UA127339C2 - СПОСІБ ПРОФІЛАКТИКИ АБО ЗМЕНШЕННЯ УРАЖЕННЯ НИРОК У СУБ'ЄКТА, ЩО СТРАЖДАЄ НА СТЕРОЇДЗАЛЕЖНУ ІМУНОГЛОБУЛІН-А-НЕФРОПАТІЮ (IgAN) - Google Patents

Abstract

Винахід стосується способу профілактики або зменшення ураження нирок у суб’єкта, що страждає на стероїдзалежну імуноглобулін-А-нефропатію (IgAN), який включає введення моноклонального антитіла проти людської мананзв'язувальної лектинасоційованої серинової протеази-2 (MASP-2)

Description

Альбумін'креатини відношення (АСК) у ДАМ пацієнтів, що одержували СОМОБАВ ; , 9 ї

З ; ГЕ дн нення 1а-тижнево лікування ітижневі дози! , 1,500, ра : с, т х роко Пацієнт я Я ах око Пацієнт 2

ВО нн в о пох чав 15

МН

Зміна від вихідного рівня йод трансформований сах веб, В: ве 00В; с: вед 15

Зміна від вихідного рівня: а: ве00Ю3; ре 007; є реб,оз3

Фіг. 40

ПЕРЕХРЕСНІ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ

Дана заявка просить пріоритет попередньої заявки на патент 62/275,025, поданої 5 січня 2016 р., і попередньої заявки на патент 62/407,979, поданої 13 жовтня 2016 р., обидві з яких включені в даний опис у всій своїй повноті за допомогою посилання.

ЗАЯВА ВІДНОСНО СПИСКУ ПОСЛІДОВНОСТІ

Список послідовностей, пов'язаний з цією заявкою, представлений у текстовому форматі замість паперової копії і включений у дану заявку за допомогою посилання. Текстовий файл, що містить список послідовностей, названий МР 1 0250 РСТ бедиепсе І ібіпуд 20170104 57125.

Текстовий файл має розмір 136 КБ, був створений 4 січня 2017 року і доступний через ЕЕ5-Мер з моменту подачі опису.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

У людей і інших хребетних система комплементу забезпечує механізм ранньої дії по ініціації, ампліфікації і регуляції імунної відповіді на мікробну інфекцію і інші гострі інфекції (І іє27ем/5Кі

М.К. апа АїкКіпзоп У.Р., 1993, іп Еипдатепаї! Іттипоіоду, Тпіка Едйоп, едітед ру МЕ. Раці, Намеп

Ргез5, Ца., Мем ХогК). Хоча активація комплементу забезпечує важливу першу лінію захисту від потенційних патогенів, активність комплементу, яка стимулює формування захисної імунної відповіді, може також бути потенційною загрозою для хазяїна (Каїїйї К.М. еї аї., 5ргіпдег бЗетіп.

Іттипораїної. 15:41-431, 1994; Могдап В.Р., Ек. У). Сіїпісаи! Іпмевід. 24:219-228, 1994).

Наприклад, протеолітичні продукти СЗ і С5 стимулюють рекрутування і активацію нейтрофілів.

Хоча нейтрофіли необхідні для захисту хазяїна, активовані нейтрофіли не виборні по вивільненню ними деструктивних ферментів і можуть викликати ушкодження органів. Крім того, активація комплементу може викликати відкладення літичних компонентів комплементу на сусідніх клітинах-хазяїнах, а також на мікробних мішенях, приводячи до лізису клітин-хазяїнів.

Система комплементу також бере участь у патогенезі численних гострих і хронічних захворювань, включаючи інфаркт міокарда, інсульт, РДСОСД, реперфузійне ушкодження, септичний шок, капілярний витік після термічних опіків, запалення після операції по кардіопульмонарному шунтуванню, відторгнення трансплантата, ревматоїдний артрит, множинний склероз, міастенію і хворобу Альцгеймера. Майже при всіх цих станах сам комплемент не викликає ці стани, але є одним з декількох факторів, що беруть участь у

Зо патогенезі. Проте, активація комплементу може бути основним патологічним механізмом і являє собою ефективну ланку для клінічного контролю при багатьох зазначених хворобливих станах.

Усе зростаюче визнання важливого значення в розумінні механізмів опосередкованого комплементом ураження тканин при різних хворобливих станах ще раз указує на необхідність у розробці ефективних лікарських речовин, інгібуючих комплемент. На сьогоднішній день

Екулізумаб (ЗоїагієФф (Соларіс)), тобто анти-С5 антитіло, є єдиним лікарським засобом, націленим на комплемент, схваленим для використання людиною. Проте, С5 є однією з декількох ефекторних молекул, що діють на "пізніх" етапах системи комплементу, і блокада С5 не приводить до пригнічення активації системи комплементу. Отже, інгібітор етапів ініціації активації комплементу мав би суттєву перевагу в порівнянні з інгібітором компонента комплементу, що діє на пізніх етапах.

На даний час загальновизнано, що система комплементу може бути активована трьома різними шляхами: класичним, лектиновим і альтернативним. Класичний шлях звичайно запускається комплексом, що складається з антитіл хазяїна, зв'язаних із чужорідною частинкою (тобто антигеном), і, отже, вимагає попереднього впливу антигену для генерації специфічної відповіді антитіла. Оскільки активація класичного шляху залежить від попередньої адаптивної імунної відповіді хазяїна, класичний шлях є частиною системи набутого імунітету. На противагу цьому, і лектиновий, і альтернативний шляхи не залежать від адаптивного імунітету і є частиною системи вродженого імунітету.

Активація системи комплементу приводить до послідовної активації зимогенів серинової протеази. Першим етапом активації класичного шляху є зв'язування молекули специфічного розпізнавання С1д 3 антигензв'язаними молекулами /дсС і ІМ. С14д асоційований з проферментами серинової протеази Сіг і С15 у вигляді комплексу, називаного С1. При зв'язуванні С1д з імунним комплексом аутопротеолітичне розщеплення Аго-Пе сайта Сг супроводжується опосередкованим Стіг розщепленням і активацією С15, таким чином забезпечуючи здатність розщеплювати С4 і С2. С4 розщеплюється на два фрагменти, позначені С4а і С4б, ї С2, аналогічно, розщеплюється на Сга і С2Б5. Фрагменти С4Б6 можуть утворювати ковалентні зв'язки з сусідніми гідроксильними групами або аміногрупами і генерувати СЗ-конвертазу (С4рг2а) за допомогою нековалентної взаємодії з фрагментом С2а активованого С2. СЗ-конвертаза (С4р2а) активує ССЗ за допомогою протеолітичного бо розщеплення на субкомпоненти СЗа і СЗр, приводячи до утворення С5-конвертази (С4Б2азь),

яка через розщеплення С5 приводить до утворення мембраноатакуючого комплексу (С5Б разом з Сб, С7, С8 і С9, також називаного МАС), який може руйнувати клітинні мембрани, приводячи до лізису клітин. Активовані форми СЗ і С4 (С3Бр ї С4б) у результаті ковалентного зв'язування осаджуються на поверхнях чужорідних мішеней, які розпізнаються рецепторами комплементу на багатьох фагоцитах.

Незалежно від цього, першим етапом активації системи комплементу по лектиновому шляху також є зв'язування молекул специфічного розпізнавання, після якого відбувається активація проферментів, асоційованих з сериновою протеазою. Однак, замість зв'язування імунних комплексів за допомогою С1д, молекули розпізнавання в лектиновому шляху містять групу вуглеводзв'язувальних білків (мананзв'язувальний лектин (МВІ), Н-фіколін, М-фіколін, І -фіколін і лектин С-типу СІ -11), відомих під загальною назвою лектини. Див. І и 5. еї а!., Віоспіт. Віорпув.

Асіа, 1572:387-400, (2002); НоІт5Ком еї аї., Аппи. Нем. Іттипої. 21:547-578 (2003); Теп еї аї.,

Іттипоіоду, 101:225-232 (2000). Див. також І цеї у. еї а!., Віоспіт. Віорпу5. Асіа, 1572:387-400 (2002); НоІт5Ком сї аїЇ, Аппи. Нем. Іттипої. 21:547-578 (2003); Теп еї аї., Іттипоіоду, 101:225- 232 (2000); Напзеп еї аї, 9. Іттипої. 185(10):6096-6104 (2010).

Ікеда еї амІ. уперше продемонстрували, що МВІ, подібно Сід, може активувати систему комплементу після зв'язування з еритроцитами, покритими дріжджовим мананом, по С4- залежному механізму (ІКеда еї аї., 9. ВіоІ. Спет. 2(52):7451-7454, (1987)). МВІ, член сімейства білків колектинів, являє собою кальційзалежний лектин, який зв'язується з вуглеводами по 3- і 4-гідроксигрупах, орієнтованих у горизонтальній площині піранозного кільця. Таким чином, основними лігандами для МВІ є ЮО-маноза і М-ацетил-О-глюкозамін, а вуглеводи, що не задовольняють цю стеричну вимогу, мають невиявлювану спорідненість до МВІ. (МУеєїв еї аї.,

Маїшге, 360:127-134, (1992)). Взаємодія між МВІ і моновалентними цукрами є дуже слабкою з константами дисоціації, що звичайно знаходяться в однорозрядному мілімолярному діапазоні.

Сильне, специфічне зв'язування МВІ. з глікановими лігандами досягається за рахунок авідності, тобто взаємодії одночасно з множиною залишків моносахаридів, локалізованих у безпосередній близькості один від одного (ее еї аї., Агспім. Віоспет. Віорпуб5. 299:129-136, (1992)). МВІ. розпізнає вуглеводні патерни, як правило, утворені мікроорганізмами, такими як бактерії, дріжджі, паразити і деякі віруси. На відміну від цього, МВІ не розпізнає Ю-галактозу і сіалову

Зо кислоту, передостанні і останні цукри, які, як правило, містяться в "зрілих" складних глікокон'югатах, присутніх на клітинній поверхні і у плазмі ссавців. Вважається, що ця специфічність зв'язування сприяє розпізнаванню "чужорідних" поверхонь і допомагає захищати від "аутоактивації" Однак МВ не зв'язується з високою спорідненістю з кластерами "попередників" гліканів з високим вмістом манози на М-зв'язаних глікопротеїнах і гліколіпідах, секвестрованих в ендоплазматичній мережі і в апараті Гольджі клітин ссавців (Маупага еї аї.,..

ВіоІ. Снет. 257:3788-3794, (1982)). Таким чином, ушкоджені клітини є потенційними мішенями для активації лектинового шляху за допомогою зв'язування з МВІ..

Фіколіни містять лектиновий домен, що відрізняється від лектинового домену МВІ., який називають фібриногеноподібним доменом. Фіколіни зв'язуються з залишками цукрів Са- незалежним способом. У людини були ідентифіковані фіколіни трьох видів (І -фіколін, М-фіколін і Н-фіколін). Два сироваткові фіколіни, І -фіколін ії Н-фіколін, мають загальну специфічність до М- ацетил-О-глюкозаміну, однак Н-фіколін також зв'язується і з М-ацетил-О-галактозаміном.

Різниця в специфічності до цукрів І-фіколіну, Н-фіколіну, СІ-11 ї МВІ. означає, що різні лектини можуть бути комплементарними і впливати на різні глікокон'юЮгати, що нехай навіть перекриваються. Ця концепція підтверджується останніми повідомленнями в літературі про те, що з відомих лектинів у лектиновому шляху тільки І-фіколін специфічно зв'язується з ліпотейхоєвою кислотою, тобто глікокон'югатом клітинної стінки, що виявляється у всіх грампозитивних бактерій (Гупсп М.. еї аї., У. Іттипої. 172:1198-1202, 2004). Колектини (тобто

МВІ) ї фіколіни не мають значимої подібності по амінокислотних послідовностях. Однак ці дві групи білків мають однакову організацію доменів і, подібно С1д, збираються в олігомерні структури, що максимально збільшує можливість мультисайтового зв'язування.

Концентрації МВІ у сироватці сильно варіюють у популяціях здорових індивідуумів і генетично контролюються поліморфізмами/мутаціями в промоторі і кодуючих областях гена

МВІ.. Експресія МВІ.,, як білка гострої фази, додатково підсилюється при запаленні. І -фіколін присутній у сироватці в концентраціях, аналогічних МВГ/.. Отже, І -фіколінова гілка лектинового шляху потенційно порівнянна по своїй силі з гілюою МВГ. МВ. ї фіколіни також функціонують як опсоніни, які дозволяють фагоцитам впливати на МВІ- і фіколін-декоровані поверхні (див. Уаск еї аї., У. ГеиКос. Віої., 77(3):328-36 (2004), Маїви5па апа Еційа, Іттипобіоіоду, 205(4-5):490-7 (2002), Асуаді еї аї., У. Іттипої. 174(1):418-25(2005)). Така опсонізація вимагає взаємодії цих 60 білків з рецепторами фагоцитів (КипІтап еї аї., ). Ехр. Мед. 169:1733, (1989); Маїзивніа е! аї., 9.

ВіоІ. Спет. 277:2448-54, (1996)), ідентичність яких поки не встановлена.

Специфічна і високоафінна взаємодія людського МВІ з унікальними С1г/С15-подібними сериновими протеазами, називаними МВІ -асоційованими сериновими протеазами (МАБР), здійснюється через його колагеноподібний домен. На цей момент описано три МА5Р. Спочатку був ідентифікований один фермент "МАБР", який був охарактеризований як фермент, відповідальний за ініціацію каскаду комплементу (тобто розщеплення С2 і С4) (Маїзив5пйа еї аї.,

У. Ехр. Мей. 176(6):1497-1502 (1992); Фі еї аї., У. Іттипої. 750:571-578, (1993)). Потім було визначено, що активність МАР фактично представлена сумішшю двох протеаз: МА5Р-Ї і

МАБР-2 (Тієї єї аїЇ., Маїште, 556:506-510, (1997)). Однак було показано, що для активації комплементу достатньо одного комплексу МВІ-МАБР-2 (Могир-Уепвеп еї аї., 9. Іттипої. 165:2093-2100, (2000)). Крім того, тільки МАБР-2 розщеплював С2 і С4 з високою швидкістю (Атбргиб еї аї. У. Іттипої. 770:1374-1382, (2003)). Таким чином, МАБР-2 є протеазою, відповідальною за активацію С4 і Сб2 з утворенням СЗ-конвертази, С4р2а. Це є суттєвою відмінністю від комплексу С1 класичного шляху, де координована дія двох специфічних серинових протеаз (Сіг і С15) приводить до активації системи комплементу. Крім того, була виділена третя нова протеаза, МАБР-З (Бані М.В. еї аї., Іттипйу, 15:127-35, 2001). МА5Р-1 і

МА5Р-3 є продуктами альтернативного сплайсингу одного і того ж гена.

Організація доменів МАБР ідентична такій в Стіг і С15, що є ферментативними компонентами комплексу Сі (Зіт еї аїЇ., Віоспет. Боб. Тгап5. 28:545, (2000)). Ці домени включають М-кінцевий С1г/С15//ЕСЕ морського їжака/домен кісткового морфогенетичного білка (СОВ), домен, подібний епідермальному фактору росту, другий домен СИВ, тандем доменів регуляторних білків комплементу і домен серинової протеази. Як і в протеазах С1, активація

МАБР-2 здійснюється через розщеплення Аго-Іе-зв'язку, суміжного з доменом серинової протеази, приводячи до розділення ферменту на ланцюги А і В, з'єднані дисульфідним зв'язком, де останній складається з домену серинової протеази.

МВІ також може бути асоційований з альтернативно сплайсованою формою МАБР-2, відомою як МВІ -асоційований білок розміром 19 кДа (МАр19) або малий МВІіІ -асоційований білок (ЗМАР), у якого відсутня каталітична активність МАБР-2 (5іомег, у). Іттипої. 162:3481-90 (1999); ТаКанавні еї аї., Ійї. Іттипої. 11:859-863, (1999)). МАр19 містить перші два домени

МАБР-2, за якими іде додаткова послідовність з чотирьох унікальних амінокислот. Функція

МАр19 залишається неясною (Оеодп еї аї.,». Іттипої. Меїоа5, 2011). Гени МА5БР-1 і МА5БР-2 локалізовані на хромосомах З і 1 людини, відповідно (Зспуаебіе еї аї., Іттипобріоіоду, 205:455- 466 (2002)).

Існує ряд даних, які дозволяють припустити, що різні комплекси МВІ-МА5Р і велика фракція

МАБР у сироватці не утворюють комплекси з МВ. (ТпПіеї 5. еї аї., У. Іттипої. 165:878-887, 2000).

Як Н-, так ії І-фіколін зв'язуються з усіма МАР і, як і МВІ, активують лектиновий шлях комплементу (ШБай!і М.К. еї аї., Іттипйу, 15:127-35, 2001; Маїзивніа М. еї аї., 9. Іттипо). 165:3502-3506, 2002). Лектиновий і класичні шляхи утворюють загальну СЗ-конвертазу (С4рга), і на цьому етапі ці два шляхи сходяться.

Існує широко розповсюджена думка, що лектиновий шлях відіграє важливу роль у захисті неінфікованого хазяїна від інфекції. Переконливі докази участі МВІ у захисті хазяїна були одержані з аналізу пацієнтів зі зниженими рівнями функціонального МВІГ. у сироватці (Кіїраїгіск

О.б., Віосніт. Віорпуз. Асіа, 1572:401-413, 2002). У цих пацієнтів спостерігається сприйнятливість до рецидивуючих бактеріальних і грибкових інфекцій. Такі симптоми звичайно з'являються в ранньому віці, у межах очевидного "вікна уразливості", коли відбувається зниження титрів материнських антитіл, доти, поки не сформується повний репертуар антитіл.

Цей синдром часто є результатом мутацій у декількох сайтах у колагеновій частині МВІ, які перешкоджають правильному утворенню олігомерів МВ. Однак, оскільки МВ може функціонувати як опсонін незалежно від комплементу, то невідомо, у якому ступені підвищення чутливості до інфекції обумовлене зниженням активації комплементу.

Вважається, що всі три шляхи (тобто класичний, лектиновий і альтернативний) сходяться в

С5, який розщеплюється з утворенням продуктів із численними прозапальними ефектами.

Шлях, у якому сходяться всі три шляхи, був визначений як термінальний шлях комплементу.

С5а являє собою найбільш сильний анафілотоксин, індукуючий зміну тонусу гладких м'язів і судин, а також проникності судин. Він також є потужним хемотаксином і активатором нейтрофілів і моноцитів. Сба-опосередкована активація клітин може значно підсилювати запальні відповіді шляхом індукування вивільнення множини додаткових медіаторів запалення, включаючи цитокіни, гідролітичні ферменти, метаболіти арахідонової кислоти і частинки активного кисню. Розщеплення С5 приводить до утворення С5р-9, також відомого як бо мембраноатакуючий комплекс (МАС). На даний час існують переконливі докази того, що сублітичне відкладення МАС, крім його ролі як літичного пороутворювального комплексу, може відігравати важливу роль у запальному процесі.

Додатково до своєї важливої ролі в імунному захисті система комплементу бере участь в ураженні тканин при багатьох клінічних станах. Незважаючи на наявність множини даних, що вказують на участь класичного і альтернативного шляхів комплементу в патогенезі неінфекційних захворювань у людини, роль лектинового шляху в такому патогенезі почали оцінювати тільки зараз. Нещодавні дослідження показали, що активація лектинового шляху може бути відповідальна за активацію комплементу і пов'язане з ним запалення при ішемічному/реперфузійному ушкодженні. СоМагі еї а). (2000) показали, що культивовані ендотеліальні клітини, піддані окисному стресу, зв'язуються з МВІ. і демонструють відкладення

СЗ у відповідь на вплив людської сироватки (Соїага еї аї., Ат. 9. Раїйої. 156:1549-1556, (2000)).

Крім того, обробка людської сироватки блокувальними моноклональними анти-МВІ. антитілами пригнічувала зв'язування МВІ і активацію комплементу. Ці дані підтверджували на щурячій моделі ішемії/реперфузії міокарда, при якій у щурів, що одержали блокувальні антитіла до щурячого МВ, спостерігалося значиме зниження ушкодження міокарда на фоні оклюзії коронарної артерії, у порівнянні з щурами, що одержували контрольне антитіло (огдап 9.Е. еї а!., Сігсшайоп, 104:1413-1418, 2001). Молекулярний механізм зв'язування МВІ із судинним ендотелієм після окисного стресу залишається поки неясним, однак останні дослідження дозволяють припустити, що активація лектинового шляху після окисного стресу може бути опосередкована зв'язуванням МВІ з судинними ендотеліальними цитокератинами, а не з глікокон'югатами (Соїага С.О. еї аїЇ., Ат. У). Рашої. 159:1045-1054, 2001). Інші дослідження вказали на роль класичного і альтернативного шляхів у патогенезі ішемічного/реперфузійного ушкодження, а роль лектиновго шляху в патогенезі такого захворювання поки залишається предметом дискусії (Ківдептапп М.С. еї аї!.,, Ат. у). Райпої. 162:363-367, 2003).

Фіброз являє собою утворення надлишкової кількості сполучної тканини в органі або тканині, що утворюється як правило у відповідь на ушкодження або ураження. Відмітною ознакою фіброзу є продукування надлишкового позаклітинного матриксу після локальної травми.

Нормальна фізіологічна відповідь на ураження приводить до утворення сполучної тканини, але цей початково цілющий процес відновлення може затягтися і стати патологічним, змінюючи

Зо архітектуру і функцію тканини. На клітинному рівні, епітеліальні клітини і фібробласти розмножуються і диференціюються в міофібробласти, приводячи до скорочення матриксу, збільшення ригідності, мікроваскулярної компресії і гіпоксії. Приплив запальних клітин, включаючи макрофаги і лімфоцити, приводить до вивільнення цитокінів і підсилює відкладення колагену, фібронектину і інших молекулярних маркерів фіброзу. Традиційні терапевтичні підходи в основному були спрямовані на запальний процес при фіброзі з використанням кортикостероїдів і імунодепресантів. На жаль, усі ці протизапальні агенти мають невеликий клінічний ефект. На даний час відсутнє ефективне лікування або терапія фіброзу, однак і звіти досліджень на тваринах, і епізодичні звіти про результати лікування людей говорять про те, що фіброзні ураження тканин можуть бути купірувані (Татре апа 7еїзрег9, Маї. Неху. Мернгої., Мої. 10:226-237, 2014).

Нирка має обмежену здатність до відновлення після травми. Різні патології нирок приводять до місцевого запалення, яке викликає рубцювання і фіброз нирок. Вплив запальних стимулів, що не припиняється, приводить до тубулоінтерстиціального запалення і фіброзу і прогресуючого функціонального порушення нирок при хронічному захворюванні нирок. Його прогресування до термінальної стадії ниркової недостатності пов'язане зі значним рівнем захворюваності і смертності Оскільки тубулоіїнтерстиціальний фіброз є загальною термінальною точкою багатьох ниркових патологій, він являє собою важливу мішень для лікування, спрямованого на запобігання нирковій недостатності. Фактори ризику (наприклад, протеїнурія), незалежні від первинного захворювання нирок, сприяють розвитку фіброзу нирок і втраті екскреторної функції нирок, стимулюючи розвиток місцевого запалення, що, у свою чергу, підсилює прогресування захворювання.

Враховуючи роль фіброзу в багатьох захворюваннях і розладах, таких як, наприклад, тубулоінтерстиціальний фіброз, що приводить до хронічного захворювання нирок, існує нагальна потреба в розробці терапевтично ефективних засобів для лікування захворювань і станів, викликаних або ускладнених фіброзом. Також, враховуючи нестачу у нових і існуючих методах лікування, що впливають на запальні профіброзні фактори при ниркових захворюваннях, необхідно розробити терапевтично ефективні засоби для лікування, пригнічення, профілактики і/або купірування фіброзу нирок, тим самим запобігання прогресуванню хронічного захворювання нирок. 60 СУТЬ ВИНАХОДУ

Цей розділ опису призначений для введення набору понять, представлених у спрощеному вигляді, які більш докладно описані нижче. Цей розділ опису не призначений для визначення ключових ознак заявленого об'єкта винаходу і не призначений для визначення обсягу заявленого об'єкта винаходу.

В одному з аспектів винахід стосується способу лікування, пригнічення, полегшення або профілактики фіброзу у ссавця, що страждає або має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту кількості інгібуючого МА5БР-2 агента, ефективної для пригнічення фіброзу. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБР-2 агент являє собою МАБР-2 антитіло або його фрагмент. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБЗР-2 агент являє собою моноклональне МА5ЗР-2 антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною

ЗЕО ІЮ МО:6. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5БР-2 агент вибірково пригнічує активацію лектинового шляху комплементу без пригнічення по суті активації С1д-залежного комплементу. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим щонайменше одним з наступного: (ї) фіброзу і/або запалення, пов'язаного з ішемічним реперфузійним ушкодженням, (ії) фіброзу і/або запалення нирок (наприклад, тубулоінтерстиціального фіброзу, хронічного захворювання нирок, хронічної ниркової недостатності, гломерулярного захворювання (наприклад, фокального сегментарного гломерулосклерозу)), порушення імунного комплексу (наприклад, ІдА-нефропатії, мембранозної нефропатії), ввовчакового нефриту, нефротичного синдрому, діабетичної нефропатії, тубулоінтерстиціального ураження і гломерулонефриту (наприклад, СЗ-гломерулопатії), (іїї) фіброзу і/або запалення легенів (наприклад, хронічної обструктивної хвороби легенів, кістозного фіброзу, фіброзу легенів, пов'язаного зі склеродермією, бронхоектазу і легеневої гіпертензії), (ім) фіброзу і/або запалення печінки (наприклад, цирозу, неалкогольної жирової хвороби печінки (стеатогепатиту)), фіброзу печінки, вторинного відносно зловживання алкоголем, фіброзу печінки, вторинного відносно гострого або хронічного гепатиту |(індукованої ліками гепатотоксичності, викликаної ацетамінофеном або іншим лікарським засобом), (м) фіброзу і/або запалення серця (наприклад, серцевого фіброзу, інфаркту міокарда, фіброзу клапана, фіброзу передсердя, фіброзу ендоміокарда, аритмічної кардіоміопатії правого шлуночка (АКПШ), (мі) судинного фіброзу (наприклад, судинного захворювання, атеросклеротичного судинного захворювання, стенозу судин, рестенозу, васкуліту, флебіту, тромбозу глибоких вен і аневризми черевної аорти), (мі) фіброзу шкіри (наприклад, надмірного загоєння ран, склеродермії, системного склерозу, келоїдів, захворювання сполучної тканини, рубцювання і гіпертрофічних рубців), (мії) фіброзу суглобів (наприклад, артрофіброзу), (їх) фіброзу центральної нервової системи (наприклад, інсульту, травматичного ушкодження головного мозку і травми спинного мозку), 09 фіброзу травної системи (наприклад, хвороби Крона, фіброзу підшлункової залози і виразкового коліту), (хі) очного фіброзу (наприклад, передньої субкапсулярної катаракти, помутніння задньої капсули, дегенерації жовтої плями і ретинальної і вітреальної ретинопатії), (хії) фіброзу структур м'яких тканин скелетно-м'язової системи (наприклад, клітинного капсуліту, контрактури Дюпюїтрена і мієлофіброзу), (хії) фіброзу репродуктивних органів (наприклад, ендометріозу і хвороби Пейроні), (хім) хронічного інфекційного захворювання, яке викликає фіброз і/або запалення (наприклад, альфа-вірусу, гепатиту А, гепатиту В, гепатиту С, туберкульозу, ВІЛ і грипу), (хм) аутоїмунного захворювання, яке викликає фіброз і/або запалення (наприклад, склеродермії і системного червоного вовчака (СЧВ), (хмії) рубцювання, пов'язаного із травмою (наприклад, де пов'язані з травмою рубці вибирають із групи, що складається з хірургічних ускладнень (наприклад, післяопераційних спайок, при яких може утворюватися рубцева тканина між внутрішніми органами, що викликає контрактуру, біль і може приводити до безплідності), індукованого хіміотерапевтичними засобами фіброзу, індукованого радіацією фіброзу і рубцювання, пов'язаного з опіками), або (хмії) трансплантації органів, фіброзу молочної залози, м'язового фіброзу, ретроперитонеального фіброзу, фіброзу щитовидної залози, фіброзу лімфатичних вузлів, фіброзу сечового міхура і плеврального фіброзу.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу лікування, пригнічення, полегшення або профілактики фіброзу нирок у ссавця, що страждає або має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням нирок, який включає введення суб'єкту кількості інгібуючого МА5ЗР-2 агента, ефективної для пригнічення фіброзу нирок. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5Р-2 агент являє собою МА5Р-2 антитіло або його фрагмент. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5БР-2 агент являє собою моноклональне МА5ЗР-2 антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною

ЗЕО ІЮ МО:6. В одному з варіантів здійснення МА5Р-2 антитіло або його фрагмент специфічно 60 зв'язується з поліпептидом, що містить 5ЕО ІЮ МО:6, зі спорідненістю, яка щонайменше в 10 разів перевищує спорідненість зв'язування з іншим антигеном у системі комплементу. В одному з варіантів здійснення антитіло або його фрагмент вибирають із групи, що складається з рекомбінантного антитіла, антитіла зі зниженою ефекторною функцією, химерного антитіла, гуманізованого антитіла і людського антитіла. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5Р- 2 агент вибірково пригнічує активацію лектинового шляху комплементу без пригнічення по суті активації СТд-залежного комплементу. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5БР-2 агент вводять підшкірно, інтраперитонеально, внутрішньом'язово, внутрішньоартеріально, внутрішньовенно або шляхом інгаляції. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5БР-2 агент вводять у кількості, ефективній для пригнічення тубулоінтерстиціального фіброзу. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5БР-2 агент вводять у кількості, ефективній для зменшення, затримання або усунення необхідності в діалізі у суб'єкта. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає захворюванням нирок або захворюванням, вибраним із групи, що складається з хронічного захворювання нирок, хронічної ниркової недостатності, гломерулярного захворювання (наприклад, фокального сегментарного гломерулосклерозу), вовчакового нефриту, нефротичного синдрому, діабетичної нефропатії, тубулоінтерстиціального ураження і гломерулонефриту (наприклад, СЗ-гломерулопатії). В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає протеїнурією, і інгібуючий МА5Р-2 агент вводять у кількості, ефективній для зменшення тяжкості протеїнурії у суб'єкта. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБ5бР-2 агент вводять у кількості і протягом періоду часу, які ефективні для досягнення щонайменше 20 95 зменшення (наприклад, щонайменше 30 95 зменшення або щонайменше 40 95 зменшення, або щонайменше 50 95 зменшення) 24-годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до лікування. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає захворюванням або розладом нирок, асоційованим з протеїнурією, вибраною із групи, що складається з нефротичного синдрому, прееклампсії, еклампсії, токсичного ураження нирок, амілоїдозу, судинно-колагенозних захворювань (наприклад, системного червоного вовчака), зневоднювання, гломерулярних захворювань (наприклад, мембранозного гломерулонефриту, фокального сегментарного гломерулонефриту, СЗ-гломерулопатії, хвороби мінімальних змін, ліпоїдного нефрозу), інтенсивного фізичного навантаження, стресу, доброякісної ортостатичної (постуральної)

Зо протеїнурії, фокального сегментарного гломерулосклерозу, ІдДА-нефропатії (наприклад, хвороби

Бергера), ІдМ-нефропатії, мембранопроліферативного гломерулонефриту, мембранозної нефропатії, хвороби мінімальних змін, саркоїдозу, синдрому Альпорта, цукрового діабету (діабетичної нефропатії), індукованої ліками токсичності (наприклад, індукованої НПЗП, нікотином, пеніциламіном, карбонатом літію, золотом і іншими важкими металами, інгібіторами

АПФ, антибіотиками (наприклад, адріаміцином) або опіатами (наприклад, героїном) або іншими нефротоксинами); хвороби Фабрі, інфекції (наприклад, ВІЛ, сифілісу, гепатиту А, В або С, постстрептококової інфекції, сечового шистосомозу); аміноацидурії, синдрому Фанконі, гіпертонічного нефросклерозу, інтерстиціального нефриту, серпоподібноклітинної хвороби, гемоглобінурії, множинної мієломи, міоглобінурії, відторгнення органів (наприклад, відторгнення трансплантата нирки), геморагічної пропасниці Ебола, синдрому нігтьової патели, сімейної пропасниці, синдрому НЕГІГР, системного червоного вовчака, гранулематозу Вегенера, ревматоїдного артриту, хвороби накопичення глікогену типу 1 (хвороба Гірке), синдрому

Гудпасчера, пурпури Шенлейна-Геноха, інфекції сечових шляхів, що поширилася на нирки, синдрому Шегрена і постінфекційного гломерулонефриту. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає ІдА-нефропатією. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає мембранозною нефропатією.

В іншому аспекті даного винаходу надається спосіб профілактики або зменшення ураження нирок у суб'єкта, що страждає захворюванням або станом, асоційованим із протеїнурією, який включає введення кількості інгібуючого МАБР-2 агента, ефективної для зменшення або профілактики протеїнурії у суб'єкта. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5Р-2 агент являє собою МА5Р-2 антитіло або його фрагмент. В одному з варіантів здійснення інгібуючий

МА5Р-2 агент являє собою моноклональне МАБ5бР-2 антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною 5ЕО ІЮО МО:6. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАЗР-2 агент вибірково пригнічує активацію лектинового шляху комплементу без пригнічення по суті активації

Стд-залежного комплементу. В одному з варіантів здійснення захворювання або стан, асоційований з протеїнурією, вибирають із групи, що складається з нефротичного синдрому, прееклампсії, еклампсії, токсичної ураження нирок, амілоїдозу, судинно-колагенозних захворювань (наприклад, системного червоного вовчака), зневоднювання, гломерулярних захворювань (наприклад, мембранозного гломерулонефриту, фокального сегментарного бо гломерулонефриту, СЗ-гломерулопатії, хвороби мінімальних змін, ліпоїдного нефрозу),

інтенсивного фізичного навантаження, стресу, доброякісної ортостатичної (постуральної) протеїнурії, фокального сегментарного гломерулосклерозу, ІдА-нефропатії (наприклад, хвороби

Бергера), ІдМ-нефропатії, мембранопроліферативного гломерулонефриту, мембранозної нефропатії, хвороби мінімальних змін, саркоїдозу, синдрому Альпорта, цукрового діабету (діабетичної нефропатії), індукованої ліками токсичності (наприклад, індукованої НПЗП, нікотином, пеніциламіном, карбонатом літію, золотом і іншими важкими металами, інгібіторами

АПФ, антибіотиками (наприклад, адріаміцином) або опіатами (наприклад, героїном)); хвороби

Фабрі, інфекції (наприклад, ВІЛ, сифілісу, гепатиту А, В або С, постстрептококової інфекції, сечового шистосомозу); аміноацидурії, синдрому Фанконі, гіпертонічного нефросклерозу, інтерстиціального нефриту, серпоподібноклітинної хвороби, гемоглобінурії, множинної мієломи, міоглобінурії, відторгнення органів (наприклад, відторгнення трансплантата нирки), геморагічної пропасниці Ебола, синдрому нігтьової патели, сімейної пропасниці, синдрому НЕЇ Р, системного червоного вовчака, гранулематозу Вегенера, ревматоїдного артриту, хвороби накопичення глікогену типу 1, синдрому Гудпасчера, пурпури Шенлейна-Геноха, інфекції сечових шляхів, що поширилася на нирки, синдрому Шегрена і постінфекційного гломерулонефриту. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБР-2 агент вводять у кількості і протягом періоду часу, які ефективні для досягнення щонайменше 20 95 зменшення (наприклад, щонайменше 30 95 зменшення або щонайменше 40 95 зменшення, або щонайменше 50 95 зменшення) 24-годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідною 24- годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до лікування.

В одному з аспектів даного винаходу надається спосіб пригнічення прогресування хронічного захворювання нирок, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, кількості інгібуючого МАБР-2 агента, ефективної для зменшення або профілактики фіброзу нирок, наприклад тубулоінтерстиціального фіброзу. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5Р- 2 агент являє собою МАБР-2 антитіло або його фрагмент. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5Р-2 агент являє собою моноклональне МА5Р-2 антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною ЗЕО ІЮ МО:6. В одному з варіантів здійснення інгібуючий

МА5Р-2 агент вибірково пригнічує активацію лектинового шляху комплементу без пригнічення по суті активації С1д-залежного комплементу. В одному з варіантів здійснення суб'єкт, що цього

Зо потребує, страждав протеїнурією до введення інгібуючого МА5Р-2 агента, причому введення інгібуючого МАБР-2 агента зменшує протеїнурію у суб'єкта. В одному з варіантів здійснення інгіібуючий МАБР-2 агент вводять у кількості і протягом періоду часу, які ефективні для досягнення щонайменше 20 96 зменшення (наприклад, щонайменше 30 95 зменшення або щонайменше 40 95 зменшення, або щонайменше 50 95 зменшення) 24-годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до лікування. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5БР-2 агент вводять у кількості, ефективній для зменшення, затримання або усунення необхідності в діалізі у суб'єкта.

В іншому аспекті даного винаходу надається спосіб захисту нирок від ураження у суб'єкта, який одержував, одержує або буде одержувати лікування одним або більше нефротоксичними агентами, який включає введення кількості інгібуючого МАБР-2 агента, ефективної для профілактики або полегшення індукованої ліками нефропатії. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБР-2 агент являє собою МАБР-2 антитіло або його фрагмент. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5Р-2 агент являє собою моноклональне МА5Р-2 антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною ЗЕО ІЮ МО:6. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБР-2 агент вибірково пригнічує активацію лектинового шляху комплементу без пригнічення по суті активації С1д-залежного комплементу.

В одному з аспектів винаходу надається спосіб лікування людини, що страждає імуноглобулін А-нефропатією (ДАМ), який включає введення суб'єкту композиції, що містить кількість інгібуючого МАБР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для пригнічення МА5БР-2-залежної активації комплементу. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає стероїд-залежною ІДАМ. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5БР-2 антитіло являє собою моноклональне антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з людським МА5Р-2. В одному з варіантів здійснення антитіло або його фрагмент вибирають із групи, що складається з рекомбінантного антитіла, антитіла зі зниженою ефекторною функцією, химерного антитіла, гуманізованого антитіла і людського антитіла. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5БР-2 антитіло по суті не пригнічує активацію класичного шляху. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5бР-2 антитіло пригнічує відкладення СЗр в 90 95 людській сироватці зі значенням ІСзо 30 нМ або менше. В одному з варіантів здійснення спосіб додатково включає ідентифікацію суб'єкта, що має стероїд-залежну (ДАМ, до етапу введення 60 суб'єкту композиції, що містить кількість інгібуючого МАБР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для поліпшення функції нирок. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МАБР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у кількості, ефективній для поліпшення функції нирок. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МАБР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у ефективній кількості і протягом періоду часу, достатнього для досягнення щонайменше 20 95 зменшення 24- годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до лікування. В одному з варіантів здійснення композицію вводять у кількості, достатній для поліпшення функції нирок і зменшення дози кортикостероїдів у зазначеного суб'єкта. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МАБР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить СОК-НІ, СОВ-Н2 і СОК-НЗ амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:67, варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить СОБ-І 1, СОВ-12 і СОК-ЇЗ амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:70.

В іншому аспекті винаходу надається спосіб лікування людини, що страждає мембранозною нефропатією (МН), який включає введення суб'єкту композиції, що містить кількість інгібуючого

МА5Р-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для пригнічення МАР - 2-залежної активації комплементу. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає стероїд- залежною МН. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МАБР-2 антитіло являє собою моноклональне антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з людським МА5БР-2. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МАБР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у кількості, ефективній для поліпшення функції нирок. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5БР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у ефективній кількості і протягом періоду часу, достатнього для досягнення щонайменше 20 90 зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею в порівнянні з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до лікування. В одному з варіантів здійснення композицію вводять у кількості, достатній для поліпшення функції нирок і зменшення дози кортикостероїдів у зазначеного суб'єкта. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5БР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить СОК-

НІ, СОВ-Н2 і СОВБ-НЗ амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:67, варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить СОК-І1, СОВ-12 і СОК-ЇЗ амінокислотної послідовності,

Зо наведеної в 5ЗЕО ІЮ МО:70.

ОПИС КРЕСЛЕНЬ

Вищевикладені аспекти і багато які із супутніх переваг цього винаходу стануть більш зрозумілими з посиланням на наведений нижче докладний опис з посиланням на прикладені креслення, на яких: фіг. 1 являє собою діаграму, що ілюструє геномну структуру людського МАЗР-2; фіг. 2А являє собою схематичну діаграму, що ілюструє структуру доменів людського білка

МА5Р-2; фіг. 28 являє собою схематичну діаграму, що ілюструє структуру доменів людського білка

МАр19; фіг. З являє собою діаграму, що ілюструє стратегію нокауту мишачого МАЗР-2; фіг. 4 являє собою діаграму, що ілюструє конструкцію міні-гена МА5Р-2; на фіг. БА представлені результати, які демонструють, що дефіцит МАБР-2 приводить до втрати С4-опосередкованої активації лектинового шляху, визначеної по відсутності відкладень

С46р на манані, як описано в прикладі 2; на фіг. 5В представлені результати, які демонструють, що дефіцит МАБР-2 приводить до втрати С4-опосередкованої активації лектинового шляху, визначеної по відсутності відкладень

С4р на зимозані, як описано в прикладі 2; на фіг. 5С представлені результати, які демонструють відносні рівні активації С4 у зразках сироватки, одержаних з МАБР-2-/-, МА5Р-2-/- ліній і лінії дикого типу, визначені по відкладенню

С46б на манані і на зимозані, як описано в прикладі 2; на фіг.б представлені результати, які демонструють, що додавання мишачого рекомбінантного МАБР-2 до зразків МАБР-2-/- сироватки відновлює С4-опосередковану активацію лектинового шляху, яка залежить від концентрації білка, визначену по відкладенню

С46р на манані, як описано в прикладі 2; на фіг. 7 представлені результати, які демонструють, що класичний шлях є функціональним у МА5Р-2-/- лінії, як описано в прикладі 8; на фіг. ВА представлені результати, які демонструють, що анти-МА5Р-2 антитіло Баб2 Мо 11 пригнічує утворення СЗ3-конвертази, як описано в прикладі 10; на фіг. 88 представлені результати, які демонструють, що анти-МА5Р-2 антитіло Баб2 Мо 11 бо зв'язується з нативним щурячим МА5Р-2, як описано в прикладі 10;

на фіг. 8С представлені результати, які демонструють, що анти-МА5Р-2 антитіло Рар2 Мо 41 пригнічує розщеплення С4, як описано в прикладі 10; на фіг. У представлені результати, які демонструють, що всі протестовані анти-МАБР-2 антитіла Рабр2, які пригнічували утворення СЗ-конвертази, також пригнічують розщеплення Са4, як описано в прикладі 10; фіг. 10 являє собою діаграму, що ілюструє рекомбінантні поліпептиди, одержані із щурячого

МАБ5Р-2, які були використані для картування епітопів блокуючих МАБР-2 антитіл Рар2, як описано в прикладі 11; на фіг. 11 представлені результати, що демонструють зв'язування анти-МА5Р-2 Бабр2 МоМо 40 і 60 з щурячими поліпептидами МА5Р-2, як описано в прикладі 11; на фіг. 12А графічно показаний рівень відкладення МАС у присутності або за відсутності людського моноклонального анти-МАБР-2 антитіла (0ОМ5646) в умовах тестування, специфічних для лектинового шляху, що свідчить про те, що ОМ5646 пригнічує опосередковане лектином відкладення МАС з величиною ІСзо, що дорівнює приблизно 1 нМ, як описано в прикладі 12; на фіг. 128 графічно показаний рівень відкладення МАС у присутності або за відсутності людського моноклонального анти-МАБР-2 антитіла (0М5646) в умовах тестування, специфічних для класичного шляху, що свідчить про те, що ОМ5646 не пригнічує опосередковане класичним шляхом відкладення МАС, як описано в прикладі 12; на фіг. 12С графічно показаний рівень відкладення МАС у присутності або за відсутності людського моноклонального анти-МАБР-2 антитіла (0ОМ5646) в умовах тестування, специфічних для альтернативного шляху, що свідчить про те, що ОМ5646 не пригнічує опосередковане альтернативним шляхом відкладення МАС, як описано в прикладі 12; на фіг. 13 графічно показаний фармакокінетичний (РК) профіль людського моноклонального анти-МАБ5Р-2 антитіла (0М5646) у мишей, що показує концентрацію ОМ5646 (середнє значення для п-З тварин/групу) залежно від часу після введення зазначеної дози, як описано в прикладі 12; на фіг. 14А графічно показана фармакодинамічна (РО) відповідь моноклонального анти-

МАБР-2 антитіла людини (0М5646), визначена по падінню активності лектинового шляху

Зо системи комплементу у мишей після внутрішньовенного введення, як описано в прикладі 12; на фіг. 148 графічно показана фармакодинамічна (РО) відповідь моноклонального МАБР-2 антитіла людини (0М5646), визначена по зниженню активності лектинового шляху системи комплементу у мишей після підшкірного введення, як описано в прикладі 12; на фіг. 15 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених сіріусом червоним; зрізи тканин одержували у мишей дикого типу і МАЗР-2- /- мишей через 7 днів після односторонньої обструкції сечоводу (ШОО) і псевдооперованих мишей дикого типу і МА5Р-2-/- мишей, як описано в прикладі 14; на фіг. 16 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених антитілами до маркера макрофагів Е4/80; зрізи тканин одержували у мишей дикого типу їі МАБР-2-/- мишей через 7 днів після односторонньої обструкції сечоводу (ШОС) і псевдооперованих мишей дикого типу і МА5Р-2-/- мишей, як описано в прикладі 14; на фіг. 17 графічно показані відносні рівні експресії мРНК колагену-4, виміряні кількісною

ПЛР (кПЛР) у зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу Її МАБР-2-/- мишей через 7 днів після односторонньої обструкції сечоводу (ШОО) і псевдооперованих мишей дикого типу і

МАБ5БР-2-/- мишей, як описано в прикладі 14; на фіг. 18 графічно показані відносні рівні експресії МРНК трансформуючого фактора росту бета-1 (ТОЕр-1), виміряні кПЛР у зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу і МА5Р- 2-/- мишей через 7 днів після односторонньої обструкції сечоводу (ШОО) і псевдооперованих мишей дикого типу і МА5Р-2-/- мишей, як описано в прикладі 14; на фіг. 19 графічно показані відносні рівні експресії мРНК інтерлейкіну-б (ІЇ/-6), виміряні

КПЛР у зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу і МАБР-2-/- мишей через 7 днів після односторонньої обструкції сечоводу (ШОО) і псевдооперованих мишей дикого типу і

МАБ5БР-2-/- мишей, як описано в прикладі 14; на фіг. 20 графічно показані відносні рівні експресії мРНК інтерферону-у, виміряні кПЛР, у зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу і МА5Р-2-/- мишей, через 7 днів після односторонньої обструкції сечоводу (ШОО) і псевдооперованих мишей дикого типу і МА5Р-2-/- мишей, як описано в прикладі 14; на фіг. 21 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених сірі усом червоним; зрізи тканин одержували через 7 днів після бо односторонньої обструкції сечоводу (ШОО) у мишей дикого типу, що одержували інгібуюче

МАБ5Р-2 антитіло і антитіло ізотипного контролю, як описано в прикладі 15; на фіг. 22 графічно показаний вміст гідроксипроліну в нирках, одержаних через 7 днів після односторонньої обструкції сечоводу (ШО) у мишей дикого типу, що одержували інгібуюче

МАБР-2 антитіло, у порівнянні з рівнем гідроксипроліну в тканині оклюдованих нирок, одержаних від мишей дикого типу, що одержували ізотипний контроль, ЇдД04, як описано в прикладі 15; на фіг. 23 графічно показана загальна кількість сироваткових білків (мг/мл), виміряна на 15-й день вивчення впливу передозування білка у контрольних мишей дикого типу (п-2), що одержували тільки фізіологічний розчин, мишей дикого типу, що одержували ВЗА (п-б), і МАБР- 2-/- мишей, що одержували В5А (п:-6б), як описано в прикладі 16; на фіг. 24 графічно показана загальна кількість білка (мг), виділеного із сечею, зібраною протягом 24-х годин, на 15-й день вивчення впливу передозування білка у контрольних мишей дикого типу (п-2), що одержували тільки фізіологічний розчин, мишей дикого типу, що одержували ВЗА (п-б), і МА5Р-2-/- мишей, що одержували ВЗА (п-б), як описано в прикладі 16; на фіг. 25 показані репрезентативні зрізи тканин нирок, забарвлені гематоксиліном і еозином (НЕ), на 15-й день вивчення рівня передозування білка у наступних груп мишей: (панель А) контрольні миші дикого типу; (панель В) МА5Р-2-/- контрольні миші, (панель С) миші дикого типу, що одержували ВЗА; і (панель Ю) МА5Р-2-/- миші, що одержували бичачий сироватковий альбумін (ВЗА), як описано в прикладі 16; на фіг. 26 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених антитілом до маркера макрофагів Е4/80, що показують середню забарвлену площу макрофагів (95), де зрізи тканин одержували на 15-й день вивчення впливу передозування білка у контрольних мишей дикого типу (п-2), мишей дикого типу, що одержували ВЗА (п-б), і мишей МА5Р-2-/-, що одержували ВЗА (п-5), як описано в прикладі 16; на фіг. 27А графічно показаний аналіз наявності кореляції між рівнем макрофагів і протеїнурією у кожної миші дикого типу (п-6), що одержувала ВЗА, у вигляді графіка залежності загальної кількості виділеного білка, виміряної в 24-годинному зразку сечі, від інфільтрації макрофагів (середня забарвлена площа, 95), як описано в прикладі 16; на фіг. 27В графічно показаний аналіз наявності кореляції між рівнем макрофагів і

Зо протеїнурією у кожної МА5Р-2-/- миші (п-:5), що одержувала ВЗА, у вигляді графіка залежності загальної кількості виділеного білка, виміряної в 24-годинному зразку сечі, від інфільтрації макрофагів (середня забарвлена площа, 95), як описано в прикладі 16; на фіг. 28 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-ТаєЕр антитілом (виміряно у вигляді площі забарвлених анти-ТОЕр антитіл, вираженої у відсотках), у мишей дикого типу, що одержували ВЗА (п-4), і МА5Р-2-/- мишей, що одержували ВЗА (п:-5), як описано в прикладі 16; на фіг. 29 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-ТМЕо; антитілом (виміряно у вигляді площі забарвлених анти-ТМЕс. антитіл), у мишей дикого типу, що одержували В5А (п--4), і МА5Р-2-/- мишей, що одержували ВЗА (п:-5), як описано в прикладі 16; на фіг. 30 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень ділянок тканин, забарвлених анти-1ІЇ-6 антитілом (виміряно у вигляді площі забарвлених анти-1іІ -6 антитіл), у контрольних мишей дикого типу, контрольних МАБР-2-/- мишей, мишей дикого типу, що одержували ВЗА (п-7), і МАБР-2-/- мишей, що одержували ВЗА (п- 7), як описано в прикладі 16; на фіг. 31 графічно показана частота ТОМЕЇ -позитивних апоптотичних клітин, підрахована у послідовно вибраних 20 полях зору під великим збільшенням (НРЕ) у зрізах тканин ниркової кіркової речовини, одержаних від контрольних мишей дикого типу (п-1), контрольних МАР -2-/- мишей (п-1), мишей дикого типу, що одержували В5А (п-б), і МАР -2-/- мишей, що одержували

ВЗА (п-7), як описано в прикладі 16; на фіг. 32 показані репрезентативні зрізи тканин, забарвлені НУЕ, одержані на 15-й день після лікування В5А наступних груп мишей: (панель А) контрольні миші дикого типу, миші, що одержували фізіологічний розчин; (панель В) миші, що одержували антитіло ізотипного контролю, і (панель С) миші дикого типу, що одержували інгібуюче МА5Р-2 антитіло, як описано в прикладі 17; на фіг. 33 графічно показана частота ТОМЕ! -позитивних апоптотичних клітин, підрахована в послідовно вибраних 20 полях зору під великим збільшенням (НРЕ) у зрізах тканин ниркової кіркової речовини, одержаних від контрольних мишей дикого типу, що одержували контрольний фізіологічний розчин і ВБА (п-8), мишей дикого типу, що одержували антитіло ізотипного контролю і ВБА (п-8), і мишей дикого типу, що одержували інгібуюче МА5БР-2 антитіло і ВБА 60 (п-7), як описано в прикладі 17;

на фіг. 34 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень ділянок тканин, забарвлених анти-ТОаЕр антитілом (виміряних у вигляді площі забарвлених анти-ТОаЕр антитіл, до), у мишей дикого типу, що одержували В5А і фізіологічний розчин (п-8), мишей дикого типу, що одержували ВЗА і антитіло ізотипного контролю (п-7), і мишей дикого типу, що одержували

ВЗА і інгібуюче МА5Р-2 антитіло (п--8), як описано в прикладі 17; на фіг. 35 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-ТМЕо; антитілом (виміряних у вигляді площі забарвлених анти-ТМЕос; антитіл,

Фо), у мишей дикого типу, що одержували В5А і фізіологічний розчин (п-8), мишей дикого типу, що одержували ВЗА і антитіло ізотипного контролю (п-7), і мишей дикого типу, що одержували

ВЗА і інгібуюче МА5Р-2 антитіло (п--8), як описано у прикладі 17; на фіг. 36 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-1І -6 антитілом (виміряних у вигляді площі забарвлених анти-1Ї -6 антитіл, 9б), у мишей дикого типу, що одержували В5А і фізіологічний розчин (п-8), мишей, що одержували

В5А і антитіло ізотипного контролю (п-7), ії мишей дикого типу, що одержували В5А і інгібуюче

МА5БР-2 антитіло (п-8), як описано в прикладі 17; на фіг. 37 показані репрезентативні зрізи тканин, забарвлені НУЕ, одержані на 14-й день після лікування тільки адріаміцином або фізіологічним розчином (контрольні), для наступних груп мишей: (панелі А-1, А-2, А-3) контрольні миші дикого типу, що одержували тільки фізіологічний розчин; (панелі В-1, В-2, В-3) миші дикого типу, що одержували адріаміцин; і (панелі С-1, б-2, С-3) МА5Р-2-/- миші, що одержували адріаміцин, як описано в прикладі 18; на фіг. 38 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених антитілом до маркера макрофагів Е4/80, що показують середню забарвлену площу макрофагів (95) на 14-й день після лікування тільки адріаміцином або фізіологічним розчином (контрольні миші дикого типу), для наступних груп мишей: контрольні миші дикого типу, що одержували тільки фізіологічний розчин; миші дикого типу, що одержували адріаміцин;

МА5Р-2-/- миші, що одержували тільки фізіологічний розчин, і МА5Р-2-/- миші, що одержували адріаміцин, де ""р-0,007, як описано в прикладі 18; на фіг. 39 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених сіріусом червоним, що показують забарвлені області відкладення колагену

Зо (95) на 14-й день після лікування тільки адріаміцином або фізіологічним розчином (контрольні миші дикого типу), для наступних груп мишей: контрольні миші дикого типу, що одержували тільки фізіологічний розчин; миші дикого типу, що одержували адріаміцин; МА5Р-2-/- миші, що одержували тільки фізіологічний розчин, і МАБР-2-/- миші, що одержували адріаміцин, де «хр-0,005, як описано в прикладі 18; і на фіг. 40 графічно показане співвідношення альбумін/креатинін в сечі (цАСЕ) у двох ІдА- пацієнтів протягом дванадцятитижневого дослідження з тижневим лікуванням інгібуючим МА5Р- 2 антитілом (0М5646), як описано в прикладі 19.

ОПИС СПИСКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

ЗЕО ІО МО:1 - КДНК людського МАр19;

ЗЕО ІО МО:С2 - людський білок МАр119 (з лідерною послідовністю);

ЗЕО ІО МО:З - людський білок МАр!19 (зрілий);

ЗЕО ІЮ МО:4 - КДНК людського МА5Р-2;

ЗЕО ІО МО:5 - людський білок МА5БР-2 (з лідерною послідовністю);

ЗЕО І МО:6 - людський білок МА5Р-2 (зрілий);

ЗЕО ІО МО:7 - ГДНК людського МА5Р-2 (екзони 1-6).

АНТИГЕНИ (ВІДНОСНО ЗРІЛОГО БІЛКА МА5БР-2)

ЗЕО І МО:8 - послідовність СИОВІ (аа 1-121);

ЗЕО І МО:9 - послідовність СОВЕСЕ (аа 1-166);

ЗЕО ІЮ МО:10 - СОВЕСЕСИВІЇ (аа 1-293);

ЗЕО ІО МО:11 - ЕСЕ-ділянка (аа 122-166);

ЗЕО ІО МО:12 - домен серинової протеази (аа 429-671);

ЗЕО ІО МО:13 - неактивний домен серинової протеази (аа 610-625 із заміною Зегб18 на Аа);

ЗЕО ІЮ МО:14 - ТР І СРКМУ/РЕРУГБГОВІ (пептид СОВІ);

ЗЕО ІЮ МО:15 - ТАРРОУВІ ВІ МЕТНЕОІГ ЕІ ЗНІ СЕМОЕМУКІ 55САКМІ АТІ ССО (пептид СОВІ);

ЗЕО ІЮ МО:16 - ТЕВ5ОУ5М (центральна частина зв'язувальної ділянки МВІ);

ЗЕО ІЮ МО:17 - ЕМ5І а55І ОІТЕАЗОУЗМЕКРЕТОЕ (зв'язувальна ділянка МВІ);

ЗЕО ІО МО:18 - ІПЕСОМАРО (пептид ЕСЕ);

ЗЕО Ір МО 19 - АММІ САС! ЕЗОХСИКОЗСВНООБОИСАЇ М (центральна частина, що зв'язує серинову протеазу). 60 ДОКЛАДНИЙ ОПИС

ПЕПТИДНІ ІНГІБІТОРИ

ЗЕО ІЮ МО:20 - повнорозмірна кКДНК МВІ;

ЗЕО ІЮ МО:21 - повнорозмірний білок МВІ ;

ЗЕО ІЮ МО:22 - ОБК-Х-ОР (консенсус зв'язування);

ЗЕО Ір МО:23 - ОСКІ С;

ЗЕО Ір МО:24 - СІ В СО СРО СОКІ РО С;

ЗЕО Ір МО:25 - аРО СРО СГ СО СРО СКІ СРО СРО СРО;

ЗЕО Ір МО26 -- акранраткаЕКсСЕРИООСІ НА ОСРОСКІ аРОСЄ;

ЗЕО ІЮ МО:27 - ВАЛОС5БОСЕКОАОСРОСРОСРОСКМОРКСОСЕОСВО (людський Н-фіколін);

ЗЕО Ір МО28 - асосвіГгосдовркаєЕдатчакваЕВНаРОСРОСКАСРОС РМаАОсСЕО (людський фіколін р35);

ЗЕО ІЮ МО:29 - ГОКАЇ ЕП/'РМЕМТІКАМЕРЕЇМРЇ (сайт розщеплення С4).

ІНГІБІТОРИ ЕКСПРЕСІЇ

ЗЕО ІЮ МО:З30 - КДНК домену СОВІ-ЕСЕ (нуклеотиди 22-680 в ЗЕО ІЮ МО 4);

ЗЕО ІЮ МО:31 - У-СсССсайСАСАССАТОАДСЬ СТО СТОАССоСтТОоСтТасяаас-з, 12-45 нуклеотиди в

ЗЕО ІЮ МО:4, що включає сайт початку ініціації трансляції МА5Р-2 (смислова);

ЗЕО Ір МО:32 - У-(44АСАТТАССТТ ССИаСТОСОаАСТОСААСОПСАСАдСИ-3", 361-396 нуклеотиди в

ЗЕО ІЮ МО:4, кодуючій ділянку, що містить МВІ--зв'язувальний сайт МА5Р-2 (смислова);

ЗЕО Ір МО:33 - У-АВСАдаСССТаААТАСССАСОвИССОСТАТОССАДА-З3", 610-642 нуклеотиди в

ЗЕО ІО МО:4, кодуючій ділянку, що містить домен СИВІЇ.

ПРАЙМЕРИ КОДУВАННЯ

ЗЕО Ір МО:34 - бсасасАТоСАТаАдаасСтТастаАСсстТо (5-ПЛР для СИВ);

ЗЕО ІЮ МО:35 - айААТТОСТАСаИстасАТА (3-ПЛР для СИВ);

ЗЕО ІЮ МО:36 - айААТТСОСТАСАСИаассаст (3-ПЛР для СОВІЕСБЕ);

ЗЕО І МО:37 - айААТТОСТАатАаТасацаАТ (3-ПЛР для СОВІЕСЕСОВІЇ);

ЗЕО ІЮ МО:38-47 - праймери клонування для гуманізованого антитіла;

ЗЕО ІЮ МО:48 - пептидний зв'язок з 9 амінокислот.

ВЕКТОР ЕКСПРЕСІЇ

ЗЕО ІЮ МО:49 являє собою вставку міні-гена МА5Р-2;

Зо 5ЕО ІЮ МО:50 являє собою кКДНК мишачого МА5Р-2;

ЗЕО ІЮ МО:51 являє собою мишачий білок МА5Р-2 (з лідерною послідовністю);

ЗЕО ІЮ МО:52 являє собою зрілий мишачий білок МА5Р-2;

ЗЕО ІЮ МО:53 являє собою КДНК щурячого МА5Р-2;

ЗЕО ІЮ МО:54 являє собою щурячий білок МА5Р-2 (з лідерною послідовністю);

ЗЕО ІЮ МО:55 являє собою зрілий щурячий білок МАБР-2;

ЗЕО 10 МО:56-59 являють собою олігонуклеотиди для сайт-спрямованого мутагенезу людського МА5Р-2, які використовуються для одержання людського МАБР-2А;

ЗЕО 10 МО:60-63 являють собою олігонуклеотиди для сайт-спрямованого мутагенезу мишачого МА5Р-2, які використовуються для одержання мишачого МАЗР-2А;

ЗЕО 10 МО:64-65 являють собою олігонуклеотиди для сайт-спрямованого мутагенезу щурячого МА5Р-2, які використовуються для одержання щурячого МАБР-2А;

ЗЕО ІЮ МО6б являє собою ДНК, кодуючу варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) 17020 асз5уМнаг1мМ11МмІ (0М5646) (без сигнального пептиду);

ЗЕБЕО ІЮ МО:67 являє собою поліпептид 17020 асз5МнНаї1мМ11МІ (О0М5646) варіабельної ділянки важкого ланцюга (МН);

ЗЕО ІЮ МО:68 являє собою поліпептид 17М1бтс варіабельної ділянки важкого ланцюга (МН);

ЗБЕО ІЮ МО:69 являє собою ДНК, кодуючу варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ) 17020 асз5уМнагї1мМ11мІ (ОоМ5646);

ЗЕБЕО ІЮ МО:70 являє собою поліпептид 17020 асз5МнНаї1мМ11МІ (О0М5646) варіабельної ділянки легкого ланцюга (Мі);

ЗЕО ІЮО МО:71 являє собою поліпептид 17М16 ас17М9 варіабельної ділянки легкого ланцюга (МУ;

ЗЕО ІЮ МО:72 являє собою ЗОМІ-2І. (повнорозмірний);

ЗЕО ІЮ МО:73 являє собою ЗОМІ-2М (укорочений варіант середньої довжини);

ЗЕО ІО МО:74 являє собою ЗОМІ-25 (укорочений варіант, короткий);

ЗЕО ІЮ МО:75 являє собою зрілий поліпептид, що містить МН-М2абб6-5ОаМІ-2-М і константну область людського Ідс4 з мутацією в шарнірній області;

ЗЕО ІЮ МО:76 являє собою зрілий поліпептид, що містить МН-М2абьб6-5ОаМІ-2-О і константну 60 область людського ІдС4 з мутацією в шарнірній області;

ЗЕО ІЮО МО:77 являє собою зрілий поліпептид, що містить МІ -М2абб6-5СО2МІ-2-М і константну область ланцюга лямбда людського Ід;

ЗЕО ІЮО МО:78 являє собою зрілий поліпептид, що містить МІ -М2абБб6-5С2МІ-2-СО і константну область ланцюга лямбда людського Ід;

ЗЕО ІЮ МО:79 являє собою пептидний лінкер (10 аа);

ЗЕО ІЮ МО:80 являє собою пептидний лінкер (6 аа);

ЗЕО ІЮ МО:81 являє собою пептидний лінкер (4 аа);

ЗЕО І МО:82 являє собою полінуклеотид, кодуючий поліпептид, що містить МН-Ма2арб-

ЗОМІ-2-М і константну область людського Ідс4 з мутацією в шарнірній області;

ЗЕО ІЮ МО:83 являє собою полінуклеотид, кодуючий поліпептид, що містить МН-Ма2арб-

ЗОаМІ-2-СО і константну область людського Ідсо4 з мутацією в шарнірній області;

ЗЕБЕО ІЮ МО:84 представляє полінуклеотид, кодуючий поліпептид, що містить МІ -Магабрб-

ЗОМІ-2-М і константну область ланцюга лямбда людського Ід;

ЗЕБЕО ІЮ МО:85 представляє полінуклеотид, кодуючий поліпептид, що містить МІ -Магабрб-

ЗОаМІ-2-СО і константну область ланцюга лямбда людського Ід.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Даний винахід оснований на несподіваному відкритті авторів даного винаходу, що інгібування мананзв'язувальної лектинасоційованої серинової протеази-2 (МАБР-2), ключового регулятора лектинового шляху системи комплементу, значною мірою зменшує запалення і фіброз у різних моделях тварин фіброзного захворювання, включаючи модель односторонньої обструкції сечоводу (ШОЮ), модель передозування білка і модель фіброзу нирок при індукованій адріаміцином нефропатії. Таким чином, автори винаходу продемонстрували, що пригнічення

МА5Р-2-опосередкованої активації лектинового шляху забезпечує ефективний терапевтичний підхід для полегшення, лікування або профілактики фіброзу нирок, наприклад тубулоінтерстиціального запалення і фіброзу, незалежно від основної причини. У даному описі також показано, що застосування інгібуючого МАБ5Р-2 антитіла (0М5646) ефективно поліпшує функції нирок і зменшує необхідність в кортикостероїдах у людей, що страждають імуноглобулін

А-нефропатією (ІдАМ) і мембранозною нефропатією (МН).

Ї. ВИЗНАЧЕННЯ

Зо Якщо спеціально не зазначене інше, то всі використовувані в даному описі терміни мають таке ж значення, яке є зрозумілим фахівцю в галузі, до якої належить даний винахід. Наведені нижче визначення призначені для прояснення термінів, які використовуються в описі і у формулі даного винаходу.

Використовуваний у даному описі термін "МА5БР-2-залежна активація комплементу" стосується МА5БР-2-залежної активації лектинового шляху, яка відбувається у фізіологічних умовах (тобто в присутності Сам) і яка приводить до утворення СЗ-конвертази С4р2а лектинового шляху і накопичення продукту розщеплення С3, такого як СЗБр, а далі утворення

С5-конвертази С4р2а(СЗр) п, що, як було визначено, є основною причиною опсонізації.

Використовуваний у даному описі термін "альтернативний шлях" стосується активації комплементу, яка ініціюється, наприклад, зимозаном із клітинних стінок грибів і дріжджів, ліпополісахаридом (ЛПС) зовнішньої мембрани грамнегативних бактерій і кролячими еритроцитами, а також множиною чистих полісахаридів, кролячих еритроцитів, вірусів, бактерій, пухлинних клітин тварин, паразитів і ушкоджених клітин, і яка, як прийнято вважати, виникає в результаті спонтанного протеолітичного розщеплення фактора комплементу СЗ з утворенням

СЗЗ.

Використовуваний у даному описі термін "лектиновий шлях" стосується активації комплементу, яка відбувається за допомогою специфічного зв'язування сироваткових і несироваткових карбогідратзв'язувальних білків, включаючи мананзв'язувальний лектин (МВ),

СІ -11 ї фіколіни (Н-фіколін, М-фіколін або І -фіколін).

Використовуваний у даному описі термін "класичний шлях" стосується активації комплементу, яка запускається антитілом, зв'язаним з чужорідною частинкою, і для здійснення якої необхідне зв'язування з молекулою розпізнавання С14.

Використовуваний у даному описі термін "інгібуючий МА5Р-2 агент" означає будь-який агент, який зв'язується або безпосередньо взаємодіє з МА5БР-2 і ефективно пригнічує МАБР-2- залежну активацію комплементу, включаючи анти-МА5Р-2 антитіла і їх МА5Р-2-зв'язувальні фрагменти, натуральні і синтетичні пептиди, малі молекули, розчинні МАБР-2 рецептори, інгібітори експресії і виділені натуральні інгібітори; а також пептиди, які в лектиновому шляху активації конкурують із МА5Р-2 за зв'язування з іншими молекулами розпізнавання (наприклад,

МВІ., Н-фіколіном, М-фіколіном або І -фіколіном), при цьому цей термін не охоплює антитіла, які бо зв'язуються з іншими молекулами розпізнавання. Інгібуючі МАЗР-2 агенти, використовувані в даному винаході, можуть знижувати рівень МАЗР-2-опосередкованої активації комплементу більше ніж на 20 95, наприклад більше ніж на 50 95, наприклад більше ніж на 90 95. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5БР-2 агент знижує рівень МА5Р-2-опосередкованої активації комплементу більше ніж на 90 95 (тобто рівень МАЗР-2-опосередкованої активації комплементу буде в результаті становити тільки 10 95 або менше).

Використовуваний у даному описі термін "фіброз" означає утворення або присутність надлишкової сполучної тканини на органі або тканині. Фіброз може виникнути як реакція відповіді у вигляді відновлення або заміщення на стимул, такий як ушкодження тканини або запалення. Відмітною ознакою фіброзу є продукування надлишкового позаклітинного матриксу.

Нормальна фізіологічна відповідь на ушкодження приводить до утворення сполучної тканини, як складової процесу загоєння, але це утворення сполучної тканини може затягтися і стати патологічним, змінюючи архітектуру і функцію тканини. На клітинному рівні, епітеліальні клітини і фібробласти розмножуються і диференціюються в міофібробласти, приводячи до скорочення матриксу, збільшення ригідності, мікроваскулярної компресії і гіпоксії.

Використовуваний у даному описі термін "лікування фіброзу у ссавця, що страждає або має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням" означає купірування, ослаблення, полегшення або пригнічення фіброзу у зазначеного ссавця.

Використовуваний у даному описі термін "протеїнурія" означає наявність білка в сечі людини в аномальній кількості, наприклад у кількості, що перевищує 0,3 г білка в сечі людини, зібраній за 24 години, або в концентрації, що перевищує 1 г/л.

Використовуваний у даному описі термін "поліпшення при протеїнурії" або "зменшення протеїнурії" означає зменшення у суб'єкта, що страждає протеїнурією, 24-годинної екскреції білка з сечею щонайменше на 20 95, наприклад щонайменше на 30 95, наприклад щонайменше на 40 95, наприклад щонайменше на 50 95, або більше у порівнянні з вихідною 24-годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до його лікування інгібуючим МА5Р-2 агентом. В одному з варіантів здійснення лікування інгібуючим МАБ5бР-2 агентом згідно зі способом за винаходом є ефективним відносно зменшення протеїнурії у людини настільки, що досягається більше ніж 20

Фо зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею або, наприклад, більше ніж 30 95 зменшення

Зо 24-годинної екскреції білка з сечею, або, наприклад, більше ніж 40 95 зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею, або, наприклад, більше ніж 50 95 зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею.

Використовуваний у даному описі термін "антитіло" охоплює антитіла і їх фрагменти, одержані від будь-якого виробляючого антитіла ссавця (наприклад, миші, щура, кролика і примата, включаючи людину) або одержані за допомогою гібридоми, відбору фагів, рекомбінантної експресії або трансгенних тварин (або іншими способами одержання антитіл або фрагментів антитіл), де зазначені антитіла або їх фрагменти специфічно зв'язуються з цільовим поліпептидом, таким як, наприклад, МА5Р-2, його поліпептидами або ділянками. Це не означає, що термін "антитіло" обмежений зазначеними в даному описі джерелами походження антитіл або способами їх одержання (наприклад, за допомогою гібридоми, відбору фагів, рекомбінантної експресії, трансгенних тварин, синтезу пептидів і т. п.). Антитіла, що наводяться як приклад, включають поліклональні, моноклональні і рекомбінантні антитіла; мультивалентні, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла, триспецифічні антитіла); гуманізовані антитіла; мишачі антитіла; химерні антитіла; моноклональні антитіла "миша- людина", "миша-примат", "примат-людина"; і антиїіїдіотипічні антитіла, які можуть бути інтактними антитілами, або їх фрагменти. Використовуваний у даному описі термін "антитіло" охоплює не тільки інтактні поліклональні або моноклональні антитіла, але також їх фрагменти (такі як АБ, Раб, Рар', К(аб)»2, Ем), одноланцюжкові фрагменти (5СЕм), їх синтетичні варіанти, природні варіанти, гібридні білки, що включають частину антитіла разом з антигензв'язувальним фрагментом з потрібною специфічністю, гуманізовані антитіла, химерні антитіла і будь-які модифіковані конфігурації імуноглобулінових молекул, що містять антигензв'язувальну ділянку або фрагмент (ділянку, що розпізнає епітоп) з потрібною специфічністю. "Моноклональне антитіло" означає гомогенну популяцію антитіл, у якій моноклональне антитіло складається з амінокислот (що зустрічаються в природі і не зустрічаються в природі), які беруть участь у селективному зв'язуванні епітопа. Моноклональні антитіла є високоспецифічними відносно цільового антигену. Термін "моноклональне антитіло" охоплює не тільки інтактні моноклональні антитіла і повнорозмірні моноклональні антитіла, але також їх фрагменти (такі як Раб, Раб Е(ар)», Ем), одноланцюжкові фрагменти (5сЕм), їх варіанти, рекомбінантні білки, що містять антигензв'язувальну частину, гуманізовані моноклональні бо антитіла, химерні моноклональні антитіла і будь-яку модифіковану конфігурацію імуноглобулінової молекули, що містить антигензв'язувальний фрагмент (ділянку, що розпізнає епітоп) з потрібною специфічністю і здатністю зв'язуватися з епітопом. Це не означає, що цей термін обмежений зазначеними в даному описі джерелами походження антитіл або способами їх одержання (наприклад, за допомогою гібридоми, відбору фагів, рекомбінантної експресії, трансгенних тварин і т. п.). Цей термін включає цілі імуноглобуліни, а також фрагменти і т. д., описані вище під визначенням "антитіло".

Використовуваний у даному описі термін "фрагмент антитіла" стосується частини, яка одержана або належить до повнорозмірного антитіла, такого як, наприклад, анти-МАБР-2 антитіло, що звичайно включає антигензв'язувальну або варіабельну ділянку цього антитіла.

Репрезентативні приклади фрагментів антитіл включають Бар, Рар, Е(аб)», Кіа)» ії Емх- фрагменти, 5сЕм-фрагменти, діатіла, лінійні антитіла, молекули одноланцюжкових антитіл і мультиспецифічні антитіла, утворені із фрагментів антитіл.

Використовуваний у даному описі "одноланцюжковий Ем" або "5сЕм"-фрагмент антитіла містить МН- і Мі-домени антитіла, причому ці домени присутні в одному поліпептгидному ланцюзі. Як правило, Ем-поліпептид додатково містить поліпептидний лінкер між МН- і МІ - доменами, який дозволяє 5сЕм формувати потрібну структуру для зв'язування антигену.

Використовуваний у даному описі термін "химерне антитіло" являє собою рекомбінантний білок, який містить варіабельні домени і області, що визначають комплементарність, одержані з нелюдського (наприклад, гризуна) антитіла, тоді як інша частина молекули антитіла одержана з людського антитіла.

Використовуваний у даному описі термін "гуманізоване антитіло" являє собою химерне антитіло, що містить мінімальну послідовність, яка відповідає специфічним областям, що визначають комплементарність, одержаним з нелюдського імуноглобуліну, трансплантованого в каркас антитіла людини. Гуманізовані антитіла, як правило, являють собою рекомбінантні білки, у яких тільки області що визначають комплементарність, антитіла мають нелюдське походження.

Використовуваний у даному описі термін "мананзв'язувальний лектин"' (МВІ) є еквівалентним мананзв'язувальному білку (МВР).

Використовуваний у даному описі термін "мембраноатакуючий комплекс" (МАС) означає комплекс із п'яти кінцевих компонентів комплементу (С5р, об'єднаний з Сб, С7, С8 і С9), який вбудовується в мембрани і руйнує їх (також називаний С56Б-9).

Використовуваний у даному описі термін "суб'єкт" включає всіх ссавців, включаючи, без обмеження, людей, приматів, що не належать до людини, собак, кішок, коней, овець, кіз, корів, кроликів, свиней і гризунів.

Використовувані в даному описі амінокислотні залишки мають нижченаведені скорочення: аланін (Аїа; А), аспарагін (Азп; М), аспарагінова кислота (Азр; 0), аргінін (Аго; К), цистеїн (Сув;

С), глутамінова кислота (Сіи; Е), глутамін (Сп; 0), гліцин (Су; С), гістидин (Нів; Н), ізолейцин (Пе; І), лейцин (Гени; І), лізин (Гу5; К), метіонін (Меї; М), фенілаланін (Ре; Е), пролін (Рго; Р), серин (5ег; 5), треонін (ТАг; Т), триптофан (Тгр; УМ), тирозин (Туг; ХУ) і валін (мМаї; М).

У більш широкому розумінні, природні амінокислоти можуть бути розділені на групи, виходячи з хімічних властивостей бічних ланцюгів відповідних амінокислот. "Гідрофобними" амінокислотами є Пе, ей, Меї, Ре, Тгр, Туг, Маї, Аіїа,Й Суб5 або Рго. "Гідрофільними" амінокислотами є су, Авп, Сп, Зег, ТПг, Ар, Сім, Гуз, Агуд або Ні. Ця група амінокислот може бути також розділена на підкласи. "Незарядженими гідрофільними" амінокислотами є 5ег, ТПг,

Ап або Сіп. "Кислотними" амінокислотами є Сім або Ар. "Основними" амінокислотами є Гуз,

Агу або Нів.

Використовуваний у даному описі термін "консервативна амінокислотна заміна" представлений амінокислотними замінами усередині однієї з наступних груп: (1) гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин, (2) фенілаланін, тирозин і триптофан, (3) серин і треонін, (4) аспартат і глутамат, (5) глутамін і аспарагін, і (6) лізин, аргінін і гістидин.

Використовуваний у даному описі термін "олігонуклеотид" означає олігомер або полімер рибонуклеїнової кислоти (РНК) або дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) або їх міметики. Цей термін також охоплює такі олігонуклеобази, які складаються із природних нуклеотидів, цукрів і ковалентних міжнуклеозидних (остов) зв'язків, а також олігонуклеотидів, які мають модифікації, що не зустрічаються в природі.

Використовуваний у даному описі термін "епітоп" означає ділянку на білку (наприклад, білку

МА5Р-2), з якою зв'язується антитіло. "Епітопи, що перекриваються" включають щонайменше один (наприклад, два, три, чотири, п'ять або шість) загальний амінокислотний залишок (залишки), включаючи лінійні і нелінійні епітопи. 60 Використовувані в даному описі терміни "поліпептид", "пептид" і "білок" є взаємозамінними і означають будь-який зв'язаний з пептидом ланцюг амінокислот, незалежно від довжини або посттрансляційної модифікації. Білок МАБР-2, розкритий у даному описі, може містити або являти собою білок дикого типу або може являти собою варіант, який має не більше 50 (наприклад, не більше 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 або 50) консервативних амінокислотних замін. Консервативні заміни звичайно включають заміни в межах однієї з наступних групах: гліцин і аланін; валін, ізолейцин і лейцин; аспарагінова кислота і глутамінова кислота; аспарагін, глутамін, серин і треонін; лізин, гістидин і аргінін; і фенілаланін і тирозин.

У деяких варіантах здійснення людський білок МАБР-2 може мати амінокислотну послідовність, яка є ідентичною на 70 95 або більше (наприклад, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 95) людському білку МАБР-2, що має амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО:5.

У деяких варіантах здійснення пептидні фрагменти можуть мати в довжину щонайменше 6 (наприклад, щонайменше 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, Зб, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 400, 450, 500 або 600 або більше) амінокислотних залишків (наприклад, щонайменше 6 суміжних амінокислотних залишків з ЗЕО ІЮ МО:5). У деяких варіантах здійснення антигенний пептидний фрагмент білка

МАБ5Р-2 людини має в довжину менше 500 (наприклад, менше 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, Аб, 45, 44, 43, 42, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 або 6) амінокислотних залишків (наприклад, менше 500 суміжних амінокислотних залишків у будь-якому місці послідовності ЗЕО ІЮ МО:5).

