HU211891A9 - Ribozymes - Google Patents
Ribozymes Download PDFInfo
- Publication number
- HU211891A9 HU211891A9 HU95P/P00362P HU9500362P HU211891A9 HU 211891 A9 HU211891 A9 HU 211891A9 HU 9500362 P HU9500362 P HU 9500362P HU 211891 A9 HU211891 A9 HU 211891A9
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- rna
- ribozyme
- ribonucleotides
- sequence
- target rna
- Prior art date
Links
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 title claims abstract description 209
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 202
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 title claims abstract description 200
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 160
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 56
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 56
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 81
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 74
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 41
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 35
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 35
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 22
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 20
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 19
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 19
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 11
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 9
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 3
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 19
- 108091027075 5S-rRNA precursor Proteins 0.000 claims 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 50
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 abstract description 10
- 102100030011 Endoribonuclease Human genes 0.000 abstract description 8
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 75
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 48
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 31
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 22
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 19
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 19
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 17
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 13
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 6
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 5
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 5
- 108020005543 Satellite RNA Proteins 0.000 description 5
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 241001428638 Tobacco ringspot virus satellite RNA Species 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000726311 Citrus exocortis viroid Species 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 4
- 101100348617 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) NIK1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000724705 Lucerne transient streak virus Species 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 3
- 101100007329 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 3
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 102000002494 Endoribonucleases Human genes 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000002358 autolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 230000002245 ribonucleolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- GGKNTGJPGZQNID-UHFFFAOYSA-N (1-$l^{1}-oxidanyl-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl)-trimethylazanium Chemical compound CC1(C)CC([N+](C)(C)C)CC(C)(C)N1[O] GGKNTGJPGZQNID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039601 ARF GTPase-activating protein GIT1 Human genes 0.000 description 1
- 101710194905 ARF GTPase-activating protein GIT1 Proteins 0.000 description 1
- 102100039602 ARF GTPase-activating protein GIT2 Human genes 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Ala-Gly Chemical group C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001452028 Escherichia coli DH1 Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101710081758 High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208133 Nicotiana plumbaginifolia Species 0.000 description 1
- 241000228669 Nicotiana velutina Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000264479 Persea americana guatemalensis Species 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108091006231 SLC7A2 Proteins 0.000 description 1
- 108020004487 Satellite DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000214911 Solanum americanum Species 0.000 description 1
- 235000019048 Solanum nodiflorum Nutrition 0.000 description 1
- 206010064127 Solar lentigo Diseases 0.000 description 1
- 241000248384 Tetrahymena thermophila Species 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000863814 Thyris Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- BWVHQINTNLVWGZ-ZKWXMUAHSA-N Val-Cys-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N BWVHQINTNLVWGZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 230000006266 hibernation Effects 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
- A01N57/10—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds
- A01N57/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds containing heterocyclic radicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/60—Isolated nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/121—Hammerhead
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/124—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes based on group I or II introns
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
A jelen találmány szintetikus RNS molekulák egyik osztályával és ezen molekulák származékaival foglalkozik; ezeket az RNS molekulákat a továbbiakban ribozimoknak nevezzük, amelyek rendkívül speciális endoribonukleáz aktivitással bírnak.
Számos természetben előforduló RNS molekula, pl. az avokádó napfolt viroid (ASBV), a dohány gyűrűs folt vírus szatellit RNS-ei (sTobRV) és a lucerna átmeneti csíkozó vírus (sLTSV), átmegy ön-katalizált hasadáson. Az ilyen hasadás, úgy tűnik, eszenciális és egyedi része ezen RNS-ek és más RNS-ek életciklusának.
Az ön-katalizált RNS hasítási reakcióknak van egy közös követelményük, a kétértékű fémionok jelenléte; és semleges vagy ennél nagyobb pH szükséges. A reakció 5’hidroxil és 2’, 3’-ciklikus foszfát vég csoportokkal bíró RNS előállítását eredményezi [Prody és munkatársai; Science 231. 1577-1580 (1986); Buzayan és munkatársai: Virology 151, 186-199 (1986)]. A hasítási reakciót maga az RNS katalizálja, valószínűleg olyan konformáció eredményeképpen, amely a reaktív csoportokat szoros közelségbe hozza egymáshoz. Az ön-katalizált hasítás helyei a természetben előforduló RNS-ekben az RNS szekunder szerkezetének nagymértékben megőrzött területein belül helyezkednek el [Buzayan és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83. 8859-8862 (1986); Forster A. C. és Symons R. H. Cell. 50, 9-16(1987)].
A dohány gyűrűs folt vírus (sTobRV) szatellit RNSein végzett kísérleteink új endoribonukleázok tervezéséhez vezettek (ezeket a későbbiekben „ribozim”-oknak nevezzük), vagyis olyan enzimekhez, amelyek RNS célmolekulák specifikus hasítását katalizáló RNS-ből állnak.
Cech endoribonukleáz továbbá módosítja is az RNS-t, szabad guanozin nukleotidot adva a hasított RNS 5'végéhez.
Ezzel ellentétben a jelen találmány ribozimjai hatékonyan hibridizálnak cél-RNS szekvenciák széles skálájához, és nem módosítják a hasított cél-RNS-t.
A jelen találmány szerinti ribozimok tartalmaznak egy hibridizáló területet, amely nukleotid szekvenciájában komplementer egy cél-RNS legalább egy részével, és egy katalitikus területet, amely adaptálódik, hogy elhasítsa a cél-RNS-t. A hibridizáló terület 9 vagy több nukleotidot tartalmaz.
Egy előnyös szempont szerint a jelen találmány ribozimjai olyan hibridizáló területtel rendelkeznek, amely egyszálú RNS-ből képzett egy vagy több kart tartalmaz, és olyan szekvenciával bír, amely komplementer a cél-RNS legalább egy részével, ahol az említett egy vagy több kar egy olyan katalitikus területtel társul, amely képes elhasítani az említett cél-RNS-t; és ahol a hibridizáló terület az RNS egy egyedi karját tartalmazza, amely kar legalább 9 nukleotidot tartalmaz, és ahol a hibridizáló terület az RNS 2 vagy több karját tartalmazza, itt a nukleotidok összege az említett karokban 9 nukleotidnál több.
A jelen találmány egyik előnyös kiviteli formájában az (1) képletű ribozimot állítjuk elő:
ahol a képletben X jelentése bármely ribonukleotid
A „ribozim” kifejezés, ahogyan a leírásban alkalmazzuk, olyan molekulákra vonatkozik, amelyek teljes egészében RNS-ből vagy ennek származékaiból állnak.
A jelen találmány ribozimjai különböznek azoktól az RNS endoribonukleázoktól, amelyek a természetben, a Tetrahymena thermophila-ban fordulnak elő (ezek IVS, vagy L-19 IVS RNS-ként ismertek), és amelyeket részletesen ismertettek Cech Thomas és munkatársai [Zaug A. J. és munkatársai: Science 224, 574-578 (1984); Zaug A. J. és Cech T. R„ Science 231, 470-475 (1986); Zaug A. J. és munkatársai: Natúré 324, 429-433 (1986); WO 88/04300 számon publikált PCT közzétételi irat (University Patent Inc.)]
A Cech endoribonukleáznak van egy nyolc bázispáros aktív helye, amely hibridizál egy cél-RNS szekvenciával, ami után a cél-RNS hasítása megtörténik, és ez szabad guanozint vagy guanozin származékot igényel. Azok a fragmentumok, amelyek a hasításkor keletkeznek, 5’ terminális foszfátot és 3’ terminális hidroxilcsoportot tartalmaznak. A valamely RNS szubsztrátunhoz való hibridizáláshoz rendelkezésre álló nukleotidok korlátozott száma határt szab a Cech endoribonukleáz hatékonyságának vagy hatásfokának, mivel általában a húsznál kevesebb nukleotidot tartalmazó oligonukleotidok gyengén hibridizálnak a célszekvenciákhoz. gy tűnik, hogy a nukleotidok egy bizonyos száma is szükséges a Cech endoribonukleáz aktív helyén, hogy megőrződjék a hatékony endoribonukleáz aktivitás. Ez korlátozza az aktív hely szekvenciák sorrendváltoztatási lehetőségének számát, amelyeket a célszekvenciához való hatékony hibridizáláshoz tervezhetünk, ezáltal korlátozva van a Cech endoribonukleáz által hasítható cél-RNS szekvenciák tartománya. A
3’ 5’ /x/rx X/X/n, /1/ Λ C /1/
A τ U
G AG /11/ /1/
C > G G Λ
I ( *
X’ X”
5’ 3’ és az egyes X gyökök lehetnek azonosak vagy különbözők; az n és n' összege nagyobb, mint 6 és n és n’ lehet azonos vagy különböző; a * valamely bázispárt képvisel komplementer ribonukleotidok között; X’ és X” legalább hosszúságuk egy része mentén komplementer szekvencia oligonukleotidjait képviselik, hogy lehető legyen a bázispárképzés az oligonukleotidok között, vagy X’ és X” együtt egyedi RNS szekvenciát képeznek, ahol az említett szekvencia legalább egy
HU 211 891 A9 része komplementer nukleotidok közti bázispárképzéssel kialakított nyélből áll; és kívánt esetben egy további A, G, C vagy U nukleotid lehet beiktatva az *A után az (1) képletben.
Az (1) képlet (I) területe egy ribozim olyan karjait vagy szegélyező szekvenciáit képviseli, amelyek egy cél-RNS szekvencia megfelelő részeihez hibridizálnak. A karok hibridizálhatnak a cél-RNS teljes hossza mentén, vagy csak egy része mentén. Egy RNS katalitikus területet mutat be az (1) képlet (II) területe, A katalitikus terület tartalmazhat egy vagy több további nuldeotidot, amelyek nem befolyásolják károsan a katalitikus aktivitást. Az ilyen toldalékokat könnyen meg lehet vizsgálni ribozim aktivitásra túl nagy kísérleti munka nélkül, követve a leírás kitanítását. A katalitikus terület képezheti a hibridizáló terület egy részét is.
Az X’ és X” oligonukleotidok 5000 vagy több nukleotidot tartalmazhatnak.
Ajelen találmány egy másik előnyös kiviteli formájában a (2) képletű ribozimot állítjuk elő:
3’5' (X)„A X(X)n.
A C
A U θ * A G
A*G G A (2)
X *xx
X *x (X)m *(X)m·
XX
B ahol a képletben X jelentése bármely ribonukleotid és az egyes X gyökök lehetnek azonosak vagy különbözők; a * valamely bázispárt képvisel komplementer ribonukleotidok között; n és n’ a korábbi képletnél megadott jelentésűek; m és m’ jelentésé 1 vagy több és lehetnek azonosak vagy különbözők; B egy kötést, egy bázispárt, egy ribonukleotidot, vagy egy legalább 2 ribonukleotidot tartalmazó öligoribonukleotidot jelent, és kívánt esetben egy további A, G, C vagy U nukleotid lehet beiktatva az 'A után a (2) képletben.
A jelen találmány szerinti ribozimokat a szakterületen az RNS molekulák sziptéziséhez ismert eljárásokkal állíthatjuk elő. [Ilyen pl. A Promega (Madison, Wisconsin, USA) által javasolt munkamenet.]
A jelen találmány szerinti ribozimokat elsősorban megfelelő DNS szekvenciákból állíthatjuk elő. [Ilyen pl. A Promega (Madison, Wisconsin, USA) által javasolt munkamenet.] A jelen találmány szerinti ribozimokat elsősorban megfelelő DNS szekvenciákból állíthatjuk elő (DNS, amely átíráskor ribozimot termel, és amelyet a DNS szintézisére a szakterületen ismert eljárások szerint szintetizálhatunk), amely DNS szekvenciák működőképesen kapcsolódnak egy RNS polimeráz promotorhoz, pl. a T7 RNS polimeráz promotorjához vagy az SP6 RNS polimeráz promotorjához. Egy jelen találmány szerinti ribozimnak megfelelő DNS szekvenciát ligálhatunk egy DNS transzfer vektorba, pl. egy plazmid- vagy bakteriofág DNS-be. Ahol a transzfer vektor egy RNS polimeráz promotort tartalmaz működőképesen összekapcsolva egy ribozimnak megfelelő DNS-hez, a ribozimot kényelmesen előállíthatjuk egy RNS polimerázzal való inkubálással. A ribozimokat ennek megfelelően in vitro állíthatjuk elő RNS polimeráz inkubálásával valamely, egy ribozimnak megfelelő DNS-hez működőképesen kapcsolt RNS polimeráz promotorral, ribonukleotidok jelenlétében. Prokarióta vagy eukarióta sejteket (beleértve az emlős és növényi sejteket) átfertőzhetünk megfelelő transzfer vektorral, amely egy, a jelen találmány szerinti ribozimnak megfelelő genetikai anyagot tartalmaz működőképesen összekapcsolva egy RNS polimeráz promotorral, olyannal, amellyel a ribozim átíródik a gazdasejtben. A transzfer vektorok lehetnek bakteriális plazmidok, vagy vírus RNS-ek vagy DNS-ek. A ribozimoknak megfelelő nukleotid szekvenciák általában erős promotorok szabályozása alatt helyezkednek el, ilyenek pl. a lac, aV40 késői, SV40 korai, metallotionin, vagy λ promotorok. A ribozimok közvetlenül átíródhatnak in vivő egy transzfer vektorból, vagy egy másik eljárás szerint átíródhatnak egy nagyobb RNS molekula részeként. így pl. ribozim szekvenciáknak megfelelő DNS-t ligálhatunk egy hordozó gén 3’ végébe, pl. egy transzlációs stop szignál után. Nagyobb RNS molekulák segíthetnek stabilizálni a ribozim molekulákat a nukleázos emésztés ellen a sejten belül. Transzlációkor a hordozó gén egy olyan fehérjét alakíthat ki, amelynek jelenléte közvetlenül kimutatható pl. enzimes reakcióval. A hordozó gén pl. kódolhat egy enzimet.
A jelen találmány egy további szempontja szerint olyan DNS transzfer vektort állítunk elő, amely egy ribozimnak megfelelő DNS szekvenciát tartalmaz működőképesen kapcsolva valamely promotorhoz, hogy a ribozim transzkripciója létrejöjjön.
A ribozim előállításának egyik előnyös eljárásában a komplementer szekvencia két szintetikus oligonukleotidját állítjuk elő standard eljárásokkal [pl. az Applied Biosystems Model 38OA DNA Synthesizer berendezést (Applied Biosystems Inc., Foster City, California 94404) alkalmazva], és összehibridizáljuk ezeket. Az oligonukleotidok egyike egy kívánt ribozimot kódol. A hibridizált oligonukleotidok megfelelő végei különböző restrikciós enzimhelyeknek felelnek meg, nevezetesen EcoRI helynek az egyik és PstI helynek a másik végén. A megfelelő restrikciós enzimekkel (a fenti példában EcoRI-gyel és Pstl-gyel) végzett hasítás után a kettős szálú DNS fragmentumot valamely transzfer vektorba klónozhatjuk. Ahol a plazmid vektor tartalmaz egy RNS polimeráz promotort a jelen találmány valamely ribozimjának DNS szekvenciájától felfelé, könnyen állíthatunk elő a ribozimnak megfelelő RNS átiratokat akár in vivő, akár in vitro. Ahol a ribozim két félből áll, amelyeket komplenenter nukleotidok közti bázispárképzés tart össze, a ribozimok egyes feleit a fenti eljárások szerint állíthatjuk elő, és a feleket együtt inkubálhatjuk, hogy a ribozimot kialakítsuk.
