KR20220053057A

KR20220053057A - Masp-2 의존성 보체 활성화와 관련된 상태의 치료 방법

Info

Publication number: KR20220053057A
Application number: KR1020227013267A
Authority: KR
Inventors: 그레고리 에이. 데모풀로스; 토마스 두들러; 한스-빌헬름 슈웨블
Original assignee: 오메로스 코포레이션; 유니버시티 오브 레스터
Priority date: 2013-10-17
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2022-04-28
Also published as: JP2022000467A; AU2020203748A1; AU2014337047A1; CN105683219B; EP3057993A4; DK3057993T3; CY1123776T1; PL3057993T3; CL2018001557A1; US20240124611A1; KR20160062186A; BR112016008409B1; JP2020037568A; RS61351B1; IL283373A; EP3750919A1; NZ757986A; RU2020111211A; LT3057993T; ES2829913T3

Abstract

한 측면으로, 발명은 혈전성 미세혈관병증 (TMA)에 걸려 있거나 걸릴 위험이 있는 살아있는 대상에서 MASP-2-의존성 보체 활성화의 효과를 억제하는 방법을 제공한다. 그 방법은 그런 필요가 있는 대상에게, MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2-중재된 대체 보체 경로 활성화와 관련된 세포 손상을 억제하는 한편, 면역 시스템의 고전적 (C1q-의존성) 경로 성분은 무상으로 남겨둔다.

Description

MASP-2 의존성 보체 활성화와 관련된 상태의 치료 방법{METHODS FOR TREATING CONDITIONS ASSOCIATED WITH MASP-2 DEPENDENT COMPLEMENT ACTIVATION}

본 발명은 MASP-2 의존성 보체 활성화와 관련된 상태의 치료 방법에 관한 것이다.

서열 목록에 관한 진술

본 출원과 관련된 서열 목록은 서류 사본 대신 텍스트 양식으로 제공되며 본원 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 포함하고 있는 텍스트 파일의 명칭은 MP_1_0220_PCT_Sequence_Listing_20141015_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 115 KB이고; 2014년 10월 15일에 작성되었으며; 명세서의 출원과 함께 EFS-Web을 통해 제출되었다.

보체 (complement) 시스템은 인간 및 다른 척추동물에서, 미생물 감염 및 심각한 손상에 대한 면역 반응을 개시하고, 증폭시키며 조직화하기 위한 초기 작용 메커니즘을 제공한다 (M.K.　Liszewski and J.P.　Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E.　Paul, Raven Press, Ltd., New York). 보체 활성화가 잠재적인 병원체에 대해 중요한 제일선 방어를 제공하는 한편, 보호용 면역 반응을 촉진하는 보체의 활성은 또한 숙주에게 잠재적인 위협을 나타낼 수 있다 (K.R.　Kalli, et　al., Springer Semin. Immunopathol.　15:417-431, 1994; B.P.　Morgan, Eur.　J. Clinical Investig.　24:219-228, 1994). 예를 들어, C3 및 C5 단백질 가수분해 생성물은 호중구를 모집하고 활성화한다. 활성화된 호중구는 숙주 방어에 없어서는 안되는 것인 한편, 파괴적인 효소를 방출하는 데 있어 무차별적이어서 기관 손상을 유발할 수 있다. 또한, 보체 활성화는 가까운 숙주 세포뿐만 아니라 미생물 표적 상에도 용해성 (lytic) 보체 성분들의 침착 (deposition)을 유발하여 숙주 세포 용해를 초래할 수 있다.

보체 시스템은 또한 다음을 포함하는 많은 급성 및 만성 질병 상태의 발병론에도 함축되어 왔다: 심근 경색, 뇌줄중, ARDS, 재관류 손상, 패혈성 쇼크, 열성열상에 이어지는 모세관 누출, 후심폐 우회 염증, 이식 거부반응, 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 중증 근무력증 및 알츠하이머병. 모든 이들 상태의 대부분에서, 보체는 원인은 아니지만 발병에 포함된 여러 인자들 중 하나이다. 그럼에도 불구하고, 보체 활성화는 주요 병리적 메커니즘일 수 있고 많은 이들 질병 상태의 임상적 제어를 위한 효과적인 지점을 나타낸다. 다양한 질병 상태에서 보체-중재된 조직 손상의 중요성에 대한 증가하는 인식은 효과적인 보체 억제 약물에 대한 필요성을 강조한다. 현재까지, C5에 대한 항체인 유클리주맙 (Eculizumab (Solaris®))이 인간에 사용할 수 있게 승인된 유일한 보체-표적화 약물이다. 그러나, C5는 보체 시스템의 "하류"에 위치한 여러 이펙터 분자들 중 하나에 불과하고, C5의 차단은 보체 시스템의 활성화를 억제하지 못한다. 그러므로, 보체 활성화의 개시 단계의 억제제가 "하류" 보체 억제제를 능가하는 중요한 장점을 나타낼 수 있을 것이다.

현재, 보체 시스템은 다음 3가지의 뚜렷한 경로를 통해 활성화될 수 있는 것으로 보편적으로 받아들여지고 있다: 고전적 경로, 렉틴 경로 및 대체 경로. 고전적 경로는 보통 외래 입자 (즉 항원)에 결합된 숙주 항체들로 구성된 복합체에 의해 야기되고 그로써 특이적 항체 반응의 생성을 위해서는 항원에 대한 선행 노출을 필요로 한다. 고전적 경로의 활성화가 숙주에 의한 선행하는 적응성 면역 반응에 좌우되기 때문에, 고전적 경로는 후천적 면역 시스템의 일부이다. 대조적으로, 렉틴 및 대체 경로는 둘 다 적응성 면역성과는 무관하고 선천성 면역 시스템의 일부이다.

보체 시스템의 활성화는 세린 프로테아제 자이모겐의 순차적인 활성화를 초래한다. 고전적 경로의 활성화에서 제 1 단계는 특이적인 인식 분자, C1q의 항원-결합된 IgG 및 IgM 분자에의 결합이다. C1q는 Cl로 불리는 복합체로서의 C1r 및 C1s 세린 프로테아제 전효소와 결합한다. C1q가 면역 복합체에 결합될 때, C1r의 Arg-Ile 부위의 자가 단백질분해성 절단에 이어 C1r-중재된 절단 및 C1s의 활성화가 일어나고, 그로써 C4 및 C2의 절단능력을 획득한다. C4는 C4a 및　C4b로 표시되는 2개의 단편으로 절단되고, 유사하게 C2는 C2a 및 C2b로 절단된다. C4b 단편은 인접한 하이드록실 또는 아미노기와 함께 공유 결합을 형성하고 활성화된 C2의 C2a 단편과의 비공유 상호작용을 통해 C3 전환효소 (C4b2a)를 생성한다. C3 전환효소 (C4b2a)는 단백질 가수분해성 절단에 의해 C3를 C3a 및 C3b 하위성분으로 활성화하여 C5 전환효소 (C4b2a3b)의 생성을 유도하고, 그것은 C5를 절단함으로써 세포막을 파괴하여 세포 용해를 유도할 수 있는 막 공격 복합체 (C6, C7, C8 및 C-9과 조합된 C5b, "MAC"로도 언급됨)의 형성을 유도한다. C3 및 C4의 활성화 형태 (C3b 및 C4b)는 외래 표적 표면에 공유적으로 침착되고, 그것은 다중 식세포 상의 보체 수용체들에 의해 인식된다.

독립적으로, 렉틴 경로를 통한 보체 시스템의 활성화의 제 1 단계 또한 특이적 인식 분자들의 결합이고, 관련된 세린 프로테아제 전효소들의 활성화가 그것에 이어진다. 그러나, C1q에 의한 면역 복합체의 결합 외에, 렉틴 경로의 인식 분자들은 렉틴으로서 포괄적으로 언급되는, 탄수화물-결합 단백질의 그룹 (만나-결합 렉틴 (MBL), H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린 및 C-형 렉틴 CL-11)을 포함한다. J.　Lu et　al., Biochim. Biophys. Acta　1572:387-400, (2002); Holmskov et　al., Annu. Rev. Immunol.　21:547-578 (2003); Teh et　al., Immunology　101:225-232 (2000)) 참조. 또한 J. Luet et al., Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Holmskov et al, Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000); Hansen et al, J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010) 참조.

Ikeda 등은 먼저, C1q와 같이, MBL이 C4-의존성 방식으로 효모 만나-코팅된 적혈구에 결합할 때 보체 시스템을 활성화할 수 있을 것을 증명하였다 (keda et　al., J.　Biol. Chem.　262:7451-7454, (1987)). 콜렉틴 단백질 패밀리의 구성원인 MBL은 탄수화물에 결합하는 칼슘-의존성 렉틴이고 이때 3- 및 4-하이드록시기는 피라노오스 고리의 적도면으로 배향되어 있다. 따라서 MBL에 대한 우세한 리간드는 D-만노오스 및 N-아세틸-D-글루코사민인 한편, 이 입체 요건에 맞지 않는 탄수화물은 MBL에 대한 검출할 수 없는 친화성을 갖는다 (Weis　et　al., Nature　360:127-134, (1992)). MBL과 1가 당 사이의 상호작용은 매우 약하며, 해리 상수는 전형적으로 한 자릿수의 밀리몰 범위에 있다. MBL은 글리칸 리간드에 강한 결합력에 의해, 즉 서로에 대해 매우 가깝게 위치한 다수의 단당 잔기들과 동시에 상호작용함으로써 단단하고 특이적으로 결합하게 된다 (Lee　et　al., Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, (1992)). MBL은 보통 박테리아, 효모, 기생충 및 특정 바이러스와 같은 미생물을 장식하는 탄수화물 패턴을 인식한다. 대조적으로, MBL은 통상적으로 포유류 혈장 및 세포 표면 당단백질 상에 존재하는 "성숙한" 복합체 당포합체를 장식하는 끝에서 두 번째 및 마지막 당인 D-갈락토오스 및 시알산을 인식하지 못한다. 이런 결합 특이성은 "외래" 표면의 인식을 촉진하고 "자체-활성화"로부터 보호하는 것으로 여겨진다. 그러나, MBL은 포유류 세포의 세포질 망상구조 및 골기체에 격리되어 있는 (sequestered) N-연결된 당단백질 및 당지질 상에서 고-만노오스 "전구체" 글리칸의 클리스터에 고친화성으로 결합한다 (Maynard　et　al., J. Biol. Chem.　257:3788-3794, (1982)). 그러므로 손상된 세포들은 MBL 결합을 통한 렉틴 경로 활성화에 대한 잠재적인 표적들이다.

피콜린은 피브리노겐-유사 도메인으로 불리는, MBL과 상이한 유형의 렉틴 도메인을 가진다. 피콜린은 당 잔기에 Ca⁺⁺-의존성 방식으로 결합한다. 인간에서, 3 종류의 피콜린 (L-피콜린, M-피콜린 및 H-피콜린)이 확인되어 있다. 2개의 혈청 피콜린, 즉 L-피콜린과 H-피콜린은 공통적으로 N-아세틸-D-글루코사민에 대한 특이성을 가진다; 그러나 H-피콜린은 N-아세틸-D-갈락토사민에도 결합한다. L-피콜린, H-피콜린, CL-11 및 MBL의 당 특이성의 차이는 상이한 렉틴들이 상보할 수 있고, 중복 (overlapping)을 통해서 상이한 당포합체를 표적화할 수 있음을 의미한다. 이런 개념은 최근 연구에 의해 렉틴 경로에서 공지된 렉틴 중에서, 단지 L-피콜린만이 모든 그람-포지티브 박테리아 상에서 발견된 세포벽 당포합체인 리포테이코산에 특이적으로 결합하는 것을 지지한다 (Lynch et　al., J.　Immunol. 172:1198-1202, (2004)). 콜렉틴 (즉 MBL) 및 피콜린은 아미노산 서열에 유의미한 유사성을 포함하지 않는다. 그러나, 단백질의 2 그룹은 유사한 도메인 조직을 가지고, C1q와 같이, 올리고머 구조로 어셈블링되며, 그것은 다중부위 결합의 가능성을 최대화시킨다.

MBL의 혈청 농도는 건강한 집단에서는 매우 가변적으로 이것은 MBL 유전자의 프로모터 및 코딩 영역 둘 다에서 다형성/돌연변이에 의해 유전적으로 제어된다. 급성기 단백질 (acute phase protein)로서, MBL의 발현은 염증 동안에 추가로 상향조절된다. L-피콜린은 혈청에 MBL의 농도와 유사한 농도로 존재한다. 그러므로, 렉틴 경로의 L-피콜린 가지는 강도에 있어서 잠재적으로 MBL 팔에 필적한다. MBL과 피콜린은 또한 옵소닌으로서 기능할 수 있는데, 그것은 식세포가 MBL- 및 피콜린-장식된 표면을 표적화하는 것을 허용한다 (Jack et al., J Leukoc Biol., 77(3):328-36 (2004), Matsushita and Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 (2002), Aoyagi et al., J Immunol, 174(1):418-25(2005 참조). 이 옵소닌화는 이들 단백질과 식세포 수용체와의 상호작용을 필요로 하지만 (Kuhlman et　al., J. Exp. Med. 169:1733, (1989); Matsushita　et　al., J. Biol. Chem.　271:2448-54, (1996)), 그것의 정체성은 수립되지 않았다.

인간 MBL은 그것의 콜라겐-유사 도메인과, MBL-관련 세린 프로테아제 (MASP)로 명명되는,독특한 C1r/C1s-유사 세린 프로테아제와의 특이적인 고-친화성 상호작용을 형성한다. 현재까지, 3개의 MASP가 설명되었다. 먼저, 단일 효소 "MASP"가 보체 캐스케이드 (즉 C2와 C4를 절단함)의 억제에 기여하는 효소로서 확인되었고 특성확인되었다 (Matsushita et al., J Exp Med 176(6):1497-1502 (1992); Ji et　al., J.　Immunol. 150:571-578, (1993)). 계속해서 MASP 활성은 실제로 2개의 프로테아제: MASP-1 및 MASP-2의 혼합물인 것이 측정되었다 (Thiel et　al., Nature 386:506-510, (1997)). 그러나, MBL-MASP-2 복합체는 단독으로 보체 활성화에 충분한 것으로 증명되었다 (Vorup-Jensen et　al., J. Immunol. 165:2093-2100, (2000)). 나아가, 단지 MASP-2만이 C2와 C4를 고속으로 절단하였다 (Ambrus et　al., J.　Immunol. 170:1374-1382, (2003)). 그러므로 MASP-2는 C3 전환효소, C4b2a를 생성하기 위해 C4 및 C2를 활성화하는 데 기여하는 프로테아제이다. 이것은 고전적 경로의 C1 복합체와 다른 중요한 차이인데, 2가지 특이적 세린 프로테아제 (C1r 및 C1s)의 조화로운 작용은 보체 시스템의 활성화를 유도한다. 또한, 신규한 제 3 프로테아제인 MASP-3이 분리되었다 (Dahl, M.R.,　et　al., Immunity 15:127-35, 2001). MASP-1 및 MASP-3은 동일 유전자의 선택적 스플라이싱 생성물이다.

MASP들은 C1 복합체의 효소적 성분들인 C1r 및 C1s의 도메인 조직과 동일한 도메인 조직을 공유한다 (Sim et　al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, (2000)). 이들 도메인은 N-말단 C1r/C1s/성게 VEGF/골형성 단백질 (CUB) 도메인, 내피 성장 인자-유사 도메인, 제 2 CUB 도메인, 보체 제어 단백질 도메인의 탠덤 및 세린 프로테아제 도메인을 포함한다. C1 프로테아제에서와 같이, MASP-2의 활성화는 세린 프로테아제 도메인에 인접한 Arg-Ile 결합의 절단을 통해 일어나며, 그것은 이황화-연결되어 있는 A와 B 사슬로 효소를 분열시키는데, 후자는 세린 프로테아제 도메인으로 구성된다.

MBL은 또한 19 kDa의 MBL-관련 단백질 (MAp19) 또는 작은 MBL-관련 단백질 (sMAP)로서 알려져 있고 MASP2의 촉매적 활성이 결핍되어 있는, MASP-2의 선택적 스플라이싱 형태와 결합될 수 있다 (Stover, J. Immunol. 162:3481-90, (1999); Takahashi　et　al., Int. Immunol.　11:859-863, (1999)). MAp19는 MASP-2의 처음 2개의 도메인과, 이어서 4개의 독특한 아미노산으로 된 엑스트라 서열을 포함한다. MAp19의 기능은 명확하지 않다 (Degn et al., J Immunol. Methods, 2011). MASP-1 및 MASP-2 유전자는 각각 인간 염색체 3과 1에 위치한다 (Schwaeble　et　al., Immunobiology 205:455-466, (2002)).

여러 라인의 증거는 상이한 MBL-MASP 복합체가 있고 혈청 중의 MASP의 큰 분획은 MBL과 복합체를 형성하지 않는 것을 시사한다 (Thiel, et　al., J. Immunol. 165:878-887, (2000)). H- 및 L-피콜린은 둘 다 모든 MASP에 결합하며 MBL과 같이 렉틴 보체 경로를 활성화한다 (Dahl et　al., Immunity 15:127-35, (2001); Matsushita et　al., J. Immunol.　168:3502-3506, (2002)). 렉틴 및 고전적 경로는 둘 다 공통 C3 전환효소 (C4b2a)를 형성하며 두 경로는 이 단계에서 수렴된다.

렉틴 경로는 나이브 (naive) 숙주에서 감염에 대한 숙주 방어에서 주요한 역할을 하는 것으로 널리 여겨진다. 숙주 방어에 MBL이 포함되는 것에 대한 강력한 증거는 기능성 MBL의 감소된 혈청 수준을 가지는 환자들의 분석으로부터 유래한다 (Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, (2002)). 그런 환자들은 반복성 박테리아 및 진균 감염에 대해 민감성을 나타낸다. 이들 증상은 보통 어머니로부터 유도된 역가가 약해지기 때문에 취약성이 외관상 드러나지만 항체 반응의 전체 레퍼토리가 발달하기 전인 생애 초기에 명백하다. 이 증후군은 자주 MBL의 콜라겐성 부분의 여러 부위에서의 돌연변이로부터 유발되는데, 그것은 MBL 올리고머의 적절한 형성을 간섭한다. 그런, MBL이 보체와 무관한 옵소닌으로서 기능할 수 있기 때문에, 감염에 대한 어느 정도의 증가된 민감성이 손상된 보체 활성화에 기인하는지는 알지 못한다.

고전적 및 렉틴 경로와 대조적으로, 대체 경로에서는 다른 두 경로에서 C1q와 렉틴이 수행하는 인식 기능을 만족시키는 것으로 밝혀진 개시제가 없다. 현재 대체 경로는 자발적으로 저수준의 반전 활성화를 수행하고, 그것은 점검 중인 자발적인 보체 활성화를 유지하는 적절한 분자 요소가 결핍되어 있는 외래 또는 다른 비정상 표면 (박테리아, 효모, 바이러스로 감염된 세포 또는 손상된 조직)에서 쉽게 증폭될 수 있는 것으로 널리 받아들여지고 있다. 대체 경로의 활성화에 직접적으로 포함되는 4가지 혈장 단백질이 있다: C3, 인자 B 및 D 및 프로퍼딘.

비록 비-감염성 인간 질병의 발병에서 고전적 및 대체 보체 경로가 둘 다 있음을 함축하는 광범위한 증거가 있지만, 렉틴 경로의 역할은 이제 막 평가되기 시작하는 단계이다. 최근의 연구들은 렉틴 경로의 활성화가 허혈/재관류 손상에서 보체 활성화 및 관련된 염증의 원인이 될 수 있다는 증거를 제공한다. Collard 등 (2000)은 산화성 스트레스를 받은 배양된 내피 세포들이 MBL에 결합하고 인간 혈청에 노출될 때 C3의 침착을 보인다고 보고하였다 (Collard　et　al., Am. J. Pathol. 156:1549-1556, (2000)). 또한, 인간 혈청의 차단 항-MBL 단클론성 항체들로의 처리는 MBL 결합 및 보체 활성화를 억제하였다. 이들 결과는 래트 MBL에 대해 지시된 차단 항체로 처리된 래트들이 대조 항체로 처리된 래트보다 관상 동맥이 폐색되었을 때 상당히 더 적은 심근 손상을 나타낸 심근 허혈-재관류의 래트 모델로 확대되었다 (Jordan　et　al., Circulation 104:1413-1418, (2001)). 산화성 스트레스 후에 혈관 내피에의 MBL 결합의 분자적 메커니즘은 명확하지 않다; 최근의 연구는 산화성 스트레스 후에 렉틴 경로의 활성화가 혈관 내피가 당포합체가 아닌 사이토케라틴에의 MBL 결합에 의해 중재될 수 있음을 시사한다 (Collard et　al., Am. J. Pathol. 159:1045-1054, (2001)). 다른 연구들은 허혈/재관류 손상의 발병에서의 고전적 및 대체 경로 및 이 질병에서의 렉틴 경로의 역할이 논란의 여지가 있다고 시사하였다 (Riedermann, N.C.,　et　al., Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003).

최근의 연구는 대체 경로 활성화 효소 인자 D를 그것의 자이모겐 형태로부터 그것의 효소적 활성 형태로 전환시키는 데 MASP-1 (및 가능하게는 또한 MASP-3)이 필요한 것을 보였다 (Takahashi M. et al., J Exp Med 207(1):29-37 (2010) 참조). 이 과정의 생리적 중요성은 MASP-1/3-결핍 마우스의 혈장에서 대체 경로 기능적 활성의 부재에 의해 강조된다. C3b의 천연 C3로부터의 단백질 가수분해성 생성은 대체 경로의 기능화에 필요하다. 대체 경로 C3 전환효소 (C3bBb)는 필수 하위유닛으로서 C3b를 함유하기 때문에, 대체 경로를 통한 제 1 C3b의 기원에 관련된 의문은 난해한 문제를 나타냈고 상당한 연구를 자극하였다.

C3은 티오에스테르 결합으로서 알려져 있는 드문 번역후 변형을 함유하는 단백질의 패밀리에 속한다 (C4 및 α-2 마크로글로불린과 함께). 티오에스테르기는 그것의 말단 카르보닐기가 3개의 아미노산만큼 떨어져 있는 시스테인의 설프하이드릴기와 공유 티오에스테르 연쇄를 형성하는 글루타민으로 구성된다. 이 결합은 불안정하고 친전자성 글루타밀-티오에스테르는 하이드록실 또는 아미노기와 같은 친핵성 부분들과 반응함으로써 다른 분자와 공유 결합을 형성할 수 있다. 티오에스테르 결합은 무상 C3의 소수성 포켓 내에 격리될 때 타당하게 안정적이다. 그러나, C3의 C3a 및 C3b로의 단백질 가수분해성 절단은 고도로 반응성인 티오에스테르 결합의 C3b 상으로의 노출과, 이어서 하이드록실 또는 아미노기를 포함하는 인접한 부분들에 의한 친핵성 공격을 초래하며, C3b는 표적에 공유적으로 연결된다. C3b의 보체 표적에의 공유 부착에서 잘 증명되어 있는 역할 외에, C3 티오에스테르는 또한 대체 경로를 야기하는 중심적인 역할을 가지는 것으로 여겨진다. 광범위하게 수용되어 있는 "틱-오버 (tick-over) 이론"에 따르면, 대체 경로는 유체상 전환효소인 iC3Bb의 생성에 의해 개시되는데, 그것은 가수분해된 티오에스테르를 가지는 C3 (iC3; C3(H₂O)) 및 인자 B로부터 형성된다 (Lachmann, P.J.,　et　al., Springer Semin. Immunopathol.　7:143-162, (1984)). C3b-유사 C3(H₂O)는 천연 C3로부터 단백질의 내부 티오에스테르의 느린 자발적 가수분해에 의해 생성된다 (Pangburn, M.K.,　et　al., J. Exp. Med. 154:856-867, 1981). C3(H₂O)Bb 전환효소의 활성을 통해서, C3b 분자는 표적 표면에 침착되고 그로써 대체 경로가 개시된다.

대체 경로의 활성화의 개시제들에 대해서는 알려진 것이 거의 없다. 활성화제들은 효모 세포벽 (자이모산), 많은 순수 다당, 토끼 적혈구, 특정 면역글로불린, 바이러스, 진균, 박테리아, 돔울 종양 세포, 기생충 및 손상된 세포를 포함하는 것으로 여겨진다. 이들 활성화제에 공통적인 유일한 특징은 탄수화물의 존재이지만, 탄수화물 구조의 복잡성과 다양성은 인식되는 공유된 분자 결정기를 수립하는 것을 어렵게 만들었다. 대체 경로 활성화는 이 경로의 억제성 조절 성분들, 예컨대 인자 H, 인자 I, DAF 및 CR1과 대체 경로의 유일한 포지티브 조절제인 프로퍼딘 사이의 미세한 균형을 통해 제어되는 것으로 널리 인식되어 있다 (Schwaeble W.J. and Reid K.B., Immunol Today 20(1):17-21 (1999) 참조).

상기에서 기술된 외관상 상향조절된 활성화 메커니즘 외에, 대체 경로는 또한 렉틴/고전적 경로 C3 전환효소 (C4b2a)에 대한 강력한 증폭 루프를 제공할 수 있는데, 그것은 생성된 어떠한 C3b든지 추가의 대체 경로 C3 전환효소 (C3bBb)를 형성하는 데 인자 B와 함께 참여할 수 있기 때문이다. 대체 경로 C3 전환효소는 프로퍼딘의 결합에 의해 안정화된다. 프로퍼딘은 대체 경로 C3 전환효소 반감기를 6 내지 10배 연장시킨다. 대체 경로 C3 전환효소에 C3b를 첨가하는 것은 대체 경로 C5 전환효소의 형성을 유도한다.

3개의 모든 경로 (즉 고전적, 렉틴 및 대체)는 C5에서 수렴되는 것으로 여겨졌는데, 그것은 절단되어 다중 프로염증성 (proinflammatory) 효과를 가지는 생성물들이 형성된다. 수렴된 경로는 말단 보체 경로로서 언급되었다. C5a는 가장 강력한 아나필락시스독소로, 평활근 및 혈관 색조의 변화뿐 아니라 혈간 투과성의 변화를 유도한다. 그것은 또한 호중구 및 단핵구 둘 다의 강력한 케모탁신 및 활성화제이다. C5a-중재된 세포 활성화는 다수의 추가의 염증성 조절제들, 이를테면 사이토킨, 가수분해성 효소, 아라키돈산 대사물 및 반응성 산소 종의 방출을 유도함으로써 염증성 반응을 상당히 증폭시킬 수 있다. C5 절단은 막 공격 복합체 (MAC)로서도 알려져 있는 C5b-9의 형성을 유도한다. 저용해성 (sublytic) MAC 침착이 용해성 기공-형성 복합체로서의 역할 외에 염증에서도 중요한 역할을 할 수 있다는 강력한 증거가 있다.

면역 방어에서의 본질적인 역할 외에, 보체 시스템은 많은 임상적 상태에서 조직 손상에 기여한다. 그러므로 이들 부작용을 예방하기 위하여 치료적으로 효과적인 보체 억제제를 개발해야 하는 절실한 필요성이 존재한다.

발명의 요약

본 요약은 상세한 설명에서 아래에서 한층 더 기술되는 단순화된 형태의 개념의 선택을 도입하기 위해 제공된다. 이 요약은 청구된 대상 주제의 핵심적인 특징들을 확인하기 위해 의도되지 않으며 청구된 대상 주제의 범주를 결정함에 있어 보조수단으로서 사용되기 위해 의도되지 않는다.

한 측면으로, 본 발명은 혈전성 미세혈관병증 (TMA)에 걸렸거나 그 질병에 걸릴 위험이 있는 대상에서 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하는데, 여기서 TMA는 (i) 암에 이차적인 TMA; (ii) 화학요법에 이차적인 TMA, 또는 (iii) 이식에 이차적인 TMA 중 적어도 하나이고, 그 방법은 대상에게 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 대상은 암에 이차적인 TMA에 걸렸거나 걸릴 위험이 있고, MASP-2 억제제는 그 대상에게 TMA에 걸릴 위험을 감소시키거나, TMA의 심각성을 감소시키기에 효과적인 양으로 전신적으로 투여된다. 일부 구체예에서, 대상은 화학요법에 이차적인 TMA에 걸렸거나 걸릴 위험이 있고, MASP-2 억제제는 그 대상에게 TMA에 걸릴 위험을 감소시키거나, TMA의 심각성을 감소시키기에 효과적인 양으로, 화학요법 전에, 중에 또는 후에 전신적으로 투여된다. 일부 구체예에서, 대상은 이식에 이차적인 TMA에 걸렸거나 걸릴 위험이 있고, MASP-2 억제제는 그 대상에게 TMA에 걸릴 위험을 감소시키거나, TMA의 심각성을 감소시키기에 효과적인 양으로, 이식 전에, 중에 또는 후에 전신적으로 투여된다. 일부 구체예에서, 이식 시술은 동종이계의 조혈 줄기세포 이식이다. 일부 구체예에서, 대상은 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제로의 치료가 이전에 시행되었거나 현재 진행중이다. 일부 구체예에서, 방법은 추가로 대상에게 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제, 예컨대 인간화된 항-C5 항체 또는 그것의 항원-결합 단편, 예컨대 유클리주맙을 투여하는 것을 포함한다.

다른 측면으로, 발명은 업쇼-슐만 (Upshaw-Schulman) 증후군 (USS)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상에서 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 대상에게 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 USS에 걸릴 위험이 있는 대상을 치료하는 방법을 포함하는데, 이때 방법은 TTP와 관련된 많은 임상적 증상들 중 하나를 개선하거나 예방하기에 효과적인 시간 동안 AMSP-2억제제의 효과적인 양을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 추가로 대상을 주기적으로 모니터링하고 기폭성 TTP 임상적 증상들과 관련된 것으로 알려져 있는 사건의 존재시에 MASP-2 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 추가로 대상을 주기적으로 모니터링하고 빈혈, 혈소판 감소증 또는 크레아틴 상승의 존재가 측정될 때 MASP-2 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 대상은 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제로 이전에 치료가 진행되었거나 현재 진행 중이다. 일부 구체예에서, 방법은 추가로 대상에게 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제, 예컨대 인간화된 항-C5 항체 또는 그것의 항원-결합 단편, 예컨대 유클리주맙을 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 측면으로, 발명은 데고스병 (Degos Disease)에 걸려 있는 대상에서 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 대상은 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제로 이전에 치료가 진행되었거나 현재 진행 중이다. 일부 구체예에서, 방법은 추가로 대상에게 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제, 예컨대 인간화된 항-C5 항체 또는 그것의 항원-결합 단편, 예컨대 유클리주맙을 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 측면으로, 발명은 파국성 항인지질 증후군 (CAPS)에 걸려 있는 대상에서 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 대상은 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제로 이전에 치료가 진행되었거나 현재 진행 중이다. 일부 구체예에서, 방법은 추가로 대상에게 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제, 예컨대 인간화된 항-C5 항체 또는 그것의 항원-결합 단편, 예컨대 유클리주맙을 투여하는 것을 포함한다.

발명의 개시된 방법들 중 어느 것의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 단편이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 감소된 이펙터 기능을 가진다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 실질적으로 고전적 경로를 억제하지 않는다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 SEQ ID NO:6의 일부에 특이적으로 결합하는 항-MASP-2 단클론성 항체 또는 그것의 단편이다. 일부 구체예에서, 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 감소된 이펙터 기능을 가지는 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ 및 F(ab')₂로 구성되는 군으로부터 선택된 항체 단편이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 단일-사슬 분자이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 IgG1 분자, IgG2 및 IgG4 분자로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 S228P 돌연변이를 포함하는 IgG4 분자이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 인간 MASP-2에 10 nM 이하의 K_D로 결합한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인의 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 시험관 내 분석에서 1% 인간 혈청에서 10 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 90% 인간 혈청에서 30 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제한다.

발명의 개시된 방법들 중 어느 것의 일부 구체예에서, MASP-2 억제 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 (a) i) SEQ ID NO:67의 31 내지 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO:67의 50 내지 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO:67의 95 내지 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) i) SEQ ID NO:70의 24 내지 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO:70의 50 내지 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO:70의 89 내지 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 단클론성 항체는 SEQ ID NO:67로서 제시된 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70으로서 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:67에 제시된 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체에 의해 인식된 에피토프의 적어도 일부를 특이적으로 인식한다.

발명의 다른 측면으로, 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)에 걸린 대상에서 혈전 형성을 억제하는 방법이 제공되는데, 그 방법은 대상에게 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하는 데 효과적인 양의 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 aHUS에 걸린 대상으로부터의 혈청에서 혈전 형성을 미처리 혈청에 비교하여 적어도 40% 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 aHUS에 걸린 대상으로부터의 혈청에서의 혈전 형성을 동일한 대상으로부터의 혈청에서 C5b-9 침착에 미치는 억제 효과보다 적어도 20% 더 큰 (예컨대 적어도 30% 더 큰, 적어도 40% 더 큰 또는 적어도 50% 더 큰) 수준으로 억제한다. 일부 구체예에서, 대상은 aHUS의 급성기에 있다. 일부 구체예에서, 대상은 aHUS의 관해기 (remission phase)에 있다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 SEQ ID NO:의 일부에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체 또는 그것의 단편이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 감소된 이펙터 기능을 가지는 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ and F(ab')₂로 구성되는 군으로부터 선택된 항체 단편이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 IgG1 분자, IgG2 및 IgG4 분자로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 S228P 돌연변이를 포함하는 IgG4 분자이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 인간 MASP-2에 10 nM 이하의 K_D로 결합한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인의 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 시험관 내 분석에서 1% 인간 혈청에서 C3b 침착을 10 nM 이하의 IC₅₀으로 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 90% 인간 혈청에서 C3b 침착을 30 nM 이하의 IC₅₀으로 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 (a) i) SEQ ID NO:67의 31 내지 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO:67의 50 내지 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO:67의 95 내지 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) i) SEQ ID NO:70의 24 내지 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO:70의 50 내지 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO:70의 89 내지 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 단클론성 항체는 SEQ ID NO:67로서 제시된 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70으로서 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:67에 제시된 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체에 의해 인식된 에피토프의 적어도 일부를 특이적으로 인식한다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체의 치료적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하고 있는, MASP-2-의존성 보체 활성화의 부작용을 억제하는 조성물을 제공하는 것이다. 또한 그런 필요가 있는 살아있는 대상에서 MASP-2-의존성 보체 활성화의 부작용을 억제하는 데 사용하기 위한, 치료적 유효량의 MASP-2 억제제를 약학적 담체에 포함하고 있는 의약의 제조 방법이 제공된다. 또한 하기에서 기술되는 각각의 상태, 질환 및 장애의 치료를 위해 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하는 데 사용하기 위한 의약의 제조 방법이 제공된다.

발명의 방법, 조성물 및 의약은 본원에서 한층 더 기술되는 혈전성 미세혈관병증 (TMA)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 인간을 포함하는 포유류 대상에서 생체 내에서 MASP-2-의존성 보체 활성화의 부작용을 억제하는 데 유용하다.

본 발명의 전술한 측면들 및 동반된 많은 장점들은 첨부된 도면과 함께 다음의 상세한 설명을 참조로 할 때 더 잘 이해되는 것과 같은 것으로서 쉽게 인지될 것이고, 도면들은 다음과 같다:
도 1은 인간 MASP-2의 게놈 구조를 예시하는 도표이다;
도 2a는 인간 MASP-2 단백질의 도메인 구조를 예시하는 개략적 도표이다;
도 2b는 인간 MAp19 단백질의 도메인 구조를 예시하는 개략적 도표이다;
도 3은 쥐과 동물의 MASP-2 녹아웃 전략을 예시하는 도표이다;
도 4는 인간 MASP-2 미니유전자 구성물을 예시하는 도표이다;
도 5a는 실시예 2에서 기술되는 것과 같이, 만난 상의 C4b 침착의 결핍에 의해 측정되는 바 MASP-2-결핍이 렉틴-경로-중재된 C4 활성화의 손실을 유도하는 것을 증명하는 결과를 도시한다;
도 5b는 실시예 2에서 기술되는 것과 같이, 자이모산 상의 C4b 침착의 결핍에 의해 측정되는 바 MASP-2-결핍이 렉틴-경로-중재된 C4 활성화의 손실을 유도하는 것을 증명하는 결과를 도시한다;
도 5c는 실시예 2에서 기술되는 것과 같이, 만난 및 자이모산 상의 C4b 침착에 의한 척도로서 MASP-2+/-; MASP-2-/- 및 야생형 계통들로부터 얻어진 혈청 샘플의 상대적인 C4 활성화 수준을 증명하는 결과를 도시한다;
도 6은 실시예 2에서 기술되는 것과 같이, 만난 상의 C4b 침착의 결핍에 의해 측정되는 바, 쥐과 동물의 재조합 MASP-2를 MASP-2-/- 혈청 샘플에 첨가하는 것이 단백질 농도 의존성 방식으로 렉틴-경로-중재된 C4 활성화를 회복시키는 것을 증명하는 결과를 도시한다;
도 7은 실시예 8에서 기술되는 것과 같이, 고전적 경로가 MASP-2-/- 계통에서 기능성인 것을 증명하는 결과를 도시한다;
도 8a는 실시예 10에서 기술되는 것과 같이, 항-MASP-2 Fab2 항체 #11이 C3 전환효소 형성을 억제하는 것을 증명하는 결과를 도시한다;
도 8b는 실시예 10에서 기술되는 것과 같이, 항-MASP-2 Fab2 항체 #11이 천연 래트 MASP-2에 결합하는 것을 증명하는 결과를 도시한다;
도 8c는 실시예 10에서 기술되는 것과 같이, 항-MASP-2 Fab2 항체 #41이 C4절단을 억제하는 것을 증명하는 결과를 도시한다;
도 9는 실시예 10에서 기술되는 것과 같이, C3 전환효소 형성을 억제한 시험한 모든 항-MASP-2 Fab2 항체가 또한 C4 절단을 억제하는 것으로 밝혀진 것을 증명하는 결과를 도시한다;
도 10은 실시예 11에서 기술되는 것과 같이, 항-MASP-2 차단 Fab2 항체들의 에피토프 지도화에 사용된 래트 MASP-2로부터 유도된 재조합 폴리펩티드를 예시하는 도표이다;
도 11은 실시예 11에서 기술되는 것과 같이, 항-MASP-2 Fab2 #40 및 #60의 래트 MASP-2 폴리펩티드에의 결합을 증명하는 결과를 도시한다;
도 12는 실시예 12에서 기술되는 것과 같이, 망막 허혈/재관류 손상 모델에서 재관류 후 24 및 48시간째에 야생형 (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에 대한 혈중 요소성 질소 클리어런스를 증명하는 결과를 도시한다;
도 13a는 실시예 13에서 기술되는 것과 같이, 야생형 (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스로부터 분리된 RPE-맥락막 복합체의 기준 VEGF 단백질 수준을 보여주는 결과를 도시한다;
도 13b는 실시예 13에서 기술되는 것과 같이, 황반 변성 모델에서 레이저 유도 손상 후 야생형 (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 3일째에 RPE-맥락막 복합체의 VEGF 단백질 수준을 보여주는 결과를 도시한다;
도 14는 실시예 13에서 기술되는 것과 같이, 야생형 (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 레이저 유도된 손상 후 7일째에 평균 맥락막 신혈관형성 (CNV) 부피를 보여주는 결과를 도시한다;
도 15a 및 15b는 실시예 14에서 기술되는 것과 같이, 정상적인 래트 혈청에서 MASP-2 Fab2 항체의 투여 후에 C4b 침착의 억제에 대한 용량 반응 곡선 (도 15a) 및 트롬빈 활성화의 억제에 대한 용량 반응 곡선 (도 15b)을 도시한다;
도 16a 및 16b는 실시예 15에서 기술되는 것과 같이, 산재성 혈관내 응고의 국소 Schwartzman 반응 모델에서 보체 경로가 고갈제인 코브라 독 인자 (CVF) 및 말단 경로 억제제 (C5aR 길항제)에 의해 억제되는 미처리 야생형 마우스 및 야생형 마우스에서의 혈소판 응집 (도 16a)에 비교한 MASP-2 (-/-) 마우스에서 측정된 (도 16b) 혈소판 응집 (응집체 면적으로서 표시됨)을 도시한다;
도 17은 실시예 16에서 기술되는 것과 같이, WT (+/+) (B6) 또는 WT (+/+) 공여 신장의 MASP-2 (-/-) 이식 수용체 마우스 중 어느 하나에서 측정된 혈중 요소성 질소 (BUN) 수준을 그래프로 도시한다;
도 18은 실시예 17에서 기술되는 것과 같이, 맹장 결찰 및 천자 (CLP) 모델에서 미생물 감염 후 경과일 수의 함수로서 WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스의 백분율 생존을 그래프로 도시한다;
도 19는 실시예 17에서 기술되는 것과 같이, 맹장 결찰 및 천자 (CLP) 모델에서 미생물 감염 후 WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-)에서 측정된 박테리아의 수를 그래프로 도시한다;
도 20은 실시예 18에서 기술되는 것과 같이, 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)의 비강 내 투여로의 도전 후 6일째에 WT (+/+), MASP-2 (-/-) 및 C3 (-/-) 마우스의 퍼센트 생존을 도시하는 Kaplan-Mayer 도표이다;
도 21은 실시예 19에서 기술되는 것과 같이, 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg의 마우스 항-MASP-2 단클론성 항체의 피하 투여 후 다양한 시점에서 취한 샘플에서의, 대조표준의 %로서 측정된, C4b 침착의 수준을 그래프로 도시한다;
도 22는 실시예 19에서 기술되는 것과 같이, WT 마우스에서 0.6 mg/kg의 항-MASP-2 단클론성 항체의 ip 투여 후 다양한 시점에서 취한 샘플에서의, 대조표준의 %로서 측정된, C4b 침착의 그래프로 도시한다;
도 23은 실시예 20에서 기술되는 것과 같이, 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg의 마우스 항-MASP-2 단클론성 항체의 단일 ip 주사로 사전 처리된 WT (+/+) 마우스에서 레이저 유도 손상 후 7일째의 평균 맥락막 신혈관형성 (CNV) 부피를 그래프로 도시한다;
도 24a는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 5x10⁸/100 μl cfu의 N. 메닝기티디스로의 감염 후 MASP-2 (-/-) 및 WT (+/+) 마우스의 퍼센트 생존을 그래프로 도시한다;
도 24b는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 5x10⁸cfu/100 μl의 N. 메닝기티디스로 감염된 MASP-2 KO (-/-) 및 WT (+/+) 마우스로부터 취한 혈액 샘플에서 상이한 시점에 회수된 N. 메닝기티디스의 로그 cfu/ml을 그래프로 도시한다;
도 25a는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 2x10⁸ cfu/100 μl의 N. 메닝기티디스로의 감염 후 MASP-2 KO (-/-) 및 WT (+/+) 마우스의 퍼센트 생존을 그래프로 도시한다;
도 25b는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 2x10⁸ cfu/100 μl의 N. 메닝기티디스로 감염된 WT (+/+) 마우스로부터 취한 혈액 샘플에서 상이한 시점에 회수된 N. 메닝기티디스의 로그 cfu/ml을 그래프로 도시한다;
도 25c는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 2x10⁸ cfu/100 μl의 N. 메닝기티디스로 감염된 MASP-2 (-/-) 마우스로부터 취한 혈액 샘플에서 상이한 시점에 회수된 N. 메닝기티디스의 로그 cfu/ml을 그래프로 도시한다;
도 26a는 실시예 22에서 기술되는 것과 같이, MASP-2 (-/-) 마우스가 기능성 고전적 경로를 보유하는 것을 증명하는 C3b 침착 분석의 결과를 그래프로 도시한다;
도 26b는 실시예 22에서 기술되는 것과 같이, MASP-2 (-/-) 마우스가 기능성 대체 경로를 보유하는 것을 증명하는, 자이모산 코팅된 플레이트 상에서의 C3b 침착 분석의 결과를 그래프로 도시한다;
도 27a는 실시예 22에서 기술되는 것과 같이 위험 면적 (AAR) 및 경색 크기 (INF)를 보여주는, C4 (-/-) 마우스 (n=6) 및 매칭된 WT 한배 새끼 대조표준 (n=7)에서의 관상 동맥의 좌심실 하향 가지 (LAD)의 결찰 및 재관류 후의 심근 허혈/재관류 손상 (MIRI)-유도된 조직 손실을 그래프로 도시한다;
도 27b는 실시예 22에서 기술되는 것과 같이, C4 (-/-) 마우스가 WT 대조표준 (점선)과 같이 MIRI에 대해 민감한 것을 증명하는, 도 42a에서 기술된 것과 같이 처리된 C4 (-/-) 및 WT 마우스에서의 위험 면적 (AAR)의 함수로서의 경색 크기 (INF)를 그래프로 도시한다;
도 28a는 실시예 22에서 기술되는 것과 같이, WT 마우스, C4 (-/-) 마우스로부터의 혈청 및 만난으로 사전-인큐베이션된 C4 (-/-) 마우스로부터의 혈청을 사용한 C3b 침착 분석의 결과를 그래프로 도시한다;
도 28b는 실시예 22에서 기술되는 것과 같이, 다양한 농도의 항-쥐과 동물의 MASP-2 mAb (mAbM11)와 혼합된 WT, C4 (-/-) 및 MASP-2 (-/-) 마우스로부터의 혈청에 대한 C3b 침착 분석의 결과를 그래프로 도시한다;
도 28c는 실시예 22에서 기술되는 것과 같이, WT (C4 충분)로부터의 인간 혈청 및 C4 결핍 혈청, 및 만난과 사전-인큐베이션된 C4 결핍 대상으로부터의 혈청에 대한 C3b 침착 분석의 결과를 그래프로 도시한다;
도 28d는 실시예 22에서 기술되는 것과 같이, WT (C4 충분) 및 항-인간 MASP-2 mAb (mAbH3)와 혼합된 C4 결핍 대상으로부터의 인간 혈청에 대한 C3b 침착 분석의 결과를 그래프로 도시한다;
도 29a는 실시예 22에서 기술되는 것과 같이, 렉틴 활성화 경로 특이적 분석 조건하에 또는 고전적 활성화 경로 특이적 분석 조건하에 시험된 다양한 보체 결핍 마우스 계통으로부터의 혈장의 C3 전환효소 활성의 비교 분석을 그래프로 도시한다;
도 29b는 실시예 22에서 기술되는 것과 같이, 렉틴 활성화 경로 특이적 조건하에 시험된 다양한 보체 결핍 마우스 계통으로부터의 혈장의 C3 전환효소 활성의 시간-해소 (time-resolved) 동역학을 그래프로 도시한다;
도 30은 실시예 23에서 기술되는 것과 같이, a' 사슬의 존재에 의해 표시된, 트롬빈 기질 FXIa 및 FXa에 의한 인간 C3의 활성화를 보여주는 웨스턴 블롯 분석의 결과를 도시한다;
도 31은 실시예 23에서 기술되는 것과 같이, WT, MASP-2 (-/-), F11(-/-), F11(-/-)/C4 (-/-) 및 C4 (-/-)로부터 얻어진 혈청 샘플에 대한 C3 침착 분석의 결과를 도시한다;
도 32a는 실시예 29에서 기술되는 것과 같이, 대조 마우스 및 항-쥐과 동물의 MASP-2 항체 (mAbM11) 또는 항-인간 MASP-2 항체 (mAbH6)로 처리된 마우스에서 7.0 Gy 복사선에 노출된 후 시간에 대한 퍼센트 생존을 보여주는 Kaplain-Meier 생존 도표이다;
도 32b는 실시예 29에서 기술되는 것과 같이, 대조 마우스 및 항-쥐과 동물의 MASP-2 항체 (mAbM11) 또는 항-인간 MASP-2 항체 (mAbH6)로 처리된 마우스에서 6.5 Gy 복사선에 노출된 후 시간에 대한 퍼센트 생존을 보여주는 Kaplain-Meier 생존 도표이다;
도 33은 실시예 30에서 기술되는 것과 같이, MASP-2 결핍 마우스가 N. 메닝기티디스 유도된 사망으로부터 보호되는 것을 증명하는, 2.6 x 10⁷ cfu의 감염 용량의 N. 메닝기티디스 혈청군 A Z2491의 투여 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존을 그래프로 예시하는 Kaplan-Meyer 도표이다;
도 34는 실시예 30에서 기술되는 것과 같이, MASP-2 결핍 마우스가 N. 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58 유도된 사망으로부터 보호되는 것을 증명하는, 6 x 10⁶ cfu의 감염 용량의 N. 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 투여 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존을 그래프로 예시하는 Kaplan-Meyer 도표이다;
도 35는 실시예 30에서 기술되는 것과 같이, MASP-2 KO 마우스가 WT 마우스와 같은 용량의 N. 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 감염되었어도 MASP-2 KO 마우스는 WT에 비교하여 균혈증의 증강된 클리어런스를 가졌음을 증명하는, 6x10⁶ cfu의 N. 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58 (두 그룹의 마우스에 대해 상이한 시점에서 n=3, 결과들은 평균±SEM으로서 표시됨)의 i.p. 감염 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스로부터 취한 혈액 샘플에서 상이한 시점에서 회수된 N. 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 로그 cfu/ml을 그래프로 도시한다;
도 36은 실시예 30에서 기술되는 것과 같이, MASP-2 결핍 마우스가 6시간째에 훨씬 더 많은 질환 점수로 감염에 대해 높은 저항을 보인 것을 증명하는, 6x10⁶ cfu/100 μl의 N. 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로의 감염 후 3, 6, 12 및 24 시간째에 MASP-2 및 WT 마우스의 평균 질환 점수를 그래프로 도시한다;
도 37은 실시예 31에서 기술되는 것과 같이, 항-MASP-2 항체가 N. 메닝기티디스로 감염된 대상에서 치료와 생존 향상에 효과적인 것을 증명하는, 4 x 10⁶/100 μl cfu의 감염 용량의 N. 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 투여에 이어서 감염 후 3시간 후 억제 항-MASP-2 항 (1 mg/kg) 또는 대조 아이소타입 항체 중 어느 하나의 투여 후의 마우스들의 퍼센트 생존을 그래프로 예시한 Kaplan-Meyer 도펴이다;
도 38은 실시예 32에서 기술되는 것과 같이, 인간 혈청에서 N. 메닝기티디스의 보체 의존성 사멸이 인간 항-MASP-2 항체의 첨가에 의해 상당히 증강되었음을 보여주는, (A) 정상인 혈청 (NHS) 플러스 인간 항-MASP-2 항체; (B) 정상인 혈청 (NHS) 플러스 아이소타입 대조 항체; (C) MBL-/- 인간 혈청; (D) 정상인 혈청 (NHS) 및 (E) 열 비활성화된 정상인 혈청 (NHS)의 존재하에 0, 30, 60 및 90분 동안 인큐베이션한 후, 6.5x10⁶ cfu/100 μl의 N. 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 i.p. 감염 후의 20% 인간 혈청 농도에서 상이한 시점에서 회수된 N. 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생존 계수의 로그 cfu/ml을 그래프로 도시한다;
도 39는 실시예 32에서 기술되는 것과 같이, MASP-2 -/- 마우스 혈청이 WT 마우스 혈청보다 N. 메닝기티디스에 대한 더 높은 수준의 살균 활성을 가지는 것을 증명하는, 마우스 혈청 샘플에서 상이한 시점에서 회수된 N. 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생존 계수의 로그 cfu/ml을 그래프로 도시한다;
도 40은 광범위한 혈청 농도에 걸친 인간 혈청에 의한 만난-코팅된 쥐과 동물의 적혈구의 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액 안으로의 용해된 마우스 적혈구 (Crry/C3-/-)의 헤모글로빈 방출에 의해 측정됨)을 그래프로 도시한다. 시험된 혈청은 실시예 33에서 기술되는 것과 같이, 열-비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, NHS +항-MASP-2 항체 및 NHS 대조표준을 포함하였다;
도 41은 광범위한 혈청 농도에 걸친 인간 혈청에 의한 비-코팅 쥐과 동물의 적혈구의 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액 안으로의 용해된 WT 마우스 적혈구의 헤모글로빈 방출에 의해 측정됨)을 그래프로 도시한다. 시험된 혈청은 실시예 33에서 기술되는 것과 같이, 열-비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, NHS +항-MASP-2 항체 및 NHS 대조표준을 포함하였고, MASP-2를 억제하는 것이 비-민감화된 WT 마우스 적혈구의 보체-중재된 용해를 억제하는 것을 증명한다;
도 42는 광범위한 혈청 농도에 걸친 인간 혈청에 의한 비-코팅 쥐과 동물의 적혈구의 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액 안으로의 용해된 마우스 적혈구 (CD55/59 -/-)의 헤모글로빈 방출에 의해 측정됨)을 그래프로 도시한다. 시험된 혈청은 실시예 33에서 기술되는 것과 같이, 열-비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, NHS +항-MASP-2 항체 및 NHS 대조표준을 포함하였다;
도 43은 실시예 34에서 기술되는 것과 같이, 대조 마우스 및 항-인간 MASP-2 항체 (mAbH6)로 처리된 마우스에서 8.0 Gy 복사선에 노출된 후 시간 경과 (일)에 따른 퍼센틀 생존을 그래프로 도시한다;
도 44는 실시예 35에서 기술되는 것과 같이, 혈전 형성이 WT 마우스에서 15분 후에 검출되고 WT 마우스의 최대 80%가 60분째에 혈전이 형성된 것으로 증명되었으며; 대조적으로, MASP-2 -/- 마우스는 어떤 것도 60분의 기간 중에 어떠한 혈전 형성도 나타내지 않았음 (로그 랭크: p=0.0005)을 증명하는, 60분 동안 측정된 혈전 형성을 가지는 마우스의 백분율로 나타내는, MASP-2 -/- 및 WT 마우스에서의 LPS 주사 후의 미세혈관 폐색의 개시까지의 시간을 그래프로 도시한다;
도 45는 실시예 36에서 기술되는 것과 같이, 대조 마우스는 모두 42시간째에 사망한 한편, 대조적으로 항-MASP-2 항체-처리된 마우스들은 100% 실험의 전 과정을 통해 생존했음을 증명하는, 시간 (시간)의 경과에 따른 HUS의 STX/LPS-유도된 모델에서 염수 처리된 대조 마우스 (n=5) 및 항-MASP-2 항체 처리됨 마우스 (n=5)의 퍼센트 생존을 그래프로 도시한다;
도 46은 실시예 37에서 기술되는 것과 같이, 아이소타입 대조표준으로, 또는 FITC/덱스트란의 주사 전 16시간 및 1시간 전에 인간 MASP-2 항체 mAbH6 (10mg/kg)로 처리된 후의 FITC/덱스트란 UV 모델에서 미세혈관 폐색을 나타낸 마우스의 백분율을 손상 유도 후 시간의 함수로서 그래프로 도시한다;
도 47은 인간 MASP-2 항체 (mAbH6) 및 아이소타입 대조 항체로 처리된 마우스들에 대한, 분으로 표시되는 폐색 시간을 그래프로 도시한 것으로, 데이터는 산재된 점으로서 기록되며 평균 값 (수평 막대) 및 표준 오차 막대 (수직 막대)가 표시된다. 분석에 대해 사용된 통계학적 시험은 실시예 37에서 기술되는 것과 같이, 독립표본 t 검정이었고; 이때 기호 "*"는 p=0.0129를 나타낸다;
도 48은 실시예 37에서 기술되는 것과 같이, 야생형 마우스, MASP-2 KO 마우스, 및 낮은 광 세기 (800 내지 1500)를 사용하는 혈전증의 FITC-덱스트란/빛 유도된 내피세포 손상 모델에서 혈전증의 유도 전 16시간 전에, 그리고 다시 1시간 전에 10mg/kg의 인간 MASP-2 항체 (mAbH6)로 전처리된 야생형 마우스에서 폐색이 일어날때까지의 시간을 그래프로 도시한다;
도 49는 실시예 39에서 기술되는 것과 같이, 증가하는 용량의 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6) 또는 아이소타입 대조 항체로 처리된 마우스에서 FITC-덱스트란유도된 혈전성 미세혈관병증의 시간의 함수로서의 혈전을 가진 마우스의 백분율을 보여주는 Kaplan-Meier 도표이다;
도 50은 실시예 39에서 기술되는 것과 같이, mAbH6 용량의 함수 (대조표준과 비교하여 *p<0.01)로서의 혈전 형성의 개시까지의 중간 시간 (분)을 그래프로 도시한다;
도 51은 실시예 39에서 기술되는 것과 같이, 증가하는 용량의 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6) 또는 아이소타입 대조 항체로 처리된 마우스에서 FITC-덱스트란 유도된 혈전성 미세혈관병증의 시간의 함수로서의 미세혈관 폐색을 가진 마우스의 백분율을 보여주는 Kaplan-Meier 도표이다;
도 52는 실시예 39에서 기술되는 것과 같이, mAbH6 용량의 함수 (대조표준과 비교하여 *p<0.05)로서의 미세혈관 폐색까지의 중간 시간을 그래프로 도시한다;
도 53a는 실시예 40에서 기술되는 것과 같이, OMS646이 대략 1 nM의 IC₅₀ 값으로 렉틴-중재된 MAC 침착을 억제하는 것을 증명하는, 렉틴 경로-특이적 분석 조건하에 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시의 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시한다;
도 53b는 실시예 40에서 기술되는 것과 같이, OMS646이 고전적 경로-중재된 MAC 침착을 억제하지 않는 것을 증명하는, 고전적 경로-특이적 분석 조건하에 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시의 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시한다;
도 53c는 실시예 40에서 기술되는 것과 같이, OMS646이 대체 경로-중재된 MAC 침착을 억제하지 않는 것을 증명하는, 대체 경로-특이적 분석 조건하에 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시의 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시한다;
도 54는 실시예 40에서 기술되는 것과 같이, 표시된 용량에서 투여 후 시간의 함수로서의 OMS646 농도 (n=3 동물/그룹의 평균)를 보여주는, 마우스에서의 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 약물동역학적 (PK) 프로필을 그래프로 도시한다;
도 55a는 실시예 40에서 기술되는 것과 같이, 정맥 내 투여 후에 마우스에서의 전신성 렉틴 경로 활성의 강하로서 측정된, 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 약력학적 (PD) 반응을 그래프로 도시한다;
도 55b는 실시예 40에서 기술되는 것과 같이, 피하 투여 후에 마우스에서의 전신성 렉틴 경로 활성의 강하로서 측정된, 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 약력학적 (PD) 반응을 그래프로 도시한다;
도 56은 실시예 41에서 기술되는 것과 같이, ADP-활성화된 HMEC-1 세포 상에서 aHUS 혈청-유도된 C5b-9 침착에 미치는 MASP-2 항체 (OMS646)의 억제 효과를 sCR1에 비교하여 그래프로 도시한다; 및
도 57은 실시예 42에서 기술되는 것과 같이, ADP-활성화된 HMEC-1 세포 상에서 aHUS 혈청-유도된 혈전 형성에 미치는 MASP-2 항체 (OMS646)의 억제 효과를 sCR1에 비교하여 그래프로 도시한다.

서열 목록의 설명

SEQ ID NO:1 인간 MAp19 cDNA

SEQ ID NO:2 인간 MAp19 단백질 (리더 포함함)

SEQ ID NO:3 인간 MAp19 단백질 (성숙)

SEQ ID NO:4 인간 MASP-2 cDNA

SEQ ID NO:5 인간 MASP-2 단백질 (리더 포함함)

SEQ ID NO:6 인간 MASP-2 단백질 (성숙)

SEQ ID NO:7 인간 MASP-2 gDNA (엑손 1 내지 6)

항원: (MASP-2 성숙 단백질을 참조함)

SEQ ID NO:8 CUBI 서열 (aa 1 내지 121)

SEQ ID NO:9 CUBEGF 서열 (aa 1 내지 166)

SEQ ID NO:10 CUBEGFCUBII (aa 1 내지 293)

SEQ ID NO:11 EGF 영역 (aa 122 내지 166)

SEQ ID NO:12 세린 프로테아제 도메인 (aa 429 내지 671)

SEQ ID NO:13 세린 프로테아제 도메인 비활성 (aa 610 내지 625, Ser618의 Ala 돌연변이를 포함함)

SEQ ID NO:14 TPLGPKWPEPVFGRL (CUB1 펩티드)

SEQ ID NO:15 TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ (CUBI 펩티드)

SEQ ID NO:16 TFRSDYSN (MBL 결합 영역 코어)

SEQ ID NO:17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF (MBL 결합 영역)

SEQ ID NO:18 IDECQVAPG (EGF PEPTIDE)

SEQ ID NO:19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV (세린 프로테아제 결합 코어)상세한 설명

펩티드 억제제:

SEQ ID NO:20 MBL 전 길이 cDNA

SEQ ID NO:21 MBL 전 길이 단백질

SEQ ID NO:22 OGK-X-GP (일치 결합)

SEQ ID NO:23 OGKLG

SEQ ID NO:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G

SEQ ID NO:25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO

SEQ ID NO:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOG

SEQ ID NO:27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO (인간 h-피콜린)

SEQ ID NO:28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGAOGEO (인간 피콜린 p35)

SEQ ID NO:29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI (C4 절단 부위)

발현 억제제:

CUBI-EGF 도메인의 SEQ ID NO:30 cDNA (SEQ ID NO:4의 뉴클레오티드 22 내지 680)

SEQ ID NO:31

5' CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC 3'

MASP-2 번역 출발 부위 (센스)를 포함하는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오티드 12 내지 45

SEQ ID NO:32

5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3'

MASP-2 결합 부위 (센스)를 포함하는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오티드 361 내지 396

SEQ ID NO:33

5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3'

CUBII 도메인을 포함하는 영역을 코드화하는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오티드 610 내지 642

클로닝 프라이머:

SEQ ID NO:34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC (CUB에 대한 5' PCR)

SEQ ID NO:35 GGAATTCCTAGGCTGCATA (CUB에 대한 3' PCR)

SEQ ID NO:36 GGAATTCCTACAGGGCGCT (CUBIEGF에 대한 3' PCR)

SEQ ID NO:37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT (CUBIEGFCUBII에 대한 3' PCR)

SEQ ID NOS:38 내지 47은 인간화된 항체에 대한 클로닝 프라이머이다.

SEQ ID NO:48은 9 aa 펩티드 결합이다.

발현 벡터:

SEQ ID NO:49는 MASP-2 미니유전자 삽입물이다.

SEQ ID NO:50은 쥐과 동물의 MASP-2 cDNA이다.

SEQ ID NO:51은 쥐과 동물의 MASP-2 단백질 (w/리더)이다.

SEQ ID NO:52는 성숙한 쥐과 동물의 MASP-2 단백질이다.

SEQ ID NO:53은 래트 MASP-2 cDNA이다.

SEQ ID NO:54는 래트 MASP-2 단백질 (w/리더)이다.

SEQ ID NO:55는 성숙한 래트 MASP-2 단백질이다.

SEQ ID NO:56 내지 59는 인간 MASP-2A를 생성하기 위해 사용된 인간 MASP-2 의 부위-특정된 돌연변이생성을 위한 올리고뉴클레오티드이다.

SEQ ID NO:60 내지 63은 쥐과 동물의 MASP-2A를 생성하기 위한 쥐과 동물의 MASP-2의 부위-특정된 돌연변이생성을 위한 올리고뉴클레오티드이다.

SEQ ID NO:64 내지 65는 래트 MASP-2A를 생성하기 위한 래트 MASP-2의 부위-특정된 돌연변이생성을 위한 올리고뉴클레오티드이다.

SEQ ID NO:66 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 중쇄 가변 영역 (VH) (신호 펩티드 없음)을 코드화하는 DNA

SEQ ID NO:67 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩티드

SEQ ID NO:68 17N16mc 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩티드

SEQ ID NO:69: 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 경쇄 가변 영역 (VL)을 코드화하는 DNA

SEQ ID NO:70: 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩티드

SEQ ID NO:71: 17N16_dc17N9 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩티드

상세한 설명

본 발명은 고전적 경로는 무상으로 남기면서 렉틴 중재된 MASP-2 경로를 억제하는 것이 가능하다는 본 발명자들에 의한 놀라운 결과를 기초로 한다. 본 발명은 또한 면역 시스템의 고전적 (C1q-의존성) 경로 성분을 무상으로 남기면서 렉틴-중재된 보체 경로 활성화와 관련된 세포 손상을 억제하기 위한 치료적 표적으로서의 MASP-2의 사용을 설명한다.

I. 정의

본원에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 용어는 본 발명의 기술분야의 숙련자들에 의해 인지되는 것과 같은 의미를 가진다. 다음의 정의들은 그것들이 본 발명을 기술하기 위해 명세서 및 청구범위에서 사용되는 한 그 용어들에 대해 명료함을 제공하기 위해 제공된다.

본원에서 사용되는 용어 "MASP-2-의존성 보체 활성화"는 렉틴 경로의 MASP-2-의존성 활성화를 포함하고, 그것은 렉틴 경로 C3 전환효소 C4b2a의 형성을 유도하는 생리적 조건하에 (즉 Ca⁺⁺의 존재하에) 및 C3 절단 생성물 C3b의 후속적인 C5 전환효소 C4b2a(C3b)n으로의 축적시에 일어나며, 그것은 주로 옵소닌화를 유발하는 것으로 측정되었다.

본원에서 사용되는 용어 "대체 경로"는 예를 들어 진균 및 효모 세포벽으로부터의 자이모산, 그람 네거티브 외부막 및 토끼 적혈구로부터의 다당 (LPS), 뿐만 아니라 많은 순수한 다당, 토끼 적혈구, 바이러스, 박테리아, 동물 종양 세포, 기생충 및 손상된 세포로부터의 자이모산에 의해 야기되고, 전통적으로 보체 인자 C3로부터 C3b의 자발적인 단백질 가수분해적 생성으로부터 발생하는 것으로 여겨지고 있는 보체 활성화를 말한다.

본원에서 사용되는 용어 "렉틴 경로"는 만난-결합 렉틴 (MBL), CL-11 및 피콜린 (H-피콜린, M-피콜린 또는 L-피콜린)을 포함하여 혈청 및 비-혈청 탄수화물-결합 단백질의 특이적 결합을 통해 일어나는 보체 활성화를 말한다.

본원에서 사용되는 용어 "고전적 경로"는 외래 입자에 결합된 항체에 의해 야기되고 인식 분자 C1q의 결합을 필요로 하는 보체 활성화를 말한다.

본원에서 사용되는 용어 "MASP-2 억제제"는 MASP-2에 결합하거나 직접 상호작용하고 항-MASP-2 항체 및 그것의 MASP-2 결합 단편, 천연 및 합성 펩티드, 작은 분자, 가용성 MASP-2 수용체, 발현 억제제 및 분리된 천연 억제제를 포함하여 MASP-2-의존성 보체 활성화를 효과적으로 억제하며, 또한 렉틴 경로에서 다른 인식 분자 (예컨대 MBL, H-피콜린, M-피콜린 또는 L-피콜린)에 결합하기 위해 MASP-2와 경합하는 펩티드들을 포함하지만, 그런 다른 인식 분자에 결합하는 항체들은 포함하지 않는 어떠한 제제를 말한다. 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제제는 MASP-2-의존성 보체 활성화를 20% 이상, 예컨대 50% 이상, 예컨대 90% 이상 감소시킬 수 있다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2-의존성 보체 활성화를 90% 이상 감소시킨다 (즉 단지 10% 미만의 MASP-2 보체 활성화를 초래한다).

본원에서 사용되는 용어 "항체"는 어떠한 항체-생성 포유류 (예컨대 마우스, 래트, 토끼 및 인간을 포함하는 영장류)로부터 또는 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현 또는 유전자 도입 동물 (또는 항체 또는 항체 단편을 생성하는 다른 방법)로부터 유도된, 표적 폴리펩티드, 예컨대 예를 들면 MASP-2, 폴리펩티드 또는 그것의 부분들에 특이적으로 결합하는 항체들 및 그것의 항체 단편들을 포함한다. 용어 "항체"는 항체의 공급원 또는 그것이 만들어지는 (예컨대 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 유전자도입 동물, 펩티드 합성 등에 의해) 방식에 관련된 것으로서 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 예시적인 항체는 다클론성, 단클론성 및 재조합 항체; 전체 특이성, 다중특이성 항체 (예컨대 이중특이성 항체, 삼중특이성 항체); 인간화된 항체; 쥐과 동물의 항체; 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 단클론성 항체; 및 항-이디오타입 항체를 포함하고, 어떠한 무상 항체 또는 그것의 단편일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 무상 다클론성 또는 단클론성 항체뿐 아니라 그것의 단편들 (예컨대 dAb, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단일 사슬 (ScFv), 그것의 합성 변이체, 자연 발생 변이체, 필요한 특이성의 항원-결합 단편을 가지는 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 항체, 키메라 항체 및 필요한 특이성의 항원-결합 부위 또는 단편 (에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 어떠한 다른 변형된 형태를 포함한다.

"단클론성 항체"는 단클론성 항체가 에피토프의 선택적 결합에 포함되는 아미노산들 (자연 발생 및 비-자연 발생)로 구성되는 균질한 항체 집단을 말한다. 단클론성 항체들은 표적 항원에 매우 특이적이다. 용어 "단클론성 항체"는 무상 단클론성 항체 및 전-길이 단클론성 항체뿐 아니라 그것들의 단편들 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단일 사슬 (ScFv), 그것의 변이체, 항원-결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 단클론성 항체, 키메라 항체 및 에피토프에 결합하는 필요한 특이성 및 능력의 항원-결합 단편 (에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 어떠한 다른 변형된 형태를 포함한다. 그것은 항체의 공급원 또는 그것이 만들어지는 (예컨대 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 유전자도입 동물 등에 의해) 방식에 대한 것으로 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 용어는 상기에서 "항체"의 정의하에 기술된 전체 면역글로불린뿐 아니라 항체 등도 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "항체 단편"은 전-길이 항체로부터 유도되거나 그것에 관련된 부분, 예컨대 예를 들면 일반적으로 그것의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함하여 항-MASP-2 항체를 말한다. 항체 단편의 예시적인 실례는 Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂ 및 Fv 단편, scFv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이성 항체들을 포함한다.

본원에서 사용되는 "단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함하며, 이때 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬로 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 추가로 V_H과 V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 포함하고, 그것은 scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성하는 것을 가능하게 한다.

본원에서 사용되는 "키메라 항체"는 비-인간 종 (예컨대 설치류) 항체로부터 유도된 가변 도메인과 상보성-결정 영역을 함유하는 한편 항체 분자의 나머지는 인간 항체로부터 유도되는 재조합 단백질이다.

본원에서 사용되는 "인간화된 항체"는 인간 항체 프레임워크에 이식된 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 특이적인 상보성-결정 영역에 순응하는 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 인간화된 항체는 전형적으로 항체 상보성-결정 영역만이 비-인간 기원의 것인 재조합 단백질이다.

본원에서 사용되는 용어 "만난-결합 렉틴" ("MBL")은 만난-결합 단백질 ("MBP")에 동등하다.

본원에서 사용되는 "막 공격 복합체" ("MAC")는 막에 삽입되어 파괴하는 말단의 5개의 보체 성분의 복합체 (C6, C7, C8 및 C-9와 조합된 C5b)(또한 C5b-9로도 언급됨)를 말한다.

본원에서 사용되는 "대상"은 제한 없이 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 말, 양, 염소, 소, 토끼, 돼지 및 설치류를 포함하여 모든 포유류를 포함한다.

본원에서 사용되는 아미노산 잔기는 다음과 같이 약칭된다: 알라닌 (Ala;A), 아스파라긴 (Asn;N), 아스파르트산 (Asp;D), 아르기닌 (Arg;R), 시스테인 (Cys;C), 글루탐산 (Glu;E), 글루타민 (Gln;Q), 글리신 (Gly;G), 히스티딘 (His;H), 아이소로이신 (Ile;I), 로이신 (Leu;L), 라이신 (Lys;K), 메티오닌 (Met;M), 페닐알라닌 (Phe;F), 프롤린 (Pro;P), 세린 (Ser;S), 트레오닌 (Thr;T), 트립토판 (Trp;W), 타이로신 (Tyr;Y) 및 발린 (Val;V).

광범위한 의미로, 자연 발생 아미노산은 각각의 아미노산의 측쇄의 화학적 특성에 기초하여 여러 그룹으로 나누어질 수 있다. "소수성" 아미노산은 Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys 또는 Pro 중 어느 하나를 의미한다. "친수성" 아미노산은 Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His 중 어느 하나를 의미한다. 이런 아미노산의 그룹화는 다음과 같이 한층 더 하위분류될 수 있다. "대전되지 않은 친수성" 아미노산은 Ser, Thr, Asn 또는 Gln 중 어느 하나를 의미한다. "산성" 아미노산은 Glu 또는 Asp 중 어느 하나를 의미한다. "염기성" 아미노산은 Lys, Arg 또는 His 중 어느 하나를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "보존성 아미노산 치환"은 다음 그룹 중 각각에 속하는 아미노산들 중에서의 치환에 의해 예시된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 로이신 및 아이소로이신, (2) 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파테이트 및 글루타메이트, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘.

본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 중합체 또는 그것들의 모방물을 말한다. 이 용어는 또한 자연-발생 뉴클레오티드, 당 및 공유 뉴클레오시드간 (골격) 연쇄로 구성되는 올리고뉴클레오염기뿐 아니라 비-자연-발생 변형을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본원에서 사용되는 "에피토프"는 항체에 의해 결합되는 단백질 (예컨대 인간 MASP-2 단백질) 상의 부위를 말한다. "중복하는 에피토프"는 선형 및 비-선형 에피토프를 포함하여, 적어도 하나 (예컨대, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 공통 아미노산 잔기(들)을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 상호교화적으로 사용되며 길이 또는 번역-후 변형과 관계없이 아미노산들의 어떠한 펩티드-연결된 사슬을 의미한다. 본원에서 기술된 MASP-2 단백질은 야생형 단백질을 함유하거나 그것일 수 있고 또는 50 이하 (예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 50 이하)의 보존성 아미노산 치환을 가지는 변이체일 수 있다. 보존성 치환은 전형적으로 다음 그룹내에 있는 치환을 포함한ㄷ: 글리신 및 알라닌; 발린, 아이소로이신 및 로이신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 라이신, 히스티딘 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 타이로신.

일부 구체예에서, 인간 MASP-2 단백질은 SEQ ID NO:5에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 인간 MASP-2 단백질에 70% 또는 그 이상 (예컨대 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 펩티드 단편은 적어도 6 (예컨대 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 또는 600 또는 그 이상)개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다 (예컨대 SEQ ID NO:5의 적어도 6개의 연속적인 아미노산 잔기). 일부 구체예에서, 인간 MASP-2 단백질의 항원성 펩티드 단편은 500보다 적은 (예컨대 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 또는 6보다 적은) (예컨대 SEQ ID NO:5의 어느 하나의 500보다 적은 연속적인 아미노산 잔기) 아미노산 잔기의 길이이다.

퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성은 서열들을 배열하고 필요에 따라 최대 퍼센트 서열 동일성을 이루기 위해 갭을 도입한 후, 참조 서열의 아미노산에 동일한 후보 서열의 아미노산의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 서열 동일성을 측정할 목적으로 한 배열은 기술분야의 숙련도 내에 있는 다양한 방법, 예를 들면 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 대중적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 이루어질 수 있다. 비교될 전-길이 서열에 대한 최대 배열을 이루기 위해 필요한 어떠한 알고리즘을 포함하여 배열을 측정하기 위한 적절한 변수들은 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.

II. 발명의 개관

렉틴 (MBL, M-피콜린, H-피콜린, L-피콜린 및 CL-11)은 선천적인 보체 시스템을 야기하는 특이한 인식 분자들이고 그 시스템은 렉틴 개시 경로 및 말단 보체 이펙터 분자들의 렉틴-개시된 활성화를 증폭시키는 관련된 말단 경로 증폭 루프를 포함한다. C1q는 후천적 보체 시스템을 야기하는 특이한 인식 분자이고 그 시스템은 고전적 개시 경로 및 말단 보체 이펙터 분자들의 C1q-개시된 활성화를 증폭시키는 관련된 말단 경로 증폭 루프를 포함한다. 본 발명자들은 이들 두 가지 주요 보체 활성화를 각각 렉틴-의존성 보체 시스템 및 C1q-의존성 보체 시스템으로서 언급한다.

면역 방어에서의 필수적인 역할 외에, 보체 시스템은 많은 임상적 상태에서 조직 손상에 기여한다. 그러므로 이들 부작용을 예방하기 위해 치료적으로 효과적인 보체 억제제를 개발해야 할 절실한 필요가 있다. 렉틴 중재된 MASP-2 경로를 억제하는 한편 고전적 경로를 무상으로 남겨두는 것이 가능하다는 인식을 하면, 보체의 면역 방어 능력을 완전히 폐쇄시키지 않으면서 특정 병리를 유발하는 보체 활성화 시스템만을 특이적으로 억제하는 것이 매우 바람직할 것임을 깨닫게 된다. 예를 들어, 보체 활성화가 렉틴-의존성 보체 시스템에 의해 우선적으로 중재되는 질환 상태에서, 이 시스템만을 특이적으로 억제하는 것이 유리할 것이다. 이것은 감염에 대항하여 면역 복합체 프로세싱을 취급하고 숙주 방어를 보조하기 위해 C1q-의존성 보체 활성화 시스템을 무상으로 남겨둘 수 있다.

렉틴-의존성 보체 시스템을 특이적으로 억제하기 위한 치료제의 개발에서 표적화하기에 바람직한 단백질 성분은 MASP-2이다. 렉틴-의존성 보체 시스템의 공지된 모든 단백질 성분들 (MBL, H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린, MASP-2, C2-C9, 인자 B, 인자 D 및 프로퍼딘) 중에서 단지 MASP-2만이 렉틴-의존성 보체 시스템에 대해 독특하고 시스템의 기능에도 필요하다. 렉틴들 (MBL, H-피콜린, M-피콜린,L-피콜린 및 CL-11)은 또한 렉틴-의존성 보체 시스템의 독특한 성분들이다. 그러나, 렉틴 성분들 중 어떠한 하나의 손실이라도 렉틴의 불필요한 중복 때문에 본질적으로 시스템의 활성화를 억제하지 못할 것이다. 렉틴-의존성 보체 활성화 시스템의 억제를 보장하기 위해 5가지의 모든 렉틴을 억제하는 것이 필요할 것이다. 나아가, MBL과 피콜린들은 또한 보체와 상관없이 옵소닌 활성을 가지는 것으로 알려져 있기 때문에, 렉틴 기능의 억제는 감염에 대항하는 이런 유익한 숙주 방어 메커니즘의 손실을 초래할 것이다. 대조적으로, 이 보체-의존성 렉틴 옵소닌 활성은 만약 MASP-2가 억제 표적이라면 무상으로 남아 있을 것이다. 렉틴-의존성 보체 활성화 시스템을 억제하기 위한 치료제로서의 MASP-2의 부가된 유익은 MASP-2의 혈장 농도가 어떠한 보체 단백질 중에서 가장 낮다 (~ 500　ng/ml)는 것이고; 그러므로 대응하는 낮은 농도의 MASP-2의 고-친화성 억제제가 전체 억제를 얻기에 충분할 수 있다 (Moller-Kristensen, M.,　et　al., J. Immunol Methods 282:159-167, 2003).

III. 혈전성 미세혈관병증에서 MASP-2의 역할 및 MASP-2 억제제를 사용하는 치료 방법

개관

혈전성 미세혈관병증 (TMA)은 작은 혈관에서의 혈액 응고를 특징으로 하는 병리이다 (Benz, K.; et al., Curr Opin Nephrol Hypertens 19(3):242-7 (2010)). 밑에 있는 혈관 내피에 대한 스트레스 또는 손상이 일차적인 동인 (driver)이다. TMA의 임상적 및 실험실 결과는 혈소판 감소증, 빈혈, 자반병 및 신부전을 포함한다. 고전적 TMA는 용혈성 요독 증후군 (HUS) 및 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP)이다. TMA의 특징적인 기저 병리적 특징은 작은 세동맥 및 작은 정맥에서의 혈소판 활성화 및 미세혈전의 형성이다. 적어도 부분적으로 미세혈관 내피에 대한 손상 또는 스트레스에 의해 개시된 보체 활성화는 또한 파국성 항인지질 증후군 (CAPS), 전신성 데고스병 및 암, 암 화학요법 및 이식에 이차적인 TMA를 포함하여 다른 TMA에도 포함된다.

