｎｄ Ｐｉｃ
ｋ， Ｋ，（１９９３） Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｌｏ
ｓｓ−ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ
ｏｆｔｈｅ ｆｕｓｈｉｔａｒａｚｕ ｇｅｎｅ ｗ
ｉｔｈ ａ ｔａｒｇａｔｅｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｉ
ｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ． Ｎａｔｕｒｅ，３６５，
４４８−４５１． Ｚｈｏｕ， Ｄ．−Ｍ．， Ｚｈａｎｇ， Ｌ．−
Ｈ．， Ｋｕｍａｒ， Ｐ． Ｋ． Ｒ． ａｎｄ Ｔ
ａｉｒａ， Ｋ． （１９９６） Ｔｈｅｒｉｂｏｚｙ
ｍｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ： Ｅ
ｖｉｄｅｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉｒｅｓｔ ｃｏ
ｏｒｄｉｎａｔｉｏｎｏｆ ａ Ｍｇ２＋ ｉｏｎ ｗ
ｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏ−Ｒｏｘｙｇｅｎ ｏｆ ｔｈ
ｅ ｓｃｉｓｓｉｌｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎ ｔ
ｈｅｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ ａ ｈ
ａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅ−ｃａｔａｌｙ
ｚｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ａｍ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．， １１８， ８９６９−８９７０．
ｋ， Ｋ，（１９９３） Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｌｏ
ｓｓ−ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ
ｏｆｔｈｅ ｆｕｓｈｉｔａｒａｚｕ ｇｅｎｅ ｗ
ｉｔｈ ａ ｔａｒｇａｔｅｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｉ
ｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ． Ｎａｔｕｒｅ，３６５，
４４８−４５１． Ｚｈｏｕ， Ｄ．−Ｍ．， Ｚｈａｎｇ， Ｌ．−
Ｈ．， Ｋｕｍａｒ， Ｐ． Ｋ． Ｒ． ａｎｄ Ｔ
ａｉｒａ， Ｋ． （１９９６） Ｔｈｅｒｉｂｏｚｙ
ｍｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ： Ｅ
ｖｉｄｅｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉｒｅｓｔ ｃｏ
ｏｒｄｉｎａｔｉｏｎｏｆ ａ Ｍｇ２＋ ｉｏｎ ｗ
ｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏ−Ｒｏｘｙｇｅｎ ｏｆ ｔｈ
ｅ ｓｃｉｓｓｉｌｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎ ｔ
ｈｅｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ ａ ｈ
ａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅ−ｃａｔａｌｙ
ｚｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ａｍ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．， １１８， ８９６９−８９７０．
【００７４】Zhou, D.-M., Zhang, L.-H. and Taira,
K.(1997) Explanation by the double-metal-ion mecha
nism of catalysis for the differential metal ionef
fects on the cleavage rates of 5'-oxy and 5'-thio
substrates by ahammerhead ribozyme. Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 94, 14343-14348. Zhou, D.-M. and Taira, K.(1998) The hydrolysis of
RNA: from theoreticalcalculations to the hammerhea
d ribozyme-mediated cleavage of RNA.Chem. Rev, 98m
991-1026.
K.(1997) Explanation by the double-metal-ion mecha
nism of catalysis for the differential metal ionef
fects on the cleavage rates of 5'-oxy and 5'-thio
substrates by ahammerhead ribozyme. Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 94, 14343-14348. Zhou, D.-M. and Taira, K.(1998) The hydrolysis of
RNA: from theoreticalcalculations to the hammerhea
d ribozyme-mediated cleavage of RNA.Chem. Rev, 98m
991-1026.
