KR20230080493A - 필요로 하는 대상체에서 섬유증의 억제 방법 - Google Patents

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KR20230080493A
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니겔 존 브룬스킬
그레고리 에이. 데모풀로스
토마스 두들러
한스-빌헬름 슈웨블
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유니버시티 오브 레스터
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Abstract

한 측면으로, 발명은 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 또는 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있는 포유류 대상체에서 섬유증을 치료, 억제, 완화 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 발명은 단백뇨와 관련된 신장 질환 또는 상태를 앓고 있는 대상체에서 단백뇨를 감소시키는 방법을 제공한다. 방법은 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제제의 양을, 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

Description

필요로 하는 대상체에서 섬유증의 억제 방법{METHODS FOR INHIBITING FIBROSIS IN A SUBJECT IN NEED THEREOF}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2016년 1월 5일에 출원된 가출원 번호 62/275,025의 이익을 주장하고, 2016년 10월 13일에 출원된 가출원 번호 62/407,979의 이익을 주장하며, 이것들 둘 다는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록은 서류 사본 대신에 텍스트 포맷으로 제공되며 참고로 명세서에 포함된다. 서열 목록을 포함한 텍스트 파일의 명칭은 MP_1_0250_PCT_서열_Listing_20170104_ST25t이다. 텍스트 파일은 136 KB이며; 2017년 1월 4일에 생성되었고 본 명세서의 출원과 함께 EFS-Web을 통해 제출된다.
기술분야
본 발명은 필요로 하는 대상체에서 섬유증의 억제 방법에 관한 것이다.
보체 시스템은 인간 및 다른 척추동물에서 미생물 감염 및 다른 심각한 손상에 대한 면역 반응을 개시하고, 증폭시키고 조정하기 위한 조기 작용 메커니즘을 제공한다 (M.K. Liszewski and J.P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E. Paul, Raven Press, Ltd., New York). 보체 활성화는 잠재적 병원체에 대하여 중요한 제1 선 방어를 제공하는 한편, 보호적 면역 반응을 촉진하는 보체의 활성은 또한 숙주에게 잠재적 위협을 나타낼 수 있다 (K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994). 예를 들어, C3 및 C5 단백질 가수분해 생성물은 호중구를 모집하여 활성화시킨다. 숙주 방어에 불가결하긴 하지만, 활성화된 호중구는 무분별하게 파괴적인 효소를 방출하여 장기 손상을 유발할 수도 있다. 이에 더하여, 보체 활성화는 인근의 숙주 세포, 뿐만 아니라 미생물 표적 상에 용해성 보체 성분의 침착을 유발하여, 숙주 세포의 용해를 초래할 수도 있다.
보체 시스템은 또한 다음을 포함한 많은 급성 및 만성 질환 상태의 발병 기전에 관련되어 있는 것으로 나타난다: 심근 경색(myocardial infarction), 뇌졸중(stroke), ARDS, 재관류 손상(reperfusion injury), 패혈성 쇼크(septic shock), 열성 화상에 따른 모세관 누출, 후심폐 바이패스 염증(postcardiopulmonary bypass inflammation), 이식 거부 반응, 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 및 알츠하이머 병(Alzheimer's disease). 이들 질병 중 거의 전부에서, 보체가 원인은 아니지만 발병 기전에 관련된 여러 요인 중 하나이다. 그럼에도 불구하고, 보체 활성화는 주요 생리학적 메커니즘일 수도 있으며 이들 질환 상태 중 다수에서 임상적 통제에 효과적인 지점을 나타낸다. 다양한 질환 상태에서 보체-매개 조직 손상의 중요성에 대한 인식의 증가는 효과적인 보체 억제제의 필요성을 강조한다. 지금까지, C5에 대한 항체인 에쿨리쥬맙 (Solaris®)은 인간 사용에 대하여 승인된 유일한 보체-표적화제이다. 하지만, C5는 보체 시스템의 "하류"에 위치한 여러 이펙터 분자 중 하나이며, C5의 차단이 보체 시스템의 활성화를 억제하는 것은 아니다. 그러므로, 보체 활성화의 개시 단계의 억제자는 "하류" 보체 억제자보다 큰 이점을 가질 것이다.
현재, 보체 시스템은 세 개의 별개의 경로: 고전적 경로, 렉틴 경로, 및 대체 경로를 통해 활성화될 수 있다는 것이 널리 수용되고 있다. 고전적 경로는 보통 외래 입자 (즉, 항원)에 결합된 숙주 항체로 구성된 복합체에 의해 야기되며 따라서 특정 항체 반응의 생성을 위해서는 항원에 대한 사전 노출이 필요하다. 고전적 경로의 활성화가 숙주에 의한 사전 적응성 면역 반응에 의존하기 때문에, 고전적 경로는 후천적 면역 시스템의 일부이다. 그에 반해, 렉틴 경로 및 대체 경로는 둘 다 적응성 면역력에 독립적이며 선천적 면역 시스템의 일부이다.
보체 시스템의 활성화는 세린 프로테아제 치모겐의 순차적 활성화를 초래한다. 고전적 경로 활성화의 첫 번째 단계는 항원-결합된 IgG 및 IgM 분자에 대한 특이적 인식 분자, C1q의 결합이다. C1q는 Cl이라고 불리는 복합체로서 C1r 및 C1s 세린 프로테아제 효소 전구체와 회합된다. 면역 복합체에 대한 C1q의 결합시, C1r의 Arg-Ile 부위의 자가 단백질 가수분해 절단 이후 C1s의 C1r-매개 절단 및 활성화가 이어지며, 이로 인해 C4 및 C2를 절단시키는 능력을 획득한다. C4는 C4a 및 C4b로 지정된 두 개의 단편으로 절단되고, 마찬가지로, C2는 C2a 및 C2b로 절단된다. C4b 단편은 인접한 하이드록실 또는 아미노 기와 공유 결합을 형성하고 활성화된 C2의 C2a 단편과의 비공유 결합에 의한 상호작용을 통해 C3 컨버타제 (C4b2a)를 생성할 수 있다. C3 컨버타제 (C4b2a)는 C3a 및 C3b 하위 구성요소로의 단백질 가수분해 절단에 의해 C3를 활성화시켜서 C5 컨버타제 (C4b2a3b)의 생성을 유도하며, 이것은 C5를 절단시킴으로써 세포막을 파괴시켜 세포 용해를 유도할 수 있는 막 공격 복합체 (C6, C7, C8 및 C-9와 조합된 C5b, "MAC"로도 불림)의 형성을 유도한다. 활성화된 형태의 C3 및 C4 (C3b 및 C4b)는 공유 결합에 의해 외래 표적 표면 상에 침착되며, 이것은 다수의 식균 세포 상에서 보체 수용체에 의해 인식된다.
독립적으로, 렉틴 경로를 통한 보체 시스템 활성화의 첫 번째 단계는 또한 특이적 인식 분자의 결합이며, 이후 회합된 세린 프로테아제 효소 전구체의 활성화가 이어진다. 하지만, C1q에 의한 면역 복합체의 결합보다는, 렉틴 경로의 인식 분자는 일괄적으로 렉틴이라고 불리는 탄수화물-결합 단백질 (만난-결합 렉틴 (MBL), H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린 및 C형 렉틴 CL-11)의 군을 포함한다. J.　Lu et　al., Biochim. Biophys. Acta　1572:387-400, (2002); Holmskov et　al., Annu. Rev. Immunol.　21:547-578 (2003); Teh et　al., Immunology　101:225-232 (2000)) 참조. 또한 J. Luet et al., Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Holmskov et al, Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000); Hansen et al, J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010) 참조.
Ikeda 등은 처음에, C1q와 마찬가지로, MBL이 효모 만난-코팅된 적혈구에 대한 결합시 C4-의존적 방식으로 보체 시스템을 활성화시킬 수 있다는 것을 입증하였다 (Ikeda et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, (1987)). 콜렉틴 단백질 패밀리의 구성원인 MBL은 탄수화물을 피라노스 고리의 적도면에서 배향된 3- 및 4-하이드록시 기를 가진 탄수화물에 결합하는 칼슘-의존적 렉틴이다. 따라서 MBL에 대하여 중요한 리간드는 D-만노오스 및 N-아세틸-D-글루코사민이지만, 이 입체 구조적 요건에 적합하지 않은 탄수화물은 MBL에 대하여 검출 가능한 친화도를 갖지 않는다 (Weis　et　al., Nature　360:127-134, (1992)). MBL과 1가 당 간의 상호작용은 매우 약하며, 해리 상수는 전형적으로 한 자릿 수의 밀리몰 범위에 있다. MBL은 결합력에 의해, 즉, 서로 근접하게 위치한 다수의 단당류 잔기와 동시에 상호작용함으로써 글리칸 리간드로의 단단하고, 특이적인 결합을 달성한다 (Lee et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, (1992)). MBL은 일반적으로 박테리아, 효모, 기생충 및 특정 바이러스와 같은 미생물을 가식하는 탄수화물 패턴을 인식한다. 그에 반해, MBL은 포유류 혈장 및 세포 표면 당단백질 상에 존재하는 "성숙한" 복합 당컨쥬게이트를 일반적으로 가식하는 D-갈락토스 및 시알산, 끝에서 두 번째 및 최후의 당을 인식하지 않는다. 이 결합 특이성은 "외래" 표면의 인식을 촉진하고 "자가-활성화"로부터의 보호를 돕는 것으로 생각된다. 하지만, MBL은 표유류 세포의 소포체 및 골지체에서 격리된 N-결합된 당단백질 및 당지질 상의 고-만노오스 "전구물질" 글리칸의 클러스터(cluster)에 높은 친화도로 결합한다 (Maynard et al., J. Biol. Chem. 257:3788-3794, (1982)). 그러므로, 손상된 세포는 MBL 결합을 통한 렉틴 경로 활성화에 대한 잠재적 표적이다.
피콜린은 MBL과는 상이한 유형의 렉틴 도메인, 소위 피브리노겐-유사 도메인을 가지고 있다. 피콜린은 Ca++-독립적 방식으로 당 잔기에 결합한다. 인간에서는, 세 종류의 피콜린 (L-피콜린, M-피콜린 및 H-피콜린)이 확인되었다. 두 개의 혈청 피콜린, L-피콜린 및 H-피콜린은 공통적으로 N-아세틸-D-글루코사민에 대한 특이성을 갖는다; 하지만, H-피콜린은 또한 N-아세틸-D-갈락토사민에 결합한다. L-피콜린, H-피콜린, CL-11, 및 MBL의 당 특이성의 차이는 상이한 렉틴이 상보적이며, 중복되지만, 상이한 당컨쥬게이트를 표적화할 수도 있다는 것을 의미한다. 이 개념은, 렉틴 경로의 공지된 렉틴 중에서, 단지 L-피콜린만이 모든 그람-양성(Gram-positive) 박테리아에서 발견되는 세포벽 당컨쥬게이트인 리포테이코산에 특이적으로 결합한다는 최근의 보고서에 의해 지지된다 (Lynch et al., J. Immunol. 172:1198-1202, (2004)). 콜렉틴 (즉, MBL) 및 피콜린은 아미노산 서열에서의 유의미한 유사성을 갖지 않는다. 하지만, 단백질의 두 군은 유사한 도메인 조직을 갖고, C1q와 마찬가지로, 올리고머 구조로 조립되어, 다중 부위 결합의 가능성을 극대화한다.
MBL의 혈청 농도는 건강한 집단에서 매우 가변적이고 이것은 MBL 유전자의 프로모터 및 암호화 영역 둘 다에서의 다형성/돌연변이에 의해 유전적으로 제어된다. 급성기 단백질로서, MBL의 발현은 염증 동안에 더 상향조절된다. L-피콜린은 MBL과 유사한 농도로 혈청에 존재한다. 그러므로, 렉틴 경로의 L-피콜린 브랜치(branch)는 강도가 MBL 암(arm)과 잠재적으로 비슷하다. MBL 및 피콜린은 또한 옵소닌으로서 기능할 수 있으며, 이것은 식균 세포가 MBL- 및 피콜린-가식된 표면을 표적화할 수 있게 한다 (Jack et al., J Leukoc Biol., 77(3):328-36 (2004), Matsushita and Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 (2002), Aoyagi et al., J Immunol, 174(1):418-25(2005) 참조). 이 옵소닌화는 이 단백질들과 식균 세포 수용체의 상호작용을 필요로 하며 (Kuhlman et al., J. Exp. Med. 169:1733, (1989); Matsushita et al., J. Biol. Chem. 271:2448-54, (1996)), 그 정체성이 확립된 것은 아니다.
인간 MBL은 MBL-관련 세린 프로테아제 (MASP)라고 불리는 고유한 C1r/C1s-유사 세린 프로테아제와 콜라겐-유사 도메인을 통한 특이적이고 고-친화도의 상호작용을 형성한다. 지금까지, 세 개의 MASP가 기술되었다. 먼저, 단일 효소 "MASP"가 확인되었고 보체 캐스케이드 (즉, C2 및 C4의 절단)의 개시의 원인이 되는 효소로서 특성화되었다 (Matsushita et al., J Exp Med 176(6):1497-1502 (1992); Ji et　al., J.　Immunol. 150:571-578, (1993)). 그 후 MASP 활성은, 사실상, 두 개의 프로테아제: MASP-1 및 MASP-2의 혼합물이라는 것이 측정되었다 (Thiel et al., Nature 386:506-510, (1997)). 하지만, MBL-MASP-2 복합체는 단독으로 보체 활성화에 충분하다는 것이 입증되었다 (Vorup-Jensen et al., J. Immunol. 165:2093-2100, (2000)). 게다가, MASP-2만이 높은 속도로 C2 및 C4를 절단시켰다 (Ambrus et al., J. Immunol. 170:1374-1382, (2003)). 그러므로, MASP-2는 C4 및 C2를 활성화하여 C3 컨버타제, C4b2a를 생성하는 원인이 되는 프로테아제이다. 이것은 고전적 경로의 C1 복합체와의 중요한 차이이며, 두 개의 특이적 세린 프로테아제 (C1r 및 C1s)의 협력 작용은 보체 시스템의 활성화로 이어진다. 이에 더하여, 세 번째의 새로운 프로테아제, MASP-3가 분리되었다 (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:127-35, 2001). MASP-1 및 MASP-3는 동일한 유전자의 대안적으로 스플라이싱된 생성물이다.
MASP는 C1 복합체의 효소적 구성요소인 C1r 및 C1s와 동일한 도메인 조직을 공유한다 (Sim et al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, (2000)). 이들 도메인은 N-말단 C1r/C1s/성게 VEGF/골 형성 단백질 (CUB) 도메인, 표피 성장 인자-유사 도메인, 제2 CUB 도메인, 보체 제어 단백질 도메인의 탠덤(tandem), 및 세린 프로테아제 도메인을 포함한다. C1 프로테아제에서와 같이, MASP-2의 활성화는 세린 프로테아제 도메인에 인접한 Arg-I1e 결합의 절단을 통해 일어나는데, 이것은 효소를 이황화-결합된 A 및 B 사슬로 절단시키며, 후자는 세린 프로테아제 도메인으로 구성된다.
MBL은 또한 19 kDa의 MBL-관련 단백질 (MAp19) 또는 작은 MBL-관련 단백질 (sMAP)로 알려져 있는, MASP-2의 촉매 활성이 없는, 대안적으로 스플라이싱된 형태의 MASP-2와 회합할 수 있다 (Stover, J. Immunol. 162:3481-90, (1999); Takahashi et al., Int. Immunol. 11:859-863, (1999)). MAp19는 MASP-2의 처음 두 개의 도메인에 이어서, 네 개의 고유한 아미노산 추가 서열을 포함한다. MAp19의 기능은 불분명하다 (Degn et al., J Immunol. Methods, 2011). MASP-1 및 MASP-2 유전자는 각각 인간 염색체 3 및 1 상에 위치한다 (Schwaeble et al., Immunobiology 205:455-466, (2002)).
여러 증거들이 상이한 MBL-MASP 복합체가 존재하고 혈청 중의 MASP의 큰 분획이 MBL과 복합체를 형성하지 않는다는 것을 제안한다 (Thiel, et al., J. Immunol. 165:878-887, (2000)). MBL과 마찬가지로, H- 및 L-피콜린은 둘 다 모든 MASP에 결합하고 렉틴 보체 경로를 활성화시킨다 (Dahl et al., Immunity 15:127-35, (2001); Matsushita et al., J. Immunol. 168:3502-3506, (2002)). 렉틴 및 고전적 경로는 둘 다 공통의 C3 컨버타제 (C4b2a)를 형성하고 이 단계에서 두 경로가 통합된다.
렉틴 경로는 나이브(naive) 숙주에서의 감염에 대한 숙주 방어에 중요한 역할을 하는 것으로 널리 알려져 있다. 숙주 방어에서 MBL의 포함에 대한 강력한 증거는 기능적 MBL의 혈청 수준이 감소된 환자의 분석으로부터 비롯된다 (Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, (2002)). 이러한 환자는 재발성 박테리아 및 진균류 감염에 대한 민감성을 나타낸다. 이들 증상은 보통 삶의 초기에, 모체로부터 유래된 항체 역가가 감소함에 따라 민감성이 명백한 동안에, 하지만 항체 반응의 전체 레퍼토리가 나타나기 전에 분명해진다. 이 증상은 종종 MBL의 콜라겐성 부분의 여러 부위에서 돌연변이를 초래하며, 이것은 MBL 올리고머의 제대로 된 형성을 방해한다. 하지만, MBL이 보체 독립적인 옵소닌으로서 기능할 수 있기 때문에, 어느 정도까지 감염에 대한 민감성의 증가가 손상된 보체 활성화 때문인지는 알려져 있지 않다.
3개의 모든 경로 (즉, 고전적, 렉틴 및 대체)는 C5에서 통합되는 것으로 여겨졌고, 그것은 절단되어 다중 전염증 효과를 가지는 생성물을 형성한다. 통합된 경로는 말단 보체 경로로서 언급되었다. C5a는 가장 강력한 아나필라톡신으로, 평활근 및 혈관 긴장도, 뿐만 아니라 혈관 투과성의 변화를 유발한다. 그것은 또한 호중구 및 단핵세포 둘 다의 강력한 케모탁신 및 활성화제이다. C5a-매개된 세포 활성화는 사이토카인, 가수분해성 효소, 아라키돈산 대사물, 및 반응성 산소 종을 포함하여, 다수의 추가의 염증 매개자의 방출을 유도함으로써 염증 반응을 상당히 증폭시킬 수 있다. C5 절단은 막 공격 복합체 (MAC)로서도 알려져 있는 C5b-9의 형성으로 이어진다. 이제 저용해성 MAC 침착이 용해성 기공-형성 복합체로서 역할을 하는 것에 더불어 염증에서 중요한 역할을 감당할 수 있다는 강력한 증거가 있다.
면역 방어에서의 본질적인 역할에 더불어, 보체 시스템은 많은 임상 조건에서 조직 손상에 기여한다. 비-감염성 인간 질환의 발병 기전에서 고전적 경로 및 대체 보체 경로 둘 다에 관련된 광범위한 증거가 존재하지만, 렉틴 경로의 역할은 이제 막 평가되기 시작했다. 최근의 연구는 렉틴 경로의 활성화가 허혈/재관류 손상에서의 보체 활성화 및 관련된 염증의 원인이 될 수 있다는 증거를 제공한다. Collard, 등 (2000)은 산화 스트레스를 받은 배양된 내피 세포가 MBL에 결합하고 인간 혈청에 노출시 C3의 침착을 나타낸다는 것을 보고하였다 (Collard et al., Am. J. Pathol. 156:1549-1556, (2000)). 이에 더하여, 차단 항-MBL 단클론성 항체로의 인간 혈청의 처리는 MBL 결합 및 보체 활성화를 억제하였다. 이들 발견은 심근 허혈-재관류의 래트 모델로 확장되었으며, 여기서 래트 MBL에 대해 지시된 차단 항체로 처리된 래트가 관상 동맥의 폐색 시 대조군 항체로 처리된 래트보다 훨씬 더 적은 심근 손상을 나타냈다 (Jordan　et　al., Circulation 104:1413-1418, (2001)). 산화 스트레스 후 혈관 내피에 대한 MBL 결합의 분자적 메커니즘은 불분명하다; 최근의 연구는 산화 스트레스 후 렉틴 경로의 활성화가 당컨쥬게이트가 아니라, 혈관 내피 사이토케라틴에 대한 MBL 결합에 의해 매개될 수도 있다는 것을 제안한다 (Collard et al., Am. J. Pathol. 159:1045-1054, (2001)). 다른 연구는 고전적 경로 및 대체 경로가 허혈/재관류 손상의 발병 기전에 관련되어 있음을 나타내며 이 질환에서 렉틴 경로의 역할은 여전히 논쟁의 여지가 있다 (Riedermann, N.C., et al., Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003).
섬유증은 보통 손상 또는 상해에 대한 반응으로 기관 또는 조직에서 과잉으로 연결 조직이 형성되는 것이다. 섬유증의 특징은 국소 외상 후에 과잉의 세포외 기질의 생성이다. 상해에 대한 정상적인 생리적 반응은 연결 조직의 침착을 초래하지만, 이 초기의 유익한 회복 과정은 지속적이고 병리적인 것이 되어서, 조직의 아키텍쳐(architecture) 및 기능을 변경시킬 수 있다. 세포 수준에서, 상피 세포 및 섬유모세포는 증식하고 근섬유모세포로 분화하여, 기질 수축, 증가된 경직, 미세혈관 압박, 및 저산소증을 초래한다. 대식세포 및 림프구를 포함하여 염증 세포의 유입은 사이토카인 방출을 초래하고 콜라겐, 피브로넥틴 및 섬유증의 다른 분자 마커의 침착을 증폭시킨다. 종래의 치료적 접근법은 대부분 코르티코스테로이드 및 면역억제성 약물을 포함하여 섬유증의 염증 과정을 향해 표적화되었다. 유감스럽게도, 이런 항-염증성 작용제들은 거의 임상 효과를 나타내지 못하였다. 현재 섬유증에 대해서는 효과적인 치료 또는 치료법이 없지만, 동물 연구 및 일화적인 인간 보고서들은 둘 다 섬유증 조직 손상이 반전될 수 있음을 제안한다 (Tampe and Zeisberg, Nat Rev Nephrol, Vol 10:226-237, 2014).
신장은 상해로부터 회복하려는 제한된 용량을 가진다. 다양한 신장 병리가 신장 조직의 반흔(scarring) 및 섬유증을 유발하는 국소 염증을 초래한다. 염증성 자극의 영구 보존은 세뇨관 간질성 염증 및 섬유증 및 만성 신장 질환에서 진행성 신장 기능의 손상을 유발한다. 말기 신부전으로의 진행은 상당한 유병률 및 사망률과 관련된다. 세뇨관 간질성 섬유증이 다발성 신장 병리학의 공통적인 종점이기 때문에, 그것은 신부전을 예방하는 것이 목적인 치료법에 대한 핵심 표적을 나타낸다. 일차 신장 질환과 무관한 위험 인자들 (예컨대 단백뇨)은 국소 염증을 불러일으킴으로써 신장 섬유증의 발생 및 신장 분비 기능의 상실에 기여하고, 계속해서 질환의 진행을 향상시킨다.
많은 질환 및 장애, 예컨대 만성 신장 질환으로 이어지는 세뇨관 간질성 섬유증에서, 섬유증의 역할을 고려하여, 섬유증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 및 상태를 치료하기 위하여 치료적으로 효과적인 작용제를 개발할 절실한 필요가 있다. 신장 질환에서 염증성 전-섬유화 경로를 표적으로 하는 새로운 및 기존의 치료의 부족을 추가로 고려하여, 신장 섬유증을 치료, 억제, 예방 및/또는 반전시키고 그로써 진행성 만성 신장 질환을 예방하기 위한 치료적으로 효과적인 작용제를 개발할 필요가 있다.
본 요약은 상세한 설명에서 하기에서 한층 더 기술되는 간단한 형태로 선택된 개념을 소개하기 위해 제공된다. 본 요약은 청구되는 대상 물질의 핵심 특징을 확인하기 위해 의도되지 않고, 또한 청구된 대상 물질의 범주를 측정하기 위한 보조수단으로서 사용하려는 의도도 아니다.
한 측면으로, 발명은 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애를 앓고 있는, 또는 질환 또는 장애의 발생 위험이 있는 포유류 대상체에서 섬유증을 치료, 억제, 완화 또는 예방하는 방법을 제공하며, 방법은 섬유증을 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 SEQ ID NO:6의 일부에 특이적으로 결합하는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 실질적으로 C1q-의존적 보체 활성화를 억제하지 않으면서 렉틴 경로 보체 활성화를 선택적으로 억제한다. 한 구체예에서, 대상체는 다음 중 적어도 하나에 의해 유발되거나 악화된 질환 또는 장애를 앓고 있다: (i) 허혈성 관류 손상과 관련된 섬유증 및/또는 염증, (ii) 신장 섬유증 및/또는 신장 염증 (예컨대, 세뇨관 간질성 섬유증, 만성 신장 질환, 만성 신부전, 사구체 질환 (예컨대, 국소 분절 사구체 경화증(focal segmental glomerulosclerosis)), 면역 복합체 장애 (예컨대, IgA 신증, 막성 신증(membraneous nephropathy)), 루푸스 신염(lupus nephritis), 신증 증후군(nephrotic syndrome), 당뇨성 신증, 세뇨관 간질성 손상 및 사구체신염 (예컨대, C3 사구체병증(glomerulopathy)), (iii) 폐 섬유증 및/또는 염증 (예컨대, 만성 폐색성 폐 질환, 낭포성 섬유증, 경피증(scleroderma)과 관련된 폐 섬유증, 기관지 확장(bronchiectasis) 및 폐 고혈압), (iv) 간의 섬유증 및/또는 염증 (예컨대, 간경변, 비알코올성 지방간 질환 (비알코올성 지방간염), 알코올 남용에 이차적인 간 섬유증, 급성 또는 만성 간염에 이차적인 간 섬유증, 담즙 질환 및 독성 간 손상 (예컨대, 아세트아미노펜 또는 기타 약물에 의해 유도된 약물-유도 간 손상으로 인한 간독성), (v) 심장의 섬유증 및/또는 염증 (예컨대, 심장의 섬유증, 심근 경색, 심장 판막 섬유증, 심방의 섬유증, 심내막심근(endomyocardial) 섬유증, 부정맥 유발성 우심실 심근증(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy) (ARVC), (vi) 혈관 섬유증 (예컨대, 혈관 질환, 아테롬성 동맥경화성 혈관 질환, 혈관 협착증, 재협착증, 맥관염, 정맥염, 심부 정맥 혈전증 및 복부 대동맥류(abdominal aortic aneurysm)), (vii) 피부의 섬유증 (예컨대, 과도한 상처 치유, 경피증, 전신성 경화증, 켈로이드, 연결 조직 질환, 반흔, 및 과증식형 반흔), (viii) 관절의 섬유증 (예컨대, 관절섬유증), (ix) 중추신경계의 섬유증 (예컨대, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상 및 척수 손상), (x) 소화계의 섬유증 (예컨대, 크론병, 췌장의 섬유증 및 궤양성 대장염), (xi) 눈의 섬유증 (예컨대, 전낭하 백내장(anterior subcapsular cataract), 수정체후낭 혼탁(posterior capsule opacification), 황반 변성, 및 망막 및 유리체 망막증), (xii) 근골격 연조직 구조의 섬유증 (예컨대, 유착 관절낭염(adhesive capsulitis), 듀프이트렌 구축(Dupuytren's contracture) 및 골수섬유증), (xiii) 생식 기관의 섬유증 (예컨대, 자궁내막증(endometriosis) 및 페이로니병(Peyronie's disease)), (xiv) 섬유증 및/또는 염증을 유발하는 만성 감염성 질환 (예컨대, 알파 바이러스, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 결핵, HIV 및 인플루엔자), (xv) 섬유증 및/또는 염증을 유발하는 자가면역 질환 (예컨대, 경피증 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)), (xvi) 외상과 관련된 반흔 (예컨대, 외상과 관련된 반흔이 수술 합병증 (예컨대 반흔 조직이 내부 기관 사이에서 형성될 수 있어서 구축, 통증을 유발할 수 있고 불임을 유발할 수 있는 수술 유착), 화학요법 약물-유도된 섬유증, 방사선-유도된 섬유증 및 화상과 관련된 반흔으로 구성되는 군으로부터 선택된 경우), 또는 (xvii) 기관 이식, 유방 섬유증, 근육 섬유증, 기관 이식, 복막뒤 섬유증, 갑상선 섬유증, 림프절 섬유증, 방광 섬유증 및 늑막 섬유증.
다른 측면으로, 본 발명은 신장 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애를 앓고 있는, 또는 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있는 포유류 대상체에서 신장 섬유증을 치료, 억제, 완화 또는 예방하는 방법을 제공하며, 방법은 신장 섬유증을 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 SEQ ID NO:6의 일부에 특이적으로 결합하는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 항체 또는 그것의 단편은 SEQ ID NO:6을 포함하는 폴리펩타이드에 그것이 보체 시스템에서 상이한 항원에 결합하는 것보다 적어도 10배 더 큰 친화도로 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 감소된 이펙터 기능을 가지는 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 실질적으로 C1q-의존적 보체 활성화를 억제하지 않으면서 렉틴 경로 보체 활성화를 선택적으로 억제한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 피하로, 복막내로, 근육내로, 동맥내로, 정맥내로, 또는 흡입제로서 투여된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 세뇨관 간질성 섬유증을 억제하기에 효과적인 양으로 투여된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 대상체에서 투석에 대한 필요성을 감소, 지연 또는 제거하기에 효과적인 양으로 투여된다. 한 구체예에서, 대상체는 만성 신장 질환, 만성 신부전, 사구체 질환 (예컨대, 국소 분절 사구체 경화증), 면역 복합체 장애 (예컨대, IgA 신증, 막성 신증), 루푸스 신염, 콩판 증후군, 당뇨성 신증, 세뇨관 간질성 손상 및 사구체신염 (예컨대, C3 사구체병증)으로 구성된 군으로부터 선택된 신장 질환 또는 장애를 앓고 있다. 한 구체예에서, 대상체는 단백뇨를 앓고 있고 MASP-2 억제제는 대상체에서 단백뇨를 감소시키기에 효과적인 양으로 투여된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 치료 전 대상체에서의 기준선 24-시간 요단백 배설과 비교하여 24-시간 요단백 배설에서 적어도 20 퍼센트 감소 (예컨대, 적어도 30 퍼센트 감소, 또는 적어도 40 퍼센트 감소, 또는 적어도 50 퍼센트 감소)를 이루기에 효과적인 양으로 효과적인 시간 동안 투여된다. 한 구체예에서, 대상체는 신증 증후군, 전-자간증, 자간증, 신장의 독성 병변, 아밀로이드증, 콜라겐 혈관성 질환 (예컨대 전신성 홍반성 루푸스), 탈수증, 사구체 질환 (예컨대 막성 사구체신염, 국소 분절 사구체신염, C3 사구체병증, 최소 변화 질환, 지질성 신증), 과격한 운동, 스트레스, 양성 기립성 (자세) 단백뇨, 국소 분절 사구체 경화증, IgA 신증 (즉 버거씨병), IgM 신증, 막증식형 사구체신염, 막성 신증, 최소 변화 질환, 유육종증, 알포트 증후군, 당뇨병 (당뇨성 신증), 약물-유도된 독성 (예컨대, NSAIDS, 니코틴, 페니실라민, 리튬 카보네이트, 금 및 다른 중금속, ACE 억제제, 항생물질 (예컨대 아드리아마이신) 또는 아편제 (예컨대 헤로인) 또는 다른 네프로톡신); 파브리병, 감염 (예컨대 HIV, 매독, A형, B형 또는 C형 간염, 연쇄상구균 감염 후, 요로 주혈흡충증); 아미노산뇨증, 판코니 증후군(Fanconi syndrome), 고혈압성 신장 경화증, 간질성 신염, 겸세포 질환, 혈색소뇨증, 다발성 골수종, 마이오글로빈뇨증, 기관 거부 (예컨대 신장 이식 거부반응), 에볼라 출혈열, 손발톱 슬개골 증후군(Nail patella syndrome), 가족성 지중해열(familial mediterranean fever), HELLP 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 류머티스성 관절염, 글리코겐 저장 질환 타입 1, 굿파스쳐 증후군(Goodpasture's syndrome), Henoch-Schonlein 자반증, 신장으로 확산되는 뇨도 감염, 쇠그렌 증후군 및 감염후 사구체신염으로 구성되는 군으로부터 선택된 단백뇨와 관련된 신장 질환 또는 장애를 앓고 있다. 한 구체예에서, 대상체는 IgA 신증을 앓고 있다. 한 구체예에서, 대상체는 막성 신증을 앓고 있다.
다른 측면으로, 본 발명은 대상체에서 단백뇨를 감소 또는 예방하기에 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 투여하는 단계를 포함하는, 단백뇨와 관련된 질환 또는 상태를 앓고 있는 대상체에서 신장 손상을 예방 또는 감소시키는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 SEQ ID NO:6의 일부에 특이적으로 결합하는 MASP-2 단클론성 항체 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 실질적으로 C1q-의존적 보체 활성화를 억제하지 않으면서 렉틴 경로 보체 활성화를 선택적으로 억제한다. 한 구체예에서, 단백뇨와 관련된 질환 또는 상태는 신증 증후군, 전-자간증, 자간증, 신장의 독성 병변, 아밀로이드증, 콜라겐 혈관성 질환 (예컨대 전신성 홍반성 루푸스), 탈수증, 사구체 질환 (예컨대 막성 사구체신염, 국소 분절 사구체신염, C3 사구체병증, 최소 변화 질환, 지질성 신증), 과격한 운동, 스트레스, 양성 기립성 (자세) 단백뇨, 국소 분절 사구체 경화증, IgA 신증 (즉 버거씨병), IgM 신증, 막증식형 사구체신염, 막성 신증, 최소 변화 질환, 유육종증, 알포트 증후군, 당뇨병 (당뇨성 신증), 약물-유도된 독성 (예컨대, NSAIDS, 니코틴, 페니실라민, 리튬 카보네이트, 금 및 다른 중금속, ACE 억제제, 항생물질 (예컨대 아드리아마이신) 또는 아편제 (예컨대 헤로인)); 파브리병, 감염 (예컨대 HIV, 매독, A형, B형 또는 C형 간염, 연쇄상구균 감염 후, 요로 주혈흡충증); 아미노산뇨증, 판코니 증후군, 고혈압성 신장 경화증, 간질성 신염, 겸세포 질환, 혈색소뇨증, 다발성 골수종, 마이오글로빈뇨증, 기관 거부 (예컨대 신장 이식 거부반응), 에볼라 출혈열, 손발톱 슬개골 증후군, 가족성 지중해열, HELLP 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 베게너 육아종증, 류머티스성 관절염, 글리코겐 저장 질환 타입 1, 굿파스쳐 증후군, Henoch-Schonlein 자반증, 신장으로 확산되는 뇨도 감염, 쇠그렌 증후군 및 감염후 사구체신염으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 치료 전 대상체에서의 기준선 24-시간 요단백 배설과 비교하여 24-시간 요단백 배설에서 적어도 20 퍼센트 감소 (예컨대, 적어도 30 퍼센트 감소, 또는 적어도 40 퍼센트 감소, 또는 적어도 50 퍼센트 감소)를 이루기에 효과적인 양으로 효과적인 시간 동안 투여된다.
다른 측면으로, 본 발명은 만성 신장 질환이 진행을 억제하는 방법을 제공하는데, 방법은 신장 섬유증, 예컨대, 세뇨관 간질성 섬유증을 감소 또는 예방하기에 효과적인 MASP-2 억제제의 양을, 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 SEQ ID NO:6의 일부에 특이적으로 결합하는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 실질적으로 C1q-의존적 보체 활성화를 억제하지 않으면서 렉틴 경로 보체 활성화를 선택적으로 억제한다. 한 구체예에서, 그것을 필요로 하는 대상체는 MASP-2 억제제의 투여 전에 단백뇨를 나타내고 MASP-2 억제제의 투여는 대상체에서 단백뇨를 감소시킨다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 치료 전 대상체에서의 기준선 24-시간 요단백 배설과 비교하여 24-시간 요단백 배설에서 적어도 20 퍼센트 감소 (예컨대, 적어도 30 퍼센트 감소, 또는 적어도 40 퍼센트 감소, 또는 적어도 50 퍼센트 감소)를 이루기에 효과적인 양으로 효과적인 시간 동안 투여된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 대상체에서 투석에 대한 필요성을 감소, 지연 또는 제거하기에 효과적인 양으로 투여된다.
다른 측면으로, 발명은 하나 이상의 신독성 작용제로의 치료가 진행되었거나, 진행 중이거나, 또는 진행될 대상체에서 신장 손상으로부터 신장을 보호하는 방법을 제공하며, 방법은 약물-유도된 신증을 예방 또는 개선하기에 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 SEQ ID NO:6의 일부에 특이적으로 결합하는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 실질적으로 C1q-의존적 보체 활성화를 억제하지 않으면서 렉틴 경로 보체 활성화를 선택적으로 억제한다.
다른 측면으로, 발명은 면역글로불린 A 신증 (IgAN)을 앓고 있는 인간 대상체의 치료 방법을 제공하며, 방법은 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물의 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 대상체는 스테로이드-의존적 IgAN을 앓고 있다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 감소된 이펙터 기능을 가지는 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 실질적으로 고전적 경로를 억제하지 않는다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 30 nM 이하의 IC50으로 90%의 인간 혈청에서 C3b 침착을 억제한다. 한 구체예에서, 방법은 신장 기능을 개선하기에 효과적인 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계 전에 스테로이드-의존적 IgAN을 가진 인간 대상체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 신장 기능을 개선하기에 효과적인 양으로 투여된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 치료 전 대상체에서 기준선 24-시간 뇨단백 배설과 비교하여 24-시간 뇨단백 배설에서 적어도 20 퍼센트 감소를 이루기에 충분한 시간 동안 그러한 감소를 이루기에 효과적인 양으로 투여된다. 한 구체예에서, 조성물은 상기 대상체에서 신장 기능을 개선시키고 코르티코스테로이드 투약량을 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:67로서 나타낸 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:69로서 나타낸 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 측면으로, 발명은 막성 신증 (MN)을 앓고 있는 인간 대상체의 치료 방법을 제공하며, 방법은 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물의 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 대상체는 스테로이드-의존적 MN을 앓고 있다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 신장 기능을 개선하기에 효과적인 양으로 투여된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 치료 전 대상체에서 기준선 24-시간 뇨단백 배설과 비교하여 24-시간 뇨단백 배설에서 적어도 20 퍼센트 감소를 이루기에 충분한 시간 동안 그러한 감소를 이루기에 효과적인 양으로 투여된다. 한 구체예에서, 조성물은 상기 대상체에서 신장 기능을 개선시키고 코르티코스테로이드 투약량을 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:67로서 나타낸 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:69로서 나타낸 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 전술한 측면 및 수반되는 많은 장점은 그것들이 첨부되는 도면과 함께 고려될 때, 하기 상세한 설명을 참조로 더 잘 이해되는 것과 같이 더 쉽게 인지될 것이다.
도 1은 인간 MASP-2의 게놈 구조를 도시하는 다이아그램이다;
도 2A는 인간 MASP-2 단백질의 도메인 구조를 도시하는 개략도이다;
도 2B는 인간 MAp19 단백질의 도메인 구조를 도시하는 개략도이다;
도 3은 쥐과(쥐과) MASP-2 넉아웃(knockout) 전략을 도시하는 플롯이다;
도 4는 인간 MASP-2 미니유전자(미니유전자) 구성물을 도시하는 플롯이다;
도 5A는 실시예 2에서 기술된 바와 같이, MASP-2-결핍이 만난 상에 C4b 침착의 결핍에 의해 측정된 바와 같이 렉틴-경로-매개 C4 활성화의 손실을 유발하는 것을 입증하는 결과를 제공한다;
도 5B는 실시예 2에서 기술된 바와 같이, MASP-2-결핍이 치모산 상에 C4b 침착의 결핍에 의해 측정된 바와 같이 렉틴-경로-매개 C4 활성화의 손실을 유발하는 것을 입증하는 결과를 제공한다;
도 5C는 실시예 2에서 기술된 바와 같이, 만난 및 치모산 상에 C4b 침착에 의한 측정으로서 MASP-2+/-; MASP-2-/- 및 야생형 계통으로부터 얻어진 혈청 샘플의 상대적 C4 활성화 수준을 입증하는 결과를 제공한다;
도 6은 실시예 2에서 기술된 바와 같이, MASP-2-/- 혈청 샘플로의 쥐과 재조합 MASP-2의 첨가가, 만난 상에서 C4b 침착에 의해 측정된 바와 같이, 단백질 농도 의존적 방식으로 렉틴-경로-매개 C4 활성화를 회복한다는 것을 입증하는 결과를 제공한다;
도 7은 실시예 8에서 기술된 바와 같이, 고전적 경로가 MASP-2-/- 계통에서 기능적이라는 것을 입증하는 결과를 제공한다;
도 8A는 실시예 10에서 기술된 바와 같이, 항-MASP-2 Fab2 항체 #11이 C3 컨버타제 형성을 억제하는 것을 입증하는 결과를 제공한다;
도 8B는 실시예 10에서 기술된 바와 같이, 항-MASP-2 Fab2 항체 #11이 천연 래트 MASP-2에 결합하는 것을 입증하는 결과를 제공한다;
도 8C는 실시예 10에서 기술된 바와 같이, 항-MASP-2 Fab2 항체 #41이 C4 절단을 억제하는 것을 입증하는 결과를 제공한다;
도 9는 실시예 10에서 기술된 바와 같이, C3 컨버타제 형성을 억제한, 테스트된 모든 항-MASP-2 Fab2 항체가 또한 C4 절단을 억제하는 것으로 발견되었음을 입증하는 결과를 제공한다;
도 10은 실시예 11에서 기술된 바와 같이, MASP-2 차단 Fab2 항체의 에피토프 지도화(mapping)에 사용된 래트 MASP-2로부터 유래된 재조합 폴리펩타이드를 도시하는 다이아그램이다;
도 11은 실시예 11에서 기술된 바와 같이, 래트 MASP-2 폴리펩타이드에 대한 항-MASP-2 Fab2 #40 및 #60의 결합을 입증하는 결과를 제공한다;
도 12A는 실시예 12ㅈ에서 기술된 바와 같이, 렉틴 경로-특이적 검정 조건 하에 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재 하에서 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시하며, OMS646이 대략 1 nM의 IC50 값으로 렉틴-매개 MAC 침착을 억제한다는 것을 입증한다;
도 12B는 실시예 12에서 기술된 바와 같이, 고전적 경로-특이적 검정 조건 하에 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재 하에서 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시하며, OMS646이 고전적 경로-매개 MAC 침착을 억제하지 않는다는 것을 입증한다;
도 12C는 실시예 12에서 기술된 바와 같이, 대체 경로-특이적 검정 조건 하에 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재 하에서 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시하며, OMS646이 대체 경로-매개 MAC 침착을 억제하지 않는다는 것을 입증한다;
도 13은 실시예 12에서 기술된 바와 같이, 마우스에서 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 약동학 (PK) 프로파일을 그래프로 도시하며, 표시된 용량으로 투여 후 시간의 함수로서 OMS646 농도 (n=3 동물/군의 평균)를 나타낸다;
도 14A는 실시예 12에서 기술된 바와 같이, 정맥 내 투여 후 마우스에서 전신성 렉틴 경로 활성의 하락으로서 측정된, 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 약물동역학적 (PD) 반응을 그래프로 도시한다.
도 14B는 실시예 12에서 기술된 바와 같이, 피하 투여 후 마우스에서 전신성 렉틴 경로 활성의 하락으로서 측정된, 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 약물동역학적 (PD) 반응을 그래프로 도시한다.
도 15는 실시예 14에서 기술된 바와 같이, 시리우스 레드(Sirius red)로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시하며, 조직 섹션은 일측성 요관 폐쇄 (UUO) 후 7일 후의 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 및 모의(sham)-수술된 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어졌다;
도 16은 실시예 14에서 기술된 바와 같이, F4/80 대식세포-특이적 항체로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시하며, 조직 섹션은 일측성 요관 폐쇄 (UUO) 후 7일 후의 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 및 모의-수술된 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어졌다.
도 17은 실시예 14에서 기술된 바와 같이, 일측성 요관 폐쇄 (UUO) 후 7일 후의 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의-수술된 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서, 정량 PCR (qPCR)에 의해 측정된, 콜라겐-4의 상대적인 mRNA 발현 수준을 그래프로 도시한다.
도 18은 실시예 14에서 기술된 바와 같이, 일측성 요관 폐쇄 (UUO) 후 7일 후의 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의-수술된 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서, qPCR에 의해 측정된, 형질전환 성장 인자 베타-1 (TGFβ-1)의 상대적인 mRNA 발현 수준을 그래프로 도시한다.
도 19는 실시예 14에서 기술된 바와 같이, 일측성 요관 폐쇄 (UUO) 후 7일 후의 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의-수술된 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서, qPCR에 의해 측정된, 형질전환 성장 인자 베타-1 (TGFβ-1)의 상대적인 mRNA 발현 수준을 그래프로 도시한다.
도 20은 실시예 14에서 기술된 바와 같이, 일측성 요관 폐쇄 (UUO) 후 7일 후의 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의-수술된 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서, qPCR에 의해 측정된, 인터페론-γ의 상대적인 mRNA 발현 수준을 그래프로 도시한다.
도 21은 실시예 15에서 기술된 바와 같이, 시리우스 레드로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시하며, 조직 섹션은 MASP-2 억제 항체 및 아이소타입 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스로부터 일측성 요관 폐쇄 (UUO) 후 7일 후에 얻어졌다.
도 22는 실시예 15에서 기술된 바와 같이, IgG4 아이소타입 대조군으로 처리된 야생형 마우스로부터 얻어진 폐쇄된 신장으로부터의 조직의 하이드록실 프롤린의 수준과 비교하여, MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형으로부터 얻어진 일측성 요관 폐쇄 (UUO) 후 7일 후에 수득된 신장으로부터의 하이드록실 프롤린 함량을 그래프로 도시한다.
도 23은 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 식염수를 단독으로 받은 야생형 대조군 마우스 (n=2), BSA를 받은 야생형 마우스 (n=6) 및 BSA를 받은 MASP-2-/- 마우스 (n=6)에서 단백질 과부하 연구의 제 15일에 측정된 혈청 단백질의 총량 (mg/ml)을 그래프로 도시한다.
도 24는 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 식염수를 단독으로 받은 야생형 대조군 마우스 (n=2), BSA를 받은 야생형 마우스 (n=6) 및 BSA를 받은 MASP-2-/- 마우스 (n=6)에서 단백질 과부하 연구의 제 15일에 24시간 기간에 걸쳐 수집된 뇨에서 배설된 단백질의 총량 (mg)을 그래프로 도시한다.
도 25는 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 다음과 같은 단백질 과부하 연구의 제 15일에 마우스의 다음 그룹으로부터의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색된 신장 조직 섹션을 도시한다: (패널 A) 야생형 대조군 마우스; (패널 B) MASP-2-/- 대조군 마우스, (패널 C)BSA로 처리된 야생형 마우스; 및 (패널 D) 소 혈청 알부민 (BSA)로 처리된 MASP-2-/-마우스.
도 26은 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 대식세포 평균 염색 면적 (%)을 보여주는, 대식세포-특이적 항체 F4/80으로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시하며, 조직 섹션은 야생형 대조군 마우스 (n=2), BSA로 처리된 야생형 마우스 (n=6), 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스 (n=5)로부터 단백질 과부하 연구의 제 15일에 얻어졌다.
도 27A는 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 24-시간 샘플 대비 대식세포 침윤 (평균 염색 면적 %)으로부터의 뇨에서 측정된 총 배설 단백질을 도표화함으로써 BSA로 처리된 각각의 야생형 마우스 (n=6)에서 대식세포-단백뇨 상관관계의 존재에 대한 분석을 그래프로 도시한다.
도 27B는 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 24-시간 샘플 대비 대식세포 침윤 (평균 염색 면적 %)으로부터의 뇨에서 측정된 총 배설 단백질을 도표화함으로써 BSA로 처리된 각각의 MASP-2-/- 마우스 (n=5)에서 대식세포-단백뇨 상관관계의 존재에 대한 분석을 그래프로 도시한다.
도 28은 실시예 16에서 기술된 바와 같이, BSA로 처리된 야생형 마우스 (n=4) 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스 (n=5)에서 항-TGFβ 항체로 염색된 조직 섹션 (% TGFβ 항체-염색된 면적으로서 측정됨)의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시한다.
도 29는 실시예 16에서 기술된 바와 같이, BSA로 처리된 야생형 마우스 (n=4) 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스 (n=5)에서 항-TNFα 항체로 염색된 조직 섹션 (% TNFα 항체-염색된 면적으로서 측정됨)의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시한다.
도 30은 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 야생형 대조군 마우스, MASP-2-/- 대조군 마우스, BSA로 처리된 야생형 마우스 (n=7) 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스 (n=7)에서 항-IL-6 항체로 염색된 조직 섹션 (% IL-6 항체-염색된 면적으로서 측정됨)의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시한다.
도 31은 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 야생형 대조군 마우스 (n=1), MASP-2-/- 대조군 마우스 (n=1), BSA로 처리된 야생형 마우스 (n=6) 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스 (n=7)에서 신장 피질로부터의 조직 섹션으로부터 연속적으로 선택된 20개의 고출력장 (HPF)에서 계수된 TUNEL 세포자멸성 세포의 빈도를 그래프로 도시한다.
도 32는 실시예 17에서 기술된 바와 같이, BSA로의 치료 후 제 15일에 다음 그룹으로부터의 대표적인 H&E 염색된 조직 섹션을 도시한다: (패널 A) 식염수로 처리된 야생형 대조군 마우스, (패널 B) 아이소타입 항체 처리된 대조군 마우스 및 (패널 C) MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스.
도 33은 실시예 17에서 기술된 바와 같이, 식염수 대조군 및 BSA로 처리된 야생형 마우스 (n=8), 아이소타입 대조군 항체 및 BSA로 처리된 야생형 마우스 (n=8) 및 MASP-2 억제 항체 및 BSA로 처리된 야생형 마우스 (n=7)에서 신장 피질로부터의 조직 섹션으로부터 연속적으로 선택된 20개의 고출력장 (HPF)에서 계수된 TUNEL 세포자멸성 세포의 빈도를 그래프로 도시한다.
도 34는 실시예 17에서 기술된 바와 같이, BSA 및 식염수로 처리된 야생형 마우스 (n=8), BSA 및 아이소타입 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스 (n=7) 및 BSA 및 MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스 (n=8)에서 항-TGFβ 항체로 염색된 조직 섹션 (% TGFβ 항체-염색된 면적으로서 측정됨)의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시한다.
도 35는 실시예 17에서 기술된 바와 같이, BSA 및 식염수로 처리된 야생형 마우스 (n=8), BSA 및 아이소타입 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스 (n=7) 및 BSA 및 MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스 (n=8)에서 항-TNFα 항체로 염색된 조직 섹션 (% TNFα 항체-염색된 면적으로서 측정됨)의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시한다.
도 36은 실시예 17에서 기술된 바와 같이, BSA 및 식염수로 처리된 야생형 마우스 (n=8), BSA 및 아이소타입 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스 (n=7) 및 BSA 및 MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스 (n=8)에서 항-IL-6 항체로 염색된 조직 섹션 (% IL-6 항체-염색된 면적으로서 측정됨)의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시한다.
도 37은 실시예 18에서 기술된 바와 같이, 아드리아마이신(아드리아마이신) 또는 식염수 단독 (대조군)으로 치료 후 제 14일에 마우스의 다음 그룹으로부터의 대표적인 H&E 염색된 조직 섹션을 도시한다: (패널 A-1, A-2, A-3) 식염수 단독으로 처리된 야생형 대조군 마우스; (패널 B-1, B-2, B-3) 아드리아마이신으로 처리된 야생형 마우스; 및 (패널 C-1, C-2, C-3) 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2-/- 마우스;
도 38은 실시예 18에서 기술된 바와 같이, 아드리아마이신 또는 식염수 단독 (야생형 대조군)으로 치료 후 제 14일에 마우스의 다음 그룹으로부터의 대식세포 평균 염색 면적 (%)을 보여주는, 대식세포-특이적 항체 F4/80으로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시한다: 식염수 단독으로 처리된 야생형 대조군 마우스; 아드리아마이신으로 처리된 야생형 마우스; 식염수 단독으로 처리된 MASP-2-/- 마우스; 및 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2 -/- 마우스, 여기서 **p=0.007;
도 39는 실시예 18에서 기술된 바와 같이, 아드리아마이신 또는 식염수 단독 (야생형 대조군)으로 치료 후 제 14일에 마우스의 다음 그룹으로부터의 콜라겐 침착 염색 면적 (%)을 보여주는, 시리우스 레드로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시한다: 식염수 단독으로 처리된 야생형 대조군 마우스; 아드리아마이신으로 처리된 야생형 마우스; 식염수 단독으로 처리된 MASP-2-/- 마우스; 및 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2 -/- 마우스, 여기서 **p=0.005; 및
도 40은 실시예 19에서 기술된 바와 같이, MASP-2 억제 항체 (OMS646)로 주마다 치료하는 12주 연구의 과정 동안 두 명의 IgA 환자에서 뇨 알부민/크레아티닌 비율 (uACR)을 그래프로 도시한다.
서열 목록의 설명
SEQ ID NO:1 인간 MAp19 cDNA
SEQ ID NO:2 인간 MAp19 단백질 (리더 포함)
SEQ ID NO:3 인간 MAp19 단백질 (성숙한)
SEQ ID NO:4 인간 MASP-2 cDNA
SEQ ID NO:5 인간 MASP-2 단백질 (리더 포함)
SEQ ID NO:6 인간 MASP-2 단백질 (성숙한)
SEQ ID NO:7 인간 MASP-2 gDNA (엑손 1-6)
항원: (MASP-2 성숙한 단백질에 관련하여)
SEQ ID NO:8 CUBI 서열 (aa 1-121)
SEQ ID NO:9 CUBEGF 서열 (aa 1-166)
SEQ ID NO:10 CUBEGFCUBII (aa 1-293)
SEQ ID NO:11 EGF 영역 (aa 122-166)
SEQ ID NO:12 세린 프로테아제 도메인 (aa 429 - 671)
SEQ ID NO:13 세린 프로테아제 도메인 비활성 (Ser618의 Ala 돌연변이를 가진 aa 610-625)
SEQ ID NO:14 TPLGPKWPEPVFGRL (CUBI 펩타이드)
SEQ ID NO:15 TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ (CUBI 펩타이드)
SEQ ID NO:16 TFRSDYSN (MBL 결합 영역 코어)
SEQ ID NO:17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF (MBL 결합 영역)
SEQ ID NO:18 IDECQVAPG (EGF 펩타이드)
SEQ ID NO:19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV (세린 프로테아제 결합 코어)상세한 설명
펩타이드 억제자:
SEQ ID NO:20 MBL 전체 길이 cDNA
SEQ ID NO:21 MBL 전체 길이 단백질
SEQ ID NO:22 OGK-X-GP (공통 결합)
SEQ ID NO:23 OGKLG
SEQ ID NO:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G
SEQ ID NO:25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO
SEQ ID NO:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOG
SEQ ID NO:27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO (인간 h-피콜린)
SEQ ID NO:28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGAOGEO (인간 피콜린 p35)
SEQ ID NO:29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI (C4 절단 부위)
발현 억제자:
SEQ ID NO:30 cDNA of CUBI-EGF 도메인 (SEQ ID NO:4의 뉴클레오타이드 22-680)
SEQ ID NO:31
5' CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC 3'
MASP-2 번역 시작 부위 (센스)를 포함하는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오타이드 12-45
SEQ ID NO:32
5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3'
MASP-2 MBL 결합 부위 (센스)를 포함하는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오타이드 361-396
SEQ ID NO:33
5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3'
CUBII 도메인을 포함하는 영역을 암호화하는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오타이드 610-642
클로닝 프라이머:
SEQ ID NO:34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC (CUB에 대하여 5' PCR)
SEQ ID NO:35 GGAATTCCTAGGCTGCATA (CUB에 대하여 3' PCR)
SEQ ID NO:36 GGAATTCCTACAGGGCGCT (CUBIEGF에 대하여 3' PCR)
SEQ ID NO:37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT (CUBIEGFCUBII에 대하여 3' PCR)
SEQ ID NOS:38 내지 47은 인간화된 항체에 대한 클로닝 프라이머이다
SEQ ID NO:48은 9 aa 펩타이드 결합이다
발현 벡터:
SEQ ID NO:49는 MASP-2 미니유전자 삽입물이다
SEQ ID NO: 50은 쥐과 MASP-2 cDNA이다
SEQ ID NO: 51은 쥐과 MASP-2 단백질 (w/리더)이다
SEQ ID NO: 52는 성숙한 쥐과 MASP-2 단백질이다
SEQ ID NO: 53은 래트 MASP-2 cDNA이다
SEQ ID NO: 54는 래트 MASP-2 단백질 (w/리더)이다
SEQ ID NO: 55는 성숙한 래트 MASP-2 단백질
SEQ ID NO: 56 내지 59는 인간 MASP-2A를 생성하기 위해 사용된 인간 MASP-2의 부위-특정 돌연변이생성을 위한 올리고뉴크레오타이드이다
SEQ ID NO: 60 내지 63은 쥐과 MASP-2A를 생성하기 위해 사용된 쥐과 MASP-2의 부위-특정 돌연변이생성을 위한 올리고뉴크레오타이드이다
SEQ ID NO: 64 내지 65는 래트 MASP-2A를 생서하기 위해 사용된 래트 MASP-2의 부위-특정 돌연변이생성을 위한 올리고뉴크레오타이드이다
SEQ ID NO: 66은 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 중쇄 가변 영역 (VH) (신호 펩타이드 없음)을 암호화하는 DNA이다
SEQ ID NO: 67은 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩타이드이다
SEQ ID NO: 68은 17N16mc 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩타이드이다
SEQ ID NO: 70은 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 경쇄 가변 영역 (VL)을 암호화하는 DNA이다
SEQ ID NO: 69는 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩타이드이다
SEQ ID NO: 71은 17N16_dc17N9 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩타이드이다
SEQ ID NO:72: SGMI-2L(전체 길이)
SEQ ID NO: 73: SGMI-2M (중간 절단 버전)
SEQ ID NO:74: SGMI-2S (짧은 절단 버전)
SEQ ID NO:75: VH-M2ab6-SGMI-2-N 및 힌지 돌연변이를 가진 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 성숙한 폴리펩타이드
SEQ ID NO:76: VH-M2ab6-SGMI-2-C 및 힌지 돌연변이를 가진 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 성숙한 폴리펩타이드
SEQ ID NO:77: VL-M2ab6-SGMI-2-N 및 인간 Ig 람다 불변 영역을 포함하는 성숙한 폴리펩타이드
SEQ ID NO:78: VL-M2ab6-SGMI-2-C 및 인간 Ig 람다 불변 영역을 포함하는 성숙한 폴리펩타이드
SEQ ID NO:79: 펩타이드 링커 (10aa)
SEQ ID NO:80: 펩타이드 링커 (6aa)
SEQ ID NO:81: 펩타이드 링커 (4aa)
SEQ ID NO:82: VH-M2ab6-SGMI-2-N 및 힌지 돌연변이를 가진 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
SEQ ID NO:83: VH-M2ab 6-SGMI-2-C 및 힌지 돌연변이를 가진 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
SEQ ID NO:84: VL-M2ab6-SGMI-2-N 및 인간 Ig 람다 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
SEQ ID NO:85: VL-M2ab6-SGMI-2-C 및 인간 Ig 람다 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
상세한 설명
본 발명은 보체 시스템의 렉틴 경로의 핵심 조절자인 만난-결합 렉틴-관련 세린 프로테아제-2 (MASP-2)의 억제가 일측 뇨관 폐쇄 (UUO) 모델, 단백질 과부하 모델 및 신장 섬유증의 아드리아마이신-유도된 신장학 모델을 포함하여 섬유증 질환의 다양한 동물 모델에서 염증 및 섬유증을 유의미하게 감소시킨다는, 본 발명자들에 의한 놀라운 발견을 기반으로 한다. 그러므로, 발명자들은 MASP-2-매개 렉틴 경로 활성화의 억제가 신장 섬유증, 예컨대, 세뇨관 간질성 염증 and 섬유증을, 기저의 원인과 관계없이, 개선, 치료 또는 예방하기 위한 효과적인 치료 접근법을 제공하는 것을 입증하였다. 본원에서 추가로 기술되는 것은, 면역글로불린 A 신증 (IgAN) 및 막성 신증 (MN)을 앓고 있는 인간 대상체에서 신장 기능을 개선시키고 코르티코스테로이드 요구를 감소시키기에 효과적인 MASP-2 억제 항체 (OMS646)의 사용이다.