신염군 (nephritides)의 숙주에서 보체의 병리적 역할에 대한 직접적인 증거는 특이적 보체 성분들의 유전적 결핍을 가지는 환자들의 연구에 의해 제공된다. 많은 문서에서 보체 조절 인자 H의 결핍과 신장 손상이 결합되어 있다고 보고되었다 (Ault, B.H., Nephrol. 14:1045-1053, 2000; Levy, M.,　et　al., Kidney Int. 30:949-56, 1986; Pickering, M.C.,　et　al., Nat. Genet. 31:424-8, 2002). 인자 H 결핍증은 인자 B 및 C3의 활성화-관련된 소모로 인해 이들 성분들의 낮은 혈장내 수준을 초래한다. C5b-9의 순환하는 수준은 또한 이들 환자의 혈청에서 상승되는데, 그것은 보체 활성화를 시사한다. 막성 증식성 사구체신염 (MPGN) 및 특발성 용혈성 요독 증후군 (HUS)은 인자 H 결핍증 또는 인자 H의 돌연변이와 관련된다. 인자 H-결핍 돼지 (Jansen, J.H., et　al., Kidney Int. 53:331-49, 1998) 및 인자-H 녹아웃 마우스 (Pickering, M.C., 2002)는 MPGN-유사 증후군을 나타내는데, 그것은 보체 조절에서 인자 H의 중요성을 확인해준다. 다른 보체 성분들의 결핍은 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)의 발달에 이차적인 신장 질환과 관련된다 (Walport, M.J., Davies,　et　al., Ann. N.Y. Acad. Sci.　815:267-81, 1997).　C1q, C4 및 C2에 대한 결핍증은 면역 복합체 및 아폽토시스성 물질의 결함이 있는 클리어런스에 관련된 메커니즘을 통해 강력하게 SLE가 발생하게 만든다. 이들 SLE 환자의 많은 수에서 사구체 전체를 통한 면역 복합체의 침착을 특징으로 하는 루푸스 신염이 발생한다.

aHUS

비정형인 용혈성 요독 증후군 (aHUS)은 "혈전성 미세혈관병증"으로 명명된 상태의 그룹중 일부이다. HUS의 비정형 형태 (aHUS)에서, 질환은 결함성 보체 조절과 관련되고 산발적이거나 가족성일 수 있다. aHUS의 가족성 경우는 보체 인자 H, 인자 I, 인자 B, 막 보조인자 CD46과 뿐만 아니라 보체 인자 H-관련 단백질 1 (CFHR1) 및 보체 인자 H-관련 단백질 3 (CFHR3)을 포함하여, 보체 활성화 또는 보체 조절 단백질을 코드하는 유전자의 돌연변이와 관련된다 (Zipfel, P.F., et al., PloS Genetics 3(3):e41 (2007)). aHUS와 관련된 유전자 돌연변이의 이런 다양한 어레이의 일관된 특징은 세포 또는 조직 표면 상에서의 증강된 보체 활성화에 대한 소인이다. 그러므로, 본 발명의 한 측면은 인자 H 결핍과 관련된 aHUS에 걸린 환자를 유효량의 MASP-2 억제제를 투여함으로써 치료하는 것을 포함한다. 본 발명의 다른 측면은 인자 I, 인자 B, 막 조인자 CD46, CFHR1 또는 CFHR3 결핍과 관련된 HUS에 걸린 환자를 유효량의 MASP-2 억제제를 투여함으로써 치료하는 것을 포함한다.

최근 돌연변이 보체 인자들의 다양한 세트에 의해 유발된 aHUS에서 증강된 보체 활성화의 기저를 이루는 분자 병리학의 이해에 대해 중요한 진전이 이루어졌다. 이 메커니즘은 인자 H 돌연변이에 대해 가장 잘 이해된다. 인자 H는 숙주 세포 표면에서뿐 아니라 용액에서도 보체 활성화의 네거티브 조절제로서 작용하는 20개의 짧은 일치 반복 (SCR) 도메인을 포함하는 풍부한 혈청 단백질이다. 그것은 C3의 활성화된 형태를 표적으로 하고, 인자 I 및 다른 조인자들과 함께 그것의 비활성화를 촉진하여 추가의 보체 활성화를 미연에 예방한다. 숙주 표면 상에서 보체 활성화를 효과적으로 제어하기 위하여, 인자 H는 숙주 세포와 상호작용할 필요가 있고, 그것은 SCR 도메인 16 내지 20에 의해 중재된다. 지금까지 기술된 aHUS와 관련된 모든 인자 H 돌연변이는 (SCR) 도메인 16 내지 20을 포함하고 있는 C-말단 영역에 모인다. 이들 돌연변이 인자 H 단백질들은 용액에서 C3 활성화를 제어할 때에 충분히 기능하지만, 숙주 세포 표면과는 상호작용할 수 없고, 따라서 세포 표면상에서 C3 활성화를 제어할 수 없다 (Exp Med 204(6):1249-56 (2007)). 그러므로, 인자 H의 특정 돌연변이는, 돌연변이 인자 H 단백질이 숙주 세포 표면과 상호작용할 수 없고 그로써 미세혈관 내피를 포함하여 숙주 세포 표면 상에서 보체 활성화를 효과적으로 하향 조절할 수 없기 때문에 aHUS와 관련된다. 그 결과로서, 일단 초기 C3 활성화가 발생하면, 미세혈관 내피 표면 상에서의 후속적인 보체 활성화가 인자 H 돌연변이를 가지고 있는 환자들에서 조금도 수그러들지 않고 진행된다. 보체의 이런 제어되지 않는 활성화는 궁극적으로 혈관 내피에 대한 점진적인 손상, 후속적인 혈소판 응집 및 미세혈관 응고, 및 부분적으로 폐색된 미세혈관을 통한 RBC의 전단응력에 의해 유발된 용혈을 유도한다. 그러므로, aHUS 질환의 징후 및 임상적이고 실험적인 결과들은 미세혈관 내피의 표면 상에서의 보체의 네거티브 조절의 결핍에 직접적으로 관련된다.

인자 H 돌연변이에 유사하게, 네거티브 보체 조절제 인자 I 및 막 조인자 단백질 (CD46)에서의 기능-손실 돌연변이는 또한 aHUS에 관련된다. 그 반대는 인자 B에 대해 관찰되었는데, 그 aHUS에서 C3 단백질은 이들 단백질에서의 기능-획득 돌연변이와 관련되어 있는 것으로 밝혀졌다 (Pediatr Nephrol 25(12):2431-42 (2010)). 그러므로, 수렴되는 데이터의 숙주는 aHUS 발병에서 보체 활성화를 시사한다. 이런 개념은 aHUS의 치료에서 말단 보체 단백질 C5를 차단하는 단클론성 항체인 치료 효능 오페쿨리주맙 (ofeculizumab)에 의해 가장 설득력있게 지지된다.

aHUS에서 이펙터 메커니즘으로서 보체의 중심 역할은 광범위하게 수용되고 있는 한편, 보체 활성화 및 그것에 포함된 분자 경로를 개시하는 야기제 (trigger)는 아직 해명되지 않았다. 상기 기술된 돌연변이를 포함하는 개체들이 모두 aHUS를 발생시키는 것은 아니다. 실제로, 가족력 연구는 aHUS의 침투도가 단지 ~50%에 불과한 것을 제시하였다 (Ann Hum Genet 74(1):17-26 (2010)). 그 질환의 자연사 (natural history)는 aHUS가 감염 에피소드 또는 손상과 같은 초기 사건 후에 가장 자주 발생하는 것을 제시한다. 감염원은 보체 시스템을 활성화시키는 것으로 잘 알려져 있다. 기존의 적응성 면역이 없을 때, 감염원에 의한 보체 활성화는 렉틴 경로를 통해 주로 개시될 수 있다. 그러므로 감염에 의해 야기된 렉틴 경로 활성화는 aHUS-성향이 있는 개체에서 보체 활성화의 후속적인 병리적 증폭에 대한 초기 야기제를 대표할 수 있고, 그것은 궁극적으로 질환의 진전을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 감염에 이차적인 aHUS에 걸린 환자를 유효량의 MASP-2 억제제를 투여함으로써 치료하는 것을 포함한다.

숙주 조직에 대한 다른 형태의 손상, 특히 혈관 내피에 대한 손상은 렉틴 경로를 통해 보체를 활성화할 것이다. 예를 들어 산화성 스트레스를 받은 인간 혈관 내피 세포들은 렉틴에 결합하여 보체의 렉틴 경로를 활성화시키는 표면 부분을 발현시킴으로써 반응한다 (Am J. Pathol 156(6):1549-56 (2000)). 허혈/재관류에 이어지는 혈관 손상 또한 생체 내에서 렉틴 경로를 통해 보체를 활성화한다 (Scand J Immunol 61(5):426-34 (2005)). 이런 환경에서 렉틴 경로 활성화는 숙주에 대해 병리적 결과를 나타내고, MASP-2를 차단함으로써 렉틴 경로를 억제하는 것은 추가의 숙주 조직 손상 및 해로운 결과를 예방한다 (Schwaeble PNAS 2011).

그러므로, aHUS를 침전시키는 다른 과정 또한 보체의 렉틴 경로를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 그러므로 렉틴 경로는 유전적으로 aHUS를 보일 성향이 있는 개체에서 조절되지 않은 방식으로 부적절하게 증폭되는 초기 보체 활성화 메커니즘을 나타내고, 그로써 aHUS 발병을 개시할 수 있는 것 같다. 추론하면, 항-MASP-2 항체들을 포함하여, 렉틴 경로를 통해 보체의 활성화를 차단하는 제제들은 aHUS 민감성 개체들에서 질환 진전을 예방하거나 악화를 감소킬 것으로 예상된다.

이런 개념을 한층 더 지지하는 것으로, 최근의 연구들은 소아과 aHUS 경우에 중요한 발병원으로서 S. 뉴모니아(S. pneumonia)를 확인하였다 (Nephrology (Carlton), 17:48-52 (2012); Pediatr Infect Dis J. 30(9):736-9 (2011)). 이 특정 병인학은 상당한 사망률 및 장기간 병적상태라는, 바람직하지 못한 예후를 가진 것으로 나타난다. 특히, 이들 경우는 aHUS 성향이 있는 것으로 알려진 보체 유전자의 동시발생적인 돌연변이의 증거 없이 미세혈관병증, 요독증 및 용혈을 유도하는 비-장 감염을 포함하였다. S. 뉴모니아는 보체를 활성화할 때 특히 효과적이고, 렉틴 경로를 통해 우선적으로 그렇게 작용하는 것을 주지하는 것이 중요하다. 그러므로, 폐렴성 구균 감염과 관련된 비-장 HUS의 경우에, 미세혈관병증, 요독증 및 용혈의 징후들은 우선적으로 렉틴 경로의 활성화에 의해 구동될 것으로 예상되고, 항-MASP-2 항체를 포함하여 렉틴 경로를 차단하는 제제들은 이들 환자에서 aHUS의 진전을 예방하거나 질환의 심각성을 감소시킬 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 다른 측면은 S.뉴모니아 감염과 관련된 비-장 aHUS에 걸린 환자를 유효량의 MASP-2 억제제를 투여함으로써 치료하는 것을 포함한다.

전술한 것에 따르면, 일부 구체예에서, 대상이 aHUS와 관련된 신장 질환에 걸릴 위험이 있는 환경에서, aHUS의 발달 가능성 또는 aHUS와 관련된 신장 질환에 걸릴 가능성을 감소시키는 방법이 제공되며, 그 방법은 대상의 신장 질환을 개선시키거나 예방하기에 효과적인 시간 동안 AMSP-2 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 그 방법은 추가로 대상이 aHUS와 관련된 어떠한 증상의 개시 전에 aHUS에 걸릴 위험이 있는지의 여부를 측정하는 단계를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 방법은 대상이 aHUS의 적어도 하나 또는 그 이상의 증상들 (예컨대 빈혈, 혈소판 감소증 및/또는 신부전증의 존재)이 개시될 때 및/또는 그 대상으로부터 얻어진 생검에서 혈전성 미세혈관병증이 존재할 때 aHUS에 걸릴 위험이 있는지의 여부를 측정하는 것을 포함한다. 대상이 aHUS에 걸릴 위험이 있는지의 여부를 측정하는 것은 대상이 aHUS에 걸릴 유전적 성향을 가지는가를 측정하는 것을 포함하고, 그것은 유전 정보를 (예컨대 대상의 유전형을 포함하고 있는 데이터베이스로부터) 평가하거나, 또는 aHUS와 관련된 유전자 마커의 존재 또는 부재를 측정하기 위해 게놈 서열화 또는 유전자-특이적 분석 (예컨대 PCR 분석)을 통해 대상에 대해 적어도 하나의 유전자 스크리닝 시험을 수행함으로써 (즉 보체 인자 H (CFH), 인자 I (CFI), 인자 B (CFB), 막 조인자 CD46, C3, 보체 인자 H-관련 단백질 1 (CFHR1) 또는 THBD (항응고 단백질 트롬보둘린을 코드화함) 또는 보체 인자 H-관련 단백질 3 (CFHR3) 또는 보체 인자 H-관련 단백질 4 (CFHR4)를 코드화하는 유전자들에서 aHUS와 관련된 유전자 돌연변이의 존재 또는 부재를 측정함), 및/또는 대상이 aHUS의 가족력을 가지는지의 여부를 측정함으로써 수행될 수 있다. aHUS와 관련된 유전자 돌연변이의 존재 또는 부재에 대한 유전자 스크리닝 방법은 잘 수립되어 있고, 예를 들면 다음을 참조한다: Noris M et al. "Atypical Hemolytic-Uremic Syndrome," 2007 Nov 16 [Updated 2011 Mar 10]. In: Pagon RA, Bird TD, Dolan CR, et al., editors. GeneReviews^TM, Seattle (WA): University of Washington, Seattle.

예를 들어, 보체 인자 H (CFH)의 돌연변이를 가지고 있는 개체들에서 질환의 전체 침투도는 48%이고, CD46에서 돌연변이에 대한 침투도는 53%이며, CFI에서 돌연변이에 대한 침투도는 50%이고, C3에서 돌연변이에 대한 침투도는 56%이며, THBD에서 돌연변이에 대한 침투도는 64%이다 (Caprioli J. et al., Blood, 108:1267-79 (2006); Noris et al., Clin J Am Soc Nephrol 5:1844-59 (2010)). 문헌에서 기술된 것과 같이 (Caprioli et al., (2006), 상기동일), 보체 인자 H (CFH)에 돌연변이를 가지고 있는 개체들은 상당수가 결코 aHUS에 걸리지 않으며, 이들 개체에서 차선적인 CFH 활성은 생리적 조건에서 보체 활성화의 효과로부터 숙주를 보호하기에 충분하다고 가설을 세울 수 있지만, 차선적인 CFH 활성은 보체를 활성화시키는 제제에 C3b의 정상적인 양보다 높은 양으로 노출될 때 C3b가 혈관의 내피 세포상에 침착되는 것을 예방하기에는 충분하지 않다.

따라서, 한 구체예에서, 비-인자 H-의존성 비정형 용혈성 요독성 증후군에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상에서 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되며, 그 방법은 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 그 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 인자 H-의존성 비정형 용혈성 요독성 증후군에 걸릴 위험이 있는 대상에서 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되며, 그 방법은 빈혈, 혈소판 감소증 또는 상승하는 크레아티닌의 존재 또는 부재를 측정하기 위하여 대상을 주기적으로 모니터링하고, 빈혈, 혈소판 감소증 또는 상승하는 크레아티닌의 존재가 측정될 때 MASP-2 억제제로 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 인자 H-의존성 aHUS에 걸릴 위험이 있는 대상이 aHUS와 관련된 임상적 증상들로 고생할 가능성을 감소시키기 위한 방법이 제공되며, 그 방법은 MASP-2 억제제를 aHUS 임상적 증상들을 야기하는 것과 관련된 것으로 알려져 있는 사건, 예를 들면 약물 노출 (예컨대 화학요법), 감염 (예컨대 박테리아 감염), 악성 종양, 손상, 기관 또는 조직 이식 또는 임신 전, 중 또는 후에 투여하는 것을 포함한다.

한 구체예에서, aHUS에 걸릴 위험이 있는 대상이 aHUS와 관련된 임상적 증상들로 고생할 가능성을 감소시키기 위한 방법이 제공되며, 그 방법은 빈혈, 혈소판 감소증 또는 상승하는 크레아티닌의 존재 또는 부재를 측정하기 위해 대상을 주기적으로 모니터링하고, 빈혈, 혈소판 감소증 또는 상승하는 크레아티닌의 존재가 측정될 때 MASP-2 억제제로 치료하는 것을 포함한다.

다른 구체예에서, aHUS에 걸릴 위험이 있는 대상이 aHUS와 관련된 임상적 증상들로 고생할 가능성을 감소시키기 위한 방법이 제공되며, 그 방법은 MASP-2 억제제를 aHUS 임상적 증상들을 야기하는 것과 관련된 것으로 알려져 있는 사건, 예를 들면 약물 노출 (예컨대 화학요법), 감염 (예컨대 박테리아 감염), 악성 종양, 손상, 기관 또는 조직 이식 또는 임신 전, 중 또는 후에 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 aHUS 임상적 증상들을 야기하는 것과 관련된 것으로 알려져 있는 사건의 적어도 1, 2, 3, 4일 또는 그 이상의 기간 전, 중 또는 후에 투여되며, 상태가 해소되었거나 제어될 때까지 의사의 결정에 따라 반복될 수 있다. aHUS-전 환경에서, MASP-2 억제제는 대상에게 전신적으로, 예컨대 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 코, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해 투여될 수 있다.

일부 구체예에서, aHUS의 초기 진단의 환경에서, 또는 aHUS의 진단과 일치하는 하나 또는 그 이상의 증상 (예컨대 빈혈, 혈소판 감소증 및/또는 신부전증의 존재)을 나타내는 대상에서, 대상은 혈장 사혈 (plasmapheresis)의 부재시 제일선 치료법으로서 또는 혈장 사혈과 함께 MASP-2 억제제 (예컨대 항-MASP-2 항체)의 유효량으로 치료된다. 제일선 치료법의 결과로서, MASP-2 억제제는 대상에게 전신적으로, 예컨대 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 코, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 출혈, 감염 및 혈장 공여자에게 고유한 장애 및/또는 알레르기에 대한 노출을 포함하는, 혈장 사혈의 잠재적 합병증을 피하기 위하여, 또는 그렇지 않으면 혈장 사혈을 꺼려하는 대상에서 또는 혈장 사혈을 실시할 수 없는 환경에서, 혈장 사혈의 부재시의 제일선 치료법으로서 대상에게 투여된다.

일부 구체예에서, 방법은 제 1 기간 (예컨대 적어도 하루 내지 1주 또는 2주) 동안 카테테르 (예컨대 정맥 내)를 통하여 aHUS에 걸린 대상에게 MASP-2 억제제를 투여하고 이어서 제 2 기간 (예컨대 적어도 2주 이상의 만성 단계) 동안 대상에게 MASP-2 억제제를 피하로 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제 1 및/또는 제 2 기간의 투여는 혈장 사혈의 부재시에 일어난다. 일부 구체예에서, 방법은 추가로 치료 전, 임의로 치료 중에 대상에서 적어도 하나의 보체 인자 (예컨대 C3, C5)의 수준을 측정하는 것을 더 포함하며, 이때 표준값 또는 건강한 대조 대상에 비교하여 적어도 하나의 보체 인자의 감소된 수준의 측정은 MASP-2 억제제로의 지속적인 치료에 대한 필요성을 나타낸다.

일부 구체예에서, 방법은 MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체를 aHUS에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상에게, 정맥 내로, 근육 내로 또는 바람직하게 피하로 투여하는 것을 포함한다. 치료는 만성일 수 있고 매일 내지 월마다 투여될 수 있지만, 바람직하게 2주마다 투여된다. 항-MASP-2 항체는 단독으로, 또는 C5 억제제, 예컨대 유클리주맙과 함께 투여될 수 있다.

HUS

비정형 HUS와 같이, HUS의 전형적인 형태는 TMA의 모든 임상적 및 실험적 결과를 나타낸다. 그러나 전형적인 HUS는 자주 소아과 질환이고 통상적으로 가족력 성분이 없거나 보체 유전자의 돌연변이와 직접적인 관련이 없다. 전형적인 HUS의 병인학은 특정 장 병원체로의 감염과 밀착되게 연관되어 있다. 환자들은 전형적으로 급성 신부전, 헤모글로빈 뇨증 및 혈소판 감소증을 나타내며, 전형적으로 혈리 (bloody diarrhea)가 수반된다. 그 상태는 쉬겔라 디센테리아 (Shigella dissenteria), 살모넬라 또는 대장균의 쉬가 독소 (shiga toxin)-계 생성 장출혈 균주, 예컨대 대장균 O157:H7로의 장 감염에 의해 유발된다. HUS는 의료적 긴급상황이고 5 내지 10%의 사망률을 나타낸다. 생존자들의 상당 부분이 만성 신장 질환에 걸리고 (orrigan and Boineau, Pediatr Rev 22 (11): 365-9 (2011)) 신장 이식을 필요로 할 수 있다.

전형적인 HUS에서 미세혈관 응고는 대부분이, 그러나 배타적이지 않게 신장 미세혈관계에서 발생한다. 기저 병리학은 쉬가 독소 (STX)에 의해 중재된다. 장질환 유발 미생물에 의해 장 루멘으로 분비된 STX는 장벽 (intestinal barrier)을 가로질러 혈류로 들어가고 사구체 내피상에서 우선적으로 발현되는 블로보트라이아오실 세라미드 (blobotriaosyl ceramide) 수용체 CD77을 통해 혈관 내피 세포에 결합하여 (Boyd and Lingwood Nephron 51:207 (1989)), STX의 독성 효과를 중재한다. 익단 내피에 결합되면, STX는 혈관 내피를 손상시키는 일련의 사건을 유도하고, 백혈구를 활성화시키며 vWF-의존성 혈전 형성을 유발한다 (Forsyth et al., Lancet 2: 411-414 (1989); Zoja et al., Kidney Int. 62:846-856 (2002); Zanchi et al., J. Immunol. 181:1460-1469 (2008); Morigi et al., Blood 98:1828-1835 (2001); Guessou et al., Infect. Immun., 73: 8306-8316 (2005)). 이들 미세혈전은 신장 및 다른 기관의 세동맥 및 모세혈관을 방해하거나 폐색시킨다. 미세혈전에 의한 세동맥 및 모세혈관에서의 혈류의 방해는 RBC에 적용된 전단력을 증가시키는 동시에 좁아진 혈관을 통해 RBC를 압박하게 된다. 이것은 전단력에 의한 RBC의 파괴 및 분열적혈구라 불리는 RBC 단편들의 형성을 초래할 수 있다. 분열적혈구의 존재는 HUS의 특징적인 결과이다. 이 메커니즘은 미세혈관병성 용혈로서 알려져 있다. 또한, 혈류의 방해는 허혈을 초래하여 병이 난 기관에 추가의 손상을 유발하는 보체-중재된 염증성 반응이 시작된다.

보체의 렉틴 경로는 두 가지 원칙적인 메커니즘에 의해 HUS의 발병에 기여한다: 1) 내피 손상에 의해 유발된 응고 캐스케이드의 MASP-2-중재된 직접적인 활성화 및 2) 미세혈관 혈류의 초기 페색으로부터 유발되는 허혈에 의해 유도된 렉틴-중재된 후속적인 보체 활성화.

STX는 미세혈관 내피 세포를 손상시키고, 손상된 내피 세포는 보체 시스템을 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 상기에서 상세하게 설명된 것과 같이, 내피 세포 손상에 이어지는 보체 활성화는 대부분이 렉틴 경로에 의해 구동된다. 산화성 스트레스를 받는 인간 혈관 내피 세포는 렉틴에 결합하여 보체의 렉틴 경로를 활성화하는 표면 부분들을 발현함으로써 반응한다 (Collard et al., Am J Pathol. 156(5):1549-56 (2000)). 허혈 재관류에 이어지는 혈관 손상은 또한 생체 내에서 렉틴 경로를 통하여 보체를 활성화한다 (Scand J Immunol 61(5):426-34 (2005)). 렉틴 경로 활성화는 이 환경에서 숙주에 대해 병리적 결과를 갖게 되고, 렉틴 경로의 MASP-2의 차단에 의한 억제는 추가로 숙주 조직 손상 및 해로운 결과를 예방한다 (Schwaeble et al., PNAS (2011)). 보체 활성화에 더불어, MASP-2의 렉틴-의존성 활성화는 트롬빈을 형성하고 응고를 촉진하기 위하여 프로트롬빈의 절단을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 손상된 내피 세포에 의한 보체의 렉틴 경로의 활성화는 응고 시스템을 직접적으로 활성화할 수 있다. 그러므로 MASP-2-중재된 프로트롬빈 활성화에 의한 보체의 렉틴 경로는 STX에 의한 초기 내피 손상을 응고 및 HUS에서 일어나는 미세혈관 혈전증에 연결시키는 뚜렷한 분자 경로인 것으로 보인다. 그러므로 그것에 한정되는 것은 아니지만, MASP-2 기능을 차단하는 항체를 포함하여 렉틴 경로 억제제들은 HUS에 걸린 환자들에서 미세혈관 응고, 혈전증 및 용혈을 예방하거나 완화시킬 것으로 예상된다. 실제로 항-MASP-2 항체의 투여는 전형적 HUS의 모델에서 마우스를 분명하게 보호한다. 하기 실시예 36에서 기술되고 도 45에서 알 수 있는 것과 같이, STX 및 LPS에 노출된 대조 마우스들은 모두 심각한 HUS를 발생시켰고 48시간 이내에 빈사상태에 빠지거나 죽었다. 다른 한편으로, 도 45에서 추가로 알 수 있는 것과 같이, 항-MASP-2 항체로 처리된 후 STX 및 LPS에 노출된 마우스들은 모두 생존하였다 (Fisher's exact p<0.01; N=5). 그러므로, 항-MASP-2-치료법은 이 HUS 모델에서 마우스들을 분명하게 보호한다. MASP-2 항체와 같은 MASP-2 억제제의 투여는 HUS 환자들의 치료에서 효과적일 것이고 미세혈관 응고, 혈전증 및 장질환 발생 대장균 또는 다른 STX-생성 병원체로의 감염에 의해 유발된 용혈로부터의 보호를 제공할 것으로 예상된다.

여기서 STX에 의해 유발된 HUS에 대해 보여진 한편으로, 항-MASP-2 치료법은 또한 다른 독성 제제에 의해 유발된 내피 손상으로 인한 HUS-유사 증후군에 대해서도 유익할 것으로 예상된다. 이것은 미토마이신, 티클로피딘, 시크플라틴, 퀴닌, 사이클로스포린, 블레오마이신뿐 아니라 다른 화학요법 약물 및 면역억제 약물과 같은 제제들을 포함한다. 그러므로, 항-MASP-2 항체 요법 또는 AMSP-2 활성을 억제하는 다른 양식은 응고, 혈전 형성 및 RBC 파괴를 효율적으로 예방하거나 제한할 것이도 HUS 및 다른 TMA 관련 질환 (즉 aHUS 및 TTP)에서 신부전을 예방할 것이다.

HUS에 걸린 환자들은 자주 설사 및 구토를 나타내고, 그들의 혈소판 총수는 통상 감소되며 (혈소판 감소증), RBC는 감소된다 (빈혈). HUS-전 설사 단계는 전형적으로 약 4일 동안 지속되며, 그 기간 중에 HUS에 걸릴 위험이 있는 대상들은 전형적으로 심각한 설사 외에 하나 또는 그 이상의 다음 증상들을 나타낸다: 혈관 내 적혈구 파괴의 스미어 증거가 있는 30% 아래의 혈구용적 수준, 혈소판 감소증 (혈소판 총수 < 150 x 10³/mm³) 및/또는 손상된 신장 기능의 존재 (연령별 참조 범위의 상한선보다 높은 혈청 크레아티닌 농도). 빈뇨의 존재 (>1일 동안 요 배설량 ≤0.5 mL/kg/h)는 HUS의 발생을 향한 진전에 대한 척도로서 사용될 수 있다 (C. Hickey et al., Arch Pediatr Adolesc Med 165(10):884-889 (2011) 참조). 시험은 전형적으로 대장균 박테리아 (대장균 O157:H7), 쉬겔라 또는 살모넬라 종으로의 감염의 존재에 대해 수행된다. 장 대장균 (예컨대 대장균 O157:H7)으로의 감염에 대해 포지티브인 시험 대상에서, 항생물질의 사용은 증가된 STX 생성을 통해서 HUS에 걸릴 위험을 증가시킬 수 있기 때문에 사용이 금지된다 (Wong C. et al., N Engl J. Med 342:1930-1936 (2000 참조). 쉬겔라 또는 살모넬라에 대해 포지티브인 시험 대상에 대하여, 항생물질은 전형적으로 감염을 없애기 위하여 투여된다. HUS에 대한 잘 수립된 다른 제일선 치료법은 부피 팽창, 투석 및 혈장 사혈을 포함한다.

전술한 설명에 따르면, 일부 구체예에서, HUS-전 단계와 관련된 하나 또는 그 이상의 증상들로 고생하거나 HUS에 걸릴 위험이 있는 대상의 환경 (즉 대상은 설사, 혈관 내 적혈구 파괴의 스미어 증거가 있는 30% 아래의 혈구용적 수준, 혈소판 감소증 (혈소판 총수 < 150 x 10³/mm³) 및/또는 손상된 신장 기능의 존재 (연령별 참조 범위의 상한선보다 높은 혈청 크레아티닌 농도)중 하나 또는 그 이상을 나타냄)에서, 대상에서 HUS에 걸릴 위험을 감소시키거나 신부전의 가능성을 감소시키기 위한 방법이 제공되고, 그 방법은 손상된 신장 기능을 완화시키거나 예방하기에 효과적인 시간 동안 유효한 양의 MASP-2 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 적어도 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 날의 기간 동안 투여되고, 상태가 해소되었거나 제어될 때까지 의사의 결정에 따라 반복될 수 있다. HUS-전 환경에서, MASP-2 억제제는 대상에게 전신적으로, 예컨대 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 코, 경구, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의하여 투여될 수 있다.

박테리아 항생물질, 특히 β-락탐을 사용한 대장균 O157:H7의 치료는 HUS에 걸릴 위험의 증가와 관련되어 있다 (Smith et al., Pediatr Infect Dis J 31(1):37-41 (2012). 일부 구체예에서, 대상이 그것에 대한 항생물질의 사용이 금지되어 있는 장 대장균 (예컨대 대장균 O157:H7)으로 감염된 것으로 알려져 있고, HUS-전 단계와 관련된 증상들로 고생하는 대상의 환경에서, 대상에서 HUS에 걸릴 위험을 감소시키거나 신부전의 가능성을 감소시키기 위한 방법이 제공되며, 그 방법은 대상에서 빈뇨의 존재를 억제하거나 예방하기에 효과적인 제 1 시간 (예컨대 적어도 1, 2, 3 또는 4일) 동안 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 투여하는 것을 포함하고, 이때 제 1 시간 동안 MASP-2 억제제의 투여는 항생물질의 부재시에 발생한다. 일부 구체예에서, 방법은 추가로 제 2 시간 (예컨대 적어도 1 내지 2주) 동안 항생물질과 함께 MASP-2 억제제를 대상에게 투여하는 것을 더 포함한다.

다른 구체예에서, 대상이 쉬겔라 또는 살모넬라로 감염되어 있는 것으로 알려져 있는, HUS-전 단계와 관련된 증상들로 고생하는 대상의 환경에서, 대상에서 HUS에 걸릴 위험을 감소시키거나 신부전의 가능성을 감소시키기 위한 방법이 제공되고, 그 방법은 빈뇨의 존재를 억제하거나 예방하기에 효과적인 시간 동안 유효한 양의 MASP-2 억제제를 투여하는 것을 포함하며, 이대 MASP-2 억제제의 투여는 적당한 항생물질의 존재 또는 부재하에 이루어진다.

일부 구체예에서, HUS의 초기 진단의 환경에서 또는 HUS의 진단과 일치하는 하나 또는 그 이상의 증상 (예컨대 신부전의 존재, 또는 낮은 피브리노겐의 부재시에 미세혈관병성 용혈 또는 혈소판 감소증)을 나타내는 대상에서, 대상은 유효량의 MASP-2 억제제 (예컨대 항-MASP-2 항체)로 혈장 사혈의 부재하에 제일선 치료법으로서 또는 혈장 사혈과 함께 치료된다. 제일선 치료법으로서, MASP-2 억제제는 대상에게 전신적으로, 예컨대 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 코, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의하여 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 출혈, 감염 및 혈장 공여자에게 고유한 장애 및/또는 알레르기에 대한 노출과 같은, 혈장 사혈의 합병증을 피하기 위하여, 또는 그렇지 않으면 혈장 사혈을 꺼려하는 대상에서 또는 혈장 사혈을 실시할 수 없는 환경에서, 혈장 사혈의 부재시의 제일선 치료법으로서 대상에게 투여된다.

일부 구체예에서, 방법은 제 1 기간 (예컨대 적어도 1일 내지 1주 또는 2주 동안 지속되는 급성기) 동안 카테테르 (예컨대 정맥 내)를 통하여 HUS에 걸린 대상에게 MASP-2 억제제를 투여하고 이어서 제 2 기간 (예컨대 2주 이상 지속되는 만성 단계) 동안 대상에게 MASP-2 억제제를 피하로 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제 1 및/또는 제 2 기간의 투여는 혈장 사혈의 부재시에 일어난다. 일부 구체예에서, 방법은 추가로 치료 전, 및 임의로 치료 중에 대상에서 적어도 하나의 보체 인자 (예컨대 C3, C5)의 수준을 측정하는 것을 더 포함하며, 이때 표준값 또는 건강한 대조 대상에 비교하여 적어도 하나의 보체 인자의 감소된 수준의 측정은 향상을 나타낸다.

일부 구체예에서, 방법은 MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체를 HUS에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상에게, 피하로 또는 정맥 내로 투여하는 것을 포함한다. 치료는 바람직하게 매일 이루어지지만 주마다 또는 월마다처럼 드물 수 있다. 치료는 적어도 1주 동안 지속될 것이고 3개월까지 길어질 수 있다. 항-MASP-2 항체는 단독으로 또는 C5 억제제, 예컨대 유클리주맙과 함께 투여될 수 있다.

TTP:

혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP)은 응고 캐스케이드 또는 보체 시스템을 활성화하는 자가면역 또는 유전성 기능장애에 의해 유발된, 혈액-응고 시스템의 생명을 위협하는 장애이다 (George, JN, N Engl J Med; 354:1927-35 (2006)). 이것은 전 신체적으로 작은 혈관에서 많은 미세한 응혈 또는 혈전을 초래한다. 적혈구는 그것의 막을 손상시키는 전단력을 받고 혈관내 용혈이 유도된다. 그 결과 감소된 혈류 및 내피 손상은 기관 손상, 이를테면 뇌, 심장 및 신장의 손상을 초래한다. TTP는 임상적으로 혈소판 감소증, 미세혈관병성 용혈성 빈혈, 신경학적 변화, 신장 부전 및 열을 특징으로 한다. 혈장 교환이 이루어지기 전 시기에 사망률은 급성 에피소드 중에는 90%였다. 혈장 교환이 이루어지더라도 6개월째에 생존율은 약 80%이다.

TTP는 본 빌레브란트 인자 (vWF)의 큰 다량체의 더 작은 유닛으로의 절단의 원인이 되는 금속단백질분해효소인 효소 ADAMTS-13의 유전적 또는 후천적 억제로부터 발생할 수 있다. ADAMTS-13 억제 또는 결핍은 궁극적으로 증가된 응고를 초래한다 (Tsai, H. J Am Soc Nephrol 14: 1072-1081, (2003)). ADAMTS-13은 vWF의 활성을 조절하는데; 그것이 없을 때 vWF는 더 많이 혈소판에 결합하여 환자가 미세혈관에서 혈소판 응집 및 혈전증의 성향을 가지게 되는 큰 다량체를 형성한다.

업쇼-슐만 증후군 (USS, 선천성 TTP로서도 기술됨)은 ADAMTS13 유전자 돌연변이로 인한 ADAMTS13 활성의 선천성 결핍증이다 (chulman et al., Blood, 16(1):943-57, 1960; Upshaw et al., New Engl. J. Med, 298 (24):1350-2, 1978). ADAMTS13의 많은 돌연변이가 선천성 TTP를 갖고 있는 개체들에서 확인되었다 (Kinoshita et al., International Journal of Hematology, 74:101-108 (2001); Levy et al., Nature, 413 (6855):488-494 (2001); Kokame et al., PNAS 99(18):11902-11907 (2002); Savasan et al., Blood, 101:4449-4451 (2003); Matsumoto et al., Blood, 103:1305-1310 (2004) and Fujimura et al., Brit. J. Haemat 144:742-754 (2008)). USS를 가지고 있는 대상들은 전형적으로 5 내지 10%의 정상 ADAMTS13 활성을 나타낸다 (Kokame et al., PNAS 99(18):11902-11907, 2002). 비록 후천적 TTP 및 USS가 일부 유사성을 갖고 있지만, USS는 임상적 특징에 있어 몇가지 중요한 차이를 가진다. USS는 통상 유아 또는 어린이에게서 나타나고 출생 직후 새로운 혈장 주입에 대한 반응으로 네거티브 쿰스 시험을 보이는 심각한 빌리루빈 과잉혈증 및 빈번한 재발을 특징으로 한다 (Savasan et al., Blood, 101:4449-4451, 2003). 일부 경우에, 이 유전된 ADAMTS13 결핍증을 가진 환자들은 출생시에 경미한 표현형을 나타내고 폰 빌레브란트 인자 수준이 증가된 임상적 상황, 예컨대 감염 또는 임신시에 TTP와 관련된 증상을 보일 뿐이다. 예를 들어, Fujimura 등은 유전적으로 확인된 USS를 가지는 6 가족으로부터의 9명의 일본인 여성이 그들의 첫 번째 임신 중에 장애로 진단받았음을 보고하였다. 그들의 15번의 임신 각각의 두 번째 내지 세 번째 3개월 동안 혈소판 감소증이 발생하였고, 자주 TTP도 뒤따라 발생하였다. 이들 여성은 모두 ADAMTS13 활성이 심각하게 결핍되어 있는 것으로 밝혀졌다 (Fujimura et al., Brit. J. Haemat 144:742-754, 2008).

전술한 설명에 따르면, 일부 구체예에서, 업쇼-슐만 증후군 (USS)이 있는 대상 (즉 대상은 ADAMTS13 활성이 결핍되어 있는 것으로 알려져 있거나 및/또는 대상은 하나 또는 그 이상의 ADAMTS13 유전자 돌연변이(들)을 가지고 있는 것으로 알려져 있음)의 환경에서, 선천성 TTP와 관련된 임상적 증상들 (예컨대 혈소판 감소증, 빈혈 및/또는 신장 부전)을 발달시킬 가능성을 감소시키는 방법이 제공되며, 그 방법은 TTP와 관련된 하나 또는 그 이상의 임상적 증상들을 완화시키거나 예방하기에 효과적인 시간 동안 유효한 양의 MASP-2 억제제 (예컨대 MASP-2 항체)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 그 방법은 추가로 대상이 TTP와 관련된 어떠한 증상의 개시 전에, 또는 TTP를 나타내는 적어도 하나 또는 그 이상의 증상 (예컨대 빈혈, 혈소판 감소증 및/또는 신장 부전증)이 개시될 때 선천성 TTP와 관련된 증상들을 발달시킬 위험이 있는지의 여부를 측정하는 단계를 더 포함한다. 대상이 선천성 TTP와 관련된 증상들을 발달시킬 위험이 있는지 (즉 대상이 USS를 가지고 있는지)를 측정하는 것은 대상이 ADAMTS13을 코드화하는 유전자에 돌연변이를 가지고 있는지를 측정하거나, 및/또는 대상이 ADAMTS13 활성이 결핍되어 있는지를 측정하거나, 및/또는 대상이 USS의 가족력이 있는지를 측정하는 것을 포함한다. USS와 관련된 유전자 돌연변이의 존재 또는 부재에 대한 유전자 스크리닝 방법은 잘 수립되어 있고, 예를 들면 다음 문헌들을 참조한다: Kinoshita et al., International Journal of Hematology, 74:101-108 (2001); Levy et al., Nature, 413 (6855):488-494 (2001); Kokame et al., PNAS 99(18):11902-11907 (2002); Savasan et al., Blood, 101:4449-4451 (2003); Matsumoto et al., Blood, 103:1305-1310 (2004) 및 Fujimura et al., Brit. J. Haemat 144:742-754 (2008).

한 구체예에서, 빈혈, 혈소판 감소증 또는 상승하는 크레아티닌의 존재 또는 부재를 측정하기 위하여 대상을 주기적으로 모니터링하는 것과, 빈혈, 혈소판 감소증 또는 상승하는 크레아티닌의 존재가 측정되거나 TTP 임상적 증상들을 야기하는 것과 관련된 것으로 알려져 있는 사건, 예를 들면 약물 노출 (예컨대 화학요법), 감염 (예컨대 박테리아 감염), 악성 종양, 손상, 이식 또는 임신이 존재할 때 MASP-2 억제제 (예컨대 MASP-2 항체)로 치료하는 것을 포함하는, USS로 진단된 대상이 TTP와 관련된 임상적 증상들로 고생할 가능성을 감소시키는 방법이 제공된다.

다른 구체예에서, TTP와 관련된 하나 또는 그 이상의 임상적 증상을 완화시키거나 예방하기에 효과적인 시간 동안 MASP-2 억제제 (예컨대 MASP-2 항체)의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, USS를 가지고 있고 TTP와 관련된 임상적 증상들로 고생하는 대상을 치료하는 방법이 제공된다.

TTP는 또한 ADAMTS13에 대항하는 자가-항체로 인해서도 발생될 수 있다. 또한, TTP는 유방암, 위장관암 또는 전립선암 중에 (George JN., Oncology (Williston Park). 25:908-14 (2011)), 임신 중에 (두 번째 삼분기 또는 출산 후에) (George JN., Curr Opin Hematol 10:339-344 (2003)) 발생하거나 또는 HIV와 같은 질병 또는 전신성 홍반성 루푸스와 같은 자가면역 질병과도 관련된다 (Hamasaki K, et al., Clin Rheumatol.22:355-8 (2003)). TTP는 또한 헤파린, 퀴닌, 면역매개된 성분, 암 화학요법제 (블레오마이신, 시스플라틴, 시토신 아라비노시드, 다우노마이신 겜시타빈, 미토마이신 C 및 타목시펜), 사이클로스포린 A, 경구 피임제, 페니실린, 리팜핀 및 티클로피딘 및 클로피도그렐을 포함한 항-혈소판 약물을 포함하는, 특정 약물 치료법에 의해 유발될 수 있다 (Azarm, T. et al., J Res Med Sci., 16:353-357 (2011)). TTP와 관련된 다른 인자들 또는 상태는 벌독과 같은 독소, 패혈증, 비장의 제거, 이식, 맥관염, 혈관 수술 및 폐렴 구균 및 사이토메갈로바이러스같은 감염원이다 (Moake JL., N Engl J Med., 347:589-600 (2002)). 일시적인 기능성 ADAMTS13 결핍으로 인한 TTP는 폐렴구균 감염과 관련된 내피 세포 손상의 결과로서 일어날 수 있다 (Pediatr Nephrol., 26:631-5 (2011)).

혈장 교환은 TTP에 대한 표준 치료이다 (Rock GA, et al., N Engl J Med 325:393-397 (1991)). 혈장 교환은 유전적 결함이 있는 환자에서 ADAMTS13 활성을 대체하고 후천적 자가면역 TTP를 가진 그런 환자들에서 ADAMTS13 자가항체를 제거한다 (Tsai, H-M, Hematol Oncol Clin North Am., 21(4):609-v (2007)). 면역억제 약물과 같은 추가의 제제들이 기본적으로 치료법에 첨가된다 (George, JN, N Engl J Med, 354:1927-35 (2006)). 그러나, 혈장 교환은 약 20%의 환자들에게는 성공적이지 못하고, 1/3보다 많은 환자들에서 재발이 일어나며, 혈장사멸은 값비싸고 기술적으로도 부담이 크다. 나아가, 많은 환자들이 혈장 교환을 견딜 수 없다. 따라서 TTP에 대한 추가의 더 좋은 치료에 대한 결정적 필요성이 남아 있다.

TTP가 혈액 응고 캐스케이드의 장애이기 때문에, 보체 시스템의 길항제를 사용한 치료가 질병의 안정화 및 교정을 보조할 수 있다. 대체 보체 경로의 병리적 활성화가 aHUS에 연관되어 있는 한편으로, TTP에서 보체 활성화의 역할은 덜 분명하다. ADAMTS13의 기능적 결핍은 TTP의 민감성에 대해 중요하지만, 급성 에피소드를 유발하기에는 불충분하다. 환경적 인자들 및/또는 다른 유전적 변화들이 TTP의 징후에 기여할 수 있다. 예를 들어, 응고 캐스케이드, vWF, 혈소판 기능, 내피 혈관 표면의 성분들 또는 보체 시스템에 포함된 단백질들을 코드화하는 유전자들은 급성 혈전성 미세혈관병증의 발생에 함축될 수 있다 (Galbusera, M. et al., Haematologica, 94:166-170 (2009)). 특히, 보체 활성화는 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다: ADAMTS-13 결핍증과 관련된 혈전성 미세혈관병증으로부터의 혈청은 C3 및 MAC 침착 및 보체 비활성화에 의해 없어질 수 있는 후속적인 호중구 활성화를 유발하는 것으로 밝혀졌다 (Ruiz-Torres MP, et al., Thromb Haemost, 93:443-52 (2005)). 또한, 최근에 TTP의 급성 에피소드 중에 고전적/렉틴 및 대체 경로의 활성화와 일치하게, C4d, C3bBbP 및 C3a의 수준이 증가되었음이 밝혀졌다 (M. Reti et al., J Thromb Haemost. Feb 28.(2012) doi:10.1111/j.1538-7836.2012.04674.x. [Epub ahead of print]). 급성 에피소드에서 이렇게 증가된 양의 보체 활성화는 말단 경로 활성화를 개시할 수 있고 TTP의 추가의 악화의 원인이 될 수 있다.

TTP에서 ADAMTS-13 및 vWF의 역할은 분명하게 혈소판의 활성화 및 응집 및 전단 스트레스에서의 그것들의 후속적 역할 및 미세혈관병증에서의 침착의 원인이 된다. 활성화된 혈소판들은 서로 상호작용하고 보체의 고전적 및 대체 경로 둘 다를 야기한다. 혈소판 중재된 보체 활성화는 염증성 조절제 C3a 및 C5a를 증가시킨다 (Peerschke E et al., Mol Immunol, 47:2170-5 (2010)). 그러므로 혈소판은 유전된 또는 자가면역 TTP에서 고전적 보체 활성화의 표적으로서 작용한다.

상기에서 기술된 것과 같이, 보체의 렉틴 경로는 MASP-2 중재된 프로트롬빈 활성화에 의해, HUS에서 발생하는 응고 및 미세혈관 혈전증에 내피 손상을 연관시키는 주요 분자 경로이다. 유사하게, 보체의 렉틴 경로의 활성화는 TTP에서 응고 시스템을 직접적으로 구동할 수 있다. 렉틴 경로 활성화는 TTP에서 ADAMTS-13 결핍에 의해 유발된 초기 내피 손성에 대한 반응으로 개시될 수 있다. 그러므로 렉틴 경고 억제제는, 그것에 한정되는 것은 아니지만 MASP-2 기능을 차단하는 항체들을 포함하여, TTP에 걸린 환자들에서 미세혈관 응고, 혈전증 및 용혈과 관련된 미세혈관병증을 경감시킬 것으로 예상된다.

TTP에 걸린 환자들은 전형적으로 하나 또는 그 이상의 다음의 증상들로 응급실에 온다: 자반병, 신부전증, 낮은 혈소판, 빈혈 및/또는 혈전증, 및 뇌졸중. TTP에 대한 돌봄의 현행 표준은 2주 또는 그 이상의 기간 동안, 전형적으로 주 3회지만 1일 1회의 빈도로까지 대체 혈장 사혈의 카테테르-내 전달 (예컨대 카테테르의 정맥 내 또는 다른 형태)을 포함한다. 만약 대상 시험이 ADAMTS13의 억제제의 존재에 대해 포지티브라면 (즉 ADAMTS13에 대한 내인성 항체), 혈장 사혈은 면역억제 요법 (예컨대 코르티코스테로이드, 리툭산 또는 사이클로스포린)과 함께 수행될 수 있다. 난치성 TTP를 가진 대상 (TTP 환자의 대략 20%)은 적어도 2주까지는 혈장 사혈 요법에 반응하지 않는다.

전술한 설명에 따르면, 한 구체예에서, TTP의 초기 진단의 환경에서 또는 TTP의 진단과 일치하는 하나 또는 그 이상의 증상들 (예컨대 중추 신경계 포함, 심각한 혈소판 감소증 (만약 아스피린이 없다면 5000/μL 이하의 혈소판 총수, 아스피린이 있다면 20,000/μL 이하의 혈소판 총수), 심각한 심장 관여, 심각한 폐 관여, 위장 경색 또는 괴저)을 나타내는 대상에서, 혈장 사혈의 부재시에 제일선 치료법으로서, 또는 혈장 사혈과 함께 유효량의 MASP-2 억제제 (예컨대 항-MASP-2 항체)로 대상을 치료하는 방법이 제공된다. 제일선 치료법으로서, MASP-2 억제제는 대상에 전신적으로, 예컨대 세동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 코, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 혈장 사혈의 잠재적인 합병증, 예컨대 출혈, 감염 및 혈장 공여자에 고유한 장애 및/또는 알레르기에 대한 노출을 피하기 위해, 또는 그렇지 않으면 혈장 사혈을 꺼리는 대상에서, 또는 혈장 사혈을 실시할 수 없는 환경에서 혈장 사혈의 부재시에 제일선 치료법으로서 대상에게 투여된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 TTP에 걸린 대상에게 면역억제제 (예컨대 코르티코스테로이드, 리툭산 또는 사이클로스포린)와 함께 및/또는 농축된 ADAMTS-13과 함께 (공동-투여를 포함함) 투여된다.

일부 구체예에서, 방법은 제1 기간 (예컨대 적어도 1일 내지 1주 또는 2주 동안 지속되는 급성기) 동안 카테테르 (예컨대 정맥 내)를 통하여 TTP에 걸린 대상에게 MASP-2 억제제를 투여하고 이어서 제 2 기간 (예컨대 적어도 2주 이상의 만성 단계) 동안 대상에게 MASP-2 억제제를 피하로 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제 1 및/또는 제 2 기간의 투여는 혈장 사혈의 부재시에 일어난다. 일부 구체예에서, 방법은 대상이 TTP와 관련된 하나 또는 그 이상의 증상으로 고생하는 것을 예방하는 것을 유지하기 위해 사용된다.

다른 구체예에서, TTP의 하나 또는 그 이상의 증상을 감소시키기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 투여함으로써, 난치성 TTP에 걸린 대상 (즉 적어도 2주 동안 혈장 사혈 치료법에 반응하지 못한 대상)을 치료하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대 항-MASP-2 항체)는 만성적으로 난치성 TTP에 걸린 대상에게, 적어도 2주 또는 그 이상의 시간에 걸쳐 피하 또는 다른 비경구 투여를 통해 투여된다. 투여는 상태가 해소되었거나 제어될 때까지 의사의 결정에 따라 반복될 수 있다.

일부 구체예에서, 방법은 추가로 치료 전, 및 임의로 치료 중에 대상에서 적어도 하나의 보체 인자 (예컨대 C3, C5)의 수준을 측정하는 것을 더 포함하며, 이때 표준 값 또는 건강한 대조 대상에 비교하여 적어도 하나의 보체 인자의 감소된 수준의 측정은 MASP-2 억제제를 사용한 지속적인 치료에 대한 필요성을 나타낸다.

일부 구체예에서, 방법은 MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체를 TTP에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상에게, 피하로 또는 정맥 내로 투여하는 것을 포함한다. 치료는 바람직하게 매일 이루어지지만 주마다 또는 월마다 처럼 드물 수 있다. 치료는 대상의 혈소판 총수가 적어도 연속적으로 2일 동안 150,000/ml보다 커질 때까지 지속된다. 항-MASP-2 항체는 단독으로 또는 C5 억제제, 예컨대 유클리주맙과 함께 투여될 수 있다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 다음의 특징들 중 적어도 하나 또는 그 이상을 나타낸다: 상기 항체는 10 nM 이하의 K_D로 인간 MASP-2에 결합하고, 상기 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인의 에피토프에 결합하며, 상기 항체는 10 nM 이하의 IC₅₀에서 1% 인간 혈청에서 시험관 내 분석에서 C3b 침착을 억제하고, 상기 항체는 30 nM 이하의 IC₅₀에서 90% 인간 혈청에서 시험관 내 분석에서 C3b 침착을 억제하며, 이때 항체는 Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ 및 F(ab')₂로 구성되는 군으로부터 선택된 항체 단편이고, 여기서 항체는 단일-사슬 분자이며, 상기 항체는 IgG2 분자이고, 상기 항체는 IgG1 분자이며, 상기 항체는 IgG4 분자이고, 이때 IgG4 분자는 S228P 돌연변이를 포함하며, 및/또는 항체는 고전적 경로를 실질적으로 억제하지 않는다. 한 구체예에서, 항체는 MASP-2에 결합하며 렉틴 경로를 선택적으로 억제하고 대체 경로를 실질적으로 억제하지 않는다. 한 구체예에서, 항체는 MASP-2에 결합하며 렉틴 경로를 선택적으로 억제하고 고전적 경로 또는 대체 경로를 실질적으로 억제하지 않는다 (즉 렉틴 경로를 억제하는 한편 고전적 및 대체 보체 경로는 무상으로 남겨둔다).

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 TTP에 걸린 대상으로부터의 혈청의 혈전 형성을 미처리 혈청에 비교하여 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 내지 99%까지 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 TTP에 걸린 대상으로부터의 혈청의 혈전 형성을 혈청의 C5b-9 침착에 대한 억제 효과보다 적어도 20% 이상 (예컨대 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%) 더 많은 수준으로 억제한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 TTP 환자로부터의 혈청의 혈전 형성을 미처리 혈청에 비교하여 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 내지 99%까지 억제한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 정맥 내 카테테르 또는 다른 카테테르 전달 방법을 통해 대상에게 투여된다.

한 구체예에서, 발명은 TTP에 걸린 대상으로부터 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 (I) (a) i) SEQ ID NO:67의 31 내지 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO:67의 50 내지 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO:67의 95 내지 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) i) SEQ ID NO:70의 24 내지 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO:70의 50 내지 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO:70의 89 내지 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) SEQ ID NO:67에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:67에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 그것의 변이체를 포함하는 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 방법은 SEQ ID NO:67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 방법은 SEQ ID NO:70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 방법은 SEQ ID NO:67에 제시된 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체 OMS646에 의해 인식된 인간 MASP-2 상의 에피토프의 적어도 일부를 특이적으로 인식하는 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

데고스병

악성 위축성 구진증으로도 알려져 있는 데고스병은 피부, 위장관 및 CNS의 작은 혈관의 내피에 영향을 미치는 매우 희귀한 TMA이다. 이 혈관병증은 작은 정맥 및 세동맥의 폐색을 유발하여 피부 병변, 장 허혈 및 뇌졸중, 간질 및 인지 장애를 포함한 CNS 장애를 초래한다. 피부에서, 연결 조직 괴사는 작은 동맥들의 혈전성 폐색으로 인한 것이다. 그러나, 데고스병의 원인은 알려져 있지 않다. 맥관염, 응고 장애 또는 내피 세포의 일차 기능장애가 결부되어 있다. 데고스병은 단지 2 내지 3년의 50% 생존율을 가진다. 비록 항혈소판 약물, 항응고제 및 면역억제제가 증상을 완화시키기 위해 사용되긴 하지만 데고스병에 대해 효과적인 치료는 없다.

데고스병의 메커니즘이 알려져 있지 않은 한편, 보체 경로가 결부되어 있다. Margo 등은 데고스병이 있는 4인의 말기 환자들의 피부, 위장관 및 뇌 혈관에서 뚜렷한 C5b-9 침착물을 확인하였다 (Margo et al., Am J Clin Pathol 135(4):599-610, 2011). 유클리주맙을 사용한 실험적 치료는 피부 및 장 병변의 치료에서 초기에는 효과적이었지만, 전신성 질병의 진전을 막지는 못하였다 (Garrett-Bakelman F. et al., "C5b-9는 데고스병의 병리학에서 강력한 이펙터이다; 유크리주맙을 사용한 치료의 사례 보고서" (Abstract), Jerusalem: International Society of Hematology; 2010, Poster #156; and Polito J. et al, "전신성 데고스병 (DD) 또는 악성 위축성 구진증 (MAP)의 초기 검출은 생존율을 증가시킬 수 있다" (Abstract), San Antonio, TX: American College of Gastroenterology; 2010, Poster #1205 참조).

데고스병에 걸린 많은 환자들은 혈액 응고가 결핍되어 있다. 피부의 작은 동맥들의 혈전성 폐색이 질병의 특징이다. 보체 경로가 이 질병에 결부되어 있기 때문에, 다른 TMA에 대해 본원에서 기술되는 것과 같이, 그것에 한정되는 것은 아니지만 MASP-2 기능을 차단하는 항체들을 포함하여 렉틴 경로 억제제들이 데고스병에 걸린 환자들을 치료하는 데 유리할 것으로 예상된다.

따라서, 다른 구체예에서, 발명은 약학적 담체에 치료적 유효량의 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 항체를 포함하고 있는 조성물을 데고스병 또는 데고스병으로부터 유발되는 상태로 고생하는 대상에게 투여함으로써 데고스병을 치료하는 방법을 제공한다. MASP-2 억제제는 데고스병 또는 데고스병으로부터 유발되는 상태로 고생하는 대상에게 전신적으로, 예컨대 동맥-내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩티드성 제제에 대한 경구 투여에 의해 투여된다. 항-MASP-2 항체는 단독으로 또는 C5 억제제, 예컨대 유클리주맙과 함께 투여될 수 있다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 데고스병에 걸린 대상으로부터의 혈청의 혈전 형성을 미처리 혈청에 비교하여 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 내지 99%까지 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 데고스병에 걸린 대상으로부터의 혈청의 혈전 형성을 혈청의 C5b-9 침착에 대한 억제 효과보다 적어도 20% 이상 (예컨대 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%) 더 많은 수준으로 억제한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 데고스병 환자로부터의 혈청의 혈전 형성을 미처리 혈청에 비교하여 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 내지 99%까지 억제한다.

한 구체예에서, 발명은 데고스병에 걸린 대상으로부터의 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 (I) (a) i) SEQ ID NO:67의 31 내지 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO:67의 50 내지 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO:67의 95 내지 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) i) SEQ ID NO:70의 24 내지 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO:70의 50 내지 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO:70의 89 내지 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) SEQ ID NO:67에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:67에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 그것의 변이체를 포함하는 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

파국성 항인지질 증후군 (CAPS)

파국성 항인지질 증후군 (CAPS)은 항인지질 항체 (APLA) 증후군의 극한 변이체이다. CAPS는 병원성 항체로 인한 정맥 및 동맥의 혈전증을 특징으로 한다. CAPS는 복합 장기 혈전증, 허혈 및 장기 부전을 가지는 TMA이다. 다른 TMA와 마찬가지로, 다양한 기관의 작은 혈관들의 폐색이 특징적이다. CAPS에서의 사망률은 약 50%로 높고 그것은 자주 감염 또는 외상과 관련된다. 환자들은 항인지질 항체, 일반적으로 IgG를 가진다.

임상적으로, CAPS는 작은 혈관 폐색의 조직병리학적 증거를 가지는 적어도 3개의 기관 또는 조직을 포함한다. 말초 혈전증은 CNS, 심혈관, 신장 또는 폐 시스템의 정맥 및 동맥들을 포함할 수 있다. 환자들은 항생물질, 항응고제, 코르티코스테로이드, 혈장 교환 및 정맥 내 면역글로불린으로 치료된다. 그럼에도 불구하고 복합 장기 부전으로부터 사망이 초래될 수 있다.

보체 경로는 CAPS에 결부되어 있다. 예를 들어 동물 모델에서의 연구들은 보체 억제가 CAPS와 관련된 혈전증을 예방하기에 효과적인 수단일 수 있다 (Shapira L. et al., Arthritis Rheum 64(8):2719-23, 2012). 더욱이, Shapira 등에 의해 추가로 보고된 것과 같이, CAPS에 걸린 대상에게 보체 경로를 차단하는 용량으로 유클리주맙을 투여하는 것은 급성 점진성 혈전성 사건 및 반전된 혈소판 감소증을 무산시켰다 (또한 Lim W., Curr Opin Hematol 18(5):361-5, 2011 참조). 그러므로, 본원에서 다른 TMA에 대해 기술된 것과 같이, 그것에 한정되는 것은 아니지만 MASP-2 기능을 차단하는 항체들을 포함하여 렉틴 경로 억제제들이 CAPS에 걸린 환자들을 치료하는 데 유리할 것으로 예상된다.

따라서, 다른 구체예에서, 발명은 약학적 담체에 치료적 유효량의 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 항체를 포함하고 있는 조성물을 CAPS 또는 CAPS로부터 유발된 상태로 고생하는 대상에게 투여함으로써 CAPS를 치료하는 방법을 제공한다. MASP-2 억제제는 CAPS 또는 CAPS로부터 유발된 상태로 고생하는 대상에게 전신적으로, 예컨대 동맥-내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩티드성 제제에 대한 경구 투여에 의해 투여된다. 항-MASP-2 항체는 단독으로 또는 C5 억제제, 예컨대 유클리주맙과 함께 투여될 수 있다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 CAPS에 걸린 대상으로부터의 혈청의 혈전 형성을 미처리 혈청에 비교하여 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 내지 99%까지 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 CAPS에 걸린 대상으로부터의 혈청의 혈전 형성을 혈청의 C5b-9 침착에 대한 억제 효과보다 적어도 20% 이상 (예컨대 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%) 더 많은 수준으로 억제한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 CAPS 환자로부터의 혈청의 혈전 형성을 미처리 혈청에 비교하여 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 내지 99%까지 억제한다.

한 구체예에서, 발명은 CAPS에 걸린 대상으로부터의 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 (I) (a) i) SEQ ID NO:67의 31 내지 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO:67의 50 내지 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO:67의 95 내지 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) i) SEQ ID NO:70의 24 내지 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO:70의 50 내지 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO:70의 89 내지 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) SEQ ID NO:67에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:67에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 그것의 변이체를 포함하는 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

암에 이차적인 TMA

어떠한 유형의 전신성 악성 종양이든지 TMA의 임상적 및 병리적 징후를 유도할 수 있다 (예컨대 Batts and Lazarus, Bone Marrow Transplantation 40:709-719, 2007 참조). 암-관련 TMA는 자주 폐에서 발견되고 종양 색전과도 관련이 있는 것으로 나타난다 (Francis KK et al., Commun Oncol 2:339-43, 2005). 종양 색전은 혈류를 감소시킬 수 있고 그로써 병에 걸린 세동맥 및 작은 정맥에서 저관류된 상태를 유도한다. 그 결과의 조직 응력과 손상은 국지화 방식으로 보체의 렉틴 경로를 활성화시킬 것으로 예상된다. 활성화된 렉틴 경로는 계속해서 프로트롬빈의 트롬빈으로의 MASP-2 의존성 절단을 통해 응고 캐스케이드를 활성화시킬 수 있고, 그것은 TMA의 특징인 전-혈전증 상태를 유도한다. 이런 환경에서 MASP-2 억제는 트롬빈의 국지화 활성화를 감소시키고 그로써 전-혈전증 상태를 완화시킬 것으로 예상된다.

그러므로, 다른 TMA에 대해 기술한 것과 같이, 그것에 한정되는 것은 아니지만, MASP-2 기능을 차단하는 항체들을 포함하여 렉틴 경로 억제제는 암에 이차적인 TMA에 걸린 환자들을 치료하는 데 유익할 것으로 예상된다.

따라서, 다른 구체예에서, 발명은 암에 이차적인 TMA에 걸린 또는 걸릴 위험이 있는 대상에게 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 항체의 치료적 유효량을 약학적 담체에 포함하고 있는 조성물을 투여함으로써 암에 이차적인 TMA를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. MASP-2 억제제는 암에 이차적인 TMA에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상에게 전신적으로, 예컨대 동맥-내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩티드성 제제에 대한 경구 투여에 의해 투여된다. 항-MASP-2 항체는 단독으로 또는 C5 억제제, 예컨대 유클리주맙과 함께 투여될 수 있다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 암에 이차적인 TMA에 걸린 대상으로부터의 혈청의 혈전 형성을 미처리 혈청에 비교하여 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 내지 99%까지 억제한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 암에 이차적인 TMA에 걸린 환자로부터의 혈청의 혈전 형성을 미처리 혈청에 비교하여 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 내지 99%까지 억제한다.

한 구체예에서, 발명은 암에 이차적인 TMA에 걸린 대상으로부터의 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 (I) (a) i) SEQ ID NO:67의 31 내지 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO:67의 50 내지 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO:67의 95 내지 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) i) SEQ ID NO:70의 24 내지 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO:70의 50 내지 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO:70의 89 내지 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) SEQ ID NO:67에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:67에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 그것의 변이체를 포함하는 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

암 화학요법에 이차적인 TMA

화학요법-관련 TMA는 악성 신생물이 겜시타빈, 미토마이신, 옥살리플라틴 등과 같은 화학요법제로 치료된 이력이 있는 환자들의 2 내지 10%에서 발생하는 혈소판 감소증, 미세혈관병성 용혈성 빈혈 및 신부전증을 포함하는 상태이다. 화학요법-관련 TMA는 높은 사망률과 빈약한 임상 결과와 관련되어 있다 (예컨대 Blake-Haskins et al., Clin Cancer Res 17(18):5858-5866, 2011 참조).

화학요법-관련 TMA의 병인학은 미세혈관 내피에 대해 비-특이적이고 독성인 사건을 포함한다. 내피 세포에 대한 직접적인 손상은 미토마이신-유도 TMA의 동물 모델에서 밝혀졌다 (Dlott J. et al., Ther Apher Dial 8:102-11, 2004). 다양한 메커니즘을 통한 내피 세포 손상은 보체의 렉틴 경로를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어 Stahl 등은 산화성 스트레스에 노출된 내피 세포들이 시험관 내에서나 생체 내에서 모두 보체의 렉틴 경로를 활성화하는 것을 밝혔다 (Collard et al., Am J Pathol. 156(5):1549-56, 2000; La Bonte et al, J Immunol. 15;188(2):885-91, 2012). 생체 내에서, 이 과정은 혈전 등을 유도하고, 렉틴 경로의 억제는 혈전증을 방지하는 것으로 밝혀졌다 (La Bonte et al. J Immunol. 15;188(2):885-91, 2012). 나아가, 본원의 실시예 37 내지 39에서 증명되는 것과 같이, FITC-Dex의 국소화된 광여기가 미세맥관구조에 대한 국소화된 손상을 유도하고 후속적으로 TMA 반응이 발생되도록 사용된 TMA의 마우스 모델에서, 본 발명자들은 MASP-2의 억제가 TMA를 방지할 수 있음을 밝혔다. 그러므로, 화학요법제에 의한 미세혈관 내피 손상은 보체의 렉틴 경로를 활성화할 수 있고, 계속해서 국소화된 전-혈전증 상태를 생성하고 TMA 반응을 촉진한다. 렉틴 경로의 활성화 및 전-혈전증 상태의 생성이 MASP-2-의존적이기 때문에, 그것에 한정되는 것은 아니지만 MASP-2 기능을 차단하는 항체들을 포함하여 MASP-2 억제제들은 TMA 반응을 완화시키고 암 화학요법-관련 TMA의 위험을 감소시킬 것으로 예상된다.

따라서, 다른 구체예에서, 발명은 약학적 담체에 치료적 유효량의 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 항체를 포함하는 조성물을 화학요법에 이차적인 TMA에 걸린 또는 걸릴 위험이 있는 대상에게 투여함으로써 화학요법에 이차적인 TMA를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. MASP-2 억제제는 화학요법이 진행되었거나, 진행중이거나 또는 진행될 대상에게 전신적으로, 예컨대 동맥-내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩티드성 제제에 대한 경구 투여에 의해 투여된다. 항-MASP-2 항체는 단독으로 또는 C5 억제제, 예컨대 유클리주맙과 함께 투여될 수 있다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 암 화학요법에 이차적인 TMA에 걸린 대상으로부터의 혈청의 혈전 형성을 미처리 혈청에 비교하여 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 내지 99%까지 억제한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 암 화학요법에 이차적인 TMA에 걸린 환자로부터의 혈청의 혈전 형성을 미처리 혈청에 비교하여 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 내지 99%까지 억제한다.

한 구체예에서, 발명은 암 화학요법에 이차적인 TMA에 걸린 대상으로부터의 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 (I) (a) i) SEQ ID NO:67의 31 내지 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO:67의 50 내지 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO:67의 95 내지 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) i) SEQ ID NO:70의 24 내지 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO:70의 50 내지 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO:70의 89 내지 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) SEQ ID NO:67에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:67에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 그것의 변이체를 포함하는 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

이식에 이차적인 TMA

이식-관련 TMA (TA-TMA)는 이식 환자, 예컨대 동종이계 조혈 줄기 세포 이식 수용체에서 발생할 수 있는 파괴적인 증후군이다 (예컨대 Batts and Lazarus, Bone Marrow Transplantation 40:709-719, 2007 참조). 이 상태의 발병에 대해서는 빈약하게 알려져 있지만, 내피 세포 손상을 끝내는 반응의 합일을 포함한다 (Laskin B.L. et al., Blood 118(6):1452-62, 2011). 상기에서 논의된 것과 같이, 내피 세포 손상은 렉틴 경로 활성화 및 전-혈전증증 환경의 생성에 대한 원형적 자극이다.

최근의 데이터는 TA-TMA 발병에서 렉틴 경로를 통한 보체 활성화의 역할을 한층 더 지지한다. Laskin 등은 신장 세동맥의 C4d 침착이 대조표준 (8%)과 비교하여 조직학적 TA-TMA (75%)에 걸린 대상에서 훨씬 더 통상적이었음을 증명하였다 (Laskin B.L., et al., Transplantation, 27; 96(2):217-23, 2013). 그러므로, C4d는 TA-TMA의 병리학적 마커이며, 렉틴 또는 고전적 경로를 통한 국소화된 보체 고정을 시사한다.

렉틴 경로의 활성화 및 전-혈전증 상태의 생성이 MASP-2-의존적이기 때문에, 그것에 한정되는 것은 아니지만 MASP-2 기능을 차단하는 항체들을 포함하여 MASP-2 억제제는 TMA 반응을 완화시키고 이식-관련 TMA (TA-TMA)의 위험을 감소시킬 것으로 예상된다.

따라서, 다른 구체예에서, 발명은 약학적 담체에 치료적 유효량의 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 항체를 포함하는 조성물을 이식에 이차적인 TMA에 걸린 또는 걸릴 위험이 있는 대상에게 투여함으로써 이식에 이차적인 TMA를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. MASP-2 억제제는 이식 시술이 진행되었거나, 진행중이거나 또는 진행될 대상에게 전신적으로, 예컨대 동맥-내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩티드성 제제에 대한 경구 투여에 의해 투여된다. 항-MASP-2 항체는 단독으로 또는 C5 억제제, 예컨대 유클리주맙과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 발명은 동종이계 줄기 세포 이식을 실시하기 전, 중 또는 후에 대상에게 유효량의 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 포함하고 있는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동종이계 줄기 세포 이식에 이차적인 TMA를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 이식에 이차적인 TMA에 걸린 대상으로부터의 혈청의 혈전 형성을 미처리 혈청에 비교하여 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 내지 99%까지 억제한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 이식에 이차적인 TMA에 걸린 환자로부터의 혈청의 혈전 형성을 미처리 혈청에 비교하여 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 내지 99%까지 억제한다.

한 구체예에서, 발명은 이식에 이차적인 TMA에 걸린 대상으로부터의 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 (I) (a) i) SEQ ID NO:67의 31 내지 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO:67의 50 내지 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO:67의 95 내지 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) i) SEQ ID NO:70의 24 내지 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO:70의 50 내지 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO:70의 89 내지 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) SEQ ID NO:67에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:67에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 그것의 변이체를 포함하는 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

IV. 다른 질환 및 상태에서의 MASP-2의 역할 및 MASP-2 억제제를 사용한 치료 방법

신장 질환

보체 시스템의 활성화는 다음을 포함하는 광범위한 신장 질환의 발병에 포함되어 있다: 메산지움증식성 사구체신염 (IgA-신장병, 버거스병) (Endo, M.,　et　al., Clin. Nephrology 55:185-191, 2001), 막양 사구체신염 (Kerjashki, D., Arch B Cell Pathol. 58:253-71, 1990; Brenchley, P.E.,　et　al., Kidney Int., 41:933-7, 1992; Salant, D.J.,　et　al., Kidney Int.　35:976-84, 1989), 막증식성 사구체신염 (메산지움모세혈관성 사구체신염) (Bartlow, B.G.,　et　al., Kidney Int. 15:294-300, 1979; Meri, S.,　et　al., J. Exp. Med.　175:939-50, 1992), 감염후 급성 사구체신염 (연쇄상 구균 감염후 급성 사구체신염), 한랭글로불린혈성 사구체신염 (Ohsawa, I.,　et　al., Clin Immunol.　101:59-66, 2001), 루푸스 신염 (Gatenby, P.A., Autoimmunity　11:61-6, 1991) 및 헤노흐-쇤라인 자반병 신염 (Endo, M.,　et　al., Am. J. Kidney Dis.　35:401-407, 2000). 신장 질환에 보체의 포함은 수십년 동안 인지되어 왔지만 신장 질환의 개시, 발달 및 쇠퇴기에서의 그것의 정화한 역할에 대해서는 여전히 대부분 논의중이다. 정상적인 조건하에서 보체의 기여는 숙주에게 유익하지만, 보체의 부적절한 활성화 및 침착은 조직 손상에 기여할 수 있다.

사구체의 염증인 사구체신염이 자주 사구체 또는 관형 구조상에 면역 복합체의 침착에 의해 개시되고 그런 다음 보체 활성화, 염증 및 조직 손상을 야기한다는 실질적인 증거가 있다. Kahn과 Sinniah는 다양한 형태의 사구체신염을 가지고 있는 환자들로부터 취한 생검에서 관형 기저 막에서의 C5b-9의 증가된 침착을 증명하였다 (Kahn, T.N.,　et　al., Histopath.　26:351-6, 1995). IgA 신장학을 가지고 있는 환자들의 연구에서 (Alexopoulos, A.,　et　al., Nephrol. Dial. Transplant 10:1166-1172, 1995), 관형 내피/기저막 구조에서의 C5b-9 침착은 혈장 크레아티닌 수준과 상관이 있었다. 막양 신장병의 다른 연구는 임상적 결과와 요의 sC5b-9 수준 사이의 관계를 증명하였다 (Kon, S.P.,　et　al., Kidney Int.　48:1953-58, 1995). 상승된 sC5b-9 수준은 빈약한 예후와 포지티브하게 관련이 있었다. Lehto 등은 혈장 막의 막 공격 복합체를 억제하는 보체 조절 인자인 CD59뿐 아니라 막양 사구체신염에 걸린 환자들로부터의 요에서 C5b-9의 의 상승된 수준을 측정하였다 (Lehto, T.,　et　al., Kidney Int.　47:1403-11, 1995). 이들 동일 환자들로부터의 생검 샘플의 조직병리학적 분석은 사구체에서의 C3 및 C9 단백질의 침착을 증명한 반면, 이들 조직에서 CD59의 발현은 정상 신장 조직의 그것과 비교하여 감소되었다. 이들 다양한 연구는 진행 중인 보체-중재된 사구체신염이 조직 손상 및 질병 예후의 정도와 상관관계가 있는 보체 단백질의 뇨 배설을 초래한다는 것을 시사한다.

사구체신염의 다양한 동물 모델에서의 보체 활성화의 억제는 또한 질병의 병인학에서 보체 활성화의 중요성을 증명하였다. 막증식성 사구체신염 (MPGN)의 모델에서, C6-결핍 래트 (C5b-9을 형성할 수 없음)에서 항-Thy1 항혈청의 주입은 C6+ 정상 래트에서보다 90% 더 적은 사구체 세포 증식, 80% 감소된 혈소판 및 마크로파지 침윤, 감쇠된 콜라겐 유형 IV 합성 (사구체간질 매트릭스 팽창에 대한 마커) 및 50% 더 적은 단백뇨를 초래하였다 (Brandt, J.,　et　al., Kidney Int.　49:335-343, 1996). 이들 결과는 이 래트 항-흉선 세포 혈청 모델에서 보체에 의한 조직 손상의 주요 중재자로서의 C5b-9을 시사한다. 사구체신염의 다른 모델에서, 토끼 항-래트 사구체 기저 막의 등급화된 단위용량의 주입은 코브라 독 인자 (보체를 소모시키기 위함)로의 전 처리에 의해 약화되었던 다형핵 백혈구 (PMN)의 용량-의존성 유입을 유발하였다 (Scandrett, A.L.,　et　al., Am. J. Physiol.　268:F256-F265, 1995). 코브라 독 인자-처리된 래트는 또한 대조 래트보다 감쇠된 조직병리학, 감소된 장기간 단백뇨 및 더 낮은 크레아티닌 수준을 보였다. 래트에서 세 가지 GN 모델 (항-흉선 세포 혈청, Con A 항-Con A 및 수동 헤이만 신염)을 사용하여, Couser 등은 재조합 sCR1 단백질을 사용함으로써 보체를 억제하기 위한 접근법의 잠재적 치료적 효능을 증명하였다 (Couser, W.G.,　et　al., J. Am. Soc. Nephrol.　5:1888-94, 1995). sCR1으로 처리된 래트들은 대조 래트에 대하여 상당히 감쇠된 PMN, 혈소판 및 마크로파지 유입, 감소된 메산지움 용해 및 단백뇨를 보였다. 사구체신염에서 보체 활성화의 중요성에 대한 추가의 증거는 NZB/W F1 마우스 모델에서 항-C5 MoAb의 사용에 의해 제공되었다. 항-C5 MoAb는 C5의 절단을 억제하고, 그로써 C5a 및 C5b-9의 생성을 차단한다. 항-C5 MoAb를 사용한 6개월 동안의 연속 요법은 사구체신염의 과정의 상당한 완화를 초래하였다. 인간 보체 성분 C5의 그것의 전-염증성 성분들로의 절단을 방지하는 인간화된 항-C5 MoAb 단클론성 항체 (5G1.1)는 Alexion Pharmaceuticals, Inc. (New Haven, Connecticut)에 의해 사구체신염에 대한 강력한 치료제로서 개발중에 있다.

신장 손상에서 보체의 병리학적 역할에 대한 직접적인 증거는 특이적인 보체 성분들의 유전적 결핍을 갖고 있는 환자들의 연구에 의해 제공된다. 많은 보고가 신장 질환과 보체 조절 인자 H의 결핍의 관련을 증명하였다 (Ault, B.H., Nephrol. 14:1045-1053, 2000; Levy, M.,　et　al., Kidney Int. 30:949-56, 1986; Pickering, M.C.,　et　al., Nat. Genet. 31:424-8, 2002). 인자 H 결핍은 인자 B 및 C3의 낮은 혈장 수준 및 C5b-9의 소모를 초래한다. 비전형적인 막증식성 사구체신염 (MPGN) 및 특발성 용혈성 요독성 증후군 (HUS)은 두 가지 모두 인자 H 결핍과 관련된다. 인자 H 결핍성 돼지 (Jansen, J.H., et　al., Kidney Int. 53:331-49, 1998) 및 인자 H 녹아웃 마우스 (Pickering, M.C., 2002)는 MPGN-유사 증상들을 나타내는데, 그것은 보체 조절에서 인자 H의 중요성을 확인해준다. 다른 보체 성분들의 결핍은 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)의 발달에 이차적인 신장 질환과 관련된다 (Walport, M.J., Davies,　et　al., Ann. N.Y. Acad. Sci.　815:267-81, 1997). C1q, C4 및 C2에 대한 결핍은 면역 복합체 및 아폽토시스성 물질의 결함성 클리어런스에 관련된 메커니즘을 통한 SLE의 발달에 대해 매우 취약하게 한다. 이들 SLE 환자들 중 많은 수에서 전 사구체를 통틀어 면역 복합체가 침착되는 것을 특징으로 하는 루푸스 신염이 발생한다.