A jelen találmány szerinti előnyös ribozimok olyan cél-RNS-eket hasítanak, amelyek tartalmazzák az X0' UY szekvenciát, ahol X° jelentése bármilyen ribonuk3
HU 211 891 A9 leolid, U jelentése uracil, és Y jelentése adenin, citozin vagy uracil. Az X°U egy bázispár szegélyező terület részét képezi, míg nem tagja bázispámak. Előnyösen, de semmiképpen sem kizárólagosan, X° jelentése guanidin, és X°UY jelentése GUC vagy GUA. Bármelyik RNS molekula, amely tartalmazza ezeket a szekvenciákat, elhasítható a jelen találmány szerinti ribozimokkal. Ha egy X°UY szekvenciát tartalmazó RNS átirat szekvenciáját meghatároztuk, a ribozim szekvencia karjait szintetizálhatjuk, hogy komplementerek és így hibridizálhatók legyenek az X°UY szekvenciát szegélyező célszekvencián levő RNS-hez. A ribozim karjainak hibridizációja után az X°UY szekvenciát szegélyező cél-RNS szekvenciához, a ribozim katalitikus területe elhasítja a cél-RNS-t az X°UY szekvencián belül. Az RNS hasítását megkönnyíti magnézium vagy más kétértékű kation jelenléte mintegy 8,0 pH értéken.
A jelen találmány előnyös ribozimjait tehát úgy lehet tervezni, hogy elhasítson bármilyen RNS-t, amelynek szekvenciája ismert. A ribozimok által elhasított gyökök nagy gyakorisága az RNS-ben (1:64 GUC-ra nézve valamely RNS-ben a bázis-eloszlás véletlenszerű és azonos gyakorisága mellett) azt jelenti, hogy a ribozimos hasításhoz alkalmas lehetséges helyek számát biztonsággal meg lehet jósolni bármilyen adott cél-RNS-ben.
A jelen találmány egy másik szempontja szerint eljárást nyújtunk egy cél-RNS szekvencia inaktiválására. amely eljárás abból áll, hogy az említett cél-RNS szekvenciát valamely jelen találmány szerinti ribozimmal reagáltatunk.
In vivő, vagyis egy organizmus sejtjén vagy sejtjein belül, egy transzfer vektort, pl. valamely bakteriális plazmidot vagy vírus RNS-t vagy DNS-t, amely egy van több ribozimot kódol, átfertőzhetünk sejtekbe [Llewellyn és munkatársai: J. Mól. Bioi. 195, 115-123 (1987); Hanahan és munkatársai: J. Mól. Bioi. 166 (1983)]. Amikor már a sejten belül van, a transzfer vektor replikálódhat és a celluláris polimerázok révén átíródhat, hogy olyan ribozim RNS-ek keletkezzenek, amelyek azután inaktiválnak egy kívánt cél-RNS-t. Egy másik eljárás szerint egy vagy több ribozim szekvenciát tartalmazó transzfer vektort át lehet fertőzni sejtekbe vagy mikromanipulációs technikákkal, pl. mikroinjekcióval be lehet vezetni sejtekbe úgy, hogy a transzfer vektor vagy egy része integrálódjék a gazdasejt genomjába. Az integrált genetikai anyag átírása létrehozza a ribozimokat, amelyek azután működésbe lépnek, hogy inaktiválják a kívánt cél-RNS-t.
A jelen találmány szerinti ribozimok kiterjedt gyógyászati és biológiai alkalmazásokat nyerhetnek. Úgy pl. emberekben és állatokban betegségokozó vírusokat inaktiválhatunk olyan módon, hogy a vírussal fertőzött emberbe vagy állatba egy jelen találmány szerinti ribozimot vezetünk be, amely arra van adaptálva, hogy hibridizálódjék a vírus RNS átirataihoz és elhasítsa azokat. Az ilyen ribozimokat beadhatjuk parentálisan vagy más módon. Egy másik eljárás szerint egy betegségokozó vírussal fertőzött emberbe vagy állatba bevezethetünk egy nem virulens vírust, pl. vaccinia- vagy adenovírust, amelyet genetikai manipulációs eljárásokkal olyan módon alakítottunk át, hogy tartalmazza a ribozimnak megfelelő DNS-t működőképesen összekapcsolva valamely RNS promotorral úgy, hogy a ribozim átíródjék a manipulált vírussal fertőzött gazdaállat sejtjeiben, így a betegségokozó vírus cél-RNS átiratának hatékony hasítása és/vagy inaktiválása következik be. A jelen találmány szerinti ribozimok különösen olyan vírusos betegségekhez alkalmazhatók, amelyeket pl. a herpes simplex vírus (HSV) vagy az AIDS vírus (HÍV) okoz.
A jelen találmány szerinti ribozimok ott is különleges jelentőséggel alkalmazhatók, ahol RNS átiratokat kell inaktiválni baktériumokban és más prokarióta sejtekben, növényekben és állatokban. Baktériumokban pl. a baktériumok pusztulását okozó bakteriofágok RNS átiratait inaktiválhatjuk olyan módon, hogy sejtet átfertőzünk olyan DNS transzfer vektorral, amely képes valamely, a fág RNS-t inaktiváló ribozimot termelni a jelen találmány szerint. Egy másik eljárás szerint a ribozimot magát adhatjuk a bakteriális sejtekhez, hogy befogadják ezt, és így hatásosan megtörténhet a fág RNS hasítása.
A növényekben levő RNS átiratokat úgy inaktiválhatjuk, hogy egy transzfer vektor, pl. az Agrobacterium tumefaciens Ti plazmidja által kódolt ribozimokat alkalmazunk. Amikor az ilyen vektorokat valamely növényi sejtbe fertőzzük át, az RNS polimeráz hatására ribozimok termelődnek és a fajlagos cél-RNS szekvencia hatékony hasítása következhet be. Következésképpen azokat a növényi vírusokat, amelyek RNS szekvenciája ismert, vagy növényi gének RNS átiratait inaktiválhatjuk ribozimok alkalmazásával.
Növényekben, állatokban vagy más sejttípusokban levő endogén gén átiratokat ínaktiválhatunk a jelen találmány ribozimjait alkalmazva. Következésképpen a nem kívánatos fenotípusokat vagy jellemzőket módosíthatjuk. így pl. lehetséges a jelen találmány szerinti ribozimokkal magokat eltávolítani gyümölcsökből, vagy örökletes betegségeket kezelni emberekben, amely örökletes betegségeket káros fehérje termelése vagy egy adott fehérje túltermelése okoz.
A jelent találmányt ezután nem korlátozó jellegű példákon mutatjuk be, utalva a példák és az ábrák számára.
Az alábbiakban először röviden ismertetjük az ábrákat.
Az 1. ábra vad típusú és mutált RNS-ek RNS-önhasító helyeit mutatja be; bemutat továbbá egy elektroforetikus profilt, amely az ön-katalizált RNS hasítási termékeket ábrázolja.
(a) Összefoglalja a természetben előforduló RNS hasítási helyekkel társult megőrzött szerkezeteket ASBV-ben, új szatellit DNS átiratokban és az sTobRV, LTSV, bársony dohányfolt vírus, Solarum nodiflorum folt vírus és föld alatti lóherefolt vírus szatellit RNS-eiben. Bemutatja azokat a szekvenciákat, amelyek megőrződnek ezek között a szerkezetek között, míg a többieket X jel képviseli. A bázispárképzést * jel képviseli. és az RNS hasítására szolgáló helyet nyíl mutatja.
HU 211 891 A9 (b) Bemutatja az sTobRV RNS (+) szálának hasításával társult, megőrzött nukleotid szekvenciát. A hasítási helyet nyíl jelöli.
(c) Bemutatja az sTobRV-nek nyolc nukleotid beiktatását (keretben bemutatva) tartalmazó in vitro mutánsát három nukleotid (UGU gyökök 7-től 9-ig) szegélyező duplikátumával.
(d) A vad típusú sTobRV és a D-51 in vitro mutáns szubklónozott HaelII fragmentumai át vannak írva mind a (+), mind a (-) orientációban és a radioaktívan jelzett átiratok frakciónál va vannak poliakrilamid gélelektroforézissel. A nem hasított 159 és 170 bázisos átiratok helyzetei a vad típusú (WT) illetve mutáns (D-51) szekvenciákból nyíllal vannak jelölve; a hasítási termékek méretei is be vannak mutatva.
A 2. ábra egy ribozim nukleotid szekvenciáját mutatja be, és egy ribozim hasítás termékeit gélelektroforézissel elkülönítve.
(a) A D-51 mutánsban (l.c. ábra) levő beiktatott nukleotidok tartalmaznak egy BamHI restrikciós endonukleáz helyet. A BamHI-t arra alkalmazzuk, hogy elhasítsa a mutáns DNS-t, és a két szekvenciát szubklónozzuk és külön-külön átírjuk in vitro. Vázlatosan bemutatjuk az RNS átiratokat a lehetséges bázispárképzésekkel az RNS-ek között, amelyeket * jellel jelölünk. A hasításhoz szolgáló, nyíllal jelzett helyet tartalmazó fragmentumot S-RNS-nek nevezzük, a ribozimot tartalmazó fragmentumot Rz-RNS-nek nevezzük.
(b) 32P-Rz-RNS-t (101 bázis) inkubálunk egyedül (1. csík) és nem jelzett S-RNS-sel (2. csík). [32P]-SRNS-t indukálunk egyedül (3. csík), és nem jelzett és 32P-jelzett Rz-RNS-ekkel (4. illetve 5. csíkok).
A 3. ábra a jelen találmány egyik kiviteli formája szerinti ribozim vázlatos modelljét mutatja be. Az A terület képviseli a hasítási helyet a cél-RNS-en belül. AB terület egy katalitikus területet képvisel, és a C terület a ribozim karjait képviseli.
A 4. ábra a CAT (klóramfenikol acetil transzferáz) gén átirat ellen irányuló ribozimok tervezését mutatja be. Az RzCAT-1, -2 és -3-nak nevezett ribozimok a CAT gén 835 bázispáros in vitro átiratán belül három hely ellen irányulnak. A hasítási helyek relatív elhelyezkedését az átiraton vázlatosan mutatjuk be az (a)-val jelzett szegélyező bázisokkal. Bemutatjuk a három ribozim szekvenciát [(b)-től (d)-ig] cél-szekvenciáikkal együtt. A CAT génnek megfelelő aminosav-szekvenciákat számozzuk és az RNS-hasítás megjósolt helyeit nyíllal jelöljük. Az RzCAT-1 és -3 24 bázisszekvenciát tartalmaznak, amelyek az sTobRV (+) szálából származnak (3. ábra, B terület), míg az RzCAT-2 egy egyedi U-A cserét tartalmaz ebben a területben.
Az 5. ábra a CAT RNS hasításának eredményeit mutatja be RzCAT-1, -2 és -3 ribozimokkal.
(a) A [32P]-CAT RNS-ek gélen vannak frakcionálva inkubálás után egyedül (-) vagy a három ribozim (RzCAT-1, -2 és -3) valamelyikével (1., 2., illetve 3.
csíkok). A teljes hosszúságú átirat elhelyezkedése nyíllal van bemutatva.
(b) 5’-terminális bázis elemzés. A CAT mRNS ribozimos hasításával előállított 3’ fragmentumokat [5’32P]-kinázos kezelésnek vetjük alá, gélen tisztítjuk, komplett nukleázos emésztésnek vetjük alá és a kibocsátott terminális gyököket pH 3,5-nél végzett poliakrilamid gél-elektroforézissel frakcionáljuk. Az 5’-terminális nukleotidok, amelyeket markerekhez (M csík) viszonyítva határozunk meg, A, U, illetve G az RzCAT-l-gyel, -2-vel, illetve -3-mal előállított fragmentumoknál (1., 2., illetve 3. csíkok).
A 6. ábra a ribozim (RzCAT-1) katalitikus aktivitás időbeli lefolyását mutatja be CAT RNS ellen. A 139 nukleotidos hasítási termék mennyiségét mennyiségileg meghatározzuk és függvényben ábrázoljuk. A betét bemutatja a 139 bázisos fragmentum felgyülemlését az idő függvényében, poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgálva.
A 7. ábra a CAT RNS relatív hasítási sebességeit mutatja be különböző hőmérsékleti körülmények között. A szubsztrátum RNS-t folyamatos vonal képviseli. Az egyes esetekben a hasítási termékeket szaggatott vonal képviseli.
A 8. ábra három ribozimot ábrázol (amelyek az RzCAT-2-nek felelnek meg), amelyek különböző hosszúságú karokkal vagy szegélyező szekvenciával bírnak.
A 9. ábra egy olyan ribozim előállításának vázlatát mutatja be, amely az RzCAT-1, -2, -3 hasítási tartomány mindegyikét tartalmazó katalitikus anti-sense RNS-t tartalmaz.
A 10. ábra olyan ribozimokat mutat be, amelyek a GUA (10 a) és GUU (10 b) motívumokat tartalmazó célszekvenciákhoz hibridizálnak a CAT mTNS-ben.
All. ábra az ön-katalizált RNS hasítás helyeit mutatja be citrus exorortis viroid (CEV) RNS-ben és komplementjében.
A 12. ábra az RzCEV25x(+) ribozimot mutatja be, amely a cél CEV RNS-hez (a) van hibridizálva, és bemutatja az RzCEV25x(+)-szal inkubált (+) CEV RNS és (-) CEV RNS gél-elektroforetikus profilját. A hasítási termék nyíllal van jelölve.
A 13. ábra az RzCAT-2 ribozimot mutatja be, amely hibridizál célszekvenciájához (a) és az RzSCMoV ribozimhoz (b). Az egyes ribozimok katalitikus tartománya be van keretezve. Azokat a különbségeket, amelyek az RzSCMoV katalitikus területében találhatók az RzCAT-2-vel összehasonlítva, megjelöltük.
A 14. ábra az RzCEV-2 ribozimot mutatja be, amely a citrus exocortis viroid (CEV) RNS szekvenciában levő 336. nukleotidnak felel meg. A katalitikus tartományban levő nukleotid szekvenciában történt változási az sTobRV
HU 211 891 A9 katalitikus tartományával összehasonlítva, bekarikáztuk (a). A 14.b. ábra egy kontroll RNS [CEV kontroll (-) szála] (7. csík) és a CEV RNS (+) szála (8. csík) elektroforetikus profilját mutatja be RzCEV2-vel végzett inkubálás után.
A 15. ábra az RzCAT-2 ribozimot (a) mutatja be, összehasonlítva az RzCAT-2B ribozimmal (b). A katalitikus tartományokat bekereteztük. Az RzCAT-2B katalitikus tartományában levő változásokat - az RzCAT-2-vel összehasonlítva - szintén bekereteztük.
A 16. ábra a pJ35SN plazmid térképe.
A 17. ábra négy kísérlet átlagának grafikus megjelenítése, amely kísérletek a CAT kifejeződés növényekben (dohány protoplasztok) való gátlására vonatkoztak.
Az alábbi példákat azért adjuk meg, hogy bemutassuk a jelen találmányt, de semmiképpen sem azért, hogy korlátozzuk a jelen találmány oltalmi körét.
A DNS-sel kapcsolatos reakciókat és manipulációkat (pl. ligálás, restrikciós enzimes emésztés, baktérium transzformálás, DNS szekvenciaelemzés, stb.) standard technikákkal hajtjuk végre, például azokkal, amelyeket Maniatis és munkatársai leírnak (Molecular Cloning. Cold Spring Harbour, 1982.). Az RNS-sel kapcsolatos manipulációkat szintén standard technikák szerint hajtjuk végre, pl. olyanok szerint, amelyeket Uhlenbeck [Natúré 328, 596-600 (1987). és Haseloff és Gerlach [Natúré 334, 585-591 (1988) írtak le.
1. PÉLDA
Mutált sTobRV RNS ön-katalizált hasítása
A tartományok konszenzusa társul az ASBV-ben, az sTobRV. LTSV, bársony dohányfolt vírus (VMoV), Solanum nodiflorum folt vírus (SNMV) és föld alatti lóherefolt vírus (SCMoV) új t-szatellit átirataiban és szatellit RNS-eiben levő, természetben előforduló RNS hasítási helyekkel, amint ezt az la. ábrában bemutatjuk. Bemutatjuk azokat a nukleotid szekvenciákat, amelyek megőrződtek ezek között a szerkezetek között, míg a nem megőrzött helyeket X-szel jelöljük. Egy többlet U helyezkedik el az 'A gyök után az LTSV (+) szálban.
Az sTobRV (+) szálának ön-katalizált hasításával társult tartományt tanulmányozzuk, hogy megismerjük az enzimatikus szubsztrátum aktivitást ezen a tartományon belül. Először klónozott sTobRV cDNS-eket mutagenizálunk egy oligonukleotid kapcsoló (linker) (BamHI) beiktatási munkamenetet alkalmazva.