【００７５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director-General of Agency of Industrial Science and Technology <120> Expression Systems for Transcription of Functional Nucleic Acids <130> 117F0059 <140> <141> <160> 23 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 136 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the nucleotide sequence of Rz2 <400> 1 accguugguu uccguagugu agugguuauc acguucgccu aacacgcgaa agguccccgg 60 uucgaaaccg ggcacuacaa acacaacacu gaugaggacc gaaagguccg aaacgggcac 120 gucggaaacg guuuuu 136 <210> 2 <211> 142 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the nucleotide sequence of Rz3 <400> 2 accguugguu uccguagugu agugguuauc acguucgccu aacacgcgaa agguccccgg 60 uucgaaaccg ggcacuacaa accaacacac aacacugaug aggaccgaaa gguccgaaac 120 gggcacgucg gaaacgguuu uu 142 <210> 3 <211> 128 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the nucleotide sequence of Rz1 <400> 3 accguugguu uccguagugu agugguuauc acguucgccu aacacgcgaa agguccccgg 60 uucgaaaccg ggcacccaca caacacugau gaguccguga ggacgaaacg ggcaccucga 120 gcgcuuuu 128 <210> 4 <211> 95 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the nucleotide sequence of the transcript of human placental tRNAVal <400> 4 accguugguu uccguagugu agugguuauc acguucgccu aacacgcgaa agguccccgg 60 uucgaaaccg ggcggaaaca aagacagucg cuuuu 95 <210> 5 <211> 149 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the nucleotide sequence of Rz4 <400> 5 accguugguu uccguagugu agugguuauc acguucgccu aacacgcgaa aggucccccg 60 uucgaaaccg ggcacccggg uggcugucac cggaagugcu uuccggucuc augaguccgu 120 gagggcgaaa cagccacucg agcgcuuuu 149 <210> 6 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of a sence oligonucleotide linker <400> 6 aattcaggac tagtctttta ggtcaaaaag aagaagcttt gtaaccgttg gtttccgtag 60 tgtagtggtt atcacgttcg cctaacacgc gaaaggtccc cggttcgaag 110 <210> 7 <211> 113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of an antisense oligonucleotide linker <400> 7 tcgacttcga accggggacc tttcgcgtgt taggcgaacg tgataaccac tacactacgg 60 aaaccaacgg ttacaaagct tcttcttctt tttgacctaa aagactagtc ctg 113 <210> 8 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of