CN113260375A - 针对人补体因子C2b的抗体及使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了与人补体因子C2特异性结合并且能够抑制补体系统的经典途径和凝集素途径激活的抗体及其抗原结合片段。所述抗体和抗原结合片段表现出改善的可制造性、药代动力学和抗原清扫。还提供了包含所述抗体和抗原结合片段的药物组合物、编码所述抗体和抗原结合片段的核酸和载体、包含所述核酸或载体的宿主细胞，以及制备和使用所述抗体和抗原结合片段的方法。所述抗体和抗原结合片段可用于在对象(例如人)中抑制补体激活的经典途径。所述抗体和抗原结合片段还可用于在对象(例如人)中抑制补体激活的凝集素途径。

Description

针对人补体因子C2b的抗体及使用方法

相关申请

本申请要求2018年12月13日提交的美国临时专利申请No.62/779,102的优先权的权益，其全部内容通过引用并入本文。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并在此通过引用整体并入。所述ASCII拷贝创建于2019年11月22日，命名为618634_AGX5-048PC_ST25.txt，并且大小为94,329字节。

技术领域

本发明涉及免疫学和分子生物学领域。更具体地，本发明涉及用于抑制补体系统的经典途径和凝集素途径激活的组合物和方法，以及其在治疗人病症中的用途。本发明特别涉及与人补体因子C2结合的结合分子及其制备和使用方法。

背景技术

补体系统涉及血浆酶、调节蛋白和具有细胞裂解能力的蛋白质的级联系列。在激活之前，多种补体因子作为无活性的前体蛋白循环。系统的激活导致激活级联，其中一种因子通过在级联更下游的补体蛋白的特异性蛋白水解来激活后一种因子。

补体系统的激活可以通过三种途径发生：经典(或典型)途径、旁路途径和凝集素途径。经典途径通过抗原与IgM、IgG1、IgG2或IgG3抗体相互作用以形成结合C1q(补体成分C1的亚基)的免疫复合体来激活。旁路途径被含IgA的免疫复合体激活或通过细菌和其他激活表面的识别所激活。凝集素途径负责补体激活的不依赖抗体的途径，其由甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin，MBL)(也称为甘露糖结合凝集素或甘露聚糖结合蛋白(mannan-binding protein，MBP))与多种病原体的表面上的某些碳水化合物结合而启动。

经典途径的激活以C1、C4和C2的顺序激活开始；C2进而被切割为C2a和C2b。旁路途径的激活以补体成分D、C3和B的顺序激活开始。每条途径都切割并激活共同的中心成分C3或第三补体因子，这导致共同终端途径的激活，从而导致形成膜攻击复合体(membrane-attack complex，MAC，包含补体成分C5b-9；Muller-Eberhard，Annu Rev Biochem 1988，57：321)。在补体激活期间，产生了数种炎性肽如过敏毒素C3a和C5a，以及MAC。这些激活产物引起多效性生物效应，例如白细胞的趋化作用，吞噬细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞的脱颗粒，平滑肌收缩，血管通透性提高以及细胞裂解(Hugh，Complement 1986，3：111)。补体激活产物还诱导毒性氧自由基的产生以及花生四烯酸代谢物和细胞因子的合成和释放，特别是通过吞噬细胞，这进一步扩大了炎性响应。

虽然补体是抵御致病性生物体的重要防线，但其激活也会对其他健康宿主细胞造成损害。因此认为抑制补体激活在治疗和预防补体介导的组织损伤中是有益的。因此，本领域仍然迫切需要抑制补体级联的一种或更多种关键成分的新治疗剂。

发明概述

提供了相对于现有抗体具有改善特征的新单克隆抗人C2b抗体及其抗原结合片段。新抗体的一个特征是重链可变结构域(VH)的框架区3(framework region 3，FR3)中糖基化位点的缺失。值得注意的是，与现有抗体相比，新抗体提供了改善的均一性并因此提供了改善的可制造性，以及出乎意料地改善的功能特性。改善的功能特性包括，例如，提高的pI和增强的所谓抗原清扫(antigen sweeping)的潜力。抗体及其抗原结合片段将用于人治疗。

本发明的一个方面是与人补体因子C2特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其片段包含：

VH结构域，其包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列；和

VL结构域，其包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列；

其中VH结构域的氨基酸残基72至74(Kabat编号)相应地由X₁X₂X₃组成，其中X₂是任何氨基酸，并且X₁X₂X₃不是NX₂S或NX₂T。

本发明的一个方面是包含根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段、以及可药用载体的药物组合物。

本发明的一个方面是编码根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子或多个核酸分子。

本发明的一个方面是包含根据本发明的核酸分子或多个核酸分子的载体或多个载体。

本发明的一个方面是包含编码根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子或多个核酸分子的宿主细胞。

本发明的一个方面是包含含有根据本发明的核酸分子或多个核酸分子的载体或多个载体的宿主细胞。

本发明的一个方面是制备根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在允许表达单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养根据本发明的细胞群。

本发明的一个方面是在对象中抑制经典途径或凝集素途径的激活的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。

以下实施方案适用于本发明的所有方面。

在某些实施方案中，X₁X₂X₃由DX₂S组成。

在某些实施方案中，X₁X₂X₃由DKS组成。

在某些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，VL结构域包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列，并且VL结构域包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段包含全长单克隆抗体。

在某些实施方案中，单克隆抗体包含人IgG重链恒定结构域。

在某些实施方案中，重链恒定结构域包含人IgG1重链恒定结构域。在某些实施方案中，人IgG1重链恒定结构域包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，重链恒定结构域包含人IgG4重链恒定结构域。在一些实施方案中，人IgG4重链恒定结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的重链和含有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的轻链。

在某些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的重链和含有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的轻链。

附图说明

图1描绘了装载有指定样品的聚丙烯酰胺凝胶。泳道4、5、8和9(箭头)中样品的较大分子量条带示出了具有VH3和VH4的抗体的条带分裂和迁移。

图2是描绘了在31天时间内食蟹猴中指定抗体的总水平的图。测试了以下抗体：BRO2-glyc-IgG4(猴1和2，糖基化的VH)和BRO2-IgG4(猴5和6，非糖基化的VH)。

图3A至3I是描绘了从向食蟹猴施用多种单克隆抗体起的31天时间内血清中游离C2水平的图(绘制为随时间的OD 450nm)。测试了以下抗体：BRO2-glyc-IgG4(图3A；猴1和2)、阴性对照(图3B；猴3和4)、BRO2-IgG4(图3C；猴5和6)、BRO2-IgG4-NH(图3D；猴7和8)、BRO2-IgG1-LALA-NH(图3E；ARGX-117；猴9和10)、His1-IgG4(图3F；猴11和12)、His1-IgG4-NH(图3G；猴13和14)、His1-IgG1-LALA-NH(图3H；猴15和16)和His2-IgG4(图3I；猴17和18)。

图4是描绘了从食蟹猴施用多种指定单克隆抗体起的31天时间内血清中平均游离C2水平的图(绘制为随时间的OD 450nm)。

图5是描绘了用指定的非糖基化抗体处理的食蟹猴血清中游离C2水平的图(绘制为随时间的OD 450nm)。

图6A至6D是描绘了在施用抗体之前或之后的指定时间测定的食蟹猴中游离C2水平的一系列图(绘制为OD 450nm)。猴是如图3A至3I中的。图6A，pre与pre加500mg/ml BRO-2；图6B，4小时与1天；图6C，4小时与2天；图6D，第11天与第27天。ADA，抗药抗体。

图7A至7P是描绘了向食蟹猴施用抗C2抗体或阴性对照单克隆抗体30天内的免疫原性的一系列图(绘制为OD 450nm)。猴是如图3A至3I中的。图7A，猴1；图7B，猴2；图7C，猴5；图7D，猴6；图7E，猴7；图7F，猴8；图7G，猴9；图7H，猴10；图7I，猴11；图7J，猴12；图7K，猴13；图7L，猴14；图7M，猴15；图7N，猴16；图7O，猴17；图7P，猴18。

图8A至8F是描绘了向食蟹猴施用抗C2单克隆抗体60天内的免疫原性的一系列图(绘制为随时间的OD 450nm)。猴是如图3A至3I中的。图8A，猴5；图8B，猴6；图8C，猴9；图8D，猴10；图8E，猴15；图8F，猴16。ADA，抗药抗体。

图9A至9D描绘了通过Western印迹分析和表面等离激元共振(surface plasmonresonance，SPR)评估的ARGX-117与C2的结合。图9A描绘了用ARGX-117对血清进行的Western印迹分析(代表性结果)：泳道1：MW大小标志物；泳道2：重组人C2对照(大小为约100kDa)；泳道3：血清；泳道4：通过向血清添加聚集的IgG并在37℃下孵育诱导的补体激活；泳道5：缺乏C2的血清。

图9B描绘了在固定在芯片上的C2以及不同ARGX-117 Fab作为洗脱物的情况下的SPR分析。

图9C描绘了在固定至链霉亲和素芯片的生物素-C4b和人C2、以及有和没有mAb作为洗脱物的情况下的SPR分析；黑色：无预孵育；灰色：抗FXI；对照人IgG4 mAb；绿松石色：非抑制性抗C2克隆抗C2-63，即识别C2大亚基(C2a)的克隆63；红色：ARGX-117；全部为5比1的摩尔比；曲线以临将C2注射到C4b芯片上之前的信号归一化。

图9D描绘了在固定至链霉亲和素芯片的生物素-C4b和连续地人C2以及mAb作为洗脱物的情况下的SPR分析；黑色：运行缓冲液；灰色：抗FXI；对照人IgG4 mAb；绿松石色：非抑制性抗C2克隆抗C2-63；红色：ARGX-117；曲线在临添加mAb之前归一化。