Vektor megalkotása sTobRV in vitro kifejezéséhez
Az sTobRV cDNS 160 bp-s Taql-Spel fragmentumát izoláljuk pSP 653-ból [Gerlach és munkatársai: Virology 75/, 172-185 (1985)] és Accl-gyel és Spelgyel hasított, foszfatázzal kezelt pGEM 4-hez ligáljuk, hogy megváltoztassuk az AccI helyet. Az így létrejövő kiónt Accl-gyel linearizáljuk, foszfatázzal kezeljük és az sTobRV cDNS-nek egy 359 bp-s Taql fragmentumát iktatjuk bele. Az így létrejövő kiónokat átvizsgáljuk egy olyan köralakúan permutált 520 bp-es sTobRV cDNS szekvencia jelenlétére, amely tartalmazza a 277-81 közti terminálisán nélkülözhető gyököket (pTTS). Az sTobRV szekvenciát a T7 és SP6 RNS polimerázok promotorjai szegélyezik, és az in vitro átírás az RNS-eket (+) vagy (-) orientációban hozza létre, amelyek két ön-hasítási helyet tartalmaznak.
In vitro mutagenezis
A pTTS plazmidot (50 pg) BamHI-gyel linearizáljuk, Sl-gyel kezeljük, és újból ligáljuk, hogy eltávolítsunk egy egyedi AmHI helyet. Az így létrejövő konstrukciót, a pTTS-B-t, 210-4 egység DN-áz I-gyel kezeljük 10 percen át 37 °C hőmérsékleten olyan oldatban, amely 20 mmól/1 trisz.HCl-t (pH = 7,0) és 15 mmól/1 MnCl2-t tartalmaz.
Az így létrejövő lineáris DNS-t egyenesvégűvé vágjuk és/vagy vég-betöltjük T4 DNS polimeráz alkalmazásával, és 0.7%-os LGT agaróz gél elektroforézissel és extrakcióval tisztítjuk. Kinázzal kezelt BamHI kapcsoló szekvenciákat (CGGATCCG) ligálunk a linearizált plazmidhoz egy éjszakán át szobahőmérsékleten 5% polietilén-glikol jelenlétében. Ezt követően a reakciókeveréket BamHI-gyel emésztjük, és a lineáris plazmid DNS-t újra tisztítjuk 0,7%-os LGT agaróz gél elektroforézissel (erről úgy találjuk, hogy szükséges a cirkuláris plazmid és a nem ligáit kapcsolók utolsó nyomainak eltávolítására). A plazmidokat újból köralakúvá tesszük T4 DNS Iigáz alkalmazásával, és E.coli DH-l-be transzformáljuk. Telepeket (1000-nél többet) emelünk ki az agar lemezekről, folyékony tenyészetben növesztjük telítésig, és plazmid DNS-ek kevert populációját állítjuk elő ebből. A kevert sTobRV cDNS beiktatásokat restrikciós enzimes emésztéssel kimetsszük a szegélyező EcoRI és PstI helyeknél, 1%-os LGT agaróz gél-elektroforézissel tisztítjuk, és szubklónozzuk EcoRI-gyel és Pstl-gyel hasított, foszfatázzal kezelt pGEM-4-be. Az így létrejövő transzformánsok ból ismét gyűjteményt készítünk, folyékony tenyészetben növesztjük és plazmid DNS-t állítunk elő ezekből. A plazmid DNS-eket BamHI-gyel kezeljük, hogy csak azokat a plazmidokat hasítsuk, amelyek egy BamHI kapcsoló szekvenciát tartalmaznak, és a lineáris formát ismét tisztítjuk két menetben 0,7%-os LGT agaróz gélelektroforézissel, újból köralakúvá tesszük T4 DNS ligázzal, és E.coli DH-1 törzsbe transzformáljuk. Az egyes transzformánsokat restrikciós enzimes emésztéssel átvizsgáljuk a beiktatott BamHI kapcsoló hozzávetőleges helyzetére az sTobRV szekvencián belül, szubklónozzuk M13 mp 19-be, és szekvencia-elemzést végzünk a didezoxi-nukleotid lánc-terminációs technikával.
Az sTobRV mutánsok létrejött könyvtára és a nukleotid szekvencia elemzés azt mutatja, hogy az egyes mutánsok tartalmaznak egy beiktatott BamHI kapcsoló szekvenciát (CGGATCCG) a szegélyező, kettőzött vagy kiiktatott sTobRV szekvenciákkal együtt. A mutánsokat in vitro átírjuk és az RNS-eket megvizsgáljuk arra a tulajdonságukra, hogy képesek-e hasításnak alávetni magukat. Ezekből a kísérletekből egy olyan 52
HU 211 891 A9 nukleotidos szekvenciát azonosítunk, amely tartalmazza az sTobRV RNS mind szubsztrátum, mind hasítási részleteit. Ez az 52 nukleotidos szekvencia, amelyet az lb. ábrában mutatunk be, tartalmazza a megőrzött szekvenciának azt a tartományát, amely más RNS-ek ön-hasításához szükséges (la. ábra). Az egyik mutáns, amelyet D-51-nek nevezünk, tartalmaz egy 8 nukleotidos BamHI kapcsoló szekvenciát három kettőzött sTobRV nukleotid (7-9. szám) között. Ez a mutáns keresztülmegy ön-katalizált RNS hasításon.
A vad típusú és a D-51 RNS-ek 97, illetve 108 bázispáros HaelII fragmentumait, amelyek tartalmazzák az 52 nukleotidos hasítási szekvenciát (amint ezt az lb. és le. ábrákban bemutatjuk) kimetsszük a szekvencia-elemzett plazmid kiónokból. A fragmentumokat a pGEM 4 Smal helyébe Iigáljuk és átvizsgáljuk, hogy a beiktatás mindkét orientációját megkapjuk. A plazmidokat linearizáljuk EcoRI-ot alkalmazva, és a 159, illetve 170 bázis hosszúságú, (+) és (-) RNS szálakat átírjuk, 200 egység/ml T7 RNS polimerázt alkalmazva 50 mmól/1 trisz.HCl-t (pH =
7,5), 10 mmól/1 NaCl-t, 6 mmól/1 MgCl2-t, 2 mmól/1 spermidint, 1000 egység/ml RN-ázt, 50-50 pmól/l ATP-t, CTP-t, és GTP-t, valamint 200 pmól/l [a32P] UTP-t tartalmazó oldatban. Az RNS-eket elektroforézissel frakcionáljuk 10%-os poliakril-amidot, 7 mol/1 karbamidot és 25%-os formamidot tartalmazó gélen, és autoradiográfiának vetjük alá.
Amint az ld. ábrában bemutatjuk, a (-) szálú RNS átiratok hasítását nem figyelhetjük meg. Ez várható is, mivel a (-) szál nem tartalmaz ön-katalizált hasítási helyet. Mind a vad típusú, mind a D-51 szekvenciák (+) szálainál hasítás megy végbe olyan módon, hogy a D-51 RNS hasítása valamivel kevésbé hatékony, mint a vad típusúé (ld. ábra). Ez a kísérlet azt jelzi, hogy az egyszálú hurokterület az RNS ön-katalizált hasításában érintett 52 nukleotidos szekvencia jobb kézre eső oldalán nem eszenciális.
Az enzimes és szubsztrátum aktivitások elválasztása
A BamHI restrikciós endonukleáz helyet alkalmazva a D-51-be beiktatva, megkapjuk a szegélyező HaelII-BamHI és BamHI-HaelII fragmentumokat, és mindegyiket szubklónozzuk valamely, az in vitro átíráshoz alkalmas E.coli plazmidba. Ez a mutált egyszálú hurok eltüntetéséhez vezet az ön-hasított tartományból, a területet két RNS szegmensre vágva szét (21a. ábra). A kisebb HaelII-BamHI fragmentum tartalmazza a 321-9 nukleotidokat, belefoglalva ebbe a hasítás aktuális helyeit; ezt S fragmentumnak nevezzük. Azt a BamHI-HaelII fragmentumot, amely a 7-48 sTobRV nukleotidokat tartalmazza, nevezzük ribozimnak vagy Rz fragmentumnak. Az in vitro átíráshoz alkalmazott E.coli plazmidok a pGEM3 és pGEM4 (Progmega, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok). Ezek a kifejező plazmidok az alábbiakat tartalmazzák:
(a) egy replikációs origót;
(b) szelektálható gyógyszerrezisztencia (pl. Ampr) gént;
(c) többszörös klónozó helyet, amelyet olyan RNS polimeráz promotorok szegélyeznek, amelyeket átiratok in vitro termeléséhez lehet alkalmazni. A T7 DNS polimerázzal kezelt, KpnI-gyel emésztett RzpGEM3-at és Xbal-gyel emésztett S-pGEM4-et írunk át, SP6 RNS polimerázt alkalmazva hasonló körülmények közt, ahogyan fentebb leírtuk.
Amint a 2. ábrában bemutatjuk, sem az S, sem az
Rz RNS-ek nem mutatnak jelentős bomlást, amikor egymagukban inkubáljuk (2b. ábra, 1. és 3. csíkok) olyan körülmények között, amelyek nagymértékben hatékonyak az ön-hasításhoz (50 'C, 20 mmól/1 MgCl2, pH = 8,0). A jelzett Rz-RNS, úgy tűnik, szintén változatlan marad az S-RNS-sel végzett inkubálás után (2b. ábra, 2. és 5. csíkok). Amikor azonban az S-RNS-t összekeverjük az Rz-sel, az S-RNS hatékony hasítása következik be (2b. ábra, 4. és 5. csíkok), két fragmentumot alakítva ki. A termék-méretek (84 bázis) egybevágnak az S-RNS hasításával a normális helyen, a 359. és 1. nukleotidok között, így alakítva ki 67 és 17 nukleotidos 5’, illetve 3’ proximális fragmentumokat. Ez azt mutatja, hogy az S-RNS szubsztrátumként működik az Rz-RNS által végzett ribonukleolitikus hasításhoz, ahol az Rz-RNS katalitikus szerepben működik.
Az sTobRV RNS katalitikus területén alapuló ribozim modelljét mutatja be a 3. ábra. A ribozim rendelkezik az egyes szálú RNS két karjával vagy szegélyező szekvenciáival (a C-nél bemutatva), amelyek RNS szubsztrátumon, vagyis hasítandó RNS-en levő komplementer szekvenciákhoz hibridizálnak. A C-nél bemutatott összes szegélyező szekvencia 8 ribonukleotidot tartalmaz. A C területen levő nukleotidok száma nem kritikus. Ahhoz azonban elegendő nukleotidnak kell jelen lenni, hogy a ribozim hibridizálhasson a célRNS-hez. Az egyes C területekben, úgy tűnik, négy nukleotid a minimális szám a hibridizáláshoz.
A B katalitikus terület olyan szekvenciákat tartalmaz, amelyek nagymértékben megőrzöttek a természetben megőrzött hasítási tartományban (lásd az la. ábrát). A ismert szekvenciák hasítási tartományaival végzett összehasonlításból kiderül, hogy a Π. nyél bázispár hossza nem fontos, akárcsak egy társult hurok jelenléte ennek egyik végénél.
A hasítási helyet a cél-RNS-en belül az A-nál jelezzük (a 3. ábrában), GUC-ként. Kísérleteink alapján (nem mutatjuk be), és Koizumi további kísérletei alapján [FEBS LETT 288, 228-230 (1988); FEBS LETT 239, 285-288 (1988)] a természetben előforduló RNSekben a hasítási helyeken a GUA, GUC, CUC, AUC és UUC szekvenciák szintén hasítási helyként működnek az RNS-en belül.
2. PÉLDA
Az új és különösen fajlagos ribonukleáz aktivitással bíró ribozimok tervezésének, szintézisének és aktivitásának bemutatása
A jelen találmány illusztrálására három ribozimot tervezünk, amelyek egy baktériumból származó, általánosan használt indikátor gén átirata ellen irányul; ez a
HU 211 891 A9
Tn9 klóramfenikol-acetil-transzferáz (CAT), amely antibiotikum rezisztenciát tud átadni baktériumokban, növényekben és állatokban, és könnyen kimutatható. Ezek a ribozimok, amelyeket RzCAT-1, -2, és -3-nak nevezünk, megfelelnek a tehetsége GUC hasítási helyeknek a CAT RNS-ben a 139-140., 494-495., illetve 662-663. helyeknél.
Ezeknek a ribozimoknak a szekvenciáit a 4. ábrában mutatjuk be. A ribozimnak, amely a cél CAT RNShez hibridizál, szegélyező szekvenciái minden esetben 8 nukleotid hosszúságúak. A katalitikus területet, amely úgy van kiválasztva, hogy az sTobV RNS katalitikus területének feleljen meg, a 3. ábrában mutatjuk be.
A CAT gént pCM4-ből kapjuk meg és BamHl fragmentumként klónozzuk pGEM-32-be [amelyet a Promega cégtől (Madison, Wisconsin, USA) szerzünk be]. Ezt a plazmidot HindlII-mal linearizáljuk és CAT gén átiratokat kapunk T7 RNS polimerázt alkalmazva 220 pmól/l -32P UTP-vel. Ribozim szekvenciákat szintetizálunk, mint Rz CAT-1, -2, illetve -3 oligodezoxi-nukleotidokat. Ezeket kinázzal kezeljük, és foszfatázzal kezelt, EcoRI-gyel és Pstl-gyel hasított pGEM4-gyeI ligáljuk és inkubáljuk DNS polimerázl Klenow-fragmentummal a baktérium-transzformálás előtt. EcoRIgyel linearizált plazmidokat írunk át T7 RNS polimerázzal, hogy ribozim RNS-eket állítsunk elő. Ribozimokat inkubálunk CAT átirattal 50 °C hőmérsékleten 60 percen át olyan oldatban, amely 50 mmól/1 tirsz.HCl-t (pH = 8,0) és 20 mmól/1 MgCl2-t tartalmaz, és a termékeket 5%-os poliakril-amid, 7 mol/1 karbamid és 25% formamid gél-elektroforézissel frakcionáljuk autoradiográfia előtt.
Amikor a 840 nukleotidos CAT átiratot inkubáljuk a három ribozim bármelyikével, hatékony és nagymértékben szekvenciafajlagos hasítás következik be (5. ábra), mindegyik reakcióban 2 RNS fragmentumot hozva létre. A fragmentumméretek egybevágnak a hasításkor előre jósolt méretekkel (azaz 139 és 696, 494 és 341, illetve 662 és 173 bázisos fragmentumok az Rz CAT-I. -2. illetve -3 által történő katalízis hasítási termékei). Az ezekhez a ribozim-katalizált hasításokhoz szükséges körülmények hasonlók azokhoz a körülményekhez, amelyek a természetben előforduló hasítási reakciókból figyelhetők meg [Foster A. C. és Symons R. H.; Cell 49. 211-220 (1987); és Foster A. C. és Symons R. H.: Cell 50, 9-16 (1987)], hatékonyabb hasítást érve el emelt pH értéken, hőmérsékleten és kétértékű kation koncentrációnál (adatokat nem mutatunk be). Amikor a három ribozim moláris fölöslegben van jelen, csaknem teljes hasítását végzik el a CAT RNS szubsztrátumnak 60 perc alatt 50 °C hőmérsékleten olyan oldatban, amely 50 mmól/1 trisz.HCl-t (pH = 8,0) és 20 mmól/1 MgCl2-t tartalmaz. Hasonló körülmények között 0,1 pmól/l szubsztrátummal és 3 pmól/l ribozimmal, a CAT mRNS szubsztrátum T,/2 értéke 3,5; 3,5; illetve 2.5 perc az RzCAT-1. -2, illetve -3 jelenlétében. A ribozim szekvenciák inaktívak a szubsztrátum RNS komplementje, vagyis a (+) szál ellen, és oligodezoxi-ribonukleotidok formájában (adatokat nem mutatunk be). Az egyes ribozim-katalizált reakciókból a 3’-terminális hasítási fragmentumokat izoláljuk és 5’ vég 32P-kinázos kezelésnek vetjük alá [50 mmól/1 trisz.HCl (pH = 9,), 10 mmól/1 MgCl2, 10 mmól/1 DTT, 50 pCi -32P ATP-vel és 5 egység T4 polinukleotid kinázzal 30 percen át 37 °C hőmérsékleten], A fragmentumok hatékony kinázos kezelését az jelzi, hogy olyan 5’ terminális hidroxi-csoportokkal bírnak, amelyek hasonlók a természetben előforduló hasítási reakciókban keletkező csoportokhoz.