I. 정의
본원에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어는 본 발명의 당업자에 의해 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 명세서 및 청구범위에서 본 발명을 기술하는데 사용된 용어에 관하여 명확성을 제공하기 위해 하기 정의가 제공된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "MASP-2-의존적 보체 활성화"는 렉틴 경로의 MASP-2-의존적 활성화를 포함하는데, 이것은 렉틴 경로 C3 컨버타제 C4b2a의 형성을 유발하는 생리학적 조건 하에서 (즉, Ca++의 존재 하에서) 및 그 후 C5 컨버타제 C4b2a(C3b)n로의 C3 절단 생성물 C3b의 축적시 일어나며, 이것은 주로 옵소닌화를 유발하는 것으로 측정되었다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대체 경로"는, 예컨대, 진균류 및 효모 세포벽, 그람 음성(Gram negative) 외막의 지질다당류 (LPS), 및 토끼 적혈구, 뿐만 아니라 많은 순수한 다당류, 토끼 적혈구, 바이러스, 박테리아, 동물 종양 세포, 기생충 및 손상된 세포로부터의 치모산에 의해 야기되고, 전통적으로 보체 인자 C3으로부터 C3b의 자발적 단백질 가수분해 생성으로부터 발생하는 것으로 생각되는 보체 활성화를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "렉틴 경로"는 혈청 및 만난-결합 렉틴 (MBL), CL-11 및 피콜린 (H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)을 포함하는 비-혈청 탄수화물-결합 단백질의 특이적 결합을 통해 일어나는 보체 활성화를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "고전적 경로"는 외래 입자에 결합된 항체에 의해 야기되고 인식 분자 C1q의 결합을 필요로 하는 보체 활성화를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "MASP-2 억제제"는, 항-MASP-2 항체 및 이것의 MASP-2 결합 단편, 천연 및 합성 펩타이드, 소분자, 가용성 MASP-2 수용체, 발현 억제자 및 분리된 천연 억제자를 포함하는, MASP-2에 결합하거나 이것과 직접적으로 상호작용하여 MASP-2-의존적 보체 활성화를 효과적으로 억제하는 임의의 작용제를 말하고, 또한 렉틴 경로에서 또 다른 인식 분자 (예컨대, MBL, H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)로의 결합에 대하여 MASP-2와 경합하는 펩타이드를 포함하지만, 이러한 다른 인식 분자에 결합하는 항체를 포함하지 않는다. 본 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제제는 20% 초과, 예컨대 50% 초과, 예컨대 90% 초과만큼 MASP-2-의존적 보체 활성화를 감소시킬 수 있다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 90% 초과만큼 MASP-2-의존적 보체 활성화를 감소시킨다 (즉, 단지 10% 이하의 MASP-2 보체 활성화를 초래함).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "섬유증"은 기관 또는 조직에서 과잉 연결 조직의 형성 또는 존재를 말한다. 섬유증은 조직 손상 또는 염증과 같은 자극에 대한 회복 또는 대체 반응으로서 발생할 수 있다. 섬유증의 특징은 과잉 세포외 기질의 생성이다. 손상에 대한 정상적인 생리적 반응은 치유 과정의 일부로서 연결 조직의 침착을 초래하지만, 이 연결 조직 침착은 지속적이고 병리적이 될 수 있어서, 조직의 아키텍쳐 및 기능을 변경시킨다. 세포 수준에서, 상피 세포 및 섬유모세포는 증식되고 근섬유모세포로 분화하여, 기질 수축, 증가된 경직, 미세혈관 압박, 및 저산소증을 초래한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애를 앓고 있거나 발생할 위험이 있는 포유류 대상체에서 섬유증을 치료하는"은 상기 포유류 대상체에서 섬유증을 반전, 완화, 개선 또는 억제하는 것을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단백뇨"는 뇨의 단백질이 비정상적인 양으로, 예컨대 인간 대상체로부터 24-시간 뇨 수집에서 0.3 g 단백질을 넘는 양으로, 또는 인간 대상체에서 리터당 1 g을 초과하는 농도로 존재하는 것을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단백뇨를 개선하는" 또는 "단백뇨를 감소시키는"은 MASP-2 억제제로 치료하기 전 대상체에서의 기준선 24-시간 뇨단백 배설에 비교하여 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50% 이상만큼 단백뇨를 앓고 있는 대상체에서 24-시간 뇨단백 배설을 감소시키는 것을 나타낸다. 한 구체예에서, 발명의 방법에 따라 MASP-2 억제제로의 치료는 24-시간 뇨단백 배설에서 20퍼센트 감소를 초과하여, 또는 예컨대 24-시간 뇨단백 배설에서 30퍼센트 감소를 초과하여, 또는 예컨대 24-시간 뇨단백 배설에서 40퍼센트 감소를 초과하여, 또는 예컨대 24-시간 뇨단백 배설에서 50퍼센트 감소를 초과하여 달성하기 위하여 인간 대상체에서 단백뇨를 감소시키기에 효과적이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 표적 폴리펩타이드, 예를 들어, MASP-2, 폴리펩타이드 또는 이것의 일부에 특이적으로 결합하는, 임의의 항체-생성 포유류 (예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 및 인간을 포함한 영장류), 또는 하이브리도마(hybridoma), 파지 선택, 재조합 발현 또는 형질도입(transgenic) 동물 (또는 항체 또는 항체 단편을 생성하는 다른 방법)로부터 유래된 항체 및 이것의 항체 단편을 포함한다. 용어 "항체"를 항체의 공급원 또는 그것이 만들어지는 방식 (예컨대, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 형질도입 동물, 펩타이드 합성, 등에 의해)에 관하여 제한하려는 것은 아니다. 예시적 항체는 다클론성, 단클론성 및 재조합 항체; 팬(pan)-특이적, 다중특이적 항체 (예컨대, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체); 인간화된 항체; 쥐과 항체; 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 단클론성 항체; 및 항-이디오타입(idiotype) 항체을 포함하고, 임의의 온전한 항체 또는 이것의 단편일 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 다클론성 또는 단클론성 항체뿐만 아니라 이것의 단편 (예컨대 dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬 (ScFv), 이것의 합성 변종, 자연 발생 변종, 필요한 특이성의 항원-결합 단편을 가진 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 인간화된 항체, 키메라 항체, 및 원하는 특이성의 항원-결합 부위 또는 단편 (에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성형태를 포함한다.
"단클론성 항체"는 단클론성 항체가 에피토프의 선택적 결합에 수반되는 아미노산 (자연 발생 및 비-자연 발생)으로 구성되는 균일한 항체 집단을 나타낸다. 단클론성 항체는 표적 항원에 대하여 고도로 특이적이다. 용어 "단클론성 항체"는 온전한 단클론성 항체 및 전체 길이 단클론성 항체뿐만 아니라, 이것들의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬 (ScFv), 이것의 변종, 항원-결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 단클론성 항체, 키메라 단클론성 항체, 및 필요한 특이성 및 에피토프에 결합하는 능력의 항원-결합 단편 (에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성형태를 포함한다. 항체의 공급원 또는 만들어지는 방식 (예컨대, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 형질도입 동물, 등에 의해)에 관하여 제한하려는 것은 아니다. 용어는 "항체"의 정의 하에서 상기 기술된 전체 면역글로불린, 뿐만 아니라 단편 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은 전체 길이 항체, 예를 들어, 항-MASP-2 항체로부터 유래되거나 이것과 관련된 부분을 말하며, 일반적으로 이것의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예시적인 예는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 및 Fv 단편, scFv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 더 포함하며, 이것은 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "키메라 항체"는 비-인간 종 (예컨대, 설치류) 항체로부터 유래된 가변 도메인 및 상보성-결정 영역을 포함하는 한편, 나머지 항체 분자는 인간 항체로부터 유래된 재조합 단백질이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "인간화된 항체"는 인간 항체 프레임워크로 이식된 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 특이적 상보성-결정 영역과 일치하는 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 인간화된 항체는 전형적으로 항체 상보성-결정 영역만이 비-인간 기원의 것인 재조합 단백질이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "만난-결합 렉틴" ("MBL")은 만난-결합 단백질 ("MBP")과 동등하다.
본원에서 사용된 바와 같이, "막 공격 복합체" ("MAC")는 막에 삽입되어 막을 파괴시키는 말단의 다섯 개의 보체 성분 (C6, C7, C8 및 C-9와 조합된 C5b)의 복합체 (C5b-9로도 불림)를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "대상체"는 제한되는 것이 아니라 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 말, 양, 염소, 소, 토끼, 돼지 및 설치류를 포함한 모든 포유류를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산 잔기는 다음과 같이 축약된다: 알라닌 (Ala;A), 아스파라긴 (Asn;N), 아스파르트산 (Asp;D), 아르기닌 (Arg;R), 시스테인 (Cys;C), 글루탐산 (Glu;E), 글루타민 (Gln;Q), 글리신 (Gly;G), 히스티딘 (His;H), 아이소류신 (Ile;I), 류신 (Leu;L), 리신 (Lys;K), 메티오닌 (Met;M), 페닐알라닌 (Phe;F), 프롤린 (Pro;P), 세린 (Ser;S), 트레오닌 (Thr;T), 트립토판 (Trp;W), 타이로신 (Tyr;Y), 및 발린 (Val;V).
넓은 의미에서, 자연 발생 아미노산은 각각의 아미노산의 측쇄의 화학적 특징을 기반으로 여러 그룹으로 나누어질 수 있다. "소수성" 아미노산은 Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys 또는 Pro를 의미한다. "친수성" 아미노산은 Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His를 의미한다. 아미노산의 이 부류는 다음과 같이 더 하위 부류될 수 있다. "비대전 친수성" 아미노산은 Ser, Thr, Asn 또는 Gln을 의미한다. "산성" 아미노산은 Glu 또는 Asp를 의미한다. "염기성" 아미노산은 Lys, Arg 또는 His를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "보존적 아미노산 치환"은 다음 각각의 그룹 내의 아미노산 중에서의 치환으로 예시된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신, (2) 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파테이트 및 글루타메이트, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 리신, 아르기닌 및 히스티딘.
용어 "올리고뉴클레오타이드"는 본원에서 사용된 바와 같이 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머 또는 이것들의 모방체를 말한다. 이 용어는 또한 자연 발생 뉴클레오타이드, 당 및 공유 뉴클레오사이드 간 (골격) 결합, 뿐만 아니라 비-자연 발생 변형을 가진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 상기 올리고핵염기를 커버한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "에피토프"는 항체에 의해 결합되는 단백질 (예컨대, 인간 MASP-2 단백질) 상의 부위를 말한다. "중복 에피토프"는 적어도 하나 (예컨대, 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 또는 여섯 개)의 공통 아미노산 잔기(들)를 포함하며, 선형 및 비-선형 에피토프를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 길이 또는 번역 후 변형에 관계없이 교환 가능하게 사용되고 아미노산의 임의의 펩타이드-결합된 사슬을 의미한다. 본원에서 기술된 MASP-2 단백질은 야생형 단백질을 포함하거나 야생형 단백질일 수 있거나 또는 50개 이하 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개 이하)의 보존적 아미노산 치환을 가진 변종일 수 있다. 보존적 치환은 전형적으로 다음 그룹 내의 치환을 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 아이소류신, 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 리신, 히스티딘 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 타이로신.
일부 구체예에서, 인간 MASP-2 단백질은 SEQ ID NO: 5에서 제시된 아미노산 서열을 가진 인간 MASP-2 단백질에 대하여 70%, 또는 그 이상 (예컨대, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 펩타이드 단편은 길이가 적어도 6개 (예컨대, 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 또는 600개 또는 그 이상)의 아미노산 잔기 (예컨대, SEQ ID NO: 5의 적어도 6개의 인접한 아미노산 잔기)일 수 있다. 일부 구체예에서, 인간 MASP-2 단백질의 항원성 펩타이드 단편은 길이가 500개 미만 (예를 들어, 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 또는 6개 미만)의 아미노산 잔기 (예를 들어, SEQ ID NO: 5의 어느 하나의 500개 미만의 인접한 아미노산 잔기)이다.
퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 갭(gap)을 도입한 후, 참조 서열의 아미노산과 동일한 후보 서열의 아미노산의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 서열 동일성을 측정할 목적을 위한 정렬은 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로, 예를 들어, 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대한의 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하는데 적절한 파라미터는 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
II. 발명의 개요
본원에서 기술되는 바와 같이, 발명자들은 세뇨관 신장 병리학의 개시 및 질환 진전에서 렉틴 경로의 중심 역할을 확인하였고, 그로써 IgA 신증, C3 사구체병증 및 다른 사구체신염을 포함하여 다양한 범위의 신장 질환의 병리생리학에서 렉틴 경로 활성화의 핵심적 역할을 함축하였다. 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 발명자들은 보체 시스템의 렉틴 경로의 핵심 조절자인 만난-결합 렉틴-관련 세린 프로테아제-2 (MASP-2)의 억제가 일측 뇨관 폐쇄 (UUO) 모델, 단백질 과부하 모델 및 신장 섬유증의 아드리아마이신-유도된 신장학 모델을 포함하여 섬유증 질환의 다양한 동물 모델에서 염증 및 섬유증을 유의미하게 감소시키는 것을 발견하였다. 그러므로, 발명자들은 MASP-2-매개 렉틴 경로 활성화의 억제가 신장 섬유증, 예컨대 세뇨관 간질성 섬유증을, 기저의 원인과 관계없이 개선, 치료 또는 예방하기 위한 효과적인 치료 접근법을 제공하는 것을 입증하였다.
렉틴 (MBL, M-피콜린, H-피콜린, L-피콜린 및 CL-11)은 선천적 보체 시스템을 야기하는 특이적 인식 분자이고 시스템은 렉틴 개시 경로 및 말단 보체 이펙터 분자의 렉틴-개시된 활성화를 증폭시키는 관련된 말단 경로 증폭 루프를 포함한다. C1q는 획득된 보체 시스템을 야기하는 특이적 인식 분자이고 시스템은 고전적 개시 경로 및 말단 보체 이펙터 분자의 C1q-개시된 활성화를 증폭시키는 관련된 말단 경로 증폭 루프를 포함한다. 발명자들은 이들 두 개의 주요 보체 활성화 시스템을 각각 렉틴-의존적 보체 시스템 및 C1q-의존적 보체 시스템으로 부른다.
면역 방어에 있어서 그것의 필수적인 역할에 더하여, 보체 시스템은 많은 임상적 질병에서의 조직 손상에 기여한다. 따라서, 이들 부작용을 방지하기 위해 치료적으로 효과적인 보체 억제자를 개발하는 것이 긴급히 필요하다. 렉틴 매개 MASP-2 경로를 억제하는 한편 고전적 경로는 온전하게 남겨두는 것이 가능하다는 인식으로, 보체의 면역 방어 능력을 완전히 정지시키지 않으면서 특정 병리상태를 유발하는 보체 활성화 시스템만을 특이적으로 억제하는 것이 매우 바람직하다는 것을 알게 된다. 예를 들어, 보체 활성화가 대부분 렉틴-의존적 보체 시스템에 의해 매개되는 질환 상태에서는, 이 시스템만을 특이적으로 억제하는 것이 유리할 것이다. 이것은 C1q-의존적 보체 활성화 시스템을 온전하게 남겨두어 면역 복합체 프로세싱(processing)을 처리하고 감염에 대한 숙주 방어를 돕는다.
렉틴-의존적 보체 시스템을 특이적으로 억제하기 위한 치료제의 개발을 목표로 하기에 바람직한 단백질 구성요소는 MASP-2이다. 렉틴-의존적 보체 시스템의 모든 공지된 단백질 구성요소 (MBL, H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린, MASP-2, C2-C9, 인자 B, 인자 D, 및 프로퍼딘) 중에서도, MASP-2만이 렉틴-의존적 보체 시스템에 고유하고 시스템이 기능하는데 필요하다. 렉틴 (MBL, H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린 및 CL-11)은 또한 렉틴-의존적 보체 시스템의 고유한 구성요소이다. 하지만, 렉틴 구성요소 중 어느 하나의 손실이 렉틴 중복으로 인해 시스템 활성화를 반드시 억제하는 것은 아니다. 렉틴-의존적 보체 활성화 시스템의 억제를 보장하기 위해서는 다섯 개의 렉틴 모두를 억제하는 것이 필요하다. 게다가, MBL 및 피콜린이 또한 보체 독립적인 옵소닌 활성을 갖는 것으로 알려져 있기 때문에, 렉틴 기능의 억제는 감염에 대한 이 이로운 숙주 방어 메커니즘의 손실을 초래할 것이다. 그에 반해, 이 보체-독립적 렉틴 옵소닌 활성은 MASP-2가 억제 표적인 경우 온전하게 유지될 것이다. 렉틴-의존적 보체 활성화 시스템을 억제하기 위한 치료 표적으로서 MASP-2의 추가된 이점은 MASP-2의 혈장 농도가 임의의 보체 단백질 중 가장 낮다는 것이다 (
Figure pat00001
500 ng/ml); 그러므로, MASP-2의 고친화도 억제자의 상응하는 저농도는 완전 억제를 얻기에 충분할 수도 있다 (Moller-Kristensen, M., et al., J. Immunol Methods 282:159-167, 2003).
실시예 14에서 기술된 것과 같이, 그것은 염증성 세포 침윤물 (75% 감소) 및 콜라겐 침착과 같은 섬유증의 조직학적 마커 (1/3 감소)에 의해 나타난 바와 같이, MASP-2 유전자가 없는 (MASP-2-/-) 마우스가 야생형 대조군 동물에 비교하여 상당히 더 적은 신장 질환을 나타낸 섬유증 신장 질환 (일측 뇨관 폐쇄 UUO)의 동물 모델에서 측정되었다. 실시예 15에서 추가로 나타내는 것과 같이, 렉틴 경로를 선택적으로 차단하는 한편 고전적 경로는 온전하게 남겨놓는 항-MASP-2 단클론성 항체로 전신적으로 처리된 야생형 마우스는 아이소타입 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스에 비교하여 신장 섬유증으로부터 보호되었다. 이 결과들은 렉틴 경로가 신장 질환에 대한 핵심적인 기여자인 것을 증명하고 추가로 렉틴 경로를 차단하는 MASP-2 억제자, 예컨대 MASP-2 항체가 항섬유화제로서 효과적인 것을 증명한다. 실시예 16에서 추가로 나타나는 것과 같이, 단백질 과부하 모델, 소혈청 알부민 (BSA)으로 처리된 야생형 마우스는 단백뇨성 신증을 나타낸 반면, 동일한 수준의 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스는 감소된 신장 손상을 나타냈다. 실시예 17에서 나타내는 것과 같이, 렉틴 경로를 선택적으로 차단하는 한편 고전적 경로는 온전하게 남겨놓는 항-MASP-2 단클론성 항체로 전신적으로 처리된 야생형 마우스는 단백질 과부하 모델에서 신장 손상으로부터 보호되었다. 실시예 18에서 기술되는 것과 같이, MASP-2-/- 마우스는 야생형 마우스에 비교하여 신장 섬유증의 아드리아마이신-유도된 신장 모델에서 더 적은 신장 염증 및 세뇨관 간질성 손상을 나타냈다. 실시예 19에서 기술된 것과 같이, 진행중인 2기 개방형-라벨 신장 시험에서, 항-MASP-2 항체로 처리된 IgA 신증을 가진 환자들은 시험 전체를 통해 뇨 알부민-대-크레아티닌 비율 (uACR)에서 임상적으로 의미있고 통계학적으로 상당한 감소 및 기준선으로부터 치료의 종료시까지 24-시간 뇨 단ㅂ개질 수준의 감소를 증명하였다. 실시예 19에서 추가로 기술되는 것과 같이, 동일한 2기 신장 시험에서, 항-MASP-2 항체로 처리된 막성 신증을 가진 환자들 또한 치료 중에 uACR의 감소를 증명하였다.
전술한 설명에 따르면, 본 발명은 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체의 항섬유화제로서의 사용, 섬유증 상태의 치료를 위한 약의 제조를 위한 MASP-2 억제제의 사용, 및 그것을 필요로 하는 인간 대상체에서 섬유증 상태를 예방, 치료, 완화 또는 반전시키는 방법에 관련되며, 상기 방법은 상기 환자에게 효율적인 양의 MASP-2 억제제 (예컨대, 항-MASP-2 항체)를 투여하는 단계를 포함한다.
발명의 방법은 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 임의의 질환 또는 장애, 이를테면 신장의 질환 (예컨대, 만성 신장 질환, IgA 신증, C3 사구체병증 및 기타 사구체신염), 폐 질환 (예컨대 특발성 폐 섬유증, 낭포성 섬유증, 기관지 확장증), 간 질환 (예컨대 간경변, 비알코올성 지방간 질환), 심장 질환 (예컨대 심근 경색증, 심방 섬유증, 심장판막 섬유증, 심내막심근 섬유증), 뇌 질환 (예컨대 뇌졸중), 피부 질환 (예컨대 과잉 상처 치유, 경피증, 전신성 경화증, 켈로이드), 혈관 질환 (예컨대 아테롬성 동맥경화성 혈관 질환), 장 질환 (예컨대 크론병), 안과 질환 (예컨대 전낭하 백내장, 수정체후낭 혼탁), 근골격 연조직 구조의 질환 (예컨대, 유착 관절낭염, 듀프이트렌 구축, 골수 섬유증), 생식 기관 질환 (예컨대 자궁내막증, 페이로니병), 및 일부 감염성 질환 (예컨대 알파 바이러스, C형 간염 및 B형 간염)을 앓고 있는 인간 대상체에서 섬유증 상태를 예방, 치료, 완화 또는 반전시키기 위해 사용될 수 있다.
III. 섬유증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 및 상태에서 MASP-2의 역할
섬유증은, 통상적으로 상해 및 손상에 대한 반응으로, 기관 또는 조직에서의 과잉 연결 조직의 형성 또는 존재이다. 섬유증의 특징은 손상 후에 과잉 세포외 기질의 생성이다. 신장에서, 섬유증은 원래의 신장 손상을 유발하는 일차 신장 질환과 독립적으로 신장 기능의 감쇠를 불가피하게 유발하는 신장 실질(kidney parenchyma)상에 점진적인 해로운 연결 조직이 침착되는 것을 특징으로 한다. 소위 상피의 중간엽 전이 (epithelial to mesenchymal transition (EMT))인, 세뇨관 상피 세포가 중간엽 섬유모세포로 형질전환되는 세포의 특징적인 변화는 신장 섬유증의 원리적 메커니즘을 구성한다. 섬유증은 거의 모든 조직 및 기관 시스템에 영향을 미치고 조직 손상 또는 염증과 같은 자극에 대한 수복 또는 대체 반응으로서 발생할 수 있다. 손상에 대한 정상적인 생리적 반응은 연결 조직의 침착이지만, 이 과정이 병리적이 되면, 반흔 연결 조직에 의해 고도로 분화된 세포의 대체가 조직의 아키텍쳐 및 기능을 변경시킨다. 세포 수준에서, 상피 세포 및 섬유모세포는 증식하여 근섬유모세포로 분화하여, 기질 수축, 증가된 경직, 미세혈관 압박, 및 저산소증을 초래한다. 현재 섬유증에 대한 효율적인 치료 또는 치료법은 없지만, 동물 연구 및 일화적 인간 보고들은 모두 섬유증 조직 손상이 반전될 수 있음을 제안한다 (Tampe and Zeisberg, Nat Rev Nephrol, vol 10:226-237, 2014).
신장의 질환 (예컨대, 만성 신장 질환, IgA 신증, C3 사구체병증 및 기타 사구체신염), 폐 질환 (예컨대 특발성 폐 섬유증, 낭포성 섬유증, 기관지 확장증), 간 질환 (예컨대 간경변, 비알코올성 지방간 질환), 심장 질환 (예컨대 심근 경색증, 심방 섬유증, 심장판막 섬유증, 심내막심근 섬유증), 뇌 질환 (예컨대 뇌졸중), 피부 질환 (예컨대 과잉 상처 치유, 경피증, 전신성 경화증, 켈로이드), 혈관 질환 (예컨대 아테롬성 동맥경화성 혈관 질환), 장 질환 (예컨대 크론병), 안과 질환 (예컨대 전낭하 백내장, 수정체후낭 혼탁), 근골격 연조직 구조의 질환 (예컨대, 유착 관절낭염, 듀프이트렌 구축, 골수 섬유증), 생식 기관 질환 (예컨대 자궁내막증, 페이로니병), 및 일부 감염성 질환 (예컨대 알파 바이러스, C형 간염 및 B형 간염)을 포함하여, 많은 질환이 점진적인 기관 부전을 유발하는 섬유증을 초래한다.
섬유증이 많은 조직 및 질환에서 발생하는 한편, 그것의 병리학에 대해 공통되는 분자상 및 세포상 메커니즘들이 있다. 섬유모세포에 의한 세포외 기질의 침착은 면역 세포 침윤물, 우세하게는 단핵 세포가 수반된다 (Wynn T., Nat Rev Immunol 4(8):583-594, 2004 참조, 본원에 참조로 포함됨). 왕성한 염증 반응은 성장 인자들 (TGF-베타, VEGF, 간세포 성장 인자, 연결 조직 성장 인자), 사이토킨 및 호르몬 (엔도텔린, IL-4, IL-6, IL-13, 케모카인), 분해 효소 (엘라스타제, 기질 금속함유 단백질 분해효소, 카텝신), 및 세포외 기질 단백질 (콜라겐, 피브로넥틴, 인테그린)의 발현을 초래한다.
그에 더불어, 보체 시스템은 많은 섬유증 질환에서 활성화된다. 막 공격 복합체를 포함하여 보체 성분은 많은 섬유성 조직 견본에서 확인되었다. 예를 들어, 렉틴 경로의 성분들은 신장 질환의 섬유증 병변에서 (Satomura et al., Nephron. 92(3):702-4 (2002); Sato et al., Lupus 20(13):1378-86 (2011); Liu et al., Clin Exp Immunol, 174(1):152-60 (2013)); 간 질환의 섬유증 병변에서 (Rensen et al., Hepatology 50(6): 1809-17 (2009)); 및 폐 질환의 섬유증 병변에서 (Olesen et al., Clin Immunol 121(3):324-31 (2006)) 확인되었다.
지나친 보체 활성화는 항체 무관한 사구체신염뿐만 아니라 면역 복합체-매개 사구체신염에 대한 핵심적인 기여자로서 수립되었다. 그러나, 제어되지 않은 보체의 제자리 활성화가 비-사구체 질환의 TI 섬유증의 병리생리적 진행에 본질적으로 포함되는 것을 증명하는 강력한 증거 라인이 있다 (Quigg R.J, J Immunol 171:3319-3324, 2003, Naik A. et al., Semin Nephrol 33:575-585, 2013, Mathern D.R. et al., Clin J Am Soc Nephrol 10:P1636-1650, 2015). 국소 보체 활성화에 의해 촉발되는 강한 염증 신호는 근위 세뇨관으로 여과되고 계속해서 간질 공간(interstitial space)으로 들어가는 보체 성분들에 의해, 또는 세뇨관 또는 다른 거주 및 침윤하는 세포에 의핸 보체 성분들의 비정상적인 합성에 의해, 또는 신장 세포에서 보체 조절 단백질의 변경된 발현, 또는 보체 조절 성분들의 기능 돌연변이에 대한 부재 또는 손실 또는 획득에 의해 개시될 수 있다 (Mathern D.R. et al., Clin J Am Soc Nephrol 10:P1636-1650, 2015, Sheerin N.S., et al., FASEB J 22: 1065-1072, 2008). 예를 들어 마우스에서, 보체 조절 단백질 CR1-관련 유전자/단백질 y (Crry)의 결핍은 세뇨관 간질성 (TI) 보체 활성화를 초래하고 결과적으로 인간 TI 질환에서 볼 수 있는 손상에 전형적인 염증 및 섬유증을 초래한다 (Naik A. et al., Semin Nephrol 33:575-585, 2013, Bao L. et al., J Am Soc Nephrol 18:811-822, 2007). 세뇨관 상피 세포의 아나필라톡신 C3a에의 노출은 상피의 중간엽 전이를 초래한다 (Tsang Z. et al., J Am Soc Nephrol 20:593-603, 2009). C3a 수용체 단독을 통한 C3a 신호전달의 차단은 최근에 단백뇨성 및 비-단백뇨성 동물에서의 신장 TI 섬유증을 줄이는 것으로 밝혀졌다 (Tsang Z. et al., J Am Soc Nephrol 20:593-603, 2009, Bao L. et al., Kidney Int. 80: 524-534, 2011).
본원에서 기술되는 것과 같이, 본 발명자들은 세뇨관 신장 병리의 개시 및 질환 진행에서 렉틴 경로의 중심 역할을 확인하였고, 그로써 IgA 신증, C3 사구체병증 및 기타 사구체신염을 포함하여 다양한 범위의 신장 질환 (Endo M. et al., Nephrol Dialysis Transplant 13: 1984-1990, 1998; Hisano S. et al., Am J Kidney Dis 45:295-302, 2005; Roos A. et al., J Am Soc Nephrol 17: 1724-1734, 2006; Liu L.L. et al., Clin Exp. Immunol 174:152-160, 2013; Lhotta K. et al., Nephrol Dialysis Transplant 14:881-886, 1999; Pickering et al., Kidney International 84:1079-1089, 2013), 당뇨성 신증 (Hovind P. et al., Diabetes 54:1523-1527, 2005), 허혈성 재관류 손상 (Asgari E. et al., FASEB J 28:3996-4003, 2014) 및 이식 거부반응 (Berger S.P. et al., Am J Transplant 5:1361-1366, 2005)의 병태생리에서 렉틴 경로 활성화의 핵심적인 역할을 나타내보였다.
본원에서 추가로 기술되는 것과 같이, 본 발명자들은 MASP-2 억제가 세뇨관 간질성 질환의 마우스 모델에서 염증 및 섬유증을 감소시키는 것을 증명하였다. 그러므로, MASP-2 억제제는 세뇨관 간질성 염증 and 섬유증, 단백뇨, IgA 신증, C3 사구체병증 및 기타 사구체신염 및 신장 허혈성 재관류 손상을 포함하여, 신장 섬유증의 치료에 유용할 것으로 예상된다.
신장 질환 및 장애
미국립 신장 재단에 따르면, 2천 6백만명의 미국 성인이 만성 신장 질환 (CKD)을 앓고 있다. 대부분의 환자들은 신부전으로 이어지는 진행성 질환을 가지고 있고, 생존을 위해 적혈구 생성을 자극하는 약물로의 치료, 투석 또는 신장 이식을 필요로 한다. CKD, 고혈압의 주증상을 치료할 수 있는 여러 약물이 있지만, 현재 근본적인 원인을 해결하는 약물은 없다.
연구들은 진행성 신장 손상이 네프론(nephron)으로서 알려져 있는 신장의 하위구조의 모세관 고혈압에 의해 유발되는 것을 밝혔다 (Whitworth J.A., Annals Acad of Med, vol 34(1):2005). 네프론 (신장의 여과 단위)이 이 과정에서 손상되거나 파괴됨에 따라, 염증 및 조직 반흔이 발생하고, 네프론이 비-기능성 반흔 조직으로 대체된다. 그 결과로서, 신장의 혈액을 여과하는 능력이 시간이 지남에 따라 감소한다. 이것은 신장 섬유증으로서 언급되며, 진행성 신장 질환의 공통적인 경로이다. 초기의 손상의 성질과 무관하게, 신장 섬유증은 신장 질환이 말기 신부전으로 진행되는 공통적인 최종 경로인 것으로 여겨진다. 신장 섬유증의 개선은 다음 중 하나 이상에 의해 측정될 수 있다: 간질 부피, 콜라겐 IV 침착, 및/또는 연결 조직 성장 mRNA 수준의 평가. 본원에 기술된 화합물 및 방법은 신장 섬유증의 치료에 유용하다.
신장 섬유증 및 염증은 사실상 임의의 병인학의 후기 신장 질환의 지배적인 특징이다 (Boor et al., Boor P. et al., J of Am Soc of Nephrology 18:1508-1515, 2007 and Chevalier et al., Kidney International 75:1145-1152, 2009) 참조). 신부전은 이질적 그룹의 장애에 의해 유발될 수 있다. 진행성 신장 기능부전은 단백뇨 및 신장 기능저하를 유발한다. 환자 건강이 악화됨에 따라, 단순히 신장에 대한 손상을 미연에 방지하고 다발성 장기 부전을 예방하기 위해 투석이 필요할 수 있다. 시간이 지남에 따라, 신부전 및 신장 기능저하는 신장 기능의 전체적인, 또는 거의 전체적인, 영구적 손실인 말기 신장 질환 (ESRD)로 진행될 수 있다. 신장 질환의 형태에 따라, 신장 기능은 수일만에 또는 수주만에 상실될 수 있거나 또는 서서히 및 점차로 수십년에 걸쳐 악화될 수 있다. 일단 환자가 ESRD로 진행되고 나면, 투석 (혈액 투석 또는 복막 투석)이 사망을 방지하기 위해 필요하다. 환자는 투석 처방의 일부 형태를 유지하거나 신장 이식을 받아야 한다.
렉틴 경로의 구성요소들이 신장 질환의 섬유증 병변에서 발견되었다 (Satomura et al., Nephron. 92(3):702-4 (2002); Sato et al., Lupus 20(13):1378-86 (2011); Liu et al., Clin Exp Immunol, 174(1):152-60 (2013)). IgA 신증에서, 사구체 MBL 침착을 가진 환자들은 MBL 침착이 없는 환자들보다 더 심각한 단백뇨, 감소된 신장 기능, 저수준의 혈청 알부민, 더 심각한 조직학, 및 더 큰 고혈압을 가졌다 (Liu et al., Clin Exp Immunol. 2013 Oct;174(1):152-60). 루푸스 신염을 가진 환자들 (Sato et al., Lupus, 20(13):1378-86, 2011) 및 만성 신부전을 가진 환자들 (Satomura et al., Nephron 92(3):702-4, 2002) 또한 증가된 수준의 MBL 및 렉틴 경로 활성을 가진다.
또한 C5 결핍이 일차 세뇨관 간질성 손상, 즉 일측 뇨관 폐쇄 (UUO)의 비단백뇨성 모델에서 신장 섬유증의 주요 구성요소들의 상당한 개선을 이끌어냈음이 증명되었다 (Boor P. et al., J of Am Soc of Nephrology 18:1508-1515, 2007). 또한 C3 유전자 발현이 야생형 마우스에서 UUO 후에 증가되었고, 콜라겐 침착이 야생형 마우스에 비교하여 UUO 후에 C3-/- 마우스에서 상당히 감소된 것이 보고되었는데, 이것들은 신장 섬유증에서 보체 활성화의 역할을 시사한다 (Fearn et al., Mol Immunol 48:1666-1733, 2011: Abstract). 그러나, 본 발명자들에 의해 본원에서 기술된 발견 전에, 신장 섬유증에 포함된 보체 구성요소들은 잘 정의되지 않았다. 본원에서 실시예 14 내지 17에서 기술되는 것과 같이, 본 발명자들은 뜻밖에도 MASP-2의 결핍, 또는 렉틴 경로를 선택적으로 차단하는 한편 고전적 경로는 온전하게 남겨놓은 MASP-2의 억제 항체로의 차단이 신장 질환의 다양한 동물 모델에서 신장 섬유증으로부터 마우스를 분명하게 보호하는 것을 증명하였다.
따라서, 특정 구체예에서, 개시는 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 신장 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 신장 섬유증을 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 그런 필요가 있는 대상체에게 MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 이 방법은 신장 섬유증을 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 포함하는 조성물을 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 신장 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
MASP-2 억제 조성물은, 예컨대 진료 중 조성물의 국소 적용 또는 국소 주사에 의해, 직접적으로 또는 원격으로, 예를 들면 카테테르에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 의사에 의해 결정되는 대로 상태가 해소되거나 제어될 때까지 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, 항-MASP-2 항체)는 기저 신장 질환 또는 상태에 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양상과 조합되어 투여된다. 특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, 항-MASP-2 항체)는 투석 또는 혈장교환술(plasmapheresis) 처방과 조합되어 투여된다. 특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, 항-MASP-2 항체)는 투석 또는 혈장교환술이 요구되는 빈도를 감소시키기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, 항-MASP-2 항체)는 신장 이식과 조합되어 사용된다. 특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, 항-MASP-2 항체)는 신장 이식을 기다리는 환자에서 신장 기능저하를 제어하고 신장 기능의 추가의 감소를 예방하기 위해 사용된다.
예를 들면, 특정 구체예에서, 항-MASP-2 항체는 신장 섬유증을 억제하고 그로써 국소 분절 사구체 경화증 및 신증 증후군과 같은 사구체 질환을 치료 또는 개선 (질환의 증상을 치료 또는 개선하는 것을 포함함)하기 위해 사용된다. 치료될 수 있는 예시적인 증상들로는, 한정하는 것은 아니지만, 고혈압, 단백뇨, 고지혈증, 혈뇨 및 고콜레스테롤혈증을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 세뇨관 간질성 섬유증을 억제한다. 특정 구체예에서, 치료하는 것은 신장 기능 개선, 단백뇨 감소, 고혈압 개선, 및/또는 신장 섬유증의 감소를 포함한다. 특정 구체예에서, 치료하는 것은 (i) 신장 기능저하, 신부전, 또는 ESRD로의 진행을 지연 또는 예방하는 것; (ii) 투석에 대한 요구를 지연, 감소, 또는 예방하는 것; 또는 (iii) 신장 이식에 대한 요구를 지연 또는 예방하는 것을 포함한다.
섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 특정한 특이적 신장 질환 및 장애를 하기에 기술한다.
특정 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 신장 질환은 국소 분절 사구체 경화증 (FSGS)과 같은 사구체 질환이다. 사구체 질환은 사구체를 손상시켜서 단백질 및 때로는 적혈구가 뇨로 누출되도록 한다. 때로 사구체 질환은 또한 신장에 의한 배설물의 제거를 간섭하여서, 배설물이 혈액에 쌓이기 시작한다. 사구체 질환의 증상은 단백뇨, 혈뇨, 감소된 사구체 여과율, 저단백질혈증 및 부종을 포함한다. 상이한 많은 질환이 사구체 질환을 초래할 수 있다. 그것은 신장에 대한 감염 또는 신장에 독성인 약물의 직접적인 결과일 수 있고, 또는 전신에 영향을 미치는 질환, 예컨대 고혈압, 당뇨병 또는 루푸스로부터의 결과일 수 있다. FSGS는 한가지 특별한 사구체 질환이지만, 신장의 반흔을 특징으로 하는 이 특별환 상태라도 많은 원인이 있을 수 있다. FSGS를 가진 환자들은 전형적으로 5 내지 20년 이내에 말기 신장 질환으로 진행하지만, 공격적 형태의 질환을 가진 환자들은 2 내지 3년 이내에 ESRD로 진행된다.
특정 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 신장 질환은 당뇨성 신증 (DN)으로, 실질적인 미충족 의학적 요구가 있는 분야이다. 당뇨성 신증은 당뇨병의 합병증으로서 초래된 신장 질환 또는 손상이다. 상태는 고혈압, 고혈당 수준, 및 고콜레스테롤 및 고지질 수준에 의해 악화된다. 당뇨성 신증의 정확한 원인은 알려져 있지 않다. 그러나, 이론에 의해 구속되지 않지만, 제어되지 않는 고혈당은 조직의 섬유증 및 반흔과 같은 신장 손상의 발생을 유발하는 것으로 여겨진다. 인간에서, DN은 단백뇨, 점진적으로 감소하는 사구체 여과율 (GFR) 및 심혈관 질환에 대한 증가된 위험으로 구성된 임상 증후군으로서 나타난다. 당뇨성 단백뇨는 사구체 기저막 (GBM)의 두꺼워짐(thicking) 및 사구체간질 확대(mesangial expansion)를 포함하여, 특징적인 조직병리학적 특징들의 발생과 관련된다. 단백뇨가 진행되고 신장 기능저하가 이어짐에 따라, 사구체 경화증, 세동맥 유리질증(arteriolar hyalinosis) 및 세뇨관 간질성 섬유증이 발생한다.
따라서, 한 구체예에서, 본 개시는 MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)의 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨성 신증의 치료 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 치료하는 것은 당뇨성 신증의 하나 이상의 증상을 감소시키는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 치료하는 것은 투석의 필요를 감소, 지연 또는 제거하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 치료하는 것은 신장 이식에 대한 필요를 감소, 지연 또는 제거하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 치료하는 것은 당뇨성 신증의 신부전 또는 말기 신장 질환으로의 진행을 지연, 예방 또는 반전시키는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 신장 질환은 루푸스 신염이다. 하기에서 보다 상세하게 기술되는 것과 같이, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)의 심각한 합병증인 루푸스 신염은 MASP-2 억제제 (예컨대, 항-MASP-2 항체)로 치료될 수 있는 신장 섬유증의 또 다른 예시이다.
따라서, 한 구체예에서, 본 개시는 MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 신장 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 신장 섬유증을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 신장 질환 또는 장애는 만성 신장 질환, 만성 신부전, 사구체 질환 (예컨대, 국소 분절 사구체 경화증), 면역 복합체 장애 (예컨대, IgA 신증, 막성 신증), 루푸스 신염, 신증 증후군, 당뇨성 신증, 세뇨관 간질성 손상 및 C3 사구체병증 또는 다른 유형의 사구체신염으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
약물-유도 독성에 의해 유발된 신장 손상을 예방 또는 치료하는 방법
신장 손상의 또 다른 원인은 약물-유도 독성을 포함한다. 예를 들어, 네프로톡신은 세뇨관 상피 세포에 대해 직접적인 독성을 유발할 수 있다. 본원에서 기술되는 것과 같이, 본 발명자들은 MASP-2 결핍 마우스가 아드리아마이신-유도 신증으로부터 보호되는 것을 증명하였다.
네프로톡신은, 한정하는 것은 아니지만, 치료 약물 (예컨대 시스플라틴, 젠타마이신, 세팔로리딘, 사이클로스포린, 암포테리신, 아드리아마이신), 방사성조영 염료, 살충제 (예컨대 파라콰트), 및 환경 오염물 (예컨대 트라이클로리에틸렌 및 다이클로로아세틸렌)을 포함한다. 다른 예시는 퓨로마이신 아미노뉴클레오시드 (PAN); 아미노글리코시드, 예컨대 젠타마이신; 세팔로스포린, 예컨대 세팔로리딘; 칼시뉴린 억제자, 예컨대 타크롤리무스(tacrolimus) 또는 시롤리무스(sirolimus)를 포함한다. 약물-유도 신독성은 또한 비-스테로이드성 항염증물, 항-레트로바이러스, 항-사이토카인, 면역억제제, 발암성 약물 또는 ACE 억제자에 의해 유발될 수 있다. 약물-유도 신독성은 추가로 진통제 남용, 시프로플록사신(ciprofloxacin), 클로피도그렐(clopidogrel), 코카인, 콕스-2 억제자, 디우레틱스(diuretics), 포스카메트(foscamet), 금, 이포스파미드(ifosfamide), 면역글로빈, 차이니즈 허브, 인터페론, 리튬, 만니톨, 메살라민, 미토마이신, 니트로소우레아(nitrosoureas), 페니실라민, 페니실린, 펜타아미딘, 퀴닌, 리파민, 스트렙토조신, 설폰아미드, 티클로피딘(ticlopidine), 트라이메렌(triamterene), 발프로산, 독소루비신, 글리세롤, 시도포비어(cidofovir), 토브라마이신(tobramycin), 네오마이신 설페이트, 콜리스티메테이트(colistimethate), 반코마이신, 아미카신(amikacin), 세포탁심(cefotaxime), 시스플라틴, 아시클로비어, 리튬, 인터류킨-2, 시클로스포린 또는 인디나비어(indinavir)에 의해 유발될 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 신장 손상이 발생할 위험이 있거나 신장 손상을 앓고 있는 대상체는 신독성 효과를 가지는 하나 이상의 치료 약물을 받을 수 있다. 이 대상체들은 그러한 치료제 전에 또는 동시에 발명의 MASP-2 억제자가 투여될 수 있다. 마찬가지로, AMSP-2 억제자는 신독성을 발생시킬 가능성을 치료 또는 감소시키기 위한 치료제 후에 투여될 수 있다.
단백뇨와 관련된 질환 및 상태
단백질의 손상된 사구체 여과는 단백뇨를 초래하고 모든 만성 신장 질환에서 발생하는 네프론의 점진적 손실을 가속화하는 것으로 수립되었다 (Remuzzi and Bertani, New Eng. J Med vol 339 (20):1448-1456, 1998). 예를 들어, Eddy et al., Am J Pathol 135:719-33, 1989에서 기술된 연구에서, 알부민의 사구체 여과에는 간질 병변 및 반흔의 발생이 지속적으로 뒤따랐다. Eddy 등에 의해 1989년도에 추가로 기술된 것과 같이, 근위 세뇨관의 루미날(luminal) 표면에서 보체 C3의 침착이 단백질-과부하에 의해 유도된 신증을 가진 래트에서 관찰되었고, 이것은 사구체에 의해 여과되는 보체 시스템의 구성요소들이 간질 손상을 유발할 수 있음을 가리킨다. 보체 고갈 또는 C6의 결핍은 단백뇨성 동물 모델에서 중간엽 증식성 사구체신염, 아드리아마이신 신증, 5/6의 신장 절제 및 퓨로마이신 아미노뉴클레오티드 신증과 같은 세뇨관 간질성 손상을 개선한 것으로 증명되었다 (Boor et al., et al., J of Am Soc of Nephrology: JASN 18:1508-1515, 2007). 인간 연구는 단백뇨가 만성 신장 질환의 진행에 대한 독립적인 예측변인인 것과 단백뇨의 감소는 신장을 보호하는 것임을 나타냈다 (Ruggenenti P. et al., J Am Soc Nephrol 23:1917-1928, 2012).
따라서, 한 구체예에서, 본 개시는 대상체에서 단백뇨를 감소 또는 예방하기에 유효한 MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)의 양을 투여하는 단계를 포함하는, 단백뇨와 관련된 질환 또는 상태를 앓고 있는 대상체에서 단백뇨를 예방 또는 감소 및/또는 신장 손상을 예방 또는 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 단백뇨와 관련된 질환 또는 상태는 신증 증후군, 전-자간증, 자간증, 신장의 독성 병변, 아밀로이드증, 콜라겐 혈관성 질환 (예컨대 전신성 홍반성 루푸스), 탈수증, 사구체 질환 (예컨대 막성 사구체신염, 국소 분절 사구체신염, 최소 변화 질환, 지질성 신증), 과격한 운동, 스트레스, 양성 기립성 (자세) 단백뇨, 국소 분절 사구체 경화증, IgA 신증 (즉 버거씨병), IgM 신증, 막증식형 사구체신염, 막성 신증, 최소 변화 질환, 유육종증, 알포트 증후군, 당뇨병 (당뇨성 신증), 약물-유도된 독성 (예컨대, NSAIDS, 니코틴, 페니실라민, 리튬 카보네이트, 금 및 다른 중금속, ACE 억제제, 항생물질 또는 아편제 (예컨대 헤로인)); 파브리병, 감염 (예컨대 HIV, 매독, A형, B형 또는 C형 간염, 연쇄상구균 감염 후, 요로 주혈흡충증); 아미노산뇨증, 판코니 증후군, 고혈압성 신장 경화증, 간질성 신염, 겸세포 질환, 혈색소뇨증, 다발성 골수종, 마이오글로빈뇨증, 기관 거부 (예컨대 신장 이식 거부반응), 에볼라 출혈열, 손발톱 슬개골 증후군, 가족성 지중해열, HELLP 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 베게너 육아종증, 류머티스성 관절염, 글리코겐 저장 질환 타입 1, 굿파스쳐 증후군, Henoch-Schonlein 자반증, 신장으로 확산되는 뇨도 감염, 쇠그렌 증후군 및 감염후 사구체신염으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
간 질환
간 섬유증 (liver fibrosis 또는 hepatic fibrosis)은 간에서 반흔 조직의 축적에 의해 유발되고 간 질환의 대부분의 유형에 특징적이다. 건강한 간 조직의 반흔 조직으로의 대체는 간이 적절하게 기능하는 능력을 손상시킨다. 만약 반흔을 유발하는 상태가 치료되지 않으면, 간 섬유증은 간경변으로 진행될 수 있고 생명을 위협하는 상태인 간 부전으로 완성될 수 있다. 간 섬유증의 주요 원인은 알코올 남용, 만성 C형 간염 바이러스 감염, 비알코올성 지방간염 및 간독성 (예컨대 아세트아미노펜 또는 기타 약물에 의해 유도된 약물-유도 간 손상)이다.
렉틴 경로의 구성요소들이 간 질환의 섬유증 병변에서 발견되었다 (Rensen et al., Hepatology 50(6): 1809-17 (2009)). 예를 들어, 비알코올성 지방간염 (지방간 질환으로도 알려져 있음)에서, 보체 시스템 단백질이 광범위하게 활성화되어 있고, 그것들의 발현은 질환의 심각성과 관련되며 (Rensen et al., Hepatology 50(6): 1809-17 (2009), C3 및 C9 침착에 더불어, MBL 축적이 발견되었고, 그것은 렉틴 경로의 활성화를 확인해주는 것이다.
따라서, 특정 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 간 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 간 섬유증을 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 간 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에게 간 섬유증을 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
MASP-2 억제 조성물은 예컨대 진료 중 조성물의 국소 적용 또는 국소 주입에 의해, 직접적으로 또는 원격으로, 예를 들어 카테테르에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 의사에 의해 결정된 대로 상태가 해결될 때까지 또는 제어될 때까지 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)는 기저의 간 질환 또는 상태에 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양상과 조합되어 투여된다.
일부 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 간 질환 또는 장애는 간경변, 비알코올성 지방간 질환 (지방간염), 알코올 남용에 이차적인 간 섬유증, 급성 또는 만성 감염에 이차적인 간 섬유증, 담즙 질환 및 독성 간 손상 (예컨대 아세트아미노펜 또는 기타 약물에 의해 유도된 약물-유도 간 손상으로 인한 간독성)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
폐 질환
폐 섬유증은 폐에서 과잉의 섬유상 연결 조직의 형성 또는 발생이며, 여기서 정상 폐 조직은 섬유증 조직으로 대체된다. 이런 반흔은 폐의 강성 및 손상된 폐 구조 및 기능으로 이어진다. 인간에서, 폐 섬유증은 폐의 아주 작은 공기 주머니 (폐포) 내에 있는 및 그 사이의 조직에 대한 반복된 손상으로부터 유발되는 것으로 여겨진다. 실험 세팅에서, 다양한 동물 모델이 인간 질환의 측면들을 복제하였다. 예를 들어, 블레오마이신, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 실리카, 또는 아스베스토스와 같은 외래 작용제가 동물의 기간 안으로 주입될 수 있다 (Gharaee-Kermani et al., Animal Models of Pulmonary Fibrosis. Methods Mol. Med., 2005, 117:251-259).
따라서, 특정 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 폐 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 폐 섬유증을 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 폐 섬유증을 억제하고, 폐 섬유증을 감소시키며 및/또는 폐 기능을 개선하기에 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 폐 기능의 증상의 개선은 폐 기능 및/또는 용량의 개선, 감소된 피로, 및 산소 포화의 개선을 포함한다.
일부 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 낭포성 섬유증을 앓고 있는 대상체에서 폐 섬유증을 치료, 억제, 예방 또는 개선하는 방법을 제공한다.
MASP-2 억제 조성물은 예컨대 진료 중 조성물의 국소 적용 또는 국소 주입에 의해, 직접적으로 또는 원격으로, 예를 들어 카테테르에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 의사에 의해 결정된 대로 상태가 해결될 때까지 또는 제어될 때까지 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)는 기저의 폐 질환 또는 상태에 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양상과 조합되어 투여된다.
섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 특정한 특이적 폐 질환 및 장애가 하기에 기술된다.
특정 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 폐 질환은 만성 폐색성 폐 질환 (COPD)이다. COPD는 기도 벽이 근섬유모세포 및 콜라겐의 축적으로 섬유화되는 질환으로, 장애의 원인이고, 미국에서 사망 원인의 4위로 꼽힌다. COPD는 공기 흐름을 차단하여 증상을 앓고 있는 사람이 호흡하는 것을 점점 더 어렵게 만든다. COPD는 기도에 대한 손상에 의해 유발되고 궁극적으로는 폐의 산소와 이산화탄소의 교환을 간섭하게 된다. COPD는 만성 폐색성 기관지염 및 폐기종을 포함하고 종종 둘 다를 포함한다. 폐가 이미 손상되고 폐 기능이 이미 손상되어 있는 COPD 환자는 박테리아 및 바이러스 감염과 관련된 합병증의 위함이 증가된다.
따라서, 한 구체예에서, 본 개시는 필요로 하는 대상체에서 폐 섬유증을 억제 및/또는 감소시키기 위해 MASP-2 억제제 (예컨대, 항-MASP-2 항체)의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 만성 폐색성 폐 질환 (COPD)을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 치료하는 것은 COPD의 하나 이상의 증상을 감소시키는 것을 포함한다. COPD 및/또는 폐 섬유증의 증상은, 한정하는 것은 아니지만, 점액이 있는 기침, 활성이 약하면서 점점 악화될 수 있는 숨가쁨 (호흡곤란), 피로, 빈번한 호흡기 감염, 천명(wheezing), 흉부 압박감, 불규칙한 심장 박동 (부정맥), 호흡기 및 산소 요법의 필요성, 우측 심부전 또는 폐성심 (cor pulmonale)(만성 폐 질환으로 인한 심장 팽윤 및 심부전), 폐렴, 기흉, 심각한 체중 감소 및 영양실조를 포함한다. 증상은 또한 폐 기능의 하나 이상의 표준 테스트를 사용하여 평가되는 바 폐 기능의 감소를 포함한다.
특정 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 폐 질환은 경피증과 관련된 폐 섬유증이다. 하기에서 더 상세하게 기술되는 바와 같이, 경피증과 관련된 폐 섬유증은 MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)로 치료될 수 있는 폐 섬유증의 또 다른 예시이다.
일부 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 폐 질환 또는 장애는 만성 폐색성 폐 질환, 낭포성 섬유증, 경피증과 관련된 폐 섬유증, 기관지 확장증 및 폐 고혈압으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
심장 및 혈관 질환
많은 상이한 심장 및 혈관 병리가 공통되는 섬유화 과정에 의해 유발된다. 심장에서 섬유증 조직의 과잉 침착은 심장 병리를 초래하고, 여기서 세포외 기질 단백질의 과잉 생성은 심장의 구조, 아키텍쳐, 형상을 변경시키고 수축 기능에 영향을 미친다 (Khan and Sheppard, Immunology 118: 10-24, 2006).
연구 결과 섬유증은 허혈성, 확장형 및 비대성 심근증에서 심장 기능장애에 상당히 기여할 수 있음을 가리킨다. 예를 들어, 만성 심방세동 환자들은 심근 간질성 섬유증 수준이 대조군에 비교하여 더 높은 것으로 나타난 것이 증명되었다 (Khan and Sheppard, Immunology 118: 10-24, 2006). 다른 예로서, 미국에서 부정맥 유발성 우심실 심근증 (ARVC)의 대부분의 사례가 지방 침윤 및 반흔을 나타내는 것으로 증명되었다 (섬유지방 ARVC) (Burke et al., Circulation 97:1571-1580, 1998). ARVC를 가진 인간 대상체에서 심실의 심근의 조직병리학적 특징을 조사한 연구에서, ARVC를 가진 소아과 환자들로부터의 생검 견본에 광범위한 섬유증이 존재하는 것으로 측정되었다 (Nishikawa T. et al., Cardiovascular Pathology vol 8 (4):185-189, 1999).
따라서, 특정 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 심장 또는 혈관 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 섬유증 및/또는 염증을 예방, 치료, 복귀 (reverting), 억제 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 심장 및/또는 혈관의 섬유증을 억제하고, 및/또는 심장 및/또는 혈관의 기능을 개선하기에 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 심장판막 섬유증을 앓고 있는 대상체에서 섬유증을 치료, 억제, 예방 또는 개선하는 방법을 제공한다.
MASP-2 억제 조성물은 예컨대 진료 중 조성물의 국소 적용 또는 국소 주입에 의해, 직접적으로 또는 원격으로, 예를 들어 카테테르에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 의사에 의해 결정된 대로 상태가 해결될 때까지 또는 제어될 때까지 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)는 기저의 심장 질환, 또는 혈관 질환 또는 상태에 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양상과 조합되어 투여된다.
일부 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 심장 또는 혈관의 질환 또는 장애는 심장 섬유증, 심근 경색, 심방 섬유증, 심내막심근 섬유증, 부정맥 유발성 우심실 심근증 (ARVC), 혈관 질환, 아테롬성 동맥경화성 혈관 질환, 혈관 협착증, 재협착증, 혈관염, 정맥염, 심정맥 혈전 및 복부 대동맥류로 구성되는 군으로부터 선택된다.
만성 감염성 질환
C형 간염 및 B형 간염과 같은 만성 감염성 질환은 조직 염증 및 섬유증을 유발하고, 높은 렉틴 경로 활성은 해로울 수 있다. 그러한 질환에서 MASP-2의 억제자가 유익할 수 있다. 예를 들어, MBL 및 MASP-1 수준은 C형 간염 바이러스 (HCV) 감염에서 간 섬유증의 심각성의 유의미한 예측변인인 것으로 나타난다 (Brown et al., Clin Exp Immunol. 147(1):90-8, 2007; Saadanay et al., Arab J Gastroenterol. 12(2):68-73, 2011; Saeed et al., Clin Exp Immunol. 174(2):265-73, 2013). MASP-1은 이미 MASP-2 및 렉틴 경로의 강력한 활성화제인 것으로 밝혀졌다 (Megyeri et al., J Biol Chem. 29: 288(13):8922-34, 2013). 치군군야 바이러스(chikungunya virus) 및 로스 리버 바이러스(Ross River virus)와 같은 알파바이러스는 관절염 및 근염을 초래하는 강력한 숙주 염증 반응을 유도하고, 이런 병리는 MBL 및 렉틴 경로에 의해 매개된다 (Gunn et al., PLoS Pathog. 8(3):e1002586, 2012).
따라서, 특정 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 염증 및/또는 섬유증을 유발하는 만성 감염성 질환을 앓고 있는, 또는 이미 그것을 앓고 있는 대상체에서 섬유증 및/또는 염증을 예방, 치료, 복귀, 억제 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다.
MASP-2 억제 조성물은 예컨대 진료 중 조성물의 국소 적용 또는 국소 주입에 의해, 직접적으로 또는 원격으로, 예를 들어 카테테르에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 의사에 의해 결정된 대로 상태가 해결될 때까지 또는 제어될 때까지 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)는 기저의 만성 감염성 질환에 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양상과 조합되어 투여된다.
일부 구체예에서, 염증 및/또는 섬유증을 유발하는 만성 감염성 질환은 알파 바이러스, A형 간염, B형 간염, V형 감염, 결핵, HIV 및 인플루엔자로 구성되는 군으로부터 선택된다.
자가면역 질환:
경피증은 섬유증, 혈관의 변화, 및 자가항체를 특징으로 하는 만성 자가면역 질환이다. 여기에는 두 가지 주요 형태가 있다: 제한된 전신성 경피증 및 확산성 전신성 경피증. 제한된 전신성 결피증의 피부 증상은 손, 팔 및 얼굴에 영향을 미친다. 이 형태의 경피증을 가진 환자들은 자주 다음 합병증 중 하나 이상을 가진다: 석회증, 레이노 현상, 식도 기능장애, 손발가락 경화증 및 모세관확장증. 확산성 전신성 경피증은 신속하게 진행되고 피부 및 하나 이상의 내부 기관, 자주 신장, 식도, 심장 및/또는 폐의 큰 면적에 영향을 미친다.
