MXPA04007124A - Composiciones y metodos para la inhibicion sistemica de la degradacion del cartilago. - Google Patents

Composiciones y metodos para la inhibicion sistemica de la degradacion del cartilago.

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Abstract

Se describen metodos y composiciones para inhibir la degradacion del cartilago articular. Preferiblemente, las composiciones incluyen multiples agentes condroprotectores incluyendo al menos un agente que promueva la actividad anabolica en el cartilago y al menos un agente que inhiba el catabolismo del cartilago. Las composiciones tambien pueden incluir uno o mas agentes inhibidores del dolor e inflamacion. Las composiciones pueden administrarse sistemicamente para el tratamiento de pacientes con riesgo de degradacion del cartilago en diversas articulaciones y en forma adecuada, se pueden formular en un portador o vehiculo de administracion que tenga como objetivo las articulaciones. Alternativamente, las composiciones pueden inyectarse o infundirse directamente en la articulacion.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA LA INHIBICIÓN SISTEMICA DE LA DEGRADACIÓN DEL CARTÍLAGO REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica prioridad a partir de la Solicitud Provisional de EE.UU. Núm. 60/353,552, presentada el Io de febrero de 2002 y es una continuación en parte de la Solicitud de EE.UU. No. 10/031,546 presentado el 18 de enero de 2002, que es una fase nacional EE.UU. de la Solicitud Internacional Núm. PCT/USOO/19864 presentada el 21 de julio de 2000 que designa a los Estados Unidos y reivindica prioridad a partir de la Solicitud Internacional de EE.UU. Núm. 60/144,904, presentada el 21 de julio de 1999 y también es una continuación en parte de la Solicitud de EE.UU. Núm. 09/839,633 presentada el 20 de abril de 2001, que es una continuación en parte de la Solicitud Internacional Núm. PCT/US99/26330 presentada el 5 de noviembre de 1999 que designa a los Estados Unidos, y reivindica prioridad a partir de la Solicitud Provisional de EE.UU. Núm. 60/107,256 presentada el 5 de noviembre de 1998 y de la Solicitud Internacional Núm. PCT/US99/24625 presentada el 20 de octubre de 1999 que designa a los Estados Unidos, que reivindica prioridad a partir de la Solicitud provisional de EE.UU. Núm. 60/105,026 presentada el 20 de octubre de 1998, los beneficios de prioridad se reivindican en la presente bajo las Secciones 35 del USC 119(e) y 120.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos y composiciones terapéuticos para la protección de cartílago articular .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades y estados que causan la destrucción dentro de las articulaciones presenta un peligro significativo de salud pública, particularmente en vista de la demografía de la población de edad cada vez mayor. El cartílago articular de la articulación representa un sistema complejo de varias moléculas diferentes. Están involucrados una multiplicidad de mecanismos en la degradación del cartílago articular en artritis, como la artritis reumatoide (RA por sus siglas en inglés) y osteoartritis (OA por sus siglas en inglés) . La OA, una artritis no inflamatoria, es la forma más común de enfermedad de la articulación sólo después de la enfermedad cardiovascular como causa de incapacidad y cesación temprana. Algunas personas muestran OA en una sola o una cantidad limitada de articulaciones como puede ser debido a una lesión traumática por accidente o cirugía. Varias personas más sufren de OA en varias articulaciones debido al desgaste y desgarre asociados con el envejecimiento o una actividad atlética u ocupacional durante un período prolongado de tiempo. La RA es la forma más común de artritis inflamatoria, que afecta al 3% de las mujeres y 1% de los hOmbxe-s^ ta~^ayurTa~~ e ro"s^p~a~c±"ent~e~s—ccrr-RA-tienen—síntomas en varias articulaciones, especialmente las pequeñas articulaciones de la mano, los codos, las muñecas y los hombros . La destrucción del cartílago articular hialino es el sello distintivo de OA y RA incapacitante. Aunque diversos métodos terapéuticos pueden proporcionar alivio de los síntomas, no hay un programa terapéutico que haya probado retardar la progresión de la degradación del cartílago articular. El deterioro progresivo y pérdida de cartílago articular conlleva a una disfunción irreversible del movimiento de la articulación. Estos cambios en el cartílago son los eventos patogénicos fundamentales que son comunes a la osteoartritis (OA) y artritis reumatoide (RA) . Los procesos destructores del cartílago también pueden estar asociados con o ser iniciados por procedimientos quirúrgicos de la articulación. La artroscopía es un procedimiento quirúrgico en donde una cámara, unida a una fuente de luz remota y un monitor de video, se inserta en una articulación anatómica (por ejemplo, rodilla, hombro, etc.) a través de una pequeña incisión portal en la piel subyacente y en la cápsula de la articulación. A través de varias incisiones portales, los instrumentos quirúrgicos pueden colocarse en la articulación, y su uso ser guiado mediante una visualización artroscópica . Conforme han mejorado las destrezas de los artroscopistas, una cantidad cada vez mayor de procedimientos operatorios, una vez llevados a cabo mediante una técn ca qu±rnrg± . "B¾ire~rt¾~'' pueden ahora llevarse a cabo artroscópicamente . Por ejemplo, estos procedimientos incluyen meniscectomías parciales y reconstrucciones de ligamentos en la rodilla, arcromioplastías de hombro y debridamientos de los gemelos rotatorios y sinovectomías del codo. Como resultado de las indicaciones quirúrgicas cada vez más amplias y el desarrollo de artroscopios de pequeño diámetro, las artroscopías de la muñeca y tobillo también se han vuelto rutinarias. Durante cada artroscopía, se lava continuamente a través de la articulación un fluido fisiológico de irrigación (por ejemplo, solución salina normal o solución de Ringer lactosada) , dilatando o distendiendo la cápsula articular y retirando los restos de la operación, proporcionando así una visualización intraarticular más clara. La Patente de EE.UU. Núm. 4,504,493 por Marshall describe una solución isomolar de glicerol en agua para una solución de irrigación no conductiva y ópticamente clara para la artroscopía. Los fluidos fisiológicos de irrigación convencionales no proporcionan efectos analgésicos, antiinflamatorios o antidegradantes del cartílago.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos y composiciones para reducir o prevenir la destrucción de cartílago articular en una articulación, mediante la administración de una combinación de dos o más agentes cOmdTOprot'e'cIroxes me1ra1oó~i:ameTit~e arct~ivOS~. Los agentes metabólicamente activos incluyen, entre otros, compuestos que actúan directa o indirectamente para regular o alterar el estado biológico, bioquímico o biofísico de una célula, incluyendo agentes que alteran el potencial eléctrico de la membrana plasmática, la actividad enzimática o unión del ligando de los receptores celulares, enzimas intracelularmente o extracelularmente ubicadas, interacciones proteína-proteina, interacciones ARN-proteína o interacciones ADN-proteína . En un aspecto de la presente invención, las composiciones farmacéuticas de los agentes condroprotectores metabólicamente activos se proporcionan basándose en una combinación de al menos dos agentes que actúan simultáneamente en objetivos moleculares distintos. Los agentes condroprotectores representativos incluyen, por ejemplo: (1) antagonistas de receptores de la familia interleucina-1 de proteínas, incluyendo por ejemplo, IL-?ß, IL-17 e IL-18; (2) antagonistas de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) , incluyendo por ejemplo, TNF-Rl; (3) agonistas de los receptores de interleucina 4, 10 y 13; (4) agonistas para la superfamilia de receptores TGF-ß, incluyendo por ejemplo, BMP-2, B P-4 y BMP-7; (5) inhibidores de COX-2; (6) inhibidores de la familia MAP cinasa, incluyendo por ejemplo, p38 MAP cinasa; (7) inhibidores de la familia de proteínas de metaloproteinasas de matriz (MMP) , incluyendo por ejemplo, MMP-3 y M P-9; (8) inhibidores de la familia de proteínas NF-??G, i~n~crluyendo por e~j~eTnp~Xo~; el complejo de dimeros p5U7p¾"5" con ???; (9) inhibidores de la familia de óxido nítrico sintasa (NOS) , incluyendo por ejemplo, iNOS; (10) agonistas y antagonistas de receptores de integrina, incluyendo por ejemplo, agonistas de integrina a?ß3; (11) inhibidores de la proteína cinasa C (PKC); (12) inhibidores de la familia de la proteína tirosina cinasa, incluyendo por ejemplo, la subfamilia src; (13) reguladores de la proteína tirosina fosfatasa; y (14) inhibidores de los dominios de homología 2 de la proteína src (SH2) . Los agentes condroprotectores adicionales incluyen otros factores de crecimiento y que a manera de ejemplo incluyen los factores de crecimiento similares a la insulina (por ejemplo, IGF-1) y factores de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, bFGF) . En una modalidad preferida, al menos un agente es una citocina o un agonista del receptor del factor de crecimiento que proporciona directamente actividad antiinflamatoria y/o promueve los procesos anabólicos del cartílago, que también se llama en la presente "agente anabólico" y al menos un segundo agente es antagonista del receptor o un inhibidor enzimático que actúa para inhibir los procesos catabólicos del cartílago y que también puede inhibir los procesos proinflamatorios, y también se llama en la presente un "inhibidor del catabolismo del cartílago" o "agente inhibitorio del catabolismo". Como se utiliza en la presente, el término "agentes condroprotectores" pretende incluir tanto agentes anabólicos como inhibidores del ea-ta-bol-i-síne—del—eartí-l-a-go-; ' En esta modalidad de la invención, al menos un primer agente condroprotector es una citocina antiinflamatoria/anabólica, que actúa funcionalmente para suprimir la función de citocinas proinflamatorias en la articulación, promover la síntesis de la matriz cartilaginosa e inhibir la degradación de la matriz. Estos agonistas del receptor incluyen, por ejemplo, citocinas anabólicas y antiinflamatorias específicas, como los agonistas de interleucina (IL) (por ejemplo, IL-4, IL-10 e IL-13) y miembros específicos de la superfamilia del factor transformante de crecimiento ß (por ejemplo, TGFP y BMP-7), factores de crecimiento similares a la insulina (por ejemplo, IGF-1) y factores de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, bFGF) . Al menos un segundo agente condroprotector se extrae a partir de una clase de inhibidores catabólicos de cartílago que incluyen los antagonistas de receptor o inhibidores enzimáticos que actúan para inhibir y reducir la actividad o expresión de un objetivo molecular proinflamatorio (por ejemplo, los antagonistas del receptor IL-1, antagonistas del receptor TNF-a, inhibidores de la ciclooxigenasa-2, inhibidores de MAP cinasa, inhibidores de óxido nítrico sintasa (NOS) e inhibidores del factor nuclear kappaB (NFKB) ) . El segundo agente condroprotector también puede seleccionarse a partir de inhibidores de las metaloproteinasas de matriz que inhiben el catabolismo del cartílago, moléculas de adhesión celular incluyendo agonistas de—i- teg-r-i-n-a—y—a-n-tra-g n-i-s-t-a-s—d —ír exjT±narr—gire—Í7Th~ib~eñ— T catabolismo del cartílago, inhibidores de la señalización intracelular, incluyendo inhibidores de proteína cinasa C e inhibidores de la proteína tirosina cinasa, que inhiben el catabolismo de cartílago e inhibidores de los dominios SH2 que inhiben el catabolismo del cartílago. El cartílago articular es una matriz extracelular especializada que se produce y mantiene mediante condrocitos articulares metabólicamente activos. El mantenimiento de una matriz extracelular normal y sana refleja un balance dinámico entre la velocidad de biosíntesis y la incorporación de componentes de la matriz y la velocidad de su degradación y pérdida subsecuente al cartílago en el fluido sinovial. Aunque los mecanismos reguladores que subyacen en la homeostasis de la matriz no se entienden bien, son claramente alterados en las enfermedades inflamatorias de la articulación y en respuesta a n trauma articular de manera que la velocidad de la degradación de la matriz excede la velocidad de la nueva síntesis de los componentes de la matriz. La homeostasis de matriz generalmente se considera como representante de un balance dinámico entre los efectos de citocinas catabólicas y citocinas anabólicas (incluyendo factores de crecimiento) . La combinación óptima de agentes terapéuticos útiles para la protección del cartílago cambia el equilibrio dinámico de la matriz acelerando la velocidad de síntesis e inhibiendo simultáneamente la velocidad de la degradación, maximizando así los procesos anabólicos y p-r-eme-v-ienéo—a—r-epa-r-acl-ón-; Las citocinas catabólicas, como IL-?ß y TNF-oc actúan en receptores específicos sobre los condrocitos para inducir la producción de MMP que induce la degradación de matriz mientras que la degradación se inhibe por citocinas anabólicas como TGF- ß, BMP-2 e IGF-1. Por lo tanto, un método terapéutico que está basado solo en la inhibición de los procesos catabólicos (como la combinación de un inhibidor MMP y un antagonista IL-1) no es óptimo para la reparación del cartílago ya que los agentes anabólicos son necesarios para inducir o acelerar la biosíntesis y ensamble de componentes para la producción de matriz. En segunda, la multiplicidad de citocinas catabólicas (IL-1, TNF, IL-17, IL-18, LIF) que contribuyen a la destrucción de la matriz cartilaginosa indican que no es práctico bloquear toda la actividad de citocinas catabólicas. Inversamente, un método que esté basado únicamente en el uso de agentes anabólicos, como IGF-1, BMP-2 ó BMP-7 no es óptimo ya que no se ocupa de la función contraregulatoria de las citocinas catabólicas. También las TGF-ß, BMP-2 y IGF-1 actúan en receptores específicos para inducir los condrocitos a que produzcan componentes de matriz, que se inhiben mediante IL-?ß, TNF-a, IL-17 y LIF. Por lo tanto, la combinación terapéutica óptima para la condroproteccion esta compuesto de al menos un agente anabólico y un inhibidor del catabolismo del cartílago. En un aspecto de la presente invención, se administra una diversidad de agentes condroprotectores medxaTrtre ru a- sl~s~t~émTcra a un placiente con riesgo de degradación de cartílago articular. La diversidad de agentes que se administran sxstémicamente incluyen al menos un agente que promueve la actividad anabólica del cartílago y al menos un agente que inhibe el catabolismo del cartílago. Cada agente está incluido en una cantidad suficiente para proporcionar una combinación que sea terapéuticamente efectiva cuando la solución se suministra en la articulación de un paciente tanto para inhibir los procesos catabólicos del cartílago como para promover los procesos anabólicos del mismo. Además, uno o más agentes que actúan para inhibir el dolor y/o inflamación pueden administrarse junto con los agentes condroprotectores . La administración sistémica de la diversidad de agentes condroprotectores puede preferirse cuando un paciente se encuentra en riesgo de degradación de cartílago o sufre de enfermedad degenerativa simultáneamente en varias articulaciones. A fin de minimizar los efectos sistémicos adversos o indeseados, en un aspecto de una modalidad que se suministra sistémicamente de la invención, una estrategia terapéutica es suministrar la combinación de agentes en un portador o vehículo de administración que tenga como objetivo la articulación. En una modalidad con objetivo preferida, al menos el agente condroprotector anabólico y/o al menos un agente condroprotector inhibitorio del catabolismo y preferiblemente tanto el agente condroprotector anabólico como el inhibitorio del catabolismo pueden encapsularse den^-r-o— ée—un—veh-árctio— de— admx TStxa'CT Ti-ncOTnO-una nanoesfera .
Un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo con especificidad de objetivo se acoplan con la nanoesfera. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo es especifico para una determinante antigénica con especificidad de objetivo que está ubicada dentro de la articulación. Un método terapéutico de la presente invención incluye administrar sistémicamente esta composición encapsulada con especificidad de objetivo de uno o más agentes condroprotectores a un paciente con riesgo de degradación de cartílago, preferiblemente mediante administración intravascular , intramuscular, subcutánea o de inhalación . En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan composiciones para la administración sistémica que incluyen una pluralidad de agentes condroprotectores que incluyen al menos un agente que promueva la actividad anabólica del cartílago y al menos un agente que inhiba el catabolismo del cartílago. Además, uno o más agentes que actúan para inhibir el dolor/inflamación pueden incluirse en las composiciones. Todos los agentes incluyen una dosis suficiente para proporcionar el efecto terapéutico protector del cartílago en la articulación o articulaciones cuando se administra sistémicamente. También se proporcionan métodos de elaboración del medicamento que incluyen esta composición para usarse en el tratamiento de un paciente con riesgo de degradación del cartílago. Con el fin de apuntar estas composiciones s-i-s-tém-i-eamen-t-e—admi-n-i-s -rada-s—a-—ta—axt±"cul~a"c±¾TT7 al menos un agente condroprotector anabólico y/o al menos un agente condroprotector inhibitorio del catabolismo, y preferiblemente tanto el agente condroprotector inhibitorio del catabolismo como el agente condroprotector anabólico, se encapsulan dentro de un vehículo de administración, tal como una nanoesfera, a la cual se acopla a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que sea específico para una determinante antigénica que se ubica dentro de la articulación. También se proporciona un método para elaborar este medicamento que incluye (un) agente (s) condroprotector (es) encapsulado (s) acoplado (s) a un anticuerpo o fragmento del mismo, este anticuerpo o fragmento del mismo se apunta con especificidad de objetivo hacia una determinante antigénica que esté ubicada dentro de la articulación, para usarse en el tratamiento de un paciente con riesgo de degradación del cartílago. En un aspecto diferente de la invención, se puede preparar una composición que incluye uno o preferiblemente varios agentes condroprotectores metabólicamente activos junto con uno o más agentes para inhibir el dolor, inflamación o lo similar o con mayor preferencia una combinación de agentes múltiples de agentes anabólicos e inhibidores del catabolismo, en un portador farmacéuticamente efectivo, para la administración intraarticular directamente en la articulación del paciente. Aunque la administración sistémica de las composiciones condroprotectoras de la presente—m-vencró —puede—ser—preferi-da—parra enfermedades o estados que afectan múltiples articulaciones, la administración local de las composiciones de la presente invención puede preferirse en otros casos. Estos casos pueden incluir el tratamiento de pacientes con estados o enfermedades degenerativas del cartílago que afectan solamente una sola o una cantidad limitada de articulaciones, la administración del procedimiento asociada con un procedimiento operativo o de intervención en una articulación o en casos cuando los efectos secundarios indeseables pueden estar asociados con la administración sistémica. En este aspecto de administración local de la invención, estas composiciones se administran localmente mediante inyección intraarticular (incluyendo para el tratamiento de enfermedades degenerativas del cartílago como la osteoartritis o artritis reumatoide) o por medio de infusión, incluyendo la administración fuera del procedimiento (es decir, preoperatoriamente y/o intraoperatoriamente y/o postoperatoriamente) durante los procedimientos artroscópicos quirúrgicos . Este aspecto de administración local de la presente invención proporciona una solución que constituye una mezcla de múltiples agentes a bajas concentraciones dirigidos para inhibir localmente los mediadores del dolor, inflamación y degradación del cartílago en un fluido portador de electrolitos fisiológicos. La invención también proporciona un método para administrar perioperatoriamente la solución de tr-r-ig-a-ei-éfi—q¾e—eont-rerre—estros—a-geTrtre~s—drrerrtamente eñ eT sitio quirúrgico, donde trabaja localmente a niveles enzimáticos y de receptores para limitar "preagotadoramente" el dolor, inflamación y degradación del cartílago en el sitio. Debido al método de administración local perioperatoria de la presente invención, se puede lograr un efecto terapéutico deseado con dosis más bajas de agentes que los que serían necesarios cuando se emplean otros métodos de administración (es decir, intravenosa, intramuscular, subcutánea y oral) . Los agentes contra el dolor y/o contra la inflamación y/o contra la degradación del cartílago en la solución incluyen agentes seleccionados a partir de múltiples cases de antagonistas y agonistas de receptores y activadores e inhibidores enzimáticos, cada clase actúa mediante un mecanismo de acción molecular diferente contra el dolor y/o inhibición de la inflamación y/o degradación del cartílago. Además de los agentes antidegradantes del cartílago, las composiciones de las invenciones pueden incluir agentes analgésicos y/o antiinflamatorios. Los agentes representativos para la inhibición del dolor y/o inflamación incluyen, por ejemplo: (1) antagonistas del receptor de serotonina; (2) agonistas del receptor de serotonina; (3) antagonistas del receptor de histamina; (4) antagonistas del receptor de bradicinina; (5) inhibidores de calicreína; (6) antagonistas del receptor de taquicinina, incluyendo antagonistas para el subtipo de receptores de netrroci-nl-n-ai y n-e TO'c±n-i 'a ,—<t! —ant:a~comrs"ta~s—de~l receptor deT péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) ; (8) antagonistas del receptor de interleucina; (9) inhibidores de enzimas activas en la via sintética para los metabolitos del ácido araquidónico, incluyendo (a) inhibidores de fosfolipasa, incluyendo inhibidores de la isoforma PLA2 e inhibidores de la isoforma PLC, (b) inhibidores de ciclooxigenasa y (c) inhibidores de lipooxigenasa; (10) antagonistas del receptor de prostanoide incluyendo antagonistas para el receptor eicosanoide subtipo EP-1 y EP-4 y antagonistas para el receptor del subtipo tromboxano; (11) antagonistas del receptor de leucotrieno incluyendo antagonistas del receptor de leucotrieno subtipo B4 y antagonistas para el receptor de leucotrieno subtipo D4; (12) agonistas para el receptor opioide, incluyendo agonistas para los receptores subtipo µ-opioide, d-opioide y ?-opioide; (13) antagonistas de purinoceptores incluyendo antagonistas del receptor ?2? y antagonistas del receptor P2Y; y (14) antagonistas de los canales de calcio. Cada uno de los agentes anteriores funciona ya sea como un agente antiinflamatorio y/o como un agente antinociceptor (es decir, analgésico) . La selección de agentes de estas clases de compuestos está hecha a la medida para esta solicitud en particular . La presente invención también proporciona un método para elaborar un medicamento compuesto en un aspecto de la invención como una solución diluida para irrigación para uso evr^a~ T±qac±ÓTr-corrtxnua-de±-s-rt±o--de—opera-c ón^—normal-mente" en el sitio de una articulación del paciente, durante un procedimiento de operación artroscópica . En esta modalidad de la invención de administración local, el método implica disolver en un fluido portador de electrolitos fisiológicos al menos un agente antidegradante del cartílago y preferiblemente uno o más agentes analgésicos/antiinflamatorios y para algunas aplicaciones agentes antidegradantes del cartílago, cada agente se incluye a una concentración preferiblemente no mayor que aproximadamente 100,000 nanomolar, con mayor preferencia no mayor que aproximadamente 25,000 nanomolar y más preferiblemente no mayor que aproximadamente 10,000 nanomolar . Un método del aspecto de administración local de la presente invención proporciona la administración de una combinación diluida de múltiples agonistas y antagonistas de receptores e inhibidores enzimáticos y activadores enzimáticos directamente en una lesión o sitio de operación, durante el procedimiento de diagnóstico o terapéuticos para la inhibición de degradación del cartílago, dolor y/o inflamación. Ya que los ingredientes activos en la solución se aplican localmente directamente en los tejidos operados en forma continua, los fármacos pueden utilizarse de manera eficaz en dosis extremadamente bajas en relación con aquellas dosis requeridas para el efecto terapéutico cuando los mismos fármacos se administran oralmente, intramuscularmente, presente, el término "local" abarca la aplicación de un fármaco en y alrededor de una lesión u otro sitio de operación y excluye la administración oral, subcutánea, intravenosa e intramuscular. El término "continua" como se utiliza en la presente, abarca la aplicación no interrumpida, y repetida a intervalos frecuentes y aplicaciones que son ininterrumpidas excepto por breves periodos como al permitir la introducción de otros fármacos o agentes o equipo del procedimiento quirúrgico, de manera que la concentración constante y predeterminada se mantiene localmente en la lesión o sitio de operación. Las ventajas de las aplicaciones a bajas dosis de agentes de conformidad con este aspecto de la invención son tres. La más importante es la ausencia de efectos secundarios sistémicos que comúnmente limitan la utilidad de estos agentes. Además, los agentes seleccionados para las aplicaciones particulares en las soluciones de la presente invención son altamente específicos con respecto a los mediadores y los objetivos de mediación sobre los cuáles tienen su efecto. Esta especificidad se mantiene debido a las bajas dosis utilizadas. Finalmente, el costo de estos agentes activos por procedimiento es bajo. Las ventajas de la administración local de los agentes por medio de irrigación u otra aplicación de fluidos de conformidad con este aspecto de la invención son las siguientes: (1) la administración local garantiza una eoneen-^a^-rón—conO-cida—en-e —s±t±o~"abyelrivcr s~rn importar la variabilidad entre pacientes del metabolismo, flujo sanguíneo, etc.; (2) debido al modo directo de administración, se obtiene una concentración terapéutica de manera instantánea y de esta manera, se proporciona un mejor control de la dosis y (3) la administración local de los agentes activos directamente en la lesión o sitio de operación también reduce sustancialmente la degradación de los agentes a través de los procesos sistémicos (por ejemplo, el metabolismo del primer paso y del segundo paso) que ocurriría si los agentes se administraran oralmente, intravenosamente, subcutáneamente o intramuscularmente . Esto es particularmente cierto para aquellos agentes activos que son proteínas y péptidos, y que se metabolizan rápidamente. Por lo tanto, la administración local permite el uso de compuestos o agentes que de otra manera no podrían emplearse terapéuticamente. Por ejemplo, algunos agentes en las siguientes clases son peptídicos : antagonistas del receptor de bradicinina; antagonistas del receptor de taquicinina; agonistas del receptor opioide; antagonistas del receptor CGRP; y antagonistas del receptor de interleucina, antagonistas del receptor TNF; agonistas del receptor TGF-ß; agonistas de receptores BMP-2 y BMP-7; agonistas de receptores IL4, IL10 e IL-13; y agonistas y antagonistas del receptor de integrina. La administración continua y local en la lesión o sitio de operación minimiza la degradación o metabolismo del fármaco mientras que también proporciona el reemp±a-ZO—cont TraO—de—e-sa—pcrrc ón—del agente que pueda" degradarse para asegurar que una concentración terapéutica local, suficiente para mantener la saturación enzimática u ocupación del receptor se mantenga durante la duración del procedimiento quirúrgico. La administración local de la solución en forma perioperativa durante un procedimiento quirúrgico de conformidad con este aspecto de la presente invención produce un efecto preventivo analgésico, antiinflamatorio y protector del cartílago. Como se utiliza en la presente, el término "perioperativo" abarca la aplicación intraprocedural, pre e intraprocedural , intra y postprocedural y pre, intra y postprocedural . Para maximizar los efectos preventivos antiinflamatorios, analgésicos (para ciertas aplicaciones) y protectores del cartílago (para ciertas aplicaciones) , las soluciones de la presente invención se aplican con mayor preferencia pre, intra y postoperativamente . Al ocupar los receptores objetivo o inactivar o activar las enzimas con especificidad de objetivo antes del inicio de un trauma operatorio local significativo, los agentes de la presente solución regulan las vías específicas para inhibir preventivamente los procesos patológicos con especificidad de objetivo. Si los procesos y mediadores inflamatorios se inhiben preventivamente de conformidad con la presente invención antes de que puedan ejercer daño al tejido, el beneficio es más sustancial que si se administran después de que se haya iniciado el daño. Era—innlTrifc±c"£ Ti de más o¾ un medxador de! dolor, inflamación o degradación del cartílago mediante la aplicación de soluciones de múltiples agentes de la presente invención ha demostrado reducir dramáticamente el grado de inflamación y dolor y teóricamente puede proporcionar un efecto protector del cartílago. Las soluciones de irrigación de la presente invención incluyen combinaciones de fármaco, cada solución actúa sobre múltiples receptores o enzimas. Los agentes del fármaco son por lo tanto simultáneamente efectivos contra una combinación de procesos patológicos incluyendo dolor e inflamación y pérdida de la homeostasis cartilaginosa. La acción de estos agentes se considera sinérgica ya que los múltiples antagonistas de receptores y agonistas inhibitorios de la presente proporcionan una eficacia desproporcionadamente mejorada en forma combinada en relación con la eficacia de los agentes individuales. La acción sinérgica de varios de estos agentes de la presente invención se menciona a continuación a manera de ejemplo. Utilizada en forma perioperativa, la solución dará como resultado una disminución clínicamente significativa del dolor e inflamación en el sitio de operación y de la degradación del cartílago, con respecto a los fluidos de irrigación actualmente utilizados, disminuyendo así el requerimiento analgésico postoperativo del paciente (es decir, opiatos) y cuando sea apropiado, permitir una movilización más temprana del paciente del sitio de operación. No se requiere ningún esfuerzo extra por parte del cirujano y-p"ersorra~l— auxiliar en Ta sala de operaciones para el uso de la presente solución en relación con los fluidos convencionales de irrigación. Para una condroprotección óptima de conformidad con este aspecto de la invención, las soluciones se administran directamente en la articulación antes de, durante y/o después del procedimiento quirúrgico. En otro aspecto de la invención, se proporcionan composiciones para la protección del cartílago incluyendo agentes protectores del anabolismo y agentes inhibidores del catabolismo. Estas combinaciones dan como resultado un estado que se caracteriza por: actividad anabólica del cartílago que equivale o excede a la actividad catabólica del cartílago; el mantenimiento de tejido cartilaginoso ya sea para mantener el existente o incrementar el volumen de cartílago; o un aumento en la síntesis de matriz cartilaginosa mediante condrocitos articulares y en la reducción concomitante de la degradación de la matriz cartilaginosa.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Ahora se describirá la presente invención con mayor detalle y a manera de ejemplo, haciendo referencia a los dibujos acompañantes en donde: La Figura 1 es una vista general esquemática de una célula de condrocito que muestra los objetivos moleculares y el flujo de información de señalización que conlleva a la producción de mediadores de la inflamación y cambios en el metabolismo del cartílago. La integración de señales ex-tHrífis-eeas —a—través —de—tas—ohre-rsars—f"amr±±B"s—de— eceptores de superficie celular, incluyendo receptores de citocina como familia de receptores de interleucina-1 (IL-1) y la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) , la superfamilia de receptores TGF-ß e integrinas se muestra que converge en las mismas vias de señalización intracelular que incluyen los principales grupos de moléculas proteicas que son objetivos terapéuticos de los fármacos incluidos en las soluciones de la presente invención (MAP cinasas, PKC, tirosina cinasas, proteínas SH2, COX, PLA2 y NF-??) . La activación de estas vías de señalización controla la expresión de condrocitos para una variedad de productos de genes inducibles, incluyendo IL-1, TNF-a, IL-6, IL-8 y estromelisina ( MP-3) y otros mediadores (óxido nítrico (NO) y PGE2) que pueden conllevar a la inflamación y/o degradación del cartílago o síntesis de moléculas de matriz y proliferación de condrocitos; La Figura 2 proporciona una vista general esquemática de una célula de sinoviocito que muestra los objetivos moleculares y el flujo de la información de señalización que conlleva la producción de mediadores de inflamación y cambios del metabolismo cartilaginoso. La integración de señales extrínsecas a través de las diversas familias de receptores de la superficie celular, incluyendo receptores de citocina que incluyen la familia de receptores de interleucina-1 (IL-1) y la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) , los receptores acoplados a preteéfta—€—q¾e—ifte±ttye«—bic-a&rc±rrtrt3r,—h±s1^mrna—y—subtipos de serotonina e integrinas que se demuestra que convergen en vías de señalización intracelular comunes que incluyen los principales grupos de moléculas proteicas que son objetivos terapéuticos de fármacos incluidos en las soluciones de la presente invención ( AP cinasas, PKC, tirosina cinasas, proteínas SH2, COX, PLA2 y NF-??) . La activación de estas vías de señalización controla la expresión de sinoviocitos para una variedad de productos de genes inducibles, incluyendo IL-1, TNF-a, IL-6, IL-8 y estromelisina (MMP-3), que pueden conllevar a la inflamación y/o degradación del cartílago; La Figura 3 es un diagrama de las vías comunes de señalización tanto para condrocitos como para sinoviocitos, incluyendo las proteínas de señalización clave que son responsables del "cruce de señales" entre las vías receptoras activadas por GPCR y las vías de citocinas proinflamatorias que conllevan a la inflamación y/o degradación del cartílago; La Figura 4 es un diagrama de las vías comunes de señalización tanto en condrocitos como sinoviocitos, incluyendo las proteínas señalizadoras clave responsables del "cruce de señales" entre las vías de receptor activadas por GPCR y las vías de citocinas proinflamatorias . Se identifican los sitios moleculares específicos de acción de algunos fármacos en una solución condroprotectora preferida de la presente invención; La Figura 5 es un diagrama de objetivos moleculares -re-s-ente-s—ya—s-e-a—en—eond-roe-i-t- s—o—sm irocirtos-qu~e~~ romueven una respuesta anabólica del cartílago. Se identifican los sitios específicos de acción de algunos fármacos en la solución condroprotectora preferida de la presente; La Figura 6 es un diagrama de objetivos moleculares presentes ya sea en condrocitos o sinoviocitos que promueven una respuesta catabólica del cartílago. Se identifican los sitios específicos de acción de algunos fármacos en la solución condroprotectora preferida de la presente invención; La Figura 7 es una representación gráfica de la producción de prostaglandina E2 en cultivos sinoviales mediante agonistas reguladores de proteína-G después de un cebado durante la noche con interleucina-1 (IL-1, 10U/ml) . Los cultivos fueron estimulados durante las veces indicadas con histamina (100 µ?, barras abiertas) o bradicinina (1 µ , barras cerradas) y la prostaglandina E2 liberada del sobrenadante de cultivo se determina como se describe en el Estudio 1 de la presente. Los valores que se muestran son la desviación estándar promedio + a partir de un experimento representativo y se corrigen para la producción basal de prostaglandina E2 mediante cultivos no estimulados; La Figura 8 es una representación gráfica de la inhibición de la producción de prostaglandina E2 en cultivos sinoviales mediante ketoprofeno (a veces conocido como cetoprofeno) . Los cultivos se ceban durante la noche con IL-1 (10U/ml) en presencia (como se muestra con "¦") o ausencia (como se muestra con "?" ó "V") de las concentraciones i-B-d-ie-a-d-a-s—de—ke-top-ro-ferrcr;—fre-s -cré-s—de—crn—d±a~,—se—miele la concentración de prostaglandina E2 en los sobrenadantes de los cultivos tratados durante la noche con ketoprofeno y los cultivos restantes se lavan, se incuban durante diez minutos con las concentraciones indicadas de ketoprofeno y luego se mide la producción de prostaglandina E2 en respuesta a un desafio subsecuente de tres minutos con histamina (100 µ?, V) o bradicinina (1 µ?, ?) en presencia continua de las cantidades indicadas de ketoprofeno. Los datos mostrados se normalizan hasta la respuesta máxima obtenida para cada agonista, respectivamente y representan la desviación estándar promedio + a partir de tres experimentos ejecutados en diferentes lineas celulares; y La Figura 9 es una representación gráfica del efecto de ketoprofeno sobre la producción de IL-ß mediante cultivos sinoviales a las 16 horas en presencia de concentraciones indicadas de IL-1 más los ligandos receptores acoplados a proteina-G agregada. Los cultivos se incuban durante 16 horas con IL-1 a la concentración indicada (0.3, 1.0 y 3.0 pg/ml) en ausencia y presencia de 0.75 µ? de ketoprofeno en un medio de crecimiento experimental con alguno de los siguientes ligandos de receptores adicionales: (1) isoproterenol (ISO) a 1.0 µ? para activar la via AMPc ó (2) histamina (HIS) a 100 µ? para activar la via IP3/calcio. Se recolectan los sobrenadantes del cultivo y se reemplazan con partes alícuotas de medio fresco que contienen las mismas adiciones de agonista a intervalos de 8 horas. Después del tralam ent el medro del scbrenadanire qu_e—corresponde—áT intervalo de tratamiento a partir de 8 a 16 horas se recolecta y analiza para determinar el contenido de IL-6.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA MODALIDAD PREFERIDA La presente invención proporciona métodos y composiciones para la protección del cartílago. En una primera modalidad, se proporciona un método para administrar localmente, a una articulación, una composición que incluye al menos un primer agente que actúa para promover la actividad anabólica del cartílago y al menos un segundo agente que actúa para inhibir el catabolismo del cartílago. En un primer aspecto de la modalidad de esta invención, estas composiciones se administran localmente mediante inyección de la composición, que puede incluir un vehículo de administración de liberación prolongada en la articulación. En un segundo aspecto de esta modalidad de la invención, la composición incluye un portador líquido de irrigación y se administra localmente o perioperativamente en la articulación durante un procedimiento quirúrgico o intervención. En una segunda modalidad de la invención, se proporciona un método para administrarle sistémicamente a un paciente una composición que incluye al menos un primer agente que actúa para promover la actividad anabólica del cartílago y al menos un segundo agente que actúa para inhibir el catabolismo del cartílago. En una tercera modalidad de la invención, se p^epo^e-i-ORe —un—método—pa-ra—admi-n-rstra-r—rstémi-c'amsrrte—a üñ paciente una composición que incluye al menos un agente que actúa para promover la actividad anabólica del cartílago y/o al menos un segundo agente que actúa para inhibir el catabolismo del cartílago, en donde al menos uno de los agentes tiene como especificidad de objetivo la articulación. Antes de describir con mayor detalle cada una de estas modalidades y sin desear estar limitado por la teoría, se expone una exposición razonada para la condroprotección de conformidad con la presente invención.