보체 활성화와 신장 질환을 연결짓는 추가의 증거는 보체 성분들에 대항하여 지시된 환자들의 자가항체들의 확인에 의해 제공되었는데, 그것들 중 일부는 신장 질환에 직접적으로 관련되었다 Trouw, L.A.,　et　al., Mol. Immunol.　38:199-206, 2001). 많은 이들 자가항체들은 용어 신염 인자 (NeF)가 이 활성을 나타내기 위해 도입되었을 정도로 신장 질환과 고도의 상관을 보인다. 임상 연구에서, 신염 인자에 대해 포지티브인 환자들의 약 50%가 MPGN을 발달시켰다 (Spitzer, R.E.,　et　al., Clin. Immunol. Immunopathol.　64:177-83, 1992). C3NeF는 대체 경로 C3 전환효소 (C3bBb)에 대항하여 지시된 자가항체로 이 전환효소를 안정화시키며, 그로써 대체 경로 활성화를 촉진한다 (Daha, M.R.,　et　al., J. Immunol.　116:1-7, 1976). 마찬가지로, 고전적 경로 C3 전환효소 (C4b2a)에 대한 특이성을 가지고 있고 C4NeF로 불리는 자가항체는 이 전환효소를 안정화시키고, 그로써 고전적 경로 활성화를 촉진한다 (Daha, M.R.　et　al., J. Immunol.　125:2051-2054, 1980; Halbwachs, L.,　et　al., J.　Clin. Invest.　65:1249-56, 1980). 항-C1q 자가항체들은 SLE 환자에서 신염과 관련된 것으로 기술되었고 (Hovath, L.,　et　al., Clin. Exp. Rheumatol. 19:667-72, 2001; Siegert, C.,　et　al., J. Rheumatol.　18:230-34, 1991; Siegert, C.,　et　al., Clin. Exp. Rheumatol.　10:19-23, 1992), 이들 항-C1q 자가항체들의 역가의 상승은 신염의 갑작스러운 증가를 예측하는 것으로 보고되었다 (Coremans, I.E.,　et　al., Am. J. Kidney Dis.　26:595-601, 1995). SLE 환자들의 사후 신장으로부터 용출된 면역 침착물들은 이들 항-C1q 자가항체들의 축적을 나타냈다 (Mannick, M.,　et　al., Arthritis Rheumatol.　40:1504-11, 1997). 이런 모든 사실은 이들 자가항체에 대한 병리학적 역할을 가리킨다. 그러나, 항-C1q 자가항체를 가지고 있는 환자들이 모두 신장 질환을 발달시킬뿐 아니라, 일부 건강한 개인도 낮은 역가의 항-C1q 자가항체를 가지고 있다 (Siegert, C.E.,　et　al., Clin. Immunol. Immunopathol.　67:204-9, 1993).

보체 활성화의 대체 및 고전적 경로 외에, 렉틴 경로 또한 신장 질환에서 중요한 병리적 역할을 할 수 있다. MBL, MBL-관련 세린 프로테아제 및 보체 활성화 생성물의 상승된 수준이 헤노흐-쇤라인 자반병 신염 (Endo, M.,　et　al., Am. J. Kidney Dis. 35:401-407, 2000), 한랭글로불린혈성 사구체신염 (Ohsawa, I.,　et　al., Clin Immunol.　101:59-66, 2001) 및 IgA 신장병 (Endo, M.,　et　al., Clin. Nephrology　55:185-191, 2001)을 포함하여, 여러 상이한 신장 질환으로 진단된 환자들로부터 얻어진 신장 생검 물질에 대한 면역조직화학적 기법에 의해 검출되었다. 그러므로, 보체와 신장 질환간 관련이 수십년 동안 알려져 왔음에도 불구하고, 보체가 정확하게 이들 신장 질환에 영향을 미치는 방법에 대한 데이터는 아직 완성되지 않았다.

혈액 장애

패혈증은 침입 미생물에 대한 환자의 압도적인 반응에 의해 유발된다. 보체 시스템의 주요 기능은 침입하는 박테리아와 다른 병원체들에 대한 염증성 반응을 조직하는 것이다. 이런 생리적 역할에 일치하게, 보체 활성화는 수많은 연구에서 패혈증의 발병에서 주요 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (Bone, R.C., Annals. Internal. Med.　115:457-469, 1991). 패혈증의 임상적 징후의 확인은 계속 변화해가고 있다. 패혈증은 통상 감염에 대한 전신적 숙주 반응으로서 정의된다. 그러나 많은 경우에, 패혈성 증상을 보이는 환자들에서 감염 (예컨대 포지티브 박테이라 혈액 배양물)에 대한 임상적 증거는 발견되지 않는다. 이런 불일치는 용어 "전신성 염증성 반응 증후군" (SIRS)이 수립된 때인 1992년도 합의 회의에서 먼저 고려되었고, 그것에 대하여 박테리아 감염의 한정할 수 없는 존재가 요구되었다 (Bone, R.C., et　al., Crit. Care Med.　20:724-726, 1992). 현재 패혈증과 SIRS는 염증성 반응을 조절하지 못하는 무능력에 수반되는 것으로 일반적으로 합의된다. 이런 간단한 개관을 목적으로, 본 발명자들은 패혈증의 임상적 정의를 심각한 패혈증, 패혈성 쇼크 및 SIRS를 또한 포함하는 것으로 고려할 것이다.

후기 1980년대까지는 패혈성 환자들에서 감염의 지배적인 공급원은 그람-네거티브 박테리아였다. 그람-네거티브 박테리아 세포벽의 주성분인 리포다당 (LPS)은 동물에 주입될 때 다양한 세포 유형으로부터의 염증성 중재자들의 방출을 자극하고 급성 감염성 증상들을 유도하는 것으로 알려져 있다 (Haeney, M.R., et　al., Antimicrobial Chemotherapy　41(Suppl.　A):41-6, 1998). 흥미롭게도, 타당한 미생물의 스펙트럼은 현재로서는 불명확한 이유들로 인해, 후기 1970년대 및 1980년대에 대부분 그람-네거티브 박테리아로부터 현재 대부분 그람-포지티브 박테리아로 이동되었다 (Martin, G.S., et　al., N. Eng. J. Med.　348:1546-54, 2003).

많은 연구들은 염증을 중재하고 쇼크, 특히 패혈성 및 출혈성 쇼크의 특징에 기여하는 데 있더 보체 활성화의 중요성을 밝혔다. 그람-네거티브 및 그람-포지티브 유기체들은 둘 다 공통적으로 패혈성 쇼크를 촉발시킨다. LPS는 대부분 대체 경로를 통해 보체의 강력한 활성화제이지만, 항체들에 의해 중재된 고전적 경로 활성화 또한 일어난다 (Fearon, D.T., et　al., N. Engl. J. Med.　292:937-400, 1975). 그람-포지티브 세포벽의 주요 성분들은 펩티도글리칸 및 리포테이코산이고, 두 성분 모두 대체 보체 경로의 강력한 활성화제이지만, 특이적인 항체들의 존재하에서 또한 고전적 보체 경로를 활성화할 수 있다 (Joiner, K.A., et　al., Ann. Rev. Immunol.　2:461-2, 1984).

보체 시스템은 처음에 연구자들에 의해 아나필라톡신 C3a 및 C5a가 패혈증 중에 또한 발생할 수 있는 다양한 염증 반응을 중재한다고 주지되었을 때 패혈증의 발병에 포함되었다. 이들 아나필라톡신은 패혈성 쇼크에서 중심 역할을 하는 사건들인 혈관확장 및 미세혈관의 투과도의 증가를 불러 일으킨다 (Schumacher, W.A., et　al., Agents Actions　34:345-349, 1991). 또한, 아나필라톡신은 기관지 경련, 비만 세포로부터의 히스타민 방출 및 혈소판의 응집을 유도한다. 더욱이, 아나필라톡신은 과립구, 예컨대 주화성, 응집, 부착, 리소솜성 효소들의 방출, 독성 수퍼 옥사이드 음이온의 생성 및 류코트리엔의 형성에 만은 영향을 미친다 (Shin, H.S., et　al., Science　162:361-363, 1968; Vogt, W., Complement　3:177-86, 1986). 이들 생물학적 효과는 쇼크 또는 급성 호흡곤란 증후군 (ARDS)과 같은 패혈증의 합병증의 발달에 역할을 하는 것으로 여겨진다 (Hammerschmidt, D.E., et　al., Lancet　1:947-949, 1980; Slotman, G.T., et　al., Surgery　99:744-50, 1986). 나아가, 아나필라톡신 C3a의 상승된 수준은 패혈증의 치명적 결과와 관련된다 (Hack, C.E., et　al., Am. J. Med.　86:20-26, 1989). 쇼크의 일부 동물 모델에서, 특정 보체-결핍 스트레인들 (예컨대 C5-결핍 스트레인)은 LPS 투입의 효과에 대해 더 저항성이다 (Hseuh, W., et　al., Immunol.　70:309-14, 1990).

설치류에서 패혈증이 개시되는 동안 항체들을 사용한 C5a 생성의 차단은 생존율을 크게 향상시키는 것으로 밝혀졌다 (Czermak, B.J., et　al., Nat. Med.　5:788-792, 1999). 유사한 발견이 항체나 작은 분자 억제제로 C5a 수용체 (C5aR)가 차단되었을 때 이루어졌다 (Huber-Lang, M.S., et　al., FASEB J.　16:1567-74, 2002; Riedemann, N.C., et　al., J. Clin. Invest.　110:101-8, 2002). 원숭이들에서 선행 실험 연구들은 C5a의 항체 차단이 대장균-유도 패혈성 쇼크 및 성인 호흡 곤란 증후군을 약화시켰다고 제시하였다 (Hangen, D.H., et　al., J. Surg. Res.　46:195-9, 1989; Stevens, J.H., et　al., J. Clin. Invest.　77:1812-16, 1986). 패혈증에 걸린 인간에서, C5a는 덜 심각한 패혈증 환자들과 생존자들에서의 그것과 비교할 때 상승되었고 다발성 장기 부전과 함께 상당히 감소된 생존율에 관련되었다 (Nakae, H., et　al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol.　84:189-95, 1994; Nakae, et　al., Surg. Today　26:225-29, 1996; Bengtson, A., et　al., Arch. Surg.　123:645-649, 1988). 패혈증 동안 C5a가 해로운 효과를 발휘하게 되는 메커니즘은 아직까지 더욱 상세하게 연구되지는 않았지만, 최근의 데이터는 패혈증 동안 C5a의 생성은 혈액 호중구의 타고난 면역 기능 (Huber-Lang, M.S., et　al., J. Immunol.　169:3223-31, 2002), 호흡 폭발을 나타내는 능력 및 사이토킨을 생성하는 능력 ((Riedemann, N.C., et　al., Immunity　19:193-202, 2003)을 상당히 손상시킨다고 제시한다. 또한, 패혈증 동안 C5a 생성은 응혈 촉진 효과를 가지는 것으로 나타난다 (Laudes, I.J., et　al., Am. J. Pathol.　160:1867-75, 2002). 보체-조절 단백질 CI INH는 또한 패혈증 및 ARDS의 동물 모델에서 효능을 나타냈다 (Dickneite, G., Behring Ins. Mitt.　93:299-305, 1993).

렉틴 경로는 도한 패혈증의 발병에서 역할을 할 수 있다. MBL은 그람-네거티브 및 그람-포지티브 박테리아 둘 다를 포함하여 임상적으로 중요한 광범위한 미생물에 결합하고, 렉틴 경로를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다 (Neth, O., et　al., Infect. Immun.　68:688, 2000). 리포테이코산 (LTA)은 점점 LPS의 그람-포지티브 대응물로서 간주되고 있다. 그것은 단핵 식세포 및 전혈로부터 사이토킨 방출을 유도하는 강력한 면역자극제이다 (Morath, S., et　al., J. Exp. Med.　195:1635, 2002; Morath, S., et　al., Infect. Immun.　70:938, 2002). 최근에 L-피콜린이 녹농균을 포함하여 수많은 그람-포지티브 박테리아 종으로부터 분리된 LTA에 특이적으로 결합하고, 렉틴 경로를 활성화시키는 것이 증명되었다 (Lynch, N.J., et　al., J. Immunol.　172:1198-02, 2004). MBL 또한 폴리글리세로포스페이트 사슬이 글리코실 기로 치환되어 있는 엔테로코쿠스 종으로부터의 LTA에 결합하지만, 녹농균을 포함한 9개의 다른 종으로부터의 LTA에는 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다 (Polotsky, V.Y., et　al., Infect. Immun.　64:380, 1996).

그러므로 발명의 한 측면은 치료적 유효량의 MASP-2 억제제를 약학적 담체에 포함하고 있는 조성물을, 제한 없이 심각한 패혈증, 패혈성 쇼크, 패혈증으로부터 유발된 급성 호흡 곤란 증후군 및 전신성 염증성 반응 증후군을 포함한, 패혈증 또는 패혈증으로부터 유발된 상태로 고생하는 대상에게 투여함으로써, 패혈증 또는 패혈증으로부터 유발된 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 다른 혈액 장애, 이를테면 출혈성 쇼크, 용해성 빈혈, 자가면역 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP), 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비전형적인 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) 또는 다른 골수/혈액 파괴성 상태를, 치료적 유효량의 MASP-2 억제제를 약학적 담체에 포함하고 있는 조성물을 그런 상태로 고생하는 대상에게 투여함으로써 치료하는 관련된 방법이 제공된다. MASP-2 억제제는 대상에게 전신적으로, 예컨대 동맥-내, 정맥 내, 근육 내, 흡입 (특히 ARDS의 경우에), 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩티드성 제제에 대한 경구 투여에 의해 투여된다. MASP-2 억제제 조성물은 패혈증 및/또는 쇼크의 후유증에 맞서기 위해 하나 또는 그 이상의 추가 치료제와 조합될 수 있다. 진전된 패혈증 또는 쇼크 또는 그것들로부터 유발된 괴로운 상태에 대해, MASP-2 억제 조성물은 신속-작용 단위용량 형태로, 예컨대 MASP-2 억제제 조성물을 함유하고 있는 용액의 볼루스의 정맥 내 또는 동맥-내 전달에 의해 적당하게 투여될 수 있다. 반복된 투여는 상태가 해소될 때까지 의사의 결정대로 수행될 수 있다.

응고장애

산재성 혈관내 응고 ("DIC"), 예컨대 중요한 신체적 외상에 이차적인 DIC에서 보체 시스템의 역할에 대한 증거가 발전되어 왔다.

선행 연구들은 C4-/- 마우스들이 신장 재관류 손상으로부터 보호되지 않는다는 것을 밝혔다 (Zhou, W., et al, "Predominant role for C5b-9 in renal ischemia/reperfusion injury," J Clin Invest 105:1363-1371 (2000)). C4-/- 마우스가 고전적 또는 렉틴 경로 중 어느 하나를 통해서 여전히 보체를 활성화할 수 있는지를 조사하기 위하여, C4-/- 혈장에서의 C3 턴오버를 고전적 또는 렉틴 경로 활성화 경로 중 어느 하나에 대해 특이적인 분석으로 측정하였다. 고전적 경로를 통해 활성화를 야기할 때 C3 절단이 관찰될 수 없는 한편, C4 결핍 혈청에서 C3의 고도로 효율적인 렉틴 경로-의존성 활성화가 관찰되었다 (도 30). 만난 및 자이모산 상의 C3b 침착은, 대체 경로 활성화에 대해 이전에 공개된 많은 문서에 따르면, 3가지의 모든 경로에 대해 허용적일 실험 조건하에서조차 MASP-2-/-마우스에서 심각하게 면역손상된 것을 알 수 있다. 만난 또는 자이모산 대신 면역글로불린 복합체로 코팅된 웰에서 동일한 혈청을 사용할 때, C3b 침착 및 인자 B 절단은 MASP-2+/+ 마우스 혈청 및 MASP-2-/- 혈청에서 나타나지만, C1q 고갈 혈청에서는 나타나지 않는다. 이것은 C3b가 고전적 활성을 통해 제공될 때 대체 경로 활성화가 MASP-2-/- 혈청에서 촉진되는 것을 가리킨다. 도 30c는 C3이 C4 결핍 혈장에서 렉틴 경로-의존성 방식으로 효율적으로 활성화될 수 있다는 놀라운 발견을 도시한다.

이런 "C4 우회"는 가용성 만난 또는 만노오스를 사용하는 혈장의 사전인큐베이션을 통한 렉틴-경로 활성화의 억제에 의해 사라진다.

보체 시스템의 일탈적인, 비-면역 활성화는 잠재적으로 남성에 해롭고 또한 염증성 및 혈액학적 경로 둘 다 활성화될 때 혈액학적 경로 활성화, 특히 심각한 외상 상황에서 중요한 역할을 할 수 있다. 정상적인 건강 상태에서, C3 전환율은 총 혈장 C3 단백질의 <5%이다. 패혈증 및 면역 복합체 질환을 포함한 만연성 감염에서, C3 전환율은 증가된 활용도 및 빈약한 분포의 변화로 인해, 약 30% 재-수립되고 이때 보체 수준은 자주 정상보다 더 낮다. 30%보다 큰 즉각적인 C3 경로 활성화는 일반적으로 혈관팽창 및 조직에 대한 유체 손실의 분명한 임상적 증거를 유발한다. 30% 이상의 C3 전환율에서는, 개시 메커니즘은 대부분 비-면역성이고 그 결과의 임상적 징후들은 환자에게 해롭다. 건강하거나 제어된 질환에서의 보체 C5 수준은 C3보다 훨씬 더 안정한 것으로 나타난다. C5 수준의 상당한 감소 및 또는 전환은 환자의 비정상적인 다중 외상 (예컨대 도로 교통사고) 에 대한 반응 및 유사한 쇼크 폐 증후군의 발생과 관련된다. 그러므로, 울혈 (vascular pool)의 30%를 넘는 보체 C3 활성화 또는 어떠한 C5 포함의, 또는 둘 다의 어떠한 증거든지 환자에서 해로운 병리학적 변화의 조짐인 것으로 여겨질 수 있다.

C3 및 C5는 둘 다 비만 세포 및 호염기성 세포에 작용하여 혈관확장 화학물질을 방출시키는 아나필라톡신 (C3a 및 C5a)을 유리시킨다. 그것들은 다형핵 세포 (PMN)를 면역학적 방해 (유익한 반응)의 중심으로 안내하기 위해 화학주성 구배를 수립하지만, 여기에서 그것들은 C5a가 이들 식작용 세포 상에서 특이적인 클럼핑 (응집) 효과를 가져서 반응 부위로부터 먼 곳으로 그것들의 무작위 이동하는 것을 방지하기 때문에 다르다. 정상적인 감염 제어에서, C3은 C5를 활성화시킨다. 그러나, 다중 외상에서, C5는 광범위하게 활성화되어 C5a 아나필라톡신을 전신적으로 생성하는 것으로 보인다. 이런 제어되지 않은 활성은 혈관 시스템 내에서 무리를 이루기 위해 다형태를 유발하고, 이들 무리 (clump)는 그런 다음 폐의 모세혈관 안으로 스위핑되어 모세혈관을 폐색하고 수퍼옥사이드 유리의 결과로서 국소적인 손상 효과를 생성한다. 이론에 제한되는 것을 바라지는 않으나, 그 메커니즘은 아마도 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)의 발병에 중요하지만, 이런 관점은 최근에 도전을 받았다. 시험관 내에서 C3a 아나필라톡신은 강력한 혈소판 응집제인 것으로 보일 수 있지만, 그것들의 생체 내 포함은 덜 규정되었고 혈소판 물질 및 플라스민의 상처에서의 방출은 단지 이차적으로 보체 C3를 포함할 수 있다. C3 활성화의 연장된 상승은 DIC를 생성하는 데 필요하다.

외상과 DIC 사이의 관련을 설명할 수 있는, 상기에서 개요적으로 설명된 활성화된 보체 성분의 세포 및 혈관 효과에 더불어, 드러나는 과학적 발견들은 직접적인 분자적 관련 및 보체와 응고 시스템 사이의 기능적 혼선을 확인해주고 있다. 지지하는 데이터는 C3 결핍 마우스에서의 연구들로부터 얻어졌다. C3이 보체 경로들의 각각에 대한 공유된 성분이기 때문에, C3 결핍 마우스들은 모든 성분 기능이 결핍된 것으로 예상된다. 그러나, 놀랍게도, C3 결핍 마우스는 완변하게 말단 보체 성분들을 활성화할 수 있다. (Huber-Lang, M., et al., "Generation of C5a in the absence of C3: a new complement activation pathway," Nat. Med 12:682-687 (2006)). 심층 연구에서 말단 보체 성분들의 C3-무관환 활성화가 응고 캐스케이드의 속도 제한 효소인 트롬빈에 의해 중재되는 것으로 드러났다 (Huber et al., 2006). 초기 보체 활성화 후에 트롬빈 활성화를 중재하는 분자 성분들은 알 수 없는 채로 남아있다.

본 발명자들은 보체와 응고 캐스케이드 사이의 혼선에 대한 분자적 기초인 것으로 여겨지는 것이 무엇인지를 설명하였고 두 시스템을 연결시키는 중심 조절점으로서 MASP-2를 확인하였다. MASP-2의 기질 특이성에 대한 생화학적 연구들은 가능한 기질로서, 잘 알려져 있는 C2 및 C4 보체 단백질 외에, 프로트롬빈을 확인하였다. MASP-2는 기능적으로 관련된 부위에서 프로트롬빈을 특이적으로 절단하여 응고 캐스케이드의 속도 제한 효소인 트롬빈을 생성한다 (Krarup, A., et al., "Simultaneous Activation of Complement and Coagulation by MBL-Associated Serine Protease 2," PLoS. ONE. 2:e623 (2007)). MASP-2-생성된 트롬빈은 규정된 재구성된 시험관 내 시스템에서 피브린 침착을 촉진할 수 있는데, 그것은 MASP-2 절단과 기능적으로 관련되어 있음을 증명한다 (Krarup et al., 2007). 하기 실시예에서 논의되는 것과 같이, 발명자들은 추가로 렉틴 경로 활성화 후에 정상적인 설치류 혈청에서의 트롬빈 활성화를 증명함으로써 이런 발견의 생리적 중요성을 입증하였고, 이 과정이 MASP-2 단클론성 항체들을 중화함으로써 차단되는 것을 증명하였다.

MASP-2는 보체 및 응고 시스템 둘 다의 활성화를 촉진할 수 있는, 렉틴 경로에서의 중심 분기점을 대표할 수 있다. 렉틴 경로 활성화가 많은 유형의 외상적 손상에 대한 생리적 반응이기 때문에, 본 발명자들은 공존하는 전신성 염증 (보체 성분들에 의해 중재됨)과 전파된 응고 (응고 경로를 통해 중재됨)가 두 경로를 활성화시키는 MASP-2의 능력에 의해 설명될 수 있다고 믿는다. 이들 발견은 분명하게 DIC 생성에서 MASP-2에 대한 역할 및 DIC의 치료 또는 예방에서 MASP-2 억제의 치료적 유익을 시사한다. MASP-2는 보체와 응고 시스템 사이의 분자적 관련을 제공할 수 있고, 렉틴 경로의 활성화는 그것이 외상의 환경에서 일어나는 한 MASP-2-트롬빈 축을 통해 응고 시스템의 활성화를 직접 개시할 수 있어서 외상과 DIC 사이의 기계적 관련을 제공한다. 본 발명의 한 측면에 따르면, MASP-2의 억제는 렉틴 경로 활성화를 억제할 것이고 아나필라톡신 C3a 및 C5a 둘 다의 생성을 감소시킬 것이다. C3 활성화의 연장된 상승은 DIC를 생성하는 데 필요한 것으로 여겨진다.

미세순환계 응고 (모세혈관 및 작은 혈관에서의 블롯 응고)는 패혈성 쇼크와 같은 환경에서 일어난다. 패혈성 쇼크에서 렉틴 경로의 역할은, 실시예 17 및 도 18 및 19에서 기술되는 것과 같이, 패혈증의 MASP-2 (-/-) 마우스 모델의 보호된 표현형에 의해 증명된 바, 수립된다. 나아가, 실시예 15 및 도 16a 및 16b에서 증명되는 것과 같이, MASP-2 (-/-) 마우스는 미세혈관에서의 국소화된 응고 모델인, 산재성 혈관내 응고 (DIC)의 국소화된 슈바르츠만 반응 모델에서 보호된다.

V. MASP-2 억제제

한 측면으로, 본 발명은 혈전성 미세혈관병증에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상에서 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. MASP-2 억제제는 살아있는 대상에서 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양으로 투여된다. 발명의 이런 측면의 실시에서, 대표적인 MASP-2 억제제는 다음: MASP-2의 생물학적 활성을 억제하는 분자 (예컨대 작은 분자 억제제, 항-MASP-2 항체 또는 MASP-2와 상호작용하는 또는 단백질-단백질 상호작용을 간섭하는 차단 펩티드), 및 MASP-2의 발현을 감소시키는 분자 (예컨대 MASP-2 안티센스 핵산 분자, MASP-2 특이적 RNAi 분자 및 MASP-2 리보자임)을 포함하고, 그로써 MASP-2가 렉틴 보체 경로를 활성화시키지 못하게 방지한다. MASP-2 억제제는 일차 요법으로서 단독으로 또는 다른 의학적 치료의 치료적 유익을 증강시키기 위하여 보조 치료법으로서 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다.

MASP-2-의존성 보체 활성화의 억제는 발명의 방법에 따라 MASP-2 억제제의 투여의 결과로서 발생하는 보체 시스템의 성분의 다음의 변화들 중 적어도 한 가지를 특징으로 한다: MASP-2-의존성 보체 활성화 시스템 생성물 C4b, C3a, C5a 및/또는 C5b-9 (MAC)의 생성 또는 생산의 억제 (예를 들면 실시예2에서 기술된 것과 같이 측정됨), 미감작 토기 또는 기니아 피그 적혈구를 사용한 용혈 분석에서 평가된 보체 활성화의 감소 (예를 들면 실시예 33에서 기술된 것과 같이 측정됨), C4 절단 및 C4b 침착의 감소 (예를 들면 실시예 2에서 기술된 것과 같이 측정됨) 또는 C3 절단 및 C3b 침착의 감소 (예를 들면 실시예 2에서 기술된 것과 같이 측정됨).

본 발명에 따르면, MASP-2-의존성 보체 활성화 시스템을 억제하는 데 효율적인 MASP-2 억제제가 활용된다. 발명의 이런 측면의 실시예 유용한 MASP-2 억제제는 예를 들면 항-MASP-2 항체 및 그것의 단편들, MASP-2 억제 펩티드, 작은 분자, MASP-2 가용성 수용체 및 발현 억제제를 포함한다. MASP-2 억제제는 MASP-2의 생물학적 기능을 차단함으로써 MASP-2-의존성 보체 활성화 시스템을 억제할 수 있다. 예를 들어, 억제제는 효율적으로 MASP-2 단백질-대-단백질 상호작용을 차단하거나, MASP-2 이량체화 또는 어셈블리를 간섭하거나, Ca²⁺ 결합을 차단하거나, MASP-2 세린 프로테아제 활성 부위를 간섭하거나, 또는 MASP-2 단백질 발현을 감소시킬 수 있다.

일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 선택저으로 MASP-2 보체 활성화를 억제하여 C1q-의존성 보체 활성화 시스템을 기능적으로 무상으로 남긴다.

한 구체예에서, 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제제는 보체 시스템에서 다른 항원에 대한 것보다 적어도 10배 더 큰 친화성으로 SEQ ID NO:6을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 특이적 MASP-2 억제제이다. 다른 구체예에서, MASP-2 억제제는 보체 시스템에서 다른 항원에 대한 것보다 적어도 100배 더 큰 친화성으로 SEQ ID NO:6을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 특이적 MASP-2 억제제이다. MASP-2 억제제의 결합 친화성은 적당한 결합 분석을 사용하여 측정될 수 있다.

MASP-2 폴리펩티드는 C1 보체 시스템의 프로테아제들인 MASP-1, MASP-3 및 C1r 및 C1s에 유사한 분자 구조를 나타낸다. SEQ ID NO:4에 제시된 cDNA 분자는 MASP-2의 대표적인 실례 (SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열로 구성됨)를 코드화하고 리더 서열 (aa 1 내지 15)DMF 가지는 인간 MASP-2 폴리펩티드를 제공하며, 그것은 분비 후에 절단되어 인간 MASP-2의 성숙한 형태 (SEQ ID NO:6)를 초래한다. 도 2에 도시된 것과 같이, 인간 MASP 2 유전자는 12개의 엑손을 포함한다. 인간 MASP-2 cDNA는 엑손 B, C, D, F, G, H, I, J, K 및 L에 의해 코드화된다. 선택적 스플라이싱은 MBL-관련 단백질 19로 명명되고 ("MAp19", 또한 "sMAP"로도 언급됨)(SEQ ID NO:2), 도 2에서 알 수 있는 것과 같이 엑손 B, C, D 및 E로부터 발생하는 (SEQ ID NO:1)에 의해 코드화된 20 kDa의 단백질을 초래한다. SEQ ID NO:50에 제시된 cDNA 분자는 쥐과 동물의 MASP-2 (SEQ ID NO:51에 제시된 아미노산 서열로 구성됨)를 코드화하고 리더 서열을 가지는 쥐과 동물의 MASP-2 폴리펩티드를 제공하며, 그것은 분비 후에 절단되어 쥐과 동물의 MASP-2의 성숙한 형태 (SEQ ID NO:52)를 초래한다. SEQ ID NO:53에 제시된 cDNA 분자는 래트 MASP-2 (SEQ ID NO:54에 제시된 아미노산 서열로 구성됨)를 코드화하고 리더 서열을 가지는 래트 MASP-2 폴리펩티드를 제공하며, 그것은 분비 후에 절단되어 래트 MASP-2의 성숙한 형태 (SEQ ID NO:55)를 초래한다.

기술분야의 숙련자들은 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:50 및 SEQ ID NO:53에 개시된 서열이 각각 인간, 쥐과 동물 및 래트 MASP-2의 단일 대립유전자를 나타내는 것을 인지할 것이고, 대립유전자 변이 및 선택적 스플라이싱이 일어날 것으로 예상된다는 것을 인지할 것이다. 사일런트 돌연변이를 함유하는 것들과 돌연변이가 아미노산 서열 변화를 초래하는 것들을 포함하여, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:50 및 SEQ ID NO:53에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 대립유전자 변이체들은 본 발명의 범주 내에 있다. MASP-2 서열의 대립유전자 변이체들은 프로빙 cDNA 또는 표준 과정에 따라 상이한 개체들로부터의 게놈 라이브러리에 의하여 클론될 수 있다.

인간 MASP-2 단백질 (SEQ ID NO:6)의 도메인들은 도 1 및 2a에 표시되고, N-말단 C1r/C1s/성게 Vegf/골형성 단백질 (CUBI) 도메인 (SEQ ID NO:6의 aa　1 내지 121), 내피 성장 인자-유사 도메인 (aa　122 내지 166), 제 2 CUBI 도메인 (aa 167 내지 293)과, 뿐만 아니라 보체 대조 단백질 도메인의 탠덤 및 세린 프로테아제 도메인을 포함한다. MASP 2 유전자의 선택적 스플라이싱은 도 1에 도시된 MAp19를 초래한다. MAp19는 도 1에 도시된 것처럼 엑손 E로부터 유도된 4개의 추가 잔기 (EQSL)를 가지는 MASP-2의 N-말단 CUB1-EGF 영역을 함유하는 비효소적 단백질이다.

여러 단백질들은 단백질-대-단백질 상호작용을 통해 MASP-2에 결합하거나, 그것과 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어 MASP-2는 렉틴 단백질 MBL, H-피콜린 및 L-피콜린에 결합하고, 그것과 Ca²⁺ 의존성 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 각각의 MASP-2/렉틴 복합체는 단백질 C4 및 C2의 MASP-2-의존성 절단을 통해 보체를 활성화하는 것으로 밝혀졌다 (Ikeda, K., et　al., J. Biol. Chem.　262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., et　al., J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., et　al., J.　Immunol. 168:3502-3506, 2002). 연구들은 MASP-2의 CUB1-EGF 도메인이 MASP-2의 MBL과의 결합에 대해 필수적인 것을 나타냈다 (Thielens, N.M., et　al., J.　Immunol. 166:5068, 2001). 또한 CUB1EGFCUBII 도메인은 MASP-2의 이량체화를 중재하고, 그것은 활성 MBL 복합체의 형성에 필요하다 (Wallis, R., et　al., J. Biol. Chem.　275:30962-30969, 2000). 그러므로, MASP-2 억제제는 MASP-2-의존성 보체 활성화에 중요한 것으로 알려져 있는 MASP-2 표적 영역에 결합하거나 그것을 간섭하는 것으로 확인될 수 있다.

항-MASP-2 항체들

발명의 이런 측면의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2-의존성 보체 활성화 시스템을 억제하는 항-MASP-2 항체를 포함한다. 발명의 이 측면에 유용한 항-MASP-2 항체는 어떠한 항체 생성 포유류로부터 유도된 다클론성, 단클론성 또는 재조합 항체들을 포함하고 다중특이성, 키메라, 인간화된, 항-이디오타입 및 항체 단편일 수 있다. 항체 단편들은 Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂, Fv 단편, scFv 단편 및 하기에서 한층 더 기술될 단일-사슬 항체들을 포함한다.

여러 항-MASP-2 항체들이 문헌에 기술되어 있는데, 그것들 중 일부는 하기 표 1에 열거된다. 이들 전술된 항-MASP-2 항체들은 본원에 기술된 분석들을 사용하여 MASP-2-의존성 보체 활성화 시스템을 억제하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 항 래트 MASP-2 Fab2 항체들은 하기 실시예 10 및 11에서 기술되는 것과 같이 MASP-2 의존성 보체 활성화를 차단하는 것으로 확인되었다. 일단 한-MASP-2 항체가 MASP-2 억제제로서 기능하는 것으로 확인되면, 항-이디오타입 항체들을 생성하기 위해 사용되고 하기에서 한층 더 기술되는 다른 MASP-2 결합 분자를 확인하기 위해 사용된다.

문헌으로부터의 MASP-2 특이적 항체들

항원	항체 유형	참조 문헌
재조합 MASP-2	래트 다클론성	Peterson, S.V.,　et　al., Mol. Immunol.　37:803-811, 2000
재조합 인간 CCP1/2-SP 단편 (MoAb 8B5)	래트 MoAb (하위부류 IgG1)	Moller-Kristensen, M.,　et　al., J. of Immunol. Methods 282:159-167, 2003
재조합 인간 MAp19 (MoAb 6G12) (MASP-2와 교차반응함)	래트 MoAb (하위부류 IgG1)	Moller-Kristensen, M.,　et　al., J. of Immunol. Methods 282:159-167, 2003
hMASP-2	마우스 MoAb (S/P) 마우스 MoAb (N-말단)	Peterson, S.V.,　et　al., Mol. Immunol.　35:409, April 1998
hMASP-2 (CCP1-CCP2-SP 도메인)	래트 MoAb: Nimoab101, 하이브리드 셀라인 03050904 (ECACC)에 의해 생성됨	WO 2004/106384
hMASP-2 (전 길이-his 태그됨)	쥐과 동물의 MoAbs: NimoAb104, 하이브리도마 셀라니 M0545YM035 (DSMZ)에 의해 생성됨 NimoAb108, 하이브리도마 셀라인 M0545YM029 (DSMZ)에 의해 생성됨 NimoAb109, 하이브리도마 셀라인 M0545YM046 (DSMZ)에 의해 생성됨 NimoAb110, 하이브리도마 셀라인 M0545YM048 (DSMZ)에 의해 생성됨	WO 2004/106384

감소된 이펙터 기능을 가지는 항-MASDP-2 항체들

발명의 이 측면의 일부 구체예에서, 항-MASP-2 항체들은 고전적 보체 경로의 활성화로부터 발생할 수 있는 염증을 감소시키기 위하여 감소된 이펙터 기능을 가진다. 고전적 보체 경로를 야기하는 IgG 분자들의 능력은 분자의 Fc 부분 내에 있는 것으로 밝혀졌다 (Duncan, A.R.,　et　al., Nature 332:738-740 1988). 분자의 Fc 부분이 효소적 절단에 의해 제거된 IgG 분자들은 이런 이펙터 기능이 없다 (Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988 참조). 따라서, 감소된 이펙터 기능을 가지는 항체들은 이펙터 기능을 최소화하는 유전자 엔지니어링된 Fc 서열을 가짐으로써 분자의 Fc 부분이 결핍된 결과로서, 또는 인간 IgG₂ 또는 IgG₄ 아이소타입 중 어느 하나인 결과로서 생성될 수 있다.

감소된 이펙터 기능을 가지는 항체들은 하기 실시예 9에서 기술되고 문헌에서 기술되는 것과 같이 IgG 중쇄의 Fc 부분의 표준 분자 생물학적 조작에 의해 생성될 수 있다 (Jolliffe et　al., Int'l Rev. Immunol.　10:241-250, 1993, and Rodrigues et　al., J. Immunol.　151:6954-6961, 1998). 감소된 이펙터 기능을 가지는 항체들은 또한 보체를 활성화하고 및/또는 Fc 수용체와 상호작용하는 능력이 감소되어 있는 인간 IgG2 및 IgG4 아이소타입을 포함한다 (Ravetch, J.V., et　al., Annu. Rev. Immunol.　9:457-492, 1991; Isaacs, J.D.,　et　al., J. Immunol. 148:3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G., et　al., Immunol. Today　14:215-221, 1993). IgG2 또는 IgG4 아이소타입으로 구성된 인간 MASP-2에 특이적인 인간화된 또는 전체 인간 항체는 문헌에 기술되어 있는 것과 같이, 기술분야의 숙련자에게 알려져 있는 여러 방법들 중 하나에 의해 제조될 수 있다 (Vaughan, T.J., et　al., Nature Biotechnical　16:535-539, 1998).

항-MASP-2 항체의 제조

항-MASP-2 항체들은 MASP-2 폴리펩티드 (예컨대 전 길이 MASP-2)를 사용여 또는 항원성 MASP-2 에피토프-내포 펩티드 (예컨대 MASP-2 폴리펩티드의 일부)를 사용하여 제조될 수 있다. 면역원성 펩티드는 5개의 아미노산 잔기 정도로 작을 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO:6의 전체 아미노산 서열을 포함하는 MASP-2 폴리펩티드는 발명의 방법에 유용한 항-MASP-2 항체들을 유도하기 위해 사용될 수 있다. CUBI 및 CUBIEGF 도메인과 같이, 단백질-단백질 상호작용에 포함된 것으로 알려져 있는 특별한 MASP-2 도메인, 뿐만 아니라 세린-프로테아제 활성 부위를 포함하는 영역은 실시예 3에서 기술된 것과 같이 재조합 폴리펩티드로서 발현되고 항원으로서 사용될 수 있다. 또한, MASP-2 폴리펩티드 (SEQ ID NO:6)의 적어도 6개의 아미노산의 일부를 포함하는 펩티드는 MASP-2 항체를 유도하는 데 유용하다. MASP-2 항체를 유도하는 데 유용한 MASP-2 유도된 항원들의 추가의 실례는 하기 표 2에 제공된다. 항체를 불러 일으키는 데 사용된 MASP-2 펩티드 및 폴리펩티드들은 천연 폴리펩티드, 또는 재조합 또는 합성 펩티드 및 촉매적으로 비활성 재조합 폴리펩티드, 예컨대 하기 실시예 5 내지 7에서 한층 더 기술되는 MASP-2A로서 분리될 수 있다. 발명의 이런 측면의 일부 구체예에서, 항-MASP-2 항체들은 하기 실시예 8 및 9에 기술되고 하기에서 추가로 기술되는 것과 같이 유전자 도입 마우스 계통을 사용하여 얻어진다.

항-MASP-2 항체들을 제조하기에 유용한 항원들은 또한 융합 폴리펩티드, 예컨대 MASP-2 또는 그것의 일부와 면역글로불린 폴리펩티드 또는 말토오스-결합 단백질과의 융합을 포함한다. 폴리펩티드 면역원은 전-길이 분자 또는 그것의 일부일 수 있다. 만약 폴리펩티드 부분이 합텐-형이라면, 그런 부분은 면역화를 위해 유리하게도 마크로분자 담체 (예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 파상풍 독소)에 결합 또는 연결될 수 있다.

MASP-2 유도된 항원들

SEQ ID NO:	아미노산 서열
SEQ ID NO:6	인간 MASP-2 단백질
SEQ ID NO:51	쥐과 동물의 MASP-2 단백질
SEQ ID NO:8	인간 MASP-2의 CUBI 도메인 (SEQ ID NO:6의 aa 1 내지 121)
SEQ ID NO:9	인간 MASP-2의 CUBIEGF 도메인 (SEQ ID NO:6의 aa 1 내지 166)
SEQ ID NO:10	인간 MASP-2의 CUBIEGFCUBII 도메인 (SEQ ID NO:6의 aa 1 내지 293)
SEQ ID NO:11	인간 MASP-2의 EGF 도메인 (SEQ ID NO:6의 aa 122 내지 166)
SEQ ID NO:12	인간 MASP-2의 세린-프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:6의 aa 429 내지 671)
SEQ ID NO:13 GKDSCRGDAGGALVFL	세린-프로테아제 비활성화 돌연변이 형태 (돌연변이된 Ser 618을 가지는 SEQ ID NO:6의 aa 610 내지 625)
SEQ ID NO:14 TPLGPKWPEPVFGRL	인간 CUBI 펩티드
SEQ ID NO:15: TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ	인간 CUBI 펩티드
SEQ ID NO:16: TFRSDYSN	인간 CUBI 도메인의 MBL 결합 영역
SEQ ID NO:17: FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF	인간 CUBI 도메인의 MBL 결합 영역
SEQ ID NO:18 IDECQVAPG	EGF 펩티드
SEQ ID NO:19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV	세린-프로테아제 활성 부위로부터의 펩티드

다클론성 항체들

MASP-2에 대항하는 다클론성 항체들은 동물을 MASP-2 폴리펩티드 또는 그것의 면역원성 일부로 기술분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있는 방법들을 사용하여 면역함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면 Green et　al., "Production of Polyclonal Antisera," in Immunochemical Protocols (Manson, ed.), page　105 및 하기 실시예 6에서 추가로 기술된 내용 참조. MASP-2 폴리펩티드의 면역원성은 보조제, 이를테면 미네랄 겔, 예컨대 알루미늄 하이드록사이드 또는 프로인트 보조제 (완전 또는 불완전), 표면 활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가 음이온, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 다이니트로페놀을 사용함으로써 증가될 수 있다. 다클론성 항체들은 전형적으로 말, 소, 개, 닭, 래트, 마우스, 토끼, 기니아 피그, 염소 또는 양과 같은 동물에서 생성된다. 다르게는, 본 발명에 유용한 항-MASP-2 항체는 또한 인간 이하의 영장류로부터 유도될 수 있다. 개코원숭이에서 진단적으로 및 치료적으로 유용한 항체들을 생성하기 위한 일반적 기법은 예를 들면 다음 문헌에서 찾아볼 수 있다: Goldenberg et　al., International Patent Publication No.　WO　91/11465, 및 Losman, M.J., et　al., Int. J.　Cancer　46:310, 1990. 면역학적으로 활성 항체들을 함유하고 있는 혈청은 그런 다음 기술분야에 잘 알려져 있는 표준 과정을 사용하여 그런 면역화된 동물의 혈액으로부터 제조될 수 있다.

단클론성 항체들

일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 단클론성 항체이다. 항-MASP-2 단클론성 항체는 고도로 특이적이며, 단일 MASP-2 에피토프에 대항하여 지시된다. 본원에서 사용되는 수식어 "단클론성"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어지는 것과 같은 항체의 특징을 나타내고, 어떠한 특정 방법에 의해 항체의 생성을 필요로 하는 것으로 해석되지는 않는다. 단클론성 항체들은 배양중의 연속성 셀라인, 예컨대 Kohler, G., et　al., Nature　256:495, 1975에 의해 기술된 하이브리도마 방법에 의해 항체 분자의 제조를 제공하는 어떠한 기법을 사용하여 얻어지거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예컨대 Cabilly에 부여된 미국 특허 제 4,816,567호 참조)에 의해 만들어질 수 있다. 단클론성 항체들은 또한 문헌에 기술된 기법들을 사용하여 파가 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다 (Clackson, T., et　al., Nature　352:624-628, 1991, and Marks, J.D., et　al., J. Mol. Biol.　222:581-597, 1991). 그런 항체들은 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 그것들의 어떠한 하위부류를 포함하여 어떠한 면역글로불린 부류의 것일 수 있다.

예를 들어, 단클론성 항체들은 적당한 포유류 (예컨대 BALB/c 마우스)에 MASP-2 폴리펩티드 또는 그것의 일부를 포함하는 조성물로 주입함으로써 얻어질 수 있다. 예정된 시간 후에, 비장세포들은 마우스로부터 제거되고 세포 배양 배지에 현탁된다. 그런 다음 비장세포들은 불멸의 셀라인과 융합되어 하이브리도마가 형성된다. 형성된 하이브리도마들은 세로 배양물에서 성장되고 그것들의 MASP-2에 대항하는 단클론성 항체의 제조 능력에 대해 스크리닝된다. 항-MASP-2 단클론성 항체들의 제조를 추가로 설명하는 실례는 실시예 7에 제공된다 (또한 Current Protocols in Immunology, Vol.　1., John Wiley　& Sons, pages　2.5.1-2.6.7, 1991 참조).

인간 단클론성 항체들은 항원성 도전에 대한 반응으로 특이적인 인간 항체들을 생성하기 위해 엔지니어링된 유전자도입 마우스의 사용을 통해 얻어질 수 있다. 이 기법에서, 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소들이 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 파괴를 함유하는 배아 줄기 셀라인으로부터 유도된 마우스들의 계통에 도입된다. 유전자도입 마우스들은 인간 항원, 예컨대 본원에 기술된 MASP-2 항원들에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 마우스들은 그런 동물들로부터의 B-세포를 적절한 골수종 셀라인에, 하기 실시예 7에서 한층 더 기술되는 종래의 Kohler-Milstein 기술을 사용하여 융합시킴으로써 인간 MASP-2 항체-분비 하이브리도마를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 인간 면역글로불린 게놈을 가지는 유전자도입 마우스는 상업적으로 입수할 수 있다 (예컨대 Abgenix, Inc., Fremont, CA 및 Medarex, Inc., Annandale, N.J.로부터). 유전자도입 마우스로부터 인간 항체를 얻기 위한 방법은 예를 들면 다음 문헌에 기술되어 있다: Green, L.L., et　al., Nature Genet.　7:13, 1994; Lonberg, N., et　al., Nature 368:856, 1994; and Taylor, L.D., et　al., Int. Immun.　6 :579, 1994.

단클론성 항체들은 잘-수립되어 있는 다양한 기법들에 의해 하이브리도마 배양물로부터 분리되고 정제될 수 있다. 그런 분리 기법은 단백질-A 세파로오스를 사용하는 친화성 크로마토그래피, 크기-축출 크로마토그래피 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다 (예를 들면 Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 및 pages　2.9.1-2.9.3; Baines et　al., "Purification of Immunoglobulin　G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol.　10, pages　79-104, 1992 참조).

일단 제조되면, 다클론성, 단클론성 또는 파지-유도된 항체들은 먼저 특이적인 MASP-2 결합에 대해 시험된다. 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 다양한 분석법이 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체들을 검출하기 위해 이용될 수 있다. 예시적인 분석으로는 표준 방법에 의한 웨스턴 블롯 또는 면역침전 분석 (예컨대 Ausubel 등에서 기술된 것과 같음), 면역전기영동, 효소-결합 면역-흡착 분석, 돗트 블롯, 억제 또는 경합 분석 및 샌드위치 분석을 포함한다 (Harlow and Land, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). 일단 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체들이 확인되면, 항-MASP-2 항체들은 예를 들면 렉틴-특이적 C4 절단 분석 (실시예 2에서 기술됨), C3b 침착 분석 (실시예 2에서 기술됨) 또는 C4b 침착 분석 (실시예 2에서 기술됨)과 같은 여러 분석들 중 하나로 MASP-2 억제제로서 기능하는 능력에 대해 시험된다.

항-MASP-2 단클론성 항체들의 친화성은 기술분야의 숙련자들에 의해 쉽게 측정될 수 있다 (예컨대 Scatchard, A., NY Acad. Sci.　51:660-672, 1949 참조). 한 구체예에서, 발명의 방법에 유용한 항-MASP-2 단클론성 항체들은 MASP-2에 <100 nM, 바람직하게 <10 nM, 가장 바람직하게 <2 nM의 결합 친화성으로 결합한다. 일부 구체예에서, 발명의 방법에 유용한 항-MASP-2 단클론성 항체는 (I) (a) i) SEQ ID NO:67의 31 내지 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO:67의 50 내지 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO:67의 95 내지 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) i) SEQ ID NO:70의 24 내지 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO:70의 50 내지 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO:70의 89 내지 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) SEQ ID NO:67에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:67에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 그것의 변이체를 포함하는 MASP-2 억제 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이다.

키메라/인간화된 항체들

발명의 방법에 유용한 단클론성 항체들은 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유도된 또는 특정 항체 부류에 속하는 항체의 해당 서열과 동일하거나 그것에 대해 상동하고, 사슬(들)의 나머니즌 다른 종으로부터 유도되거나 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체들에 해당하는 서열과 동일하거나 그것에 상동하는 키메라 항체와, 또한 그런 항체들의 단편들을 포함한다 (Cabilly에 부여된 미국 특허 제 4,816,567호; 및 Morrison, S.L., et　al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA　81:6851-6855, 1984).

발명에 유용한 키메라 항체의 한 가지 형태는 인간화된 단클론성 항-MASP-2 항체이다. 비-인간 (예컨대 쥐과 동물의) 항체의 인간화된 형태는 키메라 항체로, 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유한다. 인간화된 단클론성 항체는 마우스 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 사슬로부터의 비-인간 (예컨대 마우스) 상보성 결정 영역 (CDR)을 인간 가변 도메인으로 전달함으로써 제조된다. 전형적으로, 그런 다음 인간 항체들의 잔기는 비-인간 대응물의 프레임워크 영역에서 치환된다. 나아가, 인간화된 항체들은 수용체 항체에서 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 이들 변형은 추가로 항체 성능을 개선하기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이고, 이대 모든 또는 실질적으로 모든 과가변성 루프는 비-인간 면역글로불린의 그것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 Fc 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 그것이다. 인간화된 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 그것을 포함할 것이다. 추가의 상세한 설명에 대해서는 다음 문헌을 참조한다: Jones, P.T., et　al., Nature　321:522-525, 1986; Reichmann, L., et　al., Nature　332:323-329, 1988; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol.　2:593-596, 1992.

발명에 유용한 인간화된 항체들은 적어도 MASP-2 결합 CDR3 영역을 포함하는 인간 단클론성 항체들을 포함한다. 또한, Fc 부분은 인간 IgG 항체뿐 아니라 IgA 또는 IgM을 제조하기 위해 대체될 수 있다. 그런 인간화된 항체들은 그것들이 특이적으로 인간 MASP-2를 인식하지만 항체 자체에 대항하여 인간에서 면역 반응을 불러 일으키지 못할 것이기 때문에 특별한 임상적 활용성을 가질 것이다. 결국, 그것들은 인간에서, 특히 반복된 또는 장기간 투여가 필요할 때 생체 내 투여에 더 잘 맞는다.

쥐과 동물의 항-MASP-2 단클론성 항체로부터 인간화된 항-MASP-2 항체의 생성의 실례는 하기 실시예 6에 제공된다. 인간화된 단클론성 항체들의 제조 기법은 또한 예를 들면 다음 문헌에 기술되어 있다: Jones, P.T., et　al., Nature　321:522, 1986; Carter, P., et　al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA　89:4285, 1992; Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech.　12:437, 1992; Singer, I.I., et　al., J. Immun.　150:2844, 1993; Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., 1995; Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies," in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et　al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., pages 399-434, 1996; 및 Queen에 부여된 미국 특허 제 5,693,762호, 1997. 또한, 특이적인 쥐과 동물의 항체 영역으로부터 인간화된 항체들을 합성할 상업적인 개체도 존재한다 (예컨대 Protein Design Labs (Mountain View, CA)).

재조합 항체들

항-MASP-2 항체들은 또한 재조합 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 인간 항체들은 인간 항체들의 단편들 (V_H, V_L, Fv, Fd, Fab or F(ab')₂)을 제조하기 위하여 인간 면역글로불린 발현 라이브러리 (예를 들면 Stratagene, Corp., La Jolla, CA로부터 입수가능함)를 사용하여 만들어질 수 있다. 이들 단편은 그런 다음 키메라 항체의 제조 기법에 유사한 기법들을 사용하여 전체 인간 항체를 구성하는 데 사용된다.

항-이디오타입 항체들

일단 항-MASP-2 항체들이 바람직한 억제 활성으로 확인된 후, 이들 항체들은 기술분야에 잘 알려져 있는 기법들을 사용하여 MASP-2의 부분을 닮은 항-이디오타입 항체들을 생성하기 위해 사용될 수 있다 (예컨대 Greenspan, N.S., et　al., FASEB　J.　7:437, 1993 참조). 예를 들어, MASP-2에 결합하고 보체 활성화에 필요한 MASP-2 단백질 상호작용을 경합적으로 억제하는 항체들은 MASP-2 단백질 상의 MBL 결합 부위를 닮고 따라서 MASP-2의 결합 리간드, 예컨대 예를 들면 MBL에 결합하여 그것을 중화시키는 항-이디오타입을 생성하기 위해 사용될 수 있다.

면역글로불린 단편들

발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제제들은 무상 면역글로불린 분자뿐 아니라 Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂ 및 Fv 단편을 포함한 잘 알려져 있는 단편들, scFv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이성 항체들을 포함한다.

기술분야에는, 항체 분자의 단지 작은 부분, 파라토프가 항체의 에피토프에 대한 결합에 포함되는 것이 잘 알려져 있다 (예컨대 Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986 참조). 항체의 pFc' 및 Fc 영역은 고전적 보체 경로의 이펙터들이지만, 항원 결합에는 포함되지 않는다. pFc' 영역이 효소적으로 절단되어 있거나, pFc' 영역이 없이 제조된 항체는 F(ab')₂ 단편으로서 표시되고 무상 항체의 항원 결합 부위 둘 다를 보유한다. 분리된 F(ab')₂ 단편은 그것의 2개의 항원 결합 부위 때문에 2가 단클론성 단편으로서 언급된다. 유사하게, Fc 영역이 효소적으로 절단되어 있거나, Fc 영역 없이 제조된 항체는 Fab 단편으로 표시되고, 무상 항체 분자의 항원 결합 부위 중 하나를 보유한다.

항체 단편들은 단백질분해성 가수분해에 의해, 예컨대 고전적 방법에 의한 전체 항체의 펩신 또는 파파인 소화에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어 항체 단편들은 펩신을 사용한 항체의 효소적 절단에 의해 제조되어 F(ab')₂로 표시된 5S 단편이 제공된다. 이 단편은 추가로 티올 환원제를 사용하여 절단되어 3.5S Fab' 1가 단편이 제조될 수 있다. 임의로, 절단 반응은 이황화 연쇄의 절단으로부터 유발되는 설프하이드릴기에 대한 차단기를 사용하여 수행될 수 있다. 다르게는, 펩신을 사용한 효소적 절단은 2개의 1가 Fab 단편과 Fc 단편을 직접적으로 생성한다. 이들 방법은 예를 들면 Goldenberg에 부여된 미국 특허 제 4,331,647호; Nisonoff, A., et　al., Arch. Biochem. Biophys.　89:230, 1960; Porter, R.R., Biochem. J.　73:119, 1959; Edelman, et　al., in Methods in Enzymology　1:422, Academic Press, 1967; and by Coligan at pages 2.8.1-2.8.10 및　2.10.-2.10.4에 기술되어 있다.

일부 구체예에서, Fc 영역이 없는 항체 단편들의 사용은 Fc의 Fcγ 수용체에의 결합시 개시되는 고전적 보체 경로의 활성화를 피하기 위해 바람직하다. 당업자가 Fcγ 수용체 상호작용을 피하는 MoAb를 제조할 수 있는 방법은 여러가지 있다. 예를 들어, 단클론성 항체의 Fc 영역은 단백질 가수분해 효소에 의한 부분적 소화 (예컨대 피신 소화)를 화학적으로 사용하여 제거될 수 있고, 그로써 예를 들면 Fab or F(ab)₂ 단편과 같은 항원-결합 항체 단편들이 생성된다 (Mariani, M., et　al., Mol. Immunol.　28:69-71, 1991). 다르게는, Fcγ 수용체에 결합하지 않는 인간 γ4 IgG 아이소타입은 본원에 기술된 인간화된 항체의 구성 중에 사용될 수 있다. Fc 도메인이 없는 항체, 단일 사슬 항체 및 항원-결합 도메인은 본원에 기술된 재조합 기법을 사용하여 엔지니어링될 수 있다.

측쇄 항체 단편들

다르게는, 당업자는 중쇄 및 경쇄 Fv 영역들이 연결되어 있는 MASP-2에 특이적인 단일 펩티드 사슬 결합 분자를 생성할 수 있다. Fv 단편들은 펩티드 링커에 의해 연결되어 단일-사슬 항원 결합 단백질 (scFv)이 형성될 수 있다. 이들 측쇄 항원 결합 단백질들은 올리고뉴클레오티드에 의해 연결되어 있는 V_H 및 V_L 도메인을 코드화하는 DNA 서열을 포함하고 있는 구조 유전자를 구성함으로써 제조된다. 구조 유전자는 발현 벡터에 삽입되고, 그것은 계속해서 대장균과 같은 숙주 세포에 도입된다. 재조합 숙주 세포는 2개의 V 도메인을 가교시키는 링커 펩티드를 가지는 단일 폴리펩티드 사슬을 합성한다. scFv의 제조 방법은 예를 들면 다음 문헌에 기술되어 있다: Whitlow, et　al., "Methods: A Companion to Methods in Enzymology" 2:97, 1991; Bird, et　al., Science　242:423, 1988; Ladner에 부여된 미국 특허 제 4,946,778; Pack, P., et　al., Bio/Technology　11:1271, 1993.

예시적인 실례로서, MASP-2 특이적 scFv는 림프구를 시험관 내에서 MASP-2 폴리펩티드에 노출시키고 파지 또는 유사한 벡터에서 항체 디스플레이 라이브러리를 선택함으로써 (예를 들면 고정된 또는 표지된 MASP-2 단백질 또는 펩티드의 사용을 통해서) 얻어질 수 있다. 잠재적인 MASP-2 폴리펩티드 결합 도메인을 가지는 폴리펩티드를 코드화하는 유전자들은 파지상에 또는 대장균과 같은 박테리아 상에 나타난 무작위 펩티드 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 이들 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리들은 MASP-2와 상호작용하는 펩티드에 대해 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 그런 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 기법들은 기술분야에 잘 알려져 있고 (Lardner에 부여된 미국 특허 제 5,223,409호; Lardner에 부여된 미국 특허 제 4,946,778호; Lardner에 부여된 미국 특허 제 5,403,484호; Lardner에 부여된 미국 특허 제 5,571,698호; 및 Kay et　al., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996) 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리 및 그런 라이브러리를 스크리닝하기 위한 키트는 상업적으로, 예를 들면 CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.), New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.) 및 Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, N.J.)로부터 입수할 수 있다.

발명의 이런 측면에 유용한 항-MASP-2 항체 단편의 또 다른 형태는 MASP-2 항원상의 에피토프에 결합하고 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하는 단일한 상보성-결정 영역 (CDR)을 코딩하는 펩티드이다. CDR 펩티드 ("최소 인식 유닛")는 관심의 항체의 CDR을 코드화하는 유전자들을 구성함으로써 얻어질 수 있다. 그런 유전자들은 예를 들면 항체 생성 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성하기 위해 중합효소 연쇄 반응을 사용함으로써 제조된다 (예를 들면 Larrick et　al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology　2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et　al. (eds.), page 166, Cambridge University Press, 1995; and Ward　et　al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et　al. (eds.), page　137, Wiley-Liss, Inc., 1995 참조).

본원에 기술된 MASP-2 항체들은 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하기 위하여 그런 필요가 있는 대상에게 투여된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 감소된 이펙터 기능을 가지는 고-친화성 인간 또는 인간화된 단클론성 항-MASP-2 항체이다.

펩티드 억제제

발명의 이 측면의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2-의존성 보체 활성화 시스템을 억제하는 분리된 천연 펩티드 억제제 및 합성 펩티드 억제제를 포함하여, 분리된 MASP-2 펩티드 억제제를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "분리된 MASP-2 펩티드 억제제"는 렉틴 경로에서 다른 인식 분자 (예컨대 MBL, H-피콜린, M-피콜린 또는 L-피콜린)에 결합하거나 또는 결합에 대해 MASP-2와 경합함으로써, 및/또는 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하기 위해 MASP-2와 직접적으로 상호작용함으로써 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하며, 실질적으로 순수하고 본질적으로 자연계에서 실제적인 정도로 발견될 수 있는 다른 물질이 없으며 그것들의 의도된 용도에 적절한 펩티드를 말한다.

펩티드 억제제는 단백질-단백질 상호작용 및 촉매적 부위를 간섭하기 위해 생체 내에서 성공적으로 사용되어 왔다. 예를 들어 LFA-1에 구조적으로 관련된 부착 분자에 대한 펩티드 억제제는 최근에 응고장애에 임상적 사용에 대해 승인되었다 (Ohman, E.M.,　et　al., European Heart J.　16:50-55, 1995). 인티그린-의존성 부착을 방지하거나 간섭하는 짧은 선형 펩티드 (<30 아미노산)가 기술되었다 (Murayama, O., et　al., J. Biochem. 120:445-51, 1996). 25 내지 200 아미노산 잔기의 길이의 범위를 가지는 더 긴 펩티드 또한 성공적으로 인티그린-의존성 부착을 차단하기 위해 사용되었다 (hang, L., et　al., J. Biol. Chem.　271(47):29953-57, 1996). 일반적으로, 더 긴 펩티드 억제제는 짧은 펩티드보다 높은 친화성 및/또는 더 느린 오프-속도를 가지며 따라서 더 강력한 억제제일 수 있다. 고리형 펩티드 억제제는 또한 인간 염증성 질환의 치료를 위해 생체 내에서 인티그린의 효과적인 억제제인 것으로 밝혀졌다 (Jackson, D.Y., et　al., J. Med. Chem.　40:3359-68, 1997). 고리형 펩티드을 제조하는 한 가지 방법은 펩티드의 말단 아미노산이 시스테인이고, 그로써 펩티드가 말단 아미노산 사이의 이황화 결합에 의해 고리형 형태로 존재하는 것이 허용되는 펩티드의 합성을 포함하며, 그것은 조혈성 신생물의 치료를 위해 생체 내에서 친화성 및 반감기를 개선시키는 것으로 밝혀졌다 (예컨대 Larson에 부여된 미국 특허 제 6,649,592호).

합성 MASP-2 펩티드 억제제

발명의 이 측면의 방법에 유용한 MASP-2 억제 펩티드는 MASP-2 기능에 중요한 표적 영역을 모방하는 아미노산 서열을 예로 들 수 있다. 발명의 방법의 실시에 유용한 억제 펩티드는 약 5 아미노산 내지 약 300 아미노산의 크기 범위를 가진다. 하기 표 3은 본 발명의 이런 측면의 실시에 유용할 수 있는 예시적인 억제 펩티드의 목록을 제거한다. 후보 MASP-2 억제 펩티드그 예를 들면 렉틴 특이적 C4 절단 분석 (실시예 2에서 기술됨) 및 C3b 침착 분석 (실시예 2에서 기술됨)을 포함하여 여러 분석 중 하나에서 MASP-2 억제제로서 기능하는 능력에 대해 시험될 수 있다.

일부 구체예에서, MASP-2 억제 펩티드는 MASP-2 폴리펩티드로부터 유도되고 전길이의 성숙한 MASP-2 단백질 (SEQ ID NO:6)로부터, 또는 MASP-2 단백질의 특정 도메인, 예컨대 예를 들면 CUBI 도메인 (SEQ ID NO:8), CUBIEGF 도메인 (SEQ ID NO:9), EGF 도메인 (SEQ ID NO:11) 및 세린 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO:12)으로부터 선택된다. 앞서 기술된 것과 같이, CUBEGFCUBII 영역은 이량체화 및 MBL과의 결합에 필요한 것으로 밝혀졌다 (Thielens　et　al., 상기 동일). 특히, MASP-2의 CUBI 도메인의 펩티드 서열 TFRSDYN (SEQ ID NO:16)은 Asp105에서 Gly105로의 동형접합성 돌연변이를 은닉하는 인간을 확인한 연구에서 MBL에의 결합에 포함되고, 그 결과 MBL 복합체로부터 MASP-2의 손실이 초래되는 것으로 밝혀졌다 (Stengaard-Pedersen, K., et　al., New England J. Med.　349:554-560, 2003).

일부 구체예에서, MASP-2 억제 펩티드는 MASP-2에 결합하고 렉틴 보체 경로에 포함되는 렉틴 단백질로부터 유도된다. 만난-결합 렉틴 (MBL), L-피콜린, M-피콜린 및 H-피콜린을 포함하여, 이 경로에 포함되는 여러 상이한 렉틴이 확인되었다 (Ikeda, K.,　et　al., J.　Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M.,　et　al., J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M.,　et　al., J.　Immunol. 168:3502-3506, 2002). 이들 렉틴은 동형 삼량체 하위유닛의 올리고머로서 혈청에 존재하고, 이때 각각의 하위유닛은 탄수화물 인식 도메인을 가지는 N-말단 콜라겐-유사 섬유를 가진다. 이들 상이한 렉틴은 MASP-2에 결합하고, 렉틴/MASP-2 복합체는 단백질 C4 및 C2의 절단을 통해 보체를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. H-피콜린은 24 아미노산의 아미노-말단 영역, 11개의 Gly-Xaa-Yaa 반복부를 가지는 콜라겐-유사 도메인, 12 아미노산의 목 (neck) 도메인 및 207 아미노산의 피브리노겐-유사 도메인을 가진다 (Matsushita, M.,　et　al., J.　Immunol.　168:3502-3506, 2002). H-피콜린은 GlcNAc에 결합하여 S.타이피뮤리움, S.미네소타 및 대장균으로부터 유도된 LPS로 코팅된 인간 적혈구를 접합시킨다. H-피콜린은 MASP-2 및 MAp19와 결합하여 렉틴 경로를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 상기 동일. L-피콜린/P35는 또한 GlcNAc에 결합하고 인간 혈청중의 MASP-2 및 MAp19와 결합하는 것으로 밝혀졌고 이 복합체는 렉틴 경로를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다 (Matsushita, M.,　et　al., J.　Immunol. 164:2281, 2000). 따라서, ㅂ본 발명에 유용한 SP-2 억제 펩티드는 MBL 단백질 (SEQ ID NO:21), H-피콜린 단백질 (Genbank 승인 번호 NM_173452), M-피콜린 단백질 (Genbank 승인 번호 O00602) 및 L-피콜린 단백질 (Genbank 승인 번호 NM_015838)로부터 선택된 적어도 5 아미노산의 영역을 포함할 수 있다.

보다 구체적으로, 과학자들은 MBL 상의 MASP-2 결합 부위를 MBP의 힌지와 콜라겐-유사 도메인의 C-말단 부분의 목 사이에 있는 12개의 Gly-X-Y 트리플렛 "GKD GRD GTK GEK GEP GQG LRG LQG POG KLG POG NOG PSG SOG PKG QKG DOG KS" (SEQ ID NO:26) 내에 있는 것으로 확인하였다 (Wallis,　R.,　et　al., J.　Biol. Chem. 279:14065, 2004). 이 MASP-2 결합 부위 영역은 또한 인간 H-피콜린 및 인간 L-피콜린에서 고도로 보존된다. 아미노산 서열 "OGK-X-GP" (SEQ ID NO:22)를 포함하는 3개의 모든 렉틴 단백질에 존재하는 일치 결합 부위가 기술되었고, 이때 문자 "O"는 하이드록시프롤린을 나타내고 문자 "X"는 소수성 잔기이다 (Wallis　et　al., 2004, 상기 동일). 따라서, 일부 구체예에서, 발명의 이 측면에 유용한 MASP-2 억제 펩티드는 길이가 적어도 6 아미노산이고 SEQ ID NO:22를 포함한다. 아미노산 서열 "GLR GLQ GPO GKL GPO G" (SEQ ID NO:24)를 포함하는 MBL로부터 유도된 펩티드는 시험관 내에서 MASP-2에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (Wallis,　et　al., 2004, 상기 동일). MASP-2에의 결합을 증강시키기 위하여, 천연 MBL 단백질에서 발견되는 삼중 나선의 형성을 증강시키기 위해 각 단부에 2개의 GPO 트리플렛이 양옆에 있는 펩티드 ("GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GGP OGP O" SEQ ID NO:25) 가 합성될 수 있다 (추가의 상세한 설명은 Wallis, R.,　et　al., J. Biol. Chem. 279:14065, 2004 참조함).

MASP-2 억제 펩티드는 또한 H-피콜린의 일치 MASP-2 결합 영역으로부터 서열 "GAO GSO GEK GAO GPQ GPO GPO GKM GPK GEO GDO" (SEQ ID NO:27)를 포함하는 인간 H-피콜린으로부터 유도될 수 있다. 또한 L-피콜린의 일치 MASP-2 결합 영역으로부터 서열 "GCO GLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPN GAO GEO" (SEQ ID NO:28)를 포함하는 인간 L-피콜린으로부터 유도되는 펩티드가 포함된다.

MASP-2 억제 펩티드는 또한 항트롬빈 III의 C-말단 부분에 연결된 C4 절단 부위인 "LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI" (SEQ ID NO:29)와 같은 C4 절단 부위로부터 유도될 수 있다 (Glover, G.I.,　et　al., Mol. Immunol.　25:1261 (1988)).

예시적인 MASP-2 억제 펩티드

SEQ ID NO	공급원
SEQ ID NO:6	인간 MASP-2 단백질
SEQ ID NO:8	MASP-2의 CUBI 도메인 (SEQ ID NO:6의 aa 1 내지 121)
SEQ ID NO:9	MASP-2의 CUBIEGF 도메인 (SEQ ID NO:6의 aa 1 내지 166)
SEQ ID NO:10	MASP-2의 CUBIEGFCUBII 도메인 (SEQ ID NO:6의 aa 1 내지 293)
SEQ ID NO:11	MASP-2의 EGF 도메인 (aa 122 내지 166)
SEQ ID NO:12	MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 (aa 429 내지 671)
SEQ ID NO:16	MASP-2의 MBL 결합 영역
SEQ ID NO:3	인간 MAp19
SEQ ID NO:21	인간 MBL 단백질
SEQ ID NO:22 OGK-X-GP, 이때 "O"는 하이드록시프롤린이고 "X"는 소수성 아미노산 잔기임	인간 MBL 및 인간 피콜린으로부터의 합성 펩티드 일치 결합 부위
SEQ ID NO:23 OGKLG	인간 MBL 코어 결합부위
SEQ ID NO:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G	인간 MBP 트리플렛 6 내지 10 - MASP-2에의 결합을 증명함
SEQ ID NO:25 GPOGPOGLRGLQGPOGKLGPOGGPOGPO	삼중 나선의 형성을 증강시키기 위해 첨가된 GPO를 가지는 인간 MBP 트리플렛
SEQ ID NO:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOGNOGPSGSOGPKGQKGDOGKS	인간 MBP 트리플렛 1 내지 17
SEQ ID NO:27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO	인간 H-피콜린 (Hataka)
SEQ ID NO:28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGAOGEO	인간 L-피콜린 P35
SEQ ID NO:29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI	인간 C4 절단 부위

주의: 문자 "O"는 하이드록시프롤린을 나타낸다. 문자 "X"는 소수성 잔기이다.

MASP-2 세린 프로테아제 부위를 억제하는 다른 펩티드뿐 아니라 C4 절단 부위로부터 유도된 펩티드들은 화학적으로 변형되어 비가역적인 프로테아제 억제제가 될 수 있다. 예를 들어, 적절한 변형은 그것에 반드시 한정되는 것은 아니지만, C-말단에 할로메틸 케톤 (Br, Cl, I, F), Asp 또는 Glu 또는 기능성 측쇄에 첨부된; 아미노기 또는 다른 기능성 측쇄 상의 할로아세틸 (또는 다른 α-할로아세틸)기; 아미노 또는 카르복시 말단 상의 또는 기능성 측쇄 상의 에폭시드 또는 이민-함유기; 또는 아미노 또는 카르복시 말단 상의 또는 기능성 측쇄 상의 이미데이트 에스테르를 포함한다. 그런 변형은 펩티드의 공유 부착에 의해 효소를 영구적으로 억제하는 장점을 제공할 것이다. 이것은 펩티드 억제제의 더 낮은 유효 용량 및/또는 덜 빈번한 투여에 대한 필요성을 초래할 수 있을 것이다.

상기에서 기술된 억제 펩티드에 더불어, 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제 펩티드는 본원에서 기술된 것과 같이 얻어진 항-MASP-2 MoAb의 MASP-2-결합 CDR3 영역을 함유하고 있는 펩티드를 포함한다. 펩티드 합성에 사용하기 위한 CDR 영역의 서열은 기술분야에 공지되어 있는 방법들에 의해 측정될 수 있다. 중쇄 가변 영역은 일반적으로 100 내지 150 아미노산 범위의 길이를 가지는 펩티드이다. 경쇄 가변 영역은 일반적으로 80 내지 130 아미노산 범위의 길이를 가지는 펩티드이다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내에 있는 CDR 서열은 기술분야의 숙련자에 의해 쉽게 서열화될 수 있는 단지 대략 3 내지 25 아미노산 서열을 포함한다.

기술분야의 숙련자들은 상기에서 기술된 MASP-2 억제 펩티드의 실질적으로 상동성 변이가 또한 MASP-2 억제 활성을 나타낼 것임을 인지할 것이다. 예시적인 변이는, 그것들에 반드시 한정되는 것은 아니지만, 삽입, 결실, 대체 및/또는 추가의 아미노산을 대상 펩티드 또는 그것의 혼합물의 카르복시-말단 또는 아미노-말단 부분에 가지고 있는 펩티드를 포함한다. 따라서, MASP-2 억제 활성을 가지는 상동성 펩티드들은 본 발명의 방법에 유용한 것으로 여겨진다. 기술된 펩티드들은 또한 중복되는 모티프 및 보존성 치환을 가지는 다른 변형을 포함할 수 있다. 보존성 변이체는 본원의 다른 곳에서 기술되고, 유사한 전하, 크기 또는 소수성 등을 가지는 다른 것에 대한 아미노산의 교환을 포함한다.

MASP-2 억제 펩티드는 무상 단백질의 절편을 보다 밀접하게 닮기 위해 용해도를 증가시키기 위해 및/또는 포지티브 또는 네거티브 전하를 최대화시키기 위해 변형될 수 있다. 유도체가 MASP-2 억제의 바람직한 특성을 기능적으로 보유하는 한 유도체는 본원에 개시된 펩티드의 정확한 일차 아미노산 구조를 가질 수 있거나 갖지 않을 수 있다. 변형은 통상적으로 알려져 있는 20개의 아미노산 중 하나로 또는 다른 아미노산으로, 보조적으로 바람직한 특성, 예컨대 효소적 분해에 대한 내성을 가지거나, 또는 D-아미노산 또는 아미노산, 아미노산들 또는 펩티드의 천연 형태 및 기능을 모방하는 다른 분자 또는 화합물, 예컨대 탄수화물로의 치환; 아미노산 결실; 통상적으로 알려져 있는 20개의 아미노산 중 하나로 또는 다른 아미노산으로의 아미노산 삽입을 가지는 유도체화된 또는 치환된 아미노산으로, 보조적으로 바람직한 특성, 예컨대 효소적 분해에 대한 내성을 가지거나, 또는 D-아미노산 또는 아미노산, 아미노산들 또는 펩티드의 천연 형태 및 기능을 모방하는 다른 분자 또는 화합물, 예컨대 탄수화물로의 치환; 또는 원래의 펩티드의 천연 형태, 전하 분포 및 기능을 모방하는, 다른 분자 또는 화합물, 예컨대 탄수화물 또는 핵산 단량체로의 치환을 가지는 아미노산 치환을 포함하는 유도체화된 또는 치환된 아미노산으로의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 펩티드는 또한 아세틸화 또는 아미드화에 의해 변형될 수 있다.

유도체 억제 펩티드의 합성은 펩티드 생합성, 탄수화물 생합성 등의 공지된 기법들에 의지할 수 있다. 출발 지점으로서, 당업자는 관심의 펩티드의 형태를 결정하기 위하여 적당한 컴퓨터 프로그램에 의지할 수 있다. 일단 본원에서 개시된 펩티드의 형태가 공지되면, 당업자는 유도체가 원래의 펩티드의 기본적인 형태와 전하 분포를 보유하지만 원래의 펩티드에 존재하지 않거나 기존에 발견된 것들을 능가하는 증강된 특성들을 가질 수 있는 방식으로 하나 또는 그 이상의 부위에서 어떤 종류의 치환이 만들어질 수 있는지를 합리적인 디자인 방식으로 결정할 수 있다. 일단 후보 유도체 분자가 확인되면, 유도체는 그것이 본원에서 기술된 분석을 사용하여 MASP-2 억제제로서 기능하는지를 측정하기 위해 시험될 수 있다.

MASP-2 억제 펩티드에 대한 스크리닝

당업자는 또한 MASP-2의 핵심 결합 영역의 분자 구조를 모방하고 MASP-2의 보체 활성을 억제하는 펩티드들을 생성하고 그것들에 대해 스크리닝하기 위해 분자 모델링 및 합리적인 분자 디자인을 사용할 수 있다. 모델링에 사용된 분자 구조는 항-MASP-2 단클론성 항체의 CDR 영역뿐 아니라 이량체화에 필요한 영역, MBL에의 결합에 포함된 영역 및 앞서 기술된 세린 프로테아제 활성 부위를 포함하는 MASP-2 기능에 대해 중요한 것으로 여겨지는 표적 영역을 포함한다. 특정 표적에 결합하는 펩티드들을 확인하는 방법들은 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 분자 각인은 특별한 분자에 결합하는 펩티드와 같은 마크로분자 구조의 새로운 구성에 사용될 수 있다. 예를 들면 Shea, K.J., "Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De　Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sties," TRIP　2(5) 1994 참조.

예시적인 실례로서, MASP-2 결합 펩티드의 모방물을 제조하는 한 가지 방법은 다음과 같다. 공지된 MASP-2 결합 펩티드 또는 MASP-2 억제를 나타내는 항-MASP-2 항체의 결합 영역 (주형)의 기능성 단량체들이 중합된다. 그런 다음 주형은 제거되고, 이어서 주형에 의해 남겨진 보이드의 제 2 부류의 단량체들이 중합되어 주형에 유사한 하나 또는 그 이상의 바람직한 특성을 나타내는 새로운 분자가 제공된다. 이런 방식으로 펩티드를 제조하는 것 외에, 다당, 뉴클레오시드, 약물, 핵단백질, 리포단백질, 탄수화물, 당단백질, 스테로이드, 지질 및 다른 생물학적 활성 물질과 같은 MASP-2 억제제인 다른 MASP-2 결합 분자들이 또한 제조될 수 있다. 이 방법은 광범위한 생물학적 모방물이 전형적으로 기능 단량체들의 자유 라디칼 중합화에 의해 제조되어 비생체분해성 골격을 가지는 화합물이 초래되기 때문에 그것들의 천연 대응물보다 안정한 모방물을 디자인하는 데 유용하다.

펩티드 합성

MASP-2 억제 펩티드는 기술분야에 잘 알려져 있는 기법들, 예컨대 초기에 문헌에 기술되어 있는 고상 합성 기법을 사용하여 제조될 수 있다: Merrifield, in J.　Amer. Chem. Soc.　85:2149-2154, 1963. 자동화된 합성은 예를 들면 Applied Biosystems　431A 펩티드 합성기 (Foster City, Calif.)를 사용하여 제조업체에 의해 제공된 지시를 따라 이루어질 수 있다. 다른 기법들은 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있는 다른 참조 작업뿐 아니라, 예를 들면 다음 문헌에서 찾아볼 수 있다: Bodanszky, M., et　al., Peptide Synthesis, second edition, John Wiley　& Sons, 1976.

