ES2065919T5 - Ribozimas. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN MOLECULAS DE RNA SINTETICO QUE TIENEN ACTIVIDAD ENDORRIBONUCLEASICA ALTAMENTE ESPECIFICA (LLAMADAS AQUI RIBOZIMAS). LAS RIBOZIMAS CONTIENEN UNA REGION HIBRIDANTE COMPLEMENTARIA EN LA SECUENCIA NUCLEOTIDICA AL MENOS DE PARTE DE UN RNA DIANA, Y UNA REGION CATALITICA ADECUADA PARA DESCOMPONER EL RNA DIANA. TAMBIEN SE DESCRIBEN METODOS PARA INACTIVAR RNA Y COMPOSICIONES QUE CONTIENEN RIBOZIMAS.

Description

Ribozimas.

La presente invención se refiere a una clase de moléculas sintéticas de ARN y sus derivados, denominadas a partir de ahora ribozimas, que poseen una actividad endorribonucleásica altamente específica.

Una serie de moléculas de ARN de origen natural, tales como el viroide de la mancha del sol de aguacate (ASBV), los ARNs satélites del virus de la mancha anular del tabaco (sTobRV) y el virus de la mancha pasajera de lucerna (sLTSV), sufren una escisión autocatalizada. Esta escisión parece ser una parte esencial y única del ciclo de la vida de estos y otros ARN.

Las reacciones de escisión autocatalizadas de ARN comparten un requisito común de iones metálicos divalentes y un pH neutro o superior, dando como resultado la producción de ARN con términos que poseen grupos 5' hidroxilo y 2',3' fosfato cíclico (Prody y col., Science 231: 1577-1580 (1986) y Buzayan y col., Virology 151: 186-199 (1986)). Las reacciones de escisión son catalizadas por los propios ARNs, presuntamente como resultado de la conformación que lleva grupos reactivos a una estrecha proximidad. Los puntos de escisión autocatalizada en los ARNs de origen natural se localizan dentro de regiones altamente conservadas de la estructura secundaria del ARN (Buzayan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8859-8862 (1986) y Forster, A.C. y Symons, R.H., Cell 50: 9-16 (1987)).

Los ensayos que hemos llevado a cabo en los ARNs satélites del virus de la mancha anular del tabaco (sTobRV) han conducido al diseño de nuevas endorribonucleasas (denominadas a partir de ahora "ribozimas"), es decir, enzimas comprendidas de ARN que catalizan la escisión específica de moléculas diana de ARN.

El término ribozima, tal como se utiliza en la especificación, se refiere a moléculas comprendidas totalmente de ARN o derivadas de las mismas.

Las ribozimas de la presente invención son diferentes de la endorribonucleasa de ARN que tiene un origen natural en Tetrahymena Fhermophila (conocida como IVS, o L-19 IVS ARN) y que ha sido extensamente descrita por Thomas Cech y colaboradores (Zaug, A.J. y col., Science (1984) 224: 574-578; Zaug, A.J. y Cech, T.R., Science (1986) 324: 429-433; solicitud internacional de patente publicada Nº WO 88/04300 por University Patents Inc.). La endorribonucleasa de Cech tiene un punto activo de ocho pares de bases que se hibrida en una secuencia de ARN diana después de que haya tenido lugar el enclavamiento del ARN diana, con un requisito de guanosina o derivados de guanosina libres. Los fragmentos que surgen de la escisión contienen grupos 5' fosfato y 3' hidroxilo terminales. El limitado número de nucleótidos disponibles para hibridación en un sustrato de ARN limita la eficacia o eficiencia de la endorribonucleasa de Cech, puesto que, en general, los oligonucleótidos que comprenden menos de doce nucleótidos hibridan escasamente en las secuencias diana. Parece ser también que una serie de nucleótidos en el punto activo de la endorribonucleasa de Cech necesita ser conservada para una eficaz actividad endorribonucleásica. Esto restringe el número de permutaciones de secuencias de puntos activos que se pueden introducir por ingeniería para determinar la hibridación en secuencias diana, restringiendo así los límites de secuencias diana que se pueden escindir mediante la endorribonucleasa de Cech. La endorribonucleasa de Cech modifica también el ARN al añadirle un nucleótido libre de guanosina al extremo 5' del ARN escindido.

Por el contrario, las ribozimas de la presente invención se hibridan eficazmente con un amplio margen de secuencias de ARN diana y no modifican el ARN diana escindido.

Las ribozimas de la presente invención comprenden una región de hibridación que es complementaria en la secuencia de nucleótidos a, al menos, una parte de un ARN diana, y una región catalítica, que se adapta a escindir el ARN diana. La región de hibridación contiene 9 o más nucleótidos.

En un aspecto preferido, las ribozimas de la presente invención tienen una región de hibridación que comprende uno o más brazos formados por ARN de hebra simple y que tienen una secuencia complementaria a, al menos, parte de un ARN diana, el o los citados brazos están asociados con una región catalítica capaz de escindir el mencionado ARN diana; y donde la región de hibridación comprende un solo brazo de ARN, el cual contiene al menos 9 nucleótidos y donde la región de hibridación comprende 2 o más brazos de ARN, siendo la suma de nucleótidos en los citados brazos superior a 9.

De acuerdo con la invención, se ofrece una ribozima de la fórmula 1:

1

en la que cada X representa un ribonucleótido y cada residuo X puede ser igual o diferente;

en la que cada uno de (X)_{n-1} y (X)_{n'} representa un oligorribonucleótido (a) capaz de hibridación con una secuencia de ARN diana para eliminarse y (b) definida mediante una secuencia predeterminada, secuencia la cual no se da en la naturaleza enlazada covalentemente a las secuencias C-A-A-A-G-C y X-C-U-G-A, respectivamente, no estando presente tal secuencia diana de ARN en el compuesto;

en la que cada n y n' representa un número entero el cual define el número de ribonucleótidos en el oligonucleótido a condición de que la suma de n + n' sea suficiente para permitir al compuesto interaccionar de forma estable con la secuencia diana de ARN a través del apareamiento de bases;

en la que cada (*) representa un apareamiento de bases entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma;

en la que cada línea sólida representa una unión química que proporciona enlaces covalentes entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma;

en la que cada m y m' representa un número entero el cual es igual a 1; y

en la que (X)_{b} representa un oligonucleótido a condición de que b represente un número entero el cual es igual a 2.

La región (I) de la fórmula (1) representa los brazos o secuencias de los costados de una ribozima que se hibrida en las respectivas porciones de una secuencia de ARN diana. Los brazos se pueden hibridar a lo largo de toda la longitud del ARN diana o parte de la misma. En la región (II) de la fórmula 1 se muestra una región catalítica de ARN. La región catalítica puede formar parte también de la región de hibridación.

De acuerdo con una realización específica adicional de la presente invención se proporciona un procedimiento para inactivar una RNA diana en una célula, distinta de una célula en hombre o animal, el cual comprende poner en contacto el ARN diana con la célula con el compuesto de fórmula I anterior, o un compuesto que tiene la fórmula 2:

2

en el que cada X representa un ribonucleótido el cual puede ser el mismo o diferente;

en el que cada uno de (X)_{n} y (X)_{n'} representa un oligorribonucleótido (a) capaz de hibridación con una secuencia de ARN diana para eliminarse y (b) definida mediante una secuencia predeterminada, secuencia la cual no se da en la naturaleza enlazada covalentemente a las secuencias A-A-A-G-C y X-C-U-G-A, respectivamente, no estando presente tal secuencia diana de ARN en el compuesto;

en el que cada n y n' representa un número entero el cual define el número de ribonucleótidos en el oligonucleótido a condición de que la suma de n + n' sea suficiente para permitir al compuesto interaccionar de forma estable con la secuencia diana de ARN a través del apareamiento de bases;

en el que cada (*) representa un apareamiento de bases entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma;

en el que cada línea sólida representa una unión química que proporciona enlaces covalentes entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma;

en el que a representa un número entero el cual define un número de ribonucleótidos con la condición de que a pueda ser 0 ó 1, y si es 0 la A situada 5' de (X)_{a} se una a la G situada 3' de (X)_{a};

en el que cada m y m' representa un número entero el cual es mayor o igual a 1;

en el que cada línea de guiones representa independientemente tanto una unión química que proporciona enlaces covalentes entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma o la ausencia de cualquier unión química tal, y

en el que (X)_{b} representa un oligonucleótido el cual puede estar presente o ausente con la condición de que b represente un número entero el cual es mayor que o igual a 2 si (X)_{b} está presente,

en el que el compuesto es capaz de interactuar a través del apareamiento de bases con la secuencia del ARN diana bajo condiciones tales que el compuesto interacciona a través del apareamiento de bases con el ARN diana y el ARN diana se escinde,

o un compuesto que tiene la fórmula 3

(3)3'-[-(Y)_{r}-Q-(Y)_{s}-]_{z}-5'

en el que Q representa un compuesto de fórmula 1 o fórmula 2;

en el que cada Y representa un ribonucleótido el cual puede ser el mismo o diferente;

en el que cada r u s representa un número entero el cual puede ser mayor que o igual a 0, y

en el que z representa un número entero mayor que 1.