I . FUNDAMENTOS DE CONDROPROTECCION Los avances más recientes en la comprensión de la bioquímica y biología molecular de la inflamación y destrucción del cartílago han implicado una función para diversas citocinas endógenas. Los múltiples mediadores proinflamatorios que han estado implicados en la pérdida del cartílago en la articulación inflamada son las citocinas, TNF-a, IL-1, IL-6 e IL-8. Los elevados niveles de una variedad de estas citocinas preinflamatorias aparecen rápidamente en el fluido sinovial de articulaciones de la rodilla con lesiones agudas y permanecen elevadas en pacientes durante al menos 4 semanas (Cameron, M.L. et al., "Synovial fluid cytokine concentrations as possible prognostic indicators in the ACL-deficient knee," Knee Surg. Sports Traumatol. Arthroscopy 2:38-44 (1994)). Estas citocinas se producen localmente en la articulación a partir de—-a-r-iG-s^t-i-pes—ee-l-u-la-re-s—a-eiri-va-do-ST—rnc-ruyendO—fl"bro"b~las"tos" sinoviales, macrófágos sinoviales y condrocitos. Las citocinas localmente producidas regulan los eventos patofisiológicos en los estados inflamatorios agudos y crónicos y son importantes mediadores autócrinos y parácrinos del catabolismo cartilaginoso. Las acciones de estas citocinas se caracterizan por su habilidad para causar múltiples efectos en distintos objetivos celulares y por su habilidad para interactuar ya sea en forma sinérgica positiva o negativa con otras citocinas. IL-1 y TÑF-oc son particularmente importantes debido a que también inician los efectos condrodesctructores al interrumpir el balance entre la destrucción y producción normal de los componentes de la matriz cartilaginosa al regular la actividad de proteínas endógenas (por ejemplo, metaloproteinasas de matriz (MMP) ) y metaloproteinasa inhibidora del tejido (TIMP) . El control de citocina de la homeostasis del cartílago representa un balance bastante regulado ente los mediadores activos que actúan sobre condrocitos, lo cual determina si ocurre la reparación o degradación de la matriz. El daño a la articulación frecuentemente produce una respuesta inflamatoria dentro del espacio articular que implica que el tejido sinovial y conlleva a la degradación del cartílago articular. Los cambios dramáticos del metabolismo sinovial y del cartílago de la rodilla humana se han descrito después de una lesión a la articulación y cirugía artroscópica por (Cameron, M.L. et al., supra (1994) Game-r-en—M^L-.—et—ai-r-,——The—natural—hrstory—s?—thre —anterior cruciate ligament-deficient knee: Changes in synovial fluid cytokine and keratan sulfate concentrations, " Am. J. Sports Med. 25: 751-754 (1997)). Los niveles específicos de citocinas proinflamatorias se incrementan dramáticamente (hasta 2-4 órdenes de magnitud) en los fluidos sinoviales de la articulación de la rodilla durante una fase inflamatoria aguda que se observa después de la ruptura del ligamento anterior cruzado (ACL) . También ocurren cambios significativos en concentraciones de las moléculas de matriz cartilaginosa debido a la sobreproducción de metaloproteinasa de matriz (MMP) , tal como colagenasa y estromelisina-1, las cuáles se elevan en el fluido sinovial de pacientes después de un trauma agudo (Lohmander, L.S. et al., "Temporal patterns of stromelysin-1 tissue inhibitor, and proteoglycan fragments in human knee joint fluid after injury to the cruciate ligament or meniscus," J. Orthopaedic Res. 12:21-28 (1994)). Temporalmente, los cambios en las citocinas y los marcadores de matriz cartilaginosa (por ejemplo, proteoglicanos ) en el fluido sinovial, que se correlacionan con la degeneración cartilaginosa, tienen sus valores máximos en el período de lesión aguda pero son persistentes durante períodos prolongados (3 meses a 1 año), disminuyen lentamente y permanecen en mayor grados y en los niveles básales previos a la lesión. El trauma debido a cirugía artroscópica por sí misma causa una significativa inflamación postquirúrgica que r-eíie-a—íe—.a-e-ti^a-el-on-^dic^OTi-a-i—de^^-a—±nf ama-croñ~dé células en la articulación, incluyendo una articulación aceleradora de ciclooxigenasa-2 y otras citocinas proinflamatorias . Una proporción significativa de pacientes (60-90%) con ruptura de ACL muestran cambios radiográficos de la rodilla indicativos de osteoartritis (OA) 10-15 años después de la lesión (Cameron M.L. et al., supra (1994)). Por lo tanto, los efectos combinados de la lesión inicial de la rodilla y trauma quirúrgico pueden inducir a un estado inflamatorio sostenido y cambios asociados en el metabolismo de la matriz cartilaginosa que parecen ser factores causantes resultantes en el desarrollo subsecuente de cambios degenerativos en el cartílago articular y desarrollo temprano de osteoartritis. La magnitud de este problema de salud es sustancial ya que la cantidad total estimada de procedimientos artroscópicos llevados a cabo en los Estados Unidos de Norteamérica solamente en 1996 fue de 1.8 millones con una tasa de crecimiento estimada de aproximadamente 10% anual. Por lo tanto, se desea proporcionar un método farmacéutico para prevenir la degradación del cartílago articular dentro de la articulación. Mientras que el dolor postquirúrgico e inflamación se reconocen como problemas clínicos significativos, los programas actuales farmacológicos para cirugía artroscópica sólo se dirigen a la analgesia postoperativa aguda. Las modalidades existentes de tratamiento quirúrgico no se ocupan del estado inflamatorio crónico que se induce pO'stOpexat-rvameTiire n± en ta neces±da-d de rntrxbxr —l~a~ destrucción cartilaginosa de la articulación operada. Por lo tanto, es claramente necesario desarrollar una terapia de fármacos efectiva e integrada que se ocupe tanto de los aspectos agudos como crónicos del dolor e inflamación asi como de los cambios patológicos del metabolismo cartilaginoso en la articulación lesionada y operada. Según una primera modalidad de este aspecto de la invención, se proporciona un método para reducir o prevenir la destrucción del cartílago articular en una articulación, administrando directamente a la articulación del paciente una composición que incluye uno o preferiblemente múltiples agentes condroprotectores metabólicamente activos junto con uno o más agentes para inhibir el dolor y/o inflamación, como se describió previamente, o preferiblemente una combinación de dos o más agentes condroprotectores metabólicamente activos, de los cuáles al menos uno promueve los procesos anabólicos del cartílago y al menos uno de los cuáles es un inhibidor de los procesos catabólicos del cartílago, en un portador farmacéuticamente efectivo para la administración intraarticular . Los agentes metabólicamente activos incluyen, entre otros, a todos los compuestos que actúan directamente o indirectamente para regular o alterar el estado biológico, bioquímico o biofísico de una célula, incluyendo agentes que alteran el potencial eléctrico de la membrana plasmática, la actividad enzimática o de unión del ligando de receptores celulares, enzimas intracelularmente o extracelularmente ubrcarfcs^ rnlrexar rxoTres-pxOtrexrra^p oire n-a^—rnirexa^ccroTOrs-A'R ^" proteínas o interacciones ADN-proteínas . Por ejemplo, estos agentes pueden incluir agonistas de receptores que inician las cascadas de traducción de señal, antagonistas de los receptores que inhiben las vias de señalización, activadores e inhibidores de las enzimas intracelulares o extracelulares y agentes que regulen la unión de los factores de transcripción al ADN. Los agentes condroprotectores adecuados incluyen, por ejemplo, (1) antagonistas de receptores para la familia de proteínas interleucina-1 , incluyendo, por ejemplo, IL-?ß, IL-17 e IL-18; (2) antagonistas de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) , incluyendo, por ejemplo, TNF-R1; (3) agonistas de receptores de interleucina 4, 10 y 13; (4) agonistas para la superfamilia de receptores TGF-ß, incluyendo, por ejemplo, BMP-2, B P-4 y BMP-7; (5) inhibidores de COX-2; (6) inhibidores de la familia MAP cinasa, incluyendo, por ejemplo, p38 MAP cinasa; (7) inhibidores de la familia de proteínas de metaloproteinasas de matriz (MMP) , incluyendo por ejemplo, MMP-3 y MP-9; (8) inhibidores de la familia de proteínas NF-??, incluyendo por ejemplo, el complejo de dímeros p50/p65 con IkB; (9) inhibidores de óxido nítrico sintasa (NOS) , incluyendo por ejemplo, iNOS; (10) agonistas y antagonistas de receptores de integrina, incluyendo por ejemplo, agonistas de integrina a?ß3 t11) inhibidores de la familia de proteína cinasa C (PKC) ; (12) inhibidores de la familia de proteínas tirosina e-i-fi-a-s-a-7 tnetuyen-do por e-jem ±o^ subfdm irra src; (? )~ reguladores de la proteína tirosina fosfatasa; y (14) inhibidores de los dominios de homología 2 de la proteína src (SH2). Otros agentes condroprotectores adecuados para usarse en la invención incluyen otros factores de crecimiento, a manera de ejemplo, los factores de crecimiento similares a la insulina (por ejemplo, IGF-1) y factores de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, bFGF) . Una primera modalidad de la presente invención proporciona un método farmacológico para el tratamiento de una articulación lesionada u operada usando una combinación de agentes protectores del cartílago administrados localmente para lograr un máximo beneficio terapéutico. Una segunda modalidad de la presente invención proporciona un método farmacológico para proporcionar un tratamiento terapéutico mediante la administración sistémica de una combinación de agentes protectores del cartílago. El uso de una combinación de agentes condroprotectores se sobrepone a las limitaciones de los métodos terapéuticos existentes basados solamente en el uso de un solo agente para bloquear un proceso destructivo del cartílago multifactorial en donde un cambio entre la síntesis y degradación, a favor de los procesos catabólicos ha ocurrido. Este aspecto de la invención utiliza en forma única el método de combinar agentes que actúan simultáneamente sobre distintos objetivos moleculares para promover el anabolismo del cartílago e inhibir los procesos excesivos del catabolismo del cartílago que no están r guia-do-s—para—Itograr- ma—má^-lma—inhl±5±c±ón—de—lo~s procesos in lamatorios y mantener la homeostasis del cartílago, logrando asi un efecto condroprotector dentro de la articulación. La inhibición de un solo objetivo molecular o mecanismo bioquímico que se sabe induce la destrucción del cartílago (catabolismo) , como la inhibición de la unión de interleucina-1 (IL-1) al receptor IL-1, probablemente no será lo óptimo ya que por ejemplo, las acciones de TNF-cc mediadas a través de estos receptores únicos comparten varias funciones proinflamatorias y del catabolismo del cartílago sobrepuestas con IL-1 y también se reconoce como un principal mediador de la destrucción del cartílago en la articulación. Similarmente, el uso de agentes farmacéuticos que sólo potencializan los procesos anabólicos del cartílago en ausencia de la inhibición de procesos catabólicos no contrarresta de manera óptima los factores catabólicos presentes dentro de la articulación lesionada. Específicamente, un aspecto de la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas de agentes condroprotectores metabólicamente activos que se basan en una combinación de al menos dos agentes que actúan simultáneamente sobre distintos objetivos moleculares. En una modalidad representativa, al menos un agente es una citocina o agonista del receptor del factor de crecimiento que proporciona directamente actividad antiinflamatoria y/o promueve los procesos anabólicos del cartílago y al menos un segundo agente es un antagonista del receptor o un inhibidor en-z±má1rrcO qtre actúa paxa rnrii±>±r iros procesos proinflamatorios y/o del catabolismo del cartílago. Una combinación representativa de fármacos incluye al menos un agente seleccionado a partir de una clase de citocinas antiinflamatorias y/o anabólicas que actúan funcionalmente para suprimir la función de las citocinas proinflamatorias en la articulación, promover la síntesis de la matriz cartilaginosa e inhibir la degradación de la matriz. Estos agonistas de receptores incluyen, entre otros, citocinas específicas antiinflamatorias y anabólicas como los agonistas de interleucina (IL) (por ejemplo, IL-4, IL-10 e IL-13) y miembros específicos de la superfamilia del factor transformante del crecimiento ß (por ejemplo, TGFP y BMP-7), factores de crecimiento similares a la insulina (por ejemplo, IGF-1) y factores de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, bFGF) . Al menos un segundo agente se selecciona a partir de una clase de antagonistas de receptores o inhibidores enzimáticos que actúan para inhibir y reducir la actividad o la expresión del objetivo molecular proinflamatorio (por ejemplo, antagonistas del receptor IL-1, antagonistas del receptor TNF-cc, inhibidores de ciclooxigenasa-2 , inhibidores de MAP cinasa, inhibidores de óxido nítrico sintasa (NOS) e inhibidores del factor nuclear kappaB (NFKB) ) . Los agentes metabólicamente activos incluyen tanto agonistas como antagonistas funcionales de los receptores ubicados sobre la superficie de las células, así como inhibidores de membrana unidos o enzimas ^extra-cettiTa menfe s¾"cre"tra"3aB Vpur e~¾Tfip~ro~ e^1! "o l^Ls"Íña y colagenasa) . Además, varios de los agentes se dirigen hacia objetivos novedosos que son enzimas intracelularmente ubicadas y factores de transcripción que transducen e integran las señales de los receptores de superficie, incluyendo inhibidores de las enzimas NOS, COX-2, y las cinasas proteicas activadas por mitógenos (MAPK) e inhibidores de las interacciones proteina-ADN como el factor de transcripción NFKB. Este método permite que se mantenga la integridad del cartílago mediante la promoción simultánea de los procesos anabólicos regulados por citocinas e inhibir los procesos catabólicos. Las composiciones de las modalidades preferidas de la presente invención constituyen un novedoso método terapéutico al combinar múltiples agentes farmacológicos que actúan en distintos objetivos moleculares de receptores y/o enzimas. Hasta la fecha, las estrategias farmacológicas se han enfocado en el desarrollo de fármacos altamente específicos que son selectivos para los subtipos individuales de receptores e isoformas de enzimas que regulan las respuestas para las hormonas y neurotransmisores de señalización individuales. Más aún, a pesar de la inactivación de un solo subtipo de receptor o enzima, la activación de otras enzimas o subtipos de receptores y la transducción de señal resultante normalmente desencadenan un efecto de cascada. Esto explica la gran dificultad para emplear un solo fármaco específico para receptor para b-te-qttea-ir— —proeese—¾÷ofHrs~foióg- co—en—donde—to~s—múTtiples" mediadores de señalización (por ejemplo, citocinas, factores de crecimiento o eicosanoides ) tienen una función. Por lo tanto, probablemente será inefectivo apuntar con especificidad de objetivo solamente hacia un isotipo o subtipo de receptor individual especifico. A diferencia del método convencional de terapia farmacológica, el método terapéutico de las presentes composiciones está basado en el fundamento de que una combinación de fármacos que actúa simultáneamente sobre distintos objetivos moleculares es altamente efectivo para la inhibición de todo el espectro de eventos que subyacen en el desarrollo de un estado patofisiológico. Más aún, en vez de apuntar con especificidad de objetivo hacia solamente un subtipo especifico de receptor, las composiciones incluyen fármacos que apuntan con especificidad de objetivo hacia los mecanismos moleculares comunes que operan en diferentes procesos fisiológicos celulares involucrados en el desarrollo del dolor, inflamación y degradación del cartílago (ver Figura 1) . De esta forma, el efecto cascada de los receptores y enzimas adicionales en las vías nociceptoras, inflamatorias y de la degradación del cartílago se minimizan. En estas vías patofisiológicas, las composiciones inhiben el efecto cascada tanto en "dirección 5'" y "dirección 3'". Un ejemplo de una inhibición en "dirección 5'" son los antagonistas de ciclooxigenasa en la manifestación del dolor e inflamación. Las enzimas de ciclooxigenasa COXi y GQ¾-) eataü-z-a-n—ta — eoRve-rs-irórt —del — árcrdo — axH u±ttóTrico —éñ prostaglandina H las cuál es un intermediario en la biosintesis de mediadores nociceptores e inflamatorios incluyendo prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos. Los inhibidores de ciclooxigenasa bloquean en "dirección 5"' la formación de estos mediadores inflamatorios y nociceptores. Esta estrategia precluye la necesidad de bloquear las interacciones de los siete subtipos descritos de receptores prostanoides con productos prostanoides de la via bioquímica COX. Un inhibidor similar "en dirección 5'", es la aprotinina, un inhibidor de la calicreína. La enzima calicreína, una proteasa de serina, escinde los quininógenos de alto peso molecular en plasma para producir bradicininas , que son importantes mediadores del dolor e inflamación. Mediante la inhibición de calicreína, la aprotinina inhibe efectivamente la síntesis de bradicinina, proporcionando así una efectiva inhibición "en dirección 5' " de estos mediadores inflamatorios . Las composiciones de la invención pueden utilizar los inhibidores "en dirección 3'" para regular las vías patofisiológicas . En las preparaciones de sinoviocitos y condrocitos que han sido tratadas con una variedad de citocinas inflamatorias (por ejemplo, IL-?ß y TNF-cc) implicadas en la degeneración progresiva del cartílago articular, los inhibidores de MAP cinasa producen un efecto protector del cartílago. La p38 MAP cinasa es un punto de convergencia en las vías de señalización para múltiples eitroe-i-fi-a-s—e-a-fc¾b>ói-icas——srr^m ^ —ts.—regulación acelerada de los múltiples productos celulares que regulan la degradación del cartílago. Por lo tanto, los inhibidores de MAP cinasa proporcionan una ventaja significativa en la manifestación de inflamación articular al proporcionar efectos protectores del cartílago en "dirección 3'" que son independientes de la combinación fisiológica de los agonistas del receptor de citocina que inician el cambio de la homeostasis cartilaginosa.
II . ADMINISTRACIÓN LOCAL DE COMPOSICIONES CONDROPRQTECTORAS Las modalidades específicas preferidas de la solución de la presente invención para usarse en condroprotección y procedimientos quirúrgicos preferiblemente incluyen una combinación de agentes que actúan simultáneamente en distintos objetivos moleculares para promover el anabolismo del cartílago e inhibir los procesos no regulados o excesivos del catabolismo del cartílago para lograr la máxima inhibición de los procesos inflamatorios y mantener la homeostasis del cartílago, logrando así un efecto condroprotector en la articulación. La irrigación y soluciones inyectables de una modalidad de la presente invención son soluciones diluidas de uno o preferiblemente más agentes condroprotectores y opcionalmente, uno o más agentes inhibidores del dolor y/o inflamación en un portador fisiológico. El portador es una solución líquida, que como se utiliza en la presente, p-ret-enete abarcar :—s&re e^-, s sperrs-roTre~s~ geTes poliraerizables y no polimerizables, pastas y bálsamos biocompatibles así como vehículos de administración de liberación prolongada como micropartículas , microesferas o nanopartículas compuestas de proteínas, liposomas, carbohidratos, compuestos orgánicos sintéticos o compuestos inorgánicos. Preferiblemente, el portador es una solución acuosa gue puede incluir electrolitos fisiológicos como solución salina normal o solución lactosada de Ringer. En cada una de las soluciones guirúrgicas de una modalidad que se administra localmente de la presente invención, los agentes incluyen a bajas concentraciones en una solución fluida o líquida y se administran localmente a bajas dosis en relación con las concentraciones y dosis requeridas para los métodos sistémicos de administración de fármacos para lograr el efecto terapéutico deseado. Como se utiliza en la presente, los términos "líquidos" o "fluidos" pretenden abarcar los solventes, suspensiones, geles polimerizables y no polimerizables, pastas y balsámicos biocompatibles y farmacéuticamente aceptables.
Preferiblemente, el portador es una solución acuosa que puede incluir electrolitos fisiológicos como solución salina normal o solución lactosada de Ringer. Es imposible o impráctico obtener un efecto terapéutico equivalente administrando agentes similarmente dosificados por medio de otras rutas (es decir, intravenosa, subcutánea, intramuscular u oral) de administración de fármacos ya que éstos que se administran s stémi-c-amerrte—e-stán—srrjBtus a un mHt r smo de primer y" segundo paso. La concentración de cada agente se determina en parte basándose en su constante de disociación del receptor, Kd o la constante de inhibición enzimática, K . Como se utiliza en la presente, el término constante de disociación pretende abarcar tanto la constante de disociación de equilibrio para la respectiva interacción agonista-receptor o antagonista-receptor y la constante inhibitoria de equilibrio para su respectiva interacción activador-enzima o inhibidor-enzima. Preferiblemente cada agente se incluye a una baja concentración de 0.1 a 10,000 veces Kd o Ki. Preferiblemente, cada agente se incluye a una concentración de 1.0 a 1,000 veces Kd o Ki y con mayor preferencia aproximadamente 100 veces Kd o Ki. Estas concentraciones se ajustan según sea necesario para dar razón de la dilución en ausencia de transformación metabólica en el sitio de administración local. Los agentes exactos que se seleccionan para uso en solución y la concentración de los mismos, varia de conformidad con la aplicación en particular como se describe a continuación. Una solución de conformidad con un aspecto de la presente invención puede incluir un solo o varios agentes condroprotectores, preferiblemente múltiples agentes condroprotectores de los cuales al menos uno es un agente condroprotector anabólico y al menos uno de los cuales es un inhibidor del catabolismo del cartílago, o una combinación tanto de agentes condroprotectores como de agentes rnWirírdoxe-s del doi-?t yfo rn"fl"ama"ci"ón a bajas concentraciones. Sin embargo, debido al efecto sinérgico anteriormente mencionado de los múltiples agentes y el deseo de inhibir ampliamente la destrucción del cartílago y opcionalmente bloquear el dolor e inflamación se prefieren utilizar múltiples agentes. La combinación de múltiples fármacos puede administrarse localmente mediante inyección intraarticular o por medio de infusión, incluyendo la administración periprocedural (es decir, antes de la operación y/o durante la operación y/o después de la operación) durante los procedimientos artroscópicos quirúrgicos, sóla o combinada con una administración prolongada postoperatoria, como podría ser mediante una bomba regulada o mediante el uso de un vehículo de administración de liberación prolongada. Los vehículos de administración de liberación prolongada pueden incluir, entre otros, micropartículas, microesferas o nanopartículas compuestas de proteínas, liposomas, carbohidratos, compuestos orgánicos sintéticos o compuestos inorgánicos sintéticos. Por lo tanto, en algunas modalidades, la invención proporciona una combinación de agentes que se van a administrar por medio de inyección o infusión, solos o junto con agentes analgésicos y/o antiinflamatorios. El rápido comienzo de la acción lograda por la administración local y directa de los agentes condroprotectores durante o poco después del momento de la lesión (por ejemplo, perioperativamente) tiene el potencial de inhibir los p-r-e-eee-es—in-iei-a-i-es—an-t-e-s—de—qtre—p-credan—desencadenar—las" respuestas subsecuentes y con ello limitar de manera preventiva el daño a tejidos locales y la subsecuente pérdida del cartílago. Las ventajas de la presente invención incluyen: 1) una terapia de combinación de fármacos dirigida contra las causas multifactoriales de la destrucción del cartílago durante los estados agudos y/o crónicos; 2) la combinación de agentes condroprotectores puede combinarse con agentes antiinflamatorios y analgésicos; 3) la administración local de la combinación de fármacos (cuando sea aplicable) logra una concentración terapéutica instantánea de agentes condroprotectores dentro de la articulación; 4) el uso de una solución de irrigación periprocedural (cuando sea aplicable) proporciona un mantenimiento continuo de los niveles del fármaco dentro de la articulación dentro de un intervalo terapéuticamente deseable durante un procedimiento quirúrgico artroscópico; 5) la administración local (para esta modalidad de la invención) permite una reducción en la dosis total del fármaco y frecuencia de dosificación en comparación a la administración sistémica; 6) la administración local dirigida al sitio de la articulación (para esta modalidad de la invención) evita la toxicidad sistémica y reduce los efectos adversos; y 7) la administración local y directa en la articulación (para esta modalidad de la invención) permite el uso de péptidos y proteínas novedosos y farmacéuticamente activos incluyendo citocinas y factores de crecimiento, los Guaies^odr-í-a--^e—ser^b r-a- éu^^^ a las rutas sistémicas de administración. ? partir de los mecanismos moleculares y celulares de acción definidos para estos agentes condroprotectores, se espera que estos compuestos muestren acción condroprotectora cuando se apliquen perioperativamente en una solución de irrigación (en combinación con otros agentes condroprotectores o en combinación con otros agentes analgésicos y antiinflamatorios descritos en la presente) o cuando se administren directamente en la articulación por medio de infusión o inyección. En particular, se espera que estos agentes sean fármacos efectivos cuando se administren mediante una solución de irrigación durante un procedimiento quirúrgico artroscópico . Cada agente condroprotector metabólicamente activo puede administrarse preferiblemente en combinación con uno o más agentes condroprotectores, incluyendo fármacos de moléculas pequeñas, péptidos, proteínas, proteínas quiméricas recombinantes, anticuerpos, oligonucleótidos o vectores de terapia génica (virales y no virales) , en los espacios de la articulación. Por ejemplo, un fármaco como el inhibidor MAPK puede ejercer su acción sobre cualquier célula asociada con los espacios de fluido de la articulación y estructuras que comprenden la articulación y que están involucradas en la función normal de la misma o que están presentes debido a un estado patológico. Estas células y estructuras incluyen, pero no se limitan a: células sinoviales, incluyendo tanto los fibroblastos Tipo A como los —-maeréí-ago-s—?^??—B-;—1-os—componentes—ca-rt±±a-g±nO"S'0"s—de—Ta articulación como condroblastos y condrocitos; células asociadas con el hueso, incluyendo células del periosteo, osteocitos, osteoblastos, osteoclastos ; células inflamatorias incluyendo linfocitos, macrófagos, mastocitos, monocitos, eosinófilos y otras células incluyendo células endoteliales, células de músculo liso, fibroblastos y células neurales y combinaciones de las anteriores. Este aspecto de la presente invención también proporciona formulaciones de agentes terapéuticos activos que pueden administrarse en una formulación útil para la introducción y administración del fármaco en la articulación que podría potenciar la administración, absorción, estabilidad o farmacocinética de los agentes condroprotectores . Esta formulación puede incluir, entre otras, micropartículas , microesferas, nanoesferas o nanopartículas compuestas de proteínas, liposomas, carbohidratos, compuestos orgánicos sintéticos, o compuestos inorgánicos. La presente invención proporciona la administración de una combinación de agentes condroprotectores o uno o preferiblemente una multiplicidad de agentes condroprotectores con uno o más agentes analgésicos y/o antiinflamatorios presentes ya sea como múltiples sustancias farmacéuticamente activas dentro de un vehículo homogéneo (por ejemplo, una sola microesfera encapsulada) o como una mezcla discreta de vehículos individuales de administración (por ejemplo, un grupo de m-rcroe-s-fex-as—que—eiTcapBTrl^n—UTKT-o" a-g~ent¾"S~)~ Los ejemplos" de moléculas de formulación incluyen, entre otros, polímeros hidrófilos, policationes (por ejemplo, protamina, espermidina, polimicina) , ligandos peptídicos o sintéticos y anticuerpos capaces de apuntar con especificidad de objetivo a materiales de tipos específicos de células, geles, matrices de liberación lenta (es decir, vehículos de administración prolongada, partículas solubles e insolubles) así como elementos de formulación que no se mencionan. En un aspecto, la presente invención proporciona la administración local de una combinación de dos o más agentes condroprotectores o uno o preferiblemente múltiples agentes condroprotectores en combinación con uno o más agentes analgésicos y/o antiinflamatorios, solos o combinados con uno o más agentes analgésicos y/o antiinflamatorios por medio de una solución de irrigación, una infusión que contiene los fármacos que están presentes a bajas concentraciones terapéuticamente efectivas y que permiten que los fármacos sean administrados directamente en la articulación o tejido afectados. La solución de irrigación o infusión que contiene el fármaco puede emplearse preoperativamente y/o intraoperativamente y/o postoperativamente en conexión con un procedimiento quirúrgico o puede administrarse en otros momentos que no se relacionen con éstos. Los métodos sistémicos de administración de fármacos (por ejemplo intramuscular, intravenoso, subcutáneo) requieren mayores concentraciones de fármacos (y una dosis total mayor) para a-dm-i-n-is-tr-a-r-s-e en ei paciente a firn de lograr las" concentraciones terapéuticas significativas en la articulación con especificidad de objetivo. La administración sistémica ' también puede dar como resultado elevadas concentraciones en tejidos distintos a la articulación objetivo, lo cual no es deseable y dependiendo de la dosis, podría resultar en efectos secundarios adversos. Estos métodos sistémicos someten al fármaco a un metabolismo de segundo paso y rápida degradación, limitando así la duración de la concentración terapéutica efectiva. Debido a que la combinación de agentes condroprotectores (con o sin uno o más agentes analgésicos y/o antiinflamatorios) se administra directamente en la articulación mediante infusión o irrigación, en la perfusión vascular no se requiere transportar el fármaco al tejido con especificidad de objetivo. Esta ventaja significativa permite la administración local de una menor dosis total terapéuticamente efectiva para una variedad de fármacos condroprotectores .
A.MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN LOCAL Las soluciones de la presente invención tienen aplicación para una variedad de procedimientos operativos/intervencionales incluyendo técnicas quirúrgicas, de diagnóstico y terapéuticas. La combinación de agentes condroprotectores de la invención puede administrarse mediante inyección o irrigación. Para las soluciones en i-nyeee-i-ón- —ta-cairtirdad—de^tng ed entre"—arctivo-puerte comb~inarse con materiales portadores para producir una sola forma de dosificación que varia dependiendo del paciente a ser tratado, la naturaleza de los agentes activos en la solución y el modo particular de administración. Sin embargo, se entiende que el nivel de dosis especifico para cualquier paciente en particular dependerá de una amplia variedad de factores incluyendo la actividad del compuesto especifico empleado, la edad, peso corporal, estado de salud general, sexo y dieta del paciente, tiempo de administración, ruta de administración, tasa de excreción de la combinación del fármaco y la severidad de enfermedad en particular que experimenta terapia. Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones oleaginosas o acuosas estériles inyectables pueden formularse según la técnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución inyectable estéril o suspensión inyectable estéril en un solvente o diluyente no tóxico y parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en propanodiol . Entre los solventes y vehículos aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, solución de Ringer y solución de cloruro de sodio isotónico. Además, los aceites estériles y fijos se emplean convencionalmente como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito, cualquier aceite biocompatible puede emplearse incluyendo los Htefte—o—di-gd-tcéx-rdos—slTTtét±cOs-—ftdremárs"; los ácidos grasos como el ácido oleico tienen uso en la preparación de productos inyectables. Las soluciones para inyección de la invención pueden administrarse en conexión con un procedimiento quirúrgico artroscópico o en cualquier momento deseable por el médico que dirige el cuidado del paciente. Las soluciones de irrigación de la invención pueden aplicarse perioperativamente durante la cirugía artroscópica de articulaciones anatómicas. Como se utiliza en la presente, el término "perioperativo" abarca la aplicación intraprocedimiento, pre e intraprocedimiento, intra y postprocedimiento y pre, intra y postprocedimiento. Preferiblemente, la solución se aplica preprocedimiento y/o postprocedimiento así como intraprocedimiento. Estos procedimientos convencionalmente utilizan fluidos fisiológicos de irrigación como solución salina normal o solución lactosada de Ringer, que se aplican en el sitio quirúrgico mediante técnicas conocidas por los expertos. El método de la presente invención implica sustituir las soluciones de irrigación analgésicas/antiinflamatorias/condroprotectoras de la presente invención mediante los fluidos de irrigación convencionalmente aplicados. La solución de irrigación se aplica sobre la lesión o sitio quirúrgico antes del inicio del procedimiento, preferiblemente antes del trauma al tejido y continuamente durante la duración del procedimiento para bio-quea-? ^p^v-eítt-tvamefi-te doi-o-r e ÍTrf±aTnB"cíoñ y" la" degradación del cartílago. Como se utiliza durante la presente, el término "irrigación" pretende significar el enjuagado o lavado de una lesión o estructura anatómica con un flujo de líquido. En la presente, el término "aplicación" pretende abarcar la irrigación y otros métodos de introducir localmente la solución de la presente invención, como la introducción de una versión gelificada de la solución en el sitio de operación, permaneciendo entonces la solución gelificada en el sitio durante el procedimiento. Como se utiliza en la presente, el término "continuamente" también pretende incluir situaciones en donde existe una irrigación frecuente y repetida de lesiones durante una frecuencia suficiente para mantener la concentración local terapéutica predeterminada de los agentes aplicados y aplicaciones en donde puede haber una pausa intermitente de fluido de irrigación necesaria para la técnica de operación. Las concentraciones mencionadas anteriormente para cada uno de los agentes dentro de soluciones de la presente invención son las concentraciones de agentes administrados localmente en ausencia de transformación metabólica, en el sitio de operación a fin de lograr un nivel predeterminado de efecto en el sitio de operación. Se entiende que las concentraciones de fármaco en una solución predeterminada pueden necesitar de ajustes para dar razón de la dilución local al momento de administrarse. Las concentraciones de la solución en las modalidades anteriores no están ajustadas pa-ra—dax~razrán—derrra"S^T'an_s"fO"mBiim"e~E^ne^t5bólicas o dTTücioñ por la distribución total del cuerpo debido a que estas circunstancias son evitadas mediante la administración local, al contrario de la aplicación oral, intravenosa, subcutánea o intramuscular . Las técnicas artroscópicas para las cuales la presente solución puede emplearse incluyen, a manera de ejemplo no limitante, las meniscectomias y reconstrucciones del ligamento de la rodilla, acromioplastias del hombro, debridamientos del músculo rotatorio, sinovectomias del codo y artroscopias de muñeca y tobillo. La solución de irrigación se administra continuamente de manera intraoperativa en la articulación a una velocidad de flujo suficiente para distender la cápsula articular y eliminar los restos de la operación y permitir una visualización intraarticular sin obstrucción. Las soluciones de irrigación artroscopica adecuadas para la inhibición del cartílago y el control del dolor e inflamación durante estas técnicas artroscópicas se proporcionan en los Ejemplos 1-3 a continuación. En cada una de las soluciones de la presente invención pretendidas para la administración local, los agentes se incluyen a bajas concentraciones y se administran localmente a bajas dosis en relación con las concentraciones y dosis requeridas para los métodos sistémicos para lograr el efecto terapéutico deseado. Es imposible obtener un efecto terapéutico equivalente administrando agentes similarmente do-si-f-i-ead-e-s—po- —medio—de—otrra-s—ratas—de—a tm±mrstTa~c~ioñ"—de" fármacos (es decir, intravenosa, subcutánea, intramuscular u oral) ya que los fármacos administrados sistémicamente están sujetos a un metabolismo de primer y segundo paso y normalmente se depuran rápidamente de la circulación sistémica. La práctica de la presente invención deberá distinguirse de las inyecciones convencionales intraarticulares de opiatos y/o anestésicos locales al término de los procedimientos "abiertos" artroscópicos o de articulación (por ejemplo, de la rodilla, hombro, etc.). Las soluciones de este aspecto de la presente invención se utilizan para la infusión continua durante el proceso quirúrgico para proporcionar una inhibición preventiva del dolor e inflamación. A diferencia, las altas concentraciones necesarias para lograr la eficacia terapéutica con una infusión constante de anestésicos actualmente utilizados puede resultar en una toxicidad sistémica profunda. Al término del procedimiento de la presente invención, puede ser deseable inyectar o aplicar de alguna otra manera una mayor concentración de los mismos agentes condroprotectores y/o inhibidores del dolor y/o inflamación como se utilizan en la solución de irrigación en el sitio de operación, como una alternativa o suplemento a los opiatos. También puede desearse administrar una cantidad suficiente de la solución en la articulación después del procedimiento quirúrgico para que un bolo de la solución permanezca en la eáps¾i-a—s-i-n-ov-i-al—dei— a-ciren-te—de-sprré-s—de±—pxo"c¾idTml"ervto quirúrgico . Como se indica previamente, las composiciones de la presente invención incluyendo los múltiples agentes condroprotectores, incluyendo preferiblemente al menos un agente inhibidor del catabolismo y al menos un agente promotor del anabolismo también pueden adaptarse para una inyección directa en una articulación anatómica. Preferiblemente, los agentes se seleccionan y cada agente se incluye en una cantidad suficiente para proporcionar una combinación que sea terapéuticamente efectiva cuando la solución se administra localmente en la articulación de un paciente tanto para inhibir los procesos catabólicos del cartílago como para promover los procesos anabólicos del mismo. Estas composiciones pueden inyectarse localmente para proporcionar un efecto condroprotector al paciente que sufre de una condición crónica como osteoartritis o artritis reumatoide o una condición aguda como trauma debido a cirugía o lesión accidental. Una composición adecuada para su inyección local se proporciona en el siguiente Ejemplo 4.
III ¦ ADMINISTRACIÓN SISTEMICA DE COMPOSICIONES CONDROPROTECTORAS Hasta ahora se han descrito las modalidades de la presente invención en términos de la administración local de composiciones condroprotectoras como podría ser inyección intraarticular . La administración local ha sido descrita por tener varias ventajas sobre la administración sistémica, -i-nei-uyeftdo—1-a—eva-sión—de—ios—eíe-c as—s^ectrrrdHTXus—S"i"s"teTfTicos .
Aunque la administración local de las composiciones de la presente invención es la preferida en varios casos, podría no ser lo más práctico para varios estados degenerativos del cartílago. Esto es particularmente el caso de pacientes que sufren de enfermedades crónicas degenerativas del cartílago en donde múltiples sitios se encuentran simultáneamente en riesgo de degradación del cartílago, como sería la artritis reumatoide, osteoartritis poliarticular y otras poliartropatías . Para estos pacientes, la inyección de composiciones condroprotectoras en cada una o la mayoría de sus sitios enfermos (es decir las articulaciones) puede ser dolorosa, impráctico, costoso o ser disuasivo para el tratamiento. Las composiciones condroprotectoras descritas anteriormente para la administración local pueden, de conformidad con otro aspecto de la presente invención, adaptarse para su administración por medio de rutas sistémicas. La administración sistémica de las composiciones de la presente invención es adecuada, entre otras cosas, para el tratamiento de pacientes con múltiples sitios en riesgo de degeneración del cartílago. Además de la osteoartritis poliarticular o la artritis reumatoide mencionadas más adelante, este aspecto de la presente invención puede ser útil para el tratamiento de otras artritis no inflamatorias e inflamatorias incluyendo entre otras, artropatía neuropática, fiebre reumática aguda, ocrónosis, lupus sistémico eritematoso, artritis reumática juvenil, artritis psoriática, espondir±t±s—anqtrr-xosante— —otras—espondi-1-oaxl roparras— artropatías cristalinas.
A. MECANISMOS DE LA A T ISIS Este aspecto de la invención puede apreciarse mejor comprendiendo los mecanismos involucrados en la degradación del cartílago articular en artropatías reumatológicas (por ejemplo, artritis reumatoide (RA) y osteoartritis (OA) ) . La RA es la forma más común de artritis inflamatoria, afectando aproximadamente 3% de las mujeres y 1% de hombres. La mayoría de los pacientes tienen varias articulaciones involucradas, usualmente en forma simétrica, especialmente las pequeñas articulaciones de las manos, codos, muñecas y hombros. La OA es la forma más común de enfermedad articular solo después de la enfermedad cardiovascular como causa de cesación temprana e incapacidad. La OA es normalmente poliarticular . La destrucción del cartílago articular hialino es el sello distintivo de la OA y la RA incapacitante. Aunque diversos métodos terapéuticos pueden proporcionar alivio de los síntomas, ningún tratamiento ha probado retardar la progresión de la degradación del cartílago articular. En la OA, puede haber una supresión de las funciones normales de los condrocitos o la incapacidad constitutiva de estas células para igualar la velocidad de reparación con la mayor velocidad de degradación de la matriz. Se ha demostrado que diversas citocinas y mediadores de la inflamación crean un desbalance de las funciones si-s-témi-e-a-s— e—tos—condxoc±tro-s—o—a±t-eTna-tr ameTrt¾~—incrementa" el catabolismo de la matriz cartilaginosa acelerando la regulación de las diversas enzimas degradantes de la matriz, incluyendo las metaloproteinasas de matriz (que incluyen las colagenasas) . Para tratar de manera óptima las enfermedades que implican la degeneración del cartílago, se espera que un programa de tratamiento que estimule los procesos anabólicos y que simultáneamente inhiba el catabolismo del cartílago sea lo requerido. Por lo tanto, el método terapéutico descrito previamente para la inhibición de la destrucción del cartílago en enfermedades de la articulación, basado en una combinación de un agente anabólico para el cartílago y un inhibidor del catabolismo del cartílago, se espera que sea útil para el tratamiento contra estados artríticos como OA y RA. Como se indica anteriormente, las consideraciones prácticas dictan que estas enfermedades que afectan simultáneamente los múltiples sitios en el cuerpo sean tratadas con mayor éxito mediante la administración sistémica de estos agentes terapéuticos .
B. COMBINACIONES DE AGENTES Este aspecto de la presente invención proporciona así composiciones que incluyen combinaciones de agentes condroprotectores y métodos de administración sistémica de estas composiciones. Los agentes que tienen como objetivo los diferentes receptores u objetivos moleculares se utilizan para—un—método—mu-i-t-rf-a-ctoxi-ai—como—se—de-s r±b±ó— x"ev ameTTte " Preferiblemente, las composiciones terapéuticas de la presente invención incluyen al menos un agente condroprotector que promueve la actividad anabólica del cartílago y al menos un agente que inhibe el catabolismo del cartílago. Se espera que esta combinación optimice los estados para la homeostasis y que se prefiera con respecto a las terapias convencionales que se ocupan solamente de la degradación del cartílago o sobre la investigación más reciente para desarrollar fármacos que se ocupan solamente de la síntesis del cartílago. Los adecuados agentes promotores del anabolismo y agentes inhibidores del catabolismo se han descrito anteriormente para su administración local y también se espera que sean útiles para las presentes composiciones sistémicas. Los aspectos y ventajas de las composiciones de la presente invención que se describen anteriormente con respecto a la administración local se entiende que también pueden aplicarse, hasta el punto de lo aplicable, a las modalidades sistémicas de la invención. Por lo tanto, las composiciones condroprotectoras de la presente invención pueden incluir adecuadamente uno o más de los siguientes agentes promotores del anabolismo, a manera de ejemplo no limitante: agonistas de interleucina (IL) (por ejemplo, agonistas de IL-4, IL-10, IL-13) , miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante ß, incluyendo agonistas TGF-ß (por ejemplo, TGFpi, TGFp2, TGF 3) y agonistas de la proteína morfogenética del hueso (por -e^-emp-l-er—BM-P—2- —BM-P—- —B P—6 —???-?-,—f¾crto es—de-cre^litrierTto similares a insulina (por ejemplo, IGF-1) , y factores de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, bFGF) , y fragmentos, deleciones, adiciones, sustituciones de aminoácidos, mutaciones y modificaciones que retienen las características biológicas de estos agentes que ocurren naturalmente . Las composiciones condroprotectoras de la presente invención pueden incluir adecuadamente uno o más de los siguientes inhibidores del catabolismo del cartílago, a manera de ejemplo no limitante: antagonistas del receptor IL-1, antagonistas del receptor TNF-a, inhibidores específicos de ciclooxigenasa-2 , inhibidores MAP cinasa, inhibidores de óxido nítrico sintasa, inhibidores del factor nuclear kB, inhibidores de la metaloproteinasas de matriz, moléculas de adhesión celular (incluyendo agonistas y antagonistas de integrina) que inhiben el catabolismo del cartílago, inhibidores de la señalización intracelular (incluyendo inhibidores de la proteína cinasa C e inhibidores de la proteína tirosina cinasa) que inhiben el catabolismo del cartílago e inhibidores de los dominios SH2 que inhiben el catabolismo del cartílago. Como se describe con respecto a las modalidades previas, al menos un inhibidor del catabolismo del cartílago en la combinación de agentes anabólicos sistémicos/inhibidores del catabolismo puede ser un receptor soluble que inhiba el catabolismo del cartílago, como un r-eeept-ar—so-l-ubie—ü¡~±—o—un—r ceptox—sol'ublre d¾~l factor de necrosis tumoral. Los ejemplos específicos incluyen receptores solubles de IL-1 humana recombinante, receptores solubles del factor de necrosis tumoral y rhTNFR:Fc quimérico. Los ejemplos de factores de necrosis tumoral solubles útiles para incorporarse en la presente invención incluyen antagonistas funcionales de TNF-a descritos en la Patente de EE.UU. Núm. 5,605,690 otorgada a Jacobs y col., mientras que los ejemplos de receptores solubles de IL-1 de humano útiles en la presente invención incluyen aquellos descritos en la Patente de EE.UU. Núm. 6,159,460 por Thompson y col., sus descripciones se incorporan expresamente por referencia. Los inhibidores catabólicos particularmente prometedores útiles para combinarse con agentes anabólicos para su administración sistémica de conformidad con este aspecto de la invención incluyen IL-lra, y proteína de fusión TNFRl-IgGl e inhibidores de las metaloproteinasas de matriz. Como se describe aún más a continuación, las composiciones condroprotectoras también pueden incluir uno o más inhibidores del dolor y/o inflamación u otros agentes terapéuticos. Los ejemplos de composiciones condroprotectoras adecuadas para la administración sistémica se proporcionan en los siguientes Ejemplos 5 a 20.
C. ADMINISTRACIÓN SISTÉMICA El presente aspecto de la invención concierne a la administración sistémica de los agentes condroprotectores y tos— g-entre-s^p-o-te-n-e-i-a-lment-e— arc i±rr£±emartvrr±O-s—y/o—analgesleos u otros agentes terapéuticos para proporcionar asi un efecto terapéutico en múltiples sitios articulares. Como se utiliza en la presente, el término "administración sistémica" pretende incluir pero no limitarse a la administración oral, intramuscular, subcutánea, intravenosa, inhalada, sublingual, bucal, tópica, transdérmica, nasal y otras rutas de administración que resulten efectivamente en la dispersión del agente suministrado en uno solo o en múltiples sitios para la acción terapéutica que se pretende. Las rutas preferidas de administración sistémica para las presentes composiciones son la intravenosa, intramuscular, subcutánea e inhalada. Se apreciará que la ruta exacta de administración sistémica para los agentes seleccionados utilizados en las composiciones particulares de la presente invención se determina en parte para dar razón de la susceptibilidad de la gente a las vías de transformación metabólica asociadas con una ruta determinada de administración. Por ejemplo, los agentes peptidérgicos pueden administrarse mejor por rutas diferentes a la oral. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse sistémicamente periódicamente a intervalos determinados para mantener el nivel deseado de efecto terapéutico. Por ejemplo, las composiciones pueden administrarse mediante inyección subcutánea cada dos a cuatro semanas. El programa de dosificación se determinará por el médico que considere los diversos factores que pueden influir sobre—1-a—a-ceión—úe—1-a—combinación de agentes.—Erstros—factores pueden incluir el sitio del cartílago que se pretende tratar, el tamaño de la articulación (si es apropiado) , la cantidad de tejido cartilaginoso que se va a tratar, el sitio del daño al cartílago, el estado del cartílago dañado al momento del tratamiento, la edad, sexo y peso del paciente y otros factores clínicos. La dosificación para cada agente individual puede variar como función de los demás agentes anabólicos e inhibidores del catabolismo que se incluyen en la composición, así como de la presencia y naturaleza de cualquier vehículo de administración del fármaco (por ejemplo, un vehículo de administración de liberación prolongada, además, la cantidad de la dosificación puede ajustarse para dar razón a la variación en la frecuencia de administración y el comportamiento farmacocinético de los agentes administrados. El progreso en el tratamiento de un paciente puede monitorizarse mediante una variedad de métodos conocidos por los expertos, incluyendo la evaluación clínica, imágenes radiográficas y de resonancia magnética, tomografía computarizada, marcadores bioquímicos y evaluación artroscópica .