펩티드는 또한 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 표준 유전자 엔지니어링 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어 펩티드는 펩티드를 코드화하는 핵산을 발현 벡터에 삽입하고, 그 DNA를 발현시키고, 그 DNA를 필요한 아미노산의 존재하에 펩티드로 번역함으로써 효소적으로 제조될 수 있다. 그런 다음 펩티드는 크로마토그래피 또는 전기영동 기법을 사용하여, 또는 서열을 코드화하는 펩티드를 포함하는 단계에서 발현 벡터 안에 삽입함으로써 펩티드에 융합될 수 있고, 계속해서 담체 단백질을 코드화하는 핵산 서열로부터 절단될 수 있는 담체 단백질에 의해 정제된다. 융합 단백질-펩티드는 크로마토그래피, 전기영동 또는 면역학적 기법들 (예컨대 담체 단백질에 대한 항체를 통해 수지에 결합시킴)을 사용하여 분리될 수 있다. 펩티드는 화학적 방법을 사용하여 또는 효소적으로, 예컨대 하이드롤라제에 의해 절단될 수 있다.

발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제 펩티드는 또한 종래의 기법을 따라 재조합 숙주 세포에서 제조될 수 있다. 서열을 코드화하는 MASP-2 억제 펩티드를 발현시키기 위해, 그 펩티드를 코드화하는 핵산 분자는 발현 벡터에서 전사적 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고 그런 다음 숙주 세포 안에 도입된다. 전사적 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서 외에, 발현 벡터는 번역 조절 서열 및 그 발현 벡터를 운반하는 세포의 선택에 적당한 마커 유전자를 포함할 수 있다.

MASP-2 억제 펩티드를 코드화하는 핵산 분자는 포스포라미다이트 방법과 같은 프로토콜을 사용하는 "유전자 머신"으로 합성될 수 있다. 만약 유전자 또는 유전자 단편의 합성과 같은 용도에 화학적으로 합성된 이중-가닥의 DNA가 필요하다면 각각의 상보성 가닥이 별도로 만들어진다. 짧은 유전자 (60 내지 80 염기쌍)의 제조는 기술상 직진이고 상보하는 가닥을 합성함으로써 이루어진 후 그것들이 아닐링될 수 있다. 더 긴 유전자의 제조를 위해서는, 합성 유전자들 (이중-가닥)은 20 내지 100 뉴클레오티드 길이인 단일-가닥의 단편들로부터 모듈러 형식으로 조립된다. 폴리뉴클레오티드 합성에 대한 개관에 대해서는 예를 들어 다음 문헌을 참조한다: Glick and Pasternak, "Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA", ASM Press, 1994; Itakura, K., et　al., Annu. Rev. Biochem.　53:323, 1984; and Climie, S., et　al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA　87:633, 1990.

작은 분자 억제제

일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 저분자량을 가지는 천연 및 합성 물질을 포함하는 작은 분자 억제제, 예컨대 예를 들면 펩티드, 펩티드 모방물 및 비펩티드 억제제 (올리고뉴클레오티드 및 유기 화합물을 포함함)이다. MASP-2의 작은 분자 억제제는 항-MASP-2 항체의 가변 영역의 분자 구조를 기초로 생성될 수 있다.

작은 분자 억제제는 또한 컴퓨터를 사용한 약물 디자인을 사용하여 MASP-2 결정 구조를 기초로 디자인되고 생성될 수 있다 (Kuntz I.D., et　al., Science　257:1078, 1992). 래트 MASP-2의 결정 구조는 기술되어 있다 (Feinberg, H., et　al., EMBO　J.　22:2348-2359, 2003). Kuntz 등에 의해 기술된 방법을 사용하여, MASP-2 결정 구조 좌표는 DOCK와 같은 컴퓨터 프로그램에 대한 입력으로서 사용되고, MASP-2에 결합할 것으로 예상되는 작은 분자 구조의 목록이 출력된다. 그런 컴퓨터 프로그램의 사용은 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, HIV-1 프로테아제 억제제의 결정 구조는 프로그램 DOCK를 사용하여 효소의 결합 부위에 대해 Cambridge 결정학 데이터베이스에서 찾은 화합물들의 핏을 평가함으로써 HIV-1 프로테아제 억제제인 독특한 비펩티드 리간드를 확인하는 데 사용되었다 (Kuntz, I.D., et　al., J.　Mol. Biol.　161:269-288, 1982; DesJarlais, R.L.,　et　al., PNAS　87:6644-6648, 1990).

컴퓨터를 사용한 방법에 의해 잠재적인 MASP-2 억제제로서 확인된 작은 분자 구조의 목록은 실시예 10에서 기술된 MASP-2 결합 분석을 사용하여 스크리닝된다. 그런 다음 MASP-2에 결합하는 것으로 나타난 작은 분자들은 실시예 2에서 기술된 기능성 분석으로 평가되어 그것들이 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하는 지의 여부가 측정된다.

MASP-2 가용성 수용체

다른 적당한 MASP-2 억제제는 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 기법들을 사용하여 제조될 수 있는 MASP-2 가용성 수용체를 포함하는 것으로 여겨진다.

MASP-2의 발현 억제제

발명의 이 측면의 다른 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제할 수 있는 MASP-2 발현 억제제이다. 발명의 이 측면의 실시에 있어서, 대표적인 MASP-2 발현 억제제는 MASP-2 안티센스 핵산 분자 (예컨대 안티센스 mRNA, 안티센스 DNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드), MASP-2 리보자임 및 MASP-2 RNAi 분자를 포함한다.

안티센스 RNA 및 DNA 분자는 MASP-2 mRNA에 혼성화하고 MASP-2 단백질의 번역을 방지함으로써 MASP-2 mRNA의 번역을 직접적으로 차단하는 작용을 한다. 안티센스 핵산 분자는 많은 상이한 방법으로 구성될 수 있는데, 단 MASP-2의 발현을 간섭할 수 있어야 한다. 예를 들어, 안티센스 핵산 분자는 MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:4)의 코딩 영역 (또는 그것의 일부)을 그것의 보체의 전사를 허용하기 위한 전사에 대해 그것의 정상적인 방향에 대해 반전시킴으로써 구성될 수 있다.

안티센스 핵산 분자는 통상 실질적으로 표적 유전자 또는 유전자들의 적어도 일부에 동일한다. 그러나 핵산은 발현을 억제하기 위해 완벽하게 동일할 필요는 없다. 일반적으로, 더 높은 상동성이 더 짧은 안티센스 핵산 분자의 사용을 보상하기 위해 사용될 수 있다. 최소 퍼센트 동일성은 전형적으로 약 65%보다 크지만, 더 높은 퍼센트의 동일성은 내인성 서열의 발현을 더 효율적으로 억압할 수 있다. 약 80% 이상의 실질적으로 더 큰 퍼센트의 동일성이 전형적으로 바람직하지만, 약 95% 내지 절대 동일성이 전형적으로 가장 바람직하다.

안티센스 핵산 분자는 표적 유전자와 동일한 인트론 또는 엑손 패턴을 가질 필요는 없고, 표적 유전자의 비-코딩 절편은 코딩 절편으로서의 표적 유전자 발현의 안티센스 억제를 이루는데 동등하게 효과적일 수 있다. 적어도 약 8 정도의 뉴클레오티드의 DNA 서열이 안티센스 핵산 분자로서 사용될 수 있지만, 더 긴 서열이 바람직하다. 본 발명에서, MASP-2의 유용한 억제제의 대표적인 실례는 SEQ ID NO:4에 제시된 핵산 서열로 구성된 MASP-2 cDNA의 보체와 적어도 90% 동일한 안티센스 MASP-2 핵산 분자이다. SEQ ID NO:4에 제시된 핵산 서열은 SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열로 구성된 MASP-2 단백질을 코드화한다.

MASP-2 mRNA에 결합하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 표적화는 MASP-2 단백질 합성의 수준을 감소시키기 위해 사용될 수 있는 다른 메커니즘이다. 예를 들어, 폴리갈락투로나제 및 무스카린 유형 2 아세틸콜린 수용체의 합성은 그것들의 각각의 mRNA 서열에 대해 지시된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 억제된다 (Cheng에 부여된 미국 특허 제 5,739,119호 및 Shewmaker에 부여된 미국 특허 제 5,759,829호). 나아가, 안티센스 억제의 실례는 핵 단백질 사이클린, 다중 약물 내성 유전자 (MDG1), ICAM-1, E-셀렉틴, STK-1, 선조체의 GABA_A 수용체 및 인간 EGF로 증명되었다 (예컨대 Baracchini에 부여된 미국 특허 제 5,801,154호; Baker에 부여된 미국 특허 제 5,789,573호; Considine에 부여된 미국 특허 제 5,718,709호; Reubenstein에 부여된 미국 특허 제 5,610,288호).

당업자가 올리고뉴클레오티드가 발명에 유용한 지를 측정하는 것을 허용하는 시스템이 기술되었는데, 그것은 전사물 내의 서열의 접근성에 대한 표시제로서 Rnase H 절단을 사용하여 표적 mRAN의 적당한 부위들을 프로빙하는 것을 포함한다 (Scherr, M.,　et　al., Nucleic Acids Res.　26:5079-5085, 1998; Lloyd,　et　al., Nucleic Acids Res.　29:3665-3673, 2001). MASP-2 전사물의 특정 영역에 상보하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들의 혼합물이 MASP-2를 발현하는 세포 추출물, 예컨대 간세포에 첨가되고, 혼성화되어 RNAseH 취약 부위가 생성된다. 이 방법은 이량체, 헤파린 또는 숙주 세포에서 표적 mRNA에의 특이적인 결합을 감소시키거나 금지할 다른 이차 구조를 형성하는 그것들의 상대적 능력을 기초로 안티센스 조성물에 대한 최적 서열 선택을 예측할 수 있는 컴퓨터-보조 서열 선택과 조합될 수 있다. 이들 이차 구조 분석 및 표적 부위 선택에 대한 고려는 OLIGO 프라이머 분석 소프트웨어 (Rychlik, I., 1997) 및 BLASTN 2.0.5 알고리즘 소프트웨어 (Altschul, S.F.,　et　al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1997)를 사용하여 수행될 수 있다. 표적 서열에 대해 지시된 안티센스 화합물들은 바람직하게 약 8 내지 약 50 뉴클레오티드의 길이를 포함한다. 약 9 내지 약 35 정도의 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 특히 바람직하다. 발명자들은 9 내지 35 뉴클레오티드 범위 (즉 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는　35 정도의 염기 길이의 뉴클레오티드)의 모든 올리고뉴클레오티드 조성물은 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드-기초 방법의 실시에 매우 바람직하다. MASP-2 mRNA의 고도로 바람직한 표적 영역은 AUG 번역 개시 코돈에 있거나 가까이에 있는 것들, 및 mRNA의 5' 영역에 실질적으로 상보하는, 예컨대 MASP-2 유전자 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:4)의 -10과 +10 영역사이에 있는 서열들이다. 예시적인 MASP-2 발현 억제제는 표 4에 제공된다.

MASP-2의 예시적인 발현 억제제

SEQ ID NO:30 (SEQ ID NO:4의 뉴클레오티드 22 내지 680)	CUBIEGF를 코드화하는 MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:4)
SEQ ID NO:31 5'CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC3	MASP-2 번역 출발 부위 (센스)를 포함하는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오티드 12 내지 45
SEQ ID NO:32 5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3'	MASP-2 MBL 결합 부위 (센스)를 포함하는 영역을 코드화하는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오티드 361 내지 396
SEQ ID NO:33 5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3'	CUBII 도메인을 포함하는 영역을 코드화하는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오티드 610 내지 642

상기에서 주지된 것과 같이, 본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 그것의 모방물의 올리고머 또는 중합체를 말한다. 이 용어는 또한 자연 발생 뉴클레오티드, 당 및 공유 뉴클레오시드간 (골격) 연쇄뿐 아니라 비-자연 발생 변형을 가지는 올리고뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오염기를 포함한다. 이들 변형은 자연 발생 올리고뉴클레오티드를 통해 제공되지 않는 바람직한 어떤 특성, 예컨대 감소된 독성 특성, 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 안정성 및 증강된 세포 흡수를 도입하는 것을 가능하게 한다. 예시적인 구체예에서, 발명의 안티센스 화합물은 포스페이트 치환기가 포스포로티오에이트에 의해 대체되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 생명을 연장시키기 위한 포스포다이에스테르 골격의 변형에 의해 천연 DNA와 다르다. 마찬가지로, 올리고뉴클레오티드의 하나 또는 양 단부는 핵산의 가닥 내에 인접한 염기쌍을 삽입시키는 하나 또는 그 이상의 아크리딘 유도체에 의해 치환될 수 있다.

안티센스에 대한 다른 대안은 "RNA 간섭" (RNAi)의 사용이다. 이중-가닥의 RNA (dsRNA)는 포유류의 생체 내에서 유전자 침묵을 유발할 수 있다. RNAi 및 공동-억제의 천연 기능은 이동성 유전자 요소, 예컨대 레트로트란스포존 및 활성이 될 때 숙주 세포에서 일탈적인 RNA 또는 dsRNA를 생성하는 바이러스에 의한 침습에 대하여 게놈을 보호하는 것으로 나타난다 (예컨대 Jensen,　J.,　et　al., Nat. Genet. 21:209-12, 1999). 이중-가닥의 RNA 분자는 각각이 약 19 내지 25의 길이 (예컨대 19 내지 23 뉴클레오티드)를 가지는, 이중-가닥의 RNA 분자를 형성할 수 있는 2개의 RNA 가닥을 합성함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어 발명의 방법에 유용한 dsRNA 분자는 서열에 해당하는 RNA 및 표 4에 열거된 그것의 보체를 포함할 수 있다. 바람직하게, RNA의 적어도 하나의 가닥은 1 내지 5 뉴클레오티드의 3' 오버행을 가진다. 합성된 RNA 가닥은 이중-가닥 분자를 형성하는 조건하에서 조합된다. RNA 서열은 총 25 뉴클레오티드 이하의 길이를 가지는 SEQ ID NO:4의 적어도 8개의 뉴클레오티드 부분을 포함할 수 있다. 주어진 표적에 대한 siRNA 서열의 디자인은 기술분야의 통상적인 지식 내에 있다. siRNA 서열을 디자인하고 적어도 70% 녹다운의 발현을 보장하는 상업적 서비스가 활용될 수 있다 (Qiagen, Valencia, Calif).

dsRNA는 약학 조성물로서 투여되고 공지된 방법들에 의해 수행될 수 있는데, 이때 핵산은 원하는 표적 세포 안에 도입된다. 통상적으로 사용되는 유전자 전달 방법은 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 일렉트로포레이션, 마이크로주입 및 바이러스 방법들을 포함한다. 그런 방법들은 문헌에서 알 수 있다: Ausubel　et　al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1993.

리보자임, 예컨대 MASP-2 mRNA를 표적화하는 리보자임이 또한 MASP-2의 양 및/또는 생물학적 활성을 감소시키기 위해 활용될 수 있다. 리보자임은 완전히 또는 부분적으로 리보자임의 서열에 상동하는 서열을 가지는 핵산 분자를 절단할 수 있는 촉매적 RNA 분자이다. 표적 RNA와 특이적으로 쌍을 이루고 특이적인 위치에서 포스포다이에스테르 골격을 절단함으로써 표적 RNA를 기능적으로 비활성화시키는 RNA 리보자임을 코드화하는 리보자임 이식유전자를 디자인하는 것이 가능하다. 이런 절단을 수행함에 있어서, 리보자임은 그 자체로는 변하지 않고, 따라서 재순환하고 다른 분자들을 절단할 수 있다. 안티센스 RNA 내에 리보자임 서열을 포함시키는 것은 안티센스 RNA에 RNA-절단 활성을 부여하는 것이고, 그로써 안티센스 구성물의 활성은 증가된다.

발명의 실시에 유용한 리보자임은 전형적으로 적어도 약 9개의 뉴클레오티드의 혼성화 영역을 포함하는데, 그것은 뉴클레오티드 서열에 있어서 표적 MASP-2 mRNA의 적어도 일부, 및 표적 MASP-2 mRNA를 절단하기 위해 적응된 촉매적 영역에 대해 상보한다 (일반적으로 EPA No.　0 321 201; WO88/04300; Haseloff, J.,　et　al., Nature　334:585-591, 1988; Fedor, M.J.,　et　al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA　87:1668-1672, 1990; Cech, T.R.,　et　al., Ann. Rev. Biochem. 55:599-629, 1986 참조).

리보자임은 리보자임 서열을 통합하는 RNA 올리고뉴클레오티드의 형태로 세포로 직접 표적화되거나, 또는 원하는 리보자임성 RNA를 코드화하는 발현 벡터로서 세포에 도입될 수 있다. 리보자임은 안티센스 폴리뉴클레오티드에 대해 기술된 것과 많은 부분 동일한 방식으로 사용되고 적용될 수 있다.

발명의 방법에 유용한 안티센스 RNA 및 DNA, 리보자임 및 RNAi 분자들은 DNA 및 RNA 분자의 합성을 위한 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 이것들은 기술분야에 잘 알려져 있는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 및 올리고리보뉴클레오티드를 화학적으로 합성하기 위한 기법들을 포함하고, 예컨대 예를 들면 고상 포스포라미다이트 화학적 합성이 있다. 다르게는, RNA 분자들은 안티센스 RNA 분자를 코드화하는 DNA 서열의 시험관 내 및 생체 내 전사에 의해 생성될 수 있다. 그런 DNA 서열들은 T7 또는 SP6 중합효소 프로모터와 같이 적합한 RNA 중합효소 프로모터를 통합하는 광범위한 벡터에 통합될 수 있다. 다르게는, 사용된 프로모터에 따라, 안티센스 RNA를 구성적으로 또는 유도적으로 합성하는 안티센스 cDNA 구성물이 셀라인 안으로 안정하게 도입될 수 있다.

DNA 분자의 잘 알려져 있는 다양한 변형들은 안정성 및 반감기를 증가시키는 수단으로서 도입될 수 있다. 유용한 변형으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 분자의 5' 및/또는 3' 단부에 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드의 측면 서열의 첨가 또는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 골격 내에 포스포다이에스테라제 연쇄 대신 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용을 포함한다.

VI. 약학 조성물 및 전달 방법

투여

다른 측면으로, 발명은 본원에 개시된 질환 또는 상태로 고생하는 대상에서, 치료적 유효량의 MASP-2 억제제 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, MASP-2-의존성 보체 활성화의 부작용을 억제하기 위한 조성물을 제공한다. MASP-2 억제제는 투여를 필요로 하는 대상에게, MASP-2-의존성 보체 활성화와 관련된 상태를 치료하거나 완환시키기 위해 치료적으로 유요한 용량으로 투여될 수 있다. 치료적 유효량이란 질환 또는 상태와 관련된 증상들의 개선을 초래하기에 충분한 MASP-2 억제제의 양을 말한다.

MASP-2 억제제의 독성 및 치료적 효능은 실험 동물 모델, 예컨대 실시예 1에서 기술되는 인간 MASP-2 이식유전자를 발현하는 쥐과의 MASP-2 -/- 마우스 모델을 사용하는 표준 약제학 과정에 의해 측정될 수 있다. 그런 동물 모델을 사용하여 NOAEL (부작용 수준이 관찰되지 않음) 및 MED (최소한의 유효량)가 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다. NOAEL과 MED 효과 사이의 용량 비율은 치료 계수이며, 그것은 NOAEL/MED 비율로서 표시된다. 큰 치료 계수 또는 지수를 나타내는 MASP-2 억제제가 가장 바람직하다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에서 사용하기 위한 범위의 단위용량을 제형하는 데 사용될 수 있다. MASP-2 억제제의 단위용량은 바람직하게 독성이 거의 없거나 없는 MED를 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 단위용량은 사용된 단위용량 형태 및 활용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다.

어떠한 화합물 제형에 대해서든 치료적 유효량은 동물 모델을 사용하여 산정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 MED를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 이루기 위해 동물 모델에서 제형될 수 있다. 혈장 중의 MASP-2 억제제의 정량 수준 또한, 예를 들면 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

독성 연구에 더불어, 유효한 단위용량 또한 살아있는 대상에 존재하는 MASP-2 단백질의 양 및 MASP-2 억제제의 결합 친화성을 기초로 산정될 수 있다. 정상인 대상에서의 MASP-2 수준은 혈청에 500 ng/ml 범위의 낮은 수준으로 존재하고, 특별한 대상에서의 MASP-2 수준은 문헌 (Moller-Kristensen M.,　et　al., J.　Immunol. Methods　282:159-167, 2003)에 기술된 MASP-2에 대한 정량 분석을 사용하여 측정될 수 있다.

일반적으로, MASP-2 억제제를 포함하는 투여되는 조성물의 단위용량은 대상의 연령, 체중, 키, 성별, 일반적인 의료 상태 및 이전의 의학적 이력과 같은 인자들에 따라 달라진다. 예를 들면, MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체는 약 0.010 내지 10.0　mg/kg, 바람직하게　0.010 내지　1.0　mg/kg, 보다 바람직하게　0.010 내지 0.1　mg/kg의 대상 체중의 범위의 단위용량으로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 항-MASP-2 항체와 MASP-2 억제 펩티드의 조합을 포함한다.

주어진 대상에서 및 적절한 단위용량에서 MSDP-2 억제 조성물의 치료적 효능 및 본 발명의 방법은 기술분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있는 보체 분석에 따라 측정될 수 있다. 보체는 많은 특이적인 생성물을 생성한다. 최근 10년 동안, 민감하고 특이적인 분석들이 개발되어 왔고 작은 활성화 단편 C3a, C4a 및　C5a와 큰 활성화 단편 iC3b, C4d, Bb 및　sC5b-9를 포함하여, 이들 활성화 생성물 중 대부분에 대해 상업적으로 활용될 수 있다. 이들 분석은 대부분 그것으로부터 단클론성 항체가 형성되는 천연 단백질 상이 아니라 단편 상에 노출된 새로운 항원 (네오항원)과 반응하는 단클론성 항체를 활용함으로써 이들 분석은 매우 단순해지고 특이적인 것으로 만들어진다. 방사선면역 분석이 아직도 C3a 및 C5a에 대해 때로 사용되긴 하지만, ELISA 기술이 가장 많이 사용된다. 이들 후자의 분석들은 순환계에서 발견되는 주요 형태인 프로세싱되지 않은 단편과 그것의 'desArg' 단편 둘 다를 측정한다. 프로세싱되지 않은 단편과 C5a_desArg는 세포 표면 수용체에 결합함으로써 쉽게 제거되고 따라서 매우 낮은 농도로 존재하는 반면, C3a_desArg는 세포에 결합하지 않고 혈장에 축적된다. C3a의 측정은 보체 활성화의 민감한, 경로-의존성 표시제를 제공한다. 대체 경로 활성화는 Bb 단편을 측정함으로써 평가될 수 있다. 막 공격 경로 활성화의 유동상 생성물인 sC5b-9의 검출은 보체가 활성화가 완료될 때까지 진행되는 증거를 제공한다. 렉틴 및 고전적 경로 둘 다 동일한 활성화 생성물인 C4a 및 C4d를 생성하기 때문에, 이들 두 단편의 측정은 이들 두 경로중 어느 것이 활성화 생성물을 생성하였는지에 대한 어떠한 정보도 제공하지 못한다.

MASP-2-의존성 보체 활성화의 억제는 발명의 방법에 따라 MASP-2 억제제의 투여의 결과로서 발생하는 보체 시스템의 성분의 다음의 변화들 중 적어도 하나를 특징으로 한다: MASP-2-의존성 보체 활성화 시스템 생성물 C4b, C3a, C5a 및/또는 C5b-9 (MAC)의 생성 또는 생산의 억제 (예를 들면 실시예 2에서 기술되는 것과 같이 측정됨), C4 절단 및 C4b 침착의 감소 (예를 들면 실시예 10에서 기술되는 것과 같이 측정됨) 또는 C3 절단 및 C3b 침착의 감소 (예를 들면 실시예 10에서 기술되는 것과 같이 측정됨).

추가의 제제들

MASP-2 억제제를 포함하는 조성물 및 방법은 MASP-2 억제제의 활성을 높이거나 관련된 치료 기능을 첨가 또는 상조 방식으로 제공할 수 있는 하나 또는 그 이상의 추가의 치료제를 임의로 포함할 수 있다. 예를 들어, ADAM-TS13의 억제제에 대해 대상이 포지티브인, TTP에 걸린 대상의 치료의 맥락에서, 하나 또는 그 이상의 MASP-2 억제제가 하나 또는 그 이상의 면역억제제와 조합되어 (공동-투여를 포함함) 투여될 수 있다. 적당한 면역억제제는 다음을 포함한다: 코르티코스테로이드, 리툭산, 사이클로스포린 등. HUS 또는 aHUS에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상을 치료하는 맥락에서, 하나 또는 그 이상의 MASP-2 억제제는 적당한 항생물질과 조합되어 (공동-투여를 포함함) 투여될 수 있다. aHUS에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상을 치료하는 맥락에서, 하나 또는 그 이상의 MASP-2 억제제는 다른 보체 억제제, 예컨대 유클리주맙 (Soliris), TT-30, 인자 B에 대한 항체, 또는 말단 보체 성분 또는 대체 경로 증폭을 억제하는 다른 제제와 조합되어 (공동-투여를 포함함) 투여될 수 있다.

추가 제제(들)의 포함 및 선택은 원하는 치료 결과를 이루기 위해 결정될 것이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 하나 또는 그 이상의 항-염증성 및/또는 진통제와 조합되어 투여될 수 있다. 적당한 항-염증성 및/또는 진통제는 다음을 포함한다: 세로토닌 수용체 길항제; 세로토닌 수용체 아고니스트; 히스타민 수용체 길항제; 브래디키닌 수용체 길항제; 칼리크레인 억제제; 타키키닌 수용체 길항제, 이를테면 뉴로키닌₁ 및 뉴로키닌₂ 수용체 하위타입 길항제; 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 (CGRP) 수용체 길항제; 인터류킨 수용체 길항제; 아라키돈산 대사물에 대한 합성 경로에서 활성인 효소들의 억제제, 이를테면 포스포리파제 억제제, 예를 들면 PLA₂ 아이소형태 억제제 및 PLCγ 아이소형태 억제제, 사이클로옥시게나제 (COX) 억제제 (COX-1, COX-2 또는 비선택성 COX-1 및 -2 억제제일 수 있다), 리포옥시게나제 억제제; 에이코사노이드 EP-1 및 EP-4 수용체 하위타입 길항제 및 트롬복산 수용체 하위타입 길항제를 포함하는 프로스타노이드 수용체 길항제; 류코트리엔 수용체 길항제, 이를테면 류코트리엔 B4 수용체 하위타입 길항제 및 류코트리엔 D4 수용체 하위타입 길항제; 오피오이드 수용체 아고니스트, 이를테면 μ-오피오이드, δ-오피오이드 및 κ-오피오이드 수용체 하위타입 아고니스트; P_2X 수용체 길항제 및 P_2Y 수용체 아고니스트를 포함한 퓨리노셉터 아고니스트 및 길항제; 아데노신 트라이포스페이트 (ATP)-민감성 칼륨 채널 오프너; MAP 키나아제 억제제; 티코틴성 아세틸콜린 억제제; 및 알파 아드레날린작동성 수용체 아고니스트 (알파-1, 알파-2 및 비선택성 알파-1 및 2 아고니스트를 포함함).

본 발명의 MASP-2 억제제는 또한 하나 또는 그 이상의 다른 보체 억제제, 예컨대 C5의 억제제와 함게 투여될 수 있다. 현재까지, C5에 대한 항체인 유클리주맙 (Solaris®)이 인간에게 사용되도록 승인된 유일한 보체-표적화 약물이다. 그러나 일부 약리학적 제제가 생체 내에서 보체를 차단하는 것으로 밝혀졌다. K76COOH 및 나팜스타트 메실레이트는 이식의 동물 모델에서 일부 유효성을 보인 두 개의 제제이다 (Miyagawa,　S.,　et　al., Transplant Proc.　24:483-484, 1992). 저분자량 헤파린 또한 보체 활성의 조절에 효과적인 것으로 나타났다 (Edens,　R.E.,　et　al., Complement Today, pp.　96-120, Basel: Karger, 1993). 이들 작은 분자 억제제들은 본 발명의 MASP-2 억제제와 함께 사용하기 위한 제제로서 유용할 것으로 여겨진다.

다른 자연 발생 보체 억제제들은 본 발명의 MASP-2 억제제와 함께 사용하기에 유용할 수 있다. 보체의 생물학적 억제제들은 가용성 보체 인자 1 (sCR1)을 포함한다. 이것은 인간 세포의 외막상에서 발견될 수 있는 자연-발생 억제제이다. 다른 막 억제제는 DAF, MCP 및　CD59를 포함한다. 재조합 형태들은 시험관 내 및 생체 내에서 그것들의 항-보체 활성에 대해 시험되었다. sCR1은 이종이식편에서 효과적인 것으로 밝혀졌는데, 이때 보체 시스템 (대체 및 고전적 둘 다)은 새롭게 이식된 기관을 통해 혈액을 관류하는 수분 동안 내에 과민한 거부반응 증후군에 대한 트리거를 제공한다 (Platt, J.L., et　al., Immunol. Today　11:450-6, 1990; Marino, I.R., et　al., Transplant Proc.　1071:6, 1990; Johnstone, P.S., et　al., Transplantation　54:573-6, 1992). sCR1의 사용은 이식된 기관을 보호하고 생존 시간을 연장시키는데, 그것은 기관 생존의 발병에서 보체 경로를 시사한다 (Leventhal, J.R., et　al., Transplantation　55:857-66, 1993; Pruitt, S.K., et　al., Transplantation　57:363-70, 1994).

본 발명의 조성물과 함께 사용하기에 적당한 추가의 보체 억제제들은 또한, 예를 들면 Alexion Pharmaceuticals, Inc. (New Haven, Connecticut)에 의해 개발되고있는 항-C5 항체 (예컨대 유클리주맙)와 같은 MOAb 및 항-프로퍼딘 MoAb를 포함한다.

약학적 담체 및 전달 비히클

일반적으로, 어떠한 다른 선택된 치료제와 조합된 본 발명의 MASP-2 억제제 조성물은 약학적으로 허용되는 담체에 적절하게 함유된다. 담체는 비-독성이고, 생체적합하며 MASP-2 억제제 (및 그것과 조합된 어떠한 다른 치료제)의 생물학적 활성에 유해하지 않도록 선택된다. 펩티드에 대한 약학적으로 허용되는 담체의 실례는 Yamada에 부여된 미국 특허 제 5,211,657호에 기술되어 있다. 발명에 유용한 항-MASP-2 항체 및 억제 펩티드들은 고체, 반고체, 겔, 액체 또는 가스 형태의 제제, 예컨대 경구, 비경구 또는 수술적 투여를 허용하는 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 저장제, 흡입제 및 주사액으로 제형될 수 있다. 발명은 또한 의료 장치 등을 코팅함으로써 조성물의 국소 투여를 고려한다.

주사가능한, 주입 또는 관개 (irrigation) 및 국소 전달을 통한 비경구 전달에 적당한 담체는 증류수, 생리적 포스페이트-완충 염수, 정상 또는 락테이트화된 링거액, 덱스트로오스액, 행크액 또는 프로판디올을 포함한다. 또한, 멸균되고 고정된 오일이 용매 또는 현탁 매질로서 사용될 수 있다. 이런 목적에 대해 합성 모노 또는 다이글리세리드를 포함하는 어떠한 생체적합성 오일이든지 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산도 주사가능한 제제에 사용될 수 있다. 담체 및 제제는 액체, 현탁액, 중합가능한 또는 비-중합성 겔, 페이스트 또는 연고로서 화합될 수 있다.

담체는 또한 제제(들)의 전달을 지속 (즉 연장, 지연 또는 조절)시키기 위해 또는 치료제(들)의 전달, 흡수, 안정성 또는 약물동역학을 증강시키기 위해 전달 비히클을 포함할 수 있다. 그런 전달 비히클은, 비-제한적으로 예를 들면, 미세입자, 미소스피어, 단백질로 구성된 나노스피어 또는 나노입자, 리포좀, 탄수화물, 합성 유기 화합물, 무기 화합물, 중합체 또는 공중합체 하이드로겔 및 중합체 미셸을 포함한다. 적당한 하이드로겔 및 미셸 전달 시스템은 WO　2004/009664　A2에 개시된 PEO:PHB:PEO 공중합체 및 공중합체/사이클로덱스트린 복합체 및 미국 특허 출원 공보 번호 2002/0019369　A1에 개시되어 있는 PEO 및 PEO/사이클로덱스트린 복합체를 포함한다. 그런 하이드로겔은 의도된 작용 부위에 국소적으로 또는 지속적인 방출 데포를 형성하기 위하여 피하로 또는 근육 내로 주입될 수 있다.

동맥-내 전달을 위해서, MASP-2 억제제는 주사가능한 상기-기술된 액체 또는 겔 담체, 주사가능한 상기-기술된 지속성-방출 전달 비히클 또는 히알루론산 또는 히알루론산 유도체에 담겨 운반될 수 있다.

비-펩티드작동성 제제의 경구 투여를 위해서는, MASP-2 억제제는 슈크로오스, 옥수수전분 또는 셀룰로오스와 같은 비활성 충전제 또는 희석제로 운반될 수 있다.

국소 투여를 위해서, MASP-2 억제제는 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌제, 분무제, 액체 또는 분말로, 또는 겔로 또는 경피 패치를 통한 미세캡슐 전달 시스템으로 운반될 수 있다.

다양한 코 및 폐 전달 시스템, 이를테면 에어로졸, 계량-용량 흡입기, 건식 분만 흡입기 및 연무기가 개발되고 있고 각각 에어로졸, 흡입 또는 연무식 전달 비히클로 본 발명의 전달을 위해 적절하게 적응될 수 있다.

경막 내 (IT) 또는 뇌실 내 (ICV) 전달을 위해서, 적절하게 멸균된 전달 시스템 (예컨대 액체; 겔, 현탁액 등)이 본 발명을 투여하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 도한 생체적합성 부형제, 예컨대 분산 또는 습윤제, 현탁제, 희석제, 완충제, 침투 증강제, 유화제, 결합제, 농축제, 풍미제 (경구 투여용)를 포함할 수 있다.

항체 및 펩티드를 위한 약학적 담체

항-MASP-2 항체 및 억제 펩티드와 관련하여 보다 구체적으로, 예시적인 제형은 물, 오일, 염수, 글리세롤 또는 에탄올과 같은 멸균된 액체일 수 있는 약학적 담체를 포함한 생리적으로 허용되는 희석제 중의 화합물의 용액 또는 현탁액의 주사가능한 단위용량으로서 비경구적으로 투여될 수 있다. 추가로, 습윤 또는 유화제, 계면활성제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 항-MASP-2 항체 및 억제 펩티드를 포함한 조성물 중에 존재할 수 있다. 약학 조성물의 추가 성분으로는 기름 (예컨대 동물, 식물 또는 합성 기원의), 예를 들면 대두유 및 미네랄 오일을 포함한다. 일반적으로, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 주사가능한 용액에 대한 바람직한 액체 담체이다.

항-MASP-2 항체 및 억제 펩티드는 또한 활성 제제의 지속적인 또는 박동성 방출을 허용하는 방식으로 제형될 수 있는 데포 주사 또는 이식 제제의 형태로 투여될 수 있다.

발현 억제제를 위한 약학적으로 허용되는 담체

발명의 방법에 유용한 발현 억제제들과 관련하여 보다 구체적으로, 상기에서 기술된 발현 억제제 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물이 제공된다. 그 조성물은 추가로 콜로이드상 분산 시스템을 포함할 수 있다.

발현 억제제를 포함하는 약학 조성물은 그것에 한정되는 것은 아니지만, 용액, 에멀션 및 리포솜-함유 제형을 포함할 수 있다. 이들 조성물은 그것들에 한정되는 것은 아니지만 사전형성된 액체, 자체-유화 고체 및 자체-유화 반고체를 포함하는 다양한 성분들로부터 생성될 수 있다. 그런 조성물의 제조는 전형적으로 발현 억제제를 다음 중 하나 또는 그 이상과 조합하는 것을 포함한다: 완충제, 항산화제, 저분자량 폴리펩티드, 단백질, 아미노산, 글루코오스, 슈크로오스 또는 덱스트린을 포함한 탄수화물, EDTA와 같은 킬레이트화제, 글루타티온 및 다른 안정화제 및 부형제. 중성 완충 염수 또는 비-특이적 혈청 알부민과 혼합된 염수도 적절한 희석제의 실례이다.

일부 구체예에서, 조성물은 전형적으로 한 가지 액체가 방울 형태의 다른 것에 분산되어 있는 균질한 시스템인 에멀션으로서 제조되고 제형될 수 있다 (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Vol.　1, Rieger and Banker (eds.), Marcek Dekker, Inc., N.Y., 1988 참조). 에멀션 제형에 사용된 자연 발생 유화제의 실례는 아카시아, 밀랍, 라놀린, 레시틴 및 포스파타이드를 포함한다.

한 구체예에서, 핵산을 포함하고 있는 조성물은 미세에멀션으로서 제형될 수 있다. 본원에서 사용되는 미세에멀션이란 물, 오일 및 양친매성 물질의 시스템을 말하는 것으로 단일한 광학적 등방성이고 열역학적으로 안정한 액체 용액이다 (Rosoff in Pharmaceutical Dosage Forms, Vol.　1 참조). 발명의 방법은 또한 원하는 부위에 안티센스 올리고뉴클레오티드의 전달 및 수송을 위해 리포솜을 사용할 수 있다.

국소 투여를 위한 발현 억제제의 약학 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌제, 분무제, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 종래의 약학적 담체뿐 아니라 수성, 분말 또는 유성 염기 및 농축제 등도 사용될 수 있다.

투여 방식

MASP-2 억제제를 포함하는 약학 조성물은 국소적 또는 전신적 투여 방식 중 어느 것이 치료하고자 하는 상태에 가장 적절한지에 따라 많은 방법으로 투여될 수 있다. 추가로, 체외 재관류 시술에 대해 상기에서 기술한 것과 같이, MASP-2 억제제는 혈액 또는 혈장을 재순환시키기 위한 본 발명의 조성물의 도입을 통해 투여될 수 있다. 나아가, 본 발명의 조성물은 이식가능한 의료 장치상에 또는 그 안에 조성물을 코팅하거나 통합시킴으로써 전달될 수 있다.

전신적 전달

본원에서 사용되는 용어 "전신적 전달" 및 "전신적 투여"는 그것들에 한정되는 것은 아니지만 근육 내 (IM), 피하, 정맥 내 (IV), 동맥-내, 흡입으로, 혀밑으로, 볼로, 국소적, 경피, 코, 직장, 질 및 의도된 치료 작용을 하는 단일 또는 다중 부위로 전달된 제제의 분산을 효과적으로 초래할 다른 투여 경로를 포함하는 경구 및 비경구 경로를 포함하는 것으로 의도된다. 본 조성물의 바람직한 전신적 전달 경로는 정맥 내, 근육 내, 피하 및 흡입을 포함한다. 본 발명의 특정 조성물에 활용된 선택된 제제에 대한 정확한 전신적 투여 경로는 부분적으로는 주어진 투여 경로와 관련된 대사적 전환에 대한 제제의 민감성을 해결하기 위해 결정될 것임이 인지될 것이다. 예를 들어, 펩티드작동성 제제는 경구 이외의 경로에 의해 가장 적절하게 투여될 수 있다.

MASP-2 억제 항체 및 폴리펩티드는 어떠한 적당한 수단에 의해 그럴 필요가 있는 대상으로 전달될 수 있다. MASP-2 억제 항체 및 폴리펩티드의 전달 방법은 경구, 폐, 비경구에 의한 (예컨대 근육 내, 복강 내, 정맥 내 (IV) 또는 피하 주사), 흡입에 의한 (예컨대 미세 분말 제형을 통한), 경피, 코, 질, 직장 또는 혀밑 투여 경로에 의한 투여를 포함하고, 각각의 투여 경로에 대해 적절한 단위용량 형태로 제형될 수 있다.

대표적인 실례로, MASP-2 억제 항체 및 펩티드는 폴리펩티드를 흡수할 수 있는 신체의 막, 예를 들면 코, 위장 및 직장 막으로의 적용에 의해 살아있는 신체로 도입될 수 있다. 폴리펩티드는 전형적으로 침투 증강제와 함께 흡수성 막에 적용된다 (예컨대 Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys.　5 :69, 1988; Lee, V.H.L., J.　Controlled Release 13:213, 1990; Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991); DeBoer, A.G.,　et　al., J.　Controlled Release　13 :241, 1990 참조). 예를 들어, STDHF는 담즙산염에 구조적으로 유사한 스테로이드성 계면활성제인 후시드산의 합성 유도체로, 코 전달을 위한 침투 증강제로서 사용되어 왔다 (Lee, W.A., Biopharm.　22, Nov./Dec. 1990).

MASP-2 억제 항체 및 폴리펩티드는 효소적 분해로부터 폴리펩티드를 보호하기 위해 다른 분자, 예컨대 지질과 결합하여 도입될 수 있다. 예를 들면 중합체, 특히 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 공유 부착이 신체에서 효소적 가수분해로부터 특정 단백질을 보호하고 그로써 반감기를 연장시키기 위해 사용되어 왔다 (Fuertges, F.,　et　al., J.　Controlled Release　11:139, 1990). 많은 중합체 시스템이 단백질 전달에 대해 보고되었다 (Bae, Y.H.,　et　al., J.　Controlled Release　9:271, 1989; Hori, R.,　et　al., Pharm. Res.　6:813, 1989; Yamakawa, I.,　et　al., J. Pharm. Sci.　79:505, 1990; Yoshihiro, I.,　et　al., J.　Controlled Release　10:195, 1989; Asano, M.,　et　al., J.　Controlled Release　9:111, 1989; Rosenblatt, J., et　al., J.　Controlled Release　9:195, 1989; Makino, K., J.　대조led Release　12:235, 1990; Takakura, Y., et　al., J.　Pharm. Sci.　78:117, 1989; Takakura, Y.,　et　al., J. Pharm. Sci.　78:219, 1989).

최근에 이르러, 혈청 안정성과 순환계 반감기가 개선된 리포솜이 개발되었다 (예컨대 Webb에 부여된 미국 특허 제 5,741,516호 참조). 나아가, 잠재적인 약물 담체로서의 리포솜 및 리포솜-유사 제제의 다양한 방법들이 개관되었다 (예컨대 Szoka에 부여된 미국 특허 제 5,567,434호; Yagi에 부여된 미국 특허 제 5,552,157호; Nakamori에 부여된 미국 특허 제 5,565,213호; Shinkarenko에 부여된 미국 특허 제 5,738,868호; 및 Gao에 부여된 미국 특허 제 5,795,587호 참조).

경피 적용을 위해서, MASP-2 억제 항체 및 폴리펩티드는 다른 적당한 성분들, 예컨대 담체 및/또는 보조제와 조합될 수 있다. 그런 다FMS 성분들의 본질에 대한 제한은 없지만, 그것들은 의도된 투여가 약학적으로 허용되어야 하고 조성물의 활성 성분들의 활성을 분해할 수 없어야 한다. 적당한 비히클의 실례는 정제된 콜라겐이 있거나 없는 연고, 크림, 겔 또는 현탁액을 포함한다. MASP-2 억제 항체 및 폴리펩티드는 또한 바람직하게 액체 또는 반-액체 형태의 경피용 패치, 플라스터 및 붕대에 함침될 수 있다.

본 발명의 조성물은 치료 효과의 바람직한 수준을 유지하기 위해 결정된 간격으로 주기적으로 전신적으로 투여될 수 있다. 예를 들어 조성물은 예컨대 피하 주사에 의해, 매 2주 내지 4주마다 또는 그것보다 덜 빈번한 간격으로 투여될 수 있다. 단위용량 처방은 제제의 조합의 작용에 영향을 미칠 수 있는 다양한 인자들을 고려하여 의사에 의해 결정될 것이다. 이들 인자는 치료되고 있는 상태의 진전 정도, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 다른 임상적 인자들을 포함할 것이다. 각각의 개별적 제제에 대한 단위용량은 조성물에 포함되는 MASP-2 억제제뿐 아니라 어떠한 약물 전달 비히클 (예컨대 지속성 방출 전달 비히클)의 존재 및 본질의 함수로서 달라질 것이다. 또한, 단위용량의 양은 전달된 제제(들)의 투여 빈도 및 약물동역학적 행동의 변화를 설명하기 위해 조정될 수 있다.

국소 전달

본원에서 사용되는 용어 "국소"는 의도된 국소화된 작용 부위에 또는 주변에 약물을 적용하는 것을 포함하고, 예를 들면 피부 또는 다른 병에 걸린 조직에의 국소적 전달, 안과적 전달, 경막 내 (IT), 뇌실 내 (ICV), 동맥-내, 공동 내 또는 방광 내 투여, 배치 또는 관개를 포함할 수 있다. 국소 투여는 전신적인 부작용을 피하기 위해 더 적은 용량의 투여를 가능하게 하고, 국소 전달의 부위에 활성 제제의 전달 및 농축의 타이밍을 보다 정확하게 제어하기 위해 바람직할 수 있다. 국소 투여는 대사, 혈류 등의 환자간 가변성에도 불구하고 표적 부위에 확인된 농도를 제공한다. 개선된 단위용량 대조표준이 또한 직접적인 전달 방식에 의해 제공된다.

MASP-2 억제제의 국소 전달은 질환 또는 상태를 치료하기 위한 수술적 방법의 맥락에서, 예컨대 예를 들면 동맥 우회술, 아테렉토미, 레이저 시술, 초음파 시술, 풍선 혈관확장술 및 스텐트 배치와 같은 시술 중에 이루어질 수 있다. 예를 들어 MASP-2 억제제는 풍선 혈관확장술 시술과 함께 대상에게 투여될 수 있다. 풍성 혈관확장술 시술은 공기를 뺀 풍선을 가지는 카테테르를 동맥 안에 삽입시키는 것을 포함한다. 공기가 빠진 풍선은 동맥경화성 플라크에 가깝게 배치되고 플라크가 혈관 벽에 대해 압착되도록 부풀려진다. 그 결과로서, 풍선 표면은 혈관의 표면에서 혈관의 내피 세포 층과 접촉하게 된다. MASP-2 억제제는 동맥경화성 플라크 부위에 제제의 방출을 허용하는 방식으로 풍선 혈관확장술 카테테르에 부착될 수 있다. 제제는 기술분야에 공지되어 있는 표준 과정에 따라 풍선 카테테르에 부착될 수 있다. 예를 들어, 제제는 풍선이 부풀려지고, 그 지점에서 제제가 국소 환경으로 방출될 때까지 풍선 카테테르의 구획에 저장될 수 있다. 다르게는, 제제는 풍선 표면상에 함침될 수 있어서 풍선이 부풀려짐에 따라 동맥 벽의 세포에 접촉하게 된다. 제제는 또한 Flugelman, M.Y.,　et　al., Circulation　85:1110-1117, 1992에 개시된 것과 같은 천공된 풍선 카테테르로 전달될 수 있다. 또한 풍선 혈관확장술 카테테르에 치료 단백질을 부착시키기 위한 예시적 과정에 대해 PCT 출원 공보 WO　95/23161을 참조한다. 마찬가지로, MASP-2 억제제는 스텐트에 적용된 겔 또는 중합체 코팅에 포함될 수 있거나, 스텐트의 물질에 통합될 수 있어서 스텐트가 혈관에 배치된 후 MASP-2 억제제를 용출하게 된다.

관절염 및 다른 근골격계 장애의 치료에 사용된 MASP-2 억제 조성물은 동맥-내 주사에 의해 국소적으로 전달될 수 있다. 그런 조성물은 지속성 방출 전달 비히클을 적절하게 포함할 수 있다. 국소 전달이 바람직할 수 있는 경우의 추가의 실례로서, 비뇨생식기 질환의 치료에 사용된 MASP-2 억제 조성물은 방광 내에 또는 다른 비뇨생식기 구조 내에 적절하게 스며들 수 있다.

의료 장치상의 코팅

항체 및 억제 펩티드와 같은 MASP-2 억제제는 이식가능한 또는 부착가능한 의료 장치의 표면 상에 (또는 그 안에) 고정될 수 있다. 변형된 표면은 전형적으로 동물 신체 안에 이식된 후 살아있는 조직과 접촉하게 될 것이다. "이식가능한 또는 부착가능한 의료 장치"는 장치가 정상적으로 작동되는 동안 동물의 신체의 조직 안에 이식되거나 또는 부착되는 의도된 어떠한 장치 (예컨대 스텐트 및 이식가능한 약물 전달 장치)이다. 그런 이식가능한 또는 부착가능한 의료 장치는 예를 들면 니트로셀룰로오스, 다이아조셀룰로오스, 유리, 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 세파로오스, 아가, 전분, 나일론, 스테인레스 스틸, 티타늄 및 생체분해성 및/또는 생체적합성 중합체로부터 만들어질 수 있다. 장치로의 단백질의 누출은 연결된 단백질의 생물학적 활성을 파괴하지 않은 어떠한 기법에 의해, 예를 들면 단백질의 N- 또는 C-말단 잔기 중 하나 또는 둘 다를 장치에 부착시킴으로써 이루어질 수 있다. 부착은 또한 단백질의 하나 또는 그 이상의 내부 부위에서 이루어질 수 있다. 다중 부착 (단백질의 내부 및 단부 둘 다에서의)이 또한 사용될 수 있다. 이식가능한 또는 부착가능한 의료 장치의 표면은 그것에의 단백질 고정화를 위해 기능성 기 (예컨대 카르복실, 아미드, 아미노, 에테르, 하이드록실, 시아노, 니트리도, 설판아미도, 아세틸린성, 에폭시드, 실란성, 무수성, 석신성, 아지도)를 포함하도록 변형될 수 있다. 커플링 화학은 , 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 에스테르, 에테르, 아미드, 아지도 및 설판아미도 유도체의 형성, 시아네이트 및 MASP-2 항체 또는 억제 펩티드 상에서 활용가능한 기능성 기에의 다른 연쇄를 포함한다. MASP-2 항체 또는 억제 단편은 또한 단백질에의 친화성 태그 서열, 예컨대 GST (D.B. Smith and K.S. Johnson, Gene 67:31, 1988), 폴리히스티딘 (E. Hochuli　et　al., J.　Chromatog.　411:77, 1987) 또는 비오틴의 첨가에 의해 비-공유적으로 부착될 수 있다. 그런 친화성 태그는 단백질의 장치에의 가역적 부착을 위해 사용될 수 있다.

단백질은 또한 장치 몸체의 표면에 공유적으로, 예을 들면 의료 장치이ㅡ 표면의 공유 활성화에 의해 부착될 수 있다. 대표적인 실례로, 모세포 단백질(들)은 다음 쌍의 반응성 기 (쌍의 한 구성원은 장치 몸체의 표면에 존재하고 그 쌍의 다른 구성원은 모세포 단백질(들) 상에 존재한다): 에스테르 연쇄를 생성하기 위한 하이드록실/카르복실산; 에스테르 연쇄를 생성하기 위한 하이드록실/무수물; 우레탄 연쇄를 생성하기 위한 하이드록실/아이소시아네이트 중 어느 것에 의해 장치 몸체에 부착될 수 있다. 유용한 반응성 기를 갖지 않은 장치 몸체의 표면은 모세포 단백질(들)의 침착을 허용하기 위해 라디오-주파수 방출 플라즈마 (RFGD) 에칭으로 처리될 수 있다 (예컨대 산소-함유기를 도입하기 위해 산소 플라즈마로의 처리; 아민 기를 도입하기 위해 프로필 아미노 플라즈마로의 처리).

핵산 분자, 예컨대 안티센스, RNAi- 또는 DNA-코드화 펩티드 억제제를 포함하는 MASP-2 억제제는 장치 몸체에 부착된 다공성 매트릭스에 삽입될 수 있다. 표면층을 만들기에 유용한 대표적인 다공성 매트릭스는 다양한 상업적 공급원 (예컨대 Sigma and Collagen Corporation)으로부터 얻어질 수 있는 힘줄 또는 피부 콜라겐으로부터 제조된 것들, 또는 Jefferies에 부여된 미국 특허 제 4,394,370호 및 Koezuka에 부여된 제 4,975,527호에 기술된 것과 같이 제조된 콜라겐 매트릭스이다. 한 가지 콜라겐성 물질은 UltraFiber^TM으로 명명되고 Norian Corp. (Mountain View, California)로부터 얻을 수 있다.

특정 중합체 매트릭스는 또한 필요하다면 사용될 수 있고, 예를 들면 Urist에 부여된 미국 특허 제 4,526,909호에 개시된 것과 같이, 아크릴계 에스테르 중합체 및 락트산 중합체를 포함한다. 유용한 중합체의 특별한 실례는 오르토에스테르, 무수물, 프로필렌-코푸마레이트 또는 하나 또는 그 이상의 α-하이드록시 카르복실산 단량체 (예컨대 α-하이드록시 아세트산 (글리콜산) 및/또는 α-하이드록시 프로피온산 (락트산))의 중합체의 것들이다.

치료 처방

예방적 용도에서, 약학 조성물은 MASP-2-의존성 보체 활성화와 관련된 상태에 민감한, 또는 그렇지 않으면 위험이 있는 대상에게, 그 상태의 발달중인 증상의 위험을 제거하거나 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 용도에서, 약학 조성물은 약학 조성물은 MASP-2-의존성 보체 활성화와 관련된 상태가 의심되는, 또는 이미 그 상태로 고생하는 대상에게, 그 상태의 증상을 제거하거나 또는 적어도 부분적으로 감소시키기에 충분한 치료적 유효량으로 투여된다. 예방적 및 치료적 처방 둘 다에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상에서 충분한 치료적 결과가 이루어질 때까지 여러 단위용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 급성 상태, 예컨대 재관류 손상 또는 다른 외상적 손상의 치료를 위해 조성물의 단일 투여에 의해 또는 제한된 투여 순서에 의해 수행될 수 있다. 다르게는, 조성물은 예컨대 관절염 또는 건선과 같은 만성 상태의 치료를 위해 연장된 기간에 걸쳐 주기적 간격으로 투여될 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물은 전형적으로 진단 및 치료적 의학적 및 수술적 시술로부터 유발되는 염증 및 관련된 과정을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 그런 과정을 억제하기 위해, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 시술전후에 적용될 수 있다. 본원에 사용된 "시술전후에"는 시술 전에 및/또는 시술 중에 및/또는 시술 후에, 즉 시술 전, 시술 전과 중, 시술 전과 후, 시술 전, 중 및 후, 시술 중, 시술 중과 후에 또는 시술 후에 억제 조성물을 투여하는 것을 말한다. 시술전후 적용은 수술 또는 시술 부위에 조성물의 국소 투여에 의해, 예컨대 주사 또는 연속적이거나 간헐적인 부위의 관개에 의해 또는 전신적 투여에 의해 수행될 수 있다. MASP-2 억제제 용액의 국소적인 시술전후 전달에 적당한 방법은 Demopulos에 부여된 미국 특허 제 6,420,432호 및 Demopulos에 부여된 제 6,645,168호에 개시되어 있다. MASP-2 억제제(들)을 포함하는 연골보호 조성물의 국소 전달에 적당한 방법은 국제 PCT 특허 출원 WO　01/07067 A2에 개시되어 있다. MASP-2 억제제(들)을 포함하는 연골보호 조성물의 표적화된 전신적 전달에 적당한 방법 및 조성물은 국제 PCT 특허 출원 WO　03/063799 A2에 개시되어 있다.

발명의 한 측면으로, 약학 조성물은 혈전성 미세혈관병증 (TMA)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상에게 투여된다. 한 구체예에서, TMA는 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP) 및 비전형적 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 조성물은 질환의 급성기 동안 aHUS 환자에게 투여된다. 한 구체예에서, 조성물은 퇴행 단계 동안 aHUS 환자에게 투여된다 (즉 급성기의 aHUS의 에피소드로부터 회복되었거나 부분적으로 회복된 대상에서, 그런 관해는 예를 들면 Loirat C et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60, 2011 (본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있는 것과 같이, 예를 들면 증가된 혈소판 총수 및/또는 감소된 혈청 LDH 농도에 의해 증명된다). 한 구체예에서, 대상은 (i) 암에 이차적인 TMA; (ii) 화학요법에 이차적인 TMA; 또는 (iii) 이식 (예컨대 장기 이식, 예컨대 신장 이식 또는 동종이계성 조혈 줄기세포 이식)에 이차적인 TMA인 TMA에 걸리거나 걸릴 위험이 있다. 한 구체예에서, 대상은 업쇼-슐만 증후군 (USS)에 걸리거나 걸릴 위험이 있다. 한 구체예에서, 대상은 데고스병에 걸리거나 걸릴 위험이 있다. 한 구체예에서, 대상은 파국성 항인지질 증후군 (CAPS)에 걸리거나 걸릴 위험이 있다. 치료적 용도에서, 약학 조성물은 TMA에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상에게 혈전 형성을 억제하고, 상태의 증상들을 완화시키거나 또는 부분적으로 감소시키기에 충분한 치료적 유효량으로 투여된다.

예방적 및 치료적 처방 둘 다에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상에서 충분한 치료 결과가 이루어질 때까지 여러 단위용량으로 투여될 수 있다. 발명의 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체를 포함하고, 그것은 성인 환자 (예컨대 평균 체중 70 kg의 성인)에게 적절하게 0.1 mg 내지 10,000 mg, 보다 적절하게 1.0 mg 내지 5,000 mg, 보다 적절하게 10.0 mg 내지 2,000 mg, 보다 적절하게 10.0 mg 내지 1,000 mg, 더욱 적절하게 50.0 mg 내지 500 mg의 단위용량으로 투여될 수 있다. 소아과 환자에 대해서, 단위용량은 환자의 체중에 비례하여 조정될 수 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 TMA의 치료를 위해, 조성물의 단일 투여에 의해 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수 있다. 다르게는, 조성물은 TMA의 치료를 위해 연장된 기간에 걸쳐 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 주 2회, 주마다, 2주마다, 1개월마다 또는 월 2회로 투여될 수 있다.

일부 구체예에서, TMA에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상은 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제로의 치료가 이전에 진행되었거나 또는 현재 진행중이다. 일부 구체예에서, 방법은 MASP-2 억제제를 포함하는 발명의 조성물을 대상에게 투여하고 추가로 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제를 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제제는 인간화된 항-C5 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제제는 유클리주맙이다.

발명의 한 측면으로, 약학 조성물은 aHUS에 취약하거나 걸릴 위험이 있는 대상에게, 상태의 증상을 제거하거나 증상으로 발달할 위험을 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 용도에서, 약학 조성물은 aHUS가 의심되거나 이미 걸린 대상에게, 그 상태의 증상을 완화시키거나, 또는 적어도 부분적으로 감소시키기에 충분한 치료적 유효량으로 투여된다. 발명의 한 측면에서, 대상은 투여 전에, (i) 빈혈, (ii) 혈소판 감소증, (iii) 신부전증 및 (iv) 상승하는 크레아티닌을 포함하여 하나 또는 그 이상의 aHUS 증상을 나타내는 지의 여부를 측정하기 위해 조사될 수 있고, 그런 다음 본 발명의 조성물이 이들 증상(들)을 개선하기 위해 충분한 시간 동안 유효량으로 투여된다.

발명의 다른 측면으로, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 aHUS에 걸릴 위험이 증가된 대상을 예방적으로 치료하고 그로써 대상이 aHUS를 전달할 가능성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. aHUS와 관련이 있는 것으로 알려져 있는 대상에서 유전자 마커의 존재는 먼저 대상으로부터 얻어진 샘플에 대해 유전자 스크리닝 시험을 수행하고 aHUS와 관련된 적어도 하나의 유전자 마커, 보체 인자 H (CFH), 인자 I (CFI), 인자 B (CFB), 막 조인자 CD46, C3, 보체 인자 H-관련 단백질 (CFHR1), 항응고 단백질 트롬보듈린 (THBD), 보체 인자 H-관련 단백질 3 (CFHR3) 또는 보체 인자 H-관련 단백질 4 (CFHR4)의 존재를 확인함으로써 측정된다. 그런 다음 대상은 aHUS의 적어도 하나의 증상, 예컨대 빈혈, 혈소판 감소증, 신부전증 및 상승하는 크레아티닌의 존재 또는 부재를 측정하기 위해 주기적으로 (예컨대 달마다, 분기마다, 년 2회 또는 해마다) 모니터링된다. 이들 증상 중 적어도 하나의 존재가 측정될 때 대상은 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제제의 양으로, 상기 하나 또는 그 이상의 증상을 개선하기에 충분한 시간 동안 충분한 유효량으로 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 추가의 측면으로, aHUS와 관련된 유전자 마커들 중 하나를 가지는 것으로 스크리닝되고 측정됨으로써 aHUS에 걸릴 위험이 증가된 대상은 약물 노출, 감염 (예컨대 박테리아 감염), 악성 종양, 손상, 장기 또는 조직 이식 및 임신을 포함하여, aHUS 임상 증상을 야기하는 것과 관련된 사건의 발생에 대해 모니터링될 수 있다.

또한 본 발명의 추가의 측면으로, MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 감염에 이차적인 비전형적인 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상에게 투여될 수 있다. 예를 들어 S.뉴모니아 감염과 관련된 비-장 aHUS에 걸리거나 걸릴 위험이 있는 환자는 본 발명의 조성물로 치료될 수 있다.

또한 본 발명의 추가의 측면으로, aHUS에 걸린 대상은 초기에 카테테르 선, 예컨대 정맥 내 카테테르 선 또는 피하 카테테르 선을 통해 예컨대 1시간, 12시간, 1일, 2일 또는 3일의 제 1 기간 동안 투여되는 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 치료될 수 있다. 그런 다음 대상은 제 2 기간 동안 규칙적인 피하 주사, 예컨대 매일, 주 2회, 주마다, 2주마다, 1개월마다 또는 월 2회 주사를 통해 투여되는 MASP-2 억제 조성물로 치료될 수 있다.

또한 본 발명의 추가의 측면으로, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 혈장 사혈의 부재하에 aHUS에 걸린 대상 (즉 aHUS 증상이 혈장 사혈로 치료되지 않았고 MASP-2 억제 조성물을 사용한 치료시에 혈장 사혈로 치료되지 않은 대상)에게 출혈, 감염 및 혈장 공여자에게 고유한 장애 및/또는 알레르기에의 노출을 포함하여 혈장 사혈의 잠재적인 합병증을 피하기 위해, 또는 그렇지 않으면 혈장 사혈을 꺼리는 대상에서, 또는 혈장 사혈을 활용할 수 없는 환경에서 투여될 수 있다.

또한 본 발명의 추가의 측면으로, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 혈장 사혈로 환자를 치료하는 것과 동시에 aHUS에 걸린 대상에게 투여될 수 있다. 예를 들어 혈장 사혈 치료를 받는 대상은 그런 다음 혈장 교환 후에 또는 교대로 MASP-2 억제 조성물이 투여될 수 있다.

또한 본 발명의 추가의 측면으로, aHUS에 걸렸거나 걸릴 위험이 있고 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 치료중인 대상은 주기적으로, 예컨대 매 12시간마다 또는 매일을 기초로 적어도 하나의 보체 인자의 수준이 측정됨으로써 모니터링될 수 있고, 이때 적어도 하나의 보체 인자의 표준 값 또는 건강한 대상에 비교하여 감소된 수준은 조성물로의 지속적인 치료에 대한 필요성을 가리킨다.

예방적 및 치료적 처방 둘 다에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상에서 충분한 치료 결과가 이루어질 때까지 여러 단위용량으로 투여될 수 있다. 발명의 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체를 포함하고, 그것은 성인 환자 (예컨대 평균 체중 70 kg의 성인)에게 적절하게 0.1 mg 내지 10,000 mg, 보다 적절하게 1.0 mg 내지 5,000 mg, 보다 적절하게 10.0 mg 내지 2,000 mg, 보다 적절하게 10.0 mg 내지 1,000 mg, 더욱 적절하게 50.0 mg 내지 500 mg의 단위용량으로 투여될 수 있다. 소아과 환자에 대해서, 단위용량은 환자의 체중에 비례하여 조정될 수 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 aHUS의 치료를 위해, 조성물의 단일 투여에 의해 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수 있다. 다르게는, 조성물은 aHUS의 치료를 위해 연장된 기간에 걸쳐 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 주 2회, 주마다, 2주마다, 1개월마다 또는 월 2회로 투여될 수 있다.

일부 구체예에서, aHUS에 걸린 대상은 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제로의 치료가 이전에 진행되었거나 또는 현재 진행중이다. 일부 구체예에서, 방법은 MASP-2 억제제를 포함하는 발명의 조성물을 대상에게 투여하고 추가로 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제를 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제제는 인간화된 항-C5 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제제는 유클리주맙이다.

발명의 한 측면으로, 약학 조성물은 HUS에 취약하거나 그렇지 않으면 걸릴 위험이 있는 대상에게, 그 상태의 증상들을 완화시키거나 증상을 발달시킬 위험을 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 용도에서, 약학 조성물은 HUS가 의심되거나, 또는 이미 HUS에 걸린 대상에게 그 상태의 증상을 완화시키거나, 적어도 부분적으로 감소시키기에 충분한 치료적 유효량으로 투여된다.

발명의 다른 측면으로, HUS에 걸릴 위험이 있는 대상에서 손상된 신장 기능이 전개될 가능성은 그 대상에게 본 발명의 MASP-2 억제 조성물을 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하기에 충분한 양으로 투여함으로써 감소될 수 있다. 예를 들어, HUS에 걸릴 위험이 있고 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 치료될 대상은 설사, 혈관내 적혈구 파괴의 스미어 증거를 포함한 30% 미만의 헤마토크릿 수준, 혈소판 감소증 및 상승하는 크레아티닌 수준을 포함하여, HUS와 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 나타낼 수 있다. 추가의 실례로서, HUS에 걸릴 위험이 있고 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 치료될 대상은 대장균, 쉬겔라 또는 살모넬라로 감염될 수 있다. 대장균, 쉬겔라 또는 살모넬라로 감염된 그런 대상은 항생물질 치료와 함께 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 치료될 수 있고, 또는 다르게는 항생물질을 사용한, 특히 그것에 대한 항생물질 치료가 사용금지되어 있는 장질환 유발 대장균에 대한 동시 치료 없이 MASP-2 억제 조성물로 치료될 수 있다. 항생물질로 치료되었던, 장질환 유발 대장균으로 감염된 대상은 HUS에 걸릴 위험이 증가될 수 있고, 그 위험을 감소시키기 위하여 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 적절하게 치료될 수 있다. 장질환 유발 대장균으로 감염된 대상은 제 1 기간 동안 항생물질의 부재하에 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 치료될 수 있고 그런 다음 제 2 기간 동안 본 발명의 MASP-2 억제 조성물과 항생물질 둘 다로 치료될 수 있다.

또한 본 발명의 추가의 측면으로, HUS에 걸린 대상은 초기에 카테테르 선, 예컨대 정맥 내 카테테르 선 또는 피하 카테테르 선을 통해 예컨대 1시간, 12시간, 1일, 2일 또는 3일의 제 1 기간 동안 투여되는 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 치료될 수 있다. 그런 다음 대상은 제 2 기간 동안 규칙적인 피하 주사, 예컨대 매일, 주 2회, 주마다, 2주마다, 1개월마다 또는 월 2회 주사를 통해 투여되는 MASP-2 억제 조성물로 치료될 수 있다.

또한 본 발명의 추가의 측면으로, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 혈장 사혈의 부재하에 HUS에 걸린 대상 (즉 HUS 증상이 혈장 사혈로 치료되지 않았고 MASP-2 억제 조성물을 사용한 치료시에 혈장 사혈로 치료되지 않은 대상)에게 출혈, 감염 및 혈장 공여자에게 고유한 장애 및/또는 알레르기에의 노출을 포함하여 혈장 사혈의 잠재적인 합병증을 피하기 위해, 또는 그렇지 않으면 혈장 사혈을 꺼리는 대상에서, 또는 혈장 사혈을 활용할 수 없는 환경에서 투여될 수 있다.

또한 본 발명의 추가의 측면으로, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 혈장 사혈로 환자를 치료하는 것과 동시에 HUS에 걸린 대상에게 투여될 수 있다. 예를 들어 혈장 사혈 치료를 받는 대상은 그런 다음 혈장 교환 후에 또는 교대로 MASP-2 억제 조성물이 투여될 수 있다.

또한 본 발명의 추가의 측면으로, HUS에 걸렸거나 걸릴 위험이 있고 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 치료중인 대상은 주기적으로, 예컨대 매 12시간마다 또는 매일을 기초로 적어도 하나의 보체 인자의 수준이 측정됨으로써 모니터링될 수 있고, 이때 적어도 하나의 보체 인자의 표준 값 또는 건강한 대상에 비교하여 감소된 수준은 조성물로의 지속적인 치료에 대한 필요성을 가리킨다.

예방적 및 치료적 처방 둘 다에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상에서 충분한 치료 결과가 이루어질 때까지 여러 단위용량으로 투여될 수 있다. 발명의 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체를 포함하고, 그것은 성인 환자 (예컨대 평균 체중 70 kg의 성인)에게 적절하게 0.1 mg 내지 10,000 mg, 보다 적절하게 1.0 mg 내지 5,000 mg, 보다 적절하게 10.0 mg 내지 2,000 mg, 보다 적절하게 10.0 mg 내지 1,000 mg, 더욱 적절하게 50.0 mg 내지 500 mg의 단위용량으로 투여될 수 있다. 소아과 환자에 대해서, 단위용량은 환자의 체중에 비례하여 조정될 수 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 HUS의 치료를 위해, 조성물의 단일 투여에 의해 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수 있다. 다르게는, 조성물은 HUS의 치료를 위해 연장된 기간에 걸쳐 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 주 2회, 주마다, 2주마다, 1개월마다 또는 월 2회로 투여될 수 있다.

일부 구체예에서, HUS에 걸린 대상은 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제로의 치료가 이전에 진행되었거나 또는 현재 진행중이다. 일부 구체예에서, 방법은 MASP-2 억제제를 포함하는 발명의 조성물을 대상에게 투여하고 추가로 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제를 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제제는 인간화된 항-C5 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제제는 유클리주맙이다.

발명의 한 측면으로, 약학 조성물은 TTP에 취약하거나 그렇지 않으면 걸릴 위험이 있는 대상에게, 그 상태의 증상들을 완화시키거나 증상을 발달시킬 위험을 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 용도에서, 약학 조성물은 HUS가 의심되거나, 또는 이미 TTP에 걸린 대상에게 그 상태의 증상을 완화시키거나, 적어도 부분적으로 감소시키기에 충분한 치료적 유효량으로 투여된다.

본 발명의 다른 측면으로, 중추신경계 관련, 혈소판 감소증, 심각한 심장 관련, 심각한 폐 관련, 위장 경색 및 괴저를 포함하여, TTP의 하나 또는 그 이상의 증상을 나타내는 대상은 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 치료될 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면으로, ADAMTS13의 억제된 수준을 가지는 것으로 측정되고 또한 ADAMTS13의 억제제 (즉 항체)의 존재에 대해 포지티브로 시험된 대상은 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 치료될 수 있다. 본 발명의 또 다른 추가의 측면으로, ADAMTS13의 억제제의 존재에 대해 포지티브로 시험된 대상은 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로의 치료와 동시에 면역억제제 (예컨대 코르티코스테로이드, 리툭산 또는 사이클로스포린)로 치료될 수 있다. 본 발명의 또 다른 추가의 측면으로, ADAMTS13의 억제된 수준을 가지는 것으로 측정되고 ADAMTS13의 억제제의 존재에 대해 포지티브로 시험된 대상은 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로의 치료와 동시에 ADAMTS13으로 치료될 수 있다.

본 발명의 또 다른 추가의 측면으로, TTP에 걸린 대상은 초기에 카테테르 선, 예컨대 정맥 내 카테테르 선 또는 피하 카테테르 선을 통해 예컨대 1시간, 12시간, 1일, 2일 또는 3일의 제 1 기간 동안 투여되는 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 치료될 수 있다. 그런 다음 대상은 제 2 기간 동안 규칙적인 피하 주사, 예컨대 매일, 주 2회, 주마다, 2주마다, 1개월마다 또는 월 2회 주사를 통해 투여되는 MASP-2 억제 조성물로 치료될 수 있다.

또한 본 발명의 추가의 측면으로, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 혈장 사혈의 부재하에 TTP에 걸린 대상 (즉 TTP 증상이 혈장 사혈로 치료되지 않았고 MASP-2 억제 조성물을 사용한 치료시에 혈장 사혈로 치료되지 않은 대상)에게 출혈, 감염 및 혈장 공여자에게 고유한 장애 및/또는 알레르기에의 노출을 포함하여 혈장 사혈의 잠재적인 합병증을 피하기 위해, 또는 그렇지 않으면 혈장 사혈을 꺼리는 대상에서, 또는 혈장 사혈을 활용할 수 없는 환경에서 투여될 수 있다.

또한 본 발명의 추가의 측면으로, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 혈장 사혈로 환자를 치료하는 것과 동시에 TTP에 걸린 대상에게 투여될 수 있다. 예를 들어 혈장 사혈 치료를 받는 대상은 그런 다음 혈장 교환 후에 또는 교대로 MASP-2 억제 조성물이 투여될 수 있다.

또한 본 발명의 추가의 측면으로, 난치성 TTP에 걸린 대상, 즉 혈장 사혈과 같은 다른 치료에 적절하게 반응하지 않는 TTP의 증상들은 추가의 혈장 사혈이 있거나 없이, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 치료될 수 있다.

또한 본 발명의 추가의 측면으로, TTP에 걸렸거나 걸릴 위험이 있고 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 치료중인 대상은 주기적으로, 예컨대 매 12시간마다 또는 매일을 기초로 적어도 하나의 보체 인자의 수준이 측정됨으로써 모니터링될 수 있고, 이때 적어도 하나의 보체 인자의 표준 값 또는 건강한 대상에 비교하여 감소된 수준은 조성물로의 지속적인 치료에 대한 필요성을 가리킨다.

예방적 및 치료적 처방 둘 다에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상에서 충분한 치료 결과가 이루어질 때까지 여러 단위용량으로 투여될 수 있다. 발명의 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체를 포함하고, 그것은 성인 환자 (예컨대 평균 체중 70 kg의 성인)에게 적절하게 0.1 mg 내지 10,000 mg, 보다 적절하게 1.0 mg 내지 5,000 mg, 보다 적절하게 10.0 mg 내지 2,000 mg, 보다 적절하게 10.0 mg 내지 1,000 mg, 더욱 적절하게 50.0 mg 내지 500 mg의 단위용량으로 투여될 수 있다. 소아과 환자에 대해서, 단위용량은 환자의 체중에 비례하여 조정될 수 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 TTP의 치료를 위해, 조성물의 단일 투여에 의해 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수 있다. 다르게는, 조성물은 TTP의 치료를 위해 연장된 기간에 걸쳐 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 주 2회, 주마다, 2주마다, 1개월마다 또는 월 2회로 투여될 수 있다.

일부 구체예에서, TTP에 걸린 대상은 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제로의 치료가 이전에 진행되었거나 또는 현재 진행중이다. 일부 구체예에서, 방법은 MASP-2 억제제를 포함하는 발명의 조성물을 대상에게 투여하고 추가로 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제를 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제제는 인간화된 항-C5 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제제는 유클리주맙이다.

VII. 실시예

다음의 실시예들은 단지 발명을 실시하기 위해 고려된 최상의 방식을 예시하지만, 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 문헌은 분명하게 참조로 포함된다.

실시예 1

이 실시예는 MASP-2가 결핍된 (MASP-2-/-), 그러나 MAp19는 충분한 (MAp19+/+) 마우스 계통의 제조를 설명한다.

재료 및 방법: 표적화 벡터 pKO-NTKV 1901을 도 3에 도시한 것과 같이, 세린 프로테아제 도메인을 코드화하는 엑손을 포함하여, 쥐과 MASP-2의 C-말단부를 코딩하는 3개의 엑손을 파괴하도록 디자인하였다. pKO-NTKV 1901을 사용하여 쥐과 ES 셀라인 E14.1a (SV129　Ola)를 형질전환하였다. 네오마이신-내성 및 티미딘 키나아제-민감성 클론들을 선택하였다. 600개의 ES 클론을 스크리닝하고, 그것들 중에서 4개의 상이한 클론을 확인하고 서던 블롯팅에 의해 도 3에 도시된 것과 같은 선택적인 표적화 및 재조합 사건을 함유하는 것을 확증하였다. 배아 전달에 의해 이들 4개의 포지티브 클론으로부터 키메라들을 제조하였다. 그런 다음 키메라를 유전자 바탕 C57/BL6에 역교배하여 유전자도입 수컷을 제조하였다. 유전자도입 수컷들을 암컷과 교배하여 F1을 만들었고 새끼들의 50%가 파괴된 MASP-2 유전자에 대해 이형접합성을 나타냈다. 이형접합성 마우스들을 이종교배하여 동형접합성 MASP-2 결핍 새끼를 제조하였고, 그 결과 이형접합성 및 야생형 마우스와의 비율이 각각 1:2:1이 되었다.

결과 및 표현형: 그 결과의 동형접합성 MASP-2-/- 결핍 마우스들은 정확한 표적화 사건을 확인하기 위한 서던 블롯팅에 의해, MASP-2 mRNA의 부재를 확인하기 위한 노던 블롯팅에 의해, 그리고 MASP-2 단백질의 부재를 확인하기 위한 웨스턴 블롯팅에 의해, 생존 가능하였고 생식력이 있으며, MASP-2 결핍인 것으로 확인되었다 (데이터는 제시하지 않음). MAp19 mRNA의 존재 및 MASP-2 mRNA의 부재는 추가로 LightCycler 기계 상에서의 시간-분석 RT-PCR을 사용하여 확인하였다. MASP-2-/- 마우스들은 계속해서, 예상했던 것과 같이 MAp19, MASP-1 및 MASP-3 mRNA 및 단백질을 발현하였다 (데이터는 제시하지 않음). 프로퍼딘, 인자 B, 인자 D, C4, C2 및 C3에 대해 MASP-2-/- 마우스에서 mRNA의 존재 및 풍부함은 LightCycler 분석에 의해 평가하였고 그 결과 야생형 새끼 대조표준의 그것과 동일한 것으로 나타났다 (데이터는 제시하지 않음). 동형접합성 MASP-2-/- 마우스로부터의 혈장은 총체적으로 렉틴-경로-중재된 보체 활성화가 결핍되었고, 그것에 대해서 실시예 2에서 추가로 기술되다.

순수한 C57BL6　바탕에서의 MASP-2-/- 계통의 제조: MASP-2-/- 마우스들을 실험 동물 모델로서 MASP-2-/- 계통의 사용 전 9세대 전에 순수한 C57BL6 라인과 역교배하였다.

쥐과 MASP-2-/-, MAp19+/+이고 인간 MASP-2 이식유전자를 발현하는 유전자도입 마우스 계통 (쥐과 MASP-2 녹아웃 및 인간 MASP-2 녹인)은 또한 다음과 같이 제조하였다:

재료 및 방법: 도 4에 도시한 것과 같은 "미니 hMASP-2" (SEQ ID NO:49)로 불리는 인간 MASP-2를 코드화하는 미니유전자를 구성하였는데, 그것은 인간 MASP 2 유전자의 프로모터 영역을 포함하고, 처음 3개의 엑손 (엑손 1 내지 엑손 3)과 이어서 다음의 8개의 엑손의 코딩 서열을 나타내는 cDNA 서열을 포함함으로써, 그것의 내인성 프로모터에 의해 구동되는 전-길이 MASP-2 단백질을 코드화한다. 미니 hMASP-2 구성물을 이식된 유전자로 발현된 인간 MASP-2에 의해 결핍 쥐과 MASP 2 유전자를 대체하기 위해 MASP-2-/-의 수정란에 주입하였다.

실시예 2

이 실시예는 MASP-2가 렉틴 경로를 통한 보체 활성화에 필요한 것을 증명한다.

