JP2022160479A - ヒト補体因子c2bに対する抗体及び使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、 2018年12月13日に出願された米国仮特許出願第62/779,102号を基礎とする優
先権の恩典を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれている
。
本願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細
書に組み込まれている。2019年11月22日に作成された前記ASCII コピーは618634_AGX5-04
8PC_ST25.txtという名称で、サイズは94,329バイトである。
本発明は、免疫学及び分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、補体系の
古典経路及びレクチン経路の活性化を阻害するための組成物及び方法、並びにヒトの疾病
の治療におけるそれらの使用に関する。本発明は特に、ヒト補体因子C2に結合する結合分
子、並びにその作製方法及び使用方法に関する。
補体系には、細胞を溶解し得る一連のカスケードをなす血漿中酵素、調節タンパク質、
及びタンパク質が含まれる。活性化前から、様々な補体因子が不活性前駆体タンパク質と
して循環している。系が活性化すると、活性化カスケードが導かれ、該カスケードではあ
る因子がカスケードのさらに下流にある補体タンパク質を、特異的にタンパク質分解する
ことにより、後続の因子を活性化させる。
路を介して起こり得る。古典経路は、抗原及びIgM、IgG1、IgG2、又はIgG3抗体が相互作
用して、免疫複合体を形成することによって活性化され、該免疫複合体は、補体成分C1の
サブユニットであるC1qと結合する。代替経路は、IgAを含む免疫複合体、又は細菌及び他
の活性化表面の認識によって活性化する。レクチン経路は、マンノース結合レクチン又は
マンナン結合タンパク質(MBP)としても知られるマンナン結合レクチン(MBL)が、様々
な病原体表面の特定の炭水化物に結合することにより開始される、抗体非依存的な補体活
性化経路を担う。
されて、C2a及びC2bを生じる。代替経路の活性化は、補体成分D、C3、及びBの連続的な活
性化から開始する。各経路は、共通の中心成分であるC3、すなわち第3補体因子を切断し
てこれを活性化する。 その結果、共通の終末経路が活性化し、それにより膜侵襲複合体
(MAC、補体成分C5b-9を含む; Muller-Eberhardの文献、Annu Rev Biochem 1988, 57:32
1)が形成される。補体が活性化する間に、MACだけでなく、アナフィラトキシンC3a及びC
5aのようないくつかの炎症性ペプチドも生成する。これらの活性化による産物は、白血球
の走化性、貪食細胞、マスト細胞、及び好塩基球の脱顆粒、平滑筋収縮、血管透過性の増
加、並びに細胞の溶解などの、多面的な生物学的効果を引き起こす(Hughの文献、Comple
ment 1986, 3:111)。また、補体活性化による産物は、特に貪食細胞による、毒性酸素ラ
ジカルの生成並びにアラキドン酸代謝物及びサイトカインの合成及び放出を誘発し、それ
により炎症反応はさらに増幅される。
常であったはずの宿主細胞に対する損傷ももたらし得る。従って、補体活性化の阻害は、
補体によって媒介される組織損傷の治療及び予防に有益であると考えられる。従って、当
該技術分野において、補体カスケードの1以上の重要な構成要素を阻害する新規治療薬に
対する、切迫したニーズが依然として存在する。
既存の抗体と比較して改善された特徴を有する、新規モノクローナル抗ヒトC2b抗体及
びその抗原結合性断片を提供する。新規抗体の特徴は、重鎖可変ドメイン(VH)のフレー
ムワーク領域3(FR3)においてグリコシル化部位が欠失していることである。特に、新規
抗体は、既存の抗体と比較して均一性が向上し、従って製造しやすさが改善されており、
かつ機能特性が予期せず改善されている。機能特性の改善としては、例えば、pIの上昇、
及びいわゆる抗原スイーピング(antigen sweeping)の潜在性の増強が挙げられる。抗体
及びその抗原結合性断片について、ヒトの治療における使用が見いだされる。
原結合性断片であって:
配列番号:1に記載のアミノ酸配列を含む、VHドメイン;及び
配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む、VLドメインを含み、
ここでVHドメインのアミノ酸残基72-74(Kabat付番)がそれぞれX1X2X3からなり、X2が
任意のアミノ酸であり、かつX1X2X3がNX2SでもNX2Tでもない、前記モノクローナル抗体又
はその抗原結合性断片である。
として許容し得る担体を含む医薬組成物である。
する1又は複数の核酸分子である。
ある。
する1又は複数の核酸分子を含む宿主細胞である。
む宿主細胞である。
法であって、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の発現を可能にする条件下で、
本発明による細胞集団を培養することを含む、前記方法である。
あって、それを必要とする対象に、有効量の本発明によるモノクローナル抗体又はその抗
原結合性断片を投与することを含む、前記方法である。
つVLドメインは、配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む。
ーナル抗体を含む。
実施態様において、ヒトIgG1重鎖定常ドメインは、配列番号:4に記載のアミノ酸配列を
含む。
つかの実施態様において、ヒトIgG4重鎖定常ドメインは、配列番号:5に記載のアミノ酸
配列を含む。
含む重鎖及び配列番号:7に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
含む重鎖及び配列番号:7に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
(定義)
「抗体」又は「免疫グロブリン」―本明細書で使用する「免疫グロブリン」という用語
は、任意の関連する特異的免疫反応性を有するか否かにかかわらず、2つの重鎖及び2つの
軽鎖の組合わせを有するポリペプチドを含む。本明細書で使用する「抗体」という用語は
、関心対象とする抗原(例えば、C2を含む補体タンパク質複合体)に対する顕著な特異的
免疫反応活性を有するアセンブリを指す。「C2抗体」という用語は本明細書において、C2
、特にヒトC2タンパク質及びC2の切断を介して形成されるドメイン、並びにいくつかの事
例において、それらと相同な種を含む、補体タンパク質の複合体に対し免疫学的特異性を
示す抗体を指すものとして使用する。抗体及び免疫グロブリンは、軽鎖及び重鎖を含み、
それらの間の共有結合性鎖間結合の有無は問わない。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリ
ン構造は、比較的よく理解されている。
る。5つの抗体クラスは全て、本発明の範囲内にある。一般的に、以下の考察はIgGクラス
の免疫グロブリン分子を対象とする。IgGに関しては、免疫グロブリンは典型的に、分子
量およそ23,000ダルトンの2つの同一の軽鎖ポリペプチド及び分子量 53,000~70,000の2
つの同一の重鎖を含む。4つの鎖は、ジスルフィド結合によって「Y」字の構成に連結され
る。該「Y」字の構成では、軽鎖が「Y」字の口から開始して、可変領域を通るように続く
重鎖を下支えする(bracket)。
λ軽鎖のいずれかと結合し得る。一般的に、軽鎖及び重鎖は互いに共有結合され、免疫グ
ロブリンがハイブリドーマ、B細胞、又は遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって
作製される場合、二つの重鎖の「尾」部分は、共有結合性ジスルフィド結合又は非共有結
合性結合によって互いに結合される。重鎖では、アミノ酸配列はY字構成の分岐端にあるN
末端から各鎖の底にあるC末端まで走行する。当業者であれば、重鎖がガンマ、ミュー、
アルファ、デルタ、又はイプシロン(γ、μ、α、δ、又はε)に分類され、それらの間
でいくつかのサブクラスがある(例えば:γ1-γ4)ことが認識されよう。抗体の「クラ
ス」を、IgG、IgM、IgA、IgD又はIgEとしてそれぞれ決定するのは、この鎖の性質である
。免疫グロブリンのサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4 、IgA
1など)はよく特徴づけられ、機能的特殊化を付与することが知られている。これらの各
クラス及びアイソタイプの改変形態は、当業者であれば簡単な開示に照らして容易に認識
でき、従って本発明の範囲内にある。
かつこれと特異的に結合することが可能となる。すなわち、抗体のVLドメイン及びVHドメ
インが組み合わされ、3次元抗原結合部位を画定する可変領域が形成される。この4鎖抗体
構造は、Y字の各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗
原結合部位は、各VH及びVL鎖上の3つの相補性決定領域(CDR)によって画定される。
その抗原結合性断片を包含することを意図する一般的な用語である。
原との選択的結合を担うポリペプチドの領域を含む。結合ドメインは、少なくとも1つの
結合部位を含む。例示的な結合ドメインには、抗体可変ドメインがある。本発明の抗体分
子は、単一の結合部位又は複数(例えば、2、3、若しくは4個)の結合部位を含み得る。
特定の部分が抗体間で配列が広範囲に異なっており、その標的抗原に対する各特定の抗体
の結合及び特異性に使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は抗体の可変ド
メインの全体に均一に分布しているのではない。可変性は、 抗原結合部位の部分を形成
するVLドメイン及び VH ドメインの各々において、「超可変ループ」と称する3つのセグ
メントに集中している。Vλ軽鎖ドメインの第1、第2、及び第3の超可変ループを本明細書
においてL1(λ)、L2(λ)、及びL3(λ)と称し、VLドメイン中の残基 24-33(L1(λ
)、9、10、又は11アミノ酸残基からなる)、49-53(L2(λ)、3残基からなる)、及び9
0-96(L3(λ)、5残基からなる)を含むものとして定義され得る(Moreaらの文献, Meth
ods 20:267-279 (2000))。Vκ軽鎖ドメインの第1、第2、及び第3の超可変ループは本明
細書においてL1(κ)、L2(κ)、及びL3(κ)と称し、VLドメイン中の残基 25-33(L1
(κ)、6、7、8、11、12、又は13残基からなる)、49-53(L2(κ)、3残基からなる)
、及び90-97(L3(κ)、6残基からなる)を含むものとして定義され得る(Moreaらの文
献, Methods 20:267-279 (2000))。VHドメインの第1、第2、及び第3の超可変ループは本
明細書においてH1、H2、H3と称し、VHドメインの残基25-33(H1、7、8、又は9残基からな
る)、52-56(H2、3又は4残基からなる)、及び91-105(H3、長さについて高度に可変性であ
る)を含むものとして定義され得る(Moreaらの文献, Methods 20:267-279 (2000))。
3の超可変ループを指し、Vκ及びVλアイソタイプの両方から得た超可変ループを包含す
る。H1、H2、H3という用語はそれぞれVHドメインの第1、第2、及び第3の超可変ループを
指し、γ、μ、α、δ、又はεを含む既知の重鎖アイソタイプのいずれかから得た超可変
ループを包含する。
すなわち「CDR」の部分を含み得る。「超可変ループ」及び「相補性決定領域」という用
語は厳密に同義ではない。それは、超可変ループ(HV)が構造に基づいて定義されている
のに対し、相補性決定領域(CDR)は配列の可変性に基づいて定義されており(Kabatらの
文献, 「免疫学の対象となるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunologic
al Interest), 第5版、Public Health Service, National Institutes of Health, Beth
esda, MD., 1983)、かつHV及びCDRの境界は、一部のVH及びVLドメインにおいて異なり得
るためである。
できる:軽鎖可変ドメイン中の残基24-34 (LCDR1)、50-56 (LCDR2)、及び89-97 (LC
DR3)、並びに重鎖可変ドメイン中の残基31-35又は31-35b (HCDR1)、50-65 (HCDR2)
、及び95-102 (HCDR3)(Kabatらの文献、「免疫学の対象となるタンパク質の配列(Seq
uences of Proteins of Immunological Interest)」, 第5版、Public Health Service,
National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。従って、HVは対応するCDR中
に含まれ、別途示されない限り、本明細書におけるVH及びVLドメインの「超可変ループ」
への言及は、対応するCDRも包含し、その逆も同様であるものと解釈すべきである。
領域(FR)と称する。ネイティブの重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々4つのFR(それぞ
れFR1、FR2、FR3、及びFR4)を含み、主に3つの超可変ループで接続されたβシート構成
を採用する。各鎖の超可変ループは FRによってともに近接して保持され、他の鎖からの
超可変ループとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。抗体の構造解析により、
相補性決定領域によって形成される結合部位の配列及び形状の間の関係が明らかとなった
(Chothiaらの文献、J. Mol Biol. 227:799-817 (1992); Tramontanoらの文献、J. Mol.
