JP2005519917A - 軟骨分解の全身阻害のための組成物および方法 - Google Patents

軟骨分解の全身阻害のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

関節軟骨の分解を阻害するための方法および組成物。この組成物は、好ましくは、複数の軟骨保護剤（軟骨同化活性を促進する少なくとも１つの薬剤および軟骨異化を阻害する少なくとも１つの薬剤を含む）を含む。この組成物はまた、１つ以上の疼痛阻害剤および炎症阻害剤を含む。この組成物は、複数の関節における軟骨分解の危険を有する患者を処置するために、全身投与され得、そして関節に標的化されたキャリアまたは送達ビヒクル中に安定に処方され得る。あるいは、この組成物は、直接関節に注射または注入され得る。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００２年２月１日に出願された、米国仮出願番号６０／３５３，５５２からの優先権を主張し、そして２００２年１月１８日に出願された米国出願番号１０／０３１，５４６の一部継続出願であり、この出願は、米国を指定する２０００年７月２１日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ／００／１９８６４の米国の国内段階であり、これは、１９９９年７月２１日に出願された米国仮出願番号６０／１４４，９０４から優先権を主張し、そしてまた、２００１年４月２０日に出願された米国出願番号０９／８３９，６３３の一部継続出願であり、これは、米国を指定する、１９９９年１１月５日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２６３３０の一部継続出願であり、これは、１９９８年１１月５日に出願された米国仮出願番号６０／１０７，２５６号から優先権を主張し、そして米国を指定する１９９９年１０月２０日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２４６２５であり、これは、１９９８年１０月２０日に出願された米国仮出願番号６０／１０５，０２６から優先権を主張する。これらの優先権の利益は、これにより、米国特許法１１９条（ｅ）項および１２０条の元で主張される。
（発明の分野）
本発明は、関節軟骨の保護のための治療組成物および方法に関する。
（発明の背景）
関節内の軟骨の破壊を引き起こす疾患および状態は、特に老齢集団の人口統計の点で、有意な公衆衛生の問題を提起する。関節の関節軟骨は、多くの異なる分子の複雑な系を表す。複数の機構が、関節炎（例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）および変形性関節症（ＯＡ））における関節軟骨の破壊に関係する。ＯＡ（非炎症性関節炎）は、関節疾患の最も一般的な形態であり、早期退職および障害の原因として心血管障害に次ぐ。いくらかの個体は、単一の関節または限られた数の関節においてＯＡを示し、これは、例えば、事故または手術に起因した外傷性損傷から生じ得る。多くの他の個体は、加齢に関連するか、または長期にわたる運動競技活動もしくは職業活動に関連する摩耗および断裂に起因して、多種の関節においてＯＡに罹患する。ＲＡは、炎症性関節の最も一般的な形態であり、女性の３％および男性の１％が発症する。ＲＡ患者の大部分は、多種の関節（特に、手、肘、手首および肩の小さな関節）において症状を有する。
ヒアリン関節軟骨の破壊は、ＯＡの証明（ｈａｌｌｍａｒｋ）であり、ＲＡを無効（ｄｉｓａｂｌｉｎｇ）にする。種々の治療アプローチが症状の軽減を提供し得るものの、いずれの治療レジメンも、関節軟骨分解の進行を遅らせることを証明されてない。進行性の悪化および関節軟骨の損失は、関節の動きの不可逆な損傷をもたらす。軟骨におけるこれらの変化は、変形性関節症（ＯＡ）および慢性関節リウマチ（ＲＡ）に共通の最終的な病理的事象をである。
軟骨破壊性のプロセスはまた、関節の外科手順と関連し得るかまたは関節の外科手順によって開始され得る。関節鏡検査法は、遠隔光源とビデオモニターとに連結されたカメラを、上を覆う皮膚と関節包における小さな切開口を通して解剖学的関節（例えば膝、肩など）に挿入する外科的手順である。同様な切開口を通して、外科用機器を関節内に配置し得、その使用は関節鏡による映像化によって誘導される。関節鏡施術者の技術が進歩したので、かつて「開放」外科的技術によって実施されていた多くの操作手順が、現在では関節鏡により達成され得る。このような手順には、例えば、膝の部分的半月板切除術および靭帯再構築、肩の肩峰形成術および回旋筋腱板壊死組織切除法ならびに肘の滑膜切除術がある。外科適応の拡大および小径関節鏡開発の結果、手首および足首の関節鏡も慣用的になった。
各関節鏡検査法すべてを通して、生理的灌注液（例えば、通常の生理食塩水または乳酸加リンゲル液）が継続的に関節に流され、関節包を拡張すると共に手術による屑を除去し、それによって明瞭な関節内の画像を与える。Ｍａｒｓｈａｌｌに対する米国特許第４，５０４，４９３号は、関節鏡検査法用の非伝導性かつ光学的に透明な灌注液のための、水中グリセリンの等モル溶液を開示している。従来の生理的灌注液は、鎮痛効果、抗炎症効果、および抗軟骨分解効果を与えない。
（発明の要旨）
本発明は、２以上の代謝的に活性な軟骨保護（ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）剤の組合せを投与することによって、関節における関節軟骨の破壊を減少または予防するための、方法および溶液が提供される。代謝的に活性な薬剤としては、細胞の生物学的状態、生化学的状態、または生物物理学的状態を調節または変更するように、直接的または間接的に作用する化合物（原形質膜の電位、細胞性レセプターのリガンド結合もしくは酵素活性、細胞内もしくは細胞外に位置付けられた酵素、タンパク質−タンパク質相互作用、ＲＮＡ−タンパク質相互作用、またはＤＮＡ−タンパク質相互作用を変更する薬剤を含む）が挙げられるが、これに限定されない。本発明の１つの局面では、異なる分子標的に対して同時に作用する少なくとも２つの薬剤の組合せに基づいた、代謝的に活性な軟骨防御薬剤の薬学的組成物が提供される。
代表的な関節保護剤としては、例えば、以下が挙げられる：（１）例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７およびＩＬ−１８を含む、タンパク質のインターロイキン１ファミリーについてのレセプターのアンタゴニスト；（２）例えば、ＴＮＦ−Ｒ１を含む、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターファミリーのアンタゴニスト；（３）インターロイキン４レセプター、インターロイキン１０レセプターおよびインターロイキン１３レセプターについてのアゴニスト；（４）例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７を含む、ＴＧＦ−βレセプタースーパーファミリーについてのアゴニスト；（５）ＣＯＸ−２のインヒビター；（６）例えば、ｐ３８ＭＡＰキナーゼを含む、ＭＡＰキナーゼファミリーのインヒビター；（７）例えば、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９を含む、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのタンパク質のインヒビター；（８）例えば、ＩκＢとのｐ５０／ｐ６５ダイマー複合体を含む、ＮＦ−κＢファミリーのタンパク質のインヒビター；（９）例えば、ｉＮＯＳを含む、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）ファミリーのインヒビター；（１０）例えば、αvβ3インテグリンのアゴニストを含む、インテグリンレセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト；（１１）タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーのインヒビター；（１２）例えば、ｓｒｃサブファミリーを含む、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーのインヒビター；（１３）タンパク質チロシンホスファターゼのモジュレーター；および（１４）タンパク質ｓｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメインのインヒビター。さらなる軟骨保護剤としては、他の増殖因子（例えば、例として、インスリン様増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１）、および線維芽細胞増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ））が挙げられる。
好ましい実施形態において、少なくとも１つの薬剤は、サイトカインまたは増殖因子レセプターアゴニスト（これは、直接、抗炎症性活性を提供し、そして／または軟骨同化プロセスを促進し、本明細書中において、「同化性薬剤（ａｎａｂｏｌｉｃ ａｇｅｎｔ）」と呼ばれる）であり、そして少なくとも第２の薬剤は、レセプターアンタゴニストまたは酵素インヒビター（これは、軟骨同化プロセスを阻害し、そしてまた炎症促進プロセスを阻害し、本明細書中において、「軟骨同化のインヒビター」または「同化インヒビター剤」と呼ばれる）である。本明細書中において使用される場合、用語「軟骨保護剤」は、同化剤および軟骨以下のインヒビターの両方を含むことが意図される。
本発明のこの実施形態において、少なくとも第１の軟骨保護剤は、抗炎症性／同化サイトカインであり、これは、関節における炎症促進サイトカインの役割を抑制し、軟骨基質合成を促進し、そして基質破壊を阻害するように機能的に作用する。これらのレセプターアゴニストとしては、例えば、特定の抗炎症性および同化性サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ）アゴニスト（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３）およびトランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーの特定のメンバー（例えば、ＴＧＦβおよびＢＭＰ−７））、インシュリン様増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１）および線維芽細胞増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも第２の軟骨保護剤は、炎症促進分子標的の活性または発現を阻害および減少するように作用するレセプターアンタゴニストまたは酵素インヒビターを含む軟骨異化インヒビターのクラスから引き出された薬剤（例えば、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ＴＮＦ−αレセプターアンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター、ＭＡＰキナーゼインヒビター、酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）インヒビター、および核因子κＢ（ＮＦκＢ）インヒビター）である。第２の軟骨保護剤はまた、軟骨異化を阻害するマトリクスメタロプレテイナーゼのインヒビター、軟骨異化を阻害する細胞接着分子（インテグリンアゴニストおよびインテグリンアンタゴニストを含む）、軟骨異化を阻害する細胞内シグナル伝達インヒビター（プロテインキナーゼＣインヒビターおよびプロテインチロシンキナーゼインヒビターを含む）、軟骨異化を阻害するＳＨ２ドメインのインヒビターから選択され得る。
関節軟骨は、代謝的に活性な関節軟骨細胞によって生成され、そして維持される特定の細胞外基質である。正常で健康な細胞外基質の維持は、基質成分の生合成速度と取り込み速度との間、およびその分解速度と、その後の軟骨から滑液中への損失速度との間の動力学的平衡を反映する。基質ホメオスタシスの根底をなす調節機構は十分に理解されていないが、これらは明らかに、炎症性関節疾患において、そして関節外傷に応答して変更され、その結果、基質分解速度が、基質成分の新規合成速度を超える。基質ホメオスタシスは、一般的に、異化サイトカインの影響と同化性サイトカイン（増殖因子を含む）の影響との間の動力学的平衡を表すとみなされている。軟骨防御に有用な治療用薬剤の最適な組合せは、合成速度を加速させること、そして同時に、分解速度を抑制すること、このようにして、同化性プロセスを最大化し、そして修復を促進することを通して、動力学的基質平衡をシフトさせる。
異化サイトカイン（例えば、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α）は、軟骨細胞上の特定のレセプターで作用して、基質分解を誘導するＭＭＰの生成を誘導するが、この分解は、同化性サイトカイン（例えば、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、およびＩＧＦ−１）によって阻害される。従って、異化プロセスの阻害のみに基づく治療的アプローチ（例えば、ＭＭＰインヒビターとＩＬ−１アンタゴニストとの組合せ）は、軟骨修復のために最適ではない。なぜなら、基質生成のための成分の生合成およびアセンブリを誘導または加速するために、同化性薬剤が必要とされるからである。第２に、軟骨基質破壊に寄与する多種の同化性サイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＬＩＦ）は、これが、すべての異化サイトカイン活性をブロックするために実用的ではないことを示す。逆に、同化性薬剤（例えば、ＩＧＦ−１、ＢＭＰ−２、またはＢＭＰ−７）の使用のみに基づくアプローチは、最適ではない。なぜなら、これが、異化サイトカインの数を調節する役割を扱わないからである。ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、およびＩＧＦ−１はまた、特定のレセプターで作用して、軟骨細胞を誘導し、基質成分を生成する。これは、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７およびＬＩＦによって阻害される。従って、軟骨防御のための最適な治療的組合せは、少なくとも１つの同化性薬剤と１つの軟骨異化のインヒビターとから構成される。
本発明の１つの局面において、多種の軟骨保護剤が、関節軟骨分解の危険にある患者に全身経路を介して投与される。全身的に投与される多種の薬剤は、軟骨同化活性を促進する少なくとも１つの薬剤、および軟骨異化を阻害する少なくとも１つの薬剤を含む。各薬剤は、その溶液が、軟骨異化プロセスを阻害し、そして軟骨同化プロセスを促進するために患者の関節に送達される場合、治療的に有効である組合せを提供するのに十分な量で含まれる。さらに、疼痛および／または炎症を阻害するように作用する１つ以上の薬剤は、軟骨保護剤とともに投与され得る。多種の軟骨保護剤の全身投与は、患者が、多種の関節において、同時に、軟骨分解の危険にあるか、または変性疾患を罹患している場合に、好ましくあり得る。
本発明の全身送達実施形態の１つの局面において、有害なまたは望ましくない全身的な影響を最小にするために、治療ストラテジーは、関節に標的化されたキャリアまたは送達ビヒクル中の薬剤の組合せを送達することである。好ましい標的化実施形態において、少なくとも１つの同化軟骨保護剤および／または少なくとも１つの異化阻害性軟骨保護剤、好ましくは、同化軟骨保護剤および異化阻害性軟骨保護剤の両方が、送達ビヒクル（例えば、ナノスフェア）に結合される。抗体または抗体またはフラグメントは、関節内に局在化した、標的化された抗原決定基に特異的である。本発明の治療方法は、１つ以上の軟骨保護剤のこの標的化され、カプセル化された組成物を、軟骨分解の危険にある患者に、好ましくは、脈管内、筋肉内、皮下、または吸引投与によって、投与する工程を包含する。
本発明のさらなる局面において、多種の軟骨保護剤を含む全身投与のための組成物が提供され、これは、軟骨同化活性を促進する少なくとも１つの薬剤、および軟骨異化を阻害する少なくとも１つの因子を含む。さらに、疼痛および／または炎症を阻害するように作用する１つ以上の薬剤が、組成物中に含まれ得る。全ての薬剤は、全身に投与される場合、関節において軟骨保護治療効果を提供するのに十分な投薬量で含まれる。軟骨分解の危険にある患者を処置する際に使用するためのような組成物を含む医薬の製造方法がまた提供される。
このような全身投与される組成物を関節に標的化するために、少なくとも１つの同化軟骨保護剤および／または少なくとも１つの異化阻害軟骨保護剤、好ましくは、同化軟骨保護剤および異化阻害性軟骨保護剤の両方が、送達ビヒクル（例えば、ナノスフェア）内にカプセル化され、この送達ビヒクルに、関節内に局在化した抗原決定基に特異的な抗体または抗体フラグメントが結合される。軟骨分解の危険にある患者を処置する際に使用するための、抗体または抗体フラグメントに結合されたカプセル化された軟骨保護剤を含む医薬を製造するための方法がまた提供され、このような抗体または抗体フラグメントは、関節内に局在化した抗原決定基に標的化され得る。
本発明の異なる局面において、１つもしくは好ましくは多種の代謝活性な軟骨保護剤を、疼痛、炎症などの阻害のための１つ以上の薬剤とともに、またはより好ましくは、同化剤および異化のインヒビターの多種の薬剤の組合せを、薬学的に有効なキャリア中に含む組成物が、患者の関節への直接的な関節内送達のために調製され得る。本発明の軟骨保護組成物の全身送達が、多種の関節に影響する疾患または状態に好ましくあり得るが、本発明の組成物の局所送達は、他の例において好ましくあり得る。このような例としては、単一または限られた数の関節のみに影響する軟骨変性状態または疾患を有する患者の処置、関節における手術または介入手順に関連する手順時投与、または望ましくない副作用が、全身投与に関連し得る場合が挙げられる。本発明のこの局所送達の局面において、このような組成物は、関節内注射（変形性関節症および慢性関節リウマチのような軟骨変性弛緩の処置のためを含む）によって、または注入（外科手術関節鏡手順の間に、手順時的（すなわち、手術前および／または手術中および／または手術後）な投与を含む）によって、局所送達される。
本発明の局所送達の局面は、生理学的電解質キャリア流体中において、疼痛、炎症、および軟骨分解のメディエーターを局所的に阻害することに指向された、低濃度の多種の薬剤の混合物を構成する溶液を提供する。本発明はまた、これらの薬剤を含む灌注溶液の手術部位への直接的な手術時（ｐｅｒｉｏｐｅｒａｔｉｖｅ）の送達のための方法を提供し、ここで、これは、レセプターおよび酵素レベルにおいて、局所的に作用して、先制的に疼痛、炎症、および軟骨分解をその部位において制限する。本発明の局所的な手術時送達方法に起因して、所望の治療効果は、送達の他の方法（すなわち、静脈内、筋肉内、皮下、および経口）を使用する場合に必要であるよりも、低い用量の薬剤で達成され得る。
溶液中の抗疼痛および／または抗炎症剤ならびに／あるいは抗軟骨分解剤としては、多種のクラスのレセプターアンタゴニストおよびアゴニスト、ならびに酵素アクチベーターおよびインヒビターから選択される薬剤が挙げられ、各クラスは、疼痛および／または炎症阻害および／または軟骨分解のための異なる作用の分子機構を介して作用する。
抗軟骨分解剤に加えて、本発明の組成物としては、抗疼痛剤および／または抗炎症剤が挙げられ得る。疼痛および／または炎症の阻害のための代表的な薬剤としては、例えば、（１）セロトニンレセプターアンタゴニスト；（２）セロトニンレセプターアゴニスト；（３）ヒスタミンレセプターアンタゴニスト；（４）ブラジキニンレセプターアンタゴニスト；（５）カリクレインインヒビター；（６）ニューロキニン1およびニューロキニン2レセプターサブタイプアンタゴニストを含むタチキニンレセプターアンタゴニスト；（７）カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）レセプターアンタゴニスト；（８）インターロイキンレセプターアンタゴニスト；（９）（ａ）ＰＬＡ2イソ型インヒビターおよびＰＬＣイソ型インヒビターを含むホスホリパーゼインヒビター、（ｂ）シクロオキシゲナーゼインヒビター、および（ｃ）リポオキシゲナーゼインヒビターを含むアラキドン酸代謝物合成経路で活性な酵素のインヒビター；（１０）エイコサノイドＥＰ−１およびＥＰ−４レセプターサブタイプアンタゴニストならびにトロンボキサンレセプターサブタイプアンタゴニストを含むプロスタノイドレセプターアンタゴニスト；（１１）ロイコトリエンＢ４レセプターサブタイプアンタゴニストおよびロイコトリエンＤ4レセプターサブタイプアンタゴニストを含むロイコトリエンレセプターアンタゴニスト；（１２）μオピオイド、δオピオイドおよびκオピオイドレセプターサブタイプアゴニストを含むオピオイドレセプターアゴニスト；（１３）Ｐ2xレセプターアンタゴニストおよびＰ2Yレセプターアゴニストを含むプリノセプターアゴニストおよびアンタゴニスト；ならびに（１４）カルシウムチャネル拮抗剤が挙げられる。上記薬剤の各々は、抗炎症剤および／または抗侵害受容剤（すなわち、抗疼痛剤または鎮痛剤）のいずれかとして機能する。これらのクラスの化合物からの薬剤の選択が、特定の適用についてなされる。
本発明はまた、関節鏡手術手順中に手術部位、代表的には患者の関節部位に、連続的に灌注するのに用いる希釈灌注液として本発明の１つの局面において配合された医薬品を製造する方法も提供する。本発明のこの局所送達の実施形態において、この方法で必然的に伴うのは生理的電解質キャリア液に少なくとも１つの抗軟骨分解剤および好ましくは１以上の抗疼痛／抗炎症剤を溶解し、また、いくつかの適用においては抗軟骨分解剤を溶解し、各薬剤は、好ましくは約１００，０００ナノモル濃度を超えない濃度、より好ましくは約２５，０００ナノモル濃度を超えない濃度、そして最も好ましくは、約１０，０００ナノモル濃度を超えない濃度で含有される。
本発明の局所送達局面の方法は、軟骨分解、疼痛、および／または炎症の阻害のために、多種のレセプターアンタゴニストおよびアゴニストならびに酵素インヒビターおよびアクチベーターの希釈物の組合せを、治療もしくは診断手順中、創傷または手術部位に直接送達する手段を提供する。溶液中の活性成分は局所的に直接手術組織に連続的な様式で供給されるので、その薬物は、経口、筋肉内、皮下あるいは静脈内に同一薬物を送達した際の治療効果に必要な用量に比べ、非常に低用量で効率的に使用することができる。ここで用いる用語「局所」は創傷もしくは他の手術部位の内部または周囲への薬物の適応を包含し、経口、皮下、静脈内および筋肉内投与は含まない。ここで用いる用語「連続」は中断のない適用、時々中断するが繰り返し実施する適用、および中断することはないが例外的に一時的停止をする適用、例えば、他の薬物または薬剤または処置上の器具を導入するのに必要な停止を包含し、それによって実質的に一定所定量の濃度を創傷もしくは手術部位に局所的に維持する。
薬剤を低用量で適用する利点は三重である。最も重要なことは、これら薬剤の有用性をしばしば制限する全身性の副作用がないということである。加えて、本発明溶液において特別に適用するために選択した薬剤が、それらが作用するメディエーターおよび媒介標的に関して高い特異性を有することである。この特異性は低用量を利用したことにより維持される。最後に、これら活性薬物の手術当たりの経費は低い。
薬剤を灌注または他の流体物適応により局所投与することには以下のような利点がある：（１）局所投与は、患者間で代謝、血流などにばらつきがあるにもかかわらず標的部位での既知濃度を保証する；（２）直接送達法であるので、治療濃度が即座に入手可能であり、用量制御を改善したものとすることができる；そして（３）創傷もしくは手術部位に直接活性薬剤を局所投与することはまた、実質的に、さもなくば、例えば、薬剤を経口、静脈内、皮下または筋肉内投与した場合に起こる、全身性のプロセス（例えば、一次および二次経路代謝）を通じた薬剤の分解を減少させる。このことは、急速に代謝されるタンパク質およびペプチドなどの活性薬剤で特に当てはまる。このように局所投与は他の方法では治療に採用できないような化合物または薬剤の使用を可能とする。例えば、以下のクラスのいくつかの薬剤はペプチド性である：ブラジキニンレセプターアンタゴニスト；タキキニンレセプターアンタゴニスト；オピオイドレセプターアゴニスト；ＣＧＲＰレセプターアンタゴニスト；およびインターロイキンレセプターアンタゴニスト、ＴＮＦ−レセプターアンタゴニスト；ＴＧＦ−βレセプターアゴニスト；ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７レセプターアゴニスト；ＩＬ４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３レセプターアゴニスト；ならびにインテグリンレセプターアゴニストおよびアンタゴニスト。創傷もしくは手術部位に局所的連続送達することは薬剤の分解または代謝を最少化するばかりでなく、レセプター占拠または酵素飽和を維持するのに十分な局所での治療濃度が手術手順の間中維持されることを保証するために、分解可能性のある薬剤の部分を連続的に置換するものともなる。
本発明のこの局面に従って手術時の外科手順中を通して、この溶液を局所投与すると、先制的鎮痛効果、抗炎症効果、軟骨防御効果を生ずる。本明細書中で使用される場合、用語「手術時（ｐｅｒｉｏｐｅｒａｔｉｖｅ）」とは手順内での、処置前および処置内での、処置内および処置後、ならびに処置前、処置内および処置後の適用を包含する。先制的抗炎症、鎮痛（特定の適応において）、および抗軟骨保護（特定の適応において）効果を最大とするために、本発明の溶液を、最も好ましくは処置前、処置内および処置後に適用する。有意な手術的外傷を局所的に加えるに先立って、標的レセプターを占拠することにより、あるいは標的酵素を不活性化もしくは活性化することにより、本発明の溶液の薬剤は標的の病理学的プロセスを先制的に阻害するために特別な経路を調整する。炎症のメディエーターとプロセスが、それらが組織障害を起こし得る前に本発明により先制的に抑制される場合、その利益は障害が起こってから投与されるよりもより価値の高いものとなる。
本発明の多重薬剤溶液を適用することによる一種より多い疼痛、炎症、または軟骨分解メディエーターの阻害は、炎症および疼痛の程度を劇的に減少することが示され、さらに理論的には軟骨防御効果を与える。本発明の灌注用溶液は、各溶液が多数のレセプターまたは酵素に対して作用する薬剤の組み合わせを含有する。従って、薬剤類は、疼痛および炎症、軟骨ホメオスタシスの損失を含む病理学的プロセスの組み合わせに対して同時に有効である。このような薬剤の作用は、本発明の多数のレセプターアンタゴニストおよび阻害性アゴニストが、個々の薬剤の効果に対比して、組み合わせが不均衡に増加した効果をもたらす点で、相乗的と考えられている。本発明の数種の薬剤の相乗作用は、以下に示すこれらの薬剤の詳細な説明中で実施例として検討されている。
手術時に使用すると、この溶液は現在使用されている灌注液に較べて臨床的に顕著な手術部位疼痛および炎症、ならびに軟骨分解の減少をもたらし、それにより患者の術後鎮痛薬（すなわちアヘン剤）の必要性を減少し、適当な場合には、患者の手術部位の早期の可動化を可能にする。外科医および手術室要員の側では、本発明の溶液を使用するために、従来の灌注液に比較して余分な努力を全く必要としない。最適な軟骨保護のためには、本発明の溶液を、外科手順の前、外科手順の間、および／または外科手順の後に関節内に直接投与する。
本発明のさらなる局面において、同化促進剤および異化阻害剤を含む軟骨の保護のための組成物が提供される。このような組合せは、以下によって特徴付けられる状態を生じる：軟骨同化活性が軟骨異化活性と等しいかまたは超えること；存在する軟骨容積を維持するか、または軟骨容積を増加するように、軟骨組織を維持すること；あるいは関節軟骨細胞による関節基質の合成の増加および関節基質の分解の同時の減少。
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、軟骨の保護のための方法および組成物を提供する。第１の実施形態において、軟骨同化活性を促進するように作用する少なくとも１つの第１の薬剤および軟骨異化を阻害するように作用する少なくとも１つの第２の薬剤を含む組成物を、関節に局所的に投与するための方法が提供される。本発明のこの実施形態の第１の局面において、このような組成物は、組成物（これには、徐放性送達ビヒクルが含まれ得る）の関節への注射によって局所的に送達される。本発明のこの実施形態の第２の局面において、組成物は、液体灌注キャリアを含み、手術または介入手順の間に、関節へ局所的かつ手術時に送達される。
本発明の第２の実施形態において、軟骨同化活性を促進するように作用する少なくとも１つの第１の薬剤および軟骨異化を阻害するように作用する少なくとも１つの第２の薬剤を含む組成物を、患者に全身的に投与するための方法が提供される。
本発明の第３の実施形態において、軟骨同化活性を促進するように作用する少なくとも１つの第１の薬剤および／または軟骨異化を阻害するように作用する少なくとも１つの第２の薬剤を含む組成物を、患者に全身的に投与するための方法が提供され、ここで、これらの薬剤の少なくとも１つのは、関節に標的化される。これらの各々の実施形態が、より詳細に記載される前に、そして理論に制限されることを望まないで、本発明による軟骨保護のための理論が示される。
（１．軟骨保護理論）
炎症および軟骨分解の生化学および分子生物学の理解における近年の進歩は、多くの内因性サイトカインについての役割と関係を有する。炎症した関節における軟骨の損失の発生に関係してきた複数の炎症促進メディエーターは、サイトカイン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−８である。上昇したレベルの多数のこれらの炎症促進サイトカインは、急性的に損傷した膝関節の滑液中に急速に現れ、そして少なくとも４週間の間、患者において上昇したままである（Ｃａｍｅｒｏｎ，ＭＬら、「Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｓ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ＡＣＬ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｋｎｅｅ」、Ｋｎｅｅ Ｓｕｒｇ．Ｓｐｏｒｔｓ Ｔｒａｕｍａｔｏｌ．Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ ２：３８−４４（１９９４））。これらのサイトカインは、いくつかの活性化した細胞型（滑膜線維芽細胞、滑膜マクロファージ、および軟骨細胞を含む）から関節中に局所的に産生される。局所的に産生されたサイトカインは、急性炎症状態および慢性炎症状態において病態生理学的な事象を媒介し、そして軟骨異化作用の重要な自己分泌およびパラクリンメディエーターである。これらのサイトカインの作用は、別個の細胞標的に対して複数の効果をもたらすそれらの能力によって、および陽性または陰性のいずれかの相乗作用様式で他のサイトカインと相互作用するそれらの能力によって、特徴付けられる。ＩＬ−１およびＴＮＦ−αは、特に重要である。なぜなら、こららはまた、内因性タンパク質（例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびメタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ））の活性を調節することにより、軟骨マトリックス成分の正常な代謝回転と破壊との間のバランスを乱すことによって、軟骨破壊効果を開始させるからである。軟骨ホメオスタシスのサイトカイン制御は、マトリックスの分解または修復が起こるか否かを決定する、軟骨細胞に作用する活性なメディエーター間での高度に調節されたバランスを示す。
関節の損傷は、しばしば、滑膜組織を含む関節空間内の炎症性応答を生じ、そして関節軟骨の分解を引き起こし得る。ヒトの膝の滑膜代謝および軟骨代謝における劇的な変化は、以下の関節損傷および関節鏡手術に記載されている（Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｍ．Ｌ．ら（１９９４）、前出；Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｍ．Ｌ．ら、「Ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｒｕｃｉａｔｅ ｌｉｇａｍｅｎｔ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｋｎｅｅ：Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ ｋｅｒａｔａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．２５：７５１−７５４（１９９７））。特定の炎症促進サイトカインレベルは、前十字靱帯（ＡＣＬ）破断の後に見られる急性炎症段階の間に、膝関節滑液中で劇的に増加する（２〜４桁まで）。有意な変化はまた、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）（例えば、コラゲナーゼおよびストロメライシン−１）の過剰産生により、軟骨マトリックス分子の濃縮を生じる。これらのＭＭＰは、急性外傷の後に患者の滑液中で増大する（Ｌｏｈｍａｎｄｅｒ，Ｌ．Ｓ．ら、「Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−１ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｋｎｅｅ ｊｏｉｎｔ ｆｌｕｉｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｃｒｕｃｉａｔｅ ｌｉｇａｍｅｎｔ ｏｒ ｍｅｎｉｓｃｕｓ」、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓ．１２：２１−２８（１９９４））。時間的に、滑液中のサイトカインおよび軟骨マトリックスマーカー（例えば、プロテオグリカン）（これらは、軟骨変性に関連する）における変化は、急性損傷期間において最大であるが、延長した期間（３ヶ月〜１年）持続し、ゆっくりと減少し、そして損傷前のベースラインレベルよりも大きいままである。
関節鏡手術自体による外傷は、かなりの手術後炎症を引き起こし、これは、関節における細胞のさらなる炎症性活性化（シクロオキシゲナーゼ−２および他の炎症促進サイトカインの上方制御を含む）を反映する。ＡＣＬの破断を有する患者のかなりの割合（６０〜９０％）が、損傷の１０〜１５年後に変形性関節症（ＯＡ）を示す膝のレントゲン撮影の変化を示す（Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｍ．Ｌ．ら、前出（１９９４））。従って、初期の関節損傷および外科的外傷の組み合わされた効果は、軟骨マトリックス代謝における持続した炎症状態および関連する変化を誘導し得、これらは、関節軟骨における変性性変化の引き続く発症および変形性関節症の初期の発症を生じる原因となる因子であるようである。１９９６年に米国のみにおいて行われた関節鏡手順の推定される総数は１８００万回であり、毎年約１０％の推定される増加速度を有するので、この健康問題の規模はかなり大きい。従って、関節における関節軟骨の分解を防ぐための薬学的方法を提供することが望ましい。
手術後の疼痛および炎症は、重要な臨床的問題として認識されているが、関節鏡手術のための現在の薬理学的処置レジメンは、急性の手術後鎮痛を指向するのみである。既存の外科処置様式は、手術後に誘導され、そして手術により処置された関節の軟骨破壊を阻害する必要性がある、慢性炎症状態を検討しない。従って、疼痛および炎症の急性および慢性の局面、ならびに損傷した関節および手術により処置された関節の軟骨代謝における病理学的変化の両方を検討する、有効な一体化された薬物治療を開発する明らかな必要性が存在する。
本発明のこの局面の第１の実施形態に従って、組成物を患者の関節に直接投与することによって、関節における関節軟骨の破壊を減少するかまたは予防するための方法が提供される。この組成物は、１以上の代謝的に活性な軟骨保護剤を、以前記載されたような疼痛および／または炎症の阻害のための１以上の薬剤とともに、あるいは好ましくは２つ以上の代謝的に活性な軟骨保護剤（これらのうちの少なくとも１つは、軟骨同化プロセスを促進し、そしてこれらのうちの１つは、軟骨異化プロセスのインヒビターである）の組み合わせを、関節内送達のための薬学的に有効なキャリア中に含む。代謝的に活性な薬剤としては、細胞の生物学的状態、生化学的状態、または生物物理学的状態を直接的または間接的に調節または変更するように作用するすべての化合物（原形質膜の電位、細胞レセプター、細胞内もしくは細胞外に位置する酵素のリガンド結合する酵素活性、もしくはタンパク質−タンパク質相互作用、ＲＮＡ−タンパク質相互作用、またはＤＮＡ−タンパク質相互作用を変更する薬剤を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、このような薬剤としては、シグナル変換カスケードを開始するレセプターアゴニスト、シグナル伝達経路を阻害するレセプターのアンタゴニスト、細胞内酵素または細胞外酵素のアクチベーターおよびインヒビター、ならびに転写因子のＤＮＡへの結合を調節する薬剤が挙げられ得る。
適切な軟骨保護剤としては、例えば、（１）ＩＬ−１β、ＩＬ−１７およびＩＬ−１８を含む、タンパク質のインターロイキン−１ファミリーについてのレセプターのアンタゴニスト；（２）例えば、ＴＮＦ−Ｒ１を含む、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターファミリーのアンタゴニスト；（３）インターロイキン４レセプター、インターロイキン１０レセプターおよびインターロイキン１３レセプターについてのアゴニスト；（４）例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７を含む、ＴＧＦ−βレセプタースーパーファミリーについてのアゴニスト；（５）ＣＯＸ−２のインヒビター；（６）例えば、ｐ３８ＭＡＰキナーゼを含む、ＭＡＰキナーゼファミリーのインヒビター；（７）例えば、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９を含む、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのタンパク質のインヒビター；（８）例えば、ＩκＢとのｐ５０／ｐ６５二量体複合体を含む、ＮＦ−κＢファミリーのタンパク質のインヒビター；（９）例えば、ｉＮＯＳを含む、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）ファミリーのインヒビター；（１０）例えば、αｖβ３インテグリンのアゴニストを含む、インテグリンレセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト；（１１）プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーのインヒビター；（１２）例えば、ｓｒｃサブファミリーを含む、プロテインチロシンキナーゼファミリーのインヒビター；（１３）タンパク質チロシンホスファターゼのモジュレーター；および（１４）タンパク質ｓｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメインのインヒビターが挙げられる。本発明での使用のための他の適切な軟骨保護剤としては、他の増殖因子（例えば、例として、インシュリン様増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１）および線維芽細胞増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ））が挙げられる。
本発明の第１の実施形態において、最大の治療的利点を達成するために局所的に送達された軟骨保護薬剤の組み合わせを用いて、損傷したかまたは手術により処置した関節を処置する薬理学的方法を提供する。本発明の第２の実施形態は、軟骨保護剤の組み合わせを全身的に投与することにより治療的処置を提供する薬理学的方法を提供する。軟骨保護剤の組み合わせの使用は、多因子性の軟骨破壊プロセス（このプロセスにおいて、異化プロセスに有利なように合成と分解との間の変化が生じている）をブロックするための単一の薬剤の使用に依存する、現存する治療的アプローチの限界を克服する。本発明のこの局面は、別個の分子標的に対して同時に作用する薬剤の組み合わせのアプローチを独自に使用して、炎症プロセスの最大の阻害を達成しそして軟骨ホメオスタシスを維持するために、軟骨同化作用を促進しそして調整されていないかまたは過剰な軟骨異化プロセスを阻害する。これによって、関節内の軟骨保護効果が達成される。単一の分子標的の阻害または軟骨破壊（異化作用）を誘導することが公知の生化学的機構阻害（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）のＩＬ−１レセプターへの結合の阻害）は最適ではないようである。なぜなら、例えば独自のレセプターを介して媒介されたＴＮＦ−αの作用は、多くの重複する炎症促進機能および軟骨異化機能をＩＬ−１と共有し、そしてまた関節における軟骨破壊の主要なメディエーターとして認識されているからである。同様に、異化プロセスを阻害することなく軟骨同化プロセスを増強するのみの薬学的薬剤の使用は、損傷した関節内に存在する異化因子を最適には相殺しない。
詳細には、本発明の１つの局面は、代謝的に活性な軟骨保護剤の薬学的組成物を提供し、これは、別個の分子標的に同時に作用する少なくとも２つの薬剤の組み合わせに基づく。代表的な実施形態においては、少なくとも１つの薬剤は、サイトカインまたは増殖因子レセプターアゴニストであり、これらは抗炎症活性を直接的に提供し、そして／または軟骨同化プロセスを促進し、そして少なくとも第２の薬剤は、炎症促進プロセスおよび／または軟骨異化プロセスを阻害するように作用するレセプターアンタゴニストまたは酵素インヒビターである。代表的な薬剤の組み合わせは、関節における炎症促進サイトカインの役割を抑制し、軟骨マトリックス合成を促進し、そしてマトリックス分解を阻害するように機能的に作用する、抗炎症性／同化性サイトカインのクラスから引き出された少なくとも１つの薬剤を含む。これらのレセプターアゴニストとしては、特定の抗炎症性および同化性サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ）アゴニスト（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３）およびトランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーの特定のメンバー（例えば、ＴＧＦβおよびＢＭＰ−７））、インシュリン様増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１）および線維芽細胞増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも１つの第２の薬剤は、炎症促進分子標的の活性または発現を阻害および減少するように作用するレセプターアンタゴニストまたは酵素インヒビターのクラスから引き出された薬剤（例えば、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ＴＮＦ−αレセプターアンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター、ＭＡＰキナーゼインヒビター、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）インヒビター、および核因子κＢ（ＮＦκＢ）インヒビター）である。代謝的に活性な薬剤は、細胞の表面に位置するレセプターの機能的アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびに膜結合酵素または細胞外に分泌された酵素（例えば、ストロメライシンおよびコラゲナーゼ）のインヒビターの両方を含む。さらに、多くの薬剤（酵素ＮＯＳ、ＣＯＸ−２、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のインヒビターならびにタンパク質−ＤＮＡ相互作用（例えば、転写因子ＮＦκＢ）のインヒビターを含む）が新規な標的において指向され、これらの標的は、細胞内に局在化する酵素、および表面レセプターのシグナルを伝達し、組み込む転写因子である。この方法は、サイトカイン誘導性同化プロセスの促進および異化プロセスの阻害を同時に行うことによって、軟骨の完全性が維持されるのを可能にする。