Las ribozimas de la presente invención pueden estar preparadas por procedimientos conocidos per se en la técnica para la síntesis de moléculas de ARN. (Por ejemplo, de acuerdo con los protocolos recomendados de Promega, Madison, WI, EE.UU.). En particular, las ribozimas de la invención pueden estar preparadas a partir de una correspondiente secuencia de ADN (ADN que en la transcripción da una ribozima y que se puede sintetizar de acuerdo con procedimientos conocidos per se en la técnica de la síntesis de ADN), unido operacionalmente con un promotor de ARN polimerasa, como el promotor para la T7 ARN polimerasa o la SP6 ARN polimerasa. Una secuencia de ADN correspondiente a una ribozima de la presente invención puede estar ligado en un vector de transferencia de ADN, como un ADN plásmido o bacteriófago. Donde el vector de transferencia contiene un promotor de ARN polimerasa ligado operacionalmente con el ADN correspondiente a una ribozima, la ribozima puede producirse de forma conveniente por incubación con una ARN polimerasa. Por consiguiente, las ribozimas se pueden producir in vitro por incubación de ARN polimerasa con un promotor de ARN polimerasa ligado operacionalmente al ADN correspondiente a una ribozima, en presencia de ribonucleótidos. In vivo, las células procariotas o eucariotas (incluidas las células de mamíferos y plantas) pueden ser transfectadas con un vector de transferencia apropiado que contenga material genético correspondiente a una ribozima, de acuerdo con la presente invención, ligado operacionalmente a un promotor de ARN polimerasa, de forma que la ribozima sea transcrita en la célula huésped. Los vectores de transferencia pueden ser plásmidos bacterianos o ARN o ADN vírico. Las secuencias de nucleótidos correspondientes a las ribozimas generalmente se encuentran puestas bajo el control de promotores fuertes, tales como, por ejemplo, los promotores 1ac, SV40 tardío, SV40 precoz, metalotionina o lambda. Las ribozimas pueden ser transcritas directamente in vivo a partir de un vector de transferencia o, de forma alternativa, puede ser transcrita como parte de una molécula de ARN mayor. Por ejemplo, el ADN correspondiente a las secuencias de ribozimas puede estar ligado en el extremo 3' de un gen portador, por ejemplo, después de una señal de traducción de stop. Las moléculas de ARN mayores pueden ayudar a estabilizar las moléculas de ribozima contra la digestión de nucleasa dentro de las células. En la traducción, el gen portador puede dar lugar a una proteína, cuya presencia se puede analizar directamente, por ejemplo, mediante reacción enzimática. El gen portador puede, por ejemplo, codificar una enzima.

En un aspecto adicional de la invención, se ofrece un vector de transferencia de ADN que contiene una secuencia de ADN correspondiente a una ribozima de fórmula 1 o formula 3 ligada operativamente a un promotor para proporcionar la transcripción de la ribozima.

En un procedimiento preferido de producir una ribozima, se preparan dos oligonucleótidos sintéticos de secuencia complementaria, por procedimientos estándares (por ejemplo, usando un Sintetizador de ADN de Applied Biosystems Modelo 380A (Applied Biosystems Inc., Foster City, California 94404)), hibridándolos juntos. Uno de los oligonucleótidos codifica una ribozima deseada. Los respectivos extremos de los oligonucleótidos hibridados corresponden a diferentes puntos enzimáticos de restricción, por ejemplo EcoR1 en un extremo y Pstl1 en el otro. Después de la escisión con enzimas de restricción adecuadas (EcoR1 y Pstl1 en el ejemplo anterior), el fragmento de ADN de doble filamento se puede clonar en un vector de transferencia. Donde el vector del plásmido contiene un promotor de ARN polimerasa por encima de la secuencia de ADN correspondiente a una ribozima de la presente invención, se pueden preparar convenientemente transcripciones de ARN correspondientes a la ribozima, tanto in vitro como in vivo. Cuando la ribozima está formada por dos mitades, unidas entre sí por un apareamiento de bases entre nucleótidos complementarios, cada mitad de la ribozima se puede producir de acuerdo con los procedimientos antes citados, incubando las mitades juntas para formar una ribozima.

Las ribozimas preferidas de fórmula 1 de la presente invención escinden el ARN diana que contiene la secuencia XºUY, donde Xº es guanidina, U es uracilo e Y es adenina, citosina o uracilo. XºU forma parte de una región lateral de un par de bases e Y no está apareado para las bases. Preferente, pero de ninguna manera exclusivamente, para las ribozimas de fórmula 1 XºUY es GUC o GUA. Cualquier molécula de ARN que contenga estas secuencias se puede escindir con las ribozimas de la presente invención. Una vez determinada la secuencia de una transcripción de ARN que contenga la secuencia XºUY, se pueden sintetizar los brazos de la secuencia de ribozima para que sean complementarios y, por tanto, se puedan hibridar al ARN en la secuencia diana que rodea lateralmente la secuencia XºUY. En la hibridación de los brazos de la ribozima a la secuencia diana de ARN que rodea la secuencia XºUY, la región catalítica de la ribozima escinde el ARN diana dentro de la secuencia XºUY. La escisión de ARN resulta facilitada en presencia de magnesio u otro catión divalente, a un pH de aproximadamente 8,0.

Las ribozimas de fórmula 2, las cuales se usan en el procedimiento definido anteriormente para inactivar un ARN diana en una célula, distinta de una célula en hombre o animal, y en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una afección asociada con un ARN diana en hombre o animales, y en la elaboración de una composición para la inactivación de un RNA diana en plantas, escisión del ARN diana el cual contiene la secuencia XºUY, donde Xº es cualquier ribonucleótido, U es uracilo y Y es adenina, citosina o uracilo. XºU forma parte de una región de los flancos de pares de bases e Y no está formando un par de bases.

De acuerdo con ello, las ribozimas referidas de la presente invención se pueden fabricar por ingeniería para escindir cualquier ARN cuya secuencia sea conocida. La elevada frecuencia de los residuos escindidos por las ribozimas en el ARN (1:64 para GUC en un ARN con una distribución aleatoria y de igual frecuencia de bases) significa que es posible predecir de forma fiable, en cualquier ARN diana dado, un número de sitios potenciales para la escisión por ribozimas.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para la inactivación de una secuencia diana de ARN, lo cual comprende hacer reaccionar la citada secuencia diana de ARN con una ribozima de la presente invención.

In vivo, es decir, dentro de la célula o células de un organismo, se puede transfectar dentro de las células un vector de transferencia, como un plásmido bacteriano o ARN o ADN vírico, que codifique una o más ribozimas, por ejemplo (Llewellyn y col., J. Mol. Biol. (1987) 195: 115-123; Hanahan y col., J. Mo. Biol (1983) 166). Una vez dentro de la célula, el vector de transferencia puede replicar, siendo transcrito por las polimerasas celulares para producir ARNs ribozímicos que, a continuación, inactivan un ARN diana deseado. De forma alternativa, es posible transfectar en las células, o bien introducir en las células por medio de técnicas de micromanipulación como microinyección, un vector de transferencia que contenga una o más secuencias de ribozimas, de forma que el vector de transferencia o una parte del mismo quede integrado en el genoma de la célula huésped. La transcripción del material genético integrado da lugar a ribozimas que actúan desactivanedo un ARN diana deseado.

Las ribozimas de la presente invención tienen amplias aplicaciones terapéuticas y biológicas. Por ejemplo, los virus patógenos en el hombre y animales se pueden inactivar mediante la administración al individuo infectado con un virus de una ribozima de acuerdo con la presente invención, adaptada para hibridar y escindir las transcripciones de ARN del virus. Tales ribozimas se pueden administrar por vía parenteral u otra. De forma alternativa, un individuo infectado con un virus patógeno puede recibir un virus no virulento, como vaccinia o un adenovirus que ha sido genéticamente manipulado por ingeniería para contener ADN correspondiente a una ribozima ligada operacionalmente a un promotor de ARN, de forma que la ribozima sea transcrita en las células del animal huésped, transfectado con el virus manipulado por ingeniería, para determinar la escisión y/o inactivación de la transcripción diana de ARN del virus patógeno. Las ribozimas de la presente invención tienen una aplicación particular en las enfermedades víricas causadas, por ejemplo, por el virus del herpes simple (VHS) o el virus del SIDA (VIH).

La invención se refiere adicionalmente al uso de un compuesto de fórmula 1, fórmula 2 o fórmula 3, o de un vector de transferencia constituido por ADN o ARN o una combinación de los mismos, que contiene una secuencia de nucleótidos la cual en transcripción da origen a un compuesto de fórmula 1, fórmula 2 o fórmula 3, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una afección asociada con un ARN diana en hombre o animales.

Las ribozimas de la presente invención tienen también una particular aplicación en la inactivación de las transcripciones de ARN en bacterias y otras células procariotas, plantas y animales. En las bacterias, las transcripciones de ARN de, por ejemplo, bacteriófago, que causan la muerte de la célula, se pueden inactivar mediante la transfección de una célula con un vector de transferencia de ADN capaz de producir una ribozima, de acuerdo con la invención, que inactive el ADN fago. De forma alternativa, se puede añadir la propia ribozima, que es captada por la célula bacteriana para provocar la escisión del ADN fago.

Las transcripciones de ARN en plantas pueden ser inactivadas usando ribozimas codificadas por un vector de transferencia, como el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. Cuando estos vectores son transfectados en una célula vegetal, se producen ribozimas bajo la acción de la ARN polimerasa y pueden determinar la escisión de una secuencia diana específica de ARN. En consonancia, los virus de plantas cuyas secuencias de ARN sean conocidos, o las transcripciones de ARN de genes de plantas, se pueden inactivar usando ribozimas.

La invención se refiere adicionalmente al uso de un compuesto de fórmula 1, fórmula 2 o fórmula 3, o de un vector de transferencia constituido por ADN o ARN o una combinación de los mismos, que contiene una secuencia de nucleótidos la cual en transcripción da origen a un compuesto de fórmula 1, fórmula 2 o fórmula 3, en la elaboración de una composición para la inactivación de un ARN diana en plantas.

Las transcripciones genéticas endógenas en plantas, animales u otros tipos de células se pueden inactivar usando las ribozimas de la presente invención. De acuerdo con ello, es posible modular los fenotipos o características indeseables. Puede ser posible, por ejemplo, usar las ribozimas de la presente invención para eliminar piedras de frutos o tratar enfermedades hereditarias en seres humanos, causadas por la producción de una proteína deletérea o la sobreproducción de una proteína en particular.

A continuación, se ilustrará la presente invención, por medio de un ejemplo no limitante solo, con referencia a los ejemplos y figuras no limitantes siguientes.

En las figuras:

La Figura 1 muestra los puntos de autoescisión del ARN de los ARNs de tipo salvaje y mutado; así como un perfil electroforético que muestra los productos de escisión de ARN autocatalizado.

