JP7110491B2

JP7110491B2 - ヒト補体因子ｃ２ｂに対する抗体及び使用方法

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Publication number: JP7110491B2
Application number: JP2021533300A
Authority: JP
Inventors: ブランシェットクリストフ; デハードハンス
Original assignee: アルジェニクスビーブイ
Priority date: 2018-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2022-08-01
Anticipated expiration: 2039-12-13
Also published as: MX2021006864A; WO2020121282A1; US11591386B2; IL283916A; US20220119509A1; US20200239554A1; US11161900B2; US20240002484A1; AU2019397614B2; EP4375297A2; EA202191658A1; KR20210100688A; AU2019397614A1; EP3893924A1; SG11202105195PA; US11708403B2; CA3119655A1; US20220267424A1; CN113260375A; JP2022512223A

Description

（関連出願）
本願は、 2018年12月13日に出願された米国仮特許出願第62/779,102号を基礎とする優先権の恩典を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれている。

（配列表）
本願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。2019年11月22日に作成された前記ASCII コピーは618634_AGX5-048PC_ST25.txtという名称で、サイズは94,329バイトである。

（発明の分野）
本発明は、免疫学及び分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、補体系の古典経路及びレクチン経路の活性化を阻害するための組成物及び方法、並びにヒトの疾病の治療におけるそれらの使用に関する。本発明は特に、ヒト補体因子C2に結合する結合分子、並びにその作製方法及び使用方法に関する。

（発明の背景）
補体系には、細胞を溶解し得る一連のカスケードをなす血漿中酵素、調節タンパク質、及びタンパク質が含まれる。活性化前から、様々な補体因子が不活性前駆体タンパク質として循環している。系が活性化すると、活性化カスケードが導かれ、該カスケードではある因子がカスケードのさらに下流にある補体タンパク質を、特異的にタンパク質分解することにより、後続の因子を活性化させる。

補体系の活性化は、3つの経路、古典（又は古典的）経路、代替経路、及びレクチン経路を介して起こり得る。古典経路は、抗原及びIgM、IgG1、IgG2、又はIgG3抗体が相互作用して、免疫複合体を形成することによって活性化され、該免疫複合体は、補体成分C1のサブユニットであるC1qと結合する。代替経路は、IgAを含む免疫複合体、又は細菌及び他の活性化表面の認識によって活性化する。レクチン経路は、マンノース結合レクチン又はマンナン結合タンパク質（MBP）としても知られるマンナン結合レクチン（MBL）が、様々な病原体表面の特定の炭水化物に結合することにより開始される、抗体非依存的な補体活性化経路を担う。

古典経路の活性化は、C1、C4、及びC2の連続的な活性化から開始する；C2はさらに切断されて、C2a及びC2bを生じる。代替経路の活性化は、補体成分D、C3、及びBの連続的な活性化から開始する。各経路は、共通の中心成分であるC3、すなわち第3補体因子を切断してこれを活性化する。その結果、共通の終末経路が活性化し、それにより膜侵襲複合体（MAC、補体成分C5b-9を含む； Muller-Eberhardの文献、Annu Rev Biochem 1988, 57:321）が形成される。補体が活性化する間に、MACだけでなく、アナフィラトキシンC3a及びC5aのようないくつかの炎症性ペプチドも生成する。これらの活性化による産物は、白血球の走化性、貪食細胞、マスト細胞、及び好塩基球の脱顆粒、平滑筋収縮、血管透過性の増加、並びに細胞の溶解などの、多面的な生物学的効果を引き起こす（Hughの文献、Complement 1986, 3:111）。また、補体活性化による産物は、特に貪食細胞による、毒性酸素ラジカルの生成並びにアラキドン酸代謝物及びサイトカインの合成及び放出を誘発し、それにより炎症反応はさらに増幅される。

補体は病原性生物に対する重要な防衛線であるものの、その活性化はそれがなければ健常であったはずの宿主細胞に対する損傷ももたらし得る。従って、補体活性化の阻害は、補体によって媒介される組織損傷の治療及び予防に有益であると考えられる。従って、当該技術分野において、補体カスケードの1以上の重要な構成要素を阻害する新規治療薬に対する、切迫したニーズが依然として存在する。

（発明の概要）
既存の抗体と比較して改善された特徴を有する、新規モノクローナル抗ヒトC2b抗体及びその抗原結合性断片を提供する。新規抗体の特徴は、重鎖可変ドメイン（VH）のフレームワーク領域3（FR3）においてグリコシル化部位が欠失していることである。特に、新規抗体は、既存の抗体と比較して均一性が向上し、従って製造しやすさが改善されており、かつ機能特性が予期せず改善されている。機能特性の改善としては、例えば、pIの上昇、及びいわゆる抗原スイーピング（antigen sweeping）の潜在性の増強が挙げられる。抗体及びその抗原結合性断片について、ヒトの治療における使用が見いだされる。

本発明の一態様は、ヒト補体因子C2に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって：
配列番号：1に記載のアミノ酸配列を含む、VHドメイン；及び
配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含む、VLドメインを含み、
ここでVHドメインのアミノ酸残基72-74（Kabat付番）がそれぞれX₁X₂X₃からなり、X₂が任意のアミノ酸であり、かつX₁X₂X₃がNX₂SでもNX₂Tでもない、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である。

本発明の一態様は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。

本発明の一態様は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をコードする1又は複数の核酸分子である。

本発明の一態様は、本発明による1又は複数の核酸分子を含む、1又は複数のベクターである。

本発明の一態様は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をコードする1又は複数の核酸分子を含む宿主細胞である。

本発明の一態様は、本発明による1又は複数の核酸分子を含む1又は複数のベクターを含む宿主細胞である。

本発明の一態様は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の製造方法であって、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の発現を可能にする条件下で、本発明による細胞集団を培養することを含む、前記方法である。

本発明の一態様は、対象における古典経路又はレクチン経路の活性化を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を投与することを含む、前記方法である。

以下の実施態様は、本発明の全ての態様に適用される。

ある実施態様において、X₁X₂X₃はDX₂Sからなる。

ある実施態様において、X₁X₂X₃はDKSからなる。

ある実施態様において、VHドメインは、配列番号：3に記載のアミノ酸配列を含む。

ある実施態様において、VLドメインは、配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含む。

ある実施態様において、VHドメインは、配列番号：3に記載のアミノ酸配列を含み、かつVLドメインは、配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含む。

ある実施態様において、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、全長モノクローナル抗体を含む。

ある実施態様において、モノクローナル抗体は、ヒトIgG重鎖定常ドメインを含む。

ある実施態様において、重鎖定常ドメインは、ヒトIgG1重鎖定常ドメインを含む。ある実施態様において、ヒトIgG1重鎖定常ドメインは、配列番号：4に記載のアミノ酸配列を含む。

ある実施態様において、重鎖定常ドメインは、ヒトIgG4重鎖定常ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ヒトIgG4重鎖定常ドメインは、配列番号：5に記載のアミノ酸配列を含む。

ある実施態様において、モノクローナル抗体は、配列番号：6に記載のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：7に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

ある実施態様において、モノクローナル抗体は、配列番号：8に記載のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：7に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

（図面の簡単な説明）
示されたサンプルを負荷したポリアクリルアミドゲルを示す。レーン4、5、8、及び9の試料についての大きい方の分子量バンド（矢印）は、VH3及びVH4を含む抗体についてバンドが分割され、シフトしていることを示す。カニクイザルにおける31日間の経過にわたる、示されている抗体の全レベルを示すグラフである。以下の抗体を試験した：BRO2-glyc-IgG4（サル1及び2、グリコシル化VH）及び BRO2-IgG4 （サル5及び6、非グリコシル化VH）。図3A～3Iは、カニクイザルに対する様々なモノクローナル抗体の投与から31日間の経過にわたる血清中の遊離C2（経時的なOD 450 nmとしてプロットしている）のレベルを示すグラフである。以下の抗体を試験した：BRO2-glyc-IgG4（図３A；サル1及び2）、陰性対照（図3B；サル3及び4）、BRO2-IgG4（図3C；サル5及び6）、BRO2-IgG4-NH（図３D；サル7及び8）、BRO2-IgG1-LALA-NH（図3E；ARGX-117；サル9及び10）、His1-IgG4（図3F；サル11及び12）、His1-IgG4-NH（図３G；サル13及び14）、His1-IgG1-LALA-NH（図3H；サル15及び16）、並びにHis2-IgG4（図3I、サル17及び18）。示されている様々なモノクローナル抗体を投与されたカニクイザルから得た31日間の経過にわたる血清中の遊離C2レベルの平均（経時的なOD 450 nm としてプロットしている）を示すグラフである。示されている非グリコシル化抗体で処置されたカニクイサルの血清中の遊離C2レベル（経時的に OD 450 nm としてプロットしている）を示すグラフである。図6A～6D は、抗体の投与前又は後の示されている時間に決定された、カニクイザルの遊離C2レベル（OD 450 nmとしてプロットしている）を示す一連のグラフである。サルは図3A～3Iと同様とする。図6A 、前対前＋500 mg/ml BRO-2；図6B、4 時間対1日、図6C、4時間対2日；図6D、第11日対第27日。ADA、抗薬物抗体。 7A-7Pは、カニクイザルに投与された抗C2抗体又は陰性対照モノクローナル抗体の30日間にわたる免疫原性（OD 450 nmとしてプロットしている）を示す一連のグラフである。サルは図3A～3Iと同様とする。図7A、サル1；図7B、サル2、図7C、サル5、図7D、サル6；図7E、サル7；図7F、サル8、図7G 、サル9、図7H、サル10；図 7I、サル11；図7J、サル12、図7K、サル13；図7L、サル14；図7M、サル15；図7N 、サル16；図7O、サル17、図7P、サル18。 8A-8F は、カニクイザルに投与された抗C2モノクローナル抗体の60日間にわたる免疫原性（OD 450 nmとして経時的にプロットしている）を示す一連のグラフである。サルは図3A～3Iと同様とする。図8A、サル5；図8B、サル6；図8C、サル9、図8D、サル10；図8E、サル15；図8F、サル16。ADA、抗薬物抗体。図9A～9Dは、ウェスタンブロット解析及び表面プラズモン共鳴（SPR）により評価した、ARGX-117のC2との結合を示す。図 9A は、ARGX-117を含む血清のウェスタンブロッティング解析を示す（代表的な結果）：レーン1：MWサイズマーカー；レーン 2 ：組換えヒトC2対照（サイズ約100 kDa）；レーン3：血清；レーン4：血清への凝集IgGの追加及び37℃でのインキュベーションによる補体活性化の誘導；レーン5：C2 欠損血清。図9Bはチップ表面に固定化されたC2及び溶出物としての様々なARGX-117 Fabを用いたSPR解析を示す。図9Cは、溶出物としてのmAbを加えた場合及び加えない場合の、ストレプトアビジンチップに固定化されたビオチン-C4b及びヒトC2を用いたSPR解析を示す；黒：プレインキュベーションなし；灰色：抗FXI；対照ヒトIgG4 mAb；ターコイズ：非抑制性抗C2クローンの抗C2-63、すなわちC2の大サブユニット（C2a）を認識するクローン63；赤：ARGX-117を示す。これらは全て5対1のモル比であり、曲線をC4bチップ表面へのC2の注入直前のシグナルに対して正規化した。図9Dは、ストレプトアビジンチップに固定化されたビオチン-C4b及びそれに続く溶出物としてのヒトC2及びmAbを用いたSPR分析を示す；黒：実行緩衝液、灰色：抗FXI；対照ヒトIgG4mAb；ターコイズ：非抑制性抗C2のクローン抗C2-63；赤：ARGX-117；曲線はmAbの追加直前に正規化した。 C2（配列番号：21）及び補体因子B（FB）（配列番号：50）間のドメインスワップ突然変異体の模式図を示す。両タンパク質は、小断片（補体C2中のC2b；配列番号：44又は補体因子B中のFBa；配列番号：51）は、3つのSushi（又は補体制御タンパク質（CCP））ドメインからなる一方、大断片は、フォン・ウィルブランド因子A型（VWFA）ドメイン及びペプチダーゼS1ドメインから構成される。個別のドメイン間の配列は、これらの突然変異体において同時には採用されなかったが、これらもエピトープからなり得る点に留意されたい。追加の配列にはC2a、配列番号：43；C2b S1、配列番号：45；C2b S2、配列番号：46；C2b S3、配列番号：47；C2 VWFA、配列番号：48；C2ペプチダーゼS1、配列番号：49；FBb、配列番号：52；FBa S1、配列番号：53；FBa S2、配列番号：54；FBa S3、配列番号：55；FB VWFA、配列番号：56;及びFBペプチダーゼ1、配列番号：57がある。ドメインスワップ突然変異体について実施した抗FLAG ELISAを用いて得た結果を示す。トランスフェクションしたHEK293細胞から得た上清の5倍希釈物を使用してコーティングし、抗FLAGマウスモノクローナルAbをHRP標識抗マウスIgGと組み合わせて使用して、検出を行った。抗C2-5F2.4を用いて実施したドメインスワップELISAにより得た結果を示す。抗C2-5F2.4 mAb（ヒトIgG4 S241P VH4/VL3 LC-13/03-163A Bioceros）を使用してコーティングし、プレートを20倍希釈したHEK293トランスフェクション体の上清とともにインキュベートし、結合を抗FLAG Abによって検出した。同様の結果を伴う2つの独立した実験から得た代表的な結果。ヒト及びマウスC2bのSushi 2（S2）ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す。ヒトS2、配列番号：46；マウスS2、配列番号：58。星印は配列の一致を示す。ファインマッピング突然変異体についての抗FLAG ELISAを用いて得た結果を示す。トランスフェクションしたHEK293細胞から得た希釈していない上清を使用してコーティングし、ビオチン標識抗FLAGマウスモノクローナルAbをHRP標識SAコンジュゲートと組み合わせて使用して、検出を行った。ファインマッピング突然変異体についての結果を示す。抗C2-5F2.4 mAb（ヒトIgG4 S241P VH4/VL3 LC-13/03-163A Bioceros）を使用してコーティングし、プレートを20倍希釈したHEK293トランスフェクション体の上清とともにインキュベートし、結合を抗FLAG Abによって検出した。各クラスターに3つのアミノ酸突然変異を用いたクラスターマッピング突然変異体の構想を示しており、位置はヒト配列中太字フォントで示されている。各ヒト配列を突然変異させて、太字で示したヒトアミノ酸を対応するマウスのアミノ酸で置換した。ヒトS2、配列番号：46；マウスS2、配列番号：58。星印は配列の一致を示す。図17A及び17Bは、クラスターマッピング突然変異体についての抗FLAG ELISAを示す。図17Aは、トランスフェクションしたHEK293細胞から得た上清の5倍希釈物を使用してコーティングし、抗FLAGマウスモノクローナルAbを検出試薬としてのHRP標識抗マウスIgGと組み合わせたことを示す。GFP 、緑蛍光タンパク質。図17Bは、抗C2-5F2.4のクラスター突然変異体への結合を示す。抗C2-5F2.4 mAb（ヒトIgG4 S241P VH4/VL3 、LC-13/03-163A 、Bioceros）を使用してコーティングし、プレートを20倍希釈したHEK293トランスフェクション体の上清とともにインキュベートし、結合を抗FLAG Abによって検出した。GFP 、緑蛍光タンパク質。