本発明の好ましい実施形態の組成物は、別個のレセプターおよび／または酵素分子標的で作用する複数の薬理作用剤を組み合わせることにより新規な治療的アプローチを構成するものである。今日まで、薬理学的な方策は、個々のシグナルを送る神経伝達物質およびホルモンに対する応答を媒介する個々のレセプターサブタイプおよび酵素イソ型に対して選択的な高特異性薬物の開発に、焦点を合わせてきた。さらに、単一のレセプターサブタイプまたは酵素の不活化にもかかわらず、他のレセプターサブタイプまたは酵素の活性化およびそれによって生ずるシグナルの伝達がしばしば、カスケード効果の引き金になり得る。このことは、複数のシグナル伝達メディエーター（例えば、サイトカイン、増殖因子、またはエイコサノイド）が役割を果たす病理学的過程の遮断するために単一のレセプター特異的薬物を使用することに大きな困難が存在することの説明になる。それ故、特異的な個々のレセプターサブタイプまたはイソ型のみを標的とすることは、効果的でないようである。
薬理学的治療の標準的アプローチと対照的に、本発明の組成物の治療的アプローチは、別個の分子標的に同時に作用する薬物の組み合わせが、病理学的状態の発生の裏にある事象の全スペクトルを阻害するのに非常に効果的であるとの論拠に基づく。さらに、特異的レセプターサブタイプのみを標的とする代わりに、この組成物は、疼痛、炎症および軟骨破壊の発症に関係する異なった細胞生理学的過程で機能する共通の分子機構を標的とする薬物を含む（図１を参照のこと）。この方法で、侵害受容、炎症、および軟骨破壊経路におけるさらなるレセプターおよび酵素によるカスケーディングが最小化される。これらの病理学的経路で、この組成物は「上流」および「下流」の両方でカスケード効果を阻害する。
「上流」阻害の例は、疼痛および炎症環境におけるシクロオキシゲナーゼアンタゴニストである。シクロオキシゲナーゼ酵素（ＣＯＸ１およびＣＯＸ２）は、プロスタグランジン、ロイコトリエン、およびトロンボキサンを含む炎症および侵害受容メディエーターの生合成の中間体であるプロスタグランジンＨへのアラキドン酸の変換を触媒する。シクロオキシゲナーゼインヒビターは、これらの炎症および侵害受容メディエーターの形成の「上流」を遮断する。この方策は、７種のプロスタノイドレセプターの記載されるサブタイプとＣＯＸ生化学経路のプロスタノイド産物との相互作用を遮断する必要性を排除する。類似の「上流」インヒビターは、カリクレインインヒビターであるアプロチニンである。セリンプロテアーゼである酵素カリクレインは、血漿中の高分子量キニノーゲンを切断して疼痛および炎症の重要なメディエーターであるブラジキニンを生成する。カリクレインを阻害することにより、アプロチニンは効果的にブラジキニンの合成を阻害し、それによりこれらの炎症のメディエーターの効果的な「上流」阻害をもたらす。
本発明の組成物はまた、病態生理学的経路の制御に「下流」インヒビターを利用する。進行性関節軟骨変性に関係する種々の炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα）で処理した滑膜細胞および軟骨細胞の調製物において、ＭＡＰキナーゼインヒビターは、軟骨保護効果をもたらす。このｐ３８ＭＡＰキナーゼは、複数の異化サイトカインについてのシグナル伝達経路における運搬の分岐点であり、そしてその阻害は、軟骨変性を媒介する複数の細胞産物のアップレギュレーションを防ぐ。従って、このＭＡＰキナーゼインヒビターは、移動軟骨恒常性を開始するサイトカインレセプターアゴニストの生理的組み合わせに無関係な「下流」軟骨保護作用をもたらすことにより、関節炎症環境において顕著な利益を与える。
（ＩＩ．軟骨保護組成物の局所送達）
軟骨保護および外科手順における使用のための本発明の溶液の特定の好ましい実施形態は、好ましくは、薬剤の組み合わせを含み、この薬剤は、別個の分子標的に対して同時に作用して、軟骨同化を促進し、そして制御されていないかまたは過剰な軟骨異化プロセスを阻害して、炎症性プロセスの最大の阻害を達成し、かつ軟骨のホメオスタシスを維持し、それによって、関節内での軟骨保護効果を達成する。
本発明の１つの実施形態の灌注および注射用溶液は、生理学的キャリア中の１つ以上の軟骨保護剤、ならびに、必要に応じて、１つ以上の疼痛および／または炎症阻害剤の希釈液である。キャリアは液体溶液であって、これは、本明細書中で使用される場合、生体適合性溶媒、懸濁液、重合性および非重合性ゲル、ペーストおよび軟膏、ならびに徐放性送達ビヒクル（例えば、微粒子、ミクロスフェア、またはタンパク質、リポソーム、糖質、合成有機化合物、もしくは無機化合物から構成されるナノ粒子）、を包含ことが意図される。好ましくは、キャリアとしては生理食塩溶液または乳酸化リンガー溶液などの生理的電解質を含んでもよい水溶液である。
本発明の局所的に送達される実施形態の外科用溶液のそれぞれにおいては、薬剤が、液体または流体の溶液中に低濃度で含有されており、そして所望の治療効果を達成するのに全身薬物投与法で必要とされる濃度および用量に比べ低い用量で局所的に送達される。本明細書中で用いられる場合、「液体」または「流体」は、薬学的に受容可能な生体適合性の溶媒、懸濁液、重合性ゲルおよび非重合性ゲル、ペーストおよび軟膏を含むことが意図される。好ましくは、キャリアは、生理食塩溶液または乳酸化リンガー溶液のような生理的な電解質を含み得る水溶液である。薬物投与の他の経路（すなわち、静脈内、皮下、筋肉内または経口）を介して同じ用量の薬物を送達しても、等価な治療効果を得るのは不可能または非実用的である。なぜならば、全身系的に与えられる薬物は一次および二次経路代謝をうけるからである。各薬剤の濃度は、そのレセプター解離定数Ｋｄまたは酵素阻害定数Ｋｉに一部基づき決定される。本明細書中で使用される場合、解離定数という用語は、それぞれのアゴニストレセプターまたはアンタゴニストレセプター相互作用に対する平衡解離定数、およびそれぞれの活性剤−酵素またはインヒビター−酵素相互作用に対する平衡阻害定数の両方を包含することを意図される。各薬剤は、好ましくは０．１〜１０，０００倍のＫｄまたはＫｉの低濃度で含有されている。好ましくは、各薬剤は１．０〜１，０００倍のＫｄまたはＫｉの濃度で含有され、最も好ましくは約１００倍のＫｄまたはＫｉである。これらの濃度は必要により調整され、局所送達部位において代謝転換が起こらないように希釈するようにする。この溶液用に選択した的確な薬剤および薬剤濃度は後記するように特定の適用に応じて変更する。
本発明にの第２の局面に従う溶液は、単一もしくは軟骨保護剤、好ましくは複数の軟骨保護剤（これらの少なくとも１つは、同化性（ａｎａｂｏｌｉｃ）軟骨保護剤であり、そしてこれらの少なくとも１つは、軟骨異化のインヒビターである）、あるいは軟骨保護剤と疼痛および／または炎症抑制剤の両方の組合せを、低濃度で含有し得る。しかし、前記した多重薬剤の相乗作用ならびに広範囲に軟骨破壊を阻害し、必要に応じて疼痛および炎症の遮断する要求に起因して、複数薬剤を使用するのが好ましい。
複数の薬物の組み合わせは、外科的関節鏡手順の間に、単独でまたは手術後の持続性送達（例えば、制御ポンプまたは他の持続放出性送達ビヒクルによって）と組み合わせて、関節内注射によるかまたは注入（手順に沿った（ｐｅｒｉｐｒｏｃｅｄｕｒａｌｌｙ）投与（すなわち、手術前および／または手術中および／または手術後）を含む）を介して、局所的に送達され得る。持続放出性送達システムとしては、タンパク質、リポソーム、炭水化物、合成有機化合物または無機化合物で構成される微粒子、ミクロスフェアまたはナノ粒子が挙げられ得るが、これらに限定されない。従って、いくつかの実施形態においては、本発明は、注射または注入を介して、単独または鎮痛剤および／もしくは抗炎症剤とともに送達される薬剤の組み合わせを提供する。損傷時または損傷時の直後（例えば、手順に沿って）における軟骨保護剤の直接的な局所的送達によって達成される作用の迅速な開始は、引き続く応答を誘発し得る前に初期のプロセスを阻害し、それによって局所的な組織の損傷および引き続く軟骨の損失を先手を打って制限する可能性を有する。
本発明の利点としては、以下が挙げられる：１）急性状態または慢性状態の間の軟骨破壊の多因子性の原因に関する組み合わせ薬物治療；２）軟骨保護剤の組み合わせは、抗炎症剤および鎮痛剤と組み合わされ得る；３）薬物の組み合わせの局所的送達は（適用可能である場合）、関節内の軟骨保護剤の即時の治療的濃度を達成する；４）灌注溶液を手順に沿って（適用可能である場合）用いることによって、関節内の薬剤レベルを、関節鏡外科手順の間、治療的に望ましい範囲に連続的に維持する；５）（本発明の実施形態のための）局所的送達は、全身的送達と比較して全薬物用量および投与頻度の減少を可能にする；６）（本発明のこの実施形態についての）関節への局所的部位指向的送達は、全身的な毒性を避け、そして悪影響を減少させる；そして７）（本発明の実施形態のための）関節への直接的な局所的送達は、新規な薬学的に活性なペプチドおよびタンパク質（サイトカインおよび増殖因子を含む）の使用を可能にし、これらは、投与の全身的経路に限定しない場合には、治療的に有用でないかも知れない。
これらの軟骨保護因子について規定された作用の分子的機構および細胞性機構から、これらの化合物は、手術時（ｐｅｒｉｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）に灌流溶液に（本明細書中に記載される、他の軟骨保護剤と組合せるか、または他の抗疼痛および抗炎症剤と組合せて）適用されるか、そうでなければ注入または注射により直接関節に投与される場合、軟骨保護作用を示すと予測される。特に、これらの薬剤は、関節鏡検査外科手順の間、灌流溶液により送達される場合、有効な薬物であることが期待される。各々の代謝的に活性な軟骨保護剤は、好ましくは１つ以上の他の軟骨保護剤（低分子薬物、ペプチド、タンパク質、組換えキメラタンパク質、抗体、オリゴヌクレオチドまたは遺伝子治療ベクター（ウイルス性および非ウイルス性）を含む）と組合せて、関節の空隙に送達され得る。例えば、ＭＡＰＫインヒビターのような薬物は、関節の正常な機能に関与するかもしくは病理学的状態に起因して存在する、関節および関節を構成する構造の流体空隙に関連する任意の細胞に対してその作用を発揮し得る。これらの細胞および構造としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ａ型線維芽細胞およびＢ型マクロファージ細胞の両方を含む、滑膜細胞；関節の軟骨成分（例えば、軟骨芽細胞および軟骨細胞）；骨に関連する細胞（骨膜細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞を含む）；炎症性細胞（リンパ球、マクロファージ、肥満細胞、単球、好酸球を含む）；ならびに他の細胞（内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞および神経細胞を含む）；ならびに上記の組合せ。
本発明のこの局面はまた、活性治療剤の処方物を提供する。この活性治療剤は、薬物の関節ヘの導入および投与に有用物な処方で送達され得、軟骨保護剤の送達、摂取、安定性または薬物動態を増強する。このような処方物としては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない：タンパク質、リポソーム、炭水化物、合成有機化合物、もしくは無機化合物から構成される微粒子、ミクロスフェア、ナノスフェアまたはナノ粒子。本発明は、軟骨保護剤の組み合わせの送達、または均質ビヒクル（例えば、単一のカプセル化したミクロスフェア）内の複数の薬学的に活性な物質もしくは個々の送達ビヒクル（例えば、１つ以上の薬剤をカプセル化するミクロスフェアの群）の別々の混合物のいずれかとして存在する１つ以上の抗疼痛剤および／もしくは抗炎症剤を有する１つ以上の軟骨保護剤の送達を提供する。処方分子の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：親水性ポリマー、ポリカチオン（例えば、プロタミン、スペルミジン、ポリリジン）、特定の細胞型に物質を標的化し得るペプチドもしくは合成リガンドおよび抗体、ゲル、遅放性マトリクス（すなわち、持続性送達ビヒクル、可溶性粒子および不溶性粒子、ならびに列挙されない処方エレメント。
１つの局面において、本発明は、２つ以上の軟骨保護剤の組み合わせ、または１つ以上の抗疼痛剤および／もしくは抗炎症剤と組合せた１つまたは好ましくは複数の軟骨保護剤、単独または組合せた１つ以上の抗疼痛剤および／もしくは抗炎症剤の、灌流溶液を介した局所送達を提供し、輸液は治療的に有効な低濃度で存在する薬物を含有し、薬物が変質した（ａｆｆｅｃｔｅｄ）組織または関節に直接送達されることを可能にする。薬物含有輸液または灌流溶液は、手術手順に関連して手術前に、および／もしくは手術中に、および／もしくは手術後に使用され得るか、または外科手順に関連しない他の時点で投与され得る。薬物送達の全身性方法（例えば、筋肉内、静脈内、皮下）は、標的の関節において有意な治療的濃度を達成するために、患者に投与される高濃度の薬物（およびより高い総用量）を必要とする。全身的投与はまた、標的関節以外の組織において高濃度を生じ、これは望ましくなく、用量に依存して、有害な副作用を生じ得る。これらの全身的方法は、薬物を第２経路（ｓｅｃｏｎｄ−ｐａｓｓ）代謝および急速な分解に供し、それにより、有効治療濃度をの持続時間を制限する。軟骨保護剤（１つ以上の抗疼痛剤および／または抗炎症剤を伴うかまたは伴わない）の組合せは注入または灌流により直接関節に投与されるので、血管灌流は、薬物を標的組織に運ぶために必要ではない。この重要な利点は、種々の軟骨保護薬物のより低い治療有効全用量の局所送達を可能にする。
（Ａ．局所送達方法）
本発明の溶液は、種々の手術／介入手順（外科技術、診断技術および治療的技術を含む）のための適用を有する。本発明の軟骨保護剤の組み合わせは、注入または灌流により投与され得る。注入のための溶液については、キャリア材料と組合されて単一投薬形態を生成し得る活性成分の量は、処置される患者、溶液中の活性因子の性質、および投与の特定の形態に依存して変化する。しかし、任意の特定の患者のための特定の用量レベルは、種々の要因（使用される特定の化合物の活性、患者の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食事、投与の時間、投与経路、薬物の組合せの排出速度、および治療を受ける特定の疾患の重篤度を含む）に依存することが理解される。
注射可能な調製物（例えば、滅菌注射可能水性懸濁液または油性（ｏｌｅａｇｅｎｏｕｓ）懸濁液）は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して公知の技術に従って処方され得る。滅菌注射可能調製物はまた、非毒性の非経口受容可能希釈剤または溶媒中の滅菌注射可能溶液または懸濁液（例えば、プロパンジオール溶液）であり得る。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌不揮発性油は、従来、溶媒または懸濁媒体として使用される。この目的のために、任意の刺激の生体適合性油が使用される（合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む）。さらに、脂肪酸（例えば、オレイン酸）が、注射可能な調製物において使用される。
本発明の注射のための溶液は、関節鏡検査外科手順と共に投与され得るか、または患者の診療を指示する医師により望ましいと決定された任意の時点で投与され得る。
本発明の灌注溶液は、解剖学的関節の関節鏡検査手術の間、手術時に適用され得る。本明細書中で使用される場合、用語「手術時」とは手順内での、手順前および手順内での、手順内および手順後での、ならびに手順前、手順内および手順後の適用を包含する。好ましくは、この溶液は、手順前および／または手順後ならびに手順内で適用される。そのような手順は、当業者に周知の技術によって外科的部位に適用される生理学的灌注流体（例えば、通常の生理食塩水または乳酸加リンガー溶液）を慣習的に利用する。本発明の方法は、従来で適用された灌注流体に代えて、本発明の抗疼痛／抗炎症／軟骨保護性灌注溶液で代用することを含む。この灌注溶液は、手順の開始前、好ましくは組織外傷の前およびその手順の始めから終わりまでの間連続的に創傷または外科的部位に適用されて、疼痛および炎症、ならびに軟骨分解を先制的にブロックする。本明細書の全体に渡って使用される場合、用語「灌注」とは、液体の流れで創傷または解剖学的構造を洗うことを意味することを意図する。用語「適用」とは、灌注および本発明の溶液を局所的に導入する他の方法（例えば、ゲル化可能バージョンのその溶液を操作部位に導入し、次いでこのゲル化溶液が手順の間中ずっとその部位に残存する）を包含することを意図する。本明細書の全体に渡って使用される場合、用語「連続的」とは、適用される薬剤の予め決定された治療的局所濃度を維持するために十分な頻度で、創傷の反復された、頻繁な灌注が存在する状況、および操作技術により必要とされる灌注流体流の断続的停止が存在し得る適用をも含むことを意図する。
本発明の溶液内の各々の薬剤について列挙される濃度は、代謝変換の非存在下において、操作部位における効果の予め決定されたレベルを達成するために操作部位に局所的に送達される薬剤の濃度である。所定の溶液中の薬物濃度は、送達の際の局所希釈を補償するように調節されることを必要とし得るということが理解される。上記の実施形態において、溶液濃度は、代謝変換または体全体の分布による希釈を補償するように調節されない。なぜなら、これらの状況は、経口適用、皮下適用、静脈内適用または筋肉内適用とは対照的に、局所送達により回避されるからである。
本発明の溶液が使用され得る関節鏡検査技術としては、非限定例として、膝における部分的半月板切除術および靭帯再構築、肩峰形成術、回旋筋腱板壊死組織切除、肘滑膜切除術ならびに手首関節鏡検査および足首関節鏡検査が挙げられる。灌注溶液は、手術細片を除去し、そして遮るもののない関節内の可視化を可能にするために、関節包を拡張するのに十分な流速で関節に手術中に連続的に供給される。
そのような関節鏡検査技術の間、軟骨分解の阻害ならびに疼痛および炎症の制御のための適切な関節鏡検査灌注溶液は、本明細書中以下の実施例１〜３において提供される。
本発明の各々の溶液において、薬剤は、低濃度で含まれ、そして所望の治療効果を達成するために薬物投与の全身性方法で必要とされた濃度および用量に対して低い用量で局所的に送達される。薬物投与の他の経路（すなわち、静脈内、皮下、筋肉内または経口）を介して、同様に服用される薬剤を送達することによって同等な治療効果を得ることは不可能である。なぜなら、全身に与えられた薬物は、第１通過代謝および第２通過代謝に供され、そしてしばしば体系循環から迅速に浄化されるからである。
本発明の実施は、従来のアヘン剤関節内注射および／または関節鏡もしくは関節（例えば膝、肩等）「解放」手順終了時の局所麻酔と明確に区別される。本発明のこの局面の溶液は、疼痛および炎症の先制的抑制を提供するために外科処置の間ずっと連続的注入に使用される。対照的に、現在使用されている局所麻酔薬の一定注入による治療効果の達成に必要な高濃度は、甚大な全身毒性をもたらし得る。
本発明の手順の終了後、アヘン剤の代わりまたは補助として、手術部位に、灌注溶液に使用したのと同じ軟骨保護剤ならびに／または疼痛インヒビターおよび／もしくは炎症インヒビターをより高濃度で注射または他の方法で適用することが望ましくあり得る。外科手順の後、溶液のボーラスが、外科手順後に患者の滑液嚢に残留するように、関節に十分量の溶液を送達することもまた所望され得る。
上記のように、複数の軟骨保護剤（好ましくは少なくとも１つの異化阻害剤および少なくとも１つの同化促進剤を含む）を含む本発明の組成物もまた、解剖学的（ａｔｏｍｉｃ）関節への直接注射のために適合され得る。好ましくは、これらの薬剤は選択され、そして各薬剤は、軟骨異化プロセスを阻害し、かつ軟骨同化プロセスを促進するために、患者の関節に局所的に溶液が送達される場合に、治療有効量である併用を提供するのに十分な量で含まれる。このような組成物は、慢性状態（例えば、変形性関節症または慢性関節リウマチ）または急性状態（例えば、手術の外傷または事故の損傷）を被っている患者に対して軟骨保護効果を提供するために、局所的に注射され得る。局所注射のための１つの適切な組成物は、本明細書中以下の実施例４において提供される。
（ＩＩＩ．軟骨保護組成物の全身投与）
本発明の実施形態は、例えば、関節内注射による、軟骨保護組成物の局所送達に関してこれまで記載されてきた。局所投与は、全身投与を超えるいくつかの利点（全身副作用の回避を含む）を有するとして記載されてきた。本発明の組成物の局所送達は、多くの例において好ましいが、いくつかの軟骨変性状態については現実的でないかもしれない。これは、複数の部位が同時に軟骨変性の危険性にある慢性軟骨変性疾患（例えば、慢性関節リウマチ、多関節変形性関節症および他の多関節症（ｐｏｌｙａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）を被っている患者について、特に当てはまる。このような患者について、その罹患部位（例えば、関節）の各々または大部分への軟骨保護組成物の注射は、痛みを伴うか、実際的でないか、費用がかかるか、または別の理由で処置を思いとどまらせるものであり得る。局所送達について上記された軟骨保護組成物は、本発明の別の局面によれば、全身経路を介した投与のために適合され得る。本発明の組成物の全身送達は、軟骨変性の危険性にある複数の部位を有する患者の処置に適切であるが、これに限定されない。以下でさらに考察される多関節変形性関節炎および慢性関節リウマチに加えて、本発明のこの局面は、他の非炎症性関節炎および炎症性関節炎（以下が挙げられるが、これらに限定されない：神経障害性関節症、急性リウマチ性関節炎、組織褐変症、全身性エリテマトーデス、若年性リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、ならびに他の脊椎関節症（ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）および結晶性関節症（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）を処置するために有用であり得る。
（Ａ．関節炎の機構）
本発明のこの局面は、リウマチ学的関節症（例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）および変形性関節炎（ＯＡ））における関節軟骨の変性に関与する機構の理解によって、よりよく理解され得る。ＲＡは、炎症性関節炎の最も一般的な形態であり、女性の約３％および男性の約１％が罹患している。患者の大多数は、複数の、そして通常は全身的な、関節の併発（特に、手の小さい関節、肘、手首および肩）を有する。ＯＡは、関節疾患の最も一般的な形態であり、初期のリタイアおよび不能性の原因としての心血管疾患にのみ二次的である。ＯＡは、一般に、多関節性である。硝子様の関節軟骨の破壊が、ＯＡおよび無力化ＲＡの特徴である。
種々の治療アプローチが、症状の緩和を提供し得るが、関節軟骨変性の進行を遅延させることが証明された処置は存在しない。ＯＡにおいて、正常な軟骨細胞機能の抑制、またはこれらの細胞がマトリックスの変性の増大した速度に、修復速度を一致させることが構成的にできないことのいずれかが、存在し得る。種々のサイトカインおよび炎症メディエータは、軟骨細胞の合成機能において不均衡を生むか、あるいは、種々のマトリックス分解酵素（マトリックスメタロプロテイナーゼ（コラゲナーゼを含む）を含む）をアップレギュレートすることによって、軟骨マトリックス代謝を増大させるかのいずれかであることが示されている。
軟骨変性を含む疾患を最適に処置するために、同化プロセスを刺激し、そして同時に軟骨異化を阻害する処置レジメンが必要とされることが予測される。従って、軟骨同化剤および軟骨異化インヒビターの併用に基づく、関節疾患における軟骨変性の阻害について以前に記載された治療アプローチは、ＯＡおよびＲＡのような関節状態の処置において有用性を有することが予測される。上記のように、実際の考慮事項は、身体の複数の部位に同時に罹患するこのような疾患が、これらの治療剤の全身投与によって最良に処置されることを決定する。
（Ｂ．薬剤の組み合わせ）
従って、本発明のこの局面は、軟骨保護剤の組み合わせを含む組成物、およびこのような組成物の全身投与の方法を提供する。異なるレセプターまたは分子標的を標的化する薬剤は、上記のように、多因子性のアプローチについて利用される。好ましくは、本発明の治療組成物は、軟骨同化活性を促進する少なくとも１つの軟骨保護剤および軟骨異化を阻害する少なくとも１つの薬剤を含む。この組み合わせは、恒常性について条件を最適化し、そして軟骨破壊のみに対処する従来の治療または軟骨合成のみに対処する薬物を開発するより最近の研究よりも好ましいことが予測される。適切な同化促進剤および異化阻害剤は、局所投与について上記されており、そしてまた、本発明の全身組成物についても有用であると予測される。局所送達について上記された本発明の組成物の局面および利点は、適用可能な程度まで、本発明の全身実施形態にも適用されることが理解されるべきである。
従って、本発明の軟骨保護組成物は、非限定的な例として、以下の同化促進剤の１つ以上を適切に含み得る：インターロイキン（ＩＬ）アゴニスト（例えば、ＩＬ−４アゴニスト、ＩＬ−１０アゴニストおよびＩＬ−１３アゴニスト）およびトランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーのメンバー（ＴＧＦ−βアゴニスト（例えば、ＴＧＦβｌ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）を含む）および骨形態形成タンパク質アゴニスト（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７）、インシュリン様増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１）および線維芽細胞増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ）、ならびにこれらの天然に存在する因子の生物学的特徴を保持する、フラグメント、欠失、付加、アミノ酸置換、変異および改変。
本発明の軟骨保護組成物は、非限定的な例として、以下の軟骨異化インヒビターのうち１つ以上を適切に含み得る：ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ＴＮＦ−αレセプターアンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼ−２特異的インヒビター、ＭＡＰキナーゼインヒビター、一酸化窒素シンターゼインヒビター、核因子ｋＢインヒビター、マトリックスメタロプロテイナーゼのインヒビター、軟骨異化を阻害する細胞接着分子（インテグリンアゴニストおよびインテグリンアンタゴニストを含む）、軟骨異化を阻害する細胞内シグナル伝達インヒビター（プロテインキナーゼＣインヒビターおよびプロテインチロシンキナーゼインヒビターを含む）ならびに軟骨異化を阻害するＳＨ２ドメインのインヒビター。
前述の実施形態に関して記載されたように、全身同化剤／異化阻害剤の組み合わせ中の少なくとも１つの軟骨異化インヒビターは、軟骨異化を阻害する可溶性レセプター（例えば、可溶性ＩＬ−１レセプターまたは可溶性腫瘍壊死因子レセプター）であり得る。特定の例としては、組換え可溶性ヒトＩＬ−１レセプター、可溶性腫瘍壊死因子レセプターおよびキメラｒｈＴＮＦＲ：Ｆｃが挙げられる。本発明における組み込みのために有用な可溶性腫瘍壊死因子の例としては、機能的ＴＮＦ−αアンタゴニスト（Ｊａｃｏｂｓらに対して発行された米国特許第５，６０５，６９０号に開示される）が挙げられるが、一方で、本発明において有用な可溶性ヒトＩＬ−１レセプターの例としては、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらに対する米国特許第６，１５９，４６０に開示されるものが挙げられる（これらの開示は、本明細書中で、参考として明示的に援用される）。本発明のこの局面に従う全身送達のための同化剤との組み合わせについて有用な特に見込みのある異化インヒビターとしては、ＩＬ−１ｒａ、ＴＮＦＲｌ−ＩｇＧｌ融合タンパク質およびマトリックスメタロプロテイナーゼのインヒビターが挙げられる。
以下にさらに記載されるように、軟骨保護組成物はまた、疼痛および／もしくは炎症の１つ以上のインヒビターまたは他の治療剤を含み得る。全身送達に適切な軟骨保護組成物の例は、以下の実施例５〜２０に提供される。
（Ｃ．全身送達）
本発明のこの局面は、複数の関節部位にて治療効果を提供するために、軟骨保護剤ならびに潜在的に抗炎症剤および／もしくは鎮痛剤または他の治療剤の全身送達を伴う。本明細書中で使用する場合、用語「全身送達」および「全身投与」は、意図された治療作用の、単一の部位または複数の部位への送達された薬剤の分散を効果的に生じる、経口、筋内、皮下、静脈内、吸入、舌下、頬、局所、経皮、経鼻および他の投与経路が挙げられるがこれらに限定されないことが意図される。本発明の組成物についての全身送達の好ましい経路は、静脈内、筋内、皮下および吸入である。本発明の特定の組成物において利用される選択された薬剤についての正確な全身投与経路は、所定の投与経路に関連する代謝転換経路に対する薬剤の感受性を一部補償するように、決定されることが理解される。例えば、ペプチド作用性薬剤は、経口経路以外の経路によって、最も適切に投与され得る。
本発明の組成物は、所望のレベルの治療効果を維持するために決定された間隔で、定期的に全身投与され得る。例えば、組成物は、例えば、皮下注射によって、２週間〜４週間毎に投与され得る。投薬レジメンは、薬剤の組み合わせの作用に影響し得る種々の要因を医師が考慮することによって、決定される。これらの要因としては、処置について意図された軟骨部位、関節の大きさ（適切な場合）、処置されるべき軟骨組織の量、軟骨損傷の部位、処置の時点での損傷した軟骨の状態、患者の年齢、性別および体重、ならびに他の臨床的要因が挙げられる。各個々の薬剤についての投薬量は、この組成物中に含まれる他の同化剤および異化阻害剤、ならびに任意の薬物送達ビヒクル（例えば、持続放出送達ビヒクル）の存在および性質の関数として変動する。さらに、投薬量は、投与頻度および送達された薬剤の薬物動態学的挙動における変動を補償するために調節され得る。個体の処置の進行は、当該分野で公知の種々の方法（臨床的評価、Ｘ線および磁気共鳴画像化、コンピュータ断層撮影、生化学的マーカーならびに関節鏡検査評価を含む）によってモニタリングされ得る。
（Ｄ．送達ビヒクルおよび標的化）
種々の経路の全身投与のための組成物を配合する方法は、公知であり、そして本発明の組成物での使用のために適合され得る。軟骨保護剤ならびに炎症阻害剤および疼痛阻害剤（含まれる場合）または他の治療剤は、所定の経路の全身投与に適切なように、生理学的キャリアまたは送達ビヒクル（例えば、以前に記載されたもの）中に適切に配合される。本発明の１局面において、薬剤のこれらの組み合わせ、またはその任意の成分の全身送達は、薬物送達ビヒクル（例えば、徐放性送達ビヒクルおよび／または貯蔵）中に取り込まれ得るか、またはこれと合わせられ得る。
本明細書中で使用する場合、用語「送達ビヒクル」は、治療剤を含むか、治療剤と合わせられるか、または治療剤を運搬する全ての構造体（例えば、ナノスフィアおよび他のナノ粒子、ミクロスフィアおよび他のミクロ粒子、ミセルならびにリポソーム（タンパク質、脂質、炭水化物、合成有機化合物または無機化合物から形成されるこのようなビヒクルを含む））を含むことが意図される。以下にさらに記載される本発明の標的化された全身組成物について好ましい送達ビヒクルは、「粒子」であり、これは、ナノスフィアおよび他のナノ粒子、ミクロスフィアおよび他のミクロ粒子、ミセルおよび他の送達ビヒクルを含むことが意図されるが、以下にも記載されるようなあまり好ましくないリポソームを除く。用語「送達系」は、送達ビヒクルおよび１つ以上の含まれるかまたは合わされる治療剤をいうことが意図される。
用語「徐放系」は、取り込まれた薬剤のいずれかまたは全ての、延長されたか増強されたかまたは調節された送達、持続時間またはアベイラビリティを提供する送達系を意味することが意図される。徐放系の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：薬物含有のミクロ粒子、ミクロスフィア、ナノ粒子、タンパク質、リポソーム、炭水化物、合成有機化合物、無機化合物およびＪｕｎ Ｌｉらに対する米国特許出願番号０９／８６１，１８２（これは、本明細書中で参考として明示的に援用される）によって開示されるような注射可能ヒドロゲル。適切な徐放系は、他の医薬について公知であり、そして本発明に従って、薬剤のボーラス全身送達と比較した場合に、比較的一定の治療レベルで軟骨保護剤を送達するように適合され得、それによって、副作用を低減し、そして作用のより長い持続期間を提供する。
用語「貯蔵（ｄｅｐｏｔ）」は、本明細書中で使用する場合、意図された作用の部位または意図された作用の部位から離れた部位に送達された、薬物送達系を意味することが意図され、これは、徐放のための治療剤のレザバを提供する。
個々の薬剤は、均質な混合物中で配合され得るか、別個のミクロ粒子、ミクロスフィアなどの混合物または投与であり得るか、あるいは同時かつ別個に投与され得る。
有害または望まれない全身効果を最小化するために、本発明の１局面において、治療ストラテジーは、軟骨（特に関節）を含む身体中の部位に優先的に標的化される送達ビヒクル中の薬剤の組み合わせを送達することである。本明細書中で使用する場合、「標的化送達ビヒクル」は、薬物の全身送達のために使用され得、そして適合されていない送達ビヒクルを使用してか、または送達ビヒクルの非存在下で関節または所望の局所的作用部位に他の方法で達するよりも、より大量の薬物が、関節または所望の局所的作用部位に達するように適合される、送達ビヒクルである（すなわち、標的化送達ビヒクルが、分子、細胞または関節の解剖学的構造と優先的に会合するので、薬物は、関節に優先的に局在化される）。同様に「標的化送達系」は、１つ以上の治療薬物を含むこのような標的化送達ビヒクルである。「標的化薬物」は、標的化構造に直接連結または結合された治療剤をいうことを意図する。本明細書中で使用する場合、関節または他の所望の局所的作用部位での「優先的な効果」を有する全身投与された薬物は、身体中の他の部位の大部分においてよりも、関節または他の所望の局所的作用部位にて、より高い薬理学的活性を示す。
（１．標的化原理）
ＯＡにおいて、正常な軟骨細胞機能の抑制、またはこれらの細胞が、修復速度を、増大したマトリックスの分解速度と一致させることが構成的にできないことのいずれかが存在し得る。種々のサイトカインおよび炎症メディエータが、軟骨細胞の合成機能に不均衡を生むか、あるいは、種々のマトリックス分解酵素（マトリックスメタロプロテイナーゼ（コラゲナーゼを含む）を含む）をアップレギュレートすることによって、軟骨マトリックス代謝を増大させるかのいずれかであることが示されている。従って、軟骨細胞外マトリックス（ＣＥＭ）の完全性の喪失は、軟骨同化プロセスの合成活性と、分解を導く異化活性との間の動的な不均衡の結果である。
サイトカイン、増殖因子および他の生体活性分子の全身投与は、しばしば、重篤な副作用を伴う。例えば、病理学的影響が、ＴＧＦ−β１および他の因子の全身投与と相関してきた。さらに、未保護（裸）のポリペプチドの全身送達は、しばしば、前述のように、多関節関節症について好ましく、しばしば、循環における治療タンパク質の迅速な分解および不活化に起因する、タンパク質因子の安定性に関する問題によって制限される。
ＯＡおよびＲＡにおける関節軟骨の分解は、おそらく、関節の微小環境における異化因子の合成および放出に関連する。以前の研究により、炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１）および誘導性遺伝子（例えば、ＮＯシンターゼ、ＣＯＸ−２、ＭＭＰ）が、炎症性関節炎を有する患者由来の滑膜において高度に発現されることが実証されている。同様に、これらのメディエータおよび遺伝子は、ＯＡに罹患した軟骨細胞においてしばしば発現される。両方の場合において、これは、関節軟骨の状態に決定的に影響を与える病態生理学的環境を規定する、関節の特定化された微小環境である。この理由のために、関節空間内のその意図された標的に優先的に局在し、そしてこの標的に作用するように、治療分子を標的化することが所望される。本発明のこの局面は、全身投与された同化軟骨保護剤および／または全身投与された異化阻害軟骨保護剤、ならびに好ましくはこれら両方を、関節の軟骨保護のために関節に標的化するための機構を提供する。
従って、好ましい送達経路は、これらのタンパク質因子を関節内の作用部位に標的化することである。臨床的使用を達成するために、安全な方法が、持続されかつ局在化された様式で、患者の関節内にこれらの薬剤を送達するために必要とされる。全身投与された同化因子および／または異化阻害因子を保護しかつ安定化し（関節の外側ではあるが）、そして関節に薬物送達ビヒクルを標的化するための独自の方法を同時に提供する、生体分解性薬物送達ビヒクルもまた、所望される。
軟骨同化増殖因子は、関節軟骨中の局所的生物学的応答を誘発するための最少量で、関節内に局所的に身体によって分泌される、強力なメディエータである。正常な生理学的条件下で、適切な同化増殖因子は、軟骨マトリックスの代謝に影響を与えることによって、健康な安定状態の軟骨を維持するために必要なシグナルとして作用するのに十分な濃度で、関節内の軟骨細胞および他の関節構造体内の滑液細胞（ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）によって産生される。
（２．抗体標的化送達ビヒクル）
本発明の好ましい標的化軟骨保護組成物は、標的化送達ビヒクル内に含まれた、少なくとも１つの同化促進軟骨保護剤および／または少なくとも１つの異化阻害軟骨保護剤を含み、そして好ましくは、同化促進軟骨保護剤および異化阻害軟骨保護剤の両方を含む。この標的化送達ビヒクルは、好ましくは、少なくとも１つ、そして好ましくは全ての軟骨保護剤をカプセル化する、粒子を含み、そして最も好ましくは、ナノ粒子を含む。これらの粒子は、粒子に結合された標的化抗体または抗体フラグメントによって、関節に標的化され、この抗体またはフラグメントは、関節内に局在する（すなわち、体内のほとんどの他の位置に対して、関節内で優先的に発現され、好ましくは、関節内で高度に発現され、そしてより好ましくは関節に発現が限定されている）抗原決定基に特異的である。抗体標的化粒子（本明細書中で、「標的化免疫粒子（ｉｍｍｕｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）」とも称される）およびその中にカプセル化された軟骨保護剤は、全身投与される。標的化組成物の一部は、関節によって取り込まれる。残りの組成物は、排出および／または代謝される。関節内で、標的化された抗体またはフラグメントは、標的化された抗原に結合する。経時的に、粒子は、関節内で分解し、滑液細胞および軟骨細胞を含む、調節されるべき細胞（例えば、関節の初代細胞）に対して局所的に作用するように、所定の期間にわたって、徐放性様式で、関節内で局所的に軟骨保護剤の治療的濃度を送達する。治療剤は、滑液中に拡散または放出されて、関節構造内の細胞表面に引き続いて結合し得るか、取り込みを受けるか、または関節構造の細胞に進入し得るか、あるいは、滑液内に存在し得るサイトカインおよび／またはプロテアーゼに対して直接作用し得る。
本発明のこの局面の標的組成物は、関節疾患の基礎となる特定の分子病理学の知識を用いずに、本発明に従って患者の関節に対して標的化とされ得る。標的抗体は、カプセル化薬剤が、好ましくは関節内に局在すること、そしてより好ましくは関節軟骨の構成要素に局在化するかまたは結合することを保証する。
このように、本発明のこの局面は、薬学的調製物（標的薬物送達ビヒクルを含む（好ましくは軟骨同化作用作用剤および抗異化作用作用剤の両方を含む））の投与によって、炎症性疾患または非炎症性疾患あるいは他の関節疾患（１つまたは複数の関節を含む）に罹患する患者を治療する方法を提供する。このような患者は、ＯＡ、ＲＡまたは他の関節疾患（例えば、非炎症性関節炎および炎症性関節炎（ニューロパシー性関節症、急性リウマチ熱、オクロノーシス、全身性エリトマトーシス、若年性リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、および他の脊椎関節症および結晶性関節症を含むが、これらに制限されない））に罹患し得る。本発明のこの局面の標的処置方法および組成物は、変形性関節症の罹患患者に特に良好に適する。関節に標的化されキャリアにおける薬剤の組み合わせ全身性の送達によって、このような条件の処置が可能となり、その一方で、有害の全身性効果または望ましくない全身性効果が最小限になる。
（Ａ． 関節内標的の特徴付けおよび同定）
本発明は、関節に対する薬物の標的のための方法および組成物を提供し、そして関節内の好ましい標的（関節軟骨および他の関節構造の分子、細胞および組織に関連した抗原決定基を含む）を特定する。このような標的の例は、以下より選択される：コラーゲン（コラーゲンＩＩ型および微量コラーゲンＶ型、ＶＩ型、ＩＸ型、Ｘ型およびＸＩ型；プロテオグリカン（大凝集プロテオグリカン、アグレカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリンおよびルミカンが挙げられる）；軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質、糖タンパク質−３９；プロテオグリカンコンドロイチン硫酸およびグリコサミノグリカン；マクロファージ滑膜細胞および線維芽細胞滑膜細胞；ならびに軟骨細胞。
好ましい実施形態において、標的免疫粒子は、関節内の関節軟骨の特定の構成成分（硝子軟骨としても知られる）と、不可逆的に反応するか、可逆的様式で結合するか、または結合する。関節内の他の分子標的としては、関節軟骨細胞外基質の構成成分（例えば、軟骨特異的コラーゲン（コラーゲンＩＩ型、Ｖ型、ＶＩ型、ＩＸ型、Ｘ型およびＸＩ型、アグレカンおよび他の小さなロイシンリッチプロテオグリカン（デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリンおよびルミカンが挙げられる）が挙げられる）が挙げられ得る。プロテオグリカンは、タンパク質と多糖類の高分子量複合体であり、脊椎動物の構造組織（例えば軟骨）全体に見られるが、細胞表面にも存在する。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、プロテオグリカンにおける多糖類単位は、アミノ糖グルコサミンまたはガラクトサミンの酸性二糖類含有誘導体のポリマーであり、そして有用な標的である。軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質（ＣＯＭＰ）および糖タンパク質−３９（ＨＣ−ｇｐ３９、ＹＫＬ−４０とも言われる）は、同様に有用な標的である。
関節軟骨は、分子標的として本発明で有用なコラーゲンのいくつかの遺伝的に異なった型を含み、その分子標的に対して、免疫粒子（対応する抗体を含む）が結合し、その結果、カプセル化治療薬剤の抗体結合部位への送達を可能にする。ＩＩ型コラーゲンは、関節軟骨の第１コラーゲンであり、関節軟骨または硝子軟骨の総コラーゲン内容物の９０％〜９５％を占め、そして電子顕微鏡によって示される直交する（ｃｒｏｓｓ−ｂａｎｄｅｄ）繊維構造を形成する。ＩＩ型コラーゲンはまた、硝子軟骨の唯一のおよび特定のマーカーである。Ｈｏｌｌａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：１７２２（１９９４）；Ｆｒｅｅｄ，Ｌら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２４０：５８（１９９８）。コラーゲン分子の主要な細胞外修飾は、原線維形成後に生じ、共有結合の繊維内架橋の進展である。ＩＩ型コラーゲンに特異的なエピトープに結合する抗体は、Ｋａｆｉｅｎａｈ，Ｗら、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８：８１７〜８２６（２００２）；Ｋｏｌｅｔｔａｓ，Ｅら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ４０：１１４６〜１１５６（２００１）に記載されている。関節軟骨内のＩＩ型コラーゲンおよびその関連エピトープは、本発明の好ましい標的を示す。