Відсоток (95) ідентичності амінокислотної послідовності визначається як відсотковий вміст амінокислот у послідовності-кандидаті, які ідентичні амінокислотам у контрольній послідовності після вирівнювання послідовностей і введення зазорів (гепів), при необхідності, для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовностей. Вирівнювання з метою визначення відсотка ідентичності послідовностей може бути досягнуте різними способами, які знаходяться у межах компетенції фахівця в даній галузі, наприклад, за допомогою загальнодоступного програмного забезпечення, такого як ВІАБТ, ВІГАБТ-2, АСОМ, АІСМ-2 або Медаїїдн

Зо (ОМАЗТАК). Відповідні параметри для вимірювання вирівнювання, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання опо всій довжині порівнюваних послідовностей, можуть бути визначені відомими методами.

І. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Як розкрито в даному описі, автори винаходу визначили центральну роль лектинового шляху в ініціації і прогресуванні захворювання тубулярної патології нирок, що має на увазі ключову роль активації лектинового шляху в патофізіології широкого спектра ниркових захворювань, включаючи ІдА-нефропатію, СЗ-гломерулопатію і інші гломерулонефрити. У даному описі також зазначено, що автори даного винаходу відкрили, що інгібування мананзв'язувальної лектинасоційованої серинової протеази-2 (МА5Р-2), ключового регулятора лектинового шляху системи комплементу, значно зменшує запалення і фіброз у різних моделях тварин фіброзного захворювання, включаючи модель односторонньої обструкції сечоводу (ШО), модель передозування білка і модель фіброзу нирок при індукованій адріаміцином нефропатії. Таким чином, автори винаходу показали, що пригнічення МА5БР -2-опосередкованої активації лектинового шляху забезпечує ефективний терапевтичний підхід для полегшення, лікування або профілактики фіброзу нирок, наприклад тубулоінтерстиціального фіброзу, незалежно від основної причини.

Лектини (МВ, М-фіколін, Н-фіколін, І-фіколін ії СІ-11) є специфічними молекулами розпізнавання, які запускають систему комплементу по механізму реалізації вродженого імунітету, і така система включає лектиновий шлях ініціації і зв'язану 3 ним петлю посилення термінального шляху, яка підсилює ініційовану лектином активацію термінальних ефекторних молекул комплементу. С1д являє собою специфічну молекулу розпізнавання, яка запускає систему комплементу по механізму реалізації набутого імунітету, і така система включає класичний шлях ініціації і асоційовану з ним петлю посилення термінального шляху, яка підсилює С1д-ініційовану активацію термінальних ефекторних молекул комплементу. Автори посилаються на ці дві основні системи активації комплементу, такі як лектинзалежна система комплементу і С1д-залежна система комплементу, відповідно.

Додатково до своєї важливої ролі в імунному захисті система комплементу додає внесок в ураження тканин при багатьох клінічних станах. Таким чином, існує дуже нагальна потреба в розробці терапевтично ефективних інгібіторів комплементу для попередження розвитку цих бо побічних ефектів. Установлення факту можливості пригнічення МАЗР-2-опосередковуваного лектиного шляху, при цьому не зачіпаючи класичний шлях, забезпечує можливість для дуже бажаного специфічного пригнічення активації тільки системи комплементу, що викликає конкретну патологію, не пригнічуючи повністю здатність комплементу до імунного захисту. Так, наприклад, при патологічних станах, при яких активація комплементу опосередковується переважно лектинзалежною системою комплементу, переважним є специфічне пригнічення тільки цієї системи. Для регуляції процесингу імунного комплексу і для забезпечення захисту хазяїна від інфекції, система С1ід-залежної активації комплементу повинна залишатися незмінною.

Переважним білюювим компонентом для мішені при розробці терапевтичних агентів для специфічного пригнічення лектинзалежної системи комплементу є МАБР-2. Із усіх відомих білкових компонентів лектинзалежної системи комплементу (МВІ, Н-фіколіну, М-фіколіну, І- фіколіну, МАЗР-2, Сб2-С9, фактора В, фактора О і пропердину), тільки МА5Р-2 є унікальним і необхідним для функціонування цієї лектинзалежної системи комплементу. Лектини (МВІ., Н- фіколін, М-фіколін, І -фіколін і СІ-11) також є унікальними компонентами лектинзалежної системи комплементу. Однак втрата будь-якого одного із цих лектинових компонентів необов'язково буде пригнічувати активацію цієї системи, що обумовлено надлишковою кількістю лектину. Для гарантії пригнічення активації лектинзалежної системи комплементу необхідно інгібувати всі п'ять лектинів. Крім того, оскільки відомо, що МВІ і фіколіни також мають опсонінову активність, що не залежить від комплементу, то пригнічення функції лектину буде приводити до втрати цього цінного механізму захисту хазяїна від інфекції. На противагу цьому, така опсонінова активність лектину, що не залежить від комплементу, залишиться незачепленою, якщо мішенню для інгібування є МАБР-2. Інша перевага МА5БР-2 як терапевтичної мішені для пригнічення активації лектинзалежної системи комплементу полягає в тому, що концентрація МАБР-2 у плазмі, у порівнянні з будь-якими іншими білками комплементу, є найбільш низькою (500 нг/мл), і тому для повного пригнічення будуть достатніми низькі концентрації високоафінних інгібіторів МАБР-2 (МоїІег-Кіівіепзеп М. еї аї.,..

Іттипої. Меїйпоав, 282:159-167, 2003).

Як описано в прикладі 14 даного опису, на тваринній моделі фіброзної хвороби нирок (одностороння обструкція сечоводу ШО) було визначено, що захворювання нирок у мишей,

Зо позбавлених гена МАБР-2 (МАБР-2-/-), виявилося в значно меншому ступені в порівнянні з контрольними тваринами дикого типу, про що свідчили запальні клітинні інфільтрати (зниження на 75 95) і гістологічні маркери фіброзу, такі як відкладення колагену (зменшення на одну третину). У прикладі 15 додатково показано, що миші дикого типу, яким системно вводили моноклональне анти-МАБР-2 антитіло, що вибірково блокує лектиновий шлях, залишаючи незачепленим класичний шлях, були захищені від фіброзу нирок у порівнянні з мишами дикого типу, яким вводили антитіло ізотипного контролю. Ці результати свідчать про те, що лектиновий шлях є ключовим фактором, що викликає захворювання нирок, і ще раз демонструють, що блокуючий лектиновий шлях інгібітор МА5Р-2, такий як анти-МА5Р-2 антитіло, є ефективним як антифіброзний агент. У прикладі 16 на моделі передозування білка додатково показано, що у мишей дикого типу, які одержували бичачий сироватковий альбумін (В5А), розвилася протеїнурична нефропатія, тоді як у МАБР-2-/- мишей, що одержували таку ж дозу ВЗА, ушкодження нирок виявилося в меншому ступені. У прикладі 17 показано, що миші дикого типу, яким системно вводили моноклональне анти-МА5Р-2 антитіло, що вибірково блокує лектиновий шлях, залишаючи незачепленим класичний шлях, були захищені від ушкодження нирок у моделі передозування білка. У прикладі 18 показано, що у МАЗР-2-/- мишей спостерігалося запалення нирок і тубулоінтерстиціальне ушкодження в індукованій адріаміцином нефрологічній моделі фіброзу нирок у меншому ступені в порівнянні з мишами дикого типу. У прикладі 19 показано, що у фазі 2 відкритого клінічного дослідження ниркових захворювань, що проводиться на даний момент, пацієнти з ІдА-нефропатією, яким вводили анти-МА5Р-2 антитіло, до кінця лікування мали клінічно значиме і статистично достовірне зменшення співвідношення альбумін/креатинін у сечі (ШАСА) протягом усього дослідження, а також зменшення рівня білка в сечі, що збирається протягом 24-годин, у порівнянні з вихідним рівнем. У прикладі 19 також показано, що в тому ж дослідженні фази 2 у пацієнтів з мембранозною нефропатією, яким вводили анти-

МА5БР-2 антитіло, також спостерігалося зниження ЧАсСк під час лікування.

Відповідно до вищесказаного, даний винахід стосується застосування інгібуючих МА5Р-2 агентів, таких як інгібуючі МА5БР-2 антитіла, як антифіброзних агентів, застосування інгібуючих

МА5Р-2 агентів для виготовлення лікарського засобу для лікування фіброзного стану і способів профілактики, лікування, полегшення або купірування фіброзного стану у людини, що цього потребує, де зазначений спосіб включає введення зазначеному пацієнту ефективної кількості 60 інгібуючого МА5Р-2 агента (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла).

Способи за винаходом можуть бути використані для профілактики, лікування, полегшення або купірування фіброзного стану у людини, що страждає будь-яким захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, включаючи захворювання нирок (наприклад, хронічне захворювання нирок, ІдА-нефропатія, СЗ-гломерулопатія і інші гломерулонефрити), легенів (наприклад, ідіопатичний фіброз легенів, кістозний фіброз, бронхоектаз), печінки (наприклад, цироз, неалкогольна жирова хвороба печінки), серця (наприклад, інфаркт міокарда, фіброз передсердь, фіброз клапанів, фіброз ендоміокарда), мозку (наприклад, інсульт), шкіри (наприклад, надмірне загоєння ран, склеродермія, системний склероз, келоїди), судинної системи (наприклад, атеросклеротичне судинне захворювання), кишечнику (наприклад, хвороба Крона), очей (наприклад, передня субкапсулярна катаракта, помутніння задньої капсули), структур м'яких тканин скелетно-м'язової системи (наприклад, клітинний капсуліт, контрактура Дюпюїтрена, мієлофіброз), репродуктивних органів (наприклад, ендометріоз, хвороба Пейроні) і деяких інфекційних захворювань (наприклад, альфа-вірус, гепатит С і гепатит В).

І. РОЛЬ МАБ5БР-2 ПРИ ЗАХВОРЮВАННЯХ І СТАНАХ, ВИКЛИКАНИХ АБО УСКЛАДНЕНИХ

ФІБРОЗОМ

Фіброз являє собою утворення або наявність надлишкової кількості сполучної тканини в органі або тканині, що утворюється як правило у відповідь на ушкодження або ураження.

Відмітною ознакою фіброзу є продукування надлишкового позаклітинного матриксу після ураження. У нирках фіброз характеризується як прогресуюче згубне відкладення сполучної тканини на паренхімі нирки, що неминучо приводить до зниження функції нирок незалежно від первинного захворювання нирок, яке викликає їх початкове ушкодження. Так званий епітеліально-мезенхімний перехід (ЕМТ), зміна клітинних характеристик, при якій канальцеві епітеліальні клітини трансформуються в мезенхімальні фібробласти, є основним механізмом фіброзу нирок. Фіброз уражує майже всі тканини і системи органів і може виникати як реакція відповіді у вигляді відновлення або заміщення на стимул, такий як ушкодження тканини або запалення. Нормальна фізіологічна відповідь на ушкодження приводить до накопичення сполучної тканини, але, якщо цей процес стає патологічним, заміна високодиференційованих клітин шляхом рубцювання сполучної тканини змінює структуру і функцію тканини. На

Зо клітинному рівні, епітеліальні клітини і фібробласти розмножуються і диференціюються в міофібробласти, приводячи до скорочення матриксу, збільшення ригідності, мікроваскулярної компресії і гіпоксії. На даний час відсутнє ефективне лікування або терапія фіброзу, але і звіти досліджень на тваринах, і епізодичні звіти по лікуванню людей говорять про те, що фіброзні ураження тканин можуть бути купірувані (Татре апа 2еї5регу, Маї. Кем. Мерпгої., Мої. 10:226- 237, 2014).

Багато які захворювання є результатом фіброзу, який викликає прогресування органної недостатності, включаючи захворювання нирок (наприклад, хронічне захворювання нирок, ІдА- нефропатія, СЗ-гломерулопатія і інші гломерулонефрити), легенів (наприклад, ідіопатичний фіброз легенів, кістозний фіброз, бронхоектаз), печінки (наприклад, цироз, неалкогольна жирова хвороба печінки), серця (наприклад, інфаркт міокарда, фіброз передсердь, фіброз клапанів, фіброз ендоміокарда), мозку (наприклад, інсульт), шкіри (наприклад, надмірне загоєння ран, склеродермія, системний склероз, келоїди), судинної системи (наприклад, атеросклеротичне судинне захворювання), кишечнику (наприклад, хвороба Крона), очей (наприклад, передня субкапсулярна катаракта, помутніння задньої капсули), структур м'яких тканин скелетно- м'язової системи (наприклад, клітинний капсуліт, контрактура Дюпюїтрена, мієлофіброз), репродуктивних органів (наприклад, ендометріоз, хвороба Пейроні) і деяких інфекційних захворювань (наприклад, альфа-вірус, гепатит С і гепатит В і т. д.).

Хоча фіброз виникає в багатьох тканинах і при багатьох захворюваннях, у його патології існують загальні молекулярні і клітинні механізми. Відкладення позаклітинного матриксу фібробластами супроводжується інфільтратами імунних клітин, переважно мононуклеарних клітин (див. МУупп Т., Маї. Кеум. Іттипої. 4(8):583-594, 2004, включений у даний опис у вигляді посилання). Активна запальна відповідь приводить до експресії факторів росту (ТаЕДВ, МЕСЕ, фактора росту гепатоцитів, фактора росту сполучної тканини), цитокінів і гормонів (ендотеліну,

І. -4, 1-6, 1-13, хемокінів), ферментів деструкції (еластази, матриксних металопротеїназ, катепсинів) і білків позаклітинного матриксу (колагенів, фібронектину, інтегринів).

Крім того, система комплементу стає активною при численних фіброзних захворюваннях.

Компоненти комплементу, включаючи мембраноатакуючий комплекс, були ідентифіковані в численних зразках фіброзної тканини. Наприклад, компоненти лектинового шляху були виявлені при фіброзних ураженнях нирок (Заотига еї а!., Мернгоп., 92(3):702-4 (2002), Заю евї а!., І ирив, 60 00 20(13):1378-86 (2011), ім єї аї., Сііп. Ехр. Іттипої., 174(1):152-60 (2013)); захворюваннях печінки (Кепзеп еї аї., Нерафоіоду, 50(6):1809-17 (2009)); і хворобі легенів (ОЇІезеп еї аї., Сііп.

Іттипої. 121(3):324-31 (2006)).

Було встановлено, що надмірна активація системи комплементу є одним із ключових факторів розвитку опосередкованого імунним комплексом, а також антитілонезалежного, гломерулонефриту. Проте існують переконливі свідчення того, що неконтрольована активація комплементу іп 5йи пов'язана з патофізіологічним прогресуванням ТІ фіброзу при негломерулярному захворюванні (Сцідд К.О., у. Іттипої. 171:3319-3324, 2003, Маїк А. еї аї.,

Зетіп Мерігої. 33:575-585, 2013, Маїйег О.В. еї аї., Сіїп. У. Ат. бос. Мернго!. 10:Р1636-1650, 2015). Сильні прозапальні сигнали, викликані локальною активацією комплементу, можуть бути ініційовані компонентами комплементу, що потрапляють шляхом фільтрації в проксимальні канальці і надалі в інтерстиціальний простір, або аномальним синтезом компонентів комплементу канальцевими або іншими резидентними і інфільтруючими клітинами, або зміненою експресією регуляторних білків комплементу в клітинах нирок, або відсутністю або втратою, або збільшенням функціональних мутацій у регуляторних компонентах комплементу (Маїнет О.В. еї аї., Сіп. У. Ат. ос. Мернгої. 10:Р1636-1650, 2015, Зпеегіп М.5. єї а!., ЕАБЕВ .. 22:1065-1072, 2008). Наприклад, у мишей дефіцит регуляторного білка/гена (Стгу), пов'язаного з регуляторним білком комплементу СК1!, приводить до активації комплементу по типу тубулоінтерстиціального (ТІ) ушкодження з наступним запаленням і фіброзом, характерним для ушкодження, спостережуваного при ТІ захворюваннях людини (МмаїкК А. еї аїЇ., Зетіп Мернпго!. 33:575-585, 2013, Вао І. єї аІ., У. Ат. бос. Мерпгої. 18:811-822, 2007). Вплив канальцевих епітеліальних клітин на анафілатоксин СЗа приводить до епітеліально-мезенхімного переходу (Твапа 7. єї аЇ.,, У. Ат. бос. МерпгоїЇ. 20:593-603, 2009). Нещодавно було показано, що блокування передачі сигналу СЗа тільки через СЗа-рецептор зменшує ТІ фіброз нирок у тварин із протеїнуричними і непротеїнуричними захворюваннями (Тзапо 2. еї аї!., У. Ат. 5ос. Мерпгої. 20:593-603, 2009, Вао І. єї аї., Кідпеу Іпі. 80:524-534, 2011).

Як розкрито в даному описі, автори винаходу визначили центральну роль лектинового шляху в ініціації і прогресуванні тубулярної патології нирок, що має на увазі ключову роль активації лектинового шляху в патофізіології широкого спектра захворювань нирок, включаючи

ІДА-нефропатію, СЗ-гломерулопатію і інші гломерулонефрити (Епао М. еї аї!., Мерпгої. Оіаїувів

Зо Тгаперіапі, 13:1984-1990, 1998; Нізапо 5. єї а!., Ат. У. Кідпеу Орів. 45:295-302, 2005; Вооз А. єї а!., У. Ат. бос. Мернгої!. 17:1724-1734, 2006; Пи І.І. єї аї., СіІїп. Ехр. Іттипої. 174:152-160, 2013;

Ї пона К. еї аї., Ткапзріапі Мернгої. Оівувів, 14:881-886, 1999; РісКетгіпод еї аї., Кідпеу Іпіегпайопаї, 84:1079-1089, 2013), діабетичну нефропатію (Номіпа Р. еї аї., Оіабеїе5, 54:1523-1527, 2005), ішемічне реперфузійне ураження (Азаагі Е. єї аі., ЕАБЕВ у. 28:3996-4003, 2014) і відторгнення трансплантата (Вегдег 5. Р. еї аї., Ат. 9. Тгапзріапі. 5:1361-1366, 2005).

Як додатково показано в даному описі, автори винаходу продемонстрували, що пригнічення

МАБР-2 зменшує запалення і фіброз у мишачих моделях тубулоінтерстиціального захворювання. Тому передбачається, що інгібуючі МА5Р-2 агенти будуть корисні при лікуванні фіброзу нирок, включаючи тубулоіїнтерстиціальне запалення і фіброз, протеїнурію, ІдА- нефропатію, СЗ-гломерулопатію і інші гломерулонефрити і ішемічні реперфузійні ураження нирок.

Ниркові захворювання і розлади

За даними Національного ниркового фонду 26 мільйонів дорослих американців страждають хронічним захворюванням нирок (ХЗН). Більшість пацієнтів мають прогресуюче захворювання, що приводить до ниркової недостатності, яка вимагає лікування препаратами, що стимулюють еритропоез, діалізу або трансплантації нирки для виживання. Існує декілька препаратів, які можуть лікувати основний симптом ХЗН, гіпертонію, але на даний час немає ліків, які усувають його першопричину.

Дослідження показали, що прогресуюче ушкодження нирок викликане капілярною гіпертензією в підструктурах нирки, відомих як нефрони (УМпімогій У.А., Аппаї5. Асай. ої Меа., мої. 34(1):2005). Оскільки нефрони (фільтруючі одиниці нирок) ушкоджуються або руйнуються в цьому процесі, виникає запалення і відбувається рубцювання тканини, що приводить до заміни нефронів нефункціональною рубцевою тканиною. У результаті здатність нирки фільтрувати кров знижується з перебігом часу. Це називається фіброзом нирок, який є загальним процесом прогресуючого захворювання нирок. Незалежно від характеру початкового ураження, фіброз нирок вважається загальним кінцевим процесом, по якому захворювання нирок прогресує до термінальної стадії ниркової недостатності. Ослаблення фіброзу нирок можна визначити за одним або більше з наступних параметрів: оцінка інтерстиціального об'єму, відкладення колагену ІМ і/або рівні мРНК, що містить гени, які контролюють ріст сполучної тканини. Сполуки і 60 способи, описані в даній заявці, корисні в лікуванні фіброзу нирок.

Фіброз і запалення нирок є характерними ознаками пізньої стадії захворювання нирок практично будь-якої етіології (див. Воог еї аї., Воог Р. еї аї., У. ої Ат. бос. Мерпгоіоду, 18:1508- 1515, 2007; і Снемаїег еї аї., Кідпеу Іпіегтаїйопаї!, 75:1145-1152, 2009). Ниркова недостатність може бути викликана гетерогенною групою розладів. Прогресивна дисфункція нирок приводить до протеїнурії і ниркової недостатності. Оскільки стан здоров'я пацієнта погіршується, може знадобитися діаліз просто для запобігання ушкодженню нирок і попередження багатосистемної недостатності. З часом ураження нирок і ниркова недостатність можуть прогресувати до термінальної стадії ниркової недостатності (ТОНН), яка є повною або майже повною, безповоротною втратою функції нирок. Залежно від форми захворювання нирок функція нирок може бути втрачена протягом декількох днів або тижнів або може повільно і поступово погіршуватися протягом десятиліть. Після того, як захворювання пацієнта прогресувало до

ТСНН, для запобігання смерті пацієнта потрібен діаліз (гемодіаліз або перитонеальний діаліз).

Пацієнтів необхідно підтримувати в деякій формі діалізного режиму або надати нирковий трансплантат.

Компоненти лектинового шляху були виявлені при фіброзних ураженнях при ниркових захворюваннях (Заїотига еї аї., Мерпгоп., 92(3):702-4 (2002), Заю еї а!., Гирив, 20(13):1378-86 (2011), Ци еї аї., Сіп. Ехр. Іттипої!., 174(1):152-60 (2013)). При ІдА-нефропатії у пацієнтів з гломерулярним відкладенням МВІі спостерігалася більш виражена протеїнурія, знижена функція нирок, більш низькі рівні сироваткового альбуміну, більш важка гістологія і підвищений артеріальний тиск у порівнянні з пацієнтами без відкладення МВІ (ім еї аї., Сіїп Ехр Іттипої. (1):1152-60). У пацієнтів з вовчаковим нефритом (За еї аїЇ., Гири5, 20(13):1378-86, 2011) і хронічною нирковою недостатністю (Зайотига еї аїЇ., Мерпгоп 92(3):702-4, 2002) також спостерігали підвищені рівні МВІ. і активність лектинового шляху.

Було також продемонстровано, що дефіцит С5 приводить до значного ослаблення основних компонентів фіброзу нирок у непротеїнуричній моделі первинного тубулоінтерстиціального ураження, а саме односторонньої обструкції сечоводу (ШООС) (Воог Р. еї аї., У. ої Ат. 5об. ої

Мерпгоїоду, 18:1508-1515, 2007). Також є повідомлення про збільшену експресію гена СЗ3 у мишей дикого типу після ШОО і значне зменшення відкладень колагену у С3-/- мишей після ШО у порівнянні з мишами дикого типу, що вказує на роль активації комплементу при фіброзі нирок (Геат еї аї., Мої. Іттипої. 48:1666-1733, 2011: Арзігас). Однак до описаного в даній заявці відкриття авторами даного винаходу, компоненти комплементу, що беруть участь у фіброзі нирок, не були чітко визначені. Як описано в прикладах 14-17 даної заявки, автори даного винаходу несподівано визначили, що дефіцит МАБР-2 або блокада інгібуючим МАБР-2 антитілом, яке вибірково блокує лектиновий шлях, не зачіпаючи класичний шлях, явно забезпечує захист мишей від фіброзу нирок на різних тваринних моделях захворювання нирок.

Відповідно, у деяких варіантах здійснення надається спосіб пригнічення фіброзу нирок у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом нирок, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як анти-

МА5БР-2 антитіло, суб'єкту, що потребує цього. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МАБР-2, ефективну для пригнічення фіброзу нирок у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом нирок, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом локального нанесення композиції під час операції або шляхом місцевої ін'єкції або безпосередньо в область фіброзу, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інгаляційно, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю над цим станом.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАЗР-2 агенти (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, що придатні для першопричинного захворювання або стану нирок. У деяких варіантах здійснення інгібуючі

МА5Р-2 агенти (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла) вводять у комбінації з режимом діалізу або плазмаферезу. У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАЗР-2 агенти (наприклад, анти-МА5Р- 2 антитіла) використовуються для зменшення частоти необхідного діалізу або плазмаферезу. У деяких інших варіантах здійснення інгібуючі МАЗР-2 агенти (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла) використовуються в комбінації з трансплантацією нирки. У деяких інших варіантах здійснення інгібуючі МАЗР-2 агенти (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла) використовуються для здійснення бо контролю над нирковою недостатністю і запобігання подальшому погіршенню функції нирок у пацієнтів, що очікують трансплантації нирок.

Як приклад, у деяких варіантах здійснення анти-МА5бР-2 антитіла використовуються для пригнічення фіброзу нирок і, таким чином, лікування або полегшення (включаючи лікування або полегшення симптомів захворювання) гломерулярних захворювань, таких як фокальний сегментарний гломерулосклероз і нефротичний синдром. Прикладами симптомів, які можна лікувати, є, крім іншого, гіпертензія, протеїнурія, гіперліпідемія, гематурія і гіперхолестеринемія.

У деяких варіантах здійснення інгібуючий МАБР-2 агент пригнічує тубулоінтерстиціальний фіброз. У деяких варіантах здійснення лікування включає поліпшення функції нирок, зменшення протеїнурії, поліпшення стану при гіпертонії і/або зменшення фіброзу нирок. У деяких варіантах здійснення лікування включає (і) затримання або профілактику прогресування ниркової недостатності, згасання функції нирок або розвитку ТОНН; (ії) затримання, зменшення частоти або усунення необхідності в діалізі; або (ії) затримання або усунення необхідності в трансплантації нирок.

Нижче описані деякі специфічні захворювання і розлади нирок, викликані або ускладнені фіброзом і/або запаленням.

У деяких варіантах здійснення захворювання нирок, викликане або ускладнене фіброзом і/або запаленням, являє собою гломерулярне захворювання, таке як фокальний сегментарний гломерулосклероз (Е5055). Гломерулярні захворювання уражують клубочки, дозволяючи білкам, а іноді і червоним кров'яним клітинам, проникати в сечу. Іноді гломерулярне захворювання також перешкоджає ниркам здійснювати очищення від продуктів життєдіяльності, тому вони починають накопичуватися в крові. Симптоми гломерулярного захворювання включають протеїнурію, гематурію, зниження швидкості клубочкової фільтрації, гіпопротеїнемію і набряки. Декілька різних захворювань можуть привести до розвитку гломерулярного захворювання. Це може бути прямим результатом інфекції або приймання ліків, токсичних для нирок, або результатом захворювання, яке уражує весь організм, такого як гіпертонія, діабет або вовчак. ТОНН є одним із гломерулярних захворювань, але навіть цей особливий стан, що характеризується рубцюванням у нирках, може мати множину причин. У пацієнтів з ТОНН, як правило, термінальна стадія ниркової недостатності досягається протягом 5-20 років, хоча пацієнти з агресивними формами захворювання досягають ТОНН через 2-3 роки.

Зо У деяких варіантах здійснення захворювання нирок, викликане або ускладнене фіброзом і/або запаленням, являє собою діабетичну нефропатію (ДН), яка належить до сфери медицини, що вимагає негайних рішень. Діабетична нефропатія - це захворювання нирок або порушення функції нирок, яке ускладнене діабетом. Стан погіршується високим кров'яним тиском, високим рівнем цукру в крові і високим рівнем холестерину і ліпідів. Точна причина діабетичної нефропатії невідома. Однак, не обмежуючись конкретною теорією, передбачається, що неконтрольований високий рівень цукру в крові призводить до ураження нирок, такого як фіброз і рубцювання тканини. У людей ДН проявляється у вигляді клінічного синдрому, який складається з альбумінурії, поступово знижуваної швидкості клубочкової фільтрації (ШКФ) і підвищеного ризику серцево-судинних захворювань. Діабетична альбумінурія пов'язана з розвитком характерних гістопатологічних ознак, включаючи стовщення клубочкової базальної мембрани (КБМ) і експансію мезангіального матриксу. У міру розвитку альбумінурії і ниркової недостатності розвиваються гломерулосклероз, артеріоральний гіаліноз і тубулоінтерстиціальний фіброз.

Відповідно, в одному з варіантів здійснення в даному розкритті надаються способи лікування діабетичної нефропатії, які включають введення ефективної кількості інгібуючого

МА5Р-2 агента (наприклад, інгібуючого МАЗР-2 антитіла) суб'єкту, що потребує цього. У деяких варіантах здійснення лікування включає зменшення одного або більше симптомів діабетичної нефропатії. У деяких варіантах здійснення лікування включає зменшення, уповільнення або усунення необхідності в діалізі. У деяких варіантах здійснення лікування включає зменшення, уповільнення або усунення необхідності в трансплантації нирок. У деяких варіантах здійснення лікування включає затримання, профілактику або купірування прогресування діабетичної нефропатії до згасання функції нирок або термінальної стадії ниркової недостатності.

У деяких варіантах здійснення захворювання нирок, викликане або ускладнене фіброзом або запаленням, являє собою вовчаковий нефрит. Згідно з докладним описом, наведеним нижче, вовчаковий нефрит, який є серйозним ускладненням системного червоного вовчака (СЧВ), є ще одним прикладом фіброзу нирок, який можна лікувати інгібуючими МА5БР-2 агентами (наприклад, анти-МА5Р-2 антитілами).

Відповідно, в одному з варіантів здійснення дане розкриття включає способи пригнічення фіброзу нирок у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом нирок, викликаним або бо ускладненим фіброзом і/або запаленням, які включають введення ефективної кількості інгібуючого МАБР-2 агента (наприклад, інгібуючого МАБР-2 антитіла). У деяких варіантах здійснення захворювання або розлад нирок, ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з хронічного захворювання нирок, хронічної ниркової недостатності, гломерулярного захворювання (наприклад, фокального сегментарного гломерулосклерозу), імунного комплексного розладу (наприклад, ІдА-нефропатії, мембранозної нефропатії), вовчакового нефриту, нефротичного синдрому, діабетичної нефропатії, тубулоінтерстиціального ураження і СЗ-гломерулопатії або інших типів гломерулонефриту.

Способи профілактики або лікування ушкодження нирок, викликаного індукованою ліками токсичністю

Інша причина ушкодження нирок включає індуковану ліками токсичність. Наприклад, нефротоксини можуть виявляти безпосередню токсичну дію на канальцеві епітеліальні клітини.

Як розкрито в даному описі, автори винаходу продемонстрували, що миші з дефіцитом МА5Р-2 захищені від індукованої адріаміцином нефропатії.

Нефротоксини включають, без обмеження, терапевтичні лікарські речовини (наприклад, цисплатин, гентаміцин, цефалоридин, циклоспорин, амфотерицин, адріаміцин), радіоконтрастний барвник, пестициди (наприклад, паракват) і речовини, що забруднюють навколишнє середовище (наприклад, трихлоретилен і дихлорацетилен). Інші приклади включають пуроміцин-амінонуклеозид (РАМ); аміноглікозиди, такі як гентаміцин; цефалоспорини, такі як цефалоридин; інгібітори кальциневрину, такі як такролімус або сиролімус. Індукована ліками нефротоксичність також може бути викликана нестероїдними протизапальними засобами, антиретровірусними препаратами, антицитокінами, імунодепресантами, онкологічними препаратами або інгібіторами АПФ. Крім того, індукована ліками нефротоксичність може бути викликана зловживанням нальгезином, ципрофлоксацином, клопідогрелем, кокаїном, інгібіторами сох-2, діуретиками, фоскаметом, золотом, іфосфамідом, імуноглобіном, китайськими травами, інтерфероном, літієм, манітолом, мезаламіном, мітоміцином, нітрозосечовиною, пеніциламіном, пеніциліном, пентамідином, хініном, рифампіном, стрептозоцином, сульфонамідами, тиклопідином, триамтереном, вальпроєвою кислотою, доксорубіцином, гліцерином, цидофовіром, тобраміцином, неоміцинсульфатом, колістиметатом, ванкоміцином, амікацином, цефотаксимом, цисплатином, ацикловіром, літієм,

Зо інтерлейкіном-2, циклоспорином або індинавіром.

Відповідно, в одному з варіантів здійснення суб'єкт, що має ризику розвитку або страждає ушкодженням нирок, може одержувати один або більше терапевтичних препаратів, які виявляють нефротоксичну дію. Цим суб'єктам можна вводити інгібітори МА5Р-2 за винаходом до або одночасно з такими терапевтичними агентами. Аналогічно, інгібітори МА5БР-2 можна вводити після введення терапевтичного агента для лікування або зниження ймовірності розвитку нефротоксичності.

Захворювання і стани, асоційовані з протеїнурією

Установлено, що порушення клубочкової фільтрації білка приводить до протеїнурії і прискорює прогресуючу втрату нефронів, яка відбувається при всіх хронічних ниркових захворюваннях (Кетил7лі апа Вегпапі, Мем/ Епод. У. Мей., моІ. 339(20):1448-1456, 1998).

Наприклад, у дослідженні, описаному Еаду еї аї., Ат. У). Раїйпої. 135:719-33, 1989, гломерулярна фільтрація альбуміну незмінно супроводжувалася розвитком інтерстиціальних уражень і рубцюванням. Едау еї аїЇ., 1989, також відзначили, що відкладення комплементу С3 на люмінальній поверхні проксимальних канальців спостерігалося у щурів з нефропатією, викликаною передозуванням білка, що вказує на те, що компоненти системи комплементу, фільтровані в гломерулах, можуть викликати інтерстиціальні ушкодження. Було продемонстровано, що виснаження комплементу або відсутність Сб полегшувало тубулоінтерстиціальне ушкодження в протеїнуричних моделях тварин, таких як мезангіопроліферативний гломерулонефрит, адріаміцинова нефропатія, 5/6 нефректомія і пуроміцин-амінонуклеозидний нефроз (Воог еї аї., Е« аї., У. ої Ат. Зос. ої Мерпгоіоаду: УАБМ, 18:11508-1515, 2007). Дослідження на людях показали, що протеїнурія є незалежним прогностичним фактором прогресування хронічного захворювання нирок, і що зниження протеїнурії є нирково-захисним (Киддепепії Р. єї а!., У. Ат. ос. Мернгої. 23:1917-1928, 2012).

Відповідно, в одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способів профілактики або зменшення протеїнурії і/або профілактики або зменшення ураження нирок у суб'єкта, що страждає захворюванням або станом, асоційованим із протеїнурією, які включають введення кількості інгібуючого МА5Р-2 агента (наприклад, інгібуючого МА5Р-2 антитіла), ефективної для зменшення або профілактики протеїнурії у суб'єкта. В одному з варіантів здійснення захворювання або стан, асоційований з протеїнурією, вибирають із групи, що складається з бо нефротичного синдрому, прееклампсії, еклампсії, токсичного ураження нирок, амілоїдозу,

судинно-колагенозних захворювань (наприклад, системного червоного вовчака), зневоднювання, гломерулярних захворювань (наприклад, мембранозного гломерулонефриту, фокального сегментарного гломерулонефриту, СЗ3-гломерулопатії, хвороби мінімальних змін, ліпоїдного нефрозу), інтенсивного фізичного навантаження, стресу, доброякісної ортостатичної (постуральної) протеїнурії, фокального сегментарного гломерулосклерозу, ІдА-нефропатії (наприклад, хвороби Бергера), ІчМ-нефропатії, мембранопроліферативного гломерулонефриту, мембранозної нефропатії, хвороби мінімальних змін, саркоїдозу, синдрому Альпорта, цукрового діабету (діабетичної нефропатії), індукованої ліками токсичності (наприклад, індукованої НПЗП, нікотином, пеніциламіном, карбонатом літію, золотом і іншими важкими металами, інгібіторами

АПФ, антибіотиками (наприклад, адріаміцином) або опіатами (наприклад, героїном)); хвороби

Фабрі, інфекції (наприклад, ВІЛ, сифілісу, гепатиту А, В або С, постстрептококової інфекції, сечового шистосомозу); аміноацидурії, синдрому Фанконі, гіпертонічного нефросклерозу, інтерстиціального нефриту, серпоподібноклітинної хвороби, гемоглобінурії, множинної мієломи, міоглобінурії, відторгнення органів (наприклад, відторгнення трансплантата нирки), геморагічної пропасниці Ебола, синдрому нігтьової патели, сімейної пропасниці, синдрому НЕГІР, системного червоного вовчака, гранулематозу Вегенера, ревматоїдного артриту, хвороби накопичення глікогену типу 1, синдрому Гудпасчера, пурпури Шенлейна-Геноха, інфекції сечових шляхів, що поширилася на нирки, синдрому Шегрена і постінфекційного гломерулонефриту.

Захворювання печінки

Фіброз печінки, також називаний печінковим фіброзом, обумовлений накопиченням рубцевої тканини в печінці і є характерним для більшості видів захворювань печінки. Заміна здорової тканини печінки рубцевою тканиною знижує здатність печінки функціонувати належним чином.

Якщо стан, що викликає рубцювання, не лікується, фіброз печінки може прогресувати до цирозу печінки і повної печінкової недостатності, небезпечного для життя стану. Основними причинами фіброзу печінки є зловживання алкоголем, хронічна інфекція вірусу гепатиту С, неалкогольний стеатогепатит і гепатотоксичність (наприклад, індуковане ліками ушкодження печінки, викликане ацетамінофеном або іншим лікарським засобом).

Компоненти лектинового шляху були виявлені при фіброзних ураженнях печінки (Кепзеп еї

Зо аї., Нераїйюіоду, 50(6):1809-17 (2009)). Наприклад, при неалкогольному стеатогепатиті (також відомому як жирове захворювання печінки) широко розповсюджена активація білків системи комплементу, і їх експресія пов'язана з тяжкістю захворювання (Кепзеп еї аї., Нерайо!оду, 50(6):1809-17 (2009), причому, крім відкладень СЗ і СОУ, було виявлене накопичення МВІ., що підтверджує активацію лектинового шляху.

Відповідно, у деяких варіантах здійснення надається спосіб пригнічення печінкового фіброзу у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом печінки, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого

МА5БР-2 агента, такого як інгібуюче МА5БР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МАБР-2, ефективну для пригнічення печінкового фіброзу у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом печінки, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом місцевої ін'єкції або безпосередньо в область фіброзу, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного захворювання або стану печінки.

У деяких варіантах здійснення захворювання або розлад печінки, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з: цирозу, неалкогольної жирової хвороби печінки (стеатогепатиту), фіброзу печінки, вторинного відносно зловживання алкоголем, фіброзу печінки, вторинного відносно гострого або хронічного гепатиту, біліарного захворювання і токсичного ураження печінки (наприклад, гепатотоксичності в результаті індукованого ліками ушкодження печінки, викликаного ацетамінофеном або іншим лікарським засобом). бо Захворювання легенів

Легеневий фіброз - це утворення або розвиток надлишкової волокнистої сполучної тканини в легенях, при цьому нормальна легенева тканина замінюється фіброзною тканиною. Це рубцювання приводить до ригідності легенів і порушення структури і функції легенів.

Вважається, що у людей фіброз легенів є результатом багаторазового ушкодження тканини усередині крихітних повітряних мішечків (альвеол) у легенях і між ними. В експериментальних дослідженнях аспекти захворювання людини були відтворені на різних моделях тварин.

Наприклад, чужорідний агент, такий як блеоміцин, ізотіоціанат флуоресцеїну, оксид кремнію або азбест, може бути введений у трахею тварини (СПагаєе-Кептапі єї аЇ., Апіта! Моадеї5 ої

Риїтопагу Рібговзі5. Мештод5 Мої. Меа., 2005, 117:251-259).

Відповідно, у деяких варіантах здійснення надається спосіб пригнічення легеневого фіброзу у суб'єкта, що страждає легеневим захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого

МА5БР-2 агента, такого як інгібуюче МА5БР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МАБР-2, ефективну для пригнічення легеневого фіброзу, зменшення фіброзу в легенях і/або поліпшення функції легенів. Поліпшення симптомів функції легенів включає поліпшення функції і/або ємності легенів, зниження утоми і поліпшення насичення киснем.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується способу лікування, пригнічення, профілактики або полегшення легеневого фіброзу у суб'єкта, що страждає кістозним фіброзом, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МАЗР-2 агента, такого як інгібуюче МАБ5БР-2 антитіло.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом місцевої ін'єкції або безпосередньо в область фіброзу, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

Зо У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного захворювання або стану легенів.

Нижче описані деякі специфічні легеневі захворювання і розлади, викликані або ускладнені фіброзом і/або запаленням.

У деяких варіантах здійснення захворювання легенів, викликане або ускладнене фіброзом або запаленням, являє собою хронічну обструктивну хворобу легенів (ХОХЛ). ХОХЛ - це захворювання, при якому стінки дихальних шляхів є фіброзними 3 накопиченням міофібробластів і колагену, і воно є основною причиною інвалідності і четвертою основною причиною смертності в Сполучених Штатах. При ХОХЛ блокується повітряний потік і ускладнюється дихання хворого. ХОХЛ викликається ушкодженням дихальних шляхів, яке в остаточному підсумку перешкоджає обміну кисню і вуглекислого газу в легенях. ХОХЛ включає хронічний обструктивний бронхіт і емфізему і часто і те, і інше. Пацієнти з ХОХЛ, легені яких вже ушкоджені, і функція легенів уже порушена, мають підвищений ризик ускладнень, пов'язаних з бактеріальними і вірусними інфекціями.

Відповідно, в одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способів лікування хронічної обструктивної хвороби легенів (ХОХЛ), які включають введення суб'єкту, що цього потребує, кількості інгібуючого МАЗР-2 агента (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла), ефективної для пригнічення і/або зменшення фіброзу легені. У деяких варіантах здійснення лікування включає зменшення одного або декількох симптомів ХОХЛ. Симптоми ХОХЛ і/або фіброзу легенів включають, без обмеження, кашель зі слизом, задишку (диспноє), яка може погіршуватися при помірній активності, утому, часті респіраторні інфекції, хрип, здавленість у грудях, нерегулярні серцеві скорочення (аритмію), потребу в дихальному апараті і кисневій терапії правосторонню серцеву недостатність або пульмонію (набряк серця і серцеву недостатність через хронічне захворювання легенів), пневмонію, пневмоторакс, серйозну втрату у вазі і неналежне харчування. Симптоми також включають зниження функції легенів, згідно з оцінками, одержаними в результаті тестування з використанням одного або більше стандартних тестів функції легенів.

У деяких варіантах здійснення хвороба легенів, викликана або ускладнена фіброзом і/або запаленням, являє собою фіброз легенів, асоційований зі склеродермією. Як більш докладно бо описано нижче, легеневий фіброз, асоційований зі склеродермією, є ще одним прикладом фіброзу легенів, який можна лікувати інгібіторами МА5БР-2 (наприклад, інгібуючими МАБР-2 антитілами).

У деяких варіантах здійснення захворювання легенів або порушення функції легенів, викликане або ускладнене фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з хронічної обструктивної хвороби легенів, кістозного фіброзу, фіброзу легенів, асоційованого зі склеродермією, бронхоектазу і легеневої гіпертензії.

Серцево-судинні захворювання

Причиною ряду різних серцево-судинних патологій є загальний фіброзний процес. Надмірне відкладення фіброзної тканини в серці приводить до серцевої патології, при якій продукування білків позаклітинного матриксу змінює структуру, архітектуру, форму серця і впливає на його скорочувальну функцію (Кпап апа Зперрага, Іттипоїіоду, 118:10-24, 2006).

Дослідження показують, що фіброз може значною мірою сприяти серцевій дисфункції при ішемічній, дилатаційній і гіпертрофічній кардіоміопатії. Наприклад, було показано, що у пацієнтів з хронічною фібриляцією передсердь були виявлені більш високі рівні інтерстиціального фіброзу міокарда в порівнянні з контролем (Кпап апа Зперрага, Іттипоїіоду, 118:10-24, 2006).

Як інший приклад було встановлено, що в більшості випадків аритмогенної кардіоміопатії правого шлуночка (АКПШ) у США спостерігається інфільтрація жиру і рубцювання (фіброжирова

АКПШ) (ВигКе еї аї., Сігсшіацоп, 97:1571-1580, 1998). У дослідженні, у якому вивчали гістопатологічні характеристики міокарда шлуночків у людей з АКПШ, було встановлено, що великий фіброз був присутній у зразках біопсії у пацієнтів дитячого віку з АКПШ (Міхпікама Т. еї а!І., Сагдіомазсшаг Раїпоіоду, мої. 8(4):185-189, 1999).

Відповідно, у деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає серцевим або судинним захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5БР-2 агента, такого як інгібуюче МА5БР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МАБР-2, ефективну для пригнічення серцевого і/або судинного фіброзу і/або поліпшення серцевої і/або судинної функції.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується способу лікування, пригнічення,

Зо профілактики або ослаблення фіброзу у суб'єкта, що страждає фіброзом клапана, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче МАБР-2 антитіло.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом місцевої ін'єкції або безпосередньо в область фіброзу, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного серцевого або судинного захворювання або стану.

У деяких варіантах здійснення серцеве або судинне захворювання або розлад, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з: серцевого фіброзу, інфаркту міокарда, фіброзу передсердь, фіброзу ендоміокарда, аритмогенної кардіоміопатії правого шлуночка (АКПШ), судинного захворювання, атеросклеротичного судинного захворювання, судинного стенозу, рестенозу, васкуліту, флебіту, тромбозу глибоких вен і аневризми черевної аорти.

Хронічні інфекційні захворювання

Хронічні інфекційні захворювання, такі як гепатит С і гепатит В, викликають запалення тканин і фіброз, а висока активність лектинового шляху може бути шкідливою. При таких захворюваннях інгібітори МА5БР-2 можуть бути корисними. Наприклад, було виявлено, що рівні

МВІ. ї МА5Р-1 є важливими прогностичними параметрами тяжкості фіброзу печінки при інфекції вірусу гепатиту С (Вгом/п еї аї., Сііп. Ехр. Іттипої., 147(1):90-8, 2007, Заадапау еї аї., Агар. 3.

Савзігоепієгої. 12(2):68-73, 2011; Заеєай еї аї., Сіп. Ехр. Іттипої. 174(2):265-73, 2013). Раніше було показано, що МАБР-1 є потужним активатором МА5Р-2 і лектинового шляху (Медуєгі еї аї.,

У. Віої. Спет., 29:288(13):8922-34, 2013). Альфавіруси, такі як вірус чикунгунья і вірус Росс-

Рівер, викликають сильну запальну відповідь у хазяїна, що приводить до артриту і міозиту, і ця бо патологія опосередковується МВІ. і активацією лектинового шляху (Сипп еї аї., Ріо5. Раїпод.

8(3):е1002586, 2012).

Відповідно, у деяких варіант здійснення розкриття надає спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає або раніше переніс хронічне інфекційне захворювання, яке викликає запалення і/або фіброз, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче

МА5Р-2 антитіло.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом місцевої ін'єкції або безпосередньо в область фіброзу, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного хронічного інфекційного захворювання.

У деяких варіантах здійснення хронічне інфекційне захворювання, яке викликає запалення мМабо фіброз, вибирають з групи, що складається з: альфа-вірусу, гепатиту А, гепатиту В, гепатиту С, туберкульозу, ВІЛ і грипу.

Аутоїмунні захворювання

Склеродермія - хронічне аутоїмунне захворювання, що характеризується фіброзом, судинними змінами і аутоантитілами. Існують дві основні форми: обмежена системна склеродермія і дифузійна системна склеродермія. Шкірні симптоми обмеженої системної склеродермії уражують руки, плечі і обличчя. Пацієнти з цією формою склеродермії часто мають одне або декілька з наступних ускладнень: кальциноз, феномен Рейно, дисфункцію стравоходу, склеродактилія і телеангіектазії. Дифузійна системна склеродермія швидко прогресує і зачіпає велику область шкіри і один або більше внутрішніх органів, часто нирки, стравохід, серце і/або легені.

Зо Склеродермія уражує невеликі кровоносні судини, відомі як артеріоли, у всіх органах.

Спочатку, ендотеліальні клітини артеріол гинуть у результаті апоптозу разом із гладком'язовими клітинами. Ці клітини заміняються колагеном і іншим волокнистим матеріалом. Запальні клітини, зокрема СО4-- хелперні Т-клітини, проникають в артеріолу і викликають подальше ушкодження.

Шкірні прояви склеродермії можуть бути болісними, приводити до уникнення використання ураженої ділянки (наприклад, рук, пальців рук, пальців ніг, ніг і т. д.) ї можуть приводити до спотворювання таких ділянок. На шкірі можуть з'явитися виразки, і такі виразки можуть бути схильні до інфікування або навіть гангрени. Укрита виразками шкіра може бути важковиліковною або повільно піддаватися лікуванню. Тяжкість при загоєнні виразок шкіри може бути особливо ускладнена у пацієнтів з порушенням кровообігу, наприклад з феноменом

Рейно. У деяких варіантах здійснення способи за даним винаходом використовуються для лікування склеродермії, наприклад шкірних симптомів склеродермії. У деяких варіантах здійснення лікування склеродермії включає лікування шкірних виразок, таких як дигітальні виразки. Введення інгібуючого МАБР-2 агента, такого як анти-МА5БР-2 антитіло, можна використовувати для зменшення фіброзних і/або запальних симптомів склеродермії в уражених тканинах і/або органах.

Крім шкірних симптомів/проявів, склеродермія може також впливати на серце, нирки, легені, суглоби і травний тракт. У деяких варіантах здійснення лікування склеродермії включає лікування симптомів захворювання в будь-якій одній або більше з цих тканин, наприклад шляхом зменшення фіброзних і/або запальних симптомів. Проблеми, пов'язані з легенями, є одними з найбільш серйозних ускладнень склеродермії і відповідальні за більшу частину смертельних кінців, пов'язаних із цим захворюванням. Двома переважними станами легенів, пов'язаними зі склеродермією, є фіброз легенів і легенева гіпертензія. Пацієнт з ураженими легенями може мати або один, або обидва ці стани. Фіброз легенів, асоційований зі склеродермією, є одним з прикладів легеневого фіброзу, який можна лікувати інгібіторами

МА5БР-2. Склеродермія, що зачепила легеню, викликає рубцювання (фіброз легенів). Такий легеневий фіброз зустрічається в приблизно 70 90 пацієнтів зі склеродермією, хоча його прогресування, як правило, є повільним, і симптоми сильно відрізняються у пацієнтів по ступеню тяжкості. У пацієнтів, які мають симптоми, асоційовані з легеневим фіброзом, такі симптоми включають сухий кашель, задишку і зниження здатності до фізичного навантаження. 60 У приблизно 16 95 пацієнтів з деяким рівнем фіброзу легенів розвивається важкий фіброз легенів. У пацієнтів з важким легеневим фіброзом спостерігається значне зниження функції легенів і альвеоліт.

У деяких варіантах здійснення способи за даним винаходом використовуються для лікування склеродермії, наприклад фіброзу легенів, асоційованого зі склеродермією. Введення інгібуючих МА5Р-2 агентів, таких як інгібуючі МА5БР-2 антитіла, можна використовувати для зменшення фіброзних симптомів склеродермії в легенях. Наприклад, ці способи можна використовувати для поліпшення функції легенів і/або зниження ризику смерті через склеродермію.

У пацієнтів зі склеродермією також часто можуть бути уражені нирки. Фіброз нирок, асоційований зі склеродермією, є прикладом фіброзу нирок, який можна лікувати шляхом введення інгібуючих МАБР-2 агентів, таких як анти-МА5БР-2 антитіла. У деяких варіантах здійснення способи за даним винаходом використовуються для лікування склеродермії, наприклад фіброзу нирок, асоційованого зі склеродермією. В одному з варіантів здійснення введення інгібуючих МАБР-2 антитіл можна використовувати для зменшення фіброзних симптомів склеродермії в нирках. Наприклад, ці способи можна використовувати для поліпшення функції нирок, зменшення білка в сечі, зменшення тяжкості артеріальної гіпертонії або зниження ризику розвитку ниркового кризу, який може привести до фатальної ниркової недостатності.

Системний червона вовчак (СЧВ) є хронічним запальним аутоїмунним розладом, що характеризуються спонтанною аутореактивністю В- і Т-клітин і мультиорганним імунним ушкодженням і може впливати на шкіру, суглоби, нирки і інші органи. Майже у всіх людей з СЧВ є біль у суглобах і у більшості розвивається артрит. Часто ураженими суглобами є суглоби пальців, рук, зап'ястя і колін. Загальні симптоми СЧВ включають: артрит; утому; загальний дискомфорт, занепокоєння або погане почуття (нездужання); біль у суглобах і припухлість; біль у м'язах; нудоту і блювання; і шкірний висип. Крім того, симптоми також можуть включати: біль у животі; кров у сечі; зміну кольору пальців при здавлюванні або на холоді; оніміння і поколювання; і червоні плями на шкірі. У деяких пацієнтів з СЧВ є ураження легенів або нирок.

Не обмежуючись теорією, запалення і/або фіброз у легенях і нирках призводить до ураження цих органів і розвитку симптомів, асоційованих з ушкодженням легенів і/(або нирок. У деяких

Зо випадках у пацієнтів з СЧВ розвивається певний стан нирок, називаний вовчаковим нефритом.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується способів лікування СЧВ, які включають введення ефективної кількості інгібуючого МАБЗР-2 агента, такого як анти-МА5Р-2 антитіло.

Введення інгібуючих МА5Р-2 антитіл можна використовувати для зменшення одного або більше симптомів СЧВ. У деяких варіантах здійснення введення анти-МА5бР-2 антитіл використовується для лікування СЧВ у пацієнта з вовчаковим нефритом. У таких випадках лікування СЧВ включає лікування вовчакового нефриту, наприклад шляхом зменшення симптомів вовчакового нефриту. У деяких варіантах здійснення лікування включає лікування шкірних симптомів СЧВ. У деяких варіантах здійснення лікування включає зменшення одного або більше симптомів вовчакового нефриту. У деяких варіантах здійснення лікування включає зменшення, уповільнення або усунення необхідності в діалізі. У деяких варіантах здійснення лікування включає зменшення, уповільнення або усунення необхідності в трансплантації нирок. У деяких варіантах здійснення лікування включає затримання або запобігання прогресуванню вовчакового нефриту до ниркової недостатності або термінальної стадії ниркової недостатності.

Вовчаковий нефрит є запаленням нирок і серйозним ускладненням системного червоного вовчака (СЧВ). Що стосується нирок, вовчаковий нефрит може привести до інвалідизуючої втрати їх функції. У пацієнтів з вовчаковим нефритом в остаточному підсумку може розвитися ниркова недостатність, і їм може знадобитися діаліз або трансплантація нирок. Пов'язані із цим ускладнення, які також можна лікувати способами за винаходом, включають інтерстиціальний нефрит і нефротичний синдром. Симптоми вовчакового нефриту включають: кров у сечі, пінистий вигляд сечі, високий кров'яний тиск, білок у сечі, затримання рідини і набряки. Інші симптоми включають ознаки і симптоми фіброзу нирок і/або ниркової недостатності. Якщо хворобу не лікувати, вовчаковий нефрит може привести до ниркової недостатності і навіть термінальної стадії ниркової недостатності.

Відповідно, у деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає аутоїмунним захворюванням, яке викликане або ускладнюється фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5БР-2 агента, такого як інгіібуюче МАБР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МАБР-2, ефективну для пригнічення фіброзу. 60 Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом місцевої ін'єкції або безпосередньо в область фіброзу, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного аутоїмунного захворювання.

У деяких варіантах здійснення аутоїмунне захворювання, яке викликане або ускладнюється фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається зі склеродермії і системного червоного вовчака (СЧВ).

Захворювання і стани центральної нервової системи

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом центральної нервової системи, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як анти-МА5Р-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МА5Р-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом місцевої ін'єкції або безпосередньо в область фіброзу, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАЗР-2 агенти (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла)

Зо вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного захворювання або розладу центральної нервової системи.

У деяких варіантах здійснення захворювання або розлад центральної нервової системи, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з: інсульту, травматичного ушкодження головного мозку і ушкодження спинного мозку.

Шкірні захворювання або стани

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає хворобою або розладом шкіри, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче МАБР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МА5Р-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу композицію МАБР-2 можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції на шкіру або місцевого застосування під час операції або локальної ін'єкції або напряму, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим парентеральним способом введення, шляхом топічного нанесення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного шкірного захворювання або розладу.

У деяких варіантах здійснення шкірне захворювання або розлад, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з фіброзу шкіри, загоєння ран, склеродермії, системного склерозу, келоїдів, захворювань сполучної тканини, рубцювання і гіпертрофічних рубців.

Захворювання і стани кісток і м'яких тканин скелетно-м'язової системи

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає захворюванням 60 або розладом кісток або м'яких тканин, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче МА5БР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МА5Р-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції на структуру кістки або м'якої тканини або місцевого нанесення під час операції або локальної ін'єкції або напряму, або віддалено, наприклад за допомогою катетера. Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим парентеральним способом введення, шляхом топічного нанесення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного захворювання або розладу кісток або м'яких тканин.

У деяких варіантах здійснення захворювання або розлад кісток або м'яких тканин, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з остеопорозу і/або остеопенії, пов'язаної, наприклад, З кістозним фіброзом, мієлодиспластичними станами зі збільшенням кісткового фіброзу, адгезивного капсуліту, контрактури Дюпюїтрена і мієлофіброзу.

Суглобові захворювання або стани

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає суглобовим захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче

МАБР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору

МА5Р-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції на суглоб, або місцевого нанесення під час операції або локальної ін'єкції або напряму, або віддалено, наприклад за допомогою катетера.

Зо Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим парентеральним способом введення, шляхом топічного нанесення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАЗР-2 агенти (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного суглобового захворювання або розладу.

У деяких варіантах здійснення суглобове захворювання або розлад, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, являє собою артрофіброз.

Захворювання або стани травної системи

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом травної системи, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче

МАБР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору

МА5Р-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом локальної ін'єкції або напряму, або віддалено, наприклад за допомогою катетера. Альтернативно, інгібуючий МА5Р-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим парентеральним способом введення, шляхом топічного нанесення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАЗР-2 агенти (наприклад, анти-МА5Р-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного захворювання або розладу травної системи.

У деяких варіантах здійснення захворювання або розлад травної системи, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з хвороби Крона, бо виразкового коліту і фіброзу підшлункової залози.

Очні захворювання або стани

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає очним захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче

МАБР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору

МА5Р-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом локальної ін'єкції або напряму, або віддалено, наприклад за допомогою катетера. Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим парентеральним способом введення, шляхом топічного нанесення в око (наприклад, очні краплі), або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного очного захворювання або розладу.

У деяких варіантах здійснення очне захворювання або розлад, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з передньої субкапсулярної катаракти, помутніння задньої капсули, дегенерації жовтої плями і ретинальної і вітреальної ретинопатії.

Захворювання або стани репродуктивних органів

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом репродуктивних органів, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче МАБР-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МА5Р-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Зо Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом локальної ін'єкції або напряму, або віддалено, наприклад за допомогою катетера. Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим парентеральним способом 35 введення, шляхом топічного нанесення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МА5БР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які 40 придатні для першопричинного захворювання або розладу репродуктивних органів.

У деяких варіантах здійснення захворювання або розлад репродуктивних органів, викликаний або ускладнений фіброзом і/або запаленням, вибирають із групи, що складається з: ендометріозу і хвороби Пейроні.

Рубцювання, пов'язане з травмою 45 У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає захворюванням або станом, що є результатом рубцювання, пов'язаного з травмою, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче МА5Р-2 антитіло.

Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МАБР-2, ефективну для 50 пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом локальної ін'єкції або напряму, або віддалено, наприклад за допомогою катетера. Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, 55 внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим парентеральним способом введення, шляхом топічного нанесення, або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 60 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного захворювання або розладу.

У деяких варіантах здійснення рубцювання, пов'язане з травмою, вибирають із групи, що складається з: хірургічних ускладнень (наприклад, хірургічних спайок, у яких рубцева тканина може утворюватися між внутрішніми органами, викликаючи контрактуру, біль, і може приводити до безплідності), хіміотерапевтичного індукованого ліками фіброзу, індукованого радіацією фіброзу і рубцювання, пов'язаного з опіками.

Додаткові захворювання і розлади, викликані або ускладнені фіброзом і/або запаленням

У деяких варіантах здійснення надається спосіб профілактики, лікування, купірування, пригнічення і/або зменшення фіброзу і/або запалення у суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом, викликаним і/або ускладненим фіброзом і/або запаленням, вибраним із групи, що складається з трансплантації органів, фіброзу молочної залози, м'язового фіброзу, ретроперитонеального фіброзу, фіброзу щитовидної залози, фіброзу лімфатичних вузлів, фіброзу сечового міхура і плеврального фіброзу, який включає введення суб'єкту, що цього потребує, інгібуючого МА5Р-2 агента, такого як інгібуюче МА5Р-2 антитіло. Цей спосіб включає введення композиції, яка містить кількість інгібітору МАБР-2, ефективну для пригнічення фіброзу і/або запалення.

Інгібуючу МАБР-2 композицію можна вводити локально в область фіброзу, наприклад шляхом місцевого нанесення композиції під час операції або шляхом локальної ін'єкції або напряму, або віддалено, наприклад за допомогою катетера. Альтернативно, інгібуючий МАБР-2 агент можна вводити суб'єкту системно, наприклад внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, шляхом інгаляції, назально, підшкірно або іншим парентеральним способом введення, шляхом топічного нанесення в око (наприклад, очні краплі), або, у випадку непептидергічних засобів, можливе пероральне введення. Введення можна повторювати, по визначенню лікаря, до полегшення стану або до досягнення контролю.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти (наприклад, інгібуючі МАБР-2 антитіла) вводять у комбінації з одним або більше агентами або способами лікування, які придатні для першопричинного захворювання або розладу.

У деяких варіантах здійснення будь-якого з описаних у даній заявці різних способів і фармацевтичних композицій, інгібуюче МА5Р-2 антитіло вибірково пригнічує лектиновий шлях,

Зо не зачіпаючи при цьому класичний шлях.

У різних аспектах даний винахід стосується способів пригнічення несприятливих ефектів фіброзу і/або запалення, які включають введення інгібуючого МА5Р-2 агента суб'єкту, що цього потребує. Інгібуючі МА5БР-2 агенти вводять у кількості, ефективній для пригнічення МА5Р-2- залежної активації комплементу у живого суб'єкта. При практичному здійсненні цього аспекту винаходу типові інгібуючі МАБР-2 агенти включають: молекули, що пригнічують біологічну активність МАБР-2 (такі як низькомолекулярні інгібітори, анти-МА5БР-2 антитіла (наприклад, інгібуючі МА5Р-2 антитіла) або блокувальні пептиди, які взаємодіють з МА5Р-2 або порушують білок-білюову взаємодію) і молекули, які зменшують експресію МА5БР-2 (такі як молекули антисмислової нуклеїнової кислоти МАБР-2, МАБР-2-специфічні молекули РНКі і МА5БР-2 рибозими), тим самим не допускаючи МАБР-2-активацію лектинового шляху комплементу.

Інгібуючі МАЗР-2 агенти можна використовувати окремо як первинну терапію або в комбінації з іншими терапевтичними засобами як ад'ювантну терапію для підвищення терапевтичного ефекту інших медичних препаратів.

Пригнічення МАБР-2-залежної активації комплементу характеризується щонайменше однією з наступних змін у компоненті системи комплементу, які відбуваються в результаті введення інгібуючого МА5бР-2 агента згідно зі способами за винаходом: пригнічення генерації або продукування продуктів МАЗР-2-залежної активації комплементу С4Б, СЗа, Сба і/або С5Б5-9 (МАС) (виміряні, наприклад, як описано в прикладі 2), зменшення рівня розщеплення СА і відкладення С4р (виміряне, наприклад, як описано в прикладі 2) або зменшення рівня розщеплення СЗЗ і відкладення СЗБЬ (виміряне, наприклад, як описано в прикладі 2).

Відповідно до даного винаходу використовуються інгібуючі МА5Р-2 агенти, які ефективні в пригніченні фіброзу і/або запалення і проявляють виявлювану антифіброзну активність і/або індукують зменшення фіброзу. У контексті винаходу антифіброзна активність може включати щонайменше одне або більше з наступного: (1) зменшення запалення, наприклад, яке оцінюється по активації і рекрутуванню макрофагів і ендотеліальних клітин; рекрутування і активація лімфоцитів і/або еозинофілів шляхом секреції ряду цитокінів/хемокінів; вивільнення цитотоксичних медіаторів і фіброгенних цитокінів; (2) зниження проліферації клітин, синтез ВКМ (ЕСМ) або ангіогенез; і/або (3) зменшення рівня відкладення колагену в порівнянні з фіброзною активністю за відсутності інгібуючого МАБ5Р-2 агента. бо Оцінка антифіброзного агента, такого як інгібуючий МА5БР-2 агент, може здійснюватися шляхом виявлення будь-яким відомим фахівцю в даній галузі методом. Наприклад, оцінка антифіброзного агента може здійснюватися за допомогою моделі ШО (як описано в даній заявці в прикладах 12 і 14). Якщо оцінювану антифіброзну активність іиабо зменшення або зниження фіброзу оцінюють за допомогою інгібуючого МАБР-2 агента, вважається, що інгібуючий МА5ЗР-2 агент використовується як лікарський засіб для профілактики, лікування, купірування і/або пригнічення фіброзу.

Оцінку фіброзу можна здійснювати періодично, наприклад щотижня або щомісяця. Таким чином, збільшення/зменшення фіброзу і/або наявність антифіброзної активності можна оцінювати періодично, наприклад щотижня або щомісяця. Ця оцінка переважно здійснюється в декількох часових точках для даного суб'єкта або в одній або більше часових точках для даного суб'єкта і здорового контролю. Оцінка може проводитися через регулярні інтервали часу, наприклад щотижня або щомісяця. Тому оцінку можна здійснювати регулярно, наприклад щотижня або щомісяця. Якщо в результаті оцінки виявлене зменшення фіброзу або наявність антифіброзної активності, вважається, що інгібуючий МА5Р-2 агент, такий як інгібуюче МА5Р-2 антитіло, проявляє виявлювану антифіброзну активність і/або індукує зменшення або зниження фіброзу.

Інгібуючі МАБР-2 агенти, у випадку практичного застосування цього аспекту винаходу, включають, наприклад, МА5БР-2 антитіла і їх фрагменти, інгібуючі МА5БР-2 пептиди, малі молекули, розчинні МА5Р-2 рецептори і інгібітори експресії. Інгібуючі МАБР-2 агенти можуть пригнічувати систему МАЗР-2-залежної активації комплементу, блокуючи біологічну функцію

МА5Р-2. Наприклад, інгібуючий агент може ефективно блокувати взаємодію білка МАЗР-2 з білком, перешкоджати димеризації або збиранню МАБР-2, блокувати зв'язування з Са», інтерферувати з активною ділянкою серинової протеази МА5Р-2 або знижувати рівень експресії білка МА5Р-2.

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 агенти вибірково пригнічують МАЗР-2- залежну активацію комплементу, не зачіпаючи функціональну активність системи С1тд-залежної активації комплементу.

В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5Р-2 агент, використовуваний у способах за винаходом, являє собою специфічний інгібуючий МА5Р-2 агент, який специфічно зв'язується з

Зо поліпептидом, що містить ЗЕ ІЮ МО:6, зі спорідненістю зв'язування, що щонайменше в 10 разів перевищує спорідненість зв'язування з іншими антигенами в системі комплементу. В іншому варіанті здійснення інгібуючий МА5Р-2 агент специфічно зв'язується з поліпептидом, що містить ЗЕ ІЮ МО:6, зі спорідненістю зв'язування, що щонайменше в 100 разів перевищує спорідненість зв'язування з іншими антигенами в системі комплементу. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5ЗР-2 агент специфічно зв'язується щонайменше з одним з домену

ССРІ-ССР2 (аа 300-431 в ЗЕО ІЮ МО:6) або домену серинової протеази МА5Р-2 (аа 445-682 в

ЗБО ІЮ МО:б) і пригнічує активацію МА5Р-2-залежного комплементу. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5ЗР-2 агент являє собою моноклональне антитіло МАЗР-2 або його фрагмент, що специфічно зв'язується з МА5Р-2. Спорідненість зв'язування інгібуючого МАЗР-2 агента може бути визначена за допомогою придатного аналізу зв'язування.

Поліпептид МА5Р-2 має молекулярну структуру, аналогічну структурі МАБР-1, МА5Р-3 і С1г і С15, протеаз системи комплементу С1. Молекула кКДНК, представлена в 5ЕО ІЮ МО:4, кодує типовий приклад МА5Р-2 (що складається з амінокислотної послідовності, представленої в ХЕО

ІО МО:5) і забезпечує людський поліпептид МА5Р-2 з лідерною послідовністю (аа 1-15), який розщеплюється після секреції, утворюючи зрілу форму людського МАБР-2 (5ЕО ІЮ МО:6). Як показано на фіг. 2, ген людського МА5Р-2 містить дванадцять екзонів. КДНК людського МАЗР-2 кодується екзонами В, С, О, ЕЕ, 0, Н, І, у, К ї М. У результаті альтернативного сплайсингу утворюється білок розміром 20 кДа, називаний МВІ -асоційованим білком 19 (МАр19, також називаний 5МАР) (ЗЕО ІЮ МО:2), кодований (5ЕО ІЮ МО:1), одержуваний з екзонів В, С, О і Е, як показано на фіг. 2. Молекула кКДНК, представлена в 5ЕО ІЮ МО:50, кодує мишачий МА5БР-2 (що складається з амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІЮО МО:51) і забезпечує поліпептид мишачого МА5Р-2 з лідерною послідовністю, у результаті розщеплення якої після секреції утворюється зріла форма мишачого МАБР-2 (5ЕБЕО ІЮ МО:52). Молекула кДНК, представлена в 5ЕБЕО І МО:53, кодує щурячий МАБР-2 (що складається з амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІЮ МО:54) і забезпечує поліпептид щурячого МАЗР-2 з лідерною послідовністю, у результаті розщеплення якої після секреції утворюється зріла форма щурячого МАЗР-2 (ЗЕО І МО:55).

Фахівці в даній галузі техніки зрозуміють, що послідовності, розкриті в «ФЕО ІЮ МО:4, 5ЕО ІЮ

МО:50 ії БЕО ІЮ МО:53, являють собою одиночні алелі людського, мишачого і щурячого МА5Р-2, бо відповідно, і що можливі алельні варіанти і альтернативний сплайсинг. Алельні варіанти нуклеотидних послідовностей, наведені в ЗЕО І МО:4, 5БО ІО МО:50 і 5ЕБЕО ІЮ МО:53, включаючи ті, які містять сайленс-мутації, і ті, у яких мутації приводять до змін амінокислотної послідовності, знаходяться у межах даного винаходу. Алельні варіанти послідовності МАБР-2 можуть бути клоновані шляхом зондування кДНК або геномних бібліотек від різних індивідуумів згідно зі стандартними процедурами.

Домени людського білка МА5Р-2 (5ЕО ІО МО:6) показані на фіг. 1 і 2А і включають домени

М-кінцевий С1г/С15//ЕСЕ морського їжака/домен кісткового морфогенетичного білка (СОВІ) (аа 1-121 в ЗЕО ІО МО:6), домен, подібний епідермальному фактору росту (аа 122-166), другий домен СИВІ (аа 167-293), а також тандем доменів регуляторних білків комплементу.

Альтернативний сплайсинг гена МА5Р-2 приводить до утворення МАр19, показаного на фіг. 1.

МАр19 являє собою неферментний білок, що містить М-термінальну СОВІ-ЕСЕ ділянку МА5Р-2 з чотирма додатковими залишками (ЕОБІ), одержаними з екзона Е, показаного на фіг. 1.

Було показано, що деякі білки здатні зв'язуватися або взаємодіяти з МА5Р-2 за допомогою білок-білкових взаємодій. Наприклад, відомо, що МА5БР-2 здатний зв'язуватися і формувати

Са -залежні комплекси з лектиновими білками МВ, Н-фіколіном і І -фіколіном. Було показано, що кожний комплекс МАЗР-2/лектиновий білок здатний активувати комплемент за допомогою

МА5БР-2-залежного розщеплення білків С4 і С2 (ІКеда К. еї аї., 9). Віої. Спет. 262:7451-7454, 1987; Маїзивнйа М. еї а!., У. Ехр. Мед. 176:1497-2284, 2000; Маїзивпйа М. еї аї., 9. Іттипої. 168:3502-3506, 2002). Дослідження показали, що домени СОВІ-ЕСЕ МАБР-2 є важливими для зв'язування МАБР-2 з МВІ (ТВієїєп5 М.М. еї аї., У. Іттипої. 166:5068, 2001). Також було показано, що домени СОВІЄСЕСИВІЇ опосередковують димеризацію МА5Р-2, необхідну для формування активного комплексу МВІ. (Умаїїїв К. еї аї., у. Віої. Спет. 275:30962-30969, 2000).

Звідси випливає, що інгібуючі МАБР-2 агенти характеризуються своєю здатністю зв'язуватися або взаємодіяти з МА5Р-2 ділянками-мішенями, що відіграють важливу роль у процесі МАЗР-2- залежної активації комплементу.

АНТИ-МАБ5БР-2 АНТИТІЛА

У деяких варіантах здійснення цього аспекту даного винаходу інгібуючий МАЗР-2 агент включає анти-МА5бР-2 антитіло, яке пригнічує систему МАЗР-2-залежної активації комплементу.

Анти-МА5БР-2 антитіла, придатні для здійснення цього аспекту даного винаходу, включають поліклональні, моноклональні або рекомбінантні антитіла, одержані від будь-якого продукуючого антитіла ссавця, і дані антитіла можуть бути мультиспецифічними, химерними, гуманізованими, антиідіотипічними антитілами і фрагментами антитіл. Фрагменти антитіл включають Раб, Рар', Е(абр)г, К(ар)», ГЕм-фрагменти, зсЕм-фрагменти і одноланцюжкові антитіла, описані нижче.

Анти-МАБР-2 антитіла можуть бути піддані скринінгу на здатність пригнічення системи

МАБР-2-залежної активації комплементу і на антифіброзну активність і/або пригнічення ниркового ураження, асоційованого з протеїнурією або індукованою адріаміцином нефропатією, за допомогою описаного в даній заявці аналізу. Деякі анти-МА5Р-2 антитіла були описані в науковій літературі, декілька з них перераховані в таблиці 1. Наприклад, як показано в даній заявці в прикладах 10 і 11, було знайдено, що анти-МА5Р-2 антитіла Гар2 блокують МА5ЗР-2- залежну активацію комплементу. Як показано в прикладі 12 і описано в М/О 2012/151481, включеній в даний опис у вигляді посилання, було визначено, що повністю людські анти-МАБР- 2 антитіла 5сЕм (наприклад, ОМ5646) блокують МА5ЗР-2-залежну активацію комплементу. Як описано в прикладі 13, а також в М/О 024141442, включеній в даний опис у вигляді посилання, анти-МАБР-2 антитіла, що несуть пептид 5ОМІ-2, і їх фрагменти, що проявляють інгібуючу

МАБ5БР-2 активність, були одержані шляхом злиття з амінокислотною послідовністю пептиду

ЗОМІ-2 (ЗЕО ІО МО:72, 73 або 74) на аміно- або карбоксильному кінці важкого і/або легкого ланцюга людського анти-МА5Р-2 антитіла (наприклад, ОМ5646-512:3МІ-2).

Відповідно, в одному з варіантів здійснення інгібуючий МА5БР-2 агент для використання в способах за винаходом містить людське антитіло, таке як, наприклад, ОМ5646. Відповідно, в одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБР-2 агент для використання в композиціях і способах за заявленим винаходом містить людське антитіло, яке зв'язує поліпептид, що складається з людського МАЗР-2 (ЗЕО ІЮ МО:6), причому антитіло містить: (І) (а) варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить: ) СОК-НІ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 31-35 в 5ЕБО ІЮ МО:67; і ії) СОК-Н2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 50-65 в 5ЕО ІЮ МО:67; і ії) СОК-НЗ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 95-107 в ЗЕО ІЮ МО:67; і (5) варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить: Її) СОК-Ї1 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 24-34 в 5ЕО ІО МО:70; і її) СОК-1 2 легкого ланцюга, що містить амінокислотну 60 послідовність з аа 50-56 в 5БО ІЮ МО:70; і її) СОМК-ЇЗ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 89-97 в ЗЕО ІЮ МО:70; або (ІІ) його варіант, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга з щонайменше 90 95 ідентичністю з 5ЕО ІЮ МО:67 (наприклад, з щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 96, щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 до ідентичністю) з БЕО ІЮ МО:67; і варіабельну ділянку легкого ланцюга з щонайменше 90 95 ідентичністю (наприклад, з щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 95, щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 до, щонайменше 99 95 ідентичністю) з ЗЕО ІЮ МО:70.

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка містить деяку кількість інгібуючого МАБР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: б7, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО:70.

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка містить інгібуюче МА5Р-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа на людському МА5Р-2, розпізнаваному референсним антитілом

ОМ5646, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, як зазначено в ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, як зазначено в 5ЕО ІЮ МО:70. В одному з варіантів здійснення інгібуючий МАБР-2 агент, використовуваний у способах за винаходом, містить людське антитіло ОМ5646.

ТАБЛИЦЯ 1

НАВЕДЕНІ ЯК ПРИКЛАД МА5ЗР-2-СПЕЦИФІЧНІ АНТИТІЛА

Іттипої!. 37:803-811, 2000

Фрагмент рекомбінантного | Щуряче МоАБб (підклас Ідс1) Мої Іег-Кгівіепзеп М. еї аї.,»У. ої людського ССР1/2-5Р Іттипої. Меїносв, 282:159-167,

МодЬ 885 2003

Рекомбінантний людський |Щуряче МоАБ (підклас ІдсС1) Мої Іег-Кгібіепзеп М. еї аї.,». ої

МАр19 (МодЬ бат12) Іттипої. Меїйпоав5, 282:159-167, (перехресна реакція з 2003

МАБР-2

Мишаче МоАБ (М-терм.) Іттипої!. 35:409, Арії! 1998

НМАБР-2 (домен ССР1- Щуряче МоАрБ: Мітоаб101, МО 2004/106384

ССР2-5Р) продуковане гібридомною клітинною лінією 03050904 (ЕСАСС

НМАБР-2 (повнорозмірний, | Мишачі МоАбБв5: МО 2004/106384 пПів-мічений) Мітоар104, продуковане гібридомною клітинною лінією

МОо545УМ035 (054М2)

Мітоар108, продуковане гібридомною клітинною лінією

МмОо5455М029 (0587)

Мітоар109 продуковане гібридомною клітинною лінією

МмОо545УМ046 (05472)

Мітоабр110 продуковане гібридомною клітинною лінією мМо545у5М048 (05М2 (повнорозмірний) ЕРарг пептид 5ЗОМІ-2

АНТИ-МАБР-2 АНТИТІЛА ЗІ ЗНИЖЕНОЮ ЕФЕКТОРНОЮ ФУНКЦІЄЮ

У деяких варіантах здійснення цього аспекту даного винаходу анти-МА5Р-2 антитіла мають знижену ефекторну функцію для зменшення запалення, яке може виникати при активації класичного шляху комплементу. Було виявлено, що здатність молекул до запускати класичний шлях активації комплементу пов'язана з Ес-ділялнкою молекули (ЮОипсап А.В. єї аї., Майшге, 332:738-740 1988). Молекули Ідс, у яких Ес-ділянка була видалена за допомогою ферментного розщеплення, позбавлені даної ефекторної функції (див. Нагіом/у, Апііродіеє: А Іаброгайгу

Мапиа!ї, Соїй Зргіпд Нагрог ІГарогаїогу, Мем; ЖМогК, 1988). Відповідно до цього, антитіла зі зниженою ефекторною функцією можуть бути одержані в результаті видалення Ес-ділянки молекули, що містить генно-інженерну Ес-послідовність, яка має мінімальну ефекторну функцію, ця молекула може належати як до людського ізотипу Ідса2, так і до ізотипу Ід.

Антитіла зі зниженою ефекторною функцією можуть бути одержані за допомогою стандартних молекулярних біологічних маніпуляцій з Ес-ділянкою важких ланцюгів дос, як описано в даній заявці і показано в УоїІйТе еї аї., ТІ Кем. Іттипої. 10:241-250, 11993, і Коадгідце5 еї аї., У. Іттипої. 151:6954-6961, 1998. Антитіла зі зниженою ефекторною функцією також включають людські ізотипи Ідс2 і Ідо4, які мають знижену здатність активувати комплемент ілабо вступати у взаємодію з Ес-рецепторами (Камеїсі УМ. еї аІ., Аппи. Кему. Іттипої. 9:457-492, 1991; Ізсаасз У.О. єї аї., У. Іттипої. 148:3062-3071, 1992; мап де М/іпКкеї У.сх. еї аї., Іттипої. Тодау, 14:215-221, 1993). Гуманізовані або повноцінні людські антитіла, специфічні до людського

МАБР-2, що включають ізотипи Їд52 або Ід054, можуть бути одержані одним з декількох способів, відомих фахівцю в даній галузі техніко, як описано в Мацдпап Т.9. еї аї., Маїиге

Віотесппісаї, 16:535-539, 1998.