방법 및 재료:

렉틴 경로 특이적 C4 절단 분석: L-피콜린에 결합하는, 녹농균으로부터의 리포테이코산 (LTA)으로부터 유발되는 렉틴 경로 활성화를 측정하는 C4 절단 분석은 문헌에 기술되어 있다 (Petersen,　et　al., J.　Immunol. Methods　257:107 (2001)). Petersen 등에 의해 (2001) 기술된 분석을, 플레이트를 아래에서 기술되는 것과 같이 LPS 및 만난 또는 자이모산으로 코팅한 후 MASP-2 -/- 마우스로부터의 혈청을 첨가함으로써 MBL을 통한 렉틴 경로 활성화를 측정하기 위해 적응하였다. 분석을 또한 변형시켜서 고전적 경로로 인한 C4 절단의 가능성을 제거하였다. 이것은 1 M NaCl을 함유하고 있는 샘플 희석 완충액을 사용함으로써 이루었는데, 그것은 렉틴 경로 인식 성분들의 리간드에의 고친화성 결합을 허용하지만 내인성 C4의 활성화를 방지함으로써, C1 복합체를 분해함으로써 고전적 경로의 참여를 배제한다. 간단히 설명하면, 변형된 분석에서 혈청 샘플 (고염 (1 M NaCl) 완충액에 희석된)을 리간드-코팅된 플레이트에 첨가하고, 이어서 생리적 농도의 염이 포함된 완충액 중의 정제된 C4의 일정량을 첨가하였다. MASP-2를 함유하는 결합된 인식 복합체는 C4를 절단하여 C4b 침착을 초래하였다.

분석 방법:

1) Nunc Maxisorb 미세역가 플레이트 (Maxisorb, Nunc, Cat. No.　442404, Fisher Scientific)를 코팅 완충액 (15　mM Na₂CO₃, 35　mM NaHCO₃, pH　9.6)에 희석된 1 μg/ml의 만난 (M7504 Sigma) 또는 어떠한 다른 리간드 (예컨대 하기에 열거된 것들)로 코팅하였다.

다음의 시약을 분석에 사용하였다:

a. 만난 (100 μl의 코팅 완충액 중의 1 μg/웰의 만난 (M7504 Sigma))

b. 자이모산 (100 μl의 코팅 완충액 중의 1 μg/웰의 자이모산 (Sigma))

c. LTA (100 μl의 코팅 완충액 중의 1 μg/웰 또는 20 μl의 메탄올 중의 2 μg/웰)

d. 코팅 완충액 중의 1 μg의 H-피콜린 특이적 Mab 4H5

e. 에로코쿠스 비리단스 (Aerococcus viridans)로부터의 PSA (100 μl의 코팅 완충액 중의 2 μg/웰)

f. 코팅 완충액 중의 100 μg/웰의 포르말린-고정된 녹농균 DSM20233 (OD₅₅₀=0.5)

2) 플레이트를 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다.

3) 밤새 인큐베이션한 후에, 잔류 단백질 결합 부위를, 플레이트를 0.1% HSA-TBS 차단 완충액 (10　mM Tris-CL 중의 0.1% (w/v) HSA, 140　mM NaCl, 1.5　mM NaN₃, pH　7.4)으로 인큐베이션한 후 플레이트를 TBS/tween/Ca²⁺ (0.05% Tween　20 및 5 mM CaCl₂가 첨가된 TBS, 1　mM MgCl₂, pH　7.4)로 3회 세척함으로써 포화시켰다.

4) 시험한 혈청 샘플을 MBL-결합 완충액 (1M NaCl)에 희석하고 희석된 샘플을 플레이트에 첨가한 후 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 완충액만을 넣은 웰을 네거티브 대조표준으로서 사용하였다.

5) 밤새 4℃에서 인큐베이션한 후, 플레이트를 TBS/tween/Ca2+로 3회 세척하였다. 그런 다음 인간 C4 (BBS (4　mM 바르비탈, 145　mM NaCl, 2　mM CaCl₂, 1　mM MgCl₂, pH　7.4)에 희석된 1 μg/ml의 100 μg/웰)를 플레이트에 첨가하고 90분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 TBS/tween/Ca²⁺로 3회 세척하였다.

6) C4b 침착을 알칼리 포스파타제-포합된 닭 항-인간 C4c (TBS/tween/Ca²⁺에 1:1000으로 희석됨)를 사용하여, 그것을 플레이트에 첨가하고 90분 동안 실온에서 인큐베이션하여 검출하였다. 그런 다음 플레이트를 다시 TBS/tween/Ca²⁺로 3회 세척하였다.

7) 알칼리 포스파타제를 100 의 p-니트로피넬 포스페이트 기질 용액을 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 후 미세역가 플레이트 판독시에서 OD₄₀₅를 판독함으로써 검출하였다.

결과: 도 5a 및 b는 MASP-2+/+ (십자형), MASP-2+/- (원형) and MASP-2-/- (세모형)로부터의 혈청 희석액 중의 만난 (도 5a) 및 자이모산 (도 5b) 상에서의 C4b의 양을 나타낸다. 도 5c는 야생형 혈청에 대해 규준화된 C4b 침착의 양을 측정한 것을 기초로 야생형 마우스 (n=5)에 대한 MASP-2-/+ 마우스 (n=5) 및 MASP-2-/- 마우스 (n=4)로부터의 자이모산 (흰색 막대) 또는 만난 (사선 무늬 막대)으로 코팅된 플레이트상의 상대적인 C4 전환효소 활성을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 5a 내지 5c에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2-/- 마우스로부터의 혈장은 총체적으로, 만난 및 자이모산 코팅된 플레이트 상에서의 렉틴-경로-중재된 보체 활성화가 결핍되어 있다. 이들 결과는 명백하게 MASP-2가 렉틴 경로의 이펙터 성분인 것을 증명한다.

재조합 MASP-2는 MASP-2-/- 마우스로부터의 혈청에서 렉틴 경로-의존성 C4 활성화를 재구성한다

MASP-2의 부재는 MASP-2-/- 마우스에서 렉틴 경로-의존성 C4 활성화의 손실의 직접적인 원인이었음을 수립하기 위하여, 혈청 샘플에 재조합 MASP-2 단백질을 첨가하는 것의 효과를 상기에서 기술된 C4 절단 분석에서 조사하였다. 기능적으로 활성인 쥐과 MASP-2 및 촉매적으로 비활성 쥐과 MASP-2A (세린 프로테아제 도메인의 활성-부위 세린 잔기가 알라닌 잔기에 대해 치환되어 있음) 재조합 단백질들을 제조하였고, 하기 실시예 3에서 기술하는 것과 같이 정제하였다. 4마리의 MASP-2 -/- 마우스로부터 모아진 혈청을 증가하는 단백질 농도의 재조합 쥐과 MASP-2 또는 비활성 재조합 쥐과 MASP-2A와 함께 사전-인큐베이션하고 C4 전환효소 활성을 상기에서 기술한 것과 같이 분석하였다.

결과: 도 6에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2 -/- 마우스로부터 얻어진 혈청에 기능적으로 활성인 쥐과 재조합 MASP-2 단백질 (삼각형으로 나타냄)을 첨가하는 것은 단백질 농도 의존성 방식으로 렉틴 경로-의존성 C4 활성화를 복원시킨 반면, 촉매적으로 비활성인 쥐과 MASP-2A 단백질 (별모양으로 나타냄)은 C4 활성화를 복원시키지 못하였다. 도 6에 도시된 결과들은 모아진 야생형 마우스 혈청 (점선으로 나타냄)으로 관찰된 C4 활성화로 규준화한다.

실시예 3

이 실시예는 재조합 전-길이 인간, 래트 및 쥐과 MASP-2, MASP-2 유도된 폴리펩티드 및 MASP-2의 촉매적으로 비활성화된 돌연변이 형태의 재조합 발현 및 단백질 제조를 설명한다.

전-길이 인간, 쥐과 및 래트 MASP-2의 발현:

인간 MASP-2의 전길이 cDNA 서열 (SEQ ID NO:4)을 또한, CMV 인핸서/프로모터 영역의 제어 하에 진핵세포 발현을 구동하는 포유류 발현 벡터 pCI-Neo (Promega)에 하위클론하였다 (Kaufman R.J.　et　al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)). 전길이 마우스 cDNA (SEQ ID NO:50) 및 래트 MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:53)를 각각 pED 발현 벡터에 하위클론하였다. 그런 다음 MASP-2 발현 벡터를 Maniatis　등 (1989)이 기술한 표준 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 과정을 사용하여 부착성 차이니즈 햄스터 난소 셀라인 DXB1에 트랜스펙션하였다. 이들 구성물로 트랜스펙션된 세포는 매우 느리게 성장하였는데, 코드화된 프로테아제가 세포독성임을 시사한다.

다른 접근법으로, 내인성 프로모터에 의해 구동된 MASP-2의 인간 cDNA를 함유하고 있는 미니유전자 구성물 (SEQ ID NO:49)를 일시적으로 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)에 트랜스펙션하였다. 인간 MASP-2 단백질은 배양 배지로 분비되고 하기에서 기술되는 것과 같이 분리된다.

전-길이의 촉매적으로 비활성인 MASP-2의 발현:

근거: MASP-2는 인식 하위성분 MBL 또는 피콜린 (L-피콜린, H-피콜린 또는 M-피콜린 중 어느 하나)가 그것들의 각각의 탄수화물 패턴에 결합한 후에 자가촉매적 절단에 의해 활성화된다. MASP-2의 활성화를 초래하는 자가촉매적 절단은 자주 혈청으로부터 MASP-2의 분리 과정 중에, 또는 재조합 발현 후에 정제 중에 일어난다. 항원으로서 사용하기 위한 보다 안정한 단백질 제제를 얻기 위해, MASP-2A로서 디자인된, MASP-2의 촉매적 비활성 형태를 쥐에서 (SEQ ID NO:55 Ser617 내지 Ala617); 마우스에서 (SEQ ID NO:52 Ser617 내지 Ala617); 또는 인간에서 (SEQ ID NO:3 Ser618 내지 Ala618) 프로테아제 도메인의 촉매적 트라이애드에 존재하는 세린 잔기를 알라닌 잔기로 대체함으로써 생성하였다.

촉매적으로 비활성인 인간 및 쥐과 MASP-2A 단백질을 생성하기 위하여, 표 5에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 사용하여 부위-특정 돌연변이생성을 수행하였다.

표 5의 올리고뉴클레오티드들은 효소적으로 활성인 세린 및 세린 코돈을 알라닌 코돈으로 바꾸기 위한 미스매치를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 코드화하는 인간 및 쥐과 cDNA의 영역을 아닐링하기 위해 디자인하였다. 예를 들어, PCR 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO:56 내지 59를 인간 MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:4)와 함께 사용하여 출발 코돈으로부터 효소적으로 활성인 세린까지의 영역과 세린으로부터 중지 코돈까지의 영역을 증폭시켜서 Ser618 내지 Ala618 돌연변이를 함유하는 돌연변이된 MASP-2A의 완전한 오픈 리딩 프레임을 생성하였다. PCR 생성물을 아가로오스 겔 전기영동 및 밴드 제조 후에 정제하고 단일 아데노신 중복은 표준 테일링 과정을 사용하여 생성하였다. 그런 다음 아데노신 꼬리의 MASP-2A를 pGEM-T 이지 벡터 (easy vector)에 클론하고, 대장균에 형질전환하였다.

촉매적으로 비활성인 래트 MASP-2A 단백질을, SEQ ID NO:64와 SEQ ID NO:65를 이들 2개의 올리고뉴클레오티드를 등몰량으로 조합하고, 100℃에서 2분 동안 가열한 후 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 키나제 처리 및 아닐링함으로써 생성하였다. 그 결과의 아닐링된 단편은 Pst1 및 Xba1 양립성 단부를 가졌고, 야생형 래트 MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:53)의 Pst1-Xba1 단편 대신 삽입하여 래트 MASP-2A를 생성하였다.

5 'GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3' (SEQ ID NO:64)

5' CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA 3' (SEQ ID NO:65)

인간, 쥐과 및 래트 MASP-2A를 각각 추가로 하기 기술하는 것과 같이 포유류 발현 벡터 pED 또는 pCI-Neo 중 어느 하나에 하위클론하고 차이니즈 햄스터 난소 셀라인 DXB1에 트랜스펙션하였다.

다른 접근법으로, MASP-2의 촉매적으로 비활성 형태를 문헌에 기술된 방법을 사용하여 구성한다 (Chen　et　al., J. Biol. Chem., 276(28):25894-25902, 2001). 간단히 설명하면, 전-길이 인간 MASP-2 cDNA (Thiel　et　al., Nature 386:506, 1997)를 함유하고 있는 플라스미드를 Xho1 및 EcoR1으로 소화시키고 MASP-2 cDNA (본원에서 SEQ ID NO:4)를 pFastBac1 배큘로바이러스 전달 벡터 (Life Technologies, NY)의 상응하는 제한 부위에 클로닝한다. 그런 다음 Ser618에 있는 MASP-2 세린 프로테아제 활성 부위를, 펩티드 영역 아미노산 610 내지 625 (SEQ　ID NO:13)를 코드화하는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 천연 영역 아미노산 610 내지 625로 치환시킴으로써 Ala618로 변경하여 비활성 프로테아제 도메인을 가지는 MASP-2 전길이 폴리펩티드를 생성한다. 인간 MASP-2로부터 유도된 폴리펩티드 영역을 함유하는 발현 플라스미드의 구성.

다음의 구성물들을 MASP-2의 다양한 도메인들을 분비하기 위해 MASP-2 신호 펩티드 (SEQ ID NO:5의 잔기 1 내지 15)를 사용하여 제조한다. 인간 MASP-2 CUBI 도메인 (SEQ ID NO:8)을 발현하는 구성물을 MASP-2 (SEQ ID NO:6)의 잔기 1 내지 121 (N-말단 CUB1 도메인에 상응함)을 코드화하는 영역을 PCR 증폭시킴으로써 만든다. 인간 MASP-2 CUBIEGF 도메인 (SEQ ID NO:9)을 발현하는 구성물을 MASP-2 (SEQ ID NO:6)의 잔기 1 내지 166 (N-말단 CUB1EGF 도메인에 상응함)을 코드화하는 영역을 PCR 증폭시킴으로써 만든다. 인간 MASP-2 CUBIEGFCUBII 도메인 (SEQ ID NO:10)을 발현하는 구성물을 MASP-2 (SEQ ID NO:6)의 잔기 1 내지 293 (N-말단 CUBIEGFCUBII 도메인에 상응함)을 코드화하는 영역을 PCR 증폭시킴으로써 만든다. 상기 언급된 도메인들을 Vent_R 중합효소 및 주형으로서 pBS-MASP-2를 사용하여 PCR에 의해, 수립된 PCR 방법을 따라 증폭시킨다. 센스 프라이머 (5'-CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' SEQ ID NO:34)의 5' 프라이머 서열은 PCR 생성물의 5' 단부에 BamHI 제한 분위 (밑줄)를 도입시킨다. 하기 표 5에 나타낸, 각각의 MASP-2 도메인에 대한 안티센스 프라이머들은 각 PCR 생성물의 단부에 중지 코돈 (굵은 글씨)과 이어서 EcoRI 부위 (밑줄)를 도입시키기 위해 디자인된다. 일단 증폭되면, DNA 단편들은 BamHI 및 EcoRI로 소화되고 pFastBac1 벡터의 상응하는 부위들에 클로닝된다. 그 결과의 구성물을 제한 지도화에 의해 특성확인하고 dsDNA 서열화에 의해 확인한다.

MASP-2 PCR 프라이머들

MASP-2 도메인	5' PCR 프라이머	3' PCR 프라이머
SEQ ID NO:8 CUBI (SEQ ID NO:6의 aa 1 내지 121 )	5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (SEQ ID NO:34)	5'GGAATTCCTAGGCTGCATA (SEQ ID NO:35)
SEQ ID NO:9 CUBIEGF (SEQ ID NO:6의 aa 1 내지 166)	5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (SEQ ID NO:34)	5'GGAATTCCTACAGGGCGCT-3' (SEQ ID NO:36)
SEQ ID NO:10 CUBIEGFCUBII (SEQ ID NO:6의 aa 1 내지 293)	5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (SEQ ID NO:34)	5'GGAATTCCTAGTAGTGGAT 3' (SEQ ID NO:37)
SEQ ID NO:4 인간 MASP-2	5'ATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTC 3' (SEQ ID NO: 56) hMASP-2_전방	5'TTAAAATCACTAATTATGTTCTCGATC 3' (SEQ ID NO: 59) hMASP-2_역
SEQ ID NO:4 인간 MASP-2 cDNA	5'CAGAGGTGACGCAGGAGGGGCAC 3' (SEQ ID NO: 58) hMASP-2_ala_전방	5'GTGCCCCTCCTGCGTCACCTCTG 3' (SEQ ID NO: 57) hMASP-2_ala_역
SEQ ID NO:50 쥐과 MASP-2 cDNA	5'ATGAGGCTACTCATCTTCCTGG3' (SEQ ID NO: 60) mMASP-2_전방	5'TTAGAAATTACTTATTATGTTCTCAATCC3' (SEQ ID NO: 63) mMASP-2_역
SEQ ID NO:50 쥐과 MASP-2 cDNA	5'CCCCCCCTGCGTCACCTCTGCAG3' (SEQ ID NO: 62) mMASP-2_ala_전방	5'CTGCAGAGGTGACGCAGGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 61) mMASP-2_ala_역

MASP-2의 재조합 진핵세포 발현 및 효소적으로 비활성인 마우사, 래트 및 인간 MASP-2A의 단백질 제조

상기 기술된 MASP-2 및 MASP-2A 발현 구성물을 표준 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 과정 (Maniatis　et　al., 1989)을 사용하여 DXB1 세포에 트랜스펙션하였다. MASP-2A를 혈청-유리 배지에서 제조하여 제제가 다른 혈청 단백질로 오염되지 않은 것을 보장하였다. 배지를 집밀 세포로부터 2일마다 수확하였다 (총 4회). 재조합 MASP-2A의 수준은 3가지 종의 각각에 대해 배양 배지 리터당 평균 대략 1.5 mg이었다.

MASP-2A 단백질 정제: MASP-2A (상기 기술된 Ser-Ala 돌연변이)를 MBP-A-아가로오스 칼럼 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이 전략은 외부의 태그를 사용하지 않으면서 신속한 정제를 가능하게 하였다. MASP-2A (동일부피의 로딩 완충액 (150　mM NaCl 및 25　mM CaCl₂를 함유하고 있는 50　mM Tris-Cl, pH　7.5)으로 희석된 배지 100 내지 200 ml)를 10 ml의 로딩 완충액으로 사전-평형화한 MBP-아가로오스 친화성 칼럼 (4 ml)위에 로딩하였다. 그것을 추가로 10 ml의 로딩 완충액으로 세척한 후에, 단백질을 1.25 M NaCl 및 10 mM EDTA를 함유하고 있는 50　mM Tris-Cl, pH　7.5로 1 ml씩의 분획으로 용출하였다. MASP-2A를 함유하고 았는 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인하였다. 필요에 따라 MASP-2A를 추가로 MonoQ 칼럼 (HR　5/5) 상에서의 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 단백질을 50 mM NaCl을 함유하고 있는 50　mM Tris-Cl pH　7.5로 투석하고, 동일한 완충액으로 평형화한 칼럼위에 로딩하였다. 세척한 후 결합된 MASP-2A를 10 ml에 대해 0.05 내지 1 M NaCl 구배로 용출하였다.

결과: MASP-2A의 0.25 내지 0.5 mg의 수율을 200 ml의 배지로부터 얻었다. MALDI-MS에 의해 측정된 77.5 kDa의 분자량은 미변형 폴리펩티드의 계산된 값 (73.5　kDa)보다 글리코실화로 인해 더 크다. N-글리코실화 부위들에서의 글리칸의 부착은 관찰된 질량을 설명해준다. MASP-2A는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 단일 밴드로서 이동하며, 그것은 생합성 중에 단백질 가수분해적으로 처리되지 않은 것을 증명한다. 평형 초원심분리에 의해 측정된 중량-평균 분자량은 글리코실화된 폴리펩티드의 단일이량체에 대한 계산치와 일치한다.

재조합 인간 MASP-2 폴리펩티드의 제조

재조합 MASP-2 및 MASP2A 유도된 폴리펩티드의 다른 제조 방법은 문헌에 기술된다 (Thielens, N.M.,　et　al., J. Immunol. 166:5068-5077, 2001). 간단히 설명하면, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 곤충 세포 (Novagen, Madison, WI로부터 얻어진 Ready-Plaque Sf9 세포)를 50 IU/ml의 페니실린 및 50 mg/ml의 스트렙토마이신 (Life Technologies)이 첨가된 Sf900II 혈청-유리 배지 (Life Technologies)에서 성장시키고 유지시켰다. 트리코플루시아 니 (Trichoplusia ni) (High Five) 곤충 세포 (Jadwiga Chroboczek, Institut de Biologie Structurale, Grenoble, France 제공)를 50 IU/ml의 페니실린 및 50 mg/ml의 스트렙토마이신이 첨가된 10% FCS (Dominique Dutscher, Brumath, France)를 함유하고 있는 TC100 배지 (Life Technologies)에서 유지시켰다. 재조합 배큘로바이러스를 Bac-대-Bac 시스템 (Xife　Technologies)을 사용하여 생성하였다. 백미드 DNA를 Qiagen 미니프렙 정제 시스템 (Qiagen)을 사용하여 정제하고 Sf900　II SFM 배지 (Life Technologies)에서 제조업체의 프로토콜에 기술된 대로 셀펙틴을 사용하여 Sf9 곤충 세포를 트랜스펙션하기 위해 사용한다. 재조합 바이러스 입자를 4일 후에 수집하고, 바이러스 플라크 분석에 의해 적정한 후 문헌에 기술된 대로 증폭시킨다 (King and Possee, in The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., London, pp.　111-114, 1992).

하이파이브 세포 (1.75　x　10⁷ 세포/175-cm² 조직 배양 플라스크)를 MASP-2 폴리펩티드를 함유하고 있는 재조합 바이러스로 Sf900 II SFM 배지 중에 2의 감염 다중도로 28℃에서 96시간 동안 감염시킨다. 상층액을 원심분리에 의해 수집하고 다이아이소프로필 포스포로플루오리데이트를 1 mM의 최종 농도로 첨가한다.

MASP-2 폴리펩티드는 배양 배지에서 분비된다. 배양 상층액을 50　mM NaCl, 1　mM CaCl₂, 50　mM 트라이에탄올아민 염산염, pH　8.1에 대해 투석하고, 동일한 완충액으로 평형화한 Q-세파로오스 패스트 플로우 칼럼 (Amersham Pharmacia Biotech) (2.8　x　12 cm) 상에 1.5 ml/분으로 로딩한다. 용출은 동일한 완충액 중의 350 mM NaCl까지의 1.2 리터의 선형 구배를 적용함으로써 수행한다. 재조합 MASP-2 폴리펩티드를 함유하고 있는 분획을 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하고, (NH₄)₂SO₄를 60% (w/v)까지 첨가함으로써 침전을 형성시키고 밤새 4℃에 놓아둔다. 펠릿을 145　mM NaCl, 1　mM CaCl₂, 50　mM 트라이에탄올아민 염산염, pH　7.4 중에 재현탁하고, 동일한 완충액으로 평형화한 TSK G3000 SWG 칼럼 (7.5　x　600　mm) (Tosohaas, Montgomeryville, PA) 상에 적용하였다. 그런 다음 정제된 폴리펩티드를 Microsep 미세농축기 (m.w. 컷-오프　=　10,000) (Filtron, Karlstein, Germany) 상에서 한외여과에 의해 0.3　mg/ml로 농축한다.

실시예 4

이 실시예는 MASP-2 폴리펩티드에 대한 다클론성 항체의 제조방법을 설명한다.

재료 및 방법:

MASP-2 항원: 다클론성 항-인간 MASP-2 항혈청을 다음의 분리된 MASP-2 폴리펩티드로 토끼를 면역시킴으로써 제조한다: 혈청으로부터 분리한 인간 MASP-2 (SEQ ID NO:6); 재조합 인간 MASP-2 (SEQ ID NO:6), 실시예 3에 기술된 무상 프로테아제 도메인을 함유하고 있는 MASP-2A (SEQ ID NO:13); 및 실시예 3에 기술된 것과 같이 발현된 재조합 CUBI (SEQ ID NO:8), CUBEGFI (SEQ ID NO:9) 및 CUBEGFCUBII (SEQ ID NO:10).

다클론성 항체: 생후 6주된 토끼들을 멸균 염수 용액 중에 100 μg/ml의 MASP-2 폴리펩티드의 100 μg을 주사함으로써 면역시킨다. 주사는 4주마다 시행하고, 실시예 5에 기술한 ELISA 분석에 의해 항체 역가를 모니터링한다. 배양 상층액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의한 항체 정제를 위해 수집한다.

실시예 5

이 실시예는 토끼 또는 인간 MASP-2 폴리펩티드에 대한 쥐과 단클론성 항체의 제조 방법을 설명한다.

재료 및 방법:

8 내지 12주령의 수컷 A/J 마우스 (Harlan, Houston, Tex.)에 200 μl의 포스페이트 완충된 염수 (PBS) pH 7.4 중의 완전 프로인트 보조제 (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) 중의 100 μg의 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩티드 (실시예 3에서 기술한 것과 같이 제조됨)로 피하 주사한다. 2주 간격으로 마우스를 불완전 프로인트 보조제 중의 50 μg의 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩티드로 2회 피하 주사한다. 4주째에 마우스들에게 PBS 중의 50 μg의 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩티드로 주사하고 4일 후에 융합시킨다.

각각의 융합에 대해, 단일 세포 현탁액을 면역된 마우스로부터의 비장으로부터 제조하여 Sp2/O 골수종 세포와의 융합에 사용한다. 5x10⁸의 Sp2/0 및 5x10⁸의 비장 세포를 50%의 폴리에틸렌 글리콜 (M.W.　1450) (Kodak, Rochester, N.Y.) 및 5%의 다이메틸설폭사이드 (Sigma Chemical Co., St.　Louis, Mo.)를 함유하고 있는 배지에서 융합시킨다. 그런 다음 세포들을 10%의 우태아 혈청, 100 유닛/ml의 페니실린, 100 μg/ml의 스트렙토마이신, 0.1 mM 히포크산틴, 0.4 μM 아미노프테린 및 16 μM 티미딘이 첨가된 이스코브 배지 (Gibco, Grand Island, N.Y.) 중의 200 μl의 현탁액 당 1.5x10⁵ 비장 세포의 농도로 조정한다. 200 μl의 세포 현탁액을 약 20개의 96-웰 미소배양 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 약 10일 후에 배양 상층액을 취하여 ELISA 분석으로 정제된 인자 MASP-2와의 반응성에 대해 스크리닝한다.

ELISA 분석: Immulon　2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) 미세시험 플레이트의 웰들을 50 μl의 정제된 hMASP-2 또는 래트 rMASP-2 (또는 rMASP-2A)를 50　ng/ml로 밤새 실온에서 첨가함으로써 코팅한다. 코팅에 대한 저농도의 MASP-2는 고친화성 항체들의 선택을 가능하게 한다. 플레이트를 가볍게 두드림으로써 코팅 용액을 제거한 후, 200 μl의 PBS 중의 BLOTTO (탈지 분유)를 각 웰에 1시간 동안 첨가하여 비-특이적 부위들을 차단한다. 1시간 후에, 웰들을 완충액 PBST (0.05% 트윈 20을 함유한 PBS)로 세척한다. 각 융합 웰로부터의 50 마이크로리터의 배양 상층액을 수집하고 50 μl의 BLOTTO와 혼합한 후 미세시험 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 1시간 동안 인큐베이션한 후, 웰을 PBST로 세척한다. 그런 다음 결합된 쥐과 항체를 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 포합된 염소 항-마우스 IgG (Fc 특이적) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.)와의 반응에 의해 검출하고, BLOTTO에 1:2,000으로 희석한다. 0.1% 3,3,5,5 테트라메틸 벤지딘 (Sigma, St.　Louis, Mo.) 및 0.0003% 과산화 수소 (Sigma)를 함유하고 있는 퍼옥시다제 기질 용액을 발색을 위해 30분 동안 웰에 첨가한다. 웰당 50 μl의 2M H₂SO₄를 첨가함으로써 반응을 종결한다. 반응 혼합눌의 450 nm에서의 광학 밀도를 BioTek ELISA 판독기 (BioTek Instruments, Winooski, Vt.)로 판독한다.

MASP-2 결합 분석:

상기에서 기술된 MASP-2 ELISA 분석에서 포지티브로 시험된 배양 상층액을 MASP-2에 대한 MASP-2 억제제에 대한 결합 친화성을 측정하기 위해 결합 분석에서 시험할 수 있다. 유사한 분석을 또한 사용하여 억제제가 보체 시스템의 다른 항원들에 결합하는 지의 여부를 측정한다.

폴리스티렌 미소역가 플레이트 웰 (96-웰 배지 결합 플레이트, Corning Costar, Cambridge, MA)을 포스페이트-완충된 염수 (PBS) pH 7.4에서 MASP-2 (20　ng/100　μl/웰, Advanced Research Technology, San Diego, CA)로 밤새 4℃에서 코팅한다. MASP-2 용액을 흡인한 후 웰을 1% 우혈청 알부민 (BSA; Sigma Chemical)을 함유하고 있는 PBS로 2시간 동안 실온에서 차단한다. 차단 용액 중의 다른 농도에서의 하이브리도마 상층액 또는 정제된 항-MASP-2 MoAb의 부분표본들을 웰에 첨가한다. 2시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 웰을 PBS로 집중적으로 세정한다. MASP-2-결합된 항-MASP-2 MoAb를 차단 용액 중의 퍼옥시다제-포합된 염소 항-마우스 IgG (Sigma Chemical)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 검출한다. 플레이트를 다시 PBS로 철저하게 세정하고, 100 μl의 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB) 기질 (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)을 첨가한다. TMB의 반응을 100 μl의 1 M 인산의 첨가에 의해 퀀칭하고, 플레이트를 미소플레이트 판독기 (SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 450 nm에서 판독한다.

그런 다음 포지티브 웰로부터의 배양 상층액을 실시예 2에서 기술된 C4 절단 분석과 같은 기능성 분석으로 보체 활성화를 억제하는 능력에 대해 시험한다. 그런 다음 포지티브 웰의 세포들을 제한 희석에 의해 클로닝한다. MoAb를 다시 상기에서 기술된 ELISA 분석에서 hMASP-2와의 반응성에 대해 시험한다. 선택한 하이브리도마를 교반 플라스크에서 성장시키고 사용한 배양 상층액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의한 항체 정제를 위해 수집한다.

실시예 6

이 실시예는 인간화된 쥐과 항-MASP-2 항체 및 항체 단편들의 생성 및 제조를 설명한다.

쥐과 항-MASP-2 단클론성 항체를 실시예 5에서 기술한 것과 같이 수컷 A/J 마우스에서 생성한다. 그런 다음 쥐과 항체를 하기에서 기술된 것과 같이 인간화시켜서 쥐과 불변 영역을 그것들의 인간 대응물로 대체시켜서 항체의 키메라 IgG 및 Fab 단편을 생성시킴으로써 그것의 면역원성을 감소시키고, 그것은 본 발명에 따라 인간 대상에 MASP-2-의존성 보체 활성화의 부작용을 억제하는 데 유용하다.

1. 쥐과 하이브리도마 세포로부터 항-MASP-2 가변 영역 유전자의 클로닝. 총 RNA를 항-MASP-2 MoAb (실시예 7에서 기술되는 대로 얻어짐)를 분비하는 하이브리도마 세포로부터 제조업체 (Biotech, Houston, Tex.)의 프로토콜을 따라 RNAzol을 사용하여 분리한다. 첫 번째 가닥 cDNA를 프라이머로서 올리고 dT를 사용하여 총 RNA로부터 합성한다. 면역글로불린 불변 C 영역-유도된 3' 프라이머와 5' 프라이머로서 쥐과 V_H 또는 V_K 유전자들의 리더 펩티드 또는 첫 번째 프레임워크 영역으로부터 유도된 축퇴성 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 사용한다. 고정된 PCR을 Chen과 Platsucas에 의해 기술된 것과 같이 수행한다 (Chen, P.F., Scand. J. Immunol. 35:539-549, 1992). V_K 유전자의 클로닝을 위해, 이중-가닥 cDNA를 Not1-MAK1 프라이머 (5'-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3' SEQ ID NO:38)를 사용하여 제조한다. 아닐링된 어댑터 AD1 (5'-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3' SEQ ID NO:39) 및 AD2 (5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3' SEQ ID NO:40)를 이중-가닥 cDNA의 5' 및 3' 말단 둘 다에 결찰한다. 3' 단부에서 어댑터를 Not1 소화에 의해 제거한다. 그런 다음 소화 생성물을 5' 프라이머로서 AD1 올리고뉴클레오티드와 3' 프라이머로서 MAK2 (5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3' SEQ ID NO:41)를 사용하는 PCR에서 주형으로서 사용한다. 대략 500 bp의 DNA 단편들을 pUC19에 클로닝한다. 여러 개의 클론을 서열 분석에 대해 선택하여 클론된 서열이 예상된 쥐과 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 것을 증명한다. Not1-MAK1 및 MAK2 올리고뉴클레오티드를 V_K 영역으로부터 유도하는데, 그것들은 각각 C 카파 유전자의 첫 번째 염기쌍으로부터 하류 쪽으로 182 및 84 bp 거리에 있다. 완전한 V_K 및 리더 펩티드를 포함하는 클론들을 선택한다.

V_H 유전자를 클로닝하기 위하여, 이중-가닥 cDNA를 Not1 MAG1 프라이머 (5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3' SEQ ID NO:42)를 사용하여 제조한다. 아닐링된 어댑터 AD1 및 AD2를 이중-가닥 cDNA의 5' 및 3' 단부 둘 다에 결찰시킨다. 3' 단부의 어댑터를 Not1 소화에 의해 제거한다. 소화 생성물을 프라이머들로서 AD1 올리고뉴클레오티드와 MAG2 (5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3' SEQ ID NO:43)를 사용하는 PCR에서 주형으로서 사용한다. 길이가 500 내지 600 bp인 DNA 단편들을 pUC19에 클로닝한다. Not1-MAG1 및 MAG2 올리고뉴클레오티드를 쥐과 영역으로부터 유도하는데, 그것들은 각각 쥐과 Cγ.7.1 유전자의 첫 번째 bp에서 하류로 180 및 93bp에 있다. 완전한 V_H 및 리더 펩티드를 포함하는 클론들을 선택한다.

2. 키메라 MASP-2 IgG 및 Fab에 대한 발현 벡터의 구성. 상기에서 기술된 클론된 V_H 및 V_K 유전자들을 PCR 반응에서 주형으로서 사용하여 뉴클레오티드 서열의 5' 단부에 Kozak 일치 서열을 첨가하고 3' 단부에 스플라이싱 도너 (donor)를 첨가한다. 서열을 분석하여 PCR 에러의 부재를 확인한 후, 유전자를 각각 인간 C.γ1 및 C. 카파를 함유하고 있는 발현 벡터 카세트에 삽입하여 pSV2neoV_H-huCγ1 pSV2neoV-huCγ를 얻는다. 중쇄 및 경쇄 벡터의 CsCl 구배-정제된 플라스미드 DNA를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 COS 세포를 트랜스펙션한다. 48시간 후에, 배양 상층액을 ELISA에 의해 시험하여 대략 200 ng/ml의 키메라 IgG의 존재를 확인한다. 세포를 수확하고 총 RNA를 제조한다. 첫 번째 가닥 cDNA를 총 RNA로부터 프라이머로서 올리고 dT를 사용하여 합성한다. 이 cDNA를 PCR에서 주형으로서 사용하여 Fd 및 카파 DNA 단편을 생성한다. Fd 유전자에 대해서, PCR을 5' 프라이머로서 5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3' (SEQ ID NO:44) 및 CH1-유도된 3' 프라이머 (5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3' SEQ ID NO:45)를 사용하여 수행한다. DNA 서열을 인간 IgG1의 완전한 V_H 및 CH1 도메인을 함유하는 것으로 확인한다. 적절한 효소로의 소화 후에, Fd 단편을 발현 벡터 카세트 pSV2dhfr-TUS의 HindIII 및 BamHI 제한 부위에 삽입하여 pSV2dhfrFd를 얻는다. pSV2 플라스미드는 상업적으로 입수가능하고 다양한 공급원으로부터의 DNA 절편으로 구성된다: pBR322 DNA (가는 선)는 pBR322 DNA 복제 기원 (pBR ori) 및 락타마제 암피실린 내성 유전자 (Amp)를 함유하고; 넓은 간격으로 사선무늬와 마크로 표시되는 SV40 DNA는 SV40 DNA 복제 기원 (SV40 ori), 초기 프로모터 (dhfr 및 네오 유전자에 대해 5') 및 폴리아데닐화 신호 (dhfr 및 네오 유전자에 대해 3')를 함유한다. SV40-유도된 폴리아데닐화 신호 (pA) 또한 Fd 유전자의 3' 단부에 위치한다.

카파 유전자에 대해서, PCR은 5' 프라이머로서 5'- AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3' (SEQ ID NO:46) 및 C_K-유도된 3' 프라이머 (5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3' SEQ ID NO:47)를 사용하여 수행한다. DNA 서열을 완전한 V_K 및 인간 C_K 영역을 함유하는 것으로 확인한다. 적절한 제한 효소로의 소화 후에, 카파 DNA 단편을 발현 벡터 카세트 pSV2neo-TUS의 HindIII 및 BamHI 제한 부위에 삽입하여 pSV2neoK를 얻는다. Fd 및 .카파 유전자 둘 다의 발현을 HCMV-유도된 인핸서 및 프로모터 요소들에 의해 이끌어낸다. Fd 유전자는 사슬간 이황화 결합에 포함된 시스테인 아미노산 잔기를 포함하지 않기 때문에, 이 재조합 키메라 Fab는 비-공유적으로 연결된 중쇄 및 경쇄를 함유한다. 이 키메라 Fab는 cFab로서 표시된다.

중쇄 및 경쇄 사이의 이황화 결합을 가지는 재조합 Fab를 얻기 위하여, 상기 Fd 유전자를 인간 IgG1의 힌지 영역으로부터 추가의 9개의 아미노산 (EPKSCDKTH SEQ ID NO:48)에 대한 코딩 서열을 포함하기 위해 연장시킬 수 있다. Fd 유전자의 3' 단부에서 30개의 아미노산을 코드화하는 BstEII-BamHI DNA 절편을 연장된 Fd를 코드화하는 DNA 절편으로 대체할 수 있어서, pSV2dhfrFd/9aa를 얻는다.

3. 키메라 항-MASP-2 IgG의 발현 및 정제

키메라 항-MASP-2 IgG를 분비하는 셀라인을 생성하기 위하여, NSO 세포를 pSV2neoV_H-huC.γ1 및 pSV2neoV-huC 카파의 정제된 플라스미드 DNA로 일렉트로포레이션에 의해 트랜스펙션한다. 트랜스펙션된 세포를 0.7　mg/ml G418의 존재하에 선택한다. 세포를 혈청-함유 배지를 사용하여 250 ml의 교반 플라스크에서 성장시킨다.

100 ml의 교반 배양의 배양 상층액을 10-ml의 PROSEP-A 칼럼 (Bioprocessing, Inc., Princeton, N.J.) 상에 로딩한다. 결합된 항체를 50 mM 시트레이트 완충액, pH 3.0으로 용출한다. 동일한 부피의 1　M Hepes, pH　8.0을 정제된 항체를 함유하고 있는 분획에 첨가하여 pH를 7.0으로 조정한다. 잔류하는 염을 Millipore 막 한외여과 (M.W. 컷-오프: 3,000)에 의해 완충액을 PBS로 교환함으로써 제거한다. 정제된 항체의 단백질 농도를 BCA 방법 (Pierce)에 의하여 측정한다.

4. 키메라 항-MASP-2 Fab의 발현 및 정제

키메라 항-MASP-2 Fab를 분비하는 셀라인을 생성하기 위하여, CHO 세포를 pSV2dhfrFd (or pSV2dhfrFd/9aa) 및 pSV2neokappa의 정제된 플라스미드 DNA로, 일렉트로포레이션에 의해 트랜스펙션된다. 트랜스펙션된 세포를 G418 및 메토트렉세이트의 존재하에 선택한다. 선택된 셀라인은 증가하는 농도의 메토트렉세이트에서 증폭된다. 세포를 제한 희석에 의해 단일-세포 하위클론한다. 그런 다음 고-생산 단일-세포 하위클론된 셀라인을 혈청-유리 배지를 사용하여 100 ml의 교반 배양에서 성장시킨다.

키메라 항-MASP-2 Fab를 MASP-2 MoAb에 대한 마우스 항-이디오타입 MoAb를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제한다. 항-이디오타입 MoAb는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)과 포합된 쥐과 항-MASP-2 MoAb로 마우스를 감작시키고 인간 MASP-2와 경합할 수 있는 특이적 MoAb 결합에 대해 스크리닝함으로써 만들어질 수 있다. 정제를 위해, cFab 또는 cFab/9aa를 생성하는 CHO 세포의 교반 배양으로부터의 100 ml의 상층액을 항-이디오타입 MoAb와 커플링된 친화성 칼럼 위에 로딩한다. 그런 다음 칼럼을 PBS로 철저하게 세척한 후 결합된 Fab를 50 mM 다이에틸아민, pH 11.5로 용출한다. 잔류하는 염을 상기에서기술한 대로 완충액 교환에 의하여 제거한다. 정제된 Fab의 단백질 농도를 BCA 방법 (Pierce)에 의해 측정한다.

MASP-2-의존성 보체 경로를 억제하는 키메라 MASP-2 IgG, cFab 및 cFAb/9aa의 능력을 실시예 2 또는 실시예 7에 기술된 억제 분석을 사용하여 측정할 수 있다.

실시예 7

이 실시예는 L-피콜린/P35, H-피콜린, M-피콜린 또는 만난을 통해 MASP-2-의존성 보체 활성화를 차단할 수 있는 MASP-2 억제제를 확인하기 위한 기능성 스크린으로서 사용된 시험관 내 C4 절단 분석을 설명한다.

C4 절단 분석: C4 절단 분석은 문헌에 기술되어 있는데 ( Petersen, S.V.,　et　al., J.　Immunol. Methods 257:107, 2001), 그것은 L-피콜린에 결합하는 녹농균으로부터의 리포테이코산 (LTA)으로부터 유발되는 렉틴 경로 활성화를 측정한다.

시약: 포르말린-고정된 녹농균 (DSM20233)을 다음과 같이 제조한다: 박테리아를 밤새 37℃에서 트립신 작용성 소이 (soy) 혈액 배지에서 성장시키고, PBS로 3회 세척한 후 1시간 동안 실온에서 PBS/0.5% 포르말린에 고정시키고, 추가로 PBS로 3회 세척한 후 코팅 완충액 (15　mM Na₂Co₃, 35　mM NaHCO₃, pH　9.6)에 재현탁한다.

분석: Nunc MaxiSorb 미소역가 플레이트 (Nalgene Nunc International, Rochester, NY)의 웰들을 100 μl의 포르말린-고정된 녹농균 DSM20233 (OD₅₅₀　=　0.5)으로 코팅 완충액 중의 1 ug의 L-피콜린으로 포함하는 코팅 완충액중에서 코팅한다. 밤새 인큐베이션한 후에 웰을 TBS (10　mM Tris-HCl, 140　mM NaCl, pH　7.4) 중의 1%의 인간 혈청 알부민 (HSA)으로 차단한 후, 0.05% Tween　20 및 5　mM CaCl₂를 함유하고 있는 TBS (세척 완충액)로 세척한다. 인간 혈청 샘플을 내인성 C4의 활성화를 방지하고 C1 복합체 (C1q, C1r 및 C1s로 구성됨)를 분해하는 20 mM Tris-HCl, 1　M NaCl, 10　mM CaCl₂, 0.05% Triton X-100, 0.1% HSA, pH　7.4에 희석한다. 항-MASP-2 MoAbs 및 억제 펩티드를 포함하여 MASP-2 억제제를 다양한 농도로 혈청 샘플에 첨가한다. 희석된 샘플을 플레이트에 첨가하고 밤새 4℃에서 인큐베이션한다. 24시간 후, 플레이트는 세척 완충액으로 철저하게 세척한 후, 100 μl의 4　mM 바르비탈, 145　mM NaCl, 2　mM CaCl₂, 1　mM MgCl₂, pH　7.4 중의 0.1 μg의 정제된 인간 C4 (Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223:46, 1993에 기술되어있는 대로 얻어짐)를 각 웰에 첨가한다. 37℃에서 1.5시간 후에, 플레이트를 다시 세척하고 C4b 침착을 알칼리 포스파타제-포합된 닭 항-인간 C4c (Immunsystem, Uppsala, Sweden으로부터 얻어짐)를 사용하여 검출하고 비색 기질 ρ-니트로페닐 포스페이트를 사용하여 측정한다.

만난 상의 C4 분석: 상기 기술된 분석을, 플레이트를 LSP 및 만난으로 코팅한 후 다양한 MASP-2 억제제와 혼합된 혈청을 첨가함으로써 MBL을 통해 렉틴 경로 활성화를 측정하기 위해 조정한다.

H-피콜린 (Hakata Ag) 상에서의 C4 분석: 상기 기술된 분석을, 플레이트를 LSP 및 H-피콜린으로 코팅한 후 다양한 MASP-2 억제제와 혼합된 혈청을 첨가함으로써 MBL을 통해 렉틴 경로 활성화를 측정하기 위해 조정한다.

실시예 8

다음의 분석은 야생형 및 MASP-2-/- 마우스에서 고전적 경로 활성화의 존재를 측정한다.

방법: 면역 복합체를 미소역가 플레이트 (Maxisorb, Nunc, cat. No.　442404, Fisher Scientific)를 10 mM Tris, 140　mM NaCl, pH　7.4 중의 0.1% 인간 혈청 알부민으로 1시간 동안 실온에서 코팅한 후 밤새 4℃에서 TBS/tween/Ca²⁺ 중에 1:1000으로 희석된 양 항 전혈청 항혈청 (Scottish Antibody Production Unit, Carluke, Scotland)과 함께 인큐베이션함으로써 제자리 생성하였다. 혈청 샘플을 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어서 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 야생형 및 MASP-2-/- 혈청 샘플로부터 C1q가 고갈되어 있는 대조 샘플을 제조하였다. C1q-고갈된 마우스 혈청을 토끼 항-인간 C1q IgG (Dako, Glostrup, Denmark)로 코팅된 단백질-A-커플링된 Dynabeads (Dynal Biotech, Oslo, Norway)를 사용하여 공급자의 지시를 따라 제조하였다. 플레이트를 90분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 결합된 C3b를 TBS/tw/ Ca⁺⁺에 1:1000으로 희석된 다클론성 항-인간-C3c 항체 (Dako A 062)로 검출하였다. 이차 항체는 염소 항-토끼 IgG이다.

결과: 도 7은 야생형 혈청, MASP-2-/- 혈청, C1q-고갈된 야생형 및 C1q-고갈된 MASP-2-/- 혈청에서 IgG로 코팅된 플레이트 상에서의 상대적인 C3b 침착 수준을 나타낸다. 이들 결과는 고전적 경로가 MASP-2-/- 마우스 계통에서 무상인 것을 증명한다.

실시예 9

다음의 분석은 MASP-2 억제제가 고전적 경로가 면역 복합체에 의해 개시되는 조건 하에서 MASP-2 억제제의 효과를 분석함으로써 고전적 경로를 차단하는지의 여부를 시험하기 위해 사용한다.

방법: 고전적 경로가 면역 복합체에 의해 개시되는 보체 활성화의 조건에 미치는 MASP-2 억제제의 효과를 시험하기 위하여, 90% NHS를 함유하고 있는 50 μl의 샘플을 3중으로 37℃에서 10 μg/ml의 면역 복합체 (IC) 또는 PBS의 존재하에 인큐베이션하고, 동시에 37℃ 인큐베이션 중에 200 nM의 항-프로퍼딘 단클론성 항체를 함유하는 삼중 샘플 (+/- IC)을 시험에 포함시킨다. 37℃에서 2시간 인큐베이션 후에, 13 mM EDTA를 모든 샘플에 첨가하여 추가의 보체 활성화를 중단하고 샘플을 5℃로 즉시 냉각시킨다. 그런 다음 샘플을 -70℃에서 보관한 후 ELISA 키트 (Quidel, Catalog Nos. A015 및 A009)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 보체 활성화 생성물 (C3a 및 sC5b-9)에 대해 분석한다.

실시예 10

이 실시예는 MASP-2 활성을 차단하는 고친화성 항-MASP-2 Fab2 항체 단편의 확인을 설명한다.

배경 및 근거: MASP-2는 MBL 및 피콜린에 대한 결합 부위(들), 세린 프로테아제 촉매 부위, 단백질 가수분해 기질 C2에 대한 결합 부위, 단백질 가수분해 기질 C4에 대한 결합 부위, MASP-2 자이모겐의 자체활성화에 대한 MASP-2 절단 부위 및 두 개의 Ca⁺⁺ 결합 부위를 포함하여 많은 별도의 기능성 도메인을 가지는 복합 단백질이다. Fab2 항체 단편을 MASP-2에 고친화성으로 결합하는 것을 확인하였고, 확인된 Fab2 단편을 MASP-2 기능적 활성을 차단할 수 있는 지를 측정하기 위하여 기능성 분석으로 시험하였다.

MASP-2 기능적 활성을 차단하기 위하여, 항체 또는 Fab2 항체 단편은 MASP-2 기능적 활성에 필요한 MASP-2 상의 구조적 에피토프에 결합하여 그것을 간섭해야 한다. 그러므로, 많은 또는 모든 고친화성 결합 항-MASP-2 Fab2는 그것들이 MASP-2 기능적 활성에 직접적으로 포함된 MASP-2 상의 구조적 에피토프들에 결합하지 않는 한 MASP-2 기능적 활성을 억제할 수 없다.

렉틴 경로 C3 전환효소 형성의 억제를 측정하는 기능성 분석을 사용하여 항-MASP-2 Fab2의 "차단 활성"을 평가하였다. 렉틴 경로에서의 MASP-2의 일차적인 생리적 역할은 렉틴-중재된 보체 경로의 다음 기능성 성분, 즉 렉틴 경로 C3 전환효소를 생성하는 것으로 알려져 있다. 렉틴 경로 C3 전환효소는 C3을 C3a 및 C3b로 단백질 가수분해적으로 절단하는 중요한 효소 복합체 (C4bC2a)이다. MASP-2는 렉틴 경로 C3 전환효소 (C4bC2a)의 구조적 성분은 아니다; 그러나 MASP-2 기능적 활성은 렉틴 경로 C3 전환효소를 포함하는 두 개의 단백질 성분 (C4b, C2a)을 생성하기 위해 필요하다. 나아가, 상기에서 열거된 MASP-2의 별도의 기능적 활성들은 모두 렉틴 경로 C3 전환효소를 생성하기 위해 MASP-2에 필요한 것으로 보인다. 이들 이유에 대해, 항-MASP-2 Fab2의 "차단 활성"을 평가하는 데 사용하기에 바람직한 분석은 렉틴 경로 C3 전환효소 형성의 억제를 측정하는 기능성 분석인 것으로 여겨진다.

고친화성 Fab2의 생성: 인간 가변 경쇄 및 중쇄 항체 서열의 파지 디스플레이 라이브러리와 선택된 관심의 리간드와 반응하는 Fab2를 확인하기 위한 자동화 항체 선택 기술을 사용하여 래트 MASP-2 단백질 (SEQ ID NO:55)에 대한 고친화성 Fab2를 생성하였다. 공지량의 래트 MASP-2 (~1　mg, >85% 순수함)를 항체 스크리닝을 위해 이용하였다. 최상의 친화성을 가지는 항체들의 선택을 위해 3회기 증폭을 이용하였다. ELISA 스크리닝을 위해 항체 단편을 발현하는 대략 250개의 상이한 히트를 뽑았다. 고친화성 히트를 계속해서 서열화하여 상이한 항체들의 독특성을 측정하였다.

50개의 독특한 항-MASP-2 항체를 정제하였고 250 μg의 각각의 정제된 Fab2 항체를, 하기에서 보다 상세하게 기술하는 것과 같이, MASP-2 결합 친화성 및 보체 경로 기능성 시험을 특성확인하는 데 사용하였다.

항-MASP-2 Fab2의 억제 (차단) 활성을 평가하기 위해 사용된 분석들

1. 렉틴 경로 C3 전환효소의 형성의 억제를 측정하기 위한 분석:

배경: 렉틴 경로 C3 전환효소는 C3을 2개의 강력한 전염증성 단편들, 아나필라톡신 C3a 및 옵소닌 C3b로 단백질 가수분해적으로 절단하는 효소 복합체 (C4bC2a)이다. C3 전환효소의 형성은 염증을 중재하는 관점에서 렉틴 경로의 핵심 단계인 것으로 나타난다. MASP-2는 렉틴 경로 C3 전환효소 (C4bC2a)의 구조적 성분이 아니다; 그러므로 항-MASP-2 항체 (또는 Fab2)는 기존의 C3 전환효소의 활성을 직접적으로 억제하지 않을 것이다. 그러나, MASP-2 세린 프로테아제 활성은 렉틴 경로 C3 전환효소를 포함하는 두 개의 단백질 성분 (C4b, C2a)을 생성하기 위해 필요하다. 그러므로, MASP-2 기능적 활성을 억제하는 (즉 항-MASP-2 Fab2를 차단하는) 항-MASP-2 Fab2는 렉틴 경로 C3 전환효소의 새로운 형성을 억제할 것이다. C3은 그것의 구조의 일부로서 흔치 않은 고도로 반응성의 티오에스테르기를 함유한다. 이 분석에서 C3 전환효소에 의한 C3의 절단시에, C3b 상의 티오에스테르기는 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 마크로분자 상의 하이드록실 또는 아미노기와 에스테르 또는 아미드 연쇄를 통해 공유 결합을 형성함으로써 ELISA 분석에서 C3b의 검출을 용이하게 할 수 있다.

효모 만난은 렉틴 경로의 공지된 활성화제이다. C3 전환효소의 형성을 측정하기 위한 다음의 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 30분 동안 37℃에서, 렉틴 경로를 활성화시키기 위해 희석된 래트 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 이 웰을 세척하고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰 상에 고정된 C3b에 대해 분석하였다. 이 분석에서 생성된 C3b의 양은 렉틴 경로 C3 전환효소의 새로운 형성을 직접적으로 반영한다. 선택된 농도의 항-MASP-2 Fab2를 그것들의 C3 전환효소 형성 및 후속적인 C3b 생성을 억제하는 능력에 대해 이 분석으로 시험하였다.

방법:

96-웰 코스타르 배지 결합 플레이트를 밤새 5℃에서 50 mM 카보네이트 완충액, pH 9.5에 1 ug/50 Tl/웰로 희석된 만난과 함께 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션한 후에, 각 웰을 200 Tl PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음 웰을 100 Tl/웰의 PBS 중의 1% 우혈청 알부민으로 차단하고 1시간 동안 실온에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 그런 다음 각 웰을 200 Tl의 PBS로 3회 세척하였다. 항-MASP-2 Fab2 샘플을 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 함유 GVB 완충액 (4.0　mM 바르비탈, 141　mM NaCl, 1.0　mM MgCl₂, 2.0　mM CaCl₂, 0.1% 젤라틴, pH　7.4)에서 선택된 농도로 5℃에서 희석하였다. 0.5% 래트 혈청을 상기 샘플에 5℃에서 첨가하고 100 Tl을 각 웰에 옮겼다. 플레이트를 덮고 30분 동안 37℃ 수조에서 인큐베이션하여 완전히 활성화되도록 하였다. 플레이트를 37℃ 수조로부터 빙수 혼합물을 함유하고 있는 용기로 옮김으로써 반응을 중단시켰다. 각 웰을 200 Tl의 PBS-Tween　20 (PBS 중의 0.05% Tween　20)으로 5회 세척한 후, 200 Tl의 PBS로 2회 세척하였다. 100 Tl/웰의 1:10,000 희석의 일차 항체 (토끼 항-인간 C3c, DAKO A0062)를 2.0 mg/ml의 우혈청 알부민을 함유하고 있는 PBS에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl PBS로 5회 세척하였다. 100 Tl/웰의 1:10,000 희석의 이차 항체 (퍼옥시다제-포합된 염소 항-토끼 IgG, American Qualex A102PU)를 2.0 mg/ml의 우혈청 알부민을 함유하고 있는 PBS에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 진동기 상에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl의 PBS로 5회 세척하였다. 100 Tl/웰의 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)를 첨가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 100 Tl/웰의 1.0 M H₃PO₄를 첨가함으로써 퍼옥시다제 반응을 중단시켰고 OD₄₅₀을 측정하였다.

2. MASP-2-의존성 C4 전환효소의 억제를 측정하기 위한 분석

배경: MASP-2의 세린 프로테아제 활성은 매우 특이적이고 MASP-2에 대한 단지 2개의 단백질 기질만이 확인되었다: C2 및 C4. C4의 절단으로 C4a와 C4b가 생성된다. 항-MASP-2 Fab2는 C4 절단에 직접적으로 포함된 MASP-2 상의 구조적 에피토프들에 결합할 수 있고 (예컨대 C4에 대한 MASP-2 결합 부위; 세린 프로테아제 촉매적 부위), 그로써 MASP-2의 C4 절단 기능성 활성을 억제할 수 있다.

효모 만난은 렉틴 경로의 공지된 활성화제이다. MASP-2의 C4 절단 활성을 측정하기 위한 다음의 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 30분 동안 37℃에서, 렉틴 경로를 활성화시키기 위해 희석된 래트 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 이 ELISA 분석에서 사용된 일차 항체가 인간 C4만을 인식하기 때문에, 희석된 래트 혈청을 또한 인간 C4 (1.0 Tg/ml)로 보충하였다. 그런 다음 이 웰을 세척하고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰 상에 고정된 C4b에 대해 분석하였다. 이 분석에서 생성된 C4b의 양은 MASP-2-의존성 C4 절단 활성의 척도이다. 선택된 농도에서의 항-MASP-2 Fab2를 그것들의 C4 절단을 억제하는 능력에 대해 이 분석으로 시험하였다.

방법: 96-웰 코스타르 배지 결합 플레이트를 밤새 5℃에서 50 mM 카보네이트 완충액, pH 9.5에 1 Tg/50 Tl/웰로 희석된 만난과 함께 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음 웰을 100 Tl/웰의 PBS 중의 1% 우혈청 알부민으로 차단하고 1시간 동안 실온에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl의 PBS로 3회 세척하였다. 항-MASP-2 Fab2 샘플을 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 함유 GVB 완충액 (4.0　mM 바르비탈, 141　mM NaCl, 1.0　mM MgCl₂, 2.0　mM CaCl₂, 0.1% 젤라틴, pH　7.4)에서 선택된 농도로 5℃에서 희석하였다. 이들 샘플에 또한 1.0 Tg/ml인간 C4 (Quidel)를 포함시켰다. 0.5% 래트 혈청을 상기 샘플에 5℃에서 첨가하고 100 Tl을 각 웰에 옮겼다. 플레이트를 덮고 30분 동안 37℃ 수조에서 인큐베이션하여 완전히 활성화되도록 하였다. 플레이트를 37℃ 수조로부터 빙수 혼합물을 함유하고 있는 용기로 옮김으로써 반응을 중단시켰다. 각 웰을 200 Tl의 PBS-Tween　20 (PBS 중의 0.05% Tween　20)으로 5회 세척한 후, 각 웰을 200 Tl의 PBS로 2회 세척하였다. 100 Tl/웰의 1:700 희석의 비오틴-포합된 닭 항-인간 C4c (Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)를 2.0 mg/ml의 우혈청 알부민 (BSA)을 함유하고 있는 PBS에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl PBS로 5회 세척하였다. 100 Tl/웰의 0.1 Tg/ml의 퍼옥시다제-포합된 스트렙트아비딘 (Pierce Chemical #21126)을 2.0 mg/ml의 BSA를 함유하고 있는 PBS에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 진동기 상에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl의 PBS로 5회 세척하였다. 100 Tl/웰의 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)를 첨가하고 실온에서 16분 동안 인큐베이션하였다. 100 Tl/웰의 1.0 M H₃PO₄를 첨가함으로써 퍼옥시다제 반응을 중단시켰고 OD₄₅₀을 측정하였다.

3. '천연' 래트 MASP-2에 대한 항-래트 MASP-2 Fab2의 결합 분석

배경: MASP-2는 보통 혈장에 또한 특이적 렉틴 분다 (만노오스-결합 단백질 (MBL) 및 피콜린)을 포함하는MASP-2 이량체 복합체로서 존재한다. 그러므로, 만약 당업자가 MASP-2의 생리적 연관 형태에 대한 항-MASP-2 Fab2의 결합을 연구하는 데 관심이 있다면, 정제된 재조합 MASP-2 대신 혈장의 Fab2와 '천연' MASP-2 사이의 상호작용이 사용되는 결합 분석을 개발하는 것이 중요하다. 이 결합 분석에서 10% 래트 혈청으로부터의 '천연' MASP-2-MBL 복합체를 먼저 만난-코팅된 웰에 고정시켰다. 그런 다음 다양한 항-MASP-2 Fab2의 고정된 '천연' MASP-2에 대한 결합 친화성을 표준 ELISA 방법을 사용하여 연구하였다.

방법: 96-웰 코스타르 배지 결합 플레이트를 밤새 5℃에서 50 mM 카보네이트 완충액, pH 9.5에 1 Tg/50 Tl/웰로 희석된 만난과 함께 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl66 PBS로 3회 세척하였다. 웰을 100 Tl/웰의 PBST (0.05% Tween20이 첨가된 PBS) 중의 0.5% 탈지 분유로 차단하고 1시간 동안 실온에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl의 TBS/Tween/Ca⁺⁺ 세척 완충액 (Tris-완충된 염수, 0.05% Tween　20, 5.0　mM CaCl₂를 함유함, pH　7.4)으로 3회 세척하였다. 고염 결합 완충액 (20　mM Tris, 1.0 M NaCl, 10　mM CaCl₂, 0.05% Triton-X100, 0.1% (w/v) 우혈청 알부민, pH　7.4) 중의 10% 래트 혈청을 얼음 위에서 제조하였다. 100 Tl/웰을 첨가하고 밤새 5℃에서 인큐베이션하였다. 웰을 200 Tl의 TBS/Tween/Ca⁺⁺ 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 그런 다음 웰을 200 Tl의 PBS로 2회 세척하였다. Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 함유 GVB 완충액 (4.0　mM 바르비탈, 141　mM NaCl, 1.0　mM MgCl₂, 2.0　mM CaCl₂, 0.1% 젤라틴, pH　7.4)에 희석된 항-MASP-2 Fab2의 선택된 농도의 100 Tl/웰을 첨가하고 1시간 동안 실온에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl의 PBS로 5회 세척하였다. PBS 중의 2.0 mg/ml의 우혈청 알부민에 1:5000으로 희석된 HRP-포합된 염소 항-Fab2 (Biogenesis Cat No 0500-0099)를 100 Tl/웰로 첨가하고 1시간 동안 실온에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl PBS로 5회 세척하였다. 100 Tl/웰의 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)를 첨가하고 실온에서 70분 동안 인큐베이션하였다. 100 Tl/웰의 1.0 M H₃PO₄를 첨가함으로써 퍼옥시다제 반응을 중단시켰고 OD₄₅₀을 측정하였다.

결과:

래트 MASP-2에 고친화성으로 반응한 대략 250개의 상이한 Fab2를 ELISA 스크리닝을 위해 선택하였다. 이들 고친화성 Fab2들을 서열화하여 상이한 항체들의 독특성을 측정하였고, 추가의 분석을 위해 50개의 독특한 항-MASP-2 항체를 정제하였다. 250　ug의 각각의 정제된 Fab2 항체를 MASP-2 결합 친화성의 특성확인 및 보체 경로 기능성 시험에 대해 사용하였다. 이 분석의 결과를 아래의 표 6에 나타낸다.

렉틴 경로 보체 활성화를 차단하는 항-MASP-2 Fab2

Fab2 항체 #	C3 전환효소 (IC₅₀ (nM)	K_d	C4 절단 IC₅₀ (nM)
88	0.32	4.1	ND
41	0.35	0.30	0.81
11	0.46	0.86	<2　nM
86	0.53	1.4	ND
81	0.54	2.0	ND
66	0.92	4.5	ND
57	0.95	3.6	<2　nM
40	1.1	7.2	0.68
58	1.3	2.6	ND
60	1.6	3.1	ND
52	1.6	5.8	<2　nM
63	2.0	6.6	ND
49	2.8	8.5	<2　nM
89	3.0	2.5	ND
71	3.0	10.5	ND
87	6.0	2.5	ND
67	10.0	7.7	ND

상기 표 6에서 알 수 있는 것과 같이, 시험된 50개의 항-MASP-2 Fab2 중에서, 17개의 Fab2를 10 nM Fab2 이하의 IC₅₀으로 C3 전환효소 형성을 강력하게 억제하는 MASP-2 차단 Fab2로서 확인하였다 (34% 포지티브 히트율). 17개의 Fab2 중에서 8개가 하위나노몰 범위의 IC₅₀을 가지는 것으로 확인되었다. 나아가, 표 6에 나타낸 17개의 MASP-2 차단 Fab2는 모두 렉틴 경로 C3 전환효소 분석에서 본질적으로 완전한 C3 전환효소 형성의 억제를 보였다. 도 8a는 시험한 다른 Fab2 항체들을 대표하는, Fab2 항체 #11에 대한 C3 전환효소 형성 분석의 결과를 그래프로 도시하며, 그 결과는 표 6에 나타낸다. 이것은 "차단" Fab2는 각각의 MASP-2 분자가 Fab2에 의해 결합될 때조차도 MASP-2 기능을 단지 부분적으로 억제할 수 있는 것이 이론적으로 가능하기 때문에 중요한 고려사항이다.

비록 만난이 렉틱 경로의 공지된 활성화제이긴 하지만, 래트 혈청 중의 항-만난 항체들의 존재가 또한 고전적 경로를 활성화하고 고전적 경로 C3 전환효소를 통해 C3b를 생성할 수 있을 것이라는 것이 이론적으로 가능하다. 그러나, 이 실시예에서 열거된 17개의 차단 항-MASP-2 Fab2는 각각 C3b 생성을 강력하게 억제하고 (>95%), 그로써 렉틴 경로 C3 전환효소에 대한 이 분석의 특이성을 증명한다.

결합 분석을 또한 17개의 차단 Fab2 전부를 사용하여, 각각에 대한 외관상 K_d를 계산하기 위하여 수행하였다. 6개의 차단 Fab2에 대한 천연 래트 MASP-2에 대한 항-래트 MASP-2 Fab2의 결합 분석의 결과를 또한 표 6에 나타낸다. 도 8b는 Fab2 항체 #11를 사용한 결합 분석의 결과를 그래프로 도시한다. 유사한 결합 분석을 또한 다른 Fab2에 대해서도 수행하였고, 그 결과를 표 6에 나타낸다. 일반적으로, '천연' MASP-2에 대한 6개의 Fab2의 각각의 결합에 대해 얻어진 외관상 K_d는 C3 전환효소 기능성 분석에서 Fab2에 대한 IC₅₀으로 꽤 타당하게 상응한다. MASP-2가 그것의 프로테아제 활성이 활성화될 때 '비활성'에서 '활성' 형태로 형태적 변화를 진행한다는 증거가 있다 (Feinberg　et　al., EMBO J 22:2348-59 (2003); Gal　et　al., J. Biol. Chem. 280:33435-44 (2005)). C3 전환효소 형성 분석에서 사용된 정상적인 래트 혈장에서, MASP-2는 주로 '비활성' 자이모겐 형태로 존재한다. 대조적으로, 결합 분석에서, MASP-2는 고정된 만난에 결합된 MBL과의 복합체의 일부로서 존재한다; 그러므로 MASP-2는 '활성' 형태로 존재할 것이다 (Petersen　et　al., J. Immunol Methods 257:107-16, 2001). 따라서, 당업자는 반드시 이들 두 가지 기능성 분석에서 시험한 17개의 차단 Fab2의 각각에 대해 IC₅₀과 K_d 사이의 정확한 상응성을 예상할 수 없을 것인데, 왜냐하면 각각의 분석에서 Fab2가 MASP-2의 상이한 형태적 형태와 결합할 것이기 때문이다. 그럼에도 불구하고, Fab2 #88을 제외하면, 두 가지 분석에서 시험된 다른 16개의 Fab2 각각에 대해서는 IC₅₀과 외관상 K_d 사이에 상당히 밀접한 상응성이 있는 것으로 보인다 (표 6 참조).

여러 개의 차단 Fab2를 C4의 MASP-2 중재된 절단의 억제에 대해 평가하였다. 도 8c는 C4 절단 분석의 결과들을 그래프로 도시한 것으로, IC₅₀=0.81　nM인 Fab2 #41로의 억제를 나타낸다 (표 6 참조). 도 9에서 알 수 있는 것과 같이, 시험한 모든 Fab2는 C3 전환효소 분석에서 얻어진 것과 유사한 IC₅₀으로 C4 절단을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (표 6 참조).

만난이 렉틴 경로의 공지된 활성화제이긴 하지만, 래트 혈청 중의 항-만난 항체들의 존재 또한 고전적 경로를 활성화하고 그로써 C1q-중재된 C4의 절단에 의해 C4b를 생성하는 것이 이론적으로 가능하다. 그러나, 여러 개의 항-MASP-2 Fab2는 C4b 생성을 강력하게 억제하고 (>95%), 그로써 MASP-2 중재된 C4 절단에 대한 이 분석의 특이성을 증명한다. C3과 같이, C4는 그것의 구조의 일부로서 흔치 않은 고도로 반응성인 티오에스테르기를 함유한다. 이 분석에서 MAㄴP-2에 의한 C4의 절단시에, C4b 상의 티오에스테르기는 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 마크로분자 상의 하이드록실 또는 아미노기와 공유 결합을 형성함으로써 ELISA 분석에서 C4b의 검출을 용이하게 할 수 있다.

이들 연구는 C4 및 C4 전환효소 활성 둘 다를 기능적으로 차단하는 래트 MASP-2 단백질에 대한 고친화성 FAB2의 생성과, 그로써 렉틴 경로 활성화의 방지를 분명하게 증명한다.

실시예 11

이 실시예는 실시예 10에서 기술된 것과 같이 생성된 여러 개의 차단 항-래트 MASP-2 Fab2 항체들에 대한 에피토프 지도화를 설명한다.

방법:

도 10에서 알 수 있는 것과 같이, 모두 N-말단에 6X His 태그를 가지고 있는 다음의 단백질들을 pED4 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 발현시켰다:

래트 MASP-2A, 전 길이 MASP-2 단백질, 활성 센터의 세린을 알라닌으로 변경시킴으로써 비활성화됨 (S613A);

래트 MASP-2K, 자체활성화를 감소시키기 위해 변경된 전 길이 MASP-2 단백질 (R424K);

CUBI-II, CUBI, EGF-유사 및 CUBII 도메인만을 함유하는 래트 MASP-2의 N-말단 단편 래트; 및

CUBI/EGF-유사, CUBI 및 EGF-유사 도메인만을 함유하는 래트 MASP-2의 N-말단 단편.

이들 단백질을 문헌에 기술되어 있는 것과 같이 (Chen　et　al., J. Biol. Chem. 276:25894-02 (2001)) 배양 상층액으로부터 니켈-친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

래트 MASP-2의 CCPII 및 세린 프로테아제 도메인을 함유하는 C-말단 폴리펩티드 (CCPII-SP)를 pTrxFus (Invitrogen)를 사용하여 티오레독신 융합 단백질로서 대장균에서 발현시켰다. 세포 용해물로부터 티오결합 친화성 수지를 사용하여 단백질을 정제하였다. 티오레독신 융합 파트너를 빈 pTrxFus로부터 네거티브 대조표준으로서 발현시켰다.

모든 재조합 단백질을 TBS 완충액으로 투석하고 그것들의 농도를 280 nm에서의 OD를 측정함으로써 측정하였다.

돗트 블롯 분석:

상기에서 기술되고 도 10에 도시된 5개의 재조합 MASP-2 폴리펩티드의 연속적인 희석 (및 CCPII-세린 프로테아제 폴리펩티드에 대한 네거티브 대조표준으로서의 티오레독신 폴리펩티드)을 니트로셀룰로오스 막 위에 스폿팅하였다. 스폿팅된 단백질의 양은 5-배 단계에서, 100 ng 내지 6.4 pg의 범위였다. 후기 실험에서, 스폿팅된 단백질의 양은 다시 5-배 단계에서, 50 ng 내지 16 pg의 범위였다. 막을 TBS (차단 완충액) 중의 5% 탈지 분유로 차단한 후 차단 완충액 (5.0　mM Ca²⁺ 함유) 중에서 1.0 μg/ml의 항-MASP-2 Fab2와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 Fab2를 HRP-포합된 항-인간 Fab (AbD/Serotec; 1/10,000으로 희석됨)및 ECL 검출 키트 (Amersham)를 사용하여 검출하였다. 하나의 막을 포지티브 대조표준으로서 다클론성 토끼-항 인간 MASP-2 Ab (described in Stover　et　al., J Immunol 163:6848-59 (1999))와 함께 인큐베이션하였다. 이 경우, 결합된 Ab를 HRP-포합된 염소 항-토끼 IgG (Dako; 1/2,000으로 희석됨)를 사용하여 검출하였다.

MASP-2 결합 분석

ELISA 플레이트를 카보네이트 완충액 (pH 9.0) 중의 1.0 μg/웰의 재조합 MASP-2A 또는 CUBI-II 폴리펩티드로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 웰을 TBS 중의 1% BSA로 차단한 후, 항-MASP-2 Fab2의 연속 희석을 5.0　mM Ca²⁺를 함유하고 있는 TBS에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. TBS/tween/Ca²⁺로 3회 세척한 후, TBS/ Ca²⁺ 중에 1/10,000으로 희석된 HRP-포합된 항-인간 Fab (AbD/Serotec)를 첨가하고, 플레이트를 추가로 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 TMB 퍼옥시다제 기질 키트 (Biorad)를 사용하여 검출하였다.

결과:

다양한 MASP-2 폴리펩티드와의 Fab2의 반응성을 증명하는 돗트 블롯 분석의 결과를 표 7에 제공한다. 표 7에 제공된 수치는 대략 반 최고치의 신호 강도를 얻기 위해 필요한 스폿팅된 단백질의 양을 나타낸다. 나타낸 것과 같이, 모든 폴리펩티드 (티오레독신 융합 파트너만은 예외임)는 포지티브 대조 Ab (토끼에서 생성된 다클론성 항-인간 MASP-2 혈청)에 의해 인식되었다.

돗트 블로 상의 다양한 재조합 래트 MASP-2 폴리펩티드와의 반응성

Fab2 항체 #	MASP-2A	CUBI-II	CUBI/EGF-유사	CCPII-SP	티오레독신
40	0.16 ng	NR	NR	0.8 ng	NR
41	0.16 ng	NR	NR	0.8 ng	NR
11	0.16 ng	NR	NR	0.8 ng	NR
49	0.16 ng	NR	NR	>20 ng	NR
52	0.16 ng	NR	NR	0.8 ng	NR
57	0.032 ng	NR	NR	NR	NR
58	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
60	0.4 ng	0.4 ng	NR	NR	NR
63	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
66	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
67	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
71	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
81	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
86	0.4 ng	NR	NR	10 ng	NR
87	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
포지티브 대조표준	<0.032 ng	0.16 ng	0.16 ng	<0.032 ng	NR

경로 활성을 제 2 및 제 3주에 걸쳐서 관찰하였고, 이때 마우스에서 항-MASP-2 MoAb 투여후 17일째에 완전한 렉틴 경로가 복원되었다. NR = 반응 없음. 포지티브 대조 항체는 토끼에서 생성된 다클론성 항-인간 MASP-2 혈청이다.

모든 Fab2는 MASP-2A뿐만 아니라 MASP-2K와 반응하였다 (데이터는 제시하지 않음). 대부분의 Fab2는 N-말단 단편이 아니라 CCPII-SP 폴리펩티드를 인식하였다. 두 가지 예외는 Fab2 #60 및 Fab2 #57이다. Fab2 #60은 CUBI/EGF-유사 폴리펩티드 또는 CCPII-SP 폴리펩티드가 아닌 MASP-2A 및 CUBI-II 단편을 인식하는데, 그것은 CUBII의 에피토프에 결합하거나, CUBII 및 EGF-유사 도메인에 결쳐 있는 것을 시사한다. Fab2 #57은 시험된 MASP-2 단편의 어느 것이 아니라 MASP-2A를 인식하고, 그것은 이 Fab2가 CCP1의 에피토프를 인식하는 것을 시사한다. Fab2 #40 및 #49는 단지 완전한 MASP-2A에 결합하였다. 도 11에 나타낸 ELISA 결합 분석에서, Fab2 #60은 약간 더 낮은 외관상 친화성을 갖긴 하지만, 또한 CUBI-II 폴리펩티드에도 결합하였다.

이들 발견은 MASP-2 단백질의 다중 영역에 대한 독특한 차단 Fab2의 확인을 증명한다.

실시예 12

이 실시예는 쥐과 신장 허혈/재관류 모델에서 MASP-2-/- 마우스의 분석을 설명한다.

배경/근거: 체온에서의 신장의 허혈-재관류 (I/R) 손상은 저혈량성 쇼크, 신장 동맥 폐색 및 교차-클램핑 과정을 포함하여, 많은 임상 상태에서 관련성이 있다.

신장 허혈-재관류 (I/R)는 50%까지의 사망률과 관련된, 급성 신부전의 중요한 원인이다 (Levy　et　al., JAMA 275:1489-94, 1996; Thadhani　et　al., N. Engl. J. Med. 334:1448-60, 1996). 이식후 신부전은 신장 이식 후 흔한 위협적인 합병증이다 (Nicholson　et　al., Kidney Int. 58:2585-91, 2000). 신장 I/R 손상에 대한 효과적인 치료는 현재 이용할 수 없고 혈액 투석이 이용할 수 있는 유일한 치료이다. 신장 I/R의 병리학은 복잡하다. 최근의 연구는 보체 활성화의 렉틴 경로가 신장 I/R 손상의 발병에서 중요한 역할을 할 수 있는 것으로 나타났다 (deVries　et　al., Am. J. Path. 165:1677-88, 2004).

방법:

실시예 1에서 기술한 대로 MASP-2(-/-) 마우스를 생성하고 적어도 10세대 동안 C57B1/6과 역교배하였다. 체중이 22 내지 25 g인 6마리의 수컷 MASP-2(-/-) 및 6마리의 야생형 (+/+) 마우스에게 하이프노벨 (6.64　mg/kg; Roche products Ltd. Welwyn Garden City, UK)을 복강 내 주사로 투여하고, 계속해서 아이소플루란 ((Abbott Laboratories Ltd., Kent,　UK)을 흡입하게 하여 마취시켰다. 아이소플루란은 최소한의 간 독성을 나타내는 순한 흡입 마취제이기 때문에 그것을 선택하였고; 농도는 정확하게 제조하며 동물을 연장된 마취 후라도 신속하게 받아들인다. 하이프노벨은 그것이 동물에서 신경이완성 진통상태를 유발하고 그것은 더 적은 아이소플루란이 투여될 필요가 있다는 것을 의미하기 때문에 투여하였다. 체온을 일정하게 유지하기 위하여 따뜻한 패드를 동물 아래에 놓았다. 다음에, 복부 정중선 절개를 수행하고 한 쌍의 견인기를 사용하여 체강을 열린 채로 유지하였다. 결합 조직을 우측 및 좌측 신장 양쪽의 신장 정맥 및 동맥의 위아래에서 제거하고, 신장 페디클을 55분의 기간 동안 미세동맥류 클램프를 적용하여 클램핑하였다. 이 허혈 기간은 초기에 이 실험실에서 이전에 수행한 연구를 기초로 하였다 (Zhou　et　al., J. Clin. Invest. 105:1363-71 (2000)). 또한, 55분의 표준 허혈 시간을 허혈 적정에 이어 선택하였고, 55분은 5% 미만의 낮은 사망률을 나타내면서 또한 가역적인 손상과 일치하는 것으로 나타났다. 폐색 후에, 0.4 ml의 따뜻한 염수 (37℃)를 복강에 넣은 후 허혈 기간 동안 복부를 닫았다. 미세동맥류 클램프를 제거한 후, 혈액이 다시 신장으로 흐르는 표시인 색 변화가 있을 때까지 신장을 관찰하였다. 추가로 0.4 ml의 따뜻한 염수를 복강에 넣고 개구를 봉합한 다음 동물들을 다시 우리에 넣었다. 클램프를 제거하고 24시간 후에 꼬리의 혈액 샘플을 취하고, 48시간째에 마우스를 희생시키고 추가의 혈액 샘플을 수집하였다.