图10描绘了C2(SEQ ID NO：21)与补体因子B(FB)(SEQ ID NO：50)之间的结构域交换突变体的示意图。在这两种蛋白质中，小片段(补体C2中的C2b；SEQ ID NO：44；或补体因子B中的FBa；SEQ ID NO：51)由三个Sushi(或补体控制蛋白(complement controlprotein，CCP))结构域组成，而大片段是由冯·维勒布兰德因子A型(von WillebrandFactor type A，VWFA)结构域和肽酶S1结构域构成。注意，各结构域之间的序列在这些突变体中并未被携带，但也可由表位组成。另外的序列包括：C2a，SEQ ID NO：43；C2b S1，SEQ IDNO：45；C2b S2，SEQ ID NO：46；C2b S3，SEQ ID NO：47；C2 VWFA，SEQ ID NO：48；C2肽酶S1，SEQ ID NO：49；FBb，SEQ ID NO：52；FBa S1，SEQ ID NO：53；FBa S2，SEQ ID NO：54；FBa S3，SEQ ID NO：55；FB VWFA，SEQ ID NO：56；以及FB肽酶1，SEQ ID NO：57。

图11描绘了对结构域交换突变体进行抗FLAG ELISA获得的结果。使用来自经转染HEK293细胞的5倍稀释上清液进行包被，并且使用与HRP标记的抗小鼠IgG组合的抗FLAG小鼠单克隆Ab进行检测。

图12描绘了用抗C2-5F2.4进行的结构域交换ELISA获得的结果。使用抗C2-5F2.4mAb(人IgG4 S241P VH4/VL3 LC-13/03-163A Bioceros)进行包被，将板与HEK293转染子的20倍稀释的上清液一起孵育，并通过抗FLAG Ab检测结合。代表性结果来自具有类似结局的两个独立实验。

图13描绘了人和小鼠C2b Sushi 2(S2)结构域的氨基酸序列比对。人S2，SEQ IDNO：46；小鼠S2，SEQ ID NO：58。星号表示序列同一性。

图14描绘了对精细定位突变体(fine mapping mutant)进行抗FLAG ELISA获得的结果。来自经转染的HEK293细胞的未经稀释上清液用于进行包被，并且与HRP标记的SA缀合物组合的生物素标记的抗FLAG小鼠单克隆Ab用于进行检测。

图15描绘了精细定位突变体的结果。使用抗C2-5F2.4 mAb(人IgG4 S241P VH4/VL3 LC-13/03-163A Bioceros)进行包被，将板与HEK293转染子的20倍稀释的上清液一起孵育，并通过抗FLAG Ab检测结合。

图16描绘了对每个簇的使用三个氨基酸突变的簇定位突变体的计划，所述三个氨基酸突变的位置在人序列中用粗体表示。每个人序列都进行突变以用相应的小鼠氨基酸替换粗体显示的人氨基酸。人S2，SEQ ID NO：46；小鼠S2，SEQ ID NO：58。星号表示序列同一性。

图17A和17B描绘了对簇定位突变体进行的抗FLAG ELISA。图17A描绘了来自经转染的HEK293细胞的五倍稀释的上清液用于进行包被，并且与HRP标记的抗小鼠IgG组合的抗FLAG小鼠单克隆Ab用作检测。GFP，绿色荧光蛋白。

图17B描绘了抗C2-5F2.4与簇突变体的结合。抗C2-5F2.4 mAb(人IgG4 S241PVH4/VL3，LC-13/03-163A，Bioceros)用作包被物，将板与HEK293转染子的20倍稀释的上清液一起孵育，并通过抗FLAG Ab检测结合。GFP，绿色荧光蛋白。

具体实施方式

定义

“抗体”或“免疫球蛋白”——本文中使用的术语“免疫球蛋白”包括具有两条重链和两条轻链的组合的多肽，无论其是否具有任何相关的特异性免疫反应性。本文中使用的术语“抗体”是指对目的抗原(例如包括C2的补体蛋白的复合体)具有显著特异性免疫反应活性的这样的组合体。术语“C2抗体”在本文中用于指对包括C2、特别是人C2蛋白的补体蛋白的复合体和通过切割C2形成的结构域、以及在一些情况下其物种同源物表现出免疫学特异性的抗体。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，在它们之间具有或不具有链间共价键。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构已被相对充分地了解。

五种不同类别的抗体(IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)可以在生物化学上区分。所有五类抗体都在本发明的范围内。以下讨论一般性地针对IgG类的免疫球蛋白分子。关于IgG，免疫球蛋白通常包含两条相同的分子量为约23,000道尔顿的轻多肽链和两条相同的分子量为53,000至70,000的重链。四条链在“Y”构型中通过二硫键连接，其中轻链从“Y”的口起始并继续通过可变区而括住重链。

抗体的轻链被分类为kappa(κ)或lambda(λ)。每个重链类别可以与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链彼此共价结合，并且当通过杂交瘤、B细胞或经遗传改造的宿主细胞产生免疫球蛋白时，两个重链的“尾”部通过共价二硫键或非共价键彼此结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉形末端的N端延伸至每条链底部的C端。本领域技术人员将理解，重链被分类为gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ或ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质将抗体的“类别”分别确定为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等已经被充分表征并且已知赋予功能特化。鉴于本公开内容，技术人员容易辨别这些类别和同种型中每一种的经修饰形式，并且因此其在本发明的范围内。

如上所述，抗体的可变区允许抗体选择性地识别并且特异性地结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL结构域和VH结构域组合形成限定三维抗原结合位点的可变区。该四级抗体结构形成了存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地，抗原结合位点由VH和VL链中每一个上的三个互补决定区(complementary determining region，CDR)限定。

“结合分子”——本文中使用的术语“结合分子”是旨在涵盖根据本公开内容的抗体及其抗原结合片段的通用术语。

“结合位点”——本文中使用的术语“结合位点”包含负责选择性结合目的靶抗原的多肽区域。结合结构域包含至少一个结合位点。示例性结合结构域包括抗体可变结构域。本发明的抗体分子可以包含单个结合位点或多个(例如，两个、三个或四个)结合位点。

“可变区”或“可变结构域”——术语“可变”是指以下事实：可变结构域VH和VL的某些部分在抗体之间在序列上广泛不同，并且用于每种特定抗体对其靶抗原的结合和特异性。然而，变异性并非均匀地分布在抗体的整个可变结构域中。其集中在VL结构域和VH结构域中每一个中形成抗原结合位点的一部分的称为“超变环”的三个区段中。V_λ轻链结构域的第一、第二和第三超变环在本文中称为L1(λ)、L2(λ)和L3(λ)，并且可以定义为包含VL结构域中的残基24至33(L1(λ)，由9、10或11个氨基酸残基组成)、49至53(L2(λ)，由3个残基组成)和90至96(L3(λ)，由5个残基组成)(Morea et al.，Methods 20：267-279(2000))。Vκ轻链结构域的第一、第二和第三超变环在本文中称为L1(κ)、L2(κ)和L3(κ)，并且可以定义为包含VL结构域中的残基25至33(L1(κ)，由6、7、8、11、12或13个残基组成)、49至53(L2(κ)，由3个残基组成)和90至97(L3(κ)，由6个残基组成)(Morea et al.，Methods 20：267-279(2000))。VH结构域的第一、第二和第三超变环在本文中称为H1、H2和H3，并且可以定义为包含VH结构域中的残基25至33(H1，由7、8或9个残基组成)、52至56(H2，由3或4个残基组成)和91至105(H3，长度高度可变)(Morea et al.，Methods 20：267-279(2000))。

除非另有说明，否则术语L1、L2和L3分别指VL结构域的第一、第二和第三超变环，并且涵盖从V_κ和V_λ同种型二者获得的超变环。术语H1、H2和H3分别指VH结构域的第一、第二和第三超变环，并且涵盖从任何已知的重链同种型获得的超变环，包括γ、μ、α、δ或ε。

超变环L1、L2、L3、H1、H2和H3可各自包含“互补决定区”或“CDR”的一部分，如下文所限定。术语“超变环”和“互补决定区”不是严格同义的，因为超变环(HV)是基于结构定义的，而互补决定区(CDR)是基于序列变异性定义的(Kabat et al.，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.，1983)并且HV和CDR的限制在一些VH和VL结构域中可不同。

VL和VH结构域的CDR通常可以定义为包含以下氨基酸：轻链可变结构域中的残基24至34(LCDR1)、50至56(LCDR2)和89至97(LCDR3)，以及重链可变结构域中的残基31至35或31至35b(HCDR1)、50至65(HCDR2)和95至102(HCDR3)；(Kabat et al.，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。因此，HV可以包含在对应的CDR内，并且本文对VH和VL结构域的“超变环”的提及应被解释为也涵盖对应的CDR，反之亦然，除非另有说明。

可变结构域的更高度保守部分称为框架区(FR)，如下文所定义。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR(分别为FR1、FR2、FR3和FR4)，主要采用β折叠构型，其通过三个超变环连接。每条链中的超变环通过FR紧密保持在一起，并且与来自另一条链的超变环一起有助于形成抗体的抗原结合位点。抗体的结构分析揭示了序列与由互补决定区形成的结合位点的形状之间的关系(Chothia et al.，J.Mol.Biol.227：799-817(1992))；Tramontano et al.，J.Mol.Biol，215：175-182(1990))。尽管其具有高序列变异性，但六个环中的五个仅采用主链构象中的一小部分，称为“规范结构”。这些构象首先由环的长度决定，其次由环中和框架区中某些位置的关键残基的存在决定，这些残基通过其堆积、氢键键合或呈现不寻常主链构象的能力来决定构象。

“框架区”——本文中使用的术语“框架区”或“FR区”包括作为可变区的一部分但不是CDR的一部分的氨基酸残基(例如，使用CDR的Kabat定义)。因此，可变区框架的长度为约100至120个氨基酸，但仅包含在CDR之外的那些氨基酸。对于重链可变结构域的具体实例和由Kabat等定义的CDR，框架区1对应于涵盖氨基酸1至30的可变区结构域；框架区2对应于涵盖氨基酸36至49的可变区结构域；框架区3对应于涵盖氨基酸66至94的可变区结构域；并且框架区4对应于从氨基酸103到可变区末端的可变区结构域。轻链的框架区类似地由每一个轻链可变区CDR分开。类似地，使用Chothia等或McCallum等的CDR定义，框架区边界由如上所述的相应CDR末端分开。在一些优选的实施方案中，CDR如Kabat所定义。