D . VEHÍCULOS DE ADMINISTRACIÓN Y ESPECIFICIDAD HACIA EL OBJETIVO Se conocen métodos para combinar composiciones para diversas rutas de administración sistémica y pueden adaptarse para usarse con las presentes composiciones. Los agentes condroprotectores y, si se incluyen, los agentes inhibidores de—-la—i-ftf-l-a-ma-e-ión.— — &ío-r—a—o ros—agente-s—texapéutTCüs—sé combinan en forma adecuada dentro de un vehículo de administración o portador fisiológico, como los descritos previamente, según sea apropiado para una ruta determinada de administración sistémica. En un aspecto de la presente invención, la administración sistémica de estas combinaciones de agentes o de cualquier componente o componentes de la misma pueden incorporarse o combinarse con un vehículo para la administración del fármaco como podría ser un vehículo de administración de liberación prolongada y/o depot. Como se utiliza en la presente, el término "vehículo de administración" pretende incluir todas las estructuras que contienen, se unen o transportan un agente terapéutico como nanoesferas y nanopartículas, microesferas y otras micropartículas, micelios y liposomas, incluyendo los vehículos formados de proteínas, lípidos, carbohidratos, compuestos inorgánicos y orgánicos sintéticos. Los vehículos de administración preferidos para las composiciones sistémicas con especificidad de objetivo de la presente invención, que se describen a continuación, son "partículas" que pretenden incluir nanoesferas y otras nanopartículas, microesferas y otras micropartículas, micelios y otros vehículos de administración pero excluyen liposomas que son menos preferidos debido a lo que a continuación se expone. En esta descripción el término "sistema de administración" pretende referirse a un vehículo de administración y uno o más agentes terapéuticos contenidos o unidos al mismo. E-1 '-fcé-r-m-i-n-o "s-is-tema de M-bera-ci-óri—p-rolrongada-"- pretende significar un sistema de administración que proporciona para una administración prolongada, potenciada o regulada la duración o disponibilidad de cualquiera o todos los agentes incorporados. Los ejemplos de sistemas de liberación prolongada incluyen pero no se limitan a las microparticulas, microesferas, nanoparticulas, proteínas, liposomas, carbohidratos, compuestos inorgánicos y compuestos orgánicos sintéticos e hidrogeles inyectables que contienen el fármaco como los descritos por la Solicitud de Patente de EE.UU. Número de Serie 09/861,182 por Jun Li y col., expresamente incorporada en la presente como referencia. Los sistemas de liberación prolongada adecuados son conocidos por otros farmacéuticos y pueden adaptarse de conformidad con la presente invención para administrar agentes condroprotectores a un nivel terapéutico relativamente consistente, reduciendo asi los efectos secundarios y proporcionando una mayor duración de acción en comparación a la administración sistémica en un bolo de los agentes. El término "depot" como se utiliza en la presente pretende significar un sistema de administración de fármacos, que se administran en el sitio de acción pretendido o a distancia de sitio de acción pretendido, que proporciona una reserva de agentes terapéuticos para su liberación prolongada . Los agentes individuales pueden combinarse en una mezcla homogénea, pueden ser una mezcla o administrarse en administrarse concurrentemente y separadamente. A fin de minimizar los efectos sistémicos adversos o indeseados, en este aspecto de la invención, una estrategia terapéutica es administrar la combinación de agentes en un vehículo de administración que preferiblemente tenga como objetivo un sitio o sitios en el cuerpo que contengan cartílago, particularmente las articulaciones. Como se utiliza en la presente, un "vehículo de administración con especificidad hacia el objetivo" es un vehículo de administración que puede utilizarse para la administración sistémica de un fármaco y que se adapta de tal manera, que una mayor cantidad de fármaco alcanza la articulación o el sitio local deseado de acción que de otra forma alcanzaría la articulación o el sitio local deseado de acción usando un vehículo de administración no adaptado o en ausencia de éste (es decir, el fármaco preferiblemente se localiza en la articulación debido a que el vehículo de administración con especificidad de objetivo preferiblemente se asocia con moléculas, células o estructuras anatómicas de la articulación) . Asimismo, un "sistema de administración con especificidad hacia el objetivo" es un vehículo de administración con especificidad hacia el objetivo que contiene uno o más fármacos terapéuticos. Un "fármaco con especificidad hacia el objetivo" pretende referirse a un agente terapéutico que esta directamente vinculado o acoplado a una estructura objetivo. Como se utiliza en la presente, un fármaco—s--st-ém±camente— dmi-ni-s-trado—que—tenga un ""efecto preferencial" en una articulación o sitio de acción local deseado muestra una mayor actividad farmacológica en la articulación o sitio de acción local deseado que la mayoría de los demás sitios en el cuerpo. 1. FUNDAMENTOS DE LA ESPECIFICIDAD HACIA EL OBJETIVO En OA, puede haber ya sea una supresión de la función normal de condrocitos o la inhabilidad constitutiva de estas células para igualar la velocidad de reparación con la mayor velocidad de degradación de la matriz. Se ha demostrado que diversas citocinas y mediadores inflamatorios crean un desbalance de la función sistémica de los condrocitos o alternativamente, incrementan el catabolismo de la matriz del cartílago al regular en forma acelerada las diversas enzimas degradantes de la matriz, incluyendo las metaloproteinasas de matriz (que incluyen las colagenasas) . Por lo tanto, la pérdida de integridad de la matriz extracelular del cartílago (CEM por sus siglas en inglés) es el resultado de un desbalance dinámico entre las actividades sistémicas de los procesos anabólicos del cartílago y las actividades catabólicas que conllevan a su degradación. La administración sistémica de citocinas, factores de crecimiento y otras moléculas bioactivas está comúnmente asociada con efectos secundarios serios. Por ejemplo, los efectos patológicos han sido correlacionados con la administración de TGF-ß? sistémico y otros factores. Además, 1¾—a^-nrstr-a-e-rón—sirstémi a—de—un—pc±±p¾pt±do—nro—pT^tegíclc7 (desnudo) , normalmente preferido para las artropatías, poliarticulares como se mencionó previamente, está f ecuentemente limitado por problemas de estabilidad de los agentes proteicos debido a la rápida degradación e inactivación de la proteina terapéutica en la circulación. La degradación del cartílago articular en OA y RA esta probablemente relacionado a la síntesis y liberación de factores catabólicos en el microambiente de la articulación. Estudios previos han demostrado que las citocinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-1) y genes inducibles (por ejemplo, NO sintasa, COX-2, MMPs) se expresan en alto grado dentro de las membranas sinoviales de pacientes con artritis inflamatoria. Igualmente, estos mediadores y genes frecuentemente se expresan en condrocitos afectados por OA. En ambos casos, es un microambiente especializado de la articulación lo que define el ambiente patofisiológico que afecta críticamente el estado del cartílago articular. Debido a esto, se desea apuntar con especificidad de objetivo las moléculas terapéuticas para localizar preferiblemente y actuar sobre sus objetivos pretendidos dentro del espacio articular. Este aspecto de la invención proporciona un mecanismo para apuntar con especificidad de objetivo un agente condroprotector anabólico y/o un agente condroprotector inhibidor del catabolismo administrados sistémicamente y preferiblemente ambos, en la articulación para la protección del cartílago de la misma. Una— uta—de—admrrri^traci-ón—prefer±da—es—apun~ta~r" estos factores proteicos al sitio de acción en la articulación. Para lograr un uso clínico, se necesita un método seguro para la administración de estos agentes dentro de las articulaciones de pacientes en forma sostenida y localizada. También se desea un vehículo biodegradable de administración del fármaco que proteja como estabilice los factores anabólicos y/o factores inhibidores del catabolismo administrados sistémicamente mientras se encuentran fuera de la articulación y que simultáneamente proporcione un método sin igual para apuntar el vehículo de administración del fármaco a la articulación. Los factores anabólicos de crecimiento del cartílago son potentes mediadores que se secretan por el cuerpo localmente dentro de la articulación en cantidades minúsculas para provocar las respuestas biológicas locales en el cartílago articular. En condiciones fisiológicas normales, se producen los factores de crecimiento anabólico apropiados mediante los condrocitos dentro del cartílago y los sinoviocitos dentro de otras estructuras articulares a concentraciones suficientes para servir como la señal necesaria para mantener el cartílago en un estado estable y sano al influir en el metabolismo de la matriz cartilaginosa. 2. VEHÍCULOS DE ADMINISTRACIÓN CON ESPECIFICIDAD HACIA UN ANTICUERPO Una composición condroprotectora con especificidad de objetivo preferida de la presente invención incluye al meaos—-n—a-gen-te—e©nd e-p-ro-tee-to-r-^>romo-tor—dei—arratro- smO—y o al menos un agente condroprotector inhibidor del catabolismo, y de preferencia, tanto un agente condroprotector promotor del anabolismo como un agente condroprotector inhibidor del catabolismo, contenidos dentro de un vehículo de administración con especificidad de objetivo. El vehículo de administración con especificidad de objetivo de preferencia comprende partículas y con mayor preferencia nanopartículas que encapsulan al menos uno y preferiblemente todos los agentes condroprotectores . Las partículas se apuntan con especificidad de objetivo hacia la articulación mediante un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo con especificidad de objetivo que se une a la partícula, este anticuerpo o fragmento es específico para una determinante antigénica que se ubica dentro de la articulación (es decir, preferiblemente se expresa dentro de la articulación en relación con la mayoría de las demás ubicaciones dentro del cuerpo, de preferencia, tiene una elevada expresión dentro de la articulación, y con mayor preferencia se restringe a una expresión dentro de la articulación) . Las partículas con especificidad de objetivo-anticuerpo, las que también se llaman "inmunopartículas con especificidad hacia el objetivo" y los agentes condroprotectores encapsulados ahí se administran sistémicamente . Una porción de la composición con especificidad de objetivo es captada por la articulación. El resto de la composición se excreta y/o metaboliza. Dentro de la articulación, los fragmentos o anticuerpos con e-speerf-i~e-idad—ée—ob^-e-t-i-vo—se—unen—a-1—arrtrgeno—o~bj~etxvo Durante un período de tiempo, las partículas se degradan dentro de la articulación, administrando una concentración terapéutica de los agentes condroprotectores localmente dentro de la articulación en forma de liberación prolongada durante un período de tiempo predeterminado para actuar localmente sobre las células que se van a regular (por ejemplo, las células primarias de la articulación) incluyendo los sinoviocitos y los condrocitos. Los agentes terapéuticos pueden difundirse o liberarse en el líquido sinovial para unirse subsecuentemente a las superficies de las células de las estructuras de la articulación, experimentar captación o absorción dentro de las células de las estructuras de la articulación o actuar directamente sobre citocinas y/o proteasas que puedan estar presentes dentro del líquido sinovial. Las composiciones con especificidad hacia el objetivo de este aspecto de la presente invención pueden apuntarse hacia las articulaciones de un paciente de conformidad con la presente invención, sin conocimiento de la patología molecular específica que subyace a la enfermedad articular. El anticuerpo con especificidad hacia el objetivo asegura que los agentes encapsulados se ubiquen preferiblemente dentro de la articulación y con mayor preferencia se ubiquen cerca de o se unan a un constituyente del cartílago articular. Por lo tanto, este aspecto de la presente invención p-r-epo-r i-ona—un—mé-trodo—pa-r-a—t-r-a-t-a-r—pa-eien-tes—que—sufren—cíe" enfermedades inflamatorias, no inflamatorias o de la articulación que implican una o varias articulaciones mediante la administración de una preparación farmacéutica que incluye un vehículo de administración de un fármaco con especificidad hacia el objetivo, preferiblemente que contenga tanto el agente anabólico para el cartílago y un agente anticatabólico para el mismo. Estos pacientes pueden sufrir de OA, RA u otras enfermedades de la articulación como artritis no inflamatoria e inflamatoria, incluyendo, pero no limitándose a, artropatía neuropática, fiebre reumática aguda, ocronosis, lupus sistémico eritematoso, artritis reumática juvenil, artritis psoriática, espondilitis anquilosante y otras artropatías cristalinas y espondiloartropatías . Los métodos del tratamiento con especificidad hacia el objetivo y sus composiciones de la presente invención están particularmente bien adaptadas para los pacientes que sufren de osteoartritis . La administración sistémica de la combinación de agentes en un portador que se apunta hacia la articulación permite el tratamiento de estos estados mientras que minimiza los efectos sistémicos adversos o indeseados.
A. CARACTERÍSTICAS E IDENTIFICACIÓN DE OBJETIVOS DENTRO DE LA ARTICULACIÓN La presente invención proporciona métodos y composiciones para apuntar fármacos hacia la articulación y especifica los objetivos preferidos dentro de la misma ifteirtiyende -tas determinantes antigénieas a-soc-ra-da-s can moléculas, células y tejidos del cartílago articular y otras estructuras de la articulación. Los ejemplos de estos objetivos se seleccionan a partir de: colágenos, incluyendo colágeno Tipo II y los colágenos menores Tipo V, VI, IX, X y XI; proteoglicanos incluyendo los proteoglicanos agregantes grandes, agrecano, decorina, bigliclano, fibromodulina y lumicano; proteína de matriz oligomérica del cartílago, glicoproteína-39; sulfato de condroitina y proteoglicano y glicosaminoglucanos ; sinoviocito macrófago y sinoviocito fibroblasto y condrocitos. En una modalidad preferida, las inmunopartículas con especificidad hacia el objetivo reaccionan irreversiblemente, se unen en forma reversible o se asocian con componentes específicos del cartílago articular (también conocido como cartílago hialino) dentro de la articulación. Otros objetivos moleculares dentro de la articulación pueden incluir componentes dentro del cartílago articular de la matriz extracelular como los colágenos específicos del cartílago, incluyendo colágeno Tipo II, V, VI, IX, X y XI, agrecano y otros pegueños proteoglicanos ricos en leucina incluyendo decorina diglicano, fibromodulina y lumicano. Los proteoglicanos son complejos de elevado peso molecular de proteínas y polisacáridos y se encuentran en todos los tejidos estructurales de los vertebrados como el cartílago pero también están presentes en la superficie de la célula. Los glicosaminoglicanos (GAG) , las unidades de polisacárido en—-tes— ret-eegHeaños-;—son—polrtme os—de—drsacáx dO's—acídlcos que contienen derivados de amino azúcares de glucosamina o galactosamina y son objetivos útiles. La proteína de matriz oligomérica del cartílago (COMP) y glicoproteína-39 (HC-gp39), también llamada YKL-40 son igualmente objetivos útiles. El cartílago articular contiene varios tipos genéticamente distintos de colágeno que son útiles en la presente invención como objetivos moleculares a los cuales las inmunopartículas , incluyendo los anticuerpos correspondientes, pueden unirse permitiendo así la administración de los agentes terapéuticos encapsulados al sitio de la unión del anticuerpo. El colágeno Tipo II, el colágeno primario del cartílago articular, da razón del 90% a 95% de la cantidad total del colágeno del cartílago articular o hialino y forma la estructura fibrilar interligada que se observa en la microscopía electrónica. El colágeno Tipo II también es un marcador único y específico del cartílago hialino. Hollander y col., J. Clin. Invest. 93:1722 (1994); Freed, L y col., Exp. Cell Res. 240:58 (1998). Una principal modificación extracelular de las moléculas de colágeno, que ocurre después de la formación de fibrila, es el desarrollo de entrecruzamientos covalentes interfibrilares . Los anticuerpos que se unen a los epítopos específicos para el colágeno Tipo II se han descrito. Kafienah., W. y col., Tissue Engineering 8:817-826 (2002); kolettas, E, y col., Rheumatology 40:1146-1156 (2001). El colágeno Tipo II y sus epítepes—a-soe-i-ad-o-s—en—ei—esr-tüago—axti-cui-a-r-^ep ¾_s¾TTl¾rr~los" objetivos preferidos para la presente invención. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal para el colágeno Tipo II isotipo IgGi, designado como clon 6B3 (Linsenmayer, T.F. y col., Biochem. Biophys . Res. Commun . 92(2): 440-6 (1980)) reconoce tanto a las cadenas al (II) como a las a3(XI) que tienen estructuras primarias idénticas. En una transferencia Western, éste mAb reacciona con el fragmento TCA del colágeno latirítico Tipo II después de la digestión con la colagenasa de mamífero. También reacciona con colágeno Tipo II digerido con pepsina. Su epítopo se ubica en la triple hélice del colágeno Tipo II y no muestra entrecruzamiento con el colágeno Tipo I o Tipo III. La inmunotransferencia de péptidos de bromuro de cianógeno (CNBr) de colágeno II muestra que este mAb reacciona con el fragmento CB11, el cual es el sitio de los epítopos inmunogénicos a lo largo de la molécula intacta Tipo II. Incluso en otro ejemplo, un anticuerpo monoclonal de colágeno Tipo II (isotipo IgGi) (Miller, E.J., Biochemistry 11:4903-4909 (1972); Glant, T.T., y col., Histochemistry 82:149-158 (1985a); British Journal of Haematology 90:757-766 (1995)) se desarrolló usando cartílago de humano específico para colágeno II escindido con CNBr como el inmunógeno. Este mAb, comercializado por Chemicon International (Temecula, CA) , reacciona con el colágeno Tipo II de bovino y humano solubilizado con pepsina y escindido con CNBr. No se observa reactividad cruzada con el colágeno Tipo—1- ?-?- —V—y— —En—una—modax dad—preíeTída de Ta" presente invención, el anticuerpo contra el colágeno Tipo II se une al epitopo con una constante disociativa en el intervalo de 0.1-10 nM. Los colágenos cuantitativamente menores del cartílago articular también contribuyen a la estructura de la matriz y sirven como objetivos útiles para la presente invención. Por ejemplo, el colágeno Tipo IX, un colágeno corto no fibrilar (que contiene una cadena de glicosaminoglicano y por lo tanto se considera un proteoglicano) se une covalentemente a las fibrillas de colágeno Tipo II y ayudan a enlazar a las fibrillas o enlazar las fibrillas a otras moléculas de matriz. El colágeno Tipo XI, un colágeno menor fibrilar, puede estar involucrado en regular el diámetro de las fibrillas Tipo II. Otros colágenos, incluyendo los del Tipo V y Tipo VI también pueden formar parte de la matriz. Estos colágenos menores del cartílago articular también pueden funcionar como objetivos para la inmunopartícula dirigida hacia el anticuerpo que se une con anticuerpos apropiados. En otra modalidad de la invención, los distintos tipos de proteoglicanos contenidos en el cartílago articular son útiles en la presente invención como objetivos moleculares para la unión de inmunopartículas, permitiendo así la administración de agentes terapéuticos al sitio de unión del anticuerpo. En el cartílago articular, los proteoglicanos constituyen la segunda porción más grande de f-as-e—s-éü-d-a-7—eon-s^i-t-u-yendo—un—5-%—a—?-?-%—de —pers'o—e —humedo Los proteoglicanos de la matriz cartilaginosa consisten principalmente de grandes proteoglicanos agregantes (50% a 85%) y no agregantes (10% a 40%) . También están presentes los distintos proteoglicanos pequeños. Los proteoglicanos de cartílago que contribuyen con mayor significado a las propiedades del material del tejido son grandes monómeros de elevado peso molecular (peso molecular, 1-4 X 106) . Estructuralmente , los grandes proteoglicanos consisten de un núcleo proteico extendido con varias regiones distintas: una región N-terminal con dos dominios globulares (Gl y G2 ) , un dominio rico en sulfato de queratano; un dominio más largo rico en sulfato de condroitina que también puede contener algunas cadenas intercaladas de sulfato de queratano y oligosacárido neutro y un dominio globular C-terminal, G3. Los agregados se forman por varios monómeros de proteoglicano que se unen a una cadena de hialuronato en el dominio globular Gl. Cada enlace de proteoglicano-hialuronato es estabilizado por una proteina enlazante globular separada (peso molecular 41,000 a 48,000). El gran tamaño de la región rica en sulfato de condroitina (200-400 nm) y la abundancia de cadena del agregado proteoglicano y sulfato de condroitina hacen de éste un objetivo preferido para las inmunoparticulas con especificidad del objetivo del aspecto de la invención. Un objetivo adicional para los anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen a las inmunoparticulas de—ta— -r- s-en-be—i-n-v-eneién—se^ropo-rciona— or—He—gp=3--—Dentro de la articulación, los fragmentos de HC gp-39 que tienen las propiedades antigénicas apropiadas también son suficientes para apuntar el vehículo de administración del fármaco. Las inmunopartículas pueden apuntarse con especificidad hacia el objetivo con anticuerpos o fragmentos de los mismos para reaccionar irreversiblemente, ligarse en forma reversible (la más común) o asociarse con estructuras específicas de la membrana sinovial de la articulación. Las células especializadas de la articulación que son los objetivos preferidos incluyen dos principales tipos celulares de la membrana sinovial, sinoviocitos macrófagos (Tipo A) y sinoviocitos fibroblasto (Tipo B) . Los objetivos adicionales para anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen a las inmunopartículas de la presente invención son los condrocitos. Se sabe que estas células expresan para una variedad de proteínas que están presentes sobre sus superficies y que pueden servir como epxtopos con especificidad hacia el objetivo celular. En otra modalidad de la invención, el proteoglicano de sulfato de condroitina asociado con el cartílago articular representa un objetivo preferido para un sistema de administración del fármaco con especificidad hacia el objetivo. Los anticuerpos monoclonales útiles para la presente invención que se ligan a los epítopos específicos para el proteoglicano de sulfato de condroitina también han sido descritos. Morgan Jr., A. y col., Hybridoma 1:27-36 (4.-3-8-1-)-;—S&fr-a r^^y-eei^ Schrappe, M. y col., Cáncer Res. 51:4986-93 (1991) . Uno de estos ejemplos es un anticuerpo monoclonal de proteoglicano de sulfato de condroitina antihumano de ratón, el clon designado es 9.2.27 (isotipo IgG2a) ¦ El anticuerpo 9.2.27 reconoce la glicoproteína madura del núcleo de proteoglicano de sulfato de condroitina con un peso molecular de 250 kDa así como los polipéptidos precursores de 210, 220 y 240 kDa. Un anticuerpo monoclonal de agregano antihumano de ratón, clon 2A2.1, también es adecuado para la presente invención y se comercializa por United States Biological (Swampscott, MA) . Este anticuerpo no reacciona con las regiones de unión del sulfato de condroitina. La microscopía electrónica de transmisión indica que se une dentro de la porción N-terminal de la región de unión del sulfato de condroitina.
B. ESPECIFICIDAD DE OBJETIVO HACIA NEOEPITOPOS ASOCIADOS CON LA DEGENERACIÓN DEL CARTÍLAGO Los constituyentes biomoleculares del cartílago que pueden ya sea estar ausentes del cartílago normal de adulto o presentes a niveles muy bajos, pero que están a niveles elevados o que se expresan más en ciertas etapas de RA ó OA, también pueden servir como objetivos para el sistema de administración de fármacos con especificidad hacia el objetivo de la presente invención. Los objetivos preferidos asociados con los estados degenerativos del cartílago son los neoepítopos que aparecen en el cartílago articular de p-a-eiente-s—dd-agrro-s-t ca-do-s—con—&Pr,—RA—u—crtrars—e~rrfermedades degenerativas de la articulación, como los neoepitopos de agrecano u otros proteoglicanos del cartílago y específicamente los neoepitopos que están inmunolocalizados en la capa superficial del cartílago articular de estos pacientes. En un aspecto de la invención, los fragmentos de anticuerpo o anticuerpos con especificidad hacia el objetivo se unen específicamente a los neoepitopos o sitios de escisión de colágeno Tipo II o fragmentos de colágeno Tipo II, particularmente estos neoepitopos o sitios de escisión generados por la acción individual o combinada de la metaloproteinasa de matriz ( MP)-l, 3, 8 ó 13, u otros miembros de la familia de proteínas MMP, un miembro de A Desintegrina y Metaloproteinasa con la familia de proteínas de pequeños elementos estructurales que son reconocibles en varias proteínas como segmentos invariables de la secuencia de trombospondina (ADMATS) . Los ADMATS se describen aún más en las Solicitudes de Patente O 00/04917, EP 0 823 478 y EE.UU. 5, 811, 535 y en Tang, B. y col., FEBS Lett. 445 (2-3) :223-225 (1999) . Los anticuerpos dirigidos a epítopos específicos que se definen por regiones especificadas de la estructura de colágeno Tipo II son útiles para composiciones con especificidad hacia el objetivo de esta invención. Estas regiones estructurales son, parcialmente, importantes para el cartílago afectado por la degradación del colágeno Tipo II qtte—ocurre— n—T?——EA~.—La—degradacrón—del-coíágenO-TIpo TT~da' como resultado fragmentos de proteína de colágeno que se derivan de la matriz cartilaginosa y aparecen en el líquido sinovial, se mueven hacia la circulación y se eliminan a través de la orina. Para tener una máxima utilidad, las composiciones de la presente invención tienen especificidad de objetivo hacia epítopos que permanecen físicamente asociados con la matriz del cartílago en vez de fragmentos liberados . Cada una de las colagenasas, MP-1 (EC 3.4.24.7), MMP-8 (EC 3.4.24.34), y MMP-13 (EC 3.4.24.-) tienen la capacidad de escindir el colágeno Tipo II que forma la fibrilla de triple hélice, dando lugar a un fragmento grande aminoterminal (longitud 3/4) y un fragmento más pequeño carboxiterminal (longitud H) . Kafienah, . y col., Biochem. J. 331:727-732 (1998). Todos escinden inicialmente en un enlace específico Gly-Leu/Ile para generar los fragmentos característicos ¾ y . Los isotipos específicos de colaginasa han sido implicados en la pérdida patológica del cartílago. Billinghurst, R. y col., J. clin Invest. 99:1534-1545 (1997). Por ejemplo, en un modelo experimental en animal de OA las áreas focales de proteínas de colagenasa I y colagenasa 3 han sido localizadas en la matriz extracelular de los sitios de lesión por OA en la articulación de la rodilla, lo que coincide con la escisión de colágeno ¾ - . La proteína de colagenasa 3 también es abundante a través del cartílago medial de la tibia en las articulaciones enfermas. Huebner, ¦ -^y-e& -r-Art r±ti -&-Rhei^^ Se ha detectado la colagenasa 1 (MMP-1) en la membrana sinovial, líquido sinovial y muestras de cartílago de humanos con RA y OA. La colagenasa 3 (MMP-13) escinde el colágeno Tipo II a una velocidad que es 5-10 veces más rápida que la colagenasa 1. De modo significativo la MMP-13 ha sido identificada en la membrana sinovial de humanos con RA y OA, así como en el cartílago de humanos con OA. El colágeno fibrilar puede dañarse debido a una escisión helical, lo que resulta en la desnaturalización o mediante una escisión telopeptídica, lo que conlleva a la eliminación de las reticulaciones. Dos estudios han demostrado la presencia de colagenasas activas en el cartílago con antisuero policlonal específico para epítopos crípticos dentro de la región helical del colágeno Tipo II, que se exponen al momento del desdoblamiento del colágeno debido a la escisión de la colagenasa, y para un neoepítopo de colágeno generado por la colagenasa. Estos descubrimientos indican que la colagenasa 1, colagenasa 3 ó ambas, están involucradas en la degradación del cartílago asociada con varios tipos de artritis. Por lo tanto, la degradación específica del colágeno Tipo II mediante la escisión de la colagenasa forma neoepítopos para poder apuntar con especificidad hacia el objetivo los anticuerpos que son útiles para los aspectos específicos hacia el objetivo de la invención. Estos neoepítopos están ubicados dentro de la secuencia del fragmento ¾ N-terminal de la cadena alfa 1 (-? -*—¾ue—se—sabe—e©n-t-i-e-ne—epi-topos—pa-ra—??1t2?3 — —CBTTB" (reconocidos por el anticuerpo C0L2- m) . En la artritis, el incremento del catabolismo del proteoglicano y agrecano del cartílago es uno de los principales procesos patológicos que conlleva a la degeneración del cartílago articular. La pérdida consecuente de los glicosaminoglucanos sulfatados, que son componentes intrínsecos de la molécula de agrecano, compromete tanto la integridad funcional como estructural de la matriz del cartílago. Durante un período de tiempo, este proceso conlleva a la degradación del cartílago. La degradación in situ de agrecano es un proceso proteolítico que involucra la escisión de los enlaces peptídicos específicos ubicados dentro de la proteína del núcleo. Las actividades enzimáticas mejor caracterizadas que contribuyen en este proceso son el resultado de una acción específica de las metaloproteinasas . La agrecanolisis in vitro por las metaloproteinasas de matriz (MMP) ha sido ampliamente estudiada. Sin embargo, ahora se sabe bien que las proteinasas principales responsables de la degradación del agrecano in situ en el cartílago articular son las agrecanasas, dos isoformas recientemente identificadas las cuales son miembros de la familia de genes de A Desintegrina y Metaloproteinasa con pequeños elementos estructurales reconocibles en varias proteínas de trombospondina (ADAMTS) . Las tecnologías de anticuerpos monoclonales existen para identificar los neoepítopos novedosos de agrecano o productos de la degradación del ag--eGa-?-?t—Más—a-úfi7—& EQ—a-s-peeto—de—e-s-t-a—tn-v nc-rón— s-eir-u~s~o~ de estos anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos que se unen a neoepitopos en agrecano o fragmentos de agrecano para apuntar hacia nanoparticulas que contienen una combinación del agente anabólico promotor y un inhibidor catabólico. Los estudios temporales han establecido que las agrecanasas son principalmente las responsables del catabolismo y pérdida del agrecano del cartílago articular en las etapas tempranas de enfermedades artríticas de la articulación. Aunque es algo continuo este proceso aparece principalmente precediendo el catabolismo del colágeno. En una etapa posterior de este proceso de enfermedad, cuando ocurre el catabolismo del colágeno, existe evidencia de una degradación mediada por MMP de la pequeña porción de agrecano que permanece en el cartílago. Ha sido posible desarrollar y usar tecnologías de anticuerpos monoclonales para identificar los neoepitopos catabólicos sobre los productos de la degradación proteolítica para identificar los sitios específicos de escisión que son únicos y característicos de las diferentes familias de enzimas degradantes de la matriz. En estos estudios, se caracterizaron varios anticuerpos monoclonales que identifican específicamente los neoepitopos catabólicos (nuevos epítopos formados en secuencias específicas de aminoácidos N- ó C-terminal del producto de escisión proteolítica) que se generan mediante la acción de las a-g-reea-na-sa-s—fó—MMPs~)—e —ed—domxrrro—rnt rg~to-bul~aT (TGD~) del" agrecano. Estos anticuerpos se han utilizado para monitorear la proteólisis de agrecano y proteínas de unión. Más aún, los expertos en la técnica reconocen que el uso de anticuerpos que reconocen neoepítopos en productos de degradación de las proteínas de matriz generados durante el catabolismo del cartílago pueden utilizarse para apuntar inmunopartículas hacia la articulación, sin apartarse del alcance de la invención . En otro aspecto de la invención, los fragmentos de anticuerpo o anticuerpos con especificidad hacia el objetivo se unen específicamente a los neoepítopos o sitios de escisión de agrecano o sus fragmentos con el cartílago, particularmente estos neoepítopos o sitios de escisión generados por la acción individual o combinada de MMP-l, 3, 8 ó 13 u otros miembros de la familia de proteínas MMP o un miembro de la familia de proteínas ADMATS. Los ejemplos de anticuerpos monoclonales que reconocen diferentes neoepítopos o epítopos estructurales con agrecano o sus fragmentos son 8-A-4 ó BC-3. El MAb 2-B-6 ha sido utilizado para detectar la gran cantidad de productos de degradación del agrecano que resulta ya sea de agrecanasa, MMP u otras actividades proteolíticas en varios sitios a lo largo de la proteína nuclear del agrecano. El MAb 2-B-6 reconoce a los disacáridos insaturados 4-sulfatados de sulfato de condroitina que se unen a estos fragmentos de proteína nuclear. Un anticuerpo de proteína relacionado, Mab 3-8-3 también se ha utilizado para iden^i-fi a-r ÍQ-S dife-rent s meira-boi-irtos de agrecano desglicosilado que contienen oligosacáridos de sulfato de condroitina 6-sulfatada. El MAb BC-3 reconoce la secuencia de neoepítopo N-terminal definida por la secuencia de aminoácidos, alanina-arginina, glicina (ARGxx...) generados después del catabolismo de agrecanasa dentro del dominio IGD de agrecano. El gen ADAMTS-4 (Genbank NM-005099) y el gen ADAMTS-5 (Genbank 007038) codifican para una desintegrina y una metaloproteinasa con pequeños elementos estructurales que son reconocibles en varias proteínas 4 y 5 de trombospondina, que son miembros de la familia de proteínas ADAMTS, los miembros de esta familia comparten varios módulos distintos de proteínas, incluyendo una región de propéptido, un dominio de metaloproteinasa, un dominio similar a desintegrina y un pequeño elemento estructural reconocido en varias proteínas (TS) de trombospondina Tipo 1. Los miembros individuales de esta familia difieren en la cantidad de pequeños elementos estructurales reconocidos en varias proteínas TS C-terminal y algunos tienen dominios únicos C-terminal. La enzima codificada por el gen ADAMTS-4 carece del pequeño elemento estructural reconocido en varias proteínas TS C-terminal. La enzima codificada por el gen ADAMTS-5 contiene dos pequeños elementos estructurales reconocibles en varias proteínas TS C-terminales y funciones como agrecanasa para escindir agrecano, un principal proteoglicano del cartílago. Por lo tanto, ambas enzimas son responsables de la degradación del a-g^ eaR-o— —ta—g-ene-ra-eírórt—de—neoep-topo-s—en—argxe~ca~n~o— —sus" fragmentos (Tortorella, M . , y col., J. Biol. Chem. 275(33) :25791-25797 (2000); Tortorella, M. y col., J. Biol. Chem. 275(24) : 18566-18573 (2000); Abbaszade, I. y col., J. Biol. Chem. 274(33): 23443-23450 (1999)). En otra modalidad de esta invención para el tratamiento del cartílago humano durante la manifestación de OA, se utilizan un anticuerpo que tiene como especificidad hacia el objetivo el marcador temprano del neoepítopo bioquímico de OA, llamado 3-B-3(-). El epítopo 3-B-3(-) es un cambio fenotípico relacionado con OA en el término de las cadenas de sulfato de condroitina (glicosaminoglicano) del agrecano .
C . CARACTERISTICAS DEL ANTICUERPO CON ESPECIFICIDAD HACIA EL OBJETIVO Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" pretende incluir las moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina (es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que específicamente une o inmunoreacciona con un antígeno) . El término describe una inmunoglobulina, ya sea natural o sintética. Las proteínas comprenden el anticuerpo pueden derivarse de fuentes naturales o producirse sintéticamente en parte o en su totalidad. Los Ejemplos de anticuerpos incluyen todos los subtipos de inmunoglobulina y fragmentos Fab y F(ab')2r scFv, Fv, dAb, Fd, así como fragmentos descritos en la Patente de ??—?-fch 5t-5 -4—2-5t_ ¾ &c v re refirere a tos dominios" monocatenarios de unión mínima de una molécula de inmunoglobulina . El término "anticuerpo" también pretende referirse a un anticuerpo que funciona en el espacio extracelular, dentro de la membrana plasmática de una célula o en la región intracelular de la misma (por ejemplo, el citoplasma o núcleo) para regular la expresión o actividad de uno o más genes que regulan el metabolismo del cartílago. Los anticuerpos preferidos para usarse en la presente invención incluyen los anticuerpos humanizados, quiméricos y monoclonales de humano. Dentro del contexto de un anticuerpo, el término "fragmento" se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos que sea parte de cualquier polipéptido con especificidad hacia el objetivo definido anteriormente, que tenga elementos relevantes comunes de origen, estructura y mecanismo y equivalencia funcional al antígeno completo para propósitos de apuntar con especificidad hacia el objetivo dentro de la presente invención. La mención de un anticuerpo en las composiciones y métodos descritos en la presente también pretende incluir el uso de fragmentos de estos anticuerpos. Una modalidad preferida de la presente invención emplea anticuerpos humanizados o de humano o fragmentos de los mismos que se unen covalentemente a la superficie de las nanoesferas u otras partículas en donde se encapsulan los agentes condroprotectores de la presente invención. Los anticuerpos o sus fragmentos se prefieren como moléculas con s-pe if-ie-id-ad—-a-e-i-a—e-1—obj-e-t-i-v-o—s-o ^e—s-u—superfl-c e—de- partículas en donde se encapsulan los agentes condroprotectores terapéuticos debido a que deben ser lo suficientemente estables in vivo y mostrar un mínimo potencial de eliminación de la superficie de la partícula mediante el suero que contiene proteínas del fluido extracelular . Se tiene previsto que los anticuerpos monoclonales totalmente humanos o los anticuerpos humanizados de murino, que se unen a cualquier molécula de la matriz extracelular del cartílago o a las células de la articulación, serán el tipo más útil de anticuerpos que apunten hacia la articulación y que dirijan la administración del agente terapéutico en pacientes humanos debido a que no generarán una respuesta inmunitaria al momento de su administración . Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de murino puede quimerizarse mediante una recombinación genética de la secuencia de nucleótidos que codifica para la región Fv de murino, (es decir, que contiene los sitios de unión al antígeno) con la secuencia de nucleótidos que codifican para la región del dominio constante de humano y una región Fe. Algunos residuos de murino también pueden retenerse dentro de los dominios de estructura de la región variable de humano para asegurar características apropiadas de unión al sitio de objetivo. Los anticuerpos humanizados para usarse en la especificidad hacia el objetivo se reconocerán por tener la ventaja de disminuir la inmunoreactividad del anticuerpo o poi-i-pépti-d©—en—el^-receptor-Hro-sp-edexo- -pueden.—ser-útiles para incrementar la vida media in vivo y reducir la posibilidad de reacciones inmunitarias adversas al anticuerpo conjugado sobre la superficie de una nanoparticula u otra partícula encapsulante . Es muy ventajoso emplear anticuerpos o sus análogos con características totalmente humanas para el tratamiento de pacientes humanos. Los métodos pueden emplearse y son similares a los descritos en las Patentes de EE.UU. 6,075,181, 6,235,883 y 6,492,160 y la Solicitud de Patente EP 1 167 537 Al, de las cuales las descripciones se incorporan expresamente por referencia. Estos métodos se han utilizado previamente para generar una variedad de anticuerpos totalmente humanos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico y IL-8 de humano. En las modalidades más preferidas de la presente invención, el anticuerpo o su fragmento se une a un epítopo con la constante de disociación en el intervalo de 0.1 a 10 nanomolar. Aunque se prefieren los anticuerpos humanizados o totalmente de humano para usarse en la presente invención para el tratamiento de pacientes humanos, también deberá entenderse que los métodos y composiciones de la presente invención son útiles en aplicaciones de veterinaria para el tratamiento de otros mamíferos susceptibles a la degeneración articular, (por ejemplo, caballos y perros) .
D. AGENTES CONDROPROTECTORES PARA UNA ADMINISTRACIÓN CON ESPECIFICIDAD HACIA -Eir-OBaüT-rvo Un aspecto preferido de la modalidad de especificidad hacia el objetivo de la presente invención incluye al menos un agente condroprotector que se encapsula o esta contenido dentro de una nanoparticula o algún otro vehículo de administración al cual se le une una estructura con especificidad hacia el objetivo, fragmento de anticuerpo o anticuerpo con especificidad hacia el objetivo. El agente contenido o encapsulado puede ser cualquiera de los agentes condroprotectores anabólicos o agentes inhibidores del catabolismo descritos en la presente que tengan características químicas o estructurales que lo hacen fácil de encapsular o contener dentro de una nanoparticula seleccionada u otro vehículo de administración. Además, se prefieren para especificidad hacia el objetivo los agentes que de otra forma serían altamente susceptibles a la degradación metabólica mediante administración sistémica (por ejemplo, proteínas y péptidos) que causen efectos secundarios dañinos si se administran sistémicamente sin especificidad hacia el objetivo. Por ejemplo, cada una de las clases de agentes condroprotectores anabólicos descritos a continuación (incluyendo miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante (TGF) -ß, incluyendo agonistas TGF-ß y agonistas de proteína morfogenética del hueso, factores de crecimiento similares a la insulina y factores de crecimiento fibroblasto) y algunas de las clases de agentes inhibidores del catabolismo descritos a continuación (antagonistas del r eept- r—de—i»t« ieijeifta—ilr-y—¡aii¾-gon-rs-ta-s—deir^recep OT- ?G^a-)" son proteínas y como tales se adecúan bien para administrarse en forma encapsulada y con especificidad hacia el objetivo. La composición más preferida que se encuentra encapsulada y con especificidad hacia el objetivo de la presente invención incluye tanto los agentes condroprotectores anabólicos como los agentes condroprotectores inhibidores del catabolismo encapsulados en las mismas inmunopartículas con especificidad hacia el objetivo (u otras partículas con especificidad hacia el objetivo), preferiblemente ambos agentes son proteínas. Alternativamente, cada agente puede encapsularse por separado y se puede administrar una mezcla de dos (o más de dos) tipos de partículas con especificidad hacia el objetivo, o con menor preferencia dos o más agentes con especificidad hacia el objetivo pueden administrarse por separado, ya sea concomitantemente o secuencialmente para dar como resultado la presencia coincidente de los agentes dentro de la articulación. En algunos casos sólo el agente condroprotector anabólico o el agente inhibidor del catabolismo pueden ser susceptibles a la encapsulación o un agente pudiera no estar asociado con efectos secundarios sistémicos indeseados. En estos casos, un agente puede administrarse en forma encapsulada con especificidad hacia el objetivo mientras que el otro agente se administra en forma no encapsulada y sin especificidad hacia el objetivo, ya sea conjuntamente en la HHrsma-^erma—éte—desi-fteaeién—o—eot.—ima—mercia—o^ r-s^ ^xatío-;— Aunque no es tan preferido como administrar tanto el agente anabólico como el agente inhibidor del catabolismo, dadas todas las ventajas proporcionadas por esta combinación descrita anteriormente, también es posible la administración de un solo agente condroprotector (ya sea promotor del anabolismo o inhibidor del catabolismo) encapsulado dentro de una inmunoparticula que apunte hacia un antigeno ubicado dentro de la articulación.
E ¦ ENCAPSULACIÓN DE AGENTES El tamaño de la sustancia es un factor principal que determina si se puede permear a través de la pared de los capilares sinoviales y moverse desde la circulación sistémica hacia la articulación. El diámetro máximo de las partículas que pueden moverse a través de la pared capilar sinovial generalmente se considera de 50 nanómetros. Sin embargo, algunos estudios de la permeabilidad de los capilares sinoviales de rata usando partículas de poliestireno recubiertas con lecitina hasta de 240 nanómetros pueden transportarse a través de las paredes capilares sinoviales por medio de transitosis. La presente invención se sobrepone a la limitante impuesta por la barrera de permeabilidad de membrana sinovial empleando preferiblemente una clase de partículas de encapsulación (por ejemplo, nanopartículas (preferiblemente nanoesferas) ) , que están obligadas a la distribución por tamaño. fca-s—f-ormars—de—do-s±f ca-c±ón—de-rr exa-c ón^ rolongada" de la invención pueden comprender microparticulas y/o nanoparticulas que tengan los agentes dispersos por ahí o pueden comprender el agente terapéutico en forma pura, preferiblemente en forma cristalina y sólida. Las formas de dosificación terapéutica de este aspecto de la invención pueden tener cualquier configuración adecuada para su liberación prolongada. Las formas de dosificación terapéutica de liberación prolongada preferidas de la presente invención tienen las siguientes características de tamaño, biodegradación y biocompatibilidad. El sistema de administración con especificidad hacia el objetivo de la presente invención de preferencia utilizan nanoparticulas que tienen un tamaño limitado desde aproximadamente 5 nanómetros a 750 nanómetros de diámetro prefiriéndose más con aproximadamente 10 a 500 nanómetros y con mayor preferencia aproximadamente 20 a 200 nanómetros. Alternativamente útil pero menos preferido, si se demuestra que resulta en una permeabilidad suficiente en el estado enfermo, se encuentran microparticulas que abarcan en tamaño de aproximadamente 1 micrometro a 100 micrometros de diámetro prefiriéndose más aproximadamente 1 a 25 micrometros y con mayor preferencia aproximadamente 1 a 10 micrometros. Las partículas preferidas son estructuras biodegradables que se liberan el fármaco a niveles terapéuticos durante un período de tiempo de preferencia abarcando de 1 a 150 días, 7 a 60 días y prefiriéndose más 14 a—3-T—dí-a-s-—Se—e¾-t-i-e-nde— e—1-o-s—expertos—en—ta—técnica-qu¾—la liberación del fármaco de las nanoparticulas y microparticulas puede ocurrir mediante una combinación de procesos físicos que incluyen, entre otros, la difusión y degradación y pueden describirse mediante un proceso cinético complejo que es único para cada formulación de portador y combinación de agentes terapéuticos anabólicos y anticatabólicos . Las partículas preferidas son biocompatibles con tejidos con especificidad de objetivo en la articulación y el ambiente fisiológico local en el cual se administra la forma de dosificación, incluyendo la producción de productos biocompatibles de la biodegradación . Las composiciones adecuadas incluyen partículas biodegradables formuladas a partir de polímeros naturales incluyendo hialuronano, quitosana, colágeno, gelatina y alginato. Estos polímeros naturales pueden combinarse con otros polímeros para producir partículas de copolímeros compuestas de, entre otras cosas, quitosana y gelatina. Se han utilizado con éxito los poli (alfa-hidroxiésteres) biodegradables y sintéticos como el ácido poliláctico (PLLA), ácido poliglicólico (PGA) y el copolímero PLGA para la producción de microparticulas que incorporan productos terapéuticos de proteína como la hormona humana de crecimiento. Otro ejemplo de un polímero biodegradable que puede ser adecuado para usarse en preparación de partículas como en especificidad hacia el objetivo de la presente invención son los copolímeros afifíli-e-e-s—ée —fe^ s—bieq-ues—ABA—eomo— i—po±-i-(-óx±dO —de" etileno) : poli (3-hidroxibutirato) :poli (óxido de etileno) . Al seleccionar un sistema de nanoparticulas poliméricas para usarse con los agentes condroprotectores seleccionados de la presente invención, también es importante asegurar la bioactividad adecuada del fármaco encapsulado. El uso de nanoesferas poliméricas biodegradables y con especificidad hacia el objetivo tienen la ventaja de proporcionar perfiles seleccionados de liberación diferencial para los agentes terapéuticos encapsulados . Para algunas combinaciones de fármacos, la cinética óptima de liberación puede consistir de un proceso de liberación dual, en donde cada agente activo demuestra un distinto perfil cinético de liberación prolongada para proporcionar la farmacocinética más óptima para el fármaco dentro de la articulación. Los expertos en la técnica reconocerán, basándose en la descripción de la presente, que la cinética óptima de liberación para las nanoparticulas o microparticulas varia para cada fármaco individual y también será una función de la cantidad de fármaco cargado en las partículas durante la formulación, el tamaño de las partículas y otras propiedades fisioquímicas que se determinan por la composición de las partículas. Las tasas cuantitativas de liberación para cada fármaco a partir de las partículas encapsulantes que residen en la articulación se ajusta para obtener la concentración terapéutica óptima en el líquido sinovial y espacio intraarticular para lograr las concentraciones terapéuticas deseadas-:—t-es—e-stad-ros—tn-^ tro-^pueden—Hrevaxse—a—ca~b~o pa~ ¾~ caracterizar la cinética de liberación dual para la formulación de liberación prolongada en donde cada componente (por ejemplo, el fármaco anabólico y el inhibidor catabólico) demuestran una liberación prolongada durante un periodo de 7 a 30 días, a manera de ejemplo. Los métodos para cuantificar la cantidad de cada fármaco que se libera en el liquido sinovial se conocen en la técnica y pueden incluir mediciones de un fármaco radiomarcado . Alternativamente, es posible unir covalentemente moléculas indicadoras ópticas o fluorescentes para preparar fármacos marcados. Los expertos en la técnica reconocerán que existen varios métodos indirectos de cuantificación, como la ELISA o espectrometría de masas, que son específicos para cada agente. Por razones prácticas es difícil lograr una cinética de liberación similar para dos fármacos que varían considerablemente en tamaño, como es el caso de varias combinaciones anabólicas y catabólicas. Por ejemplo, en una modalidad preferida de la invención, se desea administrar un inhibidor catabólico como un inhibidor de p38 AP cinasa que pueda caracterizarse por un peso molecular de 200-500 (por ejemplo, SB203580, PM = 377) con un agente anabólico, como la IL-10 de humano, que tiene 160 aminoácidos de longitud y un peso molecular de aproximadamente 18 Kda. El control independiente de las tasas de liberación prolongada de cada agente puede lograrse variando la composición estructural de las partículas o creando una mezcla de dos o más -tn-mu-nop-a-rti-eu-l-a-s-;—E-n-^ra-^ne-z-ei-a- —un—eenj-tm-te—ée—^pa-r-ticu-l-a-s—e-s-homogénea con respecto al agente anabólico encapsulado, mientras que un conjunto distinto de partículas es homogéneo con respecto al inhibidor del catabolismo encapsulado. Los dos conjuntos de partículas mixtas pueden variar en sus tamaños respectivos y composición polimérica, pero se caracterizarán, si es apropiado, por tasas de liberación similares para sus agentes activos o mediante tasas de liberación que sean consistentes, optimizando los efectos terapéuticos locales de cada uno de los agentes encapsulados , respectivamente. Los liposomas no son los vehículos de administración preferidos para la administración sistémica con especificidad hacia el objetivo de los agentes condroprotectores de conformidad con los agentes protectores. En relación con las nanoesferas y otros sistemas de administración de partículas de liberación prolongada, los liposomas tienen una media vida corta dentro del sistema circulatorio. Los conjugados de liposoma y fármaco pueden quedarse atrapados en el hígado y bazo, dando como resultado una degradación liposomal y liberación de los agentes activos. De esta forma, los agentes se distribuyen sistémicamente en estado activo en vez de protegerse hasta que se localicen dentro de la articulación. La liberación de agentes a partir de los sistemas de administración liposomal con especificidad hacia el objetivo no es muy continuo y es mucho menos localizado que para los sistemas de objetivo. Debido a esto, el uso de partículas (por ejemplo, nanoesferas) es mucho más preferido en relación con el uso de liposomas. No obstante, para los agentes condroprotectores anabólicos de administración sistémica o combinación de agentes condroprotectores incluyendo un agente anabólico, para los cuales es muy deseada la especificidad hacia el objetivo, los liposomas con especificidad hacia el objetivo pueden probar ser más adecuados y ofrecer ventajas en relación con la administración de fármaco en estado puro.