例えば、ＩＩ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体、アイソタイプＩｇＧ１（クローン６Ｂ３という）（Ｌｉｎｓｅｎｍａｙｅｒ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９２（２）：４４０〜６（１９８０））は、同一の一次構造を有するα１（ＩＩ）鎖およびα３（ＸＩ）鎖の両方を認識する。ウエスタンブロット法において、このｍＡｂは、哺乳類のコラゲナーゼによる消化後のラチリスムＩＩ型コラーゲンのＴＣＡフラグメントと反応する。このｍＡｂはまた、ペプシン消化されたＩＩ型コラーゲンとも反応する。そのエピトープは、ＩＩ型コラーゲンの三重ヘリックスに局在しそして、Ｉ型コラーゲンまたはＩＩＩ型コラーゲンと交差反応を示さない。コラーゲンＩＩのシアンブロマイド（ＣＮＢｒ）ペプチドのイムノブロットによって、このｍＡｂがＣＢ１１フラグメントと反応し、そのフラグメントは、インタクトなＩＩ型分子に沿った免疫原性エピトープ部位であることが占められる。
さらなる別の実施例において、ＩＩ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体（アイソタイプＩｇＧ１）（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１：４９０３〜４９０９（１９７２）；Ｇｌａｎｔ，Ｔ．Ｔ．ら、Ｈｉｓｔｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８２：１４９〜１５８（１９８５ａ））；Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ９０：７５７〜７６６（１９９５））は、免疫源としてヒト軟骨特異的ＣＮＢｒ切断コラーゲンＩＩを用いて開始された。このｍＡｂは、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から市販されており、ペプシン可溶化ヒトおよびウシＩＩ型コラーゲン、およびＣＮＢｒ切断ヒトおよびウシＩＩ型コラーゲンの両方と反応する。コラーゲンＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型およびＩＸ型では、交差反応は観察されなかった。本発明の好ましい実施形態において、タイプＩＩコラーゲンは、０．１ｎＭ〜１０ｎＭの一定範囲の解離定数で標的エピトープと結合する。
関節軟骨の定量的微量コラーゲンはまた、基質の構造に寄与し、そして本発明の有用な標的として有用である。例えば、ＩＸ型コラーゲンは、短い非繊維コラーゲンであり（グリコサミノグリカン鎖を含み、従ってまた、プロテオグリカンと考えられている）、ＩＩ型コラーゲン線維と共有結合し、そして原線維を一緒に結合され得るか原線維と他の基質分子と結合させ得る。ＸＩ型コラーゲンは、微量な原線維コラーゲンであり、ＩＩ型原線維の直径の制御に関係し得る。他のコラーゲン（Ｖ型およびＶＩ型を含む）はまた、基質の部分を形成し得る。これらの関節軟骨の微量コラーゲンはまた、抗体指向性免疫粒子と適切な抗体との結合のための標的として機能し得る。
本発明の別の実施形態において、関節軟骨に含まれた異なった型のプロテオグリカンは、免疫粒子の結合のための分子標的として本発明中で有用であり、その結果、治療薬剤の抗体結合部位への送達を可能にする。関節軟骨においてプロテオグリカンは、固相の２番目に大きい部分を構成し、湿重量の５％〜１０％を占める。関節基質のプロテオグリカンは、主に大凝集プロテオグリカン（５０％〜８５％）および大非凝集プロテオグリカン（１０％〜４０％）からなる。異なった小さなプロテオグリカンもまた、存在する。
組織の物質特性に最も有意に寄与する軟骨のプロテオグリカンは、大きな高分子量モノマー（分子量１〜４×１０６）である。構造的に、大きなプロテオグリカンは、いくつかの異なる領域を有する伸長タンパク質コアからなる：２つの球状ドメインを有するＮ末端領域（Ｇ１およびＧ２）、ケラタン硫酸リッチな領域、いくつかの散在性ケラタン硫酸および中性のオリゴ糖鎖をも含み得るコンドロイチンチン硫酸リッチなより長いドメイン；およびＣ末端球状ドメイン、Ｇ３。凝集体は、Ｇ１球状ドメインでのヒアルロン酸の鎖と結合する多くのプロテオグリカンモノマーによって形成される。各プロテオグリカンヒアルロン酸結合は、分離型球状結合タンパク質（分子量４１，０００〜４８，０００）によって安定化される。コンドロイチン硫酸リッチ領域の大きなサイズ（２００ｎｍ〜４００ｎｍ）およびコンドロイチン硫酸プロテオグリカン凝集体の鎖の多さによって、凝集体が本発明のこの側面の標的免疫粒子の好ましい標的になる。
本発明の免疫粒子と結合した抗体またはそのフラグメントのさらなる標的は、ＨＣｇｐ−３９によって提供される。関節内において、適切な抗原特性を有するＨＣｇｐ−３９のフラグメントはまた、薬物送達ビヒクルを標的化するのに十分である。
免疫粒子は、抗体またはそのフラグメントを用いて標的化され得、関節の滑膜の特定の構造と不可逆的に反応するか、可逆的な様式で結合する（最も一般的）か、または結合する。好ましい標的である関節の特殊な細胞としては、滑膜の２つの主要な細胞型、（マクロファージ滑膜細胞（Ａ型）および線維芽細胞滑膜細胞（Ｂ型））が挙げられる。
本発明の免疫粒子に結合する抗体またはそのフラグメントのさらなる標的は、軟骨細胞である。これらの細胞は、その表面に存在し、そして細胞標的に対してエピトープとして働き得る複数のタンパク質を発現することが公知である。
本発明の別の実施形態において、関節軟骨に結合するコンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、標的薬物送達系の好ましい標的を示す。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンに特異的なエピトープと結合する本発明に有用であるモノクローナル抗体が記載されている。Ｍｏｒｇａｎ Ｊｒ．，Ａ．ら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １：２７〜３６（１９８１）；Ｓｃｈｒａｐｐｅ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：３８３８〜３８４４（１９９２）；Ｓｃｈｒａｐｐｅ，Ｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：４９８６〜９３（１９９１）。１つのこのような例は、マウス抗ヒトコンドロイチン硫酸プロテオグリカンモノクローナル抗体（クローン９．２．２７（ＩｇＧ２ａアイソトープ）と示される）である。９．２．２７抗体は、２５０ｋＤａの成熟コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコア糖タンパク質ならびに２１０ｋＤａ、２２０ｋＤａおよび２４０ｋＤａの前駆体ポリペプチドを認識する。マウス抗ヒトアグリカンモノクローナル抗体（クローン２Ａ２．１）はまた、本発明に適切であり、そしてＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ）から市販される。この抗体は、コンドロイチン硫酸結合領域と反応しない。透過型電子顕微鏡によって、この抗体がコンドロイチン硫酸結合領域のＮ末端部分と結合することが示される。
（Ｂ． 軟骨変性と関連する新規のエピトープの標的化）
正常成人軟骨に存在し得ないか、あるいは非常に低レベルに存在し得るが、ＲＡまたはＯＡいずれかの特定のステージで増大するかまたはより高く発現するかのいずれかであり得る、軟骨の生体分子構成成分はまた、本発明の標的薬物送達系の標的として働き得る。軟骨変性条件に関連した好ましい標的は、ＯＡ、ＲＡ、または他の変性関節疾患（例えば、アグリカンまたは他の軟骨プロテオグリカンのネオエピトープ）と診断された患者の関節軟骨に見られるネオエピトープであり、そして、具体的には、このような患者の関節軟骨の表面層に免疫局在化する新規エピトープである。
本発明の１つの側面において、標的抗体または抗体フラグメントは、タイプＩＩコラーゲンまたはタイプＩＩコラーゲンフラグメントのネオエピトープまたは切断部位（特に基質メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−１、３、８または１３あるいはＭＭＰタンパク質のファミリーの他のメンバー、あるいはトロンボスポンディンモチーフ（ＡＤＭＡＴＳ）を有するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼタンパク質ファミリーのメンバーの個々の作用または組み合わせ作用によって産生された、このようなネオエピトープまたは切断部位）と、特異的に結合する。さらに、ＡＤＭＡＴＳは特許出願ＷＯ ００／０４９１７、ＥＰ ０ ８２３ ４７８および米国特許第５，８１１，５３５号およびＴａｎｇ，Ｂ．らＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４４５（２−３）：２２３〜２２５（１９９９）に記載されている。
ＩＩ型コラーゲン構造の特定領域で定義された特定エピトープにおいて指向される抗体は、本発明の組成物の標的に有用である。これらの構造領域は、一部、ＯＡおよびＲＡに生じるＩＩ型コラーゲンの変性によって影響される軟骨において重要である。ＩＩ型コラーゲンの変性によって、軟骨基質から放出され、そして滑膜液中に現れ、循環系に移行し、そして尿を介して排出されるコラーゲンタンパク質のフラグメントを生じる。最大限の有用性を有するために、本発明の組成物は、放出されたフラグメントではなく、軟骨基質と物理的に結合したままのエピトープを標的にする。
各々のコラゲナーゼ、ＭＭＰ−１（ＥＣ３．４．２４．７）、ＭＭＰ−８（ＥＣ３．４．２４．３４）、およびＭＭＰ−１３（ＥＣ３．４．２４．−）は、三重らせん線維形成ＩＩ型コラーゲンを切断する能力を有し、大きな（３／４の長さ）のアミノ末端フラグメントおよびより小さな（１／４の長さ）カルボキシ末端フラグメントを生じる。Ｋａｆｉｅｎａｈ，Ｗ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３１：７２７〜７３２（１９９８）。それらのコラゲナーゼは全て、初めに特定のＧｌｙ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ結合を切断し、特徴的な３／４フラグメントおよび１／４フラグメントを産生する。特定のコラゲナーゼアイソタイプは、軟骨の病理学的損失に関連付けられた。Ｂｉｌｌｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１５３４〜１５４５（１９９７）。例えば、ＯＡの動物モデルにおいて、コラゲナーゼ１タンパク質およびコラゲナーゼ３タンパク質の焦点領域は、膝関節のＯＡ損傷部位の細胞外マトリックスに局在され、３／４〜１／４コラーゲン切断と一致した。コラゲナーゼ３タンパク質また、疾患関節中の内側脛骨軟骨全体に豊富であった。Ｈｕｅｂｈｅｒ，Ｊ．ら、ＡｒｔｈｒｉｔｉｓおよびＲｈｅｕｍａｔｉｓｍ ４１：８７７〜８９０（１９９８）。
コラゲナーゼ１（ＭＭＰ−１）は、ＲＡおよびＯＡを有するヒトから得た滑膜、滑膜液、軟骨サンプルにおいて検出された。コラゲナーゼ３（ＭＭＰ−１３）は、コラゲナーゼ１より５倍〜１０倍早い割合でコラーゲンＩＩ型を切断する。重要なことに、ＭＭＰ−１３は、ＲＡおよびＯＡを有するヒトの滑膜中、ならびにヒトＯＡ軟骨中で同定された。
線維コラーゲンは、らせん切断によって損傷を受け得、変性を生じ、あるいはテロペプチド切断によって、架橋結合の除去を生じる。２つの研究によって、ＩＩ型コラーゲンのらせん領域内（その領域はコラゲナーゼ切断に起因して巻き戻されるコラーゲン上に曝される）の潜在的エピトープおよびコラゲナーゼによって産生されたコラーゲンネオエピトープに特異的なポリクローナル抗血清を用いた軟骨中の活性コラゲナーゼの存在を示す。これらの発見によって、コラゲナーゼ１、コラゲナーゼ３またはその両方が、種々の皮疹と関連した軟骨分解に関与する。このように、コラゲナーゼ切断から得たＩＩ型コラーゲンの特定の分解は、本発明の特定の標的化局面に有用である抗体標的のネオエピトープを産生する。これらのネオエピトープは、α１（ＩＩ）鎖のＮ末端の３／４フラグメント配列内に位置し、そのフラグメントはＡＨ１２Ｌ３およびＣＢ１１Ｂ（抗体ＣＯＬ２−３／４ｍによって認識される）に対するエピトープを含むことが公知である。
皮疹において、軟骨プロテオグリカン、アグレカンの同化作用の増加は、関節軟骨の分解を導く主要な病理学的プロセスの１つである。硫黄化グリコサミノグリカンの結果的な損失は（硫黄化グリコサミノグリカンはアグレカン分子の内因性成分である）、軟骨基質の機能的完全性および構造的完全性に欠陥を生じる。一定期間にわたって、このプロセスは、軟骨分解に通じる。アグカンのインサイチュ分解は、コアタンパク質内に位置する特定のペプチドの切断に関連するタンパク質分解的プロセスである。このプロセスに寄与する最もよく特徴付けられた酵素活性は、メタロプロテイナーゼの特定の作用の結果である。基質メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）によるインビトロアグレカン分解が広く研究された。しかし、関節軟骨におけるインサイチュアグレカン分解を担う主要なプロテナーゼがアグレカナーゼであり、最近同定されたアイソフォームは、トロンボスポンジンのモチーフ（ＡＤＡＭＴＳ）を有するジスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ遺伝子ファミリーのメンバーである。モノクローナル抗体技術は、アグレカンまたはアグレカン分解産物上の新規ネオエピトープの同定のために存在する。さらに、本発明の別の局面は、アグレカンまたはアグレカンフラグメント上のネオエピトープに結合するこのようなモノクローナル抗体またはそのフラグメントの使用であり、同化作用作用促進薬剤および異化作用作用インヒビターの組み合せを含むナノ粒子を標的にする。
一時的な研究によって、アグレカナーゼが、関節炎の関節疾患の初期段階における関節軟骨から得たアグレカンの同化作用および損失を第一に担う。連続であるが、このプロセスは、コラーゲン異化作用を大いに進行させるように思える。疾患プロセスの後半の段階において、コラーゲン異化作用が起こっている場合、軟骨に残っているアグレカンの少ない割合のＭＭＰ媒介分解の証拠が存在する。
基質分解酵素の異なったファミリーに独特なおよび特徴的な特定の切断部位を同定するためのタンパク分解産物上の異化作用的なネオエピトープを同定するためにモノクローナル抗体技術を開発しそして使用することが可能となった。これらの研究において、いくつかのモノクローナル抗体が、アグレカンの球間（ＩＧＤ）ドメイン上の作用アグレカナーゼ（またはＭＭＰ）によって産生された、特異的に同定された異化作用ネオエピトープ（タンパク質分解切断産物の特異的なＮ末端アミノ酸配列またはＣ末端アミノ酸配列として産生された新規エピトープ）が、特徴付けられた。これらの抗体は、アグレカンおよび結合タンパク質のタンパク質分解をモニターするために使用された。さらに、当業者は、軟骨代謝の間に産生された基質タンパク質の分解産物上のネオエピトープを認識する抗体の使用が、本発明の範囲を逸脱することなく、関節に対して免疫粒子を標的化するために使用され得ることを理解する。
本発明の別の局面において、標的抗体または抗体フラグメントは、関節内のアグレカンまたはアグレカンフラグメントのネオエピトープまたは切断部位（特に、ＭＭＰ−１、３、８、または１３、あるいはＭＭＰタンパク質ファミリーの他のメンバーあるいはＡＤＭＡＴＳタンパク質ファミリーのメンバーの個々の作用または組み合わせ作用によって生成されるような切断部位）と特異的に結合する。アグレカンまたはアグレカンフラグメント内の異なった構造的エピトープまたはネオエピトープを認識するモノクローナル抗体の例は、８−Ａ−４またはＢＣ−３である。ＭＡｂ ２−Ｂ−６は、アグレカナーゼ、ＭＭＰあるいはアグレカンのコアタンパク質に沿う多くの部位の他のタンパク質分解活性のいずれかから生じる膨大数のアグレカン分解産物を検出するために使用された。ＭＡｂ ２−Ｂ−６は、これらのコアタンパク質フラグメントと結合するコンドロイチン硫酸の４−硫化不飽和二糖類を認識する。関連抗体のＭＡｂ３−８−３はまた、種々の脱グリコシル化アグレカン代謝物含有６−硫化コンドロイチン硫酸オリゴ糖を同定するために使用された。ＭＡｂ ＢＣ−３は、アグレカンの１ＧＤドメイン内のアグレカナーゼ異化作用作用の後に産生されたアミノ酸配列（アラニン−アルギニン、グリシン（ＡＲＧｘｘ．．．））によって定義されたＮ末端ネオエピトープ配列を認識する。
ＡＤＡＭＴＳ−４遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ−００５０９９）およびＡＤＡＭＴＳ−５遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ００７０３８）は、ディスインテグリンおよびトロンボスポンジンモチーフ−４および５を有するメタロプロテイナーゼをコードし、それらはＡＤＡＭＴＳタンパク質ファミリーのメンバーである。そのタンパク質ファミリーのメンバーは、いくつかの異なったタンパク質モジュール（プロペプチド領域、メタロプロテイナーゼドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、およびトロンボスポンジン１型（ＴＳ）モチーフ）を含む。このファミリーの個々のメンバーは、Ｃ末端のＴＳモチーフの数が異なり、そしてメンバーの中には、特有のＣ末端ドメインを有するものもある。ＡＤＡＭＴＳ−４遺伝子によってコードされた酵素は、Ｃ末端ＴＳモチーフを欠く。ＡＤＡＭＴＳ−５遺伝子によってコードされた酵素は、２つのＣ末端ＴＳモチーフを含み、そして軟骨の主要なプロテオグリカンであるアグレカンを切断するためのアグレカナーゼとして機能する。このように、これらの酵素の両方は、アグレカンの分解ならびにアグレカンおよびアグレカンフラグメント上のネオエピトープの産生を担う（Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ，Ｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（３３）：２５７９１〜２５７９７（２０００）；Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ，Ｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２４）：１８５６６〜１８５７３（２０００）；Ａｂｂａｓｚａｄｅ，Ｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（３３）２３４４３〜２３４５０（１９９９））。
ＯＡの硬化におけるヒト軟骨の処置のための本発明の別の実施形態において、ＯＡの初期の生化学的ネオエピトープマーカー（３−Ｂ−３（−）と呼ばれる）を標的する抗体が、使用される。３−Ｂ−３（−）エピトープは、アグレカンのコンドロイチン硫酸（グルコサミノグリカン）鎖の末端におけるＯＡ関連の表現型の変化である。
（Ｃ． 標的抗体の特徴付け）
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原と特異的に結合するか免疫反応する抗原結合部位を含む分子）を含むことを意図する。この用語は、抗体が天然に産生されるかまたは合成されるかのいずれにせよ、免疫グロブリンを示す。抗体を含むタンパク質は、部分的または全部のいずれかで天然供給に由来し得るかまたは合成的に生成され得る。抗体の例としては、全ての免疫グロブリンサブタイプおよびＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、ならびに米国特許第５，５３４，２５４号で開示されるフラグメントが挙げられる。ＳｃＦＶは、免疫グロブリン分子の単鎖最小結合ドメインをいう。用語「抗体」はまた、軟骨代謝を調節する１つ以上の遺伝子の発現または活性を調節するために、細胞外空間、細胞の形質膜、あるいは細胞の細胞内領域（例えば、細胞質または核）で機能する抗体をいうことが意図される。本発明での使用のための好ましい抗体としては、ヒト化抗体、キメラ抗体およびヒトモノクローナル抗体が挙げられる。
抗体の内容物において、用語「フラグメント」は、上記で定義された任意の標的ポリペプチドの一部であるアミノ酸の任意の配列をいい、本発明における標的化の目的での全抗原に対する、起源、構造およびメカニズムならびに機能的等価物の共通の関連要素を有する。本明細書中で記載された組成物および方法における抗体の記載はまた、このような抗体のフラグメントの使用を含むことを意図する。
本発明の好ましい実施形態は、ナノスフェア（ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ）または本発明の治療用軟骨保護剤がカプセル化される他の粒子の表面に共有結合される、ヒト化抗体、またはヒト抗体あるいはそのフラグメントを使用する。抗体またはそのフラグメントは、治療用軟骨保護剤がカプセル化される粒子の表面上の標的分子として好ましい。なぜなら、それらがインビボで十分安定であり、そして血清含有細胞外流体タンパク質によって粒子の表面から除去される最小限の能力を示さなければならないからである。完全なヒトモノクローナル抗体またはヒト化マウス抗体は、軟骨細胞外基質の任意の分子または関節の細胞と結合するが、ヒト患者に投与されるための治療薬の送達を指向する関節標的抗体の型として最も有用であると予想される。なぜなら、それらが投与の際に免疫応答を生じないからである。
例えば、マウスモノクローナル抗体は、ヒト定常ドメイン領域およびＦｃ領域をコードするヌクレオチド配列を用いて、マウスＦｖ領域をコードする（すなわち抗原結合部位を含む）ヌクレオチド配列を遺伝的に組み換えることによてキメラ化され得る。いくつかのマウス残基はまた、ヒト可変領域フレームワークドメイン内で維持され得、適切な標的部位結合特性を保証する。標的化における使用のためのヒト化抗体は、宿主レシピエントにおける抗体またはポリペプチドの免疫反応性を減少させる利点を有することが認識され、そしてインビボでの半減期を増加させ、そしてナノ粒子または他のカプセル化粒子の表面上の結合体化抗体との有害な免疫反応の可能性を減少させるために有用であり得る。
ヒト患者の処置のために完全なヒト特性を有する抗体またそれらのアナログを用いることは大いに利点がある。米国特許第６，０７５，１８１号、同第６，２３５，８８３号、および同第６，４９２，１６０号ならびに特許出願ＥＰ １ １６７ ５３７ Ａ１で開示される方法と同様の方法が用いられ得、その開示は本明細書中に参考として明確に援用されている。このような方法は以前から、ヒトＩＬ−８および上皮増殖因子レセプターに対する種々の完全なヒト抗体を産生するために使用された。本発明の最も好ましい実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、０．１〜１０ナノモルの一定範囲の解離定数で、標的エピトープと結合する。
完全なヒト抗体またはヒト化抗体がヒト患者の処置のために本発明において使用されることが好ましく、その一方で、本発明の方法および組成物がまた、関節分解を受ける他の哺乳動物（例えば、ウマおよびイヌ）の処置のための獣医学的適用において有用であるとも理解されるべきである。
（Ｄ． 標的送達のための軟骨保護剤）
本発明の標的実施形態の好ましい局面は、ナノ粒子または他の送達ビヒクル内にカプセル化されるかまたはナノ粒子または他の送達ビヒクルに含まれる少なくとも１つの軟骨保護剤を包含し、そこに標的抗体、抗体フラグメントまたは他の標的構造が結合される。カプセル化剤または含有剤は、本明細書中で開示される同化作用軟骨保護剤または異化作用抑制剤のいずれかであり得る、選択されたナノ粒子または他の送達ビヒクル中にカプセル化または含有されるようにする化学的特性または構造的特性を有する。さらに、覆われていなければ、全身投与から代謝的分解を大いに受け易いか、または標的化せずに全身投与された場合有害な副作用を起こす薬剤（例えば、タンパク質およびペプチド）が、標的として好ましい。例えば、下記の本明細書中で開示される同化作用軟骨保護剤の各々のクラス（形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−βスーパーファミリーのメンバー（ＴＧＦ−βアゴニストおよび骨形態形成タンパク質アゴニスト、インスリン様増殖因子ならびに線維芽細胞増殖因子を含む）を含む）および下記の本明細書中で開示される特定のクラスの異化作用抑制剤（インターロイキン−１レセプターアンタゴニストおよびＴＮＦ−αレセプターアンタゴニスト）はタンパク質であり、そしてこのような薬剤が、標的カプセル化形態における送達に十分適切である。
本発明の最も好ましい標的カプセル化組成物としては、同じ標的化免疫粒子（または他の標的粒子）中にカプセル化された同化作用軟骨保護剤および異化作用抑制軟骨保護剤（好ましくは両方の薬剤がタンパク質である）の両方が挙げられる。あるいは、各薬剤は別々にカプセル化され得、そしてその２つ（または２つより多い）の型の標的粒子の混合物が投与されるか、またはより好ましくはないが、２つ以上の標的薬剤が別々に（同時にあるいは連続的にのいずれかで）送達され得、その結果関節内に薬剤の共存が生じる。
いくつかの例において、同化作用軟骨保護剤のみあるいは異化作用抑制剤のいずれかが、カプセル化を受け易いか、または１つの薬剤が所望でない全身性副作用と関連があり得ない。このような例において、１つの薬剤は、カプセル化標的化形式で送達され得る一方で、他の薬剤は非標的化非カプセル化形式で、混合物として同量形式で一緒に送達されるか、あるいは別々に送達されるかのいずれかである。
同化作用剤および異化作用抑制剤の両方を投与するほど好ましくなく、上述のこの組み合せによって提供された利点の全てが与えられた場合、関節内に局在化した抗原を標的とする免疫粒子内にカプセル化された単一の軟骨保護剤（同化作用促進剤または異化作用抑制剤のいずれか）の送達がまた、可能である。
（Ｅ． 薬剤のカプセル化）
物質のサイズは、その物質が滑膜の毛細管壁を透過でき、そして全身循環から関節内へ移行できるか決定するための主要な要素である。滑膜毛細管壁を越えて移動できる粒子の最大直径は、一般的に５０ナノメーターであると考えられている。しかし、直径２４０ナノメーターまでのレシチンコート化ポリスチレン粒子を用いた、ラットの滑膜毛細管のいくつかの透過性研究は、トランスサイトーシスを介して滑膜毛細管壁を通して輸送され得る。本発明は、カプセル化粒子（例えば、ナノ粒子（好ましくはナノスフェア））（これは、サイズ分布に制限される）のクラスを好ましくは用いることによって、滑膜透過バリアによって課された制限を克服する。
本発明の徐放性投薬形態は、その中に分散された治療的薬剤を有するマイクロ粒子および／またはナノ粒子を含み得るか、または純粋で、好ましくは結晶性固体形態の治療薬剤を含み得る。本発明のこの局面の治療的投薬形態は、徐放性放出に適した任意の形状であり得る。本発明の好ましい徐放性治療投薬形態は、以下のサイズ、生体分解特性および生体適合性特性を有する。
本発明の標的化送達システムは、好ましくは、直径約５ナノメートル〜約７５０ナノメートルのサイズに制限されたナノ粒子を利用し、約１０ナノメートル〜約５００ナノメートルが、より好ましく、最も好ましくは、約２０ナノメートル〜約２００ナノメートルである。交互に有用であるが、それ程好ましくないのは、疾患状態において十分な透過性を生じるように実証された場合、直径約１マイクロメートル〜約１００マイクロメートルのサイズ範囲である微粒子であり、約１マイクロメートル〜約２５マイクロメートルが、より好ましく、最も好ましくは、約１マイクロメートル〜約１０マイクロメートルである。
好ましい粒子は、好ましくは約１日間〜約１５０日間、好ましくは約７日間〜約６０日間の間の期間にわたって治療レベルで充填された薬物を生分解して放出する、生分解性構造物であり、約１４日間〜約３０日間がより好ましい。ナノ粒子およびマイクロ粒子からの薬物放出は、物理的プロセス（拡散および分解が挙げられるが、これらに限定されない）の組み合わせにより生じ得、そして各キャリア処方物ならびに同化治療剤と抗異化治療剤との組み合わせにとって特有である、複雑な速度論的プロセスにより記載され得ることが、当業者により理解される。
好ましい粒子は、関節の標的組織および投薬形態が投与される（生体適合性の生分解性生成物を生じることを含む）局所的な生理学的環境に生体適合性である。適切な組成物としては、天然ポリマー（ヒアルロナン、キトサン、コラーゲン、ゼラチンおよびアルギネート）から処方される生分解性粒子が挙げられる。これらの天然ポリマーは、他のポリマーと混合されて、例えば、キトサンおよびゼラチンからなるコポリマー粒子を生じ得る。生分解性の合成ポリ（α−ヒドロキシエステル）（例えば、ポリ乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびコポリマーＰＬＧＡ）は、タンパク質治療剤（例えば、ヒト成長ホルモン）を組み込む微粒子の生成のために、首尾よく使用されている。本発明の標的粒子を調製するために適切であり得る生分解性ポリマーの別の例は、両親媒性ＡＢＡトリブロックコポリマー（例えば、ポリ（エチレンオキシド）：ポリ（３−ヒドロキシブチレート）：ポリ（エチレンオキシド））である。
本発明の選択された軟骨保護剤と共に使用するためのポリマーナノ粒子系を選択する際に、カプセル化される薬物の十分な生物活性を確実にすることもまた、重要である。
標的化された生分解性のポリマーナノスフィアの使用は、カプセル化された治療剤についての選択された異なる放出プロフィールを提供する利点を有する。いくつかの薬物の組み合わせについて、最適な放出動力学は、各活性剤が異なる徐放動力学プロフィールを示して、関節内における最も最適な薬物の薬物動力学を提供する、薬物放出プロセスからなり得る。当業者は、本明細書中の開示に基づいて、ナノ粒子または微粒子からの差異的な放出動力学が、各個々の薬物について変動し、そしてまた、処方の間に粒子に充填される薬物の量、粒子の大きさ、および粒子の組成によって決定される他の物理化学的特性の関数であることを認識する。関節に滞留するカプセル化された粒子からの各薬物の定量的な放出速度は、滑液および関節内空間における最適な治療濃度を得て所望の治療濃度を達成するように調節される。インビトロ研究を、各成分（例えば、同化作用薬物および異化作用インヒビター）が、例えば、７〜３０日間にわたる徐放を示す徐放処方物について、二重放出動力学を特徴付けるように実施し得る。滑液中に放出される各薬物の量を定量するための方法は、当該分野において周知であり、そして放射能標識された薬物の測定を包含し得る。あるいは、蛍光性分子または他の光学レポーター分子を共有結合させて、標識薬物を調製することが可能である。当業者は、各薬剤に特異的な、定量のための多くの間接的方法（例えば、ＥＬＩＳＡまたは質量分析）が存在することを認識する。
実用の理由により、大きさがかなり異なる２つの薬物について（同化作用と異化作用との組合せの多くについての場合と同様に）、類似の放出動力学を達成することは、困難である。例えば、本発明の１つの好ましい実施形態において、２００〜５００の分子量によって特徴付けられ得るｐ３８ ＭＡＰキナーゼインヒビターのような同化作用インヒビター（例えば、ＳＢ２０３５８０、ＭＷ＝３７７）を、同化作用剤（例えば、ヒトＩＬ−１０であり、これは、１６０アミノ酸長であり、そして約１８ＫｄａのＭＷを有する）と共に送達することが望ましい。各薬剤についての徐法速度の独立した制御は、粒子の構造的組成を変化させることによって、そして／または２つ以上の免疫粒子の混合物を作製することによって、達成され得る。この混合物において、１つのセットの粒子は、カプセル化される同化作用剤に対して均一であり、一方で別のセットの粒子は、カプセル化される異化作用インヒビターに対して均一である。これらの２つのセットの投与される粒子は、それぞれの大きさおよびポリマー組成が異なり得るが、適切な場合には、それらの活性剤についての類似の放出速度、または同時であって、カプセル化された薬剤の各々の局所的治療効果をそれぞれ最適にする放出速度によって特徴付けられる。
リポソームは、本発明による軟骨保護剤の標的化全身送達に適切な送達ビヒクルではない。ナノスフィアおよび他の徐放粒子送達系と比較して、リポソームは、循環系内で短い半減期を有する。リポソーム薬物結合体は、肝臓および脾臓においてトラップされ得、リポソーム崩壊および活性薬剤の放出を生じる。従って、薬剤は、間接内に局在するまで保護されるのではなく、活性形態で全身に分布する。標的化されたリポソーム送達系からの薬剤の放出は、さほど維持されず、そして標的化された免疫粒子送達系についてほどには局在しない。これらの理由により、粒子（例えば、ナノスフィア）の使用は、リポソームの使用と比較して非常に好ましい。それでもなお、標的化が非常に望ましい、全身送達される同化作用軟骨保護剤、または同化作用剤を含有する軟骨保護剤の組み合わせについて、標的化リポソームは、適切であることが示され得、そして裸の薬物送達と比較して利点を提供する。
（Ｆ．カプセル化された薬剤への抗体のカップリング）
標的化抗体を徐放ナノ粒子に、共有結合または非共有結合を介して連結するための、代表的な「カップリング」方法としては、標的抗体の反応性基（例えば、ヒドロキシル基、アミノ基、アミド基、またはスルフヒドリル基）と、ナノ粒子または他の標的化ビヒクルの表面に存在する（類似の化学的性質の）他の反応性基との間で反応して結合を形成する、化学架橋剤およびヘテロ二官能性架橋化合物（すなわち、「リンカー」）が挙げられる。標的抗体と粒子または他の送達ビヒクルとの間に形成されるこの結合としては、以下が挙げられ得るが、それらに限定されない：ペプチド結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、アミド結合およびチオエーテル結合。
標的タンパク質（抗体）への、除放される投薬形態の直接の結合体化は、標的分子または細胞の、改変された標的抗体による認識を妨害し得る。リガンドサンドイッチ結合技術は、標的結合タンパク質（抗体）への、除放投薬形態の結合を達成するための有用な代替である。これらの技術は、標的細胞集団に結合しないタンパク質を使用する、一次ペプチドまたはタンパク質のシェルの形成を包含し得る。次いで、結合タンパク質を一次ペプチドまたはタンパク質のシェルに結合させて、機能的結合タンパク質／ペプチドを有する得られる粒子を提供する。例示的なリガンドサンドイッチアプローチは、「直接」結合アプローチに関して上に記載されたような官能基を介しての、アビジンまたはストレプトアビジンの、粒子への共有結合を包含する。結合タンパク質は、官能基化されたビオチンを介して（例えば、活性エステル、ヒドラジン、ヨードアセタール、マレイミジルなどの官能基を介して）、好ましくは最小に誘導体化される。アビジン／ストレプトアビジン一次タンパク質シェルの利用可能なビオチン結合部位へのリガンド（すなわち、結合ペプチドまたはタンパク質／官能基化ビオチン）結合は、飽和量のビオチン化タンパク質／ペプチドの使用を介して起こる。
（３．代用処置および優先効果送達方法）
軟骨保護剤および本発明におけるその組み合わせの標的化の他の方法、または身体の他の部位に対する関節におけるこのような薬剤もしくは組み合わせの優先的な有効性を達成する際の他の方法もまた、本発明の範囲内である。例えば、滑膜の２つの原理的な細胞型（マクロファージ滑膜細胞（Ａ型）および線維芽細胞滑膜細胞（Ｂ型））、ならびに軟骨細胞は、これらの細胞の表面上に存在する種々の独特なタンパク質を発現すること、および特異的細胞標的化のためのエピトープとして働き得ることが公知である。選択薬剤、ならびに好ましくは、関節において優先的に発現されるタンパク質、または炎症関節もしくは疾患関節において優先的に発現されるタンパク質に指向する、同化作用促進剤および異化作用阻害剤の組み合わせは、望ましくない全身の影響を最小にしながら、局所効果を優先的に増加させ得る。
上で議論されたように、関節内の分子標的は、軟骨細胞外マトリックスの成分（軟骨特異的コラーゲンなどであり、コラーゲンＩＩ型、ＩＸ型、Ｘ型、ＸＩ型、アグリカン、および他の小さいロイシンリッチプロテオグリカン（例えば、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリンおよびルミカン（ｌｕｍｉｃａｎ））が挙げられる）を含み得る。標的としてはまた、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）および糖タンパク質−３９（ＨＣ−ｇｐ３９）（ＹＫＬ−４０ともまた称される）が挙げられる。本発明のこの局面において使用するために望ましい標的は、正常な成体軟骨において存在しなくても、非常に低レベルで存在してもよいが、ＲＡまたはＯＡの特定の段階に存在する、生化学的軟骨マーカーである。同様に、軟骨保護剤、ならびに好ましくは、疾患状態もしくは炎症状態においてアップレギュレートされるレセプターに特異的な同化作用促進剤および異化作用阻害剤の組み合わせの選択もまた、身体の他の領域に対して、局所効果を優先的に増加させ得る。
上で注意したように、カプセル化された薬剤は、このカプセル化された薬剤を対応する標的抗体（または抗体フラグメント）にカップリングさせることによって、関節において１つ以上の構造体を標的化し得る。潜在的に、このような抗体はまた、結合における局所環境内で切断される結合を使用して、裸の薬物自体にカップリングし、全身投与された薬物の乾」接への標的化および送達を達成する。同様に、本発明の同化促進および異化阻害の組成物中に含まれる軟骨保護剤は、身体の残りの部分と比較して関節における部位に優先的に作用し、これによって、それらの効果を、滑膜細胞および／または軟骨細胞および／または細胞外マトリックスの成分に付与する。
（Ｅ．送達ビヒクルおよび投薬の選択のための方法）
選択された薬剤を送達するための、本発明に従って使用されるべき特異的なナノスフィア系および標的抗体またはフラグメント、ならびに標的組成物を含むための治療剤の正確な負荷または投薬量は、本発明に従って、分岐的に決定され得る。分析方法は、カプセル化された治療剤を含む抗体標識されたナノスフィア（または他の標的粒子）を、このような診断試験を必要とする患者に接触させる工程、およびこの患者を画像化分析に供して、薬物含有ナノスフィアの位置を決定する工程を包含する。次いで、この患者における関節の沈積物の程度が、画像化分析の使用によって決定され得る。画像化分析は、医学の分野において周知であり、そして限定されないが、Ｘ線分析、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）またはコンピュータ連動断層撮影（ＣＴ）が挙げられる。好ましい実施形態において、関節処置抗体は、患者において画像化され得る検出可能な薬剤で標識され得る。例えば、標的抗体は、造影剤（例えば、Ｘ線分析のために使用され得るバリウム）、または磁気造影剤（例えば、ＭＲＩもしくはＣＴを使用して検出され得るガドリニウムキレート）で標識され得る。他の標識薬剤としては、限定されないが、放射性同位元素（例えば、９９Ｔｃ）が挙げられる。画像化分析に加えて、生検が患者から得られて、関節（例えば、滑膜組織）における粒子の存在および濃度を決定し得る。
本発明の局所送達実施形態は、局所的に送達される場合の、局所的な送達部位（例えば、関節）において予め決定されたレベルの阻害効果もしくは治療効果を提供するために十分な、治療剤についての適切な濃度の観点で記載された。全身送達される場合、より大きい濃度または投薬量の薬剤が、投与のために必要とされる。この全身投薬量および／または濃度は、任意の代謝形質転換プロセスの後に、潜在的な軟骨変性の所望の部位において、所望のレベルの局所治療効果を達成するために必要とされる、十分な活性剤の供給を生じるために必要とされるものである。特に、全身投薬量および／または濃度についての適切な治療レベルおよび好ましいレベルは、局所部位（例えば、関節）において、先に記載された、それぞれ局所送達治療範囲および好ましい濃度範囲内の濃度レベルで、活性剤の供給を生じるものである。
標的化された徐放送達系について、薬剤の十分な投薬量または負荷は、関節または作用部位において、予め決定された徐放期間にわたって、所望のレベルの治療効果を、所望の徐放期間の持続した時間にわたって達成する、局所濃度を生じるように、組成物中に含まれる。従って、十分な投薬量または負荷の薬剤が、関節もしくは関節の局所環境に達する前に起こる薬剤の任意の代謝形質転換を考慮して、関節によって取り込まれる予め決定された量のカプセル化薬剤を生じるように、含まれる。関節に達する、カプセル化薬剤のこの予め決定された量は、本明細書中に含まれる開示に従って、ナノスフィアまたは他のカプセル化送達系が分解する場合に薬剤が局所作用部位において放出されて、その薬剤に対する治療濃度範囲内の局所濃度を徐放の所望の期間の間（例えば、１日〜４週間、より好ましくは、１日と２週間との間の期間）提供するように、決定される。
（ＩＶ．軟骨変性の阻害のために薬剤）
以下は、軟骨保護剤の例示的なクラス、および各クラス内の例示的な薬剤の記載であり、これらは、本発明の組成物において使用するために適切である。理論によって制限されることを望まないが、薬剤を作動可能にすると考えられる、種々のクラスの薬剤の選択の正当化もまた、記載される。
（１．インターロイキン−１（ＩＬ−１）レセプターアンタゴニスト）
インターロイキンＩＬ−１は、２つの形態（ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β）で存在し、これらは、免疫調節機能および炎症促進機能の類似のスペクトルを共有する別々の遺伝子産物から誘導されるポリペプチドである。ＩＬ−１は、１７ｋＤのポリペプチドであり、関節内の多数の細胞型（滑膜線維芽細胞およびマクロファージ、軟骨細胞、内皮細胞、ならびに単球およびマクロファージを含む）に作用し得るし、そして関節内の多数の細胞型により産生もされ得る。ＩＬ−１が、損傷した関節において起こる関節炎症および関節軟骨の病態生理学的な損失において中心的な役割を果たすことの実質的な証拠が存在する。
この軟骨破壊サイトカインの両方の形態の作用は、２つのＩＬ−１レセプター（ＩＬ−１Ｒ）（Ｉ型ＩＬ−１レセプターまたはＩＩ型ＩＬ−１レセプター）のうちの１つによって媒介される。ＩＬ−１レセプターは、構造的に異なり、そして免疫グロブリン結合ドメインの存在によって特徴付けられる別々のスーパーファミリーに属する。これらのレセプターは、免疫グロブリンドメインを有する多のレセプターとの近接したアミノ酸相同性を有する。より大きなＩ型ＩＬ−１レセプターの発現は、Ｔ細胞および線維芽細胞上に存在するが、より小さなＩＩ型ＩＬ−１レセプターは、Ｂ細胞、単球、好中球、および骨髄細胞上に存在する。
ＩＩ型ＩＬ−１レセプターは、ＩＬ−１βと高い親和力で結合するが、ＩＬ−１β結合は、Ｉ型ＩＬ−１レセプターへの結合の際に開始するような細胞内シグナル伝達を開始しない。対照的に、ＩＩ型レセプターは、細胞から流出されることが示されている可溶性ＩＬ−１結合因子の前駆体として役立ち、そしてこの可溶性レセプターは、生理学的ＩＬ−１βアンタゴニストとして作用する。ＩＩ型レセプターの可溶性外部タンパク質に対応する天然に存在するＩＬ−１結合タンパク質が記載されている。
ＩＬ−１レセプターに結合する天然に存在する分泌可溶性リガンド（あるいは、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ｓＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１ｒａ）ともいう）は、クローン化され、配列決定され、２２ｋＤタンパク質をコードすることが見出されてきた。ＩＬ−１Ｒａは、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βのＩ型ＩＬ−１レセプターおよびＩＩ型ＩＬ−１レセプターの両方への結合競合的に阻害する。ＩＬ−１Ｒａは、純粋なレセプターアンタゴニストである。なぜなら、そのレセプターへの結合は、ＩＬ−１レセプターに付随する膜の細胞シグナル伝達機構を活性化しないからである。このタンパク質のＩＬ−１Ｒａへの高い親和力の結合にも関わらず、Ｉ型ＩＬ−１Ｒを発現する細胞のＩＬ−１生物学的応答を阻害するためには、１０〜１００倍モル過剰が必要とされる。ＩＬ−１Ｒａを産生することが知られている細胞としては、単球、好中球、マクロファージ、骨膜細胞および軟骨細胞が挙げられる。ＩＬ−１Ｒａは、ＰＧＥ２合成、炎症促進サイトカインおよびＭＭＰの誘導、および酸化窒素の生成を阻害することが示されてきた。分泌ＩＬ−１Ｒａは、実験的に誘導された炎症の間にインビボで放出される。重要なことには、ＩＬ−１Ｒａは、滑膜組織において発現され、そして正常なヒト滑液中に存在する。膝損傷を有する患者においては、滑液中のＩＬ−１Ｒａのレベルは、損傷後の急性期において劇的に増加し、そして引き続いて準急性（ｓｕｂ−ａｃｕｔｅ）状態および慢性状態においては、正常レベル未満まで減少する。従って、ＩＬ−１Ｒａは、損傷に対する関節の応答において生理学的役割を果たすことが示されてきた。