경피증은 모든 기관에서, 세동맥으로 알려져 있는 작은 혈관에 영향을 미친다. 먼저, 세동맥의 내피 세포는 평활근 세포와 함께 세포자멸적으로 죽는다. 이 세포들은 콜라겐 및 다른 섬유성 물질에 의해 대체된다. 염증 세포, 특히 CD4+ 헬퍼 T 세포는 세동맥을 침윤하여 추가의 손상을 유발한다.
경피증의 피부 징후는 고통스러울 수 있고, 영향을 받은 구역의 사용 (예컨대 손, 손가락, 발가락, 발 등의 사용)을 손상시킬 수 있으며 흉하게 만들 수 있다. 피부 궤양화가 발생할 수 있고, 그러한 궤양은 감염되거나 또는 심지어 괴저가 일어나기 쉽다. 궤양화된 피부는 치유가 어렵거나 느릴 수 있다. 피부 궤양화를 치유하는 데 있어 어려움은 특히 순환계가 손상된 환자, 예컨대 레이노 현상을 나타내는 환자들에서는 악화될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 개시의 방법은 경피증, 예를 들어 경피증의 피부 증상을 치료하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 경피증을 치료하는 것은 피부 궤양화, 예컨대 손가락 궤양을 치료하는 것을 포함한다. MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체의 투여는 영향을 받은 조직 및/또는 기관에서 섬유증 및/또는 경피증의 염증성 증상을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
피부 증상/징후에 더불어, 경피증은 또한 심장, 신장, 폐, 관절 및 소화관에도 영향을 줄 수 있다. 특정 구체예에서, 경피증을 치료하는 것은 이들 조직 중 임의의 하나 이상의 조직에서의 질환의 증상을, 예컨대 섬유증 및/또는 염증성 증상을 감소시킴으로써 치료하는 것을 포함한다. 폐의 문제는 그 중에서도 가장 심각한 경피증의 합병증이며 질환과 관련된 사망률의 대부분의 원인이 된다. 경피증과 관련된 두 가지의 두드러진 폐 상태는 폐 섬유증 및 폐 고혈압이다. 폐가 포함된 화자는 어느 하나 또는 두 가지 상태를 모두 가질 수 있다. 경피증과 관련된 폐 섬유증은 MASP-2 억제제로 치료될 수 있는 폐 섬유증의 한 예이다. 폐를 포함하는 경피증은 반흔 (폐 섬유증)을 유발한다. 그런 폐 섬유증은 경피증 환자의 약 70%에서 발생하지만, 그것의 진행은 전형적으로 느리고 증상은 심각성의 관점에서 볼 때 환자마다 광범위하게 다르다. 폐 섬유증과 관련된 증상을 가지는 환자들에 대해, 증상은 마른 기침, 숨가쁨, 및 감소된 운동 능력을 포함한다. 어느 정도 수준의 폐 섬유증을 가진 환자들의 약 16%가 심각한 폐 섬유증으로 발달한다. 심각한 폐 섬유증을 가진 환자들은 폐 기능 및 폐포염에서 유의미한 감소를 경험한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 경피증, 예를 들어 경피증과 관련된 폐 섬유증을 치료하기 위해 사용된다. MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체의 투여는 폐에서 경피증의 섬유증 증상을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 방법은 폐 기능을 개선하고 및/또는 경피증으로 인한 사망 위험을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
신장 관련은 또한 경피증 환자들에서 공통적이다. 경피증과 관련된 신장 섬유증은 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체의 투여에 의해 치료될 수 있는 신장 섬유증의 한 예시이다. 특정 구체예에서, 본 개시는 경피증, 예를 들어 경피증과 관련된 신장 섬유증을 치료하기 위해 사용된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체의 투여는 신장에서 경피증의 섬유증 증상을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 방법은 신장 기능을 개선하기 위해, 뇨에서 단백질을 감소시키기 위해, 고혈압을 감소시키기 위해, 및/또는 치명적인 신부전을 유발할 수 있는 신장 위기의 위험을 감소시키기 위하여 사용될 수 있다.
전신성 홍반성 루푸스 (SLE)는 자발적인 B 및 T 세포 자가반응 및 다중기관 면역 손상을 특징으로 하고 피부, 관절, 신장, 및 다른 기관에 영향을 줄 수 있는 만성, 염증성 자가면역 장애이다. SLE를 가진 거의 모든 사람들은 관절 통증이 있고 대부분 관절염이 발생한다. 빈번하게 영향을 받는 관절은 손가락, 손, 손목, 및 무릎이다. SLE의 일반적인 증상은 피로; 일반적인 불편함, 거북함 또는 아픈 느낌 (불안감); 관절 통증 및 팽윤; 근육통; 오심 및 구토; 및 피부 발진을 포함한다. 추가적으로 증상은 또한 복부 통증; 혈뇨; 압박을 받거나 저온에서 색이 변하는 손가락; 저림 및 얼얼함; 및 피부의 적색 반점을 포함할 수 있다. 일부 환자에서, SLE는 폐 또는 신장이 포함된다. 이론에 구속되지는 않지만, 폐 및 신장에서의 염증 및/또는 섬유증은 그 기관들을 손상시키고 폐 및/또는 신장 손상과 관련된 증상들을 유발시킨다. 일부 경우에, SLE를 가진 환자들은 루푸스 신염으로 불리는 특별한 신장 상태를 나타낸다. 특정 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, SLE를 치료하는 방법을 제공한다. MASP-2 억제 항체를 투여하는 것은 SLE의 하나 이상의 증상을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 항-MASP-2 항체를 투여하는 것은 루푸스 신염을 가진 환자에서 SLE를 치료하기 위해 사용된다. 그런 경우에, SLE를 치료하는 것은 루푸스 신염을, 예컨대 루푸스 신염의 증상을 감소시킴으로써 치료하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 치료하는 것은 SLE의 피부 증상을 치료하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 치료하는 것은 루푸스 신염의 하나 이상의 증상을 감소시키는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 치료하는 것은 투석에 대한 필요를 감소, 지연 또는 제거하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 치료하는 것은 신장 이식에 대한 필요를 감소, 지연 또는 제거하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 치료하는 것은 루푸스 신염의 신부전 또는 말기 신장 질환으로의 진행을 지연 또는 예방하는 것을 포함한다.
루푸스 신염은 신장의 염증이고, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)의 심각한 합병증이다. 신장에서, 루푸스 신염은 기능을 약화시키는 손실로 이어질 수 있다. 루푸스 신염을 가진 환자들은 궁극적으로 신부전을 나타낼 수 있고 투석 또는 신장 이식을 필요로 할 수 있다. 개시된 방법을 사용하여 또한 치료될 수 잇는 관련된 합병증은 간질성 신염 및 신증 증후군을 포함한다. 루푸스 신염의 증상은 혈뇨, 뇨의 거품 발생, 고혈압, 단백뇨, 체액 잔류 및 부종을 포함한다. 다른 증상들로는 신장 섬유증 및/또는 신부전의 신호 및 증상을 포함한다. 만약 치료되지 않은 채로 방치되면, 루푸스 신염은 신부전, 및 심지어 말기 신장 질환으로 이어질 수 있다.
따라서, 특정 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 및/또는 염증을 유발하거나 악화시키는 자가면역 질환을 앓고 있는 대상체에서 섬유증 및/또는 염증을 예방, 치료, 복귀, 억제 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 섬유증을 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
MASP-2 억제 조성물은 예컨대 진료 중 조성물의 국소 적용 또는 국소 주입에 의해, 직접적으로 또는 원격으로, 예를 들어 카테테르에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 의사에 의해 결정된 대로 상태가 해결될 때까지 또는 제어될 때까지 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)는 기저의 자가면역 질환에 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양상과 조합되어 투여된다.
일부 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증을 유발하거나 악화시키는 자가면역 질환은 경피증 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
중추신경계 질환 및 상태:
특정 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 중추신경계의 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 섬유증 및/또는 염증을 예방, 치료, 복귀, 억제 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 섬유증 및/또는 염증을 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
MASP-2 억제 조성물은 예컨대 진료 중 조성물의 국소 적용 또는 국소 주입에 의해, 직접적으로 또는 원격으로, 예를 들어 카테테르에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 의사에 의해 결정된 대로 상태가 해결될 때까지 또는 제어될 때까지 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)는 기저의 중추신경계의 질환 또는 장애에 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양상과 조합되어 투여된다.
일부 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 중추신경계의 질환 또는 장애는 뇌졸중, 외상성 뇌 손상 및 척수 손상으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
피부 질환 및 상태
특정 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 피부 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 섬유증 및/또는 염증을 예방, 치료, 복귀, 억제 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 섬유증 및/또는 염증을 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
MASP-2 억제 조성물은 예컨대 조성물의 피부에의 국소 적용에 의해, 또는 진료 중 국소 적용 또는 국소 주입에 의해, 직접적으로 또는 원격으로, 예를 들어 카테테르에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 국소 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 의사에 의해 결정된 대로 상태가 해결될 때까지 또는 제어될 때까지 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)는 기저의 피부 질환 또는 장애에 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양상과 조합되어 투여된다.
일부 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 피부 질환 또는 장애는 피부 섬유증, 상처 치유, 경피증, 전신성 경화증, 켈로이드, 연결 조직 질환, 반흔 및 비후성 반흔으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
근골격 뼈 및 연조직 장애 및 상태
특정 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 뼈 또는 연조직 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 섬유증 및/또는 염증을 예방, 치료, 복귀, 억제 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 섬유증 및/또는 염증을 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
MASP-2 억제 조성물은 예컨대 조성물의 뼈 또는 연조직 구조에의 국소 적용에 의해, 또는 진료 중 국소 적용 또는 국소 주입에 의해, 직접적으로 또는 원격으로, 예를 들어 카테테르에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 국소 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 의사에 의해 결정된 대로 상태가 해결될 때까지 또는 제어될 때까지 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)는 기저의 뼈 또는 연조직 질환 또는 장애에 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양상과 조합되어 투여된다.
일부 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 뼈 또는 연조직 질환 또는 장애는 예를 들어 낭포성 섬유증과 관련된 골다공증 및/또는 골연화증, 뼈 섬유증이 증가된 골수이형성 상태, 유착 관절낭염, 듀프이트렌 구축, 골수 섬유증으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
관절 질환 및 상태
특정 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 관절 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 섬유증 및/또는 염증을 예방, 치료, 복귀, 억제 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 섬유증 및/또는 염증을 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
MASP-2 억제 조성물은 예컨대 조성물의 관절에의 국소 적용에 의해, 또는 진료 중 국소 적용 또는 국소 주입에 의해, 직접적으로 또는 원격으로, 예를 들어 카테테르에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 국소 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 의사에 의해 결정된 대로 상태가 해결될 때까지 또는 제어될 때까지 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)는 기저의 관절 질환 또는 장애에 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양상과 조합되어 투여된다.
일부 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 관절 질환 또는 장애는 관절섬유증이다.
소화성 질환 및 상태
특정 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 소화성 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 섬유증 및/또는 염증을 예방, 치료, 복귀, 억제 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 섬유증 및/또는 염증을 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
MASP-2 억제 조성물은 예컨대 진료 중 국소 적용 또는 국소 주입에 의해, 직접적으로 또는 원격으로, 예를 들어 카테테르에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 국소 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 의사에 의해 결정된 대로 상태가 해결될 때까지 또는 제어될 때까지 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)는 기저의 소화성 질환 또는 장애에 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양상과 조합되어 투여된다.
일부 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 소화성 질환 또는 장애는 크론병, 궤양성 대장염 및 췌장 섬유증으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
안과 질환 및 상태
특정 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 안과 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 섬유증 및/또는 염증을 예방, 치료, 복귀, 억제 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 섬유증 및/또는 염증을 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
MASP-2 억제 조성물은 예컨대 진료 중 국소 적용 또는 국소 주입에 의해, 직접적으로 또는 원격으로, 예를 들어 카테테르에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 눈에의 국소 투여에 의해 (예컨대 점안액으로서), 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 의사에 의해 결정된 대로 상태가 해결될 때까지 또는 제어될 때까지 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)는 기저의 안과 질환 또는 장애에 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양상과 조합되어 투여된다.
일부 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 안과 질환 또는 장애는 전낭하 백내장, 수정체후낭 혼탁, 황반 변성, 및 망막 및 유리체 망막증으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
생식 기관의 질환 및 상태
특정 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 생식기 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 섬유증 및/또는 염증을 예방, 치료, 복귀, 억제 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 섬유증 및/또는 염증을 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
MASP-2 억제 조성물은 예컨대 진료 중 국소 적용 또는 국소 주입에 의해, 직접적으로 또는 원격으로, 예를 들어 카테테르에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 국소 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 의사에 의해 결정된 대로 상태가 해결될 때까지 또는 제어될 때까지 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)는 기저의 생식기 질환 또는 장애에 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양상과 조합되어 투여된다.
일부 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 생식기 질환 또는 장애는 자궁내막증 및 페이로니병으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
외상 관련 반흔
특정 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 외상 관련 반흔으로부터 유발된 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 섬유증 및/또는 염증을 예방, 치료, 복귀, 억제 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 섬유증 및/또는 염증을 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
MASP-2 억제 조성물은 예컨대 진료 중 국소 적용 또는 국소 주입에 의해, 직접적으로 또는 원격으로, 예를 들어 카테테르에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 국소 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 의사에 의해 결정된 대로 상태가 해결될 때까지 또는 제어될 때까지 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)는 기저의 질환 또는 장애에 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양상과 조합되어 투여된다.
일부 구체예에서, 외상 관련 반흔은 수술 합병증 (예컨대 반흔 조직이 내부 기관 사이에서 형성될 수 있어서 구축, 통증을 유발할 수 있고 불임을 유발할 수 있는 수술 유착), 화학요법 약물-유도된 섬유증, 방사선-유도된 섬유증 및 화상과 관련된 반흔으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 추가의 질환 및 장애
특정 구체예에서, 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 기관 이식, 유방 섬유증, 근육 섬유증, 복막뒤 섬유증, 갑상선 섬유증, 림프절 섬유증, 방광 섬유증 및 늑막 섬유증으로 구성되는 군으로부터 선택된 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 섬유증 및/또는 염증을 예방, 치료, 복귀, 억제 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 섬유증 및/또는 염증을 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
MASP-2 억제 조성물은 예컨대 진료 중 국소 적용 또는 국소 주입에 의해, 직접적으로 또는 원격으로, 예를 들어 카테테르에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 눈에의 국소 투여에 의해 (예컨대 점안액으로서), 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 의사에 의해 결정된 대로 상태가 해결될 때까지 또는 제어될 때까지 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)는 기저의 질환 또는 장애에 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양상과 조합되어 투여된다.
본원에 기술된 다양한 방법 및 제약학적 조성물 중 임의의 것의 특정 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 렉틴 경로를 선택적으로 차단하는 한편, 고전적 경로는 온전하게 남겨둔다.
IV. MASP-2 억제제
다양한 측면으로, 본 발명은 MASP-2 억제제를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 섬유증 및/또는 염증의 부작용을 억제하는 방법을 제공한다. MASP-2 억제제는 살아있는 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양으로 투여된다. 본 발명의 이런 측면을 실행할 때, 대표적인 MASP-2 억제제는 MASP-2의 생물학적 활성을 억제하는 분자 (예컨대, 소분자 억제자, 항-MASP-2 항체 (예컨대, MASP-2 억제 항체) 또는 MASP-2와 상호작용하거나 또는 단백질-단백질 상호작용을 간섭하는 차단 펩타이드), 및 MASP-2의 발현을 감소시키는 분자 (예컨대, MASP-2 안티센스 핵산 분자, MASP-2 특이적 RNAi 분자 및 MASP-2 리보자임)를 포함하며, 이로 인해 MASP-2가 렉틴 보체 경로를 활성화시키는 것을 방지한다. MASP-2 억제제는 1차 요법으로서 단독으로 또는 보조 요법으로서 다른 치료제와 조합하여 사용되어 다른 의학적 처리의 치료적 이점을 향상시킬 수 있다.
MASP-2-의존적 보체 활성화의 억제는 발명의 방법에 따라 MASP-2 억제제의 투여의 결과로서 일어나는 보체 시스템의 구성요소에서의 다음의 변화 중 적어도 하나를 특징으로 한다: MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템 생성물 C4b, C3a, C5a 및/또는 C5b-9 (MAC)의 생성 또는 생성의 억제 (예를 들어, 실시예 2에서 기술된 바와 같이 측정됨), C4 절단 및 C4b 침착의 감소 (예를 들어, 실시예 2에서 기술된 바와 같이 측정됨), 또는 C3 절단 및 C3b 침착의 감소 (예를 들어, 실시예 2에서 기술된 바와 같이 측정됨).
본 발명에 따르면, MASP-2 억제제는 섬유증 및/또는 염증을 억제하는 데 효과적이고, 검출 가능한 항섬유증 활성을 나타내며 및/또는 섬유증의 감소를 유도한다. 발명의 맥락 내에서, 항-섬유증 활성은 다음 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다: (1) 예를 들어 대식세포 및 내피 세포의 활성화 및 보충; 많은 사이토카인/케모카인의 분비를 통한 림프구 및/또는 호산구의 보충 및 활성화; 세포독성 매개자 및 섬유 형성 사이토카인의 방출에 의해 평가되는 바, 염증의 감소; (2) 세포 증식의 감소, ECM 합성 또는 맥관형성, 및/또는 (3) MASP-2 억제제의 부재시에 섬유증 활성과 비교하여 콜라겐 침착의 감소.
항섬유화제, 예컨대 MASP-2 억제제의 평가는 숙련된 사람들에게 공지되어 있는 임의의 기법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 항섬유화제의 평가는 UUO 모델에서 평가될 수 있다 (본원의 실시예 12 및 14에서 기술됨). 만약 검출 가능한 항섬유증 활성 및/또는 섬유증의 축소 또는 감소가 MASP-2 억제제를 사용하여 평가된다면, 그러한 MASP-2 억제제는 섬유증을 예방, 치료, 복귀 및/또는 억제하기 위한 약으로서 사용될 수 있다고 할 수 있다.
섬유증의 평가는 주기적으로, 예컨대 각각의 주에, 또는 각각의 달에 수행될 수 있다. 섬유증의 증가/감소 및/또는 항섬유증 활성의 존재는 그러므로 주기적으로, 예컨대 각각의 주에, 또는 각각의 달에 평가될 수 있다. 이런 평가는 바람직하게는 주어진 대상체에 대해 여러 시점에 또는 주어진 대상체 및 건강한 대조군에 대해 1회 또는 여러 시점에 수행된다. 평가는 규칙적인 시간 간격으로, 예컨대 각각의 주에, 또는 각각의 달에 수행될 수 있다. 평가는 그러므로 규칙적으로, 예컨대 각각의 주에, 또는 각각의 달에 평가될 수 있다. 1회 평가가 섬유증의 감소 또는 항섬유증 활성의 존재의 발견을 이끌어냈을 때, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체는 검출 가능한 항섬유증 활성을 나타내고 및/또는 섬유증의 축소 또는 감소를 유도한 것이라고 할 수 있다.
발명의 이런 측면의 실행에 유용한 MASP-2 억제제는, 예를 들어, MASP-2 항체 및 이것의 단편, MASP-2 억제 펩타이드, 소분자, MASP-2 가용성 수용체 및 발현 억제자를 포함한다. MASP-2 억제제는 MASP-2의 생물학적 기능을 차단함으로써 MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템을 억제할 수 있다. 예를 들어, 억제제는 효과적으로 MASP-2 단백질-대-단백질 상호작용을 차단하거나, MASP-2 다이머화 또는 조립을 간섭하거나, Ca2+ 결합을 차단하거나, MASP-2 세린 프로테아제 활성 부위를 간섭하거나, 또는 MASP-2 단백질 발현을 감소시킬 수 있다.
일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 보체 활성화를 선택적으로 억제하여, C1q-의존적 보체 활성화 시스템을 기능적으로 온전하게 남겨둔다.
한 구체예에서, 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제제는 보체 시스템의 다른 항원보다 적어도 10배 더 높은 친화도로 SEQ ID NO:6을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 특이적 MASP-2 억제제이다. 다른 구체예에서, MASP-2 억제제는 보체 시스템의 다른 항원보다 적어도 100배 더 높은 결합 친화도로 SEQ ID NO:6을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 (i) CCP1-CCP2 도메인 (SEQ ID NO:6의 aa 300-431) 또는 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:6의 aa 445-682) 중 적어도 하나에 특이적으로 결합하고 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 MASP-2에 특이적으로 결합하는 그것의 단편이다. MASP-2 억제제의 결합 친화도는 적합한 결합 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
MASP-2 폴리펩타이드는 C1 보체 시스템의 프로테아제인 MASP-1, MASP-3, 및 C1r 및 C1s와 유사한 분자 구조를 나타낸다. SEQ ID NO:4에서 제시된 cDNA 분자는 MASP-2 (SEQ ID NO:5에서 제시된 아미노산 서열로 구성됨)의 대표적인 예를 암호화하고 분비 후 절단되는 리더 서열 (aa 1-15)을 가진 인간 MASP-2 폴리펩타이드를 제공하며, 성숙한 형태의 인간 MASP-2 (SEQ ID NO:6)를 발생시킨다. 도 2에서 도시된 바와 같이, 인간 MASP 2 유전자는 12개의 엑손을 포함한다. 인간 MASP-2 cDNA는 엑손 B, C, D, F, G, H, I, J, K 및 L에 의해 암호화된다. 대체 스플라이스(splice)는 도 2에서 도시된 바와 같이 MBL-관련 단백질 19 ("MAp19", "sMAP"로도 불림) (SEQ ID NO:2)로 불리고, 엑손 B, C, D 및 E로부터 발생한 (SEQ ID NO:1)에 의해 암호화된 20 kDa 단백질을 발생시킨다. SEQ ID NO:50에서 제시된 cDNA 분자는 쥐과 MASP-2 (SEQ ID NO:51에서 제시된 아미노산 서열로 구성됨)를 암호화하고 분비 후 절단되는 리더 서열을 가진 쥐과 MASP-2 폴리펩타이드를 제공하며, 성숙한 형태의 쥐과 MASP-2 (SEQ ID NO:52)를 발생시킨다. SEQ ID NO:53에서 제시된 cDNA 분자는 래트 MASP-2 (SEQ ID NO:54에서 제시된 아미노산 서열로 구성됨)를 암호화하고, 분비 후 절단되는 리더 서열을 가진 래트 MASP-2 폴리펩타이드를 제공하며, 성숙한 형태의 래트 MASP-2 (SEQ ID NO:55)를 발생시킨다.
당업자는 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:50 및 SEQ ID NO:53에서 개시된 서열이 각각 인간, 쥐과 및 래트 MASP-2의 단일 대립 유전자를 나타내고, 대립 유전자 변이 및 대체 스플라이싱(splicing)이 일어날 것으로 예상된다는 것을 인식할 것이다. 침묵(silent) 돌연변이를 포함하는 것과 돌연변이가 아미노산 서열 변화를 초래하는 것을 포함한, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:50 및 SEQ ID NO:53에서 나타난 뉴클레오타이드 서열의 대립 유전자 변종은 본 발명의 범위 내에 있다. MASP-2 서열의 대립 유전자 변종은 표준 과정에 따라 상이한 개체의 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로빙함으로써 클로닝될 수 있다.
인간 MASP-2 단백질의 도메인 (SEQ ID NO:6)은 도 1 및 도 2A에 도시되고 N-말단 C1r/C1s/성게 Vegf/골 형성 단백질 (CUBI) 도메인 (SEQ ID NO:6의 aa 1-121), 표피 성장 인자-유사 도메인 (aa 122-166), 제2 CUBI 도메인 (aa 167-293), 뿐만 아니라 보체 제어 단백질 도메인 및 세린 프로테아제 도메인의 탠덤을 포함한다. MASP 2 유전자의 대체 스플라이싱은 도 1에서 나타낸 MAp19를 발생시킨다. MAp19는 도 1에서 나타낸 바와 같이 엑손 E로부터 유래된 네 개의 추가적인 잔기 (EQSL)를 가진 MASP-2의 N-말단 CUBI-EGF 영역을 포함하는 비효소 단백질이다.
여러 단백질이 MASP-2에 결합하거나, 또는 단백질-대-단백질 상호작용을 통해 이것과 상호작용하는 것으로 나타났다. 예를 들어, MASP-2는 렉틴 단백질 MBL, H-피콜린 및 L-피콜린에 결합하여, 이것들과 Ca2+ 의존성 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 각각의 MASP-2/렉틴 복합체는 단백질 C4 및 C2의 MASP-2-의존적 절단을 통해 보체를 활성화시키는 것으로 나타났다 (Ikeda, K., et　al., J. Biol. Chem.　262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., et　al., J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., et　al., J.　Immunol. 168:3502-3506, 2002). 연구는 MASP-2의 CUBI-EGF 도메인이 MASP-2와 MBL의 회합에 필수적이라는 것을 보여주었다 (Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166:5068, 2001). 또한 CUBIEGFCUBII 도메인이 MASP-2의 다이머화를 매개하며, 이것은 활성 MBL 복합체의 형성에 필요한 것으로 나타났다 (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 275:30962-30969, 2000). 그러므로, MASP-2-의존적 보체 활성화에 중요한 것으로 알려져 있는 MASP-2 표적 영역에 결합하거나 또는 이것을 간섭하는 MASP-2 억제제가 확인될 수 있다.
항-MASP-2 항체
본 발명의 이 측면의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템을 억제하는 항-MASP-2 항체를 포함한다. 본 발명의 이 측면에 유용한 항-MASP-2 항체는 임의의 항체 생성 포유동물로부터 유래된 다클론성, 단클론성 또는 재조합 항체를 포함하고 다중특이적, 키메라, 인간화된, 항-이디오타입, 및 항체 단편일 수 있다. 항체 단편은 본원에서 추가로 기술된 바와 같이 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv 단편, scFv 단편 및 단일 사슬 항체를 포함한다.
MASP-2 항체는 본원에서 기술된 검정을 사용하여 MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템을 억제하는 능력에 대하여 및 항섬유증 활성 및/또는 단백뇨 또는 아드리아마이신-유도 신증과 관련된 신장 손상을 억제하는 능력에 대하여 스크리닝될 수 있다. 여러 MASP-2 항체들이 문허에 기술되어 있고 일부는 새롭게 생성되었는데, 그 중 일부가 하기 표 1에서 열거된다. 예를 들어, 본원에서 실시예 10 및 11에서 기술된 바와 같이, MASP-2 의존적 보체 활성화를 차단하는 항-MASP-2 Fab2 항체가 확인되었다. 실시예 12에서 기술되는 것과 같이, 또한 본원에 참조로 포함되는 WO2012/151481에서 기술되는 것과 같이, MASP-2-의존적 보체 활성화를 차단하는 전체 인간 MASP-2 scFv 항체 (예컨대, OMS646)가 확인되었다. 실시예 13에서 기술되는 것과 같이, 또한 본원에 참조로 포함되는 WO2014/144542에서 기술되는 것과 같이, MASP-2 억제 활성을 가지는 SGMI-2 펩타이드-포함 MASP-2 항체 및 그것의 단편은 SGMI-2 펩타이드 아미노산 서열 (SEQ ID NO:72, 73 or 74)을 인간 MASP-2 항체 (예컨대, OMS646-SGMI-2)의 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노 또는 카르복시 말단에 융합시킴으로써 생성되었다.
따라서, 한 구체예에서, 발명의 방법에 사용하기 위한 MASP-2 억제제는 인간 항체, 예컨대 OMS646을 포함한다. 따라서, 한 구체예에서, 청구된 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 MASP-2 억제제는 인간 MASP-2 (SEQ ID NO:6)로 구성되는 폴리펩타이드에 결합하는 인간 항체를 포함하고, 여기서 항체는 (I) (a) i) SEQ ID NO:67의 31 내지 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; ii) SEQ ID NO:67의 50 내지 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO:67의 95 내지 107의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; (b) i) SEQ ID NO:69의 24 내지 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; ii) SEQ ID NO:69의 50 내지 65의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO:69의 89 내지 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) SEQ ID NO:67에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대, SEQ ID NO:67에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:69에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 그것의 변종을 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 SEQ ID NO:67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:69에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 SEQ ID NO:67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:69에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 참조 항체 OMS646에 의해 인식된 인간 MASP-2 상의 에피토프의 적어도 일부를 특이적으로 인식하는 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 발명의 방법에 사용하기 위한 MASP-2 억제제는 인간 항체 OMS646을 포함한다.
예시의 MASP-2 특이적 항체
항원 항체 유형 참고문헌
재조합 MASP-2 래트 다클론성 Peterson, S.V.,　et　al., Mol. Immunol.　37:803-811, 2000
재조합 인간 CCP1/2-SP 단편 (MoAb 8B5) 래트 MoAb
(하위 부류 IgG1)		 Moller-Kristensen, M.,　et　al., J. of Immunol. Methods 282:159-167, 2003
재조합 인간 MAp19 (MoAb 6G12) (MASP-2와 교차 반응함) 래트 MoAb
(하위 부류 IgG1)		 Moller-Kristensen, M.,　et　al., J. of Immunol. Methods 282:159-167, 2003
hMASP-2 마우스 MoAb (S/P)
마우스 MoAb (N-말단)		 Peterson, S.V.,　et　al., Mol. Immunol.　35:409, April 1998
hMASP-2 (CCP1-CCP2-SP 도메인 래트 MoAb: Nimoab101, 하이브리도마 세포주 03050904 (ECACC)에 의해 생성됨 WO 2004/106384
hMASP-2 (전체 길이-his 태그됨) 쥐과 MoAb:
하이브리도마 세포주 M0545YM035 (DSMZ)에 의해 생성된 NimoAb104

하이브리도마 세포주 M0545YM029 (DSMZ)에 의해 생성된 NimoAb108

하이브리도마 세포주 M0545YM046 (DSMZ)에 의해 생성된 NimoAb109

하이브리도마 세포주 M0545YM048 (DSMZ)에 의해 생성된 NimoAb110		 WO 2004/106384
래트 MASP-2 (전체 길이) MASP-2 Fab2 항체 단편 실시예 10
hMASP-2 (전체 길이) 전체 인간 scFv 클론 실시예 12 및 WO2012/151481
hMASP-2 (전체 길이) SGMI-2 펩타이드 포함 MASP-2 항체 실시예 13 및 WO2014/144542
감소된 이펙터 기능을 가지는 항-MASP-2 항체
발명의 본 측면의 일부 구체예에서, 항-MASP-2 항체는 고전적 보체 경로의 활성화로부터 발생할 수 있는 염증을 감소시키기 위해 감소된 이펙터 기능을 갖는다. IgG 분자가 고전적 보체 경로를 촉발할 수 있는 능력은 분자의 Fc 부분 내에 존재하는 것으로 나타났다 (Duncan, A.R., et al., Nature 332:738-740 1988). 분자의 Fc 부분이 효소적 절단에 의해 제거된 IgG 분자는 이런 이펙터 기능이 없다 (Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988 참조). 따라서, 감소된 이펙터 기능을 가진 항체는 이펙터 기능을 최소화하거나 인간 IgG2 또는 IgG4 아이소타입 중 어느 것인 유전적으로 엔지니어링된 Fc 서열을 가짐으로써 분자의 Fc 부분의 결핍의 결과로서 생성될 수 있다.
감소된 이펙터 기능을 가진 항체는 본원에서 기술된 바와 같이 IgG 중쇄의 Fc 부분의 표준 분자 생물학적 조작에 의해 생성될 수 있고 또한 Jolliffe et al., Int'l Rev. Immunol. 10:241-250, 1993, 및 Rodrigues et al., J. Immunol. 151:6954-6961, 1998에서 기술되어 있다. 감소된 이펙터 기능을 가진 항체는 또한 보체를 활성화시키고 및/또는 Fc 수용체와 상호작용하는 능력이 감소된 인간 IgG2 및 IgG4 아이소타입을 포함한다 (Ravetch, J.V., et　al., Annu. Rev. Immunol.　9:457-492, 1991; Isaacs, J.D.,　et　al., J. Immunol. 148:3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G., et　al., Immunol. Today　14:215-221, 1993). IgG2 또는 IgG4 아이소타입으로 구성된 인간 MASP-2에 특이적인 인간화된 또는 완전한 인간 항체는 당업자에게 공지된 여러 방법 중 하나에 의해 생성될 수 있으며, Vaughan, T.J., et al., Nature Biotechnical 16:535-539, 1998에서 기술된 바와 같다.
항-MASP-2 항체의 생성
항-MASP-2 항체는 MASP-2 폴리펩타이드 (예컨대, 전체 길이 MASP-2)를 사용하여 또는 항원성 MASP-2 에피토프-함유 펩타이드 (예컨대, MASP-2 폴리펩타이드의 일부)를 사용하여 생성될 수 있다. 면역원성 펩타이드는 5개의 아미노산 잔기만큼 작을 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO:6의 전체 아미노산 서열을 포함하는 MASP-2 폴리펩타이드는 본 발명의 방법에 유용한 항-MASP-2 항체를 유도하는데 사용될 수 있다. 단백질-단백질 상호작용에 포함된 것으로 공지되어 있는 특정 MASP-2 도메인, 예컨대 CUBI, 및 CUBIEGF 도메인, 뿐만 아니라 세린-프로테아제 활성 부위를 포함하는 영역은 실시예 3에서 기술된 바와 같이 재조합 폴리펩타이드로서 발현되고 항원으로서 사용될 수도 있다. 또한, MASP-2 폴리펩타이드 (SEQ ID NO:6)의 적어도 6개의 아미노산의 일부를 포함하는 펩타이드는 또한 MASP-2 항체를 유도하는데 유용하다. MASP-2 항체를 유도하는데 유용한 MASP-2 유래 항원의 추가적인 예는 하기 표 2에서 제공된다. 항체를 발생시키는데 사용된 MASP-2 펩타이드 및 폴리펩타이드는 본원에서 추가로 기술되는 것과 같이, 천연 폴리펩타이드, 또는 재조합 또는 합성 펩타이드 및 촉매 비활성 재조합 폴리펩타이드, 예컨대 MASP-2A로서 분리될 수 있다. 본 발명의 이 측면의 일부 구체예에서, 항-MASP-2 항체는 본원에서 기술되는 것과 같이 형질도입 마우스 계통을 사용하여 얻어진다.
항-MASP-2 항체를 생성하는데 유용한 항원은 또한 융합 폴리펩타이드, 예컨대 MASP-2 또는 이것의 일부와 면역글로불린 폴리펩타이드 또는 말토오스-결합 단백질의 융합체를 포함한다. 폴리펩타이드 면역원은 전체 길이 분자 또는 이것의 일부일 수 있다. 폴리펩타이드 일부가 합텐-유사한 경우, 이러한 일부는 유리하게는 면역화를 위해 고분자 담체 (예컨대, 키홀 림펫 헤모사이아닌 (keyhole limpet hemocyanin; KLH), 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid))에 결합되거나 연결될 수 있다.
MASP-2 유래 항원
SEQ ID NO: 아미노산 서열
SEQ ID NO:6 인간 MASP-2 단백질
SEQ ID NO:51 쥐과 MASP-2 단백질
SEQ ID NO:8 인간 MASP-2의 CUBI 도메인
(SEQ ID NO:6의 aa 1-121)
SEQ ID NO:9 인간 MASP-2의 CUBIEGF 도메인
(SEQ ID NO:6의 aa 1-166)
SEQ ID NO:10 인간 MASP-2의 CUBIEGFCUBII 도메인
(SEQ ID NO:6의 aa 1-293)
SEQ ID NO:11 인간 MASP-2의 EGF 도메인
(SEQ ID NO:6의 aa 122-166)
SEQ ID NO:12 인간 MASP-2의 세린-프로테아제 도메인
(SEQ ID NO:6의 aa 429-671)
SEQ ID NO:13
GKDSCRGDAGGALVFL		 세린-프로테아제 비활성화된 돌연변이 형태
(돌연변이된 Ser 618을 가진 SEQ ID NO:6의 aa 610-625)
SEQ ID NO:14
TPLGPKWPEPVFGRL		 인간 CUBI 펩타이드
SEQ ID NO:15: TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ 인간 CUBI 펩타이드
SEQ ID NO:16:
TFRSDYSN		 인간 CUBI 도메인의 MBL 결합 영역
SEQ ID NO:17:
FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF		 인간 CUBI 도메인의 MBL 결합 영역
SEQ ID NO:18
IDECQVAPG		 EGF 펩타이드
SEQ ID NO:19
ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV		 세린-프로테아제 활성 부위로부터의 펩타이드
다클론성 항체MASP-2에 대한 다클론성 항체는 당업자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 MASP-2 폴리펩타이드 또는 그것의 면역원성 부분으로 동물을 면역화함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera," in Immunochemical Protocols (Manson, ed.), 페이지 105 참조. MASP-2 폴리펩타이드의 면역원성은 미네랄 겔, 예컨대 알루미늄 하이드록사이드 또는 프로인트 보조제(Freund's adjuvant) (완전 또는 불완전), 표면 활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다음이온, 유성 에멀젼, 키홀 림펫 헤모사이아닌 및 디나이트로페놀을 포함하는 보조제의 사용을 통해 증가될 수 있다. 다클론성 항체는 전형적으로 말, 소, 개, 닭, 래트, 마우스, 토끼, 기니아 피그, 염소, 또는 양과 같은 동물에서 발생된다. 대안적으로, 본 발명에 유용한 항-MASP-2 항체는 또한 인간 이하의 영장류로부터 유래될 수 있다. 개코 원숭이에서 진단적으로 및 치료적으로 유용한 항체를 발생시키기 위한 일반적인 기술은, 예를 들어, Goldenberg et al., 국제 특허출원 공개 번호 WO 91/11465, 및 Losman, M.J., et al., Int. J. Cancer 46:310, 1990에서 찾아볼 수 있다. 그 다음에 면역학적으로 활성인 항체를 포함하는 혈청은 업계에 공지된 표준 과정을 사용하여 이와 같이 면역화된 동물의 혈액으로부터 생성된다.
단클론성 항체
일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 단클론성 항체이다. 항-MASP-2 단클론성 항체는 고도로 특이적이며, 단일 MASP-2 에피토프에 대해 지시된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로는 균질한 코호트으로부터 얻어지는 것으로서 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 단클론성 항체는 배양 중인 무한 증식 세포주에 의해 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기법, 예컨대 Kohler, G., et al., Nature 256:495, 1975에 의해 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 얻어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, Cabilly의 미국 특허 번호 4,816,567 참조). 단클론성 항체는 또한 Clackson, T., et al., Nature 352:624-628, 1991, 및 Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991에서 기술된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 이것들의 임의의 하위 부류를 포함하는 임의의 면역글로불린 부류의 것일 수 있다.
예를 들어, 단클론성 항체는 적합한 포유동물 (예를 들어, BALB/c 마우스)에 MASP-2 폴리펩타이드 또는 이것의 일부를 포함하는 조성물을 주사하여 얻어질 수 있다. 예정된 기간 이후, 비장세포는 마우스로부터 제거되어 세포 배양 배지에 현탁된다. 그 다음에 비장세포는 불멸의 세포주와 융합되어 하이브리도마를 형성한다. 형성된 하이브리도마는 세포 배양에서 성장하고 MASP-2에 대한 단클론성 항체를 생성하는 능력에 대하여 스크리닝된다. 항-MASP-2 단클론성 항체의 생성을 추가로 기술하는 예들이 본원에서 제공된다 (또한 Current Protocols in Immunology, Vol. 1., John Wiley & Sons, pages 2.5.1-2.6.7, 1991. 참조).
인간 단클론성 항체는 항원성 도전에 반응하여 특이적 인간 항체를 생성하도록 엔지니어링된 형질도입 마우스의 사용을 통해 얻어질 수 있다. 이 기법에서, 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소들이 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 파괴를 포함하는 배아 줄기 세포주로부터 유래된 마우스 계통으로 도입된다. 형질도입 마우스는 인간 항원, 예컨대 본원에서 기술된 MASP-2 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 마우스는 본원에서 추가로 기술된 통상적인 쾰러-밀스타인(Kohler-Milstein) 기술을 사용하여 이러한 동물로부터의 B-세포를 적합한 골수종 세포주에 융합시킴으로써 인간 MASP-2 항체-분비 하이브리도마를 생성하는데 사용될 수 있다. 인간 면역글로불린 게놈을 가진 형질도입 마우스는 상업적으로 입수 가능하다 (예컨대, 캘리포니아 퍼몬트의 Abgenix, Inc., 및 뉴저지 애넌데일의 Medarex, Inc.). 형질도입 마우스로부터 인간 항체를 얻기 위한 방법은, 예를 들어, Green, L.L., et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg, N., et al., Nature 368:856, 1994; 및 Taylor, L.D., et al., Int. Immun. 6 :579, 1994에 의해 기술되어 있다.
단클론성 항체는 다양한 잘 확립된 기법들에 의해 하이브리도마 배양물로부터 분리되고 정제될 수 있다. 이러한 분리 기술은 단백질-A 세파로스를 이용한 친화도 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다 (예를 들어, Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 및 pages 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", in Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol. 10, pages 79-104, 1992 참조).
생성되면, 다클론성, 단클론성 또는 파지-유래 항체는 먼저 특이적 MASP-2 결합에 대하여 테스트된다. 당업자에게 공지되어 있는 다양한 검정이 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하는데 활용될 수 있다. 예시적 검정은 표준 방법에 의한 웨스턴 블롯 또는 면역 침강 분석 (예컨대, Ausubel, 등에서 기술됨), 면역전기영동법, 효소-결합 면역-흡착 검정, 도트 블롯, 억제 또는 경합 검정 및 샌드위치(sandwich) 검정 (Harlow and Land, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988에서 기술됨)을 포함한다. MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체가 확인되면, 항-MASP-2 항체는 여러 검정들, 예를 들어, 렉틴-특이적 C4 절단 검정 (실시예 2에서 기술됨), C3b 침착 검정 (실시예 2에서 기술됨) 또는 C4b 침착 검정 (실시예 2에서 기술됨) 중 하나에서 MASP-2 억제제로서 기능하는 능력에 대하여 테스트된다.
항-MASP-2 단클론성 항체의 친화도는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다 (예컨대, Scatchard, A., NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949 참조). 한 구체예에서, 발명의 방법에 유용한 항-MASP-2 단클론성 항체는 <100 nM, 바람직하게는 <10 nM 및 가장 바람직하게는 <2 nM의 결합 친화도로 MASP-2에 결합한다.
키메라/인간화된 항체
발명의 방법에 유용한 단클론성 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 이것과 상동성인 한편, 사슬(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또는 또 다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체, 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편과 동일하거나 또는 이것과 상동성인 키메라 항체를 포함한다 (Cabilly의 미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison, S.L., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984).
발명에서 유용한 키메라 항체의 한 형태는 인간화된 단클론성 항-MASP-2 항체이다. 비-인간 (예를 들어, 쥐과) 항체의 인간화된 형태는 키메라 항체이며, 이것은 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함한다. 인간화된 단클론성 항체는 비-인간 (예컨대, 마우스) 상보성 결정 영역 (CDR)을 마우스 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 사슬로부터 인간 가변 도메인으로 옮김으로써 생성된다. 전형적으로, 인간 항체의 잔기는 그 다음에 비-인간 대응물의 프레임워크 영역에서 치환된다. 나아가, 인간화된 항체는 수령체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더 개량하기 위해서 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 모든, 적어도 하나, 및 전형적으로는 두 개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 이것에서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 Fv 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화된 항체는 또한 선택적으로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 더 상세한 설명을 위해서는, Jones, P.T., et al., Nature 321:522-525, 1986; Reichmann, L., et al., Nature 332:323-329, 1988; 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992를 참조한다.
발명에서 유용한 인간화된 항체는 적어도 MASP-2 결합 CDRH3 영역을 포함하는 인간 단클론성 항체를 포함한다. 이에 더하여, Fc 부분은 IgA 또는 IgM, 뿐만 아니라 인간 IgG 항체를 생성하기 위해 대체될 수 있다. 이러한 인간화된 항체는 인간 MASP-2를 특이적으로 인식하지만 인간에서 항체 그 자체에 대한 면역 반응을 유발하지 않기 때문에 특별한 임상적 유용성을 가질 것이다. 그 결과, 그것들은, 특히 반복되거나 또는 장기간 투여가 필요할 때, 인간에서의 생체 내 투여에 더 적합하다.
쥐과 항-MASP-2 단클론성 항체로부터 인간화된 항-MASP-2 항체의 생성의 예는 본원에서 실시예 6에서 제공된다. 인간화된 단클론성 항체를 생성하기 위한 기법들은 또한, 예를 들어, Jones, P.T., et al., Nature 321:522, 1986; Carter, P., et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992; Singer, I.I., et al., J. Immun. 150:2844, 1993; Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., 1995; Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies," in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., pages 399-434, 1996; 및 1997년 Queen의 미국 특허 번호 5,693,762에 의해 기술되어 있다. 이에 더하여, 특이적 쥐과 항체 영역으로부터 인간화된 항체를 합성하는 상업적 실체, 예컨대 Protein Design Labs (캘리포니아 마운틴 뷰)이 존재한다.
재조합 항체
항-MASP-2 항체는 또한 재조합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 인간 항체는 인간 항체의 단편 (VH, VL, Fv, Fd, Fab 또는 F(ab')2)을 생성하기 위해 인간 면역글로불린 발현 라이브러리 (예를 들어, Stratagene, Corp., La Jolla, CA로부터 입수 가능함)를 사용하여 제조될 수 있다. 이들 단편은 키메라 항체를 생성하기 위한 것들과 유사한 기법술을 사용하여 전체 인간 항체를 구성하는데 사용된다.
항-이디오타입 항체
원하는 억제 활성을 가진 항-MASP-2 항체가 확인되면, 이들 항체는 업계에 널리 공지된 기법을 사용하여 MASP-2의 일부와 유사한 항-이디오타입 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예컨대, Greenspan, N.S., et al., FASEB J. 7:437, 1993 참조. 예를 들어, MASP-2에 결합하여 보체 활성화에 필요한 MASP-2 단백질 상호작용을 경합적으로 억제하는 항체는 MASP-2 단백질 상의 MBL 결합 부위와 유사하며 그러므로 MASP-2의 결합 리간드, 예를 들어, MBL에 결합하여 이것을 중화시키는 항-이디오타입을 생성하는데 사용될 수 있다.
면역글로불린 단편
발명의 방법에서 유용한 MASP-2 억제제는 온전한 면역글로불린 분자뿐만 아니라 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 및 Fv 단편, scFv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하는 널리 공지된 단편들도 포함한다.
항체 분자의 작은 부분, 파라토프만이 에피토프에 대한 항체의 결합에 포함된다는 것은 업계에 널리 공지되어 있다 (예컨대, Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986 참조). 항체의 pFc' 및 Fc 영역은 고전적 보체 경로의 이펙터이지만, 항원 결합에는 포함되지 않는다. pFc' 영역이 효소적으로 절단되거나, 또는 pFc' 영역 없이 생성된 항체는 F(ab')2 단편으로 지정되고 온전한 항체의 항원 결합 부위 둘 다를 보유한다. 분리된 F(ab')2 단편은 두 개의 항원 결합 부위 때문에 2가 단클론성 단편이라고 불린다. 마찬가지로, Fc 영역이 효소적으로 절단되었거나, 또는 Fc 영역 없이 생성된 항체는 Fab 단편으로 지정되고, 온전한 항체 분자의 항원 결합 부위 중 하나를 보유한다.
항체 단편은 단백질 가수분해성 가수분해, 예컨대 통상적인 방법에 의한 전체 항체의 펩신 또는 파파인 소화에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 펩신을 이용한 항체의 효소적 절단에 의해 생성되어 F(ab')2로 표시된 5S 단편을 제공할 수 있다. 이 단편은 3.5S Fab' 1가 단편을 생성하기 위해 티올 환원제를 사용하여 더 절단될 수 있다. 선택적으로, 절단 반응은 이황화 결합의 절단로부터 발생한 설프하이드릴 기에 대한 차단기를 사용하여 수행될 수 있다. 대안적으로서, 펩신을 사용한 효소적 절단은 직접적으로 두 개의 1가 Fab 단편 및 Fc 단편을 생성한다. 이들 방법은, 예를 들어, Goldenberg의 미국 특허 번호 4,331,647; Nisonoff, A., et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, R.R., Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman, et al., in Methods in Enzymology 1:422, Academic Press, 1967에 의해; 및 Coligan에 의해 2.8.1-2.8.10 및 2.10.-2.10.4 페이지에서 기술되어 있다.
일부 구체예에서, Fc 영역이 결핍된 항체 단편의 사용은 Fc를 Fcγ 수용체에 결합시킬 때 개시되는 고전적 보체 경로의 활성화를 방지하는데 바람직하다. Fcγ 수용체 상호작용을 방지하는 MoAb를 생성할 수 있는 여러 방법이 존재한다. 예를 들어, 단클론성 항체의 Fc 영역은 단백질 가수분해 효소에 의한 부분적 소화 (예컨대, 피신 소화)를 사용하여 화학적으로 제거될 수 있으며, 이로 인해, 예를 들어, 항원-결합 항체 단편, 예컨대 Fab 또는 F(ab)2 단편이 생성된다 (Mariani, M., et　al., Mol. Immunol.　28:69-71, 1991). 대안적으로, Fcγ 수용체에 결합하지 않는 인간 γ4 IgG 아이소타입은 본원에서 기술된 바와 같이 인간화된 항체의 구성 중에 사용될 수 있다. Fc 도메인이 결핍된 항체, 단일 사슬 항체 및 항원-결합 도메인은 또한 본원에서 기술된 재조합 기술을 사용하여 엔지니어링될 수 있다.
단일-사슬 항체 단편
대안적으로, 중쇄 및 경쇄 Fv 영역이 연결된 MASP-2에 특이적인 단일 펩타이드 사슬 결합 분자를 생성할 수 있다. Fv 단편은 단일 사슬 항원 결합 단백질 (scFv)을 형성하기 위해 펩타이드 링커에 의해 연결될 수 있다. 이들 단일 사슬 항원 결합 단백질은 올리고뉴클레오타이드에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA 서열들을 포함하는 구조 유전자(structural gene)를 구성함으로써 제조된다. 구조 유전자는 발현 벡터로 삽입되며, 그 후 대장균과 같은 숙주 세포로 도입된다. 재조합 숙주 세포는 두 개의 V 도메인을 연결하는 링커 펩타이드와 함께 단일 폴리펩타이드 사슬을 합성한다. scFv를 생성하기 위한 방법은, 예를 들어, Whitlow, et　al., "Methods: A Companion to Methods in Enzymology" 2:97, 1991; Bird, et　al., Science　242:423, 1988; Ladner의 미국 특허 번호　4,946,778; Pack, P., et　al., Bio/Technology　11:1271, 1993에 의해 기술되어 있다.
예시적인 예로서, MASP-2 특이적 scFv는 시험관 내에서 림프구를 MASP-2 폴리펩타이드에 노출시키고 파지 또는 유사한 벡터에서 항체 디스플레이 라이브러리를 선택함으로써 (예를 들어, 고정되거나 라벨링된 MASP-2 단백질 또는 펩타이드의 사용을 통해) 얻어질 수 있다. 잠재적 MASP-2 폴리펩타이드 결합 도메인을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자들은 파지 또는 박테리아, 예컨대 대장균 상에 디스플레이된 무작위 펩타이드 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 이들 무작위 펩타이드 디스플레이 라이브러리는 MASP-2와 상호작용하는 펩타이드에 대하여 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이러한 무작위 펩타이드 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는 기법들은 업계에 널리 공지되어 있으며 (Lardner의 미국 특허 번호 5,223,409; Ladner의 미국 특허 번호 4,946,778; Ladner의 미국 특허 번호 5,403,484; Ladner의 미국 특허 번호 5,571,698; 및 Kay et　al., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996) 무작위 펩타이드 디스플레이 라이브러리 및 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 키트는, 예를 들어, CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.), New England Biolabs, Inc. (Ipswich, Mass.), 및 Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, N.J.)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
본 발명의 이 측면에서 유용한 항-MASP-2 항체 단편의 또 다른 형태는 MASP-2 항원 상의 에피토프에 결합하여 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 단일 상보성-결정 영역 (CDR)을 암호화하는 펩타이드이다. CDR 펩타이드 ("최소 인식 유닛")는 관심있는 항체의 CDR을 암호화하는 유전자들을 구성함으로써 얻어질 수 있다. 이러한 유전자는, 예를 들어, 항체-생성 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성하기 위해 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 제조된다 (예를 들어, Larrick et　al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology　2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et　al. (eds.), page 166, Cambridge University Press, 1995; 및 Ward　et　al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et　al. (eds.), page　137, Wiley-Liss, Inc., 1995 참조).
본원에서 기술된 MASP-2 항체는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기 위해 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 고-친화도 인간 또는 인간화된 단클론성 항-MASP-2 감소된 이펙터 기능을 가진 항체이다.
펩타이드 억제자
발명의 이 측면의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 분리된 천연 펩타이드 억제자 및 합성 펩타이드 억제자를 포함하는, MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템을 억제하는 분리된 MASP-2 펩타이드 억제자를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분리된 MASP-2 펩타이드 억제자"는 MASP-2에 결합하고, 렉틴 경로에서 또 다른 인식 분자 (예컨대, MBL, H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)에 대한 결합에 대하여 MASP-2와 경합하고, 및/또는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기 위해 MASP-2와 직접적으로 상호작용하여 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하며 실질적으로 순수하고, 의도된 용도에 실용적이고 적절한 정도로 자연에서 발견될 수 있는 다른 물질이 본질적으로는 없는 펩타이드를 말한다.
펩타이드 억제자는 생체 내에서 단백질-단백질 상호작용 및 촉매 부위를 성공적으로 간섭하는데 사용되었다. 예를 들어, LFA-1과 구조적으로 관련된 접착 분자에 대한 펩타이드 억제자는 최근에 응고장애에서의 임상적 사용에 대하여 승인되었다 (Ohman, E.M., et al., European Heart J. 16:50-55, 1995). 인테그린-의존적 접착을 방지하거나 간섭하는 짧은 선형 펩타이드 (<30개 아미노산)가 기술되어 있다 (Murayama, O., et al., J. Biochem. 120:445-51, 1996). 길이가 25 내지 200개의 아미노산 잔기의 범위에 있는 더 긴 펩타이드가 또한 인테그린-의존적 접착을 성공적으로 차단하는데 사용되었다 (Zhang, L., et　al., J. Biol. Chem.　271(47):29953-57, 1996). 일반적으로, 더 긴 펩타이드 억제자는 짧은 펩타이드보다 더 높은 친화도 및/또는 더 느린 오프-속도(off-rate)를 가지며 그러므로 더 강력한 억제자일 수 있다. 고리형 펩타이드 억제자는 또한 생체 내에서 인간 염증성 질환의 치료에 효과적인 인테그린 억제자인 것으로 나타났다 (Jackson, D.Y., et al., J. Med. Chem. 40:3359-68, 1997). 고리형 펩타이드를 생성하는 한 가지 방법은 펩타이드의 말단 아미노산이 시스테인이며, 이로 인해 펩타이드가 말단 아미노산 사이의 이황화 결합에 의해 고리형 형태로 존재하게 하는 펩타이드의 합성을 포함하며, 이것은 조혈성 신생물의 치료를 위해 생체 내에서 친화도 및 반감기를 개선하는 것으로 나타났다 (예컨대, Larson의 미국 특허 번호 6,649,592).
합성 MASP-2 펩타이드 억제자
발명의 이 측면의 방법에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 MASP-2 기능에 중요한 표적 영역을 모방한 아미노산 서열로 예시된다. 발명의 방법의 실행에 유용한 억제 펩타이드는 크기가 약 5개의 아미노산 내지 약 300개의 아미노산의 범위에 있다. 표 3은 본 발명의 이 측면의 실행에 유용할 수 있는 예시의 억제 펩타이드의 목록을 제공한다. 후보 MASP-2 억제 펩타이드는, 예를 들어, 렉틴 특이적 C4 절단 검정 (실시예 2에서 기술됨), 및 C3b 침착 검정 (실시예 2에서 기술됨)을 포함한 여러 검정 중 하나에서 MASP-2 억제제로서 기능하는 능력에 대하여 테스트될 수 있다.
일부 구체예에서, MASP-2 억제 펩타이드는 MASP-2 폴리펩타이드로부터 유래되고 전체 길이 성숙한 MASP-2 단백질 (SEQ ID NO:6), 또는 MASP-2 단백질의 특정 도메인, 예를 들어, CUBI 도메인 (SEQ ID NO:8), CUBIEGF 도메인 (SEQ ID NO:9), EGF 도메인 (SEQ ID NO:11), 및 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:12)으로부터 선택된다. 앞서 기술된 바와 같이, CUBEGFCUBII 영역은 다이머화 및 MBL과의 결합에 필요한 것으로 나타났다 (Thielens et al., supra). 특히, MASP-2의 CUBI 도메인에서 펩타이드 서열 TFRSDYN (SEQ ID NO:16)은 Asp105에서 Gly105로의 동형 접합성 돌연변이를 가지고 있는 인간을 식별하는 연구에서 MBL에의 결합에 포함되는 것으로 나타났으며, MBL 복합체로부터 MASP-2의 손실을 초래한다 (Stengaard-Pedersen, K., et al., New England J. Med. 349:554-560, 2003).
일부 구체예에서, MASP-2 억제 펩타이드는 MASP-2에 결합하는 렉틴 단백질로부터 유래되고 렉틴 보체 경로에 포함된다. 만난-결합 렉틴 (MBL), L-피콜린, M-피콜린 및 H-피콜린을 포함하여, 이 경로에 포함된 여러 상이한 렉틴이 확인되었다 (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., et al., J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). 이들 렉틴은 호모트라이머 하위유닛의 올리고머로서 혈청에 존재하며, 각각 탄수화물 인식 도메인을 가진 N-말단 콜라겐-유사 섬유를 갖는다. 이들 상이한 렉틴은 MASP-2에 결합하는 것으로 나타났고, 렉틴/MASP-2 복합체는 단백질 C4 및 C2의 절단을 통해 보체를 활성화시킨다. H-피콜린은 24개의 아미노산의 아미노-말단 영역, 11개의 Gly-Xaa-Yaa 반복부위를 가진 콜라겐-유사 도메인, 12개의 아미노산의 넥(neck) 도메인, 및 207개의 아미노산의 피브리노겐-유사 도메인을 갖는다 (Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). H-피콜린은 GlcNAc에 결합하여 살모넬라 타이피뮤리움(S. typhimurium), 살모넬라 미네소타(S. minnesota) 및 대장균으로부터 유래된 LPS로 코팅된 인간 적혈구를 응집시킨다. H-피콜린은 MASP-2 및 MAp19와 회합되는 것으로 나타났으며 렉틴 경로를 활성화시킨다. 상동. L-피콜린/P35는 또한 GlcNAc에 결합하고 인간 혈청에서 MASP-2 및 MAp19와 회합되는 것으로 나타났으며 이 복합체는 렉틴 경로를 활성화시키는 것으로 나타났다 (Matsushita, M., et al., J. Immunol. 164:2281, 2000). 따라서, 본 발명에서 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 MBL 단백질 (SEQ ID NO:21), H-피콜린 단백질 (Genbank 기탁 번호 NM_173452), M-피콜린 단백질 (Genbank 기탁 번호 O00602) 및 L-피콜린 단백질 (Genbank 기탁 번호 NM_015838)로부터 선택되는 적어도 5개의 아미노산의 영역을 포함할 수 있다.