신장 손상의 평가: 신장 기능을 6마리의 수컷 MASP-2(-/-) 및 6마리의 WT (+/+) 마우스에서 재관류 후 24시간 및 48시간째에 평가하였다. 혈액 크레아티닌 척도를 질량 분광계에 의해 측정하였는데, 그것은 신장 기능의 재생성 지수 (민감성 < 1.0 μmol/L)를 제공한다. 도 12는 야생형 C57Bl/6 대조표준과 MASP-2 (-/-)에 대한 재관류 후 24시간 및 48시간째의 혈중 요소 질소 클리어런스를 그래프로 도시한다. 도 12에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2(-/-) 마우스들은 야생형 대조 마우스들과 비교하여 24 및 48시간째에 혈중 요소의 양이 상당히 감소한 것으로 나타났고, 그것은 허혈 재관류 손상 모델에서 신장 손상으로부터의 보호 기능성 효과를 가리킨다.

전체적으로, 증가된 혈중 요소는 WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스들에서 수술 과정 및 허혈 손상 후 24 및 48시간째에 볼 수 있었다. 비-허혈성 WT (+/+) 수술 동물의 혈중 요소 수준은 별도로 측정한 결과 5.8　mmol/L이었다. 도 12에 나타낸 데이터에 더불어, 한 마리의 MASP-2 (-/-) 동물은 허혈 손상으로부터 거의 완전한 보호를 나타냈고, 이때 24 및 48시간째의 값은 각각 6.8 및 9.6　mmol/L이었다. 이 동물은 허혈성 손상이 나타나지 않았으므로 잠재적 열외로서 그룹 분석으로부터 배제하였다. 그러므로, 도 12에 나타낸 최종 분석은 5마리의 MASP-2(-/-) 마우스 및 6마리의　WT (+/+) 마우스를 포함하였고, 통계학적으로 유의미한 혈중 요소의 감소는 MASP-2(-/-) 마우스에서 24 및 48시간째에 볼 수 있었다 (학생 t-시험 p<0.05). 이들 발견은 MASP-2 활성의 억제가 허혈성 손상에 기인한 신장 손상으로부터 예방적 또는 치료적 효과를 가지는 것으로 예상될 것임을 가리킨다.

실시예 13

이 실시예는 쥐과 황반 변성 모델에서 MASP-2-/-의 결과를 설명한다.

배경/근거: 노화-관련 황반 변성 (AMD)은 산업화된 나라에서 55세 이후의 실명의 선도적 원인이다. AMD는 두 가지 주요 형태로 일어난다: 신생혈관 (습식) AMD 및 위축성 (건식) AMD. 신생혈관 (습식) 형태는 AMD와 관련된 심각한 시력 손실의 90%를 차지하지만, AMD를 가진 개체의 단지 ~20% 만이 습식 형태를 나타낸다. AMD의 임상적 특징은 다발성 드루젠, 지도형 위축 및 맥락막 신생혈관 (CNV)를 포함한다. 2004년 12월에, FDA는 AMD의 습식 (신생혈관) 형태의 치료를 위해, 혈관 내피 성장인자 (VEGF)를 특이적으로 표적화하고 그 효과를 차단하기 위한 새로운 안과용 약물의 부류인 마쿠겐 (Macugen) (페갑타닙)을 승인하였다 (Ng　et　al., Nat Rev. Drug Discov 5:123-32 (2006)). 비록 마쿠겐이 AMD 환자들의 하위그룹에 대한 전도유망한 새로운 치료 옵션을 나타내긴 하지만, 이 복잡한 질환에 대한 추가의 치료를 개발할 절실한 필요성은 여전히 남아 있다. 다중적이고 독립적인 라인의 연구조사는 AMD의 발병에서 보체 활성화에 대한 중심 역할을 함축한다. AMD의 가장 심각한 형태인 맥락막 신생혈관 (CNV)의 발병은 보체 경로의 활성화를 포함할 수 있다.

Ryan은 25년에 걸쳐 동물에서 CNV의 레이저-유도된 손상 모델을 기술하였다 (Ryan, S.J., Tr. Am. Opth. Soc. LXXVII:707-745, 1979). 모델은 처음에 붉은털 원숭이를 사용하여 개발되었으나, 동일한 기술이 마우스를 포함한 다양한 연구 동물에서 CNV의 유사한 모델을 개발하는 데 사용되어 왔다 (Tobe　et　al., Am. J. Pathol. 153:1641-46, 1998). 이 모델에서, 레이저 광응고가 브루흐막을 파괴하기 위해 사용되는데, 그것의 작용은 CNV-유사 막의 형성을 초래한다. 레이저-유도된 모델은 인간 상태의 많은 중요한 특징들을 포착한다 (최근 개관을 위해서 Ambati　et　al., Survey Ophthalmology 48:257-293, 2003 참조). 레이저-유도된 마우스 모델은 현재 잘 수립되어 있고, 대부분의, 심지어 증가하고 있는 많은 연구 프로젝트에서 실험 기초로서 사용된다. 일반적으로 레이저-유도된 모델은 발병의 임상전 연구 및 이 모델을 사용한 약물 억제가 인간의 CNV와 관련되어 있는, 인간의 CNV와의 충분한 생물학적 유사성을 공유한다고 인식된다.

방법:

MASP-2-/- 마우스를 실시예 1에서 기술한 대로 생성하였고, 10세대 동안 C57Bl/6과 역교배시켰다. 본 연구는 조직 손상의 척도로서 주사 레이저 공초점 현미경에 의해 레이저-유도된 CNV의 부피에 초점이 모아진 신생혈관 AMD의 가속화된 모델인, MASP-2 (-/-) 및 MASP-2 (+/+) 수컷 마우스를 레이저-유도된 CMV의 과정에서 평가하였을 때의 결과들을 레이저 손상 후에 ELISA에 의해 망막 색소 내피 (RPE)/맥락막에서의, CNV에 연루된 강력한 혈관형성 인자인 VEGF의 수준의 측정과 비교하였다.

맥락막 혈관신생 (CNV)의 유도: 레이저 광응고 (532 nm, 200 mW, 100 ms, 75 μm; Oculight GL, Iridex, Mountain View, CA)를 약물 그룹 평가에 대해 차단된 단일 개인에 의해 0일에 각 동물의 양 눈에 대해 수행하였다. 레이저 스폿을 슬릿 램프 전달 시스템과 접촉 렌즈로서 커버슬립을 사용하여 눈 신경 주변에 표준화된 방식으로 적용하였다. 레이저 손상의 형태학적 종료점은 브루흐막의 파괴와 상관된 것으로 여겨지는 신호인 공동화 기포의 출현이었다. 평가한 상세한 방법 및 종점은 다음과 같다.

플루오레신 혈관촬영: 플루오레신 혈관촬영을 레이저 광응고 후 1주 후에 카메라 및 영상 시스템 (TRC 50 1A camera; ImageNet 2.01 system; Topcon, Paramus , NJ)으로 수행하였다. 사진을 0.1 ml의 2.5% 플루오레신 나트륨을 복막 내 주사한 후에 기저부 카메라 렌즈와 접촉하는 20-D 렌즈로 포착하였다. 망막은 차단된 방식으로 단일 시팅에서 플루오레신 혈관촬영으로 평가된 레이저 광응고 또는 혈관촬영에 포함되지 않았다.

맥락막 혈관신생 (CNV)의 부피: 레이저 손상 후 1주 후에, 양눈을 적출하여 4% 파라포름알데하이드에 30분 동안 4℃에서 고정하였다. 안구 앞부분을 제거함으로써 아이컵 (eye cup)을 얻었고, 그것을 PBS로 3회 세척한 후 탈수하고 메탄올 시리즈를 통해 재수화하였다. 완충액 (1% 우혈청 알부민 및 0.5% 트리톤 X-100을 함유하고 있는 PBS)으로 30분 동안 실온에서 2회 차단한 후 아이컵을 밤새 4℃에서, 0.2% BSA 및 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 희석되고, 내피 세포의 표면상에서 말단 β-D-갈락토오스 잔기와 결합하고 쥐과 맥관구조를 선택적으로 표지하는 0.5% FITC-아이소렉틴 B4 (Vector laboratories, Burlingame, CA)와 함께 인큐베이션하였다. 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 2회 세척한 후에, 감각신경성 망막을 부드럽게 떼어내고 시신경으로부터 잘라냈다. 4개의 이완 방사상 절개를 만들었고, 남아있는 RPE-맥락막-공막 복합체를 쇠퇴 방지 배지 (Immu-Mount Vectashield Mounting Medium; Vector Laboratories)에 플랫마운팅하고 커버를 덮었다.

플랫마운트를 주사 레이저 공초점 현미경 (TCS SP; Leica, Heidelberg, Germany)으로 조사하였다. 혈관을 블루 아르곤 파장 (488 nm)으로 여기시키고 515와 545 nm 사이의 방출을 포착함으로써 가시화하였다. 40X 유침용 대물렌즈를 모든 영상 연구에 대해 사용하였다. 수평 광학 섹션 (1 μm 단계)을 RPE-맥락막-공막 복합체 표면으로부터 얻었다. 주변의 맥락막 혈관 네트워크가 병변에 연결되어 있는 것을 확인할 수 있었던 가장 깊은 초점면을 병변의 바닥인 것으로 판단하였다. 레이저-표적화된 구역에 있거나 이 참조 평면에 대해 피상적인 어떠한 혈관이든지 CNV로서 판단하였다. 각 섹션의 영상을 디지털 방식으로 보관하였다. CNV-관련 형광을 현미경 소프트웨어 (TCS SP; Leica)를 사용하여 컴퓨터화된 영상 분석에 의해 측정하였다. 각각의 수평 섹션에서 전체 형광 구역의 합계를 CNV의 부피에 대한 지수로서 사용하였다. 영상화를 치료 그룹 평가에 대해 차단된 작업자에 의해 수행하였다.

각각의 레이저 병변이 CNV를 전개할 가능성이 그것이 속해있는 그룹 (마우스, 눈 및 레이저 스폿)에 의해 영향을 받기 때문에, 평균 병변 부피를 분할 반복-측정 디자인으로 선형 혼합 모델을 사용하여 비교하였다. 전체 도표 인자는 동물이 속한 유전자 그룹이었던 반면, 분할 인자는 눈이었다. 통계학적 유의미를 0.05 수준에서 측정하였다. 평균들의 인과 비교를 다중 비교를 위한 본페로닌 조정을 사용하여 구성하였다.

VEGF ELISA. 12개의 레이저 스폿에 의한 손상 후 3일째에, RPE-맥락막 복합체를 얼음 위의 용해 완충액 (20　mM 이미다졸 HCl, 10　mM KCl, 1　mM MgCL₂, 10　mM EGTA, 1% Triton X-100, 10　mM NaF, 1　mM Na 몰리브데이트 및 1　mM EDTA, 프로테아제 억제제가 포함됨)에서 15분 동안 음파처리하였다. 상층액 중의 VEGF 단백질 수준을 450 내지 570 nm (Emax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 모든 스플라이싱 변이체를 인식하는 ELISA 키트 (R&D Systems, Minneapolis, MN)에 의해 측정하고, 총 단백질로 규준화하였다. 이중 측정은 광응고, 영상화 또는 혈관촬영에 포함되지 않는 작업자에 의해 차단된 방식으로 수행하였다. VEGF 수를 적어도 3개의 독립적인 실험의 평균 +/- SEM으로서 표시하고 Mann-Whitney U 시험을 사용하여 비교하였다. 영가설은 P<0.05에서 거부하였다.

결과:

VEGF 수준의 평가:

도 13a는 0일에 C57Bl6 야생형 및 MASP-2(-/-) 마우스로부터 분리한 RPE-맥락막 복합체에서의 VEGF 단백질 수준을 그래프로 도시한다. 도 13a에서 알 수 있는 것과 같이, VEGF 수준의 평가는 MASP-2 (-/-) 마우스 대 C57bl 야생형 대조 마우스에서 VEGF에 대한 기준선 수준의 감소를 나타낸다. 도 13b는 레이저 유도된 손상에 이어 3일째에 측정된 VEGF 단백질 수준을 그래프로 도시한다. 도 13b에서 알 수 있는 것과 같이, VEGF 수준은 레이저 유도된 손상 후 3일째에 야생형 (+/+) 마우스에서 상당히 증가하였고, 그것은 공개된 연구들과 일치한다 (Nozaki　et　al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:2328-33 (2006)). 그러나, 놀랍게도 매우 낮은 수준의 VEGF를 MASP-2 (-/-) 마우스에서 볼 수 있었다.

맥락막 혈관신생 (CNV)의 평가:

레이저 유도된 황반 변성 후에 VEGF 수준의 감소에 더불어, CNV 구역을 레이저 손상 전과 후에 측정하였다. 도 14는 C57bl 야생형 마우스 및 MASP-2(-/-) 마우스에서 레이저 유도된 손상 후 7일째에 측정된 CNV 부피를 그래프로 도시한다. 도 14에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2 (-/-) 마우스는 야생형 대조 마우스에 비교하여 레이저 유도된 손상 후 7일째에 CNV의 30% 감소를 나타냈다.

이들 발견은 MASP (-/-) 마우스 대 야생형 (+/+) 대조표준에서 볼 수 있는 것과 같이 VEGF와 CNV의 감소를 나타내고, 억제제를 사용한 MASP-2의 차단은 황반 변성의 치료에서 예방 또는 치료 효과를 나타낼 것이다.

실시예 14

이 실시예는 트롬빈 활성화가 생리적 조건하에서 렉틴 경로 활성화에 이어 일어날 수 있음을 증명하고, MASP-2 포함 정도를 증명한다. 정상적인 래트 혈청에서, 렉틴 경로의 활성화는 보체 활성화 (C4 침착으로서 평가됨)와 동시에 트롬빈 활성화 (트롬빈 침착으로서 평가됨)를 유도한다. 도 15a 및 15b에서 알 수 있는 것과 같이, 이 시스템에서 트롬빈 활성화는 MASP-2 차단 항체 (Fab2 방식)에 의해 개시되어 보체 활성화에 대한 것 (도 15a)과 평행하는 억제 농도-반응 곡선 (도 15b)을 나타낸다. 이들 데이터는 렉틴 경로의 활성화가 그것이 외상에서 일어나는 것과 같이 전체적으로 MASP-2에 의존적인 과정에서 보체와 응고 시스템 둘 다의 활성화를 유도할 것임을 시사한다. MASP-2 차단 항체는 간섭에 의하여, 주요 외상 사건에 사망으로 유도하는 특징들 중 하나인 과잉의 시스템 응고, 예컨대 산재성 혈관내 응고의 경우에 효능을 나타낼 수 있다.

실시예 15

이 실시예는 DIC에서 렉틴 경로의 역할을 평가하기 위해 MASP-2 -/- 결핍 및 MASP-2 +/+ 충분 마우스에서 산재성 혈관내 응고 ("DIC")의 슈바르츠만 반응 모델을 사용하여 생성된 결과를 제공한다.

배경/근거:

상기에서 기술된 것과 같이, MASP-2의 차단은 렉틴 경로 활성화를 억제하고 아나필라톡신 C3a 및 C5a 둘 다의 생성을 감소시킨다. C3a 아나필라톡신은 시험관 내에서 강력한 혈소판 응집제인 것으로 나타났지만, 생체 내에 포함되는 경우에는 잘 규정되어 있지 않고 상처 회복에서 혈소판 물질과 플라스민의 방출은 단지 보체 C3만을 이차적으로 포함할 수 있다. 이 실시예에서, 렉틴 경로의 역할을 C3 활성화의 연장딘 상승이 산재성 혈관 내 응고를 생성하기 위해 필요한 것인지의 여부를 해명하기 위해 MASP-2 (-/-) 및 WT (+/+) 마우스에서 분석하였다.

방법:

이 연구에 사용된 MASP-2 (-/-) 마우스를 실시예 1에서 기술한 대로 생성하였고 적어도 10세대 동안 C57Bl/6과 역교배시켰다.

국소화된 슈바르츠만 반응 모델을 이 실험에 사용하였다. 국소화된 슈바르츠만 반응 (LSR)은 선천적 면역 시스템의 세포 및 체액 요소로부터 잘 수립된 기여를 받는, 리포다당 (LPS)-유도된 반응이다. 보체에 대한 LSR의 의존성은 잘 수립되어 있다 (Polak,　L., et al., Nature 223:738-739 (1969); Fong J.S. et al., J Exp Med 134:642-655 (1971)). LSR 모델에서, 마우스를 4시간 동안 TNF 알파 (500 ng, 음낭 내)로 프라이밍한 후, 마우스를 마취시키고, 고환거근의 생체 내 현미경검사를 준비하였다. 혈류가 양호한 (1 내지 4 mm/s) 후-모세관 정맥 (15 내지 60 μm 직경)의 네타워크를 관찰을 위해 선택하였다. 동물들을 형광 항체로 처리하여 호중구 또는 혈소판을 선택적으로 표지하였다. 혈관 네트워크를 계속해서 스캐닝하고 모든 혈관의 영상을 나중의 분석을 위해 디지털 방식으로 기록하였다. 미세순환계의 기저 상태를 기록한 후에, LPS (100 μg)를 단독으로 또는 하기에 열거된 제제와 함께 마우스에 단일 정맥 내 주사하였다. 그런 다음 동일한 혈관 네트워크를 1시간 동안 10분마다 스캐닝하였다. 형광발색단의 특이적인 축적을 바탕 형광을 빼고 영상의 임계값 설정에 의해 증강시킴으로써 확인하였다. 반응의 크기를 기록된 영상들로부터 측정하였다. 슈바르츠만 반응의 일차 측정은 응집 데이터였다.

연구들은 공지된 보체 경로 고갈제, 코브라 독 인자 (CVF) 또는 말단 경로 억제제 (C5aR 길항제) 중 어느 하나에 노출된 MASP-2 +/+ 충분 또는 야생형 마우스를 비교하였다. 결과 (도 16a)는 C5aR 뿐만 아니라 CVF도 둘 다 맥관구조에 응집체가 나타나는 것을 방지하였음을 증명한다. 또한 MASP-2 -/- 결핍 마우스 (도 16b)도 국소화된 슈바르츠만 반응의 완전한 억제를 증명하였고, 그것은 렉틴 경로 포함을 지지한다. 이들 결과는 분명하게 DIC 생성에서 MASP-2의 역할을 증명하고 DIC의 치료 및 예방을 위한 MASP-2 억제제의 사용을 지지한다.

실시예 16

이 실시예는 쥐과 신장 이식 모델에서 MASP-2 (-/-) 마우스의 분석을 설명한다.

배경/근거:

신장 이식의 기능적 결과에서 MASP-2의 역할을 마우스 모델을 사용하여 평가하였다.

방법:

신장 이식의 기능적 결과를 유니네프레코마이즈드 (uninephrecomized) 수용체 마우스, 6마리의 WT (+/+) 이식 수용체 (B6) 및 6마리의 MASP-2 (-/-) 이식 수용체로의 단일 신장 동계이식편을 사용하여 평가하였다. 이식된 신장의 기능을 평가하기 위하여, 나머지 천연 신장을 이식 후 5일째에 수용체로부터 제거하였고, 신장 기능을 24시간 후에 혈액 요소 질소 (BUN) 수준의 측정에 의해 평가하였다.

결과:

도 17은 WT (+/+) 수용체 및 MASP-2 (-/-) 수용체에서 신장 이식후 6일째에 신장의 혈액 요소 질소 (BUN) 수준을 그래프로 도시한다. 도 17에서 알 수 있는 것과 같이, 강력하게 상승된 BUN 수준을 WT (+/+) (B6) 이식 수용체에서 관찰하였고 (마우스에서 정상 BUN 수준은 <5 mM임), 그것은 신부전증을 가리킨다. 대조적으로, MASP-2 (-/-) 동계이식편 수용체 마우스는 실질적으로 낮은 BUN 수준을 보였으며, 그것은 개선된 신장 기능을 시사한다. 이들 결과는 WT (+/+) 신장 공여체로부터의 이식편을 사용하여 얻어졌고, 이식 수용체에서 기능성 렉틴 경로의 부재는 단독으로 치료 유익을 이루기에 충분한 것을 시사하는 것임이 주지된다.

이들 결과를 함께 취합하면, MASP-2 억제를 통한 렉틴 경로의 일시적인 억제가 이병률 및 신장 이식에서 지연된 이식편 기능을 감소시키는 방법을 제공하는 것을 가리키고, 이 접근법이 다른 이식 환경에서 유용할 것으로 보이는 것을 가리킨다.

실시예 17

이 실시예는 MASP-2 (-/-) 마우스가 쥐과 다균성 패혈증 복막염 모델에서 패혈성 쇼크에 내성인 것을 증명한다.

배경/근거:

감염에서 MASP-2 (-/-)의 잠재적 효과를 평가하기 위하여, 다균성 패혈성 복막염 모델인 맹장 결찰 및 천공 (CLP) 모델을 평가하였다. 이 모델은 인간 패혈성 복막염의 과정을 가장 정확하게 모방하는 것으로 여겨진다. 맹장 결창 및 천공 (CLP) 모델은 맹장이 결찰되고 바늘에 의해 천공되어 박테리아가 복강으로 연속적으로 누출되는 것을 유발하여 결국 림프 누수를 통해 혈액에 도달한 후 모든 복부 기관으로 분포됨으로써 복합 장기 부전 및 패혈성 쇼크를 유발하는 모델이다 (Eskandari et al., J Immunol 148(9):2724-2730 (1992)). CLP 모델은 환자들에서 관찰된 패혈증의 과정을 모방하고 초기의 과대한 염증성 반응에 이어 뚜렷한 아-염증 상태를 유도한다. 이 단계 동안에, 동물들은 박테리아 도전에 매우 민감하다 (Wichterman et al., J. Surg. Res. 29(2):189-201 (1980)).

방법:

맹장 결찰 및 천공 (CLP) 모델을 사용한 다균성 감염의 사망률을 WT (+/+) (n=18) 및 MASP-2 (-/-) (n=16) 마우스에서 측정하였다. 간단하게 기술하자면, MASP-2 결핍 마우스 및 그것들의 야생형 새끼들을 마취시키고, 맹장을 적출한 다음 원위 단부위로 30% 결찰시켰다. 그런 다음 매앙을 0.4 mm 직경의 바늘로 1회 천공하였다. 그런 다음 맹장을 복강에 배치하고 피부를 클램프로 닫았다. CLP를 받은 마우?? 생존율을 CLP 후 14일의 기간 동안 모니터링하였다. CLP 후 16시간째의 복강 세척물을 마우스에서 수집하여 박테리아 로드를 측정하였다. 복강 세척물의 연속 희석을 PBS에서 제조하였고 Mueller Hinton 플레이트에서 접종한 다음 계속해서 37℃에서 혐기 조건하에 24시간 동안 인큐베이션한 후 박테리아 로드를 측정하였다.

박테리아 감염에 대한 TNF-알파 사이토킨 반응을 또한 WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 CLP 후 16시간째에 폐 및 비장에서 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)을 통해 측정하였다. WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 CLP 후 16시간째에 TNF-알파의 혈청 수준을 또한 샌드위치 ELISA에 의해 정량하였다.

결과:

도 18은 CLP 과정 후 경과일의 함수로서 CLP 처리된 동물들의 백분율 생존을 그래프로 도시한다. 도 18에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2 (-/-) 마우스에서 렉틴 경로 결핍은 WT (+/+) 마우스에 비교하여 맹장 결찰 및 천공 모델을 사용한 다균성 감염 후에 마우스의 사망률을 증가시키기 않는다. 그러나, 도 19에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2 (-/-) 마우스는 그것들의 WT (+/+) 한배 새끼들과 비교하였을 때 복강 세척물에서 상당히 더 높은 박테리아 로드를 나타냈다 (박테리아 수로 대략 1000-배 증가). 이들 결과는 MASP-2 (-/-) 결핍 마우스가 패혈성 쇼크에 내성임을 가리킨다. 이 모델에서 MASP-2 결핍 마우스에서 감소된 박테리아 클리어런스는, C3 침착이 MASP-2 의존성인 것으로 증명되었기 때문에, 손상된 C3b 중재된 식세포작용에 기인할 수 있다.

박테리아 감염에 대한 TNF-알파 사이토킨 반응은 WT (+/+) 대조표준에 비교하여 MASP-2 (-/-) 마우스에서 상승되지 않은 것으로 측정되었다 (데이터는 제시하지 않음). 또한 MASP-2 (-/-) 마우스와 대조적으로, CLP 후 16시간째에 WT (+/+) 마우스에서 TNF-알파는 상당히 더 높은 혈청 농도인 것으로 측정되었고, 이때 TNF-알파위 혈청 수준은 거의 변화하지 않은 채로 유지되었다. 이들 결과는 패혈성 조건에 대한 격렬한 염증성 반응은 MASP-2 (-/-) 마우스에서 완화되었고 동물이 더 높은 박테리아 카운트의 존재하에서도 생존하는 것을 허용하였음을 시사한다.

이들 결과를 함께 취합하면, 압도적인 패혈증 및 패혈증에 걸린 환자에서 증가된 사망률의 경우 렉틴 경로 보체 활성화의 잠재적인 해로운 효과를 증명한다. 이들 결과는 추가로 MASP-2 결핍이 염증성 면역 반응을 조절하고 패혈증 중에 염증성 중재자의 발현 수준을 감소시키는 것을 증명한다. 그러므로, MASP-2에 대한 억제 단클론성 항체의 투여에 의한 MASP-2 (-/-)의 억제가 패혈성 쇼크로 고생하는 대상에서 염증성 반응을 감소시키는 데 효과적일 것이라고 여겨진다.

실시예 18

이 실시예는 쥐과 비강 내 감염 모델에서 MASP-2 (-/-) 마우스의 분석을 설명한다.

배경/근거:

녹농균은 특히 면역-손상된 개체에서 광범위한 감염을 유발하는 그람 네거티브 기회성 인간 박테리아 병원체이다. 그것은 후천적 병원성 감염, 특히 병원-감염 폐렴의 주요 공급원이다. 또한 그것은 낭포성 섬유증 (CF) 환자들에서 상당한 이병률 및 사망률에 기여한다. 녹농균 폐 감염은 강력한 호중구 충원 및 상당한 폐 염증과 결과적으로 야기된 광범위한 조직 손상을 특징으로 한다 (Palanki M.S. et al., J.　Med. Chem 51:1546-1559 (2008)).

이 실시예에서, MASP-2 (-/-) 마우스에서 렉틴 경로의 제거가 박테리아 감염에 대한 마우스의 취약성을 증가시키는 지의 여부를 측정하기 위하여 연구를 수행하였다.

방법:

22마리의 WT (+/+) 마우스, 22마리의 MASP-2 (-/-) 마우스 및 11마리의 C3 (-/-) 마우스를 녹농균 박테리아 균주의 비강내 투여로 도전시켰다. 마우스들을 감염 후 6일간 모니터링하였고 퍼센트 생존을 나타내는 Kaplan-Mayer 도표를 만들었다.

결과:

도 20은 감염 후 6일 후의 WT (+/+), MASP-2 (-/-) 또는 C3 (-/-) 마우스의 퍼센트 생존의 Kaplan-Mayer 도표이다. 도 20에서 알 수 있는 것과 같이, WT (+/+) 마우스에 대해 MASP-2 (-/-) 마우스에서 차이는 관찰되지 않았다. 그러나 C3 (-/-) 마우스에서 고전적 (C1q) 경로의 제거는 박테리아 감염에 대한 심각한 취약성을 초래하였다. 이들 결과는 MASP-2 억제가 박테리아 감염에 대한 취약성을 증가시키지 않았음을 증명하고, 그것은 외상 환자에서 고전적 보체 경로를 사용하여 감염으로 비약하는 환자의 능력을 손상시키지 않으면서 MASP-2를 억제함으로써 바람직하지 못한 염증성 합병증을 감소시키는 것이 가능한 것을 가리킨다.

실시예 19

이 실시예는 실시예 10에서 기술된 것과 같이 확인된 대표적인 고친화성 항-MASP-2 Fab2 항체의 약물동역학적 분석을 설명한다.

배경/근거:

실시예 10에서 기술된 것과 같이, 래트 렉틴 경로를 차단하는 고친화성 항체들을 확인하기 위하여, 래트 MASP-2 단백질을 활용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 만들었다. 이 라이브러리는 높은 면역학적 다양성을 제공하기 위하여 디자인하였고, 전체 인간 면역글로불린 유전자 서열을 사용하여 구성하였다. 실시예 10에서 기술된 것과 같이, ELISA 스크리닝에 의해 래트 MASP-2 단백질에 고친화성으로 결합하는 대략 250개의 개별 파지 클론을 확인하였다. 이들 클론의 서열화로 50개의 독특한 MASP-2 항체 코드화 파지를 확인하였다. Fab2 단백질을 이들 클론으로부터 발현시키고, 정제하고, MASP-2 결합 친화성 및 렉틴 보체 경로 기능성 억제에 대해 분석하였다.

실시예 10의 표 6에서 알 수 있는 것과 같이, 이 분석의 결과로서 기능성 차단 활성을 가지는 17개의 항-MASP-2 Fab2를 확인하였다 (차단 항체에 대해 34% 히트율). Fab2에 의한 렉틴 보체 경로의 기능성 억제는 C4 침착 수준에서 나타났고, 그것은 MASP-2에 의한 C4 절단의 직접적인 척도이다. 중요하게, 억제는 C3 전환효소 활성이 평가된 때 동등하게 명백하였고, 그것은 렉틴 보체 경로의 기능성 차단을 증명한다. 실시예 10에서 기술된 것과 같이 확인된 17개의 MASP-2 차단 Fab2는 강력하게 C3 전환효소 형성을 억제하고 그때의 IC₅₀ 값은 10 nM 이하이다. 17개의 Fab 중 8개가 나노몰 이하의 범위로 IC₅₀ 값을 가지는 것으로 확인되었다. 나아가, 17개의 MASP-2 차단 Fab2는 모두 도 8a 내지 8c에서 도시되고, 실시예 10의 표 6에서 요약?? 것과 같이, 렉틴 경로 C3 전환효소 분석에서 C3 전환효소 형성의 본질적으로 완전한 억제는 나타냈다. 더욱이, 표 6에 나타낸 17개의 MASP-2 차단 Fab2는 각각 C3b 생성을 강력하게 억제하고 (>95%), 그로써 렉틴 경로 C3 전환효소에 대한 이 분석의 특이성을 증명한다.

래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 전-길이 항체 아이소타입 변이체들을 Fab2 #11로부터 유도하였다. 이 실시예는 약물동역학적 변수에 대해 이들 아이소타입을 생체 내에서 특성확인한 것을 설명한다.

방법:

실시예 10에서 기술된 것과 같이, 래트 MASP-2 단백질을 활용하여 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 만들고, 그것으로부터 Fab2#11을 확인하였다. 래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 전-길이 항체 아이소타입 변이체들을 Fab2 #11로부터 유도하였다. 래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 전-길이 항체 아이소타입을 둘 다 다음과 같이 약물동역학적 변수들에대해 생체 내에서 특성확인하였다.

마우스에서 생체 내 연구:

약물동역학적 연구를 생체 내에서 혈장 렉틴 경로 활성에 미치는 항-MASP-2 항체 투여의 효과를 조사하기 위해 마우스에서 수행하였다. 이 연구에서, C4 침착을 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg의 마우스 항-MASP-2 MoAb (Fab2#11로부터 유도된 마우스 IgG2a 전-길이 항체 아이소타입)의 피하 (sc) 및 복강 내 (ip) 투여 후 다양한 시점에서 렉틴 경로 분석으로 생체 외에서 측정하였다.

도 21은 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg의 마우스 항-MASP-2 MoAb 중 어느 하나의 피하 투여 후 다양한 시점에서 마우스 (n=3 마우스/그룹)로부터 취한 미희석 혈청 샘플에서 생체 외로 측정된, 렉틴 경로 특이적 C4b 침착을 그래프로 도시한다. 항체 투여 전 수집된 마우스로부터의 혈청 샘플은 네거티브 대조표준 (100% 활성)으로서 작용한 한편, 100 nM의 동일한 차단 항-MASP-2 항체로 시험관 내에서 보충된 혈청은 포지티브 대조표준 (0% 활성)으로서 사용하였다.

도 21에 나타낸 결과들은 1.0 mg/kg 용량의 마우스 항-MASP-2 MoAb의 피하 투여 후의 C4b 침착의 신속하고 완전한 억제를 증명한다. C4b 침착의 부분적인 억제는 0.3 mg/kg 용량의 마우스 항-MASP-2 MoAb의 피하 투여 후에 볼 수 있었다.

렉틴 경로 회복의 시간 과정은 마우스에서 0.6 mg/kg의 마우스 항-MASP-2 MoAb의 단일 ip 투여 후에 3주 동안 이어졌다. 도 22에서 알 수 있는 것과 같이, 렉틴 경로 활성의 급강하는 항체 투여 후 발생했고 완전한 렉틴 경로 억제가 ip 투여 후 약 7일 동안 지속되었다. 렉틴의 느린 복원.

이들 결과는 Fab2 #11로부터 유도된 마우스 항-MASP-2 MoAb가 전신적으로 전달될 대 용량-반응 방식으로 마우스의 렉틴 경로를 억제하는 것을 증명한다.

실시예 20

이 실시예는 노화-관련 황반 변성에 대한 마우스 모델에서의 효능에 대해 Fab2 #11로부터 유도된 마우스 항-MASP-2 Moab의 분석을 설명한다.

배경/근거:

실시예 10에서 기술된 것과 같이, 래트 MASP-2 단백질을 활용하여 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 만들고, 그것으로부터 Fab2#11을 기능적으로 활성인 항체로서 확인하였다. 래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 아이소타입의 전 길이 항체를 Fab2 #11로부터 생성하였다. 마우스 IgG2a 아이소타입의 전 길이 항-MASP-2 항체를 실시예 19에서 기술한 것과 같이 약물동역학적 변수들에 대해 특성확인하였다. 이 실시예에서, Fab2 #11로부터 유도된 마우스 항-MASP-2 전-길이 항체를 Bora P.S. et al, J Immunol 174:491-497 (2005)에서 기술된 것과 같이, 노화-관련 황반 변성 (AMD)의 마우스 모델에서 분석하였다.

방법:

실시예 19에서 기술한 것과 같이, Fab2#11로부터 유도된 마우스 IgG2a 전-길이 항-MASP-2 항체 아이소타입을 실시예 13에서 기술한 것과 같은 노화-관련 황반 변성 (AMD)의 마우스 모델에서 다음과 같이 변형시켜서 분석하였다.

마우스-항-MASP-2 MoAb의 투여

두 가지 상이한 용량 (0.3 mg/kg 및 1.0 mg/kg)의 마우스 항-MASP-2 MoAb를 아이소타입 대조표준 MoAb 치료와 함께 CNV 유도 16시간 전에 WT (+/+) 마우스 (n= 8 마우스/그룹)에 주사하였다.

맥락막 혈관신생 (CNV)의 유도

맥락막 혈관신생 (CNV)의 유도 및 CNV의 부피의 측정을 실시예 13에서 기술한 것과 같이 레이저 광응고를 사용하여 수행하였다.

결과:

도 23은 아이소타입 대조표준 MoAb 또는 마우스 항-MASP-2 MoAb (0.3 mg/kg 및 1.0 mg/kg) 중 어느 하나로 처리된 마우스에서 레이저 손상 후 7일째에 측정된 CNV 구역을 그래프로 도시한다. 도 23에서 알 수 있는 것과 같이, 1.0 mg/kg 항-MASP-2 MoAb로 사전처리된 마우스에서, CNV의 통계학적으로 유의미한 (p <0.01) 대략 50%의 감소가 레이저 처리 후 7일째에 관찰되었다. 도 23에서 추가로 알 수 있는 것과 같이, 0.3 mg/kg 용량의 항-MASP-2 MoAb는 CNV 감소에 효능을 나타내지 않은 것으로 관찰되었다. 0.3 mg/kg 용량의 항-MASP-2 MoAb는 실시예 19에서 기술되고 도 21에서 알 수 있는 것과 같이, 피하 투여 후에 C4 침착의 부분적이고 일시적인 억제를 나타냈다.

이 실시예에서 기술된 결과들은 억제제, 예컨대 항-MASP-2 MoAb로의 MASP-2의 차단이 황반 변성의 치료에 예방적이고 및/또는 치료적인 효과를 가지는 것을 증명한다. 이들 결과는 실시예 13에서 기술된, MASP-2 (-/-) 마우스에서 수행된 연구에서 관찰된 결과들과 일치하는 것이 주지되는데, 이때 레이저 처리 후 7일째에 야생형 대조 마우스에 비교하여 MASP-2 (-/-) 마우스에서 CNV의 30% 감소가 관찰되었다. 더욱이, 이 실시예의 결과들은 추가로 전신적으로 전달된 항-MASP-2 항체가 눈에 국소적 치료 유익을 제공하고, 그로써 AMD 환자들에 대한 전신적 투여 경로에 대한 잠재성을 강조한다. 요약하면, 이들 결과는 AMD의 치료에 MASP-2 MoAb의 사용을 지지하는 증거를 제공한다.

실시예 21

이 실시예는 MASP-2 결핍 마우스가 나이세리아 메닝기티디스로 감염된 후에 N. 메닝기티디스 유도된 사망으로부터 보호되고 야생형 대조 마우스에 비교하여 균혈증의 증강된 클리어런스를 가지는 것을 증명한다.

근거: 나이세리아 메닝기티디스는 수막염 및 수막염구균균혈증과 같은 수막염구균성 질병의 다른 형태에서의 역할에 대해 알려져 있는 종속영양성 그람-네거티브 쌍구균성 박테리아이다. N. 메닝기티디스는 아동기 중의 이병 및 사망의 주된 원인이다. 심각한 합병증은 패혈증, 워터하우스-프리데릭센 증후군, 부신 기능부전 및 산재성 혈관내 응고 (DIC)를 포함한다. 예컨대 Rintala E. et al., Critical Care Medicine 28(7):2373-2378 (2000) 참조. 이 실시예에서, MASP-2 결핍 마우스가 N. 메닝기티디스 유도된 사망에 민감한 지의 여부를 해명하기 위하여 MASP-2 (-/-) 및 WT (+/+) 마우스에서 렉틴 경로의 역할을 분석하였다.

방법:

MASP-2 녹아웃 마우스를 실시예 1에서 기술한 대로 생성하였고 적어도 10세대 동안 C57Bl/6과 역교배시켰다. 10주령의 MASP-2 KO 마우스 (n=10) 및 야생형 C57/B6 마우스 (n=10)를 400　mg/kg의 철 덱스트란 중의 5x10⁸ cfu/100 μl, 2x10⁸ cfu/100 μl 또는 3x10⁷ cfu/100 μl 중 어느 하나의 단위용량의 나이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491로 정맥 내 주사함으로써 접종하였다. 감염 후 마우스의 생존을 72시간의 기간에 걸쳐 모니터링하였다. 혈액 샘플을 감염 후 매시간 간격으로 마우스로부터 취하고 감염을 증명하고 혈청으로부터 박테리아의 클리어런스 속도를 측정하기 위하여 N. 메닝기티디스의 혈청 수준 (로그 cfu/ml)을 측정하기 우해 분석하였다.

결과:

도 24a는 5x10⁸ cfu/100 μl의 감염 용량의 N. 메닝기티디스의 투여 후에 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존을 그래프로 도시한다. 도 24a에서 알 수 있는 것과 같이, 가장 높은 용량인 5x10⁸/100 μl cfu의 N. 메닝기티디스로의 감염 후에, 100%의 MASP-2 KO 마우스가 감염 후 72시간 동안 내내 생존하였다. 대조적으로 WT 마우스는 단지 20%만이 감염 후 24시간 후에 생존하였다. 이들 결과는 MASP-2 결핍 마우스가 N. 메닝기티디스 유도된 사망으로부터 보호되었음을 증명한다.

도 24b는 5x10⁸ cfu/100 μl의 N. 메닝기티디스로 감염된 MASP-2 KO 및 WT 마우스로부터 취한 혈액 샘플에서 상이한 시점에 회수된 N. 메닝기티디스의 로그 cfu/ml을 그래프로 도시한다. 도 24b에서 알 수 있는 것과 같이, WT 마우스에서, 혈액 중의 N. 메닝기티디스의 수준은 감염 후 24시간에는 약 6.5 로그 cfu/ml의 피크에 도달하였고 감염 후 48시간에는 0으로 떨어졌다. 대조적으로, MASP-2 KO 마우스에서, N. 메닝기티디스의 수준은 감염 후 6시간에는 3.5 로그 cfu/ml의 피크에 도달하였고 감염 후 36시간에는 0으로 떨어졌다.

도 25a는 2x10⁸ cfu/100 μl의 감염 용량의 N. 메닝기티디스의 투여 후에 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존을 그래프로 도시한다. 도 25a에서 알 수 있는 것과 같이, 5x10⁸cfu/100 μl의 N. 메닝기티디스로의 감염 후에, 100%의 MASP-2 KO 마우스가 감염 후 72시간 동안 내내 생존하였다. 대조적으로 WT 마우스는 단지 80%만이 감염 후 24시간 후에 여전히 생존하였다. 도 24a에 나타낸 결과와 일치하게, 이들 결과는 MASP-2 결핍 마우스가 N. 메닝기티디스 유도된 사망으로부터 보호되었음을 증명한다.

도 25b는 2x10⁸ cfu/100 μl의 N. 메닝기티디스로 감염된 WT 마우스로부터 취한 혈액 샘플에서 상이한 시점에 회수된 N. 메닝기티디스의 로그 cfu/ml을 그래프로 도시한다. 도 25b에서 알 수 있는 것과 같이, WT 마우스의 혈액에서, N. 메닝기티디스의 수준은 감염 후 12시간에는 약 4 로그 cfu/ml의 피크에 도달하였고 감염 후 24시간에는 0으로 떨어졌다. 도 25c는 2x10⁸ cfu/100 μl의 N. 메닝기티디스로 감염된 MASP-2 KO 마우스로부터 취한 혈액 샘플에서 상이한 시점에 회수된 N. 메닝기티디스의 로그 cfu/ml을 그래프로 도시한다. 도 25c에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2 KO 마우스의 혈액에서, N. 메닝기티디스의 수준은 감염 후 2시간에는 3.5 로그 cfu/ml의 피크에 도달하였고 감염 후 3시간에는 0으로 떨어졌다. 도 24b에 나타낸 결과와 일치하게, 이들 결과는 MASP-2 KO 마우스가 WT 마우스처럼 동일한 용량의 N. 메닝기티디스로 감염되었지만, MASP-2 KO 마우스는 WT에 비교하여 균혈증의 증강된 클리어런스를 나타냈음을 증명한다.

최저 용량의 3x10⁷ cfu/100 μl의 N. 메닝기티디스로 감염된 후의 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존은 72시간 기간에 100%였다 (데이터는 제시하지 않음).

논의

이들 결과는 MASP-2 결핍 마우스가 WT 마우스에 비교하여 N. 메닝기티디스 유도된 사망으로부터 보호되고 균혈증의 증강된 클리어런스를 나타냈음을 보인다. 그러므로, 이들 결과의 관점에서, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 MoAb의 치료적 적용은 N. 메닝기티디스 박테리아로의 감염의 영향 (즉 패혈증 및 DIC)을 치료, 예방 또는 경감시키는 데 효력이 있는 것으로 예상될 수 있다. 나아가, 이들 결과는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 MoAb의 치료적 적용이 대상이 N. 메닝기티디스 감염에 걸릴 위험이 증가되도록 만들지는 않을 것이라는 것을 가리킨다.

실시예 22

이 실시예는 보체 C3의 신규한 렉틴 경로 중재되고 MASP-2 의존성 C4-우회 활성화의 발견을 설명한다.

근거:

심근 허혈/재관류 손상 (MIRI)을 제한하기 위해 보체 활성화의 억제제를 활용할 때의 원칙적인 치료 유익은 20년 전 심근 경색의 실험 래트 모델에서 설득력있게 증명되었다: 세포 표면 보체 수용체 유형-1 (CR1)의 가용성 절단된 유도체인 재조합 sCR1을 정맥 내로 제공하고 그것의 영향을 MIRI의 래트 생체 내 모델에서 평가하였다. sCR1으로의 처리는 경색의 부피를 40% 이상 감소시켰다 (Weisman, H.F., et al., Science 249:146-151 (1990)). 이 재조합 억제제의 치료적 잠재력은 계속해서 MI에 걸린 환자들에서 sCR1의 투여가 허혈 수 심장의 위축성 기능부전을 방지했음을 보여주는 임상 실험에서 증명되었다 (Shandelya, S., et al., Circulation 87:536-546 (1993)). 그러나, 허혈 조직에서 보체의 활성화를 유도하는 일차 메커니즘은 주로 적절한 실험 모델의 결핍, 산소-박탈 세포의 보체 활성화를 유도하는 분자 과정에 대한 제한된 이해 및 상이한 보체 활성화 경로간의 상호간섭 및 상조작용으로 인해 궁극적으로 규정되지 않았다.

면역 반응의 기초적인 성분으로서, 보체 시스템은 항체-의존성 및 항체-무관한 메커니즘 둘 다를 통해 침입 미생물에 대한 보호를 제공한다. 그것은 많은 세포 및 체액 상호작용, 이를테면 화학주성, 식세포작용, 세포 부착 및 B-세포 분화를 면역 반응 내에서 조정한다. 3가지의 상이한 경로는 보체 캐스케이드를 개시한다: 고전적 경로, 대체 경로 및 렉틴 경로. 고전적 경로 인식 하위성분 C1q는 다양한 표적 -가장 두드러지게는 면역 복합체-에 결합하여 결합된 세린 프로테아제의 단계식 활성화를 개시하고, C1r 및 C1s는 적응성 면역 시스템에 의한 맞물림 후에 병원체와 면역 복합체 클리어런스에 대한 주요 메커니즘을 제공한다. 면역 복합체에의 C1q의 결합은 C1r 자이모겐 이량체를 절단을 위해 그것의 활성 형태로 전환시키고 그로써 C1s를 활성화시킨다. C1s는 C1q 결합을 2개의 절단 부위의 보체 활성화로 번역한다: 먼저 C4를 C4a 및 C4b로 전환한 후 C4b-결합된 C2를 절단하여 C3 전환효소 C4b2a를 형성한다. 이 복합체는 풍부한 혈장 성분 C3를 C3a와 C3b로 전환한다. C4b2a 복합체와 아주 가까이에 C3b의 축적은 C3에 대한 기질 특이성을 C5로 변동시켜서 C5 전환효소 C4b2a(C3b)_n을 형성하게 한다. 고전적 경로 활성화를 통해 생성된 C3 및 C5 전환효소 복합체는 렉틴 경로 활성화 루트를 통해 성성된 것들과 동일하다. 대체 경로에서, 성분 C3의 자발적 저-수준 가수분해는 단백질 단편즐의 세포 표면위로의 침착을 초래하여 외래 세포에 대한 보체 활성화를 야기하는 한편, 숙주 조직 상의 세포-결합된 조절 단백질들은 활성화를 피함으로써 자체-손상을 방지한다. 대체 경로처럼, 렉틴 경로는 면역 복합체의 부재시에 활성화될 수 있다. 활성화는 주로 박테리아, 진균 또는 바이러스 병원체 상에 존재하는 탄수화물 구조 또는 아폽토시스 세포, 괴사 세포, 악성 종양 세포 또는 산소-박탈된 세포 상의 일탈적인 글리코실화 패턴인 병원체-관련 분자 패턴 (Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP))에 대한 다중-분자 렉틴 경로 활성화 복합체의 결합에 의해 개시된다 (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 156:1549-1556 (2000); Walport, M.J., N. Engl. J. Med. 344:1058-1066 (2001); Schwaeble, W., et al., Immunobiology 205:455-466 (2002); and Fujita, T., Nat. Rev. Immunol. 2:346-353 (2002)).

만난-결합 렉틴 (MBL)은 MBL-관련 세린 프로테아제 (MASP)로 명명되고 그것들의 발견 순서에 따라 넘버링된 (즉 MASP-1, MASP-2 및 MASP-3), 신규한 세린 프로테아제 그룹과 복합체를 형성하는 것으로 밝혀진 제 1 탄수화물 인식 하위성분이었다. 남자에서, 렉틴 경로 활성화 복합체는 상이한 탄수화물 결합 특이성을 가지는 4개의 대체 탄수화물 인식 하위성분, 즉 MBL 2 및 피콜린 패밀리의 3가지 상이한 구성원, 즉 L-피콜린, H-피콜린 및 M-피콜린 및 MASP로 형성될 수 있다. MBL의두 가지 형태, MBL A 및 MBL C와 피콜린-A는 마우스 및 래트 혈장에서 MASP와 렉틴 활성화 경로 복합체를 형성한다. 본 발명자들은 MASP-2 및 추가의 절단된 10 kDa의 MASP-2 유전자 생성물을 이전에 클론하고 특성확인하였고, 인간, 마우스 및 래트에서 MAp19 또는 sMAP로 명명하였다 (Thiel, S., et al., Nature 386:506-510 (1997);. Stover, C.M., et al., J. Immunol. 162:3481-3490 (1999); Takahashi, M., et al., Int. Immunol. 11:859-863 (1999); and Stover, C.M., et al., J. Immunol. 163:6848-6859 (1999)). MAp19/ sMAP는 프로테아제 활성은 없지만, MASP의 탄수화물 인식 복합체에의 결합에 대해 경합함으로써 렉틴 경로 활성화를 조절할 수 있다 (Iwaki, D. et al., J. Immunol. 177:8626-8632 (2006)).

세 가지의 MASP 중에서 오직 MASP-2만이 렉틴 경로 인식 복합체의 결합을 완전환 활성화로 번역하는 데 필요한 것을 시사하는 증거가 있다 (Thiel, S., et al. (1997); Vorup-Jensen, T., et al., J. Immunol. 165:2093-2100 (2000); Thiel, S., et al., J. Immunol. 165:878-887 (2000); Rossi, V., et al., J. Biol. Chem. 276:40880-40887 (2001)). 이 결론은 MASP-1 및 MASP-3이 결핍된 가장 최근에 기술된 마우스 계통의 표현형에 의해 강조된다. 시험관 내에서의 렉틴 경로 중재된 보체 활성화의 개시의 지연과 별도로 MASP-1/3 결핍 마우스는 렉틴 경로 기능적 활성을 보유하고 있다. 재조합 MASP-1을 사용한 MASP-1 및 MASP-3 결핍 혈청의 재구성은 이런 렉틱 경로 활성화의 지연을 극복하게 하고, 그것은 MASP-1이 MASP-2 활성화를 용이하게 할 수 있음을 의미한다 (Takahashi, M., et al., J. Immunol. 180:6132-6138 (2008)). 가장 최근의 연구는 MASP-1 (및 아마도 또한 MASP-3)이 대체 경로 활성화 효소 인자 D를 그것의 자이모겐 형태로부터 그것의 효소적 활성 형태로 전환시키는 데 필요하다는 것을 밝혔다 (Takahashi, M., et al., J. Exp. Med. 207:29-37 (2010)). 이 과정의 생리적 중요성은 MASP-1/3 결핍 마우스의 혈장의 대체 경로 기능적 활성의 부재에 의해 강조된다.

렉틴 경로 탄수화물 인식 하위성분 MBL A 및 MBL C의 표적화된 결핍이 조합되어 있는, 최근에 생성된 마우스 계통은 여전히 남아있는 쥐과 렉틴 경로 인식 하위성분 피콜린 A를 통해 렉틴 경로 활성화를 개시할 수 있다 (Takahashi, K., et al., Microbes Infect. 4:773-784 (2002)). MASP-2 결핍 마우스의 어떠한 잔류하는 렉틴 경로 기능적 활성의 부재는 건강하거나 병든 선천적 체액 면역성의 이런 이펙터 아암의 역할을 연구하기 위한 결정적 모델을 내놓게 한다.

C4 및 MASP-2 결핍 마우스 계통을 활용하여 본 발명자들은 보체 C3의 신규한 렉틴 경로 특이적인, 그러나 MASP-2 의존성인 C4-우회 활성화 루트를 규정할 수 있었다. 이 신규한 렉틴 경로 중재된 C4-우회 활성화 루트의 허혈-후 조직 손실을 향한 본질적인 기여는 MIRI에서 MASP-2 결핍의 우세한 보호형 표현형에 의해 강조되는 한편, 동일 모델에서 시험된 C4-결핍 마우스는 보호를 나타내지 않았다.

이 실시예에서, 본 발명자드른 보체 C3의 신규한 렉틴 경로 중재된 및 MASP-2 의존성 C4-우회 활성화를 설명한다. 이 신규한 활성화 루트의 생리적 관련성은 심근 허혈/재관류 손상 (MIRI)의 실험 모델에서 MASP-2 결핍의 보호형 표현형에 의해 수립되며, 이때 C4 결핍 동물들은 보호되지 않았다.

방법:

MASP-2 결핍 마우스는 총체적인 비정상을 보이지 않는다. MASP-2 결핍 마우스를 실시예 1에서 기술한 대로 생성하였다. 이형접합성 (^+/-) 및 동형접합성 (^-/-) MASP-2 결핍 마우스는 건강하고 수태가능하며, 총체적인 비정상을 보이지 않는다. 그것들의 기대수명은 그것들의 WT 한배 새끼들의 그것과 유사하다 (>18개월). 이들 마우스의 표현형을 질환의 실험 모델에서 연구하기 전에, 본 발명자들의 MASP-2^-/- 라인을 11세대 동안 C57BL/6 배경에 대해 역교배하였다. MASP-2 mRNA의 총 부재를 폴리 A+ 선택된 간 RNA 제제의 노던 블롯팅에 의해 확인한 한편, MAp19 또는 sMAP (MASP2 유전자의 절단된 선택적 스플라이싱 생성물)를 코드화하는 1.2kb mRNA가 풍부하게 발현된다.

MASP-2 (B 사슬)의 세린 프로테아제 도메인에 대한 코딩 서열 또는 A-사슬에 대한 코딩 서열의 나머지 중 어느 하나에 특이적인 프라이머쌍을 사용한 qRT-PCR 분석은 B 사슬 코드화 mRNA를 MASP-2 ^-/- 마우스에서는 검출할 수 없는 한편 파괴된 A 사슬 mRNA 전사물의 풍부함은 상당히 증가된 것을 보였다. 마찬가지로, MAp19/sMAP 코드화 mRNA의 풍부함은 MASP-2 ^+/- 및 MASP-2 ^-/- 마우스에서 증가된다. ELISA에 의해 각 유전형의 5마리씩의 동물에 대해 측정된 혈장 MASP-2 수준은 WT 대조표준에 대해서는 300 ng/ml (260 내지 330 ng/ml 범위), 이형접합성 마우스에 대해서는 360ng/ml (330 내지 395 ng/ml 범위)였고 MASP-2 ^-/- 마우스에서는 검출할 수 없었다. qRT-PCR을 사용하여, mRNA 발현 프로필을 수립하였고, MASP-2^-/-마우스가 MBL A, MBL C, 피콜린 A, MASP-1, MASP-3, C1q, C1rA, C1sA, 인자 B, 인자 D, C4 및 C3에 대한 mRNA를 그것들의 MASP-2 충분한 한배 새끼들의 그것과 유사한 풍부함으로 발현하는 것을 증명하였다 (데이터는 제시하지 않음).

MASP-2^-/- (n=8) 및 MASP-2^+/+ (n=7) 한배 새끼들의 혈장 C3 수준을 상업적으로 입수가능한 마우스 C3 ELISA 키트 (Kamiya, Biomedical, Seattle, WA)를 사용하여 측정하였다. MASP-2 결핍 마우스의 C3 수준 (평균 0.84 mg/ml, +/- 0.34)은 WT 대조표준의 그것 (평균 0.92, +/- 0.37)과 유사하였다.

결과:

MASP-2는 렉틴 경로 기능적 활성에 필수적이다.

실시예 2 에 기술되고 도 5에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2^-/-혈장의 시험관 내 분석은 C4의 활성화에 대해 활성화하는 만난- 및 자이모산-코팅된 표면 상에서 렉틴 경로 기능적 활성이 총체적으로 없음을 보였다. 마찬가지로, 렉틴 경로-의존성 C4나 C3 절단을, MBL A, MBL C 및 피콜린 A와 결합하여 그것을 통해 활성화를 야기하는 N-아세틸 글루코사민으로 코팅된 표면상에서 MASP-2^-/- 혈장에서 검출할 수 없었다 (데이터는 제시하지 않음).

MASP-2-/-마우스의 혈청 및 혈장의 분석은 분명하게 MASP-2가 렉틴 경로를 통해 보체를 활성화하기 위해 필수적으로 필요하다는 것을 증명하였다. 그러나, 렉틴 경로 기능적 활성의 총체적 결핍은 다른 보체 활성화 경로를 무상으로 남긴다: MASP-2-/- 혈장은 여전히 고전적 (도 26a) 및 대체 경로 (도 26b)를 통해 보체를 활성화할 수 있다. 도 26a 및 26b에서, 기호 "*"는 WT (MASP-2 (+/+))로부터의 혈청을 나타내고; 기호 "●"는 WT (C1q 고갈됨)로부터의 혈청을 나타내며; 기호 "□"는 MASP-2 (-/-) (C1q 고갈됨)로부터의 혈청을 나타낸다.

도 26a는 MASP-2-/- 마우스가 기능성 고전적 경로를 보유한 것을 그래프로 도시한다: C3b 침착을 면역 복합체 (BSA로 코팅한 후 염소 항-BSA IgG를 첨가함으로써 제자리 생성됨)로 코팅된 미세역가 플레이트상에서 분석하였다. 도 26b는 MASP-2 결핍 마우스가 기능성 대체 경로를 보유한 것을 그래프로 도시한다: C3b 침착을 단지 대체 경로 활성화만을 허용하는 조건하에서 자이모산 코팅된 미세역가 플레이트 상에서 분석하였다 (Mg²⁺ 및 EGTA를 함유하는 완충액). 도 26a 및 26b에 나타낸 결과들은 이중의 평균이고 3개의 독립적인 실험에 전형적인 것이다. 혈장 공급원에 대한 동일한 기호를 전체적으로 사용하였다. 이들 결과는 도 26b에서 도시된 결과들에서 증거되는 것과 같이, 대체 경로를 직접적으로 야기하는 한편 고전적 경로 및 렉틴 경로 둘 다는 비활성화하도록 디자인된 실험 조건하에서 기능성 대체 경로가 MASP-2 결핍 마우스에 존재하는 것을 보여준다.

보체 활성화의 렉틴 경로는 심근 허혈/재관류 손상 (MIRI)에서 염증성 조직 손실에 결정적으로 기여한다.

렉틴 경로 기능적 활성의 MIRI에의 기여를 연구하기 위하여, 본 발명자들은 MIRI의 모델에서 관상 동맥의 좌측 전방 하향 분지 (LAD)의 일시적인 결찰 및 재관류 후에 MASP-2^-/-마우스와 WT 한배새끼 대조표준을 비교하였다. 보체 C4의 존재 또는 부재는 MIRI에서 허혈성 조직 손실의 정도에 아무 영향을 미치지 않았다. 본 발명자들은 실험적 MIRI 후에 경색 크기에 미치는 C4 결핍의 충격을 평가하였다. 도 27a 및 도 27b에서 알 수 있는 것과 같이, C4-결핍 마우스 및 그것들의 WT 한배새끼 둘 다에서 동일한 경색 크기를 관찰하였다. 도 27a는 C4-/- 마우스 (n=6) 및 매치되는 WT 한배새끼 대조표준 (n=7)에서의 LAD 결찰 및 재관류 후에 MIRI-유도된 조직 손실을 그래프로 도시한다. 도 27b는 C4-/- 마우스가 그것들의 WT 대조표준 (점선)처럼 MIRI에 취약한 것을 분명하게 증명하는, AAR의 함수로서의 INF를 그래프로 도시한다.

이들 결과는 C4 결핍 마우스가 MIRI로부터 보호되지 않는 것을 증명한다. 이 결과는 예상하지 못했던 것인데, 주요 C4 활성화 단편, C4b가 고전적 및 렉틴 경로 C3 전환효소 C4b2a의 필수 성분이라는 광범위하게 수용된 관점과 충돌하기 때문이다. 그러므로 본 발명자들은 보체 C3의 잔류하는 렉틴 경로 특이적 활성화가 C4-결핍 마우스 및 인간 혈장에서 검출될 수 있는지를 평가하였다.

렉틴 경로는 신규한 MASP-2 의존성 C4-우회 활성화 루트를 통해 C4의 부재시에 보체 C3를 활성화할 수 있다.

C4-결핍 기니아 피그 혈청에서 C4-우회 활성화 루트의 존재를 가리키는 역사적인 보고 (May, J.E., and M. Frank, J. Immunol. 111:1671-1677 (1973))에 고무되어, 본 발명자들은 C4-결핍 마우스가 잔류하는 고전적 또는 렉틴 경로 기능적 활성을 가질 수 있는 지를 분석하였고 대체 경로의 기여를 배제하는 경로-특이적 분석 조건하에서 C3의 활성화를 모니터링하였다.

C3b 침착을 대체 경로 활성화를 금지할만한 혈장 농도 (1.25% 및 그 아래)에서 재칼슘경화된 혈장을 사용하여 만난-코팅된 미세역가 플레이트상에서 분석하였다. 고전적 경로 활성화에 대해 시험한 C4-결핍 혈장에서 C3의 절단을 검출할 수 없었던 (데이터는 제시하지 않음) 한편, 렉틴 경로를 통해 보체 활성화를 개시했을 때 C4-결핍 마우스 혈장에서 강력한 잔류 C3 절단 활성이 관찰되었다. 렉틴 경로 의존성을 가용성 만난과 함께 C4-결핍 혈장 희석을 사전인큐베이션한 후에 C3 절단의 경합성 억제에 의해 측정한다 (도 28a 참조). 도 28a 내지 28d에서 알 수 있는 것과 같이, C3의 MASP-2 의존성 활성화를 C4가 없을 때 관찰하였다. 도 28a는 C4+/+ (십자형) 및 C4-/- (흰색 원형) 마우스 혈장에 의한 C3 침착을 그래프로 도시한다. 분석 전에 과잉 (1 μg/ml) 유동상 만난과 함께 C4-/- 혈장의 사전 인큐베이션은 C3 침착을 완전히 억제한다 (검은색 원형). 결과들은 3개의 독립적인 실험에 전형적이다. 도 28b는 야생형, MASP-2 결핍 (흰색 사각형) 및 C4-/-마우스 혈장 (1%)이 다양한 농도의 항-래트 MASP-2 mAbM11 (abscissa)과 혼합되고 C3 침착이 만난-코팅된 플레이트 상에서 분석되는 실험의 결과를 그래프로 도시한다. 결과들은 4회 분석 (각 유형의 혈장 중 2개의 이중)의 평균 (± SD)이다. 도 28c는 인간 혈장에서의 실험 결과들을 그래프로 도시한다: NHS 모음 (십자형), C4-/- 혈장 (흰색 원형) 및 1 μg/ml 만난과 사전-인큐베이션된 C4-/- 혈장 (검은색 원형). 결과들은 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. 도 28d는 항-인간 MASP-2 mAbH3에 의한 C4 충분 및 C4 결핍 인간 혈장 (1%)의 C3b 침착의 억제를 그래프로 도시한다 (삼중 실험의 평균 ± SD). 도 28b에서 알 수 있는 것과 같이, 나란히 분석된 MASP-2-/-혈장에서 렉틴 경로-의존성 C3 활성화는 검출할 수 없었고, 그것은 C3의 이런 C4-우회 활성화 루트가 MASP-2 의존성임을 의미한다.

추가로 이들 발견을 확증하기 위하여, 본 발명자들은 재조합 인간 및 래트 MASP-2A (활성 프로테아제 도메인의 세린 잔기가 부위-특정 돌연변이생성에 의해 알라닌으로 대체되어 있어서 항원의 자가용해성 분해가 방지됨)에 대한 친화성 스크리닝에 의해 파지 디스플레이 항체 라이브러리로부터 분리된 일련의 재조합 억제 mAb를 수립하였다. MASP-2에 대한 재조합 항체들 (AbH3 및 AbM11)을 Combinatorial Antibody Libraries (Knappik, A., et al., J. Mol. Biol. 296:57-86 (2000))로부터, 항원으로서 재조합 인간 및 래트 MASP-2A를 사용하여 분리하였다 (Chen, C.B. and Wallis, J. Biol. Chem. 276:25894-25902 (2001)). 마우스 혈장 (IC50 ~1 nM)에서 C4 및 C3의 렉틴 경로-중재된 활성화를 강력하게 억제한 항-래트 Fab2 단편을 전-길이 IgG2a 항체로 전환시켰다. 다클론성 항-쥐과 MASP-2A 항혈청을 래트에서 생성시켰다. 이들 도구로 본 발명자들은 아래에서 더 기술하는 것과 같이, 이 신규한 C3의 렉틴 경로 특이적 C4-우회 활성화 루트의 MASP-2 의존성을 확인할 수 있었다.

도 28b에서 알 수 있는 것과 같이, 마우스 및 래트 MASP-2에 선택적으로 결합하는 억제 단클론성 항체인 M211은 C4-결핍 마우스에서 C3의 C4-우회 활성화뿐 아니라 WT 마우스 혈장의 C3 활성화를, 유사한 IC₅₀ 값을 가지는 농도 의존 방식으로 렉틴 경로를 통해 억제하였다. 모든 분석을 대체 경로 활성화 루트를 기능부전으로 만드는 경향이 있는 높은 혈장 희석에서 수행하였다 (최고 혈장 농도는 1.25%임).

인간에서 C3의 유사한 렉틴 경로 특이적 C4-우회 활성화의 존재를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 인간 C4 유전자들 (즉 C4A 및 C4B) 둘 다의 고유한 결핍을 가짐으로써 C4의 총체적인 부재를 초래하는 공여자의 혈장을 분석하였다 (Yang, Y., et al., J. Immunol. 173:2803-2814 (2004)). 도 28c는 고혈장 희석 (대체 활성화 경로는 기능부전으로 만든다)에서 이 환자의 혈장이 C3를 효율적으로 활성화하는 것을 나타낸다. 만난-코팅된 플레이트상에 C3 활성화의 렉틴 경로 특이적 방식은 쥐과 C4-결핍 혈장 (도 28a) 및 인간 C4 결핍 혈장 (도 28c)에서 과잉 농도의 유동상 만난을 첨가함으로써 증명된다. 인간 C4-결핍 혈장에서 C3의 이런 활성화 메커니즘의 MASP-2 의존성을 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하고 MASP-2 기능적 활성을 제거하는 단클론성 항체인 AbH3을 사용하여 평가하였다. 도 28d에서 알 수 있는 것과 같이, AbH3은 C4-충분 및 C4-결핍 인간 혈장에서 비교할만한 효능으로 C3b (및 C3dg)의 침착을 억제하였다.

C3의 C4-우회 활성화에서 다른 보체 성분들의 가능한 역할을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 MASP-1/3-/- 및 Bf/C2-/-마우스의 혈장을 MASP-2-/-, C4-/- 및 C1q-/- 혈장 (대조표준으로서)과 함께 렉틴 경로 특이적 및 고전적 경로 특이적 분석 둘 다의 조건하에서 시험하였다. C3 절단의 상대적 양을 WT 혈장을 사용하였을 때 침착된 C3의 양에 대해 도표화하였다.

도 29a는 렉틴 활성화 경로 또는 고전적 활성화 경로 특이적 분석 조건하에서 시험된 다양한 보체 결핍 마우스 계통들로부터의 혈장에서 C3 전환효소 활성의 비교할만한 분석을 그래프로 도시한다. WT 마우스 (n=6), MASP-2-/-마우스 (n=4), MASP-1/3-/- 마우스 (n=2), C4-/- 마우스 (n=8), C4/MASP-1/3-/- 마우스 (n=8), Bf/C2-/- (n=2) 및 C1q-/- 마우스 (n=2)의 희석된 혈장 샘플 (1%)을 나란히 시험하였다. 2.5 μg/ml의 재조합 래트 C2 (Bf/C2-/- +C2)를 사용한 Bf/C2-/- 혈장의 재구성으로 C3b 침착을 회복시켰다. 도 29a에서 알 수 있는 것과 같이, 실질적인 C3 침착을 고전적 경로 특이적 조건이 아닌 렉틴 경로 특이적 분석 조건하에서 시험한 C4-/- 혈장에서 볼 수 있다. 다시 한 번 말하면, C3 침착은 렉틴 경로 활성화 루트를 통해서 MASP-2 결핍 혈장에서 볼 수 없는 한편, 동일한 혈장을 고전적 경로를 통해 C3을 침착시켰다. MASP-1/3-/- 혈장에서, C3 침착은 렉틴 및 고전적 경로 특이적 분석 조건 둘 다에서 발생하였다. C3 침착을 C4 및 MASP-1/3의 결핍이 조합된 혈장에서, 렉틴 경로 또는 고전적 경로 특이적 조건들을 사용하여 볼 수 없었다. C2/Bf-/- 혈장에서, 렉틴 경로를 통해서나 고전적 경로를 통해서 C3 침착을 검출할 수 없다. 그러나, 재조합 C2를 사용한 C2/Bf-/- 마우스 혈장의 재구성은 렉틴 경로 및 고전적 경로-중재된 C3 절단을 둘 다 회복시켰다. 분석 조건은 C1q-/- 혈장을 사용하여 확인하였다.

도 29b는 렉틴 활성화 경로 특이적 분석 조건하에 시험한 다양한 보체 결핍 마우스 계통 WT, fB-/-, C4-/-, MASP-1/3-/- 및 MASP-2-/-혈장으로부터의 혈장에서 C3 전환효소 활성의 시간-해소 동역학을 그래프로 도시한다 (1% 혈장, 결과들은 3개의 독립적 실험의 결과이다). 도 29b에서 알 수 있는 것과 같이, C3 절단을 MASP-2-/-혈장, fB-/- 혈장에서 볼 수 없는 한편, C3은 WT 혈장에 대한 것과 유사한 동역학으로 절단되었다. C3의 C3b (및 C3dg)로의 렉틴 경로-의존성 전환의 상당한 지연을 C4-/- 뿐만 아니라 MASP-1/3 결핍 혈장에서 볼 수 있었다. 이런 MASP-1/3-/- 혈장에서의 C3 활성화의 지연은 최근에 MASP-3 의존성이기보다는 MASP-1 의존성인 것으로 밝혀졌다 (Takahashi, M., et al., J. Immunol. 180:6132-6138 (2008)).

논의:

이 실시예에서 기술된 결과들은 MASP-2 기능적 활성이 C4의 존재 및 부재 둘 다의 조건에서 렉틴 경로를 통한 C3의 활성화에 필수적인 것을 강력하게 시사한다. 나아가, C2 및 MASP-1은 이런 C3의 신규한 렉틴 경로 특이적 C4-우회 활성화 루트가 작동하는 데 필요하다. MASP-2-/-뿐만 아니라 C4-/- 혈장에서 렉틴 경로 기능적 활성의 비교 분석은 이전에 인식하지 못했던 보체 C3의 C4-독립적, 그러나 MASP-2-의존성 활성화 루트의 존재를 드러냈고, C3이 총체적으로 C4가 없을 때 렉틴 경로-의존적 방식으로 활성화될 수 있음을 나타냈다. 이 신규한 MASP-2 의존성 C3 전환효소의 활성화사건의 상세한 분자 조성 및 서열은 아직 설명의 여지가 있는 한편, 본 발명자들의 결과는 이 C4-우회 활성화 루트가 보체 C2 뿐만 아니라 MASP-1의 존재를 추가로 필요로 한다는 것을 의미한다. 조합된 C4 및 MASP-1/3 결핍을 가지는 마우스의 혈장에서 렉틴 경로-중재된 C3 절단 활성의 손실은 MASP-2의 직접적인 절단 및 활성화를 통해 MASP-2 의존성 보체 활성화를 증강시키기 위한 MASP-1의 역할에 대해 가장 최근에 기술된 것에 의해 설명될 수 있다 (akahashi, M., et al., J. Immunol. 180:6132-6138 (2008)). 마찬가지로, MASP-1은 C2를 절단하는 능력을 통해 MASP-2 기능적 활성을 보조할 수 있다 (Moller-Kristensen, et al., Int. Immunol. 19:141-149 (2007)). 두 가지 활성 모두 렉틴 활성화 경로를 통해 MASP-1/3 결핍 혈장이 C3를 절단하는 속도의 감소 및 MASP-1이 C4-우회 활성화 루트를 통해 C3 전환을 지속시키기 위해 필요할 수 있는 이유를 설명해줄 수 있다.

렉틴 경로를 통해 C3을 활성화하지 못하는 C2/fB-/- 혈장의 무능력은 재조합 래트 C2의 C2/fB-/- 혈장에의 첨가가 만난-코팅된 플레이트 상에서 재구성된 혈장의 C3을 활성화하는 재구성된 혈장의 능력을 회복시켰기 때문에 C2-의존성인 것으로 나타났다.

C4 결핍이 고전적 보체 활성화 경로를 특이적으로 파괴한 한편 렉틴 경로는 MASP-2 의존성 C4-우회 활성화 루트를 통해 C3 전환효소 활성의 생리적으로 중요한 수준을 보유한다는 발견은 실험적 S. 뉴모니아에 감염 (Brown, J. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99:16969-16974 (2002); Experimental Allergic Encephalomyelitis (Boos, L.A., et al., Glia 49:158-160 (2005)) 및 C3 의존성 쥐과 간 재생의 모델 (Clark, A., et al., Mol. Immunol. 45:3125-3132 (2008))을 포함하여, 다양한 질병 모델에서 렉틴 경로의 역할의 재평가를 필요로 한다. 후자의 그룹은 인자 B 기능적 활성의 항체-중재된 고갈에 의해 대체 경로의 생체 내 억제가 C4-/- 마우스에서 C3 절단-의존성 간 재생에 효과를 나타내지 못하였기 때문에 C4-결핍 마우스가 대체 경로 의존성 방식으로 C3을 활성화할 수 있는 것을 증명하였다 (Clark, A., et al. (2008)). C3의 이런 렉틴 경로 중재된 C4-우회 활성화 루트는 또한 본 발명자들의 MIRI 모델에서뿐 아니라 신장 동종이식 거부반응에 대해 이전에 기술된 모델에서 C4 결핍의 보호용 표현형의 결핍을 설명해줄 수 있다 (Lin, T., et al., Am. J. Pathol. 168:1241-1248 (2006)). 대조적으로, 본 발명자들의 최근 결과들은 신장 이식 모델에서 MASP-2-/-마우스의 상당한 보호용 표현형을 독립적으로 증명하였다 (Farrar, C.A., et al., Mol. Immunol. 46:2832 (2009)).

요약하면, 이 실시예의 결과는 C3의 MASP-2 의존성 C4-우회 활성화가 C4의 활용이 C3 활성화를 제한하는 조건하에서 중요할 수 있는 생리적으로 관련된 메커니즘이란 관점을 지지한다.

실시예 23

이 실시예는 트롬빈 기질에 의한 C3의 활성화 및 WT (+/+), MASP-2 (-/-), F11 (-/-), F11/C4 (-/-) 및 C4 (-/-) 마우스에서 만난 상의 C3 침착을 설명한다.

근거:

실시예 14에서 기술된 것과 같이, 트롬빈 활성화가 생리적 조건하에서 렉틴 경로 활성화에 이어 일어날 수 있는지 측정되었고, MASP-2 포함의 정도를 증명한다. C3은 보체 시스템의 활성화에서 중식 역할을 한다. C3 활성화는 고전적 및 대체 보체 활성화 경로 둘 다에 필요하다. 트롬빈 기질에 의해 C3이 활성화되는지 여부를 측정하기 위해 실험을 수행하였다.

방법:

트롬빈 기질에 의한 C3 활성화

C3의 활성화를 다음의 트롬빈 기질들의 활성화 형태의 존재하에 측정하였다: 인간 FCXIa, 인간 FVIIa, 소과 FXa, 인간 FXa, 인간 활성화된 단백질 C 및 인간 트롬빈. C3을 다양한 트롬빈 기질과 함께 인큐베이션한 후 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 환원 조건하에 분리하였다. 셀룰로오스 막을 사용하여 전기영동에 의해 전달한 후 막을 단클론성 비오틴-결합된 래트 항-마우스 C3와 함께 인큐베이션하고, 스트렙트아비딘-HRP 키트로 검출하고, ECL 시약을 사용하여 전개시켰다.

결과:

C3의 활성화는 무상 a-사슬의 절단된 a'사슬 및 가용성 C3a로의 절단을 포함한다 (도 30에는 도시되지 않음). 도 30은 트롬빈 기질에 의한 인간 C3의 활성화에 대한 웨스턴 블롯 분석의 결과를 도시하고, 여기서 절단되지 않은 C3 알파 사슬 및 활성화 생성물 a' 사슬은 화살표로 표시된다. 도 30에서 알 수 있는 것과 같이, C3의 인간 응고 인자 XI 및 인자 X의 활성화된 형태, 뿐만 아나라 활성화된 소과 응고 인자 X와의 인큐베이션은 어떠한 보체 프로테아제의 부재하에 시험관 내에서 C3을 절단할 수 있다.

만난 상의 C3 침착

C3 침착 분석을 WT, MASP-2 (-/-), F11(-/-), F11(-/-)/C4(-/-) 및 C4(-/-)로부터 얻어진 혈청 샘플에 대해 수행하였다. F11은 응고 인자 XI을 코드화하는 유전자이다. C3 활성화를 측정하기 위하여, 미세역가 플레이트를 만난으로 코팅 (1 μg/웰)한 후, TBS/tween/Ca²⁺ 중의 양 항-HSA 혈청 (2 μg/웰)을 첨가하였다. 혈장 샘플을 플레이트에 첨가된 4 mM 바르비탈, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH 7.4에 희석하고 1.5시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세척 후 결합된 C3b를 토끼 항-인간 C3c (Dako)와, 이어서 알칼리 포스파타제-포합된 염소 항-토기 IgG 및 pNPP를 사용하여 검출하였다.

결과:

도 31은 WT, MASP-2 (-/-), F11(-/-), F11(-/-)/C4 (-/-) 및 C4 (-/-)로부터 얻은 혈청 샘플에 대한 C3 침착 분석의 결과를 나타낸다. 도 31에서 알 수 있는 것과 같이, C4의 완전한 부재시에도 기능적 렉틴 경로가 존재한다. 도 31에서 추가로 알 수 있는 것과 같이, 이 신규한 렉틴 경로 의존성 보체 활성화는 응고 인자 XI을 필요로 한다.

논의:

이 실험 전에 얻어진 결과 전에, 기술분야의 숙련자들은 보체의 렉틴 경로는 활성을 위해 C4를 필요로 한다고 믿었다. 따라서, C4 녹아웃 마우스 (및 C4 결핍 인간)로부터의 데이터를 그런 유기체들이 렉틴 경로가 결핍되었다 (고전적 경로 결핍에 더불어)는 가정으로 간섭하였다. 본 결과들은 이 개념이 잘못되었음을 증명한다. 그러므로, 과거 연구들의 결론은 렉틴 경로가 C4 결핍 동물들의 표현형이 잘못일 수 있다는 것을 기초로 특정 질병 환경에서 중요하지 않았음을 시사한다. 이 실시예에 기술된 데이터는 또한 전체 혈청의 생리적 맥락에서 렉틴 경로는 응고 캐스케이드의 성분들을 활성화시킬 수 있음을 보여준다. 그러므로, 보체와 MASP-2를 포함하는 응고 사이에는 상호간섭이 존재한다는 것이 증명된다.

실시예 24

이 실시예는 발작성 야행성 혈색소뇨증 (PNH) 환자들로부터 얻어진 혈액 샘플로부터의 적혈구의 용해에 미치는 항-MASP-2 항체의 효과를 평가하기 위한 방법을 설명한다.