ＩＬ−１は、軟骨細胞および滑膜細胞の両方による分解酵素および炎症促進サイトカインの産生を刺激するその能力により、関節破壊において中心的役割を果たす主要な軟骨破壊サイトカインであると考えられる。さらに、ＩＬ−１βは、軟骨細胞によるプロテオグリカンおよびコラーゲン合成の強力なインヒビターである。細胞レベルにおいては、滑膜線維芽細胞のＩＬ−１β誘導応答は、ＰＧＥ２、コラゲナーゼおよび他の中性プロテアーゼの増加した産生、ならびに炎症促進サイトカイン、ＩＬ−６およびＩＬ−８の上方制御を含む。
ＩＬ−１（これは、関節炎疾患を有する患者の関節液中に存在する）は、以下のために軟骨細胞を刺激する：１）増加した量の酵素（例えば、ストロメライシン、線維芽細胞および好中球コラゲナーゼならびにプラスミノーゲンアクチベーター）を合成するため、および２）プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１およびＴＩＭＰの合成を阻害するため。さらに、ＩＬ−１βは、マトリックス成分（例えば、ＩＩ型コラーゲン、関節軟骨中のコラーゲンの主要な形態、およびプロテオグリカン）の合成の強力なインヒビターである。インヒビターのレベルとプロテアーゼのレベルとの間の不均衡は、活性プロテアーゼの量の増加を導く。この増加は、マトリックス生合成の抑制と組み合わされて、軟骨の分解を生じる。動物研究においては、ウサギ膝関節へのＩＬ−１の注射は、関節軟骨からのプロテオグリカンの減少を引き起こす。
ＩＬ−１は、慢性骨膜炎および軟骨分解の病因に関与する重要なサイトカインの１つであるので、その産生の減少またはその作用のブロッキングは、滑膜炎症を減少させ、そして軟骨保護効果を提供するための新規な処置のための適切な戦略を示す。アゴニスト（ＩＬ−１）のその天然の膜結合レセプターとの相互作用をアンタゴナイズするための種々の治療的アプローチが使用され得、これらのアプローチとしては以下が挙げられる：１）現在までに特徴付けられている、天然に存在する特定のＩＬ−１活性のインヒビター（ＩＬ−１Ｒａおよび可溶性ＩＬ−１レセプターを含む）；２）抗ＩＬ−１ Ａｂ；および３）ペプチド性または非ペプチド性のいずれかであり得る小分子アンタゴニスト。
この重要なサイトカインの作用をブロックする能力は、関節における多くの細胞型（例えば、滑膜線維芽細胞および軟骨細胞）に影響を及ぼし、従って引き続く病理学的効果（例えば、炎症細胞の関節への侵入、滑膜過形成、滑膜細胞活性化、ならびに軟骨崩壊および軟骨マトリックス合成の阻害）を阻害する。ＩＬ−１レセプターアンタゴニストは、ＩＬ−１による炎症性応答の伝達をブロックするべきであり、それによって疾患の進行を妨げる。多数のＩＬ−１レセプターアンタゴニストの治療可能性は、炎症および関節炎（ＲＡおよびＯＡ）の動物モデルにおいて確立されてきた。ＲＡを患っている患者は、ＩＬ−１Ｒａの皮下注射または可溶性Ｉ型ＩＬ−１Ｒの関節内注射後に臨床的に改善された。
ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａの効果は、それらのそれぞれの局所的濃度に依存する。ＲＡ滑膜切片の上清においては、ＩＬ−１βレベルはＩＬ−１Ｒａのレベルより３倍高かった。従って、ＩＬ−１Ｒａの自発的な局所的産生は、ＩＬ−１β効果を阻害するには十分ではない。なぜなら、より大きな（１０〜１００倍）モル過剰のＩＬ−１Ｒａは、Ｉ型ＩＬ−１Ｒを発現する細胞におけるＩＬ−１誘導生物学的応答を阻害することが必要とされるからである。従って、ＩＬ−１Ｒａの高い用量は、ＲＡを有する患者におけるヒトボランティアにおいて、ＩＬ−１をブロックするためにインビボで使用されてきた。ＩＬ−１Ｒａは、滑膜中に局所的に存在し、陰性のシグナルを提供し、滑膜炎におけるＩＬ−１媒介プロセス（例えば、炎症組織における白血球蓄積、滑膜細胞によるＰＧＥ２産生およびコラゲナーゼ産生）の少なくとも一部を下方制御する。ＩＬ−１Ｒａの軟骨保護効果は、イヌＡＣＬモデルにおける関節へのＩＬ−１Ｒａの直接的な注射を用い、そしてヒト滑膜線維芽細胞へのＩＬ−１Ｒａ遺伝子のトランスフェクションに基づく遺伝子治療アプローチを使用することによって実証されてきた。
本発明は、ＩＬ−１可溶性レセプタータンパク質（これは、ＩＬ−１Ｒの細胞外ドメインを構成し、そして溶液中でＩＬ−１サイトカイン分子を結合し得る）の局所的送達を開示する。特に、そして例示の目的で、米国特許第５，３１９，０７１号および米国特許第５，７２６，１４８号に開示されるようなアミノ酸配列１〜３１２を本質的に含む可溶性ヒトＩＬ−１レセプター（ｓｈｕＩＬ−１Ｒ）ポリペプチドは、抗炎症クラス、抗疼痛クラス、または軟骨保護クラスのいずれかから選択される１以上の薬物と組み合わせて使用するために本明細書中で開示される。あるいは、ｓＩＬ−１Ｒ結合ドメインポリペプチドからなる融合タンパク質の局所的送達は、米国特許第５，３１９，０７１号に開示されるように、軟骨保護を促進するために提案される。さらに、米国特許第５，８１７，３０６号に開示されるようなＩＬ−１レセプターアンタゴニストの局所的送達は、本発明における使用のために開示される。ｓｈｕＩＬ−１Ｒ可溶性レセプターは、ナノモル濃度の親和力でＩＬ−１と結合することが示されてきた。治療的に有効な濃度のＩＬ−１Ｒ可溶性レセプター（例えば、ｓｈｕＩＬ−１Ｒ）の局所的送達は、関節の直接的な注射または灌注溶液中（例えば、関節鏡外科手順の間）により、１以上の軟骨保護薬、抗炎症薬、または抗疼痛薬との組み合わせで起こり得、そして種々の炎症状態または病態生理学的状態における関節の組織に局所的に適用される場合に、軟骨保護剤として本明細書中で開示される。あるいは、このような薬剤は、標的化全身送達系においてのように、全身送達され得る。このような処置は、コラゲナーゼ−１およびストロメライシン−１の産生のＩＬ−１刺激を先手を取って阻害する。ＩＬ−１および／またはＴＮＦ−αに対する１型可溶性レセプターの局所的産生のための、遺伝子送達に基づく完全に異なる方法を使用することによって、これらのサイトカインに対する可溶性レセプターの存在が、抗原誘導関節炎の急性炎症期の間にウサギ膝関節に対する保護を与えることが見出された。
ヒトＩ型ＩＬ−１レセプターと高い親和力で特異的に結合するＩＬ−１レセプターアンタゴニストペプチド（１１〜１５アミノ酸）は、軟骨保護剤としての本発明における使用に適切である。これらの小さなペプチドは、より大きな組換えＩＬ−１可溶性レセプターまたは組換えＩＬ−１ｒａよりも、多くの利点を提供し、これらの利点としては、合成の容易さおよび費用、ならびに生物学的バリアを透過する能力が挙げられる。インビトロでの効力に基づく最も強力なペプチドのうちの２つは、以下である：Ａｃ−ＦＥＷＴＰＧＷＹＱＪＹＡＬＰＬ−ＮＨ２（ＡＦ１２１９８、ＩＣ５０＝０．５〜２ｎＭ）およびＡｃ−ＦＥＷＴＰＧＷＹＱＪＹ−ＮＨ２（ＡＦ１１５６７）。ＡＦ１１５６７は、ＡＦ１２１９８の短縮形態であり、４Ｃ末端残基を欠き、Ｉ型ＩＬ−１レセプターに対してわずかにより低い親和力を示すが、２．３〜２．６時間の同様の血漿半減期を有する。乏しい溶解度および迅速な代謝は、静脈内注入を介して全身的に投与された場合に、ＡＦ１２１９８のインビボにおける効力を制限するようである。これらの制限は、上記のような直接的な局所的送達方法を介して（例えば、関節内の関節空間への注射または外科灌注液もしくは他の注入液への包含により、あるいは標的化送達ビヒクルを使用する全身送達を介して）、ある程度克服される。本発明のために適切なＩＬ−１レセプターアンタゴニスト薬剤の例は、以下に列挙される。局所的送達のすべての様式（すなわち、注射、注入および灌注）のために、各適切な薬剤の最適な用量および／または濃度は、治療的に有効な用量および／または濃度である。例として、列挙された薬剤の各々について、列挙した薬剤を含有する灌注溶液の好ましい濃度および最も好ましい濃度が提供され、このような濃度は、治療的に有効であると予想される。同様に、本発明に従う全身組成物は、列挙される治療的範囲内の局所濃度を関節または作用部位において生じるのに十分な薬剤の投薬量または負荷を適切に含む。標的化された徐放送達システムについて、列挙された治療範囲内の局所濃度を、関節または作用部位において、予め決定された徐放期間にわたって生じるために十分な投薬量または負荷の薬剤が、組成物中に含まれる。
（表１）
（インターロイキン−１レセプターアンタゴニストの治療濃度および好ましい濃度）
Figure 2005519917
 （２．腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターアンタゴニスト）
ＴＮＦ−α（活性化マクロファージによって主に産生されるサイトカイン）は、特定のＴＮＦレセプターによって媒介されるいくつかの遺伝子の転写調節および免疫調節活性を含む多くの生物学的作用を有する。本来は、ＴＮＦ−Ｒ１およびＴＮＦ−Ｒ２と命名された２つの異なるレセプターは、クローン化され、特徴付けられ、そしてまた、可溶性レセプターとして産生されることが見出された。
このファミリー中のレセプターは、これらの細胞外ドメインにおいてかなりの相同性を有する単一の膜貫通タンパク質であり、その一方で、これらの相対的に短い細胞内ドメインは、非常にわずかにしか配列相同性を保有しない。ＴＮＦの作用は、研究されてきた実質的に全ての細胞型上に存在する細胞表面レセプターへの因子の結合の結果である。２つのレセプターは、同定され、そしてクローン化された。ＴＮＦＲ−ＩＩ（またはＡ型または７５ｋＤａ）と命名された１つのレセプター型は、４３９アミノ酸の膜貫通タンパク質をコードし、そして、７５ｋＤａの見かけ分子量を有する。ＴＮＦＲ−Ｉ（またはＢ型または５５ｋＤａ）と命名された第２のレセプター型は、５５ｋＤａの見かけ分子量を示し、そして４２６アミノ酸の膜貫通タンパク質をコードする。ＴＮＦＲ１は、ＮＦ−κＢ経路を通るシグナル伝達を開始し得る細胞内ドメインを含む。
ＴＮＦレセプターの両方は、ＴＮＦα結合について高い親和性を示す。可溶性ＴＮＦレセプター（ｓＴＮＦＲ）は、単離され、そして膜結合レセプターの細胞外ドメインのシェディング（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）の結果として生じることが示された。２つの型のｓＴＮＦＲが、同定され、そしてｓＴＮＦＲ１（ＴＮＦ ＢＰＩ）およびｓＴＮＦＲＩＩ（ＴＮＦ ＢＰＩＩ）として示された。これらの可溶性レセプター形態の両方は、上記されるＴＮＦＲの２つの型の短縮型形態を表すことが示されてきた。
ＴＮＦ−αは、炎症性応答および軟骨破壊の基礎をなす細胞性事象および分子事象の進行において中心的な役割を果たす。ＴＮＦ−αの効果の多くは、ＩＬ−１の前炎症性効果と重複する。他の炎症性サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−８を含む）の放出の刺激は、ＴＮＦ−αの炎症性作用の中にある。ＴＮＦ−αはまた、好中球、繊維芽細胞および軟骨細胞（一部、コラーゲナーゼの刺激によって軟骨を分解する）からのマトリクスメタロプロテイナーゼの放出を誘導する。さらに、ＴＮＦ−αは、正常ヒト関節性軟骨細胞および滑膜繊維芽細胞において、ＣＯＸ−２をアップレギュレートし、ＰＧＥ２産生の上昇を生じる。
ＩＬ−１と共にこのサイトカインは、関節において軟骨に対する生理学的効果（白血球浸潤、滑膜過形成、滑膜細胞活性化、軟骨破壊および軟骨マトリクス合成の阻害を含む）を開始し、そして生じると考えられる。特に、滑膜炎症の間、ＴＮＦ−αのレベルの増加が、関節の滑液において見出され、滑膜細胞によるＴＮＦ−αの産生の増加が生じる。従って、全身送達（標的化送達系、または刺激性溶液中の可溶性ＴＦＮ−αレセプターの局所送達、輸液、あるいは注射を含む）は、遊離のＴＮＦ−αを結合し、周囲の組織においてＴＮＦレセプターのアンタゴニストとして機能し、従って、軟骨保護効果を提供する。
本発明は、利用可能な遊離リガンドの除去またはレセプターそれ自体との直接的競合相互作用のいずれかによって、リガンドのこれらの同族の膜レセプターとの相互作用を、単独でかまたは他の薬剤と組み合わせて、細胞外的にブロックし、軟骨保護効果を提供するように作用するＴＮＦ−αの機能的アンタゴニストの使用を記載する。アゴニスト（ＴＮＦ−α）のその天然の膜結合レセプターとの相互作用をアンタゴナイズするための種々の治療アプローチが使用され、これは、以下を包含する：１）今日までに特徴付けられた天然に存在するＴＮＦ−α活性の特異的インヒビター（可溶性ＴＮＦ−αレセプターを含む）の使用；２）抗−ＴＮＦ−α抗体の使用および３）ペプチド性または非ペプチド性いずれかであり得る低分子アンタゴニストの使用。
本発明は、キメラ可溶性レセプター（ＣＳＲ）タンパク質の使用を開示し、ここで、ＴＮＦレセプターの細胞外ドメイン（ＴＮＦ分子に対する結合活性を保有する）は、ＩｇＧ分子のドメインに共有結合される。特に、第１の実施例によって、マウスＩｇＧ１重鎖ポリペプチドのＣＨ２およびＣＨ３領域に連結されたＴＮＦレセプター細胞外ポリペプチドの細胞外ドメインを含むキメラポリペプチド（組換えキメラ）は、米国特許第５，４４７，８５１号に開示されるように使用され得る。キメラＴＮＦ可溶性レセプター（米国特許第５，４４７，８５１号において「キメラＴＮＦインヒビター」とも命名される）は、高い親和性でＴＮＦ−αを結合することが示され、そしてＴＮＦ−αの生物学的活性のインヒビターとして高度に活性であることが示された。さらに、第２の実施例は、ＴＮＦ−αレセプターに対して作製されたＦｃ抗体の部分を有するＴＮＦレセプター（Ｆｃ融合可溶性レセプター）のリガンド結合ドメインから構成されるキメラ融合構築物である。本発明はまた、米国特許第５，６０５，６９０号に記載されるように、可溶性ＴＮＦレセプター：Ｆｃ融合タンパク質または任意の改変形態の使用を開示する。活性な可溶性レセプター融合タンパク質の分子形態は、モノマー性またはダイマー性のいずれかであり得る。現在の研究は、このような可溶性ＴＮＦレセプター：Ｆｃ融合タンパク質が、ＴＦＮ−αに対する高い結合活性を維持することを確立する。
薬理学的アンタゴニストとして可溶性レセプターを定義する背景において、用語可溶性レセプターは、以下を包含するがこれらに限定されない：（１）天然に産生される（内因性）アミノ酸配列に対応する可溶性レセプターまたは全長膜レセプターの細胞外ドメインからなる該可溶性レセプターのフラグメント、（２）同族リガンドを結合する能力を保持し、そして生物学的活性を保持する、全長の天然に存在するアミノ酸配列の短縮型配列または部分配列である、組換え可溶性レセプターおよびそのアナログ、ならびに（３）生物学的活性および同族のリガンドを結合する活性を保持するＩｇＧポリペプチド（例えば、ＩｇＧヒンジおよびＦｃドメイン）の部分に対応する配列にオリゴマー（例えば、アミノ酸）を介して結合される全長レセプターアミノ酸配列の細胞外結合ドメインの部分に対応する、短縮配列または部分配列から構成される組換え可溶性レセプターである、キメラ可溶性レセプター。
サイトカインレセプターの可溶性細胞外リガンド結合ドメインは、体液中に天然に存在し、そして、サイトカインの生物学的活性の調節に関与すると考えられている。多くの造血性サイトカインレセプターの可溶性短縮型形態の天然の存在が、報告された（ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＴＮＦＲ）。例えば、可溶性ＴＮＦＲは、健康な被験体の血清および尿中に約１〜２ｎｇ／ｍｌの濃度で見出される。シグナル伝達機能を欠損しているので、これらのサイトカイン結合タンパク質は、完全レセプター配列（膜結合形態）に対するｍＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、またはレセプターの膜結合形態のタンパク質分解的切断および放出の結果として、生じる。これらの可溶性短縮型レセプターのインビボ機能は十分に確立されていないが、これらは、これらの相補的内因性サイトカインの生理学的アンタゴニストとして作用するように見える。（１）その同族可溶性レセプターへの結合によって遊離リガンドを除去することは、膜結合レセプターに利用可能な有効遊離濃度を減少し、（２）サイトカインの作用が、細胞表面レセプターへの結合の後にのみ産生されるので、この拮抗作用が、生じる。
ＴＮＦ−α可溶性レセプターは、遊離リガンドの共通プールに対して、これらの細胞表面レセプターと競合することによって、ＴＮＦ−Ｒ１およびＴＮＦ−Ｒ２の天然のアンタゴニストとして機能する。薬理学的には、ＴＮＦ可溶性レセプターは、競合阻害の機構によって（すなわち、膜レセプター上の共通の結合部位に対する内因性リガンドと競合することによって）ではなく、遊離リガンドのバイオアベイラビリティーを減少する能力によって、アンタゴニストとして機能する。治療有効量のＴＮＦ可溶性レセプターの関節への添加によって、リガンドの生物学的活性は有効に中和されるはずである。組換え可溶性レセプターがインビボで投与される実験は、炎症性応答を阻害し、アンタゴニストとして作用する能力を示した。
本発明において、他の軟骨保護抗疼痛剤および／または抗炎症剤と組み合わせて使用するための、軟骨破壊を阻害する軟骨保護剤として適切な薬剤としては、可溶性ＴＮＦＲ、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されるＴＮＦ−αレセプター（ｐ８０）の細胞外ドメインを含むヒトキメラポリペプチド（組換えキメラ）、および抗−ＴＮＦ−α抗体が挙げられる。局所送達（すなわち、注射、輸液および灌注）の全ての様式について、各適切な薬剤の最適用量および／または最適濃度は、治療的に有効である用量および／または濃度である。例として、列挙された薬剤の各々について、列挙された薬剤を含有する灌注溶液の好ましい濃度および最も好ましい濃度が提供され、このような濃度は、治療的に有効であると予想される。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内で、関節または作用部位での局所濃度を生じるのに十分な薬剤の投薬量または負荷を適当に含む。標的化された徐放性送達系について、十分な投薬量または負荷の薬剤は、組成物中に含まれ、所定の徐放性期間にわたって、列挙された治療範囲内で、関節または作用部位での局所濃度を生じる。
（表２）
（ＴＮＦ−レセプターアンタゴニストの治療濃度および好ましい濃度）
Figure 2005519917
 （３．インターロイキンレセプターアゴニスト）
いくつかのサイトカインは、滑膜炎症および軟骨破壊の重要なメディエーターであるシグナル伝達糖タンパク質である。軟骨破壊の機構の最近の分析は、前炎症性マスターサイトカイン（ｍａｓｔｅｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）（ＩＬ−１）の絶対的なレベルが、軟骨損失の決定において重要であるだけでなく、軟骨恒常性のサイトカイン制御が、異化作用調節サイトカインおよび同化作用調節サイトカインと同化作用増殖因子とのバランスによって支配されることを示唆する。ＩＬ−１β産生とＩＬ−１Ｒａ産生との間のバランスが、炎症部位において、ＩＬ−１βの方が優位に変更される場合、膝関節外科手術後に生じることが公知であるように、慢性炎症性状態および軟骨破壊の病因に寄与する。関節内の炎症部位での前炎症性サイトカインの産生を阻害する潜在的な治療薬剤としては、前炎症性サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３）が挙げられる。これらのサイトカインは、ＩＬ−１の影響を低下するある範囲の経路に対するこれらの効果によって、インビトロおよびインビボでの関節軟骨破壊を大いに低下することが観察された。従って、抗−炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３）は、以下による、炎症の低減において有用であり得る：１）前炎症性サイトカインの産生の低下、および２）最近、ＩＬ−４についてインビボで示されるように、天然の抗−炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１Ｒａ）の産生の誘導。
ＩＬ−４は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者の滑膜における炎症性プロセスを低下するように見える。リウマチ様滑膜において、ＩＬ−４は、滑膜の部分による前−炎症性サイトカインの産生の阻害、滑膜細胞の増殖の阻害および骨吸収の減少を示されてきた。ＩＬ−４は、ヒト関節軟骨細胞におけるマトリクスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭＰ−３）合成の抑制による直接軟骨保護効果を促進し得る。ヒト関節軟骨細胞を使用する細胞培養系は、ＭＭＰ−３およびメタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター（ＴＩＭＰ−１）のＩＬ−１誘導産生に対する、ＩＬ−４の効果を評価するために使用された。ＩＬ−４は、ＩＬ−１刺激ＭＭＰ−３タンパク質活性および酵素活性を抑制したことが示された。さらに、ＩＬ−４は、ＩＬ−１誘導ＭＭＰ−３ ｍＲＮＡを抑制した。ｉＮＯＳの誘導は、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３によって阻害され得る。従って、ＩＬ−４は、炎症性関節疾患に見られる関節破壊の保護メディエーターとして特徴付けられ得る。
さらに、ＩＬ−１調節サイトカインレベルのバランスに対するＩＬ−４の効果はまた、軟骨保護役割を支持することが見出された。ＩＬ−４およびＩＬ−１０は、新鮮に調製されたリウマチ様滑膜細胞による炎症性サイトカインの産生を抑制することが見出された。各インターロイキンは、単独で有効であり、その一方で、ＩＬ−４とＩＬ−１０との組み合わせは、細胞生存性に対する効果を有さずに、ＩＬ−６およびＩｌ−８の、ＩＬ−１およびＴＮＦ−α刺激産生を相乗作用的に阻害した。ＩＬ−４のＲＡ滑膜培養物への添加によって、ＩＬ−１Ｒａの産生を増加し、そしてＩＬ−１βの産生を減少した。ＩＬ−４を用いたインビボ処置は、ＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｒａバランスに対して差示的に作用することによって、ラット実験的関節炎の低減を促進することが最近報告された。ＩＬ−４と多くの特徴を共有する別のケモカインであるＩＬ−１３はまた、ＲＡ滑膜におけるＩＬ−１Ｒａを誘導した。従って、ＩＬ−４とＩＬ−１３との組み合わせの全身送達または局所送達は、相乗作用的治療価値を提供し得る。
ＩＬ−１０は、それが軟骨破壊を阻害する良好な候補であることを示す多くの特徴を有する。これは、ＩＬ−１放出およびＴＮＦ−α放出の両方を阻害し、ＴＩＭＰ−１産生を刺激し、その一方で、ＭＭＰ−２を阻害する。ＲＡ滑膜の内部のＩＬ−１０の産生は、最近報告され、ＩＬ−１０の抗−炎症性効果が、特徴付けられた。ＩＬ−１０は、滑膜の部分を使用するエキソビボＲＡモデルにおけるＩＬ−１β産生を抑制するが、ＩＬ−４より低い程度である。
軟骨破壊に対するＩＬ−４およびＩＬ−１０の保護効果は、サイトカインについての送達の非局所的方法を使用して、動物の関節炎モデルにおいて見出された。マウスコラーゲン誘導関節炎モデルにおいて、ＩＬ−４とＩＬ−１０との組み合わせ処置は、実質的な改善を生じた。炎症の巨視的症状の抑制に加えて、ＩＬ−４とＩＬ−１０との組み合わせ処置は、滑膜組織中の細胞性浸潤を減少させ、そして軟骨破壊に対する著しい保護を引き起こした。さらに、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１についてのｍＲＮＡのレベルは、滑膜組織および関節軟骨の両方において、高度に抑制された。対照的に、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）ｍＲＮＡのレベルは、上昇したままであり、このことは、保護機構が、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１の抑制された産生、付随するＩＬ−１Ｒａ／ＩＬ−１バランスのアップレギュレーションに関連し得るということを示唆する。これらのデータは、炎症性応答および関節軟骨の破壊の内因性抑制におけるＩＬ−１０の優先的な役割に一致し、ＩＬ−４とＩＬ−１０との組み合わせ処置は、潜在的に治療価値があるように見える。
マクロファージ依存性連鎖球菌性細胞壁（ＳＣＷ）関節炎モデルの初期段階における、マウス内因性ＩＬ−４およびＩＬ−１０の役割ならびにこれらのサイトカインの添加の関節炎症および軟骨破壊に対する治療効果がまた、調査されてきた。内因性ＩＬ−１０は、ＳＣＷ関節炎の調節において役割を果たすことが示された。外因性ＩＬ−１０の添加は、内因性ＩＬ−１０の抑制効果をさらに拡大した。さらにより顕著な効果が、ＩＬ−４とＩＬ−１０との組み合わせを用いて見出された。組み合わせは、腫脹の減少を生じ、軟骨細胞プロテオグリカン合成を上昇した。ＩＬ−４とＩＬ−１０との組み合わせを用いた処置は、ＩＬ−１０処置単独に対して生じるように、ＴＮＦ−αのレベルを実質的に減少するが、滑膜においてＩＬ−１βレベルを大きく減少する（潜在的な臨床的利益のさらなる効果）。全体的に、データは、全身的にまたは関節に局所的に送達され、軟骨破壊を防止する軟骨保護薬剤としてのＩＬ−４およびＩＬ−１０の両方に対する役割と一致し、そしてＩＬ−４およびＩＬ−１０を含む組み合わせが、いずれかの薬剤単独より高い潜在的な治療価値を提供し得ることを示す。
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスは、軟骨分解およびインビボでのヒトリウマチ様滑膜への単核細胞（ＭＮＣ）の補充に対する、ＩＬ−４またはＩＬ−１０注射の効果を評価するためのモデルとして使用された。５人の慢性関節リウマチ患者由来のヒトリウマチ様滑膜および軟骨に、組換えヒトＩＬ−４（ｒｈＩＬ−４、１００ｎｇ；ｒｈＩＬ−１０、１００ｎｇ）、ＩＬ−４とＩＬ−１０との組み合わせ、またはＴＮＦ−α（１０００Ｕ）、あるいはリン酸緩衝化生理食塩水が、１週間に２回、４週間にわたって注射された。ヒトＩＬ−４とＩＬ−１０との組み合わせが、軟骨分解およびヒト滑膜組織による浸潤を阻害することが見出され、これらのインターロイキンアゴニストの軟骨保護特性を確立した。
ヒトＩＬ−１３は、クローン化され、そして配列決定され、ＩＬ−４の特徴の多くを共有することが見出された。ＩＬ−１３は、ＩＬ−４に対して約２５％相同である。ＩＬ−４と同様に、ＩＬ−１３は、前炎症性サイトカイン（ＩＬ−４およびＴＮＦ−αが挙げられる）の滑液単核細胞による産生を減少する。ＩＬ−１３は、インビボにおいて抗−炎症性効果を示し、従って、関節における軟骨破壊の処置においての治療潜在性を有する。
ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３アゴニストとして有用な化合物としては、天然に存在するヒトＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３、ヒト組換えＩＬ−４（ｒｈＩＬ−４）、ｒｈＩＬ−１０およびｒｈＩＬ−１３、ならびにこれらの部分配列、またはペプチド配列が挙げられ、これらは、組換えＤＮＡ技術を使用して、ＩＬ−４レセプター、ＩＬ−１０レセプターおよびＩＬ−１３レセプターを認識するように構築され、そして細胞表面上のこれらのレセプターを活性化し得る。これは、抗−Ｆｃレセプター部分ならびに抗−ＩＬ−４レセプター部分、抗−ＩＬ−１０レセプター部分、および抗−ＩＬ−１３レセプター部分から構成される多特異的分子を、特に含む。ここで、少なくとも１つの部分が、組換えＤＮＡ技術を使用して構築される。薬理学的アゴニストとしてインターロイキンアゴニストを定義する背景において、用語インターロイキンアゴニストは、以下を包含するがこれらに限定されない：（１）天然に（内因的に）産生されるアミノ酸配列またはそのフラグメントに対応するペプチド配列、（２）同族レセプターを結合する能力を保持し、そして生物学的活性を保持する、全長の天然に存在するインターロイキンアミノ酸配列の短縮型配列または部分配列である、組換えインターロイキンおよびそのアナログ、ならびに（３）同族レセプターを結合する能力を保持し、そして生物学的活性を保持する、ＩｇＧポリペプチド（例えば、ＩｇＧヒンジおよびＦｃドメイン）の部分に対応する配列にオリゴマー（例えば、アミノ酸）を介して結合される全長アミノ酸配列の部分に対応する、短縮配列または部分配列から構成される組換えポリペプチドである、キメラインターロイキン。
本発明に適切なインターロイキンアゴニストの例が、以下に列挙される。局所送達（すなわち、注射、輸液および灌注）の全ての様式について、各適切な薬剤の最適用量および／または最適濃度は、治療的に有効である用量および／または濃度である。例として、列挙された薬剤の各々について、列挙された薬剤を含有する灌注溶液の好ましい濃度および最も好ましい濃度が提供され、このような濃度は、治療的に有効であると予想される。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内で、関節または作用部位での局所濃度を生じるのに十分な薬剤の投薬量または負荷を適当に含む。標的化された徐放性送達系について、十分な投薬量または負荷の薬剤は、組成物中に含まれ、所定の徐放性期間にわたって、列挙された治療範囲内で、関節または作用部位での局所濃度を生じる。
（表３）
（インターロイキンアゴニストの治療濃度および好ましい濃度）
Figure 2005519917
 （４．トランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーアゴニスト）
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーメンバーは、種々の細胞機能に影響を与え得る２５ｋＤの多面発現性の多機能性タンパク質であり、組織修復およびリモデリングに関与することが公知である。多くの場合において、これは、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）との細胞相互作用を増強し、ＥＣＭタンパク質およびプロテアーゼインヒビターの産生および分泌を刺激することによってＥＣＭの蓄積を増大する。ＴＧＦ−βはまた、他のサイトカインとの相乗的相互作用を有することを示し、一般的に、抗炎症性活性を示す。近いアミノ酸配列相同性を共有する複数のＴＧＦ−βのアイソフォームが、同定された。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３は、ヒト組織において見出され、哺乳動物細胞において活性であるが、結合親和性は異なる。
ＴＧＦ−βサブファミリーのメンバーは、軟骨細胞増殖、分化および細胞外マトリクス蓄積の強力なモジュレーターである。軟骨器官培養物において、ＴＧＦ−β１は、プロテオグリカンの代謝を調節し、ウサギ関節軟骨細胞による、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンの合成を調節する。さらに、ＴＧＦ−β１は、ヒト関節軟骨細胞におけるＴＩＭＰ発現を増大し、そして関節軟骨におけるＩＬ−１レセプターの発現をダウンレギュレートする。
骨形態形成因子（ＢＭＰ）は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βスーパーファミリーに属する、細胞増殖、細胞分化およびアポトーシスの多機能性調節因子である。ＢＭＰタンパク質ファミリーの１２を超えるメンバーが、哺乳動物において同定され、これらは、これらの構造に依存していくつかの群に下位分類し得る。ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４は、互いに高度に類似する。ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、骨形成性タンパク質（ＯＰ）−１（ＢＭＰ−７と呼ばれる）、およびＯＰ−２／ＢＭＰ−８は、互いに構造的に類似する。増殖−分化因子（ＧＤＦ）−５（軟骨由来形態形成タンパク質−１とも呼ばれる）、ＧＤＦ−６（軟骨由来形態形成タンパク質−２とも呼ばれる）、およびＧＤＦ−７は、別の関連する群を形成する。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−１／ＢＭＰ−７（インビボで骨および軟骨の形成を誘導する）とは対照的に、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、およびＧＤＦ−７は、より効率的にインビボで軟骨および腱様構造を誘導する（Ｗｏｌｆｍａｎら、１９９７）。
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、２つの型のセリン／トレオニンキナーゼレセプター（これらは両方、シグナル伝達に必須である（Ｍａｓｓａｇｕｅ、１９９８））への結合によってそれらの効果を発揮する。ＩＩ型レセプターは、構成的に活性なキナーゼであり、これは、リガンド結合時にＩ型レセプターをトランスリン酸化する。Ｉ型レセプターは、Ｓｍａｄタンパク質のような細胞内基質を活性化し、そしてこの機構によって、細胞内シグナル伝達の特異性が生じる。７個の異なるＩ型レセプターが哺乳動物において単離され、これは、もともとアクチビンレセプター様キナーゼ（ＡＬＫ）−１−ＡＬＫ７と呼ばれた。ＢＭＰ ＩＡ型レセプター（ＢＭＰＲ−ＩＡまたはＡＬＫ−３）およびＢＭＰ ＩＢ型レセプター（ＢＭＰＲ−ＩＢまたはＡＬＫ−６）は、互いに構造的に類似し、ＩＩ型レセプターと一緒にＢＭＰに特異的に結合する。ＡＬＫ−２は、アクチビンに結合することが示されているが、最近のデータは、それは、特定のＢＭＰ（例えば、ＯＰ−１／ＢＭＰ−７（Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａら、１９９８）に対するＩ型レセプターであることを明らかにした。ＡＬＫ−１は、ＡＬＫ−２に対して構造的に非常に類似しているが、その生理学的なリガンドはまだ知られていない。ＡＬＫ−５およびＡＬＫ−４は、それぞれＴＧＦ−β（ＴβＲ−１）およびアクチビン（ＡｃｔＲ−ＩＢ）のＩ型レセプターである。ＡＬＫ−７は、構造的にＡＬＫ−４およびＡＬＫ−５に類似するが、そのリガンドは、まだ決定されていない。
本発明の軟骨保護溶液における使用に適切な天然のＴＧＦ−βおよびＢＭＰアゴニスト、ならびに合成またはヒト組換え（ｒｈ）アゴニストは、上記ＢＭＰレセプターのいずれかと相互作用し得る。本明細書中で使用されるように、用語「ＴＧＦ−βおよびＢＭＰアゴニスト」は、フラグメント、欠失、付加、アミノ酸置換、変異、およびそれらの改変を含み、これらは、天然のヒトＴＧＦ−βおよびＢＭＰアゴニストリガンドの生物学的な特徴を保持する。ＴＧＦ−βまたはＢＭＰアゴニストは、単独で、または同化作用軟骨薬剤（軟骨形成性または軟骨マトリクス修復を促進する）としてＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーと相乗的に組み合わされて、または軟骨異化作用を遮断する阻害性の薬剤と組み合わせて使用され得る。
Ｉ型レセプターは、ＩＩ型レセプターの下流成分として機能する。Ｉ型レセプターによる細胞内シグナルの特異性は、Ｌ４５ループと呼ばれるセリン／トレオニンキナーゼドメインにおける特定の領域によって決定される。従って、ＢＭＰＲ−ＩＡ／ＡＬＫ−３およびＢＭＰＲ−ＩＢ／ＡＬＫ−６（ＢＭＰＲ−Ｉ群）のＬ４５ループの構造は、互いに同一であり、そしてそれらは、細胞内に類似のシグナルを伝達し得る。同様に、ＴβＲ−Ｉ／ＡＬＫ−５、ＡｃｔＲ−ＩＢ／ＡＬＫ−４、およびＡＬＫ−７（ＴβＲ−Ｉ群）のＬ４５ループは、互いに同一であり、それらは、類似の基質を活性化する（Ｃｈｅｎら、１９９８）。ＡＬＫ−１およびＡＬＫ−２（ＡＬＫ−１群）のＬ４５ループは、他のＩ型レセプターから最も分岐しているが、これらは、ＢＭＰＲ−Ｉ群のＩ型レセプターのＬ４５ループと同じ基質を活性化する（Ａｒｍｅｓら、１９９９）。
種々のタンパク質が、ＴＧＦ−βおよびＢＭＰセリン／トレオニンキナーゼレセプターからのシグナルを伝達し得る。それらのうち、最も研究された分子は、Ｓｍａｄファミリーのタンパク質である。８個の異なるＳｍａｄタンパク質が哺乳動物において同定され、そしてこれらのタンパク質が３つのサブグルーグ（すなわち、レセプター制御Ｓｍａｄ（Ｒ−Ｓｍａｄ）、共通パートナーＳｍａｄ（ｃｏ−Ｓｍａｄ）、および阻害性Ｓｍａｄ）に分類される。Ｒ−Ｓｍａｄは、Ｃｏ−Ｓｍａｄとの複合体からＩ型レセプターによって直接活性化され、そして核にトランスロケートする。Ｓｍａｄヘテロマーは、直接的および他のＤＮＡ結合タンパク質によって間接的にＤＮＡに結合し、それによって、標的遺伝子の転写を調節する。Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、およびＳｍａｄ８は、ＢＭＰによって活性化され、一方Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３は、ＴＧＦ−βによって活性化される。例えば、Ｓｍａｄ２は、Ｃｏ−Ｓｍａｄとして機能するＳｍａｄ４と組み合わせて、核にトランスロケートされ、ここで、これは、ＴＧＦの生物学的効果を媒介する遺伝子の転写を活性化する。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は、他のＳｍａｄに構造的に離れて関連し、そして阻害性のＳｍａｄとして作用する。ＢＭＰがインビトロおよびインビボにおいて新たな軟骨および骨の形成を誘導し、そして軟骨細胞の増殖および分化を制御することが示された。さらに、これらのタンパク質はまた、軟骨修復プロセスにおいて関連する。種々の研究によって、ＢＭＰもまた軟骨形成表現型を促進しそして維持することが示されたが、これは、ニワトリ肢芽細胞培養物および胎児ラット軟骨芽細胞において、ならびにウサギおよびウシ関節軟骨細胞においてプロテオグリカン合成を刺激するそれらの能力によって示される。軟骨および骨の形成についてのＢＭＰの重要性は、特定ＢＭＰ遺伝子ノックアウトが研究されたトランスジェニックアプローチによって証明されている。
ＢＭＰファミリーの１つのメンバー、骨形成性タンパク質（ＯＰ−１またはＢＭＰ−７）は、正常な状態および病理学的な状態（例えば、軟骨の修復の間）において軟骨恒常性について特に重要であるようである。ＯＰ−１は、成人の関節軟骨細胞によって発現される軟骨誘導性形態形成タンパク質とともに、ＢＭＰファミリーの唯一のメンバーであるようである（Ｃｈｕｂｉｎｓｋａｙａ，Ｓ．、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８：２３９−５０（２０００））。ＯＰ−１は、骨マトリクスからもともと精製され、軟骨および骨形成を誘導することが示された。ヒトＯＰ−１遺伝子は、クローン化され、そして生物学的に活性な組換えＯＰ−１ホモダイマーが生成された。ヒト組換えＯＰ−１は、インビトロでヒト関節軟骨細胞によってアグリカンおよびコラーゲンＩＩ型の合成を刺激し得る。これはまた、これらの軟骨細胞の代謝に対するＩＬ−１の有害な効果に対抗し得、そしてフィブロネクチンフラグメントによって媒介されるウシ軟骨損傷を遮断し得る。この効果は、インターロイキン−１βの存在下で培養されるヒト関節軟骨細胞によるプロテオグリカン、プロスタグランジン Ｅ２、およびＩＬ−１レセプターアゴニストの産生に対する組換えヒトＯＰ−１の効果を研究することによって示された。ＯＰ−１を用いたヒト関節軟骨細胞の処置は、低用量のＩＬ−１βによって誘導されるプロテオグリカン合成のダウンレギュレーションに打ち勝つ際に効果的であった。さらに、ある研究によって、ＯＰ−１がヒアルロナンおよびＣＤ４４の合成を刺激し、他の分子は、ヒト軟骨細胞によるマトリクス構築に必要とされることが見出された。ヒト成人軟骨におけるＯＰ−１の発現およびＯＰ−１に対する調節のこれらの研究は、軟骨保護および修復におけるＯＰ−１の役割を示唆し、そしてＯＰ−１がヒト関節軟骨の軟骨同化作用および修復を促進する治療薬剤として使用され得ることを示す。
ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）は、インビボで骨格内部および骨格外部位で移植される場合に軟骨および骨形成を誘導する。全厚関節軟骨欠損の治癒に対するＯＰ−１の影響が、ウサギのひざ関節の関節軟骨を通して２つの隣接する穴を穿孔することによって調査された。ＯＰ−１は、成熟関節軟骨細胞と似ている細胞を含んだ関節表面の関節軟骨治癒および再生を誘導した。
これらのデータは、外科的外傷後に、ヒトにおいて、軟骨の分解の予防および関節軟骨の生物学的ホメオスタシスを維持のために本発明を実施するのに有用な溶液の１つの好ましい実施形態は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー（好ましくは、ＴＧＦβ２、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）またはＢＭＰ−２のいずれか）あるいは等価なアゴニスト（このアゴニストは、これらのリガンドによって使用される同じレセプターを介して作用する）の全身的または局所的適用が挙げられる。全身的または局所的送達は、軟骨異化プロセスのインヒビター（例えば、ＭＡＰキナーゼインヒビター、ＭＭＰインヒビターまたは酸化窒素シンターゼインヒビター）である薬物（単数または複数）および／または疼痛および炎症の阻害のための他の試薬を組合せることで起こり得る。
薬理学的なアゴニストとしてＴＧＦ−βおよびＢＭＰアゴニストを規定する文脈の中で、用語ＴＧＦ−βおよびＢＭＰアゴニストとしては、以下の（１）〜（３）が挙げられるが、これらに限定されない：（１）天然に（内在的）産生されるアミノ酸配列またはそれらのフラグメントに対応するペプチド配列、（２）天然に存在する、全長ＴＧＦ−βおよびＢＭＰアミノ酸配列の短縮型配列または部分配列である組換えＴＧＦ−βおよびＢＭＰであって、これらは、それらの同属の各レセプターと結合する能力を保持し、かつ生物学的活性およびそのアナログを保持する、組換えＴＧＦ−βおよびＢＭＰ（３）ＩｇＧポリペプチド（例えば、ＩｇＧヒンジおよびＦｃドメイン）の一部に対応する配列にオリゴマー（例えば、アミノ酸）を介して結合される、全長アミノ酸配列の一部に対応する短縮型配列または部分配列からなる組換えポリペプチドである、キメラＴＧＦ−βおよびＢＭＰ（これは、同属のレセプターと結合する能力を保持し、かつ生物学的活性を保持する）。
本発明に適切なＴＧＦ−βおよびＢＭＰアゴニストの例は、以下に列挙される。局所送達の全モード（すなわち、注射、注入および洗浄）のために、各適切な薬剤の最適な用量および／または濃度は、治療学的に有効である用量および／または濃度である。例として、列挙される薬剤の各々に対して、列挙した薬剤を含む洗浄溶液の好ましいおよび最も好ましい濃度は、例えば、治療学的に有効であると予想される濃度で提供される。同様に、本発明に従う全身的組成物は、関節または列挙された治療範囲内の作用部位で局所的濃度を生じるに十分な薬剤の投薬量または負荷量を適切に含む。標的化された徐放送達系について、薬剤の十分な投薬量または負荷量は、所定の徐放期間にわたって、関節または列挙された治療範囲内の作用部位で局所的濃度を生じるために、組成物中に含まれる。
外科的溶液の関節への局所的送達または局所的作用のための治療学的濃度の範囲は、その同属のレセプターに対する各リガンドの解離濃度（Ｋｄ）の値から見積もられ得る。これらの値は、特定の細胞型および組織に対して変化するが、以下の例がＢＭＰ−４のために与えられる。１２５Ｉ−ＢＭＰ−４の結合実験により、１１０ｐＭの見掛け解離定数および１細胞当たり約６０００個のレセプターを有する、特異的な高親和性結合部位の存在が明らかとなった。従って、１１ｎＭのＢＭＰ−４において、リガンドの結合が最大となり、そして利用可能なレセプターで完全に占有される（飽和される）。第１関節軟骨細胞におけるＢＭＰ−４に対する機能的レセプターの存在が、実証された。
Figure 2005519917
 （５．シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）インヒビター）
