ES2829913T3 - Procedimientos de tratamiento de afecciones asociadas con la activación del complemento dependiente de MASP-2 - Google Patents

Procedimientos de tratamiento de afecciones asociadas con la activación del complemento dependiente de MASP-2 Download PDF

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Abstract

Un agente inhibidor de MASP-2 para su uso en el tratamiento o la prevención de microangiopatía trombótica (MAT) secundaria a un trasplante, en el que el trasplante es un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas, en el que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del agente inhibidor de MASP-2 en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar una MAT secundaria a un trasplante en el que el agente inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo monoclonal anti-MASP-2, o fragmento del mismo que se une específicamente a una porción de SEQ ID NO: 6 e inhibe selectivamente la activación del complemento dependiente de MASP-2, en el que el anticuerpo monoclonal anti-MASP-2 o fragmento del mismo, comprende una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 70.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos de tratamiento de afecciones asociadas con la activación del complemento dependiente de MASP-2
Antecedentes
El sistema del complemento proporciona un mecanismo de acción temprano para iniciar, amplificar y orquestar la respuesta inmunitaria a una infección microbiana y otras lesiones agudas (M.K. Liszewski y J.P. Atkinson, 1993, en Fundamental Immunology, Tercera edición, editado por W.E. Paul, Raven Press, Ltd., Nueva York), en seres humanos y otros vertebrados. Si bien la activación del complemento proporciona una valiosa defensa de primera línea contra posibles patógenos, las actividades del complemento que promueven una respuesta inmunitaria protectora también pueden representar una posible amenaza para el hospedador (K.R. Kalli, y col., Springer Semin. Immunopathol.
15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994). Por ejemplo, los productos proteolíticos C3 y C5 reclutan y activan neutrófilos. Si bien son indispensables para la defensa del hospedador, los neutrófilos activados son indiscriminados en su liberación de enzimas destructivas y pueden causar daño a los órganos. Además, la activación del complemento puede provocar el depósito de componentes líticos del complemento en las células hospedadoras cercanas, así como en las dianas microbianas, dando como resultado la lisis celular en el hospedador.
El sistema del complemento también se ha implicado en la patogenia de numerosas enfermedades agudas y crónicas, que incluyen: infarto de miocardio, apoplejía, SDRA, lesión por reperfusión, choque séptico, fuga capilar después de quemaduras térmicas, inflamación posderivación cardiopulmonar, rechazo de trasplantes, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, miastenia grave y enfermedad de Alzheimer. En casi todas estas afecciones, el complemento no es la causa, pero es uno de varios factores implicados en la patogenia. No obstante, la activación del complemento puede ser un mecanismo patológico importante y representa un punto eficaz para el control clínico en muchos de estas enfermedades. El creciente reconocimiento de la importancia de la lesión tisular mediada por complemento en una variedad de enfermedades subraya la necesidad de fármacos inhibidores del complemento eficaces. Hasta la fecha, Eculizumab (Solaris®), un anticuerpo contra C5, es el único fármaco dirigido al complemento que ha sido aprobado para uso humano. Incluso, C5 es una de varias moléculas efectoras ubicadas "corriente abajo" en el sistema del complemento, y el bloqueo de C5 no inhibe la activación del sistema del complemento. Por tanto, un inhibidor de las etapas de iniciación de la activación del complemento tendría ventajas significativas sobre un inhibidor del complemento "corriente abajo".
En la actualidad, está ampliamente aceptado que el sistema del complemento se puede activar a través de tres rutas distintas: la ruta clásica, la ruta de la lectina y la ruta alternativa. La ruta clásica suele desencadenarse por un complejo compuesto por anticuerpos del hospedador unidos a una partícula extraña (es decir, un antígeno) y, por tanto, requiere una exposición previa a un antígeno para la generación de una respuesta de anticuerpo específica. Dado que la activación de la ruta clásica depende de una respuesta inmunitaria adaptativa previa del hospedador, la ruta clásica es parte del sistema inmunitario adquirido. Por el contrario, tanto la ruta de la lectina como la alternativa son independientes de la inmunidad adaptativa y forman parte del sistema inmunitario innato.
La activación del sistema del complemento da como resultado la activación secuencial de zimógenos de serina proteasa. La primera etapa en la activación de la ruta clásica es la unión de una molécula de reconocimiento específica, C1q, a moléculas de IgG e IgM unidas a antígenos. C1q está asociada con las proenzimas de serina proteasa Clr y Cls como un complejo llamado C1. Tras la unión de C1q a un complejo inmunitario, la escisión autoproteolítica del sitio Arg-Ile de Clr va seguida de la escisión mediada por Clr y la activación de Cls, que de ese modo adquiere la capacidad de escindir C4 y C2. C4 se escinde en dos fragmentos, designados C4a y C4b, y, de forma similar, C2 se escinde en C2a y C2b. Los fragmentos C4b son capaces de formar enlaces covalentes con grupos hidroxilo o amino adyacentes y generar la C3 convertasa (C4b2a) a través de una interacción no covalente con el fragmento C2a del C2 activado. La C3 convertasa (C4b2a) activa C3 mediante escisión proteolítica en los subcomponentes C3a y C3b que conducen a la generación de la C5 convertasa (C4b2a3b), que, mediante escisión de C5 conduce a la formación del complejo de ataque a membrana (C5b combinado con C6, C7, C8 y C-9, también conocido como "MAC"(por sus siglas en inglés)) que puede alterar las membranas celulares que conduce a la lisis celular. Las formas activadas de C3 y C4 (C3b y C4b) se depositan covalentemente en las superficies diana extrañas, que se reconocen por los receptores del complemento en múltiples fagocitos.
Independientemente, la primera etapa en la activación del sistema del complemento a través de la ruta de la lectina es también la unión de moléculas de reconocimiento específicas, que va seguida por la activación de proenzimas de serina proteasa asociadas. Sin embargo, en lugar de la unión de complejos inmunitarios mediante C1q, las moléculas de reconocimiento en la ruta de la lectina comprenden un grupo de proteínas de unión a hidratos de carbono (lectina de unión a manano (MBL, por sus siglas en inglés), H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina y lectina CL-11 de tipo C), denominadas colectivamente lectinas. Véase J. Lu y col., Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, (2002); Holmskov y col., Annu. Rev. Immunol. 21:547-578 (2003); Teh y col., Immunology 101:225-232 (2000)). Véase también J. Luet y col., Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Holmskov y col., Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003); Teh y col., Immunology 101:225-232 (2000); Hansen y col., J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010).
Ikeda y col. demostraron por primera vez que, como C1q, MBL podría activar el sistema del complemento al unirse a eritrocitos recubiertos de manano de levadura de una manera dependiente de C4 (Ikeda y col., J. Biol. Chem.
262:7451-7454, (1987)). MBL, un miembro de la familia de proteínas colectinas, es una lectina dependiente de calcio que une hidratos de carbono con grupos 3- y 4-hidroxi orientados en el plano ecuatorial del anillo de piranosa. Los ligandos destacados para MBL son, por tanto, D-manosa y N-acetil-D-glucosamina, mientras que los hidratos de carbono que no se ajustan a este requisito estérico tienen una afinidad indetectable por MBL (Weis y col., Nature 360:127-134, (1992)). La interacción entre MBL y azúcares monovalentes es extremadamente débil, con constantes de disociación normalmente en el intervalo milimolar de un solo dígito. MBL logra una unión estrecha y específica a ligandos de polisacáridos por avidez, es decir, mediante interacción simultánea con múltiples restos de monosacáridos ubicados muy cerca unos de otros (Lee y col., Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, (1992)). MBL reconoce los patrones de hidratos de carbono que comúnmente decoran microorganismos tales como bacterias, levaduras, parásitos y determinados virus. Por el contrario, MBL no reconoce D-galactosa ni ácido siálico, los azúcares penúltimos y últimos que suelen decorar los glucoconjugados complejos "maduros" presentes en el plasma de mamíferos y las glucoproteínas de la superficie celular. Se cree que esta especificidad de unión promueve el reconocimiento de superficies "extrañas" y ayuda a proteger de la "autoactivación". Sin embargo, MBL se une con alta afinidad a grupos de polisacáridos "precursores" con alto contenido de manosa en glucoproteínas ligadas a N y glucolípidos secuestrados en el retículo endoplásmico y Golgi de células de mamíferos (Maynard y col., J. Biol. Chem. 257:3788-3794, (1982)). Por tanto, las células dañadas son posibles dianas para la activación de la ruta de la lectina mediante la unión a MBL.
Las ficolinas poseen un tipo diferente de dominio de lectina que MBL, llamado dominio similar a fibrinógeno. Las ficolinas se unen a restos de azúcar de una manera independiente de Ca++. En seres humanos, se han identificado tres tipos de ficolinas (L-ficolina, M-ficolina y H-ficolina). Las dos ficolinas séricas, L-ficolina y H-ficolina, tienen en común una especificidad por la N-acetil-D-glucosamina; sin embargo, la H-ficolina también se une a N-acetil-D-galactosamina. La diferencia en la especificidad del azúcar de L-ficolina, H-ficolina, CL-11 y MBL significa que las diferentes lectinas pueden ser complementarias y dirigirse a glucoconjugados diferentes, aunque superpuestos. Este concepto está respaldado por el informe reciente de que, de las lectinas conocidas en la ruta de la lectina, solo la L-ficolina se une específicamente al ácido lipoteicoico, un glucoconjugado de la pared celular que se encuentra en todas las bacterias grampositivas (Lynch y col., J. Immunol. 172:1198-1202, (2004)). Las colectinas (es decir, MBL) y las ficolinas no tienen similitudes significativas en la secuencia de aminoácidos. Sin embargo, los dos grupos de proteínas tienen organizaciones de dominio similares y, como C1q, se ensamblan en estructuras oligoméricas, lo que maximiza la posibilidad de unión multisitio.
Las concentraciones séricas de MBL son muy variables en poblaciones sanas y esto está controlado genéticamente por polimorfismos/mutaciones en las regiones promotora y codificadora del gen MBL. Como proteína de fase aguda, la expresión de MBL aumenta aún más durante la inflamación. La L-ficolina está presente en suero en concentraciones similares a las de MBL. Por tanto, la rama de L-ficolina de la ruta de la lectina es potencialmente comparable en resistencia al brazo de MBL. Las MBL y ficolinas también pueden funcionar como opsoninas, que permiten que los fagocitos se dirijan a superficies decoradas con MBL y ficolinas (véase Jack y col., J Leukoc Biol., 77(3):328-36 (2004), Matsushita y Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 (2002), Aoyagi y col., J Immunol, 174(1):418-25(2005). Esta opsonización requiere la interacción de estas proteínas con receptores de fagocitos (Kuhlman y col., J. Exp. Med.
169:1733, (1989); Matsushita y col., J. Biol. Chem. 271:2448-54, (1996)), cuya identidad no ha sido establecida.
La MBL humana forma una interacción específica y de alta afinidad a través de su dominio similar al colágeno con serina proteasas únicas similares a C1r/Cls, denominadas serina proteasas asociadas a MBL (MASP, por sus siglas en inglés). Hasta la fecha, se han descrito tres MASP. En primer lugar, se identificó una sola enzima "MASP" y se caracterizó como la enzima responsable del inicio de la cascada del complemento (es decir, que escinde C2 y C4) (Matsushita y col., J Exp Med 176(6):1497-1502 (1992); Ji y col., J. Immunol. 150:571-578, (1993)). Posteriormente se determinó que la actividad de MASP era, de hecho, una mezcla de dos proteasas: MASP-1 y MASP-2 (Thiel y col., Nature 386:506-510, (1997)). Sin embargo, se demostró que el complejo MBL-MASP-2 solo es suficiente para la activación del complemento (Vorup-Jensen y col., J. Immunol. 165:2093-2100, (2000)). Además, solo MASP-2 escindió C2 y C4 a altas tasas (Ambrus y col., J. Immunol. 170:1374-1382, (2003)). Por tanto, MASP-2 es la proteasa responsable de activar C4 y C2 para generar la C3 convertasa, C4b2a. Esta es una diferencia significativa del complejo C1 de la ruta clásica, en la que la acción coordinada de dos serina proteasas específicas (C1r y C1s) conduce a la activación del sistema del complemento. Además, una tercera proteasa nueva, m As P-3, ha sido aislado (Dahl, M.R., y col., Immunity 15:127-35, 2001). MASP-1 y MASP-3 son productos empalmados alternativamente del mismo gen.
Las MASP comparten organizaciones de dominio idénticas con las de Clr y Cls, los componentes enzimáticos del complejo C1 (Sim y col., Biochem. Soc. Trans. 28:545, (2000)). Estos dominios incluyen un dominio N-terminal Clr/Cls/VEGF de erizo de mar/proteína morfogénica ósea (CUB, por sus siglas en inglés), un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico, un segundo dominio CUB, un tándem de dominios de proteínas de control del complemento y un dominio de serina proteasa. Como en las proteasas C1, la activación de MASP-2 se produce a través de la escisión de un enlace Arg-Ile adyacente al dominio de serina proteasa, que divide la enzima en cadenas A y B unidas por disulfuro, la última formada por el dominio de serina proteasa.
MBL también se puede asociar con una forma cortada alternativa de MASP-2, conocida como proteína asociada a MBL de 19 kDa (Map19, por sus siglas en inglés) o proteína asociada a MBL pequeña (sMAP, por sus siglas en inglés), que carece de la actividad catalítica de MASP2. (Stover, J. Immunol. 162:3481-90, (1999); Takahashi y col., Int. Immunol. 11:859-863, (1999)). MAp19 comprende los dos primeros dominios de MASP-2, seguidos de una secuencia extra de cuatro aminoácidos únicos. La función de Map19 no está clara (Degn y col., J Immunol. Methods, 2011). Los genes MASP-1 y MASP-2 se ubican en los cromosomas humanos 3 y 1, respectivamente (Schwaeble y col., Immunobiology 205:455-466, (2002)).
Varias líneas de evidencia sugieren que existen diferentes complejos MBL-MASP y que una gran fracción de las MASP en suero no forma complejos con MBL (Thiel, y col., J. Immunol. 165:878-887, (2000)). Tanto la H como la L-ficolina se unen a todas las mAs P y activan la ruta del complemento de la lectina, al igual que MBL (Dahl y col., Immunity 15:127-35, (2001); Matsushita y col., J. Immunol. 168:3502-3506, (2002)). Tanto la ruta de la lectina como la clásica forman una C3 convertasa común (C4b2a) y las dos rutas convergen en esta etapa.
Se cree ampliamente que la ruta de la lectina tiene un papel importante en la defensa del hospedador contra una infección en el hospedador no tratado. Una fuerte evidencia de la implicación de MBL en la defensa del hospedador proviene del análisis de pacientes con niveles séricos disminuidos de MBL funcional (Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, (2002)). Estos pacientes muestran susceptibilidad a infecciones bacterianas y fúngicas recurrentes. Estos síntomas suelen ser evidentes en las primeras etapas de la vida, durante un margen aparente de vulnerabilidad a medida que disminuye el título de anticuerpos maternos, pero antes de que se desarrolle un repertorio completo de respuestas de anticuerpos. Este síndrome a menudo es el resultado de mutaciones en varios sitios de la porción colágena de MBL, que interfieren con la formación adecuada de oligómeros MBL. Sin embargo, dado que MBL puede funcionar como una opsonina independiente del complemento, se desconoce hasta qué punto el aumento de la susceptibilidad a una infección se debe a una activación alterada del complemento.
A diferencia de la ruta clásica y de la lectina, no se han encontrado iniciadores de la ruta alternativa que cumplan las funciones de reconocimiento que realizan C1q y las lectinas en las otras dos rutas. Actualmente está ampliamente aceptado que la ruta alternativa sufre espontáneamente un bajo nivel de activación del recambio, que se puede amplificar fácilmente en superficies extrañas u otras anómalas (bacterias, levaduras, células infectadas por virus o tejido dañado) que carecen de los elementos moleculares adecuados que mantienen bajo control la activación espontánea del complemento. Hay cuatro proteínas plasmáticas directamente implicadas en la activación de la ruta alternativa: C3, factores B y D, y properdina.
Aunque existe una amplia evidencia que implica a las rutas del complemento clásica y alternativa en la patogenia de las enfermedades humanas no infecciosas, el papel de la ruta de la lectina apenas está comenzando a evaluarse. Estudios recientes proporcionan evidencia de que la activación de la ruta de la lectina puede ser responsable de la activación del complemento y la inflamación relacionada en la lesión por isquemia/reperfusión. Collard y col. (2000) informaron que las células endoteliales cultivadas sometidas a estrés oxidativo se unen a MBL y muestran depósito de C3 tras la exposición a suero humano (Collard y col., Am. J. Pathol. 156:1549-1556, (2000)). Además, el tratamiento de sueros humanos con anticuerpos monoclonales de bloqueo anti-MBL inhibió la unión de MBL y la activación del complemento. Estos hallazgos se extendieron a un modelo de rata de isquemia-reperfusión miocárdica en el que las ratas tratadas con un anticuerpo de bloqueo dirigido contra MBL de rata mostraron significativamente menos daño miocárdico tras la oclusión de una arteria coronaria que las ratas tratadas con un anticuerpo de control (Jordan y col., Circulation 104:1413-1418, (2001)). El mecanismo molecular de la unión de MBL al endotelio vascular después del estrés oxidativo no está claro; un estudio reciente sugiere que la activación de la ruta de la lectina después del estrés oxidativo puede estar mediada por la unión de MBL a citoqueratinas endoteliales vasculares y no a glucoconjugados (Collard y col., Am. J. Pathol. 159:1045-1054, (2001)). Otros estudios han implicado las rutas clásica y alternativa en la patogenia de la lesión por isquemia/reperfusión y el papel de la ruta de la lectina en esta enfermedad sigue siendo controvertido (Riedermann, N.C., y col., Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003).
Un estudio reciente ha demostrado que se requiere MASP-1 (y posiblemente también MASP-3) para convertir la enzima Factor D de activación de la ruta alternativa de su forma de zimógeno a su forma enzimáticamente activa (véase Takahashi M. y col., J Exp Med 207(1):29-37 (2010)). La importancia fisiológica de este procedimiento se subraya por la ausencia de la actividad funcional de la ruta alternativa en el plasma de ratones deficientes en MASP-1/3. Se requiere la generación proteolítica de C3b a partir de C3 nativo para que funcione la ruta alternativa. Dado que la ruta alternativa C3 convertasa (C3bBb) contiene C3b como una subunidad esencial, la pregunta sobre el origen del primer C3b a través de la ruta alternativa ha presentado un problema desconcertante y ha estimulado una investigación considerable.
C3 pertenece a una familia de proteínas (junto con C4 y a-2 macroglobulina) que contienen una rara modificación postraduccional conocida como enlace tioéster. El grupo tioéster está compuesto por una glutamina cuyo grupo carbonilo terminal forma un enlace tioéster covalente con el grupo sulfhidrilo de una cisteína a tres aminoácidos de distancia. Este enlace es inestable y el glutamil-tioéster electrófilo puede reaccionar con fracciones nucleófilas tales como grupos hidroxilo o amino y, por tanto, formar un enlace covalente con otras moléculas. El enlace tioéster es razonablemente estable cuando se fija dentro de un espacio hidrófobo de C3 inalterada. Sin embargo, la escisión proteolítica de C3 a C3a y C3b da como resultado la exposición del enlace tioéster altamente reactivo en C3b y, después del ataque nucleófilo por fracciones adyacentes que comprenden grupos hidroxilo o amino, C3b se une covalentemente a una diana. Además de su papel bien documentado en la unión covalente de C3b para complemetar dianas, también se cree que el tioéster C3 tiene un papel fundamental en la activación de la ruta alternativa. De acuerdo con la "teoría tic-over" ampliamente aceptada, la ruta alternativa se inicia mediante la generación de una convertasa en fase fluida, iC3Bb, que se forma a partir de C3 con tioéster hidrolizado (iC3; C3(H2O)) y factor B (Lachmann, P.J., y col., Springer Semin. Immunopathol. 7:143-162, (1984)). La C3(H2O) similar a C3b se genera a partir de la C3 natural mediante una lenta hidrólisis espontánea del tioéster interno en la proteína (Pangburn, M.K., y col., J. Exp. Med.
154:856-867, 1981). A través de la actividad de la covertasa C3(H2O)Bb, las moléculas C3b se depositan en la superficie de la diana iniciando así la ruta alternativa.
Se sabe muy poco sobre los iniciadores de la activación de la ruta alternativa. Se cree que los activadores incluyen paredes de células de levadura (cimosano), muchos polisacáridos puros, eritrocitos de conejo, determinadas inmunoglobulinas, virus, hongos, bacterias, células tumorales animales, parásitos y células dañadas. La única característica común a estos activadores es la presencia de hidratos de carbono, pero la complejidad y variedad de las estructuras de hidratos de carbono ha hecho difícil establecer los determinantes moleculares compartidos que se reconocen. Se ha aceptado ampliamente que la activación de la ruta alternativa se controla mediante el delicado equilibrio entre componentes reguladores inhibidores de esta ruta, tales como el factor H, Factor I, DAF y CR1 y la properdina, que es el único regulador positivo de la ruta alternativa (véase Schwaeble W.J. y Reid K.B., Immunol Today 20(1):17-21 (1999)).
Además del mecanismo de activación aparentemente no regulado descrito anteriormente, la ruta alternativa también puede proporcionar un poderoso bucle de amplificación para la C3 convertasa de la ruta de la lectina/clásica (C4b2a) ya que cualquier C3b generado puede participar con el factor B en la formación adicional de C3 convertasa (C3bBb) de la ruta alternativa. La C3 convertasa de la ruta alternativa se estabiliza mediante la unión de properdina. La properdina extiende la semivida de la C3 convertasa de la ruta alternativa de seis a diez veces. La adición de C3b a la C3 convertasa de la ruta alternativa conduce a la formación de la C5 convertasa de la ruta alternativa.
Se ha pensado que las tres rutas (es decir, la clásica, de la lectina y alternativa) convergen en C5, que se escinde para formar productos con múltiples efectos proinflamatorios. La ruta convergente se ha denominado ruta del complemento terminal. C5a es la anafilotoxina más potente, que induce alteraciones en el tono vascular y del músculo liso, así como en la permeabilidad vascular. También es una poderosa quimiotaxina y activador de neutrófilos y monocitos. La activación celular mediada por C5a puede amplificar significativamente las respuestas inflamatorias mediante la inducción de la liberación de múltiples mediadores inflamatorios adicionales, incluyendo citocinas, enzimas hidrolíticas, metabolitos del ácido araquidónico y especies reactivas del oxígeno. La escisión de C5 conduce a la formación de C5b-9, también conocido como complejo de ataque a membrana (MAC). En la actualidad existe una fuerte evidencia de que el depósito de MAC sublítico puede desempeñar un papel importante en la inflamación además de su papel como complejo lítico formador de poros.
Además de su papel esencial en la defensa inmunitaria, el sistema del complemento contribuye al daño tisular en muchas afecciones clínicas. Por tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar inhibidores del complemento terapéuticamente eficaces para prevenir estos efectos secundarios.
Los documentos US 2013/26650, WO 2012/139081, WO 2005/123128 y WO 2012/151481 se refieren a anticuerpos MASP-2 para terapia.
Sumario
La presente invención es como se expone en las reivindicaciones.
Las realizaciones y/o ejemplos de la siguiente descripción que no están abarcados por las reivindicaciones adjuntas no se consideran parte de la presente invención. En el presente documento se describe un procedimiento para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar una microangiopatía trombótica (MAT), en el que la MAT es al menos una de (i) una MAT secundaria por cáncer; (ii) una MAT secundaria por quimioterapia, o (iii) una MAT secundaria por trasplante, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2. En algunos casos, el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar una MAT secundaria por cáncer, y el agente inhibidor de MASP-2 se administra sistémicamente al sujeto en una cantidad eficaz para reducir el riesgo de desarrollar MAT o reducir la intensidad de la MAT. En algunos casos, el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar una MAT secundaria por quimioterapia, y el agente inhibidor de MASP-2 se administra sistémicamente al sujeto antes de, durante o después de la quimioterapia, en una cantidad eficaz para reducir el riesgo de desarrollar MAT o reducir la intensidad de la MAT. En algunos casos, el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar una MAT secundaria por trasplante, y el agente inhibidor de MASP-2 se administra sistémicamente al sujeto antes de, durante o después del procedimiento de trasplante, en una cantidad eficaz para reducir el riesgo de desarrollar MAT o reducir la intensidad de la MAT. En algunos casos, el procedimiento de trasplante es un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. En algunos casos, el sujeto se ha sometido previamente, o se encuentra actualmente, en tratamiento con un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína del complemento C5. En algunos casos, el procedimiento comprende además administrar al sujeto un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína del complemento C5, tal como un anticuerpo humanizado anti-C5 o fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como eculizumab.
También se describe en el presente documento un procedimiento para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar el síndrome de Upshaw-Schulman (SUS) que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2. En algunos casos, el procedimiento comprende tratar a un sujeto en riesgo de desarrollar el SUS, en el que el procedimiento comprende administrar una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 durante un período de tiempo eficaz para mejorar o evitar uno o más síntomas clínicos asociados con la PTT. En algunos casos, el procedimiento comprende además controlar periódicamente al sujeto y administrar el agente inhibidor de MASP-2 ante la presencia de un evento que se sabe que está asociado con el desencadenamiento de síntomas clínicos de la PTT. En algunos casos, el procedimiento comprende además controlar periódicamente al sujeto y administrar el agente inhibidor de MASP-2 tras la determinación de la presencia de anemia, trombocitopenia o aumento de creatina. En algunos casos, el sujeto se ha sometido previamente, o se encuentra actualmente, en tratamiento con un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína del complemento C5. En algunos casos, el procedimiento comprende además administrar al sujeto un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína del complemento C5, tal como un anticuerpo humanizado anti-C5 o fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como eculizumab.
También se describe en el presente documento un procedimiento para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece la enfermedad de Degos, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2. En algunos casos, el sujeto se ha sometido previamente, o se encuentra actualmente, en tratamiento con un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína del complemento C5. En algunos casos, el procedimiento comprende además administrar al sujeto un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína del complemento C5, tal como un anticuerpo humanizado anti-C5 o fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como eculizumab.
También se describe en el presente documento un procedimiento para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece el síndrome antifosfolipídico catastrófico (SAFC), que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2. En algunos casos, el sujeto se ha sometido previamente, o se encuentra actualmente, en tratamiento con un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína del complemento C5. En algunos casos, el procedimiento comprende además administrar al sujeto un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína del complemento C5, tal como un anticuerpo humanizado anti-C5 o fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como eculizumab.
En algunos casos, de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el agente inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo inhibidor de MASP-2 o fragmento del mismo. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 tiene una función efectora reducida. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 no inhibe sustancialmente la ruta clásica. En algunos casos, el agente inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo monoclonal anti-MASP-2, o fragmento del mismo, que se une específicamente a una porción de SEQ ID NO: 6. En algunos casos, el anticuerpo anti-MASP-2 o fragmento del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo recombinante, un anticuerpo que tiene una función efectora reducida, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, Fab', F(ab)2 y F(ab')2. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 es una molécula monocatenaria. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se selecciona del grupo que consiste en una molécula de IgG1, una IgG2 y una molécula de IgG4. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 es una molécula de IgG4 que comprende una mutación S228P. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se une a MASP-2 humana con una Kd de 10 nM o menos. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se une a un epítopo en el dominio CCP1 de MASP-2. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe el depósito de C3b en un ensayo in vitro en suero humano al 1 % en un CI50 de 10 nM o menos. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe el depósito de C3b en suero humano al 90 % con un CI50 de 30 nM o menos.
En algunos casos de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el anticuerpo monoclonal inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una CDR-H1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 31-35 de la SEQ ID NO: 67; y ii) una CDR-H2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-65 de la SEQ ID NO: 67; y iii) una CDR-H3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 95-102 de la SEQ ID NO: 67 y (b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una CDR-L1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 24-34 de la SEQ ID NO: 70; y ii) una CDR-L2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-56 de la SEQ ID NO: 70; y iii) una CDR-L3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 89-97 de la SEQ ID NO: 70. En algunos casos, el anticuerpo monoclonal inhibidor de MASP-2 comprende una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 70. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 o fragmento de unión a antígeno del mismo reconoce específicamente al menos parte de un epítopo reconocido por un anticuerpo de referencia que comprende una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 70.
En el presente documento se describen procedimientos para inhibir la formación de trombos en un sujeto que padece síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa), que comprende administrar al sujeto una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en suero de un sujeto que padece el SUHa en al menos un 40 % en comparación con suero no tratado. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en suero de un sujeto que padece el SUHa a un nivel al menos un 20 % mayor (por ejemplo, al menos un 30 % mayor, al menos un 40 % mayor, o al menos un 50 % mayor) que su efecto inhibidor sobre el depósito de C5b-9 en el suero del mismo sujeto. En algunos casos, el sujeto se encuentra en la fase aguda del SUHa. En algunos casos, el sujeto está en la fase de remisión del SUHa. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo monoclonal, o fragmento del mismo, que se une específicamente a una porción de SEQ ID NO: 6. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 o fragmento del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo recombinante, un anticuerpo que tiene una función efectora reducida, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, Fab', F(ab)2 y F(ab')2. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 es una molécula monocatenaria. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se selecciona del grupo que consiste en una molécula de IgG1, una IgG2 y una molécula de IgG4. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 es una molécula de IgG4 que comprende una mutación S228P. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se une a MASP-2 humana con una Kd de 10 nM o menos. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se une a un epítopo en el dominio CCP1 de MASP-2. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe el depósito de C3b en un ensayo in vitro en suero humano al 1 % en un CI50 de 10 nM o menos. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe el depósito de C3b en suero humano al 90 % con un CI50 de 30 nM o menos. En algunos casos, el anticuerpo monoclonal inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una CDR-H1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 31-35 de la SEQ ID NO: 67; y ii) una CDR-H2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-65 de la SEQ ID NO: 67; y iii) una CDR-H3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 95-102 de la SEQ ID NO: 67 y (b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una CDR-L1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 24-34 de la SEQ ID NO: 70; y ii) una CDR-L2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-56 de la SEQ ID NO: 70; y iii) una CDR-L3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 89-97 de la SEQ ID NO: 70. En algunos casos, el anticuerpo monoclonal inhibidor de MASP-2 comprende una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 70. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 o fragmento de unión a antígeno del mismo reconoce específicamente al menos parte de un epítopo reconocido por un anticuerpo de referencia que comprende una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 70.
También se describen composiciones para inhibir los efectos secundarios de la activación del complemento dependiente de MASP-2, que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo inhibidor de MASP-2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se describen procedimientos para fabricar un medicamento para su uso en la inhibición de los efectos secundarios de la activación del complemento dependiente de MASP-2 en sujetos vivos que lo necesiten, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehículo farmacéutico. También se describen procedimientos para fabricar medicamentos para su uso en la inhibición de la activación del complemento dependiente de MASP-2 para el tratamiento de cada una de las afecciones, enfermedades y trastornos descritos en el presente documento a continuación.
Los procedimientos, composiciones y medicamentos descritos en el presente documento son útiles para inhibir los efectos secundarios de la activación del complemento dependiente de MASP-2 in vivo en sujetos mamíferos, incluyendo seres humanos que padecen o están en riesgo de desarrollar una microangiopatía trombótica (MAT) como se describe adicionalmente en el presente documento.
Descripción de los dibujos
Lo anterior se apreciará más fácilmente a medida que se entienda mejor por referencia a la siguiente descripción detallada, cuando se toma junto con los dibujos adjuntos, en los que:
la FIGURA 1 es un diagrama que ilustra la estructura genómica de MASP-2 humana;
la FIGURA 2A es un diagrama esquemático que ilustra la estructura de dominios de la proteína MASP-2 humana; la FIGURA 2B es un diagrama esquemático que ilustra la estructura de dominios de la proteína MAp19 humana; la FIGURA 3 es un diagrama que ilustra la estrategia de desactivación de MASP-2 murina;
la FIGURA 4 es un diagrama que ilustra la construcción de minigén de MASP-2 humana;
la FIGURA 5A presenta resultados que demuestran que la deficiencia de MASP-2 conduce a la pérdida de la activación de C4 mediada por la ruta de la lectina medida por la falta de depósito de C4b en manano, tal como se describe en el Ejemplo 2;
la FIGURA 5B presenta resultados que demuestran que la deficiencia de MASP-2 conduce a la pérdida de la activación de C4 mediada por la ruta de la lectina medida por la falta de depósito de C4b en cimosano, tal como se describe en el Ejemplo 2;
la FIGURA 5C presenta resultados que demuestran los niveles relativos de activación de C4 de muestras de suero obtenidas de cepas MASP-2 /-; MASP-2 -/- y de tipo silvestre según la medición del depósito de C4b en manano y cimosano, tal como se describe en el Ejemplo 2;
la FIGURA 6 presenta resultados que demuestran que la adición de MASP-2 recombinante murino a muestras de suero MASP-2 -/- recupera la activación de C4 mediada por la ruta de la lectina de una manera dependiente de la concentración de proteínas, medido por el depósito de C4b en manano, tal como se describe en el Ejemplo 2; la FIGURA 7 presenta resultados que demuestran que la ruta clásica es funcional en la cepa MASP-2 -/-, tal como se describe en el Ejemplo 8;
la FIGURA 8A presenta resultados que demuestran que el anticuerpo Fab2 n.° 11 anti-MASP-2 inhibe la formación de C3 convertasa, tal como se describe en el Ejemplo 10;
la FIGURA 8B presenta resultados que demuestran que el anticuerpo Fab2 n.° 11 anti-MASP-2 se une a MASP-2 natural de rata, tal como se describe en el Ejemplo 10;
la FIGURA 8C presenta resultados que demuestran que el anticuerpo Fab2 n.° 41 anti-MASP-2 inhibe la escisión de C4, tal como se describe en el Ejemplo 10;
la FIGURA 9 presenta resultados que demuestran que todos los anticuerpos Fab2 anti-MASP-2 probados que inhibieron la formación de C3 convertasa también inhibieron la escisión de C4, tal como se describe en el Ejemplo 10;
la FIGURA 10 es un diagrama que ilustra los polipéptidos recombinantes procedentes de MASP-2 de rata que se usaron para el mapeo de epítopos de los anticuerpos de bloqueo Fab2 anti-MASP-2, tal como se describe en el Ejemplo 11;
la FIGURA 11 presenta resultados que demuestran la unión de los Fab2 n.° 40 y n.° 60 anti-MASP-2 a polipéptidos MASP-2 de rata, tal como se describe en el Ejemplo 11;
la FIGURA 12 presenta resultados que demuestran el aclaramiento de nitrógeno ureico en sangre para ratones de tipo silvestre (+/+) y MASP-2 (-/-) a las 24 y 48 horas después de la reperfusión en un modelo de lesión por isquemia/reperfusión renal, tal como se describe en el Ejemplo 12; la FIGURA 13A presenta resultados que muestran los niveles de proteína VEGF iniciales en el complejo coroide-EPR aislado de ratones de tipo silvestre (+/+) y MASP-2 (-/-), tal como se describe en el Ejemplo 13;
la FIGURA 13B presenta resultados que muestran los niveles de proteína VEGF en el complejo EPR-coroide el día 3 en ratones de tipo silvestre (+/+) y MASP-2 (-/-) después de una lesión inducida por láser en un modelo de degeneración macular, tal como se describe en el Ejemplo 13;
la FIGURA 14 presenta resultados que muestran el volumen medio de neovascularización coroidea (NVC) en el día siete después de una lesión inducida por láser en ratones de tipo silvestre (+/+) y MASP-2 (-/-), tal como se describe en el Ejemplo 13;
Las Figuras 15A y 15B presentan curvas de respuesta a la dosis para la inhibición del depósito de C4b (Figura 15A) y la inhibición de la activación de la trombina (Figura 15B) después de la administración de un anticuerpo Fab2 de MASP-2 en suero de rata normal, tal como se describe en el Ejemplo 14;
Las FIGURAS 16A y 16B presentan la agregación plaquetaria medida (expresada como área agregada) en ratones MASP-2 (-/-) (FIGURA 16B) en comparación con la agregación plaquetaria en ratones de tipo silvestre no tratados y ratones de tipo silvestre en los que se inhibe la ruta del complemento mediante agente de agotamiento del factor de veneno de cobra (FVC) y un inhibidor de la ruta terminal (antagonista C5aR) (FIGURA 16A) en un modelo de reacción de Schwartzman localizado de coagulación intravascular diseminada, tal como se describe en el Ejemplo 15;
la FIGURA 17 ilustra gráficamente los niveles de nitrógeno ureico en sangre (NUS) medidos en ratones TS (+/+) (B6) o MASP-2 (-/-) receptores de trasplante de riñones de donantes TS (+/+), tal como se describe en el Ejemplo 16;
la FIGURA 18 ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de ratones TS (+/+) y MASP-2 (-/-) en función del número de días después de la infección microbiana en el modelo de ligadura y punción cecal (LPC), tal como se describe en el Ejemplo 17;
la FIGURA 19 ilustra gráficamente el número de bacterias medidas en TS (+/+) y MASP-2 (-/-) después de una infección microbiana en el modelo de ligadura y punción cecal (LPC), tal como se describe en el Ejemplo 17; la FIGURA 20 es un gráfico de Kaplan-Mayer que ilustra el porcentaje de supervivencia de ratones Ts (+/+), MASP-2 (-/-) y C3 (-/-) seis días después de la exposición con administración intranasal de Pseudomonas aeruginosa, tal como se describe en el Ejemplo 18;
la FIGURA 21 ilustra gráficamente el nivel de depósito de C4b, medido como % de control, en muestras tomadas en varios puntos temporales después de la administración subcutánea de 0,3 mg/kg o 1,0 mg/kg de anticuerpo monoclonal de ratón anti-MASP-2 en ratones TS, tal como se describe en el Ejemplo 19;
la FIGURA 22 ilustra gráficamente el nivel de depósito de C4b, medido como % de control, en muestras tomadas en varios puntos temporales después de la administración ip de 0,6 mg/kg de anticuerpo monoclonal de ratón anti-MASP-2 en ratones Ts , tal como se describe en el Ejemplo 19;
la FIGURA 23 ilustra gráficamente el volumen medio de neovascularización coroidea (NVC) el día siete después de la lesión inducida por láser en ratones TS (+/+) tratados previamente con una única inyección ip de 0,3 mg/kg o 1,0 mg/kg anticuerpo monoclonal de ratón anti-MASP-2; tal como se describe en el Ejemplo 20;
la FIGURA 24A ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de ratones MASP-2 (-/-) y TS (+/+) después de la infección con 5x108/100 pl de ufc de N. meningitidis, tal como se describe en el Ejemplo 21;
la FIGURA 24B ilustra gráficamente el log ufc/ml de N. meningitidis recuperado en diferentes puntos temporales en muestras de sangre tomadas de los ratones MASP-2 KO (-/-) y TS (+/+) infectados con 5x108 ufc/100 pl de N. meningitidis, tal como se describe en el Ejemplo 21;
la FIGURA 25A ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de ratones MASP-2 KO (-/-) y TS (+/+) después de la infección con 2x108 ufc/100 |jl de N. meningitidis, tal como se describe en el Ejemplo 21;
la FIGURA 25B ilustra gráficamente el log ufc/ml de N. meningitidis recuperado en diferentes puntos temporales en muestras de sangre tomadas de los ratones TS (+/+) infectados con 2x108 ufc/100 j l de N. meningitidis, tal como se describe en el Ejemplo 21; la FIGURA 25C ilustra gráficamente el log ufc/ml de N. meningitidis recuperado en diferentes puntos temporales en muestras de sangre tomadas de los ratones MASP-2 (-/-) infectados con 2x108 ufc/100 j l de N. meningitidis, tal como se describe en el Ejemplo 21; la FIGURA 26A ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de depósito de C3b que demuestra que los ratones MASP-2 (-/-) conservan una ruta clásica funcional, tal como se describe en el Ejemplo 22;
la FIGURA 26B ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de depósito de C3b en placas recubiertas de cimosano, demostrando que los ratones MASP-2 (-/-) conservan una ruta alternativa funcional, tal como se describe en el Ejemplo 22;
la FIGURA 27A ilustra gráficamente la pérdida de tejido inducida por lesión por isquemia/reperfusión miocárdica (LIRM) después de la ligadura de la rama descendente anterior izquierda (DAI) de la arteria coronaria y la reperfusión en ratones C4 (-/-) (n = 6) y la comparación de controles de camada TS correspondientes (n = 7), que muestran el área de riesgo (ADR) y el tamaño del infarto (INF) como se describe en el Ejemplo 22;
la FIGURA 27B ilustra gráficamente el tamaño del infarto (INF) en función del área de riesgo (ADR) en ratones C4 (-/-) y TS tratados como se describe en la FIGURA 42A, demostrando que los ratones C4 (-/-) son tan susceptibles a LIRm como los controles TS (línea discontinua), tal como se describe en el Ejemplo 22;
la FIGURA 28A ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de depósito de C3b usando suero de ratones TS, ratones C4 (-/-) y suero de ratones C4 (-/-) incubado previamente con manano, tal como se describe en el Ejemplo 22;
la FIGURA 28B ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de depósito de C3b en suero de ratones TS, C4 (-/-) y MASP-2 (-/-) mezclados con diversas concentraciones de un AcM anti-MASP-2 murina (AcMM11), como se describe en el Ejemplo 22;
la FIGURA 28C ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de depósito de C3b en suero humano de suero TS (suficiente en C4) y deficiente en C4, y suero de sujetos deficientes en C4 incubado previamente con manano, tal como se describe en el Ejemplo 22;
la FIGURA 28D ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de depósito de C3b en suero humano de sujetos TS (suficiente en C4) y deficientes en C4 mezclados con AcM anti-MASP-2 humana (AcMH3), como se describe en el Ejemplo 22;
la FIGURA 29A ilustra gráficamente un análisis comparativo de la actividad de la C3 convertasa en plasma de varias cepas de ratón deficientes en complemento probadas en condiciones de ensayo específicas de la ruta de activación de lectina o en condiciones de ensayo específicas de la ruta de activación clásica, tal como se describe en el Ejemplo 22;
la FIGURA 29B ilustra gráficamente la cinética resuelta en el tiempo de la actividad de C3 convertasa en plasma de varias cepas de ratón deficientes en complemento probadas en condiciones específicas de la ruta de activación de la lectina, tal como se describe en el Ejemplo 22;
la FIGURA 30 ilustra los resultados de un análisis de transferencia Western que muestra la activación de C3 humana, mostrada por la presencia de la cadena a', mediante sustratos de trombina FXIa y FXa, tal como se describe en el Ejemplo 23;
la FIGURA 31 muestra los resultados del ensayo de depósito de C3 en muestras de suero obtenidas de TS, MASP-2 (-/-), F11(-/-), F11(-/-)/C4 (-/-) y C4 (-/-), tal como se describe en el Ejemplo 23;
la FIGURA 32A es un gráfico de supervivencia de Kaplain-Meier que muestra el porcentaje de supervivencia a lo largo del tiempo después de una exposición a radiación de 7,0 Gy en ratones de control y en ratones tratados con anticuerpo anti-MASP-2 murina (AcMM11) o anticuerpo anti-MASP-2 humana (AcMH6). como se describe en el Ejemplo 29;
la FIGURA 32B es un gráfico de supervivencia de Kaplain-Meier que muestra el porcentaje de supervivencia a lo largo del tiempo después de una exposición a radiación de 6,5 Gy en ratones de control y en ratones tratados con anticuerpo anti-MASP-2 murina (AcMM11) o anticuerpo anti-MASP-2 humana (AcMH6), como se describe en el Ejemplo 29;
la FIGURA 33 es un diagrama de Kaplan-Meyer que ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de ratones MASP-2 KO y TS después de la administración de una dosis infecciosa de 2,6 x 107 ufc de N. meningitidis serogrupo A Z2491, demostrando que los ratones deficientes en MASP-2 están protegidos de la mortalidad inducida por N. meningitidis, tal como se describe en el Ejemplo 30;
la FIGURA 34 es un diagrama de Kaplan-Meyer que ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de ratones MASP-2 KO y TS después de la administración de una dosis infecciosa de 6 x 106 ufc de la cepa MC58 de N. meningitidis serogrupo B, demostrando que los ratones deficientes en MASP-2 están protegidos de la mortalidad inducida por la cepa MC58 de N. meningitidis serogrupo B, tal como se describe en el Ejemplo 30;
la FIGURA 35 ilustra gráficamente el log ufc/ml de la cepa MC58 de N. meningitidis serogrupo B recuperada en diferentes puntos temporales en muestras de sangre tomadas de ratones MASP-2 KO y Ts después de una infección ip con 6x106 ufc de cepa MC58 de N. meningitidis serogrupo B (n = 3 en diferentes puntos temporales para ambos grupos de ratones, los resultados se expresan como medias ± EEM) demostrando que aunque los ratones MASP-2 KO estaban infectados con la misma dosis de la cepa MC58 de N. meningitidis serogrupo B como los ratones TS, los ratones MASP-2 KO tienen un aclaramiento mejorado de bacteriemia en comparación con TS, tal como se describe en el Ejemplo 30;
la FIGURA 36 ilustra gráficamente la puntuación de enfermedad promedio de los ratones MASP-2 y TS a las 3, 6, 12 y 24 horas después de la infección con 6x106 ufc/100 |jl de la cepa MC58 de N. meningitidis serogrupo B, demostrando que los ratones deficientes en MASP-2 mostraron una alta resistencia a la infección, con puntuaciones de enfermedad mucho más bajas a las 6 horas, tal como se describe en el Ejemplo 30;
la FIGURA 37 es un diagrama de Kaplan-Meyer que ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de los ratones después de la administración de una dosis infecciosa de 4 x 106/100 j l de ufc la cepa MC58 de N. meningitidis serogrupo B, seguido de la administración 3 horas después de la infección del anticuerpo inhibidor anti-MASP-2 (1 mg/kg) o del anticuerpo de isotipo de control, demostrando que el anticuerpo anti-MASP-2 es eficaz para tratar y mejorar la supervivencia en sujetos infectados con N. meningitidis, tal como se describe en el Ejemplo 31;
la FIGURA 38 ilustra gráficamente el log ufc/ml de recuentos viables de MC58 de N. meningitidis serogrupo B recuperadas en diferentes puntos temporales en una concentración de suero humano al 20 % después de la infección ip con 6,5x106 ufc/100 j l de la cepa MC58 de N. meningitidis serogrupo B a los 0, 30, 60 y 90 minutos después de la incubación en presencia de: (A) suero humano normal (SHN) más anticuerpo humano anti-MASP-2; (B) suero humano normal (SHN) más anticuerpo de control de isotipo; (C) suero humano MBL -/-; (D) suero humano normal (SHN) y (E) suero humano normal (SHN) inactivado por calor, mostrando que la destrucción dependiente del complemento de N. meningitidis en suero humano se mejoró significativamente mediante la adición del anticuerpo humano anti-MASP-2, tal como se describe en el Ejemplo 32;
la FIGURA 39 ilustra gráficamente el log ufc/ml de recuentos viables de MC58 de N. meningitidis serogrupo B recuperado en diferentes puntos temporales en las muestras de sueros de ratón, demostrando que el suero de ratón MASP-2 -/- tiene un mayor nivel de actividad bactericida para N. meningitidis que los sueros de ratón TS, tal como se describe en el Ejemplo 32;
la FIGURA 40 ilustra gráficamente la hemólisis (medida por la liberación de hemoglobina de eritrocitos de ratón lisados (Crry/C3-/-) en el sobrenadante medido mediante fotometría) de eritrocitos murinos recubiertos de manano mediante suero humano en un intervalo de concentraciones de suero. Los sueros analizados incluyeron SHN inactivado por calor (IC), MBL-/-, SHN anticuerpo anti-MASP-2 y SHN de control, tal como se describe en el Ejemplo 33;
La Figura 41 ilustra gráficamente la hemólisis (medida por la liberación de hemoglobina de eritrocitos de ratón TS lisados en el sobrenadante medido mediante fotometría) de eritrocitos murinos no recubiertos mediante suero humano en un intervalo de concentraciones de suero. Los sueros analizados incluyeron SHN inactivado por calor (IC), MBL-/-, SHN anticuerpo anti-MASP-2 y SHN de control, demostrando que la inhibición de MASP-2 inhibe la lisis mediada por complemento de eritrocitos de ratón TS no sensibilizados, tal como se describe en el Ejemplo 33; la FIGURA 42 ilustra gráficamente la hemólisis (medida por la liberación de hemoglobina de eritrocitos de ratón lisados (CD55/59 -/-) en el sobrenadante medido mediante fotometría) de eritrocitos murinos no recubiertos mediante suero humano en un intervalo de concentraciones de suero. Los sueros analizados incluyeron SHN inactivado por calor (IC), MBL-/-, SHN anticuerpo anti-MASP-2 y SHN de control, tal como se describe en el Ejemplo 33;
La FIGURA 43 ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia a lo largo del tiempo (días) después de una exposición a radiación de 8,0 Gy en ratones de control y en ratones tratados con anticuerpo anti-MASP-2 humana (AcMH6), como se describe en el Ejemplo 34;
la FIGURA 44 ilustra gráficamente el tiempo hasta el inicio de la oclusión microvascular después de una inyección de LPS en ratones MASP-2 -/- y TS, que muestra el porcentaje de ratones con formación de trombos medido durante 60 minutos, demostrando que la formación de trombos se detecta después de 15 minutos en ratones TS, con hasta un 80 % de los ratones TS que demuestran la formación de trombos a los 60 minutos; por el contrario, ninguno de los ratones MASP-2 -/- mostró formación de trombos durante el período de 60 minutos (orden logarítmico: p = 0,0005), como se describe en el Ejemplo 35;
la FIGURA 45 ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de ratones de control tratados con solución salina (n = 5) y ratones tratados con anticuerpo anti-MASP-2 (n = 5) en el modelo de SUH inducido por TXS/LPS a lo largo del tiempo (horas), demostrando que todos los ratones de control murieron a las 42 horas, mientras, por el contrario, el 100 % de los ratones tratados con anticuerpos anti-MASP-2 sobrevivieron durante el transcurso del experimento, tal como se describe en el Ejemplo 36;
la FIGURA 46 ilustra gráficamente, en función del tiempo después de la inducción de la lesión, el porcentaje de ratones con oclusión microvascular en el modelo UV FITC/Dextrano después del tratamiento con control de isotipo, o anticuerpo AcMH6 humano MASP-2 (10 mg/kg) dosificado a las 16 horas y 1 hora antes de la inyección de FITC/Dextrano, tal como se describe en el Ejemplo 37;
la FIGURA 47 ilustra gráficamente el tiempo de oclusión en minutos para ratones tratados con el anticuerpo humano MASP-2 (AcMH6) y el anticuerpo de control de isotipo, en el que los datos se informan como puntos de dispersión con valores medios (barras horizontales) y barras de error estándar (barras verticales). La prueba estadística utilizada para el análisis fue la prueba t para datos no apareados; en la que el símbolo "*" indica p = 0,0129, tal como se describe en el Ejemplo 37; y
la FIGURA 48 ilustra gráficamente el tiempo hasta la oclusión en minutos para ratones de tipo silvestre, ratones MASP-2 KO y ratones de tipo silvestre tratados previamente con anticuerpo humano MASP-2 (AcMH6) administrado i.p. a 10 mg/kg 16 horas antes, y nuevamente 1 hora antes de la inducción de trombosis en el modelo de trombosis por lesión de células endoteliales inducida por FITC-dextrano/luz con baja intensidad de luz (800­ 1500), como se describe en el Ejemplo 37;
la FIGURA 49 es un diagrama de Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de ratones con trombos en función del tiempo en microangiopatía trombótica inducida por FITC-Dextrano en ratones tratados con dosis crecientes de anticuerpo humano inhibidor de MASP-2 (AcMH6) o un anticuerpo de control de isotipo, tal como se describe en el Ejemplo 39;
la FIGURA 50 ilustra gráficamente la mediana del tiempo hasta el inicio (minutos) de la formación de trombos en función de la dosis de AcMH6 (* p < 0,01 en comparación con el control), tal como se describe en el Ejemplo 39; la FIGURA 51 es un gráfico de Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de ratones con oclusión microvascular en función del tiempo en microangiopatía trombótica inducida por FITC-Dextrano en ratones tratados con dosis crecientes de anticuerpo humano inhibidor de MASP-2 (AcMH6) o un anticuerpo de control de isotipo, tal como se describe en el Ejemplo 39;
la FIGURA 52 ilustra gráficamente el tiempo medio hasta la oclusión microvascular en función de la dosis de AcMH6 (*p < 0,05 en comparación con el control), tal como se describe en el Ejemplo 39;
la FIGURA 53A ilustra gráficamente el nivel de depósito de MAC en presencia o ausencia de anticuerpo monoclonal humano MASP-2 (OMS646) en condiciones de ensayo específicas de la ruta de la lectina, demostrando que OMS646 inhibe el depósito de MAC mediada por lectina con un valor de CI50 de aproximadamente 1 nM, tal como se describe en el Ejemplo 40;
la FIGURA 53B ilustra gráficamente el nivel de depósito de MAC en presencia o ausencia de anticuerpo monoclonal humano MASP-2 (OMS646) en condiciones de ensayo específicas de la ruta de clásica, demostrando que OMS646 no inhibe el depósito de MAC mediado por la ruta clásica, tal como se describe en el Ejemplo 40;
la FIGURA 53C ilustra gráficamente el nivel de depósito de MAC en presencia o ausencia de anticuerpo monoclonal humano MASP-2 (OMS646) en condiciones de ensayo específicas de la ruta alternativa, demostrando que OMS646 no inhibe el depósito de MAC mediado por la ruta alternativa, tal como se describe en el Ejemplo 40; la FIGURA 54 ilustra gráficamente el perfil farmacocinético (PK, por sus siglas en inglés) del anticuerpo monoclonal humano MASP-2 (OMS646) en ratones, mostrando la concentración de OMS646 (media de n = 3 animales/grupos) en función del tiempo después de la administración a la dosis indicada, tal como se describe en el Ejemplo 40; la FIGURA 55A ilustra gráficamente la respuesta farmacodinámica (PD, por sus siglas en inglés) del anticuerpo monoclonal humano MASP-2 (OMS646), medida como una caída en la actividad de la ruta sistémica de la lectina en ratones después de la administración intravenosa, tal como se describe en el Ejemplo 40;
la FIGURA 55B ilustra gráficamente la respuesta farmacodinámica (PD) del anticuerpo monoclonal humano MASP-2 (OMS646), medida como una caída en la actividad de la ruta sistémica de la lectina en ratones después de la administración subcutánea, tal como se describe en el Ejemplo 40;
la FIGURA 56 ilustra gráficamente el efecto inhibidor del anticuerpo MASP-2 (OMS646) en comparación con sCR1 en el depósito de C5b-9 inducido por suero de SUHa en células HMEC-1 activadas por ADP, tal como se describe en el Ejemplo 41; y
la FIGURA 57 ilustra gráficamente el efecto inhibidor del anticuerpo MASP-2 (OMS646) en comparación con sCR1 en la formación de trombos inducida por el suero de SUHa en células HMEC-1 activadas por ADP, tal como se describe en el Ejemplo 42.
Descripción del listado de secuencias
SEQ ID NO: 1 ADNc de MAp19 humana
SEQ ID NO: 2 proteína MAp19 humana (con líder)
SEQ ID NO: 3 proteína MAp19 humana (madura)
SEQ ID NO: 4 ADNc de MASP-2 humana
SEQ ID NO: 5 proteína MASP-2 humana (con líder)
SEQ ID NO: 6 proteína MASP-2 humana (madura)
SEQ ID NO: 7 ADNg de MASP-2 humana (exones 1-6)
ANTÍGENOS: (EN REFERENCIA A LA PROTEÍNA MADURA MASP-2)
SEQ ID NO: 8 secuencia CUBI (aa 1-121)
SEQ ID NO: 9 secuencia CUBEGF (aa 1-166)
SEQ ID NO: 10 CUBEGFCUBII (aa 1-293)
SEQ ID NO: 11 región EGF (aa 122-166)
SEQ ID NO: 12 dominio de serina proteasa (aa 429 - 671)
SEQ ID NO: 13 dominio de serina proteasa inactivo (aa 610-625 con mutación Ser618 a Ala)
SEQ ID NO: 4 TPLGPKWPEPVFGRL (péptido CUBI)
SEQ ID NO: 15 TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ (péptido CUBI)
SEQ ID NO: 16 TFRSDYSN (núcleo de la región de unión a MBL)
SEQ ID NO: 17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF (región de unión a MBL)
SEQ ID NO: 18 IDECQVAPG (PÉPTIDO EGF)
SEQ ID NO: 19 ANMLCAGLe Sg GKDSCRGDSGGALV (núcleo de unión a serina proteasa) Descripción detallada
INHIBIDORES PEPTÍDICOS:
SEQ ID NO: 20 ADNc de longitud completa de MBL
SEC ID NO: 21 proteína de longitud completa de MBL
SEQ ID NO: 22 OGK-X-GP (unión a consenso)
SEQ ID NO: 23 OGKLG
SEQ ID NO: 24 GLR GLQ GPO GKL GPO G
SEQ ID NO: 25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO
SEQ ID NO: 26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOG
SEQ ID NO: 27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO (h-ficolina humana)
SEQ ID NO: 28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGA OGEO (ficolina p35 humana) SEQ ID NO: 29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI (sitio de escisión de C4)
INHIBIDORES DE EXPRESIÓN:
SEQ ID NO: 30 ADNc del dominio CUBI-EGF (nucleótidos 22-680 de la SEQ ID NO: 4)
SEQ ID NO: 31
5' CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC 3'
Nucleótidos 12-45 de la SEQ ID NO: 4 que incluyen el sitio de inicio de traducción MASP-2 (sentido)
SEQ ID NO: 32
5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3'
Nucleótidos 361-396 de la SEQ ID NO: 4 que codifican una región que comprende el sitio de unión a MASP-2 de MBL (sentido)
SEQ ID NO: 33
5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3'
Nucleótidos 610-642 de la SEQ ID NO: 4 que codifican una región que comprende el dominio CUBII
CEBADORES DE CLONACIÓN:
SEQ ID NO: 34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC (PCR en 5' para CUB)
SEQ ID NO: 35 GGAATTCCTAGGCTGCATA (PCR en 3' para CUB)
SEQ ID NO: 36 GGAATTCCTACAGGGCGCT (PCR en 3' para CUBIEGF)
SEQ ID NO: 37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT (PCR en 3' para CUBIEGFCUBII)
SEQ ID NO: 38-47 son cebadores de clonación para el anticuerpo humanizado SEQ ID NO: 48 es un enlace peptídico de 9 aa
VECTORES DE EXPRESIÓN:
SEQ ID NO: 49 es el inserto del minigén MASP-2
SEQ ID NO: 50 es el ADNc de MASP-2 murina
SEQ ID NO: 51 es la proteína MASP-2 murina (con líder)
SEQ ID NO: 52 es la proteína MASP-2 murina madura
SEQ ID NO: 53 el ADNc de MASP-2 de rata
SEQ ID NO: 54 es la proteína MASP-2 de rata (con líder)
SEQ ID NO: 55 es la proteína MASP-2 de rata madura
SEQ ID NO: 56-59 son los oligonucleótidos para la mutagénesis dirigida al sitio de MASP-2 humana usados para generar MASP-2A humana
SEQ ID NO: 60-63 son los oligonucleótidos para la mutagénesis dirigida al sitio de MASP-2 murina usados para generar MASP-2A murina
SEQ ID NO: 64-65 son los oligonucleótidos para la mutagénesis dirigida al sitio de MASP-2 de rata utilizados para generar MASP-2A de rata
SEQ ID NO: 66 ADN que codifica la región variable de cadena pesada (VH) de 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) (sin péptido señal)
SEQ iD NO: 67 polipéptido de región variable de cadena pesada (VH) de 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) SEQ ID NO: 68 polipéptido de región variable de cadena pesada (VH) de 17N16mc
SEQ ID NO: 69: ADN que codifica la región variable de cadena ligera (VL) de 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) SEQ ID NO: 70: polipéptido de región variable de cadena ligera (VL) de 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) SEQ ID NO: 71: polipéptido de región variable de cadena ligera (VL) de 17N16_dc17N9
Descripción detallada
La presente invención proporciona un agente inhibidor de MASP-2 para su uso en el tratamiento o la prevención de microangiopatía trombótica (MAT) secundaria por trasplante, en el que el trasplante es un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas, en el que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del agente inhibidor de MASP-2 en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar una MAT secundaria por trasplante en el que el agente inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo monoclonal anti-MASP-2, o fragmento del mismo que se une específicamente a una porción de SEQ ID NO: 6 e inhibe selectivamente la activación del complemento dependiente de MASP-2, en el que el anticuerpo monoclonal anti-MASP-2 o fragmento del mismo, comprende una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 70.
I. Definiciones
A menos que se defina específicamente en el presente documento, todas las expresiones usadas en el presente documento tienen el mismo significado que entenderían los expertos en la materia descrita en el presente documento. Las siguientes definiciones se describen con el fin de proporcionar claridad con respecto a las expresiones que se utilizan en la memoria descriptiva y las reivindicaciones para describir la presente invención.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "activación del complemento dependiente de MASP-2" comprende la activación de la ruta de la lectina dependiente de MASP-2, que ocurre en condiciones fisiológicas (es decir, en presencia de Ca++) que conduce a la formación de la C3 convertasa C4b2a de la ruta de la lectina y tras la acumulación del producto de escisión de C3 C3b posteriormente a la C5 convertasa C4b2a (C3b)n, que se ha determinado que causa principalmente opsonización.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "ruta alternativa" se refiere a la activación del complemento que se desencadena, por ejemplo, por cimosano de las paredes celulares de hongos y levaduras, lipopolisacárido (LPS) de membranas externas gramnegativas y eritrocitos de conejo, así como de muchos polisacáridos puros, eritrocitos de conejo, virus, bacterias, células tumorales animales, parásitos y células dañadas, y que tradicionalmente se ha pensado que surge de la generación proteolítica espontánea de C3b a partir del factor del complemento C3.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "ruta de la lectina" se refiere a la activación del complemento que se produce a través de la unión específica de proteínas de unión a hidratos de carbono séricas y no séricas, incluyendo la lectina de unión a manano (MBL), CL-11 y las ficolinas (H-ficolina, M-ficolina o L-ficolina).
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "ruta clásica" se refiere a la activación del complemento que es desencadenada por un anticuerpo unido a una partícula extraña y requiere la unión de la molécula de reconocimiento C1q.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "agente inhibidor de MASP-2" se refiere a cualquier agente que se une o interactúa directamente con MASP-2 e inhibe eficazmente la activación del complemento dependiente de MASP-2, incluyendo anticuerpos anti-MASP-2 y fragmentos de unión a MASP-2 de los mismos, péptidos naturales y sintéticos, moléculas pequeñas, receptores de MASP-2 solubles, inhibidores de la expresión e inhibidores naturales aislados, y también abarca péptidos que compiten con MASP-2 por unirse a otra molécula de reconocimiento (por ejemplo, MBL, H-ficolina, M-ficolina o L-ficolina) en la ruta de la lectina, pero no abarca anticuerpos que se unen a otras moléculas de reconocimiento. Los agentes inhibidores de MASP-2 útiles en el procedimiento descrito en el presente documento pueden reducir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en más de un 20 %, tal como más de un 50 %, tal como más de un 90 %. En un caso, el agente inhibidor de MASP-2 reduce la activación del complemento dependiente de MASP-2 en más de un 90 % (es decir, lo que da como resultado una activación del complemento MASP-2 de solo un 10 % o menos).
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" abarca anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de los mismos, procedentes de cualquier mamífero productor de anticuerpos (por ejemplo, ratón, rata, conejo y primate, incluyendo el ser humano), o de un hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante o animales transgénicos (u otros procedimientos de producción de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo"), que se unen específicamente a un polipéptido diana, tal como, por ejemplo, MASP-2, polipéptidos o porciones del mismo. No se pretende que el término "anticuerpo" se limite con respecto a la fuente del anticuerpo o la manera en que se produce (por ejemplo, mediante hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante, animal transgénico, síntesis de péptidos, etc.). Anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales y recombinantes; anticuerpos panespecífico, multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos específicos); anticuerpos humanizados; anticuerpos murinos; anticuerpos monoclonales quiméricos, ratón-ser humano, ratón-primate, primateser humano; y anticuerpos antidiotípicos, y puede ser cualquier anticuerpo inalterado o fragmento del mismo. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" abarca no solo anticuerpos policlonales o monoclonales inalterados, sino también fragmentos de los mismos (tales como dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), cadena simple (ScFv), variantes sintéticas de los mismos, variantes de origen natural, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo con un fragmento de unión a antígeno de la especificidad requerida, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio o fragmento de unión a antígeno (sitio de reconocimiento del epítopo) de la especificidad requerida.
Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población de anticuerpos homogénea en la que el anticuerpo monoclonal está compuesto por aminoácidos (de origen natural y no natural) que están implicados en la unión selectiva de un epítopo. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos para el antígeno diana. La expresión "anticuerpo monoclonal" abarca no solo anticuerpos monoclonales inalterados y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), cadena simple (ScFv), variantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de unión a antígeno, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un fragmento de unión a antígeno (sitio de reconocimiento del epítopo) de la especificidad y capacidad de unión a un epítopo requerida. No se pretende que esté limitado en cuanto a la fuente del anticuerpo o la forma en que se produce (por ejemplo, mediante hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante, animales transgénicos, etc.). La expresión incluye inmunoglobulinas completas así como los fragmentos, etc. descritos anteriormente bajo la definición de "anticuerpo".
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción procedente de o relacionada con un anticuerpo de longitud completa, tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti-MASP-2, incluyendo generalmente la región variable o de unión a antígeno del mismo. Ejemplos ilustrativos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 y Fv, fragmentos scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos monocatenarios y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Tal como se utiliza en el presente documento, un fragmento de anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" comprende los dominios Vh y Vl de un anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En general, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl, lo que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo quimérico" es una proteína recombinante que contiene los dominios variables y las regiones determinantes de complementariedad procedentes de un anticuerpo de una especie no humana (por ejemplo, roedor), mientras que el resto de la molécula de anticuerpo procede de un anticuerpo humano.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo quimérico que comprende una secuencia mínima que se ajusta a regiones determinantes de complementariedad específicas procedentes de inmunoglobulina no humana que se trasplanta a un marco de anticuerpo humano. Los anticuerpos humanizados son normalmente proteínas recombinantes en las que solo las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo son de origen no humano.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "lectina de unión a manano" ("MBL", por sus siglas en inglés) es equivalente a proteína de unión a manano ("MBP", por sus siglas en inglés).
Tal como se utiliza en el presente documento, el "complejo de ataque a membrana" ("MAC") se refiere a un complejo de los cinco componentes terminales del complemento (C5b combinado con C6, C7, C8 y C-9) que se inserta y rompe las membranas (también conocido como C5b-9).
Tal como se utiliza en el presente documento, "un sujeto" incluye todos los mamíferos, incluyendo, sin limitación, seres humanos, primates no humanos, perros, gatos, caballos, ovejas, cabras, vacas, conejos, cerdos y roedores.
Tal como se utiliza en el presente documento, los restos de aminoácidos se abrevian como sigue: alanina (Ala; A), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), arginina (Arg; R), cisteína (Cys; C), ácido glutámico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).
En el sentido de uso habitual, los aminoácidos de origen natural se pueden dividir en grupos basándose en las características químicas de la cadena lateral de los respectivos aminoácidos. Por aminoácido "hidrófobo" se entiende Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys o Pro. Por aminoácido "hidrófilo" se entiende Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg o His. Esta agrupación de aminoácidos puede subclasificarse adicionalmente como sigue. Por aminoácido "hidrófilo no cargado" se entiende Ser, Thr, Asn o Gln. Por aminoácido "ácido" se entiende Glu o Asp. Por aminoácido "básico" se entiende Lys, Arg o His.
Como se usa en el presente documento, la expresión "sustitución conservadora de aminoácidos" se ilustra mediante una sustitución entre aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina, y triptófano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina.
El término "oligonucleótido" como se usa en el presente documento se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o miméticos del mismo. Este término también cubre aquellas oligonucleobases compuestas de nucleótidos de origen natural, azúcares y enlaces internucleósidos covalentes (cadena principal) así como oligonucleótidos que tienen modificaciones de origen no natural.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "epítopo" se refiere al sitio en una proteína (por ejemplo, una proteína MASP-2 humana) que está unido mediante un anticuerpo. Los "epítopos superpuestos" incluyen al menos un (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis) resto(s) de aminoácidos comunes, incluyendo epítopos lineales y no lineales.
Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína" se usan indistintamente y significan cualquier cadena de aminoácidos unida a péptidos, independientemente de la extensión o modificación postraduccional. La proteína MASP-2 descrita en el presente documento puede contener o ser proteínas de tipo silvestre o pueden ser variantes que no tienen más de 50 (por ejemplo, no más de una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 50) sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las sustituciones conservadoras incluir normalmente sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina, glutamina, serina y treonina; lisina, histidina y arginina; y fenilalanina y tirosina.
En algunos casos, la proteína MASP-2 humana puede tener una secuencia de aminoácidos que es, o es mayor que, 70 (por ejemplo, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100) % idéntica a la proteína MASP-2 humana que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5.
En algunos casos, los fragmentos peptídicos pueden ser al menos 6 (por ejemplo, al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o 600 o más) restos de aminoácidos de longitud (por ejemplo, al menos 6 restos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 5). En algunos casos, un fragmento peptídico antigénico de una proteína MASP-2 humana es menos de 500 (por ejemplo, menos de 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 o 6) restos de aminoácidos en longitud (por ejemplo, menos de 500 restos de aminoácidos contiguos en una cualquiera de las SEQ ID NO: 5).
El porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos se define como el porcentaje de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los aminoácidos en una secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia se puede lograr de varias formas que están dentro de la experiencia en la materia, por ejemplo, utilizando programas informáticos de computadora disponibles públicamente tales como BLAST, BLAs T-2, ALINEAR, ALIGN-2 o el programa informático Megalign (DNASTAR). Se pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación en la longitud completa de las secuencias que se comparan, mediante procedimientos conocidos.
II. Visión General
Las lectinas (MBL, M-ficolina, H-ficolina, L-ficolina y CL-11) son las moléculas de reconocimiento específicas que desencadenan el sistema del complemento innato y el sistema incluye la ruta de iniciación de la lectina y el bucle de amplificación de la ruta terminal asociada que amplifica la activación iniciada por lectina de moléculas efectoras terminales del complemento. C1q es la molécula de reconocimiento específica que desencadena el sistema del complemento adquirido y el sistema incluye la ruta de iniciación clásica y el bucle de amplificación de la ruta terminal asociada que amplifica la activación iniciada por C1q de las moléculas efectoras terminales del complemento. Se refiere a estos dos principales sistemas de activación del complemento como el sistema del complemento dependiente de lectina y el sistema del complemento dependiente de C1q, respectivamente.
Además de su papel esencial en la defensa inmunitaria, el sistema del complemento contribuye al daño tisular en muchas afecciones clínicas. Por tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar inhibidores del complemento terapéuticamente eficaces para prevenir estos efectos secundarios. Con el reconocimiento de que es posible inhibir la ruta de la lectina mediada por MASP-2 mientras se deja inalterada la ruta clásica, se llega a la conclusión de que sería muy deseable inhibir específicamente solo el sistema de activación del complemento que causa una patología en particular sin suprimir por completo las capacidades de defensa inmunitaria del complemento. Por ejemplo, en enfermedades en las que la activación del complemento está mediada predominantemente por el sistema del complemento dependiente de lectina, sería ventajoso inhibir específicamente solo este sistema. Esto dejaría inalterado el sistema de activación del complemento dependiente de C1q para manejar el procesamiento del complejo inmunitario y ayudar en la defensa del hospedador contra la infección.
El componente de proteína preferido como diana en el desarrollo de agentes terapéuticos para inhibir específicamente el sistema del complemento dependiente de lectina es MASP-2. De todos los componentes proteicos conocidos del sistema del complemento dependiente de lectina (MBL, H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina, MASP-2, C2-C9, Factor B, Factor D, y properdina), solo MASP-2 es tanto exclusivo del sistema del complemento dependiente de lectina como necesario para que el sistema funcione. Las lectinas (MBL, H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina y CL-11) también son componentes únicos en el sistema del complemento dependiente de lectina. Sin embargo, la pérdida de uno cualquiera de los componentes de lectina no inhibiría necesariamente la activación del sistema debido a la redundancia de lectina. Sería necesario inhibir las cinco lectinas para garantizar la inhibición del sistema de activación del complemento dependiente de lectina. Además, dado que también se sabe que MBL y las ficolinas tienen actividad opsónica independiente del complemento, la inhibición de la función de la lectina daría como resultado la pérdida de este mecanismo de defensa beneficioso del hospedador contra la infección. Por el contrario, esta actividad opsónica de lectina independiente del complemento permanecería inalterada si MASP-2 fuera la diana inhibidora. Un beneficio adicional de MASP-2 como diana terapéutica para inhibir el sistema de activación del complemento dependiente de lectina es que la concentración plasmática de MASP-2 está entre las más bajas de cualquier proteína del complemento (“ 500 ng/ml); por lo tanto, en consecuencia, bajas concentraciones de inhibidores de alta afinidad de MASP-2 pueden ser suficientes para obtener una inhibición completa (Moller-Kristensen, M., y col., J. Immunol Methods 282:159-167, 2003).