（詳細な説明）
（定義）
「抗体」又は「免疫グロブリン」―本明細書で使用する「免疫グロブリン」という用語は、任意の関連する特異的免疫反応性を有するか否かにかかわらず、2つの重鎖及び2つの軽鎖の組合わせを有するポリペプチドを含む。本明細書で使用する「抗体」という用語は、関心対象とする抗原（例えば、C2を含む補体タンパク質複合体）に対する顕著な特異的免疫反応活性を有するアセンブリを指す。「C2抗体」という用語は本明細書において、C2、特にヒトC2タンパク質及びC2の切断を介して形成されるドメイン、並びにいくつかの事例において、それらと相同な種を含む、補体タンパク質の複合体に対し免疫学的特異性を示す抗体を指すものとして使用する。抗体及び免疫グロブリンは、軽鎖及び重鎖を含み、それらの間の共有結合性鎖間結合の有無は問わない。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。

5つの異なる抗体クラス（IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgE）は、生化学的に識別可能である。5つの抗体クラスは全て、本発明の範囲内にある。一般的に、以下の考察はIgGクラスの免疫グロブリン分子を対象とする。IgGに関しては、免疫グロブリンは典型的に、分子量およそ23,000ダルトンの2つの同一の軽鎖ポリペプチド及び分子量 53,000～70,000の2つの同一の重鎖を含む。4つの鎖は、ジスルフィド結合によって「Y」字の構成に連結される。該「Y」字の構成では、軽鎖が「Y」字の口から開始して、可変領域を通るように続く重鎖を下支えする（bracket）。

抗体の軽鎖はカッパ（κ）又はラムダ（λ）に分類される。各クラスの重鎖は、κ又はλ軽鎖のいずれかと結合し得る。一般的に、軽鎖及び重鎖は互いに共有結合され、免疫グロブリンがハイブリドーマ、B細胞、又は遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって作製される場合、二つの重鎖の「尾」部分は、共有結合性ジスルフィド結合又は非共有結合性結合によって互いに結合される。重鎖では、アミノ酸配列はY字構成の分岐端にあるN末端から各鎖の底にあるC末端まで走行する。当業者であれば、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロン（γ、μ、α、δ、又はε）に分類され、それらの間でいくつかのサブクラスがある（例えば：γ1-γ4）ことが認識されよう。抗体の「クラス」を、IgG、IgM、IgA、IgD又はIgEとしてそれぞれ決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4 、IgA1など）はよく特徴づけられ、機能的特殊化を付与することが知られている。これらの各クラス及びアイソタイプの改変形態は、当業者であれば簡単な開示に照らして容易に認識でき、従って本発明の範囲内にある。

上記のように、抗体の可変領域により、抗体は抗原上のエピトープを選択的に認識し、かつこれと特異的に結合することが可能となる。すなわち、抗体のVLドメイン及びVHドメインが組み合わされ、3次元抗原結合部位を画定する可変領域が形成される。この4鎖抗体構造は、Y字の各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、各VH及びVL鎖上の3つの相補性決定領域（CDR）によって画定される。

「結合分子」―本明細書で使用する「結合分子」という用語は、本開示により抗体及びその抗原結合性断片を包含することを意図する一般的な用語である。

「結合部位」―本明細書で使用する「結合部位」という用語は、関心対象とする標的抗原との選択的結合を担うポリペプチドの領域を含む。結合ドメインは、少なくとも1つの結合部位を含む。例示的な結合ドメインには、抗体可変ドメインがある。本発明の抗体分子は、単一の結合部位又は複数（例えば、2、3、若しくは4個）の結合部位を含み得る。

「可変領域」又は「可変ドメイン」―「可変」という用語は、可変ドメインVH及びVLの特定の部分が抗体間で配列が広範囲に異なっており、その標的抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性に使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインの全体に均一に分布しているのではない。可変性は、抗原結合部位の部分を形成するVLドメイン及び VH ドメインの各々において、「超可変ループ」と称する3つのセグメントに集中している。Vλ軽鎖ドメインの第1、第2、及び第3の超可変ループを本明細書においてL1（λ）、L2（λ）、及びL3（λ）と称し、VLドメイン中の残基 24-33（L1（λ）、9、10、又は11アミノ酸残基からなる）、49-53（L2（λ）、3残基からなる）、及び90-96（L3（λ）、5残基からなる）を含むものとして定義され得る（Moreaらの文献, Methods 20:267-279 (2000)）。Vκ軽鎖ドメインの第1、第2、及び第3の超可変ループは本明細書においてL1（κ）、L2（κ）、及びL3（κ）と称し、VLドメイン中の残基 25-33（L1（κ）、6、7、8、11、12、又は13残基からなる）、49-53（L2（κ）、3残基からなる）、及び90-97（L3（κ）、6残基からなる）を含むものとして定義され得る（Moreaらの文献, Methods 20:267-279 (2000)）。VHドメインの第1、第2、及び第3の超可変ループは本明細書においてH1、H2、H3と称し、VHドメインの残基25-33(H1、7、8、又は9残基からなる)、52-56(H2、3又は4残基からなる)、及び91-105（H3、長さについて高度に可変性である）を含むものとして定義され得る（Moreaらの文献, Methods 20:267-279 (2000)）。

別途示されない限り、L1、L2、L3という用語はそれぞれVLドメインの第1、第2、及び第3の超可変ループを指し、Vκ及びVλアイソタイプの両方から得た超可変ループを包含する。H1、H2、H3という用語はそれぞれVHドメインの第1、第2、及び第3の超可変ループを指し、γ、μ、α、δ、又はεを含む既知の重鎖アイソタイプのいずれかから得た超可変ループを包含する。

超可変ループL1、L2、L3、H1、H2、及びH3は、各々以下に定義する「相補性決定領域」すなわち「CDR」の部分を含み得る。「超可変ループ」及び「相補性決定領域」という用語は厳密に同義ではない。それは、超可変ループ（HV）が構造に基づいて定義されているのに対し、相補性決定領域（CDR）は配列の可変性に基づいて定義されており（Kabatらの文献, 「免疫学の対象となるタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）, 第5版、Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1983）、かつHV及びCDRの境界は、一部のVH及びVLドメインにおいて異なり得るためである。

VL及びVHドメインのCDRは典型的に、以下のアミノ酸を含むものとして定義することができる：軽鎖可変ドメイン中の残基24-34 （LCDR1）、50-56 （LCDR2）、及び89-97 （LCDR3）、並びに重鎖可変ドメイン中の残基31-35又は31-35b （HCDR1）、50-65 （HCDR2）、及び95-102 （HCDR3）（Kabatらの文献、「免疫学の対象となるタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」, 第5版、Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。従って、HVは対応するCDR中に含まれ、別途示されない限り、本明細書におけるVH及びVLドメインの「超可変ループ」への言及は、対応するCDRも包含し、その逆も同様であるものと解釈すべきである。

可変ドメインのより高度に保存された部分は、以下に定義するように、フレームワーク領域（FR）と称する。ネイティブの重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々4つのFR（それぞれFR1、FR2、FR3、及びFR4）を含み、主に3つの超可変ループで接続されたβシート構成を採用する。各鎖の超可変ループは FRによってともに近接して保持され、他の鎖からの超可変ループとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。抗体の構造解析により、相補性決定領域によって形成される結合部位の配列及び形状の間の関係が明らかとなった（Chothiaらの文献、J. Mol Biol. 227:799-817 (1992); Tramontanoらの文献、J. Mol. Biol, 215:175-182 (1990))）。その配列の可変性が高いにもかかわらず、6つのループのうち5つは、「カノニカル構造」と称するレパートリーがわずか少数である主鎖のコンフォメーションを採用する。これらのコンフォメーションは、まず第1に、ループの長さによって決定され、第2に、その充填、水素結合、又は異常な主鎖コンフォメーションを仮定する能力を通じてコンフォメーションを決定するループ及びフレームワーク領域中の特定の位置に重要な残基が存在することによって決定される。

「フレームワーク領域」―本明細書で使用する「フレームワーク領域」又は「FR領域」という用語は、可変領域の部分であるが、CDRの部分ではないアミノ酸残基を含む（例えば、CDRのKabat定義を使用する）。従って、可変領域フレームワークの長さは約100～120アミノ酸であるが、CDRの外側にあるアミノ酸のみを含む。重鎖可変ドメインの具体例及びKabatらの文献で定義されているCDRについて、フレームワーク領域1はアミノ酸1-30を包含する可変領域のドメインに対応し；フレームワーク領域2は、アミノ酸36-49を包含する可変領域のドメインに対応し；フレームワーク領域3はアミノ酸66-94を包含する可変領域のドメインに対応し、かつフレームワーク領域4はアミノ酸 103から可変領域の末端までの可変領域のドメインに対応する。軽鎖のフレームワーク領域は、各軽鎖可変領域CDRによって同様に区分される。同様に、 Chothiaらの文献又は McCallumらの文献によるCDRの定義を使用して、フレームワーク領域の境界は上記のように、それぞれのCDRの終端によって隔てられる。好ましい実施態様において、CDRはKabatによって定義される。

天然抗体では、各単量体抗体上に存在する6つのCDRは、抗体が水性環境でその3次元構成を呈する際に特定の配置をとって抗原結合部位を形成する短い不連続のアミノ酸配列である。重可変ドメイン及び軽可変ドメインの残りの部分は、アミノ酸配列において示す分子間の可変性がより小さく、かつフレームワーク領域と命名される。フレームワーク領域は概してβシートコンフォメーションを採用し、CDRはループを形成して、βシート構造と接続し、かついくつかの事例ではその部分を形成する。従って、これらのフレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によって6つのCDRの正しい方向への配置を提供する足場を形成するように作用する。配置されたCDRによって形成される抗原結合部位は、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を画定する。この相補的な表面により、免疫反応性抗原エピトープに対する抗体の非共有結合が促進される。CDR の位置は、当業者であれば容易に特定できる。