더 구체적으로, 과학자들은 MBL 상의 MASP-2 결합 부위가 MBP의 콜라겐-유사 도메인의 C-말단 부분의 힌지와 넥 사이에 있는 12개의 Gly-X-Y 트리플릿(triplet) "GKD GRD GTK GEK GEP GQG LRG LQG POG KLG POG NOG PSG SOG PKG QKG DOG KS" (SEQ ID NO:26) 내에 있는 것으로 확인하였다 (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 279:14065, 2004). 이 MASP-2 결합 부위 영역은 또한 인간 H-피콜린 및 인간 L-피콜린에서 고도로 보존된다. 아미노산 서열 "OGK-X-GP" (SEQ ID NO:22)를 포함하는 세 개의 렉틴 단백질 모두에 존재하는 공통 결합 부위가 기술되었는데 문자 "O"는 하이드록시프롤린을 나타내고 문자 "X"는 소수성 잔기이다 (Wallis et al., 2004, supra). 따라서, 일부 구체예에서, 발명의 이 측면에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 길이가 적어도 6개의 아미노산이고 SEQ ID NO:22를 포함한다. 아미노산 서열 "GLR GLQ GPO GKL GPO G" (SEQ ID NO:24)를 포함하는 MBL로부터 유래된 펩타이드는 시험관 내에서 MASP-2에 결합하는 것으로 나타났다 (Wallis, et al., 2004, 상기 동일). MASP-2에의 결합을 향상시키기 위해, 천연 MBL 단백질에서 발견된 바와 같이 삼중 나선의 형성을 향상시키기 위해 각 단부에서 두 개의 GPO 트리플렛 ("GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GGP OGP O" SEQ ID NO:25)이 양 옆에 있는 펩타이드가 합성될 수 있다 (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 279:14065, 2004에서 더 기술됨).
MASP-2 억제 펩타이드는 또한 H-피콜린의 공통 MASP-2 결합 영역의 서열 "GAO GSO GEK GAO GPQ GPO GPO GKM GPK GEO GDO" (SEQ ID NO:27)를 포함하는 인간 H-피콜린으로부터 유래될 수 있다. 또한 L-피콜린의 공통 MASP-2 결합 영역의 서열 "GCO GLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPN GAO GEO" (SEQ ID NO:28)를 포함하는 인간 L-피콜린으로부터 유래된 펩타이드가 포함된다.
MASP-2 억제 펩타이드는 또한 항트롬빈 III의 C-말단 부분에 연결된 C4 절단 부위인 "LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI" (SEQ ID NO:29)와 같은 C4 절단 부위로부터 유래될 수 있다 (Glover, G.I., et al., Mol. Immunol. 25:1261 (1988)).
예시의 MASP-2 억제 펩타이드
SEQ ID NO 공급원
SEQ ID NO:6 인간 MASP-2 단백질
SEQ ID NO:8 CUBI 도메인 of MASP-2 (SEQ ID NO:6의 aa 1-121)
SEQ ID NO:9 CUBIEGF 도메인s of MASP-2 (SEQ ID NO:6의 aa 1-166)
SEQ ID NO:10 MASP-2의 CUBIEGFCUBII 도메인
(SEQ ID NO:6의 aa 1-293)
SEQ ID NO:11 MASP-2의 EGF 도메인 (aa 122-166)
SEQ ID NO:12 MASP-2의 세린-프로테아제 도메인 (aa 429-671)
SEQ ID NO:16 MASP-2의 MBL 결합 영역
SEQ ID NO:3 인간 MAp19
SEQ ID NO:21 인간 MBL 단백질
SEQ ID NO:22
OGK-X-GP,
여기서 "O" = 하이드록시프롤린이고 "X"는 소수성 아미노산 잔기이		 인간 MBL 및 인간 피콜린의 합성 펩타이드 공통 결합 부위
SEQ ID NO:23
OGKLG		 인간 MBL 코어 결합 부위
SEQ ID NO:24
GLR GLQ GPO GKL GPO G		 MASP-2에 대한 인간 MBP 트리플렛 6-10-입증된 결합
SEQ ID NO:25
GPOGPOGLRGLQGPOGKLGPOGGPOGPO		 삼중 나선의 형성을 향상시키기 위해 GPO가 첨가된 인간 MBP 트리플렛
SEQ ID NO:26
GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOGNOGPSGSOGPKGQKGDOGKS		 인간 MBP 트리플렛 1-17
SEQ ID NO:27
GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO		 인간 H-피콜린 (Hataka)
SEQ ID NO:28
GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGAOGEO		 인간 L-피콜린 P35
SEQ ID NO:29
LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI		 인간 C4 절단 부위
SEQ ID NO:72LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ SGMI-2L (전체 길이)
SEQ ID NO:73TCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ SGMI-2M (중간 절단 버전)
SEQ ID NO:74TCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ SGMI-2S (짧은 절단 버전)
주: 문자 "O"는 하이드록시프롤린을 나타낸다. 문자 "X"는 소수성 잔기이다.C4 절단 부위로부터 유래된 펩타이드, 뿐만 아니라 MASP-2 세린 프로테아제 부위를 억제하는 다른 펩타이드는 비가역적 프로테아제 억제자가 되도록 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 적절한 변형은 C-말단, Asp 또는 Glu에서, 또는 기능적 측쇄에 첨부된 할로메틸 케톤 (Br, Cl, I, F); 아미노 기 또는 다른 기능적 측쇄 상의 할로아세틸 (또는 다른 α-할로아세틸) 기; 아미노 또는 카르복시 말단 또는 기능적 측쇄 상의 에폭사이드 또는 이민-함유 기; 또는 아미노 또는 카르복시 말단 또는 기능적 측쇄 상의 이미데이트 에스테르를 포함할 수 있지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 변형은 펩타이드의 공유 결합에 의한 부착에 의해 효소를 영구히 억제하는 이점을 제공할 것이다. 이것은 펩타이드 억제자의 더 낮은 유효 용량 및/또는 덜 빈번한 투여 필요성을 초래한다.
상기 기술된 억제 펩타이드에 더하여, 본 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 본원에서 기술된 바와 같이 얻어진 항-MASP-2 MoAb의 MASP-2-결합 CDRH3 영역을 포함하는 펩타이드를 포함한다. 펩타이드를 합성하는데 사용되는 CDR 영역의 서열은 업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 중쇄 가변 영역은 길이가 일반적으로 100 내지 150개의 아미노산의 범위에 있는 펩타이드이다. 경쇄 가변 영역은 길이가 일반적으로 80 내지 130개의 아미노산의 범위에 있는 펩타이드이다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내 CDR 서열은 당업자에 의해 쉽게 서열분석될 수 있는 대략 3 내지 25개의 아미노산 서열만을 포함한다.
당업자는 상기 기술된 MASP-2 억제 펩타이드의 실질적으로 상동성인 변종이 또한 MASP-2 억제 활성을 나타낸다는 것을 인식할 것이다. 예시적 변종은 대상 펩타이드의 카르복시-말단 또는 아미노-말단 부분 상에 삽입, 결실, 대체, 및/또는 추가적인 아미노산 및 이것들의 혼합물을 가진 펩타이드를 포함하지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, MASP-2 억제 활성을 가진 상기 상동성 펩타이드는 본 발명의 방법에 유용한 것으로 간주된다. 기술된 펩타이드는 또한 복제 모티프(motif) 및 보존적 치환을 가진 다른 변형을 포함할 수 있다. 보존적 변종은 본원 다른 곳에서도 기술되고, 아미노산의, 유사한 전하, 크기 또는 소수성 등의 또 다른 아미노산에 대한 교환을 포함한다.
MASP-2 억제 펩타이드는 온전한 단백질의 분절과 더 많이 유사해지도록 가용성을 증가시키고 및/또는 양전하 또는 음전하를 극대화하도록 변형될 수 있다. 유도체는 유도체가 기능적으로 MASP-2 억제의 원하는 특성을 보유하는 한 본원에서 개시된 펩타이드의 정확한 1차 아미노산 구조를 가질 수 있거나 아닐 수 있다. 변형은 일반적으로 알려져 있는 20개의 아미노산 중 하나로 또는 또 다른 아미노산으로, 부수적인 바람직한 특징, 예컨대 효소성 분해에 대한 내성을 가진 유도되거나 치환된 아미노산으로 또는 D-아미노산으로의 아미노산 치환 또는 아미노산, 아미노산들 또는 펩타이드의 자연적 확인 및 기능을 모방하는 또 다른 분자 또는 화합물, 예컨대 탄수화물로의 치환; 아미노산 결실; 일반적으로 알려져 있는 20개의 아미노산 중 하나 또는 또 다른 아미노산으로, 부수적인 바람직한 특징, 예컨대 효소성 분해에 대한 내성을 가진 유도되거나 치환된 아미노산 또는 D-아미노산으로의 삽입 또는 아미노산, 아미노산들 또는 펩타이드의 자연적 확인 및 기능을 모방하는, 또 다른 분자 또는 화합물, 예컨대 탄수화물로의 치환; 또는 모체 펩타이드의 자연적 확인, 전하 분포 및 기능을 모방하는, 또 다른 분자 또는 화합물, 예컨대 탄수화물 또는 핵산 모노머로의 치환을 포함할 수 있다. 펩타이드는 또한 아세틸화 또는 아미드화에 의해 변형될 수 있다.
유도체 억제 펩타이드의 합성은 펩타이드 생합성, 탄수화물 생합성 등의 공지된 기법들에 의존할 수 있다. 시작점으로서, 당업자는 관심있는 펩타이드의 구성형태를 결정하는데 적합한 컴퓨터 프로그램에 의존할 수 있다. 본원에서 개시된 펩타이드의 구성형태가 공지되면, 당업자는 합리적인 디자인 방식으로 모체 펩타이드의 기본적인 구성형태 및 전하 분포를 보유하지만 모체 펩타이드에 존재하지 않거나 모체 펩타이드에서 발견된 것들보다 향상된 특징을 가질 수 있는 유도체를 제조하기 위해 하나 이상의 부위에서 어떤 종류의 치환이 이루어질 수 있는지를 결정할 수 있다. 후보 유도체 분자가 확인되면, 유도체는 그것들이 MASP-2 억제제로서 기능하는지를 결정하기 위해 본원에서 기술된 검정을 사용하여 테스트될 수 있다.
MASP-2 억제 펩타이드에 대한 스크리닝
MASP-2의 주요 결합 영역의 분자 구조를 모방하고 MASP-2의 보체 활성을 억제하는 펩타이드를 생성하여 이것에 대하여 스크리닝하기 위해 분자 모델링 및 합리적인 분자 설계를 사용할 수 있다. 모델링에 사용된 분자 구조는 앞서 기술된 바와 같이 항-MASP-2 단클론성 항체의 CDR 영역, 뿐만 아니라 다이머화에 필요한 영역, MBL에 대한 결합에 포함된 영역, 및 세린 프로테아제 활성 부위를 포함하는, MASP-2 기능에 중요한 것으로 알려져 있는 표적 영역을 포함한다. 특정 표적에 결합하는 펩타이드를 확인하기 위한 방법은 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 분자 각인이 특정 분자에 결합하는 펩타이드와 같은 고분자 구조의 데노보(de novo) 구성에 사용되었다. 예를 들어, Shea, K.J., "Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De　Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sties," TRIP　2(5) 1994 참조.
예시적인 예로서, MASP-2 결합 펩타이드의 모방체를 제조하는 한 방법은 다음과 같다. 공지된 MASP-2 결합 펩타이드 또는 MASP-2 억제를 나타내는 항-MASP-2 항체의 결합 영역의 기능적 모노머 (주형)가 폴리머화된다. 그 다음 주형이 제거된 후 이어서, 주형에 의해 남겨진 빈 공간에 제2 부류의 모노머를 폴리머화하여, 주형과 유사한 하나 이상의 원하는 성질을 나타내는 새로운 분자를 제공한다. 이 방식으로 펩타이드를 제조하는 것에 더불어, MASP-2 억제제인 다른 MASP-2 결합 분자, 예컨대 다당류, 뉴클레오사이드, 약물, 핵단백질, 지질단백질, 탄수화물, 당단백질, 스테로이드, 지질 및 다른 생물학적 활성 물질이 또한 제조될 수 있다. 이 방법은 그것들이 전형적으로 기능적 모노머의 유리 라디칼 폴리머화에 의해 제조되어, 비생분해성 골격을 가진 화합물을 생성하기 때문에 천연 대응물보다 더 안종한 다양한 생물학적 모방체를 설계하는데 유용하다.
펩타이드 합성
MASP-2 억제 펩타이드는 업계에 널리 공지된 기술, 예컨대 Merrifield, in J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963에 의해 처음에 기술된 고체상 합성 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 자동화된 합성은, 예를 들어, 제조사에 의해 제공된 지침에 따라 Applied Biosystems 431A 펩타이드 합성기 (Foster City, Calif.)를 사용하여 달성될 수 있다. 다른 기법은, 예를 들어, Bodanszky, M., et al., Peptide Synthesis, second edition, John Wiley & Sons, 1976, 뿐만 아니라 당업자에게 알려져 있는 다른 참조 문헌들에서 발견될 수 있다.
펩타이드는 또한 당업자에게 공지되어 있는 표준 유전자 엔지니어링 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 펩타이드를 암호화하는 핵산을 발현 벡터로 삽입하여, DNA를 발현시키고, 필요한 아미노산의 존재 하에서 DNA를 펩타이드로 번역함으로써 효소적으로 생성될 수 있다. 그 다음에 펩타이드는 크로마토그래피 또는 전기영동 기법을 사용하여, 또는 담체 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 펩타이드 암호화 서열과 함께 동상의(in phase) 발현 벡터로 삽입함으로써 펩타이드에 융합된 다음 펩타이드로부터 절단될 수 있는 담체 단백질에 의해 정제된다. 융합 단백질-펩타이드는 크로마토그래피, 전기영동 또는 면역학적 기법 (예컨대, 담체 단백질에 대한 항체를 통해 레진에 결합)을 사용하여 분리될 수 있다. 펩타이드는 화학적 방법론을 사용하여 또는 효소적으로, 예를 들어, 가수분해 효소에 의해 절단될 수 있다.
발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 또한 통상적인 기술에 따라 재조합 숙주 세포에서 생성될 수 있다. MASP-2 억제 펩타이드를 암호화하는 서열을 발현시키기 위해서, 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자는 발현 벡터에서 전사 발현을 제어하는 조절 서열에 작동 가능하게 결합된 다음 숙주 세포로 도입되어야 한다. 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서 외에도, 발현 벡터는 발현 벡터를 가지고 있는 세포의 선택에 적합한, 번역 조절 서열 및 마커 유전자를 포함할 수 있다.
MASP-2 억제 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자는 포스포라미다이트 방법과 같은 프로토콜을 사용하여 "유전자 합성기(gene machine)"로 합성될 수 있다. 화학적으로 합성된 이중-가닥 DNA가 유전자 또는 유전자 단편의 합성과 같은 용도에 필요한 경우, 각각의 상보성 가닥은 별도로 만들어진다. 짧은 유전자 (60 내지 80개의 염기쌍)의 생성은 기술적으로 간단하며 상보성 가닥을 합성한 다음 그것들을 어닐링(annealing)함으로써 달성될 수 있다. 더 긴 유전자의 생성을 위해서, 합성 유전자 (이중-가닥)는 길이가 20 내지 100개의 뉴클레오타이드인 단일-가닥 단편의 모듈 형태로 조립된다. 폴리뉴클레오타이드 합성에 대한 리뷰를 위해서, 예를 들어, Glick and Pasternak, "Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA", ASM Press, 1994; Itakura, K., et　al., Annu. Rev. Biochem.　53:323, 1984; 및 Climie, S., et　al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA　87:633, 1990을 참조한다.
소분자 억제자
일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 저분자량을 가진 천연 및 합성 물질, 예를 들어, 펩타이드, 펩티도모방체 및 비펩타이드 억제자 (올리고뉴클레오타이드 및 유기 화합물 포함)을 포함하는 소분자 억제자이다. MASP-2의 소분자 억제자는 항-MASP-2 항체의 가변 영역의 분자 구조에 기초하여 생성될 수 있다.
소분자 억제자는 또한 컴퓨터 약물 설계를 사용하여 MASP-2 결정 구조에 기초하여 설계되고 생성될 수 있다 (Kuntz I.D., et al., Science 257:1078, 1992). 래트 MASP-2의 결정 구조가 기술되어 있다 (Feinberg, H., et al., EMBO J. 22:2348-2359, 2003). Kuntz 등에 의해 기술된 방법을 사용하여, MASP-2 결정 구조 좌표는 DOCK와 같은 컴퓨터 프로그램에 대한 입력값으로 사용되며, 이것은 MASP-2에 결합할 것으로 예상되는 소분자 구조의 목록을 산출한다. 이러한 컴퓨터 프로그램의 사용은 당업자에게 널리 알려져 있다. 예를 들어, HIV-1 프로테아제 억제자의 결정 구조는 프로그램 DOCK를 사용하여 효소의 결합 부위에 대한 캠브리지 결정학 데이터베이스(Cambridge Crystallographic database)에서 발견된 화합물의 적합성을 평가함으로써 HIV-1 프로테아제 억제자인 독특한 비펩타이드 리간드를 확인하는데 사용되었다 (Kuntz, I.D., et al., J. Mol. Biol. 161:269-288, 1982; DesJarlais, R.L., et al., PNAS 87:6644-6648, 1990).
잠재적 MASP-2 억제자로서 컴퓨터를 사용한 방법에 의해 확인되는 소분자 구조의 목록은 실시예 10에서 기술된 바와 같은 MASP-2 결합 검정을 사용하여 스크리닝된다. MASP-2에 결합하는 것으로 나타난 소분자는 그것들이 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는지를 측정하기 위해 실시예 2에서 기술된 것과 같은 기능적 검정으로 검정된다.
MASP-2 가용성 수용체
다른 적합한 MASP-2 억제제는 당업자에게 공지된 기법을 사용하여 생성될 수 있는 MASP-2 가용성 수용체를 포함하는 것으로 생각된다.
MASP-2의 발현 억제자
발명의 이 측면의 또 다른 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제할 수 있는 MASP-2 발현 억제자이다. 본 발명의 이 측면의 실행에서, 대표적인 MASP-2 발현 억제자는 MASP-2 안티센스 핵산 분자 (예컨대, 안티센스 mRNA, 안티센스 DNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드), MASP-2 리보자임 및 MASP-2 RNAi 분자를 포함한다.
안티센스 RNA 및 DNA 분자는 MASP-2 mRNA에 혼성체화하여 MASP-2 단백질의 번역을 방지함으로써 MASP-2 mRNA의 번역을 직접적으로 차단하는 작용을 한다. 안티센스 핵산 분자는 많은 상이한 방식으로 구성될 수 있으며 단 그것은 MASP-2의 발현을 간섭할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산 분자는 보체의 전사를 허용하기 위해 전사에 대한 정상 배향에 관련하여 MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:4)의 암호화 영역 (또는 이것의 일부)을 반전시킴으로써 구성될 수 있다.
안티센스 핵산 분자는 보통 표적 유전자 또는 유전자들의 적어도 일부와 실질적으로 동일하다. 하지만, 핵산은 발현을 억제하기 위해서는 완전히 동일할 필요는 없다. 일반적으로, 더 높은 상동성이 더 짧은 안티센스 핵산 분자의 사용을 보충하는데 사용될 수 있다. 최소 퍼센트 동일성은 전형적으로 약 65%보다 더 높지만, 더 높은 퍼센트 동일성은 내인성 서열의 발현의 더 효과적인 억제를 나타낼 수 있다. 약 80% 초과의 실질적으로 더 높은 퍼센트 동일성이 전형적으로 바람직하지만, 약 95%의 절대적 동일성이 전형적으로 가장 바람직하다.
안티센스 핵산 분자는 표적 유전자와 같은 인트론 또는 엑손 패턴을 가질 필요는 없으며, 표적 유전자의 비-암호화 분절은 암호화 분절로서 표적 유전자 발현의 안티센스 억제를 달성하는데 있어서 동일하게 효과적일 수 있다. 적어도 약 8개 정도의 뉴클레오타이드의 DNA 서열이 안티센스 핵산 분자로서 사용될 수 있지만, 더 긴 서열이 바람직하다. 본 발명에서, MASP-2의 유용한 억제제의 대표적인 예는 SEQ ID NO:4에서 제시된 핵산 서열로 구성된 MASP-2 cDNA의 보체와 적어도 90 퍼센트 동일한 안티센스 MASP-2 핵산 분자이다. SEQ ID NO:4에서 제시된 핵산 서열은 SEQ ID NO:5에서 제시된 아미노산 서열로 구성된 MASP-2 단백질을 암호화한다.
MASP-2 mRNA에 결합하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 표적화는 MASP-2 단백질 합성의 수준을 감소시키는데 사용될 수 있는 또 다른 메커니즘이다. 예를 들어, 폴리갈락투로나제 및 무스카린 2형 아세틸콜린 수용체의 합성은 그것들 각각의 mRNA 서열에 대해 지시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 억제된다 (Cheng의 미국 특허 번호 5,739,119, 및 Shewmaker의 미국 특허 번호 5,759,829). 게다가, 안티센스 억제의 예는 핵 단백질 사이클린, 다중 약물 저항 유전자 (MDG1), ICAM-1, E-셀렉틴, STK-1, 선조체 GABAA 수용체 및 인간 EGF로 입증되었다 (예컨대, Baracchini의 미국 특허 번호 5,801,154; Baker의 미국 특허 번호 5,789,573; Considine의 미국 특허 번호 5,718,709; 및 Reubenstein의 미국 특허 번호 5,610,288 참조).
당업자가 올리고뉴클레오타이드가 본 발명에서 유용한지를 결정할 수 있게 하는 시스템이 기술되어 있으며, 이것은 RNAse H 절단을 사용하여 전사물 내 서열의 접근성에 대한 지표로서 표적 mRNA 내의 적합한 부위를 프로빙하는 것을 포함한다. Scherr, M., et al., Nucleic Acids Res. 26:5079-5085, 1998; Lloyd, et al., Nucleic Acids Res. 29:3665-3673, 2001. MASP-2 전사물의 특정 영역에 대하여 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 혼합물이 MASP-2를 발현하는 세포 추출물, 예컨대 간세포에 첨가되고, RNAseH 취약 부위를 생성하기 위해 혼성체화된다. 이 방법은 다이머, 헤어핀, 또는 숙주 세포에서 표적 mRNA로의 특이적 결합을 감소시키거나 금지하는 다른 2차 구조를 형성하는 상대적인 능력에 기초하여 안티센스 조성물에 대한 최적의 서열 선택을 예측할 수 있는 컴퓨터-지원형 서열 선택과 조합될 수 있다. 이들 2차 구조 분석 및 표적 부위 선택의 고려사항은 OLIGO 프라이머 분석 소프트웨어 (Rychlik, I., 1997) 및 BLASTN 2.0.5 알고리즘 소프트웨어 (Altschul, S.F., et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1997)를 사용하여 수행될 수 있다. 표적 서열에 대해 지시된 안티센스 화합물은 바람직하게는 길이가 약 8 내지 약 50개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 약 9 내지 약 35개 정도의 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 특히 바람직하다. 본 발명자는 9 내지 35개의 뉴클레오타이드의 범위 (즉, 길이가 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35개 정도인 것들)에 있는 모든 올리고뉴클레오타이드 조성물이 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드-기반 방법의 실행에 매우 바람직하다는 것을 고려한다. MASP-2 mRNA의 매우 바람직한 표적 영역은 AUG 번역 개시 코돈에 또는 그 근처에 있는 것들, 및 예컨대, MASP-2 유전자 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:4)의 -10 내지 +10 사이의 영역에 있는 mRNA의 5' 영역에 실질적으로 상보하는 그런 서열들이다. 예시적 MASP-2 발현 억제자가 표 4에서 제공된다.
MASP-2의 예시적인 발현 억제자
SEQ ID NO:30 (SEQ ID NO:4의 뉴클레오타이드 22-680) CUBIEGF를 암호화하는 MASP-2 cDNA의 핵산 서열 (SEQ ID NO:4)
SEQ ID NO:31
5'CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC3		 MASP-2 번역 시작 부위 (센스)를 포함하는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오타이드 12-45
SEQ ID NO:32
5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3'		 MASP-2 MBL 결합 부위 (센스)를 포함하는 영역을 암호화하는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오타이드 361-396
SEQ ID NO:33
5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3'		 CUBII 도메인을 포함하는 영역을 암호화하는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오타이드 610-642
상기 주지된 바와 같이, 본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머 또는 이것의 모방체를 말한다. 이 용어는 또한 자연 발생적인 뉴클레오타이드, 당 및 뉴클레오사이드 간 (골격) 공유 결합, 뿐만 아니라 비-자연 발생적인 변형을 가진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 올리고핵염기를 커버한다. 이들 변형은 독성 특성 감소, 뉴클레아제 분해에 대한 안정성 증가 및 세포 섭취 향상과 같이, 자연 발생적인 올리고뉴클레오타이드를 통해 제공되지 않는 특정의 원하는 특성을 도입할 수 있게 한다. 예시의 구체예에서, 발명의 안티센스 화합물은 포스페이트 치환기가 포스포로티오에이트로 대체된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 수명을 연장시키기 위한 포스포다이에스테르 골격의 변형에 의해 천연 DNA와는 다르다. 마찬가지로, 올리고뉴클레오타이드의 하나 또는 양 단부는 핵산의 가닥 내 인접한 염기쌍 사이에 개재된 하나 이상의 아크리딘 유도체로 치환될 수 있다.안티센스에 대한 또 다른 대안은 "RNA 간섭" (RNAi)의 사용이다. 이중-가닥 RNA (dsRNA)는 포유동물에서 생체 내에서 유전자 침묵을 유발할 수 있다. RNAi의 자연적 기능 및 동시-억제는 레트로트랜스포존(retrotransposon)과 같은 이동성 유전적 요소 및 활성이 될 때 숙주 세포에서 일탈적인 RNA 또는 dsRNA를 생성하는 바이러스에 의한 침입에 대한 게놈의 보호인 것으로 보인다 (예컨대, Jensen, J., et al., Nat. Genet. 21:209-12, 1999 참조). 이중-가닥 RNA 분자는 이중-가닥 RNA 분자를 형성할 수 있는 두 개의 RNA 가닥을 합성함으로써 제조될 수 있으며, 각각 약 19 내지 25개 (예컨대, 19 내지 23개의 뉴클레오타이드)의 길이를 갖는다. 예를 들어, 발명의 방법에 유용한 dsRNA 분자는 표 4에서 열거된 서열 및 그것의 보체에 상응하는 RNA를 포함할 수 있다. 바람직하게는, RNA의 적어도 하나의 가닥은 1 내지 5개의 뉴클레오타이드의 3' 돌출부(overhang)를 갖는다. 합성된 RNA 가닥은 이중-가닥 분자를 형성하는 조건 하에서 조합된다. RNA 서열은 SEQ ID NO:4의 적어도 8개의 뉴클레오타이드 부분을 포함할 수 있으며 25개 이하의 뉴클레오타이드의 총 길이를 갖는다. 주어진 표적에 대한 siRNA 서열의 설계는 업계의 통상적인 기술 범위 내에 있다. siRNA 서열을 설계하고 발현의 적어도 70% 넉다운(knockdown)을 보장하는 상업적인 서비스가 입수 가능하다 (Qiagen, Valencia, Calif)
dsRNA는 약학적 조성물로서 투여되고 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 핵산은 원하는 표적 세포로 도입된다. 일반적으로 사용되는 유전자 전달 방법은 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 전기천공법, 미세주사법 및 바이러스 방법을 포함한다. 이러한 방법은 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1993에서 교시된다.
리보자임은 또한 MASP-2, 예컨대 MASP-2 mRNA를 표적화하는 리보자임의 양 및/또는 생물학적 활성을 감소시키는데 이용될 수 있다. 리보자임은 리보자임의 서열에 완전히 또는 부분적으로 상동성인 서열을 갖는 핵산 분자를 절단시킬 수 있는 촉매 RNA 분자이다. 표적 RNA와 특이적으로 쌍을 형성하는 RNA 리보자임을 암호화하고 특이적인 위치에서 포스포다이에스테르 골격을 절단시키며, 그로써 표적 RNA를 기능적으로 비활성화시키는 리보자임 이식 유전자를 설계하는 것이 가능하다. 이 절단을 수행하는데 있어서, 리보자임은 그 자체로 변화되지 않으며, 따라서 다른 분자를 재사용하여 절단시킬 수 있다. 안티센스 RNA 내 리보자임 서열의 포함은 그것들에 대한 RNA-절단 활성을 부여하며, 그로써 안티센스 구조의 활성을 증가시킨다.
본 발명의 실행에 유용한 리보자임은 전형적으로 뉴클레오타이드 서열에서 표적 MASP-2 mRNA의 적어도 일부에 상보적인 적어도 약 9개의 뉴클레오타이드의 혼성체화 영역, 및 표적 MASP-2 mRNA를 절단시키도록 조정된 촉매 영역을 포함한다 (일반적으로 EPA No. 0 321 201; WO88/04300; Haseloff, J., et al., Nature 334:585-591, 1988; Fedor, M.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1668-1672, 1990; Cech, T.R., et al., Ann. Rev. Biochem. 55:599-629, 1986 참조).
리보자임은 리보자임 서열을 통합하는 RNA 올리고뉴클레오타이드의 형태로 세포에 직접적으로 표적화되거나, 또는 원하는 리보자임 RNA를 암호화하는 발현 벡터로서 세포로 도입될 수 있다. 리보자임은 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 대하여 사용된 것과 동일한 방식으로 사용되고 적용될 수 있다.
발명의 방법에 유용한 안티센스 RNA 및 DNA, 리보자임 및 RNAi 분자는 DNA 및 RNA 분자의 합성을 위해 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이것들은 업계에 널리 공지된 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 및 올리고리보뉴클레오타이드를 화학적으로 합성하기 위한 기법들, 예를 들어 고체상 포스포라미다이트 화학적 합성을 포함한다. 대안적으로, RNA 분자는 안티센스 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열의 시험관 내 및 생체 내 전사에 의해 생성될 수 있다. 이러한 DNA 서열은 T7 또는 SP6 폴리머라제 프로모터와 같은 적합한 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 다양한 벡터로 통합될 수 있다. 대안적으로, 사용된 프로모터에 따라 안티센스 RNA를 구성적으로 또는 유도 가능하게 합성하는 안티센스 cDNA 구조물은 세포주로 안정하게 도입될 수 있다.
DNA 분자의 다양한 널리 공지된 변형은 안정성 및 반감기를 증가시키는 수단으로서 도입될 수 있다. 유용한 변형은 분자의 5' 및/또는 3' 단부에 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드의 플랭킹 서열의 첨가 또는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 골격 내에서 포스포다이에스테르라제 결합 대신에 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
V. 제약학적 조성물 및 전달 방법
투약
또 다른 측면으로, 발명은 본원에서 개시된 질환 또는 질병을 앓고 있는 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화의 부작용을 억제하기 위한 조성물을 제공하며, MASP-2 억제제의 치료적 유효량 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. MASP-2 억제제는 MASP-2-의존적 보체 활성화와 관련된 질병을 치료하거나 개선하기 위해 치료적 유효량으로, 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 치료적 유효량은 질환 또는 질병과 관련된 증상의 개선을 초래하기에 충분한 MASP-2 억제제의 양을 말한다.
MASP-2 억제제의 독성 및 치료적 효능은 실험 동물 모델, 예컨대 실시예 1에서 기술된 인간 MASP-2 이식 유전자를 발현하는 쥐과 MASP-2 -/- 마우스 모델을 이용하는 표준 제약학적 과정에 의해 측정될 수 있다. 이러한 동물 모델의 사용시, NOAEL (관찰된 부작용 수준 없음) 및 MED (최소 유효량)는 표준 방법을 사용하여 측정될 수 있다. NOAEL 및 MED 효과 간의 용량 비율은 치료적 비율이며, 비율 NOAEL/MED로서 표현된다. 큰 치료적 비율 또는 지표를 나타내는 MASP-2 억제제가 가장 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터가 인간에서 사용을 위한 투약량의 범위를 제제화하는데 사용될 수 있다. MASP-2 억제제의 투약량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없이 MED를 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투약량은 이 범위 내에서 이용되는 투약 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.
일부 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애를 앓고 있는, 또는 그것이 발생할 위험이 있는 포유류 대상체에서 섬유증을 치료, 억제, 완화 또는 예방하기 위한 MASP-2 억제제의 치료적 효능은 다음 중 하나 이상에 의해 측정된다: 신장 조직에서의 염증 및 반흔의 하나 이상의 마커 (예컨대 TGFβ-1, CTFF, IL-6, 세포자멸, 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, EMT, 침윤성 대식세포)의 감소; 뇨 및 혈장으로의 염증 및 섬유증 신장 질환의 가용성 마커의 방출의 감소 (예컨대 신장 배설 기능의 측정에 의함).
임의의 화합물 제제에 대하여, 치료적 유효량은 동물 모델을 사용하여 추정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 MED를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 제제화될 수 있다. 혈장 내 MASP-2 억제제의 정량적 수준은 또한, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
독성 연구에 더하여, 효과적인 투약량은 또한 살아있는 대상체에 존재하는 MASP-2 단백질의 양 및 MASP-2 억제제의 결합 친화도에 기초하여 추정될 수 있다. 정상 인간 대상체에서 MASP-2 수준은 혈청에서 500 ng/ml의 범위 내의 낮은 수준으로 존재하고, 특정 대상체에서 MASP-2 수준은 Moller-Kristensen M.,　et　al., J.　Immunol. Methods　282:159-167, 2003에서 기술된, MASP-2에 대한 정량적 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
일반적으로, MASP-2 억제제를 포함하는 투여된 조성물의 투약량은 대상체의 나이, 체중, 키, 성별, 일반적인 의학적 상태, 및 이전의 병력과 같은 요인에 따라 달라진다. 예로서, MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체는 대상체 체중의 약 0.010 내지 10.0 mg/kg, 바람직하게는 0.010 내지 1.0 mg/kg, 더 바람직하게는 0.010 내지 0.1 mg/kg의 투약 범위 내에서 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 항-MASP-2 항체 및 MASP-2 억제 펩타이드의 조합을 포함한다.
주어진 대상체에서 본 발명의 MASP-2 억제 조성물 및 방법의 치료적 효능, 및 적절한 투약량은 당업자에게 널리 공지된 보체 검정에 따라 측정될 수 있다. 보체는 많은 특이적 생성물을 생성한다. 지난 10년간, 민감하고 특이적인 검정이 개발되었으며 작은 활성화 단편 C3a, C4a, 및 C5a 및 큰 활성화 단편 iC3b, C4d, Bb, 및 sC5b-9를 포함하는, 이들 활성화 생성물 대부분에 대하여 상업적으로 활용 가능하다. 이들 검정 중 대부분은 단편 상에 노출되지만, 그것들이 형성된 천연 단백질 상에는 노출되지 않은 새로운 항원 (신항원)과 반응하는 단클론성 항체를 이용하여, 이들 검정을 매우 단순하고 특이적으로 만든다. 대부분은 ELISA 기술에 의존하지만, C3a 및 C5a에 대해서는 방사 면역 검정이 때때로 사용된다. 이들 후자의 검정은 순환에서 발견되는 주요 형태인 미처리 단편 및 그것들의 'desArg' 단편 둘 다를 측정한다. 미처리 단편 및 C5adesArg는 세포 표면 수용체에 결합하여 신속하게 제거되며 따라서 매우 낮은 농도로 존재하는 반면, C3adesArg는 세포에 결합하지 않고 혈장에 축적된다. C3a의 측정은 보체 활성화의 민감하고, 경로-독립적인 지표를 제공한다. 대안의 경로 활성화는 Bb 단편을 측정함으로써 평가될 수 있다. 막 공격 경로 활성화의 유동상 생성물, sC5b-9의 검출은 보체가 완성되기 위해 활성화되고 있다는 증거를 제공한다. 렉틴 경로 및 고전적 경로는 둘 다 동일한 활성화 생성물, C4a 및 C4d를 생성하기 때문에, 이들 두 개의 단편의 측정은 이들 두 개의 경로 중 어느 것이 활성화 생성물을 생성하였는지에 대한 어떤 정보도 제공하지 못한다.
MASP-2-의존적 보체 활성화의 억제는 발명의 방법에 따라 MASP-2 억제제의 투여의 결과로서 발생한 보체 시스템의 구성요소에서 다음 변화 중 적어도 하나를 특징으로 한다: MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템 생성물 C4b, C3a, C5a 및/또는 C5b-9 (MAC)의 생성 또는 생성의 억제 (예를 들어, 실시예 2에서 기술된 바와 같이 측정됨), C4 절단 및 C4b 침착의 감소 (예를 들어, 실시예 10에서 기술된 바와 같이 측정됨), 또는 C3 절단 및 C3b 침착의 감소 (예를 들어, 실시예 10에서 기술된 바와 같이 측정됨).
추가적인 작용제
특정 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증을 예방, 치료, 복귀 및/또는 억제하는 방법은 섬유증 및/또는 염증을 억제하기에 적절한 하나 이상의 다른 약물, 생물 제제, 또는 치료적 개입과 함께 치료 처방의 일부로서 MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)를 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 추가적인 약물, 생물 제제, 또는 치료적 개입은 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애와 관련된 특정 증상들에 적절하다. 예를 들면, MASP-2 억제 항체는 하나 이상의 면역억제제, 예컨대 메토트렉세이트, 사이클로포스파미드, 아자티오프린(azathioprine), 및 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)과 함께 치료 처방의 일부로서 투여될 수 있다. 추가로 예를 들면, MASP-2 억제 항체는 혈류를 증가시키기 위해 고안된 하나 이상의 작용제 (예컨대 니페디핀 (nifedipine), 암로디핀 (amlodipine), 딜티아젬 (diltiazem), 펠로디핀 (felodipine), 또는 니카르디핀 (nicardipine))와 함께 치료 처방의 일부로서 투여될 수 있다. 추가로 예를 들면, MASP-2 억제 항체는 섬유증을 감소시키기 위해 의도된 하나 이상의 작용제, 예컨대 d-페니실라민, 콜키신, PUVA, 렐락신 (Relaxin), 사이클로스포린, TGF 베타 차단제 및/또는 p38 MARK 차단제와 함께 치료 처방의 일부로서 투여될 수 있다. 추가로 예를 들면, MASP-2 억제 항체는 스테로이드류 또는 기관지 확장제들과 함께 치료 처방의 일부로서 투여될 수 있다.
MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)를 포함하는 조성물 및 방법은 하나 이상의 추가적인 치료제를 선택적으로 포함할 수 있고, 그것들은 MASP-2 억제제의 활성을 증대시키거나 또는 추가적인 또는 상조적 양상으로 관련된 치료 기능을 제공할 수 있다. 예를 들어, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체를 치료하는 맥락에서, 하나 이상의 MASP-2 억제제는 하나 이상의 추가적인 항섬유화제 및/또는 하나 이상의 항-염증성 작용제 및/또는 면역억제제와 조합하여 투여될 수 있다 (동시 투여를 포함함).
MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)는 코르티코스테로이드, 면역억제성 또는 세포독성 작용제, 및/또는 항섬유화제와 같은 일반적인 면역억제성 약물과 같은 다른 치료제와 조합되어 사용될 수 있다.
제약학적 담체 및 전달 비히클
일반적으로, 임의의 다른 선택된 치료제와 조합된 본 발명의 MASP-2 억제제 조성물은, 적합하게는 제약학적으로 허용되는 담체에 포함된다. 담체는 비-독성이고, 생체 적합성이며 MASP-2 억제제 (및 그것과 조합된 임의의 다른 치료제)의 생물학적 활성에 해로운 영향을 미치지 않도록 선택된다. 펩타이드에 대한 예시적인 제약학적으로 허용되는 담체는 Yamada의 미국 특허 번호 5,211,657에 기술되어 있다. 발명에서 유용한 항-MASP-2 항체 및 억제 펩타이드는 경구, 비경구 또는 수술 투여를 허용하는 고체, 반고체, 겔, 액체 또는 기체 형태, 예컨대 타블렛, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌제, 흡입제 및 주사제의 조제물로 제제화될 수 있다. 발명은 또한 의료 장치 등을 코팅함으로써 조성물의 국소적 투여를 고려한다.
주사, 투입 또는 관주법 및 국부적 전달을 통한 비경구 전달에 적합한 담체는 증류수, 생리적 포스페이트-완충 식염수, 정상 또는 젖산 링거액(lactated Ringer's solution), 덱스트로스 용액, 행크 용액(Hank's solution), 또는 프로판디올을 포함한다. 이에 더하여, 멸균된 고정유가 용매 또는 현탁화 매질로서 이용될 수 있다. 이 목적을 위해서, 합성 모노- 또는 다이글리세리드를 포함하는 임의의 생체 적합성 오일이 이용될 수 있다. 이에 더하여, 올레산과 같은 지방산이 주사제의 제조에 사용된다. 담체 및 작용제는 액체, 현탁액, 폴리머화 가능한 또는 비-폴리머화 가능한 겔, 페이스트 또는 고약으로서 합성될 수 있다.
담체는 또한 작용제(들)의 전달을 지속하거나 (즉, 연장하거나, 지연시키거나 또는 조절하거나) 또는 치료제(들)의 전달, 흡수, 안정성 또는 약동학을 향상시키기 위해 전달 비히클을 포함할 수 있다. 이러한 전달 비히클은 비-제한적 예로서, 단백질, 리포솜, 탄수화물, 합성 유기 화합물, 무기 화합물, 폴리머 또는 코폴리머 하이드로겔 및 폴리머 미셀(micelle)로 구성된 미세입자, 미소구체, 나노구체 또는 나노입자를 포함할 수 있다. 적합한 하이드로겔 및 미셀 전달 시스템은 WO 2004/009664 A2에서 개시된 PEO:PHB:PEO 코폴리머 및 코폴리머/사이클로덱스트린 복합체 및 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0019369 A1에서 개시된 PEO 및 PEO/사이클로덱스트린을 포함한다. 이러한 하이드로겔은 의도된 작용 부위에 국소적으로, 또는 피하로 또는 근육 내로 주사되어 지효성 데포(depot)를 형성할 수 있다.
관절 내 전달을 위해, MASP-2 억제제는 주사 가능한 상기 기술된 액체 또는 겔 담체, 주사 가능한 상기 기술된 지효성 전달 비히클, 또는 히알루론산 또는 히알루론산 유도체에 들어있을 수 있다.
비-펩타이드성 작용제의 경구 투여를 위해, MASP-2 억제제는 비활성 충전제 또는 희석제, 예컨대 수크로오스, 옥수수 전분, 또는 셀룰로스에 들어있을 수 있다.
국부적 투여를 위해, MASP-2 억제제는 연고, 로션, 크림, 겔, 안약, 좌제, 스프레이, 액체 또는 분말, 또는 경피 패치를 통한 겔 또는 마이크로캡슐 전달 시스템에 들어있을 수 있다.
에어로졸, 계량된 용량 흡입기, 건성 분말 흡입기, 및 분무기를 포함하는 다양한 비강 및 폐 전달 시스템이 개발 중이고 각각 에어로졸, 흡입제, 또는 분무된 전달 비히클로 본 발명의 전달에 맞춰 적합하게 조정될 수 있다.
척추강 내 (IT) 또는 뇌실 내 (ICV) 전달, 적절하게는 멸균 전달 시스템 (예를 들어, 액체; 겔, 현탁액, 등)이 본 발명을 투여하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 분산제 또는 습윤제, 현탁화제, 희석제, 완충제, 흡수 촉진제, 유화제, 결합제, 점증제, 향미제 (경구 투여용)와 같은 생체 적합성 부형제를 포함할 수 있다.
항체 및 펩타이드용 제약학적 담체
더 구체적으로 항-MASP-2 항체 및 억제 펩타이드에 관하여, 예시적 제제는 물, 오일, 식염수, 글리세롤 또는 에탄올과 같은 멸균 액체일 수 있는 제약학적 담체와 함께 생리학적으로 허용되는 희석제 중의 화합물의 용액 또는 현탁액의 주사 가능한 투약량으로서 비경구로 투여될 수 있다. 추가적으로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 계면활성제, pH 완충 물질, 등이 항-MASP-2 항체 및 억제 펩타이드를 포함하는 조성물에 존재할 수 있다. 제약학적 조성물의 추가적인 구성요소는 석유 (예컨대, 동물성, 식물성 또는 합성 기원), 예를 들어, 대두 오일 및 미네랄 오일을 포함한다. 일반적으로, 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 주사용액에 바람직한 액체 담체이다.
항-MASP-2 항체 및 억제 펩타이드는 또한 활성제의 지효성 또는 박동성 방출을 허용하는 것과 같은 방식으로 제제화될 수 있는 데포 주사 또는 이식 조제물의 형태로 투여될 수 있다.
발현 억제자용 제약학적으로 허용되는 담체
더 구체적으로 발명의 방법에 유용한 발현 억제자에 관하여, 상기 기술된 발현 억제자 및 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 콜로이드성 분산 시스템을 더 포함할 수 있다.
발현 억제자를 포함하는 제약학적 조성물은 용액, 에멀젼, 및 리포솜-함유 제제를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 조성물은 사전 형성된 액체, 자가-에멀젼화 고체 및 자가-에멀젼화 반고체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 구성요소로부터 생성될 수 있다. 이러한 조성물의 제조는 전형적으로 발현 억제자를 다음 중 하나 이상과 조합하는 것을 포함한다: 완충제, 항산화제, 저분자량 폴리펩타이드, 단백질, 아미노산, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트린을 포함하는 탄수화물, 킬레이트화제, 예컨대 EDTA, 글루타티온 및 다른 안정화제 및 부형제. 중성의 완충된 식염수 또는 비-특이적 혈청 알부민과 혼합된 식염수가 적합한 희석제의 예이다.
일부 구체예에서, 조성물은 전형적으로 액적의 형태로 다른 액체에 분산된 한 액체의 불균질 시스템인 에멀젼으로서 제조 및 제제화될 수 있다 (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Vol. 1, Rieger and Banker (eds.), Marcek Dekker, Inc., N.Y., 1988 참조). 에멀젼 제제에 사용된 자연 발생적인 유화제의 예는 아카시아, 비즈왁스, 라놀린, 레시틴 및 포스파티드를 포함한다.
한 구체예에서, 핵산을 포함하는 조성물은 마이크로에멀젼으로 제제화될 수 있다. 마이크로에멀젼은, 본원에서 사용된 바와 같이 물, 오일, 및 양친매성 물질의 시스템을 말하며, 이것은 단일 시각적으로 등방성이고 열역학적으로 안정한 액체 용액이다 (Rosoff in Pharmaceutical Dosage Forms, Vol. 1 참조). 발명의 방법은 또한 원하는 부위로의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 수송 및 전달을 위해 리포솜을 사용할 수 있다.
국부적 투여를 위한 발현 억제자의 제약학적 조성물 및 제제는 경피성 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 안약, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 제약학적 담체, 뿐만 아니라 수성, 분말 또는 유성 염기 및 점증제 등이 사용될 수 있다.
*투여 방식
MASP-2 억제제를 포함하는 제약학적 조성물은 국소적 또는 전신적 투여 방식 중 어느 것이 치료되는 질병에 가장 적절한지에 따라 많은 방식으로 투여될 수 있다. 추가로, 본 발명의 조성물은 조성물을 이식 가능한 의료 장치에 코팅하거나 포함시킴으로써 전달될 수 있다.
전신적 전달
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전신 전달" 및 "전신 투여"는 근육 내 (IM), 피하, 정맥 내 (IV), 동맥 내, 흡입, 혀 밑, 볼, 국부적, 경피성, 비강, 직장, 질 및 의도된 치료 작용의 단일 또는 다수의 부위로 전달된 작용제의 분산을 효과적으로 발생시키는 다른 투여 경로를 포함하는 경구 및 비경구 경로를 포함하지만 이제 제한하려는 것은 아니다. 본 조성물에 대한 전신 전달의 바람직한 경로는 정맥 내, 근육 내, 피하 및 흡입을 포함한다. 본 발명의 특정 조성물에 이용되는 선택된 작용제에 대한 정확한 전신 투여는 부분적으로는 주어진 투여 경로와 관련된 대사 형질전환 경로에 대한 작용제의 민감성을 설명하기 위해 결정될 것이다. 예를 들어, 펩타이드성 작용제는 적합하게는 경구 이외의 경로에 의해 투여될 수 있다.
MASP-2 억제 항체 및 폴리펩타이드는 임의의 적합한 수단에 의해 필요로 하는 대상체에게 전달될 수 있다. MASP-2 항체 및 폴리펩타이드의 전달 방법은 경구, 폐, 비경구 (예를 들어, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 (IV) 또는 피하 주사), 흡입 (예컨대, 미세 분말 제제를 통해), 경피성, 비강, 질, 직장, 또는 혀 밑 투여 경로에 의한 투여를 포함하고, 각각의 투여 경로에 적절한 투약 형태로 제제화될 수 있다.
대표적인 예로서, MASP-2 억제 항체 및 펩타이드는 폴리펩타이드를 흡수할 수 있는 체막, 예를 들어, 비강, 위장 및 직장 막에 의해 살아있는 신체로 도입될 수 있다. 폴리펩타이드는 전형적으로 침투 향상제와 함께 흡수성 막에 적용된다 (예컨대, Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys.　5 :69, 1988; Lee, V.H.L., J.　Controlled Release 13:213, 1990; Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991); DeBoer, A.G.,　et　al., J.　Controlled Release　13 :241, 1990. 참조). 예를 들어, STDHF는 담즙산염과 구조가 유사한 스테로이드성 계면활성제인 푸시드산의 합성 유도체이고, 비강 전달을 위한 침투 향상제로서 사용되었다 (Lee, W.A., Biopharm. 22, Nov./Dec. 1990).
MASP-2 억제 항체 및 폴리펩타이드는 효소성 분해로부터 폴리펩타이드를 보호호기 위해서 또 다른 분자, 예컨대 지질과 함께 도입될 수 있다. 예를 들어, 폴리머, 특히 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 공유 결합에 의한 부착은 신체 내 효소적 가수분해로부터 특정 단백질을 보호하며 따라서 반감기를 연장하는데 사용되었다 (Fuertges, F., et al., J. Controlled Release 11:139, 1990). 많은 폴리머 시스템이 단백질 전달에 대하여 보고되었다 (Bae, Y.H.,　et　al., J.　Controlled Release　9:271, 1989; Hori, R.,　et　al., Pharm. Res.　6:813, 1989; Yamakawa, I.,　et　al., J. Pharm. Sci.　79:505, 1990; Yoshihiro, I.,　et　al., J.　Controlled Release　10:195, 1989; Asano, M.,　et　al., J.　Controlled Release　9:111, 1989; Rosenblatt, J., et　al., J.　Controlled Release　9:195, 1989; Makino, K., J.　Controlled Release　12:235, 1990; Takakura, Y., et　al., J.　Pharm. Sci.　78:117, 1989; Takakura, Y.,　et　al., J. Pharm. Sci.　78:219, 1989).
최근에는, 개선된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 가진 리포솜이 개발되었다 (예컨대, Webb의 미국 특허 번호 5,741,516 참조). 게다가, 잠재적 약물 담체로서 리포솜 및 리포솜-유사 제조의 다양한 방법이 검토되었다 (예컨대, Szoka의 미국 특허 번호 5,567,434; Yagi의 미국 특허 번호 5,552,157; Nakamori의 미국 특허 번호 5,565,213; Shinkarenko의 미국 특허 번호 5,738,868; 및 Gao의 미국 특허 번호 5,795,587 참조).
경피성 적용을 위해, MASP-2 억제 항체 및 폴리펩타이드는 다른 적합한 성분, 예컨대 담체 및/또는 보조제와 조합될 수 있다. 의도된 투여를 위해 제약학적으로 허용되어야 하고, 조성물의 활성 성분의 활성을 분해시킬 수 없다는 것을 제외하고는, 이러한 다른 성분의 성질에 대하여 제한되지 않는다. 적합한 비히클의 예는 정제된 콜라겐 유무에 관계없이, 연고, 크림, 겔, 또는 현탁액을 포함한다. MASP-2 억제 항체 및 폴리펩타이드는 또한 바람직하게는 액체 또는 반액체 형태로 경피성 패치, 플라스터, 및 붕대로 함침될 수 있다.
본 발명의 조성물은 치료 효과의 원하는 수준을 유지하기 위해 주기적으로 간격을 두고 전신으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은, 예컨대 피하 주사에 의해 2 내지 4주마다 또는 덜 빈번한 간격으로 투여될 수 있다. 투약 처방은 작용제의 조합의 작용에 영향을 미칠 수 있는 다양한 요인을 고려하여 의사에 의해 결정될 것이다. 이들 요인은 치료되는 질병의 진행 정도, 환자의 나이, 성별, 체중, 다른 임상적 요인들을 포함할 것이다. 개개의 작용제에 대한 투약량은 조성물에 포함되는 MASP-2 억제제의 기능, 뿐만 아니라 임의의 약물 전달 비히클 (예컨대, 지효성 전달 비히클)의 존재 및 성질에 따라 달라질 것이다. 이에 더하여, 투약량은 전달된 작용제(들)의 투여 빈도의 변화 및 약동학적 거동을 설명하기 위해 조정될 수 있다.
국소적 전달
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "국소적"은 의도된 국소화된 작용 부위에 또는 그 주위에 약물의 적용을 포함하고, 예를 들어, 피부 또는 다른 영향을 받는 조직으로와 국부적 전달, 안구 전달, 척추강 내 (IT), 뇌실 내 (ICV), 관절 내, 공동 내, 두개 내 또는 방광 내 투여, 배치 또는 관주법을 포함할 수 있다. 국소적 투여는 더 낮은 용량의 투여를 가능하게 하기 위해, 전신의 부작용을 막기 위해 및 국소적 전달 부위에 활성제의 전달 시기 및 농도의 더 정확한 제어를 위해 바람직할 수 있다. 국소적 투여는 대사, 혈류, 등의 환자 간 변동성에 관계없이, 표적 부위에 공지된 농도를 제공한다. 개선된 투약량 제어는 또한 직접적인 전달 방식에 의해 제공된다.
MASP-2 억제제의 국소적 전달은 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 수술적 방법의 맥락에서, 예를 들어 수술과 같은 과정 중에 이루어질 수 있다.
치료 처방
예방 용도에서, MASP-2 억제제 (예컨대, MASP-2 억제 항체)를 포함하는 제약학적 조성물은 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애에 취약한, 또는 그렇지 않으면 걸릴 위험이 있는 대상체에게 섬유증 및/또는 염증을 억제하기에 충분한 양으로 투여되고 그로써 상태의 증상들이 발생할 위험을 제거하거나 감소시킨다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애가 의심되는, 또는 이미 앓고 있는 대상체에게 상태의 증상을 완화, 또는 적어도 부분적으로 감소시키기에 충분한 치료적 유효량으로 투여된다. 예방 및 치료 처방에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상체에서 충분한 치료 결과가 이루어질 때까지 다회수 투약량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 섬유증 및/또는 염증과 관련된 급성 상태의 치료를 위해 조성물의 단일 투여에 의해, 또는 제한된 투여 순서에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 섬유증 및/또는 염증과 관련된 만성 상태의 치료를 위해 연장된 기간에 걸쳐 주기적인 간격으로 투여될 수 있다.
예방 및 치료 처방 둘 다에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상체에서 충분한 결과가 달성될 때까지 다회수 투약량으로 투여될 수 있다. 발명의 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체를 포함하며, 이것은 적합하게는 0.1 mg 내지 10,000 mg, 더 적합하게는 1.0 mg 내지 5,000 mg, 더 적합하게는 10.0 mg 내지 2,000 mg, 더 적합하게는 10.0 mg 내지 1,000 mg 및 더 적합하게는 50.0 mg 내지 500 mg의 투약량으로 성인 환자 (예를 들어, 70 kg의 평균 성인 체중)에게 투여될 수 있다. 소아 환자에 대하여, 투약량은 환자의 체중에 비례하여 조정될 수 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애를 앓고 있거나 발생 위험이 있는 대상체의 치료를 위해, 조성물의 1회 투여, 또는 제한된 순서의 투여로 수행될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애를 앓고 있거나 발생 위험이 있는 대상체의 치료를 위해, 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월마다 투여될 수 있다.
예방 및 치료 처방 둘 다에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상체에서 충분한 치료 결과가 이루어질 때까지 다회수 투약량으로 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 대상체는 대상체가 예를 들어 혈청 크레아티닌 수준, 혈청 크레아티닌 제거, 혈중 우레아 질소 수준, 뇨의 단백질에 의해 평가되는 바 손상된 신장 기능의 하나 이상의 증상을 가지는 것으로 측정됨으로써, 및/또는 신장 질환 또는 손상과 관련된 하나 이상의 생체마커가 측정됨으로써 섬유증 또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애가 발생될 위험이 있는 것으로 확인된다.
신장 기능의 평가 방법은 업계에 널리 알려져 있고, 혈액 시스템 및 사구체 모세관 압력, 단백뇨 (예컨대, 알부민뇨증), 현미경적 및 육안적 혈뇨, 혈청 크레아티닌 수준 (예컨대 인간의 신장 기능을 산정하기 위한 한 가지 식은 2.0 mg/dl의 크레아티닌 수준 내지 정상 신장 기능의 50% 및 4.0 mg/dl 내지 25%와 같다), 사구체 여과율의 감소 (예컨대 크레아티닌 제거율), 및 관형 손상 정도를 포함하여, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 신장 기능의 평가는 혈청 크레아티닌 수준, 크레아티닌 제거율, 24-시간 뇨단백질 배설, 사구체 여과율, 뇨알부민 크레아티닌 비율, 알부민 배설 속도, 및 신장 생검 (예컨대 콜라겐 및/또는 피브로넥틴의 침착을 측정함으로써 신장 섬유증의 정도를 측정함)과 같은 생물학적 및/또는 생리적 파라미터들을 사용하여 적어도 하나의 신장 기능을 평가하는 것을 포함할 수 있다.
VI. 실시예
다음의 실시예는 단지 발명을 실시하기 위해 현재 고려되고 있는 최선의 방식을 예시하지만, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에서 모든 인용 문헌은 분명히 참조로 포함된다.
실시예 1
이 실시예는 MAp19는 충분하지만 (MAp19+/+) MASP-2의 마우스 계통 결핍 (MASP-2-/-)의 생성을 기술한다.
재료 및 방법: 도 3에서 도시된 바와 같이, 세린 프로테아제 도메인을 암호화하는 엑손을 포함한, 쥐과 MASP-2의 C-말단 단부를 암호화하는 세 개의 엑손을 파괴하기 위해 표적화 벡터 pKO-NTKV 1901을 설계하였다. PKO-NTKV 1901을 사용하여 쥐과 ES 세포주 E14.1a (SV129 Ola)를 트랜스펙션하였다. 네오마이신-내성 및 티미딘 키나제-민감성 클론을 선택하였다. 600 ES 클론을 스크리닝하였고, 이것들 중에서, 네 개의 상이한 클론을 서던 블롯에 의해 도 3에서 도시된 바와 같이 예상된 선택적 표적화 및 재조합 이벤트를 포함하는 것으로 식별하고 확인하였다. 배아 이식에 의해 이들 네 개의 양성 클론으로부터 키메라를 생성하였다. 그 다음에 키메라를 유전적 배경 C57/BL6에서 역교배시켜 형질도입 수컷을 생성하였다. 형질도입 수컷을 암컷과 교배하여 자손 중 50%가 파괴된 MASP-2 유전자에 대하여 이형접합성을 나타내는 F1을 생성하였다. 이형접합성 마우스를 이종교배시켜 동형접합성 MASP-2 결핍 자손을 생성하였으며, 각각 1:2:1 비율의 이형접합성 및 야생형 마우스를 생성하였다.
결과 및 표현형: 결과적으로 생성된 동형접합성 MASP-2-/- 결핍 마우스는 생존 가능하고 수태 가능한 것으로 밝혀졌으며 정확한 표적화 이벤트를 확인하기 위한 서던 블롯에 의해, MASP-2 mRNA의 부재를 확인하기 위한 노던 블롯에 의해, 및 MASP-2 단백질의 부재를 확인하기 위한 웨스턴 블롯에 의해 MASP-2 결핍인 것으로 확인하였다 (데이터 미도시). MAp19 mRNA의 존재 및 MASP-2 mRNA의 부재를 LightCycler 장치 상에서 시간-해소 RT-PCR을 사용하여 더 확인하였다. MASP-2-/- 마우스는 예상된 바와 같이 MAp19, MASP-1, 및 MASP-3 mRNA 및 단백질을 발현하였다 (데이터 미도시). MASP-2-/- 마우스에서 프로퍼딘, 인자 B, 인자 D, C4, C2, 및 C3에 대한 mRNA의 존재 및 풍부함을 LightCycler 분석에 의해 평가하였고 야생형 한배 새끼 대조군과 동일하다는 것을 발견하였다 (데이터 미도시). 동형접합성 MASP-2-/- 마우스의 혈장은 실시예 2에서 더 기술된 바와 같이 렉틴-경로-매개 보체 활성화가 완전히 결핍된다.