III. EL PAPEL DE MASP-2 EN MICROANGIOPATÍAS TROMBÓTICAS Y PROCEDIMIENTOS TERAPÉUTICOS QUE UTILIZAN AGENTES INHIBIDORES DE MASP-2
Visión General
La microangiopatía trombótica (MAT) es una patología caracterizada por coágulos de sangre en vasos sanguíneos pequeños (Benz, K.; y col., Curr Opin Nephrol Hypertens 19(3):242-7 (2010)). Se cree que el estrés o la lesión del endotelio vascular subyacente es el factor principal. Los hallazgos clínicos y de laboratorio de MAT incluyen trombocitopenia, anemia, púrpura e insuficiencia renal. Las MAT clásicas son el síndrome urémico hemolítico (SUH) y la púrpura trombocitopénica trombótica (PTT). La característica patológica subyacente característica de las MAT es la activación plaquetaria y la formación de microtrombos en las pequeñas arteriolas y vénulas. La activación del complemento iniciada, al menos en parte, por una lesión o estrés en el endotelio microvascular, también está implicada en otras MAT, incluyendo el síndrome antifosfolipídico catastrófico (SAFC), enfermedad de Degos sistémica y MAT secundarias por cáncer, quimioterapia contra el cáncer y trasplantes.
Estudios de pacientes con deficiencias genéticas en componentes específicos del complemento describen pruebas directas de una función patológica del complemento en una serie de nefríticas. Varios informes han documentado una asociación de lesión renal con deficiencias del factor H regulador del complemento (Ault, B.H., Nephrol. 14:1045-1053, 2000; Levy, M., y col., Kidney Int. 30:949-56, 1986; Pickering, M.C., y col., Nat. Genet. 31:424-8, 2002). La deficiencia de factor H da como resultado niveles plasmáticos bajos de factor B y C3 debido al consumo relacionado con la activación de estos componentes. Los niveles circulantes de C5b-9 también están elevados en el suero de estos pacientes, lo que implica activación del complemento. La glomerulonefritis membranoproliferativa (GNMP) y el síndrome urémico hemolítico (SUH) idiopático se asocian con la deficiencia de factor H o mutaciones del factor H. Cerdos con deficiencia de factor H (Jansen, J.H., y col., Kidney Int. 53:331-49, 1998) y ratones inactivados para el factor H (Pickering, MC, 2002) muestran síntomas similares a GNMP, confirmando la importancia del factor H en la regulación del complemento. Las deficiencias de otros componentes del complemento están asociadas con enfermedad renal, secundaria al desarrollo de lupus eritematoso sistémico (LES) (Walport, M.J., Davies, y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 815:267-81, 1997). La deficiencia de C1q, C4 y C2 predispone fuertemente al desarrollo de LES a través de mecanismos relacionados con el aclaramiento defectuoso de complejos inmunitarios y material apoptótico. En muchos de estos pacientes con LES se produce nefritis lúpica, caracterizada por el depósito de complejos inmunitarios en todo el glomérulo.
SUHa
El síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa) es parte de un grupo de afecciones denominadas "microangiopatías trombóticas". En la forma atípica de SUH (SUHa), la enfermedad se asocia con una regulación defectuosa del complemento y puede ser esporádica o hereditaria. Los casos hereditarios de SUHa se asocian con mutaciones en genes que codifican la activación del complemento o proteínas reguladoras del complemento, incluyendo el factor H, factor I, factor B del complemento, el cofactor de membrana CD46, así como la proteína 1 relacionada con el factor H del complemento (CFHR1, por sus siglas en inglés) y la proteína 3 relacionada con el factor H del complemento (CFHR3, por sus siglas en inglés). (Zipfel, P.F., y col., PloS Genetics 3(3):e41 (2007)). La característica unificadora de esta diversa gama de mutaciones genéticas asociadas con el SUHa es una predisposición a la activación mejorada del complemento en las superficies celulares o tisulares. Por tanto, un ejemplo descrito en el presente documento comprende tratar a un paciente que padece SUHa asociado con una deficiencia del factor H mediante la administración de una cantidad eficaz de un agente inhibidor de MASP-2. Otro ejemplo descrito en el presente documento comprende tratar a un paciente que padece SUH asociado con una deficiencia del factor I, factor B, cofactor de membrana CD46, CFHR1 o CFHR3 mediante la administración de una cantidad eficaz de un agente inhibidor de MASP-2.
Recientemente se ha logrado un progreso significativo hacia la comprensión de la fisiopatología molecular subyacente a la activación mejorada del complemento en el SUHa causada por el conjunto diverso de factores del complemento mutantes. Este mecanismo se comprende mejor para las mutaciones del factor H. El factor H es una proteína sérica abundante que comprende 20 dominios de repetición consenso corta (RCC) que actúa como un regulador negativo de la activación del complemento tanto en solución como en la superficie de células hospedadoras. Se dirige a la forma activada de C3 y, junto con el factor I y otros cofactores, promueve su inactivación, previniendo una mayor activación del complemento. Para controlar eficazmente la activación del complemento en superficies de células hospedadoras, el factor H necesita interactuar con células hospedadoras, que está mediado por los dominios RCC 16­ 20. Todas las mutaciones del factor H asociadas con el SUHa descritas hasta la fecha se agrupan en la región C-terminal que abarca los dominios (RCC) 16-20. Estas proteínas mutantes del factor H son completamente funcionales para controlar la activación de C3 en solución, pero no son capaces de interactuar con las superficies de células hospedadoras y, en consecuencia, no pueden controlar la activación de C3 en las superficies celulares (Exp Med 204(6): 1249-56 (2007)). Por tanto, determinadas mutaciones del factor H están asociadas con el SUHa porque la proteína del factor H mutante no interactúa con las superficies de células hospedadoras y, por lo tanto, no puede modular de manera eficaz la activación del complemento en superficies de células hospedadoras, incluyendo el endotelio microvascular. Como resultado, una vez que se ha producido la activación inicial de C3, la activación posterior del complemento en las superficies endoteliales microvasculares continúa sin cesar en pacientes con mutaciones del factor H. Esta activación incontrolada del complemento finalmente conduce a una lesión progresiva del endotelio vascular, posterior agregación plaquetaria y coagulación microvascular, y hemólisis causada por el estrés puro del paso de los eritrocitos a través de microvasos parcialmente ocluidos. Por tanto, las manifestaciones de la enfermedad SUHa y los hallazgos clínicos y de laboratorio están directamente relacionados con un defecto en la regulación negativa del complemento en la superficie del endotelio microvascular.
De manera análoga a la mutación del factor H, las mutaciones de pérdida de función en los moduladores negativos del complemento, el factor I y la proteína cofactor de membrana (CD46), también están relacionadas a SUHa. Se ha observado lo contrario para el factor B, la proteína C3, ya que se encontró que el SUHa estaba asociado con mutaciones de ganancia de función en estas proteínas (Pediatr Nephrol 25(12):2431-42 (2010)). Por tanto, una gran cantidad de datos convergentes implican la activación del complemento en la patogenia del SUHa. Esta noción está respaldada de manera más convincente por la eficacia terapéutica de eculizumab, un anticuerpo monoclonal que bloquea la proteína C5 del complemento terminal en el tratamiento del SUHa.
Si bien el papel central del complemento como mecanismo efector en el SUHa está ampliamente aceptado, los desencadenantes que inician la activación del complemento y las rutas moleculares implicadas están sin resolver. No todos los individuos portadores de las mutaciones descritas anteriormente desarrollan el SUHa. De hecho, estudios hereditarios han sugerido que la penetrancia del SUHa es solo ~ 50 % (Ann Hum Genet 74(1):17-26 (2010)). La historia natural de la enfermedad sugiere que el SUHa se desarrolla con mayor frecuencia después de un evento iniciador, tal como un episodio infeccioso o una lesión. Se sabe que los agentes infecciosos activan el sistema del complemento. En ausencia de inmunidad adaptativa existente previamente, la activación del complemento mediante agentes infecciosos puede iniciarse principalmente a través de la ruta de la lectina. Por tanto, la activación de la ruta de la lectina desencadenada por una infección puede representar el desencadenante de inicio para la posterior amplificación patológica de la activación del complemento en individuos predispuestos al SUHa, que en última instancia puede conducir a la progresión de la enfermedad. En consecuencia, otro ejemplo descrito en el presente documento comprende tratar a un paciente que padece SUHa secundario por una infección mediante la administración de una cantidad eficaz de un agente inhibidor de MASP-2.
Otras formas de lesión del tejido del hospedador activarán el complemento a través de la ruta de la lectina, en particular, lesión del endotelio vascular. Las células endoteliales vasculares humanas sujetas a estrés oxidativo, por ejemplo, responden mediante la expresión de fracciones de superficie que se unen a lectinas y activan la ruta de la lectina del complemento (Am J. Pathol 156(6):1549-56 (2000)). La lesión vascular después de isquemia/reperfusión también activa el complemento a través de la ruta de la lectina in vivo (Scand J Immunol 61(5):426-34 (2005)). La activación de la ruta de la lectina en este entorno tiene consecuencias patológicas para el hospedador, y la inhibición de la ruta de la lectina mediante el bloqueo de MASP-2 previene una lesión adicional del tejido del hospedador y resultados adversos (Schwaeble PNAS 2011).
Por tanto, también se sabe que otros procedimientos que precipitan el SUHa activan la ruta de la lectina del complemento. Por lo tanto, es probable que la ruta de la lectina pueda representar el mecanismo de activación del complemento inicial que se amplifica inapropiadamente de manera desregulada en individuos genéticamente predispuestos al SUHa, iniciando así la patogenia del SUHa. Por inferencia, se espera que agentes que bloquean la activación del complemento a través de la ruta de la lectina, incluyendo anticuerpos anti-MASP-2, prevengan la progresión de la enfermedad o reduzcan el empeoramiento en individuos susceptibles al SUHa.
En apoyo adicional de este concepto, estudios recientes han identificado S. neumonía como agente etiológico importante en casos pediátricos de SUHa. (Nephrology (Carlton), 17:48-52 (2012); Pediatr Infect Dis J. 30(9):736-9 (2011)). Este origen particular parece tener un pronóstico desfavorable, con mortalidad significativa y morbilidad a largo plazo. De forma notable, estos casos implicaron infecciones no entéricas que llevaron a manifestaciones de microangiopatía, uremia y hemólisis sin evidencia de mutaciones concurrentes en genes del complemento que se sabe que predisponen al SUHa. Es importante observar que S. neumonía es particularmente eficaz para activar el complemento y lo hace predominantemente a través de la ruta de la lectina. Por tanto, en casos de s Uh no entérico asociado con infección neumocócica, se espera que las manifestaciones de microangiopatía, uremia y hemólisis sean impulsadas predominantemente por la activación de la ruta de la lectina, y los agentes que bloquean la ruta de la lectina, incluyendo anticuerpos anti-MASP-2, se espera que prevengan la progresión del SUHa o reduzca la gravedad de la enfermedad en estos pacientes. En consecuencia, otro ejemplo descrito en el presente documento comprende tratar a un paciente que padece SUHa no entérico que está asociado con una infección por S. pneumonia mediante la administración de una cantidad eficaz de un agente inhibidor de MASP-2.
De acuerdo con lo anterior, en algunos casos, en el contexto de un sujeto en riesgo de desarrollar insuficiencia renal asociada con SUHa, se describe un procedimiento para disminuir la probabilidad de desarrollar SUHa, o de desarrollar insuficiencia renal asociada con SUHa, que comprende administrar una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 durante un período de tiempo eficaz para mejorar o prevenir la insuficiencia renal en el sujeto. En algunos casos, el procedimiento comprende además la etapa de determinar si un sujeto está en riesgo de desarrollar SUHa antes de la aparición de cualquier síntoma asociado con el SUHa. En otros casos, el procedimiento comprende determinar si un sujeto tiene riesgo de desarrollar SUHa tras la aparición de al menos uno o más síntomas indicativos de SUHa (por ejemplo, la presencia de anemia, trombocitopenia y/o insuficiencia renal) y/o la presencia de microangiopatía trombótica en una biopsia obtenida del sujeto. La determinación de si un sujeto está en riesgo de desarrollar SUHa comprende determinar si el sujeto tiene una predisposición genética a desarrollar SUHa, que puede llevarse a cabo mediante la evaluación de información genética (por ejemplo, de una base de datos que contiene el genotipo del sujeto), o la realización de al menos una prueba de detección genética en el sujeto para determinar la presencia o ausencia de un marcador genético asociado con el SUHa (es decir, determinar la presencia o ausencia de una mutación genética asociada con el SUHa en los genes que codifican el factor H del complemento (FHC), factor I (FIC), factor B (FBC), cofactor de membrana CD46, C3, proteína 1 relacionada con el factor H del complemento (CFHR1), o THBD (que codifica la proteína anticoagulante trombodulina) o proteína 3 relacionada con el factor H del complemento (CFHR3), o proteína 4 relacionada con el factor H del complemento (CFHR4)) ya sea mediante secuenciación del genoma o análisis específico de genes (por ejemplo, análisis de PCR) y/o determinar si el sujeto tiene antecedentes hereditarios de SUHa. Los procedimientos de detección genética para la presencia o ausencia de una mutación genética asociada con el SUHa están bien establecidos, por ejemplo, véase Noris M y col. "Atypica1Hemolytic-Uremic Syndrome", 16 de noviembre de 2007 [actualizado el 10 de marzo de 2011]. en: Pagon RA, Bird TD, Dolan CR, y col., editores. GeneReviews™, Seattle (WA): Universidad de Washington, Seattle.
Por ejemplo, en general, la penetrancia de la enfermedad en aquellos con mutaciones del factor H del complemento (FHC) es de un 48 % y la penetrancia de las mutaciones en CD46 es de un 53 %, para mutaciones en el FIC es 50 %, para mutaciones en C3 es 56 % y para mutaciones en THBD es 64 % (Caprioli J. y col., Blood, 108:1267-79 (2006); Noris y col., Clin J Am Soc Nephrol 5:1844-59 (2010)). Como se describe en Caprioli y col., (2006), supra, un número sustancial de individuos con una mutación en el factor H del complemento (FHC) nunca desarrollan SUHa, y se postula que la actividad del FHC subóptima en estos individuos es suficiente para proteger al hospedador de los efectos de la activación del complemento en condiciones fisiológicas, sin embargo, la actividad subóptima del FHC no es suficiente para evitar que el C3b se deposite en células endoteliales vasculares cuando la exposición a un agente que activa el complemento produce cantidades de C3b superiores a las normales.
En consecuencia, en un caso, se describe un procedimiento para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar un síndrome urémico hemolítico atípico no dependiente del factor H, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2. En otro caso, se describe un procedimiento para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto en riesgo de desarrollar síndrome urémico hemolítico atípico dependiente del factor H, que comprende controlar periódicamente al sujeto para determinar la presencia o ausencia de anemia, trombocitopenia o aumento de creatinina, y tratarle con un agente inhibidor de MASP-2 tras la determinación de la presencia de anemia, trombocitopenia o aumento de creatinina. En otro caso, se describe un procedimiento para reducir la probabilidad de que un sujeto en riesgo de desarrollar SUHa dependiente del factor H sufra síntomas clínicos asociados con SUHa, que comprende administrar un agente inhibidor de MASP-2 antes, durante o después de un evento conocido por estar asociado con el desencadenamiento de síntomas clínicos del SUHa, por ejemplo, exposición a fármacos (por ejemplo, quimioterapia), infección (por ejemplo, infección bacteriana), neoplasia maligna, una herida, trasplante de órganos o tejidos, o embarazo.
En un caso, se describe un procedimiento para reducir la probabilidad de que un sujeto en riesgo de desarrollar SUHa sufra síntomas clínicos asociados con el SUHa, que comprende controlar periódicamente al sujeto para determinar la presencia o ausencia de anemia, trombocitopenia o aumento de creatinina, y tratarle con un agente inhibidor de MASP-2 tras la determinación de la presencia de anemia, trombocitopenia o aumento de creatinina.
En otro caso, se describe un procedimiento para reducir la probabilidad de que un sujeto en riesgo de desarrollar SUHa sufra síntomas clínicos asociados con el SUHa que comprende administrar un agente inhibidor de MASP-2 antes, durante o después de un evento conocido por estar asociado con el desencadenamiento de síntomas clínicos del SUHa, por ejemplo, exposición a fármacos (por ejemplo, quimioterapia), infección (por ejemplo, infección bacteriana), neoplasia maligna, una herida, trasplante de órganos o tejidos, o embarazo.
En algunos casos, el agente inhibidor de MASP-2 se administra durante un período de tiempo de al menos uno, dos, tres, cuatro días o más, antes de, durante o después del evento asociado con el desencadenamiento de los síntomas clínicos del SUHa y puede repetirse según lo determine un médico hasta que la afección se haya resuelto o controlado. En un entorno previo al SUHa, el agente inhibidor de MASP-2 se puede administrar al sujeto sistémicamente, tal como mediante administración intrarterial, intravenosa, intramuscular, inhalatoria, nasal, subcutánea u otra parenteral.
En algunos casos, en el contexto del diagnóstico inicial del SUHa, o en un sujeto que presenta uno o más síntomas coherentes con un diagnóstico de SUHa (por ejemplo, la presencia de anemia, trombocitopenia y/o insuficiencia renal), el sujeto se trata con una cantidad eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-MASP-2) como terapia de primera línea en ausencia de plasmaféresis o en combinación con plasmaféresis. Como terapia de primera línea, el agente inhibidor de MASP-2 se puede administrar al sujeto sistémicamente, tal como mediante administración intrarterial, intravenosa, intramuscular, inhalatoria, nasal, subcutánea u otra parenteral. En algunos casos, el agente inhibidor de MASP-2 se administra a un sujeto como terapia de primera línea en ausencia de plasmaféresis para evitar las posibles complicaciones de la plasmaféresis, que incluyen hemorragia, infección y exposición a trastornos y/o alergias inherentes al donante del plasma, o en un sujeto que de otra manera se opone a la plasmaféresis, o en un entorno en el que la plasmaféresis no está disponible.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar un agente inhibidor de MASP-2 a un sujeto que padece SUHa a través de un catéter (por ejemplo, por vía intravenosa) durante un primer período de tiempo (por ejemplo, al menos un día a una semana o dos semanas) seguido de la administración de un agente inhibidor de MASP-2 al sujeto por vía subcutánea durante un segundo período de tiempo (por ejemplo, una fase crónica de al menos dos semanas o más). En algunos casos, la administración en el primer y/o segundo período de tiempo se produce en ausencia de plasmaféresis. En algunos casos, el procedimiento comprende además determinar el nivel de al menos un factor del complemento (por ejemplo, C3, C5) en el sujeto antes del tratamiento y, opcionalmente, durante el tratamiento, en el que la determinación de un nivel reducido de al menos un factor del complemento en comparación con un valor estándar o un sujeto de control sano es indicativo de la necesidad de un tratamiento continuo con el agente inhibidor de MASP-2.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar un agente inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo anti-MASP-2, a un sujeto que padece, o está en riesgo de desarrollar, SUHa ya sea por vía intravenosa, por vía intramuscular o, preferentemente, por vía subcutánea. El tratamiento puede ser crónico y administrarse de diariamente o mensualmente, pero preferentemente cada dos semanas. El anticuerpo anti-MASP-2 se puede administrar solo o en combinación con un inhibidor de C5, tal como eculizamab.
SUH
Como el SUH atípico, la forma normal del SUH muestra todos los hallazgos clínicos y de laboratorio de una MAT. El SUH normal, sin embargo, es a menudo una enfermedad pediátrica y no suele tener un componente hereditario ni una asociación directa con mutaciones en los genes del complemento. El origen del SUH normal está estrechamente relacionada con la infección por determinados patógenos intestinales. Los pacientes presentar normalmente insuficiencia renal aguda, hemoglobinuria y trombocitopenia, que suele seguir a un episodio de diarrea sanguinolenta. La afección es causada por una infección entérica con Shigella dissenteria, Salmonella o cepas enterohemorrágicas productoras de toxina semejante a shiga de E. co lital como O157:H7 de E. coli. Los patógenos se adquieren a partir de alimentos o agua contaminados. El SUH es una emergencia médica y conlleva una mortalidad del 5 al 10 %. Una parte importante de los supervivientes desarrollan enfermedad renal crónica (Corrigan y Boineau, Pediatr Rev 22 (11): 365-9 (2011)) y pueden requerir un trasplante de riñón.
La coagulación microvascular en el SUH normal ocurre predominantemente, aunque no exclusivamente, en la microvasculatura renal. La fisiopatología subyacente está mediada por la toxina Shiga (TXS). Excretada por microbios enteropáticos en la luz intestinal, la TXS atraviesa la barrera intestinal, ingresa al torrente sanguíneo y se une a células endoteliales vasculares a través del receptor CD77 de blobotriaosil ceramida (Boyd y Lingwood Nephron 51:207 (1989)), que se expresa preferentemente en el endotelio glomerular y media el efecto tóxico de la TXS. Una vez unida al endotelio, la TXS induce una serie de eventos que dañan el endotelio vascular, activa leucocitos y causa la formación de trombos dependientes del FvW (Forsyth y col., Lancet 2: 411-414 (1989); Zoja y col., Kidney Int. 62: 846-856 (2002); Zanchi y col., J. Immunol. 181:1460-1469 (2008); Morigi y col., Blood 98: 1828-1835 (2001); Guessou y col., Infect. Immun., 73: 8306-8316 (2005)). Estos microtrombos obstruyen u ocluyen las arteriolas y capilares del riñón y otros órganos. La obstrucción del flujo sanguíneo en arteriolas y capilares por microtrombos aumenta la fuerza de cizallamiento aplicada a los eritrocitos cuando se aprietan a través de los vasos sanguíneos estrechados. Esto puede dar como resultado la destrucción de los eritrocitos por la fuerza de cizallamiento y la formación de fragmentos de eritrocitos llamados esquistocitos. La presencia de esquistocitos es un hallazgo característico del SUH. Este mecanismo se conoce como hemólisis microangiopática. Además, la obstrucción del flujo sanguíneo da como resultado isquemia, iniciando una respuesta inflamatoria mediada por el complemento que causa daño adicional al órgano afectado.
La ruta de la lectina del complemento contribuye a la patogenia del SUH mediante dos mecanismos principales: 1) activación directa mediada por MASP-2 de la cascada de coagulación provocada por lesión endotelial, y 2) activación posterior del complemento mediada por lectina inducida por la isquemia resultante de la oclusión inicial del flujo sanguíneo microvascular.
La TXS daña células endoteliales microvasculares y se sabe que las células endoteliales lesionadas activan el sistema del complemento. Como se detalla anteriormente, la activación del complemento que sigue a la lesión de células endoteliales se impulsa predominantemente por la ruta de la lectina. Las células endoteliales vasculares humanas sujetas a estrés oxidativo responden mediante la expresión de fracciones de superficie que se unen a lectinas y activan la ruta de la lectina del complemento (Collard y col., Am J Pathol. 156(5):1549-56 (2000)). La lesión vascular después de la reperfusión por isquemia también activa el complemento a través de la ruta de la lectina in vivo (Scand J Immunol 61(5):426-34 (2005)). La activación de la ruta de la lectina en este entorno tiene consecuencias patológicas para el hospedador, y la inhibición de la ruta de la lectina mediante el bloqueo de MASP-2 previene una lesión tisular adicional del hospedador y resultados adversos (Schwaeble y col., PNAS (2011)). Además de la activación del complemento, se ha demostrado que la activación de MASP-2 dependiente de lectina da como resultado la escisión de protrombina para formar trombina y promover la coagulación. Por tanto, la activación de la ruta de la lectina del complemento mediante células endoteliales lesionadas puede activar directamente el sistema de coagulación. La ruta de la lectina del complemento, en virtud de la activación de protrombina mediada por MASP-2, es, por lo tanto, probablemente la ruta molecular dominante que une la lesión endotelial inicial por la TXS con la coagulación y la trombosis microvascular que ocurre en el SUH. Por tanto, se espera que inhibidores de la ruta de la lectina, incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos que bloquean la función MASP-2, prevengan o mitiguen la coagulación microvascular, trombosis y hemólisis en pacientes que padecen el SUH. De hecho, la administración de anticuerpo anti-MASP-2 protege profundamente a los ratones en un modelo de SUH normal. Como se describe en el Ejemplo 36 y se muestra en la FIGURA 45, todos los ratones de control expuestos a TXS y LPS desarrollaron SUH grave y se volvieron moribundos o murieron en 48 horas. Por otro lado, como se muestra además en la FIGURA 45, todos los ratones tratados con un anticuerpo anti-MASP-2 y luego expuestos a TXS y LPS sobrevivieron (prueba exacta de Fisher p < 0,01; N = 5). Por tanto, la terapia anti-MASP-2 protege profundamente a los ratones en este modelo de SUH. Se espera que la administración de un agente inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo MASP-2, será eficaz en el tratamiento de pacientes con SUH y proporcionará protección contra la coagulación microvascular, trombosis y hemólisis causada por infección con E. coli enteropática u otros patógenos productores de TXS.
Si bien se muestra en el presente documento para el SUH causado por TXS, se espera que la terapia anti-MASP-2 también sea beneficiosa para los síndromes similares al SUH debido a la lesión endotelial causada por otros agentes tóxicos. Esto incluye agentes tales como mitomicina, ticlopidina, cisplatino, quinina, ciclosporina, bleomicina, así como otros fármacos de quimioterapia e inmunodepresores. Por tanto, se espera que la terapia con anticuerpos anti-MASP-2, u otras modalidades que inhiban la actividad de MASP-2, evitará o limitará eficazmente la coagulación, formación de trombos y destrucción de eritrocitos y evitará insuficiencia renal en SUH y otras enfermedades relacionadas con la MAT (es decir,, SUHa y PTT).
Los pacientes que padecen SUH suelen presentar diarrea y vómitos, sus recuentos de plaquetas generalmente se reducen (trombocitopenia) y los eritrocitos se reducen (anemia). Una fase de diarrea previa al SUH suele durar unos cuatro días, durante los cuales los sujetos en riesgo de desarrollar SUH presentan normalmente uno o más de los siguientes síntomas además de la diarrea intensa: un nivel de hematocrito por debajo del 30 % con pruebas de frotis de destrucción de eritrocitos intravascular, trombocitopenia (recuento de plaquetas < 150 x 103/ mm3) y/o la presencia de insuficiencia renal alterada (concentración de creatinina sérica mayor que el límite superior del intervalo de referencia para la edad). La presencia de oligoanuria (diuresis < 0,5 ml/kg/h durante > 1 día) se puede utilizar como una medida de la progresión hacia el desarrollo del SUH (véase C. Hickey y col., Arch Pediatr Adolesc Med 165(10):884-889 (2011)). Las pruebas se realizan normalmente para detectar la presencia de infección con bacterias E. coli (O157:H7 de E. coli), o especies de Shigella o Salmonella. En un sujeto con resultado positivo para la infección por E. coli enterogénica (por ejemplo, 0157:H7 de E. coli), el uso de antibióticos está contraindicado porque el uso de antibióticos puede aumentar el riesgo de desarrollar SUH a través del aumento de la producción de tXs (Véase Wong C. y col., N Engl J. Med 342:1930-1936 (2000). Para sujetos que dieron positivo en Shigella o Salmonella, normalmente se administran antibióticos para eliminar la infección. Otra terapia de primera línea bien establecida para el SUH incluye expansión de volumen, diálisis y plasmaféresis.
De acuerdo con lo anterior, en algunos casos, en el contexto de un sujeto que padece uno o más síntomas asociados con una fase previa al SUH y en riesgo de desarrollar SUH (es decir, el sujeto exhibe uno o más de los siguientes: diarrea, un nivel de hematocrito inferior al 30 % con prueba de frotis de destrucción intravascular de eritrocitos, trombocitopenia (recuento de plaquetas inferior a 150 x 103/ mm3) y/o la presencia de insuficiencia renal alterada (concentración de creatinina sérica mayor que el límite superior del intervalo de referencia para la edad), se describe un procedimiento para disminuir el riesgo de desarrollar SUH, o para disminuir la probabilidad de insuficiencia renal en el sujeto, que comprende administrar una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 durante un período de tiempo eficaz para mejorar o prevenir el deterioro de la función renal. En algunos casos, el agente inhibidor de MASP-2 se administra durante un período de tiempo de al menos uno, dos, tres, cuatro o más días, y puede repetirse según lo determine un médico hasta que la afección se haya resuelto o controlado. En un entorno previo al SUH, el agente inhibidor de MASP-2 se puede administrar al sujeto sistémicamente, tal como mediante administración intrarterial, intravenosa, intramuscular, inhalatoria, nasal, oral, subcutánea u otra parenteral.
El tratamiento de la infección por 0157:H7 de E. coli con antibióticos bactericidas, particularmente p-lactámicos, se ha asociado con un mayor riesgo de desarrollar SUH (Smith y col., Pediatr Infect Dis J 31(1):37-41 (2012). En algunos casos, en el contexto de un sujeto que padece síntomas asociados con una fase previa al SUH, en el que se sabe que el sujeto tiene una infección por E. coli enterogénica para los cuales el uso de antibióticos está contraindicado (por ejemplo, 0157:H7 de E. coli), se describe un procedimiento para disminuir el riesgo de desarrollar SUH, o de disminuir la probabilidad de insuficiencia renal en el sujeto, que comprende administrar una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 durante un primer período de tiempo eficaz para inhibir o prevenir la presencia de oligoanuria en el sujeto (por ejemplo, al menos uno, dos, tres o cuatro días), en el que la administración del agente inhibidor de MASP-2 durante el primer período de tiempo ocurre en ausencia de un antibiótico. En algunos casos, el procedimiento comprende además administrar el agente inhibidor de MASP-2 al sujeto en combinación con un antibiótico durante un segundo período de tiempo (tal como al menos una a dos semanas).
En otros casos, en el contexto de un sujeto que padece síntomas asociados con una fase previa al SUH, en el que se sabe que el sujeto tiene una infección con Shigella o Salmonella, se describe un procedimiento para disminuir el riesgo de desarrollar SUH, o para disminuir la probabilidad de insuficiencia renal en el sujeto, que comprende administrar una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 y durante un período de tiempo eficaz para inhibir o prevenir la presencia de oligoanuria en el sujeto, en el que la administración del agente inhibidor de MASP-2 es en presencia o en ausencia de un antibiótico adecuado.
En algunos casos, en el contexto de un diagnóstico inicial de SUH, o en un sujeto que presenta uno o más síntomas coherentes con un diagnóstico de SUH (por ejemplo, la presencia de insuficiencia renal o anemia hemolítica microangiopática en ausencia de fibrinógeno bajo o trombocitopenia) el sujeto se trata con una cantidad eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-MASP-2) como terapia de primera línea en ausencia de plasmaféresis o en combinación con plasmaféresis. Como terapia de primera línea, el agente inhibidor de MASP-2 se puede administrar al sujeto sistémicamente, tal como mediante administración intrarterial, intravenosa, intramuscular, inhalatoria, nasal, subcutánea u otra parenteral. En algunos casos, el agente inhibidor de MASP-2 se administra a un sujeto como terapia de primera línea en ausencia de plasmaféresis para evitar las complicaciones de la plasmaféresis tales como hemorragia, infección y exposición a trastornos y/o alergias inherentes al donante del plasma, o en un sujeto que de otra manera se opone a la plasmaforesis, o en un entorno en el que la plasmaféresis no está disponible.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar un agente inhibidor de MASP-2 a un sujeto que padece SUH a través de un catéter (por ejemplo, por vía intravenosa) durante un primer período de tiempo (por ejemplo, una fase aguda que dura al menos un día a una semana o dos semanas) seguido de la administración de un agente inhibidor de MASP-2 al sujeto por vía subcutánea durante un segundo período de tiempo (por ejemplo, una fase crónica de al menos dos semanas o más). En algunos casos, la administración en el primer y/o segundo período de tiempo se produce en ausencia de plasmaféresis. En algunos casos, el procedimiento comprende además determinar el nivel de al menos un factor del complemento (por ejemplo, C3, C5) en el sujeto antes del tratamiento y, opcionalmente, durante el tratamiento, en el que la determinación de un nivel reducido del al menos un factor del complemento en comparación con un valor estándar o un sujeto de control sano es indicativo de la necesidad de tratamiento, y en el que la determinación de un nivel normal es indicativo de mejora.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar un agente inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo anti-MASP-2, a un sujeto que padece, o está en riesgo de desarrollar, SUH por vía subcutánea o intravenosa. El tratamiento es preferentemente diario, pero puede ser tan poco frecuente como semanal o mensual. El tratamiento continuará durante al menos una semana y hasta 3 meses. El anticuerpo anti-MASP-2 se puede administrar solo o en combinación con un inhibidor de C5, tal como eculizamab.
PTT:
La púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) es un trastorno potencialmente mortal del sistema de coagulación sanguíneo, causada por disfunciones autoinmunitarias o hereditarias que activan la cascada de la coagulación o el sistema del complemento (George, JN, N Engl J Med; 354:1927-35 (2006)). Esto da como resultado numerosos coágulos microscópicos o trombosis, en pequeños vasos sanguíneos de todo el cuerpo. Los glóbulos rojos están sujetos a una fuerza de cizallamiento que daña sus membranas, que conduce a la hemólisis intravascular. El flujo sanguíneo reducido resultante y la lesión endotelial dan como resultado daño orgánico, incluyendo el cerebro, corazón y riñones. La PTT se caracteriza clínicamente por trombocitopenia, anemia hemolítica microangiopática, cambios neurológicos, insuficiencia renal y fiebre. En la era anterior a la plasmaféresis, la tasa de letalidad era de un 90 % durante los episodios agudos. Incluso con plasmaféresis, la supervivencia a los seis meses es de aproximadamente un 80 %.
La PTT puede surgir de la inhibición genética o adquirida de la enzima ADAMTS-13, una metaloproteasa responsable de escindir grandes multímeros del factor von Willebrand (FvW) en unidades más pequeñas. La inhibición o deficiencia de ADAMTS-13 finalmente da como resultado un aumento de la coagulación (Tsai, H. J Am Soc Nephrol 14:1072-1081, (2003)). La ADAMTS-13 regula la actividad del FvW; en su ausencia, el FvW forma grandes multímeros que tienen más probabilidades de unirse a plaquetas y predispone a los pacientes a la agregación plaquetaria y a la trombosis en la microvasculatura.
El síndrome de Upshaw-Schulman (SUS, también descrito como PTT congénita) es una deficiencia congénita de la actividad de ADAMTS13 debido a mutaciones del gen ADAMTS13 (Schulman y col., Blood, 16(1):943-57, 1960; Upshaw y col., New Engl. J. Med, 298 (24):1350-2, 1978). Se han identificado numerosas mutaciones en ADAMTS13 en individuos con PTT congénita (Kinoshita y col., International Journal of Hematology, 74:101-108 (2001); Levy y col., Nature, 413 (6855):488-494 (2001); Kokame y col., PNAS 99(18):11902-11907 (2002); Savasan y col., Blood, 101:4449-4451 (2003); Matsumoto y col., Blood, 103:1305-1310 (2004) y Fujimura y col., Brit. J. Haemat 144:742-754 (2008)). Los sujetos con SUS suelen tener un 5-10 % de la actividad normal de ADAMTS13 (Kokame y col., PNAS 99(18):11902-11907, 2002). Aunque la PTT y el SUS adquiridos tienen algunas similitudes, el SUS tiene algunas diferencias importantes en las características clínicas. El SUS generalmente se presenta en la infancia o la niñez y se caracteriza por hiperbilirrubinemia intensa con prueba de Coombs negativa poco después del nacimiento, respuesta a la infusión de plasma fresco y recaídas frecuentes (Savasan y col., Blood, 101:4449-4451,2003). En algunos casos, los pacientes con esta deficiencia hereditaria de ADAMTS13 tienen un fenotipo leve al nacer y solo desarrollan síntomas asociados con PTT en situaciones clínicas con niveles elevados del factor von Willebrand, tal como en una infección o en un embarazo. Por ejemplo, Fujimura y col. informaron de 9 mujeres japonesas de 6 familias con SUS confirmado genéticamente que fueron diagnosticadas con el trastorno durante su primer embarazo. La trombocitopenia ocurrió durante el segundo al tercer trimestre en cada uno de sus 15 embarazos, seguido a menudo por PTT. Se encontró que todas estas mujeres tenían una deficiencia grave en la actividad de ADAMTS13 (Fujimura y col., Brit. J. Haemat 144:742-754, 2008).
De acuerdo con lo anterior, en algunos casos, en el contexto de un sujeto con síndrome de Upshaw-Schulman (SUS) (es decir, se sabe que el sujeto es deficiente en la actividad de ADAMTS13 y/o se sabe que el sujeto tiene una o más mutaciones del gen ADAMTS13), se describe un procedimiento para disminuir la probabilidad de desarrollar síntomas clínicos asociados con PTT congénita (por ejemplo, trombocitopenia, anemia, fiebre y/o insuficiencia renal) que comprende administrar una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, un anticuerpo de MASP-2) durante un período de tiempo eficaz para mejorar o prevenir uno o más síntomas clínicos asociados con PTT. En algunos casos, el procedimiento comprende además la etapa de determinar si un sujeto está en riesgo de desarrollar síntomas asociados con PTT congénita antes del inicio de cualquier síntoma asociado con PTT, o al inicio de al menos uno o más síntomas indicativos de PTT (por ejemplo, la presencia de anemia, trombocitopenia y/o insuficiencia renal). La determinación de si un sujeto tiene riesgo de desarrollar síntomas asociados con PTT congénita (es decir, el sujeto tiene SUS), comprende determinar si el sujeto tiene una mutación en el gen que codifica ADAMTS13, y/o determinar si el sujeto es deficiente en la actividad de ADAMTS13, y/o determinar si el sujeto tiene antecedentes hereditarios de SUS. Los procedimientos de cribado genético para la presencia o ausencia de una mutación genética asociada con el SUS están bien establecidos, por ejemplo, véase Kinoshita y col., International Journal of Hematology, 74:101-108 (2001); Levy y col., Nature, 413 (6855):488-494 (2001); Kokame y col., PNAS 99(18):11902-11907 (2002); Savasan y col., Blood, 101:4449-4451 (2003); Matsumoto y col., Blood, 103:1305-1310 (2004) y Fujimura y col., Brit. J. Haemat 144:742-754 (2008).
En un caso, se describe un procedimiento para reducir la probabilidad de que un sujeto diagnosticado con SUS sufra síntomas clínicos asociados con PTT que comprende controlar periódicamente al sujeto para determinar la presencia o ausencia de anemia, trombocitopenia o aumento de creatinina, y tratarle con un agente inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, un anticuerpo MASP-2) tras la determinación de la presencia de anemia, trombocitopenia o aumento de creatinina, o ante la presencia de un evento conocido por estar asociado con el desencadenamiento de síntomas clínicos de PTT, por ejemplo, exposición a fármacos (por ejemplo, quimioterapia), infección (por ejemplo, infección bacteriana), neoplasia maligna, lesión, trasplante o embarazo.
En otro caso, se describe un procedimiento para tratar a un sujeto con SUS y que padece síntomas clínicos asociados con PTT que comprende administrar una cantidad de un agente inhibidor de Ma SP-2 (por ejemplo, un anticuerpo de MASP-2) durante un período de tiempo eficaz para mejorar o prevenir uno o más síntomas clínicos asociados con PTT.
La PTT también puede desarrollarse debido a autoanticuerpos contra ADAMTS-13. Además, la PTT puede desarrollarse durante un cáncer de mama, del tracto gastrointestinal o de próstata (George JN., Oncology (Williston Park). 25:908-14 (2011)), embarazo (segundo trimestre o posparto), George JN., Curr Opin Hematol 10:339-344 (2003)), o está asociado con enfermedades, tales como el VIH o enfermedades autoinmunitarias tales como el lupus eritematoso sistémico (Hamasaki K, y col., Clin Rheumatol.22:355-8 (2003)). La PTT también puede ser causada por determinadas terapias con fármacos, incluyendo heparina, quinina, ingrediente inmunomediado, agentes quimioterapéuticos contra el cáncer (bleomicina, cisplatino, arabinósido de citosina, daunomicina gemcitabina, mitomicina C y tamoxifeno), ciclosporina A, anticonceptivos orales, penicilina, rifampicina y fármacos antiplaquetarios que incluyen ticlopidina y clopidogrel (Azarm, T. y col., J Res Med Sci., 16: 353-357 (2011)). Otros factores o condiciones asociados con la PTT son las toxinas tales como el veneno de abeja, septicemia, secuestro esplénico, trasplante, vasculitis, cirugía vascular e infecciones como neumonía por Estreptococo y citomegalovirus (Moake JL., N Engl J Med., 347:589-600 (2002)). La PTT debido a una deficiencia funcional transitoria de ADAMTS-13 puede ocurrir como consecuencia de la lesión de células endoteliales asociada con infección por S. neumoniae (Pediatr Nephrol., 26:631-5 (2011)).
La plasmaféresis es el tratamiento estándar para PTT (Rock GA, y col., N Engl J Med 325:393-397 (1991)). La plasmaféresis reemplaza la actividad de ADAMTS-13 en pacientes con defectos genéticos y elimina los autoanticuerpos de ADAMTS-13 en aquellos pacientes con PTT autoinmunitaria adquirida (Tsai, HM, Hematol Oncol Clin North Am., 21(4): 609-v (2007)). Agentes adicionales, tales como fármacos inmunodepresores, se añaden de forma rutinaria a la terapia (George, JN, N Engl J Med, 354:1927-35 (2006)). Sin embargo, la plasmaféresis no tiene éxito en aproximadamente un 20 % de los pacientes, la recaída ocurre en más de un tercio de los pacientes y la plasmaféresis es costosa y técnicamente exigente. Además, muchos pacientes no pueden tolerar la plasmaféresis. En consecuencia, sigue existiendo una necesidad crítica de tratamientos adicionales y mejores para la PTT.
Dado que la PTT es un trastorno de la cascada de la coagulación sanguínea, el tratamiento con antagonistas del sistema del complemento puede ayudar a estabilizar y corregir la enfermedad. Si bien la activación patológica de la ruta alternativa del complemento está relacionada con el SUHa, el papel de la activación del complemento en PTT es menos claro. La deficiencia funcional de ADAMTS13 es importante para la susceptibilidad de pTt , sin embargo, no es suficiente para provocar episodios agudos. Los factores ambientales y/u otras variaciones genéticas pueden contribuir a la manifestación de PTT. Por ejemplo, genes que codifican proteínas implicadas en la regulación de la cascada de coagulación, el FvW, función plaquetaria, componentes de la superficie del vaso endotelial o el sistema del complemento pueden estar implicados en el desarrollo de microangiopatía trombótica aguda (Galbusera, M. y col., Haematologica, 94: 166-170 (2009)). En particular, se ha demostrado que la activación del complemento juega un papel fundamental; se ha demostrado que el suero de microangiopatía trombótica asociada con deficiencia de ADAMTS-13 causa el depósito de C3 y del MAC y la activación posterior de neutrófilos que podría anularse por inactivación del complemento (Ruiz-Torres MP, y col., Thromb Haemost, 93:443-52 (2005)). Además, recientemente se ha demostrado que durante los episodios agudos de PTT hay niveles elevados de C4d, C3bBbP y C3a (M. Reti y col., J Thromb Haemost. 28 de febrero (2012) doi: 10.1111/j.1538-7836.2012.04674.x. [Publicación electrónica antes de impresión]), coherente con la activación de las rutas clásica/lectina y alternativa. Esta cantidad aumentada de activación del complemento en episodios agudos puede iniciar la activación de la ruta terminal y ser responsable de un mayor empeoramiento de PTT.
El papel de la ADAMTS-13 y del FvW en PTT es claramente responsable de la activación y agregación de plaquetas y su papel posterior en la fuerza de cizallamiento y el depósito en microangiopatías. Las plaquetas activadas interactúan con, y desencadenan, las rutas clásicas y alternativas del complemento. La activación del complemento mediada por plaquetas aumenta los mediadores inflamatorios C3a y C5a (Peerschke E y col., Mol Immunol, 47:2170-5 (2010)). Por tanto, las plaquetas pueden servir como dianas de la activación clásica del complemento en PTT hereditaria o autoinmunitaria.
Como se ha descrito anteriormente, la ruta de la lectina del complemento, en virtud de la activación de protrombina mediada por MASP-2, es la ruta molecular dominante que une la lesión endotelial con la coagulación y la trombosis microvascular que se produce en el SUH. De forma similar, la activación de la ruta de la lectina del complemento puede impulsar directamente el sistema de coagulación en PTT. La activación de la ruta de la lectina puede iniciarse en respuesta a la lesión inicial del endotelio causada por la deficiencia de ADAMTS-13 en PTT. Por tanto, se espera que inhibidores de la ruta de la lectina, incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos que bloquean la función MASP-2, mitiguen las microangiopatías asociadas con la coagulación microvascular, trombosis y hemólisis en pacientes que padecen PTT.
Los pacientes que padecen PTT normalmente se presentan en la sala de emergencias con uno o más de los siguientes: púrpura, insuficiencia renal, plaquetas bajas, anemia y/o trombosis, incluyendo accidente cerebrovascular. El estándar actual de atención para la PTT implica la administración intracatéter (por ejemplo, intravenosa u otra forma de catéter) de plasmaféresis de reemplazo durante un período de dos semanas o más, normalmente tres veces por semana, y hasta a diario. Si el sujeto da positivo por la presencia de un inhibidor de ADAMTS13 (es decir, un anticuerpo endógeno contra ADAMTS13), entonces la plasmaféresis puede llevarse a cabo en combinación con terapia inmunodepresora (por ejemplo, corticoesteroides, rituxan o ciclosporina). Los sujetos con PTT refractaria (aproximadamente un 20 % de los pacientes con PTT) no responden al menos a dos semanas de terapia de plasmaféresis.
De acuerdo con lo anterior, en un caso, en el contexto de un diagnóstico inicial de PTT o en un sujeto que presenta uno o más síntomas coherentes con un diagnóstico de PTT (por ejemplo, afectación del sistema nervioso central, trombocitopenia grave (un recuento de plaquetas menor o igual a 5000/pl si no se toma aspirina, menor o igual a 20.000/pl si toma aspirina), afectación cardíaca grave, afectación pulmonar grave, infarto gastrointestinal o gangrena), se describe un procedimiento para tratar al sujeto con una cantidad eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-MASP-2) como terapia de primera línea en ausencia de plasmaféresis, o en combinación con plasmaféresis. Como terapia de primera línea, el agente inhibidor de MASP-2 se puede administrar al sujeto sistémicamente, tal como mediante administración intrarterial, intravenosa, intramuscular, inhalatoria, nasal, subcutánea u otra parenteral. En algunos casos, el agente inhibidor de MASP-2 se administra a un sujeto como terapia de primera línea en ausencia de plasmaféresis para evitar las posibles complicaciones de la plasmaféresis, tales como hemorragia, infección y exposición a trastornos y/o alergias inherentes al donante del plasma, o en un sujeto que de otra manera se opone a la plasmaféresis, o en un entorno en el que la plasmaféresis no está disponible. En algunos casos, el agente inhibidor de MASP-2 se administra al sujeto que padece PTT en combinación (incluyendo administración conjunta) con un agente inmunodepresor (por ejemplo, corticoesteroides, rituxan o ciclosporina) y/o en combinación con ADAMTS-13 concentrada.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar un agente inhibidor de MASP-2 a un sujeto que padece PTT a través de un catéter (por ejemplo, por vía intravenosa) durante un primer período de tiempo (por ejemplo, una fase aguda que dura al menos un día a una semana o dos semanas) seguido de la administración de un agente inhibidor de MASP-2 al sujeto por vía subcutánea durante un segundo período de tiempo (por ejemplo, una fase crónica de al menos dos semanas o más). En algunos casos, la administración en el primer y/o segundo período de tiempo se produce en ausencia de plasmaféresis. En algunos casos, el procedimiento se usa para mantener al sujeto para evitar que el sujeto sufra uno o más síntomas asociados con PTT.
En otro caso, se describe un procedimiento para tratar a un sujeto que padece PTT refractaria (es decir, un sujeto que no ha respondido al menos a dos semanas de terapia de plasmaforesis), mediante la administración de una cantidad de un inhibidor de MASP-2 eficaz para reducir uno o más síntomas de PTT. En un caso, el inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-MASP-2) se administra a un sujeto con PTT refractaria de forma crónica, durante un período de tiempo de al menos dos semanas o más por vía subcutánea u otra administración parenteral. La administración puede repetirse según lo determine un médico hasta que la afección se haya resuelto o esté controlada.
En algunos casos, el procedimiento comprende además determinar el nivel de al menos un factor del complemento (por ejemplo, C3, C5) en el sujeto antes del tratamiento y, opcionalmente, durante el tratamiento, en el que la determinación de un nivel reducido del al menos un factor del complemento en comparación con un valor estándar o un sujeto de control sano es indicativo de la necesidad de un tratamiento continuo con el agente inhibidor de MASP-2.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar un agente inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo anti-MASP-2, a un sujeto que padece, o está en riesgo de desarrollar, PTT por vía subcutánea o intravenosa. El tratamiento es preferentemente diario, pero puede ser tan poco frecuente como quincenal. El tratamiento se continúa hasta que el recuento de plaquetas del sujeto es superior a 150.000/ml durante al menos dos días consecutivos. El anticuerpo anti-MASP-2 se puede administrar solo o en combinación con un inhibidor de C5, tal como eculizamab.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 exhibe al menos una o más de las siguientes características: dicho anticuerpo se une a m As P-2 humana con una Kd de 10 nM o menos, dicho anticuerpo se une a un epítopo en el dominio CCP1 de MASP-2, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en un ensayo in vitro en suero humano al 1 % en una CI50 de 10 nM o menos, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en suero humano al 90 % con una CI50 de 30 nM o menos, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, Fab', F(ab)2 y F(ab')2 , en el que el anticuerpo es una molécula monocatenaria, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG2, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG1, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG4, en el que la molécula de IgG4 comprende una mutación S228P y/o en el que el anticuerpo no inhibe sustancialmente la ruta clásica. En un caso, el anticuerpo se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la ruta de la lectina y no inhibe sustancialmente la ruta alternativa. En un caso, el anticuerpo se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la ruta de la lectina y no inhibe sustancialmente la ruta clásica o la ruta alternativa (es decir, inhibe la ruta de la lectina mientras deja inalteradas las rutas clásica y alternativa del complemento).
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un sujeto que padece PTT en al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % hasta un 99 %, en comparación con el suero no tratado. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un sujeto que padece PTT a un nivel de al menos un 20 por ciento o más, (por ejemplo, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %) más que el efecto inhibidor sobre el depósito de C5b-9 en suero.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un paciente con PTT en al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % hasta un 99 %, en comparación con el suero no tratado.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se administra al sujeto mediante un catéter intravenoso u otro procedimiento de administración por catéter.
En un caso, en el presente documento, se describe un procedimiento para inhibir la formación de trombos en un sujeto que padece PTT que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende (I) (a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una CDR-H1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 31-35 de la SEQ ID NO: 67; y ii) una CDR-H2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-65 de la SEQ ID NO: 67; y iii) una CDR-H3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 95-102 de la SEQ ID NO: 67 y b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una CDR-L1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 24-34 de la SEQ ID NO: 70; y ii) una CDR-L2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-56 de la SEQ ID NO: 70; y iii) una CDR-L3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 89-97 de la SEQ ID NO: 70, o (II) una variante del mismo que comprende una región variable de cadena pesada con al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 67 (por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 67) y una región variable de cadena ligera con al menos un 90 % de identidad (por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 70.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 67. En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 70.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que reconoce específicamente al menos parte de un epítopo en MASP-2 humana reconocido por el anticuerpo de referencia OMS646 que comprende una región variable de cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO: 70.
Enfermedad de Pegos
La enfermedad de Degos, también conocida como papulosis atrófica maligna, es una MAT muy rara que afecta al endotelio de pequeños vasos de la piel, tracto gastrointestinal y SNC. Esta vasculopatía causa la oclusión de vénulas y arteriolas, dando como resultado lesiones cutáneas, isquemia intestinal y trastornos del SNC, incluyendo accidentes cerebrovasculares, epilepsia y trastornos cognitivos. En la piel, la necrosis del tejido conectivo se debe a la oclusión trombótica de las arterias pequeñas. Sin embargo, se desconoce la causa de la enfermedad de Degos. Se ha implicado vasculitis, coagulopatía o disfunción primaria de las células endoteliales. La enfermedad de Degos tiene una supervivencia del 50 % de solo dos a tres años. No existe un tratamiento eficaz para la enfermedad de Degos, aunque se utilizan fármacos antiplaquetarios, anticoagulantes e inmunodepresores para aliviar los síntomas.
Si bien se desconoce el mecanismo de la enfermedad de Degos, se ha implicado la ruta del complemento. Margo y col., identificaron depósitos prominentes de C5b-9 en vasos de la piel, tracto gastrointestinal y cerebrales de cuatro pacientes terminales con enfermedad de Degos (Margo y col., Am J Clin Pathol 135(4):599-610, 2011). El tratamiento experimental con eculizumab fue inicialmente eficaz en el tratamiento de lesiones cutáneas e intestinales, pero no evitó la progresión de la enfermedad sistémica (véase Garrett-Bakelman F. y col., "C5b-9 is a potential effector in the pathophysiology of Degos disease; a case report of treatment with eculizumab" (Abstract), Jerusalem: International Society of Hematology; 2010, Póster n.° 156; y Polito J. y col., "Early detection of systemic Degos disease (DD) or malignant atrophic papulosis (MAP) may increase survival" (Abstract), San Antonio, TX: American College of Gastroenterology; 2010, Póster n.° 1205).
Muchos pacientes que padecen la enfermedad de Degos tienen defectos de coagulación sanguínea. La oclusión trombótica de pequeñas arterias en la piel es característica de la enfermedad. Debido a que la ruta del complemento está implicada en esta enfermedad, como se describe en el presente documento para otras MAT, se espera que inhibidores de la ruta de la lectina, incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos que bloquean la función MASP-2, sean beneficiosos en el tratamiento de pacientes que padecen la enfermedad de Degos.
En consecuencia, en otro caso, se describen en el presente documento procedimientos para tratar la enfermedad de Degos mediante la administración de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo MASP-2, en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece la enfermedad de Degos o una afección resultante de la enfermedad de Degos. El agente inhibidor de MASP-2 se administra sistémicamente al sujeto que padece la enfermedad de Degos o una afección resultante de la enfermedad de Degos, tal como mediante administración intrarterial, intravenosa, intramuscular, inhalatoria, subcutánea u otra parenteral, o potencialmente mediante administración oral para agentes no peptidérgicos. El anticuerpo anti-MASP-2 se puede administrar solo o en combinación con un inhibidor de C5, tal como eculizamab.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 exhibe al menos una o más de las siguientes características: dicho anticuerpo se une a MASP-2 humana con una Kd de 10 nM o menos, dicho anticuerpo se une a un epítopo en el dominio CCP1 de MASP-2, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en un ensayo in vitro en suero humano al 1 % en una CI50 de 10 nM o menos, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en suero humano al 90 % con una CI50 de 30 nM o menos, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, Fab', F(ab)2 y F(ab')2 , en el que el anticuerpo es una molécula monocatenaria, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG2, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG1, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG4, en el que la molécula de IgG4 comprende una mutación S228P y/o en el que el anticuerpo no inhibe sustancialmente la ruta clásica. En un caso, el anticuerpo se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la ruta de la lectina y no inhibe sustancialmente la ruta alternativa. En un caso, el anticuerpo se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la ruta de la lectina y no inhibe sustancialmente la ruta clásica o la ruta alternativa (es decir, inhibe la ruta de la lectina mientras deja inalteradas las rutas clásica y alternativa del complemento).
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un sujeto que padece la enfermedad de Degos en al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % hasta un 99 %, en comparación con el suero no tratado. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un sujeto que padece la enfermedad de Degos a un nivel de al menos un 20 por ciento o más, (por ejemplo, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %) más que el efecto inhibidor sobre el depósito de C5b-9 en suero.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un paciente con enfermedad de Degos en al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % hasta un 99 %, en comparación con el suero no tratado.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se administra al sujeto mediante un catéter intravenoso u otro procedimiento de administración por catéter.
En un caso, en el presente documento, se describe un procedimiento para inhibir la formación de trombos en un sujeto que padece enfermedad de Degos que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende (I) (a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una CDR-H1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 31-35 de la SEQ ID NO: 67; y ii) una CDR-H2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-65 de la SEQ ID NO: 67; y Ni) una CDR-H3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 95-102 de la SEQ ID NO: 67 y b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una CDR-L1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 24-34 de la SEQ ID NO: 70; y ii) una CDR-L2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-56 de la SEQ ID NO: 70; y iii) una CDR-L3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 89-97 de la SEQ ID NO: 70, o (II) una variante del mismo que comprende una región variable de cadena pesada con al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 67 (por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 67) y una región variable de cadena ligera con al menos un 90 % de identidad (por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 70.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la s Eq ID NO: 67. En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 70.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que reconoce específicamente al menos parte de un epítopo en MASP-2 humana reconocido por el anticuerpo de referencia OMS646 que comprende una región variable de cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO: 70.
Síndrome antifosfolipídico catastrófico (SAFC)
El síndrome antifosfolipídico catastrófico (SAFC) es una variante extrema del síndrome de anticuerpos antifosfolipídicos (AAFL). El SAFC se caracteriza por una trombosis arterial y venosa debida a anticuerpos patógenos. El SAFC es una MAT con trombosis multiorgánica, isquemia e insuficiencia orgánica. Como en otras MAT, es característica la oclusión de pequeños vasos en varios órganos. Existe una alta tasa de mortalidad en SAFC de alrededor de un 50 % y, a menudo, se asocia con infección o traumatismo. Los pacientes tienen anticuerpos antifosfolipídicos, generalmente IgG.
Clínicamente, el SAFC implica al menos tres órganos o tejidos con evidencia histopatológica de oclusión de vasos pequeños. La trombosis periférica puede implicar venas y arterias en el SNC, sistema cardiovascular, renal o pulmonar. Los pacientes se tratan con antibióticos, anticoagulantes, corticoesteroides, plasmaféresis e inmunoglobulina intravenosa. No obstante, la muerte puede resultar de un fallo orgánico múltiple.
La ruta del complemento se ha implicado en el SAFC. Por ejemplo, estudios en modelos animales indican que la inhibición del complemento puede ser un medio eficaz para prevenir la trombosis asociada con el SAFC (Shapira L. y col., Arthritis Rheum 64(8):2719-23, 2012). Por otra parte, como también informó Shapira y col., la administración de eculizumab a un sujeto que padecía SAFC a dosis que bloqueaban la ruta del complemento abortaban eventos trombóticos progresivos agudos y revertían la trombocitopenia (véase también Lim W., Curr Opin Hematol 18(5):361-5, 2011). Por tanto, como se describe en el presente documento para otras MAT, se espera que inhibidores de la ruta de la lectina, incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos que bloquean la función MASP-2, sean beneficiosos en el tratamiento de pacientes que padecen el SAFC.
También se describen procedimientos para tratar SAFC mediante la administración de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo MASP-2, en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece SAFC o una afección resultante de SAFC. El agente inhibidor de MASP-2 se administra sistémicamente al sujeto que padece SAFC o una afección resultante de SAFC, tal como mediante administración intrarterial, intravenosa, intramuscular, inhalatoria, subcutánea u otra parenteral, o potencialmente mediante administración oral para agentes no peptidérgicos. El anticuerpo anti-MASP-2 se puede administrar solo o en combinación con un inhibidor de C5, tal como eculizamab.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 exhibe al menos una o más de las siguientes características: dicho anticuerpo se une a MASP-2 humana con una Kd de 10 nM o menos, dicho anticuerpo se une a un epítopo en el dominio CCP1 de MASP-2, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en un ensayo in vitro en suero humano al 1 % en una CI50 de 10 nM o menos, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en suero humano al 90 % con una CI50 de 30 nM o menos, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, Fab', F(ab)2 y F(ab')2 , en el que el anticuerpo es una molécula monocatenaria, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG2, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG1, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG4, en el que la molécula de IgG4 comprende una mutación S228P y/o en el que el anticuerpo no inhibe sustancialmente la ruta clásica. En un caso, el anticuerpo se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la ruta de la lectina y no inhibe sustancialmente la ruta alternativa. En un caso, el anticuerpo se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la ruta de la lectina y no inhibe sustancialmente la ruta clásica o la ruta alternativa (es decir, inhibe la ruta de la lectina mientras deja inalteradas las rutas clásica y alternativa del complemento).
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un sujeto que padece SAFC en al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % hasta un 99 %, en comparación con el suero no tratado. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un sujeto que padece SAFC a un nivel de al menos un 20 por ciento o más, (por ejemplo, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %) más que el efecto inhibidor sobre el depósito de C5b-9 en suero.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un paciente con SAFC en al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % hasta un 99 %, en comparación con el suero no tratado.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se administra al sujeto mediante un catéter intravenoso u otro procedimiento de administración por catéter.
En un caso, en el presente documento, se describe un procedimiento para inhibir la formación de trombos en un sujeto que padece el SAFC que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende (I) (a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una CDR-H1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 31-35 de la SEQ ID NO: 67; y ii) una CDR-H2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-65 de la SEQ ID NO: 67; y iii) una CDR-H3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 95­ 102 de la SEQ ID NO: 67 y b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una CDR-L1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 24-34 de la SEQ ID NO: 70; y ii) una CDR-L2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-56 de la SEQ ID NO: 70; y iii) una CDR-L3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 89-97 de la SEQ ID NO: 70, o (II) una variante del mismo que comprende una región variable de cadena pesada con al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 67 (por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 67) y una región variable de cadena ligera con al menos un 90 % de identidad (por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 70.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la s Eq ID NO: 67. En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 70.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que reconoce específicamente al menos parte de un epítopo en MASP-2 humana reconocido por el anticuerpo de referencia OMS646 que comprende una región variable de cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO: 70.
MAT secundaria por cáncer
Las neoplasias malignas sistémicas de cualquier tipo pueden conducir a manifestaciones clínicas y patológicas de MAT (véase, por ejemplo, Batts y Lazarus, Bone Marrow Transplantation 40:709-719, 2007). La MAT asociada al cáncer se encuentra a menudo en los pulmones y parece estar asociada con émbolos tumorales (Francis KK y col., Commun Oncol 2:339-43, 2005). Los émbolos tumorales pueden reducir el flujo sanguíneo y, por tanto, conducir a un estado de hipoperfusión en las arteriolas y vénulas afectadas. Se espera que el estrés y la lesión tisular resultantes activen la ruta del complemento de la lectina de forma localizada. La ruta de la lectina activada a su vez puede activar la cascada de coagulación a través de la escisión dependiente de MASP-2 de protrombina a trombina, que conduce a un estado protrombótico característico de la MAT. Se espera que la inhibición de MASP-2 en este contexto reduzca la activación localizada de la trombina y alivie así el estado protrombótico.
Por tanto, como se describe en el presente documento para otras MAT, se espera que inhibidores de la ruta de la lectina, incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos que bloquean la función MASP-2, sean beneficiosos en el tratamiento de pacientes que padecen MAT secundaria por cáncer.
También se describen procedimientos para tratar o prevenir la MAT secundaria por cáncer mediante la administración de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo MASP-2, en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece, o está en riesgo de desarrollar, una MAT secundaria por cáncer. El agente inhibidor de MASP-2 se administra sistémicamente al sujeto que padece, o está en riesgo de desarrollar, una MAT secundaria por cáncer, tal como mediante administración intrarterial, intravenosa, intramuscular, inhalatoria, subcutánea u otra parenteral, o potencialmente mediante administración oral para agentes no peptidérgicos. El anticuerpo anti-MASP-2 se puede administrar solo o en combinación con un inhibidor de C5, tal como eculizamab.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 exhibe al menos una o más de las siguientes características: dicho anticuerpo se une a m As P-2 humana con una Kd de 10 nM o menos, dicho anticuerpo se une a un epítopo en el dominio CCP1 de MASP-2, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en un ensayo in vitro en suero humano al 1 % en una CI50 de 10 nM o menos, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en suero humano al 90 % con una CI50 de 30 nM o menos, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, Fab', F(ab)2 y F(ab')2 , en el que el anticuerpo es una molécula monocatenaria, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG2, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG1, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG4, en el que la molécula de IgG4 comprende una mutación S228P y/o en el que el anticuerpo no inhibe sustancialmente la ruta clásica. En un caso, el anticuerpo se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la ruta de la lectina y no inhibe sustancialmente la ruta alternativa. En un caso, el anticuerpo se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la ruta de la lectina y no inhibe sustancialmente la ruta clásica o la ruta alternativa (es decir, inhibe la ruta de la lectina mientras deja inalteradas las rutas clásica y alternativa del complemento).
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un sujeto que padece MAT secundaria por cáncer en al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % hasta un 99 %, en comparación con el suero no tratado.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un paciente que padece MAT secundaria por cáncer en al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % hasta un 99 %, en comparación con el suero no tratado.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se administra al sujeto mediante un catéter intravenoso u otro procedimiento de administración por catéter.
En un caso, en el presente documento, se describe un procedimiento para inhibir la formación de trombos en un sujeto que padece MAT secundaria por cáncer que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de m As P-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende (I) (a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una CDR-H1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 31-35 de la SEQ ID NO: 67; y ii) una CDR-H2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-65 de la SEQ ID NO: 67; y iii) una CDR-H3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 95-102 de la SEQ ID NO: 67 y b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una CDR-L1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 24-34 de la SEQ ID NO: 70; y ii) una CDR-L2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-56 de la SEQ ID NO: 70; y iii) una CDR-L3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 89-97 de la SEQ ID NO: 70, o (II) una variante del mismo que comprende una región variable de cadena pesada con al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 67 (por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 67) y una región variable de cadena ligera con al menos un 90 % de identidad (por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 70.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la s Eq ID NO: 67. En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 70.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que reconoce específicamente al menos parte de un epítopo en MASP-2 humana reconocido por el anticuerpo de referencia OMS646 que comprende una región variable de cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO: 70.
MAT secundaria por quimioterapia contra el cáncer
La MAT asociada a quimioterapia es una afección que implica trombocitopenia, anemia hemolítica microangiopática y disfunción renal que se desarrolla en un 2 a un 10 % de los pacientes con antecedentes de neoplasias malignas tratados con agentes quimioterapéuticos tales como gemcitabina, mitomicina, oxaliplatino y otros. La MAT asociada a quimioterapia se asocia con resultados clínicos desfavorables de alta mortalidad (véase, por ejemplo, Blake-Haskins y col., Clin Cáncer Res 17(18):5858-5866, 2011).
Se cree que el origen de la MAT asociada a quimioterapia abarca una lesión tóxica no específica del endotelio microvascular. Se ha demostrado una lesión directa a las células endoteliales en un modelo animal de MAT inducida por mitomicina (Dlott J. y col., Ther Apher Dial 8:102-11, 2004). Se ha demostrado que la lesión de células endoteliales a través de una variedad de mecanismos activa la ruta de la lectina del complemento. Por ejemplo, Stahl y col. han demostrado que células endoteliales expuestas a estrés oxidativo activan la ruta de la lectina del complemento tanto in vitro como in vivo (Collard y col., Am J Pathol. 156(5):1549-56, 2000; La Bonte y col., J Immunol. 15;188(2):885-91, 2012). In vivo, este procedimiento conduce a trombosis, y se ha demostrado que la inhibición de la ruta de la lectina evita la trombosis (La Bonte y col. J Immunol. 15;188(2):885-91,2012). Además, como se demuestra en los Ejemplos 37-39 en el presente documento, en el modelo de ratón de MAT en el que se utilizó la fotoexcitación localizada de FITC-Dex para inducir una lesión localizada en la microvasculatura con el desarrollo posterior de una respuesta de MAT, los presentes inventores han demostrado que la inhibición de MASP-2 puede evitar la MAT. Por tanto, la lesión del endotelio microvascular por agentes quimioterapéuticos puede activar la ruta de la lectina del complemento que luego crea un estado protrombótico localizado y promueve una respuesta de MAT. Dado que la activación de la ruta de la lectina y la creación de un estado protrombótico es dependiente de MASP-2, se espera que los inhibidores de MASP-2, incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos que bloquean la función MASP-2, alivien la respuesta de MAT y reduzcan el riesgo de MAT asociada a la quimioterapia contra el cáncer.
También se describen procedimientos para tratar o prevenir la MAT secundaria por quimioterapia mediante la administración de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo MASP-2, en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece, o está en riesgo de desarrollar, una MAT secundaria por quimioterapia. El agente inhibidor de MASP-2 se administra sistémicamente a un sujeto que se ha sometido, se está sometiendo o se va a someter a quimioterapia, tal como mediante administración intrarterial, intravenosa, intramuscular, inhalatoria, subcutánea u otra parenteral, o potencialmente mediante administración oral para agentes no peptidérgicos. El anticuerpo anti-MASP-2 se puede administrar solo o en combinación con un inhibidor de C5, tal como eculizamab.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 exhibe al menos una o más de las siguientes características: dicho anticuerpo se une a MASP-2 humana con una Kd de 10 nM o menos, dicho anticuerpo se une a un epítopo en el dominio CCP1 de MASP-2, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en un ensayo in vitro en suero humano al 1 % en una CI50 de 10 nM o menos, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en suero humano al 90 % con una CI50 de 30 nM o menos, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, Fab', F(ab)2 y F(ab')2 , en el que el anticuerpo es una molécula monocatenaria, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG2, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG1, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG4, en el que la molécula de IgG4 comprende una mutación S228P y/o en el que el anticuerpo no inhibe sustancialmente la ruta clásica. En un caso, el anticuerpo se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la ruta de la lectina y no inhibe sustancialmente la ruta alternativa. En un caso, el anticuerpo se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la ruta de la lectina y no inhibe sustancialmente la ruta clásica o la ruta alternativa (es decir, inhibe la ruta de la lectina mientras deja inalteradas las rutas clásica y alternativa del complemento).
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un sujeto que padece MAT secundaria por quimioterapia del cáncer en al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % hasta un 99 %, en comparación con el suero no tratado.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un paciente que padece MAT secundaria por quimioterapia contra el cáncer en al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % hasta un 99 %, en comparación con el suero no tratado.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se administra al sujeto mediante un catéter intravenoso u otro procedimiento de administración por catéter.
También se describe en el presente documento un procedimiento para inhibir la formación de trombos en un sujeto que padece MAT secundaria por quimioterapia del cáncer que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende (I) (a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una CDR-H1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 31-35 de la s Eq ID NO: 67; y ii) una CDR-H2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-65 de la SEQ ID NO: 67; y iii) una CDR-H3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 95-102 de la SEQ ID NO: 67 y b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una CDR-L1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 24-34 de la SEQ ID NO: 70; y ii) una CDR-L2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-56 de la SEQ ID NO: 70; y iii) una CDR-L3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 89-97 de la SEQ ID NO: 70, o (II) una variante del mismo que comprende una región variable de cadena pesada con al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 67 (por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 67) y una región variable de cadena ligera con al menos un 90 % de identidad (por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 70.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la s Eq ID NO: 67. En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 70.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que reconoce específicamente al menos parte de un epítopo en MASP-2 humana reconocido por el anticuerpo de referencia OMS646 que comprende una región variable de cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO: 70.
MAT secundaria por trasplante
La MAT asociada a trasplante (MAT-AT) es un síndrome devastador que puede ocurrir en pacientes trasplantados, tales como receptores de trasplantes de células madre hematopoyéticas alogénicas (véase, por ejemplo, Batts y Lazarus, Bone Marrow Transplantation 40:709-719, 2007). La patogenia de esta afección es poco conocida, pero probablemente implica una confluencia de respuestas que culminan en una lesión de células endoteliales (Laskin B.L. y col., Blood 118(6):1452-62, 2011). Como se ha analizado anteriormente, la lesión de células endoteliales es un estímulo prototípico para la activación de la ruta de la lectina y la generación de un entorno protrombótico.
Datos recientes apoyan aún más el papel de la activación del complemento a través de la ruta de la lectina en la patogenia MAT-AT. Laskin y col., han demostrado que el depósito de C4d arteriolar renal era mucho más común en sujetos con MAT-AT histológica (75 %) en comparación con controles (8 %) (Laskin BL, y col., Transplantation, 27; 96(2):217-23, 2013). Por tanto, C4d puede ser un marcador patológico de MAT-AT, que implica la fijación localizada del complemento a través de la ruta de la lectina o clásica.