a sense oligonucleotide linker <400> 8 cgaaaccggg cacccgggga atataacctc gagcgctttt tttctatcgc gtc 53 <210> 9 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of an antisense oligonuclotide linker <400> 9 tcgacgcgat agaaaaaaag cgctcgaggt tatattcccc gggtgcccgg tttc 54 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of an upper primer <400> 10 cgccagggtt tcccagtcac gac 23 <210> 11 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of a lower primer including the sequences of Rz1 and a terminator <400> 11 ctgcaggtcg acgcgataga aaaaaagcgc tcgaggtgcc cgtttcgtcc tcacggactc 60 atcagtgttg tgtgggtgcc cggtttcgaa ccgggacctt t 101 <210> 12 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of a lower primer including the sequences of Rz2 and a terminator <400> 12 ctgcaggtcg acgcgataga aaaaaaccgt ttccgacgtg cccgtttcgg tcctttcggt 60 cctcatcagt gttgtgtttg tagtgcccgg tttcgaaccg gggaccttt 109 <210> 13 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of a lower primer including the sequences of Rz3 and a terminator <400> 13 ctgcaggtcg acgcgataga aaaaaaccgt ttccgacgtg cccgtttcgg tcctcatcag 60 tgttgtgtgt tggtttgtag tgcccggttt cgaaccgggg accttt 106 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of a probe specific for the reference RNA <400> 14 aaatcgctat aaaaagcgct cgaggttatg ctccccgggt 40 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of a probe specific for the ribozyme <400> 15 ctcatctgtg ttgtgt 16 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of a primer for b-actin <400> 16 gtggccatct cttgctcgaa 20 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of a primer for the ribozyme <400> 17 gacctttcgg tcctcatc 18 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of an upper oilgonucleotide primer <400> 18 gactacctca tgaagatcct 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of a lower oligonucleotide primer <400> 19 gtggccatct cttgctcgaa 20 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of an upper oligonucleotide primer <400> 20 gttatcacgt tcgcctaa 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of a lower oligonucleotide primer <400> 21 gacctttcgg tcctcatc 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of a probe specific for the ribozyme <400> 22 acgcgaaagg tccccggt 18 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: the sequence of a probe specific for b-actin <400> 23 gcgggaaaat cgtgcgtga 19