在天然存在的抗体中，存在于每个单体抗体上的六个CDR是短的、非连续的氨基酸序列，其在抗体在水性环境中呈现其三维构型时特别地定位以形成抗原结合位点。重链和轻链可变结构域的其余部分在氨基酸序列中显示出较小的分子间变异性，并且被称为框架区。框架区主要采用β折叠构型，并且CDR形成连接β折叠结构的环且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，这些框架区起到形成支架的作用，该支架通过链间非共价相互作用将六个CDR定位在正确的方向上。由定位的CDR形成的抗原结合位点限定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进抗体与免疫反应性抗原表位的非共价结合。本领域普通技术人员可以容易地鉴定CDR的位置。

“非糖基化的”——本文中使用的术语“非糖基化的”是指在抗体或抗原结合片段中的潜在糖基化位点处缺乏糖基化的抗体或其抗原结合片段的形式。在某些实施方案中，术语“非糖基化的”是指在抗体或抗原结合片段中的潜在N-连接糖基化位点处缺乏糖基化的抗体或其抗原结合片段的形式。在某些实施方案中，术语“非糖基化的”是指在重链可变区中的潜在N-连接糖基化位点处缺乏糖基化的抗体或其抗原结合片段的形式。

“恒定区”——本文中使用的术语“恒定区”是指可变结构域或可变区之外的抗体分子部分。免疫球蛋白轻链具有单结构域“恒定区”，其通常称为“CL或CL1结构域”。该结构域位于VL结构域的C端。免疫球蛋白重链的恒定区根据免疫球蛋白类别而不同(γ、μ、α、δ、ε)。重链γ、α和δ具有由三个免疫球蛋白结构域(称为CH1、CH2和CH3)组成的恒定区以及将CH1和CH2结构域分开的柔性铰链区。重链μ和ε具有由四个结构域(CH1至CH4)组成的恒定区。重链的恒定结构域位于VH结构域的C端。

免疫球蛋白重链和轻链中氨基酸的编号从Y构型的叉形末端的N端延伸至每条链底部的C端。不同的编号方案用于限定免疫球蛋白重链和轻链的恒定结构域。根据EU编号方案，IgG分子的重链恒定结构域标识如下：CH1-氨基酸残基118至215；CH2-氨基酸残基231至340；CH3-氨基酸残基341至446。“铰链区”包含将CH1结构域与CH2结构域连接的重链分子部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N端抗原结合区独立移动。铰链区可细分为三个不同的结构域：上游、中部和下游铰链结构域(Roux K.H.etal.J.Immunol.161：4083-901998)。包含“全人”铰链区的本发明抗体可包含下表1中所示的铰链区序列之一。

表1.人铰链序列

“片段”——在本发明的抗体的背景下使用的术语“片段”是指抗体或抗体链的区段或部分，其包含的氨基酸残基少于完整或完全抗体或抗体链。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其特异性结合抗原或与完整抗体(即，与其所来源于的完整抗体)竞争与抗原特异性结合(例如，与C2蛋白或其部分特异性结合)。本文中使用的术语抗体分子的“片段”包括抗体的抗原结合片段，例如，抗体轻链可变结构域(VL)、抗体重链可变结构域(VH)、单链抗体(scFv)、F(ab’)2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、单臂(单价)抗体、双体、三体、四体或通过组合、组装或缀合这样的抗原结合片段形成的任何抗原结合分子。本文中使用的术语“抗原结合片段”还旨在涵盖选自单体(unibody)、结构域抗体和纳米抗体(nanobody)的抗体片段。片段可例如通过化学或酶处理完整或完全抗体或抗体链或者通过重组方式获得。

补体成分C2

人补体的第二成分(C2)是90至100kDa的糖蛋白，其参与补体激活的经典途径和凝集素途径。C2可以被经典途径的C1s激活或被凝集素途径的MASP2激活。C2与表面结合的C4b(在Mg²⁺存在下)结合，以形成C4bC2复合体，其随后被激活的C1s或MASP2切割成两个片段：较大的70kDa片段，传统上称为C2a，其仍然连接至C4b，以形成C3转化酶C4bC2a；和较小的30kDa N端片段，传统上称为C2b，其被释放到流体相中。一些作者最近交换了C2a和C2b的名称，以使得C2b是指较大的70kDa片段，并且C2a是指较小的30kDa片段。本文中使用的C2a应指较大的70kDa片段，并且C2b应指较小的30kDa片段。一旦C2a被激活并与C4b结合，其就构成了能够分别切割C3和C5的C3和C5转化酶的催化亚基。

人C2的氨基酸序列是已知的(GenBank登录号：NM_000063)并显示为SEQ ID NO：21。

人C2的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)：

与许多其他血浆蛋白一样，C2具有模块化结构。从其N端开始，C2由三个补体控制蛋白模块(CCP1-3，也称为短共有重复序列(short consensus repeat，SCR)或sushi结构域重复序列)、包含金属离子依赖性黏附位点的冯·维勒布兰德因子A型(vWFA)结构域以及丝氨酸蛋白酶(serine protease，SP)结构域组成(Arlaud et al.，Adv Immunol 1998，69：249)。电子显微术研究表明，C2由三个结构域组成。三个CCP模块(CCP1-3)一起形成N端结构域，其对应于C2b。vWFA结构域构成第二结构域，并且SP结构域构成第三结构域。第二和第三结构域一起构成分子的较大的C2a部分。

CCP模块是许多蛋白质中存在的共同结构基序。这些球状单元由约60个氨基酸残基组成，并折叠成围绕四个不变的二硫键结合的半胱氨酸残基构建的紧凑的六至八链的β折叠结构(Norman et al.，JMol Biol 1991，219：717)。相邻的CCP模块由保守性差的接头共价连接。

C2与表面结合的C4b的初始结合由两个低亲和力位点介导：一个在C2b上(Xu&Volanakis，J Immunol 1997，158：5958)，并且另一个在C2a的vWFA结构域上(Horiuchi etal.，J Immunol 1991，47：584)。尽管C2b和C2a的晶体结构已被确定为

分辨率(Milderet al.，Structure 2006，14：1587；Krishnan et al.，J Mol Biol 2007，367：224；Krishnan et al.，Acta Cristallogr D Biol Crystallogr 2009，D65：266)，但构成C2上C4和C3接触位点的氨基酸残基的确切拓扑学和结构是未知的。因此，涉及与C4相互作用的C2氨基酸残基仍有待确定(Krishnan et al.，Acta Cristallogr D Biol.Crystallogr2009，D65：266)。

抗C2抗体

本发明的一个方面是与人补体因子C2特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其片段包含：

VH结构域，其包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列；和

VL结构域，其包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列；

其中VH结构域的氨基酸残基72至74(Kabat编号)相应地由X₁X₂X₃组成，其中X₂是任何氨基酸，并且X₁X₂X₃不是NX₂S或NX₂T。

VH结构域包含互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3。VL结构域包含CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列示于表2中。

表2.CDR

在某些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段与人补体因子C2b特异性结合。在某些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段与人补体因子C2的对应于人补体因子C2b的部分中的表位特异性结合。

在某些实施方案中，重链的可变结构域是非糖基化的。在某些实施方案中，重链的可变结构域的氨基酸序列不包含以序列N-X-S/T为特征的潜在糖基化位点，其中N表示天冬酰胺，X表示任何氨基酸，并且S/T表示丝氨酸或苏氨酸。因此，在某些实施方案中，可以修饰具有包含序列N-X-S/T的VH结构域的抗体，以使得这些残基相应地由X₁X₂X₃组成，其中X₂是任何氨基酸，并且X₁X₂X₃不是NX₂S或NX₂T。即，X₁可以是除N之外的任何氨基酸，和/或X₃可以是除S或T之外的任何氨基酸。在某些实施方案中，可以修饰具有包含序列N-X-S或N-X-T的VH结构域的抗体，以使得这三个残基相应地由D-X-S组成。在某些另外的实施方案中，可以修饰具有包含序列N-X-S或N-X-T的VH结构域的抗体，以使得这三个残基相应地由D-X-T组成。

在某些实施方案中，残基72至74(Kabat编号)处的重链氨基酸相应地由X₁X₂X₃组成，其中X₂是任何氨基酸，并且X₁X₂X₃不是NX₂S或NX₂T。

在某些实施方案中，残基72至74(Kabat编号)处的重链氨基酸由DX₂S组成。

在某些实施方案中，残基72至74(Kabat编号)处的重链氨基酸由DKS组成。

在某些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，VH结构域的氨基酸序列由SEQ ID NO：3中所示的序列组成。

在某些实施方案中，VL结构域包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，VL结构域的氨基酸序列由SEQ ID NO：2中所示的序列组成。

在某些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列，并且VL结构域包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，VH结构域的氨基酸序列由SEQ ID NO：3中所示的序列组成，并且VL结构域的氨基酸序列由SEQ ID NO：2中所示的序列组成。

SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2的氨基酸序列示于表3中。SEQ ID NO：2对应于Broteio Pharma B.V的美国专利No.9,944,717中公开的人源化5F2.4(BRO2)的VL(VK3)结构域。表3中还显示，SEQ ID NO：28对应于美国专利No.9,944,717中公开的人源化5F2.4(BRO2)的VH(VH4)结构域，其通过引用并入本文。

表3.VH和VL结构域

在某些实施方案中，本发明的单克隆抗体包含人抗体，特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。

在某些实施方案中，抗体包含人IgG1的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且包含CH2结构域中的替换L234A和L235A。

在某些实施方案中，抗体包含人IgG1的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且包含CH3结构域中的替换H433K和N434F。

在某些实施方案中，抗体包含人IgG1的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且包含CH2结构域中的替换L234A和L235A以及CH3结构域中的替换H433K和N434F。

在某些实施方案中，抗体包含人IgG4的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。在某些实施方案中，抗体包含人IgG4的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且包含铰链结构域中的替换S228P。

在某些实施方案中，抗体包含人IgG4的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且包含CH3结构域中的替换L445P。

在某些实施方案中，抗体包含人IgG4的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且包含铰链结构域中的替换S228P和CH3结构域中的替换L445P二者。

在某些实施方案中，抗体包含人IgG4的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且包含CH3结构域中的替换H433K和N434F。

在某些实施方案中，抗体包含人IgG4的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且包含铰链结构域中的替换S228P和CH3结构域中的替换H433K和N434F。

在某些实施方案中，抗体包含人IgG4的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且包含CH3结构域中的替换H433K、N434F和L445P。