Dado que la activación de la ruta de la lectina y la creación de un estado protrombótico es dependiente de MASP-2, se espera que los inhibidores de MASP-2, incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos que bloquean la función MASP-2, alivien la respuesta de MAT y reduzcan el riesgo de MAT asociada a trasplante (MAT-AT).
También se describen procedimientos para tratar o prevenir una MAT secundaria por trasplante mediante la administración de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo MASP-2, en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar una MAT secundaria por trasplante. El agente inhibidor de MASP-2 se administra sistémicamente a un sujeto que se ha sometido, se está sometiendo o se someterá a un procedimiento de trasplante, tal como mediante administración intrarterial, intravenosa, intramuscular, inhalatoria, subcutánea u otra parenteral, o potencialmente mediante administración oral para agentes no peptidérgicos. El anticuerpo anti-MASP-2 se puede administrar solo o en combinación con un inhibidor de C5, tal como eculizamab. En algunos casos, en el presente documento se describen procedimientos para tratar o prevenir una MAT secundaria por trasplante de células madre alogénicas que comprenden administrar una composición que comprende una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo inhibidor de MASP-2, a un sujeto antes de, durante o después de someterse a un trasplante alogénico de células madre.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 exhibe al menos una o más de las siguientes características: dicho anticuerpo se une a MASP-2 humana con una Kd de 10 nM o menos, dicho anticuerpo se une a un epítopo en el dominio CCP1 de MASP-2, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en un ensayo in vitro en suero humano al 1 % en una CI50 de 10 nM o menos, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en suero humano al 90 % con una CI50 de 30 nM o menos, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, Fab', F(ab)2 y F(ab')2 , en el que el anticuerpo es una molécula monocatenaria, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG2, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG1, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG4, en el que la molécula de IgG4 comprende una mutación S228P y/o en el que el anticuerpo no inhibe sustancialmente la ruta clásica. En un caso, el anticuerpo se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la ruta de la lectina y no inhibe sustancialmente la ruta alternativa. En un caso, el anticuerpo se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la ruta de la lectina y no inhibe sustancialmente la ruta clásica o la ruta alternativa (es decir, inhibe la ruta de la lectina mientras deja inalteradas las rutas clásica y alternativa del complemento).
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un sujeto que padece MAT secundaria por trasplante en al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % hasta un 99 %, en comparación con el suero no tratado.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un paciente que padece MAT secundaria por trasplante en al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % hasta un 99 %, en comparación con el suero no tratado.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se administra al sujeto mediante un catéter intravenoso u otro procedimiento de administración por catéter.
También se describe en el presente documento un procedimiento para inhibir la formación de trombos en un sujeto que padece MAT secundaria por trasplante que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende (I) (a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una CDR-H1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 31-35 de la SEQ ID NO: 67; y ii) una CDR-H2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-65 de la SEQ ID NO: 67; y iii) una CDR-H3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 95-102 de la SEQ ID NO: 67 y b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una CDR-L1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 24-34 de la SEQ ID NO: 70; y ii) una CDR-L2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-56 de la SEQ ID NO: 70; y iii) una CDR-L3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 89-97 de la SEQ ID NO: 70, o (II) una variante del mismo que comprende una región variable de cadena pesada con al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 67 (por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 67) y una región variable de cadena ligera con al menos un 90 % de identidad (por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 70.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la s Eq ID NO: 67. En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 70.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que reconoce específicamente al menos parte de un epítopo en MASP-2 humana reconocido por el anticuerpo de referencia OMS646 que comprende una región variable de cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO: 70.
IV. EL PAPEL DE MASP-2 EN OTRAS ENFERMEDADES Y AFECCIONES Y PROCEDIMIENTOS TERAPÉUTICOS QUE UTILIZAN AGENTES INHIBIDORES DE MASP-2
CONDICIONES RENALES
La activación del sistema del complemento se ha implicado en la patogenia de una amplia variedad de enfermedades renales; incluyendo, glomerulonefritis mesangioproliferativa (nefropatía por IgA, Enfermedad de Berger) (Endo, M., y col., Clin. Nephrology 55:185-191, 2001), glomerulonefritis membranosa (Kerjashki, D., Arch B Cell Pathol. 58:253-71, 1990; Brenchley, P.E., y col., Kidney Int., 41:933-7, 1992; Salant, D.J., y col., Kidney Int. 35:976-84, 1989), glomerulonefritis membranoproliferativa (glomerulonefritis mesangiocapilar) (Bartlow, B.G., y col., Kidney Int. 15:294-300, 1979; Meri, S., y col., J. Exp. Med. 175:939-50, 1992), glomerulonefritis posinfecciosa aguda (glomerulonefritis posestreptocócica), glomerulonefritis crioglobulinémica (Ohsawa, I., y col., Clin Immunol. 101:59-66, 2001), nefritis lúpica (Gatenby, P.A., Autoimmunity 11:61-6, 1991), y nefritis por púrpura de Henoch-Schonlein (Endo, M., y col., Am. J. Kidney Dis. 35:401-407, 2000). La implicación del complemento en la enfermedad renal se ha apreciado durante varias décadas, pero aún existe una gran discusión sobre su papel exacto en el inicio, el desarrollo y la fase de resolución de la enfermedad renal. En condiciones normales el aporte de complemento es beneficioso para el hospedador, pero la activación y el depósito inapropiados del complemento pueden contribuir al daño tisular.
Existe evidencia sustancial de que la glomerulonefritis, inflamación de los glomérulos, a menudo se inicia por el depósito de complejos inmunitarios en estructuras glomerulares o tubulares que luego desencadenan activación del complemento, inflamación y daño tisular. Kahn y Sinniah demostraron un mayor depósito de C5b-9 en membranas basales tubulares en biopsias tomadas de pacientes con diversas formas de glomerulonefritis (Kahn, T.N., y col., Histopath. 26:351-6, 1995). En un estudio de pacientes con nefrología IgA (Alexopoulos, A., y col., Nephrol. Dial. Transplant 10:1166-1172, 1995), el depósito de C5b-9 en las estructuras de la membrana basal/epitelial tubular se correlaciona con los niveles de creatinina plasmática. Otro estudio de nefropatía membranosa demostró una relación entre el resultado clínico y los niveles urinarios de sC5b-9 (Kon, S.P., y col., Kidney Int. 48:1953-58, 1995). Los niveles elevados de sC5b-9 se correlacionaron positivamente con un mal pronóstico. Lehto y col., midieron niveles elevados de CD59, un factor regulador del complemento que inhibe el complejo de ataque a membrana en membranas plasmáticas, así como C5b-9 en la orina de pacientes con glomerulonefritis membranosa (Lehto, T., y col., Kidney Int.
47:1403-11, 1995). El análisis histopatológico de muestras de biopsia tomadas de estos mismos pacientes demostró depósito de proteínas C3 y C9 en los glomérulos, mientras que la expresión de CD59 en estos tejidos disminuyó en comparación con la del tejido renal normal. Estos diversos estudios sugieren que la glomerulonefritis mediada por complemento en curso da como resultado la excreción urinaria de proteínas del complemento que se correlacionan con el grado de daño tisular y el pronóstico de la enfermedad.
La inhibición de la activación del complemento en varios modelos animales de glomerulonefritis también ha demostrado la importancia de la activación del complemento en el origen de la enfermedad. En un modelo de glomerulonefritis membranoproliferativa (GNMP), la infusión de antisuero anti-Thyl en ratas deficientes en C6 (que no pueden formar C5b-9) dio como resultado un 90 % menos de proliferación celular glomerular, reducción de un 80 % en plaquetas e infiltración de macrófagos, disminución de la síntesis de colágeno tipo IV (un marcador de expansión de la matriz mesangial) y un 50 % menos de proteinuria que en ratas C6+ normales (Brandt, J., y col., Kidney Int.
49:335-343, 1996). Estos resultados implican a C5b-9 como un mediador principal del daño tisular por el complemento en este modelo de suero antitimocito de rata. En otro modelo de glomerulonefritis, la infusión de dosis graduadas de membrana basal glomerular anti-rata de conejo produjo una afluencia dependiente de la dosis de leucocitos polimorfonucleares (PMN) que fue atenuada por el tratamiento previo con factor de veneno de cobra (para consumir complemento) (Scandrett, A.L., y col., Am. J. Physiol. 268:F256-F265, 1995). Las ratas tratadas con factor de veneno de cobra también mostraron histopatología disminuida, disminución de la proteinuria a largo plazo y niveles más bajos de creatinina que las ratas de control. Empleando tres modelos de GN en ratas (suero antitimocitos, Con A anti-Con A y nefritis pasiva de Heymann), Couser y col., demostraron la posible eficacia terapéutica de los enfoques para inhibir el complemento mediante el uso de la proteína sCR1 recombinante (Couser, W.G., y col., J. Am. Soc. Nephrol. 5:1888-94, 1995). Las ratas tratadas con sCR1 mostraron una disminución significativa de PMN, afluencia de plaquetas y macrófagos, disminución de la mesangiólisis y proteinuria frente a ratas de control. Se han descrito pruebas adicionales de la importancia de la activación del complemento en la glomerulonefritis mediante el uso de un AcM anti-C5 en el modelo de ratón NZB/W F1. El AcM anti-C5 inhibe la escisión de C5, bloqueando así la generación de C5a y C5b-9. La terapia continua con AcM anti-C5 durante 6 meses dio como resultado una mejora significativa del curso de la glomerulonefritis. Se está desarrollando un anticuerpo monoclonal AcM anti-C5 humanizado (5G1.1) que previene la escisión del componente del complemento humano C5 en sus componentes proinflamatorios por Alexion Pharmaceuticals, Inc., New Haven, Connecticut, como posible tratamiento para la glomerulonefritis.
La evidencia directa de un papel patológico del complemento en una lesión renal se describe mediante estudios de pacientes con deficiencias genéticas en componentes específicos del complemento. Varios informes han documentado una asociación de enfermedad renal con deficiencias del factor H regulador del complemento (Ault, B.H., Nephrol. 14:1045-1053, 2000; Levy, M., y col., Kidney Int. 30:949-56, 1986; Pickering, M.C., y col., Nat. Genet. 31:424-8, 2002). La deficiencia de factor H da como resultado bajos niveles plasmáticos de factor B y C3 y en el consumo de C5b-9. Tanto la glomerulonefritis membranoproliferativa (GNMP) atípica como el síndrome urémico hemolítico (SUH) idiopático están asociados con la deficiencia de factor H. Cerdos con deficiencia de factor H (Jansen, J.H., y col., Kidney Int. 53:331-49, 1998) y ratones inactivados para el factor H (Pickering, MC, 2002) muestran síntomas similares a GNMP, confirmando la importancia del factor H en la regulación del complemento. Las deficiencias de otros componentes del complemento están asociadas con enfermedad renal, secundaria al desarrollo de lupus eritematoso sistémico (LES) (Walport, M.J., Davies, y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 815:267-81, 1997). La deficiencia de C1q, C4 y C2 predispone fuertemente al desarrollo de LES a través de mecanismos relacionados con el aclaramiento defectuoso de complejos inmunitarios y material apoptótico. En muchos de estos pacientes con LES se produce nefritis lúpica, caracterizada por el depósito de complejos inmunitarios en todo el glomérulo.
Se ha descrito evidencia adicional que vincula la activación del complemento y la enfermedad renal mediante la identificación en pacientes de autoanticuerpos dirigidos contra componentes del complemento, algunos de los cuales se han relacionado directamente con la enfermedad renal (Trouw, L.A., y col., Mol. Immunol. 38:199-206, 2001). Varios de estos autoanticuerpos muestran un grado tan alto de correlación con la enfermedad renal que se introdujo el término factor nefrítico (FNe) para indicar esta actividad. En estudios clínicos, alrededor de un 50 % de los pacientes positivos para factores nefríticos desarrollaron GNMP (Spitzer, R.E., y col., Clin. Immunol. Immunopathol. 64:177-83, 1992). C3NeF es un autoanticuerpo dirigido contra la C3 convertasa de la ruta alternativa (C3bBb) y estabiliza esta convertasa, promoviendo así la activación de la ruta alternativa (Daha, M.R., y col., J. Immunol. 116:1-7, 1976). Asimismo, un autoanticuerpo con especificidad para la C3 convertasa de la ruta clásica (C4b2a), llamada C4NeF, estabiliza esta convertasa y por lo tanto promueve la activación de la ruta clásica (Daha, M.R. y col., J. Immunol.
125:2051-2054, 1980; Halbwachs, L., y col., J. Clin. Invest. 65:1249-56, 1980). Se ha descrito que los autoanticuerpos anti-Clq están relacionados con la nefritis en pacientes con LES (Hovath, L., y col., Clin. Exp. Rheumatol. 19:667-72, 2001; Siegert, C., y col., J. Rheumatol. 18:230-34, 1991; Siegert, C., y col., Clin. Exp. Rheumatol. 10:19-23, 1992), y se informó que un aumento en el valor de estos autoanticuerpos anti-Clq predecía un brote de nefritis (Coremans, I.E., y col., Am. J. Kidney Dis. 26:595-601, 1995). Los depósitos inmunitarios eluidos de los riñones necroscópicos de pacientes con LES revelaron la acumulación de estos autoanticuerpos anti-Clq (Mannick, M., y col., Arthritis Rheumatol. 40:1504-11, 1997). Todos estos hechos apuntan a un papel patológico de estos autoanticuerpos. Sin embargo, no todos los pacientes con autoanticuerpos anti-Clq desarrollan enfermedad renal y también algunos individuos sanos tienen valores bajos de autoanticuerpos anti-Clq (Siegert, C.E., y col., Clin. Immunol. Immunopathol.
67:204-9, 1993).
Además de las rutas alternativa y clásica de activación del complemento, la ruta de la lectina también puede tener un papel patológico importante en la enfermedad renal. Niveles elevados de MBL, productos de activación del complemento y serina proteasa asociados a MBL se han detectado mediante técnicas inmunohistoquímicas en material de biopsia renal obtenido de pacientes diagnosticados con varias enfermedades renales diferentes, incluyendo la nefritis por púrpura de Henoch-Schonlein (Endo, M., y col., Am. J. Kidney Dis. 35:401-407, 2000), glomerulonefritis crioglobulinémica (Ohsawa, I., y col., Clin. Immunol. 101:59-66, 2001) y neuropatía IgA (Endo, M., y col., Clin. Nephrology 55:185-191, 2001). Por tanto, a pesar de que se conoce desde hace varias décadas una asociación entre el complemento y las enfermedades renales, los datos sobre cómo el complemento influye exactamente en estas enfermedades renales están lejos de ser completos.
TRASTORNOS DE LA SANGRE
La sepsis es causada por una reacción fulminante del paciente a microorganismos invasores. Una función principal del sistema del complemento es orquestar la respuesta inflamatoria a bacterias y otros patógenos invasores. De acuerdo con este papel fisiológico, se ha demostrado en numerosos estudios que la activación del complemento tiene un papel importante en la patogenia de la sepsis (Bone, R.C., Annals. Internal. Med. 115:457-469, 1991). La definición de las manifestaciones clínicas de la sepsis está en constante evolución. La sepsis generalmente se define como la respuesta sistémica del hospedador a una infección. Sin embargo, en muchas ocasiones, no se encuentra evidencia clínica de infección (por ejemplo, hemocultivos bacterianos positivos) en pacientes con síntomas sépticos. Esta discrepancia se tuvo en cuenta por primera vez en una Conferencia de Consenso en 1992 cuando se estableció la expresión "síndrome de respuesta inflamatoria sistémica" (SRIS), y para el cual no se requería una presencia definible de infección bacteriana (Bone, R.C., y col., Crit. Care Med. 20:724-726, 1992). En la actualidad existe un acuerdo generalizado de que la sepsis y el SRIS van acompañados de la incapacidad de regular la respuesta inflamatoria. A los efectos de esta breve reseña, se considera que la definición clínica de sepsis también incluye la sepsis intensa, choque séptico y SRIS.
La fuente predominante de infección en pacientes sépticos antes de finales de la década de 1980 fueron bacterias gramnegativas. Se sabía que el lipopolisacárido (LPS), el componente principal de la pared celular de bacterias gramnegativas, estimulaba la liberación de mediadores inflamatorios de varios tipos de células e inducía síntomas infecciosos agudos cuando se inyectaba en animales (Haeney, M.R., y col., Antimicrobial Chemotherapy 41 (Suppl. A):41-6, 1998). Curiosamente, el espectro de microorganismos responsables parece haber pasado de bacterias predominantemente gramnegativas a finales de la década de 1970 y 1980 a bacterias predominantemente grampositivas en la actualidad., por razones que actualmente no están claras (Martin, G.S., y col., N. Eng. J. Med.
348:1546-54, 2003).
Muchos estudios han demostrado la importancia de la activación del complemento para mediar la inflamación y contribuir a las características del choque, particularmente choque séptico y hemorrágico. Tanto los microorganismos gramnegativos como los grampositivos suelen desencadenar un choque séptico. El LPS es un potente activador del complemento, predominantemente a través de la ruta alternativa, aunque también se produce la activación de la ruta clásica mediada por anticuerpos (Fearon, D.T., y col., N. Engl. J. Med. 292:937-400, 1975). Los componentes principales de la pared celular grampositiva son el peptidoglucano y el ácido lipoteicoico, y ambos componentes son potentes activadores de la ruta alternativa del complemento, aunque en presencia de anticuerpos específicos también pueden activar la ruta clásica del complemento (Joiner, K.A., y col., Ann. Rev. Immunol. 2:461-2, 1984).
El sistema del complemento estuvo inicialmente implicado en la patogenia de la sepsis cuando los investigadores observaron que las anafilotoxinas C3a y C5a median una variedad de reacciones inflamatorias que también podrían ocurrir durante la sepsis. Estas anafilotoxinas provocan vasodilatación y un aumento de la permeabilidad microvascular, eventos que juegan un papel central en el choque séptico (Schumacher, W.A., y col., Agents Actions 34:345-349, 1991). Además, las anafilotoxinas inducen broncoespasmo, liberación de histamina de los mastocitos y agregación de plaquetas. Por otra parte, ejercen numerosos efectos sobre los granulocitos, tales como quimiotaxis, agregación, adhesión, liberación de enzimas lisosomales, generación de anión superóxido tóxico y formación de leucotrienos (Shin, H.S., y col., Science 162:361-363, 1968; Vogt, W., Complement 3:177-86, 1986). Se cree que estos efectos biológicos desempeñan un papel en el desarrollo de complicaciones de la sepsis tales como el choque o el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) (Hammerschmidt, D.E., y col., Lancet 1:947-949, 1980; Slotman, G.T., y col., Surgery 99:744-50, 1986). Además, niveles elevados de anafilotoxina C3a se asocian con un desenlace fatal en la sepsis (Hack, C.E., y col., Am. J. Med. 86:20-26, 1989). En algunos modelos animales de choque, determinadas cepas deficientes en complemento (por ejemplo, las deficientes en C5) son más resistentes a los efectos de las infusiones de LPS (Hseuh, W., y col., Immunol. 70:309-14, 1990).
Se ha demostrado que el bloqueo de la generación C5a con anticuerpos durante la aparición de la sepsis en roedores mejora enormemente la supervivencia (Czermak, B.J., y col., Nat. Med. 5:788-792, 1999). Se hicieron hallazgos similares cuando se bloqueó el receptor C5a (C5aR), ya sea con anticuerpos o con un inhibidor molecular pequeño (Huber-Lang, M.S., y col., FASEB J. 16:1567-74, 2002; Riedemann, N.C., y col., J. Clin. Invest. 110:101-8, 2002). Estudios experimentales anteriores en monos han sugerido que el bloqueo de anticuerpos de C5a atenúa el choque séptico inducido por E. coli y el síndrome de dificultad respiratoria del adulto (Hangen, D.H., y col., J. Surg. Res. 46:195-9, 1989; Stevens, J.H., y col., J. Clin. Invest. 77:1812-16, 1986). En seres humanos con sepsis, C5a estaba elevado y se asoció con tasas de supervivencia significativamente reducidas junto con fallo multiorgánico, en comparación con la de pacientes y supervivientes con septicemia menos grave (Nakae, H., y col., Res. Commun. Chem. Pathol.
Pharmacol. 84:189-95, 1994; Nakae, y col., Surg. Today 26:225-29, 1996; Bengtson, A., y col., Arch. Surg. 123:645-649, 1988). Los mecanismos por los que C5a ejerce sus efectos nocivos durante la sepsis aún no se han investigado con mayor detalle, pero datos recientes sugieren que la generación de C5a durante la sepsis compromete significativamente las funciones inmunitarias innatas de neutrófilos sanguíneos (Huber-Lang, M.S., y col., J. Immunol.
169:3223-31, 2002), su capacidad para expresar un estallido respiratorio y su capacidad para generar citocinas (Riedemann, N.C., y col., Immunity 19:193-202, 2003). Además, La generación de C5a durante la sepsis parece tener efectos procoagulantes (Laudes, I.J., y col., Am. J. Pathol. 160:1867-75, 2002). La proteína moduladora del complemento CI INH también ha demostrado eficacia en modelos animales de sepsis y SDRa (Dickneite, G., Behring Ins. Mitt. 93:299-305, 1993).
La ruta de la lectina también puede tener un papel en la patogenia de la sepsis. Se ha demostrado que la MBL se une a una variedad de microorganismos clínicamente importantes, incluyendo bacterias gramnegativas y grampositivas, y activa la ruta de la lectina (Neth, O., y col., Infect. Immun. 68:688, 2000). El ácido lipoteicoico (ALT) se considera cada vez más como el equivalente grampositivo del LPS. Es un potente inmunoestimulante que induce la liberación de citocinas de fagocitos mononucleares y sangre completa (Morath, S., y col., J. Exp. Med. 195:1635, 2002; Morath, S., y col., Infect. Immun. 70:938, 2002). Recientemente se demostró que la L-ficolina se une específicamente al ALT aislado de numerosas especies de bacterias grampositivas, incluyendo Staphylococcus aureus, y activa la ruta de la lectina (Lynch, N.J., y col., J. Immunol. 172:1198-02, 2004). También se ha demostrado que la MBL se une al ALT de Enterococcus spp en el que la cadena de poliglicerofosfato está sustituida con grupos glucosilo), pero no al ALT de otras nueve especies, incluyendo S. aureus (Polotsky, V.Y., y col., Infect. Immun. 64:380, 1996).
En el presente documento se describe un procedimiento para tratar la sepsis o una afección resultante de la sepsis, mediante la administración de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece sepsis o una afección resultante de sepsis que incluye, sin limitación, sepsis grave, choque séptico, síndrome de dificultad respiratoria aguda resultante de sepsis y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica. Se describen procedimientos relacionados para el tratamiento de otros trastornos sanguíneos, incluyendo choque hemorrágico, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) autoinmunitaria, síndrome urémico hemolítico (SUH), síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa) u otras afecciones que destruyen la médula o la sangre, mediante la administración de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece dicha afección. El agente inhibidor de MASP-2 se administra al sujeto sistémicamente, tal como mediante administración intrarterial, intravenosa, intramuscular, inhalatoria (particularmente en el caso de SDRA), subcutánea u otra parenteral, o potencialmente mediante administración oral para agentes no peptidérgicos. La composición del agente inhibidor de MASP-2 se puede combinar con uno o más agentes terapéuticos adicionales para combatir las secuelas de la sepsis y/o el choque. Para sepsis avanzada o choque o una afección de malestar resultante de la misma, la composición inhibidora de MASP-2 puede administrarse adecuadamente en una forma de dosificación de acción rápida, tal como mediante administración intravenosa o intrarterial de un bolo de una solución que contiene la composición de agente inhibidor de MASP-2. La administración repetida puede realizarse según lo determine un médico hasta que se haya resuelto la afección.
COAGULOPATÍAS
Se han desarrollado pruebas del papel del sistema del complemento en la coagulación intravascular diseminada ("CID"), tal como la CID secundaria por traumatismo corporal significativo.
Estudios anteriores han demostrado que ratones C4-/- no están protegidos de la lesión por reperfusión renal. (Zhou, W., y col., "Predominant role for C5b-9 in renal ischemia/reperfusion injury", J Clin Invest 105:1363-1371 (2000)) Para investigar si ratones C4-/- aún son capaces de activar el complemento a través de la ruta clásica o la de la lectina, el recambio de C3 en plasma C4-/- se midió en ensayos específicos para la ruta de activación de la ruta clásica o de la lectina. Si bien no se pudo observar escisión de C3 cuando se desencadenó la activación a través de la clásica, se observó una activación de C3 dependiente de la ruta de la lectina altamente eficaz en suero deficiente en C4 (FIGURA 30). Puede verse que el depósito de C3b en manano y cimosano está gravemente comprometido en ratones MASP-2-/-, incluso en condiciones experimentales, que, de acuerdo con muchos artículos publicados anteriormente sobre la activación de la ruta alternativa, debe ser permisivo para las tres rutas. Cuando se utilizan los mismos sueros en pocillos recubiertos con complejos de inmunoglobulina en lugar de manano o cimosano, el depósito de C3b y la escisión del factor B se ven en sueros de ratones MASP-2+/+ y sueros MASP-2-/-, pero no en sueros empobrecidos en C1q. Esto indica que la activación de la ruta alternativa se facilita en los sueros MASP-2-/- cuando el C3b inicial se describe mediante la actividad clásica. La FIGURA 30C representa el sorprendente hallazgo de que C3 puede activarse eficazmente de una manera dependiente de la ruta de la lectina en plasma deficiente en C4.
Este "puente de C4" se elimina mediante la inhibición de la activación de la ruta de la lectina mediante incubación previa del plasma con manano soluble o manosa.
La activación anómala no inmunitaria del sistema del complemento es potencialmente peligrosa para el ser humano y también puede desempeñar un papel importante en la activación de la ruta hematológica, particularmente en situaciones de traumatismo intenso en las que se activan rutas tanto inflamatorias como hematológicas. En condiciones normales de salud, la conversión de C3 es < 5 % de la proteína C3 plasmática total. En una infección general, incluyendo septicemia y enfermedad por inmunocomplejos, la conversión de C3 se restablece en aproximadamente un 30 % con niveles del complemento frecuentemente más bajos de lo normal, debido a una mayor utilización y cambios en la distribución del conjunto. La activación inmediata de la ruta C3 de más de un 30 % generalmente produce evidencia clínica obvia de vasodilatación y pérdida de líquido a los tejidos. Por encima de un 30 % de conversión de C3, los mecanismos de iniciación son predominantemente no inmunitarios y las manifestaciones clínicas resultantes son perjudiciales para el paciente. Los niveles de C5 del complemento en condiciones de salud y en enfermedad controlada parecen mucho más estables que los de C3. Las disminuciones significativas y/o la conversión de los niveles de C5 están asociadas con la respuesta del paciente a un politraumatismo anormal (por ejemplo, accidentes de tráfico) y el probable desarrollo de síndromes pulmonares de choque. Por tanto, cualquier evidencia de activación del complemento C3 más allá de un 30 % del conjunto vascular o de cualquier implicación de C5, o ambos, puede considerarse probable que sea un presagio de un cambio patológico perjudicial en el paciente.
Tanto C3 como C5 liberan anafilotoxinas (C3a y C5a) que actúan sobre los mastocitos y basófilos liberando sustancias químicas vasodilatadoras. Establecen gradientes quimiotácticos para guiar a las células polimorfonucleares (PMN) al centro de las alteraciones inmunitarias (una respuesta beneficiosa), pero aquí difieren porque C5a tiene un efecto de agrupamiento (agregación) específico en estas células fagocíticas, evitando su movimiento aleatorio fuera del sitio de reacción. En control normal de la infección, C3 activa C5. Sin embargo, en politraumatismos, C5 parece estar ampliamente activado, generando anafilotoxinas C5a sistémicamente. Esta actividad descontrolada hace que los polimorfos se agrupen dentro del sistema vascular, y estos grupos luego se arrastren hacia los capilares de los pulmones, que ocluyen y generan efectos dañinos locales como resultado de la liberación de superóxido. Aunque sin desear quedar limitados a teoría alguna, el mecanismo es probablemente importante en la patogenia del síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), aunque esta opinión ha sido cuestionada recientemente. Puede demostrarse in vitro que las anafilotoxinas C3a son potentes agregadores de plaquetas, pero su participación in vivo está menos definida y la liberación de sustancias plaquetarias y plasmina en la reparación de heridas puede implicar solo de forma secundaria al complemento C3. Es posible que sea necesaria una elevación prolongada de la activación de C3 para generar CID.
Además de los efectos celulares y vasculares del componente del complemento activado descrito anteriormente que podrían explicar el vínculo entre el traumatismo y la CID, los descubrimientos científicos emergentes han identificado vínculos moleculares directos e interferencias funcionales entre el complemento y los sistemas de coagulación. Se han obtenido datos de apoyo de estudios en ratones deficientes en C3. Dado que C3 es el componente compartido para cada una de las rutas del complemento, se predice que ratones deficientes en C3 carecen de toda la función del complemento. Sorprendentemente, sin embargo, ratones deficientes en C3 son perfectamente capaces de activar componentes terminales del complemento. (Huber-Lang, M., y col., "Generation of C5a in the absence of C3: a new complement activation pathway", Nat. Med 12:682-687 (2006)) Estudios detallados revelaron que la activación de los componentes terminales del complemento independiente de C3 está mediada por trombina, la enzima limitante de la velocidad de la cascada de coagulación. (Huber y col., 2006) Los componentes moleculares que median la activación de la trombina después de la activación inicial del complemento siguen siendo esquivos.
Los presentes inventores han dilucidado lo que se cree que es la base molecular de la interferencia entre el complemento y las cascadas de coagulación e identificaron MASP-2 como un punto de control central que une los dos sistemas. Estudios bioquímicos sobre la especificidad del sustrato de MASP-2 han identificado a la protrombina como un posible sustrato, además de las bien conocidas proteínas del complemento C2 y C4. MASP-2 escinde específicamente la protrombina en sitios funcionalmente relevantes, generando trombina, la enzima limitante de la velocidad de la cascada de coagulación. (Krarup, A., y col., "Simultaneous Activation of Complement and Coagulation by MBL-Associated Serine Protease 2", PloS. ONE. 2:e623 (2007)) La trombina generada con MASP-2 es capaz de promover el depósito de fibrina en un sistema reconstituido definido in vitro, demostrando la relevancia funcional de la escisión de MASP-2. (Krarup y col., 2007) Como se explica en los ejemplos en el presente documento a continuación, los inventores han corroborado además la importancia fisiológica del presente descubrimiento al documentar la activación de la trombina en suero de roedor normal después de la activación de la ruta de la lectina, y han demostrado que este procedimiento se bloquea mediante la neutralización de anticuerpos monoclonales MASP-2.
MASP-2 puede representar un punto de ramificación central en la ruta de la lectina, capaz de promover la activación tanto del sistema del complemento como del de coagulación. Dado que la activación de la ruta de la lectina es una respuesta fisiológica a muchos tipos de lesiones traumáticas, los presentes inventores creen que la inflamación sistémica simultánea (mediada por componentes del complemento) y la coagulación diseminada (mediada a través de la ruta de la coagulación) pueden explicarse mediante la capacidad de MASP-2 para activar ambas rutas. Estos hallazgos sugieren claramente un papel de MASP-2 en la generación de la CID y el beneficio terapéutico de la inhibición de MASP-2 en el tratamiento o la prevención de la CID. MASP-2 puede proporcionar el vínculo molecular entre el sistema del complemento y el sistema de coagulación, y la activación de la ruta de la lectina cuando ocurre en situaciones de traumatismo puede iniciar directamente la activación del sistema de coagulación a través del eje MASP-2-trombina, proporcionando un vínculo farmacodinámico entre el traumatismo y la CID. De acuerdo con un ejemplo descrito en el presente documento, la inhibición de MASP-2 inhibiría la activación de la ruta de la lectina y reduciría la generación de las anafilotoxinas C3a y C5a. Se cree que es necesaria una elevación prolongada de la activación de C3 para generar CID.
La coagulación microcirculatoria (coágulos de transferencia en capilares y vasos sanguíneos pequeños) ocurre en situaciones como un choque séptico. Se establece un papel de la ruta de la lectina en el choque séptico, como lo demuestra el fenotipo protegido de los modelos de ratón MASP-2 (-/-) de sepsis, descrito en el Ejemplo 17 y las FIGURAS 18 y 19. Además, como se demuestra en el Ejemplo 15 y las FIGURAS 16A y 16B, ratones Ma SP-2 (-/-) están protegidos en el modelo de reacción de Schwartzman localizado de coagulación intravascular diseminada (CID), un modelo de coagulación localizada en microvasos.
V. AGENTES INHIBIDORES DE MASP-2
En el presente documento se describen procedimientos para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar una microangiopatía trombótica. Los agentes inhibidores de MASP-2 se administran en una cantidad eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto vivo. En la práctica de este ejemplo descrito en el presente documento, los agentes inhibidores de MASP-2 representativos incluyen: moléculas que inhiben la actividad biológica de MASP-2 (tales como inhibidores de moléculas pequeñas, anticuerpos anti-MASP-2 o péptidos de bloqueo que interactúan con MASP-2 o interfieren con una interacción proteína-proteína) y moléculas que disminuyen la expresión de MASP -2 (tales como moléculas de ácido nucleico antisentido MASP-2, moléculas de ARNi específicas de MASP-2 y ribozimas MASP-2), evitando así que MASP-2 active la ruta del complemento de la lectina. Los agentes inhibidores de MASP-2 pueden usarse solos como terapia primaria o en combinación con otros tratamientos como terapia adyuvante para mejorar los beneficios terapéuticos de otros tratamientos médicos.
La inhibición de la activación del complemento dependiente de MASP-2 se caracteriza por al menos uno de los siguientes cambios en un componente del sistema del complemento que se produce como resultado de la administración de un agente inhibidor de MASP-2 de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento: la inhibición de la generación o producción de productos del sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2 C4b, C3a, C5a y/o C5b-9 (MAC) (medidos, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2), la reducción de la activación del complemento evaluada en un ensayo hemolítico usando glóbulos rojos de conejo o cobaya no sensibilizados (medidos, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 33), la reducción de la escisión de C4 y el depósito de C4b (medidos, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2), o la reducción de la escisión de C3 y el depósito de C3b (medidos, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2).
Tal como se describe en el presente documento, se utilizan agentes inhibidores de MASP-2 que son eficaces para inhibir el sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2. Agente inhibidores de MASP-2 útiles en la práctica de este ejemplo descrito en el presente documento incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-MASP-2 y fragmentos de los mismos, péptidos inhibidores de MASP-2, moléculas pequeñas, receptores solubles e inhibidores de la expresión de MASP-2. Los agentes inhibidores de MASP-2 pueden inhibir el sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2 mediante el bloqueo de la función biológica de MASP-2. Por ejemplo, un agente inhibidor puede bloquear eficazmente las interacciones proteína-proteína de MASP-2, interferir con la dimerización o el ensamblaje de MASP-2, bloquear la unión a Ca2+, interferir con el sitio activo de la serina proteasa MASP-2, o puede reducir la expresión de la proteína MASP-2.
En algunos casos, los agentes inhibidores de MASP-2 inhiben selectivamente la activación del complemento MASP-2, dejando funcionalmente inalterado el sistema de activación del complemento dependiente de C1q.
En un caso, un agente inhibidor de MASP-2 útil en los procedimientos descritos en el presente documento es un agente inhibidor de MASP-2 específico que se une específicamente a un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 6 con una afinidad de al menos diez veces mayor que a otros antígenos en el sistema del complemento. En otro caso, un agente inhibidor de MASP-2 se une específicamente a un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 6 con una afinidad de unión de al menos 100 veces mayor que a otros antígenos en el sistema del complemento. La afinidad de unión del agente inhibidor de MASP-2 se puede determinar usando un ensayo de unión adecuado.
El polipéptido MASP-2 exhibe una estructura molecular similar a MASP-1, MASP-3, C1r y C1s, las proteasas del sistema del complemento C1. La molécula de ADNc expuesta en la SEQ ID NO: 4 codifica un ejemplo representativo de MASP-2 (que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5) y proporciona el polipéptido MASP-2 humano con una secuencia líder (aa 1 -15) que se escinde después de la secreción, dando como resultado la forma madura de MASP-2 humana (SEQ ID NO: 6). Como se muestra en la FIGURA 2, el gen MASP 2 humano abarca doce exones. El ADNc de MASP-2 humana está codificado por los exones B, C, D, F, G, H, I, J, K y L. Un empalme alternativo da como resultado una proteína de 20 kDa denominada proteína 19 asociada a MBL ("MAp19", también denominada "sMAP") (SEQ ID NO: 2), codificada por (SEQ ID NO: 1) que surge de los exones B, C, D y E como se muestra en la FIGURA 2. La molécula de ADNc expuesta en la SEQ ID NO: 50 codifica la MASP-2 murina (que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 51) y proporciona el polipéptido MASP-2 murino con una secuencia líder que se escinde después de la secreción, dando como resultado la forma madura de MASP-2 murina (SEQ ID NO: 52). La molécula de ADNc expuesta en la SEQ ID NO: 53 codifica MASP-2 de rata (que consiste en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 54) y proporciona el polipéptido MASP-2 de rata con una secuencia líder que se escinde después de la secreción, dando como resultado la forma madura de MASP-2 de rata (SEQ ID NO: 55).
Los expertos en la materia reconocerán que las secuencias desveladas en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 53 representan alelos individuales de MASP-2 humana, murina y de rata respectivamente, y se espera que ocurran variaciones alélicas y empalmes alternativos. Variantes alélicas de las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 53, incluyendo las que contienen mutaciones silenciosas y aquellas en las que las mutaciones dan como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos, están dentro del ámbito de la presente divulgación. Se pueden clonar variantes alélicas de la secuencia MASP-2 sondando bibliotecas de ADNc o genómicas de diferentes individuos de acuerdo con procedimientos estándar.
Los dominios de la proteína MASP-2 humana (SEQ ID NO: 6) se muestran en la FIGURA 1 y 2A e incluyen un dominio N-terminal C1r/C1s/Vegf de erizo de mar/proteína morfogénica ósea (CUBI) (aa 1-121 de la SEQ ID NO: 6), un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico (aa 122-166), un segundo dominio CUBI (aa 167-293), así como un tándem de dominios de proteína de control del complemento y un dominio de serina proteasa. El empalme alternativo del gen MASP 2 da como resultado MAp19 que se muestra en la FIGURA 1. MAp19 es una proteína no enzimática que contiene la región N-terminal CUB1-EGF de MASP-2 con cuatro restos adicionales (EQSL) procedentes del exón E como se muestra en la FIGURA 1.
Se ha demostrado que varias proteínas se unen o interactúan con MASP-2 a través de interacciones proteína a proteína. Por ejemplo, se sabe que MASP-2 se une a, y forma complejos dependientes Ca2+ con, las proteínas de lectina MBL, H-ficolina y L-ficolina. Se ha demostrado que cada complejo MASP-2/lectina activa el complemento a través de la escisión dependiente de MASP-2 de las proteínas C4 y C2 (Ikeda, K., y col., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., y col., J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., y col., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). Estudios han demostrado que los dominios CUB1-EGF de MASP-2 son esenciales para la asociación de MASP-2 con MBL (Thielens, N.M., y col., J. Immunol. 166:5068, 2001). También se ha demostrado que los dominios CUB1EGFCUBII median la dimerización de MASP-2, que se requiere para la formación de un complejo MBL activo (Wallis, R., y col., J. Biol. Chem. 275:30962-30969, 2000). Por tanto, Se pueden identificar agentes inhibidores de MASP-2 que se unen o interfieren con regiones diana de MASP-2 que se sabe que son importantes para la activación del complemento dependiente de MASP-2.
ANTICUERPOS ANTI-MASP-2
El agente inhibidor de MASP-2 comprende un anticuerpo anti-MASP-2 que inhibe el sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2. Los anticuerpos anti-MASP-2 útiles en este ejemplo descritos en el presente documento incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales o recombinantes procedentes de cualquier mamífero productor de anticuerpos y pueden ser multiespecíficos, quiméricos, humanizados, antidiotípicos y fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, fragmentos Fv, fragmentos scFv y anticuerpos monocatenarios como se describe adicionalmente en el presente documento.
En la literatura se han descrito varios anticuerpos anti-MASP-2, algunos de los cuales se enumeran a continuación en la TABLA 1. Estos anticuerpos anti-MASP-2 descritos previamente pueden cribarse para determinar la capacidad de inhibir el sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2 usando los ensayos descritos en el presente documento. Por ejemplo, se han identificado anticuerpos Fab2 anti-MASP-2 de rata que bloquean la activación del complemento dependiente de MASP-2, como se describe con más detalle en los Ejemplos 10 y 11 en el presente documento. Una vez que se identifica un anticuerpo anti-MASP-2 que funciona como agente inhibidor de MASP-2, se puede usar para producir anticuerpos antidiotípicos y para identificar otras moléculas de unión a MASP-2 como se describe adicionalmente más adelante.
TABLA 1: ANTICUERPOS ESPECÍFICOS DE MASP-2 DE LA LITERATURA
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(continuación)
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ANTICUERPOS ANTI-MASP-2 CON FUNCION EFECTORA REDUCIDA
Los anticuerpos anti-MASP-2 pueden tener una función efectora reducida para reducir la inflamación que puede surgir de la activación de la ruta clásica del complemento. Se ha demostrado que la capacidad de las moléculas de IgG para desencadenar la ruta clásica del complemento reside dentro de la porción Fc de la molécula (Duncan, A.R., y col., Nature 332:738-740 1988). Las moléculas de IgG en las que la porción Fc de la molécula se ha eliminado mediante escisión enzimática carecen de esta función efectora (véase Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988). En consecuencia, se pueden generar anticuerpos con función efectora reducida como resultado de la falta de la porción Fc de la molécula al tener una secuencia Fc modificada genéticamente que minimiza la función efectora, o al ser de isotipo IgG2 o IgG4 humanos.
Los anticuerpos con función efectora reducida se pueden producir mediante manipulación biológica molecular estándar de la porción Fc de las cadenas pesadas de IgG como se describe en el Ejemplo 9 en el presente documento y también se describe en Jolliffe y col., Int'l Rev. Immunol. 10:241-250, 1993, y en Rodrigues y col., J. Immunol. 151:6954-6961, 1998. Los anticuerpos con función efectora reducida también incluyen isotipos IgG2 e IgG4 humanos que tienen una capacidad reducida para activar el complemento y/o interactuar con receptores Fc (Ravetch, J.V., y col., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991; Isaacs, J.D., y col., J. Immunol. 148:3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G., y col., Immunol. Today 14:215-221, 1993). Se pueden producir anticuerpos humanizados o completamente humanos específicos para MASP-2 humana compuestos por isotipos IgG2 o IgG4 mediante uno de varios procedimientos conocidos por un experto en la materia, como se describe en Vaughan, T.J., y col., Nature Biotechnical 16:535-539, 1998.
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-MASP-2
Se pueden producir anticuerpos anti-MASP-2 usando polipéptidos MASP-2 (por ejemplo, MASP-2 de longitud completa) o usando péptidos antigénicos que portan el epítopo MASP-2 (por ejemplo, una porción del polipéptido MASP-2). Los péptidos inmunogénicos pueden ser tan pequeños como cinco restos de aminoácidos. Por ejemplo, el polipéptido MASP-2 que incluye la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 6 puede usarse para inducir anticuerpos anti-MASP-2 útiles en el procedimiento descrito en el presente documento. Dominios particulares de MASP-2 que se sabe que están implicados en interacciones proteína-proteína, tales como los dominios CUBI y CUBIEGF, así como la región que abarca el sitio activo de serina-proteasa, pueden expresarse como polipéptidos recombinantes como se describe en el Ejemplo 3 y usarse como antígenos. Además, también son útiles péptidos que comprenden una porción de al menos 6 aminoácidos del polipéptido MASP-2 (SEQ ID NO: 6) para inducir anticuerpos MASP-2. Ejemplos adicionales de antígenos procedentes de MASP-2 útiles para inducir anticuerpos MASP-2 se describen a continuación en la TABLA 2. Los péptidos y polipéptidos MASP-2 usados para generar anticuerpos pueden aislarse como polipéptidos naturales, o péptidos recombinantes o sintéticos y polipéptidos recombinantes catalíticamente inactivos, tales como MASP-2A, como se describe adicionalmente en los Ejemplos 5-7. En algunos casos de este ejemplo descrito en el presente documento, se obtienen anticuerpos anti-MASP-2 usando una cepa transgénica de ratón como se describe en los Ejemplos 8 y 9 y se describe adicionalmente a continuación.
Los antígenos útiles para producir anticuerpos anti-MASP-2 también incluyen polipéptidos de fusión, tales como fusiones de MASP-2 o una porción de la misma con un polipéptido de inmunoglobulina o con una proteína de unión a maltosa. El inmunógeno polipeptídico puede ser una molécula de longitud completa o una porción de la misma. Si la porción polipeptídica es similar a un hapteno, dicha porción se puede unir o enlazar ventajosamente a un vehículo macromolecular (tal como la hemocianina de lapa californiana (KLH, por sus siglas en inglés), albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés) o toxoide tetánico) para inmunización.
TABLA 2: ANTÍGENOS PROCEDENTES DE MASP-2
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ANTICUERPOS POLICLONALES
Se pueden preparar anticuerpos policlonales contra MASP-2 mediante la inmunización de un animal con el polipéptido MASP-2 o una porción inmunogénica del mismo usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Green y col., "Production of Polyclonal Antisera", en Immunochemical Protocols (Manson, ed.), página 105, y como se describe adicionalmente en el Ejemplo 6. La inmunogenicidad de un polipéptido MASP-2 puede aumentarse mediante el uso de un adyuvante, incluyendo geles minerales, tales como hidróxido de aluminio o adyuvante de Freund (completo o incompleto), sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol. Normalmente se generan anticuerpos policlonales en animales tales como caballos, vacas, perros, pollos, ratas, ratones, conejos, cobayas, cabras u ovejas. Como alternativa, un anticuerpo anti-MASP-2 útil en la presente divulgación también puede proceder de un primate infrahumano. Se pueden encontrar técnicas generales para generar anticuerpos diagnósticos y terapéuticamente útiles en babuinos, por ejemplo, en Goldenberg y col., Publicación de Patente Internacional N.° WO 91/11465, y en Losman, M.J., y col., Int. J. Cancer 46:310, 1990. A continuación, se producen sueros que contienen anticuerpos inmunológicamente activos a partir de la sangre de dichos animales inmunizados usando procedimientos estándar bien conocidos en la materia.
ANTICUERPOS MONOCLONALES
En algunos casos, el agente inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo monoclonal anti-MASP-2. Los anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 son altamente específicos, estando dirigidos contra un solo epítopo MASP-2. Tal como se utiliza en el presente documento, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo mediante ningún procedimiento particular. Se pueden obtener anticuerpos monoclonales utilizando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares continuas en cultivo, tal como el procedimiento de hibridoma descrito por Kohler, G., y col., Nature 256:495, 1975, o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567 de Cabilly). También pueden aislarse anticuerpos monoclonales de bibliotecas de anticuerpos de fagos utilizando las técnicas descritas en Clackson, T., y col., Nature 352:624-628, 1991, y Marks, J.D., y col., J. Mol. Biol.
222:581-597, 1991. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas.
Por ejemplo, se pueden obtener anticuerpos monoclonales mediante la inyección a un mamífero adecuado (por ejemplo, un ratón BALB/c) de una composición que comprende un polipéptido MASP-2 o una porción del mismo. Después de un período de tiempo predeterminado, se extraen los esplenocitos del ratón y se suspenden en un medio de cultivo celular. A continuación, los esplenocitos se fusionan con una línea celular inmortal para formar un hibridoma. Los hibridomas formados se cultivan en cultivo celular y se seleccionan para determinar su capacidad para producir un anticuerpo monoclonal contra MASP-2. En el Ejemplo 7 se describe un ejemplo que describe además la producción de anticuerpos monoclonales anti-MASP-2. (Véase también Current Protocols in Immunology, Vol. 1., John Wiley & Sons, páginas 2.5.1-2.6.7, 1991.)
Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales humanos mediante el uso de ratones transgénicos que han sido genomanipulados para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a una exposición al antígeno. En esta técnica, se introducen elementos del locus de cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina humana en cepas de ratones procedentes de líneas de células madre embrionarias que contienen alteraciones dirigidas de los loci de cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina endógena. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, tales como los antígenos MASP-2 descritos en el presente documento, y los ratones se pueden usar para producir hibridomas que secretan anticuerpos MASP-2 humanos mediante la fusión de linfocitos B de dichos animales con líneas celulares de mieloma adecuadas usando tecnología Kohler-Milstein convencional como se describe adicionalmente en el Ejemplo 7. Ratones transgénicos con un genoma de inmunoglobulina humana están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Abgenix, Inc., Fremont, CA y Medarex, Inc., Annandale, N.J.). Se describen procedimientos para obtener anticuerpos humanos de ratones transgénicos, por ejemplo, en Green, L.L., y col., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg, N., y col., Nature 368:856, 1994; y Taylor, L.D., y col., Int. Immun. 6:579, 1994.
Pueden aislarse anticuerpos monoclonales y purificarse a partir de cultivos de hibridomas mediante una variedad de técnicas bien establecidas. Dichas técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con proteína A sefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico (véase, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y páginas 2.9.1-2.9.3; Baines y col., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol. 10, páginas 79-104, 1992).
Una vez producidos, los anticuerpos policlonales, monoclonales o procedentes de fagos se prueban primero para determinar la unión específica a Ma s P-2. Se pueden utilizar una variedad de ensayos conocidos por los expertos en la materia para detectar anticuerpos que se unen específicamente a MASP-2. Los ensayos ejemplares incluyen transferencia Western o análisis de inmunoprecipitación mediante procedimientos estándar (por ejemplo, como se describe en Ausubel y col.), inmunoelectroforesis, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas, inmunotransferencia por puntos, ensayos de inhibición o competencia y ensayos sándwich (como se describe en Harlow y Land, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Una vez que se identifican los anticuerpos que se unen específicamente a MASP-2, los anticuerpos anti-MASP-2 se prueban para determinar la capacidad de funcionar como un agente inhibidor de MASP-2 en uno de varios ensayos tales como, por ejemplo, un ensayo de escisión de C4 específico de lectina (descrito en el Ejemplo 2), un ensayo de depósito de C3b (descrito en el Ejemplo 2) o un ensayo de depósito de C4b (descrito en el Ejemplo 2).
La afinidad de los anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 se puede determinar fácilmente por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Scatchard, A., NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949). En un caso, los anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 útiles para los procedimientos descritos en el presente documento se unen a MASP-2 con una afinidad de unión de < 100 nM, preferentemente < 10 nM y lo más preferentemente < 2 nM. En algunos casos, un anticuerpo monoclonal inhibidor de MASP-2 útil en los procedimientos descritos en el presente documento es un anticuerpo monoclonal inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende (I) (a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una CDR-H1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 31-35 de la SEQ ID NO: 67; y ii) una CDR-H2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-65 de la SEQ ID NO: 67; y iii) una CDR-H3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 95-102 de la SEQ ID NO: 67 y b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una CDR-L1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 24-34 de la SEQ ID NO: 70; y ii) una CDR-L2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-56 de la SEQ ID NO: 70; y iii) una CDR-L3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 89-97 de la SEQ ID NO: 70, o (II) una variante del mismo que comprende una región variable de cadena pesada con al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 67 (por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 67) y una región variable de cadena ligera con al menos un 90 % de identidad (por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 70.
ANTICUERPOS QUIMÉRICOS/HUMANIZADOS
Los anticuerpos monoclonales útiles en los procedimientos descritos en el presente documento incluyen anticuerpos quiméricos en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos procedentes de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos procedentes de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos (Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567, de Cabilly; y Morrison, S.L., y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984).
Una forma de anticuerpo quimérico útil en la divulgación es un anticuerpo anti-MASP-2 monoclonal humanizado. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos, que contienen una secuencia mínima procedente de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos monoclonales humanizados se producen mediante la transferencia de las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) no humanas (por ejemplo, de ratón), de las cadenas variables pesada y ligera de la inmunoglobulina de ratón a un dominio variable humano. Normalmente, los restos de anticuerpos humanos se sustituyen luego en las regiones marco de los equivalentes no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en el que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco de Fv son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, véase Jones, P.T., y col., Nature 321:522-525, 1986; Reichmann, L., y col., Nature 332:323-329, 1988; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992.
Los anticuerpos humanizados útiles como se describen en el presente documento incluyen anticuerpos monoclonales humanos que incluyen al menos una región CDR3 de unión a MASP-2. Además, las porciones Fc pueden reemplazarse para producir IgA o IgM así como anticuerpos IgG humanos. Dichos anticuerpos humanizados tendrán una utilidad clínica particular porque reconocerán específicamente MASP-2 humana pero no provocarán una respuesta inmunitaria en seres humanos contra el propio anticuerpo. En consecuencia, son más adecuados para administración in vivo en seres humanos, especialmente cuando es necesaria la administración repetida o prolongada.
En el presente documento, en el Ejemplo 6 se describe un ejemplo de la generación de un anticuerpo anti-MASP-2 humanizado a partir de un anticuerpo monoclonal anti-MASP-2 murino. También se describen técnicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados, por ejemplo, en Jones, P.T., y col., Nature 321:522, 1986; Carter, P., y col., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992; Singer, I.I., y col., J. Immun.
150:2844, 1993; Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., 1995; Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies", en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland y col. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., páginas 399-434, 1996; y en la Patente de Estados Unidos N.° 5.693.762, en Queen, 1997. Además, existen entidades comerciales que sintetizan anticuerpos humanizados a partir de regiones específicas de anticuerpos murinos, tales como Protein Design Labs (Mountain View, CA).
ANTICUERPOS RECOMBINANTES
También se pueden preparar anticuerpos anti-MASP-2 usando procedimientos recombinantes. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos humanos usando bibliotecas de expresión de inmunoglobulina humana (disponibles, por ejemplo, de Stratagene, Corp., La Jolla, CA) para producir fragmentos de anticuerpos humanos (Vh, Vl, Fv, Fd, Fab o F(ab')2). Estos fragmentos se usan luego para construir anticuerpos humanos completos usando técnicas similares a las de producir anticuerpos quiméricos.
ANTICUERPOS ANTIDIOTÍPICOS
Una vez que se identifican los anticuerpos anti-MASP-2 con la actividad inhibidora deseada, estos anticuerpos se pueden usar para generar anticuerpos antidiotípicos que se asemejen a una porción de MASP-2 usando técnicas que son bien conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, Greenspan, N.S., y col., FASEB J. 7:437, 1993. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a MASP-2 e inhiben competitivamente una interacción de la proteína MASP-2 necesaria para la activación del complemento se pueden usar para generar antidiotípicos que se asemejan al sitio de unión a MBL en la proteína MASP-2 y, por lo tanto, se unen y neutralizan un ligando de unión de MASP-2 tal como, por ejemplo, MBL.
FRAGMENTOS DE INMUNOGLOBULINA
Los agentes inhibidores de MASP-2 útiles en el procedimiento descrito en el presente documento abarcan no solo moléculas de inmunoglobulina inalteradas sino también los fragmentos bien conocidos que incluyen Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2y fragmentos Fv, fragmentos scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos monocatenarios y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Es bien sabido en la materia que solo una pequeña porción de una molécula de anticuerpo, el parátopo, está implicado en la unión del anticuerpo a su epítopo (véase, por ejemplo, Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modem Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986). Las regiones pFc' y Fc del anticuerpo son efectoras de la ruta clásica del complemento, pero no están implicadas en la unión a antígenos. Un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región pFc' o que se ha producido sin la región pFc', se designa como fragmento F(ab')2 y conserva ambos sitios de unión a antígeno de un anticuerpo inalterado. Un fragmento F(ab')2 aislado se denomina fragmento monoclonal bivalente debido a sus dos sitios de unión a antígeno. De forma similar, un anticuerpo a partir del cual se ha escindido enzimáticamente la región Fc, o que se ha producido sin la región Fc, se denomina fragmento Fab y conserva uno de los sitios de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo inalterada.
Se pueden obtener fragmentos de anticuerpos mediante hidrólisis proteolítica, tal como mediante digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos mediante procedimientos convencionales. Por ejemplo, se pueden producir fragmentos de anticuerpos mediante escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')2. Este fragmento se puede escindir adicionalmente usando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes Fab' 3.5S. Opcionalmente, la reacción de escisión se puede realizar usando un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escisión de enlaces disulfuro. Como alternativa, una escisión enzimática que usa pepsina produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos procedimientos se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 4.331.647 de Goldenberg; Nisonoff, A., y col., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, R.R., Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman, y col., en Methods in Enzymology 1:422, Academic Press, 1967; y por Coligan en las páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10.-2.10.4.
En algunos casos, se prefiere el uso de fragmentos de anticuerpos que carecen de la región Fc para evitar la activación de la ruta clásica del complemento que se inicia tras la unión de Fc al receptor Fcy. Existen varios procedimientos mediante los cuales se puede producir un AcM que evite las interacciones del receptor Fcy. Por ejemplo, la región Fc de un anticuerpo monoclonal se puede eliminar químicamente mediante digestión parcial mediante enzimas proteolíticas (tal como la digestión con ficina), generando así, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos tales como fragmentos Fab o F(ab)2 (Mariani, M., y col., Mol. Immunol. 28:69-71, 1991). Como alternativa, el isotipo y4 de IgG humano, que no se une a receptores Fcy, se puede usar durante la construcción de un anticuerpo humanizado como se describe en el presente documento. Los anticuerpos, los anticuerpos monocatenarios y los dominios de unión a antígeno que carecen del dominio Fc también se pueden genomanipular mediante técnicas recombinantes descritas en el presente documento.
FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS MONOCATENARIOS
Como alternativa, se pueden crear moléculas de unión a una sola cadena peptídica específicas para MASP-2 en las que las regiones Fv de la cadena pesada y ligera están conectadas. Los fragmentos Fv se pueden conectar mediante un enlazador peptídico para formar una proteína de unión a antígeno monocatenaria (scFv). Estas proteínas de unión a antígenos monocatenarias se preparan mediante la construcción de un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican los dominios Vh y Vl que están conectados mediante un oligonucleótido. El gen estructural se inserta en un vector de expresión, que posteriormente se introduce en una célula hospedadora, tal como E. coli. Las células hospedadoras recombinantes sintetizan una única cadena polipeptídica con un péptido enlazador que une los dos dominios V. Los procedimientos para producir scFv se describen, por ejemplo, por Whitlow, y col., "Methods: A Companion to Methods in Enzymology" 2:97, 1991; Bird, y col., Science 242:423, 1988; Patente de Estados Unidos n.° 4.946.778, en Ladner; Pack, P., y col., Bio/Technology 11:1271, 1993.
Como ejemplo ilustrativo, se puede obtener un scFv específico de MASP-2 mediante la exposición de linfocitos al polipéptido MASP-2 in vitro y la selección de bibliotecas de presentación de anticuerpos en fagos o vectores similares (por ejemplo, mediante el uso de proteína o péptido MASP-2 inmovilizado o marcado). Se pueden obtener genes que codifican polipéptidos que tienen posibles dominios de unión al polipéptido MASP-2 mediante la selección de bibliotecas de péptidos aleatorios presentados en fagos o en bacterias tales como E. coli. Estas bibliotecas de presentación de péptidos aleatorios se pueden usar para seleccionar péptidos que interactúan con MASP-2. Las técnicas para crear y seleccionar dichas bibliotecas de presentación de péptidos aleatorios son bien conocidas en la materia (Patente de Estados Unidos N.° 5.223.409, de Lardner; Patente de Estados Unidos n.° 4.946.778, en Ladner; Patente de Estados Unidos n.° 5.403.484, de Lardner; Patente de Estados Unidos n.° 5.571.698, de Lardner; y Kay y col., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996) y las bibliotecas de presentación de péptidos aleatorios y kits para la detección de dichas bibliotecas están disponibles comercialmente, por ejemplo de CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.), New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.), y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, N.J.).
Otra forma de un fragmento de anticuerpo anti-MASP-2 útil en este ejemplo descrito en el presente documento es un péptido que codifica una única región determinante de complementariedad (CDR) que se une a un epítopo en un antígeno MASP-2 e inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-2. Se pueden obtener péptidos CDR ("unidades de reconocimiento mínimo") mediante la construcción de genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Dichos genes están preparados, por ejemplo, mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable a partir del ARN de las células productoras de anticuerpos (véase, por ejemplo, Larrick y col., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter y col. (eds.), página 166, Cambridge University Press, 1995; y Ward y col., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Birch y col. (eds.), página 137, Wiley-Liss, Inc., 1995).
Los anticuerpos MASP-2 descritos en el presente documento se administran a un sujeto que los necesita para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2. En algunos casos, el agente inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo anti-MASP-2 monoclonal humano o humanizado de alta afinidad con función efectora reducida.
INHIBIDORES PEPTÍDICOS
El agente inhibidor de MASP-2 descrito en el presente documento puede comprender inhibidores peptídicos de MASP-2 aislados, incluyendo inhibidores peptídicos naturales aislados e inhibidores peptídicos sintéticos que inhiben el sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "inhibidores peptídicos de MASP-2 aislados" se refiere a péptidos que inhiben la activación del complemento dependiente de MASP-2 mediante la unión a, compitiendo con MASP-2 por unirse a otra molécula de reconocimiento (por ejemplo, MBL, H-ficolina, M-ficolina o L-ficolina) en la ruta de la lectina, y/o interactuando directamente con MASP-2 para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 que son sustancialmente puros y están esencialmente libres de otras sustancias con las que se pueden encontrar en naturaleza hasta un grado práctico y apropiado para su uso previsto.
Se han utilizado inhibidores peptídicos con éxito in vivo para interferir con las interacciones proteína-proteína y los sitios catalíticos. Por ejemplo, han sido aprobados recientemente inhibidores peptídicos de moléculas de adhesión estructuralmente relacionadas con LFA-1 para su uso clínico en coagulopatías (Ohman, E.M., y col., European Heart J. 16:50-55, 1995). Se han descrito péptidos lineales cortos (< 30 aminoácidos) que evitan o interfieren con la adhesión dependiente de integrina (Murayama, O., y col., J. Biochem. 120:445-51, 1996). También se han utilizado con éxito péptidos más largos, que varían en longitud de 25 a 200 restos de aminoácidos, para bloquear la adhesión dependiente de integrina (Zhang, L., y col., J. Biol. Chem. 271(47):29953-57, 1996). En general, los inhibidores peptídicos más largos tienen afinidades más altas y/o constantes de disociación más lentas que los péptidos cortos y, por lo tanto, pueden ser inhibidores más potentes. También se ha demostrado que los inhibidores peptídicos cíclicos son inhibidores eficaces de las integrinas in vivo para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria humana (Jackson, D.Y., y col., J. Med. Chem. 40:3359-68, 1997). Un procedimiento para producir péptidos cíclicos implica la síntesis de péptidos en los que los aminoácidos terminales del péptido son cisteínas, permitiendo así que el péptido exista en una forma cíclica mediante enlace disulfuro entre los aminoácidos terminales, que han demostrado mejorar la afinidad y la semivida in vivo para el tratamiento de neoplasias hematopoyéticas (por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 6.649.592, de Larson).
INHIBIDORES PEPTÍDICOS DE MASP-2 SINTÉTICOS
Los péptidos inhibidores de MASP-2 útiles en los procedimientos descritos en el presente documento se ejemplifican mediante secuencias de aminoácidos que imitan las regiones diana importantes para la función de MASP-2. Los péptidos inhibidores útiles en la práctica de los procedimientos descritos en el presente documento varían en tamaño desde aproximadamente 5 aminoácidos hasta aproximadamente 300 aminoácidos. La TABLA 3 proporciona una lista de péptidos inhibidores ejemplares que pueden ser útiles en la práctica de este ejemplo descrito en el presente documento. Se puede probar la capacidad de un péptido inhibidor de MASP-2 candidato para funcionar como un agente inhibidor de MASP-2 en uno de varios ensayos que incluyen, por ejemplo, un ensayo de escisión de C4 específico de lectina (descrito en el Ejemplo 2) y un ensayo de depósito de C3b (descrito en el Ejemplo 2).
En algunos casos, los péptidos inhibidores de MASP-2 proceden de polipéptidos MASP-2 y se seleccionan de la proteína MASP-2 madura de longitud completa (SEQ ID NO: 6), o de un dominio particular de la proteína MASP-2 tal como, por ejemplo, el dominio CUBI (SEQ ID n O: 8), el dominio CUBIEGF (SEQ ID NO: 9), el dominio EGF (SEQ ID NO: 11) y el dominio de serina proteasa (SEQ ID NO: 12). Tal como se ha descrito anteriormente, se ha demostrado que las regiones CUBEGFCUBII son necesarias para la dimerización y la unión con MBL (Thielens y col., supra). En particular, se ha demostrado que la secuencia peptídica TFRSDYN (SEQ ID NO: 16) en el dominio CUBI de MASP-2 está implicada en la unión a MBL en un estudio que identificó a un ser humano que portaba una mutación homocigótica en Asp105 a Gly105, dando como resultado la pérdida de MASP-2 del complejo m Bl (Stengaard-Pedersen, K., y col., Nueva Inglaterra J. Med. 349:554-560, 2003).
En algunos casos, los péptidos inhibidores de MASP-2 proceden de las proteínas de lectina que se unen a MASP-2 y están implicadas en la ruta del complemento de la lectina. Se han identificado varias lectinas diferentes que están implicadas en esta ruta, incluyendo lectina de unión de manano (MBL), L-ficolina, M-ficolina y H-ficolina. (Ikeda, K., y col., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., y col., J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., y col., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). Estas lectinas están presentes en el suero como oligómeros de subunidades homotriméricas, teniendo cada una fibras de tipo colágeno N terminales con dominios de reconocimiento de hidratos de carbono. Se ha demostrado que estas lectinas diferentes se unen a MASP-2, y el complejo lectina/MASP-2 activa el complemento mediante la escisión de las proteínas C4 y C2. La H-ficolina tiene una región aminoterminal de 24 aminoácidos, un dominio de tipo colágeno con 11 repeticiones de Gly-Xaa-Yaa, un dominio de cuello de 12 aminoácidos y un dominio de tipo fibrinógeno de 207 aminoácidos (Matsushita, M., y col., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). La H-ficolina se une a GlcNAc y aglutina eritrocitos humanos recubiertos con LPS procedente de S.
typhimurium, S. minnesota y E. coli. Se ha demostrado que la H-ficolina está asociada con MASP-2 y MAp19 y activa la ruta de la lectina. Id. El L-ficolina/P35 también se une a GlcNAc y se ha demostrado que está asociado con MASP-2 y MAp19 en suero humano y se ha demostrado que este complejo activa la ruta de la lectina (Matsushita, M., y col., J. Immunol. 164:2281,2000). En consecuencia, los péptidos inhibidores de MASP-2 útiles en la presente divulgación pueden comprender una región de al menos 5 aminoácidos seleccionados de la proteína MBL (SEQ ID NO: 21), la proteína H-ficolina (número de registro de Genbank NM_173452), la proteína M-ficolina (número de registro de Genbank 000602) y la proteína L-ficolina (número de registro de Genbank NM_015838).
Más específicamente, los científicos han identificado que el sitio de unión a MASP-2 en MBL está dentro de los 12 tripletes Gly-X-Y "GKD GRD GTK GEK GEP GQG LRG LQG POG KLG POG NOG PSG SOG PKG QKG DOG KS" (SEQ ID NO: 26) que se encuentran entre la bisagra y el cuello en la porción C terminal del dominio de tipo colágeno de MBP (Wallis, R., y col., J. Biol. Chem. 279:14065, 2004). Esta región del sitio de unión a MASP-2 también está altamente conservada en H-ficolina humana y L-ficolina humana. Se ha descrito un sitio de unión de consenso que está presente en las tres proteínas de lectina que comprenden la secuencia de aminoácidos "OGK-X-GP" (SEQ ID NO: 22) en la que la letra "O" representa hidroxiprolina y la letra "X" es una resto hidrófobo (Wallis y col., 2004, supra). En consecuencia, en algunos casos, los péptidos inhibidores de MASP-2 útiles en este ejemplo descrito en el presente documento tienen al menos 6 aminoácidos de longitud y comprenden la SEQ ID NO: 22. Se ha demostrado que los péptidos procedentes de MBL que incluyen la secuencia de aminoácidos "GLR GLQ GPO GKL GPO G" (SEQ ID NO: 24) se unen a MASP-2 in vitro (Wallis, y col., 2004, supra). Para mejorar la unión a MASP-2, se pueden sintetizar péptidos flanqueados por dos tripletes de GPO en cada extremo ("GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GGP OGP O" SEQ ID NO: 25) para mejorar la formación de triples hélices que se encuentran en la proteína MBL natural (como se describe adicionalmente en Wallis, R., y col., J. Biol. Chem. 279:14065, 2004).
Los péptidos inhibidores de MASP-2 también pueden proceder de H-ficolina humana que incluyen la secuencia "GAO GSO GEK GAO GPQ GPO GPO GKM GPK GEO GDO" (SEQ ID NO: 27) de la región de unión a MASP-2 consenso en H-ficolina. También se incluyen péptidos procedentes de L-ficolina humana que incluyen la secuencia "GCO GLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPN GAO GEO" (SEQ ID NO: 28) de la región de unión a MASP-2 consenso en L-ficolina.
Los péptidos inhibidores de MASP-2 también pueden proceder del sitio de escisión de C4 tal como "LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI" (SEQ ID NO: 29) que es el sitio de escisión de C4 unido a la porción C terminal de la antitrombina III (Glover, G.I., y col., Mol. Immunol. 25:1261 (1988)).
TABLA 3: PÉPTIDOS INHIBIDORES DE MASP-2 EJEMPLARES
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(continuación)
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Los péptidos procedentes del sitio de escisión de C4 así como otros péptidos que inhiben el sitio de la serina proteasa MASP-2 pueden modificarse químicamente para que sean inhibidores de proteasa irreversibles. Por ejemplo, las modificaciones apropiadas pueden incluir, pero no necesariamente se limitan a, halometil cetonas (Br, Cl, I, F) en el extremo C, Asp o Glu, o añadidas a cadenas laterales funcionales; grupos haloacetilo (u otros a-haloacetilo) en grupos amino u otras cadenas laterales funcionales; grupos que contienen epóxido o imina en los extremos amino o carboxi o en cadenas laterales funcionales; o imidatos de ésteres en los extremos amino o carboxi o en cadenas laterales funcionales. Dichas modificaciones proporcionarían la ventaja de inhibir permanentemente la enzima mediante unión covalente del péptido. Esto podría dar como resultado dosis eficaces más bajas y/o la necesidad de una administración menos frecuente del inhibidor peptídico.
Además de los péptidos inhibidores descritos anteriormente, los péptidos inhibidores de MASP-2 útiles en el procedimiento descrito en el presente documento incluyen péptidos que contienen la región CDR3 de unión a MASP-2 del AcM anti-MASP-2 obtenido como se describe en el presente documento. La secuencia de las regiones CDR para su uso en la síntesis de péptidos puede determinarse mediante procedimientos conocidos en la materia. La región variable de cadena pesada es un péptido que generalmente varía de 100 a 150 aminoácidos en longitud. La región variable de cadena ligera es un péptido que generalmente varía de 80 a 130 aminoácidos en longitud. Las secuencias de CDR dentro de las regiones variables de cadena pesada y ligera incluyen solo aproximadamente 3-25 secuencias de aminoácidos que pueden ser fácilmente secuenciadas por un experto en la materia.
Los expertos en la materia reconocerán que variaciones sustancialmente homólogas de los péptidos inhibidores de MASP-2 descritos anteriormente también exhibirán actividad inhibidora de MASP-2. Las variaciones ejemplares incluyen, pero no necesariamente se limitan a, péptidos que tienen inserciones, eliminaciones, reemplazos y/o aminoácidos adicionales en las porciones carboxiterminal o aminoterminal de los péptidos objeto y mezclas de los mismos. En consecuencia, aquellos péptidos homólogos que tienen actividad inhibidora de MASP-2 se consideran útiles en los procedimientos descritos en el presente documento. Los péptidos descritos también pueden incluir motivos duplicados y otras modificaciones con sustituciones conservadoras. Las variantes conservadoras se describen en otra parte en el presente documento e incluyen el intercambio de un aminoácido por otro de carga similar, tamaño o hidrofobicidad y similares.
Los péptidos inhibidores de MASP-2 se pueden modificar para aumentar la solubilidad y/o maximizar la carga positiva o negativa con el fin de parecerse más al segmento de la proteína inalterada. El derivado puede tener o no la estructura exacta de aminoácidos primarios de un péptido desvelado en el presente documento siempre que el derivado retenga funcionalmente la propiedad deseada de inhibición de MASP-2. Las modificaciones pueden incluir la sustitución de aminoácidos con uno de los veinte aminoácidos comúnmente conocidos o con otro aminoácido, con un aminoácido derivatizado o sustituido con características complementarias deseables, tal como resistencia a la degradación enzimática o con un D-aminoácido o la sustitución por otra molécula o compuesto, tal como un hidrato de carbono, que imita la confirmación natural y la función del aminoácido, aminoácidos o péptidos; eliminación de aminoácidos; inserción de aminoácidos con uno de los veinte aminoácidos comúnmente conocidos o con otro aminoácido, con un aminoácido derivatizado o sustituido con características complementarias deseables, tal como resistencia a la degradación enzimática o con un D-aminoácido o la sustitución por otra molécula o compuesto, tal como un hidrato de carbono, que imita la confirmación natural y la función del aminoácido, aminoácidos o péptidos; o sustitución por otra molécula o compuesto, tal como un monómero de hidrato de carbono o ácido nucleico, que imita la conformación natural, distribución de carga y función del péptido original. Los péptidos también pueden modificarse mediante acetilación o amidación.