F. UNION DE ANTICUERPOS CON AGENTES ENCAPSULADOS Los métodos representativos de "unión" para ligar el anticuerpo con especificidad hacia el objetivo a la nanopartícula de liberación prolongada mediante enlaces covalentes o no covalentes incluyen agentes químicos de entrecruzamiento y compuestos heterobifuncionales de entrecruzamiento (es decir, "enlazantes") que reaccionan para formar una unión entre los grupos reactivos (como grupos hidroxilo, amino, amido o sulfhidrilo) del anticuerpo con especificidad hacia el objetivo y otros grupos reactivos (de una naturaleza química similar) que estén presentes sobre la superficie de la nanopartícula u otro vehículo con especificidad hacia el objetivo. Este enlace formado entre el anticuerpo con especificidad hacia el objetivo y la partícula u otro vehículo de administración puede incluir pero no se limita a lo siguiente: un enlace peptídico, un enlace -dins¾-l- ur-07 —un—eíti-aee—-íoé^ -r-, — ra —enl-a-ce—amxda— -un—eTTiáce tioéter . La conjugación directa de las formas de dosificación de liberación prolongada en la proteina con especificidad hacia el objetivo (anticuerpos) puede interrumpir el reconocimiento de la molécula o célula objetivo por el anticuerpo con especificidad hacia el objetivo modificado. Las técnicas de unión del ligando en dos capas son alternativas útiles para lograr la unión de la forma de dosificación de liberación prolongada a las proteínas enlazantes con especificidad hacia el objetivo (anticuerpo) . Estas técnicas pueden involucrar la formación de un péptido o coraza proteica primaria usando una proteína que no se una a la población de células objetivo. La proteína enlazante luego se une a la coraza proteica o péptido primario para proporcionar la partícula resultante con un péptido/proteína enlazante funcional. Un método ejemplificante de ligando en dos capas involucra la unión covalente de avidina o estreptavidina en las partículas a través de grupos funcionales como se describe anteriormente con respecto a el método de unión "directa". La proteína enlazante se derivatiza, preferiblemente en forma mínima, por medio de biotina funcionalizada (por ejemplo, a través de grupos funcionales activos de éster, hidrazida, iodoacetalo, maleimidilo) . La unión del ligando (es decir, el péptido enlazante o la biotina funcionalizada/proteína) a los sitios disponibles de unión a la biotina de la coraza proteica primaria -de—a ^di^iay- s-t e tavddiTa-OC--rre—median e-e~l uso de" una cantidad saturante de péptido/proteina biotinilada. 3. MÉTODOS ALTERNATIVOS DE ESPECIFICIDAD HACIA EL OBJETIVO Y ADMINISTRACIÓN CON EFECTO PREFERENTE También se encuentran dentro del alcance de la presente invención otros métodos de apuntar los agentes condroprotectores y sus combinaciones en la presente invención o para lograr la efectividad preferente de estos agentes o combinaciones en la articulación en relación con otros sitios del cuerpo. Por ejemplo, los dos tipos celulares principales de la membrana sinovial, los sinoviocitos macrófagos (Tipo A) y sinoviocitos fibroblastos (Tipo B) , y condrocitos se conocen porque expresan para una variedad de proteínas únicas que están presentes sobre las superficies de esas células que pueden servir como epítopos para una especificidad hacia el objetivo celular específico. La selección de agentes y preferiblemente la combinación de un agente promotor del anabolismo y un agente inhibidor del catabolismo que se dirigen a proteínas que preferiblemente se expresan en la articulación o que preferiblemente se expresan en una articulación inflamada o enferma, puede incrementar de manera preferente el efecto local mientras que minimiza los efectos sistémicos indeseados. Como se menciona anteriormente, los objetivos moleculares dentro de la articulación pueden incluir componentes de la matriz extracelular del cartílago como los eel-cH^e-B-es— spe í-f-i-ees— a-r-a—ei—e-a-rtí-i-a-go — i rci tyeTrdo— 'o ágeno" Tipo II, IX, X, XI, agrecano y otros proteoglicanos pequeños ricos en leucina (por ejemplo, decorina, diglicano, fibromodulina y lumicano) . También se incluyen como objetivos la proteina de la matriz oligomérica del cartílago (COMP) y la glicoproteína-39 (HC-gp39) , también llamada YKL-40. Un objetivo deseado para usarse en este aspecto de la invención sería un marcador bioquímico del cartílago que pueda ya sea estar ausente del cartílago normal del adulto o estar presente a niveles muy bajos pero que si se encuentre en ciertas etapas de RA ó OA. Asimismo, la selección de agentes condroprotectores y preferiblemente una combinación de un agente promotor del anabolismo y un agente inhibidor del catabolismo que sean específicos para los receptores que estén regulados en forma acelerada en estado inflamado o enfermo, también puede incrementar preferentemente el efecto local en relación con otras áreas del cuerpo. Como se indica anteriormente, los agentes o agente encapsulado pueden apuntarse a una o más estructuras dentro de la articulación al unir el agente encapsulado a un anticuerpo correspondiente con especificidad hacia el objetivo (o fragmento de anticuerpo) . Potencialmente, estos anticuerpos también pueden unirse a los fármacos puros, usando una unión que se escinde dentro del ambiente local de la articulación para lograr la especificidad hacia el objetivo y administración de los fármacos sistémicamente administrados en la articulación. Similarmente, los agentes eond-ropio-tector-es que se ±nc±tryen en mra CO"m o^"cioñ inhibidora del catabolismo y promotora del anabolismo de la presente invención pueden seleccionarse de manera que actúen preferiblemente en sitios dentro de la articulación, en relación con el resto del cuerpo, ejerciendo asi sus efectos sobre los sinoviocitos y/o condrocitos y/o componentes de la matriz extracelular .
E. METODOS DE SELECCION DE LA DOSIFICACION Y VEHICULOS DE ADMINISTRACION El sistema especifico de nanoesferas y el anticuerpo con especificidad hacia el objetivo o su fragmento que se van a usar de conformidad con la presente invención para administrar agentes seleccionados y la carga o dosificación precisa de agentes terapéuticos para incluirse en las composiciones con especificidad hacia el objetivo puede determinarse analíticamente de conformidad con la invención. El método analítico incluye la administración de una nanoesfera marcada con anticuerpo (u otra partícula con especificidad hacia el objetivo) que contenga los agentes terapéuticos encapsulados para el paciente que necesita esta prueba de diagnóstico y someter al paciente a un análisis de imágenes para determinar la ubicación de las nanoesferas que contienen el fármaco. El grado de deposición en la articulación del paciente puede determinarse usando análisis de imagenología . Estos análisis se conocen bien en la técnica médica e incluyen, entre otros los análisis por rayos X, la -i-ma-geno-l-og-í-a—^po-r—-e-s-en n^-ia—¾agn-ét-i-ea—(-MR1— o-r—s s-s±g±as—eir inglés) o la tomografía computarizada (CT, por sus siglas en inglés) . En una modalidad preferida, los anticuerpos que apuntan hacia la articulación pueden marcarse con un agente detectable que pueda observarse en una imagen del paciente. Por ejemplo, el anticuerpo con especificidad hacia el objetivo puede marcarse con un agente de contraste, como el bario, que puede usarse para el análisis mediante rayos X o un agente de contraste magnético como el quelato de gadolinio que puede ser detectado usando MRI o CT. Otros agentes de marcación incluyen, entre otros, radioisótopos, como 99Tc . Además de los análisis de imagenología, se puede obtener una biopsia del paciente para determinar la presencia y concentración de las partículas en articulación (por ejemplo, tejidos sinoviales) . La modalidad de la presente invención sobre la administración local se describe en términos de concentraciones adecuadas de agentes terapéuticos cuando se administran localmente, suficiente para proporcionar un nivel predeterminado de un efecto terapéutico o inhibidor en el sitio de administración local (por ejemplo, la articulación) . Cuando se administran sistémicamente, será necesaria una concentración o dosis mayor de agentes. Esta concentración y/o dosificación sistémica es la requerida para dar como resultado, después de cualquiera de los procesos de transformación metabólica, la administración de una cantidad suficiente de agentes activos en los sitios deseados de -paten-GÍaL—deg^ da-eión—de^l—ea-r-tü-ago—neces r±o-s—paxa~~]rograr eG nivel deseado de efecto terapéutico local. En particular, los niveles preferidos y terapéuticos adecuados para las dosis y/o concentraciones sistémicas son aquellos que dan como resultado la administración de agentes activos en el sitio local (por ejemplo, la articulación) a un nivel de concentración que se encuentre dentro de los intervalos de concentración preferidos y de administración terapéutica local, respectivamente, como se describe previamente. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una dosis o carga de agente suficientes en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción durante un periodo de tiempo de liberación prolongada predeterminada que logre el nivel deseado de efecto terapéutico durante la duración sustancial del periodo de liberación prolongada deseado. Por lo tanto, se incluye una carga o dosificación suficiente de agente para dar como resultado una cantidad predeterminada de agente encapsulado que sea absorbida por la articulación, lo que dé razón por cualquier transformación metabolica del agente que ocurra antes de alcanzar la articulación o en el ambiente local de la misma. Esta cantidad predeterminada de agente encapsulado que alcanza la articulación será determinada de conformidad con la descripción contenida en la presente de manera que la nanoesfera o cualquier otro sistema encapsulante de administración degrade el agente que se -de—a-cci~ón para proporcionar una concentración local que se encuentre dentro del intervalo terapéutico de concentración para ese agente durante un periodo deseado de liberación prolongada (por ejemplo durante un periodo de 1 dia a 4 semanas, con mayor preferencia entre 1 dia y 2 semanas) .
IV. AGENTES PARA LA INHIBICIÓN DE LA DEGRADACIÓN DEL CARTÍLAGO Lo siguiente es una descripción de las clases de ejemplificantes de agentes condroprotectores y fármacos ejemplificantes dentro de cada una de las clases que son adecuadas para usarse dentro de las composiciones de la presente invención. Aunque no se desea estar limitado por la teoría, también se expone la justificación sobre la selección de las diversas clases de agentes que se piensa los convierten en agentes operativos. 1. ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR INTERLEUCINA-1 (IL-1) La Interleucina IL-1 existe en dos formas, IL-loc e IL-?ß, que son polipéptidos derivados de productos génicos separados que comparten un espectro similar de funciones inmunorreguladoras y proinflamatorias . La IL-1 es un polipéptido de 17 kD que puede actuar tanto como producirse por una variedad de tipos celulares en la articulación, incluyendo macrofagos y fibroblastos sinoviales, condrocitos, células endoteliales macrofagos y monocitos. Existe evidencia sustancial que la IL-1 tiene una función primordial en la i-i'^HL-ama-e-rón—de—ira—art±crai¾c±ón— —en—péxdxda— ¾^_fTs~i^io^i"ca del cartílago articular que ocurre en la articulación lesionada . Las acciones de ambas formas de esta citocina destructora del cartílago están mediadas por uno de los dos receptores de IL-1 (IL-1R) , receptores IL-1 Tipo I ó IL-1 Tipo II. Los receptores de IL-1 son estructuralmente distintos y pertenecen a una superfamilia separada caracterizada por la presencia de dominios de unión a la inmunoglobulina . Estos receptores tienen una cercana homología de aminoácidos con otros receptores que contienen dominios de inmunoglobulina. La expresión de los receptores de IL-1 Tipo I más grandes está presente en células T y fibroblastos mientras que el receptor de IL-1 Tipo II está presente en células B, monocitos, neutrófilos y células de la médula ósea. Los receptores de IL-1 Tipo II se unen a IL-?ß con una elevada afinidad, pero la unión de IL-?ß no inicia la transducción de señal intracelular como lo hace al momento de unirse al receptor IL-1 Tipo I. A diferencia de esto, el receptor Tipo II sirve como un precursor para un factor soluble de unión a IL-1 que ha demostrado ser expulsado de células y este receptor soluble actúa como un antagonista de IL-?ß fisiológico. Una proteína de unión IL-1 que ocurre naturalmente se ha descrito la cuál corresponde a una porción externa soluble del receptor Tipo II. Un ligando soluble y secretado que ocurre natttifaifftente—qtt-e—s-e—une—a—lo-s—receptores—d —rtr=^l~;—que alternativamente se refiere como el antagonista del receptor IL-1 (sIL-IRA, IL-IRa, IL-lra), ha sido clonado, secuenciado y se descubrió que codifica para una proteina de 22 kD. La IL-IRa inhibe de manera competitiva la unión de IL-?a e IL-?ß a los receptores Tipo I y II de IL-1. IL-IRa es un antagonista puro de receptor ya que su unión al receptor no activa la maquinaria celular de transducción de señal de la membrana asociada con los receptores IL-1. A pesar de la unión de alta afinidad de esta proteina a la IL-lRs, se requiere un exceso molar de 10-100 veces para inhibir las respuestas biológicas de IL-1 de las células que expresan para la IL-1R Tipo I. Las células que se conocen por producir IL-IRa incluyen monocitos, neutrófilos, macrófagos, sinoviocitos y condrocitos. Se ha demostrado que la IL-IRa inhibe la síntesis de PGE2, la inducción de citocinas proinflamatorias y MMP y la producción de óxido nítrico. La IL-IRa secretada se libera in vivo durante la inflamación inducida experimentalmente . De importancia, la IL-IRa se expresa en el tejido sinovial y está presente en el líquido sinovial normal de humano. En pacientes con lesiones de la rodilla, los niveles de IL-IRa en el líquido sinovial se incrementan dramáticamente en la fase aguda después de la lesión y subsecuentemente disminuye por debajo de los niveles normales en los estados crónicos y subagudos. Por lo tanto, se ha demostrado que IL-IRa tiene una función fisiológica preponderante en las respuestas de la articulación a las Se considera que la IL-1 es la citocina dominante destructiva del cartílago que tiene una función fundamental en la destrucción de la articulación debido a su habilidad de estimular la producción de enzimas degradantes y citocinas proinflamatorias tanto por los condrocitos como los sinoviocitos . Más aún, la IL-?ß es un potente inhibidor de proteoglicano y síntesis del colágeno por los condrocitos. A nivel celular, las respuestas inducidas por IL-?ß de los fibroblastos sinoviales incluyen una mayor producción de PGE2, colagenasa y otras proteasas neutras y la regulación acelerada de citocinas proinflamatorias, IL-6 e IL-8. La IL-1, que está presente en el líquido articular de pacientes con enfermedades artríticas, estimula a los condrocitos para que: 1) sinteticen grandes cantidades de enzimas como estromelisina, colagenasa de neutrófilos y fibroblastos y activador del plasminogeno y 2) inhiba la síntesis del inhibidor-1 del activador del plasminogeno TIMP. Además, IL-?ß es un potente inhibidor de la síntesis de los constituyentes de matriz como el colágeno tipo II, la forma predominante de colágeno del cartílago articular y proteoglicanos . El desbalance entre los niveles de inhibidores y proteasas conlleva a un incremento en la cantidad de proteasas activas. Este incremento, combinado con la supresión de la biosíntesis de matriz, da como resultado la degradación del cartílago. En estudios experimentales en animales, la inyección de IL-1 en articulaciones de rodilla de—cone-j-os—ea-u-s-a—un—a-gotam-iento—dei— rot ogrtrcanO—en el" cartílago articular. Ya que la IL-1 es una de las citocinas clave involucradas en la patogénesis de la sinovitis crónica y la degradación del cartílago, la reducción de su producción o bloqueo de su acción representa una estrategia apropiada para los nuevos tratamientos en la reducción de la inflamación sinovial y para proporcionar un efecto condroprotector . Se puede utilizar una amplia variedad de métodos terapéuticos para antagonizar la interacción del agonista, IL-1, con su receptor de unión a la membrana natural que incluyen: 1) inhibidores específicos que existen naturalmente, de la actividad de IL-1 que han sido caracterizados hasta la fecha, incluyendo receptores de IL-1 soluble e IL-IRa; 2) Abs anti-IL-l; y 3) antagonistas de moléculas pequeñas que pueden ser peptídicos o no peptídicos. La habilidad de bloquear acciones de esta citocina clave tendrá efectos en varios tipos celulares y en la articulación (por ejemplo, condrocitos y fibroblastos sinoviales), inhibiendo así los efectos patológicos subsecuentes como infiltración de células inflamatorias en la inflamación, hiperplasia sinovial, activación de células sinoviales así como la degradación del cartílago e inhibición de la síntesis de la matriz cartilaginosa. Un antagonista para receptor de IL-1 debe bloquear la propagación de la respuesta inflamatoria por IL-1 e interrumpir así los procesos de enfermedad. El potencial terapéutico de una variedad—de—an-ta-goní-s-ta-s—éel^-reeepto- —Hi—1—se—ha—establ"e"c±i.to~ en modelos experimentales en animales de inflamación y artritis (RA y OA) . Los pacientes que sufren de RA han mejorado clínicamente después de una inyección subcutánea de IL-IRa o una inyección intraarticular de IL-1R soluble Tipo I. Los efectos de IL-?ß e IL-IRa dependen de sus concentraciones locales respectivas. En los sobrenadantes de las piezas sinoviales de RA, los niveles de IL-?ß fueron tres veces mayores que aquellos de IL-IRa. Por lo tanto, la producción local espontánea de IL-IRa no es suficiente para inhibir los efectos de IL-?ß debido a que se requiere un exceso molar mucho mayor (10 a 100 veces) de IL-IRa para inhibir las respuestas biológicas inducidas por IL-1 en células que expresan para la IL-1R Tipo I. Por lo tanto, se han utilizado elevadas dosis de IL-IRa in vivo para bloquear IL-1 en voluntarios humanos y en pacientes con RA. La IL-IRa presente localmente en la membrana sinovial proporciona una señal negativa, lentificando al menos parte de los procesos mediados por IL-1 en la sinovitis, como la acumulación de leucocitos en el tejido inflamado, la producción de PGE2 y colagenasa por células sinoviales. Un efecto condroprotector de IL-IRa ha sido demostrado usando una inyección directa de IL-IRa en la articulación en un modelo experimental canino con ACL y empleando un método de terapia génica avanzado en la transfección del gen IL-IRa en fibroblastos sinoviales de humano . ka— -r-e-se-n-te—in-vene-i-é«—describe—ia—adm±n stT¾iTiT5rT local y sistémica de una proteína receptora soluble de IL-1, que comprende un dominio extracelular de IL-IR y que es capaz de unirse en solución a una molécula de IL-1 de citocina. En particular y a manera de ejemplo, un polipéptido soluble del receptor IL-1 de humano (shuIL-lR) que comprende esencialmente la secuencia 1-312, de aminoácidos se describe dentro de la Patente de EE.UU. Núm. 5,319,071 y en la Patente de EE.UU. Núm. 5,726,148 que se describe en la presente para usarse en combinación con uno o más fármacos seleccionados a partir de una clase antiinflamatoria, analqésica o condroprotectora . Alternativamente, la administración local o sistémica de una proteína de fusión que consiste del dominio de unión sIL-lR se propone para usarse en la promoción de la condroprotección como se describe en la Patente de EE.UU. Núm. 5,319,071. Además, la administración local o sistémica de un antagonista receptor IL-1 se describe dentro de la Patente de EE.UU. Núm. 5,817,306 para usarse en la presente invención. El receptor soluble shuIL-lR ha demostrado unirse a IL-1 con afinidad nanomolar. La administración local de una concentración terapéuticamente efectiva de un receptor soluble de IL-IR, como el shuIL-lR puede ocurrir mediante inyección directa en la articulación o una solución de irrigación (por ejemplo, durante un procedimiento quirúrgico artroscópico) en combinación con uno o más fármacos condroprotectores, fármacos antiinflamatorios o fármacos analgésicos y se describe en la presente como un agente -Eotec-to-r—de-1—sa-r-t-í-l-a-ge— u-an-do—se—apl-ica-^^caiment-e^.-t'ej'rd'o de la articulación en una variedad de estados inflamatorios o patológicos. Alternativamente, estos agentes pueden administrarse sistémicamente, como en el caso de un sistema de administración sistémico con especificidad hacia el objetivo. Este tratamiento inhibe preventivamente la estimulación de IL-1 de la producción de colagenasa-1 y estromelisina-1. Se ha descubierto que al emplear un método totalmente diferente basándose en la administración génica para la producción local de receptores solubles Tipo I de IL-1 y/o TNF-oc, la presencia de receptores solubles para estas citocinas es capaz de conferir protección en la articulación de rodilla de conejo durante una fase aguda de inflamación por artritis inducida por antigeno. Los péptidos antagonistas del receptor IL-1 (11-15 aminoácidos) que se unen específicamente con una elevada afinidad al receptor IL-1 Tipo I de humano son adecuados para usarse en la presente invención como agentes condroprotectores . Estos pequeños péptidos proporcionan una variedad de ventajas con respecto a los receptores solubles de IL-1 de tamaño más grande o IL-lra recombinante, incluyendo facilidad y costo de la síntesis y habilidad para penetrar las barreras biológicas. Dos de los péptidos más potentes, basándose en la eficacia in vitro son: Ac-FEW PGWYQJYALPL-NH2 (AF12198, IC50 = 0.5-2nM) y Ac-FEWTPG YQJY-NH2 (AF11567) . El AF11567 es una versión truncada de AF12198, que carece de los cuatro residuos C-terminales y que—mue-s-fe-r-a—u-na—a-fin-i-da-d—l-i-g-er-a-mei¾t«^neft©r— -a-ra—ei—re-ceptror" de IL-1 Tipo I pero que posee una vida media plasmática similar de 2.3-2.6 horas. La pobre solubilidad y el rápido metabolismo parecen limitar la eficacia in vivo de AF12198 cuando se administra sistémicamente por medio de infusión intravenosa. Estas limitacione se superan en parte mediante métodos de administración local y directa mediante inyección en el espacio intraarticular o mediante inclusión en el fluido de irrigación quirúrgica u otra infusión o mediante la administración sistémica usando vehículos de administración con especificidad hacia el objetivo como se describen anteriormente. A continuación se enumeran los ejemplos de agentes antagonistas para el receptor de IL-1 útiles y adecuados para la presente invención. Para todos los modos de administración local (es decir, inyección, infusión e irrigación) y administración sistémica (incluyendo el uso de un sistema de administración con especificidad hacia el objetivo) la dosis óptima y/o concentración óptima de cada agente adecuado es la que sea terapéuticamente efectiva. Se proporcionan como ejemplo, para cada uno de los agentes enumerados, las concentraciones preferidas y más preferidas de una solución de irrigación que contiene el agente enumerado. Se espera que estas concentraciones sean terapéuticamente efectivas. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la invención incluyen, en forma adecuada, una dosis o carga del agente que sea suficiente para dar como resultado la concentración local en la a-rticuia-G-i-ó —T—si-fe-ie—de—a-ee-i-én—de-1-—i-nte-rva-lo—texapéutíco enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, una carga o dosificación suficientes del agente se incluye en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 1 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DE INTERLEUCINA-1 Concentraciones Concentraciones terapéuticas de más preferidas Compuesto administración para la local (nM) administración local (nM) rshuIL-lR 0.2-2000 200 rhlL-lra 0.2-2000 200 Anticuerpo anti-ILl 0.2-2000 200 AF12198 0.2-2000 200 AF11567 0.2-2000 200 2. ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DEL FACTOR DE NECROSIS TOMORAL (TNF) El TNF-a, una citocina que se produce principalmente por macrófagos activados, tiene varias acciones biológicas incluyendo la regulación transcripcional de^v-ai -os—gene-s—que—es-t^-Trce ±a o-s—por^ c ptroTe^ de TNF, así como actividades inmunorreguladoras . Originalmente, se clonaron dos diferentes receptores llamados TNF-Rl y TNF-R2 y se caracterizaron y se descubrió que se producen como receptores solubles. Los receptores de esta familia son proteínas transmembranales únicas con una homología considerable en sus dominios extracelulares mientras que sus dominios intracelulares relativamente cortos tienen muy poca homología de secuencia. Las acciones de TNF son el resultado del factor que se une a los receptores de superficie celular que están presentes en virtualmente todos los tipos celulares que se han estudiado. Se han clonado e identificado dos receptores. Un tipo de receptor, llamado TNFR-II (o Tipo A ó 75 kDa) codifica para una proteína transmembranal de 439 aminoácidos y tiene un peso molecular aparente de 75 kDa. El segundo tipo de receptor, llamado TNFR-I (o Tipo B ó 55 kDa) muestra un peso molecular aparente de 55 kDa y codifica para una proteína transmembranal de 426 aminoácidos. El TNFR1 contiene un dominio intracelular que puede iniciar la señalización mediante la vía de NF-KB. Ambos receptores de TNF muestran una elevada afinidad para unirse a TNFa. Los receptores solubles TNF (sTNFR) han sido aislados y se probó que se manifiestan como resultado de la separación de los dominios extracelulares de los receptores unidos a la membrana. Se han identificado dos tipos de sTNFR y se nombraron sTNFRl (TNF BPI) y sTNFRII (TNF B-ü-)- Ambas—de—es-tas—formas—de— eceptor—so-rub±e—hair demostrado representar las formas truncadas de los dos tipos de TNFR descritos anteriormente. El TNF- tiene una función central en la secuencia de los eventos moleculares y celulares que subyacen a la respuesta inflamatoria y destrucción del cartílago. Varios de los efectos del TNF-a se sobreponen con los eventos proinflamatorios de IL-1. Entre las acciones preinflamatorias de TNF-a se encuentran la estimulación de la liberación de otras citocinas proinflamatorias incluyendo IL-1, IL-6 e IL-8. El TNF-a también induce la liberación de las metaloproteinasas de matriz a partir de los neutrófilos, fibroblastos y condrocitos que degradan el cartílago, en parte a través de la estimulación de la colagenasa. Más aún, el TNF-a acelera la regulación de COX-2 en condrocitos normales de la articulación de humano y fibroblastos sinoviales, dando como resultado una mayor producción de PGE2. Esta citocina, junto con IL-1, se considera como la iniciadora y productora de los efectos patológicos en el cartílago y la articulación, incluyendo la infiltración de leucocitos, hiperplasia sinovial, activación de células sinoviales, desintegración del cartílago e inhibición de la síntesis de matriz cartilaginosa. En particular, durante la inflamación sinovial, se encuentran mayores niveles de TNF-a en el líquido sinovial de articulaciones y ocurre una mayor producción de TNF-a por las células sinoviales. Por lo tanto, -la admi-nis-tra-eié-n s÷s-feémrea incluyendo un s±steina de" administración con especificidad hacia el objetivo o la administración local de un receptor soluble de TNF-a en una solución de irrigación, infusión o inyección se unen al TNF-a libre y funciona como un antagonista de receptores de TNF en el tejido circundante, proporcionando asi un efecto protector del cartílago. La presente invención describe el uso de antagonistas funcionales de TNF-a que actúan extracelularmente para bloquear la interacción del ligando con sus receptores cognados de membrana ya sea neutralizando el ligando libre disponible o mediante una interacción competitiva directa con el receptor en sí mismo, solo o en combinación con otros agentes para proporcionar un efecto condroprotector . Se puede incluir una amplia variedad de métodos terapéuticos para antagonizar la interacción del agonista, TNF-a, con su receptor natural unido a la membrana que incluyen: 1) el uso de inhibidores específicos naturales para la actividad de TNF-a que se han caracterizado hasta la fecha, incluyendo receptores solubles TNF-a; 2) el uso de anticuerpos anti-TNF-a y 3) el uso de antagonistas de moléculas pequeñas que pueden ser peptídicos o no peptídicos. La presente invención describe el uso de un receptor soluble quimérico (CSR por sus siglas en inglés) en forma de proteína, en donde el dominio extracelular de un receptor TNF, que posee actividad de unión para una molécula TNF, se enlaza covalentemente a un dominio de una molécula íqG-.—&n-^ r^i-etht-a^7—y a mane-ra—de—e-j-empl-cr—s-e—Odrra—at"i~Hzar un polipéptido quimérico (quimera recombinante) que comprende el dominio extracelular del polipéptido extracelular del receptor TNF acoplado a las regiones CH2 y CH3 de un polipéptido de una IgGl de ratón de cadena pesada, como se describe en la Patente de EE.UU. Núm. 5,447,851. El receptor soluble TNF quimérico (también llamado el "inhibidor TNF quimérico" en la Patente de EE.UU. Núm. 5,447,851) ha demostrado unirse a TNF-oc con gran afinidad y se ha demostrado que tiene una elevada actividad como inhibidor de la actividad biológica de TNF-a. Además, un segundo ejemplo es una estructura de fusión quimérica que comprende el dominio de unión al ligando del receptor TNF con porciones del anticuerpo Fe (llamados receptores solubles de fusión Fe) que han sido creados para los receptores TNF-cc. La presente invención también describe el uso de un receptor soluble TNF: proteina de fusión Fe o cualquiera de sus formas modificadas, como se describe en la Patente de EE.UU. Núm. 5,605, 690. La forma molecular de la proteina de fusión del receptor soluble activo puede ser monomérica o dimérica. Los estudios actuales establecen que el receptor soluble TNF: proteina de fusión Fe retienen una elevada afinidad de unión para TNF-oc. Dentro del contexto para definir receptores solubles como antagonistas farmacológicos, el término receptores solubles incluye, pero no se limita a: (1) receptores solubles que corresponden a secuencias de aminoácidos producidas naturalmente (endógenas) o sus fragmento-s—soi bies—que—eomp-r-eftde-n—^ui^demi-n-i©—e-xt-ace-l-ul-ax-de un receptor de membrana de longitud completa, (2) receptores solubles recombinantes que están truncados o secuencias parciales de la longitud completa, secuencias de aminoácidos receptores que ocurren naturalmente que retienen la habilidad de unirse al ligando cognado y retener su actividad biológica y sus análogos, y (3) receptores solubles quiméricos que son receptores solubles recombinantes que comprenden secuencias parciales o truncadas que corresponden a una porción del dominio extracelular de las secuencias de aminoácidos receptores de cadena completa unidas mediante oligomeros (por ejemplo, aminoácidos) a una secuencia que corresponde a una porción de un polipéptido IgG (por ejemplo, la porción de bisagra de IgG y el dominio Fe) que retienen la actividad biológica y la habilidad de unirse al ligando cognado. Los dominios solubles y extracelulares de unión al ligando de los receptores de citocina ocurren naturalmente en fluidos corporales y se piensa que están involucrados en la regulación de las actividades biológicas de las citocinas. Se ha mencionado la existencia natural de las formas solubles y truncadas de una variedad de receptores de citocina hematopoyética (IL-1R, IL-4R, IL-6R, TNFR) . Por ejemplo, se descubrió que el TNFR soluble a concentraciones de aproximadamente 1-2 ng/ml en el suero y orina de sujetos normales. Al carecer de estas funciones de transducción de señal, estas proteínas de unión a la citocina se producen como resultado de una eliminación alternativa del ARNm de la secuencia—Gomp-l-e-ta —de-1-—-r-eeep-to- (-l-a —f-e-r-ma —uni-da —a —ra- membrana) o como resultado de una escisión proteolitica y liberación de la forma unida a la membrana del receptor. Aunque las funciones in vivo de estos receptores solubles truncados no están totalmente establecidas, parecen actuar como antagonistas fisiológicos de sus citocinas endógenas complementarias. Este antagonismo ocurre debido a (1) neutralización del ligando libre mediante su unión al receptor soluble cognado que reduce la concentración libre efectiva disponible para los receptores unidos a la membrana y (2) las acciones de las citocinas sólo se producen subsecuentemente a la unión de los receptores de superficie celular . El receptor soluble TNF-oc funciona como un antagonista natural para TNF-R1 y TNF-R2 al competir con estos receptores de superficie celular para un grupo común de ligando libre. Farmacológicamente, el receptor soluble TNF funciona como un antagonista mediante su habilidad para disminuir la biodisponibilidad del ligando libre en vez de un mecanismo de inhibición competitiva (es decir, competir con un ligando endógeno para un sitio común de unión en el receptor de membrana) . La adición de una cantidad terapéuticamente efectiva del receptor soluble TNF en la articulación deberá neutralizar efectivamente la actividad biológica del ligando. Los experimentos en donde se han administrado receptores solubles recombinantes in vivo han demostrado la capacidad de inhibir las respuestas i-n-f-l-ama%o-r-ia-s^^a-e-u^ En esta invención, los agentes adecuados como agentes condroprotectores para usarse en combinación con otros agentes condroprotectores, analgésicos y/o antiinflamatorios para inhibir la destrucción del cartílago incluyen TNFR soluble, el polipéptido quimérico de humano (quimera recombinante) que comprende el dominio extracelular del receptor TNF-a (p80) unido a la porción Fe de la IgGl de humano y el anticuerpo anti-TNF-a. Para todos los modos de administración local (es decir, inyección, infusión e irrigación) la dosis óptima y/o concentración óptima de cada agente adecuado es la que sea terapéuticamente efectiva. Como ejemplo, para cada uno de los agentes enumerados, las concentraciones preferidas y más preferidas de una solución de irrigación que contiene el agente enumerado se proporcionan de manera que las concentraciones esperadas sean terapéuticamente efectivas. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una dosis o carga del agente suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficiente del agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un período de liberación prolongado predeterminado.
TABLA 2 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR TNF Compuesto Concentraciones Concentraciones de terapéuticas de administración loca administración local más preferidas (nM) (nM) STNFR 0.1-2000 200 rhTNFR: Fe 0.1-2000 200 quimérico Anticuerpo 0.2-2000 200 anti-TNF-a 3. AGONISTAS DEL RECEPTOR DE INTERLEUCINA Algunas citocinas son glicoproteinas de señalización que son mediadores importantes de la inflamación sinovial y la destrucción del cartílago. Los análisis más recientes del mecanismo de la destrucción del cartílago sugieren que no solamente es importante el nivel absoluto de la citocina proinflamatoria principal, IL-1, para determinar la pérdida de cartílago, pero que el control de la citocina para la homeostasis del cartílago está gobernado por el balance de citocinas anabólicas y catabólicas reguladoras y factores de crecimiento anabólicos. Si el balance entre la producción de IL-?ß e IL-IRa se altera en estado inflamatorio a favor de IL-?ß, entonces esto contribuirá a la patogénesis de estados inflamatorios crónicos y destrucción del -ea-r-t-í-l-ag07—eome—se—s-abe—c^e—ocurre—después—de-una—errugía de articulación de la rodilla. Los agentes terapéuticos potenciales que podrían inhibir la producción de las citocinas proinflamatorias en los sitios de inflamación dentro de la articulación incluyen las citocinas antiinflamatorias, IL-4, IL-10 e IL-13. Se ha observado que estas citocinas reducen en gran medida la destrucción del cartílago articular in vitro e in vivo por medio de su efecto sobre la gama de vías que reducen el impacto de IL-1. Por lo tanto, las citocinas antiinflamatorias como IL-4, IL-10 e IL-13 pueden ser útiles para reducir la inflamación al: 1) reducir la producción de citocinas proinflamatorias y 2) inducir la producción de citocinas antiinflamatorias naturales como IL-IRa, como se mostró recientemente in vivo para IL- . La IL-4 parece atenuar el proceso inflamatorio en pacientes con artritis reumatoide (RA) . En la membrana sinovial reumatoide, se ha demostrado que IL-4 inhibe la producción de citocinas proinflamatorias mediante pedazos de membrana sinovial, para inhibir la proliferación de sinoviocitos y disminuir la resorción ósea. La IL-4 puede promover un efecto condroprotector directo mediante la supresión de la síntesis de metaloproteinasa-3 de matriz (MMP-3) en condrocitos articulares de humano. Se utilizó un sistema de cultivo celular que emplea condrocitos articulares de humano para evaluar el efecto de IL-4 sobre la producción inducida por IL-1 de MMP-3 y la inhibición de tejido por metalop-ro-te-i-na-sa—1—(? ?--1-)~—Se—d- s-eu-b-r-íó—que—ta—¾^—STipTlme" la proteina M P-3 estimulada por la IL-1 y su actividad enzimática. Además, la IL-4 suprimió al ARNm de MMP-3 inducida por IL-1. Se puede inhibir la inducción de iNOS mediante IL-4, IL-10 e IL-13. Por lo tanto, la IL-4 puede caracterizarse como un mediador protector de la destrucción de la articulación que se observa en enfermedades inflamatorias de la articulación. Más aún, los efectos de IL-4 en el balance de los niveles de IL-1 en citocinas regulatorias también apoyan una función protectora del cartílago. Se descubrió que la IL-4 e IL-10 suprime la producción de citocinas inflamatorias en células sinoviales reumatoides recientemente preparadas. Aunque cada interleucina es efectiva por sí sola, la combinación de IL-4 e IL-10 inhibe sinérgicamente la producción de IL-6 e IL-8 estimulada por IL-1 y TNF-a, sin efectos sobre la viabilidad celular. La adición de IL-4 a cultivos sinoviales con RA incrementa la producción de IL-lRa y disminuye la de IL-?ß. El tratamiento in vivo con IL-4 promueve una reducción en artritis experimental en ratas actuando en forma diferente sobre el balance de IL-lp/IL-lRa . La IL-13, otra citocina que comparte muchas propiedades con IL-4, también induce IL-1RA en la membrana sinovial con RA. Por lo tanto, la administración local o sistémica de una combinación de IL-4 e IL-13 puede proporcionar un valor terapéutico sinérgico. La IL-10 tiene una variedad de propiedades que i¾d €afi^q-ue e-s—un— uen—eaftdi-áa^E-e—pafa-^-n- ±fe-i-r—la—de-s-trucc ón-del cartílago. Inhibe la liberación tanto de IL-1 como de TNF-cc y estimula la producción de TIMP-1 mientras que inhibe la de MMP-2. La producción de IL-10 dentro de la membrana sinovial con artritis reumatoide ha sido mencionada recientemente y se han caracterizado los efectos antiinflamatorios de IL-10. La IL-10 suprime la producción de IL-?ß en un modelo experimental ex vivo de artritis reumatoide usando pedazos de membrana sinovial, pero en menor grado que IL-4. Un efecto protector del tratamiento con IL-4 e IL- 10 sobre la destrucción del cartílago se ha descubierto en modelos experimentales en animales con artritis que emplean métodos no locales de administración para las citocinas. En un modelo experimental de artritis en murino inducida por colágeno, el tratamiento combinado de IL-4 e IL-10 produce una mejora sustancial. Además de la supresión de los signos macroscópicos de inflamación, el tratamiento combinado con IL-4 e IL-10 también reduce los infiltrados celulares en el tejido sinovial y causa una pronunciada protección contra la destrucción del cartílago. Más aún, los niveles de ARNm para TNF-a e IL-1 se suprimieron bastante tanto en el tejido sinovial como el cartílago articular. A diferencia de esto, los niveles de IL-1 del antagonista receptor (IL-IRa) permanecieron elevados, lo que sugiere que el mecanismo de protección puede estar relacionado con una protección suprimida de TNF- e IL-1, con la regulación acelerada Goaeo^roi-feaRte—de-1—baiaR-ee—de—H~ -Ray-Hi--1-—Estos—dat~o~s—son consistentes con una función dominante de IL-10 en la supresión endógena de la respuesta inflamatoria y destrucción del cartílago articular y un tratamiento combinado con IL-4 e IL-10 parece tener un valor terapéutico potencial. También ha sido investigada la función de IL-4 e IL-10 endógenos y el efecto terapéutico de la adición de estas citocinas en la inflamación de la articulación y destrucción del cartílago en las etapas tempranas del modelo experimental de artritis por la pared celular de estreptococos (SC ) en murino dependiente de macrófagos. Se demostró que la IL-10 endógena tiene una función en la regulación de la artritis por SCW. La adición de IL-10 exógena magnifica aún más el efecto supresor de la IL-10 endógena. Se descubrió un efecto incluso más pronunciado con la combinación de IL-4 e IL-10. La combinación dio como resultado un hinchamiento reducido y un incremento en la síntesis de proteoglicano de condrocitos. El tratamiento con la combinación de IL-4 e IL-10 disminuyó sustancialmente los niveles de TNF-a, como ocurre con el tratamiento solamente con IL-10, pero también dio como resultado niveles de IL-?ß bastante reducidos en la membrana sinovial, otro efecto del beneficio clínico potencial. En general, los datos son consistentes con una función de IL-4 e IL-10 como agentes condroprotectores administrados sistémicamente o localmente en las articulaciones para prevenir la destrucción del cartílago e indica una combinación que contiene IL-4 e IL-10 -qoie—puede—p-ro or-ei n^^ que cualquiera de estos agentes por si solos. Se utilizaron ratones combinados con inmunodeficiencia severa (SCID) como un modelo experimental para evaluar el efecto de una inyección de IL-4 ó IL-10 sobre la degradación del cartílago y el reclutamiento de células mononucleares (MNC) in vivo en la membrana sinovial reumatoide de humano. La membrana sinovial reumatoide de humano y el cartílago de 5 pacientes con artritis reumatoide se inyectaron con IL-4 recombinante de humano (rhIL-4, 100 ng; rhIL-10, 100 ng) , una combinación de IL-4 e IL-10, ó TNF-alfa (1000 U) o solución salina amortiguada con fosfato dos veces por semana durante cuatro semanas. Se descubrió que una combinación de IL-4 e IL-10 de humano inhibe la degradación de cartílago e invasión de tejido sinovial de humano, estableciendo las propiedades condroprotectoras de estos agonistas de interleucina . Se ha secuenciado y clonado la IL-13 de humano y se descubrió que comparte varias de las propiedades de IL- . La IL-13 es aproximadamente un 25% homologa a IL-4. Al igual que IL-4, la IL-13 disminuye la producción de citocinas proinflamatorias, incluyendo IL-1 y TNF-a, mediante las células mononucleares de líquido sinovial. La IL-13 muestra efectos antiinflamatorios in vivo y por lo tanto tiene potencial terapéutico en el tratamiento contra la destrucción del cartílago de la articulación. Los compuestos útiles como agonistas de IL-4, IL-10 e— iíiel«y-€-H—¡ta—Hr~ -,—I-L—1-?—e—I-ir—13—deHromrro—que-ocurre- naturalmente, las IL-4 (rhIL-4), IL-10 (rhIL-10) e IL-13 (rhIL-13) recombinante de humano asi como las secuencias parciales de las mismas o secuencias de péptidos que se han estructurado usando técnicas de ADN recombinante para reconocer los receptores de IL-4, IL-10 e IL-13 y que sean capaces de activar estos receptores sobre la superficie celular. Esto incluye específicamente las moléculas multiespecíficas comprendidas por una porción de receptor anti-Fc y una porción de receptor anti-IL-4, anti-IL-10 y anti-IL-13, en donde al menos una porción se estructura usando técnicas de ADN recombinante. Dentro del contexto que definen los agonistas de interleucina como agonistas farmacológicos, el término agonista de interleucina incluye, entre otros: (1) secuencias peptídicas que corresponden las secuencias de aminoácidos producidos naturalmente (endógenos) o fragmentos de los mismos, (2) interleucinas recombinantes que son secuencias parciales o truncadas de las secuencias de aminoácidos de cadena completa de la interleucina que ocurre naturalmente que retiene la habilidad de unirse al receptor cognado y retener la actividad biológica y análogos del mismo, y (3) interleucinas quiméricas que son polipéptidos recombinantes que comprenden secuencias truncadas o parciales que corresponden a una porción de las secuencias de aminoácidos de cadena completa unidas mediante oligómeros (por ejemplo, aminoácidos) a una secuencia que corresponde a una porción del polipéptido IgG (por ejemplo, la porción de -bisagra—d -^-G-^^e-^^emi-H-io-^-e-)—q¾e-^et-i-eften—la—h-ai3i-±±dad~~de" unirse al receptor cognado y retener su actividad biológica. Los ejemplos de agonistas de interleucina adecuados para la presente invención se enumeran a continuación. Para todos los modos de administración local (es decir, inyección, infusión e irrigación) la dosis y/o concentración óptimas de cada agente adecuado es la que sea terapéuticamente efectiva. Como ejemplo, para cada uno de los agentes enumerados, se proporcionan las concentraciones preferidas y más preferidas de una solución de irrigación que contiene el agente enumerado, estas concentraciones se espera que sean terapéuticamente efectivas. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluirán de forma adecuada una dosis o carga del agente suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes de agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación y sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo de liberación prolongada predeterminado.