Meghatározzuk az RzCAT-1, -2 és -3 által végzett CAT-szekvencia-hasításakor termelődött fragmentumok terminális nukleotidját. Röviden ismertetve: radioaktívan jelzett fragmentumokat tisztítunk 5%-os poliakril-amid gélen és azonos térfogatban emésztjük 500 egység/ml Tl-RN-ázzal, 25 egység/ml T2-RN-ázzal és 0,125 mg/ml A-RN-ázzal 50 mmól/1 ammónium-acetátban (pH = 4,5) 120 percen át 37 C hőmérsékleten. A termékeket 20%-os poliakril-amid gélen frakcionáljuk, amely 25 mmól/1 nátrium-citrátot (pH = 3,5) és 7 mol/1 karbamidot tartalmaz. Az 5b. ábra azt mutatja, hogy a CAT szekvenciák RzCAT-1, -2, illetve -3-mal végzett hasítása pontosan az A, U, illetve G előtt történik.
A CAT gén fragmentumok terminális szekvenciáját közvetlenül a részleges enzimes emésztési technikával határozzuk meg [Donis-Keller és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 4, 2527-2538 (1980)], a bázis-specifikus részleges ribonukleolitikus hasítást alkalmazva. A fragmentumok szekvenciája igazolja, hogy hasítás a várt elhelyezkedésnél történik a CAT RNS-en belül (nem mutatjuk be).
Enzimes katalízis
Abból a célból, hogy demonstráljuk: a ribozimok a CAT mRNS szubsztrátumok hasítását katalitikus módon idézik elő, mindegyiket a szubsztrátum moláris fölöslegével inkubáljuk, olyan körülmények között, amelyek kedvezőek mind a hatékony hasításhoz, mind a termék disszociáláshoz. A 6. ábra mutatja be egy olyan kísérlet eredményeit, ahol 75 percen át 50 °C hőmérsékleten, pH = 8,0 értéken 20 mmól/1 MgCl2.ben 10 pmól RzCAT-1 katalizálta egy csonkított CAT mRNS (173 bázis) szubsztrátum 163 pmóljának fajlagos hasítását, így alakítva ki 139, illetve 34 bázisos 5’, illetve 3’ fragmentumokat. Átlagban mindegyik ribozim több, mint tíz hasítási eseményben vesz részt 75 perc után 50 °C hőmérsékleten az RNS-nek bizonyos nem fajlagos hasítása is észlelhető a különleges körülmények miatt, de a megmaradó ép RNS-ek (163 pmól) 70%-a 139 bázisos fragmentumként akkumulálódik. Hasonló eredményeket kapunk az RzCAT-2-nél és -3-nál is (adatokat nem mutatunk be), és így ezek mindegyike RNS enzimként működik.
3. PÉLDA
A hőmérséklet hatása a ribozim-aktivitásra
Megvizsgáljuk a reakcióhőmérséklet hatását a ribozim aktivitás in \ itro sebességére.
Az RzCAT-1, -2, és -3 ribozimok reakcióinak idő8
HU 211 891 A9 beli lefolyását vizsgáljuk CAT RNS szubsztrátumon 37 ’C és 50 ’C hőmérsékleten.
Ebben a kísérletben az egyes ribozimok által végzett reakciókat két párhuzamosban hajtjuk végre, olyan reakció-körülményeket alkalmazva a ribozimos hasításhoz, amelyeket a 2. példában leírtunk. Az egyik reakciókeveréket 37 ’C, a másikat 50 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. 90 percig különböző időpontokban mintát veszünk és a reakció előrehaladásának mértékét denaturáló poliakril-amid gél-elektroforézissel elemezzük. A 7. ábra mutatja be a reakció időbeli lefolyását a RzCAT-1, -2 és -3 ribozimoknál 37 ’C és 50 ’C hőmérsékleten. Az egyes ribozimok reakciósebessége növekszik az emelkedő reakció-hőmérséklettel.
A CAT RNS 50%-os hasításához szükséges időt (t)/2) az 1. táblázatban mutatjuk be.
7. TÁBLÁZAT t|/2 értékek (perc)
| RzCAT-1 | RzCAT-2 | RzCAT-3 | |
| 50 ’C | 3,5 | 3,5 | 2,5 |
| 37 ’C | 55.0 | 70,0 | 65,0 |
Amint az 1. táblázatból látható, a ribozimok reakciósebessége 37 ’C hőmérsékleten mintegy 20szor lassabb, mint a reakciósebesség 50 ‘C hőmérsékleten.
4. PÉLDA
A ribozimok különböző kar (vagy szegélyező szekvencia) hosszúságainak hatása a ribozim katalitikus aktivitására.
Egy ribozim karjai vagy szegélyező szekvenciái [az
1. képlet (I) területe] hibridizálják a ribozimot egy cél-RNS-hez, amely után az RNS hasítása bekövetkezik. Ebben a kísérletben egy célszekvencia hasítási sebességére való hatást vizsgálunk, változtatva a komplementeritás mértékét és ebből következően a ribozim-karok bázispárképzésének hosszát a célszekvenciához. Ribozimokat állítunk elő 4, 8 és 12 bázisos komplementeritással az RzCAT-2 célszekvenciához az egyes karokon (8a. ábra). A ribozimokat a 2. példában leírt eljárás szerint állítjuk elő. A ribozim-aktivitást úgy határozzuk meg, hogy a ribozim RNS-t CAT RNS-sel inkubáljuk, amint ezt korábban leírtuk.
Az a ribozim, amelynek 4 bázisos komplementeritása van az egyes karokhoz, nem hasítja az RNS szubsztrátumot. Az a ribozim, amelynek 8 bázisos komplementeritása van az egyes karokhoz, hasítja a CAT szubsztrátumot, akárcsak az a ribozim, amelynek 12 bázisos komplementeritása van. Az a ribozim, amelynek 12 bázisos komplementeritása van, hatékonyabban hasítja a cél-RNS-t az in vitro reakciósebesség alapján elbírálva, mint azok a ribozimok, amelyeknek kisebb számú bázis-komplementeritásuk van. Úgy tűnik, hogy a négynél több bázis-komplementeritás feltétlenül szükséges, és a ribozimok hibridizáló területének hosszát növelve növekszik ezek reakciósebessége is.
Egy második kísérletben megvizsgáljuk különböző ribozimok reakció-hatékonyságát, mégpedig az alábbiakét: (a) komplementer a CAT átirat cél-RNS teljes hosszához; (b) több katalitikus tartománnyal bír.
A CAT RNS szekvenciákban négy GUC célhelyet választunk ki. Ezen helyek elleni katalitikus ribozim tartományokat „iktatunk be” a CAT átirat valamely komplett anti-sense (-) szekvenciájába és megvizsgáljuk a katalitikus aktivitást.
A négy kiválasztot hely közül három annak felel meg, amelyet az RzCAT-1, -2 és -3-nál megnevezve már korábban leírtunk, egy további helyet pedig az alábbi képlettel jellemezhetünk.
Új CAT hely # 192
His His Alá Val Cys Asp Gly 5' 3'
CAU CAU GCC GUC UGU GAU GGC ahol a képletben a „# 192” a CAT polipeptidben levő 192. aminosavra utal és a # jel a hasítás helyére utal.
A ribozim katalitikus tartományokat tartalmazó és ezen hasítási helyek mindegyikét átérő oligodezoxi-ribonukleotidokat alkalmazunk az M13 mutagenezis kísérletekhez, hogy olyan szekvenciát kapjunk, amely tartalmazza a CAT szekvencia teljes komplementjét, de a négy ribozim katalitikus tartomány bele van iktatva. Az M13 mutagenezist úgy hajtjuk végre, hogy a ribozim beiktatásokat tartalmazó oligonukleotidokat uracilt tartalmazó egyszálú M13 DNS-ekhez kötjük, majd a beiktatást tartalmazó komplementer DNS szintézisét végezzük el. A komplementer DNS-t eltávolítjuk, megfelelő Escherichia coli törzsben való klónozást követően [Kunkel T. A.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492 (1985)]. Az így kapott kettősszálú cDNS-t egy in vitro kifejező vektorban klónozzuk T7 polimeráz transzkripciós rendszert alkalmazva, hogy ribozim RNS-t állítsunk elő. A ribozim-aktivitást olyan módon határozzuk meg, hogy a ribozim RNS-t CAT átirattal inkubáljuk, majd elvégezzük a reakciókeverék gél-elektroforézist glioxálos kezelés után (amely a nukleinsavakat denaturálja).
Az autolitikus hasítás az összes várt helyen végbemegy a CAT átiraton. Következésképpen a karok vagy egy ribozim szegélyező szekvenciái kiterjedhetnek az elhasítandó RNS átirat teljes hosszúságán keresztül.
A 9. ábra vázlatosan bemutatja a négy ribozim mindegyikét tartalmazó katalitikus anti-sense RNS előállítását. A katalitikus anti-sense RNS mintegy 900 bázist tartalmaz.
A fenti reakciókörülmények között a ribozim és a célszekvenciák nagy molekulatömegű komplexeket képeznek, valószínűleg kiterjedt bázispárképződéssel. Erős denaturáló kezelés, mint pl. glioxálos kezelés szükséges ahhoz, hogy felbontsa a reakciótermékeket az elektroforézis során.
HU 211 891 A9
5. PÉLDA
Célszekvenciák a ribozimos hasításhoz
Az mRNS-ben a GUA motívumot vizsgáljuk, hogy megnézzük, vajon egy ribozim ennél a szekvenciánál hat-e az RNS hasításra. Kiválasztunk egy fajlagos helyet a CAT mRNS-ben, beleértve a GUA motívumot is (10a. ábra), és egy megfelelő ribozim szekvenciát állítunk elő és vizsgálunk aktivitásra. A ribozim 8 ribonukleotidos karokat tartalmaz.
A 10. ábra ribozimjának megfelelő szintetikus oligonukleotidokat állítunk elő a 2. példa szerint, és kettősszálú cDNS-t klónozunk egy in vitro kifejező vektorba (pGEM 4, amelyet korábban már ismertettünk) E. coliban, abból a célból, hogy ribozim RNS-t állítsunk elő a T7 polimeráz transzkripciós rendszert alkalmazva. A ribozim aktivitást olyan módon határozzuk meg, hogy ribozim RNS-t CAT mRNS-sel inkubálunk, majd a reakciókeveréket gél-elektroforézisnek vetjük alá, amint korábban leírtuk.
A ribozim-hasítást idéz elő a GUA célhelyen (nem mutatjuk be). Következésképpen a GUA motívum az RNS-ben szubsztrátuma a jelen találmány szerinti ribozimoknak. Ez nem teljesen váratlan, mivel az egyik természetben előforduló hasítási hely a lucerna átmeneti sáv vírus szatellit RNS-ében egy GUA hely felismerését igényli.
Hasonlóképpen megvizsgáljuk a GSUU motívumot a CAT RNS célszekvenciában megfelelő ribozimmal (lásd 10b. ábrát), és hasítás jön létre.
6. PÉLDA
Vírus RNS ribozimos hasítása
Vírus RNS-t hasítunk citrus exocortis viroid RNS formájában, jelen találmány szerinti ribozimot alkalmazva.
Két GUC célhelyet választunk ki a citrus exocortis viroid (CEV) RNS-ben. Egy helyet kiválasztunk a komplementer szál szekvenciában is. Ribozimokat készítünk ezen helyek mindegyike ellen és megvizsgáljuk aktivitásra. A ribozimokat CEV9x(+)-nak, CEV9x(-)-nak és CEV25x(+)-nak nevezzük. A 11. ábra mutatja be a három hasítási helyet a CEV RNS-ben ezen ribozimok mindegyikénél.
A ribozimokat a korábban ismertetett eljárások szerint állítjuk elő. Az RzCEV25x(+) ribozimot a 12. ábrán mutatjuk be. Ez a ribozim hasítja a GUC elemet a CEV RNS 116. nukleotidjánál.
A 12(b) ábra a CEV RNS hasítását mutatja be az RzCEV9x(+) ribozimmal. Nem figyelhető meg hasítás az RzCEV9x(-)-szal. Ez a kísérlet azt jelzi, hogy a ribozimok aktívak különböző forrásokból származó cél-RNS szekvenciák ellen. Ez várható is, hiszen minden RNS az alap ribonukleotid építőelemekből, adeninből, guaninból, citozinból és uracilból képződik, függetlenül állati, növényi vagy mikrobiológiai eredetétől.
7. PÉLDA
Példák változó katalitikus tartománnyal bíró ribozimokra
CAT-2 hely ellen irányuló ribozimot állítunk elő a földalatti lóherefolt vírusból (SCMoV) származó katalitikus tartomány szekvenciát alkalmazva. A ribozim kar szegélyező szekvencia tizenkét bázisos komplementeritását építjük be az RzSCMoV ribozim mintájába. Az RzCAT-2 és RzSCMoV ribozimokat a 13a. illetve 13b. ábrákban mutatjuk be. Az RzSCMoV hurok-területe 5 nukleotidot tartalmaz, amelyek szekvenciája AAAUC. Ez ellentétben van az RzCAT-2 hurokterületével, amely 4 nukleotidot tartalmaz, amelyek szekvenciája AGAG. Ezenkívül az RzSCMoV C-t tartalmaz a katalitikus területben az RzCAT-2-ben levő U* helyett. Azokat az RzSCMoV-ben levő szekvenciákat, amelyek az RzCAT-2-vel összehasonlítva eltérők, jelöljük.
Az RzSCMoV-t a 2. példa szerint állítjuk elő. Az RzSCMoV aktív, és amint várható, két hasítási terméket alakít ki.
Egy másik kísérletben a citrus exocortis viroid (CEV) célhelyet a -336 nukleotidnál hasítjuk komplementer RNS-ében, olyan ribozimot alkalmazva (RzCEV2), amely a 14a. ábrán bemutatott szekvenciával bír. A hurok-terület, amelyet „L” betűvel jelölünk a 14. ábrán, hat nukleotidból áll és szekvenciája 3’-CCTATA-5'. Ez különbözik az sTobRV hurok-területétől, amely négy nukleotidból áll és szekvenciája 3’-AGAG-5’. Ez a ribozim a cél CEV komplementer RNS-t a -336. helynél hasítja, amint ezt a 14b. ábrán látható elektroforetikus profilon bemutatjuk.
Ez a kísérlet azt jelzi, hogy a nukleotidok száma és a nukleotid szekvencia a hurok-területben nem fontos a ribozim aktivitás szempontjából. Ezekben a kísérletekben a ribozimokat a leírásban korábban bemutatott eljárások szerint készítjük.
Egy további kísérletben megvizsgáljuk a bázispárképzés hatását a ribozim aktivitásra a katalitikus tartományban (nyél-terület).
Módosított ribozimot állítunk elő, amely az RzCAT-2-nek felel meg, de négy további bázispárt tartalmaz, és ezt a ribozimot megvizsgáljuk. A 15a. ábrában az RzCAT-2 ribozim szekvenciáját mutatjuk be, amint hibridizál a cél CAT RNS-hez. A vizsgálati ribozimot a 15b. ábrában mutatjuk be, ahol a további bázispárokat bekeretezzük. A vizsgálati ribozim hasonló aktivitást mutat, mint az RzCAT-2 aktivitása. Ez azt jelzi, hogy a ribozim katalitikus tartomány bázispárba szerveződő területe különböző hosszúságú lehet anélkül, hogy ez hatással lenne a katalitikus aktivitásra.