La síntesis de péptidos inhibidores derivados puede basarse en técnicas conocidas de biosíntesis de péptidos, biosíntesis de hidratos de carbono y similares. Como punto de partida, el experto en la materia puede confiar en un programa informático adecuado para determinar la conformación de un péptido de interés. Una vez que se conoce la conformación del péptido desvelado en el presente documento, el experto en la materia puede entonces determinar de una manera de diseño racional qué tipo de sustituciones se pueden hacer en uno o más sitios para crear un derivado que retenga la conformación básica y la distribución de carga del péptido original, pero que pueda poseer características que no están presentes o están mejoradas sobre las encontradas en el péptido original. Una vez que se identifican las moléculas derivadas candidatas, los derivados pueden probarse para determinar si funcionan como agentes inhibidores de MASP-2 usando los ensayos descritos en el presente documento.
SELECCIÓN DE PÉPTIDOS INHIBIDORES DE MASP-2
También se puede utilizar el modelado molecular y el diseño molecular racional para generar y seleccionar péptidos que imitan las estructuras moleculares de las regiones de unión clave de MASP-2 e inhiben las actividades complementarias de MASP-2. Las estructuras moleculares utilizadas para el modelado incluyen las regiones CDR de anticuerpos monoclonales anti-MASP-2, así como las regiones diana que se sabe que son importantes para la función de MASP-2, incluyendo la región necesaria para la dimerización, la región implicada en la unión a MBL y el sitio activo de serina proteasa como se describió previamente. Los procedimientos para identificar péptidos que se unen a una diana particular son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, la impronta molecular se puede utilizar para construcción de novo de estructuras macromoleculares tales como péptidos que se unen a una molécula en particular. Véase, por ejemplo, Shea, K.J., "Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sties", TRIP 2(5) 1994.
Como ejemplo ilustrativo, un procedimiento para preparar miméticos de péptidos de unión a MASP-2 es el siguiente. Se polimerizan monómeros funcionales de un péptido de unión a MASP-2 conocido o la región de unión de un anticuerpo anti-MASP-2 que exhibe inhibición de MASP-2 (el molde). Luego se elimina la plantilla, seguido de la polimerización de una segunda clase de monómeros en el vacío dejado por la plantilla, para proporcionar una nueva molécula que exhibe una o más propiedades deseadas que son similares a la plantilla. Además de preparar péptidos de esta manera, también se pueden preparar otras moléculas de unión a MASP-2 que son agentes inhibidores de MASP-2 tales como polisacáridos, nucleósidos, fármacos, nucleoproteínas, lipoproteínas, hidratos de carbono, glucoproteínas, esteroide, lípidos y otros materiales biológicamente activos. Este procedimiento es útil para diseñar una amplia variedad de imitadores biológicos que son más estables que sus equivalentes naturales porque normalmente se preparan mediante polimerización por radicales libres de monómeros funcionales, dando como resultado un compuesto con una cadena principal no biodegradable.
SÍNTESIS PEPTÍDICA
Los péptidos inhibidores de MASP-2 se pueden preparar usando técnicas bien conocidas en la materia, tal como la técnica sintética en fase sólida descrita inicialmente por Merrifield, en J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963. Se puede lograr una síntesis automatizada, por ejemplo, utilizando Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Foster City, California) de acuerdo con las instrucciones descritas por el fabricante. Se pueden encontrar otras técnicas, por ejemplo, en Bodanszky, M., y col., Peptide Synthesis, segunda edición, John Wiley & Sons, 1976, así como en otros trabajos de referencia conocidos por los expertos en la materia.
Los péptidos también se pueden preparar usando técnicas estándar de ingeniería genética conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, el péptido se puede producir enzimáticamente mediante la inserción de un ácido nucleico que codifica el péptido en un vector de expresión, la expresión del ADN y la traducción del ADN en el péptido en presencia de los aminoácidos necesarios. A continuación, el péptido se purifica utilizando técnicas cromatográficas o electroforéticas, o por medio de una proteína transportadora que se puede fusionar a, y posteriormente escindir de, el péptido mediante la inserción en el vector de expresión en fase con la secuencia que codifica el péptido de una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína transportadora. La fusión proteína-péptido se puede aislar usando técnicas cromatográficas, electroforéticas o inmunológicas (tales como la unión a una resina mediante un anticuerpo de la proteína transportadora). El péptido se puede escindir usando procedimientos químicos o enzimáticamente, como mediante, por ejemplo, hidrolasas.
Los péptidos inhibidores de MASP-2 que son útiles en el procedimiento descrito en el presente documento también se pueden producir en células hospedadoras recombinantes siguiendo técnicas convencionales. Para expresar una secuencia que codifica el péptido inhibidor de MASP-2, una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido debe unirse operativamente a secuencias reguladoras que controlan la expresión transcripcional en un vector de expresión y luego introducirse en una célula hospedadora. Además de las secuencias reguladoras transcripcionales, tales como promotores y potenciadores, los vectores de expresión pueden incluir secuencias reguladoras de la traducción y un gen marcador, que son adecuados para la selección de células que transportan el vector de expresión.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican un péptido inhibidor de MASP-2 se pueden sintetizar con "máquinas génicas" usando protocolos tales como el procedimiento de la fosforamidita. Si se requiere ADN bicatenario sintetizado químicamente para una aplicación tal como la síntesis de un gen o un fragmento de gen, entonces, cada hebra complementaria se fabrica por separado. La producción de genes cortos (60 a 80 pares de bases) es técnicamente sencilla y se puede lograr mediante la síntesis de las cadenas complementarias y su hibridación posterior. Para la producción de genes más largos, se ensamblan genes sintéticos (de doble cadena) en forma modular a partir de fragmentos de una sola cadena que tienen de 20 a 100 nucleótidos de longitud. Para revisiones sobre síntesis de polinucleótidos, véase, por ejemplo, Glick y Pasternak, "Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA", As M Press, 1994; Itakura, K., y col., Annu. Rev. Biochem. 53:323, 1984; y Climie, S., y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633, 1990.
INHIBIDORES DE MOLÉCULA PEQUEÑA
En algunos casos, los agentes inhibidores de MASP-2 son inhibidores de molécula pequeña que incluyen sustancias naturales y sintéticas que tienen un peso molecular bajo, tales como, por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos e inhibidores no peptídicos (incluyendo oligonucleótidos y compuestos orgánicos). Se pueden generar inhibidores de molécula pequeña de MASP-2 basándose en la estructura molecular de las regiones variables de los anticuerpos anti-MASP-2.
Los inhibidores de molécula pequeña también pueden diseñarse y generarse basándose en la estructura cristalina de MASP-2 utilizando el diseño de fármacos computacionales (Kuntz I.D., y col., Science 257:1078, 1992). Se ha descrito la estructura cristalina de MASP-2 de rata (Feinberg, H., y col., EMBO J. 22:2348-2359, 2003). Usando el procedimiento descrito por Kuntz y col., las coordenadas de la estructura cristalina MASP-2 se utilizan como entrada para un programa informático tal como DOCK, que genera una lista de estructuras de moléculas pequeñas que se espera que se unan a MASP-2. El uso de dichos programas informáticos es bien conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, la estructura cristalina del inhibidor de la proteasa del VIH-1 se utilizó para identificar ligandos no peptídicos únicos que son inhibidores de la proteasa del VIH-1 mediante la evaluación del ajuste de los compuestos que se encuentran en la base de datos cristalográfica de Cambridge al sitio de unión de la enzima utilizando el programa DOCK (Kuntz, I.D., y col., J. Mol. Biol. 161:269-288, 1982; DesJarlais, R.L., y col., PNAS 87:6644-6648, 1990).
La lista de estructuras de moléculas pequeñas que se identifican mediante un procedimiento computacional como posibles inhibidores de MASP-2 se seleccionan usando un ensayo de unión a MASP-2 como se describe en el Ejemplo 10. Las moléculas pequeñas que se encuentran que se unen a MASP-2 se analizan luego en un ensayo funcional tal como el descrito en el Ejemplo 2 para determinar si inhiben la activación del complemento dependiente de MASP-2.
RECEPTORES SOLUBLES DE MASP-2
Se cree que otros agentes inhibidores de MASP-2 adecuados incluyen receptores solubles de MASP-2, que se puede producir usando técnicas conocidas por los expertos en la materia.
INHIBIDORES DE EXPRESIÓN DE MASP-2
Como también se describe en el presente documento, el agente inhibidor de MASP-2 puede ser un inhibidor de la expresión de MASP-2 capaz de inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2. Los inhibidores de la expresión de MASP-2 representativos incluyen moléculas de ácido nucleico antisentido de MASP-2 (tales como ARNm antisentido, ADN antisentido u oligonucleótidos antisentido), ribozimas de MASP-2 y moléculas de ARNi de MASP-2.
Las moléculas de ARN y ADN antisentido actúan para bloquear directamente la traducción de ARNm de MASP-2 mediante la hibridación con ARNm de MASP-2 y evitar la traducción de la proteína MASP-2. Una molécula de ácido nucleico antisentido se puede construir de varias formas diferentes descritas que es capaz de interferir con la expresión de MASP-2. Por ejemplo, se puede construir una molécula de ácido nucleico antisentido invirtiendo la región codificante (o una porción de la misma) del ADNc de MASP-2 (SEQ ID NO: 4) con respecto a su orientación normal para la transcripción para permitir la transcripción de su complemento.
La molécula de ácido nucleico antisentido suele ser sustancialmente idéntica a al menos una parte del gen o genes diana. El ácido nucleico, sin embargo, no es necesario que sea perfectamente idéntico para inhibir la expresión. En general, se puede usar una homología más alta para compensar el uso de una molécula de ácido nucleico antisentido más corta. El porcentaje mínimo de identidad normalmente es superior a aproximadamente un 65 %, pero un mayor porcentaje de identidad puede ejercer una represión más eficaz de la expresión de la secuencia endógena. Normalmente se prefiere un porcentaje de identidad sustancialmente mayor de más de aproximadamente un 80 %, aunque normalmente lo más preferido es aproximadamente un 95 % hasta la identidad absoluta.
La molécula de ácido nucleico antisentido no necesita tener el mismo patrón de intrón o exón que el gen diana, y los segmentos no codificantes del gen diana pueden ser igualmente eficaces para lograr la supresión antisentido de la expresión del gen diana como segmentos codificantes. Se puede usar una secuencia de ADN de al menos aproximadamente 8 nucleótidos o así como la molécula de ácido nucleico antisentido, aunque es preferible una secuencia más larga. En la presente divulgación, un ejemplo representativo de un agente inhibidor útil de MASP-2 es una molécula de ácido nucleico antisentido de MASP-2 que es al menos un noventa por ciento idéntica al complemento del ADNc de MASP-2 que consiste en la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 4. La secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 4 codifica la proteína MASP-2 que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5.
El direccionamiento de oligonucleótidos antisentido para unirse al ARNm de MASP-2 es otro mecanismo que puede usarse para reducir el nivel de síntesis de proteína MASP-2. Por ejemplo, la síntesis de poligalacturonasa y del receptor de acetilcolina muscarina tipo 2 se inhibe mediante oligonucleótidos antisentido dirigidos a sus respectivas secuencias de ARNm (Patente de Estados Unidos N.° 5.739.119, de Cheng, y la Patente de Estados Unidos N.° 5.759.829, de Shewmaker). Además, se han demostrado ejemplos de inhibición antisentido con la proteína nuclear ciclina, el gen de resistencia a múltiples fármacos (MDG1), lCAM-1, E-selectina, STK-1, receptor de GABAA estriatal y EGF humano (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.° 5.801.154, de Baracchini; la Patente de Estados Unidos n.° 5.789.573, de Baker; la Patente de Estados Unidos n.° 5.718.709, de Considine; y la patente de Estados Unidos n.° 5.610.288, de Reubenstein).
Se ha descrito un sistema que permite a un experto en la materia determinar qué oligonucleótidos son útiles en la divulgación, que implica sondear sitios adecuados en el ARNm diana utilizando la escisión mediante RNasa H como indicador de la accesibilidad de secuencias dentro de las transcripciones. Scherr, M., y col., Nucleic Acids Res.
26:5079-5085, 1998; Lloyd, y col., Nucleic Acids Res. 29:3665-3673, 2001. Se añade una mezcla de oligonucleótidos antisentido que son complementarios a determinadas regiones del transcrito MASP-2 a extractos celulares que expresan MASP-2, tal como hepatocitos, y se hibridan para crear un sitio vulnerable a la RNasaH. Este procedimiento se puede combinar con la selección de secuencia asistida por computadora que puede predecir la selección de secuencia óptima para composiciones antisentido en función de su capacidad relativa para formar dímeros, horquillas u otras estructuras secundarias que reducirían o impedirían la unión específica al ARNm diana en una célula hospedadora. Estos análisis de estructuras secundarias y las consideraciones de selección del sitio diana se pueden realizar utilizando el programa informático de análisis de cebadores OLIGO (Rychlik, I., 1997) y el programa informático de algoritmos BLAs Tn 2.0.5 (Altschul, S.F., y col., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1997). Los compuestos antisentido dirigidos hacia la secuencia diana comprenden preferentemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. Se prefieren particularmente los oligonucleótidos antisentido que comprenden de aproximadamente 9 a aproximadamente 35 nucleótidos. Los inventores contemplan que todas las composiciones de oligonucleótidos en el intervalo de 9 a 35 nucleótidos (es decir, los de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 o así bases de longitud) son muy preferidas para la práctica de los procedimientos basados en oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento. Las regiones diana muy preferidas del ARNm de MASP-2 son aquellas que están en o cerca del codón de inicio de la traducción AUG, y aquellas secuencias que son sustancialmente complementarias a las regiones en 5' del ARNm, por ejemplo, entre las regiones -10 y 10 de la secuencia de nucleótidos del gen MASP-2 (SEQ ID NO: 4). En la TABLA 4 se describen inhibidores de expresión de MASP-2 ejemplares.
TABLA 4: INHIBIDORES DE EXPRESIÓN DE MASP-2 EJEMPLARES
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(continuación)
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Como se ha observado anteriormente, el término "oligonudeótido" como se usa en el presente documento se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o miméticos de los mismos. Este término también cubre aquellas oligonucleobases compuestas de nucleótidos de origen natural, azúcares y enlaces internucleósidos covalentes (cadena principal) así como oligonucleótidos que tienen modificaciones de origen no natural. Estas modificaciones permiten introducir determinadas propiedades deseables que no se ofrecen a través de oligonucleótidos de origen natural, tales como propiedades tóxicas reducidas, mayor estabilidad frente a la degradación de nucleasas y absorción celular mejorada. En casos ilustrativos, los compuestos antisentido descritos en el presente documento difieren del ADN nativo por la modificación de la cadena principal del fosfodiéster para prolongar la vida del oligonucleótido antisentido en el que los sustituyentes fosfato se reemplazan por fosforotioatos. Asimismo, uno o ambos extremos del oligonucleótido pueden estar sustituidos por uno o más derivados de acridina que se intercalan entre pares de bases adyacentes dentro de una cadena de ácido nucleico.
Otra alternativa al antisentido es el uso de "interferencia por el ARN" (iARN). Los ARN bicatenarios (ARNbc) pueden provocar silenciamiento génico en mamíferos in vivo. La función natural de la iARN y la supresión conjunta parece ser la protección del genoma contra la invasión de elementos genéticos móviles tales como retrotransposones y virus que producen ARNbc o ARN anómalo en la célula hospedadora cuando se activan (véase, por ejemplo, Jensen, J., y col., Nat. Genet. 21:209-12, 1999). La molécula de ARN bicatenario se puede preparar mediante la síntesis de dos cadenas de ARN capaces de formar una molécula de ARN de doble cadena, teniendo cada una una longitud de aproximadamente 19 a 25 (por ejemplo, 19-23 nucleótidos). Por ejemplo, una molécula de ARNbc útil en los procedimientos descritos en el presente documento puede comprender el ARN correspondiente a una secuencia y su complemento enumerados en la TABLA 4. Preferentemente, al menos una cadena de ARN tiene un saliente en 3' de 1-5 nucleótidos. Las cadenas de ARN sintetizadas se combinan en condiciones que forman una molécula bicatenaria. La secuencia de ARN puede comprender al menos una porción de 8 nucleótidos de la SEQ ID NO: 4 con una longitud total de 25 nucleótidos o menos. El diseño de secuencias de ARNip para una diana dada está dentro del conocimiento ordinario de un experto en la materia. Hay servicios comerciales disponibles que diseñan la secuencia de ARNip y garantizan al menos un 70 % de atenuación de la expresión (Qiagen, Valencia, California).
El ARNbc puede administrarse como una composición farmacéutica y llevarse a cabo mediante procedimientos conocidos, en los que se introduce un ácido nucleico en una célula diana deseada. Los procedimientos de transferencia de genes comúnmente utilizados incluyen procedimientos con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, microinyección y víricos. Estos procedimientos se enseñan en Ausubel. y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1993.
También se pueden utilizar ribozimas para disminuir la cantidad y/o la actividad biológica de MASP-2, tales como las ribozimas que se dirigen al ARNm de MASP-2. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas que pueden escindir moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia que es total o parcialmente homóloga a la secuencia de la ribozima. Es posible diseñar transgenes de ribozima que codifiquen ribozimas de ARN que se emparejen específicamente con un ARN diana y escindan ella cadena principal del fosfodiéster en una ubicación específica, inactivando así funcionalmente el ARN diana. Al realizar esta escisión, la ribozima no se altera en sí misma y, por tanto, es capaz de reciclarse y escindir otras moléculas. La inclusión de secuencias de ribozimas dentro de ARN antisentido les confiere actividad de escisión de ARN, aumentando así la actividad de las construcciones antisentido.
Las ribozimas útiles en la práctica descrita en el presente documento normalmente comprenden una región de hibridación de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, que es complementaria en la secuencia de nucleótidos a al menos parte del ARNm de MASP-2 diana, y una región catalítica que está adaptada para escindir el ARNm de MASP-2 diana (véase, en general, el documento EPA N.° 0321 201; el documento WO88/04300; Haseloff, J., y col., Nature 334:585-591, 1988; Fedor, M.J., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1668-1672, 1990; Cech, T.R., y col., Ann. Rev. Biochem. 55:599-629, 1986).
Las ribozimas pueden dirigirse directamente a células en forma de oligonucleótidos de ARN que incorporan secuencias de ribozimas, o introducirse en la célula como un vector de expresión que codifica el ARN ribozimático deseado. Las ribozimas pueden usarse y aplicarse de manera muy similar a la descrita para polinucleótidos antisentido.
Las moléculas de ARN y ADN antisentido, ribozimas y de iARN útiles en los procedimientos descritos en el presente documento pueden prepararse mediante cualquier procedimiento conocido en la materia para la síntesis de moléculas de ADN y ARN. Estas incluyen técnicas para sintetizar químicamente oligodesoxirribonucleótidos y oligorribonucleótidos bien conocidos en la materia, tales como, por ejemplo, síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Como alternativa, las moléculas de ARN pueden generarse mediante transcripción in vitro e in vivo de secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN antisentido. Dichas secuencias de ADN pueden incorporarse en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores de ARN polimerasa adecuados tales como los promotores de polimerasa T7 o SP6. Como alternativa, se puede introducir construcciones de ADNc antisentido que sintetizan ARN antisentido de forma constitutiva o inducible, dependiendo del promotor utilizado, de forma estable en líneas celulares.
Se pueden introducir varias modificaciones bien conocidas de las moléculas de ADN como un medio para aumentar la estabilidad y la semivida. Las modificaciones útiles incluyen, pero sin limitación, la adición de secuencias flanqueantes de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos a los extremos 5' y/o 3' de la molécula o el uso de enlaces fosforotioato o 2' O-metil en lugar de fosfodiesterasa dentro de la cadena principal oligodesoxirribonucleotídica.
VI. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y PROCEDIMIENTOS DE DOSIFICACIÓN DE ADMINISTRACIÓN
También se describen en el presente documento composiciones para inhibir los efectos secundarios de la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece una enfermedad o afección como se desvela en el presente documento, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los agentes inhibidores de MASP-2 se pueden administrar a un sujeto que los necesite, en dosis terapéuticamente eficaces para tratar o mejorar las afecciones asociadas con la activación del complemento dependiente de MASP-2. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad del agente inhibidor de MASP-2 suficiente para dar como resultado una mejora de los síntomas asociados con la enfermedad o afección.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de agentes inhibidores de MASP-2 se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar que emplean modelos animales experimentales, tales como el modelo murino de ratón MASP-2 -/- que expresa el transgén MASP-2 humano descrito en el Ejemplo 1. Usando dichos modelos animales, el NSESO (nivel sin efectos secundarios observados) y la DME (la dosis mínimamente eficaz) se pueden determinar utilizando procedimientos estándar. La relación de dosis entre los efectos del NSESO y la DME es la relación terapéutica, que se expresa como la relación NSESO/DME. Los agentes inhibidores de MASP-2 que exhiben grandes relaciones o índices terapéuticos son los más preferidos. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y los estudios en animales se pueden usar para formular una variedad de dosis para su uso en seres humanos. La dosis del agente inhibidor de MASP-2 se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DME con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada.
Para cualquier formulación compuesta, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar utilizando modelos animales. Por ejemplo, se puede formular una dosis en un modelo animal para lograr un rango de concentración plasmática circulante que incluya la DME. También se pueden medir los niveles cuantitativos del agente inhibidor de MASP-2 en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Además de los estudios de toxicidad, la dosificación eficaz también se puede estimar basándose en la cantidad de proteína MASP-2 presente en un sujeto vivo y la afinidad de unión del agente inhibidor de MASP-2. Se ha demostrado que los niveles de MASP-2 en sujetos humanos normales están presentes en el suero en niveles bajos en el intervalo de 500 ng/ml, y los niveles de MASP-2 en un sujeto en particular pueden determinarse usando un ensayo cuantitativo para MASP-2 descrito en Moller-Kristensen M., y col., J. Immunol. Methods 282:159-167, 2003.
En general, la dosis de las composiciones administradas que comprenden agentes inhibidores de MASP-2 varía dependiendo de dichos factores como la edad del sujeto, peso, altura, sexo, condición médica general e historial médico previo. A modo de ilustración, los agentes inhibidores de MASP-2, tales como anticuerpos anti-MASP-2, se pueden administrar en intervalos de dosificación de aproximadamente 0,010 a 10,0 mg/kg, preferentemente de 0,010 a 1,0 mg/kg, más preferentemente de 0,010 a 0,1 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunos casos, la composición comprende una combinación de anticuerpos anti-MASP-2 y péptidos inhibidores de MASP-2.
La eficacia terapéutica de las composiciones inhibidoras de MASP-2 y los procedimientos descritos en el presente documento en un sujeto dado, y las dosis apropiadas, se pueden determinar de acuerdo con ensayos de complemento bien conocidos por los expertos en la materia. El complemento genera numerosos productos específicos. Durante la última década, se han desarrollado ensayos sensibles y específicos y están disponibles comercialmente para la mayoría de estos productos de activación, incluyendo los pequeños fragmentos de activación C3a, C4a y C5a y los grandes fragmentos de activación iC3b, C4d, Bb y sC5b-9. La mayoría de estos ensayos utilizan anticuerpos monoclonales que reaccionan con nuevos antígenos (neoantígenos) expuestos en el fragmento, pero no en las proteínas naturales de las que se forman, haciendo que estos ensayos sean muy simples y específicos. La mayoría se basa en la tecnología ELISA, aunque el radioinmunoensayo todavía se usa a veces para C3a y C5a. Estos últimos ensayos miden tanto los fragmentos sin procesar como sus fragmentos 'desArg', que son las formas principales que se encuentran en circulación. Los fragmentos sin procesar y C5adesArg se eliminan rápidamente mediante la unión a receptores de la superficie celular y, por lo tanto, están presentes en concentraciones muy bajas, mientras que C3adesArg no se une a células y se acumula en el plasma. La medición de C3a proporciona un indicador sensible, independiente de la ruta, de la activación del complemento. La activación de la ruta alternativa se puede evaluar mediante la medición del fragmento Bb. La detección del producto en fase líquida de la activación de la ruta de ataque a membrana, sC5b-9, proporciona evidencia de que el complemento se está activando hasta su finalización. Debido a que tanto la ruta de la lectina como la clásica generan los mismos productos de activación, C4a y C4d, la medición de estos dos fragmentos no proporciona ninguna información sobre cuál de estas dos rutas ha generado los productos de activación.
La inhibición de la activación del complemento dependiente de MASP-2 se caracteriza por al menos uno de los siguientes cambios en un componente del sistema del complemento que se produce como resultado de la administración de un agente inhibidor de MASP-2 de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento: la inhibición de la generación o producción de productos del sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2 C4b, C3a, C5a y/o C5b-9 (MAC) (medidos, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2), la reducción de la escisión de C4 y el depósito de C4b (medidos, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 10), o la reducción de la escisión de C3 y el depósito de C3b (medidos, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 10).
AGENTES ADICIONALES
Las composiciones y procedimientos que comprenden agentes inhibidores de MASP-2 pueden comprender opcionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales, que pueden aumentar la actividad del agente inhibidor de MASP-2 o que proporcionan funciones terapéuticas relacionadas de forma aditiva o sinérgica. Por ejemplo, en el contexto del tratamiento de un sujeto que padece PTT, en el que el sujeto es positivo para un inhibidor de ADAM-TS13, se pueden administrar uno o más agentes inhibidores de MASP-2 en combinación (incluyendo la administración conjunta) con uno o más agentes inmunodepresores. Los agentes inmunodepresores adecuados incluyen: corticoesteroides, rituxan, ciclosporina y similares. En el contexto del tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar, SUH o SUHa, se pueden administrar uno o más agentes inhibidores de MASP-2 en combinación (incluyendo la administración conjunta) con un antibiótico adecuado. En el contexto del tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar SUHa, se pueden administrar uno o más agentes inhibidores de MASP-2 en combinación (incluyendo la administración conjunta) con otros agentes inhibidores del complemento tales como eculizumab (Soliris), TT-30, anticuerpo contra el factor B u otros agentes que inhiben los componentes terminales del complemento o la amplificación de la ruta alternativa.
La inclusión y selección de agentes adicionales se determinará para lograr un resultado terapéutico deseado. En algunos casos, se puede administrar el agente inhibidor de MASP-2 en combinación con uno o más agentes antiinflamatorios y/o analgésicos. Los agentes antiinflamatorios y/o analgésicos adecuados incluyen: antagonistas del receptor de serotonina; agonistas del receptor de serotonina; antagonistas del receptor de histamina; antagonistas del receptor de bradicinina; inhibidores de calicreína; antagonistas del receptor de taquicinina, incluyendo subtipos de antagonistas del receptor de neurocinina1 y neurocinina2; antagonistas del receptor del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (PRGc ); antagonistas del receptor de interleucina; inhibidores de enzimas activas en la ruta sintética de los metabolitos del ácido araquidónico, incluyendo inhibidores de la fosfolipasa, incluyendo inhibidores de isoformas de PLA2 e inhibidores de isoformas de PLCy, inhibidores de la ciclooxigenasa (COX) (que pueden ser inhibidores de COX-1, COX-2, o no selectivos de COX-1 y -2), inhibidores de lipooxigenasa; antagonistas del receptor de prostanoides, incluyendo los antagonistas de los subtipos de receptores EP-1 y EP-4 de eicosanoides y los antagonistas del subtipo de receptores de tromboxano; antagonistas del receptor de leucotrienos, incluyendo antagonistas del subtipo del receptor de leucotrieno B4 y antagonistas del subtipo del receptor de leucotrieno D4; agonistas del receptor de opioides, incluyendo agonistas del subtipo del receptor opioide p, opioide 8 y opioide K; agonistas y antagonistas de purinoceptores, incluyendo antagonistas del receptor P2X y agonistas del receptor P2Y; abridores de canales de potasio sensibles al trifosfato de adenosina (ATP, por sus siglas en inglés); inhibidores de MAP cinasa; inhibidores nicotínicos de acetilcolina; y agonistas del receptor alfa adrenérgico (incluyendo agonistas alfa-1, alfa-2 y no selectivos de alfa-1 y 2).
Los agentes inhibidores de MASP-2 descritos en el presente documento también se pueden administrar en combinación con uno o más de otros inhibidores del complemento, tales como un inhibidor de C5. Hasta la fecha, Eculizumab (Solaris®), un anticuerpo contra C5, es el único fármaco dirigido al complemento que ha sido aprobado para uso humano. Sin embargo, se ha demostrado que algunos agentes farmacológicos bloquean el complemento in vivo. El K76COOH y el mesilato de nafamstat son dos agentes que han demostrado cierta eficacia en modelos animales de trasplante (Miyagawa, S., y col., Transplant Proc. 24:483-484, 1992). También se ha demostrado que heparinas de bajo peso molecular son eficaces para regular la actividad del complemento (Edens, R.E., y col., Complement Today, págs. 96-120, Basel: Karger, 1993). Se cree que estos inhibidores de molécula pequeña pueden ser útiles como agentes para usar en combinación con los agentes inhibidores de MASP-2 descritos en el presente documento.
Otros inhibidores del complemento de origen natural pueden ser útiles en combinación con los agentes inhibidores de MASP-2 descritos en el presente documento. Los inhibidores biológicos del complemento incluyen el factor 1 del complemento soluble (sCR1, por sus siglas en inglés). Este es un inhibidor de origen natural que se puede encontrar en la membrana externa de células humanas. Otros inhibidores de membrana incluyen DAF, MCP y CD59. Se han probado las formas recombinantes para determinar su actividad anticomplemento in vitro e in vivo. Se ha demostrado que sCR1 es eficaz en xenotrasplantes, en los que el sistema del complemento (tanto alternativo como clásico) proporciona el desencadenante de un síndrome de rechazo hiperactivo a los pocos minutos de perfundir sangre a través del órgano recién trasplantado (Platt, J.L., y col., Immunol. Today 11:450-6, 1990; Marino, I.R., y col., Transplant Proc. 1071:6, 1990; Johnstone, P.S., y col., Transplantation 54:573-6, 1992). El uso de sCR1 protege y extiende el tiempo de supervivencia del órgano trasplantado, que implica la ruta del complemento en la patogenia de la supervivencia del órgano (Leventhal, J.R., y col., Transplantation 55:857-66, 1993; Pruitt, S.K., y col., Transplantation 57:363-70, 1994).
Los inhibidores del complemento adicionales adecuados para su uso en combinación con las composiciones descritas en el presente documento también incluyen, a modo de ejemplo, AcM tales como un anticuerpo anti-C5 (por ejemplo, eculizumab) que está desarrollando Alexion Pharmaceuticals, Inc., New Haven, Connecticut, y AcM anti-properdina.
VEHÍCUILOS FARMACÉUTICOS Y VEHÍCULOS DE ADMINISTRACIÓN
En general, las composiciones de agentes inhibidores de MASP-2 descritas en el presente documento, combinadas con cualquier otro agente terapéutico seleccionado, están adecuadamente contenidas en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo es no tóxico, biocompatible y se selecciona de modo que no afecte negativamente a la actividad biológica del agente inhibidor de MASP-2 (y cualquier otro agente terapéutico combinado con el mismo). Vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares para péptidos se describen en la Patente de Estados Unidos n.° 5.211.657 de Yamada. Los anticuerpos anti-MASP-2 y los péptidos inhibidores útiles en la invención pueden formularse en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, en gel, líquidas o gaseosas tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, depósitos, inhalantes e inyecciones que permiten la administración oral, parenteral o quirúrgica. La divulgación también contempla la administración local de las composiciones mediante el recubrimiento de dispositivos médicos y similares.
Vehículos adecuados para administración parenteral mediante inyectables, infusión o irrigación y administración tópica incluyen agua destilada, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer normales o lactadas, solución de dextrosa, solución de Hank o propanodiol. Además, pueden emplearse aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite biocompatible incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como ácido oleico son de utilidad en la preparación de sustancias inyectables. El vehículo y el agente pueden estar compuestos como un líquido, suspensión, gel polimerizable o no polimerizable, pasta o ungüento.
El vehículo también puede comprender un vehículo de administración para sostener (es decir, prolongar, retrasar o regular) la administración del agente(s) o para mejorar la administración, absorción, estabilidad o farmacocinética del agente o agentes terapéuticos. Dicho vehículo de administración puede incluir, a modo de ejemplo no limitante, micropartículas, microesferas, nanoesferas o nanopartículas compuestas de proteínas, liposomas, hidratos de carbono, compuestos orgánicos sintéticos, compuestos inorgánicos, hidrogeles poliméricos o copoliméricos y micelas poliméricas. Los sistemas de administración de hidrogel y micelas adecuados incluyen los complejos de copolímero/ciclodextrina y copolímeros PEO:PHB:PEO desvelados en el documento WO 2004/009664 a 2 y los complejos PEO/ciclodextrina y PEO desvelados en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2002/0019369 A1. Dichos hidrogeles pueden inyectarse localmente en el sitio de acción pretendida, o por vía subcutánea o intramuscular para formar un depósito de liberación sostenida.
Para administración intrarticular, el agente inhibidor de MASP-2 puede transportarse en vehículos líquidos o en gel descritos anteriormente que son inyectables, vehículos de administración sostenida descritos anteriormente que son inyectables, o un ácido hialurónico o derivado de ácido hialurónico.
Para la administración oral de agentes no peptidérgicos, el agente inhibidor de MASP-2 puede transportarse en un material de relleno o diluyente inerte tal como sacarosa, almidón de maíz o celulosa.
Para la administración tópica, el agente inhibidor de MASP-2 puede transportarse en pomada, loción, crema, gel, gotas, supositorio, pulverizador, líquido o polvo, o en gel o sistemas de administración microcapsular a través de un parche transdérmico.
Varios sistemas de administración nasal y pulmonar, incluyendo aerosoles, inhaladores de dosis medidas, inhaladores de polvo seco y nebulizadores, se están desarrollando y pueden adaptarse adecuadamente para la administración descrita en el presente documento en un aerosol, vehículo de administración inhalado o nebulizado, respectivamente.
Para la administración intratecal (IT) o intracerebroventricular (ICV), se pueden usar sistemas de administración apropiadamente estériles (por ejemplo, líquidos; geles, suspensiones, etc.) para administrar las composiciones descritas en el presente documento.
Las composiciones descritas en el presente documento también pueden incluir excipientes biocompatibles, tales como agentes dispersantes o humectantes, agentes de suspensión, diluyentes, tampones, potenciadores de la penetración, emulsionantes, aglutinantes, espesantes, agentes aromatizantes (para administración oral).
VEHÍCULOS FARMACÉUTICOS PARA ANTICUERPOS Y PÉPTIDOS
Más específicamente con respecto a anticuerpos anti-MASP-2 y péptidos inhibidores, formulaciones ejemplares pueden administrarse por vía parenteral como dosis inyectables de una solución o suspensión del compuesto en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo farmacéutico que puede ser un líquido estéril tal como agua, aceites, solución salina, glicerol o etanol. De manera adicional, sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias reguladoras del pH y similares pueden estar presentes en composiciones que comprenden anticuerpos anti-MASP-2 y péptidos inhibidores. Los componentes adicionales de las composiciones farmacéuticas incluyen aceites (tal como de origen animal, vegetal o sintético), por ejemplo, aceite de soja y aceite mineral. En general, glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son vehículos líquidos preferidos para soluciones inyectables.
Los anticuerpos anti-MASP-2 y los péptidos inhibidores también se pueden administrar en forma de una inyección de depósito o preparación de implante que se puede formular de tal manera que permita una liberación sostenida o pulsátil de los agentes activos.
VEHÍCULOS FARMACÉUTICAMENTE ACEPTABLES PARA INHIBIDORES DE EXPRESIÓN
Más específicamente con respecto a inhibidores de expresión útiles en los procedimientos descritos en el presente documento, se describen composiciones que comprenden un inhibidor de expresión como se describió anteriormente y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender además un sistema de dispersión coloidal.
Las composiciones farmacéuticas que incluyen inhibidores de expresión pueden incluir, pero sin limitación, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero sin limitación, líquidos formados previamente, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes. La preparación de dichas composiciones normalmente implica combinar el inhibidor de expresión con uno o más de los siguientes: tampones, antioxidantes, polipéptidos de bajo peso molecular, proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono, incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutatión y otros estabilizantes y excipientes. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina de suero no específica son ejemplos de diluyentes adecuados.
En algunos casos, las composiciones se pueden preparar y formular como emulsiones que son normalmente sistemas heterogéneos de un líquido disperso en otro en forma de gotitas (véase, Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Vol.
1, Rieger y Banker (eds.), Marcek Dekker, Inc., N.Y., 1988). Ejemplos de emulsionantes de origen natural utilizados en formulaciones de emulsiones incluyen goma arábiga, cera de abejas, lanolina, lecitina y fosfátidos.
En un caso, las composiciones que incluyen ácidos nucleicos se pueden formular como microemulsiones. Una microemulsión, como se usa en el presente documento, se refiere a un sistema de agua, aceite y anfifilo, que es una única solución líquida ópticamente isotrópica y termodinámicamente estable (véase Rosoff en Pharmaceutical Dosage Forms, Vol. 1). El procedimiento descrito en el presente documento también puede usar liposomas para la transferencia y administración de oligonucleótidos antisentido al sitio deseado.
Las composiciones farmacéuticas y las formulaciones de inhibidores de expresión para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizadores, líquidos y polvos. Se pueden usar vehículos farmacéuticos convencionales, así como bases y espesantes acuosos, en polvo o aceitosos y similares.
MODOS DE ADMINISTRACION
Las composiciones farmacéuticas que comprenden agentes inhibidores de MASP-2 pueden administrarse de varias formas dependiendo de si un modo de administración local o sistémico es el más apropiado para la afección que se está tratando. De manera adicional, como se describe en el presente documento anteriormente con respecto a procedimientos de reperfusión extracorpórea, se pueden administrar agentes inhibidores de MASP-2 mediante la introducción de las composiciones descritas en el presente documento en plasma o sangre en circulación. Además, las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse mediante el recubrimiento o la incorporación de las composiciones en o dentro de un dispositivo médico implantable.
ADMINISTRACIÓN SISTÉMICA
Tal como se utiliza en el presente documento, las expresiones "liberación sistémica" y "administración sistémica" pretenden incluir, pero no se limitan a, vía oral y parenteral, incluyendo vías de administración intramuscular (IM), subcutánea, intravenosa (IV), intrarterial, inhalatoria, sublingual, bucal, tópica, transdérmica, nasal, rectal, vaginal y otras que dan como resultado la dispersión eficaz del agente administrado a uno o varios sitios de acción terapéutica prevista. Las vías preferidas de administración sistémica para las presentes composiciones incluyen intravenosa, intramuscular, subcutánea e inhalatoria. Se apreciará que la vía de administración sistémica exacta para agentes seleccionados utilizados en composiciones particulares descritas en el presente documento se determinará en parte para explicar la susceptibilidad del agente a las rutas de transformación metabólica asociadas con una vía de administración dada. Por ejemplo, los agentes peptidérgicos pueden administrarse de forma más adecuada por vías distintas de la oral.
Los polipéptidos y anticuerpos inhibidores de MASP-2 se pueden administrar a un sujeto que lo necesite mediante cualquier medio adecuado. Los procedimientos de administración de polipéptidos y anticuerpos MASP-2 incluyen administración mediante vías de administración oral, pulmonar, parenteral (por ejemplo, inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutánea), inhalatoria (por ejemplo, a través de una formulación de polvo fino), transdérmica, nasal, vaginal, rectal o sublingual, y se pueden formular en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración.
A modo de ejemplo representativo, los péptidos y anticuerpos inhibidores de MASP-2 se pueden introducir en un organismo vivo mediante la aplicación a una membrana corporal capaz de absorber los polipéptidos, por ejemplo membranas nasales, gastrointestinales y rectales. Los polipéptidos se aplican normalmente a la membrana absorbente junto con un potenciador de la penetración. (Véase, por ejemplo, Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5:69, 1988; Lee, V.H.L., J. Controlled Release 13:213, 1990; Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, Nueva York (1991); DeBoer, A.G., y col., J. Controlled Release 13:241, 1990.) Por ejemplo, STDHF es un derivado sintético del ácido fusídico, un tensioactivo esteroideo que tiene una estructura similar a las sales biliares y que se ha utilizado como potenciador de la penetración para la administración nasal. (Lee, W.A., Biopharm. 22, noviembre/diciembre 1990.)
Los polipéptidos y anticuerpos inhibidores de MASP-2 pueden introducirse en asociación con otra molécula, tal como un lípido, para proteger los polipéptidos de la degradación enzimática. Por ejemplo, la unión covalente de polímeros, especialmente polietilenglicol (PEG), se ha utilizado para proteger determinadas proteínas de la hidrólisis enzimática en el cuerpo y así prolongar la semivida (Fuertges, F., y col., J. Controlled Release 11:139, 1990). Se han informado muchos sistemas poliméricos para la administración de proteínas (Bae, Y.H., y col., J. Controlled Release 9:271, 1989; Hori, R., y col., Pharm. Res. 6:813, 1989; Yamakawa, I., y col., J. Pharm. Sci. 79:505, 1990; Yoshihiro, I., y col., J. Controlled Release 10:195, 1989; Asano, M., y col., J. Controlled Release 9:111, 1989; Rosenblatt, J., y col., J. Controlled Release 9:195, 1989; Makino, K., J. Controlled Release 12:235, 1990; Takakura, Y., y col., J. Pharm. Sci.
78:117, 1989; Takakura, Y., y col., J. Pharm. Sci. 78:219, 1989).
Recientemente, se han desarrollado liposomas con una estabilidad sérica y tiempos medios de circulación mejorados (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.° 5.741.516, de Webb). Además, se han revisado varios procedimientos de preparaciones de liposomas y similares a liposomas como posibles vehículos de fármacos (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.° 5.567.434, de Szoka; la Patente de Estados Unidos n.° 5.552.157, de Yagi; la Patente de Estados Unidos n.° 5.565.213, de Nakamori; la Patente de Estados Unidos n.° 5.738.868, de Shinkarenko; y la patente de Estados Unidos n.° 5.795.587, de Gao).
Para aplicaciones transdérmicas, los polipéptidos y anticuerpos inhibidores de MASP-2 pueden combinarse con otros ingredientes adecuados, tales como vehículos y/o adyuvantes. No existen limitaciones sobre la naturaleza de dichos otros ingredientes, excepto que deben ser farmacéuticamente aceptables para su administración prevista y no pueden degradar la actividad de los principios activos de la composición. Ejemplos de vehículos adecuados incluyen ungüentos, cremas, geles o suspensiones, con o sin colágeno purificado. Los polipéptidos y anticuerpos inhibidores de MASP-2 también se pueden impregnar en parches transdérmicos, yesos y vendajes, preferentemente en forma líquida o semilíquida.
Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse sistémicamente de forma periódica a intervalos determinados para mantener un nivel deseado de efecto terapéutico. Por ejemplo, se pueden administrar composiciones, tales como mediante inyección subcutánea, cada dos a cuatro semanas o en intervalos menos frecuentes. El régimen de dosificación lo determinará el médico considerando varios factores que pueden influir en la acción de la combinación de agentes. Estos factores incluirán el grado de progreso de la afección que se está tratando, la edad, sexo y peso del paciente, y otros factores clínicos. La dosis para cada agente individual variará en función del agente inhibidor de MASP-2 que se incluye en la composición, así como de la presencia y naturaleza de cualquier vehículo de administración de fármacos (por ejemplo, un vehículo de administración de liberación sostenida). Además, la cantidad de dosificación puede ajustarse para tener en cuenta la variación en la frecuencia de administración y el comportamiento farmacocinético del agente o agentes administrados.
ADMINISTRACIÓN LOCAL
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "local" abarca la aplicación de un fármaco en, o alrededor de, un sitio de acción localizada prevista y puede incluir, por ejemplo, la administración tópica en la piel u otros tejidos afectados, administración oftálmica, colocación, irrigación o administración intratecal (IT), intracerebroventricular (ICV), intrarticular, intracavidad, intracraneal o intravesicular. Puede ser preferible la administración local para permitir la administración de una dosis más baja, para evitar efectos secundarios sistémicos y para un control más preciso del momento de administración y concentración de los agentes activos en el sitio de administración local. La administración local proporciona una concentración conocida en el sitio diana, independientemente de la variabilidad entre pacientes en el metabolismo, circulación sanguínea, etc. El control de dosis mejorado también se describe mediante el modo directo de administración.
La administración local de un agente inhibidor de MASP-2 se puede lograr en el contexto de procedimientos quirúrgicos para tratar una enfermedad o afección, tal como, por ejemplo, durante procedimientos tales como la cirugía de derivación arterial, aterectomía, procedimientos con láser, procedimientos ultrasónicos, angioplastia con globo y colocación de prótesis intravaculares. Por ejemplo, se puede administrar un inhibidor de MASP-2 a un sujeto junto con un procedimiento de angioplastia con globo. Un procedimiento de angioplastia con globo implica la inserción de un catéter con un balón desinflado en una arteria. El globo desinflado se coloca cerca de la placa aterosclerótica y se infla de manera que la placa se comprime contra la pared vascular. Como resultado, la superficie del globo está en contacto con la capa de células endoteliales vasculares en la superficie del vaso sanguíneo. El agente inhibidor de MASP-2 se puede unir al catéter de la angioplastia con globo de manera que permita la liberación del agente en el sitio de la placa aterosclerótica. El agente se puede unir al catéter del globo de acuerdo con los procedimientos estándar conocidos en la materia. Por ejemplo, el agente puede almacenarse en un compartimento del catéter del globo hasta que se infla el globo, momento en el que se libera al entorno local. Como alternativa, el agente puede estar impregnado en la superficie del globo, de manera que entre en contacto con las células de la pared arterial cuando se infla el globo. El agente también se puede administrar en un catéter de globo perforado tal como los desvelados en Flugelman, M.Y., y col., Circulation 85:1110-1117, 1992. Véase también la solicitud PCT publicada WO 95/23161 para conocer un procedimiento ejemplar para unir una proteína terapéutica a un catéter de angioplastia con globo. Asimismo, el agente inhibidor de MASP-2 puede incluirse en un gel o recubrimiento polimérico aplicado a una prótesis intravascular, o puede incorporarse al material de la prótesis endovascular, de manera que la prótesis endovascular eluya el agente inhibidor de MASP-2 después de la colocación vascular.
Las composiciones inhibidoras de MASP-2 utilizadas en el tratamiento de artritis y otros trastornos musculoesqueléticos pueden administrarse localmente mediante inyección intrarticular. Dichas composiciones pueden incluir de forma adecuada un vehículo de administración de liberación sostenida. Como otro ejemplo de casos en los que se puede desear administración local, las composiciones inhibidoras de MASP-2 utilizadas en el tratamiento de afecciones urogenitales pueden instilarse adecuadamente por vía intravesical o dentro de otra estructura urogenital.
RECUBRIMIENTO EN UN DISPOSITIVO MÉDICO
Los agentes inhibidores de MASP-2 tales como anticuerpos y péptidos inhibidores pueden inmovilizarse sobre (o dentro de) una superficie de un dispositivo médico implantable o acoplable. La superficie modificada normalmente estará en contacto con tejido vivo después de la implantación en el cuerpo de un animal. Por "dispositivo médico implantable o acoplable" se entiende cualquier dispositivo que esté implantado en, o acoplado a, tejido de un cuerpo animal, durante el funcionamiento normal del dispositivo (por ejemplo, prótesis y dispositivos de administración de fármacos implantables). Dichos dispositivos médicos implantables o acoplables pueden estar hechos de, por ejemplo, nitrocelulosa, diazocelulosa, vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, dextrano, sefarosa, agar, almidón, nailon, acero inoxidable, titanio y polímeros biodegradables y/o biocompatibles. El enlace de la proteína a un dispositivo se puede lograr mediante cualquier técnica que no destruya la actividad biológica de la proteína enlazada, por ejemplo, mediante la unión de uno o ambos restos de los extremos N y C de la proteína al dispositivo. La unión también se puede realizar en uno o más sitios internos de la proteína. También se pueden usar múltiples uniones (tanto internas como en los extremos de la proteína). Una superficie de un dispositivo médico implantable o acoplable se puede modificar para incluir grupos funcionales (por ejemplo, carboxilo, amida, amino, éter, hidroxilo, ciano, nitrido, sulfanamido, acetilínico, epóxido, silánico, anhidro, succinímico, azido) para la inmovilización de proteínas en el mismo. Las químicas de acoplamiento incluyen, pero sin limitación, la formación de ésteres, éteres, amidas, derivados azido y sulfanamido, cianato y otros enlaces a los grupos funcionales disponibles en anticuerpos MASP-2 o péptidos inhibidores. Los anticuerpos MASP-2 o fragmentos inhibidores también se pueden unir de forma no covalente mediante la adición de una secuencia de marcador de afinidad a la proteína, tal como GST (D.B. Smith y K.S. Johnson, Gene 67:31, 1988), polihistidinas (E. Hochuli y col., J. Chromatog. 411:77, 1987) o biotina. Dichos marcadores de afinidad pueden usarse para la unión reversible de la proteína a un dispositivo.
Las proteínas también se pueden unir covalentemente a la superficie del cuerpo de un dispositivo, por ejemplo, mediante activación covalente de la superficie del dispositivo médico. A modo de ejemplo representativo, las proteínas matricelulares pueden unirse al cuerpo del dispositivo mediante cualquiera de los siguientes pares de grupos reactivos (un miembro del par está presente en la superficie del cuerpo del dispositivo y el otro miembro del par está presente en la proteína(s) matricelular): hidroxilo/ácido carboxílico para producir un enlace éster; hidroxilo/anhídrido para producir un enlace éster; hidroxilo/isocianato para producir un enlace uretano. Una superficie del cuerpo de un dispositivo que no posee grupos reactivos útiles puede tratarse con grabado de plasma de descarga de radiofrecuencia (RFGD, por sus siglas en inglés) para generar grupos reactivos con el fin de permitir el depósito de proteína(s) matricelulares (por ejemplo, tratamiento con plasma de oxígeno para introducir grupos que contienen oxígeno; tratamiento con plasma de propil amino para introducir grupos amina).
Los agentes inhibidores de MASP-2 que comprenden moléculas de ácido nucleico tales como inhibidores de péptidos que codifican ARNi o ADN antisentido se pueden incrustar en matrices porosas unidas al cuerpo de un dispositivo. Las matrices porosas representativas útiles para hacer la capa superficial son las preparadas a partir de tendón o colágeno dérmico, como se puede obtener de una variedad de fuentes comerciales (por ejemplo, Sigma and Collagen Corporation), o matrices de colágeno preparadas como se describe en las Patentes de Estados Unidos n.° 4.394.370, de Jefferies, y 4.975.527, de Koezuka. Un material de colágeno se denomina UltraFiber™ y se puede obtener de Norian Corp. (Mountain View, California).
También se pueden emplear determinadas matrices poliméricas si se desea, e incluyen polímeros de éster acrílico y polímeros de ácido láctico, como se desvela, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos n.° 4.526.909 y 4.563.489, de Urist. Ejemplos particulares de polímeros útiles son los de ortoésteres, anhídridos, cofumaratos de propileno, o un polímero de uno o más monómeros de ácido a-hidroxicarboxílico, (por ejemplo, ácido a-hidroxiacético (ácido glicólico) y/o ácido a-hidroxipropiónico (ácido láctico)).
REGÍMENES DE TRATAMIENTO
En aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto susceptible de, o en riesgo de sufrir, una afección asociada con la activación del complemento dependiente de MASP-2 en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo de desarrollar síntomas de la afección. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto susceptible de, o que ya padece, una afección asociada con la activación del complemento dependiente de MASP-2 en una cantidad terapéuticamente eficaz suficiente para aliviar, o al menos reducir parcialmente, los síntomas de la afección. Tanto en regímenes profilácticos como terapéuticos, las composiciones que comprenden agentes inhibidores de MASP-2 pueden administrarse en varias dosis hasta que se haya logrado un resultado terapéutico suficiente en el sujeto. La aplicación de las composiciones inhibidoras de MASP-2 descritas en el presente documento se puede realizar mediante una sola administración de la composición, o una secuencia limitada de administraciones, para el tratamiento de una afección aguda, por ejemplo, lesión por reperfusión u otra lesión traumática. Como alternativa, la composición se puede administrar a intervalos periódicos durante un período prolongado de tiempo para el tratamiento de afecciones crónicas, por ejemplo, artritis o psoriasis.
Los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento se pueden usar para inhibir la inflamación y los procesos relacionados que normalmente resultan de procedimientos médicos y quirúrgicos de diagnóstico y terapéuticos. Para inhibir dichos procedimientos, la composición inhibidora de m As P-2 descrita en el presente documento se puede aplicar de manera periprocedimental. Como se usa en el presente documento, "de manera periprocedimental" se refiere a la administración de la composición inhibidora preprocedimiento y/o intraprocedimiento y/o posprocedimiento, es decir, antes del procedimiento, antes y durante el procedimiento, antes y después del procedimiento, antes, durante y después del procedimiento, durante el procedimiento, durante y después del procedimiento, o después del procedimiento. La aplicación periprocedimental se puede llevar a cabo mediante la administración local de la composición en el sitio quirúrgico o del procedimiento, tal como mediante inyección o irrigación continua o intermitente del sitio o mediante administración sistémica. Los procedimientos adecuados para la administración perioperatorio local de soluciones de agentes inhibidores de MASP-2 se desvelan en las Patentes de Estados Unidos N.° 6.420.432 de Demopulos y 6.645.168 de Demopulos. En la Solicitud de Patente Internacional PCT WO 01/07067 A2 se desvelan procedimientos adecuados para la administración local de composiciones condroprotectoras que incluyen agente(s) inhibidor de MASP-2. En la Solicitud de Patente Internacional PCT WO 03/063799 A2 se desvelan procedimientos y composiciones adecuados para la administración sistémica dirigida de composiciones condroprotectoras que incluyen agente(s) inhibidor de MASP-2.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden administrarse a un sujeto que padece, o está en riesgo de desarrollar, una microangiopatía trombótica (MAT). En un caso, la MAT se selecciona del grupo que consiste en síndrome urémico hemolítico (SUH), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) y síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa). En un caso, la MAT es SUHa. En un caso, la composición se administra a un paciente con SUHa durante la fase aguda de la enfermedad. En un caso, la composición se administra a un paciente con SUHa durante la fase de remisión (es decir, en un sujeto que se ha recuperado o parcialmente recuperado de un episodio de SUHa en fase aguda, dicha remisión evidenciada, por ejemplo, mediante un recuento de plaquetas aumentado y/o concentraciones séricas de LDH reducidas, por ejemplo, como se describe en Loirat C y col., Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60, 2011, incorporado en el presente documento como referencia). En un caso, el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, una MAT que es (i) una MAT secundaria por cáncer; (ii) una MAT secundaria por quimioterapia; o (iii) una MAT secundaria por trasplante (por ejemplo, trasplante de órgano, tal como trasplante de riñón o trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas). En un caso, el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, el síndrome de Upshaw-Schulman (SUS). En un caso, el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, la enfermedad de Degos. En un caso, el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, el síndrome antifosfolipídico catastrófico (SAFC). En aplicaciones terapéuticas, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto que padece, o está en riesgo de desarrollar, una MAT en una cantidad terapéuticamente eficaz suficiente para inhibir la formación de trombos, aliviar, o al menos reducir parcialmente, los síntomas de la afección.
Tanto en regímenes profilácticos como terapéuticos, las composiciones que comprenden agentes inhibidores de MASP-2 pueden administrarse en varias dosis hasta que se haya logrado un resultado terapéutico suficiente en el sujeto. En un caso descrito en el presente documento, el agente inhibidor de MASP-2 comprende un anticuerpo antim As P-2, que se puede administrar adecuadamente a un paciente adulto (por ejemplo, un adulto de peso medio de 70 kg) en una dosis de 0,1 mg a 10.000 mg, más adecuadamente de 1,0 mg a 5.000 mg, más adecuadamente de 10,0 mg a 2.000 mg, más adecuadamente 10,0 mg a 1000 mg y aún más adecuadamente de 50,0 mg a 500 mg. Para pacientes pediátricos, la dosis se puede ajustar en proporción al peso del paciente. La aplicación de las composiciones inhibidoras de MASP-2 descritas en el presente documento se puede realizar mediante una sola administración de la composición, o una secuencia limitada de administraciones, para el tratamiento de MAT. Como alternativa, la composición se puede administrar a intervalos periódicos tales como diariamente, quincenalmente, semanalmente, cada dos semanas, mensualmente o bimestralmente durante un período prolongado de tiempo para el tratamiento de MAT.
En algunos casos, el sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar una MAT se ha sometido previamente, o está sometido actualmente a tratamiento con un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína C5 del complemento. En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición descrita en el presente documento que comprende un inhibidor de MASP-2 y además administrar al sujeto un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína C5 del complemento. En algunos casos, el inhibidor del complemento terminal es un anticuerpo humanizado anti-C5 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, el inhibidor del complemento terminal es eculizumab.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto susceptible de, o con riesgo de sufrir, el SUHa en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo de desarrollar síntomas de la afección. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto susceptible de, o que ya padece, el SUHa en una cantidad terapéuticamente eficaz suficiente para aliviar, o al menos reducir parcialmente, los síntomas de la afección. En un ejemplo descrito en el presente documento, antes de la administración, el sujeto se puede examinar para determinar si presenta uno o más síntomas del SUHa, incluyendo (i) anemia, (ii)trombocitopenia (iii) insuficiencia renal y (iv) aumento de creatinina, y la composición descrita en el presente documento se administra luego en una cantidad eficaz y durante un período de tiempo suficiente para mejorar estos síntomas.
Las composiciones inhibidoras de MASP-2 descritas en el presente documento pueden usarse para tratar profilácticamente a un sujeto que tiene un riesgo elevado de desarrollar SUHa y, por lo tanto, reducir la probabilidad de que el sujeto presente SUHa. La presencia de un marcador genético en el sujeto que se sabe que está asociado con el SUHa se determina primero mediante la realización de una prueba de cribado genético en una muestra obtenida del sujeto y la identificación de la presencia de al menos un marcador genético asociado con el SUHa, factor H (FHC), factor I (FIC), factor B (FBC) del complemento, cofactor de membrana CD46, C3, proteína relacionada con el factor H del complemento (CFHR1), proteína anticoagulante trombodulina (THBD), proteína 3 relacionada con el factor H del complemento (CFHR3) o proteína 4 relacionada con el factor H del complemento (CFHR4). Luego, el sujeto se controla periódicamente (por ejemplo, mensualmente, trimestralmente, dos veces al año o anualmente) para determinar la presencia o ausencia de al menos un síntoma del SUHa, tal como anemia, trombocitopenia, insuficiencia renal y aumento de creatinina. Tras la determinación de la presencia de al menos uno de estos síntomas, al sujeto se le puede administrar una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2, en una cantidad eficaz y durante un período de tiempo suficiente para mejorar dichos uno o más síntomas. En un ejemplo adicional descrito en el presente documento, un sujeto con mayor riesgo de desarrollar SUHa debido a haber sido examinado y determinado que tiene uno de los marcadores genéticos asociados con el SUHa puede controlarse para la aparición de un evento asociado con el desencadenamiento de síntomas clínicos del SUHa, incluyendo exposición a fármacos, infección (por ejemplo, infección bacteriana), neoplasia maligna, lesión, trasplante de órganos o tejidos y embarazo.
Una composición que comprende una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 puede administrarse a una persona que padece o está en riesgo de desarrollar síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa) secundario a una infección. Por ejemplo, un paciente que padece o está en riesgo de desarrollar SUHa no entérico asociado con una infección por S. neumonía puede tratarse con las composiciones descritas en el presente documento.
Un sujeto que padece SUHa puede tratarse inicialmente con una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento que se administra a través de una línea de catéter, tal como una línea de catéter intravenoso o una línea de catéter subcutáneo, durante un primer período de tiempo, tal como una hora, doce horas, un día, dos días o tres días. A continuación, el sujeto puede tratarse durante un segundo período de tiempo con la composición inhibidora de MASP-2 administrada mediante inyecciones subcutáneas regulares, tales como inyecciones diarias, quincenales, semanales, cada dos semanas, mensuales o bimensuales.
Una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento puede administrarse a un sujeto que padece SUHa en ausencia de plasmaféresis (es decir, un sujeto cuyos síntomas del SUHa no se han tratado con plasmaféresis y no se tratan con plasmaféresis en el momento del tratamiento con la composición inhibidora de MASP-2), para evitar las posibles complicaciones de la plasmaféresis, incluyendo hemorragia, infección y exposición a trastornos y/o alergias inherentes al donante del plasma, o en un sujeto que de otra manera se opone a la plasmaféresis, o en un entorno en el que la plasmaféresis no está disponible.
Una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento puede administrarse a un sujeto que padece SUHa coincidiendo con el tratamiento del paciente con plasmaféresis. Por ejemplo, a un sujeto que recibe tratamiento con plasmaféresis se le puede administrar la composición inhibidora de MASP-2 siguiendo o alternando con el plasmaféresis.
Un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar SUHa y está siendo tratado con una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento puede controlarse mediante la determinación periódica, tal como cada doce horas o diariamente, del nivel de al menos un factor del complemento, en el que la determinación de un nivel reducido del al menos un factor del complemento en comparación con un valor estándar o con un sujeto sano es indicativo de la necesidad de un tratamiento continuado con la composición.
Tanto en regímenes profilácticos como terapéuticos, las composiciones que comprenden agentes inhibidores de MASP-2 pueden administrarse en varias dosis hasta que se haya logrado un resultado terapéutico suficiente en el sujeto. En un caso descrito en el presente documento, el agente inhibidor de MASP-2 comprende un anticuerpo antim As P-2, que se puede administrar adecuadamente a un paciente adulto (por ejemplo, un adulto de peso medio de 70 kg) en una dosis de 0,1 mg a 10.000 mg, más adecuadamente de 1,0 mg a 5.000 mg, más adecuadamente de 10,0 mg a 2.000 mg, más adecuadamente 10,0 mg a 1000 mg y aún más adecuadamente de 50,0 mg a 500 mg. Para pacientes pediátricos, la dosis se puede ajustar en proporción al peso del paciente. La aplicación de las composiciones inhibidoras de MASP-2 descritas en el presente documento se puede realizar mediante una sola administración de la composición, o una secuencia limitada de administraciones, para el tratamiento del SUHa. Como alternativa, la composición puede administrarse a intervalos periódicos, tal como diariamente, quincenalmente, semanalmente, cada dos semanas, mensualmente o bimestralmente, durante un período prolongado de tiempo para el tratamiento del SUHa.
En algunos casos, el sujeto que padece SUHa se ha sometido previamente, o se está sometiendo actualmente a un tratamiento con un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína C5 del complemento. Dichos procedimientos pueden comprender administrar al sujeto una composición descrita en el presente documento que comprende un inhibidor de MASP-2 y administrar además al sujeto un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína C5 del complemento. En algunos casos, el inhibidor del complemento terminal es un anticuerpo humanizado anti-C5 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, el inhibidor del complemento terminal es eculizumab.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden administrar a un sujeto susceptible de, o en riesgo de padecer, SUH en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo de desarrollar síntomas de la afección. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto susceptible de, o que ya padece, el SUH en una cantidad terapéuticamente eficaz suficiente para aliviar, o al menos reducir parcialmente, los síntomas de la afección.
La probabilidad de desarrollar función renal alterada en un sujeto con riesgo de desarrollar SUH puede reducirse mediante la administración al sujeto de una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento en una cantidad eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2. Por ejemplo, un sujeto en riesgo de desarrollar SUH y ser tratado con una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento puede presentar uno o más síntomas asociados con el SUH, incluyendo diarrea, un nivel de hematocrito de menos de un 30 % con evidencia de frotis de destrucción de eritrocitos intravascular, trombocitopenia y aumento de los niveles de creatinina. Como ejemplo adicional, un sujeto en riesgo de desarrollar SUH y ser tratado con las composiciones inhibidoras de MASP-2 descritas en el presente documento puede estar infectado con E. coli, Shigella o Salmonella. Dichos sujetos infectados con E. coli, Shigella o Salmonella pueden tratarse con una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento de forma simultánea con el tratamiento con antibióticos, o alternativamente pueden tratarse con una composición inhibidora de MASP-2 sin tratamiento simultáneo con un antibiótico, particularmente para E. coli enterogénica para la cual el tratamiento con antibióticos está contraindicado. Un sujeto infectado con E. coli enterogénica que ha sido tratado con un antibiótico puede tener un riesgo elevado de desarrollar SUH y puede tratarse adecuadamente con una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento para reducir ese riesgo. Un sujeto infectado con E. coli enterogénica puede tratarse durante un primer período de tiempo con una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento en ausencia de un antibiótico y luego durante un segundo período de tiempo con una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento y un antibiótico.
Un sujeto que padece SUH puede tratarse inicialmente con una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento que se administra a través de una línea de catéter, tal como una línea de catéter intravenoso o una línea de catéter subcutáneo, durante un primer período de tiempo, tal como una hora, doce horas, un día, dos días o tres días. A continuación, el sujeto puede tratarse durante un segundo período de tiempo con la composición inhibidora de MASP-2 administrada mediante inyecciones subcutáneas regulares, tales como inyecciones diarias, quincenales, semanales, cada dos semanas, mensuales o bimensuales.
Una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento puede administrarse a un sujeto que padece SUH en ausencia de plasmaféresis (es decir, un sujeto cuyos síntomas del SUH no se han tratado con plasmaféresis y no se tratan con plasmaféresis en el momento del tratamiento con la composición inhibidora de MASP-2), para evitar las posibles complicaciones de la plasmaféresis, incluyendo hemorragia, infección y exposición a trastornos y/o alergias inherentes al donante del plasma, o en un sujeto que de otra manera se opone a la plasmaféresis, o en un entorno en el que la plasmaféresis no está disponible.
Una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento puede administrarse a un sujeto que padece SUH coincidiendo con el tratamiento del paciente con plasmaféresis. Por ejemplo, a un sujeto que recibe tratamiento con plasmaféresis se le puede administrar la composición inhibidora de MASP-2 siguiendo o alternando con el plasmaféresis.
Un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar SUH y está siendo tratado con una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento puede controlarse mediante la determinación periódica, tal como cada doce horas o diariamente, del nivel de al menos un factor del complemento, en el que la determinación de un nivel reducido del al menos un factor del complemento en comparación con un valor estándar o con un sujeto sano es indicativo de la necesidad de un tratamiento continuado con la composición.
Tanto en regímenes profilácticos como terapéuticos, las composiciones que comprenden agentes inhibidores de MASP-2 pueden administrarse en varias dosis hasta que se haya logrado un resultado terapéutico suficiente en el sujeto. El agente inhibidor de MASP-2 puede comprender un anticuerpo anti-MASP-2, que se puede administrar adecuadamente a un paciente adulto (por ejemplo, un adulto de peso medio de 70 kg) en una dosis de 0,1 mg a 10.000 mg, más adecuadamente de 1,0 mg a 5.000 mg, más adecuadamente de 10,0 mg a 2.000 mg, más adecuadamente 10,0 mg a 1000 mg y aún más adecuadamente de 50,0 mg a 500 mg. Para pacientes pediátricos, la dosis se puede ajustar en proporción al peso del paciente. La aplicación de las composiciones inhibidoras de MASP-2 descritas en el presente documento se puede realizar mediante una sola administración de la composición, o una secuencia limitada de administraciones, para el tratamiento del SUH. Como alternativa, la composición puede administrarse a intervalos periódicos, tal como diariamente, quincenalmente, semanalmente, cada dos semanas, mensualmente o bimestralmente, durante un período prolongado de tiempo para el tratamiento del SUH.
En algunos casos, el sujeto que padece SUH se ha sometido previamente, o se está sometiendo actualmente a un tratamiento con un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína C5 del complemento. En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición descrita en el presente documento que comprende un inhibidor de MASP-2 y además administrar al sujeto un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína C5 del complemento. En algunos casos, el inhibidor del complemento terminal es un anticuerpo humanizado anti-C5 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, el inhibidor del complemento terminal es eculizumab.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto susceptible de, o con riesgo de sufrir, PTT en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo de desarrollar síntomas de la afección. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto susceptible de, o que ya padece, PTT en una cantidad terapéuticamente eficaz suficiente para aliviar, o al menos reducir parcialmente, los síntomas de la afección.
Un sujeto que presenta uno o más de los síntomas de PTT, incluyendo la implicación del sistema nervioso central, trombocitopenia, afectación cardíaca grave, afectación pulmonar grave, infarto gastrointestinal y gangrena, se puede tratar con una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento. Un sujeto que se determina que tiene un nivel reducido de ADAMTS13 y que también da positivo por la presencia de un inhibidor de (es decir, un anticuerpo) ADAMTS13 se puede tratar con una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento. En un ejemplo adicional descrito en el presente documento, un sujeto que da positivo por la presencia de un inhibidor de ADAMTS13 se puede tratar con un inmunodepresor (por ejemplo, corticoesteroides, rituxan o ciclosporina) al mismo tiempo que el tratamiento con una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento. Un sujeto que se determina que tiene un nivel reducido de ADAMTS13 y que da positivo por la presencia de un inhibidor de ADAMTS13 se puede tratar con ADAMTS13 al mismo tiempo que el tratamiento con una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento.
Un sujeto que padece PTT se puede tratar inicialmente con una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento que se administra a través de una línea de catéter, tal como una línea de catéter intravenoso o una línea de catéter subcutáneo, durante un primer período de tiempo, tal como una hora, doce horas, un día, dos días o tres días. A continuación, el sujeto puede tratarse durante un segundo período de tiempo con la composición inhibidora de MASP-2 administrada mediante inyecciones subcutáneas regulares, tales como inyecciones diarias, quincenales, semanales, cada dos semanas, mensuales o bimensuales.
Una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento puede administrarse a un sujeto que padece SUH en ausencia de plasmaféresis (es decir, un sujeto cuyos síntomas del PTT no se han tratado con plasmaféresis y no se tratan con plasmaféresis en el momento del tratamiento con la composición inhibidora de MASP-2), para evitar las posibles complicaciones de la plasmaféresis, incluyendo hemorragia, infección y exposición a trastornos y/o alergias inherentes al donante del plasma, o en un sujeto que de otra manera se opone a la plasmaféresis, o en un entorno en el que la plasmaféresis no está disponible.
Una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento puede administrarse a un sujeto que padece PTT coincidiendo con el tratamiento del paciente con plasmaféresis. Por ejemplo, a un sujeto que recibe tratamiento con plasmaféresis se le puede administrar la composición inhibidora de Ma SP-2 siguiendo o alternando con el plasmaféresis.
Un sujeto que padece PTT refractaria, es decir, síntomas de PTT que no han respondido adecuadamente a otros tratamientos tales como la plasmaféresis, puede tratarse con una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento, con o sin plasmaféresis adicional.
Un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar PTT y está siendo tratado con una composición inhibidora de MASP-2 descrita en el presente documento puede controlarse mediante la determinación periódica, tal como cada doce horas o diariamente, del nivel de al menos un factor del complemento, en el que la determinación de un nivel reducido del al menos un factor del complemento en comparación con un valor estándar o con un sujeto sano es indicativo de la necesidad de un tratamiento continuado con la composición.
Tanto en regímenes profilácticos como terapéuticos, las composiciones que comprenden agentes inhibidores de MASP-2 pueden administrarse en varias dosis hasta que se haya logrado un resultado terapéutico suficiente en el sujeto. En un caso descrito en el presente documento, el agente inhibidor de MASP-2 comprende un anticuerpo antim As P-2, que se puede administrar adecuadamente a un paciente adulto (por ejemplo, un adulto de peso medio de 70 kg) en una dosis de 0,1 mg a 10.000 mg, más adecuadamente de 1,0 mg a 5.000 mg, más adecuadamente de 10,0 mg a 2.000 mg, más adecuadamente 10,0 mg a 1000 mg y aún más adecuadamente de 50,0 mg a 500 mg. Para pacientes pediátricos, la dosis se puede ajustar en proporción al peso del paciente. La aplicación de las composiciones inhibidoras de MASP-2 descritas en el presente documento se puede realizar mediante una sola administración de la composición, o una secuencia limitada de administraciones, para el tratamiento de PTT. Como alternativa, la composición puede administrarse a intervalos periódicos, tal como diariamente, quincenalmente, semanalmente, cada dos semanas, mensualmente o bimestralmente, durante un período prolongado de tiempo para el tratamiento de PTT.