(a) Resume las estructuras conservadas asociadas con los puntos de escisión de ARN de origen natural en ASBV, las transcripciones del ADN satélite newt y los ARNs satélites de sTobRV, LTSV, el virus de la mancha de terciopelo del tabaco, el virus de la mancha de solanum nodiflorum y el virus de la mancha del trébol subterráneo. Se muestran las secuencias de nucleótidos que están conservadas entre estas estructuras, en tanto que otras están representadas como X. El apareamiento de bases está representado por "*" y se señala con una flecha el punto de escisión de ARN.

(b) Muestra la secuencia de nucleótido conservada asociada a la escisión de la hebra (+) del ARN de sTobRV. El punto de escisión está señalado con una flecha.

(c) Se muestra un mutante in vitro de sTobRV que contiene una inserción de ocho nucleótidos (encuadrado), junto con una duplicación lateral de tres nucleótidos (residuos UGU 7 a 9).

(d) Los fragmentos HaeIII subclonados del sTobRV de tipo salvaje y el mutante D-51 in vitro fueron transcritos en orientaciones tanto (+) como (-) y las transcripciones radiomarcadas se fraccionaron por electroforesis sobre gel de poliacrilamida. Se señalan con flechas las posiciones de las transcripciones de base no escindidas 159 y 170 de las secuencias de tipo salvaje (WT) y mutante (D-51); se muestran los tamaños de los productos de escisión.

La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos de una ribozima y los productos de la escisión ribozímica, separados por electroforesis sobre gel.

(a) Los nucleótidos insertados en el mutante D-51 (Fig 1c) contienen un punto de endonucleasa de restricción BamHI. Se usó BamHI para separar el ADN mutante y las dos secuencias se subclonaron y transcribieron por separado in vitro. Las transcripciones de ARN se muestran de forma esquemática, indicando con "*" los apareamientos potenciales de bases entre los ARNs. El fragmento que contiene el punto, señalado con una flecha, de escisión es denominado S-ARN, en tanto que el fragmento que contiene la ribozima se designa como Rz-ARN.

(b) [^{32}P]-Rz-ARN (101 bases) se incubó solo (pista 1) y con S-ARN no marcado (pista 2). El [^{32}P]-S-ARN se incubó solo (pista 3) y con Rz-ARNs no marcado y marcado con ^{32}P (pistas 4 y 5, respectivamente).

La Figura 3 muestra un modelo esquemático de una ribozima, de acuerdo con una configuración de la presente invención. La Región A representa la secuencia de escisión dentro del ARN diana. La Región B representa una región catalítica y las regiones C representan los brazos de la ribozima.

La Figura 4 muestra el diseño de las ribozimas llevadas a cabo contra la transcripción genética CAT (cloranfenicol acetil transferasa). Las ribozimas, designadas como RzCAT-1, 2 y 3 fueron llevadas a cabo contra tres puntos dentro de una transcripción in vitro de 835 bases del gen CAT. Las localizaciones relativas de los puntos de escisión en la transcripción se muestran de forma esquemática con las bases laterales numeradas (a). Se muestran las tres secuencias de ribozimas ((b) a (d)) con sus secuencias dianas. Las secuencias de aminoácidos del gen CAT están numerados y se indican con una flecha los puntos previstos de la escisión del ARN. Las Rz-CAT-1 y 3 contienen secuencias de 24 bases derivadas de la hebra (+) sTobRV (región B, Fig 3), mientras que RzCAT-2 contiene un único cambio U-A en esta región.

La Figura 5 muestra los resultados de la escisión de ARN de CAT con las ribozimas RzCAT-1 a 3.

(a) los ARNs de [^{32}P]-CAT se fraccionaron sobre gel tras la incubación solos (-) o con una de las tres ribozimas, RzCAT-1 a 3 (pistas 1, 2 y 3, respectivamente). Se muestra la localización de la transcripción de longitud total con una flecha.

(b) Análisis de la base 5'-terminal. Los fragmentos 3' producidos por la escisión ribozímica del ARNm de CAT se trataron con [5'-^{32}P]-quinasa, se purificaron sobre gel y fueron sometidos a una completa digestión con nucleasa, fraccionándose los residuos terminales liberados por electroforesis sobre gel de poliacrilamida a pH 3,5. Los nucleótidos 5' terminal, determinados por referencia a los marcadores (pista M) fueron A, U y G para los fragmentos producidos por RzCAT-1 a 3 (pistas 1, 2 y 3, respectivamente).

La Figura 6 muestra el desarrollo en el tiempo de la actividad catalítica de la ribozima (RzCAT-1) contra el ARN de CAT. Se cuantificaron y trazaron las cantidades de los 139 nucleótidos como producto de la escisión. La inserción muestra la acumulación de los 139 fragmentos de base con el tiempo, tras la electroforesis con gel de poliacrilamida.

La Figura 7 muestra los índices relativos de escisión del ARN de CAT bajo diferentes condiciones de temperatura. El ARN sustrato se representa por una línea sólida. En cada caso, el producto de escisión se representa por una línea de puntos.

La Figura 8 muestra tres ribozimas (correspondientes a RzCAT-2) provistas de brazos o secuencias laterales de diversas longitudes.

La Figura 9 muestra el esquema para la producción de una ribozima que comprende ARN catalítico anti-transferencia, conteniendo cada uno de los dominios de escisión RzCAT-1 a 3.

La Figura 10 muestra las ribozimas en hibridación con secuencias dianas, conteniendo los motivos GUA (10a) y GUU (10b) en el ARNm de CAT.

La Figura 11 muestra los puntos de escisión de ARN autocatalizada en el ARN del viroide del citrus exocortis (CEV) y su complemento.

La Figura 12 muestra la ribozima RzCEV25x (+) hibridada con el ARN diana del CEV (a) y un perfil de electroforesis sobre gel del ARN del CEV (+) y el ARN del CEV (-) complementario, incubado con RzCEV25x (+) (b, pistas 1 y 2, respectivamente. Se señala con una flecha el producto de la escisión.

La Figura 13 muestra la ribozima RzCAT-2 en hibridación con su secuencia diana (a) y la ribozima RzSCMoV (b). El dominio catalítico de cada ribozima está enmarcado. Se marcan las diferencias en la región catalítica de RzSCMoV, en comparación con RzCAT-2.

La Figura 14 muestra la ribozima RzCEV-2 en hibridación con una secuencia diana en el ARN del viroide del citrus exocortis (CEV). El punto de escisión corresponde al nucleótido 336 en la secuencia del ARN del CEV. El círculo destaca la alteración en la secuencia de nucleótidos en el dominio catalítico, en comparación con el dominio catalítico del sTobRV (a). La fig. 14(b) muestra un perfil electroforético de una hebra de control (-) del ARN del CEV, pista 7, y la hebra (+) del ARN del CEV, pista 8, tras la incubación con RzCEV2.

La Figura 15 muestra la ribozima RzCAT-2 (a) comparada con la ribozima RzCAT-2B (b). Los dominios catalíticos están enmarcados. De igual forma, se enmarcan los cambios en los dominios catalíticos de RzCAT-2B, en comparación con RzCAT-2;

La Figura 16 muestra un mapa del plásmido pJ35SN; y

Figura 17 es una presentación gráfica del promedio de cuatro experimentos sobre la inhibición de la expresión de CAT en plantas (protoplastos del tabaco).

Los siguientes ejemplos se dan a modo de ilustración de la presente invención y no se deben considerar como limitantes de la presente invención.

Las reacciones y manipulaciones que implican el ADN, tales como ligaciones, digestiones de enzimas de restricción, transformación bacteriana, secuenciación de ADN, etc., se llevaron a cabo de acuerdo con técnicas estándares, como las descritas por Maniatis y col. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbour, 1982). Las manipulaciones relativas al ARN se llevaron a cabo también de acuerdo con técnicas estándares, como las descritas por Uhlenbeck (Nature 328, 596-600 (1987)) y Haselhoff y Gerlach (NAture 334, 585-591 (1988)).

Ejemplo 1 Escisión autocatalizada del ARN sTobRV mutado

Un consenso de los dominios asociados con los puntos de escisión de origen natural del ARN en el ASBV, las transcripciones del ADN satélite de newt y los ARNs satélites de sTobRV, LTSV, virus de las manchas de terciopelo del tabaco (VMoV), virus de la mancha de solanum nodiflorum (SNMV) y el virus de la mancha del trébol subterráneo (SCMoV), tal como se muestra en la Figura 1a. Se muestran las secuencias de nucleótidos conservadas entre estas estructuras, en tanto que las estructuras no conservadas se representan como X. Se sitúa un U extra después del residuo ^{1}A en la hebra LTSV (+).

Se estudió el dominio asociado con la escisión autocatalizada de la hebra (+) se sTobRV para determinar la actividad del sustrato enzimático dentro de este dominio. En primer lugar, se mutagenizaron ADNc de sTobRV clonados, usando un protocolo de inserción de un enlazador de oligonucleótidos (BamH1).

Construcción de un vector para la expresión in vitro de sTobRV

Se aisló un fragmento 160 bp Taq 1-Spe 1 del ADNc de sTobRV del pSP653 (Gerlach y col., 1985, Virology 151: 172-185), ligándolo a un pGEM 4 Acc 1 - Spe 1, cortado y tratado con fosfatasa para reformar el punto Acc 1. Se linealizó un clon resultante con Acc 1, tratado con fosfatasa y se insertó un fragmento 359 bp Taq 1 del ADNc del sTobRV. Los clones resultantes se analizaron en busca de una secuencia de ADNc de sTobRV 520 bp permutada de forma circular que contuviera los residuos terminalmente redundantes 277 a 81 (pTTS). La secuencia sTobRV está flanqueada por promotores para las ARN polimerasas T7 y SP6 y la transcripción in vitro dio lugar a ARN de orientación (+) y (-) que contenían dos puntos de autoescisión.