Biol, 215:175-182 (1990)))。その配列の可変性が高いにもかかわらず、6つのループの
うち5つは、「カノニカル構造」と称するレパートリーがわずか少数である主鎖のコンフ
ォメーションを採用する。これらのコンフォメーションは、まず第1に、ループの長さに
よって決定され、第2に、その充填、水素結合、又は異常な主鎖コンフォメーションを仮
定する能力を通じてコンフォメーションを決定するループ及びフレームワーク領域中の特
定の位置に重要な残基が存在することによって決定される。
という用語は、可変領域の部分であるが、CDRの部分ではないアミノ酸残基を含む(例え
ば、CDRのKabat定義を使用する)。従って、可変領域フレームワークの長さは約100~120
アミノ酸であるが、CDRの外側にあるアミノ酸のみを含む。重鎖可変ドメインの具体例及
びKabatらの文献で定義されているCDRについて、フレームワーク領域1はアミノ酸1-30を
包含する可変領域のドメインに対応し;フレームワーク領域2は、アミノ酸36-49を包含す
る可変領域のドメインに対応し;フレームワーク領域3はアミノ酸66-94を包含する可変領
域のドメインに対応し、かつフレームワーク領域4はアミノ酸 103から可変領域の末端ま
での可変領域のドメインに対応する。軽鎖のフレームワーク領域は、各軽鎖可変領域CDR
によって同様に区分される。同様に、 Chothiaらの文献又は McCallumらの文献によるCDR
の定義を使用して、フレームワーク領域の境界は上記のように、それぞれのCDRの終端に
よって隔てられる。好ましい実施態様において、CDRはKabatによって定義される。
成を呈する際に特定の配置をとって抗原結合部位を形成する短い不連続のアミノ酸配列で
ある。重可変ドメイン及び軽可変ドメインの残りの部分は、アミノ酸配列において示す分
子間の可変性がより小さく、かつフレームワーク領域と命名される。フレームワーク領域
は概してβシートコンフォメーションを採用し、CDRはループを形成して、βシート構造
と接続し、かついくつかの事例ではその部分を形成する。従って、これらのフレームワー
ク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によって6つのCDRの正しい方向への配置を提供す
る足場を形成するように作用する。配置されたCDRによって形成される抗原結合部位は、
免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を画定する。この相補的な表面により、免
疫反応性抗原エピトープに対する抗体の非共有結合が促進される。CDR の位置は、当業者
であれば容易に特定できる。
抗原結合性断片の潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化を欠いた形態の抗体又はそ
の抗原結合性断片を指す。ある実施態様において、「非グリコシル化」という用語は、抗
体又は抗原結合性断片の潜在的なN-結合型グリコシル化部位でのグリコシル化を欠いた形
態の抗体又はその抗原結合性断片を指す。ある実施態様において、「非グリコシル化」と
いう用語は、重鎖の可変領域の潜在的なN-結合型グリコシル化部位でのグリコシル化を欠
いた形態の抗体又はその抗原結合性断片を指す。
領域の外側にある抗体分子の部分を指す。免疫グロブリン軽鎖は単一ドメインの「定常領
域」を有し、典型的に「CL又はCL1ドメイン」と称する。このドメインは、VLドメインに
対してC末端側にある。免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリンのクラス(γ、μ、α、
δ、ε)に応じその定常領域が異なる。重鎖γ、α及びδは、3つの免疫グロブリンドメ
イン(CH1、CH2、及びCH3と称する)からなる定常領域を有し、CH1及びCH2ドメインを隔
てる柔軟なヒンジ領域を伴う。重鎖のμとεは、4つのドメイン(CH1-CH4)からなる定常
領域を有する。重鎖の定常ドメインは、C末端を VH ドメインに配置する。
から各鎖の底にあるC末端まで順次決定する(run)。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の定常
ドメインを定義するために、異なる付番体系が使用される。EU付番体系に従うと、IgG分
子の重鎖定常ドメインは以下のように特定される:CH1―アミノ酸残基118-215;CH2―ア
ミノ酸残基 231-340;CH3―アミノ酸残基 341-446。「ヒンジ領域」は、CH1ドメインをCH
2ドメインに結合する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域はおよそ25残基を含み、か
つ柔軟性があるため、2つのN末端抗原結合領域は独立して運動することができる。ヒンジ
領域は、上部、中央部、及び下部のヒンジドメイン(Roux K.H. らの文献、J. Immunol.1
61:4083-90 1998)の 3 つの異なるドメインに細分可能である。「完全ヒト」ヒンジ領域
を含む本発明の抗体は、以下の表1に示すヒンジ領域配列の1つを含み得る。
、又は完全な抗体又は抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体又は抗体鎖の一部又は
部分を指す。「抗原結合性断片」という用語は、抗原に特異的に結合し、又は抗原特異的
結合(例えば、C2タンパク質又はその部分との特異的結合)についてインタクトな抗体と
(すなわち、それらが由来するインタクトな抗体と)競合する免疫グロブリン又は抗体の
ポリペプチド断片を指す。本明細書で使用する抗体分子の「断片」という用語は、抗体の
抗原結合性断片、例えば、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、
単鎖抗体(scFv)、F(ab’)2断片、Fab断片、Fd断片、Fv断片、単一アーム(一価)抗
体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、又はそのような抗原結合性断片の組合
わせ、アセンブリ、若しくはコンジュゲーションによって形成される任意の抗原結合分子
を含む。本明細書で使用する「抗原結合性断片」という用語は、ユニボディ、ドメイン抗
体、及びナノボディからなる群から選択される抗体断片を包含することをさらに意図して
いる。断片は、例えばインタクトな若しくは完全な抗体若しくは抗体鎖の化学的若しくは
酵素的処理、又は組換え手段によって取得可能である。
ヒト補体の第2成分(C2)は、古典経路及びレクチン経路の補体活性化に関与する90~1
00 kDaの糖タンパク質である。C2は、古典経路のC1s又はレクチン経路の活性化MASP2によ
って活性化され得る。C2は(Mg2+の存在下で)表面結合C4bに結合し、C4bC2複合体を形成
する。この複合体は続いて、活性化C1s又はMASP2によって切断され、2つの断片となる:
大きい方の70 kDaの断片は、従来C2aと称され、C4bに結合したままC3変換酵素C4bC2aを形
成し、小さい方の30 kDa N-末端断片は、従来C2bと称され、流体相に放出される。著者の
中には最近、C2a及びC2bの呼称を逆にして、C2bが大きい方の70 kDa断片を指し、C2aが小
さい方の30 kDa断片を指すように用いる方もいる。本明細書で使用するC2aは、大きい方
の70 kDa断片を指し、C2bは、小さい方の30 kDa断片を指すものとする。一度活性化され
、C4bと結合すると、C2aは、それぞれC3及びC5を切断することができるC3及びC5変換酵素
の触媒サブユニットを構成する。
て示される。
から出発して、3つの補体制御タンパク質モジュール(CCP1-3、ショートコンセンサス反
復配列(SCR)又はsushi-ドメイン反復配列としても知られる)、金属イオン依存的接着
部位を含むフォン・ウィルブランド因子A 型(vWFA)ドメイン、セリンプロテアーゼ(SP
)ドメイン(Arlaudらの文献、 Adv Immunol、 1998, 69:249)からなる。電子顕微鏡研究
から、C2は3つのドメインからなることが明らかになった。3つのCCPモジュール(CCP1-3
)は一緒になってN-末端ドメインを形成し、これがC2bに相当する。vWFAドメインは第2の
ドメインを構成し 、SPドメインは第3のドメインを構成する。第2及び第3のドメインは、
一緒になって分子の大きな方のC2a部分を構成する。
の球状ユニットはおよそ60アミノ酸残基からなり、4つの不変のジスルフィド結合システ
イン残基の周囲に構築された、6~8個のストランドによるコンパクトなβシート構造に折
りたたまれる(Normanらの文献、J Mol Biol 1991, 219: 717)隣接するCCPモジュールは
、保存性の低いリンカーによって共有結合で結合される。
方がC2bと (Xu及びVolanakisの文献、J Immunol 1997, 158:5958)、他方がC2aのvWFAド
メインと(Horiuchiらの文献、J Immunol 1991, 47: 584)、結合する。C2b及びC2aの結
晶構造は1.8 Åの分解能まで決定されているものの(Milderらの文献, Structure 2006,
14:1587; Krishnanらの文献, J Mol Biol 2007, 367: 224; Krishnanらの文献, Acta Cri
stallogr D Biol Crystallogr 2009, D65: 266)、C2上のC4及びC3との接触部位を構成す
るアミノ酸残基の正確なトポロジー及び構造は不明である。このため、C4との相互作用に
関与するC2のアミノ酸残基は依然として確立されないままである(Krishnanらの文献、Ac
ta Cristallogr D Biol. Crystallogr 2009, D65: 266)。
本発明の一態様は、ヒト補体因子C2に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗
原結合性断片であって:
配列番号:1に記載のアミノ酸配列を含む、VHドメイン;及び
配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む、VLドメインを含み、
ここでVHドメインのアミノ酸残基72-74(Kabat付番)がそれぞれX1X2X3からなり、X2が
任意のアミノ酸であり、かつX1X2X3がNX2SでもNX2Tでもない、前記モノクローナル抗体又
はその抗原結合性断片である。
は、CDR LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLC
DR3 のアミノ酸配列を表2に示す。
C2bと特異的に結合する。ある実施態様において、モノクローナル抗体又はその抗原結合
性断片は、ヒト補体因子C2bに相当するヒト補体因子C2の部分のエピトープに特異的に結
合する。
において、重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列N-X-S/T(Nはアスパラギンを表し、
Xは任意のアミノ酸を表し、かつS/Tはセリン又はスレオニンを表す)によって特徴付けら
れる潜在的なグリコシル化部位を含まない。従ってある実施態様において、配列N-X-S/T
を含むVHドメインを含む抗体は改変されて、これらの残基がそれぞれX1X2X3からなり得る
(ここでX2は任意のアミノ酸であり、かつX1X2X3がNX2SでもNX2Tでもない)。すなわち、
X1はN以外の任意のアミノ酸であり、かつ/又はX3は、S若しくはT以外の任意のアミノ酸で
あり得る。ある実施態様において、配列N-X-S又はN-X-Tを含むVHドメインを含む抗体は改
変されて、これら3つの残基がそれぞれD-X-Sからなり得る。ある他の実施態様において、
配列N-X-S又はN-X-Tを含むVHドメインを含む抗体は改変されて、これら3つの残基がそれ
ぞれD-X-Tからなり得る。
らなる(ここでX2は任意のアミノ酸であり、かつX1X2X3はNX2SでもNX2Tでもない)。
る。
る。
ドメインは、配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む。
り、VLドメインのアミノ酸配列は配列番号:2に記載の配列からなる。
Pharma B.V.に付与された米国特許第9,944,717号に開示されているヒト化5F2.4(BRO2)
のVL(VK3)ドメインに対応する。また、表3に示す配列番号:28は、参照により本明細書
に組み込まれている米国特許第9,944,717号に開示されているヒト化5F2.4(BRO2)のVH(V
H4)ドメインに対応する。
G2、IgG3、又はIgG4のCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを
含む。
、及びCH3ドメインを含み、かつCH2ドメイン中に置換L234A及びL235Aを含む。
、及びCH3ドメインを含み、かつCH3ドメイン中に置換H433K及びN434Fを含む。
、及びCH3ドメインを含み、かつCH2ドメイン中に置換L234A及びL235Aを、並びにCH3ドメ
イン中に置換H433K及びN434Fを含む。
、及びCH3ドメインを含む。ある実施態様において、抗体はヒトIgG4のCH1ドメイン、ヒン
ジドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含み、かつヒンジドメイン中に置換S228P
を含む。
、及びCH3ドメインを含み、かつCH3ドメイン中に置換L445Pを含む。