在某些实施方案中，抗体包含人IgG4的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且包含铰链结构域中的替换S228P以及CH3结构域中的替换H433K、N434F和L445P。

在某些实施方案中，单克隆抗体包含人IgG重链恒定结构域。在某些实施方案中，重链恒定结构域包含人IgG1重链恒定结构域。在某些实施方案中，重链恒定结构域由人IgG1重链恒定结构域组成。

在某些实施方案中，重链恒定结构域包含人IgG1重链恒定结构域，其包含如SEQID NO：29所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链恒定结构域的氨基酸序列由如SEQID NO：29所示的序列组成。

在某些实施方案中，重链恒定结构域包含人IgG1重链恒定结构域，其包含如SEQID NO：4所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链恒定结构域的氨基酸序列由如SEQ IDNO：4所示的序列组成。

在某些实施方案中，重链恒定结构域包含人IgG4重链恒定结构域。在某些实施方案中，重链恒定结构域由人IgG4重链恒定结构域组成。

在某些实施方案中，重链恒定结构域包含人IgG4重链恒定结构域，其包含如SEQID NO：30所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链恒定结构域的氨基酸序列由如SEQID NO：30所示的序列组成。

在某些实施方案中，重链恒定结构域包含人IgG4重链恒定结构域，其包含如SEQID NO：31所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链恒定结构域的氨基酸序列由如SEQID NO：31所示的序列组成。

在某些实施方案中，重链恒定结构域包含人IgG4重链恒定结构域，其包含如SEQID NO：5所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链恒定结构域的氨基酸序列由如SEQ IDNO：5所示的序列组成。

SEQ ID NO：4、5和29至31的氨基酸序列示于表4中。

表4.重链恒定结构域

在某些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段包含全长单克隆抗体。

在某些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段由全长单克隆抗体组成。

在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的重链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的轻链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的轻链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链以及与如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的轻链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的重链以及与如SEQID NO：7所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的轻链的单克隆抗体。

在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的重链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的轻链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的轻链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQID NO：6所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链以及与如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的轻链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的重链以及与如SEQID NO：7所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的轻链的单克隆抗体。

在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的重链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链以及与如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一生的轻链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的重链以及与如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的轻链的单克隆抗体。

在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的重链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链以及与如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的轻链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的重链以及与如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的轻链的单克隆抗体。

在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的重链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链以及与如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的轻链的单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中提供了包含与如SEQID NO：8所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的重链以及与如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有100％序列同一性的轻链的单克隆抗体。

SEQ ID NO：6至8和32至34的氨基酸序列示于表5中。

表5.重链和轻链

对于其中抗体的重链和/或轻链由与参考序列的特定百分比序列同一性限定的一些实施方案，重链和/或轻链可保留与参考序列中存在的那些CDR序列相同的CDR序列，以使得变异仅存在于CDR区域之外。

除非在本申请中另外说明，否则两个氨基酸序列之间的％序列同一性可以通过比较以最佳方式排列的这两个序列而确定，并且其中待比较的氨基酸序列可以相对于参照序列包含添加或缺失以用于这两个序列之间的最佳比对。如下计算同一性百分比：确定两个序列之间氨基酸残基相同的相同位置的数目，将该相同位置的数目除以比较窗口中的位置总数并将得到的结果乘以100以获得这两个序列之间的同一性百分比。例如，可以使用BLAST程序“BLAST 2sequences”(Tatusova et al，“Blast 2sequences-a new tool forcomparing protein and nucleotide sequences”，FEMS Microbiol Lett.174：247-250)，使用的参数是默认给出的那些(特别是参数“开放空位罚分”：5，和“延伸空位罚分”：2；所选矩阵是例如程序提出的矩阵“BLOSUM 62”)，待比较的两个序列之间的同一性百分比由程序直接计算。

在一些非限制性实施方案中，本发明的抗体可包含以下CH1结构域和/或CL结构域(分别来自重链和轻链)：其氨基酸序列完全或基本上是人的。在本发明的抗体或抗原结合片段是意图用于人治疗用途的抗体的情况下，抗体的整个恒定区或其至少一部分通常具有完全或基本上人的氨基酸序列。因此，CL结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域(如果存在的话)中的一个或更多个或者任意组合对于其氨基酸序列可以是完全或基本上人的。

有利地，CL结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域(如果存在的话)可以全部具有完全或基本上人的氨基酸序列。在人源化或嵌合抗体或者抗体片段的恒定区的背景下，术语“基本上人的”是指与人恒定区至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少97％、或至少99％的氨基酸序列同一性。在本上下文中，术语“人氨基酸序列”是指由人免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，其包括种系、重排和体细胞突变的基因。本发明还考虑了包含相对于人序列通过进行一个或更多个氨基酸添加、缺失或替换而被改变的“人”序列恒定结构域的多肽，明确要求存在“完全人”铰链区的那些实施方案除外。

本发明的C2结合抗体中“完全人”铰链区的存在对于使免疫原性最小化和优化抗体稳定性二者可以是有益的。

C2结合抗体可以在Fc区内被修饰以提高对新生儿Fc受体FcRn的结合亲和力。提高的结合亲和力可在酸性pH(例如从约pH 5.5至约pH 6.0)下是可测量的。提高的结合亲和力可在中性pH(例如从约pH 6.9至约pH 7.4)下也是可测量的。在该实施方案中，“提高的结合亲和力”意指相对于未经修饰的Fc区的结合亲和力提高对FcRn的结合亲和力。通常，未经修饰的Fc区将具有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的野生型氨基酸序列。在这样的一些实施方案中，具有经修饰Fc区的抗体分子对FcRn的提高的结合亲和力将相对于野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4对FcRn的结合亲和力进行测量。

C2结合抗体可以在Fc区内被修饰以提高对人新生儿Fc受体FcRn的结合亲和力。提高的结合亲和力可在酸性pH(例如从约pH 5.5至约pH 6.0)下是可测量的。提高的结合亲和力可在中性pH(例如从约pH 6.9至约pH 7.4)下也是可测量的。在该实施方案中，“提高的结合亲和力”意指相对于未经修饰的Fc区的结合亲和力提高对人FcRn的结合亲和力。通常，未经修饰的Fc区将具有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的野生型氨基酸序列。在这样的一些实施方案中，具有经修饰Fc区的抗体分子对人FcRn的提高的结合亲和力将相对于野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4对人FcRn的结合亲和力进行测量。

药物组合物

本发明的一个方面是药物组合物，其包含与人补体因子C2特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及可药用载体，其中所述单克隆抗体或其片段包含：

VH结构域，其包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列；和

VL结构域，其包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列；

其中VH结构域的氨基酸残基72至74(Kabat编号)相应地由X₁X₂X₃组成，其中X₂是任何氨基酸，并且X₁X₂X₃不是NX₂S或NX₂T。

本发明的药物组合物可以与可药用载体或稀释剂以及任何其他已知的辅料和赋形剂一起根据常规技术例如(Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，Gennaro，Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1995)中公开的那些进行配制。

术语“可药用载体”涉及固有地无毒性的载体或赋形剂。这样的赋形剂的一些实例包括但不限于：盐水、林格液、右旋糖溶液和汉克斯液(Hanks’solution)。也可以使用非水性赋形剂，例如不挥发性油和油酸乙酯。

药物组合物通常在制造和储存条件下必须是无菌和稳定的。该组合物可被配制成溶液剂、微乳剂、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。可用于本发明药物组合物的合适的水性和非水性载体的一些实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其合适的混合物；植物油(例如橄榄油)；以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。可保持适当的流动性，例如通过使用包衣材料(例如卵磷脂)、通过在分散体的情况下保持所需粒度、以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。

药物组合物可还包含辅料，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌程序和通过包含多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸等来确保防止微生物的存在。还可期望在组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、甘油，或氯化钠。还可包含可药用的抗氧化剂，例如：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

无菌可注射溶液可通过将所需量的单克隆抗体与例如上文列举的成分之一或组合(根据需要)一起并入合适的溶剂中，然后灭菌微滤来制备。通常，通过将活性化合物并入无菌载体来制备分散体，所述载体含有基本的分散介质和所需的例如来自上文列举的那些的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的所需成分的粉末。

药物组合物优选肠胃外，优选通过静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)注射或输注施用。

本文中使用的短语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”意指除了肠内和表面施用之外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、腹膜内、皮下、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现可注射抗C2 mAb或其片段的延长吸收。

mAb或其片段可用将保护化合物免于迅速释放的载体来制备，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这样的制剂的方法通常是本领域技术人员已知的。参见，例如，Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

药物组合物可用本领域已知的医疗装置施用。

调整剂量方案以提供最佳的期望响应(例如，治疗响应)。例如，可施用单次推注(single bolus)，可随时间施用数个分开的剂量，或者可根据治疗情况的紧急程度所指示的按比例降低或提高剂量。

可改变本发明药物组合物中mAb或其片段的实际剂量水平，以获得有效实现特定患者之所期望治疗响应而对患者无毒的活性成分的量。

在一个实施方案中，根据本发明的结合分子，特别是抗体，可以以10至500mg/m²，例如200至400mg/m²的每周剂量通过输注施用。这样的施用可重复，例如1至8次，例如3至5次。施用可通过在1至24小时的时间、例如2至12小时的时间内的连续输注进行。在一些实施方案中，施用可通过一次或更多次推注进行。

在一个实施方案中，根据本发明的结合分子，特别是抗体，可以以1至50mg/kg体重(mg/kg)，例如5至25mg/kg的每周剂量通过输注施用。这样的施用可重复，例如1至8次，例如3至5次。施用可通过在1至24小时的时间、例如2至12小时的时间内的连续输注进行。在一些实施方案中，施用可通过一次或更多次推注进行。

在另一个实施方案中，本发明中公开的mAb或其片段或任何其他结合分子可以作为维持治疗施用，例如每周一次，持续6个月或更长时间。

核酸分子和载体

本发明的一个方面是编码根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子或多个核酸分子。在某些实施方案中，单个核酸分子编码根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的VH和VL结构域二者。在某些实施方案中，单个核酸分子编码根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链(HC)和轻链(LC)二者。在某些实施方案中，第一核酸分子编码根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的VH结构域，并且第二核酸分子编码VL结构域。在某些实施方案中，第一核酸分子编码根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链(HC)，并且第二核酸分子编码轻链(LC)。