Megfigyelhető (adatokat nem mutatunk be), hogy a transzgenetikus növényekben kifejezett sTobRV RNS átiratok stabil in vivő formája elsősorban köralakú, és ez valószínűleg az 5’ és 3’ végek ligálásának tulajdonítható. Ennek megfelelően két autolistikus hasítási hely, amelyek a szóbanforgó szekvenciát szegélyezik in vivő és in vitro RNS átiratokban, alkalmazása valószínűleg köralakú termékhez vezet, amely nagyobb stabilitással bír, mint a lineáris átirat. Ez a megközelítés, úgy tűnik, új eljárást nyújt ribozim szekvenciák in vivő stabilizálásához. Ezt „körré alakításának nevezzük.
HU 211 891 A9
8. PÉLDA
Ribozimok in vivő aktivitása
A jelen példában ribozimok in vivő aktivitását vizsgáljuk növényi sejtekben.
Kísérleti munkamenet:
Anti-CAT (CAT = klóramfenikol acetil transzferáz) vagy kombinált anti-CAT ribozim gén konstrukciókat (lásd később) tartalmazó plazmidokat vezetünk be dohány protoplasztokba egymáshoz viszonyítva azonos mennyiségben és arányban, egy további plazmiddal együtt, amely egy működőképes CAT gén konstrukciót tartalmaz. A CAT aktivitásokat mérjük és összehasonlítjuk a gén-aktivitás alapszintjével.
Anyagok és módszerek (a) Elektroporáció és CAT mérés
Ezeket úgy hajtjuk végre, amint ezt Llewellyn és munkatársai leírtak [J. Mól. Bioi. 195, 115-123 (1987)]. Röviden ismertetve Nicotiana plumbaginifolia T5 vonal protoplasztjait állítjuk elő egy szuszpenzióból kétnapos tenyésztés után, majd szuszpendálunk 10 mmól/1 HEPES-t (pH = 7,2), 150 mmól/1 NaCl-t és 0,2 mol/1 mannitot tartalmazó oldatban és a sűrűséget 3 106/ml-re állítjuk be. Elektroporációt végzünk, egyetlen 50 millisec pulzálást végezve 250 V-nál. A protoplasztokat tízszeresére hígítjuk és 20 órán át tenyésztjük 26 °C hőmérsékleten, sötétben. Ezeket ultrahangos kezeléssel szétzúzzuk és kivonatokat kapunk. A kivonatokat fehérjetartalomra normalizáljuk és in vitro mérjük CAT aktivitásra, 14C-klóramfenikolt és acetil CoA-t alkalmazva. A reakciótermékeket vékonyrétegkromatográfiával elkülönítjük és autoradiográfiával tesszük láthatóvá. A reakciók mértékét a l4C-klóramfenikol templátból való radioaktív termék származékok kialakulásából számoljuk ki.
(b) Gén-konstrukciók
Gén-konstrukciókat vezetünk be 0,1 ml protoplaszt-szuszpenziókba plazmid DNS-ek formájában, amelyeket előzőleg baktériumokból tisztítottunk extrakcióval és két menetben CsCl egyensúlyi sűrűséggradiens centrifugálással. Felhasználáshoz ezeket újra szuszpendáljuk 10 mmól/1 triszt és 1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldatban (pH = 7,5).
Az aktív CAT gén-konstrukció a pCAT7+-nak nevezett plazmidon alakul ki. Ez úgy alakul ki, hogy egy CAT génszekvenciát Fa pCM4 plazmidból, lásd Close T. J. és Rodriguez R.: Gene 20, 305-316 (1982)] fuzionálunk a pJ35SN plazmidba [amely a p35SN-ből származik, lásd Gerlach W. L. és munkatársai: Natúré 328, 802-805 (1987)] úgy, hogy az aktív gén-konstrukció az alábbi:
5!__3’
| -> | ||
| 35S | CAT | NOS |
A 35S a 35S CaMV (karfiol mozaikvírus) promotorra, a NOS a nopalin szintetáz poliadenilező helyre (T/C az átíráskor) utal. 0,2 gg pCAT7+-szal együtt hozzáadunk különböző gén-konstrukciókat is fölös5 legben, amint ezt az alábbiakban leírjuk. A gén-konstrukciók a plazmidokon belül találhatók az alábbi elnevezésekkel:
pJ35SN - Ez a vektor plazmid, amelynek térképét a
16. ábrában mutatjuk be, egy 35S CaMV promotort és növény nopalin szintáz 3’ poliadenilező helyet tartalmaz; ezt az alábbi formában ábrázolhatjuk:
35S
NOS pCAT7 - Ez a CAT gén-szekvenciát tartalmazza a pJ35SN-be beiktatva úgy, hogy az átírás az anti-sense CAT RNS termelését eredményezze; ezt az alábbi for20 mában ábrázolhatjuk:
' 35S j CAT ~ ' HŐS] pCatl9-Ez a CAT gént tartalmazzza, amelyen belül négy katalitikus ribozimtartomány van (lásd a 4. példát és a 9. ábrát), és ez a CAT gén pJ35SN-be van beiktatva úgy, hogy az átírás a négy katalitikus ribozimtartományt tartalmazó anti-sense CAT termelését eredményezze; ezt az alábbi formában ábrázoljuk:
5’
CAT
katalitikus tartomány beiktatások
Eredmények:
Az alábbi 2. táblázat a relatív CAT aktivitásokat 40 mutatja be a sejtekben 20 órával az elektroporáció után. Az aktivitást a klóramfenikol szubsztrátum százalékos átalakulásában fejezzük ki az 1. ábrában.
2. TÁBLÁZAT gg, elektroporézisnek alávetett plazmid
| Kezelés | pCAT7+ | pJ35SN | pCAT7·^ | :AT19- | % átalakulás |
| 1A | 0 | ||||
| IB | 0 | ||||
| 2A | 0,2 | 18 | 21 | ||
| 2B | 0,2 | 18 | 46 | ||
| 3A | 0,2 | 9 | 9 | 28 | |
| 3B | 0,2 | 9 | 9 | 32 | |
| 4A | 0,2 | 18 | 26 | ||
| 4B | 0,2 | 18 | 19 | ||
| 5A | 0,2 | 9 | 9 | 19 |
HU 211 891 A9
| Kezelés | pCAT7+ | pJ35SN | pCAT7-* | ZAT19- | % átalakulás |
| 5B | 0,2 | 9 | 9 | 22 | |
| 6A | 0,2 | 18 | 14 | ||
| 6B | 0,2 | 18 | 16 |
(az egyes kezeléseknél az „A” és „B” párhuzamos vizsgálatokat jelent)
Ezekből az eredményekből az alábbi következtéié- 10 sek vonhatók le:
(a) A CAT gén-konstrukció bevezetése jelentős CAT aktivitást eredményez, összehasonlítva a 2A és B-t az lAés B-vel.
A párhuzamosok között az eltérés jelentős. A többi 15 mintából látható irányzatok alapján [lásd alább a (b) és (c) magyarázatokat] valószínű, hogy a 2A. abnormálisán kis aktivitást mutat.
(b) Egy anti-sense gén-konstrukció együttes bevezetése csökkenést eredményez az aktivitás szintjében, 20 összehasonlítva a 3A és B-t és a 4A és B-t a 2B-vel. A csökkenés mértéke közvetlenül összefüggésben van a plazmidként hozzáadott anti-sense gén szintjével, öszszehasonlítva a 3A és B-t a 4A és B-vel.
(c> A kombinált anti-sense/ribozim génkonstrukció 25 együttes bevezetése csökkenést eredményez a gén aktivitásban, összehasonlítva az 5A és B-t, valamint a 6A és B-t a 2B-vel. A csökkenés továbbá még jellegzetesebb. mint az anti-sense génkonstrukciók megfelelő szintjeinél, összehasonlítva az 5A és B-t a 3A és B-vel, 30 valamint a 6A és B-t a 4A és B-vel.
Négy in vivő kísérlet átlageredményeit a 17. ábrában mutatjuk be. Ebben az ábrában a „kontroll” a 2. kezelést képviseli. Az „anti-sense” a 4. kezelést képviseli. A „katalitikus” a 6. kezelést képviseli és a „háttér” 35 az 1. kezelést képviseli.
A katalitikus ribozim a CAT aktivitást átlagosan 47%-bán gátolja, míg egy anti-sense ribozimnál ez az átlag 34%.
A ribozimot hordozó gének bevezetése növényi sej- 40 tekbe gátolja azoknak a géneknek az aktivitását, amelyek ellen irányulnak. Ezen kívül a gátlás nagyobb, mint a megfelelő anti-sense RNS molekuláknál.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a ribozimok aktívak lehetnek állati, növényi, vagy mikrobiális 45 sejtekben sokféle cél-RNS molekula ellen.
A ribozimok hatásmechanizmusa ebben a példában nem világos.
Úgy pl. az anti-sense ribozim irreverzíbilisen hibridizálhat egy cél-RNS-hez és katalizálhat foszfodiészter 50 kötés hasításokat egy vagy több kiválasztott célhelynél a cél-RNS mentén.
Egy másik alternatíva, hogy celluláris enzimek legöngyölíthetik az anti-sense RNS-t cél-szekvenciájáról úgy, hogy a cél-RNS két vagy több fragmentumra hasad. 55
9. PÉLDA
Ribozimok in vitro aktivitása állati sejtekben
Ebben a példában ribozimok aktivitását mutatjuk be egy cél-RNS inaktiválásában emlős sejtekben. 60
Anyagok és módszerek
Ribozimokat kódoló aktív gén-konstrukciókat fertőzünk elektroporációval a széles körben hozzáférhető COS1 majomvese sejtvonalba. Ebben az eljárásban 3106/ml COS1 sejtet, amely 10% FCS-t (borjúembrió szérum) is tartalmazó, pufferolt fiziológiás sóoldatban van szuszpendálva, érintkezésbe hozunk különböző gén-konstrukciókkal, és elektromos töltéseket alkalmazunk, hogy a DNS elektroporációját vigyük végbe a sejtekbe. Az átfertőzött sejteket 37 ’C hőmérsékleten 48 órán át inkubáljuk tenyésztő tápközegben, mielőtt megvizsgálnánk CAT és luciferáz aktivitásra.
A CAT gén-konstrukciók a pTK CAT-nak nevezett plazmidon alakulnak ki [Miksicek és munkatársai: Cell 46, 283-290 (1986)]. Ez a plazmid úgy keletkezik, hogy CAT gén-szekvenciát vezetünk be a pSV2 plazmidba úgy, hogy ez a herpes simplex vírus timidin kináz promotorjának szabályozása alatt legyen.
Ribozimokat kódoló gén-konstrukciók a pSV232A plazmidon alakulnak ki [De Wet és munkatársai: Molecular and Cellular Biology 7, 725-737 (1987)], amely tartalmazza a luciferáz gént az SV40 korai promotorhoz fuzionálva. A ribozimokat kódoló DNS-t a luciferáz gén 3’-végénél levő Xbal helybe ligáljuk Maniatis és munkatársai standard eljárásai szerint [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour (1982)].
Az alábbi konstrukciókat készítjük el Maniatis és munkatársai fentebb idézett standard technikáival.
pFC58 - Ez a plazmid-vektor tartalmazza az RzCAT-1 ribozimot kódoló DNS-t a luciferáz gén 3’végéhez fuzinálva nem működőképes orientációban.
Ezt az alábbiak szerint ábrázolhatjuk:
232A
SV40 HluciferázV* RzCAT-1 korai (ribozim
Ikis
T poli* I 232A ahol 232A a pSV232A szekvenciákra utal, az SV40 korai az SV40 korai promotorra utal, és a kis T az SV40 kis T beavatkozó szekvenciáját kódoló DNS. Ez a konstrukció olyan RNS molekulát alakít ki, amely luciferázt kódol és kódolja az RzCAT-1 ribozimot, ahol az utóbbi olyan orientációban van, hogy nem várható, hogy katalitikus legyen.
pFC4 - Ez a plazmid ugyanolyan, mint a pFC58, azzal a kivétellel, hogy az RzCAT-l-et RzCAT-3 helyettesíti.
pFCl-6-Εζ a plazmid ugyanolyan, mint a pFC58, azzal a kivétellel, hogy az RzCAT-l-et RzCAT-3 helyettesíti a sence orientációban (5*—3*).
pFC20-Ez a plazmid ugyanolyan, mint a pFCl-6, azzal a kivétellel, hogy az RzCAT-3-at RzCAT-2 helyettesíti, amelynek 8 nukleotidos szegélyező szekvenciái vannak.
pFC12 - Ez a plazmid ugyanolyan, mint a pFC20, azzal a kivétellel, hogy az RzCAT-2 tizenkét mukleotidos szegélyező szekvenciát tartalmaz.
pFC50 - Ez a plazmid a CAT gént tartalmazza négy,
HU 211 891 A9 beleépített katalitikus ribozim tartománnyal (lásd a
4. példát és a 9. ábrát) a sense orientációban (5’-3’), amely átíráskor inaktív ribozimot alakít ki. A plazmidot az alábbiak szerint ábrázolhatjuk:
SV40 CAT gén, amely ribozim PolT kéBÓi tartományokat tartalmaz A+
->
nem-katalitikua RNS pFC54 - Ez a plazmid ugyanolyan, mint a pFC50, azzal a kivétellel, hogy a CAT-gén és ribozim tartományok az antisense (3’-5’) aktív orientációban vannak.
pFC64 - Ez a plazmid is rendelkezik az SV40 promotorral és poliadenilező szignálokkal, mint a pFC50, és a vad típusú CAT gént tartalmazza beiktatott ribozim tartományok nélkül. Ez a gén anti-sense orientációban van, és így nem termel CAT fehérjét. pFC65 - Ez a plazmid ugyanolyan, mint a pFC64, azzal a kivétellel, hogy a vad típusú CAT gén a sense (5’-3’) orientációban van és így termelője a CAT fehérjének.
Vizsgálati módszerek
A luciferáz aktivitást De Wet és munkatársai szerint mérjük (fentebb idézett munka). Röviden ismertetve: COS sejteket lizálunk 48 órával az átfertőzés után, és a sejt-lizátumot luciferinnel, a luciferáz szubsztrátum ával inkubáljuk, és a lumineszenciát mérjük, szcintillációs számlálót alkalmazva.
A CAT aktivitást szintén COS sejt-lizátumokat alkalmazva mérjük (a sejt-lizátumokat két részre osztjuk, és az egyes részeket vagy luciferáz, vagy CAT aktivitásra mérjük), Sleigh M. J. eljárása szerint [Anal. Biochem. 756, 251-256 (1986)].
Az in vivo mérésekben a pFC58 és pFC4 nem hat a CAT aktivitásra az átfertőzött sejtekben. Ezt az aktivitást 100% CAT aktivitásnak és 0% CAT gátlásnak nevezzük. A CAT aktivitást más plazmidokkal átfertőzött sejtekben a pFC58-hoz viszonyítva mérjük. A CAT gátlás %-át \ CAT kontroll / képlet alapján mérjük, a luciferáz-termelésre normalizálva.
CAT vizsgált = CAT vizsgálati eredmény a vizsgált konstrukcióknál.
CAT kontroll = CAT vizsgálati eredmény a kontroll konstrukcióknál (pFC4 és pFC58).
A luciferáz-termelés az elektroporáció belső kontrollja, és a ribozim-termelés mértékét adja meg az egyes, elektroporác iónak alávetett szövettenyésztett telepeken belül.
Eredmények (i) Kísérlet
3. TÁBLÁZAT pg elektroporézisnek alávetett plazmid /1,5- l(fi sejt
| Keze- lés | pTKCA T | pFC58 | pFC20 | pFCl- 6 | pFC12 | % CAT gátlás |
| 1 | 5 | 2 | 56 | |||
| 2 | 5 | 1 | 1 | 53 | ||
| 3 | 5 | 2 | 40 | |||
| 4 | 5 | 2 | 0 |
Minden kezelést két párhuzamosban végezzük, és az átlagot adjuk meg.