ОДЕРЖАННЯ АНТИ-МАБ5Р-2 АНТИТІЛ

Анти-МАБР-2 антитіла можуть бути одержані за допомогою поліпептидів МАБР-2 (наприклад, повнорозмірного МАБЗР-2) або антигенних пептидів, що несуть епітоп МАБР-2 (наприклад, частина поліпептиду МА5Р-2). Імунногенні пептиди можуть складатися всього з п'яти амінокислотних залишків. Наприклад, поліпептид МА5Р-2, що містить повну амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:б, може бути використаний для індукції анти-МА5Р-2 антитіл, які можуть бути використані в способі за даним винаходом. Відомо, що конкретні домени МА5бР-2, залучені в білок-білкові взаємодії, такі як домени СИОВІ ії СОВІЄСЕ, а також область, що містить

Зо активну ділянку серинової протеази, можна експресувати у вигляді рекомбінантних поліпептидів, як описано в прикладі 3, і використовувати як антигени. Крім того, пептиди, які містять ділянку, що складається з щонайменше б амінокислот поліпептиду МАБР-2 (5ЕО Ір

МО:6), також можна використовувати для індукції МА5БР-2 антитіл. Додаткові приклади одержаних антигенів МА5Р-2, що мають здатність індукувати МА5Р-2 антитіла, наведені нижче в таблиці 2. Пептиди і поліпептиди МА5Р-2, використовувані для генерації антитіл, можуть бути виділені у вигляді природних поліпептидів або рекомбінантних або синтетичних пептидів і каталітично неактивних рекомбінантних поліпептидів, таких як МАБР-2А, як описано далі в даній заявці. У деяких варіантах здійснення цього аспекту даного винаходу анти-МА5Р-2 антитіла одержані з використанням трансгенної лінії мишей, як описано нижче в даній заявці.

Антигени, здатні продукуватися анти-МА5Р-2 антитіла, також включають злиті поліпептиди, наприклад поліпептиди, одержані в результаті злиття МА5Р-2 або його частини з поліпептидом імуноглобуліну або білком, що зв'язує мальтозу. Поліпептидний імуноген може бути представлений повнорозмірною молекулою або її частиною. Якщо частина поліпептиду представлена гаптеном, така частина може бути переважно приєднана або зв'язана для імунізації з макромолекулярним носієм (таким як гемоціанін фісурели (КІН), бичачий сироватковий альбумін (В5А) або правцевий анатоксин).

ТАБЛИЦЯ 2

АНТИГЕНИ МАЗБР-2 аа 1-121 в БЕО ІЮ МО:6) аа 1-166 в ЗЕО ІЮ МО:6) аа 1-293 в БЕО ІЮ МО:6)

ТАБЛИЦЯ 2

АНТИГЕНИ МАЗБР-2 аа 122-166 в ЗЕО ІЮ МО:6) аа 429-671 в ЗЕО ІЮ МО:6)

ЗЕО І МОЗ Мутантна форма з інактивованим доменом серинової скрозовНардасцаА| мг. протеази аа 610-625 в ЗЕО ІЮ МО:6 з мутантним 5егб18

ТР аРКМУРЕРУЕБСОВІ.

ЗЕО ІЮ МО:15: Людський пептид СИВІ

ТАРРОИУВІ ВІ МЕТНЕОІ ЕГ.

ЗНІ СЕМОЕМКІ З5САКМІ АТІ ССО

ТЕВБОМОМ

ЕМ аз ОІТЕВЗОМЗМЕКРЕТИа ЕЕ

ІОЕСОМАРСИ

АММІ САаГЕЗССКОЗСнОрзасаціА М

ПОЛІКЛОНАЛЬНІ АНТИТІЛА

Поліклональні анти-МАБР-2 антитіла можуть бути одержані шляхом імунізації тварин поліпептидом МА5БР-2 або його імуногенною ділянкою способами, добре відомими фахівцю в даній галузі техніки. Див., наприклад, Сгееп еї аї., Ргодисіп ої Роїусіопа! Апіїзега, в

Ітітипоспетіса! РгоїосоЇї5 (Мапзоп, еа.), стор. 105. Імуногенність поліпептиду МАБР-2 можна підвищити за допомогою ад'юванту, включаючи мінеральні гелі, такі як гідроксид алюмінію або ад'ювант Фрейнда (повний або неповний), поверхнево-активних речовин, таких як лізолецитин, високомолекулярних спиртів - плюроніків, поліаніонів, масляних емульсій, гемоціаніну фісурели і динітрофенолу. Для одержання поліклональних антитіл звичайно використовують тварин, таких як коні, корови, собаки, кури, щури, миші, кролики, морські свинки, кози або вівці. Як альтернатива, анти-МА5Р-2 антитіло, використовуване в даному винаході, може також бути одержане від людиноподібної мавпи. Загальний метод одержання діагностично і терапевтично корисних антитіл у бабуїнів можна знайти, наприклад, в СоїЇдепрегд еї аї., публікація міжнародної заявки на патент УМО 91/11465, і в Го5тап М... еї аї., Іпї. У. Сапсег, 46:310, 1990.

Потім за допомогою стандартних загальновідомих процедур із крові таких імунізованих тварин одержують сироватку, що містить імунологічно активні антитіла.

МОНОКЛОНАЛЬНІ АНТИТІЛА

У деяких варіантах здійснення інгібуючий МА5БР-2 агент являє собою моноклональне анти-

МАБР-2 антитіло. Моноклональні анти-МА5БР-2 антитіла є високоспецифічним епітопом, спрямованим проти одного епітопа МА5Р-2. Як використовується в даному описі, модифікатор "моноклональне" указує на характер антитіла, одержаного з по суті гомогенної популяції антитіл, і не має на увазі одержання антитіл яким-небудь конкретним способом. Моноклональні антитіла можуть бути одержані будь-яким методом, що передбачає одержання молекул антитіл у культурі стабільної клітинної лінії, таким як, наприклад, метод гібридом, описаний в Копіег 0. еї аїЇ,, Майшиге, 256:495, 1975, або вони можуть бути одержані методами рекомбінантних ДНК (див., наприклад, патент США Мо 4,816,567, Сарійу). Моноклональні антитіла можуть бути також виділені з фагової бібліотеки антитіл методами, описаними в Сіаскзхоп Т. еї аїЇ., Майшге, 352:624- 628, 1991, і Магкз 9.0. еї аї., У. Мої. Віої. 222:581-597, 1991. Подібні антитіла можуть належати до

Зо будь-якого класу імуноглобулінів, включаючи Ідс, ІМ, ІДЕ, ІдА, до, ії будь-якого їх підкласу.

Наприклад, моноклональні антитіла можуть бути одержані шляхом ін'єкцій придатному ссавцю (наприклад, миші лінії ВАГ. В/с) композиції, яка містить поліпептид МАБР-2 або його частину. Після попередньо визначеного періоду часу, у миші виділяють спленоцити і ресуспендують їх у культуральному середовищі. Потім здійснюють злиття спленоцитів з імморталізованою клітинною лінією для утворення гібридоми. Утворені гібридоми вирощують у культурі клітин і піддають їх скринінгу на здатність до продукування моноклональних антитіл до

МАБР-2. Далі в даному описі наведені приклади одержання моноклональних анти-МА5Р-2 антитіл (див. також Сигтепі Ргоїосої5 іп Іттипоіоду, Мої. 1, дхопп Уміеу 5 5оп5, радез 2.5.1-2.6.7, 1991.)

Людські моноклональні антитіла можуть бути одержані від трансгенних мишей, створених методами генної інженерії для продукування людських антитіл у відповідь на антигенний стимул. У цьому методі елементи локусу важких і легких ланцюгів людського імуноглобуліну вводять у лінії мишей, одержані із клітинних ліній ембріональних стовбурних клітин, які містять спрямовані руйнування локусів важких і легких ланцюгів ендогенного імуноглобуліну. Трансгенні миші можуть синтезувати людські антитіла, специфічні до людських антигенів, таких як антигени

МАБР-2, описані в даному винаході, і цих мишей можна використовувати для одержання гібридом, секретуючих антитіла до людського МА5Р-2, шляхом злиття В-клітин, одержаних від таких тварин, з придатними клітинними лініями мієломи звичайним методом Келера-

Мільштейна, як описано нижче в даній заявці. Трансгенні миші з геномом людського імуноглобуліну є комерційно доступними (наприклад, від Ардепіх, Іпс., Егетопі, СА, і Медагех,

Іпс., Аппапааїє, М.)У.). Способи одержання людських антитіл від трансгенної миші описані в науковій літературі, наприклад Сгееп ЇЇ. еї аїЇ., Маїшге Сепеї, 7:13, 1994; Іопрегуд М. еї аї.,

Маїшцге, 368:856, 1994; і Тауїог І.О. еї аї., Іпї. Іттип. 6:579, 1994.

Моноклональні антитіла можуть бути виділені ії очищені від гібридомної культури різними добре відомих методами. Такі методи виділення включають афінну хроматографію на сефарозі з білюом А, ексклюзійну хроматографію і іонообмінну хроматографію (див., наприклад, Соїїдап стор. 2.7.1-2.7.12 і стор. 2.9.1-2.9.3; Ваїпе5 еї аї., "Ригійсайоп ої Іттиподіориййп с (1д()", в

Меївпод3з іп МоїІесшціаг Віоіоду, Те Нитапа Ргез5, Іпс., Мої. 10, стор. 79-104, 1992).

Після одержання поліклональні, моноклональні антитіла або антитіла, вироблені фагами, спочатку тестують на специфічне зв'язування з МАБР-2. Для визначення антитіл, що специфічно зв'язуються з МА5ЗР-2, можна використовувати множину різних способів, відомих фахівцю в даній галузі техніки. Ілюстративні приклади аналізу, що проводяться стандартними способами, включають вестерн-блот або аналіз імунопреципітації (наприклад, як описано в

А!йзцире! еї аї.), імуноелектрофорез, імуноферментний аналіз (ІФА), дот-блотинг, аналіз пригнічення або конкурентний аналіз (як описано в Нагіом/ і Ії апа, Апііродіеє: А І аброгафгу

Мапиа!, Соїй Зргіпд Нагрог Гарогаїогу Ргез55, 1988). Після визначення антитіл, здатних специфічно зв'язуватися з МАБР-2, анти-МАБР-2 антитіла тестують на можливість функціонувати як інгібуючий МАБР-2 агент одним з декількох методів оцінки, таким як, наприклад, аналіз лектин-специфічного розщеплення С4 (описаний у прикладі 2), аналіз відкладення СЗБЬ (описаний у прикладі 2) або аналіз відкладення С4Б (описаний у прикладі 2).

Спорідненість зв'язування анти-МА5Р-2 моноклональних антитіл може бути легко визначена фахівцем у даній галузі техніки (див., наприклад, 5саїспага А., МУ Асай. з5сі. 51:660-672, 1949).

В одному з варіантів здійснення моноклональні анти-МА5БР-2 антитіла, використовувані в способах за даним винаходом, зв'язуються з МА5Р-2 зі спорідненістю зв'язування «100 нмоль, переважно «10 нмоль і більш переважно «2 нмоль.

ХИМЕРНІ/ГУМАНІЗОВАНІ АНТИТІЛА

Моноклональні антитіла, використовувані в способі за даним винаходом, включають химерні антитіла, у яких частина важкого і/або легкого ланцюга є ідентичною або гомологічною відповідним послідовностям в антитілах, які одержані з конкретного виду або належать до конкретного класу або підкласу антитіл, у той час як інша частина ланцюга (ланцюгів) є ідентичною або гомологічною відповідним послідовностям антитіл, які виділені з іншого виду або належать до іншому класу або підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл (патент

США Мо 4,816,567, Сарійу; і Моїтізоп 5.І... еї аї., Ргос. Маї! Асад. 5сі. ОБА, 81:6851-6855, 1984).

Одна з форм химерного антитіла, використовуваного в даному винаході, представлена гуманізованим моноклональним анти-МАБР-2 антитілом. Гуманізовані форми нелюдських (наприклад, мишачих) антитіл представлені химерними антитілами, які містять мінімальну послідовність, виділену з нелюдського імуноглобуліну. Гуманізовані моноклональні антитіла одержують шляхом перенесення нелюдських (наприклад, мишачих) областей, що визначають комплементарність (СОК), з варіабельних ділянок важких і легких ланцюгів імуноглобуліну миші в людський варіабельний домен. Як правило, залишки людських антитіл потім заміщають у каркасних областях нелюдських прототипів. Більше того, гуманізовані антитіла можуть містити залишки, які не виявляються в антитілах реципієнта або в антитілах донора. Дані модифікації проводяться з метою подальшого поліпшення ефективності антитіл. У загальному випадку, гуманізоване антитіло може містити по суті всі з щонайменше одного й, як правило, двох варіабельні доменів, у яких усі або по суті усі гіперваріабельні петлі відповідають петлям 60 нелюдського імуноглобуліну і всі або по суті всі Ем-каркасні області є областями з послідовності людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло може також містити щонайменше частину константної області імуноглобуліну (Ес), як правило людського імуноглобуліну. Докладний опис можна знайти в ЧЩопез еї аї., Маїиге, 321:522-525, 1986; Неісптапп есеї а!., Маїшиге, 332:323-329, 1988; Ргезіа, Ст. Ор. Бігисі. Віо!., 2:593-596, 1992.

Гуманізовані антитіла, використовувані в даному винаході включають людські моноклональні антитіла, що включають щонайменше МАЗБР-2-зв'язувальну ділянку СОКНЗ.

Крім того, Ес-ділянки можуть бути замінені таким чином, щоб продукувалися ІА або ІдМ, а також людські (ДО антитіла. Таким чином, гуманізовані антитіла знайдуть, зокрема, клінічне застосування, оскільки вони будуть специфічно розпізнавати людський МА5Р-2, не викликаючи у людини імунної відповіді проти самого антитіла. Як наслідок, вони краще придатні для введення людині іп мімо, особливо, коли потрібне повторне або тривале введення.

Приклад одержання гуманізованого анти-МА5Р-2 антитіла з мишачого моноклонального анти-МАБР-2 антитіла наведений в прикладі 6. Методи одержання гуманізованих моноклональних антитіл також описані, наприклад, в Щдопев Р.Т. еї аї., Маїиге, 321:522, 1986;

Сапег Р. ві а!., Ргос. Маї". Асад. сі. ОБА, 89:4285, 1992; Запани 9.5., Стії. Вем. Віоїесп. 12:437, 1992; Зіпдег І.І. еї аї., У. Іттип. 150:2844, 1993; Бицаніг (єд.), Апіїбоду Епдіпеегіпдуд Ргоїосоїв,

Нитапа Ргезв, Іпс., 1995; КеїПеу, "Епдіпеегіпу ТНегарешіс Апііродіеєв", іп Ргоївїп Епдіпеенгіпа:

Ргіпсірієх апа Ргасіїсе, Сівеіапа еї аї. (вдв.), дойп УМПеу в 5опв, Іпс., раде5 399-434, 1996; і в патенті США Мо 5,693,762, Оцееп, 1997. Крім того, існують комерційні організації, які синтезують гуманізовані антитіла зі специфічних ділянок антитіла, наприклад Ргоївіп Оезідп І арх (Моипіаїп

Мієм, СА).

РЕКОМБІНАНТНІ АНТИТІЛА

Анти-МАБ5БР-2 антитіла також можуть бути одержані за допомогою рекомбінантних методів.

Наприклад, людські антитіла можуть бути одержані з використанням експресійної бібліотеки людського імуноглобуліну (доступні, наприклад, в бігаїадепе, Согр., І а доПа, СА) для одержання фрагментів людських антитіл (МН, Мі, Ем, Ба, Раб або Р(абБ)2). Ці фрагмента потім використовуються для конструювання повноцінних людських антитіл методами, аналогічними методам, використовуваним для одержання химерних антитіл.

АНТИІДІОТИПІЧНІ АНТИТІЛА

Зо Після визначення анти-МА5Р-2 антитіл з потрібною інгібуючою активністю, ці антитіла можна використовувати для одержання антиідіотипічних антитіл, які схожі з частиною МА5Р-2, методами, добре відомими в даній галузі. Див., наприклад, Сгеепзрап М.5. єї а)Ї., ЕАБЗЕВ 3. 7:437, 1993. Наприклад, антитіла, які зв'язуються з МА5Р-2 і конкурентно пригнічують МА5Р-2- білкові взаємодії, необхідні для активації комплементу, можуть бути використані для одержання антиіїдіотипічних антитіл, які мають подібність з МВІ -зв'язувальною ділянкою білка МА5Р-2 і, отже, зв'язуються і нейтралізують зв'язування лігандів МА5Р-2, таких як, наприклад, МВІ..

ФРАГМЕНТИ ІМУНОГЛОБУЛІНУ

Інгібуючі МАБР-2 агенти, використовувані в способі за винаходом, охоплюють не тільки інтактні молекули імуноглобулінів, але і добре відомі фрагменти, включаючи Рабр, Рабр', Е(аб)»,

Каб)» і Ем-фрагменти, зсЕм-фрагменти, димери, лінійні антитіла, одноланцюжкові молекули антитіл і мультиспецифічні антитіла, сформовані із фрагментів антитіл.

Добре відомо, що тільки невелика частина молекули антитіла, паратоп, бере участь у зв'язуванні антитіла з його епітопом (див., наприклад, Сіагк М/.К., Те Ехрегітепіаї! Роипаайоп5 ої Модет Іттипоіоду, УМіеу 5 Боп5, Іпс., МУ, 1986). Ділянки рЕс і Ес антитіла є ефекторами класичного шляху активації комплементу, але не беруть участь у зв'язування антигенів.

Антитіло, від якого ферментативно відщеплена ділянка рЕс або яке було продуковане без ділянки рЕс, позначене Е(аб)г-фрагментом і містить обидві антигензв'язувальні ділянки інтактного антитіла. Виділений фрагмент Е(аб)» належить до бівалентного моноклонального фрагмента через наявність двох антигензв'язувальних ділянок. Аналогічно, антитіло, від якого ферментативно відщеплена ділянка Ес або яке було продуковане без ділянки Ес, позначене

Еаб-фрагментом і містить одну з антигензв'язувальних ділянок молекули інтактного антитіла.

Фрагменти антитіл можуть бути одержані шляхом протеолітичного гідролізу, такого як пепсиновий або папаїновий гідроліз цільних антитіл, стандартними способами. Наприклад, фрагменти антитіла можуть бути одержані ферментним розщепленням антитіл пепсином з одержанням фрагмента 55, позначеного К(аб)». Цей фрагмент може бути далі розщеплений за допомогою агента, що відновлює тіол, з одержанням 3,55 ЕРар' моновалентних фрагментів.

Необов'язково, реакцію розщеплення можна здійснювати з використанням групи, блокуючої сульфгідрильні групи, одержані в результаті розщеплення дисульфідних зв'язків. Як альтернатива, ферментне розщеплення за допомогою пепсину дає два моновалентних бо фрагменти Раб і фрагмент Ес. Ці способи описані, наприклад, у патенті США Мо 4,331,647,

Соідепрего; Мібзопоїйї А. єї аї., Агсп. Віоспет. Віорпуз. 89230, 1960; Ропег В.В., Віоспет. .. 73:119, 1959; Едеїтап еї аї!., в Меїйпод5 іп Еплутоїіоду 1:422, Асадетіс Ргез5, 1967; і в Соїїдап, стор. 2.8.1-2.8.10 і 2.10.-2.10.4.

У деяких варіантах здійснення використання фрагментів антитіл з відсутньою Ес-ділянкою є переважним, оскільки дозволяє уникнути активації класичного шляху комплементу, яка ініціюється шляхом зв'язування Ес з рецептором Есу. Існує декілька способів продукування

МоОАр, яке не впливає на взаємодії рецептора Есу. Наприклад, Ес-ділянка моноклонального антитіла може бути видалена хімічним способом шляхом часткового розщеплення за участі протеолітичних ферментів (наприклад, розщеплення фіцином), з одержанням, наприклад, антигензв'язувальних фрагментів антитіл, таких як фрагменти Раб або К(аб)» (Маїапі М. еї аї.,

МОЇ. Іттипої. 28:69-71, 1991). Альтернативно, ізотип у4 людського ІДС, який не зв'язується з рецепторами Есу, може бути використаний для створення гуманізованого антитіла, як описано в даній заявці. Антитіла, одноланцюжкові антитіла і антигензв'язувальні домени, у яких відсутній

Ес-домен, також можуть бути створені рекомбінантними методами, описаними в даній заявці.

ФРАГМЕНТИ ОДНОЛАНЦЮЖКОВИХ АНТИТІЛ

Альтернативно, можна створити МАБР-2-специфічні молекули, що зв'язують один поліпептидний ланцюг, у яких Ем-ділянки важкого і легкого ланцюгів зв'язані між собою. Ем- фрагменти можуть бути зв'язані за допомогою пептидного лінкера з утворенням одноланцюжкового антигензв'язувального білка (5СЕм). Такі одноланцюжкові антигензв'язувальні білки одержують шляхом створення структурного гена, що містить послідовності ДНК, кодуючі домени МН і Мі, зв'язані з олігонуклеотидом. Структурний ген вбудовують у вектор експресії, який потім вводять у клітину-хазяїна, таку як, БЕ. соїї.

Рекомбінантні клітини-хазяїни синтезують одиничний поліпептидний ланцюг з пептидним лінкером, що зв'язує два М-домени. Способи одержання 5сЕм описані, наприклад, в М/пйШому/ еї аі,, "Меїтоа»: А Сотрапіоп ю Меїподз іп Епгутоіоаду", 2:97, 1991; Віга єї аї., бсіепсе, 242:423, 1988; патент США Мо 4,946,7 78, І адпег; РаскК Р. еї а!ї., Віо/ТесппоїЇоду, 11:1271, 1993.

Як ілюстративний приклад, МАБЗР-2-специфічний 5сЕм можна одержувати, піддаючи лімфоцити впливу поліпептиду МА5Р-2 іп міїго і селекції бібліотек антитіл методом фагового дисплея у фагах або аналогічних векторах (наприклад, шляхом використання іммобілізованих або мічених білків або пептидів МА5Р-2). Гени, кодуючі поліпептиди, що містять потенційні домени, які зв'язують поліпептиди МА5Р-2, можуть бути одержані шляхом скринінгу будь-яких пептидних бібліотек, відображених на фагу або бактеріях, таких як Е. соїї. Ці випадкові пептидні фагові бібліотеки можуть бути використані для скринінгу пептидів, які взаємодіють з МА5Р-2.

Методи створення і скринінгу таких випадкових пептидних дисплейних бібліотек добре відомі (див. патент США Мо 5,223,409, І агапег; патент США Мо 4,946,778, І аапег; патент США Мо 5,403,484, І агапег; патент США Мо 5,571,698, І агапег; і Кау еї аіІ.,, Ріаде Оізріау оїреріїде5 апа

Ргоївіп5 Асадетіс Ргев5, Іпс., 1996), а випадкові пептидні дисплейні бібліотеки і набори для скринінгу таких бібліотек є комерційно доступними, наприклад від СІ ОМТЕСН І абогаютгієв, Іпс. (Раїо АЮ, Саїї.), Іпийгодеп Іпс. (Зап Оієдо, Саїйї.), Меу/ Епдіапа Віоїарв, Іпс. (Ірзм/ісп, Ма55.) і

Рпаптасіа І КВ Віотесппоіоду Іпс. (Різсаїамау, М.У.).

Іншою формою фрагмента анти-МАБР-2 антитіла, використовуваного в цьому аспекті даного винаходу, є пептид, кодуючий одну область, що визначає комплементарність (СОК), яка зв'язується з епітопом на антигені МА5Р-2 і пригнічує МА5Р-2-залежну активацію комплементу.

СОК пептиди ("мінімальні одиниці розпізнавання") можуть бути одержані шляхом конструювання генів, коюодуючих СОК антитіла, що представляє інтерес. Такі гени одержують, наприклад, методом полімеразної ланцюгової реакції для синтезу варіабельної ділянки із РНК клітини, продукуючої антитіла (див., наприклад, І агтіск еї аІ., Меїйод»5: А Сотрапіоп о Меїподзь іп Епгутоїоду 2:106, 1991; Сошпепау-Ї ск, "Сепеїййс Мапіршацйоп ої Мопосіопа! Апіїроадіев", в

Мопосіопаї! Апііродієв: Ргодисіюп, Епдіпеегіпд апа Сіїіпіса! Арріїсайіоп, Віцег вї а. (єд5.), раде 166,

Сатбргідде Опімегейу Ргевз5, 1995; і УмМага еї аї.,, "Сепеїйс Мапіршіайоп апа Ехргезвіоп ої

Апіїродієв", в Мопосіопаї Апііїродієв: Ргіпсірієз апа Арріісайопв, Вігсп еї а. (сав5.), раде 137, ММіІеу-

І ів5, Іпс., 1995).

Анти-МА5БР-2 антитіла, описані в даній заявці, вводять суб'єкту, що цього потребує, для пригнічення МА5Р-2-залежної активації комплементу. У деяких варіантах здійснення інгібуючий

МА5БР-2 агент являє собою людське або гуманізоване моноклональне анти-МАБ5Р-2 антитіло зі зниженою ефекторною функцією.

ПЕПТИДНІ ІНГІБІТОРИ

У деяких варіантах здійснення цього аспекту даного винаходу інгібуючий МА5Р-2 агент містить виділені пептидні інгібітори МА5Р-2, у тому числі виділені природні пептидні інгібітори і бо синтетичні пептидні інгібітори, які пригнічують систему МАЗР-2-залежної активації комплементу.

Як зазначено в даному описі, термін "виділені пептидні інгібітори МАБР-2" стосується пептидів, які інгібують МАБР-2-залежну активацію комплементу шляхом зв'язування з МА5БР-2, конкуренції з МА5БР-2 за зв'язування з іншою молекулою розпізнавання (наприклад, МВІ., Н- фіколіном, М-фіколіном або І-фіколіном) у лектиновому шляху активації і/або шляхом прямої взаємодії з МАБР-2, таким чином пригнічуючи МА5Р-2-залежну активацію комплементу, при цьому ці інгібітори є по суті чистими і практично не містять інші речовини, з якими вони можуть знаходитися в природних умовах, настільки, що є придатними для застосування за цільовим призначенням.

Пептидні інгібітори успішно використовуються іп мімо з метою пригнічення білок-білкових взаємодій і каталітичної ділянки. Наприклад, пептидні інгібітори молекул адгезії, структурно споріднені ГЕА-1, нещодавно були схвалені для клінічного застосування при коагулопатії (Оптап Е.М. єї аІ., Єигорвап Неап -. 16:50-55, 1995). Було показано, що короткі лінійні пептиди («30 амінокислот) мають здатність попереджати або перешкоджати інтегринзалежній адгезії (Мигауата 0. еї аї., 9. Віоспет. 120:445-51, 1996). Більш довгі пептиди, від 25 до 200 амінокислотних залишків, також успішно використовувалися для блокування інтегринзалежної адгезії (папа Г. еї аї., 9. ВіоЇ. Спет. 271(47):29953-57, 1996). Як правило, більш довгі пептидні інгібітори мають більш високу спорідненість і/або більш низькі швидкості дисоціації, ніж короткі пептиди, й, отже, можуть бути більш ефективними інгібіторами. Також було показано, що циклічні пептидні інгібітори є ефективними інгібіторами інтегринів іп мімо при лікуванні запальних захворювань людини (даскхоп О.У. еї аї., У. Мед. Спет. 40:3359-68, 1997). Один зі способів одержання циклічних пептидів включає синтез пептидів, у якому термінальні амінокислоти пептиду є цистеїнами, що дозволяє пептиду існувати в циклічній формі за рахунок утворення дисульфідних зв'язків між термінальними амінокислотами, що, як було показано, поліпшує спорідненість зв'язування і період напіввиведення іп мімо при лікуванні гемопоетичних неоплазій (наприклад, патент США Мо 6,649,592, І агвоп).

СИНТЕТИЧНІ ПЕПТИДНІ ІНГІБІТОРИ МА5Р-2

Пептиди, інгібуючі МАБР-2, використовувані в способах цього аспекту даного винаходу, являють собою амінокислотні послідовності, які імітують ділянки-мішені, важливі для функції

МА5Р-2. Розміри інгібуючих пептидів, використовуваних на практиці в способах за даним винаходом, знаходяться у межах від приблизно 5 амінокислот до приблизно 300 амінокислот. У таблиці З представлений список наведених як приклад інгібуючих пептидів, які можуть бути використані при практичному застосуванні цього аспекту даного винаходу. Інгібуючий МАБР-2 пептид-кандидат може бути протестований на здатність функціонувати як інгібуючий МА5БР-2 агент в одному або більше аналізах, включаючи, наприклад, аналіз лектин-специфічного розщеплення С4 (описаний в прикладі 2) і аналіз відкладення СЗбр (описаний в прикладі 2).

У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 пептиди одержують із поліпептидів МАЗР-2 і вибирають із повнорозмірного зрілого білюка МАБЗР-2 (ЗЕО ІЮ МО:6) або з конкретного домену білка МА5Р-2, такого як, наприклад, домен СИВІ (ЗЕО ІЮ МО:8), домен СОВІЄСЕ (ЗЕО ІЮ МО:9), домен ЕСЕ (5ЕО ІО МО:11) і домен серинової протеази (5ЕО ІО МО:12). Як описувалося раніше, було показано, що ділянки СОВЕСЕСИВІЇ необхідні для димеризації і зв'язування з МВІ. (Тпівїеп5 еї аї., зирга). Зокрема, у дослідженні з ідентифікації людини, що несе гомозиготну заміну Азр105 на СІу105, яка приводить до втрати МА5Р-2 з комплексу МВІ., було показано, що пептидна послідовність ТРКЗОММ (5ЕО І МО:16) у домені СОВІ МАБР-2 бере участь у зв'язуванні з МВІ. (Зіепдаага-Редегзеп К. єї аІ., Мем Епдіапа У). Мед. 349:554-560, 2003).

У деяких варіантах здійснення пептиди, інгібуючі МАБР-2, одержували з лектинових пептидів, які зв'язуються з МА5Р-2 і беруть участь у лектиновому шляху активації комплементу.

Були визначені декілька різних лектинів, які беруть участь у цьому шляху, включаючи мананзв'язувальний лектин (МВ), І -фіколін, М-фіколін і Н-фіколін (ІКкеда К. еї аї.,». Віої. Спет. 262:7451-7454, 1987; Маїзизніа М. еї аї., 9. Ехр. Мей. 176:1497-2284, 2000; Маїзизніа М. еїаї.,».

Іттипої. 168:3502-3506, 2002). Ці лектини присутні в сироватці у вигляді олігомерів або гомотримерних субодиниць, кожна з яких має М-термінальні колагеноподібні волокна, з доменами упізнавання вуглеводнів. Було показано, що ці різні лектини зв'язуються з МА5Р-2, і комплекс лектин/МмА5Р-2 активує комплемент через розщеплення білків С4 і С2. Н-фіколін має амінокислотну термінальну ділянку з 24 амінокислот, колагеноподібний домен з 11 повторами

Спіу-Хаа-Уаа, шийковий домен з 12 амінокислот і фібриногеноподібний домен з 207 амінокислот (Маїзибпйа М. еї аї., У. Іттипої. 168:3502-3506, 2002). Н-фіколін зв'язується з СІСМАс і аглютинує людські еритроцити, покриті ЛПС, одержані з 5. їурпітигішт, 5. тіппезоїа і Е. соїї.

Було показано, що Н-фіколін зв'язується з МАБР-2 і МАр 19 і активує лектиновий шлях комплементу. Ід. Г-фіколін/Р35 також зв'язується з СІСМАс і, як було показано, утворює зв'язки з бо МА5Р-2 і МАр19 у людській сироватці, і цей комплекс активує лектиновий шлях комплементу

(Маїзихпйа М. еї аї., 9У. Іттипої. 164:2281, 2000). Відповідно, інгібуючі МАБР-2 пептиди, використовувані в даному винаході, можуть містити ділянку, що складається з щонайменше 5 амінокислот, вибраних з білка МВІ (5ЕО ІЮ МО:21), білка Н-фіколін (номер доступу в Сепрапк

ММ 173452), білка М-фіколін (номер доступу в Сепрапк 000602) і білка І-фіколін (номер доступу Сепрапк ММ 015838).

Більш конкретно, учені ідентифікували зв'язуючу МА5Р-2 ділянку в МВІ, що складається з 12 триплетів СіІу-Хх-Х "ЯКО ВО ТК СЕК СЕР СОС: НИ ГО РОС КО РОСІЇ МОСІ РІО 5ОС

РКа Ока рода ке" (ЗЕО ІЮ МО:26), які розташовані між шарнірною і шийковою ділянками в С- термінальній частині колагеноподібного домену МВР (Умаїїїв БК. еї аї., У. ВіоЇ. Спет. 279:14065, 2004). Ця зв'язуюча МАБР-2 ділянка є також дуже консервативною у людського Н-фіколіну і людського І -фіколіну. Описана консенсусна ділянка зв'язування, яка представлена у всіх трьох лектинових білках, що містить амінокислотну послідовність "ОСК-Х-ЯР" (5ЕО ІЮ МО:22), де буква "О" означає гідроксипролін, а буква "Х" являє собою гідрофобний залишок (УМаїїїв еї аї., 2004, в5ирга). Відповідно, у деяких варіантах здійснення інгібуючі МАБР-2 пептиди, використовувані в цьому аспекті даного винаходу, мають у довжину щонайменше 6 амінокислот і містять ЗЕО ІЮ МО:22. Було показано, що пептиди, одержані з МВІ, які включають амінокислотну послідовність "ЗІ А СО СРО СКІ СРО С" (ЗЕО ІЮ МО:24), зв'язуються з МАЗР- 2 іп мійго (УМаїййїв, еї аїі., 2004, вирга). Для посилення зв'язування з МА5БР-2 можуть бути синтезовані пептиди, фланковані двома триплетами СРО на кожному кінці (СРО СРО СІ В агОсРО СОКІ СРО СОР ОСР ОО", 5ЕО ІЮО МО:25) для підвищення ймовірності утворення потрійних спіралей, виявлених у нативного білка МВІ (як описано в Умаїрї5 В. еї аї.,». Віої. Снет. 279:14065, 2004).

Інгібуючі МА5Р-2 пептиди також можуть бути одержані з людського Н-фіколіну, який включає послідовність "ЗАО 150 СЕК САО СРО СРО 2СРО КМ РК БО а0БО" (ЗЕО ІЮ МО 27), з консенсусної МАЗР-2-зв'язувальної ділянки в Н-фіколіні. Також включені пептиди, одержані з людського І-фіколіну, який включає послідовність "СО СО БАО ОК СЕА ТМ КА СЕН

СРО СРО СКА СРО РМ САО СЕО" (ЗЕО ІО МО:С28), з консенсусної МА5Р-2-зв'язувальної ділянки в І -фіколіні.

Інгібуючі МАБР-2 пептиди також можуть бути одержані із сайта розщеплення С4, такого як

Зо " ОВАЇГ ЕІП/'РМАМТІКАМА РЕМ" (ЗЕО ІЮ МО:29), який є сайтом розщеплення С4, зв'язаним з С- термінальною частиною антитромбіну ПІ! (СіІомег 5.1. єї аї., Мої. Іттипої. 25:1261 (1988)).

ТАБЛИЦЯ З

НАВЕДЕНІ ЯК ПРИКЛАД ІНГІБУЮЧІ МАЗР-2 ПЕПТИДИ

ЗЕО ІЮ МО:22 Синтетичний пептид, консенсусна ділянка зв'язування з рак-хХ-аР, людського МВІ. і людських фіколінів де "О" є гідроксипроліном, і "Х" є гідрофобним аміноксилотним залишком рака ссв-ас о-аРО-КІ-аРО-С МАБ5БР-2

ЗЕО ІЮ МО:25 Людські МВР триплети з СРО, додані для посилення сРєРОСРОІ Ва ОСРОСКІ аРОСОР | утворення потрійних спіралей оаРО скравНвраткаЕкКаЕРООСІ ВНИаГОС

ТАБЛИЦЯ З

НАВЕДЕНІ ЯК ПРИКЛАД ІНГІБУЮЧІ МАЗР-2 ПЕПТИДИ реко шт роавк;

ЗЕО І МО:27 Людський Н-фіколін (Наїака) садоаБОоаЕКаАОСРОаЧРОССРОС кМмаРКкаЕоаро

ЗЕО ІЮ МО:28 Людський І -фіколін РЗ35 ссоаі ослосркаєЕАаатМчакКна

ЕВНаРОСРОСКАСРОСРМИадОСсСЕО

ГОВАГЕІСРМАМТІКАМАРЕЇМРЇ

ЗЕО І МО:72 ЗОМІ-2І. (повнорозмірний)

ГЕМТСЕРОТТЕКОКСМТСНСИ,ЗОрСИ

КЗ5АУМСТКІ МСМО

ЗЕО ІЮ МО:73 ЗОМІ-2М (укорочений варіант, середня довжина)

ТСЕРОТТЕКОКСМТонОСОаБООКЗА

УСсТКкІмУСсМО товСазраквзАМСТКІМСМО

Примітка: буква "О" означає гідроксипролін, буква "Х" означає гідрофобний залишок.

Пептиди, одержані з сайта розщеплення С4, а також інші пептиди, інгібуючі ділянку серинової протеази МА5Р-2, можуть бути хімічно модифіковані таким чином, щоб вони стали необоротно діючими інгібіторами протеази. Наприклад, придатні модифікації можуть включати, без обмеження, галогенметилкетони (Вг, СІ, І, Е) на С-термінальному кінці, А5р або Сім, або можуть бути приєднані до функціональних бічних ланцюгів; галогенацетилові (або інші а- галогенацетилові) групи на аміногрупах або інших функціональних бічних ланцюгах; епоксид- або імінвмісні групи на аміно- або карбокситермінальних кінцях або функціональних бічних ланцюгах; або складні ефіри, імідати на аміно- або карбокситермінальних кінцях або функціональних бічних ланцюгах. Такі модифікації можуть забезпечувати перевагу при необоротному пригніченні ферменту за рахунок ковалентного приєднання пептиду. Це може привести до зменшення ефективної дози і/або зниження частоти введення пептидного інгібітору.

Додатково до описаних вище інгібуючих пептидів, інгібуючі МАБР-2 пептиди, використовувані в способі за даним винаходом, включають пептиди, що містять МА5Р-2- зв'язувальну ділянку СОКЗ в анти-МА5Р-2 МоАбБ, одержаному описаним у даній заявці способом. Послідовність ділянок СОК для застосування в синтезі пептидів може бути визначена відомими в даній галузі способами. Варіабельна ділянка важкого ланцюга являє собою пептид, довжина якого звичайно знаходиться в межах від 100 до 150 амінокислот. Варіабельна ділянка легкого ланцюга являє собою пептид, довжина якого звичайно знаходиться в межах від 80 до 130 амінокислот. Послідовності СОК усередині варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів включають послідовності, що складаються тільки з приблизно 3-25 амінокислот, які можуть бути легко секвеновані фахівцем у даній галузі техніки.

Фахівцям у даній галузі техніки відомо, що по суті гомологічні варіанти описаних вище інгібуючих МА5БР-2 пептидів також будуть проявляти МА5Р-2-інгібуючу активність. Ілюстративні варіанти включають, без обмеження, пептиди, що містять вставки, делеції, заміни і/або додаткові амінокислоти на карбокситермінальних або амінотермінальних ділянках заявлених пептидів, і їх суміші. Відповідно, такі гомологічні пептиди, що мають МАБР-2-інгібуючу активність, також передбачаються для використання в способах за даним винаходом. Описані

Зо пептиди також можуть включати повторювані мотиви і інші модифікації з консервативними замінами. Консервативні варіанти описані в даній заявці і включають заміну однієї амінокислоти іншою амінокислотою з аналогічним зарядом, аналогічного розміру, з аналогічною гідрофобністю і т. д.

Інгібуючі МАБР-2 пептиди можуть бути модифіковані для збільшення розчинності і/або одержання максимального позитивного або негативного заряду для посилення подібності з сегментом в інтактному білку. Похідне може мати або не мати точну первинну амінокислотну структуру пептиду, розкритого в даній заявці, за умови, що це похідне залишається функціонально активним відносно інгібування МАБР-2. Модифікації можуть включати заміну амінокислоти однією з добре відомих двадцяти амінокислот або будь-якою іншою амінокислотою, дериватизованою або заміщеною амінокислотою з додатковими необхідними характеристиками, такими як стійкість до ферментного розщеплення, або ЮО-амінокислотою, або заміну іншою молекулою або сполукою, такою як вуглевод, що імітує природну конформацію і функцію амінокислоти, амінокислот або пептиду; делецію амінокислоти; вставку однієї із двадцяти добре відомих амінокислот або будь-якої іншої амінокислоти, дериватизованої або заміщеної амінокислоти з додатковими необхідними характеристиками, такими як стійкість до ферментного розщеплення, або ЮО-амінокислоти, або заміну іншою молекулою або сполукою, такою як вуглевод, що імітує природну конформацію і функцію амінокислоти, амінокислот або пептиду; або заміну іншою молекулою або сполукою, такою як вуглевод або мономер нуклеїнової кислоти, що імітує природну конформацію, розподіл зарядів і функцію батьківського пептиду. Пептиди також можуть бути модифіковані шляхом ацетилювання або амідування.

Синтез похідних інгібуючих пептидів може бути оснований на відомих методах біосинтезу пептидів, біосинтезу вуглеводів і т. п. Як відправну точку, фахівець може використовувати придатну комп'ютерну програму для визначення конформації пептиду, що представляє інтерес.

Після визначення конформації розкритого в даному описі пептиду, фахівець, використовуючи методи моделювання, може визначити тип замін, який необхідний на тій або іншій ділянці для одержання похідного, у якого збережена базова конформація і розподіл заряду, характерні для батьківського пептиду, але яке може мати характеристики, відсутні у батьківського пептиду або поліпшені в порівнянні з характеристиками батьківського пептиду. Після ідентифікації похідних молекул-кандидатів, ці похідні можуть бути протестовані за допомогою описаних у даному винаході аналізів для визначення їх здатності функціонувати як інгібуючі МА5Р-2 агенти.

СКРИНІНГ ІНГІБУЮЧИХ МА5БР-2 ПЕПТИДІВ

Для одержання і скринінгу пептидів, які імітують молекулярну структуру ключових ділянок зв'язування МАБР-2 і пригнічують МАБР-2-залежну активацію комплементу, можна використовувати методи молекулярного моделювання і раціонального молекулярного проектування. Молекулярні структури, використовувані для моделювання, включають ділянки

СОК анти-МА5Р-2 моноклональних антитіл, а також цільові області, відомі своєю важливістю для функціонування МА5Р-2, включаючи ділянку, необхідну для димеризації, ділянку, залучену у зв'язування МВ, і активну ділянку серинової протеази, як описано вище. Способи ідентифікації пептидів, які зв'язуються з конкретною мішенню, добре відомі в даній галузі.

Наприклад, для де помо конструювання макромолекулярних структур, таких як пептиди, що зв'язуються з конкретною молекулою, можна використовувати молекулярний імпринтинг. Див., наприклад, Зпеа К.)., "МоїІесшаг Ітргіпіпод ої Зупіпеїіс Меїуогк РоїЇутеге: Те ЮОе Момо зупіпевів ої Масготоїіесціаг Віпаїпу апа Саїаїуїйс Зпев", ТВІР, 25), 1994.

Як ілюстрація нижче наведений приклад одного зі способів одержання міметиків МА5Р-2- зв'язуючих пептидів. Функціональні мономери відомого МАБР-2-зв'язуючого пептиду або зв'язувальної ділянки анти-МА5Р-2 антитіла, які пригнічують активність МАЗР-2 (матриця) піддають полімеризації. Потім матрицю видаляють, після чого іде полімеризація другого класу мономерів у тому місці, звідки була видалена матриця, для створення нової молекули, що демонструє одну і більше необхідних властивостей, аналогічних властивостям матриці. Крім одержання пептидів, таким способом можуть бути одержані інші МАБР-2-зв'язуючі молекули, які є інгібуючими МАБР-2 агентами, такі як полісахариди, нуклеозиди, лікарські речовини, нуклеопротеїни, ліпопротеїни, вуглеводи, глікопротеїни, стероїди, ліпіди і інші біологічно активні речовини. Даний спосіб можна використовувати для створення великого різноманіття біологічних міметиків, які є більш стабільними, ніж їх природні прототипи, оскільки вони одержані методом вільнорадикальної полімеризації функціональних мономерів, утворюючи в результаті сполуку з каркасом, не схильним до біохімічного розкладання.

СИНТЕЗ ПЕПТИДІВ

Інгібуючі МАБР-2 пептиди можуть бути одержані методами, добре відомими в даній галузі, такими як метод твердофазного синтезу, вперше описаний Меггійеій, в У. Атег. Спет. зоб. 85:2149-2154, 1963. За допомогою апарата 431А Рерійїде Зупіпезігег від Арріїєй Віозуєтет5 (Бозієг Сйу, Саїй) можна виконувати автоматизований синтез відповідно до інструкцій виробника. Інші методи описані, наприклад, в Водап57Ку М. еї аї!., Реріїде 5упіпевів, зесопа еайіоп, доп УМієу 5 Боп5, 1976, а також в інших роботах, відомих фахівцям у даній галузі техніки.

Пептиди також можуть бути одержані стандартними методами генної інженерії, відомими бо фахівцям у даній галузі техніки. Наприклад, пептид може бути одержаний у результаті ферментативного синтезу шляхом введення нуклеїнової кислоти, кодуючої пептид, у вектор експресії, що здійснює експресію ДНК і трансляцію цієї ДНК у пептид у присутності необхідних амінокислот. Потім пептид очищають за допомогою хроматографії або електрофорезу, або білка-носія, який може бути злитий, а надалі відщеплений від пептиду, шляхом вбудовування у вектор експресії послідовності нуклеїнової кислоти, кодуючої білок-носій, разом з кодуючою пептид послідовністю. Злитий білок-пептид може бути виділений за допомогою методів хроматографії, електрофорезу або імунологічних методів (наприклад, зв'язування білка-носія зі смолою за допомогою антитіла). Пептид може бути відщеплений хімічним методом або ферментативно, наприклад за допомогою гідролази.

Інгібуючі МАБР-2 пептиди, використовувані в способі за винаходом, також можуть бути одержані в рекомбінантних клітинах-хазяїнах за допомогою звичайних методів. Для експресії послідовності, кодуючої інгібуючі МАБР-2 пептиди, молекула нуклеїнової кислоти, кодуюча пептид, повинна бути функціонально зв'язана з регуляторними послідовностями, що контролюють транскрипційну експресію у векторі експресії, а потім впроваджена в клітину- хазяїна. Додатково до транскрипційних регулюючих послідовностей, таких як промотори і енхансери, вектори експресії можуть включати трансляційні регуляторні послідовності і маркерний ген, які є придатними для відбору клітин, що несуть вектор експресії.

Молекули нуклеїнових кислот, кодуючі інгібуючий МА5БР-2 пептид, можуть бути синтезовані за допомогою "генних машин" по протоколах, таких як фосфорамідний метод. Якщо для додатка, такого як синтез гена або фрагмент гена, необхідний хімічний синтез двониткової ДНК, то кожну комплементарну нитку синтезують окремо. Одержання коротких генів (від 60 до 80 пар основ) не викличе складностей і може бути виконане шляхом синтезування комплементарних ниток з наступним відпалом. Для одержання більш довгих генів синтетичні гени (двониткові) збирають у модульну форму з одноланцюжкових фрагментів довжиною від 20 до 100 нуклеотидів. Огляд синтезу полінуклеотидів можна знайти, наприклад, в сСіїсК апа Разхіегпак,

Моїесшіаг Віоїесппоіоду, Ргіпсіріеєз апа Арріїсайоп5 ої Весотбіпапі ОМА, АЗМ Ргезз, 1994; Накига

К. еї аІ., Аппи. Нем. Віоспет. 53:323, 1984; і Сіїтіє 5. єї аї,, Ргос. Маг! Асад. 5сі. ОА, 87:633, 1990.

НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНІ ІНГІБІТОРИ

Зо У деяких варіантах здійснення інгібуючі МАЗР-2 агенти являють собою низькомолекулярні інгібітори, включаючи природні і синтетичні речовини, що мають низьку молекулярну масу, такі як пептиди, пептидоміметики і непептидні інгібітори (включаючи олігонуклеотиди і органічні речовини). Низькомолекулярні інгібітори МА5Р-2 можуть бути одержані на основі молекулярної структури варіабельних ділянок анти-МА5Р-2 антитіл.

Низькомолекулярні інгібітори також можуть бути сконструйовані і створені на основі кристалічної структури МАБР-2 за допомогою програм для комп'ютерного моделювання лікарських речовин (Кипія І.О. еї аї!., Зсіепсе, 257:1078, 1992). Описана кристалічна структура щурячого МА5Р-2 (Реїіпрегу Н. еї аІ., ЕМВО 4. 22:2348-2359, 2003). Використовуючи метод, описаний Кипі7 еї аЇ., координати кристалічної структури МАБР-2 вводять у комп'ютерну програму, таку як ООСК, яка на виході видає список низькомолекулярних структур, які, як передбачається, зв'язуються з МАБР-2. Використання таких комп'ютерних програм добре відоме фахівцю в даній галузі техніки. Наприклад, кристалічна структура інгібітору протеази

НІМ-1 була використана для ідентифікації унікальних непептидних лігандів, які є інгібіторами протеази НІМ-1, шляхом оцінки сумісності речовин з бази даних Сатрбгідде СтгувзіаПодгарпіс зі зв'язувальним сайтом ферменту за допомогою програми БОСК (Кипі І.О. еї аї., 9. Мої. Віої!.

Му:269-288, 1982; Оезіапаїв В... вії а!І., РМАБ, 87:6644-6648, 1990).

Список низькомолекулярних структур, ідентифікованих за допомогою комп'ютерних програм як потенційні інгібітори МА5Р-2, піддають скринінгу в аналізі зв'язування МА5Р-2, такому, як описано в прикладі 10. Ті малі молекули, які, як було визначено, зв'язуються з МА5Р-2, потім оцінюють у функціональному аналізі, такому, як описано в прикладі 2, для визначення їх здатності пригнічувати МА5Р-2-залежну активацію комплементу.

РОЗЧИННІ РЕЦЕПТОРИ МАЗБР-2

Вважається, що інші придатні інгібуючі МА5БР-2 агенти включають розчинні рецептори

МАБ5Р-2, які можуть бути одержані методами, добре відомими фахівцю в даній галузі техніки.

ІНГІБІТОРИ ЕКСПРЕСІЇ МА5Р-2

В іншому варіанті здійснення цього аспекту винаходу, інгібуючий МА5Р-2 агент являє собою інгібітор експресії МА5Р-2, здатний пригнічувати МА5БР-2-залежну активацію комплементу. При практичному застосуванні цього аспекту здійснення даного аспекту винаходу характерні інгібітори експресії МАЗР-2 включають молекули антисмислової нуклеїнової кислоти МА5Р-2 бо (такі як антисмислова мРНК, антисмислова ДНК або антисмислові олігонуклеотиди), рибозими

МА5Р-2 і молекули РНКі МА5Р-2.

Антисмислові молекули РНК і ДНК прямо блокують трансляцію МРНК МАБР-2 шляхом гібридизації з МРНК МАБ5Р-2, запобігаючи трансляції більа МА5БР-2. Молекула антисмислової нуклеїнової кислоти може бути сконструйована різними способами, і вона здатна перешкоджати експресії МАБР-2. Наприклад, молекула антисмислової нуклеїнової кислоти може бути сконструйована шляхом інвертування кодуючої ділянки (або її частини) КДНК МАЗР-2 (ЗЕО І

МО:4) відносно її нормальної орієнтації при транскрипції, що забезпечує транскрипцію її комплементу.

Звичайно молекула антисмислової нуклеїнової кислоти є ідентичною щонайменше частині цільового гена або генів. Однак для пригнічення експресії цільового гена нуклеїнова кислота не обов'язково повинна бути абсолютно ідентичною його нуклеотидній послідовності. Як правило, чим коротше послідовність антисмислової нуклеїнової кислоти, тим більш високу гомологію вона повинна мати. Мінімальний відсоток ідентичності звичайно становить не менше приблизно 65 95, але більш високий відсоток дозволяє досягати більш ефективного пригнічення експресії ендогенної послідовності. Відсоток ідентичності, що суттєво перевищує приблизно 80 95, звичайно є переважним, хоча значення в інтервалі від приблизно 95 95 до повної ідентичності є найбільш переважними.

Молекула антисмислової нуклеїнової кислоти не обов'язково повинна мати інтрон або екзон такої ж структури, як у цільового гена; некодуючі сегменти цільового гена можуть бути так само ефективні в досягненні антисмислового пригнічення експресії цільового гена, як і кодуючі сегменти. Як молекула антисмислової нуклеїнової кислоти може бути використана послідовність ДНК з 8 або більше нуклеотидів, хоча переважною є більш довга послідовність. У даному винаході типовим прикладом інгібуючого МАБР-2 агента є молекула антисмислової нуклеїнової кислоти МА5Р-2, яка щонайменше на 90 95 ідентична комплементарній КДНК МА5Р- 2, що складається з послідовності нуклеїнової кислоти, представленої в 5ЕБЕО ІЮ МО4.

Послідовність нуклеїнової кислоти, представлена в 5ЕБО ІЮ МО:4, кодує білок МАБР-2, що складається з амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІЮ МОБ.

Націлювання антисмислових олігонуклеотидів на зв'язування з МРНК МА5БР-2 являє собою інший механізм, який може бути використаний для зниження рівня синтезу білка МА5Р-2.

Зо Наприклад, синтез полігалактуронази і ацетилхолінового мускаринового рецептора типу 2 пригнічується антисмисловими олігонуклеотидами, спрямованими на відповідні послідовності

МРНК (патент США Мо 5,739,119, Спепо, і патент США Мо 5,759,829, ЗпемлтакКег). Крім того, приклад антисмислового пригнічення був продемонстрований для ядерного білка цикліну, гена множинної лікарської стійкості (МОС1), ІСАМ-1, Е-селектину, З5ТК-1, стріарного рецептора

ГАМК» і людського ЕСЕ (див., наприклад, патент США Мо 5,801,154, Вагасспіпі; патент США Мо 5,789,573, ВаКег; патент США Мо 5,718,709, Сопвідіпе; і патент США Мо 5,610,288, Кеибрепзіеїп).

Була описана система, яка дозволяє фахівцю в даній галузі техніки визначати, які олігонуклеотиди можуть бути використані для цілей даного винаходу, яка включає зондування придатних сайтів у цільовій МРНК шляхом розщеплення РНКазою Н як індикатор доступності послідовностей у транскриптах. Зспе!їт М. еї аї., Мисієвїс Асід5 Кев. 26:5079-5085, 1998; ПІсуа єї а!., Мисієїс Асідб5 Нев5. 29:3665-3673, 2001. Суміш антисмислових олігонуклеотидів, що є комплементарними відносно певних ділянок транскрипту МА5Р-2, додають у клітинні екстракти, експресуючі МАБ5Р-2, такі як гепатоцити, і здійснюють гібридизацію для створення сайтів, чутливих до дії РНКази Н. Цей спосіб може бути об'єднаний з вибором послідовностей за допомогою комп'ютерної програми, яка може передбачити вибір оптимальних послідовностей для антисмислових композицій на основі їх відносної здатності формувати димери, шпильки або інші вторинні структури, які могли б знизити або запобігти специфічному зв'язуванню з цільовою

МРНК у клітині-хазяїні. Аналіз цих вторинних структур і вибір цільових сайтів можуть бути виконані за допомогою комп'ютерної програми ФО ІСО для аналізу праймерів (КУсПІЇїК І., 1997) і комп'ютерної програми ВІГАБТМ 2.0.5 (Акб5спиці 5.Е. еї аї!., Мисі. Асід5 Кевз. 25:3389-3402, 1997).

Антисмислові сполуки, спрямовані на цільову послідовність, переважно містять від приблизно 8 до приблизно 50 нуклеотидів. Антисмислові олігонуклеотиди, що містять від приблизно 9 до приблизно 35 нуклеотидів, є особливо переважними. Автори винаходу розглядають усі олігонуклеотидні композиції в межах від 9 до 35 нуклеотидів (тобто, що мають у довжину 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 або 35 нуклеотидів) як найбільш переважні для способів за винаходом, основаних на застосуванні антисмислових олігонуклеотидів. Найбільш переважними цільовими ділянками мРНК МА5Р-2 є ті, які розташовані в безпосередній близькості від кодону ініціації трансляції А!Їс, і послідовності, які по суті комплементарні 5'-ділянкам мРНК, наприклад між -10 ії 410 ділянками 60 нуклеотидної послідовності гена МАЗР-2 (ЗЕО ІЮ МО:4). Приклади інгібіторів експресії МАБР-2 представлені в ТАБЛИЦІ 4.

ТАБЛИЦЯ 4

ПРИКЛАДИ ІНГІБІТОРІВ ЕКСПРЕСІЇ МАБР-2

ІО МО:4 (ЗЕО ІЮ МО:4), кодуюча СОВІЕЄСЕ

ЗЕО ІЮ МО:З1 Нуклеотиди 12-45 послідовності ЗЕО ІЮ МО:4, 5-СсапсаСАСАССАТОАСаСсТастад включаючи сайт ініціації трансляції МА5Р-2 состоСтасас-з' (смисловий)

ЗЕО ІЮ МО:32 Нуклеотиди 361-396 послідовності БЕО ІЮ МО:4, 5-ВАСАТТАССТТОСОСТОСОСАСТО кодуючої ділянку, що містить МВІ -зв'язувальний

СААдСОаАсСАдс-3! сайт МА5Р-2 (смисловий)

ЗЕО ІЮ МО:ЗЗ Нуклеотиди 610-642 послідовності БЕО ІЮ МО:4, в-дАаСсАдаСсССстТаААТАСССАСОСОЯСО кодуючої ділянку, що містить домен СОВІЇ ,ТАТСССАДА-З'

Як вказувалося вище, використовуваний у даному описі термін "олігонуклеотид" означає олігомер або полімер рибонуклеїнової кислоти (РНК) або дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) або їх міметики. Цей термін також охоплює такі олігонуклеобази, які складаються з природних нуклеотидів, цукрів і ковалентних міжнуклеозидних (остов) зв'язків, а також олігонуклеотидів, які мають модифікації, що не зустрічаються в природі. Такі модифікації дозволяють вводити певні потрібні властивості, яких не мають природні олігонуклеотиди, такі як зменшення токсичних властивостей, поліпшення стійкості до розщеплення нуклеазою і підвищення клітинного захоплення. В ілюстративних варіантах здійснення антисмислові сполуки за винаходом відрізняються від нативної ДНК модифікаціями фосфодіефірного остова, призначеними для продовження життєвого циклу антисмислового олігонуклеотиду, в якому фосфатні замісники замінені фосфоротіоатами. Подібним чином, один або обидва кінці олігонуклеотиду можуть бути заміщені одним або більше акридиновими похідними, які інтеркалюють між сусідніми парами нуклеотидів у ланцюзі нуклеїнової кислоти.

Іншою альтернативою використання антисмислових елементів є використання "РНК інтерференції" (РНКІ). Дволанцюжкові РНК (длРНК) можуть провокувати сайленсинг генів у ссавців іп мімо. Природна функція РНКІ і косупресія, очевидно, є захистом геному від інвазії мобільних генетичних елементів, таких як ретротранспозони і віруси, продукуючі аберантні РНК або длРНК у клітині-хазяїні при їх активації (див., наприклад, Уепзеп .. еї аї., Маї. Сепеї. 21:209- 12, 1999). Молекула дволанцюжкової РНК може бути одержана в процесі синтезу двох ланцюгів

РНК, здатних формувати молекули дволанцюжкової РНК, кожний з яких має довжину від приблизно 19 до 25 (наприклад, 19-23 нуклеотидів). Наприклад, молекула длРНК, використовувана в способах за винаходом, може містити РНК, відповідну послідовності і її комплементу, наведеним у таблиці 4. Переважно, щонайменше один ланцюг РНК має 3 "липкий" кінець із 1-5 нуклеотидів. Синтезовані ланцюги РНК комбінують в умовах, при яких утворюється дволанцюжкова молекула. Послідовність РНК може містити щонайменше частини з 8 нуклеотидів послідовності ЗЕО ІЮ МО:4 з загальною довжиною 25 нуклеотидів або менше.

Конструювання послідовностей міРНК для заданої мішені добре відоме фахівцю в даній галузі техніки. Існують комерційні організації, що займаються конструюванням послідовностей мігРНК, які гарантують щонайменше 70 9о нокдаун експресії (Оіадеп, МаІепсіа, Саїйїв).

ДлЛРНК може бути введена у формі фармацевтичної композиції відомими способами, за допомогою яких нуклеїнову кислоту вводять у необхідну клітину-мішень. Загальновідомі способи перенесення генів включають фосфат-кальцієвий спосіб, ОЕАЕ-декстрановий спосіб, електропорацію, мікроін'єкцію і способи з використанням вірусів. Такі способи описані в А!йзибеї еї аі., Сцтепі Ргоїюсої5 іп Моїіесшіаг Віоіоду, допп УМіеу б Бопв, Іпс., 1993.

Для зменшення кількості і/або біологічної активності МА5Р-2 також можуть бути використані рибозими, такі як рибозими, націлені на мРНК МА5БР-2. Рибозими являють собою каталітичні молекули РНК, здатні розщеплювати молекули нуклеїнової кислоти з послідовністю, повністю або частково гомологічною послідовності рибозиму. Існує можливість конструювання рибозимних трансгенів, кодуючих рибозими РНК, які утворюють специфічні пари з цільовою РНК і розщеплюють фосфодіефірний остов у специфічній ділянці, внаслідок чого відбувається функціональна інактивація цільової РНК. При здійсненні такого розщеплення сам рибозим не міняється й, таким чином, здатний до рециклінгу і розщеплення інших молекул. Включення рибозимних послідовностей в антисмислові РНК обумовлює активність розщеплення РНК, таким чином збільшуючи активність антисмислових конструкцій.

Рибозими, використовувані у винаході, звичайно містять ділянку, що гібридизується, із щонайменше дев'яти нуклеотидів, яка є комплементарною нуклеотидній послідовності щонайменше частини цільової МРНК МАБ5Р-2, і каталітичну область, яка здатна до розщеплення цільової МРНК (див. ЕРА Мо 0 321 201; УМО 88/04300; Назеїйонй .. еї а!., Майиге, 334:585-591, 1988;

Еєедог М.У. еї аї!., Ргос. Май). Асад. осі. ОБА, 87:1668-1672, 1990; Сесі Т.В. єї аї., Апп. Веу.

Віоспет. 55:599-629, 1986).

Рибозими можуть або бути націлені безпосередньо на клітини у формі олігонуклеотидів

РНК, що включають рибозимні послідовності, або бути введені в клітину як вектор експресії, кодуючий необхідну рибозимну РНК. Рибозими можна використовувати і застосовувати практично так само, як описано для антисмислових полінуклеотидів.

Антисмислові РНК ії ДНК, рибозими і молекули РНКІі, використовувані в способах за винаходом, можуть бути одержані будь-яким методом, відомим у даній галузі, для синтезу молекул ДНК їі РНК. Вони включають методи хімічного синтезу олігодезоксирибонуклеотидів і олігорибонуклеотидів, широко відомі в галузі техніки, такі як твердофазний фосфорамідний хімічний синтез. Альтернативно, молекули РНК можуть бути одержані за допомогою іп міїго і іп мімо транскрипції послідовностей ДНК, кодуючих молекулу антисмислової РНК. Такі послідовності ДНК можуть бути введені в широкий спектр векторів, які включають придатні промотори РНК полімерази, такі як промотори полімерази Т7 або 5Рб. Альтернативно, конструкції антисмислової кДНК, синтезуючі антисмислову РНК конститутивно або індуцибельно, залежно від використовуваного промотору, можуть стабільно вводитися в клітинні лінії.

Різні добре відомі модифікації молекул ДНК можуть бути введені для підвищення стабільності і періоду напіввиведення. Придатні модифікації включають, без обмеження, додавання фланкуючих послідовностей рибонуклеотидів або дезоксирибонуклеотидів до 5'- мМабо З3-кінців молекули або використання фосфоротіоату або 2-О-метилу замість фосфодіефірних зв'язків усередині олігодезоксирибонуклеотидного каркаса.

М. ФАРМАЦЕВТИЧНІ КОМПОЗИЦІЇ ї СПОСОБИ ДОСТАВКИ

ДОЗУВАННЯ

В іншому аспекті даного винаходу надаються композиції для пригнічення побічних ефектів

МА5Р-2-залежної активації комплементу у суб'єкта, що страждає захворюванням або станом, як розкрито в даному описі, які містять терапевтично ефективну кількість інгібуючого МА5Р-2 агента і фармацевтично прийнятний носій. Інгібуючі МАБР-2 агенти можуть вводитися суб'єкту, що цього потребує, в терапевтично ефективних дозах для лікування або поліпшення станів, асоційованих з МАБР-2-залежною активацією комплементу. Під терапевтично ефективною дозою мається на увазі кількість інгібуючого МАБР-2 агента, достатня для полегшення симптомів, асоційованих із захворюванням або станом.

Токсичність і терапевтична ефективність інгібуючих МА5Р-2 агентів може бути визначена стандартними фармацевтичними процедурами з використанням експериментальних тваринних моделей, таких як МАБР-2-/- мишача модель, експресуюча людський трансген МАЗБР-2, описаний у прикладі 1. Використовуючи такі тваринні моделі, значення МОАЕЇ (рівень відсутності спостережуваних побічних ефектів) і МЕЗО (мінімальна ефективна доза) можуть бути визначені стандартними способами. Відношення дози між ефектами МОАБЇ і МЕО є терапевтичним відношенням, яке виражається як відношення МОАЕЇ /МЕО. Інгібуючі МАБР-2 агенти, що демонструють високі терапевтичні відношення або показники, є найбільш переважними. Дані, одержані в результаті вивчення клітинних культур і тварин, можуть бути використані для визначення діапазону доз для людини. Дози інгібуючого МА5Р-2 агента переважно знаходяться у діапазоні концентрацій, спостережуваних у кровотоку, які включають

МЕ з мінімальною токсичністю або без неї. Доза може варіювати усередині цього діапазону залежно від лікарської форми або використовуваного способу введення.

У деяких варіантах здійснення, терапевтична ефективність інгібуючих МА5Р-2 агентів для лікування, пригнічення, полегшення або профілактики фіброзу у ссавця, що страждає або має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням, визначають за допомогою одного або більше із наступного: зменшення в нирковій тканині одного або більше маркерів запалення або рубцювання (наприклад, ТОЕД-1, СТЕР, ІІ -6, апоптозу, фібронектину, ламініну, колагенів, ЕМТ, інфільтруючих макрофагів); зменшення рівня вивільнення в сечу або плазму розчинних маркерів запалення і фіброзного ниркового захворювання (наприклад шляхом вимірювання ниркової екскреторної функції). 60 Для складу будь-якої сполуки, терапевтично ефективну дозу можна оцінити за допомогою тваринних моделей. Наприклад, доза може бути підібрана на тваринній моделі таким чином, щоб досягався діапазон концентрацій, циркулюючих у плазмі, який включає МЕО. Кількісні рівні інгібуючого МА5БР-2 агента в плазмі також можуть бути виміряні, наприклад, за допомогою високоефективної рідинної хроматографії.

Крім вивчення токсичності, ефективну дозу також можна оцінити по кількості МАР -2 білка у живого суб'єкта і спорідненості зв'язування інгібуючого МА5Р-2 агента. Було показано, що рівні

МА5Р-2 у здорових людей у сироватці є низькими, у межах 500 нг/мл, при цьому рівні МА5Р-2 у конкретного суб'єкта можуть бути визначені методами кількісного аналізу МАБР-2, як описано в

Мої Іег-Кгібїепзеп М. еї аї., У. Іттипої. МеїШйодв5, 282:159-167, 2003.

Звичайно, доза композицій, що вводяться, які містять інгібуючі МА5БР-2 агенти, варіює залежно від таких факторів як віх суб'єкта, його вага, ріст, стать, загальний стан здоров'я і історія хвороби. Як ілюстрація, інгібуючі МА5Р-2 агенти, такі як анти-МА5Р-2 антитіла, можуть вводитися в межах дози від приблизно 0,010 до 10,0 мг/кг, переважно від 0,010 до 1,0 мг/кг, більш переважно від 0,010 до 0,1 мг/кг ваги тіла суб'єкта. У деяких варіантах здійснення композиція містить комбінацію анти-МА5Р-2 антитіл і інгібуючих МАЗР-2 пептидів.

Терапевтична ефективність інгібуючих МАБР-2 композицій і способів за винаходом для даного суб'єкта, а також придатні дози можуть бути визначені за допомогою аналізу реакцій комплементу, добре відомих фахівцю в даній галузі техніки. Комплемент генерує численні специфічні продукти. За останні десять років були розроблені точні і специфічні аналізи, які є комерційно доступними для більшості з таких продуктів активації, включаючи малі фрагменти активації СЗа, Сда і С5а і великі фрагменти активації іС3Зр, С4а, ВЬ і 5С50-9. У більшості цих аналізів використовуються моноклональні антитіла, які реагують на нові антигени (неоантигени), розташовані на цих фрагментах, але не на нативні білки, з яких вони утворилися, що робить ці аналізи досить доступними і специфічними. У більшості випадків використовують метод ІФА, хоча для СЗа і Сба дотепер усе ще іноді використовується радіоімунологічний аналіз. Останній аналіз використовується для вимірювання рівня як непроцесованих Фрагментів, так і їх "де5Агу' фрагментів, які є основними формами, що виявляються в кров'яному руслі. Непроцесовані фрагменти і Сбадеєслю швидко виводяться через зв'язування з рецепторами клітинної поверхні й, отже, присутні в дуже низьких концентраціях, тоді як СЗадеслдю не зв'язується з клітинами і

Зо накопичується в плазмі. Вимірювання СЗа є чутливим, незалежним індикатором активації комплементу. Альтернативний шлях активації комплементу може бути визначений шляхом вимірювання фрагмента Вр. Виявлення розчинних продуктів активації мембраноатакуючого шляху, 5С5Б-9, є свідченням того, що комплемент повністю активований. Оскільки обидва, лектиновий і класичний, шляхи активації генерують одні і ті ж продукти активації, С4а і С44, вимірювання цих двох фрагментів не дає ніякої інформації про те, який із цих двох шляхів активації комплементу згенерував продукти активації.

Пригнічення МАБР-2-залежної активації комплементу характеризується щонайменше однією з наступних змін у компоненті системи комплементу, які виникають у результаті введення інгібуючого МА5бР-2 агента згідно зі способами за винаходом: пригнічення генерації або продукування продуктів системи МА5Р-2-залежної активації комплементу: С4р, СЗа, Сба іабо С5р-9 (виміряні, наприклад, як описано в прикладі 2), зменшення рівня розщеплення Са і відкладення С4Бб (виміряне, наприклад, як описано в прикладі 10) або зменшення рівня розщеплення СЗЗ і відкладення СЗБ (виміряне, наприклад, як описано в прикладі 10).

ДОДАТКОВІ АГЕНТИ

У деяких варіантах здійснення способи профілактики, лікування, купірування і/або пригнічення фіброзу і або запалення включають введення пригнічуючого МА5БР-2 агента (наприклад, інгібуючого МА5Р-2 антитіла) у рамках терапевтичного режиму з однією або більше іншими лікарськими речовинами, біологічними речовинами або терапевтичними методами лікування, що придатні для пригнічення фіброзу і/або запалення. У деяких варіантах здійснення додаткові лікарська, біологічна речовина або терапевтичний метод лікування є придатними для конкретних симптомів, асоційованих з захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням. Як приклад, інгібуючі МА5Р-2 антитіла можна вводити як частину терапевтичного режиму разом з одним або більше імунодепресантами, такими як метотрексат, циклофосфамід, азатіоприн і мікофеноляту мофетил. Як інший приклад, інгібуючі

МА5Р-2 антитіла можна вводити як частину терапевтичного режиму разом з одним або більше агентами, призначеними для посилення кровотоку (наприклад, ніфедипін, амлодипін, дилтіазем, фелодипін або нікардипін). Як інший приклад, інгібуючі МА5БР-2 антитіла можна вводити як частину терапевтичного режиму разом з одним або більше агентами, призначеними для зменшення фіброзу, такими як а-пеніциламін, колхіцин, РОМА, релаксин, циклоспорин, ТОЕр- 60 блокатори і/або рЗ8 МАРК-блокатори. Як додатковий приклад, інгібуючі МА5Р-2 антитіла можна вводити як частину терапевтичного режиму разом зі стероїдами або бронхорозширювачами.

Композиції і способи, що використовують інгібуючі МА5Р-2 агенти (наприклад, інгібуючі

МА5БР-2 антитіла), необов'язково можуть включати один або більше додаткових терапевтичних агентів, які здатні підсилювати активність інгібуючого МАБР-2 агента або які забезпечують споріднені терапевтичні функції, забезпечуючи додатковий або синергетичний ефект.

Наприклад, у контексті лікування суб'єкта, що страждає захворюванням або розладом, викликаним або ускладненим фіброзом і/або запаленням, один або більше інгібуючих агентів

МАБР-2 можна вводити в комбінації (включаючи спільне введення) з одним або більше додатковими антифіброзними агентами і/або одним або більше протизапальними агентами ілабо імунодепресантами.

Інгібуючі МА5Р-2 агенти (наприклад, інгібуючі МА5БР-2 антитіла) можна застосовувати в комбінації з іншими терапевтичними агентами, такими як імунодепресанти загальної дії, такі як кортикостероїди, імунодепресанти або цитотоксичні агенти і/або антифіброзні агенти.

ФАРМАЦЕВТИЧНІ НОСІЇ ї ЗАСОБИ ДОСТАВКИ

Як правило, композиції інгібуючих МА5БР-2 агентів за даним винаходом, об'єднані з будь- яким іншим вибраним терапевтичним агентом, містяться в придатному фармацевтично прийнятному носії. Носій є нетоксичним, біосумісним і вибирається так, щоб можна було уникнути шкідливого впливу біологічної активності інгібуючого МА5БР-2 агента (і будь-якого іншого терапевтичного агента, включеного в комбінацію). Типові фармацевтично прийнятні носії для пептидів описані в патенті США Мо 5,211,657, Матада. Анти-МАБ5Р-2 антитіла і інгібуючі пептиди, використовувані в даному винаході, можуть бути складені у тверду, напівтверду, гелеподібну, рідку і газоподібну лікарську форму, таку як таблетки, капсули, порошки, гранули, мазі, розчини, супозиторії, інгаляції і ін'єкції для перорального, парентерального або хірургічного введення. Даний винахід також передбачає місцеве введення композицій шляхом нанесення покриття на медичні інструменти і т. п.

Придатними носіями для парентерального введення шляхом ін'єкції, інфузії або зрошення і місцевої доставки є дистильована вода, забуферений фосфатом фізіологічний розчин, розчин

Рінгера, нормальний або з лактатом, розчин Ю-глюкози, розчин Хенка або пропандіол. Крім того, стерильні нелеткі масла можуть застосовуватися як розчинник або суспендуюче середовище.

Зо Для цієї мети можна використовувати будь-яке біосумісне масло, включаючи синтетичні моно- або дигліцериди. Крім того, жирні кислоти, такі як олеїнова кислота, можуть застосовуватися для приготування придатних для ін'єкції препаратів. Носій і агент можуть бути змішані у вигляді рідких розчинів, суспензій, здатних або не здатних до полімеризації гелів, паст або бальзамів.

Носії також можуть містити засіб доставки для уповільнення (тобто пролонгування, затримання або контролю) доставки агента (агентів) або для посилення доставки, поглинання, стабілізації або фармакокінетичних параметрів терапевтичного агента (агентів). Такий засіб доставки може включати, без обмеження, мікрочастинки, мікросфери, наносфери або наночастинки, що складаються з білків, ліпосом, вуглеводів, синтетичних органічних речовин, неорганічних сполук, полімерних або співполімерних гідрогелів і полімерних міцел. Придатні системи доставки на основі гідрогелів і міцел включають співполімери РЕО:РНВ:'РЕО і співполімерні/циклодекстринові комплекси, описані в УУО 2004/009664 А2, і РЕО і

РЕО/циклодекстринові комплекси, описані в публікації заявки на патент США Мо 2002/0019369

А1. Такі гідрогелі можуть бути введені шляхом місцевих ін'єкцій в область передбачуваного впливу або підшкірно, або внутрішньом'язово для забезпечення уповільненого вивільнення агента.

У випадку внутрішньосуглобової доставки інгібуючий МА5Р-2 агент може бути доставлений у вищеописаних призначених для ін'єкцій рідких або гелевих носіях, вищеописаних призначених для ін'єкцій засобах доставки, що забезпечують уповільнене вивільнення, або носіях на основі гіалуронової кислоти або її похідних.

У випадку перорального введення непептидергічних агентів інгібуючий МА5Р-2 агент може бути доставлений в інертних наповнювачах або розчинниках, таких як сахароза, кукурудзяний крохмаль або целюлоза.

У випадку місцевого введення інгібуючий МА5Р-2 агент може бути доставлений у складі мазі, лосьйону, крему, гелю, крапель, супозиторія, спрею, рідини або порошку, або в гелевих або мікрокапсульних системах доставки за допомогою трансдермального пластиру.

Різні назальні і легеневі системи доставки, включаючи аерозолі, дозуючі інгалятори, інгалятори сухого порошку і розпилювачі, знаходяться у стадії розробки і можуть відповідним чином бути адаптовані для доставки препарату за даним винаходом за допомогою аерозолю, інгалятора або засобу доставки у вигляді розпилювача, відповідно. бо У випадку інтратекальної (ІТ) або інтрацеребровентрикулярної (ІСМ) доставки можуть бути використані відповідні стерильні системи доставки (наприклад, рідини, гелі, суспензії і т. д.).

Композиції за даним винаходом також можуть включати біосумісні наповнювачі, такі як диспергуючі або зволожуючі агенти, суспендуючі агенти, розчинники, буфери, агенти, що підсилюють проникнення, емульгатори, зв'язуючі засоби, загусники, ароматизуючі речовини (для перорального введення).

ФАРМАЦЕВТИЧНІ НОСІЇ ДЛЯ АНТИТІЛ І ПЕПТИДІВ

Більш конкретно, відносно анти-МА5бР-2 антитіл і інгібуючих пептидів, наведені як приклад склади можуть вводитися парентерально у вигляді дозованих ін'єкцій розчину або суспензії сполуки у фізіологічно прийнятному розчиннику з фармацевтичним носієм, який може являти собою стерильну рідину, таку як вода, масло, фізіологічний розчин, гліцерин або етанол. У композиціях, що містять анти-МА5БР-2 антитіла і інгібуючі пептиди, додатково можуть бути присутні допоміжні речовини, такі як зволожуючі або емульгуючі агенти, поверхнево-активні речовини, регулюючі рН речовини і т. п. Додаткові компоненти фармацевтичних композицій включають вуглеводневу суміш (таку як тваринного, рослинного або синтетичного походження), наприклад соєву олію і мінеральне масло. Для розчинів, що вводяться шляхом ін'єкцій, переважними рідкими носіями, як правило, є гліколі, такі як пропіленгліколь і поліетиленгліколь.

Анти-МАБР-2 антитіла і інгібуючі пептиди також можуть вводитися у формі ін'єкцій речовин уповільненого всмоктування або імплантованого препарату, який може бути складений з можливістю уповільненого або пульсуючого вивільнення активних агентів.

ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЙНЯТНІ НОСІЇ ДЛЯ ІНГІБІТОРІВ ЕКСПРЕСІЇ

Що стосується інгібіторів експресії, використовуваних у способах за винаходом, надаються композиції, які містять інгібітор експресії, як описано вище, і фармацевтично прийнятний носій або розчинник. Композиції можуть додатково містити колоїдну дисперсійну систему.

Фармацевтичні композиції, які містять інгібітори експресії, можуть включати, без винятку, склади, що містять розчини, емульсії і ліпосоми. Такі композиції можуть бути одержані з різних компонентів, що включають, без обмеження, попередньо приготовлені рідини, самоемульговані тверді речовини і самоемульговані напівтверді речовини. Приготування таких композицій звичайно включає комбінування інгібітору експресії з одним або більше з наступного: буфери, антиоксиданти, низькомолекулярні поліпептиди, білки, амінокислоти, вуглеводи, включаючи

Зо глюкозу, сахарозу або декстрин, хелатуючі агенти, такі як ЕОТА, глютатіон і інші стабілізатори і наповнювачі. Нейтральні забуферені фізіологічні розчини або фізіологічні розчини, змішані з неспецифічним сироватковим альбуміном, є прикладами відповідних розчинників.

У деяких варіантах здійснення композиції можуть бути приготовлені і складені у вигляді емульсій, які звичайно є гетерогенними системами однієї рідкої речовини, диспергованої в іншій у вигляді мікрокрапель (див., Ій450п, в Рпагтасешіса! бозаде Еогт5, Мої. 1, Кіедег апа ВапКег (сєд5.), Магсек ОекККег, Іпс., М.М., 1988). Прикладами природних емульгуючих агентів, використовуваних для складів у вигляді емульсій, є гуміарабік, бджолиний віск, ланолін, лецитин і фосфатиди.