「非グリコシル化」―本明細書で使用する「非グリコシル化」という用語は、抗体又は抗原結合性断片の潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化を欠いた形態の抗体又はその抗原結合性断片を指す。ある実施態様において、「非グリコシル化」という用語は、抗体又は抗原結合性断片の潜在的なN-結合型グリコシル化部位でのグリコシル化を欠いた形態の抗体又はその抗原結合性断片を指す。ある実施態様において、「非グリコシル化」という用語は、重鎖の可変領域の潜在的なN-結合型グリコシル化部位でのグリコシル化を欠いた形態の抗体又はその抗原結合性断片を指す。

「定常領域」―本明細書で使用する「定常領域」という用語は、可変ドメイン又は可変領域の外側にある抗体分子の部分を指す。免疫グロブリン軽鎖は単一ドメインの「定常領域」を有し、典型的に「CL又はCL1ドメイン」と称する。このドメインは、VLドメインに対してC末端側にある。免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリンのクラス（γ、μ、α、δ、ε）に応じその定常領域が異なる。重鎖γ、α及びδは、3つの免疫グロブリンドメイン（CH1、CH2、及びCH3と称する）からなる定常領域を有し、CH1及びCH2ドメインを隔てる柔軟なヒンジ領域を伴う。重鎖のμとεは、4つのドメイン（CH1-CH4）からなる定常領域を有する。重鎖の定常ドメインは、C末端を VH ドメインに配置する。

重鎖及び軽鎖免疫グロブリンにおけるアミノ酸の付番は、Y字構成の分岐端にあるN末端から各鎖の底にあるC末端まで順次決定する（run）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の定常ドメインを定義するために、異なる付番体系が使用される。EU付番体系に従うと、IgG分子の重鎖定常ドメインは以下のように特定される：CH1―アミノ酸残基118-215；CH2―アミノ酸残基 231-340；CH3―アミノ酸残基 341-446。「ヒンジ領域」は、CH1ドメインをCH2ドメインに結合する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域はおよそ25残基を含み、かつ柔軟性があるため、2つのN末端抗原結合領域は独立して運動することができる。ヒンジ領域は、上部、中央部、及び下部のヒンジドメイン（Roux K.H. らの文献、J. Immunol.161:4083-90 1998）の 3 つの異なるドメインに細分可能である。「完全ヒト」ヒンジ領域を含む本発明の抗体は、以下の表1に示すヒンジ領域配列の1つを含み得る。

（表1.ヒトヒンジ配列）

「断片」―本発明の抗体の文脈において使用する「断片」という用語は、インタクトな、又は完全な抗体又は抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体又は抗体鎖の一部又は部分を指す。「抗原結合性断片」という用語は、抗原に特異的に結合し、又は抗原特異的結合（例えば、C2タンパク質又はその部分との特異的結合）についてインタクトな抗体と（すなわち、それらが由来するインタクトな抗体と）競合する免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を指す。本明細書で使用する抗体分子の「断片」という用語は、抗体の抗原結合性断片、例えば、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）、抗体重鎖可変ドメイン（VH）、単鎖抗体（scFv）、F（ab’）2断片、Fab断片、Fd断片、Fv断片、単一アーム（一価）抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、又はそのような抗原結合性断片の組合わせ、アセンブリ、若しくはコンジュゲーションによって形成される任意の抗原結合分子を含む。本明細書で使用する「抗原結合性断片」という用語は、ユニボディ、ドメイン抗体、及びナノボディからなる群から選択される抗体断片を包含することをさらに意図している。断片は、例えばインタクトな若しくは完全な抗体若しくは抗体鎖の化学的若しくは酵素的処理、又は組換え手段によって取得可能である。

（補体成分C2）
ヒト補体の第2成分（C2）は、古典経路及びレクチン経路の補体活性化に関与する90～100 kDaの糖タンパク質である。C2は、古典経路のC1s又はレクチン経路の活性化MASP2によって活性化され得る。C2は（Mg²⁺の存在下で）表面結合C4bに結合し、C4bC2複合体を形成する。この複合体は続いて、活性化C1s又はMASP2によって切断され、2つの断片となる：大きい方の70 kDaの断片は、従来C2aと称され、C4bに結合したままC3変換酵素C4bC2aを形成し、小さい方の30 kDa N-末端断片は、従来C2bと称され、流体相に放出される。著者の中には最近、C2a及びC2bの呼称を逆にして、C2bが大きい方の70 kDa断片を指し、C2aが小さい方の30 kDa断片を指すように用いる方もいる。本明細書で使用するC2aは、大きい方の70 kDa断片を指し、C2bは、小さい方の30 kDa断片を指すものとする。一度活性化され、C4bと結合すると、C2aは、それぞれC3及びC5を切断することができるC3及びC5変換酵素の触媒サブユニットを構成する。

ヒトC2のアミノ酸配列は公知であり（GenBank受託番号NM_000063）、配列番号：21として示される。

ヒトC2のアミノ酸配列（配列番号：21）：

多くの他の血漿タンパク質と同様に、C2はモジュール構造を有する。C2は、そのN末端から出発して、3つの補体制御タンパク質モジュール（CCP1-3、ショートコンセンサス反復配列（SCR）又はsushi-ドメイン反復配列としても知られる）、金属イオン依存的接着部位を含むフォン・ウィルブランド因子A 型（vWFA）ドメイン、セリンプロテアーゼ（SP）ドメイン（Arlaudらの文献、 Adv Immunol、 1998, 69:249)からなる。電子顕微鏡研究から、C2は3つのドメインからなることが明らかになった。3つのCCPモジュール（CCP1-3）は一緒になってN-末端ドメインを形成し、これがC2bに相当する。vWFAドメインは第2のドメインを構成し、SPドメインは第3のドメインを構成する。第2及び第3のドメインは、一緒になって分子の大きな方のC2a部分を構成する。

CCPモジュールは、いくつかのタンパク質中にある共通の構造モチーフである。これらの球状ユニットはおよそ60アミノ酸残基からなり、4つの不変のジスルフィド結合システイン残基の周囲に構築された、6～8個のストランドによるコンパクトなβシート構造に折りたたまれる（Normanらの文献、J Mol Biol 1991, 219: 717）隣接するCCPモジュールは、保存性の低いリンカーによって共有結合で結合される。

C2の表面結合C4bとの最初の結合は、2つの低親和性部位によって仲介され、これらの一方がC2bと (Xu及びVolanakisの文献、J Immunol 1997, 158:5958）、他方がC2aのvWFAドメインと（Horiuchiらの文献、J Immunol 1991, 47: 584）、結合する。C2b及びC2aの結晶構造は1.8 Åの分解能まで決定されているものの（Milderらの文献, Structure 2006, 14:1587; Krishnanらの文献, J Mol Biol 2007, 367: 224; Krishnanらの文献, Acta Cristallogr D Biol Crystallogr 2009, D65: 266）、C2上のC4及びC3との接触部位を構成するアミノ酸残基の正確なトポロジー及び構造は不明である。このため、C4との相互作用に関与するC2のアミノ酸残基は依然として確立されないままである（Krishnanらの文献、Acta Cristallogr D Biol. Crystallogr 2009, D65: 266）。

（抗C2抗体）
本発明の一態様は、ヒト補体因子C2に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって：
配列番号：1に記載のアミノ酸配列を含む、VHドメイン；及び
配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含む、VLドメインを含み、
ここでVHドメインのアミノ酸残基72-74（Kabat付番）がそれぞれX₁X₂X₃からなり、X₂が任意のアミノ酸であり、かつX₁X₂X₃がNX₂SでもNX₂Tでもない、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である。

VHドメインは、相補性決定領域（CDR） HCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む。VLドメインは、CDR LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3 のアミノ酸配列を表2に示す。

（表2. CDR）

ある実施態様において、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ヒト補体因子C2bと特異的に結合する。ある実施態様において、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ヒト補体因子C2bに相当するヒト補体因子C2の部分のエピトープに特異的に結合する。

ある実施態様において、重鎖可変ドメインはグリコシル化されていない。ある実施態様において、重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列N-X-S/T（Nはアスパラギンを表し、Xは任意のアミノ酸を表し、かつS/Tはセリン又はスレオニンを表す）によって特徴付けられる潜在的なグリコシル化部位を含まない。従ってある実施態様において、配列N-X-S/Tを含むVHドメインを含む抗体は改変されて、これらの残基がそれぞれX₁X₂X₃からなり得る（ここでX₂は任意のアミノ酸であり、かつX₁X₂X₃がNX₂SでもNX₂Tでもない）。すなわち、X₁はN以外の任意のアミノ酸であり、かつ/又はX3は、S若しくはT以外の任意のアミノ酸であり得る。ある実施態様において、配列N-X-S又はN-X-Tを含むVHドメインを含む抗体は改変されて、これら3つの残基がそれぞれD-X-Sからなり得る。ある他の実施態様において、配列N-X-S又はN-X-Tを含むVHドメインを含む抗体は改変されて、これら3つの残基がそれぞれD-X-Tからなり得る。

ある実施態様において、残基72～74（Kabat付番）の重鎖アミノ酸はそれぞれX₁X₂X₃からなる（ここでX₂は任意のアミノ酸であり、かつX₁X₂X₃はNX₂SでもNX₂Tでもない）。

ある実施態様において、残基72～74（Kabat付番）の重鎖アミノ酸はDX₂Sからなる。

ある実施態様において、残基72～74（Kabat付番）の重鎖アミノ酸はDKSからなる。

ある実施態様において、VHドメインのアミノ酸配列は配列番号：3に記載の配列からなる。

ある実施態様において、VLドメインのアミノ酸配列は配列番号：2に記載の配列からなる。

ある実施態様において、VHドメインは、配列番号：3に記載のアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含む。

ある実施態様において、VHドメインのアミノ酸配列は配列番号：3に記載の配列からなり、VLドメインのアミノ酸配列は配列番号：2に記載の配列からなる。

配列番号：3及び配列番号：2のアミノ酸配列を、表3に示す。配列番号：2は、Broteio Pharma B.V.に付与された米国特許第9,944,717号に開示されているヒト化5F2.4（BRO2）のVL（VK3）ドメインに対応する。また、表3に示す配列番号：28は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第9,944,717号に開示されているヒト化5F2.4（BRO2）のVH(VH4)ドメインに対応する。

（表3. VH及びVLドメイン）

ある実施態様において、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト抗体、特にヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4のCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含む。

ある実施態様において、抗体はヒトIgG1のCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含み、かつCH2ドメイン中に置換L234A及びL235Aを含む。

ある実施態様において、抗体はヒトIgG1のCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含み、かつCH3ドメイン中に置換H433K及びN434Fを含む。

ある実施態様において、抗体はヒトIgG1のCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含み、かつCH2ドメイン中に置換L234A及びL235Aを、並びにCH3ドメイン中に置換H433K及びN434Fを含む。

ある実施態様において、抗体はヒトIgG4のCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含む。ある実施態様において、抗体はヒトIgG4のCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含み、かつヒンジドメイン中に置換S228Pを含む。

ある実施態様において、抗体はヒトIgG4のCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含み、かつCH3ドメイン中に置換L445Pを含む。

ある実施態様において、抗体はヒトIgG4のCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含み、かつヒンジドメイン中に置換S228P、並びにCH3ドメイン中に置換L445Pの両方を含む。

ある実施態様において、抗体はヒトIgG4のCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含み、かつCH3ドメイン中に置換H433K及びN434Fを含む。

ある実施態様において、抗体はヒトIgG4のCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含み、かつヒンジドメイン中に置換S228Pを、並びにCH3ドメイン中に置換H433K及びN434Fを含む。

ある実施態様において、抗体はヒトIgG4のCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含み、かつCH3ドメイン中に置換H433K、N434F及びL445Pを含む。

ある実施態様において、抗体はヒトIgG4のCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含み、かつヒンジドメイン中に置換S228Pを、並びにCH3ドメイン中に置換H433K、N434F、及びL445Pを含む。

ある実施態様において、モノクローナル抗体は、ヒトIgG重鎖定常ドメインを含む。ある実施態様において、重鎖定常ドメインは、ヒトIgG1重鎖定常ドメインを含む。ある実施態様において、重鎖定常ドメインは、ヒトIgG1重鎖定常ドメインからなる。

ある実施態様において、重鎖定常ドメインは、配列番号：29に記載のアミノ酸配列を含むヒトIgG1重鎖定常ドメインを含む。ある実施態様において、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列は配列番号：29に記載の配列からなる。