、及びCH3ドメインを含み、かつヒンジドメイン中に置換S228P、並びにCH3ドメイン中に
置換L445Pの両方を含む。
、及びCH3ドメインを含み、かつCH3ドメイン中に置換H433K及びN434Fを含む。
、及びCH3ドメインを含み、かつヒンジドメイン中に置換S228Pを、並びにCH3ドメイン中
に置換H433K及びN434Fを含む。
、及びCH3ドメインを含み、かつCH3ドメイン中に置換H433K、N434F及びL445Pを含む。
、及びCH3ドメインを含み、かつヒンジドメイン中に置換S228Pを、並びにCH3ドメイン中
に置換H433K、N434F、及びL445Pを含む。
る実施態様において、重鎖定常ドメインは、ヒトIgG1重鎖定常ドメインを含む。ある実施
態様において、重鎖定常ドメインは、ヒトIgG1重鎖定常ドメインからなる。
むヒトIgG1重鎖定常ドメインを含む。ある実施態様において、重鎖定常ドメインのアミノ
酸配列は配列番号:29に記載の配列からなる。
むヒトIgG1重鎖定常ドメインを含む。ある実施態様において、重鎖定常ドメインのアミノ
酸配列は配列番号:4に記載の配列からなる。
実施態様において、重鎖定常ドメインは、ヒトIgG4重鎖定常ドメインからなる。
むヒトIgG4重鎖定常ドメインを含む。ある実施態様において、重鎖定常ドメインのアミノ
酸配列は配列番号:30に記載の配列からなる。
むヒトIgG4重鎖定常ドメインを含む。ある実施態様において、重鎖定常ドメインのアミノ
酸配列は配列番号:31に記載の配列からなる。
むヒトIgG4重鎖定常ドメインを含む。ある実施態様において、重鎖定常ドメインのアミノ
酸配列は配列番号:5に記載の配列からなる。
ーナル抗体を含む。
ーナル抗体からなる。
くとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列
同一性を有する重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本
明細書では、配列番号:32として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖を
含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号
:7として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、 少なくとも97%、 少な
くとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を
提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号:7として示すアミノ酸配列
との100%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態
様において、本明細書では、配列番号:32として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、
少なくとも95%、 少なくとも97%、 少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有
する重鎖、及び配列番号:7として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%
、 少なくとも97%、 少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する軽鎖を含
む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号:
32として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号:7として
示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供
する。
くとも90%、少なくとも95%、 少なくとも97%、 少なくとも98%、又は少なくとも99%の配
列同一性を有する重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、
本明細書では、配列番号:6として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖
を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番
号:7として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、 少なくとも97%、 少
なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体
を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号:7として示すアミノ酸配
列との100%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施
態様において、本明細書では、配列番号:6として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、
少なくとも95%、 少なくとも97%、 少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有
する重鎖、及び配列番号:7として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%
、 少なくとも97%、 少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する軽鎖を含
む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号:
6として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号:7として示
すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供す
る。
くとも90%、少なくとも95%、 少なくとも97%、 少なくとも98%、又は少なくとも99%の配
列同一性を有する重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、
本明細書では、配列番号:33として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖
を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番
号:33として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、 少なくとも97%、
少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号:7として
示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、 少なくとも97%、 少なくとも98%
、又は少なくとも99%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する
。ある実施態様において、本明細書では、配列番号:33として示すアミノ酸配列との100%
の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号:7として示すアミノ酸配列との100%の配列同
一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。
くとも90%、少なくとも95%、 少なくとも97%、 少なくとも98%、又は少なくとも99%の配
列同一性を有する重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、
本明細書では、配列番号:34として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖
を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番
号:34として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、 少なくとも97%、
少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号:7として
示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、 少なくとも97%、 少なくとも98%
、又は少なくとも99%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する
。ある実施態様において、本明細書では、配列番号:34として示すアミノ酸配列との100%
の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号:7として示すアミノ酸配列との100%の配列同
一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。
くとも90%、少なくとも95%、 少なくとも97%、 少なくとも98%、又は少なくとも99%の配
列同一性を有する重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、
本明細書では、配列番号:8として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖
を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番
号:8として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、 少なくとも97%、 少
なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号:7として示
すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、 少なくとも97%、 少なくとも98%、
又は少なくとも99%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。
ある実施態様において、本明細書では、配列番号:8として示すアミノ酸配列との100%の
配列同一性を有する重鎖、及び配列番号:7として示すアミノ酸配列との100%の配列同一
性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。
よって定義されている実施態様について、重鎖及び/又は軽鎖は、参照配列中に存在するC
DR配列と同一のCDR配列を保持し、その結果変化はCDR領域の外部にのみ存在し得る。
でアラインメントされた(該アラインメントにおいては、比較したいアミノ酸配列がこれ
ら2つの配列間の最適なアラインメントのための参照配列と比較して付加又は欠失を含み
得る)これら2つの配列を比較することによって、決定され得る。同一性のパーセンテー
ジは、そこでの2つの配列間のアミノ酸残基が同一である同一位置の数を決定し、この同
一位置の数を比較域中の位置の総数によって除し、かつこれら2つの配列間の同一性のパ
ーセンテージを得るために、得られた結果に100を乗じることにより、計算する。例えば
、BLASTプログラム、「BLAST2 sequences」(Tatusovaらの文献、「BLAST2 sequences―
タンパク質及びヌクレオチドの配列を比較するための新規ツール(Blast 2 sequences -
a new tool for comparing protein and nucleotide sequences)」 FEMS Microbiol Let
t. 174:247-250)を使用して、用いるパラメータはデフォルトによって与えられる条件と
し(特にパラメータ「オープンギャップペナルティ」:5及び「伸長ギャップペナルティ
」:2、選択されるマトリックスを例えば、プログラムによって提案される「BLOSUM 62」
マトリックスとして)比較したい2つの配列間の同一性のパーセンテージを、プログラム
によって直接計算することが可能である。
ぞれ重鎖及び軽鎖に由来する)を含み、そのアミノ酸配列は完全に又は実質的にヒトであ
る。本発明の抗体又は抗原結合性断片がヒトの治療における使用を意図する抗体である場
合、抗体の定常領域全体又は少なくともその一部が、完全に又は実質的にヒトのアミノ酸
配列を有することが典型的である。従って、CLドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2
ドメイン、CH3ドメイン、及びCH4ドメイン(存在する場合)の1以上又は任意の組合わせ
は、そのアミノ酸配列に関して完全に又は実質的にヒトであり得る。
ドメイン(存在する場合)は、すべて完全に又は実質的にヒトのアミノ酸配列を有し得る
。ヒト化抗体若しくはキメラ抗体の定常領域、又は抗体断片の文脈において、「実質的に
ヒト」という用語は、ヒト定常領域との少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%
、 少なくとも97%、又は少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を指す。この文脈における