(ii) Kísérlet
4. TÁBLÁZAT pg elektroporézisnek alávetett plazmid /l,51(fi sejt
| Keze- lés | pTKCA T | pFCl- 6 | pFC20 | pFC12 | pFC4 | % CAT gátlás |
| 5 | 5 | 2 | 75 | |||
| 6 | 5 | 2 | 75 | |||
| 7 | 5 | 4 | 62 | |||
| 8 | 5 | 1 | 1 | 70 | ||
| 9 | 5 | 4 | 51 | |||
| 10 | 5 | 2 | 0 |
Az 5-10. kísérleti kezeléseket két párhuzamosban végezzük, és az átlagot adjuk meg.
(iii) Kísérlet
5. TÁBLÁZAT pg elektroporézisnek alávetett plazmid /1,5-1 (fi sejt
| Kezelés | pTKCAT | pFCl-6 | pFC4 | % CAT gátlás |
| 11 | 5 | 2 | 66 | |
| 12 | 5 | 2 | 0 |
A kezeléseket öt párhuzamosban hajtjuk végre, és az átlagértéket adjuk meg.
(iv) Kísérlet
6. TÁBLÁZAT pg elektroporézisnek alávetett plazmid/1,5 1 (fi sejt
| Keze- lés | pTKCA T | pFC50 | pFC54 | pFC64 | pFC65 | % CAT gátlás |
| 13 | 5 | 2 | 0 | |||
| 14 | 5 | 2 | 26 | |||
| 15 | 5 | 2 | 2 | |||
| 16 | 0 | 2 | NA |
HU 211 891 A9
A 13-16. kezeléseket négy párhuzamosban hajtjuk végre.
A sense CAT konstrukció (16. kezelés) magas szinten termel CAT aktivitást „saját jogán”. Ennél fogva a %-os gátlás nem alkalmazható (NA).
Több kísérletet végzünk, amelyben a pTKCAT TK promotorja humán metallotionein promotorral van helyettesítve. Amikor ezt a CAT konstrukciót együtt fertőzzük COS1 sejtekbe egy. vagy több ribozimot kódoló plazmidokkal, a CAT aktivitásban erőteljes csökkenés következik be.
A fenti adatok világosan demonstrálják a ribozimok in vivő inaktiváló aktivitását állati sejtekben.
Bár a ribozimok hatékonyságát in vivő úgy hisszük, hogy ezt egy vagy több olyan katalitikus terület okozza, amely egy cél-RNS hasítására képes, az ilyen területek jelenléte „antisense” RNS típusú ribozimokban ténylegesen nem vezet in vivő hasításhoz, ha a teljes RNS/anti-sense RNS molekula nem esik szét. Tekintet nélkül azonban arra, vajon a molekula szétesik vagy sem, az eddigi példák megfelelően demonstrálják a ribozim hatékonyságát a cél-RNS inaktiválásában. Úgy a jelen találmány alkalmazható minden olyan ribozimra. amelynek hasítás előidézésére képes katalitikus területe és hibridizáló területe van, tekintet nélkül arra, vajon a hasítás ténylegesen a cél-RNS-ben történik vagy sem. A hibiridizáló terület ugyanis lehet olyan nagy. hogy lehetővé teszi a kombinált RNS/ribozim együttmaradását és megakadályozhatja, hogy a célRNS külön komponensekké különüljön el. bár a katalitikus terület maga képes a hasítás előidézésére.
Claims (30)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Oligoribonukleotid molekula, amely a cél-RNS molekulát egy előre kiválasztott hasítási helyen képes elhasítani, azzal jellemezve, hogy az említett oligoribonukleotid molekula tartalmaz (i) egy ribozim katalitikus régiót, és az említett régió katalitikus aktivitása független a cél-RNS szekvenciájától, és a célRNS-t egy előre kiválasztott helyen hasítja el, és (ii) egy hibridizálódó régiót, amely a katalitikus régió 5’ végéről kinyúló hibridizáló kart tartalmaz, valamint a katalitikus régió 3' végéről kinyúló hibridizáló kart, és az említett karok elég hosszúak ahhoz, hogy biztosítsák a stabil hibridizálást a cél-RNS komplementer szekvenciáihoz, amelyek a kiválasztott hasítási helyet veszik közre.
- 2. AI. általános képletű molekula, azzal jellemezve, hogy benne mindegyik X jelentése egy ribonukleotid, amelyek lehetnek egyformák vagy különbözőek;benne mindegyik (X)„ és (X)n· jelentése egy olyan oligoribonukleotid, amelynek előre meghatározott szekvenciája van, és amely képes bázispárosodás révén kölcsönhatásba lépni egy elhasítandó RNS célszekvenciával, és a természetben nem fordul elő kovalens kötéssel az X-A-A-G-C és X-C-U-G-A szekvenciákhoz kötve;benne mindegyik n és n’ jelentése egész szám, amely meghatározza az oligonukleotidban levő ribonukleotidok számát, azzal a feltétellel, hogy az n+n’ összeg elegendő ahhoz, hogy bázispárosodás révén biztosítsa a ribozim stabil kölcsönhatását az RNS célszekvenciával:benne mindegyik * jelentése bázispárosodást jelent a bármelyik oldalán levő ribonukleotidok között;Benne minden folyamatos vonal kémiai kötést jelent, amely kovelens kötést biztosít a bármelyik oldalán levő ribonukleotidok között;benne a jelentése egész szám, amely meghatározza a ribonukleotidok számát, azzal a feltétellel, hogy a értéke lehet 0 vagy 1, és ha 0, akkor az (X)a-tól 5’ irányban található A az (X)a-tól 3’ irányban G-hez kapcsolódik;benne m és m’ értéke egész szám, amely nagyobb vagy egyenlő eggyel;benne mindegyik szaggatott vonal egymástól függetlenül vagy egy kémiai kötést jelent, amely kovalens kötést biztosít a bármelyik oldalán levő ribonukleotidokkal, vagy bármely ilyen kötés hiányát; és benne (X)b jelentése oligoribonukleotid, amely vagy jelen van vagy nincs, azzal a feltétellel, hogy b jelentése egész szám, amely nagyobb vagy egyenlő kettővel, ha (X)b jelen van.
- 3. Ali általános képletű molekula, azzal jellemezve, hogy benne mindegyik X jelentése egy ribonukleotid, amelyek lehetnek egyformák vagy különbözőek;benne mindegyik (X)n és (X)„ jelentése egy olyan oligoribonukleotid, amelynek előre meghatározott szekvenciája van, és amely képes bázispárosodás révén kölcsönhatásba lépni egy elhasítandó RNS célszekvenciával, és a természetben nem fordul elő kovalens kötéssel az A-A-A-G-C és X-C-U-G-A szekvenciákhoz kötve;benne mindegyik n és n’ jelentése egész szám, amely meghatározza az oligonukleotidban levő ribonukleotidok számát, azzal a feltétellel, hogy az n+n’ összeg elegendő ahhoz, hogy bázispárosodás révén biztosítsa a ribozim stabil kölcsönhatását az RNS célszekvenciával;benne mindegyik * jelentése bázispárosodást jelent a bármelyik oldalán levő ribonukleotidok között;benne minden folyamatos vonal kémiai kötést jelent, amely kovelens kötést biztosít a bármelyik oldalán levő ribonukleotidok között;benne a jelentése egész szám, amely meghatározza a ribonukleotidok számát, azzal a feltétellel, hogy az értéke lehet 0 vagy 1, és ha 0, akkor az (X)a-tól 5’ irányban található A az (X)a-tól 3’ irányban G-hez kapcsolódik;benne m és m’ értéke egész szám, amely nagyobb vagy egyenlő eggyel;benne mindegyik szaggatott vonal egymástól függetlenül vagy egy kémiai kötést jelent, amely kovalens kötést biztosít a bármelyik oldalán levő ribonukleotidokkal, vagy bármely ilyen kötés hiányát; és benne (X)b jelentése oligoribonukleotid, amely vagy jelen van vagy nincs, azzal a feltétellel, hogy bHU 211 891 A9 jelentése egész szám, amely nagyobb vagy egyenlő kettővel, ha (X)b jelen van.
- 4. AIII. általános képletű molekula, azzal jellemezve, hogy benne mindegyik X jelentése egy ribonukleotid, amelyek lehetnek egyformák vagy különbözőek;benne mindegyik (X)n., és (Χ)π· jelentése egy olyan oligoribonukleotid, amelynek előre meghatározott szekvenciája van, és amely képes bázispárosodás révén kölcsönhatásba lépni egy elhasítandó RNS célszekvenciával, és a természetben nem fordul elő kovalens kötéssel a C-A-A-A-G-C és X-C-U-G-A szekvenciákhoz kötve;benne mindegyik n és n’ jelentése egész szám, amely meghatározza az oligonukleotidban levő ribonukleotidok számát, azzal a feltétellel, hogy az n+n’ összeg elegendő ahhoz, hogy bázispárosodás révén biztosítsa a ribozim stabil kölcsönhatását az RNS célszekvenciával;benne mindegyik * jelentése bázispárosodást jelent a bármelyik oldalán levő ribonukleotidok között;benne minden folyamatos vonal kémiai kötést jelent, amely kovelens kötést biztosít a bármelyik oldalán levő ribonukleotidok között;benne a jelentése egész szám, amely meghatározza a ribonukleotidok számát, azzal a feltétellel, hogy az értéke lehet 0 vagy 1, és ha 0 akkor az (X)a-tól 5’ irányban található A az (X)a-tól 3’ irányban G-hez kapcsolódik;benne m és m’ értéke egész szám, amely nagyobb vagy egyenlő eggyel;benne mindegyik szaggatott vonal egymástól függetlenül vagy egy kémiai kötést jelent, amely kovalens kötést biztosít a bármelyik oldalán levő ribonukleotidokkal, vagy bármely ilyen kötés hiányát; és benne (X)b jelentése oligoribonukleotid, amely vagy jelen van vagy nincs, azzal a feltétellel, hogy b jelentése egész szám. amely nagyobb vagy egyenlő kettővel, ha (X)b jelen van.
- 5. A IV. általános képletű molekula, azzal jellemezve, hogy benne mindegyik X jelentése egy ribonukleotid. amelyek lehetnek egyformák vagy különbözőek;benne mindegyik (X)n.i és (X)n- jelentése egy olyan oligoribonukleotid, amelynek előre meghatározott szekvenciája van, és amely képes bázispárosodás révén kölcsönhatásba lépni egy elhasítandó RNS célszekvenciával, és a természetben nem fordul elő kovalens kötéssel a C-A-A-A-G-C és X-C-U-G-A szekvenciákhoz kötve;benne mindegyik n és n’ jelentése egész szám, amely meghatározza az oligonukleotidban levő ribonukleotidok számát, azzal a feltétellel, hogy az n+n’ összeg elegendő ahhoz, hogy bázispárosodás révén biztosítsa a ribozim stabil kölcsönhatását az RNS célszekvenciával;benne mindegyik * jelentése bázispárosodást jelent a bármelyik oldalán levő ribonukleotidok között;benne minden folyamatos vonal kémiai kötést jelent, amely kovelens kötést biztosít a bármelyik oldalán levő ribonukleotidok között;benne m és m’ értéke egész szám, amely nagyobb vagy egyenlő eggyel;benne mindegyik szaggatott vonal egymástól függetlenül vagy egy kémiai kötést jelent, amely kovalens kötést biztosít a bármelyik oldalán levő ribonukleotidokkal, vagy bármely ilyen kötés hiányát; és benne (X)b jelentése oligoribonukleotid, amely vagy jelen van vagy nincs, azzal a feltétellel, hogy b jelentése egész szám, amely nagyobb vagy egyenlő kettővel, ha (X)h jelen van.
- 6. A 2-5. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy az n+n’ összeg nagyobb vagy egyenlő 14-gyei.
- 7. A 2-6. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy az n+n’ összeg nagyobb vagy egyenlő 6-tal.
- 8. A 3’-[-(Y)r-Q-(Y)s-]z-5’ általános képletű vegyület, amelyben Q jelentése a 2-6. igénypontok bármelyike szerinti vegyület;Y jelentése ribonukleotid, amely lehet azonos vagy eltérő;benne r és s jelentése egész szám, amely nagyobb vagy egyenlő O-val; és benne z jelentése egész szám, amely nagyobb, vagy egyenlő 1-gyel.
- 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy benne a hasítandó RNS célszekvencia egy virális szekvencia.
- 10. Készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet tartalmazza, egy gyógyászatilag, állatgyógyászatilag vagy mezőgazdaságilag elfogadható hordozóval együtt.
- 11. Eljárás az 1-9. igéynpontok bármelyike szerinti vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk:(a) egy DNS-t, RNS-t, vagy a kettő kombinációját tartalmazó transzfer vektorba az említett vegyületnek megfelelő nukleotid szekvenciát ligálunk;(b) az (a) lépésben szereplő nukleotid szekvenciát egy RNS polimerázzal átírjuk;(c) kinyerjük a vegyületet.
- 12. RNS-t, DNS-t, vagy a kettő kombinációját tartalmazó transzfer vektor, azzal jellemezve, hogy egy olyan nukleotid szekvenciát tartalmaz, amely transzkripció révén az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet eredményezi.
- 13. Készítmény, azzal jellemezve, hogy a 12. igénypont szerinti transzfer vektort tartalmazza egy gyógyászatilag, állatgyógyászatilag, vagy mezőgazdaságilag elfogadható hordozóval együtt.
- 14. Prokarióta vagy eukarióta sejt, azzal jellemezve, hogy egy olyan nukleotid szekvenciát tartalmaz, amely transzkripció révén az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti vegyület eredményez.
- 15. A 14. igénypont szerinti eukarióta sejt.
- 16. A 15. igénypont szerinti növényi vagy állati sejt.
- 17. Növény, azzal jellemezve, hogy a 16. igénypont szerinti növényi sejtet tartalmazza.
- 18. Eljárás egy cél-RNS inaktiválására egy sejtben, azzal jellemezve, hogy a sejtben levő cél-RNS-t az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti vegyülettel hozzukHU 211 891 A9 érintkezésbe, amely vegyület bázispárosodás révén képes kölcsönhatásba lépni a cél-RNS szekvenciájával, olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik, hogy a vegyület bázispárosodás révén stabil kölcsönhatásba lépjen a cél-RNS-sel és elhasítsa azt.
- 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cél-RNS a sejtben előforduló gén átirata.
- 20. A 18. igénypont szerinü eljárás, azzal jellemezve, hogy a cél-RNS a sejtben elő nem forduló gén átirata.
- 21. A 18-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejt prokarióta vagy eukarióta sejt.
- 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejt egy növényi vagy állati sejt.
- 23. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi sejt egy növény része.
- 24. Eljárás egy emberben vagy állatban levő célRNS-hez kapcsolódó állapot kezelésére, azzal jellemezve, hogy az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet vagy a 12. igénypont szerinti transzfer vektort használjuk.
- 25. Eljárás egy cél-RNS inaktiválására növényekben, azzal jellemezve, hogy az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet vagy a 12. igénypont szerinti transzfer vektort használjuk.
- 26. Eljárás vírusbetegség kezelésére emberben vagy állatban, azzal jellemezve, hogy az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet vagy a 12. igénypont szerinti transzfer vektort használjuk.
- 27. Eljárás egy eukarióta sejtben levő cél-RNS inaktiválására, azzal jellemezve, hogy az eukarióta sejtbe egy exogén nukleinsav szekvenciát juttatunk be, amely, vagy amelynek transzkripciója egy, az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti olyan oligodezoxiribonukleotidot eredményez, amely az említett cél-RNS-t egy kiválasztott hasítási helyen képes elhasítani, és ezzel az említett cél-RNS inaktiválódását okozza, olyan körülmények között, amikor a cél-RNS lehasad vagy inaktiválódik.
- 28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid vegyület az eukarióta sejtben keletkezik.
- 29. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid vegyület az eukarióta sejten kívül keletkezik.