ある実施態様において、重鎖定常ドメインは、配列番号：4に記載のアミノ酸配列を含むヒトIgG1重鎖定常ドメインを含む。ある実施態様において、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列は配列番号：4に記載の配列からなる。

ある実施態様において、重鎖定常ドメインは、ヒトIgG4重鎖定常ドメインを含む。ある実施態様において、重鎖定常ドメインは、ヒトIgG4重鎖定常ドメインからなる。

ある実施態様において、重鎖定常ドメインは、配列番号：30に記載のアミノ酸配列を含むヒトIgG4重鎖定常ドメインを含む。ある実施態様において、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列は配列番号：30に記載の配列からなる。

ある実施態様において、重鎖定常ドメインは、配列番号：31に記載のアミノ酸配列を含むヒトIgG4重鎖定常ドメインを含む。ある実施態様において、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列は配列番号：31に記載の配列からなる。

ある実施態様において、重鎖定常ドメインは、配列番号：5に記載のアミノ酸配列を含むヒトIgG4重鎖定常ドメインを含む。ある実施態様において、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列は配列番号：5に記載の配列からなる。

配列番号：4、5、及び29～31のアミノ酸配列を、表4に示す。

（表4. 重鎖定常ドメイン）

ある実施態様において、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、全長モノクローナル抗体からなる。

ある実施態様において、本明細書では、配列番号：32として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：32として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：7として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：7として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：32として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号：7として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：32として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号：7として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。

ある実施態様において、本明細書では、配列番号：6として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：6として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：7として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：7として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：6として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号：7として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：6として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号：7として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。

ある実施態様において、本明細書では、配列番号：33として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：33として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：33として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号：7として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：33として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号：7として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。

ある実施態様において、本明細書では、配列番号：34として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：34として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：34として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号：7として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：34として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号：7として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。

ある実施態様において、本明細書では、配列番号：8として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：8として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：8として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号：7として示すアミノ酸配列との少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様において、本明細書では、配列番号：8として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号：7として示すアミノ酸配列との100%の配列同一性を有する軽鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。

配列番号：6～8、及び32～34のアミノ酸配列を、表5に示す。

（表5.重鎖及び軽鎖）

抗体の重鎖及び/又は軽鎖が、参照配列に対する特定のパーセンテージの配列同一性によって定義されている実施態様について、重鎖及び/又は軽鎖は、参照配列中に存在するCDR配列と同一のCDR配列を保持し、その結果変化はCDR領域の外部にのみ存在し得る。

本願中別途言及されない限り、2つのアミノ酸配列間の配列同一性（%）は、最適な様式でアラインメントされた（該アラインメントにおいては、比較したいアミノ酸配列がこれら2つの配列間の最適なアラインメントのための参照配列と比較して付加又は欠失を含み得る）これら2つの配列を比較することによって、決定され得る。同一性のパーセンテージは、そこでの2つの配列間のアミノ酸残基が同一である同一位置の数を決定し、この同一位置の数を比較域中の位置の総数によって除し、かつこれら2つの配列間の同一性のパーセンテージを得るために、得られた結果に100を乗じることにより、計算する。例えば、BLASTプログラム、「BLAST2 sequences」（Tatusovaらの文献、「BLAST2 sequences―タンパク質及びヌクレオチドの配列を比較するための新規ツール（Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences）」 FEMS Microbiol Lett. 174:247-250）を使用して、用いるパラメータはデフォルトによって与えられる条件とし（特にパラメータ「オープンギャップペナルティ」：5及び「伸長ギャップペナルティ」：2、選択されるマトリックスを例えば、プログラムによって提案される「BLOSUM 62」マトリックスとして）比較したい2つの配列間の同一性のパーセンテージを、プログラムによって直接計算することが可能である。

非限定的な実施形態において、本発明の抗体はCH1ドメイン及び/又はCLドメイン（それぞれ重鎖及び軽鎖に由来する）を含み、そのアミノ酸配列は完全に又は実質的にヒトである。本発明の抗体又は抗原結合性断片がヒトの治療における使用を意図する抗体である場合、抗体の定常領域全体又は少なくともその一部が、完全に又は実質的にヒトのアミノ酸配列を有することが典型的である。従って、CLドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、及びCH4ドメイン（存在する場合）の1以上又は任意の組合わせは、そのアミノ酸配列に関して完全に又は実質的にヒトであり得る。

有利には、CLドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメイン（存在する場合）は、すべて完全に又は実質的にヒトのアミノ酸配列を有し得る。ヒト化抗体若しくはキメラ抗体の定常領域、又は抗体断片の文脈において、「実質的にヒト」という用語は、ヒト定常領域との少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を指す。この文脈における「ヒトアミノ酸配列」という用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を指し、該免疫グロブリン遺伝子には、生殖細胞系列遺伝子、再編成遺伝子、及び体細胞突然変異を起こした遺伝子がある。また、本発明は、ヒト配列に対して1以上のアミノ酸の付加、欠失、又は置換によって変化した「ヒト」配列の定常ドメインを含むポリペプチドを意図しているが、「完全ヒト」ヒンジ領域の存在が明らかに要求される場合の実施態様は除かれる。

本発明のC2結合抗体に「完全ヒト」ヒンジ領域が存在することは、免疫原性を最小限に抑えること、抗体の安定性を最適化することの双方にとって有益であり得る。

C2結合抗体は、Fc領域中で改変され、新生児Fc受容体FcRnへの結合親和性が増加し得る。酸性pH（例えば、およそpH 5.5～およそpH 6.0）での増加した結合親和性が測定可能である。また、増加した結合親和性は、中性pH（例えば、およそpH 6.9～およそpH 7.4）で測定可能である。この実施態様において、「結合親和性の増加」とは、未改変のFc領域の結合親和性に対するFcRnへの結合親和性の増加を意味する。典型的に、未改変のFc領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4の野生型アミノ酸配列を有する。そのような実施態様において、Fc領域を改変された抗体分子のFcRn結合親和性の増加は、FcRnの野生型IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4への結合親和性に対して測定される。

C2結合抗体は、Fc領域中で改変され、ヒト新生児Fc受容体FcRnへの結合親和性が増加し得る。酸性pH（例えば、およそpH 5.5～およそpH 6.0）での結合親和性の増加が測定可能である。また、結合親和性の増加は、中性pH（例えば、およそpH 6.9～およそpH 7.4）で測定可能である。この実施態様において、「結合親和性の増加」とは、未改変のFc領域の結合親和性に対するヒトFcRnへの結合親和性の増加を意味する。典型的に、未改変のFc領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4の野生型アミノ酸配列を有する。そのような実施態様において、Fc領域を改変された抗体分子のヒトFcRnとの結合親和性の増加は、ヒトFcRnの野生型IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4への結合親和性に対して測定される。

（医薬組成物）
本発明の一態様は、ヒト補体因子C2に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物であって、該モノクローナル抗体又はその断片が：
配列番号：1に記載のアミノ酸配列を含む、VHドメイン；及び
配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含む、VLドメインを含み、
ここでVHドメインのアミノ酸残基72-74（Kabat付番）はそれぞれX₁X₂X₃からなり、ここでX₂が任意のアミノ酸であり、かつX₁X₂X₃がNX₂SでもNX₂Tでもない、前記医薬組成物である。

本発明の医薬品組成物は、(「レミントン：製薬の科学と実践（Remington: The Science and Practice of Pharmacy）」, 第19版, Gennaro編, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1995)に開示されている技術などの従来技術に従って、医薬として許容し得る担体又は希釈剤、並びに任意の他の公知の補助剤及び賦形剤とともに製剤化することができる。

「医薬として許容し得る担体」という用語は、本質的に無毒である担体又は賦形剤に関する。そのような賦形剤の例には、これらに限定はされないが、生理食塩水、リンガー液、ブドウ糖溶液、及びハンクス溶液がある。固定油及びオレイン酸エチルなどの非水性賦形剤も使用することができる。

医薬組成物は典型的に、製造及び保管の条件下で無菌かつ安定していなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は薬物濃度を高くするのに好適な他の秩序立った構造として製剤化することができる。本発明の医薬組成物に利用され得る好適な水性及び非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがある。例えば、レシチンのようなコーティング物質の使用により、分散剤の場合必要とされる粒子サイズを維持することにより、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性を、維持することができる。

医薬組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤のような補助剤を含み得る。微生物の存在の予防は、滅菌手順と様々な抗菌薬及び抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの含有との双方により保証され得る。また、組成物中に糖、マンニトール、ソルビトール、グリセロールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムなどの等張化剤を含めることが、望ましい。医薬として許容し得る抗酸化剤、例えば(1) 水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等、(2) 油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロール等；及び(3) 金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等も含めることができる。

滅菌注射可能溶液を、適切な溶媒中の必要量のモノクローナル抗体を、必要に応じて例えば先に列挙したように1つの成分又は成分の組合わせと合わせることにより調製し、続いて滅菌マイクロろ過することができる。一般的には、分散剤は、活性化合物を基礎分散媒体及び例えば先に列挙したものから必要な他の成分を含む無菌のビヒクルと合わせることにより調製する。滅菌注射可能溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）であり、活性成分及びその予め滅菌ろ過した溶液から得た任意の追加の所望の成分の粉末を得る。

医薬組成物は、非経口的に、好ましくは静脈内（i.v.）又は皮下（s.c.）への注射又は注入により投与する。

本明細書で使用する「非経口投与」及び「非経口的に投与する」という句は、通常は経腸及び局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、限定はされないが、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、動脈内、髄膜内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、経気管、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内への注射及び注入を含む。

注射可能な抗C2 mAb又はその断片の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン塩やゼラチンを含めることでもたらされる。

mAb又はその断片は、化合物を急速放出から保護する担体と共に調製することができ、例えばインプラント、経皮パッチ、マイクロカプセル送達系を含む制御放出製剤などとする。生分解性、生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤の調製方法は、一般に当業者に公知である。例えば、「持続及び制御放出薬物送達系（Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems）」、J. R. Robinson編, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。

医薬組成物は、当該技術分野で公知の医療機器を用いて投与することができる。

投薬レジメンを調整して、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供する。例えば、単一のボーラスを投与し、いくつかの分割用量を経時的に投与し、治療状況の緊急度によって示されるように、用量を比例的に減少又は増加させることができる。

本発明の医薬組成物中のmAb又はその断片の実際の投薬レベルを変化させ、特定の患者に毒性を示すことなくその患者につき所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得る。

一実施態様において、本発明による結合分子、特に抗体は、週に1回10～500 mg/m²、例えば200～400 mg/m²の投薬量で注入により投与することができる。そのような投与は、1～8回、例えば3～5回反復することができる。投与は、1～24時間の期間、例えば2～12時間の期間にわたる、連続的な注入により実施することができる。いくつかの実施態様において、投与は、1以上のボーラス注射によって実施することができる。

一実施態様において、本発明による結合分子、特に抗体は、週に1回1～50 mg/kg体重(mg/kg)、例えば5～25 mg/kgの投薬量で注入により投与することができる。そのような投与は、例えば1～8回、例えば3～5回反復することができる。投与は、1～24時間の期間、例えば2～12時間の期間にわたる、連続的な注入により実施することができる。いくつかの実施態様において、投与は、1以上のボーラス注射によって実施することができる。

さらに別の実施態様において、本発明で開示するmAb若しくはその断片、又は任意の他の結合分子は、例えば6ヶ月以上の期間にわたり週に1回などの維持療法として投与することができる。

（核酸分子及びベクター）
本発明の一態様は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をコードする1又は複数の核酸分子である。ある実施態様において、単一の核酸分子は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のVH及びVLドメインの両方をコードする。ある実施態様において、単一の核酸分子は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の重鎖（HC）及び軽鎖（LC）の両方をコードする。ある実施態様において、第1の核酸分子が本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のVHドメインをコードし、第2の核酸分子が本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のVLドメインをコードする。ある実施態様において、第1の核酸分子は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の重鎖（HC）をコードし、第2の核酸分子は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の軽鎖（LC）をコードする。