【００７６】
【００７７】
【配列番号１】配列番号１の配列はＲｚ２の塩基配列で
ある。
ある。
【００７８】
【配列番号２】配列番号２の配列はＲｚ３の塩基配列で
ある。
ある。
【００７９】
【配列番号３】配列番号３の配列はＲｚ１の塩基配列で
ある。
ある。
【００８０】
【配列番号４】配列番号４の配列はヒト胎盤ｔＲＮＡ
Val の転写物の塩基配列である。
Val の転写物の塩基配列である。
【００８１】
【配列番号５】配列番号５の配列はＲｚ４の塩基配列で
ある。
ある。
【００８２】
【配列番号６】配列番号６の配列はセンスオリゴヌクレ
オチドリンカーの塩基配列である。
オチドリンカーの塩基配列である。
【００８３】
【配列番号７】配列番号７の配列はアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドリンカーの塩基配列である。
ヌクレオチドリンカーの塩基配列である。
【００８４】
【配列番号８】配列番号８の配列はセンスオリゴヌクレ
オチドリンカーの塩基配列である。
オチドリンカーの塩基配列である。
【００８５】
【配列番号９】配列番号９の配列はアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドリンカーの塩基配列である。
ヌクレオチドリンカーの塩基配列である。
【００８６】
【配列番号１０】配列番号１０の配列はアッパープライ
マーの塩基配列である。
マーの塩基配列である。
【００８７】
【配列番号１１】配列番号１１の配列はＲｚ１とターミ
ネーターの配列を含むロアープライマーの塩基配列であ
る。
ネーターの配列を含むロアープライマーの塩基配列であ
る。
【００８８】
【配列番号１２】配列番号１２の配列はＲｚ２とターミ
ネーターの配列を含むロアープライマーの塩基配列であ
る。
ネーターの配列を含むロアープライマーの塩基配列であ
る。
【００８９】
【配列番号１３】配列番号１３の配列はＲｚ３とターミ
ネーターの配列を含むロアープライマーの塩基配列であ
る。
ネーターの配列を含むロアープライマーの塩基配列であ
る。
【００９０】
【配列番号１４】配列番号１４の配列は参照ＲＮＡに特
異的なプローブの塩基配列である。
異的なプローブの塩基配列である。
【００９１】
【配列番号１５】配列番号１５の配列はリボザイムに特
異的なプローブの塩基配列である。
異的なプローブの塩基配列である。
【００９２】
【配列番号１６】配列番号１６の配列はβ−アクチン用
のプライマーの塩基配列である。
のプライマーの塩基配列である。
【００９３】
【配列番号１７】配列番号１７の配列はリボザイム用の
プライマーの塩基配列である。
プライマーの塩基配列である。
【００９４】
【配列番号１８】配列番号１８の配列はアッパーオリゴ
ヌクレオチドプライマーの塩基配列である。
ヌクレオチドプライマーの塩基配列である。
【００９５】
【配列番号１９】配列番号１９の配列はロアーオリゴヌ
クレオチドプライマーの塩基配列である。
クレオチドプライマーの塩基配列である。
【００９６】
【配列番号２０】配列番号２０の配列はアッパーオリゴ
ヌクレオチドプライマーの塩基配列である。
ヌクレオチドプライマーの塩基配列である。
【００９７】
【配列番号２１】配列番号２１の配列はロアーオリゴヌ
クレオチドプライマーの塩基配列である。
クレオチドプライマーの塩基配列である。
【００９８】
【配列番号２２】配列番号２２の配列はリボザイムに特
異的なプローブの塩基配列である。
異的なプローブの塩基配列である。
【００９９】
【配列番号２３】配列番号２３の配列はβ−アクチンに
特異的なプローブの塩基配列である。
特異的なプローブの塩基配列である。
【図１】図１は、コンピュータフォールディングによっ
て予測されたｔＲＮＡVal-リボザイムの二次構造を示
す。ハンマーヘッド型リボザイムの配列（太い大文字）
を種々のリンカー配列を介してｔＲＮＡVal配列（大文
字）の下流に連結した。７塩基欠失ｔＲＮＡValの内部
プロモーターに対応する配列、すなわちＡおよびＢボッ
クスは影を付けて囲って示してある。図Ａ〜Ｄは、それ
ぞれｔＲＮＡVal-リボザイム１（Ｒｚ１）、２（Ｒｚ
２）、３（Ｒｚ３）および４（Ｒｚ４）の二次構造を示
す。リボザイムの認識アームを下線をつけて示す。図Ｅ
はヒト胎盤ｔＲＮＡValの転写物の二次構造を示す。ｔ