В одному з варіантів здійснення композиції, які містять нуклеїнові кислоти, можуть бути складені у вигляді мікроемульсій. Мікроемульсія, як зазначено в даному описі, являє собою систему з води, масла і амфіфільної речовини, яка являє собою єдиний оптично однорідний і термодинамічно стабільний рідкий склад (див. Ко5боїї, в РПагтасецшііса! Оозаде Еоптв5, Мо1.1).

Спосіб за винаходом також може включати використання ліпосом для перенесення і доставки антисмислових олігонуклеотидів у потрібну ділянку.

Фармацевтичні композиції і склади інгібіторів експресії для топічного нанесення можуть включати трансдермальні пластири, мазі, лосьйони, креми, гелі, краплі, супозиторії, спреї, рідини і порошки. Також можуть бути використані традиційні фармацевтичні носії, наприклад на основі води, порошків або масел, загусники і т. п.

СПОСОБИ ВВЕДЕННЯ

Фармацевтичні композиції, які містять інгібуючі МАЗР-2 агенти, можуть бути введені різними способами, залежно від того, який зі способів введення, місцевий або системний, є більш придатним для захворювання, що підлягає лікуванню. Далі, композиції за даним винаходом можуть бути доставлені шляхом покривання або включення композицій у поверхню імплантованого медичного пристрою або в сам цей пристрій.

СИСТЕМНА ДОСТАВКА

Відповідно до даного опису, термін "системна доставка" або "системне введення" включає, без обмеження, пероральний і парентеральний способи введення, включаючи внутрішньом'язовий (ІМ), підшкірний, внутрішньовенний (ІМ), внутрішньоартеріальний, інгаляційний, під'язиковий, букальний, топічне нанесення, трансдермальний, назальний, бо ректальний, вагінальний і інші способи введення, які забезпечують ефективне диспергування 5О0 доставленого агента в одній або численних ділянках передбачуваного терапевтичного впливу.

Переважні способи системної доставки цих композицій включають внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, підшкірний і інгаляційний. Буде зрозуміло, що точний спосіб системного введення вибраних агентів, використовуваних у конкретних композиціях за даним винаходом, може бути визначений з урахуванням схильності цього агента до метаболічної трансформації способом, асоційованим з даним способом введення. Наприклад, найбільш придатним способом введення пептидергічних агентів є будь-який, крім перорального.

Антитіла і поліпептиди, інгібуючі МАБР-2, можуть бути доставлені суб'єкту, що цього потребує, будь-яким придатним способом. Способи доставки антитіл і поліпептидів МАБР-2 включають пероральне, пульмональне, парентеральне введення (наприклад, внутрішньом'язові, інтраперитонеальні, внутрішньовенні (ІМ) або підшкірні ін'єкції), інгаляцію (наприклад, тонкоподрібненого порошку), трансдермальне, назальне, вагінальне, ректальне або підшкірне введення, і можуть бути приготовлені в лікарських формах, придатних для кожного зі способів введення.

Як ілюстративний приклад, антитіла і пептиди, інгібуючі МАБР-2, можуть бути введені в живий організм шляхом нанесення на слизову оболонку, що має здатність абсорбувати поліпептиди, наприклад слизову носа, шлунково-кишкового тракту і прямої кишки. Поліпептиди звичайно наносять на абсорбуючу слизову оболонку в комбінації з агентом, що підсилює проникність (див., наприклад, І ее М.Н.Г.., Стії. Кем. Тпег. Огид Саїтієг ув. 5:69, 1988; І ее М.Н.Г..,

У. СопігоїІєд Веїєазе, 13:213, 1990; І ее М.Н.І., Еда., Реріїде апа Ргоївіп Огид Оеєїїмегу, Магсеї!

РекКег, Мем Моїк (1991); Оероєг А.С. єї аї., У. СопіюїІєд Веїєазе, 13:241, 1990). Наприклад,

ЗТОНЕ являє собою синтетичне похідне фусидової кислоти, стероїдної поверхнево-активної речовини, яка по своїй структурі аналогічна солям жовчних кислот і яка використовується як агент, що підсилює проникність при назальній доставці (І ее М/.А., Віорпатт. 22, Мом./Оеєс. 1990).

Антитіла і поліпептиди, інгібуючі МАБР-2, можуть бути введені в комбінації з іншою молекулою, наприклад ліпідом, для захисту поліпептидів від ферментної деградації. Наприклад, ковалентне прикріплення полімерів, зокрема поліетиленгліколю (РЕС), використовували для захисту деяких білків від ферментного гідролізу в організмі і, таким чином, продовжували період їх напіввиведення (Риегіде5 Р. еї аїЇ.,, У. СопігоПей Кеїеазе, 11:139, 1990). Описано багато полімерних систем для доставки білків (Ває У.Н. еї аї.,.). СопігоПей Кеїеавзе, 9:271, 1989; Ногі Кк. еї аі., Рнапт. Незв. 6:813, 1989; МатакКауча І. єї аї., У. Рнапт. сі. 79:505, 1990; Мознпініго І. еї аї., у.

Сопігоїїєд Веїєазе, 10:195, 1989; Азапо М. евї аї.,. СопігоїІєд Реїєазе, 9:111, 1989; Возепріай 4). еї аї., у. СопігоїІєд Веїєазе, 9:195, 1989; Макіпо К., У. Сопігоей Неїєазе 12:235, 1990; ТаКаКита

У. еї а!., У. Рпагт. 5сі. 78:117, 1989; Такакига У. єї аї., У. Рнапт. 5сі. 78:219, 1989).

Нещодавно були розроблені ліпосоми з підвищеною стабільністю в сироватці і збільшеним періодом напіввиведення (див., наприклад, патент США Мо 5,741,516, УМерб). Крім того, були розглянуті різні способи виробництва ліпосом і ліпосомоподібних препаратів як потенційних носіїв лікарських речовин (див., наприклад, патент США Мо 5,567,434, 520Ка; патент США Мо 5,552,157, Маді; патент США Мо 5,565,213, МаКатогі; патент США Мо 5,738,868, ЗПпіпКагепко; і патент США Мо 5,795,587, сао).

Для трансдермального нанесення антитіла і поліпептиди, інгібуючі МА5БР-2, можуть бути об'єднані з іншими придатними інгредієнтами, такими як носії і/або ад'юванти. Такі інгредієнти використовуються незалежно від їх природи, за винятком того, що вони повинні бути фармацевтично прийнятними для передбачуваного введення і не повинні зменшувати вплив активних інгредієнтів композиції. Приклади придатних основ включають креми, мазі, гелі або суспензії, що містять або не містять очищений колаген. Антитіла і поліпептиди, інгібуючі МА5Р- 2, також можуть бути імпрегновані в трансдермальні пластири, пов'язки і бандажі, переважно в рідкій або напіврідкій формі.

Композиції за даним винаходом можуть вводитися системно через визначені проміжки часу, необхідні для підтримання необхідного рівня терапевтичного ефекту. Наприклад, склади можуть вводитися шляхом підшкірних ін'єкцій кожні два-чотири тижні або через менш часті проміжки часу. Режим дозування визначається лікарем з урахуванням різних факторів, які можуть впливати на дію комбінації агентів. Ці фактори включають ступінь прогресування захворювання, що підлягає лікуванню, вік пацієнта, його стать і вагу і інші клінічні фактори. Доза кожного окремого агента буде мінятися залежно від функції інгібуючого МА5БР-2 агента, включеного в композицію, а також від наявності і природи будь-якого засобу для доставки лікарської речовини (наприклад, засобу для доставки з уповільненим вивільненням). Крім того, дозування можна коректувати з урахуванням частоти введення і фармакокінетичної поведінки агента (агентів), що доставляється. 60 МІСЦЕВА ДОСТАВКА

Використовуваний у даному описі термін "місцеве" охоплює нанесення препарату на або навколо області передбачуваного місцевого впливу і може включати, наприклад, топічну доставку на шкіру або іншу уражену тканину, офтальмологічну доставку, інтратекальне (ІТ), інтрацеребровентрикулярне (ІСМ), внутрішньосуглобове, внутрішньопорожнинне, внутрішньочерепне або внутрішньоміхурове введення, розміщення або зрошення. Місцеве введення може бути більш переважним з точки зору введення більш низьких доз, запобігання виникненню системних побічних ефектів і для більш точного контролю часу доставки і концентрації активних агентів у ділянці місцевої доставки. Місцеве введення передбачає відомі концентрації в цільовій області, незалежно від індивідуальних відмінностей між пацієнтами з точки зору метаболізму, кровообігу і т. д. Поліпшений контроль дозування також забезпечується прямою доставкою.

Місцева доставка інгібуючого МА5Р-2 агента може бути досягнута в контексті хірургічних методів лікування захворювань або розладів, викликаних або ускладнених фіброзом і/або запаленням, наприклад під час процедур, таких як операція.

РЕЖИМИ ЛІКУВАННЯ

У профілактичних цілях фармацевтичні композиції, які містять інгібуючий МАЗР-2 агент (наприклад, інгібуюче МАБР-2 антитіло), вводять суб'єкту, що схильний до або має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням, у кількості, достатній для пригнічення фіброзу і/або запалення, таким чином усуваючи або зменшуючи ризик розвитку симптомів цього стану. У деяких варіантах здійснення, фармацевтичні композиції вводять суб'єкту з підозрою на наявність захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням, або який вже страждає таким захворюванням або розладом, у терапевтично ефективній кількості, достатній для полегшення або щонайменше часткового зменшення симптоматики цього стану. Як у профілактичних, так і в терапевтичних цілях, композиції, які містять інгібуючий МАБЗР-2 агент, можуть вводитися декількома дозами до досягнення достатнього терапевтичного результату. Застосування інгібуючих МА5Р-2 композицій за даним винаходом може здійснюватися шляхом однократного введення композиції або обмеженої серії введень для лікування гострого стану, асоційованого з фіброзом і/або запаленням. Альтернативно, композиція може вводитися через визначені

Зо проміжки часу протягом тривалого часу для лікування хронічного стану, асоційованого з фіброзом і/або запаленням.

Як у профілактичних, так і в терапевтичних цілях, композиції, які містять інгібуючий МА5Р-2 агент, можуть вводитися декількома дозами до досягнення достатнього терапевтичного результату. В одному з варіантів здійснення, інгібуючий МА5Р-2 агент містить інгібуюче МАБР-2 антитіло, яке переважно може бути введене дорослому пацієнту (наприклад, дорослому пацієнту з середньою вагою 70 кг) у дозі в межах від 0,1 до 10000 мг, більш переважно від 1,0 до 5000 мг, більш переважно від 10,0 до 2000 мг, більш переважно від 10,0 до 1000 мг і ще більш переважно від 50,0 до 500 мг. Для пацієнтів дитячого віку дозу можна коректувати пропорційно вазі пацієнта. Застосування інгібуючих МА5Р-2 композицій за даним винаходом може здійснюватися шляхом однократного введення композиції або обмеженої серії введень для лікування суб'єкта, що страждає або має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням. Альтернативно, композицію можна вводити через визначені проміжки часу, наприклад щодня, два рази на тиждень, раз на тиждень, через тиждень, раз на місяць, два рази на місяць, протягом тривалого часу для лікування суб'єкта, що страждає або має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом і/або запаленням.

Як у профілактичних, так і в терапевтичних цілях, композиції, які містять інгібуючий МА5Р-2 агент, можуть вводитися декількома дозами до досягнення достатнього терапевтичного результату.

У деяких варіантах здійснення суб'єкта ідентифікують як такого, що має ризик розвитку захворювання або розладу, викликаного або ускладненого фіброзом або запаленням, шляхом визначення наявності у суб'єкта одного або більше симптомів порушення функції нирок, оцінених, наприклад, шляхом вимірювання рівня креатиніну в сироватці, швидкості виведення креатиніну з сироватки, рівня азоту в сечі, білка в сечі і/або шляхом вимірювання одного або більше біомаркерів, асоційованих з захворюванням або ураженням нирок.

Способи оцінки функції нирок добре відомі в даній галузі і включають, без обмеження, вимірювання системного кров'яного тиску і гломерулярного капілярного тиску, протеїнурії (наприклад, альбумінурії), мікроскопічної і макроскопічної гематурії, рівня креатиніну в сироватці (наприклад, відповідно одній з формул оцінки функції нирок у людей, рівень креатиніну, що 60 дорівнює 2,0 мг/дл, відповідає 50 95 нормальній функції нирок, а 4,0 мг/дл - 25 95), зниження швидкості клубочкової фільтрації (наприклад, швидкості кліренсу креатиніну) і ступінь канальцевого ушкодження. Наприклад, оцінка функції нирок може включати оцінку щонайменше однієї функції нирок з використанням біологічних і/або фізіологічних параметрів, таких як рівень креатиніну в сироватці крові, швидкість кліренсу креатиніну, секреція білка за 24 години, швидкість клубочкової фільтрації, співвідношення креатиніну і альбуміну в сечі, швидкість виведення альбуміну (наприклад, визначення ступеня фіброзу нирок шляхом вимірювання відкладення колагену і/або фібронектину).

МІ. ПРИКЛАДИ

Наведені нижче приклади є тільки ілюстрацією найкращого способу практичної реалізації даного винаходу і не повинні розглядатися як обмежуючі даний винахід. Усі згадані в даній заявці літературні джерела включені в даний опис у вигляді посилання.

ПРИКЛАД 1

У цьому прикладі описане одержання мишачої лінії, дефіцитної по МАБР-2 (МА5Р-2-/-), але повноцінної по МАр19 (МАр19-/).

Матеріали і методи

Цільовий вектор рКОо-МТКУ-1901 створювали для руйнування трьох екзонів, кодуючих С- термінальний кінець мишачого МАБР-2, включаючи екзон, який кодує домен серинової протеази, як показано на фіг. 3. РКО-МТКУ-1901 використовували для трансфекції мишачої Е5 клітинної лінії Е14.1їа (5М129 Оіа). Відбирали клони, стійкі до неоміцину і чутливі до тимідинкінази. 600 Е5б-клонів піддавали скринінгу, і з них за допомогою саузерн-блот-аналізу ідентифікували і верифікували чотири різні клони, що містять необхідні селективні цільові і рекомбінантні події, як показано на фіг. 3. Шляхом перенесення ембріона із цих чотирьох позитивних клонів одержували химери. Потім химери піддали зворотному схрещуванню з фоновим фенотипом С57/ВІб6 з одержанням трансгенних особин чоловічої статі. Потім трансгенних особин чоловічої статі схрещували з жіночими з одержанням РЕ1 з 50 95 потомства, що проявляє гетерозиготність по порушеному гену МА5БР-2. Гетерозиготних мишей схрещували між собою з одержанням гомозиготного потомства, дефіцитного по МА5БР-2, з одержаним співвідношенням між гетерозиготними мишами і мишами дикого типу 1:2:1, відповідно.

Результати і фенотип

Зо Одержаних у результаті гомозиготних МАБР-2-/- дефіцитних мишей, які виявилися життєздатними і фертильними, перевіряли на дефіцит по МА5Р-2 за допомогою саузерн-блот- аналізу для підтвердження коректної цільової події, за допомогою нозерн-блот-аналізу для підтвердження відсутності мРНК МАБР-2 і за допомогою вестерн-блот-аналізу для підтвердження відсутності білка МА5Р-2 (дані не показані). Наявність мРНК Март9 і відсутність

МРНАК МАБР-2 далі підтверджували методом ПЛР-РЧ з розрізненням за часом на пристрої

ПопСусіег. Як і очікувалося, у МАЗР-2-/- мишей тривала експресія мРНК і білків Мар19, МА5Р-1 і МАБ5БР-3 (дані не показані). МАБР-2-/- мишей аналізували на наявність і надмірну кількість

МРНК пропердину, фактора В, фактора 0, С4, С2 і СЗ за допомогою І ідпіСусієг аналізу, і було знайдено, що вони ідентичні рівням, наявним у контрольних одноприплідних тварин дикого типу (дані не показані). Плазма гомозиготних МА5ЗР-2-/- мишей була повністю дефіцитною відносно активації комплементу, опосередкованої лектиновим шляхом, як описано нижче в прикладі 2.

Генерація МА5Р-2-/- лінії на чистому фоновому генотипі С57ВІ 6

МА5Р-2-/- мишей піддавали зворотному схрещуванню з чистою лінією С57ВІ 6 протягом дев'яти генерацій до використання МА5Р-2-/- лінії як експериментальної тваринної моделі.

Трансгенну мишачу лінію, яка являє собою мишачу МАБЗР-2-/-, МАр19-/- лінію і яка експресує людський МАБР-2 трансген (мишачий МА5БР-2 нокаут і людський МАЗР-2 нокін), одержували наступним чином.

Матеріали і методи

Створювали міні-ген, коюодуючий людський МА5Р-2, названий "міні- пМАБР-2" (ЗЕО ІЮ МО:49), як показано на фіг. 4, який включає промоторну область гена людського МАБР-2, включаючи три перші екзони (екзон 1 - екзон 3), за якою іде послідовність КДНК, яка є кодуючою послідовністю з 8 послідовно розташованих екзонів, забезпечуючи кодування повнорозмірного білка МА5Р-2, що запускається ендогенним промотором. Конструкцію міні-пМА5Р-2 вводили в запліднені яйця МАБР-2-/-. щоб замінити дефіцитний мишачий МАБР-2 ген трансгенно експресованим людським МА5Р-2.

ПРИКЛАД 2

У цьому прикладі показано, що МАБР-2 потрібний для активації комплементу через лектиновий шлях.

Матеріали і методи бо Аналіз розщеплення С4, специфічного для лектинового шляху

Аналіз розщеплення С4 описаний в Реїеггхеп еї аї.,»У. Іттипої. Меїйпоав5, 257:107 (2001), у якому вимірювали активацію лектинового шляху, ініційовану ліпотейхоєвою кислотою (І ТА) від 95. ашгецйв5, яка зв'язується з І -фіколіном. Аналіз, описаний Реїегзеп еї аї!. (2001), адаптували для вимірювання активації лектинового шляху за допомогою МВІ шляхом нанесення на планшет

ЛПС ї манану або зимозану перед додаванням сироватки, одержаної від МАБР-2-/- мишей, як описано нижче. Аналіз також модифікували для виключення можливості розщеплення С4 по класичному шляху. Це досягалося шляхом використання буфера для розведення зразка, що містить ТМ Масі, який забезпечував високу спорідненість зв'язування компонентів упізнавання лектинового шляху зі своїми лігандами, але запобігав активації ендогенного С4, таким чином виключаючи участь класичного шляху в результаті дисоціації комплексу С1. Коротко, у модифікованому аналізі зразки сироватки (розведені буфером з високим вмістом солі (1М масі) додавали в планшети, покриті лігандом, з наступним додаванням постійної кількості очищеного СА у буфері з фізіологічною концентрацією солі. Зв'язані комплекси упізнавання, що містять МАБР-2, розщеплюють С4, приводячи до відкладення С4р.

Способи аналізу 1) Титраційні мікропланшети Мипс Махізогр (МахібЗогоФ, Мипс, кат. Мо 442404, Різпег

Зсіепійіс) покривали 1 мкг/мл мананом (М7504 5бідта) або будь-яким іншим лігандом (таким, як перераховані нижче), розведеним у буфері для нанесення покриття (15 мМ МаСоОз, 35 мМ

Ммансо», рН 9,6).

В аналізі використовували наступні реагенти: а) манан (1 мкг на ямку манану (М7504 бідіта) в 100 мкл буфера для нанесення покриття); р) зимозан (1 мкг на ямку зимозану (5бідта) в 100 мкл буфера для нанесення покриття); с) Г ТА (1 мкг на ямку в 100 мкл буфера для нанесення покриття або 2 мкг на ямку в 20 мкл метанолу); а) 1 мкг Н-фіколін-специфічного Маб 4Н5 у буфері для нанесення покриття; е) РБА від Аегососсиз мігідап5 (2 мкг на ямку в 100 мкл буфера для нанесення покриття);

І) 100 мкл на ямку 5. ашген5 О5М20233, фіксованого у формаліні (ОЮО550о-0,5), у буфері для нанесення покриття. 2) Планшет інкубували протягом ночі при 4 2С.

Зо З) Після нічної інкубації ділянки зв'язування білка, що залишилися, насичували шляхом інкубації планшетів з 0,1 95 НЗА-ТВ5 блокувальним буфером (0,1 95 (в/о) Н5А в 10 мМ Ттів-СІ, 140 мМ Масі, 1,5 мМ Мам», рН 7,4) протягом 1-3 годин, і потім планшети промивали три рази сумішшю ТВ5/Твін/Саг: (ТВ5 з 0,05 95 Твін 20 і 5 мМ Сасі», 1 мм Масі», рН 7,4). 4) Зразки сироватки, що підлягають тестуванню, розбавляли в МВІ -зв'язувальному буфері (М масі), і розведені зразки додавали в планшети і інкубували протягом ночі при 4 "С. Ямки, у які додавали тільки буфер, використовували як негативний контроль. 5) Після нічної інкубації при 4 "С, планшети тричі промивали сумішшю ТВ5/Івін/Са?". Потім у планшет додавали людський С4 (1 мкг/мл розведеного в ВВ5 (4 мМ барбіталу, 145 мМ Масі, 2

ММ Сабсі», 1 мМ Масі»г, рН 7,4) по 100 мкл на ямку) і інкубували протягом 90 хвилин при 37 С.

Потім планшети знову тричі промивали сумішшю ТВ5/Івін/Саг». 6) Відкладення С4Б визначали за допомогою кон'югованого з лужною фосфатазою курячого антилюдського С4с (розведеного у співвідношенні 1:11000 в ТВ5/Івін/Саг:"), яке додавали в планшети і інкубували протягом 90 хв. при кімнатній температурі. Потім планшети знову тричі промивали сумішшю ТВ5/Твін/Саг». 7) Лужну фосфатазу детектували шляхом додавання 100 мкл розчину п- нітрофенілфосфатного субстрату, інкубації при кімнатній температурі протягом 20 хвилин і зчитування оптичної густини ОЮхо на пристрої зчитування титраційних мікропланшетів.

Результати

На фіг. 5А-В показане відкладення С46 на манані (фіг. 5А) і зимозані (фіг. 58) у розведених сироватках, одержаних від МАБР-2-/- (хрести), МАБР-2-/- (замкнені кільця) і МАБР-2-/- (замкнені трикутники) мишей. На фіг. 5С показана відносна активність С4-конвертази на планшетах, покритих зимозаном (білі стовпці) або мананом (темні стовпці) для МАБР-2-/-- мишей (п-5) ії МАБР-2-/- мишей (п-4) відносно мишей дикого типу (п-5), виміряна по відкладенню С4р, нормалізованого відносно сироватки мишей дикого типу. Планки погрішностей представляють стандартне відхилення. Як показано на фіг. 5БА-С, у покритих мананом і зимозаном планшетах плазма, одержана від МАБР-2-/- мишей, є повністю дефіцитною по активації комплементу, опосередкованій лектиновим шляхом. Ці результати з очевидністю демонструють, що МА5БР-2, а не МАБР-1 або МАБбР-3, є ефекторним компонентом лектинового шляху. 60 Рекомбінантний МАБР-2 відновлює активацію С4, опосередковану лектиновим шляхом, у сироватці, одержаній від МА5Р-2-/- мишей

Для встановлення факту, що відсутність у МАБР-2-/- мишей МА5БР-2 є безпосередньою причиною втрати активації С4, залежної від лектинового шляху, за допомогою описаного вище аналізу розщеплення С4 оцінювали вплив додавання рекомбінантного білка МАБР-2 у зразки сироватки. Рекомбінантні білки, функціонально активний мишачий МАЗР-2 і каталітично неактивний мишачий МА5Р-2А (у якому сериновий залишок в активній ділянці домену серинової протеази заміщений залишком аланіну), одержували і очищали, як описано нижче в прикладі 3.

Об'єднану сироватку, одержану від чотирьох МАБР-2-/- мишей, попередньо інкубували з підвищенням концентрації рекомбінантного мишачого МА5Р-2 або неактивного рекомбінантного мишачого МА5Р-2А, і активність С4-конвертази оцінювали, як описано вище.

Результати

Як показано на фіг. 6, додавання функціонально активного мишачого рекомбінантного білка

МАБР-2 (показаного білими трикутниками) у сироватку, одержану від МАБР-2-/- мишей, відновлювало активацію С4, залежну від лектинового шляху, залежно від концентрації білка, при цьому каталітично неактивний мишачий білок МАЗР-2А (показаний зірочками) не відновлював активацію С4. Результати, показані на фіг. 6, нормалізували відносно активації С4, спостережуваної в об'єднаній сироватці мишей дикого типу (позначено пунктирною лінією).

ПРИКЛАД З

У цьому прикладі показана рекомбінантна експресія і продукування рекомбінантних повнорозмірних людських, щурячих і мишачих білків МА5Р-2, поліпептидів, похідних від МА5Р- 2, і каталітично неактивних мутантних форм МА5Р-2.

Експресія повнорозмірного людського, щурячого і мишачого МАБР-2

Повнорозмірну послідовність КДНК людського МАБР-2 (5ЕО ІЮ МО:4) також субклонували у вектор експресії рСІ-Мео ссавців (Рготеда), який керує еукаріотичною експресією під контролем

СМУ енхансерної/промоторної області (описано в Кашїтап К..). еї аї., Мисівїс Асіа5 Кезеагсй, 19:4485-90, 1991; Кашїтап, Меїноад5 іп Епгутоіоду, 185:531-66 (1991)). Повнорозмірні мишачу

КДНК (ЗЕО ІЮ МО:50) і щурячу КДНК МАБР-2 (5ЕО ІЮ МО:53) субклонували у вектор експресії рЕО. Вектори експресії МА5БР-2 потім трансфікували в адгезивні лінії клітин яєчників китайського хом'ячка ЮХВІ по стандартній процедурі трансфекції з використанням фосфату кальцію,

Зо описаної в Мапіаїз єї а!., 1989. Клітини, трансфіковані такими конструкціями, розвивалися дуже повільно, що можна пояснити цитотоксичністю кодованої протеази.

В іншому підході, конструкцію міні-гена (ЗЕО ІЮ МО:49), що містить людську КДНК МА5Р-2, керовану ендогенним промотором, піддавали тимчасовій трансфекції в клітинах яєчників китайського хом'ячка (СНО). Людський білок МАБР-2, секретований у культуральне середовище, виділяли за схемою, описаною нижче.

Експресія повнорозмірного каталітично неактивного МА5Р-2

Обгрунтування

МАБР-2 активували шляхом аутокаталітичного розщеплення після зв'язування субкомпонентів розпізнавання МВІ. або фіколінів (або І-фіколіну, Н-фіколіну, або М-фіколіну) з відповідними їм вуглеводними молекулами. Аутокаталітичне розщеплення, що приводить до активації МА5Р-2, часто відбувається під час процедури виділення МА5Р-2 із сироватки або під час очищення після рекомбінантної експресії. Для одержання більш стабільного препарату білка для застосування як антигену каталітично неактивну форму МА5Р-2, позначену як МА5Р-2А, створювали шляхом заміщення залишку серину, який присутній у каталітичній тріаді домену протеази, залишком аланіну у щурів (5ЕО ІЮ МО:55 5егб617 на АїІаб17); у мишей (ЗЕО ІО МО:52 зегб17 на АІаб17) або у людини (ЗЕО ІЮ МО:6 Зегб18 на АїІаб18).

Для одержання каталітично неактивних людських і мишачих білків МА5Р-2А, здійснювали сайт-спрямований мутагенез, використовуючи олігонуклеотиди, представлені в таблиці 5.

Олігонуклеотиди, наведені в таблиці 5, створювали шляхом відпалу з ділянкою людської і мишачої кДНК, кодуючої ферментативно активний серин, а олігонуклеотид містив невідповідність для заміни кодону серину на кодон аланіну. Наприклад, ПЛР-олігонуклеотиди

ЗЕО ІЮ МО5:56-59 використовували в комбінації з лодською КДНК МА5БР-2 (5ЕО ІЮО МО:4) для ампліфікації ділянки від старт-кодону до ферментативно активного серину і від серину до стоп- кодону для одержання повного відкритого зчитування з мутованого МАБР-2А, що містить мутацію 5егб18/АІаб18. Продукти ПЛР очищали після електрофорезу в агарозному гелі і одержання смуг, і одержували одиночні аденозинові перекриття, використовуючи стандартну процедуру нарощування. Потім МАБР-2А з доданим аденозином клонували у вектор РЕЕМ-Т

Еазу і трансформували в Е. сої.

Каталітично неактивний щурячий білок МАЗР-2А одержували, піддаючи 5ЕО ІЮ МО:64 і 5ЕО бо ІО МО:65 дії кінази і відпалу шляхом об'єднання цих двох олігонуклеотидів у рівних молярних об'ємах, нагрівання при температурі 100 "С протягом 2 хвилин і повільного охолодження при кімнатній температурі. Одержаний у результаті відпалу фрагмент містив РЗИ і Храї1 сумісні кінці і був вставлений замість фрагмента РеИ-Хра!1! КДНК щурячого МА5БР-2 дикого типу (ЗЕО ІЮ

МО:53) з одержанням щурячого МА5Р-2А. 5в-алдсстадСа,асАада,аавАдасайСАТТАСТаТттт-3 (5ЕО І МО:64);

Б-СТАБАААСАСТААТОССССТоСстТасСсаТтСАССТОСТасА-З (5ЕО ІЮ МО:65).

Потім кожний з людського, мишачого і щурячого МА5Р-2А субклонували у вектори експресії ссавців РЕО або рсіІ-Мео і трансфікували в лінії клітин ОХВІ яєчників китайського хом'ячка, як описано нижче.

В іншому підході каталітично неактивну форму МАЗР-2 одержували способом, описаним в

Спеп еї аї., У. Віої. Спет., 276(28); 25894-25902, 2001. Коротко, плазміду, що містить повнорозмірну КДНК людського МА5Р-2 (описано в Тієї еї аІ. Маїиге, 386:506, 1997), розрізали рестриктазами Хпої і ЕсоК1, і кДНК МАБР-2 (наведену в даному описі в 5ЕО ІЮ МО:4) клонували по відповідних сайтах рестрикції в бакуловірусний вектор перенесення рЕабзіВавє (І іїте

Тесппоодіє5, МУ). Потім 5егб618 в активній ділянці серинової протеази МА5БР-2 заміняли АїІаб18 шляхом заміщення двониткових олігонуклеотидів, кодуючих ділянку пептиду з 610 по 625 амінокислоту (ЗЕО ІЮО МО:13), природною ділянкою з 610 по 625 амінокислоту для одержання повнорозмірного поліпептиду МА5Р-2 з неактивним протеазним доменом.

Конструювання експресійних плазмід, що містять поліпептидні ділянки, одержані від людського МАБР-2

Для забезпечення секреції різних доменів МАЗР-2 одержували наступні конструкції з використанням сигнального пептиду МАБР-2 (залишки 1-15 в 5ЕБО ІЮ МО:5). Конструкцію, експресуючу домен СОВІ людського МАБР-2 (5ЕБЕО ІО МО:8), одержували ПЛР-ампліфікацією ділянки, кодуючої залишки 1-121 МАБР-2 (ЗЕО ІЮ МО:6) (відповідає М-термінальному домену

СИВІ) Конструкцію, експресуючу домен СИОВІЄСОЕ людського МАБР-2 (5ЕБЕО ІЮ МО:9), одержували ПЛР-ампліфікацією ділянки, кодуючої залишки 1-166 МАБР-2 (5ЕО ІЮ МО:6) (відповідає М-термінальному домену СИВІЕСЕ). Конструкцію, експресуючу домен

СОВІЕСЕСИиВІЇ людського МАБР-2 (5ЕБЕО ІЮ МО:10), одержували ПЛР-ампліфікацією ділянки, кодуючої залишки 1-293 МАБР-2 (5ЕБЕО ІО МО:6б) (відповідає М-термінальному домену

Зо СОВІЕСЕСИВІІ)О. Вищевказані домени ампліфікували методом ПЛР, використовуючи Мепів полімеразу і рВ5-МАБР-2 як матрицю, відповідно до встановлених способів ПЛР. У послідовність 5'-праймера смислового праймера (5-СЧСаАТОСАТОАаСОаСсТастаАСссСто-3'

ЗБО ІЮ МО:34) вводили сайт рестрикції Ватні (підкреслений) на 5'-кінці ПЛР-продукту.

Антисмислові праймери для кожного домену МА5Р-2, показані нижче в таблиці 5, одержували шляхом введення стоп-кодону (напівжирний шрифт), за яким додавали сайт Есокі (підкреслений) на кінці кожного ПЛР-продукту. Після ампліфікації фрагменти ДНК обробляли рестриктазами Ватні і ЕсокіІ і клонували у відповідні ділянки вектора рЕазіВас1. Одержані в результаті конструкції були охарактеризовані за допомогою рестрикційного картування і підтверджені секвенуванням длДНК.

ТАБЛИЦЯ 5

ПЛР-ПРАЙМЕРИ ДЛЯ МА5Р-2

ЗЕО ІЮ МО:8 5-баспАТССАТада 5в-айпААТТОСТАСИасСтТасА

СИОВІ (аа 1-121 в БЕО ІЮ МО:6) | аСТасСстТадсссто-3' (5ЕО ІО | ТА-9'(5ЕО ІО МО:З5)

МО:34

ЗЕО І МО:9 5-баспАТССАТада 5Б-апААТТОСТАСАССОКЯССС

СОВІЕСЕЕ (аа 1-166 в БЕОІЮ | с,СстТастадсссто-3' (5ЕО ІО | СТ-3'(5ЕО ІО МО:З36)

МО:6 МО:34

ЗЕО І МО0 5-баспАТССАТада 5Б-апААТТОСТАИТАаТОас

СОВІЕСЕСИВІЇ (аа 1-293 в БЕО ССТасСтТадсссто-3' (5ЕО ІО | АТ-3' (5ЕО О МО:37)

ІО МО:6б МО:34

ЗЕО І МО4 5-АТЯВОАСОЯОСТО,СТаА Б-ТТААААТСАСТААТТАТ

Людський МА5Р-2 состостасасстто-3 (5ЕеЕО | ат оТосСАТО-3' (5ЕО І

ІО МО:56) ЛИМАБР-2 прямий МО:59) ИМА5Р-2 зворотний

ЗЕО ІЮ МО:А 5-бдадаатадСОасСА вБ-атассосстостасатсА

КДНК людського МА5Р-2 сслдсаспасСАС-З3' (5ЕО1О ССтТотТа-3 (ЗЕО І МО:57)

МО:58) ИМАБР-2 Аа прямий |НМА5Р-2 Аа зворотний

ТАБЛИЦЯ 5

ПЛР-ПРАЙМЕРИ ДЛЯ МА5Р-2

ЗЕО ІЮ МО:50 5-АТОАСОСТАСТСА Б-ТТАСАААТТАСТТАТТАТ

КДНК мишачого МА5ЗР-2 ТеоТТоСтТОаа-3 (5ЕБЕО І МО:60)| «ТТ СОТСААТОСЗ- (5ЕО 10 тптМАБР-2 прямий МО:63) тМА5бР-2 зворотний

ЗЕО ІЮ МО:50 5Б-ссссоссста7асиато 5-стаСсАаАлсатадСасАа

КДНК мишачого МАБР-2 Аестотасда-35' (5ЕО І саасиаа-3' (5ЕО ОО МО:61)

МО:62) тМА5Р-2 АЇїа прямий |тМА5БР-2 АїПІа зворотний

Еукаріотична експресія рекомбінантного МАБР-2 і одержання ферментативно неактивних мишачого, щурячого і людського білків МАЗР-2А

Вищеописані експресійні конструкції МАБР-2 і МАБР-2А трансфікували в ОХВ1-клітини за допомогою стандартної процедури кальцій-фосфатної трансфекції (Мапіаї5 еї а!., 1989). МА5Р- 2А одержували в безсироватковому живильному середовищі, щоб виключити контамінацію препаратів іншими сироватковими білками. Через день збирали конфлюентні клітини з живильних середовищ (у загальній складності процес проводили чотири рази). Середній рівень рекомбінантного МАБЗР-2А для кожного із трьох видів склав приблизно 1,5 мг/літр культурального середовища.

Очищення білка МА5Р-2А

МА5Р-2А (мутантну форму Зег-АІа, описану вище) очищали афінною хроматографією на колонках із МВР-А-агарозою. Ця стратегія дозволяє проводити швидке очищення без використання зовнішніх маркерів. МАБР-2А (100-200 мл живильного середовища, розведеного рівним об'ємом завантажувального буфера (50 мМ Ттгі5-СІ, рН 7,5, що містить 150 мМ Масі і 25

ММ Сасіг) завантажували в колонку з МВР-агарозою (4 мл) для афінної хроматографії, попередньо зрівноважену 10 мл завантажувального буфера. Після промивання додатковими 10 мл завантажувального буфера білок елюювали в 1 мл фракціях з 50 мМ Тгіб5-СІ, рН 7,5, що містить 1,25М Масі і 10 мМ ЕОТА. Фракції, що містять МА5Р-2А, ідентифікували за допомогою зО5-електрофорезу в поліакриламідному гелі. При необхідності, МАЗР-2А додатково очищали за допомогою іонообмінної хроматографії на колонці Мопос) (МЕ 5/5). Білок діалізували з 50 мМ

Тіів-СІ, рН 7,5, що містить 50 мМ Масі, і завантажували в колонку, зрівноважену тим же буфером. Після промивання зв'язаний МАБР-2А елюювали 10 мл 0,05-1М градієнтним розчином Масі.

Результати

Вихід білка МАБР-2А склав 0,25-0,5 мг на 200 мл середовища. Молекулярна маса, визначена методом МАГОІ-М5, склала 77,5 кДа, що перевищило розрахункову величину для немодифікованого поліпептиду (73,5 кДа) у зв'язку з глікозилуванням. Приєднання гліканів до кожного з сайтів М-глікозилування пояснює спостережувану масу. МАБР-2А мігрував у вигляді

Зо однієї смуги в 5ЗО5-поліакриламідних гелях, свідчачи про те, що в процесі біосинтезу він не піддався протеолітичному розкладанню. Середньозважена молекулярна маса, визначена шляхом рівноважного ультрацентрифугування, узгоджується з розрахунковою величиною для гомодимерів глікозилованого поліпептиду.

ОДЕРЖАННЯ РЕКОМБІНАНТНИХ ПОЛІПЕПТИДІВ ЛЮДСЬКОГО МАЗБР-2

Інший спосіб одержання рекомбінантних похідних поліпептидів МА5Р-2 і МАБР-2А описаний в Тпієїеєп5 М.М. еї аї., У. Іттипої. 166:5068-5077, 2001. Коротко, клітини комахи 5родорієга

Тїпидірегаа (клітини Кеаду-Ріадне 50, одержані від компанії Момадеп, Мадізоп, УЛ) вирощують і підтримують у безсироватковому живильному середовищі 519001 (те Тесппоіодієв), що містить 50 МЕ/мл пеніциліну і 50 мг/мл стрептоміцину (І їе Тесппоіодіє5). Клітини комахи Тгіспоріивіа пі (Ніч Гїмеє) (одержані від дайміда Спгорослек, Іпбійшї де Віоїодіє бігисіигаІє, Степобіє, Егапсе), підтримують у середовищі ТС100 (І їе Тесппоїодіе5), що містить 10 95 ЕС5 (ЮОотіпідне Оші5спег,

Вгитаїйй, Егапсе), доповненому 50 МЕ/мл пеніциліну і 50 мг/мл стрептоміцину. Рекомбінантні бакуловіруси одержують за допомогою системи Вас-0о-Вас (І їе Тесппоіодіе5). Бакмідну ДНК очищають за допомогою системи очищення Оіадеп тідіргер (Оіадеп) і використовують для трансфекції клітин комах 519, використовуючи селфектин у середовищі 51900 І ЗЕМ (Ше

Тесппоодіє5), згідно з протоколом виробника. Рекомбінантні вірусні частинки збирають через 4 дні, титрують методом вірусних бляшок і ампліфікують, як описано в Кіпд апа Роз5еє, Те

Васшоміги5 Ехргеззіоп Зувзієт: А І арогаюгу Сиціде, Спартап апа Наї! Па., І опаоп, рр.111-114, 1992.

Клітини Нідп іме (1,75х107 клітин/175-см" тканинної культури в колбі) інфікували рекомбінантними вірусами, що містять поліпептиди МА5Р-2, шляхом множинного інфікування, 2 рази, у середовищі 51900 І 5ЕМ при 28 "С протягом 96 годин. Супернатанти збирали центрифугуванням і додавали дізопропілфосфорофлуоридат до одержання кінцевої концентрації 1 мМ.

Поліпептиди МАБР-2 секретувалися у клітинній культурі в живильне середовище.

Культуральні супернатанти піддавали діалізу проти 50 мМ Масі, 1 мМ СасСі», 50 мМ триетаноламіну гідрохлориду, рН 8,1, і завантажували зі швидкістю 1,5 мл/хв. у колонку О- зЗерпагозе Раві Ріом/ (Атег5Нат РНаптасіа Віоїесі) (2,8х12 см), зрівноважену тим же буфером.

Елюювання проводили, використовуючи 1,2 літра лінійного градієнта в 350 мм Масі у цьому ж буфері. Фракції, що містять рекомбінантні поліпептиди МАБбР-2, ідентифікували вестерн-блот- аналізом, осаджували шляхом додавання (МНа4)25054 до 60 95 (по вазі) і залишали на ніч при 4 "б. Осади ресуспендували в 145 мМ Масі, 1 мМ Сасі», 50 мМ триетаноламіну гідрохлориду, рН 7,4, і вносили в колонку Т5К 53000 БУС (7,5х600 мм) (Тозопаа5, МопідотегуміПе, РА), зрівноважену тим же буфером. Потім очищені поліпептиди концентрували до 0,3 мг/мл методом ультрафільтрації в мікроконцентраторах Місгозер (порогове значення ММУ-10000) (Рійгоп,

Капвівіп, Септапу).

ПРИКЛАД 4

У цьому прикладі описане одержання поліклональних антитіл до МА5Р-2 поліпептидів.

Матеріали і методи

МА5Р-2 антигени

Поліклональну антисироватку проти людського МАБР-2 одержували імунізацією кроликів наступними виділеними поліпептидами МА5БР-2: людський МАБР-2 (ЗЕО ІО МО:6), виділений із сироватки; рекомбінантний людський МА5Р-2 (5ЕО ІЮО МО:б6), МА5Р-2А, що містить неактивний домен протеази (5ЕО ІЮО МО:13), описаний у прикладі 3; і рекомбінантні СОВІ (5ЕО ІЮО МО:8),

СОВЕСРІ (ЗЕО ІО МО:9) ії СОВЕСЕСОВІ! (ЗЕО І МО:10), експресовані, як описано в прикладі 3.

Поліклональні антитіла

Шеститижневих кроликів, примованих ВСО (вакциною проти бацили Кальметта-Герена), імунізували шляхом введення у вигляді ін'єкції 100 мкг поліпептиду МА5Р-2 у концентрації 100

Зо мкг/мл у фізіологічному розчині. Ін'єкції здійснювали кожні 4 тижні титром антитіл, який відслідковували методом ІФА, як описано в прикладі 5. Культуральні супернатанти збирали для очищення антитіл за допомогою афінної хроматографії з білком А.

ПРИКЛАД 5

У цьому прикладі описаний спосіб одержання мишачих моноклональних антитіл проти щурячих або людських поліпептидів МА5Р-2.

Матеріали і методи

Самцям мишей лінії А/У (Нагіап, Ноизіоп, Тех.) у віці 8-12 тижнів підшкірно вводили 100 мкг людських або щурячих поліпептидів ГМА5Р-2 або гМА5Р-2А (одержаних, як описано в прикладі

З) у повному ад'юванті Фрейнда (Оїсо І арогафогіе5, ЮОеїгоїї, Місп.) в 200 мкл забуференого фосфатом фізіологічного розчину (РВ5), рН 7,4. Миші двічі одержували підшкірні ін'єкції 50 мкг людського або щурячого поліпептиду ГМАБР-2 або гМА5Р-2А у неповному ад'юванті Фрейнда із двотижневими інтервалами. На четвертому тижні миші одержували ін'єкцію 50 мкг людського або щурячого поліпептиду ГІМА5Р-2 або гМА5Р-2А в РВЕ, і через 4 дні миші були використані для злиття.

Для кожного злиття приготовляли одноклітинні суспензії із селезінки імунізованої миші і використовували для злиття з 5рг/0 клітинами мієломи. Злиття 5х108 клітин 5рг/0 і 5х108 клітин селезінки здійснювали в середовищі, що містить 50 95 поліетиленгліколю (М.М/. 1450) (Коаак,

Коспевіег, М.М.) ії 5 96 диметилсульфоксиду (Зідта СПетіса! Со., 5. Гоці5, Мо.). Потім концентрацію клітин доводили до 1,5х105 клітин селезінки в 200 мкл суспензії в середовищі

Івсоме ((ібсо, Сгапа Івзіапа, М.М), доповненому 10 95 фетальної сироватки, 100 Од/мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину, 0,1 мМ гіпоксантину, 0,4 мкМ аміноптерину і 16 мкм тимідину. Двісті мікролітрів клітинної суспензії додавали в кожну ямку із приблизно двадцяти 96- ямкових мікропланшетів. Через десять днів методом ІФА виконували скринінг культуральних супернатантів на їх здатність вступати в реакцію з очищеним фактором МА5Р-2.

Аналіз ІФА

Ямки мікропланшетів Іттипо!Ф 2 (Оупаїесі І арогафгіе5, СпапіШу, Ма.) покривали шляхом додавання 50 мкл очищеного ПМАБР-2 або щурячого гМА5бР-2 (або "гМА5Р-2А) з концентрацією 50 нг/мл протягом ночі при кімнатній температурі. Низька концентрація МА5БР-2 для покриття забезпечує можливість для відбору високоафінних антитіл. Після видалення розчину для 60 покриття шляхом струшування планшета, у кожну ямку на одну годину для блокування неспецифічних сайтів додавали 200 мкл ВІ ОТТО (знежирене сухе молоко) в РВ5. Через годину ямки промивали буфером РВ5Т (РВЗ з вмістом 0,05 95 Твін 20). П'ятдесят мікролітрів культуральних супернатантів від кожного злиття збирали і змішували з 50 мкл ВГОТТО і потім додавали в окремі ямки мікропланшетів. Через годину інкубації ямки промивали РВ5Т. Потім зв'язані мишачі антитіла детектували за допомогою реакції з козячими антимишачими до (Ес- специфічними), кон'югованими з пероксидазою хрону (НКР) (дЧаскбоп ІттипоКезеагси

І арогагогіех, МуУеб5і Сгоме, Ра.), і розбавляли у співвідношенні 1:2000 в ВІОТТО. Розчин субстрату пероксидази, що містить 0,1 95 3,3,5,5-тетраметилбензидину (бідта, І оці5, Мо.) і 0,0003 95 перекису водню (зЗідта), додавали в ямки і залишали на 30 хвилин для проявлення забарвлення. Реакцію завершували додаванням у кожну ямку 50 мкл 2М Не25О»х. Оптичну густину реакційної суміші при 450 нм визначали за допомогою приладу ВіоТек ЕГІ5А Кеаадег (ВіоТекф Іпзігитепів, М/іпоов5кі, Мі).

Аналіз зв'язування МА5Р-2

Культуральні супернатанти, що дали позитивний результат в аналізі МА5Р-2 методом ІФА, як описано вище, можуть бути протестовані в аналізі зв'язування для визначення спорідненості зв'язування інгібуючих МА5Р-2 агентів з МА5БР-2. Аналогічний аналіз може бути використаний для визначення здатності інгібуючого агента зв'язуватися з іншими антигенами в системі комплементу.

Ямки полістирольного мікропланшета (96-ямкові планшети для зв'язування середовища,

Согпіпд Созіаг, Сатрьгідде, МА) покривали МА5Р-2 (20 нг/100 мкл на ямку, Адмапсей Незвєагсп

Тесппоіоду, Зап Оіедо, СА) у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (РВ5), рН 7,4, протягом ночі при 4 С. Після видалення розчину МАБР-2 ямки блокували РВ5, що містить 1 95 бичачого сироваткового альбуміну (ВБА; Зідта СПептіса!), протягом 2 годин при кімнатній температурі. Ямки без покриття МАБР-2 використовували як контроль. У ямки додавали аліквоти гібридомних супернатантів або очищених анти-МА5БР-2 МоАБ зі змінною концентрацією в блокувальному розчині. Після двогодинної інкубації при кімнатній температурі ямки рясно промивали РВ5. МАБР-2-зв'язане анти-МА5БР-2 МоАБр детектували шляхом додавання кон'югованих з пероксидазою козячих антимишачих Ідс (Зідта СПпетісаї) у блокувальний розчин, який інкубували 1 годину при кімнатній температурі. Планшет знову обполіскували РВ5,

Зо після чого додавали 100 мкл субстрату 3,3,5,5'-тетраметилбензидину (ТМВ) (Кігкедаага апа

Реїту І арогафогіез, Сайпег5ригд, МО). Реакцію ТМВ зупиняли шляхом додавання 100 мкл 1М фосфорної кислоти, і планшет зчитували при 450 нм за допомогою пристрою зчитування мікропланшетів (ЗРЕСТКА МАХ 250, МоїІесшціаг Оемісе5, З,иппумаїє, СА).

Потім культуральні супернатанти з позитивних ямок тестували на здатність пригнічувати активацію комплементу у функціональному аналізі, такому як аналіз розщеплення С4, як описано в прикладі 2. Після цього, клітини з позитивних ямок клонували методом серійних розведень. МОоАБ знову тестували методом ІФА на їх здатність вступати в реакцію з АМА5Р-2, як описано вище. Відібрані гібридоми вирощували в обертових колбах, і виснажений культуральний супернатант збирали для очищення антитіл за допомогою афінною хроматографії з білком А.

ПРИКЛАД 6

У цьому прикладі описане одержання і продукування гуманізованих мишачих анти-МА5Р-2 антитіл і фрагментів антитіл.

Мишаче анти-МАБР-2 моноклональне антитіло одержували у самців мишей лінії А/), як описано в прикладі 5. Потім мишаче антитіло піддавали процесу гуманізації, як описано нижче, для зменшення його імуногенності шляхом заміни мишачих константних областей людськими аналогами з одержанням химерного Ідс і Еар-фрагмента антитіла, який може бути використаний для пригнічення побічних ефектів МА5Р-2-залежної активації комплементу у людей, відповідно до даного винаходу. 1. Клонування генів варіабельних областей анти-МА5Р-2 із клітин мишачої гібридоми

Загальну РНК виділяли із клітин гібридоми, секретуючих анти-МА5БР-2 МоАБ (одержаної, як описано в прикладі 7), використовуючи ЕМА?2ої, відповідно до протоколу виробника (Віоїесй,

Ноизіоп, Тех). Перший ланцюг кКДНК синтезували на основі загальної РНК, використовуючи оліго-4Т як праймер. ПЛР виконували, використовуючи 3'-праймери, одержані з константної С- області імуноглобуліну, і набори вироджених праймерів, одержаних з лідерного пептиду або першої каркасної області генів мишачих Мн або Мк, як 5'-праймерів. Заякорену ПЛР виконували, як описано в Спеп і Ріаїзисаз5 (Спеп Р.Е, зсапа. у. Іттипої. 35:539-549, 1992). Для клонування гена Мк одержували дволанцюжкову кДНК за допомогою праймера Мой-МАКІ (5- тассасСсастатаа,аатТастатсттт-3 5ЕО ІО МО:38). Піддані відпалу адаптери АО1 (5'- 60 ваААТТСАСТСИаТТАТТСТОССОА-3 ЗЕО ІЮ МО:39) і АО2 (5-ТССОСАСААТААСО,адИатТа-3 ЗЕО І

МО:40) лігували з обома 5'- і 3-кінцями дволанцюжкової кКДНК. Адаптери на 3'-кінцях видаляли шляхом розщеплення Мой. Потім продукт розщеплення використовували як матрицю в ПЛР з олігонуклеотидом АЮ як 5'-праймером і МАК2 (5-САТТОААдаСстт ТтассатАаААдаТтТа,атто-3

ЗБО ІЮО МО:41) як 3-праймером. Фрагменти ДНК довжиною приблизно 500 пара основ клонували у вектор рИиС19. Декілька клонів відбирали для аналізу послідовності для підтвердження того, що клонована послідовність охоплює необхідну константну область мишачого імуноглобуліну. Олігонуклеотиди МоОй-МАКІ ії МАК? одержували з області Мк і розташовували на ділянках 182 і 84 п.о., відповідно, нижче від першої пари основ гена С-Карра.

Відбирали клони, які містили повнорозмірний Ук і лідерний пептид.

Для клонування гена Мн одержували дволанцюжкову КкДНК за допомогою праймера Мой1- мАдат1 п-ссСсса,асСса,асбАастТастСАпАатТатАСЦіА-5 ЗЕО ІЮ МО:42). Піддані відпалу адаптери

АБІ і АОБ2 лігували з обома 5- і 3'-кінцями дволанцюжкової кКДНК. Адаптери на 3'-кінцях видаляли шляхом розщеплення Мой. Потім продукт розщеплення використовували як матрицю в ПЛР з олігонуклеотидом АОІ і МАС2 (5-СССТААаСтТтсАСТОааСТоАсСацпАААТА-З' 5ЕО Ір

МО:43) як праймерами. Фрагменти ДНК розміром від 500 до 600 п.о. клонували в рисСт19.

Олігонуклеотиди Мой1-МАС1 і МАС2 одержували з мишачої області Су.7.1 і розташовували на ділянках 180 ї 93 п.о., відповідно, нижче від першої пари основ у гені мишачого Су.7.1.

Відбирали клони, які містили повнорозмірний Мн і лідерний пептид. 2. Конструювання векторів експресії для химерного МА5Р-2 Ід і Бар

Клоновані гени Мн і Мк, описані вище, використовували як матрицю в реакції ПЛР для додавання консенсусної послідовності Козака до 5'-кінця і донора сплайсингу до 3'-кінця нуклеотидної послідовності. Після аналізу послідовностей на відсутність ПЛР-помилок гени Мн і

Мк вбудовували в касети векторів експресії, що містять людський С.у! і С.Карра, відповідно, з одержанням роМ2гпеоМН-пиСу! і ре5Ма2пеом-пиСу. Очищені в градієнті С5СІ плазмідні ДНК векторів важкого і легкого ланцюгів використовували для трансфекції клітин СО5 методом електропорації. Через 48 годин інкубації культуральний супернатант тестували методом ІФА для підтвердження наявності приблизно 200 нг/мл химерного до. Із зібраних клітин виділяли тотальну РНК. Перший ланцюг кКДНК синтезували на основі тотальної РНК, використовуючи оліго-дДТ як праймер. Цю кДНК використовували як матрицю в ПЛР для одержання ДНК-

Зо фрагментів для Бай і Карра. Для гена Ба виконували ПЛР, використовуючи 5'-

ААпчААХасттасСасСАССАТОааАТТааСтТатасААСТ-3 (ЗЕО ІЮ МО:44) як 5-праймер і 3- праймер, виділений з СНІ (5-сСсацпАТССТСАААСТТТСОТТатоСАССТТОИ-3 5ЕО ІЮ МО:45).

Підтверджували, що послідовність ДНК містить повноцінний Мн і домен СНІ людського ІдДС1.

Після проведення розщеплення відповідними ферментами фрагменти ДНК для Ба вбудовували в сайти рестрикції НіпаП ї Ватні у касеті вектора експресії ремг2аниі-тО5 для одержання роУгантва. Плазміда ремМ2 є комерційно доступною і складається із сегментів ДНК, одержаних з різних джерел: ДНК рВвкзЗ22 (тонка лінія) містить сайт початку реплікації ДНК рвК322 (рВЕ огі) і ген стійкості лактамази до ампіциліну (Атр); ДНК 5М40, показана широкими штрихами і маркуванням, містить сайт початку реплікації ДНК 5М40 (5М40 огі), ранній промотор (5' до генів апіїї ї пео) і сигнал поліаденілювання (3 до генів аПіїї і пео). Сигнал поліаденілювання, одержаний з 5М40 (рА), також поміщали на 3'-кінець гена га.

Для гена Карра проводили ПЛР, використовуючи 5-

ААСАААДИаСсТТасСсасСАССАТаТтТСсТСАСТАССТОСТ-3 (5ЗБО ІЮ МО:46) як 5-праймер і 3- праймер, одержаний з Ск (5-СОСбССАТОСТСТОССТСТААСАСТСТ-3 БЕО 10 0 МО:47).

Підтверджували, що послідовність ДНК містить ділянки повнорозмірного Мк і людського Ск.

Після розщеплення відповідними ферментами рестрикції ДНК фрагменти для Карра вбудовували в сайти рестрикції НіпаП! ї Ватні у касеті вектора експресії роМ2пео-ТО5 з одержанням роМа2пеоК. Експресію обох генів Ра і Карра ініціювали за допомогою енхансера і промотору, одержаних з НСМУ. Оскільки ген га не включає залишок цистеїнової амінокислоти, що бере участь в утворенні дисульфідного зв'язку між ланцюгами, цей рекомбінантний химерний Раб містить нековалентним чином зв'язані важкі і легкі ланцюги. Цей химерний Бар позначений як сЕаб.

Для одержання рекомбінантного Бар з дисульфідним зв'язком між важким і легким ланцюгами, вищевказаний ген БЯ може бути подовжений шляхом включення послідовності, кодуючої дев'ять додаткових амінокислот (ЕРКЗСОКТН 5ЕО ІО МО:48) із шарнірної області людського ІДС1. Сегмент ДНК Ве5їЕП-Ватні, кодуючий 30 амінокислот на 3'-кінці гена Ба, може бути заміщений сегментами ДНК, кодуючими подовжений Ба, що в результаті дає роУгаптва/З9аа. 3. Експресія і очищення химерного анти-МА5Р-2 Ід бо Для одержання клітинних ліній, секретуючих химерний анти-МАБР-2 ІдС, клітини МБО трансфікували очищеними ДНК-плазмідами ремМ2пеоМН-писС у ї реМ2пеом-пиС-Карра методом електропорації. Трансфіковані клітини відбирали в присутності 0,7 мг/мл (0418. Клітини вирощували в 250 мл обертовій колбі з середовищем, що містить сироватку.

Культуральний супернатант, одержаний після центрифугування 100 мл культури, завантажували в 10 мл колонку РКОБЗЕР-А (Віоргосеззіпду, Іпс., Ргіпсейоп, М.У.). Колонку промивали 10 об'ємами шару РВ5. Зв'язане антитіло елюювали 50 мМ цитратним буфером, рн 3,0. Рівний об'єм 1М Неревз, рН 8,0, додавали до фракції, що містить очищене антитіло, для доведення рН до 7,0. Залишкові солі видаляли шляхом заміни буфера на РВ5 методом ультрафільтрації через мембрану Міїїїроге (порогове значення ММУ: 3000). Концентрацію білка очищеного антитіла визначали методом ВСА (Ріегсе). 4. Експресія і очищення химерного анти-МА5Р-2 Раб

Для одержання клітинних ліній, секретуючих химерні анти-МА5БР-2 Раб, клітини СНО трансфікували очищеними ДНК-плазмідами роугантва (або реугантгаюаа) і ромМ2пеоКарра методом електропорації. Трансфіковані клітини відбирали в присутності 5418 і метотрексату.

Відібрані клітинні лінії розмножували при підвищених концентраціях метотрексату. Клітини були представлені одиночними клітинами, субклонованими методом серійних розведень. Потім високопродуктивні клітинні лінії, одержані від субклонованих одиночних клітин, вирощували в 100 мл культури в безсироватковому середовищі при постійному перемішуванні.

Химерне анти-МА5БР-2 Раб очищали методом афінної хромотографії з використанням мишачого антиідіотипічного МОАБ до МАБР-2 МоАБ. Антиїдіотипічне МАБР-2 МоАБ може бути одержане шляхом імунізації мишей мишачим анти-МАБР-2 МоАБ, кон'югованим з гемоціаніном фісурели (КІН), а потім піддане скринінгу на специфічне зв'язування з МоАб, яке може конкурувати з людським МА5БР-2. Для очищення, 100 мл супернатанту з культури клітин СНО, продукуючих сЕаб або сЕар/9аа, завантажували в афінну колонку зі зв'язаним антиідіотипічним

МАБР-2 МоАр. Потім колонку ретельно промивали РВ5 до елюції зв'язаного Бар 50 мМ діетиламіном, рН 11,5. Залишкові солі видаляли шляхом заміни буфера, як описано вище.

Концентрацію білка очищеного Рар визначали методом ВСА (Ріегсе).

Здатність химерних МАЗР-2 ІдС, сРаб і сбар/даа пригнічувати МАБР-2-залежний шлях активації комплементу може бути визначена шляхом аналізу пригнічення, описаного в прикладі 2.

ПРИКЛАД 7

У цьому прикладі описаний аналіз розщеплення С4 іп мійго, використовуваний як функціональний скринінг для ідентифікації інгібуючих МА5БР-2 агентів, здатних пригнічувати

МА5Р-2-залежну активацію, за допомогою І -фіколіну/Р35, Н-фіколіну, М-фіколіну або манану.

Аналіз розщеплення С4

Аналіз розщеплення С4 описаний в Регегзеп, еї аї., У. Іттипої. Меїпоаз, 257:107 (2001), у якому вимірювали активацію лектинового шляху, ініційовану ліпотейхоєвою кислотою (І ТА) з 5. ацйгец5, яка зв'язується з І -фіколіном.

Реагенти

Фіксований у формаліні препарат 5. ашгеои5 (05М20233) приготовляли наступним чином: бактерії вирощували протягом ночі при 37 "С у середовищі на основі триптон-соєвого агару з додаванням крові, тричі промивали РВ5, потім фіксували протягом 1 години при кімнатній температурі в РВЗ/0,5 95 формалін і тричі відмивали РВ5 перед ресуспендуванням у буфері для іммобілізації (15 мМ МагСОз, 35 мМ Мансо», рн 9,6).

Аналіз

Ямки мікропланшета Мипс Махізого (Маїдепе Мипс Іпіегпайопаї!, Коспевзіег, МУ) покривали 100 мкл препарату фіксованого у формаліні 5. ашгенх ЮО5М20233 (00550-0,5) у буфері для іммобілізації з 1 мкг І -фіколіну. Після інкубації протягом ночі ямки блокували 0,1 95 розчином сироваткового альбуміну людини (НЗА) в ТВ5 (10 мМ Тгтгі5-НСЇ, 140 мМ Масі, рн 7,4), потім промивали ТВ5, що містить 0,05 95 Твін 20 і 5 мМ Сасіг» (промивальний буфер). Зразки людської сироватки розчиняли в 20 мМ Ттгі5-НСЇ, 1М Масі, 10 мМ Сасі», 0,05 95 Тип Х-100, 0,1 95 НЗА, рН 7,4, який попереджав активацію ендогенного С4 і приводив до дисоціації комплексу С1 (що складається з С1д, Стіг ії С15). Інгібуючі МАБР-2 агенти, включаючи анти-МА5Р-2 МоАБ і інгібуючі пептиди, додавали до зразків сироватки в різних концентраціях. Розведені зразки наносили на планшет і інкубували протягом ночі при 4 С. Через 24 години планшети ретельно промивали промивальним буфером, потім у кожну ямку додавали 0,1 мкг очищеного людського

С4 (одержаного, як описано в Бодаз АМУ., МеШшоа5 Еплутої!. 223:46, 1993) в 100 мкл 4 мМ барбіталу, 145 мМ Масі, 2 мМ Сасбсі», 1 мМ Мас», рН 7,4. Через 1,5 години інкубації при 37 "С планшети знову промивали, і визначали відкладення С4р, використовуючи кон'югований з бо лужною фосфатазою курячий антилюдський Са4с (Іпітипзузіет, Оррзаїа, Змедеп), і вимірювали колориметричним методом за допомогою субстрату п-нітрофенілфосфат.

Аналіз С4 на манані

Вищеописаний аналіз адаптували для вимірювання активації лектинового шляху за допомогою МВІ шляхом покривання планшета ЛПС і мананом перед додаванням сироватки, змішаної з різними інгібуючими МА5Р-2 агентами.

Аналіз С4 по Н-фіколіну (НакКаїа Ад)

Вищеописаний аналіз адаптували для вимірювання активації лектинового шляху за допомогою Н-фіколіну шляхом покривання планшета ЛПС і Н-фіколіном перед додаванням сироватки, змішаної з різними інгібуючими МА5Р-2 агентами.

ПРИКЛАД 8

Наступний аналіз демонструє наявність активації класичного шляху у мишей дикого типу і

МА5Р-2-/- мишей.

Методи

Імунні комплекси одержували іп 5йи шляхом покривання мікропланшетів (МахізЗогр, Мипс, кат. Мо 442404, Ріхпег бсіепійіс) 0,1 95 розчином людського сироваткового альбуміну в 10 мМ

Тгі5, 140 мм масі, рн 7,4, протягом 1 години при кімнатній температурі з наступною інкубацією протягом ночі при 4 С з овечою антицільною антисироваткою (5сойцізп Апіїроду Ргодисіноп Опії,

Сапике, ЗсоМПапа), розведеною у співвідношенні 1:1000 сумішшю ТВ5/Твін/Са?:. Зразки сироватки одержували від мишей дикого типу і МА5Р-2-/- мишей і додавали в покриті планшети.

Приготовляли контрольні зразки, у яких С14 витягали зі зразків сироватки мишей дикого типу і

МА5Р-2-/- мишей. Мишачу сироватку, збіднену по С14, приготовляли за допомогою зв'язаних з білююм А мікросфер ОупабреадзФ (ЮОупа! Віоїесй, 50, Могмау), покритих кролячими антилюдськими ІдсС Стід (Оако, Сіозігир, ЮОептагк), відповідно до інструкцій виробника.

Планшети інкубували протягом 90 хвилин при 37 "С. Зв'язаний СЗЬ детектували за допомогою поліклональних антилюдських СЗс антитіл (Шако А 062), розведених в ТВ5/Івін/Са- у співвідношенні 1:1000. Вторинне антитіло являло собою козячі антикролячі Ід.

Результати

На фіг. 9 показані відносні рівні відкладення СЗО на покритих ЇдДО планшетах у сироватці дикого типу, сироватці МАЗР-2-/-, збідненій по С1Тд сироватці дикого типу і збідненій по Ста

Зо сироватці МА5БР-2-/-. Ці результати свідчать про те, що у мишей лінії МАБР-2-/- класичний шлях залишається незачепленим.

ПРИКЛАД 9

Наступний аналіз використовували для перевірки здатності інгібуючого МА5БР-2 агента блокувати класичний шлях активації шляхом вивчення дії інгібуючого МА5Р-2 агента в умовах ініціації класичного шляху імунними комплексами.

Методи

Для оцінки дії інгібуючого МА5Р-2 агента в умовах активації комплементу, при яких ініціація класичного шляху здійснюється імунними комплексами, три зразки сироватки, по 50 мкл кожний, що містили 90 95 МН5, інкубували при 37 С у присутності 10 мкг/мл імунного комплексу (ІС) або

РВ5, і паралельно інкубували ще три зразки (ї/-ІС), що містять 200 нМ анти-пропердин моноклональних антитіл, при 37 "С. Після двогодинної інкубації при 37 "С в усі зразки додавали 13 мМ ЕДТО для зупинення подальшої активації комплементу, після чого всі зразки негайно охолоджували до 5 "С. Потім зразки зберігали при -70 "С до моменту їх використання в аналізі на продукти активації комплементу (СЗа і 5С25р0-9) за допомогою набору ІФА (Опцідеї, кат. МоМо

АО15 і АОО09), відповідно до інструкцій виробника.

ПРИКЛАД 10

У цьому прикладі описана ідентифікація високоафінних фрагментів Бабр2 анти-МА5Р-2 антитіл, блокуючих активність МА5Р-2.

Передумови і обгрунтування

МАБР-2 являє собою білковий комплекс з множиною окремих функціональних доменів, включаючи: ділянку (ділянки) зв'язування для МВІ і фіколінів, каталітичну ділянку серинової протеази, ділянку зв'язування для протеолітичного субстрату С2, ділянку зв'язування для протеолітичного субстрату С4, ділянку розщеплення МА5Р-2 для самоактивації зимогену

МАБР-2 і дві Са--зв'язувальні ділянки. Ідентифіковані фрагменти Еар2 антитіл, які є високоафінними відносно МА5Р-2, і ці ідентифіковані Рар2-фрагменти були протестовані у функціональному аналізі для визначення їх здатності блокувати функціональну активність

МА5Р-2.

Для блокування функціональної активності МАБР-2 антитіло або Рар2-фрагмент антитіла має зв'язуватися або інтерферувати зі структурним епітопом на МА5Р-2, який необхідний для 60 функціональної активності МАЗР-2. Отже, багато які або всі високоафінні зв'язуючі анти-МА5Р-

2 БРар2 не мають здатності пригнічувати функціональну активність МАБР-2, якщо вони не зв'язуються зі структурними епітопами на МАБР-2, які беруть безпосередню участь у функціональній активності МА5Р-2.

Функціональний аналіз по вимірюванню пригнічення утворення СЗ-конвертази лектинового шляху використовували для оцінки "блокувальної активності" анти-МАБР-2 Раб2. Відомо, що первинна фізіологічна роль МА5Р-2 в активації комплементу по лектиновому шляху полягає в утворенні наступного функціонального компонента лектинзалежної активації комплементу, відомого як СЗ-конвертаза лектинового шляху. СЗ3-конвертаза лектинового шляху являє собою критичний ферментний комплекс (С4рсСга), який здійснює протеолітичне розщеплення СЗ на

СЗа і СЗр. МА5БР-2 не є структурним компонентом СЗ-конвертази лектинового шляху (С4рсСга); однак функціональна активність МАБР-2 необхідна для утворення двох білкових компонентів (С4р, С2а), які містять СЗ-конвертазу лектинового шляху. Крім того, усі окремі види функціональної активності МА5Р-2, перераховані вище, є необхідними для утворення за участі

МА5БР-2 СЗ-конвертази лектинового шляху. Із цієї причини переважним способом аналізу для оцінки "блокувальної активності" анти-МА5Р-2 Раб2 вважається функціональний аналіз, який дозволяє виконувати вимірювання пригнічення утворення СЗ-конвертази лектинового шляху.

Утворення високоафінних Бар2

Для створення високоафінних Бар2 до щурячого білка МАБЗР-2 (5ЕБЕО ІО МО:55) використовували бібліотеку фагового дисплея послідовностей легкого і важкого ланцюгів людського антитіла і автоматизовану технологію відбору антитіл для ідентифікації Рабр2г, які реагують з вибраними лігандами, що представляють інтерес. Відому кількість щурячого білка

МАБР-2 (71 мг, »85 95 чистоти) використовували для скринінгу антитіл. Для відбору антитіл з найкращою спорідненістю використовували три цикли ампліфікації. Для скринінгу методом ІФА відбирали приблизно 250 різних варіантів, експресуючих фрагменти антитіл. Високоафінні варіанти надалі секвенували для визначення унікальності різних антитіл.

П'ятдесят унікальних анти-МА5Р-2 антитіл очищали, і 250 мкг кожного очищеного антитіла

Еар2 використовували для характеристики спорідненості зв'язування МА5Р-2 і функціонального тестування шляху комплементу, як описано більш докладно нижче.

Аналізи, використовувані для оцінки пригнічувальної (блокувальної) активності анти-МАБР-2

Еарг 1. Аналіз для вимірювання пригнічення утворення СЗ-конвертази лектинового шляху

Передумови

С3-конвертаза лектинового шляху являє собою ферментативний комплекс (С4рсС2а), який здійснює протеолітичне розщеплення ССЗ на два потенційні прозапальні фрагменти, анафілатоксин СзЗа і опсонін СЗБ. Утворення СЗ-конвертази є ключовим етапом у лектиновому шляху з точки зору опосередкування запалення. МАБР-2 не є структурним компонентом С3- конвертази (С4Б0БС2а) лектинового шляху, тому анти-МАБР-2 антитіла (або Рар2) не будуть прямо пригнічувати активність раніше існуючої СЗ-конвертази. Однак для одержання двох білкових компонентів (С4Б, С2а), які містять СЗ3-конвертазу лектинового шляху, потрібна активність серинової протеази МАБР-2. Отже, анти-МА5БР-2 Бар2, які пригнічують функціональну активність МА5Р-2 (тобто блокують анти-МА5Р-2 Рар2), будуть пригнічувати де помо утворення СЗ-конвертази лектинового шляху. ССЗ містить незвичайну і високореактивну тіоефірну групу у своїй структурі При розщепленні СЗ3 СЗ-конвертазою у цьому аналізі тіоефірна група на СЗ3р може утворювати ковалентний зв'язок з гідроксильними групами або аміногрупами на макромолекулах, іммобілізованих на дні пластикових ямок, за допомогою складноефірних або амідних зв'язків, що полегшує виявлення СЗ3БЬ методом ІФА.

Дріжджовий манан відомий як активатор лектинового шляху. У наступному методі вимірювання утворення С3-конвертази пластикові ямки, покриті мананом, інкубували протягом 30 хв. при 37 "С з розведеною щурячою сироваткою для активації лектинового шляху. Потім ямки промивали і аналізували на наявність СЗБ, іммобілізованого в ямках, стандартними методами ІФА. Кількість СЗБЬ, утвореного в цьому аналізі, є прямим відображенням де помо утворення СЗ-конвертази лектинового шляху. Анти-МА5Р-2 Рар?2 в вибраних концентраціях тестували в цьому аналізі на їх здатність пригнічувати утворення СЗ-конвертази і наступного утворення СЗБ.

Методи 9б-ямкові планшети Созіаг Медішт Віпаїпуд інкубували протягом ночі при 5 С з мананом, розведеним в 50 мМ карбонатному буфері (рН 9,5) у кількості 1,0 мкг/50 мкл/ямку. Після нічної інкубації кожну ямку тричі промивали 200 мкл РВ5. Потім ямки блокували 100 мкл/ямку 1 96-ним бичачим сироватковим альбуміном в РВ5 і інкубували протягом однієї години при кімнатній бо температурі при легкому помішуванні. Кожну ямку тричі промивали 200 мкл РВ5. Зразки анти-

МА5Р-2 Рар2 розбавляли до вибраних концентрацій буфером СМУВ, що містить Са і Мд"- (4,0

ММ барбіталу, 141 мМ Масі, 1,0 мМ Масі», 2,0 мМ Сасі», 0,1 95 желатин, рН 7,4) при 5 "С. У зазначені вище зразки додавали 0,5 95 щурячу сироватку при 5 2С, і по 100 мкл вносили в кожну ямку. Планшети закривали кришкою і інкубували протягом 30 хвилин на водяній бані при 37 "С для активації комплементу. Реакцію зупиняли шляхом перенесення планшетів з водяної бані з температурою 37 "С у контейнер, що містить суміш льоду і води. Кожну ямку промивали п'ять разів 200 мкл РВ5-Твін 20 (0,05 95 Твін 20 в РВ5), потім двічі промивали 200 мкл РВ5. Первинне антитіло (кроляче антилюдське СЗ3с, ЮАКО А0Об2) з розведенням 1:10000 у кількості 100 мкл/ямку додавали в РВ5, що містить 2,0 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну, і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі при слабкому перемішуванні. Кожну ямку промивали п'ять разів 200 мкл РВ5. Вторинне антитіло (кон'юговане з перксидазою козячого антикролячого дО, Атегісап Оцаіех АТ02РИ) з розведенням 1:10000 у кількості 100 мкл/ямку додавали в РВ5, що містить 2,0 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну, і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі на шейкері при слабкому перемішуванні. Кожну ямку промивали п'ять разів 200 мкл РВ5. Пероксидазний субстрат ТМВ (КігкКедаага 8 Реггту

І арогасфогієз) додавали в кількості 100 мкл/ямку і інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Пероксидазну реакцію зупиняли шляхом додавання 1,0М НзРОх у кількості 100 мкл/ямку і вимірювали ОЮг50. 2. Аналіз для вимірювання пригнічення МАР -2-залежного розщеплення С4

Передумови

Активність серинової протеази МА5БР-2 має високу специфічність, і тільки два білкові субстрати ідентифіковані для МАБР-2, С2 і С4. При розщепленні С4 утворюються С4а і С4р.

Анти-МАБР-2 Бабр2 може зв'язуватися зі структурними епітопами на МАБР-2, які беруть безпосередню участь у розщеплення С4 (наприклад, МА5Р-2-зв'язувальна ділянка для СА;

МА5Р-2-каталітична ділянка серинової протеази) і таким чином пригнічують функціональну активність МАБР-2, що приводить до розщеплення Са.

Дріжджовий манан відомий як активатор лектинового шляху. В описаному нижче способі вимірювання активності МАБР-2 по розщепленню С4, пластикові ямки, покриті мананом, інкубували протягом 30 хвилин при 37 "С з розведеною щурячою сироваткою для активації

Зо лектинового шляху. Оскільки первинні антитіла, використані в цьому методі ІФА, розпізнають тільки С4, розведену щурячу сироватку також доповнювали людським С4 (1,0 мкг/мл). Потім ямки промивали і аналізували на наявність людського С4Б, іммобілізованого на ямках, стандартними способами ІФА. Кількість утвореного в цьому аналізі С4б5 є мірою МА5БР-2- залежної активності розщеплення С4. Анти-МА5Р-2 Рабр2 в вибраних концентраціях тестували в цьому аналізі на їх здатність пригнічувати розщеплення С4.

Методи 9б-ямкові планшети Созіаг Медішт Віпаїпуд інкубували протягом ночі при 5 С з мананом, розведеним в 50 мМ карбонатному буфері (рН 9,5) у кількості 1,0 мкг/50 мкл/ямку. Кожну ямку промивали три рази 200 мкл РВ5. Потім ямки блокували 100 мкл/ямку 1 95-ним бичачим сироватковим альбуміном в РВЗ і інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі при легкому помішуванні. Кожну ямку промивали три рази 200 мкл РВ5. Зразки анти-МА5Р-2

Еар2 розбавляли до вибраних концентрацій буфером ОМВ, що містить Сає і Мод (4,0 мМ барбіталу, 141 мМ Масі, 1,0 мМ Масі», 2,0 мМ Сасі», 0,1 95 желатин, рН 7,4) при 5 С. У ці зразки також вводили 1,0 мкг/мл людського С4 (Оцідеї). У зазначені вище зразки додавали 0,5

Фо щурячої сироватки при 5 "С, і по 100 мкл вносили в кожну ямку. Планшети закривали кришкою і інкубували протягом 30 хвилин на водяній бані при 37 "С для активації комплементу.

Реакцію зупиняли шляхом перенесення планшетів з водяної бані з температурою 37 С у контейнер, що містить суміш льоду і води. Кожну ямку промивали п'ять разів 200 мкл РВ5-Твін 20 (0,05 95 Твін 20 в РВ5), потім кожну ямку двічі промивали 200 мкл РВ5. Кон'югований з біотином курячий антилюдський СА (Іттипзузіет АВ, Оррзаїа, Змедеп) з розведенням 1:700 у кількості 100 мкл/ямку додавали в РВ5, що містить 2,0 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну (В5А), і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі при слабкому перемішуванні.

Кожну ямку промивали п'ять разів 200 мкл РВ5. 0,1 мкг/мл кон'югованого з пероксидазою стрептавідину (Ріегсе Спетісаї! 221126) у кількості 100 мкл/ямку додавали в РВ5, що містить 2,0 мг/мл ВЗА, ії інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі на шейкері при слабкому перемішуванні. Кожну ямку промивали п'ять разів 200 мкл РВ5. Пероксидазний субстрат ТМВ (Кігкедаага 8. Регту І арогайюгіе5) додавали в кількості 100 мкл/ямку і інкубували при кімнатній температурі протягом 16 хвилин. Пероксидазну реакцію зупиняли шляхом додавання 1,0М

НзРоОх у кількості 100 мкл/ямку і вимірювали ОЮзво. бо 3. Аналіз зв'язування антищурячого МА5БР-2 Рар2 з нативним щурячим МА5Р-2

Передумови

МАБР-2 звичайно присутній у плазмі у формі димерних комплексів МА5Р-2, які також включають специфічні лектинові молекули (манозозв'язувальний білок (МВІ) і фіколіни). Як наслідок, при наявності інтересу до вивчення зв'язування анти-МА5Р-2 Раб2 з фізіологічно релевантною формою МАБР-2, важливо розробити аналіз зв'язування, у якому використовується взаємодія Рар2 не з очищеним рекомбінантним МА5Р-2, а з нативним МА5Р- 2 у плазмі. У такому аналізі зв'язування нативний комплекс МАБР-2-МВІ з 10 9о-ної щурячої сироватки спочатку іммобілізують у ямках, покритих мананом. Потім вивчають спорідненість зв'язування різних анти-МАБР-2 Раб2 відносно іммобілізованого нативного МАБР-2 стандартним методом ІФА.