En algunos casos, el sujeto que padece PTT se ha sometido previamente, o se está sometiendo actualmente a un tratamiento con un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína C5 del complemento. En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición descrita en el presente documento que comprende un inhibidor de MASP-2 y además administrar al sujeto un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína C5 del complemento. En algunos casos, el inhibidor del complemento terminal es un anticuerpo humanizado anti-C5 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, el inhibidor del complemento terminal es eculizumab.
VI. Ejemplos
Los ejemplos que no están dentro del ámbito de las reivindicaciones se incluyen como ejemplos de referencia para la ayuda del experto.
EJEMPLO 1
Este ejemplo describe la generación de una cepa de ratón deficiente en MASP-2 (MASP-2-/-) pero suficiente en MAp19 (MAp19+/+).
Materiales y procedimientos: El vector de dirección pKO-NTKV 1901 se diseñó para alterar los tres exones que codifican el extremo C terminal de MASP-2 murina, incluyendo el exón que codifica el dominio de serina proteasa, tal como en la FIGURA 3. Se usó PKO-NTKV 1901 para transfectar la línea celular ME murina E14.1a (Sv 129 Ola). Se seleccionaron clones resistentes a neomicina y sensibles a timidina cinasa. Se seleccionaron 600 clones ME y, de estos, se identificaron y verificaron cuatro clones diferentes mediante transferencia Southern para contener el evento de recombinación y direccionamiento selectivo esperado como se muestra en la FIGURA 3. Se generaron quimeras a partir de estos cuatro clones positivos mediante transferencia de embriones. A continuación, las quimeras se retrocruzaron en el antecedente genético C57/BL6 para crear machos transgénicos. Los machos transgénicos se cruzaron con hembras para generar F1 con un 50 % de la descendencia mostrando heterocigosidad para el gen MASP-2 alterado. Los ratones heterocigotos se cruzaron para generar descendencia homocigótica deficiente en MASP-2, dando como resultado ratones heterocigotos y de tipo silvestre en la tasa de 1:2:1, respectivamente.
Resultados y fenotipo: Se encontró que los ratones homocigotos deficientes en MASP-2-/- resultantes eran viables y fértiles y se verificó que eran deficientes en MASP-2 mediante transferencia Southern para confirmar el evento de direccionamiento correcto, mediante transferencia Northern para confirmar la ausencia de ARNm de MASP-2, y mediante transferencia Western para confirmar la ausencia de proteína MASP-2 (datos no mostrados). La presencia de ARNm de MAp19 y la ausencia de ARNm de MASP-2 se confirmó adicionalmente usando RT-PCR de resolución temporal en una máquina LightCycler. Los ratones MASP-2-/- continúan expresando proteína y ARNm de MAp19, MASP-1 y MASP-3 como se esperaba (datos no mostrados). La presencia y abundancia de ARNm en los ratones MASP-2-/- para properdina, Factor B, Factor D, C4, C2 y C3 se evaluaron mediante análisis LightCycler y se encontró que eran idénticos a los de los controles de camada de tipo silvestre (datos no mostrados). El plasma de ratones MASP-2-/- homocigotos es totalmente deficiente en la activación del complemento mediada por la ruta de la lectina, como se describe con más detalle en el Ejemplo 2.
Generación de una cepa MASP-2-/- sobre un antecedente C57BL6 puro: Los ratones MASP-2-/- se retrocruzaron con una línea C57BL6 pura durante nueve generaciones antes del uso de la cepa MASP-2-/- como modelo animal experimental.
Una cepa de ratón transgénico que es MASP-2-/- murina, MAp19+/+ y que expresa un transgén MASP-2 humano (un MASP-2 murino desactivado y un MASP-2 humano insertado) también se generó de la siguiente manera:
Materiales y procedimientos: Se construyó un minigén que codifica MASP-2 humana llamado "mini hMASP-2" (SEQ ID NO: 49) como se muestra en la FIGURA 4 que incluye la región promotora del gen MASP 2 humano, incluyendo los primeros 3 exones (exón 1 al exón 3) seguidos de la secuencia de ADNc que representa la secuencia codificante de los siguientes 8 exones, codificando así la proteína MASP-2 de longitud completa impulsada por su promotor endógeno. La construcción de mini hMASP-2 se inyectó en huevos fecundados de MASP-2-/- con el fin de reemplazar el gen MASP 2 murino deficiente por MASP-2 humano expresado transgénicamente.
EJEMPLO 2
Este ejemplo demuestra que se requiere MASP-2 para la activación del complemento a través de la ruta de la lectina.
Procedimientos y materiales:
Ensayo de escisión de C4 específica de la ruta de la lectina: Se ha descrito un ensayo de escisión de C4 por Petersen, y col., J. Immunol. Methods 257:107 (2001) que mide la activación de la ruta de la lectina resultante del ácido lipoteicoico (ALT) de S. aureus, que se une a L-ficolina. El ensayo descrito por Petersen y col., (2001) se adaptó para medir la activación de la ruta de lectina a través de MBL mediante el recubrimiento de la placa con LPS y manano o cimosano antes de añadir suero de ratones MASP-2 -/- como se describe a continuación. El ensayo también se modificó para eliminar la posibilidad de escisión de C4 debido a la ruta clásica. Esto se logró utilizando un tampón de dilución de muestra que contenía NaCl 1 M, que permite la unión de alta afinidad de los componentes de reconocimiento de la ruta de la lectina a sus ligandos pero evita la activación del C4 endógeno, excluyendo así la participación de la ruta clásica mediante la disociación del complejo C1. Descrito brevemente, en el ensayo modificado, se añaden muestras de suero (diluidas en tampón con alto contenido de sal (NaCl 1 M)) a placas recubiertas de ligando, seguido de la adición de una cantidad constante de C4 purificado en un tampón con una concentración fisiológica de sal. Los complejos de reconocimiento unidos que contienen MASP-2 escinden el C4, dando como resultado el depósito de C4b.
Procedimientos de ensayo:
1) Se recubrieron placas de microtitulación Nunc Maxisorb (Maxisorb, Nunc, n.° de cat. 442404, Fisher Scientific) con 1 |jg/ml de manano (M7504 Sigma) o cualquier otro ligando (por ejemplo, tal como los que se enumeran a continuación) diluido en tampón de recubrimiento (Na2CO315 mM, NaHCO335 mM, pH 9,6).
Se utilizaron los siguientes reactivos en el ensayo:
a. manano (1 pg/pocillo de manano (M7504 Sigma) en 100 pl de tampón de recubrimiento):
b. cimosano (1 pg/pocillo de cimosano (Sigma) en 100 pl de tampón de recubrimiento);
c. ALT (1 pg/pocillo en 100 pl de tampón de recubrimiento o 2 pg/pocillo en 20 pl de metanol)
d. 1 pg del AcM 4H5 específico de H-ficolina en tampón de recubrimiento
e. PSA de Aerococcus viridans (2 pg/pocillo en 100 pl de tampón de recubrimiento)
f. DSM20233 de S. aureus fijado con formalina 100 pl/pocillo (DO550= 0,5) en tampón de recubrimiento.
2) Las placas se incubaron durante la noche a 4 °C.
3) Después de la incubación durante la noche, los sitios de unión a proteínas residuales se saturaron mediante incubación de las placas con tampón de bloqueo HSA-TBS al 0,1 % (HSA al 0,1 % (p/v) en Tris-CL 10 mM, NaCl 140 mM, NaN31,5 mM, pH 7,4) durante 1-3 horas, luego mediante lavado de las placas 3X con TBS/tween/Ca2+ (TBS con Tween 20 al 0,05 % y CaCh 5 mM, MgCh 1 mM, pH 7,4).
4) Las muestras de suero a ensayar se diluyeron en tampón de unión a MBL (NaCl 1 M) y las muestras diluidas se añadieron a las placas y se incubaron durante la noche a 4 °C. Los pocillos que solo recibieron tampón se utilizaron como controles negativos.
5) Después de la incubación durante la noche a 4 °C, las placas se lavaron 3X con TBS/tween/Ca2+. Se añadió C4 humano (100 pl/pocillo de 1 pg/ml diluido en BBS (barbital 4 mM, NaCl 145 mM, CaCh 2 mM, MgCh 1 mM, pH 7,4)) a las placas y se incubó durante 90 minutos a 37 °C. Las placas se lavaron nuevamente 3X con TBS/tween/Ca2+.
6) El depósito de C4b se detectó con un anticuerpo de pollo anti-C4c humano conjugado con fosfatasa alcalina (diluido 1:1000 en TBS/tween/Ca2+), que se añadió a las placas y se incubó durante 90 minutos a temperatura ambiente. Luego, las placas se lavaron nuevamente 3X con TBS/tween/Ca2+.
7) Se detectó fosfatasa alcalina mediante la adición de 100 pl de solución de sustrato de fosfato de p-nitrofenilo, la incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos y la lectura de la DO405 en un lector de placas de microtitulación.
Resultados: Las FIGURAS 5A-B muestran la cantidad de depósito de C4b en manano (FIGURA 5A) y cimosano (FIGURA 5B) en diluciones de suero de MASP-2+/+ (cruces), MASP-2+/-(círculos cerrados) y MASP-2-/-(triángulos cerrados). La FIGURA 5C muestra la actividad relativa de C4 convertasa en placas recubiertas con cimosano (barras blancas) o manano (barras sombreadas) de ratones MASP-2-/+ (n = 5) y ratones MASP-2-/- (n = 4) en relación a ratones de tipo silvestre (n = 5) basándose en la medición de la cantidad de depósito de C4b normalizada al suero de tipo silvestre. Las barras de error representan la desviación estándar. Como se muestra en las FIGURAS 5A-C, el plasma de ratones MASP-2-/- es totalmente deficiente en la activación del complemento mediada por la ruta de la lectina en placas recubiertas con manano y cimosano. Estos resultados demuestran claramente que MASP-2 es un componente efector de la ruta de la lectina.
MASP-2 recombinante reconstituye la activación de C4 dependiente de la ruta de la lectina en suero de ratones MASP-2-/-
Para establecer que la ausencia de MASP-2 fue la causa directa de la pérdida de la activación de C4 dependiente de la ruta de la lectina en los ratones MASP-2-/-, se examinó el efecto de añadir proteína MASP-2 recombinante a muestras de suero en el ensayo de escisión de C4 descrito anteriormente. Las proteínas recombinantes MASP-2 murina funcionalmente activa y MASP-2A murina catalíticamente inactiva (en la que el resto de serina del sitio activo en el dominio de serina proteasa se sustituyó por el resto de alanina) se produjeron y purificaron como se describe a continuación en el Ejemplo 3. El suero combinado de 4 ratones MASP-2 -/- se incubó previamente con concentraciones crecientes de proteína de MASP-2 murina recombinante o MASP-2A murina recombinante inactiva y se ensayó la actividad C4 convertasa como se describió anteriormente.
Resultados: Como se muestra en la FIGURA 6, la adición de la proteína MASP-2 murina recombinante funcionalmente activa (mostrada como triángulos abiertos) al suero obtenido de los ratones MASP-2 -/- restauró la activación de C4 dependiente de la ruta de la lectina de una manera dependiente de la concentración de proteína, mientras que la proteína MASP-2A murina catalíticamente inactiva (mostrada como estrellas) no restauró la activación de C4. Los resultados mostrados en la FIGURA 6 se normalizan a la activación de C4 observada con suero de ratón de tipo silvestre combinado (mostrado como una línea de puntos).
EJEMPLO 3
Este ejemplo describe la expresión recombinante y la producción de proteínas de MASP-2 humana, de rata y murina de longitud completa recombinante, polipéptidos procedentes de MASP-2 y formas mutantes catalíticamente inactivadas de m As P-2
Expresión de MASP-2 humana, murina y de rata de longitud completa:
La secuencia de ADNc de longitud completa de MASP-2 humana (SEQ ID NO: 4) también se subclonó en el vector de expresión de mamífero pCI-Neo (Promega), que impulsa la expresión eucariota bajo el control de la región potenciadora/promotora de CMV (descrita en Kaufman R.J. y col., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)). El ADNc de ratón de longitud completa (SEQ ID NO: 50) y el ADNc de MASP-2 de rata (SEQ ID NO: 53) se subclonaron cada uno en el vector de expresión pED. Los vectores de expresión de MASP-2 se transfectaron luego en la línea celular de ovario de hámster chino adherente DXB1 utilizando el procedimiento estándar de transfección con fosfato de calcio descrito en Maniatis y col., 1989. Las células transfectadas con estas construcciones crecieron muy lentamente, lo que implica que la proteasa codificada es citotóxica.
En otro enfoque, la construcción del minigén (SEQ ID NO: 49) que contiene el ADNc humano de MASP-2 impulsado por su promotor endógeno se transfecta de forma transitoria en células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés). La proteína MASP-2 humana se secreta en el medio de cultivo y se aísla como se describe a continuación.
Expresión de MASP-2 catalíticamente inactiva de longitud completa:
Fundamento: MASP-2 se activa mediante escisión autocatalítica después de que los subcomponentes de reconocimiento MBL o ficolinas (ya sea L-ficolina, H-ficolina o M-ficolina) se unan a sus respectivos patrones de hidratos de carbono. La escisión autocatalítica que da como resultado la activación de MASP-2 a menudo ocurre durante el procedimiento de aislamiento de MASP-2 del suero o durante la purificación que sigue a la expresión recombinante. Para obtener una preparación de proteínas más estable para su uso como antígeno, una forma catalíticamente inactiva de MASP-2, diseñada como MASP-2A, se creó mediante el reemplazo del resto de serina que está presente en la tríada catalítica del dominio de proteasa con un resto de alanina en rata (SEQ ID NO: 55 Ser617 a Ala617); en ratón (SEQ ID NO: 52 Ser617 a Ala617); o en seres humanos (SEQ ID NO: 3 Ser618 a Ala618).
Para generar proteínas MASP-2A humanas y murinas catalíticamente inactivas, se llevó a cabo mutagénesis dirigida al sitio utilizando los oligonucleótidos que se muestran en la TABLA 5. Los oligonucleótidos en la TABLA 5 se diseñaron para hibridarse con la región del ADNc humano y murino que codifica la serina enzimáticamente activa y el oligonucleótido contiene un desapareamiento para cambiar el codón de serina en un codón de alanina. Por ejemplo, se usaron oligonucleótidos de p Cr SEQ ID NOS: 56-59 en combinación con el ADNc de MASP-2 humana (Se Q ID NO: 4) para amplificar la región desde el codón de inicio hasta la serina enzimáticamente activa y desde la serina hasta el codón de terminación para generar la lectura abierta completa de la MASP-2A mutada que contiene la mutación Ser618 a Ala618. Los productos de la PCR se purificaron después de la electroforesis en gel de agarosa y la preparación de la banda y se generaron solapamientos de adenosina individuales usando un procedimiento de colas estándar. La MASP-2A con cola de adenosina se clonó luego en el vector pGEM-T easy, transformado en E. coli.
Se generó una proteína MASP-2A de rata catalíticamente inactiva mediante cinasa e hibridación de la SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 65 mediante la combinación de estos dos oligonucleótidos en cantidades molares iguales, calentamiento a 100 °C durante 2 minutos y enfriado lentamente a temperatura ambiente. El fragmento hibridado resultante tiene extremos compatibles con Pst1 y Xbal y se insertó en lugar del fragmento Pst1-Xba1 del ADNc de MASP-2 de rata de tipo silvestre (Se Q ID NO: 53) para generar MASP-2A de rata.
5' GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3' (SEQ ID NO: 64)
5' CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA 3' (SEQ ID NO: 65)
Se subclonó adicionalmente cada una de MASP-2A humana, murina y de rata en cualquiera de los vectores de expresión de mamífero pED o pCI-Neo y se transfectaron en la línea celular de ovario de hámster chino DXB1 como se describe a continuación.
En otro enfoque, se construye una forma catalíticamente inactiva de MASP-2 usando el procedimiento descrito en Chen y col., J. Biol. Chem., 276(28):25894-25902, 2001. En resumen, el plásmido que contiene el ADNc de MASP-2 humana de longitud completa (descrito en Thiel y col., Nature 386:506, 1997) se digiere con Xho1 y EcoRI y el ADNc de MASP-2 (descrito en el presente documento como SEQ ID NO: 4) se clona en los correspondientes sitios de restricción del vector de transferencia de baculovirus pFastBac1 (Life Technologies, NY). El sitio activo de la serina proteasa de MASP-2 en Ser618 se altera luego a Ala618 mediante la sustitución de los oligonucleótidos bicatenarios que codifican el aminoácido 610-625 de la región peptídica (SEQ ID NO: 13) con los aminoácidos 610 a 625 de la región natural para crear un polipéptido de MASP-2 de longitud completa con un dominio de proteasa inactivo. Construcción de plásmidos de expresión que contienen regiones polipeptídicas procedentes de Masp-2 humana.
Las siguientes construcciones se producen usando el péptido señal de MASP-2 (restos 1-15 de la SEQ ID NO: 5) para secretar varios dominios de MASP-2. Se elabora una construcción que expresa el dominio CUBI de MASP-2 humana (SEQ ID NO: 8) mediante amplificación por PCR de la región que codifica los restos 1-121 de MASP-2 (SEQ ID NO: 6) (correspondiente al dominio CUB1 N-terminal). Una construcción que expresa el dominio CUBIEGF de MASP-2 humana (SEQ ID NO: 9) se elabora mediante PCR amplificando la región que codifica los restos 1-166 de MASP-2 (SEQ ID NO: 6) (correspondiente al dominio CUBIEGF N-terminal). Se elabora una construcción que expresa el dominio CUBIe Gf CUBII de MASP-2 humana (SEQ ID NO: 10) mediante ampliación por PCR de la región que codifica los restos 1-293 de MASP-2 (SEQ ID NO: 6) (correspondiente al dominio c Ub IEGf Cu BII N-terminal).
Los dominios mencionados anteriormente se amplifican mediante PCR usando polimerasa VentRy pBS-MASP-2 como plantilla, de acuerdo con los procedimientos de PCR establecidos. La secuencia del cebador en 5' del cebador de sentido (5'-CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' SEQ ID NO: 34) introduce un sitio de restricción SamHI (subrayado) en el extremo 5' de los productos de PCR. Cebadores antisentido para cada uno de los dominios MASP-2, que se muestran a continuación en la TABLA 5, están diseñados para introducir un codón de terminación (negrita) seguido de un sitio £coRI (subrayado) en el extremo de cada producto de PCR. Una vez amplificado, los fragmentos de ADN se digieren con SamHi y £coRI y se clonan en los sitios correspondientes del vector pFastBac1. Las construcciones resultantes se caracterizan por mapeo de restricción y se confirman mediante secuenciación de ADNbc.
TABLA 5: CEBADORES DE MASP-2 PARA PCR
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(continuación)
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Expresión eucariota recombinante de MASP-2 y producción de proteínas de MASP-2A de ratón, de rata y humana enzimáticamente inactiva.
Las construcciones de expresión MASP-2 y MASP-2A descritas anteriormente se transfectaron en células DXB1 utilizando el procedimiento de transfección estándar de fosfato cálcico (Maniatis y col., 1989). Se produjo MASP-2A en medio sin suero para garantizar que las preparaciones no se contaminasen con otras proteínas de suero. El medio se recogió de las células confluentes cada dos días (cuatro veces en total). El nivel de MASP-2A recombinante promedió aproximadamente 1,5 mg/litro de medio de cultivo para cada una de las tres especies.
Purificación de proteínas MASP-2A: La MASP-2A (mutante Ser-Ala descrito anteriormente) se purificó mediante cromatografía de afinidad en columnas de MBP-A-agarosa. Esta estrategia permitió una purificación rápida sin el uso de marcadores extraños. Se cargó MASP-2A (100-200 ml de medio diluido con un volumen igual de tampón de carga (Tris-Cl 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 150 mM y CaCh 25 mM) en una columna de afinidad de MBP-agarosa (4 ml) equilibrada previamente con 10 ml de tampón de carga. Después de lavar con otros 10 ml de tampón de carga, la proteína se eluyó en fracciones de 1 ml con Tris-Cl 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 1,25 M y EDTA 10 mM. Las fracciones que contenían la MASP-2A se identificaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Cuando fue necesario, se purificó MASP-2A adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico en una columna MonoQ (HR 5/5). La proteína se dializó con Tris-Cl 50 mM pH 7,5, que contenía NaCl 50 mM y se cargó en la columna equilibrada en el mismo tampón. Después del lavado, la MASP-2A unida se eluyó con un gradiente de NaCl 0,05-1 M sobre 10 ml.
Resultados: Se obtuvieron rendimientos de 0,25-0,5 mg de proteína MASP-2A a partir de 200 ml de medio. La masa molecular de 77,5 kDa determinada por MALDI-MS es mayor que el valor calculado del polipéptido no modificado (73,5 kDa) debido a la glucosilación. La unión de polisacáridos en cada uno de los sitios de A/-glucosilación representa la masa observada. MASP-2A migra como una sola banda en geles de poliacrilamida-SDS, demostrando que no se procesa proteolíticamente durante la biosíntesis. La masa molecular promedio en peso determinada por ultracentrifugación en equilibrio está de acuerdo con el valor calculado para los homodímeros del polipéptido glucosilado.
PRODUCCIÓN DE POLIPÉPTIDOS MASP-2 HUMANOS RECOMBINANTES
Otro procedimiento para producir polipéptidos recombinantes procedentes de MASP-2 y MASP2A se describe en Thielens, N.M., y col., J. Immunol. 166:5068-5077, 2001. En resumen, las células de insectos Spodoptera frugiperda (células Ready-Plaque Sf9 obtenidas de Novagen, Madison, WI) se cultivan y mantienen en medio sin suero Sf900II (Life Technologies) complementado con 50 UI/ml de penicilina y 50 mg/ml de estreptomicina (Life Technologies). Las células de insectos Trichoplusia ni (High Five) (descritas por Jadwiga Chroboczek, Institut de Biologie Structurale, Grenoble, Francia) se mantienen en medio TC100 (Life Technologies) que contiene FCS al 10 % (Dominique Dutscher, Brumath, Francia) complementado con 50 UI/ml de penicilina y 50 mg/ml de estreptomicina. Los baculovirus recombinantes se generan utilizando el sistema Bac-to-Bac (Life Technologies). El ADN bácmido se purifica usando el sistema de purificación Qiagen midiprep (Qiagen) y se usa para transfectar células de insectos Sf9 usando Cellfectin en medio Sf900 II SFM (Life Technologies) como se describe en el protocolo del fabricante. Las partículas víricas recombinantes se recogen 4 días después, valoradas mediante ensayo de placa de virus y amplificadas según lo descrito por King y Possee, en The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., Londres, págs. 111-114, 1992.
Se infectan células High Five (1,75 x 107 células/175 cm2 de matraz de cultivo de tejidos) con los virus recombinantes que contienen polipéptidos MASP-2 a una multiplicidad de infección de 2 en medio Sf900 II SFM a 28 °C durante 96 horas. Los sobrenadantes se recogen mediante centrifugación y se añade fosforofluoridato de diisopropilo hasta una concentración final de 1 mM.
Los polipéptidos MASP-2 se secretan en el medio de cultivo. Los sobrenadantes del cultivo se dializan frente a NaCl 50 mM, CaCl2 1 mM, clorhidrato de trietanolamina 50 mM, pH 8,1 y se cargan a 1,5 ml/min en una columna Q-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) (2,8 x 12 cm) equilibrada en el mismo tampón. La elución se realiza mediante la aplicación de un gradiente lineal de 1,2 litros a NaCl 350 mM en el mismo tampón. Las fracciones que contienen los polipéptidos MASP-2 recombinantes se identifican mediante análisis de transferencia Western, precipitadas mediante la adición de (NH^SO4 al 60 % (p/v), y se dejó durante la noche a 4 °C. Los sedimentos se resuspenden en NaCl 145 mM, CaCh 1 mM, clorhidrato de trietanolamina 50 mM, pH 7,4 y se aplican en una columna TSK G3000 SWG (7,5 x 600 mm) (Tosohaas, Montgomeryville, PA) equilibrada en el mismo tampón. Los polipéptidos purificados se concentran luego a 0,3 mg/ml mediante ultrafiltración en microconcentradores Microsep (límite de p.m. = 10.000) (Filtron, Karlstein, Alemania).
EJEMPLO 4
Este ejemplo describe un procedimiento para producir anticuerpos policlonales contra polipéptidos MASP-2.
Materiales y procedimientos:
Antígenos MASP-2: El antisuero policlonal anti-MASP-2 humana se produce mediante la inmunización de conejos con los siguientes polipéptidos Ma Sp-2 aislados: MASP-2 humana (Se Q ID NO: 6) aislada del suero; MASP-2 humana recombinante (SEQ iD NO: 6), MASP-2A que contiene el dominio de proteasa inactivo (SEQ ID NO: 13), como se describe en el Ejemplo 3; y CUBI (SEQ ID NO: 8), CUBEGFI (SEQ ID NO: 9) y CUBEGFCUBII (SEQ ID NO: 10) recombinantes expresados como se describe anteriormente en el Ejemplo 3.
Anticuerpos policlonales: Se inmunizan conejos de seis semanas, cebados con BCG (vacuna de bacilo de Calmette-Guerin) mediante la inyección de 100 |jg de polipéptido MASP-2 a 100 jg/m l en solución salina estéril. Las inyecciones se realizan cada 4 semanas, con el valor de anticuerpos controlado mediante ensayo ELISA como se describe en el Ejemplo 5. Los sobrenadantes del cultivo se recogen para la purificación de anticuerpos mediante cromatografía de afinidad de proteína A.
EJEMPLO 5
Este ejemplo describe un procedimiento para producir anticuerpos monoclonales murinos contra polipéptidos MASP-2 de rata o humanos.
Materiales y procedimientos:
Se inyectan ratones A/J macho (Harlan, Houston, Texas), de 8-12 semanas de edad, por vía subcutánea con 100 |jg de polipéptidos rMASP-2 o rMASP-2A humanos o de rata (preparados como se describe en el Ejemplo 3) en adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) en 200 j l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4. A intervalos de dos semanas, los ratones se inyectan dos veces por vía subcutánea con 50 jg de polipéptido rMASP-2 o rMASP-2A humano o de rata en adyuvante incompleto de Freund. En la cuarta semana, los ratones se inyectan con 50 jg de polipéptido rMASP-2 o rMASP-2A humano o de rata en PBS y se fusionan 4 días después.
Para cada fusión, se preparan suspensiones de células individuales a partir del bazo de un ratón inmunizado y se utilizan para la fusión con células de mieloma Sp2/0. 5x108 de las células Sp2/0 y 5x108 células del bazo se fusionan en un medio que contiene polietilenglicol al 50 % (P.M. 1450) (Kodak, Rochester, N.Y.) y dimetilsulfóxido al 5% (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Luego, las células se ajustan a una concentración de 1,5x105 células de bazo por 200 j l de la suspensión en medio Iscove (Gibco, Grand Island, N.Y.), complementado con suero bovino fetal al 10 %, 100 unidades/ml de penicilina, 100 jg/m l de estreptomicina, hipoxantina 0,1 mM, aminopterina 0,4 jM y timidina 16 jM . Se añaden doscientos microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de aproximadamente veinte placas de microcultivo de 96 pocillos. Después de aproximadamente diez días, se retiran los sobrenadantes del cultivo para detectar la reactividad con el factor MASP-2 purificado en un ensayo ELISA.
Ensayo ELISA: Se recubren los pocillos de placas de microensayo Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) mediante la adición de 50 j l de hMASP-2 purificada a 50 ng/ml o rMASP-2 de rata (o rMASP-2A) durante la noche a temperatura ambiente. La baja concentración de MASP-2 para el recubrimiento permite la selección de anticuerpos de alta afinidad. Después de que la solución de recubrimiento se elimine dando golpecitos a la placa, se añaden 200 j l de BLOTTO (leche desnatada en polvo) en PBS a cada pocillo durante una hora para bloquear los sitios no específicos. Una hora más tarde, a continuación, se lavan los pocillos con un tampón PBST (PBS que contiene Tween 20 al 0,05 %). Se recogen cincuenta microlitros de sobrenadantes de cultivo de cada pocillo de fusión y se mezclan con 50 j l de BLOTTO y luego se añaden a los pocillos individuales de las placas de microensayo. Después de una hora de incubación, los pocillos se lavan con PBST. Los anticuerpos murinos unidos se detectan luego mediante reacción con anti-IgG de ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (específica de Fc) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.) y se diluyen a 1:2000 en BLOTTO. Se añade a los pocillos una solución de sustrato de peroxidasa que contiene 3,3,5,5 tetrametilbencidina (Sigma, St. Louis, Mo.) al 0,1 % y peróxido de hidrógeno al 0,0003 % (Sigma) para el desarrollo de color durante 30 minutos. La reacción se termina mediante la adición de 50 j l de H2SO42 M por pocillo. La densidad óptica a 450 nm de la mezcla de reacción se lee con un lector de ELISA BioTek (BioTek Instruments, Winooski, Vt.).
Ensayo de unión a MASP-2:
Los sobrenadantes de cultivo que dan positivo en el ensayo ELISA de MASP-2 descrito anteriormente pueden probarse en un ensayo de unión para determinar la afinidad de unión que los agentes inhibidores de MASP-2 tienen por MASP-2. También se puede utilizar un ensayo similar para determinar si los agentes inhibidores se unen a otros antígenos en el sistema del complemento.
Se recubren pocillos de placa de microtitulación de poliestireno (placas de unión de medio de 96 pocillos, Corning Costar, Cambridge, MA) con MASP-2 (20 ng/100 jl/pocillo, Advanced Research Technology, San Diego, CA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 durante la noche a 4 °C. Después de aspirar la solución MASP-2, los pocillos se bloquean con PBS que contiene albúmina de suero bovino al 1 % (BSA; Sigma Chemical) durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos sin recubrimiento MASP-2 sirven como controles de fondo. Alícuotas de sobrenadantes de hibridomas o AcM anti-MASP-2 purificados, a concentraciones variables en la solución de bloqueo, se añaden a los pocillos. Después de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente, los pocillos se enjuagan extensamente con PBS. El AcM anti-MASP-2 unido a MASP-2 se detecta mediante la adición de anti-IgG de ratón de cabra conjugada con peroxidasa (Sigma Chemical) en la solución de bloqueo, que se deja incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se enjuaga de nuevo a fondo con PBS y se añaden 100 j l de sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). La reacción de TMB se apaga mediante la adición de 100 j l de ácido fosfórico 1 M y la placa se lee a 450 nm en un lector de microplacas (SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Los sobrenadantes del cultivo de los pocillos positivos se analizan luego para determinar la capacidad de inhibir la activación del complemento en un ensayo funcional tal como el ensayo de escisión de C4 como se describe en el Ejemplo 2. Las células de los pocillos positivos se clonan luego mediante dilución limitante. Los AcM se prueban de nuevo para determinar la reactividad con hMASP-2 en un ensayo ELISA como se describe anteriormente. Los hibridomas seleccionados se cultivan en matraces giratorios y el sobrenadante del cultivo agotado se recoge para la purificación de anticuerpos mediante cromatografía de afinidad de proteína A.
EJEMPLO 6
Este ejemplo describe la generación y producción de anticuerpos murinos humanizados anti-MASP-2 y fragmentos de anticuerpos.
Se genera un anticuerpo monoclonal murino anti-MASP-2 en ratones A/J macho como se describe en el Ejemplo 5.
El anticuerpo murino se humaniza luego como se describe a continuación para reducir su inmunogenicidad mediante le reemplazo de las regiones constantes murinas con sus equivalentes humanas para generar una IgG quimérica y un fragmento Fab del anticuerpo, que es útil para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de MASP-2 en sujetos humanos de acuerdo con la presente divulgación.
1. Clonación de genes de región variable anti-MASP-2 de células de hibridoma murino. El ARN total se aísla de las células de hibridoma que secretan AcM anti-MASP-2 (obtenido como se describe en el Ejemplo 7) usando RNAzol siguiendo el protocolo del fabricante (Biotech, Houston, Tex.). El ADNc de la primera cadena se sintetiza a partir del ARN total utilizando oligo dT como cebador. La PCR se realiza utilizando los cebadores en 3' procedentes de la región C constante de inmunoglobulina y conjuntos de cebadores degenerados procedentes del péptido líder o la primera región marco de genes Vh o Vk murinos como los cebadores en 5'. La PCR anclada se lleva a cabo como describen Chen y Platsucas (Chen, P.F., Scand. J. Immunol. 35:539-549, 1992). Para clonar el gen Vk, se prepara ADNc bicatenario usando un cebador Not1-MAK1 (5'-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3' SEQ ID NO: 38). Los adaptadores hibridados AD1 (5'-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3' SEQ ID NO: 39) y AD2 (5'-Tc Cg AGAATAACGAGTG-3' SEQ ID NO: 40) se ligan a ambos extremos 5' y 3' del ADNc bicatenario. Los adaptadores en los extremos 3' se eliminan mediante digestión con Notl. El producto digerido se usa luego como molde en PCR con el oligonucleótido AD1 como cebador en 5' y MAK2 (5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3' SEQ ID NO: 41) como cebador en 3'. Se clonan fragmentos de ADN de aproximadamente 500 pb en pUC19. Se seleccionan varios clones para el análisis de secuencia para verificar que la secuencia clonada abarca la región constante de inmunoglobulina murina esperada. Los oligonucleótidos Not1-MAK1 y MAK2 proceden de la región Vk y tienen 182 y 84 pb, respectivamente, corriente abajo del primer par de bases del gen C kappa. Se eligen clones que incluyan la Vk completa y el péptido líder.
Para clonar el gen Vh, se prepara ADNc bicatenario usando el cebador Not1 MAG1 (5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3' SEQ ID NO: 42). Los adaptadores hibridados AD1 y AD2 se ligan a ambos extremos 5' y 3' del ADNc bicatenario. Los adaptadores en los extremos 3' se eliminan mediante digestión con Notl. El producto digerido se utiliza como molde en PCR con el oligonucleótido AD1 y MAG2 (5'-CGGTAAGcTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3' SEQ ID NO: 43) como cebadores. Los fragmentos de ADN de 500 a 600 pb de longitud se clonan en pUC19. Los oligonucleótidos Notl-MAG1 y MAG2 proceden de la región Cy.7.1 murina y tienen 180 y 93 pb, respectivamente, corriente abajo del primer pb del gen Cy.7.1 murino. Se eligen clones que abarquen la Vh completa y el péptido líder.
2. Construcción de vectores de expresión para IgG y Fab quiméricos de MASP-2.
Los genes Vh y Vk clonados descritos anteriormente se utilizan como moldes en una reacción de PCR para añadir la secuencia consenso de Kozak al extremo 5' y el donante de empalme al extremo 3' de la secuencia de nucleótidos. Después de analizar las secuencias para confirmar la ausencia de errores de PCR, los genes Vh y Vk se insertan en casetes de vectores de expresión que contienen C.y1 y C.kappa humanos respectivamente, para dar pSV2neoVH-huCYl y pSV2neoV-huCy. Los ADN plasmídicos purificados en gradiente de CsCl de los vectores de cadena pesada y ligera se utilizan para transfectar células COS mediante electroporación. Después de 48 horas, el sobrenadante del cultivo se prueba mediante ELISA para confirmar la presencia de aproximadamente 200 ng/ml de IgG quimérica. Las células se recogen y se prepara a Rn total. El ADNc de la primera cadena se sintetiza a partir del ARN total utilizando oligo dT como cebador. Este ADNc se utiliza como molde en PCR para generar los fragmentos de ADN Fd y kappa. Para el gen Fd, se lleva a cabo una PCR utilizando 5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3' (SEQ ID NO: 44) como cebador en 5' y un cebador en 3' procedente de CHI (5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3' SEQ ID NO: 45). Se confirma que la secuencia de ADN contiene la Vh completa y el dominio CHI de IgG1 humana. Después de la digestión con las enzimas adecuadas, los fragmentos de ADN Fd se insertan en los sitios de restricción HindIII y BamHI del casete del vector de expresión pSV2dhfr-TUS para dar pSV2dhfrFd. El plásmido pSV2 está disponible comercialmente y consiste en segmentos de ADN de varias fuentes: el ADN de pBR322 (línea fina) contiene el origen de replicación del ADN de pBR322 (pBR ori) y el gen de resistencia a ampicilina (Amp) lactamasa; el ADN de SV40, representado por un sombreado más ancho y marcado, contiene el origen de replicación del ADN de SV40 (SV40 ori), el promotor temprano (en 5' para los genes dhfr y neo) y la señal de poliadenilación (en 3' para los genes dhfr y neo). La señal de poliadenilación (pA) procedente de SV40 también se coloca en el extremo 3' del gen Fd.
Para el gen kappa, se lleva a cabo una PCR utilizando 5'-AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3' (SEQ ID NO: 46) como cebador en 5' y un cebador en 3' procedente de Ck (5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3' SEQ ID NO: 47). Se confirma que la secuencia de a Dn contiene la Vk completa y regiones Ck humanas. Después de la digestión con enzimas de restricción adecuadas, los fragmentos de ADN kappa se insertan en los sitios de restricción HindIII y BamHI del casete del vector de expresión pSV2neo-TUS para dar pSV2neoK. La expresión de los genes Fd y .kappa está dirigida por los elementos potenciadores y promotores procedentes de HCMV. Dado que el gen Fd no incluye el resto de aminoácido de cisteína implicado en el enlace disulfuro entre cadenas, este Fab quimérico recombinante contiene cadenas ligera y pesada unidas de forma no covalente. Este Fab quimérico se denomina cFab.
Para obtener Fab recombinante con un enlace disulfuro entre cadenas pesada y ligera, el gen Fd anterior puede extenderse para incluir la secuencia codificante de 9 aminoácidos adicionales (EPKSCDKTH SEQ ID NO: 48) de la región bisagra de la IgG1 humana. El segmento de ADN BstEII-BamHI que codifica 30 aminoácidos en el extremo 3' del gen Fd puede reemplazarse con segmentos de ADN que codifican el Fd extendido, dando como resultado pSV2dhfrFd/9aa.
3. Expresión y purificación de IgG anti-MASP-2 quimérica
Para generar líneas celulares que secreten IgG anti-MASP-2 quimérica, se transfectan células NSO con ADN plasmídicos purificados de pSV2neoVH-huC.Yl y pSV2neoV-huC kappa mediante electroporación. Las células transfectadas se seleccionan en presencia de 0,7 mg/ml de G418. Las células se cultivan en un matraz giratorio de 250 ml usando medio que contiene suero.
El sobrenadante de cultivo de 100 ml de cultivo giratorio se carga en una columna PROSEP-A de 10 ml (Bioprocessing, Inc., Princeton, N.J.). La columna se lava con 10 volúmenes de lecho de PBS. El anticuerpo unido se eluye con tampón citrato 50 mM, pH 3,0. Igual volumen de Hepes 1 M, pH 8,0 se añade a la fracción que contiene el anticuerpo purificado para ajustar el pH a 7,0. Las sales residuales se eliminan mediante intercambio de tampón con p Bs mediante ultrafiltración con membrana Millipore (límite de P.M.: 3.000). La concentración de proteína del anticuerpo purificado se determina mediante el procedimiento BCA (Pierce).
4. Expresión y purificación de Fab anti-MASP-2 quimérico
Para generar líneas celulares que secreten Fab anti-MASP-2 quimérico, se transfectan células CHO con ADN plasmídico purificado de pSV2dhfrFd (o pSV2dhfrFd/9aa) y pSV2neokappa, mediante electroporación. Las células transfectadas se seleccionan en presencia de G418 y metotrexato. Las líneas celulares seleccionadas se amplifican en concentraciones crecientes de metotrexato. Las células unicelulares se subclonan mediante dilución limitante. A continuación, se cultivan líneas celulares subclonadas unicelulares de alta producción en un cultivo giratorio de 100 ml utilizando medio sin suero.
El Fab anti-MASP-2 quimérico se purifica mediante cromatografía de afinidad usando un AcM antidiotípico de ratón para el AcM MASP-2. Puede prepararse un AcM MASP-2 antidiotípico mediante la inmunización de ratones con un AcM murino anti-MASP-2 conjugado con hemocianina de lapa californiana (HLC) y la selección de la unión específica al AcM que puede competir con MASP-2 humana. Para purificación, se cargan 100 ml de sobrenadante de cultivos giratorios de células CHO que producen cFab o cFab/9aa en la columna de afinidad acoplada con un AcM MASP-2 antidiotípico. Después, la columna se lava a fondo con PBS antes de que el Fab unido se eluya con dietilamina 50 mM, pH 11,5. Las sales residuales se eliminan mediante intercambio de tampón como se describe anteriormente. La concentración de proteína del Fab purificado se determina mediante el procedimiento BCA (Pierce).
La capacidad de la IgG MASP-2 quimérica, cFab y cFAb/9aa para inhibir las rutas del complemento dependientes de MASP-2 se pueden determinar mediante el uso de los ensayos inhibidores descritos en el Ejemplo 2 o Ejemplo 7.
EJEMPLO 7
Este ejemplo describe un ensayo in vitro de escisión de C4 utilizado como cribado funcional para identificar agentes inhibidores de MASP-2 capaces de bloquear la activación del complemento dependiente de MASP-2 a través de L-ficolina/P35, H-ficolina, M-ficolina o manano.
Ensayo de escisión de C4: Se ha descrito un ensayo de escisión de C4 por Petersen, S.V., y col., J. Immunol. Methods 257:107, 2001, que mide la activación de la ruta de la lectina resultante a partir de ácido lipoteicoico (ALT) de S. aureus que se une a L-ficolina.
Reactivos: Se prepara S. aureous fijado con formalina (DSM20233) de la siguiente manera: se cultivan las bacterias durante la noche a 37 °C en medio de soja tripsínica con sangre, se lavan tres veces con PBS, luego se fijan durante 1 hora a temperatura ambiente en PBS/formalina al 0,5 %, y se lavan tres veces más con PBS, antes de ser resuspendidas en tampón de recubrimiento (Na2CO315 mM, NaHCO335 mM, pH 9,6).
Ensayo: Los pocillos de una placa de microtitulación Nunc MaxiSorb (Nalgene Nunc International, Rochester, NY) están recubiertos con: 100 pl de S. aureus fijada con formalina DSM20233 (DO550 = 0,5) en tampón de recubrimiento con 1 pg de L-ficolina en tampón de recubrimiento. Después de la incubación durante la noche, los pocillos se bloquean con albúmina de suero humano (HSA, por sus siglas en inglés) al 0,1 % en TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4), luego se lavan con TBS que contiene Tween 20 al 0,05 % y CaCh 5 mM (tampón de lavado). Las muestras de suero humano se diluyen en Tris-HCl 20 mM, NaCl 1 M, CaCh 10 mM, Triton X-100 al 0,05 %, HSA al 0,1 %, pH 7,4, que previene la activación del C4 endógeno y disocia el complejo C1 (compuesto por C1q, C1r y C1s). Los agentes inhibidores de MASP-2, incluyendo AcM anti-MASP-2 y péptidos inhibidores se añaden a las muestras de suero en concentraciones variables. Las muestras diluidas se añaden a la placa y se incuban durante la noche a 4 °C. Después de 24 horas, las placas se lavan a fondo con tampón de lavado, luego se añade a cada pocillo 0,1 pg de C4 humano purificado (obtenido como se describe en Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223:46, 1993) en 100 pl de barbital 4 mM, NaCl 145 mM, CaCh 2 mM, MgCh 1 mM, pH 7,4. Después de 1,5 horas a 37 °C, las placas se lavan de nuevo y el depósito de C4b se detecta utilizando anti-C4c humano de pollo conjugado con fosfatasa alcalina (obtenido de Immunsystem, Uppsala, Suecia) y se mide utilizando el sustrato colorimétrico p-nitrofenil fosfato.
Ensayo de C4 en manano: El ensayo descrito anteriormente está adaptado para medir la activación de la ruta de la lectina a través de MBL mediante el recubrimiento de la placa con LSP y manano antes de añadir suero mezclado con varios agentes inhibidores de MASP-2.
Ensayo de C4 en H-ficolina (Ag Hakata): El ensayo descrito anteriormente está adaptado para medir la activación de la ruta de la lectina a través de H-ficolina mediante el recubrimiento de la placa con LPS y H-ficolina antes de añadir suero mezclado con varios agentes inhibidores de MASP-2.
EJEMPLO 8
El siguiente ensayo demuestra la presencia de activación de la ruta clásica en ratones de tipo silvestre y MASP-2-/-.
Procedimientos: Se generaron complejos inmunitarios in situ mediante le recubrimiento de placas de microtitulación (Maxisorb, Nunc, n.° de cat. 442404, Fisher Scientific) con albúmina de suero humano al 0,1 % en Tris 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 durante 1 hora a temperatura ambiente seguido de incubación durante la noche a 4 °C con antisuero de oveja antisuero completo (Scottish Antibody Production Unit, Carluke, Escocia) diluido 1:1000 en TBS/tween/Ca2+. Se obtuvieron muestras de suero de ratones de tipo silvestre y MASP-2-/- y se añadieron a las placas recubiertas. Se prepararon muestras de control en las que se agotó C1q de las muestras de suero de tipo silvestre y MASP-2-/-. Se preparó suero de ratón empobrecido en C1q usando Dynabeads acopladas a proteína A (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) recubiertas con IgG de conejo anti-C1q humano (Dako, Glostrup, Dinamarca), de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las placas se incubaron durante 90 minutos a 37 °C. El C3b unido se detectó con un anticuerpo policlonal anti-C3c humano (Dako A 062) diluido en TBS/tw/Ca++ a 1:1000. El anticuerpo secundario es anti-IgG de conejo de cabra.
Resultados: La FIGURA 7 muestra los niveles relativos de depósito de C3b en placas recubiertas con IgG en suero de tipo silvestre, suero MASP-2-/-, suero MASP-2-/- empobrecido en C1q y de tipo silvestre empobrecido en C1q. Estos resultados demuestran que la ruta clásica está inalterada en la cepa de ratón MASP-2-/-.
EJEMPLO 9
El siguiente ensayo se usa para probar si un agente inhibidor de MASP-2 bloquea la ruta clásica mediante el análisis del efecto de un agente inhibidor de MASP-2 en condiciones en las que la ruta clásica se inicia mediante inmunocomplejos.
Procedimientos: Para probar el efecto de un agente inhibidor de MASP-2 en condiciones de activación del complemento en el que la ruta clásica se inicia mediante inmunocomplejos, se incuban muestras triplicadas de 50 pl que contienen SHN al 90 % a 37 °C en presencia de 10 pg/ml de inmunocomplejo (IC) o PBS, y también se incluyen muestras triplicadas paralelas (+/- IC) que contienen anticuerpo monoclonal antiproperdina 200 nM durante la incubación a 37 °C. Después de dos horas de incubación a 37 °C, se añade EDTA l3 mM a todas las muestras para detener la activación adicional del complemento y las muestras se enfrían inmediatamente a 5 °C. A continuación, las muestras se almacenan a -70 °C antes de analizarlas para los productos de activación del complemento (C3a y sC5b-9) utilizando kits ELISA (Quidel, números de catálogo A015 y A009) siguiendo las instrucciones del fabricante.
EJEMPLO 10
Este ejemplo describe la identificación de fragmentos de anticuerpo Fab2 anti-MASP-2 de alta afinidad que bloquean la actividad de MASP-2.
Antecedentes y justificación: MASP-2 es una proteína compleja con muchos dominios funcionales separados, incluyendo: sitio(s) de unión para MBL y ficolinas, un sitio catalítico de serina proteasa, un sitio de unión para el sustrato proteolítico C2, un sitio de unión para el sustrato proteolítico C4, un sitio de escisión de MASP-2 para la autoactivación del zimógeno MASP-2, y dos sitios de unión a Ca++. Se identificaron fragmentos de anticuerpo Fab2 que se unen con alta afinidad a MASP-2, y los fragmentos Fab2 identificados se probaron en un ensayo funcional para determinar si eran capaces de bloquear la actividad funcional de MASP-2.
Para bloquear la actividad funcional de MASP-2, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo Fab2 debe unirse e interferir con un epítopo estructural en MASP-2 que se requiere para la actividad funcional de MASP-2. Por tanto, muchos o todos los Fab2 anti-MASP-2 de unión de alta afinidad pueden no inhibir la actividad funcional de MASP-2 a menos que se unan a epítopos estructurales en MASP-2 que están directamente implicados en la actividad funcional de MASP-2.
Se usó un ensayo funcional que mide la inhibición de la formación de C3 convertasa de la ruta de la lectina para evaluar la "actividad de bloqueo" de Fab2 anti-MASP-2. Se sabe que el papel fisiológico principal de MASP-2 en la ruta de la lectina es generar el siguiente componente funcional de la ruta del complemento mediada por lectina, a saber, la C3 convertasa de la ruta de la lectina. La C3 convertasa de la ruta de la lectina es un complejo enzimático crítico (C4bC2a) que escinde proteolíticamente C3 en C3a y C3b. MASP-2 no es un componente estructural de la C3 convertasa (C4bC2a) de la ruta de la lectina; sin embargo, la actividad funcional de MASP-2 es necesaria para generar los dos componentes proteicos (C4b, C2a) que comprenden la C3 convertasa de la ruta de la lectina. Además, todas las actividades funcionales separadas de MASP-2 enumeradas anteriormente parecen ser necesarias para que MASP-2 genere la C3 convertasa de la ruta de lectina. Por estas razones, se cree que un ensayo preferido para usar en la evaluación de la "actividad de bloqueo" de Fab2 anti-MASP-2 es un ensayo funcional que mide la inhibición de la formación de C3 convertasa de la ruta de la lectina.
Generación de Fab2 de alta afinidad: Se utilizó una biblioteca de presentación de fagos de secuencias de anticuerpos de cadena pesada y ligera variables humanas y tecnología de selección de anticuerpos automatizada para identificar Fab2 que reaccionan con ligandos seleccionados de interés para crear Fab2 de alta afinidad por la proteína MASP-2 de rata (SEQ ID NO: 55). Se utilizó una cantidad conocida de proteína MASP-2 de rata (~ 1 mg, > 85 % de pureza) para la selección de anticuerpos. Se utilizaron tres rondas de amplificación para la selección de los anticuerpos con la mejor afinidad. Aproximadamente 250 resultados positivos diferentes que expresan fragmentos de anticuerpos se escogieron para el cribado ELISA. Posteriormente, se secuenciaron resultados positivos de alta afinidad para determinar la singularidad de los diferentes anticuerpos.
Se purificaron cincuenta anticuerpos anti-MASP-2 únicos y se usaron 250 pg de cada anticuerpo Fab2 purificado para la caracterización de la afinidad de unión a MASP-2 y las pruebas funcionales de la ruta del complemento, tal como se describe con más detalle más adelante.
Ensayos utilizados para evaluar la actividad inhibidora (de bloqueo) de Fab2 anti-MASP-2
1. Ensayo para medir la inhibición de la formación de C3 convertasa de la ruta de la lectina:
Antecedentes: La C3 convertasa de la ruta de la lectina es el complejo enzimático (C4bC2a) que escinde proteolíticamente C3 en dos potentes fragmentos proinflamatorios, anafilotoxina C3a y C3b opsónica. La formación de C3 convertasa parece ser una etapa clave en la ruta de la lectina en términos de mediar la inflamación. MASP-2 no es un componente estructural de la C3 convertasa (C4bC2a) de la ruta de la lectina; por lo tanto, los anticuerpos (o Fab2) anti-MASP-2 no inhibirán directamente la actividad de la C3 convertasa preexistente. Sin embargo, la actividad de la MASP-2 serina proteasa es necesaria para generar los dos componentes proteicos (C4b, C2a) que comprenden la C3 convertasa de la ruta de la lectina. Por tanto, el Fab2 anti-MASP-2 que inhibe la actividad funcional de MASP-2 (es decir, Fab2 anti-MASP-2 de bloqueo) inhibirá de novo la formación de C3 convertasa de la ruta de la lectina. C3 contiene un grupo tioéster inusual y altamente reactivo como parte de su estructura. Tras la escisión de C3 por C3 convertasa en este ensayo, el grupo tioéster en C3b puede formar un enlace covalente con grupos hidroxilo o amino en macromoléculas inmovilizadas en el fondo de los pocillos de plástico a través de enlaces éster o amida, facilitando así la detección de C3b en el ensayo ELISA.
El manano de levadura es un conocido activador de la ruta de la lectina. En el siguiente procedimiento para medir la formación de C3 convertasa, los pocillos de plástico recubiertos con manano se incubaron durante 30 minutos a 37 °C con suero de rata diluido para activar la ruta de la lectina. A continuación, los pocillos se lavaron y se ensayó para determinar el C3b inmovilizado en los pocillos utilizando procedimientos ELISA estándar. La cantidad de C3b generado en este ensayo es un reflejo directo de la formación de novo de C3 convertasa de la ruta de la lectina. En este ensayo se probaron Fab2 anti-MASP-2 a concentraciones seleccionadas para determinar su capacidad para inhibir la formación de C3 convertasa y, por consiguiente, la generación de C3b.
Procedimientos:
Se incubaron placas de unión media Costar de 96 pocillos durante la noche a 5 °C con manano diluido en tampón de carbonato 50 mM, pH 9,5 a 1 |jg/50 Tl/pocillo. Después de la incubación durante la noche, cada pocillo se lavó tres veces con 200 TI PBS. A continuación, los pocillos se bloquearon con 100 Tl/pocillo de albúmina de suero bovino al 1 % en PBS y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con mezcla suave. Después, cada pocillo se lavó tres veces con 200 T1 de PBS. Las muestras de Fab2 anti-MASP-2 se diluyeron a concentraciones seleccionadas en tampón GVB que contiene Ca++ y Mg++ (barbital 4,0 mM, NaCl 141 mM, MgCh 1,0 mM, CaCh 2,0 mM, gelatina al 0,1 %, pH 7,4) a 5 °C. Se añadió suero de rata al 0,5 % a las muestras anteriores a 5 °C y se transfirieron 100 T1 a cada pocillo. Las placas se cubrieron y se incubaron durante 30 minutos en un baño de agua a 37 °C para permitir la activación del complemento. La reacción se detuvo transfiriendo las placas del baño de agua a 37 °C a un recipiente que contenía una mezcla de hielo y agua. Cada pocillo se lavó cinco veces con 200 T1 con PBS-Tween 20 ( Tween 20 al 0,05 % en PBS), luego se lavó dos veces con 200 Tl de PBS. Se añadió 100 Tl/pocillo de una dilución 1:10.000 del anticuerpo primario (de conejo anti-C3c humano, DAKO A0062) en PBS que contenía 2,0 mg/ml de albúmina de suero bovino y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con mezcla suave. Cada pocillo se lavó 5 x 200 T1 con PBS. Se añadió 100 Tl/pocillo de dilución 1:10.000 del anticuerpo secundario (anti-IgG de conejo de cabra conjugado con peroxidasa, American Qualex A102PU) en PBS que contenía 2,0 mg/ml de albúmina de suero bovino y se incubó durante una hora a temperatura ambiente en un agitador con mezcla suave. Cada pocillo se lavó cinco veces con 200 T1 con PBS. Se añadieron 100 Tl/pocillo del sustrato de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. La reacción de peroxidasa se detuvo mediante la adición de 100 Tl/pocillo de H3PO41,0 M y se midió la DO450.
2. Ensayo para medir la inhibición de la escisión de C4 dependiente de MASP-2
Antecedentes: La actividad de la serina proteasa de MASP-2 es altamente específica y solo se han identificado dos sustratos proteicos para MASP-2; C2 y C4. La escisión de C4 genera C4a y C4b. Un Fab2 anti-MASP-2 puede unirse a epítopos estructurales en MASP-2 que están directamente implicados en la escisión de C4 (por ejemplo, sitio de unión a MASP-2 para C4; sitio catalítico de serina proteasa de MASP-2) y, por lo tanto, inhibir la actividad funcional de escisión de C4 de MASP-2.
El manano de levadura es un conocido activador de la ruta de la lectina. En el siguiente procedimiento para medir la actividad de escisión de C4 de MASP-2, se incubaron pocillos de plástico recubiertos con manano durante 30 minutos a 37 °C con suero de rata diluido para activar la ruta de la lectina. Dado que el anticuerpo primario utilizado en este ensayo ELISA solo reconoce C4 humano, el suero de rata diluido también se complementó con C4 humano (1,0 Tg/ml). A continuación, se lavaron los pocillos y se ensayó la C4b humana inmovilizada en los pocillos usando procedimientos ELISA estándar. La cantidad de C4b generada en este ensayo es una medida de la actividad de escisión de C4 dependiente de MASP-2. En este ensayo se probó la capacidad de Fab2 anti-MASP-2 a concentraciones seleccionadas para determinar su capacidad de inhibir la escisión de C4.
Procedimientos: Se incubaron placas de unión media Costar de 96 pocillos durante la noche a 5 °C con manano diluido en tampón de carbonato 50 mM, pH 9,5 a 1,0 Tg/50 Tl/pocillo. Cada pocillo se lavó 3X con 200 T1 de PBS. A continuación, los pocillos se bloquearon con 100 TI/pocillo de albúmina de suero bovino al 1 % en PBS y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con mezcla suave. Cada pocillo se lavó 3X con 200 T1 de PBS. Las muestras de Fab2 anti-MASP-2 se diluyeron a concentraciones seleccionadas en tampón GVB que contenía Ca++ y Mg++ (barbital 4,0 mM, NaCl 141 mM, MgCh 1,0 mM, CaCh 2,0 mM, gelatina al 0,1 %, pH 7,4) a 5 °C. También se incluyó en estas muestras 1,0 Tg/ml de C4 humano (Quidel). Se añadió suero de rata al 0,5 % a las muestras anteriores a 5 °C y se transfirieron 100 T1 a cada pocillo. Las placas se cubrieron y se incubaron durante 30 minutos en un baño de agua a 37 °C para permitir la activación del complemento. La reacción se detuvo transfiriendo las placas del baño de agua a 37 °C a un recipiente que contenía una mezcla de hielo y agua. Cada pocillo se lavó 5 x 200 T1 con PBS-Tween 20 (Tween 20 al 0,05 % en PBS), luego, cada pocillo se lavó con 2X con 200 T1 de PBS. Se añadieron 100 Tl/pocillo de dilución 1:700 de anti-C4c humano de pollo conjugado con biotina (Immunsystem AB, Uppsala, Suecia) en PBS que contenía 2,0 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) y se incubó durante una hora a temperatura ambiente con mezcla suave. Cada pocillo se lavó 5 x 200 Tl de PBS. Se añadieron 100 Tl/pocillo de 0,1 Tg/ml de estreptavidina conjugada con peroxidasa (Pierce Chemical n.° 21126) en PBS que contenía 2,0 mg/ml de BSA y se incubó durante una hora a temperatura ambiente en un agitador con mezcla suave. Cada pocillo se lavó 5 x 200 Tl con PBS. Se añadieron 100 Tl/pocillo del sustrato de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) y se incubaron a temperatura ambiente durante 16 minutos. La reacción de peroxidasa se detuvo mediante la adición de 100 Tl/pocillo de H3PO41,0 M y se midió la DO450.
3. Ensayo de unión de Fab2 anti-MASP-2 de rata a MASP-2 de rata 'natural'
Antecedentes: MASP-2 suele estar presente en el plasma como un complejo dímero MASP-2 que también incluye moléculas de lectina específicas (proteína de unión a manosa (MBL) y ficolinas). Por tanto, si se está interesado en estudiar la unión de Fab2 anti-MASP-2 a la forma fisiológicamente relevante de MASP-2, es importante desarrollar un ensayo de unión en el que se utilice la interacción entre el Fab2 y la MASP-2 'natural' en plasma, en lugar de MASP-2 recombinante purificada. En este ensayo de unión, el complejo MASP-2-MBL 'natural' de suero de rata al 10 % se inmovilizó primero en pocillos recubiertos con manano. A continuación, se estudió la afinidad de unión de varios Fab2 anti-MASP-2 a la MASP-2 "natural" inmovilizada usando una metodología ELISA estándar.
Procedimientos: Se incubaron placas de unión alta Costar de 96 pocillos durante la noche a 5 °C con manano diluido en tampón de carbonato 50 mM, pH 9,5 a 1 Tg/50 Tl/pocillo. Cada pocillo se lavó 3X con 200 T1 de PBS. Los pocillos se bloquearon con 100 Tl/pocillo de leche en polvo descremada al 0,5 % en PBST (PBS con Tween 20 al 0,05 %) y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con mezcla suave. Cada pocillo se lavó 3X con 200 T1 de tampón de lavado TBS/Tween/Ca++ (solución salina tamponada con Tris, Tween 20 al 0,05 %, que contiene CaCh 5,0 mM, pH 7,4. Se preparó en hielo suero de rata al 10 % en tampón de unión con alto contenido de sal (Tris 20 mM, NaCl 1,0 M, CaCl210 mM, Triton-XIOO al 0,05 %, albúmina de suero bovino al 0,1 % (p/v), pH 7,4). Se añadieron 100 Tl/pocillo y se incubaron durante la noche a 5 °C. Los pocillos se lavaron 3X con 200 T1 de tampón de lavado TBS/Tween/Ca++. A continuación, los pocillos se lavaron 2X con 200 Tl de PBS. Se añadieron 100 Tl/pocillo de concentración seleccionada de Fab2 anti-MASP-2 diluido en tampón GVB que contiene Ca++ y Mg++ (barbital 4,0 mM, NaCl 141 mM, MgCh 1,0 mM, CaCh 2,0 mM, gelatina al 0,1 %, pH 7,4) y se incubó durante una hora a temperatura ambiente con mezcla suave. Cada pocillo se lavó 5 x 200 Tl de PBS. Se añadieron 100 Tl/pocillo de anti-Fab2 de cabra conjugado con HRP (n.° de cat. de Biogenesis 0500-0099) diluido 1:5000 en 2,0 mg/ml de albúmina de suero bovino en PBS y se incubó durante una hora a temperatura ambiente con mezcla suave. Cada pocillo se lavó 5 x 200 Tl de PBS. Se añadieron 100 Tl/pocillo del sustrato de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) y se incubó a temperatura ambiente durante 70 minutos. La reacción de peroxidasa se detuvo mediante la adición de 100 Tl/pocillo de H3PO41,0 M y se midió la DO450.
RESULTADOS:
Aproximadamente 250 Fab2 diferentes que reaccionaron con alta afinidad por la proteína MASP-2 de rata se escogieron para el cribado ELISA. Estos Fab2 de alta afinidad se secuenciaron para determinar la singularidad de los diferentes anticuerpos, y se purificaron 50 anticuerpos anti-MASP-2 únicos para su análisis adicional. Se utilizaron 250 |jg de cada anticuerpo Fab2 purificado para la caracterización de la afinidad de unión de MASP-2 y las pruebas funcionales de la ruta del complemento. Los resultados de este análisis se muestran a continuación en la TABLA 6.
TABLA 6: FAB2 ANTI-MASP-2 QUE BLOQUEA LA ACTIVACIÓN DEL COMPLEMENTO DE LA RUTA DE LA
LECTINA
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(continuación)
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Como se muestra arriba en la TABLA 6, de los 50 Fab2 anti-MASP-2 probados, se identificaron diecisiete Fab2 como Fab2 de bloqueo de MASP-2 que inhiben de forma potente la formación de C3 convertasa con CI50 igual o menor que 10 nM de Fab2 (una tasa de resultados positivos del 34 %). Ocho de los diecisiete Fab2 identificados tienen CI50 en el intervalo subnanomolar. Además, los diecisiete Fab2 de bloqueo de MASP-2 mostrados en la TABLA 6 dan una inhibición esencialmente completa de la formación de C3 convertasa en el ensayo de C3 convertasa de la ruta de la lectina. La FIGURA 8A ilustra gráficamente los resultados del ensayo de formación de C3 convertasa para el anticuerpo Fab2 n.° 11, que es representativo de los otros anticuerpos Fab2 probados, cuyos resultados se muestran en la TABLA 6. Esta es una consideración importante, ya que es teóricamente posible que un Fab2 "de bloqueo" solo pueda inhibir de forma fraccionada la función de MASP-2 incluso cuando cada molécula de MASP-2 esté unida por el Fab2.
Aunque el manano es un activador conocido de la ruta de la lectina, en teoría, es posible que la presencia de anticuerpos antimanano en el suero de rata también active la ruta clásica y genere C3b a través de la C3 convertasa de la ruta clásica. Sin embargo, cada uno de los diecisiete Fab2 anti-MASP-2 de bloqueo enumerados en este ejemplo inhibe de forma potente la generación de C3b (> 95 %), demostrando así la especificidad de este ensayo para la C3 convertasa de la ruta de la lectina.
También se realizaron ensayos de unión con los diecisiete de los Fab2 de bloqueo para calcular una Kd aparente para cada uno. Los resultados de los ensayos de unión de Fab2 anti-MASP-2 de rata a MASP-2 de rata natural para seis de los Fab2 de bloqueo también se muestran en la TABLA 6. La FIGURA 8B ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de unión con el anticuerpo Fab2 n.° 11. También se llevaron a cabo ensayos de unión similares para los otros Fab2, cuyos resultados se muestran en la TABLA 6. En general, las Kd aparentes obtenidas para la unión de cada uno de los seis Fab2 a MASP-2 'natural' se corresponde razonablemente bien con la CI50 para el Fab2 en el ensayo funcional de la C3 convertasa. Existe evidencia de que MASP-2 sufre un cambio conformacional de una forma 'inactiva' a una 'activa' tras la activación de su actividad proteasa (Feinberg y col., EMBO J 22:2348-59 (2003); Gal y col., J. Biol. Chem. 280:33435-44 (2005)). En el plasma de rata normal utilizado en el ensayo de formación de la C3 convertasa, MASP-2 está presente principalmente en la conformación de zimógeno "inactivo". Por el contrario, en el ensayo de unión, MASP-2 está presente como parte de un complejo con MBL unida al manano inmovilizado; por lo tanto, la MASP-2 estaría en la conformación 'activa' (Petersen y col., J. Immunol Methods 257:107-16, 2001). En consecuencia, uno no esperaría necesariamente una correspondencia exacta entre la CI50 y la Kd para cada uno de los diecisiete Fab2 de bloqueo analizados en estos dos ensayos funcionales, ya que en cada ensayo el Fab2 se uniría a una forma conformacional diferente de MASP-2. No obstante, con la excepción del Fab2 n.° 88, parece haber una correspondencia razonablemente estrecha entre la CI50 y la Kd aparente para cada uno de los otros dieciséis Fab2 probados en los dos ensayos (véase la TABLA 6).
Se evaluaron varios de los Fab2 de bloqueo para determinar la inhibición de la escisión de C4 mediada por MASP-2. La FIGURA 8C ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de escisión de C4, que muestra la inhibición con el Fab2 n.° 41, con una CI50= 0,81 nM (véase la TABLA 6). Tal como se muestra en la FIGURA 9, se encontró que todos los Fab2 probados inhiben la escisión de C4 con CI50 similares a los obtenidos en el ensayo de la C3 convertasa (véase la TABLA 6).
Aunque el manano es un activador conocido de la ruta de la lectina, teóricamente es posible que la presencia de anticuerpos antimanano en el suero de rata también pueda activar la ruta clásica y, de este modo, generar C4b mediante escisión de C4 mediada por C1s. Sin embargo, se han identificado varios Fab2 anti-MASP-2 que inhiben de forma potente la generación de C4b (> 95 %), demostrando así la especificidad de este ensayo para la escisión de C4 mediada por MASP-2. C4, como C3, contiene un grupo tioéster inusual y altamente reactivo como parte de su estructura. Tras la escisión de C4 mediante MASP-2 en este ensayo, el grupo tioéster en C4b puede formar un enlace covalente con grupos hidroxilo o amino en macromoléculas inmovilizadas en el fondo de los pocillos de plástico a través de enlaces éster o amida, facilitando así la detección de C4b en el ensayo ELISA.
Estos estudios demuestran claramente la creación de FAB2 de alta afinidad por la proteína MASP-2 de rata que bloquea funcionalmente la actividad convertasa de C4 y de C3, evitando así la activación de la ruta de la lectina.
EJEMPLO 11
Este ejemplo describe el mapeo de epítopos para varios de los anticuerpos de bloqueo Fab2 anti-MASP-2 de rata que se generaron como se describe en el Ejemplo 10.
Procedimientos:
Como se muestra en la FIGURA 10, las siguientes proteínas, todas con marcadores 6X His N-terminales, se expresaron en células CHO utilizando el vector pED4:
MASP-2A de rata, una proteína MASP-2 de longitud completa, inactivada mediante la alteración de la serina en el centro activo a alanina (S613A);
MASP-2K de rata, una proteína MASP-2 de longitud completa alterada para reducir la autoactivación (R424K); CUBI-II, un fragmento N-terminal de MASP-2 de rata que contiene solamente los dominios CUBI, tipo EGF y CUBII; y
tipo CUBI/EGF, un fragmento N-terminal de MASP-2 de rata que contiene solamente los dominios de tipo EGF y CUBI.
Estas proteínas se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo mediante cromatografía de afinidad de níquel, como se describió anteriormente (Chen y col., J. Biol. Chem. 276:25894-02 (2001)).
Un polipéptido C-terminal (CCPII-SP), que contiene CCPII y el dominio de serina proteasa de MASP-2 de rata, se expresó en E. coli como proteína de fusión de tiorredoxina usando pTrxFus (Invitrogen). La proteína se purificó a partir de lisados celulares usando resina de afinidad Thiobond. El compañero de fusión de tiorredoxina se expresó a partir de pTrxFus vacío como control negativo.
Todas las proteínas recombinantes se dializaron en tampón TBS y se determinaron sus concentraciones mediante la medición de la DO a 280 nm.
ANÁLISIS DE INMUNOTRANSFERENCIA POR PUNTOS:
Diluciones en serie de los cinco polipéptidos MASP-2 recombinantes descritos anteriormente y mostrados en la FIGURA 10 (y el polipéptido tiorredoxina como control negativo para el polipéptido CCPII-serina proteasa) se colocaron sobre una membrana de nitrocelulosa. La cantidad de proteína detectada varió entre 100 ng y 6,4 pg, en etapas de cinco veces. En experimentos posteriores, la cantidad de proteína detectada varió entre 50 ng a 16 pg, de nuevo en etapas de cinco veces. Las membranas se bloquearon con leche desnatada en polvo al 5 % en TBS (tampón de bloqueo) y luego se incubaron con 1,0 pg/ml de Fab2 anti-MASP-2 en tampón de bloqueo (que contenía Ca2+ 5,0 mM). Los Fab2 unidos se detectaron usando anti-Fab humano conjugado con HRP (AbD/Serotec; diluido 1/10.000) y un kit de detección ECL (Amersham). Una membrana se incubó con Ac policlonal de conejo anti-MASP-2 humana (descrito en Stover y col., J Immunol 163:6848-59 (1999)) como control positivo. En este caso, el Ac unido se detectó usando anti-IgG de conejo de cabra conjugado con HRP (Dako; diluido 1/2.000).
Ensayo de unión a MASP-2
Se recubrieron placas de ELISA con 1,0 pg/pocillo de polipéptido MASP-2A o CUBI-II recombinante en tampón carbonato (pH 9,0) durante la noche a 4 °C. Los pocillos se bloquearon con BSA al 1 % en TBS, luego se añadieron diluciones seriadas de los Fab2 anti-MASP-2 en TBS que contenía Ca2+ 5,0 mM. Las placas se incubaron durante una hora a TA. Después de lavar tres veces con TBS/tween/Ca2+, se añadió anti-Fab humano conjugado con HRP (AbD/Serotec) diluido 1/10.000 en TBS/Ca2+ y las placas se incubaron durante una hora más a TA. El anticuerpo unido se detectó usando un kit de sustrato de peroxidasa TMB (Biorad).
RESULTADOS:
Los resultados del análisis de inmunotransferencia por puntos que demuestran la reactividad de los Fab2 con varios polipéptidos MASP-2
se describen a continuación en la TABLA 7. Los valores numéricos descritos en la TABLA 7 indican la cantidad de proteína detectada necesaria para dar aproximadamente la mitad de la resistencia de la señal máxima. Tal como muestra, todos los polipéptidos (con la excepción del compañero de fusión de tiorredoxina solo) se reconocieron por el Ac de control positivo (sueros policlonales anti-MASP-2 humana, criados en conejos).
TABLA 7: REACTIVIDAD CON VARIOS POLIPÉPTIDOS MASP-2 DE RATA RECOMBINANTES EN
INMUNOTRANSFERENCIAS POR PUNTOS
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(continuación)
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Se observó actividad de la ruta durante la segunda y tercera semana, con restauración completa de la ruta de la lectina en los ratones 17 días después de la administración del AcM anti-MASP-2. SR = Sin reacción. El anticuerpo de control positivo son sueros policlonales anti-MASP-2 humana, criados en conejos.