ＲＮＡは３つの部位（矢じりのマーク）でプロセシング
され、成熟ｔＲＮＡVal（大文字）を生じる。
て予測されたｔＲＮＡVal-リボザイムの二次構造を示
す。ハンマーヘッド型リボザイムの配列（太い大文字）
を種々のリンカー配列を介してｔＲＮＡVal配列（大文
字）の下流に連結した。７塩基欠失ｔＲＮＡValの内部
プロモーターに対応する配列、すなわちＡおよびＢボッ
クスは影を付けて囲って示してある。図Ａ〜Ｄは、それ
ぞれｔＲＮＡVal-リボザイム１（Ｒｚ１）、２（Ｒｚ
２）、３（Ｒｚ３）および４（Ｒｚ４）の二次構造を示
す。リボザイムの認識アームを下線をつけて示す。図Ｅ
はヒト胎盤ｔＲＮＡValの転写物の二次構造を示す。ｔ
ＲＮＡは３つの部位（矢じりのマーク）でプロセシング
され、成熟ｔＲＮＡVal（大文字）を生じる。
【図２】図２は、in vitroにおけるｔＲＮＡVal-リボザ
イムによって媒介される切断を示す。パネルＡは基質Ｒ
ＮＡを図式的に表す。（基質ＲＮＡはpNL432のヌクレオ
チド第500〜711、すなわちHIV-1 ＲＮＡのU5領域に対応
する。）この基質ＲＮＡはｔＲＮＡVal-リボザイムによ
って２個の断片に切断された（5'切断産物: 70量体; 3'
切断産物: 156量体）。パネルＢは切断反応の結果を示
すオートラジオグラムである。レーン：M - マーカー;
ベクター - リボザイムをもたないｔＲＮＡValベクター
単独; Ｒｚ１ - リボザイム１；Ｒｚ２ - リボザイム
２；およびＲｚ３ - リボザイム３。
イムによって媒介される切断を示す。パネルＡは基質Ｒ
ＮＡを図式的に表す。（基質ＲＮＡはpNL432のヌクレオ
チド第500〜711、すなわちHIV-1 ＲＮＡのU5領域に対応
する。）この基質ＲＮＡはｔＲＮＡVal-リボザイムによ
って２個の断片に切断された（5'切断産物: 70量体; 3'
切断産物: 156量体）。パネルＢは切断反応の結果を示
すオートラジオグラムである。レーン：M - マーカー;
ベクター - リボザイムをもたないｔＲＮＡValベクター
単独; Ｒｚ１ - リボザイム１；Ｒｚ２ - リボザイム
２；およびＲｚ３ - リボザイム３。
【図３】図３は、in vivoにおけるｔＲＮＡVal-リボザ
イムの安定性を示す。パネルＡは、参照遺伝子の使用に
よりトランスフェクション効率の標準化を可能としたpU
C-Rrを図式的に表す。参照遺伝子はリボザイム発現カセ
ットの下流で発現された。２つの発現カセットにおい
て、プロモーターおよびターミネーターの配列はそれぞ
れ同一であった。パネルＢはｔＲＮＡVal-リボザイムの
発現の定常レベルを示す。図はリボザイムに特異的なプ
ローブ（上）および参照遺伝子に特異的なプローブ
（下）を用いたノーザンブロット分析を示す。図Ｃは、
安定にリボザイムを導入した細胞におけるｔＲＮＡVal-
リボザイムの半減期を示す。図中、○はｔＲＮＡVal-リ
ボザイム１（Ｒｚ１）の相対量を示す。□および◇は、
それぞれｔＲＮＡVal-リボザイム２（Ｒｚ２）および３
（Ｒｚ３）の相対量を示す。横棒は３回のアッセイによ
る結果のS.E.を示す。
イムの安定性を示す。パネルＡは、参照遺伝子の使用に
よりトランスフェクション効率の標準化を可能としたpU
C-Rrを図式的に表す。参照遺伝子はリボザイム発現カセ
ットの下流で発現された。２つの発現カセットにおい
て、プロモーターおよびターミネーターの配列はそれぞ
れ同一であった。パネルＢはｔＲＮＡVal-リボザイムの
発現の定常レベルを示す。図はリボザイムに特異的なプ
ローブ（上）および参照遺伝子に特異的なプローブ
（下）を用いたノーザンブロット分析を示す。図Ｃは、
安定にリボザイムを導入した細胞におけるｔＲＮＡVal-
リボザイムの半減期を示す。図中、○はｔＲＮＡVal-リ
ボザイム１（Ｒｚ１）の相対量を示す。□および◇は、
それぞれｔＲＮＡVal-リボザイム２（Ｒｚ２）および３
（Ｒｚ３）の相対量を示す。横棒は３回のアッセイによ
る結果のS.E.を示す。
【図４】図４は、HeLa細胞におけるU5 LTR-ルシフェラ
ーゼ融合遺伝子の産生抑制。パネルＡ。HeLa細胞におけ
る一過性発現。標的発現プラスミドおよびリボザイムを
コードするpUCdt-Rzの両方を用いてHeLa細胞を同時トラ
ンスフェクションした。パネルＢ。安定にリボザイムを
導入した細胞における一過性発現。各構築物につき、挿
入遺伝子（ｔＲＮＡValまたはｔＲＮＡVal-リボザイ
ム）の転写物のレベルが類似している２つの独立したク
ローンを選択した。リボザイム産生HeLa細胞のトランス
フェクションには、標的発現プラスミドのみを用いた。
横棒は５回のアッセイによる結果のS.E.を示す。
ーゼ融合遺伝子の産生抑制。パネルＡ。HeLa細胞におけ
る一過性発現。標的発現プラスミドおよびリボザイムを
コードするpUCdt-Rzの両方を用いてHeLa細胞を同時トラ