Методи 9б-ямкові планшети Совіаг Нідп Віпадіпуд інкубували протягом ночі при 5 "С з мананом, розведеним в 50 мМ карбонатному буфері (рН 9,5) у кількості 1 мкг/50 мкл/ямку. Кожну ямку промивали три рази 200 мкл РВ5. Ямки блокували 0,5 95 знежиреним сухим молоком в РВ5Т (РВЗ з 0,05 95 Твін 20) у кількості 100 мкл/ямку і інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі при легкому помішуванні. Кожну ямку промивали три рази 200 мкл промивального буфера ТВ5/Івін/Са"" (фізіологічний розчин, забуферений Тріс, 0,05 95 Твін 20, що містить 5,0

ММ Сасі», рН 7.4). На льоду приготовляли 10 95 щурячу сироватку в буфері іммобілізації з високим вмістом солі (20 мМ Тгі5, 1,0М Масі, 10 мМ Сасі», 0,05 95 Ттійоп Х100, 0,1 95 (в/о) бичачий сироватковий альбумін, рН 7,4). 100 мкл/ямку додавали і інкубували протягом ночі при 5 "Сб. Ямки промивали три рази 200 мкл промивального буфера ТВ5/ТІвін/Сає. Потім ямки промивали два рази 200 мкл РВ5. 100 мкл/ямку вибраної концентрації анти-МАБР-2 Рарг, розведених у буфері СУВ, що містить Са: і Мд"- (4,0 мМ барбітал, 141 мМ Масі, 1,0 мМ Масі», 2,0 мМ Сасі», 0,1 95 желатин, рН 7,4), додавали і інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі при слабкому перемішуванні. Кожну ямку промивали п'ять разів 200 мкл

РВ5. Кон'юговані з НЕР козячі анти-Рар2 (Віодепезіз кат. Мо 0500-0099), розведені у співвідношенні 1:5000 в 2,0 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну в РВ5, додавали в кількості 100 мкг/ямку і інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі при слабкому перемішуванні. Кожну ямку промивали п'ять разів 200 мкл РВ5. Пероксидазний

Зо субстрат ТМВ (Кігкедаага 8. Реїту І арогайогіє5) додавали в кількості 100 мкл/ямку і інкубували при кімнатній температурі протягом 70 хвилин. Пероксидазну реакцію зупиняли шляхом додавання 1,0М НзРоОх у кількості 100 мкл/ямку і вимірювали ОЮг50.

Результати

Приблизно 250 різних Рабрг, які реагували з високою спорідненістю з щурячим білком МА5Р- 2, відбирали для скринінгу методом ІФА. Ці високоафінні Рар2 секвенували для визначення унікальності різних антитіл, і 50 унікальних анти-МА5БР-2 антитіл очищали для подальшого аналізу. 200 мкг кожного очищеного антитіла Бар2 використовували для характеристики спорідненості зв'язування МАБР-2 і функціонального тестування шляху комплементу.

Результати цього аналізу представлені нижче в Таблиці 6.

ТАБЛИЦЯ 6

АНТИ-МАБ5БР-2 ЕАВ2, БЛОКУЮЧІ АКТИВАЦІЮ КОМПЛЕМЕНТУ ПО ЛЕКТИНОВОМУ

ШЛЯХУ

. СЗ3-конвертаза Розщеплення С4 11117867777717711111111053 | 7777714 771111166 7 177711111099 | .-..( « 45 щЩ | М 060111711111111111611 11111113 11111111 11065 717711111111120 | ..ЮюЮюЮюрюДл66 11117111 у

ТАБЛИЦЯ 6

АНТИ-МАБ5БР-2 ЕАВ2, БЛОКУЮЧІ АКТИВАЦІЮ КОМПЛЕМЕНТУ ПО ЛЕКТИНОВОМУ

ШЛЯХУ

. СЗ3-конвертаза Розщеплення С4 22898711171111111113011117 11111125 11111111 2871117111111111116011111111125 щЩщ | м

Як показано вище в таблиці 6, з 50 протестованих анти-МА5Р-2 Рабр2 сімнадцять Рар2 були ідентифіковані як РГар2, блокуючі МА5Р-2, які потенційно можуть пригнічувати утворення С3- конвертази з ІСво, що дорівнює або менше 10 нмоль Рар2 (34 95-ний позитивний коефіцієнт успіху). Вісім із сімнадцяти ідентифікованих Бар2 мають значення ІСзо у субнаномолярній області. Крім цього, усі сімнадцять Рар2, що блокують МА5бР-2, показані в таблиці 6, по суті демонструють повне пригнічення утворення СЗ-конвертази в аналізі СЗ-конвертази лектинового шляху. На фіг. 8А графічно показані результати аналізу утворення СЗ-конвертази для антитіла

Бар2 Мо 11, яке є типовим представником протестованих антитіл Бар2, результати яких наведені в таблиці 6. Цей факт є важливим, оскільки він передбачає теоретичну можливість того, що "бСлокуюче" Рар2 може тільки частково пригнічувати функцію МА5Р-2, навіть коли кожна молекула МА5Р-2 зв'язується з Бар2г.

Хоча манан є відомим активатором лектинового шляху, існує теоретична можливість того, що наявність анти-мананових антитіл у щурячій сироватці також може активувати класичний шлях і генерувати СЗр за допомогою СЗ-конвертази класичного шляху. Однак кожне із сімнадцяти блокуючих анти-МА5Р-2 Рарг2, перерахованих у цьому прикладі, потенційно може пригнічувати утворення СЗБр (295 95), таким чином демонструючи специфічність даного аналізу відносно СЗ-конвертази лектинового шляху.

Аналіз зв'язування також виконували для всіх сімнадцяти блокуючих Бар? з метою підрахунку уявного Ка для кожного з них. Результати аналізу зв'язування анти-щурячих МАБР-2

Еар2 з нативними щурячими МА5Р-2 для шести блокуючих Рабр2 також представлені в таблиці 6. На фіг. 88 графічно показані результати аналізу зв'язування антитіла Бар2 Мо 11. Подібний аналіз зв'язування також виконували для інших ЕРаб2г, результати яких представлені в таблиці 6.

В основному, уявні Ка, одержані для зв'язування кожного із шести Бар2 з нативним МА5Р-2, повністю відповідають ІСво для Рар2 у функціональному аналізі СЗ-конвертази. Існують докази того, що МАБР-2 піддається конформаційним змінам з неактивної в активну форму при активації його протеазної активності (Реїіпрегод еї аІ., ЕМВО . 22:2348-59 (2003); Са! еї аї., 9. Віої.

Спет. 280:33435-44 (2005)). У нормальній щурячій плазмі, використовуваній в аналізі утворення

СЗ-конвертази, МАБР-2 присутній в основному в "неактивній" конформації зимогену. На

Зо противагу цьому, в аналізі зв'язування МА5БР-2 присутній у вигляді частини комплексу з МВГ., зв'язаного з іммобілізованим мананом; тому МАБЗР-2 скоріше представлений "активною" конформацією (Регїегзеп еї аї.,». Іттипої. Мейоз, 257:107-16, 2001). Отже, не слід очікувати чіткого зв'язку між ІСво і Ка для кожного із сімнадцяти блокуючих Рабв2, протестованих у цих двох функціональних аналізах, оскільки в кожному аналізі Бар2 буде зв'язуватися з різними конформаційними формами МАБР-2. Проте, за винятком Бар2 Мо 88, очевидно існує досить близька відповідність між ІСвзо і уявним Ка для кожного з інших шістнадцяти Рабр2, протестованих у двох тестах (див. таблицю 6).

Деякі блокуючі Рар2 оцінювали на здатність пригнічувати МАЗР-2-залежне розщеплення С4.

На фіг.8С графічно показані результати аналізу розщеплення С4, що демонструють пригнічення у випадку Раб2 Мо 41, з ІСто-0,81 нМ (див. таблицю 6). Як показано на фіг. 9, усі з протестованих Рар2 пригнічували розщеплення С4 зі значеннями ІСвхо, аналогічними тим, які були одержані в аналізі СЗ-конвертази (див. таблицю 6).

Хоча манан є відомим активатором лектинового шляху, існує теоретична можливість того, що наявність анти-мананових антитіл у щурячій сироватці також може активувати класичний шлях і, таким чином, генерувати С46 за допомогою розщеплення С4, опосередкованого С15.

Однак було ідентифіковано декілька анти-МА5Р-2 Раб2г, які ефективно пригнічували утворення

С4р (295 90), тим самим демонструючи специфічність цього аналізу відносно МАЗБР-2- опосередкованого розщеплення С4. С4, подібно ССЗ, містить у своїй структурі незвичайну і високореактивну тіоефірну групу. У цьому аналізі при розщепленні С4 за участі МА5БР-2 тіоефірна група на С4р може утворювати ковалентний зв'язок з гідроксильними групами або аміногрупами на макромолекулах, іммобілізованих на дні пластикових ямок, за допомогою складноефірних або амідних зв'язків, що полегшує виявлення С4Бб методом ІФА.

Ці дослідження наочно демонструють створення високоафінних Бар2 для щурячого білка

МАБР-2, які функціонально блокують активність як С4-, так і СЗ-конвертази, тим самим попереджаючи активацію лектинового шляху.

ПРИКЛАД 11

У цьому прикладі описане картування епітопів декількох блокувальних антищурячих МА5Р-2 антитіл Рар2, одержаних описаним у прикладі 10 способом.

Методи

Як показано на фіг. 10, наступні білки, усі з М-термінальними бхНів-мітками, експресувалися у клітинах СНО за допомогою вектора рЕОЯ4: щурячий МАБР-2А, повнорозмірний білок МАБР-2, інактивований шляхом заміни в активному центрі серину аланіном (5613А); щурячий МА5Р-2К, повнорозмірний білок МА5Р-2, змінений для зменшення аутоактивації (8424К);

СОВІ-П, М-термінальний фрагмент щурячого МАБР-2, який містить тільки домени СИВІ,

ЕСЕЕ-подібний і СОВІЇ; і

СОВІ/ЕСЕЕ-подібний, М-термінальні фрагменти щурячого МАЗ5Р-2, які містять тільки домени

СОВІ ї ЕСЕ-подібний.

Ці білки очищали з культуральних супернатантів нікель-афіною хроматографією, як було описано раніше (Спеп еї аї., 9. Віої. Спет. 276:25894-02 (2001)).

С-термінальний поліпептид (ССРІІ-5Р), що містить ССРІЇ і домен серинової протеази щурячого МА5Р-2, експресували в Е. соїї у вигляді злитого з тіоредоксином білка за допомогою рТхЕРиз (Іпмігодеп). Білок очищали від клітинних лізатів за допомогою афінної смоли Тпіоропа.

Злитий з тіоредоксином білок експресували в порожньому ртгіхРиз5 як негативний контроль.

Усі рекомбінантні білки піддавали діалізу в буфері ТВ, і їх концентрації визначили шляхом вимірювання ОО при 280 нм.

Дот-блот-аналіз

Зо Серійне розведення п'яти рекомбінантних поліпептидів МА5Р-2, описаних вище і показаних на фіг. 10 (і поліпептид тіоредоксину як негативний контроль для поліпептиду ССРІІ!-серинової протеази), наносили на нітроцелюлозну мембрану. Кількість білка, що наноситься, знаходилася в діапазоні від 100 нг до 6,4 пг, у п'ятикратних розведеннях. У наступних експериментах, кількість білка, що наноситься, знаходилася в діапазоні від 50 нг до 16 пг, також у п'ятикратних розведеннях. Мембрани блокували 5 95 знежиреним сухим молоком в ТВ5 (блокувальний буфер), потім інкубували з 1,0 мкг/мл анти-МА5БР-2 Рар2 у блокувальному буфері (що містить 5,0 ММ Са). Зв'язані Гар2 визначали, використовуючи НЕР-кон'юговане антилюдське ЕРар (Арр/Зегоїес; розведене в співвідношенні 1/10000) і набір для виявлення ЕСІ. (Атег5Ппат). Одну мембрану інкубували з поліклональним кролячим антилюдським МАБР-2 АБ (описаним в 5іомег еї аї., У. Іттипої. 163:6848-59 (1999)) як позитивний контроль. У цьому випадку, зв'язане АБ детектували за допомогою НКР-кон'югованого козячого антикролячого Іде (Бако; розведеного у співвідношенні 1/2000).

Аналіз зв'язування МА5Р-2

Планшети ІФА покривали рекомбінантним МАБР-2А або поліпептидом СОВІ-Й у карбонатному буфері (рН 9,0) у кількості 1,0 мкг на ямку протягом ночі при 4 "С. Ямки блокували 1 95 В5А в ТВ5, потім додавали серійні розведення анти-МА5бР-2 Рабр2 в ТВ5, що містить 5,0 мМ

Са. Планшети інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі. Після потрійного промивання ТВ5/Івін/Са", додавали НЕР-кон'юговане антилюдське Бар (АрОр/зегоїес), розведене у співвідношенні 1/10000 в ТВ5/Саг:, і планшети знову інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі. Зв'язане антитіло детектували за допомогою набору ТМВ, субстрату пероксидази (Віогай).

Результати

Результати дот-блот-аналізу, що демонструють реакційну здатність БГар2 відносно різних поліпептидів МА5Р-2, представлені нижче в таблиці 7. Числові значення, наведені в таблиці 7, позначають кількість білка, що наноситься, необхідну для одержання сигналу з інтенсивністю приблизно 1/2 від максимального значення. Як можна бачити, позитивне контрольне АБ (сироватка поліклонального антилюдського МА5Р-2, одержана від кроликів) розпізнавало всі поліпептиди (виключення становить тільки химерний білок тіоредоксину).

ТАБЛИЦЯ 7

РЕАКЦІЙНА ЗДАТНІСТЬ ВІДНОСНО РІЗНИХ РЕКОМБІНАНТНИХ ПОЛІПЕПТИДІВ ЩУРЯЧОГО

МАБР-2 У ДОТ-БЛОТ-АНАЛІЗІ подібний 60 | оО4ні | О4н | ма мА | мВ 66 | оО4нг | МА | ма 2б0н | мВ ( 786 | о4н | МА | ма | он | мав контроль

МА-немає реакції. Позитивне контрольне антитіло являє собою сироватку поліклонального антилюдського МА5Р-2, одержану від кроликів.

Усі Рар2 вступали в реакцію з МА5БР-2А, а також з МА5БР-2К (дані не показані). Більшість

Бар2 розпізнавали поліпептид ССРІІ-5Р, але не М-термінальні фрагменти. Виключення представляють Раб2 Мо 60 і Бар2 Мо 57. Бар2 Мо 60 розпізнає МА5БР-2А і фрагмент СОВІ-ЇЇ, але не розпізнає СОВІ/ЛЕСЕ-подібний поліпептид або ССРІІ-5Р поліпептид, що передбачає його зв'язування з епітопом на СОВІЇ, або перекривання СИВІІ ії ЕСЕ-подібного домену. Бар2 Мо 57 розпізнає МА5Р-2А, при цьому не розпізнає жоден із протестованих фрагментів МА5Р-2, що вказує на те, що це антитіло БГар2 розпізнає епітоп на ССРІ. Бар2 Мо 40 і Мо 49 зв'язуються тільки з повним МА5Р-2А. В аналізі зв'язування ІФА, показаному на фіг. 11, Бар2 Мо 60 також зв'язувався з поліпептидом СИВІ-ІЇ, хоча із трохи більш низькою уявною спорідненістю.

Ці результати демонструють унікальну здатність Бар2 блокувати численні ділянки білка

МА5Р-2.

ПРИКЛАД 12

У цьому прикладі описана ідентифікація за допомогою фагового дисплея повністю людських 5сЕм-антитіл, які зв'язуються з МА5Р-2 і пригнічують опосередковувану лектином активацію комплементу, при цьому не зачіпаючи класичний (С1д-залежний) шлях компонента імунної системи.

Короткий огляд

Повністю людські, високоафінні антитіла МАБР-2 ідентифікували шляхом скринінгу бібліотеки фагового дисплея. Фрагменти варіабельних ділянок легкого і важкого ланцюгів антитіл виділяли як у форматі 5сЕм, так і у форматі повнорозмірного Ід. Людські антитіла до

МАБР-2 є корисними для пригнічення клітинного ушкодження, асоційованого з опосередкованою лектином активацією шляху комплементу, при цьому не зачіпаючи класичний (Стд-залежний) шлях компонента імунної системи. У деяких варіантах здійснення представлені інгібуючі МАБР-2 антитіла мають наступні характеристики: (а) висока спорідненість до людського МАБР-2 (наприклад, Ко-10 нМ або менше) і (Б) пригнічують МАЗР-2-залежну

Зо активність комплементу в 90 95 людській сироватці з ІСво, що дорівнює 30 нМ або менше.

Методи

Експресія повнорозмірного каталітично неактивного МАБР-2

Повнорозмірну послідовність КДНК людського МАБР-2 (ЗЕО ІЮ МО:4), кодуючу людський поліпептид МАЗР-2 з лідерною послідовністю (ЗЕО ІЮ МО:5), субклонували у вектор експресії рСІ-Мео ссавців (Рготеда), який запускає експресію у еукаріот під керуванням СММУ енхансерної/промоторної області (описано в Каййтап К.). еї аїЇ., Мисіеіс Асіає Кезеагсй,

19:4485-90, 1991; Каштап, Меїподз іп Епгутоїіоду, 185:531-66 (1991)).

Для одержання каталітично неактивного людського білька МА5БР-2А здійснювали сайт- спрямований мутагенез, як описано в 5 2007/0172483, включеному в даний опис у вигляді посилання. Продукти ПЛР очищали після електрофорезу в агарозному гелі і одержання смуг, і одержували одиночні аденозинові перекриття за допомогою стандартної процедури нарощування. Потім МАБР-2А з доданим аденозином клонували у вектор рОЕМ-Т Еаву і трансформували в Е. соїї. Людський МАЗР-2А додатково субклонували у вектор експресії ссавців РЕО або рсСіІ-Мео.

Вищеописану експресійну конструкцію МАБР-2 і МАБР-2А трансфікували в клітини ОХВ1, використовуючи стандартну процедуру кальцій-фосфатної трансфекції (Мапіаїі5 еї аї., 1989).

МАБР-2А одержували в безсироватковому живильному середовищі, щоб виключити контамінацію препаратів іншими сироватковими білками. Через день збирали конфлюентні клітини з живильних середовищ (загалом процес проводили чотири рази). Середній рівень рекомбінантного МАБР-2А склав приблизно 1,5 мг/літр культурального середовища. МАБР-2А (мутантну форму 5ег-АЇІа, описану вище) очищали афінною хроматографією на колонках з МВР-

А-агарозою.

Метод ІФА для МА5БР-2А на клонах-кандидатах 5сСЕм, ідентифікованих шляхом пенінг/5сЕм- перетворення і скринінгу за допомогою фільтра

Бібліотеку фагового дисплея послідовностей варіабельних ділянок легкого і важкого ланцюгів людського імуноглобуліну піддавали антигенному пенінгу з наступним автоматизованим скринінгом і відбором для виявлення високоафінних 5сЕм-антитіл до людського білка МА5БР-2. Виконували три цикли пенінгу 5сЕм-фагової бібліотеки відносно НІ5- мітки або міченого біотином МА5Р-2А. У третьому циклі пенінгу виконували елюцію спочатку з

МВІ, а потім з ТЕА (лужний). Для відстеження специфічного збагачення фагів, що демонструють фрагменти 5сЕм відносно цільового МАБР-2А, виконували ІФА для поліклональних фагів проти іммобілізованого МА5Р-2А. Гени 5сЕм із циклу З пенінгу клонували у вектор експресії РНОС і виконували скринінг через дрібний фільтр для пошуку конкретних клонів, націлених на МАБР-2А.

Бактеріальні колонії, що містять плазміди, кодуючі 5сЕм-фрагменти із циклу З пенінгу,

Зо збирали, поміщали на нітроцелюлозні мембрани і вирощували протягом ночі на неіндукуючому середовищі для одержання майстер-планшетів. Загалом було відібрано і проаналізовано 18000 колоній із циклу З пенінгу, половина в результаті конкурентної елюції і половина в результаті наступної елюції ТЕА. Пенінг бібліотеки фагмідних 5сЕм проти МАБЗР-2А з наступним 5сЕхм- перетворенням і скринінгом з використанням фільтра дав 137 позитивних клонів. 108/137 клонів виявилися позитивними в аналізі ІФА відносно зв'язування МА5Р-2 (дані не показані), з яких 45 клонів були додатково проаналізовані на здатність блокувати активність МАБР-2 у нормальній людській сироватці.

Аналіз для вимірювання пригнічення утворення СЗ-конвертази лектинового шляху

Функціональний аналіз по вимірюванню пригнічення утворення СЗ-конвертази лектинового шляху використовували для оцінки "бСлокувальної активності" 5сЕм-клонів-кандидатів МА5Р-2.

Для одержання двох білкових компонентів (С4Б, Сга), які містять СЗ-конвертазу лектинового шляху, потрібна активність серинової протеази МА5Р-2. Отже, зсЕм МАБР-2, які пригнічують функціональну активність МА5Р-2 (тобто блокують 5сЕм МА5Р-2), будуть пригнічувати де помо утворення СЗ-конвертази лектинового шляху. СЗ містить у своїй структурі незвичайну і високореактивну тіоефірну групу. При розщепленні СЗ3 СЗ-конвертазою у цьому аналізі тіоефірна група на СЗ3р може утворювати ковалентний зв'язок з гідроксильними групами або аміногрупами на макромолекулах, іммобілізованих на дні пластикових ямок, за допомогою складноефірних або амідних зв'язків, що полегшує виявлення СЗЬ методом ІФА.

Дріжджовий манан відомий як активатор лектинового шляху. У наступному методі вимірювання утворення СЗ-конвертази пластикові ямки, покриті мананом, інкубували з розведеною людською сироваткою для активації лектинового шляху. Потім ямки промивали і аналізували на наявність СЗБ, іммобілізованого в ямках, стандартними методами ІФА. Кількість

СЗБ, утвореного в цьому аналізі, є прямим відображенням де помо утворення СЗ-конвертази лектинового шляху. 5сЕм-клони МА5Р-2 в вибраних концентраціях тестували в цьому аналізі на здатність пригнічувати утворення СЗ-конвертази і наступного утворення СЗБ.

Методи 45 клонів-кандидатів, ідентифікованих, як описано вище, експресували, очищали і розбавляли до однієї і тієї ж маточної концентрації, яку знову розбавляли буфером СМВ, що містить Са і Мд"- (4,0 мМ барбіталу, 141 мМ Масі, 1,0 мМ Масіг»г, 2,0 мМ Сасі», 0,1 95 желатин, бо рН 7,4), для гарантії того, що всі клони мають однакову кількість буфера. 5сЕм-клони тестували в трьох повторах у концентрації 2 мкг/мл. Позитивним контролем служив ОМ5100 Рар2, який тестували при концентрації 0,4 мкг/мл. Утворення СЗс відслідковували в присутності і за відсутності клонів З5СЕмМ/Ідо.

Маннан розбавляли до концентрації 20 мкг/мл (1 мкг/ямку) в 50 мМ карбонатному буфері (15

ММ МагбОз35 мМ МансСози1,5 мМ Мам»), рН 9,5, і покривали ним планшети ІФА, залишаючи на ніч при 4 "С. Наступного дня покриті мананом планшети промивали З рази 200 мкл РВ5.

Потім у ямки додавали по 100 мкл 1 95 блокуючого Н5ЗА розчину і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Планшети тричі промивали 200 мкл РВЗ5 і зберігали на льоду з 200 мкл РВ5З до додавання зразків.

Звичайну людську сироватку розбавляли до 0,5 95 концентрації в буфер СамосмвВ, і в цей буфер додавали 5сЕм-клони або позитивний контроль ОМ5100 Рар2 трьома повторами в концентраціях 0,01 мкг/мл, 1 мкг/мл (тільки контроль ОМ5100) ії 10 мкг/мл і попередньо інкубували протягом 45 хвилин на льоду перед додаванням у заблокований планшет ІФА.

Реакцію ініціювали інкубацією протягом однієї години при 37 С, яку зупиняли шляхом перенесення планшетів на льодяну баню. Відкладення СЗр детектували за допомогою кролячого антитіла до о-мишачого СЗс, після якого використовували НКР-кон'юговане козяче анти-о-кроляче антитіло. Негативним контролем служив буфер без антитіл (без антитіл-максимальний рівень відкладень СЗБ), а позитивним контролем служив буфер з ЕДТО (без відкладення СЗ3Б). Фон визначали, використовуючи той же аналіз, за винятком того, що ямки не містили манан. Фоновий сигнал відносно планшетів без манану віднімали із сигналів у мананвмісних ямках. Критерій порогового значення встановлювали рівним половині активності нерелевантного 5сЕм-клону (МАМ) і чистого буфера.

Результати

Грунтуючись на критерії порогового значення, загалом було виявлено 13 клонів, блокуючих активність МАБР-2. Усі 13 клонів, що забезпечують »50 95 пригнічення шляху, відбирали і секвенували, одержавши 10 унікальних клонів. Було знайдено, що всі десять клонів мають легкий ланцюг одного і того ж підкласу, АЗ, але важкий ланцюг трьох різних підкласів: МН2, УНЗ і

МНВб. У функціональному аналізі у п'яти з десяти 5сЕу-клонів-кандидатів значення ІСзо у НМ були менше цільового критерію, 25 нМ, із застосуванням 0,5 95 людської сироватки.

Для виявлення антитіл з поліпшеною ефективністю, три материнські 5сЕм-клони, визначені, як описано вище, піддавали методу перетасування легкого ланцюга. Цей процес включав створення комбінаторної бібліотеки, що складається з Мн кожного материнського клону, спареного з бібліотекою нативних людських легких лямбда-ланцюгів (Мі), одержаних від шести здорових донорів. Потім цю бібліотеку піддавали скринінгу на виявлення 5сЕм-клонів з поліпшеною спорідненістю зв'язування і/або функціональністю.

ТАБЛИЦЯ 8

Порівняння функціональної ефективності по ІСво (НМ) основних дочірніх клонів і відповідних їм материнських клонів (усі у форматі 5сСЕм) 5сСЕУ-клон 195 людська сироватка, 90 95 людська 90 95 людська аналіз СЗ сироватка, сироватка, (ІСво нМ) аналіз СЗ аналіз СА

ІСво НМ) ІСво нМ) 1 ляЯМівтс 7 177777771711716811111117 11111111 ма 77717171 мсСщС

Нижче представлені послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга (МН) для материнських клонів і дочірніх клонів, показаних вище в таблиці 8.

СО (31-35 (НІ), 50-65 (Н2) і 95-107 (НЗ)) по Кабваї виділені напівжирним шрифтом; і СОК (26-32 (НІ), 52-56 (Н2) і 95-101 (НЗ)) по Споїйіа підкреслені.

Варіабельна ділянка важкого ланцюга (МН) 17020 35МН-21М11М. (ЗЕО ІЮ МО:67, кодованої

ЗЕО ІЮ МО:66)

ОМТІКЕБОаРМІ МКРТЕТІ ТІ ТСТУБав5І БДаКМОам5уУМмАОРРОКАГЕУ АНІЕЗЗОЕКОЗУВТОІ.

КОАІГТІЗКОТЗКМОММІ ТМТММОРМОТАТУУСАВІВ НОСІ СОСТІ МТУ, варіабельна ділянка важкого ланцюга (МН) а17М9 (ЗЕО І МО:68)

ОМОГ ОО5аРИЇ МКРБЗОТІ 5І ТСАІЗИа ЗУ ЗААМММІВОЗРЗВаГ ем авт иивЗКУУУМОУ

АМ5УКЗВІТІМРОТЗКМОЕ5І ОЇ М5МТРЕОТАУУУСАВОРЕСУРЕОМ ССХОСТММУТМУ55.

Нижче представлені послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга (МІ) для материнських клонів і дочірніх клонів, показаних вище в таблиці 8.

СО (24-34 (І 1); 50-56 (І 2) і 89-97 (І 3)) по Кабваї виділені напівжирним шрифтом; і СОЕК (24- 34 (11); 50-56 (12) ї 89-97 (13)) СпоїШпіа підкреслені. Ці ділянки є однаковими, незалежно від системи нумерації, по Кабаї або Споїпіа.

Варіабельна ділянка легкого ланцюга (МІ) 17020т а3521М11 (ЗЕО ІЮ МО:70, кодованої

ЗЕО ІЮ МО:69)

ОРМГТОРРБІ БМОРООТАБІТОЗИаЕКІ аОКМАМУ УООКРИОБРМІ УМУОСКОАРБЗИЇРЕВЕ5О

ЗМЗамтТАТІ ТІ ТОАМОЕАВОУМСОАМ О55ТАМгасааТткІі тм, варіабельна ділянка легкого ланцюга (МІ) 17М1бт а17М9 (5ЕО ІЮ МО:71)

ЗУЄЕПОРРОУЗМАРСОТАТІТСАСОМІ аСККАУНУУООВРООСАРМІ МІМООБОВРЗаИа РОВЕЗАЗМ

ЗаМТАТІ ТІТАСЕАИрЕАОМУСОММ ОІАТОНУМРаСсаИТткІ ТМ АААДИЗЕОКІИ ЗЕ.

Анти-МАБР-2 антитіла ОМ5100 і Модр а3521М11М| (що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, представлену в ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, представлену в БЗЕО ОО МО:70, також називані "ОМ5646" і "тАБб"), які обидва продемонстрували зв'язування людського МАБР-2 з високою спорідненістю і мають здатність блокувати функціональну активність комплементу, проаналізували відносно зв'язування епітопа за допомогою дот-блот-аналізу. Результати показують, що антитіла ОМ5646 і ОМ5100 є високоспецифічними відносно МА5Р-2 і не зв'язуються з МА5Р-1/3. Жодне антитіло, зв'язане з

МАр19 або фрагментами МА5БР-2, не містило домен ССРІ1І МАБР-2, що дозволило зробити висновок, що ділянки зв'язування включають ССРІ1.

Було визначено, що анти-МА5Р-2 антитіло ОМ5646 активно зв'язується з рекомбінантним

МА5Р-2 (Ка від 60 до 250 мкМ) з селективністю, що перевищує в 5000 разів таку для зв'язування

С15, С1г або МА5Р-1 (див. таблицю 9 нижче).

ТАБЛИЦЯ 9

Спорідненість зв'язування і специфічність взаємодії анти-МА5Р-2 антитіла ОМ5646 з МА5Р-2, за результатами твердофазного ІФА "середнє значенняй50; п-12.

ОМ5646 специфічно блокує компоненти лектинзалежної активації

Методи

Зо Вплив ОМ5646 на відкладення мембраноатакуючого комплексу (МАС) проаналізували, використовуючи специфічні умови для лектинового шляху, класичного шляху і альтернативного шляху. Із цією метою використовували набір для скринінгу комплементу УМезіар Сотр300 (Умезіаб, І ипа, зугедеп), відповідно до інструкцій виготовлювача.

Результати

На фіг. 12А графічно показаний рівень відкладення МАС у присутності або за відсутності анти-МАБР-2 антитіла (0М5646) у специфічних для лектинового шляху умовах. На фіг. 128 графічно показаний рівень відкладення МАС у присутності або за відсутності анти-МА5Р-2 антитіла (0М5646) у специфічних для класичного шляху умовах. На фіг.12С графічно показаний рівень відкладення МАС у присутності або за відсутності анти-МА5Р-2 антитіла (ОМ5646) у специфічних для альтернативного шляху умовах.

Як показано на фіг. 12А, ОМ5646 блокує опосередковану лектином активацію відкладення

МАС зі значенням ІСвхо, що дорівнює приблизно 1 нМ. Однак ОМ5646 не впливав на відкладення

МАС, що відбувається в результаті активації, опосередкованої класичним шляхом (фіг. 128) або альтернативним шляхом (фіг. 120).

Фармакокінетика і фармакодинаміка ОМ5646 після внутрішньовенного (ІМ) або підшкірного (5С) введення мишам

Фармакокінетику (РК) і фармакодинаміку (РО) ОМ5646 оцінювали в 28-денному дослідженні

РК/РО у мишей при однократному введенні дози. У дослідженні тестували рівні доз 5 мг/кгі 15 мг/кг 0М5646, що вводяться підшкірно (С), а також рівень дози 5 мг/кг ОМ5646, що вводиться внутрішньовенно (ІМ).

Що стосується РК-профілю ОМ5646, на фіг. 13 графічно показана концентрація ОМ5646 (середня кількість тварин п-З на групу) залежно від часу після введення ОМ5646 у зазначеній дозі. Як показано на фіг. 13, при 5 мг/кг 5С максимальна концентрація ОМ5646 у плазмі, що дорівнює 5-6 мкг/мл, була досягнута приблизно через 1-2 дні після дозування. Біодоступність

ОМ5646 при 5 мг/кг 5С становила приблизно 60 95. На фіг. 13 також показано, що при 15 мг/кг 5С максимальна концентрація в плазмі ОМ5646, що дорівнює 10-12 мкг/мл, була досягнута приблизно через 1-2 дні після дозування. У всіх групах ОМ5646 повільно виводився із системного кровотоку з кінцевим періодом напіврозпаду приблизно 8-10 днів. Профіль ОМ5646 виявився типовим для людських антитіл у мишей.

РО-активність ОМ5646 графічно показана на фіг. 14А їі 14В. На фічг. 14А і 148 показана відповідь РО (зниження системної активності лектинового шляху) для кожної миші в групах, що одержали 5 мг/кг ІМ (фіг. 14А) і 5 мг/кг С (фіг. 148). Пунктирна лінія вказує вихідний рівень в аналізі (максимальне пригнічення, інтактна мишача сироватка, ін'єктована іп міго з надлишком

ОМ5646 перед аналізом). Як показано на фіг. 14А, після ІМ введення 5 мг/кг ОМ5646 активність лектинового шляху системи комплементу відразу знизилася майже до невиявлюваних рівнів, а відновлення активності лектинового шляху протягом 28-денного періоду спостереження було помірним. Як показано на фіг. 148, у мишей, що одержали дозу 5 мг/кг О0М5646 5С, спостерігалося залежне від часу пригнічення активності лектинового шляху. Активність лектинового шляху знижувалася до майже невиявлюваних рівнів протягом 24 годин після введення лікарської речовини і залишалася на низькому рівні протягом щонайменше 7 днів.

Активність лектинового шляху поступово збільшувалася з перебігом часу, але не верталася до рівнів, спостережуваних до введення дози, протягом 28-денного періоду спостереження.

Профіль активності лектинового шляху залежно від часу, спостережуваний після введення 15 мг/кг 5С, був аналогічним профілю для дози 5 мг/кг 5С (дані не показані), що вказує на насичення кінцевої точки РО. Дані також указують на те, що дози 5 мг/кг ОМ5646, що вводяться

Зо раз на тиждень або ІМ, або 5С, є достатніми для досягнення безперервного пригнічення активності лектинового шляху системи комплементу у мишей.

ПРИКЛАД 13

У цьому прикладі описане одержання рекомбінантних антитіл, які інгібують МА5Р-2, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга і/або легкого ланцюга, яка містить одну або більше СОК, які специфічно зв'язуються з МАБР-2, і щонайменше одну ядерну пептидну послідовність ЗОМІ (також називаних анти-МА5бР-2 антитіло, що несе ЗОМІ-пептид, або його антигензв'язувальний фрагмент).

Передумови/обгрунтування

Створення специфічних інгібіторів МАБР-2, називаних 5ОМІ-2, описане в Неда еї аї., 9. Віоі!.

Спет. 287:20290 (2012); і Не)да еї аІ.,, РМАБ5, 109:10498 (2012), які включені у даний опис у вигляді посилання. 5ОМІ-2 являє собою пептид з 36 амінокислот, який був вибраний з фагової бібліотеки варіантів інгібітору 2 протеази ЗсПібіосегса дгедагіа, у якому шість із восьми положень зв'язуючої протеазу петлі були повністю рандомізовані. Наступна еволюція іп міго давала в результаті моноспецифічні інгібітори з однорозрядними значеннями К; у нМ діапазоні (Неда єї аї., 9. ВіоІ.,, Спет., 287:20290, 2012). Структурні дослідження показали, що оптимізована зв'язуюча протеазу петля утворює первинну ділянку зв'язування, яка визначає специфічність двох інгібіторів. Амінокислотні послідовності подовжених вторинних і внутрішніх зв'язувальних ділянок є загальними для обох інгібіторів і додають внесок у ділянку контакту (Не)а еї аї., 2012.

У. Вісі. Спет., 287:20290). Механічно ЗОМІ-2 блокує активацію лектинового шляху комплементу,

БО не впливаючи на класичний шлях (Неда єї а!., 2012. Ргос. Маї!. Асад. 5сі. 109:10498).

Амінокислотні послідовності інгібіторів зОМІ-2 наведені нижче:

ЗОМІ-2І,, повнорозмірний:

ГЕМТСЕРОТТЕРКОКСМТСсАСОавОИакзАМСТКІ М/СМО (5ЕО ІО МО:72),

ЗОМІ-2ГІ,, середньої довжини:

ТСЕРОТТЕКОКСМТсАСавракЗзАМСТКІ МСМО (5ЕО І МО:73),

ЗОМІ-2Г,, короткий: тонСавзраквзАМСТКІМСМО (5ЕО ІО МО:74).

Як описано в цьому прикладі, а також в УМО 2014/144542, анти-МАБ5Р-2 антитіла, що несуть пептид ЗОМІ-2, і їх фрагменти одержували шляхом злиття з амінокислотною послідовністю 60 пептиду ЗОМІ-2 (5ЕО ІО МО:72, 73 або 74) на аміно- або карбоксильному кінці важкого і/або легкого ланцюга людського анти-МА5Р-2 антитіла. Анти-МА5БР-2 антитіла, що несуть пептид

ЗОМІ-2, і їх фрагменти мають підвищену інгібуючу активність у порівнянні з анти-МАБР-2 антитілом з оголеним остовом, яке не містить пептидну послідовність 5ОМІ-2, згідно з результатами аналізу відкладення СЗ3Б або С4Бб з використанням людської сироватки, як описано в УМО 2014/144542, а також мають підвищену інгібуючу активність у порівнянні з анти-

МА5БР-2 антитілом з оголеним остовом, виміряну в мишачій моделі іп мімо. Способи одержання анти-МА5БР-2 антитіла, що несе пептид 5ОМІ-2, описані нижче.

Методи

Одержували експресійні конструкції для кодування чотирьох ілюстративних анти-МА5Р-2 антитіл, що несуть пептид 5ОМІ-2, де пептид ЗОМІ-2 був злитий або з М-, або з С-кінцем важкого або легкого ланцюга репрезентативного інгібуючого МАБР-2 антитіла ОМ5646 (як описано в прикладі 12).

ТАБЛИЦЯ 10

ЗЛИТТЯ МАБР-2 АНТИТІЛО/5ОМІ-2 ні-м2

Солемаєвоомемє 02001711 н-М2-5ОМі2-М | вБамі2 | 7-17 -171171117- 117570 н-М2-5ОМі2-С | 7-1 о 5Бамі2 | - 1/7 - | 760 і-ме-5аміеМ 7777 -11717171117- 11 85амае | - | б п-ме-ваміес 1777 -117717777- 11711711 - 00001 5ама | 67-78

Позначення в таблиці 10: "Н-М"-амінокінець важкого ланцюга; "Н-С"-карбоксильний кінець важкого ланцюга; "Г-М"-амінокінець легкого ланцюга; "І-С"екарбоксильний кінець легкого ланцюга; "М2"-остов МАБР-2 аб (0М5646).

Для М-кінцевих злиттів, показаних у таблиці 10, додавали пептидний лінкер сатасссвиаве 5ЕО ІО МО:79) між пептидом ЗОМІ-2 і варіабельною ділянкою.

Для С-кінцевих злиттів, показаних у таблиці 10, додавали пептидний лінкер ГААССБИ ЕС

ІО МО:80) між константною областю і пептидом ЗОМІ-2, а другий пептид "З5ОА"' (ЗЕО ІЮ МО:81) додавали на С-кінці злитого поліпептиду для захисту С-кінцевих пептидів 5ОМІ-2 від деградації.

Амінокислотні послідовності наведені нижче для наступних репрезентативних злиттів МА5Р - 2 антитіло/5МІ-2:

Н-М2арб-5ОМІ-2-М (ЗЕО ІО МО:75, кодована 5ЕО ІЮ МО:82):

ГЕМТСЕРОТТЕКОКСМТсНСИаБОСКЗАМСТКІ УСсМОСТастивавоБоОМтТІ КЕЗОРМІ МКРТЕТ

Зо ГТТСТУБавгБ5І ЗНЕКМОамМУЛАОРРОКАЇ ЕМ/І АНІЕЗ5ОЕКОУВТ5І КОВІ ТІЗКОТ5КМОММІ ТМТ

ММОРМОТАТУМСАВІВВааТТМУСОСТІ МТГМУ55АЗБТКОРОЗМЕРІ АРСЗАЗТЗЕЗТААЇ ССІ МКОМЕР

ЕРМТУБМ/МБОАЇ Т5ИаМНТЕРАМІ О5БаЇ 51 55 МГ МРБББІ ЯТКТМ ГТОММОНКРОЬМТКМОКАМЕЗК

МЖОРРСОРРОРАРЕРІ СОаРБМУРБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУУМОУМ5ОЕОРЕМОЄММ УМО МЕМНМА

КТКРАЕЄЕОЄМОТУАММУБМІ ТМІ НОМ МЕКЕМУКСКУ5МКИї РОБІЕКТІЗКАКООРВЕРОМУТІ РР

ОБЕМТКМОМ5І ТОЇ МКОЕМРООІТАМЕМ ЕМО ОРЕММУКТТРРМІ ОБООаЗЕРІ МА ТМЮОКЗАМОБаИ

ММЕ5СО5ММНЕАЇ НМНУТОКОІ 5І БІ СК 491 аа білок, аа 1-36-502МІ-2 (підкреслено), аа 37-46-лінкер (виділено курсивом); аа 47- 164-варіабельна ділянка важкого ланцюга МАБР-2 ар Мо 6 (підкреслено); аа 165-491-ІДСс4А константна ділянка з мутацією в шарнірній областіЇ.

Н-М2арб-5ОМІ-2-О (ЗЕО ІО МО:76, кодована 5ЕО І МО:83):

ОМТІ КЕБОРМІ МКРТЕТІ ТІ ТСТУ5ОаЕ5І 5ЗВЕАКМИаИм5УвВОРРОКАГЕМІ АНІЄЗ5ОЕКОУ ВТБ.

КЗАГТІБКОТЗКМОУМІ ТМІТІММОРМОТАТУУСАВІННСОССІВУМС,ОСТІ МТМ55АЗБТКОаРБОМЕРІ АРС

ЗА5ЗТЗЕЗТААЇ аСІ МКОМЕРЕРУТУБУУМ5ОИАІ Т5ОМНТЕРАМІ 05501 У5І 55 РОЗВ СИТКТМТ

СМУМОНКРОЬМТКМОКАМЕЗКУСРРСОРРСРАРЕГРІ ЧОРОМГЕЇ ЕРРКРКОТІ МІЗВА ТРЕМТСУММОМБОЕ

ОРЕМОЄММУУМВОаМЕМНМАКТКРАЕЄОЕЄМЗТУВМУМУ5МІ ТМІ НООУМІ МОКЕУКСКУ5МКИЇ РЗБІЕКТІ

ЗКАКИОРАЕРОМУТІ РРЗОБЕМТКМОМБІ ТС УКИаЕМРОЗОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ О50А

ЗЕБРА ТМОКО5АУМОБСММЕЗСОЗММНЕАЇ НМНУТОКБІ 5І БІ КАдсаваіЕМТСЕРЕТТЕКОКС мМтонСавраквАМСТКІ МСМОсаВаА

491 аа білок, аа 1-118-варіабельна ділянка важкого ланцюга МА5БР-2 аб Мо 6 (підкреслено); аа 119-445-|3654 константна ділянка з мутацією в шарнірній області; аа 446-451-перший лінкер (виділено курсивом); аа 452-487-5(02МІ-2; аа 488-491-другий лінкер (виділено курсивом))|.

Г-М2арбв-5аМІ-2-М (5ЕО І МО:77, кодована ЗЕО ІЮ МО:84):

ГЕМТСЕРОТТЕРКОКСОМТсАСазВакЗАМСТК МУСсМОСТасававеЗОРМІ ТОРРБІ 5М5РООТ

АБІТСЗИаЕКІ аОКкКуУАММУ МООКРООБЗРМІ УММОСКОВАВРЗИаЇРЕВЕЗИаЗМЗОИМТАТІ ТІЗИТОАМОЕА рУМСОАМрЗЗТАМРИасСаТткІ ТМ ад(ОРКААРБЗМТІ ЕРРЗБЗЕЕЇ ОАМКАТІ МСГ ІБОЕУРЕАМТМАМ/КА

Р5ЗРУКАСМЕТТТРОКОЗММКМУААБЗЗМІ ЗІ ТРЕОМУКЗНАЗУЗСОМТНЕВЗТУЕКТУАРТЕСЗ (258 аа білок, аа 1-36-5025МІ-2 (підкреслено); аа 37-46-лінкер (виділено курсивом); аа 47- 152-варіабельна ділянка легкого ланцюга МАБР-2 ар Мо 6 (підкреслено); аа 153- 258-константна ділянка людського Ід лямбда|.

І -М2арб-5С2МІ-2-С (5ЕО ІЮ МО:78, кодована 5ЕО ІЮ МО:85):

ОРМГТОРРБОІ БМОРООТАБІТОЗИаЕКІ аОКМАМУ УООКРИОБРМІ УМУОСКОАРБЗИаЇРЕВЕЗО

ЗМЗамтТАТІ ТІ ТОАМОЕАВОУМСОАМ О5ЗТАУРасаИткІ ТМ а(ОРКААРЗМТІ ЕРРОЗЕБЇ ОАМКА т УСИ І50БЕМРЕІАМТМАМКАОЗЗРУКАСМЕТТТРУКОЗММКУААБЗОЗМУІ ЗІ ТРЕОСМУКЗНАЗУЗСОМТН

ЕВЗТУЕКТМАРТЕСЗААСИавзаі ЕМТІСЕРОТТЕКОКСМТсАСОаЗОСаКЗАУСТКІ УСсМОсаБаА (258 аа білок, аа 1-106-варіабельна ділянка легкого ланцюга МАБР-2 ар Мо 6 (підкреслено); аа 107-212-константна ділянка людського Ід лямбда; аа 213-218-перший лінкер; аа 219- 254-5(2МІ-2; аа 255-258-другий лінкері.

Функціональний аналіз

Чотири конструкції анти-МА5Р-2-502МІ-2 злитого антитіла транзієнтно експресували в клітинах Ехрі293Е (Іпмігодеп), очищали за допомогою афінної хроматографії з білком А і тестували в 10 95 нормальній людській сироватці для пригнічення відкладення СЗБ в аналізі з мікросферами, покритими мананом, як описано нижче.

Тестування МАЗР-2-5ОМІ-2 злиттів в аналізі відкладення СЗБЬ з використанням мікросфер, покритих мананом

МАБР-2-5ОМІ-2 злиті антитіла оцінювали на здатність пригнічувати лектиновий шлях в аналізі відкладення СЗБбБ на покритих мананом мікросферах. Цей аналіз, який дозволяє визначити ступінь активності методом проточної цитометрії, має більш високе розрізнення, ніж

Зо аналіз М/езіарф. Аналіз лектинового шляху з використанням мікросфер виконували наступним чином: манан адсорбували на полістирольних мікросферах діаметром 7 мкМ (Вапод5

І абогасогіє5, Різпегв, ІМ, О5А) протягом ночі при 4 С у карбонатно-бікарбонатному буфері (рн 9,6). Мікросфери промивали РВЗ і піддавали впливу 10 95 людської сироватки або 10 95 сироватку попередньо інкубували з антитілами або інгібіторами. Суміш сироватка-мікросфери інкубували при кімнатній температурі протягом однієї години при перемішуванні. Після інкубації в сироватці мікросфери промивали, і відкладення СЗО на мікросферах вимірювали шляхом виявлення за допомогою анти-СЗс поліклонального кролячого антитіла (Юако Могпйп Атегіса,

Сагріпіеєгіа, СА, ЮОБА) і РЕ-Суб-кон'югованого козячого анти-кролячого вторинного антитіла (бБошнегтп Віоїеси, Віппіпопат, АГ, О5А). Після процедури забарвлення мікросфери аналізували за допомогою проточного цитометра Расзсаїїриг. Мікросфери аналізували у вигляді однорідної популяції, використовуючи пряме і бічне розсіювання, і відкладення СЗЬ проявлялося у вигляді

ЕІ З-позитивних частинок (РІ -3 або "РІ -3-канал" указують на третій або червоний канал на цитометрі). Середню геометричну інтенсивність флуоресценції (МЕЇ) для популяції для кожного експериментального стану виводили на графіку залежності від концентрації антитіло/інгібітор для оцінки пригнічення лектинового шляху.

Значення ІСво розраховували за допомогою програмного забезпечення СгарпРай РКІЗМ.

Зокрема, значення ІСво одержували шляхом застосування нелінійної (чотирипараметричної), зі змінюваним кутом нахилу підгонки кривих залежності Іод (антитіло) від середньої інтенсивності флуоресценції, одержаних у результаті цитометричного аналізу.

Результати показані в таблиці 11.

ТАБЛИЦЯ 11

Відкладення СЗБ (аналіз з використанням покритих мананом мікросфер) в 10 95 людській сироватці

ТАБЛИЦЯ 11

Відкладення СЗБ (аналіз з використанням покритих мананом мікросфер) в 10 95 людській сироватці

Результати

Контрольне анти-МАБР-2 антитіло з "голим" остовом, що не містить ЗОМІ (тАбБ Мо 6), виявилося інгібуючим у цьому аналізі з величиною ІС5хо»3,63 НМ, що узгоджується з результатами інгібування, спостережуваними в прикладі 12. Примітно те, що, як показано в таблиці 11, усі злиття 5ОМІ-2-МА5БР-2 антитіло, які були протестовані, поліпшували ефективність антитіла МАБР-2-остов у цьому аналізі, що вказує на те, що підвищена валентність також може бути корисною при пригніченні відкладення С3р.

Тестування злиттів МАБР-2-5024МІ-2 в аналізі з покритими мананом мікросферами для вивчення відкладення С46 з 10 95 людською сироваткою

Аналіз відкладення С4Бб проводили з використанням 10 95 людської сироватки, у тих же умовах аналізу, які описані вище для аналізу відкладення СЗБ0, з наступними модифікаціями.

Аналіз для виявлення СА і аналіз проточної цитометрії проводили шляхом забарвлення реакції відкладення анти-С45б мишачим о моноклональним антитілом (1:500, ОпцідеІ))Й ї шляхом забарвлення вторинним козячим антимишачим Е(ар)г2, кон'югованим з РЕ-Су5 (1200, Зошнпет

Віоїесі)), перед аналізом проточної цитометрії.

Результати

Обидва злиття 50ОМ5-2-несуче анти-МАБР-2-М-термінальне антитіло (Н-М2-5СаМІ-2-М:

ІСво-0,34 НМ, І-М2-5ОМІ-2-М: ІСто-0,41 нМ) мали підвищену ефективність у порівнянні з антитілом анти-МАБР-2-остов (НІ-М2: ІСво-0,78 НМ).

Аналогічним чином, злиття одиночне ЗОМ-2-несуче С-термінальне анти-ММ5-2-антитіло (Н-

М2-5ОМІ-2-С: ІСво-0,45 нМ ї Г-М2-52МІ-2О: ІСво-0,47 НМ) мали підвищену активність у порівнянні з антитілом анти-МА5Р-2-остов (НІ -М2: ІСво-1,2 нМ).

Тестування злиттів МАБР-2-52МІ-2 в аналізі відкладення СЗОБ з покритими мананом мікросферами з 10 956 мишачою сироваткою

Аналіз відкладення СЗБ з покритими мананом мікросферами здійснювали, як описано вище, з 10 95 мишачою сироваткою. Аналогічно результатам, спостережуваним у випадку використання людської сироватки, було встановлено, що в мишачій сироватці злиття 5ОМІ-2- несучі анти-МАБР-2 мають підвищену ефективність у порівнянні з антитілом анти-МАБР-2-

Зо остов.

Короткий огляд результатів. Результати в цьому прикладі демонструють, що всі злиття

ЗОаМІ-2-МАБР-2 антитіло, які були протестовані, поліпшували ефективність антитіла анти-

МА5Р-2-остов.

ПРИКЛАД 14

У цьому прикладі представлені результати, одержані з використанням моделі фіброзу нирок на фоні односторонньої обструкції сечоводу (ШОО) у МАБР-2-/- дефіцитних і МАЗР-2-/-- достатніх мишей для оцінки ролі лектинового шляху при фіброзі нирок.

Передумови/обгрунтування

Фіброз нирок і запалення є характерними ознаками пізньої стадії захворювання нирок.

Тубулоінтерстиціальний фіброз нирок являє собою прогресуючий процес, що включає стійке ушкодження клітин, аберантне загоєння, активацію резидентних і інфільтруючих клітин нирок, вивільнення цитокінів, запалення і фенотипічну активацію клітин нирок для продукування позаклітинного матриксу. Тубулоінтерстиціальний (ТІ) фіброз нирок є загальною термінальною точкою множинних патологій нирок і являє собою ключову ціль для потенційних методів лікування, спрямованих на запобігання прогресуючому функціональному порушенню нирок при хронічному захворюванні нирок (ХЗН). Ниркова ТІ недостатність тісно пов'язана зі зниженням функції нирок при гломерулярних захворюваннях (Кізаоп К.А. еї аї., І апсеї. 1:363-366, 1968;

ЗесНаїписк І.І. еї аі., Нит. Раїйпої. 1:631-640, 1970; Маїй К.А., Ат. У. Кіа. Оів. 20:1-17, 1992) і характерна для ХЗН, при якому відбувається накопичення міофібробластів, а потенційний простір між канальцями і перитубулярними капілярами забивається матриксом, що складається з колагенів і інших протеогліканів. Питання походження ТІ міофібробластів залишається досить суперечливим, але фіброзу звичайно передує запалення, яке спочатку характеризується ТІіІ-

накопиченням Т-лімфоцитів, а потім макрофагів (Гі У. еї аІ., Маї. Кем. Мерпгої. 7:684-696, 2011;

БинйівЇіа 9У.5., у. Сііп. Іпмеві. 124:2299-2306, 2014).

Модель ОО гризунів генерує прогресуючий фіброз нирок, відмітна ознака прогресуючого захворювання нирок практично будь-якої етіології (Спемаїіег еї аї., Кідпеу Іпіегпайопаї, 75:1145- 1152, 2009). Є повідомлення про збільшену експресію гена СЗ3 у мишей дикого типу після ШО і значне зменшення відкладень колагену у С3-/- нокаутних мишей після ОО у порівнянні з мишами дикого типу, що вказує на роль активації комплементу при фіброзі нирок (Реат еї аї.,

МОЇ. Іттипої. 48:1666-1733, 2011). Є також повідомлення, що дефіцит С5 приводив до значного ослаблення основних компонентів фіброзу нирок у моделі тубулоінтерстиціального ураження (Воог Р. еї аї., У. ої Ат. бос. ої Мерпгоіоду, 18:1508-1515, 2007). Однак до описаного в даній заявці дослідження, виконаного авторами винаходу, конкретні компоненти комплементу, що беруть участь у фіброзі нирок, не були чітко визначені. Таким чином, було проведене наступне дослідження для оцінки МА5Р-2 (-/-) і МАБР-2 (1/к) мишей у моделі односторонньої обструкції сечоводу (ШОО).

Методи

Одержували МА5Р-2-/- мишу, як описано в прикладі 1, і піддавали зворотному схрещуванню протягом 10 поколінь з С57ВІ /ю. Мишей дикого типу (М/Т) С57ВІ/6 і гомозиготних МА5Р-2- дефіцитних (МА5Р-2-/-) мишей на фоні С57ВІ /6 тримали в стандартизованих умовах із циклом день/ніч - 12/12, при цьому мишей годували стандартними харчовими гранулами, вода і їжа були у вільному доступі. Десятитижневих мишей, по б на групу, анестезували 2,5 95 ізофлураном в 1,5 л/хв. кисню. Праві сечоводи у двох групах десятитижневих самців мишей

С56/ВІ 6, дикого типу і МА5Р-2-/- лігували хірургічним шляхом. Праву нирку оголювали через бічний розріз довжиною 1 см. Правий сечовід повністю блокували у двох точках, використовуючи поліглактинову нитку 6/0). Анестезію здійснювали бупренорфіном інтраопераційно кожні 12 годин до 5 доз залежно від ступеня болю. Місцеву анестезію бупівакаїном проводили один раз під час операції.

Мишей умертвляли через 7 днів після операції, а тканини нирок збирали, фіксували і заливали в парафінові блоки. Кров збирали у мишей шляхом серцевої пункції під анестезією, і після нефректомії мишей знекровлювали. Кров залишали на льоду для коагуляції на 2 години, і

Зо сироватку відокремлювали центрифугуванням і зберігали в замороженому вигляді у вигляді аліквот при -80 20.

Імуногістохімія тканини нирок

Для вимірювання ступеня фіброзу в нирках по відкладенню колагену 5-мікронні парафінові зрізи нирок забарвлювали пікросіріусом червоним, колаген-специфічні плями, як описано в 35 Мупінакег Р. еї а!., Вазіс Рез. Сагаїйо!. 89:397-410, 1994. Коротко, зрізи нирок депарафінували, регідратували і колаген забарвлювали протягом 1 години водним розчином червоного пікросіріусу (0,5 г сіріусу червоного, Зідта, Юогзеї ОК) в 500 мл насиченого водного розчину пікринової кислоти. Слайди двічі промивали підкисленою водою (0,5 95 льодяна оцтова кислота в дистильованій воді) протягом 5 хвилин кожного разу, потім зневоднювали і приготовляли 40 препарат для дослідження.

Для вимірювання ступеня запалення, про що свідчить інфільтрація макрофагів, зрізи нирок забарвлювали специфічним до макрофагів антитілом Е4/80 наступним чином. Фіксовані у формаліні, залиті парафіном 5-мікронні зрізи нирок депарафінізували і регідратували.

Демаскування антигену проводили в цитратному буфері при 95 "С протягом 20 хвилин з 45 наступним блокуванням ендогенної активності пероксидази шляхом інкубації в 3 95 НгО» протягом 10 хвилин. Зрізи тканин інкубували в блокувальному буфері (10 95 інактивована теплом нормальна козяча сироватка з 1 95 бичачим сироватковим альбуміном у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (РВ5)) протягом 1 години при кімнатній температурі з наступним блокуванням авідином/біотином. Зрізи тканини промивали РВ5 після кожної стадії по 50 три рази протягом 5 хвилин. Первинне антитіло до макрофага Е4/80 (Запіа Сги7, Оайав, ТХ,

ОБА), розведене 1:100 у блокувальному буфері, наносили протягом 1 години. Потім біотинільоване козяче антищуряче вторинне антитіло, розведене 1:200, наносили протягом 30 хвилин з наступним нанесенням кон'югованого з пероксидази хрону (НКР) ферменту протягом хвилин. Колір забарвлення проявлявся під впливом субстрату діамінобензидину (ОАВ) (уУесіог І арх, Регегрогоцдп ШК) протягом 10 хвилин, і слайди промивали у воді, зневоднювали і приготовляли для дослідження без контрастного забарвлення для спрощення комп'ютерного аналізу.

Аналіз зображень

Відсоток забарвлення кортикального шару нирок визначали, як описано в Ригпе55 Р.М. еї аї., 60 У. Сііп. Раїнпої. 50:118-122, 1997. Коротко, 24-бітові кольорові зображення брали з послідовних полів, що не перекриваються, ниркової кіркової речовини безпосередньо під нирковою капсулою навколо всієї периферії зрізу нирки. Після кожного захоплення зображення використовували

МІН-зображення для витягання з нього червоного каналу у вигляді 8-бітового монохромного зображення. Нерівномірність фонового освітлення віднімали, використовуючи попередньо записане зображення освітленого поля мікроскопа без розміщеного на ньому зрізу. Для зображення задавали фіксований поріг для визначення області зображення, відповідної позитивному забарвленню. Потім обчислювали відсоток чорних пікселів, і після того, як усі зображення навколо нирки були виміряні таким чином, реєстрували середній відсоток, що забезпечує значення, відповідне відсотку забарвленої області в зрізі нирки.

Аналіз експресії генів

Експресію декількох генів, що мають відношення до запалення нирок і фіброзу в нирках миші, вимірювали кількісною ПЛР (кКПЛР) наступним чином. Загальну РНК виділяли з ниркової кіркової речовини за допомогою Ттгі2о!їФф (ТептоРіб5пег Зсіепійіс, РаїбІеу, ШОК), згідно з інструкціями виробника. Екстраговану РНК обробляли за допомогою набору Тигро без ДНК (Тпегтогізпег 5сіепійіс) для усунення забруднення ДНК, а потім синтезували першу нитку КДНК за допомогою АММ-системи зворотної транскрипції (Рготеда, Мадізоп, УМ, ОА). Цілісність

КДНК підтверджували однією реакцією кПЛР за допомогою набору ТадМап САРОН Аззау (Арріїей Віозузієт5, Раїзієу ОК) з наступною реакцією кПЛР з використанням 96б-ямкових планшетів Сибіот Тадмап Агтау (Іе Тесппоіодіє5, Раїзієу, ОК).

У цьому аналізі вивчали дванадцять генів:

Колаген типу ІМ альфа-1 (соі4о--1; ІД аналізу: МіпО1210125 т/);

Трансформуючий фактор росту бета-1 (Тагр-1; ІД аналізу: МтО1178820 т/!);

Кадгерин-1 (Сан-1; ІД аналізу: Мт0О1247357 т/!);

Фібронектин 1 (ЕРп1; ІД аналізу: МтО1256744 ті);

Інтерлейкін-6 (ІІ -6; ІД аналізу Мт0О0446191 ті);

Інтерлейкін-10 (1-10; ІД аналізу МтО0439614 т/);

Інтерлейкін-12а (ІІ -12а; ІД аналізу МтоО0434165 пт);

Віментин (Міт; ІД аналізу МтО1333430 т);

Актинін альфа-1 (Асіп-1; ІД аналізу МтОо1304398 1);

Зо Фактор некрозу пухлини о; (ТМЕс, ІД аналізу Міт0О0443260 91);

Компонент комплементу З (С3; ІД аналізу МіпО0437838 ті);

Інтерферон-гамма (Нп-у; ІД аналізу МтО1168134).

Використовували наступні конститутивні контрольні гени:

Гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (САРОН, ІД аналізу Міт99999915 91);

Глюкуронідази бета (Си5р; ІД аналізу МітО0446953 тт!);

Еукаріотичної 185 рРНК (185; ІД аналізу Н»599999901 51);

Гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферази (НРЕТ; ІД аналізу МіпО0446968 1). 20 мкл реакційних агентів ампліфікували, використовуючи суміш ТадМап Равзі Опімегзаї!

Мазіег Міх (Арріїед Віозузіветв5), протягом 40 циклів. Дані ампліфікації ПЛР у реальному часі аналізували з використанням програмного забезпечення Арріїеа Віозузієт5 7000 505 м1.4.

Результати

Після односторонньої обструкції сечоводу (ШОО) в оклюдованих нирках спостерігається приплив запальних клітин, зокрема макрофагів, з наступним швидким розвитком фіброзу, про що свідчить накопичення колагену поряд з дилатацією трубочок і стоншенням проксимального трубчастого епітелію (див. Спемаїіег К.Г... еї аї., Кіапеу Іпї. 75:1145-1152, 2009).

На фіг. 15 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених сіріусом червоним, де ділянки тканини одержували від мишей дикого типу і

МАБР-2-/- мишей через 7 днів після обструкції сечоводу (ШОО) і від псевдооперованих контрольних мишей. Як показано на фіг. 15, ділянки нирок мишей дикого типу через 7 днів після обструкції сечоводу показали значно більшу кількість відкладень колагену в порівнянні з МА5Р- 2-/- мишами (значення р-0,0096). Середні значення-стандартна помилка середнього для ШОО- оперованих мишей у групах дикого типу і МА5Р-2 -/- становили 24,79-1,908 (п-б) і 16,58-41,3 (п-б), відповідно. Як додатково показано на фіг. 15, зрізи тканини від псевдооперованих контрольних мишей дикого типу і псевдооперованих контрольних МА5Р-2 -/- мишей показали дуже низькі рівні забарвлення колагену, як і очікувалося.

На фіг. 16 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених антитілами, специфічними до маркера макрофагів Е4/80, де зрізи тканин одержували від мишей дикого типу і МАЗР-2-/- мишей через 7 днів після обструкції сечоводу або від псевдооперованих контрольних мишей. Як показано на фіг. 16, у порівнянні з мишами 60 дикого типу, тканини, одержані з ШШОО-нирок МАБР-2-/- мишей, показали значно меншу інфільтрацію макрофагів через 7 днів після обструкції сечоводу (96 площі макрофагів, забарвленої в М/Т: 2,23--0,4, проти МАБР-2-/-: 0,53--0,06, р-0,0035). Як додатково показано на фіг. 16, зрізи тканин від псевдооперованих мишей дикого типу і псевдооперованих МА5Р-2-/- мишей не показали виявлюваного забарвлення макрофагів.

Аналіз експресії множини різних генів, пов'язаних з запаленням нирок і фіброзом, здійснювали на зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу і МА5Р-2-/- мишей через 7 днів після обструкції сечоводу і від псевдооперованих мишей дикого типу і МАЗР-2-/- мишей.

Дані, показані на фіг. 17-20, являють собою Годо відносної кількості в зразку псевдооперованих мишей дикого типу, а планки являють собою стандартну помилку середнього. Що стосується результатів аналізу експресії генів, пов'язаних з фіброзом, на фіг. 17 графічно показані відносні рівні експресії МРНК колагену ІМ типу альфа-1 (колаген-4), виміряні методом кПЛР у зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу і МАЗР-2-/- мишей через 7 днів після обструкції сечоводу і від псевдооперованих контрольних мишей. На фіг. 18 графічно показані відносні рівні експресії МРНК трансформуючого фактора росту бета-1ї (ТОаЕр-1), виміряні КПЛР, у зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу і МАБР-2-/- мишей через 7 днів після обструкції сечоводу і від псевдооперованих контрольних мишей. Як показано на фіг. 17 ії 18, оклюдовані нирки мишей дикого типу показали значимо збільшену експресію пов'язаних з фіброзом генів колагену типу ІМ (фіг. 17) і ТОЕр-1 (фіг. 18) у порівнянні з псевдооперованими нирками у мишей дикого типу, що свідчить про те, що ці пов'язані з фіброзом гени були індуковані після ШОО- ушкодження у мишей дикого типу, як і очікувалося. Навпаки, як додатково показано на фіг. 17 і 18, оклюдовані нирки МАБР-2-/- мишей, підданих ШОО-ушкодженню, продемонстрували значиме зниження експресії колагену типу ІМ (фіг. 17, р-0,0388) і значиме зниження експресії такегр-1 (фіг. 18, р-0,0174) у порівнянні з мишами дикого типу, підданими ШШО-ушкодженню.

Що стосується результатів аналізу експресії генів, пов'язаних із запаленням, то на фіг. 19 графічно показані відносні рівні експресії мРНК інтерлейкіну-б (1-6), виміряні КПЛР у зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу і МАЗР-2-/- мишей через 7 днів після обструкції сечоводу і від псевдооперованих контрольних мишей. На фіг. 20 графічно показані відносні рівні експресії МРНК інтерферону-у, виміряні КПЛР, у зрізах тканин нирок, одержаних від мишей дикого типу і МАЗР-2-/- мишей через 7 днів після обструкції сечоводу і від псевдооперованих

Зо контрольних мишей. Як показано на фіг. 19 ї 20, оклюдовані нирки у мишей дикого типу продемонстрували значимо підвищену експресію пов'язаних із запаленням генів інтерлейкіну-б (фіг. 19) і інтерферону-у (фіг. 20) у порівнянні з псевдооперованими нирками мишей дикого типу, що свідчить про те, що ці пов'язані із запаленням гени індукуються після ШОО-ушкодження у мишей дикого типу. Навпаки, як додатково показано на фіг. 19 і 20, оклюдовані нирки МА5Р-2-/- мишей, підданих ШОО-ураженню, продемонстрували значиме зниження експресії інтерлейкіну-б (фіг. 19, р-0,0109) і інтерферону-у (фіг. 20, р-0,0182) у порівнянні з мишами дикого типу, підданими ШОШО-ураженню.

Слід зазначити, що експресія генів Міт, Асіп-1, ТМЕсо, СЗ і 11-10 значно підсилюється в ШОО- нирках, одержаних як від мишей дикого типу, так і МА5Р-2-/- мишей, без суттєвої різниці в рівнях експресії цих конкретних генів між мишами дикого типу і МА5Р-2-/- мишами (дані не показані). Рівні експресії генів Сан-1 ії 1/-12а не змінилися в оклюдованих нирках тварин у жодній з груп (дані не показані).

Обговорення

Визнано, що ОШО-модель у гризунів викликає раннє, активне і глибоке ушкодження в оклюдованій нирці зі зменшеним нирковим кровотоком, інтерстиціальним запаленням і швидким фіброзом протягом одного-двох тижнів після обструкції і широко використовується для розуміння загальних механізмів і медіаторів запалення і фіброзу в нирках (див., наприклад,

Спемаїег В.Г, Кідпеу Іпї. 75:1145-1152, 2009; Мапо Н. еїа!., Огид Оівсом. Тодау ів. Модвів, 7:13- 19, 2010).

Результати, описані в цьому прикладі, демонструють значиме зниження відкладення колагену і рівня інфільтрації макрофагів в ШОШО-оперованих нирках у МА5БР-2 (-/-) мишей у порівнянні з контрольними (4/5) мишами дикого типу. Несподівані результати, що свідчать про значиме скорочення ушкодження нирок як на гістологічному рівні, так і на рівні експресії генів у

МА5Р-2-/- тварин, показують, що лектиновий шлях активації комплементу впливає на розвиток запалення і фіброз в оклюдованій нирці. Не обмежуючись конкретною теорією, вважається, що лектиновий шлях впливає на патофізіологію фіброзного захворювання шляхом запуску і підтримання прозапальних стимулів, які закріплюють порочне коло, у якому ушкодження клітин викликає запалення, що, у свою чергу, викликає подальше ураження клітин, рубцювання і втрату тканини. Виходячи із цих результатів, очікується, що пригнічення або блокада МАБР-2 60 інгібітором буде мати профілактичний і/або терапевтичний ефект, що проявляється в пригніченні або профілактиці фіброзу нирок, а також у пригніченні або профілактиці фіброзу взагалі (тобто незалежно від тканини або органа).

ПРИКЛАД 15

У цьому прикладі описаний аналіз ефективності моноклонального інгібуючого антитіла

МА5Р-2 у моделі односторонньої обструкції сечоводу (ШОЮ), мишачій моделі фіброзу нирок.

Передумови/обгрунтування

Полегшення тубулоінтерстиціального фіброзу, загальної кінцевої точки багатьох ниркових патологій, являє собою важливу мішень для методів лікування, спрямованих на профілактику прогресування ниркових захворювань. Враховуючи нестачу нових і існуючих методів лікування, спрямованих на запальні профіброзні шляхи при захворюванні нирок, існує гостра потреба в розробці нових методів лікування. Багато які пацієнти з протеїнуричним захворюванням нирок мають тубулоінтерстиціальне запалення і прогресуючий фіброз, які тісно пов'язані зі зниженням функції нирок. Протеїнурія сама по собі викликає тубулоінтерстиціальне запалення і приводить до розвитку протеїнуричної нефропатії (Вгип5КіїЇ М.У. еї аїЇ., У. Ат. Боб. Мерпгої. 15:504-505, 2004). Незалежно від первинної хвороби нирок тубулоінтерстиціальне запалення і фіброз незмінно спостерігаються у пацієнтів з прогресуючою нирковою недостатністю і тісно корелюють зі зниженням екскреторної функції (Кізаоп Е.А. еї аї., І апсеї. 1:363-366, 1968; ЗсНнаіпискК І.І. єї аІ., Нит. Раїйої. 1:631-640, 1970). Методи терапії, здатні перервати загальні ключові клітинні шляхи, що ведуть до фіброзу, знайдуть широке застосування при ниркових розладах.

Як описано в прикладі 14, в ШШО-моделі непротеїнуричного фіброзу нирок було встановлено, що у МАЗР-2-/- мишей спостерігається значно більш низький ступінь фіброзу і запалення нирок у порівнянні з контрольними тваринами дикого типу, про що свідчать запальні клітинні інфільтрати (75 9б) і гістологічні маркери фіброзу, такі як колаген (зменшення на одну третину), тим самим доводячи ключову роль лектинового шляху при фіброзі нирок.

Як описано в прикладі 13, також було показано, що синтезоване моноклональне анти-МА5БР- 2 антитіло (0ОМ5646-502МІ-2 злитий білок, що містить пептид ЗОМІ-2, злитий з С-кінцем важкого ланцюга ОМ5646), яке специфічно блокує функцію лектинового шляху у людини, блокує лектиновий шлях у мишей. У цьому прикладі ОМ5646-52МІ-2 аналізували в мишачій ШШО- моделі фіброзу нирок у мишей дикого типу для визначення здатності специфічного інгібітору

Зо МА5Р-2 пригнічувати фіброз нирок.

Методи

У цьому дослідженні оцінювали вплив інгібуючого МА5Р-2 антитіла (10 мг/кг ОМ5646-502МІ- 2) у порівнянні з контрольним антитілом до людського ізотипу Ід(4 (10 мг/кг ЕТ904) і контролем у вигляді середовища доставки у самців М/Ї мишей С57ВІ /6. Антитіла (10 мг/кг) вводили групам з 9 мишей шляхом внутрішньоочеревинної (і.р.) ін'єкції на 7-й день, 4-й день і 1-й день до операції ШОО і потім на 2-й день після операції. Зразки крові брали перед введенням антитіл, і наприкінці експерименту оцінювали функціональну активність лектинового шляху.

Операцію ОО, збирання тканин і забарвлення сірі усом червоним і специфічним до макрофагів антитілом Е4/80 проводили способами, описаними в прикладі 14.

Вміст гідроксипроліну в нирках мишей вимірювали за допомогою специфічного тестового набору для колориметричного аналізу (Зідта), відповідно до інструкцій виробника.

Для оцінки фармакодинамічного ефекту інгібуючого тАБ-МАБР-2 у мишей оцінювали активність лектинового шляху системи комплементу шляхом кількісного визначення індукованої лектином активації СЗ у мінімально розведених зразках сироватки, зібраних у зазначений час після ір. введення мишам тАр МАБЗР-2 або контрольного тАбБ. Коротко, полістирольні мікросфери діаметром 7 мкМ (Вапоз І арогайгіє5, Різпег ІМ, ОБА) покривали мананом шляхом інкубації протягом ночі з 30 мкг/мл манану (Зідта) у натрій-бікарбонатному буфері (рН 9,6), потім промивали, блокували 1 95 фетальної бичачої сироватки в РВЗ5 і ресуспендували в РВ5 до кінцевої концентрації 1їх108 міросфер/мл. Реакції відкладення комплементу ініціювали додаванням 2,5 мкл мікросфер, покритих мананом (5250000 мікросфер), в 50 мкл мінімально розведених зразків мишачої сироватки (кінцева концентрація сироватки 90 95) з наступною інкубацією протягом 40 хвилин при 4 С. Після припинення реакції відкладення шляхом додавання 250 мкл льодяного буфера для проточної цитометрії (ЕВ:РВ5, що містить 0,1 95 фетальної бичачої сироватки), мікросфери збирали центрифугуванням і промивали ще два рази 300 мкл льодяного ЕВ.

Для кількісної оцінки індукованої лектином активації СЗ3 мікросфери інкубували протягом 1 години при 4 С з 50 мкл кролячого анти-людського СЗс антитіла (Обако, Сагрепієгіа, СА, ОА), розведеного в ЕВ. Після двох промивань ЕВ для видалення незв'язаного матеріалу мікросфери інкубували протягом 30 хвилин при 4 С з 50 мкл козячого антикролячого антитіла, 60 кон'югованого з РЕ-Су5 (Бошпегп Віоїеси, Віптпіпанат, АГ, О5А), розведеного в ЕВ. Після двох промивань ЕВ для видалення незв'язаного матеріалу мікросфери ресуспендували в ЕВ і аналізували за допомогою цитометра БАС Саїїриг Мікросфери аналізували у вигляді однорідної популяції, використовуючи пряме і бічне розсіювання, і виконували кількісне визначення відкладення СЗБр у кожному зразку у вигляді середньої інтенсивності флуоресценції.

Результати

Оцінка відкладення колагену

На фіг. 21 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених сірі усом червоним, де зрізи тканин були одержані через 7 днів після обструкції сечоводу у мишей дикого типу, що одержували або інгібуюче МА5Р-2 антитіло, або антитіло ізотипного контролю. Як показано на фіг. 21, зрізи тканини із нирок, зібраних через 7 днів після обструкції (ШОО), одержані від мишей дикого типу, що одержували інгібуюче МАЗР-2 антитіло, показали значиме зниження (р-0,0477) відкладення колагену в порівнянні з кількістю відкладень колагену в зрізах тканин з оклюдованих нирок, одержаних від мишей дикого типу, що одержували Ідся4 ізотипний контроль.

Оцінка вмісту гідроксипроліну

Гідроксипролін вимірювали в тканинах нирок як індикатор вмісту колагену. Гідроксипролін є параметром, який є дуже показовим індикатором патофізіологічного прогресування захворювання, індукованого в цій моделі.

На фіг. 22 графічно показаний вміст гідроксипроліну в нирках, зібраних через 7 днів після обструкції (ШО), одержаних від мишей дикого типу, що одержували або інгібуюче МА5ЗР-2 антитіло, або антитіло ізотипного контролю. Як показано на фіг. 22, тканини оклюдованих нирок мишей, що одержували інгібуюче МАБР-2 антитіло, показали значиме зменшення гідроксипроліну, індикатору вмісту колагену, у порівнянні з нирками мишей, що одержували тАБ ізотипного контролю, Ід4 (р-0,0439).

Оцінка запалення

В оклюдованих нирках від тварин дикого типу, що одержували антитіло ізотипного контролю, і тварин дикого типу, що одержували інгібуюче МА5Р-2 антитіло, спостерігали рясний інфільтрат макрофагів. Ретельна кількісна оцінка не виявила суттєвої різниці в відсотковому вмісті забарвлених макрофагів між цими двома групами (дані не показані). Однак, незважаючи

Зо на еквівалентну кількість інфільтруючих макрофагів, в оклюдованих нирках від тварин, ін'єктованих інгібуючими МАБР-2 антитілами, фіброз розвився в значно меншому ступені, судячи з забарвлення сіріусом червоним, у порівнянні з оклюдованими нирками від тварин, яким вводили ізотипний контроль, цей результат узгоджується з результатами, згідно з якими тканини оклюдованих нирок від мишей, що одержували інгібуюче МАЗБР-2 антитіло, мали значимо меншу кількість гідроксипроліну, ніж в нирках мишей, що одержували тАб ізотипного контролю, Ідса4.

Обговорення

Результати, описані в цьому прикладі, показали, що використання інгібуючого МА5БР-2 антитіла забезпечує захист від фіброзу нирок в ШОО-моделі, що узгоджується з результатами, описаними в прикладі 14, які демонструють, що фіброз і запалення нирок у МАЗР-2-/- миші в

ОШОО-моделі виявилися значимо меншого ступеня в порівнянні з мишами дикого типу.

Результати в цьому прикладі демонструють зменшений фіброз у мишей, що одержували інгібуюче МА5Р-2 антитіло. Виявлення того, що фіброз в ШОО-нирках зменшується у тварин зі зменшенням або блокадою МА5Р-2-залежної активності лектинового шляху, є дуже значимим новим відкриттям. У сукупності результати, представлені в прикладі 14 і в цьому прикладі, демонструють сприятливий ефект інгібування МА5БР-2 на тубулоінтерстиціальне запалення нирок, ушкодження канальцевих клітин, вивільнення профіброзних цитокінів і рубцювання.

Зменшення фіброзу нирок залишається ключовою ціллю лікування нирок. ШОО-модель є моделлю важкого стану з прискореним фіброзом нирок, і втручання, яке зменшує фіброз у цій моделі, наприклад використання інгібуючих МА5Р-2 антитіл, імовірно, буде використовуватися для пригнічення або запобігання фіброзу нирок. Результати ШОО-моделі, імовірно, також можна віднести до захворювань нирок, що характеризуються гломерулярним і/або протеїнуричним ушкодженням канальців.

ПРИКЛАД 16

У цьому прикладі представлені результати, які були одержані з використанням моделі фіброзу, запалення і тубулоінтерстиціального ушкодження нирок на фоні викликаної передозуванням білка протеїнурії у МА5ЗР-2-/- мишей і мишей дикого типу для оцінки ролі лектинового шляху при протеїнуричній нефропатії.