在某些实施方案中，编码VH结构域的核酸分子包含如SEQ ID NO：35所示的核酸序列。

在某些实施方案中，编码VL结构域的核酸分子包含如SEQ ID NO：36所示的核酸序列。

在某些实施方案中，编码HC的核酸分子包含如SEQ ID NO：37所示的核酸序列。

在某些实施方案中，编码HC的核酸分子包含如SEQ ID NO：38所示的核酸序列。

在某些实施方案中，编码HC的核酸分子包含如SEQ ID NO：39所示的核酸序列。

在某些实施方案中，编码HC的核酸分子包含如SEQ ID NO：40所示的核酸序列。

在某些实施方案中，编码HC的核酸分子包含如SEQ ID NO：41所示的核酸序列。

在某些实施方案中，编码LC结构域的核酸分子包含如SEQ ID NO：42所示的核酸序列。

在某些实施方案中，编码VH结构域的核酸分子的核酸序列由如SEQ ID NO：35所示的序列组成。

在某些实施方案中，编码VL结构域的核酸分子的核酸序列由如SEQ ID NO：36所示的序列组成。

在某些实施方案中，编码HC的核酸分子的核酸序列由如SEQ ID NO：37所示的序列组成。

在某些实施方案中，编码HC的核酸分子的核酸序列由如SEQ ID NO：38所示的序列组成。

在某些实施方案中，编码HC的核酸分子的核酸序列由如SEQ ID NO：39所示的序列组成。

在某些实施方案中，编码HC的核酸分子的核酸序列由如SEQ ID NO：40所示的序列组成。

在某些实施方案中，编码HC的核酸分子的核酸序列由如SEQ ID NO：41所示的序列组成。

在某些实施方案中，编码LC结构域的核酸分子的核酸序列由如SEQ ID NO：42所示的序列组成。

对应于SEQ ID NO：35至42的核酸序列示于表6中。

表6.VH、VL、HC和LC的核酸序列

对于SEQ ID NO：35和39，a217g产生N72D突变

本发明还提供了包含根据本发明的核酸分子的基因递送载剂或载体。基因递送载剂或载体可以是质粒或其他由细菌复制的核酸。这样的基因递送载剂或载体可以容易地转移至例如生产细胞。基因递送载剂也可以是病毒载体。一些优选的病毒载体是腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体。

本发明还提供了包含根据本发明的核酸分子或多个核酸分子的载体。在某些实施方案中，单个载体包含编码根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的VH和VL结构域二者的单个核酸分子。在某些实施方案中，单个载体包含编码根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链(HC)和轻链(LC)二者的单个核酸分子。

在某些实施方案中，第一载体包含编码根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的VH结构域的第一核酸分子，并且第二载体包含编码VL结构域的第二核酸分子。在某些实施方案中，第一载体包含编码根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链(HC)的核酸分子，并且第二载体包含编码轻链(LC)的第二核酸分子。

根据本发明的载体包括适用于通过宿主细胞表达单克隆抗体或其抗原结合片段的表达载体。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。

本发明提供了包含编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸分子或多个核酸分子的宿主细胞。作为替代或补充，本发明提供了包含编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段的载体或多个载体的宿主细胞。可以使用任何合适的技术，包括例如但不限于转导、转化、转染和注射，将一个或更多个核酸分子或类似地一个或更多个载体引入到宿主细胞中。这些方法的多种形式是本领域中公知的，包括例如电穿孔、磷酸钙转染、脂质转染(lipofection)、细胞挤压(cell squeezing)、声穿孔、光学转染和基因枪。

在某些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是酵母细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是昆虫细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是人细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是选自杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞、NS0细胞、人胚肾(HEK293)细胞和PER.C6^TM细胞的哺乳动物细胞。本发明还考虑了除了上文提及的那些之外的其他宿主细胞。宿主细胞还包括被开发用于商业生产根据本发明的抗体及其抗原结合片段的细胞系。

提供有所述核酸的细胞系可以在实验室或生产工厂中产生结合分子/抗体。或者，将核酸转移至有此需要的动物体内的细胞，并且通过经转化的细胞在体内产生结合分子/抗体。本发明的核酸分子通常提供有调节序列以在细胞中表达结合分子。然而，如今的同源重组技术已经变得高效得多。这些技术涉及，例如，使用位点特异性双链断裂诱导核酸酶如TALEN的双链断裂辅助同源重组。这样的或类似的同源重组系统可以将核酸分子插入到提供一个或更多个顺式所需调节序列的区域中。

本发明还提供了包含根据本发明的核酸分子或载体的分离的或重组的细胞、或体外细胞培养物细胞。本发明还提供了包含根据本发明的结合分子的分离的或重组的细胞、或体外细胞培养物细胞。优选地，所述细胞产生所述结合分子。在某些实施方案中，所述细胞分泌所述结合分子。在一个优选的实施方案中，所述细胞是杂交瘤细胞、CHO细胞、NS0细胞、HEK293细胞或PER-C6^TM细胞。在一个特别优选的实施方案中，所述细胞是CHO细胞。还提供了包含根据本发明的细胞的细胞培养物。多个机构和公司已经开发出用于大规模生产抗体，例如用于临床用途的细胞系。这样的细胞系的一些非限制性实例是CHO细胞、NS0细胞或PER.C6^TM细胞。这些细胞还用于其他目的，例如生产蛋白质。被开发用于工业规模生产蛋白质和抗体的细胞系在本文中还称为工业细胞系。本发明提供了包含根据本发明的核酸分子、结合分子和/或抗体的工业细胞系。本发明还提供了被开发用于大规模生产蛋白质和/或抗体的包含本发明的结合分子或抗体的细胞系。本发明还提供了被开发用于大规模生产本发明的结合分子和/或抗体的细胞系的用途。

制备抗体的方法

本发明还提供了制备根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在允许表达单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养根据本发明的宿主细胞群。在某些实施方案中，该方法还包括从培养物中收获所述单克隆抗体或其抗原结合片段。优选地，所述细胞在无血清培养基中培养。优选地，所述细胞适于悬浮生长。还提供了可通过根据本发明的用于产生抗体的方法获得的抗体。抗体优选从培养物的培养基中纯化。优选地，所述抗体是亲和纯化的。

使用方法

本发明的一个方面是在对象中抑制经典途径或凝集素途径的激活的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，对象是哺乳动物。在某些实施方案中，对象是小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、山羊、绵羊、猪、猫、狗、马或牛。在某些实施方案中，对象是非人灵长类，例如猴。在某些实施方案中，对象是人。

可使用任何合适的方法，包括例如测量总补体活性，即基于血清样品裂解用抗绵羊抗体包被的绵羊红细胞的能力的溶血活性测试，来评估抗体或抗原结合片段的抑制作用。与未经处理的对照样品相比溶血作用降低表明抗体或抗原结合片段的抑制作用。在一个实施方案中，未经处理的对照样品可以是在开始用抗体或抗原结合片段处理之前获得的历史样品。通常，与对照相比总补体活性降低至少5％表明有效性。在某些实施方案中，与对照相比总补体活性降低至少10％表明有效性。

可通过根据本发明的方法或单克隆抗体或其抗原结合片段来治疗或预防的疾病是：自身免疫病，例如实验性变态反应性神经炎、II型胶原蛋白诱导型关节炎、重症肌无力、溶血性贫血、肾小球肾炎、特发性膜性肾病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、免疫复合体诱导的血管炎、成人型呼吸窘迫综合征、卒中、异种移植、同种异体移植、多发性硬化、烧伤、体外透析和血氧合，炎性疾病，包括脓毒症和脓毒症休克，细胞因子或mAb的体内施用诱导的毒性，抗体介导的同种异体移植物(例如肾同种异体移植物)排斥，多发性创伤，缺血再灌注损伤和心肌梗死。

患有涉及补体介导的损伤的疾病或处于发生这样的补体介导的损伤的风险之中的个体可以通过向有此需要的个体施用有效量的根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段来治疗。因此，生物活性补体衍生肽在个体中减少并且补体对细胞和组织的裂解和其他破坏作用被减弱或防止。“有效量”意指足以实现期望的生物响应的量。在一个实施方案中，“有效量”意指根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的能够在个体中抑制补体激活的量。

治疗(预防性或治疗性)通常由与药用载体一起肠胃外例如静脉内、皮下或局部施用根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段组成。施用通常可以通过注射或输注来完成。根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的剂量和施用方案将取决于旨在抑制补体激活的程度。通常，对于本发明的单克隆抗体，量为2至20mg/kg体重。对于肠胃外施用，根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段将被配制成与可药用肠胃外载剂组合的可注射形式。这样的载剂是本领域中公知的，并且一些实例包括盐水、右旋糖溶液、林格液和含有少量人血清白蛋白的溶液。

药物组合物通常在制造和储存条件下必须是无菌和稳定的。该组合物可被配制成溶液剂、微乳剂、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。可用于本发明药物组合物的合适的水性和非水性载体的一些实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其合适的混合物；植物油(例如橄榄油)；以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。可保持适当的流动性，例如通过使用包衣材料(例如卵磷脂)、通过在分散体的情况下保持所需粒度、以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。

药物组合物可还包含辅料，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌程序和通过包含多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸等来确保防止微生物的存在。还可期望在组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、甘油，或氯化钠。还可包含可药用的抗氧化剂，例如：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

无菌可注射溶液可通过将所需量的mAb或其片段与例如上文列举的成分之一或组合(根据需要)一起并入合适的溶剂中，然后灭菌微滤来制备。通常，通过将活性化合物并入无菌载体来制备分散体，所述载体含有基本的分散介质和所需的例如来自上文列举的那些的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的所需成分的粉末。

通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现可注射抗C2 mAb或其片段的延长吸收。

mAb或其片段可用将保护化合物免于迅速释放的载体来制备，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这样的制剂的方法通常是本领域技术人员已知的。参见，例如，Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