순수한 C57BL6 배경의 MASP-2-/- 계통의 생성: MASP-2-/- 마우스를 실험 동물 모델로서 MASP-2-/- 계통의 사용 전에 순수한 C57BL6 계통과 9세대 동안 역교배시켰다.
쥐과 MASP-2-/-, MAp19+/+이고 인간 MASP-2 이식 유전자 (쥐과 MASP-2 넉아웃(knock-out) 및 인간 MASP-2 넉인(knock-in))를 발현하는 형질도입 마우스 계통을 다음과 같이 생성하였다:
재료 및 방법: 도 4에서 도시된 바와 같이 인간 MASP 2 유전자의 프로모터 영역을 포함하는, "미니 hMASP-2"라고 불리는 인간 MASP-2를 암호화하는 미니유전자 (SEQ ID NO:49)를 구성하였으며, 처음 3개의 엑손 (엑손 1 내지 엑손 3)에 이어서 다음 8개의 엑손의 암호화 서열을 제공하는 cDNA 서열을 포함하여, 내인성 프로모터에 의해 구동되는 전체 길이 MASP-2 단백질을 암호화한다. 결핍성 쥐과 MASP 2 유전자를 유전자 이식에 의해 발현된 인간 MASP-2에 의해 대체하기 위해 미니 hMASP-2 구조체를 MASP-2-/-의 수정란에 주사하였다.
실시예 2
이 실시예는 MASP-2가 렉틴 경로를 통한 보체 활성화에 필요하다는 것을 입증한다.
방법 및 재료:
렉틴 경로 특이적 C4 절단 검정: L-피콜린에 결합하는, 스타필로코쿠스 아우레우스의 리포테이코산 (LTA)으로부터 발생한 렉틴 경로 활성화를 측정하는 C4 절단 검정은 Petersen,　et　al., J.　Immunol. Methods　257:107 (2001)에 의해 기술되어 있다. Petersen et al., (2001)에서 기술된 검정을 하기 기술된 바와 같이 ASP-2 -/- 마우스의 혈청을 첨가하기 전에 LPS 및 만난 또는 치모산으로 플레이트를 코팅함으로써 MBL을 통한 렉틴 경로 활성화를 측정하도록 맞춰 조정하였다. 고전적 경로로 인한 C4 절단의 가능성을 제거하기 위해 검정을 또한 변형시켰다. 이것을 1 M NaCl을 함유하는 샘플 희석 완충액을 사용하여 달성하였으며, 이것은 리간드로의 렉틴 경로 인식 구성요소의 고친화도 결합을 허용하지만 내인성 C4의 활성화를 방지하며, 이로 인해 C1 복합체를 해리시킴으로써 고전적 경로의 참여를 배제한다. 간략히 기술된 바와 같이, 변형된 검정에서 혈청 샘플 (고염 (1 M NaCl) 완충액에 희석됨)을 리간드-코팅된 플레이트에 첨가한 후 이어서, 염의 생리학적 농도를 가진 완충액에서 일정한 양의 정제된 C4를 첨가하였다. MASP-2를 함유하는 결합된 인식 복합체는 C4를 절단시키며, C4b 침착을 초래한다.
검정 방법:
1) Nunc Maxisorb 미세역가 플레이트 (MaxiSorb®, Nunc, 카탈로그 번호 442404, Fisher Scientific)를 코팅 완충액 (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6)에 희석된 1 μg/ml 만난 (M7504 Sigma) 또는 임의의 다른 리간드 (예를 들어, 하기 나열된 것들)로 코팅하였다.
다음 시약을 검정에 사용하였다:
a. 만난 (100 μl 코팅 완충액 중의 1 μg/웰 만난 (M7504 Sigma)):
b. 치모산 (100 μl 코팅 완충액 중의 1 μg/웰 치모산 (Sigma));
c. LTA (100 μl 코팅 완충액 중의 1μg/웰 또는 20 μl 메탄올 중의 2 μg/웰)
d. 코팅 완충액 중의 H-피콜린 특이적 Mab 4H5 1 μg
e. 에어로코쿠스 비리단스(Aerococcus viridans)의 PSA (100 μl 코팅 완충액 중의 2 μg/웰)
f. 코팅 완충액 중의 포르말린-고정된 스타필로코쿠스 아우레우스 DSM20233 100 μl/웰 (OD550=0.5).
2) 플레이트를 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다.
3) 밤새도록 인큐베이션 후, 잔류 단백질 결합 부위를, 플레이트를 0.1% HSA-TBS 차단 완충액 (10 mM Tris-CL, 140 mM NaCl, 1.5 mM NaN3, pH 7.4 중의 0.1% (w/v) HSA)과 함께 1-3시간 동안 인큐베이션하여 포화시킨 다음, 플레이트를 TBS/tween/Ca2+ (0.05% Tween 20 및 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4가 들어있는 TBS)로 3회 세척하였다.
4) 테스트하고자 하는 혈청 샘플의 MBL-결합 완충액 (1 M NaCl)에서 희석하였고 희석된 샘플을 플레이트에 첨가하여 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 단지 완충액만을 받은 웰을 음성 대조군으로 사용하였다.
5) 4℃에서 밤새도록 인큐베이션 후, 플레이트를 TBS/tween/Ca2+로 3회 세척하였다. 그 다음에 인간 C4 (BBS (4 mM 바르비탈, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4)에 희석된 1 μg/ml의 100 μl/웰)를 플레이트에 첨가하였고 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 TBS/tween/Ca2+로 3회 세척하였다.
6) C4b 침착을 알칼리성 포스파타제-컨쥬게이션된 닭 항-인간 C4c (TBS/tween/Ca2+에 1:1000로 희석됨)로 검출하였으며, 이것을 플레이트에 첨가하였고 실온에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 플레이트를 다시 TBS/tween/Ca2+로 3회 세척하였다.
7) p-나이트로페닐 포스페이트 기질 용액 100 μl를 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하고, 미세역가 플레이트 리더에서 OD405를 판독하여 알칼리성 포스파타제를 검출하였다
결과: 도 5A-B는 MASP-2+/+ (십자형), MASP-2+/- (닫힌 원) 및 MASP-2-/- (닫힌 삼각형)의 혈청 희석액에서 만난 (도 5A) 및 치모산 (도 5B) 상의 C4b 침착의 양을 나타낸다. 도 5C는 치모산 (흰색 막대) 또는 만난 (음영 막대)으로 코팅된 플레이트 상에서 야생형 혈청에 대하여 표준화된 C4b 침착의 양의 측정을 기반으로 야생형 마우스 (n=5)에 관하여 MASP-2-/+ 마우스 (n=5) 및 MASP-2-/- 마우스 (n=4)의 상대적 C4 컨버타제 활성을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 5A-C에서 도시된 바와 같이, MASP-2-/- 마우스의 혈장은 만난 및 치모산 코팅된 플레이트에서 렉틴-경로-매개 보체 활성화가 완전히 결핍되어 있다. 이들 결과는 MASP-2가 렉틴 경로의 이펙터 구성요소임을 분명하게 입증한다.
재조합 MASP-2는 MASP-2-/- 마우스의 혈청에서 렉틴 경로-의존적 C4 활성화를 복원한다.
MASP-2의 부재가 MASP-2-/- 마우스에서 렉틴 경로-의존적 C4 활성화의 손실의 직접적인 원인임을 확립하기 위해서, 혈청 샘플로의 재조합 MASP-2 단백질의 추가의 효과를 상기 기술된 C4 절단 검정으로 검사하였다. 기능적으로 활성인 쥐과 MASP-2 및 촉매적 비활성 쥐과 MASP-2A (여기서 세린 프로테아제 도메인의 활성-부위 세린 잔기가 알라닌 잔기에 대하여 치환됨) 재조합 단백질을 하기 실시예 3에서 기술된 바와 같이 생성하고 정제하였다. 4마리의 MASP-2 -/- 마우스로부터 모아진 혈청을 증가하는 단백질 농도의 재조합 쥐과 MASP-2 또는 비활성 재조합 쥐과 MASP-2A와 함께 사전 인큐베이션하였고 C4 컨버타제 활성을 상기 기술된 바와 같이 검정하였다.
결과: 도 6에서 도시된 바와 같이, MASP-2 -/- 마우스로부터 얻어진 혈청에 기능적으로 활성인 쥐과 재조합 MASP-2 단백질 (열린 삼각형으로 표시됨)의 첨가는 단백질 농도 의존성 방식으로 렉틴 경로-의존적 C4 활성화를 회복시키는 반면, 촉매 비활성 쥐과 MASP-2A 단백질 (별표로 표시됨)은 C4 활성화를 회복시키지 않았다. 도 6에 나타낸 결과는 모아진 야생형 마우스 혈청으로 관찰된 C4 활성화 (점선으로 표시됨)에 대하여 표준화된다.
실시예 3
이 실시예는 재조합 전체 길이 인간, 래트 및 쥐과 MASP-2, MASP-2 유래된 폴리펩타이드, 및 MASP-2의 촉매에 의해 비활성화된 돌연변이 형태의 재조합 발현 및 단백질 생성을 기술한다.
전체 길이 인간, 쥐과 및 래트 MASP-2의 발현:
인간 MASP-2의 전체 길이 cDNA 서열 (SEQ ID NO: 4)을 또한 포유류 발현 벡터 pCI-Neo (Promega)로 하위클로닝하였으며, 이것은 CMV 인핸서/프로모터 영역의 제어 하에서 진핵세포 발현을 구동한다 (Kaufman R.J.　et　al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)에서 기술됨). 전체 길이 마우스 cDNA (SEQ ID NO:50) 및 래트 MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:53)를 각각 pED 발현 벡터로 하위클로닝하였다. 그 다음에 MASP-2 발현 벡터를 Maniatis et al., 1989에서 기술된 표준 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 과정을 사용하여 부착형 중국 햄스터 난소 DXB1으로 트랜스펙션하였다. 이 구조체로 트랜스펙션된 세포는 매우 천천히 성장하였으며, 암호화된 프로테아제가 세포독성이라는 것을 나타낸다.
또 다른 접근법에서, 내인성 프로모터에 의해 구동되는 MASP-2의 인간 cDNA를 포함하는 미니유전자 구조체 (SEQ ID NO:49)를 중국 햄스터 난소 세포 (CHO)로 일시적으로 트랜스펙션하였다. 인간 MASP-2 단백질은 배양 배지로 분비되어 하기 기술된 바와 같이 분리된다.
전체 길이 촉매적 비활성 MASP-2의 발현:
근거: MASP-2는 인식 하위 구성요소 MBL 또는 피콜린 (L-피콜린, H-피콜린 또는 M-피콜린)이 각각의 탄수화물 패턴에 결합한 후 자가촉매적 절단에 의해 활성화된다. MASP-2의 활성화를 초래하는 자가촉매적 절단은 종종 혈청의 MASP-2의 분리 과정 중에, 또는 재조합 발현 후 정제 중에 일어난다. 항원으로 사용되는 더 안정한 단백질 조제물을 얻기 위해서, MASP-2A로 지정된 MASP-2의 촉매 비활성 형태를 프로테아제 도메인의 촉매 삼중체로 존재하는 세린 잔기를 래트에서 (SEQ ID NO:55 Ser617에서 Ala617로); 마우스에서 (SEQ ID NO:52 Ser617에서 Ala617로); 또는 인간에서 (SEQ ID NO:6 Ser618에서 Ala618로) 알라닌 잔기로 대체하여 생성하였다.
촉매 비활성 인간 및 쥐과 MASP-2A 단백질을 생성하기 위해서, 표 5에서 나타낸 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 부위-특이적 돌연변이 유발을 수행하였다. 표 5의 올리고뉴클레오타이드를 효소적 활성 세린을 암호화하는 인간 및 쥐과 cDNA의 영역에 어닐링하도록 설계하였고 올리고뉴클레오타이드는 세린 코돈을 알라닌 코돈으로 바꾸기 위해서 미스매치(mismatch)를 포함한다. 예를 들어, 시작 코돈에서 효소적 활성 세린까지 및 세린에서 종결 코돈까지의 영역을 증폭시키기 위해 PCR 올리고뉴클레오타이드 SEQ ID NO:56-59를 인간 MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:4)와 조합하여 사용하여 Ser618에서 Ala618로의 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 MASP-2A의 완전한 오픈 리딩 프레임을 생성하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동 및 밴드 제조 후 정제하였고 표준 테일링(tailing) 과정을 사용하여 단일 아데노신 중복을 생성하였다. 그 다음에 아데노신 꼬리가 달린 MASP-2A를 pGEM-T 이지 벡터로 클로닝하여, 대장균으로 형질전환하였다.
SEQ ID NO:64 및 SEQ ID NO:65를 키나아제 처리하고 어닐링하고, 이들 두 개의 올리고뉴클레오타이드를 같은 몰량으로 조합하고, 100℃에서 2분 동안 가열하고, 서서히 실온으로 냉각시켜서 촉매 비활성 래트 MASP-2A 단백질을 생성하였다. 결과로 생성된 어닐링 단편은 Pst1 및 Xba1 호환성 단부를 가지며 야생형 래트 MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:53)의 Pst1-Xba1 단편의 위치에 삽입되어 래트 MASP-2A를 생성하였다.
5 'GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3' (SEQ ID NO:64)
5' CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA 3' (SEQ ID NO:65)
하기 기술된 바와 같이 인간, 쥐과 및 래트 MASP-2A를 각각 포유류 발현 벡터 pED 또는 pCI-Neo 중 하나에 추가로 하위클로닝하였고 중국 햄스터 난소 세포주 DXB1로 트랜스펙션하였다.
또 다른 접근법에서, 촉매 비활성 형태의 MASP-2를 Chen et al., J. Biol. Chem., 276(28):25894-25902, 2001에서 기술된 방법을 사용하여 구성한다. 간략히 말하면, 전체 길이 인간 MASP-2 cDNA를 포함하는 플라스미드 (Thiel et al., Nature 386:506, 1997에서 기술됨)를 Xho1 및 EcoR1으로 분해하고 MASP-2 cDNA (본원에서 SEQ ID NO:4로 기술됨)를 pFastBac1 바큘로바이러스(baculovirus) 전송 벡터 (Life Technologies, NY)의 상응하는 제한 부위로 클로닝한다. 그 다음에 펩타이드 영역 아미노산 610-625 (SEQ ID NO:13)를 암호화하는 이중 나선 올리고뉴클레오타이를 고유 영역 아미노산　610 내지 625로 치환하여 비활성 프로테아제 도메인을 가진 MASP-2 전체 길이 폴리펩타이드를 생성함으로써 Ser618의 MASP-2 세린 프로테아제 활성 부위를 Ala618로 변화시킨다.
인간 MASP-2로부터 유래된 발현 플라스미드 포함 폴리펩타이드 영역의 구성.
MASP-2의 다양한 도메인을 분비하기 위해 MASP-2 신호 펩타이드 (SEQ ID NO:5의 잔기 1-15)를 사용하여 다음 구조체를 생성하였다. 인간 MASP-2 CUBI 도메인 (SEQ ID NO:8)을 발현하는 구조체를 MASP-2 (SEQ ID NO:6)의 잔기 1-121을 암호화하는 영역 (N-말단 CUBI 도메인에 상응함)을 증폭시키는 PCR에 의해 제조한다. 인간 MASP-2 CUBIEGF 도메인 (SEQ ID NO:9)을 발현하는 구조체를 MASP-2 (SEQ ID NO:6)의 잔기 1-166을 암호화하는 영역 (N-말단 CUBIEGF 도메인에 상응함)을 증폭시키는 PCR에 의해 제조한다. 인간 MASP-2 CUBIEGFCUBII 도메인 (SEQ ID NO:10)을 발현하는 구조체를 MASP-2 (SEQ ID NO:6)의 잔기 잔기 1-293을 암호화하는 영역 (N-말단 CUBIEGFCUBII 도메인에 상응함)을 증폭시키는 PCR에 의해 제조한다. 상기 언급된 도메인을 확립된 PCR 방법에 따라 VentR 폴리머라제 및 주형으로서 pBS-MASP-2를 사용한 PCR에 의해 증폭하였다. 센스 프라이머의 5' 프라이머 서열 (5'-CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' SEQ ID NO:34)은 PCR 생성물의 5' 단부에서 BamHI 제한 부위 (밑줄)를 도입한다. 각각의 PCR 생성물의 단부에서 종결 코돈 (볼드체)에 이어서 EcoRI 부위 (밑줄)를 도입하기 위해, 하기 표 5에서 나타난, MASP-2 도메인 각각에 대한 안티센스 프라이머를 설계한다. 증폭되면, DNA 단편을 BamHI 및 EcoRI로 분해하여 pFastBac1 벡터의 상응하는 부위에 클로닝한다. 결과로 생성된 구조체는 제한 매핑을 특징으로 하고 dsDNA 서열분석으로 확인한다.
MASP-2 PCR 프라이머
MASP-2 도메인 5' PCR 프라이머 3' PCR 프라이머
SEQ ID NO:8
CUBI (SEQ ID NO:6의 aa 1-121) 		5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (SEQ ID NO:34) 5'GGAATTCCTAGGCTGCATA (SEQ ID NO:35)
SEQ ID NO:9
CUBIEGF (SEQ ID NO:6의 aa 1-166)		 5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (SEQ ID NO:34) 5'GGAATTCCTACAGGGCGCT-3' (SEQ ID NO:36)
SEQ ID NO:10CUBIEGFCUBII (SEQ ID NO:6의 aa 1-293) 5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (SEQ ID NO:34) 5'GGAATTCCTAGTAGTGGAT 3' (SEQ ID NO:37)
SEQ ID NO:4
인간 MASP-2 		5'ATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTC 3' (SEQ ID NO: 56) hMASP-2_전방 5'TTAAAATCACTAATTATGTTCTCGATC 3' (SEQ ID NO: 59) hMASP-2_역방향
SEQ ID NO:4
인간 MASP-2 cDNA		 5'CAGAGGTGACGCAGGAGGGGCAC 3' (SEQ ID NO: 58) hMASP-2_ala_전방 5'GTGCCCCTCCTGCGTCACCTCTG 3' (SEQ ID NO: 57) hMASP-2_ala_역방향
SEQ ID NO:50
쥐과 MASP-2 cDNA		 5'ATGAGGCTACTCATCTTCCTGG3' (SEQ ID NO: 60) mMASP-2_전방 5'TTAGAAATTACTTATTATGTTCTCAATCC3' (SEQ ID NO: 63) mMASP-2_역방향
SEQ ID NO:50
쥐과 MASP-2 cDNA		 5'CCCCCCCTGCGTCACCTCTGCAG3' (SEQ ID NO: 62) mMASP-2_ala_전방 5'CTGCAGAGGTGACGCAGGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 61) mMASP-2_ala_역방향
MASP-2의 재조합 진핵세포 발현 및 효소적 비활성 마우스, 래트, 및 인간 MASP-2A의 단백질 생성
상기 기술된 MASP-2 및 MASP-2A 발현 구조체를 표준 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 과정을 사용하여 DXB1 세포로 트랜스펙션하였다 (Maniatis et al., 1989). MASP-2A를 조제물이 다른 혈청 단백질로 오염되지 않았음을 보장하기 위해 무혈청 배지에서 생성하였다. 배지를 격주마다 융합성 세포로부터 수확하였다 (총 4번). 재조합 MASP-2A의 수준은 평균적으로 세 개의 종 각각에 대한 배양 배지의 대략 1.5 mg/리터이다.
MASP-2A 단백질 정제: MASP-2A (상기 기술된 Ser-Ala 돌연변이)를 MBP-A-아가로스 컬럼 상에서 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이 전략은 무관한 태그의 사용 없이 신속한 정제를 가능하게 한다. MASP-2A (동량의 로딩 완충액 (150 mM NaCl 및 25 mM CaCl2를 포함하는 50 mM Tris-Cl, pH 7.5)으로 희석된 배지 중 100-200　ml)를 로딩 완충액 10 ml로 사전 평형화된 MBP-아가로스 친화도 컬럼 (4 ml)에 로딩하였다. 추가의 로딩 완충액 10 ml로 세척 후, 1.25 M NaCl 및 10 mM EDTA를 포함하는 50 mM Tris-Cl, pH 7.5로 1 ml 분획에서 단백질을 용출하였다. MASP-2A를 포함하는 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 식별하였다. 필요한 경우, MASP-2A를 MonoQ 컬럼 (HR 5/5) 상에서 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 단백질을 50 mM NaCl을 포함하는 50 mM Tris-Cl pH 7.5로 투석하였고 같은 완충액에서 평형화된 컬럼에 로딩하였다. 세척 후, 결합된 MASP-2A를 10 ml에서 0.05-1 M NaCl 구배로 용출하였다.
결과: MASP-2A 단백질의 0.25-0.5 mg의 수율을 배지 200 ml로부터 얻었다. MALDI-MS에 의해 측정된 77.5 kDa의 분자 질량은 글리코실화 때문에 변형되지 않은 폴리펩타이드 (73.5 kDa)의 계산치보다 더 큰 것으로 측정된다. 각각의 N-글리코실화 부위에서 글리칸의 부착은 관찰된 질량을 설명한다. MASP-2A는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 단일 밴드로 이동하며, 생합성 중에 단백질 가수분해로 가공된 것이 아님을 입증한다. 평형 초원심분리에 의해 측정된 중량-평균 분자 질량은 글리코실화된 폴리펩타이드의 호모다이머에 대한 계산치와 일치한다.
재조합 인간 MASP-2 폴리펩타이드의 생성
재조합 MASP-2 및 MASP2A 유래된 폴리펩타이드를 생성하기 위한 또 다른 방법은 Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166:5068-5077, 2001에서 기술되어 있다. 간략히 말하면, 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 곤충 세포 (Novagen, Madison, WI로부터 얻어진 Ready-Plaque Sf9 세포)를 50 IU/ml 페니실린 및 50 mg/ml 스트렙토마이신 (Life Technologies)으로 보충된 Sf900II 무혈청 배지 (Life Technologies)에서 키우고 유지한다. 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) (High Five) 곤충 세포 (Jadwiga Chroboczek, Institut de Biologie Structurale, Grenoble, France에 의해 제공됨)를 50 IU/ml 페니실린 및 50 mg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 10% FCS (Dominique Dutscher, Brumath, France)를 함유하는 TC100 배지 (Life Technologies)에서 유지한다. 재조합 바큘로바이러스를 Bac-to-Bac 시스템® (Life Technologies)을 사용하여 생성하였다. 백미드(bacmid) DNA를 Qiagen midiprep 정제 시스템 (Qiagen)을 사용하여 정제하고 제조사의 프로토콜에서 기술된 바와 같이 Sf900 II SFM 배지 (Life Technologies) 중의 셀펙틴을 사용하여 Sf9 곤충 세포를 트랜스펙션하는데 사용한다. 재조합 바이러스 입자를 4일 후에 수거하고, 바이러스 플라크 검정으로 적정하고, King and Possee, in The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., London, pp.　111-114, 1992에 의해 기술된 바와 같이 증폭시켰다.
High Five 세포 (1.75 x 107개의 세포/175-cm2 조직 배양 플라스크)를 Sf900 II SFM 배지에서 2의 감염 다중도로 MASP-2 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 바이러스로 28℃에서 96 h 동안 감염시켰다. 상층액을 원심분리에 의해 수거하고 디아이소프로필 포스포로플루오리데이트를 1 mM의 최종 농도로 첨가한다.
MASP-2 폴리펩타이드는 배양 배지에서 분지된다. 배양 상층액을 50 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 50 mM 트라이에탄올아민 하이드로클로라이드, pH 8.1에 의해 투석하고, 같은 완충액에서 평형화된 Q-세파로스 Fast Flow 컬럼 (Amersham Pharmacia Biotech) (2.8 x 12 cm)에 1.5 ml/min으로 로딩한다. 같은 완충액 중의 350 mM NaCl에 1.2 리터 선형 구배를 적용함으로써 용출을 실시한다. 재조합 MASP-2 폴리펩타이드를 포함하는 분획을 웨스턴 블롯 분석에 의해 식별하고, 60% (w/v)까지 (NH4)2SO4를 첨가하여 침전시키고, 4℃에서 밤새도록 내버려둔다. 펠릿을 145 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 50 mM 트라이에탄올아민 하이드로클로라이드, pH 7.4에 재현탁시키고, 같은 완충액으로 평형화된 TSK G3000 SWG 컬럼 (7.5 x 600 mm) (Tosohaas, Montgomeryville, PA)에 적용한다. 그 다음에 정제된 폴리펩타이드를 Microsep 미세농축기 상에서의 초원심분리에 의해 0.3 mg/ml로 농축한다 (m.w. 컷오프(cut-off) = 10,000) (Filtron, Karlstein, Germany).
실시예 4
이 실시예는 MASP-2 폴리펩타이드에 대한 다클론성 항체를 생성하는 방법을 기술한다.
재료 및 방법:
MASP-2 항원: 다클론성 항-인간 MASP-2 항혈청은 다음의 분리된 MASP-2 폴리펩타이드로 토끼를 면역화하여 생성한다: 혈청으로부터 분리된 인간 MASP-2 (SEQ ID NO:6); 재조합 인간 MASP-2 (SEQ ID NO:6), 실시예 3에서 기술된 바와 같이 비활성프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:13)을 포함하는 MASP-2A; 및 실시예 3에서 기술된 바와 같이 발현되는 재조합 CUBI (SEQ ID NO:8), CUBEGFI (SEQ ID NO:9), 및 CUBEGFCUBII (SEQ ID NO:10).
다클론성 항체: BCG (바실루스 칼메트-구에린 백신(bacillus Calmette-Guerin vaccine))로 프라이밍된(primed) 6주령 토끼를, MASP-2 폴리펩타이드 100 μg을 멸균 식염수 용액 중의 100 μg/ml로 주사하여 면역화한다. 주사를 4주마다 실행하며, 항체 역가를 실시예 5에서 기술되는 바와 같이 ELISA 검정에 의해 모니터링한다. 배양 상층액을 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의한 항체 정제를 위해 수거한다.
실시예 5
이 실시예는 래트 또는 인간 MASP-2 폴리펩타이드에 대한 쥐과 단클론성 항체를 생성하기 위한 방법을 기술한다.
재료 및 방법:
8-12주령 수컷 A/J 마우스 (Harlan, Houston, Tex.)를 포스페이트 완충된 식염수 (PBS) pH 7.4 200 μl 중의 완전 프로인트 보조제 (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) 중의 100 μg 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩타이드 (실시예 3에서 기술된 바와 같이 제조됨)로 피하로 주사한다. 2주 간격으로 마우스를 불완전 프로인트 보조제 중의 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩타이드 50 μg으로 피하로 2회 주사한다. 제4 주에 마우스를 PBS 중의 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩타이드 50 μg으로 주사하고 4일 후에 융합시킨다.
각각의 융합을 위해, 단일 세포 현탁액을 면역화된 마우스의 비장으로부터 제조하고 Sp2/0 골수종 세포로의 융합에 사용한다. 5x108개의 Sp2/0 및 5x108 비장 세포를 50% 폴리에틸렌 글리콜 (M.W. 1450) (Kodak, Rochester, N.Y.) 및 5% 디메틸설폭사이드 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)를 포함하는 배지에서 융합시킨다. 그 다음에 세포를 10% 태아 소 혈청, 100 유닛/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 0.1 mM 하이포잔틴, 0.4 μM 아미노프테린 및 16 μM 티미딘으로 보충된 Iscove 배지 (Gibco, Grand Island, N.Y.) 중의 현탁액 200 μl 당 1.5x105개의 비장 세포의 농도로 조정한다. 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 약 20개의 96-웰 미소 배양 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 약 10일 후 ELISA 검정에서 정제된 인자 MASP-2와의 반응성에 대하여 스크리닝하기 위해 배양 상층액을 회수한다.
ELISA 검정: Immulon® 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) 마이크로테스트 플레이트의 웰을 50 ng/ml 래트 rMASP-2 (또는 rMASP-2A)로 50 μl의 정제된 hMASP-2를 첨가하여 밤새도록 실온에서 코팅한다. 코팅용 저농도의 MASP-2는 고친화도 항체의 선택을 가능하게 한다. 플레이트를 털어서 코팅 용액을 제거한 후, PBS 중의 BLOTTO (무지방 탈지 분유) 200 μl를 각 웰에 1시간 동안 첨가하여 비-특이적 부위를 차단한다. 1시간 후, 웰을 완충액 PBST (0.05% Tween 20을 포함하는 PBS)로 세척한다. 각 융합 웰의 배양 상층액 50 마이크로리터를 수거하여 BLOTTO 50 μl와 혼합한 다음 마이크로테스트 플레이트의 개개의 웰에 첨가한다. 인큐베이션 1시간 후, 웰을 PBST로 세척한다. 결합된 쥐과 항체를 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG (Fc 특이적) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.)와의 반응으로 검출하고 BLOTTO에서 1:2,000로 희석한다. 0.1% 3,3,5,5 테트라메틸 벤지딘 (Sigma, St. Louis, Mo.) 및 0.0003% 과산화수소 (Sigma)의 퍼옥시다제 기질 용액을 발색 현상을 위해 30분 동안 웰에 첨가한다. 반응을 웰 당 2M H2SO4 50 μl의 첨가에 의해 중단시킨다. 반응 혼합물의 450 nm에서의 광학 밀도를 BioTek® ELISA Reader (BioTek® Instruments, Winooski, Vt.)로 판독한다.
MASP-2 결합 검정:
상기 기술된 MASP-2 ELISA 검정에서 양성 반응을 보이는 배양 상층액을 결합 검정으로 테스트하여 MASP-2에 대하여 MASP-2억제제가 갖는 결합 친화도를 측정할 수 있다. 유사한 검정을 또한 사용하여 보체 시스템에서 억제제가 다른 항원에 결합하는지를 측정할 수 있다.
폴리스티렌 미세역가 플레이트 웰 (96-웰 배지 결합 플레이트, Corning Costar, Cambridge, MA)을 포스페이트-완충된 식염수 (PBS) pH 7.4 중의 MASP-2 (20 ng/100 μl/웰, Advanced Research Technology, San Diego, CA)로 4℃에서 밤새도록 코팅한다. MASP-2 용액을 빨아낸 후, 웰을 실온에서 2 h 동안 1% 소 혈청 알부민 (BSA; Sigma Chemical)을 포함하는 PBS로 차단한다. MASP-2 코팅되지 않은 웰은 백그라운드 대조군의 역할을 한다. 하이브리도마 상층액 또는 정제된 항-MASP-2 MoAb의 부분 표본액을 차단 용액 중의 다양한 농도로 웰에 첨가한다. 실온에서 2 h 인큐베이션 후, 웰을 PBS로 광범위하게 헹군다. MASP-2-결합된 항-MASP-2 MoAb를 차단 용액 중의 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG (Sigma Chemical)의 첨가에 의해 검출하며, 이것을 실온에서 1 h 동안 인큐베이션시킨다. 플레이트를 다시 PBS로 충분히 헹구고, 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB) 기질 (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) 100 μl를 첨가한다. TMB의 반응을 1M 인산 100 μl의 첨가에 의해 퀸칭하고, 플레이트를 마이크로플레이트 리더 (SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 450 nm에서 판독한다.
양성 웰의 배양 상층액을 실시예 2에서 기술된 바와 같이 C4 절단 검정과 같은 기능적 검정에서 보체 활성화를 억제하는 능력에 대하여 테스트한다. 양성 웰의 세포를 한계 희석에 의해 클로닝한다. MoAb를 hMASP-2와의 반응성에 대하여 상기 기술된 바와 같이 ELISA 검정에서 다시 테스트한다. 선택된 하이브리도마를 스피너(spinner) 플라스크에서 키우고 소비된 배양 상층액을 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의한 항체 정제를 위해 수거한다.
실시예 6
이 실시예는 인간화된 쥐과 항-MASP-2 항체 및 항체 단편의 생성 및 생성을 기술한다.
쥐과 항-MASP-2 단클론성 항체는 실시예 5에서 기술된 바와 같이 수컷 A/J 마우스에서 생성된다. 쥐과 항체는 쥐과 불변 영역을 인간 대응물로 대체하여 키메라 IgG 및 항체의 Fab를 생성함으로써 면역원성을 감소시키기 위해 하기 기술된 바와 같이 인간화되며, 이것은 본 발명에 따라 인간 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화의 부작용을 억제하는데 유용하다.
1. 쥐과 하이브리도마 세포의 항-MASP-2 가변 영역 유전자의 클로닝. 전체 RNA를 제조사 (Biotech, Houston, Tex.)의 프로토콜에 따라 RNAzol을 사용하여 항-MASP-2 MoAb를 분비하는 하이브리도마 세포 (실시예 7에서 기술된 바와 같이 얻어짐)로부터 분리한다. 제1 가닥 cDNA를 프라이머로서 올리고 dT를 사용하여 전체 RNA로부터 합성한다. PCR를 면역글로불린 불변 C 영역-유래 3' 프라이머 및 5' 프라이머로서 쥐과 VH 또는 VK 유전자의 리더 펩타이드 또는 제1 프레임워크 영역으로부터 유래된 변성 프라이머 세트를 사용하여 수행한다. 고정된 PCR을 Chen and Platsucas에 의해 기술된 바와 같이 수행한다 (Chen, P.F., Scand. J. Immunol. 35:539-549, 1992). VK 유전자를 클로닝하기 위해, 이중-가닥 cDNA를 Notl-MAK1 프라이머 (5'-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3' SEQ ID NO:38)를 사용하여 제조한다. 어닐링된 어댑터 AD1 (5'-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3' SEQ ID NO:39) 및 AD2 (5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3' SEQ ID NO:40)를 이중-가닥 cDNA의 5' 및 3' 말단 둘 다에 결찰시킨다. 3' 단부의 어댑터를 Notl 분해에 의해 제거한다. 그 다음에 분해된 생성물을 주형으로서 5' 프라이머로서 AD1 올리고뉴클레오타이드 및 3' 프라이머로서 MAK2 (5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3' SEQ ID NO:41)와 함께 PCR에 사용한다. 대략 500 bp의 DNA 단편을 pUC19로 클로닝한다. 클로닝된 서열이 예상 쥐과 면역글로불린 불변 영역을 포함한다는 것을 확인하기 위한 서열 분석을 위해 여러 클론을 선택한다. Not1-MAK1 및 MAK2 올리고뉴클레오타이드는 VK 영역으로부터 유래되고 각각 C 카파 유전자의 제1 염기쌍의 하류의 182 및 84 bp이다. 완전한 VK 및 리더 펩타이드를 포함하는 클론을 선택한다.
VH 유전자를 클로닝하기 위해, Not1 MAG1 프라이머 (5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3' SEQ ID NO:42)를 사용하여 이중-가닥 cDNA를 제조한다. 어닐링된 어댑터 AD1 및 AD2를 이중-가닥 cDNA의 5' 및 3' 말단 둘 다로 결찰시킨다. 3' 단부의 어댑터를 Notl 분해에 의해 제거한다. 분해된 생성물을 프라이머로서 AD1 올리고뉴클레오타이드 및 MAG2 (5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3' SEQ ID NO:43)와 함께 주형으로서 PCR에 사용한다. 길이가 500 내지 600 bp의 DNA 단편을 pUC19로 클로닝한다. Notl-MAG1 및 MAG2 올리고뉴클레오타이드를 쥐과 Cγ.7.1 영역으로부터 유도하고, 각각 쥐과 Cγ.7.1 유전자의 제1 bp의 하류의 180 및 93 bp이다. 완전한 VH 및 리더 펩타이드를 포함하는 클론을 선택한다.
2. 키메라 MASP-2 IgG 및 Fab에 대한 발현 벡터의 구성. 뉴클레오타이드 서열의 5' 단부에 코자크(Kozak) 공통 서열 및 3' 단부에 스플라이스 공여체를 첨가하기 위해 상기 기술된 클로닝된 VH 및 VK 유전자를 PCR 반응의 주형으로서 사용한다. PCR 오류의 부재를 확인하기 위해 서열을 분석한 후, VH 및 VK 유전자를 각각 인간 C.γ1 및 C. 카파를 포함하는 발현 벡터 카세트로 삽입하여 pSV2neoVH-huCγ1 및 pSV2neoV-huCγ를 제공한다. 중쇄 및 경쇄 벡터의 CsCl 구배-정제된 플라스미드 DNA를 사용하여 전기천공법에 의해 COS 세포를 트랜스펙션한다. 48시간 후, 배양 상층액을 ELISA로 테스트하여 대략 200 ng/ml의 키메라 IgG의 존재를 확인한다. 세포를 수확하여 전체 RNA를 제조한다. 제1 가닥 cDNA를 프라이머로서 올리고 dT를 사용하여 전체 RNA로부터 합성한다. 이 cDNA를 PCR에서 주형으로 사용하여 Fd 및 카파 DNA 단편을 생성한다. Fd 유전자에 대하여, 5' 프라이머로서 5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3' (SEQ ID NO:44) 및 CH1-유래 3' 프라이머 (5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3' SEQ ID NO:45)를 사용하여 PCR을 수행한다. DNA 서열을 인간 IgG1의 완전한 VH 및 CH1 도메인을 포함하는지 확인한다. 적절한 효소로의 소화 후, Fd DNA 단편을 발현 벡터 카세트 pSV2dhfr-TUS의 HindIII 및 BamHI 제한 부위에 삽입하여 pSV2dhfrFd를 제공한다. pSV2 플라스미드는 상업적으로 입수 가능하고 다양한 공급원의 DNA 분절로 구성된다: pBR322 DNA (얇은 선)는 DNA 복제의 pBR322 기원 (pBR ori) 및 락타마제 앰피실린 저항성 유전자 (Amp)를 포함하고; 더 넓은 해칭(hatching)으로 나타나고 표시된 SV40 DNA는 DNA 복제의 SV40 기원 (SV40 ori), 초기 프로모터 (dhfr 및 neo 유전자에 대하여 5'), 및 폴리아데닐화 신호 (dhfr 및 neo 유전자에 대하여 3')를 포함한다. SV40-유래 폴리아데닐화 신호 (pA)를 또한 Fd 유전자의 3' 단부에 배치한다.
카파 유전자에 대하여, 5' 프라이머로서 5'- AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3' (SEQ ID NO:46) 및 CK-유래 3' 프라이머 (5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3' SEQ ID NO:47)를 사용하여 PCR을 수행한다. DNA 서열을 완전한 VK 및 인간 CK 영역을 포함하는지 확인한다. 적절한 제한 효소로의 소화 후, 카파 DNA 단편을 발현 벡터 카세트 pSV2neo-TUS의 HindIII 및 BamHI 제한 부위에 삽입하여 pSV2neoK를 제공한다. Fd 및 카파 유전자의 발현을 HCMV-유래 인핸서 및 프로모터 요소에 의해 구동한다. Fd 유전자가 사슬간 이황화 결합에 포함된 시스테인 아미노산 잔기를 포함하지 않기 때문에, 이 재조합 키메라 Fab는 비-공유 결합에 의해 결합된 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 이 키메라 Fab는 cFab로 지정된다.
중쇄 및 경쇄 간 이황화 결합을 가진 재조합 Fab를 얻기 위해서, 상기 Fd 유전자를 인간 IgG1의 힌지 영역의 추가적인 9개의 아미노산 (EPKSCDKTH SEQ ID NO:48)에 대한 암호화 서열을 포함하도록 연장시킬 수 있다. Fd 유전자의 3' 단부에서 30개의 아미노산을 암호화하는 BstEII-BamHI DNA 분절을 연장된 Fd를 암호화하는 DNA 분절로 대체할 수 있으며, pSV2dhfrFd/9aa를 발생시킨다.
3. 키메라 항-MASP-2 IgG의 발현 및 정제
키메라 항-MASP-2 IgG를 분비하는 세포주를 생성하기 위해, NSO 세포를 전기천공법에 의해 pSV2neoVH-huC.γ1 및 pSV2neoV-huC 카파의 정제된 플라스미드 DNA로 트랜스펙션한다. 트랜스펙션된 세포를 0.7 mg/ml G418의 존재 하에서 선택한다. 세포를 혈청-함유 배지를 사용하여 250 ml 스피너 플라스크에서 키운다.
100 ml 스피너 배양액의 배양 상층액을 10-ml PROSEP-A 컬럼 (Bioprocessing, Inc., Princeton, N.J.)에 로딩한다. 컬럼을 10배 부피의 PBS로 세척한다. 결합된 항체를 50 mM 시트레이트 완충액, pH 3.0으로 용출시킨다. 동일한 부피의 1 M Hepes, pH 8.0을 정제된 항체를 포함하는 분획에 첨가하여 pH를 7.0로 조정한다. 잔류 염을 Millipore 막 한외여과에 의한 PBS로의 완충액 교환에 의해 제거한다 (M.W. 컷오프: 3,000). 정제된 항체의 단백질 농도를 BCA 방법 (Pierce)에 의해 결정한다.
4. 키메라 항-MASP-2 Fab의 발현 및 정제
키메라 항-MASP-2 Fab를 분비하는 세포를 생성하기 위해, CHO 세포를 전기천공법에 의해 pSV2dhfrFd (또는 pSV2dhfrFd/9aa) 및 pSV2neokappa의 정제된 플라스미드 DNA로 트랜스펙션한다. 트랜스펙션된 세포를 G418 및 메토트렉세이트의 존재 하에서 선택한다. 선택된 세포주를 증가하는 농도의 메토트렉세이트에서 증폭시킨다. 세포는 제한 희석에 의해 클로닝된 단일 세포이다. 고생성 단일 세포 하위클로닝된 세포주를 무혈청 배지를 사용하는 100 ml 스피너 배양액에서 키운다.
키메라 항-MASP-2 Fab를 MASP-2 MoAb에 대한 마우스 항-이디오타입 MoAb를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 정제한다. 마우스를 키홀 림펫 헤모사이아닌 (KLH)과 컨쥬게이션된 쥐과 항-MASP-2 MoAb로 면역화하고 인간 MASP-2와 경합할 수 있는 특이적 MoAb 결합에 대하여 스크리닝하여 항-이디오타입 MASP-2 MoAb를 제조할 수 있다. 정제를 위해서, cFab 또는 cFab/9aa를 생성하는 CHO 세포의 스피너 배양액의 상층액 100 ml를 항-이디오타입 MASP-2 MoAb와 커플링된 친화도 컬럼에 로딩한다. 결합된 Fab가 50 mM 디에틸아민, pH 11.5로 용출되기 전에 컬럼을 PBS로 철저히 세척한다. 잔류 염을 상기 기술된 바와 같이 완충액 교환에 의해 제거한다. 정제된 Fab의 단백질 농도를 BCA 방법 (Pierce)에 의해 결정한다.
키메라 MASP-2 IgG, cFab, 및 cFAb/9aa가 MASP-2-의존적 보체 경로를 억제하는 능력을 실시예 2 또는 실시예 7에서 기술된 억제 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
실시예 7
이 실시예는 L-피콜린/P35, H-피콜린, M-피콜린 또는 만난을 통해 MASP-2-의존적 보체 활성화를 차단할 수 있는 MASP-2 억제제를 식별하기 위한 기능적 스크리닝으로서 사용된 시험관 내 C4 절단 검정을 기술한다.
C4 절단 검정: C4 절단 검정은 Petersen, S.V.,　et　al., J.　Immunol. Methods 257:107, 2001에 의해 기술되어 있으며, 이것은 L-피콜린에 결합하는 스타필로코쿠스 아우레우스의 리포테이코산 (LTA)으로부터 발생하는 렉틴 경로 활성화를 측정한다.
시약: 포르말린-고정된 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureous) (DSM20233)를 다음과 같이 제조한다: 박테리아를 트립신 처리된 대두 혈액 배지(tryptic soy blood medium)에서 37℃에서 밤새도록 키우고, PBS로 3회 세척한 다음, 실온에서 1 h 동안 PBS/0.5% 포르말린에서 고정하고, 코팅 완충액 (15 mM Na2Co3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6)에 재현탁하기 전에 추가로 PBS로 3회 세척한다.
검정: Nunc MaxiSorb® 미세역가 플레이트 (Nalgene Nunc International, Rochester, NY)의 웰을 코팅 완충액 중의 L-피콜린 1 μg과 함께 코팅 완충액 중의 포르말린-고정된 스타필로코쿠스 아우레우스 DSM20233 (OD550 = 0.5) 100 μl로 코팅한다. 밤새도록 인큐베이션한 후, 웰을 TBS (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, pH 7.4) 중의 0.1% 인간 혈청 알부민 (HSA)으로 차단한 다음, 0.05% Tween 20 및 5 mM CaCl2를 포함하는 TBS (세척 완충액)로 세척한다. 인간 혈청 샘플을 20 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Triton X-100, 0.1% HSA, pH 7.4에 희석하며, 이것은 내인성 C4의 활성화를 방지하고 C1 복합체 (C1q, C1r 및 C1s로 구성됨)를 해리시킨다. 항-MASP-2 MoAb 및 억제 펩타이드를 포함한 MASP-2 억제제를 다양한 농도로 혈청 샘플에 첨가한다. 희석된 샘플을 플레이트에 첨가하고 4℃에서 밤새도록 인큐베이션한다. 24시간 후, 플레이트를 세척 완충액으로 철저하게 세척한 다음, 4 mM 바르비탈, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4 100 μl 중 정제된 인간 C4 (Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223:46, 1993에서 기술된 바와 같이 얻어짐) 0.1 μg을 각 웰에 첨가한다. 37℃에서 1.5 h 후, 플레이트를 다시 세척하고 C4b 침착을 알칼리성 포스파타제-컨쥬게이션된 닭 항-인간 C4c (Immunsystem, Uppsala, Sweden으로부터 얻어짐)를 사용하여 검출하고 비색 기질 ρ-나이트로페닐 포스페이트를 사용하여 측정한다.
만난에 대한 C4 검정: 상기 기술된 검정은 다양한 MASP-2 억제제와 혼합된 혈청을 첨가하기 전에 LSP 및 만난으로 플레이트를 코팅함으로써 MBL을 통해 렉틴 경로 활성화를 측정하도록 조정된다.
H-피콜린 (Hakata Ag)에 대한 C4 검정: 상기 기술된 검정은 다양한 MASP-2 억제제와 혼합된 혈청을 첨가하기 전에 LSP 및 H-피콜린으로 플레이트를 코팅함으로써 H-피콜린을 통해 렉틴 경로 활성화를 측정하도록 조정된다.
실시예 8
다음 검정은 야생형 및 MASP-2-/- 마우스에서 고전적 경로 활성화의 존재를 입증한다.
방법: 실온에서 1시간 동안 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4 중의 0.1% 인간 혈청 알부민으로 제자리에서(in situ) 미세역가 플레이트 (Maxisorb®, Nunc, 카탈로그 번호 442404, Fisher Scientific)를 코팅한 후 이어서 TBS/tween/Ca2+에서 1:1000으로 희석된 양 항 전체 혈청 항혈청 (Scottish Antibody Production Unit, Carluke, Scotland)과 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하여 면역 복합체를 생성한다. 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 혈청 샘플을 얻었고 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 야생형 및 MASP-2-/- 혈청 샘플로부터 C1q이 고갈된 대조군 샘플을 제조한다. 공급자의 지시에 따라 토끼 항-인간 C1q IgG (Dako, Glostrup, Denmark)로 코팅된 단백질-A-커플링된 Dyna비드® (Dynal Biotech, Oslo, Norway)를 사용하여 C1q-고갈된 마우스 혈청을 제조하였다. 플레이트를 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 결합된 C3b를 TBS/tw/ Ca++에서 1:1000으로 희석된 다클론성 항-인간-C3c 항체 (Dako A 062)로 검출하였다. 제2 항체는 염소 항-토끼 IgG이다.
결과: 도 7은 야생형 혈청, MASP-2-/- 혈청, C1q-고갈된 야생형 및 C1q-고갈된 MASP-2-/- 혈청에서 IgG로 코팅된 플레이트 상에서의 상대적인 C3b 침착 수준을 나타낸다. 이들 결과는 고전적 경로가 MASP-2-/- 마우스 계통에서 온전하다는 것을 입증한다.
실시예 9
고전적 경로가 면역 복합체에 의해 개시되는 조건 하에서 MASP-2 억제제의 효과를 분석함으로써 MASP-2 억제제가 고전적 경로를 차단하는지를 테스트하기 위해 다음 검정을 사용한다.
방법: 고전적 경로가 면역 복합체에 의해 개시되는 경우 보체 활성화의 조건에 대한 MASP-2 억제제의 효과를 테스트하기 위해서, 90% NHS를 포함하는 3배수의 50 μl 샘플을 10 μg/ml 면역 복합체 (IC) 또는 PBS의 존재 하에 37℃에서 인큐베이션하고, 37℃ 인큐베이션 중에 200 nM 항-프로퍼딘 단클론성 항체를 포함하는 유사한 3배수 샘플 (+/-IC)이 또한 포함된다. 37℃에서 2시간 인큐베이션 후, 13 mM EDTA를 모든 샘플에 첨가하여 추가의 보체 활성화를 중단시키고 샘플을 즉시 5℃로 냉각시킨다. 그 다음에 제조사의 지시에 따라 ELISA 키트 (Quidel, 카탈로그 번호 A015 및 A009)를 사용하여 보체 활성화 생성물 (C3a 및 sC5b-9)에 대하여 검정하기 전에 샘플을 -70℃에 저장한다.
실시예 10
이 실시예는 MASP-2 활성을 차단하는 고친화도 항-MASP-2 Fab2 항체 단편의 확인을 기술한다.
배경 및 근거: MASP-2는 다음을 포함하는 많은 별도의 기능적 도메인을 가진 복합 단백질이다: MBL 및 피콜린에 대한 결합 부위(들), 세린 프로테아제 촉매 부위, 단백질 가수분해 기질 C2에 대한 결합 부위, 단백질 가수분해 기질 C4에 대한 결합 부위, MASP-2 치모겐의 자가활성화에 대한 MASP-2 절단 부위, 및 두 개의 Ca++ 결합 부위. MASP-2에 고친화도로 결합하는 Fab2 항체 단편을 식별하였고, 확인된 Fab2 단편을 기능적 검정에서 그것들이 MASP-2 기능적 활성을 차단할 수 있는지를 결정하기 위해 테스트하였다.
MASP-2 기능적 활성을 차단하기 위해서, 항체 또는 Fab2 항체 단편은 MASP-2 기능적 활성이 필요한 MASP-2 상의 구조적 에피토프에 결합하여 이것을 방해해야 한다. 그러므로, 많은 또는 모든 고친화도 결합 항-MASP-2 Fab2는 그것들이 MASP-2 기능적 활성에 직접적으로 관련된 MASP-2 상의 구조적 에피토프에 결합하지 않는 한 MASP-2 기능적 활성을 나타내지 않을 수 있다.
렉틴 경로 C3 컨버타제 형성의 억제를 평가하는 기능적 검정을 항-MASP-2 Fab2의 "차단 활성"을 평가하는데 사용하였다. 렉틴 경로에서 MASP-2의 주요 생리학적 역할은 렉틴-매개 보체 경로의 그 다음의 기능적인 구성요소, 즉, 렉틴 경로 C3 컨버타제를 생성하는 것이라고 알려져 있다. 렉틴 경로 C3 컨버타제는 단백질 가수분해에 의해 C3을 C3a 및 C3b로 절단시키는 중요한 효소 복합체 (C4bC2a)이다. MASP-2가 렉틴 경로 C3 컨버타제의 구조적 구성요소 (C4bC2a)는 아니다; 하지만, MASP-2 기능적 활성은 렉틴 경로 C3 컨버타제를 포함하는 두 개의 단백질 구성요소 (C4b, C2a)를 생성하기 위해 필요하다. 게다가, 상기 나열된 MASP-2의 모든 별도의 활성은 MASP-2가 렉틴 경로 C3 컨버타제를 생성하기 위해 필요한 것으로 보인다. 이러한 이유로, 항-MASP-2 Fab2의 "차단 활성"을 평가하는데 사용하기에 바람직한 검정은 렉틴 경로 C3 컨버타제 형성의 억제를 평가하는 기능적 검정인 것으로 생각된다.
고친화도 Fab2의 생성: 인간 가변 경쇄 및 중쇄 항체 서열의 파지 디스플레이 라이브러리 및 관심있는 선택된 리간드와 반응하는 Fab2를 식별하기 위한 자동화된 항체 선택 기술을 사용하여 래트 MASP-2 단백질 (SEQ ID NO:55)에 대한 고친화도 Fab2를 생성하였다. 래트 MASP-2 (~1 mg, >85% 순도) 단백질의 공지된 양을 항체 스크리닝에 이용하였다. 최고의 친화도를 가진 항체의 선택을 위해 3 라운드의 증폭을 이용하였다. ELISA 스크리닝을 위해 항체 단편을 발현하는 대략 250개의 상이한 히트(hit)를 골랐다. 그 후 고친화도 히트를 서열분석하여 상이한 항체의 독특성을 결정하였다.
하기 더 상세히 기술된 바와 같이, 50개의 독특한 항-MASP-2 항체를 정제하였고 각각의 정제된 Fab2 항체 250 μg을 MASP-2 결합 친화도 및 보체 경로 기능적 테스트의 특성화에 사용하였다.
항-MASP-2 Fab2의 억제 (차단) 활성을 평가하는데 사용되는 검정
1. 렉틴 경로 C3 컨버타제 형성의 억제를 측정하기 위한 검정:
배경: 렉틴 경로 C3 컨버타제는 단백질 가수분해에 의해 C3를 두 개의 강력한 전염증성 단편, 아나필라톡신 C3a 및 옵소닌 C3b로 절단시키는 효소 복합체 (C4bC2a)이다. C3 컨버타제의 형성은 염증의 매개에 관하여 렉틴 경로에서 중요한 단계인 것으로 보인다. MASP-2는 렉틴 경로 C3 컨버타제 (C4bC2a)의 구조적 구성요소는 아니며; 그러므로 항-MASP-2 항체 (또는 Fab2)는 기존의 C3 컨버타제의 활성을 직접적으로 억제하지는 않을 것이다. 하지만, MASP-2 세린 프로테아제 활성은 렉틴 경로 C3 컨버타제를 포함하는 두 개의 단백질 구성요소 (C4b, C2a)를 생성하기 위해 필요하다. 그러므로, MASP-2 기능적 활성을 억제하는 (즉, 항-MASP-2 Fab2를 차단하는) 항-MASP-2 Fab2는 렉틴 경로 C3 컨버타제의 데노보 형성을 억제할 것이다. C3은 구조의 일부로서 특이하고 고도로 반응성인 티오에스테르 기를 포함한다. 이 검정에서 C3 컨버타제에 의한 C3의 절단시, C3b 상의 티오에스테르 기는 에스테르 또는 아미드 결합을 통해 플라스틱 웰 바닥에 고정된 고분자에서 하이드록실 또는 아미노 기와 공유 결합을 형성할 수 있으며, 따라서 ELISA 검정에서 C3b의 검출을 용이하게 한다.
효모 만난은 렉틴 경로의 공지된 활성화 인자이다. C3 컨버타제의 형성을 측정하기 위한 다음 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 희석된 래트 혈청과 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 렉틴 경로를 활성화시켰다. 그 다음에 웰을 흘려버리고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰에 고정된 C3b에 대하여 테스트하였다. 이 검정에서 생성된 C3b의 양은 렉틴 경로 C3 컨버타제의 데노보 형성의 직접적인 반영이다. 선택된 농도의 항-MASP-2 Fab2를 이 검정에서 C3 컨버타제 형성 및 그 결과로 일어나는 C3b 생성을 억제하는 능력에 대하여 테스트하였다.
방법:
96-웰 Costar Medium Binding 플레이트를 50 mM 카보네이트 완충액, pH 9.5에 1 μg/50 μL/웰로 희석된 만난과 함께 5℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 밤새도록 인큐베이션 후, 각각의 웰을 200 μL PBS로 3회 세척하였다. 그 다음에 웰을 PBS 중 100 μL/웰의 1% 소 혈청 알부민으로 차단하였고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 그 다음에 각 웰을 200 μL PBS로 3회 세척하였다. 항-MASP-2 Fab2 샘플을 5℃에서 Ca++ 및 Mg++ 포함 GVB 완충액 (4.0 mM 바르비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)에서 선택된 농도로 희석하였다. 0.5% 래트 혈청을 5℃에서 상기 샘플에 첨가하였고 100 μL을 각 웰로 옮겼다. 플레이트를 덮고 37℃ 수조에서 30분 동안 인큐베이션하여 보체를 활성화시켰다. 플레이트를 37℃ 수조로부터 얼음물 혼합물을 포함하는 용기로 옮김으로써 반응을 중단시켰다. 각 웰을 PBS-Tween 20 (PBS 중의 0.05% Tween 20) 200 μL로 5회 세척한 다음, 200 μL PBS로 2회 세척하였다. 1차 항체 (토끼 항-인간 C3c, DAKO A0062)의 1:10,000 희석액의 100 μL/웰을 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS에 첨가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 μL PBS로 5회 세척하였다. 2차 항체 (퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG, American Qualex A102PU)의 1:10,000 희석액의 100 μL/웰을 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS에 첨가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 μL의 PBS로 5회 세척하였다. 100 μL/웰의 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)를 첨가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL/웰의 1.0 M H3PO4를 첨가하여 퍼옥시다제 반응을 중단시켰고 OD450을 측정하였다.
2. MASP-2-의존적 C4 절단의 억제를 측정하기 위한 검정
배경: MASP-2의 세린 프로테아제 활성은 매우 특이적이고 MASP-2에 대하여 단지 두 개의 단백질 기질, C2 및 C4를 식별하였다. C4의 절단은 C4a 및 C4b를 생성하였다. 항-MASP-2 Fab2는 C4 절단에 직접적으로 포함되는 MASP-2 상의 구조적 에피토프 (예를 들어, C4에 대한 MASP-2 결합 부위; MASP-2 세린 프로테아제 촉매 부위)에 결합할 수 있으며 이로 인해 MASP-2의 C4 절단 기능적 활성을 억제한다.
효모 만난은 렉틴 경로의 공지된 활성화 인자이다. MASP-2의 C4 절단 활성을 측정하기 위한 다음 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 희석된 래트 혈청과 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 렉틴 경로를 활성화시킨다. 이 ELISA 검정에 사용된 1차 항체는 단지 인간 C4만을 인식하기 때문에, 희석된 래트 혈청에는 또한 인간 C4 (1.0 μg/ml)를 공급한다. 그 다음에 웰을 세척하고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰에 고정된 인간 C4b에 대하여 검정하였다. 이 검정에서 생성된 C4b의 양은 MASP-2 의존성 C4 절단 활성의 측정치이다. 선택된 농도의 항-MASP-2 Fab2를 이 검정에서 C4 절단을 억제하는 능력에 대하여 테스트하였다.
방법: 96-웰 Costar Medium Binding 플레이트를 1.0 μg/50 μL/웰로 50 mM 카보네이트 완충액, pH 9.5에 희석된 만난과 함께 5℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 μL PBS로 3회 세척하였다. 그 다음에 웰을 PBS 중의 100 μL/웰의 1% 소 혈청 알부민으로 차단하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 μL의 PBS로 3회 세척하였다. 항-MASP-2 Fab2 샘플을 5℃에서 Ca++ 및 Mg++ 함유 GVB 완충액 (4.0 mM 바르비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)에 선택된 농도로 희석하였다. 1.0 μg/ml 인간 C4 (Quidel)를 또한 이 샘플에 포함시켰다. 0.5% 래트 혈청을 5℃에서 상기 샘플에 첨가하였고 100 μL을 각 웰로 옮겼다. 플레이트를 덮고 37℃ 수조에서 30분 동안 인큐베이션하여 보체 활성화시켰다. 플레이트를 37℃ 수조로부터 얼음물 혼합물을 포함하는 용기로 옮김으로써 반응을 중단시켰다. 각 웰을 PBS-Tween 20 (PBS 중의 0.05% Tween 20) 200 μL로 5회 세척한 다음, 각 웰을 200 μL PBS로 2회 세척하였다. 비오틴-컨쥬게이션된 닭 항-인간 C4c (Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)의 1:700 희석액의 100 μL/웰을 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS에 첨가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 웰을 200 μL PBS로 5회 세척하였다. 0.1 μg/ml의 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 스트렙타비딘 (Pierce Chemical #21126)의 100 μL/웰을 2.0 mg/ml BSA를 함유하는 PBS에 첨가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각각의 웰을 200 μL PBS로 5회 세척하였다. 100 μL/웰의 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)을 첨가하였고 실온에서 16분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL/웰의 1.0 M H3PO4를 첨가하여 퍼옥시다제 반응을 중단시켰고 OD450을 측정하였다.