Mutagénesis in vitro

El plásmido pTTS (50 ug) se linealizó con BamH1, se trató con nucleasa S1 y se religó, para eliminar un único punto BamH 1. La construcción resultante pTTS-B, se trató con 2 x 10^{-4} unidades de ADNasa 1 en 20 mM TRis-HCl pH 7,0, 15 mM MnCl_{2} durante 10 minutos a 37ºC. Los ADN lineales resultantes se ajustó y/o se rellenaron sus extremos utilizando ADN Polimerasa T4, purificándolo por electroforesis sobre gel de agarosa 0,7% LGT y extracción. Las secuencias tratadas con quinasa del enlazador BamH 1 (CGGATCCG) se ligaron al plásmido linealizado durante la noche a temperatura ambiente, en presencia de 5% de polietilén glicol. A continuación, las reacciones se digirieron con BamH 1 y se volvieron a purificar los ADN de plásmidos lineales mediante electroforesis sobre gel de agarosa 0,7% LGT (fue necesario para eliminar las últimas trazas de plásmido circular, junto con los enlazadores no ligados). Los plásmidos se volvieron a circularizar usando ADN ligasa T4 y se transformaron en E. coli DH-1. Las colonias (mayores de 1000) se rasparon de placas de agar, se cultivaron en medios de cultivo líquidos hasta saturación y se preparó una población mixta de ADN de plásmidos. Las inserciones mixtas de ADNc sTobRV se escindieron por digestión con enzimas de restricción en los puntos laterales EcoR1 y Pstl 1, se purificaron por electroforesis sobre gel de agarosa 1% LGT y se subclonaron en pGEM 4 EcoR1-Pst1 cortados y tratados con fosfatos. Se reunieron una vez más los transformantes resultantes, se cultivaron en medios de cultivo líquidos y se preparó ADN de plásmido. Los ADN de plásmido se trataron con BamH 1 para escindir sólo aquellos plásmidos que contenían una secuencia de enlazador BamH1 y se purificaron otra vez las formas lineales mediante dos rondas de electroforesis sobre gel de agarosa 0,7% LGT, se recircularizaron con ADN ligasa T4 y se transformaron en E. coli DH-1. En los transformantes individuales se analizó la posición aproximada del enlazador BamH1 insertado dentro de la secuencia de sTobRV por medio de digestión con enzimas de restricción, se subclonaron en M13 mp19 y se secuenciaron por vía de la técnica de terminación de la cadena de dideoxinucleótido.

Resultó una colección de mutantes de sTobRV y el análisis de secuencia de nucleótidos demostró que cada mutante contenía una secuencia insertada de enlazador BamH1 (CGGATCCG), junto con secuencias laterales duplicadas o borradas de sTobRV. Los mutantes se transcribieron in vitro y se analizaron los ARN en cuanto a su capacidad de sufrir una escisión. A partir de estos experimentos, se identificó una secuencia de 52 nucleótidos que contenía tanto las porciones de sustrato como las de escisión del ARN de sTobRV. Esta secuencia de 52 nucleótidos, mostrada en la Fig. 1b, contenía el dominio de secuencia conservada necesario para la autoescisión de otros ARN (Figura 1a). Un mutante, denominado D-51, contenía una secuencia de enlazador BamH1 de ocho nucleótidos insertada entre tres nucleótidos duplicados de sTobRV numerados 7 a 9. Este mutante sufrió una escisión de ARN autocatalizado.

Los fragmentos HaeIII de 97 y 108 pares de bases que contenían la secuencia de escisión de 52 nucleótidos del ARN de tipo salvaje y D-51 (como se muestra en las Figuras 1b y 1c) se escindieron a partir de clones de plásmidos secuenciados. Los fragmentos se ligaron en el punto Smal del pGEM4 y se analizaron para obtener ambas orientaciones de la inserción. Los plásmidos se linealizaron usando EcoR1 y hebras (+) y (-) de ARN de longitudes 159 y 170 bases se transcribieron usando 200 unidades/ml de ARN polimerasa T7 en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de NaCl, 6 mM de MgCl_{2}, 2 mM de espermidina, 1000 unidades/ml de ARNasina, 500 microM de ATP, CTP y GTP con 200 microM [alfa^{32}P] UTP. Los ARN se fraccionaron por electroforesis sobre un gel de poliacrilamida al 10%, urea 7 molar y formamida al 25% y se autorradiografiaron.

Como se ve en la Figura 1d, no se observó escisión alguna de la hebra (-) de las transcripciones de ARN. Era lo que cabía esperar, dado que la hebra (-) no contenía un punto de escisión autocatalizada. Con las hebras (+) de las secuencias tanto del tipo salvaje como de D-51, se produjo la escisión, siendo la de D-51 algo menos eficaz que la del tipo salvaje (Figura 1d). Este experimento indica que la región de asa de hebra simple al lado derecho de la secuencia de 52 nucleótidos, implicada en la escisión autocatalizada del ARN, no es esencial.

Separación de las actividades enzimáticas y de sustrato

Usando el punto de endonucleasa de restricción BamH1 insertado en D-51, se obtuvieron los fragmentos laterales HaeIII-BamH1 y Bamh1-HaeIII, subclonando cada uno de ellos en un plásmido de E. coli adecuado para la transcripción in vitro. Esto condujo a la eliminación del asa mutada de hebra simple del dominio de autoescisión, separando la región en dos segmentos de ARN (Figura 2a). El fragmento HaeIII-BamH1 menor contenía los nucleótidos 321 a 9, incluyendo el punto real de escisión y se denominó como el fragmento S. El fragmento BamH1-HaeIII que contenía los nucleótidos de sTobRV 7 a 48 se designó como el fragmento de ribozima o Rz. Los plásmidos de E. coli usados para la transcripción in vitro fueron pGEM3 y pGEM4 (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Estos plásmidos de expresión contienen:

(a) un origen de replicación;

(b) un gen seleccionable de resistencia a un fármaco (Amp^{r});

(c) un punto de clonación múltiple rodeado por promotores de ARN polimerasa, que se pueden usar para la producción in vitro de transcripciones.

La Rz-pGEM3 tratada con ADN polimerasa T7 y digerida con Kpnl y el S-pGEM4 digerido con Xbal se transcribieron usando ARN polimerasa SP6 bajo las mismas condiciones descritas anteriormente.

Como se ve en la Figura 2, ni el ARN S ni el RZ mostraron una degradación significativa al ser incubados solos (Figuras 2b, pistas 1 y 3) bajo condiciones adecuadas para una autoescisión altamente eficaz (50ºC, 20 mM MgCl_{2}, pH 8,0). El ARN Rz marcado también apareció inalterado tras la incubación con el S-ARN (Figura 2b, pistas 2 y 5). Sin embargo, al mezclar el S-ARN con el Rz-ARN, se produjo una escisión eficaz del S-ARN (Figura 2b, pistas 4 y 5), dando lugar a dos fragmentos. Los tamaños de los productos coincidieron con la escisión del S-ARN (84 bases) en el punto normal entre los nucleótidos número 359 y número 1, para dar fragmentos 5' y 3' proximales de 67 y 17 nucleótidos, respectivamente. Esto demuestra que el S-ARN actuó como un sustrato para la escisión ribonucleolítica por el Rz-ARN, que actuó de forma catalítica.

En la Figura 3 se muestra un modelo de una ribozima basada en la región catalítica del ARN de sTobRV. La ribozima tiene dos brazos o secuencias laterales de ARN de hebra simple, mostrado en C, que se hibridan con las secuencias complementarias en un ARN de sustrato, es decir, el ARN que va a ser escindido. Cada secuencia lateral mostrada en C contiene 8 ribonucleótidos. El número de nucleótidos contenidos en la región C no es crítico. Sin embargo, debe haber una cantidad suficiente de nucleótidos para permitir que la ribozima se hibride con un ARN diana. El número mínimo de nucleótidos en cada región C para la hibridación parece ser de cuatro.

La región catalítica B contiene secuencias que permanecen altamente conservadas en los dominios de escisión de origen natural (véase Figura 1a). En base a una comparación con los dominios de escisión de las secuencias conocidas, la longitud del par de bases del tronco II no resulta importante, como lo es la presencia de un asa asociada en un extremo del mismo.

El punto de escisión dentro del ARN diana aparece representado en A (en la Figura 3) como GUC. En base a los experimentos realizados (no mostrados), así como de otros por Koizumi (FEBS LETT 288: 228-230 (1988); y FEBS LETT 239: 285-288 (1988), los puntos de escisión identificados en los ARN de origen natural, las secuencias GUA, GUC, CUC, AUC y UUC actúan también como puntos de escisión dentro del ARN.

Ejemplo 2 Demostración del diseño, síntesis y actividad de las ribozimas con una actividad endorribonucleásica nueva y altamente específica

Como ilustración de esta invención, se han diseñado tres ribozimas, que son llevadas a cabo contra la transcripción de un gen indicador frecuentemente utilizado, derivado de bacterias, el Tn9 Cloranfenicol Acetil Transferasa (CAT), que puede conferir resistencia a los antibióticos en bacterias, plantas y animales y que puede ser fácilmente analizado. Estas ribozimas, denominadas RzCAT-1-a 3 corresponden a potenciales puntos de escisión en el ARN de CAT en las posiciones 139-140, 494-495 y 662-663, respectivamente. Las secuencias de estas ribozimas aparecen representadas en la Figura 4. En cada caso, las secuencias laterales de la ribozima que se hibrida con el ARN de CAT, tuvieron una longitud de ocho nucleótidos. La región catalítica se eligió como la correspondiente a la del ARN de sTobRV, mostrada en la Figura 3.

El gen de CAT se obtuvo a partir de pGEM4 y se subclonó como el fragmento BamH1 en pGEM-32 (de Promega, Madison, WI, EE.UU.). Esta plásmido se linealizó con HindIII y se obtuvieron transcripciones del gen de CAT usando ARN polimerasa T7 con 220 uM [alfa-^{32}P]UTP. Las secuencias de las ribozimas se sintetizaron como oligodeoxinucleótidos, RzCAT-1, 2 y 3, respectivamente. Se les trató con quinasa, se ligaron con pGEM4 tratado con fosfatasa, EcoR1-Pst1 cortado y se incubaron con el fragmento Klenow de ADN polimerasa 1 antes de la transformación bacteriana. Los plásmidos linealizados con EcoR1 se transcribieron con ARN polimerasa T7 para producir ARN de ribozima. Las ribozimas se incubaron con transcripción de CAT en 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 20 mM de MgCl_{2} a 50ºC durante 60 minutos y los productos se fraccionaron por electroforesis sobre gel de poliacrilamida al 5% 7M urea, 25% formamida antes de la autorradiografía.