「ヒトアミノ酸配列」という用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされるア
ミノ酸配列を指し、該免疫グロブリン遺伝子には、生殖細胞系列遺伝子、再編成遺伝子、
及び体細胞突然変異を起こした遺伝子がある。また、本発明は、ヒト配列に対して1以上
のアミノ酸の付加、欠失、又は置換によって変化した「ヒト」配列の定常ドメインを含む
ポリペプチドを意図しているが、「完全ヒト」ヒンジ領域の存在が明らかに要求される場
合の実施態様は除かれる。
抑えること、抗体の安定性を最適化することの双方にとって有益であり得る。
。酸性pH(例えば、およそpH 5.5~およそpH 6.0)での増加した結合親和性が測定可能で
ある。また、増加した結合親和性は、中性pH(例えば、およそpH 6.9~およそpH 7.4)で
測定可能である。この実施態様において、「結合親和性の増加」とは、未改変のFc領域の
結合親和性に対するFcRnへの結合親和性の増加を意味する。典型的に、未改変のFc領域は
、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4の野生型アミノ酸配列を有する。そのような実施態様
において、Fc領域を改変された抗体分子のFcRn結合親和性の増加は、FcRnの野生型IgG1、
IgG2、IgG3、又はIgG4への結合親和性に対して測定される。
得る。酸性pH(例えば、およそpH 5.5~およそpH 6.0)での結合親和性の増加が測定可能
である。また、結合親和性の増加は、中性pH(例えば、およそpH 6.9~およそpH 7.4)で
測定可能である。この実施態様において、「結合親和性の増加」とは、未改変のFc領域の
結合親和性に対するヒトFcRnへの結合親和性の増加を意味する。典型的に、未改変のFc領
域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4の野生型アミノ酸配列を有する。そのような実施
態様において、Fc領域を改変された抗体分子のヒトFcRnとの結合親和性の増加は、ヒトFc
Rnの野生型IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4への結合親和性に対して測定される。
本発明の一態様は、ヒト補体因子C2に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗
原結合性断片及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物であって、該モノクローナ
ル抗体又はその断片が:
配列番号:1に記載のアミノ酸配列を含む、VHドメイン;及び
配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む、VLドメインを含み、
ここでVHドメインのアミノ酸残基72-74(Kabat付番)はそれぞれX1X2X3からなり、ここ
でX2が任意のアミノ酸であり、かつX1X2X3がNX2SでもNX2Tでもない、前記医薬組成物であ
る。
e and Practice of Pharmacy)」, 第19版, Gennaro編, Mack Publishing Co., Easton,
Pa., 1995)に開示されている技術などの従来技術に従って、医薬として許容し得る担体又
は希釈剤、並びに任意の他の公知の補助剤及び賦形剤とともに製剤化することができる。
する。そのような賦形剤の例には、これらに限定はされないが、生理食塩水、リンガー液
、ブドウ糖溶液、及びハンクス溶液がある。固定油及びオレイン酸エチルなどの非水性賦
形剤も使用することができる。
。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は薬物濃度を高くするのに好
適な他の秩序立った構造として製剤化することができる。本発明の医薬組成物に利用され
得る好適な水性及び非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセ
ロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、及びそれらの好適な混
合物、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが
ある。例えば、レシチンのようなコーティング物質の使用により、分散剤の場合必要とさ
れる粒子サイズを維持することにより、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性を、
維持することができる。
微生物の存在の予防は、滅菌手順と様々な抗菌薬及び抗真菌薬、例えば、パラベン、クロ
ロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの含有との双方により保証され得る。また、
組成物中に糖、マンニトール、ソルビトール、グリセロールなどの多価アルコール、又は
塩化ナトリウムなどの等張化剤を含めることが、望ましい。医薬として許容し得る抗酸化
剤、例えば(1) 水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナト
リウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等、(2) 油溶性抗酸化剤、例えばパ
ルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシ
トルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロール等;及び(3) 金属キ
レート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、
リン酸等も含めることができる。
えば先に列挙したように1つの成分又は成分の組合わせと合わせることにより調製し、続
いて滅菌マイクロろ過することができる。一般的には、分散剤は、活性化合物を基礎分散
媒体及び例えば先に列挙したものから必要な他の成分を含む無菌のビヒクルと合わせるこ
とにより調製する。滅菌注射可能溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方
法は、真空乾燥及びフリーズドライ(凍結乾燥)であり、活性成分及びその予め滅菌ろ過
した溶液から得た任意の追加の所望の成分の粉末を得る。
注入により投与する。
腸及び局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、限定はされないが、静脈内
、腹腔内、皮下、筋肉内、動脈内、髄膜内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、経気管、表皮下
、 関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内への注射及び注入を含む。
例えばモノステアリン塩やゼラチンを含めることでもたらされる。
例えばインプラント、経皮パッチ、マイクロカプセル送達系を含む制御放出製剤などとす
る。生分解性、生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグ
リコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を使用することができる。
そのような製剤の調製方法は、一般に当業者に公知である。例えば、「持続及び制御放出
薬物送達系(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)」、J. R. Ro
binson編, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
、単一のボーラスを投与し、いくつかの分割用量を経時的に投与し、治療状況の緊急度に
よって示されるように、用量を比例的に減少又は増加させることができる。
に毒性を示すことなくその患者につき所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量
を得る。
えば200~400 mg/m2の投薬量で注入により投与することができる。そのような投与は、1
~8回、例えば3~5回反復することができる。投与は、1~24時間の期間、例えば2~12時
間の期間にわたる、連続的な注入により実施することができる。いくつかの実施態様にお
いて、投与は、1以上のボーラス注射によって実施することができる。
g/kg)、例えば5~25 mg/kgの投薬量で注入により投与することができる。そのような投与
は、例えば1~8回、例えば3~5回反復することができる。投与は、1~24時間の期間、例
えば2~12時間の期間にわたる、連続的な注入により実施することができる。いくつかの
実施態様において、投与は、1以上のボーラス注射によって実施することができる。
の結合分子は、例えば6ヶ月以上の期間にわたり週に1回などの維持療法として投与するこ
とができる。
本発明の一態様は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をコード
する1又は複数の核酸分子である。ある実施態様において、単一の核酸分子は、本発明に
よるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のVH及びVLドメインの両方をコードする
。ある実施態様において、単一の核酸分子は、本発明によるモノクローナル抗体又はその
抗原結合性断片の重鎖(HC)及び軽鎖(LC)の両方をコードする。ある実施態様において
、第1の核酸分子が本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のVHドメイ
ンをコードし、第2の核酸分子が本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断
片のVLドメインをコードする。ある実施態様において、第1の核酸分子は、本発明による
モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の重鎖(HC)をコードし、第2の核酸分子は
、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の軽鎖(LC)をコードする。
酸配列を含む。
酸配列を含む。
含む。
含む。
含む。
含む。
含む。
酸配列を含む。
に記載の配列からなる。
に記載の配列からなる。
配列からなる。
配列からなる。
配列からなる。
配列からなる。
配列からなる。
に記載の配列からなる。
する。遺伝子送達ビヒクル又はベクターは、プラスミド又は他の細菌複製核酸であり得る
。そのような遺伝子送達ビヒクル又はベクターは、例えばプロデューサ細胞に容易に導入
することができる。遺伝子送達ビヒクルはまたウイルスベクターであり得る。好ましいウ
イルスベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイ
ルスベクター、及びレトロウイルスベクターである。
実施態様において、単一のベクターは、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結
合性断片のVH及びVLドメインの両方をコードする単一の核酸分子を含む。ある実施態様に
おいて、単一のベクターは、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の
重鎖(HC)及び軽鎖(LC)の両方をコードする単一の核酸分子を含む。
原結合性断片のVHドメインをコードする第1の核酸分子を含み、第2のベクターは本発明に
よるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のVLドメインをコードする第2の核酸分
子を含む。ある実施態様において、第1のベクターは、本発明によるモノクローナル抗体
又はその抗原結合性断片の重鎖(HC)をコードする核酸分子を含み、第2のベクターは、
本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の軽鎖(LC)をコードする第2
の核酸分子を含む。
の発現における使用に好適な発現ベクターを含む。宿主細胞には真核生物又は原核生物が
あり得る。
子を含む宿主細胞を提供する。あるいはさらに、本発明は、本発明による抗体又はその抗
原結合性断片をコードする1又は複数のベクターを含む宿主細胞を提供する。1又は複数の
核酸分子、又は同様に1又は複数のベクターを、例えば限定はされないが、形質導入、形
質転換、トランスフェクション、及びインジェクションを含む任意の好適な技術を使用し
て宿主細胞に導入することができる。これらの方法の様々な形態が当技術分野で周知され
ており、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、リ
ポフェクション、細胞スクイージング、ソノポレーション、光学トランスフェクション、
及び遺伝子銃がある。
細胞は酵母細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は昆虫細胞である。ある実施態
様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。ある実施態様において、宿主細胞はヒト細
胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハム
スター卵巣(CHO)細胞、NS0細胞、ヒト胎児腎(HEK293)細胞、及び PER.C6 (商標)細
胞からなる群から選択される哺乳動物細胞である。本発明は、これら上記の細胞に加え、
他の宿主細胞も更に意図する。宿主細胞は、本発明による抗体及びその抗原結合性断片の
商業生産用に開発された細胞株をさらに含む。
きる。あるいは、核酸はそれを必要とする動物の体内の細胞に導入され、形質転換された
細胞によって結合分子/抗体をインビボで生産する。本発明の核酸分子は典型的に、細胞
内の結合分子を発現するための調節配列とともに提供される。しかしながら、現在の相同
組換え技術は、はるかに効率的になっている。これらの技術は例えばヌクレアーゼ、例と
してTALENを誘導する部位特異的二本鎖切断を用いる、二本鎖切断によって補助される相
同性組換えを伴う。そのような類似の相同組換え系は、核酸分子を1以上のシスに要求さ
れる調節配列を提供する領域に挿入できる。
又はインビトロ細胞培養細胞を提供する。本発明はさらに、本発明による結合分子を含む
単離若しくは組換え細胞、又はインビトロ細胞培養細胞を提供する。好ましくは前記細胞
は前記結合分子を生産する。ある実施態様において、前記細胞は前記結合分子を分泌する
。好ましい実施態様において、前記細胞はハイブリドーマ細胞、CHO細胞、NS0細胞、HEK2
93細胞、又はPER-C6(商標)細胞である。特に好ましい実施態様において、前記細胞はCH
O細胞である。本発明による細胞を含む細胞培養をさらに提供する。様々な研究所及び企
業が、例えば臨床用途のために、抗体の大規模生産のための細胞株を開発している。その
ような細胞株の非限定的な例は、CHO細胞、NS0細胞、又はPER.C6(商標)細胞である。こ
れらの細胞は、タンパク質の生産などの他の目的にも使用する。本明細書ではさらに、タ
ンパク質及び抗体の工業的規模生産用に開発された細胞株を、工業用細胞株と称する。本
発明は、本発明による核酸分子、結合分子、及び/又は抗体を含む工業用細胞株を提供す
る。また、本発明は、本発明の結合分子又は抗体を含むタンパク質及び/又は抗体の大規
模生産用に開発された細胞株を提供する。本発明はまた、本発明の結合分子及び/又は抗
体の大規模生産用に開発された細胞株の使用を提供する。
本発明は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の製造方法であっ
て、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の発現を可能にする条件下で、本発明に
よる宿主細胞集団を培養することを含む、前記方法をさらに提供する。ある実施態様にお
いて、方法は、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を培養物から回収するこ
とをさらに含む。好ましくは、前記細胞は無血清培地で培養する。好ましくは、前記細胞
は浮遊増殖に適応する。本発明による抗体を生産する方法で得られる抗体をさらに提供す
る。抗体は好ましくは培養培地から精製する。好ましくは、前記抗体はアフィニティー精
製する。
本発明の一態様は、対象における古典経路又はレクチン経路の活性化を阻害する方法で
あって、それを必要とする対象に、有効量の本発明によるモノクローナル抗体又はその抗
原結合性断片を投与することを含む、前記方法である。ある実施態様において、対象は、
哺乳動物である。ある実施態様において、対象はマウス、ラット、ハムスター、モルモッ
ト、ウサギ、 ヤギ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、又はウシである。ある実施態様
において、対象は非ヒト霊長類、例えばサルである。ある実施態様において、対象は、ヒ
トである。
ジ抗体でコーティングされたヒツジ赤血球を溶解する能力に基づく溶血活性の試験を含む
、任意の好適な方法を用いて評価することができる。未処理の対照試料と比較した溶血の
減少は、抗体又は抗原結合性断片の阻害効果を示している。一実施態様において、未処理
の対照試料は、抗体又は抗原結合性断片による処理を開始する前に得た履歴試料(histor
ical sample)であり得る。一般的に、対照と比較した全補体活性が少なくとも5%低下する
ことは、有効であることを示す。ある実施態様において、対照と比較した全補体活性が少
なくとも10%低下することは、有効であることを示している。
は予防することができる疾患は、実験的アレルギー性神経炎、II型コラーゲン誘発性関節
炎、重症筋無力症、溶血性貧血、糸球体腎炎、特発性膜性腎症、関節リウマチ、全身性エ
リテマトーデス、免疫複合性血管炎などの自己免疫性疾患、成人呼吸窮迫症候群、脳卒中
、異種移植、同種移植、多発性硬化症、 火傷、体外透析及び血液酸素化、敗血症及び敗
血症性ショックを含む炎症性障害、サイトカイン又はmAbのインビボ投与により誘発され
る毒性、腎移植片などの同種移植片の抗体媒介性拒絶反応、多発外傷、虚血再灌流傷害、
並びに心筋梗塞である。
クにさらされている個体は、それを必要とする個体へ本発明による有効量のモノクローナ
ル抗体又はその抗原結合性断片を投与することにより治療することができる。その結果、
個体体内の生物活性を有する補体由来ペプチドは減少し、細胞及び組織に対する補体の溶
解作用及び他の傷害作用は減少し、又は防止される。「有効量」とは、所望の生物学的反
応を達成するのに十分な量を意味する。一実施態様において、「有効量」とは、個体体内
における補体活性化を阻害することが可能な本発明によるモノクローナル抗体又はその抗
原結合性断片の量を意味する。
合性断片を、医薬担体と一緒に非経口的に、例えば静脈内、皮下、又は局所に投与するこ
とからなる。投与は典型的に、注射又は注入によって果たすことができる。本発明による
モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の用量及び投与レジメンは、目的とする補体
活性化の阻害の程度によって異なる。典型的に、本発明のモノクローナル抗体について、
量は体重1 kgあたり2~20 mgの範囲である。非経口投与のために、本発明によるモノクロ
ーナル抗体又はその抗原結合性断片を、医薬として許容し得る非経口ビヒクルと組み合わ
せた注射可能な形態で製剤化する。そのようなビヒクルは当技術分野で周知されており、
例として、生理食塩水、ブドウ糖溶液、リンガー溶液、及び少量のヒト血清アルブミンを
含む溶液がある。
。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は薬物濃度を高くするのに好
適な他の秩序立った構造として製剤化することができる。本発明の医薬組成物に利用され
得る好適な水性及び非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロ
ール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、及びそれらの好適な混合
物、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがあ
る。例えば、レシチンのようなコーティング物質の使用により、分散剤の場合必要とされ
る粒子サイズを維持することにより、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性を、維
持することができる。
微生物の存在の予防は、滅菌手順と様々な抗菌薬及び抗真菌薬、例えば、パラベン、クロ
ロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの含有との双方により保証され得る。また、
組成物中に糖、マンニトール、ソルビトール、グリセロールなどの多価アルコール、又は
塩化ナトリウムなどの等張化剤を含めることが、望ましい。医薬として許容し得る抗酸化
剤、例えば(1) 水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナト
リウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等、(2) 油溶性抗酸化剤、例えばパ
ルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシ
トルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、α- トコフェロール等;及び(3) 金属
キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸
、リン酸等も含めることができる。
ば先に列挙したように1つの成分又は成分の組合わせと合わせ、続いて滅菌マイクロろ過
することにより、調製することができる。一般的には、分散剤は、活性化合物を基礎分散
媒体及び例えば先に列挙したものから必要な他の成分を含む無菌のビヒクルと合わせるこ
とにより調製する。滅菌注射可能溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方
法は、真空乾燥及びフリーズドライ(凍結乾燥)であり、活性成分及びその以前に滅菌ろ
過した溶液から得た任意の追加の所望の成分の粉末を得る。
例えばモノステアリン塩やゼラチンを含めることでもたらされる。
例えばインプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル送達系を含む制御放出製剤とす
る。生分解性、生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグ
リコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を使用することができる。
そのような製剤の調製方法は、一般に当業者に公知である。例えば、「持続及び制御放出
薬物送達系(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)」、J. R. Ro
binson編, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
、単一のボーラスを投与し、いくつかの分割用量を経時的に投与し、治療状況の緊急度に
よって示されるように、用量を比例的に減少又は増加させることができる。
に毒性を示すことなくその患者につき所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量
を得る。
えば200~400 mg/m2の投薬量で注入により投与することができる。そのような投与は、例
えば1~8回、例えば3~5回反復することができる。投与は、2~24時間、例えば2~12時間
の期間にわたる、連続的な注入により実施することができる。
の結合分子は、例えば6ヶ月以上の期間にわたり週に1回などの維持療法として投与するこ
とができる。
、これらの実施態様は単なる例証であり、いかなる方法においても本発明を制限するよう
に解釈されるものではないことに留意すべきである。
(実施例1:抗C2bモノクローナル抗体からのグリコシル化部位の除去)
(BRO2-glyc-IgG4)
米国特許第9,944,717号には、マウス抑制性抗C2bモノクローナル抗体(mAb)が開示さ
れている。このリードから、異なる重鎖可変ドメイン(VH1、VH2、VH3、又はVH4)及びκ
軽鎖可変ドメイン(VK1、VK2、VK3、又はVK4)を含む4つのヒト化バリアントを、Antitop
e Ltd (Cambridge、UK)の複合ヒト抗体(Composite Human Antibody)技術を使用して
作製した。インシリコ解析に基づき、ヒト化VH及びVKの各配列に対する免疫原性のリスク
を予測した。表7に示すように、VH4をVK3又はVK4と対にすると、免疫原性のリスクが最も
低く、それとともに最も近縁のヒト生殖細胞系列バリアントとの同一性のパーセンテージ
が最も高くなることが予測された。この観察結果は、ヒトMHCクラスIIに対する無差別的
結合ペプチドの数が最小であったことに基づく。最も近縁のヒト生殖細胞系列に対するそ
の同一性のパーセンテージが比較的高いため、VH4が好ましい。さらに、結合及び効力に
基づいて、VH4/VK3を抗ヒトC2bヒト化リード抗体として選択した。これを本明細書ではBR
O2-glyc-IgG4と称する。
ンド及びバンドシフトがあることが明らかとなった。このシフトは、VH3及びVH4のフレー
ムワーク領域3(FR3)の残基72-74(Kabat付番)にある潜在的グリコシル化部位(モチー
フNXS)に起因すると仮定した。この潜在的グリコシル化部位により、哺乳動物細胞株か
ら発現される抗体産物が不均一となるだけでなく、抗体機能も不均一となる可能性があっ
たため、潜在的グリコシル化部位は除去した。グリコシル化部位は、 部位指定突然変異
誘発を用いてVHのN72Dバリアント(本明細書ではVH3.2又はVH4.2と称する)を作製するこ
とにより除去した。N72D突然変異により、VH3及びVH4で観察されたバンドパターンの変化
が除去された(図1)。これにより、二重バンド及びバンドシフトが、重鎖のグリコシル化
及び不均一性によって引き起こされたことが確認された。
H4.2が、不均一にグリコシル化された親mAb BRO2-glyc-IgG4と比較して特性の改善を示す
かどうかをさらに決定するため、各抗体の熱耐性を決定した。
度上昇により、ヒト化バリアントを処理した。残留結合能を、Biacore 3000上、血清から
精製したヒトC2(3500 RU、Complement Technologies Cat#A112, lot#20)を直接コーテ