배경/근거:

Marchiafava-Micheli 증후군으로도 언급되는 발작성 야행성 혈색소뇨증 (PNH)은 보체-유도된 혈관내 용혈성 빈혈을 특징으로 하는, 잠재적으로 생명을 위협하는 혈액의 후천적 질병이다. PNH의 특징은 보체의 대체 경로의 조절되지 않은 활성화의 결과인 만성 혈관내 용혈이다. Lindorfer, M.A., et al., Blood 115(11) (2010). PNH에서 빈혈은 혈류의 적혈구의 파괴로 인한 것이다. PNH의 증상들은 뇨 중의 헤모글로빈의 출현으로 인한 혈뇨 및 혈전증을 포함한다. PNH는 "일차 PNH"로 언급되는 자체적으로, 또는 "이차 PNH"로 언급되는 재생불량성 빈혈과 같은 다른 골수 장애의 맥락으로 발달될 수 있다. PNH에 대한 치료는 빈혈에 대한 수혈, 혈전증에 대한 응고 방지 및 보체 시스템을 억제함으로써 면역 파괴에 대해 혈액 세포들을 보호하는 단클론성 항체 유클리주맙 (Soliris)의 사용을 포함한다 (Hillmen P. et al., N. Engl. J. Med. 350(6):552-9 (2004)). 그러나, 유클리주맙으로 치료된 PNH 환자들의 상당 부분이 항체가 보체의 대체 경로의 활성화를 차단하지 못하기 때문에 만성적으로 유의미한 면역-주재된 용혈성 빈혈을 보였다.

이 실시예는 ABO-매치된 산성화된 정상인 혈청과 인큐베이션된 PNH 환자들로부터 얻어진 혈액 샘플로부터의 적혈구의 용혈에 미치는 항-MASP-2 항체의 효과를 평가하기 위한 방법을 설명한다.

방법:

결과:

정상 공여자로부터 및 PNH에 걸린 환자들 (Solaris로 치료되지 않음)로부터의 적혈구를 정맥 천자에 의해 얻고, 문헌에 기술한 대로 제조한다 (Wilcox, L.A., et al., Blood 78:820-829 (1991), 본원에 참조로 포함됨). 렉틴 경로의 기능적 차단 활성을 가지는 항-MASP-2 항체를 실시예 10에서 기술한 대로 제조하였다.

용혈 분석:

PNH 환자로부터의 적혈구의 용혈을 차단하는 능력에 미치는 항-MASP-2 항체의 효과를 측정하기 위한 방법을 문헌에 설명된 방법을 사용하여 수행한다: Lindorfer, M.A., et al., Blood 15(11):2283-91 (2010) and Wilcox, L.A., et al., Blood 78:820-829 (1991), 둘 다 본원에 참조로 포함된다. Lindorfer 등에 의해 기술된 것과 같이, PNH 환자 샘플로부터의 적혈구를 원심분리하고, 버피 코트를 흡인한 후 각 실험 전에 세포를 젤라틴 베로날 완충액 (GVB)으로 세척한다. 적혈구를 다음과 같이 APC-중재된 용혈에 대한 취약성에 대해 시험한다. ABO-중재된 정상인 혈청을 0.15 mM CaCl₂ 및 0.5 mM MgCl₂ (GVB⁺²)를 함유하고 있는 GVB로 희석하고 50% aNHS 중의 1.6%의 헤마토크릿에 적혈구를 재구성하기 위해 사용한다. 그런 다음 혼합물을 37℃에서 인큐베이션하고, 1시간 후에 적혈구를 원심분리에 의해 펠릿화한다. 회수된 상층액의 부분표본의 광학 밀도를 405 nM에서 측정하고 퍼센트 용해를 계산하는 데 사용한다. 산성화된 혈청-EDTA에 재구성된 샘플을 유사하게 처리하고 바탕 비보체-중재된 용혈 (전형적으로 3% 미만)을 규정하기 위해 사용한다. 완전한 용해 (100%)는 적혈구를 증류수에서 인큐베이션한 후에 측정한다.

PNH 적혈구의 용혈에 미치는 항-MASP-2 항체의 효과를 측정하기 위하여, PNH 환자로부터의 적혈구를 aNHS에서 증가하는 농도의 항-MASP-2 항체의 조재하에 인큐베이션하고, 용혈의 존재/양을 계속해서 정량한다.

항-MASP-2 항체가 대체 보체 경로의 후속적인 활성화를 차단하는 것으로 밝혀진 사실의 관점에서, 항-MASP-2 항체가 PNH 적혈구의 대체 경로-중재된 용혈을 차단하는 데 효과적일 것이고 PNH에 걸린 환자들을 치료하기 위한 치료제로서 유용할 것으로 예상된다.

실시예 25

이 실시예는 한랭글로불린혈증에 걸린 환자들로부터 얻어진 혈액 샘플에서의 한랭글로불린에 의한 보체 활성화에 미치는 항-MASP-2 차단 항체의 효과를 평가하는 방법을 설명한다.

배경/근거:

한랭글로불린혈증은 혈청중의 한랭글로불린의 존재를 특징으로 한다. 한랭글로불린은 저온에서 가역적 응집을 진행하는 단일 또는 혼합 면역글로불린 (전형적으로 IgM 항체)이다. 응집은 고전적 경로 보체 활성화 및 염증을 혈관상에서, 특히 말초 혈관상에서 유도한다. 한랭글로불린혈증은 임상적으로 맥관염 및 사구체신염으로 나타날 수 있다.

한랭글로불린혈증은 한랭글로불린 조성을 기초로 다음과 같이 분류될 수 있다: 유형 I 한랭글로불린혈증 또는 단순 한랭글로불린혈증은 단클론성 면역글로불린, 통상 면역글로불린 M (IgM)의 결과이고; 유형 II 및 III 한랭글로불린혈증 (혼합 한랭글로불린혈증)은 통상적으로 다클론성 IgG의 Fc 부분과 복합체를 형성하는 IgM인 류머티스성 인자 (RF)를 함유한다.

한랭글로불린혈증과 관련된 상태는 C형 간염 감염, 림프증식성 장애 및 다른 자가면역 질환들을 포함한다. 한랭글로불린-함유 면역 복합체는 아마도 보체를 활성화시키는 능력으로 인해 전신성 염증의 임상 증후군을 초래한다. IgG 면역 복합체가 정상적으로 보체의 고전적 경로를 활성화시키는 한편, 복합체를 함유하는 IgM은 또한 렉틴 경로를 통해 보체를 활성화할 수 있다 (Zhang, M., et al., Mol Immunol 44(1-3):103-110 (2007) 및Zhang. M., et al., J. Immunol. 177(7):4727-34 (2006)).

면역조직학적 연구는 한랭글로불린 면역 복합체가 렉틴 경로의 성분들을 함유하고, 한랭글로불린혈증 사구체신염에 걸린 환자로부터의 생검이 제자리 렉틴 경로 활성화의 면역조직화학적 증거를 나타냈음을 추가로 증명하였다 (Ohsawa, I., et al., Clin Immunol 101(1):59-66 (2001)). 이들 결과는 렉틴 경로가 한랭글로불린혈증 질환에서 염증 및 역효과에 기여할 수 있음을 시사한다.

방법:

한랭글로불린혈증의 부작용을 차단하는 능력에 대한 항-MASP-2 항체의 효과를 측정하기 위한 방법을 문헌에 기술된 것과 같은 유동상 C3 전환에 대한 분석을 사용하여 수행한다 (Ng Y.C. et al., Arthritis and Rheumatism 31(1):99-107 (1988), 본원에 참조로 포함됨). Ng 등에서 기술된 것과 같이, 본태성 복합 한랭글로불린혈증 (EMC)에서, 단클론성 류머티스성 인자 (mRF), 보통 IgM은 다클론성 IgG와 복합체화하여 특징적인 저온침전물 면역 복합체 (IC) (유형 II 한랭글로불린)를 형성한다. 면역글로불린과 C3은 피부, 신경 및 신장과 같은 병에 걸린 조직의 혈관 벽에서 증명되었다. Ng 등에서 기술된 것과 같이, ¹²⁵I-표지된 mRF를 혈청 (정상인 혈청 및 한랭글로불린혈증에 걸린 환자들로부터 얻어진 혈청)에 첨가하고, 37℃에서 인큐베이션하여 적혈구에의 결합을 측정한다.

유동상 C3 전환을 항-MASP-2 항체의 존재 또는 부재하에, 다음의 IC의 존재 또는 부재하에 혈청 (정상인 혈청 및 한랭글로불린혈증에 걸린 환자들로부터 얻어진 혈청)에서 측정한다: BSA-항 BSA, mRF, mRF 플러스 IgG 또는 한랭글로불린. IC에의 C3 및 C4의 고정을 F(ab')2 항-C3 및 F(ab')2 항-C4를 사용한 저온침전물 분석을 사용하여 측정한다.

항-MASP-2 항체가 렉틴 경로의 활성화를 차단하는 것으로 밝혀진 사실의 관점에서, 항-MASP-2 항체는 한랭글로불린혈증과 관련된 보체 중재된 부작용을 차단하는 데 효과적일 것이고 한랭글로불린혈증에 걸린 환자들을 치료하기 위한 치료제로서 유용할 것이라고 예상된다.

실시예 26

이 실시예는 빈혈로서 나타나는, 저온응집병에 걸린 환자들로부터 얻어진 혈액 샘플에 대한 항-MASP-2 항체의 효과를 평가하는 방법을 설명한다.

배경/근거:

저온응집병 (CAD)은 자가면역 용혈성 빈혈 유형이다. 저온응집소 항체 (보통 IgM)는 저온에 의해 활성화되고 적혈구에 결합하여 적혈구를 응집시킨다. 저온응집소 항체는 보체와 조합되어 적혈구 표면 성의 항원을 공격한다. 이것은 적혈구의 옵소닌화 (용혈)을 유도하고 세망내피계에 의해 그것들의 클리어런스를 야기한다. 응집이 일어나는 온도는 환자마다 다르다.

CAD는 빈혈로서 나타난다. 적혈구 파괴의 파괴속도가 골수가 적절한 수의 산소-운반 세포를 생성하는 용량을 초과할 때 빈혈은 일어난다. CAD는 "이차 CAD"로서 언급되는 기저 질병 또는 장애, 예컨대 감염성 질환 (미코플라즈마 폐렴, 볼거리, 단핵증), 림프구증식성 질환 (림프종, 만성 림프성 백혈병) 또는 결합 조직 장애에 의해 유발될 수 있다. 일차 CAD 환자들은 저급 림프구증식성 골수 장애를 가지는 것으로 여겨진다. 일차 및 이차 CAD 둘 다 후천적 상태이다.

방법:

시약:

정상 공여자 및 CAD에 걸린 환자들로부터의 적혈구를 정맥 천자에 의해 얻는다. 렉틴 경로의 기능적 차단 활성을 가지는 항-MASP-2 항체를 실시예 10에서 기술한 것과 같이 제조할 수 있다.

렉틴 경로의 저온응집소-중재된 활성화를 차단하는 항-MASP-2 항체의 효과를 다음과 같이 측정할 수 있다. 혈액군 I 포지티브 환자들로부터의 적혈구를 저온응집소 (즉 IgM 항체)로, 항-MASP-2 항체의 존재 또는 부재하에 감작시킨다. 그런 다음 적혈구를 렉틴 경로를 활성화하는 능력에 대해 C3 결합을 측정함으로써 시험한다.

항-MASP-2 항체가 렉틴 경로의 활성화를 차단하는 것으로 밝혀진 사실의 관점에서, 항-MASP-2 항체는 저온응집병과 관련된 보체 중재된 부작용을 차단하는 데 효과적일 것이고 저온응집병에 걸린 환자들을 치료하기 위한 치료제로서 유용할 것으로 예상된다.

실시예 27

이 실시예는 비전형적인 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)을 가진 마우스로부터 얻어진 혈액 샘플에서 적혈구의 용혈에 미치는 항-MASP-2 항체의 효과를 평가하는 방법을 설명한다.

배경/근거:

비전형적인 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)은 용혈성 빈혈, 혈소판 감소증 및신장 및 다른 장기의 미세순환계의 혈소판 혈전증에 의해 유발된 신부전증을 특징으로 한다. aHUS는 결함성 보체 조절과 관련되고 산발성이거나 가족성이다. aHUS는 보체 인자 H, 막 조인자 B 및 인자 I, 뿐만 아니라 보체 인자 H-관련 1 (CFHR1) 및 보체 인자 H-관련 3 (CFHR3)을 포함하여 보체 활성화를 코드하는 유전자의 돌연변이와 관련된다 (Zipfel, P.F., et al., PloS Genetics 3(3):e41 (2007)). 이 실시예는 aHUS 마우스로부터 얻어진 혈액 샘플로부터의 적혈구의 용혈에 미치는 항-MASP-2 항체의 효과를 평가하는 방법을 설명한다.

방법:

aHUS를 치료하는 항-MASP-2 항체의 효과는 내인성 마우스 fH 유전자가 aHUS 환자들에서 빈번하게 발견되는 fH의 돌연변이를 코드화하는 인간 상동체로 대체되어 있는 이 질병의 마우스 모델에서 측정할 수 있다 (Pickering M.C. et al., J. Exp. Med. 204(6):1249-1256 (2007) 참조, 본원에 참조로 포함됨). Pickering 등에 의해 기술된 것과 같이, 그런 마우스는 aHUS 유사 병리를 발달시킨다. aHUS의 치료를 위한 항-MASP-2 항체의 효과를 평가하기 위하여, 항-MASP-2 항체를 돌연변이 aHUS 마우스에 투여하고 항-MASP-2 Ab 처리된 및 미처리된 대조표준으로부터 얻어진 적혈구의 용혈을 비교한다. 항-MASP-2 항체가 렉틴 경로의 활성화를 차단하는 것으로 밝혀진 사실의 관점에서, 항-MASP-2 항체는 aHUS로 고생하는 포유류에서 적혈구의 용혈을 차단하는 데 효과적일 것으로 예상된다.

실시예 28

이 실시예는 녹내장의 치료를 위한 항-MASP-2 항체의 효과를 평가하는 방법을 설명한다.

배경/근거:

제어되지 않은 보체 활성화는 녹내장에서 망막 신경절 세포 (RGC), 그것들의 시냅스 및 축색돌기에 대한 퇴행성 손상의 진전에 기여하는 것으로 밝혀졌다. Tezel G. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 51:5071-5082 (2010) 참조, 예를 들어, 인간 조직의 조직병리학적 연구 및 상이한 동물 모델을 사용한 시험관 내 연구들은 C1q 및 C3을 포함하여, 보체 성분들이 녹내장성 망막에서 합성되고 말단 보체 복합체가 형성되는 것을 증명하였다 (Stasi K. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 47:1024-1029 (2006), Kuehn M.H. et al., Exp Eye Res 83:620-628 (2006) 참조). 또한 Kuehn M.H. 등에의해 기술된 것과 같이 (Kuehn M.H. et al., Experimental Eye Research 87:89-95 (2008)), 보체 합성 및 침착이 망막 I/R에 의해 유도되고 보체 캐스케이드의 파괴가 RGC 변성을 지연시킨다. 이 연구에서, 보체 성분 C3의 표적화된 파괴를 운반하는 마우스는 정상 동물과 비교할 때 일시적인 망막 I/R 후에 지연된 RGC 변성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.

방법:

RGC 변성에 미치는 항-MASP-2 항체의 효과를 측정하기 위한 방법은 Kuehn M.H. 등에 의해 기술된 것과 같이 (Kuehn M.H. et al., Experimental Eye Research 87:89-95 (2008), 본원에 참조로 포함됨) 망막 I/R의 동물 모델에서 수행한다. Kuehn 등에 의해 기술된 것과 같이, 동물을 마취시킨 후, 포스페이트 완충된 염수를 함유하고 있는 저장소에 연결된 30-게이지 바늘을 눈의 전실에 삽입함으로써 망막 허혈을 유도한다. 그런 다음 염수 저장소를 상승시켜서 전실의 압력을 망막 맥관구조를 통해 순환을 완전히 방지하기에 충분한 104 mmHg로 상승시킨다. 상승된 안내 허혈을 홍채 및 망막의 창백해짐에 의해 확인하고 허혈을 좌안에서만 45분 동안 유지한다; 우안은 대조표준으로서 작용하며 캐뉼라를 삽입하지 않는다. 그런 다음 마우스를 허혈 손상 후 1 또는 3주 후에 안락사시킨다. 허혈성 손상 전에 투여된 항-MASP-2 항체의 효과를 평가하기 위해 항-MASP-2 항체는 눈에 국소적으로 또는 전식적으로 마우스에 투여된다.

눈의 면역조직화학적 연구를, 보체 침착을 검출하기 위하여 C1q 및 C3에 대한 항체들을 사용하여 수행한다. 시신경 손상은 또한 표준 전자 현미경법을 사용하여 평가할 수 있다. 생존하는 동물의 망막의 RGC의 정량을 감마 시누클레인 표지화를 사용하여 수행한다.

결과:

Kuehn 등에 의해 기술된 것과 같이, 정상적인 대조 마우스에서, 일시적인 망막 허혈은 시신경의 퇴행성 변화 및 면역조직화학에 의해 검출할 수 있는 C1q 및 C3의 망막 침착을 초래한다. 대조적으로, C3 결핍 마우스는 축색돌기 변성의 현저한 감소를 나타냈고, 유도 후 1주 후에 시신경 손상은 다지 미미한 수준인 것을 나타냈다. 이들 결과를 토대로, 이 분석을 MASP-2 녹아웃 마우스에서 수행할 때, 그리고 허혈 손상 전에 정상 마우스에 항-MASP-2 항체를 투여할 때 유사한 결과가 관찰될 수 있을 것으로 예상된다.

실시예 29

이 실시예는 MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체가 복사선 노출의 치료 및/또는 급성 복사선 증후군의 치료, 개선 또는 방지를 위해 효과적인 것을 증명한다.

근거:

고용량의 이온화 복사선에의 노출은 2가지 주요 메커니즘에 의해 사망을 유발한다: 골수에 대한 독성 및 위장 증후군. 골수 독성은 모든 혈액 세포에서의 강하를 초래하여 유기체가 감염 및 출혈에 의해 사망하게 만든다. 위장 증후군은 보다 심각하고 소화관 내피층의 분해 및 장의 내분비 기능의 상실로 인한 장의 장벽 기능의 상실에 의해 구동된다. 이것은 사망을 초래할 수 있는 패혈증 및 관련된 전신성 염증성 반응 증후군을 유도한다.

보체의 렉틴 경로는 조직 손상 및 외래 표면 (즉 박테리아)에 대한 노출에 대한 반응으로 염증을 개시하는 선천성 면역 메커니즘이다. 이 경로의 차단은 허혈성 장 조직 손상 또는 패혈성 쇼크의 마우스 모델에서 더 좋은 결과를 유도한다. 렉틴 경로는 복사선-유도된 조직 손상에 대한 반응으로 과잉의 해로운 염증을 야기할 수 있는 것으로 가설을 세울 수 있다. 그러므로 렉틴 경로의 차단은 이차 손상을 줄일 수 있고 급성 복사선 노출 후의 생존을 증가시킬 수 있다.

이 실시예에서 기술한 것과 같이 수행한 연구의 목적은 항-쥐과 MASP-2 항체를 투여함으로써 복사선 손상의 마우스 모델에서 생존에 미치는 렉틴 경로 차단의 효과를 평가하는 것이었다.

방법 및 재료:

재료. 이 연구에서 사용된 시험 물질은 트랜스펙션된 포유류 세포에서 생성된 렉틴 보체 경로의 MASP-2 단백질을 차단하는 (i) 고친화성 항-쥐과 MASP-2 항체 (mAbM11) 및 (ii) 고친화성 항-인간 MASP-2 항체 (mAbH6)였다. 투여 농도는 1 mg/kg의 항-쥐과 MASP-2 항체 (mAbM11), 5mg/kg의 항-인간 MASP-2 항체 (mAbH6) 또는 멸균 염수였다. 각각의 투여 기간에 대해서는, 적당한 부피의 새로운 투여 용액을 제조하였다.

동물. 젊은 성숙한 수컷 Swiss-Webster 마우스를 Harlan Laboratories (Houston, TX)로부터 얻었다. 동물들을 알파-드라이 베딩 (Alpha-Dri bedding)을 포함하고 인증된 PMI 5002 설치류 다이어트 (Animal Specialties, Inc., Hubbard OR)가 제공되며 물은 임의로 공급되는 딱딱한-바닥의 우리에 하우징하였다. 온도를 모니터링하였고 동물 보유실은 12시간 빛/12시간 어둠의 광사이클로 조작하였다.

조사 (irradiation). 2주의 시설 순응 후에 마우스를 6.5 및 7.0 Gy에서 320-kV 고안정성 X-선 발생기, 금속 세라믹 X-선 튜브, 가변 x-선 빔 콜리메이터 및 필터가 장착된 Therapax X-RAD 320 시스템 (Precision X-ray Incorporated, East Haven, CT)을 사용하여 0.78 Gy/분의 투여 속도로 전신 노출에 의해 조사하였다. 용량 수준은 동일한 계통의 마우스로 수행된 선행 연구들을 기초로 선택하였고, LD_50/30은 6.5와 7.0 Gy 사이인 것으로 나타난다 (데이터는 제시하지 않음).

약물 제형 및 투여. 적절한 부피의 농축 스톡 용액을 0.2 mg/ml 항-쥐과 MASP-2 항체 (mAbM11) 또는 0.5 mg/ml 항-인간 MASP-2 항체 (mAbH6)의 투여 용액을 제조하기 위하여 프로토콜에 따라 빙냉 염수로 희석하였다. 항-MASP-2 항체 mAbM11 및 mAbH6을 1 mg/kg mAbM11, 5mg/kg mAbH6 또는 염수 비히클을 전달하기 위하여 동물 체중을 기초로 25-게이지 바늘을 사용하여 IP 주사를 통해 투여하였다.

연구 디자인. 마우스를 표 8에 기술한 것과 같은 그룹들로 무작위로 배정하였다. 체중 및 온도를 매일 측정하고 기록하였다. 그룹 7, 11 및 13의 마우스들을 조사 후 7일에 희생시키고 심층 마취하에 심장 천공에 의해 혈액을 수집하였다. 조사 후 30일째에 생존하는 동물들을 동일 방식으로 희생시키고 혈액을 수집하였다. 수집된 혈액 샘플로부터 혈장을 프로토콜에 따라 제조하고 분석을 위해 스폰서에 돌려보냈다.

연구 그룹

그룹 ID	N	조사 수준 (Gy)	처리	용량 스케줄
1	20	6.5	비히클	조사 전 18시간, 조사 후 2시간째, 매주 부스터
2	20	6.5	항-쥐과 MASP-2 ab (mAbM11)	조사 전 18시간에만
3	20	6.5	항-쥐과 MASP-2 ab (mAbM11)	조사 전 18시간, 조사 후 2시간째, 매주 부스터
4	20	6.5	항-쥐과 MASP-2 ab (mAbM11)	조사 후 2시간째, 매주 부스터
5	20	6.5	항-인간 MASP-2 ab (mAbH6)	조사 전 18시간, 조사 후 2시간째, 매주 부스터
6	20	7.0	비히클	조사 전 18시간, 조사 후 2시간째, 매주 부스터
7	5	7.0	비히클	조사 후 2시간째에만
8	20	7.0	항-쥐과 MASP-2 ab (mAbM11)	조사전 18시간에만
9	20	7.0	항-쥐과 MASP-2 ab (mAbM11)	조사 전 18시간, 조사 후 2시간째, 매주 부스터
10	20	7.0	항-쥐과 MASP-2 ab (mAbM11)	조사 후 2시간째, 매주 부스터
11	5	7.0	항-쥐과 MASP-2 ab (mAbM11)	조사후 2시간째에만
12	20	7.0	항-인간 MASP-2 ab (mAbH6)	조사 전 18시간, 조사 후 2시간째, 매주 부스터
13	5	없음	없음	없음

통계학적 분석. Kaplan-Meier 생존 곡선을 만들었고 로그-등급과 Wilcoxon 방버을 사용하는 처리 그룹 사이의 평균 생존 시간을 비교하는 데 사용하였다. 표준편차를 포함한 평균, 또는 평균의 표준오차를 기록한다. 통계학적 비교를 제어된 조사된 동물과 개별 처리 그룹 사이의 2-방향의 짝이 없는 t-시험을 사용하여 실시하였다.

결과

7.0 및 6.5 Gy 노출 그룹에 대한 Kaplan-Meier 생존 도표를 도 32a 및 도 32b에 각각 제공하고 하기의 표 9에 요약한다. 전체적으로, 항-쥐과 MASP-2 ab (mAbM11) 사전-조사로의 처리는 비히클 처리된 조사된 대조 동물에 비교하여 6.5 (20% 증가) 및 7.0 Gy (30% 증가) 노출 수준 둘 다에서 생존을 증가시켰다. 6.5 Gy 노출 수준에서, 조사-후 항-쥐과 MASP-2 처리는 비히클 대조 조사된 동물에 비교하여 중간정도의 생존의 증가 (15%)를 초래하였다.

비교하면, 7.0 Gy 노출 수준에서 처리된 모든 동물은 비히클 처리된 조사된 대조 동물에 비교하여 생존율의 증가를 나타냈다. 생존율의 가장 큰 변화는 mAbH6을 받은 동물에서 발생하였는데, 대조 동물에 비교하여 45% 증가하였다. 나아가 7.0 Gy 노출 수준에서, mAbH6 처리된 그룹에서의 사망은 비히클 처리된 조사된 대조 동물에 대해 조사 후 8일째에 나타난 것에 비해 조사 후 15일에 처음 발생하였고, 대조 동물에 대해 7일의 증가를 보였다. mAbH6를 받은 마우스에 대한 사망까지의 평균 시간 (27.3 ± 1.3일)은 7.0 Gy 노출 수준에서 대조 동물 (20.7 ± 2.0일)에 비교하여 상당히 증가되었다 (p = 0.0087).

체중의 퍼센트 변화를 조사 전날 (-1일)에 비교하여 연구하는 내내 기록하였다. 일시적인 체중 손실이 조사된 모든 동물에서 발생하였는데, 대조표준에 비교하여 mAbM11 또는 mAbH6 처리로 인한 차등 변화에 대한 증거는 없었다 (데이터는 제시하지 않음). 연구 종료시, 생존한 모든 동물은 출발시 (-1일) 체중으로부터 체중의 증가를 나타냈다.

복사선에 노출된 시험 동물들의 생존율

시험 그룹	노출 수준	생존율 (%)	사망가지의 시간 (평균 ± SEM, 일)	처음/마지막 사망 (일)
대조 조사	6.5 Gy	65 %	24.0 ± 2.0	9/16
mAbM11 노출전	6.5 Gy	85 %	27.7 ± 1.5	13/17
mAbM11 노출전 + 후	6.5 Gy	65 %	24.0 ± 2.0	9/15
mAbM11 노출후	6.5 Gy	80 %	26.3 ± 1.9	9/13
mAbH6 노출전 + 후	6.5 Gy	65 %	24.6 ± 1.9	9/19
대조 조사	7.0 Gy	35 %	20.7 ± 2.0	8/17
mAbM11 노출전	7.0 Gy	65 %	23.0 ± 2.3	7/13
mAbM11 노출전 + 후	7.0 Gy	55 %	21.6 ± 2.2	7/16
mAbM11 노출후	7.0 Gy	70 %	24.3 ± 2.1	9/14
mAbH6 노출전 + 후	7.0 Gy	80 %	27.3 ± 1.3*	15/20

*p = 제어된 조사된 동물과 동일한 조사 노출 수준에서의 처리 그룹사이의 쌍을 이루지 않은 2-방향 t-시험에 의해 0.0087.

논의

급성 복사선 증후군은 3가지 규정된 하위증후군: 조혈기, 위장기 및 뇌혈관 급성 복사선 증후군으로 구성된다. 증후군은 1 Gy를 초과하는 상당한 신체 부분 또는 전신 복사선 노출이 있을 때 복사선 용량에 따라 관찰된 인간에서 관찰된 조혈 효과와 함께 관찰되었다. 조혈기 증후군은 면역 시스템에 대한 손상에 부수적으로 일어나는 혈액 카운트, 적혈구 및 백혈구 및 혈소판의 변화를 포함하는 범혈구감소증으로 유도하는 골수 기능의 심각한 저하를 특징으로 한다. 말초혈에 존재하는 호중구 및 혈소판의 수가 적어지는 최악의 상황이 일어남에 따라, 호중성 백혈구 감소증, 열, 패혈증과 제어불능의 출혈의 합병증이 사망을 유발한다.

본 연구에서, mAbH6의 투여는 7.0 Gy에서 조사된 Swiss-Webster 수컷 마우스에서 전신 x-선 조사의 생존성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 주지할 것은, 7.0 Gy 노출 수준에서, mAbH6을 받은 동물의 80%가 비히클 처리된 조사된 대조 동물의 35%에 비교하여 30일까지 생존하였다. 중요하게도, 이 처리그룹에서 첫 번째 사망일은 조사 후 15일까지 일어나지 않았고, 비히클 처리된 조사된 대조 동물에서 관찰된 것보다 7-일 증가하였다. 신기하게도, 더 낮은 X-선 노출 (6.5 Gy)에서, mAbH6의 투여는 비히클 처리된 조사된 대조 동물에 비교하여 생존성이나 사망의 지연에 영향을 미치는 것으로 나타나지 않았다. 노출 수준간 반응의 이런 차이에 대해 여러 이유가 있을 수 있지만, 어떠한 가설이든지 증명하기 위해서는 미생물 배양 및 혈액학적 변수들에 대한 중간 샘플 수집을 포함하여 추가의 연구를 필요로 할 것이다. 한 가지 설명은 아마도 그룹에 배정받은 동물의 수가 어떠한 미묘한 처리-관련 차이를 보는 것을 막았을 것이라고 단순화될 수 있다. 예를 들어 n=20의 그룹 크기일 때 65% (mAbH6, 6.5 Gy 노출)와 80% (mAbH6, 7.0 Gy 노출) 사이의 생존의 차이는 3마리 동물이다. 다른 한편으로, 35% (비히클 대조표준, 7.0 Gy 노출)와 80% (mAbH6, 7.0 Gy 노출) 사이의 차이는 9마리 동물로, 처리-관련 차이의 확실한 증거를 제공한다.

이들 결과는 항-MASP-2 항체가 급성 복사선 증후군의 해로운 영향을 받고 있거나, 받은 위험이 있는 포유류 대상을 치료하는 데 효과적인 것을 증명한다.

실시예 30

이 실시예는 MASP-2 결핍 마우스가 나이세리아 메닝기티디스 혈청군 A 또는 나이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 중 어느 하나로의 감염 후에 나이세리아 메닝기티디스 유도된 사망으로부터 보호되는 것을 증명한다.

방법:

MASP-2 녹아웃 마우스 (MASP-2 KO 마우스)를 실시예 1에서 기술한 대로 제조하였다. 10-주령 MASP-2 KO 마우스 (n=10) 및 야생형 (WT) C57/BL6 마우스 (n=10)를 100 μl 부피 중의 2.6 x 10⁷ CFU의 단위용량의 나이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491로 복강 내 (i.p.) 주사에 의해 접종하였다. 감염 용량을 400　mg/kg의 최종 농도에서 철 덱스트란과 함께 마우스에 투여하였다. 감염 후 마우스의 생존을 72시간에 걸쳐 모니터링하였다.

별도의 실험으로, 10-주령 MASP-2 KO 마우스 (n=10) 및 야생형 (WT) C57/BL6 마우스 (n=10)를 100 μl 부피 중의 6 x 10⁶ CFU의 단위용량의 나이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 i.p. 주사에 의해 접종하였다. 감염 용량을 400　mg/kg의 최종 농도에서 철 덱스트란과 함께 마우스에 투여하였다. 감염 후 마우스의 생존을 72시간에 걸쳐 모니터링하였다. 질환 점수를 또한 하기 표 10에 기술한, Fransen 등의 계획 (Fransen et al. (2010))을 기초로 약간 변형시킨 질환 점수 변수들을 기초로 감염 후 72시간 동안 WT 및 MASP-2 KO 마우스에 대해 측정하였다.

감염된 마우스에서 임상 신호와 관련된 질환 점수

신호	점수
정상	0
약간 주름진 털	1
주름진 털, 둔하고 들러붙는 눈	2
주름진 털, 졸린듯 감기는 눈	3
매우 병들고 자극 후에도 이동이 없음	4
사망	5

감염 후 혈액 샘플을 시간마다 마우스로부터 취하여 감염을 증명하고 혈청으로부터 박테리아의 클리어런스 속도를 측정하기 위하여 N. 메닝기티디스의 혈청 수준 (로그 cfu/mL)을 측정하여 분석하였다.

결과:

도 33은 2.6 x 10⁷ cfu의 감염 용량의 나이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491의 투여 후에 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존을 그래프로 나타낸 Kaplan-Meyer 도표이다. 도 33에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2 KO 마우스는 100%가 감염 후 72시간의 주기 내내 생존하였다. 대조적으로, WT 마우스는 82% (p=0.012)만이 감염 후 24시간째에 생존하였고, 감염 후 72시간째에는 단지 50%만이 여전히 생존하였다. 이들 결과는 MASP-2-결핍 마우스가 나이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491-유도된 사망으로부터 보호된 것을 증명한다.

도 34는 6 x 10⁶ cfu의 감염 용량의 나이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 투여 후에 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존을 그래프로 나타낸 Kaplan-Meyer 도표이다. 도 34에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2 KO 마우스의 90%는 감염 후 72시간의 주기 내내 생존하였다. 대조적으로, WT 마우스는 20% (p=0.0022)만이 감염 후 24시간째에 생존하였다. 이들 결과는 MASP-2-결핍 마우스가 나이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58-유도된 사망으로부터 보호된 것을 증명한다.

도 35는 6 x 10⁶ cfu의 나이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 i.p. 감염 후에 MASP-2 KO 및 WT 마우스로부터 취한 혈액 샘플에서 상이한 시점에 회수한 나이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 로그 cfu/mL을 그래프로 도시한다 (마우스의 두 그룹에 대해 상이한 시점에서 n=3). 결과는 평균±SEM으로서 표시한다. 도 35에서 알 수 있는 것과 같이, WT 마우스에서, 혈액 중의 N. 메닝기티디스의 수준은 감염 후 24시간째에 약 6.0 로그 cfu/mL의 피크에 도달하였고 감염 후 36시간째에는 약 4.0 로그 cfu/mL로 떨어졌다. 대조적으로, MASP-2 KO 마우스에서, N. 메닝기티디스의 수준은 감염 후 12시간째에 약 4.0 로그 cfu/mL의 피크에 도달하였고 감염 후 36시간째에는 약 1.0 로그 cfu/mL로 떨어졌다 (기호 "*"는 p<0.05를 나타내고; 기호 "**"는 p=0.0043을 나타낸다). 이들 결과는 비록 MASP-2 KO 마우스가 WT 마우스와 동일한 용량의 N. 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 감염되었지만, MASP-2 KO 마우스는 WT에 비교하여 균혈증의 증강된 클리어런스를 가지는 것을 증명한다.

도 36은 6 x 10⁶ cfu의 N. 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 감염 후 3, 6, 12 및 24시간째의 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 평균 질환 점수를 그래프로 도시한다. 도 36에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2-결핍 마우스는 감염에 대한 높은 내성을 보였는데, 질환 점수는 WT 마우스에 비교하여 감염 후 6시간째에 (기호 "*"는 p=0.0411을 나타냄), 12시간째에 (기호 "**"는 p=0.0049를 나타냄) 및 24시간째에 (기호 "***"는 p=0.0049를 나타냄) 훨씬 낮았다. 도 36의 결과를 평균±SEM으로서 표시한다.

요약하면, 이 실시예의 결과는 MASP-2-결핍 마우스가 N. 메닝기티디스 혈청군 A 또는 N. 메닝기티디스 혈청군 B 중 어느 하나로의 감염 후 나이세리아 메닝기티디스-유도된 사망으로부터 보호되는 것을 증명한다.

실시예 31

이 실시예는 N. 메닝기티디스로의 감염 후 항-MASP-2 항체의 투여가 N. 메닝기티디스로 감염된 마우스의 생존율을 증가시키는 것을 증명한다.

배경/근거:

실시예 10에서 기술한 것과 같이, 래트 MASP-2 단백질을 활용하여 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 만들고, 그것으로부터 Fab2 #11을 기능적 활성 항체로서 확인하였다. 래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 아이소타입의 전-길이 항체를 Fab2 #11로부터 제조하였다. 마우스 IgG2a 아이소타입의 전-길이 항-MASP-2 항체를 약물동역학적 변수들에 대해 특성확인하였다 (실시예 19에서 기술한 것과 같음).

방법:

상기에서 기술한 것과 같이 제조한, Fab2 #11로부터 유도된 마우스 IgG2a 전-길이 항-MASP-2 항체 아이소타입을 다음과 같이 N. 메닝기티디스 감염의 마우스 모델에서 시험하였다.

감염 후 마우스-항-MASP-2 단클론성 항체 (MoAb)의 투여

9-주령 C57/BL6 Charles River 마우스를 고용량 (4x10⁶ cfu)의 N. 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 i.p. 주사후 3시간째에 억제 마우스 항-MASP-2 항체 (1.0 mg/kg) (n=12) 또는 대조 아이소타입 항체 (n=10)로 처리하였다.

결과:

도 37은 4 x 10⁶ cfu의 감염 용량의 N. 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 투여와, 이어서 억제 항-MASP-2 항체 (1.0 mg/kg) 또는 대조 아이소타입 항체 중 어느 하나의 감염 후 3시간의 투여 후에 마우스들의 퍼센트 생존을 그래프로 나타내는 Kaplan-Meyer 도표이다. 도 37에서 알 수 있는 것과 같이, 항-MASP-2 항체로 처리된 마우스의 90%가 감염 후 72시간 내내 생존하였다. 대조적으로, 아이소타입 대조 항체로 처리된 마우스은 단지 50%만이 감염 후 72시간을 통틀어 생존하였다. 기호 "*"는 2개의 생존 곡선의 비교에 의해 측정되는 바, p=0.0301을 나타낸다.

이들 결과는 항-MASP-2 항체가 N. 메닝기티디스로 감염된 대상에서 치료 및 생존율을 개선하는 데 효과적인 것을 증명한다.

본원에서 증명되는 것과 같이, N. 메닝기티디스로 감염된 대상에서 항-MASP-2 항체의 치료에의 사용은 감염 후 3시간 이내에 투여될 때 효율적이고, 감염 후 24시간 내지 48시간 내에 효과적인 것으로 예상된다. 수막염구균성 질환 (수막염균혈증 또는 수막염)은 의학적 응급이고, 치료법은 전형적으로 수막염구균성 질환이 의심되는 즉시 (즉 N. 메닝기티디스가 발병 병원체로서 포지티브로 확인되기 전) 개시될 것이다.

실시예 30에서 증명된 MASP-2 KO 마우스에서의 결과의 관점에서, N. 메닝기티디스로의 감염 전에 항-MASP-2 항체의 투여는 감염의 심각성을 방지 또는 개선하기에 또한 효과적일 것으로 여겨진다.

실시예 32

이 실시예는 항-MASP-2 항체의 투여가 인간 혈청의 N. 메닝기티디스 감염을 치료하기에 효과적인 것을 증명한다.

근거:

기능성 MBL의 혈청 수준이 감소된 환자들은 재발되는 박테리아 및 진균 감염에 대해 증가된 취약성을 나타낸다 (Kilpatrick et al., Biochim Biophys Acta 1572:401-413 (2002)). N. 메닝기티디스는 MBL에 의해 인식되는 것으로 알려져 있고, MBL-결핍 혈청은 나이세리아균을 용해시키지 못하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 30 및 31에서 기술된 결과들의 관점에서, 보체-결핍 및 대조 인간 혈청에서 N. 메닝기티디스 감염을 치료하는 항-MASP-2 항체의 투여의 효능을 측정하기 위하여 일련의 실험을 수행하였다. 실험을 보체 경로를 보존하기 위해 고농도의 혈청 (20%)에서 수행하였다.

방법:

1. 다양한 보체-결핍 인간 혈청 및 인간 항-MASP-2 항체로 처리된 인간 혈청에서 혈청의 살균 활성

다음의 보체-결핍 인간 혈청 및 대조 인간 혈청을 이 실험에 사용하였다:

시험한 인간 혈청 샘플 (도 38에 도시된 것과 같음)

샘플	혈청 유형
A	정상인 혈청 (NHS) + 인간 항-MASP-2 Ab
B	NHS + 아이소타입 대조 Ab
C	MBL -/- 인간 혈청
D	NHS
E	열-비활성화된 (HI) NHS

인간 MASP-2에 대한 재조합 항체를 Combinatorial Antibody Library (Knappik, A., et al., J. Mol. Biol. 296:57-86 (2000))로부터, 항원으로서 재조합 인간 MASP-2A를 사용하여 분리하였다. 인간 혈청 중의 C4 및 C3의 렉틴 경로-중재된 활성화를 강력하게 억제한 (IC50 ~20 nM) 항-인간 scFv 단편을 확인하였고 전-길이 인간 IgG4 항체로 전환시켰다.

N. 메닝기티디스 혈청군 B-MC58을 표 11에 나타낸 상이한 혈청과 함께, 각각 20%의 혈청 농도에서, 억제 인간 항-MASP-2 항체 (100 μl의 총 부피 중에 3 μg)를 첨가하거나 첨가하지 않고 37℃에서 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 샘플을 다음 시점: 0-, 30-, 60- 및 90-분 간격으로 취하고, 플레이팅 아웃하여 생존 카운트를 측정하였다. 열-비활성화된 인간 혈청을 네거티브 대조표준으로서 사용하였다.

결과:

도 38은 표 11에 나타낸 인간 혈청 샘플에서 상이한 시점에 회수한 N. 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생존 카운트의 로그 cfu/mL을 그래프로 도시한다. 표 12는 도 38에 대한 학생 t-시험 결과를 나타낸다.

도 38에 대한 학생 t-시험 결과 (시점 60분)

	평균 Diff. (Log)	유의미? P<0.05?	P 값 요약
A 대 B	-0.3678	Yes	***(0.0002)
A 대 C	-1.1053	Yes	***(p<0.0001)
A 대 D	-0.2111	Yes	**(0.0012)
C 대 D	1.9	Yes	***(p<0.0001)

도 38 및 표 12에서 알 수 있는 것과 같이, 인간 20% 혈청에서 N. 메닝기티디스의 보체-의존성 사멸은 인간 항-MASP-2 억제 항체의 첨가에 의해 상당히 증강되었다.

2. MASP-2가 결핍된 20% (v/v) 마우스 혈청에서 N. 메닝기티디스 의 보체-의존성 사멸

이 실험에서 다음의 보체-결핍 마우스 혈청 및 대조 마우스 혈청을 사용하였다:

시험한 마우스 혈청 샘플 (도 39에 도시된 것과 같음)

샘플	혈청 유형
A	WT
B	MASP-2 -/-
C	MBL A/C -/-
D	WT 열-비활성화된 (HIS)

N. 메닝기티디스 혈청군 B-MC58을 상이한 보체-결핍 마우스 혈청과 함께, 각각 20%의 혈청 농도에서, 37℃에서 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 샘플을 다음 시점: 0-, 15-, 30-, 60-, 90- 및 120-분 간격으로 취하고, 플레이팅 아웃하여 생존 카운트를 측정하였다. 열-비활성화된 인간 혈청을 네거티브 대조표준으로서 사용하였다.

결과:

도 39는 표 13에 나타낸 마우스 혈청 샘플에서 상이한 시점에 회수한 N. 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생존 카운트의 로그 cfu/mL을 그래프로 도시한다. 도 39에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2 -/- 마우스 혈청은 WT 마우스 혈청보다 N. 메닝기티디스에 대해 더 높은 수준의 살균 활성 수준을 가진다. 기호 "**"는 p=0.0058을 나타내고, 기호 "***"는 p=0.001을 나타낸다. 표 14는 도 39에 대한 학생 t-시험 결과를 나타낸다.

도 39에 대한 학생 t-시험 결과

비교	시점	평균 Diff. (LOG)	유의미? (p<0.05)?	P 값 요약
A 대 B	60 분	0.39	yes	** (0.0058)
A 대 B	90 분	0.6741	yes	*** (0.001)

요약하면, 이 실시예의 결과들은 MASP-2 -/- 혈청이 WT 마우스보다 N. 메닝기티디스에 대한 더 높은 수준의 살균 활성을 가지는 것을 증명한다.

실시예 33

이 실시예는 발작성 야행성 혈색소뇨증 (PNH)의 마우스 모델로부터 얻어진 혈액 샘플로부터의 적혈구의 용혈에 미치는 MASP-2 결핍의 억제 효과를 증명한다.

배경/근거:

Marchiafava-Micheli 증후군으로도 언급되는 발작성 야행성 혈색소뇨증 (PNH)은 보체-유도된 혈관내 용혈성 빈혈을 특징으로 하는, 잠재적으로 생명을 위협하는 혈액의 후천적 질병이다. PNH의 특징은 PNH 적혈구 상의 보체 조절자 CD55 및 CD59의 부재로 인한 보체의 대체 경로의 조절되지 않은 활성화의 결과인 만성 보체-중재된 혈관내 용혈과, 후속되는 혈색소뇨증 및 빈혈이다. Lindorfer, M.A., et al., Blood 115(11) (2010), Risitano, A.M, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535 (2011). PNH에서 빈혈은 혈류의 적혈구의 파괴로 인한 것이다. PNH의 증상들은 뇨 중의 헤모글로빈의 출현으로 인한 혈뇨, 요통, 피로감, 짧은 호흡 및 혈전증을 포함한다. PNH는 "일차 PNH"로 언급되는 자체적으로, 또는 "이차 PNH"로 언급되는 재생불량성 빈혈과 같은 다른 골수 장애의 맥락으로 발달될 수 있다. PNH에 대한 치료는 빈혈에 대한 수혈, 혈전증에 대한 응고 방지 및 보체 시스템을 억제함으로써 면역 파괴에 대해 혈액 세포들을 보호하는 단클론성 항체 유클리주맙 (Soliris®)의 사용을 포함한다 (Hillmen P. et al., N. Engl. J. Med. 350(6):552-9 (2004)). 유클리주맙 (Soliris®)은 보체 성분 C5를 표적으로 하고, C5 전환효소에 의한 그것의 절단을 차단함으로써 C5a의 생성 및 MAC의 조립을 방지하는 인간화된 단클론성 항체이다. 유클리주맙을 사용한 PNH 환자들의 치료는 락테이트 데하이드로게나제 (LDH)에 의해 측정되는 바, 혈관내 용혈의 감소를 초래함으로써 헤모글로빈 안정화 및 환자의 약 절반에서의 수혈 무관을 유발하였다 (Hillmen P, et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, vol 11(6) (2011)). 유클리주맙으로 치료중인 거의 모든 환자들이 정상 또는 거의 정상적인 LDH 수준을 이루는 한편 (혈관내 용혈의 제어로 인하여), 단지 환자들의 약 1/3은 11gr/dL보다 높은 헤모글로빈 값에 도달하고, 유클리주맙에 대한 나머지 환자들은 중간 정도의 심각한 (즉 수혈-의존성) 빈혈을, 거의 동등한 비율로 나타낸다 (Risitano A.M. et al., Blood 113:4094-100 (2009)). Risitano 등에 의해 기술된 것과 같이 (Risitano et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11:528-535 (2011)), 유클리주맙에 대한 PNH 환자들은 그들의 PNH 적혈구의 실질적인 부분에 결합된 C3 단편들을 함유함으로써 (한편 치료되지 않은 환자들은 그렇지 않았음), 막-결합된 C3 단편들이 PNH 적혈구 상의 옵소닌으로서 작용하여 특이적인 C3 수용체를 통한 세망내피 세포에서의 포획을 초래하고 후속적인 혈관외 용혈을 초래한다는 결론에 도달하는 것이 증명되었다. 그러므로, C3 단편-중재된 혈관외 용혈을 나타내는 환자들에 대해, 그들은 계속해서 적혈구 수혈을 필요로 하기 때문에, 유클리주맙을 사용하는 것 외의 치료 전략이 요구된다.

이 실시예는 PNH의 마우스 모델로부터 얻어진 혈액 샘플로부터의 적혈구의 용혈에 미치는 MASP-2- 결핍 혈청 및 MASP-2 억제제로 치료된 혈청의 효과를 평가하고 PNH에 걸린 대상을 치료하기 위한 MASP-2 억제의 효능을 증명하는 방법을 설명하며, 또한 유클리주맙과 같은 C5 억제제를 사용하여 치료가 진행중인 PNH 대상에서 C3 단편-중재된 혈관외 용혈의 효과를 개선하기 위한 MASP-2의 억제제의 사용을 지지한다.

방법:

PNH 동물 모델:

혈액 샘플을 Crry가 결핍된 유전자-표적화된 마우스 및 C3 (Crry/C3-/-) 및 CD55/CD59-결핍 마우스로부터 얻었다. 이들 마우스는 각각의 표면 보체 조절제가 없고, 따라서 그것들의 적혈구는 PNH 인간 혈구처럼 자발적 보체 자가용해되기 쉽다.

이들 적혈구를 한층 더 감작시키기 위하여, 이들 세포를 만난에 의한 코팅과 함께 및 그것 없이 사용한 후 WT C56/BL6 혈장, MBL null 혈장, MASP-2 -/- 혈장, 인간 NHS, 인간 MBL -/- 혈장 및 인간 항-MASP-2 항체로 처리된 NHS에서 용혈에 대해 시험하였다.

1. MASP-2-결핍/고갈된 혈청 및 대조표준에서 Crry/C3 및 CD55/CD59 이중-결핍 쥐과 적혈구의 용혈 분석

제 1일. 쥐과 RBC (±만난 코팅)의 제조

포함된 재료: 신선한 마우스 혈액, BBS/Mg^2+/Ca²⁺ (4.4 mM 바르비투르산, 1.8 mM 나트륨 바르비톤, 145 mM NaCl, pH7.4, 5mM Mg²⁺, 5mM Ca²⁺), 크로뮴 클로라이드, CrCl_3·6H₂0 (BBS/Mg2+/Ca2+ 중의 0.5mg/mL) 및 BBS /Mg2+/Ca2+ 중의 만난, 100 μg/mL.

전혈 (2 mL)을 1 내지 2분 동안 2000 xg에서 냉장 원심분리기에서 4℃에서 회전시켰다. 혈장과 버피 코트를 흡인제거하였다. 그런 다음 샘플을, RBC 펠릿을 2 mL의 빙냉 BBS/젤라틴/Mg2+/Ca2+에 재현탁하고 원심분리 단계를 반복함으로써 3회 세척하였다. 세 번째 세척 후에 펠릿을 4mL BBS/Mg2+/Ca2+에 재현탁하였다. RBC의 2 mL의 부분표본을 미코팅 대조표준으로서 한쪽에 놓았다. 2 mL을 유지하기 위하여, 2 mL CrCl3 및 2 mL 만난을 첨가하고 샘플을 부드럽게 혼합하면서 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 7.5 mL의 BBS/젤라틴/Mg2+/Ca2+를 첨가함으로써 종결시켰다. 샘플을 상기와 같이 회전시키고, 2 mL의 BBS/젤라틴/Mg2+/Ca2+에 재현탁하고 추가로 상기와 같이 2회 세척한 후 4℃에서 보관하였다.

제 2일. 용혈 분석

재료는 BBS/젤라틴/Mg²⁺/Ca²⁺ (상기와 같음), 시험 혈청, 96-웰 둥근-바닥 및 평평-바닥 플레이트 및 96-웰 플레이트를 410 내지 414 nm에서 판독하는 분광 광도계를 포함하였다.

RBC의 농도를 먼저 측정하고 세포를 10⁹/mL로 조정한 다음 이 농도에서 보관하였다. 사용 전에, 분석 완충액을 10⁸/mL로 희석한 후 웰당 100 μl를 사용하였다. 용혈을 410 내지 414 nm에서 측정하였다 (그런 다음 541 nm에서 더 큰 민감성을 허용함). 시험 혈청의 희석을 빙냉 BBS/젤라틴/Mg2+/Ca2+에서 제조하였다. 100 μl의 각 혈청 희석을 둥근-바닥 플레이트에 피펫팅하여 넣었다 (플레이트 배치 참조). 100 μl의 적절하게 희석된 RBC 제제를 첨가하고 (즉 10⁸ /mL) (플레이트 배치 참조), 37℃에서 약 1시간 동안 인큐베이션하고, 용해에 대해 관찰하였다. (플레이트를 이 시점에서 사진을 찍을 수 있다.) 그런 다음 플레이트를 5분 동안 최대 속도에서 회전시켰다. 유동상에서 100 μl를 흡입하여 평평-바닥 플레이트에 옮기고, OD를 410 내지 414 nm에서 기록하였다. RBC 펠릿을 유지하였다 (이것들은 계속해서 물로 용해시켜 반전 결과를 얻을 수 있다).

실험 #1:

CD55/CD59 이중-결핍 마우스로부터 얻어진 신선한 혈액 및 Crry/C3 이중-결핍 마우스의 혈액과 적혈구를 상기 프로토콜에서 기술한 것과 같이 제조하였다. 세포를 나누어 세포의 절반을 만난으로 코팅하고 다른 절반을 미처리 상태로 놓아두고 최종 농도를 1x 10⁸/mL로 조정한 후, 그것의 100 μl를 상기에서 기술한 것과 같이 수행하는 용혈 분석에 사용하였다.

실험 #1의 결과: 렉틴 경로는 PNH 동물 모델에서 적혈구 용혈에 포함된다

초기 실험에서, 미코팅 WT 마우스 적혈구는 어떠한 마우스 혈청에서도 용해되지 않은 것으로 측정되었다. 또한 만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구는 WT 마우스 혈청에서 느리게 용해 (37℃에서 3시간 이상)되었지만, 그것들은 MBL 무의미 혈청에서는 용해되지 않았다 (데이터는 제시하지 않음).

만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구는 만난 혈청에서 신속하게 용해되었지만, 열-비활성화된 NHS에서는 용해되지 않은 것으로 측정되었다. 중요하게, 만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구는 1/640으로 희석된 NHS에서 용해되었다 (즉 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 및 1/640 희석에서 모두 용해되었다). (데이터는 제시하지 않음). 이 희석에서, 대체 경로는 작동하지 않는다 (AP 기능적 활성은 8% 혈청 농도 아래로 상당히 감소된다).

실험 #1로부터의 결론

만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구는 MBL이 없는 것이 아닌 MBL이 첨가된 고도로 희석된 인간 혈청에서 매우 잘 용해되었다. 시험된 모든 혈청 농도에서의 효율적인 용해는 대체 경로가 이 용해에 포함되지 않거나 이 용해가 필요하지 않음을 의미한다. MBL-결핍 마우스 혈청 및 인간 혈청이 만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구를 용해시키지 못하는 무능력은 고전적 경로 또한 관찰된 용해를 사용하여 이루어지는 것이 없음을 가리킨다. 렉틴 경로 인식 분자가 필요하기 때문에 (즉 MBL), 이 용해는 렉틴 경로에 의해 중재된다.

실험 #2:

Crry/C3 및 CD55/CD59 이중-결핍 마우스로부터 얻어진 신선한 혈액과 만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구를 상기에서 기술한 것과 같이 용혈 분석으로 다음의 인간 혈청의 존재하에 분석하였다: MBL 무의미; WT; 인간 항-MASP-2 항체로 전처리된 NHS; 및 대조표준으로서의 열-비활성화된 NHS.

실험 #2의 결과: MASP-2 억제제는 PNH 동물 모델에서 적혈구 용해를 방지한다

만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구를 사용하여 NHS를 1/640으로 희석한 희석 (즉 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 및 1/640), 인간 MBL-/- 혈청, 항-MASP-2 mAb로 전처리된 NHS 및 대조표준으로서의 열-비활성화된 NHS에서 인큐베이션하였다.

ELISA 미세역가 플레이트를 회전시키고 용해되지 않은 적혈구를 둥금-웰 플레이트의 바닥에 수집하였다. 각 웰의 상층액을 수집하고 용해된 적혈구로부터 방출된 헤모글로빈의 양을 ELISA 판독시에서 OD415 nm를 판독함으로써 측정하였다.

대조 열-비활성화된 NHS (네거티브 대조표준)에서, 예상했던 것과 같이, 용해가 관찰되지 않았다. MBL-/- 인간 혈청은 만난-코팅된 마우스 적혈구를 1/8 및 1/16 희석에서 용해시켰다. 항-MASP-2-항체-전처리된 NHS는 만난-코팅된 마우스 적혈구를 1/8 및 1/16 희석에서 용해시킨 한편, WT 인간 혈청은 1/32의 희석에으로 다운된 만난-코팅된 마우스 적혈구를 용해시켰다.

도 40은 열-비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, 항-MASP-2 항체로 전처리된 NHS 및 NHS 대조표준으로부터의 혈청의 넓은 혈청 농도에 걸쳐, 인간 혈청에 의한 만난-코팅된 쥐과 적혈구의 용혈 (용해된 마우스 적혈구 (Cryy/C3-/-)의 상층액으로의 헤모글로빈 방출에 의해 광도 측정에 의해 측정됨)을 그래프로 도시한다.

도 40에 도시된 결과로부터, 항-MASP-2 항체를 사용한 MASP-2 억제는 CH50을 상당히 변동시켰고 자체 보체 활성화로부터 보호되지 않으면서 감작된 적혈구의 보체-중재된 용혈을 억제하였음이 증명된다.

실험 #3

미-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구에서 Crry/C3 및 CD55/CD59 이중-결핍 마우스로부터 얻어진 신선한 혈액을 다음 혈청의 존재하에 상기 기술된 것과 같은 용혈 분석으로 분석하였다: MBL -/-; WT 혈청; 인간 항-MASP-2 항체로 전처리된 NHS 및 대조표준으로서의 열-비활성화된 대조표준.

결과:

도 41은 열-비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, 항-MASP-2 항체로 전처리된 NHS 및 NHS 대조표준으로부터의 혈청의 넓은 혈청 농도에 걸쳐, 인간 혈청에 의한 미-코팅된 쥐과 적혈구의 용혈 (용해된 WT 마우스 적혈구의 상층액으로의 헤모글로빈 방출에 의해 광도 측정에 의해 측정됨)을 그래프로 도시한다. 도 41에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2를 억제하는 것은 미-감작된 WT 마우스 적혈구의 보체-중재된 용해를 억제하는 것이 증명된다.

도 42는 열-비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, 항-MASP-2 항체로 전처리된 NHS 및 NHS 대조표준으로부터의 혈청의 넓은 혈청 농도에 걸쳐, 인간 혈청에 의한 미-코팅된 쥐과 적혈구의 용혈 (용해된 WT 마우스 적혈구 (CD55/59-/-)의 상층액으로의 헤모글로빈 방출에 의해 광도 측정에 의해 측정됨)을 그래프로 도시한다.

주: "CH₅₀"은 보체 중재된 용혈이 50%에 도달하는 지점이다.

요약하면, 이 실시예의 결과는 MASP-2를 억제하는 것이 자체 보체 활성화로부터 보호되지 않으면서 감작된 및 미-감작된 적혈구의 보체-중재된 용해를 억제하는 것을 증명한다. 그러므로, MASP-2 억제제는 PNH에 걸린 대상을 치료하기 위해 사용될 수 있고, 또한 유클리주맙 (Soliris®)과 같은 C5 억제제로 치료가 진행중인 PNH 환자들에서의 혈관외 용혈을 개선 (즉 억제, 방지 또는 심각성의 감소)하는 데 사용될 수 있다.

실시예 34

이 실시예는 상기 실시예 29에서 기술된 공부하는 연구를 따라 기술되고, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 항체가 복사선 노출의 치료를 위해 및/또는 급성 복사선 증후군의 치료, 개선 또는 방지를 위해 효과적인 것을 확인하는 추가의 증거를 제공한다.

근거: 실시예 29에서 기술된 초기 연구에서, 마우스에서 항-MASP-2 항체를 사용한 6.5 Gy 및 7.0 Gy 둘 다의 노출 수준에서 조사전 처리가 비히클 처리된 조사된 대조 동물에 비교하여 조사된 마우스의 생존을 증가시켰음이 증명되었다. 추가로 실시예 29에서 6.5 Gy 노출 수준에서, 항-MASP-2 항체를 사용한 조사후 처리는 비히클 대조표준 조사된 동물에 비교하여 생존율의 보통의 증가를 초래하였다. 이 실시예는 첫 번째 연구의 결과를 확인하기 위해 수행된 두 번째 복사선 연구를 설명한다.

방법:

연구 A의 디자인:

Swiss Webster 마우스 (n=50)를 이온화 복사선 (8.0 Gy)에 노출시켰다. 복사선 노출 전 18시간과 노출 후 2시간에, 그리고 그 이후에 주마다 투여된 항-MASP-2 항체 치료법 (mAbH6 5mg/kg)이 사망에 미치는 효과를 평가하였다.

연구 A의 결과:

도 43에서 알 수 있는 것과 같이, 항-MASP-2 항체 mAbH6의 투여는 8.0 Gy에 노출된 마우스에서의 생존율을 증가시켰고, 이때 조정된 중간 생존율은 비히클 대조표준을 받은 마우스에 비교하여 4에서 6일로 증가하였고, 사망률은 비히클 대조표준을 받은 마우스에 비교하여 12% 감소하였다 (로그-등급 시험, p=0.040).

연구 B의 디자인:

Swiss Webster 마우스 (n=50)를 다음의 그룹에서 이온화 복사선 (8.0 Gy)에 노출시켰다: (I: 비히클) 염수 대조표준; (II: 낮은) 항-MASP-2 항체 mAbH6 (5 mg/kg)을 조사 전 18시간 및 조사 후 2시간에 투여함; (III: 높은) mAbH6 (10 mg/kg)을 조사 전 18시간 및 조사 후 2시간에 투여함; 및 (IV: 가장 높은) mAbH6 (10mg/kg)를 조사 후 2시간에만 투여함.

연구 B의 결과:

조사 전 및 후의 항-MASP-2 항체의 투여는 비히클 대조표준을 받은 동물에 비교하여 평균 생존을 4에서 5일로 조정하였다. 항-MASP-2 항체-처리된 마우스에서의 사망률은 비히클 대조 마우스에 비교하여 6 내지 12% 감소하였다. 추가로 어떠한 유의미한 유해 처리 효과도 관찰되지 않은 것으로 주지된다 (데이터는 제시하지 않음).

요약하면, 이 실시예에 나타낸 결과들은 실시예 29에서 나타낸 결과들과 일치하고, 추가로 항-MASP-2 항체가 급성 복사선 증후군에 걸릴 위험이 있거나 그것의 역효과로 고생하는 포유류 대상을 치료하는 데 효과적인 것을 증명한다.

실시예 35

이 연구는 LPS (리포다당)-유도된 혈전증의 마우스 모델에서 MASP-2-결핍의 효과를 조사한다.

근거:

쉬가 독소-생성 대장균 감염에 의해 유발되는 용혈성 요독성 증후군 (HSu)은 아동의 급성 신부전의 선도적 원인이다. 이 실시예에서, LPS-유도된 혈전증 (미세혈관 응고)의 슈바르츠만 모델을 MASP-2-/- (KO) 마우스에서 MASP-2 억제가 혈관내 혈전의 형성을 억제하거나 방지하는데 효과적인지를 측정하기 위해 수행하였다.

방법:

MASP-2-/- (n=9) 및 WT (n=10) 마우스를 LPS-유도된 혈전증 (미세혈관 응고)의 슈바르츠만 모델에서 분석하였다. 마우스에게 세라티아속 LPS를 투여하고, 혈전 형성을 시간에 따라 모니터링하였다. 미세혈전 및 LPS-유도된 미세혈관 응고의 발생을 비교하였다.

결과:

주의할 것은 모든 시험된 MASP-2 -/- 마우스 (9/9)가 세라티아 LPS 투여 후에 혈관내 혈전을 형성하지 않았다는 것이다. 대조적으로, 미세혈전은 나란히 시험된 WT 마우스의 10마리 중 7마리에서 검출되엇다 (p=0.0031, Fischer's exact). 도 44에서 알 수 있는 것과 같이, LPS 감염에 이어지는 미세혈관 폐색의 개시 시간을 MASP-2-/- 및 WT 마우스에서 측정하였고, 그것은 60분에 걸쳐 측정된 혈전 형성된 WT 마우스의 백분율을 나타내며, 이때 혈전 형성은 약 15분 정도로 일찍 검출되었다. 80%까지의 WT 마우스가 60분에 혈전 형성을 증명하였다. 대조적으로, 도 44에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2 -/- 중 어느 것도 60분에 혈전을 형성하지 않았다 (로그 등급: p=0.0005).

이들 결과는 MASP-2 억제가 HUS 모델에서 혈관내 혈전의 발생에 대해 보호적인 것을 증명한다.

실시예 36

이 실시예는 정제된 쉬가 독소 2 (STX2) 플러스 LPS의 복강 내 공동-주사를 사용한 HUS의 마우스 모델에서의 항-MASP-2 항체의 효과를 설명한다.

배경:

HUS의 마우스 모델을 정제된 쉬가 독소 2 (STX2) 플러스 LPS의 복강내 공동-주사를 사용하여 개발하였다. 마우스 신장의 생화학적 및 마이크로어레이 분석은 STX2 플러스 LPS 도전이 어느 하나의 제제 단독의 효과와는 구별되는 것으로 드러났다. 이들 마우스의 혈액 및 혈청 분석은 호중구 증가증, 혈소판 감소증, 적혈구 용혈 및 증가된 혈청 크레아티닌 및 혈중 요소 질소를 나타냈다. 또한, 마우스 신장의 조직학적 분석 및 전자 현미경검사는 사구체 피브린 침착, 적혈구 적체, 미세혈전 형성 및 사구체의 초미세구조의 변화를 증명하였다. HUS의 이 모델은 C57BL/6 마우스에서 인간 질환을 규정하는 혈소판 감소증, 용혈성 빈혈 및 신부전증을 포함하여, 인간 HUS 병리학의 모든 임상적 증상을 유도한다 (J. Immunol 187(1):172-80 (2011)).

방법:

체중이 18 내지 20 g인 C57BL/6 암컷 마우스를 Charles River Laboratories로부터 구매하고 2 그룹으로 나누었다 (각 그룹에 5마리의 마우스). 한 그룹의 마우스를 총 150 μl 부피의 염수에 희석한 재조합 항-MASP-2 항체 mAbM11 (100 μg/마우스; 5 mg/kg 체중의 최종 농도에 상응함)을 사용한 복강 내 (i.p.) 주사에 의해 전처리하였다. 대조 그룹에게는 어떠한 항체도 없는 염수를 주었다. 항-MASP-2 항체 mAbM11의 i.p. 주사후 6시간째에 모든 마우스에게 치사량에 가까운 용량 (3 μg/동물; 150 μg/kg 체중에 해당함)의 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens)의 LPS와 4.5 ng/동물의 용량 (225 ng/kg에 해당함)의 STX2 (LD50 용량의 2배)를 조합하여 총 부피 150 μl로 i.p. 주사하였다. 염수 주사를 대조표준에 대해 사용하였다.

마우스의 생존을 투여 후 6시간마다 모니터링하였다. 마우스를 그것들이 HUS 병리학의 치사 단계에 이르면 즉시 도태시켰다. 36시간 후에 모든 마우스는 도태되었고, 양쪽 신장을 면역조직화학 및 주사 전자 현미경검사를 위해 제거하였다. 혈액 샘플을 실험 종료시에 심장 천공에 의해 취하였다. 처리 및 대조 그룹 둘 다에서 BUN과 혈청 크레아티닌 수준을 측정하기 위해 혈청을 분리하고 -80℃에서 냉동 보관하였다.

면역조직화학

각 마우스의 신장의 1/3을 4% 파라포름알데하이드에 24시간 동안 고정하고, 처리한 후 파라핀에 삽입시켰다. 3-미크론 두께의 단편을 절단하여 H & E 얼룩으로의 후속적인 염색을 위해 대전된 슬라이드 위에 놓았다.

전자 현미경검사

신장의 중간 섹션을 대략 1 내지 2 mm³의 블록으로 절단하여 4℃에서 1x PBS 중의 2.5% 글루타르알데하이드에 밤새 고정시켰다. 고정된 조직을 계속해서 University of Leicester 전자 현미경 설비에 의해 처리하였다.

크리오스타트 섹션

신장의 다른 1/3을 대략 1 내지 2 mm³의 블록으로 절단하고, 액체 질소 중에 잠깐 냉동시켰다가 크리오스타트 섹션 및 mRNA 분석을 위해 -80℃에서 보관하였다.

결과:

도 45는 시간 경과에 따라 STX/LPS-유도된 모델에서 염수-처리된 대조 마우스 (n=5) 및 항-MASP-2 항체-처리된 마우스 (n=5)의 퍼센트 생존을 그래프로 도시한다. 주지할 것은, 도 45에서 알 수 있는 것과 같이, 모든 대조 마우스가 42시간내에 사망한 것이었다. 극명하게 대조적으로, 100%의 항-MASP-2 항체-처리된 마우스가 실험 기간을 통틀어 생존하였다. 도 45에 도시된 결과와 일치하게, 심각한 질환 신호를 나타내며 사망하거나 도태된 미처리 마우스는 모두 상당한 사구체 손상을 가졌던 한편, 항-MASP-2 항체-처리된 모든 마우스의 사구체는 정상으로 보이는 것이 관찰되었다 (데이터는 제시하지 않음). 이들 결과는 MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체가 혈전성 미세혈관병증 (TMA), 예컨대 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비전형적인 HUS (aHUS) 또는 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 증명한다.

실시예 37

이 실시예는 혈전증의 쥐과 FITC-덱스트란/광 유도된 내피 세포 손상 모델에서 MASP-2 결핍 및 MASP-2 억제의 영향을 설명한다.

배경/근거: 실시예 35 및 36에서 증명된 것과 같이, MASP-2 결핍 (MASP-2 KO) 및 MASP-2 억제 (억제 MASP-2 항체의 투여를 통한)는 전혀적인 HUS의 모델에서 마우스를 보호한 반면, STX 및 LPS에 노출된 대조 마우스는 48시간 이내에 빈사상태가 되거나 사망하였다. 예를 들어, 도 54에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2 억제 항체로 처리된 후 STX 및 LPS에 노출된 마우스들은 모두 생존하였다 (Fisher's exact p<0.01; N=5). 그러므로, 항-MASP-2 치료법은 이 HUS 모델에서 마우스를 보호한다.

다음의 실험을, 다른 병인학을 가지는 HUS, aHUS, TTP 및 TMA의 치료를 위해 MASP-2 억제제의 유익을 한층 더 증명하기 위하여, 혈전성 미세혈관병증 (TMA)의 플루오레세인 아이소티오시아네이트 (FITC)-덱스트란-유도된 내피 세포 손상 모델에서의 MASP-2 결핍 및 MASP-2 억제의 효과를 분석하기 위해 수행하였다.

방법:

생체 내 현미경검사

마우스를 문헌에 기술되어 있는 것과 같이 (Frommhold et al., BMC Immunology 12:56-68, 2011) 생체 내 현미경검사를 위해 준비하였다. 간단하게 설명하면, 마우스를 케타민 (125 mg/kg 체중, Ketanest, Pfitzer GmbH, Karlsruhe, Germany) 및 자일라진 (12.5 mg/kg 체중; Rompun, Bayer, Leverkusen, Germany)의 복강 내 (i.p.) 주사로 마취시키고 체온을 37℃로 유지하기 위해 가열 패드 위에 놓았다. 생체 내 현미경검사를 염수 액침 대물렌즈 (SW 40/0.75 개구수, Zeiss, Jena, Germany)가 부착되어 있는 수직 현미경 (Leica, Wetzlar, Germany)상에서 수행하였다. 쉬운 호흡을 위해, 마우스를 PE 90 튜빙 (Becton Dickson and Company, Sparks, MD, USA)을 사용하여 삽관하였다. 혈액 샘플링과 전신성 단클론성 항체 (mAb) 투여를 위해 좌측 경동맥에 PE10 튜빙 (Becton Dickson and Company, Sparks, MD, USA)으로 카뉼레를 삽입하였다.

고환거근 제조

생체 내 현미경검사를 위한 고환거근의 수술적 제조를 문헌에 기술된 것과 같이 수행하였다 (Sperandio et al., Blood, 97:3812-3819, 2001). 간단히 설명하면, 음낭을 열고 고환거근을 고정시켰다. 근육을 세로방향으로 절개하고 커버 유리 위에 펼쳐놓고, 부고환 및 고환을 이동시켜 측면에 핀으로 고정하여 전체 현미경이 고환거근 미소순환계에 접근할 수 있도록 하였다. 고환거근 정맥을 CCD 카메라 (CF8/1; Kappa, Gleichen, Germany)를 통해 Panasonic S-VHS 리코더 상에 기록하였다. 고환거근에 앞서 문헌에 기술되어 있는 것과 같이 (Frommhold et al., BMC Immunology 12:56-68, 20112011) 열-제어된 (35℃) 바이카보네이트-완충된 염수를 쏟아부었다.

광 여기 FITC 덱스트란 손상 모델

고환거근 정맥 및 세동맥의 내피의 제어된, 광-용량-의존성 혈관 손상을 광독성 (FITC)-덱스트란 (Cat. No. FD150S, Sigma Aldrich, Poole, U.K.)의 광 여기에 의해 유도하였다. 이 과정은 국소화된 혈전증을 개시한다. 광독성 시약으로서, 60 μL의 10% w/v 용액의 FITC-덱스트란을 좌측 경동맥 접근을 통해 주사하고 10분 동안 순환하는 혈액을 통해 균질하게 퍼지도록 하였다. 잘-관류된 정맥을 선택한 후, 낮은 세기 내지 중간범위 세기 (800 내지 1500)의 할로겐 광을 관심의 혈관에 초점을 맞추어 FITC-덱스트란 형광 및 내피 표면에 약한 내지 적당한 광독성을 유도하여 재생가능하고 제어된 방식으로 혈전증을 자극하였다. FITC-덱스트란의 여기에 필요한 광독성 광의 세기를 할로겐 램프 (12V, 100W, Zeiss, Oberkochen, Germany)를 사용하여 생성하였다. 형광 색소의 광-유도된 여기로부터 발생하는 광독성은 광세기의 임계값 및/또는 발광 기간을 필요로 하고 내피 표면의 직접적인 가열 또는 문헌에 기술되어 있는 것과 같이 (Steinbauer et al., Langenbecks Arch Surg 385:290-298, 2000) 반응성 산소 라디칼의 생성 중 어느 한 가지에 의해 유발된다.

각 혈관에 적용된 광의 세기를 저전력 측정 (Labmaster LM-2, Coherent, Auburn, USA)을 위한 파장-보정용 다이오드 검출기에 의해 측정하여 조정하였다. 비디오 스캔의 오프-라인 분석을 컴퓨터 보조된 미세순환계 분석 시스템 (CAMAS, Dr. Zeintl, Heidelberg)에 의해 수행하였고 적혈구 속도를 문헌에 기술되어 있는 것과 같이 측정하였다 (Zeintl et al., Int J Microcirc Clin Exp, 8(3):293-302, 2000).

혈전증의 유도 전 단클론성 항-인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6) 및 비히클 제어의 적용

맹검 연구 디자인을 사용하여, 9-주령 수컷 C57BL/6 WT 한배새끼 마우스에 MASP-2 기능적 활성의 억제제인 재조합 단클론성 인간 MASP-2 항체 (mAbH6) (10mg/kg 체중의 최종 농도로 제공함) 또는 동일한 양의 아이소타입 대조 항체 (MASP-2 억제 활성이 없음) 중 어느 하나를 생체 내 현미경검사의 혈전증의 거고근 모델에서 광독성을 유도하기 16시간 전에 제공하였다. 혈전증 유도 1시간 전에, 제 2 용량의 mAbH6 또는 대조 항체를 제공하였다. MASP-2 녹아웃 (KO) 마우스를 또한 이 모델에서 평가하였다.

mAbH6 (재조합 인간 MASP-2에 대해 수립됨)은 인간 MASP-2 기능적 활성의 강력한 억제제로, 마우스 MASP-2와 반응하고, 그것과 결합하고 억제하지만, 그것의 종 특이성으로 인해 친화성이 낮다 (데이터는 제시하지 않음). 마우스 MASP-2에 대한 mAbH6의 낮은 친화성을 보상하기 위하여, mAbH6을 종 특이성의 변화를 극복하기 위해 고농도 (10mg/kg 체중)로 제공하였고, 마우스 MASP-2에 대한 더 적은 친화성은 생체 내 조건하에서 쥐과 MASP-2 기능적 활성의 효과적인 차단을 제공한다.

이 맹검 연구에서, 각각의 개별적인 시험된 정맥 (선택 기준은 비교할만한 직경 및 혈류 속도에 의한 것이었음)에 대해 완전히 폐색되기에 필요한 시간을 기록하였다.

미세혈관 폐색을 나타낸 마우스의 백분율, 개시 시간 및 폐색까지 걸린 시간을 60-분 관찰 주기에 걸쳐 생체 내 현미경검사 비디오 기록들을 사용하여 평가하였다.

결과:

도 46은 손상 유도 후 시간의 함수로서, FITC/덱스트란 UV 모델에서 FITC/덱스트란의 주사 전 16시간 및 1시간 전에 투여된 아이소타입 대조표준 또는 인간 MASP-2 항체 mAbH6 (10mg/kg)으로의 처리 후에 미세혈관 폐색을 나타낸 마우스의 백분율을 그래프로 도시한다. 도 46에서 알 수 있는 것과 같이, 아이소타입 대조 항체를 받은 야생형 마우스의 85%가 30분 이하의 시간 내에 폐색된 반면, 인간 MASP-2 항체 (mAbH6)로 전처리된 야생형 마우스는 단지 19%만이 동일한 기간 내에 폐색되었으며, 폐색까지의 시간은 인간 MASP-2 항체-처리된 그룹에서 최종적으로 폐색된 마우스에서 지연되었다. 또한 MASP-2 mAbH6 처리된 마우스 중 3마리가 60-분 관찰 기간 내에 전혀 폐색되지 않았다 (즉 혈전성 폐색으로부터 보호되었다).

도 47은 인간 MASP-2 항체 (mAbH6) 및 아이소타입 대조 항체로 처리된 마우스에 대한 분의 폐색 시간을 그래프로 도시한다. 데이터는 분산-점으로서 기록되고 평균 값 (수평 막대)과 표준 오차 막대 (수직 막대)가 표시된다. 이 도면은 폐색을 관찰할 수 있는 마우스에서의 폐색 시간을 나타낸다. 그러므로 60분의 관찰 기간 동안 폐색되지 않은 3 마리의 MASP-2 항체-처리된 마우스를 이 분석에 포함시키지 않았다 (폐색되지 않은 대조 처리된 마우스는 없었음). 분석에 사용한 통계학적 시험은 쌍을 이루지 않은 t 시험이었다; 여기서 기호 "*"는 p=0.0129를 나타낸다. 도 47에서 알 수 있는 것과 같이, 폐색된 4마리의 MASP-2 항체 (mAbH6)-처리된 마우스에서, MASP-2 항체로의 처리는 아이소타입 대조 항체로 처리된 마우스에 비교하여, 낮은 광세기 (800 내지 1500)를 사용한 혈전증의 FITC-덱스트란/광-유도된 내피 세포 손상 모델에서 정맥 폐색 시간을 상당히 증가시켰다. 아이소타입 대조표준의 전체 폐색 시간의 평균은 19.75분이었던 한편, MASP-2 항체 처리 그룹에 대한 전체 폐색 시간의 평균은 32.5분이었다.

도 48은 낮은 광세기 (800 내지 1500)를 사용한 혈전증의 FITC-덱스트란/광-유도된 내피 세포 손상 모델에서 야생형 마우스, MASP-2 KO 마우스및 인간 MASP-2 항체 (mAbH6)로 혈전증을 유도하기 전 16시간 전에 10mg/kg으로 i.p. 투여된 후 혈전증 유도 전 1시간 전에 다시 i.v. 투여되어 전처리된 마우스에 대해 폐색이 일어나기까지의 시간을 분으로 표시한 그래프로 도시한다. 폐색된 동물들만은 도 48에 포함시켰다; 아이소타입 대조 항체를 받은 야생형 마우스에 대해 n=2; MASP-2 KO에 대해 n=2; 및 인간 MASP-2 항체 (mAbH6)를 받은 야생형 마우스에 대해 n=4. 기호 "*"는 p<0.01을 나타낸다. 도 48에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2 결핍 및 MASP-2 억제 (10 mg/kg의 mAbH6)는 낮은 광세기 (800 내지 1500)를 사용한 혈전증의 FITC-덱스트란/광-유도된 내피 세포 손상 모델에서 정맥 폐색 시간을 증가시켰다.