ンスフェクションした。パネルＢ。安定にリボザイムを
導入した細胞における一過性発現。各構築物につき、挿
入遺伝子（ｔＲＮＡValまたはｔＲＮＡVal-リボザイ
ム）の転写物のレベルが類似している２つの独立したク
ローンを選択した。リボザイム産生HeLa細胞のトランス
フェクションには、標的発現プラスミドのみを用いた。
横棒は５回のアッセイによる結果のS.E.を示す。
【図５】図５は、HIV ベクターの図式的表示である。各
ｔＲＮＡVal-リボザイムのための発現カセットを、HIV-
1由来ベクター（Ａ）のTK-neorのすぐ上流に位置するSa
lI部位に挿入し、ｔＲＮＡVal-リボザイムをコードする
レトロウイルスベクターHIVRibo.N （Ｂ）を得た。Ψは
パッケージングシグナルを示す。
ｔＲＮＡVal-リボザイムのための発現カセットを、HIV-
1由来ベクター（Ａ）のTK-neorのすぐ上流に位置するSa
lI部位に挿入し、ｔＲＮＡVal-リボザイムをコードする
レトロウイルスベクターHIVRibo.N （Ｂ）を得た。Ψは
パッケージングシグナルを示す。
【図６】図６は、安定にリボザイムを導入したＨ９細胞
(CD4+ T細胞）におけるｔＲＮＡVal-リボザイム発現の
定量化、および上記導入細胞におけるp24 産生の抑制を
示す。パネルＡ。リボザイム導入Ｈ９細胞の２個の独立
したクローン由来のRT-PCR増幅リボザイムのサザンブロ
ット分析の結果（図Ｂに示す）の定量化。13、15および
17サイクル後のＰＣＲ産物を、32P標識オリゴヌクレオ
チドプローブを用いてサザンブロッティングにより分析
した。図中、四角および丸はそれぞれリボザイム２（Ｒ
ｚ２）およびリボザイム３（Ｒｚ３）を導入した細胞を
用いた結果を示す。パネルＢ。サザンブロッティングの
結果。パネルＣ。HIV-1 NL432を感染させた後、細胞を1
1日間培養した。３、７および11日目に各培養物から少
量の上清を調製した。HIV-1抗原捕獲ELISA によりp24
抗原のレベルを測定した。図中、三角はｔＲＮＡVal-リ
ボザイム１（Ｒｚ１）の結果を示す。四角および丸はそ
れぞれリボザイム２（Ｒｚ２）およびリボザイム３（Ｒ
ｚ３）の結果を示す。三角は対照細胞を用いた場合の結
果を示す。
(CD4+ T細胞）におけるｔＲＮＡVal-リボザイム発現の
定量化、および上記導入細胞におけるp24 産生の抑制を
示す。パネルＡ。リボザイム導入Ｈ９細胞の２個の独立
したクローン由来のRT-PCR増幅リボザイムのサザンブロ
ット分析の結果（図Ｂに示す）の定量化。13、15および
17サイクル後のＰＣＲ産物を、32P標識オリゴヌクレオ
チドプローブを用いてサザンブロッティングにより分析
した。図中、四角および丸はそれぞれリボザイム２（Ｒ
ｚ２）およびリボザイム３（Ｒｚ３）を導入した細胞を
用いた結果を示す。パネルＢ。サザンブロッティングの
結果。パネルＣ。HIV-1 NL432を感染させた後、細胞を1
1日間培養した。３、７および11日目に各培養物から少
量の上清を調製した。HIV-1抗原捕獲ELISA によりp24
抗原のレベルを測定した。図中、三角はｔＲＮＡVal-リ
ボザイム１（Ｒｚ１）の結果を示す。四角および丸はそ
れぞれリボザイム２（Ｒｚ２）およびリボザイム３（Ｒ
ｚ３）の結果を示す。三角は対照細胞を用いた場合の結
果を示す。
【図７】図７は、ｔＲＮＡVal-リボザイムの細胞内局在
を示す。各細胞内画分由来のＲＮＡを用いてノーザンブ
ロット分析を実施した。リボザイム遺伝子を安定に導入
した細胞（図４Ｂに結果を示す実験に用いたｔＲＮＡ
Val-リボザイム産生HeLa細胞）から核ＲＮＡおよび細胞
質ＲＮＡを別々に調製した。パネルＡおよびＣは、ｔＲ
ＮＡVal-リボザイムに特異的な32P標識プローブを用い
て得た結果を示す。ＢおよびＤは対照を示す。天然のU6
遺伝子の転写物に特異的なプローブを用いて、細胞質画
分の汚染を調べた。
を示す。各細胞内画分由来のＲＮＡを用いてノーザンブ
ロット分析を実施した。リボザイム遺伝子を安定に導入
した細胞（図４Ｂに結果を示す実験に用いたｔＲＮＡ
Val-リボザイム産生HeLa細胞）から核ＲＮＡおよび細胞
質ＲＮＡを別々に調製した。パネルＡおよびＣは、ｔＲ
ＮＡVal-リボザイムに特異的な32P標識プローブを用い
て得た結果を示す。ＢおよびＤは対照を示す。天然のU6
遺伝子の転写物に特異的なプローブを用いて、細胞質画
分の汚染を調べた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎｅＳｅｑ
Claims (7)
- 【請求項１】 下記の塩基配列(I) または(II)を持つヌ
クレオチド配列を含むリボザイム。 塩基配列(I): 5'-ACCGUUGGUUUCCGUAGUGUAGUGGUUAUCACGU
UCGCCUAACACGCGAAAGGUCCCCGGUUCGAAACCGGGCACUACAAACAC