ある実施態様において、VHドメインをコードする核酸分子は、配列番号：35に記載の核酸配列を含む。

ある実施態様において、VLドメインをコードする核酸分子は、配列番号：36に記載の核酸配列を含む。

ある実施態様において、HCをコードする核酸分子は、配列番号：37に記載の核酸配列を含む。

ある実施態様において、HCをコードする核酸分子は、配列番号：38に記載の核酸配列を含む。

ある実施態様において、HCをコードする核酸分子は、配列番号：39に記載の核酸配列を含む。

ある実施態様において、HCをコードする核酸分子は、配列番号：40に記載の核酸配列を含む。

ある実施態様において、HCをコードする核酸分子は、配列番号：41に記載の核酸配列を含む。

ある実施態様において、LCドメインをコードする核酸分子は、配列番号：42に記載の核酸配列を含む。

ある実施態様において、VHドメインをコードする核酸分子の核酸配列は、配列番号：35に記載の配列からなる。

ある実施態様において、VLドメインをコードする核酸分子の核酸配列は、配列番号：36に記載の配列からなる。

ある実施態様において、HCをコードする核酸分子の核酸配列は、配列番号：37に記載の配列からなる。

ある実施態様において、HCをコードする核酸分子の核酸配列は、配列番号：38に記載の配列からなる。

ある実施態様において、HCをコードする核酸分子の核酸配列は、配列番号：39に記載の配列からなる。

ある実施態様において、HCをコードする核酸分子の核酸配列は、配列番号：40に記載の配列からなる。

ある実施態様において、HCをコードする核酸分子の核酸配列は、配列番号：41に記載の配列からなる。

ある実施態様において、LCドメインをコードする核酸分子の核酸配列は、配列番号：42に記載の配列からなる。

配列番号：35～42に対応する核酸配列を、表6に示す。

（表6.VH、VL、HC、及びLCの核酸配列）

配列番号：35及び39について、a217gはN72D突然変異を生み出す。

本発明は、本発明による核酸分子を含む遺伝子送達ビヒクル又はベクターをさらに提供する。遺伝子送達ビヒクル又はベクターは、プラスミド又は他の細菌複製核酸であり得る。そのような遺伝子送達ビヒクル又はベクターは、例えばプロデューサ細胞に容易に導入することができる。遺伝子送達ビヒクルはまたウイルスベクターであり得る。好ましいウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターである。

本発明は、本発明による1又は複数の核酸分子を含むベクターをさらに提供する。ある実施態様において、単一のベクターは、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のVH及びVLドメインの両方をコードする単一の核酸分子を含む。ある実施態様において、単一のベクターは、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の重鎖（HC）及び軽鎖（LC）の両方をコードする単一の核酸分子を含む。

ある実施態様において、第1のベクターは本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のVHドメインをコードする第1の核酸分子を含み、第2のベクターは本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のVLドメインをコードする第2の核酸分子を含む。ある実施態様において、第1のベクターは、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の重鎖（HC）をコードする核酸分子を含み、第2のベクターは、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の軽鎖（LC）をコードする第2の核酸分子を含む。

本発明によるベクターは、宿主細胞によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の発現における使用に好適な発現ベクターを含む。宿主細胞には真核生物又は原核生物があり得る。

本発明は、本発明による抗体又はその抗原結合性断片をコードする1又は複数の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。あるいはさらに、本発明は、本発明による抗体又はその抗原結合性断片をコードする1又は複数のベクターを含む宿主細胞を提供する。1又は複数の核酸分子、又は同様に1又は複数のベクターを、例えば限定はされないが、形質導入、形質転換、トランスフェクション、及びインジェクションを含む任意の好適な技術を使用して宿主細胞に導入することができる。これらの方法の様々な形態が当技術分野で周知されており、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、細胞スクイージング、ソノポレーション、光学トランスフェクション、及び遺伝子銃がある。

ある実施態様において、宿主細胞は真核生物細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は酵母細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は昆虫細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。ある実施態様において、宿主細胞はヒト細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、NS0細胞、ヒト胎児腎（HEK293）細胞、及び PER.C6 （商標）細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞である。本発明は、これら上記の細胞に加え、他の宿主細胞も更に意図する。宿主細胞は、本発明による抗体及びその抗原結合性断片の商業生産用に開発された細胞株をさらに含む。

核酸を提供された細胞株は、研究室又は生産工場で結合分子/抗体を生産することができる。あるいは、核酸はそれを必要とする動物の体内の細胞に導入され、形質転換された細胞によって結合分子/抗体をインビボで生産する。本発明の核酸分子は典型的に、細胞内の結合分子を発現するための調節配列とともに提供される。しかしながら、現在の相同組換え技術は、はるかに効率的になっている。これらの技術は例えばヌクレアーゼ、例としてTALENを誘導する部位特異的二本鎖切断を用いる、二本鎖切断によって補助される相同性組換えを伴う。そのような類似の相同組換え系は、核酸分子を1以上のシスに要求される調節配列を提供する領域に挿入できる。

本発明はさらに、本発明による核酸分子又はベクターを含む単離若しくは組換え細胞、又はインビトロ細胞培養細胞を提供する。本発明はさらに、本発明による結合分子を含む単離若しくは組換え細胞、又はインビトロ細胞培養細胞を提供する。好ましくは前記細胞は前記結合分子を生産する。ある実施態様において、前記細胞は前記結合分子を分泌する。好ましい実施態様において、前記細胞はハイブリドーマ細胞、CHO細胞、NS0細胞、HEK293細胞、又はPER-C6（商標）細胞である。特に好ましい実施態様において、前記細胞はCHO細胞である。本発明による細胞を含む細胞培養をさらに提供する。様々な研究所及び企業が、例えば臨床用途のために、抗体の大規模生産のための細胞株を開発している。そのような細胞株の非限定的な例は、CHO細胞、NS0細胞、又はPER.C6（商標）細胞である。これらの細胞は、タンパク質の生産などの他の目的にも使用する。本明細書ではさらに、タンパク質及び抗体の工業的規模生産用に開発された細胞株を、工業用細胞株と称する。本発明は、本発明による核酸分子、結合分子、及び/又は抗体を含む工業用細胞株を提供する。また、本発明は、本発明の結合分子又は抗体を含むタンパク質及び/又は抗体の大規模生産用に開発された細胞株を提供する。本発明はまた、本発明の結合分子及び/又は抗体の大規模生産用に開発された細胞株の使用を提供する。

（抗体の作成方法）
本発明は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の製造方法であって、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の発現を可能にする条件下で、本発明による宿主細胞集団を培養することを含む、前記方法をさらに提供する。ある実施態様において、方法は、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を培養物から回収することをさらに含む。好ましくは、前記細胞は無血清培地で培養する。好ましくは、前記細胞は浮遊増殖に適応する。本発明による抗体を生産する方法で得られる抗体をさらに提供する。抗体は好ましくは培養培地から精製する。好ましくは、前記抗体はアフィニティー精製する。

（使用方法）
本発明の一態様は、対象における古典経路又はレクチン経路の活性化を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を投与することを含む、前記方法である。ある実施態様において、対象は、哺乳動物である。ある実施態様において、対象はマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、又はウシである。ある実施態様において、対象は非ヒト霊長類、例えばサルである。ある実施態様において、対象は、ヒトである。

抗体又は抗原結合性断片の阻害効果は、例えば、全補体活性の測定、血清試料が抗ヒツジ抗体でコーティングされたヒツジ赤血球を溶解する能力に基づく溶血活性の試験を含む、任意の好適な方法を用いて評価することができる。未処理の対照試料と比較した溶血の減少は、抗体又は抗原結合性断片の阻害効果を示している。一実施態様において、未処理の対照試料は、抗体又は抗原結合性断片による処理を開始する前に得た履歴試料（historical sample)であり得る。一般的に、対照と比較した全補体活性が少なくとも5%低下することは、有効であることを示す。ある実施態様において、対照と比較した全補体活性が少なくとも10%低下することは、有効であることを示している。

本発明による方法又はモノクローナル抗体若しくはその抗原結合性断片によって治療又は予防することができる疾患は、実験的アレルギー性神経炎、II型コラーゲン誘発性関節炎、重症筋無力症、溶血性貧血、糸球体腎炎、特発性膜性腎症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、免疫複合性血管炎などの自己免疫性疾患、成人呼吸窮迫症候群、脳卒中、異種移植、同種移植、多発性硬化症、火傷、体外透析及び血液酸素化、敗血症及び敗血症性ショックを含む炎症性障害、サイトカイン又はmAbのインビボ投与により誘発される毒性、腎移植片などの同種移植片の抗体媒介性拒絶反応、多発外傷、虚血再灌流傷害、並びに心筋梗塞である。

補体媒介性損傷を伴う疾患に罹患する個体、又はそのような補体媒介性損傷の発症リスクにさらされている個体は、それを必要とする個体へ本発明による有効量のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を投与することにより治療することができる。その結果、個体体内の生物活性を有する補体由来ペプチドは減少し、細胞及び組織に対する補体の溶解作用及び他の傷害作用は減少し、又は防止される。「有効量」とは、所望の生物学的反応を達成するのに十分な量を意味する。一実施態様において、「有効量」とは、個体体内における補体活性化を阻害することが可能な本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の量を意味する。

治療（予防的又は療法的）は、一般に本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、医薬担体と一緒に非経口的に、例えば静脈内、皮下、又は局所に投与することからなる。投与は典型的に、注射又は注入によって果たすことができる。本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の用量及び投与レジメンは、目的とする補体活性化の阻害の程度によって異なる。典型的に、本発明のモノクローナル抗体について、量は体重1 kgあたり2～20 mgの範囲である。非経口投与のために、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、医薬として許容し得る非経口ビヒクルと組み合わせた注射可能な形態で製剤化する。そのようなビヒクルは当技術分野で周知されており、例として、生理食塩水、ブドウ糖溶液、リンガー溶液、及び少量のヒト血清アルブミンを含む溶液がある。

医薬組成物は典型的に、製造及び保管の条件下で無菌かつ安定していなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は薬物濃度を高くするのに好適な他の秩序立った構造として製剤化することができる。本発明の医薬組成物に利用され得る好適な水性及び非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがある。例えば、レシチンのようなコーティング物質の使用により、分散剤の場合必要とされる粒子サイズを維持することにより、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性を、維持することができる。

医薬組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤のような補助剤を含み得る。微生物の存在の予防は、滅菌手順と様々な抗菌薬及び抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの含有との双方により保証され得る。また、組成物中に糖、マンニトール、ソルビトール、グリセロールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムなどの等張化剤を含めることが、望ましい。医薬として許容し得る抗酸化剤、例えば(1) 水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等、(2) 油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、α- トコフェロール等；及び(3) 金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等も含めることができる。

滅菌注射可能溶液を、適切な溶媒中の必要量のmAb又はその断片を、必要に応じて例えば先に列挙したように1つの成分又は成分の組合わせと合わせ、続いて滅菌マイクロろ過することにより、調製することができる。一般的には、分散剤は、活性化合物を基礎分散媒体及び例えば先に列挙したものから必要な他の成分を含む無菌のビヒクルと合わせることにより調製する。滅菌注射可能溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）であり、活性成分及びその以前に滅菌ろ過した溶液から得た任意の追加の所望の成分の粉末を得る。

mAb又はその断片は、化合物を急速放出から保護する担体と共に調製することができ、例えばインプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル送達系を含む制御放出製剤とする。生分解性、生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤の調製方法は、一般に当業者に公知である。例えば、「持続及び制御放出薬物送達系（Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems）」、J. R. Robinson編, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。

一実施態様において、本発明によるモノクローナル抗体は、週に1回10～500 mg/m²、例えば200～400 mg/m²の投薬量で注入により投与することができる。そのような投与は、例えば1～8回、例えば3～5回反復することができる。投与は、2～24時間、例えば2～12時間の期間にわたる、連続的な注入により実施することができる。

本発明は、特に有利な実施態様を示す以下の実施例を参照して例証する。しかしながら、これらの実施態様は単なる例証であり、いかなる方法においても本発明を制限するように解釈されるものではないことに留意すべきである。

（実施例）
（実施例1：抗C2bモノクローナル抗体からのグリコシル化部位の除去）
（BRO2-glyc-IgG4）
米国特許第9,944,717号には、マウス抑制性抗C2bモノクローナル抗体（mAb）が開示されている。このリードから、異なる重鎖可変ドメイン（VH1、VH2、VH3、又はVH4）及びκ軽鎖可変ドメイン（VK1、VK2、VK3、又はVK4）を含む4つのヒト化バリアントを、Antitope Ltd （Cambridge、UK）の複合ヒト抗体（Composite Human Antibody）技術を使用して作製した。インシリコ解析に基づき、ヒト化VH及びVKの各配列に対する免疫原性のリスクを予測した。表7に示すように、VH4をVK3又はVK4と対にすると、免疫原性のリスクが最も低く、それとともに最も近縁のヒト生殖細胞系列バリアントとの同一性のパーセンテージが最も高くなることが予測された。この観察結果は、ヒトMHCクラスIIに対する無差別的結合ペプチドの数が最小であったことに基づく。最も近縁のヒト生殖細胞系列に対するその同一性のパーセンテージが比較的高いため、VH4が好ましい。さらに、結合及び効力に基づいて、VH4/VK3を抗ヒトC2bヒト化リード抗体として選択した。これを本明細書ではBRO2-glyc-IgG4と称する。