Cuando se incubó la transcripción de 840 nucleótidos de CAT con cualquiera de las tres ribozimas, se produjo una escisión eficaz y altamente específica para la secuencia (Figura 5), produciendo 2 fragmentos de ARN en cada reacción. Los tamaños de los fragmentos coincidieron con los puntos previstos de escisión (es decir, los fragmentos de 139 y 696, 494 y 341, 662 y 173 bases fueron los productos 5' y 3' de la escisión catalizada por RzCAT-1 a 3, respectivamente). Las condiciones necesarias para estas escisiones catalizadas por estas ribozimas fueron similares a las observadas para las reacciones de escisión de origen natural (Foster, A.C. y Symons, R.H., Cell 49: 211-220 (1987) y Foster, A.C. y Symons, R.H., Cell 50: 9-16 (1987)), ocurriendo una escisión más eficaz a pH, temperatura y concentraciones elevados de cationes divalentes (datos no mostrados). Cuando estuvieron presentes en exceso molar, las tres ribozimas catalizaron casi la escisión completa del sustrato de ARN del CAT después de 60 min. en 50 mM Tris HCl, pH 8,0, 20 mM MgCl_{2} a 50ºC. Bajo condiciones similares y 3 uM de ribozimas, el T_{1/2} del sustrato del ARNm del CAT fue de 3,5, 3,5 y 2,5 min. en presencia de RzCAT-1 a 3, respectivamente. Las secuencias de ribozimas fueron inactivas contra el complemento del ARN del sustrato (es decir, la hebra (+)) y en la forma de oligodeoxirribonucleótidos (datos no mostrados). Se aislaron los fragmentos de la escisión 3' terminal de cada reacción catalizada por las ribozimas y se trataron con 5' ^{32}P-quinasa (50 mM Tris HCl pH 9, 10 mM MgCl_{2}, 10 mM DTT con 50 uCi de gamma-^{32}P ATP y 5 unidades de quinasa de polinucleótido T4 durante 30 min. a 37ºC). El tratamiento eficaz con quinasa de los fragmentos indicó que poseían grupos hidroxi 5' terminales, similares a los producidos en las reacciones naturales de escisión.

Se determinó el nucleótido terminal de los fragmentos producidos por la escisión de las secuencias de CAT mediante las RzCAT-1 a 3. De forma resumida, se purificaron fragmentos radiomarcados sobre un gel de poliacrilamida al 5% y se digirieron con un volumen igual de 500 unidades/ml de ARNasa T1, 25 unidades/ml de ARNasa T2 y 0,125 mg/ml de ARNasa A en 50 mM de acetato de amonio a pH 4,5 durante 120 min. a 37ºC. Los productos se fraccionaron sobre un gel de poliacrilamida al 20% que contenía 25 mM de citrato sódico, pH 3,5 y urea 7 molar. La Figura 5b muestra que la escisión de las secuencias de CAT mediante las RzCAT-1 a 3 tiene lugar precisamente antes de los nucleótidos A, U y G, respectivamente.

Los fragmentos de la secuencia terminal del gen de CAT se determinaron directamente, utilizando la técnica de la digestión enzimática parcial (Donis-Keller y col., Nucleic Acid Res. 4: 2527-2538 (1980)), usando escisión ribonucleolítica parcial específica de bases. La secuencia de los fragmentos confirmó que la escisión tiene lugar en las localizaciones esperadas dentro del ARN del CAT (no mostrado).

Catálisis enzimática

Para demostrar que las ribozimas provocan, de forma catalítica, la escisión del sustrato del ARN del CAT, se incubó cada una de ellas con un exceso molar de sustrato, bajo condiciones que deberían favorecer tanto una escisión eficaz como una disociación del producto. La Figura 6 muestra los resultados de un experimento, en el que después de 75 min. a 50ºC, pH 8,0 en 20 mM MgCl_{2}, 10 pmoles de la RzCAT-1 habían catalizado la escisión específica de 163 pmoles de un sustrato truncado de ARNm de CAT (173 bases), para dar fragmentos 5' y 3' de 139 y 34 bases, respectivamente. En promedio, cada ribozima había participado en más de diez sucesos de escisión. Después de 75 min. a 50ºC, se observó una cierta escisión no específica del ARN, debido a las condiciones extremas, pero el 70% de los ARN intactos restantes (163 pmoles) se había acumulado como el fragmento de 139 bases. Se obtuvieron resultados similares para RzCAT-2 y 3 (datos no mostrados), por lo que cada una de ellas actúa como una enzima del ARN.

Ejemplo 3 Efecto de la temperatura sobre la actividad de las ribozimas

Se examinó el efecto de la temperatura de reacción sobre la tasa de actividad in vitro de las ribozimas.

Se llevó a cabo una evolución en el tiempo de las reacciones para las ribozimas RzCAT-1 a 3 sobre sustrato de ARN de CAT a 37ºC y 50ºC.

En este experimento, se establecieron las reacciones para cada ribozima por duplicado, utilizando las condiciones de reacción para la escisión ribozímica fijadas en el Ejemplo 2. Una reacción se incubó a 37ºC y la otra, a 50ºC. Las muestras se extrajeron cada cierto tiempo determinado, hasta 90 minutos, analizando el grado de reacción mediante electroforesis desnaturalizante sobre gel de poliacrilaminda. La Figura 7 muestra la evolución en el tiempo de la reacción para cada una de las ribozimas RzCAT-1 a 3 a 37ºC y 50ºC. La tasa de reacción de cada ribozima se incrementa al elevar la temperatura de reacción.

En la Tabla 1 se muestra el tiempo necesario para una escisión del 50% (t_{1/2}) del ARN de CAT.

TABLA 1

3

Como se ve en la Tabla 1, la tasa de reacción de las ribozimas a 37ºC es aproximadamente 20 veces más lenta que la tasa de reacción a 50ºC.

Ejemplo 4 Efectos de las longitudes variables de brazos de las ribozimas (o secuencia lateral) sobre la actividad catalítica de las ribozimas

Los brazos o secuencias laterales de una ribozima (región (I) de la fórmula 1) hibridan la ribozima a un ARN diana, tras lo cual tiene lugar la escisión del ARN. En este experimento, se investigó el efecto sobre la tasa de escisión de una secuencia diana, mediante la alteración del grado de complementariedad y subsiguiente longitud del apareamiento de bases de los brazos de la ribozima a la secuencia diana.

Las ribozimas se produjeron con una complementariedad de 4, 8 y 12 bases a la secuencia diana RzCAT-2 en cada brazo (Figura 8a). Las ribozimas se prepararon de acuerdo con los procedimientos del Ejemplo 2. La actividad de las ribozimas se determinó mediante la incubación del ARN de ribozima con ARN de CAT, tal como se ha descrito previamente.

La ribozima que tenía una complementariedad de 4 bases sobre cada brazo no escindió el ARN sustrato. La ribozima con una complementariedad de 8 bases en cada brazo escindió el sustrato de CAT, tal como lo hizo la ribozima con una complementariedad de 12 bases. Las ribozimas con una complementariedad de 12 bases escindieron el ARN diana de forma más eficaz, tal como se evalúa por la tasa de reacción in vitro, que las ribozimas con un número menor de complementariedades de base. Aun cuando parece necesario tener una complementariedad de más de 4 bases, el aumento de la longitud de la región de hibridación de las ribozimas incrementa su tasa de reacción.

En un segundo experimento, se investigó la eficacia de reacción de una ribozima que tiene (a) una complementariedad correspondiente a la longitud total del ARN diana de la transcripción de CAT y (b) múltiples dominios catalíticos.

Se seleccionaron cuatro puntos diana GUC en las secuencias de ARN de CAT. Los dominios catalíticos de las ribozimas contra estos puntos se "insertaron" en una secuencia completamente antisentido (-) para la transcripción de CAT, analizándose la actividad catalítica.

Los cuatro puntos elegidos fueron los tres especificados por las RzCAT-1 a 3 descritos anteriormente, además de otro punto que se puede representar de la forma siguiente:

4

donde "192" se refiere al aminoácido 192 en el polipéptido CAT y un se refiere al punto de escisión.

Se utilizaron oligodeoxirribonucleótidos que contenían dominios catalíticos de ribozimas y la medición de cada uno de estos puntos de escisión para experimentos de mutagénesis M13 para producir una secuencia que contenía el complemento completo de la secuencia CAT, pero con los cuatro dominios catalíticos de las ribozimas insertados en su interior. La mutagénesis M13 se realizó uniendo oligonucleótidos que contenían inserciones de ribozimas a ADN M13 de cadena simple que contenían uracilo, seguido de la síntesis de ADN complementarios que contenían la inserción. Los ADN complementarios se recuperaron tras la clonación en una cepa apropiada de Escherichia coli (T.A. Kunkel 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82: 488-492). El ADNc de doble hebra resultante se clonó en un vector de expresión in vitro para producir ARN de ribozima usando el sistema de transcripción de polimerasa T7. La actividad de las ribozimas se determinó por incubación del ARN de ribozima con la transcripción de CAT, seguida por electroforesis sobre gel de la mezcla de reacción, después de un tratamiento con glioxal para desnaturalizar los ácidos nucleicos.

La escisión autolítica tuvo lugar en todos los puntos esperados en la transcripción de CAT. En consonancia, las secuencias laterales de brazos, o bien una ribozima, se puede extender a todo lo largo de la transcripción del ARN que se va a escindir.

La Figura 9 muestra esquemáticamente la producción de ARN catalítico anti-sentido que contiene cada una de las cuatro ribozimas. El ARN catalítico anti-sentido contiene aproximadamente 900 bases.

Bajo las citadas condiciones de reacción, la ribozima y las secuencias diana forman complejos de elevado peso molecular, probablemente por una amplio apareamiento de bases. Se requiere un fuerte tratamiento de desnaturalización, como el de glioxal, para resolver los productos de reacción durante la electroforesis.