Todos los Fab2 reaccionaron con MASP-2A así como con MASP-2K (datos no mostrados). La mayoría de los Fab2 reconocieron el polipéptido CCPII-SP pero no los fragmentos N-terminales. Las dos excepciones son el Fab2 n.° 60 y el Fab2 n.° 57. El Fab2 n.° 60 reconoce MASP-2A y el fragmento CUBI-II, pero no el polipéptido tipo EGF/CUBI o el polipéptido CCPII-SP, sugiriendo que se une a un epítopo en CUBII, o que abarca el dominio CUBII y de tipo EGF. El Fab2 n.° 57 reconoce MASP-2A pero no ninguno de los fragmentos m As P-2 probados, lo que indica que este Fab2 reconoce un epítopo en CCP1. El Fab2 n.° 40 y n.° 49 se unieron solo para completar MASP-2A. En el ensayo de unión ELISA mostrado en la FIGURA 11, el Fab2 n.° 60 también se une al polipéptido CUBI-II, aunque con una afinidad aparente ligeramente menor.
Estos hallazgos demuestran la identificación de Fab2 de bloqueo únicos en múltiples regiones de la proteína MASP-2
EJEMPLO 12
Este ejemplo describe el análisis de ratones MASP-2-/- en un modelo murino de isquemia/reperfusión renal.
Antecedentes/Justificación: La lesión por isquemia-reperfusión (I/R) en el riñón a temperatura corporal tiene relevancia en una serie de afecciones clínicas, incluyendo choque hipovolémico, procedimientos de oclusión de la arteria renal y pinzamiento cruzado.
La isquemia-reperfusión renal (I/R) es una causa importante de insuficiencia renal aguda, asociada con una tasa de mortalidad de hasta un 50 % (Levy y col., JAMA 275:1489-94, 1996; Thadhani y col., N. Engl. J. Med. 334:1448-60, 1996). La insuficiencia renal postrasplante es una complicación común y potencialmente mortal después de un trasplante renal (Nicholson y col., Kidney Int. 58:2585-91, 2000). Actualmente no se dispone de un tratamiento eficaz para la lesión renal por I/R y la hemodiálisis es el único tratamiento disponible. La fisiopatología de la lesión renal por I/R es complicada. Estudios recientes han demostrado que la ruta de la lectina de activación del complemento puede tener un papel importante en la patogenia de la lesión renal por I/R (deVries y col., Am. J. Path. 165:1677-88, 2004).
Procedimientos:
Se generó un ratón MASP-2(-/-) como se describe en el Ejemplo 1 y se retrocruzó durante al menos 10 generaciones con C57B1/6. Se administró a seis ratones MASP-2(-/-) machos y seis ratones de tipo silvestre (+/+) que pesaban entre 22-25 g una inyección intraperitoneal de Hypnovel (6,64 mg/kg; Roche products Ltd. Welwyn Garden City, Reino Unido), y posteriormente se anestesiaron mediante inhalación de isoflurano (Abbott Laboratories Ltd., Kent, Reino Unido). Se eligió el isoflurano porque es un anestésico por inhalación suave con una toxicidad hepática mínima; las concentraciones se producen con precisión y el animal se recupera rápidamente, incluso después de una anestesia prolongada. Se administró Hypnovel porque produce una afección de neuroleptanalgesia en el animal y significa que se necesita administrar menos isoflurano. Se colocó una almohadilla caliente debajo del animal para mantener una temperatura corporal constante. A continuación, se realizó una incisión abdominal en la línea media y la cavidad corporal se mantuvo abierta con un par de retractores. El tejido conectivo se limpió por encima y por debajo de la vena y la arteria renal de los riñones derecho e izquierdo, y el pedículo renal se pinzó mediante la aplicación de pinzas de microaneurisma durante un período de 55 minutos. Este período de isquemia se basó inicialmente en un estudio previo realizado en este laboratorio (Zhou y col., J. Clin. Invest. 105:1363-71 (2000)). Además, se eligió un tiempo isquémico estándar de 55 minutos después de la titulación isquémica y se encontró que 55 minutos produjeron una lesión constante que también fue reversible, con baja mortalidad, menos de un 5 %. Después de la oclusión, se colocaron 0,4 ml de solución salina tibia (37 °C) en la cavidad abdominal y luego se cerró el abdomen durante el período de isquemia. Después de retirar las pinzas de microaneurisma, se observaron los riñones hasta que cambiaron de color, una indicación de reflujo de sangre a los riñones. Se colocaron 0,4 ml más de solución salina tibia en la cavidad abdominal y se suturó la abertura, después de lo cual los animales fueron devueltos a sus jaulas. Se tomaron muestras de sangre de la cola 24 horas después de retirar las pinzas, y a las 48 horas se sacrificaron los ratones y se recogió una muestra de sangre adicional.
Evaluación de la lesión renal: La función renal se evaluó a las 24 y 48 horas después de la reperfusión en seis ratones machos MASP-2(-/-) y seis TS (+/+). La medición de la creatinina en sangre se determinó mediante espectrometría de masas, que proporciona un índice reproducible de función renal (sensibilidad < 1,0 pmol/l). La FIGURA 12 ilustra gráficamente el aclaramiento de nitrógeno ureico en sangre para los controles C57B1/6 de tipo silvestre y MASP-2 (-/-) a las 24 horas y 48 horas después de la reperfusión. Tal como se muestra en la FIGURA 12, los ratones MASP-2(-/-) mostraron una reducción significativa en la cantidad de urea en sangre a las 24 y 48 horas, en comparación con los ratones de control de tipo silvestre, lo que indica un efecto funcional protector del daño renal en el modelo de lesión por reperfusión por isquemia.
En general, se observó un aumento de urea en sangre tanto en los ratones TS (+/+) como en los MASP-2 (-/-) a las 24 y 48 horas después del procedimiento quirúrgico y la lesión isquémica. Se determinó por separado que los niveles de urea en sangre en un animal quirúrgico TS (+/+) no isquémico eran 5,8 mmol/l. Además de los datos presentados en la FIGURA 12, un animal MASP-2 (-/-) mostró una protección casi completa contra la lesión isquémica, con valores de 6,8 y 9,6 mmol/l a las 24 y 48 horas, respectivamente. Este animal fue excluido del análisis de grupo como un posible valor atípico, en el que no puede haber estado presente la lesión isquémica. Por tanto, el análisis final mostrado en la FIGURA 12 incluyó 5 ratones MASP-2(-/-) y 6 ratones TS (+/+) y se observó una reducción estadísticamente significativa en la urea en sangre a las 24 y 48 horas en los ratones MASP-2 (-/-) (prueba t de Student p < 0,05). Estos hallazgos indican que se esperaría que la inhibición de la actividad de MASP-2 tuviera un efecto protector o terapéutico del daño renal debido a la lesión isquémica.
EJEMPLO 13
Este ejemplo describe los resultados de MASP-2-/- en un modelo murino de degeneración macular.
Antecedentes/Justificación: La degeneración macular asociada con la edad (DMAE) es la principal causa de ceguera después de los 55 años en el mundo industrializado. La DMAE se presenta en dos formas principales: DMAE neovascular (húmeda) y DMAE atrófica (seca). La forma neovascular (húmeda) representa un 90 % de la pérdida visual grave asociada con la DMAE, aunque solo un 20 % de las personas con DMAe desarrollan la forma húmeda. Las características clínicas de la DMAE incluyen múltiples drusas, atrofia geográfica y neovascularización coroidea (NVC). En diciembre de 2004, la FDA aprobó Macugen (pegaptanib), una nueva clase de fármacos oftálmicos para atacar y bloquear específicamente los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés), para el tratamiento de la forma húmeda (neovascular) de DMAE (Ng y col., Nat Rev. Drug Discov 5:123-32 (2006)). Aunque Macugen representa una nueva opción terapéutica prometedora para un subgrupo de pacientes con DMAE, sigue existiendo una necesidad imperiosa de desarrollar tratamientos adicionales para esta compleja enfermedad. Múltiples líneas de investigación independientes implican un papel central para la activación del complemento en la patogenia de la DMAE. La patogenia de la neovascularización coroidea (NVC), la forma más grave de DMAE, puede implicar la activación de las rutas del complemento.
Hace más de veinticinco años, Ryan describió un modelo de lesión inducida por láser de NVC en animales (Ryan, S.J., Tr. Am. Opth. Soc. LXXVII:707-745, 1979). El modelo se desarrolló inicialmente utilizando macacos de la India, sin embargo, desde entonces, la misma tecnología se ha utilizado para desarrollar modelos similares de NVC en una variedad de animales de investigación, incluyendo el ratón (Tobe y col., Am. J. Pathol. 153:1641-46, 1998). En este modelo, la fotocoagulación con láser se utiliza para romper la membrana de Bruch, un acto que da como resultado la formación de membranas similares a NVC. El modelo inducido por láser captura muchas de las características importantes de la afección humana (para una revisión reciente, véase Ambati y col., Survey Ophthalmology 48:257-293, 2003). El modelo de ratón inducido por láser está ahora bien establecido y se utiliza como base experimental en un gran, y cada vez mayor, número de proyectos de investigación. En general, se acepta que el modelo inducido por láser comparte suficiente similitud biológica con la NVC en seres humanos, por lo que los estudios preclínicos de patogenia e inhibición de fármacos que utilizan este modelo son relevantes para la NVC en seres humanos.
Procedimientos:
Se generó un ratón MASP-2-/- como se describe en el Ejemplo 1 y se retrocruzó durante 10 generaciones con C57B1/6. El estudio actual comparó los resultados cuando se evaluaron ratones macho MASP-2 (-/-) y MASP-2 (+/+) en el curso de la NVC inducida por láser, un modelo acelerado de DMAE neovascular que se centra en el volumen de la NVC inducida por láser mediante microscopía confocal de barrido con láser como medida de lesión tisular y determinación de los niveles de VEGF, un potente factor angiogénico implicado en la NVC, en el epitelio pigmentario de la retina (EPR)/coroides mediante ELISA después de una lesión con láser.
Inducción de neovascularización coroidea (NVC): Se realizó fotocoagulación láser (532 nm, 200 mW, 100 ms, 75 |jm; Oculight GL, Iridex, Mountain View, CA) en ambos ojos de cada animal el día cero por un solo individuo enmascarado a la asignación del grupo de fármacos. Los impactos de láser se aplicaron de forma estandarizada alrededor del nervio óptico, utilizando un sistema de administración de lámpara de hendidura y un cubreobjetos como lente de contacto. El punto final morfológico de la lesión por láser fue la aparición de una burbuja de cavitación, un signo que se cree que se correlaciona con la alteración de la membrana de Bruch. Los procedimientos detallados y los criterios de valoración que se evaluaron son los siguientes.
Angiografía con fluoresceína: La angiografía con fluoresceína se realizó con una cámara y un sistema de imágenes (cámara TRC 50 1A; ImageNet 2.01 system; Topcon, Paramus, NJ) 1 semana después de la fotocoagulación con láser. Las fotografías se capturaron con una lente 20-D en contacto con la lente de la cámara del fondo de ojo después de una inyección intraperitoneal de 0,1 ml de fluoresceína sódica al 2,5 %. Un experto en retina que no participó en la fotocoagulación con láser ni en la angiografía evaluó los angiogramas con fluoresceína en una sola sesión y de manera enmascarada.
Volumen de neovascularización coroidea (NVC): Una semana después de la lesión por láser, los ojos se enuclearon y fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 30 minutos a 4 °C. Las copas de los ojos se obtuvieron retirando los segmentos anteriores y se lavaron tres veces en PBS, seguido de deshidratación y rehidratación mediante una serie de metanol. Después de bloquear dos veces con tampón (PBS que contiene seroalbúmina bovina al 1 % y Triton X-100 al 0,5 %) durante 30 minutos a temperatura ambiente, las copas oculares se incubaron durante la noche a 4 °C con FITC-isolectina B4 al 0,5 % (Laboratorios Vector, Burlingame, CA), diluido con PBS que contiene BSA al 0,2 % y Triton X-100 al 0,1%, que se une a restos terminales de p-D-galactosa en la superficie de células endoteliales y marca selectivamente la vasculatura murina. Después de dos lavados con PBS que contiene Triton X-100 al 0,1 %, la retina neurosensorial se desprendió suavemente y se seccionó del nervio óptico. Se realizaron cuatro incisiones radiales relajantes, y el resto del complejo EPR-coroides-esclerótica se montó en forma plana en medio antidecoloración (Immu-Mount Vectashield Mounting Medium; Vector Laboratories) y se cubrió con cubreobjetos.
Los montajes planos se examinaron con un microscopio confocal láser de barrido (TCS SP; Leica, Heidelberg, Alemania). Los vasos se visualizaron mediante excitación con una longitud de onda de argón azul (488 nm) y captura de la emisión entre 515 y 545 nm. Se utilizó un objetivo de inmersión en aceite de 40X para todos los estudios de imágenes. Se obtuvieron secciones ópticas horizontales (etapa de 1 jm ) de la superficie del complejo EPR-coroidesesclerótica. Se consideró que el plano focal más profundo en el que podía identificarse la red vascular coroidea circundante que conectaba con la lesión era el suelo de la lesión. Cualquier vaso en el área apuntada por láser y superficial a este plano de referencia se consideró como NVC. Las imágenes de cada sección se almacenaron digitalmente. El área de fluorescencia relacionada con la NVC se midió mediante análisis de imágenes computarizado con el programa informático de microscopio (TCS SP; Leica). La suma del área fluorescente total en cada sección horizontal se utilizó como índice para el volumen de NVC. Las imágenes se realizaron por un operador enmascarado a la asignación del grupo de tratamiento.
Debido a que la probabilidad de que cada lesión por láser desarrolle NVC está influenciada por el grupo al que pertenece (ratón, ojo e impacto de láser), los volúmenes medios de las lesiones se compararon mediante un modelo lineal mixto con un diseño de medidas repetidas de parcela dividida. Todo el factor de la parcela completa fue el grupo genético al que pertenece, mientras que el factor de parcela dividida fue el ojo. La significancia estadística se determinó al nivel de 0,05. Las comparaciones a posteriori de medias se construyeron con un ajuste de Bonferroni para comparaciones múltiples.
ELISA DEL VEGF. Tres días después de la lesión por 12 impactos de láser, el complejo EPR-coroides se sonicó en tampón de lisis (imidazol HCl 20 mM, KCl 10 mM, MgCh 1 mM, EGTA 10 mM, Tritón X-100 al 1 %, NaF 10 mM, molibdato de sodio 1 mM y EDTA 1 mM con inhibidor de proteasa) en hielo durante 15 minutos. Los niveles de proteína VEGF en el sobrenadante se determinaron mediante un kit ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) que reconoce todas las variantes de empalme, de 450 a 570 nm (Emax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y se normalizó a proteína total. Un operador que no participó ni en la fotocoagulación ni en la toma de imágenes ni en la angiografía realizó mediciones duplicadas de forma enmascarada. Los número del VEGF se representaron como la media /- EEM de al menos tres experimentos independientes y se compararon usando la prueba U de Mann-Whitney. La hipótesis de diferencia nula fue rechazada en P < 0,05.
RESULTADOS:
Evaluación de los niveles de VEGF:
La FIGURA 13A ilustra gráficamente los niveles de proteína VEGF en el complejo EPR-coroide aislado de ratones C57B16 de tipo silvestre y MASP-2(-/-) en el día cero. Como se muestra en la FIGURA 13A, la evaluación de los niveles de VEGF indica una disminución de los niveles de referencia para VEGF en los ratones MASP-2 (-/-) frente a los ratones de control de tipo silvestre C57bl. La FIGURA 13B ilustra gráficamente los niveles de proteína VEGF medidos el día tres después de la lesión inducida por láser. Como se muestra en la FIGURA 13B los niveles de VEGF aumentaron significativamente en los ratones de tipo silvestre (+/+) tres días después de la lesión inducida por láser, coherente con los estudios publicados (Nozaki y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:2328-33 (2006)). Sin embargo, sorprendentemente, se observaron niveles muy bajos de VEGF en los ratones MASP-2 (-/-).
Evaluación de la neovascularización coroidea (NVC):
Además de la reducción en los niveles de VEGF después de la degeneración macular inducida por láser, se determinó el área de la NVC antes y después de la lesión por láser. La FIGURA 14 ilustra gráficamente el volumen de CNV medido en ratones de tipo silvestre C57bl y ratones MASP-2(-/-) el día siete después de la lesión inducida por láser. Tal como se muestra en la FIGURA 14, los ratones MASP-2 (-/-) mostraron aproximadamente una reducción del 30 % en el área de la NVC después del daño inducido por láser en el día siete en comparación con los ratones de control de tipo silvestre.
Estos hallazgos indican una reducción en VEGF y NVC como se observa en los ratones MASP (-/-) frente a el control de tipo silvestre (+/+) y que el bloqueo de MASP-2 con un inhibidor tendría un efecto preventivo o terapéutico en el tratamiento de la degeneración macular.
EJEMPLO 14
Este Ejemplo demuestra que la activación de la trombina puede ocurrir después de la activación de la ruta de la lectina en condiciones fisiológicas y demuestra el grado de implicación de MASP-2. En suero de rata normal, la activación de la ruta de la lectina conduce a la activación de la trombina (evaluada como depósito de trombina) al mismo tiempo que la activación del complemento (evaluada como depósito de C4). Como puede verse en las FIGURAS 15A y 15B, la activación de la trombina en este sistema se inhibe por un anticuerpo de bloqueo MASP-2 (formato Fab2), que exhibe una curva de inhibición concentración-respuesta (FIGURA 15B) que es paralela a la de la activación del complemento (FIGURA 15A). Estos datos sugieren que la activación de la ruta de la lectina a medida que ocurre en el traumatismo conducirá a la activación de los sistemas de coagulación y del complemento en un procedimiento que depende completamente de MASP-2. Por inferencia, los anticuerpos de bloqueo MASP2 pueden resultar eficaces para mitigar los casos de coagulación sistémica excesiva, por ejemplo, coagulación intravascular diseminada, que es una de las señas de identidad que conducen a la mortalidad en los casos de traumatismos graves.
EJEMPLO 15
Este Ejemplo proporciona resultados generados usando un modelo de reacción de Schwartzman localizado de coagulación intravascular diseminada ("CID") en ratones deficientes en MASP-2 -/- y suficientes en MASP-2 /+ para evaluar el papel de la ruta de lectina en la CID.
Antecedentes/Justificación:
Como se describió más arriba, el bloqueo de MASP-2 inhibe la activación de la ruta de la lectina y reduce la generación de anafilotoxinas C3a y C5a. Se puede demostrar que las anafilotoxinas C3a son potentes agregadores plaquetarios in vitro, pero su implicación in vivo está menos bien definida y la liberación de sustancias plaquetarias y plasmina en la reparación de heridas puede implicar solo secundariamente al complemento C3. En este Ejemplo, se analizó el papel de la ruta de la lectina en ratones MASP-2 (-/) y TS (+/+) para abordar si es necesaria una elevación prolongada de la activación de C3 para generar coagulación intravascular diseminada.
Procedimientos:
Los ratones MASP-2 (-/-) utilizados en este estudio se generaron como se describe en el Ejemplo 1 y se retrocruzaron durante al menos 10 generaciones con C57B1/6.
En este experimento se utilizó el modelo de reacción de Schwartzman localizado. La reacción de Schwartzman localizada (RSL) es una respuesta inducida por lipopolisacáridos (LPS) con contribuciones bien caracterizadas de elementos celulares y humorales del sistema inmunitario innato. La dependencia de la RSL del complemento está bien establecida (Polak, L., y col., Nature 223:738-739 (1969); Fong J.S. y col., J Exp Med 134:642-655 (1971)). En el modelo de RSL, los ratones se cebaron durante 4 horas con TNF alfa (500 ng, intraescrotal), luego, los ratones se anestesiaron y prepararon para microscopía intravital del músculo cremáster. Se seleccionaron para observación redes de vénulas poscapilares (15-60 pm de diámetro) con buen flujo sanguíneo (1-4 mm/s). Los animales se trataron con anticuerpos fluorescentes para marcar selectivamente neutrófilos o plaquetas. Se escaneó secuencialmente la red de vasos y se registraron digitalmente imágenes de todos los vasos para su posterior análisis. Después de registrar el estado basal de la microcirculación, los ratones recibieron una única inyección intravenosa de LPS (100 pg), ya sea solo o con los agentes enumerados a continuación. Luego, se escaneó la misma red de vasos cada 10 minutos durante 1 hora. La acumulación específica de fluoróforos se identificó mediante la sustracción de la fluorescencia de fondo y se mejoró mediante la formación de umbral de la imagen. La magnitud de las reacciones se midió a partir de imágenes grabadas. La medida principal de las reacciones de Schwartzman fueron los datos agregados.
Los estudios compararon ratones MASP-2 /+ suficiente, o de tipo silvestre, expuestos a un agente de agotamiento de la ruta del complemento conocido, factor de veneno de cobra (FVC), o un inhibidor de la ruta terminal (antagonista de C5aR). Los resultados (FIGURA 16A) demuestran que el FVC, así como un antagonista de C5aR, previnieron la aparición de agregados en la vasculatura. Además, los ratones deficientes en MASP-2 -/- (FIGURA 16B) también demostró una inhibición completa de la reacción de Schwartzman localizada, lo que apoya la implicación de la ruta de la lectina. Estos resultados demuestran claramente el papel de MASP-2 en la generación de la CID y respaldan el uso de inhibidores de MASP-2 para el tratamiento y la prevención de la CID.
EJEMPLO 16
Este ejemplo describe el análisis de ratones MASP-2 (-/-) en un modelo murino de trasplante renal.
Antecedentes/Justificación:
El papel de MASP-2 en el resultado funcional del trasplante de riñón se evaluó utilizando un modelo de ratón.
Procedimientos:
El resultado funcional del trasplante de riñón se evaluó utilizando un único isoinjerto de riñón en ratones receptores no nefrectomizados, con seis receptores de trasplante TS (+/+) (B6) y seis receptores de trasplante MASP-2 (-/-). Para evaluar la función del riñón trasplantado, el riñón nativo restante se extrajo del receptor 5 días después del trasplante y la función renal se evaluó 24 horas después mediante la medición de los niveles de nitrógeno ureico en sangre (NUS).
Resultados:
La FIGURA 17 ilustra gráficamente los niveles de nitrógeno ureico en sangre (NUS) del riñón a los 6 días después del trasplante de riñón en los receptores TS (+/+) y los receptores MASP-2 (-/-). Como se muestra en la FIGURA 17, se observaron niveles muy elevados de NUS en los receptores de trasplante de TS (+/+) (B6) (los niveles normales de NUS en ratones son < 5 mM), lo que indica insuficiencia renal. Por el contrario, los ratones receptores de isoinjertos MASP-2 (-/-) mostraron niveles de NUS sustancialmente más bajos, sugiriendo una mejor función renal. Se observa que estos resultados se obtuvieron utilizando injertos de donantes de riñón TS (+/+), lo que sugiere que la ausencia de una ruta funcional de lectina en el receptor del trasplante por sí sola es suficiente para lograr un beneficio terapéutico.
Tomados en conjunto, estos resultados indican que la inhibición transitoria de la ruta de la lectina a través de la inhibición de MASP-2 proporciona un procedimiento para reducir la morbilidad y el retraso en la función del injerto en el trasplante renal, y que es probable que este enfoque sea útil en otros entornos de trasplante.
EJEMPLO 17
Este ejemplo demuestra que los ratones MASP-2 (-/-) son resistentes al choque séptico en un modelo murino de peritonitis séptica polimicrobiana.
Antecedentes/Justificación:
Para evaluar los posibles efectos de MASP-2 (-/-) en la infección, el modelo de ligadura y punción cecal (LPC), se evaluó un modelo de peritonitis séptica polimicrobiana. Se cree que este modelo imita con mayor precisión el curso de la peritonitis séptica humana. El modelo de ligadura y punción cecal (LPC) es un modelo en el que el ciego se liga y perfora con una aguja, conduciendo a una fuga continua de bacterias hacia la cavidad abdominal que llegan a la sangre a través del drenaje linfático y luego se distribuyen a todos los órganos abdominales, lo que conduce a insuficiencia multiorgánica y hoque séptico (Eskandari y col., J Immunol 148(9):2724-2730 (1992)). El modelo de LPC imita el curso de la sepsis observada en pacientes e induce una respuesta hiperinflamatoria temprana seguida de una fase hipoinflamatoria pronunciada. Durante esta fase, los animales son muy sensibles a las exposiciones bacterianas (Wichterman y col., J. Surg. Res. 29(2):189-201 (1980)).
Procedimientos:
La mortalidad de la infección polimicrobiana utilizando el modelo de punción y ligadura cecal (LPC) se midió en ratones TS (+/+) (n = 18) y MASP-2 (-/-) (n = 16). Descrito brevemente, se anestesiaron ratones deficientes en MASP-2 y sus compañeros de camada de tipo silvestre y se exteriorizó el ciego y se ligó un 30 % por encima del extremo distal. Después de esto, el ciego se perforó una vez con una aguja de 0,4 mm de diámetro. A continuación, se volvió a colocar el ciego en la cavidad abdominal y se cerró la piel con pinzas. La supervivencia de los ratones sometidos a LPC se controló durante un período de 14 días después de la LPC. Se recogió un lavado peritoneal en ratones 16 horas después de la LPC para medir la carga bacteriana. Se prepararon diluciones en serie del lavado peritoneal en PBS y se inocularon en placas Mueller Hinton con incubación posterior a 37 °C en condiciones anaerobias durante 24 horas, tras lo cual se determinó la carga bacteriana.
La respuesta de las citocinas TNF-alfa a la infección bacteriana también se midió en los ratones TS (+/+) y MASP-2 (-/-) 16 horas después de la LPC en pulmones y bazos a través de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR ). El nivel sérico de TNF-alfa 16 horas después de la LPC en los ratones TS (+/+) y MASP-2 (-/-) también se cuantificó mediante ELISA sándwich.
Resultados:
La FIGURA 18 ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de los animales tratados con LPC en función de los días posteriores al procedimiento de LPC. Tal como se muestra en la FIGURA 18, la deficiencia de la ruta de la lectina en los ratones MASP-2 (-/-) no aumenta la mortalidad de los ratones después de la infección polimicrobiana usando el modelo de ligadura y punción cecal en comparación con los ratones TS (+/+). Sin embargo, como se muestra en la FIGURA 19, los ratones MASP-2 (-/-) mostraron una carga bacteriana significativamente mayor (aproximadamente un aumento de 1000 veces en el número de bacterias) en el lavado peritoneal después de la LPC en comparación con sus compañeros de camada de TS (+/+). Estos resultados indican que los ratones deficientes en MASP-2 (-/-) son resistentes al choque séptico. El aclaramiento bacteriano reducido en ratones deficientes en MASP-2 en este modelo puede deberse a una fagocitosis mediada por C3b alterada, ya que se demostró que el depósito de C3 es dependiente de MASP-2.
Se determinó que la respuesta de las citocinas TNF-alfa a la infección bacteriana no estaba elevada en los ratones MASP-2 (-/-) en comparación con los controles TS (+/+) (datos no mostrados). También se determinó que había una concentración sérica significativamente mayor de TNF-alfa en ratones TS (+/+) 16 horas después de la LPC en contraste con ratones MASP-2 (-/-), en los que el nivel sérico de TNF-alfa permaneció casi inalterado. Estos resultados sugieren que la intensa respuesta inflamatoria a la condición séptica se atenuó en ratones MASP-2 (-/-) y permitió que los animales sobrevivieran en presencia de recuentos bacterianos más altos.
Tomados en conjunto, estos resultados demuestran los posibles efectos perjudiciales de la activación del complemento de la ruta de la lectina en el caso de septicemia y el aumento de la mortalidad en pacientes con sepsis fulminante. Estos resultados demuestran además que la deficiencia de MASP-2 modula la respuesta inmunitaria inflamatoria y reduce los niveles de expresión de mediadores inflamatorios durante la sepsis. Por tanto, se cree que la inhibición de MASP-2 (-/) mediante la administración de anticuerpos monoclonales inhibidores contra MASP-2 sería eficaz para reducir la respuesta inflamatoria en un sujeto que padece de choque séptico.
EJEMPLO 18
Este ejemplo describe el análisis de ratones MASP-2 (-/-) en un modelo murino de infectividad intranasal.
Antecedentes/Justificación:
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno bacteriano humano oportunista gramnegativo que causa una amplia gama de infecciones, particularmente en individuos inmunodeprimidos. Es una fuente importante de infecciones hospitalarias adquiridas, en particular neumonía adquirida en el hospital. También es responsable de una morbilidad y mortalidad significativas en pacientes con fibrosis quística (FQ). La infección pulmonar por P. aeruginosa se caracteriza por un fuerte reclutamiento de neutrófilos y una inflamación pulmonar significativa que da como resultado un daño tisular extenso (Palanki M.S. y col., J. Med. Chem 51:1546-1559 (2008)).
En este Ejemplo, se realizó un estudio para determinar si la eliminación de la ruta de la lectina en ratones MASP-2 (-/-) aumenta la susceptibilidad de los ratones a infecciones bacterianas.
Procedimientos:
Se expusieron veintidós ratones TS (+/+), veintidós ratones MASP-2 (-/-) y once ratones C3 (-/-) a la administración intranasal de una cepa bacteriana de P. aeruginosa. Los ratones se controlaron durante los seis días posteriores a la infección y se construyeron gráficos de Kaplan-Mayer que mostraban el porcentaje de supervivencia.
Resultados:
La FIGURA 20 es un gráfico de Kaplan-Mayer del porcentaje de supervivencia de ratones TS (+/+), MASP-2 (-/-) o C3 (-/-) seis días después de la infección. Como se muestra en la FIGURA 20, no se observaron diferencias en los ratones MASP-2 (-/-) frente a los ratones TS (+/+). Sin embargo, la eliminación de la ruta clásica (C1q) en los ratones C3 (-/-) dio como resultado una susceptibilidad intensa a la infección bacteriana. Estos resultados demuestran que la inhibición de MASP-2 no aumenta la susceptibilidad a la infección bacteriana, indicando que es posible reducir las complicaciones inflamatorias indeseables en pacientes con traumatismos mediante la inhibición de MASP-2 sin comprometer la capacidad del paciente para combatir infecciones utilizando la ruta clásica del complemento.
EJEMPLO 19
Este ejemplo describe el análisis farmacodinámico de anticuerpos Fab2 anti-MASP-2 de alta afinidad representativos que se identificaron como se describe en el Ejemplo 10.
Antecedentes/Justificación:
Tal como se describe en el Ejemplo 10, para identificar anticuerpos de alta afinidad que bloquean la ruta de la lectina de rata, se utilizó proteína MASP-2 de rata para seleccionar una biblioteca de presentación de fagos. Esta biblioteca se diseñó para proporcionar una alta diversidad inmunitaria y se construyó utilizando secuencias de genes de inmunoglobulina completamente humanas. Tal como se describe en el Ejemplo 10, se identificaron aproximadamente 250 clones de fagos individuales que se unían con alta afinidad a la proteína MASP-2 de rata mediante selección ELISA. La secuenciación de estos clones identificó 50 fagos codificantes de anticuerpos MASP-2 únicos. La proteína Fab2 se expresó a partir de estos clones, se purificó y analizó para determinar la afinidad de unión a MASP-2 y la inhibición funcional de la ruta de la lectina del complemento.
Como se muestra en la TABLA 6 del Ejemplo 10, se identificaron 17 Fab2 anti-MASP-2 con actividad de bloqueo funcional como resultado de este análisis (una tasa de resultados positivos del 34 % para los anticuerpos de bloqueo). La inhibición funcional de la ruta de la lectina del complemento mediante Fab2 fue evidente al nivel de depósito de C4, que es una medida directa de la escisión de C4 mediante MASP-2. De manera importante, la inhibición fue igualmente evidente cuando se evaluó la actividad de la C3 convertasa, demostrando el bloqueo funcional de la ruta de la lectina del complemento. Los 17 Fab2 de bloqueo MASP-2 identificados como se describe en el Ejemplo 10 inhiben de forma potente la formación de C3 convertasa con valores de CI50 iguales o inferiores a 10 nM. Ocho de los 17 Fab2 identificados tienen valores de CI50 en el intervalo subnanomolar. Además, los 17 Fab2 de bloqueo MASP-2 dieron una inhibición esencialmente completa de la formación de C3 convertasa en el ensayo de la C3 convertasa de la ruta de la lectina, como se muestra en las FIGURAS 8A-C, y se resume en la TABLA 6 del Ejemplo 10. Por otra parte, cada uno de los 17 Fab2 de bloqueo anti-MASP-2 que se muestran en la TABLA 6 inhiben de forma potente la generación de C3b (> 95 %), demostrando así la especificidad de este ensayo para la C3 convertasa de la ruta de la lectina.
Las variantes de isotipo de anticuerpo de longitud completa de IgG2c de rata e IgG2a de ratón procedieron del Fab2 n.° 11. Este ejemplo describe la caracterización in vivo de estos isotipos para parámetros farmacodinámicos.
Procedimientos:
Como se describe en el Ejemplo 10, se utilizó proteína MASP-2 de rata para seleccionar una biblioteca de presentación de fagos Fab, a partir de la cual se identificó Fab2 n.°11. Las variantes de isotipo de anticuerpo de longitud completa de IgG2c de rata e IgG2a de ratón procedieron del Fab2 n.° 11. Se caracterizaron isotipos de anticuerpos de longitud completa IgG2c de rata e IgG2a de ratón in vivo por parámetros farmacodinámicos de la siguiente manera.
Estudio in vivo en ratones:
Se llevó a cabo un estudio farmacodinámico en ratones para investigar el efecto de la dosificación de anticuerpos anti-MASP-2 sobre la actividad de la ruta de la lectina plasmática in vivo. En el presente estudio, se midió el depósito de C4 ex vivo en un ensayo de la ruta de la lectina en varios puntos de temporales después de la administración subcutánea (sc) e intraperitoneal (ip) de 0,3 mg/kg o 1,0 mg/kg de AcM anti-MASP-2 de ratón (isotipo de anticuerpo de longitud completa IgG2a de ratón procedente de Fab2 n.° 11).
La FIGURA 21 ilustra gráficamente el depósito de C4b específico de la ruta de la lectina, medido ex vivo en muestras de suero sin diluir tomadas de ratones (n = 3 ratones/grupo) en varios puntos temporales después de la dosificación subcutánea de 0,3 mg/kg o 1,0 mg/kg de AcM anti-MASP-2 de ratón. Las muestras de suero de ratones recolectadas antes de la dosificación de anticuerpos sirvieron como controles negativos (100 % de actividad), mientras que el suero complementado in vitro con 100 nM del mismo anticuerpo de bloqueo anti-MASP-2 se utilizó como control positivo (0 % de actividad).
Los resultados mostrados en la FIGURA 21 demuestran una inhibición rápida y completa del depósito de C4b tras la administración subcutánea de una dosis de 1,0 mg/kg de AcM anti-MASP-2 de ratón. Se observó una inhibición parcial del depósito de C4b después de la administración subcutánea de una dosis de 0,3 mg/kg de AcM anti-MASP-2 de ratón.
Se siguió el curso temporal de la recuperación de la ruta de la lectina durante tres semanas después de una única administración ip AcM anti-MASP-2 de ratón a 0,6 mg/kg en ratones. Tal como se muestra en la FIGURA 22, se produjo una caída abrupta de la actividad de la ruta de la lectina después de la dosificación del anticuerpo, seguida de una inhibición completa de la ruta de la lectina que duró aproximadamente 7 días después de la administración ip. Restauración lenta de lectina
Estos resultados demuestran que el AcM anti-MASP-2 de ratón procedente de Fab2 n.° 11 inhibe la ruta de la lectina de los ratones de una manera que responde a la dosis cuando se administra sistémicamente.
EJEMPLO 20
Este Ejemplo describe el análisis del AcM anti-MASP-2 de ratón procedente de Fab2 n.° 11 para determinar su eficacia en un modelo de ratón para la degeneración macular asociada con la edad.
Antecedentes/Justificación:
Tal como se describe en el Ejemplo 10, se utilizó proteína MASP-2 de rata para seleccionar una biblioteca de presentación de fagos Fab, a partir de la cual se identificó Fab2 n.° 11 como un anticuerpo funcionalmente activo. Se generaron anticuerpos de longitud completa de los isotipos IgG2c de rata e IgG2a de ratón a partir de Fab2 n.° 11. El anticuerpo anti-MAsP-2 de longitud completa del isotipo IgG2a de ratón se caracterizó por parámetros farmacodinámicos como se describe en Ejemplo 19. En este Ejemplo, el anticuerpo de longitud completa anti-MASP-2 de ratón procedente de Fab2 n.° 11 se analizó en el modelo de ratón de degeneración macular asociada con la edad (DMAE), descrito por Bora P.S. y col., J Immunol 174:491-497 (2005).
Procedimientos:
El isotipo de anticuerpo anti-MASP-2 de longitud completa IgG2a de ratón procedente de Fab2 n.° 11 como se describe en el Ejemplo 19, se probó en el modelo de ratón de degeneración macular asociada con la edad (DMAE) como se describe en el Ejemplo 13 con las siguientes modificaciones.
Administración de AcM anti-MASP-2 de ratón
Se inyectaron ip dos dosis diferentes (0,3 mg/kg y 1,0 mg/kg) de AcM anti-MASP-2 de ratón junto con un tratamiento con AcM de control de isotipo en ratones TS (+/+) (n = 8 ratones por grupo) 16 horas antes de la inducción de NVC
Inducción de neovascularización coroidea (NVC)
La inducción de la neovascularización coroidea (NVC) y la medición del volumen de NVC se llevaron a cabo usando fotocoagulación con láser como se describe en el Ejemplo 13.
Resultados:
La FIGURA 23 ilustra gráficamente el área de NVC medida 7 días después de la lesión con láser en ratones tratados con AcM de control de isotipo o AcM anti-MASP-2 de ratón (0,3 mg/kg y 1,0 mg/kg). Tal como se muestra en la FIGURA 23, en los ratones tratados previamente con 1,0 mg/kg de AcM anti-MASP-2, se observó una reducción estadísticamente significativa (p < 0,01) de aproximadamente un 50 % en la NVC siete días después del tratamiento con láser. Como se muestra además en la FIGURA 23, se observó que una dosis de 0,3 mg/kg de AcM anti-MASP-2 no fue eficaz para reducir la NVC. Cabe señalar que se demostró que la dosis de 0,3 mg/kg de AcM anti-MASP-2 tiene una inhibición parcial y transitoria del depósito de C4b tras la administración subcutánea, como se describe en el Ejemplo 19 y se muestra en la FIGURA 21.
Los resultados descritos en este Ejemplo demuestran que el bloqueo de MASP-2 con un inhibidor, tal como el AcM anti-MASP-2, tiene un efecto preventivo y/o terapéutico en el tratamiento de la degeneración macular. Se observa que estos resultados son coherentes con los resultados observados en el estudio realizado en los ratones MASP-2 (-/-), descritos en el Ejemplo 13, en el que se observó una reducción de un 30 % en la NVC 7 días después del tratamiento con láser en ratones MASP-2 (-/-) en comparación con los ratones de control de tipo silvestre. Por otra parte, los resultados de este Ejemplo demuestran además que el anticuerpo anti-MASP-2 administrado sistémicamente proporciona un beneficio terapéutico local en el ojo, destacando así el potencial de una ruta de administración sistémica para tratar a los pacientes con DMAE. En resumen, estos resultados proporcionan evidencia que apoya el uso de AcM MASP-2 en el tratamiento de DMAE.
EJEMPLO 21
Este Ejemplo demuestra que los ratones deficientes en MASP-2 están protegidos de la mortalidad inducida por Neisseria meningitidis después de una infección con N. meningitidis y tienen un aclaramiento mejorado de bacteriemia en comparación con los ratones de control de tipo silvestre.
Fundamento: Neisseria meningitidis es una bacteria diplocócica gramnegativa heterótrofa conocida por su papel en la meningitis y otras formas de enfermedad meningocócica como la meningococemia. N. meningitidis es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad durante la infancia. Las complicaciones graves incluyen septicemia, síndrome de Waterhouse-Friderichsen, insuficiencia suprarrenal y coagulación intravascular diseminada (CID). Véase, por ejemplo, Rintala E. y col., Critical Care Medicine 28(7):2373-2378 (2000). En este Ejemplo, el papel de la ruta de la lectina se analizó en ratones MASP-2 (-/-) y TS (+/+) para determinar si los ratones deficientes en MASP-2 serían susceptibles a la mortalidad inducida por N. meningitidis.
Procedimientos:
Se generaron ratones MASP-2 inactivados como se describe en el Ejemplo 1 y se retrocruzaron durante al menos 10 generaciones con C57B1/6. Se inocularon ratones MASP-2 inactivados de 10 semanas (n = 10) y ratones C57/B6 de tipo silvestre (n = 10) mediante inyección intravenosa con una dosis de 5x108 ufc/100 pl, 2x108 ufc/100 pl o 3x107 ufc/100 pl de Z2491 del serogrupo A de Neisseria meningitidis en 400 mg/kg de hierro dextrano. Se controló la supervivencia de los ratones después de la infección durante un período de tiempo de 72 horas. Se tomaron muestras de sangre de los ratones a intervalos de una hora después de la infección y se analizaron para determinar el nivel en suero (log ufc/ml) de N. meningitidis para verificar la infección y determinar la tasa de eliminación de las bacterias del suero.
Resultados:
La FIGURA 24A ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de los ratones MASP-2 inactivados y TS después de la administración de una dosis infecciosa de 5x108/1o0 pl de ufc de N. meningitidis. Como se muestra en la FIGURA 24A, después de la infección con la dosis más alta de 5x108/100 pl de ufc de N. meningitidis, el 100 % de los ratones MASP-2 inactivados sobrevivieron durante el período de 72 horas después de la infección. Por el contrario, solo un 20 % de los ratones TS seguían vivos 24 horas después de la infección. Estos resultados demuestran que los ratones deficientes en MASP-2 están protegidos de la mortalidad inducida por N. meningitidis.
La FIGURA 24B ilustra gráficamente el log ufc/ml de N. meningitidis recuperado en diferentes puntos temporales en muestras de sangre tomadas de los ratones MASP-2 inactivados y TS infectados con 5x108 ufc/100 pl de N. meningitidis. Como se muestra en la FIGURA 24B, en ratones TS el nivel de N. meningitidis en la sangre alcanzó un máximo de aproximadamente 6,5 log ufc/ml a las 24 horas después de la infección y cayó a cero a las 48 horas después de la infección. Por el contrario, en los ratones MASP-2 inactivados, el nivel de N. meningitidis alcanzó un máximo de aproximadamente 3,5 log ufc/ml a las 6 horas después de la infección y cayó a cero a las 36 horas después de la infección.
La FIGURA 25A ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de los ratones MASP-2 inactivados y TS después de la infección con 2x108 ufc/100 pl de N. meningitidis. Como se muestra en la FIGURA 25A, después de la infección con la dosis de 2x108 ufc/100 pl de N. meningitidis, el 100 % de los ratones MASP-2 inactivados sobrevivieron durante el período de 72 horas después de la infección. Por el contrario, solo un 80 % de los ratones TS seguían vivos 24 horas después de la infección. De acuerdo con los resultados mostrados en la FIGURA 24A, estos resultados demuestran además que los ratones deficientes en MASP-2 están protegidos de la mortalidad inducida por N. meningitidis.
La FIGURA 25B ilustra gráficamente el log ufc/ml de N. meningitidis recuperado en diferentes puntos temporales en muestras de sangre tomadas de los ratones TS infectados con 2x108 ufc/100 pl de N. meningitidis. Como se muestra en la FIGURA 25B, el nivel de N. meningitidis en la sangre de ratones TS infectados con 2x108 ufc alcanzó un máximo de aproximadamente 4 log ufc/ml a las 12 horas después de la infección y cayó a cero a las 24 horas después de la infección. La FIGURA 25C ilustra gráficamente el log ufc/ml de N. meningitidis recuperado en diferentes puntos temporales en muestras de sangre tomadas de los ratones MASP-2 inactivados infectados con 2x108 ufc/100 pl de N. meningitidis. Como se muestra en la FIGURA 25C, el nivel de N. meningitidis en la sangre de ratones MASP-2 inactivados infectados con 2x108 ufc alcanzó un nivel máximo de aproximadamente 3,5 log ufc/ml a las 2 horas después de la infección y cayó a cero a las 3 horas después de la infección. De acuerdo con los resultados mostrados en la FIGURA 24B, estos resultados demuestran que aunque los ratones MASP-2 inactivados se infectaron con la misma dosis de N. meningitidis que los ratones TS, los ratones MASP-2 KO tienen un aclaramiento mejorado de bacteriemia en comparación con Ts .
El porcentaje de supervivencia de ratones MASP-2 inactivados y TS después de la infección con la dosis más baja de 3x107 ufc/100 pl de N. meningitidis fue del 100 % en el período de 72 horas (datos no mostrados).
Análisis
Estos resultados muestran que los ratones deficientes en MASP-2 están protegidos de la mortalidad inducida por N. meningitidis y han mejorado el aclaramiento de bacteriemia en comparación con los ratones TS. Por tanto, en vista de estos resultados, se espera que la aplicación terapéutica de inhibidores de MASP-2, tal como el AcM MASP-2, se esperaría que fuera eficaz para tratar, prevenir o mitigar los efectos de la infección con bacterias N. meningitidis (es decir, sepsis y CID). Además, estos resultados indican que la aplicación terapéutica de inhibidores de MASP-2, tales como el AcM MASP-2 no predispondría a un sujeto a un mayor riesgo de contraer infecciones por N. meningitidis.
EJEMPLO 22
Este Ejemplo describe el descubrimiento de una nueva activación del complemento C3 mediada por la ruta de la lectina y dependiente de MASP-2 por derivación de C4.
Fundamento:
El principal beneficio terapéutico de utilizar inhibidores de la activación del complemento para limitar la lesión por isquemia/reperfusión miocárdica (LIRM) se demostró de manera convincente en un modelo experimental de infarto de miocardio en ratas hace dos décadas: Se administró por vía intravenosa sCR1 recombinante, un derivado soluble truncado del receptor del complemento tipo 1 (RC1) de la superficie celular y se evaluó su efecto en modelo de rata in vivo de LIRM. El tratamiento con sCR1 redujo el volumen del infarto en más de un 40 % (Weisman, H.F., y col., Science 249:146-151 (1990)). El potencial terapéutico de este inhibidor recombinante se demostró posteriormente en un ensayo clínico que demostró que la administración de sCR1 en pacientes con IM evitaba la insuficiencia contráctil en el corazón posisquémico (Shandelya, S., y col., Circulation 87:536-546 (1993)). El mecanismo principal que conduce a la activación del complemento en el tejido isquémico, sin embargo, no ha sido finalmente definido, principalmente debido a la falta de modelos experimentales adecuados, el conocimiento limitado de los procedimientos moleculares que conducen a la activación del complemento de las células privadas de oxígeno, y la interferencia y sinergias entre las diferentes rutas de activación del complemento.
Como componente fundamental de la respuesta inmunitaria, el sistema del complemento proporciona protección contra microorganismos invasores a través de mecanismos independientes y dependientes de anticuerpos. Esto orquesta muchas interacciones celulares y humorales dentro de la respuesta inmunitaria, incluyendo quimiotaxis, fagocitosis, adhesión celular y diferenciación de linfocitos B. Tres rutas diferentes inician la cascada del complemento: la ruta clásica, la ruta alternativa y la ruta de la lectina. El subcomponente C1q de reconocimiento de la ruta clásica se une a una variedad de dianas, principalmente a los complejos inmunitarios, para iniciar la activación escalonada de las serina proteasas asociadas, C1r y C1s, proporcionando un mecanismo principal para el aclaramiento de patógenos e inmunocomplejos tras la intervención del sistema inmunitario adaptativo. La unión de C1q a inmunocomplejos convierte el dímero de zimógeno C1r en su forma activa para escindir y, por lo tanto, activar C1s. C1s traduce la unión de C1q en activación del complemento en dos etapas de escisión: Primero convierte C4 en C4a y C4b y luego escinde el C2 unido a C4b para formar la C3 convertasa C4b2a. Este complejo convierte el abundante componente plasmático C3 en C3a y C3b. La acumulación de C3b en las proximidades del complejo C4b2a desplaza la especificidad del sustrato para C3 a C5 para formar la C5 convertasa C4b2a(C3b)n. Los complejos de C3 y C5 convertasa generados mediante la activación de la ruta clásica son idénticos a los generados mediante la ruta de activación de la ruta de la lectina. En la ruta alternativa, la hidrólisis espontánea de bajo nivel del componente C3 da como resultado el depósito de fragmentos de proteína en las superficies celulares, desencadenando la activación del complemento en células extrañas, mientras que las proteínas reguladoras asociadas a las células en los tejidos del hospedador evitan la activación, evitando así autolesiones. Como la ruta alternativa, la ruta de la lectina puede activarse en ausencia de complejos inmunitarios. La activación se inicia mediante la unión de un complejo de activación de la ruta de lectina multimolecular a Patrones Moleculares Asociados a Patógenos (PMAP), principalmente estructuras de hidratos de carbono presentes en patógenos bacterianos, fúngicos o víricos o patrones de glucosilación anómalos en células apoptóticas, necróticas, malignas o privadas de oxígeno (Collard, C.D., y col., Am. J. Pathol. 156:1549-1556 (2000); Walport, M.J., N. Engl. J. Med. 344:1058-1066 (2001); Schwaeble, W., y col., Immunobiology 205:455-466 (2002); y Fujita, T., Nat. Rev. Immunol. 2:346-353 (2002)).
La lectina de unión a manano (MBL) fue el primer subcomponente de reconocimiento de hidratos de carbono que demostró formar complejos con un grupo de nuevas serina proteasas, denominadas serina proteasas asociadas a MBL (MASP) y numeradas de acuerdo con la secuencia de su descubrimiento (es decir, MASP-1, MASP-2 y MASP-3). En seres humanos, los complejos de activación de la ruta de la lectina se pueden formar con cuatro subcomponentes alternativos de reconocimiento de hidratos de carbono con diferentes especificidades de unión a hidratos de carbono, es decir, MBL 2, y tres miembros diferentes de la familia de las ficolinas, a saber, L-Ficolina, H-ficolina y M-ficolina y MASP. Dos formas de MBL, MBL A y MBL C, y ficolina-A forman complejos de la ruta de activación de la lectina con MASP en plasma de ratón y rata. Previamente se ha clonado y caracterizado MASP-2 y un producto génico de MASP-2 truncado adicional de 19 kDa, denominado MAp19 o sMAP, en seres humanos, ratón y rata (Thiel, S., y col., Nature 386:506-510 (1997);. Stover, C.M., y col., J. Immunol. 162:3481-3490 (1999); Takahashi, M., y col., Int. Immunol. 11:859-863 (1999); y Stover, C.M., y col., J. Immunol. 163:6848-6859 (1999)). MAp19/sMAP carece de actividad proteasa, pero puede regular la activación de la ruta de la lectina compitiendo por la unión de MASP a complejos de reconocimiento de hidratos de carbono (Iwaki, D. y col., J. Immunol. 177:8626-8632 (2006)).
Existe evidencia que sugiere que de las tres MASP, solo se requiere MASP-2 para traducir la unión de los complejos de reconocimiento de la ruta de la lectina en activación del complemento (Thiel, S., y col. (1997); Vorup-Jensen, T., y col., J. Immunol. 165:2093-2100 (2000); Thiel, S., y col., J. Immunol. 165:878-887 (2000); Rossi, V., y col., J. Biol. Chem. 276:40880-40887 (2001)). Esta conclusión está subrayada por el fenotipo de una cepa de ratón deficiente en MASP-1 y MASP-3 descrita más recientemente. Aparte de un retraso en el inicio de la activación del complemento mediada por la ruta de la lectina in vitro, ratones deficientes en MASP-1/3 conservan la actividad funcional de la ruta de la lectina. La reconstitución de suero deficiente en MASP-1 y MASP-3 con MASP-1 recombinante supera este retraso en la activación de la ruta de la lectina, lo que implica que MASP-1 puede facilitar la activación de MASP-2 (Takahashi, M., y col., J. Immunol. 180:6132-6138 (2008)). Un estudio más reciente ha demostrado que se requiere MASP-1 (y probablemente también MASP-3) para convertir la enzima de activación de la ruta alternativa Factor D de su forma de zimógeno a su forma enzimáticamente activa (Takahashi, M., y col., J. Exp. Med. 207:29-37 (2010)). La importancia fisiológica de este procedimiento se subraya por la ausencia de actividad funcional de la ruta alternativa en el plasma de ratones deficientes en MASP-1/3.
Las cepas de ratón generadas recientemente con deficiencias dirigidas combinadas de los subcomponentes MBL A y MBL C de reconocimiento de hidratos de carbono de la ruta de la lectina aún pueden iniciar la activación de la ruta de la lectina a través del subcomponente de reconocimiento de la ruta de la lectina murina restante ficolina A (Takahashi, K., y col., Microbes Infect. 4:773-784 (2002)). La ausencia de cualquier actividad funcional residual de la ruta de la lectina en ratones deficientes en MASP-2 ofrece un modelo concluyente para estudiar el papel de este brazo efector de la inmunidad humoral innata en la salud y la enfermedad.
La disponibilidad de cepas de ratón deficientes en C4 y MASP-2 permitió definir una nueva ruta de la lectina específica, pero dependiente de MASP-2, ruta de activación por derivación de C4 del complemento C3. La contribución esencial de esta nueva ruta de activación por derivación de C4 mediada por la ruta de la lectina hacia la pérdida de tejido posisquémica está subrayada por el prominente fenotipo protector de la deficiencia de MASP-2 en LIRm , mientras que los ratones deficientes en C4 probados en el mismo modelo no muestran protección.
En este Ejemplo, se describe una nueva activación por derivación de C4 del complemento C3 mediada por la ruta de la lectina y dependiente de MASP-2. La relevancia fisiológica de esta nueva ruta de activación está establecida por el fenotipo protector de la deficiencia de MASP-2 en un modelo experimental de lesión por isquemia/reperfusión miocárdica (LIRM), en el que los animales deficientes en C4 no estaban protegidos.
Procedimientos:
Los ratones deficientes en MASP-2 no muestran anomalías graves. Se generaron ratones deficientes en MASP-2 como se describe en el Ejemplo 1. Ambos ratones deficientes en MASP-2 heterocigotos (+/_) y homocigotos ('/') son sanos y fértiles, y no muestran anomalías graves. Su esperanza de vida es similar a la de sus compañeros de camada TS (> 18 meses). Antes de estudiar el fenotipo de estos ratones en modelos experimentales de enfermedad, se retrocruzó la línea MASP-2^ durante once generaciones sobre un antecedente C57BL/6. La ausencia total de ARNm de MASP-2 se confirmó mediante transferencia Northern de preparaciones de ARN de hígado seleccionadas con poli A+, mientras que el ARNm de 1,2 kb que codifica MAp19 o sMAP (un producto de corte y empalme alternativo truncado del gen MASP2) se expresa abundantemente.
El análisis de qRT-PCR utilizando pares de cebadores específicos para la secuencia codificante del dominio de serina proteasa de MASP-2 (cadena B) o el resto de la secuencia codificante para la cadena A mostró que no es detectable el ARNm que codifica la cadena B en ratones MASP-2^, mientras que la abundancia de la transcripción de ARNm de la cadena A interrumpida aumentó significativamente. Asimismo, la abundancia de ARNm que codifica MAp19/sMAP aumenta en ratones MASP-2+/_ y MASP-2^'. Los niveles de plasma MASP-2, determinados por ELISA para 5 animales de cada genotipo, fueron 300 ng/ml para los controles TS (intervalo 260-330 ng/ml), 360 ng/ml para ratones heterocigotos (intervalo 330-395 ng/ml) e indetectables para ratones inMASP-2‘/‘. Usando qRT-PCR, se establecieron perfiles de expresión de ARNm demostrando que los ratones MASP-2^ expresan ARNm para MBL A, MBL C, ficolina A, MASP-1, MASP-3, C1q, C1rA, C1sA, Factor B, Factor D, C4 y C3 en una abundancia similar a la de sus compañeros de camada suficientes en MASP-2 (datos no mostrados).
Los niveles plasmáticos de C3 de compañeros de camada MASP-2^ (n = 8) y MASP-2+/+ (n = 7) se midieron usando un kit ELISA C3 de ratón disponible comercialmente (Kamiya, Biomedical, Seattle, WA). Los niveles de C3 de ratones deficientes en MASP-2 (promedio de 0,84 mg/ml, /- 0,34) fueron similares a los de los controles TS (promedio 0,92, /- 0,37).
Resultados:
MASP-2 es esencial para la actividad funcional de la ruta de la lectina.
Como se describe en el Ejemplo 2 y se muestra en la FIGURA 5, los análisis in vitro de plasma MASP-2^ mostraron una ausencia total de actividad funcional de la ruta de la lectina en la activación de superficies recubiertas de manano y cimosano para la activación de C4. Asimismo, ni la escisión de C4 ni C3 dependiente de la ruta de la lectina se detectó en plasma MASP-2^ en superficies recubiertas con N-acetilglucosamina, que se une y desencadena la activación a través de MBL A, MBL C y ficolina A (datos no mostrados).
Los análisis de sueros y plasma de ratones MASP-2 -/- demostraron claramente que MASP-2 es esencialmente necesario para activar el complemento a través de la ruta de la lectina. La deficiencia total de actividad funcional de la ruta de la lectina, sin embargo, deja inalteradas las otras rutas de activación del complemento: el plasma MASP-2 -/­ aún puede activar el complemento a través de la ruta clásica (FIGURA 26A) y la ruta alternativa (FIGURA 26B). En la FIg UrA 26A y 26B, el símbolo "*" indica suero de TS (MASP-2 (+/+)); el símbolo "•" indica suero de TS (C1q agotado); el símbolo "□" indica suero de MASP-2 (-/-); y el símbolo "A" indica suero de MASP-2 (-/-) (C1q agotado).
La FIGURA 26A ilustra gráficamente que los ratones MASP-2 -/- conservan una ruta clásica funcional: el depósito de C3b se ensayó en placas de microtitulación recubiertas con inmunocomplejos (generados in situ mediante recubrimiento con BSA y luego adición de IgG anti-BSA de cabra). La FIGURA 26B ilustra gráficamente que los ratones deficientes en MASP-2 conservan una ruta alternativa funcional: El depósito de C3b se ensayó en placas de microtitulación recubiertas con cimosano en condiciones que solo permiten la activación de la ruta alternativa (tampón que contiene Mg2+ y EGTA). Los resultados mostrados en la FIGURA 26A y la FIGURA 26B son medias de duplicados y son normales de tres experimentos independientes. Se utilizaron los mismos símbolos para las fuentes de plasma en todas partes. Estos resultados muestran que una ruta alternativa funcional está presente en ratones deficientes en MASP-2, como se evidencia en los resultados que se muestran en la FIGURA 26b en condiciones experimentales diseñadas para activar directamente la ruta alternativa, mientras inactiva tanto la ruta clásica como la ruta de la lectina.
La ruta de la lectina de la activación del complemento contribuye de manera crítica a la pérdida de tejido inflamatorio en lesión por isquemia/reperfusión miocárdica (LIRM).
Para estudiar la contribución de la actividad funcional de la ruta de la lectina a la LIRM, se comparan ratones MASP-2'1' y controles de compañeros de camada TS en un modelo de LIRM después de la ligadura y reperfusión transitorias de la rama descendente anterior izquierda (DAI) de la arteria coronaria. La presencia o ausencia de complemento C4 no influye en el grado de pérdida de tejido isquémico en LIRM. Se evaluó el impacto de la deficiencia de C4 en el tamaño del infarto después de la LIRM experimental. Como se muestra en la FIGURA 27A y la FIGURA 27B, se observaron tamaños de infarto idénticos tanto en ratones deficientes en C4 como en sus compañeros de camada TS. La FIGURA 27A ilustra gráficamente la pérdida de tejido inducida por LIRM después de la ligadura y reperfusión de DAI en ratones C4 -/-(n = 6) y controles de compañeros de camada TS coincidentes (n = 7). La FIGURA 27B ilustra gráficamente INF en función de ADR, demostrando claramente que los ratones C4 -/- son tan susceptibles a LIRM como sus controles TS (línea discontinua).
Estos resultados demuestran que los ratones deficientes en C4 no están protegidos de la LIRM. Este resultado fue inesperado, ya que está en conflicto con la opinión ampliamente aceptada de que el principal fragmento de activación C4, C4b, es un componente esencial de la C3 convertasa C4b2a de la ruta clásica y de la ruta de la lectina. Por lo tanto, se evaluó si se puede detectar una activación específica de la ruta de lectina residual del complemento C3 en plasma humano y de ratón deficiente en C4.
La ruta de la lectina puede activar el complemento C3 en ausencia de C4 a través de una nueva ruta de activación por derivación de C4 dependiente de MASP-2.
Alentado por informes históricos que indican la existencia de una ruta de activación por derivación de C4 en suero de cobaya deficiente en C4 (May, J.E., y M. Frank, J. Immunol. 111:1671-1677 (1973)), se analizó si los ratones deficientes en C4 pueden tener actividad funcional residual de la ruta clásica o de la lectina y se controló la activación de C3 en condiciones de ensayo específicas de la ruta que excluyen las contribuciones de la ruta alternativa.
El depósito de C3b se ensayó en placas de microtitulación recubiertas de manano utilizando plasma recalcificado a concentraciones plasmáticas prohibitivas para la activación de la ruta alternativa (1,25 % y menos). Si bien no se detectó escisión de C3 en plasma deficiente en C4 probado para la activación de la ruta clásica (datos no mostrados), se observó una fuerte actividad de escisión de C3 residual en plasma de ratón deficiente en C4 al iniciar la activación del complemento a través de la ruta de la lectina. La dependencia de la ruta de la lectina se demuestra mediante la inhibición competitiva de la escisión de C3 después de la incubación previa de diluciones de plasma deficientes en C4 con manano soluble (véase la FIGURA 28A). Como se muestra en las FIGURAS 28A-D, se observó activación de C3 dependiente de MASP-2 en ausencia de C4. La FIGURA 28A ilustra gráficamente el depósito de C3b por plasma de ratón C4+/+ (cruces) y C4-/-(círculos abiertos). La incubación previa del plasma C4-/- con exceso (1 pg/ml) de manano en fase líquida antes del ensayo inhibe completamente el depósito de C3 (círculos rellenos). Los resultados son normales de 3 experimentos independientes. La FIGURA 28B ilustra gráficamente los resultados de un experimento en el que se mezcló plasma de ratón C4 -/- de tipo silvestre deficiente en MASP-2 (cuadrados abiertos) (1 %) con diversas concentraciones de AcMM11 anti-MASP-2 de rata (abscisas) y se ensayó el depósito de C3b en placas recubiertas con manano. Los resultados son medias (± DE) de 4 ensayos (duplicados de 2 de cada tipo de plasma). La FIGURA 28C ilustra gráficamente los resultados de un experimento en el que el plasma humano: SHN agrupado (cruces), plasma C4 -/-(círculos abiertos) y plasma C4 -/- se incuban previamente con 1 pg/ml de manano (círculos llenos). Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. La FIGURA 28D ilustra gráficamente la inhibición del depósito de C3b en plasma humano suficiente en C4 y deficiente en C4 (1%) mediante AcM H3 anti-MASP-2 humana (Media ± DE de triplicados). Como se muestra en la FIGURA 28B, no se detectó activación de C3 dependiente de la ruta de la lectina en plasma MASP-2 -/- analizado en paralelo, lo que implica que esta ruta de activación por derivación de C4 de C3 es dependiente de MASP-2.
Para corroborar adicionalmente estos hallazgos, se estableció una serie de AcM inhibidores recombinantes aislados de bibliotecas de anticuerpos de presentación de fagos mediante selección por afinidad contra MASP-2A recombinante humana y de rata (en la que el resto de serina del dominio de proteasa activo se reemplazó por un resto de alanina mediante mutagénesis dirigida al sitio para evitar la degradación autolítica del antígeno). Los anticuerpos recombinantes contra MASP-2 (Ac H3 y Ac M11) se aislaron de bibliotecas de anticuerpos combinatorios (Knappik, A., y col., J. Mol. Biol. 296:57-86 (2000)), utilizando MASP-2A recombinante humana y de rata como antígenos (Chen, C.B. y Wallis, J. Biol. Chem. 276:25894-25902 (2001)). Un fragmento anti-Fab2 de rata que inhibía de forma potente la activación de C4 y C3 mediada por la ruta de la lectina en plasma de ratón (CI50 ~ 1 nM) se convirtió en un anticuerpo IgG2a de longitud completa. Se generó antisuero policlonal anti-MASP-2A murina en ratas. Estas herramientas permitieron confirmar la dependencia de MASP-2 de esta nueva ruta de la lectina específica de la ruta de activación de C3 por derivación de C4, como se describe más adelante.
Como se muestra en la FIGURA 28B, M211, un anticuerpo monoclonal inhibidor que se une selectivamente a MASP-2 de ratón y rata inhibió la activación de C3 por derivación de C4 en ratón deficiente en C4, así como la activación de C3 de plasma de ratón TS a través de la ruta de la lectina de una manera dependiente de la concentración con valores de CI 50 similares. Todos los ensayos se llevaron a cabo a altas diluciones de plasma, lo que hizo que la ruta de activación de la ruta alternativa fuera disfuncional (con la concentración plasmática más alta siendo un 1,25 %).
Con el fin de investigar la presencia de una activación análoga de C3 por derivación de C4 específica de la ruta de la lectina en seres humanos, se analizó el plasma de un donante con una deficiencia heredada de ambos genes C4 humanos (es decir, C4A y C4B), lo que dio como resultado una ausencia total de C4 (Yang, Y., y col., J. Immunol.
173:2803-2814 (2004)). La FIGURA 28C muestra que el plasma de este paciente activa eficazmente C3 en altas diluciones de plasma (lo que hace que la ruta de activación alternativa sea disfuncional). El modo específico de la ruta de la lectina de activación de C3 en placas recubiertas de manano se demuestra en plasma murino deficiente en C4 (FIGURA 28A) y plasma humano deficiente en C4 (FIGURA 28C) mediante la adición de concentraciones en exceso de manano en fase líquida. La dependencia de MASP-2 de este mecanismo de activación de C3 en plasma humano deficiente en C4 se evaluó utilizando Ac H3, un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a MASP-2 humana y elimina la actividad funcional de MASP-2. Como se muestra en la FIGURA 28D, el Ac H3 inhibió el depósito de C3b (y C3dg) tanto en el plasma humano con suficiente C4 como en el deficiente en C4 con una potencia comparable.
Para evaluar un posible papel de otros componentes del complemento en la activación de C3 por derivación de C4, se probó plasma de ratones MASP-1/3-/- y Bf/C2-/-junto con plasma MASP-2-/-, C4-/- y C1q-/-(como controles) en condiciones de ensayo específicas de la ruta de la lectina y de la ruta clásica. La cantidad relativa de escisión de C3 se representó gráficamente frente a la cantidad de C3 depositada cuando se usó plasma TS.
La FIGURA 29A ilustra gráficamente un análisis comparativo de la actividad de C3 convertasa en plasma de varias cepas de ratón deficientes en complemento probadas en condiciones de ensayo específicas de la ruta de activación de lectina o de la ruta de activación clásica. Se probaron en paralelo muestras de plasma diluidas (1 %) de ratones TS (n = 6), ratones MASP-2-/-(n = 4), ratones MASP-1/3-/-(n = 2), ratones C4-/-(n = 8), ratones C4/MASP-1/3-/-(n = 8), ratones Bf/C2-/-(n = 2) y C1q-/-(n = 2). La reconstitución de plasma Bf/C2-/- con 2,5 pg/ml de C2 de rata recombinante (Bf/C2-/- C2) restauró el depósito de C3b. Los resultados son medias (± DE). **p < 0,01 (comparado con plasma TS). Como se muestra en la FIGURA 29A, se observa un depósito sustancial de C3 en plasma C4-/- analizado en condiciones de ensayo específicas de la ruta de la lectina, pero no en condiciones específicas de la ruta clásica. De nuevo, no se observó depósito de C3 en plasma deficiente en MASP-2 a través de la ruta de activación de la ruta de la lectina, mientras que el mismo plasma depositó C3 a través de la ruta clásica. En plasma MASP-1/3-/-, el depósito de C3 ocurrió en condiciones de ensayo específicas tanto de la ruta de la lectina como de la ruta clásica. No se observó depósito de C3 en plasma con una deficiencia combinada de C4 y MASP-1/3, ya sea utilizando condiciones específicas de la ruta de la lectina o de la ruta clásica. No se detecta depósito de C3 en plasma C2/Bf-/-, ya sea por la ruta de la lectina o por la ruta clásica. La reconstitución de plasma de ratón C2/Bf-/- con C2 recombinante, sin embargo, restauró tanto la escisión de C3 mediada por la ruta de la lectina como por la ruta clásica. Las condiciones del ensayo se validaron utilizando C1q-/plasma.
LA FIGURA 29B ilustra gráficamente la cinética resuelta en el tiempo de la actividad de la C3 convertasa en plasma de varias cepas TS de ratón deficientes en complemento, plasma fB-/-, C4-/-, MASP-1/3-/- y MASP-2-/-, probados en condiciones de ensayo específicas de la ruta de activación de la lectina (plasma al 1 %, los resultados son normales de tres experimentos independientes). Como se muestra en la FIGURA 29b , si bien no se observó escisión de C3 en plasma MASP-2-/-, el plasma fB-/- escindió C3 con una cinética similar a la del plasma TS. Se observó un retraso significativo en la conversión de C3 a C3b (y C3dg) dependiente de la ruta de la lectina en C4 -/- así como en plasma deficiente en MASP-1/3. Recientemente se demostró que este retraso de la activación de C3 en plasma MASP-1/3-/-es dependiente de MASP-1, en lugar de dependiente de MASP-3 (Takahashi, M., y col., J. Immunol. 180:6132-6138 (2008)).
Análisis:
Los resultados descritos en este Ejemplo sugieren fuertemente que la actividad funcional de MASP-2 es esencial para la activación de C3 a través de la ruta de la lectina tanto en presencia como en ausencia de C4. Además, C2 y m As P-1 son necesarios para que funcione esta nueva ruta de activación de C3 por derivación de C4 específica de la ruta de lectina. El análisis comparativo de la actividad funcional de la ruta de la lectina en plasma MASP-2-/- y C4-/- reveló la existencia de una ruta de activación del complemento C3 independiente de C4 previamente no reconocida, pero dependiente de MASP-2 y mostró que C3 se puede activar de un modo dependiente de la ruta de lectina en ausencia total de C4. Si bien la composición molecular detallada y la secuencia de eventos de activación de esta nueva C3 convertasa dependiente de MASP-2 aún no se han aclarado, los resultados implican que esta ruta de activación por derivación de C4 requiere adicionalmente la presencia del complemento C2 así como MASP-1. La pérdida de la actividad de escisión de C3 mediada por la ruta de la lectina en el plasma de ratones con deficiencia combinada de C4 y MASP-1/3 puede explicarse por un papel descrito más recientemente de MASP-1 para mejorar la activación del complemento dependiente de MASP-2 a través de la escisión y activación directas de MASP-2 (Takahashi, M., y col., J. Immunol. 180:6132-6138 (2008)). Asimismo, MASP-1 puede ayudar a la actividad funcional de MASP-2 a través de su capacidad para escindir C2 (Moller-Kristensen, y col., Int. Immunol. 19:141-149 (2007)). Ambas actividades pueden explicar la velocidad reducida por la cual el plasma deficiente en MASP-1/3 escinde C3 a través de la ruta de activación de lectina y por qué MASP-1 puede ser necesaria para mantener la conversión de C3 a través de la ruta de activación por derivación de C4.
Se demostró que la incapacidad del plasma C2/fB-/- para activar C3 a través de la ruta de la lectina es dependiente de C2, ya que la adición de C2 de rata recombinante al plasma C2/fB-/- restauró la capacidad del plasma reconstituido para activar C3 en placas recubiertas de manano.
El hallazgo de que la deficiencia de C4 altera específicamente la ruta clásica de activación del complemento mientras que la ruta de la lectina conserva un nivel fisiológicamente crítico de la actividad de la C3 convertasa a través de una ruta de activación por derivación de C4 dependiente de MASP-2 requiere otra evaluación del papel de la ruta de la lectina en varios modelos de enfermedades, incluyendo la infección experimental por S. pneumoniae (Brown, J. S., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 99:16969-16974 (2002); encefalomielitis alérgica experimental (Boos, L.A., y col., Glia 49:158-160 (2005); y modelos de regeneración hepática murina dependiente de C3 (Clark, A., y col., Mol. Immunol. 45:3125-3132 (2008)). El último grupo demostró que los ratones deficientes en C4 pueden activar C3 de una manera independiente de la ruta alternativa, ya que la inhibición in vivo de la ruta alternativa mediante un agotamiento de la actividad funcional del factor B mediado por anticuerpos no afectó la regeneración hepática dependiente de la escisión de C3 en ratones C4-/-(Clark, A., y col. (2008)). Esta ruta de lectina mediada por la ruta de activación de C3 por derivación de C4 también puede explicar la falta de un fenotipo protector de la deficiencia de C4 en el modelo de LIRM, así como en un modelo descrito previamente de rechazo de aloinjerto renal (Lin, T., y col., Am. J. Pathol.