（表7.1（＝最低）から5（＝最高）に順位付けされた免疫原性のリスク（中程度の親和性よりも高い親和性を優先）及び最も近縁なヒト生殖細胞系列との配列同一性）

BRO2-glyc-IgG4のバリアントのSDS-PAGE分析により、VH3及びVH4のバリアントに二重バンド及びバンドシフトがあることが明らかとなった。このシフトは、VH3及びVH4のフレームワーク領域3（FR3）の残基72-74（Kabat付番）にある潜在的グリコシル化部位（モチーフNXS）に起因すると仮定した。この潜在的グリコシル化部位により、哺乳動物細胞株から発現される抗体産物が不均一となるだけでなく、抗体機能も不均一となる可能性があったため、潜在的グリコシル化部位は除去した。グリコシル化部位は、部位指定突然変異誘発を用いてVHのN72Dバリアント（本明細書ではVH3.2又はVH4.2と称する）を作製することにより除去した。N72D突然変異により、VH3及びVH4で観察されたバンドパターンの変化が除去された（図1)。これにより、二重バンド及びバンドシフトが、重鎖のグリコシル化及び不均一性によって引き起こされたことが確認された。

BRO2-glyc-IgG4と同一のVHであるが、FR3中にグリコシル化部位を有さないバリアントVH4.2が、不均一にグリコシル化された親mAb BRO2-glyc-IgG4と比較して特性の改善を示すかどうかをさらに決定するため、各抗体の熱耐性を決定した。

熱耐性試験のため、サーモサイクラー（Biometra）を用いた55℃から最大75℃までの温度上昇により、ヒト化バリアントを処理した。残留結合能を、Biacore 3000上、血清から精製したヒトC2（3500 RU、Complement Technologies Cat#A112, lot#20）を直接コーティングしたCM5チップ表面で分析した。データは、BIAevaluationソフトウェアを使用して分析した。各バリアントの特異的結合の傾きは、BIAevaluationソフトウェアの、センサグラムの線形相からの一般的フィッティング（注入開始から 5 秒後に開始され、11秒後に停止した）により決定した。続いて、4℃の温度での活性を100%として、59℃、56.9℃、55℃の温度で得た傾きの平均値を使用して、活性のパーセンテージを計算した。最後に、活性のパーセンテージをGraphPad Prismでプロットした（対数（アゴニスト）対反応、可変スロープ（4パラメータ））。抗体がその結合能の50%を失った温度（TM50）を以下の表 8 に示す。

（BRO2-IgG4）
BRO2-glyc-IgG4に存在するグリコシル化部位を有さない両バリアントは、耐熱性が改善されたことを示した（表8）。BRO2-glyc-IgG4は、64.0℃のTM50を示した。VH4.2/VK3（本明細書ではBRO2-IgG4とも称する）は、2回の独立した実験で65.0又は65.1℃のTM50を示した。VH4.2/VK4は、2 回の独立した実験で65.2又は65.4℃のTM50を示した。

（表8.抗C2bモノクローナル抗体の最も近縁なヒト生殖細胞系列配列に対する同一性の割合及び熱耐性）

（実施例2：非グリコシル化IgG4及び非グリコシル化IgG1バリアントの調製）
（BRO2-IgG4-NH）
pH依存的抗原結合を有する抗体は、細胞への内部移行後、酸性エンドソーム中で結合した抗原を解離させる。その結果、放出された抗原はリソソームに輸送されて分解される一方、抗原と結合していない解離抗体はFcRnによって血漿に戻りリサイクルされる。リサイクルされた遊離抗体は別の標的抗原と結合することができる。このサイクルを繰り返すことで、pH依存的抗原結合抗体は標的抗原に複数回結合し、従って抗体の中和能が改善され得る。抗体が、酸性エンドソームpH（pH 6.0）では抗体のFcRnとの結合を強化し、中性pH（pH 7.4）では強化しないNHance（登録商標）（NH）技術（argenx, Belgium）で準備されている場合、このプロセスはさらに改善され得る。従って、BRO2-IgG4のFc領域のアミノ酸を突然変異させ、FcRnとのpH依存的結合性を変化させた（H433K、N434F）。結果として得られる抗体を、本明細書においてBRO2-IgG4-NHと称する。

（BRO2-IgG1-NH及びBRO2-IgG1-LALA-NH (ARGX-117)）
免疫グロブリンサブクラスによる効力への影響についても調べた。さらに NHance（登録商標）バリアントを、ヒトIgG1バックグラウンド（BRO2-IgG1-NH）において調製した。抗体エフェクター機能は、抗体のFcγ受容体との結合性を変化させるFc領域での突然変異によりさらに減少させることができる。従って、アミノ酸置換L234A及びL235A（「LALA」）をBRO2-IgG1-NHに組み込んで、BRO2-IgG1-LALA-NH（本明細書ではARGX-117とも称する）を得た。

（His1-IgG1-LALA-NH）
BRO2-IgG1-LALA-NHのpH依存性を改善して、インビボでのその薬物動態及び薬力学（PK/PD）効果を拡張できるかどうかを決定するため、 BRO2-IgG1-LALA-NH抗体のVK中のアミノ酸をヒスチジンに突然変異させた（G29H突然変異体VK、本明細書ではVk3m3と称する）。結果として得られる抗体を、本明細書においてHis1-IgG1-LALA-NHと称する。

（His1-IgG4）
同様に、BRO2-IgG4のpH依存性を改善して、インビボでのそのPK/PD効果を拡張できるかどうかを決定するため、 BRO2-IgG4抗体のVK中のアミノ酸をヒスチジンに突然変異させた（G29H突然変異体VK、本明細書ではVk3m3と称する）。結果として得られる抗体（VH4.2/Vk3m3）を、本明細書においてHis1-IgG4と称する。

（His1-IgG4-NH）
リサイクルによる抗体の効力への影響を調べるため、NHance（登録商標）突然変異をHis1-IgG4（VH4.2/Vk3m3）抗体に組み込んだ。結果として得られる抗体を、本明細書においてHis1-IgG4-NHと称する。

（His2-IgG4-NH）
BRO2-IgG4-NHのpH依存性を改善して、インビボでのそのPK/PD効果を拡張できるかどうかを決定するため、 BRO2-IgG4-NH抗体のVH4のアミノ酸をヒスチジンに突然変異させた（K26H VH突然変異体、本明細書ではVH4.2m12と称する）。さらに、BRO2-IgG4-NH抗体のVK3軽鎖を上記のVK4軽鎖に置き換えて、第2のアミノ酸をヒスチジンに突然変異させた（G29H、VK4突然変異体、本明細書ではVK4m3と称する）。結果として得られる抗体（VH4.2m12/VK4m3）を、本明細書においてHis2-IgG4-NHと称する。

（実施例3：非グリコシル化BRO2バリアントにおける効力の改善）
（全薬物動態（PK））
カニクイザル(n=2、群当たり1頭の雄及び1頭の雌) をランダムに割り当てて、下記の表9に従い、別個の治療群に分けた。

（表9.治療群の割り当て）

試験抗体の投与の1日前に（第-1日又は「前」）、各サルから血清試料を取得した。続いて第1日（d1）に、表9に従い各サルに5 mg/kgの試験抗体の単回静脈注射を行った。続いて、最大60日間にわたり（d60まで）連続的に、各サルから血清試料を取得した。

全抗体のPK（全PK）について、マイクロタイタープレートを100 μLの5 μg/mLヤギ抗ヒトIgG（Bethyl；A80-319A）により4℃で一晩コーティングした。プレートを少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20で3回洗浄し、続いて200 μL PBS-2% BSAにより室温(RT)で2時間ブロッキングした。少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20でプレートを3回洗浄した後、血清試料、標準、 QC試料（プールされた未処理のカニクイザル血清中で調製）を 100倍希釈以上にして二連で適用し、これを100 μL PBS-0.2% BSA-1%プールされた未処理カニクイザル血清で希釈した。各抗体について、それら特有の凍結標準及びQC試料を二連で適用した（サルに注射したバッチと同じバッチの抗体を使用した）。陰性対照抗体は、非C2補体成分と結合する抗体である。プレートを振盪しながら、インキュベーションをRTで2時間行った。プレートを少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20で5回洗浄した後、100 μLのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）-標識マウス抗ヒトIgGκ（Southern Biotech、9230-05）を PBS 0.2% BSAで260,000倍希釈し、ウェルに適用し、RTで1時間置いた。プレートを少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20で5回洗浄し、100 μL 3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB)を用いた染色を行い、100 μL 0.5 M H₂SO₄（CHEM LAB, Cat#CL05-2615-1000）で10分後に停止させた。450 nmでのODを測定し、GraphPad Prismを使用して試料濃度を逆算した（それぞれについてそれ特有の標準を使用）。

結果を表10に示す。グリコシル化BRO2-glyc-IgG4の非グリコシル化BRO2-IgG4との比較を図2に示す。全PKアッセイにおいて、非グリコシル化BRO2-IgG4の濃度は一般に、グリコシル化BRO2-glyc-IgG4の濃度よりも高くなった。この全PKの改善は全く予期し得なかったものであり、非グリコシル化抗体のさらなる重要な利点となる。

（表10.全PK）

（遊離C2）
カニクイザル(n=2、群当たり1頭の雄及び1頭の雌) に、上記のように5 mg/kgの試験抗体を単回静脈注射した。

このアッセイにおいて、100 μLの2.5 μg/mLマウス抗ヒトC2モノクローナル抗体mAb32（抗C2 #32 m-IgG@3.31 mg/mL、0.2 μm PBS、LC-12/05-166、12-apr-13）を用いて、マイクロタイタープレートを4℃で一晩コーティングした。この抗体は、C2のBRO2とは異なるエピトープに結合する。プレートを少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20で3回洗浄し、続いて200 μL PBS-2% BSA (pH 7.4)により室温(RT)で2時間ブロッキングした。一方、試料、凍結標準（各抗体に特異的、プールされた未処理のカニクイザル血清中で調製）、及び凍結QC試料（プールされた未処理のカニクイザル血清中で調製）を解凍し、80 μL PBS-0.2% BSAで6.7倍に希釈した。40 μLのビオチン化抗C2 VH4/VK3を0.6 μg/mLで追加した。各試料は二連で作製した。100 μLの混合物は、ビオチン化抗体を加えた後、すぐに洗浄したコーティングプレートに移した。プレートはRTで2時間インキュベートし、少なくとも200 μLのPBS-0.02% Tween20で5回洗浄し、PBS-0.2% BSAで300,000倍希釈した100 μL strep-HRP（Jackson、016-030-084）を加えた。RTで1時間インキュベートした後、プレートを少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20で5回洗浄し、100 μL TMB(Calbiochem, CL07)を用いた染色を行い、100 μL 0.5 M H₂SO₄（CHEM LAB, Cat#CL05-2615-1000）で10分後に停止させた。450 nmでのODを測定し、これを用いてC2のレベルを決定した。

以下のサルから得た血清はまず、異なる日に行った遊離C2アッセイを用いて一緒に試験した：サル1及び2；サル3及び4；サル5及び6、サル7、8、9、及び10；サル11、12、15、及び16；並びにサル13、14、17、及び18。

全てのサルの遊離C2のレベルを図3A～３I及び表11に示す。

サル3及び4には陰性対照抗体を投与していたため、予想通り、これらのサルについては、遊離C2の減少はなかった。BRO2バリアントを用いて処置した全てのサルについて、第2日までは遊離C2のレベルは非常に低かった。

BRO2-glyc-IgG4（サル1及び2）並びにBRO2-IgG4（サル5及び6）を与えたサルについては、C2のレベルは第4日から復帰し始め、第31日までにベースラインレベルまで復帰した。非グリコシル化抗体で処置したサル5及び6は、一貫してBRO2-glyc-IgG4で処置したサルよりも低い遊離C2レベルを示した（図3C、表11）。

抗薬物抗体（ADA、図3D～3I中*のマークで示す）を用いたサルを除いて、他のサルは全て、C2レベルはずっとゆっくりと上昇し、第31日まででさえもC2レベルはベースラインには戻らなかった。

図4は、各群の2頭のサルの遊離C2レベル（OD 450 nm）の平均の立ち上がり（対数スケール）を示す。BRO2バリアントに対する遊離C2レベルは、His1バリアントに対するよりも低くなった。