3. '천연' 래트 MASP-2에 대한 항-래트 MASP-2 Fab2의 결합 검정
배경: MASP-2는 보통 특이적 렉틴 분자 (만노오스-결합 단백질 (MBL) 및 피콜린)를 포함하는 MASP-2 다이머 복합체로서 혈장에 존재한다. 그러므로, 생리학적으로 적절한 형태의 MASP-2로의 항-MASP-2 Fab2의 결합을 연구하는데 관심이 있으면, 정제된 재조합 MASP-2 대신에, 혈장 내 '천연' MASP-2 및 Fab2 간의 상호작용이 사용된 결합 검정을 개발하는 것이 중요하다. 이 결합 검정에서 10% 래트 혈청의 '천연' MASP-2-MBL 복합체를 먼저 만난-코팅된 웰에 고정하였다. 표준 ELISA 방법론을 사용하여 고정된 '천연' MASP-2로의 다양한 항-MASP-2 Fab2의 결합 친화도를 연구하였다.
방법: 96-웰 Costar High Binding 플레이트를 50 mM 카보네이트 완충액, pH 9.5에서 1 μg/50 μL/웰로 희석된 만난과 함께 5℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 μL PBS로 3회 세척하였다. 웰을 PBST (0.05% Tween 20이 들어있는 PBS) 중의 100 μL/웰의 0.5% 무지방 탈지 분유로 차단하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 각 웰을 TBS/Tween/Ca++ Wash 완충액 (Tris-완충된 식염수, 0.05% Tween 20, 5.0 mM CaCl2 함유, pH 7.4) 200 μL로 3회 세척하였다. 고염 결합 완충액 (20 mM Tris, 1.0 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Triton-X100, 0.1% (w/v) 소 혈청 알부민, pH 7.4) 중의 10% 래트 혈청을 얼음 위에서 제조하였다. 100 μL/웰을 첨가하였고 5℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 웰을 TBS/Tween/Ca++ 세척 완충액 200 μL로 3회 세척하였다. 그 다음에 웰을 200 μL PBS로 2회 세척하였다. Ca++ 및 Mg++ 함유 GVB 완충액 (4.0 mM 바르비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)에 희석된 선택된 농도의 항-MASP-2 Fab2의 100 μL/웰을 첨가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 μL PBS에서 5회 세척하였다. PBS 중의 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민에서 1:5000으로 희석된 HRP-컨쥬게이션된 염소 항-Fab2 (Biogenesis 카탈로그 번호 0500-0099)의 100 μL/웰을 첨가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 μL PBS로 5회 세척하였다. 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)의 100 μL/웰을 첨가하였고 실온에서 70분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL/웰의 1.0 M H3PO4를 첨가하여 퍼옥시다제 반응을 중단시켰고 OD450을 측정하였다.
방법: 96-웰 Costar High Binding 플레이트를 50 mM 카보네이트 완충액, pH 9.5에서 1 μg/50 μL/웰로 희석된 만난과 함께 5℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 μL PBS로 3회 세척하였다. 웰을 PBST (0.05% Tween 20이 들어있는 PBS) 중의 100 μL/웰의 0.5% 무지방 탈지 분유로 차단하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 각 웰을 TBS/Tween/Ca++ Wash 완충액 (Tris-완충된 식염수, 0.05% Tween 20, 5.0 mM CaCl2 함유, pH 7.4) 200 μL로 3회 세척하였다. 고염 결합 완충액 (20 mM Tris, 1.0 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Triton-X100, 0.1% (w/v) 소 혈청 알부민, pH 7.4) 중의 10% 래트 혈청을 얼음 위에서 제조하였다. 100 μL/웰을 첨가하였고 5℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 웰을 TBS/Tween/Ca++ 세척 완충액 200 μL로 3회 세척하였다. 그 다음에 웰을 200 μL PBS로 2회 세척하였다. Ca++ 및 Mg++ 함유 GVB 완충액 (4.0 mM 바르비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)에 희석된 선택된 농도의 항-MASP-2 Fab2의 100 μL/웰을 첨가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 μL PBS에서 5회 세척하였다. PBS 중의 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민에서 1:5000으로 희석된 HRP-컨쥬게이션된 염소 항-Fab2 (Biogenesis 카탈로그 번호 0500-0099)의 100 μL/웰을 첨가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 μL PBS로 5회 세척하였다. 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)의 100 μL/웰을 첨가하였고 실온에서 70분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL/웰의 1.0 M H3PO4를 첨가하여 퍼옥시다제 반응을 중단시켰고 OD450을 측정하였다.
결과:
ELISA 스크리닝을 위해 래트 MASP-2 단백질에 대하여 고친화도로 반응한 대략 250개의 상이한 Fab2를 골랐다. 이들 고친화도 Fab2를 서열분석하여 상이한 항체의 독특성을 결정하였고, 추가의 분석을 위해 50개의 독특한 항-MASP-2 항체를 정제하였다. 각각의 정제된 Fab2 항체 250 μg을 MASP-2 결합 친화도 및 보체 경로 기능적 테스트의 특성화에 사용하였다. 이 분석의 결과는 하기 표 6에 나타낸다.
렉틴 경로 보체 활성화를 차단하는 항-MASP-2 FAB2
Fab2 항체 # C3 컨버타제
IC50 (nM)		 Kd C4 절단
IC50 (nM)
88 0.32 4.1 ND
41 0.35 0.30 0.81
11 0.46 0.86 <2　nM
86 0.53 1.4 ND
81 0.54 2.0 ND
66 0.92 4.5 ND
57 0.95 3.6 <2　nM
40 1.1 7.2 0.68
58 1.3 2.6 ND
60 1.6 3.1 ND
52 1.6 5.8 <2　nM
63 2.0 6.6 ND
49 2.8 8.5 <2　nM
89 3.0 2.5 ND
71 3.0 10.5 ND
87 6.0 2.5 ND
67 10.0 7.7 ND
상기 표 6에서 나타난 바와 같이, 테스트된 50개의 항-MASP-2 Fab2 중에서, 17개의 Fab2가 10 nM Fab2 이하의 IC50로 C3 컨버타제를 강력하게 억제하는 MASP-2 차단 Fab2로 확인되었다 (34% 양성 적중률). 식별된 17개의 Fab2 중 7개는 나노몰 이하의 범위의 IC50을 갖는다. 게다가, 표 6에서 나타난 17개의 MASP-2 차단 Fab2 모두는 렉틴 경로 C3 컨버타제 검정에서 C3 컨버타제 형성의 본질적으로 완전한 억제를 제공하였다. 도 8A는 Fab2 항체 #11에 대한 C3 컨버타제 형성 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 이것은 테스트된 다른 Fab2 항체를 대표하고, 이 결과는 표 6에서 나타난다. "차단" Fab2가 각각의 MASP-2 분자가 Fab2에 의해 결합될 때에도 MASP-2 기능을 단편적으로만 억제할 수 있다는 것이 이론적으로 가능하기 때문에, 이것은 중요한 고려사항이다.만난은 렉틴 경로의 공지된 활성화 인자이지만, 래트 혈청에서 항-만난 항체의 존재가 고전적 경로를 활성화시키고 고전적 경로 C3 컨버타제를 통해 C3b를 생성할 수 있다는 것은 이론적으로는 가능하다. 하지만, 이 실시예에서 나열된 17개의 차단 항-MASP-2 Fab2 각각은 C3b 생성을 강력하게 억제하며 (>95 %), 따라서 렉틴 경로 C3 컨버타제에 대한 이 검정의 특이성을 입증한다.
각각에 대하여 분명한 Kd를 계산하기 위해서 17개의 차단 Fab2 모두로 결합 검정을 수행하였다. 차단 Fab2 중 6개에 대하여 천연 래트 MASP-2로의 항-래트 MASP-2 Fab2의 결합 검정의 결과는 표 6에서 나타난다. 도 8B는 Fab2 항체 #11과의 결합 검정의 결과를 그래프로 도시한다. 유사한 결합 검정을 다른 Fab2에 대하여 수행하였으며, 그 결과는 표 6에 나타낸다. 일반적으로, '천연' MASP-2로의 6개의 Fab2 각각의 결합에 대하여 얻어진 분명한 Kd는 C3 컨버타제 기능적 검정에서 Fab2에 대한 IC50과 합리적으로 상응한다. 프로테아제 활성의 활성화시 MASP-2는 '비활성'에서 '활성' 형태로의 구성형태의 변화를 거친다는 증거가 있다 (Feinberg et al., EMBO J 22:2348-59 (2003); Gal et al., J. Biol. Chem. 280:33435-44 (2005)). C3 컨버타제 형성 검정에 사용된 정상 래트 혈장에서, MASP-2는 주로 '비활성' 치모겐 구성형태로 존재한다. 그에 반해, 결합 검정에서, MASP-2는 고정된 만난에 결합된 MBL을 가진 복합체의 일부로서 존재하며; 그러므로, MASP-2는 '활성' 구성형태로 되어 있을 것이다 (Petersen　et　al., J. Immunol Methods 257:107-16, 2001). 그 결과, 각각의 검정에서 Fab2는 MASP-2의 상이한 구성형태에 결합하기 때문에, 이들 두 개의 기능적 검정에서 테스트된 17개의 차단 Fab2 각각에 대한 IC50 및 Kd 간의 정확한 대응을 예상하지는 않는다. 그럼에도 불구하고, Fab2 #88을 제외하면, 두 검정에서 테스트된 다른 16개의 Fab2 각각에 대한 IC50 및 분명한 Kd 간에 합리적으로 밀접한 대응이 있는 것으로 보인다 (표 6 참조).
차단 Fab2의 다수를 C4의 MASP-2 매개 절단의 억제에 대하여 평가하였다. 도 8C는 C4 절단 검정의 결과를 그래프로 도시하는데, Fab2 #41로의 억제를 나타내며, IC50=0.81 nM이다 (표 6 참조). 도 9에서 도시된 바와 같이, 테스트된 모든 Fab2는 C3 컨버타제 검정에서 얻어진 것과 유사한 IC50으로 C4 절단을 억제하는 것으로 발견되었다 (표 6 참조).
만난이 렉틴 경로의 공지된 활성화 인자이지만, 래트 혈청에서 항-만난 항체의 존재는 또한 고전적 경로를 활성화시키며 이로 인해 C4의 C1s-매개 절단에 의해 C4b를 생성한다는 것은 이론적으로 가능하다. 하지만, 강력하게 C4b 세대를 억제하는 여러 항-MASP-2 Fab2가 확인되었으며 (>95 %), 따라서 MASP-2 매개 C4 절단에 대한 이 검정의 특이성을 입증한다. C3과 마찬가지로, C4는 구조의 일부로서 특이하고 고도로 반응성인 티오에스테르 기를 포함한다. 이 검정에서 MASP-2에 의한 C4의 절단시, C4b 상의 티오에스테르 기는 에스테르 또는 아미드 결합을 통해 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 고분자 상에서 하이드록실 또는 아미노 기와 공유 결합을 형성할 수 있으며, 따라서 ELISA 검정에서 C4b의 검출을 용이하게 한다.
이들 연구는 C4 및 C3 컨버타제 활성 둘 다를 기능적으로 차단하는 래트 MASP-2 단백질에 대한 고친화도 Fab2의 생성을 입증하며, 이로 인해 렉틴 경로 활성화를 방지한다.
실시예 11
이 실시예는 실시예 10에서 기술된 바와 같이 생성된 차단 항-래트 MASP-2 Fab2 항체의 다수에 대한 에피토프 매핑을 기술한다.
방법:
도 10에서 도시된 바와 같이, 모두 N-말단 6X His 태그를 가진 다음 단백질을 pED4 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 발현시켰다:
래트 MASP-2A, 전체 길이 MASP-2 단백질, 활성 중심에서 세린을 알라닌 (S613A)으로 변경하여 비활성화됨;
래트 MASP-2K, 자가활성화를 감소시키도록 변화된 전체 길이 MASP-2 단백질 (R424K);
CUBI-II, CUBI, EGF-유사 및 CUBII 도메인만을 포함하는 래트 MASP-2의 N-말단 단편; 및
CUBI/EGF-유사, CUBI 및 EGF-유사 도메인만을 포함하는 래트 MASP-2의 N-말단 단편.
이들 단백질을 이전에 기술된 바와 같이 니켈-친화도 크로마토그래피에 의해 배양 상층액으로부터 정제하였다 (Chen et al., J. Biol. Chem. 276:25894-02 (2001)).
래트 MASP-2의 CCPII 및 세린 프로테아제 도메인을 포함하는 C-말단 폴리펩타이드 (CCPII-SP)는 대장균에서 pTrxFus (Invitrogen)를 사용하여 티오레독신 융합 단백질로 발현된다. 단백질을 Thiobond 친화도 레진을 사용하여 세포 용해물로부터 정제하였다. 티오레독신 융합 파트너는 음성 대조군으로서 빈(empty) pTrxFus로부터 발현된다.
모든 재조합 단백질을 TBS 완충액로 투석하였고 그 농도를 280 nm에서 OD를 측정하여 결정하였다.
도트 블롯 분석:
상기 기술되고 도 10에서 도시된 다섯 개의 재조합 MASP-2 폴리펩타이드 (및 CCPII-세린 프로테아제 폴리펩타이드에 대한 음성 대조군으로서 티오레독신 폴리펩타이드)의 단계 희석액을 나이트로셀룰로스 막에 스폿팅하였다. 스폿팅된 단백질의 양은 5배 단계에서 100 ng 내지 6.4 pg의 범위에 있다. 이후의 실험에서, 스폿팅된 단백질의 양은 다시 5배 단계에서 50 ng 미만 내지 16 pg의 범위에 있다. 막을 TBS (차단 완충액) 중의 5% 탈지 분유로 차단한 다음 차단 완충액 (5.0 mM Ca2+포함) 중의 1.0 μg/ml 항-MASP-2 Fab2와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 Fab2를 HRP-컨쥬게이션된 항-인간 Fab (AbD/Serotec; 1/10,000로 희석됨) 및 ECL 검출 키트 (Amersham)를 사용하여 검출하였다. 한 막을 양성 대조군으로서 다클론성 토끼-항 인간 MASP-2 Ab (Stover et al., J Immunol 163:6848-59 (1999)에서 기술됨)와 함께 인큐베이션하였다. 이 경우에, 결합된 Ab를 HRP-컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG (Dako; 1/2,000로 희석됨)를 사용하여 검출하였다.
MASP-2 결합 검정
*ELISA 플레이트를 카보네이트 완충액 (pH 9.0) 중의 1.0 μg/웰의 재조합 MASP-2A 또는 CUBI-II 폴리펩타이드로 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. 웰을 TBS 중의 1% BSA로 차단한 다음, 항-MASP-2 Fab2의 단계 희석액을 5.0 mM Ca2+를 함유하는 TBS에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. TBS/tween/Ca2+로 3회 세척 후, TBS/Ca2+에서 1/10,000으로 희석된 HRP-컨쥬게이션된 항-인간 Fab (AbD/Serotec)를 첨가하였고 플레이트를 추가로 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 TMB 퍼옥시다제 기질 키트 (Biorad)를 사용하여 검출하였다.
결과:
다양한 MASP-2 폴리펩타이드와의 Fab2의 반응성을 입증하는 도트 블롯 분석의 결과를 하기 표 7에서 제공한다. 표 7에서 제공된 수치는 반-최고 신호 강도를 제공하기에 필요한 스폿팅된 단백질의 양을 나타낸다. 나타난 바와 같이, 모든 폴리펩타이드 (티오레독신 융합 파트너 단독을 제외하면)가 양성 대조군 Ab (다클론성 항-인간 MASP-2 혈청, 토끼에서 발생함)에 의해 인식되었다.
도트 블롯에서 다양한 재조합 래트 MASP-2 폴리펩타이드와의 반응성
Fab2 항체 # MASP-2A CUBI-II CUBI/EGF-유사 CCPII-SP 티오레독신
40 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
41 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
11 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
49 0.16 ng NR NR >20 ng NR
52 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
57 0.032 ng NR NR NR NR
58 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
60 0.4 ng 0.4 ng NR NR NR
63 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
66 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
67 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
71 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
81 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
86 0.4 ng NR NR 10 ng NR
87 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
양성 대조군 <0.032 ng 0.16 ng 0.16 ng <0.032 ng NR
NR = 반응 없음. 양성 대조군 항체는 토끼에서 생성된 다클론성 항-인간 MASP-2 혈청이다.
모든 Fab2가 MASP-2A뿐만 아니라 MASP-2K와 반응하였다 (데이터 미도시). 대부분의 Fab2는 CCPII-SP 폴리펩타이드를 인식하였지만 N-말단 단편은 인식하지 않는다. 두 가지 예외는 Fab2 #60 및 Fab2 #57이다. Fab2 #60은 MASP-2A 및 CUBI-II 단편을 인식하지만, CUBI/EGF-유사 폴리펩타이드 또는 CCPII-SP 폴리펩타이드를 인식하지 않으며, 그것은 CUBII의 에피토프에 결합하거나, 또는 CUBII 및 EGF-유사 도메인에 걸쳐있다는 것을 제안한다. Fab2 # 57은 MASP-2A를 인식하지만 테스트된 MASP-2 단편 중 어느 것도 인식하지 않으며, 이 Fab2는 CCP1에서 에피토프를 인식한다. Fab2 #40 및 #49는 완전한 MASP-2A에만 결합하였다. 도 11에서 나타난 ELISA 결합 검정에서, Fab2 #60은 또한 약간 더 낮은 분명한 친화도에도 불구하고, CUBI-II 폴리펩타이드에 결합하였다.
이 발견들은 MASP-2 단백질의 다수의 영역에 대한 독특한 차단 Fab2의 확인을 입증한다.
실시예 12
이 실시예는 파지 디스플레이를 사용하여, MASP-2에 결합하고 렉틴-매개 보체 활성화를 억제하는 한편 면역 체계의 고전적 (C1q-의존적) 경로 구성요소들을 온전하게 남기는 전체 인간 scFv 항체의 확인을 기술한다.
개요:
*완전한 인간, 고-친화도 MASP-2 항체를 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인하였다. 항체의 가변 경쇄 및 중쇄 단편을 scFv 포맷 및 전체 길이 IgG 포맷 둘 다로 분리하였다. 인간 MASP-2 항체는 렉틴 경로-매개 보체 경로 활성화와 관련된 세포 손상을 억제하는 한편 면역 체계의 고전적 (C1q-의존적) 경로 성분을 온전하게 남기는 데 유용하다. 일부 구체예에서, 대상체 MASP-2 억제 항체는 다음의 특징을 가진다: (a) 인간 MASP-2에 대한 고친화도 (예를 들어, 10 nM 이하의 KD), 및 (b) 30 nM 이하의 IC50으로 90% 인간 혈청에서 MASP-2-의존적 보체 활성을 억제한다.
방법:
전체 길이 촉매적 비활성 MASP-2의 발현 :
리더 서열 (SEQ ID NO:5)을 가진 인간 MASP-2 폴리펩타이드를 암호화하는 인간 MASP-2 (SEQ ID NO:4)의 전체 길이 cDNA 서열을 CMV 인핸서/프로모터 영역의 제어하에 진핵세포 발현을 유도하는 포유류 발현 벡터 pCI-Neo (Promega)에 하위클로닝하였다 (Kaufman R.J. et al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)에 기술됨).
촉매 비활성 인간 MASP-2A 단백질을 생성하기 위하여, 부위-특이적 돌연변이 유발을 본원에 참조로 포함된 US2007/0172483에 기술된 대로 수행하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동 후에 정제하고 밴드 제제 및 단일 아데노신 오버랩을 표준 테일링 과정을 사용하여 생성하였다. 그런 다음 아데노신-테일 MASP-2A를 pGEM-T 용이 벡터에 클로닝하고 대장균에 형질전환하였다. 인간 MASP-2A를 추가로 포유류 발현 벡터 pED 또는 pCI-Neo 중 하나에 하위클로닝하였다.
상기 기술된 MASP-2A 발현 구성물을 DXB1 세포에 표준 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 과정을 사용하여 트랜스펙션하였다 (Maniatis et al., 1989). 조제물이 다른 혈청 단백질로 오염되지 않았음을 보장하기 위해 MASP-2A를 무혈청 배지에서 제조하였다. 배지를 2일마다 융합성 세포로부터 수득하였다 (총 4회). 재조합 MASP-2A의 수준은 평균 대략 1.5 mg/배양 배지 리터였다. MASP-2A (상기 기술된 Ser-Ala 돌연변이)를 MBP-A-아가로스 컬럼에서의 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
패닝/scFv 전환 및 필터 스크리닝에 의해 확인된 ScFv 후보 클론들에 대한 MASP-2A ELISA
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열의 파지 디스플레이 라이브러리에 대해 인간 MASP-2 단백질에 대해 고친화도 scFv 항체를 확인하기 위해 항원 패닝과 이어서 자동 항체 스크리닝 및 선택을 수행하였다. HIS-태그된 또는 비오틴-태그된 MASP-2A에 대한 scFv 파지 라이브러리의 패닝을 3 라운드로 수행하였다. 제3 라운드의 패닝을 먼저 MBL로 용출한 후 TEA (알칼리성)로 용출하였다. 표적 MASP-2A에 대해 scFv 단편을 나타내는 파지의 특이적 풍부함을 모니터링하기 위하여, 고정된 MASP-2A에 대한 다클론성 파지 ELISA를 수행하였다. 패닝 라운드 3으로부터의 scFv 유전자를 pHOG 발현 벡터에 클로닝하고 소규모 필터 스크리닝으로 작동시켜서 MASP-2A에 대한 특이적 클론들을 찾았다.
제3 라운드의 패닝으로부터의 scFv 단편을 암호화하는 플라스미드를 함유하는 박테리아 콜로니들을 뽑아서, 나이트로셀룰로스 막 위에 그리딩하고 비-유도 배지에서 밤새도록 성장시켜서 마스터 플레이트를 생성하였다. 제3 패닝 라운드로부터 총 18,000개의 콜로니를 뽑아서 분석하고, 그 중 절반을 경쟁 용출하고 나머지 절반을 TEA 용출하였다. MASP-2A에 대한 scFv 파지플라스미드 복합체 라이브러리의 패닝과 이어서 scFv 전환 및 필터 스크리닝으로 137개의 양성 클론을 얻었다. 108/137 클론이 MASP-2 결합에 대한 ELISA 검정에서 포지티브였고 (데이터 미도시), 그 중 45개의 클론을 추가로 정상 인간 혈청에서 MASP-2 활성을 차단하는 능력에 대해 분석하였다.
렉틴 경로 C3 컨버타제의 형성의 억제를 측정하기 위한 검정
렉틴 경로 C3 컨버타제 형성의 억제를 측정하는 기능적 검정을 사용하여 MASP-2 scFv 후보 클론들의 "차단 활성"을 평가하였다. MASP-2 세린 프로테아제 활성은 렉틴 경로 C3 컨버타제를 포함하는 2개의 단백질 성분 (C4b, C2a)을 생성하기 위해 필요하다. 그러므로, MASP-2 기능적 활성을 억제하는 MASP-2 scFv (즉, 차단 MASP-2 scFv)는 렉틴 경로 C3 컨버타제의 데노보 형성을 억제할 것이다. C3은 그것의 구조의 일부로서 흔치 않은 고도로 반응성인 티오에스테르 기를 함유한다. 이 검정에서 C3 컨버타제 의한 C3의 절단시에, C3b 상의 티오에스테르 기는 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 마크로분자 상의 하이드록실 또는 아미노 기와, 에스테르 또는 아미드 결합을 통해 공유 결합을 형성함으로써, ELISA 검정에서 C3b의 검출을 용이하게 한다.
효모 만난은 렉틴 경로의 공지된 활성화 인자이다. C3 컨버타제의 형성을 측정하기 위한 다음의 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 렉틴 경로를 활성화시키기 위하여 희석된 인간 혈청과 인큐베이션하였다. 그런 다음 웰을 세척하고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰 상에 고정된 C3b에 대해 검정하였다. 이 검정에서 생성된 C3b의 양은 렉틴 경로 C3 컨버타제의 데노보 형성을 직접 반영한다. 선택된 농도에서 선택한 MASP-2 scFv 클론들은 C3 컨버타제 형성 및 결과적인 C3b 생성을 억제하는 능력에 대해 이 검정에서 테스트하였다.
방법:
상기 기술된 것과 같이 확인된 45개의 후보 클론을 발현시키고, 정제하고 동일한 스톡 농도로 희석하고, 그것을 다시 Ca++ 및 Mg++ 함유 GVB 완충액 (4.0 mM 바르비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)에 희석하여 모든 클론이 동일한 양의 완충액을 가지도록 확인하였다. scFv 클론들을 각각 2 μg/mL의 농도에서 삼중으로 테스트하였다. 양성 대조군은 OMS100 Fab2였고 0.4 μg/mL에서 테스트하였다. C3c 형성을 scFv/IgG 클론의 존재 및 부재하에 모니터링하였다.
만난을 50mM 탄산염 완충액 (15mM Na2CO3 + 35mM NaHCO3 + 1.5 mM NaN3), pH 9.5로 20 μg/mL (1 μg/웰)의 농도로 희석하고 ELISA 플레이트를 밤새도록 4℃에서 코팅하였다. 다음날, 만난-코팅된 플레이트를 200 μl의 PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음 100 μl의 1% HSA 차단 용액을 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 200 μl의 PBS로 3회 세척하고, 샘플을 첨가할 때까지 200 μl의 PBS와 함께 얼음에서 보관하였다.
정상 인간 혈청을 CaMgGVB 완충액로 0.5%로 희석하고, scFv 클론 또는 OMS100 Fab2 포지티브 대조군을 0.01 μg/mL; 1 μg/mL (OMS100 단독 대조군) 및 10 μg/mL에서 이 완충액에 삼중으로 첨가하고, 45분 동안 얼음에서 사전인큐베이션한 후 차단된 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 반응을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써 시작하였고 플레이트를 얼음조로 이동함으로써 중단시켰다. C3b 침착을 토끼 α-마우스 C3c 항체와 이어서 염소 α-토끼 HRP로 검출하였다. 네거티브 대조군은 항체가 없는 완충액이었고 (항체 없음 = 최대 C3b 침착), 포지티브 대조군은 EDTA가 첨가된 완충액이었다 (C3b 침착 없음). 동일한 검정을 수행하되 웰을 만난이 없게 하여 바탕값을 측정하였다. 만난이 없는 플레이트에 대한 바탕값 신호를 만난-함유 웰의 신호로부터 뺐다. 컷오프 기준을 무관한 scFv 클론 (VZV) 및 완충액 단독의 활성의 절반으로 설정하였다.
결과: 컷오프 기준을 기준으로, 총 13개의 클론이 MASP-2의 활성을 차단하는 것으로 나타났다. > 50% 경로 억제를 생성하는 모두 13개의 클론을 선택하고 서열을 분석하여 10개의 독특한 클론을 얻었다. 모두 10개의 클론이 동일한 경쇄 하위 분류, 엡실론3을 갖지만, 상이한 3개의 중쇄 하위 분류: VH2, VH3 및 VH6을 가지는 것으로 나타났다. 기능적 검정에서, 10개의 후보 scFv 클론 중 5개가 0.5% 인간 혈청을 사용하여 25 nM 표적 기준보다 적은 IC50 nM 값을 제공하였다.
개선된 효능을 가지는 항체를 확인하기 위하여, 상기와 같이 확인된 3개의 모 scFv 클론에 대해 경쇄 셔플링을 수행하였다. 이 과정은 6개의 건강한 공여체로부터 유래된 나이브, 인간 람다 경쇄 (VL)의 라이브러리와 쌍을 이룬 모 클론의 각각의 VH로 구성되는 조합 라이브러리의 생성을 포함하였다. 이 라이브러리를 그런 다음 개선된 결합 친화도 및/또는 기능성을 가지는 scFv 클론에 대해 스크리닝하였다.
선두 딸 클론 및 그것들의 각각의 모 클론 (모두 scFv 포맷임)의 IC50 (nM)으로의 기능적 효능의 비교
scFv 클론 1% 인간 혈청
C3 검정
(IC 50 nM) 		90% 인간 혈청
C3 검정
(IC 50 nM) 		90% 인간 혈청
C4 검정
(IC 50 nM)
17D20mc 38 nd nd
17D20m_d3521N11 26 >1000 140
17N16mc 68 nd nd
17N16m_d17N9 48 15 230
하기에 상기 표 8에서 나타낸 모 클론 및 딸 클론에 대한 중쇄 가변 영역 (VH) 서열이 제공된다.
Kabat CDR들 (31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-107 (H3))은 진하게 표시되고; Chothia CDR들 (26-32 (H1), 52-56 (H2) 및 95-101 (H3))은 밑줄로 표시된다.
17D20_35VH-21N11VL 중쇄 가변 영역 (VH) (SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:66에 의해 암호화됨)
QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS RG KMGVSWIRQPPGKALEWLA HIFSS DEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTAT YYCARIR RGGIDYWGQGTLVTVSS
d17N9 중쇄 가변 영역 (VH) (SEQ ID NO:68)
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS ST SAAWNWIRQSPSRGLEWLG RTYYR SKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDT AVYYCAR DPFGVPFDIWGQGTMVTVSS
하기에 상기 표 8에 나타낸 모 클론 및 딸 클론에 대한 경쇄 가변 영역 (VL) 서열이 제공된다.
Kabat CDR들 (24-34 (L1); 50-56 (L2); 및 89-97 (L3)은 진하게 표시되고; Chothia CDR들 (24-34 (L1); 50-56 (L2) 및 89-97 (L3)은 밑줄로 표시된다. 이 영역들은 Kabat 또는 Chothia 시스템에 의해 넘버링되든 동일하다.
17D20m_d3521N11 경쇄 가변 영역 (VL) (SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70에 의해 암호화됨)
QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCS GEKLGDKYAYW YQQKPGQSPVLVMYQ DKQRPSG IPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQ AWDSSTAVF GGGTKLTVL
17N16m_d17N9 경쇄 가변 영역 (VL) (SEQ ID NO:71)
SYELIQPPSVSVAPGQTATITCA GDNLGKKRVHW YQQRPGQAPVLVIYD DSDRPSG IPDRFSASNSGNTATLTITRGEAGDEADYYCQ VWDIATDHV VFGGGTKLTVLAAAGSEQKLISE
고친화도로 인간 MASP-2에 결합하는 것으로 증명되었고 기능적 보체 활성을 차단하는 능력을 가지는 MASP-2 항체 OMS100 및 MoAb_d3521N11VL (SEQ ID NO:67에서 제시된 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:69에서 제시된 경쇄 가변 영역을 포함함, 또한 "OMS646" 및 "mAb6"으로도 언급됨)을 돗트 블롯 분석에 의해 에피토프 결합에 관련하여 분석하였다. 그 결과는 OMS646 및 OMS100 항체가 MASP-2에 대해 고도로 특이적이며 MASP-1/3에 결합하지 않는 것을 보여준다. 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인을 함유하지 않은 MAp19 또는 MASP-2 단편에 결합되지 않아서, 결합 부위가 CCP1을 포함한다는 결론을 유도하였다.
MASP-2 항체 OMS646은 에 재조합 MASP-2 (Kd 60-250pM)에 C1s, C1r 또는 MASP-1과 비교할 때 >5000배 선택성으로 왕성하게 결합하는 것으로 측정되었다 (하기 표 9 참조).
고체상 ELISA 연구에 의해 평가되는 OMS646 MASP-2 항체-MASP-2 상호작용의 친화도 및 특이성
항원 KD (pM)
MASP-1 >500,000
MASP-2 62±23*
MASP-3 >500,000
정제된 인간 C1r >500,000
정제된 인간 C1s ~500,000
*평균±SD; n=12
OMS646은 말단 보체 성분의 렉틴-의존적 활성화를 특이적으로 차단한다
방법:
막 공격 복합체 (MAC) 침착에 대한 OMS646의 효과를 렉틴 경로, 고전적 경로 및 대체 경로에 대한 경로-특이적 조건들을 사용하여 분석하였다. 이 목적을 위해, Wieslab Comp300 보체 스크리닝 키트 (Wieslab, Lund, Sweden)를 제조자의 설명을 따라 사용하였다.
결과:
도 12A는 렉틴 경로-특이적 검정 조건하에서 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재하에 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시한다. 도 12B는 고전적 경로-특이적 검정 조건하에서 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재하에 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시한다. 도 12C는 대체 경로-특이적 검정 조건하에서 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재하에 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시한다.
도 12A에서 나타난 것과 같이, MS646은 대략 1 nM의 IC50 값으로 MAC 침착의 렉틴 경로-매개 활성화를 차단한다. 하지만, OMS646은 고전적 경로-매개 활성화 (도 12B)로부터 또는 대체 경로-매개 활성화 (도 12C)로부터 생성된 MAC 침착에는 아무런 효과를 나타내지 않았다.
마우스에의 정맥 내 (IV) 또는 피하 (SC) 투여 후의 OMS646의 약동학 및 약역학
OMS646의 약동학 (PK) 및 약역학 (PD)을 마우스에서 28일 단일 용량 PK/PD 연구로 평가하였다. 연구는 피하로 (SC) 투여된 5mg/kg 및 15mg/kg의 OMS646의 용량 수준, 뿐만 아니라 정맥 내로 (IV) 투여된 5mg/kg OMS646의 용량 수준을 테스트하였다.
OMS646의 PK 프로파일과 관련하여, 도 13은 OMS646 농도 (평균 n=3마리 동물/그룹)를 표시된 용량에서 OMS646의 투여 후 시간의 함수로서 그래프로 도시한다. 도 13에서 나타낸 것과 같이, 5mg/kg SC에서, OMS646은 투약 후 대략 1 내지 2일 후에 5 내지 6 ug/mL의 최대 혈장 농도에 도달하였다. 5 mg/kg SC에서 OMS646의 생체이용률은 대략 60%였다. 추가로 도 13에서 나타낸 것과 같이, 15 mg/kg SC에서, OMS646은 투약 후 대략 1 내지 2일 후에 10 내지 12 ug/mL의 최대 혈장 농도에 도달하였다. 모든 그룹에 대해, OMS646은 대략 8 내지 10일의 말단 반감기로 전신 순환계로부터 서서히 제거되었다. OMS646의 프로파일은 마우스에서 인간 항체에 대해 전형적이다.
OMS646의 활성은 도 14A 및 14B에 그래프로 도시된다. 도 14A 및 14B는 5mg/kg IV (도 55A) 및 5mg/kg SC (도 55B) 그룹에서 각 마우스에 대한 PD 반응 (전신적 렉틴 경로 활성의 강하)을 보여준다. 파선은 검정의 기준선을 나타낸다 (최대 억제; 검정 전 과잉 OMS646으로 시험관 내 스파이크된 나이브 마우스 혈청). 도 14A에서 나타난 것과 같이, 5mg/kg의 OMS646의 IV 투여 후에, 전신적 렉틴 경로 활성은 즉시 검출할 수 없는 수준으로 떨어졌고, 렉틴 경로 활성은 28일 관찰 기간에 걸쳐 단지 중간 정도의 회복을 나타냈다. 도 14B에서 나타난 것과 같이, 5mg/kg의 OMS646 SC로 투약된 마우스에서, 렉틴 경로 활성의 시간-의존적 억제가 관찰되었다. 렉틴 경로 활성은 약물 투여 24시간 이내에 거의 검출할 수 없는 수준으로 떨어졌고 적어도 7일 동안 저수준으로 유지되었다. 렉틴 경로 활성은 시간에 따라 점차로 증가하였지만, 28일 관찰 기간 내에 용량-전 수준으로 반전되지는 않았다. 15mg/kg SC의 투여 후 관찰된 렉틴 경로 활성 대비 시간 프로파일은 5 mg/kg SC 용량 (데이터 미도시)과 유사하였고, 그것은 PD 종점의 포화를 나타낸다. 데이터는 추가로 IV 또는 SC로 투여된 5mg/kg의 OMS646의 주마다의 투여가 마우스에서 전신적 렉틴 경로 활성의 연속적인 억제를 이루기에 충분한 것을 나타냈다.
실시예 13
이 실시예는 MASP-2에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 CDR을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 및 적어도 하나의 SGMI 코어 펩타이드 서열을 포함하는, MASP-2를 억제하는 재조합 항체 (또한 SGMI-펩타이드 함유 MASP-2 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로도 언급됨)의 생성을 기술한다.
배경/근거:
*SGMI-2로 불리는 MASP-2의 특이적 억제자의 생성은 Heja et al., J Biol Chem 287:20290 (2012) 및 Heja et al., PNAS 109:10498 (2012)에 기술되어 있으며, 이것들은 각각 본원에 참조로 포함된다. SGMI-2는 프로테아제 결합 루프의 8개의 위치 중 6개가 완전히 무작위화되어 있는 스키스토세르카 그레가리아(Schistocerca gregaria) 프로테아제 억제자 2의 변종의 파지 라이브러리로부터 선택된 36개의 아미노산 펩타이드이다. 시험관내에서의 후속적인 발달은 단일 자리수 nM의 KI 값을 가지는 단일-특이적 억제자를 생성하였다 (Heja et al., J. Biol. Chem. 287:20290, 2012). 구조적 연구들은 최적화된 프로테아제 결합 루프가 2개의 억제자의 특이성을 규정하는 1차 결합 부위를 형성하는 것을 나타냈다. 연장된 2차 및 내부 결합 영역의 아미노산 서열은 2개의 억제자에 공통적이고 접촉 계면에 기여한다 (Heja et al., 2012. J. Biol. Chem. 287:20290). 기계론적으로, SGMI-2는 고전적 경로에 영향을 미치지 않으면서 보체 활성화의 렉틴 경로를 차단한다 (Heja et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. 109:10498).
SGMI-2 억제자의 아미노산 서열을 하기에 제시한다:
SGMI-2-전체 길이: LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ (SEQ ID NO:72)
SGMI-2-중간 길이: TCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ (SEQ ID NO:73)
SGMI-2-짧은 길이:...................TCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ (SEQ ID NO:74)
이 실시예에서 기술된 것과 같이, 그리고 또한 WO2014/144542에서 기술된 것과 같이, SGMI-2 펩타이드-함유 MASP-2 항체 및 그것의 단편을 인간 MASP-2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노 또는 카르복시 말단에 SGMI-2 펩타이드 아미노산 서열 (예컨대, SEQ ID NO: 72, 73 또는 74)을 융합시킴으로써 생성하였다. SGMI-2 펩타이드-함유 MASP-2 항체 및 단편은 WO2014/144542에 기술된 것과 같이, 인간 혈청을 사용하여 C3b 또는 C4b 침착 검정에서 측정될 때, SGMI-2 펩타이드 서열을 포함하지 않은 네이키드 MASP-2 스캐폴드 항체와 비교하여 향상된 억제 활성을 가지며, 또한 마우스 모델 생체내에서 측정될 때 네이키드 MASP-2 스캐폴드 항체와 비교하여 향상된 억제 활성을 가진다. SGMI-2 펩타이드 함유 MASP-2 항체의 생성 방법은 하기에 기술한다.
방법:
SGMI-2 펩타이드가 대표적인 MASP-2 억제 항체 OMS646 (실시예 12에서 기술된 것과 같이 생성됨)의 중쇄 또는 경쇄의 N- 또는 C-말단의 어느 하나에 융합되어 있는, 4개의 예시적인 SGMI-2 펩타이드 함유 MASP-2 항체를 암호화하는 발현 구성물을 생성하였다.
MASP-2 항체/SGMI-2 융합
항체 참조 항체 상의 펩타이드 위치 SEQ ID NO:
H-N H-C L-N L-C
HL-M2
(네이키드 MASP-2 OMS646)		 - - - - 67 + 69
H-M2-SGMI-2-N SGMI-2 - - - 75 + 69
H-M2-SGMI-2-C - SGMI-2 - - 76 + 69
L-M2-SGMI-2-N - - SGMI-2 - 67 + 77
L-M2-SGMI-2-C - - - SGMI-2 67 + 78
표 10에서의 약어:
"H-N"= 중쇄의 아미노 말단
"H-C"= 중쇄의 카르복실 말단
"L-N"= 경쇄의 아미노 말단
"L-C"= 경쇄의 카르복실 말단
"M2"=MASP-2 ab 스캐폴드 (대표적인 OMS646)
표 10에 나타낸 N-말단 융합에 대해, 펩타이드 링커 ('GTGGGSGSSS' SEQ ID NO: 79)를 SGMI-2 펩타이드와 가변 영역 사이에 첨가하였다.
표 10에 나타낸 C-말단 융합에 대해, 펩타이드 링커 ('AAGGSG' SEQ ID NO: 80)를 불변 영역과 SGMI-2 펩타이드 사이에 첨가하고, 제 2 펩타이드 "GSGA" (SEQ ID NO: 81)를 C-말단 SGMI-2 펩타이드를 분해로부터 보호하기 위해 융합 폴리펩타이드의 C-말단 단부에 첨가하였다.
다음의 대표적인 MASP-2 항체/SGMI-2 융합에 대해 아미노산 서열을 하기에 제공한다:
H-M2ab6-SGMI-2-N (SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:82에 의해 암호화됨):
LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ GTGGGSGSSS QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVS
GFSLSRGKMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSSDEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYY
CARIRRGGIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSV
FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE
SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
[491 aa 단백질, aa 1-36=SGMI-2 (밑줄), aa37-46=링커 (이탤릭체); aa47-164=MASP-2 ab#6의 중쇄 가변 영역 (밑줄); aa165-491=힌지 돌연변이를 가진 IgG4 불변 영역].
H-M2ab6-SGMI-2-C (SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:83에 의해 암호화됨):
QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSSDEKSYRTSLKSRLTI
SKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARIRRGGIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAA
LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVD
KRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE
MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM
HEALHNHYTQKSLSLSLGKAAGGSG LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ GSGA
[491aa 단백질, aa1-118=MASP-2 ab#6의 중쇄 가변 영역 (밑줄); aa 119-445=힌지 돌연변이를 가진 IgG4 불변 영역; aa 446-451=제 1 링커 (이탤릭체); aa452-487=SGMI-2; aa488-491=제 2 링커 (이탤릭체)].
L-M2ab6-SGMI-2-N (SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:84에 의해 암호화됨):
LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ GTGGGSGSSS QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCSGE
KLGDKYAYWYQQKPGQSPVLVMYQDKQRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTAV
FGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQ
SNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
[258aa 단백질, aa1-36=SGMI-2 (밑줄); aa37-46=링커 (이탤릭체); aa47-152=MASP-2 ab#6의 경쇄 가변 영역 (밑줄); aa153-258=인간 Ig 람다 불변 영역].
L-M2ab6-SGMI-2-C (SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:85에 의해 암호화됨):
QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCSGEKLGDKYAYWYQQKPGQSPVLVMYQDKQRPSGIPERFSGSNSGNTAT
LTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPG
AVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSA
AGGSG LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ GSGA
[258aa 단백질, aa1-106=MASP-2 ab#6의 경쇄 가변 영역 (밑줄); aa 107-212=인간 Ig 람다 불변 영역; aa 213-218=제 1 링커; aa219-254=SGMI-2; aa255-258=제 2 링커].
기능 분석:
4개의 MASP-2-SGMI-2 융합 항체 구성물을 Expi293F 세포 (Invitrogen)에서 일시적으로 발현시키고, 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제한 후, 하기 기술된 것과 같은 만난-코팅 비드 검정으로 10% 정상 인간 혈청에서 C3b 침착의 억제에 대해 테스트하였다.
만난-코팅 비드 검정에서 C3b 침착에 대한 MASP-2-SGMI-2 융합의 테스트
MASP-2-SGMI-2 융합 항체를 만난-코팅 비드 상에서 C3b 침착의 검정으로 렉틴 경로 억제제 대해 평가하였다. 유동 세포분석에 의해 활성 정도를 측정하는 이 검정은 Wieslab® 검정보다 큰 해상도를 제공한다. 렉틴 경로 기반 검정을 다음과 같이 수행하였다: 만난을 7 μM-직경의 폴리스티렌 비드 (Bangs Laboratories; Fishers, IN, USA)에 밤새도록 4℃에서 탄산염-중탄산염 완충액 (pH 9.6)에서 흡수시켰다. 비드를 PBS로 세척하고 10% 인간 혈청, 또는 항체 또는 억제자로 사전 인큐베이션된 10% 혈청에 노출시켰다. 혈청-비드 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 혈청 인큐베이션 후에, 비드를 세척하고, 비드 상의 C3b 침착을 항-C3c 토끼 다클론성 항체 (Dako North America; Carpinteria, CA, USA) 및 PE-Cy5 컨쥬게이트된 염소 항-토끼 2차 항체 (Southern Biotech; Birmingham, AL, USA)를 사용한 검출에 의해 측정하였다. 염색 과정 후에, 비드를 FACSCalibur 유동 세포분석기를 사용하여 분석하였다. 비드를 전방 및 사이드 스캐터를 사용하여 균일한 군집으로서 모으고, C3b 침착을 FL3-양성 입자 (FL-3, 또는 "FL-3 채널"은 세포분석기 상의 제 3 또는 적색 채널을 나타낸다)로서 나타냈다. 각 실험 조건에 대한 군집에 대한 기하학적 평균 형광 세기 (MFI)를 렉틴 경로 억제를 평가하기 위하여 항체/억제자 농도에 비례하여 도표화하였다.
IC50 값을 GraphPad PRISM 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 구체적으로, IC50 값을 가변 경사율 (4개의 파라미터), 비선형 피트를 세포분석 검정으로부터 얻어진 로그 (항체) 대비 평균 형광 세기 곡선에 적용함으로써 얻었다.
그 결과를 표 11에 나타낸다.
10% 인간 혈청에서의 C3b 침착 (만난-코팅 비드 검정)
구성물 IC 50 (nM)
네이키드 N2 ab (mAb#6) ≥ 3.63 nM
H-M2-SGMI-2-N 2.11 nM
L-M2-SGMI-2-C 1.99 nM
H-M2-SGMI-2-N 2.24 nM
L-M2-SGMI-2-N 3.71 nM
결과:
대조군인, 비-SGMI-함유 MASP-2 "네이키드" 스캐폴드 항체 (mAb#6)는 이 검정에서, 3.63 nM 이상의 IC50 값으로 억제성이었고, 이것은 실시예 12에서 관찰된 결과와 일치한다. 현저하게, 표 11에서 나타난 것과 같이, 테스트된 모든 SGMI-2-MASP-2 항체 융합은 이 검정에서 MASP-2 스캐폴드 항체의 효능을 개선시켰고, 그것은 증가된 결합가가 또한 C3b 침착의 억제에서 유익할 수 있음을 시사한다.
만난-코팅 비드 검정에서 10% 인간 혈청을 사용한 C4b 침착에 대한 MASP-2-SGMI-2 융합의 테스트
C4b 침착 검정을 다음의 변형을 포함하여 C3b 침착 검정에 대해 상기에서 기술한 것과 동일한 검정 조건을 사용하여 수행하였다. C4b 검출 및 유동 세포분석 분석을 침착 반응을 항-C4b 마우스 단클론성 항체 (1:500, Quidel)로 염색하고 PE Cy5 (1:200, Southern Biotech)에 컨쥬게이트된 2차 염소 항-마우스 F(ab')2를 사용하여 염색한 후 유동 세포분석 분석을 수행하였다.
결과:
SGMI-2-함유 MASP-2- N-말단 항체 융합 (H-M2-SGMI-2-N: IC50=0.34nM), L-M2-SGMI-2-N: IC50=0.41 nM))은 둘 다, MASP-2 스캐폴드 항체 (HL-M2: IC50=0.78nM)에 비교하여 증가된 효능을 가졌다.
만난-코팅 비드 검정에서 10% 마우스 혈청을 사용한 C3b 침착에 대한 MASP-2-SGMI-2 융합의 테스트
C3b 침착에 대한 만난-코팅 비드 검정을 10% 마우스 혈청을 사용하여 상기 기술한 것과 같이 수행하였다. 인간 혈청에서 관찰된 결과와 유사하게, SGMI-2-함유 MASP-2 융합이 마우스 혈청에서 MASP-2 스캐폴드 항체와 비교하여 증가된 효능을 가진 것으로 측정되었다.
결과의 요약: 이 실시예에서의 결과들은 테스트된 모든 SGMI-2-MASP-2 항체 융합이 MASP-2 스캐폴드 항체의 효능을 개선시켰음을 증명한다.
실시예 14
이 실시예는 신장 섬유증에서 렉틴 경로의 역할을 평가하기 위하여 MASP-2 -/- 결핍 및 MASP-2 +/+ 충분한 마우스에서 신장 섬유증의 일측성 요관 폐쇄 (UUO) 모델을 사용하여 생성된 결과를 제공한다.
배경/근거:
신장 섬유증 및 염증은 후기 신장 질환의 지배적인 특징이다. 신장 세뇨관 간질성 섬유증은 지속적인 세포 손상, 일탈적 치유, 거주성 및 침윤성 신장 세포의 활성화, 사이토카인 방출, 염증 및 세포외 기질을 생성하는 신장 세포의 표현형 활성화를 포함하는 진행성 과정이다. 신장 세뇨관 간질성 (TI) 섬유증은 다수의 신장 병리의 공통적인 종점이고 만성 신장 질환 (CKD)에서 진행성 신장 기능의 손상을 방지하는 것을 목적으로 하는 잠재적 치료법에 대한 중요 표적을 나타낸다. 신장 TI 손상은 사구체 질환에서 감소하는 신장 기능에 밀접하게 연결되고 (Risdon R.A. et al., Lancet 1: 363-366, 1968; Schainuck L.I. et al, Hum Pathol 1: 631-640, 1970; Nath K.A., Am J Kid Dis 20:1-17, 1992), 근섬유모세포의 축적이 존재하고, 세관과 세관 주위의 모세혈관 사이의 잠재적 공간이 콜라겐 및 다른 프로테오글리칸으로 구성된 기질에 의해 점유되는 CKD의 특징이다. TI 근섬유모세포의 기원은 매우 논란이 많은 채로 남아 있지만, 섬유증은 일반적으로 초기에 T 림프구의 TI 축적 후 나중에 대식세포의 TI 축적을 특징으로 하는 염증이 선행된다 (Liu Y. et al., Nat Rev Nephrol 7:684-696, 2011; Duffield J.S., J Clin Invest 124:2299-2306, 2014).
UUO의 설치류 모델은 실제로 임의의 병인학의 진행성 신장 질환의 특징인 진행성 신장 섬유증을 생성한다 (Chevalier et al., Kidney International 75:1145-1152, 2009). C3 유전자 발현이 UUO 후에 야생형 마우스에서 증가되었고, 콜라겐 침착이 야생형 마우스에 비교하여 UUO 후의 C3-/- 넉아웃 마우스에서 상당히 감소되었고, 그것은 신장 섬유증에서 보체 활성화의 역할을 시사하는 것으로 보고되었다 (Fearn et al., Mol Immunol 48:1666-1733, 2011). 또한 C5 결핍이 세뇨관 간질성 손상의 모델에서 신장 섬유증의 주요 성분들의 상당한 개선을 이끌었던 것으로 보고되었다 (Boor P. et al., J of Am Soc of Nephrology: 18:1508-1515, 2007). 하지만, 본 발명자들에 의해 수행된 본원에서 기술된 연구 이전에, 신장 섬유증에 포함된 특정 보체 성분이 널리 규정되었다. 그러므로, 다음의 연구를 일측 뇨관 폐쇄 (UUO) 모델에서 MASP-2 (-/-) 및 MASP-2 (+/+) 수컷 마우스를 평가하기 위해 수행하였다.
방법:
MASP-2-/- 마우스를 실시예 1에서 기술한 것과 같이 생성하고 10 세대 동안 C57BL/6과 역교배시켰다. 수컷 야생형 (WT) C57BL/6 마우스, 및 C57BL/6 배경의 동형접합성 MASP-2 결핍 (MASP-2-/-) 마우스를 12/12 주간/야간 사이클의 표준화 조선하에서 유지하였고, 표준 펠릿 사료를 공급하고 음식과 물에 자유롭게 접근하도록 하였다. 그룹당 6마리의, 10-주령 마우스를 1.5 L/분 산소 중의 2.5% 아이소플루란으로 마취시켰다. 10-주령 수컷 C56/BL6 마우스, 야생형 및 MASP-2-/-의 2 그룹의 우측 요관을 수술로 결찰시켰다. 우측 신장을 1 cm 플랭크 절개를 통해 노출시켰다. 우측 요관을 2 지점에서 6/0 폴리글락틴 봉합선을 사용하여 완전히 폐쇄시켰다. 부프레노르핀을 사용한 통각상실증을 수술 전후로 매 12시간마다 통증 득점에 따라 최대 5회 용량까지 제공하였다. 국소 부피바카인 마취제를 수술 중에 한 번 제공하였다.
마우스들을 수술 후 7일 후에 희생시키고 신장 조직을 수집하여, 고정시키고 파라핀 블록에 삽입하였다. 혈액을 마취 하에 심장 천공에 의해 마우스로부터 수집하고, 마우스를 신장 절제 후 방혈에 의해 도태시켰다. 혈액을 얼음 위에 2시간 놓아두어 응고되도록 하였고 혈청을 원심분리에 의해 분리한 후 부분표본액으로서 -80℃에서 냉동 보관하였다.
신장 조직의 면역조직화학
콜라겐 침착에 의해 표시된 바 신장 섬유증의 정도를 측정하기 위하여, 5개의 마이크론 파라핀 삽입된 신장 절편을 Whittaker P. et al., Basic Res Cardiol 89:397-410, 1994에서 기술된 것과 같이 콜라겐-특이적 염색인 피크로시리우스 레드로 염색하였다. 간단하게 기술하면, 신장 절편에서 파라핀을 제거하고, 재수화한 후 1시간 동안 500 mL의 피크르산의 포화 수용액 중의 피크로시리우스 레드 수용액 (0.5 gm Sirius red, Sigma, Dorset UK)으로 콜라겐 염색하였다. 슬라이드를 산성화된 물 (증류수 중의 0.5% 빙초산)로 각각 5분동안씩 세척한 후, 탈수시키고 고정시켰다.
대식세포 침윤에 의해 나타난 것과 같은 염증의 정도를 측정하기 위하여, 신장 절편을 다음과 같이 대식세포-특이적 항체 F4/80으로 염색하였다. 포르말린 고정되고, 파라핀 삽입된, 5 마이크론의 신장 절편을 파라핀을 제거하고 재수화하였다. 항원 회수를 95℃의 시트레이트 완충액 중에서 20분 동안 수행한 후 내인성 퍼옥시다제 활성을 3% H2O2에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 퀀칭하였다. 조직 절편을 차단 완충액 (포스페이트 완충 식염수 (PBS) 중의 1% 소 혈청 알부민을 포함한 10% 열 비활성화된 정상 염소 혈청)에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후 아비딘/비오틴 차단을 하였다. 조직 절편을 각 단계 후에 5분 동안 PBS로 3회 세척하였다. 차단 완충액 중에 1:100으로 희석한 F4/80 대식세포 1차 항체 (Santa Cruz, Dallas, TX, USA)를 1시간 동안 적용하였다. 그런 다음 1:200으로 희석한, 비오티닐화된 염소 항-래트 2차 항체를 30분 동안 적용한 후 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 컨쥬게이트된 효소를 30분 동안 적용하였다. 염색 색을 다이아미노벤지딘 (DAB) 기질 (Vector Labs, Peterborough UK)을 사용하여 10분 동안 발색시키고 슬라이드를 물로 세척하고, 탈수한 후 컴퓨터 기반 분석을 용이하게 하기 위하여 대응 염색 없이 고정시켰다.
영상 분석
신장 피질 염색의 백분율을 Furness P. N. et al., J Clin Pathol 50:118-122, 1997에서 기술한 것과 같이 측정하였다. 간단하게 기술하자면, 24 비트 컬러 영상은 신장 부분의 전체 주변 주위의 신피막 바로 아래에 있는 신장 피질의 순차적 비-중복 필드로부터 포획하였다. 각각의 영상 포획 후에 NIH Image를 사용하여 적색 채널을 8 비트 흑백 영상으로서 뽑아냈다. 배경 조명의 불균질을 제자리에서 부분이 없는 조명된 현미경 시야의 사전-기록된 영상을 사용하여 뺐다. 영상에 고정된 한계값을 적용하여 염색 확실성에 상응하는 영상의 면적을 확인하였다. 그런 다음 검정 화소를 계산하였고, 이 방법으로 신장 주위의 모든 영상을 측정한 후에 평균 백분율을 기록하여 신장 부분의 염색된 면적의 백분율에 상응하는 값을 제공하였다.
유전자 발현 분석
마우스 신장에서 신장 염증 및 섬유증과 관련된 여러 유전자의 발현을 다음과 같이 정량 PCT (qPCR)에 의해 측정하였다. 총 RNA를 Trizol® (ThermoFisher Scientific, Paisley, UK)을 사용하여 제조자의 설명에 따라 신장 피질로부터 분리하였다. 추출된 RNA를 DNA 오염을 제거하기 위해 Turbo DNA-유리 키트 (ThermoFisher Scientific)로 처리한 후, 제 1 가닥 cDNA를 AMV 역전사 시스템 (Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 합성하였다. cDNA 통합성을 TaqMan GAPDH 검정 (Applied Biosystems, Paisley UK)을 사용하는 단일 qPCR 반응에 의해, 이어서 Custom TaqMan Array 96-웰 플레이트 (Life Technologies, Paisley, UK)를 사용하는 qPCR에 의해 확인하였다.
12개의 유전자를 이 분석에서 연구하였다:
콜라겐 타입 IV 알파 1 (col4α1; 검정 ID: Mm01210125_m1)
형질전환 성장 인자 베타-1 (TGF
Figure pat00002
-1; 검정 ID: Mm01178820_m1);
카데린 1 (Cdh1; 검정 ID: Mm01247357_m1);
피브로넥틴 1 (Fn1; 검정 ID:Mm01256744_m1);
인터류킨 6 (IL6; 검정 ID Mm00446191_m1);
인터류킨 10 (IL10; 검정 ID Mm00439614_m1);
인터류킨 12a (IL12a; 검정 ID Mm00434165_m1);
비멘틴 (Vim; 검정 ID Mm01333430_m1);
악티닌 알파 1 (Actn1; 검정 ID Mm01304398_m1);
종양 괴사 인자-α (TNF-α; 검정 ID Mm00443260_g1)
보체 성분 3 (C3; 검정 ID Mm00437838_m1);
인터페론 감마 (Ifn-γ; 검정 ID Mm01168134)
다음의 하우스키핑 제어 유전자를 사용하였다:
글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소 (GAPDH; 검정 ID Mm99999915_g1);
글루쿠로니다제 베타 (Gusβ; 검정 ID Mm00446953_m1);
진핵 18S rRNA (18S; 검정 ID Hs99999901_s1);
하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트란스페라제 (HPRT; 검정 ID Mm00446968_m1)
20 μL의 반응을 TaqMan Fast Universal 마스터 믹스 (Applied Biosystems)를 사용하여 40 사이클 동안 증폭시켰다. 실시간 PCR 증폭 데이터를 Applied Biosystems 7000 SDS v1.4 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
결과:
일측성 요관 폐쇄 (UUO) 후에, 폐쇄된 신장은 염증 세포, 특히 대식세포의 유입을 경험하고, 이어서 근위 세뇨관 상피의 요관 확장 및 약화와 나란히 콜라겐의 축적에 의해 증명되는 바 즉각적으로 섬유증이 발생된다 (Chevalier R. L. et al., Kidney Int 75:1145-1152, 2009 참조).
도 15는 시리우스 레드로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시하는데, 조직 섹션은 일측성 요관 폐쇄 (UUO)의 7일 후에 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 또는 모의-수술된 대조군 마우스로부터 얻어졌다. 도 15에서 나타난 것과 같이, 요관 폐쇄 후 7일 후에 야생형 마우스의 신장 섹션은 MASP-2-/- 마우스에 비교하여 상당히 더 큰 콜라겐 침착을 보였다 (p 값 = 0.0096). 야생형 및 MASP-2-/- 그룹에서 UUO 수술한 마우스에 대한 평균 값 ± 평균의 표준 오차는 각각 4.79±1.908 (n=6마리) 및 16.58±1.3 (n=6마리)이었다. 도 15에서 추가로 나타난 것과 같이, 모의-수술된 대조군 야생형 및 모의 수술된 대조군 MASP-2-/- 마우스로부터의 조직 섹션은 예상했던 것과 같이, 매우 낮은 수준의 콜라겐 염색을 보였다.