药物组合物可用本领域已知的医疗装置施用。

调整剂量方案以提供最佳的期望响应(例如，治疗响应)。例如，可施用单次推注，可随时间施用数个分开的剂量，或者可根据治疗情况的紧急程度所指示的按比例降低或提高剂量。

可改变本发明药物组合物中mAb或其片段的实际剂量水平，以获得有效实现特定患者之所期望治疗响应而对患者无毒的活性成分的量。

在一个实施方案中，根据本发明的单克隆抗体可以以10至500mg/m²，例如200至400mg/m²的每周剂量通过输注施用。这样的施用可重复，例如1至8次，例如3至5次。施用可通过在2至24小时例如2至12小时的时间内的连续输注进行。

在另一个实施方案中，本发明中公开的mAb或其片段或任何其他结合分子可以通过维持治疗施用，例如每周一次，持续6个月或更长时间。

现在将参考以下实施例举例说明本发明，这些实施例阐述了特别有利的一些实施方案。然而，应注意，这些实施方案仅是举例说明性的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1：从抗C2b单克隆抗体中去除糖基化位点

BRO2-glyc-IgG4

美国专利No.9,944,717公开了一种鼠抑制性抗C2b单克隆抗体(mAb)。由该先导物，使用Antitope Ltd(Cambridge，UK)的复合人抗体技术产生了四种人源化变体，其包含不同的重链可变结构域(VH1、VH2、VH3或VH4)和κ轻链可变结构域(VK1、VK2、VK3或VK4)。基于计算机模拟分析，预测了每个人源化VH和VK序列的免疫原性风险。如表7中所示，当VH4与VK3或VK4配对时，预测了免疫原性的最低风险，以及与最接近的人种系变体的最高同一性百分比。这一观察结果基于针对人MHC II类的混杂结合肽的最低数量。VH4是优选的，因为它与最接近的人种系的同一性百分比更高。此外，基于结合和效力，VH4/VK3被选择作为抗人C2b人源化先导抗体，并且在本文中称为BRO2-glyc-IgG4。

表7.等级为1(＝最低)至5(＝最高)的免疫原性风险(高亲和力优先于中等亲和力)以及与最接近的人种系的序列同一性

BRO2-glyc-IgG4变体的SDS-PAGE分析揭示了VH3和VH4变体中的双条带和条带迁移。假设这种迁移是由VH3和VH4的框架区3(FR3)中残基72至74(Kabat编号)处的潜在糖基化位点(基序NXS)引起的。由于这种潜在的糖基化位点不仅会导致由哺乳动物细胞系表达的抗体产物的异质性，还会导致抗体功能的异质性，因此去除了潜在的糖基化位点。糖基化位点通过定点诱变去除以产生VH的N72D变体，其在本文中称为VH3.2或VH4.2。N72D突变消除了在VH3和VH4中观察到的改变的条带模式(图1)，证实了双条带和条带迁移是由重链中的糖基化和异质性引起的。

为了进一步确定变体VH4.2与异质糖基化的亲本mAb BRO2-glyc-IgG4相比是否表现出改善的特性，确定了每个抗体的热耐受，VH4.2是与BRO2-glyc-IgG4相同但在FR3中没有糖基化位点的VH。

为了测试热耐受，用Thermocycler(Biometra)将温度从55℃升高至75℃对人源化变体进行处理。在Biacore 3000上在用从血清(3500RU，Complement Technologies Cat#A112，批次#20)中纯化的人C2直接包被的CM5芯片上分析剩余的结合能力。使用BIAevaluation软件分析数据。每个变体的特异性结合的斜率用BIAevaluation软件确定，一般从传感图的线性相位拟合(在注射开始之后5秒时开始并在11秒之后停止)。然后使用对于59℃、56.9℃、55℃和4℃温度获得的斜率的平均值作为100％活性来计算活性百分比。最后，在GraphPad Prism中绘制活性百分比(Log(激动剂)相对于响应，可变斜率(4个参数))。抗体失去其50％结合能力时的温度(TM50)示于下表8中。

BRO2-IgG4

不具有BRO2-glyc-IgG4中存在的糖基化位点的两种变体均表现出改善的热耐受(表8)。BRO2-glyc-IgG4表现出64.0℃的TM50。VH4.2/VK3(在本文中也称为BRO2-IgG4)在两个独立实验中表现出65.0或65.1℃的TM50。VH4.2/VK4在两个独立实验中表现出65.2或65.4℃的TM50。

表8.抗C2b单克隆抗体与最接近的人种系序列的同一性百分比和热耐受

实施例2：非糖基化IgG4和非糖基化IgG1变体的制备

BRO2-IgG4-NH

具有pH依赖性抗原结合的抗体在内化到细胞中之后在酸性内体中解离结合的抗原。因此，释放的抗原被运送至溶酶体并被降解，而脱离抗原的解离的抗体通过FcRn再循环回到血浆。再循环的游离抗体可以与另一靶抗原结合。通过重复此循环，pH依赖性抗原结合抗体可以多于一次地与靶抗原结合，并因此提高抗体的中和能力。此过程在抗体用

(NH)技术(argenx，Belgium)装配时可进一步改善，

(NH)技术在酸性内体pH(pH 6.0)下但不在中性pH(pH 7.4)下增强抗体与FeRn的结合。因此，BRO2-IgG4的Fc区中的氨基酸发生突变以改变与FcRn的pH依赖性结合(H433K、N434F)。所得抗体在本文中称为BRO2-IgG4-NH。

BRO2-IgG1-NH和

BRO2-IgG1-LALA-NH(ARGX-117)

还检查了免疫球蛋白亚类对效力的作用。在人IgG1背景中制备了另外的

变体(BRO2-IgG1-NH)。通过Fc区中的改变了抗体与Fcγ受体的结合的突变，抗体效应物功能可进一步减弱。因此，氨基酸替换L234A和L235A(“LALA”)被并入到BRO2-IgG1-NH中以产生BRO2-IgG1-LALA-NH，在本文中也称为ARGX-117。

His1-IgG1-LALA-NH

为了确定BRO2-IgG1-LALA-NH的pH依赖性是否可以被改善以延长其体内药代动力学和药效学(PK/PD)效应，将BRO2-IgG1-LALA-NH抗体的VK中的一个氨基酸突变为组氨酸(G29H，突变体VK在本文中称为Vk3m3)。所得抗体在本文中称为His1-IgG1-LALA-NH。

His1-IgG4

类似地，为了确定BRO2-IgG4的pH依赖性是否可以被改善以延长其体内PK/PD效应，将BRO2-IgG4抗体的VK中的一个氨基酸突变为组氨酸(G29H，突变体VK在本文中称为Vk3m3)。所得抗体(VH4.2/Vk3m3)在本文中称为His1-IgG4。

His1-IgG4-NH

为了检查再循环对抗体效力的作用，将

突变并入到His1-IgG4(VH4.2/Vk3m3)抗体中。所得抗体在本文中称为His1-IgG4-NH。His2-IgG4-NH

为了确定BRO2-IgG4-NH的pH依赖性是否可以被改善以延长其体内PK/PD效应，将BRO2-IgG4-NH抗体的VH4的一个氨基酸突变为组氨酸(K26H，VH突变体在本文中称为VH4.2m12)。此外，将BRO2-IgG4-NH抗体的VK3轻链替换为上述VK4轻链，并将第二氨基酸突变为组氨酸(G29H，VK4突变体在本文中称为VK4m3)。所得抗体(VH4.2m12/VK4m3)在本文中称为His2-IgG4-NH。

实施例3：非糖基化BRO2变体的效力改善

总药代动力学(PK)

根据下表9将食蟹猴(n＝2，每组1只雄性和1只雌性)随机分配到各处理组中。

表9.处理组分配

在接受受试抗体之前一天(第-1天，或“PRE”)从每只猴获得血清样品。然后在第1天(d1)，根据表9，每只猴接受5mg/kg受试抗体的单次静脉内注射。然后在长达60天(至d60)期间从每只猴连续获得血清样品。

对于总抗体的PK(总PK)，将微量滴定板用100μL 5μg/mL山羊抗人IgG(Bethyl；A80-319A)在4℃下包被过夜。将板用至少200μL PBS-0.05％Tween20洗涤3次，并随后在室温(room temperature，RT)下用200μL PBS-2％BSA封闭2小时。在将板用至少200μL PBS-0.05％Tween20洗涤3次之后，将以100倍或更多倍稀释度并在100μL PBS-0.2％BSA-1％混合未经处理食蟹猴血清中稀释的血清样品、标准品和QC样品(在混合未经处理食蟹猴血清中制备)一式两份地应用。对于每种抗体，将其自己的冷冻标准品和QC样品一式两份地应用(使用与注射到猴中的批次相同的抗体批次)。阴性对照抗体是结合非C2补体成分的抗体。孵育在室温下进行2小时，同时摇动板。在将板用至少200μL PBS-0.05％Tween20洗涤5次之后，将100μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗人IgGκ(Southern Biotech，9230-05)在PBS 0.2％BSA中260,000倍地稀释并在室温下应用到孔中1小时。将板用至少200μL PBS-0.05％Tween20洗涤5次，用100μL 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)进行染色，并且在10分钟之后用100μL 0.5M H₂SO₄(CHEM LAB，Cat#CL05-2615-1000)停止。在450nm下测量OD，并使用GraphPad Prism来反算样品的浓度(各自使用其自己的标准品)。

结果示于表10中，并且糖基化的BRO2-glyc-IgG4与非糖基化的BRO2-IgG4的比较示于图2中。在总PK测定中，非糖基化的BRO2-IgG4的浓度总体上高于糖基化BRO2-glyc-IgG4的浓度。总PK的这种改善是完全出乎意料的，并且代表了非糖基化抗体的一个重要的另外的优势。