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、抗炎症剤として幅広く使用されているが、軟骨保護剤として特異的に展開または治療学的に使用されていなかった。ＮＳＡＩＤ薬物のための直接的な分子標的は、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼまたは脂肪酸シクロオキシゲナーゼのいずれかとして言及される、プロスタグランジン合成経路の第１酵素である。シクロオキシゲナーゼ−１または１型（ＣＯＸ−１）およびシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）と呼ばれる、シクロオキシゲナーゼの関連する２種の形態が、特徴付けされている。これらのイソ酵素はまた、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｇ／Ｈ Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＰＧＨＳ）−１およびＰＧＨＳ−２として公知である。両方の酵素は、アラキドン酸をプロスタグランジンＨ２に変換するプロスタノイドの形成における律速段階を触媒する。ＣＯＸ−１は、血小板および内皮細胞中に存在し、そして構成性の活性を示す。これに対し、ＣＯＸ−２は、関節中の内皮細胞、マクロファージ、線維芽細胞および他の細胞中で同定され、そしてこの発現は、炎症促進サイトカイン（例えば、ＩＬ−１およびＴＮＦ−α）によって誘導される。
炎症した関節において、ＣＯＸ−２の発現は上方制御され、そしてこのＣＯＸ−２の発現は、ＣＯＸ−２の活性の大幅な増加がこの上方制御で同時に発生することが示され、炎症性関節症を患った患者の滑液中に存在するプロスタグランジンの増加した合成に導かれる。関節内のプロスタグランジン（ＰＧ）の細胞供給源には、活性化軟骨細胞、Ａ型およびＢ型滑膜細胞および湿潤性マクロファージが挙げられる。ＰＧによって調整される軟骨の代謝において重要である細胞の機能には、遺伝子発現、細胞外マトリクス合成および増殖が挙げられる。ＣＯＸ−２は、炎症した関節組織において、すなわち炎症のメディエーター（例えば、損傷または外科的外傷の結果として）への曝露後に発現されるので、ＣＯＸ−２インヒビターの使用は、抗炎症活性および軟骨保護活性の両方を提供すると期待される。
炎症性関節症での軟骨の破壊は、関節の損傷の結果および関節鏡検査の外科的手順の結果として誘発され得る。軟骨細胞は、関節軟骨中の唯一の細胞型であり、ＰＧを含む内因的炎症のメディエーターの放出により、それ自体のマトリクスの分解に関ることが公知である。研究により、正常なヒト関節軟骨細胞中のＣＯＸ−２遺伝子の発現、タンパク質合成およびＰＧ放出が、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を含むサイトカインによって迅速に誘導されることが示された。ｍＲＮＡのレベルは、サイトカインの導入後２時間程度の早さで検出され、６時間で高いレベルに達し、そして少なくとも７２時間で著しく長期間の発現を示す。同様に、ヒトの滑膜細胞のＩＬ−１αおよびＴＮＦ−α活性化の細胞培養研究により、ＣＯＸ−２の発現およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の産生の大きな増加が示された。種々のＮＳＡＩＤ（例えば、ケトプロフェン）を用いた処理により、導入されたＰＥＧ２の応答がなくされる。軟骨細胞培養系において、ＰＥＧ２産生の増加を妨げる特定のＣＯＸ−２インヒビター化合物ＮＳ−３９８は、サイトカインにより誘導されるが、ＣＯＸ−１のレベルは、安定したままであった（Ｍｏｒｉｓｓｅｔ，Ｓ．，１９９８，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２５：１１４６−５３）。従って、ＣＯＸ−２の発現に関連する活性化された軟骨細胞によってＰＧ産物を遮断することで、軟骨保護効果を提供し得ることが推定され得る。
ＮＳＡＩＤは、変形性関節症または慢性関節リウマチを有する患者の処置に一般に使用されるが、これらの関節炎疾患の状態における関節軟骨代謝に対するそれらの効果は、議論の主題のままである。例えば、ＮＳＡＩＤを有する変形性関節症および慢性関節リウマチの臨床処置は、炎症を軽減することに成功している。しかし、ＣＯＸ−２に対して選択的でないいくつかのＮＳＡＩＤ（主に、サリチル酸塩およびインドメタシン）は、軟骨細胞によってプロテオグリカン合成を減少させるこで、変形性関節症軟骨破壊を加速すると考えられ、一方他のＮＳＡＩＤは、軟骨の修復を刺激することによっていくらかの軟骨保護効果を有すると考えられる。ほとんどの研究により、ＮＳＡＩＤは軟骨に対してほとんどまたは全く効果を有さないことが示された。滑膜炎および軟骨の破壊、続く外傷性関節損傷および外科的外傷の処置において、現在のこのクラスの薬物の使用の欠如に起因して、軟骨の破壊に寄与する病態生理学的機構における各ＮＳＡＩＤの独特の特性を、構築する必要がある。
２種のＣＯＸイソ酵素が薬理学的に異なるので、抗炎症性治療に有用であるイソ酵素特異的（選択的）シクロオキシゲナーゼインヒビターを開発し、そしてこれらの同一のＣＯＸ−２インヒビターのいくつかを、関節炎のモデルで試験した。しかし、軟骨プロテオグリカンの合成および分解における、ＣＯＸ−２インヒビターのインビトロでの効果、ならびに、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびプロスタノイドの産生は、特定のＮＳＡＩＤがインターロイキンおよびエイコサノイドの軟骨での産生および滑膜での産生におけるインビボのそれらの効果を著しく変え得、その結果、これらのパラメータの一体的な効果は、軟骨の完全性においてＣＯＸ−２インヒビターの結果に影響を与え得る。例えば、いくつかのＮＳＡＩＤは、炎症促進サイトカインの産生を増強するか、または軟骨プロテオグリカン合成を阻害することによって、変形性関節症での関節損傷を加速し得る。しかし、ＣＯＸ−２特異的インヒビターのうちで臨床効果における可能な変動にも関らず、ＣＯＸ−２の阻害により、代表的に、滑膜炎の減少および軟骨損傷の危険性の予想される減少が得られる。
種々の生化学的アッセイおよび細胞アッセイおよび動物アッセイを展開し、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２アイソフォームのついて、インヒビターの相対的選択性を評価した。一般に、選択性を規定するための判断基準は、所定の生化学的アッセイ系または細胞アッセイ系から得られるＣＯＸ−１／ＣＯＸ−２（またはＣＯＸ−２／ＣＯＸ−１）の阻害定数の比である。この選択比により、顆粒体と細胞アッセイ系（組換えヒトＣＯＸイソ酵素を安定して発現する血小板とマクロファージ細胞株）との間で得られる酵素活性の阻害について、異なる絶対値ＩＣ５０を評価する。さらに、ＣＯＸ−２の阻害は、軟骨保護（阻害性）サイトカイン（例えば、ＩＬ−４）によって誘発される阻害効果を模倣し、これにより、細胞内ＣＯＸ−２合成を下方制御する。４５より多いＮＳＡＩＤの選択性および選択的ＣＯＸ−２インヒビターを比較すると（Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７５：１０８８−９５（１９９７））、ＣＯＸ−２ 対 ＣＯＸ−１について以下の序列の相対的選択性を示した：ＤｕＰ６９７＞ＳＣ−５８４５１＝セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）＞ニメスリド＝メロキシカム＝ピロキシカム＝ＮＳ−３９８＝ＲＳ−５７０６７＞ＳＣ−５７６６６＞ＳＣ−５８１２５＞フロスリド（ｆｌｏｓｕｌｉｄｅ）＞エトドラク＞Ｌ−７４５，３３７＞ＤＦＵ−Ｔ−６１４（７ｎＭ〜１７μＭの範囲のＩＣ５０値）。
選択的ＣＯＸ−２インヒビター（例えば、セレコキシブおよびロテコキシブ（ｒｏｔｅｃｏｘｉｂ））について規定される作用の分子機構および細胞機構から、ならびに動物の研究から、これらの化合物は、洗浄溶液または関節への直接的注射で手術中に適用した場合に、軟骨保護作用を示すことが期待される。特に、ＣＯＸ−２インヒビターは、関節鏡検査の外科手順の間に洗浄溶液で、あるいは関節への外科的手順もしくは他の損傷の前、その間、またはその後に、関節へ直接的に注射することにより、送達されるに有効な薬物であると期待される。
本発明に適切なＣＯＸ−２インヒビターの例が、以下に列挙される。局所送達の全モード（すなわち、注射、注入および洗浄）のために、各適切な薬剤の最適な用量および／または濃度は、治療学的に有効である用量および／または濃度である。例として、列挙される薬剤の各々に対して、列挙した薬剤を含む洗浄溶液の好ましいおよび最も好ましい濃度は、治療学的に有効であると予想される濃度で提供される。
Figure 2005519917
 （６．ＭＡＰキナーゼインヒビター）
マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼは、細胞表面から核に信号を伝達する際に、種々の細胞外刺激および機能に応答して活性化される、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼの群である。このＭＡＰキナーゼカスケードは、初期遺伝子を媒介するために成長因子、ホルモンおよび炎症性サイトカインからの信号を伝達する主な細胞内シグナル伝達経路の一つである。他のシグナル伝達経路と組合せて、これらの活性化マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）は、リン酸化状態および転写因子の活性を差示的に変化させ、そして細胞増殖、分化および環境的ストレスに対する細胞応答を究極的に調節する。例えば、ＭＡＰＫファミリー（ｐ３８）のメンバーは、強力な炎症促進サイトカイン（ＩＬ−１およびＴＮＦ−α）からの主な生化学的シグナル伝達経路を媒介し、ＣＯＸ−２遺伝子の転写制御に関連するシス作用因子を介して、刺激されたマクロファージ中でのシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の誘導に導く。
ＭＡＰキナーゼクラスの薬剤のメンバーは、少なくとも３つのファミリーを構成し、このファミリーは、配列、活性化ループのサイズ、および異なるシグナル伝達経路での細胞外刺激および関与による活性化が異なることが公知である。このＭＡＰキナーゼのファミリーの中で顕著なメンバーとしては、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２（それぞれｐ４４ＭＡＰＫおよびｐ４２ＭＡＰＫ）；ストレス−活性化タンパク質キナーゼ１（ＳＡＰＫ１）ファミリー（このファミリーはまた、ＪＮＫまたはＮ末端キナーゼファミリーとして言及される）；およびｐ３８ ＭＡＰキナーゼファミリー（このファミリーはまた、ストレス−活性化キナーゼ２／３（ＳＡＰＫ−２／３）として公知である）が挙げられる。ｐ３８キナーゼは、ストレス（最も特に、炎症促進サイトカイン）によって活性化される。ｐ３８ファミリー内で、少なくとも４つの異なるホモログ（アイソタイプまたはイソ酵素）が存在する。この標準的命名法は、それぞれ、ＳＡＰＫ２ａ、ＳＡＰＫ２ｂ、ＳＡＰＫ２ｄ、ＳＡＰＫ３、またはｐ３８α、β、δ（ＳＡＰＫ４）およびγとしていずれかを言及する。本発明の実施に有用であるＭＡＰキナーゼのインヒビターは、上記ＭＡＰキナーゼのいずれか１個または組合せで相互作用し得る。特定のＭＡＰキナーゼインヒビターについて、精製されたインビトロ酵素のアッセイを介しておよび細胞アッセイにおいて特徴付けされた阻害定数が、広範な濃度範囲にわたって変化し得、そしてこの適用での利用を実証し得る。ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化は、トレオニンおよびチロシン残基の二重のリン酸化によって媒介される。細胞のＴＮＦ−αとＩＬ−１の両方の処置により、迅速（５分内）にリン酸化を増強し、そしてｐ３８ ＭＡＰキナーゼを活性化することを示した。
以前の仕事により、小分子のインヒビターが、ｐ３８ キナーゼを特異的に阻害し得（Ｌｅｅ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３７２：７３９−７４６（１９９４））、そして生化学レベルおよび種々の動物モデルにおいて抗炎症性効果を生じることが示された。Ｃｕｅｎｄａおよび共同研究者（Ｃｕｅｎｄａ，Ａ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３６４：２２９（１９９５））は、化合物ＳＢ２０３５８０［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール］が、インビトロでｐ３８を阻害（ＩＣ５０＝０．６μＭ）し、ＭＡＰＫ活性化プロテインキナーゼ−２の活性を抑制し、そしてインビボでＩＬ−１および細胞ストレスに応答して、熱ショック蛋白（ｈｓｐ）２７のリン酸化を阻害した。ｐ３８に対するＳＢ２０３５８０阻害作用のキナーゼ選択性は、その失敗によって、またはインビトロで少なくとも１５の他のタンパク質キナーゼの最も弱い阻害で実証された。このキナーゼとしては、ＰＫＣ、ＰＫＡ、ｓｒｃおよびレセプターチロシンキナーゼファミリーのメンバーが挙げられる（Ｌｅｅ，Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８２：３８９−３９７（１９９９））。細胞の研究において、ＳＢ２０３５８０でのプレインキュベーションにより、酵素のＩＬ−１およびＴＮＦ−α誘導リン酸化および続くＩＬ−８の産生を阻害することが示された。このことは、外科手術の間に、インヒビターを送達する先取り効果を支持する。
軟骨の破壊から得られる生化学的炎症性応答におけるｐ３８マイトジェン−活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の役割を、ＳＢ２０３５８０を使用して研究し、これは、この酵素を特異的に阻害した。ｐ３８ ＭＡＰＫによって選択的に制御されるＩＬ−１の作用は、プロスタグランジンＨシンターゼ−２（ＣＯＸ−２）、メタロプロテイナーゼ、およびＩＬ−６の調節である（Ｒｉｄｌｅｙ，Ｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３１６５−７３（１９９７））。ヒトの線維芽細胞および血管内皮細胞において、ＳＢ２０３５８０は、他の公知のＩＬ−１活性化プロテインキナーゼ経路（ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫ，ｐ５４ ＭＡＰＫ／ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ）に影響を与えない線維芽細胞中のｈｓｐ２７（ｐ３８ ＭＡＰＫ活性のインディケーター）のＩＬ−１誘導リン酸化を阻害した（ＩＣ５０＝０．５μＭ）。さらに、ＳＢ２０３５８０は、ＩＬ−１−刺激ＩＬ−６（３０〜５０％（１μＭ））を有意に阻害したが、ヒトの線維芽細胞および内皮細胞からのＩＬ−８の産生を阻害しなかった。
重要なことは、ＳＢ２０３５８０は、線維芽細胞およびヒト内皮細胞による、ＩＬ−１刺激プロスタグランジンの産生を強力に阻害した。このことは、ＣＯＸ−２タンパク質およびｍＲＮＡの誘発の阻害と関連していた。ＰＧＥ２は、軟骨の破壊の重要なメディエーターであるマトリクスメタロプロテイナーゼの増加した発現に寄与する。滑膜線維芽細胞と軟骨細胞の両方は、サイトカインによる活性化および細胞外刺激で、高いレベルのＣＯＸ−２遺伝子を発現する。ＭＡＰＫインヒビターは、これらの細胞型および他の細胞型において発現するＭＡＰキナーゼの阻害活性に起因して、軟骨保護活性を提供する。
ＭＡＰＫインヒビターは、種々の炎症性状態または病態生理学的状態において、関節の組織に全身的にまたは局所的に適用された場合に、軟骨保護薬として有用であることが期待される。ＳＢ２０３５８０は、インビボで数種の病態生理学的モデルにおいて特徴付けされ、そして長期の経口投与下で活性を有することが実証された。ＳＢ２０３５８０は、ＴＩＭＰ−１の合成に影響を与えることなく、ＩＬ−１によるコラゲナーゼ−１およびストロメライシンー１の産生の刺激を阻害することが見出された。さらに、ＳＢ２０３５８０は、ＩＬ−１刺激コラーゲナーゼ−１およびストロメライシンー１ ｍＲＮＡの増加を防止する。軟骨の破壊のモデルにおいて、短時間のＩＬ−１刺激プロテオグリカンの再吸収およびプロテオグリカン合成の阻害は、ＳＢ２０３５８０によって影響されなかったが、一方で、長時間のコラーゲンの破壊が、防止された。さらに、ＳＢ２０３５８０は、ウシの関節軟骨移植片および軟骨細胞においてＩＬ−１誘導一酸化窒素の産生を阻害するのに有効であることが見出された（Ｂａｄｇｅｒ １９９８）。インビトロでのこれらの観察は、関節中のこれらの組織に全身的にまたは直接的および局所的に投与されるＭＡＰキナーゼインヒビターの軟骨保護活性についての基礎を提供する。
ｐ３８ ＭＡＰキナーゼは、ＴＮＦ−誘導サイトカインキナーゼの発現に関し、そして、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性のインヒビターとして機能する薬物が炎症促進サイトカインの産生を阻害する（Ｂｅｙａｅｒｔ，Ｒ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１５：１９１４−２３（１９９６））。細胞のＴＮＦ−α処置により、増加したｐ３８ ＭＡＰＫ自体のリン酸化およびその基質タンパク質の活性化によって示されるように、ｐ３８ ＭＡＰＫ経路を活性化した。ＳＢ２０３５８０を用いた細胞の前処置により、タンパク質キナーゼ−２およびｈｓｐ２７リン酸化を活性化するＭＡＰＫのＴＮＦ−α誘導活性を完全に阻害した。同じ条件下で、ＳＢ２０３５８０はまた、ＩＬ−６のＴＮＦ−α誘導合成および２つのＮＦ−κＢエレメントを含む最小のプロモータによって駆動されたレセプター遺伝子の発現を完全に阻害した。従って、他のｐ３８インヒビターについての、これらの研究および関連する研究は、インヒビター（例えば、ｐ３８ ＭＡＰＫにおけるＳＢ２０３５８０およびＦＲ１３３６０５）の作用により、軟骨の分解物に結合する種々のタンパク質のＴＮＦ−α−およびＩＬ−１誘導活性を選択的に妨害することを示す。従って、レセプターのキナーゼ下流の阻害によって、これらの鍵となる炎症促進サイトカインの経路をシグナル伝達するＭＡＰキナーゼの選択的な阻害は、ＭＡＰキナーゼインヒビターが軟骨保護効果を提供し得ることを示す。
ＳＢ２０３５８０を、サイトカイン阻害および炎症性疾患のいくつかの動物モデルにおいて評価した。１５〜２５ｍｇ／ｋｇのＩＣ５０値を有するマウスおよびラットの両方において、インビボで炎症性サイトカイン産生の強力なインヒビターであることを実証した。ＳＢ２０３５８０は、ＤＢＡ／ＬＡＣＪマウスのコラーゲン誘導関節炎において治療学的活性を有し、５０ｍｇ／ｋｇの投与により足の炎症の有意な阻害が得られた。抗関節炎活性はまた、ＳＢ２０３５８０が、３０および６０ｍｇ／ｋｇ／日で経口投与された場合に、Ｌｅｗｉｓラットのアジュバンド誘導関節炎において観測された。さらなる証拠が、０．６μＭのＩＣ５０での骨再吸収において有利な効果で得られた。
要約すると、種々の生化学研究、細胞研究および動物研究により、Ｐ３８ ＭＡＰＫがＩＬ−１およびＴＮＦ−αへの応答の制御において重要な役割を果たすこと、ならびにいくらかの炎症性応答遺伝子（例えば、ＣＯＸ−２）のｍＲＮＡレベルの調節に関与していることが示される。ｐ３８のインヒビターは、炎症促進サイトカインの産生を遮断し、そしてＭＭＰの産生を阻害し、そして軟骨移植片のコラーゲン破壊を阻害することが実証された。
鍵となる炎症促進サイトカイン（例えば、ＩＬ−１およびＴＮＦ−α）の活性を遮断するためのＭＡＰＫインヒビターの使用は、滑膜線維芽細胞、マクロファージおよび軟骨細胞を含む、関節中の多くの細胞型で有利な効果を有し、これにより、続く病理学的効果（例えば、炎症性細胞の関節への侵入、滑膜の増殖、滑膜細胞の活性化、および軟骨の破壊）を阻害する。従って、ＭＡＰＫインヒビターは、上述のサイトカインによる炎症性応答の伝播を遮断し、これにより、疾患プロセスを妨害する。
本発明に適切なＭＡＰＫインヒビターの例は、以下に列挙される。局所送達の全モード（すなわち、注射、注入および洗浄）のために、各適切な薬剤の最適な用量および／または濃度は、治療学的に有効である用量および／または濃度である。例として、列挙される薬剤の各々に対して、列挙した薬剤を含む洗浄溶液の好ましいおよび最も好ましい濃度は、例えば、局所送達のために治療学的に有効であると予想される濃度で提供される。同様に、本発明に従う全身的組成物は、関節または列挙された治療範囲内の作用部位で局所的濃度を生じるに十分な薬剤の投薬量または負荷量を適切に含む。標的化された徐放送達系について、薬剤の十分な投薬量または負荷量は、所定の徐放期間にわたって、関節または列挙された治療範囲内の作用部位で局所的濃度を生じるために、組成物中に含まれる。
Figure 2005519917
 （７．マトリクスメタロプロテイナーゼのインヒビター）
関節軟骨の破壊は、関節疾患（例えば、変形性関節症および慢性関節リウマチ）の共通した特徴であるが、関節へ損傷に続いて発生する。病態生理学的に、軟骨の生物力学特性を損なう、プロテオグリカンおよびコラーゲンの構造破壊が観測される。正常な健康な細胞外マトリクスの維持は、生合成およびマトリクス成分の取り込みの速度と、それらの分解および軟骨から滑液への続く損失の速度との間の平衡を反映する。種々のプロテアーゼは、軟骨を分解する能力を有し、分解プロセス（最も著しくは、マトリクスメタロプロテイナーゼ）に関与する。
マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）またはマトリキシン（ｍａｔｒｉｘｉｎ）は、細胞外で機能する少なくとも１５個の亜鉛エンドペプチダーゼのファミリーであり、そして組織の病理学的な分解において鍵となる役割を果たす。ＭＭＰのメンバーの現在の命名法および別名を、表７に提供する。ほとんどのＭＭＰは、高度に制御され、そしてほとんどのＭＭＰは、正常の組織において構成的に発現されない。しかし、炎症促進サイトカイン（例えば、ＩＬ−１およびＴＮＦ−α）は、転写および発現を開始する。組織分解ＭＭＰの上方制御および活性化によって生じる不均衡は、関節損傷後の慢性炎症性疾患および持続性滑膜炎症性応答の間に、軟骨破壊プロセスの第１の原因となる因子である。軟骨マトリクスの代謝が、膝の半月板損傷または前十字靱帯断裂のいずれかを有する患者において研究されている。ストロメライシン−１（ＭＭＰ−３）、コラゲナーゼ、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ−１）、およびプロテリオグリカンフラグメントの濃度が、膝損傷の治療後に、ヒトの膝滑液中で増加することが示された。時間的に、これらの値は、参照のレベルを上回って即座に上昇し、そして１年の期間にわたって有意に上昇（１０倍の増加）したままであった。これらの変化は、膝の靭帯損傷後に、滑液において観測されるプロテオグリカンフラグメントの濃度の増加をおそらく駆動する。
Figure 2005519917
 ＭＭＰファミリーの酵素は、ヒト軟骨細胞から、滑膜線維芽細胞のような滑膜細胞により分泌されることが示されている。さらに、インサイチュハイブリダイゼーションを用いて、ヒト滑膜が、ストロメリシン−１およびコラゲナーゼの両方を合成することが示された。ストロメリシン−１（ＭＭＰ−３）は、軟骨マトリックスの全ての成分を分解し得る。軟骨細胞が、マトリックス分解酵素（コラゲナーゼ−３）の放出により、軟骨の分解に寄与することの証拠が存在する。炎症促進性サイトカインにより活性化されると、ＭＭＰが細胞から潜伏性形態で分泌され、細胞外で活性化され、そしてメタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）により阻害される。ＭＭＰ活性とＴＩＭＰ活性との間の平衡は、インタクトな軟骨マトリックスの維持に重要であると考えられる。変形関節症および慢性関節リウマチのような病理学的条件下で、いくつかの研究が、ＭＭＰの増大した量を示し、それにより、ＭＭＰとＴＩＭＰとの間の不均衡が生じる。これは、観察された軟骨破壊を説明すると考えられる。
ＭＭＰは、軟骨細胞および滑膜細胞に作用してそのプロテアーゼ産生を増強する、サイトカイン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）および成長因子）により調節される。他の炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−α）はまた、マトリックス分解酵素の産生をアップレギュレートする。これは、通常硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の欠如およびコラーゲンの切断として評価される、軟骨破壊をもたらす。関節炎疾患を有する患者の関節流体内に存在するＩＬ−１は、軟骨破壊を刺激して、増大した量の酵素（例えば、ストロメリシン、線維芽細胞コラゲナーゼおよび好中球コラゲナーゼ、ならびにプラスミノーゲンアクチベーター）を合成する。さらに、ＩＬ−１は、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１およびＴＩＭＰの合成を阻害し、そしてまた、コラーゲンのようなマトリックス成分の合成を阻害する。インヒビターのレベルと酵素のレベルとの不均衡は、マトリックス生合成の抑制とともに活性なプロテアーゼの量の増加をもたらし、その結果、軟骨分解を生じる。
インビトロモデルとして軟骨スライスを用いて、コラゲナーゼインヒビターが、ＩＬ−１またはＩＬ−８のいずれかが刺激するリウマチ様滑膜線維芽細胞（ＲＳＦ）による関節軟骨の侵襲を阻害し得ることが示されている。コラゲナーゼインヒビター（１，１０−ｏ−フェナントロンリンおよびホルホラミドン）は、１０〜１５０Ｍの濃度で、ＲＳＦ細胞による軟骨の濃度依存性の浸透を実質的に阻害した。プロテイナーゼの分泌に対するサイトカインの選択的な効果は、滑膜線維芽細胞様細胞媒介性の関節分解が高度に調節されたプロセスであることを示す。従って、プロテアーゼ活性および関節内の関連マトリックス分解を局所的に阻害する能力は、軟骨破壊プロセスを阻害することが期待される。制限されたインビトロ系におけるインヒビターの作用は、適切な薬物動態を有する合成ＭＭＰインヒビターの全身性送達または局所性送達を用いる治療的介入が、軟骨保護剤として有効であることを示す。
本発明に適するＭＭＰインヒビターの例としては、以下が挙げられ：Ｕ−２４５２２（（Ｒ，Ｓ）−Ｎ−［２−［２−（ヒドロキシルアミノ）−２−オキソエチル］−４−メチル−１−オキソペンチル］−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニアミド）；ＢＢ２５１６；（Ｎ２−［３５［ヒドロキシ−４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２Ｒ−イソブチル］−Ｌ−ロイシン−Ｎ１−メチルアミド（マリマスタット（ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）としても公知））ペプチド（例えば、ＭＭＰインヒビター−ＩおよびＭＭＰ−３インヒビター）、およびより大きいタンパク質（例えば、ＴＩＭＰ−１またはそのフラグメント）、その例は、以下の表に列挙される：局所送達の全ての様式（すなわち、注射、注入および潅注）について、適する薬剤の各々の最適容量および／または濃度は、治療的に有効である用量／濃度である。１例として、列挙された薬剤の各々について、列挙した薬剤を含む潅注溶液の好ましい濃度および最も好ましい濃度が提供され、このような濃度は、局所的に送達された場合、治療的に有効であることが期待される。同様に、本発明に従う全身組成物は、関節または作用部位において、列挙した治療範囲内の局所濃度を生じるのに十分な薬物の用量または負荷を適切に含む。標的化徐放送達系について、薬剤の十分な容量または負荷が組成物注に含まれ、その結果、所定の徐放期間にわたって、関節または作用部位において、列挙した治療範囲内の局所濃度を生じる。
Figure 2005519917
 （８．核因子κＢ（ＮＦκＢ）のインヒビター）
炎症促進性細胞経路および軟骨破壊性細胞経路は、新規の治療的局所薬物送達および治療的全身薬物送達の標的である、細胞外シグナル伝達機構および細胞内シグナル伝達機構により調節される。炎症性サイトカインであるインターロイキン−１（ＩＬ−１）により利用され、転写因子、核因子κＢ（ＮＦκＢ）を活性化する完全な分子シグナル伝達系機構は、ほとんど定義されていない。
それにも拘らず、遺伝子転写のレベルでの細胞内シグナル伝達に関与する重要な分子は、炎症促進性転写因子（ＮＦκＢ）である。ＮＦκＢ活性は、ホモダイマーおよびヘテロダイマー形態のいずれかでＤＮＡと結合する転写因子サブユニットファミリーにより媒介される。これらのサブユニットは、代表的に、ＩκＢと称される阻害サブユニットの結合に起因して、不活性形態の細胞の細胞質内に存在する。ＩＬ−１レセプターおよび他の細胞外シグナルの活性化は、ＩκＢの分解およびそれに付随するインヒビターからのＮＦκＢの解離を誘導し、その後、核へのトランスロケーションが生じる。ＮＦκＢは、ＩＬ−１誘導性の発現に関与することが見出され、ＲＡ滑膜線維芽細胞における炎症促進性のＣＯＸ−２タンパク質発現を増加し得た。
重要な分子標的としてのＮＦκＢの同定は、関節炎症経路および軟骨破壊経路に関連したいくつかの決定的な炎症メディエーターの遺伝子発現を調節する共通の下流シグナル伝達エレメントとしてのその役割に基づく。多くの遺伝子（ＣＯＸ−２、コラゲナーゼ、ＩＬ−６、ＩＬ−８）の応答は、両方のＮＦκＢプロモーターエレメントを含むプロモーターにより支配される。ＮＦκＢの活性化は、炎症プロセスの中心となる多くのタンパク質（例えば、サイトカイン、細胞接着分子、メタロプロテイナーゼ、および骨膜細胞におけるプロスタグランジンおよびロイコトリエン（ＣＯＸ−２）の産生に関与する他のタンパク質の誘導を媒介する。従って、この転写因子は、ヒト滑膜線維芽細胞、ヒト関節軟骨細胞、および関節における他の細胞の損傷応答に指向された治療において生理学的に重要な標的を表す。
詳細には、ヒトリウマチ様滑膜線維芽細胞（ＲＳＦ）をインターロイキン１β（ＩＬ−１β）に暴露することにより、８５ｋＤのホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）および誘導シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）の協調アップレギュレーションを生じる。これら２つの酵素は共に、ＰＧＥ２（関節における主要な炎症メディエーター）のその後の生合成を促進する。オリゴヌクレオチドデコイおよびアンチセンスを使用して、プロスタノイド代謝酵素の調節における（ＮＦκＢ）の関与を実証した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してＮＦκＢ ｍＲＮＡを拮抗することにより、ＣＯＸ遺伝子プロモーターへの減少した結合を生じた。
海洋天然産物であるヒメニアルディシン（ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ）は、近年、ＮＦκＢ活性化のインヒビターとして特徴付けされ、ＩＬ−１への暴露により刺激されたＲＳＦは、濃度依存性様式でＰＧＥ２産生を阻害した（ＩＣ５０＝１μＭ）。分子標的の特異性は、アナログであるアルディシン（ａｌｄｉｓｉｎｅ）およびプロテインキナーゼＣインヒビター（ＲＯ ３２−０４３２）の使用（これらは不活性であった）により示された。ＩＬ−１誘導ＮＦκＢ活性化に対するｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅの直接的な作用は、古典的なκＢコンセンサスモチーフへのＮＦκＢ結合における有意な減少（約８０％）および処理された細胞の細胞質ゾルからの刺激されたｐ６５遊走の阻害により実証された。ＮＦκＢ転写調節のインヒビターに関して予測されるように、ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ処理ＲＳＦは、ＩＬ−１に応答してＣＯＸ−２またはＰＬＡ２のいずれについてもｍＲＮＡを転写しなかった。結果として、これらの酵素についての減少したタンパク質レベルおよびＰＧＥ２を産生する能力における減少が観察された。さらに、ＩＬ−１刺激インターロイキン−８（ＩＬ−８）産生（これは、ＮＦκＢ調節事象であることが知られている）もまた、ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅにより阻害されたが、一方、脈管内皮増殖因子のＩＬ−１誘導産生（非ＮＦκＢ調節遺伝子）は、ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎへの暴露により影響されなかった。従って、ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎは、ＮＦκＢ活性化に対する阻害効果により、ＰＧＥ２のＩＬ−１刺激滑膜線維芽細胞形成を阻害する。このことは、関節炎症および軟骨破壊におけるＮＦκＢの役割を遮断する新規なインヒビターとしてのその用途を規定するための基礎を提供する。
本発明に適切なＮＦκＢインヒビターの例は、以下に列挙される。局所送達の全ての様式（すなわち、注射、注入および灌注）について、各適切な薬剤の最適な用量および／または濃度は、治療的に有効な用量および／または濃度である。例として、列挙された薬剤の各々について、列挙された薬剤を含む灌注液の好ましい濃度および最も好ましい濃度が提供され、このような濃度は、局所的に送達された場合に治療的に有効であると予測される。同様に、本発明に従う全身組成物は、列挙された治療的範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるために十分な薬剤の投薬量または負荷を適切に含む。標的化された持続性放出送達系については、薬剤の十分な投薬量または負荷が、所定の持続放出期間にわたって列挙された治療的範囲内の、関節または作用部位における局所濃度を生じるように組成物に含まれる。
Figure 2005519917
 （９．酸化窒素シンターゼインヒビター）
酸化窒素（ＮＯ）は、いくつかの結合組織疾患の病理学的機構に関与する広く行き渡った細胞内および細胞間メディエーターである。ＮＯは、細胞内に局在化される酵素ファミリー（ＮＯシンターゼ）によりＬ−アルギニンから形成される。ＮＯシンターゼの３つのアイソフォームは、クローン化されそして配列決定された。内皮細胞ＮＯシンターゼ（ｅｃＮＯＳ）および脳ＮＯシンターゼ（ｂＮＯＳ）は、構成的に活性である。ＮＯシンターゼの別個のアイソフォーム（誘導性ＮＯＳ（ｉＮＯＳ））は、多くの細胞型（軟骨細胞を含む）で見出される。これは、基底条件下で存在しないが、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αのような炎症促進性メディエーターに応じてアップレギュレートされる。最近の発見は、ＩＬ−１が軟骨細胞ＮＯ合成の非常に強力な刺激物質であること、およびＩＬ−１が、ｉＮＯＳのレベルをアップレギュレートするその能力により作用することを示す。関節内において、軟骨細胞は、ＮＯの主要な供給源であり、そして炎症促進性サイトカインにより誘導される軟骨細胞ｉＮＯＳは、炎症性関節症におけるＩＬ−１の多くの効果を媒介すると考えられている。
軟骨細胞誘導性ＮＯシンターゼ（ｉＮＯＳ）を特異的に阻害する薬物は、関節損傷（例えば、関節を含む外科手順）に起因して生じる軟骨破壊の予防において治療的役割を有し得る。このような有益な治療効果を支持する証拠は、変形性関節症を有する患者由来の培養された軟骨細胞および軟骨の外植片において誘導性ＮＯシンターゼ活性を阻害するそれらの能力について種々のｉＮＯＰＳインヒビターを評価した実質的な数の研究に基づく。Ｓ−置換イソチオウレアと称される種類の化合物は、軟骨におけるＮＯ生合成の強力なインヒビターとして特徴付けされた。Ｓ−メチルイソチオウレアおよびＳ−（アミノエチル）イソチオウレアは、ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニンよりも２〜４倍強力であり、アミノグアニジンよりも５〜１０倍強力であり、そしてＮω−ニトロ−Ｌ−アルギニンおよびＮω−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステルよりも３００倍を超えて強力であった。これらのイソチオウレア化合物は、軟骨におけるｉＮＯＳの強力でかつ比較的特異的なインヒビターの種類を提供し、従って、本発明の局面による全身送達または局所送達に適切である（Ｊａｎｇ，Ｄ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３１２：３４１−３４７（１９９６））。
ＮＯシンターゼインヒビターの軟骨保護の治療的能力はまた、軟骨マトリクスに対する効果を規定するために単離された軟骨細胞のようなインビトロ系を使用して評価された。ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）（確立されたＮＯシンターゼインヒビター）による内因性ＮＯ産生の阻害は、ＩＬ−１β刺激軟骨細胞によるゲラチナーゼ産生、コラゲナーゼ産生およびストロメリシン産生の抑制をもたらす。ＮＯ産生の阻害はまた、軟骨細胞のＩＬ−１βへの暴露により生じるラクテート産生における増加を部分的に低減する。Ｌ−ＮＭＭＡを用いる軟骨断片の処理は、グリコサミノグリカン合成のＩＬ−１β阻害効果を部分的に逆転し、ＩＬ−１β刺激ＭＭＰ活性を阻害し、そしてＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）産生を増加する。ＮＯはまた、ＩＬ−１βに暴露された軟骨細胞によるＴＧＦ−β１の産生を減少することにより、間接的にプロテオグリカン合成を調節し得る。これは、ＴＧＦ−β１におけるオートクラインに刺激された増加を防止し、それにより軟骨細胞におけるこのサイトカインの同化効果を減少する。
ある研究は、プロテオグリカン合成およびＮＯ産生に対する組み換えヒトＩＬ−１応答の阻害効果に関して、新規なアミノグアニジンＮＯＳインヒビター、Ｓ−メチルイソチオウレア（ＳＭＴ）ＮＯＳインヒビター、Ｓ−アミノエチルイソチオウレア（ＡＥＴＵ）ＮＯＳインヒビター、Ｌ−ＮＭＭＡ ＮＯＳインヒビターおよびＮ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）ＮＯＳインヒビターの効力を比較した。異なる培養系は、ＮＯ産生の大量の増加およびプロテオグリカン合成の顕著な抑制を伴い、ＩＬ−１βチャレンジに対して濃度依存性様式で応答することが示された。上記のＮＯＳインヒビター（１〜１０００μＭ）は、ＩＬ−１βで処理された軟骨細胞によるＮＯ産生を阻害し、そして軟骨細胞における修復プロテオグリカン合成に対する顕著な効果を有した。従って、ＮＯ産生が、治療的に有効な濃度および用量を使用して遮断され得る場合、プロテオグリカン合成のＩＬ−１β阻害は防止される。
ＮＯシンターゼは、関節炎疾患を有する患者の関節から得られた軟骨において発現される。慢性関節リウマチまたは変形性関節症のいずれかを示す患者において、増加したレベルの亜硝酸塩が滑液中に観察されており、そしてこれらの患者におけるＮＯ産生の有意な供給源が、関節軟骨に由来することが示された。さらに、ｉＮＯＳの強力なインヒビターであるＬ−ＮＩＬの持続性全身送達が、イヌにおける（ＡＣＬの切開により誘導された）実験的ＯＡの進行を低減し、そしてＩＬ−１β産生、ＰＧＥ２産生、ＮＯ産生およびＭＭＰ産生における実質的な減少を生じることが見出された。これらの発見は、ＮＯが、ＩＬ−１βの効果の強力な調節因子であり、そして関節疾患の病理学に寄与していることを示唆する。
従って、これらのインビトロおよびインビボの結果は、ＮＯシンターゼの特異的インヒビターが、滑膜炎症の臨床的処置のための強力な新規薬物であり、そして外科処置された関節又は他の損傷した関節を処置するための抗炎症性クラス、軟骨保護クラスおよび抗疼痛クラスから選択される１つ以上の薬物と組み合わせて全身的または局所的に送達された場合に軟骨保護効果を提供し得ることを示す。
本発明に適切なＮＯシンターゼインヒビターの例は、以下に列挙される。局所送達の全ての様式（すなわち、注射、注入および灌注）について、各適切な薬剤の最適な用量および／または濃度は、治療的に有効な用量および／または濃度である。例として、列挙された薬剤の各々について、列挙された薬剤を含む灌注液の好ましい濃度および最も好ましい濃度が提供され、このような濃度は、局所的に送達された場合に治療的に有効であると予測される。同様に、本発明に従う全身組成物は、列挙された治療的範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるために十分な薬剤の投薬量または負荷を適切に含む。標的化された持続性放出送達系については、薬剤の十分な投薬量または負荷が、所定の持続放出期間にわたって列挙された治療的範囲内の、関節または作用部位における局所濃度を生じるように組成物に含まれる。一実施形態において、本発明の液剤中に含めるための好ましいＮＯシンターゼインヒビターは、１４００Ｗ（（Ｎ−３−（アミノメチル）ベンジル）アセトアミジン）（選択的で、緩慢な、しっかりと結合するｉＮＯＳインヒビター）、ジフェニレンヨージニウムおよび１，３−ＰＢＩＴである。
Figure 2005519917
 （１０．細胞接着分子）
（１０ａ．インテグリンアゴニストおよびインテグリンアンタゴニスト）
インテグリンは、αサブユニットおよびβサブユニットを含む、形質膜上に位置するヘテロダイマーレセプターであり、細胞外基質（ＥＣＭ）成分であるかまたは他の大きなタンパク質（例えば、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、オステオポンチン（ＯＰＮ）およびフィブロネクチン（ＦＮ））であり得る、リガンドに結合する。軟骨基質の分解は、これらの細胞とＥＣＭとの相互作用に依存する機構を介して軟骨細胞により調節される。軟骨細胞遺伝子発現は、軟骨細胞を取り囲む環境におけるＥＣＭの成分とのインテグリンの相互作用を含む細胞接触により、一部制御される。それ故、軟骨細胞上のインテグリンは、軟骨ホメオスタシスの制御に関与し、そしてこのファミリーのレセプターは、軟骨分解を防ぐための治療標的の種類を代表する。
ヒト軟骨細胞は、別個のαサブユニットおよびβサブユニットから構成される一連のインテグリンレセプター（α１β１、α５β１、αＶβ３およびより少ない量のその他のものを含む）を発現する。特に重要なものは、αＶβ３インテグリンであり、これは、ＯＰＮに結合することが知られている。αＶβ３複合体特異的機能をブロックするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＬＭ６０９は、リガンドＯＰＮに類似の様式でアゴニストとして作用する。これは、多数の炎症促進性メディエーターおよび軟骨破壊メディエーター（例えば、ＩＬ−１、ＮＯおよびＰＧＥ２）の産生を減弱させる。従って、アゴニストｍＡｂ ＬＭ６０９は、本発明における使用に適切であると考えられる。
さらに、２つのペプチドミメティック（ＭＫ−３８３（Ｍｅｒｃｋ）およびＲＯ４４８３（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｐｃｈｅ））は、フェーズＩＩ臨床試験で研究されている。これらは両方とも低分子であるので、これらは、短い半減期および高い有効性を有する。しかし、これらは、低い特異性も有するようであり、他の密接に関連するインテグリンと相互作用する。これらのペプチドミメティックもまた、本発明における使用に適切である。
Figure 2005519917
 （１１．抗走化性薬剤）
抗走化性薬剤は、炎症細胞の走化性を防ぐ。これらの薬剤が作用する抗走化性標的の代表例としては、Ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅレセプター、ＩＬ−８レセプター、ＭＣＰ−１レセプター、およびＭＩＰ−１−Ｉ／ＲＡＮＴＥＳレセプターが挙げられるが、これらに限定されない。この薬剤のクラス内の薬物は、開発段階の初期にあるが、本発明における使用に適切であり得ると理論づけられる。
（１２．細胞内シグナル伝達インヒビター）
（１２ａ．プロテインキナーゼインヒビター）
（ｉ．プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）インヒビター）