Передумови/обгрунтування бо Протеїнурія є фактором ризику розвитку фіброзу нирок і втрати екскреторної функції незалежно від первинної хвороби нирок (Тгуддмазоп К. еї аї.,.). Іпїегп. Мей. 254:216-224, 2003,

Матв М., Ат. У). Мернгої. 25:77-94, 2005). Поняття протеїнуричної нефропатії описує токсичні ефекти надлишкового білка, що надходить у проксимальні канальці в результаті порушення гломерулярної вибірної селективності (Вгип5КіїЇ М.9., у. Ат. Зос. МерпгоїЇ. 15:504-505, 2004,

Ваіїпез ВА.9У., Мате Веху. МерНгоїЇ. 7:177-180, 2011). Це явище, звичайне для багатьох захворювань клубочків, приводить до прозапального середовища рубцювання в нирках і характеризується змінами в проксимальному рості канальцевих клітин, апоптозом, транскрипцією генів і продукуванням запальних цитокінів як наслідок сигнальних шляхів з порушеною регуляцією, стимульованих протеїнуричною канальцевою рідиною. Протеїнурична нефропатія звичайно визнається ключовим фактором, що сприяє прогресуючому ураженню нирок, характерному для різних первинних патологій нирок.

Хронічна хвороба нирок уражує більше 15 95 дорослого населення в Сполучених Штатах і щорічно є причиною приблизно 750 000 смертей в усьому світі (І 072апо К. еї аї., І апсеї. мої. 380,

І65йце 9859:2095-2128, 2012). Протеїнурія є показником хронічного захворювання нирок, а також фактором, що сприяє прогресуванню захворювання. Багато пацієнтів із протеїнуричним захворюванням нирок мають тубулоінтерстиціальне запалення і прогресуючий фіброз, які тісно пов'язані зі зниженням функції нирок. Протеїнурія сама по собі викликає тубулоінтерстиціальне запалення і приводить до розвитку протеїнуричної нефропатії (Вгип5кКіїЇ М... еї аї., У. Ат. Боб.

Мерпгої. 15:504-505, 2004). При протеїнуричних захворюваннях нирок надмірна кількість альбуміну і інших макромолекул фільтрується через клубочки і повторно поглинається проксимальними трубчастими епітеліальними клітинами. Це викликає порочне запальне коло, опосередковане активацією комплементу, що приводить до інфільтратів цитокінів і лейкоцитів, які викликають інтерстиціальне ушкодження канальців і фіброз, тим самим збільшуючи протеїнурію і приводячи до втрати функції нирок і, в остаточному підсумку, до прогресування аж до термінальної стадії ниркової недостатності (див., наприклад, Сіагк еї аїЇ., Сападіап Меадісаї

Авзосіайоп дошцгтпаї, 178:173-175, 2008). Очікується, що методи лікування, які модулюють цей шкідливий цикл запалення і протеїнурії, поліпшать результат при хронічному захворюванні нирок.

Враховуючи позитивний ефект інгібування МА5БР-2 в ШОО-моделі тубулоінтерстиціального

Зо ушкодження, був виконаний наступний експеримент для визначення, чи може інгібування

МАБР-2 зменшити ушкодження нирок у моделі передозування білка. У цьому дослідженні використовували передозування білка для індукування протеїнуричного захворювання нирок, як описано в Ізпоїа еї аІ., Еигореап Кепаї Авзосіайоп, 21:591-597, 2006.

Методи

Одержували МА5Р-2-/- мишу, як описано в прикладі 1, і піддавали зворотному схрещуванню протягом 10 поколінь з ВАЇ В/с. У даному дослідженні порівнювали результати, одержані для мишей дикого типу і МАБР-2-/- ВАЇВ/с мишей у моделі індукованої передозуванням білка протеїнурії.

За тиждень до початку експерименту мишам видаляли одну нирку перед передозуванням білка для одержання оптимальної відповіді. Індукуючий протеїнурію агент являв собою бичачий сироватковий альбумін з низьким рівнем ендотоксину (ВЗА, Зідта), який вводили в нормальному фізіологічному розчині УМТ (п-:7) і МАБР-2-/- мишам (п--7) у наступних дозах: одну дозу по 2 мг В5А/г, 4 мг В5А/г, 6 мг В5А/г, 8 мг В5А/г, 10 мг В5А/г і 12 мг В5А/г ваги тіла і 9 доз по 15 мг В5А/г ваги тіла, загалом протягом 15 днів було введено і.р. 15 доз. Контрольні миші МУТ (п-4) і МАБР-2-/- (п-4) миші одержували фізіологічний розчин, що вводиться тільки внутрішньоочеревинно. Після введення останньої дози тварин розміщали по одній в метаболічні клітки на 24 години для збирання сечі. Кров збирали за допомогою серцевої пункції під наркозом, кров залишали для коагуляції на льоду на 2 години, і сироватку відокремлювали центрифугуванням. Зразки сироватки і сечі збирали наприкінці експерименту на 15-й день, зберігали і заморожували для аналізу.

Мишей умертвляли через 24 години після останнього введення ВЗА на 15-й день, і для аналізу збирали різні тканини. Нирки збирали і обробляли для забарвлення НаЕ і імунозабарвлення. Імуногістохімічне забарвлення проводили наступним чином. Фіксовані у формаліні, залиті парафіном 5-мікронні зрізи тканин нирок від кожної миші депарафінізували і регідратували. Демаскування антигену проводили в цитратному буфері при 95 "С протягом 20 хвилин з наступною інкубацією тканин в З 95 НгОг2г протягом 10 хвилин. Потім тканини інкубували в блокувальному буфері (10 95 сироватки з виду, у якому було вирощене вторинне антитіло, і 1 до ВБА в РВ5) з 10 95 розчином авідину протягом 1 години при кімнатній температурі. Зрізи тканин промивали РВБ5 після кожної стадії по три рази протягом 5 хвилин. Потім бо використовували первинне антитіло в блокувальному буфері з 10 95 розчином біотину протягом

1 години при концентрації 1:100 для антитіл Е4/80 (Запіа Сги7, кат. Мо 506-25830), Таєгр (Запіа

Сги7, кат. Мо 5606-7892), І -6 (Запіа Сги7, кат. Мо 50с-1265) і концентрації 1:50 для антитіла ТМЕо, (Запіа Стги7, кат. Мо 50с-1348). Потім застосовували біотинільоване вторинне антитіло протягом 30 хвилин при концентрації 1:200 для зрізів з Е4/80, ТОЕРр і 11/-6 ї 1:100 для зрізів з ТМЕсо; з наступним застосуванням кон'югата ферменту НКР протягом ще 30 хвилин. Забарвлення проводили за допомогою набору із субстратом діамінобензидину (САВ) (Месіог І арх) протягом хвилин, і слайди промивали у воді, зневоднювали і приготовляли для дослідження без контрастного забарвлення для спрощення комп'ютерного аналізу. Забарвлені зрізи тканин з ниркової кіркової речовини аналізували за допомогою захоплення цифрового зображення з 10 наступною кількісною оцінкою з використанням програмного забезпечення для автоматичного аналізу зображень.

Апоптоз оцінювали в зрізах тканин шляхом забарвлення кінцевої мітки ЯОТР. з використанням термінальної дезоксинуклеотидилтрансферази (ТОМЕЇ) наступним чином.

Апоптотичні клітини в зрізах нирок забарвлювали, використовуючи набір з пероксидазою

АрортТадФ Регохідазе (МіПроге) наступним чином. Залиті парафіном, фіксовані формаліном зрізи нирок від кожної миші депарафінізували, регідратували, а потім білок пермеабілізували за допомогою протеїнази К (20 мкг/мл), яку наносили на кожний зразок протягом 15 хвилин при кімнатній температурі. Між стадіями зразки промивали РВ5. Активність ендогенної пероксидази гасили шляхом інкубації тканин в З 95 Нг2гОг протягом 10 хвилин. Потім тканини інкубували в зрівноважувальному буфері з наступною інкубацією з ферментом Тат протягом 1 години при 37 аб. Після промивання в зупинному/промивальному буфері протягом 10 хвилин кон'югат анти- дигоксигеніну наносили на 30 хвилин при кімнатній температурі з наступним промиванням.

Забарвлення здійснювали за допомогою набору з ЮАВ-субстратом протягом 4 хвилин з наступним промиванням у воді. Тканини піддавали контрастному забарвленню в гематоксиліні і установлювали в ОВХ. Частоту ТОМЕЇ -забарвлених (коричневого кольору) апоптотичних клітин підраховували вручну в послідовно вибраних 20 полях зору кіркової речовини під великим збільшенням за допомогою світлового мікроскопа І еіса ОВХМ.

Результати

Оцінка протеїнурії

Зо Для підтвердження наявності протеїнурії у мишей загальний білок у сироватці аналізували на 15-й день, а загальну кількість виділеного білка вимірювали в зразках сечі, зібраних протягом 24 годин на 15-й день дослідження.

На фіг. 23 графічно показана загальна кількість сироваткових білків (мг/мл), виміряна на 15- й день у контрольних мишей дикого типу (п-2), що одержували тільки фізіологічний розчин, мишей дикого типу, що одержували В5А (п-б), і МАБР-2-/- мишей, що одержували ВЗА (п-б).

Як показано на фіг. 23, введення ВЗА збільшувало загальний рівень білка в сироватці як у групах дикого типу, так і в МАБР-2-/- групі більше ніж у два рази в порівнянні з концентрацією в контрольній групі, що одержувала тільки фізіологічний розчин, при цьому між групами, що одержали лікування, суттєвої різниці не спостерігалося.

На фіг. 24 графічно показана загальна кількість білка (мг), виділеного із сечею, зібраною протягом 24 годин на 15-й день вивчення у контрольних мишей дикого типу (п-2), що одержували тільки фізіологічний розчин, мишей дикого типу, що одержували ВЗА (п-6), і МА5Р- 2-/- мишей, що одержували В5А (п-б). Як показано на фіг. 24, на 15-й день цього дослідження спостерігали приблизно шестикратне збільшення загальної кількості виділеного з сечею білка в групах, що одержували В5А, у порівнянні з контрольною групою з імітованим лікуванням, яка одержувала тільки фізіологічний розчин. Результати, наведені на фіг. 23 і 24, свідчать про те, що модель протеїнурії працює, як очікувалося.

Оцінка гістологічних змін у нирках

На фіг. 25 показані репрезентативні забарвлені НУЕ зрізи тканин нирок, які збирали на 15-й день дослідження передозування білка від мишей наступних груп: (панель А) контрольні миші дикого типу; (панель В) МАБР-2-/- контрольні миші; (панель С) миші дикого типу, що одержували В5А; і (панель Ю) МА5Р-2-/- миші, що одержували ВЗА. Як показано на фіг. 25, у групі МАБР-2-/- передозування (панель 0) спостерігали значно більш високий ступінь збереження тканини в порівнянні з групою передозування дикого типу (панель С) при однаковому рівні провокації передозуванням білка. Наприклад, капсули Боумена у мишей дикого типу, що одержували ВЗА (передозування) (панель С), були значимо розширені в порівнянні з капсулами Боумена в контрольній групі дикого типу (панель А). Навпаки, у капсул

Боумена мишей МАБР-2-/- (передозування), що одержували таку ж кількість ВЗА (панель б), зберігалася морфологія, аналогічна тій, яка спостерігалася у контрольних МАЗР-2-/- мишей бо (панель В) і контрольних мишей дикого типу (панель А). Як додатково показано на фіг. 25, в2 великі литі структури білків накопичуються в проксимальних і дистальних канальцях ниркових ділянок у дикого типу (панель С), які є більш крупними і більш численними в порівнянні з такими у МА5Р-2-/- мишей (панель 0).

Слід також зазначити, що аналіз зрізів нирок у цьому дослідженні за допомогою просвічувального електронного мікроскопа показав, що миші, які одержували В5А, мали загальне ураження на циліарних краях у дистальних і проксимальних клітинах ниркового канальця з вмістом клітин і ядрами, що впровадилися в просвіт канальця. Навпаки, тканина у

МА5Р-2-/- мишей, що одержували ВЗА, зберігалася.

Оцінка інфільтрації макрофагів у нирках

Щоб виміряти ступінь запалення, про що свідчить інфільтрація макрофагів, зрізи тканин зібраних нирок забарвлювали також антитілом до маркера макрофагів Е4/80 способами, описаними в Воог еї аї., У. ої Ат. ос. МерпгоЇоду, 18:1508-1515, 2007.

На фіг. 26 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених антитілом до маркера макрофагів Е4/80, що показують середню забарвлену площу макрофагів (95), де зрізи тканин одержували на 15-й день вивчення передозування білка у контрольних мишей дикого типу (п-2), мишей дикого типу, що одержували ВЗА (п-6), і МА5Р- 2-/- мишей, що одержували ВЗА (п-5). Як показано на фіг. 26, зрізи тканин нирок, забарвлені антитілом до маркерів макрофагів Р4/80, свідчать про те, що, хоча обидві групи, що одержували

В5А, показали значиме збільшення інфільтрації макрофагів у нирках (виміряне у вигляді 90 області забарвлених Е4/80 антитіл) у порівнянні з контрольними мишами дикого типу з імітованим лікуванням, значиме зниження інфільтрації макрофагів спостерігали в зрізах тканин у МАБР-2-/- мишей, що одержували В5А, у порівнянні з інфільтрацією макрофагів у зрізах тканин у мишей дикого типу, що одержували ВЗА (значення р-0,0345).

На фіг. 27А графічно показаний аналіз наявності кореляції між рівнем макрофагів і протеїнурією у кожної миші дикого типу (п-б), що одержувала В5А, у вигляді графіка залежності загальної кількості виділеного білка, виміряної в сечі з 24-годинного зразка, від ступеня інфільтрації макрофагів (96 середньої забарвленої площі). Як показано на фіг. 27А, більшість зразків із нирок дикого типу дали позитивну кореляцію між рівнем протеїнурії і ступенем інфільтрації макрофагів.

Зо На фіг. 27В графічно показаний аналіз наявності кореляції між рівнем макрофагів і протеїнурією у кожної МА5Р-2-/- миші (п-5), що одержувала В5А, у вигляді графіка залежності загальної кількості виділеного білка, виміряної в сечі з 24-годинного зразка, від ступеня інфільтрації макрофагів (96 середньої забарвленої площі). Як показано на фіг. 27В, позитивна кореляція, спостережувана у мишей дикого типу, між рівнем протеїнурії і ступенем інфільтрації макрофагів (показана на фіг. 27А) не спостерігалася у МАБР-2-/- мишей. Не обмежуючись конкретною теорією, ці результати можуть указувати на наявність механізму очищення від запалення при високих рівнях протеїнурії у МАБР-2-/- мишей.

Оцінка інфільтрації цитокінів

Інтерлейкін-б (1-6), трансформуючий фактор росту бета (ТОЕрД) ії фактор некрозу пухлини альфа (ТМЕо) є прозапальними цитокінами, які, як відомо, активуються в проксимальних канальцях мишей дикого типу в моделі протеїнурії (Аббраїе М еї аї., доигпа! ої Те Атегісап зЗосієїу ої Мерпгоіїоду: ЗАМ, 17:2974-2984, 2006; ЮОамій 5. єї аї.,, Мерпгоіоду, ОБідаїувів,

Тгаперіапіайоп, ОНісіа! Рибіїсайоп ої Ше Еигореап Оіаїузізапа Тгапзріапі Авззосіайоп - Еигореап

Вепа! Аззосіайоп, 12:51-56, 1997). Зрізи тканин нирок забарвлювали цитокін-специфічними антитілами, як описано вище.

На фіг. 28 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-ТИЕрР антитілом (виміряно у вигляді 95 площі забарвлених анти-ТаЕр антитіл), у мишей дикого типу, що одержували В5А (п-4), і МАБР-2-/- мишей, що одержували

В5А (п-5). Як показано на фіг. 28, значиме збільшення забарвлення ТОЕрД спостерігалося в групі мишей дикого типу, що одержувала ВЗА (передозування), у порівнянні з групою, МАБР-2-/- мишей, що одержувала В5А (передозування) (р-0,026).

На фіг. 29 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-ТМЕо антитілом (виміряно у вигляді 96 площі забарвлених анти-ТМЕо, антитіл), у мишей дикого типу, що одержували В5А, і МА5Р-2-/- мишей, що одержували ВЗА (п-5). Як показано на фіг. 29, значиме збільшення забарвлення ТМЕс; спостерігалося в групі дикого типу, що одержувала В5А (передозування), у порівнянні з МА5БР-2-/- групою, що одержувала ВЗА (передозування) (р-0,0303).

На фіг. 30 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-1ІЇІ -6 антитілом (виміряно у вигляді 95 площі забарвлених анти-1Ї -6 антитіл), у 60 контрольних мишей дикого типу, контрольних МАБР-2-/- мишей, мишей дикого типу, що одержували В5А (п-7), і МАБР-2-/- мишей, що одержували В5А (п-7). Як показано на фіг. 30, у групі дикого типу, що одержувала В5А, спостерігалося дуже значне збільшення забарвлення ЇЇ - 6 у порівнянні з МА5Р-2-/- групою, що одержувала ВЗА (р-0,0016).

Оцінка апоптозу

Апоптоз оцінювали в тканинних зрізах шляхом забарвлення кінцевої мітки ЯОТР з використанням термінальної дезоксинуклеотидилтрансферази (ТОМЕЇ), а частоту забарвлених

ТОМЕЇ -апоптотичних клітин підраховували в послідовно вибраних 20 полях зору кіркової речовини під великим збільшенням (НРЕ).

На фіг. 31 графічно показана частота ТОМЕГ! -позитивних апоптотичних клітин, підрахована у послідовно вибраних 20 полях зору під великим збільшенням (НРРЕ), у зрізах тканин ниркової кіркової речовини у контрольних мишей дикого типу (п-1), контрольних МА5Р-2-/- мишей (п-1), мишей дикого типу, що одержували В5А (п-б), і МАБР-2-/- мишей, що одержували ВЗА (п-7).

Як показано на фіг. 31, значно більш високий рівень апоптозу в кірковій речовині спостерігався в нирках, одержаних від мишей дикого типу, що одержували ВЗА, у порівнянні з нирками, одержаними від МА5Р-2-/- мишей, що одержували ВЗА (р-0,0001).

Загальний огляд результатів і висновки

Результати цього прикладу свідчать про те, що у МАБР-2-/- миші зменшене ушкодження нирок у моделі передозування білка. Отже, інгібуючі МА5Р-2 агенти, такі як інгібуючі МАБР-2 антитіла, як очікувалося, пригнічують або запобігають шкідливому циклу запалення і протеїнурії і поліпшують результати при хронічному захворюванні нирок.

ПРИКЛАД 17

У цьому прикладі описаний аналіз моноклонального інгібуючого антитіла МАБР-2 на ефективність у зниженні і/або запобіганні запаленню нирок і тубулоінтерстиціальному ушкодженню в моделі викликаної передозуванням білка протеїнурії у мишей дикого типу.

Передумови/обгрунтування

Як описано в прикладі 16, у моделі викликаної передозуванням білка протеїнурії було встановлено, що МА5Р-2-/- миші демонструють значно кращі результати (наприклад, менший ступінь тубулоїнтерстиціального ушкодження і менший ступінь запалення нирок), ніж миші дикого типу, що має на увазі патогенну роль лектинового шляху в протеїнуричному

Зо захворюванні нирок.

Як описано в прикладі 13, було створено моноклональне інгібуюче МА5БР-2 антитіло (О0М5646-51(23МІ-2), яке специфічно блокує функцію лектинового шляху у людини, а також було показано, що воно блокує лектиновий шлях у мишей. У цьому прикладі оцінювали ефективність інгібуючого МАБР-2 антитіла ОМ5646-5(22МІ-2 у мишачій моделі викликаної передозуванням білка протеїнурії відносно зменшення і/або профілактики запалення нирок і тубулоінтерстиціального ушкодження у мишей дикого типу.

Методи

У цьому дослідженні оцінювали вплив інгібуючого МА5Р-2 антитіла (10 мг/кг ОМ5646-502МІ- 2) у порівнянні з антитілом до людського Ідеї ізотипного контролю (10 мг/кг ЕТ904) і контролем з фізіологічним розчином.

Подібно дослідженню, описаному в прикладі 16, у цьому дослідженні використовували передозування білка для індукування протеїнуричного захворювання нирок (Із5поїа еї аї.,

Ешмгореап Вепаї Аззосіайоп, 21:591-597, 2006). Протеїнурію індукували у ВаІр/с мишей з однією видаленою ниркою щоденною і.р. ін'єкцією ескалаційних доз (від 2 до 15 г/кг) бичачого сироваткового альбуміну з низьким вмістом ендотоксину (ВЗА) протягом 15 днів, як описано в прикладі 16.

Лікування антитілами здійснювали шляхом і.р. ін'єкції два рази на тиждень, починаючи за 7 днів до індукції протеїнурії протягом усього дослідження. Ця схема дозування була вибрана на основі попередніх досліджень РК/РО і фармакологічних досліджень, що демонструють стійке пригнічення лектинового шляху (дані не показані). Мишей умертвляли на 15-й день, і нирки збирали і обробляли для забарвлення НУЕ і імунозабарвлення. Забарвлені зрізи тканин з ниркової кіркової речовини аналізували за допомогою захоплення цифрового зображення з наступною кількісною оцінкою з використанням програмного забезпечення для автоматичного аналізу зображень.

Оцінку імуногістохімічного забарвлення і апоптозу проводили, як описано в прикладі 16.

Результати

Оцінка протеїнурії

Для підтвердження наявності протеїнурії у мишей загальну кількість виділеного з сечею білка аналізували в зразках сечі, зібраних протягом 24-х годин, на 15-й день (кінець бо експерименту). Було встановлено, що в зразках сечі загальний рівень білка в середньому був збільшений майже в шість разів у групах, що одержували ВЗА, у порівнянні з контрольними групами, що не одержували В5А (дані не показані), що підтверджує наявність протеїнурії у мишей, які одержували ВЗА. У рівнях білка між групами, що одержували В5А, ніяких суттєвих відмінностей не спостерігалося.

Оцінка гістологічних змін

На фіг. 32 показані типові зрізи забарвлених НУЕ тканин для наступних груп мишей на 15-й день після лікування ВЗА: (панель А) контрольні миші дикого типу, що одержували фізіологічний розчин; (панель В) контрольні миші, що одержували ізотип антитіла; і (панель С) миші дикого типу, що одержували інгібуюче МА5Р-2 антитіло.

Як показано на фіг. 32, у групі, що одержувала інгібуюче МА5БР-2 антитіло (панель С), спостерігався значно більш високий ступінь збереження тканини в порівнянні з групою дикого типу, що одержувала фізіологічний розчин (панель А) або ізотипний контроль (панель В), при тому ж рівні провокації передозуванням білка.

Оцінка апоптозу

Апоптоз оцінювали в тканинних зрізах шляхом забарвлення кінцевої мітки ЯОТР з використанням термінальної дезоксинуклеотидилтрансферази (ТОМЕГ), а частоту забарвлених

ТОМЕЇ -апоптотичних клітин підраховували в послідовно вибраних 20 полях зору кіркової речовини під великим збільшенням (НРЕ). На фіг. 33 графічно показана частота ТОМЕЇ - позитивних апоптотичних клітин, підрахована в послідовно вибраних 20 полях зору під великим збільшенням (НРЕ) у зрізах тканин ниркової кіркової речовини у контрольних мишей дикого типу, що одержували фізіологічний розчин і ВБА (п-8), мишей дикого типу, що одержували антитіло ізотипного контролю і В5А (п-8), і мишей дикого типу, що одержували інгібуюче МА5Р- 2 антитіло і В5А (п--7). Як показано на фіг. 33, дуже значне зниження рівня апоптозу в кірковій речовині спостерігалося в нирках, одержаних з групи, що одержувала інгібуюче МА5БР-2 антитіло, у порівнянні з групою, що одержувала фізіологічний розчин і ізотипний контроль (р-0,0002 для контролю з фізіологічним розчином проти інгібуючого МА5Р-2 антитіла; р-0,0052 для ізотипного контролю проти інгібуючого МА5Р-2 антитіла).

Оцінка інфільтрації цитокінів

У зрізах тканин нирок, одержаних у цьому дослідженні, оцінювали інтерлейкін-б (ІІ -6),

Зо трансформуючий фактор росту бета (ТОЕрР) і фактор некрозу пухлини альфа (ТМЕо), які є прозапальними цитокінами й, як відомо, активуються в проксимальних канальцях у мишей дикого типу в моделі протеїнурії.

На фіг. 34 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-ТИЕрР антитілом (виміряно у вигляді 95 площі забарвлених анти-ТаЕр антитіл), у мишей дикого типу, що одержували В5А і фізіологічний розчин (п-8), мишей дикого типу, що одержували ВЗА і антитіло ізотипного контролю (п-7), і мишей дикого типу, що одержували В5А і інгібуюче МА5Р-2 антитіло (п-8). Як показано на фіг. 34, кількісне визначення забарвлених ТОЕрД областей показало значиме зниження рівнів ТОД у мишей, що одержували інгіібуюче МА5БР-2 антитіло, у порівнянні із групами, що одержували фізіологічний розчин і антитіла ізотипного контролю (значення р-0,0324 і 0,0349, відповідно).

На фіг. 35 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-ТМЕо антитілом (виміряно у вигляді 96 площі забарвлених анти-ТМЕо, антитіл), у мишей дикого типу, що одержували ВЗА і фізіологічний розчин (п-8), мишей дикого типу, що одержували ВЗА і антитіло ізотипного контролю (п-7), і мишей дикого типу, що одержували В5А і інгібуюче МА5Р-2 антитіло (п-8). Як показано на фіг. 35, аналіз забарвлених зрізів показав значиме зниження рівня ТМЕо; у групі, що одержувала інгібуюче МА5Р-2 антитіло, у порівнянні з контрольною групою, що одержувала фізіологічний розчин (р-0,011), а також групою, що одержувала ізотипний контроль (р-:0,0285).

На фіг. 36 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин, забарвлених анти-1Ї -6 антитілом (виміряно у вигляді 95 площі забарвлених анти-1Ї -6 антитіл), у мишей дикого типу, що одержували ВЗА і фізіологічний розчин (п-8), мишей, що одержували

В5А і антитіло ізотипного контролю (п-7), і мишей дикого типу, що одержували В5А і інгібуюче

МА5БР-2 антитіло (п-8). Як показано на фіг. 36, аналіз забарвлених ділянок показав значиме зниження рівня ІЇ/-б у групі, що одержувала інгібуюче МАБР-2 антитіло, у порівнянні з контрольною групою, що одержувала фізіологічний розчин (р-0,0269), а також групою, що одержувала ізотипний контроль (р-:0,0455).

Загальний огляд результатів і висновки

Результати в цьому прикладі демонструють, що використання інгібуючого МА5Р-2 антитіла забезпечує захист від ниркового ушкодження в моделі передозування білка, що узгоджується з бо результатами, описаними в прикладі 16, який демонструє, що у МАБР-2-/- мишей зменшене ушкодження нирок у моделі протеїнурії.

ПРИКЛАД 18

У цьому прикладі представлені результати, які були одержані з використанням моделі фіброзу нирок, запалення і тубулоіїнтерстиціального ушкодження на фоні індукованої адріаміцином нефрології у МА5Р-2-/- мишей і мишей дикого типу для оцінки ролі лектинового шляху при протеїнуричній нефропатії.

Передумови/обгрунтування

Адріаміцин є антацикліновим протипухлинним антибіотиком, використовуваним для лікування широкого спектра онкологічних захворювань, включаючи гематологічні злоякісні пухлини, саркоми м'яких тканин і багато які види карцином. Індукована адріаміцином нефропатія - добре відома модель хронічної хвороби нирок у гризунів, яка дозволила краще зрозуміти прогресування хронічної протеїнурії (І ее апа Наїтіх5, Мерпгоїоду, 16:30-38, 2011). Тип структурного і функціонального ушкодження при індукованій адріаміцином нефропатії дуже схожий на тип хронічного протеїнуричного захворювання нирок у людей (Рірріп сеї а!., Атегісап

Уоитаї! ої Репаї Рпузіоіоду, 296:6213-29, 2009).

Індукована адріаміцином нефропатія характеризується ушкодженням подоцитів з наступним гломерулосклерозом, тубулоіїнтерстиціальним запаленням і фіброзом. У багатьох дослідженнях показано, що індукована адріаміцином нефропатія модулюється як імунними, так і неїімунними механізмами (І ее апа Нагтіз, Мерпгоїоду, 16:30-38, 2011). Індукована адріаміцином нефропатія має декілька переваг як модель захворювання нирок. По-перше, це дуже добре відтворена і передбачувана модель ушкодження нирок, оскільки вона характеризується індукцією ушкодження нирок протягом декількох днів після введення лікарського засобу, що дозволяє полегшити розробку експерименту, оскільки ушкодження розвивається послідовно з перебігом часу. Це також модель, у якій ступінь ушкодження тканини є серйозним, незважаючи на прийнятний рівень смертності («5 90) їі захворюваності (втрата ваги). Тому через тяжкість і розвиток з перебігом часу ушкодження нирок при індукованій адріаміцином нефропатії ця модель є придатною для тестування терапевтичних методів, що захищають від ушкодження нирок.

Як описано в прикладах 16 і 17, у моделі індукованої передозуванням білка протеїнурії було

Зо встановлено, що МА5Р-2-/- миші і миші, що одержували інгібуюче МА5Р-2 антитіло, показали значно поліпшені результати (наприклад, менший ступінь тубулоіїнтерстиціального ушкодження і менший ступінь запалення нирок), у порівнянні з мишами дикого типу, що свідчить про патогенну роль лектинового шляху при протеїнуричній хворобі нирок.

У цьому прикладі МА5БР-2-/- мишей аналізували в порівнянні з мишами дикого типу в індукованій адріаміцином (АМ) нефрологічній моделі для визначення того, чи може дефіцит

МАБР-2 зменшити і/або запобігти розвитку запалення нирок і тубулоінтерстиціального ушкодження, викликаного адріаміцином.

Методи 1. Оптимізація дози і часової точки

Спочатку проводили експеримент для визначення дози адріаміцину і часової точки, при якій у мишей ВАГВ/сС розвивається рівень запалення нирок, придатний для тестування терапевтичного втручання.

Трьом групам мишей ВАГ В/с дикого типу (п-8) вводили ІМ одну дозу адріаміцину (10,5 мг/кг).

Мишей умертвляли в трьох точках: через один тиждень, два тижні і чотири тижні після введення адріаміцину. Контрольним мишам вводили тільки фізіологічний розчин.

Результати

У всіх мишей у трьох групах спостерігали ознаки гломерулосклерозу і протеїнурії, обумовлені забарвленням НЯЕ, з поступовим збільшенням ступеня запалення тканин, як виміряно по ступеню інфільтрації макрофагів у нирках (дані не показані). Ступінь ушкодження тканини був помірним в однотижневій групі, помірним у двотижневій групі і важким в чотиритижневій групі (дані не показані). Для частини дослідження, що залишилася, була вибрана двотижнева точка. 2. Аналіз індукованої адріаміцином нефропатії у мишей дикого типу і МА5Р-2-/- мишей

Щоб з'ясувати роль лектинового шляху комплементу в індукованій адріаміцином нефропатії, групу МА5Р-2-/- (ВАЇ В/с) мишей порівнювали з мишами дикого типу (ВАЇ В/с) при однаковій дозі адріаміцину. МА5Р-2-/- мишей схрещували з ВАГ В/с мишами протягом 10 поколінь.

Мишам дикого типу (п-8) і МАБР-2-/- мишам (п-8) вводили ІМ адріаміцин (10,5 мг/кг) і трьом мишам кожної лінії вводили тільки фізіологічний розчин як контроль. Усіх мишей умертвляли через два тижні після лікування, і тканини збирали. Ступінь гістопатологічного ушкодження бо оцінювали шляхом забарвлення НаЕ.

Результати

На фіг. 37 показані типові зрізи забарвлених НУЕ тканин для наступних груп мишей на 14-й день після лікування тільки адріаміцином або фізіологічним розчином (контроль): (панелі А-1, А- 2, А-3) контрольні миші дикого типу, що одержували тільки фізіологічний розчин; (панелі В-1, В- 2, В-3) миші дикого типу, що одержували адріаміцин; і (панелі С-1, 0-2, С-3) МАБР-2-/- миші, що одержували адріаміцин. Кожна фотографія (наприклад, панель А-1, А-2, А-3) являє собою окрему мишу.

Як показано на фіг. 37, в МАБР-2-/- групі що одержувала адріаміцин, спостерігається набагато більш високий ступінь збереження тканини в порівнянні з групою дикого типу, що одержувала таку ж дозу адріаміцину.

На фіг. 38 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених антитілом до маркера макрофагів Е4/80, що показують середню забарвлену площу макрофагів (95) для наступних груп мишей на 14 день після лікування тільки адріаміцином або фізіологічним розчином (контроль дикого типу): контрольні миші дикого типу, що одержували тільки фізіологічний розчин; миші дикого типу, що одержували адріаміцин;

МА5Р-2-/- миші, що одержували тільки фізіологічний розчин, і МА5Р-2-/- миші, що одержували адріаміцин. Як показано на фіг. 38, у МАБР-2-/- мишей, що одержували адріаміцин, ступінь інфільтрації макрофагів знижений ("р-0,007) у порівнянні з мишами дикого типу, що одержували адріаміцин.

На фіг. 39 графічно показані результати комп'ютерного аналізу зображень зрізів тканин нирок, забарвлених сірі усом червоним, що показують область забарвленого відкладення колагену (95) для наступних груп мишей на 14 день після лікування тільки адріаміцином або фізіологічним розчином (дикого типу контроль): контрольні миші дикого типу, що одержували тільки фізіологічний розчин; миші дикого типу, що одержували адріаміцин; МА5Р -2-/- миші, що одержували тільки фізіологічний розчин, і МАБР-2-/- миші, що одержували адріаміцин. Як показано на фіг. 39, у МАБР-2-/- мишей, що одержували адріаміцин, ступінь відкладення колагену знижений (7 р-0,005) у порівнянні з мишами дикого типу, що одержували адріаміцин.

Результати і висновки

Полегшення ниркового тубулоінтерстиціального запалення є ключовою ціллю лікування

Зо захворювань нирок. Представлені в даному описі результати показують, що лектиновий шлях активації комплементу додає суттєвий внесок у розвиток ниркового тубулоінтерстиціального запалення. Як додатково показано в даному описі, інгібуючий МА5Р-2 агент, такий як інгібуюче

МАБР-2 антитіло, може бути використаний як новий терапевтичний підхід для лікування протеїнуричної нефропатії, індукованої адріаміцином нефропатії і для зменшення ниркового тубулоінтерстиціального запалення.

ПРИКЛАД 19

У цьому прикладі описані початкові результати поточного клінічного випробування фази 2 для оцінки безпеки і клінічної ефективності повністю людського моноклонального інгібуючого

МАБР-2 антитіла у дорослих зі стероїд-залежною імуноглобулін-А нефропатією (ДАМ) і у дорослих зі стероїд-залежною мембранозною нефропатією (МН).

Передумови

Хронічні захворювання нирок уражують більше 20 мільйонів людей у Сполучених Штатах (Огаму? Р. єї аї., Апп. Іпієт. Мед. 162(11), ІТС1-16, 2015). Гломерулонефропатії (СМ), включаючи

ІЗАМ і МН, є захворюваннями нирок, при яких ушкоджені клубочки і які часто приводять до термінальної стадії ниркової недостатності і діалізу. Існує декілька типів первинних ОМ, найпоширенішою з яких є ІДАМ. У багатьох із цих пацієнтів спостерігається персистуюче запалення нирок і прогресуюче погіршення стану. Часто ці пацієнти лікуються кортикостероїдами або імунодепресантами, для яких характерні численні серйозні віддалені несприятливі наслідки. У багатьох пацієнтів стан продовжує погіршуватися навіть при цих методах лікування. Спосіб лікування ІДАМ або МН відсутній.

ІДА-нефропатія

Імуноглобулін А-нефропатія (ДАМ) - це аутоїмунне захворювання нирок, яке приводить до запалення усередині нирок і ушкодження нирок. ІДАМ є найпоширенішим первинним гломерулярним захворюванням в усьому світі Судячи з оцінок, при щорічному рівні захворюваності приблизно 2,5 на 100000 людей у 1 з 1400 людей у США розвивається ІДАМ. У 40 95 пацієнтів з ІДАМ хвороба буде прогресувати до термінальної стадії ниркової недостатності (ТОНН). У пацієнтів, як правило, спостерігається мікроскопічна гематурія з легкою і помірною протеїнурією і різними рівнями ниркової недостатності (Умуай К.). еї аІ., М. Епої. У. Меа. 368(25):2402-14, 2013). Клінічні маркери, такі як порушення функції нирок, тривала гіпертензія і бо важка протеїнурія (більше 1 г на день), пов'язані з поганим прогнозом (Соїо М. еїаї., Тгап5ріапі.

Мернгої. ОіаІ. 24(10):3068-74, 2009; Веппоих Р. еї а!., У. Ат. бос. Мернгої. 22(4):752-61, 2011).

Протеїнурія є найбільш сильним прогностичним фактором, що не залежить від інших факторів ризику за результатами декількох великих неекспериментальних і проспективних досліджень (Сорро В. евї аї., у. Мернгої!. 18(5):503-12, 2005; Веїсп Н.М. еї а!., У. Ат. бос. Мернгої!. 18(12):3177- 83, 2007). По оцінках, 15-20 905 пацієнтів досягають ТОНН протягом 10 років після початку захворювання, якщо вони не одержують лікування (О'Атісо С3., Ат. .). Кідпеу Рів. 36(2):227-37, 2000).

Діагностичною ознакою ІДАМ є переважання відкладення або тільки ІдА, або в комбінації з

ІЧ, ДМ або обох у гломерулярному мезангіумі. При ДАМ біопсія нирок виявляє гломерулярне відкладення мананзв'язувального лектину (МВІ), ключової молекули розпізнавання для активації МАБР-2, ефекторного ферменту лектинового шляху системи комплементу.

Гломерулярні відкладення МВІ, які звичайно локалізовані спільно з ІдА і указують на активацію комплементу, і високий рівень МВІ. у сечі пов'язані з несприятливим прогнозом при ІДАМ, при цьому у цих пацієнтів проявляються більш серйозні гістологічні зміни і мезангіальна проліферація, ніж у пацієнтів без відкладення МВІ. або з високими рівнями МВІ. у сечі (Маїзида

М. єї аї., Мерпгоп, 80(4):408-13, 1998; (іш І. єї аї., СіІїп. Ехр. Іттипої. 169(2):148-155, 2012;

Воо5 А. еї аї., у). Ат. бос. Мерпгої. 17(6):1724-34, 2006; Пи Г.С. еї аї., СіІіп. Ехр. Іттипої. 174(1):152-60, 2013). Частота ремісії також значно нижче у пацієнтів з відкладенням МВІ. (Гі

Г.М. еїа)., Сііп. Ехр. Іттипої. 174(1):152-60, 2013).

Поточна терапія ІДАМ включає контроль артеріального тиску і часто приймання кортикостероїдів і/або інших імунодепресантів, таких як циклофосфамід, азатіоприн або мікофеноляту мофетил, у випадках важкого стану захворювання (наприклад, серпоподібні

ІЗАМ). Згідно з керівництвом Хвороби нирок по поліпшенню глобальних результатів лікування при гломерулонефриті (КОІСО) (Іпі. ос. ої Мерпгої. 2(2):139-274, 2012) рекомендується вводити кортикостероїди пацієнтам з протеїнурією дозою, яка вище або дорівнює 1 г/день, зі звичайною тривалістю лікування 6 місяців. Однак навіть при агресивному імуносупресивному лікуванні, яке пов'язане з серйозними віддаленими наслідками, у деяких пацієнтів спостерігається прогресуюче погіршення функції нирок. Схвалене лікування ІДАМ відсутнє, навіть у випадку застосування інгібіторів ангіотензинперетворювального ферменту (АСЕ) або блокаторів

Зо рецепторів ангіотензину (АКВ) для контролю артеріального тиску у деяких пацієнтів зберігається підвищена протеїнурія. Було показано, що жоден із цих методів не зупиняє або навіть не уповільнює прогресування ІДАМ у пацієнтів з ризиком швидкого прогресування захворювання.

Мембранозна нефропатія

Щорічний рівень захворюваності мембранозною нефропатією (МН) становить приблизно 10- 12 на 1000000 людей. Пацієнти з МН можуть мати змінний перебіг захворювання, але приблизно у 25 95 буде розвиватися термінальна стадія ниркової недостатності.

Мембранозна нефропатія - це імуномодульоване клубочкове захворювання і одна з найпоширеніших причин нефротичного синдрому у дорослих. Хвороба характеризується утворенням імунних відкладень, у першу чергу 904, на зовнішньому шарі гломерулярної базальної мембрани, які містять антигени подоцитів і антитіла, специфічні до цих антигенів, що приводить до активації комплементу. Початкові прояви МЕН пов'язані з нефротичним синдромом: протеїнурією, гіпоальбумінемією, гіперліпідемією і набряком.

Хоча МН може слабшати спонтанно, без лікування, у однієї третини пацієнтів спостерігається прогресуюча втрата функції нирок і прогресування захворювання до ТОНН у середньому через 5 років після встановлення діагнозу. Часто для лікування МН застосовуються кортикостероїди, і існує необхідність у розробці альтернативних методів лікування. Крім того, пацієнти, які, як вважається, мають помірний ризик прогресування, залежно від тяжкості протеїнурії одержують преднізон у комбінації з циклофосфамідом або інгібітором кальциневрину, і ці два методи лікування, застосовувані спільно, часто пов'язані з серйозними системними побічними ефектами.

Методи

Два клінічні дослідження Фази 1, проведені на здорових добровольцях, продемонстрували, що як внутрішньовенне, так і підшкірне введення інгібуючого МАБР-2 антитіла, ОМ5646, приводило до стійкого пригнічення лектинового шляху.

У цьому прикладі описані проміжні результати Фази 2, що проводиться на даний час, неконтрольованого, багатоцентрового дослідження інгібуючого МАБР-2 антитіла, ОМ5646, у суб'єктів з ІЗАМ і МН. Згідно з критеріями включення необхідно, щоб стан усіх пацієнтів у цьому дослідженні, незалежно від підтипу захворювання нирок, підтримувався прийманням стабільної 60 дози кортикостероїдів протягом щонайменше 12 тижнів до їх включення в дослідження (тобто пацієнти були залежними від стероїдів). Дослідження являє собою непорівняльне пілотне дослідження з 12-тижневим лікуванням і б-тижневим періодом спостереження.

Згідно з планом дослідження необхідно набрати приблизно по чотири пацієнти на одне захворювання. Дослідження призначене для оцінки можливості ОМ5646 поліпшувати функцію нирок (наприклад, зменшувати тяжкість протеїнурії) і знижувати потреби в кортикостероїдах у пацієнтів з (ДАМ ії МН. На сьогоднішній день 2 пацієнти з ІдДА-нефропатією і 2 пацієнти з мембранозною нефропатією завершили лікування в цьому дослідженні.

Для входження в дослідження кожний суб'єкт повинен мати високий рівень білка в сечі, незважаючи на постійне лікування стабільною дозою кортикостероїдів. Ці критерії вибрані для пацієнтів, у яких навряд чи відбудеться спонтанне поліпшення під час дослідження.

Вік суб'єктів під час відбору становив 218, і суб'єктів включали в дослідження тільки в тому випадку, якщо в них діагностували одне з наступного: ІДАМ при біопсії нирок або первинну МН при біопсії нирок. Зараховані пацієнти також повинні були відповідати всім наведеним нижче критеріям включення: (1) середнє співвідношення альбумін/креатинін у сечі 20,6 у трьох зразках, що збираються послідовно і щодня перед кожним з двох відвідувань у період відбору; (2) приймання преднізону дозою 210 мг або еквівалентною дозою протягом щонайменше 12 тижнів до відвідування 1 у період відбору; (3) при фоновому імуносупресивному лікуванні (наприклад, циклофосфамідом, мікофеноляту мофетилом) прийом стабільної дози протягом як мінімум 2 місяців до візиту 1 у період відбору без очікуваної зміни дози під час дослідження; (4) оцінена швидкість клубочкової фільтрації (есЕкК) 530 мл/хв.11,73 ме, обчислена по рівнянню МОВО"; (5) проходження призначеної лікарем стабільної, оптимізованої терапії інгібіторами ангіотензинперетворювального ферменту (АСЕЇ) і/або блокаторами рецепторів ангіотензину (АКВ), систолічний артеріальний тиск «150 мм рт. ст. і діастолічний артеріальний тиск «90 мм рт. ст. у розслабленому стані; (б) невикористання белімумабу, ецулізумабу або ритуксимабу протягом б місяців до відвідування 1 у період відбору; а також

Зо (7) відсутність трансплантації нирки. "Рівняння МОКО: есгК (мл/хв./1,73 м2)-175 х (сг) - 1,154 х (Вік) - 0,203 х (0,742, якщо жінка) х (1,122, якщо афроамериканець). Примітка: Зсг - вимірювання креатиніну в сироватці крові повинно бути виражене в мг/дл.

Моноклональне антитіло, використовуване в цьому дослідженні, ОМ5646, являє собою повністю людське ІдД054 моноклональне антитіло, яке зв'язує і інгібує люодський МАЗР-2. МАБР-2 є ефекторним ферментом лектинового шляху. Як показано в прикладі 12, ОМ5646 ефективно зв'язується з рекомбінантним МА5Р-2 (уявна рівноважна константа дисоціації в діапазоні 100

ПМ) і проявляє більше ніж 5000-кратну селективність до гомологічних білків С15, С1іг і МАБР-1. У функціональних аналізах ОМ5646 пригнічує активність лектинового шляху людини з ефективністю в межах наномолів (концентрація, що забезпечує 50 95 інгібування (ІСво), становить приблизно З НМ), але не виявляє суттєвого впливу на класичний шлях. ОМ5646, що вводиться або внутрішньовенною (ІМ), або підшкірною (5С) ін'єкцією мишам, приматам, що не належать до людини, і людям, приводив до високих концентрацій у плазмі, які були пов'язані з пригніченням активації лектинового шляху в аналізі ех мімо.

У цьому дослідженні лікарська речовина ОМ5646 надавалася в концентрації 100 мг/мл, яку додатково розбавляли для ІМ введення. Відповідний розрахований об'єм 100 мг/мл розчину

ОМ5646 для ін'єкцій витягали з флакона за допомогою шприца для приготування дози. Мішок для інфузії вводили протягом чотирьох годин після приготування.

Дослідження включало періоди скринінгу (28 днів), лікування (12 тижнів) і наступного спостереження (6 тижнів), як показано на схемі дослідження, наведеній нижче.

Схема дослідження іх вВормех ! і Ягве : дікування сСпостзпежения

У | ! ел рн : і ї ен ГІОБУвеМнХ | Чен: НА кош ПТ ПВА ТО : | сучок | мив ие ' ба ; ; ї лень зві ітяждень ІВ:

Тдааннннннчннннннних ралкдддааааанннннях ному до Ге. да в. У дккдклкккккн Кк З дккжккнк чн нккняякккКнЯ, З уоооооееююєкккя

Під час відбору до введення першої дози ОМ5646 пацієнти, що пройшли відбір, надавали по три зразки сечі (які збирали раз на добу) у кожному із двох триденних періодів для встановлення вихідних значень відношення альбуміну до креатиніну в сечі. Після закінчення періоду відбору відібраним суб'єктам вводили ІМ ОМ5646 по 4 мг/кг один раз на тиждень протягом 12 тижнів (період лікування). Після останньої дози ОМ5646 йшов б-тижневий період спостереження.

Протягом перших 4 тижнів лікування за допомогою ОМ5646 випробувані продовжували приймати стабільну дозу кортикостероїдів, яку приймали до початку лікування. Наприкінці перших 4-х тижнів 12-тижневого періоду приймання суб'єктами кортикостероїду поступово скорочували (тобто дозу кортикостероїдів зменшували), якщо це було можливо, протягом 4 тижнів, а потім йшли 4 тижні, протягом яких продовжувалося приймання одержаної в результаті зменшеної дози кортикостероїдів. Метою було зниження дози преднізону до «б мг (або еквівалентної дози) щодня. У цей період поступове зниження дози припиняли у пацієнтів, у яких спостерігалося погіршення функції нирок, по оцінці дослідника. Суб'єктів лікували ОМ5646 на фоні поступового зниження дози кортикостероїду і протягом повних 12 тижнів. Потім пацієнтів спостерігали протягом додаткових б тижнів після останнього приймання ОМ5646. Поступове зниження дози кортикостероїдів і лікування ОМ5646 дозволили оцінити, чи дозволяє приймання

ОМ5646 знижувати дози кортикостероїдів, необхідних для підтримання стабільної функції нирок.

Ключовими заходами ефективності в цьому дослідженні є зміна співвідношення альбумін/креатинін у сечі (АСК) і 24-годинний рівень білка відносно вихідного рівня, одержаного до початку 12 тижнів. Вимірювання білка або альбуміну в сечі звичайно використовується для оцінки ураження нирок, а стійкі високі рівні білка в сечі корелюють з прогресуванням захворювання нирок. шАСК використовується в клінічних дослідженнях для оцінки протеїнурії.

Оцінка ефективності

Аналізоване значення пшАСК визначають як середнє від усіх значень, одержаних у деякій

Зо часовій точці. Планована кількість ЧАСК дорівнює трьом для кожного запланованого моменту часу. Вихідне значення пАСК визначали як середнє значення аналізованих значень при двох відвідуваннях.

Результати

На фіг. 40 графічно показані шАСК для двох пацієнтів з (ДАМ протягом 12-тижневого дослідження із щотижневим лікуванням інгібуючим МАЗР-2 антитілом (0М5646) у кількості 4 мг/кг. Як показано на фіг. 40, зміна від вихідного рівня статистично значима в часовій точці "а" (р-0,003); часовій точці "р" (р-0,007) і часовій точці "с" (р-0,033), згідно з нетрансформованим аналізом. У таблиці 12 представлені дані для білка в 24-годинній сечі пацієнтів з (ДАМ, що одержували ОМ5646.

ТАБЛИЦЯ 12

Білок в 24-годинній сечі (мг/добу) у ІДАМ-пацієнтів, що одержували ОМ5646 (мг/24 години) (мг/24 години)

Як показано на фіг. 40 і в таблиці 12, у ході дослідження у пацієнтів з (ІДАМ спостерігали клінічно і статистично значиме поліпшення функції нирок. Статистично значиме зниження як величини ЧАС (див. фіг. 40), так і концентрації білка в 24-годинній сечі (див. таблицю 12). Як показують дані ЧАСК на фіг. 40, середній вихідний рівень пАСК становив 1264 мг/г і наприкінці лікування досяг 525 мг/г (р-0,011), знизившись до 128 мг/г наприкінці періоду спостереження.

На фіг. 40 додатково показано, що лікувальний ефект підтримувався протягом усього періоду спостереження. Вимірювання 24-годинної екскреції білка з сечею відслідковували по ЧАСК, з середнім зниженням від 3156 мг/24 години до 1119 мг/24 години (р-0,017). Ефекти лікування у двох пацієнтів були у високому ступені узгодженими. У обох пацієнтів спостерігалося зниження приблизно на 2000 мг/добу, і обидва пацієнти досягали часткової ремісії (визначеної як більше 50-відсоткове зниження екскреції білка в 24-годинній сечі і/або кінцевої екскреції білюка менше 1000 мг/добу; повну ремісію визначали як екскрецію білка менше 300 мг/добу). Величина 24- годинного зниження протеїнурії у обох пацієнтів з ІдА-нефропатією пов'язана зі значним поліпшенням виживаності нирок. Обидва пацієнти з ІдА-нефропатією також виявилися толерантними до суттєвого зменшення прийнятих ними доз стероїдів, зі зниженням добової дози до «5 мг (від 60 до 0 мг, від 30 до 5 мг).

У двох пацієнтів з МН також спостерігали зниження ЧчАСК під час лікування ОМ5646. У одного пацієнта з МН рівень ЧАСЕ знизився з 1003 до 69 мг/г, і цей низький рівень зберігався протягом періоду спостереження. У іншого пацієнта з МН спостерігалося зниження ЧАсСк з 1323 до 673 мг/г зі змінним курсом після лікування. У першого пацієнта з МН спостерігали виражене зниження рівня білка в 24-годинній сечі (10771 мг/24 години на початку лікування до 325 мг/24 години на день 85), що забезпечувало часткову і майже повну ремісію, тоді як у іншого він залишався практично незмінним (4272 мг/24 години на початку лікування до 4502 мг/24 на день 85). Рівні стероїдів у двох пацієнтів з МН поступово знижувалися від 30 до 15 мг і від 10 до 5 мг.

Таким чином, узгоджені поліпшення функції нирок спостерігали у пацієнтів з ІЗАМ і МН, що одержували лікування інгібуючим МА5ЗР-2 антитілом, ОМ5646. Ефекти лікування ОМ5646 у пацієнтів з ІДАМ є надійними і узгодженими, що свідчить про сильний сигнал ефективності. Ці ефекти підтверджені результатами у пацієнтів з МН. Часовий профіль і величина змін ПАС під час лікування були узгодженими у всіх чотирьох пацієнтів з ІДАМ і МН. Ніяких суттєвих проблем з безпекою не спостерігалося. Пацієнти в цьому дослідженні належали до групи,

Зо важкодоступної для лікування, і терапевтичний ефект у цих пацієнтів свідчить про ефективність інгібуючого МА5Р-2 антитіла, такого як ОМ5646, у пацієнтів з ІДАМ і МН, таких як пацієнти, що страждають стероїд-залежними ІДАМ і МН (тобто пацієнтів, що одержували лікування стабільною дозою кортикостероїдів до лікування інгібуючим МА5Р-2 антитілом), у тому числі пацієнтів з підвищеним ризиком швидкого прогресування до термінальної стадії ниркової недостатності.

Відповідно до вищевикладеного, в одному з варіантів здійснення винаходу надається спосіб лікування людини, що страждає ІДАМ або МН, який включає введення суб'єкту композиції, що містить кількість інгібуючого МА5БР-2 антитіла, ефективну для пригнічення МА5Р-2-залежної активації комплементу. В одному з варіантів здійснення спосіб включає введення людині, що страждає ІЩАМ або МН, кількості інгібуючого МАБР-2 антитіла, достатньої для поліпшення функції нирок (наприклад, зменшення протеїнурії). В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає стероїд-залежною ІДАМ. В одному з варіантів здійснення суб'єкт страждає стероїд- залежною МН. В одному з варіантів здійснення інгібуюче МАБ5Р-2 антитіло вводиться суб'єкту, що страждає стероїд-залежною ІДАМ або стероїд-залежною МН, у кількості, достатній для поліпшення функції нирок і/або зниження дози кортикостероїдів у зазначеного суб'єкта.

В одному з варіантів здійснення спосіб додатково включає ідентифікацію суб'єкта, що страждає стероїд-залежною ІДАМ, до етапу введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгіібуючого МАБР-2 антитіла, ефективну для пригнічення МАБР-2-залежної активації комплементу.

В одному з варіантів здійснення спосіб додатково включає ідентифікацію суб'єкта, що має стероїд-залежну МН, до етапу введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгібуючого

МА5Р-2 антитіла, ефективну для пригнічення МА5Р-2-залежної активації комплементу.

Відповідно до будь-якого з розкритих тут варіантів здійснення інгібуюче МА5Р-2 антитіло проявляє щонайменше одну або декілька з наступних характеристик: зазначене антитіло зв'язує людський МАБбР-2 з Ко 10 нМ або менше, зазначене антитіло зв'язує епітоп у домені ССРІ1

МАБ5БР-2, зазначене антитіло пригнічує відкладення СЗ3Б в аналізі іп мійго в 1 95 людській сироватці з ІСво 10 нМ або менше, зазначене антитіло пригнічує відкладення СЗБ в 90 95 людської сироватці з ІЇС5о 30 нМ або менше, де антитіло являє собою фрагмент антитіла, вибраний із групи, що складається з Ем, Бар, Раб", Е(аб)» і Е(аб)г2, де антитіло являє собою бо одноланцюжкову молекулу, де зазначене антитіло являє собою молекулу ІдО2, де зазначене антитіло являє собою молекулу ІдДО1, де зазначене антитіло являє собою молекулу Ідс4ї, де молекула Ідсш4 містить мутацію 5228Р. В одному з варіантів здійснення антитіло зв'язується з

МА5Р-2 і вибірково пригнічує лектиновий шлях без пригнічення по суті класичного шляху (тобто пригнічує лектиновий шлях, залишаючи неушкодженим класичний шлях комплементу).

В одному з варіантів здійснення інгібуюче МА5Р-2 антитіло вводять у кількості, ефективній для поліпшення щонайменше одного або більше клінічних параметрів, пов'язаних з функцією нирок, таких як зменшення протеїнурії (наприклад, зменшення шАСЕ і/або зменшення концентрації білка в 24-годинній сечі, таке як більше ніж 20 95 зменшення екскреції білка в 24- годинній сечі, або таке як більше ніж 30 95 зменшення екскреції білка в 24-годинній сечі, або таке як більше ніж 40 95 зменшення екскреції білка в 24-годинній сечі, або таке як більше 50 95 зменшення екскреції білка в 24-годинній сечі).

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення інгібуючого МА5Р-2 антитіла суб'єкту, що страждає ІДАМ (такою як стероїд-залежна ДАМ), через катетер (наприклад, внутрішньовенно) протягом першого періоду часу (наприклад, щонайменше від одного дня до тижня або двох тижнів, або трьох тижнів, або чотирьох тижнів або більше) з наступним введенням інгібуючого МАБР-2 антитіла суб'єкту підшкірно протягом другого періоду часу (наприклад, хронічної фази протягом щонайменше двох тижнів або більше).

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення інгібуючого МА5Р-2 агента суб'єкту, що страждає МН (такою як стероїд-залежна МН), через катетер (наприклад, внутрішньовенно) протягом першого періоду часу (наприклад, щонайменше від одного дня до тижня або двох тижнів, або трьох тижнів, або чотирьох тижнів, або більше) з наступним введенням інгібуючого

МА5Р-2 антитіла суб'єкту підшкірно протягом другого періоду часу (наприклад, хронічної фази протягом щонайменше двох тижнів або більше).

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення інгібуючого МА5Р-2 антитіла суб'єкту, що страждає ІДАМ (такою як стероїд-залежна ІДАМ) або МН (такою як стероїд-залежна

МН) внутрішньовенно, внутрішньом'язово або підшкірно. Лікування може бути хронічним і вводитися щодня щомісяця, але переважно щонайменше кожні два тижні або щонайменше раз на тиждень, наприклад два рази на тиждень або три рази на тиждень.

В одному з варіантів здійснення спосіб включає лікування суб'єкта, що страждає ІДАМ (такою

Зо як стероїд-залежна ІДАМ) або МН (такою як стероїд-залежна МН), яке включає введення суб'єкту композиції, що містить кількість інгібуючого МА5Р-2 антитіла або антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить СОБ-НІ, СОВ-Н2 і

СОВ-НЗ амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить СОК-І1, СОВ-12 і СОК-І3 амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІЮ МО:70. У деяких варіантах здійснення композиція містить інгібуюче

МА5Р-2 антитіло, що містить (І) (а) варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить: і) СОВ-НІ1 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 31-35 в 5ЕО ІЮ МО:67; і ії) СОК-

Н2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 50-65 в 5ЕО ІЮО МО:67; і їїї)

СОВ-НЗ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 95-107 в 5ЕО ІЮ МО:67; і (б) варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить: ) СОК-Ї1 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 24-34 в 5ЕО ІЮ МО:70; і і) СОК-12 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 50-56 в 5ЕБО ІЮО МО:70; і ії) СОК-І З легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність з аа 89-97 в 5ЕО ІЮ МО:70; або (Ії) його варіант, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга з щонайменше 90 95 ідентичністю з ЗЕО ІЮ

МО:67 (наприклад, щонайменше 91 9565, щонайменше 92 96, щонайменше 93 95, щонайменше 94 до, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 956, щонайменше 99 95 ідентичністю) з ЗЕО ІЮО МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга з ідентичністю щонайменше 90 95 (наприклад, щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 95, щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98

БО до, щонайменше 99 95 ідентичністю) з ЗЕО ІЮ МО:70.

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгібуючого МА5БР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в

ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО:70.

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка містить інгібуюче МА5Р-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа на людському МА5Р-2, розпізнаваному референсним антитілом

ОМ5646, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, як зазначено в 5ЗЕО ІЮ МО:67, і бо варіабельну ділянку легкого ланцюга, як зазначено в ЗЕО ІЮ МО:70.

У деяких варіантах здійснення спосіб включає введення суб'єкту, що страждає або має ризик розвитку ІДАМ (такої як стероїд-залежна ІЩАМ) або МН (такої як стероїд-залежна МН), композиції, яка містить інгібуюче МАБР-2 антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮО МО:70, у дозі від 1 до 10 мг/кг (тобто 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9 або 10 мг/кг) не рідше одного разу на тиждень (наприклад, щонайменше два рази на тиждень або щонайменше три рази на тиждень) протягом щонайменше 3 тижнів або протягом щонайменше 4 тижнів, або протягом щонайменше 5 тижнів, або протягом щонайменше б тижнів, або протягом щонайменше 7 тижнів, або протягом щонайменше 8 тижнів, або протягом щонайменше 9 тижнів, або протягом щонайменше 10 тижнів, або протягом щонайменше 11 тижнів, або протягом щонайменше 12 тижнів.

Інші варіанти здійснення

Усі публікації, патентні заявки і патенти, згадані в цьому описі, включені в даний опис у вигляді посилання.

Різні модифікації і варіанти описаних способів і композицій за винаходом будуть очевидні фахівцям у даній галузі техніки без відхилення від обсягу і суті винаходу. Хоча винахід був описаний відносно конкретних переважних варіантів здійснення, слід розуміти, що заявлений винахід жодним чином не повинен бути обмежений такими конкретними варіантами здійснення.

Хоча продемонстровані і описані ілюстративні варіанти здійснення, буде зрозуміло, що можуть бути внесені різні зміни без відхилення від суті і обсягу винаходу.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 Ощтеков5 Согрогасіоп

Опіуеквісу ої Геїісевтекг

ВгппеКкі11, Мідеї

Рештшорціов, Ссгедогу А. ридіег, Тот зспмаєбіє, Напе-Ші1Ппеїт

Зо «1205 СПОСІБ ПРИГНІЧЕННЯ ФІБРОЗУ У СУБ'ЄКТА, ЩО ЦЬОГО ПОТРЕБУЄ «1305 МР.1.0О250. РОСТ «1505 62/275,025 «1515 2016-01-05 «1505» 62/407,979 35 «1515 2016-10-13 «1605 85 «1705 РабепсІпПп уеквзіоп 3.5 «21051 «2115 725 40 «2125» ДНК «213» Ношо зарієпь «220» «2215 Кодуюча послідовність «222» (27)..(584) 45 «4005 1 чдассаддсса дседдасоддда сасасс асд адд ссд сбд асс ссс ссд ддес се з

Меє Агд Гей Гей ТПг Гей Ггец С1Уу Іей 1. 5 50 сгЧд сдє дос сСсу деуд дссоасс оссс су дос о ссу аад Єд9у ссеЕ даа ссе 101

Тец Сув бі1у Бек Уаі Аїа ТПг Рго Геш с1іу Рго Ппув Тер Рго бій Рго 10 15 20 25

ЧЕЯд ЄС дод сс сед дса сс о ссс дос ССС о сса ддуд дад бас дсс ааєс 55 149

Уаї Рпе с1у Агкд Гей Аза бек Рго сіу Ропе Рго сіу біц Тук Аї1а Авп час сад дад судд судс ду асс о ссд асо дса ссс оссс о дудс гас сдс сгд 197 бо Авр біп бій Агуд Агуд Тер Тпс Гей ТПг АТа Рго Рго сіу Туг Ак9д Іецй зо зо сдс сс бас сссоасс осас ссс о дас студ дад сс сс осас сес гбодс дад

Акуд Гей Тук Рбе ТПг Ні Ррпе Авр Тец біц ІТецйп бек Нів Гец Сув бі бо 65 70 бас дас ЄсСсС дсс оаад ссд адс сСсу дод дсс оаад дсод сс дес оасу сід 293

Тук Авр Рпе Уа1! пуб Гец бек бек сіу Аїа пуб Уаі Іецй А1їа ТПг Іецй 75 80 85 бдс дод сад дад адс аса дас асуд дад с9дд дсс о ссЕ дадас аад дас асе 341

Сув б1у біп сій Бек ТПг Авр ТПг бі Агуд Аза Рго с1і1у Пув Авр ТЕП 90 95 100 105

ЕС бас су сед ддс сс оадс ссд дас асс асс сс сдудс сс дас бас 389

Рпе Тук бек Гей сі1у бек бек Гецп Авр І1е ТПг Рре Агуд бек Авр Туг 110 115 120 сс аас дад аад сс ЄС ас ддуд ССС дад дсс о сссС бас дса дсс дад 437 век Авп о біц пуб Рго Рпе ТПг сбіу Рпбе бій Аї1а Рпе Туг Аїа Аїа сіц 125 130 135 час аєє дас дад Єдс сад дед дсс о оссуд дда дад дсуд сссоасс бдс дас 485

Авр І1е Авр біц Сув біп Уаі Аза Рго б1у бій Аза Рго ТПг Сув Авр 140 145 150 сас сас Сдс сас аас сас сруд дудс дає сСесС Сас осдс сСсс о сдс о сдс дса з33

Нів Нів Сув Нів Авп Нів Іец сіу сіу Рібе Туг Сув бек Сув Агуд Аїа 155 160 165

Час бас дЕС срд сас саєЄ аас аад сдс асс бдс сСса дад сад адс сс

Зо з81 сбі1у Тук Маї Гей Нів Агуд Авп ГПув Агуд ТБг Сув бек біц біп бек Ієц 170 175 180 185

Бад ссеЕссссвдуд адсессоддсесс Єдсссадсад дссадаадсс ададссадсс 634

ЕдсЕддссес адсесссоддУає Сдодсеєдадча СододссдЕдсс ссаассссса гЕсСасссасс 694 аєддасссаа баасааассе ддссссассс с 725 «2105 2 «2115 185 «212» Протеїн «213» Ношо зарієпь «4005 2

Меє Агд Гей Гей ТПг Гей Гец сіу Гей Гей Сув біу бек Уаі Аїа ТПг 1. 5 10 15

Ркго Гей біу Ркго пуб Тер Рго біц Рго Уа! Рпе с1іу Агд Гей Аїа 5ег 20 25 30

Ркго сіу Рбе Рго біу бій Туг Аза АБп АвБр біп бій Агуд Агд Тер Тбг 35 40 45

Тем ТПг АТа Рго Рго с1іу Туг Акд Гей Агд Гей Тук Рібе ТПг Нів РБГе 50 З бо

Авр Гей біц Гец бек Нів Гей Сув біц Тук Авр Рпе Уаії Ппув Гей 5ег 65 70 75 80 зек сіу Аїа пув Уаі Іейп Аїа ТБПг Іец Сув б1у біп бій Бек ТПг Авр 85 90 95

ТП біш Агуд Аза Рго біу Пув Авр ТПг Рібе Туг бек Іец б1у бек 5бег 100 105 110

Тец Авр І1е ТПг Рпе Агуд бек Авр Туг Бек Авп біц Ппув Рго Рое ТЕПг 115 120 125 бо с1у Рпе біц АТїа Рпе Туг Аїа Аза бій АБр чІ1е Авр бій Сув сіп Уаї 130 135 140

Аза Рго сіу біц Аза Ркго ТПг Сув Авр Нів Нів Сув Нів Авп Нів Іец 145 150 155 160 сбі1у б1у Рпе Туг Сув Бек Сув Акуд Аїа сіу Тук Уаії Іец Нів Агд Авп 165 170 175 цув Агуд Тк Сув бек бій біп бек Іецй 180 185 «2105 З «2115» 170 «212» Протеїн «213» Ношто варієпь «4005 З

ТПЕ Рго Гей сіу Рго Ппув Тгр Рго бій Рго Уаі Рпе с1у Агд Іецй Аї1а 1. 5 10 15 зек Рго біу Робе Рго б1у бій Туг Азї1а АБп Авр сбіп бій Агуд Агд Тер

ТПЕ гейш ТПг АТа Рго Рго біу Туг Агд Гец Агд ІТецй Тук Робе ТіПг Нів

Рпе Авр Гец біц Іец бек Нів Іїец Сув бій Тук Авр Рпе Уа1ї! Гпув ГІец

З бо 20 зек бек біу Аїа Ппуз Уаії Гей Аїа ТПг Те Сув сбіу біп сій бек ТПг 65 70 75 80

Авр ТЕ біц Агуд Аза Рго бі1у Ппув Авр ТПг Рпе Туг Бек Геи сіу б5ег 85 90 95 зек Гей Авр І1е ТПг Рпе Агуд бек Авр Тук Бек Авп бій Ппув Рго Ре 25 100 105 110

ТП б1у Рпе сіц Аза Рібе Туг Аза Аза біц АБр І1е АБр б1п Сув сіп 115 120 125

Ууаї Аза Рго сіу біш Аза Рго ТПг Сув Авр Нів Нів Суб Нібв Авп Нів 130 135 140

Зо Те біу б1у Рпе Тук Сув бек Сув Агуд Аї1а сіу Тук Уа1ї Іецй Нів Агд 145 150 155 160

Авп опув Агуд ТБг Сув бек бій біп бек Іей 165 170 «2105 4

З5 «211» 2460 «2125» ДНК «213» Ношо зарієпь «220» «2215 Кодуюча послідовність 40 «222» (22)..12082) «4005 4 чдассадсєдуд асодддсасас с аєдч адд ссд сбд асс ссс суд ддс сс сгд зі

Меє Агд Гей Гей ТпПг Гей Ггец сіу Іец Іей 45 1. 5 10

БбЧдЕ додс єс дед дссоасс оссс ЄбЯ додс о ссуд аад бду сс даа ссє 959 39

Сув бі1у бек Уаі Аза ТПг Рго Гей с1у Рго Ппув Тер Рго біц Рго Уаї 15 20 25 50 сс дод сдс ссд дса сс о ссс дос СЕ сса дод дад бає дсс аає дас 147

Рпе с1у Агд Іец Аза бек Рго сіу Рпе Рго сб1у сій Туг Аїа Авп Авр 30 35 40 сад дад сдд сдс бдуд асс о ссд ас дса ссс о ссс дудс гас о сдс стгд сс 195 біп бій Агуд Агуд Тер ТпПг Гей ТпПг Аза Рго Рго сіу Туг Агд Іец Агд 45 50 З сеЕСсС бас сссоасс осас ссс дас студ дад сс сс осас сес гбдс дад гас 243 бо Тем Тук Рпе ТПг Нів Рібе Авр Гей бій Гей бек Нів Гей Сув сбіц Туг бо 65 70 час ЄС дЕС аад сед адс су ддд дсс оаад десд сгд дсс о асуд стд гос

Авр Рпе Уаї Ппув Гец бек бек біу Аїа Туз Уаі Іейп Аїа ТПг ГІецй Сув 75 80 85 90 д9д9 сад дад адс аса дас асуд дад суд дос сс ддудс аауд дас ас сс 339 сбі1у бі1іп бій Бек ТПг Авр ТПг бій Агуд Аза Рго б1і1у Гув Авр ТПг РБе 95 100 105

Бас су сед ддс сс оадс сбуд дас асс асс ссс о сдудс сс одас бас ссс 387

Тук Бек Гей сіу бек бек Тец Авр І1е ТПг Рбе Агд бек Авр Тукг 5ег 110 115 120 аас дад аад ссуд ЄС ас доадд ССС дад дсс о ссс бас дса дсс дад дас 435

Авп обі пув Рго Рпе ТПг сіу Рпе сій Аїа Рбе Туг Аїа Аза бій Авр 125 130 135 ав дас дад єдс сад дед дсс сс дда дад дсд ссс оасс бдс дас сас 483

І1е Авр біц Суб біп Уаії Аза Рго б1у бій Аза Рго ТПг Сув Авр Нів 140 145 150 сас бдс сас аас сас ссд ддс дує ЕС гас обдс сс о бдс сдс дса дос з31

Нів Сув Нів Авп Нів Іїец біу сіу Рібе Туг Сув бек Сув Агуд Аїа 01Уу 155 160 165 170 бас дес о ссд сас суєЄ аас оаад сдс асс бдс сСса дсс суд Сдс ссс дае 579

Тук Уаі1 гей Нів Агд Авп о Гув Агуд ТБПг Сув бек Аїа Гей Сув Бех щу 175 180 185 сад дес сссСоасс осад адд ССС д9д9уд дад о ссс оадс адс сс даа гас сса

Зо 627 біп Маії Рпе ТПг сбіп Агуд бек с1іу бій Гей бек бек Рго біц Туг Ркго 190 195 200 сдд ссуд бає сссоааа ссс сСссоаде бдс ас гас адс ас адс ст дад 675

Агуд Рго Тук Ркго Пув Гей бек бек Сув ТПг Туг бек Іїе бек Іеч с1іц 205 210 215 чач дадд ЄС адеЕ дес аєє сьо дас ССС дсд дад СссосесС дає дсд дад 723 бі б1у Рпе бек Уаі Іїе гей Авр Рпе Уаі сій бек Рібе Авр Уа! сій 220 225 230 аса сас ссЕ даа асс сед де сссобас дас ССС ссс аад асс саа аса 771

ТПЕ Нів Рго сій ТБПг Гец Сув Ркго Туг Авр Робе Іецй Гув І1е сіп ТПг 235 240 245 250 час ада даа даа сас ддс сса СС єдс дод оаад аса ССуд ссс о сас ад 819

Авр Агуд біц біц Нів б1у Рго Робе Сув б1у Гпув ТПг Гей Рго Нів Агд 255 260 265 ав даа аса ааа адс аас асу дсд ассассоасс сс дсс оаса дає даа 867

ІТ1е сбіц ТБг пуб бек АвБп о ТПг о Уа1і ТПг І1е ТПг Рпе Уаі ТПг Авр сіц 270 275 280 са дда дас сас аса додс ду аад ас осас бас оасуд адс аса дсд сад 915 зек б1у Авр Нів ТПг с1у Тер Пув І1їе Нів Туг ТПг бек ТПг Аїа сі1іп 285 290 295 сесс бдс сс бас ссуд асбд дсуд сса сс аає ддс сас дес са сс 959

З63

Ркго Сув Рго Туг Рго Меє Аза Рго Рго АБп о сіу Нів Уа1і Бек Рго Уаї бо 300 305 310 саа дсс оааа бас асс ссд ааа дас адс Ес Сссасс сс содас дад асо біп Аза Гуз Тук Іїе Гей Ппув Авр Бек Рпе бек Іїе Робе Сув біц ТЕПг 315 320 325 330 час бає дад се серд саа дудє сас ссдд ссс оссд ааа Ссс о сес асо дса 1059 сі1у Тук бій Гей Гей біп сіу Нів Гей Рго Іїец Гу бек Рпе ТПг Аїа 335 340 345 чЧЕЄ де сад ааа дає дда ЄсСЕ Сду дас сдуд сса абд ссс дсуд бдс адс 1107

Уа1ї Сув біп пув Авр біу Бек Тгр Авр Агуд Рго Меє Рго Аїа Сув 5ег 350 355 360 авг вче дас де дос сс сс дає дає ста ссс ад ддс са дегд дад 1155

І1е Маї Авр Суб бі1у Рго Рго Авр Авр Тецйп Рго бек с1у Агд Уа1 сіц 365 370 375

Бас аєс аса ддЕ ссеЕ дда дед ассоасс бас ааа дсеЕ дед ас сад гас 1203

Тук Іїе ТПкг сіу Рго біу Маії ТПг ТБбПг Тук ув Аїа Уаі І1ї1е сіп Туг 380 385 390 адс єдЕ даа дад асс сс бас аса асуд ааа дсуд аає дає ддЕ ааа бас 1251 зек Сув біц біц ТП Рпе Тук ТПг Меє Гуз УМаї Авп Авр с1у пув Туг 395 400 405 410

ЧЕЯд єЧдЕ дад дсеЕ дає дда єс Сдуа асуд адс Ссс оааа дда даа ааа сса 1299

Уаї Сув біш Аза Авр сіу Рібе Тер ТПг бек бек пув біу бій Ппув бег 415 420 425 сс сса дес сбдс дад сс дес сбде дда ста са дсс о сдс аса аса дода 1347

Зо Тем Рго Уаї Сув бій Ркго УМаї! Сув сбіу Гей Бек Аіїа Акуд ТПг ТЕ 1У 430 435 440

Чад счє аєа ває дда д9дд саа аад дса ааа сс дає дасте сс 99 1395 сб1у Акд І1е Тук с1у с1і1у біп пув Аїа Ппув Рго с1іу Авр Робе Рго Тгр

З5 445 450 455 саа дес ссрд асба сСса ддс дда асс аса дса дса ддЕ дса се Єсга гає 1443 біп Уаї їейп Іїе Геш сіу сіу ТПг ТПпПг Аза Аїа сіу Аїа Гей Іец Туг 460 465 470 час аас ду дсс сса аса дсс дсеЕ сає дсс дес бас дад саа ааа сає 1491

Авр Авп о Тер Уаії їец ТПг Аза Аза Нів Аїа Уаі Тук бій сіп Ппув Нів 475 480 485 490 чає дса сс дсс осбд дас аєє сда асд ддс асс ссд ааа ада ста сса 1539

Авр Аза бек Аза Іец Авр І1е Акуд Меє б1у ТПг Гей Ппув Агд Гей б5ег 495 500 505 сс сає бас аса саа дсс Сдуа СЕ даа дсЕ 92 Є ага сає даа 995 1587

Рго Нів Туг ТПг біп Аза Тер бек біц Аїа Уаї Рпбе І1е Нів сій 01Уу 510 515 520

Бає асеє сає дає дсЕеЕ дос ЄЕС дас аас дас аса дса суд асс ааа ЄС 1635

Тук ТпПкЕ Нів Авр Аза біу Рпбе Авр АвБп АвБр І1е Аїа Гей Іїе Гпув Гей 525 530 535 аає аас ааа ЧчЕеЕЄ деса аєс аає адс аас ассоасуд сс асс сдДс ссд сса 1683

Авп о Авпогув Уаї Уаі І1їе Авп бБег АвБп о І1е ТПг Рго І1їе Сув Гей Рго 540 545 550 бо ада ааа даа дссЕ даа Єсс ЕСС асуд адд аса дає дас аєс ода асо дса 1731

Акуд пув бі Аза біц бек Рпе Мес Агуд ТПг АБр АБр І1е с1у ТПг Аї1а 555 560 565 570

ЕСЕ дда ду дда ба асс саа адд ддсЕ СЕС сс дсс ада ааєс сга ад 1779

Ззек б1і1у Ткр бі1у Геш ТПг сіп Акуд с1у Рбе Гец Аза Агд Ап Тецй Мес 575 580 585

Ббає деЕСсС дас аба ссу аєє дес дас саєс саа ааа Сдс асо дсс дса бас 1827

Тук Уаі1 Авр Іїе Рго І1е Уаії Авр Нів біп Гпув Су5 ТПг Аз1а Аза Туг 590 595 бо чаа аад сса ссс о бає сса ад дда адс дса асо дсс аасасд сс са 1875 біш Гпув Рго Рго Тук Рго Акуд сіу Бек Уа1і ТПг Аїа Авп Меє Іец Сув 605 610 615

ЧдсЕ ддс о єЄсСа даа ад 9д99 ддс аад час адс єдс ада д9дс дас адс дда 1923

А1їа сі1у Гец біц бек бі1у б1у Мпув Авр бек Сув Агд с1у Авр Бех Щ1У 620 625 630 чад дса сед д69 Є свра дає адс даа аса дад адд Сода СЕС дсд дова 1971 сб1у А1ї1а Гей Уаі Рпе Гей Авр Бек біц ТПг бій Агд Тер Рпе Уа1 0Щ1У 635 640 645 650 чча аба дед сс ду дає сс оабд аасє Сдс д9дд даа дса ддс сад бас 2019 с1у Іїе Маї Бек Тер с1у бек Меє АвБп Сув с1у бі Аїа с1у сіп Туг 655 бо 665 да дЕСсС бас аса ааа дес аєє аас бас асс ссс сбдуа ас дад аас ага 2067 сі1у Маї Тук ТПг Ппув Уаі1і Іїе АвБп Туг Іїе Рго Тер І1е біц АБп І1е

Зо 670 675 68о0 аєє адеЕ дає єс аа сЕЄЧдсЧЯєдЕСсС Содсадесаадч дчасєссеєссає ссссадааає 2122

І1е Бек Авр РіПе 685

ЧдсесЕдсдаад асссгддсад сдасдєддсЕ сосадаадсає Єсаєсаєтас єдсддвасаєд 2182 чсадеЕєдеЕвєд сессасссаа ааааасадас сСссаддсдад дссдссдсса СЕСсссссасе 2242

ЕдссадеЕєвса аєєссадссе басссаєсєсда сссаадддда сасааассас дададесдаса 2302

ЧдЕСсСаєсеЕєвд сссасссадеЕ деааєдссас сдсссааасс асассссаєс ассссааааа 2362 дссадеЕСЕсЕ ЕЄЄСагасед дсеЕдЕсСдддса СЄСЕСсСсдсааа седсссдссс асрдсссессвд 2422