TABLA. 3 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGONISTAS DE INTERLEÜCINA Compuestos Concentraciones Concentraciones terapéuticas de preferidas de administración administración loe local (nM) (nM) rhumano IL-4 0.5-5,000 5-500 rhumano IL-10 0.5-5,000 5-500 rhumano IL-13 0.5-5,000 5-500 4. AGONISTAS DE SUPERFAMILIA DE FACTOR DE CRECIMIENTO TRANSFORMANTE ß 5 Los miembros de la subfamilia del factor de crecimiento transformante ß (TGF-ß) son proteínas multifuncionales y pleiotrópicas de 25 kD capaces de influir sobre una variedad de funciones celulares y se sabe que están involucradas en la remodelación y reparación del tejido. En 10 varios casos, intensifica la interacción celular con la matriz extracelular (ECM) e incrementa la acumulación de ECM al estimular la producción y secreción de proteínas ECM e inhibidores de proteasa. También se ha demostrado que TGF-ß tiene interacciones sinérgicas con otras citocinas, 15 generalmente mostrando actividades antiinflamatorias. Se han identificado múltiples isoformas de TGF-ß que comparten homologías próximas de la secuencia de aminoácidos. Se han descubierto TGF-ß?, TGF^2 y TGF-ß? en el tejido de humano y son activas en células de mamífero, aunque difieren en su -2-g a-f-iaidad—de—anión-.
Los miembros de la subfamilia de TGF-ß son potentes reguladores de la proliferación, diferenciación de condrocitos y acumulación de la matriz extracelular . En los cultivos de órganos cartilaginosos, el TGF-ß? regula el metabolismo de proteoglicanos y estimula la síntesis de glicosaminoglicano y colágeno en condrocitos articulares de conejo. Además, el TGF-ß? incrementa la expresión para TIMP en condrocitos articulares de humano y lentifica la expresión para los receptores de IL-1 en el cartílago articular. Las proteínas morfogenéticas del hueso (BMP, por sus siglas en inglés) son reguladores multifuncionales del crecimiento, diferenciación y apoptosis celular que pertenecen a la superfamilia del factor de crecimiento transformante (TGFJ-ß. Se han identificado en mamíferos más de una docena de miembros de la familia de proteínas BMP, los cuáles pueden subclasificarse en varios grupos dependiendo de sus estructuras. La BMP-2 y BMP-4 son bastante similares entre sí. La BMP-5, BMP-6, la proteína osteogénica (OP) -1 (también llamada BMP-7) y OP-2/BMP-8 son estructuralmente similares entre sí. El factor de diferenciación del crecimiento (GDF)-5 (también llamado proteína-1 morfogenética derivada del cartílago) , GDF-6, (también llamada proteína-2 morfogenética derivada de cartílago) , y GDF-7 forman otro grupo relacionado. A diferencia de BMP-2, BMP-4 , BMP-6 y OP-l/BMP-7, que inducen la formación in vivo del hueso y cartílago, la GDF-5, GDF-6 y GDF-7 inducen de manera más e-f-i-G-i-e-nfee—las—e-s-feruetru^a-s—sim-i-l-aire-s—a—tendón— —caxtrl-ago—±n vivo ( olfman y col., 1997) . Los miembros de la superfamilia TGF-ß ejercen sus efectos al unirse a dos tipos de receptores de serina/treonina cinasa, de los cuáles ambos son esenciales para la transducción de señal (Massague, 1998) . Los receptores Tipo II son cinasas constitutivamente activas las cuáles transfosforilan los receptores Tipo I al unirse al ligando. Los receptores Tipo I activan los sustratos intracelulares como las proteínas Smad y es mediante este mecanismo que ocurre la especificidad de la transducción de señal intracelular . Se han aislado en mamíferos siete receptores Tipo I, que originalmente se llamaron cinasa similar al receptor de activina (ALK) -l-ALK-7. El receptor BMP Tipo IA (BMPR-IA ó ALK-3) y el receptor de BMP Tipo IB (BMPR-IB ó ALK-6) son estructuralmente similares entre sí y se unen específicamente a BMP con receptores Tipo II. Se ha demostrado que ALK-2 se une a la activina, pero los últimos datos revelan que es un receptor Tipo I para ciertas BMP (por ejemplo, OP-l/BMP-7 ) (Macias-Silva y col., 1998) . La ALK-1 es estructuralmente muy similar a ALK-2, pero aún se desconoce su ligando fisiológico. La ALK-5 y ALK-4 son receptores Tipo I para TGF-ß (?ß??-?) y activina (ActR-IB) , respectivamente. La ALK-7 es estructuralmente similar a ALK-4 y ALK-5, pero aún no se ha determinado su ligando. Los agonistas de TGF-ß y BMP que ocurren naturalmente así como los agonistas (rh) recombinantes de humano—o—s-i-nfeéfe-i-eo-s—adeeu-aées— -a-r-a—us-a-rs —en— a—sO±u"ci"ón" protectora del cartílago de la presente invención pueden interactuar con cualquiera de los receptores BMP descritos anteriormente. Como se utiliza en la presente, el término "agonistas de TGF-ß y BMP" incluye fragmentos, deleciones, adiciones, sustituciones de aminoácidos, mutaciones y modificaciones de la misma que retengan las características biológicas de los ligandos del agonista TGF-ß y BMP de humano que ocurren naturalmente. Los agonistas de TGF-ß o BMP pueden usarse solos o en combinación sinérgica con otros miembros de la superfamilia TGFP como agentes anabólicos del cartílago (condrogénicos o promotores de la reparación de la matriz cartilaginosa) o en combinación con agentes inhibidores que bloquean el catabolismo del cartílago. Los receptores Tipo I funcionan como componentes en dirección 3' de los receptores Tipo II. La especificidad de señales intracelulares por los receptores Tipo I se determina mediante una región especificada en el dominio de serina/treonina cinasa, llamado el bucle L45. Por lo tanto, las estructuras del bucle L45 de BMPR-IA/ALK-3 y MBPR-IB/ALK-6 (grupo BMPR-I) son idénticas entre sí y pueden transducir señales similares en las células. Similarmente, los bucles L45 de TpR-l/ALK-5, ActR-IB/ALK-4 y ALK-7 (grupos TpR-I) son idénticas entre sí y activan sustratos similares (Chen y col., 1998). Los bucles de L45 ALK-1 y ALK-2 (grupo ALK-1) son más divergentes del otro tipo de receptores Tipo I, pero activan sustratos similares a los de los receptores Tipo I de-].—^upe-^M-R— (-A^m s-^e©±--^--r-^-^ Las diversas proteínas pueden transducir señales a partir de los receptores TGF-ß y BMP serina/treonina cinasa. Entre estos, las moléculas mejor estudiadas son proteínas de la familia Smad. Se han identificado ocho diferentes proteínas Smad en los mamíferos y estas proteínas se clasifican en tres subgrupos (es decir, Smads reguladas por el receptor (R-Smads) , las Smads comunes asociadas (Co-Smads) y las Smads inhibitorias). Las R-Smads se activan directamente por receptores Tipo I y de complejos con Co-Smads y se translocan en el núcleo. Los heterómeros de Smad se unen al ADN directamente, indirectamente o por medio de proteínas de unión al ADN y regulan así la transcripción de los genes objetivo. Smadl, Smad5 y Smad8 se activan por medio de BMP mientras que Smad2 y Smad3 se activan por medio de TGF-ß. Por ejemplo, Smad2, en combinación con Smad4 que funciona como una Co-Smad se transloca al núcleo en donde activa la transcripción de genes que intervienen en los efectos biológicos de TGF. Smad6 y Smad7 tienen una relación estructural distante con otras Smads y actúan como Smads inhibitorias. Se ha demostrado que BMP induce nueva formación de hueso y cartílago in vitro e in vivo y regulan la diferenciación del crecimiento de condrocitos. Más aún, estas proteínas también están implicadas en los procesos de reparación de cartílago. Diversos estudios demuestran que BMP también promueven y mantienen el fenotipo condrogénico, que está indicado por su habilidad para estimular la síntesis del -p-reteeg-l-i-earie--en—eondrebi-a-s-tos—de—feto—de— ata—y—ccdrtivO celular de yema de articulación de pollo asi como en condrocitos articulares de conejo y bovino. La importancia de BMP para la formación de hueso y cartílago ha sido probada con un método transgénico en donde se estudiaron la desactivación de genes específicos para BMP. Un miembro de la familia BMP, proteína osteogénica (OP-1 ó BMP-7), parece ser particularmente importante para la homeostasis del cartílago bajo condiciones normales y patológicas, como durante la reparación del cartílago. OP-1 parece ser el único miembro de la familia BMP, junto con las proteínas morfogenéticas derivadas del cartílago, que se expresa por condrocitos articulares de adulto (Chubinskaya, S., J. Histochemistry and Cytochemistry 48: 239-50(2000)). La OP-1 se purifica originalmente a partir de la matriz ósea y se muestra que induce la formación de hueso y cartílago. El gen de OP-1 de humano ha sido clonado y se han producido homodímeros de OP-1 recombinante biológicamente activos. El OP-1 recombinante de humano puede estimular la síntesis de agrecano y colágeno Tipo II por los condrocitos articulares de humano in vitro. También puede contrarrestar los efectos nocivos de IL-1 sobre el metabolismo de estos condrocitos y bloquear el daño al cartílago de bovino por los fragmentos de fibronectina . Este efecto fue demostrado por el estudio de los efectos de OP-1 humano recombinante sobre la producción de proteoglicano, prostaglandina E2 y antagonista del receptor IL-1 mediante los condrocitos articulares de humano e-a-l-^ti-va-d-ee—e-n—p3?e-s-eftei-a do ±^e^í^^n&-i-b&t^ —El—rat-am enfc de condrocitos articulares de humano con OP-1 fue efectivo para sobreponerse a la lentificación de la síntesis del proteoglicano inducida por bajas dosis de IL-?ß. Más aún, un estudio encontró que la OP-1 estimula la síntesis de hialuronano y CD44, otras moléculas requeridas para el ensamble de la matriz por los condrocitos de humano. Estos estudios de expresión y regulación para OP-1 en el cartílago de humano adulto sugieren una función para OP-1 en la protección del cartílago y reparación e indican que la OP-1 puede utilizarse como el agente terapéutico que promueva el anabolismo del cartílago y repare el cartílago articular de humano . La OP-1 (BMP-7) incluye formación ósea y de cartílago cuando se implanta en sitios dentro y fiera del esqueleto in vivo. La influencia de OP-1 en la cicatrización de defectos de cartílago articular de grosor completo fue investigada al perforar dos orificios adyacentes a través del cartílago articular de una articulación de la rodilla de un conejo. La OP-1 indujo la regeneración y cicatrización del cartílago articular de la superficie de la articulación que contiene células que se asemejan a condrocitos maduros de la articulación . Estos datos sugieren que una modalidad preferida de la solución útil para la práctica de la presente invención para la prevención de la degradación del cartílago y mantenimiento de la homeostasis biológica del cartílago a-r^tiethk-ar-—de—hame-ne—d spués—de—m—fc-r-atima—q^trú-rgico—podr-ra-incluir la aplicación sistémica o local de un miembro de la superfamilia TGF-ß, preferiblemente TGFP2, B P-7 (OP-1) ó BMP-2, o un agonista equivalente que actúe a través de los mismos receptores empleados por estos ligandos. La administración sistémica o local puede ocurrir en combinación con un fármaco o fármacos que sean inhibidores de los procesos catabólicos del cartílago (por ejemplo, inhibidores de ??? cinasa, inhibidores de MMP o inhibidores de óxido nítrico sintasa) y/u otros agentes para la inhibición del dolor e inflamación. Dentro del contexto para definir los agonistas TGF-ß y BMP como agonistas farmacológicos, el término agonistas de TGF-ß y BMP incluye, entre otras cosas: (1) secuencias peptídicas que corresponden a secuencias de aminoácidos producidas naturalmente (endógenas) o fragmentos de las mismas, (2) TGF-ß y BMP recombinante que son secuencias parciales o truncadas de la cadena completa de secuencias de aminoácidos de TGF-ß y BMP que ocurren naturalmente y que retienen la habilidad de unir el cognado a su respectivo receptor y retener la actividad biológica y análogos del mismo, y (3) TGF-ße y BMPs quiméricos que son polipéptidos recombinantes comprendidos de secuencias parciales o truncadas que corresponden a una porción de la cadena completa de secuencias de aminoácidos unidos a través de sus oligómeros (por ejemplo, aminoácidos) a una secuencia que corresponde a una porción de un polipéptido IgG (por ejemplo, la—bisag-r-a—I-gG——e-1—d^m-i-ni-e—Fe-)—que retierren—^ra—ha-b±± darr~de unir el receptor cognado y retener la actividad biológica. A continuación se enumeran los ejemplos de agonistas TGF-ß y BMP adecuados para la presente invención. Para todos los modos de administración local (es decir, inyección, infusión, irrigación) la concentración y/o dosis óptima de cada agente adecuado es la que sea terapéuticamente efectiva. Como ejemplo, para cada uno de los agentes enumerados, las concentraciones preferidas y más preferidas de una solución de irrigación que contiene el agente enumerado se proporcionan de manera que se espere que estas concentraciones sean terapéuticamente efectivas.
Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis de agentes suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes de agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada. Se puede estimar un intervalo de concentraciones terapéuticas de administración local o acción local en la solución quirúrgica para la articulación a partir de valores de las constantes de disociación (Kd) de cada ligando para su ie ee-p-te- —e qña e-. Atm -ue—estos—-v iof s—-ar-í-a-n—pa~ra—ros-tejidos y tipos celulares en particular, el siguiente ejemplo se da para BMP- . Los experimentos de unión con 125I-BMP-4 , revelaron la presencia de sitios de unión específicos de alta afinidad con una constante de disociación aparente de 110 pM y aproximadamente 6000 receptores por célula. Por lo tanto, a 11 nM BMP-4, la unión del ligando será máxima y los receptores disponibles se ocuparán totalmente (estarán saturados) . Se ha demostrado la presencia de receptores funcionales para BMP-4 en condrocitos articulares primarios.
TABLA 4 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS PARA AGONISTAS DEL RECEPTOR TGF-ß Y BMP Compuesto Concentraciones Concentraciones más terapéuticas de preferidas de administración local administración local (nanomolar) (nanomolar) TGF-ß? 0.05-500 0.5-100 TGF-P2 0.05-500 0.5-100 BMP-2 0.1-2000 1-200 BMP-4 0.1-2000 1-200 BMP-7 (OP-1) 0.1-2000 1-200 5. INHIBIDORES DE CICLOOXIGENASA—2 (COX-2) Se utilizan ampliamente los fármacos antiinflamatorios no esteroidales (NSAID) como agentes a t-t -fd~a»^ o terapéuticamente como agentes condroprotectores . El objetivo molecular directo para un fármaco NSAID es la primera enzima en la vía sintética de las prostaglandinas , referidas como prostaglandina endoperoxidasa sintasa o ácido graso ciclooxigenasa . Dos formas relacionadas de ciclooxigenasa, las llamadas ciclooxigenasa-1 o Tipo 1 (COX-1) y ciclooxigenasa-2 (COX-2) han sido caracterizadas. Estas isozimas también se conocen como prostaglandina G/H sintasa (PGHS)-l y PGHS-2. Ambas enzimas catalizan la etapa limitante de la velocidad para la formación de prostanoides que es la conversión de ácido araquidónico en prostaglandina H2. La COX-1 está presente en plaquetas y células endoteliales y muestra actividad constitutiva. A diferencia, se ha identificado COX-2 en células endoteliales, macrófagos, fibroblastos y otras células en la articulación y su expresión está inducida por citocinas proinflamatorias , como IL-1 y TNF-a. Dentro de la articulación inflamada, la expresión para COX-2 se regula aceleradamente y se ha demostrado que ocurren grandes incrementos en la actividad de COX-2 en combinación con su regulación acelerada, lo que conlleva a una síntesis incrementada de prostaglandinas que están presentes en el líquido sinovial de pacientes que sufren de artropatías inflamatorias. Las fuentes celulares de prostaglandinas (PG) en la articulación incluyen condrocitos activados, sinoviocitos Tipo A y B y macrófagos de infiltraeíé-n-; L-a-s func-rone-s—ceitrra-re-s—rmp-ortrant-e-s—e~ —eX metabolismo por el cartílago reguladas por PG incluyen la expresión génica, síntesis y proliferación de la matriz extracelular . Debido a que COX-2 se expresa en el tejido de la articulación inflamada o después de la exposición a mediadores de la inflamación (por ejemplo, como resultado de una lesión o trauma quirúrgico) , el uso de un inhibidor proporcionará una actividad tanto inflamatoria como protectora del cartílago. La destrucción del cartílago en artropatías inflamatorias puede desencadenarse como consecuencia de una lesión en la articulación y como resultado de procedimientos quirúrgicos artroscópicos . Los condrocitos son el único tipo celular en el cartílago articular y se sabe que participan en la descomposición de su propia matriz mediante la liberación de mediadores inflamatorios endógenos, incluyendo PG. Los estudios han demostrado que la expresión génica para COX-2, la síntesis proteica y la liberación de PG en condrocitos normales articulares de humano se induce rápidamente por citocinas, incluyendo IL-1, TNF-ot e IL-6. Se detectan niveles de ARNm tan pronto como dos horas después de la inducción por citocina, alcanzan altos niveles a las 6 horas y muestran una duración extremadamente larga de expresión durante al menos 72 horas. Similarmente, los estudios en cultivos celulares de activación por IL-loc y TNF-a de sinoviocitos humanos han demostrado un gran incremento en la expresión para COX-2 y producción de prostaglandina E2 (PGE2). El tratamiento con -u-n-a— -a-ri-edard—de— S-??-?, como—el-—ket-opro-ferrcr, rmpxdre—Ta~ respuesta inducida por PGE2. En un sistema de cultivo de células de condrocito, el inhibidor especifico para COX-2, NS-398, previene el incremento en la producción de PGE2 inducida por la citocinas mientras que los niveles de COX-1 permanecen estables (Morisset, S., 1998, J. Rheumatol. 25: 1146-53) . Por lo tanto, puede deducirse que al bloquear la producción de PG por condrocitos activados, lo cuál se asocia con la expresión de COX-2, puede proporcionar un efecto condroprotector . Normalmente se utilizan NSAIDs en el tratamiento de pacientes con osteoartritis o artritis reumatoide, pero sus efectos sobre el metabolismo del cartílago articular en el contexto de estas enfermedades artríticas permanece en tema de debate. Por ejemplo, el tratamiento clínico contra osteoartritis y artritis reumatoide con NSAID es exitoso para reducir la inflamación. Sin embargo, se piensa que algunas NSAIDs que no son selectivas para COX-2, principalmente salicilatos e indometacina, aceleran la destrucción del cartílago osteoartrítico al interferir con la síntesis de proteoglicano por condrocitos, mientras que otras NSAIDs tienen cierto efecto condroprotector al estimular la reparación del cartílago. La mayoría de los estudios han demostrado que NSAID tienen muy poco o ningún efecto sobre el cartílago. Debido a la carencia del uso de estas clases de fármacos en el tratamiento contra sinovitis y destrucción del cartílago después de una lesión traumática en la articulación —trauma—qui^úr-g-i-e© —tas— -r©pieda-de-s—antees—de—cada—NSATD" sobre los mecanismos patofisiológicos que contribuyen a la destrucción del cartílago aún necesitarán establecerse. Ya que ambas isozimas COX son farmacológicamente distintas, los inhibidores de ciclooxigenasa específicos para isozima (selectivos) que son útiles para la terapia antiinflamatoria han sido desarrollados y algunos de estos mismos inhibidores COX han sido probados en modelos experimentales de inflamación en la articulación. Sin embargo, los efectos in vitro de los inhibidores COX-2 sobre la síntesis y degradación de los proteoglicanos del cartílago, así como la producción sinovial de IL-1, IL-6, IL-8 y prostanoides , indica que ciertas NSAIDs pueden variar considerablemente en cuanto a sus efectos in vivo sobre el cartílago y producción sinovial de interleucinas y eicosanoides , de manera que los efectos integrados de estos parámetros pueden influir sobre el resultado de estos inhibidores COX-2 sobre la integridad del cartílago. Por ejemplo, algunas NSAIDs pueden acelerar el daño a la articulación en la osteoartritis al potenciar la producción de citocinas proinflamatorias o inhibir la síntesis de proteoglicano del cartílago. Sin embargo, a pesar de la posible varianza en cuanto al efecto clínico entre los inhibidores específicos para COX-2, la inhibición de COX-2 normalmente da como resultado una reducción de sinovitis y una esperada disminución en cuanto al riesgo de daño al cartílago . -Se han d s-a-r-r-oü-a-de «na v¾r-i-ed-ad—de eTrsByo"s_ bioquímicos y celulares en animales para evaluar la selectividad relativa de inhibidores para las isoformas de COX-1 y COX-2. En general, los criterios para definir la selectividad es la proporción de constantes inhibitorias para C0X-1/C0X-2 (o C0X-2/C0X-1) obtenidos para un sistema dado de ensayo bioquímico o celular. La proporción de selectividad es la razón de los diferentes valores absolutos IC50 para la inhibición de actividad enzimática que se obtienen entre los sistemas de valoración microsomal y celular (por ejemplo, líneas celulares de macrófagos y plaquetas que expresan establemente para isozimas de COX recombinantes de humano) . Más aún, la inhibición de COX-2 imita los efectos inhibitorios desencadenados por las citocinas condroprotectoras (inhibitorias), como la IL-4, que lentifica la síntesis intracelular de COX-2. La comparación de la selectividad de más de 45 NSAID e inhibidores selectivos de COX-2 (Can. J. Physiol. Pharmacol. 75: 1088-95 (1997)) demostró la siguiente selectividad relativa ordenada por importancia para COX-2 con respecto a COX-1 : DuP697>SC-58451=celecoxib>nimesulide=meloxicam=piroxicam=NS-398=RS- 57067>SC-57666>SC-58125>flosulide>etodolac>L-745, 337>DFU-T-614, con valores IC50 que abarcan de 7 nM a 17 µ?. A partir del mecanismo molecular y celular de acción definido por los inhibidores selectivos de COX-2, como el celecoxib y rotecoxib, así como a partir de estudios en animales, se espera que estos compuestos muestren acción condropr-o eetora—cuando—&e—¡a üquen— erl-ope-r-at-irvamentre—en~un¾_ solución de irrigación o en una inyección directamente en la articulación. En particular, los inhibidores de COX-2 son fármacos efectivos administrados en una solución de irrigación durante un procedimiento quirúrgico artroscópico mediante inyección directa en la articulación antes de, durante o después de un procedimiento quirúrgico u otra lesión en la articulación. A continuación se enumeran los ejemplos de inhibidores COX-2 adecuados para la presente invención. Para todos los modos de administración local (es decir, inyección, infusión e irrigación) la concentración y/o dosis óptima de cada agente adecuado es la que sea terapéuticamente efectiva. Se proporciona como ejemplo, para cada uno de los agentes enumerados, las concentraciones preferidas y más preferidas de una solución de irrigación que contienen el agente enumerado, se espera que estas concentraciones sean terapéuticamente efectivas. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluirán adecuadamente una carga o dosis del agente suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una dosis o carga suficientes del agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante TABLA 5 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE INHIBIDORES DE CICLOOXIGENASA-2 Compuestos Concentraciones Concentraciones más terapéuticas preferidas de preferidas de administración local administración local (nanomolar) (nanomolar) rofecoxib 0.3-30, 000 30-3, 000 (MK 966) SC-58451 0.3-30,000 30-3, 000 celecoxib 0.3-30,000 30-3, 000 (SC-58125) meloxicam 0.5-50,000 50-5, 000 nimesulide 0.5-50,000 50-5, 000 diclofenaco 0.3-30, 000 30-3, 000 NS-398 0.3-30, 000 30-3,000 L-745,337 0.2-100, 000 20-10,000 RS57067 0.2-100, 000 20-10,000 SC-57666 0.2-100,000 20-10,000 flosulide 0.2-100,000 20-10, 000 6. INHIBIDORES DE MAP CINASA Las cinasas de proteina activada por mitógeno (MAP) son un grupo de cinasas de la proteina serina/treonina que se activan en respuesta a una variedad de estímulos ext-race-lttiares—y—f rrc-ron-an—en—ta— ransdtrccrÓTi— e—seflale^ desde la superficie celular hacia el núcleo. La cascada de MAP cinasa es una de las principales vías intracelulares de señalización que transmiten señales de los factores de crecimiento, hormonas y citocinas inflamatorias hacia los genes tempranos e intermedios. En combinación con otras vias de señalización, estas cinasas de proteina activada por mitógeno activado (MAPK) alteran diferencialmente el estado de fosforilación y actividad de los factores de transcripción y ultimadamente regulan la proliferación celular, diferenciación y respuesta celular a la tensión ambiental. Por ejemplo, un miembro de la familia MAPK (p38) interviene en las principales vias bioquímicas de la transducción de señal de las potentes citocinas proinflamatorias, IL-1 y TNF-cc, lo que conlleva a la inducción de ciclooxigenasa-2 (COX-2) en macrófagos estimulados, mediante sus factores que actúan en cis involucrados en la regulación transcripcional del gen COX-2. Los miembros de la clase de agentes de MAP cinasa están compuestos de al menos tres familias que se sabe difieren en cuanto a secuencia, tamaño del bucle de activación, activación por estímulos extracelulares y participación en las distintas vías de transducción de señal. Los miembros prominentes entre esta familia de MAP cinasas, incluyen las cinasas reguladas por señal extracelular (ERKs), ERK1 y ERK2 (p44MAPK y p42MAPK, respectivamente); familia de proteína cinasa 1 (SAPK1) activada por estrés que también se üama—ia—familia—de—einas-a—JN-K—©—f-affii-i-i-a—de—jan—c±na-sa—N= terminal; y la familia p38 MAP cinasa que también se conoce como cinasa 2/3 activada por estrés (SAPK-2/3) . Las p38 cinasas se activan por estrés, notablemente las citocinas proinflamatorias . Dentro de la familia p38, hay al menos 4 homólogos distintos (isotipos o isoenzimas) que en la nomenclatura convencional se llaman SAPK2a, SAPK2b, SAPK2d, SAPK3, ó ?38a,ß,d (SAPK4) y ?, respectivamente. Los inhibidores de MAP cinasas útiles para la práctica de la invención pueden interactuar con cualquiera o la combinación de las MAP cinasas anteriores. Para inhibidores específicos de MAP cinasa, las constantes inhibitorias caracterizadas mediante ensayos de enzimas purificadas in vitro y en ensayos celulares pueden variar con respecto a una amplia gama de concentraciones y demuestran utilidad en esta aplicación. La activación de p38 MAP cinasa está mediada por una fosforilación dual de residuos de tirosina y treonina. Se ha demostrado que el tratamiento de células con TNF-a e IL-1 incrementa rápidamente (dentro de un lapso de 5 minutos) la fosforilación y activan la p38 MAP de cinasa. La investigación previa ha demostrado que los inhibidores de molécula pequeña que pueden inhibir específicamente p38 MAP cinasa (Lee, J. , y col., Nature 372: 739-746 (1994)) y producir efectos antiinflamatorios a nivel bioquímico en diversos modelos experimentales en animales. Cuenda y colaboradores (Cuenda, A., y col., FEBS Lett . 364: 229 (1995)) demostraron que el compuesto, SB203580 [4- (4-f-l-ue-ro-fenil-)—2—(-4~meti^s-ui- -n^^enii-)-^—(-4—p-irid-j--l-^:m-id-a-ZO-l-]— inhibe p38 in vitro (IC50 = 0.6 µ?) , suprime la activación de proteina cinasa-2 activadora de MAPK y previene la fosforilación de la proteina de choque térmico (hsp) 27 en respuesta a IL-1 durante estrés celular in vivo. La selectividad de cinasa para la acción inhibitoria de SB203580 para p38 se demostró por su incapacidad o cuanto mucho la débil inhibición de al menos 15 otras proteínas cinasas in vitro, incluyendo miembros de las familias PKC, PKA y del receptor de tirosina cinasa (Lee, J.f Pharmacol. Ther. 82: 389-397 (1999)). En estudios celulares, la preincubación con SB203580 ha demostrado bloquear la fosforilación inducida por IL-1 y TNF-oc de la enzima y una producción subsecuente de IL-8. Esto apoya el efecto preventivo de la administración de inhibidores durante el procedimiento quirúrgico. La función de la proteína cinasa activada por mitógeno p38 (MAPK) en respuestas inflamatorias bioquímicas que resultan en la destrucción del cartílago ha sido estudiado usando SB203580, que inhibe específicamente la enzima. Las acciones de IL-1 que se controlan selectivamente mediante p38 MAPK son la regulación de la prostaglandina H sintasa-2 (COX-2), metaloproteinasas e IL-6 (Ridley, S., y col.,J. Immunol. 158: 3165-73 (1997)). En células del endotelio vascular y fibroblastos de humano, SB203580 inhibió (IC50 = 0.5 µ?) la fosforilación inducida por IL-1 de hsp 27 (un indicador de la actividad de p38 MAPK) en fibroblastos sin afectar las otras vías conocidas de proteína cinasa a-cfeL-vada—po-r-—it—1—f·4-2- ?-44— —p-5- —MA^-Z^e—vJtm—crfna-sa—N= terminal) . Además, SB203580 inhibió significativamente IL-1 estimulada por IL-6 (30 a 50% a 1 µ?) pero no la producción de IL-8 a partir de células endoteliales y fibroblastos de humano . De manera importante, SB203580 inhibió bastante la producción de prostaglandina estimulada por IL-1 mediante células endoteliales de humano y fibroblastos. Esto estuvo asociado con la inhibición de la inducción de proteina COX-2 y ARNm. La PGE2 contribuye a una mayor expresión de las metaloproteinasas de matriz que son mediadores importantes de la degradación del cartílago. Tanto los condrocitos como fibroblastos sinoviales expresan para el gen COX-2 en altos niveles al momento de la activación para las citocinas y estímulos extracelulares . El inhibidor MAPK proporciona actividad condroprotectora debido a su actividad inhibitoria sobre MAPK cinasas expresadas en estos y otros tipos celulares . Se espera que los inhibidores MAPK sean efectivos como agentes protectores del cartílago cuando se apliquen sistémicamente o localmente en tejidos de la articulación en una variedad de estados inflamatorios o patofisiológicos . Se ha caracterizado SB203580 en varios modelos farmacológicos in vivo y se ha demostrado que tiene actividad en dosificaciones orales a largo plazo. Se descubrió que SB203580 inhibe la estimulación de la producción de colagenasa-1 y estromelisina-1 mediante IL-1 sin afectar la síntesis de T-I P—1^—Má-s—a&ñ-,—S-B-2-&3-5-8-G— ifev-ien-e—tm—aumento—de —ARNm—de" colagenasa-1 y estromelisina-1 estimulados por IL-1. En un modelo experimental de descomposición del cartílago, la resorción del proteoglicano estimulada por IL-1 a corto plazo e inhibición de la síntesis de proteoglicano no fueron afectados por SB203580, mientras que el desdoblamiento del colágeno a largo plazo se pudo prevenir. Además, se descubrió que SB203580 es efectivo para inhibir la producción de óxido nítrico inducida por IL-1 en explantes y condrocitos de cartílago articular de bovino (Badger, 1998). Estas observaciones in vitro proporcionan una base para la actividad protectora del cartílago de inhibidor MAP cinasa administrado sistémicamente o directamente y localmente en estos tejidos dentro de la articulación. La p38 MAP cinasa está involucrada en la expresión de citocina inducida por TNF y los fármacos que funcionan como inhibidores de la actividad de p38 MAP cinasa bloquean la producción de citocinas proinflamatorias (Beyaert, R. , y col., EMBO J. 15: 1914-23 (1996)). El tratamiento con TNF-a activa la vía de p38 MAPK como se muestra por una mayor fosforilación de p38 MAPK y activación de sus proteínas sustrato. El pretratamiento de células con SB203580 bloquea completamente la activación de fosforilación de hsp27 y MAPK activador de la proteína cinasa-2 inducidas por TNF-a. En las mismas condiciones el SB203580 también inhibe completamente la síntesis de IL-6 y expresión de un gen indicador inducidas por TNF-a que fue impulsada por un promotor mínimo que eoft-t-i-en-e—dos—eí^metrt^s—ífF--6-B-;—Par— r &ntO-,—e'stro's-estudios y los estudios relacionados con otros inhibidores p38 muestran que la acción de inhibidores, como SB203580 y FR133605, sobre p38 MAPK interfieren selectivamente con la activación inducida por TNF-a e IL-1 de diversas proteínas asociadas con la degradación del cartílago. Por lo tanto, la inhibición selectiva de las vías de señalización de MAP cinasa de estas citocinas proinflamatorias clave mediante la inhibición de una cinasa en dirección 3' del receptor indican que los inhibidores de MAP cinasa pueden proporcionar un efecto condroprotector . Se ha evaluado SB 203580 en diversos modelos experimentales en animales para determinar la inhibición de citocinas y enfermedad inflamatoria. Se demostró que es un potente inhibidor de la producción de citocina inflamatoria in vivo tanto en ratones como en ratas con valores IC50 de 15 a 25 mg/kg. El SB 203580 posee actividad terapéutica en la artritis inducida por colágeno en ratones DBA/LACJ con una dosis de 50 mg/kg dando como resultado una inhibición significativa de la inflamación de la pata. También se observó actividad antiartrítica en artritis inducida por adyuvante en la rata Lewis cuando se administró per os SB203580 a 30 y 60 mg/kg/día. Se obtuvo evidencia adicional con respecto a los efectos beneficiosos en la resorción ósea con un IC50 de 0.6 µ?. En resumen, una variedad de estudios bioquímicos y celulares y animales muestran que p38 MAPK tiene una función im ortante—en—la—¾ou±a-ci- n—de—ras—respuestas— ara—??=1—y TNF-a y que está involucrado en la regulación de los niveles de ARNm de algunos genes de la respuesta inflamatoria, como el COX-2. Los inhibidores de p38 bloquean la producción de citocinas proinflamatorias e inhiben la producción de MMP y se ha demostrado que inhiben el desdoblamiento del colágeno en explantes de cartílago. El uso de inhibidor MAPK para bloquear las acciones de las citocinas proinflamatorias clave, como IL-1 y TNF-a tendrá efectos beneficiosos sobre diversos tipos celulares en la articulación, incluyendo fibroblastos, macrófagos y condrocitos sinoviales, inhibiendo así los efectos patológicos subsecuentes como infiltración de células inflamatorias en la articulación, hiperplasia sinovial, activación de células sinoviales y descomposición del cartílago. Por lo tanto, el inhibidor MAPK deberá bloquear la propagación de la respuesta inflamatoria mediante las citocinas anteriormente mencionadas, interrumpiendo así el proceso de enfermedad. Los ejemplos de inhibidores MAPK adecuados para la presente invención se enumeran a continuación. Para todos los modos de administración local (es decir, inyección, infusión e irrigación, la concentración y/o dosis óptimas de cada gente adecuado es la que sea terapéuticamente efectiva. Como ejemplo, para cada uno de los agentes enumerados, las concentraciones requeridas y más preferidas de una solución de irrigación que contiene el agente numerado se proporcionan, se—espe-ra—q¾-e—e-s-ta-s—eoneent-raciOnes s"e~an~ terapéuticamente efectivas para su administración local. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluirán adecuadamente una carga o dosis del agente suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficiente de agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 6 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE INHIBIDORES DE MAPK CINASA Compuestos Concentraciones Concentraciones terapéuticas de preferidas de administración administración local (nanomolar) local (nanomolar SB 203580 0.5-50, 000 50-5, 000 SB 203580 iodo 0.5-50, 000 50-5, 000 SB 202190 0.2-20, 000 20-2, 000 SB 242235 0.2-10, 000 20-1, 000 SB 220025 0.2-10, 000 20-1, 000 R J 67657 0.3-30, 000 30-3, 000 RWJ 68354 0.9-90, 000 90-9, 000 t'k 133605 1-100, OOU 10-10, 000 L-167307 0.5-50,000 50-5, 000 PD 98059 0.1-10,000 10-1000 PD 169316 1-100, 000 10-10,000 7. INHIBIDORES DE LAS METALOPROTEINASAS DE MATRIZ La destrucción del cartílago articular es una característica común en enfermedades como la osteoartritis y artritis reumatoide, pero también ocurre después de una lesión en la articulación. Patofisiológicamente, una degradación estructural de los proteoglicanos y colágeno se observa, lo cual deteriora las propiedades bioquímicas del cartílago. El mantenimiento de una matriz extracelular normal y sana refleja un balance entre la velocidad de biosíntesis y la incorporación de los componentes de la matriz y la velocidad de su biodegradación y pérdida subsecuente del cartílago en el fluido sinovial. Una amplia variedad de proteasas tienen el potencial de escindir el cartílago y ser involucradas en la degradación, totalmente las metaloproteinasas de matriz. Las metaloproteinasas de matriz (MMPs, por sus siglas en inglés) , o matrixinas, son una familia de al menos 15 zinc endopeptidasas que funcionan extracelularmente y tienen una función primordial en la degradación patológica del tejido. La nomenclatura actual y nombres alternativos para los miembros de MMP se proporcionan en la Tabla 7. La mayoría de las MMP se regulan bastante y la mayoría no se ex^r-e-s-a-n—eo ^-itu -í ameTre—en-^e-jrdcrs—rroTmate'-r; S n embargo, las citocinas proinflamatorias, como la IL-1 y TNFa, inician la transcripción y expresión. Un desbalance creado debido a una regulación acelerada y activación de las MMP degradantes del tejido es un factor causante primario de los procesos de la degradación del cartílago durante las enfermedades inflamatorias crónicas y las respuestas inflamatorias sostenidas sinoviales durante la lesión a la articulación. El metabolismo de la matriz cartilaginosa ha sido estudiado en pacientes con lesión en los meniscos o una ruptura del ligamento cruzado anterior de la rodilla. Se ha demostrado que las concentraciones de estromelisina-1 (MMP-3), colagenasa, inhibidor tisular de las metaloproteinasas (TI P-1) , y fragmentos de proteoglicano se incrementan en el fluido sinovial de la rodilla de humano después de una lesión traumática en la rodilla. Temporalmente, estos valores se incrementan inmediatamente con respecto a los niveles de referencia y permanecen significativamente elevados (un incremento de 10 veces) durante un período de un año. Probablemente estos cambios promueven el incremento de la concentración de fragmentos de proteoglicano que se observa en el líquido sinovial después de una lesión del ligamento de la rodilla.