ィングしたCM5チップ表面で分析した。データは、BIAevaluationソフトウェアを使用して
分析した。各バリアントの特異的結合の傾きは、BIAevaluationソフトウェアの、センサ
グラムの線形相からの一般的フィッティング(注入開始から 5 秒後に開始され、11秒後
に停止した)により決定した。続いて、4℃の温度での活性を100%として、59℃、56.9℃
、55℃の温度で得た傾きの平均値を使用して、活性のパーセンテージを計算した。最後に
、活性のパーセンテージをGraphPad Prismでプロットした(対数(アゴニスト)対反応、
可変スロープ(4パラメータ))。抗体がその結合能の50%を失った温度(TM50)を以下の
表 8 に示す。
BRO2-glyc-IgG4に存在するグリコシル化部位を有さない両バリアントは、耐熱性が改善
されたことを示した(表8)。BRO2-glyc-IgG4は、64.0℃のTM50を示した。VH4.2/VK3(本
明細書ではBRO2-IgG4とも称する)は、2回の独立した実験で65.0又は65.1℃のTM50を示し
た。VH4.2/VK4は、2 回の独立した実験で65.2又は65.4℃のTM50を示した。
(BRO2-IgG4-NH)
pH依存的抗原結合を有する抗体は、細胞への内部移行後、酸性エンドソーム中で結合し
た抗原を解離させる。その結果、放出された抗原はリソソームに輸送されて分解される一
方、抗原と結合していない解離抗体はFcRnによって血漿に戻りリサイクルされる。リサイ
クルされた遊離抗体は別の標的抗原と結合することができる。このサイクルを繰り返すこ
とで、pH依存的抗原結合抗体は標的抗原に複数回結合し、従って抗体の中和能が改善され
得る。抗体が、酸性エンドソームpH(pH 6.0)では抗体のFcRnとの結合を強化し、中性pH
(pH 7.4)では強化しないNHance(登録商標)(NH)技術(argenx, Belgium)で準備さ
れている場合、このプロセスはさらに改善され得る。従って、BRO2-IgG4のFc領域のアミ
ノ酸を突然変異させ、FcRnとのpH依存的結合性を変化させた(H433K、N434F)。結果とし
て得られる抗体を、本明細書においてBRO2-IgG4-NHと称する。
免疫グロブリンサブクラスによる効力への影響についても調べた。さらに NHance(登
録商標)バリアントを、ヒトIgG1バックグラウンド(BRO2-IgG1-NH)において調製した。
抗体エフェクター機能は、抗体のFcγ受容体との結合性を変化させるFc領域での突然変異
によりさらに減少させることができる。従って、アミノ酸置換L234A及びL235A(「LALA」
)をBRO2-IgG1-NHに組み込んで、BRO2-IgG1-LALA-NH(本明細書ではARGX-117とも称する
)を得た。
BRO2-IgG1-LALA-NHのpH依存性を改善して、インビボでのその薬物動態及び薬力学(PK/
PD)効果を拡張できるかどうかを決定するため、 BRO2-IgG1-LALA-NH抗体のVK中のアミノ
酸をヒスチジンに突然変異させた(G29H突然変異体VK、本明細書ではVk3m3と称する)。
結果として得られる抗体を、本明細書においてHis1-IgG1-LALA-NHと称する。
同様に、BRO2-IgG4のpH依存性を改善して、インビボでのそのPK/PD効果を拡張できるか
どうかを決定するため、 BRO2-IgG4抗体のVK中のアミノ酸をヒスチジンに突然変異させた
(G29H突然変異体VK、本明細書ではVk3m3と称する)。結果として得られる抗体(VH4.2/V
k3m3)を、本明細書においてHis1-IgG4と称する。
リサイクルによる抗体の効力への影響を調べるため、NHance(登録商標)突然変異をHi
s1-IgG4(VH4.2/Vk3m3)抗体に組み込んだ。結果として得られる抗体を、本明細書におい
てHis1-IgG4-NHと称する。
BRO2-IgG4-NHのpH依存性を改善して、インビボでのそのPK/PD効果を拡張できるかどう
かを決定するため、 BRO2-IgG4-NH抗体のVH4のアミノ酸をヒスチジンに突然変異させた(
K26H VH突然変異体、本明細書ではVH4.2m12と称する)。さらに、BRO2-IgG4-NH抗体のVK3
軽鎖を上記のVK4軽鎖に置き換えて、第2のアミノ酸をヒスチジンに突然変異させた(G29H
、VK4突然変異体、本明細書ではVK4m3と称する)。結果として得られる抗体(VH4.2m12/V
K4m3)を、本明細書においてHis2-IgG4-NHと称する。
(全薬物動態(PK))
カニクイザル(n=2、群当たり1頭の雄及び1頭の雌) をランダムに割り当てて、下記の表
9に従い、別個の治療群に分けた。
いて第1日(d1)に、表9に従い各サルに5 mg/kgの試験抗体の単回静脈注射を行った。続
いて、最大60日間にわたり(d60まで)連続的に、各サルから血清試料を取得した。
ヒトIgG(Bethyl;A80-319A)により4℃で一晩コーティングした。プレートを少なくとも
200 μLのPBS-0.05% Tween20で3回洗浄し、続いて200 μL PBS-2% BSAにより室温(RT)で2
時間ブロッキングした。少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20でプレートを3回洗浄し
た後、血清試料、標準、 QC試料(プールされた未処理のカニクイザル血清中で調製)を
100倍希釈以上にして二連で適用し、これを100 μL PBS-0.2% BSA-1%プールされた未処理
カニクイザル血清で希釈した。各抗体について、それら特有の凍結標準及びQC試料を二連
で適用した(サルに注射したバッチと同じバッチの抗体を使用した)。陰性対照抗体は、
非C2補体成分と結合する抗体である。プレートを振盪しながら、インキュベーションをRT
で2時間行った。プレートを少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20で5回洗浄した後、10
0 μLのセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)-標識マウス抗ヒトIgGκ(Southern Bio
tech、9230-05)を PBS 0.2% BSAで260,000倍希釈し、ウェルに適用し、RTで1時間置いた
。プレートを少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20で5回洗浄し、100 μL 3,3’,5,5’
-テトラメチルベンジジン(TMB)を用いた染色を行い、100 μL 0.5 M H2SO4(CHEM LAB, C
at#CL05-2615-1000)で10分後に停止させた。450 nmでのODを測定し、GraphPad Prismを
使用して試料濃度を逆算した(それぞれについてそれ特有の標準を使用)。
を図2に示す。全PKアッセイにおいて、非グリコシル化BRO2-IgG4の濃度は一般に、グリコ
シル化BRO2-glyc-IgG4の濃度よりも高くなった。この全PKの改善は全く予期し得なかった
ものであり、非グリコシル化抗体のさらなる重要な利点となる。
カニクイザル(n=2、群当たり1頭の雄及び1頭の雌) に、上記のように5 mg/kgの試験抗
体を単回静脈注射した。
(抗C2 #32 m-IgG@3.31 mg/mL、0.2 μm PBS、LC-12/05-166、12-apr-13)を用いて、マ
イクロタイタープレートを4℃で一晩コーティングした。この抗体は、C2のBRO2とは異な
るエピトープに結合する。プレートを少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20で3回洗浄
し、続いて200 μL PBS-2% BSA (pH 7.4)により室温(RT)で2時間ブロッキングした。一方
、試料、凍結標準(各抗体に特異的、プールされた未処理のカニクイザル血清中で調製)
、及び凍結QC試料(プールされた未処理のカニクイザル血清中で調製)を解凍し、80 μL
PBS-0.2% BSAで6.7倍に希釈した。40 μLのビオチン化抗C2 VH4/VK3を0.6 μg/mLで追加
した。各試料は二連で作製した。100 μLの混合物は、ビオチン化抗体を加えた後、すぐ
に洗浄したコーティングプレートに移した。プレートはRTで2時間インキュベートし、少
なくとも200 μLのPBS-0.02% Tween20で5回洗浄し、PBS-0.2% BSAで300,000倍希釈した10
0 μL strep-HRP(Jackson、016-030-084)を加えた。RTで1時間インキュベートした後、
プレートを少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20で5回洗浄し、100 μL TMB(Calbioche
m, CL07)を用いた染色を行い、100 μL 0.5 M H2SO4(CHEM LAB, Cat#CL05-2615-1000)
で10分後に停止させた。450 nmでのODを測定し、これを用いてC2のレベルを決定した。
した:サル1及び2;サル3及び4;サル5及び6、サル7、8、9、及び10;サル11、12、15、
及び16;並びにサル13、14、17、及び18。
、遊離C2の減少はなかった。BRO2バリアントを用いて処置した全てのサルについて、第2
日までは遊離C2のレベルは非常に低かった。
は、C2のレベルは第4日から復帰し始め、第31日までにベースラインレベルまで復帰した
。非グリコシル化抗体で処置したサル5及び6は、一貫してBRO2-glyc-IgG4で処置したサル
よりも低い遊離C2レベルを示した(図3C、表11)。
て、C2レベルはずっとゆっくりと上昇し、第31日まででさえもC2レベルはベースラインに
は戻らなかった。
ール)を示す。BRO2バリアントに対する遊離C2レベルは、His1バリアントに対するよりも
低くなった。
レベルを有していた。サル5及び6、9及び10、並びに15及び16から得た60日間の遊離C2レ
ベルの比較結果を、図5に見ることができる。サル10はまた、全PKも最高であった(上記参
照)。生データを表11に示す。グリコシル化バリアント及び非グリコシル化バリアントを
比較した平均データを表12に示す。
、4時間、第1、2、4、11、及び27日)での分析を、全てのサルから得た血清を単一のプレ
ート上にとって反復した(図6A~6D)。「前」試料も、過剰のBRO2(500 μg/mL)を加え
た場合と加えない場合で試験した。
同等であったことを示していた(図6A)。「前」試料を500 μg/mLのBRO2でプレインキュ
ベートすると、全てのシグナルが0.013~0.015のODまで低下した(図6A及び6B)。そのよ
うな低いOD値は、いずれのPK試料についても得られず、いずれの時点においても遊離C2は
完全には除去されていないことが示された。最低レベルは4時間で得られ、 それらはBRO2
バリアントについて最低であった(ODが0.02~0.03)(サル5、6、7、8、9、及び10、図6
C)。第11日及び第27日の結果の解釈は、ADA(抗薬物抗体)によって阻止され、このこと
は数頭のサルで観察された(図6D)。
カニクイザル(n=2、群当たり1頭の雄及び1頭の雌) に、上記のように5 mg/kgの試験抗
体を単回静脈注射した。全てのサルから得た血清試料は、ベースライン(曝露前)から第
31日までの間にADA(抗薬物抗体)について試験した(図7A~7P)。サル5及び6、9及び10
、並びに15及び16から得た血清試料は、第59日までさらに試験した(図8A~8F)。
で一晩コーティングすることにより決定した。プレートを少なくとも200 μLのPBS-0.05%
Tween20で3回洗浄し、続いて200 μL PBS-1%カゼインを用いてRTで2時間ブロッキングし
た。少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20でプレートを3回洗浄した後、血清試料を100
μL PBS-0.1%カゼイン中20倍以上に希釈し、コーティングしたウェル中室温(RT)で2時間
インキュベートした。プレートを少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20で5回洗浄した
後、100 μLの8000倍希釈した抗サルIgG-HRP(Southern Biotech#4700-05)をウェルに追
加し、RTで1時間置いた。プレートを少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20で5回洗浄し
、100 μL TMBを用いた染色を行い、100 μL 0.5 M H2SO4(CHEM LAB, Cat#CL05-2615-10
00)で10分後に停止させた。450 nmでのODを測定した。代表的な結果を図7A~7Pに示す。
s1-IgG1-LALA-NH)について、明確なADA反応が観察された(それぞれ図7F、7I、7K及び7L
、並びに7N)。実に、抗体注射後のELISAで得られたシグナルは、ベースライン(「前」
)シグナル(抗体注射前)と比較して、少なくとも2倍高かった。
)については第15日に;及びサル14(図7L)については第19日に、ADAが観察された。
ルの増加が観察されたが、ベースライン試料でのシグナルは既に高く、経時的な増加は小
さかった(約1.5倍)。
いシグナルが観察された。また、このシグナルは、後の時点におけるシグナルよりも高か
った。このことは、アッセイに伴う抗体(血清中に存在)の干渉によって説明することが