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、多数の生理学的プロセスについての細胞表面シグナル伝達において重要な役割を果たす。ＰＫＣアイソザイムは、Ｇタンパク質結合レセプター（例えば、セロトニン、ブラジキニンなど）または炎症促進サイトカインレセプターのいずれかの最初の活性化から生じる下流標的として活性化され得る。これらのレセプターのクラスの両方は、軟骨破壊の媒介において重要な役割を果たす。
分子クローニング分析は、ＰＫＣが少なくとも８の亜種（アイソザイム）からなる大きなファミリーとして存在することを明らかにした。これらのアイソザイムは、構造およびレセプター活性化を特定の細胞の増殖応答における変化と結び付ける機構において実質的に異なる。特定のアイソザイムの発現は、以下を含む広範な種々の細胞型において見出される：滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）、軟骨細胞、好中球、骨髄性細胞、および平滑筋細胞。従って、ＰＫＣのインヒビターは、インヒビターがアイソザイム特異性を示さなければ、いくつかの細胞型においてシグナル伝達経路をもたらすようである。従って、ＰＫＣのインヒビターは、滑膜細胞および軟骨細胞の活性化をブロックする際に効果的であると予測され得、そしてまた、好中球活性化およびその後の付着をブロックする際に抗炎症効果を有し得る。いくつかのインヒビターが記載されており、そして最初の報告は、ｃａｌｐｈｏｓｔｉｎ Ｃ阻害活性についての５０μＭのＩＣ50を示す。Ｇ−６２０３（Ｇｏ６９７６としても公知）は、２〜１０μＭ範囲のＩＣ50値を有する特定のＰＫＣアイソタイプについて高い選択性を有する、新しい強力なＰＫＣインヒビターである。これらの薬物および本発明における局部送達の使用に適切と考えられる別の薬物（ＧＦ１０９２０３Ｘ（Ｇｏ６８５０またはビスインドイルマレイミドＩとしても公知）（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔから入手可能））の濃度を以下に述べる。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙される治療範囲内の関節および作用部位での局所的な濃度を生じるのに十分な投薬量および負荷の薬剤を適切に含む。標的化除放送達システムのために、十分な投薬量および負荷の薬剤が、所定の除放期間にわたる列挙される治療範囲内の関節および作用部位での局所的濃度を生じるように組成物に含まれる。
（表１２ 軟骨破壊阻害剤の治療的濃度および好ましい濃度）
Figure 2005519917
 （ｉｉ．プロテインチロシンキナーゼインヒビター）
レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーの多数のメンバーの間には、多大な多様性が存在するが、これらのレセプターにより使用されるシグナル伝達機構は、多くの共通する特徴を共有する。生化学および分子遺伝学の研究は、ＲＴＫの細胞外ドメインへのリガンドの結合が、細胞内ドメインの内因性のチロシンキナーゼ触媒活性を急速に活性化することを示した（図５を参照のこと）。増加した活性は、共通の配列モチーフを含む多数の細胞内基質のチロシン特異的リン酸化を生じる。結果的に、これは、多数の「下流」シグナル伝達分子の活性化、ならびにリン脂質代謝、アラキドン酸代謝、タンパク質リン酸化（プロテインキナーゼ以外の機構を含む）、カルシウム動員および転写活性を調節する細胞内経路のカスケードを引き起こす（図２を参照のこと）。ＲＴＫ細胞質ドメインの成長因子依存性チロシンキナーゼ活性は、細胞増殖をもたらす細胞内シグナルを生成するための主な機構である。従って、インヒビターは、このシグナル伝達をブロックし、それにより滑膜細胞および軟骨細胞の活性化を妨げる潜在能力を有する。
いくつかの関連するチルホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）化合物のいずれかは、チロシンキナーゼ活性の特異的インヒビターとしての能力を有する（０．５〜１．０μＭ範囲のインビトロでのＩＣ50）。なぜならば、これらの化合物は、他のプロテインキナーゼおよび他のシグナル伝達系に対してほとんど影響を及ぼさないからである。現在までに、多くのチルホスチン化合物のうちわずかしか市販されておらず、そしてこれらの薬剤の本発明において使用される場合の適切な濃度は、以下に示される。さらにスタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）は、ｓｒｃサブファミリーのいくつかのプロテインチロシンキナーゼに対する強力な阻害効果を示すことが報告されており、そして局所送達のために本発明において使用される場合のこの薬剤の適切な濃度もまた、以下に述べられる。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙される治療範囲内の関節および作用部位での局所的な濃度を生じるのに十分な投薬量および負荷の薬剤を適切に含む。標的化除放送達システムのために、薬剤の十分な投薬量および負荷が、所定の除放期間にわたる列挙される治療範囲内の関節および作用部位での局所的濃度を生じる組成物に含まれる。
（表１３ 阻害剤の治療的濃度および好ましい濃度のモジュレーター）
Figure 2005519917
 （１２ｂ．細胞内プロテインチロシンホスファターゼの調節因子）
ｓｒｃ−ｈｏｍｏｌｏｇｙ2 ＳＨ２ドメインを含む非膜貫通プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）は、公知であり、そしてこれらの名称は、ＳＨ−ＰＴＰ１およびＳＨ−ＰＴＰ２という。さらに、ＳＨ−ＰＴＰ１は、ＰＴＰ１Ｃ、ＨＣＰまたはＳＨＰとしても公知である。ＳＨ−ＰＴＰ２は、ＰＴＰ１ＤまたはＰＴＰ２Ｃとしても公知である。同様に、ＳＨ−ＰＴＰ１は、全ての直系および全ての分化段階の造血細胞において高いレベルで発現され、そしてＳＨ−ＰＴＰ１遺伝子は、虫食い状（ｍｏｔｈｅａｔｅｎ）（ｍｅ）マウス表現型の原因であると同定されており、そしてこれは、細胞基質との相互作用をブロックするインヒビターの効果を推測するための基礎を提供する。走化性ペプチドでの好中球の刺激は、好中球応答を媒介するチロシンキナーゼの活性化を生じることが公知であり（Ｃｕｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４））、そしてＰＴＰａｓｅ活性は、細胞刺激の最初の段階において活性化されたチロシンキナーゼの効果を逆方向にすることにより、アゴニスト誘導活性を調節する。ＰＴＰａｓｅ活性を刺激し得る薬剤は、抗炎症のメディエーターとして潜在的な治療的適用を有し得る。
これらの同じＰＴＰａｓｅはまた、特定のＲＴＫの活性を調節することが示されてきた。これらは、活性化レセプターキナーゼの効果を相殺するようであり、従って重要な薬物標的を提示し得る。インビトロでの実験は、ＰＴＰａｓｅの注射が、内因性タンパク質上のチロシル残基のインスリン刺激リン酸化をブロックすることを示す。従って、ＰＴＰａｓｅの活性化のアクチベーターは、再狭窄におけるＰＴＫレセプター作用の活性化を逆にするように作用し得、そして本発明の溶液において有用であると考えられる。さらに、レセプター連結ＰＴＰａｓｅはまた、細胞接着分子のＰＴＰａｓｅと同様に、細胞外リガンドとして機能する。リガンドの細胞外ドメインへの結合の機能的結果は、まだ規定されていないが、結合が細胞内でホスファターゼ活性を調節するのに役立つと仮定することは妥当である（Ｆａｓｈｅｎａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５；１３６７−１３６９（１９９５））。このような作用は、他の細胞表面接着分子（ＮＣＡＭ）により媒介される接着をブロックし得、そして抗炎症性効果を提供する。このような適用のために開発された薬物はまだない。
（１２ｃ．ＳＨ２ドメイン（ｓｒｃＨｏｍｏｌｏｇｙ2ドメイン）のインヒビター）
ＳＨ２ドメイン（元々プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）のｓｒｃサブファミリーで同定された）は、非触媒的タンパク質配列であり、そして種々のシグナル伝達タンパク質の間で保存される約１００個のアミノ酸からなる（Ｃｏｈｅｎら、１９９５）。ＳＨ２ドメインは、ホスホチロシン結合モジュールとして機能し、それにより、細胞内のシグナル伝達経路における重要なタンパク質−タンパク質結合を媒介する（Ｐａｗｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，５７３−５８０，１９９５）。特に、ＳＨ２ドメインの役割は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）レセプターの場合のように、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）媒介シグナル伝達に重要であると、明確に規定された。自己リン酸化ＲＴＫ上のホスホチロシン含有部位は、ＳＨ２−タンパク質の結合部位として作用し、それにより、生化学的シグナル伝達経路の活性化を媒介する（図２を参照のこと）（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｇ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３２８３−３２８９ １９９２；Ｓｉｅｒｋｅ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１０１０２−１０１０８（１９９３））。ＳＨ２ドメインは、活性化成長因子レセプターの細胞応答への結合を担い、この応答は、遺伝子発現における変更、および最終的に細胞増殖を含む。従って、滑膜細胞表面上に発現される特定のＲＴＫ（ＩＧＦＲおよびＦＧＦＲを除く）の活性化の効果を選択的にブロックするインヒビターは、関節鏡検査手順後の軟骨分解をブロックする際に効果的であると予測される。
少なくとも２０の細胞質ゾルタンパク質は、ＳＨ２ドメインを含み、そして細胞内シグナル伝達において機能すると同定されている。ＳＨ２ドメインの分布は、特定のタンパク質ファミリーに限られず、いくつかのクラスのタンパク質、プロテインキナーゼ、脂質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、Ｒａｓ制御タンパク質およびいくつかの転写因子において見出される。多くのＳＨ２含有タンパク質は、既知の酵素活性を有するが、他のタンパク質（Ｇｒｂ２およびＣｒｋ）は、細胞表面レセプター間の「リンカー」および「アダプター」ならびに「下流」エフェクター分子として機能する（Ｍａｒｅｎｇｅｒｅ，Ｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３６９：５０２−５０５，１９９４）。シグナル伝達の際に活性化される酵素活性を有するＳＨ２ドメイン含有タンパク質の例としては、プロテインチロシンキナーゼのｓｒｃサブファミリー（ｓｒｃ（ｐｐ６０c-src）、ａｂｌ、ｌｃｋ、ｆｙｎ、ｆｇｒなど）、ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ−３−キナーゼ）、ｐ２１−ｒａｓ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）およびＳＨ２含有プロテインチロシンホスファターゼ（ＳＨ−ＰＴＰａｓｅ）が挙げられるが、これらに限定されない（Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ ７２，７６７−７７８，１９９３）。活性化細胞表面レセプターから最終的に細胞応答を規定するさらなる分子相互作用のカスケードへシグナルを伝達する際のこれらの種々のＳＨ２−タンパク質が占める中心的役割に起因して、特定のＳＨ２タンパク質（例えば、ｃ−ｓｒｃ）結合をブロックするインヒビターは、軟骨保護の潜在的な治療的適用を有する薬剤として望ましい。
さらに、多くの免疫／炎症応答の調節が、ＳＨ２ドメインを含む非レセプターチロシンキナーゼを介してシグナルを伝達するレセプターにより媒介される。抗原特異的Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を介するＴ細胞活性化は、リンホカイン分泌およびＴ細胞増殖をもたらすシグナル伝達カスケードを開始する。ＴＣＲ活性化に続く最も初期の生化学的応答の１つは、チロシンキナーゼ活性の増加である。特に、好中球活性化は、細胞表面免疫グロブリンＧレセプターの応答により部分的に制御される。これらのレセプターの活性化は、ＳＨ２ドメインを有することが既知である、同定されていないチロシンキナーゼの活性化を媒介する。いくつかのｓｒｃ−ファミリーキナーゼ（ｌｃｋ、ｂｌｋ、ｆｙｎ）が、サイトカインおよびインテグリンレセプターからのシグナル伝達に関与し、従っていくつかの独立したレセプター構造から受ける刺激を統合するように作用し得ることを、さらなる証拠が示す。従って、特定のＳＨ２ドメインのインヒビターは、多くの好中球機能をブロックする能力を有し、そして抗炎症のメディエーターとして作用する。
ＳＨ２ドメインを標的とする薬物を開発する努力は、現在では生化学的インビトロレベルおよび細胞レベルで行われている。このような努力が成功すると、得られる薬物は、本発明の実施において有用であると予測される。
（Ｖ．追加の薬剤）
上記の軟骨保護剤に加えて、本発明の局所的および全身的に送達される組成物はまた、他の治療剤を含み得る。例えば、１つ以上の、抗炎症剤または鎮痛薬（本名細書中で抗疼痛剤ともいわれる）が、含まれ得る。抗炎症剤および／または鎮痛剤の適切な例は、さらに以下に詳細に記載される。さらなる例としては、本発明の組成物は、１つ以上の疾患改変抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）（例えば、メトトレキサート、スルファサラジン、金化合物（経口の金、金ナトリウムチオルナレート（ｔｈｉｏｒｎａｌａｔｅ）およびアウロチオグルコース）、アザチオグリン、サイクロスポリン、抗マラリア薬、ステロイド、コルヒチン、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｎｍｉｄｅ）、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド（ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）、ミノサイクリンおよびペニシラミン）を含み得る。抗炎症性薬剤、鎮痛性薬剤および／またはＤＭＡＲＤ薬剤は、本発明の組成物に含まれ得るか、または同時にもしくは連続的にのいずれかで、、または別個に投与され得る。
軟骨保護薬剤と作用した局所的投与、標的化全身性投与、および複数の薬剤の使用の、以前に述べられた利益に関する本発明の多くの局面はまた、他の薬剤の投与に適用される。術後患者の疼痛および苦痛の軽減は、特に毎年実施される外来患者の手術数の増加に伴ない、臨床用医薬において特別な関心がもたれる分野である。最も広く使用される全身性薬剤であるシクロオキシゲナーゼインヒビター（例えばイブプロフェン）およびオピオイド（例えばモルヒネ、フェンタニール）は、胃腸管刺激／出血および呼吸抑制を含む顕著な副作用を有する。オピオイドに関連する悪心および嘔吐の高率発生は、術後期間において特に問題である。有害な副作用を回避しつつ術後の疼痛を処置することを目的とする治療剤は、これらの薬剤の分子標的が身体内に広く分布し、そして多様な生理的作用を媒介するので、容易に開発されない。疼痛および炎症ならびに軟骨分解を阻害することが重要な臨床的必要性を有するにもかかわらず、全身性副作用を最少化させつつ有効投薬量で、疼痛、炎症、および軟骨分解のインヒビターを送達する方法は、開発されていない。一例として、治療用量のアヘン剤の全身性の（すなわち、静脈内、経口、皮下または筋肉内）投与方法は、重篤な呼吸抑制、気分の変化および意識混濁、強い悪心および嘔吐を含む顕著に有害な副作用をしばしば付随する。
先行技術研究は、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、本明細書中では時折「５−ＨＴ」という）、ブラジキニンおよびヒスタミンのような内因性因子が疼痛および炎症を生じさせる能力を示した。Ｓｉｃｕｔｅｒｉ，Ｆ．ら，Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ−Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐａｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ Ｍａｎ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．４，３０９−３１６頁（１９６５）；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｓ．Ｒ．，Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ａｓ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｆｏｒ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｐａｉｎ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔ．９８−１０５頁（１９７７）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ Ｍ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｙ ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ ３１６：，１２６−１３１頁（１９８５）；Ｗｈａｌｌｅｙ，Ｅ．Ｔ．ら，Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｋｉｎｉｎ Ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ，Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂ Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６：６５２−５７頁（１９８７）；Ｌａｎｇ，Ｅ．ら，Ｃｈｅｍｏ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｆｉｎｅ Ａｆｆｅｒｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｒａｔ Ｓｋｉｎ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．：８８７−９０１頁（１９９０）。
例えば、ヒトの水疱基底（露出皮膚（ｄｅｎｕｄｅｄ ｓｋｉｎ））に適用した５−ＨＴは、５−ＨＴ3レセプターアンタゴニストにより阻害され得る疼痛を引き起こすことが実証された。Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、（１９８５）。同様に、末梢的に適用したブラジキニンは、ブラジキニンレセプターアンタゴニストでブロックし得る疼痛を生ずる。Ｓｉｃｕｔｅｒｉら，１９６５；Ｗｈａｌｌｅｙら，１９８７；Ｄｒａｙ，Ａ．ら，Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：９９−１０４頁（１９９３）。末梢に適用されたヒスタミンは、血管拡張、かゆみ、および疼痛を生じさせ、これらは、ヒスタミンレセプターアンタゴニストによって阻害され得る。Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，１９７７；Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｗ．Ｗ．，「Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ５−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ（Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ」、Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｌ．Ｓ．ら編，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，６０５−６３８頁（１９８５）；Ｒｕｍｏｒｅ，Ｍ．Ｍ．ら，Ａｎａｌｇｅｓｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｎｔｉｈｉｓｔａｍｉｎｉｃｓ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３６，４０３−４１６頁（１９８５）。一緒に適用したこれら３種のアゴニスト（５−ＨＴ、ブラジキニンおよびヒスタミン）の組み合わせは、相乗的疼痛発生作用を示し、長期の強い疼痛シグナルを生ずることが示された。Ｓｉｃｕｔｅｒｉら、１９６５；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら，１９８５；Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｗ．ら、「Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ａｆｆｅｒｅｎｔ Ｎｅｒｖｅ Ｅｎｄｉｎｇｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ｂｙ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ａｎｄ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ」，Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．９１：４６７−４７６（１９９２）。
身体中では、５−ＨＴは血小板および中枢神経中に存在し、ヒスタミンは肥満細胞において見出され、そしてブラジキニンは、組織外傷、ｐＨ変化、および温度変化の間に大きな前駆体分子から産生される。５−ＨＴは組織傷害部位の血小板から大量に放出され得、産生中の血漿レベルは休止中レベルよりも２０倍高い（Ａｓｈｔｏｎ，Ｊ．Ｈ．ら、「Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ａｓ ａ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ Ｃｙｃｌｉｃ Ｆｌｏｗ Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｔｅｎｏｓｅｄ Ｃａｎｉｎｅ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｉｅｓ」，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ７３：５７２−５７８（１９８６））ので、内因性５−ＨＴが術後疼痛、痛覚過敏および炎症の発生に役割を果たす可能性がある。事実、血小板の活性化は、インビトロで末梢侵害受容器を興奮させることが示された。Ｒｉｎｇｋａｍｐ，Ｍ．ら，「Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ Ｅｘｃｉｔｅ Ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ Ｒａｔ Ｓｋｉｎ，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ」，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１７０：１０３−１０６（１９９４）。同様に、ヒスタミンおよびブラジキニンもまた外傷の間に組織中に放出される。Ｋｉｍｕｒａ，Ｅ．ら，「Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ Ｌｅｖｅｌ ｉｎ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ｓｉｎｕｓ Ｂｌｏｏｄ Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ」，Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ．８５：６３５−６４７（１９７３）；Ｄｏｕｇｌａｓ，１９８５；Ｄｒａｙら（１９９３）。
さらに、プロスタグランジン類はまた、疼痛および炎症を起こすことが公知である。シクロオキゲナーゼインヒビター（例えば、イブプロフェン）は、プロスタグランジン産生をブロックし、それによりプロスタグランジン媒介の疼痛および炎症を減少させるために、非外科手術環境および術後環境において通常使用されている。Ｆｌｏｗｅｒ，Ｒ．Ｊ．ら、Ａｎａｌｇｅｓｉｃ−Ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ａｇｅｎｔｓ；Ｄｒｕｇｓ Ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｏｕｔ，Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｌ．Ｓ．ら編，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，６７４−７１５頁（１９８５）。シクロオキシゲナーゼインヒビターは、全身的に適用すると、いくつかの有害な全身性副作用を伴う。例えば、インドメタシンまたはケテロラックは、よく認識された胃腸管および腎性有害副作用を有する。
考察されたように、５−ＨＴ、ヒスタミン、ブラジキニンおよびプロスタグランジン類は、疼痛と炎症を起こす。これらの薬剤が末梢組織にその作用を伝達する種々のレセプターは、過去２０年間に知られてきており、そして／または検討されてきた。多くの研究は、ラットまたは他の動物モデルで実施された。しかし、ヒトと動物種との間には薬理およびレセプター配列に相違がある。
さらに、これらのメディエーターのアンタゴニストは、現在、術後疼痛の処置に使用されていない。アミトリプチリンを含む、５−ＨＴおよびノルエピネフリン取り込みアンタゴニストと称される薬物のクラスが経口的に使用され、慢性疼痛状態において一応の成果をあげた。しかし、慢性 対 急性の疼痛状態の機構はかなり異なると考えられる。事実、アミトリプチリンを手術時に使用する急性疼痛環境の２種の研究は、アミトリプチリンの疼痛軽減作用を全く示さなかった。Ｌｅｖｉｎｅ，Ｊ．Ｄ．ら、「Ｄｅｓｉｐｒａｍｉｎｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｏｐｉａｔｅ Ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｇｅｓｉａ，Ｐａｉｎ ２７：４５−４９（１９８６）；Ｋｅｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら、「Ｌｏｗ−Ｄｏｓｅ Ａｍｉｔｒｉｐｔｙｌｉｎｅ ａｓ ａｎ Ａｄｊｕｎｃｔ ｔｏ Ｏｐｉｏｉｄｓ ｆｏｒ Ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ Ｐａｉｎ：ａ Ｐｌａｃｅｂｏ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｔｒｉａｌ Ｐｅｒｉｏｄ」，Ｐａｉｎ ５２：３２５−３０（１９９３）。両方の研究において、薬物は経口投与された。第２の研究は、経口のアミトリプチリンが実際に術後患者の総安寧感覚（ｏｖｅｒａｌｌ ｓｅｎｓｅ ｏｆ ｗｅｌｌ ｂｅｉｎｇ）を低くし、これが脳の複数のアミンレセプターに対するその薬剤の親和性に起因し得ることに注目した。
アミトリプチリンは、５−ＨＴおよびノルエピネフリンの取り込みのブロックに加えて、強力な５−ＨＴレセプターアンタゴニストである。従って、上述の研究における術後疼痛軽減効果の欠如は、急性疼痛における内因性５−ＨＴの役割に関する提案と矛盾するように見える。これらの２種の研究においてアミトリプチリンで見出された急性疼痛軽減の欠如には数多くの理由が存在する。（１）第１の研究（Ｌｅｖｉｎｅら、１９８６年）は、アミトリプチリンを術前１週間から手術前夜まで手術前に使用し、一方、第２の研究（Ｋｅｒｒｉｃｋら、１９９３年）は、アミトリプチリンを術後にのみ使用した。従って、実際の組織傷害相の間および５−ＨＴの放出が意図される時点に、手術部位の組織に存在したアミトリプチリンのレベルは未知である。（２）アミトリプチリンは、肝臓で大規模に代謝されることが知られている。第２の研究において、経口投与では、手術部位の組織におけるアミトリプチリンの濃度が、術後放出５−ＨＴの活性を阻害するに十分なほど長い期間にわたり、十分に高くなかった可能性がある。（３）複数の炎症のメディエーターが存在するので、研究は、炎症のメディエーター間の相乗作用を示し、一つの薬剤（５−ＨＴ）のみのブロックでは組織傷害に対する炎症応答を十分阻害しない可能性がある。
ヒスタミン1（Ｈ1）レセプターアンタゴニストの著しい高濃度（１％〜３％溶液、すなわち１ｍｌ当たり１０〜３０ｍｇ）が外科手順のための局所麻酔薬として作用する能力を示す研究が少数存在する。この麻酔効果は、Ｈ1レセプターによって媒介されるとは考えられず、むしろ（リドカインの作用と同様）神経膜のナトリウムチャネルとの非特異的相互作用によると考えられる。このヒスタミンレセプターアンタゴニストの高「麻酔」濃度に付随する副作用（例えば、鎮静）を考慮して、ヒスタミンレセプターアンタゴニストの局所投与は現在、手術時環境において使用されてない。
（Ａ．抗疼痛剤および／または抗炎症剤ならびに軟骨保護剤の治療的組合せから誘導される相乗作用性相互作用）
関節鏡治療手順後の炎症および軟骨ホメオスタシスの損失に関連する疾患プロセスの複雑性、ならびに関与する分子標的の多重性を考慮すると、単一の分子標的の遮断または阻害は、軟骨分解および変形性関節症の発症の予防における適切な有効性を提供するようである。実際、異なる個々の分子レセプターおよび／または酵素を標的化する多数の動物研究は、動物モデルにおいて効果的であることを証明されていないか、または今までの臨床試験において有効性が得られていない。従って、個々の分子標的に作用し、かつ局所的にまたは全身に送達される薬物の治療用組合せは、軟骨保護への治療的アプローチにおける臨床的有効性のために望ましいようである。以下に示されるように、この相乗的分子標的化治療についての理論的解釈は、基本的な生化学的機構の理解における最近の進歩に由来し、これにより、滑液および軟骨中の滑膜細胞および軟骨細胞が、関節鏡手順の間に曝される刺激を伝達および統合する。
細胞シグナル伝達を担う分子スイッチは、伝統的に主要な別個のシグナル伝達経路に分けられ、各々の経路は、細胞外刺激の特定の組についてのトランスデューサーとして作用しそして別個の細胞応答を媒介するタンパク質ファミリーの別々の組を含む。このような経路の１つは、神経伝達物質およびホルモンからのシグナルを、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）を介して変換して、炎症のメディエーター（例えば、ＰＧＥ２）の産生を含む収縮性応答を生じる。ＧＰＣＲは、細胞内標的に三量体Ｇタンパク質の活性化を介して結合する（図２を参照のこと）。滑膜細胞および軟骨細胞の活性化に関与する、ＧＰＣＲ経路を介するシグナル伝達分子の例は、ヒスタミン、ブラジキニン、セロトニンおよびＡＴＰである。第２の主要な経路は、炎症促進サイトカイン（例えば、ＩＬ−１）からのシグナルを、キナーゼカスケードおよびＮＦ−κＢタンパク質を介して、遺伝子発現の調節ならびに異化サイトカインおよび他の異化因子（ＮＯを含む）の産生へと変換する。
神経伝達物質およびホルモンから伝達されるシグナルは、以下の２つのクラスのレセプターのいずれかを刺激する：７ヘリックスの膜貫通領域からなるＧＰＣＲまたはリガンド作働性イオンチャネル。両方の種類のレセプターからの「下流」シグナルは、細胞質Ｃａ2+の濃度を調節する際に収束する（図３を参照のこと）。各ＧＰＣＲ膜貫通レセプターは、特定のクラスの三量体Ｇタンパク質（Ｇq、Ｇiまたは多くの他のＧタンパク質を含む）を活性化する。Ｇqサブユニットは、ホスホリパーゼＣγを活性化し、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化および細胞質カルシウムのレベルの増加を生じる（図３）。次いで、増加した細胞内カルシウムは、ｃＰＬＡ２の活性化およびアラキドン酸（ＡＡ）の産生をもたらす。ＡＡは、滑膜細胞および軟骨細胞の両方においてＣＯＸの基質として作用し、ＰＧＥ２の産生をもたらす。ＰＫＣ活性化はまた、ＮＦ−Ｂの活性化をもたらすＭＡＰキナーゼの活性化を生じ、炎症促進サイトカインへの曝露によりプライムされた細胞および組織において軟骨異化に関与するタンパク質の増加した遺伝子発現を調節する。
ＩＬ−１およびＴＮＦ−αの両方により異なる同種レセプターを介して媒介されるような炎症促進サイトカインシグナル伝達はまた、細胞遺伝子発現の調節の際に収束する。これらの異なるレセプターにより利用されるシグナル変換経路は、レセプターの近傍の異なるキナーゼを使用するが、シグナル伝達経路は、続いてＭＡＰキナーゼのレベルで異化する（図３および４）。シグナル変換は、キナーゼ（ｐ３８ ＭＡＰキナーゼのような「下流」酵素を含む）のカスケードにおける残基のリン酸化に依存する。ＩＬ−１レセプターおよびＴＮＦレセプターの活性化はまた、ＭＡＰキナーゼの刺激をもたらし、共通の段階がＧq結合ＧＰＣＲにより共有される（図３を参照のこと）。リガンド非依存性「クロストーク」が、特定のＧＰＣＲおよびサイトカイン（例えば、ＩＬ−１）の同時刺激に応じてキナーゼ経路を相互活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ）し得、相乗作用性細胞応答をもたらす（図３を参照のこと）。従って、（図１および２に示されるような）共通のシグナル伝達経路の相互活性化をブロックして炎症促進サイトカイン（ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、およびＭＭＰ）の増加した遺伝子発現をもたらす選択的インヒビターの組合せは、相乗的に作用して、関節鏡検査外科手順後の炎症および軟骨分解を防ぐ。
（Ｂ．抗炎症剤および抗疼痛剤）
本発明の組成物および方法で使用のための抗炎症剤および抗疼痛剤適切なクラスとしては、以下が挙げられる：（１）セロトニンレセプターアンタゴニスト；（２）セロトニンレセプターアゴニスト；（３）ヒスタミンレセプターアンタゴニスト；（４）ブラジキニンレセプターアンタゴニスト；（５）カリクレインインヒビター；（６）ニューロキニン1およびニューロキニン2レセプターサブタイプアンタゴニストを含む、タチキニンレセプターアンタゴニスト；（７）カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）レセプターアンタゴニスト；（８）インターロイキンレセプターアンタゴニスト；（９）（ａ）ＰＬＡ2アイソフォームインヒビターおよびＰＬＣアイソフォームインヒビターを含む、ホスホリパーゼインヒビター、（ｂ）シクロオキシゲナーゼインヒビター、および（ｃ）リポオキシゲナーゼインヒビターを含む、アラキドン酸代謝物合成経路で活性な酵素のインヒビター；（１０）エイコサノイドＥＰ−１およびＥＰ−４レセプターサブタイプアンタゴニストならびにトロンボキサンレセプターサブタイプアンタゴニストを含む、プロスタノイドレセプターアンタゴニスト；（１１）ロイコトリエンＢ4レセプターサブタイプアンタゴニストおよびロイコトリエンＤ4レセプターサブタイプアンタゴニストを含む、ロイコトリエンレセプターアンタゴニスト；（１２）μ−オピオイド、δ−オピオイドおよびκ−オピオイドレセプターサブタイプアゴニストを含む、オピオイドレセプターアゴニスト；（１３）Ｐ2xレセプターアンタゴニストおよびＰ2Yレセプターアンタゴニストを含む、プリン受容体アゴニストおよびプリン受容体アンタゴニスト；ならびに（１４）カルシウムチャネルアンタゴニスト。
以下は、局所送達が意図される本発明の抗炎症剤／抗疼痛剤の前出の各々のクラス、および溶液中での使用のために適切な濃度の記載である。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるのに十分な薬剤の投薬量または負荷量（ｌｏａｄ）を適切に含有する。標的化された徐放性送達系について、所定の徐放期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるように、薬剤の十分な投薬量または充填量がこの組成物に含まれる。理論によって制限されることを望まないが、それらの薬剤を作動可能にすると考えられる種々のクラスの薬剤の選択の背後にある正当化もまた、示される。
各薬剤は、好ましくは、０．１〜１０，０００倍のＫｄまたはＫｉの低濃度で含有されている；但し、シクロオキシゲナーゼインヒビターは例外であって、これは、選択した特定のインヒビターに依存して高濃度を要し得る。好ましくは、各薬物は１．０〜１，０００倍のＫｄまたはＫｉの濃度で含有され、最も好ましくは約１００倍のＫｄまたはＫｉである。これらの濃度は必要により調整され、局所送達部位において代謝転換が起こらないように希釈するようにする。この溶液用に選択した的確な薬剤および薬剤濃度は後記するように特定の適用に応じて変更する。
（１．セロトニンレセプターアンタゴニスト）
セロトニン（５−ＨＴ）は、末梢における侵害受容ニューロン上のセロトニン２（５−ＨＴ２）レセプターおよび／またはセロトニン３（５−ＨＴ３）レセプターを刺激することにより疼痛を生ずると考えられる。多くの研究者は、末梢侵害受容器上の５−ＨＴ３レセプターが５−ＨＴにより生ずる即時性疼痛の感覚を媒介することを承認している（リチャードソンら、１９８５年）。５−ＨＴ３レセプターアンタゴニストは、５−ＨＴ誘導疼痛の阻害に加えて、侵害受容器の活性化を阻害することにより、神経原性の炎症をも阻害し得る。Ｂａｒｎｅｓ Ｐ．Ｊ．ら、「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ｎｏｖｅｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｉｅｎｃｅｓ １１、１８５−１８９頁（１９９０年）。しかし、ラット足根関節における研究は、５−ＨＴによる侵害受容器の活性化に５−ＨＴ２レセプターが関係することを主張する。Ｇｒｕｂｂ，Ｂ．Ｄ．ら、「Ａ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ５−ＨＴ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｆｆｅｒｅｎｔ Ｎｅｒｖｅｓ Ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｅｄ Ｒａｔ Ａｎｋｌｅ Ｊｏｉｎｔｓ」、Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ２５、２１６−１８頁（１９８８年）。それ故、５−ＨＴ２レセプターの活性化はまた末梢の疼痛および神経原性炎症において役割を果たす可能性がある。
本発明の溶液の一つの目的は、疼痛および多数の炎症過程を遮断することである。すなわち、以下に述べるように、５−ＨＴ２レセプターおよび５−ＨＴ３レセプターアンタゴニストは共に、独立してまたは一緒に、本発明の溶液に適切に使用することができる。アミトリプチリン（ＥｌａｖｉｌＴＭ）は、本発明で使用するのに適した５−ＨＴ２レセプターアンタゴニストである。アミトリプチリンは、多年にわたり抗うつ薬として臨床的に使用され、ある種の慢性疼痛患者で有用な効果をもつことが見出されている。メトクロプラミド（ＲｅｇｌａｎＴＭ）は、鎮吐薬として臨床的に使用されているが、中程度の５−ＨＴ３レセプター親和性を示し、このレセプターに対する５−ＨＴの作用を阻害することができ、おそらく血小板からの５−ＨＴ放出による疼痛を阻害する。従って、これもまた本発明で使用するに適する。
その他の適当な５−ＨＴ２レセプターアンタゴニストには、イミプラミン、トラザドン、デシプラミンおよびケタンセリンが含まれる。ケタンセリンは、その抗高血圧作用により臨床的に使用されてきた。Ｈｅｄｎｅｒ，Ｔ．ら、「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ Ｎｅｗ Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，Ｋｅｔａｎｓｅｒｉｎ，ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ」、Ａｍ Ｊ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ３１７ｓ−２３ｓ頁（１９８８年７月）。その他の適当な５−ＨＴ３レセプターアンタゴニストには、シサプリドおよびオンダンセトロンが含まれる。適当なセロトニン１Ｂレセプターアンタゴニストには、ヨヒンビン、Ｎ−［メトキシ−３−（４−メチル−１−ピペランジニル）フェニル］−２’−メチル−４’−（５−メチル−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）［１，１−ビフェニル］−４−カルボキシアミド（「ＧＲ１２７９３５」）およびメチオテピンが含まれる。本発明の局面の溶液中でのこれらの薬物の局所送達用途のための治療濃度および好ましい濃度を、表１４に示す。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるのに十分な薬剤の投薬量または充填量を適切に含有する。標的化された徐放性送達系について、所定の徐放期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるように、薬剤の十分な投薬量または充填量がこの組成物に含まれる。
（表１４）
（疼痛阻害剤および／または炎症阻害剤の治療濃度および好ましい濃度）
Figure 2005519917
 （２．セロトニンレセプターアゴニスト）
５−ＨＴ１Ａレセプター、５−ＨＴ１Ｂレセプターおよび５−ＨＴ１Ｄレセプターは、アデニレートシクラーゼ活性を阻害することが知られている。それ故、溶液に低用量のこれらのセロトニン１Ａレセプターアゴニスト、セロトニン１Ｂレセプターアゴニストおよびセロトニン１Ｄレセプターアゴニストを含有させると、疼痛および炎症を媒介するニューロンを阻害するはずである。セロトニン１Ｅレセプターアゴニストおよびセロトニン１Ｆレセプターアゴニストについても、これらのレセプターもアデニレートシクラーゼを阻害するので、同じ作用が期待される。
ブスピロンは、本発明で使用するのに適した１Ａレセプターアゴニストである。スマトリプタンは、適当な１Ａレセプターアゴニスト、１Ｂレセプターアゴニスト、１Ｄレセプターアゴニストおよび１Ｆレセプターアゴニストである。適当な１Ｂレセプターアゴニストおよび１Ｄレセプターアゴニストは、ジヒドロエルゴタミンである。適当な１Ｅレセプターアゴニストは、エルゴノビンである。局所的に送達される場合のこれらのレセプターアゴニストの治療濃度および好ましい濃度を、表１５に示す。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるのに十分な薬剤の投薬量または充填量を適切に含有する。標的化された徐放性送達系について、所定の徐放期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるように、薬剤の十分な投薬量または充填量がこの組成物に含まれる。
（表１５）
（疼痛阻害剤および／または炎症阻害剤の治療濃度および好ましい濃度）
Figure 2005519917
 （３．ヒスタミンレセプターアンタゴニスト）
一般にヒスタミンレセプターは、ヒスタミン１（Ｈ１）サブタイプおよびヒスタミン２（Ｈ２）サブタイプに分類される。ヒスタミンの末梢投与に対する古典的炎症応答は、Ｈ１レセプターにより媒介される。Ｄｏｕｇｌａｓ、１９８５年。それ故、本発明の溶液は、好ましくは、ヒスタミンＨ１レセプターアンタゴニストを含有する。プロメタジン（ＰｈｅｎｅｒｇａｎＴＭ）は、Ｈ１レセプターを強力に遮断する、一般的に使用される鎮吐薬であり、本発明で使用するに適したものである。興味深いことに、この薬物はまた局所麻酔作用をも有することが示されたが、この作用に必要な濃度は、Ｈ１レセプターの遮断に必要な濃度より数オーダー高く、従ってその作用は、異なる機構により生ずると考えられる。溶液中のヒスタミンレセプターアンタゴニストの濃度は、侵害受容器の活性化に関与するＨ１レセプターを阻害するに十分であるが、「局所麻酔」作用は達成せず、それにより全身的副作用の心配を除外する。