Ejemplo 5 Secuencias dianas para la escisión por ribozimas

Se analizó el motivo GUA en el ARNm para ver si era posible que una ribozima produjera escisión del ARN en esta secuencia.

Se seleccionó un punto específico en el ARNm de CAT, incluido el motivo GUA (Figura 10a), preparándose una secuencia adecuada de ribozima cuya actividad se analizó. La ribozima contenía brazos de 8 ribonucleótidos.

Se prepararon oligonucleótidos sintéticos correspondientes a la ribozima de la Figura 10, de acuerdo con el Ejemplo 2, clonándose ADNc de doble hebra en un vector de expresión in vitro (pGEM4, véase más arriba) en E. coli, al objeto de producir ARN de ribozima usando el sistema de transcripción de polimerasa T7. La actividad de la ribozima se determinó por incubación de ARN de ribozima con ARNm de CAT, seguida por electroforesis sobre gel de la mezcla de reacción, tal como se ha descrito anteriormente.

La ribozima provocó la escisión del punto GUA diana (no se muestra). En consonancia, el motivo GUA en el ARN es un sustrato para las ribozimas de la presente invención. No se trató de algo totalmente inesperado, puesto que un punto de escisión de origen natural en el ARN satélite de virus de la mancha pasajera de la alfalfa requiere el reconocimiento de un punto GUA.

De forma similar, se analizó un motivo GUU en la secuencia diana del ARN de CAT con una ribozima apropiada (véase Figura 10b), produciéndose la escisión.

Ejemplo 6 Escisión por ribozimas del ARN vírico

Se escindió el ARN viroide, en forma del ARN del viroide del Citrus exocortis, usando una ribozima de la presente invención.

Se seleccionaron dos puntos diana GUC en el ARN de viroide de citrus exocortis (CEV). Se seleccionó, asimismo, un punto en la secuencia de la hebra complementaria. Las ribozimas se prepararon contra todos estos puntos, analizándose su actividad. Las ribozimas se designaron CEV9x(+), CEV9x(-) y CEV25x(+). La Figura 11 muestra los tres puntos de escisión en el ARN de CEV para cada una de estas ribozimas.

Las ribozimas se prepararon de acuerdo con procedimientos anteriores. En la Figura 12 se muestra la ribozima RzCEV25x(+). Esta ribozima escinde el motivo GUC en el nucleótido 116 del ARN de CEV.

La Figura 12(b) muestra la escisión del ARN de CEV con la ribozima RzCEV9x(+). No se observa escisión con la ribozima RzCEV9x(-).

Este experimento indica que las ribozimas son activas contra secuencias dianas de ARN de diversos orígenes. Esto era de esperar, puesto que todos los ARN están formados por los bloques básicos de construcción de ribonucleótidos de adenina, guanina, citosina y uracilo, independientemente de su origen animal, vegetal o microbiano.

Ejemplo 7 Ejemplos de ribozimas con dominios catalíticos variables

Se preparó una ribozima dirigida contra un punto CAT-2, usando la secuencia de dominio catalítico del ARN satélite del virus de la mancha del trébol subterráneo (SCMoV). Se incorporó una complementariedad de doce bases de la secuencia lateral del brazo de la ribozima en el diseño de la ribozima RzSCMoV. Las ribozimas RzCAT-2 y RzSCMoV aparecen en las Figuras 13a y 13b, respectivamente. La región del asa de la RzSCMoV contiene 5 nucleótidos, teniendo una secuencia AAAUC. Esto se debe contrastar con la región del asa de la RzCAT-2 que contiene 4 nucleótidos, con la secuencia AGAG. Además, la RzSCMoV contiene una C en la región catalítica, en lugar de la U* en la RzCAT-2. Las diferentes secuencias en la RzSCMoV, en comparación con la RzCAT-2, aparecen marcadas.

La RzSCMoV se produjo de acuerdo con el Ejemplo 2. La RzSCMoV era activa, dando dos productos de escisión, como se esperaba.

En otro experimento, el punto diana del viroide del Citrus exocortis (CEV), en el nucleótido-336 en su ARN complementario se escindió usando una ribozima (RzCEV2), que tenía la secuencia mostrada en la Figura 14a. La región del asa, designada con la letra "L" en la Figura 14, comprende seis nucleótidos con la secuencia 3'-CCTATA-5'. Esto es diferente de la región del asa del sTobRV, que comprende cuatro nucleótidos con la secuencia 3'-AGAG-5'. Esta ribozima escinde el ARN complementario diana del CEV en la posición -336, tal como se muestra en el perfil electroforético de la Figura 14b.

Este experimento señala que el número de nucleótidos, así como la secuencia de nucleótidos de la región del asa, carecen de importancia en la actividad de la ribozima. En estos experimentos, la ribozima se produjo de acuerdo con los procedimientos descritos previamente en la especificación.

En otro experimento, se investigó el efecto del apareamiento de bases en el dominio catalítico (región del tronco) sobre la actividad de la ribozima.

Se preparó y analizó una ribozima modificada, correspondiente a la RzCAT-2, pero que contenía cuatro pares extras de bases. En la Figura 15a, se muestra la secuencia de la ribozima RzCAT-2 en hibridación con el ARN diana de CAT. La ribozima de prueba se muestra en 15b, enmarcando los pares adicionales de bases. La ribozima de prueba tenía una actividad comparable a la de la RxCAT-2. Esto indica que la región de apareamiento de bases del dominio catalítico de la ribozima puede ser de longitud variable, sin afectar a su actividad catalítica.

Hemos observado (datos no mostrados) que la forma estable in vivo de las transcripciones del ARN del sTobRV, expresada en plantas transgénicas, es principalmente circular, presumiblemente debido a la unión de los términos 5' y 3'. Por consiguiente, el uso de dos puntos de escisión que flanqueen una secuencia de interés en una transcripción in vivo de ARN conducirá probablemente a un producto circular, que puede tener una mayor estabilidad que las transcripciones lineales. Este enfoque parece proporcionar un procedimiento nuevo para la estabilización in vivo de las secuencias de ribozimas. Se denomina circularización.

Ejemplo 8 Actividad in vivo de las ribozimas

En este Ejemplo, se investigó la actividad in vivo de las ribozimas en células vegetales.

Protocolo experimental

Se introdujeron plásmidos que contenían construcciones genéticas anti-CAT (CAT = cloranfenicol acetil transferasa) o combinadas anti-CAT/ribozima (véase más abajo), en protoplastos de tabaco, en la misma cantidad y proporción relativas entre sí, junto con otros plásmidos que contenían una construcción genética CAT funcional. Las actividades de CAT se midieron y compararon con el nivel de base de la actividad genética.

Materiales y procedimientos (a) Electroporaciones y ensayos de CAT

Se llevaron a cabo según se describe en Llewellyn y col., J. Mol. Biol. (1987) 195:115-123. En forma resumida, se prepararon protoplastos de Nicotina plumbaginifolia de la línea T5, a partir de una suspensión dos días después del subcultivo, se suspendieron en 10 mM HEPES, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,2M manitol y se ajustaron para una densidad de 3 x 10^{6}/ml. La electroporación se llevó a cabo usando un único pulso de 50 ms a 250V. Los protoplastos se diluyeron 10 veces y se cultivaron durante 20 horas a 26ºC en la obscuridad. Se rompieron por ultrasonido, obteniendo los extractos. Los extractos se normalizaron para el contenido en proteínas, analizando su actividad CAT in vitro usando ^{14}C-cloranfenicol y acetil CoA. Los productos de reacción se separaron por cromatografía de capa fina, visualizándolos por autorradiografía. El grado de las reacciones se calcularon por la producción de derivados radiactivos del producto, a partir del templado de ^{14}C-cloranfenicol.

(b) Construcciones genéticas

Se introdujeron construcciones genéticas en suspensiones de protoplastos de 0,1 ml como ADN de plásmidos, que habían sido purificados de las bacterias por extracción y dos ciclos de centrifugación contra gradiente de densidad de equilibrio CsCl. Se resuspendieron en 10 mM Tris/1 mM EDTA/pH=7,5 para su uso.

La construcción genética activa CAT era portada por el plásmido designado pCAT7+. Se trataba de un derivado por fusión de una secuencia genética de CAT (del plásmido pCM4, véase T.J. Close y R. Rodríguez, 1982, Gene 20: 305-316) en el plásmido pJ35SN (derivado de p35SN, W.L. Gerlach y col., 1987, Nature 328: 802-805), de forma que la construcción genética activa era:

5

35S se refiere al promotor del 35S CaMV (virus del mosaico de la coliflor), NOS a la señal de poliadenilación de la nopalina sintetasa, T/C a transcripción.

Junto con 0,2 ug de pCAT7+, se añadieron varias construcciones genéticas en exceso, como se describe más abajo. Las construcciones genéticas estaban contenidas dentro de plásmidos con las siguientes designaciones:

pJ35SN-

Este plásmido vector, cuyo mapa se muestra en la Figura 16, contiene un promotor de CaMV 35S y una señal de 3' poliadenilación de nopalina sintetasa vegetal, que se puede mostrar de la forma siguiente:

6

pCAT7-

Contiene la secuencia genética de CAT insertada en el pJ35SN, de forma que la transcripción resultará en la producción del ARN de CAT anti-sentido, que se puede representar de la forma siguiente:

7

pCAT19-

Contiene el gen de CAT con cuatro dominios de ribozimas catalíticas incluidas en él (véanse Ejemplo 4 y Figura 9), insertados en pJ35SN, de modo que la transcripción resultará en la producción de ARN de CAT anti-sentido, conteniendo cuatro dominios de ribozimas catalíticas, que se pueden representar de la forma siguiente:

8

Resultados

La tabla siguiente muestra las actividades relativas de CAT en las células, 20 horas después de la electroporación. La actividad se expresa como la conversión porcentual de sustrato de cloranfenicol en un ensayo de 1 hora.

ug de plásmido electroporado

9

A partir de estos resultados, se pueden extraer las siguientes conclusiones:

(a)

La introducción de la construcción genética CAT da como resultado una actividad de CAT significativa - compárense 2A,B con 1 A,B. Hay una variabilidad entre duplicados. De las tendencias observadas en otras muestras (véanse "b" y "c" más abajo), es probable que 2A muestre una actividad anormalmente baja.