도 16은 F4/80 대식세포-특이적 항체로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시하는데, 조직 섹션은 일측성 요관 폐쇄 (UUO)의 7일 후에 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 또는 모의-수술된 대조군 마우스로부터 얻어졌다. 도 16에서 나타난 것과 같이, 야생형 마우스와 비교하여, MASP-2-/- 마우스로부터의 UUP 신장으로부터 얻어진 조직은 요관 폐쇄의 7일 후에 상당히 적은 대식세포 침윤을 나타냈다 (WT:2.23±0.4 vs MASP-2-/-에서 염색된 % 대식세포 면적: 0.53±0.06, p=0.0035). 도 16에서 추가로 나타난 것과 같이, 모의-수술된 야생형 및 모의-수술된 MASP-2-/- 마우스로부터의 조직 섹션은 검출 가능한 대식세포 염색을 보이지 않았다.
신장 염증 및 섬유증과 연결된 다양한 유전자의 유전자 발현 분석을 요관 폐쇄의 7일 후에 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 및 모의-수술된 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서 수행하였다. 도 17 내지 도 20에서 나타낸 데이터는 야생형 모의 수술된 샘플에 대한 상대적 정량의 Log10이고, 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 섬유증-관련 유전자의 유전자 발현 분석의 결과와 관련하여, 도 17은 요관 폐쇄의 7일 후에 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의-수술된 대조군 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서 qPCR에 의해 측정되는 바, 콜라겐 타입 IV 알파 1 (콜라겐-4)의 상대적인 mRNA 발현 수준을 그래프로 도시한다. 도 18은 요관 폐쇄의 7일 후에 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의-수술된 대조군 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서 qPCR에 의해 측정되는 바, 형질전환 성장 인자 베타-1 (TGFβ-1)의 상대적인 mRNA 발현 수준을 그래프로 도시한다. 도 17 및 18에서 나타난 것과 같이, 야생형 마우스로부터의 폐쇄된 신장은 야생형 마우스에서의 모의-수술된 신장과 비교하여 섬유증-관련 유전자 콜라겐-타입 IV (도 17) 및 TGFβ-1 (도 18)의 상당히 증가된 발현을 증명하였고, 이것은 예상했던 것과 같이, 야생형 마우스에서 UUO 손상 후에 이런 섬유증-관련 유전자들이 유도된 것을 증명한다. 대조적으로, 도 17 및 18에서 추가로 나타난 것과 같이, UUO 손상이 수행된 MASP-2-/-로부터의 폐쇄된 신장은 UUO 손상이 수행된 야생형 마우스에 비교하여, 콜라겐-타입 IV의 발현에서 상당한 감소 (도 17, p=0.0388) 및 TGFβ-1의 발현에서 상당한 감소 (도 18, p=0.0174)를 나타냈다.
염증-관련 유전자들의 유전자 발현 분석의 결과와 관련하여, 도 19는 요관 폐쇄의 7일 후에 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의-수술된 대조군 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서 qPCR에 의해 측정되는 바, 인터류킨-6 (IL-6)의 상대적인 mRNA 발현 수준을 그래프로 도시한다. 도 20은 요관 폐쇄의 7일 후에 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의-수술된 대조군 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서 qPCR에 의해 측정되는 바, 인터페론-γ의 상대적인 mRNA 발현 수준을 그래프로 도시한다. 도 19 및 20에서 나타난 것과 같이, 야생형 마우스로부터의 폐쇄된 신장은 야생형 마우스에서의 모의-수술된 신장과 비교하여, 염증-관련된 유전자 인터류킨-6 (도 19) 및 인터페론-γ (도 20)의 상당히 증가된 발현을 증명하였고, 이것은 야생형 마우스에서 UUO 손상 후에 이들 염증-관련 유전자들이 유도된 것을 증명한다. 대조적으로, 도 19 및 20에서 추가로 나타난 것과 같이, UUO 손상이 수행된 MASP-2-/-로부터의 폐쇄된 신장은 UUO 손상이 수행된 야생형 마우스에 비교하여, 인터류킨-6의 발현 (도 19, p=0.0109) 및 인터페론-γ의 발현에서 (도 20, p=0.0182) 상당한 감소를 나타냈다.
Vim, Actn-1, TNFα, C3 및 IL-10 에 대한 유전자 발현은 모두 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 둘 다로부터 얻어진 UUO 신장에서 상당히 상향-조절되었고, 야생형과 MASP-2-/- 마우스 사이에 이들 특정 유전자의 발현 수준에는 유의미한 차이가 없었음이 주지된다 (데이터 미도시). Cdh-1 및 IL-12a의 유전자 발현 수준은 어떠한 그룹의 동물들로부터의 폐쇄된 신장에서 변화하지 않았다 (데이터 미도시).
논의:
설치류에서 UUO 모델은 폐쇄된 신장에서 폐쇄 후 1 내지 2주 이내에 감소된 신장 혈류, 간질 염증 및 급속한 섬유증을 보이면서 초기, 활성 및 현저한 손상을 유도하고 신장에서 염증 및 섬유증의 공통적인 메커니즘 및 매개자를 이해하기 위해 광범위하게 사용되어 온 것으로 인식된다 (예컨대, Chevalier R.L., Kidney Int 75:1145-1152, 2009; Yang H. et al., Drug Discov Today Dis Models 7:13-19, 2010 참조).
이 실시예에서 기술된 결과는 MASP-2(-/-) 마우스 대비 야생형 (+/+) 대조군 마우스에서 UUO 수술된 신장에서 콜라겐 침착 및 대식세포 침윤에 상당한 감소가 있는 것을 증명한다. MASP-2-/- 동물에서 조직학적 및 유전자 발현 수준 둘 다에서의 신장 손상의 상당한 감소를 보여주는 예상밖의 결과는 보체 활성화의 렉틴 경로가 폐쇄된 신장에서 염증 및 섬유증의 발생에 유의미하게 기여하는 것을 증명한다. 특정 이론에 구속되기를 바라지 않지만, 렉틴 경로는 계속해서 추가로 세포 손상, 반흔 및 조직 손실을 유발하는 염증을 세포 손상이 구동하게 되는 악순환을 영속시키는 전-염증성 자극을 촉발시키고 유지함으로써 섬유증 질환의 병리에 치명적으로 기여하는 것으로 여겨진다. 이 결과들의 관점에서, 억제자로 MASP-2를 억제 또는 차단하는 것은 신장 섬유증의 억제 또는 예방에서, 및 일반적으로 섬유증의 억제 또는 예방을 위해 (즉 조직 또는 기관과 무관하게) 예방 및/또는 치료 효과를 가지게 될 것이라고 예상된다.
실시예 15
이 실시예는 신장 섬유증의 쥐과 모델인 일측성 요관 폐쇄 (UUO) 모델에서의 효능에 대한 단클론성 MASP-2 억제 항체의 분석을 기술한다.
배경/근거:
다수의 신장 병리의 공통적인 종점인 신장 세뇨관 간질성 섬유증의 개선은 진행성 신장 질환을 예방하는 것을 목적으로 하는 치료 전략에 대한 핵심 표적을 나타낸다. 신장 질환에서 염증성 전-섬유증 경로를 표적으로 하는 새로우면서 기존의 치료가 많지 않아서, 새로운 치료법을 개발하려는 절실한 필요가 있다. 단백뇨성 신장 질환을 가진 많은 환자들은 약해지는 신장 기능과 극히 유사한 세뇨관 간질성 염증 및 진행성 섬유증을 나타낸다. 단백뇨 자체는 세뇨관 간질성 염증 및 단백뇨성 신증의 발생을 유도한다 (Brunskill N.J. et al., J Am Soc Nephrol 15:504-505, 2004). 1차 신장 질환과 관계 없이, 세뇨관 간질성 염증 및 섬유증은 예외없이 진행성 신장 손상을 가진 환자들에서 나타나고 약화되는 배설 기능과 밀접하게 관련된다 (Risdon R.A. et al., Lancet 1:363-366, 1968; Schainuck L.I., et al., Hum Pathol 1: 631-640, 1970). 섬유증을 유발하는 핵심적인 공통 세포 경로를 간섭하는 잠재력을 가진 치료범들은 신장 장애에 광범위하게 적용될 전망을 가졌다.
실시예 14에서 기술된 것과 같이, 비-단백뇨성 신장 섬유증의 UUO 모델에서, MASP-2-/- 마우스가 염증 세포 침윤물 (75% 감소), 및 콜라겐과 같은 섬유증의 조직학적 마커 (1/3 감소)에 의해 나타난 것과 같이, 야생형 대조군 동물에 비교하여 상당히 더 적은 신장 섬유증 및 염증을 나타냈던 것으로 측정되었고, 그로 인해 신장 섬유증에서 렉틴 경로의 핵심 역할을 수립하게 되었다.
실시예 13에서 기술된 것과 같이, 또한 마우스에서 렉틴 경로를 차단한 것으로 나타난 인간 렉틴 경로의 기능을 특이적으로 차단하는 단클론성 MASP-2 항체 (OMS646-SGMI-2 융합, OMS646의 중쇄의 C-말단에 융합된 SGMI-2 펩타이드를 포함함)를 생성하였다. 이 실시예에서, OMS646-SGMI-2를 MASP-2의 특이적 억제자가 신장 섬유증을 억제할 수 있는지를 측정하기 위하여 야생형 마우스에서 신장 섬유증의 UUO 마우스 모델에서 분석하였다.
방법:
이 연구는 인간 IgG4 아이소타입 대조군 항체 (10 mg/kg ET904), 및 비히클 대조군과 비교하여, 수컷 WT C57BL/6 마우스에서 MASP-2 억제 항체 (10 mg/kg OMS646-SGMI-2)의 효과를 평가하였다. 항체 (10mg/kg)를 9마리의 마우스의 그룹에 복강내 (ip) 주사에 의해 UUO 수술전 7일 전, 4일 전 및 1일 전에, 그리고 다시 수술 후 2일째에 투여하였다. 혈액 샘플을 렉틴 경로 기능적 활성을 평가하기 위하여 항체 투여 전 및 실험이 끝날 때에 취하였다.
UUP 수술, 조직 수집 및 시리우스 레드 및 대식세포-특이적 항체 F4/80으로의 염색을 실시예 14에서 기술한 방법을 사용하여 수행하였다.
마우스 신장의 하이드록시프롤린 함량을 특이적인 비색 검정 테스트 키트 (Sigma)를 제조자의 설명을 따라 사용하여 측정하였다.
마우스에서 MASP-2 억제 mAb의 약물역학적 효과를 평가하기 위하여, 전신적 렉틴 경로 활성을 마우스에 MASP-2 mAb 또는 대조군 mAb를 i.p. 투여한 후 표시된 시간에 수집된 최소 희석된 혈청 샘플 중의 렉틴-유도된 C3 활성화를 정량함으로써 평가하였다. 간단히 기술하자면, 7 μM 직경의 폴리스티렌 마이크로스피어 (Bangs Laboratories, Fisher IN, USA)를 중탄산 나트륨 완충액 (pH 9.6) 중의 30μg/mL 만난 (Sigma)과 함께 밤새도록 인쿠베이션하고, 세척한 후 PBS 중의 1% 소 태아 혈청으로 차단하고 PBS에 1x108 비드/mL의 최종 농도로 재현탁함으로써 만난으로 코팅하였다. 보체 침착 반응을 2.5 μL의 만난-코팅된 비드 (~250,000 비드)를 50 μL의 최소 희석된 마우스 혈청 샘플 (90%의 최종 혈청 농도)에 첨가함으로써 개시하고, 이어서 40분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 250 μL의 빙-냉 유동 세포분석 완충액 (FB: PBS containing 0.1% fetal bovine serum)을 첨가함으로써 침착 반응을 종결한 후에, 비드를 원심분리에 의해 수집하고 300 μL의 빙-냉 FB로 2회 이상 세척하였다.
렉틴-유도된 C3 활성화를 정량하기 위하여, 비드를 1시간 동안 4℃에서 FB에 희석된 50 μL의 토끼 항-인간 C3c 항체 (Dako, Carpenteria, CA, USA)와 함께 인큐베이션하였다. 미결합 물질을 제거하기 위해 FB로 2회 세척한 후에, 비드를 FB에 희석된 PE-Cy5 (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA)에 컨쥬게이트된 50 μL의 염소 항-토끼 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 미결합 물질을 제거하기 위해 FB로 2회 세척한 후에, 비드를 FB에 재현탁하고 FACS Calibur 세포 분석기에 의해 분석하였다. 비드를 전방 및 사이드 스캐터를 사용하여 균일한 군집으로서 모으고, 각 샘플의 C3b 침착을 평균 형광 세기 (MFI)로서 정량하였다.
결과:
콜라겐 침착의 평가:
도 21은 시리우스 레드로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시하며, 조직 섹션은 MASP-2 억제 항체 또는 아이소타입 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스로부터 요관 폐쇄 후 7일 후에 얻어졌다. 도 21에서 나타난 것과 같이, MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스로부터 얻어진 폐쇄 (UUO) 후 7일 후에 수득된 신장으로부터의 조직 섹션은 IgG4 아이소타입 대조군으로 처리된 야생형 마우스로부터 얻어진 폐쇄된 신장으로부터의 조직 섹션에서 콜라겐 침착의 양과 비교하여 콜라겐 침착의 상당한 감소를 보였다 (p=0.0477).
하이드록시 프롤린 함량의 평가:
하이드록시 프롤린을 콜라겐 함량의 지표로서 신장 조직에서 측정하였다. 하이드록시 프롤린은 이 모델에서 유도된 질환의 병리생리적 진행을 고도로 나타내는 파라미터이다.
도 22는 MASP-2 억제 항체 또는 아이소타입 대조군 항체 중 어느 하나로 처리된 야생형 마우스로부터 얻어진 폐쇄 (UUO) 후 7일 후에 수득된 신장으로부터의 하이드록실 프롤린 함량을 그래프로 도시한다. 도 22에서 나타난 것과 같이, MASP-2 억제 항체로 처리된 마우스로부터의 폐쇄된 신장 조직은 IgG4 아이소타입 대조군 mAb로 처리된 마우스로부터의 신장보다, 상당히 더 적은, 콜라겐 함량의 지표인 하이드록실 프롤린을 증명하였다 (p=0.0439).
염증의 평가:
야생형, 아이소타입 대조군 항체-처리된 동물들, 및 MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 동물들로부터의 폐쇄된 신장은 대식세포의 활발한 침윤물을 증명하였다. 세심한 정량은 이들 두 그룹 사이에서 대식세포 백분율 염색 면적에 유의미한 차이가 없는 것을 드러냈다 (데이터 미도시). 하지만, 침윤성 대식세포의 동등한 수에도 불구하고, MASP-2 억제 항체-주입 동물로부터의 폐쇄된 신장은 시리우스 레드 염색에 의해 판단되는 바, 아이소타입 대조군 주입된 동물들로부터의 폐쇄된 신장과 비교하여 상당히 더 적은 섬유증을 나타냈고, 그 결과는 MASP-2 억제 항체로 처리된 마우스로부터의 폐쇄된 신장 조직이 IgG4 아이소타입 대조군 mAb로 처리된 신장보다 상당히 더 적은 하이드록실 프롤린을 가졌다는 결과와 일치한다.
논의
이 실시예에서 기술된 결과들은 MASP-2 억제 항체의 사용이 UUO 모델에서 신장 섬유증에 대한 보호를 제공하는 것을 증명하고, 그것은 MASP-2-/- 마우스가 야생형 마우스에 비교하여 UUO 모델에서 상당히 감소된 신장 섬유증 및 염증을 가졌음을 증명하는 실시예 14에서 기술된 결과들과 일치한다. 이 실시예의 결과는 MASP-2 억제 항체로 처리된 마우스에서 감소된 섬유증을 보여준다. MASP-2-의존적 렉틴 경로 활성의 감소 또는 차단을 가진 동물에서 UUO 신장에서 감소된 섬유증의 발견은 매우 유의미한 신규한 발견이다. 함께 취하면, 실시예 14 및 이 실시예에서 제공된 결과들은 신장 세뇨관 간질성 염증, 세뇨관 세포 손상, 전섬유형성 사이토카인 방출 및 반흔에 미치는 MASP-2 억제의 유익한 영향을 증명한다. 신장 섬유증의 완화는 신장 치료법에 대한 핵심 목표로 남아 있다. UUO 모델은 가속화된 신장 섬유증의 심각한 모델이고, 이 모델에서 섬유증을 감소시키는 개입, 예컨대 MASP-2 억제 항체의 사용은 신장 섬유증을 억제하거나 예방하기 위해 사용될 가능성이 있다. UUO 모델로부터의 결과들은 사구체 및/또는 단백뇨성 세뇨관 손상을 특징으로 하는 신장 질환으로 양도될 가능성이 있다.
실시예 16
이 실시예는 단백뇨성 신증에서 렉틴 경로의 역할을 평가하기 위하여 MASP-2-/- 및 야생형 마우스에서 신장 섬유증, 염증 및 세뇨관 간질성 손상의 단백질 과부하 단백뇨 모델을 사용하여 생성된 결과들을 제공한다.
배경/근거:
단백뇨는 1차 신장 질환과 관계 없이, 신장 섬유증의 발생 및 신장 배설 기능의 손실에 대한 위험 인자이다 (Tryggvason K. et al., J Intern Med 254:216-224, 2003, Williams M., Am J. Nephrol 25:77-94, 2005). 단백뇨성 신증의 개념은 손상된 사구체 선택투과성의 결과로서 근위 세뇨관으로 유입되는 과잉 단백질의 독성 영향를 기술한다 (Brunskill N.J., J Am Soc Nephrol 15:504-505, 2004, Baines R.J., Nature Rev Nephrol 7:177-180, 2011). 많은 사구체 질환에 공통적인 이 현상은 신장에서 전-염증성 반흔 환경을 초래하고 단백뇨성 세뇨관액에 의해 자극된 조절장애를 일으킨 신호전달 경로의 결과로서 근위 세뇨관 세포 성장, 세포자멸, 유전자 전사 및 염증성 사이토카인 생성의 변화를 특징으로 한다. eskqorsy성 신증은 일반적으로 다양한 1차 신장 병리에 공통적인 진행성 신장 손상에 대한 핵심 기여자인 것으로 인식된다.
만성 신장 질환은 미국에서 성인 집단의 15%보다 많은 성인에 영향을 미치고 전세계적으로 해마다 대략 750,000건의 사망을 차지한다 (Lozano R. et al., Lancet vol 380, Issue 9859:2095-2128, 2012). 단백뇨는 만성 신장 질환의 지표일뿐 아니라 질환 진행을 촉진하는 인자이다. 단백뇨성 신장 질환을 가진 많은 환자들이 약화된 신장 기능과 극히 유사한 세뇨관 간질성 염증 및 진행성 섬유증을 나타낸다. 단백뇨 자체는 세뇨관 간질성 염증 및 단백뇨성 신증의 발생을 유도한다 (Brunskill N.J. et al., J Am Soc Nephrol 15:504-505, 2004). 단백뇨성 신장 질환에서, 과잉량의 알부민 및 다른 거대분자가 사구체를 통해 여과되고 근위 세뇨관 상피 세포에 의해 재흡수된다. 이것은 세뇨관-간질성 손상 및 섬유증을 유발하는 사이토카인 및 류코사이트 침윤물을 유도하하는 보체 활성화에 의해 매개된 염증성 악순환을 유발하고, 그로써 단백뇨를 악화시키고 신장 기능의 손실을 유도하며 궁극적으로 말기 신부전으로의 진행을 유도한다 (예컨대, Clark et al., Canadian Medical Association Journal 178:173-175, 2008 참조). 염증 및 단백뇨의 이런 해로운 사이클을 조절하는 치료법은 만성 신장 질환의 결과를 개선할 것으로 예상된다.
세뇨관 간질성 손상의 UUO 모델에서 MASP-2 억제의 유익한 효과의 관점에서, 단백질 과부하 모델에서 MASP-2 억제가 신장 손상을 감소시킬 수 있을지를 측정하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다. 이 연구는 Ishola et al., European Kidney Association 21:591-597, 2006에서 기술된 것과 같이 단백뇨성 신장 질환을 유도하기 위하여 단백질 과부하를 사용하였다.
방법:
MASP-2-/- 마우스를 실시예 1에서 기술한 것과 같이 생성하고 BALB/c와 10세대 동안 역교배시켰다. 현재의 연구를 단백질 과부하 단백뇨 모델에서 야생형 및 MASP-2-/- BALB/c 마우스의 결과와 다음과 같이 비교하였다.
실험하기 1주 전에, 마우스들을 최적 반응을 보기 위하여 단백질 과부하 도전 전에 한쪽에서 신장을 적출하였다. 사용된 단백뇨 유도제는 다음의 용량으로 WT (n=7마리) 및 MASP-2 -/- 마우스 (n=7마리)에 정상 식염수로 i.p.로 제공된 저용량 내독소 소 혈청 알부민 (BSA, Sigma)이었다: 15일의 기간에 걸쳐 i.p.로 투여된 총 15 용량에 대해, 2mg BSA/gm, 4mg BSA/gm, 6mg BSA/gm, 8mg BSA/gm, 10mg BSA/gm 및 12mg BSA/gm 체중의 각각 한 용량, 및 15mg BSA/gm 체중의 9 용량. 대조군 WT (n=4마리) 및 MASP-2-/- (n=4마리) 마우스는 식염수만을 i.p.로 투여받았다. 마지막 용량의 투여 후에, 동물들을 별도로 대사 우리(metabolic cages)에 24시간 동안 가두고 뇨를 수집하였다. 혈액을 마취 하에 심장 천공에 의해 수집하고, 혈액을 얼음에 2시가 동안 놓아두어 응고되도록 하고 혈청을 원심분리에 의해 분리하였다. 혈청 및 뇨 샘플을 15일째에 실험이 끝날 때 수집하고, 분석을 위해 냉동 보관하였다.
마우스들을 15일 째에 마지막 투여 후 24시간 후에 희생시키고 다양한 조직을 분석을 위해 수집하였다. 신장을 수득하고 H&E 및 면역염색에 대해 처리하였다. 면역조직화학 염색을 다음과 같이 수행하였다. 각 마우스로부터의 포르말린 고정된, 파라핀-삽입된 5 마이크론 신장 조직 섹션을 파라핀을 제거하고 재수화하였다. 항원 회수를 시트레이트 완충액에서 95℃에서 20분 동안 수행하고 이어서 조직을 3% H2O2에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 조직을 차단 완충액 (2차 항체가 발생된 종으로부터 10% 혈청 및 PBS 중의 1% BSA)에서 10% 아비딘 용액과 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 섹션을 각 단계 후에, PBS로 3회, 각각 5분씩 세척하였다. 그런 다음 1차 항체를 10% 비오틴 용액을 포함한 차단 완충액에서 1시간 동안 항체 F4/80 (Santa Cruz cat# sc-25830), TGFβ (Santa Cruz cat# sc-7892), IL-6 (Santa Cruz cat# sc-1265)에 대해서는 1:100의 농도로, 및 TNFα 항체 (Santa Cruz cat# sc-1348)에 대해서는 1:50의 농도로 적용하였다. 비오티닐화된 2차 항체를 그런 다음 30분 동안 F4/80, TGFβ 및 IL-6 섹션에 대해 1:200의 농도로 및 TNFα 섹션에 대해 1;100의 농도로 적용하고 이어서 HRP 컨쥬게이트 효소를 다시 30분 동안 적용하였다. 다이아미노벤지딘 (DAB) 기질 키트 (Vector labs)를 사용하여 10분 동안 색을 발색시키고 슬라이드를 물로 세척하고, 탈수시키고 컴퓨터-기반 영상 분석을 용이하게 하기 위하여 대조 염색 없이 고정시켰다. 신장 피질로부터의 염색된 조직 섹션을 디지털 영상 포획에 의해, 이어서 자동 영상 분석 소프트웨어를 사용하는 정량에 의해 분석하였다.
세포자멸을 조직 섹션에서 말단 데옥시뉴클레오타이딜 트란스페라제 dUTP 닉 단부 라벨링 (TUNEL)에 의해 다음과 같이 평가하였다. 신장 섹션의 세포자멸성 세포를 다음과 같이 ApopTag® 퍼옥시다제 키트 (Millipore)를 사용하여 염색하였다. 각 마우스로부터 파라핀 삽입되고, 포르말린 고정된 신장 섹션을 파라핀을 제거하고, 재수화한 후 실온에서 각 견본에 15분 동안 적용된 프로테이나제 K (20 μg/mL)를 사용하여 단백질을 투과시켰다. 견본을 단계들 사이에 PBS로 세척하였다. 내인성 퍼옥시다제 활성을 10분 동안 3% H2O2에 조직을 인큐베이션함으로써 퀀칭하였다. 그런 다음 조직을 평형 완충액에서 인큐베이션하고 이어서 TdT 효소와 함께 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 중단/세척 완충액으로 10분 동안 세척한 후, 항-디곡시게닌 컨쥬게이트를 30분 동안 실온에서 적용한 후 세척하였다. 색을 DAB 기질 키트에서 4분 동안 발색시킨 후 물로 세척하였다. 조직을 헤마토크실린에서 대조 염색하고 DBX에 고정시켰다. TUNEL 염색된 (갈색) 세포자멸성 세포의 빈도를 Leica DBXM 광현미경을 사용하여 피질로부터 연속적으로 선택된 20개의 고출력 장에서 수동으로 계수하였다.
결과:
단백뇨의 평가
마우스에서 단백뇨의 존재를 확인하기 위하여, 혈청의 총 단백질을 제 15일에 분석하였고 뇨 중의 총 배설 단백질을 연구의 제 15일에 24시간 기간에 걸쳐 수집한 뇨 샘플에서 측정하였다.
도 23은 식염수만을 받은 야생형 대조군 마우스 (n=2마리), BSA를 받은 야생형 마우스 (n=6마리) 및 BSA를 받은 MASP-2-/- 마우스 (n=6마리)에서 제 15일에 측정된 혈청 단백질의 총 양 (mg/ml)을 그래프로 도시한다. 도 23에서 나타난 것과 같이, BSA의 투여는 야생형 및 MASP-2-/- 그룹 둘 다에서 혈청 총 단백질 수준을 식염수만을 받은 대조군 그룹의 농도보다 2배 이상 증가시켰고, 처리된 그룹 간의 유의미한 차이는 없었다.
도 24는 식염수만을 받은 야생형 대조군 마우스 (n=2마리), BSA를 받은 야생형 마우스 (n=6마리) 및 BSA를 받은 MASP-2-/- 마우스 (n=6마리)로부터 제 15일에 24시간 기간에 걸쳐 수집한 뇨에서 배설된 단백질의 총 양 (mg)을 그래프로 도시한다. 도 24에서 나타난 것과 같이, 이 연구에 제 15일에, 식염수만을 받은 모의-처리된 대조군 그룹에 비교하여 BSA 처리된 그룹에서 뇨에서 총 배설된 단백질에 대략 6-배의 증가가 있었다. 도 23 및 24에 나타낸 결과들은 단백뇨 모델이 예상했던 것과 같이 작용하고 있었음을 증명한다.
신장에서 조직학적 변화의 평가
도 25는 다음의 마우스 그룹으로부터 단백질 과부하 연구의제 15일에 수득된 대표적인 H&E 염색된 신장 조직 섹션을 도시한다: (패널 A) 야생형 대조군 마우스; (패널 B) MASP-2-/- 대조군 마우스; (패널 C) BSA로 처리된 야생형 마우스; 및 (패널 D) BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스. 도 25에서 나타난 것과 같이, 동일한 수준의 단백질 과부하 도전에서 야생형 과부하 그룹 (패널 C)과 비교하여 MASP-2-/- 과부하 그룹 (패널 D)에서 훨씬 더 높은 정도의 조직 보존이 있다. 예를 들어, BSA (과부하)로 처리된 야생형 마우스에서 Bowman 캡슐은 야생형 대조군 그룹 (패널 A)에서 Bowman 캡슐에 비교하여 크게 확대된 것으로 (패널 C) 관찰되었다. 대조적으로, 동일한 수준의 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스 (과부하) (패널 D)에서 Bowman 캡슐은 MASP-2-/- 대조군 마우스 (패널 B) 및 야생형 대조군 마우스 (패널 A)와 유사한 형태를 보유하였다. 도 25에서 추가로 나타난 것과 같이, 큰 단백질 캐스트 구조는 야생형 신장 섹션의 근위 및 원위 세뇨관에서 축적되었고 (패널 C), 그것은 MASP-2-/- 마우스 (패널 D)에 비교하여 더 크고 더 풍부하다.
또한 전자 전송 현미경에 의한 이 연구로부터의 신장 섹션의 분석은 BSA로 처리된 마우스가, 세포의 내용물 및 핵이 요관 루멘으로 쓸려들어가면서, 원위 및 근위 세뇨관 세포의 모세관 경계에 대해 전체적으로 손상된 것을 보여준 것이 주지된다. 대조적으로, 조직은 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스에서 보존되었다.
신장에서 대식세포 침윤의 평가
대식세포 침윤에 의해 표시되는 바, 염증의 정도를 측정하기 위하여, 수득된 신장의 조직 섹션을 또한 Boor et al., J of Am Soc of Nephrology 18:1508-1515, 2007에 기술된 방법을 사용하여 대식세포-특이적 항체 F4/80으로 염색하였다.
도 26은 대식세포 평균 염색 면적 (%)을 보여주는, 대식세포-특이적 항체 F4/80으로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시하는데, 조직 섹션은 야생형 대조군 마우스 (n=2마리), BSA로 처리된 야생형 마우스 (n=6마리), 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스 (n=5마리)로부터 단백질 과부하 연구의 제 15일에 얻어졌다. 도 26에서 나타난 것과 같이, F4/80 항-대식세포 항체로 염색된 신장 조직 섹션은, BSA로 처리된 두 그룹이 모두 야생형 모의 대조군과 비교하여 신장 대식세포 침윤에서 상당한 증가를 보인 (%F4/80 항체-염색된 면적으로서 측정됨) 한편 BSA-처리된 야생형 마우스로부터의 조직 섹션에서 대식세포 침윤과 비교하여 BSA-처리된 MASP-2-/- 마우스로부터의 조직 섹션에서 대식세포 침윤의 상당한 감소가 과찰되었음을 보였다 (p 값=0.0345).
도 27A는 24시간 샘플로부터의 뇨에서 측정된 총 배설 단백질 대비 대식세포 침윤 (평균 염색 면적 %)을 도표화함으로써 BSA로 처리된 각각의 야생형 마우스 (n=6마리)에서 대식세포-단백뇨 상관관계의 존재에 대한 분석을 그래프로 도시한다. 도 27A에서 나타난 것과 같이, 야생형 신장들로부터의 샘플은 대부분 단백뇨 존재 수준과 대식세포 침윤 정도 사이에 양성 상관관계를 보였다.
도 28B는 24시간 샘플의 뇨 중의 총 배설 단백질 대비 대식세포 침윤 (평균 염색 면적 %)을 도표화함으로써 BSA로 처리된 각각의 MASP-2-/- 마우스 (n=5마리)에서 대식세포-단백뇨 상관관계의 존재에 대한 분석을 그래프로 도시한다. 도 27B에서 나타난 것과 같이, 단백뇨 수준과 대식세포 침윤 정도 사이에 야생형 마우스에서 관찰된 양성 상관관계 (도 27A에서 도시됨)는 MASP-2-/- 마우스에서는 관찰되지 않았다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지는 않지만, 이런 결과들은 MASP-2-/- 마우스에서 고수준의 단백뇨에서 염증 제거의 메커니즘의 존재를 가리킬 수 있다.
사이토카인 침윤의 평가
인터류킨 6 (IL-6), 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)는 단백뇨의 모델에서 야생형 마우스의 근위 세뇨관에서 상향 조절되는 것으로 알려져 있는 전-염증성 사이토카인들이다 (Abbate M. et al., Journal of the American Society of Nephrology: JASN, 17: 2974-2984, 2006; David S. et al., Nephrology, Didalysis, Transplantation, Official Publication of the European Dialysis and Transplant Association- European Renal Association 12: 51-56, 1997). 신장의 조직 섹션을 상기에서 기술한 것과 같이 사이토카인-특이적 항체로 염색하였다.
도 28은 BSA로 처리된 야생형 마우스 (n=4마리) 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스 (n=5마리)에서 항-TGFβ 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과 (% TGFβ 항체-염색 면적으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다. 도 28에서 나타난 것과 같이, MASP-2-/- BSA 처리된 (과부하) 그룹에 비교하여 야생형 BSA 처리된 (과부하) 그룹에서 TGFβ의 염색에 상당한 증가가 관찰되었다 (p=0.026).
도 29는 BSA로 처리된 야생형 마우스 (n=4마리) 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스 (n=5마리)에서 항-TNFα 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과 (% TNFα 항체-염색 면적으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다. 도 29에서 나타난 것과 같이, MASP-2-/- BSA 처리된 (과부하) 그룹에 비교하여 야생형 BSA 처리된 (과부하) 그룹에서 TNFα의 염색에 상당한 증가가 관찰되었다 (p=0.0303).
도 30은 야생형 대조군 마우스, BSA로 처리된 야생형 마우스 (n=7마리) 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스 (n=7마리)에서 항-IL-6 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과 (% IL-6 항체-염색 면적으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다. 도 30에서 나타난 것과 같이, MASP-2-/- BSA 처리된 그룹에 비교하여 야생형 BSA 처리된 그룹에서 IL-6의 염색에 매우 상당한 증가가 관찰되었다 (p=0.0016).
세포자멸의 평가
세포자멸을 말단 데옥시뉴클레오타이딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 단부 라벨링 (TUNEL)으로의 염색에 의해 조직 섹션에서 평가하였고 TUNEL 염색된 세포자멸성 세포의 빈도를 피질로부터 연속적으로 선택된 20개의 고출력 장 (HPF)에서 계수하였다.
도 31은 야생형 대조군 마우스 (n=1마리), MASP-2-/- 대조군 마우스 (n=1마리), BSA로 처리된 야생형 마우스 (n=6마리) 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스 (n=7마리)에서 신장 피질로부터의 조직 섹션으로부터 연속적으로 선택된 20개의 고출력 장 (HPF)에서 계수된 TUNEL 세포자멸성 세포의 빈도를 그래프로 도시한다. 도 31에서 나타난 것과 같이, 피질의 상당히 더 높은 세포자멸 속도가 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어진 신장과 비교하여 BSA로 처리된 야생형 마우스로부터 얻어진 신장에서 관찰되었다 (p=0.0001).
결과의 전체적인 요약 및 결론:
이 실시예의 결과들은 MASP-2-/- 마우스가 단백질 과부하 모델에서 신장 손상이 감소되었음을 증명한다. 그러므로, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체는 염증 및 단백뇨의 해로운 순환을 억제 또는 예방하고 만성 신장 질환의 결과를 개선할 것으로 예상될 것이다.
실시예 17
이 실시예는 야생형 마우스의 마우스 단백질 과부하 단백뇨 모델에서 신장 염증 및 세뇨관 간질성 손상을 감소 및/또는 예방하는 효능에 대하여 단클론성 MASP-2 억제 항체의 분석을 기술한다.
배경/근거:
실시예 16에서 기술한 것과 같이, 단백뇨의 단백질 과부하 모델에서 MASP-2-/- 마우스가 야생형 마우스보다 상당히 더 나은 결과 (예컨대 더 적은 세뇨관 간질성 손상 및 더 적은 신장 염증)를 나타낸 것으로 측정되었고, 그것은 단백뇨성 신장 질환에서 렉틴 경로에 대한 병원성 역할을 시사한다.
실시예 13에서 기술된 것과 같이, 인간 렉틴 경로의 기능을 선택적으로 차단하고 또한 마우스에서 렉틴 경로를 차단하는 것으로 밝혀진 단클론성 MASP-2 억제 항체 (OMS646-SGMI-2)를 생성하였다. 이 실시예에서, MASP-2 억제 항체 OMS646-SGMI-2를 야생형 마우스에서 신장 염증 및 세뇨관 간질성 손상을 감소 및/또는 예방하는 데 있어서의 효능에 대해 마우스 단백질 과부하 단백뇨 모델에서 분석하였다.
방법:
이 연구는 인간 IgG4 아이소타입 대조군 항체, ET904 (10 mg/kg), 및 식염수 대조군에 비교하여 MASP-2 억제 항체 (10 mg/kg OMS646-SGMI-2)의 효과를 평가하였다.
실시예 16에서 기술된 연구와 유사하게, 이 연구는 단백뇨성 신장 질환을 유도하기 위하여 단백질 과부하를 사용하였다 (Ishola et al., European Renal Association 21:591-597, 2006). 단백뇨를 실시예 16에서 기술한 것과 같이, 한쪽에서 신장이 절제된 Balb/c 마우스에서 매일, 증가하는 용량 (2 g/kg에서 15 g/kg)의 낮은 내독소 소 혈청 알부민 (BSA)으로 총 15일 동안 i.p. 주사함으로써 유도하였다.
항체 치료를 단백뇨 유도 전 7일 전에 시작하여 격주로 i.p. 주사에 의해 투여하였고 연구가 끝날 때까지 계속하였다. 이 투약 계획은 이전의 PK/PD 및 지속적인 렉틴 경로 억제를 증명한 약물학 연구 (데이터 미도시)를 기반으로 선택하였다. 마우스를 제 15일에 희생시키고 신장을 수득하여 H&E 및 면역염색에 대해 처리하였다. 신장 피질로부터의 염색된 조직 섹션을 디지털 영상 포획과 이어서 자동 영상 분석 소프트웨어를 사용한 정량에 의해 분석하였다.
면역조직화학 염색 및 세포자멸 평가를 실시예 16에서 기술한 것과 같이 수행하였다.
결과:
단백뇨의 평가
마우스에서 단백뇨의 존재를 확인하기 위하여, 뇨의 총 배설 단백질을 제 15일 (실험이 끝난 시점)에 24시간 기간에 걸펴 수집한 뇨 샘플에서 측정하였다. 뇨 샘플은 BSA로 처리되지 않은 대조군 그룹에 비교하여 BSA로 처리된 그룹에서 총 단백질 수준에 평균 거의 6-배의 증가를 보인 것으로 측정되었고 (데이터 미도시), 이것은 BSA로 처리된 마우스에서 단백뇨의 존재를 확인해 주었다. BSA-처리된 그룹들 사이에서 단백질 수준의 유의미한 차이는 관찰되지 않았다.
조직학적 변화의 평가
도 32는 BSA로 처리 후 제 15일째의 마우스의 다음 그룹들로부터의 대표적인 H&E 염색된 조직 섹션을 도시한다: (패널 A) 식염수로 처리된 야생형 대조군 마우스; (패널 B) 아이소타입 항체 처리된 대조군 마우스; 및 (패널 C) MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스.
도 32에서 나타난 것과 같이, 동일한 수준의 단백질 과부하 도전에서 식염수로 처리된 야생형 그룹 (패널 A) 또는 아이소타입 대조군 (패널 B)에 비교하여 MASP-2 억제 항체-처리된 그룹 (패널 C)에서 훨씬 더 고도의 조직 보존이 있다.
세포자멸의 평가
세포자멸을 말단 데옥시뉴클레오타이딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 단부 라벨링 (TUNEL)으로의 염색에 의해 조직 섹션에서 평가하였고 TUNEL 염색된 세포자멸성 세포의 빈도를 피질로부터 연속적으로 선택된 20개의 고출력 장 (HPF)에서 계수하였다. 도 33은 식염수 대조군 및 BSA로 처리된 야생형 마우스 (n=8마리), 아이소타입 대조군 항체 and BSA로 처리된 야생혀 마우스 (n=8마리) 및 MASP-2 억제 항체 and BSA로 처리된 야생혀 마우스 (n=7마리)에서 신장 피질로부터의 조직 섹션으로부터 연속적으로 선택된 20개의 고출력 장 (HPF)에서 계수된 TUNEL 세포자멸성 세포의 빈도를 그래프로 도시한다. 도 33에서 나타난 것과 같이, 식염수 및 아이소타입 대조군 처리된 그룹에 비교하여 MASP-2 억제 항체 처리된 그룹으로부터 얻어진 신장에서 피질의 세포자멸의 속도에서 고도로 상당한 증가가 관찰되었다 (식염수 대조군 대비 MASP-2 억제 항체에 대해 p=0.0002; 아이소타입 대조군 대비 MASP-2 억제 항체에 대해 p=0.0052).
사이토카인 침윤의 평가
단백뇨의 모델에서 야생형 마우스의 근위 세뇨관에서 상향 조절되는 것으로 알려져 있는 전-염증성 사이토카인들인 인터류킨 6 (IL-6), 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)를 이 연구에서 얻어진 신장 조직 섹션에서 평가하였다.
도 34는 BSA 및 식염수로 처리된 야생형 마우스 (n=8마리), BSA 및 아이소타입 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스 (n=7마리) 및 BSA 및 MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스 (n=8마리)에서 항-TGFβ 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과 (% TGFβ 항체-염색 면적으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다. 도 34에서 나타난 것과 같이, TGFβ 염색 면적의 정량은 식염수 및 아이소타입 대조군 항체-처리된 대조군 그룹에 비교하여 MASP-2 억제 항체-처리된 마우스에서 TGFβ의 수준에 상당한 감소를 나타냈다 (각각 p 값= 0.0324 및 0.0349).
도 35는 BSA 및 식염수로 처리된 야생형 마우스 (n=8마리), BSA 및 아이소타입 대조군 항체 (n=7마리) 및 BSA 및 MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스 (n=8마리)에서 항-TNFα 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과 (% TNFα 항체-염색 면적으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다. 도 35에서 나타난 것과 같이, 염색된 섹션의 분석은은 아이소타입 대조군 그룹 (p=0.0285)뿐만 아니라 식염수 대조군 그룹 (p=0.011)에 비교하여 MASP-2 억제 항체-처리된 그룹에서 TNFα의 수준에 상당한 감소를 나타냈다.
도 36은 BSA 및 식염수로 처리된 야생형 마우스 (n=8마리), BSA 및 아이소타입 대조군 항체 (n=7마리) 및 BSA 및 MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스 (n=8마리)에서 항-IL-6 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과 (% IL-6 항체-염색 면적으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다. 도 36에서 나타난 것과 같이, 염색된 섹션의 분석은은 아이소타입 대조군 그룹 (p=0.0445)뿐만 아니라 식염수 대조군 그룹 (p=0.0269)에 비교하여 MASP-2 억제 항체-처리된 그룹에서 IL-6의 수준에 상당한 감소를 나타냈다.
결과의 전체 요약 및 결론:
이 실시예의 결과들은 MASP-2 억제 항체의 사용이 단백질 과부하 모델에서 신장 손상에 대한 보호를 제공하는 것을 증명하며, 그것은 MASP-2-/- 마우스가 단백뇨 모델에서 신장 손상이 감소되었음을 증명하는 실시예 16에서 기술된 결과들과 일치한다.
실시예 18
이 실시예는 아드리아마이신-유도된 신증에서 렉틴 경로의 역할을 평가하기 위하여 MASP-2-/- 및 야생형 마우스에서 신장 섬유증, 염증 및 세뇨관 간질성 손상의 아드리아마이신-유도된 신장학 모델을 사용하여 생성된 결과들을 제공한다.
배경/근거:
아드리아마이신은 혈액학적 악성 종양, 연조직 육종 및 많은 유형의 암종을 포함하여, 광범위한 암의 치료에 사용된 안트라사이클린 항종양 항생물질이다. 아드리아마이신-유도된 신증은 만성 단백뇨의 진행을 더 잘 이해할 수 있게 해준 만성 신장 질환의 잘 수립된 설치류 모델이다 (Lee and Harris, Nephrology, 16:30-38, 2011). 아드리아마이신-유도된 신증에서 구조적 및 기능적 손상의 유형은 인간에서 만성 단백뇨성 신장 질환의 그것과 매우 유사하다 (Pippin et al., American Journal of Renal Physiology 296:F213-29, 2009).
아드리아마이신-유도된 신증은 사구체경화증, 세뇨관 간질성 염증 및 섬유증이 수반되는 족세포에 대한 손상을 특징으로 한다. 많은 연구에서 아드리아마이신-유도된 신증은 면역 및 비-면역 유래 메커니즘 둘 다에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다 (Lee and Harris, Nephrology, 16:30-38, 2011). 아드리아마이신-유도된 신증은 신장 질환의 모델로서 여러 강점을 가진다. 첫째로, 그것은 고도로 재생가능하고 예측 가능한 신장 손상의 모델이다. 이것은 약물 투여 후 수일 이내에 신장 손상이 유도되는 것이 특징이고, 그것은 손상의 타이밍이 일관되기 때문에 실험 설계의 용이성을 허용하기 때문이다. 또한 조직 손상의 정도가 심각한 한편 허용되는 사망률 (<5%) 및 이병률 (체중 손실)과 관련되는 모델이기도 한다. 그러므로, 아드리아마이신-유도된 신증에서 신장 손상의 심각성 및 타이밍으로 인해, 그것은 신장 손상에 대해 보호하는 개입을 테스트하기 위해 적합한 모델이다.
실시예 16 및 17에서 기술된 것과 같이, 단백뇨의 단백질 과부하 모델에서 MASP-2 억제 항체로 처리된 MASP-2-/- 마우스 및 마우스가, 단백뇨성 신장 질환에서 렉틴 경로에 대한 병원성 역할을 시사하는, 야생형 마우스보다 상당히 더 나은 결과 (예컨대 더 적은 세뇨관 간질성 손상, 및 더 적은 신장 염증)을 나타냈는지를 측정하였다.
이 실시예에서, MASP-2-/- 마우스를 MASP-2 결핍이 아드리아마이신에 의해 유도된 신장 염증 및 세뇨관 간질성 손상을 감소 및/또는 예방하는지를 측정하기 위하여 아드리아마이신-유도된 신장학 모델 (AN)에서 야생형 마우스와 비교하여 분석하였다.
방법:
1. 투약량 및 시점 최적화
초기 실험을 BALB/c 마우스가 치료적 개입을 테스트하기에 적합한 아드리아마이신의 용량 및 신장 염증 수준을 발생시키는 시점을 측정하기 위해 수행하였다.
3 그룹의 야생형 BALB/c 마우스 (n=8마리)를 IV로 투여된 단일 용량의 아드리아마이신 (10.5 mg/kg)을 주사하였다. 마우스들을 3개의 시점에서 도태시켰다: 아드리아마이신 투여 후 1주 후, 2주 후 및 4주 후. 대조군 마우스에는 식염수만을 주사하였다.
결과: 3 그룹의 모든 마우스는 H&E 염색에 의해 측정되는 바, 사구체 경화증 및 단백뇨의 신호를 보였고, 신장에서의 대식세포 침윤에 의해 측정되는 바 조직 염증의 점증적으로 증가하는 정도를 보였다 (데이터 미도시). 조직 손상 정도는 1주 그룹에서는 경미하였고, 2주 그룹에서는 중간이었으며 4주 그룹에서는 심각하였다 (데이터 미도시). 연구의 나머지에 대해 2주 시점을 선택하였다.
2. 야생형 및 MASP-2-/- 마우스에서 아드리아마이신-유도된 신장학의 분석
아드리아마이신-유도된 신장학에서 보체의 렉틴 경로의 역할을 설명하기 위하여, MASP-2-/- 마우스 (BALB/c)의 그룹을 동일한 용량의 아드리아마이신에서 야생형 마우스 (BALB/c)와 비교하였다. MASP-2-/- 마우스를 10세대 동안 BALB/c 마우스와 역교배시켰다.
야생형 (n=8마리) 및 MASP-2-/- (n=8마리)에 아드리아마이신 (10.5 mg/kg)으로 IV 주사하고 대조군으로서 각 계통의 3마리의 마우스에 식염수만을 주었다. 모든 마우스를 치료 후 2주 후에 도태시켰고 조직을 수집하였다. 조직병리적 손상의 정도를 H&E 염색에 의해 평가하였다.
결과:
도 37은 아드리아마이신 또는 식염수만으로 (대조군) 치료 후 제 14일 째에 마우스들의 다음 그룹으로부터의 대표적인 H&E 염색된 조직 섹션을 도시한다: 패널 A-1, A-2, A-3) 식염수만으로 처리된 야생형 대조군 마우스; (패널 B-1, B-2, B-3) 아드리아마이신으로 처리된 야생형 마우스; 및 (패널 C-1, C-2, C-3) 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2-/- 마우스. 각각의 사진 (예컨대, 패널 A-1, A-2, A-3)은 상이한 마우스를 나타낸다.
도 37에서 나타난 것과 같이, 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2-/- 그룹에서 동일한 용량의 아드리아마이신으로 처리된 야생형 그룹에 비교하여 훨씬 더 높은 정도의 조직 보존이 존재한다.
도 38은 아드리아마이신 또는 식염수만으로 (대조군) 치료 후 제 14일 째에 마우스들의 다음 그룹으로부터의 대식세포 평균 염색 면적 (%)을 보여주는, 대식세포-특이적 항체 F4/80으로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시한다: 아드리아마이신으로 처리된 야생형 마우스; 식염수 만으로 처리된 MASP-2-/- 마우스, 및 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2 -/- 마우스. 도 38에서 나타난 것과 같이, 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2 -/- 마우스는 아드리아마이신으로 처리된 야생형 마우스에 비교하여 감소된 대식세포 침윤을 나타낸다 (**p=0.007).
도 39는 아드리아마이신 또는 식염수만으로 (야생형 대조군) 치료 후 제 14일 째에 마우스들의 다음 그룹으로부터의 콜라겐 침착 염색 면적 (%)을 보여주는, 시리우스 레드로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터-기반 영상 분석의 결과를 그래프로 도시한다: 식염수 만으로 처리된 야생형 대조군 마우스; 아드리아마이신으로 처리된 야생형 마우스; 식염수 만으로 처리된 MASP-2-/- 마우스, 및 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2 -/- 마우스. 도 39에서 나타난 것과 같이, 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2 -/- 마우스는 아드리아마이신으로 처리된 야생형 마우스에 비교하여 감소된 콜라겐 침착을 나타낸다 (**p=0.005).
전체 요약 및 결론:
신장 세뇨관 간질성 염증의 개선은 신장 질환의 치료에 대한 핵심 표적이다. 여기에서 제공된 결과들은 보체 활성화의 렉틴 경로가 신장 세뇨관 간질성 염증의 발생에 상당히 기여하는 것을 나타낸다. 여기에서 추가로 증명되는 것과 같이, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체는 단백뇨성 신증, 아드리아마이신 신증의 치료 및 신장 세뇨관 간질성 염증의 개선에서 신규한 치료 접근법으로서 사용될 수 있다.
실시예 19
이 실시예는 스테로이드-의존적 면역글로불린 A 신증 (IgAN)를 가진 성인 및 스테로이드-의존적 막성 신증 (MN)을 가진 성인에서 전체 인간 단클론성 MASP-2 억제 항체의 안전성 및 임상적 효능을 평가하기 위해 진행중인 2단계 임상 실험의 초기 결과를 기술한다.
배경:
만성 신장 질환은 미국에서 2천만명 이상의 사람들에게 발생한다 (Drawz P. et al., Ann Intern Med 162(11); ITC1-16, 2015). 미국에서 IgAN 및 MN을 포함하여, 사구체신염 (GN)은 사구체가 손상되고 빈번하게 말기 신장 질환 및 투석으로 이어지는 신장 질환이다. 여러 유형의 1차 GN이 존재하는데, 가장 흔한 것은 IgAN이다. 이 환자들 중 다수가 지속적인 신장 염증 및 진행성 악화를 경험한다. 자주 이런 환자들은 코르티코스테로이드류 또는 면역억제지로 치료되는데, 그것들은 많은 심각한 장기 부작용을 가진다. 많은 환자들이 이런 치료에도 악화가 지속된다. IgAN 또는 MN의 치료를 위해 승인된 치료는 없다.
IgA 신증
면역글로불린 A 신증 (IgAN)은 신장 내부 염증 및 신장 손상을 초래하는 자가면역 신장 질환이다. IgAN은 세계적으로 가장 흔한 1차 사구체 질환이다. 매녕 발생률은 대략 100,000명단 2.5로, 미국에서 1400명 중 1명이 IgAN을 나타낼 것으로 추산된다. IgAN을 가진 환자들 중 40%나 많은 수가 말기 신장 질환 (ESRD)으로 발달할 것이다. 환자들은 전형적으로 경미한 내지 중간 정도의 단백뇨 및 가변 수준의 신장 기능저하가 포함된 현미경적 혈뇨가 존재한다 (Wyatt R.J., et al., N Engl J Med 368(25):2402-14, 2013). 손상된 신장 기능, 지속적인 고혈압, 및 중쇄 단백뇨 (1일당 1 g 초과)와 같은 임상적 마커들은 빈약한 예후와 관련된다 (Goto M et al., Nephrol Dial Transplant 24(10):3068-74, 2009; Berthoux F. et al., J Am Soc Nephrol 22(4):752-61, 2011). 단백뇨는 다수의 대규모 관찰 연구 및 미래의 실험에서 다른 위험 인자들과 무관한 가장 강력한 예측 인자이다 (Coppo R. et al., J Nephrol 18(5):503-12, 2005; Reich H. N., et al., J Am Soc Nephrol 18(12):3177-83, 2007). 환자들의 15 내지 20%가 치료되지 않은 채로 있다면 질환이 개시되고 10년 이내에 ESRD에 도달하는 것으로 추정된다 (D'Amico G., Am J Kidney Dis 36(2):227-37, 2000).
IgAN의 진단적 특징은 사구체 간질에서 IgA 침착이 단독으로 또는 IgG, IgM, 또는 둘 다와 함께 지배적이라는 것이다. IgAN에서, 신장 생검은 보체 시스템의 렉틴 경로의 이펙터 효소인 MASP-2의 활성화를 위한 핵심 인식 분자인 만난-결합 렉틴 (MBL)의 사구체 침착을 드러낸다. 보통 IgA와 공동-국소화되고 보체 활성화를 나타내는 것인, 사구체 MBL 침착, 및 고수준의 뇨 MBL은 IgAN의 바람직하지 못한 예후와 관련되며, 이들 환자들은 MBL 침착 또는 고수준의 뇨 MBL을 나타내지 않는 환자들보다 더 심각한 조직학적 변화 및 간질의 증식을 보인다 (Matsuda M. et al., Nephron 80(4):408-13, 1998; Liu LL et al., Clin Exp Immunol 169(2):148-155, 2012; Roos A. et al., J Am Soc Nephrol 17(6):1724-34, 2006; Liu LL et al., Clin Exp Immunol 174(1):152-60, 2013). 치료 관해율 또한 MBL 침착이 있는 환자들에 대해 실질적으로 더 낮다 (Liu LL et al., Clin Exp Immunol 174(1):152-60, 2013).
IgAN에 대한 현재의 치료법은 혈압 제어 및, 빈번하게, 코르티코스테로이드류 및/또는 다른 면역억제제, 예컨대 사이클로포스파미드, 아자티오프린, 또는 마이코페놀레이트 모페틸을 심각한 질환 (예컨대 반월상 IgAN)에 대해 포함한다. 사구체 신염에 대한 신장 질환 개선 글로벌 아웃컴 (KDIGO) 가이드라인 (Int. Soc of Nephrol 2(2):139-274, 2012)은 코르티코스테로이드가 단백뇨 환자에게 1 g/1일 이상, 보통 6개월의 치료 기간 동안 투여되어야 한다고 권장한다. 하지만, 심각한 장기간 스케줄과 관련된 공격적인 면역억제 치료에도, 일부 환자는 신장 기능이 점진적으로 악화된다. IgAN에 대한 승인된 치료는 없으며, 혈압을 제어하기 위한 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제자 또는 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB)의 사용에도 불구하고, 일부 환자에서는 증가된 단백뇨가 지속된다. 이런 치료들 중 어느 것도 질환의 급속한 진행 위험이 있는 환자들에서 IgAN의 진행을 중단시키거나 둔화시키는 것으로 밝혀진 것은 없었다.
막성 신증
년간 막성 신증 (MN)의 발생율은 대략 1,000,000명당 10 내지 12건이다. MN 환자들은 가변적인 임상 과정을 가질 수 있지만, 대략 25%가 말기 신장 질환으로 발달할 것이다.
막성 신증은 면역-매개 사구체 질환이고 성인에서 신증 증후군의 가장 흔한 원인 중 하나이다. 질환은 사구체 기저막의 외부 측면에서 족세포 항원 및 그런 항원에 특이적인 항체를 함유하여 보체 활성화를 초래하는 면역 침착, 주로 IgG4의 형성을 특징으로 한다. NM의 초기 징후는 신증 증후군: 단백뇨, 저알부민혈증, 고지질혈증 및 부종과 관련된다.
비록 MN이 치료 없이 자연적으로 소관될 수 있긴 하지만, 환자의 1/3 정도로 많은 환자가 신장 기능의 진행성 손실을 증명하고 진단 후 평균 5년에 ESRD로 진행된다. 종종, MN을 치료하기 위해 코르티코스테로이드가 사용되고 대체 치료법을 개발할 필요성이 있다. 추가적으로, 단백뇨의 심각성을 기준으로, 진행 위험이 중간 정도인 것으로 측정된 환자들이 사이클로포스파미드 또는 칼시뉴레인 억제자와 함께 프레드니손으로 치료되는데, 이 두 치료는 함께 종종 심각한 전신성 부작용과 관련된다.
방법:
건강한 지원자들에서 수행된 2개의 단계 1 임상 실험은 MASP-2 억제 항체, OMS646의 정맥내 및 피하 두 가지의 투약이 지속적인 렉틴 경로 억제를 초래하였음을 증명하였다.
이 실시예는 IgAN 및 MN을 가진 대상체들에서 MASP-2 억제 항체, OMS646의 진행중인 단계 2, 미제어, 다센터 연구로부터의 중간 결과를 기술한다. 포함 기준은 이 연구의 모든 환자가 신장 질환 유형과 관계없이, 연구 등록 전 적어도 12주 동안 안정적인 용량의 코르티코스테로이드로 유지되었던 것 (즉 환자들은 스테로이드-의존적임)을 필요로 한다. 연구는 12주 치료 및 6-주 후속-기간이 포함된 단일-암 파일럿 연구이다.
대략 4명의 대상체가 질환당 등록될 것으로 계획한다. 연구를 IgAN 및 MN을 가진 대상체들에서 OMS646이 신장 기능을 개선 (예컨대 단백뇨를 개선)하고 코르티코스테로이드 요구를 감소시킬 수 있는지를 평가하기 위해 설계한다. 지금까지, IgA 신증을 가진 2명의 환자 및 막성 신증을 가진 2명의 환자가 연구에서 치료를 완료하였다.
연구를 시작할 때 각 대상체는 안정적인 코르티코스테로이드 용량으로 치료가 진행중임에도 불구하고 뇨에서 고수준의 단백질을 나타내야 했다. 이런 기준들로 연구 기간 중에 자연적으로 개선될 가능성이 없는 환자들을 선택한다.
대상체들은 선별시 연령이 18세 이상이었고 다음 중 하나로 진단될 경우에만 연구에 포함되었다: 신장 생검에서 진단된 IgAN 또는 신장 생검에서 진단된 1차 MN. 등록된 환자들은 또한 다음의 포함 기준 모두를 만족해야 했다:
(1) 선별 기간 동안 2회 방문의 각각의 방문 전에 연속적으로 및 매일 수집된 3개의 샘플로부터 >0.6의 평균 뇨 알부민/크레아티닌 비율을 가져야 한다;
(2) 1회 선별 방문 전에 적어도 12주 동안 ≥ 10 mg의 프레드니손 또는 동등한 용량으로 치료되어야 한다;
(3) 만약 면역억제제 치료중이라면 (예컨대 사이클로스파미드, 마이코페놀레이트 모페틸), 1회 선별 방문 전 적어도 2개월 동안 안정적인 용량으로 치료되어야 하고 연구 기간 동안 용량의 변화가 예상되지 않아야 한다;
(4) MDRD 식1에 의해 계산된 ≥ 30 mL/min/1.73m2 의 추정된 사구체 여과율 (eGFR)을 가져야 한다;
(5) 의사가 지시한, 안정적이고 최적화된 안지오텐신 전환 효소 억제자 (ACEI) 및/또는 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB)로의 치료 중이고, 휴식 시 <150 mmHg의 수축기 혈압 및 <90mmHg의 이완기 혈압을 가져야 한다;
(6) 1회 선별 방문의 6개월 이내에 벨리무맙, 에쿨리주맙 또는 리투지맙을 사용하지 않아야 한다; 및
(7) 신장 이식의 이력이 없어야 한다.