他の適当なＨ１レセプターアンタゴニストには、テルフェナジン、ジフェンヒドラミン、アミトリプチリン、メピラミンおよびトリポリジンが挙げられる。アミトリプチリンはセロトニン２レセプターアンタゴニストとしても有効であるので、本発明で使用するとき２重の機能を有する。局所送達用のこれらのＨ１レセプターアンタゴニストそれぞれに適切な治療濃度および好ましい濃度を、表１６に示す。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるのに十分な薬剤の投薬量または充填量を適切に含有する。標的化された徐放性送達系について、所定の徐放期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるように、薬剤の十分な投薬量または充填量がこの組成物に含まれる。
（表１６）
（疼痛阻害剤および／または炎症阻害剤の治療濃度および好ましい濃度）
Figure 2005519917
 （４．ブラジキニンレセプターアンタゴニスト）
一般にブラジキニンレセプターは、ブラジキニン１（Ｂ１）サブタイプおよびブラジキニン２（Ｂ２）サブタイプに分類される。研究は、ブラジキニンによって生ずる急性の末梢の疼痛と炎症はＢ２サブタイプにより媒介され、一方慢性炎症設定におけるブラジキニン誘導疼痛はＢ１サブタイプを介して媒介されることを示した。Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｍ．Ｎ．ら、「Ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ Ｂ１ ａｎｄ Ｂ２ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ，ｄｅｓ−Ａｒｇ９、［Ｌｅｕ８］−ＢＫ ａｎｄ ＨＯＥ １４０，Ｔｗｏ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ Ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｔ」、Ｐａｉｎ ５３：１９１−９７頁（１９９３年）；Ｄｒａｙ，Ａ．ら「Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｉｎ」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：９９−１０４頁（１９９３年）（これらの文献は、本明細書中で参考として援用される）。
現在、ブラジキニンレセプターアンタゴニストは臨床的に使用されていない。これらの薬物のいくつかはペプチドであり、従って、これらは消化されるので、経口摂取できない。Ｂ２レセプターに対するアンタゴニストは、ブラジキニン誘導急性疼痛および炎症を抑制する。Ｄｒａｙら、１９９３年。Ｂ１レセプターアンタゴニストは、慢性炎症症状における疼痛を抑制する。パーキンスら、１９９３年；Ｄｒａｙら、１９９３年。それ故、用途に依存して、本発明の溶液は、好ましくは、ブラジキニンＢ１レセプターアンタゴニストおよびＢ２レセプターアンタゴニストの一方または両方を含有するのが好ましい。例えば、関節鏡検査法は急性および慢性の症状の両方で実施され、従って、関節鏡検査法用の灌注用溶液はＢ１レセプターアンタゴニストおよびＢ２レセプターアンタゴニストの両方を含有し得る。
本発明で使用するに適したブラジキニンレセプターアンタゴニストには、下記のブラジキニン１レセプターアンタゴニストが含まれる：Ｄ−Ａｒｇ−（Ｈｙｐ３−Ｔｈｉ５−Ｄ−Ｔｉｃ７−Ｏｉｃ８）−ＢＫの［ｄｅｓ−Ａｒｇ１０］誘導体（「ＨＯＥ１４０の［ｄｅｓ−Ａｒｇ１０］誘導体」、ヘキスト・ファーマシューティカルス販売）；および［Ｌｅｕ８］ｄｅｓ−Ａｒｇ９−ＢＫ。適当なブラジキニン２レセプターアンタゴニストには、［Ｄ−Ｐｈｅ７］ＢＫ；Ｄ−Ａｒｇ−（Ｈｙｐ３−Ｔｈｉ５，８−Ｄ−Ｐｈｅ７）−ＢＫ（「ＮＰＣ３４９」）；Ｄ−Ａｒｇ−（Ｈｙｐ３−Ｄ−Ｐｈｅ７）−ＢＫ（「ＮＰＣ５６７」）；およびＤ−Ａｒｇ−（Ｈｙｐ３−Ｔｈｉ５−Ｄ−Ｔｉｃ７−Ｏｉｃ８）−ＢＫ（「ＨＯＥ１４０」）が含まれる。これらの化合物は、前に援用したＰｅｒｋｉｎｓら、１９９３年およびＤｒａｙら、１９９３年の文献にさらに詳細に記載されている。局所送達に適当な治療濃度および好ましい濃度を、表１７に示す。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるのに十分な薬剤の投薬量または充填量を適切に含有する。標的化された徐放性送達系について、所定の徐放期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるように、薬剤の十分な投薬量または充填量がこの組成物に含まれる。
（表１７）
（疼痛阻害剤および／または炎症阻害剤の治療濃度および好ましい濃度）
Figure 2005519917
 （５．カリクレインインヒビター）
前記のように、ペプチドであるブラジキニンは、重要な疼痛および炎症のメディエーターである。ブラジキニンは、血漿中の高分子量物質キニノーゲンに対するカリクレインの作用により切断生成物として産生される。それ故、カリクレインインヒビターは、ブラジキニンの産生ならびにそれによって生ずる疼痛および炎症を阻害することにより治療作用をもつと考えられる。本発明で使用するに適したカリクレインインヒビターは、アプロチニンである。局所送達する際に、本発明の溶液で使用するに適した濃度を、以下で表１８において示す。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるのに十分な薬剤の投薬量または充填量を適切に含有する。標的化された徐放性送達系について、所定の徐放期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるように、薬剤の十分な投薬量または充填量がこの組成物に含まれる。
（表１８）
（疼痛阻害剤および／または炎症阻害剤の治療濃度および好ましい濃度）
Figure 2005519917
 （６．タキキニンレセプターアンタゴニスト）
タキキニン（ＴＫ）は、サブスタンスＰ、ニューロキニンＡ（ＮＫＡ）およびニューロキニンＢ（ＮＫＢ）を含む構造的に関連したペプチドのファミリーである。ニューロンは、末梢における主要なＴＫの供給源である。ＴＫの重要な一般的作用は神経刺激であるが、その他の作用には、内皮依存性血管拡張、血漿タンパク質溢出、マスト細胞動員ならびに炎症細胞の脱顆粒および刺激が含まれる。Ｍａｇｇｉ，Ｃ．Ａ．Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２２：１−２４頁（１９９１年）。ＴＫレセプターの活性化により媒介される上記の生理学的作用の組み合わせに起因して、ＴＫレセプターの標的化は、無痛覚の促進および神経原性炎症の処置のために都合の良いアプローチである。
（６ａ．ニューロキニン１レセプターサブタイプアンタゴニスト）
サブスタンスＰは、ＮＫ１と称されるニューロキニンレセプターサブタイプを活性化する。サブスタンスＰは、感覚神経の末端に存在するウンデカペプチドである。サブスタンスＰは、血管拡張、血漿溢出およびマスト細胞脱顆粒を含む、Ｃ−繊維の活性化後、末梢において炎症および疼痛を生ずる多数の作用を有することが知られている。Ｌｅｖｉｎｅ，Ｊ．Ｄ．ら、「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｆｆｅｒｅｎｔ Ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３、２２７３頁（１９９３年）。適当なサブスタンスＰアンタゴニストは、（［Ｄ−Ｐｒｏ９［スピロ−ガンマ−ラクタム］Ｌｅｕ１０，Ｔｒｐ１１］フィザレミン−（１−１１））（「ＧＲ８２３３４」）である。ＮＫ１レセプターに作用する、本発明で使用できるその他の適当なアンタゴニストは、１−イミノ−２−（２−メトキシフェニル）エチル）−７，７−ジフェニル−４−ペルヒドロイソインドロン（３ａＲ，７ａＲ）（「ＲＰ６７５８０」）；および２Ｓ，３Ｓ−シス−３−（２−メトキシベンジルアミノ）−２ーベンズヒドリルキヌクリジン（「ＣＰ９６，３４５」）である。局所送達する際のこれらの薬剤の適した濃度を、表１９に示す。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるのに十分な薬剤の投薬量または充填量を適切に含有する。標的化された徐放性送達系について、所定の徐放期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるように、薬剤の十分な投薬量または充填量がこの組成物に含まれる。
（表１９）
（疼痛阻害剤および／または炎症阻害剤の治療濃度および好ましい濃度）
Figure 2005519917
 （６ｂ．ニューロキニン２レセプターサブタイプアンタゴニスト）
ニューロキニンＡは、サブスタンスＰと共に感覚ニューロンに位置し、かつ炎症および疼痛もまた促進するペプチドである。ニューロキニンＡは、ＮＫ２と称される特異的ニューロキニンレセプターを活性化する。Ｅｄｍｏｎｄｓ−Ａｌｔ、Ｓ．ら、「Ａ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｎｏｎ−Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ Ａ（ＮＫ２）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５０：ＰＬ１０１（１９９２年）。適当なＮＫ２アンタゴニストの例には、（（Ｓ）−Ｎ−メチル−Ｎ−［４−（４−アセチルアミノ−４−フェニルピペリジノ）−２−（３，４−ジクロロフェニル）ブチル］ベンズアミド（「（±）−ＳＲ４８９６８」）；Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｄａｐ−Ｌｅｕ（「ＭＥＮ１０，６２７」）；およびｃｙｃ（Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）（「Ｌ６５９，８７７」））が含まれる。局所送達のためのこれらの薬剤の適当な濃度を、表２０に示す。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるのに十分な薬剤の投薬量または充填量を適切に含有する。標的化された徐放性送達系について、所定の徐放期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるように、薬剤の十分な投薬量または充填量がこの組成物に含まれる。
（表２０）
（疼痛阻害剤および／または炎症阻害剤の治療濃度および好ましい濃度）
Figure 2005519917
 （７．ＣＧＲＰレセプターアンタゴニスト）
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）は、サブスタンスＰと共に感覚ニューロンにもまた位置し、血管拡張薬として作用しサブスタンスＰの作用を強化するペプチドである。Ｐ．Ｂｒａｉｎ，Ｓ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９９、２０２頁（１９８５年）。適当なＣＧＲＰレセプターアンタゴニストの例は、ＣＧＲＰの短縮化バージョンであるＩ−ＣＧＲＰ−（８−３７）である。このポリペプチドは、ＣＧＲＰレセプターの活性化を阻害する。局所送達する場合の、この薬剤の適当な濃度を、表２１に示す。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるのに十分な薬剤の投薬量または充填量を適切に含有する。標的化された徐放性送達系について、所定の徐放期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるように、薬剤の十分な投薬量または充填量がこの組成物に含まれる。
（表２１）
（疼痛阻害剤および／または炎症阻害剤の治療濃度および好ましい濃度）
Figure 2005519917
 （８．インターロイキンレセプターアンタゴニスト）
インターロイキンは、サイトカインに分類され、炎症のメディエーターに応答して白血球およびその他の細胞によって産生されるペプチドファミリーである。インターロイキン（ＩＬ）は、強力な末梢性痛覚過敏薬であり得る。Ｆｅｒｒｉｅｒａ，Ｓ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：６９８頁（１９８８年）。適切なＩＬ−１βレセプターアンタゴニストの例は、ＩＬ−１βの短縮化バージョンであるＬｙｓ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒである。このトリペプチドは、ＩＬ−１βレセプターの活性化を阻害する。局所送達用のこの薬剤の適切な濃度を、表２２に示す。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるのに十分な薬剤の投薬量または充填量を適切に含有する。標的化された徐放性送達系について、所定の徐放期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるように、薬剤の十分な投薬量または充填量がこの組成物に含まれる。
（表２２）
疼痛および／または炎症阻害剤の治療的濃度および好ましい濃度
Figure 2005519917
 （９．アラキドン酸代謝産物についての合成経路において活性な酵素のインヒビター）
（９ａ．ホスホリパーゼインヒビター）
ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）酵素（ｃＰＬＡ２、ｉＰＬＡ２、ｓＰＬＡ２）およびホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）によるアラキドン酸の生成は、エイコサノイドとして知られる炎症の多数のメディエータを生成する反応のカスケードを生じる。この経路全体にわたって阻害され得る多数の段階が存在し、それにより、これにより炎症性メディエータの生成が減少される。これらの種々の段階における阻害の例は、以下に示される。
酵素ＰＬＡ２アイソフォームの阻害は、細胞膜からのアラキドン酸の放出を阻害し、従って、プロスタグランジンおよびロイコトリエンの生成を阻害し、その結果、炎症および疼痛の減少を生じる。Ｇｌａｓｅｒ，Ｋ．Ｂ．，「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ」，Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２．３１（１９９５）。適切なＰＬＡ２アイソフォームインヒビターの例は、マノアリド（ｍａｎｏａｌｉｄｅ）である。ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）アイソフォームの阻害はまた、プロスタノイドおよびロイコトリエンの生成の減少を生じ、従って、疼痛および炎症の減少を生じる。ＰＬＣγアイソフォームインヒビターの例は、１−［６−（（１７β−３−メトキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−イル）アミノ）ヘキシル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンである。局所的に送達される場合のこの薬剤の適切な濃度は、表２３に含まれる。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内の関節および作用部位において局所濃度を生じるのに十分な投薬量または負荷の薬剤を適切に含む。標的化された持続性放出送達系について、予め決定された持続性放出期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節および作用部位において局所濃度を生じるのに十分な投薬量または負荷の薬剤が、この組成物中に含まれる。
（表２３）
疼痛および／または炎症阻害剤の治療的濃度および好ましい濃度
Figure 2005519917
 （９ｂ．シクロオキシゲナーゼインヒビター）
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、抗炎症剤、抗発熱剤および鎮痛剤として広く使用されている。Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ ａｎｄ Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，第３版（Ｋｅｌｌｅｙ Ｗ．Ｎ．ら編）ｐ．２５８（１９８９）。これらの薬物についての分子標的は、Ｉ型およびＩＩ型のシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２）である。これらの酵素は、プロスタグランジンＨシンターゼ（ＰＧＨＳ）−１（構成的）およびＰＧＨＳ−２（誘導性）としても公知であり、アラキドン酸からプロスタグランジンＨ（これはプロスタグランジンおよびトロンボキサンの生合成における中間体である）への変換を触媒する。ＣＯＸ−２酵素は、内皮細胞、マクロファージおよび線維芽細胞において同定されている。この酵素は、ＩＬ−１およびＴＮＦ−αによって誘導され、そしてその発現は、炎症部位においてアップレギュレートされている。ＣＯＸ−１の構成的活性およびＣＯＸ−２の誘導性活性の両方は、疼痛および炎症に寄与するプロスタグランジンの合成を導く。
現在市販されている多くのＮＳＡＩＤ（ジクロフェナク、ナプロキセン、インドメタシン、イブプロフェンなど）は、一般に、ＣＯＸの両方のアイソフォームの非選択的インヒビターであるが、ＣＯＸ−２よりもＣＯＸ−１に対してより強い選択性を示し得る。しかしながら、この比は、異なる化合物について変化する。プロスタグランジンの形成をブロックするためのＣＯＸ−１インヒビターおよびＣＯＸ−２インヒビターの使用は、プロスタノイドレセプターの７つの記載されたサブタイプと天然リガンドとの相互作用をブロックすることを試みるよりも優れた治療ストラテジーを示す。エイコサノイドレセプター（ＥＰ−１、ＥＰ−２、ＥＰ−３）の報告されたアンタゴニストは、非常に希少であり、そしてトロンボキサンＡ２レセプターの特異的な高親和性アンタゴニストのみである。Ｗａｌｌａｃｅ，Ｊ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１５：４０５−４０６（１９９４）。
溶液中の、局所送達用途のためのシクロオキシゲナーゼインヒビターの代表的な治療的濃度および好ましい濃度は、表２４に提供される。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内の関節または作用部位において局所濃度を生じるのに十分な投薬量または負荷の薬剤を適切に含む。標的化された持続性放出送達系について、予め決定された持続性放出期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位における局所濃度を生じるのに十分な投薬量または負荷の薬剤が、この組成物中に含まれる。
（表２４）
疼痛および／または炎症阻害剤の治療的濃度および好ましい濃度
Figure 2005519917
 （９ｃ．リポオキシゲナーゼインヒビター）
酵素リポオキシゲナーゼの阻害は、ロイコトリエン（例えば、ロイコトリエンＢ４）の生成を阻害し、ロイコトリエンは、炎症および疼痛の重要なメディエータであることが公知である。Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ ａｎｄ Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｒ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，第３版（Ｋｅｌｌｅｙ Ｗ．Ｎ．ら編），ｐ．２５８（１９８９）。５−リポオキシゲナーゼアンタゴニストの一例は、２，３，５−トリメチル−６−（１２−ヒドロキシ−５，１０−ドデカジイニル）−１，４−ベンゾキノン（「ＡＡ ８６１」）であり、この適切な局所送達濃度は、表２５に列挙される。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内の関節または作用部位において局所濃度を生じるのに十分な投薬量または負荷の薬剤を適切に含む。標的化された持続性放出送達系について、予め決定された持続性放出期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位において局所濃度を生じるのに十分な投薬量または負荷の薬剤が、この組成物中に含まれる。
（表２５）
疼痛および／または炎症阻害剤の治療的濃度および好ましい濃度
Figure 2005519917
 （１０．プロスタノイドレセプターアンタゴニスト）
アラキドン酸の代謝産物として生成される特定のプロスタノイドは、プロスタノイドレセプターの活性化を介するその炎症効果を媒介する。特定のプロスタノイドアンタゴニストのクラスの例は、エイコサノイドＥＰ−１およびＥＰ−４のレセプターサブタイプアンタゴニストおよびトロンボキサンレセプターサブタイプアンタゴニストである。適切なプロスタグランジンＥ２レセプターアンタゴニストは、８−クロロジベンズ［ｂ，ｆ］［１，４］オキサゼピン−１０（１１Ｈ）−カルボン酸、２−アセチルヒドラジド（「ＳＣ １９２２０」）である。適切なトロンボキサンレセプターサブタイプアンタゴニストは、［１５−［１α，２β（５Ｚ），３β，４α］−７−［３−［２−（フェニルアミノ）−カルボニル］ヒドラジノ］メチル］−７−オキソビシクロ−［２，２，１］−へプト−２−イル］−５−ヘプタン酸（「ＳＱ ２９５４８」）である。局所的に送達される場合のこれらの薬剤の適切な濃度は、表２６に記載される。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙される治療範囲内の関節または作用部位において局所濃度を生じるのに十分な投薬量または負荷の薬剤を含む。標的化された持続性放出送達系について、予め決定された持続性放出期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位において局所濃度を生じるのに十分な投薬量または負荷の薬剤が、この組成物中に含まれる。
（表２６）
疼痛および／または炎症阻害剤の治療的濃度および好ましい濃度
Figure 2005519917
 （１１．ロイコトリエンレセプターアンタゴニスト）
ロイコトリエン（ＬＴＢ４、ＬＴＣ４およびＬＴＤ４）は、酵素的に生成され、かつ重要な生物学的特性を有する、アラキドン酸代謝産物の５−リポオキシゲナーゼ経路の産物である。ロイコトリエンは、多数の病理学的状態（炎症を含む）に関連する。特定のアンタゴニストは、現在、これらの病理学における潜在的な治療的介入のために、多くの製薬会社によって研究されている。Ｈａｌｕｓｈｋａ，Ｐ．Ｖ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２９：２１３−２３９（１９８９）；Ｆｏｒｄ−Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ａ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１−１２（１９９０）。ＬＴＢ４レセプターは、好酸球および好中球を含む特定の免疫細胞において見出されている。これらのレセプターへのＬＴＢ４の結合は、走化性およびリソソーム酵素放出を生じ、それにより炎症プロセスに寄与する。ＬＴＢ４レセプターの活性化に関連するシグナル伝達プロセスは、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）代謝のＧタンパク質媒介性刺激および細胞内カルシウムの上昇を含む（図２を参照のこと）。
適切なロイコトリエンＢ４レセプターアンタゴニストの例は、ＳＣ（＋）−（Ｓ）−７−（３−（２−（シクロプロピルメチル）−３−メトキシ−４−［（メチルアミノ）−カルボニル］フェノキシ（プロポキシ）−３，４−ジヒドロ−８−プロピル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−プロパン酸（「ＳＣ ５３２２８」）である。他の適切なロイコトリエンＢ４レセプターアンタゴニストとしては、［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］［［３−（ジメチルアミノ−３−オキソプロピル）チオ］メチル］チオプロパン酸（「ＭＫ ０５７１」）ならびに薬物ＬＹ ６６，０７１およびＩＣＩ ２０，３２１９が挙げられる。ＭＫ ０５７１はまた、ＬＴＤ４レセプターサブタイプアンタゴニストとして作用する。本発明の局所送達法の実施のために適切なこの薬剤の濃度は、表２７に提供される。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙される治療範囲内の関節または作用部位において局所濃度を生じるのに十分な投薬量または負荷の薬剤を適切に含む。標的化された持続性放出送達系について、予め決定された持続性放出期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位において局所濃度を生じるのに十分な投薬量または負荷の薬剤が、この組成物中に含まれる。
（表２７）
疼痛および／または炎症阻害剤の治療的濃度および好ましい濃度
Figure 2005519917
 （１２．オピオイドレセプターアゴニスト）
オピオイドレセプターの活性化は、抗侵害受容効果を生じ、従って、これらのレセプターに対するアゴニストが、所望される。オピオイドレセプターとしては、μ−、δ−およびκ−オピオイドレセプターサブタイプが挙げられる。μ−レセプターは、末梢の感覚ニューロン末端に位置し、そしてこれらのレセプターの活性化は、感覚ニューロン活性を阻害する。Ｂａｓｂａｕｍ，Ａ．Ｉ．ら，「Ｏｐｉａｔｅ ａｎａｌｇｅｓｉａ：Ｈｏｗ Ｃｅｎｔｒａｌ ｉｓ ａ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔａｒｇｅｔ？」，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２５：１１６８（１９９１）。δ−レセプターおよびκ−レセプターは、交感神経遠心末端に位置し、そしてプロスタグランジンの放出を阻害し、従って、疼痛および炎症を阻害する。Ｔａｉｗｏ，Ｙ．Ｏ．ら、「Ｋａｐｐａ− ａｎｄ Ｄｅｌｔａ−Ｏｐｉｏｉｄｓ Ｂｌｏｃｋ Ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ」，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：９２８（１９９１）。オピオイドレセプターサブタイプは、Ｇタンパク質結合レセプタースーパーファミリーのメンバーである。従って、全てのオピオイドレセプターアゴニストは、その同族Ｇタンパク結合レセプターを介するシグナル伝達と相互作用し、そしてこのシグナル伝達を開始する。適切なμオピオイドレセプターアゴニストの例は、フェンタニルおよびＴｒｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−［Ｎ−ＭｅＰｈｅ］−ＮＨ（ＣＨ２）−ＯＨ（「ＤＡＭＧＯ」）である。適切なδ−オピオイドレセプターアゴニストの例は、［Ｄ−Ｐｅｎ２，Ｄ−Ｐｅｎ５］エンケファリン（「ＤＰＤＰＥ」）である。適切なκ−オピオイドレセプターアゴニストの例は、（ｔｒａｎｓ）−３，４−ジクロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−［２−（１−ピロリドニル）シクロヘキシル］−ベンゼンアセトアミド（「Ｕ５０，４８８」）。これらの薬剤の各々の局所送達のために適切な濃度は、表２８に記載される。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内の関節または作用部位において局所濃度を生じるのに十分な投薬量または負荷の薬剤を含む。標的化された持続性放出送達系について、予め決定された持続性放出期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位において局所濃度を生じるのに十分な投薬量または負荷の薬剤が、この組成物中に含まれる。
（表２８）
疼痛および／または炎症阻害剤の治療的濃度および好ましい濃度
Figure 2005519917
 （１３．プリン受容体アンタゴニスト）
細胞外ＡＴＰは、Ｐ２プリン受容体との相互作用を介してシグナル伝達分子として作用する。１つの主要なクラスのプリン受容体は、Ｐ２Ｘプリン受容体であり、これは、Ｎａ＋、Ｋ＋およびＣａ２＋を透過可能な内在性イオンチャネルを保有するリガンドリガンド型イオンチャネルである。感覚ニューロンにおいて記載されるＰ２ｘレセプターは、原発性求心性神経伝達および侵害受容器に重要である。ＡＴＰは、感覚ニューロンを脱極することが知られており、そして侵害受容器の活性化において役割を果たす。なぜなら、損傷した細胞から放出されるＡＴＰは、Ｐ２Ｘレセプターを刺激して、侵害受容器神経線維末端の脱極を生じるからである。Ｐ２Ｘ３レセプターは、高度に制限された分布を有する（Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｃ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，第３７７巻、ｐｐ．４２８−４３１（１９９５））。なぜなら、このレセプターは、脊髄中を走る感覚Ｃ繊維神経において選択的に発現され、これらのＣ繊維の多くは、有痛性の刺激に対するレセプターを輸送することが知られているからである。従って、Ｐ２Ｘ３レセプターサブユニットの高度に制限された発現の局在化によって、これらのサブタイプは、鎮痛作用の非常に優れた標的となる（図３および７を参照のこと）。
Ｇタンパク質レセプタースーパーファミリーに属するカルシウム動員プリンレセプターは、哺乳動物関節軟骨細胞の表面について記載されてきた。ＡＴＰは、分化した原発性軟骨細胞において、カルシウムイオン濃度の用量依存的な一過性の上昇を刺激することが見出された。異種脱感作実験は、軟骨細胞が、ＡＴＰでの最初の刺激後、ＵＴＰに対して引き続き応答しないことを示した。これらの結果は、軟骨細胞の細胞表面のＰ２Ｙレセプターの存在と一致する。継代した軟骨細胞におけるプリン誘導性カルシウムの動員は、アゴニストの感受性に関して同じ薬理学的プロファイルを示した。ＡＴＰおよびＵＴＰは、カートリッジ外移植または原発性軟骨細胞によるグリコサミノグリカンへの［３５Ｓ］スルフェートの組み込み速度によって測定した場合、軟骨基質合成を変化させなかった。基質分解（軟骨外移植からのグリコサミノグリカンの放出によって測定される）もまた、いずれのアゴニストによっても変化されなかった。原発性関節軟骨細胞の表面上の機能的Ｐ２Ｙプリンレセプターの存在によって、細胞外プリン（例えば、ＡＴＰ）の濃度が軟骨細胞代謝の活性化の活性化を可能にする。
他の研究は、ヒト関節軟骨細胞によるＰ１プリンレセプターおよびＰ２プリンレセプター遺伝子の両方の発現を定義し、そしてリガンド媒介性プロスタグランジンＥ２放出を特徴付けた。Ｐ２Ｙ２レセプターアゴニストＡＴＰおよびＵＴＰは、ヒトＩＬ−１αで予め処置された後に相乗的に促進されるＰＧＥ２のわずかな放出を刺激した。ＩＬ−１で予め処置した後のＡＴＰおよびＵＴＰの同時添加に反応するＰＧＥ２放出は、酢酸ミリスチン酸ホルボールによって模倣された。Ｐ２Ｙ２レセプターの機能は、ＩＬ−１媒介性ＰＧＥ２放出を増加させることであり、それにより、関節内の疼痛および炎症を促進する。従って、本発明におけるＰ２Ｙアンタゴニストの使用は、滑膜細胞および軟骨細胞の両方による炎症メディエータの生成の活性化を防止するはずである。
本発明で使用するためのＰ２Ｘ／ＡＴＰプリン受容体の適切なアンタゴニストとしては、例えば、スラミン、およびピリドキシルホスフェート−６−アゾフェニル−２，４−ジスルホン酸（「ＰＰＡＤＳ」）が挙げられる。これらの薬剤の局所送達のために適切な濃度は、表２９に提供される。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内の関節または作用部位において局所濃度を生じるのに十分な投薬量または負荷の薬剤を適切に含む。標的化された持続性放出送達系について、予め決定された持続性放出期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位において局所濃度を生じるのに十分な投薬量または負荷の薬剤が、この組成物中に含まれる。
（表２９）
疼痛および／または炎症阻害剤の治療的濃度および好ましい濃度
Figure 2005519917
 （１４．Ｃａ２＋チャネルアンタゴニスト）
カルシウムチャネルアンタゴニストは、神経炎症を媒介する細胞応答の活性化に必要なカルシウムイオンの膜貫通フラックスを妨害する異なる群の薬物である。滑膜細胞および軟骨細胞へのカルシウムの流入は、これらの細胞における応答の活性化を媒介する重要な事象である。さらに、神経炎症シグナル伝達経路の媒介におけるブラジキニン、ヒスタミン、セロトニン（ＳＨＴ２）およびニューロキニンレセプター（ＮＫ１およびＮＫ２）の役割は、細胞内カルシウムの増加を含み、従って、原形質膜上のカルシウムチャネルの活性化を生じる。多くの組織において、カルシウムチャネルアンタゴニスト（例えば、ニフェジピン）は、種々の刺激によって誘発されるアラキドン酸、プロスタグランジンおよびロイコトリエンの放出を低下させ得る。Ｍｏｎｃａｄａ，Ｓ．ら，Ｇｏｏｄｍａｎ’ｓ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，（第７版），ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌ．Ｉｎｃ．，６６０−５（１９９５）。
最終的に、カルシウムチャネルアンタゴニスト、およびタキキニン、ヒスタミンまたはブラジキニンアンタゴニストのいずれかは、神経炎症の阻害において相乗効果を示す。神経炎症の媒介におけるニューロキニンレセプターの役割は、確立されている。ニューロキニン１（ＮＫ１）レセプターおよびニューロキニン２（ＮＫ２）レセプター（Ｇタンパク質結合スーパーファミリーのメンバー）のシグナル伝達経路は、細胞内カルシウムの増加に関与し、従って、原形質膜上のカルシウムチャネルの活性化を生じる。同様に、ブラジキニン２（ＢＫ２）レセプターの活性化は、滑膜細胞および軟骨細胞における細胞内カルシウムの増加に関連する。従って、カルシウムチャネルアンタゴニストは、細胞内カルシウム（この一部は、Ｌ型チャネルを介して流入する）の上昇に関与する共通の機構を妨害する。これは、カルシウムチャネルアンタゴニストとニューロキニン、ヒスタミン、Ｐ２Ｙおよびブラジキニン２レセプターに対するアンタゴニストとの間の相乗的相互作用の基礎である。
本発明の実施のために適切なカルシウムチャネルアンタゴニストとしては、ニソルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ラシジピン（ｌａｃｉｄｉｐｉｎｅ）、イスラジピンおよびアムロジピンが挙げられる。これらの薬剤の局所送達に適切な濃度は、表３０に記載される。同様に、本発明に従う全身性組成物は、列挙された治療範囲内の関節および作用部位において局所濃度を生じるのに十分な投薬量または負荷の薬剤を適切に含む。標的化された持続性放出送達系について、予め決定された持続性放出期間にわたって、列挙された治療範囲内の関節または作用部位において局所濃度を生じるのに十分な投薬量または負荷の薬剤が、この組成物中に含まれる。
（表３０）
痙攣阻害剤の治療的濃度および好ましい濃度
Figure 2005519917
（ＶＩ．実施例）
以下は特定の作業手順における洗浄（実施例１〜３）および全身送達（例えば、筋肉内注射または皮下注射（実施例４〜１１）による）に適切な本発明の局面に従う処方物であり、そして以下の本発明の薬剤を利用する３つの臨床研究の要約を示す。
（実施例１）
（関節鏡検査のための洗浄溶液）
以下の組成物は、関節鏡検査手順の間、解剖学的関節洗浄において使用するのに適切である。各薬物は、以下の実施例で記載される残りの溶液と同様に、生理学的電解質（例えば、正常生理食塩水または乳酸加リンガー溶液）を含有するキャリア流体中で可溶化される。
Figure 2005519917
 （実施例２）
（関節鏡検査のための代替の洗浄溶液）
以下の組成物は、関節鏡検査手順の間、解剖学的関節洗浄において使用するのに適切な代替の処方物である。
Figure 2005519917
 （実施例３）
（代替の洗浄溶液）
以下の薬物および生理学的キャリア流体中の溶液の濃度範囲は、本発明における使用に適切である。
Figure 2005519917
 （実施例４）
（注射用の軟骨保護（ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）溶液）
以下の組成物は、解剖学的関節への注射のために適切である。各薬物を、生理学的電解質（例えば、正常生理食塩水または乳酸加リンガー溶液）を含有するキャリア流体中に可溶化する。この溶液の２０ｍｌの投薬量が、患者への投与に適切である。
Figure 2005519917
 （実施例５）
以下の軟骨保護組成物は、例えば、筋肉内投与または皮下投与による全身送達のために適切である。各薬物を、意図した作用部位において以下の濃度を生じる濃度で、この組成物中に含有させ、そして生理学的キャリア流体または送達系中に可溶化する。
（実施例６）
（全身送達のための代替的な軟骨保護（Ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）組成物）
以下の軟骨保護組成物は、全身送達（例えば、筋肉内投与または皮下投与）に適切である。各薬物は、組成物中に、意図された作用部位で以下の濃度を生じるために十分な濃度で、含まれ、そして、生理学的キャリア流体または送達システムにおいて可溶化される。
薬剤の分類 薬物 作用部位での濃度
（ナノモル）
ＭＡＰキナーゼインヒビター ＳＢ２０３５８０ ２００
一酸化窒素シンターゼインヒビター Ｌ−ＮＩＬ １，０００
インターロイキンレセプターアゴニスト ＩＬ−１０ １００
（実施例７）
（全身送達のための代替の軟骨保護組成物）
以下の軟骨保護組成物は、全身送達（例えば、筋肉内投与または皮下投与）に適切である。各薬物は、組成物中に、意図された作用部位で以下の濃度を生じるために十分な濃度で、含まれ、そして、生理学的キャリア流体または送達システムにおいて可溶化される。
薬剤の分類 薬物 作用部位での濃度
（ナノモル）
ＭＡＰキナーゼインヒビター ＳＢ２４２２３５ ２００
一酸化窒素シンターゼインヒビター Ｌ−ＮＩＬ １０，０００
ＴＧＦ−βアゴニスト ＴＧＦ−β２ １００
（実施例８）
（全身送達のための代替の軟骨保護組成物）
以下の軟骨保護組成物は、全身送達（例えば、筋肉内投与または皮下投与）に適切である。各薬物は、組成物中に、意図された作用部位で以下の濃度を生じるために十分な濃度で、含まれ、そして、生理学的キャリア流体または送達システムにおいて可溶化される。
薬剤の分類 薬物 作用部位での濃度
（ナノモル）
可溶性ＴＮＦ−αレセプター Ｅｔａｎｅｒｏｃｅｐｔ ２５０
（ｓＴＮＦＲＩＩ：Ｆｃ） （ＥｎｂｒｅｌＴＭ、Ｉｍｍｕｎｅｘ）

ＭＡＰキナーゼインヒビター ＳＢ２０３５８０ ５００
ＴＧＦ−βアゴニスト ＴＧＦ−β２ １００
（実施例９）
（全身送達のための代替の軟骨保護組成物）
以下の軟骨保護組成物は、全身送達（例えば、筋肉内投与または皮下投与）に適切である。各薬物は、組成物中に、意図された作用部位で以下の濃度を生じるために十分な濃度で、含まれ、そして、生理学的キャリア流体または送達システムにおいて可溶化される。
薬剤の分類 薬物 作用部位での濃度
（ナノモル）
ＩＬ−１レセプター Ａｎａｋｉｎｒａ ２５０
アゴニスト（ＩＬ−１ Ｒａ） （ＫｉｎｅｒｅｔＴＭ、Ａｍａｇｅｎ）
ＭＡＰキナーゼインヒビター ＳＢ２０３５８０ ５００
ＴＧＦ−βアゴニスト ＴＧＦ−β２ ２００
（実施例１０）
（全身送達のための代替の軟骨保護組成物）
以下の軟骨保護組成物は、全身送達（例えば、筋肉内投与または皮下投与）に適切である。各薬物は、組成物中に、意図された作用部位で以下の濃度を生じるために十分な濃度で、含まれ、そして、生理学的キャリア流体または送達システムにおいて可溶化される。
薬剤の分類 薬物 作用部位での濃度
（ナノモル）
ＭＡＰキナーゼインヒビター ＳＢ２０３５８０ ５００
ＩＧＦ−１ ＩＧＦ−１ ２５０
ＢＭＰアゴニスト ＢＭＰ−２ ２００
（実施例１１）
（全身送達のための代替の軟骨保護組成物）
以下の軟骨保護組成物は、全身送達（例えば、筋肉内投与または皮下投与）に適切である。各薬物は、組成物中に、意図された作用部位で以下の濃度を生じるために十分な濃度で、含まれ、そして、生理学的キャリア流体または送達システムにおいて可溶化される。
薬剤の分類 薬物 作用部位での濃度
（ナノモル）
可溶性ＴＮＦ−αレセプター Ｅｔａｎｅｒｏｃｅｐｔ ０．５〜１．０
（ｓＴＮＦＲＩＩ：Ｆｃ） （ＥｎｂｒｅｌＴＭ、Ｉｍｍｕｎｅｘ）
ＭＡＰキナーゼインヒビター ＳＢ２０３５８０ ３０〜６０
ＴＧＦ−βアゴニスト ＴＧＦ−β２ ０．１〜１０
（実施例１２）
（全身送達のための代替の軟骨保護組成物）
以下の軟骨保護組成物は、全身送達（例えば、筋肉内投与または皮下投与）に適切である。各薬物は、組成物中に、意図された作用部位で以下の濃度を生じるために十分な濃度で、含まれ、そして、生理学的キャリア流体または送達システムにおいて可溶化される。
薬剤の分類 薬物 作用部位での濃度
（ナノモル）
ＩＬ−１レセプター Ａｎａｋｉｎｒａ ２．０
アゴニスト（ＩＬ−１ Ｒａ） （ＫｉｎｅｒｅｔＴＭ、Ａｍａｇｅｎ）
ＭＡＰキナーゼインヒビター ＳＢ２０３５８０ ３０〜６０
ＴＧＦ−βアゴニスト ＴＧＦ−β２ ０．１〜１０
（実施例１３）
（標的化された軟骨保護薬物送達システム）
以下の軟骨保護組成物は、全身送達（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与または吸入投与）に適切である。薬物を、ＤＬ−ラクチド／グルコリドコポリマー（ＰＬＧＡ）ナノスフェア内にカプセル化し、これを、抗ヒトＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体に結合する。この抗体は、関節軟骨内のヒトＩＩ型コラーゲンのエピトープを標的にする。各薬物は、組成物中に徐放期間にわたるナノスフェアの分解および薬剤の放出に関して意図された作用部位で以下の平均濃度を生じるために十分な濃度で、含まれる。
薬剤の分類 薬物 作用部位での濃度
（ナノモル）
増殖因子 ＩＧＦ−１ ２５０ｎＭ
ＭＡＰキナーゼインヒビター ＳＢ２２００２５ １０００ｎＭ
ＭＭＰインヒビター ＢＢ２５１６ ２００ｎＭ
（ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）
（実施例１４）
（標的化された軟骨保護薬物送達システム）
以下の軟骨保護組成物は、全身送達（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与または吸入投与）に適切である。薬物を、生分解性ＰＬＡ／ＰＬＧＡコポリマーナノスフェア内にカプセル化し、これを、抗ヒトアグレカンモノクローナル抗体に結合する。この抗体は、関節軟骨内のヒトアグレカンのネオエピトープを標的にする。各薬物は、組成物中に、意図された作用部位で以下の濃度を生じるために十分な濃度で、徐放期間にわたるナノスフェアの分解および薬剤の放出に関して含まれる。
薬剤の分類 薬物 作用部位での濃度
（ナノモル）
増殖因子 ＩＧＦ−１ ２５０ｎＭ
ＭＡＰキナーゼインヒビター ＳＢ２２００２５ １０００ｎＭ
ＭＭＰインヒビター ＢＢ２５１６ ２００ｎＭ
（ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）
（実施例１５）
（標的化された軟骨保護薬物送達システム）