168:1241-1248 (2006)). Por el contrario, los resultados recientes han demostrado de forma independiente un fenotipo protector significativo de ratones MASP-2-/- en modelos de trasplante renal (Farrar, C.A., y col., Mol. Immunol. 46:2832 (2009)).
En resumen, los resultados de este Ejemplo apoyan la opinión de que la activación de C3 por derivación de C4 dependiente de MASP-2 es un mecanismo fisiológicamente relevante que puede ser importante en condiciones en las que la disponibilidad de C4 limita la activación de C3.
EJEMPLO 23
Este Ejemplo describe la activación de C3 mediante sustratos de trombina y el depósito de C3 sobre manano en ratones TS (+/+), MASP-2 (-/-), F11 (-/-), F11/C4 (-/-) y C4 (-/-).
Fundamento:
Tal como se describe en el Ejemplo 14, se determinó que la activación de la trombina puede ocurrir después de la activación de la ruta de la lectina en condiciones fisiológicas, y demuestra el grado de implicación de MASP-2. C3 juega un papel central en la activación del sistema del complemento. La activación de C3 es necesaria para las rutas de activación del complemento clásica y alternativa. Se llevó a cabo un experimento para determinar si C3 se activa mediante sustratos de trombina.
Procedimientos:
Activación de C3 mediante sustratos de trombina
La activación de C3 se midió en presencia de las siguientes formas activadas de sustratos de trombina; FCXIa humano, FVIIa humano, FXa bovino, FXa humano, proteína C activada humana y trombina humana. C3 se incubó con los diversos sustratos de trombina, luego se separaron en condiciones reductoras en geles de poliacrilamida-SDS al 10 %. Después de la transferencia electroforética usando membrana de celulosa, la membrana se incubó con anti-C3 de ratón de rata acoplado con biotina monoclonal, se detectó con un kit de estreptavidina-HRP y se desarrolló con reactivo ECL.
Resultados:
La activación de C3 implica la escisión de la cadena a inalterada en la cadena a' truncada y C3a soluble (no se muestra en la FIGURA 30). La FIGURA 30 muestra los resultados de un análisis de transferencia Western sobre la activación de C3 humano mediante sustratos de trombina, en el que la cadena C3alfa no escindida y la cadena a' del producto de activación se muestran mediante flechas. Como se muestra en la FIGURA 30, la incubación de C3 con las formas activadas del factor X y el factor XI de coagulación humanos, así como el factor X de coagulación bovino activado, puede escindir C3 in vitro en ausencia de cualquier proteasa del complemento.
Depósito de C3 en manano
Los ensayos de depósito de C3 se llevaron a cabo en muestras de suero obtenidas de TS, MASP-2 (-/-), F11 (-/-), F11 (-/-)/C4 (-/-) y C4 (-/-). F11 es el gen que codifica el factor de coagulación XI. Para medir la activación de C3, se recubrieron placas de microtitulación con manano (1 pg/pocillo), añadiendo luego suero anti-HSA de oveja (2 pg/ml) en TBS/tween/Ca2+. Las placas se bloquearon con HSA al 0,1 % en TBS y se lavaron como antes. Las muestras de plasma se diluyeron en barbital 4 mM, NaCl 145 mM, CaCh 2 mM, MgCh 1 mM, pH 7,4, se añadió a las placas y se incubó durante 1,5 horas a 37 °C. Después del lavado, se detectó C3b unido usando anti-C3c humana de conejo (Dako), seguido de anti-IgG de conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina y pNPP.
Resultados:
La FIGURA 31 muestra los resultados del ensayo de depósito de C3 en muestras de suero obtenidas de TS, MASP-2 (-/-), F11(-/-), F11 (-/-)/C4 (-/-) y C4 (-/-). Como se muestra en la FIGURA 31, hay una ruta de la lectina funcional incluso en ausencia total de C4. Como se muestra además en la FIGURA 31, esta nueva activación del complemento dependiente de la ruta de la lectina requiere el factor de coagulación XI.
Análisis:
Antes de los resultados obtenidos en este experimento, los expertos en la materia creían que la ruta de la lectina del complemento requería C4 para su actividad. Por tanto, los datos de ratones inactivados para C4 (y seres humanos deficientes en C4) se interpretaron asumiendo que dichos organismos eran deficientes en la ruta de lectina (además de la deficiencia en la ruta clásica). Los presentes resultados demuestran que esta noción es falsa. Por tanto, las conclusiones de estudios anteriores que sugieren que la ruta de la lectina no era importante en determinados entornos de enfermedad basados en el fenotipo de animales deficientes en C4 pueden ser falsas. Los datos descritos en este Ejemplo también muestran que en el contexto fisiológico del suero completo, la ruta de la lectina puede activar componentes de la cascada de coagulación. Por tanto, se demuestra que existe una interferencia entre el complemento y la coagulación que implica MASP-2.
EJEMPLO 24
Este Ejemplo describe procedimientos para evaluar el efecto de un anticuerpo anti-MASP-2 sobre la lisis de glóbulos rojos de muestras de sangre obtenidas de pacientes con hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN).
Antecedentes/Justificación:
La hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), también conocida como síndrome de Marchiafava-Micheli, es una enfermedad de la sangre adquirida, potencialmente mortal, caracterizada por anemia hemolítica intravascular inducida por el complemento. El sello distintivo de la HPN es la hemólisis intravascular crónica que es consecuencia de la activación no regulada de la ruta alternativa del complemento. Lindorfer, M.A., y col., Blood 115(11) (2010). La anemia en la HPN se debe a la destrucción de los glóbulos rojos en el torrente sanguíneo. Los síntomas de la HPN incluyen orina roja, debido a la aparición de hemoglobina en la orina y trombosis. La HPN puede desarrollarse por sí sola, denominada "HPN primaria" o en el contexto de otros trastornos de la médula ósea tales como anemia aplásica, denominada "HPN secundaria". El tratamiento para la HPN incluye transfusión de sangre para la anemia, anticoagulación para la trombosis y el uso del anticuerpo monoclonal eculizumab (Soliris), que protege las células sanguíneas contra la destrucción inmunitaria mediante la inhibición del sistema del complemento (Hillmen P. y col., N. Engl. J. Med. 350(6):552-9 (2004)). Sin embargo, una parte significativa de los pacientes con HPN tratados con eculizumab quedan con anemia hemolítica inmunomediada clínicamente significativa porque el anticuerpo no bloquea la activación de la ruta alternativa del complemento.
Este Ejemplo describe procedimientos para evaluar el efecto de un anticuerpo anti-MASP-2 sobre la lisis de glóbulos rojos de muestras de sangre obtenidas de pacientes con HPN (no tratados con Soliris) que se incuban con suero humano normal acidificado compatible con ABO.
Procedimientos:
Reactivos:
Los eritrocitos de donantes normales y de pacientes que padecen HPN (no tratados con Soliris) se obtienen mediante punción venosa y se preparan como se describe en Wilcox, L.A., y col., Blood 78:820-829 (1991), incorporado en el presente documento como referencia. Se pueden generar anticuerpos anti-MASP-2 con actividad de bloqueo funcional de la ruta de la lectina como se describe en el Ejemplo 10.
Análisis de hemólisis:
El procedimiento para determinar el efecto de los anticuerpos anti-MASP-2 sobre la capacidad de bloquear la hemólisis de los eritrocitos de pacientes con HPN se lleva a cabo utilizando los procedimientos descritos en Lindorfer, M.A., y col., Blood 15(11):2283-91 (2010) y Wilcox, L.A., y col., Blood 78:820-829 (1991), ambas referencias se incorporan en el presente documento como referencia. Como se describe en Lindorfer y col., se centrifugan los eritrocitos de las muestras de pacientes con HPN, la capa leucocitaria se aspira y las células se lavan en tampón veronal de gelatina (GVB, por sus siglas en inglés) antes de cada experimento. Los eritrocitos se prueban para determinar la susceptibilidad a la lisis mediada por APC como sigue. Se diluyen sueros humanos normales compatibles con ABO con GVB que contiene CaCh 0,15 mM y MgCh 0,5 mM (GVB+2) y acidificado a pH 6,4 (SHN acidificado, SHNa) y se utilizan para reconstituir los eritrocitos a un hematocrito de un 1,6 % en SHNa al 50 %. Las mezclas se incuban luego a 37 °C, y después de 1 hora, los eritrocitos se sedimentan mediante centrifugación. La densidad óptica de una alícuota del sobrenadante recuperado se mide a 405 nM y se usa para calcular el porcentaje de lisis. Las muestras reconstituidas en suero acidificado-EDTA se procesan de manera similar y se utilizan para definir la lisis de fondo no mediada por complementos (normalmente menos de un 3 %). La lisis completa (100 %) se determina después de incubar los eritrocitos en agua destilada.
Para determinar el efecto de los anticuerpos anti-MASP-2 sobre la hemólisis de los eritrocitos de HPN, se incuban eritrocitos de pacientes con HPN en SHNa en presencia de concentraciones incrementales de los anticuerpos anti-MASP-2, y posteriormente se cuantifica la presencia/cantidad de hemólisis.
En vista del hecho de que se ha demostrado que los anticuerpos anti-MASP-2 bloquean la activación posterior de la ruta alternativa del complemento, se espera que los anticuerpos anti-MASP-2 sean eficaces para bloquear la hemólisis mediada por la ruta alternativa de los eritrocitos de HPN, y serán útiles como tratamiento para tratar a pacientes que padecen HPN.
EJEMPLO 25
Este Ejemplo describe procedimientos para evaluar el efecto de un anticuerpo de bloqueo anti-MASP-2 sobre la activación del complemento mediante crioglobulinas en muestras de sangre obtenidas de pacientes que padecen crioglobulinemia.
Antecedentes/Justificación:
La crioglobulinemia se caracteriza por la presencia de crioglobulinas en el suero. Las crioglobulinas son inmunoglobulinas simples o mixtas (normalmente anticuerpos IgM) que experimentan agregación reversible a bajas temperaturas. La agregación conduce a la activación e inflamación del complemento de la ruta clásica en los lechos vasculares, particularmente en la periferia. Las presentaciones clínicas de la crioglobulinemia incluyen vasculitis y glomerulonefritis.
La crioglobulinemia se puede clasificar de la siguiente manera según la composición de la crioglobulina: crioglobulinemia tipo I, o crioglobulinemia simple, es el resultado de una inmunoglobulina monoclonal, generalmente inmunoglobulina M (IgM); crioglobulinemia de tipos II y III (crioglobulinemia mixta) que contiene factores reumatoides (FR), que suelen ser IgM en complejos con la porción Fc de la IgG policlonal.
Las condiciones asociadas con la crioglobulinemia incluyen infección por hepatitis C, trastornos linfoproliferativos y otras enfermedades autoinmunitarias. Los complejos inmunitarios que contienen crioglobulina dan como resultado un síndrome clínico de inflamación sistémica, posiblemente debido a su capacidad para activar el complemento. Mientras que los inmunocomplejos IgG normalmente activan la ruta clásica del complemento, los complejos que contienen IgM también pueden activar el complemento a través de la ruta de la lectina (Zhang, M., y col., Mol Immunol 44(1-3):103-110 (2007) y Zhang. M., y col., J. Immunol. 177(7):4727-34 (2006)).
Los estudios inmunohistoquímicos han demostrado además que los complejos inmunitarios de crioglobulina contienen componentes de la ruta de la lectina, y las biopsias de pacientes con glomerulonefritis crioglobulinémica mostraron evidencia inmunohistoquímica de activación de la ruta de la lectina in situ (Ohsawa, I., y col., Clin Immunol 101(1):59-66 (2001)). Estos resultados sugieren que la ruta de la lectina puede contribuir a la inflamación y los resultados adversos en enfermedades crioglobulémicas.
Procedimientos:
El procedimiento para determinar el efecto de los anticuerpos anti-MASP-2 sobre la capacidad de bloquear los efectos secundarios de la crioglobulinemia se lleva a cabo utilizando el ensayo de conversión de C3 en fase líquida como se describe en Ng Y.C. y col., Arthritis and Rheumatism 31(1):99-107 (1988), incorporado como referencia en el presente documento. Como se describe en Ng y col., en la crioglobulinemia mixta esencial (CME), factor reumatoide monoclonal (FRm), generalmente IgM, forma complejos con IgG policlonal para formar los complejos inmunitarios (CI) crioprecipitados característicos (crioglobulina tipo II). Se han demostrado inmunoglobulinas y C3 en las paredes de los vasos de los tejidos afectados, tales como la piel, nervio y riñón. Como se describe en Ng y col., se añade FRm marcado con I125 al suero (suero humano normal y suero obtenido de pacientes que padecen crioglobulinemia), se incuba a 37 °C, y se mide la unión a los eritrocitos.
La conversión de C3 en fase líquida se determina en suero (suero humano normal y suero obtenido de pacientes que padecen crioglobulinemia) en presencia o ausencia del siguiente CI: BSA-anti BSA, FRm, FRm más IgG o crioglobulinas, en presencia o ausencia de anticuerpos anti-MASP-2. La fijación de C3 y C4 a CI se mide usando un ensayo de precipitación conjunta con F(ab')2 anti-C3 y F(ab')2 anti-C4.
En vista del hecho de que se ha demostrado que los anticuerpos anti-MASP-2 bloquean la activación de la ruta de la lectina, se espera que los anticuerpos anti-MASP-2 sean eficaces para bloquear los efectos secundarios mediados por el complemento asociados con la crioglobulinemia, y serán útiles como un tratamiento para tratar a pacientes que padecen crioglobulinemia.
EJEMPLO 26
Este Ejemplo describe procedimientos para evaluar el efecto de un anticuerpo anti-MASP-2 en muestras de sangre obtenidas de pacientes con enfermedad por crioaglutininas, que se manifiesta como anemia.
Antecedentes/Justificación:
La enfermedad por crioaglutininas (ECA), es un tipo de anemia hemolítica autoinmunitaria. Los anticuerpos contra las crioaglutininas (generalmente IgM) se activan con temperaturas frías y se unen a glóbulos rojos y los agregan. Los anticuerpos contra las crioaglutininas se combinan con el complemento y atacan el antígeno en la superficie de glóbulos rojos. Esto conduce a la opsonización de los glóbulos rojos (hemólisis) que desencadena su eliminación por el sistema reticuloendotelial. La temperatura a la que tiene lugar la aglutinación varía de un paciente a otro.
La ECA se manifiesta como anemia. Cuando la velocidad de destrucción de los glóbulos rojos excede la capacidad de la médula ósea para producir una cantidad adecuada de células transportadoras de oxígeno, entonces ocurre la anemia. La ECA puede ser causada por una enfermedad o trastorno subyacente, denominado "ECA secundaria", tal como una enfermedad infecciosa (neumonía por micoplasma, paperas, mononucleosis), enfermedad linfoproliferativa (linfoma, leucemia linfocítica crónica) o trastorno del tejido conectivo. Se considera que los pacientes con ECA primaria tienen un trastorno linfoproliferativo de la médula ósea de bajo grado. Tanto la ECA primaria como la secundaria son afecciones adquiridas.
Procedimientos:
Reactivos:
Los eritrocitos de donantes normales y de pacientes que padecen ECA se obtienen mediante punción venosa. Se pueden generar anticuerpos anti-MASP-2 con actividad de bloqueo funcional de la ruta de la lectina como se describe en el Ejemplo 10.
El efecto de los anticuerpos anti-MASP-2 para bloquear la activación de la ruta de la lectina mediada por crioaglutininas puede determinarse como sigue. Los eritrocitos de los pacientes positivos del grupo sanguíneo I se sensibilizan con crioaglutininas (es decir, anticuerpos IgM), en presencia o ausencia de anticuerpos anti-MASP-2. A continuación, se analiza la capacidad de los eritrocitos para activar la ruta de la lectina mediante la medición de la unión a C3.
En vista del hecho de que se ha demostrado que los anticuerpos anti-MASP-2 bloquean la activación de la ruta de la lectina, se espera que los anticuerpos anti-MASP-2 sean eficaces para bloquear los efectos secundarios mediados por el complemento asociados con la enfermedad por crioaglutininas, y serán útiles como tratamiento para tratar pacientes que padecen la enfermedad por crioaglutininas.
EJEMPLO 27
Este Ejemplo describe procedimientos para evaluar el efecto de un anticuerpo anti-MASP-2 sobre la lisis de glóbulos rojos en muestras de sangre obtenidas de ratones con síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa).
Antecedentes/Justificación:
El síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa) se caracteriza por anemia hemolítica, trombocitopenia e insuficiencia renal causada por trombos plaquetarios en la microcirculación del riñón y otros órganos. El SUHa se asocia con una regulación defectuosa del complemento y puede ser esporádico o hereditario. El SUHa se asocia con mutaciones en genes que codifican la activación del complemento, incluyendo el factor H del complemento, el cofactor B de membrana y el factor I, así como el factor H del complemento relacionado 1 (CFHR1) y el factor H del complemento relacionado 3 (CFHR3). Zipfel, P.F., y col., PloS Genetics 3(3):e41 (2007). Este Ejemplo describe procedimientos para evaluar el efecto de un anticuerpo anti-MASP-2 sobre la lisis de glóbulos rojos de muestras de sangre obtenidas de ratones con SUHa.
Procedimientos:
El efecto de los anticuerpos anti-MASP-2 para tratar el SUHa puede determinarse en un modelo de ratón de esta enfermedad en el que el gen fH de ratón endógeno se ha reemplazado por un homólogo humano que codifica una forma mutante de fH que se encuentra con frecuencia en pacientes con SUHa. Véase Pickering M.C. y col., J. Exp. Med. 204(6):1249-1256 (2007), incorporado como referencia en el presente documento. Como se describe en Pickering y col., estos ratones desarrollan una patología similar al SUHa. Para evaluar el efecto de un anticuerpo anti-MASP-2 para el tratamiento del SUHa, se administran anticuerpos anti-MASP-2 a los ratones SUHa mutantes y se compara la lisis de los glóbulos rojos obtenidos de tratados con Ac anti-MASP-2 y controles no tratados. En vista del hecho de que se ha demostrado que los anticuerpos anti-MASP-2 bloquean la activación de la ruta de la lectina, se espera que los anticuerpos anti-MASP-2 sean eficaces para bloquear la lisis de glóbulos rojos en sujetos mamíferos que padecen SUHa.
EJEMPLO 28
Este Ejemplo describe procedimientos para evaluar el efecto de un anticuerpo anti-MASP-2 para el tratamiento de glaucoma.
Justificación/Antecedentes:
Se ha demostrado que la activación incontrolada del complemento contribuye a la progresión de la lesión degenerativa de las células ganglionares de la retina (CGR), sus sinapsis y axones en el glaucoma. Véase Tezel G. y col., Invest Ophthalmol Vis Sci 51:5071-5082 (2010). Por ejemplo, estudios histopatológicos de tejidos humanos y estudios in vivo que utilizan diferentes modelos animales han demostrado que los componentes del complemento, incluyendo C1q y C3, se sintetizan y el complejo del complemento terminal se forma en la retina glaucomatosa (véase Stasi K. y col., Invest Ophthalmol Vis Sci 47:1024-1029 (2006), Kuehn M.H. y col., Exp Eye Res 83:620-628 (2006)). Como se describe con más detalle en Kuehn M.H. y col., Experimental Eye Research 87:89-95 (2008), la síntesis y el depósito del complemento se induce mediante la I/R retiniana y la alteración de la cascada del complemento retrasa la degeneración de CGR. En el presente estudio, se encontró que los ratones que portaban una alteración dirigida del componente C3 del complemento exhibían una degeneración retardada de CGR después de una I/R retiniana transitoria en comparación con animales normales.
Procedimientos:
El procedimiento para determinar el efecto de los anticuerpos anti-MASP-2 sobre la degeneración de CGR se lleva a cabo en un modelo animal de I/R de retina como se describe en Kuehn M.H. y col., Experimental Eye Research 87:89-95 (2008), incorporado como referencia en el presente documento. Como se describe en Kuehn y col., la isquemia retiniana se induce mediante la anestesia a los animales, insertando luego una aguja de calibre 30 conectada a un depósito que contiene solución salina tamponada con fosfato a través de la córnea hacia la cámara anterior del ojo. A continuación, se eleva el depósito de solución salina para producir una presión intraocular de 104 mmHg, suficiente para evitar completamente la circulación a través de la vasculatura retiniana. La isquemia intraocular elevada se confirma por el blanqueamiento del iris y la retina y la isquemia se mantiene durante 45 minutos solo en el ojo izquierdo; el ojo derecho sirve como control y no recibe canulación. A continuación, los ratones se sacrifican 1 o 3 semanas después de la lesión isquémica. Los anticuerpos anti-MASP-2 se administran a los ratones localmente en el ojo o sistémicamente para evaluar el efecto de un anticuerpo anti-MASP administrado antes de la agresión isquémica.
La inmunohistoquímica de los ojos se lleva a cabo utilizando anticuerpos contra C1q y C3 para detectar el depósito del complemento. El daño del nervio óptico también se puede evaluar utilizando procedimientos estándar de microscopía electrónica. La cuantificación de las CGR retinianas supervivientes se realiza usando marcaje con gamma sinucleína.
Resultados:
Como se describe en Kuehn y col., en ratones normales de control, la isquemia retiniana transitoria da como resultado cambios degenerativos del nervio óptico y depósitos retinianos de C1q y C3 detectables mediante inmunohistoquímica. Por el contrario, ratones deficientes en C3 mostraron una marcada reducción en la degeneración axonal, exhibiendo solo niveles menores de daño del nervio óptico 1 semana después de la inducción. Basándose en estos resultados, se espera que se observen resultados similares cuando este ensayo se lleva a cabo en un ratón con inactivación de MASP-2 y cuando se administran anticuerpos anti-MASP-2 a un ratón normal antes de la lesión isquémica.
EJEMPLO 29
Este Ejemplo demuestra que un inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo anti-MASP-2, es eficaz para el tratamiento de la exposición a la radiación y/o para el tratamiento, mejora o prevención del síndrome de radiación aguda.
Fundamento:
La exposición a altas dosis de radiación ionizante causa mortalidad por dos mecanismos principales: toxicidad para la médula ósea y síndrome gastrointestinal. La toxicidad de la médula ósea da como resultado una disminución de todas las células hematológicas, predisponiendo al organismo a la muerte por infección y hemorragia. El síndrome gastrointestinal es más grave y se debe a una pérdida de la función de la barrera intestinal debido a la desintegración de la capa epitelial intestinal y a la pérdida de la función endocrina intestinal. Esto conduce a la sepsis y al síndrome de respuesta inflamatoria sistémica asociado que puede dar como resultado la muerte.
La ruta de la lectina del complemento es un mecanismo inmunitario innato que inicia la inflamación en respuesta a la lesión tisular y la exposición a superficies extrañas (es decir, bacterias). El bloqueo de esta ruta conduce a mejores resultados en modelos de ratón de lesión tisular intestinal isquémica o choque séptico. Se plantea la hipótesis de que la ruta de la lectina puede desencadenar una inflamación excesiva y dañina en respuesta a la lesión tisular inducida por la radiación. Por tanto, el bloqueo de la ruta de la lectina puede reducir la lesión secundaria y aumentar la supervivencia después de una exposición aguda a radiación.
El objetivo del estudio llevado a cabo como se describe en este Ejemplo fue evaluar el efecto del bloqueo de la ruta de la lectina sobre la supervivencia en un modelo de ratón de lesión por radiación mediante la administración de anticuerpos anti-MASP-2 murinas.
Procedimientos y materiales:
Materiales. Los artículos de prueba usados en este estudio fueron (i) un anticuerpo anti-MASP-2 murina de alta afinidad (AcMM11) y (ii) un anticuerpo anti-MASP-2 humana de alta afinidad (AcMH6) que bloquea el componente proteico MASP-2 de la ruta del complemento de la lectina que se produjeron en células de mamífero transfectadas. Las concentraciones de dosificación fueron de 1 mg/kg de anticuerpo anti-MASP-2 murina (AcMM11), 5 mg/kg de anticuerpo anti-MASP-2 humana (AcMH6) o solución salina estéril. Para cada sesión de dosificación, se preparó un volumen adecuado de nuevas soluciones de dosificación.
Animales. Se obtuvieron ratones Swiss-Webster machos adultos jóvenes de Harían Laboratories (Houston, TX). Los animales se alojaron en jaulas de fondo sólido con lecho de Alpha-Dri y se describió una dieta para roedores certificada PMI 5002 (Animal Specialties, Inc., Hubbard OR) y agua a voluntad. Se controló la temperatura y el alojamiento de los animales funcionó con un ciclo de luz de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad.
Irradiación. Después de una aclimatación de 2 semanas en las instalaciones, los ratones se irradiaron a 6,5 y 7,0 Gy mediante exposición de todo el cuerpo en grupos de 10 a una velocidad de dosis de 0,78 Gy/min utilizando un sistema Therapax X-RAD 320 equipado con un generador de rayos X de alta estabilidad de 320 kV, tubo de rayos X de cerámica de metal, colimador y filtro de haz de rayos X variable (Precision X-ray Incorporated, East Haven, CT). Los niveles de dosis se seleccionaron basándose en estudios previos realizados con la misma cepa de ratones que indicaron que la DL50/30 estaba entre 6,5 y 7,0 Gy (datos no mostrados).
Formulación y administración de fármacos. El volumen apropiado de soluciones madre concentradas se diluyó con solución salina enfriada con hielo para preparar soluciones de dosificación de 0,2 mg/ml de anticuerpo anti-MASP-2 murina (AcMM11) o 0,5 mg/ml de anticuerpo anti-MASP-2 humana (AcMH6) de acuerdo con el protocolo. La administración del anticuerpo anti-MASP-2 AcMM11 y AcMH6 se realizó mediante inyección IP usando una base de aguja de calibre 25 sobre el peso del animal para administrar 1 mg/kg de AcMM11, 5 mg/kg de AcMH6 o un vehículo salino.
Diseño del estudio. Los ratones se asignaron al azar a los grupos como se describe en la Tabla 8. El peso corporal y la temperatura se midieron y registraron diariamente. Los ratones de los grupos 7, 11 y 13 se sacrificaron en el día 7 posterior a la irradiación y se recogió sangre mediante punción cardíaca bajo anestesia profunda. Los animales supervivientes en el día 30 posterior a la irradiación se sacrificaron de la misma manera y se extrajo sangre. El plasma se preparó a partir de muestras de sangre recogidas de acuerdo con el protocolo y se devolvió al laboratorio promotor para su análisis.
TABLA 8: Grupos de estudio
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Análisis estadístico. Se generaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y se utilizaron para comparar el tiempo medio de supervivencia entre los grupos de tratamiento mediante los procedimientos log-Rank y Wilcoxon. Se informan los promedios con desviaciones estándar o medias con error estándar de la media. Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando una prueba t de dos colas no apareadas entre animales controlados irradiados y grupos de tratamiento individuales.
Resultados
Los gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier para los grupos de exposición de 7,0 y 6,5 Gy se describen en las FIGURAS 32A y 32B, respectivamente, y se resumen a continuación en la Tabla 9. En general, el tratamiento con irradiación previa de Ac anti-MASP-2 murina (AcMM11) aumentó la supervivencia de los ratones irradiados en comparación con los animales de control irradiados tratados con vehículo a niveles de exposición de 6,5 (aumento de un 20 %) y 7,0 Gy (aumento de un 30 %). En el nivel de exposición de 6,5 Gy, el tratamiento posterior a la irradiación con Ac anti-MASP-2 murina dio como resultado un modesto aumento en la supervivencia (15 %) en comparación con los animales irradiados de control con vehículo.
En comparación, todos los animales tratados al nivel de exposición de 7,0 Gy mostraron un aumento en la supervivencia en comparación con los animales de control irradiados tratados con vehículo. El mayor cambio en la supervivencia ocurrió en animales que recibieron AcMH6, con un aumento de un 45 % en comparación con los animales de control. Además, al nivel de exposición de 7,0 Gy, la mortalidad en el grupo tratado con AcMH6 se produjo por primera vez en el día 15 posterior a la irradiación en comparación con el día 8 posterior a la irradiación para los animales de control irradiados tratados con vehículo, un aumento de 7 días sobre los animales de control. El tiempo medio de mortalidad para los ratones que recibieron AcMH6 (27,3 ± 1,3 días) aumentó significativamente (p = 0,0087) en comparación con los animales de control (20,7 ± 2,0 días) al nivel de exposición de 7,0 Gy.
El cambio porcentual en el peso corporal en comparación con el día anterior a la irradiación (día -1) se registró durante todo el estudio. Se produjo una pérdida de peso transitoria en todos los animales irradiados, sin evidencia de cambios diferenciales debido al tratamiento con AcMM11 o AcMH6 en comparación con los controles (datos no mostrados). Al finalizar el estudio, todos los animales supervivientes mostraron un aumento de peso corporal desde el peso corporal inicial (día -1).
TABLA 9: Tasas de supervivencia de animales probados expuestos a radiación
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Análisis
El síndrome de radiación aguda consiste en tres subsíndromes definidos: hematopoyético, gastrointestinal y cerebrovascular. El síndrome observado depende de la dosis de radiación, con los efectos hematopoyéticos observados en seres humanos con exposiciones significativas a la radiación de todo el cuerpo o parciales superiores a 1 Gy. El síndrome hematopoyético se caracteriza por una depresión intensa de la función de la médula ósea que conduce a pancitopenia con cambios en los recuentos sanguíneos, glóbulos rojos y blancos y plaquetas que ocurren simultáneamente con daño al sistema inmunitario. A medida que ocurre el nadir, con pocos neutrófilos y plaquetas presentes en sangre periférica, la neutropenia, la fiebre, las complicaciones de la sepsis y la hemorragia incontrolable conducen a la muerte.
En el presente estudio, se encontró que la administración de AcMH6 aumentaba la capacidad de supervivencia a la irradiación de rayos X de todo el cuerpo en ratones macho Swiss-Webster irradiados a 7,0 Gy. De forma notable, al nivel de exposición de 7,0 Gy, un 80 % de los animales que recibieron AcMH6 sobrevivieron hasta 30 días en comparación con un 35 % de los animales irradiados de control tratados con vehículo. De manera importante, el primer día de muerte en este grupo tratado no ocurrió hasta el día 15 después de la irradiación, un aumento de 7 días con respecto al observado en animales irradiados de control tratados con vehículo. Curiosamente, a la menor exposición a los rayos X (6,5 Gy), la administración de AcMH6 no pareció afectar la supervivencia o el retraso en la mortalidad en comparación con los animales irradiados de control tratados con vehículo. Puede haber varias razones para esta diferencia en la respuesta entre los niveles de exposición, aunque la verificación de cualquier hipótesis puede requerir estudios adicionales, incluyendo la recogida provisional de muestras para cultivo microbiológico y parámetros hematológicos. Una explicación puede ser simplemente que el número de animales asignados a los grupos puede haber impedido ver diferencias sutiles relacionadas con el tratamiento. Por ejemplo, con tamaños de grupos de n = 20, la diferencia en la supervivencia entre un 65 % (AcMH6 a una exposición de 6,5 Gy) y un 80 % (AcMH6 a una exposición de 7,0 Gy) es de 3 animales. Por otro lado, la diferencia entre un 35 % (control del vehículo con una exposición de 7,0 Gy) y un 80 % (AcMH6 con una exposición de 7,0 Gy) es de 9 animales, y proporciona pruebas sólidas de una diferencia relacionada con el tratamiento.
Estos resultados demuestran que los anticuerpos anti-MASP-2 son eficaces en el tratamiento de un sujeto mamífero en riesgo o que padece los efectos perjudiciales del síndrome de radiación aguda.
EJEMPLO 30
Este Ejemplo demuestra que ratones deficientes en MASP-2 están protegidos de la mortalidad inducida por Neisseria meningitidis después de una infección con N. meningitidis serogrupo A o Neisseria meningitidis serogrupo B.
Procedimientos:
Se generaron ratones inactivados para MASP-2 (ratones MASP-2 KO) como se describe en el Ejemplo 1. Se inocularon ratones MASP-2 KO de 10 semanas (n = 10) y ratones C57/BL6 de tipo silvestre (TS) (n = 10) mediante inyección intraperitoneal (ip) con una dosis de 2,6 x 107 UFC de Z2491 de Neisseria meningitidis serogrupo A en un volumen de 100 pl. La dosis infecciosa se administró a ratones junto con hierro dextrano a una concentración final de 400 mg/kg. Se controló la supervivencia de los ratones después de la infección durante un período de 72 horas.
En un experimento aparte, se inocularon ratones MASP-2 KO de 10 semanas (n = 10) y ratones C57/BL6 de tipo silvestre (n = 10) mediante inyección ip con una dosis de 6 x 106 UFC de la cepa MC58 de Neisseria meningitidis de serogrupo B en un volumen de 100 pl. La dosis infecciosa se administró a ratones junto con hierro dextrano a una dosis final de 400 mg/kg. Se controló la supervivencia de los ratones después de la infección durante un período de 72 horas. También se determinó una puntuación de enfermedad para los ratones TS e inactivos MASP-2 durante el período de 72 horas después de la infección, basado en los parámetros de puntuación de enfermedad descritos a continuación en la TABLA 10, que se basa en el esquema de Fransen y col. (2010) con ligeras modificaciones.
TABLA 10: Puntuación de enfermedad asociada con signos clínicos en ratones infectados
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Se tomaron muestras de sangre de los ratones a intervalos de una hora después de la infección y se analizaron para determinar el nivel en suero (log ufc/ml) de N. meningitidis para verificar la infección y determinar la tasa de eliminación de las bacterias del suero.
Resultados:
LA FIGURA 33 es un diagrama de Kaplan-Meyer que ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de ratones MASP-2 KO y TS después de la administración de una dosis infecciosa de 2,6 x 107 ufc de Z2491 de N. meningitidis serogrupo A. Como se muestra en la FIGURA 33, el 100 % de los ratones inactivos MASP-2 sobrevivieron durante el período de 72 horas después de la infección. Por el contrario, solo un 80 % de los ratones TS (p = 0,012) seguían vivos 24 horas después de la infección, y solo un 50 % de los ratones TS seguían vivos 72 horas después de la infección. Estos resultados demuestran que los ratones deficientes en MASP-2 están protegidos de la mortalidad inducida por Z2491de N. meningitidis serogrupo A.
La FIGURA 34 es un diagrama de Kaplan-Meyer que ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de ratones inactivos MASP-2 y TS después de la administración de una dosis infecciosa de 6 x 106 ufc de la cepa MC58 de N. meningitidis de serogrupo B. Como se muestra en la FIGURA 34, el 90 % de los ratones inactivos MASP-2 sobrevivieron durante el período de 72 horas después de la infección. Por el contrario, solo un 20 % de los ratones TS (p = 0,0022) seguían vivos 24 horas después de la infección. Estos resultados demuestran que los ratones deficientes en MASP-2 están protegidos de la mortalidad inducida por la cepa MC58 de N. meningitidis de serogrupo B.
La FIGURA 35 ilustra gráficamente el log ufc/ml de la cepa MC58 de N. meningitidis de serogrupo B recuperada en diferentes puntos temporales en muestras de sangre tomadas de ratones MASP-2 KO y TS después de la infección ip con 6x106 ufc de la cepa MC58 de N. meningitidis de serogrupo B (n = 3 en diferentes puntos temporales para ambos grupos de ratones). Los resultados se expresan como medias ± EEM. Tal como se muestra en la FIGURA 35, en ratones TS el nivel de N. meningitidis en la sangre alcanzó un máximo de aproximadamente 6,0 log ufc/ml a las 24 horas después de la infección y cayó a aproximadamente 4,0 log ufc/ml a las 36 horas después de la infección. Por el contrario, en los ratones MASP-2 inactivados, el nivel de N. meningitidis alcanzó un máximo de aproximadamente 4,0 log ufc/ml a las 12 horas después de la infección y cayó a aproximadamente 1,0 log ufc/ml a las 36 horas después de la infección (el símbolo "*" indica p < 0,05; el símbolo "**" indica p = 0,0043). Estos resultados demuestran que aunque los ratones inactivos para MASP-2 se infectaron con la misma dosis de la cepa MC58 de N. meningitidis de serogrupo B que los ratones TS, los ratones MASP-2 KO tienen un aclaramiento mejorado de bacteriemia en comparación con TS.
La FIGURA 36 ilustra gráficamente la puntuación de enfermedad promedio de los ratones MASP-2 KO y TS a las 3, 6, 12 y 24 horas después de la infección con 6x106 ufc de la cepa MC58 de N. meningitidis de serogrupo B. Tal como se muestra en la FIGURA 36, los ratones deficientes en MASP-2 mostraron una alta resistencia a la infección, con puntuaciones de enfermedad mucho más bajas a las 6 horas (el símbolo "*" indica p = 0,0411), 12 horas (símbolo "**" indica p = 0,0049) y 24 horas (símbolo "***" indica p = 0,0049) después de la infección, en comparación con los ratones TS. Los resultados en FIGURA 36 se expresan como medias ± EEM.
En resumen, los resultados de este Ejemplo demuestran que los ratones deficientes en MASP-2 están protegidos de la mortalidad inducida por Neisseria meningitides después de la infección con N. meningitidis de serogrupo A o N. meningitidis de serogrupo B.
EJEMPLO 31
Este ejemplo demuestra que la administración de anticuerpo anti-MASP-2 después de una infección con N. meningitidis aumenta la supervivencia de ratones infectados con N. meningitidis.
Antecedentes/Justificación:
Como se describe en el Ejemplo 10, se utilizó proteína MASP-2 de rata para seleccionar una biblioteca de presentación de fagos Fab, a partir de la cual se identificó Fab2 n.° 11 como un anticuerpo funcionalmente activo. Se generaron anticuerpos de longitud completa de los isotipos IgG2c de rata e IgG2a de ratón a partir de Fab2 n.° 11. El anticuerpo anti-MASP-2 de longitud completa del isotipo IgG2a de ratón se caracterizó por parámetros farmacodinámicos (como se describe en el Ejemplo 19).
En este Ejemplo, el anticuerpo anti-MASP-2 de longitud completa de ratón procedente de Fab2 n.° 11 se analizó en el modelo de ratón de infección por N. meningitidis.
Procedimientos:
El isotipo IgG2a de anticuerpo anti-MASP-2 de longitud completa de ratón procedente de Fab2 n.° 11, generado como se describe anteriormente, se probó en el modelo de ratón de infección por N. meningitidis de la siguiente manera.
Administración de anticuerpos monoclonales (AcM) anti-MASP-2 de ratón después de la infección
Se trataron ratones C57/BL6 Charles River de 9 semanas con anticuerpo inhibidor de ratón anti-MASP-2 (1,0 mg/kg) (n = 12) o anticuerpo de isotipo de control (n = 10) a las 3 horas después de la inyección ip con un dosis alta (4x106 ufc) de la cepa MC58 de N. meningitidis de serogrupo B.
Resultados:
La FIGURA 37 es un diagrama de Kaplan-Meyer que ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de ratones después de la administración de una dosis infecciosa de 4x106 ufc de la cepa MC58 de N. meningitidis de serogrupo B, seguido de la administración 3 horas después de la infección del anticuerpo inhibidor anti-MASP-2 (1,0 mg/kg) o del anticuerpo de isotipo de control. Como se muestra en la FIGURA 37, un 90 % de los ratones tratados con anticuerpo anti-MASP-2 sobrevivieron durante el período de 72 horas después de la infección. Por el contrario, solo un 50 % de los ratones tratados con anticuerpo de control de isotipo sobrevivieron durante el período de 72 horas después de la infección. El símbolo "*" indica p = 0.0301, según se determina por comparación de las dos curvas de supervivencia.
Estos resultados demuestran que la administración del anticuerpo anti-MASP-2 es eficaz para tratar y mejorar la supervivencia en sujetos infectados con N. meningitidis.
Como se demuestra en el presente documento, el uso de anticuerpos anti-MASP-2 en el tratamiento de un sujeto infectado con N. meningitidis es eficaz cuando se administra dentro de las 3 horas posteriores a la infección, y se espera que sea eficaz dentro de las 24 a 48 horas posteriores a la infección. La enfermedad meningocócica (ya sea meningococemia o meningitis) es una emergencia médica y, por lo general, el tratamiento se iniciará de inmediato si se sospecha la enfermedad meningocócica (es decir, antes de que N. meningitidis se identifique positivamente como el agente etiológico).
En vista de los resultados en el ratón MASP-2 KO demostrado en el EJEMPLO 30, se cree que la administración de anticuerpo anti-MASP-2 antes de la infección con N. meningitidis también sería eficaz para prevenir o mejorar la gravedad de la infección.
EJEMPLO 32
Este Ejemplo demuestra que la administración de anticuerpo anti-MASP-2 es eficaz para tratar una infección por N. meningitidis en suero humano.
Fundamento:
Los pacientes con niveles séricos reducidos de MBL funcional muestran una mayor susceptibilidad a infecciones bacterianas y fúngicas recurrentes (Kilpatrick y col., Biochim Biophys Acta 1572:401-413 (2002)). Se sabe que N. meningitidis es reconocido por MBL, y se ha demostrado que los sueros deficientes en MBL no lisan Neisseria.
En vista de los resultados descritos en los Ejemplos 30 y 31, se llevaron a cabo una serie de experimentos para determinar la eficacia de la administración del anticuerpo anti-MASP-2 para tratar una infección por N. meningitidis en sueros humanos deficientes y de control. Los experimentos se realizaron en una alta concentración de suero (20 %) con el fin de conservar la ruta del complemento.
Procedimientos:
1. Actividad bactericida sérica en varios sueros humanos deficientes en complemento y en sueros humanos tratados con anticuerpo anti-MASP-2 humano
En este experimento se utilizaron los siguientes sueros humanos deficientes en complemento y sueros humanos de control:
TABLA 11: Muestras de suero humano analizadas (como se muestra en la FIGURA 38)
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Se aisló un anticuerpo recombinante contra MASP-2 humano de una biblioteca combinatoria de anticuerpos (Knappik, A., y col., J. Mol. Biol. 296:57-86 (2000)), utilizando MASP-2A humana recombinante como antígeno (Chen, C.B. y Wallis, J. Biol. Chem. 276:25894-25902 (2001)). Se identificó un fragmento anti-scFv humano que inhibía de forma potente la activación de C4 y C3 mediada por la ruta de la lectina en plasma humano (CI50-20 nM) y se convirtió en un anticuerpo IgG4 humano de longitud completa.
MC58 de N. meningitidis de serogrupo B se incubó con los diferentes sueros mostrados en TABLA 11, cada una a una concentración sérica de un 20 %, con o sin la adición de anticuerpo inhibidor anti-MASP-2 humano (3 |jg en 100 |jl de volumen total) a 37 °C con agitación. Se tomaron muestras en los siguientes momentos: intervalos de 0, 30, 60 y 90 minutos, se colocaron en placas y luego se determinaron los recuentos viables. Se utilizó suero humano inactivado por calor como control negativo.
Resultados:
La FIGURA 38 ilustra gráficamente el log ufc/ml de recuentos viables de MC58 de N. meningitidis de serogrupo B recuperada en diferentes puntos temporales en las muestras de suero humano que se muestran en la TABLA 11. La TABLA 12 proporciona los resultados de la prueba t de Student para la FIGURA 38.
TABLA 12: Resultados de la prueba t de Student para la FIGURA 38 (punto temporal 60 minutos)
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Como se muestra en la FIGURA 38 y la TABLA 12, la destrucción dependiente del complemento de N. meningitidis en suero humano al 20 % mejoró significativamente mediante la adición del anticuerpo inhibidor anti-MASP-2 humano.
2. Destrucción dependiente del complemento de N. m eningitid is en sueros de ratón deficientes en MASP-2 al 20 % (v/v).
En este experimento se utilizaron los siguientes sueros de ratón deficientes en complemento y sueros de ratón de control:
TABLA 13: Muestras de sueros de ratón analizadas (como se muestra en la FIGURA 39
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MC58 de N. meningitidis de serogrupo B se incubó con diferentes sueros de ratón deficientes en complemento, cada una a una concentración sérica de un 20 %, a 37 °C con agitación. Se tomaron muestras en los siguientes momentos: intervalos de 0, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos, se colocaron en placas y luego se determinaron los recuentos viables. Se utilizó suero humano inactivado por calor como control negativo.
Resultados:
La FIGURA 39 ilustra gráficamente el log ufc/ml de recuentos viables de MC58 de N. meningitidis serogrupo B recuperado en diferentes puntos temporales en las muestras de sueros de ratón que se muestran en la TABLA 13.
Como se muestra en la FIGURA 39, los sueros de ratón MASP-2 -/- tienen un mayor nivel de actividad bactericida para N. meningitidis que los sueros de ratón TS. El símbolo "**" indica p = 0,0058, el símbolo "***" indica p = 0,001. La TABLA 14 proporciona los resultados de la prueba t de Student para la FIGURA 39.
TABLA 14: Resultados de la prueba t de Student para la FIGURA 39
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En resumen, los resultados de este Ejemplo demuestran que los sueros MASP-2 -/-tienen un mayor nivel de actividad bactericida para N. meningitidis que los sueros TS.
EJEMPLO 33
Este Ejemplo demuestra el efecto inhibidor de la deficiencia de MASP-2 sobre la lisis de glóbulos rojos de muestras de sangre obtenidas de un modelo de ratón de hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN).
Antecedentes/Justificación:
La hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), también conocida como síndrome de Marchiafava-Micheli, es una enfermedad de la sangre adquirida, potencialmente mortal, caracterizada por anemia hemolítica intravascular inducida por el complemento. El rasgo característico de la HPN es la hemólisis intravascular crónica mediada por el complemento que es una consecuencia de la activación no regulada de la ruta alternativa del complemento debido a la ausencia de los reguladores del complemento CD55 y CD59 en los eritrocitos de la HPN, con posterior hemoglobinuria y anemia. Lindorfer, M.A., y col., Blood 115(11) (2010), Risitano, A.M, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535 (2011). La anemia en la HPN se debe a la destrucción de los glóbulos rojos en el torrente sanguíneo. Los síntomas de la HPN incluyen orina roja, debido a la aparición de hemoglobina en la orina, dolor de espalda, astenia, dificultad para respirar y trombosis. La HPN puede desarrollarse por sí sola, denominada "HPN primaria" o en el contexto de otros trastornos de la médula ósea tales como anemia aplásica, denominada "HPN secundaria". El tratamiento para la HPN incluye transfusión de sangre para la anemia, anticoagulación para la trombosis y el uso del anticuerpo monoclonal eculizumab (Soliris®), que protege las células sanguíneas contra la destrucción inmunitaria mediante la inhibición del sistema del complemento (Hillmen P. y col., N. Engl. J. Med.
350(6):552-9 (2004)). Eculizumab (Soliris®) es un anticuerpo monoclonal humanizado que se dirige al componente del complemento C5, bloqueando su escisión mediante C5 convertasas, evitando así la producción de C5a y el ensamblaje del MAC. El tratamiento de pacientes con HPN con eculizumab ha dado como resultado una reducción de la hemólisis intravascular, medida mediante lactato deshidrogenasa (LDH), que conduce a la estabilización de la hemoglobina y la independencia de la transfusión en aproximadamente la mitad de los pacientes (Hillmen P, y col., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, vol 11(6) (2011)). Si bien casi todos los pacientes que reciben tratamiento con eculizumab alcanzan niveles de LDH normales o casi normales (debido al control de la hemólisis intravascular), solo alrededor de un tercio de los pacientes alcanzan un valor de hemoglobina superior a 11 gr/dl, y el resto de los pacientes tratados con eculizumab continúan presentando anemia de moderada a grave (es decir., dependiente de transfusión), en proporciones aproximadamente iguales (Risitano A.M. y col., Blood 113:4094-100 (2009)). Como se describe en Risitano y col., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11:528-535 (2011), se demostró que los pacientes con HPN que tomaban eculizumab contenían fragmentos C3 unidos a una parte sustancial de sus eritrocitos de HPN (mientras que los pacientes no tratados no), lo que lleva a la conclusión de que los fragmentos C3 unidos a la membrana funcionan como opsoninas en los eritrocitos de HPN, dando como resultado su atrapamiento en las células reticuloendoteliales a través de receptores C3 específicos y posterior hemólisis extravascular. Por tanto, se necesitan estrategias terapéuticas además del uso de eculizumab para aquellos pacientes que desarrollan hemólisis extravascular mediada por fragmentos C3 porque continúan requiriendo transfusiones de glóbulos rojos.
Este Ejemplo describe procedimientos para evaluar el efecto del suero deficiente en MASP-2 y el suero tratado con un agente inhibidor de MASP-2 sobre la lisis de glóbulos rojos de muestras de sangre obtenidas de un modelo de ratón de HPN y demuestra la eficacia de la inhibición de MASP-2 para tratar a sujetos que padecen HPN y también apoya el uso de inhibidores de MASP-2 para mejorar los efectos de la hemólisis extravascular mediada por fragmentos C3 en sujetos con HPN sometidos a tratamiento con un inhibidor de C5 como eculizumab.
Procedimientos:
Modelo animal de HPN:
Se obtuvieron muestras de sangre de ratones dirigidos a genes con deficiencias de Crry y C3 (Crry/C3-/-) y ratones deficientes en CD55/CD59. A estos ratones les faltan los respectivos reguladores del complemento de superficie y sus eritrocitos son, por lo tanto, susceptibles a la autólisis espontánea del complemento como lo son las células sanguíneas humanas de HPN.
Para sensibilizar aún más a estos eritrocitos, estas células se usaron con y sin recubrimiento mediante manano y luego se analizaron para detectar hemólisis en plasma TS C56/BL6, plasma nulo MBL, plasma MASP-2 -/-, SHN humano, plasma MBL -/- humano y SHN tratado con anticuerpo humano anti-MASP-2.
1. Ensayo de hemólisis de eritrocitos murinos doblemente deficientes en Crry/C3 y CD55/CD59 en controles y sueros agotados y deficientes en MASP-2
Día 1. Preparación de eritrocitos murinos (± recubrimiento de manano)
Materiales incluidos: sangre fresca de ratón, BBS/Mg2 'California2* (Ácido barbitúrico 4,4 mM, barbitona sódica 1,8 mM, NaCl 145 mM, pH 7,4, Mg2+ 5 mM, Ca2+ 5 mM), cloruro de cromo, CrCl3-6H20 (0,5 mg/ml en BBS/Mg2+/Ca2+) y manano, 100 pg/ml en BBS/Mg2+/Ca2+.
Se centrifugó sangre completa (2 ml) durante 1-2 min a 2000xg en una centrífuga refrigerada a 4 °C. Se aspiraron el plasma y la capa leucocitaria. Después, la muestra se lavó tres veces resuspendiendo el sedimento de eritrocitos en 2 ml de BBS/gelatina/Mg2+/Ca2+ enfriados con hielo y repitiendo la etapa de centrifugación. Después del tercer lavado, el sedimento se resuspendió en 4 ml de BBS/Mg2+/Ca2+. Se apartó una alícuota de 2 ml de eritrocitos como control sin recubrir. A los 2 ml restantes, se añadieron 2 ml de CrCl3 y 2 ml de manano y la muestra se incubó mezclando suavemente a temperatura ambiente durante 5 minutos. La reacción se terminó mediante la adición de 7,5 ml de BBS/gelatina/Mg2+/Ca2+. La muestra se centrifugó como arriba, se resuspendió en 2 ml de BBS/gelatina/Mg2+/Ca2+ y se lavó dos veces más como antes, luego se almacenó a 4 °C.
Día 2. Ensayo de hemólisis
Materiales incluidos BBS/gelatina/Mg2+/Califomia2+ (como anteriormente), sueros de prueba, placas de 96 pocillos de fondo redondo y plano y un espectrofotómetro que lee placas de 96 pocillos a 410-414 nm.
Primero se determinó la concentración de eritrocitos y las células se ajustaron a 109/ml y se almacenaron a esta concentración. Antes de su uso, el tampón de ensayo se diluyó a 108/ml, y luego se utilizaron 100 pl por pocillo. La hemólisis se midió a 410-414 nm (lo que permite una mayor sensibilidad que la de 541 nm). Se prepararon diluciones de sueros de prueba en BBS/gelatina/Mg2+/Ca2+ enfriados con hielo. Se pipetearon 100 pl de cada dilución de suero en una placa de fondo redondo (véase disposición de la placa). Se añadieron 100 pl de preparación de eritrocitos adecuadamente diluida (es decir, 108/ml) (véase disposición de la placa), se incubó a 37 °C durante aproximadamente 1 hora y se observó la lisis. (Las placas pueden fotografiarse en este punto). A continuación, la placa se centrifugó a velocidad máxima durante 5 minutos. Se aspiraron 100 pl de la fase líquida, se transfirió a placas de fondo plano y se registró la DO a 410-414 nm. Se retuvieron los sedimentos de eritrocitos (estos pueden posteriormente lisarse con agua para obtener un resultado inverso).
Experimento n.° 1:
Se obtuvo sangre fresca de ratones con doble deficiencia en CD55/CD59 y se preparó sangre de ratones con doble deficiencia en Crry/C3 y eritrocitos como se describe en detalle en el protocolo anterior. Las células se dividieron y la mitad de las células se recubrieron con manano y la otra mitad se dejó sin tratar, ajustando la concentración final a 1x 108 por ml, de los cuales 100 pl se utilizaron en el ensayo de hemólisis, que se llevó a cabo como se describe anteriormente.
Resultados del experimento n.° 1: La ruta de la lectina está implicada en la lisis de eritrocitos en el modelo animal de HPN
En un experimento inicial, se determinó que los eritrocitos de ratón TS no recubiertos no se lisaron en ningún suero de ratón. Se determinó además que los eritrocitos de ratón Crry-/- recubiertos con manano se lisaron lentamente (más de 3 horas a 37 grados) en suero de ratón TS, pero no se lisaron en suero nulo de MBL. (Datos no mostrados).
Se determinó que los eritrocitos de ratón Crry-/- recubiertos con manano se lisaron rápidamente en suero humano pero no en SHN inactivado por calor. De manera importante, se lisaron eritrocitos de ratón Crry-/- recubiertos con manano en SHN diluido hasta 1/640 (es decir, diluciones 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640 todas lisadas). (Datos no mostrados). En esta dilución, la ruta alternativa no funciona (la actividad funcional de la RA se reduce significativamente por debajo de un 8 % de la concentración sérica).
Conclusiones del Experimento n.° 1
Los eritrocitos de ratón Crry-/- recubiertos de manano se lisan muy bien en suero humano altamente diluido con MBL, pero no en el que no tiene MBL. La lisis eficaz en cada concentración sérica probada implica que la ruta alternativa no está implicada o no es necesaria para esta lisis. La incapacidad del suero de ratón y del suero humano deficientes en MBL para lisar los eritrocitos de ratón Crry-/- recubiertos de manano indica que la ruta clásica tampoco tiene nada que ver con la lisis observada. Como se requieren moléculas de reconocimiento de la ruta de la lectina (es decir, MBL), esta lisis está mediada por la ruta de la lectina.
Experimento n.° 2:
Se obtuvo sangre fresca de los ratones doblemente deficientes en Crry/C3 y CD55/CD59 y se analizaron eritrocitos de ratón Crry-/- recubiertos con manano en el ensayo de hemólisis como se describe anteriormente en presencia del siguiente suero humano: MBL nulo; TS; SHN tratado previamente con anticuerpo humano anti-MASP-2; y SHN inactivado por calor como control.
Resultados del experimento n.° 2: Los inhibidores de MASP-2 evitan la lisis de eritrocitos en el modelo animal de HPN
Con los eritrocitos de ratón Crry-/- recubiertos de manano, se incubó SHN en las diluciones diluidas hasta 1/640 (es decir, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640), suero MBL-/- humano, SHN tratado previamente con AcM anti-MASP-2 y SHN inactivado por calor como control.
La placa de microtitulación de ELISA se centrifugó y los eritrocitos no lisados se recogieron en el fondo de la placa de pocillos redondos. Se recogió el sobrenadante de cada pocillo y se midió la cantidad de hemoglobina liberada de los eritrocitos lisados mediante la lectura de la DO415 nm en un lector de ELISA.
En el SHN de control inactivado por calor (control negativo), tal como se esperaba, no se observó lisis. EL suero humano MBL-/- lisó eritrocitos de ratón recubiertos con manano en diluciones 1/8 y 1/16. El SHN tratado previamente con anticuerpo anti-MASP-2 lisó eritrocitos de ratón recubiertos con manano en diluciones 1/8 y 1/16 mientras que el suero humano TS lisó eritrocitos de ratón recubiertos con manano hasta diluciones de 1/32.
La FIGURA 40 ilustra gráficamente la hemólisis (medida por la liberación de hemoglobina de eritrocitos de ratón lisados (Cryy/C3-/-) en el sobrenadante medida mediante fotometría) de eritrocitos murinos recubiertos de manano mediante suero humano en un intervalo de concentraciones séricas en suero a partir de SHN inactivado por calor (IC), MBL-/-, SHN tratado previamente con anticuerpo anti-MASP-2 y SHN de control.
De los resultados que se muestran en la FIGURA 40, está demostrado que la inhibición de MASP-2 con anticuerpo anti-MASP-2 desplazó significativamente el CH50 e inhibió la lisis mediada por complemento de eritrocitos sensibilizados con protección deficiente frente a la activación del complemento autóloga.
Experimento n.° 3
La sangre fresca obtenida de los ratones doblemente deficientes en Crry/C3 y CD55/CD59 en eritrocitos de ratón Crry-/- no recubiertos se analizó en el ensayo de hemólisis como se describe anteriormente en presencia del siguiente suero: MBL -/-; sueros TS; SHN tratado previamente con anticuerpo humano anti-MASP-2 y SHN inactivado por calor como control.
Resultados:
La FIGURA 41 ilustra gráficamente la hemólisis (medida por la liberación de hemoglobina de eritrocitos de ratón TS lisados en el sobrenadante medida mediante fotometría) de eritrocitos murinos no recubiertos mediante suero humano en un intervalo de concentraciones séricas en suero a partir de SHN inactivado por calor (IC), MBL-/-, SHN tratado previamente con anticuerpo anti-MASP-2 y SHN de control. Como se muestra en la FIGURA 41, se demuestra que la inhibición de MASP-2 inhibe la lisis mediada por complemento de eritrocitos de ratón TS no sensibilizados.
La FIGURA 42 ilustra gráficamente la hemólisis (medida por la liberación de hemoglobina de eritrocitos de ratón lisados (CD55/59 -/-) en el sobrenadante medida mediante fotometría) de eritrocitos murinos no recubiertos mediante suero humano en un intervalo de concentración sérica en suero a partir de SHN inactivado por calor (IC), MBL-/-, SHN tratado previamente con anticuerpo anti-MASP-2 y SHN de control.
TABLA 12: Valores de CH50 expresados como concentraciones séricas
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En resumen, los resultados de este Ejemplo demuestran que la inhibición de MASP-2 inhibe la lisis mediada por complemento de eritrocitos sensibilizados y no sensibilizados con una protección deficiente frente a la activación del complemento autóloga. Por tanto, los inhibidores de MASP-2 pueden usarse para tratar sujetos que padecen HPN, y también pueden usarse para mejorar (es decir,, inhibir, prevenir o reducir la gravedad de) la hemólisis extravascular en pacientes con HPN que reciben tratamiento con un inhibidor de C5 tal como eculizumab (Soliris®).
EJEMPLO 34
Este Ejemplo describe un estudio de seguimiento del estudio descrito anteriormente en el Ejemplo 29, proporcionando más pruebas que confirman que un inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo MASP-2, es eficaz para el tratamiento de la exposición a la radiación y/o para el tratamiento, mejora o prevención del síndrome de radiación aguda.
Fundamento: En el estudio inicial descrito en el Ejemplo 29, se demostró que el tratamiento de irradiación previa con un anticuerpo anti-MASP-2 en ratones aumentó la supervivencia de los ratones irradiados en comparación con los animales de control irradiados tratados con vehículo a niveles de exposición de 6,5 Gy y 7,0 Gy. En el Ejemplo 29 se demostró además que al nivel de exposición de 6,5 Gy, el tratamiento posterior a la irradiación con anticuerpo anti-MASP-2 dio como resultado un modesto aumento de la supervivencia en comparación con los animales de control irradiados con vehículo. Este Ejemplo describe un segundo estudio de radiación que se llevó a cabo para confirmar los resultados del primer estudio.
Procedimientos:
Diseño del Estudio A:
Se expusieron ratones Swiss Webster (n = 50) a radiación ionizante (8,0 Gy). Se evaluó el efecto del tratamiento con anticuerpos anti-MASP-2 (AcMH6 5 mg/kg), administrado 18 horas antes y 2 horas después de la exposición a la radiación, y luego semanalmente, sobre la mortalidad.
Resultados del Estudio A:
Como se muestra en la FIGURA 43, se determinó que la administración del anticuerpo anti-MASP-2 AcMH6 aumentó la supervivencia en ratones expuestos a 8.0 Gy, con una tasa de supervivencia mediana ajustada que aumentó de 4 a 6 días en comparación con ratones que recibieron control de vehículo, y una mortalidad reducida en un 12 % en comparación con los ratones que recibieron control de vehículo (prueba del orden logarítmico, p = 0,040).
Diseño del Estudio B:
Se expusieron ratones Swiss Webster (n = 50) a radiación ionizante (8.0 Gy) en los siguientes grupos (I: vehículo) control de solución salina; (II: bajo) anticuerpo anti-MASP-2 AcMH6 (5 mg/kg) administrado 18 horas antes de la irradiación y 2 horas después de la irradiación; (III: alto) AcMH6 (10 mg/kg) administrado 18 horas antes de la irradiación y 2 horas después de la irradiación; y (IV: alto posterior) AcMH6 (10 mg/kg) administrado solamente 2 horas después de la irradiación.
Resultados del Estudio B:
La administración de anticuerpo anti-MASP-2 antes y después de la irradiación ajustó la supervivencia media de 4 a 5 días en comparación con los animales que recibieron el control de vehículo. La mortalidad en los ratones tratados con anticuerpo anti-MASP-2 se redujo en un 6-12 % en comparación con los ratones de control de vehículo. Se observa además que no se observaron efectos de tratamiento perjudiciales significativos (datos no mostrados).
En resumen, los resultados mostrados en este Ejemplo son coherentes con los resultados mostrados en el Ejemplo 29 y demuestran además que los anticuerpos anti-MASP-2 son eficaces en el tratamiento de un sujeto mamífero en riesgo de o que padece los efectos perjudiciales del síndrome de radiación aguda.
EJEMPLO 35
Este Estudio investiga el efecto de la deficiencia de MASP-2 en un modelo de ratón de trombosis inducida por LPS (lipopolisacárido).
Fundamento:
El síndrome urémico hemolítico (SUH), que se produce por una infección por E. coli que produce la toxina Shiga, es la principal causa de insuficiencia renal aguda en niños. En este Ejemplo, se llevó a cabo un modelo de Schwartzman de trombosis (coagulación microvascular) inducida por LPS en ratones MASP-2 -/- (KO) para determinar si la inhibición de MASP-2 es eficaz para inhibir o evitar la formación de trombos intravasculares.
Procedimientos:
Se analizaron ratones MASP-2-/- (n = 9) y TS (n = 10) en un modelo de Schwarztman de trombosis (coagulación microvascular) inducida por LPS. A los ratones se les administró LPS Serratia y se controló la formación de trombos a lo largo del tiempo. Se llevó a cabo una comparación de la incidencia de coagulación microvascular inducida por LPS y microtrombos.
Resultados:
De forma notable, todos los ratones MASP-2 -/- probados (9/9) no formaron trombos intravasculares después de la administración de LPS Serratia. Por el contrario, se detectaron microtrombos en 7 de 10 de los ratones TS probados en paralelo (p = 0,0031, prueba exacta de Fischer). Como se muestra en la FIGURA 44, se midió el tiempo hasta el inicio de la oclusión microvascular después de la infección por LPS en ratones MASP-2-/- y TS, que muestra el porcentaje de ratones TS con formación de trombos medido durante 60 minutos, con formación de trombos detectada tan pronto como aproximadamente 15 minutos. Hasta un 80 % de los ratones TS demostraron formación de trombos a los 60 minutos. Por el contrario, como se muestra en la FIGURA 44, ninguno de los MASP-2 -/- tuvo formación de trombos a los 60 minutos (orden logarítmico: p = 0,0005).
Estos resultados demuestran que la inhibición de MASP-2 protege contra el desarrollo de trombos intravasculares en un modelo de SUH.
EJEMPLO 36
Este Ejemplo describe el efecto de anticuerpos anti-MASP-2 en un modelo de ratón de SUH usando inyección conjunta intraperitoneal de Toxina Shiga 2 (TXS2) purificada más LPS.
Antecedentes:
Se desarrolló un modelo de ratón de SUH usando inyección conjunta intraperitoneal de toxina de Shiga 2 (TXS2) purificada más LPS. El análisis bioquímico y de micromatrices de riñones de ratón reveló que la exposición a TXS2 más LPS es distinta de los efectos de cada agente solo. El análisis de sangre y suero de estos ratones mostró neutrofilia, trombocitopenia, hemólisis de glóbulos rojos y aumento de creatinina sérica y nitrógeno ureico en sangre. Además, el análisis histológico y la microscopía electrónica de riñones de ratón demostraron depósito de fibrina glomerular, congestión de glóbulos rojos, formación de microtrombos y cambios ultraestructurales glomerulares. Se estableció que este modelo de SUH induce todos los síntomas clínicos de la patología del SUH humano en ratones C57BL/6, incluyendo trombocitopenia, anemia hemolítica e insuficiencia renal que definen la enfermedad humana. (J. Immunol 187(1):172-80 (2011))
Procedimientos:
Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 que pesaban entre 18 y 20 g en Charles River Laboratories y se dividieron en 2 grupos (5 ratones en cada grupo). Un grupo de ratones se trató previamente mediante inyección intraperitoneal (i.p.) con el anticuerpo recombinante anti-MASP-2 AcMM11 (100 |jg por ratón; correspondiente a una concentración final de 5 mg/kg de peso corporal) diluido en un volumen total de 150 j l de solución salina. El grupo de control recibió solución salina sin ningún anticuerpo. Seis horas después de la inyección i.p. del anticuerpo anti-MASP-2 AcMM11, todos los ratones recibieron una inyección i.p. combinada de una dosis subletal (3 jg/animal; correspondiente a 150 jg/kg de peso corporal) de LPS de Serratia marcescens (L6136; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y una dosis de 4,5 ng/animal (correspondiente a 225 ng/kg) de TXS2 (dos veces la dosis de LD50) en un volumen total de 150 jl. Se utilizó una inyección de solución salina para el control.
La supervivencia de los ratones se controló cada 6 horas después de la dosificación. Los ratones se sacrificaron tan pronto como alcanzaron la etapa letárgica de la patología del SUH. Después de 36 horas, se sacrificaron todos los ratones y se extrajeron ambos riñones para inmunohistoquímica y microscopía electrónica de barrido. Se tomaron muestras de sangre al final del experimento mediante punción cardíaca. El suero se separó y se mantuvo congelado a -80 °C para medir los niveles de NUS y creatinina en suero en los grupos tratados y de control.
Inmunohistoquímica
Un tercio de cada riñón de ratón se fijó en paraformaldehído al 4 % durante 24 horas, se procesó y embebió en parafina. Se cortaron secciones de tres micrómetros de grosor y se colocaron en portaobjetos cargados para la tinción posterior con tinción H&E.
Microscopía electrónica
La sección media de los riñones se cortó en bloques de aproximadamente 1 a 2 mm3y se fijó durante la noche a 4 °C en glutaraldehído al 2,5 % en 1x PBS. Posteriormente, el tejido fijado se procesó mediante la instalación de microscopía electrónica de la Universidad de Leicester
Secciones de crióstato
El otro tercio de los riñones se cortó en bloques de aproximadamente 1 a 2 mm3 y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se mantuvieron a -80 °C para secciones de crióstato y análisis de ARNm.
Resultados:
La FIGURA 45 ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de ratones de control tratados con solución salina (n = 5) y ratones tratados con anticuerpo anti-MASP-2 (n = 5) en el modelo inducido por TXS/LPS a lo largo del tiempo (horas). De forma notable, como se muestra en la FIGURA 45, todos los ratones de control murieron a las 42 horas. En agudo contraste, el 100 % de los ratones tratados con anticuerpo anti-MASP-2 sobrevivieron durante el transcurso del tiempo del experimento. De acuerdo con los resultados que se muestran en la FIGURA 45, se observó que todos los ratones no tratados que murieron o tuvieron que ser sacrificados con signos de enfermedad intensa tenían lesiones glomerulares significativas, mientras que los glomérulos de todos los ratones tratados con anti-MASP-2 parecían normales (datos no mostrados). Estos resultados demuestran que los inhibidores de MASP-2, tal como anticuerpos anti-MASP-2, pueden utilizarse para tratar a sujetos que padecen o están en riesgo de desarrollar una microangiopatía trombótica (MAT), tal como el síndrome urémico hemolítico (SUH), SUH atípico (SUHa) o púrpura trombocitopénica trombótica (PTT).
EJEMPLO 37
Este Ejemplo describe el efecto de la deficiencia de MASP-2 y la inhibición de MASP-2 en un modelo murino de trombosis de lesión de células endoteliales inducida por FITC-dextrano/luz.
Antecedentes/Justificación: Como se demuestra en los Ejemplos 35 y 36, la deficiencia de MASP-2 (MASP-2 KO) y la inhibición de MASP-2 (mediante la administración de un anticuerpo inhibidor de MASP-2) protege a los ratones en un modelo de SUH normal, en el que todos los ratones de control expuestos a TXS y LPS desarrollaron SUH grave y se volvieron moribundos o murieron en 48 horas. Por ejemplo, como se muestra en la FIGURA 54, todos los ratones tratados con un anticuerpo inhibidor de MASP-2 y luego expuestos a TXS y LPS sobrevivieron (prueba exacta de Fisher p < 0,01; N = 5). Por tanto, la terapia anti-MASP-2 protege a los ratones en este modelo de SUH.
Los siguientes experimentos se llevaron a cabo para analizar el efecto de la deficiencia de MASP-2 y la inhibición de MASP-2 en un modelo de microangiopatía trombótica (MAT) de lesión de células endoteliales inducida por isotiocianato de fluoresceína (FITC, por sus siglas en inglés)-dextrano con el fin de demostrar aún más el beneficio de inhibidores de MASP-2 para el tratamiento del SUH, SUHa, PTT y MAT con otros orígenes.
Procedimientos:
Microscopía intravital
Se prepararon ratones para microscopía intravital como describe Frommhold y col., BMC Immunology 12:56-68, 2011. En resumen, se anestesiaron los ratones con inyección intraperitoneal (i.p.) de cetamina (125 mg/kg de peso corporal, Ketanest, Pfitzer GmbH, Karlsruhe, Alemania) y xilacina (12,5 mg/kg de peso corporal; Rompun, Bayer, Leverkusen, Alemania) y se coloca sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal a 37 °C. La microscopía intravital se realizó en un microscopio vertical (Leica, Wetzlar, Alemania) con un objetivo de inmersión en solución salina (apertura numérica SW 40/0,75, Zeiss, Jena, Alemania). Para facilitar la respiración, los ratones se intubaron usando tubos de PE 90 (Becton Dickson and Company, Sparks, MD, EE.UU.). Se colocó una cánula en la arteria carótida izquierda con un tubo de PE10 (Becton Dickson and Company, Sparks, MD, EE.UU.) para la toma de muestras de sangre y la administración de anticuerpos monoclonales (AcM) sistémicos.
Preparación del músculo cremáster
La preparación quirúrgica del músculo cremáster para microscopía intravital se realizó según lo descrito por Sperandio y col., Blood, 97:3812-3819, 2001. En resumen, se abrió el escroto y se movilizó el músculo cremáster. Después de la incisión longitudinal y la extensión del músculo sobre un cubreobjetos, el epidídimo y los testículos se movieron y se inmovilizaron a un lado, dando acceso microscópico completo a la microcirculación del músculo cremáster. Las vénulas del músculo cremáster se registraron mediante una cámara CCD (CF8/1; Kappa, Gleichen, Alemania) en una grabadora Panasonic S-VHS. El músculo cremáster se superfundió con termocontrolado (solución salina tamponada con bicarbonato a 35 °C) como describió anteriormente Frommhold. y col., BMC Immunology 12:56-68, 20112011.