TABLA 7 METALOPROTEINASAS DE MATRIZ MMP Nombres Número EC Sustratos alternativos MMP-1 Colagenasa, EC3.4.24.7 Colágenos I, II, II, VII y X), Colagenasa de Gelatina; agrecano, versicano fibroblastos , tratado con hialuronidasa; colagenasa proteina de enlace al intersticial proteoglicano; tenascina-C grande; inhibidor de proteinasa ai/antitripsina-<Xi (?^-??) ; antiquimotripsina (oCi-ACHYM) ; 2?; oCjM de rata; proteina de la zona de embarazo; ail3 de rata (inhibidor 3-oti) ; ovostatina; entactina; MBP; péptido GST- TNF/TNF; selección-L; IL-?ß; amiloide A sérico A; IGF-BP5; IGF- BP3; MMP-2; MMP-13 MMP-2 Gelatinasa 72- EC3.4.24.24 Colágenos (I, IV, V, VI, X, XI, y kDa XIV) ; gelatina; elastina; Gelatinasa A fibronectina; laminina-l, Colagenasa laminina-5; gelactina-3; agrecano; Tipo IV decorina; versicano tratado con Gelatinasa de hialuronidasa; proteina de enlace neutrófilo al proteoglicano; osteonectina; MBP; péptido GST-TNF/TNF; IL-?ß; ?ß1-40; ?ß10-20; APP695; a?-??; proteina ae rusion de prolilisilo oxidasa; IGF-BP5; IGF-BP3; FGF Rl; MMP-1; MMP-9; MMP-13 MMP-3 Estromelisina- EC3.4.24.17 Colágenos III, IV V y IX); 1 gelatina; agrecano; veriscano y Transina veriscano tratado con hialuronidasa; perlecano; decorina; proteina ligada con proteoglicano; tenascina-C grande; fibronectina; laminina; entactina osteonectina; elastina; caseína; di-ACHYM; antitrombina-III ; a2M; ovostatina; sustancia P; MBP; péptido GST-TNF/TNF; IL-?ß; amiloide A sérico; IGF-BP3; fibrinógeno y fibrina entrecruzada; plasminógeno; "superactivación" de MMP-1, complejo MMP-2/TIMP-2 ; MMP-7; MMP- 8; MMP-9; MMP-13 MMP-7 Matrilisina EC3.4.24.23 Colágeno IV y X; Gelatina; PUMP agrecano; decorina; proteina de enlace al proteoglicano; fibronectina y laminina; fibrillas insolubles de fibronectina; enactina; tenascina-C grande y pequeña; osteonectina; integrina 0 ; elastina; caseína; transferrina; MBP; ?-??; péptidos GST-TNF/TNF; plasminógeno; MMP-1; MMP-2; MMP-9; MMP-9/TIMP-1 MMP-8 Colagenasa de EC3.4.24.34 Colágenos (I, II, III, V, VII y Neutrófilo X) ; Gelatina; agrecano; a?-??; (??- Colagenasa I ACHYM; antiplasmina-a2; fibronectina MMP-9 Gelatinasa 92 EC3.4.24.35 Colágenos (IV, V, VII, X Y XIV); kDa gelatina, elastina, galectina-3; Gelatinasa B agrecano, versicano tratado con hialuronidasa; proteina de enlace al proteoglicano; fibronectina, entactina; osteonectina; <Xi-AT; MBP; péptido GST-TNF/TNF; IL-?ß; ?ß1-40; plasminógeno MMP- Estromelisina- EC3.4.24.22 Colágenos (III, IV y V) ; Gelatina, 10 2 caseína; agrecano, elastina, proteína de enlace al proteoglicano; MMP-1; MMP-8 MMP- Estromelisina- EC3.4.24 Enzima humana: oii-AT; oc2M; 11 3 caseína, laminina, fibronectina, gelatina, colágeno IV y transferrina carboximetilada MMP- Metaloelastasa EC3.4.24 Colágeno IV; Gelatina, elastina y 12 de macrófago elastina-?; caseína; ?^-??; fibronectina; vitronectina; laminina; enactina; monómero de proteoglicano; GST-TNF; MBP; fibrinógeno; fibrina; plasminógeno MMP- Colagenasa-3 EC3.4.24 Colágenos (I, II y III, IV, IX, X 13 y XIV) ; Gelatina, al-ACHYM e inhibidor del activador del plasminógeno 2; agrecano, perlecano, tenascina-C grande; fibronectina, osteonectina; MMP-9 MMP- MT-MMP-1 EC3.4.24 Colágeno (I, II y III); Gelatina, 14 caseano, elastina- , fibronectina, laminina, vitronectina y proteoglicanos ; tenascina-C grande, enactina; (??-??, a2?; GST- TNF; MMP-2; MMP-13 MMP- MT-MMP-2 Fibronectina, tenascina-C grande, 15 entactina, laminina, agrecano, perlecano; GST-TNF; MMP-2 La familia P de enzimas ha demostrado ser secretada de condrocitos de humano y células de la membrana sinovial, como fibroblastos sinoviales. Más aún, al utilizar hibridación in situ, se demostró que la membrana sinovial de humano sintetiza la estromelisina-1 y la colagenasa. La estromelisina-1 (MMP-3) es capaz de degradar todos los componentes de la matriz de cartílago. Existe evidencia que los condrocitos contribuyen a la degradación del cartílago me-di^nlre-^^-^^e a^iTS r-de-la-eTrz ma degradante de la matríz7 la colagenasa-3. Al activarse por citocinas proinflamatorias , las MP se secretan de células en forma latente y se activan extracelularmente y se inhiben mediante inhibidores tisulares de las metaloproteinasas. El balance entre las actividades de (TIM) . El balance entre las actividades de MMP y TIMP es importante para el procedimiento de la matriz cartilaginosa intacta. Bajo condiciones patológicas como osteoartritis y artritis reumatoide, varios estudios han demostrado cantidades elevadas de MMP dando como resultado un desbalance entre MMP y TIMP que se considera causante de la destrucción del cartílago que se observa. Las MMP son reguladas por las citocinas, como la interleucina-1 (IL-1) , y factores de crecimiento que actúan sobre los condrocitos y sinoviocitos para potenciar su producción de proteasa. Otras citocinas proinflamatorias, como las IL-6, IL-8 y TNFa, también regulan en forma acelerada la producción de las enzimas de la matriz. Esto conlleva a la destrucción del cartílago, que normalmente se evalúa por la pérdida de glicosaminoglicanos sulfatados (GAG)y la escisión del colágeno. La IL-1, que está presente en el líquido de la articulación de pacientes con enfermedades artríticas, estimula a que los condrocitos sinteticen cantidades elevadas de enzimas como estromelisina, colagenasa de neutrófilo y fibroblasto y activador del plasminógeno . Además, la IL-1 inhibe la síntesis del inhibidor-1 y TIMP activadores del plasminógeno y también inhibe—l —síntesis—de—tes—ee-n-s^^te e-ftt s—de—mafcrrz—como—e~!" colágeno. El desbalance entre los niveles de inhibidores y enzimas conlleva a un incremento en la cantidad proteasas activas que combinados con la supresión de la biosíntesis de la matriz, da como resultado la degradación del cartílago. El uso de cortes de cartílago en un modelo experimental in vitro, se ha demostrado que los inhibidores de colagenasa pueden inhibir la invasión estimulada por IL-1 ó IL-8 en el cartílago articular por fibroblastos sinoviales reumatoides (RSF) . Los inhibidores de la colagenasa, l,10-o-fenantrolina y fosforamidon, inhiben sustancialmente la penetración dependiente de la concentración del cartílago por células RSF a concentraciones de 10-150 µ?. El efecto selectivo de citocinas sobre la secreción de proteinasas demuestran que la degradación articular mediada por células similares a fibroblastos sinoviales es un proceso bastante regulado. Por lo tanto, la inhabilidad de inhibir la actividad de la proteasa y la degradación de matriz asociada localmente dentro de la articulación se espera que inhiba el proceso de destrucción del cartílago. La acción de los inhibidores en el sistema limitado in vitro sugiere que la intervención terapéutica usando una administración sistémica o local de inhibidores sintéticos MMP con una farmacocinética apropiada será efectiva como agentes condroprotectores. Los ejemplos de inhibidores MMP adecuados para usarse en la presente invención incluyen U-24522 ((R,S)-N-[2- [2- (hidroxilamino) -2-oxoetil] -4-metil-l-oxopentil] -L-leucil-i^e^^-ai Mra»ida-H—BB2516 —pép-tidos—de—WH^5+ii ch:ax±=4^†W=-hidroxiamino) -2R-isobutil ] -L-leucin-N -metilamida, también conocida como marimastat) , tales como inhibidor I MP e inhibidor MMP-3, y proteínas mayores como TIMP-1 o fragmentos de las mismas se enumeran en la siguiente Tabla: Para todos los modos de administración local (es decir, inyección, infusión e irrigación) la concentración y/o dosis óptimas para cada agente adecuado es la sea terapéuticamente efectiva. Como ejemplo, para cada uno de los agentes enumerados, las concentraciones preferidas y más preferidas de una solución de irrigación que contiene el agente enumerado se proporcionan, se espera que estas concentraciones sean terapéuticamente efectivas cuando se administren localmente. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen en forma adecuada una carga o dosis del agente suficiente para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficiente el agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo enumerado durante un período de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 8 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS PARA LOS INHIBIDORES fe AIiOPROTEMNAS S—BE— ftTRíZ—{MMP- Compuestos Concentraciones Concentraciones más terapéuticas de preferidas de administración local administración local (nanomolar ) (nanomolar) 1. BB2516 0.2-2000 2-200 2. GM1489 0.2-400 2-100 3. GM6001 0.4-800 2-200 4. U-24522 0.2-2,000 20-200 minociclina 30-500, 000 300-3, 000 Inhibidor I de MMP 0.3-3, 000 3-600 Inhibidor de 4-Abz- 0.5-5, 000 5-500 Gly-Pro-D-Leu-D-Ala- NHOH P-3 Ac-Arg-Cys-Gly-Val- 0.5-5, 000 5-500 Pro-Asp-NH2 rhuman TIMP1 rhuman TIMP2 0.3-3, 000 3-600 8. INHIBIDORES DEL FACTOR NUCLEAR KAPPA B (NFKB) Las vías celulares destructoras del cartílago y proinflamatorias son reguladas por los mecanismos de señalización intracelular y extracelular que son objetivos de los nuevos sistemas terapéuticos de administración de fármaco sistémico y local. Los mecanismos completos de señalización molecular utilizados por la citocina proinflamatoria interleucina-1 (IL-1) para activar el factor de definidos. No obstante, una molécula clave que esta involucrada en la señalización intracelular a nivel de la transcripción génica es el factor de transcripción proinflamatorio, (NFKB) . La actividad de NFKB esta mediada por una familia de subunidades del factor de transcripción que se unen al ADN ya sea en forma de homodimeros o heterodimeros . Estas subunidades normalmente están presentes dentro del citoplasma de células en forma inactiva debido a la unión de la subunidad inhibitoria llamada ???. La activación de los receptores IL-1 y otras señales extracelulares, inducen la degradación de ??? y la disociación concomitante de NFKB de los inhibidores, seguido por una translocación al núcleo. Se descubrió que NFKB está involucrado en la expresión inducida por IL-1 y es capaz de incrementar la expresión de la proteina proinflamatoria COX-2 en fibroblastos sinoviales de RA. La identificación de NFKB como un objetivo molecular clave está basado en su función como un elemento común de señalización en dirección 3' que regula la expresión génica de varios mediadores inflamatorios críticos ligados a la inflamación de la articulación y las vías destructoras del cartílago. La respuesta de varios genes (COX-2, colagenasa, IL-6, IL-8) está gobernada por promotores que contienen ambos elementos promotores de NFKB. La activación de NFKB interviene en la inducción de varias proteínas centrales a los procesos inflamatorios, como las citocinas, moléculas de adhesión—ee-ta-t ^—meta-lropr tre-ift-a-s-as—y—et^?¾s— rot-ei-n-a-s—que" participan en la producción de prostaglandina y leucotrienos (COX-2) en los sinoviocitos . Por lo tanto, este factor de transcripción representa un objetivo fisiológicamente significativo en terapias dirigidas contra respuestas a lesiones de los fibroblastos sinoviales de humano, condrocitos articulares de humano asi como otras células de la articulación. Específicamente, se ha demostrado que la exposición a fibroblastos sinoviales reumatoides de humano (RSF)a la interleucina-1 eta (IL-lbeta) da como resultado la regulación acelerada coordinada de A2(PLA2) de 85-kD y la ciclooxigenasa inducible (COX-2) . Conjuntamente, ambas enzimas promueven la biosíntesis subsecuente de PGE2, un mediador inflamatorio primario en la articulación. Se utilizaron oligonucleótidos señuelo y antisentido para demostrar la participación de NFKB) , en la regulación de las enzimas que metabolizan al prostanoide. El ARNm de NFKB antagonista usando un oligonucleótido antisentido dio como resultado una unión disminuida al promotor del gen COX. La himenialdisina, un producto marino natural, ha sido recientemente caracterizado como un inhibidor de la activación de NFKB y la exposición de IL-1 estimuló la producción de RSF inhibida por PGE2 en forma dependiente de la concentración (IC50= 1 µ?) . La especificidad del objetivo molecular se demostró mediante el uso de un análogo, aldisina y el inhibidor de la proteína cinasa C, RO 32-0432, que fue ifta-etivo . La—a-eeién—di-r-ee-ta—d —h-imefti-ai-di-s-ifia—s-ob-re—ta-activación de NFKB inducida por IL-1 fue demostrada por una reducción significativa (de aproximadamente 80%) en la unión de NFKB a el segmento invariable de la secuencia de consenso KB y la inhibición de la migración estimulada de p65 desde el citosol de las células tratadas. Como se podía esperar para un inhibidor de la regulación transcripcional de NFKB, el RSF tratado con himenialdisina no transcribió el ARNm ya sea para COX-2 ó PLA2 en respuesta a IL-1. En consecuencia, se observaron niveles reducidos de proteína para estas enzimas y las reducciones en la habilidad para producir PGE2. Más aún, la producción de interleucina-8 (IL-8) estimulada por IL-1 que se conoce por ser un evento regulado por NFKB, también fue inhibido mediante la himenialdisina, mientras que la producción inducida por IL-1 del factor de crecimiento del endotelio vascular, un gen no regulado por NFKB, no fue afectado por la exposición a himenialdisina. Por lo tanto, la himenialdisina inhibe la formación de fibroblastos sinoviales estimulada por IL-1 de PGE2 mediante su efecto inhibidor sobre la activación de NFKB. Esto proporciona una base para definir su uso como un nuevo inhibidor para bloquear la función de NFKB en la inflamación de articulación de destrucción del cartílago. A continuación se enumeran los ejemplos de inhibidores adecuados de NFKB para la presente invención. Para todos los modos de administración local (es decir, inyección, infusión e irrigación) , la concentración y/o dosis óp-fc ma—de—ca-d-a—gen-te— dee ade—e-s la que sea-^e-rapé-orircame-nire-efectiva. Como ejemplo, para cada uno de los agentes enumerados, las concentraciones preferidas y más preferidas de una solución de irrigación que contiene el agente enumerado se proporcionan, se espera que estas concentraciones sean terapéuticamente efectivas cuando se administren localmente. Similarmente las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluirán de manera adecuada una carga o dosis de agentes suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes del agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo predeterminado de tiempo de liberación prolongada.
TABLA 9 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE INHIBIDORES DE NFKB Compuestos Concentraciones Concentraciones más terapéuticas de preferidas de administración administración local (nanomolar) local (nanomolar) Ester feniletílico 1-100,000 50-20,000 de ácido caféico DM-CAPE 0.5-50,000 50-5, 000 péptido SN-50 0.1-100, 000 100-20, 000 himenialdisina 1-100, 000 100-10, 000 ditiocarbamato de 1-50,000 50-10, 000 pirolidona 9. INHIBIDORES DE ÓXIDO NÍTRICO SINTASA El óxido nitrico (NO) es un mediador intracelular y extracelular ampliamente difundido involucrado en los mecanismos patofisiológicos de algunas enfermedades del tejido conectivo. El NO está formado de L-arginina por una familia de enzimas, las NO sintasas, que se localizan intracelularmente . Se han clonado y secuenciado tres isoformas de NO sintasa. La NO sintasa en célula endotelial (ecNOS) y la NO sintasa del cerebro (bNOS) son constitutivamente activas. Una isoforma distinta de NO sintasa, la NOS (iNOS) inducible, se encuentra en varios tipos celulares, incluyendo los condrocitos. Esta ausente en condiciones básales pero se regula aceleradamente en respuesta a los mediadores proinflamatorios como IL-?ß y TNF-a. Los recientes descubrimientos muestran que IL-1 es un estimulante muy potente de la NO síntesis de condrocitos y que la IL-1 actúa mediante su habilidad para regular aceleradamente el nivel de iNOS. Dentro de la articulación, los condrocitos son la principal fuente de NO y iNOS condrocítica inducida por citocinas proinflamatorias se considera que intervienen varios 'fectos des IL^I eñ las" artropatías inflamatorias. Los fármacos que inhiben específicamente la NO sintasa inducible por condrocitos (iNOS) pueden tener una función terapéutica en la prevención de la condrodestrucción que ocurre debido a lesión en la articulación (por ejemplo, procedimientos quirúrgicos que involucran la articulación) . La evidencia que apoya este beneficio terapéutico esta basado en una cantidad sustancial de estudios que han evaluado una amplia variedad de inhibidores iNOS por su habilidad para inhibir la actividad de NO sintasa inducible en condrocitos y explantes cultivados de cartílago de pacientes con osteoartritis . Una clase de compuestos, llamados isotioureas S-sustituidas , han sido caracterizados como potentes inhibidores de la biosíntesis de NO en el cartílago. La isotiourea de S-metilo e isotiourea S- (aminoetilo) fueron 2-4 veces más potentes de NG-monometil-L-arginina, 5-10 veces más potente que la aminoguanidina y más de 300 veces más potente que Na-nitro-L-arginina y éster metílico Nra-nitro-L-arginina . Estos compuestos de isotiourea proporcionan una clase potente y relativamente específica de inhibidores de iNOS en el cartílago y por lo tanto son adecuadas para la administración sistémica o local de conformidad con los aspectos de la invención (Jang, D., Eur J. Pharmacol. 312:341-347(1996)). El potencial terapéutico protector del cartílago de los inhibidores de NO sintasa también ha sido evaluado utilizando sistemas in vitro como condrocitos aislados para def-tn-árr—tos—efectos sobre—-ta—mairrirz—del—caxt±±a~gO~ L~a~ inhibición de la producción de NO endógeno por NG-monometil-L-arginina (L-NMMA) , un inhibidor establecido de NO sintasa, conlleva a la supresión de la producción de gelatinasa, colagenasa y estromelisina mediante condrocitos estimulados por IL-?ß. La inhibición de la producción de NO también produce parcialmente el incremento de la producción de lactato que ocurre debido a la exposición de los condrocitos a IL-?ß. El tratamiento de los fragmentos de cartílago con L-NMMA revierte parcialmente el efecto inhibitorio de IL-?ß por la síntesis de glicosaminoglicano, inhibe las actividades de MMP estimuladas por IL-?ß e incrementa la producción del antagonista del receptor IL-1 (IL-lra) . El NO también puede regular la síntesis de proteoglicano indirectamente al disminuir la producción de TGF-ß? por los condrocitos expuestos a IL-?ß. Previene el incremento estimulado autócrinamente en TGF-ß?, disminuyendo así los efectos anabólicos de la citocina en los condrocitos. Un estudio ha comparado la potencia de la nueva aminoguanidina, S-metilisotiourea (S T) , S-aminoetilisotiourea (AETU) , L-NMMA y éster metílico de N-nitro-L-arginina (L-NAME) de los inhibidores NOS sobre el efecto inhibitorio de las respuestas de IL-1 recombinante de humano sobre la síntesis de proteoglicano y producción de NO. Los diferentes sistemas de cultivo han demostrado responder en forma dependiente de la concentración a un desafío con IL-1ß con un gran incremento en la producción de NO y una ma-r-G-a-da—supr-es-i-én—ea—1-a—s-í-ntes-ts—de—^et egü ano-; Ero-s" inhibidores NOS anteriores (a l a 1000 µ?) inhiben la producción de NO por las células de cartílago tratadas con IL-?ß y tuvo efectos marcados o notorios en la restauración de la síntesis de proteoglicano en condrocitos. Por lo tanto, si se puede bloquear la producción de NO usando una concentración y dosis terapéuticamente efectivas, entonces se podrá prevenir la inhibición de la síntesis de proteoglicano debido a IL-?ß. La NO sintasa se expresa en el cartílago obtenido de la articulación de pacientes con enfermedad artrítica. En pacientes que presentan artritis reumatoide u osteoartritis , se han observado mayores niveles de nitrito en el líquido sinovial y se ha demostrado que una fuente significativa de la producción de NO en estos pacientes se deriva del cartílago articular. Más aún, se ha descubierto que una administración sistémica prolongada de L-NIL, un potente inhibidor de iNOS reduce la progresión de OA experimental en perros (inducida al seccionar el ligamento cruzado anterior "LCA") y causa una disminución sustancial en la producción de IL-?ß, PGE2, NO y MNP. Estos descubrimientos sugieren que el NO es un potente regulador de los efectos de IL-?ß y contribuye a la patofisiología de las enfermedades del corazón . Por lo tanto, estos resultados in vitro e in vivo indican que los inhibidores específicos de NO sintasas son potenciales fármacos novedosos para el tratamiento clínico GQfttr-a—-l —-in-f-l-affia-e-i- n—&inev-i-a —y-^ueden—^p^e-íort-a-r—e-fectos- condroprotectores cuando se administran sistémicamente o localmente en combinación con uno o más fármacos seleccionados a partir de las clases antiinflamatorias, protectoras del cartílago y analgésicas para tratar una articulación quirúrgicamente tratada u otra articulación lesionada . A continuación se enumeran los ejemplos de inhibidores de NO sintasa adecuados para la presente invención. Para todos los modos de administración local (es decir, inyección, infusión e irrigación) , la concentración y/o dosis óptimas de cada agente adecuado es la que sea terapéuticamente efectiva. Por ejemplo, para cada uno de los agentes enumerados, las concentraciones preferidas y más preferidas de una solución de irrigación que contienen el agente enumerado se proporcionan, se espera que estas concentraciones sean terapéuticamente efectivas cuando se administren localmente. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluirán de manera adecuada una carga o dosis de agente suficiente para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado du-r-a-nte—un—pe-r-íodo—d —fe-i-empo—p-2^d€ter-m-n-d-e—de— -bera-c on" prolongada. En una modalidad, los inhibidores preferidos de NO sintasa para la inclusión en las soluciones de la invención es 1400 W ( (N-3- (aminometil) bencil) acetamidina) , un inhibidor selectivo de unión lenta y apretada de iNOS, difenileniodinio y 1,3-PBIT.
TABLA 10 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE LOS INHIBIDORES DE ÓXIDO NÍTRICO SINTASA 10. MOLÉCULAS DE ADHESIÓN CELULAR 10a . ANTAGONISTAS Y AGONISTAS DE INTEGRINA Las integrinas son receptores heterodiméricos ubicados sobre la membrana plasmática que contienen subunidades a y ß que unen ligandos que son componentes de la matriz extracelular (ECM) o pueden ser otras grandes proteínas como el colágeno, laminina, vitronectina, osteopontina (OPN) y fibronectina (FN) . La degradación de la matriz cartilaginosa se regula por condrocitos mediante mecanismos que dependen de la interacción de estas células con el ECM. La expresión génica de condrocitos es, en parte, controlada mediante contactos celulares que involucran la interacción de integrinas con componentes de ECM en el ambiente circundante del condrocito. Por lo tanto, las integrinas en los condrocitos están involucradas en el control de la homeostasis del cartílago, y esta familia de receptores representa una clase de objetivos terapéuticos para prevenir la degradación del cartílago. Los condrocitos de humano expresan para una arreglo de receptores de integrina compuestos de distintas subunidades a y ß, incluyendo a,?ß?, (dß?, ocVp3 y menores cantidades de otros más. La integrina ocVB3 es de particular interés, ya que se sabe que se une a OPN. La función específica para el complejo a?ß3 que bloquea el anticuerpo monoclonal (mAb) LM609 actúa como un agonista en forma similar al ligando, OPN. Atenúa la producción de una variedad de mediadores destructivos del cartílago y proinflamatorios como IL-1, NO y PGE2. Por lo tanto, se piensa que el mAb LM-&0-9—agon-i-sta— s—a-deeuado—pa-ra—us-a-r-se—e —l~a—presentre-invención como agentes terapéuticos para prevenir la degradación del cartílago. Además, dos peptidomiméticos, MK-383 (Merck y RO 4483 (Hoffmann-LaRoche) , han sido estudiados en estudios clínicos de Fase II. Ya que éstos son moléculas pequeñas, tienen una media vida corta y elevada potencia. Sin embargo, también parecen tener menos especificidad, interactuando con otras integrinas estrechamente relacionadas. Estos peptidomiméticos también son adecuados para usarse en la presente invención.
TABLA 11 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE INTEGRINAS 11. AGENTES ANTIQUIMIOTÁCTICOS Los agentes antiquimiotácticos previenen la quimiotaxis de células inflamatorias. Los ejemplos representativos de objetivos antiquimiotácticos sobre los cuales estos agentes pueden actuar incluye, entre otros, re-ce JTB-s-F=Met"=T^n=Ptle~ receptores lL-?-; receptores MCP-1 y receptores ???-1-I/RANTES . Los fármacos dentro de esta clase de agentes se encuentran dentro de las primeras etapas de desarrollo, pero se tiene la teoría de que pueden ser adecuados para usarse en la presente invención. 12 INHIBIDORES DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR 12A. INHIBIDORES DE PROTEÍNA CIMASA I . INHIBIDORES DE PROTEÍNA CINASA C (PKC) La proteína cinasa C (PKC) tiene una función crucial en la transducción de señales de la superficie celular para una variedad de procesos fisiológicos. Las isozimas pueden activarse como objetivos en dirección 3' dando como resultado la activación inicial de los receptores acoplados a la proteína-G (por ejemplo, serotonina) , bradicinina, etc.) o receptores de citocinas proinflamatorias . Ambas clases de receptores tienen importantes funciones en la mediación de la destrucción del cartílago . Los análisis de clonación molecular han revelado que el PKC existe como una gran familia que consiste de al menos 8 subespecies (isozimas) . Estas isozimas difieren sustancialmente en la estructura y mecanismo para la activación del receptor ligador a los cambios en la respuesta proliferativa de células específicas. La expresión de isozimas específicas se encuentra en una amplia variedad de tipos celulares, incluyendo: sinoviocitos , condrocitos, —neu-fe-r-ófi1 &s-,—eé-tuia-s—mi^ioírd s-^—eéi¾-i¾s—de—^mtrsctt-o—rr"SO"; —p~or lo tanto los inhibidores de PKC tienen probabilidad de efectuar las vías de señalización en diversos tipos celulares al menos que el inhibidor muestre especificidad para la isozima. Por lo tanto, se puede predecir que los inhibidores de PKC son efectivos en el bloqueo de la activación de sinoviocitos y condrocitos y también puede tener un efecto antiinflamatorio al bloquear la activación de neutrófilos y su unión subsecuente. Se han descrito varios inhibidores y los informes iniciales indican que una IC50 de 50 µ? para la actividad inhibidora de calfostina C. G-6203 (también conocida como Go 6976) es un nuevo y potente inhibidor de PKC con una alta selectividad para ciertos isotipos de PKC con valores de IC50 en el intervalo de 2-10 µ?. Se exponen a continuación las concentraciones de éstos y otro fármaco, el GF 109203X, también conocido como Go 6850 o bis-indoilmaleimida I (comercializado por Warner-Lambert) , que se piensa son adecuados para la administración local en la presente invención. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una dosis o carga de agentes suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye en la composición una carga o dosis suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio da—a-G-Gi-óa—dentro de-í—i-Rte-rv-a-te—te-r-a éü^ti o—ename-rado—durante- un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 12 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES INHIBIDORES DE LA DESTRUCCIÓN DEL CARTÍLAGO II . INHIBIDORES DE PROTEÍNA TIROSINA CINASA Aunque existe una tremenda diversidad entre los diversos miembros de la familia de receptores de tirosina cinasa (RTK) , los mecanismos de señalización usados por estos receptores comparten varias características en común. Los estudios bioquímicos y de genética molecular han demostrado que la unión del ligando al dominio extracelular del RTK activa rápidamente la actividad intrínseca catalítica de la tirosina cinasa del dominio intracelular (ver FIGURA 5) . El incremento de actividad da como resultado una fosforilación específica para la tirosina de una variedad de sustrato intraced-tt-a-res—que cOTiirre reri un s¾"gmeTTto invariable de l~a secuencia común. En consecuencia, esto causa la activación de diversas moléculas de señalización en "dirección 3'" y una cascada de vías intracelulares que regulan el metabolismo de fosfolipidos , metabolismo del araquidonato, fosforilación de proteínas (que involucra los mecanismos diferentes a las proteínas cinasas) movilización de calcio y activación transcripcional (ver FIGURA 2) . La actividad de tirosina cinasa dependiente del factor de crecimiento del dominio citoplásmico de RTK es el mecanismo principal de generación de señales intracelulares que conllevan a la proliferación celular. Por lo tanto, los inhibidores tienen el potencial de bloquear esta señalización y prevenir así la activación de sinoviocitos y condrocitos. Cualquiera de los diversos compuestos relacionados de tirfostina tienen el potencial de inhibidores específicos de la actividad de tirosina cinasa (ICsos in vitro en el intervalo de 0.5-10 µ?) , ya que tienen poco efecto sobre otras proteínas cinasas y otros sistemas de transducción de señal. Hasta la fecha sólo unos cuantos de los diversos compuestos de tirfostina se comercializan, se utilizan concentraciones adecuadas de estos agentes en la presente invención como se muestra a continuación. Además, se ha mencionado que la estaurosporina demuestra potentes efectos inhibidores contra varias proteínas tirosina cinasa de la subfamilia src y también se muestra a continuación una concentración adecuada de este agente como se utiliza en la p-re-sen-te i-n-vene-i-ón pa-r-a- s-tt adrai-n-i-s-tr-ac-ión l-o-cai— Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen, de manera adecuada, una dosis o carga de agentes suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes de agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 13 12B. REGULADORES DE PROTEÍNA TIROSI A FOSFATASA INTRACELULAR Las fosfatasas proteína tirosina no transmembranales (PTPasas) que contiene dominios SH2 de src- homología2 son conocidas y la nomenclatura se refiere a ellas como SH-PTP1 y SH-PTP2. Además, SH-PTP1 también se conoce como PTP1C, HCP ó SHP. SH-PTP2 se conoce también como PTPlD o PTP2C. Similarmente, SH-PTP1 se expresa en altos niveles en células hematopoyéticas de todos los linajes y etapas de diferenciación y el gen SHPTP1 ha sido identificado y es responsable del fenotipo del ratón "motheaten" (me) (apolillado, ratón genéticamente manipulado) esto proporciona una base para predecir los efectos de inhibidores que podrían bloquear su interacción con sus sustratos celulares. La estimulación de neutrófilos con péptidos quimiotácticos da como resultado la activación de tirosina cinasa que intervienen en las respuestas de neutrófilos (Cui, y col., J. Immunol. (1994)) y la actividad de PTPasa regula la actividad reducida por antagonista al reducir los efectos de la tirosina cinasa activada en las fases iniciales de la estimulación celular. Los agentes que podrían estimular la activación de PTPasa podrían tener aplicaciones terapéuticas potenciales como mediadores antiinflamatorios. Estas mismas PTPasas también regulan la actividad de ciertas RTK. Parecen contrarrestar el efecto de las cinasas receptoras activadas y por lo tanto pueden -^ep-r-es-enta-i? im er^taRtes o&j-efci-v-e-s p¾-ra— ± f-áxmarccr: L~o~s~~ experimentos in vitro muestran que la inyección de PTPasa bloquea la fosforilación estimulada por insulina de residuos de tirosilo en proteínas endógenas. Por lo tanto, los activadores de la actividad de PTPasa podrían servir para revertir la activación de la acción del receptor de RTK en la restenosis y se piensa que son útiles en las soluciones de la presente invención. Además, las PTPasas ligadas al receptor funcionan como ligandos extracelulares , similares a los de las moléculas de adhesión celular. Las consecuencias funcionales de la unión de un ligando al dominio extracelular aún no han sido definidas pero es razonable asumir que esta unión podría servir para regular la actividad de fosfatasa dentro de las células (Fashena y col., Current Biology, 5; 1367-1369 (1995)). Estas acciones podrían bloquear la adhesión mediada por otras moléculas de adhesión de la superficie celular (NCAM) y proporcionar un efecto antiinflamatorio. Aún no se han desarrollado fármacos para estas aplicaciones. 12c. INHIBIDORES DE LOS DOMINIOS SH2 (DOMINIOS DE SRC-HOMOLOGÍA2) Los dominios SH2, originalmente vienen identificados en la subfamilia src de proteína tirosina cinasa (PTK) son secuencias de proteínas no catalíticas y comprenden aproximadamente 100 aminoácidos conservados entre una variedad de proteínas transductoras de señal (Cohén, y col., 1995). Los dominios SH2 funcionan como módulos de unión a—La—^£os£ot-i-r-osina— —r-e-gy-la-n—asi—ías—a-socd-aci-ones—crrtrcas" proteína-proteina en las vías de la transducción de señal dentro de las células (Pawson, Nature, 573-580, 1995) . En particular, la función de los dominios SH2 ha sido claramente definida como critica para la señalización mediada por el receptor de tirosina cinasa (RTK) como en el caso del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . Los sitios que contienen fosfotirosina en los RTK autofosforilados sirven como sitios de unión para las proteínas SH2 e intervienen así en la activación de las vías de señalización bioquímica (ver FIGURA 2) (Carpenter, G., FASEB J. 6:3283-3289 (1992); Sierke S. y col., J. Biochem. 32:10102-10108 (1993)). Los dominios SH2 son responsables de acoplar los receptores activados del factor de crecimiento en respuestas celulares que incluyen alteraciones en expresión de genes y ultimadamente, la proliferación celular. Por lo tanto, los inhibidores que bloquean selectivamente los efectos de la activación RTK específicas (excluyendo IGFR y FGFR) expresadas sobre la superficie de sinoviocitos son efectivos en el bloqueo de la degradación del cartílago después de los procedimientos artroscópicos. Al menos se han identificado 20 proteínas citosólicas que contienen dominios SH2 y funcionan en la señalización intracelular . La distribución de los dominios SH2 no se restringe a una particular familia de proteínas, pero se encuentra en varias clases de proteína, cinasas proteicas, cinasas lipídicas, fosfatasas proteicas, írxs-f -llpas-as-,— -t4n -s^r-eg-uiado-r-a-s—de—Ra-s- y—a-iguno-s- de transcripción. Varias proteínas que contienen SH2 tienen actividades enzimáticas conocidas mientras que otras (Grb2 y Crk) funcionan como "ligadores" y "adaptadores" entre los receptores de superficie celular y moléculas efectoras en "dirección 3'" (Marengere, L . , y col., Nauture 369:502-505 (1994) . Los ejemplos de proteínas que contienen dominios SH2 con actividades enzimáticas que se activan durante la transducción de señal incluyen, entre otros, la subfamilia src de proteína tirosina cinasa (src (pp60c_src) , abl, lck, fyn, fgr y otras), fosfolipasa Cy (PLCy) , fosfatidilinositol 3-cinasa (??-3-cinasa) , p21-ras proteína activadora de GTPasa (GAP) y SH2 y proteína tirosina fosfatasa (SH-PTPasa) que contienen SH2 (Songyang, y col., Cell 72:767-778 (1993). Debido a la función central de las diversas proteínas SH2 ocupan en la transmisión de señales de receptores activados de superficie celular una cascada de interacciones moleculares adiciones que ultimadamente definen las respuestas celulares, se desean como agentes los inhibidores que bloquean la unión específica de proteína SH2 (por ejemplo, c-src) como agentes con potenciales aplicaciones terapéuticas en la protección del cartílago. Además, la regulación de varias respuestas inmunitarias/inflamatorias está mediada a través de receptores que transmiten señales mediante tirosina cinasas no receptoras que contienen dominios SH2. La activación de células T por medio del receptor de células T específicas pa-r-a el a-n^í-gefto—HF€f¾r)—i-frire-i-a-^u-na—ea-s-ead-a— e^t an-s-d c roTr-d" señal que conlleva a la secreción de linfocina y proliferación de células T. Una de las respuestas bioquímicas más tempranas después de la activación TCR es un incremento de la actividad de tirosina cinasa. En particular, la activación de neutrófilos se controla parcialmente mediante las respuestas de los receptores de inmunoglobulina G de la superficie celular. La activación de estos receptores regula la activación de las tirosina cinasa no identificadas que se conoce poseen dominios SH2. La evidencia adicional indica que varias cinasas de la familia src (lck, blk, fyn) participan en las vías de transducción de señal que van desde los receptores de integrina y citocina y por lo tanto pueden servir para integrar el estímulo recibido de las diversas estructuras independientes como receptores. Por lo tanto, los inhibidores de los dominios específicos de SH2 tienen el potencial de bloquear varias funciones de neutrófilos y servir como mediadores antiinflamatorios. Actualmente se lleva a cabo esfuerzos para desarrollar fármacos con especificidad de objetivo hacia los dominios SH2 a nivel bioquímico in vitro y celular. Si se tiene éxito, se tiene la teoría de que los fármacos resultantes serían útiles para la práctica de la presente invención .
V. AGENTES ADICIONALES Además de los agentes condroprotectores descritos a-nfcer-i-o-r-meRtreT 1-a-s—eempos-i-c-i-one-s ioeaimentre— —si-sirémrca~ administradas de la presente invención también pueden incluir otros agentes terapéuticos. Por ejemplo, se pueden incluir uno o más agentes antiinflamatorios y analgésicos (también llamados en la presente agentes para aliviar el dolor) . Los ejemplos adecuados de agentes antiinflamatorios y/o analgésicos se describen con mayor detalle a continuación. Como otro ejemplo, las composiciones de la presente invención pueden incluir uno o más fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARDs) , como el metotrexato, sulfasalacina, compuestos áureos como el oro oral, tiornalato de oro sódico y aurotioglucosa, azatioprina, ciclosporina, antimaláricos, esferoides, colchicinas, ciclofosfamida, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, minociclina y penicilamina . Los agentes antiinflamatorios, analgésicos y/o DMARD puede incluirse en las composiciones de la presente invención, o puede administrarse por separado, ya sea concurrentemente o secuencialmente. Varios de los aspectos de la presente invención con respecto a los beneficios previamente indicados de administración local, administración sistémica con especificidad hacia el objetivo y el uso de múltiples agentes en combinación con agentes condroprotectores también se aplica a la administración de otros agentes. El alivio del dolor y sufrimiento en pacientes postoperatorios es un área de enfoque especial en medicina clínica, especialmente con la cantidad cada vez mayor de operaciones con pacientes no hosp-i-fra-l-i-z-a-do-s—que—se—üevan—a—cabo—cada—a-ñ-0-7 —hos—agentes sistémicos de uso más amplio, inhibidores de ciclooxigenasa (por ejemplo, ibuprofeno) y opioides (por ejemplo, morfina, fentanilo) , tienen efectos secundarios significativos incluyendo sangrado/irritación gastrointestinal y depresión respiratoria. La elevada incidencia de náusea y vomito relacionado con los opioides es especialmente problemático en el periodo postoperatorio. Los agentes terapéuticos pensados para el tratamiento del dolor postoperatorio evitando al mismo tiempo los efectos secundarios nocivos no se desarrollan fácilmente debido a que los objetivos moleculares para estos agentes se distribuyen ampliamente a través del cuerpo e intervienen acciones fisiológicas. A pesar de la necesidad clínica significativa para inhibir inflamación y dolor, así como la degradación del cartílago, aún no se han desarrollado métodos para la administración de inhibidores del dolor, inflamación y degradación del cartílago a dosis efectivas mientras que minimizan los efectos secundarios sistémicos adversos. Como ejemplo, los métodos sistémicos (es decir intravenosos, orales, subcutáneos o intramusculares) de administración de opiatos a dosis terapéuticas está frecuentemente asociado con efectos secundarios adversos significativos, incluyendo depresión respiratoria severa, cambios del estado de ánimo, ofuscación, vómito y náusea pronunciados . Los estudios anteriores han demostrado la habilidad de los agentes endógenos, como la serotonina (5-hidroxitrriptamina-;—qte—a-^fe-ces—s¾—refiere—en la pxe5'ent'e~cgmo "5-HT") , bradicinina e histamina, para producir dolor e inflamación. Sicuteri, F., y col., Serotonin-Bradykinin Potentiation in the Pain Receptors in Man, Life Sci. 4:309-316 (1965); Rosenthal, S.R., Histamine as the Chemical Mediator for Cutaneous Pain, J. Invest. Dermat : 98-105 (1977); Richardson, B.P., y col., Identification of Serotonin M-Receptor Subtypes and their Specific Blockade by a New Class of Drugs, Nature 316:, 126-131 (1985); Whalley, E. . , y col., The Effect of Kinin Agonists and Antagonists, Naunyn-Schmiedeb Arch. Pharmacol. 36: 652-57 (1987); Lang, E . , y col., "Chemo-Sensitivity of Fine Afferents from Rat Skin In Vitro" J. Neurophysiol. : 887-901 (1990). Por ejemplo, se ha demostrado que 5-HT aplicado en la base de una ampolla en humano (piel desnuda) causa dolor el cual puede inhibirse por antagonistas del receptor 5-HT3. Richardson y col., (1985). Similarmente, la bradicinina aplica periféricamente produce dolor que puede bloquearse mediante los antagonistas del receptor de bradicinina. Sicuteri y col., 1965: Whalley y col., 1987; Dray, A., y col., "Bradykinin and Inflammatory Pain", Trends Neurosci. 16:99-104 (1993). La histamina aplicada periféricamente produce vasodilatación, comezón y dolor que puede inhibirse mediante los antagonistas del receptor histamina. Rosenthal, 1977; Douglas, W. W., "Histamine and 5-hidroxitriptamine (Serotonin) and their Antagonists", en Goodman, L.S., y col., The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan P¾b1ishÍ-?q—Gomp-a-n-y-^—N-u- va—???-kr,—págs^—60-5—6-38—(-1- 8-5-)-;—Tmrcrre~r M.M., y col., Analgesic Effects of antihistaminics, Life Sci 36, págs. 403-416 (1985) . Las combinaciones de los tres agentes (5-HT, bradicinina e histamina) aplicados conjuntamente muestran un efecto sinérgico causante del dolor, que produce una señal intensa y duradera del dolor. Sicuteri y col., 1965; Richardson y col., 1985; Kessler, W., y col., "Excitation of Cutaneous Afferent Nerve Endings In Vitro by a Combination of Inflammatory Mediators and Conditioning Effect of Substance P," Exp. Brain Res. 91:467-476 (1992). En el cuerpo, 5-HT esta ubicado en plaquetas y en neuronas centrales, la histamina se encuentra en mastocitos y la bradicinina se forma a partir de una molécula precursora de tamaño grande durante el trauma a los tejidos, cambios del pH y cambios de temperatura. Debido a que 5-HT puede liberarse en grandes cantidades de las plaquetas en los sitios de lesión tisular, produciendo niveles plasmáticos 20 veces mayor que a niveles básales (Ashton, J.H., y col., "Serotonin as a Mediator of Cyclic Flow Variations in Stenosed Canine Coronary Arteries", Circulation 73:572-578 (1986)), es posible que la 5HT endógena tenga una función en la producción del dolor postoperatorio, hiperalgesia e inflamación. Ciertamente, la activación de las plaquetas ha demostrado dar como resultado la excitación de nociceptores periféricos in vitro. Ringkamp, M. , y col., "Activated Human Platelets in Plasma Excite Nociceptors in Rat Skin, In v-i-tro-r^—Me4EG&G ,—Le-tt—11Q .-Q =i&e—i--94^—S-imiiai¾ien-te —ta-histamina y bradicinina también se liberan en tejidos durante el trauma. Kimura, E., y col., "Changes in Bradykinin Level in Coronary Sinus Blood After the Experimental Occlusion of a Coronary Artery, " Am Heart J. 85:635-647 (1973); Douglas, 1985; Dray y col. (1993). Además, se sabe que las prostaglandinas causan dolor e inflamación. Normalmente se utilizan los inhibidores de ciclooxigenasa (es decir, ibuprofeno) en ambientes postoperatorios y no quirúrgicos para bloquear la producción de prostaglandinas, reduciendo asi el dolor e inflamación mediados por prostaglandina . Flower, R.J., y col., Analgesic-Antipyretics and Anti-Inflam atory Agents; Drugs Employed in the Treatment of Goul, in Goodman, L. S., y col., ed., The Pharmacological Basis of Therapeutics MacMillan Publishing Company, Nueva York, págs. 674-715 (1985) . Los inhibidores de ciclooxigenasa están asociados con algunos efectos secundarios sistémicos adversos cuando se aplican sistémicamente . Por ejemplo, la indometacina o el ketorolaco tienen efectos secundarios adversos renales y gastrointestinales bastante reconocidos. Como se mencionó, 5-HT, histamina, bradicinina y prostaglandinas causan dolor e inflamación. Los diversos receptores mediante los cuales estos agentes intervienen en sus efectos sobre tejidos periféricos se conocen y/o han sido debatidos durante las últimas dos décadas. La mayoría de los estudios se han llevado a cabo en ratas u otros modelos e-x^e-r-imefit-a-lres—en—an-imaie-s-;—S-t-n—embarco^— ay—di-f-e-rencia-s—en" la farmacología y secuencias de receptores entre las secuencias de animales y humanos. Más aún, los antagonistas de estos mediadores no se utilizan actualmente para el tratamiento contra el dolor postoperatorio. Una clase de fármacos, llamada 5-HT y antagonistas de la absorción de norepinefriña que incluyen amitriptilina, se han usado oralmente con éxito moderado para los estados de dolor crónico. Sin embargo, los mecanismos de estados de dolor crónico con respecto a dolor agudo son considerablemente diferentes. De hecho, dos estudios sobre la manifestación del dolor agudo usando perioperativamente amitriptilina han demostrado que no hay ningún efecto contra el dolor de amitriptilina. Levine, J.D. y col., "Desipramine Enhances Opiate Postoperative Analgesia, Pain 27:45-49 (1986); Kerrick, J.M. y col., "Low-Dose amitriptyline as an Adjunct to Opioids for Postoperative Orthopedic Pain: a Placebo-Controlled Trial Period, " Pain 52:325-30(1993). En ambos estudios, el fármaco se administró oralmente. El segundo estudio notó que la amitriptilina oral de hecho producía un menor sentido general en pacientes postoperatorios, que puede deberse a la afinidad del fármaco para los múltiples aminoceptores del cerebro. La amitriptilina, además de bloquear la captación o absorción de 5-HT y norepinefriña, es un potente antagonista del receptor 5-HT. Por lo tanto la carencia de eficacia para reducir el dolor postoperatorio en los estudios previamente mencionados parecería oponerse a—la—-proptre-sira~ -de—orra—f vcxóñ para el 5HT endógeno en el dolor agudo. Hay una variedad de razones por las que se carece de un alivio del dolor agudo al usar amitriptilina en ambos estudios. (1) El primer estudio (Levine y col., 1986) utilizó amitriptilina preoperatoriamente durante una semana hasta la noche antes de la cirugía mientras que el segundo estudio (Kerrick y col., 1993) solo usó amitriptilina postoperatoriamente. Por lo tanto, se desconoce el nivel de amitriptilina que estuvo presente en los tejidos del sitio de operación durante la fase actual de lesión al tejido y el momento en el cual se pretendía que se liberara el 5-HT. (2) se sabe que la amitriptilina se metaboliza ampliamente en el hígado. Con la administración oral, la concentración de amitriptilina en los tejidos de sitio de operación posiblemente no haya sido suficientemente alta por un periodo prolongado para poder inhibir la actividad de la 5-HT liberada después de la operación, en el segundo estudio. (3) como existe varios mediadores inflamatorios y los estudios han demostrado sinergismo entre los mediadores inflamatorios, el bloqueo de solo un agente (5-HT) puede no ser el suficiente para inhibir la respuesta inflamatoria ante la lesión del tejido. Han habido algunos estudios que demuestran habilidad de concentraciones extremadamente elevadas (soluciones 1% - 3% -- es decir, 10-30 mg por mililitro) de antagonistas del receptor de histaminai (Hi) para actuar como anestésicos locales en procedimientos quirúrgicos. No se -prensa—que—este—efecto—anestésrco—esté—medrado—por—lus" receptores Hi, pero más bien, es debido a una interacción especifica con los canales de sodio de la membrana neuronal (similar a la acción de la lidocaina) . Dado los efectos secundarios (por ejemplo, sedación) asociados con estas elevadas concentraciones "anestésicas" de los antagonistas de receptor de histamina, la administración local de antagonistas de receptor de histamina no se utiliza actualmente en escenarios perioperatorios .
A. INTERACCIONES SINERGICAS DERIVADAS DE COMBINACIONES TERAPÉUTICAS DE AGENTES ANALGÉSICOS ?/? ANTIINFLAMATORIOS Y AGENTES CONDROPROTECTQRES Dada la complejidad del proceso de enfermedad asociado con inflamación y pérdida de la homeostasis del cartílago después de procedimientos terapéuticos artroscópicos y la multiplicidad de objetivos moleculares involucrados, el bloqueo o inhibición de un solo objetivo molecular tiene pocas probabilidades de proporcionar una eficacia en adecuada en la prevención de la degradación del cartílago y desarrollo de osteoartritis . De hecho, una variedad de estudios en animales que tienen como objetivo los diferentes receptores moleculares individuales y/o enzimas no han probado ser efectivos en modelos experimentales de animales o no han producido eficacia en ensayos clínicos hasta la fecha. Por lo tanto, una combinación terapéutica de fármacos que actúen sobre los distintos objetivos moleculares y que se administren localmente o sistémicamente parece ser - ^D—me-j-or— -srira—la~-e-fect-i-v-i-dad—ctmd-C3—en-ei—méiro'do^exap"éxit ccr— de protección para el cartílago. Como se describe a continuación, el fundamento para esta terapia sinérgica con especificidad de objetivo molecular se deriva de los recientes avances en la comprensión fundamental de los mecanismos bioquímicos mediante los cuales las células de sinoviocitos y condrocitos en la membrana sinovial y cartílago transmiten e integran estímulos a los cuales están expuestos durante los procedimientos artroscópicos . Los interruptores moleculares responsables de la señalización celular se han dividido tradicionalmente en principales vías de señalización discretas, cada una comprende un distinto juego de familias proteicas que actúan como transductores para un conjunto particular de estímulos extracelulares y que intervienen en distintas respuestas celulares. Una de estas vías transduce señales de los neurotransmisores y hormonas a través de los receptores acoplados a la proteína-G (GPCR) para producir respuestas contráctiles que incluyen la producción de mediadores inflamatorios , como sería la PGE2. Las GPCR se acoplan a objetivos intracelulares mediante la activación de las proteínas G triméricas (ver FIGURA 2) . Los ejemplos de moléculas de señalización involucradas en la activación de sinoviocitos y condrocitos mediante la vía GPCR son histamina, bradicinina, serotonina y ATP. Una segunda vía principal transduce señales de citocinas proinflamatorias , como la IL-1, mediante la cascada de cinasas y proteína NF-6B -en—ta—regtria-c ó —de— a—expr stó —gérrica—y— a— radu'cció'n—de~ citocinas catabólicas y otros factores catabólicos, incluyendo NO. Las señales transmitidas de neurotransmisores y hormonas estimulan alguna de dos clases de receptores: GPCR compuestas de regiones transmembranales de siete hélices, o canales iónicos controlados por puertas de ligandos. Las señales en "dirección 3'" de ambos tipos de receptores convergen en el control de la concentración del Ca2+ citoplásmico (ver FIGURA 3) . Cada receptor transmembranal GPCR activa una clase específica de proteínas G triméricas, incluyendo Gq, Gi o varias más. Las subunidades Gq activan la fosfolipasa CY, dando como resultado la activación de la proteína cinasa C (PKC) y un incremento de los niveles de calcio citoplásmico (FIGURA 3) . A su vez, el calcio intracelular elevado conlleva la activación de cPLA2, y la producción de ácido araquidónico (AA) . El AA sirve como sustrato para COX tanto en los sinoviocitos como en los condrocitos, lo que conlleva a la producción de PGE2. La activación de PKC también da como resultado la activación de MAP cinasa lo que conlleva a la activación de NF-B y, en células y tejidos que han sido cebados mediante exposición a citocinas proinflamatorias, regulan una mayor expresión génica de proteínas involucradas en el catabolismo en el cartílago . La señalización de citocinas proinflamatorias , como las que están mediadas tanto por IL-1 y TNF-a mediante sus dis-feiRt s—- eep-feo-r-e-s —eogaa-des-r --también—eonve-rge —s-obre—ra-regulación de la expresión génica de las células. Las vías de transducción de señal utilizadas por estos distintos receptores, emplean distintas cinasas que están próximas a los receptores pero las vías de señalización convergen subsecuentemente a nivel de las MAP cinasas (FIGURAS 3 y 4) . La transducción de señal depende de la fosforilación de residuos en una cascada de cinasas, incluyendo las enzimas en "dirección 3'" como la p38 MAP cinasa. La activación de el receptor IL-1 y el receptor TNF conlleva a la estimulación de MAP cinasa, que son pasos comunes compartidos por las GPCR acopladas a Gq (ver FIGURA 3) . Ahora se sabe que el "cruce de señales" independiente del ligando puede transactivar las vías de cinasa en respuesta a una estimulación simultánea de citocinas y GPCR especificas como la IL-1, lo que conlleva a respuestas celulares sinérgicas (ver FIGURA 3) . Por lo tanto una combinación de inhibidores selectivos que bloquean la transactivación de una vía de señalización común (como se muestra en las FIGURAS 1 y 2) llevando a una expresión génica de citocinas proinflamatorias, iNOS, COX-2 y MMP actúa sinérgicamente para prevenir la inflamación y degradación del cartílago después de procedimientos quirúrgicos artroscópicos .