できる。従って、このサルでADA反応があったかどうかを決定することはできなかった。
あるIgG1モノクローナル抗体のVH突然変異体を調べたIgawaらの文献(Protein Eng Des
Sel 2010, 23(5):385-392)では、等電点(pI)及びモノクローナル抗体クリアランスの
間に強い正の相関があり、かつpI及びモノクローナル抗体半減期の間に負の相関があるこ
とが報告された。本実施例においては、様々な形態の抗ヒトC2bのpIを決定した。結果を
表13に示す。
117のpIは、密接に関連するIgG4抗体のpIよりも有意に高いことが見いだされた。ARGX-11
7について観察されたpIは、いわゆる抗原スイーピングの潜在性が増強されたことを明示
していると予想される。
ンマッピング)
図1に示すように、ARGX-117の結合特性を、ウェスタンブロッティング及び表面プラズ
モン共鳴(SPR)分析によって評価した。ウェスタンブロッティングの結果から、図9Aに
示すように、ARGX-117はC2及びC2bと結合することが明らかになった。ARGX-117の結合特
性を、図9Bに示すように、Biacore 300を用いたSPRによって、固相にC2(配列番号:21)
をコーティングし、様々な濃度のARGX-117のFabを溶離液として用いて、さらに調べた。F
ab及びC2の間の結合が1:1であると仮定して親和性を計算し、約0.3 nMというKdを得た。A
RGX-117による作用機序を調べるため、図9Cに示すように、ストレプトアビジンでコーテ
ィングしたチップに固定化したビオチン化C4を用いて、C3変換酵素(C4bC2a)の形成を模
倣したSPR分析を実施した。C2を単独で、又は対照mAbによりプレインキュベートした後で
フローバッファーに追加すると、チップ上でC2の結合が観察された。抗C2クローン63(す
なわち抗C2-63)を用いたプレインキュベーションを行うと、シグナルが強くなった。こ
れはおそらく、このmAb形態がC2との複合体を形成し、かつC2:mAb複合体が一つに結合
して分子量の増加及びSPRシグナルの増加をもたらしたためであろう。C2をARGX-117とと
もにプレインキュベートすると、C2のC4bとの結合が大きく低下した。C2のC4bとの最初の
相互作用は、C2bドメイン(配列番号:44)によって開始すると考えられる。その後、大
きなC2aドメイン(配列番号:43)がこれに代わり、この相互作用はC3変換酵素複合体の
形成において極めて重要となる。この実験の結果から、ARGX-117はC4bとの結合を阻害す
ることにより、C2を阻害することが示唆される。
ジンチップ上に固定化されたC4bと結合させ、フロー緩衝液単独によって安定化させた後
、図9Dに示すように、試料を流した。実行緩衝液又は無関係の可溶性抗原を標的とする対
照ヒトIgG4 mAb(すなわち、抗第XI因子(抗FXI))はいく分かのシグナルの低下をもた
らし、これは注入が終わった後正規化した。抗C2-63を注入するとシグナルが増加し、こ
のmAbがC3変換酵素(C4bC2a)に結合できることが示唆される。このことは、C2のC4bとの
予測結合モデルと整合する。このことから、C2と結合した後も、C2aドメインは依然概し
て利用可能であることが示唆される。興味深いことに、ARGX-117はC3変換酵素との強い結
合を示し、その後急速に解離した。これらの結果はARGX-117はC2と結合できるが、この結
合は非常に不安定であり、活性化を促進するようにC2に影響を及ぼす可能性が高いことを
示唆している。これらの結果はまた、ARGX-117がC2分子からC2bと一緒に放出されること
を示唆する。
抗C2-5F2.4のエピトープをマッピングするために、抗C2-5F2.4が因子B(FB、配列番号
:50)と交叉反応せず、かつC2及びFBは類似したドメイン構造を有する高度に相同なタン
パク質であるという事実を利用した。これらのタンパク質は両方とも小断片と大断片を含
む。補体C2の小断片をC2b(配列番号:44)と呼び、因子Bの小断片をFBa(配列番号:51
)と呼ぶ。各々の小断片は、3つのSushi(CCPドメイン)を含む。図10に示すように、各
々の大断片は、フォン・ウィルブランド因子A型ドメイン(VWFA)及びペプチダーゼS1ド
メインを含む。ドメインスワップ突然変異体には、C末端FLAGタグを含めた。
然変異体のDNAコンストラクトをGenScriptから取得した。DNAをコンピテント大腸菌(E.
coli)細胞(ThermoFisher)に熱ショック形質転換した。細胞を寒天プレート上にストリ
ークし、37℃で16時間増殖させた。200 mL LB(Luria Broth)培地のボトルを13本調製し
(MP Bio)、オートクレーブした。300 μLのアンピシリン(100 mg/mL)を各ボトルに追加
した。各コンストラクトについて、3 mL LB培地を用いて前培養を開始した。6時間後、前
培養物をボトルに移し、37℃で16時間、撹拌しながら増殖させた。DNAは、製造業者の指
示書に従いプラスミドDNA精製キット(MaxiPrep, NucleoBond PC 500, Macherey-Nagel)
により細菌ペレットから精製し、TE緩衝液中に再構成した。プラスミドDNA濃度はNanoDro
pにより決定し、1 μg/μLに設定した。プラスミドの完全性は制限分析によって検証した
。各コンストラクトにつき、1 μLプラスミドDNA及び9 μL制限酵素ミックス(PstI及びPv
uII) を混合し、37℃で2時間インキュベートした。DNAを、Bio-Rad ChemiDoc MPシステム
を使用して、100 Vで1% アガロースゲル上1時間泳動した後、分析した。ファインマッピ
ング用のDNAコンストラクト(以下を参照)は同様に取り扱ったが、その完全性を配列決
定法により確認した。
た。HEK細胞は、完全 DMEM (10% 胎仔ウシ血清(FCS)及び1%ペニシリン/ストレプトマイシ
ン(P/S)を補充したDMEM (Gibco))中で培養した。トランスフェクションの1日前に、2つ
のフラスコの細胞を10 cm2の培養ディッシュ15個(Greiner Bio-One)に播種した。トラ
ンスフェクション前に、21 mLの空のDMEM培地を630 μLのポリエチレンイミン(P-Pei, P
olysciences, Inc.)と混合した。対照として、空のプラスミドPF45 pcDNA3.1及びPF146
H2B GFPをトランスフェクションした。15 μgのプラスミドDNAを、エッペンドルフチュー
ブ中の1500 μLの空培地-P-Peiミックスにおいて20分間インキュベートした。トランスフ
ェクションミックスを慎重に細胞に加え、培地を上下にピペッティングすることによって
混合した。8時間後、培地を15 mLの空培地に交換した。3日後、蛍光顕微鏡で細胞をGFPの
発現について確認した。第4日に上清を回収し、0.22 μmフィルター(Sartorius)により
ろ過滅菌し、Vivaspinカラム(Sartorius)で濃縮して、元の体積のおよそ1/3にした。ド
メインスワップ突然変異体は30,000 MWCOカラムで濃縮し、ファインマッピング用のC2b突
然変異体は10,000 MWCOカラムで濃縮した。全ての上清は-20℃で保存し、 SDS-PAGE 及び
抗FLAGウェスタンブロットによっても分析した。
。マイクロプレート(Maxisorp、NUNC、Cat#439454)は、PBSで5倍希釈した、又は希釈し
ていない100 μLのHEK293T上清(それぞれ、ドメインスワップ突然変異体及びファインマ
ッピング突然変異体用)により一晩コーティングした。PBS及び0.05% Tween-20で4 回洗
浄した後、100 μL/ウェルのPBS及び0.1% Tween-20(PBST)中の1 μg/mL抗FLAG Ab(ク
ローンM2、Sigma-Aldrich)を加えて、撹拌しながら室温(RT)で1時間インキュベートし
た。検出Abとして、 100 μL/ ウェルのセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤ
ギ抗マウスIgG(Santa Cruz Biotechnology、Cat# sc-2005、1000倍希釈)をPBSTに追加
し、RTで1時間インキュベートした。最後の洗浄工程の後、100 μL/ウェルのTMB(Invitr
ogen、Cat#SB02)を基質として加え、100 μL/ウェルのHCl(Fischer、Cat#J/4320/15)
により数分後に反応を停止し、450 nmでの吸光度を読み取った(BioRad、iMarkマイクロ
プレートリーダ)。
りタンパク質が検出された。突然変異体間のばらつきは、生産が異なること、又はコーテ
ィング後の抗FLAG mAbによる検出効率が異なることによって説明することができる。
ロプレート(Maxisorp, NUNC, Cat# 439454)を、100 μL PBS中の2 μg/mL抗C2-5F2.4に
より一晩コーティングした。プレートを0.05% Tween-20を含むPBSで4回洗浄し、200 μL
の0.1% Tween-20及び1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBS(PBST-BSA)により、RTで1時
間ブロッキングした。洗浄後、PBST-BSAで20倍希釈した突然変異体を含む100 μLの培養
上清を加え、撹拌しながらRTで2時間インキュベートした。洗浄後、検出抗体としてPBST-
BSA中の1 μg/mLビオチン標識抗FLAG(クローンM2、Sigma-Aldrich)を加え、RTで1時間
おいた。プレートを洗浄し、1 μg/mLストレプトアビジン-PODコンジュゲート(Roche, C
at# 11089153001)を加え、暗所で30分間インキュベートした。プレートを洗浄し、100
μL/ウェルのTMB(Invitrogen、Cat#SB02)を基質として加え、100 μL/ウェルのHCl(Fi
scher、Cat#J/4320/15)により数分後に反応を停止した。450 nmでの吸光度をマイクロプ
レートリーダ(BioRad、iMarkマイクロプレートリーダ)で測定した。
ン(配列番号:54)に置き換えられたC2-(FB-S2)についてのみ、結合の喪失が観察された
。対照的に、図12に示すように、野生型FBとの結合は見られなかったが、因子B S2ドメイ
ン(配列番号:54)が補体C2 S2ドメイン(配列番号:46)に置き換えられた突然変異体F
B-(C2-S2)について強い結合が検出された。これらの結果は、抗C2-5F2.4がC2b上のS2(Su
shiドメイン2)上のエピトープを認識することを明確に示す。また、この結果はC2-(FB-P
ep1)が十分な量で生産されることを示す。マウスIgG2a抗C2-5F2.4を使用した場合も同様
の結果を得た。さらに、緩衝液中の1.25 mM Ca++の存在下で結合を調べた場合も同様の結
果を得た。ヒトC2及びマウスC2の間のドメインスワップ突然変異体を使用して実施された
Bioceros BVによるエピトープマッピングも同様の結論に至っている。さらに、カニクイ
ザルC2のSushiドメイン2のアミノ酸配列は、ヒトC2のSushiドメイン2と完全に同一である
。
抗C2-5F2.4は、マウスC2に交叉反応せず、マウスS2ドメイン(配列番号:58)は図13に
示すように、ヒトS2ドメイン(配列番号:46)と10個のアミノ酸位置で異なる。これらの
10個のアミノ酸のうちのいずれがmAbとの結合に寄与するかを調べるために、ファインマ
ッピング突然変異体を作製した。ファインマッピングコンストラクトには、ヒトC2b断片
(huC2b)、マウスS2を有するhuC2b (huC2b-mS2)、及び各々マウス配列からヒト配列へ
の1アミノ酸逆突然変異を含む、10個の突然変異体を含めた。ドメインスワップ突然変異
体に類似した突然変異体C2bタンパク質は、HEK293細胞への一過性トランスフェクション
により作製した。
した通り、抗C2-5F2.4はhuC2bとは結合したが、マウスS2を有するhuC2b(huC2b-mS2)と
は結合しなかった。図15に示すように、いずれの復帰点突然変異も、抗C2-5F2.4との結合
を回復せず、このことから、このmAbのエピトープが、S2 ドメイン上の少なくとも2つの
アミノ酸から構成されていることが示唆される。緩衝液中の1.25 mM Ca++の存在下で結合
を調べた場合も同様の結果を得た。
2-5F2.4のエピトープに寄与する可能性のある10個のアミノ酸の位置を解析した。この解
析から、各々エピトープに寄与し得る3つのアミノ酸から構成される、3つの可能性のある
クラスターが明らかとなった。これらのクラスター突然変異体のDNAコンストラクトを設
計し、取得した。クラスター突然変異体は、ヒトC2b S2のアミノ酸を対応するマウスC2b
S2のアミノ酸に突然変異させることにより作製した。各変異体において3つのアミノ酸を
変化させた。これら3つのアミノ酸が抗C2-5F2.4のエピトープに寄与した場合、結合が喪
失することが予想された。図17Aは、クラスター1突然変異体が十分に発現し、結合に影響
がなく、従ってこれらのアミノ酸は結合に寄与しないことを示す。抗FLAG ELISAに基づい
て、クラスター2の突然変異体の発現は低下し、これにより抗C2-5F2.4による結合が喪失
した。クラスター3の突然変異体も十分に発現しておらず、このことが、図17Bに示されて
いるように抗C2-5F2.4による結合の喪失の最も妥当な説明を与えるだろう。緩衝液中の1.