Modelo de lesión de FITC dextrano de excitación ligera
Se indujo una lesión vascular controlada, dependiente de la dosis de luz, del endotelio de las vénulas y arteriolas del músculo cremáster mediante la excitación por luz de fototóxico (FITC)-dextrano (n.° de cat. FD150S, Sigma Aldrich, Poole, Reino Unido). Este procedimiento inicia una trombosis localizada. Como reactivo fototóxico, se inyectaron 60 |jl de una solución al 10 % p/v de FITC-dextrano a través del acceso de la arteria carótida izquierda y se dejó que se extendiera homogéneamente por toda la sangre circulante durante 10 minutos. Después de seleccionar una vénula bien perfundida, la luz halógena de intensidad baja a media (800-1500) se enfocó en el vaso de interés para inducir la fluorescencia de FITC-dextrano y una fototoxicidad leve a moderada en la superficie endotelial con el fin de estimular la trombosis de manera reproducible y controlada. La intensidad de luz fototóxica necesaria para la excitación de FITC-dextrano se generó utilizando una lámpara halógena (12V, 100W, Zeiss, Oberkochen, Alemania). La fototoxicidad resultante de la excitación inducida por la luz del fluorocromo requiere un umbral de intensidad de la luz y/o duración de la iluminación y se produce por el calentamiento directo de la superficie endotelial o por la generación de radicales reactivos de oxígeno como lo describe Steinbauer. y col., Langenbecks Arch Surg 385:290-298, 2000.
La intensidad de la luz aplicada a cada vaso se midió para su ajuste mediante un detector de diodo corrector de longitud de onda para mediciones de baja potencia (Labmaster LM-2, Coherent, Auburn, Estados Unidos). El análisis fuera de línea de los escaneos de vídeo se realizó mediante un sistema de análisis de microcirculación asistido por computadora (CAMAS, Dr. Zeintl, Heidelberg) y se midió la velocidad de los glóbulos rojos según lo descrito por Zeintl y col., Int J Microcirc Clin Exp, 8(3):293-302, 2000.
Aplicación de anticuerpo inhibidor monoclonal anti-MASP-2 humana (AcMH6) y control de vehículo antes de la inducción de trombosis
Usando un diseño de estudio ciego, se administraron a ratones machos de camada C57BL/6 TS de 9 semanas de edad inyecciones i.p. del anticuerpo monoclonal recombinante MASP-2 humana (AcMH6), un inhibidor de la actividad funcional de MASP-2 (administrado a una concentración final de 10 mg/kg de peso corporal), o la misma cantidad de un anticuerpo de control de isotipo (sin actividad inhibidora de MASP-2) 16 horas antes de la inducción fototóxica de trombosis en el modelo cremáster de microscopía intravital. Una hora antes de la inducción de trombosis, se administró una segunda dosis de AcMH6 o del anticuerpo de control. En este modelo también se evaluaron ratones con inactivación de MASP-2 (KO).
El AcMH6 (establecido contra MASP-2 humana recombinante) es un potente inhibidor de la actividad funcional de MASP-2 humana, que reacciona de forma cruzada con, se une a e inhibe, MASP-2 de ratón pero con menor afinidad debido a su especificidad de especie (datos no mostrados). Para compensar la menor afinidad del AcMH6 por MASP-2 de ratón, se administró AcMH6 en una concentración alta (10 mg/kg de peso corporal) para superar la variación en la especificidad de la especie y la menor afinidad por MASP-2 de ratón, para proporcionar un bloqueo eficaz de la actividad funcional de m As P-2 murina en condiciones in vivo.
En este estudio ciego, se registró el tiempo requerido para cada vénula individual analizada (los criterios de selección fueron por diámetros y velocidades de flujo sanguíneo comparables) para ocluir completamente.
El porcentaje de ratones con oclusión microvascular, el tiempo de aparición y el tiempo de oclusión se evaluaron durante un período de observación de 60 minutos utilizando grabaciones de vídeo de microscopía intravital.
Resultados:
La FIGURA 46 ilustra gráficamente, en función del tiempo después de la inducción de la lesión, el porcentaje de ratones con oclusión microvascular en el modelo UV FITC/Dextrano después del tratamiento con control de isotipo o anticuerpo humano MASP-2 AcMH6 (10 mg/kg) dosificado a las 16 horas y 1 hora antes de la inyección de FITC/Dextrano. Como se muestra en la FIGURA 46, un 85 % de los ratones de tipo silvestre que recibieron el anticuerpo de control de isotipo ocluyeron en 30 minutos o menos, mientras que solo un 19 % de los ratones de tipo silvestre tratados previamente con el anticuerpo MASP-2 humano (AcMH6) ocluyeron dentro del mismo período de tiempo, y el tiempo de oclusión se retrasó en los ratones que finalmente ocluyeron en el grupo tratado con anticuerpos MASP-2 humanos. Se observa además que tres de los ratones tratados con AcMH6 m As P-2 no se ocluyeron en absoluto dentro del período de observación de 60 minutos (es decir, estaban protegidos de la oclusión trombótica).
La FIGURA 47 ilustra gráficamente el tiempo de oclusión en minutos para ratones tratados con el anticuerpo MASP-2 humano (AcMH6) y el anticuerpo de control de isotipo. Los datos se presentan como puntos de dispersión con valores medios (barras horizontales) y barras de error estándar (barras verticales). Esta figura muestra el tiempo de oclusión en los ratones en los que se observó oclusión. Por tanto, los tres ratones tratados con anticuerpo MASP-2 que no ocluyeron durante el período de observación de 60 minutos no se incluyeron en este análisis (no hubo ningún ratón tratado de control que no ocluyera). La prueba estadística utilizada para el análisis fue la prueba t para datos no apareados; en la que el símbolo "*" indica p = 0,0129. Como se muestra en la FIGURA 47, en los cuatro ratones tratados con anticuerpo MASP-2 (AcMH6) que ocluyeron, el tratamiento con anticuerpo MASP-2 aumentó significativamente el tiempo de oclusión venosa en el modelo de trombosis de lesión de células endoteliales inducida por FITC-dextrano/luz con baja intensidad de luz (800-1500) en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo de control de isotipo. El promedio del tiempo de oclusión total del control de isotipo fue de 19,75 minutos, mientras que el promedio del tiempo de oclusión total para el grupo tratado con anticuerpo MASP-2 fue de 32,5 minutos.
La FIGURA 48 ilustra gráficamente el tiempo hasta la oclusión en minutos para ratones de tipo silvestre, ratones MASP-2 KO y ratones de tipo silvestre tratados previamente con anticuerpo MASP-2 humano (AcMH6) administrado i.p. a 10 mg/kg 16 horas antes, y luego administrado nuevamente i.v. 1 hora antes de la inducción de trombosis en el modelo de trombosis de lesión de células endoteliales inducida por FITC-dextrano/luz con baja intensidad de luz (800­ 1500). En la FIGURA 48 solo se incluyeron los animales que ocluyeron; n = 2 para ratones de tipo silvestre que reciben anticuerpo de control de isotipo; n = 2 para MASP-2 KO; y n = 4 para ratones de tipo silvestre que reciben anticuerpo MASP-2 humano (AcMH6). El símbolo "*" indica p < 0,01. Como se muestra en la FIGURA 48, la deficiencia de MASP-2 y la inhibición de MASP-2 (AcMH6 a 10 mg/kg) aumentaron el tiempo de oclusión venosa en el modelo de trombosis de lesión de células endoteliales inducida por FITC-dextrano/luz con baja intensidad de luz (800-1500).
Conclusiones:
Los resultados de este Ejemplo demuestran además que un agente inhibidor de MASP-2 que bloquea la ruta de la lectina (por ejemplo, anticuerpos que bloquean la función de MASP-2), inhibe la coagulación microvascular y la trombosis, los rasgos característicos de múltiples trastornos microangiopáticos, en un modelo de ratón de MAT. Por tanto, se espera que la administración de un agente inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo inhibidor de MASP-2, sea un tratamiento eficaz en pacientes que padecen SUH, SUHa, PTT u otros trastornos microangiopáticos y brindan protección contra la coagulación microvascular y la trombosis.
EJEMPLO 38
Este Ejemplo describe un estudio que demuestra que el anticuerpo inhibidor de MASP-2 humano (AcMH6) no tiene efecto sobre la función plaquetaria en plasma humano rico en plaquetas.
Antecedentes/Justificación: Como se describe en el Ejemplo 37, se demostró que la inhibición de MASP-2 con el anticuerpo inhibidor de MASP-2 humano (AcMH6) aumentó el tiempo de oclusión venosa en el modelo de trombosis de lesión de células endoteliales inducida por FITC-dextrano/luz. Se llevó a cabo el siguiente experimento para determinar si el anticuerpo inhibidor de MASP-2 (AcMH6) tiene un efecto sobre la función plaquetaria.
Procedimientos: El efecto del anticuerpo AcMH6 MASP-2 humano se probó sobre la agregación de plaquetas inducida por ADP como sigue. Se añadió AcMH6 MASP-2 humano a una concentración de 1 pg/ml o 0,1 pg/ml en una solución de 40 pl a 360 pl de plasma humano rico en plaquetas recién preparado. Se utilizó un anticuerpo de control de isotipo como control negativo. Después de añadir los anticuerpos al plasma, se indujo activación plaquetaria mediante la adición de ADP a una concentración final de 2 pM. El ensayo se inició mediante agitación de las soluciones con un pequeño imán en la cubeta de 1 ml. La agregación plaquetaria se midió en un agregómetro de plaquetas Chrono-log de dos canales Modelo 700 de sangre total/agregómetro óptico de luminiscencia.
Resultados:
El porcentaje de agregación en las soluciones se midió durante un período de tiempo de cinco minutos. Los resultados se muestran a continuación en la TABLA 13.
TABLA 13: Agregación plaquetaria durante un período de cinco minutos.
Figure imgf000105_0001
Como se muestra arriba en la TABLA 13, no se observó ninguna diferencia significativa entre la agregación de las plaquetas inducidas por ADP tratadas con el anticuerpo de control o el anticuerpo MASP-2 AcMH6. Estos resultados demuestran que el anticuerpo MASP-2 humano (AcMH6) no tiene ningún efecto sobre la función plaquetaria. Por tanto, los resultados descritos en el Ejemplo 37 que demuestran que la inhibición de MASP-2 con el anticuerpo inhibidor de MASP-2 humano (AcMH6) aumentó el tiempo de oclusión venosa en el modelo de trombosis de lesión de células endoteliales inducida por FITC-dextrano/luz, no se debieron a un efecto del AcMH6 sobre la función plaquetaria. Por tanto, la inhibición de MASP-2 evita la trombosis sin afectar directamente la función plaquetaria, revelando un mecanismo terapéutico que es distinto de los agentes antitrombóticos existentes.
EJEMPLO 39
Este Ejemplo describe el efecto de la inhibición de MASP-2 sobre la formación de trombos y la oclusión de vasos en un modelo murino de MAT.
Antecedentes/Justificación: La ruta de la lectina juega un papel dominante en la activación del sistema del complemento en situaciones de estrés o lesión de células endoteliales. Esta activación se amplifica rápidamente por la ruta alternativa, que está desregulada en muchos pacientes que presentan SUHa. Por lo tanto, se espera que la prevención de la activación de MASP-2 y la ruta de la lectina detenga la secuencia de reacciones enzimáticas que conducen a la formación del complejo de ataque a membrana, activación plaquetaria y reclutamiento de leucocitos. Este efecto limita el daño tisular.
Además, MASP-2 tiene actividad similar al factor Xa y escinde la protrombina para formar trombina. Esta activación impulsada por MASP-2 del sistema de coagulación puede desequilibrar la hemostasia y dar como resultado la patología de la MAT. Por tanto, la inhibición de MASP-2 usando un inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo inhibidor de MASP-2 que bloquea la activación del complemento y los sistemas de coagulación, se espera que mejore los resultados en el SUHa y otras afecciones relacionadas con la MAT.
Como se describe en el Ejemplo 37, se demostró que la inhibición de MASP-2 con el anticuerpo inhibidor de MASP-2 humano (AcMH6) aumentó el tiempo de oclusión venosa en el modelo de trombosis de lesión de células endoteliales inducida por FITC-dextrano/luz. En este modelo de MAT, los ratones se sensibilizaron mediante inyección IV de FITC-dextrano, seguida de fotoactivación localizada del FITC-dextrano en la microvasculatura del músculo cremáster del ratón (Thorlacius H y col., Eur J Clin. Invest 30(9): 804-10, 2000; Agero y col., Toxicon 50(5):698-706, 2007).
Se llevó a cabo el siguiente experimento para determinar si el anticuerpo inhibidor de MASP-2 (AcMH6) tiene un efecto respuesta a la dosis sobre la formación de trombos y la oclusión de vasos en un modelo murino de MAT.
Procedimientos: La trombosis localizada se indujo mediante la fotoactivación de dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano) en la microvasculatura del músculo cremáster de ratones C57B1/6 y se utilizó microscopía intravital para medir el inicio de la formación de trombos y la oclusión de vasos utilizando los procedimientos descritos en Ejemplo 37, con las siguientes modificaciones. Se administro a los grupos de ratones AcMH6 (2 mg/kg, 10 mg/kg o 20 mg/kg) o anticuerpo de control de isotipo (20 mg/kg) mediante inyección intravenosa (iv) una hora antes de la inducción de MAT. Se registraron el tiempo hasta el inicio de la formación de trombos y el tiempo hasta la oclusión completa del vaso. Se utilizó el análisis de reproducción de vídeo de imágenes de microscopía intravital grabadas durante 30 a 60 minutos para evaluar el tamaño de los vasos, velocidad del flujo sanguíneo, intensidad de luz, tasa de aparición de trombos como equivalente a la adhesión plaquetaria, tiempo hasta el inicio de la formación de trombos, tasa de oclusión total del vaso y tiempo hasta la oclusión total del vaso. El análisis estadístico se realizó utilizando SigmaPlot v12.0.
Resultados:
Inicio de la formación de trombos
La FIGURA 49 es un gráfico de Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de ratones con trombos en función del tiempo en microangiopatía trombótica inducida por FITC-Dextrano en ratones tratados con dosis crecientes de anticuerpo inhibidor de MASP-2 humano (AcMH6 a 2 mg/kg, 10 mg/kg o 20 mg/kg) o un anticuerpo de control de isotipo. Como se muestra en la FIGURA 49, el inicio de la formación de trombos se retrasó en los ratones tratados con AcMH6 de una manera dependiente de la dosis en relación con los ratones tratados con el control.
La FIGURA 50 ilustra gráficamente el tiempo medio hasta el inicio (minutos) de la formación de trombos en función de la dosis de AcMH6 (* p < 0,01 en comparación con el control). Como se muestra en la FIGURA 50, el tiempo medio hasta el inicio de la formación de trombos aumentó con dosis crecientes de AcMH6 de 6,8 minutos en el grupo de control a 17,7 minutos en el grupo tratado con 20 mg/kg de AcMH6 (p < 0,01). Los datos experimentales y el análisis estadístico subyacentes se describen en las TABLAS 14 y 15.
El tiempo hasta el inicio de la formación de trombos en ratones individuales registrado basándose en la evaluación de la grabación videográfica se detalla a continuación en la TABLA 14.
TABLA 14: Tiempo hasta el inicio de la formación de trombos después de una lesión inducida por tintes claros
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El análisis estadístico que compara el tiempo hasta el inicio de la oclusión entre los animales de control y tratados con AcMH6 se muestra a continuación en la TABLA 15.
TABLA 15: Tiempo hasta el inicio: datos del estudio de respuesta a la dosis de FITC Dex
Figure imgf000106_0001
Oclusión microvascular
La FIGURA 51 es una gráfica de Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de ratones con oclusión microvascular en función del tiempo en microangiopatía trombótica inducida por FITC-Dextrano en ratones tratados con dosis crecientes de anticuerpo inhibidor de MASP-2 humano (AcMH6 a 2 mg/kg, 10 mg/kg o 20 mg/kg) o un anticuerpo de control de isotipo. Como se muestra en la FIGURA 51, la oclusión microvascular completa se retrasó en los grupos tratados con AcMH6 en comparación con los ratones de control.
La FIGURA 52 ilustra gráficamente el tiempo medio hasta la oclusión microvascular en función de la dosis de AcMH6 (*p < 0,05 en comparación con el control). Como se muestra en la FIGURA 52, el tiempo medio para completar la oclusión microvascular aumentó de 23,3 minutos en el grupo de control a 38,6 minutos en el grupo tratado con 2 mg/kg de AcMH6 (p < 0,05). Las dosis de 10 mg/kg o 20 mg/kg de AcMH6 se realizaron de manera similar (el tiempo medio para la oclusión microvascular completa fue de 40,3 y 38 minutos, respectivamente) al grupo tratado con 2 mg/kg de AcMH6. Los datos experimentales y el análisis estadístico subyacentes se describen en las TABLAS 16 y 17.
El tiempo para completar la oclusión del vaso en ratones individuales registrado basándose en la evaluación primaria de la grabación videográfica se detalla a continuación en la TABLA 16.
TABLA 16: Tiempo para completar la oclusión después de una lesión inducida por tintes claros
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El análisis estadístico que compara el tiempo para completar la oclusión entre los animales de control y tratados con AcMH6 se muestra a continuación en la TABLA 17.
TABLA 17: Tiempo para completar la oclusión microvascular: datos del estudio de respuesta a la dosis de FITC Dex
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Sumario
Como se resume en la TABLA 18, el inicio de la formación de trombos se retrasó en los ratones tratados con AcMH6 de una manera dependiente de la dosis en relación con los ratones tratados con el control (tiempo medio hasta el inicio de 10,4 a 17,7 minutos frente a 6,8 minutos). El tiempo medio para completar la oclusión se retrasó significativamente en todos los grupos tratados con AcMH6 en relación con los grupos tratados con el control (Tabla 18).
TABLA 18: Tiempo medio hasta el inicio de la formación de trombos y la oclusión completa
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Estos resultados demuestran que el AcMH6, un anticuerpo monoclonal humano que se une a MASP-2 y bloquea la ruta de la lectina del sistema del complemento, redujo la trombosis microvascular de una manera dependiente de la dosis en un modelo de ratón experimental de MAT. Por tanto, se espera que la administración de un agente inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo inhibidor de MASP-2, sea un tratamiento eficaz en pacientes que padecen SUH, SUHa, PTT u otros trastornos microangiopáticos tales como otras MAT, incluyendo el síndrome antifosfolipídico catastrófico (SAFC), enfermedad de Degos sistémica y MAT secundarias por cáncer, quimioterapia y trasplante y brindan protección contra la coagulación microvascular y la trombosis.
EJEMPLO 40
Este Ejemplo describe la identificación, usando presentación de fagos, de anticuerpos scFv completamente humanos que se unen a MASP-2 e inhiben la activación del complemento mediada por lectina mientras dejan inalterados los componentes de la ruta clásica (dependiente de C1q) y la ruta alternativa del sistema inmunitario.
Visión general:
Se identificaron anticuerpos MASP-2 de alta afinidad completamente humanos mediante la selección de una biblioteca de presentación de fagos. Los fragmentos variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos se aislaron tanto en formato scFv como en formato de IgG de longitud completa. Los anticuerpos MASP-2 humanos son útiles para inhibir la lesión celular asociada con la activación de la ruta del complemento alternativa mediada por la ruta de la lectina mientras dejan inalterado el componente de la ruta clásica (dependiente de C1q) del sistema inmunitario. En algunos casos, los anticuerpos inhibidores de MASP-2 en cuestión tienen las siguientes características: (a) alta afinidad por MASP-2 humana (por ejemplo, una Kd de 10 nM o menos), y (b) inhiben la actividad del complemento dependiente de MASP-2 en suero humano al 90 % con una CI50 de 30 nM o menos.
Procedimientos:
Expresión de MASP-2 catalíticamente inactiva de longitud completa:
La secuencia de ADNc de longitud completa de MASP-2 humana (SEQ ID NO: 4), que codifica el polipéptido MASP-2 humano con la secuencia líder (SEQ ID NO: 5) se subclonó en el vector de expresión de mamífero pCI-Neo (Promega), que impulsa la expresión eucariota bajo el control de la región potenciadora/promotora de CMV (descrita en Kaufman R.J. y col., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)). Para generar la proteína MASP-2A humana catalíticamente inactiva, se llevó a cabo mutagénesis dirigida al sitio como se describe en el documento US2007/0172483, incorporado como referencia en el presente documento. Los productos de la PCR se purificaron después de la electroforesis en gel de agarosa y la preparación de la banda y se generaron solapamientos de adenosina individuales usando un procedimiento de colas estándar. La MASP-2A con cola de adenosina se clonó luego en el vector pGEM-T easy y se transformó en E. coli. La MASP-2A humana se subclonó adicionalmente en cualquiera de los vectores de expresión de mamíferos pED o pCI-Neo.
La construcción de expresión de MASP-2A descrita anteriormente se transfectó en células DXB1 utilizando el procedimiento de transfección estándar de fosfato de calcio (Maniatis y col., 1989). La MASP-2A se produjo en medio sin suero para garantizar que las preparaciones no se contaminen con otras proteínas séricas. El medio se recogió de las células confluentes cada dos días (cuatro veces en total). El nivel de MASP-2A recombinante promedió aproximadamente 1,5 mg/litro de medio de cultivo. La MASP-2A (mutante Ser-Ala descrito anteriormente) se purificó mediante cromatografía de afinidad en columnas de MBP-A-agarosa
ELISA de MASP-2A en clones candidatos de ScFv identificados mediante selección/conversión de scFv y cribado de filtro
Una biblioteca de presentación en fagos de secuencias de región variable de la cadena ligera y pesada de inmunoglobulina humana se sometió a selección de antígenos seguida de un cribado y selección de anticuerpos automatizado para identificar anticuerpos scFv de alta afinidad para la proteína MASP-2 humana. Se llevaron a cabo tres rondas de selección de la biblioteca de fagos scFv contra MASP-2A marcada con HIS o marcada con biotina. La tercera ronda de selección se eluyó primero con MBL y luego con TEA (alcalina). Para controlar el enriquecimiento específico de los fagos que muestran fragmentos scFv contra la MASP-2A diana, se llevó a cabo un ELISA de fagos policlonales contra MASP-2A inmovilizada. Los genes scFv de la ronda 3 de selección se clonaron en un vector de expresión pHOG y se procesaron en un cribado de filtro a pequeña escala para buscar clones específicos contra MASP-2A.
Se escogieron colonias bacterianas que contenían plásmidos que codificaban fragmentos scFv de la tercera ronda de selección, se cuadricularon sobre membranas de nitrocelulosa y se cultivaron durante la noche en medio no inductor para producir placas maestras. Se escogieron y analizaron un total de 18.000 colonias de la tercera ronda de selección, la mitad de la elución competitiva y la otra mitad de la elución de TEA posterior. La selección de la biblioteca de fagémidos scFv frente a MASP-2A seguida de conversión de scFv y un cribado de filtro produjo 137 clones positivos.
108/137 clones fueron positivos en un ensayo ELISA para la unión a MASP-2 (datos no mostrados), de los cuales 45 clones se analizaron adicionalmente para determinar la capacidad de bloquear la actividad de MASP-2 en suero humano normal.
Ensayo para medir la inhibición de la formación de C3 convertasa de la ruta de la lectina
Se usó un ensayo funcional que mide la inhibición de la formación de C3 convertasa de la ruta de la lectina para evaluar la "actividad de bloqueo" de los clones candidatos de scFv MASP-2. La actividad de la MASP-2 serina proteasa es necesaria para generar los dos componentes proteicos (C4b, C2a) que comprenden la C3 convertasa de la ruta de la lectina. Por tanto, un scFv MASP-2 que inhibe la actividad funcional de MASP-2 (es decir, un scFv de bloqueo MASP-2), inhibirá de novo la formación de C3 convertasa de la ruta de la lectina. C3 contiene un grupo tioéster inusual y altamente reactivo como parte de su estructura. Tras la escisión de C3 por C3 convertasa en este ensayo, el grupo tioéster en C3b puede formar un enlace covalente con grupos hidroxilo o amino en macromoléculas inmovilizadas en el fondo de los pocillos de plástico a través de enlaces éster o amida, facilitando así la detección de C3b en el ensayo ELISA.
El manano de levadura es un conocido activador de la ruta de la lectina. En el siguiente procedimiento para medir la formación de C3 convertasa, se incubaron pocillos de plástico recubiertos con manano con suero humano diluido para activar la ruta de la lectina. A continuación, los pocillos se lavaron y se ensayó para determinar el C3b inmovilizado en los pocillos utilizando procedimientos ELISA estándar. La cantidad de C3b generado en este ensayo es un reflejo directo de la formación de novo de C3 convertasa de la ruta de la lectina. En este ensayo se probaron clones de scFv MASP-2 a concentraciones seleccionadas para determinar su capacidad para inhibir la formación de C3 convertasa y la consiguiente generación de C3b.
Procedimientos:
Se expresaron los 45 clones candidatos identificados como se describió anteriormente, se purificaron y se diluyeron a la misma concentración de stock, que se diluyó nuevamente en Ca++ y Mg++ que contenía tampón GVB (barbital 4,0 mM, NaCl 141 mM, MgCh 1,0 mM, CaCh 2,0 mM, gelatina al 0,1 %, pH 7,4) para asegurar que todos los clones tuvieran la misma cantidad de tampón. Cada uno de los clones scFv se ensayó por triplicado a la concentración de 2 |jg/ml. El control positivo fue el Fab2 OMS100 y se probó a 0,4 jg/m l. La formación de C3c se controló en presencia y ausencia de los clones scFv/IgG.
El manano se diluyó a una concentración de 20 jg/m l (1 jg/pocillo) en tampón de carbonato 50 mM (Na2CO315 mM NaHCO335 mM NaN31,5 mM), pH 9,5 y se recubrió en una placa ELISA durante la noche a 4 °C. El día siguiente, las placas recubiertas con manano se lavaron 3 veces con 200 j l de PBS. A continuación, se añadieron a los pocillos 100 j l de solución de bloqueo de HSA al 1 % y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con 200 j l de PBS y se almacenaron en hielo con 200 j l de PBS hasta la adición de las muestras.
Se diluyó suero humano normal al 0,5 % en tampón CaMgGVB, y se añadieron por triplicado clones scFv o el control positivo Fab2 OMS100 a 0,01 jg/ml; 1 jg/m l (solo control OMS100) y 10 jg/m l a este tampón y se incubaron previamente durante 45 minutos en hielo antes de añadirlo a la placa ELISA bloqueada. La reacción se inició mediante incubación durante una hora a 37 °C y se detuvo mediante la transferencia de las placas a un baño de hielo. El depósito de C3b se detectó con un anticuerpo de conejo C3c de a-ratón seguido de HRP de a-conejo de cabra. El control negativo fue tampón sin anticuerpo (sin anticuerpo = depósito máximo de C3b) y el control positivo fue tampón con EDTA (sin depósito de C3b). El antecedente se determinó realizando el mismo ensayo, excepto que los pocillos estaban libres de manano. La señal de antecedentes contra las placas sin manano se restó de las señales en los pocillos que contienen manano. Se estableció un criterio de corte a la mitad de la actividad de un clon scFv irrelevante (VZV) y tampón solo.
Resultados: Según el criterio de corte, se encontró que un total de 13 clones bloqueaban la actividad de MASP-2. Se seleccionaron y secuenciaron los 13 clones que producían > 50 % de supresión de la ruta, produciendo 10 clones únicos. Se encontró que los diez clones tenían la misma subclase de cadena ligera, A3, pero tres subclases diferentes de cadenas pesadas: VH2, VH3 y VH6. En el ensayo funcional, cinco de los diez clones candidatos scFv dieron valores de CI50 nM inferiores a los criterios diana de 25 nM utilizando suero humano al 0,5 %.
Para identificar anticuerpos con potencia mejorada, los tres clones madre scFv, identificados como se describe anteriormente, se sometieron a una mezcla de cadenas ligeras. Este procedimiento implicó la generación de una biblioteca combinatoria que consiste en la VH de cada uno de los clones madre emparejados con una biblioteca de cadenas ligeras (VL) lambda humanas no tratadas procedentes de seis donantes sanos. A continuación, se examinó esta biblioteca en busca de clones scFv con afinidad de unión y/o funcionalidad mejoradas.
TABLA 19: Comparación de potencia funcional en CI50 (nM) de los clones hijos principales y sus respectivos clones madre (todos en formato scFv)
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A continuación se presentan las secuencias de región variable de cadena pesada (VH) para los clones madre y los clones hijos que se muestran arriba en la TABLA 19, y se enumeran a continuación en las TABLAS 20A-F.
Las CDR de Kabat (31-35 (HI), 50-65 (H2) y 95-102 (H3)) están en negrita; y las CDR de Chothia (26-32 (HI), 52-56 (H2) y 95-101 (H3)) están subrayadas.
Región variable de cadena pesada (VH) de 17D20 35VH-21N11VL (SEQ ID NO: 67, codificada mediante SEQ ID NO: 66)
O V T L K E S G P V L V K P T E T L T L T C T V S G F S L S R G K M G V S W IR O P P G K A L E W L A H
IF S S D E K S Y R T S L K S R L T IS K D T S K N O V V L T M T N M D P V D T A T Y Y C A R IR R G G ID Y W
G Q G T L Y T Y SS
Región variable de cadena pesada (VH) de d17N9 (SEQ ID NO: 68)
O V O L O O SG PG L V K PSO T L SL T C A ISG D S V S S T S A A W N W IR O SPSR G L E W L G R T Y Y R S
K W Y N D Y A V S V K SR IT IN PD T SKN OF SLO LN S V T PE D T A V Y Y C A R D PF G V PFD IW GO
G TM V T V SS
Región variable de cadena pesada
TABLA 20 A: Cadena pesada (aa 1-20)
Figure imgf000110_0002
TABLA 20B: C a de na pe sada (aa 21 -40 )
Figure imgf000111_0001
TABLA 20C: Cadena pesada (aa 41-60)
Figure imgf000111_0002
TABLA 20D: Cadena pesada (aa 61-80)
Figure imgf000111_0003
TABLA 20E: Cadena pesada (aa 81-100)
Figure imgf000111_0004
TABLA 20F: ca d e n a pe sad a (aa 101-118)
Figure imgf000112_0002
A continuación se presentan las secuencias de región variable de cadena ligera (VL) para los clones madre y los clones hijos enumerados a continuación en las TABLAS 21A-F.
Las CDR de Kabat (24-34 (L1); 50-56 (L2); y 89-97 (L3) están en negrita; y las CDR de Chothia (24-34 (L1); 50-56 (L2) y 89-97 (L3) están subrayadas. Estas regiones son las mismas ya sea que estén numeradas por el sistema Kabat o Chothia.
Región variable de cadena ligera (VL) de 17D20m d3521N11 (SEQ ID NO: 70, codificada mediante SEQ ID NO: 69)
Figure imgf000112_0001
Región variable de cadena ligera (VL) de 17N16m d17N9 (SEQ ID NO: 71)
S Y E L IO P PS V S V A PG O T A T IT C A G D N L G K K R V H W Y O O R PG O A PV L V IY D D S
D R P S G IP D R F S A SN S G N T A T L T IT R G E A G D E A D Y Y C O V W D IA T D H W FG G G T K L T V
L A A A G S E Q K L IS E
TABLA 21A: Cadena ligera (aa 1-20)
Figure imgf000112_0003
TABLA 21B: Cadena ligera (aa 21-40)
Figure imgf000112_0004
TABLA 21C: C a d e n a lige ra (aa 41 -60 )
Figure imgf000113_0001
TABLA 21D: Cadena ligera (aa 61-80)
Figure imgf000113_0002
TABLA 21E: Cadena ligera (aa 81-100)
Figure imgf000113_0003
TABLA 21F: Cadena ligera (aa 101-120)
Figure imgf000113_0004
______
Los anticuerpos OMS100 MASP-2 y AcM_d3521N11VL, (que comprenden una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 70, también se conocen como "OMS646" y "AcMH6"), que se ha demostrado que se unen a MASP-2 humana con alta afinidad y tienen la capacidad de bloquear la actividad del complemento funcional, se analizaron con respecto a la unión a epítopo mediante análisis de transferencia puntual. Los resultados muestran que los anticuerpos OMS646 y OMS100 son altamente específicos para MASP-2 y no se unen a MASP-1/3. Ni el anticuerpo se unió a MAp19 ni a los fragmentos de MASP-2 que no contenían el dominio CCP1 de MASP-2, lo que lleva a la conclusión de que los sitios de unión abarcan CCP1.
Se determinó que el anticuerpo OMS646 MASP-2 se unía ávidamente a MASP-2 recombinante (Kd 60-250 pM) con una selectividad > 5000 veces en comparación con C1s, C1r o MASP-1 (véase la TABLA 22 a continuación):
TABLA 22: Afinidad y especificidad de la interacción anticuerpo OMS646 MASP-2-MASP-2 según lo evaluado mediante estudios ELISA en fase sólida
Figure imgf000114_0001
OMS646 bloquea específicamente la activación dependiente de lectina de componentes terminales del complemento
Procedimientos:
El efecto de OMS646 sobre el depósito del complejo de ataque a membrana (MAC) se analizó utilizando condiciones específicas de la ruta para la ruta de la lectina, la ruta clásica y la ruta alternativa. Para este fin, el kit de cribado complementario Wieslab Comp300 (Wieslab, Lund, Suecia) se utilizó siguiendo las instrucciones del fabricante.
Resultados:
La FIGURA 53A ilustra gráficamente el nivel de depósito de MAC en presencia o ausencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646) en condiciones específicas de ensayo de la ruta de lectina. La FIGURA 53B ilustra gráficamente el nivel de depósito de MAC en presencia o ausencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646) en condiciones específicas de ensayo de la ruta clásica. La FIGURA 53C ilustra gráficamente el nivel de depósito de MAC en presencia o ausencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646) en condiciones específicas de ensayo de la ruta alternativa.
Tal como se muestra en la FIGURA 53A, OMS646 bloquea la activación del depósito de MAC mediada por la ruta de la lectina con un valor de CI50 de aproximadamente 1 nM. Sin embargo, OMS646 no tuvo ningún efecto sobre el depósito de MAC generado a partir de la activación mediada por la ruta clásica (FIGURA 53B) o a partir de la activación mediada por la ruta alternativa (FIGURA 53C).
Farmacocinética y farmacodinámica de OMS646 después de administración intravenosa (IV) o subcutánea (SC) a ratones
La farmacocinética (PK) y la farmacodinámica (PD) de OMS646 se evaluaron en un estudio PK/PD de dosis única de 28 días en ratones. El estudio probó niveles de dosis de 5 mg/kg y 15 mg/kg de OMS646 administrados por vía subcutánea (SC), así como un nivel de dosis de 5 mg/kg de OMS646 administrado por vía intravenosa (IV).
Con respecto al perfil PK de OMS646, la FIGURA 54 ilustra gráficamente la concentración de OMS646 (media de n = 3 animales/grupos) en función del tiempo después de la administración de OMS646 a la dosis indicada. Como se muestra en la FIGURA 54, a 5 mg/kg SC, OMS646 alcanzó la concentración plasmática máxima de 5-6 pg/ml aproximadamente 1-2 días después de la dosificación. La biodisponibilidad de OMS646 a 5 mg/kg SC fue aproximadamente de un 60 %. Como se muestra además en la FIGURA 54, a 15 mg/kg SC, OMS646 alcanzó una concentración plasmática máxima de 10-12 pg/ml aproximadamente 1 a 2 días después de la dosificación. Para todos los grupos, el OMS646 se eliminó lentamente de la circulación sistémica con una semivida terminal de aproximadamente 8-10 días. El perfil de OMS646 es normal de anticuerpos humanos en ratones.
La actividad PD de OMS646 se ilustra gráficamente en las FIGURAS 55A y 55B. Las FIGURAS 55A y 55B muestran la respuesta PD (caída en la actividad sistémica de la ruta de lectina) para cada ratón en los grupos de 5 mg/kg IV (FIGURA 55A) y 5 mg/kg SC (FIGURA 55B). La línea discontinua indica la línea de referencia del ensayo (inhibición máxima; suero de ratón no tratado enriquecido in vitro con exceso de OMS646 antes del ensayo). Tal como se muestra en la FIGURA 55A, después de la administración IV de 5 mg/kg de OMS646, la actividad sistémica de la ruta de la lectina cayó inmediatamente a niveles casi indetectables, y la actividad de la ruta de la lectina mostró solo una modesta recuperación durante el período de observación de 28 días. Como se muestra en la FIGURA 55B, en ratones tratados con 5 mg/kg de OMS646 SC, se observó una inhibición dependiente del tiempo de la actividad de la ruta de la lectina. La actividad de la ruta de la lectina cayó a niveles casi indetectables dentro de las 24 horas posteriores a la administración del fármaco y permaneció en niveles bajos durante al menos 7 días. La actividad de la ruta de la lectina aumentó gradualmente con el tiempo, pero no volvió a los niveles previos a la dosis dentro del período de observación de 28 días. El perfil de actividad de la ruta de la lectina frente al tiempo observado después de la administración SC de 15 mg/kg fue similar a la dosis SC de 5 mg/kg (datos no mostrados), indicando saturación del punto final de la PD. Los datos indicaron además que dosis semanales de 5 mg/kg de OMS646, administrado por vía IV o SC, es suficiente para lograr la supresión continua de la actividad sistémica de la ruta de la lectina en ratones.
EJEMPLO 41
Este Ejemplo demuestra que un anticuerpo inhibidor de MASP-2 (OMS646) inhibe el depósito de C5b-9 del complemento inducido por suero SUHa en la superficie de células endoteliales microvasculares humanas (HMEC-1, por sus siglas en inglés) activadas después de la exposición al suero de pacientes con síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa) ) obtenido durante la fase aguda y la fase de remisión de la enfermedad.
Antecedentes/Justificación: El siguiente estudio se llevó a cabo para analizar el depósito de C5b-9 del complemento inducido por el suero SUHa en la superficie de las células HMEC-1 activadas después de la exposición al suero de un paciente con SUHa obtenido (1) durante la fase aguda y (2) durante la fase de remisión de la enfermedad en presencia o ausencia de OMS646, un anticuerpo MASP-2 que se une específicamente a MASP-2 e inhibe la activación de la ruta de la lectina.
Procedimientos:
Pacientes: Cuatro pacientes con SUHa, estudiados tanto durante la fase aguda de la enfermedad como en remisión, se seleccionaron para este estudio entre los incluidos en el Registro Internacional de SUH/PTT y genotipados por el Laboratorio de Inmunología y Genética de Trasplantes y Enfermedades Raras del Instituto Mario Negri. Un paciente con SUHa tenía una mutación heterocigota del factor H del complemento (FHC) p.R1210C y uno tenía autoanticuerpos anti-FHC, mientras que en los otros dos pacientes con SUHa no se encontraron mutaciones ni anticuerpos frente al FHC.
Las tablas 23 y 24 resumen los resultados del cribado de mutaciones del gen del complemento y autoanticuerpos anti-FHC en los cuatro pacientes con SUHa analizados en este estudio junto con los datos clínicos y bioquímicos medidos durante la fase aguda o en remisión.
TABLA 23: Parámetros clínicos de los cuatro pacientes con SUHa en este estudio
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TABLA 24: Parámetros del complemento de los cuatro pacientes con SUHa en este estudio
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Procedimientos experimentales: Las células de una línea celular endotelial microvascular humana (HMEC-1) de origen dérmico se sembraron en placas de vidrio y se usaron cuando confluyeron. Las células HMEC-1 confluentes se activaron con ADP (difosfato de adenosina) 10 pM durante 10 minutos y luego se incubaron durante cuatro horas con suero de los cuatro pacientes con SUHa descritos anteriormente en las Tablas 23 y 24 recolectados durante la fase aguda de la enfermedad o de los mismos pacientes con SUHa en remisión, o de 4 sujetos de control sanos. El suero se diluyó 1:2 con medio de prueba (HBSS con BSA al 0,5 %) en presencia o en ausencia de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, OMS646 (100 pg/ml), generado como se describe anteriormente en el Ejemplo 40, o en presencia del receptor 1 del complemento soluble (sCR1) (150 pg/ml), como control positivo de la inhibición del complemento. Al final de la etapa de incubación, las células HMEC-1 se trataron con anticomplemento C5b-9 humano de conejo seguido de anticuerpo secundario conjugado con FITC. En cada experimento, el suero de un control sano se analizó en paralelo con el suero de un paciente con SUHa (fase aguda y remisión). Se utilizó un microscopio láser confocal invertido para la adquisición de la tinción fluorescente en la superficie de células endoteliales. Se adquirieron quince campos por muestra y el área ocupada por la tinción fluorescente se evaluó mediante detección automática de bordes utilizando funciones específicas integradas del programa informático Image J y se expresó como píxel2 por campo analizado. Los campos que muestran los valores más bajos y más altos se excluyeron del cálculo.
Para el análisis estadístico (ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey para comparaciones múltiples) se utilizaron los resultados en píxeles2 de los 13 campos considerados en cada condición experimental para cada paciente y control.
Resultados:
Los resultados del análisis de depósitos del complemento con los sueros de los cuatro pacientes con SUHa se resumen a continuación en la Tabla 25A, y los resultados con los sueros de los cuatro sujetos sanos se resumen a continuación en la Tabla 25B.
TABLA 25A: Efecto de los inhibidores del complemento sobre el depósito de C5b-9 inducido por suero de SUHa en células HMEC-1 activadas por ADP
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TABLA 25B: Efecto de los inhibidores del complemento en sueros de cuatro sujetos de control sanos (que no padecen SUHa) sobre el depósito de C5b-9 en células HMEC-1 activadas por ADP
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Para las Tablas 25A y 25B: Los datos son la media ± DT. °P < 0,001 frente al control; *P < 0,001, **P < 0,01 frente a SUHa en fase aguda sin tratamiento; §P < 0,001, §§P < 0,01, §§§P < 0,05 frente a fase de remisión de SUHa sin tratamiento.
La Figura 56 ilustra gráficamente el efecto inhibidor del anticuerpo MASP-2 (OMS646) y sCR1 sobre el depósito de C5b-9 inducido por suero de SUHa en células HMEC-1 activadas por ADP. En la Figura 56, los datos son la media ± DT. °P < 0,0001 frente al control; * P < 0,0001 frente a SUHa en fase aguda sin tratamiento; AP < 0,0001 frente a SUHa en fase aguda sCR1; §P < 0,0001 frente a SUHa en fase de remisión sin tratamiento y #P < 0,0001 frente a SUHa en fase de remisión sCR1.
Como se muestra en la Tabla 25A, 25B y la Figura 56, las células HMEC-1 estimuladas con ADP expuestas al suero de pacientes con SUHa (recogidas en la fase aguda o en remisión) durante cuatro horas en condiciones estáticas mostraron un depósito intenso de C5b-9 en la superficie celular detectado mediante microscopía confocal. Mediante la medición del área cubierta por C5b-9, se observó una cantidad significativamente mayor de depósito de C5b-9 en las células expuestas al suero de pacientes con SUHa que en las células expuestas al suero de sujetos de control sanos, independientemente de si el suero de SUHa se recogió en la fase aguda o durante la remisión. No se observaron diferencias en los depósitos de C5b-9 endotelial inducidos por suero entre la fase aguda y en remisión.
Como se muestra además en la Tabla 25A, 25B y la Figura 56, la adición del anticuerpo MASP-2 OMS646 al suero de SUHa (ya sea obtenido de pacientes durante la fase aguda o en remisión) condujo a una reducción significativa del depósito de C5b-9 en la superficie de las células endoteliales en comparación con el suero de SUHa sin tratar. Sin embargo, el efecto inhibidor de OMS646 sobre el depósito de C5b-9 fue menos profundo que el efecto ejercido por el paninhibidor del complemento sCR1. De hecho, se observó una diferencia estadísticamente significativa entre los depósitos de C5b-9 inducidos por suero de SUHa en presencia de OMS646 frente a sCR1 (Figura 56 y Tablas 25A y 25B).
Cuando se calcula como una media de los cuatro pacientes con SUHa, los porcentajes de reducción de los depósitos de C5b-9 (en comparación con los depósitos de C5b-9 inducidos por el suero no tratado de los mismos pacientes tomados al 100 %) observados en presencia de los inhibidores del complemento fueron los siguientes:
Fase aguda:
sCR1 (150 |jg/ml): reducción del 91 % en depósitos C5b-9
OMS646 (100 jg/ml): reducción del 40 % en depósitos C5b-9
Fase de remisión:
sCR1 (150 jg/ml): reducción del 91 % en depósitos C5b-9
OMS646 (100 |jg/ml): reducción del 54 % en depósitos C5b-9
Conclusión: Los resultados descritos en este Ejemplo demuestran que la ruta de la lectina del complemento se estimula mediante células endoteliales microvasculares activadas y que esta estimulación es un impulsor significativo de la característica exagerada de respuesta de activación del complemento del SUHa. También se demuestra que esta estimulación de la ruta de la lectina y la respuesta de activación del complemento exagerada resultante ocurre tanto durante la fase aguda como en la remisión clínica del SUHa. Por otra parte, este hallazgo no parece estar limitado a ningún defecto del complemento particular asociado con el SUHa. Como se demuestra adicionalmente en este Ejemplo, la inhibición selectiva de la ruta de la lectina con un anticuerpo inhibidor de MASP-2 tal como OMS646 reduce el depósito del complemento en pacientes con SUHa con diversas orígenes.
EJEMPLO 42
Este Ejemplo demuestra que un anticuerpo inhibidor de MASP-2 (OMS646) inhibe la agregación plaquetaria inducida por suero SUHa y la formación de trombos en la superficie de células endoteliales microvasculares humanas (HMEC-1) activadas después de la exposición al suero de un paciente con SUHa obtenido durante (1) la fase aguda y (2) la fase de remisión del SUHa.
Procedimientos:
Pacientes: Tres pacientes (pacientes n.° 1, n.° 2 y n.° 4 como se describe en las Tablas 23, 24, 25A y 25B en el Ejemplo 41) con SUHa (un paciente tenía una mutación heterocigota de FHC p.R1210C, mientras que en los otros dos pacientes no se encontraron mutaciones ni anticuerpos anti-FHC) se estudiaron tanto durante la fase aguda de la enfermedad como en remisión. Los pacientes se seleccionaron para este estudio entre los incluidos en el Registro Internacional de SUH/PTT y genotipados por el Laboratorio de Inmunología y Genética de Trasplantes y Enfermedades Raras del Instituto Mario Negri. También se seleccionaron cinco sujetos sanos como donantes de sangre para experimentos de perfusión.
Procedimientos: Se activaron células HMEC-1 confluentes con ADP 10 pM durante 10 minutos y luego se incubaron durante tres horas con sueros de tres pacientes con SUHa (pacientes n.° 1,2 y 4 descritos en el Ejemplo 41) recogidos durante la fase aguda de la enfermedad o de los mismos pacientes en remisión, o con sueros de control de sujetos sanos. El suero se diluyó 1:2 con medio de prueba (HBSS con BSA al 0,5 %), en presencia o en ausencia de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, OMS646 (100 pg/ml), generado como se describe en el Ejemplo 40; o con sCR1 (150 pg/ml), como control positivo de la inhibición del complemento. Para los pacientes n.° 1 y n.° 2, se incubaron pocillos adicionales con sueros (de fase aguda y remisión) diluidos 1:2 con medio de prueba que contenía 100 pg/ml de anticuerpo de control de isotipo irrelevante o con 20 pg/ml de OMS646 (para el último el caso n.° 1 se probó solo en remisión y el caso n.° 2 tanto durante la fase aguda como en remisión).
Al final de la etapa de incubación, Las células HMEC-1 se perfundieron en una cámara de flujo con sangre completa heparinizada (10 Ul/ml) obtenida de sujetos sanos (que contenía el colorante fluorescente mepacrina que marca las plaquetas) en la fuerza de cizallamiento encontrada en la microcirculación (60 dinas/cm2, tres minutos). Después de tres minutos de perfusión, las monocapas de células endoteliales se fijaron en acetona. Se tomaron quince imágenes por muestra de trombos plaquetarios en la superficie de las células endoteliales mediante microscopio láser invertido confocal, y se evaluaron las áreas ocupadas mediante trombos utilizando el programa informático Image J. Los campos que muestran los valores más bajos y más altos se excluyeron del cálculo.
Para el análisis estadístico (ANOVA unidireccional seguida de la prueba de Tukey para comparaciones múltiples), se utilizaron los resultados en píxeles2 de los 13 campos considerados en cada condición experimental para cada paciente y control.
Resultados:
Los resultados de los experimentos de formación de trombos con los sueros de los tres pacientes con SUHa se resumen a continuación en la Tabla 26A, y los resultados con los sueros de los cinco sujetos sanos se resumen a continuación en la Tabla 26B.
TABLA 26A: Efecto de los inhibidores del complemento sobre la formación de trombos inducida por el suero SUHa (píxel2± DT) en células HMEC-1 activadas por ADP
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(continuación)
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TABLA 26B: Efecto de los inhibidores del complemento en sueros de cinco sujetos de control sanos (que no padecen SUHa) en el ensayo de formación de trombos (píxel2± DT) en células HMEC-1 activadas por ADP
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Para las Tablas 26A y 26B: Los datos son la media ± DT. °P < 0,001 frente al control; *P < 0,001, *** P < 0,05 frente a SUHa en fase aguda sin tratamiento; §P < 0,001, §§§P < 0,05 frente a fase de remisión de SUHa sin tratamiento.
La Figura 57 ilustra gráficamente el efecto del anticuerpo MASP-2 (OMS646) y sCR1 sobre la formación de trombos inducida por suero de SUHa en células HMEC-1 activadas por ADP. En la Figura 57, los datos mostrados son la media ± DE. ° P < 0,0001, °°P < 0,01 frente al control; *P < 0,0001, **P < 0,01 frente a SUHa en fase aguda sin tratamiento; §P < 0,0001 frente a fase de remisión del SUHa sin tratamiento.
Como se muestra en la Tabla 26A y la Figura 57, se observó un marcado aumento en el área cubierta por trombos en las células HMEC-1 tratadas con suero de SUHa, recogido durante la fase aguda o en remisión, en comparación con las células expuestas al suero de sujetos de control sanos (Tabla 26B y Figura 57). Como se muestra en la Figura 57 y en la Tabla 26A, OMS646 (tanto a 100 pg/ml como a 20 pg/ml) mostró una inhibición parcial de la formación de trombos en células expuestas previamente a suero de SUHa tomado durante la fase aguda. El efecto antitrombogénico fue comparable entre las dos dosis diferentes de OMS646 y no fue diferente del efecto de sCR1 (Figura 57 y Tabla 26A). La adición del anticuerpo de control de isotipo irrelevante no tuvo ningún efecto inhibidor sobre la formación de trombos inducida por el suero SUHa.
Como se muestra en la Figura 57 y la Tabla 26A, el efecto inhibidor de OMS646 fue aún más evidente en el suero de SUHa recogido durante la fase de remisión. De hecho, la adición de OMS646, a dosis de 100 pg/ml y 20 pg/ml, al suero de un paciente con SUHa recolectado en remisión dio como resultado una inhibición casi completa de la formación de trombos, similar a la observada con la adición de sCR1. El anticuerpo de control de isotipo irrelevante no mostró un efecto inhibidor significativo.
Cuando se calcula como una media de los tres pacientes con SUHa, los porcentajes de reducción de la superficie de HMEC-1 cubierta por depósitos de trombos (en comparación con el área de trombos inducida por los sueros no tratados de los mismos pacientes tomados como 100 %) registrados con los inhibidores del complemento fueron los siguientes:
Fase aguda:
sCR1 (150 |jg/ml): 60 %
reducción con OMS646 (100 pg/ml): 57 %
reducción con OMS646 (20 jg/ml): 45% de reducción
Fase de remisión:
sCR1 (150 jg/ml): 85 %
reducción con o Ms 646 (100 pg/ml): 79 %
reducción con OMS646 (20 jg/ml): 89 % de reducción
Discusión de resultados:
Los resultados de este Ejemplo demuestran que un anticuerpo inhibidor de MASP-2, tal como OMS646 (generado como se describe en el Ejemplo 40), tiene un fuerte efecto inhibidor sobre la formación de trombos inducida por el suero SUHa en células h Me C-1. Sorprendentemente, el efecto inhibidor de OMS646 sobre la formación de trombos fue mayor que su efecto sobre los depósitos de C5b-9 inducidos sobre HMEC-1 (como se describe en el Ejemplo 41). También es sorprendente que la adición de OMS646, a dosis de 100 pg/ml y 20 pg/ml, al suero de un paciente con SUHa recogido en la remisión dio como resultado una inhibición casi completa de la formación de trombos. Otro hallazgo sorprendente es la observación de que OMS646, tanto en fase aguda como en remisión, fue tan eficaz como el control positivo sCR1, que es un inhibidor amplio y casi completo del sistema del complemento (Weisman H. y col., Science 249:146-151, 1990; Lazar H. y col., Circulation 100:1438-1442, 1999).
Se observa que el suero de control de sujetos sanos también indujo una modesta formación de trombos en células HMEC-1. No se observó un efecto inhibidor constante sobre la formación de trombos inducida por suero de control con OMS646 o con sCR1. Aunque sin desear quedar ligado a cualquier teoría particular, se cree que los trombos inducidos por el control no dependen del complemento, como se confirma por depósitos de C5b-9 muy bajos observados en HMEC-1 incubadas con suero de control (véase el Ejemplo 41).
Conclusión:
En conclusión, el efecto antitrombótico observado de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, tal como OMS646, parece sustancialmente mayor de lo que se hubiera esperado basándose en el efecto inhibidor de OMS646 sobre el depósito de C5b-9 observado en este sistema experimental (como se describe en el Ejemplo 41 y se muestra en la Figura 56). Por ejemplo, como se describe en Gastoldi y col., Immunobiology 217:1129-1222 Abstract 48 (2012) titulado "C5a/C5aR interaction mediates complement activation and thrombosis on endothelial cells in atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS)", se determinó que la adición de un anticuerpo C5 que inhibe los depósitos de C5b-9 (reducción de un 60 %) limita la formación de trombos en HMEC-1 en un grado comparable (reducción de un 60 %). Por el contrario, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 (OMS646 a 100 pg/ml) inhibió los depósitos de C5b-9 con valores medios de (fase aguda = reducción de un 40 %; fase de remisión = reducción de un 54 %); e inhibió la formación de trombos en un porcentaje sustancialmente más alto (fase aguda = reducción del 57 %; fase de remisión = reducción de un 79 %). En comparación, OMS646 inhibió el depósito del complemento en un porcentaje menor que el inhibidor del complemento de control positivo (sCR1 a 150 pg/ml, inhibición en la fase aguda del depósito de C5b-9 = reducción de un 91 %; fase de remisión = reducción de un 91 %) pero fue igualmente eficaz como el control positivo de sCR1 para inhibir la formación de trombos (sCR1 a 150 pg/ml, fase aguda = reducción de un 60 %; fase de remisión = reducción de un 85 %). Estos resultados demuestran que un anticuerpo inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, OMS646) es sorprendentemente eficaz para inhibir la formación de trombos en el suero obtenido de sujetos con SUHa tanto en la fase aguda como en la fase de remisión.
De acuerdo con lo anterior, en un caso descrito en el presente documento, es un procedimiento para inhibir la formación de trombos en un sujeto que padece, o está en riesgo de desarrollar, una microangiopatía trombótica (MAT) que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2. En un caso, la MAT se selecciona del grupo que consiste en síndrome urémico hemolítico (SUH), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) y síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa). En un caso, la MAT es SUHa. En un caso, la composición se administra a un paciente con SUHa durante la fase aguda de la enfermedad. En un caso, la composición se administra a un paciente con SUHa durante la fase de remisión (es decir, en un sujeto que se ha recuperado o parcialmente recuperado de un episodio de SUHa en fase aguda, dicha remisión evidenciada, por ejemplo, por el aumento del recuento de plaquetas y/o concentraciones séricas reducidas de LDH, por ejemplo, como se describe en Loirat C y col., Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60, 2011, incorporado como referencia en el presente documento).
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 exhibe al menos una o más de las siguientes características: dicho anticuerpo se une a MASP-2 humano con una Kd de 10 nM o menos, dicho anticuerpo se une a un epítopo en el dominio CCP1 de MASP-2, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en un ensayo in vitro en suero humano al 1 % en una CI50 de 10 nM o menos, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en suero humano al 90 % con una CI50 de 30 nM o menos, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, Fab', F(ab)2y F(ab')2, en el que el anticuerpo es una molécula monocatenaria, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG2, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG1, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG4, en el que la molécula de IgG4 comprende una mutación S228P y/o en el que el anticuerpo no inhibe sustancialmente la ruta clásica. En un caso, el anticuerpo se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la ruta de la lectina y no inhibe sustancialmente la ruta alternativa. En un caso, el anticuerpo se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la ruta de la lectina y no inhibe sustancialmente la ruta clásica o la ruta alternativa (es decir, inhibe la ruta de la lectina mientras deja inalteradas las rutas clásica y alternativa del complemento).
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un sujeto que padece una MAT tal como SUHa (fase aguda o en remisión), en al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % hasta un 99 %, en comparación con el suero no tratado. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un sujeto que padece SUHa a un nivel de al menos un 20 por ciento o más, (tal como al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %) más que el efecto inhibidor sobre el depósito de C5b-9 en suero.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un paciente con SUHa en fase de remisión en al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % hasta un 99 %, en comparación con el suero no tratado. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero en un paciente con SUHa en fase de remisión a un nivel de al menos un 20 por ciento o más, (tal como al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %) más que el efecto inhibidor sobre el depósito de C5b-9 en suero.
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se administra al sujeto mediante un catéter intravenoso u otro procedimiento de administración por catéter.
En un caso que se describe en el presente documento, se describe un procedimiento para inhibir la formación de trombos en un sujeto que padece MAT que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende (I) (a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una CDR-H1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 31-35 de la SEQ ID NO: 67; y ii) una CDR-H2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-65 de la SEQ ID NO: 67; y iii) una CDR-H3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 95-102 de la SEQ ID NO: 67 y b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una CDR-L1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 24-34 de la SEQ ID NO: 70; y ii) una CDR-L2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-56 de la SEQ ID NO: 70; y iii) una CDR-L3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 89-97 de la SEQ ID NO: 70, o (II) una variante del mismo que comprende una región variable de cadena pesada con al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 67 (por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 67) y una región variable de cadena ligera con al menos un 90 % de identidad (por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 70.
En un caso, la MAT se selecciona del grupo que consiste en síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa) (fase aguda o de remisión), SUH y PTT. En un caso, el sujeto se encuentra en fase aguda de SUHa. En un caso, el sujeto está en fase de remisión de SUHa.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la s Eq ID NO: 67. En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 70.
En algunos casos, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición que comprende un anticuerpo inhibidor de MASP-2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que reconoce específicamente al menos parte de un epítopo en MASP-2 humana reconocido por el anticuerpo de referencia OMS646 que comprende una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 70. La competencia entre los miembros de unión se puede analizar fácilmente in vitro, por ejemplo, usando ELISA y/o mediante el marcaje de una molécula indicadora específica en un miembro de unión que puede detectarse en presencia de otro miembro(s) de unión no marcado, para permitir la identificación de miembros de unión específicos que se unen al mismo epítopo o un epítopo superpuesto. Por tanto, actualmente se describe un anticuerpo específico o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo humano, que compite con el anticuerpo de referencia OMS646 por la unión a MASP-2 humana.
EJEMPLO 43
Este Ejemplo demuestra que un anticuerpo inhibidor de MASP-2 humano (OMS646) es capaz de inhibir la inducción de apoptosis mediada por plasma de pacientes con MAT en células endoteliales microvasculares (CEMV) humanas primarias de origen dérmico.
Antecedentes/Justificación:
Se sabe que la fisiopatología de la MAT implica una lesión de las células endoteliales inducida por varios factores que va seguida de oclusiones de vasos pequeños (por ejemplo, arteriolas pequeñas y capilares) mediante tapones de plaquetas y/o trombos de fibrina (Hirt-Minkowsk P. y col., Nephron Clin Pract 114:c219-c235, 2010; Goldberg R.J. y col., Am J Kidney Dis 56(6):1168-1174, 2010). Se ha demostrado que las CEMV sufren una lesión apoptótica cuando se exponen in vitro al plasma de pacientes con trastornos relacionados con MAT (véase Stefanescu y col., Blood Vol 112 (2):340-349, 2008; Mitra D. y col., Blood 89:1224-1234, 1997). La lesión apoptótica asociada con MAT se ha documentado en CEMV obtenidas de biopsias de tejido (piel, hueso, médula, bazo, riñón, íleon) de dichos pacientes. También se ha demostrado que las lesiones apoptóticas a las CEMV reducen los niveles de proteínas reguladoras del complemento unidas a la membrana en las CEMV (véase, por ejemplo, Mold & Morris, Immunology 102:359-364, 2001; Christmas y col., Immunology 119:522, 2006).
Se cree que un bucle de realimentación positiva que implica componentes terminales del complemento está implicado en la fisiopatología de las MAT, incluyendo el síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa) y las MAT asociadas con el síndrome antifosfolipídico catastrófico (SAFC), enfermedad de Degos y MAT secundarias por cáncer, quimioterapia contra el cáncer, autoinmunidad y trasplante, sabiendo o creyendo que cada una de estas afecciones responde a la terapia anti-C5 con el AcM eculizumab (Chapin J. y col., Brit. J. Hematol 157:772-774, 2012; Tsai y col., Br J Haematol 162(4):558-559, 2013); Magro C. M. y col., Journal of Rare Diseases 8:185, 2013).
El siguiente experimento se llevó a cabo para analizar la capacidad del anticuerpo inhibidor de MASP-2 humano (OMS646) para bloquear la inducción de apoptosis mediada por plasma de pacientes con MAT en CEMV dérmicas humanas primarias en muestras de plasma obtenidas de pacientes que padecen SUHa, Púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) relacionada con la deficiencia de ADAMTS13, CAPS y enfermedad de Degos sistémica, así como MAT secundarias por cáncer, trasplante, enfermedades autoinmunitarias y quimioterapia.
Procedimientos:
Se llevó a cabo un ensayo in vitro para analizar la eficacia de un anticuerpo inhibidor de MASP-2 (OMS646) para bloquear la inducción de apoptosis mediada por plasma de pacientes con MAT en CEMV humanas primarias de origen dérmico como se describe en Stefanescu R. y col., Blood Vol 112 (2):340-349, 2008, la cual se incorpora en el presente documento por referencia. Las muestras de plasma utilizadas en este ensayo se obtuvieron de una colección de sujetos de control sanos y de individuos con microangiopatías trombóticas en fase aguda o convalecientes. La presencia de microangiopatía en los pacientes con MAT se evaluó mediante la detección de esquistocitos en un frotis de sangre periférica. Adicionalmente, la PTT se diagnosticó como se describe en Stefanescu R. y col., Blood Vol 112 (2):340-349, 2008.
Cultivo de células endoteliales (CE)
Como se describe en Stefanescu y col., las CEMV humanas primarias de origen dérmico se adquirieron de ScienCell Research Labs (San Diego, CA). Las CEMV expresaron Cd 34 hasta los pasajes 5 y 6 (Blood 89:1224-1234, 1997). Las CEMV se mantuvieron en matraces de poliestireno recubiertos con gelatina al 0,1 % en agua en medio ECM1001 (ScienCell Research Labs) que contenía un complemento de crecimiento de células endoteliales, penicilina, estreptomicina y suero bovino fetal al 15 %. Todos las CEMV se utilizaron en los pasajes 2 a 6. Los subcultivos implicaron una exposición de 5 a 10 minutos a EDTA-tripsina al 0,25 %.
Ensayo de apoptosis
Las CEMV humanas primarias representativas de origen dérmico que se sabe que son susceptibles a la apoptosis inducida por plasma de PTT/SUH se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se colocaron en cámaras de placas de 12 pocillos, recubiertas con gelatina al 0,1 % en agua a 0,15x106 células viables/ml. Las células CEMV en placa se privaron de alimento en medio completo durante 24 horas y luego se expusieron a concentraciones variables (de 2 % a 20 % v/v) de muestras de plasma de pacientes con MAT o plasma de donantes sanos durante 18 horas en presencia o ausencia de AcM MASP-2 OMS646 (150 pg/ml) y luego las células se recolectaron mediante tripsinización. Cada muestra de paciente de MAT se analizó por duplicado. El grado de apoptosis mediada por plasma se evaluó mediante tinción con yoduro de propidio (IP), con > 5 x103 células analizadas en un citofluorógrafo y máximos A0 definidos mediante programa informático de computadora (MCycle Av, Phoenix Flow Systems, San Diego, CA). La cuantificación basada en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de fragmentos de ADN asociados a histonas citoplasmáticas del lisado celular también se realizó según las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania).
Resultados:
Los resultados del ensayo de apoptosis de CEMV inducida por plasma de pacientes con MAT en presencia de AcM MASP-2 (OMS646) se muestran a continuación en la Tabla 27.
Tabla 27: Plasma de paciente con MAT probado en CEMV humana primaria de origen dérmico en presencia de AcM
MASP-2 (OMS646)
Figure imgf000123_0001
De acuerdo con los resultados informados en Stefanescu R. y col., Blood Vol 112 (2):340-349, 2008, se observó una apoptosis significativa para las CEMV primarias de origen dérmico en presencia de las trece muestras de plasma de pacientes con MAT en ausencia del anticuerpo MASP-2. Se analizaron en paralelo muestras de plasma de control de sujetos humanos sanos y no indujeron apoptosis en las CEMV (datos no mostrados). Como se muestra en la Tabla 27, el AcM inhibidor de MASP-2 (OMS646) inhibió la inducción de apoptosis mediada por plasma de pacientes con MAT en CEMV primarias ("responde" en la Tabla 27) en 6 de las 13 muestras de plasma de pacientes analizadas (46 %). En particular, se observa que el AcM inhibidor de MASP-2 (OMS646) inhibió la apoptosis en el plasma obtenido de pacientes que padecían SUHa, PTT, enfermedad de Degos, LES, trasplante y AAFL (SAFC). Con respecto a las siete muestras de pacientes analizadas en este ensayo en las que el AcM MASP-2 no bloqueó la apoptosis ("no responde" en la Tabla 27), se observa que la apoptosis se puede inducir por varias rutas, no todas dependientes del complemento. Por ejemplo, como se indica en Stefanescu R. y col., Blood Vol 112 (2):340-349, 2008, la apoptosis en un ensayo de CE depende del estado de activación de CE basal que está influenciado por factores plasmáticos que pueden jugar un papel en la determinación del nivel de lesión requerido para inducir la apoptosis. Como se indica además en Stefanescu R. y col., factores adicionales capaces de modular la apoptosis pueden estar presentes en el plasma del paciente con MAT, tales como citocinas y varios componentes del sistema del complemento. Por tanto, debido a estos factores sobreañadidos, no es sorprendente que el anticuerpo MASP-2 no mostrara un efecto de bloqueo en todas las muestras de plasma que presentaban apoptosis inducida por plasma de MAT.
Además, en este sentido, se indica que se llevó a cabo un análisis similar usando un ensayo de apoptosis inducida por plasma de MAT con el anticuerpo anti-C5 eculizumab y se observaron resultados muy similares (véase Chapin y col., Blood (ASH Annual Meeting Abstracts): Resumen n.° 3342, 120: 2012). La eficacia clínica de eculizumab, un producto comercial de gran éxito, parece mayor que la eficacia demostrada en este modelo, lo que sugiere que este modelo in vitro puede subestimar el potencial clínico de los fármacos inhibidores del complemento.
Estos resultados demuestran que un anticuerpo inhibidor de MASP-2, tal como OMS646, es eficaz para inhibir la apoptosis inducida por plasma de MAT en plasma obtenido de pacientes que padecen una MAT tal como SUHa, PTT, enfermedad de Degos, LES, trasplante y a Af L (SAFC). Se sabe que el daño endotelial y la apoptosis juegan un papel clave en la patología de las MAT tales como la PTT idiopática y el SUH esporádico (Kim y col., Microvascular Research vol 62(2):83-93, 2001). Como se describe en Dang y col., se demostró apoptosis en la pulpa roja esplénica de pacientes con PTT, pero no en sujetos de control sanos (Dang y col., Blood 93(4): 1264-1270, 1999). También se ha observado evidencia de apoptosis en células glomerulares renales de origen CEMV en un paciente con SUH (Arends M.J. y col., Hum Pathol 20:89, 1989). Por tanto, se espera que la administración de un agente inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, OMS646) sea una terapia eficaz en pacientes que padecen una MAT tal como SUHa, PTT u otro trastorno microangiopático tal como otra MAT, incluyendo SAFC, enfermedad de Degos sistémica y una MAT secundaria por cáncer; una MAT secundaria por quimioterapia o una MAT secundaria por trasplante.
De acuerdo con lo anterior, en un caso descrito en el presente documento es un procedimiento para inhibir el daño de células endoteliales y/o la apoptosis de células endoteliales, y/o la formación de trombos en un sujeto que padece, o está en riesgo de desarrollar, una microangiopatía trombótica (MAT) que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo inhibidor de MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2. En un caso, la MAT se selecciona del grupo que consiste en síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) y síndrome urémico hemolítico (SUH). En un caso, la MAT es SUHa. En un caso, la composición se administra a un paciente con SUHa durante la fase aguda de la enfermedad. En un caso, la composición se administra a un paciente con SUHa durante la fase de remisión (es decir, en un sujeto que se ha recuperado o parcialmente recuperado de un episodio de SUHa en fase aguda, dicha remisión evidenciada, por ejemplo, por el aumento del recuento de plaquetas y/o concentraciones séricas reducidas de LDH, por ejemplo, como se describe en Loirat C y col., Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60, 2011, incorporado como referencia en el presente documento).
En un caso, el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, una MAT que es (i) una MAT secundaria por cáncer; (ii) una MAT secundaria por quimioterapia; o (iii) una MAT secundaria por trasplante (por ejemplo, trasplante de órgano, tal como trasplante de riñón o trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas). En un caso, el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, el síndrome de Upshaw-Schulman (SUS). En un caso, el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, la enfermedad de Degos. En un caso, el sujeto padece, o está en riesgo de desarrollar, el síndrome antifosfolipídico catastrófico (SAFC).
De acuerdo con cualquiera de los casos desvelados en el presente documento, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 exhibe al menos una o más de las siguientes características: dicho anticuerpo se une a MASP-2 humano con una Kd de 10 nM o menos, dicho anticuerpo se une a un epítopo en el dominio CCP1 de MASP-2, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en un ensayo in vitro en suero humano al 1 % en una CI50 de 10 nM o menos, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en suero humano al 90 % con una CI50 de 30 nM o menos, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, Fab', F(ab)2 y F(ab')2, en el que el anticuerpo es una molécula monocatenaria, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG2, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG1, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG4, en el que la molécula de IgG4 comprende una mutación S228P y/o en el que el anticuerpo no inhibe sustancialmente la ruta clásica. En un caso, el anticuerpo se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la ruta de la lectina y no inhibe sustancialmente la ruta alternativa. En un caso, el anticuerpo se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la ruta de la lectina y no inhibe sustancialmente la ruta clásica (es decir, inhibe la ruta de la lectina mientras deja inalterada la ruta clásica del complemento).
En un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la apoptosis de CEMV inducida por plasma en el suero de un sujeto que padece una MAT tal como SUHa (fase aguda o en remisión), síndrome urémico hemolítico (SUH), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), una MAT secundaria por cáncer; una MAT secundaria por quimioterapia; una MAT secundaria por trasplante (por ejemplo, trasplante de órgano, tal como trasplante de riñón o trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas), o en suero de un sujeto que padece el síndrome de Upshaw-Schulman (SUS), o en suero de un sujeto que padece la enfermedad de Degos, o en un sujeto que padece el síndrome antifosfolipídico catastrófico (SAFC)), en el que la apoptosis de CEMV inducida por plasma se inhibe en al menos un 5 %, tal como al menos un 10 %, tal como al menos un 20 %, tal como al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 85 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % hasta un 99 %, en comparación con el suero no tratado. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 inhibe la formación de trombos en el suero de un sujeto que padece una MAT (por ejemplo, tal como SUHa (fase aguda o en remisión), síndrome urémico hemolítico (SUH), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), una MAT secundaria por cáncer; una MAT secundaria por

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un agente inhibidor de MASP-2 para su uso en el tratamiento o la prevención de microangiopatía trombótica (MAT) secundaria a un trasplante, en el que el trasplante es un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas, en el que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del agente inhibidor de MASP-2 en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar una MAT secundaria a un trasplante en el que el agente inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo monoclonal anti-MASP-2, o fragmento del mismo que se une específicamente a una porción de SEQ ID NO: 6 e inhibe selectivamente la activación del complemento dependiente de MASP-2, en el que el anticuerpo monoclonal anti-MASP-2 o fragmento del mismo, comprende una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 70.
2. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el agente se administra junto con un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína C5 del complemento.
3. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el agente inhibidor de MASP-2 se administra sistémicamente al sujeto antes, durante o después de recibir el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.
4. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo monoclonal inhibidor de MASP-2 o fragmento del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo recombinante, un anticuerpo que tiene función efectora reducida y un anticuerpo quimérico.
5. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo inhibidor de MASP-2 es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, Fab', F(ab)2 y F(ab')2.
6. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo inhibidor de MASP-2 es una molécula monocatenaria.
7. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo inhibidor de MASP-2 se selecciona del grupo que consiste en una molécula de IgG1, una IgG2 y una molécula de IgG4.
8. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la molécula de IgG4 comprende una mutación S228P.
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