1MDRD 식: eGFR (mL/min/1.73m2) = 175 x (SCr)-1.154 x (Age)-0.203 x (0.742, 여성인 경우) x (1.212, 아프리카계 미국인인 경우). 주: SCr=혈청 크레아티닌 측정은 mg/dL이어야 한다.
이 연구에서 사용한 단클론성 항체, OMS646는 인간 MASP-2에 결합하여 그것을 억제하는 전체 인간 IgG4 단클론성 항체이다. MASP-2는 렉틴 경로의 이펙터 효소이다. 실시예 12에서 증명된 것과 같이, OMS646은 재조합 MASP-2에 강력하게 결합하고 (100 pM 범위의 외관상 평형 해리 상수) 상동성 단백질 C1s, C1r 및 MASP-1을 능가하는 5,000-배 이상의 선택성을 나타낸다. 기능적 검정에서, OMS646은 나노몰 효능 (대략 3 nM의 50% 억제 [IC50]를 유도하는 농도)으로 인간 렉틴 경로를 억제하지만 고전적 경로에는 유의미한 효과를 나타내지 않는다. 마우스, 비-인간 영장류 및 인간에게 정맥 내 (IV) 또는 피하 (SC) 주사에 의해 투여된 OMS646은 생체 외 검정에서 렉틴 경로 활성화의 억제와 관련된 고혈장 농도를 초래하였다.
이 연구에서, OMS646 약물 물질을 100 mg/mL의 농도에서 제공하였는데, 그것을 IV 투여를 위해 추가로 희석하였다. OMS646 100 mg/mL 주사 용액의 적절하게 계산된 부피를 용량 조제물을 위해 주사기를 사용하여 바이알로부터 철회하였다. 투입 백을 제조 후 4시간 이내에 투여하였다.
연구는 하기 연구 설계 계획에 나타낸 것과 같이, 선별 (28일), 치료 (12주) 및 후속 (6주) 기간으로 구성된다.
연구 설계 계획
Figure pat00003
선별 기간 내에 및 제 1 OMS646 용량 전에, 서면 동의한 대상체들은 3개의 뇨 샘플 (매일 1회 수집함)을 2/3-연속일 기간의 각각에 제공하여 뇨의 알부민-대-크레아티닌 비율의 기준선 값을 수립하였다. 선별 기간 후에, 자격을 갖춘 대상체들에게 12주 (치료 기간) 동안 주 1회 OMS646 4 mg/kg을 IV로 주었다. 마지막 OMS646 후에는 6-주의 후속 기간을 두었다.
OMS646으로 치료하는 초기 4주 동안, 대상체들은 그들의 안정적인 연구-전 코르티코스테로이드 용량을 유지하였다. 12-주 치료 기간 중 초기 4-주가 끝났을 때, 대상체들은 코르티코스테로이드 테이퍼(taper)를 받았고 (즉 코르티코스테로이드 용량이 감소됨), 그것을 4주에 걸쳐 견딜 수 있다면, 그 결과의 코르티코스테로이드 용량을 다음 4주 동안 유지하였다. 표적은 매일 ≤ 6 mg 프레드니손 (또는 동등한 용량)의 테이퍼였다. 이 기간 동안, 테이퍼는 조사자에 의해 측정되는 바, 신장 기능의 악화를 보인 대상체들에서는 중단하였다. 대상체들은 전체 12주의 치료를 통해 코르티코스테로이드 테이퍼를 통해 OMS646으로 처리되었다. 그런 다음 환자들을 마지막 치료 후 추가로 6주 동안 후속조처하였다. 코르티코스테로이드의 테이퍼 및 OMS646 치료는 OMS646이 안정적인 신장 기능을 유지하기 위해 필요한 코르티코스테로이드의 용량의 감소를 허용하는지에 대한 평가를 허용하였다.
이 연구에서 핵심적인 효능 척도는 뇨의 알부민-대-크레아티닌 비율 (uACR) 및 기준선으로부터 12주까지의 24-시간 단백질 수준이다. 뇨의 단백질 또는 알부민의 측정은 일상적으로 신장 개선을 평가하기 위해 사용되고 뇨의 단백질의 지속적인 고수준은 신장 질환 진행과 상관이 있다. uACR을 단백뇨를 평가하기 위해 임상적으로 사용한다.
효능 분석
uACR에 대한 분석 값을 시점에 대해 얻어진 모든 값의 평균으로서 규정한다. 계획된 회수의 uACR은 각각의 예정된 시점에서 3이다. uACR의 기준선 값은 2회의 선별 방문시 분석 값의 평균으로서 규정한다.
결과:
도 40은 4 mg/kg MASP-2 억제 항체 (OMS646)로의 주마다의 치료를 포함한 12주의 연구 과정 동안 2명의 IgAN 환자에서의 uACR을 그래프로 도시한다. 도 40에서 나타난 것과 같이, 기준선으로부터의 변화는 변형된 분석에 의해 시점 "a" (p=0.003); 시점 "b" (p=0.007) 및 시점 "c" (p=0.033)에서 통계학적으로 중요하다. 하기 표 12는 OMS646으로 치료된 2명의 IgAN 환자들에 대한 24-시간 뇨-단백질 데이터를 제공한다.
OMS646-치료된 IgAN 환자들에서 24-시간 뇨 단백질 (mg/일)
샘플 시간 환자 #1
(mg/24시간)		 환자 #2
(mg/24시간)		 평균
기준선 3876 2437 3156
제 85일 1783 455 1119
p= 0.017
도 40 및 표 12에서 나타난 것과 같이, IgAN을 가진 환자들은 연구 과정에 걸쳐 신장 기능에서 임상적으로 및 통계학적으로 중요한 개선을 증명하였다. uACR (도 40 참조) 및 24-시간 뇨 단백질 농도 (표 12 참조) 둘 다에서 통계학적으로 유의미한 감소가 있었다. 도 40의 uACR 데이터에서 나타난 것과 같이, 평균 기준선 uACR은 1264 mg/g이었고 치료가 끝났을 때 525 mg/g에 도달하였으며 (p=0.011), 후속 기간이 끝났을 때 128 mg/g으로 감소하였다. 추가로 도 40에서 나타난 것과 같이, 치료 효과는 후속 기간을 통해 유지되었다. 24-시간 뇨단백 배설의 측정은 uACR을 따랐고, 평균 3156 mg/24시간에서 1119 mg/24시간으로 감소하였다 (p=0.017). 2명의 환자 전체에서 치료 효과는 매우 일관되었다. 두 환자 모두 대략 2000 mg/일의 감소를 경험하였고 둘 다 부분적인 차도를 이루었다 (24-시간 뇨단백 배설에서 50퍼센트 이상의 감소 및/또는 결과적으로 1000 mg/일보다 적은 단백질 배설로서 규정됨; 완전한 차도는 300 mg/일보다 적은 단백질 배설로서 규정됨). 2명의 IgAN 신증 환자에서 24-시간 단백뇨 감소의 크기는 신장 생존의 상당한 개선과 관련된다. 2명의 IgA 신증 환자들은 또한 그들의 스테로이드를 실질적으로 점차 감소시킬 수 있었는데, 각각 매일 용량을 ≤5 mg으로 (60 mg에서 0 gm; 30 mg에서 5 mg) 감소시켰다.
2명의 MN 환자들 또한 OMS646으로 치료한 중에 uACR의 감소를 증명하였다. 한 명의 MN 환자는 1003 mg/g으로부터 69 mg/g으로의 uACR의 감소를 보였고 이 저수준을 후속 기간 내내 유지하였다. 다른 MN 환자는 1323 mg/g으로부터 673 mg/g으로의 uACR의 감소를 보였고 치료 후에는 가변적인 과정이 있었다. 첫 번째 MN 환자는 24-시간 뇨 단백질 수준에서 현저한 감소를 보였고 (기준선에서 10,771 mg/24시간으로부터 제 85일에 325 mg/24시간), 부분적인, 거의 완전한 차도를 이룬 한편, 다른 환자는 본질적으로 변화하지 않은 채로 유지되었다 (기준선에서 4272 mg/24시간으로부터 제 85일에 4502 mg/24시간). 스테로이드를 두 명의 MN 환자에서 30 mg으로부터 15 mg으로 및 10 mg으로부터 5 mg으로 점차 감소시켰다.
요약하면, 신장 기능의 일관된 개선이 MASP-2 억제 항체 OMS646으로 치료된 IgAN 및 MN 대상체들에서 관찰되었다. IgAN을 가진 환자들에서 OMS646 치료의 효과는 왕성하고 일관되어서, 강력한 효능 신호를 시사한다. 이 효과는 MN 환자들에서의 결과에 의해 지지된다. 치료 중 uACR 변화의 시간 과정 및 크기는 IgAN 및 MN을 가진 모두 4명의 환자 사이에서 일관되었다. 유의할만한 안전성 관련 사항은 관찰되지 않았다. 이 연구의 환자들은 치료가 어려운 그룹을 나타내고 이 환자들에서의 치료 효과는 말기 신장 질환으로 급속이 진행될 위험이 있는 환자들을 포함하여, IgAN 및 MN 환자들, 예컨대 스테로이드-의존적 IgAN 및 MN을 앓고 있는 환자들 (즉 MASP-2 억제 항체로의 치료 전에 안정적인 코르티코스테로이드 용량으로 치료가 진행 중인 환자들)에서 MASP-2 억제 항체, 예컨대 OMS646을 사용한 효능을 예견해주는 것으로 여겨진다.
전술한 설명에 따르면, 한구체예에서, 발명은 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제 항체의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, IgAN 또는 MN을 앓고 있는 인간 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 방법은 IgAN 또는 MN을 앓고 있는 인간 대상체에게 신장 기능을 개선 (예컨대 단백뇨를 개선)하기에 충분한 MASP-2 억제 항체의 양을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 대상체는 스테로이드-의존적 IgAN을 앓고 있다. 한 구체예에서, 대상체는 스테로이드-의존적 MN을 앓고 있다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 스테로이드-의존적 IgAN 또는 스테로이드-의존적 MN을 앓고 있는 대상체에게 상기 대상체에서 신장 기능을 개선하고 및/또는 코르티코스테로이드 투약량을 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다.
한 구체예에서, 방법은 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제 항체의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하기 전에 스테로이드-의존적 IgAN을 앓고 있는 인간 대상체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
한 구체예에서, 방법은 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제 항체의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하기 전에 스테로이드-의존적 MN을 앓고 있는 인간 대상체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 구체예들 중 임의의 구체예에 따르면, MASP-2 억제 항체는 다음 특징 중 적어도 하나 이상을 나타낸다: 상기 항체는 10 nM 이하의 KD로 인간 MASP-2에 결합하고, 상기 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인에서 에피토프에 결합하며, 상기 항체는 1% 인간 혈청에서의 시험관 내 검정에서 10 nM 이하의 IC50으로 C3b 침착을 억제하고, 상기 항체는 90% 인간 혈청에서 30 nM 이하의 IC50으로 C3b 침착을 억제하며, 항체는 Fv, Fab, Fab', F(ab)2 및 F(ab')2로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편이고, 항체는 단일 사슬 분자이며, 상기 항체는 IgG2 분자이고, 상기 항체는 IgG1 분자이며, 상기 항체는 IgG4 분자이고, IgG4 분자는 S228P 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 MASP-2에 결합하고 렉틴 경로를 선택적으로 억제하며 실질적으로 고전적 경로를 억제하지는 않는다 (즉, 렉틴 경로를 억제하는 한편 고전적 보체 경로를 온전하게 남겨둔다).
한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 신장 기능과 관련된 적어도 하나 이상의 임상적 파라미터를 개선, 예컨대 단백뇨의 개선 (예컨대, uACR의 감소 및/또는 24-시간 뇨 단백질 농도의 감소, 예컨대 24-시간 뇨단백 배설에서 20퍼센트 이상의 감소, 또는 예컨대 24-시간 뇨단백 배설에서 30퍼센트 이상의 감소, 또는 예컨대 24-시간 뇨단백 배설에서 40퍼센트 이상의 감소, 또는 예컨대 24-시간 뇨단백 배설에서 50퍼센트 이상의 감소)하기에 효과적인 양으로 투여된다.
일부 구체예에서, 방법은 첫 번째 기간 동안 (예컨대 적어도 1일 내지 1주 또는 2주 또는 3주 또는 4주 또는 그 이상) 카테테르를 통하여 (예컨대 정맥내로) IgAN (예컨대 스테로이드-의존적 IgAN)을 앓고 있는 대상체에게 MASP-2 억제 항체를 투여하는 단계, 이어서 두 번째 기간 (예컨대 적어도 2주 이상의 만성 단계)에 대해 대상체에게 피하로 MASP-2 억제 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 첫 번째 기간 동안 (예컨대 적어도 1일 내지 1주 또는 2주 또는 3주 또는 4주 또는 그 이상) 카테테르를 통하여 (예컨대 정맥내로) MN (예컨대 스테로이드-의존적 MN)을 앓고 있는 대상체에게 MASP-2 억제 항체를 투여하는 단계, 이어서 두 번째 기간 (예컨대 적어도 2주 이상의 만성 단계)에 대해 대상체에게 피하로 MASP-2 억제 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 IgAN (예컨대 스테로이드-의존적 IgAN) 또는 MN (예컨대 스테로이드-의존적 MN)을 앓고 있는 대상체에게 MASP-2 억제 항체를 정맥내로, 근육내로, 또는 피하로 투여하는 단계를 포함한다. 치료는 만성적일 수 있고 날마다 내지는 월마다 투여될 수 있지만, 바람직하게는 2주마다, 또는 적어도 주 1회, 예컨대 주 2회 또는 3회 투여될 수 있다.
한 구체예에서, 방법은 SEQ ID NO:67에 제시된 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:69에 제시된 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, IgAN (예컨대 스테로이드-의존적 IgAN) 또는 MN (예컨대 스테로이드-의존적 MN)을 앓고 있는 대상체를 치료하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 (a) i) SEQ ID NO:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO:67의 95-107의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 b) i) SEQ ID NO:69의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO:69의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO:69의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) SEQ ID NO:67에 대하여 적어도 90% 동일성 (예컨대, SEQ ID NO:67에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:69에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, SEQ ID NO:69에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 이것의 변종을 포함하는 MASP-2 억제 항체를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 SEQ ID NO:67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:69에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 SEQ ID NO:67에 제시된 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:69에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체 OMS646에 의해 인식된 인간 MASP-2 상의 에피토프의 적어도 일부를 특이적으로 인식하는 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 IgAN (예컨대 스테로이드-의존적 IgAN) 또는 MN (예컨대 스테로이드-의존적 MN)을 앓고 있는, 또는 발생시킬 위험이 있는 대상체에게, SEQ ID NO:67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:69에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg (즉, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg 또는 10 mg/kg)의 투약량으로, 적어도 주 1회 (예컨대 적어도 주 2회 또는 적어도 주 3회) 적어도 3주, 또는 적어도 4주, 또는 적어도 5주, 또는 적어도 6주, 또는 적어도 7주, 또는 적어도 8주, 또는 적어도 9주, 또는 적어도 10주, 또는 적어도 11주, 또는 적어도 12주의 기간 동안 투여하는 단계를 포함한다.
다른 구체예들
본 명세서에서 언급된 모든 공개물, 특허 출원 및 특허들은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 기술된 방법 및 조성물의 다양한 변형 및 변화가 발명의 범주 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 업계의 숙련자들에게 드러날 것이다. 발명이 특정한 바람직한 구체예들과 관련하여 기술되었지만, 청구되는 발명이 그러한 특정 구체예들에 지나치게 제한되지 않아야 한다는 것이 인지되어야 한다.
예시적인 구체예들이 예시되고 기술된 한편, 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변화들이 그 안에서 이루어질 수 있는 것이 인지될 것이다.
독점적 특성 또는 특권이 청구되는 발명의 구체예들은 다음과 같은 청구범위로 규정된다.
SEQUENCE LISTING <110> Omeros Corporation University of Leicester Brunskill, Nigel Demopulos, Gregory A. Dudler, Tom Schwaeble, Hans-Wilhelm <120> Methods for Inhibiting Fibrosis in a Subject in Need Thereof <130> MP.1.0250.PCT <150> 62/275,025 <151> 2016-01-05 <150> 62/407,979 <151> 2016-10-13 <160> 85 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 725 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (27)..(584) <400> 1 ggccaggcca gctggacggg cacacc atg agg ctg ctg acc ctc ctg ggc ctt 53 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu 1 5 ctg tgt ggc tcg gtg gcc acc ccc ttg ggc ccg aag tgg cct gaa cct 101 Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro 10 15 20 25 gtg ttc ggg cgc ctg gca tcc ccc ggc ttt cca ggg gag tat gcc aat 149 Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn 30 35 40 gac cag gag cgg cgc tgg acc ctg act gca ccc ccc ggc tac cgc ctg 197 Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu 45 50 55 cgc ctc tac ttc acc cac ttc gac ctg gag ctc tcc cac ctc tgc gag 245 Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu 60 65 70 tac gac 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185 tag cctcccctgg agctccggcc tgcccagcag gtcagaagcc agagccagcc 634 tgctggcctc agctccgggt tgggctgaga tggctgtgcc ccaactccca ttcacccacc 694 atggacccaa taataaacct ggccccaccc c 725 <210> 2 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser Glu Gln Ser Leu 180 185 <210> 3 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala 1 5 10 15 Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp 20 25 30 Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His 35 40 45 Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu 50 55 60 Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser 85 90 95 Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe 100 105 110 Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln 115 120 125 Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His 130 135 140 Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg 145 150 155 160 Asn Lys Arg Thr Cys Ser Glu Gln Ser Leu 165 170 <210> 4 <211> 2460 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (22)..(2082) <400> 4 ggccagctgg acgggcacac c atg agg ctg ctg acc ctc ctg ggc ctt ctg 51 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu 1 5 10 tgt ggc tcg gtg gcc acc ccc ttg ggc ccg aag tgg cct gaa cct gtg 99 Cys Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val 15 20 25 ttc ggg cgc ctg gca tcc ccc ggc ttt cca ggg gag tat gcc aat gac 147 Phe Gly Arg Leu Ala Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp 30 35 40 cag gag cgg cgc tgg acc ctg act gca ccc ccc ggc tac cgc ctg cgc 195 Gln Glu Arg Arg Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg 45 50 55 ctc tac ttc acc cac ttc gac ctg gag ctc tcc cac ctc tgc gag tac 243 Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr 60 65 70 gac ttc gtc aag ctg agc tcg ggg gcc aag gtg ctg gcc acg ctg tgc 291 Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys 75 80 85 90 ggg cag gag agc aca gac acg gag cgg gcc cct ggc aag gac act ttc 339 Gly Gln Glu Ser Thr Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe 95 100 105 tac tcg ctg ggc tcc agc ctg gac att acc ttc cgc tcc gac tac tcc 387 Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser 110 115 120 aac gag aag ccg ttc acg ggg ttc gag gcc ttc tat gca gcc gag gac 435 Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp 125 130 135 att gac gag tgc cag gtg gcc ccg gga gag gcg ccc acc tgc gac cac 483 Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His 140 145 150 cac tgc cac aac cac ctg ggc ggt ttc tac tgc tcc tgc cgc gca ggc 531 His Cys His Asn His Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly 155 160 165 170 tac gtc ctg cac cgt aac aag cgc acc tgc tca gcc ctg tgc tcc ggc 579 Tyr Val Leu His Arg Asn Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly 175 180 185 cag gtc ttc acc cag agg tct ggg gag ctc agc agc cct gaa tac cca 627 Gln Val Phe Thr Gln Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro 190 195 200 cgg ccg tat ccc aaa ctc tcc agt tgc act tac agc atc agc ctg gag 675 Arg Pro Tyr Pro Lys Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu 205 210 215 gag ggg ttc agt gtc att ctg gac ttt gtg gag tcc ttc gat gtg gag 723 Glu Gly Phe Ser Val Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu 220 225 230 aca cac cct gaa acc ctg tgt ccc tac gac ttt ctc aag att caa aca 771 Thr His Pro Glu Thr Leu Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr 235 240 245 250 gac aga gaa gaa cat ggc cca ttc tgt ggg aag aca ttg ccc cac agg 819 Asp Arg Glu Glu His Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg 255 260 265 att gaa aca aaa agc aac acg gtg acc atc acc ttt gtc aca gat gaa 867 Ile Glu Thr Lys Ser Asn Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu 270 275 280 tca gga gac cac aca ggc tgg aag atc cac tac acg agc aca gcg cag 915 Ser Gly Asp His Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln 285 290 295 cct tgc cct tat ccg atg gcg cca cct aat ggc cac gtt tca cct gtg 963 Pro Cys Pro Tyr Pro Met Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val 300 305 310 caa gcc aaa tac atc ctg aaa gac agc ttc tcc atc ttt tgc gag act 1011 Gln Ala Lys Tyr Ile Leu Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr 315 320 325 330 ggc tat gag ctt ctg caa ggt cac ttg ccc ctg aaa tcc ttt act gca 1059 Gly Tyr Glu Leu Leu Gln Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala 335 340 345 gtt tgt cag aaa gat gga tct tgg gac cgg cca atg ccc gcg tgc agc 1107 Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser 350 355 360 att gtt gac tgt ggc cct cct gat gat cta ccc agt ggc cga gtg gag 1155 Ile Val Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu 365 370 375 tac atc aca ggt cct gga gtg acc acc tac aaa gct gtg att cag tac 1203 Tyr Ile Thr Gly Pro Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr 380 385 390 agc tgt gaa gag acc ttc tac aca atg aaa gtg aat gat ggt aaa tat 1251 Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr 395 400 405 410 gtg tgt gag gct gat gga ttc tgg acg agc tcc aaa gga gaa aaa tca 1299 Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser 415 420 425 ctc cca gtc tgt gag cct gtt tgt gga cta tca gcc cgc aca aca gga 1347 Leu Pro Val Cys Glu Pro Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly 430 435 440 ggg cgt ata tat gga ggg caa aag gca aaa cct ggt gat ttt cct tgg 1395 Gly Arg Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp 445 450 455 caa gtc ctg ata tta ggt gga acc aca gca gca ggt gca ctt tta tat 1443 Gln Val Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr 460 465 470 gac aac tgg gtc cta aca gct gct cat gcc gtc tat gag caa aaa cat 1491 Asp Asn Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His 475 480 485 490 gat gca tcc gcc ctg gac att cga atg ggc acc ctg aaa aga cta tca 1539 Asp Ala Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser 495 500 505 cct cat tat aca caa gcc tgg tct gaa gct gtt ttt ata cat gaa ggt 1587 Pro His Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly 510 515 520 tat act cat gat gct ggc ttt gac aat gac ata gca ctg att aaa ttg 1635 Tyr Thr His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu 525 530 535 aat aac aaa gtt gta atc aat agc aac atc acg cct att tgt ctg cca 1683 Asn Asn Lys Val Val Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro 540 545 550 aga aaa gaa gct gaa tcc ttt atg agg aca gat gac att gga act gca 1731 Arg Lys Glu Ala Glu Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala 555 560 565 570 tct gga tgg gga tta acc caa agg ggt ttt ctt gct aga aat cta atg 1779 Ser Gly Trp Gly Leu Thr Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met 575 580 585 tat gtc gac ata ccg att gtt gac cat caa aaa tgt act gct gca tat 1827 Tyr Val Asp Ile Pro Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr 590 595 600 gaa aag cca ccc tat cca agg gga agt gta act gct aac atg ctt tgt 1875 Glu Lys Pro Pro Tyr Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys 605 610 615 gct ggc tta gaa agt ggg ggc aag gac agc tgc aga ggt gac agc gga 1923 Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly 620 625 630 ggg gca ctg gtg ttt cta gat agt gaa aca gag agg tgg ttt gtg gga 1971 Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly 635 640 645 650 gga ata gtg tcc tgg ggt tcc atg aat tgt ggg gaa gca ggt cag tat 2019 Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr 655 660 665 gga gtc tac aca aaa gtt att aac tat att ccc tgg atc gag aac ata 2067 Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile 670 675 680 att agt gat ttt taa cttgcgtgtc tgcagtcaag gattcttcat ttttagaaat 2122 Ile Ser Asp Phe 685 gcctgtgaag accttggcag cgacgtggct cgagaagcat tcatcattac tgtggacatg 2182 gcagttgttg ctccacccaa aaaaacagac tccaggtgag gctgctgtca tttctccact 2242 tgccagttta attccagcct tacccattga ctcaagggga cataaaccac gagagtgaca 2302 gtcatctttg cccacccagt gtaatgtcac tgctcaaatt acatttcatt accttaaaaa 2362 gccagtctct tttcatactg gctgttggca tttctgtaaa ctgcctgtcc atgctctttg 2422 tttttaaact tgttcttatt gaaaaaaaaa aaaaaaaa 2460 <210> 5 <211> 686 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln Arg 180 185 190 Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Leu 195 200 205 Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val Ile 210 215 220 Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr Leu 225 230 235 240 Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly 245 250 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Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn Trp Val Leu Thr 465 470 475 480 Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala Ser Ala Leu Asp 485 490 495 Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala 500 505 510 Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Asp Ala Gly 515 520 525 Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn Lys Val Val Ile 530 535 540 Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Glu Ser 545 550 555 560 Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly Trp Gly Leu Thr 565 570 575 Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val Asp Ile Pro Ile 580 585 590 Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Pro Pro Tyr Pro 595 600 605 Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly 610 615 620 Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu 625 630 635 640 Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly 645 650 655 Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val 660 665 670 Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asp Phe 675 680 685 <210> 6 <211> 671 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala 1 5 10 15 Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp 20 25 30 Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His 35 40 45 Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu 50 55 60 Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser 85 90 95 Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe 100 105 110 Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln 115 120 125 Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His 130 135 140 Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg 145 150 155 160 Asn Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln 165 170 175 Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys 180 185 190 Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val 195 200 205 Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr 210 215 220 Leu Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His 225 230 235 240 Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser 245 250 255 Asn Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr 260 265 270 Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro 275 280 285 Met Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile 290 295 300 Leu Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu 305 310 315 320 Gln Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp 325 330 335 Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly 340 345 350 Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro 355 360 365 Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr 370 375 380 Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr Val Cys Glu 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aaggagtagc 540 cagggttcag ggacacctgg gagcaggggc caggcttggc caggagggag atcaggcctg 600 ggtcttgcct tcactccctg tgacacctga ccccacagct gagctcgggg gccaaggtgc 660 tggccacgct gtgcgggcag gagagcacag acacggagcg ggcccctggc aaggacactt 720 tctactcgct gggctccagc ctggacatta ccttccgctc cgactactcc aacgagaagc 780 cgttcacggg gttcgaggcc ttctatgcag ccgagggtga gccaagaggg gtcctgcaac 840 atctcagtct gcgcagctgg ctgtgggggt aactctgtct taggccaggc agccctgcct 900 tcagtttccc cacctttccc agggcagggg agaggcctct ggcctgacat catccacaat 960 gcaaagacca aaacagccgt gacctccatt cacatgggct gagtgccaac tctgagccag 1020 ggatctgagg acagcatcgc ctcaagtgac gcagggactg gccgggcgcg gcagctcacg 1080 cctgtaattc cagcactttg ggaggccgag gctggcttga taatttgagg gtcaggagtt 1140 caaggccagc cagggcaaca cggtgaaact ctatctccac taaaactaca aaaattagct 1200 gggcgtggtg gtgcgcacct ggaatcccag ctactaggga ggctgaggca ggagaattgc 1260 ttgaacctgc gaggtggagg ctgcagtgaa cagagattgc accactacac tccacctggg 1320 cgacagacta gactccgtct caaaaaacaa aaaacaaaaa ccacgcaggg ccgagggccc 1380 atttacaagc tgacaaagtg ggccctgcca gcgggagcgc tgcaggatgt ttgattttca 1440 gatcccagtc cctgcagaga ccaactgtgt gacctctggc aagtggctca atttctctgc 1500 tccttagaag ctgctgcaag ggttcagcgc tgtagccccg ccccctgggt ttgattgact 1560 cccctcatta gctgggtgac ctcggccgga cactgaaact cccactggtt taacagaggt 1620 gatgtttgca tctttctccc agcgctgctg ggagcttgca gcgaccctag gcctgtaagg 1680 tgattggccc ggcaccagtc ccgcacccta gacaggacct aggcctcctc tgaggtccac 1740 tctgaggtca tggatctcct gggaggagtc caggctggat cccgcctctt tccctcctga 1800 cggcctgcct ggccctgcct ctcccccaga cattgacgag tgccaggtgg ccccgggaga 1860 ggcgcccacc tgcgaccacc actgccacaa ccacctgggc ggtttctact gctcctgccg 1920 cgcaggctac gtcctgcacc gtaacaagcg cacctgctca ggtgagggag gctgcctggg 1980 ccccaacgca ccctctcctg ggatacccgg ggctcctcag ggccattgct gctctgccca 2040 ggggtgcgga gggcctgggc ctggacactg ggtgcttcta ggccctgctg cctccagctc 2100 cccttctcag ccctgcttcc cctctcagca gccaggctca tcagtgccac cctgccctag 2160 cactgagact aattctaaca tcccactgtg tacctggttc cacctgggct ctgggaaccc 2220 ctcatgtagc cacgggagag tcggggtatc taccctcgtt ccttggactg ggttcctgtt 2280 ccctgcactg ggggacgggc cagtgctctg gggcgtgggc agccccaccc tgtggcgctg 2340 accctgctcc cccgactcgg tttctcctct cggggtctct ccttgcctct ctgatctctc 2400 ttccagagca gagcctctag cctcccctgg agctccggct gcccagcagg tcagaagcca 2460 gagccaggct gctggcctca gctccgggtt gggctgagat gctgtgcccc aactcccatt 2520 cacccaccat ggacccaata ataaacctgg ccccacccca cctgctgccg cgtgtctctg 2580 gggtgggagg gtcgggaggc ggtggggcgc gctcctctct gcctaccctc ctcacagcct 2640 catgaacccc aggtctgtgg gagcctcctc catggggcca cacggtcctt ggcctcaccc 2700 cctgttttga agatggggca ctgaggccgg agaggggtaa ggcctcgctc gagtccaggt 2760 ccccagaggc tgagcccaga gtaatcttga accaccccca ttcagggtct ggcctggagg 2820 agcctgaccc acagaggaga caccctggga gatattcatt gaggggtaat ctggtccccc 2880 gcaaatccag gggtgattcc cactgcccca taggcacagc cacgtggaag aaggcaggca 2940 atgttggggc tcctcacttc ctagaggcct cacaactcaa atgcccccca ctgcagctgg 3000 gggtggggtg gtggtatggg atggggacca agccttcctt gaaggataga gcccagccca 3060 acaccccgcc ccgtggcagc agcatcacgt gttccagcga ggaaggagag caccagactc 3120 agtcatgatc actgttgcct tgaacttcca agaacagccc cagggcaagg gtcaaaacag 3180 gggaaagggg gtgatgagag atccttcttc cggatgttcc tccaggaacc agggggctgg 3240 ctggtcttgg ctgggttcgg gtaggagacc catgatgaat aaacttggga atcactgggg 3300 tggctgtaag ggaatttagg ggagctccga aggggccctt aggctcgagg agatgctcct 3360 ctcttttccc gaattcccag ggacccagga gagtgtccct tcttcctctt cctgtgtgtc 3420 catccacccc cgccccccgc cctggcagag ctggtggaac tcagtgctct agcccctacc 3480 ctggggttgc gactctggct caggacacca ccacgctccc tgggggtgtg agtgagggcc 3540 tgtgcgctcc atcccgagtg ctgcctgttt cagctaaagc ctcaaagcaa gagaaacccc 3600 ctctctaagc ggcccctcag ccatcgggtg ggtcgtttgg tttctgggta ggcctcaggg 3660 gctggccacc tgcagggccc agcccaaccc agggatgcag atgtcccagc cacatccctg 3720 tcccagtttc ctgctcccca aggcatccac cctgctgttg gtgcgagggc tgatagaggg 3780 cacgccaagt cactcccctg cccttccctc cttccagccc tgtgctccgg ccaggtcttc 3840 acccagaggt ctggggagct cagcagccct gaatacccac ggccgtatcc caaactctcc 3900 agttgcactt acagcatcag cctggaggag gggttcagtg tcattctgga ctttgtggag 3960 tccttcgatg tggagacaca ccctgaaacc ctgtgtccct acgactttct caaggtctgg 4020 ctcctgggcc cctcatcttg tcccagatcc tcccccttca gcccagctgc accccctact 4080 tcctgcagca tggcccccac cacgttcccg tcaccctcgg tgaccccacc tcttcaggtg 4140 ctctatggag gtcaaggctg gggcttcgag tacaagtgtg ggaggcagag tggggagggg 4200 caccccaatc catggcctgg gttggcctca ttggctgtcc ctgaaatgct gaggaggtgg 4260 gttacttccc tccgcccagg ccagacccag gcagctgctc cccagctttc atgagcttct 4320 ttctcagatt caaacagaca gagaagaaca tggcccattc tgtgggaaga cattgcccca 4380 caggattgaa acaaaaagca acacggtgac catcaccttt gtcacagatg aatcaggaga 4440 ccacacaggc tggaagatcc actacacgag cacagtgagc aagtgggctc agatccttgg 4500 tggaagcgca gagctgcctc tctctggagt gcaaggagct gtagagtgta gggctcttct 4560 gggcaggact aggaagggac accaggttta gtggtgctga ggtctgaggc agcagcttct 4620 aaggggaagc acccgtgccc tcctcagcag cacccagcat cttcaccact cattcttcaa 4680 ccacccattc acccatcact catcttttac ccacccaccc tttgccactc atccttctgt 4740 ccctcatcct tccaaccatt catcaatcac ccacccatcc atcctttgcc acacaaccat 4800 ccacccattc ttctacctac ccatcctatc catccatcct tctatcagca tccttctacc 4860 acccatcctt cgttcggtca tccatcatca tccatccatc 4900 <210> 8 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala 130 135 <210> 9 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser 180 <210> 10 <211> 293 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln Arg 180 185 190 Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Leu 195 200 205 Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val Ile 210 215 220 Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr Leu 225 230 235 240 Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly 245 250 255 Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser Asn 260 265 270 Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr Gly 275 280 285 Trp Lys Ile His Tyr 290 <210> 11 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys 1 5 10 15 Asp His His Cys His Asn His Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg 20 25 30 Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn Lys 35 40 <210> 12 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn 20 25 30 Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala 35 40 45 Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His 50 55 60 Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr 65 70 75 80 His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn 85 90 95 Lys Val Val Ile Asn Ser Asn 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43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp 1 5 10 15 Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln 35 40 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn 1 5 <210> 17 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr 1 5 10 15 Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe 20 25 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly 1 5 <210> 19 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys 1 5 10 15 Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val 20 25 <210> 20 <211> 960 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (51)..(797) <400> 20 attaactgag attaaccttc cctgagtttt ctcacaccaa ggtgaggacc atg tcc 56 Met Ser 1 ctg ttt cca tca ctc cct ctc ctt ctc ctg agt atg gtg gca gcg tct 104 Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala Ala Ser 5 10 15 tac tca gaa act gtg acc tgt gag gat gcc caa aag acc tgc cct gca 152 Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys Pro Ala 20 25 30 gtg att gcc tgt agc tct cca ggc atc aac ggc ttc cca ggc aaa gat 200 Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp 35 40 45 50 ggg cgt gat ggc acc aag gga gaa aag ggg gaa cca ggc caa ggg ctc 248 Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu 55 60 65 aga ggc tta cag ggc ccc cct gga aag ttg ggg cct cca gga aat cca 296 Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro 70 75 80 ggg cct tct ggg tca cca gga cca aag ggc caa aaa gga gac cct gga 344 Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly 85 90 95 aaa agt ccg gat ggt gat agt agc ctg gct gcc tca gaa aga aaa gct 392 Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala 100 105 110 ctg caa aca gaa atg gca cgt atc aaa aag tgg ctc acc ttc tct ctg 440 Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu 115 120 125 130 ggc aaa caa gtt ggg aac aag ttc ttc ctg acc aat ggt gaa ata atg 488 Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met 135 140 145 acc ttt gaa aaa gtg aag gcc ttg tgt gtc aag ttc cag gcc tct gtg 536 Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val 150 155 160 gcc acc ccc agg aat gct gca gag aat gga gcc att cag aat ctc atc 584 Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile 165 170 175 aag gag gaa gcc ttc ctg ggc atc act gat gag aag aca gaa ggg cag 632 Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln 180 185 190 ttt gtg gat ctg aca gga aat aga ctg acc tac aca aac tgg aac gag 680 Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu 195 200 205 210 ggt gaa ccc aac aat gct ggt tct gat gaa gat tgt gta ttg cta ctg 728 Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu 215 220 225 aaa aat ggc cag tgg aat gac gtc ccc tgc tcc acc tcc cat ctg gcc 776 Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala 230 235 240 gtc tgt gag ttc cct atc tga agggtcatat cactcaggcc ctccttgtct 827 Val Cys Glu Phe Pro Ile 245 ttttactgca acccacaggc ccacagtatg cttgaaaaga taaattatat caatttcctc 887 atatccagta ttgttccttt tgtgggcaat cactaaaaat gatcactaac agcaccaaca 947 aagcaataat agt 960 <210> 21 <211> 248 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Ser Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala 1 5 10 15 Ala Ser Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys 20 25 30 Pro Ala Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly 35 40 45 Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly 65 70 75 80 Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp 85 90 95 Pro Gly Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg 100 105 110 Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe 115 120 125 Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu 130 135 140 Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala 145 150 155 160 Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn 165 170 175 Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu 180 185 190 Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp 195 200 205 Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu 210 215 220 Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His 225 230 235 240 Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile 245 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Wherein X at position 1 represents hydroxyproline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Wherein X at position 4 represents hydrophobic residue <400> 22 Xaa Gly Lys Xaa Gly Pro 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Wherein X represents hydroxyproline <400> 23 Xaa Gly Lys Leu Gly 1 5 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(15) <223> Wherein X at positions 9 and 15 represents hydroxyproline <400> 24 Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly Lys Leu Gly Pro Xaa Gly 1 5 10 15 <210> 25 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(27) <223> Wherein X at positions 3, 6, 15, 21, 24, 27 represents hydroxyproline <400> 25 Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly 1 5 10 15 Lys Leu Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa 20 25 <210> 26 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 26 Gly Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly 1 5 10 15 Gln Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly Lys Leu Gly Pro Xaa 20 25 30 Gly Asn Xaa Gly Pro Ser Gly Ser Xaa Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly 35 40 45 Asp Xaa Gly Lys Ser 50 <210> 27 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(33) <223> Wherein X at positions 3, 6, 12, 18, 21, 30, 33 represents hydroxyproline <400> 27 Gly Ala Xaa Gly Ser Xaa Gly Glu Lys Gly Ala Xaa Gly Pro Gln Gly 1 5 10 15 Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Lys Met Gly Pro Lys Gly Glu Xaa Gly Asp 20 25 30 Xaa <210> 28 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(45) <223> Wherein X at positions 3, 6, 9, 27, 30, 36, 42, 45 represents hydroxyproline <400> 28 Gly Cys Xaa Gly Leu Xaa Gly Ala Xaa Gly Asp Lys Gly Glu Ala Gly 1 5 10 15 Thr Asn Gly Lys Arg Gly Glu Arg Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Lys 20 25 30 Ala Gly Pro Xaa Gly Pro Asn Gly Ala Xaa Gly Glu Xaa 35 40 45 <210> 29 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile Leu Pro Asn Arg Val Thr Ile Lys Ala 1 5 10 15 Asn Arg Pro Phe Leu Val Phe Ile 20 <210> 30 <211> 559 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 atgaggctgc tgaccctcct gggccttctg tgtggctcgg tggccacccc cttgggcccg 60 aagtggcctg aacctgtgtt cgggcgcctg gcatcccccg gctttccagg ggagtatgcc 120 aatgaccagg agcggcgctg gaccctgact gcaccccccg gctaccgcct gcgcctctac 180 ttcacccact tcgacctgga gctctcccac ctctgcgagt acgacttcgt caagctgagc 240 tcgggggcca aggtgctggc cacgctgtgc gggcaggaga gcacagacac ggagcgggcc 300 cctggcaagg acactttcta ctcgctgggc tccagcctgg acattacctt ccgctccgac 360 tactccaacg agaagccgtt cacggggttc gaggccttct atgcagccga ggacattgac 420 gagtgccagg tggccccggg agaggcgccc acctgcgacc accactgcca caaccacctg 480 ggcggtttct actgctcctg ccgcgcaggc tacgtcctgc accgtaacaa gcgcacctgc 540 tcagccctgt gctccggcc 559 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 cgggcacacc atgaggctgc tgaccctcct gggc 34 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 gacattacct tccgctccga ctccaacgag aag 33 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 agcagccctg aatacccacg gccgtatccc aaa 33 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 cgggatccat gaggctgctg accctc 26 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 ggaattccta ggctgcata 19 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 ggaattccta cagggcgct 19 <210> 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tac ttc acc cac ttt gac ctg gaa ctc tct tac cgc 245 Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp Leu Glu Leu Ser Tyr Arg 60 65 70 tgc gag tat gac ttt gtc aag ttg agc tca ggg acc aag gtg ctg gcc 293 Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala 75 80 85 aca ctg tgt ggg cag gag agt aca gac act gag cag gca cct ggc aat 341 Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp Thr Glu Gln Ala Pro Gly Asn 90 95 100 gac acc ttc tac tca ctg ggt ccc agc cta aag gtc acc ttc cac tcc 389 Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser 105 110 115 gac tac tcc aat gag aag ccg ttc aca ggg ttt gag gcc ttc tat gca 437 Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala 120 125 130 135 gcg gag gat gtg gat gaa tgc aga gtg tct ctg gga gac tca gtc cct 485 Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Val Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro 140 145 150 tgt gac cat tat tgc cac aac tac ttg ggc ggc tac tat tgc tcc tgc 533 Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys 155 160 165 aga gcg ggc 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Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys 65 70 75 ttg acc tca ggg acc aag gtg cta gcc acg ctg tgt ggg cag gag agt 291 Leu Thr Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser 80 85 90 aca gat act gag cgg gca cct ggc aat gac acc ttc tac tca ctg ggt 339 Thr Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly 95 100 105 110 ccc agc cta aag gtc acc ttc cac tcc gac tac tcc aat gag aag cca 387 Pro Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro 115 120 125 ttc aca gga ttt gag gcc ttc tat gca gcg gag gat gtg gat gaa tgc 435 Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys 130 135 140 aga aca tcc ctg gga gac tca gtc cct tgt gac cat tat tgc cac aac 483 Arg Thr Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn 145 150 155 tac ctg ggc ggc tac tac tgc tcc tgc cga gtg ggc tac att ctg cac 531 Tyr Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly Tyr Ile Leu His 160 165 170 cag aac aag cat acc tgc tca gcc ctt tgt tca ggc cag gtg ttc act 579 Gln Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr 175 180 185 190 ggg agg tct ggc ttt ctc agt agc cct gag tac cca cag cca tac ccc 627 Gly Arg Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro 195 200 205 aaa ctc tcc agc tgc gcc tac aac atc cgc ctg gag gaa ggc ttc agt 675 Lys Leu Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg Leu Glu Glu Gly Phe Ser 210 215 220 atc acc ctg gac ttc gtg gag tcc ttt gat gtg gag atg cac cct gaa 723 Ile Thr Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Met His Pro Glu 225 230 235 gcc cag tgc ccc tac gac tcc ctc aag att caa aca gac aag agg gaa 771 Ala Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Arg Glu 240 245 250 tac ggc ccg ttt tgt ggg aag acg ctg ccc ccc agg att gaa act gac 819 Tyr Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp 255 260 265 270 agc aac aag gtg acc att acc ttt acc acc gac gag tca ggg aac cac 867 Ser Asn Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp Glu Ser Gly Asn His 275 280 285 aca ggc tgg aag ata cac tac aca agc aca gca cag ccc tgc cct gat 915 Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp 290 295 300 cca acg gcg cca cct aat ggt cac att tca cct gtg caa gcc acg tat 963 Pro Thr Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr 305 310 315 gtc ctg aag gac agc ttt tct gtc ttc tgc aag act ggc ttc gag ctt 1011 Val Leu Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu 320 325 330 ctg caa ggt tct gtc ccc ctg aag tca ttc act gct gtc tgt cag aaa 1059 Leu Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys 335 340 345 350 gat gga tct tgg gac cgg ccg ata cca gag tgc agc att att gac tgt 1107 Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys 355 360 365 ggc cct ccc gat gac cta ccc aat ggc cac gtg gac tat atc aca ggc 1155 Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly 370 375 380 cct gaa gtg acc acc tac aaa gct gtg att cag tac agc tgt gaa gag 1203 Pro Glu Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu 385 390 395 act ttc tac aca atg agc agc aat ggt aaa tat gtg tgt gag gct gat 1251 Thr Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp 400 405 410 gga ttc tgg acg agc tcc aaa gga gaa aaa tcc ctc ccg gtt tgc aag 1299 Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys 415 420 425 430 cct gtc tgt gga ctg tcc aca cac act tca gga ggc cgt ata att gga 1347 Pro Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly 435 440 445 gga cag cct gca aag cct ggt gac ttt cct tgg caa gtc ttg tta ctg 1395 Gly Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu 450 455 460 ggt gaa act aca gca gca ggt gct ctt ata cat gac gac tgg gtc cta 1443 Gly Glu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu 465 470 475 aca gcg gct cat gct gta tat ggg aaa aca gag gcg atg tcc tcc ctg 1491 Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu 480 485 490 gac atc cgc atg ggc atc ctc aaa agg ctc tcc ctc att tac act caa 1539 Asp Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln 495 500 505 510 gcc tgg cca gag gct gtc ttt atc cat gaa ggc tac act cac gga gct 1587 Ala Trp Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala 515 520 525 ggt ttt gac aat gat ata gca ctg att aaa ctc aag aac aaa gtc aca 1635 Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr 530 535 540 atc aac aga aac atc atg ccg att tgt cta cca aga aaa gaa gct gca 1683 Ile Asn Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala 545 550 555 tcc tta atg aaa aca gac ttc gtt gga act gtg gct ggc tgg ggg tta 1731 Ser Leu Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu 560 565 570 acc cag aag ggg ttt ctt gct aga aac cta atg ttt gtg gac ata cca 1779 Thr Gln Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro 575 580 585 590 att gtt gac cac caa aaa tgt gct act gcg tat aca aag cag ccc tac 1827 Ile Val Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr 595 600 605 cca gga gca aaa gtg act gtt aac atg ctc tgt gct ggc cta gac cgc 1875 Pro Gly Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg 610 615 620 ggt ggc aag gac agc tgc aga ggt gac agc gga ggg gca tta gtg ttt 1923 Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe 625 630 635 cta gac aat gaa aca cag aga tgg ttt gtg gga gga ata gtt tcc tgg 1971 Leu Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp 640 645 650 ggt tct att aac tgt ggg ggg tca gaa cag tat ggg gtc tac acg aaa 2019 Gly Ser Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys 655 660 665 670 gtc acg aac tat att ccc tgg att gag aac ata ata aat aat ttc taa 2067 Val Thr Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe 675 680 685 tttgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2091 <210> 54 <211> 685 <212> PRT <213> Rat <400> 54 Met Arg Leu Leu Ile Val Leu Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val Ser 20 25 30 Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly Asn His Gln Asp Arg Ser Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Phe Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe 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1380 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg 1440 caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 1500 cagaagagcc tctccctgtc tctcgggaaa tga 1533 <210> 83 <211> 1533 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 83 atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggcccag 60 gtcaccttga aggagtctgg tcctgtgctg gtgaaaccca cagagaccct cacgctgacc 120 tgcaccgtct ctgggttctc actcagcagg ggtaaaatgg gtgtgagctg gatccgtcag 180 cccccaggga aggccctgga gtggcttgca cacatttttt cgagtgacga aaaatcctac 240 aggacatcgc tgaagagcag gctcaccatc tccaaggaca cctccaaaaa ccaggtggtc 300 cttacaatga ccaacatgga ccctgtggac acagccacgt attactgtgc acggatacga 360 cgtggaggaa ttgactactg gggccaggga accctggtca ctgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac 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ggttcagatg ggaaatcggc ggtctgcaca 1500 aagctctggt gtaaccaggg tagtggtgct tga 1533 <210> 84 <211> 834 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 84 atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggccttg 60 gaagtgacgt gtgagcccgg aacgacattc aaagacaagt gcaatacttg tcggtgcggt 120 tcagatggga aatcggcggt ctgcacaaag ctctggtgta accagggcac cggtggaggg 180 tcgggatcca gctcacagcc agtgctgact cagcccccct cactgtccgt gtccccagga 240 cagacagcca gcatcacctg ctctggagag aaattggggg ataaatatgc ttactggtat 300 cagcagaagc caggccagtc ccctgtgttg gtcatgtatc aagataaaca gcggccctca 360 gggatccctg agcgattctc tggctccaac tctgggaaca cagccactct gaccatcagc 420 gggacccagg ctatggatga ggctgactat tactgtcagg cgtgggacag cagcactgcg 480 gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggccagc ctaaggcggc gccctcggtc 540 accctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 600 ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 660 aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 720 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 780 acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gtggccccta cagaatgttc atag 834 <210> 85 <211> 834 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 85 atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggcccag 60 ccagtgctga ctcagccccc ctcactgtcc gtgtccccag gacagacagc cagcatcacc 120 tgctctggag agaaattggg ggataaatat gcttactggt atcagcagaa gccaggccag 180 tcccctgtgt tggtcatgta tcaagataaa cagcggccct cagggatccc tgagcgattc 240 tctggctcca actctgggaa cacagccact ctgaccatca gcgggaccca ggctatggat 300 gaggctgact attactgtca ggcgtgggac agcagcactg cggtattcgg cggagggacc 360 aagctgaccg tcctaggcca gcctaaggcg gcgccctcgg tcaccctgtt cccgccctcc 420 tctgaggagc ttcaagccaa caaggccaca ctggtgtgtc tcataagtga cttctacccg 480 ggagccgtga cagtggcctg gaaggcagat agcagccccg tcaaggcggg agtggagacc 540 accacaccct ccaaacaaag caacaacaag tacgcggcca gcagctatct gagcctgacg 600 cctgagcagt ggaagtccca cagaagctac agctgccagg tcacgcatga agggagcacc 660 gtggagaaga cagtggcccc tacagaatgt tcagccgctg gtggtagtgg tttggaagtg 720 acgtgtgagc ccggaacgac attcaaagac aagtgcaata cttgtcggtg cggttcagat 780 gggaaatcgg cggtctgcac aaagctctgg tgtaaccagg gtagtggtgc ttag 834

Claims (9)

  1. 겸세포 질환, 신장의 독성 병변, 아밀로이드증, 최소 변화 질환, 지질성 신증, 양성 기립성 단백뇨, IgM 신증, 유육종증, 알포트 증후군, 파브리병, 아미노산뇨증, 판코니 증후군, 고혈압성 신장 경화증, 간질성 신염, 다발성 골수종, 마이오글로빈뇨증, 에볼라 출혈열, 손발톱 슬개골 증후군, 가족성 지중해열, HELLP 증후군, 글리코겐 저장 질환 타입 1, 신장으로 확산되는 뇨도 감염, 및 쇠그렌 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백뇨와 관련된 질환 또는 상태를 앓고 있는 대상체에서 신장 손상을 예방 또는 감소시키기 위한 의약으로서, 의약은 상기 대상체에서 단백뇨를 감소 또는 예방하기에 효과적인 양으로 MASP-2 억제 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는, 의약.
  2. 제1항에 있어서, 의약은 치료전 기준선 24-시간 뇨단백질 배설과 비교하여 24-시간 뇨단백질 배설에서 적어도 20%의 감소를 이루기에 효과적인 양 및 시간 동안 투여되도록 조정된 것을 특징으로 하는 의약.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단백뇨와 관련된 질환 또는 상태는 겸세포 질환인 것을 특징으로 하는 의약.
  4. 제1항에 있어서, 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 이펙터 기능이 감소된 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 및 인간 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 의약.
  5. 제1항에 있어서, MASP-2 억제 항체는 고전적 경로를 실질적으로 억제하지 않는 것을 특징으로 하는 의약.
  6. 제1항에 있어서, MASP-2 억제 항체는 30 nM 이하의 IC50으로 90%의 인간 혈청에서 C3b 침착을 억제하는 것을 특징으로 하는 의약.
  7. 제1항에 있어서, 의약은 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 신장 기능을 개선하기에 효과적인 양으로 포함하는 것을 특징으로 하는 의약.
  8. 제1항에 있어서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:67에 제시된 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:69에 제시된 나타낸 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 의약.
  9. 제1항에 있어서, 의약은 피하로, 복강내로, 근육내로, 동맥내로, 정맥내로, 또는 흡입제로 투여되기 위해 조정된 것을 특징으로 하는 의약.
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101141544B1 (ko) 2009-03-13 2012-05-03 한국과학기술원 에스아이알엔에이 다중 접합체 및 이의 제조방법
KR20180039621A (ko) 2015-06-15 2018-04-18 엠펙 엘에이, 엘엘씨 정의된 다중 접합체 올리고뉴클레오티드
EP3400012A4 (en) 2016-01-05 2019-12-11 University Of Leicester PROCESS FOR INHIBITING FIBROSIS IN A NEEDED SUBJECT
JOP20170170B1 (ar) 2016-08-31 2022-09-15 Omeros Corp صيغ لجسم مضاد تثبيطية لـ masp-2 بتركيز عالي ولزوجة منخفضة وأطقم، وطرق
JOP20190068A1 (ar) * 2016-10-13 2019-04-01 Omeros Corp طرق لتقليل البول البروتيني في خاضع بشري يعاني من الاعتلال الكلوي a الناتج عن الجلوبيولين المناعي
KR102200428B1 (ko) 2018-05-16 2021-01-08 주식회사 지놈앤컴퍼니 Lrit2 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2020186256A1 (en) * 2019-03-14 2020-09-17 Aravive Inc Methods of treating immunoglobulin a nephropathy (igan) using axl decoy receptors
WO2021026476A1 (en) * 2019-08-08 2021-02-11 Mpeg La, L.L.C. Complement targeting with multimeric oligonucleotides
KR20220104201A (ko) * 2019-11-26 2022-07-26 오메로스 코포레이션 조혈 줄기 세포 이식과 관련된 특발성 폐렴 증후군 (ips) 및/또는 모세혈관 누출 증후군 (cls) 및/또는 생착 증후군 (es) 및/또는 체액 과부하 (fo)를 치료 및/또는 예방하는 방법
WO2021113686A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Omeros Corporation Masp-2 inhibitors and methods of use
US12030853B2 (en) 2019-12-04 2024-07-09 Omeros Corporation MASP-2 inhibitors and methods of use
CA3159167A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Neil S. Cutshall Masp-2 inhibitors and methods of use
JP2023504543A (ja) 2019-12-04 2023-02-03 オメロス コーポレーション Ｍａｓｐ－２阻害剤および使用方法
MX2022007471A (es) 2019-12-17 2022-08-17 Chinook Therapeutics Inc Metodos de tratamiento de la nefropatia por iga con atrasentan.
CN111419860A (zh) * 2020-03-19 2020-07-17 长春市儿童医院 一种肾小球分叶状肾病造模方法
WO2022081716A1 (en) * 2020-10-13 2022-04-21 Accubit LLC - Biotechnology Methods of treating iga nephropathy with thiol-containing molecules
IL313331A (en) 2021-12-10 2024-08-01 Omeros Corp Therapeutic antibodies that bind to the SERINE PROTEASE domain of MASP-2 and uses thereof
CN116615544A (zh) * 2021-12-10 2023-08-18 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 特异性识别masp2的抗体及其应用
WO2023225163A1 (en) * 2022-05-19 2023-11-23 Chinook Therapeutics, Inc. Methods of treating focal segmental glomerulosclerosis with atrasentan
US20240228499A1 (en) 2022-11-30 2024-07-11 Omeros Corporation Masp-2 inhibitors and methods of use

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
ATE115999T1 (de) 1987-12-15 1995-01-15 Gene Shears Pty Ltd Ribozyme.
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8822492D0 (en) 1988-09-24 1988-10-26 Considine J Apparatus for removing tumours from hollow organs of body
US5211657A (en) 1988-11-07 1993-05-18 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Laminin a chain deduced amino acid sequence, expression vectors and active synthetic peptides
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5549910A (en) 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
EP0438803B1 (en) 1990-01-26 1997-03-12 Immunomedics, Inc. Vaccines against cancer and infectious diseases
JP3218637B2 (ja) 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
US5789573A (en) 1990-08-14 1998-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ICAM-1, E-selectin, and CMV IE1/IE2
JP2958076B2 (ja) 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
IL108367A0 (en) 1993-01-27 1994-04-12 Hektoen Inst For Medical Resea Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5741516A (en) 1994-06-20 1998-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5738868A (en) 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
US5739119A (en) 1996-11-15 1998-04-14 Galli; Rachel L. Antisense oligonucleotides specific for the muscarinic type 2 acetylcholine receptor MRNA
US6649592B1 (en) 2000-01-14 2003-11-18 Science & Technology Corporation @ Unm Peptide inhibitors of LFA-1/ICAM-1 interaction
SG98393A1 (en) 2000-05-19 2003-09-19 Inst Materials Research & Eng Injectable drug delivery systems with cyclodextrin-polymer based hydrogels
ES2601143T3 (es) 2002-07-19 2017-02-14 Omeros Corporation Copolímeros tribloque biodegradables, métodos de síntesis de los mismos, e hidrogeles y biomateriales preparados a partir de los mismos
ES2629344T3 (es) 2003-05-12 2017-08-08 Helion Biotech Aps Anticuerpos contra la MASP-2
US7919094B2 (en) 2004-06-10 2011-04-05 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
US20140056873A1 (en) * 2004-06-10 2014-02-27 University Of Leicester Methods for Treating Conditions Associated with MASP-2 Dependent Complement Activation
US8840893B2 (en) 2004-06-10 2014-09-23 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
US7626730B2 (en) * 2006-03-31 2009-12-01 Eastman Kodak Company Method of making a multilevel halftone screen
BR112012008970A2 (pt) 2009-10-16 2019-12-10 Omeros Corp uso de uma composição, e, composição
WO2012100262A1 (en) 2011-01-21 2012-07-26 Fibrogen, Inc. Therapeutic method using anti - ctgf antibody
CN103781492A (zh) 2011-04-08 2014-05-07 莱斯特大学 用于治疗与masp-2依赖性补体活化相关的状况的方法
US9644035B2 (en) * 2011-04-08 2017-05-09 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
CN107011443B (zh) * 2011-05-04 2021-04-30 奥默罗斯公司 用于抑制masp-2依赖的补体活化的组合物
EP4119577A3 (en) * 2012-06-18 2023-11-08 Omeros Corporation Compositions and methods of inhibiting masp-1 and/or masp-2 and/or masp-3 for the treatment of various diseases and disorders
JP2016514456A (ja) * 2013-03-15 2016-05-23 オメロス コーポレーション 生物活性ペプチド担持抗体を生成する方法およびそれを含む組成物
ES2829913T3 (es) * 2013-10-17 2021-06-02 Omeros Corp Procedimientos de tratamiento de afecciones asociadas con la activación del complemento dependiente de MASP-2
EP3400012A4 (en) 2016-01-05 2019-12-11 University Of Leicester PROCESS FOR INHIBITING FIBROSIS IN A NEEDED SUBJECT
JOP20170170B1 (ar) * 2016-08-31 2022-09-15 Omeros Corp صيغ لجسم مضاد تثبيطية لـ masp-2 بتركيز عالي ولزوجة منخفضة وأطقم، وطرق
US20180105604A1 (en) 2016-10-13 2018-04-19 University Of Leicester Methods for reducing proteinuria in a human subject suffering from immunoglobulin a nephropathy
KR101930345B1 (ko) * 2016-12-20 2019-03-11 김은진 지혈제 조성물

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