BRO2-IgG1-LALA-NH（ARGX-117）を注射したサル10は、試験した全ての時点で最低のC2レベルを有していた。サル5及び6、9及び10、並びに15及び16から得た60日間の遊離C2レベルの比較結果を、図5に見ることができる。サル10はまた、全PKも最高であった(上記参照)。生データを表11に示す。グリコシル化バリアント及び非グリコシル化バリアントを比較した平均データを表12に示す。

（表11.全ての抗体に対する遊離C2（OD450nm））

（表12.グリコシル化抗体及び非グリコシル化抗体の平均遊離C2）

これらの上記異なるサルのアッセイは異なる日に実行したため、選択した数の時点（前、4時間、第1、2、4、11、及び27日）での分析を、全てのサルから得た血清を単一のプレート上にとって反復した（図6A～6D）。「前」試料も、過剰のBRO2（500 μg/mL）を加えた場合と加えない場合で試験した。

「前」試料のODは全てのサルについて同等であり、異なるサルにおける遊離C2レベルが同等であったことを示していた（図6A）。「前」試料を500 μg/mLのBRO2でプレインキュベートすると、全てのシグナルが0.013～0.015のODまで低下した（図6A及び6B）。そのような低いOD値は、いずれのPK試料についても得られず、いずれの時点においても遊離C2は完全には除去されていないことが示された。最低レベルは4時間で得られ、それらはBRO2バリアントについて最低であった（ODが0.02～0.03）（サル5、6、7、8、9、及び10、図6C）。第11日及び第27日の結果の解釈は、ADA（抗薬物抗体）によって阻止され、このことは数頭のサルで観察された（図6Ｄ）。

（免疫原性）
カニクイザル(n=2、群当たり1頭の雄及び1頭の雌) に、上記のように5 mg/kgの試験抗体を単回静脈注射した。全てのサルから得た血清試料は、ベースライン（曝露前）から第31日までの間にADA（抗薬物抗体）について試験した（図7A～7P）。サル5及び6、9及び10、並びに15及び16から得た血清試料は、第59日までさらに試験した（図8A～8F）。

免疫原性は、1 μg/mLのそれぞれの抗体100 μLによりマイクロタイタープレートを4℃で一晩コーティングすることにより決定した。プレートを少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20で3回洗浄し、続いて200 μL PBS-1%カゼインを用いてRTで2時間ブロッキングした。少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20でプレートを3回洗浄した後、血清試料を100 μL PBS-0.1%カゼイン中20倍以上に希釈し、コーティングしたウェル中室温(RT)で2時間インキュベートした。プレートを少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20で5回洗浄した後、100 μLの8000倍希釈した抗サルIgG-HRP（Southern Biotech#4700-05）をウェルに追加し、RTで1時間置いた。プレートを少なくとも200 μLのPBS-0.05% Tween20で5回洗浄し、100 μL TMBを用いた染色を行い、100 μL 0.5 M H₂SO₄（CHEM LAB, Cat#CL05-2615-1000）で10分後に停止させた。450 nmでのODを測定した。代表的な結果を図7A～7Pに示す。

サル8（BRO2-IgG4-NH）、11（His1-IgG4）、13及び14（His1-IgG4-NH）、並びに16（His1-IgG1-LALA-NH）について、明確なADA反応が観察された（それぞれ図7F、7I、7K及び7L、並びに7N）。実に、抗体注射後のELISAで得られたシグナルは、ベースライン（「前」）シグナル（抗体注射前）と比較して、少なくとも2倍高かった。

サル11、13、及び16（それぞれ図7I、7K、及び7N）については第11日に；サル8（図7F）については第15日に；及びサル14（図7L）については第19日に、ADAが観察された。

サル9（BRO2-IgG1-LALA-NH）（図7G）については、抗体の注射後に全ての試料でシグナルの増加が観察されたが、ベースライン試料でのシグナルは既に高く、経時的な増加は小さかった（約1.5倍）。

サル5(図7C）については、抗体を注射する前から、ベースライン試料において異常に高いシグナルが観察された。また、このシグナルは、後の時点におけるシグナルよりも高かった。このことは、アッセイに伴う抗体（血清中に存在）の干渉によって説明することができる。従って、このサルでADA反応があったかどうかを決定することはできなかった。

（実施例4：等電位点（pI））
あるIgG1モノクローナル抗体のVH突然変異体を調べたIgawaらの文献（Protein Eng Des Sel 2010, 23(5):385-392）では、等電点（pI）及びモノクローナル抗体クリアランスの間に強い正の相関があり、かつpI及びモノクローナル抗体半減期の間に負の相関があることが報告された。本実施例においては、様々な形態の抗ヒトC2bのpIを決定した。結果を表13に示す。

（表13.抗ヒトC2bモノクローナル抗体の見かけのpI）

試験した3つの抗体はすべて、VHにグリコシル化を有さない。表13に示すように、ARGX-117のpIは、密接に関連するIgG4抗体のpIよりも有意に高いことが見いだされた。ARGX-117について観察されたpIは、いわゆる抗原スイーピングの潜在性が増強されたことを明示していると予想される。

（実施例5：ウェスタンブロッティング及び表面プラズモン共鳴（SPR）分析によるドメインマッピング）
図1に示すように、ARGX-117の結合特性を、ウェスタンブロッティング及び表面プラズモン共鳴（SPR）分析によって評価した。ウェスタンブロッティングの結果から、図9Aに示すように、ARGX-117はC2及びC2bと結合することが明らかになった。ARGX-117の結合特性を、図9Bに示すように、Biacore 300を用いたSPRによって、固相にC2（配列番号：21）をコーティングし、様々な濃度のARGX-117のFabを溶離液として用いて、さらに調べた。Fab及びC2の間の結合が1:1であると仮定して親和性を計算し、約0.3 nMというKdを得た。ARGX-117による作用機序を調べるため、図9Cに示すように、ストレプトアビジンでコーティングしたチップに固定化したビオチン化C4を用いて、C3変換酵素（C4bC2a）の形成を模倣したSPR分析を実施した。C2を単独で、又は対照mAbによりプレインキュベートした後でフローバッファーに追加すると、チップ上でC2の結合が観察された。抗C2クローン63（すなわち抗C2-63）を用いたプレインキュベーションを行うと、シグナルが強くなった。これはおそらく、このmAb形態がC2との複合体を形成し、かつC2：ｍAb複合体が一つに結合して分子量の増加及びSPRシグナルの増加をもたらしたためであろう。C2をARGX-117とともにプレインキュベートすると、C2のC4bとの結合が大きく低下した。C2のC4bとの最初の相互作用は、C2bドメイン（配列番号：44）によって開始すると考えられる。その後、大きなC2aドメイン（配列番号：43）がこれに代わり、この相互作用はC3変換酵素複合体の形成において極めて重要となる。この実験の結果から、ARGX-117はC4bとの結合を阻害することにより、C2を阻害することが示唆される。

ARGX-117によるC2の阻害の作用機序をさらに理解するために、まずC2をストレプトアビジンチップ上に固定化されたC4bと結合させ、フロー緩衝液単独によって安定化させた後、図9Dに示すように、試料を流した。実行緩衝液又は無関係の可溶性抗原を標的とする対照ヒトIgG4 mAb（すなわち、抗第XI因子（抗FXI））はいく分かのシグナルの低下をもたらし、これは注入が終わった後正規化した。抗C2-63を注入するとシグナルが増加し、このmAbがC3変換酵素（C4bC2a）に結合できることが示唆される。このことは、C2のC4bとの予測結合モデルと整合する。このことから、C2と結合した後も、C2aドメインは依然概して利用可能であることが示唆される。興味深いことに、ARGX-117はC3変換酵素との強い結合を示し、その後急速に解離した。これらの結果はARGX-117はC2と結合できるが、この結合は非常に不安定であり、活性化を促進するようにC2に影響を及ぼす可能性が高いことを示唆している。これらの結果はまた、ARGX-117がC2分子からC2bと一緒に放出されることを示唆する。

（実施例6：C2及び因子Bのドメインスワップ突然変異体を使用するドメインマッピング）
抗C2-5F2.4のエピトープをマッピングするために、抗C2-5F2.4が因子B（FB、配列番号：50）と交叉反応せず、かつC2及びFBは類似したドメイン構造を有する高度に相同なタンパク質であるという事実を利用した。これらのタンパク質は両方とも小断片と大断片を含む。補体C2の小断片をC2b（配列番号：44）と呼び、因子Bの小断片をFBa（配列番号：51）と呼ぶ。各々の小断片は、3つのSushi（CCPドメイン）を含む。図10に示すように、各々の大断片は、フォン・ウィルブランド因子A型ドメイン（VWFA）及びペプチダーゼS1ドメインを含む。ドメインスワップ突然変異体には、C末端FLAGタグを含めた。

様々なスワップ突然変異体を作製するために、C2、FB、及び10個のドメインスワップ突然変異体のDNAコンストラクトをGenScriptから取得した。DNAをコンピテント大腸菌（E. coli）細胞（ThermoFisher）に熱ショック形質転換した。細胞を寒天プレート上にストリークし、37℃で16時間増殖させた。200 mL LB（Luria Broth）培地のボトルを13本調製し（MP Bio）、オートクレーブした。300 μLのアンピシリン(100 mg/mL)を各ボトルに追加した。各コンストラクトについて、3 mL LB培地を用いて前培養を開始した。6時間後、前培養物をボトルに移し、37℃で16時間、撹拌しながら増殖させた。DNAは、製造業者の指示書に従いプラスミドDNA精製キット（MaxiPrep, NucleoBond PC 500, Macherey-Nagel）により細菌ペレットから精製し、TE緩衝液中に再構成した。プラスミドDNA濃度はNanoDropにより決定し、1 μg/μLに設定した。プラスミドの完全性は制限分析によって検証した。各コンストラクトにつき、1 μLプラスミドDNA及び9 μL制限酵素ミックス(PstI及びPvuII) を混合し、37℃で2時間インキュベートした。DNAを、Bio-Rad ChemiDoc MPシステムを使用して、100 Vで1% アガロースゲル上1時間泳動した後、分析した。ファインマッピング用のDNAコンストラクト（以下を参照）は同様に取り扱ったが、その完全性を配列決定法により確認した。

突然変異体タンパク質は、HEK293T細胞中の一過性トランスフェクションにより作製した。HEK細胞は、完全 DMEM (10% 胎仔ウシ血清(FCS)及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を補充したDMEM (Gibco)）中で培養した。トランスフェクションの1日前に、2つのフラスコの細胞を10 cm²の培養ディッシュ15個（Greiner Bio-One）に播種した。トランスフェクション前に、21 mLの空のDMEM培地を630 μLのポリエチレンイミン（P-Pei, Polysciences, Inc.）と混合した。対照として、空のプラスミドPF45 pcDNA3.1及びPF146 H2B GFPをトランスフェクションした。15 μgのプラスミドDNAを、エッペンドルフチューブ中の1500 μLの空培地-P-Peiミックスにおいて20分間インキュベートした。トランスフェクションミックスを慎重に細胞に加え、培地を上下にピペッティングすることによって混合した。8時間後、培地を15 mLの空培地に交換した。3日後、蛍光顕微鏡で細胞をGFPの発現について確認した。第4日に上清を回収し、0.22 μmフィルター（Sartorius）によりろ過滅菌し、Vivaspinカラム（Sartorius）で濃縮して、元の体積のおよそ1/3にした。ドメインスワップ突然変異体は30,000 MWCOカラムで濃縮し、ファインマッピング用のC2b突然変異体は10,000 MWCOカラムで濃縮した。全ての上清は-20℃で保存し、 SDS-PAGE 及び抗FLAGウェスタンブロットによっても分析した。

様々なコンストラクトの発現を確認するために、抗FLAGタグELISAアッセイを実施した。マイクロプレート（Maxisorp、NUNC、Cat#439454）は、PBSで5倍希釈した、又は希釈していない100 μLのHEK293T上清（それぞれ、ドメインスワップ突然変異体及びファインマッピング突然変異体用）により一晩コーティングした。PBS及び0.05% Tween-20で4 回洗浄した後、100 μL/ウェルのPBS及び0.1% Tween-20（PBST）中の1 μg/mL抗FLAG Ab（クローンM2、Sigma-Aldrich）を加えて、撹拌しながら室温（RT）で1時間インキュベートした。検出Abとして、 100 μL/ ウェルのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ヤギ抗マウスIgG（Santa Cruz Biotechnology、Cat# sc-2005、1000倍希釈）をPBSTに追加し、RTで1時間インキュベートした。最後の洗浄工程の後、100 μL/ウェルのTMB（Invitrogen、Cat#SB02）を基質として加え、100 μL/ウェルのHCl（Fischer、Cat#J/4320/15）により数分後に反応を停止し、450 nmでの吸光度を読み取った（BioRad、iMarkマイクロプレートリーダ）。