СЕЕсСвааасе гєдсєсеЕсаєс дааааааааа аааааааа 2460 «2105 5 «2115» 686 «212» Протеїн «213» Ношто варієпвз «4005 5

Меє Агд Гей Гей ТПг Гей Гец сіу Гей Гей Сув біу бек Уаі Аїа ТПг 1. 5 10 15

Ркго Гей біу Ркго пуб Тер Рго біц Рго Уа! Рпе с1іу Агд Гей Аїа 5ег 20 25 30

Ркго сіу Рбе Рго біу бій Ту Аза АвБп Авр біп бій Агуд Агд Тср Тс 35 40 45

Тец ТПпг Аза Рго Рго сіу Тукг Агд Гей Агуд Гей Тук РоПе ТПг Нів РБПе 50 З бо бо Авр Гечп сій Тецй бек Нів Гей Сув бій Туг Авр Рпе Уаї ПУув Іецй 5ег 65 70 75 80 зек сіу Аїа пув Уаі Іейп Аїа ТБПг Іец Сув б1у біп бій Бек ТПг Авр 85 90 95

ТПгЕ біш Агуд Аза Рго біу Пув Авр ТПг Рое Тук бек Геип с1іу бек в5ег 100 105 110

Тем Авр І1е ТПг Рпе Акуд бек Авр Туг бек Авп бій Пув Рго Рпе Тіг 115 120 125 сб1у Рпе бій Аза Рпе Туг Аїа Аза бій Ар І1ї1е Авр біц Сув біп Уаї 130 135 140

Аза Рго сіу біц Аза Ркго ТПг Сув Авр Нів Нів Сув Нів Авп Нів Іец 145 150 155 160 сі1у б1у Рпе Туг Сув Бек Сув Агуд Аїа сіу Тук Уа1і Гей Нібв Агд Авп 165 170 175 ув Агуд ТПг о Сув Бек Аїа Гей Сув Бек сбіу біп Уаі Робе ТПг сіп Агд 180 185 190 зек б1і1у бій Гей бек бек Рго бій Тук Ркго Агуд Рго Тук Рго ТУув Іецй 195 200 205 зек бек Сув ТПг Тук бек І1ї1е бек Іец бій бій с1іу Рпе Бек Уа1 Те 210 215 220

Тец Авр Рпе Уаі бі Бек Рпе Авр Уаі бій ТпПкг Нів Рго біц Тік Іей 225 230 235 240

Сув Ркго Тук Авр Рпе Гей пув Іїе сіп ТПг Ар Агд сій сбіц Нів с1У 245 250 255

Рко Рпе Сув біу пуб ТПг Гей Рго Ні Агуд І1е сій ТПг пув Бек Авп 260 265 270

ТП Маї ТпПг Іїе ТПг Рре Уаї ТПг Авр бій бек сб1у Авр Нів ТПг о1Уу 275 280 285

ТЕр пув Іїе Нів Тукг ТПг бек ТПг Аїа біп Рго Сув Рго Тук Рго Меє 290 295 300

Аза Ркго Рго Авп о біу Ні Уаії бек Ркго Уаі біп Аїа Ппув Тукг І1е Іей

Зо 305 310 315 320 ув Авр бек Рпе бБег ІїІе Рпе Сув бій ТПг сіу Тук бій Гец Іец сіп 325 330 335 сбі1у Нів Гей Рго Гей Ппув бек Рпе ТПг Аїа Уаї Сув сбіп гув Авр Щ1У 340 345 350 зек Тер Авр Агуд Рго Меє Рго Аїа Сув бек І1е УМаі Авр Сув б1у Рго 355 360 365

Рго Авр Авр ТІецй Рго бек б1у Акд Уаі бій Ту Іїе ТП о1у Рго щЩ1У 370 375 380

Уаї ТПпг ТПгЕ Тук пув Аїа Уаії Іїе сіп Тук бек Сув біц бій ТПг РБГе 385 390 395 400

Тук ТпПкЕ Меє пуб Уаії Авп Авр сіу пув Тук Уаі Сув бій Аза Ар Щ1У 405 410 415

Рпе Тер ТПг бек бек Гув б1у біц пуб бек Гей Рго Уаі Сув сій Рго 420 425 430

Уа1ї1 Сув б1у Гей бек Аїа Агу ТПг ТПг сіу с1у Акуд І1е Ту 1у У 435 440 445 біп гув Аза пув Рго с1у Авр Рпе Рго Тгр сіп Уаі Гей І1е ГІец С1Уу 450 455 460 сбі1у ТПпг ТП Аза Аза с1іу Аїа Гей Гей Туг Авр Авп Тгр Уаї Іецй ТЕПг 465 470 475 480

Аза Аза Нів Аза Уаі Тук бій біп ув Нів Авр Аза бек Аїа Гей Авр 485 490 495

І1е Акуд Месє сіу ТПг Іецйп Гув Агд ІТец бек Рго Нів Туг ТПг сіп Аї1а 500 505 510

Тер Бек бій Аїа Уаї Рпе ІчІ1е Нів сій с1у Туг ТПЕ Ні Авр Аїа с1Уу 515 520 525

Рпе Авр АвБп Авр І1е Аза Гей І1е Гу ІТецй АвБп Авп Гув Уа1 Уа1 те 530 535 540

АвпобБек Авп о І1е ТПг Рго І1е Сув Тїец Рго Агд пув біц Аїа сіц 5ег бо 545 550 555 560

Рпе Меє Агуд ТПг АвБр АвБр І1е сіу ТПг Аза бек с1у Тгр 01Уу Гей ТЕГ

565 570 575 біп Акуд б1у Рпе гейш Аїа Агуд АвБп Гей Меє Туг Уаі АБр І1е Рго Ше 580 585 590

Уаї Авр Нів сбіп пув Сув ТПг Аза Аза Тук біц Гув Рго Рго Туг Рго 595 6боо 605

Акуд сіу бек Уаії ТПг Аза АвБп Месє їец Суб Азїа с1у Гей бі Бек 01Уу 610 615 620 сб1у гув Авр бек Сув Агуд сіу Авр Бек сіу сіу Аїа Гей Уаї РіПе Іей 625 630 635 640

Авр бек бій ТБг бі Агуд Тер Рпбе Уаі сСіу сбіу І1е Уаї бек Ткгр 01У 645 650 655 зек Меє АвБп Сув б1у б1п Аза сі1у біп Тук с1іу Уа1і Тук ТПкг Гпув Уаї 6бво 665 670

І1е Авп Туг І1е Рго Тгр І1е біц АБп І1е І1е бек Авр РІПе 675 68о0 685 «2105 6 «2115 671 «212» Протеїн «213» Ношо зарієпь «4005 6

ТПЕ Рго Гей сіу Рго Пув Тер Рго сій Рго Уаі Рпре сб1у Агд Те Аїа 1. 5 10 15 зек Рго біу Робе Рго б1у бій Туг Азї1а АБп Авр сбіп бій Агуд Агд Тер 20 25 30

ТП еп ТпПг АТа Рго Рго сіу Туг Агд Гей Акд Гей Тук РПпе ТПг Нів

Рпе Авр Гец біц Іец бек Нів Іїец Сув бій Тук Авр Рпе Уа1ї! Гпув ГІец бо зек бек біу Аїа їпув УМаї Іейп Аїа ТПг Іецп Сув с1у біп бій Бек ТПг

Зо 65 70 75 80

Авр ТЕ біц Агуд Аза Рго бі1у Ппув Авр ТПг Рпе Туг Бек Геи сіу б5ег 85 90 95 зек Гей Авр І1е ТПг Рпе Агуд бек Авр Тук Бек Авп бій Ппув Рго Ре 100 105 110 35 ТПЕ б1у Рпе сіц Аза Рпе Туг Аза Аза сій Авр Ії1е АБр біц Сув сіп 115 120 125

Ууаї Аза Рго сіу біш Аза Рго ТПг Сув Авр Нів Нів Суб Нібв Авп Нів 130 135 140

Тец б1у сб1у Рпе Туг Сув Бек Сув Агуд Аїа сіу Тук Уаї Гец Нібв Агд 40 145 150 155 160

Авпопув Агуд ТБг Сув бек Аза їецп Сув Бек сбіу біп Уа1і Робе ТПг сіп 165 170 175

Акуд Бек с1іу біц Гец бек бек Рго біц Туг Рго Агуд Рго Тук Рго Гув 180 185 190 45 Тен бек бек Сув ТПг Тук бек І1їе бек Гей біц біц с1у Рре бек Уаї1ї 195 200 205

І1е Ггец Авр Робе Уа! бій бек Робе Авр Уа! бій ТП Нів Рго бій ТЕГ 210 215 220

Тецп Сув Рго Туг Авр Рпе Гей пув Іїе біп ТПг Авр Агд біц біц Нів 50 225 230 235 240 б1у Рко Рпе Сув с1у Ппув ТПг Гей Рго Нів Агуд Іїе сій ТПг Гпув бег 245 250 255

АвпоТПг Уаї ТПг І1е ТПг Рпе Уа! ТПг Авр бій бек с1у АвБр Нів ТЕГ 260 265 270 55 с1у Тегр Ппув Іїе Нів Тук ТПг бек ТПг АТа біп Рго Сув Рго Тукг Рго 275 280 285

Меє Аза Рго Рго Ап о сіу Нів Уа1 бек Рго Уаі Сбіп Азї1а Гув Ту Ше 290 295 300

Тецшц Ггув Авр Бек РпПе бБег Іїе Рпе Сув бій ТПг сіу Тук біц Іец Іей бо 305 310 315 320 біп б1у Нів Гей Рго Гей Ппув Бек Рпе ТПг Аїа Уа1! Сув біп Гув Авр

325 330 335 бі1у бек Тгр Авр Агуд Рго Меє Рго Аїа Сув Бек Іїе Уаі1і Авр Сув 01У 340 345 350

Ркго Рго Авр Авр ТІецй Рго бек біу Акд Уаі сій Туг Іїе ТПгЕ с1у Рго 355 360 365 сбі1у Маї ТПг ТПг Ту пув Аїа Уаі І1їе сбіп Тук бек Сув біц біц Тс 370 375 380

Рпе Тук ТіПг Меє Гуз Маї Авп Авр о б1у Гув Тук Уаі Сув бі Аїа Авр 385 390 395 400 с1у Ррбе Тгр ТПг бек бек пув сі1у біц пуб бек Гей Ркго Уаї Сув сіц 405 410 415

Ркго Уаї Сув бі1у Іец бек Азї1а Агд ТПг ТПг сб1у с1у Агуд І1е Ту щу 420 425 430 сб1у бі1іп гув Аза Ппув Рго сіу Авр РібПе Рго Тгр біп Уаії Іецп Іїе Іец 435 440 445 сбі1у б1у ТПпг ТП Аза Аїа сіу Аза Гей Гей Туг Авр Авп Тгр Уаї Іей 450 455 460

ТПгЕ Аза Аза Нів Аїа Уаі! Тук сбіц біп ув Нів Авр Аза бБег Аїа Іей 465 470 475 480

Авр чІ1е Акуд Меє с1у ТПг Гей Ппув Аг Гей бек Рго Нів Туг Тібг сіп 485 490 495

Аза Тер бек біц Аза Уаії Рпе І1е Ні біц с1у Туг ТП Нів Авр А1а 500 505 510 б1у Рпе Авр Авп Ар Іїе Аїа Гей Іїе Гпув Гей Авп Авп Гпув Уа1ї! Уаї 515 520 525

І1е Авп бек АБп о І1е ТПг Рго І1е Сув5 ІТецй Рго Агд пув бій Аза сіц 530 535 540 зек Рпе Месє Агуд ТПг АвБр АвБр І1е с1у ТПг Азїа бек с1у Тер с01Уу Іец 545 550 555 560

Зо ТПгЕ біп Акуд с1у Ррбе Гец Аза Агуд Авп Гей Меє Туг Уаії Авр І1е Рго 565 570 575

І1е Уаї Авр Нів біп ув Сув ТПг Аза Аза Тук сій Ппув Рго Рго Туг 580 585 590

Рго Агуд біу бек Уаі ТПпг Аза Авп Меє Іец Сув Аза с1у Гей сіц б5ег

З5 595 бо 605 сі1у б1у Гпув Авр Бек Сув Агуд с1іу Авр Бек сіу сіу Аїа Гец Уаї РБПе 610 615 620

Тец Авр бек бій ТПг бій Агуд Тер Рпе Уаі1і сіу сіу І1е Уаї бек Тгр 625 630 635 640 сіу бек Мес Авп Сув с1і1у біц Азїа с1у сбіп Тук с1у Ма1 Тук ТркгЕ Гув 645 650 655

Уаї І1їе АвБп Туг Іїе Рго Тгр І1їе бій Авп І1е І1ї1е бБег Авр РіПе бо 665 670 «2105 7 «2115» 4900 «2125 ДНК «213» Ношо зарієпь «4005 7 ссгдссссдс ссдсссддаа ссСссдадсад дсгддадесса гсддадесдає єсссадааєсс бо ссададссад ддаддссддд ддсаддддса ддессассдда сааасадаєс аааддеєдада 120 ссадсдсадд ассдсадасс аддссаддсс адсгсддасдда дсасассаєд адодгадчаєдвд 180 дсдссасадс сЕСсСсЕдсад доаєдсдодаЕ доддадсасад дссеЕдддссо сассдссссье 240 дсесссеЕдссса баддсеєдсед асссеЕСсстддд дессссссдсда сддсссддсд дссасссссо 300

Баддсссдаа деЕддссеєдаа ссеЕдЕдсЕссоа ддсдссгддс ассссссдде ЄЕЕсссаддаад 60 360 адеаєдссаа Єдассаддад сддсодссдда ссссдассдс ассссссддс Сассдсстдс десЕСтвасеє сасссасеєс дассеєддадс сСсосссассо ссдсдадсас дасессддеса 480 аддеЕдссдЕєс адасодддада дсеЕдоаддасЄсс сссадддссу дддддеЕсссс ааддадсадс 540 садддЕссад ддасассодуд дадсаддддс саддсесддс саддадоадчад ассаддсестд бо дЯдЕСЕвдссЕ Єсасессстд Єдасассода ссссасадсе дадсесдддд дссааддедс бо

Еддссасусс дЕдсодддсад дадчадсасад асасддадсуд ддссссгддс ааддасасье 720

ЕсгасесдсЕ доддсеЕссадс седдасаєса ссЕсссдсссС сдасстасоссс аасдадаадс 780 сдЕссасддда дЕссдаддсес ссссаєсдсад ссдаддадеда дссаададдд деЕсстьдсаас 840 аєсеЕсадеЕсе дсдсадседа сЕДдЕЧдоддоадЕ аассссдссо саддссаддсес адсссодссе 900

ЕсадеЕєеєссс сассесєсєссс адддсадддуд ададдессссс ддсссдасає саєсссасаає 960 дсааадасса ааасадссує дасссссаєе сасасдоуддсЕ дадедссаас ЕССсдадссад 1020 чдчдаєсєдадуд асадсаєсдс сеЕСсаадсдас дсадддассд дссдддсдсда дсадсеєсасд 1080 ссбдсааєссс садсассссд ддаддссдад дсгддсеЕсєда сааєєєдада деЕсаддадеє 1140 сааддссадс садддсааса сддсдааасе стаєсессас гаааассаса ааааєстсадсе 1200 чадсаєдавд деЕдсодсассе ддааєсссад ссассаддда ддссдаддса ддадааєссдс 1260

Зо Есдаассвдс дчаддеддада сеЕдсадсдаа сададасєсєдс ассастасас Сссассед49д9 1320 сдасадасса дассссуєсєсеє саааавасаа аааасааааа ссасдсаддд ссдадддссс 1380 аєеєвсасаадс єдасааадед додссссдсса дсдддадсдс Сдсаддаєсдєсє сСсдаєсессса

З5 1440 чаєсссадеЕс ссеЕдсадада ссаассдсдс дасссссддс аадсддссса ассссестдс 1500

ЕссЕсадаад седсеєдсаад ддЕєсадсдс сСдсадссссду сссссгдддє Єсдаєєсдвасе 1560 ссссессасса дсеЕдоддЕЧдас сесддссоуда сасеєдааасс сссаседдеЕє Саасададде 1620 чаєдеЕсеєдса єсСЕЄЕсСЕеЕСсСсс адсоассдссд ддадсссдса дсдасссгад дссеєдсаадда 1680

Ечаєєддссс додсассадес ссдсасссса дасаддассої аддссессес єдаддессас 1740

ЕсЕЧдаддеєса єддаєсеєсся додаддадсс саддссддаєс сссуссссес сссссссгсда 1800 сддссгдссс ддссссдссо сссссссада саєєсдасдад сдссаддсдда ссссододдвада 1860 чдадасодсссасс гдсдассасс аседссасаа ссасстдддс ддЕЕссСтасс дссссеєдссо 1920 сдсаддссас дсЕсссдсасс дсаасаадсуд сасссдссса доасдадддад дседсссд9д494д 1980 ссссаасдса сссссссссд ддасасссдуд ддсессссад ддссаєсдсе дсеЕсгрдссса 2040 чададєдсода доаддссеЕддоас седдасассд додсдссссса ддсссгдссд ссессадсес 2100 сссЕссссад ссссдссссс ссссссадса дссаддсеса гсадердссас ссеЕдссстад 2160 бо сассдачасеЕ аасеєссааса Есссасеуєд басседдсеєс сасссдоддсЕ ссдодаассс 2220 сесаєсдсадс сасдддадад Ссддддраєс гассссудрс ссеЕсддасьд д9десссстдее сссгдсассд ддддасдддс садсдсесьтд доддсдсдддс адссссассс гДдеЕддсоастд 2340 асссеЕдсеЕсс сссдасссуд СЕЕССсСсСЕсСеЕ суддодессеЕсс ссседуссесеЕ сечцчассессс 2400

БбЕєссададса дадссеЕстад ссессссодуда адссссоддсс дсссадсадд Ссадаадсса 2460 чадссаддсеЕ дсеЕддссеЕса дсЕССсСЯдЯдЕЄ дддссдадає дссдсдсссс аасссссасєє 2520 сасссассаєсє ддасссааса асааассрдд ссссасссса ссгдссдссд ссдеЕсестд 2580 чаЧдЕЧдоадада дЕСЯдоададдадс даєддддсдс дссссссссс дсссасссос сссасадссєо 2640 саєдаасссс аддЕССсдеЕдда дадссссссс сасдоддддсса сасуддеЕсссє ддссесассс 2700 ссгдЕсссда адасддддадса ссдаддссдд ададдддсраа ддссЕсдсес дадесссадде 2760 ссссададдс Сдадсссада дсаассеєсда ассассссса ЕєСсСадддЕсс ддассгддадд 2820 адссЕдассс асададдада сассссддда дасаєсссаєсс даддддесаає седдсссссс 2880 чдсаааєссад доаодедаєєсс сасеєдсссса Саддсасадс сасдсддаад ааддсаддса 2940 асдЕєддддсес Ессссассеєс стададдссе сасаасесаа асдсссссса седсадссд9д9 3000 чаЧдЕЧаддаєЯ дЕдЧдваєдоад аєддддасса адссеЕсссЕс дааддасада дсссадссса 3060 асассссдсс ссдєддсадс адсаєсасдсє дЕсссадсда ддааддадад сассадасес

Зо 3120 адеЕсаєдчаєс асеЕдеЕєдссе єдаассссса адаасадссс садддсаадд дссаааасад 3180 чадааадчодду деЕдчаєчадад асссЕссессс содасдеЕссс сссаддаасс аддоадаст9д 3240 сЕЧдДєЄсСЕсдо ссдодсеєсод деаддадасс саєдаєдаає ааассєдоода ассассд9в9ад 3300

ЕддсЕдеаад ддааєеєсада ддадссссда аддддссссс аддсссдада адасдсєсссо 3360 сЕсСссссссс дааєсссссад ддасссадда чЧдадусддерсссюі дссрссссьєс ссрдрдєес 3420 саєсссасссс сдссссссдс ссгддсадад ссддсддаас Ссадсдсссо адсссстасс 3480 седдддЕсдс дассссддсесс саддасасса ссасдсессс гдоддоадеЕЧдед адесдадддесс 3540

ЕдеЕдсдсеЕсс аєсссдадеуд сеЕдссЕдеЕеЄ садссааадс сссааадсаа дадааасссс 3600 сЕСсСсСсаадс ддссссосад ссассуддаєд д9дссоУєеЕс94д ЄЕЕЕСсСеЕдодддста ддссегсаддад 366о чЧдсЕддссасс єдсадддсессс адсссаассс адддаєсдсад асдссссадс сасаєсссстд 3720

ЕсссадеЕєеєс седсесссса аддсаєссас ссгдссдссда деседсдадддс Єдасадад4ад 3780 сасдссаадс сассссссод ссссссссес сеЕсссадссс гдеЕдсеЕссдд у ссаудесеес 3840 асссададудс сеЕддддадсеЕ садсадсссе даасасссас ддссуєбаєсс сааасесссс 3900 адеЕєдсасеє асадсаєсад ссеєддаддад доаддсЕссадесд Ссасєсссдда сЕссдсддвад 3960

ЕссЕєсдаєд єддадасаса сссеєдааасс ссдсдссссо асзчасеЕсессє сааддесс99 60 4020 сЕССсСсдддес ссоссассєсдд ссссадаєрсс ссссссрсса дсссадсрдс ассссстасе

Есседсадса єддсссссас сасдесєсссуд єсасссесудд єдассссасс єСЕєСадаЧаєд 4140 сеЕСсСсасддад дссааддссд доддссссдад сбасаадесдед ддаддсадад єдодводадчоада 4200 сассссааєсєс сасддссодда дЕсСддссеса ЕсоддсеЕдЕсСсС сеЕдаааєдсе даддвадаєд9ад 4260 чЧдЕвасеЕсєссс ЕСсСсдсссадуд ссадасссад дсадссдсессс сссадссссс асдадсессе 4320

ЕссСеЕСадаєс сааасадаса дадаадааса Сдодсссассс єдеЕоЧоодаада сассдсссса 4380 садчдасєсдаа асааааадса асасддесдас саєсассеЕсе десасадаєд аассаддада 4440 ссасасаддс Сддаадасєсс ассасасдад сасадедадс аадесдддсеєс адасєссев9д 4500

Еддаадсдса дадсеєдссеєс єСсСЕСЕЄЯДдаді дсааддадсес дсададесодса дадсессеЕсесе 4560 чадсаддасе аддаадддас ассаддеєсса дсддсдссда ддсссдаддс адсадссссе 4620 ааддоддаадс асссудєдссс Сссссадсад сасссадсає ссесассасс сасссессаа 4680 ссасссассс асссаєсасс сасссресврас ссасссассс ЕЕгдссасьс арссЕссвдве 4740 ссессесасссо сссаассасс сассаассас ссасссаєрсс арссЕссдсс асасаассає 4800 ссасссассс ссссасссас ссассстаєс саєссаєрссют Естаєсадса ЕссеЕрстасс 4860 асссаєсстЕє сдєєсоодеЕСса Єссаєсаєса сссаєссаєс 4900

Зо «2105 8 «2115 136 «212» Протеїн «213» Ношо зарієпь «4005 8

Меє Агуд Гецп Гей ТПг Гей Гецп сіу Гей Гей Сув біу бек Уаі Аїа Тбг 1. 5 10 15

Ркго Гей біу Ркго пуб Тер Рго біц Рго Уа! Рпе с1іу Агд Гей Аїа 5ег 20 25 30

Рго сіу Рбе Рго біу бій Туг Аза АБп АвБр біп бій Агуд Агд Тср Тс 35 40 45

Тец ТПпг Аза Рго Рго сіу Тукг Агд Гей Агуд Гей Тук РоПе ТПг Нів РБПе 50 З бо

Авр Гей біц Гец бек Нів Гей Сув біц Тук Авр Рпе Уаії Ппув Гей 5ег 65 70 75 80 зек б1у Аїа Ппув Маі Геп Аза ТПг Гей Сув б1у біп бій бек ТБПг Авр 85 90 95

ТП біш Агуд Аза Рго біу Пув Авр ТПг Рібе Туг бек Іец б1у бек 5бег 100 105 110

Тец Авр І1е ТПг Рпе Агуд бек Авр Туг Бек Авп біц Ппув Рго Рое ТЕПг 115 120 125 сб1у Рпе сій Аза Рпе Туг Аїа Аза 130 135 «2105 9 «2115 181 «212» Протеїн «213» Ношо зарієпь «4005 9

Меє Агд Гей Гей ТПг Гей Гец сіу Гей Гей Сув біу бек Уаі Аїа ТПг 1. 5 10 15 бо Рго пей с1у Рго пуб Тер Рго бій Рго Уаі! Робе с1у Агд Гецп Аїа 5ег 20 25 30

Ркго сіу Рбе Рго біу бій Ту Аза АвБп Авр біп бій Агуд Агд Тср Тс 35 40 45

Тец ТПпг Аза Рго Рго сіу Тукг Агд Гей Агуд Гей Тук РоПе ТПг Нів РБПе 50 55 бо

Авр Гечп сій Тецй бек Нів Гей Сув бій Туг Авр Рпе Уаї Ппув Іецй 5ег 65 70 75 80 зек сіу Аїа пув Уаі Іейп Аїа ТБПг Іец Сув б1у біп бій Бек ТПг Авр 85 90 95

ТПгЕ біш Агуд Аза Рго біу Пув Авр ТПг Рое Тук бек Геип с1іу Бек 5ег 100 105 110

Тец Авр І1е ТПг Рпе Агуд бек Авр Туг Бек Авп біц Ппув Рго Рое ТЕПг 115 120 125 сб1у Рпе бій Аза Рпе Туг Аїа Аза бій Ар І1ї1е Авр біц Сув біп Уаї 130 135 140

А1а Рго с1у бій АТїа Рго ТпПкК Сув Авр Нів Нів Суб Нів Авп Нів Іецй 145 150 155 160 сі1у б1у Рпе Туг Сув Бек Сув Агуд Аїа сіу Тук Уа1і Гей Нібв Агд Авп 165 170 175

Туз Агд ТпПг Сув бег 180 «2105 10 «2115 293 «212» Протеїн «213» Ношо зарієпь «4005 10

Меє Агд Гей Гей ТПг Гей Гец сіу Гей Гей Сув біу бек Уаі Аїа ТПг 1. 5 10 15

Ркго Гец біу Ркго Пув ТеЕр Рго сій Рго Уаі Рпе сіу Агд Гец Аїа 5ег 20 25 30

Зо Рго с1у Рбе Рго сб1у бій Туг Аза Авп Авр б1іп бій Агуд Агуд Тер Тог

Тец ТПпг Аза Рго Рго с1іу Туг Агд Гей Агуд Гей Тук Рпе ТПг Нів РІПе бо

Авр Гей біц Гец бек Нів Гей Сув біц Тук Авр Рпе Уаії Ппув Гей 5ег 35 65 70 75 80 зек сіу Аїа Гуз Уаі Іейп Аїа ТБПг Іец Сув б1у біп бій Бек ТПг Авр 85 90 95

ТП біш Агуд Аза Рго біу Пув Авр ТПг Рібе Туг бек Іец б1у бек 5бег 100 105 110 40 Тем Авр І1е ТПг Рпе Акуд бек Авр Туг бек Авп бій Пув Рго Рпе Тіг 115 120 125 сб1у Рпе бій Аза Рпе Туг Аїа Аза бій Ар І1ї1е Авр біц Сув біп Уаї 130 135 140

Аза Рго сіу біц Аза Ркго ТПг Сув Авр Нів Нів Сув Нів Авп Нів Іец 45 145 150 155 160 сі1у б1у Рпе Туг Сув Бек Сув Агуд Аїа сіу Тук Уа1і Гей Нібв Агд Авп 165 170 175 ув Агуд ТПг о Сув Бек Аїа Гей Сув Бек сбіу біп Уаі Робе ТПг сіп Агд 180 185 190 50 зек б1і1у бій Гей бек бек Рго бій Тук Ркго Агуд Рго Тук Рго ТУув Іецй 195 200 205 зек бек Сув ТПг Тук бек І1ї1е бек Іец бій бій с1іу Рпе Бек Уа1 Те 210 215 220

Тец Авр Рпе Уаі бі Бек Рпе Авр Уаї бій ТпПкг Нів Рго біц Тік Іей 55 225 230 235 240

Сув Ркго Тук Авр Рпе Гей Ппув Іїе сіп ТПг Ар Агд сій бі Нів с1У 245 250 255

Рко Рпе Сув біу пуб ТПг Гей Рго Нів Агуд Іїе сій ТБбг пув бек Авп 260 265 270 бо ТП Маї ТпПг Іїе ТПг Рре Уаї ТПг Авр сій бек сб1у Авр Нів ТПг о1Уу 275 280 285

ТЕр гув І1їе Нів Туг «2105 11 «2115» 41 «212» Протеїн «213» Ношо зарієпь «4005 11 бі Авр І1е АвБр бій Сув біп Уаі Аза Рго сіу сбіц Аза Ркго ТПг Сув 1. 5 10 15

Авр Нів Нів Сув Нів Авп о Нів Гецп сіу с1і1у Робе Тук Сув бек Сув Агд 20 25 30

А1їа с1іу Тук Уаї Гец Нібв Агд Авп Гув 35 40 «2105 12 «2115» 242 «212» Протеїн «213» Ношо зарієпь «4005 12

І1е Тук бі1у б1у біп Гув Аза їув Рго б1у Авр Рпе Рго Тер сіп Уаї 1. 5 10 15

Тец І1їе Гей сіу с1у ТПг ТПг Аза Аза с1іу Аїа Гей Гей Туг Авр Авп 20 25 30

Тер Уаі1 гей ТБг Аза Аза Ні Аїа Уаї Тук біц біп Гув Нів Авр Аза 35 40 45 зек Аїа Гемй Авр І1е Агуд Меє сіу ТПг Гецп Ппув Акуд Тецй бек Рго Нів 50 55 бо

Тук ТпПкг біп Аза Тгр бек біц Аза Уаії Робе І1е Ні5 біц с1у Тукєк ТПг 65 70 75 80

Нів Авр Аза сіу Рібе Авр АБп Авр І1е Аїа Гей Іїе Ппув Гец АвБп АвБп

Зо 85 90 95 їпув Маї Уаї Іїе Авп Бек Ап І1е ТПг Рго Іїе Сув Гец Рго Агд Гу 100 105 110 бі Аза сій бек Рпе Меє Агуд ТПг Авр Ар І1е сіу ТПг Аза Бех щУу 115 120 125

Тер б1у Гей ТПг біп Агуд б1іу Рбе Гец Аза Акуд АвБп Гецй Меє Тук Уаї1ї 130 135 140

Авр І1ї1е Рго Ії1е Уаії Авр Ні біп пув Суб ТПг Аза Азїа Тук сій Гув 145 150 155 160

Ркго Рго Туг Рго Агуд біу бек Уаі ТПг Аза АвБп Меє Гей Сув Аїа 0Щ1У 165 170 175

Те бій бек сіу с1у Ппув Авр Бек Сув Агуд с1іу Авр бек біу С1у А1а 180 185 190

Тец Маї Рпе Гей Авр бек бій ТПг бі Агуд Тер Рбе Уаї сСіу сС1у І1е 195 200 205

Уа1ї бек Тер сіу бек Меє АвБп Сув б1у бішц Аїа с1у біп Тук с1у Уаї 210 215 220

Тук ТпПкЕ Ппув Уа1! Іїе Авп Туг Іїе Рго Тгр І1е біцш АБп І1е І1е 5ег 225 230 235 240

Авр Ре «2105 13 «211» 16 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 13 сб1у гув Авр бек Сув Агуд с1іу Авр Аїа сіу сіу Аїа Гей Уаї РіПе Іей 1. 5 10 15 «2105» 14 60 «2115 15 «212» Протеїн

«2135 Штучна послідовність «223» Синтетична «4005 14

ТПЕ Рго Гей с1у Рго Ппув Тер Рго сій Ркго Уа1! Рпре с1у Агд Іец 1. 5 10 15 «2105 15 «2115 43 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 15

ТПЕ АТа Рго Рго сіу Туг Агд Гей Агд Гец Тук Ропе ТПг Нів Рпе Авр 1. 5 10 15

Тецп бій Гей бек Нів Гей Сув сій Туг Авр Рбе Уа! ГПув Іецй бек 5бег сб1у А1ї1а ув Уаії гейш Аїа ТПг Гей Сув с1у сіп 20 «2105 16 «2115 8 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «2205 25 «223» Синтетична «4005 16

ТПЕ Рпе Агкуд бек Авр Туг бек Авп 1. 5 «2105 17

Зо «2115 25 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична 35 «4005 17

Рпе Тук бек Іец біу бек бек Тец Авр І1е ТПг Рпе Агуд Бек Авр Туг 1. 5 10 15 век Авп біц Гув Рго Рпе ТПг сі1у РПе 20 25 40 «2105 18 «2115 9 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 18

І1е Авр біц Сув біп Уаі Аз1а Рго 01Уу 1. 5 «2105 19 «2115 25 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 19

Аза Авп Меє Ггец Суб Аза б1у Гец біц бек бі1у б1у Ппув Авр Бек Сув 1. 5 10 15

Акуд с1у Авр бек біу б1у Аїа Іец Уаї 20 25 бо «2105 20 «2115 960

«2125 ДНК «213» Ношо зарієпь «2205 «2215 Кодуюча послідовність «2225 (51)..1797) «4005 20 аєєсаасеєдад аєсаассеЕєс сседадеЕссс сссасассаа ддсдаддасс асд Ссс 56

Меєс 5екг 1 сбд ССС о сса са ссс о ссс ссс сс сс суд ад аєд дед дса дсд се 104

Пес РібБе Рго Бек Гей Рго Гей Гей Гей Гей бек Меєсє Уаі Аза А1а 5ег 2 10 15 бас са даа асо дсд асс єдс дад дає дсс о саа аауд асс сбдс ссеЕ дса 152

Тук Бек бій ТПг Уаї ТПг Сув б1іц Авр Аза сіп Ппув ТПг Сув Рго Аї1а чеЕчЧ аєє дсс де адс се сса ддс асс оаас ддс ССС о сса ддс ааа дає 20 200

Уаї Іїе Аїа Сув Бек бек Рго сбіу Іїе Авп біу Робе Рго б1у Пув Авр

Чдад сє дає ддс асс аауд дда даа аад д9дуа даа сса ддс саа дод сеЕс 248 25 с1у Агкуд Авр б1іу ТпПг пув біу біц пув б1у бій Рго с1і1у біп с1Уу Гей

З бо 65 ача додс ба сад ддс ссс сс дда аад ЄСЯд доадд сс сса дда аає сса 296

Акуд с1у Гец біп б1іу Рго Рго біу пуб ІТецй б1у Рго Рго с1у Авп Рго

Зо 70 75 80 чад ссЕ СЕ дод са сса дда сса аад ддс саа ааа дда дас сс дода 344 б1у Ркго Бек сіу Бек Рго сіу Рго Ппув біу біп Гув с1у Авр Рго Щ1У 85 90 95 35 адаа адеЕ сс дає ддсЕ дає адс адс ссуд дсЕ дсс о сСса даа ада ааа дсе 392

Тпув век Рго Авр с1у Авр бек бек Гей Аїа Аїа бек сбіц Агд ТУу5 А1а 100 105 110 сбд саа аса даа асд дса суд ас ааа аад бдд сс асс Ес ЕСЕ СЕ 40 440

Тец біп ТП сі Меє Аїа Агуд І1їе Ппув Ппув Тер Гей ТПг Ріе бек Іей 115 120 125 130

Час ааа саа ЧЕ дод о аас аад ССС ССС ссд асс аасє ддс даа ага ад 488 45 сі1у Ппув біп Маї с1у Авп ГПув Рібе Робе Гей ТПг Ап сіу бій І1е Меє 135 140 145 асс єс даа ааа дед аад дсс сс СДС дос аад ССС сад дес ссеЕ 959 з36б

ТПЕ Рпе бій Ппув Уаї пув Аїа Гей Сув Уаії пув Рпе бі1іп Аїа бек Уаї 50 150 155 160 дес оасс оссс адуд аає дсЕ дса дад аасє дда дссоасс сад аає сс аєсс 584

Аза ТПг Рго Агд АБп Аза Азїа сбіц АБп о б1у Аза І1е сіп А5п Тецй І1е 165 170 175 аад дад даа дсс о єсСс ссуд ддс ас ас дає дад оаад оаса даа 9д99 сад 632 пув бі бій Аза Рпе гейш сіу Іїе ТПг Авр бій пув ТБПг біц с1у сіп 180 185 190

Є де69д дає суд аса дда аає ада ссд асс бас оаса аас сбдуд о аас дад 60 68о0

Рпе УМаї Авр їец ТПг б1у АвБп Агуд Тецйп ТПг Туг ТПг Авп Тер Ап сій

195 200 205 210 дає даа ссс оаас аає дсЕ дає ССС дає даа дає сдс дра СсСдд ста сгд 728 б1у бій Рго Авп Авп Аїа сіу Бек Авр бій Авр Сув Уаї Гей Іецй Іей 215 220 225 ааа аає ддс сад Єдуд аає дас дос ссс о бдс сбссоасс сбссосає ссд дес 776

Тув Авп обіу біп Тгр Авп Авр о Уа1і Рго Сув Бек ТПг бек Нів Іецй А1а 230 235 240

ЧдЕСсС ДЕ дад ЄСЄсС сс асс єда адддеєсагбає сасесаддес сЕссеЕрдесе 827

Уаї Сув бі Рпе Рго І1е 245

ЄЕєсаседса асссасаддс ссасадсаєд сссдаааада Саааєссасбає саасрєсєсссес 887 асаєссадера єЄєсєдЕеЕсссСЕвЄ єЧдЕЧЄоддсааєс сассааааає дассассаас адсассааса 947 аадсааєаає адес 960 «2105 21 «211» 248 «212» Протеїн «213» Ношо зарієпь «4005 21

Меє бек Гей Рпе Рго бек Гей Рго Гей Гей Гей ІТецй бек Меє Уаї Аїа 1. 5 10 15

А1їа бек Тук бек біц ТПг Уаі! ТБПг Сув біц Авр Азї1а біп Гпув ТПг Сув 20 25 30

Рго Аїа Уаії І1ї1е Аїа Сув бек бек Рго біу І1е АБп с1у Рпе Рго 0Щ1У

Зо 35 40 45

Тув Авр б1у Агуд Авр с1у ТПг Ппув с1у бій пув с1у бій Рго сбіу сіп 50 З бо сб1у теп Агкуд сіу Гей біп сіу Рго Рго сбіу Ппув Гей с1іу Рго Рго 01Уу 65 70 75 80

АвпоРго с1іу Рго бек сіу бек Рго с1іу Ркго Ппув с1у біп Пув б1у Авр 85 90 95

Рко сіу Ппув Бек Рго Авр б1у Авр бек бек Іїейп Аза Аза Бек бій Агд 100 105 110

Тпув Аза їейп сіп ТП бі Меє Аза Агуд І1їе Ппув Ппув Тер Гей ТПг РБре 115 120 125 зек Гец біу пув біп Маї б1у Авп Ппув Рпе Рпе Гей ТПг Ап сбіу бій 130 135 140

ІІе Меє ТПг Ре біцш Гуз Уаї пув Аза Іїецйп Сув Уаії Ппув Рпе сіп Аї1а 145 150 155 160 зек Уаі Аїа ТПг Рго Агуд АБп Аза Аза бій АБп сб1іу Аїа І1е с1іп Авп 165 170 175

Тецп І1ї1е гув сій бі Аїа Рпе Гей с1у Іїе ТПг Авр сій пув ТПг б1ц 180 185 190 сбі1у біп Рпе Уаі Авр Гей ТПг с1у Авп Агуд Гей ТПг Тукг ТПг АвБп Тгр 195 200 205

Авп обіц сб1у біц Рго АвБп о АвБп Аза біу бек Авр бій Авр Сув Уаі1ї Іец 210 215 220

Тецшп Геп Гпув Авп сбіу біп Тер Авп Авр Уа1 Рго Сув бек ТПг бек Нів 225 230 235 240

Те Аїа Уаї Сув бій Рібе Рго І1е 245 «2105 22 «2115 6 «212» Протеїн 6о0 «213» Штучна послідовність «220»

«223» Синтетична «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (1)..(1) «223» де Х в положенні 1 являє собою гідроксипролін «2205 «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (4)..(4) «223» де Х в положенні 4 являє собою гідрофобний залишок «4005 22

Хаа с1у пув Хаа с1Уу Рго 1. 5 «2105 23 «2115 5 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «2205 «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (1)..(1) «223» де Х являє собою гідроксипролін «4005 23

Хаа с1у ув Те ШУ 1. 5 «2105 24 «2115 16 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність

Зо «2205 «223» Синтетична «2205 «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (9)..(15) «223» де Х в положениях 9 і 15 являє собою гідроксипролін «4005 24 сб1у теп Акуд сіу Гей біп сіу Рго Хаа сіу Ппув Гей с1іу Рго Хаа с1У 1. 5 10 15 «2105 25 «2115 27 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «2205 «221» МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (3)..(27) «223» де Х в положениях 3, 6, 15, 21, 24, 27 являє собою гідроксипролін «4005 25 б1у Ркго Хаа сіу Рго Хаа сіу Гей Агуд с1іу Гей сіп сіу Рго Хаа с1У 1. 5 10 15

Тув ТГеп с1у Рго Хаа сіу Рго Хаа с1іу Рго Хаа 20 25 «2105 26 «2115 53 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «2205 бо «223» Синтетична «2205

«221» щтівс Теасикге «222» (26)..(26) «223» Хаа може бути будь-якою амінокислотою, що зустрічається в природі «2205 «221» щтівс Теасикге «222» (32)..(32) «223» Хаа може бути будь-якою амінокислотою, що зустрічається в природі «2205 «221» щтівс Теасикге «222» (35)..(35) «223» Хаа може бути будь-якою амінокислотою, що зустрічається в природі «2205 «221» щтівс Теасикге «222» (41)..(41) «223» Хаа може бути будь-якою амінокислотою, що зустрічається в природі «2205 «221» щтівс Теасикге «222» (50)..(50) «223» Хаа може бути будь-якою амінокислотою, що зустрічається в природі «4005 26 с1у гув Авр с1у Агуд Авр сіу ТПпг пув с1у бій пув с1у бій Рго с1Уу 1. 5 10 15 біп б1у Гей Агкуд с1у Гей біп сіу Рго Хаа сіу Ппув Гец сіу Рго Хаа 20 25 30

Зо с1у Авп Хаа сіу Рго бек біу бек Хаа сб1у Рго Ппув с1у біп Гуз 1У

Авр Хаа с1у Ппув вег «2105 27 35 «2115 33 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична 40 «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (3)..(33) «223» де Х в положениях 3, 6, 12, 18, 21, 30, 33 являє собою гідроксипролін 45 «4005 27 сб1у А1ї1а Хаа сіу Бек Хаа сіу бій пув сбі1іу Аї1а Хаа с1у Рго біп Щ1У 1. 5 10 15

Рго Хаа сіу Ркго Хаа б1у Ппув Меєсє б1у Рго пув с1у бій Хаа с1у Авр 20 25 30 50 Хаа «2105 28 «2115 45 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «2205 «2215 МІ5С ЕЕАТОВЕ «222» (3)..(45) 6о0 «223» де Х в положениях 3, 6, 9,27, 30, 36, 42, 45 являє собою гідроксипролін

«4005 28 с1у Сув Хаа сіу Гей Хаа сіу Аїа Хаа с1у Авр Гув сС1іу біц Аїа с1У 1. 5 10 15

ТПЕ Авп с1іу Пув Агуд біу біцш Агуд сб1іу Рго Хаа бі1у Рго Хаа с1У Гув 20 25 30

Аза сі1у Рго Хаа біу Рго АвБп сбіу Аїа Хаа с1у сі Хаа 35 40 45 «2105 29 «2115 24 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 29

Те біп Агуд Аїа Гей бій І1їе Гей Рго АБп Агуд Уа! ТіПг І1е пу5з Аїа 1. 5 10 15

Ап Агуд Рго Ріпе Гец Уаії Рпе І1е «2105 30 20 «2115 559 «2125 ДНК «213» Ношо зарієпь «4005 30 аєчаддсеєдс ЕЄдасссеєссе доаддсссссгда сдсддсссдд сддссасссос сеЕсдддесссд бо аадеддсствд аассЕдеЕдеЕсє соддадсдссод дсассссссду дссссссадуа ддадсаєсдсс 120 ааєдассадд адсддсдсед дассссдасс дсассссссуд дссассдсесс дсдесестас 180

Зо Ессасссасс Есдасссдда дсеЕСсСсссас сссгдсдаде асдасеєссуає саадседадс 240

Есдддддсса аддеєдсеєддс сасоадссдсдс дддсаддада дсасадасас ддадсдддасс 300 сссддсаадд асасссссста сссдсрдддс сссадсстдуа асаєтассе ссдсессдас

З5 360

Басессаасу адаадссЧєсє сасоддддЕсс даддесссссо асдсадссда ддасаєєсдас 420 чадеЕдссадд єддссссоодоа ададдсдссс асссдсдасс ассассдсса саассасстд 480 чЧасодЧЕсЕСсСС ассдсесстуд ссодсдсадудс басудссссдс ассуєЄаасаа дсдсасстдс 540

ЕсадссседЕ дсеЕссддес 559 «2105 31 «2115 34 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 31 сдддсасасс асдаддссдс Сдасссоссе доддс 34 «2105 32 «2115 33 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 32 бо часаєсассо ЕссдсЕсСсда сЕСсСаасддад аад 33

«2105 33 «2115 33 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 33 адсадсссвд аасасссасу дссдабаєссс ааа 33 «2105 34 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 34 сдддчаєссає даддссдссд асссіс 26 «2105 35 «2115 19 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 35 чавааєєсста дасеєдсаєса 19 «2105 36 «2115 19 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 36 чддааєеєсста садддсдсе 19 «2105 37 «2115 19 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 37 чавааєєсста деадесоаває 19 «2105 38 «2115 25 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 38

ЕдсддссоасеЕ дсададсдассаЯа сс 25 «2105» 39 «2115 23 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 бо «223» Синтетична «4005 39 чавааєєсасеЕ саеєсаєєсеєс дова «2105 40 «2115 17 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 40

Єссдадааса асдзадесд 17 «2105 41 «2115 29 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 41 саєсдааадс ЄсСсодоадсад аадессоаюес 29 «2105 42 «2115 27 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 42 сдсддссдса дссдсссада дсдсада 27

Зо «2105» 43 «2115 28 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 43 сддсаадссс сассддссса дддааатга 28 «2105 44 «2115 37 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 44 аачаадсеєєд ссдссассає двдваєсддссд Сддаасес 37 «2105 45 «2115 31 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 45 сддадчаєсссс ааасеЕсссьс деЕссассєво д 31 «2105» 46 «2115 36 «2125 ДНК 6о0 «213» Штучна послідовність «2205

«223» Синтетична «4005 46 аачааадсеє дссдссасса ЄдДдЕЄСсСсСасо адсессе 36 «2105 47 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 47 сддчассссс сессссесссаа сасессяе 26 «2105» 48 «2115 9 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 48 біц Рко Ппув Бек Сув Авр ГПув ТПг Нів 1. 5 «2105» 49 «211» 4960 «2125 ДНК «213» Ношо барієепь «4005 49 ссддасдсдда Сддсдсасдс ссдсааєсссс адсгасссодод даддсеєдадда саддадаасе бо

Зо ЧдсЕСсСЧдаассс соодадоадсада дЯєссодсодд сесасассод Сааєсссадс ассседсвад 120 чЧдсЕЧаддсад деЕдсаєсдсе ЕєдодсЕсСадд адсссаадас садссєддоадс аасасадада 180 часссссаєс Есбасааааа асааааасаа асасаааддд дасааааааа ааааааадас

З5 240 аачдасаєдаа єссаєдадда садчадсдсдд аададдаадс адсадсссса аадссстсдда 300 адсЕддаада асадаєааас аддеєдсдааа Саассдссод дааадсаасс Сссссссессе 360

ЕСЕ ЕЄсоаоодсодуч адесссасес сдЕєсЯдЕсСсад дседдадедс адсддеєдсода 420

ЕсЕсддаєса седсаассес содссеЕсСссад дсссаадсаа СССЕСсСсСгдсесс ссадссоссс 480 чадеадсеєда даєсаєааде дсодсоассдсс асасссддає дасссессддра Єссессадсад 540 ачаєдодадавєє єсассавєдеЕє ддеєсаддссд дссссааасо сссаассесд єдаєссассс бо ассЕєддссЕ сссааадеєдс єдоадасєсаса ддсасаадсс ассдадссса дссаааадсд бо асеЕеєссаадс сеЕдсааддда аєсодддааєе доадєддсасса ддєсссеєсвд асаддуаєєста 720 ачаааєсадс садссеєдадд седддсасодд Сддсссасас ссдсааєсссс адсасеєєсс9а 780 чадодстєаадд саддеддаєс асседадддс аддадесєсаа дассадсстд ассаасає9д9д 840 адааасссса Єсссрассаа аааєаааадаа сСсадссаддас дсЕддсддеЕдс сСсдасстгдсаа 900

Есссадсвбас ЕєЄЧОдддадоасе дадаєдоддад дассдсссда асасаддаад СбСададдсесдс 960 бо адеЕчадстасє дассдсадса сеЕдсассдаа дссддддсаа садаасаада гссааааааа 1020 ачзачадоаддЧдєЕ даддддадсада дссаддассс дЕссссаддс сдссдеєсасс саддессдас

Есседдсесс сададсадсс єЄдДдЕСССдссо дссгддаасоі ссдадсаддс сддадессаєд 1140 чадеЕсдаєеєс ссадаасссс ададссадодчд ададссдоадад саддддсадда Есасгддаса 1200 аасадаєсаа аддеєдадасс адсдрадддс Сдсадассад дссаддссад седдасдддас 1260 асассаєдад деаддеєдддс дсссасадсс ссссгдсадда деЕдсддоадсд ддадсасадд 1320 ссгдддсссс сассдссссо дсссгдссса гаддсрдсьтд ассссстуда дессеєесєст9Чвда 1380

ЕддсЕсСоддед дссасссссе єдоддсссдаа дсддсссдаа сседсдЕсса ддсдссгдас 1440 ассссссоддс ЕЕєсСссаддду адсасдссаа Єдассаддад сддсудсЕдда сссеєдаседс 1500 ассссссуддс бассдсседс дссеЕсстасесс сасссасессс дасссддадс Ссесссассяо 1560 седсдадсас дассссдодєсса аддсдссдЕс аддасодддад доасЕдодддеЕє ЕсЕСсСаддааес 1620 чададддЕссс сааддадсад ссадддссса дододасасссд ддадсадддд ссаддсеЕє99у 1680 ссаддаддда дассаддссс дододссеЕрдсесс ссасессст дедасасстд ассссасадс 1740

Едадсссоодуд доассааддед сеЕддссасуус СдЕдсоододса ддадчадсаса дасасодадс 1800 чдадсссседд сааддасасеє єєСсСтасссдс сдддссссад сссддасасс ассеЕсссдсс 1860 ссдассассс саасдадаад ссдсссасдодд ддсссдаддс сЕссстаєсдса дссдаддадаед

Зо 1920 адссаадчадд ддЕссЕдсаа саєсєсадесс сдсдасадссд дседсдддда Єаасеседес 1980

Ебаддссадд садсссеєдсс ЄЄсадесссс ссассссссс садддсаддадд дададдсесєес 2040

Еддсссдаса сасссасаа Сдсааадасс аагвгасадссу Єдасссссає єсасаєддоас 2100

Едчадедссаа сеЕСЕДЧдадсса додаєссдад дасадсаєсд ссссаадсда сдсадддасес 2160 чдассдддсдс адсадсеєсас дсседсаасс ссадсасссс доддаддссда ддассддссда 2220

Есаєєєдада єсаддадесєс ааддссадсс адддсаасас ддасдааассс басссссасе 2280 аааассасаа аааєстадсвд додсдєдаєда Сдсодсассод дааєсссадс гасгаддодад 2340

ЧдсЕдаддсад дчадааєсдсеЕ Сдаасссдсу аддсддаддс Єдсадсдаас ададаєсдса 2400 ссассасасс ссадсссддуда сдасададссї адассссдрс саааадаса ааааасаааа 2460 асдасдсадд додссдадддс сссаєссаса дссдасааад Сддддсссгд ссадсдддад 2520 сдссдссадуд асдсссдасс ссадаєссса дсесссрдсад адассаастд гдеЕдассьсь 2580 часаадеЕддс ЄсааЕсєєсєсеєс єдсеЕсСсссад даадссдссд саадддеєсєса дсдседсадс 2640 сссдсссссЕ додоадЕссдаєс ддасессссес аєсадссдодд Єдчассесодда ссоддасасед 2700 ааасеєсссас єддЕеЕєсааса дадаєдасоає ссдсассєсс сссссадсдс сдссдодадс 2760

Еєдсадсдас ссраддссвд Єаадаєдасс ддсссддсас садссссдса сссгадасад 60 2820 часчаддссеЕ ссеЕСЕДдадудеє ссасеєссдад дссасддаєс сссгсдддада адсссаддсе чддаєсссдсесс ЕЄСсСЕЄЕсСссЕсС сеЕЯДасддсесо дссгддсссс дессссссссс садасаєєсдвда 2940 счадсдссад дсЕддссссдуд дададдсдесс сассодсдас сассассдсс асаассассо 3000 чЧадсаЯодЕСЕСсС баседсессе дссодсдсадд сстасдссссд сассдбааса адсдсасстд 3060 сесадсссбд сдссссддсс аддсссссас ссададдесе додддадссса дсадссстгда 3120 асасссасуд ссдсраєссса аасссьссад СЕдсасесас адсаєсадсс гддадавадоад 3180

ЧдЕєСадеЕЧдЕеЕС аєєстддасеЕ ЕєЧдсоодадес сессдваєсдсд дадасасасс ссдааасссс 3240 дЕДЕССсССсСтас дасеЕсеєсеєса адаєєсааас адасададаа даасаєсддес сасєсєстсдесд9дда 3300 чаачдасаєєд ссссасадда ЄЄдааасааа аадсаасасуд десдассаєса ссеЕссдессас 3360 ачаєдааєса ддадассаса саддссддаа дасссассас асдадсасад сдсасасеє9д 3420 ссессссаєссоо асоддсдссас ссааєддсса сддсеЕЕєсСассо деЕдсаадсса аагасаєссяе 3480 чааадасадс ЕЄЄсСЕССаєЄСсСЕ ЄЄєЧдсдадас сддсстаєсдад сЕсссдсаад дессасеЕсдсс 3540 сссдааассс сссассдсад ССсдссадаа адчаєддаєсі гсдодассддс сааєрдсссдс 3600

ЧдЕдсадсаєє деЕєЄЧасеєдед дсссЕсСсєда Єдаєссассс адсдоассдадч Єодадсасає 366о сасаддесссс ддадсдасса сссасааадс єдеЕдаєссад гбасадссдесд аададасстє 3720

Зо стасасаасуд ааачесдааєд аєддсаааса ЕЧЗ9СсоЯєЧЯдсдад дсЕДдаєддає ссеЕдддасвад 3780 сессааадда дааааассас сСсссадесстд єдадсесеЕдеЕс єдеЕддастає садсссдсас 3840 аасаддадоадд содбаєаєаєд дадддсаааа ддсаааассої ддадсдассссс сссддсааді

З5 3900 ссєдасаєсєса ддсддаасса садсадсадд бдсасеЕсєеєвта гаєдасаасе доддеЕсСстаас 3960 адсЕдсеЕсає дссдЕСсСтсаєд адсаааааса сСдаєсдсаєссс дсссгддаса Єссддаає9а9ад 4020 сасссеЕдааа адассаєсас сесаєсаєрас асаадсссду ЄсЕЧчаадсед єЕСсевасаса 4080

ЕдчааддеєЕсає асеєсаєдаєд сеЕддссссда саасдасаса дсассдаєса аассдааєсаа 4140 сааадссдса ассаасадса асассасдсес гарєвєдеЕсьд ссаадаааад аадседаасс 4200 сЕссасдадуда асадаєдаса Ссддаасеєдс ассгддаєда ддаєсаассс аааддоадеЕве 4260

ЕсЕєдсвада ааєсєааєдеЕ аєдеЕсдасає ассдассдеЕс дассаєсааа аасдсасесдс 4320

Едсаєаєдаа аадссасссе аєссаадддачд аадсдеаасеЕ дсгаасардс ЄЕЄсСоЯгоаоссо9 4380 сеЕсадааадс дддддсаадд асадссдсад аддседасадс ддаддддсас содеЕдеЕеесяе 4440 ачаєадедаа асадачадчє дсчдЕеЕЕдсддоа аддаасадсд СсссдодддеЕє ссаєдааєтвд 4500

Едвдоддаадса ддеєсадесаєд дадеЕссасас аааадессасс аассасаєссс сссддаєсда 4560 чаасаєагаєє адечаєєєвє аасеЕсєдсдєд сссдсадесса аддасссьтсс асссссадаа 4620 бо асдсссдеЕда адассеЕсддс адсдасдсєдуд сЕСЧдадаадс асеєсаєсаєс ассдеддаса 4680

ЕддсадеЕєдеЕ єдсеЕссассс ааааааасад ассссададєд аддссдссоас сасеєссссса сЕсдссадес саассссадс сссасссаєс дасессааддуд дасасааасс асдададеда 4800 садесаєссеЕ сдсссассса дсдсааєудсєс ассдсссааа Єбасаєєссса Сгассевааа 4860 аадссадеЕсеЕ сЕЄєеєеєсавас єдоаседессдд сасссстсдса аассдсссдс ссардеєссее 4920 гЕЧЕСЕесааа сЕЄдЕеЕєсСЕеЕса єЄдааааааа аааааааааа 4960 «2105 50 «2115» 2090 «2125 ДНК «213» Мишача «2205 «2215 Кодуюча послідовність «222» (33)..(2090) «4005 50 часодсЕддас єдсададсва єддєддсаса сс оасд адд сста сс асс ссс ст

З3

Ме Агд Гей Гей Іїе Ріе Ієец 1. 5 чає сед сед Єдд адеЕ єбд дед дсс оаса сс ссд ддс сСса аад Сдд сс 101 с1у Гей Гецп Тер бек Гей Уаії Аїа ТПг Гецй Гей сіу бек Гув Тгр Рго 10 15 20 чаа ссЕ два єс дод содс сед дсд Сссоссс ддс ССС о сса дад аад бас 149 біц Рко Уаі Рпе сіу Агкуд Гей Уаії Бек Рго сіу Рпе Рго біц пув Туг

Зо 25 30 35

ЧдсЕ дас сає саа дає сда сс Сбду аса сбд асо дса ссс о оссс ддс бас 197

Аза Авр Нів біп Авр Агуд бБег Тер ТПг Іецй ТПг Аза Рго Рго с1у Туг 40 45 50 З сдс сг сус сеЕсС Сас сес асс сас ЄЕС дас студ даа сеЕсС ЕСЕ бас сос 245

Акуд Гей Агд Гец Тук Рпе ТПг Нів Рбе Авр Теп сій Гей бБег Туг Аг4д бо 65 70

Ббдс дад бає дас ЄС дЕС аад ССуд адс сса ддуд асс аад дед сгд дес 293

Сув бій Тук Авр Рпе Уа1 Ппув Гей бек бек сіу ТПг пуб Уаї Іецй А1а 75 80 85 аса серд єЧдЕ д9дд сад дад адеЕ аса дас асо дад сад дса сс ддс ааєс 341

ТПЕ Гецп Сув с1у біп біц бек ТПг Авр ТПг бій біп Азїа Рго с1У Авп 90 95 100 час асс ЄЕС бас са сед дудє сссоадс ста аад дос асс сЕсс сас сесс 389

Авр ТПг Рібе Тук бек ІТец біу Рго Бек ІТецй Гпув Уаії ТПг Рпе Нів 5ег 105 110 115 час бас сс аає дад аад ссу ССС аса дод ССС дад дсс о сессС бас дса 437

Авр Тук бек Авп обіц Гув Рго Рбе ТПг б1у Рпе сій Аза Рпе Туг Аїа 120 125 130 135 чс9 дад дає дс9 дає даа єдс ада де сс ссуд дда дас сСса дос ссе 485

Аза сій Авр Уаії Авр б1іцп Сув Агкд Уаі бек Гей с1іу Авр Бек Уа1і1 Рго 140 145 150 де дас сає ває єдс сас аас бас є у додс дудс бас тає где сс гос 60 з33

Сув Авр Нів Тук Сув Нів Авп Туг Ге сіу сіу Тук Тук Сув бек Сув

155 160 165 ача дсуд додс бас аєеє сес сас сад аас аад сас асуд Сбдс сСса дсс сс з81

Агуд Аза сіу Туг І1е Іецшц Нів біп Авп Ппув Нів ТПг Сув бек Аїа Іей 170 175 180 де са додс сад дед єс аса дда ада ССС ддд бас ссс ад адс сс 629

Сув бек б1у сбіп Уаі Рпе ТПг сіу Агуд Бек сіу Тук Гец бек бек Рго 185 190 195 чад бас ссуд сад сса бас о ссс оаад сс Сссоадс Сдс асс бас адс асс 677 біц Тук Ркго сбіп Рго Тук Рго Ппув Гей бек бек Сув ТПг Туг бек І1е 200 205 210 215 сдс ссбд дад дас ддс ССС адс дес ас студ дас ЄС де дад сс Ес 725

Акд Гей біц Авр о біу Ррпе бек Уаії І1е Іїецй Авр Рпе Уаі бій бек Ре 220 225 230 чає дед дад асуд сас ссеє даа дсс осад бдс ссос обаєЄ дас сс о сес аад 77

Авр Уаї сій ТБг Нів Рго сій Аза сіп Сув Рго Тук Авр бек Іецй Гув 235 240 245 ав саа аса дас аад додд даа сас ддс сса СЕС сдС дод о аад ас сгд 821

І1е сбіп ТБг Авр оГув б1у бій Нів біу Ркго Рпе Сув с1у Ппув ТПгЕ ГІец 250 255 260 сс о ссосоадд асс даа асо дас адс сас аад дрд асс ас асс ЕЕ десс 869

Рго Рго Агд І1е біцп ТПг Авр бек Ні Гув Уаії ТПг Іїе ТПг Ріе Аї1а 265 270 275

Зо асЕ дас дад суд 9д99д аас сас аса ддс Сду аад аса сас Сас аса адс 917

ТПЕ Авр бій бек б1і1у АвБп Ні ТПг с1іу Тер пув Іїе Нів Тук ТіПг 5ег 280 285 290 295 аса дса сдд ссс о бдс сс дає сса асуд дсуд сса сс ааєс ддс адс асєс

З5 965

ТПгЕ АТа Агуд Рго Сув Рго Авр Рго ТПг Аза Рго Рго АБп б1у бек Ше 300 305 310 са ссеЕ дед саа дсс ас бає дос ссд аад дас адда СЕС сс дес ес 1013 зек Рго Уаі біп Аза ТПг Тук Уаї Гей їув Авр Агуд Рпе бек Уа1! РіПе 315 320 325

Ббдс аад аса ддс сс дад сс сед саа дод сс дес оссс сс ааа сса 1061

Сув Кпув ТпПг с1іу Рпе бій Гей Гей сіп сіу Бек Уа1 Рго Гец пуб бег 330 335 340

БЕеС асеЕ дсЕеЕ дЕС де сад ааа дає дда ССС Сдуд дас сдуда ссд абд сса 1109

Рпе ТПг Аїа Уаї Сув біп Гув Авр сіу Бек Тер Авр Агд Рго Меє Рго 345 350 355 чад Єдс адс ас ас дає дес ддс сс сссодає дас ста ссс о аає ддас 1157 бі Сув бек Іїе Іїе Авр Сув с1у Рго Рго Авр Авр Гей Рго АБп 01Уу 360 365 370 375 сає дсд дас бас ассоаса ддс сс саа дед ас асс гас ааа дсЕ 959 1205

Нів Уа1і Авр Тук Іїе ТПг б1у Рго сбіп Уа! ТПг ТП Тук Ггув Аїа Уаї 380 385 390 ав сад бас адс ЄДдЕ даа дач асо ссс Сас аса асд адс адс аає дає 1253 бо Іїе сіп Тук бек Сув бій сій ТПг Рпе Туг ТіПг Мес бек бек АвБп 01уУу 395 400 405 ааа бає дед ЧЕ дад дсЕ дає дда ССС сСду асуд адс сСсс о ааа дда даа

Тпув Тук Уаії Сув бі Аїа Авр с1іу Рпе Тер ТПг бек бек Гув сС1у с1и 410 415 420 адвавда ссс ссс о ссу ЯсЄ де дад сс ДЕ сдЕ дод сс сСссоаса сас асо 1349

Тув Гей Рго Рго Уаі Сув бій Рго Уаі Сув сіу Гей бек ТПг Нів ТЕПг 425 430 435 аєа дда дда сдс аба де дда ддд сад сс дса аад сс дає дас СЕС 1397

І1е с1у б1у Акд І1е Уаї сі1у б1у біп Рго Аїа Ппув Рго сб1у Авр Ріє 440 445 450 455 сесс бдуд саа доссС сс ссуд ссуд ддЕ саа ас оаса дса дса дса да дса 1445

Рго Тер біп Уаї Гецй Гей Гей с1іу сіп Тбг ТПг Аза Аза Аза сС1і1у А1а 460 465 470 сс аса сасє дас аасє Сду дос ста аса дсс о дсеЕ сає дсеЕ два гає дад 1493

Тецшц І1їе Нів Авр Авп Тер Уаі Гей ТПг Аза Аза Нів Аза Уаї Тук с1и 475 480 485 ааа ада аєд дса дсуд сс сс сбд аас асс сда асд ддс асс ссс ааа 1541 пуб Акуд Меє Аза Аїа бек бек Гей Ап Іїе Акуд Меє сіу І1е Іец Гув 490 495 500 адд ссс Єса сс сає бас асо саа дсс о сСду ссс одауд даа асс ссе ага 1589

Акд Гей бек Рго Нів Туг ТПг біп Аїа Тер Рго бій бій Іїе Робе Те 505 510 515 сає даа ддс бас оасс сас ддс дсЕеЕ 992 Є дас аає дає ага дса 9

Зо 1637

Нів біц с1іу Тук ТБПг Нів с1у Аїа сіу Рібе Авр АБп АвБр І1е Аза Гей 520 525 530 535 аєє ааа сес аад аас ааа дес аса асс оаас дда адс ассасд сс дес 1685

Іїе пув Пес Гпув АБп оПпув Уаї ТПг І1їе Авп с1і1у Бек Іїе Меє Рго Уаї 540 545 550

Ббдс о свра ссуд сда ааа даа дсЕ дса Ссс осСса асд ада аса дас сс асо 1733

Сув Гей Рго Агуд пув біш Аза Аза бек Гей Меє Агуд ТПг Авр Рое ТЕПг 555 560 565 чча асеЕ деЕд дсЕ додс ду дод Єба асс сад аад ддд сс сс дос ада 1781 сбі1у ТП Уаії Аза с1у Тер сіу Гей ТПг сбіп пув сіу Гей Гец Аїа Агд 570 575 580 аас ста ас ЄС 9дс9 дас аса сса ас дсЕ дас сас саа ааа сдДдЕ асс 1829

Авп о Гей Месє Рбе Уаі АвБр І1е Рго І1е Аза АБр Нів сіп Гпув Сув ТПг 585 590 595 асс дед ває даа аад сес бає сса дда дса ада дса адс дос аас ад 1877

ТпПгЕ Уа1 Тук сій пув Гец Тук Рго сіу Уаі Агд Уаі бек А1ї1а Авп Меє бо 605 610 615

СЕС сдДс дсе ддс сСса дад асо дує ддс аад дас адс бдс ада дае дас 1925 їеч Сув Аї1а сіу Гей бі ТПг сіу сб1у Ппув Авр бек Сув Агуд с01у Авр 620 625 630 ачЕ додд доад дса Єса дсд ЄС ссра дає аає дад аса сад сча Сад СЕС 1973 зек сіу бі1у Аї1а Іец Маї Рпе їец Авр АБп бій ТПг біп Агд Тер Ре 60 635 640 645

ЧчЕЧдЧ дда дда аса дес сс до ддасЄ сс оасс ааєсє СД д9адд дсд дса дас

Ууаї с1у с1у Іїе Уа1 бек Тер сіу бек І1е АБп Сув сС1у Аїа Аїа 0Щ1У 650 655 6бво сад бас ддд дос Сас оаса ааа дес ас оаас гає ас ссс да аає дад 2069 біп Тук сб1у Уаї Тук ТпПг Ппув Уаі Іїе Авп Туг Іїе Рго Тгр АБп бій 665 670 675 аас аєа аса аде аає ЄС аа 2090

АБп отІ1е І1е бек АвБп Ріе 68о0 685 «2105 51 «211» 685 «212» Протеїн «213» Мишачий «4005 51

Меє Агд Гей гейш Іїе Рбе Гец сіу Гей Гей Тгр бег Іец Уаі Аїа ТПг 1. 5 10 15

Тецшп Гецп сі1у Бек Ппув Тер Рго бій Рго Уаі Рпе сіу Агкд Гец Уа1ї! 5ег 20 25 30

Ркго сіу Рбе Рго біцш Гув Туг Аза Авр Нібв біп Авр Агуд Бек Тер ТЕГ 35 40 45

Тец ТПпг Аза Рго Рго сіу Тукг Агуд Гей Агуд Гей Тук РоПе ТПг Нів РБПе 50 55 бо

Авр Геч сій Тей бек Тук Агуд Сув бій Туг Авр Рпе Уаї Ппув Іеч 5ег 65 70 75 80 зек сіу ТПг пув УМаії Іейп Аїа ТПг Гей Сув с1у біп біц бек ТЕГ Авр 85 90 95

ТП біц біп Аза Рго біу АвБп Авр ТПг Рібе Туг бек Іец б1у Рго 5ег

Зо 100 105 110

Тецшц Кпув УМаї ТПг Рпе Нів бек Авр Туг Бек Авп о біц Гув Рго Рпе ТПг 115 120 125 сб1у Рпе бій Аза Рпе Туг Аїа Аза бій Авр Уаі1і Авр сбіц Сув Агд Уаї 130 135 140 зек Гпечп с1у Авр Бек УМаії Рго Сув Авр Нів Тук Суб Нів Авп Тукг Іецй 145 150 155 160 сі1у б1у Тук Тук Сув Бек Сув Агуд Аза с1іу Туг Іїе Гец Нібв сіп Авп 165 170 175

Тпув Нів ТПг Сув Бек Аїа Гей Сув Бек сбіу біп Уаі1 Робе ТПг с1у Агд 180 185 190 зек сіу Тук Гец бек бек Рго біц Тук Рго біп Рго Тук Рго Пув Іец 195 200 205 зек бек Сув ТПг Тук бек І1їе Агд Іец бій Авр сіу Рпе Бек Уа1 Те 210 215 220

Тем Авр Рпе Уаії сій бек Рібе Авр Уаї сі ТПгЕ Нів Рго бій Аї1а сіп 225 230 235 240

Сув Ркго Тук Авр Бек Гей Ппув Іїе сіп ТПг Ар Гпув сС1іу сбіц Нів с1У 245 250 255

Рко Рпе Сув біу Ппув ТПг Гей Рго Рго Агд І1їе бій ТПг Авр бек Нів 260 265 270 їпув Маї ТПпг Іїе ТПг Рпе Аза ТПг Авр бій бек с1у АвБп Нів ТПг с1Уу 275 280 285

ТЕр пув Іїе Нів Тукг ТПг бек ТПг Аза Агуд Рго Сув Рго АвБр Рго ТПг 290 295 300

А1а Рго Рго АвБп о біу Бек І1їе Бек Рго Уаі! сбіп А1ї1а ТПг Тугк Уаі1ї Іеєц 305 310 315 320 пуб Авр Агуд Рпе бек Уа1і Рпе Сув пуб ТПг біу Роре б1іцп Іец Іец сіп 325 330 335 бі1у бек УМаії Рго Гей Ппув Бек Рпе ТПг Аїа Уа1 Сув сбіп ув Авр 01У 60 340 345 350 зек Тер Авр Агд Рго Меє Рго бій Сув Бек Іїе Іїе Авр Сув С1у Ркго

355 360 365

Рго Авр Авр Тецй Рго АБп о сбіу Ні Уаі Авр Туг Іїе ТПг о1у Рго сіп 370 375 380

Уаї ТПпг ТПг Тук пув Аза Уаії Іїе сіп Тук бек Сув біц бій ТПкг Ре 385 390 395 400

Тук ТпПкг Меє бек бек Авп о біу Ппув Тук Уаії Суб біц Аз1а Авр с1у РПе 405 410 415

ТЕр ТПг бек бек пув біу біцш Ппув Гей Рго Рго Уаі Сув бій Рго Уаї 420 425 430

Сув біу Гецп бек ТПг Нів ТПг Іїе сі1у сб1у Агд І1їе Уа1і с1і1у с1у сіп 435 440 445

Рго Аїа пуб Рго б1у Авр Рпе Рго Тгр біп Уаї Гей Гей Ге сС1у сіп 450 455 460

ТПг ТпПг Аза Аза Аза сіу Аїа Гей І1ї1е Нібв АвБр АБп Тгр Уаї Ге ТПг 465 470 475 480

Аза Аза Нів Аза Уаі Тук бій пуб Агд Меє Аза Аза бек бек Гей Авп 485 490 495

І1е Акуд Месє сіу І1е Іїецй Гпув Агд Іец бек Рго Нів Туг ТПг сіп Аї1а 500 505 510

ТЕр Рго сій бій І1їе Рпбе І1е Ні сій с1у Туг ТПЕ Нів с1у Аїа с1Уу 515 520 525

Рпе Авр АвБп АвБр І1е Аза Гей І1е Гу ІТецй Гпув Авп Гпув Уа1і ТПкг Те 530 535 540

Авпосіу бек І1е Меєсє Ркго Уаї Сув Іецй Рго Агд Гув бі Аза Аїа 5ег 545 550 555 560

Тецп Меє Агуд ТПг Авр Рпе ТпПг сіу ТПпПг Уаі Аза сіу Тер с1у Гей ТЕПг 565 570 575 біп гув б1у Гей Геш Аїа Агуд Авп о Геш Меє Рпе Уаі Авр І1е Рго І1е 580 585 590

Зо А1а Авр Нів біп Гуз Сув ТПК Тбг Уа! Тук біш пув Гей Туг Рго 1У 595 6боо 605

Уаї Агкуд Уаі Бек Аза Авп Меє гей Сув Аїа сі1у Гец біц ТПгЕ с1у ШУ 610 615 620 ув Авр бек Сув Агуд б1у Авр бек сіу сбіу Аїа Гей Уаї РПпе Гей Авр 625 630 635 640

Авп обі ТБ біп Агуд Тер Рпе Уа! сСіу б1у І1е Уаі Бек Тер с1у б5ег 645 650 655

І1е Авп Сув бі1у Аї1а А1ї1а сі1у біп Тук бі1у УМаї Тук ТПг пув Уаї І1е 6бво 665 670

АвпоТук І1їе Рго Тгр АБп о біц АвБп о І1е І1е бек Авп Ріе 675 68о0 685 «2105 52 «2115» 670 «212» Протеїн «213» Мишачий «4005 52

ТПЕ Ггец Гей сіу бек Ппув Тр Рго бій Рго Уаі Рпе с1у Агд Гей Уаї 1. 5 10 15 зек Рго біу Робе Рго бій Ппув Туг Азїа Авр Нів сіп Авр Агуд бек Тгр 20 25 30

ТПЕ гейш ТПг АТа Рго Рго біу Туг Агд Гец Агд ІТецй Тук Рпе ТіПг Нів 35 40 45

Рпе Авр Гец біц Іец бек Тугк Агд Сув бій Тук Авр Рпе Уа1ї! Гпув Іец 50 55 бо зек бек б1іу ТПг Ппув УМаї Гей Аїа ТПг Те Сув сіу біп сій бек ТПг 65 70 75 80

Авр ТПгЕ біц біп Аза Рго б1у АвБп Авр ТПг Рпе Туг Бек Гей с1у Рго 85 90 95 зек Гей пув Уаі! ТП Рпе Нів Бек Авр Тук Бек Авп бій Ппув Рго Ре 60 100 105 110

ТП б1у Рпе сіц Аза Рібе Туг Аїа Аза біц Авр Уаі Авр б1п Сув Аг4д

115 120 125

Уаї бек Ггеш с1у Авр Бек Уаії Рго Сув Авр Нів Тук Сув Нів Авп Туг 130 135 140

Тец б1у с1у Тук Тук Сув Бек Сув Агуд Аїа сіу Тукг І1їе Гец Нів сіп 145 150 155 160

Авпопув Нів ТПг о Сув бек Аза Гец Суб бек бі1у біп Уаі Рпе ТПг щ1У 165 170 175

Акуд Бек сіу Тук Гец бек бек Рго біц Тук Рго біп Рго Тук Рго Гув 180 185 190

Пен бек бек Сув ТПг Туг бек І1їе Агуд гейш бій Авр сбіу РіПе бек Уаї 195 200 205

І1е Ггец Авр Робе Уа! бій бек Рпе Авр Уаі сій ТПг Нібв Рго сбіц А1а 210 215 220 біп Сув Рго Туг Авр Бек Гей Ппув Іїе біп ТПг Авр пув с1і1у б1іц Нів 225 230 235 240 б1у Рко Рпе Сув с1у Ппув ТпПг Гей Рго Рго Агд І1е бій ТПг АвБр 5ег 245 250 255

Нів Ппув Уа1 ТПг Іїе ТБг Ррбе Аза ТБПг Авр біц бек б1у АБп Нів ТПг 260 265 270 с1у Тер Ппув Іїе Нів Тугк ТПг бек ТПг Аза Агд Рго Сув Рго Авр Рго 275 280 285

ТПгЕ АТа Рго Рго Авп біу бек Іїе бек Рго Уаі біп А1ї1а ТПг Тук Уаї 290 295 300

Тецшц ув Авр Агуд Рпе бек Уа1 Рпе Сув Ппув ТПг сіу Рбе сіц Іецй Іей 305 310 315 320 біп б1у бек Уаі Рго Гей Ппув Бек Рпе ТПг Аїа Уа1! Сув біп Гув Авр 325 330 335 бі1у бек Тгр Авр Агуд Рго Меє Рго сій Сув Бек Іїе І1ї1е Авр Сув 01У 340 345 350

Зо Рго Рго Авр Авр Гей Рго Ав5п о сіу Нів Уа1і Авр Туг І1е ТПг с1у Рго 355 360 365 біп Маї ТПг ТПпс Ту пув Аїа Уаі І1ї1е сбіп Тук бек Сув біц біц Тс 370 375 380

Рпе Тук ТіПг Меєс бек бек Авп біу Гуз Тук Уаі Сув бі Аза Ар Щ1У 385 390 395 400

Рпе Тер ТПг бек бек Гув б1у біцш Гу Гей Рго Рго Уаі Сув сій Рго 405 410 415

Уаї Сув с1у Гей бек ТПг Нів ТПг Іїе сіу с1у Акд І1е Уа1і с1у щЩУ 420 425 430 сбіп Рго Аїа Ппув Рго с1у Авр Рібе Рго Тгр сбіп Уаі Гечп Іецй Іешц 1У 435 440 445 біп Тпс ТПпг Аза Аза Аїа сіу Аза Гей Іїе Нів Авр Ап Тгр Уаї Іей 450 455 460

ТП Аза Аза Нів Аїа Уаї Тук сій пув Акуд Месє Аза Аза бек бек Іеєец 465 470 475 480

Ап очІ1е Акуд Месє сіу І1е їецй Гпув Агуд Гей бек Рго Нів Тукг ТПг сіп 485 490 495

Аза Тер Рго біц біц І1е Рпе І1е Ні біцп сі1у Туг ТПгЕ Нів с1у Аї1а 500 505 510 с1у Рпбе Авр АвБп Авр І1їе Аїа Гей І1їе Ппув Геп Пув АБп пуб Уа1ї ТЕГ 515 520 525

І1е Авп біу бек І1е Меє Рго Уаії Сув ІТецй Рго Агуд Гув бій Аза Аї1а 530 535 540 зек Гей Мес Агуд ТПг АвБр Рпе ТПг біу ТПпг Уаі Аза с1у Тер с01Уу Іец 545 550 555 560

ТП біп пув сіу Гец Гец Аза Агуд Авп Гец Меє Роре Уаії АвБр Те Рго 565 570 575

І1е Аїа Авр Нів біп ув Сув ТБПг Тс оУаї Тук сій Ппув Гей Тук Рго 580 585 590 бо сіу Маі Акуд Маії бек Аза Авп Меє Іїей Су5 Аза с1у Ге бій ТЕ 1У 595 6боо 605 сб1у гув Авр бек Сув Агуд сіу Авр Бек сіу сіу Аїа Гей Уаї РіПе Іей 610 615 620

Авр Авп обіц ТБ біп Агуд Тер Рбе Уаі сі1у б1у І1ї1е Уаі Бек Тер С1У 625 630 635 640 зек Іїе Авп Сув б1у Аїа Аїа сіу сіп Тук сб1у Маі Тук ТПг Гув Уаї 645 650 655