(b)

La introducción simultánea de una construcción genética de anti-sentido da como resultado un descenso del nivel de actividad - compárense 3A,B y 4A,B con 2B. El grado de descenso está directamente relacionado con el nivel del gen anti-sentido añadido como plásmido - compárense 3A,B y 4A,B.

(c)

La introducción simultánea de la construcción genética combinada antisentido/ribozima da como resultado un descenso de la actividad genética - compárense 5A, B y 6A, B con 2B. Además, la reducción es más marcada que para los niveles correspondientes de construcciones genéticas de anti-sentido - compárense 5A, B con 3A, B y 6A, B con 4A, B.

En la Figura 17 aparecen los resultados promedios para cuatro experimentos in vivo. En esta Figura, "control" representa el tratamiento 2. "Anti-sentido" representa el tratamiento 4. "Catalítico" representa el tratamiento 6 y "antecedentes" representa el tratamiento 1.

La ribozima catalítica inhibe la actividad de CAT un promedio de 47%, en comparación con una media de 34% para una ribozima de anti-sentido.

La introducción de genes portadores de ribozimas en células vegetales inhibe la actividad de los genes contra los que están dirigidos. Además, la inhibición es mayor que para las correspondientes moléculas de ARN anti-sentido.

Estos resultados demuestran que las ribozimas serán activas en células animales, vegetales o microbianas, contra una serie de moléculas de ARN diana.

Los mecanismos de acción de las ribozimas en este Ejemplo no están totalmente definidos. Por ejemplo, la ribozima anti-sentido puede hibridarse de forma irreversible a un ARN diana y catalizar la escisión del enlace fosfodiéster en uno o más puntos dianas seleccionados a lo largo del ARN diana. De forma alternativa, las enzimas celulares pueden devanar el ARN anti-sentido de su secuencia diana, de modo que el ARN diana sea escindido en dos o más fragmentos.

Ejemplo 9 Actividad in vitro de las ribozimas en células animales

En este ejemplo, se demuestra la actividad de las ribozimas en la inactivación de un ARN diana en células de mamífero.

Materiales y procedimientos

Las construcciones genéticas activas que codifican para ribozimas, fueron transfectadas mediante electroporación, en la línea celular de riñón de mono COSl, ampliamente disponible. En este procedimiento, se hicieron contactar 3 x 10^{6}/ml células COSl, suspendidas en una solución salina tamponada con FCS al 10% (suero de ternera fetal), con diversas construcciones genéticas, aplicando una descarga eléctrica para provocar la electroporación de ADN en las células. Las células transfectadas se incubaron a 37ºC durante 48 horas, en medio de cultivo, antes de ensayar su actividad de CAT y luciferasa.

Las construcciones genéticas de CAT fueron portadas sobre el plásmido designado pTK CAT (Miksicek y col., Cell 46: 283-290, 1986). Este plásmido se derivó de la introducción de una secuencia genética de CAT en el plásmido pSV2, de modo que está bajo el control del promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple.

Las construcciones genéticas que codifican para ribozimas fueron portadas sobre el plásmido pSV232A (De Wet y col., Molecular and Cellular Biology 7: 725-737, 1987), que contiene el gen de la luciferasa fundido con el promotor precoz SV40. El ADN que codifica para las ribozimas estaba ligado en el punto XbaI en el extremo 3' del gen de la luciferasa, de acuerdo con los procedimientos estándares de Maniatis y col. (Molecular Cloning, Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbour, 1982).

Se prepararon las siguientes construcciones empleando técnicas estándares de Maniatis y col (véase arriba):

pFC58-

Este vector plásmido contiene ADN que codifica para la ribozima RzCAT-1 fundida con el extremo 3' del gen de la luciferasa en una orientación no funcional.

Esto se puede representar de la forma siguiente:

10

donde 232A se refiere a las secuencias pSV232A, SV40 precoz se refiere al promotor precoz SV40 y T pequeña es ADN que codifica la secuencia interventora T pequeña de SV40. Esta construcción da como resultado la producción de una molécula de ARN que codifica para luciferasa y la ribozima RzCAT-1, estando esta última en una orientación tal que no se espera que sea catalítica.

pFC4-

Este plásmido es igual que pFC58, excepto que la RzCAT-1 está reemplazada por RzCAT-3.

pFC1-6-

Este plásmido es igual que pFC58, excepto que la RzCAT-1 está reemplazada por RzCAT-3 en la orientación de sentido (5'-3').

pFC20-

Este plásmido es igual que pFC1-6, excepto que la RzCAT-3 está reemplazada por RzCAT-2, con secuencias laterales de ocho nucleótidos.

pFC12-

Este plásmido es igual que pFC20, excepto que la ribozima RzCAT-2 contiene secuencias laterales de doce nucleótidos.

pFC50-

Este plásmido contiene el gen CAT con cuatro dominios de ribozimas catalíticas incluidos en su interior (véanse Ejemplo 4 y Figura 9) en el sentido de orientación (5'-3'), que en la transcripción da lugar a una ribozima inactiva. El plásmido se puede representar como a continuación:

11

pFC54-

Este plásmido es igual a pFC50, excepto que el gen CAT y los dominios de ribozimas están en la orientación activa de anti-sentido (3'-5').

pFC64-

Este plásmido comparte el promotor SV40 y las señales de poliadenilación con pFC50 y contiene el gen de CAT de tipo salvaje sin dominios de ribozimas insertados. Se halla en orientación anti-sentido y, por tanto, no produce proteína CAT.

pFC65-

Este plásmido es igual a pFC64, excepto que el gen CAT de tipo salvaje está en orientación de sentido (5'-3') y produce, por tanto, proteína CAT.

Ensayos

La actividad de luciferasa se ensayó de acuerdo con los procedimientos de De Wet y col. (véase antes). Resumidamente, se lisaron las células COS 48 horas después de la transfección y el lisado celular se incubó con luciferina, el sustrato de la luciferasa, y se detectó la luminiscencia usando un contador de escintilación.

La actividad de CAT se midió también usando lisados de células COS (los lisados celulares se dividieron en dos y cada porción se analizó bien para actividad de luciferasa, o bien de CAT), de acuerdo con el procedimiento de Sleigh, M.J., Anal. Biochem. 156: 251-256, (1986).

En los ensayos in vitro, pFC58 y pFC4 no provocaron actividad CAT en las células transfectadas. Esta actividad se designó actividad CAT 100% y supresión CAT 0%. La actividad CAT en las células transfectadas con otros plásmidos se midió en relación con pFC58. El porcentaje de supresión CAT se midió como

100 - (CAT_{prueba}/CAT_{control}) \ x 100

normalizada para la producción de luciferasa. CAT_{prueba} = CAT resultado del ensayo para las construcciones de prueba. CAT control = CAT ensayo para construcciones de control (pFC4 y pFC58).

La producción de luciferasa es un control interno de la electroporación y proporciona una medida de la producción de ribozimas dentro de cada placa de cultivo de tejido individualmente electroporado.

Resultados

Experimento (i)

ug de plásmido electroporado/1,5x10^{6} células

12

Todos los tratamientos se llevaron a cabo por duplicado, dando un valor promedio.

Experimento (ii)

ug plásmido electroporado/1,5x10^{6} células

13

Los tratamientos 5 a 10 se llevaron a cabo por duplicado, dando un valor promedio.

Experimento (iii)

ug plásmido electroporado/1,5x10^{6} células

14

Los tratamientos se llevaron a cabo por quintuplicado, dando un valor promedio.

Experimento (iv)

ug plásmido electroforado

15

Cada uno de los tratamientos 13 a 16 se llevaron a cabo por cuadruplicado.

La construcción CAT de sentido (tratamiento 16) produjo elevados niveles de actividad CAT en su propia derecha. Por lo tanto, el porcentaje de supresión no es aplicable (NA).

Se realizaron también numerosos experimentos con el promotor TK de pTKCAT sustituido por el promotor de metalotioneína humana. Cuando se cotransfectó esta construcción de CAT en células COS1 con plásmidos que codifican para una o más ribozimas, se observó un marcado descenso de la actividad CAT.

Los resultados anteriores demuestran claramente la actividad inactivadora in vivo de las ribozimas en células animales.

Mientras que la eficacia de las ribozimas in vivo se cree que está causada por una o más regiones catalíticas capaces de escisión de un ARN diana, la presencia de tales regiones en las ribozimas tipo ARN "anti-sentido" puede no conducir, en realidad, a la escisión in vivo si no se desintegra la totalidad de la molécula ARN/ARN anti-sentido. Sin embargo, independientemente de si la molécula se desintegra o no, los anteriores Ejemplos demuestran la eficacia de las ribozimas en la inactivación del ARN diana. Así, la invención es aplicable a todas las ribozimas que tienen una región catalítica capaz de provocar escisión y una región de hibridación, independientemente de si la escisión tiene lugar en el ARN diana. Es decir, la región de hibridación puede ser tan grande como para provocar que la combinación ARN/ribozima permanezca unida y evitar que el ARN diana sea escindido en componentes separados, aun cuando la región catalítica sea, por sí misma, capaz de provocar escisión.

Claims (22)

1. Un compuesto que tiene la fórmula:

16

en el que cada X representa un ribonucleótido que puede ser el mismo o diferente;

en el que cada uno de (X)_{n} y (X)_{n'} representa un oligorribonucleótido (a) capaz de hibridarse con una secuencia diana de ARN que se va a escindir y (b) definido por una secuencia predeterminada, la cual no se presenta, en la naturaleza, unida covalentemente a las secuencias C-A-A-A-G-C y X-C-U-G-A-, respectivamente, sin que tal secuencia diana de ARN esté presente dentro del compuesto;

en el que cada uno de n y n' representa un número entero que define el número de ribonucleótidos en el oligonucleótido, con la condición de que la suma de n + n' sea suficiente para permitir que el compuesto interactúe de forma estable con la secuencia diana de ARN a través de apareamiento de bases;

en el que cada * representa apareamiento de bases entre los ribonucleótidos situados a ambos lados del mismo;

en el que cada línea sólida representa un enlace químico que proporciona uniones covalentes entre los ribonucleótidos situados a ambos lados de la misma;

en el que cada una de m y m' representa un número entero que es igual o mayor que 1; y

en el que (X)_{b} representa un oligorribonucleótido que puede estar presente o ausente, con la condición de que b represente un número entero que sea igual o mayor que 2 si (X)_{b} está presente.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que la suma de n + n' es mayor que o igual a 14.

3. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en el que cada una de n y n' es mayor que 6.

4. Un compuesto que tiene la fórmula:

3'-[-(Y)_{r}-Q-(Y)_{s}-]_{z}-5'

en el que Q representa un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 o un compuesto que tiene la fórmula A:

17

en el que cada X representa cualquier ribonucleótido el cual puede ser el mismo o diferente;

en el que cada uno de (X)_{n} y (X)_{n} representa un oligorribonucleótido (a) capaz de hibridación con una secuencia de ARN diana para eliminarse y (b)definida mediante una secuencia predeterminada, secuencia la cual no se da en la naturaleza enlazada covalentemente a las secuencias A-A-A-G-C y X-C-U-G-A, respectivamente, no estando presente tal secuencia diana de ARN en el compuesto;

en el que cada n y n' representa un número entero el cual define el número de ribonucleótidos en el oligonucleótido a condición de que la suma de n + n' sea suficiente para permitir al compuesto interaccionar de forma estable con la secuencia diana de ARN a través del apareamiento de bases;

en el que cada (*) representa un apareamiento de bases entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma;

en el que cada línea sólida representa una unión química que proporciona enlaces covalentes entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma;

en el que a representa un número entero el cual define un número de ribonucleótidos, con la condición de que a pueda ser 0 ó 1, y si es 0 la A situada 5' de (X)_{a} se una a la G situada 3' de (X)_{a};

en el que cada m y m' representa un número entero el cual es mayor o igual a 1;

en el que cada línea de guiones representa independientemente tanto una unión química que proporciona enlaces covalentes entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma o la ausencia de cualquier unión química tal, y

en el que (X)_{b} representa un oligorribonucleótido el cual puede estar presente o ausente con la condición de que b represente un número entero el cual es mayor que o igual a 2 si (X)_{b} está presente,

en el que cada Y representa un ribonucleótido el cual puede ser el mismo o diferente;

en el que cada r y s representa un número entero el cual puede ser mayor que o igual a 0, y

en el que z representa un número entero mayor que 1.

5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, ó 4 en el que la secuencia del ARN diana a escindirse es una secuencia de ARN vírico.

6. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, en asociación con un vehículo farmacéuticamente, veterinariamente, o agrícolamente aceptable.

7. Un procedimiento para producir el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, el cual comprende las etapas de:

(a)

ligar en un vector de transferencia formado por ADN, ARN o una combinación de ellos, una secuencia de nucleótidos que corresponde al citado compuesto;

(b)

transcribir la secuencia de nucleótidos de la etapa (a) con una ARN polimerasa; y

(c)

recuperar el compuesto.

8. Un vector de transferencia formado por ARN o ADN o una combinación de ambos, que contiene una secuencia de nucleótidos que, en la transcripción, da lugar al compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, ó 5.

\newpage

9. Una composición la cual comprende el vector de transferencia de la reivindicación 8 en asociación con un vehículo farmacéuticamente, veterinariamente, o agrícolamente aceptable.

10. Una célula procariota o eucariota que comprende una secuencia de nucleótidos la cual es, o da lugar en transcripción, al compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, ó 5.

11. Una célula eucariota de la reivindicación 10.

12. Una célula vegetal o animal de la reivindicación 11.

13. Una planta que comprende la célula vegetal de la reivindicación 12.

14. Un procedimiento para inactivar un ARN diana en una célula, distinta de una célula en hombre o animal, el cual comprende poner en contacto el ARN diana dentro de la célula con el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, o un compuesto que tiene la fórmula A:

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18

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en el que cada X representa cualquier ribonucleótido el cual puede ser el mismo o diferente;

en el que cada uno de (X)_{n} y (X)_{n} representa un oligorribonucleótido (a) capaz de hibridación con una secuencia de ARN diana para eliminarse y (b) definida mediante una secuencia predeterminada, secuencia la cual no se da en la naturaleza enlazada covalentemente a las secuencias A-A-A-G-C y X-C-U-G-A, respectivamente, no estando presente tal secuencia diana de ARN en el compuesto;

en el que cada n y n' representa un número entero el cual define el número de ribonucleótidos en el oligonucleótido a condición de que la suma de n + n' sea suficiente para permitir al compuesto interaccionar de forma estable con la secuencia diana de ARN a través del apareamiento de bases;

en el que cada (*) representa un apareamiento de bases entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma;

en el que cada línea sólida representa una unión química que proporciona enlaces covalentes entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma;

en el que a representa un número entero el cual define un número de ribonucleótidos, con la condición de que a pueda ser 0 ó 1, y si es 0 la A situada 5' de (X)_{a} se una a la G situada 3' de (X)_{a};

en el que cada m y m' representa un número entero el cual es mayor o igual a 1;

en el que cada línea de guiones representa independientemente tanto una unión química que proporciona enlaces covalentes entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma o la ausencia de cualquier unión química tal, y

en el que (X)_{b} representa un oligorribonucleótido el cual puede estar presente o ausente con la condición de que b represente un número entero el cual es mayor que o igual a 2 si (X)_{b} está presente, en el que el compuesto es capaz de interactuar a través de apareamiento de bases con la secuencia del ARN diana bajo condiciones tales, que el compuesto interactúa de forma estable a través de apareamiento de bases con el ARN diana y el ARN diana se escinde.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el ARN diana es una transcripción de un gen que es endógeno para la célula.

16. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el ARN diana es una transcripción de un gen que es exógeno para la célula.

17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 14, 15 ó 16, en el que la célula es procariota o eucariota.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que la célula es una célula vegetal o animal.

19. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que la célula vegetal es un componente de una planta.

20. Uso del compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, o un compuesto que tiene la fórmula A:

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19

\vskip1.000000\baselineskip

en el que cada X representa cualquier ribonucleótido el cual puede ser el mismo o diferente;

en el que cada uno de (X)_{n} y (X)_{n} representa un oligorribonucleótido (a) capaz de hibridación con una secuencia de ARN diana para eliminarse y (b) definida mediante una secuencia predeterminada, secuencia la cual no se da en la naturaleza enlazada covalentemente a las secuencias A-A-A-G-C y X-C-U-G-A, respectivamente, no estando presente tal secuencia diana de ARN en el compuesto;

en el que cada n y n' representa un número entero el cual define el número de ribonucleótidos, con la condición de que la suma de n + n' sea suficiente para permitir al compuesto interaccionar de forma estable con la secuencia diana de ARN a través del apareamiento de bases;

en el que cada (*) representa un apareamiento de bases entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma;

en el que cada línea sólida representa una unión química que proporciona enlaces covalentes entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma;

en el que a representa un número entero el cual define un número de ribonucleótidos en el oligonucleótido a condición de que a pueda ser 0 ó 1, y si es 0 la A situada 5' de (X)_{a} se una a la G situada 3' de (X)_{a};

en el que cada m y m' representa un número entero el cual es mayor o igual a 1;

en el que cada línea de guiones representa independientemente tanto una unión química que proporciona enlaces covalentes entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma o la ausencia de cualquier unión química tal,
y

en el que (X)_{b} representa un oligorribonucleótido el cual puede estar presente o ausente con la condición de que b represente un número entero el cual es mayor que o igual a 2 si (X)_{b} está presente, o del vector de transferencia de la reivindicación 8 o de un vector de trasferencia constituido por ARN o ADN o una combinación de los mismos que contiene una secuencia de nucleótidos la cual en transcripción da origen al compuesto que tiene dicha fórmula A en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una afección asociada con un ARN diana en hombre o animales.

21. Uso de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, ó 5 o un compuesto que tiene la fórmula A:

20

en el que cada X representa cualquier ribonucleótido el cual puede ser el mismo o diferente;

en el que cada uno de (X)_{n} y (X)_{n} representa un oligorribonucleótido (a) capaz de hibridación con una secuencia de ARN diana para eliminarse y (b) definida mediante una secuencia predeterminada, secuencia la cual no se da en la naturaleza enlazada covalentemente a las secuencias A-A-A-G-C y X-C-U-G-A, respectivamente, no estando presente tal secuencia diana de ARN en el compuesto;

en el que cada n y n' representa un número entero el cual define el número de ribonucleótidos en el oligonucleótido a condición de que la suma de n + n' sea suficiente para permitir al compuesto interaccionar de forma estable con la secuencia diana de ARN a través del apareamiento de bases;

en el que cada (*) representa un apareamiento de bases entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma;

en el que cada línea sólida representa una unión química que proporciona enlaces covalentes entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma;

en el que a representa un número entero el cual define un número de ribonucleótidos en el oligonucleótido, con la condición de que a pueda ser 0 ó 1, y si es 0 la A situada 5' de (X)_{a} se una a la G situada 3' de (X)_{a};

en el que cada m y m' representa un número entero el cual es mayor o igual a 1;

en el que cada línea de guiones representa independientemente bien una unión química que proporciona enlaces covalentes entre los ribonucleótidos situados en cada lado de la misma o la ausencia de cualquier unión química tal, y

en el que (X)_{b} representa un oligorribonucleótido el cual puede estar presente o ausente con la condición de que b represente un número entero el cual es mayor que o igual a 2 si (X)_{b} está presente, o del vector de transferencia de la reivindicación 8 o de un vector de trasferencia constituido por ARN o ADN o una combinación de los mismos que contiene una secuencia de nucleótidos la cual en transcripción da origen al compuesto que tiene dicha fórmula A en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una afección asociada con un ARN diana en plantas.

22. Uso del compuesto de cualquiera de la reivindicación 5 o de un vector de transferencia el cual da origen en transcripción a tal compuesto, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad vírica en el hombre o animales.