表10.总PK

游离C2

如上所述，食蟹猴(n＝2，每组1只雄性和1只雌性)接受5mg/kg受试抗体的单次静脉内注射。

在该测定中，将微量滴定板用100μL 2.5μg/mL小鼠抗人C2单克隆抗体mAb32(抗C2#32 m-IgG@3.31mg/mL，0.2μm PBS，LC-12/05-166，13年4月12日)在4℃下包被过夜。该抗体与C2上与BRO2不同的表位结合。将板用至少200μL PBS-0.05％Tween20洗涤3次，并随后用200μL PBS-2％BSA(pH 7.4)在室温下封闭2小时。与此同时，将样品、冷冻标准品(对于每种抗体具有特异性，在混合的未经处理的食蟹猴血清中制备)和冷冻QC样品(在混合的未经处理的食蟹猴血清中制备)解冻并在80μL PBS-0.2％BSA中6.7倍地稀释。以0.6μg/mL添加40μL的生物素化的抗C2 VH4/VK3。每种样品一式两份地制备。在添加生物素化的抗体之后，立即将100μL混合物转移至洗涤过的经包被的板。将板在室温下孵育2小时，用至少200μLPBS-0.02％Tween20洗涤5次，并且添加在PBS-0.2％BSA中300,000倍稀释的100μL strep-HRP(Jackson，016-030-084)。在于室温下孵育1小时之后，将板用至少200μL PBS-0.05％Tween20洗涤5次，用100μL TMB(Calbiochem，CL07)进行染色，并且在10分钟之后用100μL0.5M H₂SO₄(CHEM LAB，Cat#CL05-2615-1000)停止。在450nm下测量OD并将其用于确定C2水平。

首先使用在不同日进行的游离C2测定一起测试来自以下猴的血清：猴1和2；猴3和4；猴5和6；猴7、8、9和10；猴11、12、15和16；以及猴13、14、17和18。

所有猴的游离C2水平示于图3A至3I和表11中。

如所预期的，对于猴3和4，游离C2没有下降，因为这些猴用阴性对照抗体进行给药。对于用BRO2变体处理的所有猴，直到第2天之后，游离C2水平才非常低。

对于接受BRO2-glyc-IgG4(猴1和2)和BRO2-IgG4(猴5和6)的猴，C2水平在第4天开始回升，并且到第31天回到基线水平。用非糖基化的抗体处理的猴5和6始终显示出比用BRO2-glyc-IgG4处理的那些更低的游离C2水平(图3C，表11)。

对于除了在抗药抗体(ADA)情况下的那些(在图3D至3I中用*标记)之外的所有其他猴，C2水平的提高要缓慢得多，并且甚至到第31天C2水平也没有恢复到基线。

图4示出了每组2只猴的平均游离C2水平(OD 450nm)的放大(对数尺度)。BRO2变体的游离C2水平低于His1变体。

注射有BRO2-IgG1-LALA-NH(ARGX-117)的猴10在所有的测试时间点均具有最低的C2水平。图5中可以看到来自猴5和6、9和10以及15和16的直至60天的游离C2水平的比较。猴10也具有最佳的总PK(见上文)。原始数据示于表11中，并且比较糖基化和非糖基化变体的平均值数据示于表12中。

表12.糖基化和非糖基化抗体的平均游离C2

由于这些刚刚描述的对于不同猴的测定在不同日进行，因此对于所选数目的时间点，重复该分析(pre，4小时，第1、2、4、11和27天)，其中来自所有猴的血清放在单个板上(图6A至6D)。在添加和不添加过量BRO2(500μg/mL)的情况下，也对pre-样品进行了测试。

所有猴的pre-样品的OD都是可比较的，表明不同猴的游离C2水平是可比较的(图6A)。当pre-样品与500μg/mL BRO2一起预孵育时，所有信号下降到0.013至0.015的OD(图6A和6B)。对于任何PK样品都没有获得这样低的OD值，表明在任何时间点游离C2都没有完全耗竭。最低水平在4小时时获得，并且其对于BRO2变体(猴5、6、7、8、9和10，图6C)是最低的(OD为0.02至0.03)。在第11天和第27天的结果的解释受到ADA(抗药抗体)的妨碍，这在数只猴中观察到(图6D)。

免疫原性

如上所述，食蟹猴(n＝2，每组1只雄性和1只雌性)接受5mg/kg受试抗体的单次静脉内注射。从基线(暴露之前)直至第31天，对获自所有猴的血清样品针对ADA(抗药抗体)进行测试(图7A至7P)，并且获自猴5和6、9和10以及15和16的血清样品进行进一步测试直至第59天(图8A至8F)。

通过将微量滴定板用100μL 1μg/mL的相应抗体在4℃下包被过夜来确定免疫原性。将板用至少200μL PBS-0.05％Tween20洗涤3次，并随后用200μL PBS-1％酪蛋白在室温下封闭2小时。在将板用至少200μL PBS-0.05％Tween20洗涤3次之后，将血清样品在100μLPBS-0.1％酪蛋白中20倍或更多倍地稀释，并在室温(RT)下在经包被的孔中孵育2小时。在将板用至少200μL PBS-0.05％Tween20洗涤5次之后，在室温下将100μL抗猴IgG-HRP(Southern Biotech#4700-05)以8000倍稀释度添加至孔1小时。将板用至少200μL PBS-0.05％Tween20洗涤5次，用100μL TMB进行染色，并且在10分钟之后用100μL 0.5MH₂SO₄(CHEM LAB，Cat#CL05-2615-1000)停止。在450nm下测量OD。代表性的结果示于图7A至7P中。

对于猴8(BRO2-IgG4-NH)、11(His1-IgG4)、13和14(His1-IgG4-NH)以及16(His1-IgG1-LALA-NH)(分别为图7F、7I、7K和7L以及7N)，观察到明显的ADA响应。实际上，注射抗体之后在ELISA中获得的信号相比于基线(“PRE”)信号(注射抗体之前)提高了至少2倍。

对于猴11、13和16(分别为图7I、7K和7N)，从第11天开始观察到ADA；对于猴8(图7F)，从第15天开始；并且对于猴14(图7L)，从第19天开始。

对于猴9(BRO2-IgG1-LALA-NH)(图7G)，注射抗体之后对所有样品均观察到信号提高，但基线样品中的信号已经很高了，并且随时间的提高较低(约1.5倍)。

对于猴5(图7C)，在注射抗体之前在基线样品中观察到异常高的信号。该信号也高于后期时间点的信号。这可以通过抗体(存在于血清中)对测定的干扰来解释。因此无法确定这只猴中是否有ADA响应。

实施例4：等电点(pI)

Igawa等(Protein Eng Des Sel 2010，23(5)：385-392)，研究某些IgG1单克隆抗体的VH突变体，报道了等电点(pI)与单克隆抗体清除之间强正相关以及pI与单克隆抗体半衰期之间负相关。在该实施例中，确定了多种形式的抗人C2b的pI。结果示于表13中。

表13.抗人C2b单克隆抗体的表观pI

受试的所有三种抗体在VH中都没有糖基化。如表13中所示，发现ARGX-117的pI显著大于密切相关的IgG4抗体的pI。预期观察到的ARGX-117的pI将表现为所谓的抗原清扫的潜力增强。

实施例5：通过Western印迹和表面等离激元共振(SPR)分析进行的结构域定位

ARGX-117的结合特性通过Western印迹和表面等离激元共振(SPR)分析进行评估，如图1中所示。Western印迹结果显示ARGX-117与C2和C2b结合，如图9A中所示。ARGX-117的结合特性通过SPR，使用Biacore 300，用不同浓度的ARGX-117Fab作为洗脱物通过将C2(SEQID NO：21)包被在固相上进行进一步研究，如图9B中所示。假设在Fab与C2之间1：1结合，计算亲和力，并产生了约0.3nM的Kd。为了研究ARGX-117的作用机制，进行了SPR分析，其模拟了在固定至链霉亲和素包被的芯片的生物素化C4情况下的C3转化酶(C4bC2a)的形成，如图9C中所示。当添加单独的或与对照mAb一起预孵育的在流动缓冲液中的C2时，在芯片上观察到C2结合。与抗C2克隆63(即抗C2-63)一起预孵育产生了更高的信号，大概是因为与C2复合的该mAb形式和C2：mAb复合体结合在一起，导致了更高的分子量和更高的SPR信号。当C2与ARGX-117一起预孵育时，C2与C4b的结合大大降低。C2与C4b的初始相互作用被认为是由C2b结构域(SEQ ID NO：44)启动的。此后，大的C2a结构域(SEQ ID NO：43)接管，并且这种相互作用对于C3转化酶复合体的形成至关重要。来自该实验的结果表明ARGX-117通过抑制与C4b的结合来抑制C2。

为了进一步理解ARGX-117对C2抑制的作用机制，首先让C2与固定至链霉亲和素芯片的C4b结合，并在仅通过流动缓冲液稳定化之后，使样品流过，如图9D中所示。运行缓冲液或靶向无关可溶性抗原的对照人IgG4 mAb(即抗因子XI(抗FXI))导致一些信号降低，这在停止注射之后正常。注射抗C2-63导致信号提高，表明该mAb能够与C3转化酶(C4bC2a)结合。这与预测的C2与C4b的结合模型一致，这表明在C2上结合之后，C2a结构域仍然大部分可用。有趣的是，ARGX-117表现出与C3转化酶的强结合，其随后快速解离。这些结果表明ARGX-117能够与C2结合，但这种结合非常不稳定，可能以促进激活的方式影响C2。这些结果还表明ARGX-117将与C2b一起从C2分子中释放。

实施例6：使用C2和因子B的结构域交换突变体的结构域定位

为了定位抗C2-5F2.4的表位，利用了以下事实：抗C2-5F2.4不与因子B(FB；SEQ IDNO：50)交叉反应，并且C2和FB是具有类似结构域结构的高度同源蛋白质。这两种蛋白质都包含一个小片段和一个大片段。补体C2中的小片段称为C2b(SEQ ID NO：44)，并且因子B中的小片段称为FBa(SEQ ID NO：51)。每种蛋白质中的小片段包含三个Sushi结构域(CCP结构域)。每种蛋白质中的大片段包含冯·维勒布兰德因子A型结构域(VWFA)和肽酶S1结构域，如图10中所示。结构域交换突变体包含C端FLAG标签。

为了生成多种交换突变体，从GenScript获得C2、FB和十个结构域交换突变体的DNA构建体。将DNA热休克转化到感受态大肠杆菌(E.coli)细胞(ThermoFisher)中。细胞在琼脂板上划线并在37℃下生长16小时。制备(MP Bio)13瓶200mL LB(Luria肉汤(LuriaBroth))培养基并将其高压灭菌。将300μL氨苄青霉素(100mg/mL)添加至每个瓶。对于每个构建体，用3mL LB培养基开始预培养。6小时之后，将预培养物转移到瓶中并使其在37℃下在搅拌下生长16小时。通过质粒DNA纯化试剂盒根据制造商的说明(MaxiPrep，NucleoBondPC 500，Macherey-Nagel)，从细菌沉淀中纯化DNA，并在TE缓冲液中进行重构。质粒DNA浓度通过NanoDrop测定，并且设置为1μg/μL。质粒的完整性通过限制性分析来验证。对于每个构建体，将1μL质粒DNA和9μL限制性酶混合物(PstI和PvuII)混合并在37℃下孵育2小时。使用Bio-Rad ChemiDoc MP系统，在100V下运行1小时之后，在1％琼脂糖凝胶上分析DNA。用于精细定位的DNA构建体(见下文)以相同方式处理，但其完整性通过测序来检查。