図11に示すように、C2-(FB-Pep1)を除く全ての突然変異体の上清中で抗FLAG ELISAによりタンパク質が検出された。突然変異体間のばらつきは、生産が異なること、又はコーティング後の抗FLAG mAbによる検出効率が異なることによって説明することができる。

次に、抗C2-5F2.4抗体によるスワップ突然変異体の認識を調べた。この趣旨で、マイクロプレート（Maxisorp, NUNC, Cat# 439454）を、100 μL PBS中の2 μg/mL抗C2-5F2.4により一晩コーティングした。プレートを0.05% Tween-20を含むPBSで4回洗浄し、200 μLの0.1% Tween-20及び1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBS（PBST-BSA）により、RTで1時間ブロッキングした。洗浄後、PBST-BSAで20倍希釈した突然変異体を含む100 μLの培養上清を加え、撹拌しながらRTで2時間インキュベートした。洗浄後、検出抗体としてPBST-BSA中の1 μg/mLビオチン標識抗FLAG（クローンM2、Sigma-Aldrich）を加え、RTで1時間おいた。プレートを洗浄し、1 μg/mLストレプトアビジン-PODコンジュゲート（Roche, Cat# 11089153001）を加え、暗所で30分間インキュベートした。プレートを洗浄し、100 μL/ウェルのTMB（Invitrogen、Cat#SB02）を基質として加え、100 μL/ウェルのHCl（Fischer、Cat#J/4320/15）により数分後に反応を停止した。450 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダ（BioRad、iMarkマイクロプレートリーダ）で測定した。

野生型C2は明確な結合を示し、補体C2 S2ドメイン（配列番号：46）が因子B S2ドメイン（配列番号：54）に置き換えられたC2-(FB-S2)についてのみ、結合の喪失が観察された。対照的に、図12に示すように、野生型FBとの結合は見られなかったが、因子B S2ドメイン（配列番号：54）が補体C2 S2ドメイン（配列番号：46）に置き換えられた突然変異体FB-(C2-S2)について強い結合が検出された。これらの結果は、抗C2-5F2.4がC2b上のS2（Sushiドメイン2）上のエピトープを認識することを明確に示す。また、この結果はC2-(FB-Pep1)が十分な量で生産されることを示す。マウスIgG2a抗C2-5F2.4を使用した場合も同様の結果を得た。さらに、緩衝液中の1.25 mM Ca++の存在下で結合を調べた場合も同様の結果を得た。ヒトC2及びマウスC2の間のドメインスワップ突然変異体を使用して実施されたBioceros BVによるエピトープマッピングも同様の結論に至っている。さらに、カニクイザルC2のSushiドメイン2のアミノ酸配列は、ヒトC2のSushiドメイン2と完全に同一である。

（実施例7：Sushiドメイン2中での抗C2-5F2.4のエピトープのファインマッピング）
抗C2-5F2.4は、マウスC2に交叉反応せず、マウスS2ドメイン（配列番号：58）は図13に示すように、ヒトS2ドメイン（配列番号：46）と10個のアミノ酸位置で異なる。これらの10個のアミノ酸のうちのいずれがmAbとの結合に寄与するかを調べるために、ファインマッピング突然変異体を作製した。ファインマッピングコンストラクトには、ヒトC2b断片（huC2b）、マウスS2を有するhuC2b （huC2b-mS2）、及び各々マウス配列からヒト配列への1アミノ酸逆突然変異を含む、10個の突然変異体を含めた。ドメインスワップ突然変異体に類似した突然変異体C2bタンパク質は、HEK293細胞への一過性トランスフェクションにより作製した。

図14に示すように、全ての突然変異体を生産し、抗FLAG ELISAによって検出した。予想した通り、抗C2-5F2.4はhuC2bとは結合したが、マウスS2を有するhuC2b（huC2b-mS2）とは結合しなかった。図15に示すように、いずれの復帰点突然変異も、抗C2-5F2.4との結合を回復せず、このことから、このmAbのエピトープが、S2 ドメイン上の少なくとも2つのアミノ酸から構成されていることが示唆される。緩衝液中の1.25 mM Ca++の存在下で結合を調べた場合も同様の結果を得た。

図16に示すように、一般に入手可能なヒトC2bの構造データを使用することにより、抗C2-5F2.4のエピトープに寄与する可能性のある10個のアミノ酸の位置を解析した。この解析から、各々エピトープに寄与し得る3つのアミノ酸から構成される、3つの可能性のあるクラスターが明らかとなった。これらのクラスター突然変異体のDNAコンストラクトを設計し、取得した。クラスター突然変異体は、ヒトC2b S2のアミノ酸を対応するマウスC2b S2のアミノ酸に突然変異させることにより作製した。各変異体において3つのアミノ酸を変化させた。これら3つのアミノ酸が抗C2-5F2.4のエピトープに寄与した場合、結合が喪失することが予想された。図17Aは、クラスター1突然変異体が十分に発現し、結合に影響がなく、従ってこれらのアミノ酸は結合に寄与しないことを示す。抗FLAG ELISAに基づいて、クラスター2の突然変異体の発現は低下し、これにより抗C2-5F2.4による結合が喪失した。クラスター3の突然変異体も十分に発現しておらず、このことが、図17Bに示されているように抗C2-5F2.4による結合の喪失の最も妥当な説明を与えるだろう。緩衝液中の1.25 mM Ca++の存在下で結合を調べた場合も同様の結果を得た。この解析から、クラスター1のアミノ酸を除外することができ、クラスター2及びクラスター3の4つの可能性あるアミノ酸に絞られる。

ドメインスワップ突然変異体は、C2上の抗C2-5F2.4で認識されるエピトープが、C2b上のSushiドメイン2にあることの説得力ある証拠を提供した。さらに、これらの実験より、FB上にそのドメインが存在することが、抗C2-5F2.4による認識に十分であることが示唆される。抗C2-5F2.4がマウスC2に反応しないことを考慮すると、ヒト及びマウスのSushi 2ドメイン間で異なる10個のアミノ酸のうちの1以上が、エピトープに不可欠であるはずである。単一アミノ酸逆突然変異を用いることにより、本発明者らはSushi 2中の単一のアミノ酸では結合を回復させることができないことを示す。クラスター突然変異体を用いて実施した実験から、クラスター1のアミノ酸は抗C2-5F2.4のエピトープに寄与しないと結論付けられた。クラスター2のアミノ酸は抗C2-5F2.4のエピトープに寄与する可能性があるが、この突然変異体の発現はクラスター1の突然変異体よりも低いため、クラスター2の突然変異体のフォールディングが最適化されなかったことを除外できない。クラスター3の突然変異体は十分に発現しなかったため、突然変異がフォールディングに影響を及ぼす可能性が高いと考えられ、クラスター3におけるアミノ酸の役割は依然としてはっきりとしない。

（参照による組み込み）
本明細書で引用する全ての刊行物及び特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
ヒト補体因子C2に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって：
配列番号：3に記載のアミノ酸配列を含む、VHドメイン；及び
配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含む、VLドメインを含む、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
（態様2）
全長モノクローナル抗体を含む、態様1記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
（態様3）
前記モノクローナル抗体が、ヒトIgG重鎖定常ドメインを含む、態様1又は2記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
（態様4）
前記重鎖定常ドメインが、ヒトIgG1重鎖定常ドメインを含む、態様3記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
（態様5）
前記ヒトIgG1重鎖定常ドメインが配列番号：4に記載のアミノ酸配列を含む、態様4記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
（態様6）
前記重鎖定常ドメインが、ヒトIgG4重鎖定常ドメインを含む、態様3記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
（態様7）
前記ヒトIgG4重鎖定常ドメインが配列番号：5に記載のアミノ酸配列を含む、態様6記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
（態様8）
前記モノクローナル抗体が、配列番号：6に記載のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：7に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、態様3記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
（態様9）
前記モノクローナル抗体が、配列番号：8に記載のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：7に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、態様3記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
（態様10）
ヒト補体因子C2に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物であって、該モノクローナル抗体又はその断片が：
配列番号：3に記載のアミノ酸配列を含む、VHドメイン；及び
配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含む、VLドメイン、を含む、前記医薬組成物。
（態様11）
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が、全長モノクローナル抗体を含む、態様10記載の医薬組成物。
（態様12）
前記モノクローナル抗体が、ヒトIgG重鎖定常ドメインを含む、態様10又は11記載の医薬組成物。
（態様13）
態様1～9のいずれか1項記載のモノクローナル抗体又は抗原結合性断片をコードする1又は複数の核酸分子。
（態様14）
態様13記載の1又は複数の核酸分子を含む、1又は複数のベクター。
（態様15）
態様13記載の1又は複数の核酸分子を含む、宿主細胞。
（態様16）
態様14記載の1又は複数のベクターを含む、宿主細胞。
（態様17）
前記宿主細胞が、哺乳動物細胞である、態様14～16のいずれか1項記載の宿主細胞。
（態様18）
モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を作製する方法であって：
該モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の発現に好適な条件下で、態様15～17のいずれか1項記載の宿主細胞の集団を培養すること；及び
該細胞から該モノクローナル抗体又は抗原結合性断片を単離すること、を含む、前記方法。
（態様19）
対象における補体活性化の古典経路を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の態様1～9のいずれか1項記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を投与することを含む、前記方法。
（態様20）
対象における補体活性化のレクチン経路を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の態様1～9のいずれか1項記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を投与することを含む、前記方法。
（態様21）
前記対象がヒトである、態様19又は20記載の方法。

Claims

ヒト補体因子C2に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって：
配列番号：3に記載のアミノ酸配列を含む、VHドメイン；及び
配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含む、VLドメインを含む、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
全長モノクローナル抗体を含む、請求項1記載のモノクローナル抗体。
前記モノクローナル抗体が、ヒトIgG重鎖定常ドメインを含む、請求項1又は2記載のモノクローナル抗体。
前記重鎖定常ドメインが、ヒトIgG1重鎖定常ドメインを含む、請求項3記載のモノクローナル抗体。
前記ヒトIgG1重鎖定常ドメインが配列番号：4に記載のアミノ酸配列を含む、請求項4記載のモノクローナル抗体。
前記重鎖定常ドメインが、ヒトIgG4重鎖定常ドメインを含む、請求項3記載のモノクローナル抗体。
前記ヒトIgG4重鎖定常ドメインが配列番号：5に記載のアミノ酸配列を含む、請求項6記載のモノクローナル抗体。
前記モノクローナル抗体が、配列番号：6に記載のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：7に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項3記載のモノクローナル抗体。
前記モノクローナル抗体が、配列番号：8に記載のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：7に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項3記載のモノクローナル抗体。
ヒト補体因子C2に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む医薬組成物であって、該モノクローナル抗体又はその断片が：
配列番号：3に記載のアミノ酸配列を含む、VHドメイン；及び
配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含む、VLドメイン、を含む、前記医薬組成物。
前記モノクローナル抗体が、全長モノクローナル抗体を含む、請求項10記載の医薬組成物。
前記モノクローナル抗体が、ヒトIgG重鎖定常ドメインを含む、請求項10又は11記載の医薬組成物。
請求項1記載のモノクローナル抗体又は抗原結合性断片又は請求項2～9のいずれか1項記載のモノクローナル抗体をコードする、1又は複数の核酸分子。
請求項13記載の1又は複数の核酸分子を含む、1又は複数のベクター。
請求項13記載の1又は複数の核酸分子を含む、宿主細胞。
請求項14記載の1又は複数のベクターを含む、宿主細胞。
前記宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請求項15又は16のいずれか1項記載の宿主細胞。
モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を作製する方法であって：
該モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の発現に好適な条件下で、請求項15～17のいずれか1項記載の宿主細胞の集団を培養すること；及び
該細胞から該モノクローナル抗体又は抗原結合性断片を単離すること、を含む、前記方法。
対象における補体活性化の古典経路を阻害するための医薬組成物であって、請求項1記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片又は請求項2～9のいずれか1項記載のモノクローナル抗体を含む、前記医薬組成物。
対象における補体活性化のレクチン経路を阻害するための医薬組成物であって、請求項1記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片又は請求項2～9のいずれか1項記載のモノクローナル抗体を含む、前記医薬組成物。
前記対象がヒトである、請求項19又は20記載の医薬組成物。