ІТ1е Авп Туг І1е Рго Тгр АБп о біц АвБп о І1е І1е бек Авп Ріе бо 665 670 «2105 53 «2115» 2091 «2125 ДНК «213» Щуряча «2205 «2215 Кодуюча послідовність «222» (10)..(2067) «4005 53

Еддсасаса аєд адд ста серед ас дес суд ддеЕ сг сеЕЄ год адеЕ сво 99 зі

Меє Агд Гей гейш Іїе Уа1! Гец сіу Гей Гей Тгр бек Іец Уаї 1. 5 10 дес оаса се ЄбЧд ддс сс оаад бду сс дад сс да ССС додд содс сгд 39

Аза ТПг Ггец Гец біу бек Гпув Тер Рго бій Рго Уаі Рпе с1у Агд Іец 15 20 25 30

ЧдЕд Єсс о ссд дсс о єсс о сса дад аад бас ддс аас сає сад дає сда Сес 147

Уаї бек Ггеш Аїа Рпе Рго сбіц Ппув Тук с1у Авп Ні біп Авр Агд 5ег ду асу сед асе дса ссс сс ддс ССС сдс суд сдс сс бас ссс асс

Зо 195

ТЕр ТпПкг Гей ТПг АТа Рго Рго сіу Робе Агд їец Агд ІТецй Тук Рпе ТПг

З бо сас сс оаас ссд даа сссС Ссс гас осдудс бдс дад гає дас ЕЕ дес аад 243 35 Нів Ррпе Ап Гей бій Гей бек Туг Агуд Сув бій Туг Авр Рпе Уаї Гув 65 70 75 бд асс са додд асс аад дед сса дсс ас ссд сбдс дод сад дад адс 291

Тецп ТПг бек сіу ТПг Ппув Уаі1 Гей Аза ТПг Гей Сув с1іу біп сіц 5ег 40 80 85 90 аса дає асеє дад сдд дса ссЕ ддс аас дас асс сс бас осса сс дає 339

ТПЕ Авр ТПг біц Агуд Аза Рго с1іу АвБп Авр ТПг Рпе Туг бек Ге 0Щ1У 95 100 105 110 45 ссс адс ста аад дес асс СЕС сас сс дас бас оссс оаає дад аад сса 387

Ркго Бек Гец пуб Уаі! ТПг Рпе Нів бек Авр Тук Бек Авп бій Гув Рго 115 120 125 бЕєС аса дда Є дад дсс ЄС бас дса дсуд дад дає дсд дає даа Сд9с 50 435

Рпе ТПг бі1у Рпбе б1шц Аза Рпе Туг Аї1а Аї1а сій Авр Уаї Авр б1іц Сув 130 135 140 ача аса сс сед дда дас са дос сс Суд дас сає бас сбдс сас аас 483

Агуд ТПг бек ІТей б1у Авр бек Маії Рго Сув Авр Нів Тук Сув Нів Авп 145 150 155

Бас сед додс дос бас бас Єдс Ссс обдс са дсд ддс бас асс ссд сас з31

Тук Ге с1іу сіу Тук Тук Сув Бек Сув Агкд Уаі бі1у Тук І1е Гей Нів бо 160 165 170 сад аас аад сасє асс бдс ССса дсс се буде са ддс сад дед ес асо біп Авп оГув Нів ТпПг о Сув бек Аїа Гей Сув Бек сіу біп Уаі Рое ТЕіг 175 180 185 190 чач ад єсЕ додс ЕЕ сес аде адс сс дад бас осса сад сса бас о ссс 627 б1у Акуд бек сіу РпПе Гей бек бек Рго бій Тук Рго біп Рго Туг Рго 195 200 205 ааа сеЕс сс адс Єдс дсс бас аас асс сдс ссд дад даа ддс ССС адс 675 пув Гей бек бек Сув Аїа Туг Авп І1е Агд Гецп сі бі с1іу Роре 5ег 210 215 220 аєс асс студ дас ЄС деЕд дад Ссс сс дає дод дад абд сас сс даа 723

І1е ТБПг Гец Авр Рпе Уаї бій бек Роре Авр Уаі сі Меє Нів Рго сіц 225 230 235 чдсс осад бЄдс ссс обас дас сс сос аад асс саа аса дас аад адд даа 771

Аза сіп Сув Рго Туг Авр бек Гец їув І1е біп ТПг Авр ув Агд сій 240 245 250 бас ддс сс ЕСЕ де 999 аад асу суд ссс оссс оадуд ас даа асе дас 819

Тук сб1у Ркго Рбпе Сув біу Гпув ТПг Гей Рго Рго Агд І1е бій ТПг Авр 255 260 265 270 адс аас аад дед асс аєє асс сс асс оасс дас дад Сса ддуа аас сас 867 век Авп о пув Уаі! ТПг І1їе ТПг Ре ТПг ТПг Авр бі Бек с1у Авп Нів 275 280 285 аса додс ду аад аса сас бас аса адс аса дса сад ссс бдс сс дає 915

Зо ТПЕ б1у Тер Пув І1їе Нів Тук ТПг Бек ТПг Аїа біп Рго Суб Рго Авр 290 295 300 сса асд дсуд сса сс аас ддс сас ас са сс дгд саа дсс о асдд гає

З63

Рго ТПг Аза Рго Рго АБп о біу Нів Іїе Бек Рго Уаі сіп Аїа ТПг Туг

З5 305 310 315

ЧЕС сед аад дас адс ЄС ЄсСЕ дес ССС содс аад асо ддс ССС дад сс 1011

Уаї Гей Ппув Авр бек РіПе бек Уа1 Рпе Сув Ппув ТПг бі1у Рпе сі Гей 320 325 330 суд саа до СсСЕ дЕСсС ссс осуд аад са ЄС ас дсЕ дЕС бдЕ сад ааа 1059

Тец біп с1іу Бек Уа1і Рго Гей Ппув Бек Рпе ТПг Аїа Уаї Сув біп Гув 335 340 345 350 чає дда єСсСЕ ду дас содд ссуд аба сса дад Сдс адс асс ас дас сас 1107

Авр с1іу бек Тгр АвБр Агуд Рго І1е Рго біц Суб бек І1е І1е Авр Сув 355 360 365

Чдас о сс ссс дає дас ста ссс оаасє ддс сас дсд дас бас ас оаса ддас 1155 с1у Рго Рго Авр Ар Тецй Рго АБп о сіу Нів Маі! Авр Тук І1е Тбг о1Уу 370 375 380 сс даа дсд ассоасс бас оааа дсеЕ дед ас сад гас адс де даа дад 1203

Ркго сіц Уаї ТПг ТП Тук Гув Аїа Уаії І1е сбі1іп Туг Бек Сув бій сіц 385 390 395 асеЕ ЄС бас аса аєд адс адс аас ддаєсЄ ааа бас дод СЯ дад дсе дає 1251

ТПЕ Рпе Тук ТПг Меєс бек бек Авп сіу Ппув Тук Уаі Сув б1п Азїа Авр 400 405 410 бо да сс ду асуд адс сс оааа дда даа ааа;ж сс сс ссу ДЕ Сдс аад 1299 б1у Рпе Тер ТПг бек Бек Ппув с1іу бій Ппув бек Гей Рго Уаії Сув Гув 415 420 425 430 ссс дес СДС дда ссд сссоаса сас ас са дда ддс сє ага ас дода 1347

Рго Уаії Сув біу Гец бек ТПг Ні ТПг бек сбіу сб1у Аку Іїе І1е Щ1У 435 440 445 да сад ссеЕ дса аад ссеЕ дає дас ССС сс сбду саа дес сс са сегд 1395 бі1у біп Рго Аза Ппув Рго сіу Авр Рпе Рго Тер сіп Уаї Гей Іецй Іей 450 455 460

ЧдЧдЕє даа асеє аса дса дса дає дсс сс аса сасє дас дас сд дес ста 1443 сбі1у бій ТПпг ТП Аза Аїа сіу Аза Гей Іїе Нів Авр Авр Тгр Уаї Іей 465 470 475 аса дсу дсЕ сає дссЕ дса бас дод оааа аса дад дсу асу Ссс о сСсс о сгд 1491

ТП Аза Аза Нів Аїа Уаї Тук сіу Ппув ТПг біц Аза Меє бек бек Іеєец 480 485 490 час аєс содс аєд ддс аєс сес ааа адд сс Ссс оссс асс сбасоасс саа 1539

Авр І1е Акуд Месє с1у І1е Іїецп пуб Агд Іїецй бек Гей Іїе Туг ТПкг сіп 495 500 505 510 дес о бдуд сса дад дсеЕ дЕеЕС Є ас осає даа ддс бас оасс сас дда дос 1587

А1їа Тер Рго біц Аїа Уаії Рпе І1їе Нів сій с1іу Тук ТПкг Нів Сс1у А1а 515 520 525 чч9Е ЄЄЄ дас аає дає аєса дса ссд асс ааа ссс аад аас ааа дес аса 1635 б1у Рпе Авр Авп Авр Іїе Аїа Гей Іїе Ппув Гей пув Авп о пув Уаї ТЕПг

Зо 530 535 540 аєс аас ада аас аєс аєд ссу асс сс сса сса ада ааа даа дсо дса 1683

І1е Авп Агуд АвБп о І1е Меє Рго І1е Сув5 ІТецй Рго Агуд Гув бій Аза Аї1а 545 550 555 сс са асд ааа аса дас єСсСсС ДдЕЄ дода ас дес дсЕ ддс сд9у да єЄста 1731 зек Гей Меє губ ТПг Авр Рпе Уаі! сСі1у ТПпг Уаії Аза с1у Тер с01Уу Іец 560 565 570 асс сад аад д994 ЄС СЕ дсЕ ада аас сса асуд ССС дсд дас асба сса 1779

ТП біп пув сіу Робе Гец Аза Агуд Авп Гец Меє Роре Уаії АвБр Те Рго 575 580 585 590 ав дес дас сас саа ааа єДдЕеЕ дсе асе дсуд гає аса аад сад ссс гас 1827

Іїе Уаі Авр Нів сіп пув Сув Аїа ТПг Аза Туг ТПг Ппув сіп Рго Туг 595 бо 605 сса дда дса ааа дсд асо дсЕсС аас ад сесс гд дсеЕ ддс ста дас сс 1875

Ркго сіу Аїа пуб Уаії ТПпг Уаії Авп Меє їецй Сув Аза с1у Гей Авр Аг4д 610 615 620

Чад дос оаад дас адс Єдс ада ддс дас адс дда ддд дса ССа дсд ССС 1923 сі1у б1у Гпув Авр Бек Сув Агуд с1іу Авр Бек сіу сіу Аїа Гец Уаї РБПе 625 630 635 ста дас аає даа аса сад ада Є9д9 ЄЕС 959 дода дда ага дЕЄ сс сС99д 1971

Тец Авр АБп обі ТпПг біп Агуд Тер Рпе Уаі1і сіу сіу І1е Уаї бек Тгр 640 645 650 чає ЄсСЕеЕ аєє аас ЧЕ д99 дод ССса даа сад бас доаод дес Сас асо ааа 60 2019 бі1у бек І1їе Авп Сув сіу сіу Бек бій біп Тук сіу Уаї Тук ТК Гув

655 6бво 665 670

ЧдЕС асу аас бає аєє ссс ду асс дад аас аса аса аас ааєс ССС саа 2067

Уаї ТПпгЕ Авп Туг Іїе Рго Тер І1ї1е біц АБп І1е І1е АБп АвБп Ріе 675 68о0 685 бЕєдсааааа аааааааааа аааа 2091 «2105 54 «211» 685 «212» Протеїн «213» Щурячий «4005 54

Меє Агд Гей гейш Іїе Уа1і! Гец сіу Гей Гей Тгр бег Іец Уаі Аїа ТПг 1. 5 10 15

Тем Гей с1і1у Бек Ппув Тер Рго бій Рго Ма! Ррпе с1іу Акд Гей Уаї 5ег

Тец Азї1а Рпе Рго бій Ппув Тук с1у Авп Нів біп Авр Агд бег Тгр ТЕПг

Тец ТПпг Аза Рго Рго сіу Рпе Агуд Гей Агуд Гей Тук РоПе ТПг Нів РБПе 20 50 З бо

Ап оГецй біц Гец бек Туг Агуд Сув біц Тук Авр Рпе Уаії Гпув Гей ТЕПг 65 70 75 80 зек с1іу ТПг пув УМаії Іейп Аїа ТПг Іец Сув б1у сбіп бій Бек ТПг Авр 85 90 95 25 ТПЕ біц Агуд АТїа Рго б1у Авп Авр ТПг Рпе Туг бек Гей со1у Рго 5ег 100 105 110

Тецшц Кпув УМаї ТПг Рпе Нів Бек Авр Тукг бек Авп обіц Гув Рго Рпе ТПг 115 120 125 сб1у Рпе бій Аза Рпе Туг Аїа Аза бій Авр Уаі1і Авр сій Сув Агд ТЕП

Зо 130 135 140 зек Гей біу Авр бек УМаії Рго Суб Авр Нів Тук Сув Нів Авп Тукг Іей 145 150 155 160 сі1у б1у Тук Тук Сув Бек Сув Агуд Уаі с1і1у Туг Іїе Гец Нібв сіп Авп 165 170 175 35 пув Нів ТПг Сув Бек Аїа Гей Сув бек сб1у біп Уаі Рбе ТПг с01Уу Агд 180 185 190 зек сіу РіПе ІТец бек бек Рго біц Тук Рго біп Рго Тук Рго Пув Іец 195 200 205 зек бек Сув Аїа Туг АБп І1е Агд Іешц бій бій с1у Рпе Бек Іїе ТЕГ 40 210 215 220

Тец Авр Рпе Уаі бі Бек Рпе Авр Уаі бі Меє Нів Рго біц Аїа сіп 225 230 235 240

Сув Ркго Тук Авр Бек Гей Ппув Іїе сіп ТПг Ар ув Агд бій Тує 1У 245 250 255 45 Рго Рпе Сув біу пуб ТПг Гей Рго Рго Акуд І1е біц ТПг Авр бег Авп 260 265 270 їпув Маї ТПг Іїе ТПг Рпе ТпПг ТПг Авр бі бек с1у АвБп Нів ТПг с1У 275 280 285

ТЕр пув Іїе Нів Тукг ТПг бек ТПг Аїа біп Рго Сув Рго Авр Рго ТПг 290 295 300

Аза Рго Рго АвБп обіу Ні І1е бБег Рго Уаі біп Аїа ТПг Тук Уаі1ї Іец 305 310 315 320 ув Авр бек РпПе бек Уа1 Рпе Сув Ппув ТПг сіу Рпе сій Гец Іец сіп 325 330 335 сіу бек Маії Рго Гей Ппув бек Рбпе ТПг Аїа Уаї Сув біп Гув АБр Щ1У 340 345 350 зек Тер Авр Агд Рго І1е Рго сій Сув бек І1ї1е І1їе Авр Сув С1у Рго 355 360 365

Рго Авр Авр Тецй Рго АБп о сбіу Ні Уаі Авр Туг Іїе ТПг о1у Рго сіц бо 370 375 380

Уаї ТПпг ТПг Тук пув Аза Уаії Іїе сіп Тук Бек Сув бі бі ТПкг Ре

385 390 395 400

Тук ТпПкг Меє бек бек Авп о біу Ппув Тук Уаії Суб біц Аз1а Авр с1у РПе 405 410 415

ТЕр ТПг бек бек пув біу біцш Ппув бек Гец Ркго Уа1ї Сув Пув Рго Уаї 420 425 430

Сув б1у Гей Бек ТПг Нів ТПг бек с1у с1у Агуд Іїе І1е с1іу с1у сіп 435 440 445

Рго Аїа пуб Рго б1у Авр Рпе Рго Тгр біп Уаї Гей Гей Ге с1іу сіц 450 455 460

ТПг ТПг АТа Аїа сіу Аїа Гешп І1е Ні Авр Авр Тгр Уаї Гец ТПг Аїа 465 470 475 480

Аза Нів Аїа Уаї Тук б1у Гпув ТБг біц Аза Меє бек бек Гей Авр те 485 490 495

Аку Меє сі1у Ії1е Іецп Гув Агд Гец бек ІТецй І1е Туг ТПг сбіп Аза Тгр 500 505 510

Рго сіц Аїа Уаії Рпе І1е Нів сіц с1у Тукс ТПг Нів с1у Аїа с1у Ріе 515 520 525

Авр Авп Авр о І1е Аза Іїецйц І1ї1е пуб Іецйп Гув Авп о Гув Уа1і ТПг Ії1їе Авп 530 535 540

Агуд Авп о І1е Меє Рго Іїе Сув Гецп Рго Акуд Гув б1іц Азїа Аїа бек Іецй 545 550 555 560

Мем пув ТПг Ар Рпе Уа1! сіу ТПг Уа1 Аїа сі1у Тгр С1у Іецй ТПгЕ сіп 565 570 575

Тпув б1у Рпе Гей Аза Агуд Авп о Геп Меє Рпе Уаі1 Ар І1е Рго І1е Уаї 580 585 590

Авр Нів сіп пув Суб Аїа ТПг Аза Тук ТПг Гув біп Рго Тугє Рго Щ1У 595 6боо 605

А1їа пув Уаї ТПг Уаії Авп Меє Гец Суб Аїа сб1у Гей АвБр Агуд с1у СЩШ1У 610 615 620

Зо Пув Авр бек Сув Агкуд с1у Авр бек біу сб1у Аїа Гей Уаї! Роре Геч Авр 625 630 635 640

Авп обі ТБ біп Агуд Тер Рпе Уа! сСіу б1у І1е Уаі Бек Тер с1у б5ег 645 650 655

І1е Авп Сув біу біу бек бій біп Тук бі1у Ма1 Тук ТБг Ппув Уаї Тс

З5 бо 665 670

АвпоТук І1їе Рго Тгр І1е бій АБп І1е І1е АБп АвБп Ріе 675 68о0 685 «2105 55 «2115» 670 40 «212» Протеїн «213» Щурячий «4005 55

ТПЕ Ггец Гей сіу бек Ппув Тр Рго бій Рго Уаі Рпе с1у Агд Гей Уаї 1. 5 10 15 45 зек Гей Аїа Робе Рго бій Ппув Тук с1у Авп Нів біп Авр Агкуд бек Тгр 20 25 30

ТПЕ гейш ТПг АТа Рго Рго біу Робе Агд Гец Агд Гей Тук Робе ТіПг Нів

Рпе Авп Гец біц ІТец бек Тугк Агд Сув бій Тук Авр Рпе Уа1ї! Гпув Іец 50 З бо

ТПг Бек с1іу ТПкг пув Уаії Те Аїа ТБПг Гец Сув біу біп бій бек ТПг 65 70 75 80

Авр ТЕ біц Агуд Аза Рго б1у АБп Авр ТПг Рпе Туг Бек Гей с1у Рго 85 90 95 зек Гпеп пув Маї ТПЕ Рре Нів бек Авр Туг бек АвБп о біц Пув Рго Ріе 100 105 110

ТП б1у Рпе сіц Аза Рібе Туг Аїа Аза біц Авр Уаі Авр б1п Сув Аг4д 115 120 125

ТПг Бек Гей сіу Авр бек Уаі Ркго Сув Авр Нів Тук Сув Нів Авп Туг бо 130 135 140

Тец б1у с1у Тук Тук Сув Бек Сув Агуд Уа1і сіу Тукг І1їе Гец Нів сіп

145 150 155 160

Авпопув Нів ТПг о Сув бек Аза Гец Суб бек бі1у біп Уаі Рпе ТПг щ1У 165 170 175

Акуд Бек с1іу Рібе Гец бек бек Рго біц Тук Рго біп Рго Тук Рго Гув 180 185 190

Тецп бек бек Сув Аза Туг Авп І1їе Агуд Гей бій сіц сіу Рре бек І1е 195 200 205

ТПЕ гейш Авр Рбпе Уаї біц бек Рпре Авр Уаі! біц Меє Ні Рго сій Аїа 210 215 220 сіп Сув Рго Тук Авр бек Тецй Пув І1е сбіп ТПг Ар Гуз Агуд бій Туг 225 230 235 240 б1у Рко Рпе Сув с1у Ппув ТПг Гей Рго Рго Агд І1е бій ТПг АвБр 5ег 245 250 255

Авпопув Уаї ТіПг І1е ТП Рпе ТБПг ТБПг Авр бій бек с1у АБп Нів ТЕГ 260 265 270 сб1у Тер ув Іїе Нів Туг ТПг Бек ТПг Аїа біп Рго Сув Рго Авр Рго 275 280 285

ТПгЕ АТа Рго Рго Авп біу Нів Іїе бек Рго Уаі біп А1ї1а ТПг Тук Уаї 290 295 300

Тем Ппув Авр бек Рпе бек Уа! Рібпе Сув Ппув ТПК с1іу Рібе сій Гей Гей 305 310 315 320 біп б1у бек Уаі Рго Гей Ппув Бек Рпе ТПг Аїа Уа1! Сув біп Гув Авр 325 330 335 бі1у бек Тгр Авр Агуд Рго Іїе Рго сій Сув Бек Іїе І1ї1е Авр Сув 01У 340 345 350

Ркго Рго Авр Авр Тецй Рго АБп о біу Ні Уаії Авр Туг Іїе ТПг с1у Рго 355 360 365 біц Маї ТПг ТПпс Ту пув Аїа Уаі І1ї1е сбіп Тук бек Сув біц біц Тс 370 375 380

Зо Рпе Тук ТіПг Мес бек бек Авп сіу Ппув Тук Уаї Сув5 бій Аза Авр 01У 385 390 395 400

Рпе Тер ТПг бек бек Гув б1у біц пуб бек Гей Рго Уаі1і Сув Гув Рго 405 410 415

Уаї Сув с1у Гей бек ТПг Нів ТПг бек сіу с1у Акд І1е І1е с1у ЩУ

З5 420 425 430 біп Ркго Аза Ппув Рго с1іу Авр Рпе Рго Тгр бсіп Уа1і Гей Гей Гец С1У 435 440 445 бі Тпс ТП Аза Аза сі1у Аїа Гей Іїе Нів Авр Ар Тгр Уаї Іецй ТЕПг 450 455 460

А1а Аїа Нів Аїа Уаї Тук с1і1у пув ТПг біц Аїа Меєс бек бек Іецй Авр 465 470 475 480

І1е Акуд Месє сі1у І1е Іїецй Гпув Агуд Гей бек Гей Іїе Туг ТПг Сіп А1а 485 490 495

Тер Рго бій Аїа Уаї Роре І1е Нів сіц сіу Тує ТПг Нів с1у Аїа щЩ1У 500 505 510

Рпе Авр АвБп АвБр І1е Аза Гей І1е Гу Гей Ппув Авп о ГПув Уаї ТПг І1е 515 520 525

Ап о Агуд Авп о Т1е Меєсє Рго І1ї1е Суб Іецй Рго Агд Гув бі Аза Аїа 5ег 530 535 540

Тем Меє Гпув ТПг Ар Рбе Уа! сіу ТПг Уаі Аза с1іу Ткгр с1у Гей Тіг 545 550 555 560 біп гув б1у Рпе Гей Аїа Агуд Авп Геш Меє Рпе Уаі Авр І1е Рго І1е 565 570 575

Уаї Авр Нів сбіп пув Сув Аїа ТПг Аїа Тук ТПг Гув біп Рго Туг Рго 580 585 590 сб1у А1ї1а Гпув Уа1і ТПг Уаі Авп Меє Гей Сув Аїа сіу Гей Авр Агд с1Уу 595 6боо 605 сб1у гув Авр бек Сув Агуд сіу Авр Бек сіу сіу Аїа Гей Уаї РіПе Іей 610 615 620 бо Авр Авп бій ТБг біп Агуд Тер Рбе Уаі сСіу сбіу І1е Уаї бек Ткгр 01У 625 630 635 640 зек І1їе АвБп Сув біу бі1у бек біц біп Тук с1іу Уа1і Тук ТПкг Гпув Уаї 645 650 655

ТПЕ Ап о Тукг Іїе Рго Тгр І1е сбіц АвБп І1е І1е АБп АвБп Ріе бо 665 670 «2105 56 «2115 28 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Ношто бБарієпв «4005 56 аєчаддсеєдс Єдассссссе доадсссес 28 «2105 57 «2115 23 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Ношо барієепь «4005 57 чЧдЕдссссЕсСс гдсудесасся сьд 23 «2105 58 «2115 23 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Ношо барієепь «4005 58

Зо сададдедас дсаддаддад сас 23 «2105 59 «2115 27 «2125» ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Ношо барієепь «4005 59

Ебааааєсас Єааєсасдаеє сесдваєс 27 «2105 60 «2115 22 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Мишача «4005 60 аєчаддстас єсаєстЕєсся 99 22 «2105 61 «2115 23 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Мишача «4005 61 сгдсададдє дасдодсадоаодо 999 23 «2105 62 бо «2115 23 «2125» ДНК

«2135 Штучна послідовність «223» Мишача «4005 62 ссссссссдс десассессд сад 23 «2105» 63 «2115 29 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Мишача «4005 63

Ебадаааєса сесаєсаєдє ссесааєсс 23 «2105» 64 «2115 29 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Щуряча «4005 64 чададєдасодс аддададаса ЄсбадеЕдееес 23 «2105 65 «2115 37 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Щуряча «4005 65 сстадааасас сСаасдссссо сссдсдессас сссгрдса 37 «2105 66

З5 «2115 354 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 66 саддессассс Сдааддадсс соддсссрдед седдедааас ссасададас ссесасдстд бо ассеЕдсассд ЕЄсЕСЕЧДоЯДдДЕеЕЄ сеЕСасссадс аддддсаааа Содддадсдсдад ссддаєсссде 120 садсссссад ддааддсссс ддадеддсЕсс дсасасафсєє сєеЕєсдадсда сдаааааєсс 180

Басаддасає содсеєдаадад саддсссасс асссссаадда асасссссаа ааассаддаєд 240

ЧдЕСсСЕвасаа Єдассаасає ддасссодсд дасасадсса сдбаєсєсассд Сдсасдддаєса 300 счасдсддад даассдасса ссддддссад ддаассстдд Ссассдсссс ссса 354 «2105 67 «2115 118 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 67 бо сіп Ма1ї ТПЕ Гецп Ппув бій бек с1іу Рго Маі Гецп Уаі Пув Рго ТПгЕ сі1ц 1. 5 10 15

ТПЕ Гей ТПг Гей ТПг о Сув ТПг о Уаї бек сіу Рпе Бек Гей бег Агд б1Уу 20 25 30

Тпув Меє сі1іу Уаії Бек Тер І1їе Агуд сбіп Рго Рго сіу Пув Аїа Іец с1іц 35 40 45

Тер Геп Аїа Нів І1їе Рре бек бек Авр бій Пув бек Тук Агд ТПг 5ег 50 55 бо

Тецп Гув бек Агуд Гей ТПг Іїе бек Гув Авр ТПг бек пув Авп біп Уаї 65 70 75 80

Уаї Гей ТпПг Меє ТПг Авп Мес Авр Рго Уаії Авр ТПг Аза ТПг Туг Туг 85 90 95

Сув А1ї1а Агуд І1ї1е Агуд Агуд сіу с1у І1їе Авр Туг Тер сС1іу біп с1у Тс 100 105 110 їеч Ма! ТПг Уаї бек 5ег 115 «2105» 68 «2115 121 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 68 біп Маї біп Гей біп біп бек с1іу Рго сбіу Гецй Уа1! Ппув Рго бек біп 1. 5 10 15

ТПЕ Гей бек Гей ТПг Сув Аза І1їе бек біу Авр бек Уаі! бек бек ТПг 20 25 30 зек Аїа Аза Тгр АБп о Тгр І1е Агуд біп бек Рго бек Агуд с1у Гей сіц

ТЕр гец с1у Акуд ТБг Туг Туг Акуд бек Ппув Тр Туг АБп Авр Туг Аїа бо

Зо Уа1ї бек Маії Ппув бек Агуд І1е ТПг Іїе Авп Рго Авр ТПг Бек Ппув Авп 65 70 75 80 біп Рпе бек Гей біп Гей Авп бек Уаі ТПг Рго сій Авр ТПг А1Та Уаї 85 90 95

Тук Тук Сув Аза Агд Авр Рго Рпе сіу Уаі Рго Рпе Авр І1е Тегр с01У

З5 100 105 110 біп б1у ТПпг Меє Уа1і ТПг Уа1і! бек 5ег 115 120 «2105» 69 «2115» 106 40 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 69 45 сбіп Ркго УМаії Гешп ТПг о біп Рго Ркго бек Гей бек Уаі бек Рго с1у сіп 1. 5 10 15

ТПгЕ АТїа бек Іїе ТПг Сув бек сіу біц пув ІТец б1у Авр Гув Туг Аїа 20 25 30

Тук Тер Тук біп біп губ Ркго бі1іу біп Бек Рго Уа1і Гей Уаї Меє Туг 50 35 40 45 біп Авр ув біп Агуд Рго бек с1іу Іїе Рго бій Акуд Робе бек біу бег 50 55 бо

АвпобБек с1у АвБп ТПг Аза ТПг о Гец ТПг І1е бек с1у ТПг біп А1їа Меє 65 70 75 80 55 Авр бій Аїа Авр Туг Тук Сув біп Аїа Ткгр Авр бек бек ТПг Аїа Уаї 85 90 95

Рпе сіу сіу біу ТПг Гпув Гей ТПг Уаї Іей 100 105 «2105 70 60 «2115 324 «2125» ДНК

«2135 Штучна послідовність «223» Синтетична «4005 70

Ессртасдадс Едчасасадсс асссссддед сСсадсддссс саддасадас ддассассаєе бо ассЕдеЕдсодд дадасаассеє Єдоддаадааа сдсдсдсасо ддсассадса даддссаддас 120 саддссссгд сДдеЕсддессає ссасдаєдає адсдассддсес ссгсадддає сссрдассда 180

БбЕСЕСЕДДсСсСЕ ссаасеЕсєду даасасддес асссодасса Ссассадддд сдаадссд9д4949д 240 чаєчаддссу астаєстаєєсд єсадоаєдесда дасассдсса ссдаєсаєде ддЕсЕссдадаес 300 ддадддасса адсесассдє сста 324 «2105 71 «2115 120 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 71 зек Тук біц Іїец І1е біп Рго Рго бек Уа! бек Уаі Аза Рго с1у сіп 1. 5 10 15

ТПгЕ АТа ТПг Іїе ТБПг Сув Аїа с1іу Авр АвБп Тец бі1у Гув Гув Агу Уаї1ї 20 25 30

Нів Тер Тук сбіп біп Агуд Рго сіу сбіп Аза Ркго Уаі Іец Уаі ІШе Туг

Зо Авр Авр бек Авр Агуд Рго бек б1іу І1їе Рго Авр Агуд Ррпе бег Аїа 5ег

З бо

Авп обБек с1у АвБп ТПг Аза ТПг о Гецп ТПг І1е Тпг Агуд с1у бій Аїа щ1У 65 70 75 80

Авр бій Аза Авр Туг Тук Сув біп Уаії Тгр АБр І1е Аїа ТПг Авр Нів

З5 85 90 95

Уаї Уаі1і Рпе сіу сіу сіу ТБкг Ппув Гей ТПг Уаії Ге Аї1а Аї1а Аї1а Щ1У 100 105 110 зек біц біп Гув Іецй І1е бек бій 115 120 40 «2105 72 «2115 36 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» 45 «223» Синтетична «4005 72

Те біп Маї ТПпг Сув бій Рго с1іу ТПг ТпПг Рпе пув Авр Гув Сув Авп 1. 5 10 15

ТПгЕ Сув Акуд Сув біу Бек Авр сіу Ппув бек Аїа Уаії Сув ТПг Гпув Ієецй 50 20 25 30

ТЕр Сув Авп сіп 35 «2105 73 «2115 33 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 73 бо ТПЕ Сув бій Ркго біу ТПг ТП Рпбе Ппув Авр Гув Сув АБп о ТПг Сув Агд 1. 5 10 15

Сув бі1у бек Авр с1іу Ппув Бек Аїа Уаї Сув ТБПг Гув ІТецй Тер Сув Авп 20 25 30 сіп «2105 74 «2115 20 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 74

ТПгЕ Сув Акуд Сув біу Бек Авр сіу Ппув бек Аїа Уаії Сув ТПг Гпув Ієецй 1. 5 10 15

ТЕр Сув Авп сіп 20 «2105 75 «2115» 491 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 75

Те біп Маї ТПпг Сув бій Рго с1іу ТПг ТпПг Рпе пув Авр Гув Сув Авп 1. 5 10 15

ТПгЕ Сув Акуд Сув біу Бек Авр сіу Ппув бек Аїа Уаії Сув ТПг Гпув Ієецй 20 25 30

ТЕр Сув Авп осбіп сіу ТПг біу сіу сіу бек біу бек бек бек сіп Уаї1ї

ТПЕ Гей пув біц бек біу Ркго Уаії Гей Уаі Ппув Рго ТПг сбіц Тік Іей бо

Зо ТП Гецп ТпПк Сув ТПг о Уаї бек сб1у Рре бек Гей бек Агуд с1іу Ппув Меє 65 70 75 80 сбі1у Маї бек Тер І1їе Агуд біп Рго Рго сіу Ппув Аїа Іец бій Тгр Іецй 85 90 95

А1їа Нів І1їе Рібе бек бек Авр біц пуб бек Туг Агуд ТПг бек Геци Гув

З5 100 105 110 зек Агд Пец ТПг І1е бек Гув Авр ТПг бек Гув Авп о біп Уаї Уаї Іей 115 120 125

ТПЕ Меє ТПг Авп Мес Авр Рго Уаі1і Авр ТПг Аїа ТПг Туг Тугк Сув Аїа 130 135 140 40 Агуд тІ1е Акуд Агкуд б1у б1у Іїе Авр Туг Ткгр б1у біп с1у Тбг Іец Уаї 145 150 155 160

ТПг Уа1 бек бек Аза бек ТПг Ппув сіу Рго бек Уаі Рпе Рго Гей Аїа 165 170 175

Ркго Сув Бек Агд бек ТПг бек біц бек ТПг Аза Аза Геи с1у Сув ГІец 45 180 185 190

Уаї пув Авр Тук Рпе Рго сіц Рго Уа1 ТПг Уаї бек Тгр АБп беєг ЩШ1У 195 200 205

Аза гей ТПг бек біу Маії Нів ТБг Рре Рго Аї1а Уаі Гей сбіп бек бег 210 215 220 50 с1у Гей Тук бек Гей бек бек Уа1! Уаї ТПг Уаї Рго бек бек бек Гей 225 230 235 240 сб1і1у ТП Гпув ТПг Тує ТпПг Сув Авп о Уаі Авр Нів Ппув Рго бек АвБп ОТГ 245 250 255 пув Маї Авр пув Агуд Уа1і сій бек Ппув Тук с1у Рго Рго Суб Рго Рго 55 260 265 270

Сув Рго Аза Рго бій Рпе Гей сіу с1іу Рго Бек Уа1і Рібе Гец Робе Рго 275 280 285

Рко Ппув Рго Пув Авр ТПг Теий Меє Іїе бек Агуд ТПг Рго бій Уа1 ТЕГ 290 295 300 бо Сув Ма1! Уаї Маї Авр Уа1і бек біп бій Авр Рго сій Уа1і сбіп Роре Авп 305 310 315 320

Тер Тук Уа1 Авр сіу Уаі біц Маї Нів Авп Аїа Ппув ТПг пуб Рго Агд 325 330 335 бі бій біп Рпе Авп бек ТПг Туг Агуд Уа1 Уа1 бек Уаї Гец ТПг Уаї 340 345 350

Тем Нів біп Авр Тер Гей Авп о с1іу Ппув бі Тук Пув Сув пуб Уаї 5ег 355 360 365

Авпопув с1і1у Пец Рго бек бек Ії1е біц Гув ТПг І1їе бек Гпув Аїа Гув 370 375 380 б1у біп Рго Агуд бі Рго біп Уаі Тук ТПг Гей Рго Рго бек біп сій 385 390 395 400 біц Меє ТпПг о пув Авп о біп Уа1 бек Гей ТПг Сув Гей Уаї пув с1у РБПе 405 410 415

Тук Рго Бек Авр Ії1е Аїа Уаі! сій Тер біц бек АвБп б1у біп Рго с1ци 420 425 430

Авп оАвп о Тук Тув ТПг ТБ Рго Рго Уаі Гей Авр бек Авр с1у бек РіПе 435 440 445

Рпе Гей Туг бек Агд Тецй ТПг Уаі Авр Гув бек Агд Тгр біп бій щ1У 450 455 460

Авп оУа1 РіПе бек Суб бек Уаі! Месє Ні бі1цп Аза Гей Нів Авп Нів Туг 465 470 475 480

ТПЕ біп пув бек Гец бек ТІГецй бек Гец б1у Гув 485 490 «2105 76 «2115» 491 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 76

Зо сіп Ма1ї ТПЕ Гецп Ппув бій бек с1іу Рго Маі Гецп Уаі Пув Рго ТПгЕ сі1ц 1. 5 10 15

ТПЕ Гей ТПг Гей ТПг о Сув ТПг о Уаї бек біу Рре бек Гей бБег Агд Щ1У 20 25 30

Тпув Меє сі1іу Уаії Бек Тер І1їе Агуд сбіп Рго Рго сіу Пув Аїа Іец с1іц

З5 35 40 45

ТЕр геш Аїа Нів І1їе Рібе бек бек Авр біц пуб бек Туг Агд ТПг 5ег 50 55 бо

Тецп Гув бек Агуд Гей ТПг Іїе бек Гув Авр ТПг бек пув Авп біп Уаї 65 70 75 80

Уаї Гецп ТрПг Меє ТБг Авп Мес Авр Рго Уаї Авр ТПг Аза ТПг Тук Туг 85 90 95

Сув А1ї1а Агуд І1ї1е Агуд Агуд сіу с1у І1їе Авр Туг Тер сС1іу біп с1у Тс 100 105 110

Тецп Маї ТПг Уаї бек Бек Аїа Бек ТПг Ппув сіу Рго бек Уаії РоПе Рго 115 120 125

Тец Аза Рго Сув Бек Агуд Бек ТПг бек бі Бек ТПг Аза Аїа їец С1У 130 135 140

Сув Гецп Маї Ппув Авр Тук Рпе Рго бій Рго Уа1 ТПг Уаї бек Тгр Авп 145 150 155 160 зек б1і1у Аїа Гей ТПг бек сіу Уаї Нів ТПг Рре Рго Аїа Уаї Іец сіп 165 170 175 зек бек біу Гец Тук бек Гецп бек бек Уа! Уа1ії ТПг Уа1і Рго Бек 5ег 180 185 190 зек Гец біу ТПг Гуз ТП Тук ТБ Сув Авп оУаії Авр Нів пуб Рго 5ег 195 200 205

АвпоТпЕ пув УМаії Авр Тув Агуд Уаї біц бек пув Тук б1у Рго Рго Сув 210 215 220

Ркго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Робе Іец біу б1у Рго Бек Уа1 РПе ГІец 225 230 235 240 бо Рпе Рго Ркго Пув Рго пуб Авр ТПг Гей Меє І1е бек Агуд ТПг Рго сі1ц 245 250 255

Уаї ТПпг Сув Уа1 Уа1 Уа1ї Авр Уа1і бек сбіп біц Авр Рго бій Уаї сіп 260 265 270

Рпе Авп Тер Тук Маі Авр сіу Уаі біц Уаї Нів Авп Аїа Ппув ТПкг Гув 275 280 285

Рго Акад бій бій біп Рбе Авп бек ТПг Туг Агуд Уаії Уаї бек Уаї1ї Іеєц 290 295 300

ТпПЕ Уаї Гей Нів біп Авр Тр Гей Авп біу Гуз біцп Тук Ппув Сув Гув 305 310 315 320

Уаї Бек Авп Ппув сіу Гей Рго Бек Бек Іїе сій пуб ТПг І1е бек Гув 325 330 335

Аза пув с1іу біп Рго Агкуд бій Рго біп Уаї Тук ТПг Гей Рго Рго 5бег 340 345 350 біп бій бій Меє ТпПг Ппув Авп обіп Уа1і бек Гей ТПг Сув Іец Уаї Гув 355 360 365 с1у Ррбе Тук Рго бек Авр І1їе Аїа Уаї сбіш Тер сій бек АБп с01у сіп 370 375 380

Ркго біц Авп Авп оТуг Гув ТПг ТБг Рго Рго Уаії Гей Авр 5Бег Ар 1У 385 390 395 400 зек РпПе Рібе Іїец Туг бек Агкуд Гей ТПг Уаі Авр Гуз бБег Агд Тгр сіп 405 410 415 бі б1у Авп Уа1і РпПе бек Сув Бек Уаі Меє Нів сій Аїа Гец Нів Авп 420 425 430

Нів Тук ТПг сіп пуб бек ІТец бек Гец бек Геш сіу пув Аїа Аїа с1Уу 435 440 445 сіу бек б1у Гешп сі Уа1і! ТБПг Сув бій Рго с1іу ТПг ТБг Робе пу5 Авр 450 455 460

Туз Сув Авп о ТПг Сув Агуд Сув с1іу Бек Авр сіу Ппув бек Аїа Уа1ї! Сув 465 470 475 480

ТПЕ Ппув Гей Тер Сув АвБп о біп сіу бек с1у А1а

Зо 485 490 «2105 77 «2115» 258 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 77

Те біп Маї ТПпг Сув бій Рго сіу ТБг ТБг Рпе пув Авр Гув Сув Авп 1. 5 10 15

ТП Сув Агкуд Сув біу Бек Авр сіу Ппув бек Аїа Уа! Сув ТПкг Ппув Геч 20 25 30

ТЕр Сув Авп о сбіп сіу ТПг біу сіу сіу бек біу Бек Бек бек біп Рго 35 40 45

Уаї Гей ТПг біп Ркго Рго бек Гей бек Уаї бек Рго бі1у біп ТПг Аїа

З бо зек Іїе ТПг Суб бек б1у бій пуб Іец б1у Авр Ппув Туг Аїа Тук Тгр 65 70 75 80

Тук біп біп Ппув Рго біу біп бек Рго Уаії Іец Уаії Меє Тук сбіп Авр 85 90 95 50 пув біп Агуд Рго бек с1у І1е Рго бій Агуд Рре бек сіу бек Авп 5ег 100 105 110 б1у АБп ТПпг Аза ТПг Гей ТПг І1їе бек с1у ТПг сіп Аїа Месє АБр с1ц 115 120 125

Аза Авр Тук Тук Сув біп А1ї1а Тгр Авр бек бек ТПг Аза Уаі РпПе 0Щ1У 130 135 140 сбі1у б1у ТПпг Ппув Гей ТпПг Уаі1і! Гей с1у біп Рго пув Аїа Аза Рго 5ег 145 150 155 160

Уаї ТПпгЕ Гей Рпе Рго Рго бек Бек біц біц Гец біп Аз1а АБп Гув Аїа 165 170 175 бо ТПЕ Гецш Уаї Сув Гей І1е Бек Авр Рпе Тугк Рго сбіу А1ї1а Уаї ТПг Уаї1ї 180 185 190

Аза Тер пув Аза Авр бек бек Рго Уаі їув Аї1а сіу Уаі бій ТПгЕ ТЕПг 195 200 205

ТПЕ Рго Бек Ппув біп бБег Авп Авп о Гув Тут Аза Аза бек бек Тук Ієц 210 215 220 зек Геп ТПг Рго біц біп Тер пув бек Нів Агуд бек Тук бек Сув сіп 225 230 235 240

Уаї ТпПЕ Нів бі сіу Бек ТПг Уаї біцш Гув ТПпг Уаі Аза Рго ТПг с1іц 245 250 255

Сув вБег «2105 78 «2115» 258 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 78 біп Ркго Уаії Гей ТПг біп Рго Рго Бек Гей бек Уа1і бек Рго с1і1у сіп 1. 5 10 15

ТПгЕ АТїа бек Іїе ТПг Сув бек сіу біц пув ІТец б1у Авр Гув Туг Аїа 20 25 30

Тук Тер Тук біп біп Ппув Рго сіу сіп бек Ркго Уаі! Іецй Уаї Меє Туг 35 40 45 біп Авр ув біп Агуд Рго бек с1іу Іїе Рго бій Акуд Робе бек біу бег 50 55 бо

Авп о бек с1у АБп ТПг Азїа ТПг Гей ТПг І1е бек сб1у ТПг сіп Аїа Мес 65 70 75 80

Авр сій Аза Авр Туг Тук Сув біп Аїа Тгр Авр Бек бБег ТПг Аїа Уаї 85 90 95

Рпе сіу біу біу ТП Гув Гей ТПг Уаії Іейп с1у сіп Рго пув Аза Аї1а

Зо 100 105 110

Рго Бек Уа1 ТПг Гец Рре Рго Рго бек бек бій біц Гей сіп Аза Авп 115 120 125

Тпув Аза ТПг Гей Уаії Сув Гей Іїе Бек Авр Рпе Туг Рго сіу А1їа Уаї 130 135 140

ТПЕ Маї Аїа Ткгр ув Аза Авр бек бек Рго Маі Ппув Аїа сіу Уаї сіц 145 150 155 160

ТПЕ ТПЕ Тк Рго бек Ппув біп бек Авп Авп Гпув Туг А1ї1а Аза бек 5ег 165 170 175

Тук Гей бек Гей ТПг Рго біц сбіп Тер Ппув Бек Нів Агд бек Туг вег 180 185 190

Сув біп Уаї ТПг Нів бі сіу Бек ТПг Уаі сій пув ТБПг Уаї Аї1а Рго 195 200 205

ТПЕ біц Сув бек Аза Аза бі1у сіу бек біу Іїецп бій Уаї ТПг Сув б1іц 210 215 220

Рго с1у ТБг ТПг Рбе Ппув Авр о Ппув Сув Авп ТПг Суб Агуд Сув біу б5ег 225 230 235 240

Авр с1і1у Ппув бек Аїа Уаії Сув ТБПг Гув Тецй Тер Сув АвБп біп сіу бБег 245 250 255 с1у А1а «2105 79 «211» 10 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 79 сб1у ТП с1у сіу с1іу Бек сіу Бек бек б5ег 1. 5 10 «2105 80 60 «2115 6 «212» Протеїн

«2135 Штучна послідовність «223» Синтетична «4005 80

Аза Аїа с1у сбі1у Бех Щ1Уу 1. 5 «2105 81 «2115 4 «212» Протеїн «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 81 сі1у бек с1у Аїа 1 «2105 82 «2115 1533 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 82 аєчаєдеЕссеЕ ЕЄЧдЕСсСЕСЕСЕ дсЕСССдЯдЕс ддсаєсстає сссаєсдссас ссаддссеєд бо чаадеєдасує деЕдадсссду аасдасасеєс ааадасааде дсаасасеєд єсододеЕдсдаЧеЕ 120

Есадаєдоада ааєсддсоддЕ сеЕдсасааад ссссддесдса ассадддсас сддсддадад 180

Есдддаєсса дсеЕсасаддеЕ сассеєєЄдаадч дадеЕссдадєс седесдссдаЄ дааасссаса

Зо 240 чадасссеєса содсеєдассвд сассассссс доддЕссссас сСсадсадддд Сааааєсддаае 300 чЧчЕЧадсеєдда ЕєссдЕСсадсс сссадддаад дсссгддадс ддсЕсдсаса сасєсєссєсссо 360 адеЕдчасдааа аассстрасад дасассудссуд аададсаддс Ссассаєсес сааддасасс 420

Ессааааасс аддеєддеЕсся басааєдасс аасасддасс ссдсддасас адссасзгає 480

БасеєдеЕдсас ддаєсасдаса єддаддааєсс дассассддуда дссадддаас сссддссасе 540

ЧдЕСЕССсСЕСсСад ссеЕссассаа доддсссаєссс дЕсссссссс сддсдсссгд сеЕссаддадес бо ассЕссдада дсасадссдс ссеЕдддссдс ссддссаадда ассасеЕсссс сдаассоадвед бо асддЕдЕсуєЄ ддаасесадда сдсссеєдасс адсоддсуєЄдс асасссєсссс додасеєдеЕсста 720 садесссссад дасссстассс ссссадсадс деддедассуд гбдсссессад садсеЕсдддес 780 асдаадассеє асассеєдсаа сдєбадаєсас аадсссадса асассааддІ ддасаадада 840

ЧЕєЧадесса аасаєддеЕсс сссаєдссса ссаєдсссад сассеєдадеЕс сссдоадоавдвва 900 ссаєсадесс сссодессссс сссаааассс ааддасасес ссаєдаєсеьс ссддассссь 960 чадачдЕсасає дсодсодЧдсдЧає ддасдєдадс саддаачасс ссдаддеЕсса дЕсССаастсд9д9ч 1020

Басчдєддваєд дсодєддадде дсаєаасдсес аадасааадс сдсдддадда дсадесссаас 1080 адсасдбасс дЕДдЕЧдЧдЕєсСад саєссссасс дессссдсасс аддассддсс даасддсаад 60 1140 чадеасаадеЕ дсааддеєсеєс саасаааддсес сссссдсссо ссассдадаа аассассєссс ааадссааад дасадссссу ададссасад деЕдсасассс Едсссссаєс ссаддаддад 1260 аєдассаада ассаддеєсад сседасссдс ссддссааад дсЕЕстассс садсдасаєс 1320 чЧдссадєддадеЕ додададсаа Єдддсадссуд дадаасаасо асаадассас дссосссдаєд 1380 сгддассссуд асддсссссс сссссесСвсас адсаддссаа ссудєддасаа дадсадаєд9 1440 сачдадчоадда асчдєссеЕссс асдсеЕссууєд асдсасдадд сЕССсСдсасаа ссассасаса 1500 садаададсс Ссесссссдесс ссссодддааа Сода 1533 «2105 83 «2115 1533 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 83 аєчаєдеЕссеЕ ЕЄЧдЕСсСЕСЕСЕ дсЕСССдЯдЕс ддсаєсстає сссаєсдссас ссаддсссад бо

ЧдЕСассеЕєда аддадеЕСсСєдд ЄссЕдсдссд дсдааассса сададасссо сасдсеєдасс 120

Едсассодєсс седддЕсСсЕсС асесадсаду ддаєаааасдоуа дсдЕДдчадсед даєсссоаєсад 180 сссссаддда аддссссдда дсддсеЕсдса сасареєсєеєеєс соадедасда ааааєсстас 240 аддасаєсдс ЕЄдаададсад дсесассаєсс сСссааддаса сссссааааа ссаддсддЕс

Зо 300 сесасаасда ссаасасдда сссодсддас асадссасдє ассассдсдс асддасасда 360 сдсддаддаа Ссдассассд дддссаддда асссрддсса сеЕдесЕсеЕссес адссессасс 420 аадддсссаєс ссуссеЕсссс ссеЕддсдсесс сдссссадда дсасссссда дадсасадсс 480 десссЕддодсЕ дсседдеєсаа ддастасссс сссдаассояд Сдасоддсдсс дсддаассса 540 чдасдсссеєда ссадсддсує дсасассеЕєс ссудседеЕсс гасадессьс аддасестас бо

Есссеєсадса дсодєдадєдас саєдсссосс адсадсссду дсасдаадас стасассгдс бо аасдєадаєс асаадсссад саасассаад дсддасаада дадссдадесс сааасаєсд9аді 720 сссссаєдсес сассасдссс адсасседад ЕЄСсСсСЕдддоад дассаєсаде ссесседеєс 780 сссссаааас ссааддасас сСсссаєдаєс єсссодддассс седаддесас деЕдсоадтдЧд 840 чЧчЕддасдєда дссаддаада ссссдаддсс садсссаасо ддасасдсдда Єддсдоасддвад 900

ЧдЕдсаєааєд ссаадасааа дссодсдддад дадсадссса асадсасдба ссдсдсддЕс 960 адсдЕссеса ссудЕссрдса ссаддассдд ссдаасддса аддадсасаа дедсааддес 1020

Ессаасааад дссссссудЕсС сеЕсСсаєсдадд аавгассассе ссааадссаа адддсадссс 1080 сдададссас аддсдсасас ссодссссса ссссаддадуд адаєдассаа даассаддеЕс 1140 адссЕдассеЕ дссеЕддеЕсаа аддсеЕссстас сссадсдаса Ссдссдсдда дгЕдддададс 60 1200 ааєдддсадс соддадаасаа ссбасаадасс асадссосссуд Сдссддассс сддасддсессс бЕСЕЄєсСсСЕеЕсСЕ асадсаддсе аассоасбддас аададсадді ддсаддаддадд даасдЕсесс 1320

ЕсаєдсессЯя єдаєдсаєда доадсеЕсСсдсас аассассаса сасадаадад ссессссстгд 1380

ЕсЕСЕСОдда аадссоастда єдасадсддс ссодаадсда сдсдсдадсс сддаасдваса 1440

БбЄсааадаса адедсаасас єєдЕСЯОДЯДсЯдсС ддсЕсСсадаєсда ддаааєссдЯядс ддсссдсаса 1500 аадсЕссдЧаЕ деЕаассаддад бадеддеєасе да 1533 «2105» 84 «2115» 834 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 84 аєчавєдеЕссеЕ ЕЄЧдЕСЕСЕСЕ дсЕСССддДЕС ддсаєсссстає єссаєрдссас ссаддсесе 9 бо чаадеєдасЧчдє деЕдадсссодд аасдасассс ааадасаадс дсаасасссда сСсоадсдсададі 120

Есадаєдоада ааєсддсоддЕ сеЕдсасааад ссссддесдса ассадддсас сддсддадад 180

Есдодаєсса дсссасадсс адедсеєдасе садссссссЕ саседсссуає дЕСсСсссадда 240 садасадсса дсаєссасссд ссссддадад ааассдодддада асааасаєдс ссассддасає 300 садсадаадс саддссадесс ссссдсєсд дессаєдраєс аадасаааса дсддсесссегса

Зо 360 чадчаєссстд адсдаєєсеєс єддсЕссаас сСсгідддааса садссасссс дассаєссадс 420 чадасссадд стаєддаєда додседассає сассдссадда сдсдддасад садсассдсд 480 чеаєєсддсуд дадддассаа дсеЕдассдЕс стаддссадс ссааддсоддс дсссеЕсддес 540 асссЕдеЕсєсс содсссеЕсСсеєсС єдаддадссс саадссааса аддссасасс ддсдеЕдеЕсес бо аєаадеєдасеЕ єсбасссоддуа адссодсЄдаса дсддсссдда аддсадасад садссссдЕс бо ааддсдддад Сддадассас сасасссссс ааасааадса асаасаадса сдсддссадс 720 адсвтаєсєда дссеЕдасдсс єдадсадсдд аадссссаса даадссасад ссдссаддЕс 780 асдсаєсдаад ддадсассудє ддадаадаса деЕддссссста садаасчєсс асад 834 «2105» 85 «2115» 834 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична «4005 85 аєчаєдеЕссеЕ ЕЄЧдЕСсСЕСЕСЕ дсЕСССдЯдЕс ддсаєсстає сссаєсдссас ссаддсссад бо ссадсдссда сссадссссс сссасрдрсс деЕдеЕссссад дасадасадс садсаєсасс 120

ЕдсЕСєЧддад адаааєєсдоад ддаєааасає дсссассдуді ассадсадаа дссаддссад 180 бо ЕсссссдеЧЯЄ єддсєсасдра Ссаадасааа садсддсссе саддадаєссс сСдадсчассс 240

ЕседдсесСса асеЕсеєдддаа сасадссасо ссдассаєсса дсдддассса ддастсасддвдає

Зоо чадоасеєЧдЧасеЕ аєсаседеЕса доасоаєдддас адсадсассд сддсаєссод сдвдадддасс 3З6о аадсєдассд Есссаддсса дсссааддсуд дсодсссесду Єсасссеудес сссдсссесс 420

ЕсеЕЧчаддадс єссаадссаа сааддссаса сеЕддеЕдеЕдЕСсС єсагаадеда сеЕсстасссд 480 чддадссдєда садеддссвд дааддсадає адсадссссуд Ссааддсддадда адсддадасс 5340 ассасасссе ссааасааад саасаасаад Сасдсддсса дсадстаєсєсє дадссєдасд 60 сссдадсадс ддаадсссса садаадсстас адсгрдссадд ссасдсаєда адддадсасс 6б6о чЧЕддадаада садсддсессс Сасадаасудє Ссадссооссо дсдосадеда ЕЄсодаадьд 720 асдеЕдеЕдадс ссодддаасдас аєєссааадас аадсдсааса сссдссоадсд сдаддеЕссадає 78о0 чадаааєсдд соддЕСєЄДдсас ааадссссдда Єдсаассадуд дсадсддеєдс єсгад

Claims (2)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб профілактики або зменшення ураження нирок у суб'єкта що страждає на стероїдзалежну імуноглобулін-А-нефропатію (ДАМ), який включає введення моноклонального антитіла проти людської мананзв'язувальної лектинасоційованої серинової протеази-2 (МА5Р- 2) або його фрагмента, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить 5ХЕО ІЮ МО: 67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 69, в кількості, ефективній для зменшення протеїнурії у даного суб'єкта, який страждає на стероїдзалежну Зо імуноглобулін-А-нефропатію (ДАМ).

2. Спосіб за п. 1, де інгібуюче МАБР-2 антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у кількості і протягом періоду часу, ефективних для досягнення щонайменше 20- відсоткового зменшення 24-годинної екскреції білка з сечею, порівнюючи з вихідною 24- годинною екскрецією білка з сечею у суб'єкта до лікування.

З. Спосіб за п. 1, де антитіло або його фрагмент вибирають із групи, що складається з рекомбінантного антитіла, антитіла зі зниженою ефекторною функцією, химерного антитіла, гуманізованого антитіла і людського антитіла.

4. Спосіб за п. 1, де інгібуюче МАБбБР-2 антитіло пригнічує осадження СЗр в 90 95 людській сироватці з ІСво 30 НМ або менше.

5. Спосіб за п. 1, де застосування додатково включає ідентифікацію людини, що має стероїдзалежну імуноглобулін-А-нефропатію (ДАМ), до етапу введення суб'єкту композиції, яка містить кількість інгібуючого МАБР-2 антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для зменшення протеїнурії.

6. Спосіб за п. 1, де композицію вводять у кількості, достатній для поліпшення функції нирок і зменшення дози кортикостероїдів у зазначеного суб'єкта.

7. Спосіб за п. 1, де інгібуюче МАБР-2 антитіло вводять підшкірно, інтраперитонеально, внутрішньом'язово, внутрішньоартеріально або внутрішньовенно.

г. пе. Здсч щу ко ЕбРПОВЮВИЙ : М КУТОВЕ дення во НЯ о лиття хх КЗ В ой кН Мі ЕЕГ КО кет вианяй ауд, ий ЯЗ Ме ЗТ МА, КОХ ии х ї 1 Її уз р ди лухі Мф ТУЄМУр ММЗ кМУХ МК УЗ У КИХ ПУ че її кВ КК юшки ик сяк КК ик -Я КВ ле в В Кн рОБРБОВ НО Я ГБ Б ОН КУ фе БОМ 3 ке скік жи м АКА МАНААААМ Ж х А х Ще є хх се ККАКРАККАКАКАКН х х / Те Ко «У У с их шт дет пкт що то. х У ї й й - 7 шк т ек Деса нен ше ОА Коник иии ва " У; КО жит й дя щ х і ж Є К ай й Мой деки Дай ет 5 с У ууууУ с сх их ВО КО КОВО ОО пух тв МАХР- ЕК АВ Я ПАК ВЕК ЗУ МО ОХ Ух ОО М и КК ЧКЮЮНуУ 3 чт І я епдомпаз плете с се Мате 0 беронова протваза

Фіг. 1 ССВАЦА ХР НАР. УМ АР жених КЕ есе сих СТУ ПОТІК ПА ВКМ В ВН НН МОМ ММА МИХ М КО ВК ЖК М ПАНА КЕТІ КОМИ ТКУ ММК В еВ НИ З и В ов ак в ОМ ки і і Б фен фі г и г г щу ; ї СВ домен о бе домен о СІВ домен ССР домен Домен серунової протеази

Фіг. 2А Марі» МК ВЕК В КК Я СНД ЩЕ АЛІ ДОМЕН З ДОМЕН

Фіг. 28

Ма ОТ они ура у Кн пюре З ще м шк ЯНОУЮТИВИ 3 пс с Но с НЕД 0 Се пена нщивчого СКК Р бару НИ Є ЯВНУ З о МАШР- ! вне зи ПВ . ' пу Льон Якої Ж ж Кей Ве їй Жві Уже бай) Лев пк З пн дани лннвнаннннннантннантннн сонна денна Дно пекан они но нон КОН що З явия о й пса птомідонкімази реа ще до б мадян МЕС; зви резпевюнтисст ДВА дев: вен. ДБН МН Зней З вет до неоміцин ВК мив вн кн ні Мен ендови юю маркер наветовнога 0 аСеТей МН їв касета В бжа видіяниуання З ВКСУНТКУ ТТ. відбору НЕМОВ позитивного я вьзеві вкове зай і

Же. з змі на у з ! ще с соЗНх . З дог До, се Ме ше ші Же дея: дю ВК ЯЖВИК судо бе ЗХ ЯН реря одмо- В рекомбінації: резуль саун. Шо ДАЮ. й біюхт аналізу для 5: ЯН 0 бблюлномамень 00 Й соя вивих, : клонів МЕБЛІ 68 зандквовнти В ЗОвННШНіЙ зона ! Якій 33. аикоготиму Ве ! Б Зуномашень о Ме ! " садт рестрикції, базі ЗО тя. менень Вваей! зоеНі ЗЕ дО : А КА я А АНА А А А А А Кн ни пухзіснованої пої Які! ЇВ тя, диколо тилу вай !

Фіг. З Екзони як й г й чевха КН СВ лона Ббламібний ВВ ЄСВ: ОССЕВ домен геричової пропав де гра В ЕХО ВК МОВ В КИ зе Сн рт РОБОТ БО КК КН В МІК ІІІ І МВ ПІІ Ма и МКК КК лаляялмя Е ЗТ ділянка інщшрони Я її зв вили гроно ! ' РНК МАХЕІ чне. 4 нн 12 пупок нях нд яння пн донна дення дане к ОК х а У Її ПЕТ т и нен кання дн НН Не нон нн Кодак в ча Х р-н - : ; І " х х 1 те Е х й Мох а АХ Моонюнттюнтюютюнтн . і х У х х х . 2 пет тя НЕТ У няння т НН тк ткач унітарна доле Кене нта внднтятнх тя к ж чх Ше тек ше 8 - - я т оопдетафуттттнттфутятєттюфеєттентяфеттят о СІ ЕК ф нн -82 . сс се . сннонтюоотнко Я в І 3 45 4 іву серішних розведень

Фіг. ЗА га Гн І і ее др дну ї4 Ше ку ; М У ; е ! з х х сення ДІЖНАК є АЖ | х Х сао ДО 2 ! У у х Ва пшшшшшшшшшшшшшшшшшшШьниш чи хх Ме фону, ж нн у й пн З фуда не функ офутткенннте В овенеснннчня овен нн й і у 3 4 3 5 7 4 їдо серійних розведень

Фіг. 56 2 -- пі І І і Що з Су хі З пх4 і Зомозан ! о Манан з 1-4 гл Т г Манан й і У Як ЕВ і ! в - КК і в ат ду нічия Е і яння МОЯ а і КК ЕС те т ! СК ЕТ З в5- | ші о пе ПО щ і ПЕТЯ ТК нед о о Ш о ж чи кс к і шик Ї.днююосе Дн зобов ТТ Мм2 и МО --

З. 56 і . з чо ЩОФжн00осннйн-т МА ХРО й Як і Ша 2 З о

: г. 4 ; рай - в є ЩЕ ре мл нд х Е дк й ж я 5 - Ж ще Гак 7 Ко , у я пох ле ен а шк шко й. КЕКВ ентннтнтютннн і ' і

0.0 ві і іФ ІРекомбінантний біпокі мкс/ми і З

Фіг. 6 а рек КАК КТК ВЖК ЖЖ КС ЯКА СК НКАУ КВ ЖАКА КС ЖК ТА Ж НКЮ , В Кк кА, З ко Е 58 ТТ сен Й КОНТИЄТЬ ши фу рн рент т В КИ КОНТЮЛЬ пн ко х нене Й (збіднені по СіФ Ж 86 пн др вн інд «КИ ізбЮвені по сі ше ач тк х АААААНТВ ТАТА стече тент нтчач ро ху х З ж х ОХ тт х ч Ко Дрляк Ся н: 2 пен ТМ т фен ! По, Ши оман ЧИН ! п В: В дннннннннннннооннетннтнтотенотнотнкотоотноностотостотентоетеотнеоеоооостосстооноткннотсентн 5 7 15 Хі а 2 7 Же 34 3.3 як іо розведень сироватка

Фіг.

ї0о- й» я 4 ЕаВО Ме, Пригнічення утворення З - У СЗ-конвертази Ке і ж ово ; я і я птиик сш ІС50 - ОДБ НМ -- | Повне пригнічення ЕОово- Є є Ф - Фо 04 Б 4 в | . Ск і ОО се ж ! ; во вл і 1 Бабе Мі ЯМ

Фіг. ЗА ши Порівняння Каво Ме1ї з нативним МАБР-» 7 г ї 035 і ння сн і пот ї 0,304 ре ї І і 05 4 й с- 020 я щ і бок о ко - ОДБ НМ у бло і тн о.о85- з і . ОВ тру рр уретру й аз 4 8 8 10 12 4 465 за 20 22 Баро еТ нМ

Фіг. 88 ов- Рара МОЯ, Пригнічення розщеплення 4 п. , | :

в . 1 Н я вла шо ЛО БО 0 ЯМ Гек ; й оо К сі а.

ом. в

0.08. й

0.00- лет ВЗ к 2 уутуренннкетстертренеяттр пере 001 вд 1 18 Рабе М НМ

Фіг. 80 зо Пригнічення розщеплення С4 з використанням НМ Баби жк 4 Фш : х во с ук че Во щ | І В | і шк Щ і | Що още їх шт пт е Ен і і і ТІ | І | хі ші шшщ І ; | рої і НЕ во | шини ши шин ши - і і ої ОО. Ка | ! ше | ТЕ ж : : МЕ і з ши ШЕ: о ІІ ше Пон т яв 47 яв 45 що ЗР 5» 8 8е 55 БВ Анти-МАБРИ Гаре

Фіг. 9

СВІ Ебеподібний СОВИ СОРІ ССР Серинова протеаза ББІЗА нннннн | | | | І: - МАЕ. Кк как нанннн- | | -- сиві я 1- СуВІЕСЕ-подібний Що - . СОРИ-ЗР

Фіг. 10 Зв'язування АБО) Аб Мо40 та МобО з поліпептидами шурячого МАР: 1 а сонечок дент очне аеро ее О ж оаеіте чо чено очок с п. о 08 шк дн дн - 07» ш- яті З и пкт - не що пд -як- 0 ВА МАБР-ЗА р п.5 шт тот дж с за ри пд тен: ВО МАОР-ФА ОЗ шко що той ВО СОВА 02-85 сення 0 ВО СВІ ал пкжн т фунти жи жи жи живності ткостюо тет люто ув о о й 60 во 190 ІДбі ЯМ Фіг, 11

Доктинивий лях

У.

з. 1 й й -й «й а «й -В «Ї юд Гб46б пАВ, МІ фіг. 12А 5 15 Е 0 -2 «1 -Ю в «В «Її іо 1646 тА, МІ Фіг, 128 Апвтарзнативний шлях - Ж в з в ан ав іоч 1646 тА, МІ Фіг, 120

- 5 мкг 5 -- МІУ в МИТО - 10009 ще щ -к І. соло Ж - цНине пень С а 200 00 5 800 час Й Фіг, 13 я яко 5 Можу МБ га 158 ; ; | і З, : а ІНТаКТН ї ! В- Інтактнії ОМОВАВ - ой 004 рн гою че оо 800 зв (КІ

Фіг. 14А

2.0

В. ча З МКГ М (ОМ5646) є 15 й о. ; «й Інтактні е п: -В- Інтактні» (ОМУБ48) е 108 і " п жк ль ж й ь жи ж и зв ж ж є ш і-й я ш по фронтон рони рн он нт риніт сіні 200 400 500 500 час

Фіг. 148 щд - ШОЮ оперовані Е 40 як я" Псевдооперовані х рт т 304 М р й 5 204 а» ? Б Те в " 5 10. У ї жи. 2 в Дикий тип МА5Ра Я. зр ВО Фіг, 15

- й їж

Ж. и ж БОЮ оперовані й у : З я» Поевдооперовнані 34 е Б ! т х З і , 5 24 - ; г 51» є Х ся щі й І ї :з га Дикий тип МАЕ «я «край ВОЗ

Фіг. 16 Копагев М типу да й 7 функ нннтно є Я, псевдосперовані зо ж ж 0 МАЗР-Й, повадосперовані Е -- ох а Ат ОЦЮ Фо «ха. « МАРКОЮ й 1 я 5 -- ДО оннняерннннннннннняня - рення

, . Кв: іх й Я Ки " ж й Я Ко Я в Я я а що ж Ек « « є ох я Група мишей «око ЗВ

Фіг. 17

ТОЕ бета З 35 фест , : - ! Е г МЛ, псевдооперовані Кз ! за Ж: ж МА5Р-Я, псевдоюоперовані з ! й БО -а- «є У що Ф | У ж МАР КОЮ 05 Б ощ -йе- 8 жав

«5 . о : х х «ке я й є о я Я ча я я щ ях ще з «ЕЕ «У ооо ня Група мишей зред) 0178

Фіг. 18 Інтерпейкін б -Оо фнннннннетнннннння ще с. й ак 2 У, поввдосперовані - Ж т в МАЗР-2, псевдооперовані ща й й 5? зару я ТОЮ я 8 -ї- 5

З . . св Ж х хе У ей «й «є еї в и я й я КЯ « Ко ся ще Яе З се ще я Група мишей жваОдНОоВ

Фіг. 19

Інтерферон гамма 1,5 . , Б змен кино . МТ, посевдооперовані те . а 16 га г МАБР-2, псевдооперовані р 7 ЗК т ж г м Лю -- т МАВР-о КОЮ е о

2 0. о ж 5 -К- -й й -5 і . о ке Кз я Р г ток чо в я У - - є св Ко ' ЯКО є « «Я ке я Група мишей єра:00157

Фіг. 20 Забарвлення сірусом червоним нирок, зібраних через 7 днів тсля ЦО Кз з Ф г 54 фен 8 -- чо ще 5 " НЕ а в'я " Ж й й БОБ . а - й Се п га Щщ Є Ной Осйнннняя « зон : чн о о з се « «М не й ща с я Кк й зей «ре0од477 Фіг, 21

Вміст пдроксипроліну в нирках, зібраних через 7 днів після ШО 8 154 р-- я шия ; - ! ж Я в п де і а ХЕ ; ай Е 5 се ях Кс Ух У є ау хи ж з « - ж я «рем 3О

Фіг. 22 о 0 Щ ї і -е М контроль 5 є во м а то УТ в'є а МАВР 2 -- а Я во У Б г" й м ЕЕ іі БЕ ов - НЕ пнндрівранняоя в 20 с 5 о - . ще ж У а г с Є Групи

Фіг. 25 т Е - Фе в з ут ЩО 200 у Е МИТ контрол Е | , " КОНТОлЬ : | | х 8 154 є ; Ос в- «4 Її | , МАЗР 2 4 К- жо 0 а» ж ЄЮ я В ;

р. щі Ж : ! Ж : ж то с В у р -- і « : вх Групи

Фіг. 24 - о ДИКИЙ Тип АБ фо Ваня АВМ ще ОХ селення с Ко ВО зах хурора п ОО . с В М з ОО І п ні ДО ПОЗОВ 0 в я НН КУ с НК З Же о Со о МО в юю в В її що 33 а ОО ВК о ПЕОМ ОКО п т Б Же ки Я ОКО Я 0 Бона шо

23. СО 3 а. - с с ще ОВУ НЯ 0. мя пи У о о п. А КОЖ Хе п. Б. о о Зоя Ме ес ВО В МО В Я ня З Моя ОН о ке по, я СУ ке шо Во ня Ме еВ ж ОКО иа Я а. ХОЗКОЯ ен ПОД я во ЗО ЕК с вс оо. й Дно за Мов МО Мене ОНИ З Мене с о. З с ОК ОО я ОК КВ ООН УЗ ВО ша о са ОО о Во ХХ ДК Ох ОО МК а КАХ КЕ Я я Кк С ОК ОХ ОКО п о - емо Є Мая ОО М о 1. МОН поорооснвннвкя ЗМ ОН я Ева ща В : " о За ВУ ово п ОВ я 1 5 сення Б БО ОК в с с ко плов 0 с її ее пл нн. Ж ОКУ М ОВ НК ОКО ПОВ с ОК ВН ВО КН ОО ВО бу о 0 5 ї о. М мгББе ОБННе КОНЯ Ва Ки Не МУ Ве КОД ов он ел Кн За ан ШЕ КИТИ З и о т о Сх КО ве Ох МВА ВО МЕТ в ик ее о Вих ва пи Кн УМ В ОК не

В . ПЕ кВ х ще пох Ме Бо вЯ меня Хе еемі У Ф ЯКонЯ я що Б Тк ХО Не т в КАМ і п. о. Я я шо Де й. ЗВВне я ДОН ВК Ве о ПОТОМ о жк ад Ва Кі рес Б . о 5 с Я ме я ої я и В Зав оно ПИ вона Бонн Кг ПФК оон ВО щ а Б п. ДЕК по З а о с: ПК Ох ОВО Он МО пе п п с соа- в. . ОО НК нн Вон Ме З ее . г. п ОО ОО о ЗО М ВЕ нин і. о КОХ п: ВОК і КОН ро оо що о г Оп в ОК 0 її у ТОНКЕ ня Ос п с її й 5 ПОВ іс. » а о ООН інфільтрація макрофагів, ЕУВО антитіла, МТ проти МАЗР-2-- в в 2.0- я | ; й ф я МИ контроль Я ві . "М В " а МАБР2-- 1 ! » ВВ | цін ЕЕ -ШЕ- Ж Ж в а х св 7 я Ж в КЗ Є Групи тов, Фіг. 26 інфільтрація макрофагів, кореляція з протеінурією дикий тип) З Ф б В 2004 «о моде Ж лк . що 01305 . Шо їх «

5 . яв ж 00 . ах ше . а ж Зо й ю 5 о В й хи с па с пу в -? «: хи З «? я? що ск інфільтрація макрофагів (Середній 25 забарвленої площі)

Фіг. 27А інфільтрація макрофагів, корепяція з протаінурією т (МАР е хо В 250 с « 55 180

ЗЕ .е Б 100 вх й Бо Бо . я я а ! с ; хо м. 5 Кс Р с г 5 Р інфільтрація макрофанів (Середній 5 забараленої площі!

Фіг. 2785 Транеформуючий фактор росту 304 х 8 реннннннннантнннтннннннннй е УУТ Е ж МАБР 2. 25 о В 5 154 в 3 е й ку а Групи краб 026

Фіг. 28 фактор некрозу пухлини альфа о ж . ! фунта ев У ЕІ | ш МАБР 5 -.- м 33 4 с Б | ж не 104 ск «я х У вх Км хра0.0303 Фіг, 29 Інтерпейкн б Бо як в зоонннннннннннннн .ж М контроль с- Я а шо МАБРАВА Контроль В Я « У 2 зо ТЕ. у МАБР2-. щі щі чи ше т Бор ЗЕ в чо ч -2 Даня ще ще Я х ж У Ж ю? ; ШИ я Км вх Кк Групи жяхрх0.0016

Фіг. 30

Апоптоз 80 же - є я МИ контроль т. ї г ї шко ж МАБР-2-У- Контропь Я 50 : « хх ж й ке до - з х -- т МАВР 2. Б «о Е й - ка т ЕЕ Б --- Е ж Е ппжккофрнннння 00 нення 2 петля де ще я А се в А «г в т Групи кох ФНС Патопогічні зміни. забарвлення НЯЄ А в с УА АВК В ЕМ ВК КК сили ММ М М КК ЗУ о ОО с М М КВ КУ я КО я ху З ша ММ С ПН З а: ОК шо ОК Ко МО и КО НК ЗХ ММ Я МК и по о Оу Ох У МБ ОВО в ОО АСВ З ОК С МО Ух ОО В В БО шх С ех З Ж ЩЕ ОО ОККО ЗУ ОО МН ЗОНІ МЕ Зх ОК С с я ОК ОО п ЗО ОО Бо нн. ОК о КЕ ще о. ОВ с Коцтрольна група, що одержувала Група, що одержувала Група, що одержувала фізюлогічний розчин ізотипний контроль МАБР-? тб

Фіг. 32

Апоптоз

У. її «» нин Фо Контрольна, фізютопУний розчин - ; - ; ж ІотипНий контроль У т а МАБР-АЄ тА х же - ке ; вав ? з Я « тай Кк З ще є Групи ре еежреО052

Фіг. 33 тав В «а ; й плен я Контрольна, фізіологічний розчин Е з . фннкянанні няно, яко зотипний контроль 2 х а МАБР-2 тА ря - , : - з Ка Б є З я г їе - ще, У СИ Ки ес ке Ви «В щі що Ко кс г х Гуля ругпи жрхФцОоЗ2а яко 0.0349

Фіг. 34

ТМА альфа що знннннтетннентттктннттнннест жо Контрольна, фізіологічний розчин з 8 уран плклклинно шо Ізотипний контроль ТЕ жу я" ж МАВР-? тйб

В . ж на Фо ша 5 1 о в ш Я: ; ще У КИ «В а я - КК т а Й я я ще ще «і Групи мишей зраді же: 0285

Фіг. 35 Інтерлейкін 8 як Й д- я т а // Контрольна, фізіологічний розчин я зо в я то 0 Ватипний контроль Фо А - Е Е а МАБР-Й ТАБ Б ж 2е : а 5 , -в- фо а ду а 9 У - ві. . шк хо ях Фе ; и ОЇ на ок З о У ще як Групи мишей кре 0569 я»р-:0.0445 ,

Фіг. 36

НАС) нефропатія (забаранення гаміцин-ндукована нефропатія іза Адріаміцин-індукована | свою Її о пи знтрольна група, щу пдержуваив т - ку з: ЗК В ВВ: Контрольна В хі УМ: . пи. ОВ М пох ім Ух Е вва Ооове во -3 СХ Ах ОО оіЗюлЛОгічний розчин «хі С кА с М і ж М ОО ВХ я.» ОКХ с: дії о. и. з А ПК ЗО Зх МОЗ ЗО о ЗО КК я с її 3 о УК ОК ОК МОМ КО с с . ХХ ОКХ Ух Кх КОНИК ОКХ В с с о х о.» г с с З КОХ АХ НХ КК ОХ ОО 0. о с сс Е о є с ен. 0 шй 0 с МОЯ ЗО ОКО с ПО я У с ня с п но ша ПО ОКО п с МОМ

ССС. МЕ ОО ОО хе ЕКО 7 сосожнювие

5. ОК ЗО ОВО о 3 ТКУ ск й нн ОО ооо вне к-З 55 С й ОО ша п еееновкосввоюрвоово ВОВК щі ке се о В по в осо о ово еову ОН у БО о ОВНКХ ОХ ОО Ко ка 0. а: 5 дз о ЗК а с З о 5. х ОК ОКО КИ ОВО ОО ПЕ шо УМ Ох ОО ОО с ОО ЕК я ооо в я я По еоя п с З В я КЕ: п У КОХ Я о ко Я с с с с 3 с 3 по нео а.

5. с Є я 5. с ов ка Ж оссзоооровноваевх с ВО ОО Х орки оввкй ОО 5 Пн я ЗП ян ооо вк. с-3 г МОХ З ЗО МО КИТ КИМ ОКХ МУ доз а я ЗМУ : ОО В З ПОМ Ух с дз о я ее с І є ОО Ко ок с ЗО ОО ОО ЗОН Ох ООН о я ЕК п п я а ВОК повно с о 5 с о КИ у я ее ВО с є 3 а с і. 0. М Ве ОО рн 55. о 3 65 с . 5 ко ШО 0 ОК ни ОХ МО ОХ у ОО я 5 5 ще 5 ДОМ и 37

Фіг. «св юроФдагів ще інфільтрація макроф 5 ЗНАК Як щі та -к в -- ше ще к Я вх

Фіг. 38

Відкладення колагену 5 : З ! З 2 04 Є щш ! - в-й

5 . - ча ї м . ве 5 | ще.

в.

Е. 04 рентна ще ме че же є вк « 00 су Є

Фіг. 39 Апьбумін/'креатини відношення (ЧАСІ) у ІЗАМ пацієнтів, що одержували ОМОБВАВ

2.000 пет тент тенет ткання 12-тижнева лікування ітижневі дози! 1,00 о : с, ра : око Пацієнт ! - оо Пацієнт2 Я івю У х 7 ! ох : аб рн й що : здо 159 Дні Зміна від вихідного рівня (09 трансформований: а: ве0 041: В: ред 0ОВ; ст рей 35 о Зміна від вихідного рівня. а: из ОО3г в: веб ОО; сіре

Фіг. 40