通过在HEK293T细胞中进行瞬时转染来产生突变体蛋白。HEK细胞在完全DMEM(DMEM(Gibco)，补充有10％胎牛血清(FCS)和1％青霉素/链霉素(P/S))中培养。在转染之前一天，将两个烧瓶的细胞接种到15个10cm²培养皿(Greiner Bio-One)中。在转染之前，将21mL空DMEM培养基与630μL聚乙烯亚胺(P-Pei，Polysciences，Inc.)混合。作为对照，转染空质粒PF45 pcDNA3.1和PF146 H2B GFP。将15μg质粒DNA在Eppendorf管中在1500μL空培养基-P-Pei混合物中孵育20分钟。将转染混合物小心地添加至细胞，并通过上下移液混合培养基。8小时之后，将培养基更换为15mL空培养基。3天之后，用荧光显微镜检查细胞的GFP表达。在第4天收集上清液，将其通过0.22μm过滤器(Sartorius)进行过滤除菌，并用Vivaspin柱(Sartorius)浓缩至原始体积的约三分之一。结构域交换突变体用30,000MWCO柱浓缩，并且用于精细定位的C2b突变体用10,000MWCO柱浓缩。所有上清液都储存在-20℃下，并且也通过SDS-PAGE和抗FLAG Western印迹进行分析。

为了验证不同构建体的表达，进行了抗FLAG标签ELISA测定。将微板(Maxisorp，NUNC，Cat#439454)用在PBS中5倍稀释或未稀释(分别用于结构域交换突变体和精细定位突变体)的100μL HEK293T上清液包被过夜。在用PBS和0.05％Tween-20洗涤4次之后，添加100μL/孔在PBS和0.1％Tween-20(PBST)中的1μg/mL抗FLAG Ab(克隆M2，Sigma-Aldrich)并在室温(RT)下在搅拌下孵育1小时。作为检测Ab，将100μL/孔辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology，Cat#sc-2005，1000x dil.)在PBST中添加并在室温下孵育1小时。在最后的洗涤步骤之后，添加100μL/孔TMB(Invitrogen，Cat#SB02)作为底物，几分钟之后用100μL/孔HCl(Fischer，Cat#J/4320/15)停止反应并在450nm(BioRad，iMark Microplate reader)下读取吸光度。

除C2-(FB-Pep1)之外，抗FLAG ELISA在所有突变体的上清液中均检测到蛋白质，如图11中所示。突变体之间的变异可以通过包被之后抗FLAG mAb的不同产生或不同的检测效率来解释。

接下来，研究了抗C2-5F2.4抗体对交换突变体的识别。为此，将微板(Maxisorp，NUNC，Cat# 439454)用100μL PBS中的2μg/mL抗C2-5F2.4包被过夜。将板用具有0.05％Tween-20的PBS洗涤4次，并在室温下用200μL具有0.1％Tween-20和1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(PBST-BSA)封闭1小时。洗涤之后，在PBST-BSA中20倍稀释地添加含有突变体的100μL培养物上清液，并在室温下在搅拌下孵育2小时。洗涤之后，在室温下在PBST-BSA中添加1μg/mL生物素化的抗FLAG(克隆M2，Sigma-Aldrich)1小时作为检测抗体。将板洗涤并添加1μg/mL链霉亲和素-POD缀合物(Roche，Cat# 11089153001)并在黑暗中孵育30分钟。将板洗涤并添加100μL/孔TMB(Invitrogen，Cat#SB02)作为底物，并且几分钟之后用100μL/孔HCl(Fischer，Cat#J/4320/15)停止反应。在微板读取仪(BioRad，iMark微板读取仪)上在450nm下测量吸光度。

野生型C2显示出明显的结合，并且仅对C2-(FB-S2)观察到结合的损失，其中补体C2 S2结构域(SEQ ID NO：46)被因子B S2结构域(SEQ ID NO：54)替换。相比之下，如图12中所示，未观察到与野生型FB的结合，但是检测到对突变体FB-(C2-S2)的强结合，其中因子BS2结构域(SEQ ID NO：54)被补体C2 S2结构域(SEQ ID NO：46)替换。这些结果清楚地表明抗C2-5F2.4识别C2b上S2(Sushi结构域2)上的表位。该结果还表明，C2-(FB-Pep1)以充足的量产生。当使用小鼠IgG2a抗C2-5F2.4时，获得了类似的结果。此外，当在缓冲液中存在1.25mM Ca⁺⁺的情况下研究结合时，也获得了类似的结果。通过Bioceros BV，使用人C2与小鼠C2之间的结构域交换突变体进行的表位定位也得出了类似的结论。此外，食蟹猴C2的Sushi结构域2的氨基酸序列与人C2的Sushi结构域2完全相同。

实施例7：Sushi结构域2内抗C2-5F2.4表位的精细定位

抗C2-5F2.4不与小鼠C2交叉反应，并且小鼠S2结构域(SEQ ID NO：58)在10个氨基酸位置处与人S2结构域(SEQ ID NO：46)不同，如图13中所示。为了研究这10个氨基酸中的哪一个负责mAb结合，产生了精细定位突变体。精细定位构建体包含人C2b片段(huC2b)、具有小鼠S2的huC2b(huC2b-mS2)和十个突变体，每个突变体包含从小鼠序列到人序列的一个氨基酸回复突变。通过瞬时转染到HEK293细胞中产生了类似于结构域交换突变体的突变体C2b蛋白。

如图14中所示，产生所有突变体并通过抗FLAG ELISA检测。如所预期的，抗C2-5F2.4与huC2b结合但不与具有小鼠S2的huC2b(huC2b-mS2)结合。没有任何反向点突变恢复抗C2-5F2.4的结合，表明该mAb的表位由S2结构域上的至少两个氨基酸构成，如图15中所示。当在缓冲液中存在1.25mM Ca⁺⁺的情况下研究结合时，获得了类似的结果。

通过使用公开可用的人C2b的结构数据，分析了可促成抗C2-5F2.4表位的十个可能氨基酸的位置，如图16中所示。该分析揭示了三个可能的簇，每个簇由可促成表位的三个氨基酸构成。设计并获得了这些簇突变体的DNA构建体。簇突变体通过将人C2b S2氨基酸突变为相应的小鼠C2b S2氨基酸来产生。在每个突变体中改变了三个氨基酸。如果这三个氨基酸促成抗C2-5F2.4的表位，则预期损失结合。图17A显示簇1突变体表达良好并且结合不受影响，并且因此这些氨基酸对结合没有贡献。基于抗FLAG ELISA，簇2突变体的表达较低，并且这导致了抗C2-5F2.4结合的缺乏。簇3突变体也没有良好地表达，并且这最可能解释了抗C2-5F2.4结合的缺乏，如图17B中所示。当在缓冲液中存在1.25mM Ca⁺⁺的情况下研究结合时，获得了类似的结果。从该分析中，可以排除簇1中的氨基酸，而在簇2和簇3中留下四个可能的氨基酸。

结构域交换突变体提供了强有力的证据：C2上被抗C2-5F2.4识别的表位位于C2b上的Sushi结构域2上。此外，这些实验表明，在FB上该结构域的存在是足够的以被抗C2-5F2.4识别。考虑到抗C2-5F2.4不与小鼠C2反应，人与小鼠Sushi 2结构域之间不同的10个氨基酸中的一个或更多个应该是表位所必需的。通过使用单个氨基酸回复突变，我们表明Sushi 2中的单个氨基酸不能恢复结合。从用簇突变体进行的实验，得出以下结论：簇1中的氨基酸不促成抗C2-5F2.4的表位。簇2的氨基酸可促成抗C2-5F2.4的表位，但由于该突变体的表达低于簇1突变体，因此不能排除簇2突变体的折叠不是最佳的。由于簇3突变体没有良好地表达，看起来突变可能影响了折叠，因此簇3中氨基酸的作用仍然难以捉摸。

通过引用并入

本文中引用的所有出版物和专利文件均通过引用以其整体并入本文。

Claims (21)

1.与人补体因子C2特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其片段包含：

VH结构域，其包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列；和

VL结构域，其包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含全长单克隆抗体。

3.权利要求1或权利要求2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包含人IgG重链恒定结构域。

4.权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述重链恒定结构域包含人IgG1重链恒定结构域。

5.权利要求4所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述人IgG1重链恒定结构域包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列。

6.权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述重链恒定结构域包含人IgG4重链恒定结构域。

7.权利要求6所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述人IgG4重链恒定结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。

8.权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包含含有SEQID NO：6所示的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的轻链。

9.权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包含含有SEQID NO：8所示的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的轻链。

10.药物组合物，其包含与人补体因子C2特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及可药用载体，其中所述单克隆抗体或其片段包含：

VH结构域，其包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列；和

VL结构域，其包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。

11.权利要求10所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含全长单克隆抗体。

12.权利要求10或权利要求11所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体包含人IgG重链恒定结构域。

13.核酸分子或多个核酸分子，其编码权利要求1至9中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段。

14.载体或多个载体，其包含权利要求13所述的核酸分子或多个核酸分子。

15.宿主细胞，其包含权利要求13所述的核酸分子或多个核酸分子。

16.宿主细胞，其包含权利要求14所述的载体或多个载体。

17.权利要求14至16中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

18.制备单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：

在适合于表达所述单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养权利要求15至17中任一项所述的宿主细胞群；以及

从所述细胞中分离所述单克隆抗体或抗原结合片段。

19.在对象中抑制补体激活的经典途径的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的权利要求1至9中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

20.在对象中抑制补体激活的凝集素途径的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的权利要求1至9中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

21.权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述对象是人。

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