以下の軟骨保護組成物は、全身送達（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与または吸入投与）に適切である。薬物を、キトサン／ゼラチンナノスフェア内にカプセル化し、これを、抗ヒトＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体に結合する。この抗体は、ヒトＩＩ型コラーゲンのネオエピトープを標的にする。各薬物は、組成物中に、意図された作用部位で以下の平均濃度を生じるために十分な濃度で、徐放期間にわたるナノスフェアの分解および薬剤の放出に関して含まれる。
薬剤の分類 薬物 作用部位での濃度
（ナノモル）
ＢＭＰレセプターアゴニスト ＢＭＰ−７ ２００
ＭＡＰキナーゼインヒビター ＳＢ２０３５８０ ５００
（実施例１６）
（標的化された軟骨保護薬物送達システム）
以下の軟骨保護組成物は、全身送達（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与または吸入投与）に適切である。薬物を、アルブミンナノスフェア内にカプセル化し、これは、抗ヒトＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体に結合する。この抗体は、ヒトＩＩ型コラーゲンのネオエピトープを標的にする。各薬物は、組成物中に、意図された作用部位で以下の平均濃度を生じるために十分な濃度で、徐放期間にわたるナノスフェアの分解および薬剤の放出に関して含まれる。
薬剤の分類 薬物 作用部位での濃度
（ナノモル）
ＢＭＰレセプターアゴニスト ＢＭＰ−７ ２００
ＭＭＰインヒビター ＢＢ２５１６ ２００
（実施例１７）
（標的化された軟骨保護薬物送達システム）
以下の軟骨保護組成物は、全身送達（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与または吸入投与）に適切である。薬物を、ポリ（ラクチドコグリコシド）／ポリ（エチレングリコール）コポリマーナノスフェア内にカプセル化し、これを、関節軟骨内の抗ヒトＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体に結合する。この抗体は、ヒトＩＩ型コラーゲンのネオエピトープを標的にする。各薬物は、組成物中に、意図された作用部位で以下の平均濃度を生じるために十分な濃度で、徐放期間にわたるナノスフェアの分解および薬剤の放出に関して含まれる。
薬剤の分類 薬物 作用部位での濃度
（ナノモル）
ＢＭＰレセプターアゴニスト ＢＭＰ−７ ２００
ＭＡＰキナーゼインヒビター ＳＢ２０３５８０ ５００
（実施例１８）
（標的化された軟骨保護薬物送達システム）
以下の軟骨保護組成物は、全身送達（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与または吸入投与）に適切である。ＢＭＰレセプターアゴニスト、ＢＭＰ−７を、ポリ（ラクチドコグリコシド）（ＰＬＧＡ）ナノスフェア内にカプセル化し、これを、抗ヒトＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体に結合する。ＩＧＦレセプターアゴニスト、ＩＧＦ−１は、コンドロイチン−６−硫酸塩／ゼラチンナノスフェア内に別々にカプセル化され、これもまた抗ヒトアグレカンモノクローナル抗体に結合する。各型のナノスフェアを標的化するために使用される抗体は、関節軟骨内のヒトＩＩ型コラーゲンのネオエピトープおよびアグレカンのネオエピトープに結合する。各薬物は、組成物中に、意図された作用部位で以下の平均濃度を生じるために十分な濃度で、徐放期間にわたるナノスフェアの分解および薬剤の放出に関して含まれる。
薬剤の分類 薬物 作用部位での濃度
（ナノモル）
ＢＭＰレセプターアゴニスト ＢＭＰ−７ ２００
ＩＧＦレセプターアゴニスト ＩＧＦ−１ ５００
（実施例１９）
以下の軟骨保護組成物は、全身送達（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与または吸入投与）に適切である。薬物を、アルブミンナノスフェア内にカプセル化し、これを、ＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体に結合する抗ヒトＦ（ａｂ’）２と結合する。この抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体は、ヒトＩＩ型コラーゲンのネオエピトープを標的にする。各薬物は、組成物中に、意図された作用部位で以下の平均濃度を生じるために十分な濃度で、徐放期間にわたるナノスフェアの分解および薬剤の放出に関して含まれる。
薬剤の分類 薬物 作用部位での濃度
（ナノモル）
ＢＭＰレセプターアゴニスト ＢＭＰ−７ ２００
ＮＮＰインヒビター ＢＢ２５１６ ２００
（実施例２０）
以下の軟骨保護組成物は、全身送達（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与または吸入投与）に適切である。薬物を、アルブミンナノスフェア内にカプセル化し、これを、ＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体に結合する免疫グロブリン分子（ｓｃＦＶ）の抗ヒト単鎖最小結合ドメインと結合する。このｓｃＦＶ抗体は、ヒトＩＩ型コラーゲンのネオエピトープを標的にする。各薬物は、組成物中に、意図された作用部位で以下の平均濃度を生じるために十分な濃度で、徐放期間にわたるナノスフェアの分解および薬剤の放出に関して含まれる。
薬剤の分類 薬物 作用部位での濃度
（ナノモル）
ＢＭＰレセプターアゴニスト ＢＭＰ−７ ２００
ＮＮＰインヒビター ＢＢ２５１６ ２００
（研究１）
（ＩＬ−１アゴニストおよびＧＰＣＲアゴニストに対する曝露の際の迅速なＰＧＥ２バーストの相乗刺激）
線維芽細胞様滑膜細胞は、炎症細胞の特徴を示し、そして関節炎および軟骨分解の重要な調節因子であるようである。滑膜細胞培養モデル系を使用して、関節組織の破壊（関節鏡検査手術の間の組織損傷の結果として生じる損傷を含む）を調節する際に重要である、ＩＬ−１と非サイトカイン炎症のメディエーターとの間の相乗的相互作用を特徴付けた。実験を実施して、培養されたヒト滑膜線維芽細胞におけるサイトカインおよびプロスタノイド産生の調節について、Ｇタンパク質結合化レセプター（ＧＰＣＲ）アゴニスト（ヒスタミン、ブラジキニンおよびイソプロテロノール）を研究し、そしてこの系におけるケトプロフェンの活性を特徴付けた。インターロイキン−１（ＩＬ−１）を用いる刺激に応じたプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ2）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−８（ＩＬ−８）の誘導の動態学を記載する。ＩＬ−１プライミング後のサイトカイン産生を増強するＧＰＣＲリガンドの能力を研究した。
研究１〜３において、他に示されない限り、以下の実験方法および材料を使用した。
（１．細胞培養）
滑膜組織を、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｍａｃ Ｎｅａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌによって関節置換手術を受けた骨関節炎患者から入手し、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびフンギソン（０．２５μｇ／ｍｌ）を含む、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、研究所に輸送した。滑膜を解剖して、はさみでみじん切りにし、そしてＬ−グルタミン（２ｍＭ）、熱不活性ウシ胎仔血清（１０％ｖ／ｖ）および抗生物質を含むＤＭＥＭからなる培養培地中に外植片として配置した。培養物を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７℃にて収容した。付着性滑膜細胞は、２〜３週間以内でその外植片から生じ、そしてトリプシン処理により継代された。種培養物を毎週２回与え、そしてコンフルエンシーにて継代した。実験を、３〜８継代に由来する細胞に対して実施した。実験培養物を、２ｍｌ培養培地において７．５×１０３細胞／ｃｍ２の密度で３５ｍｍ皿中にプレートした。培養物を、実験のためにコンフルエンシー近くまで増殖させ、そして２．３±０．３×１０５細胞（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝３）および１０４±１３μｇタンパク質（ｎ＝１０）を含んだ。この増殖培地を毎週２回交換した。
（２．実験的処置）
実験的処置を開始する前の日に、培地を、上記のように、２％熱不活性ウシ胎仔血清およびＬ−グルタミンならびに抗生物質を含むＤＭＥＭからなる実験用培養培地に代えて、細胞を休止状態にした。次の日、示されるように、培養物を、馴化増殖培地に対して１２〜２４時間間隔で特定濃度のＩＬ−１またはさらなるリガンドの添加によりプライミングした。いくつかの実験において、馴化増殖培地を、ＩＬ−１を用いるプライミング後の分析のために収集した。 急性の実験処理を、このプライミング間隔後、以下のように実施した。培養物をインキュベーターから取り出し、ロック生理学的緩衝液（ｍＭにおけるＬＢ組成：ＮａＣｌ、１５４；ＫＣｌ、２．６；ＫＨ２ＰＯ４、２．１５；Ｋ２ＨＰＯ４、０．８５；ＭｇＣｌ２、５；ＣａＣｌ２、２；Ｄ−グルコース、１０；ＨＥＰＥＳ、１０；ｐＨ７．４、ＢＳＡ、０．１％ ｗ／ｖ）の２ｍｌアリコートで３回洗浄し、次いで、特定のリガンドを含有するＬＢのさらなるアリコートを用いて３７℃浴上で１０分間平衡化した。この溶液を吸引により除去し、そして特定の時間間隔の間３７℃において、示されるリガンドを含む新鮮な緩衝液アリコートで置換した。薬理学的インヒビターを、代表的に、１０分間の予備インキュベーション間隔の間に添加し、そしてアゴニストおよび特定インヒビターは、３分間のチャレンジ間隔の間存在した。
（３．プロスタグランジンＥ２の測定）
表示された処置プロトコルの後、培養上清のアリコート（１ｍｌ）を収集して、液体窒素中で急速冷凍した。サンプルを、処理するまで−８０℃にて保存した。培養上清のアリコートを、プロスタグランジンＥ２およびＥ１に対して等価な反応性を有する抗体を使用して、製造業者（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）より指示されるように、競合結合ラジオイムノアッセイによって分析した。定量化のために、[３Ｈ]プロスタグランジンＥ２の固定濃度、および標準の競合プロスタグランジンＥ２の増加する濃度を使用して、標準曲線を各アッセイについて作成した。
（４．ＩＬ−６の測定）
サイトカイン、ＩＬ−６の産生もまた、−８０℃にて冷凍保存されていた上清培養培地のアリコートにおいて測定した。ＩＬ−６を、製造業者（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）により記載されるようにアルカリホスファターゼ検出を伴うサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定し、そしてそれぞれ純粋な組換えヒトサイトカインを用いて作成された標準曲線を使用して、定量した。実験決定を、二連の培養物に対して実施した。
（研究２）
（［３Ｈ］チミジン取り込みおよびＭＴＴについてのアッセイ）
滑膜細胞株を、［３Ｈ］チミジンの取り込みとして測定される、ＩＬ−１に応じた増殖能力について慣用的に評価した（Ｋｉｍｂａｌｌ＆Ｆｉｓｈｅｒ、１９８８）。この調製物において、ＩＬ−１の最大有効濃度は、２％血清中に維持される休止状態の培養物と比較して約１０〜２０倍の［３Ｈ］チミジンの取り込みを刺激する（データは示さず）。
（１．データ分析）
免疫アッセイを、各培養物に由来する二連のアリコートにおいて慣用的に実施した。実験決定を、二連または三連の培養物に対して実施した。各実験を少なくとも２つの細胞株で反復した。非線形回帰曲線のフィッティングおよび統計学的分析を、Ｇｒａｐｈ−ＰＡＤ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して実施した。
（２．材料）
細胞培養：細胞培養培地をＳｉｇｍａまたはＧｉｂｃｏ／ＢＲＬから入手した。ウシ胎仔血清をＡｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）から入手した。薬物：組換えヒトインターロイキン−１を、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手した。ケトプロフェンは、Ｏｍｅｒｏｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）により提供された。アミトリプチリン、フォルスコリン、５−ヒドロキシトリプタミン、イソプロテレノール、ブラジキニン、ヒスタミンおよびプロスタグランジンＥ２を、Ｓｉｇｍａから入手した。放射化学物質：［３Ｈ］プロスタグランジンＥ２を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。他の全ての試薬を、標準的な商業供給業者から入手可能な最高純度で入手した。
ヒト滑膜細胞におけるＰＧＥ２産生に対するＧＰＣＲアゴニスト、ヒスタミンおよびブラジキニンの効果を、これらの異なるクラスのレセプターを介する共通の薬理学的効果を媒介するアゴニスト間の機能的相互作用を評価するために、ＩＬ−１に対する前刺激を伴い、そして伴わずに測定した。培養したヒト滑膜線維芽細胞のＩＬ−１（１０Ｕ／ｍｌ）への一晩の曝露は、ＰＧＥ２産生（これは、培養上清中に増加したＰＥＧ２として、ラジオイムノアッセイによって測定され得る）の遅延され（４時間）かつ持続された大増強を生じる。延長されたＩＬ−１処理（１６〜２４時間）の間のＰＧＥ２産生の漸増は、協調的上方制御されたｃＰＬＡ２およびＣＯＸ−２の発現から生じることが示されてきた（Ｃｒｏｆｆｏｒｄ、１９８４、Ｈｕｌｋｏｗｅｒら、１９８４）。ＩＬ−１への一晩曝露により準備されていた培養物は、さらなる迅速（数分）かつ旺盛なＰＧＥ２の産生と共に、最大有効濃度のヒスタミン（１００μＭ）またはブラジキニン（１μＭ）を用いる引続くチャレンジに応答する。ヒスタミンまたはブラジキニン刺激に応じたＰＧＥ２産生の時間経過についての代表的なデータは、図７に示される。これらの条件下において、ヒスタミンは、ＧＰＣＲアゴニスト添加を受けなかったＩＬ−１プライミング細胞と比較して、５〜１０倍増のＰＥＧ２産生を誘発する。ブラジキニンは、１０〜１５倍増を誘発する。短期２分間のアゴニストチャレンジの間に産生されるＰＥＧ２の絶対量は、１８時間ＩＬ−１プライミング間隔全体の間に累積的に産生される量に近づくか、または超える。これは、図７が、最小のさらなる蓄積が引続き６０分間に渡って観察されるので、ＰＥＧ２産生におけるヒスタミン誘発性バーストの大部分は、初めの２分間以内に生じるということを示すという範囲で注目すべきことである。ブラジキニン刺激されたＰＧＥ２応答は同じ期間にわたって増加し続ける（２倍）。ＩＬ−１プライミングの非存在下において、未処理の滑膜細胞は、いずれかのＧＰＣＲアゴニストを単独で用いる刺激に応じた検出可能なＰＧＥ２産生を示さない。ＩＬ−１プライミングの条件下において、ヒスタミンおよびブラジキニンの両方は、相乗的にＰＧＥ２放出を増強した。
骨関節炎患者に由来する培養された滑膜線維芽細胞を使用して、本発明者らは、ＰＧＥ２産生に対して、炎症促進性サイトカイン（ＩＬ−１）と、生理学的に関連するＧタンパク質結合化レセプターとの間の時間依存性相乗的相互作用を見出し、そして標的治療薬剤の作用を評価した。結合される内因性滑膜細胞レセプターを介して作用するＧＰＣＲアゴニストは、細胞内カルシウム、イノシトールホスフェートを増加し、そしてＰＫＣシグナル伝達経路は、ＩＬ−１により予めプライミングされた細胞において迅速かつ劇的にＰＧＥ２産生を増幅する。ＣＯＸインヒビターは、アゴニスト誘発化迅速バーストおよびＰＧＥ２の長期蓄積の両方を効率的に減弱する。従って、細胞内シグナル伝達について異なるＧＰＣＲ経路およびＩＬ−１経路は、相乗的に相互作用して迅速またはより緩慢のいずれかのＰＧＥ２応答の長期調節を引き起こす。
迅速なＰＧＥ２バーストを産生する滑膜細胞において、ＩＬ−１とカルシウム調節ＧＰＣＲとの間の相乗作用は、アラキドン酸放出の迅速増大（多くの細胞型におけるｃＰＬＡ２活性化の基準）によって部分的に説明され得る。ＣＯＸ−２発現を誘導することに加えて、ＩＬ−１は、ｃＰＬＡ２の発現を増加させる（Ｈｕｌｋｏｗｅｒら、１９９４）。これらの２つのタンパク質は、一緒に作用して、遊離のアラキドン酸基質をＣＯＸ−２に提供する。ＩＬ−１によって誘導される重要なエイコサノイド代謝酵素の上方制御は、従って、ＧＰＣＲリガンドのアラキドネート放出を活性化する能力と相まって、プロスタノイド合成を介して基質流動全体を増加させることが予期される。ｃＰＬＡ２は、２つしか知られていないレセプター調節を示す機能特性を示すＰＬＡ２であり、そしておそらくエイコサノイド産生および細胞内シグナル伝達に関与する。ｃＰＬＡ２は、完全な活性のために、カルシウム濃度を増大させることによって活性化されて、そしてブラジキニンＢ２レセプターおよびヒスタミンＨ１レセプターの活性化は、細胞内カルシウムの動員と関連するので、これはおそらく、ＰＧＥ２産生において迅速アゴニスト刺激バーストを調節する優勢因子である。最終的に、Ｂ２レセプターまたはＨ１レセプターの活性化により引き起こされる細胞質内カルシウムの非常に迅速かつ一過性の増加は、ｃＰＬＡ２の活性化、アラキドン酸放出および観察されたＰＧＥ２バーストについて公知の動態学に類似している。
（研究３：シクロオキシゲナーゼインヒビターによるＰＧＥ２バースト形成の阻害）
シクロオキシゲナーゼインヒビターであるケトプロフェンの、ＰＥＧ２形成を軽減する作用を、長期の曝露（１６時間）の間にＩＬ−１と同時にインキュベートし；そして図８に示すように、その後のＧＰＣＲアゴニストチャレンジ間隔の前に簡単にプレインキュベートすることにより決定した。ＩＬ−１で一晩プライミングする間に特定濃度のケトプロフェンを追加することにより、ＰＧＥ２形成は排除される（ＩＣ５０は、非線形回帰分析により４．５±０．８ｎＭと決定される（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４滑膜細胞株））。同様の決定（データは示していない）を、シクロオキシゲナーゼインヒビターであるエトドラク（ＩＣ５０＝１５．２±４．６ｎＭ、ｎ＝４）、ケトロラク（２．２±０．４ｎＭ、ｎ＝４）、およびインドメタシン（３．２ｎＭ±１．５ｎＭ、ｎ＝２）を用いて実施した。
図８はまた、ＩＬ−１（１０Ｕ／ｍｌ）で一晩プライミングした滑膜細胞における、１００μＭヒスタミン（ＩＣ５０＝３．４±０．２ｎＭ、ｎ＝３）または１μＭブラジキニン（ＩＣ５０＝９．５±２．０ｎＭ、ｎ＝３）によるチャレンジに応答してアゴニストにより誘発されたＰＥＧ２バーストのケトプロフェン濃度依存的阻害を示す。これらの値は、ＰＧＥ２の一晩のＩＬ−１誘導の間のケトプロフェン阻害について観察された値と一致する。この結果は、ＣＯＸインヒビターによる阻害の発生が、ＧＰＣＲアゴニスト添加前の１０分の前処理間隔の間に起こることを示す。このことは、ＣＯＸ活性の直接的な可逆的阻害に匹敵し、そしてプロスタノイド調節酵素の発現レベルにおける変化と結び付いた機構によらない。この迅速な阻害効果はまた、関節鏡手術の間に灌注溶液中にて関節内へ局所的に送達される場合のこの薬物の迅速な効果についての基礎を提供する。
（研究４：ＩＬ−１およびＧＰＣＲアゴニストによるＩＬ−６産生の誘導およびケトプロフェンによる阻害）
ＩＬ−１による刺激に応答したインターロイキン−６誘導の速度論を記載する。滑膜細胞培養物をＩＬ−１およびヒスタミン（イノシトール三リン酸（ＩｎｓＰ３）／プロテインキナーゼＣ経路を通じたシグナル伝達を活性化するため）またはイスプロテレノール（細胞内ｃＡＭＰの増加を活性化するため）のいずれかを用いた示される処理に供した。ＰＧＥ２、ＩＬ−６、およびＩＬ−８の産生を、１、２、４、６、および２４時間処理後の培養上清において測定した。この実験において、各処理間隔を、別の培養物にて実施した。上記処理レジメンにおいて、ＩＬ−６の産生は、２４時間曝露後に、ＩＬ−１により大きく増加したが、ＩＬ−６は、最初の６時間間隔内では検出されなかった。ＩＬ−１に応答したＩＬ−６産生は、ヒスタミンの添加によりさらに増強せず、ヒスタミン単独では、ＩＬ−６産生を刺激しなかった。ＩＬ−１はまた、ＩＬ−８の有意な上昇（２０００ｐｇ／ｍｌ）を生じた。この上昇は、６時間の処理で初めて測定可能であった。ＩＬ−８産生は持続し、ＩＬ−１に対する２４時間の暴露で穏やかに増加した。
ＩＬ−１アゴニストおよびＧＰＣＲアゴニストによるサイトカイン産生の誘導に対するケトプロフェンの効果を試験した。このプロトコルはまた、ＩＬ−６の定常状態の誘導に対するＩＬ−１濃度依存性の効果も試験した。滑膜細胞培養物を示された濃度のＩＬ−１アゴニストおよびＧＰＣＲアゴニストにさらした。培養上清を回収し、８時間間隔で同じアゴニストを含有する新鮮な培地のアリコートで置き換えた。上清中のＰＧＥ２、ＩＬ−６、およびＩＬ−８を、記載されるようにアッセイした。
ＩＬ−６産生についてのデータを図９に示す。図９は、示された濃度のＩＬ−１および添加されたリガンドの存在下での１６時間（８〜１６時間の処理間隔に対応する）でのＩＬ−６産生を示す。ヒスタミンまたはイソプロテレノールの添加は、ＩＬ−１単独と比較して、ＩＬ−６産生を増強しない。１．０ｐｇ／ｍｇのＩＬ−１にて、ケトプロフェンは、ＩＬ−１誘導性ＩＬ−６産生の部分的な（≦５０％）阻害を引き起こす。さらに、ケトプロフェンは、ヒスタミンまたはイソプロテレノール／Ｉｌ−１同時刺激サンプル中でのＩＬ−６産生を阻害した。
滑膜細胞培養モデル系を使用して、ＩＬ−１と非サイトカイン性炎症メディエーター（関節組織の破壊（関節鏡視下手術中の組織損傷の結果として生じる損傷を含む）を調節する上で重要）との間の相乗的な相互作用を特徴付けた。この結果は、以下のように要約され得る：（１）ＩＬ−１は、培養滑膜細胞においてＰＧＥ２、ＩＬ−６、およびＩＬ−８の大きな増加を誘導するが、休止培養物は、検出可能な量のこれらのメディエーターを産生しない、（２）ＰＧＥ２の誘導が最も迅速に起こり、４時間の培養上清においてＰＧＥ２が放出され、次いで、６時間でＩＬ−８およびより長い間隔でＩＬ−６を放出する、および（３）３つ全てのメディエーターは、２４時間のＩＬ−１暴露後の培養上清において、上昇したままである。
ＰＧＥ２産生に対するそれらの作用と対照的に、ＧＰＣＲアゴニストは、ＩＬ−６またはＩＬ−８のＩＬ−１誘導を増強せず、ＩＬ−１によるプライミング後のＩＬ−６およびＩＬ−８放出も増加しない。ＩＬ−６およびＩＬ−８のＩＬ−１誘導は、ＰＧＥ２の付随する誘導により補強されるようである。というのも、ケトプロフェンは、ＩＬ−１に応答して、これらのサイトカインの産生を減少するからである。この結果は、ケトプロフェンが、外科手順の間に関節に送達された場合に、治療的な軟骨保護効果を提供し得ることを示す。
まとめると、これらの結果は、特定のＧ共役レセプターシグナル伝達経路と、ＩＬ−１による炎症促進性刺激による滑膜細胞の活性化との間の相互作用を実証している。同様の機構が、軟骨細胞においても機能的であると考えられる。これらの相互作用は、他のオータコイドまたは間接中の神経伝達レセプター系からのインプットに依存して、滑膜細胞および軟骨細胞の炎症促進性応答を統合するかまたは調節する手段を提供する。これらの知見は、カルシウム移動、ホスホイノシチド加水分解、およびＰＫＣ活性化を通じてシグナル伝達を媒介し、かつ関節鏡視下手術におけるＰＧＥ２産生の増加に結びついたＧタンパク質共役レセプターの阻害を標的化する治療的介入の合理的かつ強力な臨床上の利益を際立たせる。滑膜細胞および軟骨細胞上のこれらのレセプターとしては、ヒスタミンＨ１、ブラキジニン、サブスタンスＰ、５ＨＴ２、およびプリン作動性Ｐ２Ｙレセプターが挙げられる。
本発明の好ましい実施形態が示され記載されているが、開示された溶液および方法に対する種々の変更が、本発明の意図および範囲から逸脱することなくなされ得ることが認識される。例えば、本明細書中に含まれる開示に従って、開示された薬剤、標的化抗体、および送達ビヒクルを増強または置換し得る代替の軟骨保護剤、抗体、および送達ビヒクル、が発見され得る。従って、本明細書中の特許化された文字の範囲は、添付の特許請求の範囲の定義によってのみ限定されることが意図される。
本発明を、以下に、例として、添付の図面を参照してより詳細に記載する。
図１は、分子標的、ならびに炎症のメディエーターの生成および軟骨代謝における変化へと導くシグナル伝達情報のフローを示す、軟骨細胞の概略図である。細胞表面レセプターのいくつかのファミリー（インターロイキン−１（ＩＬ−１）レセプターファミリーおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターファミリーのようなサイトカインレセプター、ＴＧＦ−βレセプタースーパーファミリー、およびインテグリンを含む）を通した外因性シグナルの統合が、本発明の溶液中に含まれる薬物の治療的標的であるタンパク質分子の主要な群（ＭＡＰキナーゼ、ＰＫＣ、チロシンキナーゼ、ＳＨ２タンパク質、ＣＯＸ、ＰＬＡ２およびＮＦ−κＢ）を含む一般的な細胞内シグナル伝達経路において変換されることを示す。これらのシグナル伝達経路の活性化が、炎症および／または軟骨分解、あるいは基質分子の合成、ならびに軟骨細胞増殖へと導き得る多数の誘導可能な遺伝子産物（ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびストロメライシン（ＭＭＰ−３）、ならびに他のメディエーター（一酸化窒素（ＮＯ）およびＰＧＥ２）を含む）の軟骨細胞発現を制御する。 図２は、分子標的、ならびに炎症のメディエーターの生成および軟骨代謝における変化へと導くシグナル伝達情報のフローを示す、滑膜細胞の概略図である。細胞表面レセプターのいくつかのファミリー（インターロイキン−１（ＩＬ−１）レセプターファミリーおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターファミリーを含むサイトカインレセプター、ブラジキニン、ヒスタミンおよびセロトニンサブタイプを含むＧタンパク質共役型レセプター、ならびにインテグリンを含む）を通した外因性シグナルの統合が、本発明の溶液中に含まれる薬物の治療的標的であるタンパク質分子の主要な群（ＭＡＰキナーゼ、ＰＫＣ、チロシンキナーゼ、ＳＨ２タンパク質、ＣＯＸ、ＰＬＡ２およびＮＦ−κＢ）を含む一般的な細胞内シグナル伝達経路において変換されることを示す。これらのシグナル伝達経路の活性化が、炎症および／または軟骨分解へと導き得る多数の誘導性遺伝子産物（ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびストロメライシン（ＭＭＰ−３）を含む）の滑膜細胞発現を制御する。 図３は、軟骨細胞および滑膜細胞の両方における一般的なシグナル伝達経路の図であり、これは、ＧＰＣＲ活性化レセプター経路と、炎症および／または軟骨分解へと導く炎症促進サイトカイン経路との間の「クロストーク」を担う重要なシグナル伝達タンパク質を含む。 図４は、軟骨細胞および滑膜細胞の両方における一般的なシグナル伝達経路の図であり、これは、ＧＰＣＲ活性化レセプター経路と、炎症促進サイトカイン経路との間の「クロストーク」を担う重要なシグナル伝達タンパク質を含む。本発明の好ましい軟骨保護溶液におけるいくつかの薬物についての特定の分子作用部位が同定される。 図５は、軟骨の同化応答を促進する、軟骨細胞または滑膜細胞いずれかに存在する分子標的の図である。本発明の好ましい軟骨防御溶液におけるいくつかの薬物についての特定の作用部位が同定される。 図６は、軟骨の異化応答を促進する、軟骨細胞または滑膜細胞いずれかに存在する分子標的の図である。本発明の好ましい軟骨防御溶液におけるいくつかの薬物についての特定の作用部位が同定される。 図７は、インターロイキン−１（ＩＬ−１、１０Ｕ／ｍｌ）での一晩のプライミング後の、Ｇタンパク質調節性アゴニストによる滑膜培養物中におけるプロスタグランジンＥ２の生成のグラフ表示である。培養物を、示される時間にわたって、ヒスタミン（１００μＭ、白棒）またはブラジキニン（１μＭ、黒棒）で刺激し、そして培養上清に放出されたプロスタグランジンＥ２を、以下の本明細書における研究１に記載のように決定した。示される値は、代表的な実験からの平均±標準偏差であり、そして刺激していない培養物による基底プロスタグランジンＥ２生成に対して補正した。 図８は、ケトプロフェンによる滑膜培養物中におけるプロスタグランジンＥ２生成の阻害のグラフ表示である。培養物を一晩、示される濃度のケトプロフェンの存在下（「黒四角」として示される）または不在下（「白三角」として示される）において、ＩＬ−１（１０Ｕ／ｍｌ）でプライミングした。１日後、プロスタグランジンＥ２を、ケトプロフェンで一晩処理した培養物上清において測定し、そして残存する培養物を洗浄し、示される濃度のケトプロフェンと共に１０分間インキュベートし、次いで、示される量のケトプロフェンの継続存在下において、ヒスタミン（１００μＭ、逆白三角）またはブラジキニン（１μＭ、正白三角）での引き続く３分間のチャレンジに応答するプロスタグランジンＥ２生成を測定した。示されるデータを、それぞれ、各アゴニストについて得られた最大応答に対して正規化した。これは、異なる細胞株において実施された３つの実験から導き出された平均±標準偏差を表す。 図９は、示される濃度のＩＬ−１および添加されたＧタンパク質共役型レセプターリガンドの存在下での、１６時間での滑膜細胞培養によるＩＬ−６生成に対する、ケトプロフェンの効果のグラフ表示である。培養物を、以下のさらなるレセプターリガンドのうちの１つを有する実験増殖培地における、０．７５μＭケトプロフェンの不在および存在下で、示される濃度（０．３ｐｇ／ｍｌ、１．０ｐｇ／ｍｌ、および３．０ｐｇ／ｍｌ）のＩＬ−１と共に１６時間インキュベートした：１）ｃａｍｐ経路を活性化するためのイソプロテレノール（ＩＳＯ）１．０μＭ、または２）ＩＰ３／カルシウム経路を活性化するためのヒスタミン（ＨＩＳ）１００μＭ。培養物上清を収集し、そして８時間間隔で、同じアゴニスト添加物を含む新鮮培地のアリコートで置換した。処理後、８〜１６時間の処理間隔に対応する上清培地を収集し、ＩＬ−６について分析した。

Claims (48)

  1. 軟骨保護のための標的化薬物送達系であって、該送達系は、送達ビヒクルに含まれる複数の軟骨保護剤を含み、該送達ビヒクルは、関節内に存在する抗原決定基に特異的な抗体または抗体フラグメントに結合されており、該複数の軟骨保護剤は、少なくとも１つの同化性軟骨保護剤および少なくとも１つの軟骨異化インヒビターを含み、各々は、該複数の軟骨保護剤が、軟骨異化を阻害しかつ軟骨同化を促進するよう治療有効量で含まれる、標的化薬物送達系。
  2. 軟骨保護のための標的化薬物送達系であって、該送達系は、複数の軟骨保護剤を含み、該軟骨保護剤の少なくとも１つは、関節に標的化された送達ビヒクル内に含まれ、該複数の軟骨保護剤は、少なくとも１つの同化性軟骨保護剤および少なくとも１つの軟骨異化インヒビターを含み、該複数の軟骨保護剤の各々は、該複数の軟骨保護剤が、軟骨異化を阻害しかつ軟骨同化を促進するよう治療有効量で含まれる、標的化薬物送達系。
  3. 前記標的化送達ビヒクルが、前記関節内に存在する抗原決定基に特異的な抗体または抗体フラグメントに連結されている、請求項２に記載の標的化薬物送達系。
  4. 前記標的化された抗原決定基が、関節軟骨上または関節軟骨中に存在する、請求項３に記載の標的化薬物送達系。
  5. 前記標的化された抗原決定基が、関節軟骨のＩＩ型コラーゲン上に存在する、請求項４に記載の標的化薬物送達系。
  6. 前記標的化された抗原決定基が、軟骨コラーゲンまたは軟骨プロテオグリカン上に存在する、請求項３に記載の標的化薬物送達系。
  7. 前記標的化された抗原決定基が、ＩＩ型コラーゲンならびにＶ型、ＶＩ、型、ＩＸ型、Ｘ型、およびＸＩ型小コラーゲンを含む、コラーゲン；大凝集プロテオグリカン、アグレカン、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、およびルミカンを含む、プロテオグリカン；軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質、糖タンパク質３９；コンドロイチン硫酸プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカン；マクロファージ滑膜細胞および線維芽細胞滑膜細胞；ならびに軟骨細胞からなる群より選択される、細胞、分子、または構造上またはその中に見出される、請求項３に記載の標的化薬物送達系。
  8. 前記標的化された抗原決定基が、滑膜上または滑膜中に存在する、請求項３に記載の標的化薬物送達系。
  9. 前記標的化された抗原決定基が、関節軟骨の変性に関連するエピトープまたはネオエピトープである、請求項３に記載の標的化薬物送達系。
  10. 前記標的化されたエピトープまたはネオエピトープが、変形性関節症、慢性関節リウマチ、または他の変性関節疾患と診断された患者において、関節軟骨の表層に免疫局在化される、請求項９に記載の標的化薬物送達系。
  11. 前記標的化された抗原決定基が、関節軟骨のＩＩ型コラーゲンまたはＩＩ型コラーゲンフラグメント上のネオエピトープである、請求項９に記載の標的化薬物送達系。
  12. 前記標的化されたネオエピトープが、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、およびＭＭＰ−１３ならびにＭＭＰファミリーの他のメンバーからなる群より選択される酵素の個々の作用またはそれらの組み合わせ作用により生成される切断部位に免疫局在化される、請求項１１に記載の標的化薬物送達系。
  13. 前記標的化されたエピトープまたはネオエピトープが、関節軟骨のアグレカン、バイグリカン、またはデコリン上に存在する、請求項９に記載の標的化薬物送達系。
  14. 前記標的化されたエピトープまたはネオエピトープが、関節軟骨のアグレカンまたはアグレカンフラグメント上に存在する、請求項９に記載の標的化薬物送達系。
  15. 前記標的化されたネオエピトープが、トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）ファミリーおよび／またはＭＭＰファミリーからなる群に属する酵素の作用により生成される切断部位に免疫局在化される、請求項１４に記載の標的化薬物送達系。
  16. 前記標的化されたネオエピトープが、ＡＤＡＭＴＳ−４酵素および／またはＡＤＡＭＴＳ−５／１１酵素の個々の作用または組み合わせた作用により生成される切断部位に免疫局在化される、請求項１５に記載の標的化薬物送達系。
  17. 前記標的化抗体または抗体フラグメントが、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒトモノクローナル抗体である、請求項３に記載の標的化薬物送達系。
  18. 前記同化性軟骨保護剤が、前記標的化送達ビヒクル中に含まれる、請求項２に記載の標的化薬物送達系。
  19. 前記同化性軟骨保護剤が、軟骨同化を促進するインターロイキン（ＩＬ）アゴニスト、軟骨同化を促進するトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーのメンバー（ＴＧＦ−βアゴニストおよび骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）アゴニストを含む）、軟骨同化を促進するインシュリン様増殖因子、ならびに軟骨同化を促進する線維芽細胞増殖因子からなる群より選択される、請求項２に記載の標的化薬物送達系。
  20. 前記同化性軟骨保護剤が、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦ、ならびに天然に存在する薬剤の生物学的特徴を保持するフラグメント、欠失体、付加体、アミノ酸置換体、変異体、および改変体からなる群より選択される、請求項２に記載の標的化薬物送達系。
  21. 前記同化性軟骨保護剤が、軟骨同化を促進するトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーのメンバー（ＴＧＦ−βアゴニストおよび骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）アゴニスト）；軟骨同化を促進するインシュリン様増殖因子；ならびに軟骨同化を促進する線維芽細胞増殖因子からなる群より選択される、請求項２に記載の標的化薬物送達系。
  22. 前記軟骨異化インヒビターが、前記標的化送達ビヒクル中に含まれる、請求項２に記載の標的化薬物送達系。
  23. 前記軟骨異化インヒビターが、軟骨異化を阻害するＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、軟骨異化を阻害するＴＮＦ−αレセプターアンタゴニスト、軟骨異化を阻害するシクロオキシゲナーゼ−２特異的インヒビター、軟骨異化を阻害するＭＡＰキナーゼインヒビター、軟骨異化を阻害する一酸化窒素シンターゼインヒビター、および軟骨異化を阻害する核因子κＢインヒビターからなる群より選択される、請求項２に記載の標的化薬物送達系。
  24. 前記軟骨異化インヒビターが、軟骨異化を阻害するマトリクスメタロプロテイナーゼインヒビター；軟骨異化を阻害する細胞接着分子（インテグリンアゴニストおよびインテグリンアンタゴニストを含む）；軟骨異化を阻害する細胞内シグナル伝達インヒビター（プロテインキナーゼＣインヒビターおよびプロテインチロシンキナーゼインヒビターを含む）；ならびに軟骨異化を阻害するＳＨ２ドメインインヒビターからなる群より選択される、請求項２に記載の標的化薬物送達系。
  25. 前記軟骨異化インヒビターが、軟骨異化を阻害するＩＬ−１レセプターアンタゴニストおよび軟骨異化を阻害するＴＮＦ−αレセプターアンタゴニストから選択される薬剤を含む、請求項２に記載の標的化薬物送達系。
  26. 前記同化性軟骨保護剤および軟骨異化インヒビターの各々が、タンパク質を含む、請求項２に記載の標的化薬物送達系。
  27. 前記同化性軟骨保護剤および軟骨異化インヒビターの両方が、標的化送達ビヒクル中に含まれる、請求項２に記載の標的化薬物送達系。
  28. 前記標的化薬物送達系が、複数の標的化送達ビヒクルを含み、ここで、前記同化性軟骨保護剤および軟骨異化インヒビターが、それぞれ、該複数の標的化送達ビヒクルの第１および第２のビヒクル中に別々に含まれる、請求項２に記載の標的化薬物送達系。
  29. 前記第１および第２の標的化送達ビヒクルが、含まれる前記同化性軟骨保護剤および軟骨異化インヒビターについて一時的に異なる放出速度を生じるよう選択される、請求項２８に記載の標的化薬物送達系。
  30. 前記標的化送達ビヒクルが、標的化免疫粒子を含む、請求項２に記載の標的化薬物送達系。
  31. 前記標的化免疫粒子がナノ粒子を含む、請求項３０に記載の標的化薬物送達系。
  32. 前記ナノ粒子が、５ナノメートル〜７５０ナノメートルの範囲の直径を有する、請求項３１に記載の標的化薬物送達系。
  33. 前記ナノ粒子が、１０ナノメートル〜５００ナノメートルの範囲の直径を有する、請求項３１に記載の標的化薬物送達系。
  34. 前記ナノ粒子が、２０ナノメートル〜２００ナノメートルの範囲の直径を有する、請求項３１に記載の標的化薬物送達系。
  35. 前記ナノ粒子が、ヒアルロナン、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、アルギネート、ポリ乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、およびＰＬＧＡからなる群より選択されるポリマーから形成される、請求項３１に記載の標的化薬物送達系。
  36. 前記ナノ粒子が、１日〜４週にわたる、前記軟骨保護剤の持続性放出を提供する、請求項３１に記載の標的化薬物送達系。
  37. 静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、または吸入投与に適したキャリアをさらに含む、請求項２に記載の標的化薬物送達系。
  38. １つ以上のさらなる治療剤をさらに含む、請求項２に記載の標的化薬物送達系。
  39. １つ以上の疼痛阻害剤または炎症阻害剤をさらに含む、請求項２に記載の標的化薬物送達系。
  40. 前記疼痛阻害剤または炎症阻害剤が、セロトニンレセプターアンタゴニスト、セロトニンレセプターアゴニスト、ヒスタミンレセプターアンタゴニスト、ブラジキニンレセプターアンタゴニスト、カリクレインインヒビター、タキキニンレセプターアンタゴニスト、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）レセプターアンタゴニスト、インターロイキンレセプターアンタゴニスト、アラキドン酸代謝合成経路において活性な酵素のインヒビター、プロスタノイドレセプターアンタゴニスト、ロイコトリエンレセプターアンタゴニスト、オピオイドレセプターアゴニスト、プリノセプターアゴニストおよびアンタゴニスト、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）感受性カリウムチャネルオープナー、ならびにカルシウムチャネルアンタゴニストからなる群より選択される、請求項３９に記載の標的化薬物送達系。
  41. 軟骨保護のための標的化薬物送達系であって、該送達系は、複数の軟骨保護剤を含み、該軟骨保護剤の少なくとも１つは、硝子軟骨の分子、細胞、または構造に標的化された送達ビヒクル内に含まれ、該複数の軟骨保護剤は、少なくとも１つの同化性軟骨保護剤および少なくとも１つの軟骨異化インヒビターを含み、該複数の軟骨保護剤の各々は、該複数の軟骨保護剤が、軟骨異化を阻害しかつ軟骨同化を促進するよう治療有効量で含まれる、標的化薬物送達系。
  42. 軟骨保護のための標的化薬物送達系であって、該送達系は、治療有効量の少なくとも１つの軟骨保護剤を含み、該軟骨保護剤は、同化性軟骨保護剤または軟骨異化インヒビターであり、関節中に存在する抗原決定基に特異的な抗体または抗体フラグメントに結合された標的化免疫粒子中に含まれる、標的化薬物送達系。
  43. 軟骨保護のための標的化薬物送達系であって、該送達系は、関節に標的化された送達ビヒクル中に含まれる治療有効量の同化性軟骨保護剤を含む、標的化薬物送達系。
  44. 軟骨保護のための標的化薬物送達系であって、該送達系は、硝子軟骨の分子、細胞、または構造に標的化された送達ビヒクル中に含まれる治療有効量の同化性軟骨保護剤を含む、標的化薬物送達系。
  45. 患者の軟骨を保護する方法であって、該方法は、標的化薬物送達系を、それを必要とする患者に送達する工程を包含し、該送達系は、送達ビヒクルに含まれる複数の軟骨保護剤を含み、該送達ビヒクルは、関節内に存在する抗原決定基に特異的な抗体または抗体フラグメントに結合されており、該複数の軟骨保護剤は、少なくとも１つの同化性軟骨保護剤および少なくとも１つの軟骨異化インヒビターを含み、各々は、該複数の軟骨保護剤が、軟骨異化を阻害しかつ軟骨同化を促進するよう治療有効量で含まれる、方法。
  46. 患者の軟骨を保護する方法であって、該方法は、複数の軟骨保護剤を、それを必要とする患者に同時に投与する工程を包含し、ここで、該軟骨保護剤の少なくとも１つは、関節に標的化された送達ビヒクル内に含まれ、該複数の軟骨保護剤は、少なくとも１つの同化性軟骨保護剤および少なくとも１つの軟骨異化インヒビターを含み、該複数の軟骨保護剤の各々は、該複数の軟骨保護剤が、軟骨異化を阻害しかつ軟骨同化を促進するよう治療有効量で含まれる、方法。
  47. 患者の軟骨を保護する方法であって、該方法は、複数の軟骨保護剤を、それを必要とする患者に同時に投与する工程を包含し、ここで、該軟骨保護剤の少なくとも１つは、関節軟骨の変性に関連するネオエピトープに標的化された送達ビヒクル内に含まれ、該複数の軟骨保護剤は、少なくとも１つの同化性軟骨保護剤および少なくとも１つの軟骨異化インヒビターを含み、該複数の軟骨保護剤の各々は、該複数の軟骨保護剤が、軟骨異化を阻害しかつ軟骨同化を促進するよう治療有効量で含まれる、方法。
  48. 患者の軟骨を保護する方法であって、該方法は、複数の軟骨保護剤を、それを必要とする患者に同時に投与する工程を包含し、ここで、該軟骨保護剤の少なくとも１つは、硝子軟骨の分子、細胞、または構造に標的化された送達ビヒクル内に含まれ、該複数の軟骨保護剤は、少なくとも１つの同化性軟骨保護剤および少なくとも１つの軟骨異化インヒビターを含み、該複数の軟骨保護剤の各々は、該複数の軟骨保護剤が、軟骨異化を阻害しかつ軟骨同化を促進するよう治療有効量で含まれる、方法。
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