25 mM Ca++の存在下で結合を調べた場合も同様の結果を得た。この解析から、クラスター
1のアミノ酸を除外することができ、クラスター2及びクラスター3の4つの可能性あるアミ
ノ酸に絞られる。
のSushiドメイン2にあることの説得力ある証拠を提供した。さらに、これらの実験より、
FB上にそのドメインが存在することが、抗C2-5F2.4による認識に十分であることが示唆さ
れる。抗C2-5F2.4がマウスC2に反応しないことを考慮すると、ヒト及びマウスのSushi 2
ドメイン間で異なる10個のアミノ酸のうちの1以上が、エピトープに不可欠であるはずで
ある。単一アミノ酸逆突然変異を用いることにより、本発明者らはSushi 2中の単一のア
ミノ酸では結合を回復させることができないことを示す。クラスター突然変異体を用いて
実施した実験から、クラスター1のアミノ酸は抗C2-5F2.4のエピトープに寄与しないと結
論付けられた。クラスター2のアミノ酸は抗C2-5F2.4のエピトープに寄与する可能性があ
るが、この突然変異体の発現はクラスター1の突然変異体よりも低いため、クラスター2の
突然変異体のフォールディングが最適化されなかったことを除外できない。クラスター3
の突然変異体は十分に発現しなかったため、突然変異がフォールディングに影響を及ぼす
可能性が高いと考えられ、クラスター3におけるアミノ酸の役割は依然としてはっきりと
しない。
本明細書で引用する全ての刊行物及び特許文献は、その全体が参照により本明細書に組
み込まれている。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
(態様1)
ヒト補体因子C2に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であっ
て:
配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含む、VHドメイン;及び
配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む、VLドメインを含む、前記モノクローナル抗
体又はその抗原結合性断片。
(態様2)
全長モノクローナル抗体を含む、態様1記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性
断片。
(態様3)
前記モノクローナル抗体が、ヒトIgG重鎖定常ドメインを含む、態様1又は2記載のモノ
クローナル抗体又はその抗原結合性断片。
(態様4)
前記重鎖定常ドメインが、ヒトIgG1重鎖定常ドメインを含む、態様3記載のモノクロー
ナル抗体又はその抗原結合性断片。
(態様5)
前記ヒトIgG1重鎖定常ドメインが配列番号:4に記載のアミノ酸配列を含む、態様4記載
のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
(態様6)
前記重鎖定常ドメインが、ヒトIgG4重鎖定常ドメインを含む、態様3記載のモノクロー
ナル抗体又はその抗原結合性断片。
(態様7)
前記ヒトIgG4重鎖定常ドメインが配列番号:5に記載のアミノ酸配列を含む、態様6記載
のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
(態様8)
前記モノクローナル抗体が、配列番号:6に記載のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番
号:7に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、態様3記載のモノクローナル抗体又はその
抗原結合性断片。
(態様9)
前記モノクローナル抗体が、配列番号:8に記載のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番
号:7に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、態様3記載のモノクローナル抗体又はその
抗原結合性断片。
(態様10)
ヒト補体因子C2に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片及び医
薬として許容し得る担体を含む医薬組成物であって、該モノクローナル抗体又はその断片
が:
配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含む、VHドメイン;及び
配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む、VLドメイン、を含む、前記医薬組成物。
(態様11)
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が、全長モノクローナル抗体を含む、
態様10記載の医薬組成物。
(態様12)
前記モノクローナル抗体が、ヒトIgG重鎖定常ドメインを含む、態様10又は11記載の医
薬組成物。
(態様13)
態様1~9のいずれか1項記載のモノクローナル抗体又は抗原結合性断片をコードする1又
は複数の核酸分子。
(態様14)
態様13記載の1又は複数の核酸分子を含む、1又は複数のベクター。
(態様15)
態様13記載の1又は複数の核酸分子を含む、宿主細胞。
(態様16)
態様14記載の1又は複数のベクターを含む、宿主細胞。
(態様17)
前記宿主細胞が、哺乳動物細胞である、態様14~16のいずれか1項記載の宿主細胞。
(態様18)
モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を作製する方法であって:
該モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の発現に好適な条件下で、態様15~17の
いずれか1項記載の宿主細胞の集団を培養すること;及び
該細胞から該モノクローナル抗体又は抗原結合性断片を単離すること、を含む、前記方
法。
(態様19)
対象における補体活性化の古典経路を阻害する方法であって、それを必要とする対象に
、有効量の態様1~9のいずれか1項記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を
投与することを含む、前記方法。
(態様20)
対象における補体活性化のレクチン経路を阻害する方法であって、それを必要とする対
象に、有効量の態様1~9のいずれか1項記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断
片を投与することを含む、前記方法。
(態様21)
前記対象がヒトである、態様19又は20記載の方法。
Claims (21)
- ヒト補体因子C2に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であっ
て:
配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含む、VHドメイン;及び
配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む、VLドメインを含む、前記モノクローナル抗
体又はその抗原結合性断片。 - 全長モノクローナル抗体を含む、請求項1記載のモノクローナル抗体。
- 前記モノクローナル抗体が、ヒトIgG重鎖定常ドメインを含む、請求項1又は2記載のモ
ノクローナル抗体。 - 前記重鎖定常ドメインが、ヒトIgG1重鎖定常ドメインを含む、請求項3記載のモノクロ
ーナル抗体。 - 前記ヒトIgG1重鎖定常ドメインが配列番号:4に記載のアミノ酸配列を含む、請求項4記
載のモノクローナル抗体。 - 前記重鎖定常ドメインが、ヒトIgG4重鎖定常ドメインを含む、請求項3記載のモノクロ
ーナル抗体。 - 前記ヒトIgG4重鎖定常ドメインが配列番号:5に記載のアミノ酸配列を含む、請求項6記
載のモノクローナル抗体。 - 前記モノクローナル抗体が、配列番号:6に記載のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番
号:7に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項3記載のモノクローナル抗体。 - 前記モノクローナル抗体が、配列番号:8に記載のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番
号:7に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項3記載のモノクローナル抗体。 - ヒト補体因子C2に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む
医薬組成物であって、該モノクローナル抗体又はその断片が:
配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含む、VHドメイン;及び
配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む、VLドメイン、を含む、前記医薬組成物。 - 前記モノクローナル抗体が、全長モノクローナル抗体を含む、請求項10記載の医薬組成
物。 - 前記モノクローナル抗体が、ヒトIgG重鎖定常ドメインを含む、請求項10又は11記載の
医薬組成物。 - 請求項1記載のモノクローナル抗体又は抗原結合性断片又は請求項2~9のいずれか1項記
載のモノクローナル抗体をコードする、1又は複数の核酸分子。 - 請求項13記載の1又は複数の核酸分子を含む、1又は複数のベクター。
- 請求項13記載の1又は複数の核酸分子を含む、宿主細胞。
- 請求項14記載の1又は複数のベクターを含む、宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請求項15又は16のいずれか1項記載の宿主細胞
。 - モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を作製する方法であって:
該モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の発現に好適な条件下で、請求項15~17
のいずれか1項記載の宿主細胞の集団を培養すること;及び
該細胞から該モノクローナル抗体又は抗原結合性断片を単離すること、を含む、前記方
法。 - 対象における補体活性化の古典経路を阻害するための医薬組成物であって、請求項1記
載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片又は請求項2~9のいずれか1項記載のモ
ノクローナル抗体を含む、前記医薬組成物。 - 対象における補体活性化のレクチン経路を阻害するための医薬組成物であって、請求項
1記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片又は請求項2~9のいずれか1項記載の
モノクローナル抗体を含む、前記医薬組成物。 - 前記対象がヒトである、請求項19又は20記載の医薬組成物。
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