AACACUGAUGAGGACCGAAAGGUCCGAAACGGGCACGUCGGAAACGGUUU
UU-3' 塩基配列(II): 5'-ACCGUUGGUUUCCGUAGUGUAGUGGUUAUCACG
UUCGCCUAACACGCGAAAGGUCCCCGGUUCGAAACCGGGCACUACAAACC
AACACACAACACUGAUGAGGACCGAAAGGUCCGAAACGGGCACGUCGGAA
ACGGUUUUU-3' - 【請求項２】 請求項１記載のリボザイムをコードする
ＤＮＡを含む発現ベクター。 - 【請求項３】 請求項１記載のリボザイムをコードする
ＤＮＡを含む発現ベクターＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡ
に転写することを特徴とする、請求項１記載のリボザイ
ムの製造方法。 - 【請求項４】 下記の塩基配列(I)を持つヌクレオチド
配列を含むリボザイムまたは該リボザイムをコードする
ＤＮＡを含む発現ベクターを有効成分として含む医薬組
成物。 塩基配列(I): 5'-ACCGUUGGUUUCCGUAGUGUAGUGGUUAUCACGUUCGCCUAACACGCGAAAGGUCC CCGGUUCGAAACCGGGCACUACAAACACAACACUGAUGAGGACCGAAAGGUCCGAAACGGGCACGUCGGAAA CGGUUUUU-3' - 【請求項５】 後天性免疫不全症候群を予防および／ま
たは治療するための請求項４記載の医薬組成物。 - 【請求項６】 請求項１記載のリボザイムを用いて、標
的ＲＮＡを特異的に切断する方法。 - 【請求項７】 標的ＲＮＡがHIV-1 ＲＮＡである請求項
６記載の方法。
Priority Applications (7)
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| JP2000567673A JP3829176B2 (ja) | 1998-08-31 | 1999-08-31 | 機能性核酸転写用発現系 |
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| EP99940588A EP1118659B1 (en) | 1998-08-31 | 1999-08-31 | Expression systems for functional nucleic acid expression |
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| ATE459707T1 (de) * | 2003-06-30 | 2010-03-15 | Dnavec Research Inc | Negativ-strang rna-virus-vektoren, welche ein gen mit veränderten hypermutierbaren regionen tragen |
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| HUT71929A (en) * | 1992-06-29 | 1996-02-28 | Gene Shears Pty Ltd | Nucleic acids and methods of use thereof for controlling viral pathogens |
| WO1994008033A1 (en) * | 1992-10-02 | 1994-04-14 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | tRNA GENES TO STABILIZE UNSTABLE PLASMID INHERITANCE IN GROWING CELLS |
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| AU2233295A (en) * | 1994-04-13 | 1995-11-10 | Biotransplant Incorporated | Alpha(1,3) galactosyltransferase negative swine |
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- 1999-08-31 DE DE69930862T patent/DE69930862T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-31 US US09/763,590 patent/US6740750B1/en not_active Expired - Fee Related
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