- 30. Eukarióta gazdasejt, azzal jellemezve, hogy az 1 9. igénypontok bármelyike szerinti oligoribonukleoüd vegyületet tartalmazza, amely képes elhasítani egy kiválasztott endogén vagy exogén cél-RNS-t egy előre kiválasztott hasítási helyen, oly módon, hogy ezzel az említett cél-RNS hasítását vagy inaktiválódását okozza.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPI591187 | 1987-12-15 | ||
| AUPI995088 | 1988-08-19 | ||
| AUPJ035388 | 1988-09-09 | ||
| AUPJ130488 | 1988-11-04 | ||
| AUPJ133388 | 1988-11-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU211891A9 true HU211891A9 (en) | 1995-12-28 |
Family
ID=27507391
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU89382A HUT54407A (en) | 1987-12-15 | 1988-12-14 | Process for producing ribozimes |
| HU95P/P00362P HU211891A9 (en) | 1987-12-15 | 1995-06-22 | Ribozymes |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU89382A HUT54407A (en) | 1987-12-15 | 1988-12-14 | Process for producing ribozimes |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0640688A1 (hu) |
| JP (1) | JP3046318B2 (hu) |
| KR (1) | KR970010758B1 (hu) |
| CN (1) | CN1102174C (hu) |
| AR (1) | AR243935A1 (hu) |
| AT (1) | ATE115999T1 (hu) |
| AU (1) | AU632993B2 (hu) |
| CA (1) | CA1340831C (hu) |
| DE (1) | DE3852539T3 (hu) |
| DK (1) | DK175956B1 (hu) |
| ES (1) | ES2065919T5 (hu) |
| FI (1) | FI104562B (hu) |
| GR (1) | GR3015374T3 (hu) |
| HU (2) | HUT54407A (hu) |
| MC (1) | MC2115A1 (hu) |
| NO (2) | NO308610B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ227332A (hu) |
| RO (1) | RO114469B1 (hu) |
| WO (1) | WO1989005852A1 (hu) |
Families Citing this family (177)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5019556A (en) * | 1987-04-14 | 1991-05-28 | President And Fellows Of Harvard College | Inhibitors of angiogenin |
| CA1340323C (en) * | 1988-09-20 | 1999-01-19 | Arnold E. Hampel | Rna catalyst for cleaving specific rna sequences |
| US5866701A (en) * | 1988-09-20 | 1999-02-02 | The Board Of Regents For Northern Illinois University Of Dekalb | HIV targeted hairpin ribozymes |
| US5168053A (en) * | 1989-03-24 | 1992-12-01 | Yale University | Cleavage of targeted RNA by RNAase P |
| US5624824A (en) * | 1989-03-24 | 1997-04-29 | Yale University | Targeted cleavage of RNA using eukaryotic ribonuclease P and external guide sequence |
| DE4091533T (hu) * | 1989-08-31 | 1992-01-30 | ||
| US5225347A (en) * | 1989-09-25 | 1993-07-06 | Innovir Laboratories, Inc. | Therapeutic ribozyme compositions and expression vectors |
| US5225337A (en) * | 1989-09-25 | 1993-07-06 | Innovir Laboratories, Inc. | Ribozyme compositions and methods for use |
| DE3933384A1 (de) * | 1989-10-06 | 1991-04-18 | Hoechst Ag | Multifunktionelle rna mit selbstprozessierungsaktivitaet, ihre herstellung und ihre verwendung |
| DE3935473A1 (de) * | 1989-10-25 | 1991-05-02 | Hoechst Ag | Rna mit endonuclease- und antisense-aktivitaet, ihre herstellung und ihre verwendung |
| KR927003044A (ko) * | 1990-01-11 | 1992-12-17 | 크리스토퍼 케이. 미라벨리 | Rna 활성과 유전자 발현을 검출하고 조절하는 조성물 및 그 방법 |
| US5519164A (en) * | 1990-02-01 | 1996-05-21 | Hoechst Aktiengesellschaft | Expression of a multigene RNA having self-splicing activity |
| DE4002885A1 (de) * | 1990-02-01 | 1991-08-08 | Hoechst Ag | Expression einer multigen rna mit self-splicing aktivitaet |
| US5180818A (en) * | 1990-03-21 | 1993-01-19 | The University Of Colorado Foundation, Inc. | Site specific cleavage of single-stranded dna |
| WO1991018913A1 (en) * | 1990-06-07 | 1991-12-12 | City Of Hope | Ribozyme mediated reversal of transformation by cleavage of the hras oncogene rna |
| AU7152191A (en) * | 1990-06-07 | 1991-12-31 | City Of Hope | Ribozyme mediated reversal of transformation by cleavage of the hras oncogene rna |
| WO1991019789A1 (en) * | 1990-06-19 | 1991-12-26 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Endonucleases |
| US6008343A (en) * | 1990-06-19 | 1999-12-28 | Gene Shears Pty. Ltd. | Nucleotide based endonucleases |
| US5246921A (en) * | 1990-06-26 | 1993-09-21 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Method for treating leukemias |
| CA2086105A1 (en) * | 1990-06-26 | 1991-12-27 | Premkumar Reddy | Method for treating leukemias |
| WO1992001786A1 (en) * | 1990-07-26 | 1992-02-06 | Foundation For Research And Technology - Hellas (Fo.R.T.H.) Institute Of Molecular Biology & Biotechnology | Portable ribozyme cassettes, dna sequences containing them, ribozymes encoded by these dna sequences, and compositions containing these ribozymes |
| PL169576B1 (pl) * | 1990-10-12 | 1996-08-30 | Max Planck Gesellschaft | Sposób wytwarzania czasteczki RNA o aktywnosci katalitycznej PL PL |
| NZ241310A (en) * | 1991-01-17 | 1995-03-28 | Gen Hospital Corp | Trans-splicing ribozymes |
| NZ314630A (en) * | 1991-01-17 | 2000-11-24 | Harvard College | Use of trans-splicing ribozymes for genetic modification and cell ablation in a host cell |
| FR2675803B1 (fr) | 1991-04-25 | 1996-09-06 | Genset Sa | Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications. |
| FI913197A0 (fi) | 1991-07-01 | 1991-07-01 | Xyrofin Oy | Nya jaeststammar med reducerad foermaoga att metabolisera xylitol, foerfarande foer bildande av dessa och deras anvaendning vid framstaellning av xylitol. |
| EP0623171A4 (en) * | 1992-01-13 | 1997-02-12 | Univ Duke | ENZYMATIC RNA MOLECULES. |
| EP0592685B1 (en) * | 1992-04-17 | 2001-11-28 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Plant resistant to two or more viruses and preparation thereof |
| WO1994000012A1 (en) * | 1992-06-29 | 1994-01-06 | Gene Shears Pty. Ltd. | Nucleic acids and methods of use thereof for controlling viral pathogens |
| EP0653488B1 (en) * | 1992-07-02 | 2003-04-09 | Sankyo Company Limited | Looped, hairpin ribozyme |
| US5409823A (en) * | 1992-09-24 | 1995-04-25 | Ciba-Geigy Corporation | Methods for the production of hybrid seed |
| US5864028A (en) * | 1992-11-03 | 1999-01-26 | Gene Shears Pty. Limited | Degradation resistant mRNA derivatives linked to TNF-α ribozymes |
| ZA938208B (en) * | 1992-11-03 | 1995-01-03 | Gene Shears Pty Ltd | TNF-alpha ribozymes and degradation resistant mRNA derivatives linked to TNF-alpha ribozymes |
| JPH08506724A (ja) * | 1992-12-04 | 1996-07-23 | アポロン・インコーポレーテッド | 白血病治療のための化合物および方法 |
| WO1994013833A1 (en) * | 1992-12-04 | 1994-06-23 | Innovir Laboratories, Inc. | Ribozyme amplified diagnostics |
| EP0707638A4 (en) * | 1992-12-04 | 1998-05-20 | Innovir Lab Inc | REGULABLE NUCLEIC ACID FOR THERAPEUTIC USE AND METHODS OF USE THEREOF |
| FR2701960B1 (fr) * | 1993-02-26 | 2002-09-13 | Gene Shears Pty Ltd | Polyribozyme apte à conférer, aux plantes, une résistance aux virus et plantes résistantes produisant ce polyribozyme. |
| US5817635A (en) * | 1993-08-09 | 1998-10-06 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Modified ribozymes |
| WO1995010608A1 (en) * | 1993-10-15 | 1995-04-20 | Foundation For Research And Technology - Hellas (Fo.R.T.H.) | Asymmetric hammerhead ribozymes and nucleotide sequences for their construction |
| US5869248A (en) * | 1994-03-07 | 1999-02-09 | Yale University | Targeted cleavage of RNA using ribonuclease P targeting and cleavage sequences |
| US5998193A (en) * | 1994-06-24 | 1999-12-07 | Gene Shears Pty., Ltd. | Ribozymes with optimized hybridizing arms, stems, and loops, tRNA embedded ribozymes and compositions thereof |
| US6350934B1 (en) | 1994-09-02 | 2002-02-26 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid encoding delta-9 desaturase |
| US5683873A (en) * | 1995-01-13 | 1997-11-04 | Innovir Laboratories, Inc. | EGS-mediated inactivation of target RNA |
| US6057153A (en) * | 1995-01-13 | 2000-05-02 | Yale University | Stabilized external guide sequences |
| FR2730637B1 (fr) | 1995-02-17 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations |
| WO1996040906A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Optimized minizymes and miniribozymes and uses thereof |
| US6010904A (en) * | 1995-06-07 | 2000-01-04 | The General Hospital Corporation | Cell ablation using trans-splicing ribozymes |
| US6004806A (en) * | 1995-06-07 | 1999-12-21 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization | Optimized minizymes and miniribozymes and uses thereof |
| MX9800454A (es) * | 1995-07-13 | 1998-04-30 | Ribozyme Pharm Inc | Composiciones y metodo para modulacion de expresion de genes en las plantas. |
| US5824519A (en) * | 1995-11-08 | 1998-10-20 | Medical University Of South Carolina | Tissue-specific and target RNA-specific ribozymes |
| US5877162A (en) * | 1996-03-14 | 1999-03-02 | Innovir Laboratories, Inc. | Short external guide sequences |
| US6620805B1 (en) | 1996-03-14 | 2003-09-16 | Yale University | Delivery of nucleic acids by porphyrins |
| WO1998006837A1 (en) * | 1996-08-16 | 1998-02-19 | Yale University | Phenotypic conversion of drug-resistant bacteria to drug-sensitivity |
| US6610478B1 (en) | 1996-08-16 | 2003-08-26 | Yale University | Phenotypic conversion of cells mediated by external guide sequences |
| US6884430B1 (en) | 1997-02-10 | 2005-04-26 | Aventis Pharma S.A. | Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles |
| US7083786B2 (en) | 1997-04-03 | 2006-08-01 | Jensenius Jens Chr | MASP-2, a complement-fixing enzyme, and uses for it |
| CA2286895C (en) | 1997-04-15 | 2010-07-13 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Plant fatty acid epoxygenase genes and uses therefor |
| US7589253B2 (en) | 1997-04-15 | 2009-09-15 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Fatty acid epoxygenase genes from plants and uses therefor in modifying fatty acid metabolism |
| DE69826124T3 (de) | 1997-06-30 | 2007-10-11 | Institut Gustave Roussy | Verabreichung der nukleinsäure in den quergestreiften muskel |
| AU754803B2 (en) | 1997-09-16 | 2002-11-28 | Cropdesign N.V. | Cyclin-dependent kinase inhibitors and uses thereof |
| DE19741375C2 (de) * | 1997-09-19 | 1999-10-21 | Max Planck Gesellschaft | Transgene Pflanzen, deren oberirdische Teile früher reifen und vollständig absterben |
| EP1019082B2 (en) | 1997-10-02 | 2008-06-04 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissenschaften E.V. | Use of a colony stimulating factor (csf) for enhancing collateral growth of collateral arteries and/or other arteries from preexisting arteriolar connections |
| EP1032595B1 (en) | 1997-11-18 | 2011-05-18 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Nucleic acids involved in the responder phenotype and applications thereof |
| US6013447A (en) * | 1997-11-21 | 2000-01-11 | Innovir Laboratories, Inc. | Random intracellular method for obtaining optimally active nucleic acid molecules |
| CZ295108B6 (cs) | 1998-03-20 | 2005-05-18 | Benitec Australia Ltd | Syntetický gen obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu a genový konstrukt obsahující tento syntetický gen |
| AUPP249298A0 (en) | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
| US6248525B1 (en) | 1998-03-30 | 2001-06-19 | Yale University | Method for identifying essential or functional genes |
| WO1999067400A1 (en) | 1998-06-24 | 1999-12-29 | Musc Foundation For Research Development | Tissue-specific and target rna-specific ribozymes |
| DE19836098A1 (de) | 1998-07-31 | 2000-02-03 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke |
| JP2002527066A (ja) | 1998-10-15 | 2002-08-27 | カイロン コーポレイション | 転移性乳癌および結腸癌調節遺伝子 |
| AU773808B2 (en) * | 1998-11-09 | 2004-06-10 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Nucleic acid molecules from rice and their use for the production of modified starch |
| WO2000029592A2 (en) | 1998-11-12 | 2000-05-25 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Chimeric promoters capable of mediating gene expression in plants upon pathogen infection and uses thereof |
| EP1141331B1 (en) | 1998-12-16 | 2008-09-17 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | HUMAN CYCLIN-DEPENDENT KINASE (hPNQALRE) |
| US6271359B1 (en) | 1999-04-14 | 2001-08-07 | Musc Foundation For Research Development | Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes |
| AUPQ005299A0 (en) | 1999-04-29 | 1999-05-27 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Novel genes encoding wheat starch synthases and uses therefor |
| AU778695B2 (en) | 1999-07-20 | 2004-12-16 | Ges. Fur Erwerb Und Verwertung Von Schutzrechten-Gvs Mbh | Novel method for the generation and selection of transgenic linseed/flax plants |
| US6423885B1 (en) | 1999-08-13 | 2002-07-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) | Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells |
| CA2416289C (en) | 2000-07-21 | 2012-12-04 | Essentia Biosystems, Inc. | Multi-component biological transport systems |
| AU1480402A (en) | 2000-11-09 | 2002-05-21 | Commw Scient Ind Res Org | Barley with reduced SSII activity and starch containing products with a reduced amylopectin content |
| ITMI20011364A1 (it) * | 2001-06-28 | 2002-12-28 | Metapontum Agrobios S C R L | Robozima hammerhead specifico per la stearoyl-acp desaturesi di piante oleaginose differenti |
| CN101926824A (zh) | 2001-07-10 | 2010-12-29 | 强生和强生研究有限公司 | 用于遗传修饰造血祖细胞的方法和这些被修饰细胞的应用 |
| US7994144B2 (en) | 2001-07-10 | 2011-08-09 | Johnson & Johnson Research Pty, Limited | Process for the preparation of a composition of genetically modified hematopoietic progenitor cells |
| US8022272B2 (en) | 2001-07-13 | 2011-09-20 | Sungene Gmbh & Co. Kgaa | Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids |
| FR2829136B1 (fr) | 2001-08-29 | 2006-11-17 | Aventis Pharma Sa | Derives lipidiques d'aminoglycosides |
| US7456335B2 (en) | 2001-09-03 | 2008-11-25 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acid sequences and their use in methods for achieving pathogen resistance in plants |
| EP1427856B1 (en) | 2001-09-18 | 2011-05-11 | Carnegie Institution Of Washington | Fusion proteins useful for detecting analytes |
| WO2003051314A2 (en) | 2001-12-18 | 2003-06-26 | Medallion Biomedical, Llc | Antibiotic compounds |
| US20040005546A1 (en) | 2002-02-28 | 2004-01-08 | Oncolytics Biotech Inc. | Use of ribozymes in the detection of adventitious agents |
| DE10212892A1 (de) | 2002-03-20 | 2003-10-09 | Basf Plant Science Gmbh | Konstrukte und Verfahren zur Regulation der Genexpression |
| EP1900827A3 (en) | 2002-05-21 | 2008-04-16 | Bayer HealthCare AG | Methods and compositions for the prediction, diagnosis, prognosis, prevention and treatment of malignant neoplasia |
| CA2542171C (en) | 2002-06-26 | 2015-12-15 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Modulators and modulation of the interaction between rgm and neogenin |
| EP1527183B1 (de) | 2002-07-26 | 2008-08-20 | BASF Plant Science GmbH | Neue selektionsverfahren |
| EP1572976B1 (en) | 2002-11-21 | 2010-09-15 | Celltech R & D, Inc. | Modulating immune responses |