B . AGENTES A TIINFLAMATORIOS Y ANALGÉSICOS Las clases adecuadas de agentes antiinflamatorios y/o analgésicos para usarse en las composiciones y métodos de -.-a—p^e&ea-to inv-ene-irén in toyen-;—(-1-)—a^-ta-gonirst-a-s—de— ceptor de serotonina; (2) agonistas de receptor de serotonina; (3) antagonistas de receptor de histamina; (4) antagonistas de receptor de bradicinina; (5) inhibidores de calicreina; (6) antagonistas de receptor de taquicinina, incluyendo antagonistas del subtipo del receptor neurocininai y neurocinina2; (7) antagonistas del receptor del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) ; (8) antagonistas del receptor de interleucina; (9) inhibidores de enzimas activas en la via sintética para los metabolitos del ácido araquidónico, incluyendo (a) inhibidores de fosfolipasa, incluyendo inhibidores de la isoforma PLA2 e inhibidores de la isoforma PLC (b) inhibidores de ciclooxigenasa y (c) inhibidores de lipooxigenasa ; (10) antagonistas del receptor prostanoide incluyendo antagonistas de subtipo de receptor eicosanoide EP-1 y EP-4 y antagonistas del subtipo de receptor de tromboxano; (11) antagonistas del receptor leucotrieno incluyendo antagonistas del subtipo de receptor leucotrieno B4 y antagonistas del subtipo de receptor leucotrieno D4; (12) agonistas del receptor opioide, incluyendo agonistas del subtipo de receptor µ-opioide, d-opioide y ?-opioide; (13) antagonistas y agonistas purinoceptores incluyendo antagonistas del receptor P2X y antagonistas del receptor P2Y; y (14) antagonistas de los canales de calcio. Lo siguiente es una descripción de fármacos adecuados que se encuentran en cada una de las clases a-n^-r-i-or-meft-te me-neien-a-d-a-s de agentes antiinflaraatorios/analgésicos, así como concentraciones adecuadas para usarse en soluciones de la presente invención que se pretenden administrar localmente. Similarmente las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis de agente suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un período de tiempo predeterminado de liberación prolongada. Aunque no se desea estar limitado por la teoría, también se expone la justificación detrás de la selección de las diversas clases de agentes que se piensa hacen que sean agentes operativos. De preferencia, cada agente se incluye a una baja concentración de 0.1 a 10,000 veces su Kd ó Ki, excepto para los inhibidores de ciclooxigenasa, que pueden requerirse, a mayores concentraciones dependiendo del inhibidor en particular seleccionado. Preferiblemente, cada agente se incluye a una concentración de 1.0 a 1,000 veces Kd ó ¾ y con mayor preferencia aproximadamente 100 veces Kd ó Ki . Estas concentraciones se ajustan según sea necesario para dar razón de la dilusión en ausencia de transformación metabólica en el -sitio de admlni-s-tracl-án l ca-Jr; ÍJOS agerrte-s e ac or seleccionados para usarse en la solución y la concentración de los agentes varia de conformidad con la aplicación en particular como se describe a continuación. 1. ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DE SEROTONINA Se piensa que la serotonina (5-HT) produce dolor al estimular los receptores de serotonina2 (5-HT2) y/o serotonina3 (5-HT3) en neuronas nociceptoras en la periferia. La mayoría de los investigadores concuerda en que los receptores 5-HT3 en nociceptores periféricos intervienen en la sensación de dolor inmediato producida por 5-HT (Richardson y col., 1985) . Además de inhibir el dolor inducido por 5-HT, los antagonistas del receptor 5-HT3 al inhibir la activación del nociceptor, también pueden inhibir la inflamación neurogénica. Barnes P.J., y col., "Modulation of Neurogenic Inflammation: Novel Approaches to Inflammatory Disease", Trends in Pharmacological Sciences 11: 185-189 (1990) . Un estudio en articulaciones del tobillo de ratas, sin embargo, afirma que el receptor 5-HT2 es responsable de la activación del nociceptor mediante 5-HT. Grubb, B.D., y col., "A Study of 5-HT-Receptors Associated with Afferent Nerves Located in Normal and Inflamed Rat Ankle Joints", Agents Actions 25:216-18 (1988) . Por lo tanto, la activación de los receptores 5-HT2 también puede tener una función sobre el dolor periférico e inflamación neurogénica. Un objetivo de la solución de la presente invención es blre-efa-e-a-r e± doior y una mtrtit d d procesos inflamatorios. Por lo tanto, ambos antagonistas de los receptores 5-HT2 y 5-HT3 se usan adecuadamente, ya sea individualmente o conjuntamente, en la solución de la presente invención, como se describirá subsecuentemente. La amitriptilina (Elavil™) es un antagonista adecuado para el receptor 5-HT2 para usarse en la presente invención. La amitriptilina se ha utilizado químicamente durante varios años como un antidepresivo y se descubrió que tiene efectos beneficiosos sobre ciertos pacientes con dolor crónico. La metoclopramida (Reglan™) se utiliza clínicamente como un fármaco antiemético pero tiene una afinidad moderada para el receptor 5-HT3 y puede inhibir las acciones de 5-HT en este receptor. Posiblemente inhibiendo el dolor debido a la liberación de 5-HT de las plaquetas. Por lo tanto, también es adecuado para usarse en la presente invención.
Otros antagonistas adecuados del receptor 5-HT2 incluyen imipramina, trasodona, desipramina y ketanserina, desipramina y ketanserina. La ketanserina se ha utilizado clínicamente por sus efectos antihipertensivos . Hedner, T., y col., "Effects of a New Serotonin Antagonist, Ketanserin, in Experimental and Clinical Hypertension", Am J of Hypertension 317s-23s (Jul. 1988). Otros antagonistas adecuados del receptor 5-HT3 incluyen cisaprida y ondansetron. Los antagonistas adecuados del receptor de serotoninaiB incluyen yohimbina, N- [-metoxi-3- ( -metil-l-piperanzinil ) fenil] -2 ' -metil-4 ' - (5-metil-l,2, 4-oxadiazol-3-il) [ 1 , 1-bifenil] -4-carboxamida ("GR127935") y metiotepina. Las concentraciones terapéuticas y preferidas para el uso en administración local de estos fármacos en solución de un aspecto de la presente invención se exponen en la Tabla 14. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis de agentes suficientes para dar como resultado la concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada .
TABLA 14 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES INHIBIDORES DEL DOLOR Y/O INFLAMACIÓN Clase de Agentes Concentraciones Concentraciones terapéuticas de preferidas de administración local administración (nanomolar) local (nanomolar) Antagonistas del receptor de serotonina2: Amitriptilina 0.1-1,000 50-500 MDL-11, 939 0.1-1, 000 50-500 AMI-193 0.1-2,000 50-500 Desipramina 0.1-1, 000 50-500 Ketanserina 0.1-1, 000 50-500 Antagonistas de receptor de serotonina3 Tropisetron 0.01-100 0.05-50 Metoclop amida 10-10,000 200-2,000 Cisaprida 0.1-1, 000 20-200 Ondansetron 0.1-1, 000 20-200 Antagonistas de serotonina1B {IDB de humano) Isamoltare 0.1-1, 000 50-500 GR127935 0.1-1, 000 10-500 Metiotepina 0.1-500 1-100 SB216641 0.2-2, 000 2-200 2. AGONISTAS DEL RECEPTOR DE SEROTONINA Se sabe que los receptores de 5-HTiA, 5-HTiB y 5-HTiD inhiben la actividad del adenilato ciclasa. Por lo tanto la inclusión de una baja dosis de estos agonistas del receptor de serotoninaiA, serotoninaiB y serotoninaiD en la solución debería inhibir las neuronas implicadas en el dolor e inflamación. Se espera esta misma acción para los agonistas del receptor de serotoninaiE y serotoninaiF debido a que estos receptores también inhiben el adenilato ciclasa. La buspirona es un agonista adecuado del receptor 1A para usarse en la presente invención. El sumatriptan es un agonista adecuado del receptor 1A, IB, ID y 1F. Un agonista adecuado del receptor IB y ID es dihidroergotamina . Un agonista adecuado del receptor 1E es ergonovina. Las concentraciones preferidas y terapéuticas para estos agonistas del receptor cuando se administran localmente se proporcionan en la Tabla 15. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis de agente suficientes para dar como resultado una concentración local en el sitio de acción o articulación dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo se incluye una carga o dosis suficiente de agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado -^un—perí do—d-e—tiempo—predetcrmin-a-d-o—de—ürbeia"Ciró - prolongada .
TABLA 15 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES INHIBIDORES DEL DOLOR Y/O INFLAMACIÓN Clase de Agentes Concentraciones Concentraciones terapéuticas de preferidas de administración local administración local (nanomolar) (nanomolar) Agonistas de serotoninaiA Buspirona 1-1, 000 10-200 Sumatriptan 1-1, 000 10-200 Agonistas de serotonina1B Dihidroergotamina 0.1-1000 10-200 Sumatriptan 1-1, 000 10-200 Naratriptan 1-1, 000 10-200 Rizatriptan 1-1, 000 10-200 Zolmitriptan 1-1, 000 10-200 L-694,247 1-1, 000 10-200 Agonistas de serotoninaio dihidroergotamina 0.1-1,000 10-100 Sumatriptan 1-1, 000 10-200 Naratriptan 1-1000 10-200 Rizatriptan 1-1, 000 10-200 Zolmitriptan 1-1,000 10-200 L-694, 247 1-1, 000 10-200 Agonistas de serotoninaiE; Ergonovina 10-2, 000 100-1, 000 Agonistas de serotoninaiF; Sumatriptan 1-1, 000 10-200 3. ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DE HISTAMINA Generalmente los receptores de histamina se dividen en los subtipos histaminai (Hi) e histamina2 (¾) . La respuesta inflamatoria clásica a la administración periférica de histamina está mediada por medio del receptor ??. Douglas, 1985. Por lo tanto, la solución de la presente invención preferiblemente incluye un antagonista del receptor Hi de histamina. La prometacina (Phenergan™) es un fármaco antiemético comúnmente utilizado que bloquea potentemente los receptores Hi y es adecuado para usarse en la presente invención. De manera interesante, este fármaco también ha mostrado poseer efectos anestésicos locales pero las concentraciones necesarias para lograr este efecto son de varios órdenes de magnitud que lo necesario para bloquear los receptores Hi, por lo tanto, se piensa que los efectos ocurren mediante mecanismos diferentes. La concentración de añtagonis a de receptor de histamina ~éñ la solución es" suficiente para inhibir los receptores Hi involucrados en activación nociceptora, pero no para lograr un efecto "local anestésico", eliminando asi la preocupación concerniente a los efectos secundarios sistémicos. Otros antagonistas adecuados del receptor Hi incluyen terfenadina, difenhidramina, amitriptilina, mepiramina y tripolidina. Debido a gue la amitriptilina también es efectiva como un antagonista del receptor de serotonina2, tiene una función dual como se utiliza en la presente invención. Las concentraciones adecuadas terapéuticas y preferidas para cada uno de estos antagonistas del receptor Hi para su administración local se exponen en la Tabla 16. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una dosis o carga de agentes suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 16 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES INHIBIDORES DEL DOLOR Y/O INFLAMACIÓN 4. ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DE BRADICININA Los receptores de bradicinina generalmente se dividen en los subtipos de bradicininai (Bi) y bradicinina2 (B2) . Los estudios demuestran que el dolor periférico agudo y la inflamación producida por bradicinina están mediados por el subtipo B2 mientras que el dolor inducido por bradicinina en la manifestación de inflamación crónica está mediada por medio de la vía del subtipo Bi. Perkins, M.N., y col., w¾ntinocicept"ve A~ctivity of the Bradykinin ?? and B2 Receptor antagonists, des-Arg9, [Leu8]-BK and HOE 140, in two Models of Persistent Hyperalgesia in the Rat", Pain 53: 191-97 (1993); Dray, A., y col., "Bradykinin and Inflairanatory Pain", Trends Neurosci. 16:99-104 (1993), cada una de estas referencias se incorpora expresamente en la presente por referencia . Actualmente no se utilizan clínicamente los antagonistas para el receptor de bradicinina. Algunos de estos fármacos son péptidos y por lo tanto no pueden ingerirse oralmente, debido a que serían digeridos. Los antagonistas para los receptores B2 bloquean el dolor agudo inducido por bradicinina y la inflamación. Dray y col., 1993. Los antagonistas del receptor Bi inhiben el dolor en estados crónicos inflamatorios. Perkins y col., 1993; Dray y col., 1993. Por lo tanto, dependiendo de la aplicación, la solución de la presente invención preferiblemente incluye alguno o ambos antagonistas del receptor Bi y B2 de bradicinina. Por ejemplo, la artroscopía se lleva a cabo tanto para estados crónicos como agudos y por lo tanto una solución de irrigación para la artroscopía podría incluir ambos antagonistas del receptor Bi y B2. Los antagonistas adecuados para el receptor de bradicinina para usarse en la presente invención incluyen los siguientes antagonistas del receptor de bradicininai: el derivado [des-Arg10] de D-Arg- (Hyp3-Thi5-D-Tic7-Oic8) -BK ("el derivado [des-Arg10] de HOE 140", comercializado por Hoechst P-kara e utica1s-H Y rLe —] ée-s—Arg-9—B-K-. tos ant¾-gon"rs~tas~ adecuados del receptor de bradicinina2 incluyen: [D-Phe7] -BK; D-Arg- (Hyp3—Thi5,8-D-Phe7) -BK ("NPC 349"); D-Arg- (Hyp3—D-Phe7)-BK ( "NPC 567"); y D-Arg-Hyp3—Thi5-D-Tic7-Oic8) -BK ("HOE 140") . Estos compuestos se describen totalmente en las referencias previamente incorporadas de Perkins y col., 1993 y Dray y col., 1993. Las concentraciones adecuadas terapéuticas y preferidas para administración local se proporcionan en la Tabla 17. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis de agente suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes de agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 17 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS PARA AGENTES INHIBIDORES DEL DOLOR Y/O INFLAMACIÓN 5. INHIBIDORES DE CALICREÍNA El péptido bradicinina es un mediador importante del dolor e inflamación, como se indicó previamente. La bradicinina se produce como un producto de la escisión por la acción de calicreína sobre quininógenos plasmáticos de elevado peso molecular. Por lo tanto, se piensa que los inhibidores de calicreína son terapéuticos para inhibir la producción de bradicinina y el dolor e inflamación resultantes. Un inhibidor de calicreina adecuado para usarse en la presente invención es aprotinina. Las concentraciones adecuadas para usarse en la soluciones de la presente invención cuando se administra localmente se exponen a continuación en la Tabla 18. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis suficientes de agente para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado, para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga de dosis suficientes en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 18 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES INHIBIDORES DEL DOLOR Y/O INFLAMACIÓN Clase de Agentes Concentraciones Concentracione terapéuticas de s preferidas administración de local (nra) administración local (nm) Inhibidor de calicreina: Aprotinina 0.1-1, 000 50-500 6.ANTAGONISTAS DE RECEPTOR DE TAQOICININA Las taquicininas (TK) son una familia de péptidos estructuralmente relacionados que incluyen sustancia P, neurocinina A (NKA) y neurocinina B (NKB) . Las neuronas son la principal fuente de TK en la periferia. Un efecto general importante de TK es la estimulación neuronal, pero otros efectos incluyen la estimulación de células inflamatorias, desgranulación y reclutamiento de mastocitos, extravasación de proteina plasmática y vasodilatación dependiente del endotelio. Maggi, C.A., Gen, Pharmacol., 22: 1-24 (1991). Debido a la combinación anterior de acciones fisiológicas mediante la activación de receptores TK, la especificidad hacia el objetivo de receptores TK es un método razonable para la promoción de la analgesia y el tratamiento contra la inflamación neurogénica. 6A.ANTAGONISTAS DEL SUBTIPO DEL RECEPTOR NEüRQCININAi La sustancia P activa el subtipo de receptor de neurocinina llamado NKi. La sustancia P es un undecapéptido que está presente en las terminales nerviosas sensoriales. Se sabe que la sustancia P tiene múltiples acciones que producen inflamación y dolor en la periferia después de una activación de fibras-C, incluyendo vasodilatación, extravasación de plasma y desgranulación de mastocitos. Levine, J.D., y col., "Peptides and the Primary Afferent Nociceptor", J. Neurosci. 13:2273 (1993). Un antagonista adecuado de sustancia P es {-fB-Píe^-rspií -gaffima-^^ Trp-U —íhtsa±aem±n ("?=?1~?~ ("GR 82334") . Otros antagonistas adecuados para usarse en la presente invención que actúan sobre el receptor NKi son: 1-imino-2- (2-metoxi-fenil ) -etil) -7 , 7-difenil-4-perhidroisoindolona (3aR, 7aR) ("RP 67580"); y 2S, 3S-cis-3- ( 2-metoxibencilamino) -2-bencidrilquinuclidina ("CP 96,345"). Las concentraciones adecuadas de estos agentes cuando se administran localmente se exponen en la Tabla 19. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluirán adecuadamente una dosis o carga de agentes suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico determinado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficiente de agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 19 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES INHIBIDORES DEL DOLOR Y/O INFLAMACIÓN 6B. ANTAGONISTAS DEL SUBTIPO DE RECEPTOR DE NEUROCININA2 La neurocinina A es un péptido que se localiza en las neuronas sensoriales conjuntamente con sustancia P y que también promueve la inflamación y dolor. La neurocinina A activa el receptor especifico de neurocinina llamado NK2. Edmonds-Alt, S., y col., "A Potent and Selective Non-Peptide antagonist of the Neurokinin A (NK2) Receptor", Life Sci. 50:PL101 (1992). Los ejemplos de antagonistas adecuados de NK2 incluyen: ( (S) -N-metil-N- [4- (4-acetilamino-4-fenilpiperidino) -2- (3, 4-diclorofenil) butil] -benzamida (" ( +) -SR 48968"); Met-Asp-Trp-Phe-Dap-Leu ("MEN 10,627"); y c crGtñ^TTp^Pfre=Gly-Leu- eT) PX 65~9787T"77 La? concentraciones adecuadas de estos agentes para la administración local se proporcionan en la Tabla 20. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis del agente suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes de agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 20 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES INHIBIDORES DEL DOLOR 7. ANTAGONISTAS DE RECEPTOR CG P El péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGPR) es un péptido que también esta localizado en neuronas sensoriales con untamente con la sustancia P, y que actúa como un vasodilatador y potencializa las acciones de la sustancia P. Brain, S., y col., JBr. J. Pharmacol, 99:202 (1985) . Un ejemplo de un antagonista adecuado del receptor CGRP es I-CGRP- (8-37 ) , una versión truncada de CGRP. El polipéptido inhibe la activación de receptores CGRP. Las concentraciones adecuadas de este agente cuando se administra localmente se proporcionan en la Tabla 21. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis de agentes suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes de agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un período de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 21 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES INHIBIDORES DEL DOLOR Y/O INFLAMACIÓN 5 8. NTAGONISTAS DEL RECEPTOR DE INTERLEUCINA Las interleucinas son una familia de péptidos, clasificadas como citocinas, que se producen por leucocitos y otras células en respuesta a mediadores inflamatorios. Las interleucinas (IL) pueden ser, periféricamente, potentes 10 agentes hiperalgésicos . Ferriera, S.H., y col., Nature 334:698 (1988). Un ejemplo de un antagonista adecuado del receptor IL-?ß es Lys-D-Pro-Thr, la cual es una versión truncada de IL-?ß. Este tripéptido inhibe la activación de receptores IL-?ß. Las concentraciones adecuadas de este 15 agente para la administración local se proporciona en la Tabla 22. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis de agentes suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio -2) de—acci-ón—dentro—tfei:—rn-¾T a"±O terapéutico enumerado^ Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes de agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 22 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES INHIBIDORES DEL DOLOR Y/O INFLAMACIÓN 9. INHIBIDORES DE ENZIMAS ACTIVAS EN LA VÍA SINTÉTICA ARA LOS ETABOLITOS DEL ÁCIDO ARAQUIDÓNICO 9A. INHIBIDORES DE FOSFOLIPASA La producción de ácido araquidónico mediante enzimas (cPLA2, iPLA2, sPLA2) de fosfolipasa A2(PLA2) y fosfolipasa C (PLC) da como resultado una cascada de reacciones que produce diversos mediadores de inflamación, conocidos—como—ercosaTTOTct-s-: Hay una va~rl~eiia3 de""etapas a través de esta vía que pueden inhibirse, disminuyendo así la producción de estos mediadores inflamatorios. A continuación se proporcionan los ejemplos de inhibición en estas diversas etapas . La inhibición de la isoforma de la enzima PLA2, inhibe la liberación de ácido araquidónico de las membranas celulares y por lo tanto inhibe la producción de prostaglandinas y leucotrienos dando como resultado una menor inflamación y dolor. Glaser, K.B., "Regulation of Phospholipase A2 Enzymes: Selective Inhibitors and Their Pharmacological Potential", Adv. Pharmacol, 32:31 (1995). Un ejemplo de un inhibidor de la isoforma PLA2 es manoalida. La inhibición de la isoforma de fosfolipasa CY (PLCY) también dará como resultado una menor producción de prostanoides y leucotrienos y por lo tanto, dará como resultado una menor inflamación y dolor. Un ejemplo de un inhibidor de la isoforma PLCY es 1- [ 6- ( ( 17p-3-metoxiestra-l, 3, 5 (10) -trien-17-il) amino) hexil-lH-pirrol-2, 5-diona. Las concentraciones adecuadas de este agente cuando se administra localmente se incluyen en la Tabla 23. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis suficientes de agente para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitios de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una—ca-rga—©—dos-i-s—s-u^ie-i-e-nfees—de—a-gente—e —ta— composrcrÓTi" para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 23 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES INHIBIDORES DEL DOLOR Y/O INFLAMACIÓN 9B . INHIBIDORES DE CICLOQXIGENASA Los fármacos antiinflamatorios no esteroidales (NSAID) se utilizan ampliamente como agentes aintiinflamatorios, antipiréticos, antitrombóticos y analgésicos. Lewis, R.A., Prostaglandins and Leukotrienes, en: Textbook of Rheumatology, 3a ed. (Kelley W. . , y col., eds . ) , pág . 2~5¾ (?^??? Los objetivos moleculares para estos fármacos son las ciclooxigenasas Tipo I y Tipo II (COX-1 y COX-2) . También se conocen estas enzimas como prostaglandina H sintasa (PGHS)-l (constitutiva) y -2 (inducible) y catalizan la conversión del ácido araquidónico en prostaglandina H la cual es un intermediario en la biosintesis de prostaglandinas y tromboxanos. La enzima COX-2 ha sido identificada en células endoteliales , macrófagos y fibroblastos. Esta enzima es inducida por IL-1 y TNF-a, y su expresión se regula aceleradamente en los sitios de inflamación. La actividad constitutiva de COX-1 y la actividad inducida de COX-2 conllevan ambas a la síntesis de prostaglandinas que contribuyen al dolor e inflamación. Varias de las NSAID actualmente en el mercado (diclofenaco, naproxeno, indometacina, ibuprofeno, etc.) generalmente son inhibidores no selectivos de ambas isoformas de COX, pero pueden mostrar una mayor selectividad para COX-1 con respecto a COX-2, aunque esta proporción varía para los diferentes compuestos. El uso de inhibidores de COX-1 y 2 para bloquear la formación de prostaglandinas representa una mejor estrategia terapéutica que el intento de bloquear la interacción de los ligandos naturales con los siete subtipos descritos de receptores de prostanoides . Los antagonistas mencionados para los receptores de eicosanoides (EP-1, EP-2, EP-3) son bastante raros y solo los antagonistas específicos y de elevada afinidad del receptor A2 de tromboxano han sido mencionados. "Wallace, J. y col., Trends in Pharm Sci . , 15:^0-5-4-0-6—(-1-^4-)-, Las concentraciones representativas terapéuticas y preferidas de inhibidores de ciclooxigenasa para la administración local en la solución se proporcionan en la Tabla 24. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis de agentes suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes de agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 24 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES INHIBIDORES DEL DOLOR Y/O INFLAMACIÓN Clase de Agentes Concentraciones Concentraciones terapéuticas de preferidas de administración administración local (nanomolar) local (nanomolar) Inhibidores de ciclooxigenasa : Ketorolac 100-10,000 500-5, 000 Indometacina 1,000-500,000 10, 000-200, 000 9C. INHIBIDORES DE LIPOOXIGENASA La inhibición de la enzima lipooxigenasa inhibe la producción de leucotrienos como el leucotrieno B4, que se sabe es un mediador importante de inflamación y dolor. Lewis, R.A., Prostaglandins and Leukotrienes, en: Textbook of Rheumatology, 3a ed. (Kelley W. N., y col., eds . ) , pág. 258 (1989) . Un ejemplo de un antagonista de 5-lipooxigenasa es 2,3, 5-trimetil-6- ( 12-hidroxi-5 , 10-dodecadinil ) -1, 4-benzoquinona ("AA 861"), las concentraciones adecuadas para su administración local se enumeran en la Tabla 25. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis de suficientes de agente para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitios de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes de agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 25 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES INHIBIDORES DEL DOLOR Y/O INFLAMACIÓN 10. ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DEL PROSTANOIDE Los prostanoides específicos producidos como metabolitos del ácido araquidónico regulan sus efectos inflamatorios mediante la activación de receptores de prostanoide. Los Ejemplos de las clases de antagonistas específicos de prostanoide son los antagonistas del subtipo del receptor EP-1 y EP-4 de eicosanoide y los antagonistas del subtipo del receptor de tromboxano. Un antagonista adecuado del receptor E2 de prostaglandina es ácido 8- clorodibencil [b, f] [1, 4 ] oxazepin-10 (11H) -carboxílico, 2- acetilhidrazida ("SC 19220") . Un antagonista adecuado del subtipo de receptor de tromboxano es ácido [15- [1a, 2ß(5?), 3ß, 4a] -7- [3- [2- (fenilamino) -carbonil]hidrazino]metil] -7- oxobiciclo- [2, 2, 1] hept-2-il] -5-heptanóico ("SQ 29548"). Las CO centraTXOTre^s a~d~e~cu~a-d~a~s de e¾fo~3 agentes cuando se administran localmente se exponen en la Tabla 26. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis suficientes de agente para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitios de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes de agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 26 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES INHIBIDORES DEL DOLOR Y/O INFLAMACIÓN 11. ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DEL LEUCQTRIENO Los leucotrienos (LTB4, LTC4 y LTD4) son productos "2? d¾ ta vía 5^xr^oxxg¾rar a del metabolismo del ácicJo- araquidónico que se qeneran enzimáticamente y tienen importantes propiedades biológicas. Los leucotrienos están implicados en una variedad de estados patológicos que incluyen inflamación. Actualmente se buscan los antagonistas específicos por varias compañías farmacéuticas debido a su potencial intervención terapéutica para estas patologías. Halushka, P.V., y col., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol . , 29:213-239 (1989)/ Ford-Hutchinson, A., Crit. Rev. Immunol. 10:1-12 (1990). El receptor LTB4 se encuentra en ciertas células inmunitarias incluyendo eosinófilos y neutrófilos. La unión de LTB4 a estos receptores da como resultado la quimiotaxis y liberación de enzimas lisosomales contribuyendo así al proceso de inflamación. El proceso de transducción de señal asociado con la activación del receptor LTB4 involucra la estimulación mediada por proteína-G del metabolismo de fosfotidilinositol (PI) y elevación del calcio intracelular (ver FIGURA 2) . Un ejemplo de un antagonista adecuado del receptor B4 de leucotrieno es ácido SC (+ ) - (S) -7- (3- (2- (ciclopropilmetil) -3-metoxi-4- [ (metilamino) -carbonil] fenoxi (propoxi) -3, 4-dihidro-8-propil-2H-l-benzopiran-2-propanóico ("SC 53228") . Otros antagonistas adecuados del receptor B4 de leucotrieno incluyen ácido [3-[-2 (7-cloro-2-quinolinil ) etenil] fenil] [ [3- (dimetilamino-3-oxopropil) tio] metil] tiopropanóico ("MK 0571") y los fármacos LY 66,071 y ICI 20,3219, MK 0571 también actúan como aíita-geftirs-ra-s dei s-ubtipo de r eep-tor T&. L~a~s~ concentraciones para este agente también son adecuadas para la práctica de los métodos de administración local de la presente invención que se proporcionan en la Tabla 27. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis suficientes de agente para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitios de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 27 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES INHIBIDORES DEL DOLOR Y/O INFLAMACIÓN Clase de Agentes Concentraciones Concentraciones terapéuticas de preferidas de administración administración local (nanomolar) local (nanomolar) Antagonista B4 de leucotrieno : SC 53228 100-10,000 500-5, 000 12. AGONISTAS DEL RECEPTOR OPIOIDE La activación de los receptores opioides da como resultado efectos antinociceptores y por lo tanto, los agonistas para esos receptores son muy deseables. Los receptores opioides incluyen los subtipos de receptor µ-, d-y -opioide. Los receptores -µ están ubicados en las terminales de las neuronas sensoriales periféricas y la activación de estos receptores inhibe la actividad de la neurona sensorial. Basbaum, A.I., y col., "Opiate analgesia: How Central is a Peripheral Target?", N. Engl. J. Med. 325:1168 (1991) . Los d- y ?-receptores están ubicados en las terminales eferentes simpáticas e inhiben la proliferación de prostaglandinas, inhibiendo asi el dolor e inflamación Taiwo, Y. O., y col., "Kappa and Delta-Opioids Block Sympathetically Dependent Hyperalgesia", J. Neurosci. 11:928 (1991). Los subtipos del receptor opioide son miembros de la superfamilía de receptores acoplados a proteína-G. Por lo tanto, todos los agonistas del receptor opioide interactúan e inician la señalización mediante su receptor cognado acoplado a la proteina-G. Los ejemplos de agonistas adecuados de receptor µ-opioide son fentanilo y Try-D-Ala-Gly- [N-MePhe ] -NH (CH2) -OH ("DA GO") . Un ejemplo de un agonista adecuado de receptor d-opioide es [D-Pen2, D-Pen5] encefaliña ("DPDPE") . Un ejemplo de un agonista adecuado de receptor ?-opioide es (trans)-3,4-dicloro-N-metil-N- [2- ( 1-pirrolidinil ) ciclohexil] -bencenacetamida ("U50,488"). Las concentraciones adecuadas pa-r-a-^L-a—a^¾ifí÷s-tr¾-eién-^r© al-de— a-d-a—une—de—e-s-tos—a-gentes-s~e_ exponen en la Tabla 28. Símilármente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis de agentes suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración y liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficiente de agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un período de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 28 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES INHIBITORIOS DEL DOLOR Y/O INFLAMACIÓN Clase de agente Concentraciones Concentraciones terapéuticas de preferidas de administración administración local (nm) local (nm) Agonista µ-opioide: DAMGO 0.1-100 0.5-20 Sufentanilo 0.01-50 1-20 Fentanilo 0.1-500 10-200 PL 017 0.05-50 0.25-10 Agonista d-opioide: DPDPE 0.1-500 1.0-100 Agonista ?-opioide: U50, 88 0.1-500 1.0-100 13. ANTAGONISTAS PURINOCEPTORES El ATP extracelular actúa como una molécula de señalización mediante interacciones con purinoceptores P2. 5 Una clase principal de purinoceptores son los P2x que son canales de iones con entrada y salida de ligandos que posee canales de iones intrínsecos permeables a Na+, K+ y Ca2+. Los receptores P2x descritos en neuronas sensoriales son importantes para la nocicepción y neurotransmisión primaria 10 aferente. Se sabe que el ATP despolariza las neuronas sensoriales y tiene una función en la activación nociceptora ya que el ATP liberado de células lesionadas estimula los receptores P2x que conllevan a la despolarización de las terminales nociceptoras de fibras nerviosas. El receptor P2X3 15 tiene una distribución bastante restringida (Chen, C.C., y col., Nature, Vol . 377, págs . 428-431 (1995)) ya que se expresa selectivamente en las fibras-C nerviosas sensoriales que corren a lo largo de la médula espinal y varias de estas fibras-C transportan los receptores de estímulos dolorosos. 20 Por lo tanto, la ubicación bastante restringida de la expresión para las unidades de receptores P2X3 hacen de estos subtipos excelentes objetivos para la acción analgésica (ver Figuras 3 y 7 ) . Los receptores de purina movilizadora del calcio, que "2'5 pextenrecen—a—ta—snperrfHm±±±a de re"cept"cr ¾~ proteina-G" fian sido descritos sobre la superficie de condrocitos articulares de mamífero. Se descubrió que el ATP estimula una elevación transitoria y dependiente de la dosis de la concentración de iones de calcio en condrocitos primarios diferenciados. Los experimentos de desensibilización heteróloga demostraron que los condrocitos no muestran una respuesta subsecuente a UTP después de una estimulación inicial con ATP. Estos resultados son consistentes con la presencia de receptores P2Y de la superficie celular de condrocitos. La movilización de calcio inducida por purina en condrocitos con varias pasadas mostró el mismo perfil farmacológico con respecto a la sensibilidad al agonista. El ATP y UTP no alteraron la síntesis de matriz cartilaginosa como se cuantificó mediante la velocidad de incorporación del [35S] sulfato en el glicosaminoglicano mediante explantes de cartílago o condrocitos primarios. La degradación de la matriz, cuantificada mediante la liberación del glicosaminoglicano a partir de explantes de cartílago tampoco fue alterada por ninguno de los agonistas. La presencia de un receptor funcional de purina P2Y sobre la superficie de condrocitos articulares primarios permitió concentraciones de purinas extracelulares, como ATP, para que activaran el metabolismo condrocítico . Otros estudios han definido la expresión de los genes del receptor de purina Pl y P2 por condrocitos articulares de humano y la liberación perfilada de prostaglandina E2 mediada por ligando. Los agonistas ATP y UTP del receptor P2Y2 sinérgicamente después de un tratamiento previo con IL-loc de humano. La liberación de PGE2 en respuesta a la adición simultánea de ATP y UTP después de un tratamiento previo con IL-1 fue imitada mediante el acetato de forbol miristato. La función del receptor P2Y2 es incrementar la liberación de IL-1 mediada por PGE2, promoviendo asi el dolor e inflamación dentro de la articulación. Por lo tanto, el uso de antagonistas P2Y en la presente invención deberá prevenir la activación de la producción de mediadores inflamatorios tanto por sinoviocitos como por condrocitos . Los antagonistas adecuados de purinoceptores P2x/ATP para usarse en la presente invención incluyen, a manera de ejemplo, suramina y ácido piridoxilfosfato-6-azofenil-2, 4-disulfónico ("PPADS") . Las concentraciones adecuadas para la administración local de estos agentes se proporcionan en la Tabla 29. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis de agentes suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitios de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes de agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de administración dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación Tabla 29 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES INHIBIDORES DEL DOLOR Y/O INFLAMACIÓN 14. ANTAGONISTAS DE LOS CANALES CA Los antagonistas de los canales de calcio son un grupo distinto de fármacos que interfieren con el flujo transmem ranal de iones de calcio requerido para la activación de las respuestas celulares que intervienen en la neuroinflamación . La entrada de calcio en los sinoviocitos y condrocitos es un evento clave que interviene en la activación de las respuestas de estas células. Más aún, la función de los receptores (NKi y NK2) de bradicinina, histamina, serotonina (SHT2) y neurocinina en la regulación de la vía de la transducción de señal de la neuroinflamación incluye incremento de calcio intracelular, lo que conlleva a la activación de los canales de calcio en la membrana plasmática. En varios tejidos, los antagonistas del canal de calcio, como la nifedipina, pueden reducir la liberación de ácido araquidónico, prostaglandinas y leucotrienos desencadenada por diversos estímulos. Moneada, S., y col., Goodman 's and Gilman 's Pharmacological Basis of Therapeutics, (7a edición), Mac illan Publ . Inc., 660-5 (1995). Finalmente, los antagonistas del canal de calcio y alguno de taquicinina, histamina o bradicinina antagonistas muestran efectos sinérgicos para inhibir la neuroinflamación . Ha sido establecida la función de los receptores de neurocinina para mediar la neuroinflamación . El receptor de neurocininai (NKi) y neurocinina2 (NK2) (miembros de la superfamilia acoplada a la superfamilia-G) de la vía de la transducción de señal incluye incrementos en calcio intracelular, lo que conlleva a la activación de los canales de calcio en la membrana plasmática. Similarmente, la activación de los receptores de bradicinina2 (BK2) está ligada a incrementos de calcio intracelular en los sinoviocitos y condrocitos. Por lo tanto, los antagonistas de los canales de calcio interfieren con un mecanismo común que involucra la elevación de calcio intracelular, parte del cuál entra a través de los canales Tipo L. Esta es la base para la interacción sinérgica entre los antagonistas de canales de calcio y antagonistas de receptores de neurocinina, histamina, P2Y y bradicinina2. Los antagonistas adecuados de los canales de calcio para la práctica de la presente invención incluyen nisoldipina, nifedipina, nimodipina, lacidipina, isradipina y a-miodip-ifl-a-—¦—fca-s—¦—eo-n-een-tra-eirofte-s^ adeeaa-da-s para ta- administración local de estos agentes se exponen en la Tabla 30. Similarmente, las composiciones sistémicas de conformidad con la presente invención incluyen adecuadamente una carga o dosis de agentes suficientes para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado. Para los sistemas de administración de liberación prolongada con especificidad hacia el objetivo, se incluye una carga o dosis suficientes de agente en la composición para dar como resultado una concentración local en la articulación o sitio de acción dentro del intervalo terapéutico enumerado durante un periodo de tiempo predeterminado de liberación prolongada.
TABLA 30 CONCENTRACIONES TERAPÉUTICAS Y PREFERIDAS DE AGENTES ANTIESPASMODICOS Clase de agente Concentraciones Concentraciones terapéuticas de preferidas de administración administración local (nm) local (nm) Antagonistas del canal de calcio: Nisoldipina 1-10, 000 100-1, 000 Nifedipina 1-10, 000 100-5, 000 Nimodipina 1-10, 000 100-5, 000 Lacidipina 1-10, 000 100-5, 000 Isradipina 1-10, 000 100-5, 000 Amlodipina 1-10, 000 100-5, 000 VI . EJEMPLOS A continuación se muestran varias formulaciones de conformidad con los aspectos de la presente invención adecuadas para su irrigación en ciertos procedimientos quirúrgicos (Ejemplos 1-3) y para la administración sistémica, como podría ser la inyección intramuscular o subcutánea (Ejemplos 4-11) y son seguidos de un sumario de tres estudios clínicos que utilizan los agentes de la presente invención EJEMPLO 1 SOLUCIÓN DE IRRIGACIÓN PARA ARTRQSCQPÍA La siguiente composición es adecuada para utilizarse en una irrigación de articulación anatómica durante procedimientos artroscópicos . Cada fármaco se solubiliza en un líquido portador que contiene electrólitos fisiológicos, como solución salina normal o solución de Ringer lactosada, así como también las soluciones restantes descritas en los Ejemplos subsiguientes.
Clase de agente Fármaco Concentración (nanomolar) Inhibidor MAP cinasa SB203580 200 Inhibidor de la U-24522 200 metaloproteinasa de matriz Agonista TGF-ß Tüf-'2 UU EJEMPLO 2 SOLUCIÓN ALTERNATIVA DE IRRIGACIÓN PARA ARTROSCOPÍA La siguiente composición es una formulación alternativa adecuada para usarse en una irrigación de articulación anatómica de los procedimientos artroscópicos.
EJEMPLO 3 SOLUCIÓN ALTERNA DE IRRIGACIÓN Los siguientes fármacos e intervalos de concentraciones en solución en un líquido portador fisiológico son adecuados para usarse en la presente invención .
Clase de agente Fármaco Concentración (nm) Inhibidor MAP cinasa SB 242235 200 Inhibidor óxido nítrico L-NIL 10, 000 sintasa Agonista TGF-ß TGF-p2 100 EJEMPLO 4 SOLUCIÓN CONDROPROTECTORA PARA INYECCIÓN La siguiente composición es adecuada para inyectarse en una articulación anatómica. Cada fármaco se solubiliza en un liquido portador que contiene electrólitos fisiológicos como solución salina normal o solución lactosada Ringer. Una dosificación de 20 mi de la solución es adecuada para administrarse en un paciente.
EJEMPLO 5 COMPOSICIÓN CONDROPROTECTORA PARA LA ADMINISTRACIÓN SISTÉMICA La siguiente composición condroprotectora es adecuada para su administración sistémica, como administración intramuscular o subcutánea. Cada fármaco se incluye en la composición a una concentración suficiente para dar como resultado la siguiente concentración en el sitio de acción pretendida y se solubiliza en un líquido portador fnsxuiógico o sistema de administración.
Clase de agente Fármaco Concentración en el sitio de acción (ira) Inhibidor MAP cinasa SB203580 200 Inhibidor de la U-24522 200 metaloproteinasa de matriz Agonista TGF-ß TGF-P2 200 EJEMPLO 6 COMPOSICIÓN ALTERNA CONDROPROTECTORA DE ADMINISTRACIÓN SISTÉMICA La siguiente composición condroprotectora es adecuada para su administración sistémica, como la administración intramuscular o subcutánea. Cada fármaco se incluye en la composición a una concentración suficiente para dar como resultado la siguiente concentración en el sitio de acción pretendida y se solubiliza en un liquido portador fisiológico o sistema de administración.
Clase de agente Fármaco Concentración en el sitio de acción (nm) Inhibidor MAP cinasa SB203580 200 Inhibidor óxido nítrico sintasa L-NIL 1, 000 Agonista del receptor IL-10 100 interleucina EJEMPLO 7 COMPOSICIÓN CONDROPROTECTORA ALTERNA PARA ADMINISTRACIÓN SISTEMICA La siguiente composición condroprotectora es adecuada para su administración sistémica, como la administración intramuscular o subcutánea. Cada fármaco se incluye en la composición a una concentración suficiente para dar como resultado la siguiente concentración en el sitio de acción pretendido y se solubiliza en un liquido portador fisiológico o sistema de administración.
EJEMPLO 8 COMPOSICIÓN CONDROPROTECTORA ALTERNA PARA ADMINISTRACIÓN SISTÉMICA La siguiente composición condroprotectora es 15 adecuada para su administración sistémica como la administración intramuscular o subcutánea. Cada fármaco se incluye en la composición a una concentración suficiente para dar como resultado la siguiente concentración en el sitio de acción pretendido y se solubiliza en un líquido portador "2? t±s±o1ó~ ÍLC'o~?~3?stema de administración-; Clase de agente Fármaco Concentración en el sitio de acción (nxn) Receptor soluble TNF- Etanerocept 250 cc ( sTNFRI I : Fe ) (Enbrel™, Immunex) Inhibidor MAP cinasa SB203580 500 Agonista TGF-ß TGF- 2 200 EJEMPLO 9 COMPOSICIÓN CONDROPROTECTORA ALTERNA PARA ADMINISTRACIÓN SISTÉMICA La siguiente composición condroprotectora es adecuada para su administración sistémica, como administración intramuscular o subcutánea. Cada fármaco se incluye en la composición a una concentración suficiente para dar como resultado la siguiente concentración en el sitio de acción pretendido y se solubiliza en un liquido portador fisiológico o sistema de administración.
EJEMPLO 10 COMPOSICIÓN CONDROPROTECTORA ALTERNA PARA ADMINISTRACIÓN SISTÉMICA La siguiente composición condroprotectora es adecuada para su administración sistémica como la administración intramuscular o subcutánea. Cada fármaco se incluye en la composición a una concentración suficiente para dar como resultado la siguiente concentración en el sitio de acción pretendido y se solubiliza en un liquido portador fisiológico o sistema de administración.
EJEMPLO 11 COMPOSICIÓN CONDROPROTECTORA ALTERNA PARA ADMINISTRACIÓN SISTÉMICA La siguiente composición condroprotectora es adecuada para su administración sistémica como la administración intramuscular o subcutánea. Cada fármaco se incluye en la composición a una concentración suficiente para dar como resultado la siguiente concentración en el sitio de acción pretendido y se solubiliza en un liquido portador fisiológico o sistema de administración.
Clase de agente Fármaco Dosis (mg/kg/dia) Receptor soluble Etanerocept 0.5-1.0 TNF-a (sTNFRII:Fc) (Enbrel™, Immunex) Inhibidor MAP SB203580 30-60 cinasa Agonista TGF-ß TGF-P2 0.1-10 EJEMPLO 12 COMPOSICIÓN CONDROPROTECTORA ALTERNA PARA ADMINISTRACIÓN SISTÉMICA La siguiente composición condroprotectora es adecuada para su administración sistémica, como administración intramuscular o subcutánea. Cada fármaco se incluye en la composición a una concentración suficiente para dar como resultado la siguiente concentración en el sitio de acción pretendido y se solubiliza en un liquido portador fisiológico o sistema de administración.
Clase de agente Fármaco Dosis (mg/kg/dia) Antagonista del Anakinra (Kineret™, 2.0 receptor IL-1 (IL- Amgen) lRa) Inhibidor MAP SB203580 30-60 cinasa Agonista TGF-ß TGF-P2 0.1-10 EJEMPLO 13 SISTEMA DE ADMINISTRACIÓN DE FÁRMACO CONDROPROTECTOR CON ESPECIFICIDAD HACIA EL OBJETIVO La siguiente composición condroprotectora es adecuada para su administración sistémica, como podría ser la administración, intravenosa, intramuscular, subcutánea o inhalada. Los fármacos encapsulan dentro de una nanoesfera de copolímero DL-láctido/glicólido ( PLGA) , a la cual se acopla un anticuerpo monoclonal de colágeno Tipo II antihumano. Este anticuerpo tiene como objetivo los epitopos sobre el colágeno Tipo II de humano del cartílago articular. Cada fármaco se incluye en la composición a una concentración suficiente para dar como resultado la siguiente concentración promedio en el sitio de acción pretendido al momento de la degradación de la nanoesfera y liberación de los agentes durante un período de tiempo de liberación prolongada.
Clase de Agente Concentración en el sitio de acción (nanomolar) Factor de IGF-1 250 n crecimiento Inhibidor MAP SB220025 1000 nM cinasa Inhibidor MMP BB2516 200 nM (marimastat ) EJEMPLO 14 SISTEMA, DE ADMINISTRACIÓN DE FÁRMACO CONDROPROTECTOR CON ESPECIFICIDAD HACIA EL OBJETIVO La siguiente composición condroprotectora es adecuada para su administración sistémica, como administración, intravenosa, intramuscular, subcutánea o inhalada. Los fármacos se encapsulan dentro de una nanoesfera biodegradable copolimérica PLA/PLGA, a la cual se acopla un anticuerpo monoclonal de agrecano antihumano. Este anticuerpo tiene como objetivo los neoepitopos en el agrecano de humano del cartílago articular. Cada fármaco se incluye en la composición a una concentración suficiente para dar como resultado la siguiente concentración al momento de la degradación de la nanoesfera y liberación de agentes durante un período de tiempo de liberación prolongada.
Clase de Agente Concentración en el sitio de acción (nanomolar) Factor de IGF-1 250nM crecimiento Inhibidor MAP SB220025 ?????? cinasa Inhibidor MMP BB2516 200nM (marimastat ) EJEMPLO 15 SISTEMA, DE ADMINISTRACIÓN DE FÁRMACO CONDROPROTECTOR CON ESPECIFICIDAD HACIA EL OBJETIVO La siguiente composición condroprotectora es adecuada para su administración sistémica, como podría ser la administración, intravenosa, intramuscular, subcutánea o inhalada. Los fármacos se encapsulan dentro de una nanoesfera de quitosana/gelatina, a la cual se acopla un anticuerpo monoclonal de colágeno Tipo II antihumano. Este anticuerpo tiene como objetivo los neoepitopos del colágeno Tipo II de humano. Cada fármaco se incluye en la composición a una concentración suficiente para dar como resultado la siguiente concentración en el sitio de acción pretendido al momento de degradarse la nanoesfera y liberar los agentes durante un período deseado de liberación prolongada.
EJEMPLO 16 SISTEMA DE ADMINISTRACIÓN DE FÁRMACO CONDROPROTECTOR CON ESPECIFICIDAD EITOBJETIVO La siguiente composición condroprotectora es adecuada para su administración sistémica, como podría ser la administración, intravenosa, intramuscular, subcutánea o inhalada. Los fármacos se encapsulan dentro de una nanoesfera de albúmina, a la cual se acopla un anticuerpo monoclonal de colágeno Tipo II antihumano. Este anticuerpo tiene como objetivo los neoepitopos en el colágeno Tipo II de humano. Cada fármaco se incluye en la composición a una concentración suficiente para dar como resultado la siguiente concentración en el sitio de acción pretendido al momento de degradarse nanoesfera y liberar los agentes durante un período de tiempo de liberación prolongada.
EJEMPLO 17 SISTEMA DE ADMINISTRACIÓN DE FÁRMACO CONDROPROTECTOR CON ESPECIFICIDAD HACIA EL OBJETIVO La siguiente composición condroprotectora es adecuada para su administración sistémica, como podría ser la at±nrm-rstra-crórr intrav-enosB^ rrrtTHirra"s^cuiaT7 subcutánea o inhalada. Los fármacos se encapsulan dentro de una nanoesfera de copolimero de poli ( láctido-co-glicólido) /poli (etilenglicol) , a la cual se acopla un anticuerpo monoclonal de colágeno Tipo II antihumano. Este anticuerpo tiene como objetivo los neoepitopos sobre el colágeno Tipo II de humano en el cartílago articular. Cada fármaco se incluye en la composición a una concentración suficiente para dar como resultado la siguiente concentración en el sitio de acción pretendido al momento de degradarse la nanoesfera y liberar los agentes durante un período deseado de liberación prolongada.
EJEMPLO 18 SISTEMA, DE ADMINISTRACIÓN DE FÁRMACO CONDROPROTECTOR CON ESPECIFICIDAD HACIA EL OBJETIVO La siguiente composición condroprotectora es adecuada para su administración sistémica, como podría ser la administración, intravenosa, intramuscular, subcutánea o rnha±a:da^—El—a-gorrista ctei re~c¾p~1_l5r~BMF; BMV^T, se encapsula dentro de una nanoesfera de poli (láctido-co-glicólido) (PLGA) , a la cual se acopla un anticuerpo monoclonal de colágeno Tipo II antihumano. El agonista del receptor IGF, IGF-1 se encapsula por separado dentro de una nanoesfera de condroiteina-6-sulfato/gelatina a la cual también se acopla un anticuerpo monoclonal de agrecano antihumano. El anticuerpo usado con especificidad hacia el objetivo de cada tipo de nanoesfera se une a los neoepitopos del colágeno Tipo II de humano y neoepitopos de agrecano en el cartílago articular. Cada fármaco se incluye en la composición a una concentración suficiente para dar como resultado la siguiente concentración promedio en el sitio de acción pretendido al momento de degradarse la nanoesfera y liberar los agentes durante un período de tiempo de liberación prolongada.
EJEMPLO 19 SISTEMA DE ADMINISTRACIÓN DE FÁRMACO CONDROPROTECTOR CON ESPECIFICIDAD EL OBJETIVO -2?- -ta s-rgtrfente comp-os xTrón currdToprotectora es adecuada para su administración sistémica, como podría ser la administración, intravenosa, intramuscular, subcutánea o inhalada. Los fármacos se encapsulan dentro de una nanoesfera de albúmina, a la cual se acopla un fragmento F(ab')2 antihumano que se une al anticuerpo monoclonal de colágeno Tipo II. Este anticuerpo F(ab')2 tiene como objetivo los neoepitopos del colágeno Tipo II de humano. Cada fármaco se incluye en la composición a una concentración suficiente para dar como resultado la siguiente concentración en el sitio de acción pretendido al momento de degradarse la nanoesfera y liberar los agentes durante un período deseado de liberación prolongada .
EJEMPLO 20 SISTEMA DE ADMINISTRACIÓN DE FÁRMACO CONDROPROTECTOR CON ESPECIFICIDAD HACIA EL OBJETIVO La siguiente composición condroprotectora es adecuada para su administración sistémica, como podría ser admí-mr^t-¾círórr tntra encrsa^ inLramus ulair subcutánea o inhalada. Los fármacos se encapsulan dentro de una nanoesfera de albúmina, a la cual se acopla un dominio monocatenario de unión mínima antihumano de una molécula (scFV) de inmunoglobulina que se une al anticuerpo monoclonal de colágeno Tipo II. Este anticuerpo scFV tiene como objetivo los neoepitopos sobre el colágeno Tipo II de humano. Cada fármaco se incluye en la composición a una concentración suficiente para dar como resultado la siguiente concentración en el sitio de acción pretendido al momento degradarse la nanoesfera y liberar los agentes durante un período deseado de liberación prolongada.
ESTUDIO 1 ESTIMULACIÓN SINÉRGICA DE UN SURGIMIENTO REPENTINO DE PGE2 AL MOMENTO DE EXPONERSE A AGONISTAS DE IL-1 Y GPCR Los sinoviocitos similares a fibroblastos muestran características de células inflamatorias y parecen ser reguladores cruciales en la inflamación de articulación y degradación del cartílago. Un sistema de modelo experimental de cultivo celula de s nc^r±c^jrtc¾ 5e úTiTTza para caracterizar las interacciones sinérgicas entre IL-1 y los mediadores inflamatorios que no son citocinas y que son importantes para regular la destrucción del tejido de la articulación, incluyendo el daño que ocurre como secuencia de lesiones tisulares durante la cirugía artroscópica . Se llevaron experimentos para investigar los agonistas del receptor acoplado a la proteína-G (GPCR) (histamina, bradicinina e isoproterenol ) sobre la regulación de la producción de prostanoide y citocina en fibroblastos sinoviales de humano y para caracterizar las actividades del ketoprofeno en este sistema. Se describe La cinética de inducción de la prostaglandina E2 (PGE2), interleucina-6 (IL-6) e interleucina-8 (IL-8) en respuesta a la estimulación con interleucina-1 (IL-1) . Se investigó la habilidad de los ligandos GPCR para potenciar la producción de citocinas después de cebar con IL-1. En los estudios 1-3, se emplearon los siguientes materiales y métodos experimentales al menos que se indique otra cosa. 1. Cultivo Celular. Se obtuvo tejido sinovial de pacientes con osteoartritis que experimentaban una cirugía de reemplazo de articulación en el Clinical Research Center, MacNeal Hospital, y se transportó al laboratorio en un medio Eagle modificado de Dulbbeco (DMEM) que contiene penicilina (100 unidades/ml) , estreptomicina (100 µg/ml) y fungizona (0.25 µg/ml·) . Se cortó y se trozó con tijeras la sinovia, y &e—colocó—en—placas—e e—ex-piante-s—e¾—medio—de—crrlt-xvo" compuesto de DMEM que contiene L-glutamina (2mM) , suero fetal bovino inactivado con calor (10% v/v) además de antibióticos. Los cultivos se alojaron a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% C02. Las células sinoviales adherentes se desarrollaron a partir de los explantes durante un periodo de 2-3 semanas y se llevaron a cabo pasajes mediante tripsinización. Los cultivos sembrados fueron alimentados dos veces por semana y se les hicieron pasajes al momento de la confluencia. Se llevaron a cabo experimentos en células a partir de los pasajes 3-8. Los cultivos experimentales se colocaron en placas de 35 mm a una densidad de 7.5 X 103 células/cm2 en 2 mi de medio de cultivo. Los cultivos se desarrollaron casi hasta confluir para los experimentos y contenían 2.3 + 0.3 X 105 (media + S.E.M., n=3) , y 104 + 13 µg proteína (n=10) . El medio de cultivo se reemplaza dos veces por semana. 2. Tratamientos Experimentales . Un día antes del inicio de los tratamientos experimentales, el medio se cambió por un medio de cultivo experimental compuesto de DMEM que contiene 2% de suero fetal bovino inactivado por calor, más L-glutamina y antibióticos como se indica anteriormente, para inactivar las células. Al día siguiente se cebaron los cultivos mediante la adición de concentraciones específicas de IL-1 ó ligandos adicionales en el medio de cultivo condicionado durante intervalos de 12-24 horas, como se indica. En algunos experimentos, el medio de cultivo condicionado se recolectó para su análisis después de cebarse _eo —IL=1 Se—liev-a-r-on—a-—ea-bo—ra amie tos—e pex±meTi"t"aire"¾" agudos después de este intervalo de cebado, como sigue. Los cultivos se retiraron de la incubadora, se lavaron tres veces con alícuotas de 2 mi de amortiguador fisiológico de Locke (composición LB en mM: NaCl, 154; KC1, 2.6; KH2P04, 2.15; K2HP04, 0.85; MgCl2, 5; CaCl2, 2; D-glucosa, 10; HEPES, 10; pH 7.4, BSA, 0.1% p/v) , y luego se equilibraron con una parte alícuota adicional de LB que contiene ligandos especificados durante 10 minutos en un baño a 37°. Se retiró esta solución mediante aspiración y se reemplazó con una parte alícuota de amortiguador recién preparado que contiene los ligandos indicados para intervalos de tiempo especificados a 37°C. Normalmente se agregaron los inhibidores farmacológicos durante el intervalo de preincubación de 10 minutos y los agonistas además de los inhibidores especificados, estuvieron presentes durante el intervalo de desafío de 3 minutos. 3. Medición de Prostaglandina E2. Siguiendo los protocolos de tratamiento indicados, las partes alícuotas del sobrenadante de cultivo (1 mi) se recolectaron y congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Las muestras se almacenaron a -80° hasta su procesamiento. Las alícuotas del sobrenadante de cultivo se analizaron mediante un inmunoanálisis de unión competitiva como se especifica por el fabricante (Sigma Chemical Co.), usando un anticuerpo con una reactividad equivalente hacia las prostaglandinas E2 y El. Para la cuantificación, se prepara una curva estándar con cada análisis usando concentraciones determinadas de [3H] p-res-ta-gta-n-éi«ra—E-2— —eoneen-t-raeiones—cada—vez—mayore's—de" prostaglandina E2 competitiva auténtica. 4. Medición de IL-6. La producción de La citocina, IL-6, también se midió en partes alícuotas del sobrenadante del medio de cultivo que se ha almacenado congelado a -80 °C. La IL-6 se midió mediante una prueba ELISA en dos capas con detección de fosfatasa alcalina como se describe por el fabricante (Pharmingen) y se cuantificó usando curvas estándar preparadas con las respectivas citocinas puras recombinantes de humano. Las determinaciones experimentales se llevaron a cabo en cultivos dobles.
ESTUDIO 2 ENSAYOS PARA DETERMINAR LA INCORPORACIÓN DE [3H] TIMIDINA Y MTT Se evaluaron rutinariamente las líneas celulares de sinoviocitos para determinar la competencia para poder proliferar en respuesta a IL-1, que se mide como la incorporación de [3H]timidina (Kimball & Fisher, 1988). En esta preparación, las concentraciones máximas efectivas de IL-1 estimulan la incorporación de [3H]timidina de 10-20 veces en comparación a los cultivos inactivos que se mantienen en 2% suero (no se muestran datos) . 1. Análisis de datos. Los inmunoanálisis se llevaron a cabo rutinariamente en alícuotas dobles para cada cultivo. Se elaboraron las determinaciones experimentales en cultivos dobles o triples. Cada experimento se repitió en al menos dos líneas celulares. La curva de regresión no lineal y Prism Software (San Diego, CA) . 2. Materiales . Cultivo celular: el medio de cultivo celular se obtuvo de Sigma Gibco/BRL. El suero fetal bovino se obtuvo de Atlanta Biologicals Inc. (Norcross, GA) . Fármacos: la interleucina-1 se obtuvo de Genzume (Cambridge, MA) . El ketoprofeno fue proporcionado por Omeros Medical Systems, Inc. (Seattle, WA) . La amitriptilina, forscolina, 5-hidroxitriptamina, isoproterenol , bradicinina, histamina y prostaglandina E2 se obtuvieron de Sigma. Los isótopos radioquímicos [3H] prostaglandina E2 se obtuvieron de American Radiolabeled Chemicals, Inc. (St. Louis, MO) . Los demás reactivos se obtuvieron con la mayor pureza disponible de proveedores comerciales convencionales. El efecto de los agonistas GPCR, histamina y bradicinina, sobre la producción de PGE2 en células sinoviales de humano se midió con y sin una estimulación previa a IL-1 para evaluar las interacciones funcionales entre los agonistas que intervienen en el efecto farmacológico común a través de las diferentes clases de receptores. La exposición durante la noche de fibroblastos sinoviales de humano cultivados a IL-1 (10 U/ml) dio como resultado una producción retardada (4 hrs . ) y una gran potencialización sostenida de la producción de PGE2, que puede cuantificarse mediante un radioinmunoanálisis como una cantidad incrementada de PGE2 en el sobrenadante del cultivo. El incremento progresivo en la producción de PGE2 durante un ^a^ffii-eftt©-^£© r©ftg-ad —een-^:-ir~l^-(--6—2-4—-kr-s-H—se ha demo-slrratio-manifestarse por la expresión coordinada y regulada aceleradamente de CPLA2 y el COX-2 (Crofford, 1984, Hulkower y col., 1984). Los cultivos que se han cebado durante la noche a IL-1 responden a los desafios subsecuentes a concentraciones máximamente efectivas de histamina (100 µ ) o bradicinina (1 µ?) con adicional rápida (minutos) y contundente de PGE2. Los datos representativos del transcurso de tiempo para la producción de PGE2 en respuesta a la estimulación con histamina o bradicinina se muestran en la FIGURA 7. En estas condiciones, la histamina provoca un incremento de 5-10 veces en producción de PGE2 en comparación a las células cebadas con IL-1 que no recibieron adición del agonista GPCR. La bradicinina produce un incremento de 10-15 veces. La cantidad absoluta de PGE2 producida durante el breve desafio con agonistas durante 2 minutos se acerca o excede las cantidades que se producen cumulativamente durante todo el período de 18 horas de cebadura con IL-1. Esto es notable en cuanto a que la FIGURA 7 muestra que la vasta mayoría del surgimiento provocado por histamina en la producción de PGE2 ocurre dentro del período inicial de 2 minutos ya que se observa una mínima acumulación adicional durante el período subsiguiente de 60 minutos. La respuesta de PGE2 estimulada por bradicinina continúa incrementándose (2 veces) durante el mismo período de tiempo. En ausencia de cebadura con IL-1, los sinoviocitos que no han sido estimulados no demuestran una producción detectable de PGE2 en—r-es-p¾eis-ta—a—1-a—e-s-ti-mu-l-aeión- -eon -alguno—de—tos—a-grnrrs't~á~s GPCR. En condiciones de cebado con IL-1, tanto La histamina como la bradicinina potencializan sinérgicamente la liberación de PGE2. Usando fibroblastos sinoviales cultivados de pacientes con osteoartritis , descubrimos interacciones sinérgicas dependientes del tiempo entre la citocina proinflamatoria, IL-1, y los receptores acoplados a proteina-G fisiológicamente relevantes con respecto a la producción de PGE2, y evaluamos las acciones de los agentes terapéuticos objetivo. Los agonistas GPCR que actúan a través de los receptores endógenos de sinoviocitos que están vinculados con incrementos de calcio intracelular, inositol, fosfatasas y vías de señalización de PKC amplifican rápida y dramáticamente la producción de PGE2 en células previamente cebadas con IL-1. Los inhibidores de COX atenuaron efectivamente tanto el surgimiento repentino provocado por agonista como la acumulación a largo plazo de PGE2. Por lo tanto, las diferentes vías de GPCR e IL-1 para la transducción de señal intracelular interactúan sinérgicamente para provocar respuestas ya sea más rápidas o lentas de regulación a largo plazo de PGE2. El sinergismo entre IL-1 y las GPCR reguladoras del calcio en sinoviocitos que producen un repentino surgimiento de PGE2 puede explicarse en parte debido al rápido aumento de la liberación de ácido araquidónico, lo cual es una medición de la activación de cPLA2 en varios tipos celulares. Además de—ind cid—-la—e-x-p-resi -n— ar-a—GOX—2-t—la—H —tn-erement-a—ts expresión de CPLA2 (Hulkower y col., 1994). Ambas proteínas actúan conjuntamente para proporcionar sustrato libre de ácido araquidónico para COX-2. La regulación acelerada de las enzimas clave metabolizantes de eicosanoide inducidas por IL-1, combinada con la habilidad de los ligandos GPCR para activar la liberación de araquidonato, incrementaría el flujo general de sustrato a través de la síntesis de prostanoide. El cPLA2 es el único PLA2 que muestra propiedades funcionales indicativas de la regulación de receptores y probablemente esté involucrado en la producción de eicosanoide y señalización intracelula . Ya que la cPLA2 se activa mediante concentraciones de calcio cada vez mayores para su total actividad y la activación del receptor B2 de bradicinina y Hl de histamina se vincula con la movilización de calcio intracelular, esto es probablemente el factor predominante que regula el repentino surgimiento estimulado por agonista en la producción de PGE2. Finalmente, el incremento transitorio y muy rápido de calcio citoplásmico desencadenado por la activación del receptor B2 ó Hl es similar a la cinética conocida para la activación de cPLA2, liberación de ácido araquidónico y el surgimiento observado de PGE2.
ESTUDIO 3 INHIBICIÓN DE LA FORMACIÓN DE UN SURGIMIENTO REPENTINO DE PGE2 MEDIANTE INHIBIDORES DE CICLOOXIGENASA Se determinaron las acciones del ketoprofeno, un i-n-h~i-bi-d&£—de—e^nsl-ee-xi-g n-as-a-T- —pa-r-a—a-tenu~a~r—1-a—foxma"c±ón—de- PGE2 mediante una incubación simultánea con IL-1 durante una exposición prolongada (16 hr) ; y mediante una breve intervalo de preincubación previo a un desafio subsiguiente con el agonista GPCR, como se muestra en la FIGURA 8. La adición de las concentraciones especificadas de ketoprofeno durante una cebadura durante la noche con IL-1 inhibe la formación de PGE2, determinándose en IC5o = 4.5 + 0.8 nM mediante un análisis de regresión no lineal (media + SEM, n=4 lineas celulares de sinoviocitos) . Se llevaron a cabo determinaciones similares (no se muestran datos) con los inhibidores de ciclooxigenasa etodolaco (IC50 = 15.2 + 4.6, nM n=4), ketorolaco, (2.2 + 0.4 nM, n=4) e indometacina (3.2 + 1.5 nM, n=2) . La FIGURA 8 también muestra la inhibición dependiente de la concentración de ketoprofeno del surgimiento de PGE2 provocado por agonista en respuesta a un desafio con 100 µ? histamina (IC50 = 3.4 + 0.2 nM n=3) ó 1 µ? bradicinina (IC50 = 9.5 + 2.0 nM n=3) en sinoviocitos cebados durante la noche con IL-1 (10 U/ml) . Estos valores son comparados con aquellos que se observan con la inhibición del ketoprofeno durante la inducción de PGE2 con IL-1 durante la noche. Este resultado demuestra que la manifestación de la inhibición del inhibidor COX ocurre dentro del intervalo de pretratamiento de 10 minutos antes de la adición del agonista GPCR, lo cual es consistente con una inhibición directa y reversible de la actividad con COX y no debido a un mecanismo -ade—e©fi—eambios—en—to-s— iveie-s—de—expx s±ÓTi —de —tars- enzimas reguladoras de prostanoide. Este efecto inhibitorio inmediato también proporciona una base para la efectividad inmediata de este fármaco cuando se administra localmente en forma intraarticular en una solución de irrigación durante una cirugía artroscópica .
ESTUDIO 4 INDUCCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE IL-6 MEDIANTE AGONISTAS GPCR Y IL-1 E INHIBICIÓN MEDIANTE KETOPROFENO Se describen la cinética de inducción de interleucina-6 en respuesta a la estimulación con IL-1. Se exponen cultivos de sinoviocitos a los tratamientos indicados con IL-1 además de ya sea histamina para activar la señalización a través de la vía inositol trifosfato (InsP3) /proteína cinasa C o isoproterenol para activar los incrementos de AMPc intracelular . Se mide la producción de PGE2, IL-6 e IL-8 en los sobrenadantes del cultivo después de tratamientos de 1, 2, 4, 6 y 24 hrs.). En este experimento, cada intervalo de tratamiento se llevó a cabo en un cultivo separado. En el programa de tratamiento anterior, se incrementó la producción de IL-6 en gran medida mediante IL-1 después de una exposición de 24 horas, pero no se detectó IL-6 dentro del intervalo inicial de 6 horas. No se aumentó la producción de IL-6 en respuesta a IL-1 mediante la adición de histamina y esta misma por sí sola no pudo estimular la producción de IL-6. La IL-1 también produjo una elevación ¦tiva—de—ür--8—(-2-&&T—pg-/mi-H—q«e—s-e— udo—med±r—a"l" principio a las 6 horas de tratamiento. La producción de IL-8 se pudo mantener y se incrementó en gran medida a las 24 horas de exposición con IL-1. Se examinó el efecto del ketoprofeno sobre la inducción de la producción de citocina por agonistas IL-1 y GPCR. El protocolo también analizó los efectos de la dependencia de la concentración de IL-1 con respecto a la inducción estable de IL-6. Se expusieron los cultivos de sinoviocitos a las concentraciones indicadas de agonistas IL- 1 y GPCR. Se recolectaron los sobrenadantes del cultivo y se reemplazaron con partes alícuotas de medio fresco que contenían las mismas adiciones de agonistas a intervalos de 8 horas. Se analizaron como se describe PGE2, IL-6 y IL-8 en los sobrenadantes. Los datos para la producción de IL-6 se muestran en la FIGURA 9, que muestra la producción de IL-6 a las 16 horas (que corresponde a un intervalo de tratamiento de 8-16 horas) en presencia de las concentraciones indicadas de IL-1 además del ligando agregado. La adición de histamina e isoproterenol no potencializa la producción de IL-6 en comparación a la IL- 1 por sí sola. A una dosis de 1.0 pg/ml IL-1, el ketoprofeno causa una inhibición parcial (<50%) de la producción de IL-6 producida por IL-1. Además, el ketoprofeno inhibió la producción de IL-6 en las muestras estimuladas simultáneamente con histamina o isoproterenol/IL-1. Se utilizó el sistema de modelo experimental de -c lti-v-o eel-ul-af de sino-viGe-i-to-s pa-ra ea-r-a-eteri-zaT tas interacciones sinérgicas entre IL-1 y los mediadores inflamatorios que no son citocinas que son importantes para regular la destrucción de tejido articular, incluyendo daño que ocurre como consecuencia de lesión tisular durante la cirugía artroscópica . Los resultados se pueden resumir como sigue: (1) IL-1 induce un gran incremento de PGE2, IL-6 e IL-8 en sinoviocitos cultivados, mientras que los cultivos inactivos no producen cantidades detectables de estos mediadores, (2) la inducción de PGE2 ocurre con mayor rapidez y da como resultado la liberación de PGE2 en los sobrenadantes de cultivo a las 4 horas, seguido por IL-8 a las 6 horas e IL-6 a intervalos más largos (3) los tres mediadores permanecen elevados en el sobrenadante del cultivo después de una exposición de 24 horas a IL-1. A diferencia de sus acciones sobre la producción de PGE2, los agonistas de GPCR no intensifican la inducción de IL-6 ó IL-8 por medio IL-1 y tampoco incrementan la liberación de IL-6 e IL-8 después de cebarse con IL-1. La inducción de IL-6 e IL-8 por medio IL-1 parece estar reforzada por la inducción concomitante de PGE2 ya que el ketoprofeno reduce la producción de éstas citocinas en respuesta a IL-1. Este resultado indica que el ketoprofeno podría proporcionar un efecto terapéutico condroprotector cuando se administra en la articulación durante los procedimientos quirúrgicos. Considerándose conjuntamente, estos resultados áe¾ueH&tran—les—if^eraeeirone¾--efrtr e^—Í TS—vrars—e-spec±"f±ua~s"—de" señalización de receptor acoplado a la proteina G y la activación de sinoviocitos mediante la estimulación proinflamatoria con IL-1. Se espera que un mecanismo similar sea operativo en condrocitos. Estas interacciones proporcionan un medio para integrar y regular las respuestas proinflamatorias de sinoviocitos y condrocitos dependiendo de los aportes de otros sistemas receptores autocoides o neurotransmisores dentro de la articulación. Estos descubrimientos acentúan el fundamento y beneficio clínico potencial de las intervenciones terapéuticas que tienen como objetivo la inhibición de los receptores acoplados en proteína-G que intervienen en la señalización a través de la movilización de calcio, hidrólisis fosfoinositídica y activación de PKC y se vinculan con incrementos en la producción de PGE2 durante cirugías artroscópicas . Estos receptores en sinoviocitos y condrocitos incluyen receptores Hi histamina, bradicinina, sustancia P, 5HT2, y los receptores purinérgicos P2Y. Aunque la modalidad preferida de la invención ha sido ilustrada y descrita, se aprecia que pueden llevarse a cabo diversos cambios, en las soluciones descritas y métodos descritos sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por ejemplo, se puede descubrir que los vehículos de administración, anticuerpos y agentes condroprotectores alternos pueden aumentar o reemplazar los agentes descritos, anticuerpos con especificidad hacia el objetivo y vehículos de—admi^-s-t^a-e-i-ón—de-e^n-f-o-rmidad— en la presente. Por lo tanto se pretende que el alcance de las letras patentadas concedidas en la presente se limite solamente por las definiciones de las reivindicaciones anexas .

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES : 1. Un sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo para la protección del cartílago, caracterizado porque comprende una pluralidad de agentes condroprotectores contenidos dentro de un vehículo de administración, este se acopla a un anticuerpo o fragmento del mismo que es específico para una determinante antigénica ubicada dentro de la articulación, la pluralidad de agentes condroprotectores incluye al menos un agente condroprotector anabólico y al menos un inhibidor del catabolismo del cartílago, cada uno se incluye en cantidad terapéuticamente efectiva de manera que la pluralidad de agentes condroprotectores inhiban el catabolismo del cartílago y promuevan el anabolismo del mismo. 2. Un sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo para la protección del cartílago, que comprende una pluralidad de agentes condroprotectores, caracterizado porque al menos uno de los agentes condroprotectores está contenido dentro de un vehículo de administración el cuál tiene como objetivo la articulación, la pluralidad de agentes condroprotectores incluye al menos un agente condroprotector anabólico y al menos un agente inhibidor del catabolismo del cartílago, la pluralidad de agentes condroprotectores se incluye en cantidades terapéuticamente efectivas de manera que la pluralidad de agentes condroprotectores inhiban el ea^abolisroe—del—cartí-Ía-ge— —promuevan—ei—araixrhrsmo—de~T mismo. 3. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el vehículo de administración con especificidad hacia el objetivo se acopla a un anticuerpo o fragmento del mismo que sea específico para una determinante antigénica ubicada dentro de la articulación . 4. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la determinante antigénica con especificidad de objetivo se encuentra en o dentro del cartílago articular. 5. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la determinante antigénica con especificidad de objetivo se encuentra en el colágeno Tipo II del cartílago articular. 6. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la determinante antigénica con especificidad de objetivo se encuentra en colágeno de cartílago o proteoglicano del mismo. 7. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la determinante a-n-tigé-n-iGa—e©«— spec-if-ie-i-d-aá—de—ebj-et-i-ve—s-e—encuerrra—en—o~ dentro de una célula, molécula o estructura seleccionada a partir del grupo que comprende colágenos, incluyendo colágeno Tipo II y los colágenos menores Tipo V, VI, IX, X y XI; proteoglicanos , incluyendo los grandes proteoglicanos de agregación, agrecano, decorina, biglicano, fibromodulina y lumicano; proteina de matriz oligomérica del cartílago, glicoproteína-39; condroitín sulfato de proteoglicano y glicosaminoglicanos ; sinoviocitos macrófagos y fibroblastos y condrocitos . 8. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la determinante antigénica con especificidad de objetivo se encuentra en o dentro de la membrana sinovial. 9. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la determinante antigénica con especificidad de objetivo es un epitopo o neoepitopo asociado con la degeneración del cartílago articular. 10. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque los epitopos o neoepitopos con especificidad de objetivo se inmunolocalizan en una capa superficial de cartílago articular en un paciente diagnosticado con osteoartritis , artritis reumatoide u otras e¾£e«Re a4e-s—de-geReíativa^--é^ 11. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la determinante antigénica con especificidad de objetivo es un neoepitopo en el colágeno Tipo II o fragmentos del mismo en el cartílago articular . 12. El sistema de administración de fármaco con especificidad de objetivo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque el neoepitopo con especificidad de objetivo se inmunolocaliza en un sitio de escisión generado por la acción individual o combinada de enzimas seleccionadas a partir del grupo que comprende metaloproteinasa de matriz (MMP)-l, MMP-3, MMP-8 y MMP-13 y otros miembros de la familia M P. 13. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el epitopo o neoepitopo con especificidad de objetivo se encuentra en agrecano, biglicano o decorina del cartílago articular. 14. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el epitopo o neoepitopo con especificidad de objetivo se encuentra en agrecano o sus fragmentos del cartílago articular. 15. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la g i-v-indicaciÓR—í4-,—e ra-e-'terl-z-ado—^aiema-s-^KxrqTie—e ^e-ae- ^O^Jo" con especificidad de objetivo se inmunolocaliza en un sitio de escisión generado por la acción de una enzima que pertenece al grupo que comprende desintegrina A y metaloproteinasa con la familia de segmentos invariables de la secuencia de trombospondina (ADAMTS) y/o la familia MMP. 16. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el neoepitopo con especificidad de objetivo se inmunolocaliza en un sitio de escisión generado por la acción individual o combinada de las enzimas ADAMTS-4 y/o ADAMTS-5/11. 17. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el anticuerpo o su fragmento con especificidad de objetivo es un anticuerpo humanizado, quimérico o monoclonal de humano. 18. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el agente condroprotector anabólico está contenido dentro del vehículo de administración con especificidad hacia el objetivo. 19. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el agente condroprotector anabólico se selecciona a partir del grupo que comprende agonistas de interleucina (IL) que promueven el anabo- -s-me—dei—ea^-t^-t-l-a-goT"m emb os—de—la— t^e-rfamr±±a~d_e factor de crecimiento transformante ß incluyendo agonistas TGF-ß y agonistas de la proteina morfogenética del hueso (BMP) , que promueven el anabolismo del cartílago, factores de crecimiento similar a la insulina que promueven el anabolismo del cartílago y factores de crecimiento de fibroblastos que promueven el anabolismo del cartílago. 20. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el agente condroprotector anabólico se selecciona a partir del grupo que comprende IL-4, IL-10, IL-13, TGFpl , GFP3, BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, IGF-1, bFGF y fragmentos, deleciones, adiciones, sustituciones de aminoácidos, mutaciones y modificaciones que retienen las características biológicas de los agentes que ocurren naturalmente. 21. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el agente condroprotector anabólico se selecciona a partir del grupo que comprende: miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante ß, incluyendo agonistas TGF-ß y agonistas de la proteína morfogenética del hueso (BMP) , que promueven el anabolismo del cartílago; factores de crecimiento similar a la insulina que promueven el anabolismo del cartílago y factores de crecimiento de fibroblastos que promueven el anabolismo del cartílago. 2-2-= E-1-—s-istoma—de—aém-i-n-i-s-t-r¾-eión—de—fármaco—corr especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el inhibidor del catabolismo del cartílago está contenido dentro del vehículo de administración con especificidad hacia el objetivo. 23. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el inhibidor del catabolismo del cartílago se selecciona a partir del grupo que comprende antagonistas del receptor de IL-1 que inhiben el catabolismo del cartílago, antagonistas del receptor TNF-cc que inhiben el catabolismo del cartílago, inhibidores específicos para ciclooxigenasa-2 que inhiben el catabolismo del cartílago, inhibidores de MAP cinasa que inhiben el catabolismo del cartílago, inhibidores del óxido nítrico sintasa que inhiben el catabolismo del cartílago e inhibidores del factor nuclear kappaB que inhiben el catabolismo del catabolismo. 24. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el inhibidor del catabolismo del cartílago se selecciona a partir del grupo que comprende: inhibidores de las metaloproteinasas de matriz que inhiben el catabolismo del cartílago; moléculas de adhesión celular, incluyendo agonistas y antagonistas de integrina que inhiben el catabolismo del cartílago; inhibidores de la proteina cinasa-C e inhibidores de la proteina tirosina cinasa que inhiben el catabolismo del cartílago e inhibidores de los dominios SH2 que inhiben el catabolismo del cartílago. 25. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el inhibidor del catabolismo del cartílago comprende un agente seleccionado a partir de un antagonista del receptor IL-1 que inhibe el catabolismo del cartílago y un antagonista del receptor TNF-a que inhibe el catabolismo del cartílago. 26. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el agente condroprotector anabólico y el inhibidor del catabolismo del cartílago comprenden cada uno una proteína. 2 . El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el agente condroprotector anabólico y el inhibidor del catabolismo del cartílago están contenidos dentro de un vehículo de administración de especificidad hacia el objetivo. 28. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende una pluralidad de vehículos de administración con especificidad haci —el o j-e-t-i-vo-, e«—de-nd —e-1—a-gefi-te—COnd-raprOte'ctTGr" anabólico y el inhibidor del catabolismo del cartílago están contenidos por separado dentro de una primera y una segunda pluralidad de vehículos de administración con especificidad hacia el objetivo, respectivamente. 29. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el primer y el segundo vehículos de administración con especificidad de objetivo se seleccionan para dar como resultado una cinética de liberación temporalmente distinta para el agente condroprotector anabólico contenido ahí y el inhibidor del catabolismo del cartílago contenido ahí. 30. El sistema de administración con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el vehículo de administración con especificidad hacia el objetivo comprende inmunopartículas con especificidad hacia el objetivo. 31. El sistema de administración con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque las inmunopartículas con especificidad hacia el objetivo comprenden nanopartículas. 32. El sistema de administración con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque las nanopartículas tienen un diámetro que abarca desde 5 nanómetros a 750 nanómetros. 33. El sistema de administración con especificidad ha-eia—el—ofej-e-tivo—de—ee-nf-o-ifHdrdad—-con la—r¾_h Tdrcarróri—Sty caracterizado además porque las nanoparticulas tienen un diámetro que abarca de 10 a 500 nanómetros. 34. El sistema de administración con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque las nanoparticulas tienen un diámetro que abarca de 20 a 200 nanómetros. 35. El sistema de administración con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque las nanoparticulas se forman a partir de un polímero seleccionado a partir del grupo que comprende hialuronano, quitosana, colágeno, gelatina, alginato, ácido poliláctico (PLLA) , ácido poliglicólico (PGA) y PLGA. 36. El sistema de administración con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque las nanoparticulas proporcionan una liberación prolongada de agentes condroprotectores durante un período de tiempo de un día a 4 semanas. 37. El sistema de administración con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende un portador adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea o inhalada. 38. El sistema de administración con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende uno o más agentes -^er -pé-u-tiee-s— d-i-eionaie-s-; 39. El sistema de administración con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende uno o más agentes inhibidores del dolor o inflamación. 40. El sistema de administración con especificidad hacia el objetivo de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque los agentes inhibidores del dolor o inflamación se seleccionan a partir del grupo que comprenden antagonistas del receptor de serotonina, agonistas del receptor de serotonina, antagonistas del receptor de histamina, antagonistas del receptor de bradicinina, inhibidores de calicreina, antagonistas del receptor de taquicinina, antagonistas del receptor del péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) , antagonistas del receptor de interleucina, inhibidores de enzimas activas en la via sintética para los metabolismos del ácido araquidónico, antagonistas del receptor prostanoide, antagonistas del receptor de leucotrieno, agonistas del receptor opioide, antagonistas y agonistas purinoceptores, abridores de los canales de potasio sensibles al adenosin trifosfato (ATP) y antagonistas de canales de calcio. 41. El sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo para la protección del cartílago que comprende una pluralidad de agentes condroprotectores, caracterizado porque al menos uno de los agentes condroprotectores está contenido dentro de un ve-hí-Gu-l-o—de—a^minÍS-ta«-ién— ue—tiene—como—obye1:±vo—iirra" molécula, célula o estructura de cartílago hialino, la pluralidad de agentes condroprotectores incluye al menos un agente condroprotector anabólico y al menos un inhibidor del catabolismo del cartílago, la pluralidad de agentes condroprotectores incluye cada uno en cantidades terapéuticamente efectivas de manera que la pluralidad de agentes condroprotectores inhiban el catabolismo del cartílago y promuevan su anabolismo. 42. Un sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo para la protección del cartílago, caracterizado porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un agente condroprotector el cuál es un agente condroprotector anabólico o un inhibidor del catabolismo del cartílago, contenido dentro de inmunopartículas con especificidad hacia el objetivo que se acoplan en anticuerpos o sus fragmentos que sean específicos para una determinante antigénica ubicada dentro de la articulación. 43. Un sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo para la protección del cartílago, caracterizado porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente condroprotector anabólico contenido dentro de un vehículo de administración que tiene como objetivo la articulación. 44. Un sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo para la protección del car-t lag-o-, c^-r-aG^e^-i-z^a-do oique eemp-r-ende una can't dad terapéuticamente efectiva de un agente condroprotector anabólico contenido dentro de un vehículo de administración que tiene como objetivo una molécula, célula o estructura del cartílago hialino. 45. Un método para proteger el cartílago de un paciente, caracterizado porque comprende: administrarle al paciente que lo necesita un sistema de administración de fármaco con especificidad hacia el objetivo que comprende una pluralidad de agentes condroprotectores contenidos dentro de un vehículo de administración, éste se acopla a un anticuerpo o su fragmento que sea específico para una determinante antigénica ubicada dentro de la articulación, la pluralidad de agentes condroprotectores incluye al menos un agente condroprotector anabólicos y al menos un inhibidor del catabolismo del cartílago, cada uno se incluye en cantidades terapéuticamente efectivas de manera que la pluralidad de agentes condroprotectores inhiban el catabolismo del cartílago y promuevan su anabolismo. 46. Un método para proteger el cartílago de un paciente, caracterizado porque comprende: administrarle concomitantemente al paciente que lo necesita, una pluralidad de agentes condroprotectores, en donde al menos uno de éstos está contenido dentro de un vehículo de administración que tiene como objetivo la articulación, la pluralidad de agentes condroprotectores que ijacluye—a-1—menos—u-n—agente—e nd-rep-re-tocte-r—aftafeéüeo—y—s± menos un inhibidor del catabolismo del cartílago, la pluralidad de agentes condroprotectores incluye cada uno en cantidades terapéuticamente efectivas de manera que la pluralidad de agentes condroprotectores inhiban el catabolismo del cartílago y promuevan su anabolismo. 47. Un método para proteger el cartílago de un paciente, caracterizado porque comprende: administrarle concomitantemente al paciente que lo necesita, una pluralidad de agentes condroprotectores, en donde al menos alguno de éstos está contenido dentro de un vehículo de administración que tiene como objetivo un neopéptido asociado con la degeneración del cartílago articular, la pluralidad de agentes condroprotectores incluye al menos un agente condroprotector anabólico y al menos un inhibidor del catabolismo del cartílago, la pluralidad de agentes condroprotectores incluye cada uno en cantidades terapéuticamente efectivas de manera que la pluralidad de agentes condroprotectores inhiban el catabolismo del cartílago y promuevan su anabolismo. 48. Un método para proteger el cartílago de un paciente, caracterizado porque comprende: administrarle concomitantemente al paciente que lo necesita, una pluralidad de agentes condroprotectores, en donde al menos uno de éstos está contenido dentro de un vehículo de administración que tiene como objetivo las moléculas, células o estructuras del cartílago hialino, la Xuxa-lidad—cié—age-R-fees—eondíep^eteete--es—tftei¾ye—ai—menos-urr agente condroprotector anabólico y al menos un inhibidor del catabolismo del cartílago, la pluralidad de agentes condroprotectores se incluye cada una en cantidades terapéuticamente efectivas de manera que la pluralidad de agentes condroprotectores inhiban el catabolismo del cartílago y promuevan su anabolismo.
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