| PT1578973E (pt) | 2002-12-19 | 2008-10-16 | Bayer Cropscience Ag | Células de plantas e plantas que sintetizam um amido com uma melhor viscosidade final |
| PL1625166T3 (pl) | 2003-05-12 | 2015-08-31 | Helion Biotech Aps | Przeciwciała przeciwko masp-2 |
| US7812221B2 (en) | 2003-06-30 | 2010-10-12 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization | Wheat with altered branching enzyme activity and starch and starch containing products derived therefrom |
| EP1892306A3 (en) | 2003-10-06 | 2008-06-11 | Bayer HealthCare AG | Methods and kits for investigating cancer |
| EP1602926A1 (en) | 2004-06-04 | 2005-12-07 | University of Geneva | Novel means and methods for the treatment of hearing loss and phantom hearing |
| US7604947B2 (en) | 2004-06-09 | 2009-10-20 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection and modulation of cancer stem cells |
| ES2601497T3 (es) | 2004-06-10 | 2017-02-15 | Omeros Corporation | Métodos para tratar afecciones asociadas con la activación del complemento dependiente de MASP-2 |
| US8840893B2 (en) | 2004-06-10 | 2014-09-23 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
| US7919094B2 (en) | 2004-06-10 | 2011-04-05 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
| EP1763582B1 (en) | 2004-07-08 | 2014-12-10 | DLF - Trifolium A/S | Means and methods for controlling flowering in plants |
| CA2834275A1 (en) | 2004-08-02 | 2006-02-09 | Basf Plant Science Gmbh | Method for isolation of transcription termination sequences |
| EP1794304B1 (en) | 2004-09-24 | 2013-06-19 | BASF Plant Science GmbH | Plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress |
| JP5638736B2 (ja) | 2004-12-30 | 2014-12-10 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション | 腸の健康を改善する方法および手段 |
| EP1707632A1 (de) | 2005-04-01 | 2006-10-04 | Bayer CropScience GmbH | Phosphorylierte waxy-Kartoffelstärke |
| ES2542501T3 (es) | 2005-09-30 | 2015-08-06 | Abbvie Deutschland Gmbh & Co Kg | Dominios de unión de proteínas de la familia de proteínas de moléculas de orientación repulsiva (RGM) y fragmentos funcionales de las mismas, así como su uso |
| CA2628505A1 (en) | 2005-11-08 | 2007-05-18 | Basf Plant Science Gmbh | Use of armadillo repeat (arm1) polynucleotides for obtaining resistance to pathogens in plants |
| EP1979484B1 (en) | 2006-01-12 | 2014-03-19 | BASF Plant Science GmbH | Use of stomatin (stm1) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants |
| AU2007299219A1 (en) | 2006-04-05 | 2008-03-27 | Metanomics Gmbh | Process for the production of a fine chemical |
| EP2030021B1 (en) | 2006-05-18 | 2012-11-21 | Andreas Reichert | Method for diagnosing mitochondrial dysfunction |
| US8383597B2 (en) | 2006-05-25 | 2013-02-26 | Cornell Research Foundation, Inc. | G proteins in tumor growth and angiogenesis |
| CN101600808B (zh) | 2006-10-06 | 2014-07-09 | 强生研究有限公司 | 分子开关及其使用方法 |
| WO2008087141A2 (en) | 2007-01-15 | 2008-07-24 | Basf Plant Science Gmbh | Use of subtilisin (rnr9) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants |
| EP2074219B1 (en) | 2007-02-16 | 2013-11-20 | BASF Plant Science GmbH | Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants |
| CA2681650C (en) | 2007-03-27 | 2016-11-22 | Omeros Corporation | The use of pde7 inhibitors for the treatment of movement disorders |
| CA2687635A1 (en) | 2007-05-22 | 2008-11-27 | Basf Plant Science Gmbh | Plant cells and plants with increased tolerance and/or resistance to environmental stress and increased biomass production-ko |
| CL2008002775A1 (es) | 2007-09-17 | 2008-11-07 | Amgen Inc | Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea. |
| EP2040075A1 (en) | 2007-09-24 | 2009-03-25 | Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Compounds and markers for surface-enhanced raman scattering |
| MX2010006519A (es) | 2007-12-14 | 2010-10-15 | Amgen Inc | Metodo para tratar una fractura de hueso con anticuerpos anti-esclerostina. |
| AU2008340002A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-07-02 | Basf Plant Science Gmbh | Plants with increased yield (KO NUE) |
| US8962803B2 (en) | 2008-02-29 | 2015-02-24 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Antibodies against the RGM A protein and uses thereof |
| EP2100962A1 (en) | 2008-03-12 | 2009-09-16 | Biogemma | Plants having improved resistance to pathogens |
| US10517839B2 (en) | 2008-06-09 | 2019-12-31 | Cornell University | Mast cell inhibition in diseases of the retina and vitreous |
| US8790664B2 (en) | 2008-09-05 | 2014-07-29 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Multimodular assembly useful for intracellular delivery |
| EP2184351A1 (en) | 2008-10-30 | 2010-05-12 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Polynucleotides encoding caryophyllene synthase and uses thereof |
| ES2363358B1 (es) | 2009-04-03 | 2012-06-21 | FUNDACIÓ INSTITUT DE RECERCA HOSPITAL UNIVERSITARI VALL D'HEBRON (Titular al | Agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades asociadas con una proliferación celular indeseable. |
| DE112010003162T5 (de) | 2009-04-22 | 2012-08-16 | Basf Plant Science Company Gmbh | Gesamtsamen-spezifischer Promotor |
| EP2475367A1 (en) | 2009-09-10 | 2012-07-18 | Centre National De La Recherche Scientifique | NOVEL INHIBITORS OF STEAROYL-CoA-DESATURASE-1 AND THEIR USES |
| EP2305285A1 (en) | 2009-09-29 | 2011-04-06 | Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Means and methods for treating ischemic conditions |
| CA2777845C (en) | 2009-10-16 | 2017-08-01 | Omeros Corporation | Methods for treating disseminated intravascular coagulation by inhibiting masp-2 dependent complement activation |
| CN102812014B (zh) | 2009-10-30 | 2016-01-20 | 多美恩医疗公司 | 新颖的肟衍生物及其作为代谢型谷氨酸受体的别构调节剂的用途 |
| EP2322149A1 (en) | 2009-11-03 | 2011-05-18 | Universidad del Pais Vasco | Methods and compositions for the treatment of ischemia |
| SG181563A1 (en) | 2009-12-08 | 2012-07-30 | Abbott Gmbh & Co Kg | Monoclonal antibodies against the rgm a protein for use in the treatment of retinal nerve fiber layer degeneration |
| EP2338492A1 (en) | 2009-12-24 | 2011-06-29 | Universidad del Pais Vasco | Methods and compositions for the treatment of alzheimer |
| US8476485B2 (en) | 2010-06-24 | 2013-07-02 | Academia Sinica | Non-human animal model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) with loss-of-TDP-43 function |
| US9220715B2 (en) | 2010-11-08 | 2015-12-29 | Omeros Corporation | Treatment of addiction and impulse-control disorders using PDE7 inhibitors |
| CN103547267A (zh) | 2010-11-08 | 2014-01-29 | 奥默罗斯公司 | 使用pde7抑制剂治疗成瘾和冲动控制障碍 |
| US9644035B2 (en) | 2011-04-08 | 2017-05-09 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
| WO2012139081A2 (en) | 2011-04-08 | 2012-10-11 | University Of Leicester | Methods for treating conditions associated with masp-2 dependent complement activation |
| US20150017091A1 (en) | 2011-08-18 | 2015-01-15 | Cornell University | Detection and treatment of metastatic disease |
| WO2013039880A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Biomarkers and therapeutic targets of hepatocellular cancer |
| CA2859564C (en) | 2011-12-16 | 2020-04-14 | Board Of Trustees Of Michigan State University | P-coumaroyl-coa:monolignol transferase |
| RU2644337C2 (ru) | 2012-01-27 | 2018-02-08 | Эббви Дойчланд Гмбх Унд Ко. Кг | Композиции и способы диагностики и лечения заболеваний, ассоциированных с дегенерацией нейритов |
| WO2013138463A1 (en) | 2012-03-14 | 2013-09-19 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Neurofibromatoses therapeutic agents and screening for same |
| EP2666775A1 (en) | 2012-05-21 | 2013-11-27 | Domain Therapeutics | Substituted pyrazoloquinazolinones and pyrroloquinazolinones as allosteric modulators of group II metabotropic glutamate receptors |
| WO2014127835A1 (en) | 2013-02-22 | 2014-08-28 | Christian-Albrechts-Universität Zu Kiel | Plant-derived resistance gene |
| US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
| IL283373B1 (en) | 2013-10-17 | 2024-04-01 | Omeros Corp | Pharmaceutical preparations containing MASP-2 suppressors to suppress MASP-2-dependent complement activation and related diseases |
| NZ721036A (en) | 2013-12-18 | 2023-07-28 | Grains Res & Dev Corp | Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids |
| EP3160482A4 (en) | 2014-06-27 | 2018-02-14 | Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation | Lipid comprising docosapentaenoic acid |
| EP3000814A1 (en) | 2014-09-26 | 2016-03-30 | Domain Therapeutics | Substituted pyrazoloquinazolinones and pyrroloquinazolinones as allosteric modulators of group II metabotropic glutamate receptors |
| AU2016354117B2 (en) | 2015-11-09 | 2019-11-28 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
| UA127339C2 (uk) | 2016-01-05 | 2023-07-26 | Юніверсіті Оф Лестер | СПОСІБ ПРОФІЛАКТИКИ АБО ЗМЕНШЕННЯ УРАЖЕННЯ НИРОК У СУБ'ЄКТА, ЩО СТРАЖДАЄ НА СТЕРОЇДЗАЛЕЖНУ ІМУНОГЛОБУЛІН-А-НЕФРОПАТІЮ (IgAN) |
| SG10202009886SA (en) | 2016-03-31 | 2020-11-27 | Omeros Corp | Methods for inhibiting angiogenesis in a subject in need thereof |
| JP6995783B2 (ja) | 2016-05-26 | 2022-02-04 | ヌンヘムス、ベスローテン、フェンノートシャップ | 種なし果実を実らせる植物 |
| AU2017308889B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-11-09 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
| DK3565891T3 (da) | 2017-01-09 | 2023-07-24 | Whitehead Inst Biomedical Res | Fremgangsmåder til ændring af genekspression ved forstyrrelse af transkriptionsfaktor-multimere, der strukturerer regulatoriske sløjfer |
| US11898179B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| US10883089B2 (en) | 2017-04-04 | 2021-01-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Feruloyl-CoA:monolignol transferases |
| US10883090B2 (en) | 2017-04-18 | 2021-01-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | P-coumaroyl-CoA:monolignol transferases |
| EP3655015B1 (en) | 2017-07-17 | 2024-02-21 | The Regents of the University of Colorado | Compositions and methods for preventing and treating radiation-induced bystander effects caused by radiation or radiotherapy |
| US11732274B2 (en) | 2017-07-28 | 2023-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE) |
| TW202402809A (zh) | 2017-08-15 | 2024-01-16 | 美商歐米諾斯公司 | 用於治療和／或預防與造血幹細胞移植有關的移植物抗宿主病和／或瀰漫性肺泡出血和／或靜脈閉塞性病的方法 |
| EP3676376A2 (en) | 2017-08-30 | 2020-07-08 | President and Fellows of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
| KR20200121782A (ko) | 2017-10-16 | 2020-10-26 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 아데노신 염기 편집제의 용도 |
| US11584714B2 (en) | 2018-05-29 | 2023-02-21 | Omeros Corporation | MASP-2 inhibitors and methods of use |
| US11291176B2 (en) | 2018-06-15 | 2022-04-05 | Nunhems B.V. | Seedless watermelon plants comprising modifications in an ABC transporter gene |
| US11981904B2 (en) | 2018-11-09 | 2024-05-14 | Wisconsin Alumni Research Foundation | BAHD acyltransferases |
| BR112021018606A2 (pt) | 2019-03-19 | 2021-11-23 | Harvard College | Métodos e composições para editar sequências de nucleotídeos |
| JP2023504543A (ja) | 2019-12-04 | 2023-02-03 | オメロス コーポレーション | Ｍａｓｐ－２阻害剤および使用方法 |
| DE112021002672T5 (de) | 2020-05-08 | 2023-04-13 | President And Fellows Of Harvard College | Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz |
| CN116096378A (zh) | 2020-08-10 | 2023-05-09 | 诺华股份有限公司 | 视网膜变性疾病的治疗 |
| WO2024038089A1 (en) | 2022-08-18 | 2024-02-22 | Mitodicure Gmbh | Use of a therapeutic agent with phosphodiesterase-7 inhibitory activity for the treatment and prevention of diseases associated with chronic fatigue, exhaustion and/or exertional intolerance |
| WO2024042160A1 (en) | 2022-08-26 | 2024-02-29 | Mitodicure Gmbh | Use of a therapeutic agent with sodium-hydrogen antiporter 1 inhibitory activity for the treatment and prevention of diseases associated with chronic fatigue, exhaustion and/or exertional intolerance |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4987071A (en) * | 1986-12-03 | 1991-01-22 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods |
| US5116742A (en) * | 1986-12-03 | 1992-05-26 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods |
| DE3642623A1 (de) * | 1986-12-13 | 1988-06-23 | Burbach & Bender Ohg | Gasspuelstein fuer metallurgische gefaesse |
| DE3939771A1 (de) * | 1989-12-01 | 1991-06-06 | Behringwerke Ag | Verfahren zur biologischen inaktivierung von nukleinsaeuren |
-
1988
- 1988-12-14 RO RO145344A patent/RO114469B1/ro unknown
- 1988-12-14 NZ NZ227332A patent/NZ227332A/xx unknown
- 1988-12-14 WO PCT/AU1988/000478 patent/WO1989005852A1/en active IP Right Grant
- 1988-12-14 CA CA000585845A patent/CA1340831C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-14 HU HU89382A patent/HUT54407A/hu unknown
- 1988-12-14 KR KR1019890701528A patent/KR970010758B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-12-14 AU AU28007/89A patent/AU632993B2/en not_active Expired
- 1988-12-14 EP EP94107862A patent/EP0640688A1/en not_active Withdrawn
- 1988-12-14 ES ES88311816T patent/ES2065919T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-14 JP JP1500279A patent/JP3046318B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-14 EP EP88311816A patent/EP0321201B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-14 DE DE3852539T patent/DE3852539T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-14 AT AT88311816T patent/ATE115999T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-12-14 AR AR88312737A patent/AR243935A1/es active
- 1988-12-14 MC MC882115D patent/MC2115A1/xx unknown
- 1988-12-15 CN CN88108572A patent/CN1102174C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-06-12 DK DK199001433A patent/DK175956B1/da not_active IP Right Cessation
- 1990-06-12 FI FI902923A patent/FI104562B/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-06-14 NO NO902661A patent/NO308610B1/no unknown
-
1995
- 1995-03-13 GR GR940403895T patent/GR3015374T3/el unknown
- 1995-06-22 HU HU95P/P00362P patent/HU211891A9/hu unknown
-
2000
- 2000-01-25 NO NO20000369A patent/NO312105B1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU211891A9 (en) | Ribozymes | |
| US5766942A (en) | Ribozymes | |
| US5543508A (en) | Ribozymes | |
| US5874414A (en) | Trans-splicing ribozymes | |
| US5998193A (en) | Ribozymes with optimized hybridizing arms, stems, and loops, tRNA embedded ribozymes and compositions thereof | |
| US5641673A (en) | Cell ablation using trans-splicing ribozymes | |
| US6004806A (en) | Optimized minizymes and miniribozymes and uses thereof | |
| JP2001504328A (ja) | 医薬上使用される化合物と結合するｒｎａ標的モチーフの特徴付けおよび選択の方法 | |
| RU2144080C1 (ru) | Рибозим, способ инактивации рнк-мишени, способ получения рибозима | |
| IL88683A (en) | Ribozymes their production and pharmaceutical compositions containing them | |
| AU653787C (en) | Cell ablation using trans-splicing ribozymes |