결론:

이 실시예의 결과들은 추가로 렉틴 경로를 차단하는 MASP-2 억제제 (예컨대 MASP-2 기능을 차단하는 항체)가 TMA의 마우스 모델에서, 다중 미세혈관신생 장애의 특징인 미세혈관 응고 및 혈전증을 차단하는 것을 증명한다. 그러므로, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체의 투여는 HUS, aHUS, TTP 또는 다른 미세혈관병증 장애로 고생하는 환자들에서 효과적인 치료법이 될 것이고 미세혈관 응고 및 혈전증으로부터의 보호를 제공하는 것으로 예상된다.

실시예 38

이 실시예는 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6)가 혈소판-풍부한 인간 혈장에서 혈소판 기능에 영향을 미치지 않는 것을 증명하는 연구를 설명한다.

배경/근거: 실시예 37에서 기술된 것과 같이, 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6)를 사용한 MASP-2 억제는 혈전증의 FITC-덱스트란/광-유도된 내피 세포 손상 모델에서 정맥 폐색 시간을 증가시킨 것이 증명되었다. 다음의 실험을 MASP-2 억제 항체 (mAbH6)가 혈소판 기능에 영향을 미치는 지의 여부를 측정하기 위해 수행하였다.

방법: 인간 mAbH6 MASP-2 항체의 효과를 다음과 같이 혈소판의 ADP-유도된 응집에 대해 시험하였다. 1 μg/ml 또는 0.1 μg/ml 중 어느 하나의 농도의 인간 MASP-2 mAbH6을 40 μL의 용액으로 360 μL의 새롭게 제조한 혈소판-풍부 인간 혈장에 첨가하였다. 아이소타입 대조 항체를 네거티브 대조표준으로서 사용하였다. 항체를 혈장에 첨가한 후, 혈소판 활성화를 ADP를 2 μM의 최종 농도로 첨가함으로써 유도하였다. 1 mL의 큐벳에 있는 작은 자석으로 용액을 교반함으로써 분석을 시작하였다. 혈소판 응집을 2-채널 Chrono-log Platelet Aggregometer Model 700 Whole Blood/Optical Lumi-Aggregometer에서 측정하였다.

결과:

용액 중의 퍼센트 응집을 5분의 기간에 시간경과에 따라 측정하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.

상기 표 13에서 알 수 있는 것과 같이, 대조 항체 또는 MASP-2 mAbH6 항체로처리된 ADP-유도된 혈소판의 응집 사이에 유의미한 차이는 관찰되지 않았다. 이들 결과는 인간 MASP-2 항체 (mAbH6)가 혈소판 기능에 대해 영향을 미치지 않는 것을 증명한다. 그러므로, 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6)를 사용한 MASP-2 억제가 혈전증의 FITC-덱스트란/광-유도된 내피 세포 손상 모델에서 정맥 폐색 시간을 증가시킨 것을 증명하는 실시예 37에서 기술된 결과들은 혈소판 기능에 대한 mAbH6의 영향에 기인한 것이 아니었다. 그러므로, MASP-2 억제는 혈소판 기능에 직접적으로 영향을 주지 않으면서 혈전증을 방지하는, 기존의 항-혈전제와 구별되는 치료 메커니즘을 드러낸다.

실시예 39

이 실시예는 TMA의 쥐과 모델에서 혈전 형성 및 혈관 폐색에 미치는 MASP-2 억제의 효과를 설명한다.

배경/근거: 렉틴 경로는 내피 세포 스트레스 또는 손상의 환경에서 보체 시스템을 활성화시키는 데 지배적인 역할을 한다. 이 활성화는 대체 경로에 의해 쉽게 증폭되는데, 그것은 aHUS를 나타내는 많은 환자들에서 잘 조절되지 않는다. ㄱ그러므로 MASP-2의 활성화 및 렉틴 경로의 방지는 연속적인 막 공격 복합체의 형성 혈소판 활성화 및 류코사이트 충원을 유도하는 효소적 반응들을 정지시킬 것으로 예상된다. 이 효과는 조직 손상을 제한한다.

또한, MASP-2는 인자 Xa-유사 활성을 가지며 프로트롬빈을 트롬빈으로 절단한다. 응고 시스템의 이런 MASP-2-구동된 활성화는 지혈의 균형을 깨트리고 TMA의 병리학을 초래할 수 있다. 그러므로 MASP-2 억제제, 예컨대 보체의 활성화 응고 시스템을 차단하는 MASP-2 억제 항체를 사용한 MASP-2의 억제는 aHUS 및 다른 TMA-관련 상태들의 결과를 개선할 것으로 예상된다.

실시예 37에서 기술된 것과 같이, 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6)를 사용한 MASP-2 억제는 혈전증의 FITC-덱스트란/광-유도된 내피 세포 손상 모델에서 정맥 폐색 시간을 증가시킨 것으로 증명되었다. 이 TMA 모델에서, 마우스들을 FITC-덱스트란의 IV 주사와, 이어서 마우스 고환거근의 미세혈관계의 FITC-덱스트란의 국소화된 광-활성화에 의해 감작시켰다 (Thorlacius H et al., Eur J Clin. Invest 30(9):804-10, 2000; Agero et al., Toxicon 50(5):698-706, 2007).

다음의 실험을 MASP-2 억제 항체 (mAbH6)가 TMA의 쥐과 모델에서 혈전 형성 및 혈관 폐색에 용량-반응 효과를 나타내는지의 여부를 측정하기 위해 수행하였다.

방법: C57 Bl/6 마우스의 고환거근의 미세혈관에서 플루오레세인 아이소티오시아네이트-표지된 덱스트란 (FITC-덱스트란)의 광-활성화에 의해 국소화된 혈전증을 유도하고, 생체 내 현미경검사를 사용하고 실시예 37에서 기술된 방법을 사용하되 다음의 변형을 사용하여 혈전 형성 및 혈관 폐색의 개시를 측정하였다. mAbH6 (2mg/kg, 10 mg/kg 또는 20 mg/kg) 또는 아이소타입 대조 항체 (20 mg/kg)를 마우스들의 그룹에 TMA 유도 전 1시간 전에 정맥 내 (iv) 주사에 의해 투여하였다. 혈전 형성의 개시까지의 시간 및 완전한 혈관 폐색까지의 시간을 기록하였다. 30 내지 60분에 걸쳐 기록된 생체 내 현미경검사 영상의 비디오 재생 분석을 사용하여 혈관 크기, 혈류 속도, 광 세기, 혈소판 부착과 동등한 것으로서 혈전 형성의 개시속도, 혈전 형성의 개시까지의 시간, 총 혈관 폐색률 및 총 혈관 폐색까지의 시간을 평가하였다. 통계학적 분석을 SigmaPlot v12.0을 사용하여 수행하였다.

결과:

혈전 형성의 개시

도 49는 증가하는 용량의 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6 at 2 mg/kg, 10mg/kg 또는 20 mg/kg) 또는 아이소타입 대조 항체로 치료된 마우스에서 FITC-덱스트란 유도된 혈전성 미세혈관병증의 시간의 함수로서 혈전을 가진 마우스의 백분율을 보여주는 Kaplan-Meier 도표이다. 도 49에서 알 수 있는 것과 같이, 혈전 형성의 개시는 대조표준-처리된 마우스에 비하여 용량-의존 방식으로 mAbH6-처리된 마우스에서 지연되었다.

도 50은 mAbH6 용량의 함수로서의 혈전 형성의 개시 (분)까지의 중간 시간을 그래프로 도시한다 (대조표준에 비교하여 *p<0.01). 도 50에서 알 수 있는 것과 같이, 혈전 형성의 개시까지의 중간 시간은 대조 그룹에서 6.8분으로부터 20 mg/kg mAbH6 처리된 그룹 (p<0.01)에서 17.7분으로, mAbH6의 증가하는 용량과 함께 증가되었다. 기저 실험 데이터 및 통계학적 분석을 표 14 및 15에 제공한다.

비디오 기록물의 평가를 기초로 기록된 개별 마우스의 혈전 형성의 개시까지의 시간을 하기 표 14에 상세하게 나타낸다.

* 혈관은 표시된 관찰 기간 동안 개시를 나타내지 않았다

대조표준과 mAbH6 처리된 동물 사이의 폐색의 개시까지의 시간을 비교하는 통계학적 분석은 하기 표 15에 나타낸다.

개시까지의 시간: FITC Dex 용량 반응 연구로부터의 데이터

통계학	대조표준	mAbH6 (2 mg/kg)	mAbH6 (10 mg/kg)	mAbH6 (20 mg/kg)
사건의 수/동물의 수 (%)	11/11 (100%)	6/6 (100%)	9/9 (100%)	8/10 (80.0%)
중간 시간 (분) (95% CI)	6.8 (2.4, 8.5)	10.4 (5.9, 12.8)	11.7 (2.5, 15.8)	17.7 (10.0, 22.7)
Wilcoxon p-값*		0.2364	0.1963	0.0016
사건 = 관찰된 개시까지의 시간 중간 (분) 및 그것의 95% CI는 Kaplan-Meier 산정값을 기초로 하였다 NE=산정 불가 *p-값을 Dunnett-Hsu 다중 비교에 의해 조정하였다

미세혈관 폐색

도 51은 증가하는 용량의 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6, 2 mg/kg, 10mg/kg 또는 20mg/kg) 또는 아이소타입 대조 항체로 처리된 마우스에서 FITC-덱스트란 유도된 혈전성 미세혈관병증에서의 시간의 함수로서 미세혈관 폐색을 보이는 마우스의백분율을 보여주는 Kaplan-Meier 도표이다. 도 51에서 알 수 있는 것과 같이, 완전한 미세혈관 폐색은 대조 마우스에 비교하여 mAbH6 처리된 그룹에서 지연되었다.

도 52는 mAbH6 용량의 함수로서의 미세혈관 폐색까지의 중간 시간을 그래프로 도시한다 (대조표준에 비교하여 *p<0.05). 도 52에서 알 수 있는 것과 같이, 완전한 미세혈관 폐색까지의 중간 시간은 대조 그룹에서 23.3분으로부터 2 mg/kg mAbH6 처리된 그룹 (p<0.05)에서 38.6분으로 증가되었다. 10 mg/kg 또는 20 mg/kg의 mAbH6 용량은 2 mg/kg mAbH6 처리된 그룹에 유사하게 수행되었다 (완전한 미세혈관 폐색에 대한 중간 시간은 각각 40.3 및 38분이었다). 기저 실험 데이터 및 통계학적 분석을 표 16 및 17에 제공한다.

비디오 기록물의 일차 평가를 기초로 기록된 개별 마우스에서 완전한 혈관 폐색까지의 시간을 하기 표 16에 상세하게 나타낸다.

광 염료-유도된 손상 후 완전한 폐색까지의 시간

대조표준 처리		mAbH6 처리
폐색까지의 시간 (분)	대조표준	2 mg/kg	10 mg/kg	20 mg/kg
	37.50	42.3	30.92	38.00
	29.07	21.91	17.53	28.00
	27.12	24.4	51.38	40.58
	19.38	31.38	36.88	33.00
	19.55	61.17*	26.83	39.10
	18.00	61.55*	40.28	32.03
	16.50		55.83	38.53
	23.33		71.93*	21.75*
	14.83		98.22*	32.25*
	30*			33.17*
	61.8*

* 혈관은 표시된 관찰 기간 동안 완전히 폐색되지 않았다.

대조표준과 mAbH6 처리된 동물 사이의 완전한 폐색까지의 시간을 비교하는 통계학적 분석은 하기 표 17에 나타낸다.

완전한 미세혈관 폐색까지의 시간: FITC Dex 용량 반응 연구로부터의 데이터

통계학	대조표준	mAbH6 (2 mg/kg)	mAbH6 (10 mg/kg)	mAbH6 (20 mg/kg)
사건의 수/동물의 수 (%)	9/11 (81.8%)	4/6 (66.7%)	7/9 (77.8%)	7/10 (70.0%)
중간 시간 (분) (95% CI)	23.3 (16.5, 37.5)	36.8 (21.9, NE)	40.3 (17.5, NE)	38.0 (28.0, 40.6)
Wilcoxon p-값*		0.0456	0.0285	0.0260
사건 = 관찰된 폐색까지의 시간 중간 (분) 및 그것의 95% CI는 Kaplan-Meier 산정값을 기초로 하였다 NE=산정 불가 *p-값을 Dunnett-Hsu 다중 비교에 의해 조정하였다

요약

표 18에 요약된 것과 같이, 혈전 형성의 개시는 대조표준-처리된 마우스에 비하여 용량-의존 방식으로 mAbH6 처리된 마우스에서 지연되었다 (개시까지의 중간 시간 10.4 내지 17.7분 대 6.8분). 완전한 폐색까지의 중간 시간은 대조표준-처리된 그룹에 비해 모든 mAbH6-처리된 그룹에서 상당히 지연되었다 (표 18).

혈전 형성의 개시 및 완전한 폐색까지의 중간 시간

	대조표준	mAbH6 (2 mg/kg)	mAbH6 (10 mg/kg)	mAbH6 (20 mg/kg)
혈전 형성의 개시까지의 중간# 시간 (분)	6.8	10.4	11.7	17.7*
완전한 미세혈관 폐색까지의 중간# 시간 (분)	23.3	36.8*	40.3*	38.0*

# 중간 값은 Kaplan-Meier 산정값을 기초로 한다.

* 대조표준에 비교한 p<0.05 (다중 비교를 위해 Dunnett-Hsu에 의해 ㅈ조좆조정된 Wilcoson).

이들 결과는 MASP-2에 결합하고 보체 시스템의 렉틴 경로를 차단하는 인간 단클론성 항체인 mAbH6이 TMA의 실험 마우스 모델에서 용량-의존 방식으로 미세혈관 혈전증을 감소시켰음을 증명한다. 그러므로, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체의 투여는 HUS, aHUS, TTP 또는 다른 미세혈관병증 장애, 예컨대 파국성 항인지질 증후군 (CAPS), 전신성 데고스병 및 암, 암 화학요법 및 이식에 이차적인 TMA를 포함하여 다른 TMA에 걸린 환자들에서 효과적인 치료법이 될 것이고 미세혈관 응고 및 혈전증으로부터의 보호를 제공할 것으로 예상된다.

실시예 40

이 실시예는 MASP-2에 결합하여 렉틴-중재된 보체 활성화를 억제하는 한편 면역 시스템의 고전적 (C1q-의존성) 경로 및 대체 경로 성분들은 무상으로 남겨두는 전체 인간 scFv 항체의, 파지 디스플레이를 사용하는 확인을 설명한다.

개관:

전체 인간, 고친화성 MASP-2 항체를 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝에 의해 확인하였다. 항체의 가변성 경쇄 및 중쇄 단편들을 scFv 방식과 전-길이 IgG 방식 두 가지로 분리하였다. 인간 MASP-2 항체는 렉틴 경로-중재된 대체 보체 경로 활성화와 관련된 세포 손상을 억제하는 데 유용한 한편 한편 면역 시스템의 고전적 (C1q-의존성) 경로 성분은 무상으로 남겨둔다. 일부 구체예에서, 대상 MASP-2 억제 항체는 다음의 특징을 가진다: (a) 인간 MASP-2에 대한 고친화성 (예컨대 10 nM 이하의 K_D) 및 (b) 30 nM 이하의 IC₅₀으로 90% 인간 혈청에서 MASP-2 의존성 보체 활성을 억제한다.

방법:

촉매적으로 비활성인 전-길이 MASP-2의 발현

리더 서열을 가지는 인간 MASP-2 폴리펩티드 (SEQ ID NO:5)를 코드화하는, 인간 MASP-2 (SEQ ID NO:4)의 전-길이 cDNA 서열을 CMV 인핸서/프로모터 영역의 대조표준하에 진핵세포 발현을 구동시키는, 포유류 발현 벡터 pCI-Neo (Promega)에 하위클로닝하였다 (Kaufman R.J.　et　al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)).

촉매적으로 비활성인 인간 MASP-2A 단백질을 제조하기 위하여, US2007/0172483 (본원에 참조로 포함됨)에 기술된 것과 같이 부위-특정 돌연변이생성을 수행하였다. PCR 생성물을 아가로오스 겔 전기영동 후에 정제하고 밴드 제제 및 단일 아데노신 중복을 표준 테일링 과정을 사용하여 제조하였다. 그런 다음 아데노신-테일 MASP-2A를 pGEM-T 이지 벡터에 클로닝하고 대장균으로 형질전환하였다. 인간 MASP-2A를 추가로 포유류 발현 벡터 pED 또는 pCI-Neo 중 어느 하나에 하위클로닝하였다.

상기에서 기술된 MASP-2A 발현 구성물을 표준 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 과정 (Maniatis　et　al., 1989)을 사용하여 DXB1 세포에 트랜스펙션시켰다. MASP-2A를 제제가 다른 혈청 단백질로 오염되지 않은 것을 보장하기 위하여 혈청-유리 배지에서 제조하였다. 배지를 2일마다 집밀도 세포로부터 수확하였다 (총 4회). 재조합 MASP-2A의 평균은 대략 1.5 mg/리터의 배양 배지였다. MASP-2A (상기 기술된 Ser-Ala 돌연변이)를 MBP-A-아가로오스 칼럼 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

패닝/scFv 전환 및 필터 스크리닝에 의해 확인된 ScFv 후보 클론들에 대한 MASP-2A ELISA

인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열의 파지 디스플레이 라이브러리에 항원 패닝 (panning)과 이어서 자동 항체 스크리닝을 수행하고 인간 MASP-2 단백질에 대한 고친화성 scFv 항체를 확인하기 위한 선택을 하였다. HIS-태그된 또는 비오틴-태그된 MASP-2A에 대한 scFv 파지 라이브러리의 패닝을 3회기 수행하였다. 제 3 회기의 패닝을 먼저 MBL로 용출한 다음 TEA (알칼리성)로 용출하였다. 표적 MASP-2A에 대한 scFv 단편들을 나타내는 파지의 특이적 풍부화를 모니터링하기 위해, 고정된 MASP-2A에 대한 다클론성 파지 ELISA를 수행하였다. 3회기의 패닝으로부터의 scFv 유전자들을 pHOG 발현 벡터에 클로닝하고 MASP-2A에 대한 특이적인 클론을 찾기 위해 소규모의 필터 스크리닝으로 작동시켰다.

제 3 회기의 패닝으로부터의 scFv 단편들을 코드화하는 플라스미드를 함유하고 있는 박테리아 콜로니들을 뽑아서 니트로셀룰로오스 막 위에 격자로 배치하고 비-유도성 배지상에서 밤새 성장시켜서 마스터 플레이트를 제조하였다. 총 18,000개의 콜로니를 선택하였고 제 3 패닝 회기로부터 분석하였으며, 그 중 절반을 경합 용출에, 절반을 후속 TEA 용출에 사용하였다. MASP-2A에 대한 scFv 파지미드 라이브러리의 패닝과 이어서 scFv 반전 및 필터 스크리닝으로 137개의 포지티브 클론을 얻었다. 137개 중 108개의 클론이 MASP-2 결합에 대한 ELISA 분석에서 포지티브였고 (데이터는 제시하지 않음), 그 중 45개의 클론을 정상인 혈청에서 MASP-2 활성을 차단하는 능력에 대해 추가로 분석하였다.

렉틴 경로 C3 전환효소의 형성의 억제를 측정하기 위한 분석

렉틴 경로 C3 전환효소 형성의 억제를 측정하는 기능적 분석을 사용하여 MASP-2 scFv 후보 클론들의 "차단 활성"을 평가하였다. MASP-2 세린 프로테아제 활성은 렉틴 경로 C3 전환효소를 포함하는 두 개의 단백질 성분 (C4b, C2a)을 생성하기 위해 필요하다. 그러므로, MASP-2 기능적 활성을 억제하는 MASP-2 scFv (즉 차단 MASP-2 scFv)는 렉틴 경로 C3 전환효소의 새로운 형성을 억제할 것이다. C3은 그것의 구조의 일부로서 독특하고 고도로 반응성인 티오에스테르기를 함유한다. 이 분석에서, C3의 C3 전환효소에 의한 절단시에 C3b 상의 티오에스테르기는 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 마크로분자 상의 하이드록실 또는 아미노기와 에스테르 또는 아미드 연쇄를 통해 공유 결합을 형성함으로써, ELISA 분석에서 C3b의 검출을 용이하게 할 수 있다.

효모 만난은 렉틴 경로의 공지된 활성화제이다. C3 전환효소의 형성을 측정하기 위한 다음의 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 희석된 인간 혈청과 인큐베이션하여 렉틴 경로를 활성화시켰다. 그런 다음 웰을 세척하고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰 상에 고정된 C3b에 대해 분석하였다. 이 분석에서 생성된 C3b의 양은 렉틴 경로 C3 전환효소의 새로운 형성을 직접적으로 반영한다. 선택된 농도에서 MASP-2 scFv 클론들을 C3 전환효소 형성 및 결과적으로 일어나는 C3b 생성을 억제하는 능력에 대해 이 분석으로 시험하였다.

방법:

상기에서 기술된 것과 같이 확인된 45개의 후보 클론을 발현시키고, 정제하고 동일한 스톡 농도로 희석한 후, 다시 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 함유 GVB 완충액 (4.0 mM 바르비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl₂, 2.0 mM CaCl₂, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)에 희석하여 모든 클론이 확실하에 동일한 양의 완충액을 갖도록 하였다. scFv 클론들을 각각 2 μg/mL의 농도에서 삼중으로 시험하였다. 포지티브 대조표준은 OMS100 Fab2였고 0.4 μg/mL에서 시험하였다. C3 형성을 scFv/IgG 클론들의 존재 및 부재하에 모니터링하였다.

만난을 50 mM 카보네이트 완충액 (15mM Na₂CO₃ + 35mM NaHCO₃ + 1.5 mM NaN₃), pH 9.5 중에 20 μg/mL (1 μg/웰)의 농도로 희석하고 ELISA 플레이트 상에 밤새 4℃에서 코팅시켰다. 다음날, 만난-코팅된 플레이트를 200 μl의 PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음 100 μl의 1% HSA 차단용액을 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 200 μl의 PBS로 3회 세척하고, 얼음위에서 200 μl의 PBS와 함께 샘플을 첨가할 때까지 보관하였다.

정상인 혈청을 CaMgGVB 완충액 중에 0.5%로 희석하고, scFv 클론 또는 OMS100 Fab2 포지티브 대조표준을 삼중으로 이 완충액에 0.01 μg/mL; 1 μg/mL (오직 OMS100 대조표준) 및 10 μg/mL로 첨가하고 45분 동안 얼음상에서 사전인큐베이션한 후 차단된 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 반응을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써 개시하고 플레이트를 얼음 배쓰에 옮김으로써 중단하였다. C3b 침착을 토끼 α-마우스 C3c 항체와 이어서 염소 α-토끼 HRP로 검출하였다. 네거티브 대조표준은 항체가 없는 완충액 (항체 없음 = 최대 C3b 침착)이었고, 포지티브 대조표준은 EDTA가 첨가된 완충액 (C3b 침착 없음)이었다. 웰을 만난으로 코팅하지 않을 것을 제외하고 동일한 분석을 수행함으로써 바탕값을 측정하였다. 만난이 없는 플레이트에 대한 바탕 신호를 만난-함유 웰에서의 신호로부터 뺐다. 컷-오프 기준을 무관한 scFv 클론 (VZV)과 완충액 단독의 활성의 절반으로 설정하였다.

결과: 컷-오프 기준을 기초로, 총 13개의 클론이 MASP-2의 활성을 차단하는 것으로 밝혀졌다. >50%의 경로 억제를 보이는 13개의 클론을 모두 선택하고 서열화하여 10개의 독특한 클론을 얻었다. 10개의 클론은 모두 동일한 경쇄 하위부류, λ3와, 3개의 상이한 중쇄 하위부류: VH2, VH3 및 VH6을 가지는 것으로 밝혀졌다. 기능적 분석에서, 10개의 후보 scFv 클론 중 5개가 0.5% 인간 혈청을 사용하여 25 nM 표적 기준 미만의 IC₅₀ nM 값을 나타냈다.

개선된 효능을 가지는 항체들을 확인하기 위하여, 상기에서 기술된 것과 같이 확인된 3개의 모 (mother) scFv 클론에 경쇄 셔플링을 수행하였다. 이 과정은 6개의 건강한 공여제로부터 유도된 단순한 인간 람다 경쇄 (VL)의 라이브러리와 쌍을 이룬 모 클론의 각각의 VH로 구성된 조합 라이브러리의 생성을 포함하였다. 그런 다음 이 라이브러리를 개선된 결합 친화성 및/또는 기능성을 가지는 scFv 클론에 대해 스크리닝하였다.

IC₅₀ (nM)으로 표시된 우세한 딸 클론과 그것들의 각각의 모 클론 (모두 scFv 방식)의 기능적 효능의 비교

scFv 클론	1% 인간 혈청 C3 분석 (IC ₅₀ nM)	90% 인간 혈청 C3 분석 (IC ₅₀ nM)	90% 인간 혈청 C4 분석 (IC ₅₀ nM)
17D20mc	38	nd	nd
17D20m_d3521N11	26	>1000	140
17N16mc	68	nd	nd
17N16m_d17N9	48	15	230

하기에 상기 표 19에 나타내고 하기 표 20A 내지 20F에 열거한 모 클론 및 딸 클론에 대한 중쇄 가변 영역 (VH) 서열들을 제시한다.

Kabat CDR들 (31 내지 35 (H1), 50 내지 65 (H2) 및 95 내지 102 (H3))은 진하게 표시되고; Chothia CDR들 (26 내지 32 (H1), 52 내지 56 (H2) 및 95 내지 101 (H3))은 밑줄로 표시한다.

17D20_35VH-21N11VL 중쇄 가변 영역 (VH) (SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:66에 의해 코드화됨)

QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS RG KMGVSWIRQPPGKALEWLA HIFSS DEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTAT YYCARIR RGGIDYWGQGTLVTVSS

d17N9 중쇄 가변 영역 (VH) (SEQ ID NO:68)

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS ST SAAWNWIRQSPSRGLEWLG RTYYR SKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDT AVYYCAR DPFGVPFDIWGQGTMVTVSS

하기에 표 21A 내지 21F에 열거된 모 클론 및 딸 클론에 대한 경쇄 가변 영역 (VL) 서열을 제시한다.

Kabat CDR들 (24 내지 34 (L1); 50 내지 56 (L2); 및 89 내지 97 (L3)은 진하게 표시하고; Chothia CDR들 (24 내지 34 (L1); 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3)은 밑줄로 표시한다. 이들 영역은 Kabat 또는 Chothia 시스템 중 어느 것에 의해 넘버링되든지 동일하다.

17D20m_d3521N11 경쇄 가변 영역 (VL) (SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:69에 의해 코드화됨)

QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCS GEKLGDKYAYW YQQKPGQSPVLVMYQ DKQRPSG IPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQ AWDSSTAVF GGGTKLTVL

17N16m_d17N9 경쇄 가변 영역 (VL) (SEQ ID NO:71)

SYELIQPPSVSVAPGQTATITCA GDNLGKKRVHW YQQRPGQAPVLVIYD DSDRPSG IPDRFSASNSGNTATLTITRGEAGDEADYYCQ VWDIATDHV VFGGGTKLTVLAAAGSEQKLISE

인간 MASP-2에 고친화성으로 결합하고 기능적 보체 활성을 차단하는 능력을 가지고 있는 것으로 증명된 MASP-2 항체 OMS100 및 MoAb_d3521N11VL (SEQ ID NO:67로서 제시된 중쇄 가변 영역과 SEQ ID NO:70으로서 제시된 경쇄 가변 영역을 포함함, 또한 "OMS646" 및 "mAbH6"으로도 언급됨)을 돗트 블롯 분석에 의해 에피토프 결합에 대하여 분석하였다. 그 결과는 OMS646 및 OMS100 항체가 MASP-2에 매우 특이적이고 MASP-1/3에 결합하지 않는 것을 보여준다. MAp19에 또는 MASP-2의 CCP1 도메인을 함유하지 않는 MASP-2 단편들에 결합된 항체는 어느 것도 결합 부위가 CCP1을 포함한다는 결론을 유도하지 못하였다.

MASP-2 항체 OMS646은 C1s, C1r 또는 MASP-1에 비교하여 재조합 MASP-2 (Kd 60-250pM)에 >5000배의 선택성으로 왕성하게 결합하는 것으로 측정되었다 (하기 표 22 참조).

고상 ELISA 연구에 의해 평가된 OMS646 MASP-2 항체-MASP-2 상호작용의 친화성 및 특이성

항원	K_D (pM)
MASP-1	>500,000
MASP-2	62±23*
MASP-3	>500,000
정제된 인간 C1r	>500,000
정제된 이간 C1s	~500,000

* 평균±SD; n=12

OMS646은 말단 보체 성분들의 렉틴-의존성 활성화를 특이적으로 차단한다

방법:

막 공격 복합체 (MAC) 침착에 대한 OMS646의 영향을렉틴 경로, 고전적 경로 및 대체 경로에 대한 경로-특이적 조건들을 사용하여 분석하였다. 이 목적에 대해, Wieslab Comp300 보체 스크리닝 키트 (Wieslab, Lund, Sweden)를 제조업체의 지시를 따라 사용하였다.

결과:

도 53a는 렉틴 경로-특이적 분석 조건하에서 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시의 MAC 침착 수준을 그래프로 도시한다. 도 53b는 고전적 경로-특이적 분석 조건하에서 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시의 MAC 침착 수준을 그래프로 도시한다. 도 53c는 대체 경로-특이적 분석 조건하에서 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시의 MAC 침착 수준을 그래프로 도시한다.

도 53a에 알 수 있는 것과 같이, OMS646은 대략 1 nM의 IC₅₀ 값으로 MAC 침착의 렉틴 경로-중재된 활성화를 차단한다. 그러나, OMS646은 고전적 경로-중재된 활성화로부터 (도 53b) 또는 대체 경로-중재된 활성화로부터 (도 53c) 생성된 MAC 침착에 대해서는 영향을 미치지 못하였다.

마우스에 대한 정맥 내 (IV) 또는 피하 (sc) 투여 후의 OMS646의 약물동역학 및 약물력학

OMS646의 약물동역학 (PK) 및 약물력학 (PD)을 마우스에서 28일 단일 용량 PK/PD 연구로 평가하였다. 연구는 피하 (SC)로 투여된 5mg/kg 및 15mg/kg의 OMS646와 뿐만 아니라 정맥 내 (IV)로 투여된 5mg/kg의 OMS646의 용량 수준을 시험하였다.

OMS646의 PK 프로필에 대하여, 도 54는 표시된 용량에서 OMS646의 투여 후에 시간의 함수로서 OMS646 농도를 그래프로 도시한다 (n=3마리 동물/그룹의 평균). 도 54에서 알 수 있는 것과 같이, 5mg/kg SC에서 OMS646은 투여 후 대략 1 내지 2일 후에 5 내지 6 ug/mL의 최대 혈장 농도에 도달하였다. 모든 그룹에 대하여, OMS646은 전신성 순환계로부터 서서히 제거되었고, 말단 반감기는 대략 8 내지 10일이었다. OMS646의 프로필은 마우스에서 인간 항체에 대해 전형적이다.

OMS646의 PD 활성은 도 55a 및 55b 그래프로 도시된다. 도 55a 및 55b는 5mg/kg IV (도 55a) 및 5mg/kg SC (도 55b) 그룹에서 각 마우스에 대한 PD 반응을 나타낸다 (전신성 렉틴 경로 활성의 강하). 점선은 분석의 기준선 (최대 억제: 시험관 내에서 분석 전에 과잉 OMS646으로 스파이킹된 단순 마우스 혈청)을 나타낸다. 도 55a에서 알 수 있는 것과 같이, 5mg/kg의 OMS646의 IV 투여 후에, 전신성 렉틴 경로 활성은 즉시 검출할 수 없는 수준으로 떨어졌고, 렉틴 경로 활성은 28일의 관찰 기간에 걸쳐 단지 보통 정도의 회복을 나타냈다. 도 55b에서 알 수 있는 것과 같이, 5mg/kg의 OMS646 SC가 투여된 마우스에서, 렉틴 경로 활성의 시간-의존성 억제가 관찰되었다. 렉틴 경로 활성은 약물을 투여하고 24시간 이내에 거의 검출할 수 없는 수준으로 떨어졌으며 적어도 7일 동안 저수준을 유지하였다. 렉틴 경로 활성은 시간에 따라 점차 증가되었지만, 28일의 관찰 기간 내에 투여전 수준으로 반전되지는 않았다. 15mg/kg SC 투여 후 관찰된 렉틴 경로 활성 대 시간 프로필은 5 mg/kg SC 용량과 유사하였고 (데이터는 제시하지 않음), 그것은 PD 종점의 포화를 가리킨다. 데이터는 또한 IV 또는 SC로 투여된 5mg/kg의 OMS646의 주마다의 투여가 마우스에서 전신성 렉틴 경로 활성의 연속적인 억제를 이루기에 충분한 것을 나타냈다.

실시예 41

이 실시예는 MASP-2 억제 항체 (OMS646)가 질병의 급성기 및 관해기 중에 얻어진 비전형적인 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)환자로부터의 혈청에 대한 노출 후에 활성화된 인간 미세혈관 내피 세포 (HMEC-1) 상에서 aHUS 혈청-유도된 보체 C5b-9 침착을 억제하는 것을 증명한다.

배경/근거: MASP-2에 특이적으로 결합하여 렉틴 경로 활성화를 억제하는 MASP-2 항체인 OMS646의 존재 또는 부재시에 (1) 질병의 급성기 중에 및 (2) 관해기 중에 얻어진 aHUS 환자 혈청에 대한 노출 후에 활성화된 HMEC-1 세포를 분석하기 위하여 다음의 연구를 수행하였다.

방법:

환자: HUS/TTP의 국제 등록소에 포함되어 있고 Mario Negri Institute의 이식 및 희귀병의 면역학 및 유전학 실험실에 의해 유전형 분류가 되어 있는 환자들 중에서 질병의 급성기 중이거나 관해기 둘 다에서 연구된, aHUS를 나타내는 4명의 환자들을 이 연구를 위해 선택하였다. 한 명의 aHUS 환자는 이형접합성 p.R1210C 보체 인자 H (CFH) 돌연변이를 가졌고 한 명은 항-CFH 자가항체를 가진 한편, 다른 두 명의 aHUS 환자들에서는 CFH에 대한 돌연변이나 항체를 발견하지 못하였다.

표 23 및 24는 급성기 중이거나 관해가 있을 때 측정된 임상적 및 생화학적 데이터와 함께 본 연구에서 분석된 4명의 aHUS 환자에게서 보체 유전자 돌연변이 및 항-CFH 자가항체에 대한 스크리닝의 결과를 요약한 것이다.

본 연구의 4명의 aHUS 환자의 임상적 변수들

사례 번호	돌연변이 또는 항-CFH Ab	질병 단계	혈소판 (150-400*10³/μl)	LDH (266-500 IU/l)	헤모글로빈 (14-18g/dl)	s-크레아티닌 (0.55-1.25mg/dl)
#1	돌연변이 없음, 항-CFH Ab 없음	급성	31,000	1396	12.9	2.37
#1	돌연변이 없음, 항-CFH Ab 없음	관해	267,000	n.a.	11.5	3.76
#2	CFH-R1210C	급성	46,000	1962	7	5.7
#2	CFH-R1210C	관해	268,000	440	13.4	7.24
#3	항-CFH Ab	급성	40,000	3362	9.5	1.77
#3	항-CFH Ab	관해	271,000	338	8.8	0.84
#4	돌연변이 없음, 항-CFH Ab 없음	급성	83,000	1219	7.8	6.8
#4	돌연변이 없음, 항-CFH Ab 없음	관해	222,000	495	12.2	13

본 연구의 4명의 aHUS 환자의 보체 변수들

사례 번호	항-CFH Ab의 돌연변이	질병 단계	혈청 C3 (83-180 mg/dl)	혈장 SC5b-9 (127-400 ng/ml)
#1	돌연변이 없음, 항-CFH Ab 없음	급성	51	69
#1	돌연변이 없음, 항-CFH Ab 없음	관해	n.a.	117
#2	CFH-R1210C	급성	79	421
#2	CFH-R1210C	관해	119	233
#3	항-CFH Ab	급성	58	653
#3	항-CFH Ab	관해	149	591
#4	돌연변이 없음, 항-CFH Ab 없음	급성	108	n.a.
#4	돌연변이 없음, 항-CFH Ab 없음	관해	n.a.	n.a.

실험 방법: 피부 기원의 인간 미세혈관 내피 셀라인 (HMEC-1)으로부터의 세포들을 유리 슬라이드 위에 플레이팅하고 집밀도에 이르렀을 때 사용하였다. 집밀도 HMEC-1 세포를 10 μM의 ADP (아데노신 포스페이트)로 10분 동안 활성화시킨 후 4시간 동안 질병의 급성기 중에 수집된 상기 표 23 및 24에 기술된 4명의 aHUS 환자들로부터의 또는 관해를 보이는 동일 aHUS 환자들로부터의, 또는 4명의 건강한 대조 대상으로부터의 혈청들과 함께 인큐베이션하였다. 혈청을 보체 억제의 포지티브 대조표준으로서, 상기 실시예 40에서 기술된 것과 같이 생성된 MASP-2 억제 항체, OMS646 (100 μg/mL)의 존재하에 또는 가용성 보체 수용체 1 (sCR1) (150 μg/mL)의 존재하에 시험 배지 (0.5% BSA가 첨가된 HBSS)로 1:2로 희석하였다. 인큐베이션 단계가 끝날 때 HMEC-1 세포를 토끼 항-인간 보체 C5b-9으로, 이어서 FITC-포합된 이차 항체로 처리하였다. 각 실험에서, 한 명의 건강한 대조표준으로부터의 혈청을 aHUS 환자 혈청 (급성기 및 관해)과 나란히 시험하였다. 내피 세포 표면 상에 형광 염색의 축적을 위해 공초점 반전 레이저 현미경을 사용하였다. 샘플당 15개의 필드를 얻었고, 형광 염색이 차지한 면적을 소프트웨어 이미지 J의 빌트-인 특이적 기능을 사용하여 자동 엣지 검출에 의해 평가하였고 분석된 필드당 픽셀²으로서 표시하였다. 필드들은 최저 및 최고값이 계산으로부터 배제되었음을 보여준다.통계학적 분석 (다중 비교를 위해 일원성 ANOVA와 이어서 Tukey 시험)을 위해 각각의 환자 및 대표준에 대한 각 실험조건에서 고려된 13 필드의 픽셀²의 결과를 사용하였다.

결과:

4명의 aHUS 환자들로부터의 혈청을 사용한 보체 침착 분석의 결과를 하기 표 25A에 요약하고, 4명의 건강한 대상으로부터의 혈청을 사용한 결과를 하기 표 25B에 요약한다.

표 25A 및 25B에 대하여: 데이터는 평균 ± SE임. °P<0.001 대 대조표준; *P<0.001, **P<0.01 대 미처리된 aHUS 급성기; §P<0.001, §§P<0.01, §§§P<0.05 대 미처리된 aHUS 관해기.

도 56은 ADP-활성화된 HMEC-1 세포상에서 aHUS 혈청-유도된 C5b-9 침착에 미치는 MASP-2 항체 (OMS646) 및 sCR1의 억제 효과를 그래프로 도시한다. 도 56에서, 데이터는 평균 ± SE이다. °P<0.001 대 대조표준; *P<0.001, **P<0.01 대 미처리된 aHUS 급성기; ^P<0.0001 대 aHUS 급성기 + sCR1; §P<0.0001 대 미처리된 aHUS 관해기 및 #P<0.0001 대 aHUS 관해기 + sCR1.

표 25A, 25B 및 도 56에서 알 수 있는 것과 같이, aHUS 환자로부터의 혈청 (급성기에서 또는 관해기에서 수집됨)에 4시간 동안 정적 조건에서 노출된 ADP-자극된 HMEC-1 세포들은 공초점 현미경검사에 의해 검출되는 바 세포 표면상에 C5b-9의 격렬한 침착을 나타냈다. C5b-9이 차지한 면적을 측정함으로써, aHUS 혈청이 급성기에 있거나 관해를 보이는 중에 수집된 것과 무관하게, 건강한 대조표준 대상으로부터의 혈청에 노출된 세포들 상에서보다 aHUS 환자들로부터의 혈청에 노출된 세포상에서 상당히 더 많은 양의 C5b-9 침착을 관찰하였다. 혈청-유도된 내피 C5b-9 침착의 차이는 급성기와 관해간에 관찰되지 않았다.

추가로 표 25A, 25B 및 도 56에서 알 수 있는 것과 같이, aHUS 혈청 (급성기 중에 또는 관해를 보이는 중에 얻어진)에 MASP-2 항체 OMS646의 첨가는 미처리된 aHUS 혈청에 비교하여 내피 세포 표면 상에서 C5b-9 침착의 상당한 감소를 유도하였다. 그러나, C5b-9 침착에 미치는 OMS646의 억제 효과는 보체 판-억제제 sCR1에 의해 나타난 효과보다는 덜 뚜렷하였다. 실제로, OMS646 대 sCR1의 존재하에 aHUS 혈청-유도된 C5b-9 침착 간에 통계학적으로 유의미한 차이가 관찰되었다 (도 56 및 표 25A 및 25B).

4명의 aHUS 환자의 평균으로서 계산할 때, 보체 억제제들의 존재하에 관찰된 C5b-9 침착의 감소의 백분율 (동일 환자로부터의 미처리 혈청에 의해 유도된 C5b- 침착을 100%로 하여 비교함)은 다음과 같았다:

급성기:

sCR1 (150 μg/ml): C5b-9 침착의 91% 감소

OMS646 (100 μg/ml): C5b-9 침착의 40% 감소

관해기:

sCR1 (150 μg/ml): C5b-9 침착의 91% 감소

OMS646 (100 μg/ml): C5b-9 침착의 54% 감소

결론: 이 실시예에서 기술된 결과들은 보체의 렉틴 경로가 활성화된 미세혈관 내피 세포들에 의해 자극되고 이 자극은 aHUS의 특징적인 과장된 보체 활성화 반응에 대한 중요한 동인인 것을 증명한다. 또한 렉틴 경로의 이런 자극 및 결과적으로 발생한 과장된 보체 활성화 반응은 둘 다 aHUS의 급성기 및 임상적 관해기 중에 발생하는 것이 증명된다. 더욱이, 이런 발견은 aHUS와 관련된 어떠한 특정 보체 결함에 한정되는 것 같지 않다. 이 실시예에서 추가로 증명되는 것과 같이, MASP-2 억제 항체, 예컨대 OMS646을 사용한 렉틴 경로의 억제는 다양한 병인학을 가지는 aHUS 환자들에서 보체 침착을 감소시킨다.

실시예 42

이 실시예는 MASP-2 억제 항체 (OMS646)가 aHUS의 (1) 급성기 및 (2) 관해기 중에 얻어진 aHUS 혈청 샘플에 대한 노출 후에 활성화된 인간 미세혈관 내피 세포 (HMEC-1) 상에서의 aHUS 혈청-유도된 혈소판 응집과 혈전 형성을 억제하는 것을 증명한다.

방법:

환자: aHUS를 나타내는 3명의 환자 (실시예 41에서 표 23, 24, 25A 및 25B에 나타낸 환자 #1, #2 및 #4) (한 명의 환자는 이형접합성 p.R1210C CFH 돌연변이를 가진 한편, 다른 2명의 환자에서는 돌연변이나 항-CFH 항체가 없음)를 질병의 급성기 및 관해기 둘 다에 대해 연구하였다. 환자들은 HUS/TTP의 국제 등록소에 포함되어 있고 Mario Negri Institute의 이식 및 희귀병의 면역학 및 유전학 실험실에 의해 유전형 분류가 되어 있는 환자들 중에서 이 연구를 위해 선택하였다. 5명의 건강한 대상을 또한 관류 실험을 위한 혈액 공여자로서 선택하였다.

방법: 집밀도 HMEC-1 세포를 10 μM의 ADP로 10분 동안 활성화시킨 후 3시간 동안 질병의 급성기 중에 수집된 3명의 aHUS 환자들 (실시예 41에서 기술된 환자 #1, 2 및 4)로부터의 혈청 또는 관해를 보이는 동일한 환자들로부터의 혈청, 또는 건강한 대상으로부터의 대조 혈청들과 함께 인큐베이션하였다. 혈청을 보체 억제의 포지티브 대조표준으로서, 상기 실시예 40에서 기술된 것과 같이 생성된 MASP-2 억제 항체, OMS646 (100 μg/mL)의 존재하에 시험 배지 (0.5% BSA가 첨가된 HBSS)로; 또는 sCR1 (150 μg/mL)로 1:2로 희석하였다. 환자 #1 및 #2에 대해, 추가의 웰을 100 μg/mL의 무관한 아이소타입 대조 항체를 함유하고 있는 시험 배지로 또는 20 μg/mL의 OMS646으로 1:2로 희석된 (후자의 경우, 사례 #1은 관해기에서만 시험하였고, 사례 #2는 급성기 동안과 관해기 둘 다 시험함) 혈청과 함께 인큐베이션하였다.

인큐베이션 단계가 끝날 때 HMEC-1 세포를 건강한 대상 (혈소판을 표지하는 형광 염료 메파크린을 함유하고 있음)으로부터 얻어진 헤파린 처리된 전혈 (10UI/mL)이 채워진 흐름 챔버에서 미세순환계에서 부딪히는 전단 응력 (60 dynes/cm², 3분)으로 관류시켰다. 3회의 관류 후에, 내피-세포 단층을 아세톤에 고정시켰다. 내피 세포 표면 상의 혈소판 샘플당 15개의 영상을 공초점 반전 레이저 현미경에 의해 얻었고, 혈전이 차지한 면적을 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 최저 및 최고값을 보이는 필드들을 계산으로부터 배제하였다.

통계학적 분석 (다중 비교를 위해 일원성 ANOVA에 이어서 Tukey 시험)을 위해 각각의 환자 및 대표준에 대한 각 실험조건에서 고려된 13 필드의 픽셀²의 결과를 사용하였다.

결과:

3명의 aHUS 환자들로부터의 혈청을 사용한 혈전 형성 실험의 결과를 하기 표 26A에 요약하고, 5명의 건강한 대상으로부터의 혈청을 사용한 결과를 하기 표 26B에 요약한다.

표 26A 및 26B에 대하여: 데이터는 평균 ± SE임. °P<0.001 대 대조표준; *P<0.001, ***P<0.05 대 미처리된 aHUS 급성기; §P<0.001, §§§P<0.05 대 미처리된 aHUS 관해기.

도 57은 ADP-활성화된 HMEC-1 세포상에서 aHUS 혈청-유도된 혈전 형성에 미치는 MASP-2 항체 (OMS646) 및 sCR1의 효과를 그래프로 도시한다. 도 57에서, 데이터는 평균 ± SE이다. °P<0.0001, °°P<0.01 대 대조표준; *P<0.0001, **P<0.01 대 미처리된 aHUS 급성기; §P<0.0001 대 미처리된 aHUS 관해기.

표 26A 및 도 56에서 알 수 있는 것과 같이, 급성기에서 또는 관해기에서 수집된 aHUS 혈청으로 처리된 HMEC-1 세포 상에서, 건강한 대조 대상으로부터의 혈청에 노출된 세포들에 비교하여, 혈전이 차지한 면적은 현저하게 증가되었다 (표 26B 및 도 57). 도 57 및 표 26A에서 알 수 있는 것과 같이, OMS646 (100 μg/ml 및 20 μg/ml 둘 다에서)은 급성기 중에 취한 aHUS 혈청에 사전 노출된 세포 상에서 혈전 형성의 부분적인 억제를 나타냈다. 항-혈전 효과는 OMS646의 두 가지 상이한 용량 간에 비교할만 하였고, sCR1의 효과와는 상이하였다 (도 57 및 표 26A). 무관한 아이소타입 대조 항체의 첨가는 aHUS-혈청-유도된 혈전 형성에 억제 효과를 나타내지 못했다.

추가로 도 57 및 표 26A에서 알 수 있는 것과 같이, 관해기 동안에 수집된 aHUS 혈청에 미치는 OMS646의 억제 효과는 훨씬 더 분명하였다. 실제로, 100 μg/ml 및 20 μg/ml의 두 가지 용량에서 관해기에 수집된 aHUS 환자 혈청은 sCR1으 첨가로 관찰된 것과 유사한, 거의 완전한 혈전 형성의 억제를 초래하였다. 무관한 아이소타입 대조 항체는 유의미한 억제 효과를 나타내지 않았다.

3명의 aHUS 환자의 평균으로서 계산할 때, 보체 억제제들을 사용하여 기록된, 혈전 침착이 차지한 HMEC-1 표면의 감소의 백분율 (동일 환자로부터의 미처리 혈청에 의해 유도된 혈전 형성을 100%로 하여 비교함)은 다음과 같았다:

급성기:

sCR1 (150 μg/ml): 60% 감소

OMS646 (100 μg/ml): 57% 감소

OMS646 (20 μg/ml): 45% 감소

관해기:

sCR1 (150 μg/ml): 85% 감소

OMS646 (100 μg/ml): 79% 감소

OMS646 (20 μg/ml): 89% 감소

결과에 대한 논의:

이 실시예의 결과는 MASP-2 억제 항체, 예컨대 OMS646 (실시예 40에서 기술한 것과 같이 제조됨)이 HMEC-1 세포 상에서 aHUS 혈청-유도된 혈전 형성에 강력한 억제 효과를 나타낸다는 것을 증명한다. 놀랍게도, 혈전 형성에 미치는 OMS646의 억제 효과는 HMEC-1 상에 유도된 C5b-9 침착에 미치는 효과 (실시예 41에서 기술됨)보다 컸다. 또한 놀라운 것은 관해기에 수집된 aHUS 환자 혈청에의 100 μg/ml 및 20 μg/ml의 용량 둘 다에서의 OMS646의 첨가가 혈전 형성의 거의 완전한 억제를 초래하였다는 것이다. 다른 놀라운 발견은 급성기 및 관해기 둘 다에서 OMS646이 보체 시스템의 광범위하고 거의 완전한 억제제인 포지티브 대조 sCR1과 같이 효과적이었다는 관찰이다 (Weisman H. et al., Science 249:146-151, 1990; Lazar H. et al., Circulation 100:1438-1442, 1999).

건강한 대상으로부터의 대조 혈청은 또한 HMEC-1 세포에 대한 보통의 혈전 형성을 유도하였음이 주지된다. 본 발명자들은 OMS646이나 sCR1 중 어느 하나를 사용하여 대조 혈청 유도된 혈전 형성에 대해 일관된 억제 효과를 관찰하지는 못하였다. 어떠한 특정 이론에 구속되는 것을 바라지는 않지만, 대조표준-유도된 혈전은 대조 혈청과 함께 인큐베이션된 HMEC-1에 대해 관찰된 매우 낮은 C5b-9 침착에 의해 지지되는 바 (실시예 41 참조), 보체에 의존하지 않는 것으로 여겨진다.

결론:

결론적으로, MASP-2 억제 항체, 예컨대 OMS646의 관찰된 항-혈전 효과는 이 실험 시스템에서 관찰된 C5b-9 침착에 대한 OMS646의 억제 효과를 기초로 예상할 수 있었던 것 (실시예 41에 기술되고 도 56에 도시됨)보다 실질적으로 더 큰 것으로 나타난다. 예를 들어, Gastoldi 등에 의해 "C5a/C5aR 상호작용은 비전형적인 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)에서 내피 세포 상의 보체 활성화 및 혈전증을 중재한다"는 제목으로 기술된 것과 같이 (Gastoldi et al., Immunobiology 217:1129-1222 Abstract 48 (2012)), C5b-9 침착을 억제하는 C5 항체의 첨가가 HMEC-1 상에서의 혈전 형성을 비교할만한 정도로 (60% 감소) 억제하였다 (60% 감소). 대조적으로, MASP-2 억제 항체 (100 μg/mL에서의 OMS646)는 (급성기 = 40% 감소; 관해기 = 54% 감소)의 평균 값으로 C5b-9 침착을 억제하였고; 실질적으로 더 높은 퍼센트 (급성기 = 57% 감소; 관해기 = 79% 감소)로 혈전 형성을 억제하였다. 비교하면, OMS646은 포지티브 대조 경합 억제제 (150 μg/mL에서의 sCR1, C5b-9의 급성기 억제 = 91% 감소; 관해기 = 91% 감소)보다 낮은 백분율에서 보체 침착을 억제하였지만 혈전 형성을 억제에 있어서는 sCR1 포지티브 대조표준과 동등하게 효과적이었다 (150 μg/mL에서의 sCR1, 급성기 억제 = 60% 감소; 관해기 = 85% 감소). 이들 결과는 MASP-2 억제 항체 (예컨대 OMS646)가 놀랍게도 급성기 및 관해기 둘 다에서 aHUS 대상으로부터 얻어진 혈청에서 혈전 형성을 억제하는 데 효과적인 것을 증명한다.

전술한 설명에 따르면, 한 구체예에서, 발명은 혈전성 미세혈관병증 (TMA)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상에서 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 대상에게 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, TMA는 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 및 비전형적 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, TMA는 aHUS이다. 한 구체예에서, 조성물은 질병의 급성기에 aHUS 환자에게 투여된다. 한 구체예에서, 조성물은 관해기 (즉 급성기 aHUS의 에피소드로부터 회복된 또는 부분적으로 회복된 대상에서, 예를 들면 증가된 혈소판 카운트 및/또는 감소된 혈청 LDH 농도에 의해 증거되는 그런 관해, 예를 들면 Loirat C et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60, 2011 (본원에 참조로 포함됨)에 기술됨) 동안에 aHUS 환자에게 투여된다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 다음의 특징 중 적어도 하나 또는 그 이상을 나타낸다: 상기 항체는 10 nM 이하의 K_D로 인간 MASP-2에 결합하고, 상기 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인의 에피토프에 결합하며, 상기 항체는 시험관 내 분석에서 1% 인간 혈청에서 10 nM 이하의 IC₅₀에서 C3b 침착을 억제하고, 상기 항체는 90% 인간 혈청에서 30 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제하며, 이때 항체는 Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ 및 F(ab')₂로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체 단편이고, 항체는 단일-사슬 분자이며, 상기 항체는 IgG2 분자이고, 상기 항체는 IgG1 분자이며, 상기 항체는 IgG4 분자이고, IgG4 분자는 S228P 돌연변이를 포함하며, 및/또는 항체는 고전적 경로를 실질적으로 억제하지 않는다. 한 구체예에서, 항체는 MASP-2에 결합하고 선택적으로 렉틴 경로를 억제하며 대체 경로를 실질적으로 억제하지 않는다. 한 구체예에서, 항체는 MASP-2에 결합하고 선택적으로 렉틴 경로를 억제하며 실질적으로 고전적 경로 또는 대체 경로를 억제하지 않는다 (즉 렉틴 경로를 억제하는 한편 고전적 및 대체 보체 경로는 무상으로 남겨둔다).

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 aHUS (급성 또는 관해기)와 같은 TMA에 걸린 대상으로부터의 혈청에서 혈전 형성을, 미처리 혈청에 비교하여 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 내지 99%까지 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 aHUS에 걸린 대상으로부터의 혈청에서 혈전 형성을, 혈청 중의 C5b-9 침착에 대한 억제 효과보다 적어도 20% 이상 (예컨대 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%)의 수준으로 억제한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 관해기의 aHUS 환자로부터의 혈청에서 혈전 형성을, 미처리 혈청에 비교하여 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 내지 99%까지 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 aHUS 환자로부터의 혈청에서 혈전 형성을, 혈청 중의 C5b-9 침착에 대한 억제 효과보다 적어도 20% 이상 (예컨대 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%)의 수준으로 억제한다.

한 구체예에서, 발명은 TMA에 걸린 대상에서 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 대상에게 (I) (a) i) SEQ ID NO:67의 31 내지 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO:67의 50 내지 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO:67의 95 내지 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) i) SEQ ID NO:70의 24 내지 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO:70의 50 내지 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO:70의 89 내지 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) SEQ ID NO:67에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:67에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 그것의 변이체를 포함하는 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

한 구체예에서, TMA는 비전형적 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) (급성기 또는 관해기), HUS 및 TTP로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 대상은 aHUS의 급성기에 있다. 한 구체예에서, 대상은 aHUS의 관해기에 있다.

일부 구체예에서, 방법은 SEQ ID NO:67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 SEQ ID NO:70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 방법은 SEQ ID NO:67에 제시된 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체 OMS646에 의해 인식된 인간 MASP-2 상의 에피토프의 적어도 일부를 특이적으로 인식하는, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 결합 구성원들 간의 경합은 시험관 내에서, 예를 들면 ELISA를 사용하여 및/또는 특이적인 리포터 분자를 다른 미태그 결합 구성원(들)의 존재하에 검출될 수 있는 한 결합 구성원에 태그로 붙임으로써 동일한 에피토프 또는 중복하는 에피토프에 결합하는 특이적인 결합 구성원들의 확인을 가능하게 함으로써 쉽게 분석할 수 있다. 그러므로, 현재 인간 MASP-2에의 결합에 대해 참조 항체 OMS646과 경합하는, 인간 항체 항원-결합 부위를 포함하는, 특이적인 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이 제공된다.

실시예 43

이 실시예는 인간 MASP-2 억제 항체 (OMS646)가 피부 기원의 일차 인간 미세혈관 내피 세포 (MVEC)에서 아폽토시스의 TMA 환자 혈장-중재된 유도를 억제할 수 있는 것을 증명한다.

배경/근거:

TMA의 병리학은 다양한 인자들에 의해 유도된 내피 세포 손상과 이어지는 혈소판 플러그 및/또는 피브린 혈전에 의한 작은 혈관들 (예컨대 소동맥 및 모세혈관)의 폐색을 포함하는 것으로 알려져 있다 (Hirt-Minkowsk P. et al., Nephron Clin Pract 114:c219-c235, 2010; Goldberg R.J. et al., Am J Kidney Dis 56(6):1168-1174, 2010). MVEC는 시험관 내에서 TMA-관련 장애를 가진 환자들로부터의 혈장에 노출된 때 아폽토시스를 진행하는 것으로 알려져 있다 (Stefanescu et al., Blood Vol 112 (2):340-349, 2008; Mitra D. et al., Blood 89:1224-1234, 1997 참조). TMA와 관련되어 있는 아폽토시스성 손상은 그런 환자들의 조직 생검 (피부, 뼈, 골수, 비장, 신장, 회장)으로부터 얻어진 MVEC에서 증명되었다. 또한 MVEC에 대한 아폽토시스성 손상은 MVEC에서 막-결합된 보체 조절 단백질의 수준을 감소시키는 것으로 알려져 왔다 (예컨대 Mold & Morris, Immunology 102:359-364, 2001; Christmas et al., Immunology 119:522, 2006 참조).

말단 보체 성분들을 포함하는 포지티브 피드백은 비전형적인 용혈성-요독성 증후군 (ahUS)을 포함하는 TMA, 및 파국성 항인지질 증후군 (CAPS)과 관련된 TMA, 데고스병, 및 암, 암 화학요법, 자가면역 및 이식에 이차적인 TMA의 병리학에 포함되는 것으로 여겨지고, 이들 상태의 각각은 mAb 유클리주맙을 사용한 항-C5 치료법에 대한 반응인 것으로 알려져 있거나 생각된다 (Chapin J. et al., Brit. J. Hematol 157:772-774, 2012; Tsai et al., Br J Haematol 162(4):558-559, 2013); Magro C. M. et al., Journal of Rare Diseases 8:185, 2013).

다음의 실험을 aHUS, ADAMTS13 결핍-관련 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), CAPS 및 전신성 데고스병, 뿐만 아니라 암, 이식, 자가면역 질병 및 화학요법에 이차적인 TMA에 걸린 환자들로부터 얻어진 일차 샘플 중의 일차 인간 피부 MVEC에서 TMA 환자 혈장-중재된 아폽토시스의 유도를 차단하는 인간 MASP-2 억제 항체 (OMS646)의 능력을 분석하기 위해 수행하였다.

방법:

문헌에 기술되어 있는 것과 같이, 인간 기원의 일차 인간 MVEC에서 TMA 환자 혈장-중재된 아폽토시스의 유도를 차단하는 인간 MASP-2 억제 항체 (OMS646)의 효능을 분석하기 위해 시험관 내 분석을 수행하였다 (Stefanescu R. et al., Blood Vol 112 (2):340-349, 2008, 본원에 참조로 포함됨). 이 분석에서 사용한 혈장 샘플을 건강한 대조 대상집단으로부터 또는 급성기 또는 회복기 혈전성 미세혈관병증을 가지는 개체로부터 얻었다. TMA 환자들에서 미세혈관병증의 존재는 말초혈 스미어 상에서 분열적혈구를 검출함으로써 평가하였다. 또한, TTP를 문헌에서 기술한 대로 진단하였다 (Stefanescu R. et al., Blood Vol 112 (2):340-349, 2008).

내피 세포 (EC) 배양

Stefanescu 등에 의해 기술된 것과 같이, 피부 기원의 일차 인간 MVEC를 ScienCell Research Labs (San Diego, CA)로부터 구매하였다. MBEC는 CD34를 5 내지 6의 계대를 통해 발현하였다 (Blood 89:1224-1234, 1997). MVEC를 내피 세포 성장 보충물, 페니실린, 스트렙토마이신 및 15% 우태아 혈청을 함유하고 있는 ECM1001 배지 (ScienCell Research Labs)에서 물 중의 0.1% 젤라틴으로 코팅된 폴리스티렌 플라스크에서 유지하였다. 모든 MVEC를 2 내지 6의 계대에서 사용하였다. 하위배양은 0.25% 트립신-EDTA에 대한 5 내지 10분 노출을 포함하였다.

아폽토시스 분석

TTP/HUS 혈장-유도된 아폽토시스에 민감한 것으로 알려져 있는 피부 기원의 대표적인 일차 인간 MVEC를 인산염 완충된 염수 (PBS)로 세척하고 물 중의 0.1% 젤라틴으로 코팅된 12-웰 플레이트의 챔버에 0.15x10⁶ 생존 세포/mL로 플레이팅하여 놓았다. 플레이팅한 MVEC 세포를 완전 배지에서 24시간 동안 굶긴 후 다양한 농도 (2% 내지 20% v/v)의 TMA 환자 혈장 샘플 또는 건강한 공여자 샘플에 18시간 동안 MASP-2 mAb OMS646 (150 μg/mL)의 존재 또는 부재하에 노출시킨 다음 트립신처리에 의해 수확하였다. 각각의 TMA 환자 샘플을 이중으로 분석하였다. 혈장-유도된 아폽토시스의 정도를 프로피듐 요오다이드 (PI) 염색을 사용하여 평가하였고, >5 x10³ 세포를 세포 형광그래프로 분석하고 AO 피크를 컴퓨터 소프트웨어 (MCycle Av, Phoenix Flow Systems, San Diego, CA)에 의해 규정하였다. 세포 용해물로부터의 세포질 히스톤-관련 DNA 단편들의 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)-기초 정량을 또한 제조업체 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)의 지시대로 수행하였다.

결과:

MASP-2 mAb (OMS646)의 존재하에 TMA 환자 혈장-유도된 MVEC 아폽토시스 분석의 결과를 아래의 표 27에 나타낸다.

MASP-2 mAb (OMS646)의 존재하에 피부 기원의 일차 인간 MVEC에 대해 시험한 TMA 환자 혈장

대상 #	연령/성별	임상적 진단(TMA) 및 다른 상태	MASP-2 ng/ml	Cre/LDH를 기초로 한 진단	C5a	sC5-b9	ADAMS 활성	ADAMS 활성을 기초로 한 진단	OMS646을 사용한 보호
#2	41/f	TTP	174	TTP	34.42	772	30%	aHUS	응답
#3	52/f	TTP	150	TTP	48.32	1399	70%	aHUS	무응답
#4	20/m	TTP	224	TTP	36.9	1187	<10%	TTP	응답
#10	60/f	TTP	175.4	TTP	49.5	4406	64%	aHUS	무응답
#11	59/f	TTP	144.9	TTP	40.3	1352	<10%	TTP	무응답
#13	49/f	HUS, 암, TTP	142.8	TTP	48.6	3843	86%	aHUS	무응답
#42	27/m	TTP	341.5	TTP	100.0	5332	<5%	TTP	무응답
#46	25/f	TTP, Degos, SLE	225.11	TTP	53.9	3426	ND	ND	응답
#48	53/f	TTP, SLE, 신염s/p 신장 이식	788.5	aHUS	31.2	1066	66%	aHUS	응답
#49	64/f	TTP, APLAs, CVA	494.5		35.4	2100	ND	ND	응답
#51	25/f	aHUS, APLAs	313.1	TTP	26.8	1595	23%	aHUS	응답
#52	56/f	aHUS, SLE	333.1	TTP	18.9	1103	97%	aHUS	무응답
#53	56/f	aHUS 관해	189.9	관해 TTP	28.69	344	74%	aHUS	응답

표 27에 사용된 약어들:

"APLAs" = 파국성 항인지질 증후군 (CAPS)과 관련된 항인지질 항체

"SLE" = 전신성 홍반성 루프스

"CVA" = 뇌혈관 발작 (뇌졸중)

Stefanescu R. et al., Blood Vol 112 (2):340-349, 2008에 보고된 결과와 일관되게, 유의미한 아폽토시스가 MASP-2 항체의 부재시에 13개의 TMA 환자 혈장 샘플의 존재하에 피부 기원의 일차 MVEC에 대해 관찰되었다. 건강한 인간 대상으로부터의 대조 혈장 샘플을 나란히 작동시켰고 MVEC에서의 아폽토시스를 유도하지 않았다 (데이터는 제시하지 않음). 표 27에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2 억제 mAb (OMS646)는 시험한 13개의 환자 혈장 샘플 중 6개에서 (46%) 일차 MVEC에서 아폽토시스의 TMA 환자 혈장-중재된 유도를 억제하였다 (표 27에서 "응답"). 특히, MASP-2 억제 mAb (OMS646)는 aHUS, TTP, 데고스병, SLE, 이식 및 APLA (CAPS)에 걸린 환자들로부터 얻어진 혈장에서 아폽토시스를 억제하였다. MASP-2 mAb가 아폽토시스를 차단하지 못한, 이 분석으로 시험된 7개의 환자 샘플 (표 27에서 "무응답")에 관해서는, 아폽토시스가 여러 경로에 의해 유도될 수 있었지만, 그것들은 모두 보체 의존성이 아니었음이 주지된다. 예를 들어, Stefanescu R. 등이 주지한 것과 같이 (Stefanescu R. et al., Blood Vol 112 (2):340-349, 2008), EC 분석에서 아폽토시스는 아폽토시스를 유도하기 위해 필요한 손상의 수준을 측정하는 데 역할을 할 수 있는 혈장 인자들에 의해 영향을 받는 기준 EC 활성화 상태에 의존적이다. 추가로 Stefanescu R. 등에서 주지된 것과 같이, 아폽토시스를 조절할 수 있는 추가의 인자들, 예컨대 사이토킨 및 보체 시스템의 다양한 성분들은 TMA 환자 혈장에 존재할 수 있다. 그러므로, 이들 복합적인 인자들로 인하여, MASP-2 항체가 TMA-혈장 유도된 아폽토시스를 억제한 모든 혈장 샘플에서 차단 효과를 나타내지 못했다는 것은 놀라운 일이 아니다.

나아가 이런 관점에서, 항-C5 항체 유클리주맙을 사용한 TMA-혈장 유도된 아폽토시스를 사용하여 유사한 분석을 수행하였고 매우 유사한 결과를 관찰하였음이 주지된다 (Chapin et al., Blood (ASH Annual Meeting Abstracts): Abstract #3342, 120: 2012 참조). 매우 성공적인 상업적 제품인 유클리주맙의 임상적 효능은 이 모델에서 증명된 효능보다 더 크게 나타나고, 그것은 이 시험관 내 모델이 보체 억제 약물의 임상적 효능을 과소평가했을 것임을 시사한다.

이들 결과는 OMS646과 같은 MASP-2 억제 항체가 aHUS, TTP, 데고스병, SLE, 이식 및 APLA (CAPS)와 같은 TMA에 걸린 환자들로부터 얻어진 혈장에서 TMA-혈장-유도된 아폽토시스를 억제하는 데 효과적임을 증명한다. 내피 손상 및 아폽토시스는 특발성 TTP 및 산발성 HUS와 같은 TMA의 병리학에서 핵심 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Kim et al., Microvascular Research vol 62(2):83-93, 2001). Dang 등에 의해 기술된 것과 같이, 아폽토시스는 건강한 대조 대상에서가 아니라 TTP 환자들의 비장 적색 비수에서 증명되었다 (Dang et al., Blood 93(4):1264-1270, 1999). 아폽토시스는 또한 HUS 환자의 MVEC 기원의 신장 사구체 세포에서도 관찰되었다 (Arends M. J. et al., Hum Pathol 20:89, 1989). 그러므로, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체 (예컨대 OMS646)의 투여는 aHUS, TTP 또는 다른 미세혈관병성 장애, 예컨대 CAPS, 전신성 데고스병 및 암에 이차적인 TMA; 화학요법에 이차적인 TMA 또는 이식에 이차적인 TMA를 포함하는 다른 TMA에 걸린 환자들에서 효과적인 치료법이 될 것이라고 예상된다.

전술한 설명에 따르면, 한 구체예에서, 발명은 혈전성 미세혈관병증 (TMA)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상에서 내피 세포 손상 및/또는 내피 세포 아폽토시스, 및/또는 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 대상에게 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, TMA는 비전형적 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 및 용혈성 요독성 증후군 (HUS)으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, TMA는 aHUS이다. 한 구체예에서, 조성물은 질병의 급성기 동안에 aHUS 환자에게 투여된다. 한 구체예에서, 조성물은 관해기 (즉 급성기 aHUS의 에피소드로부터 회복된 또는 부분적으로 회복된 대상에서, 예를 들면 증가된 혈소판 카운트 및/또는 감소된 혈청 LDH 농도에 의해 증거되는 그런 관해, 예를 들면 Loirat C et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60, 2011 (본원에 참조로 포함됨)에 기술됨) 중에 aHUS 환자에게 투여된다.

한 구체예에서, 대상은 (i) 암에 이차적인 TMA; (ii) 화학요법에 이차적인 TMA; 또는 (iii) 이식 (예컨대 장기 이식, 예컨대 신장 이식 또는 동종이계성 조혈 줄기세포 이식)에 이차적인 TMA인 TMA에 걸렸거나 걸릴 위험이 있다. 한 구체예에서, 대상은 업쇼-슐만 증후군 (USS)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있다. 한 구체예에서, 대상은 데고스병에 걸렸거나 걸릴 위험이 있다. 한 구체예에서, 대상은 파국성 항인지질 증후군 (CAPS)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있다.

본원에 개시된 구체예 중 어느 것에 따르든지, MASP-2 억제 항체는 다음의 특징 중 적어도 하나 또는 그 이상을 나타낸다: 상기 항체는 10 nM 이하의 K_D로 인간 MASP-2에 결합하고, 상기 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인의 에피토프에 결합하며, 상기 항체는 시험관 내 분석에서 1% 인간 혈청에서 10 nM 이하의 IC₅₀에서 C3b 침착을 억제하고, 상기 항체는 90% 인간 혈청에서 30 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제하며, 이때 항체는 Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ 및 F(ab')₂로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체 단편이고, 항체는 단일-사슬 분자이며, 상기 항체는 IgG2 분자이고, 상기 항체는 IgG1 분자이며, 상기 항체는 IgG4 분자이고, IgG4 분자는 S228P 돌연변이를 포함하며, 및/또는 항체는 고전적 경로를 실질적으로 억제하지 않는다. 한 구체예에서, 항체는 MASP-2에 결합하고 선택적으로 렉틴 경로를 억제하며 실질적으로 대체 경로를 억제하지 않는다. 한 구체예에서, 항체는 MASP-2에 결합하고 선택적으로 렉틴 경로를 억제하며 실질적으로 고전적 경로 또는 대체 경로를 억제하지 않는다 (즉 렉틴 경로를 억제하는 한편 고전적 및 대체 보체 경로는 무상으로 남겨둔다).

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 aHUS (급성 또는 관해기), 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP), 암에 이차적인 TMA; 화학요법에 이차적인 TMA; 또는 이식 (예컨대 장기 이식, 예컨대 신장 이식 또는 동종이계 조혈 줄기세포 이식)에 이차적인 TMA와 같은 TMA에 걸린 대상으로부터의 혈청에서, 또는 업쇼-슐만 증후군 (USS)에 걸린 대상으로부터의 혈청에서, 또는 데고스병에 걸린 대상으로부터의 혈청에서, 또는 파국성 항인지질 증후군 (CAPS)에 걸린 대상으로부터의 혈청에서 혈장 유도된 MVEC 아폽토시스를 억제하는데, 이때 혈장 유도된 MVEC 아폽토시스는 미처리 혈청에 비교하여 적어도 5%, 예컨대 적어도 10%, 예컨대 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 내지 99%까지 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 TMA (예컨대 aHUS (급성 또는 관해기), 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP), 암에 이차적인 TMA; 화학요법에 이차적인 TMA; 또는 이식 (예컨대 장기 이식, 예컨대 신장 이식 또는 동종이계 조혈 줄기세포 이식)에 이차적인 TMA)에 걸린 대상으로부터의 혈청에서, 또는 업쇼-슐만 증후군 (USS)에 걸린 대상으로부터의 혈청에서, 또는 데고스병에 걸린 대상으로부터의 혈청에서, 또는 파국성 항인지질 증후군 (CAPS)에 걸린 대상으로부터의 혈청에서 혈전 형성을, 혈청 중의 C5b-9 침착에 대한 억제 효과보다 적어도 20% 이상 (예컨대 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%)의 수준으로 억제한다.

한 구체예에서, 발명은 TMA (예컨대 aHUS (급성 또는 관해기), 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP), 암에 이차적인 TMA; 화학요법에 이차적인 TMA; 또는 이식 (예컨대 장기 이식, 예컨대 신장 이식 또는 동종이계 조혈 줄기세포 이식)에 이차적인 TMA)에 걸린 대상으로부터의 혈청에서, 또는 업쇼-슐만 증후군 (USS)에 걸린 대상으로부터의 혈청에서, 또는 데고스병에 걸린 대상으로부터의 혈청에서, 또는 파국성 항인지질 증후군 (CAPS)에 걸린 대상으로부터의 혈청에서 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 대상에게 (I) (a) i) SEQ ID NO:67의 31 내지 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO:67의 50 내지 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO:67의 95 내지 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) i) SEQ ID NO:70의 24 내지 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO:70의 50 내지 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO:70의 89 내지 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) SEQ ID NO:67에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:67에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 90%의 동일성 (예컨대 SEQ ID NO:70에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성)을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 그것의 변이체를 포함하는 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

한 구체예에서, 대상은 암에 이차적인 TMA; 화학요법에 이차적인 TMA; 이식 (예컨대 장기 이식, 예컨대 신장 이식 또는 동종이계 조혈 줄기세포 이식)에 이차적인 TMA, 업쇼-슐만 증후군 (USS), 데고스병 및 파국성 항인지질 증후군 (CAPS)으로 구성되는 군으로부터 선택된 TMA에 걸려 있다.

일부 구체예에서, 방법은 SEQ ID NO:67에 제시된 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체 OMD646에 의해 인식된 인간 MASP-2 상의 에피토프의 적어도 일부를 특이적으로 인식하는 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

예시적인 구체예들이 예시되고 기술된 한편으로, 다양한 변화들이 본원에서 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있다는 것이 인지될 것이다.

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Dudler, Thomas Schwaeble, Hans-Wilhelm <120> METHODS FOR TREATING CONDITIONS ASSOCIATED WITH MASP-2 DEPENDENT COMPLEMENT ACTIVATION <130> MP.1.0220.PCT <150> US 62/020,845 <151> 2014-07-03 <150> US 61/892,283 <151> 2013-10-17 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 725 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (27)..(584) <400> 1 ggccaggcca gctggacggg cacacc atg agg ctg ctg acc ctc ctg ggc ctt 53 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu 1 5 ctg tgt ggc tcg gtg gcc acc ccc ttg ggc ccg aag tgg cct gaa cct 101 Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro 10 15 20 25 gtg ttc ggg cgc ctg gca tcc ccc ggc ttt cca ggg gag tat gcc aat 149 Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn 30 35 40 gac cag gag cgg cgc tgg acc ctg act gca ccc ccc ggc tac cgc ctg 197 Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu 45 50 55 cgc ctc tac ttc acc cac ttc gac ctg gag ctc tcc cac ctc tgc gag 245 Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu 60 65 70 tac gac ttc gtc aag ctg agc tcg ggg gcc aag gtg ctg gcc acg ctg 293 Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu 75 80 85 tgc ggg cag gag agc aca gac acg gag cgg gcc cct ggc aag gac act 341 Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr 90 95 100 105 ttc tac tcg ctg ggc tcc agc ctg gac att acc ttc cgc tcc gac tac 389 Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr 110 115 120 tcc aac gag aag ccg ttc acg ggg ttc gag gcc ttc tat gca gcc gag 437 Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu 125 130 135 gac att gac gag tgc cag gtg gcc ccg gga gag gcg ccc acc tgc gac 485 Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp 140 145 150 cac cac tgc cac aac cac ctg ggc ggt ttc tac tgc tcc tgc cgc gca 533 His His Cys His Asn His Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala 155 160 165 ggc tac gtc ctg cac cgt aac aag cgc acc tgc tca gag cag agc ctc 581 Gly Tyr Val Leu His Arg Asn Lys Arg Thr Cys Ser Glu Gln Ser Leu 170 175 180 185 tag cctcccctgg agctccggcc tgcccagcag gtcagaagcc agagccagcc 634 tgctggcctc agctccgggt tgggctgaga tggctgtgcc ccaactccca ttcacccacc 694 atggacccaa taataaacct ggccccaccc c 725 <210> 2 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser Glu Gln Ser Leu 180 185 <210> 3 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala 1 5 10 15 Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp 20 25 30 Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His 35 40 45 Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu 50 55 60 Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser 85 90 95 Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe 100 105 110 Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln 115 120 125 Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His 130 135 140 Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg 145 150 155 160 Asn Lys Arg Thr Cys Ser Glu Gln Ser Leu 165 170 <210> 4 <211> 2460 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (22)..(2082) <400> 4 ggccagctgg acgggcacac c atg agg ctg ctg acc ctc ctg ggc ctt ctg 51 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu 1 5 10 tgt ggc tcg gtg gcc acc ccc ttg ggc ccg aag tgg cct gaa cct gtg 99 Cys Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val 15 20 25 ttc ggg cgc ctg gca tcc ccc ggc ttt cca ggg gag tat gcc aat gac 147 Phe Gly Arg Leu Ala Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp 30 35 40 cag gag cgg cgc tgg acc ctg act gca ccc ccc ggc tac cgc ctg cgc 195 Gln Glu Arg Arg Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg 45 50 55 ctc tac ttc acc cac ttc gac ctg gag ctc tcc cac ctc tgc gag tac 243 Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr 60 65 70 gac ttc gtc aag ctg agc tcg ggg gcc aag gtg ctg gcc acg ctg tgc 291 Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys 75 80 85 90 ggg cag gag agc aca gac acg gag cgg gcc cct ggc aag gac act ttc 339 Gly Gln Glu Ser Thr Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe 95 100 105 tac tcg ctg ggc tcc agc ctg gac att acc ttc cgc tcc gac tac tcc 387 Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser 110 115 120 aac gag aag ccg ttc acg ggg ttc gag gcc ttc tat gca gcc gag gac 435 Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp 125 130 135 att gac gag tgc cag gtg gcc ccg gga gag gcg ccc acc tgc gac cac 483 Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His 140 145 150 cac tgc cac aac cac ctg ggc ggt ttc tac tgc tcc tgc cgc gca ggc 531 His Cys His Asn His Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly 155 160 165 170 tac gtc ctg cac cgt aac aag cgc acc tgc tca gcc ctg tgc tcc ggc 579 Tyr Val Leu His Arg Asn Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly 175 180 185 cag gtc ttc acc cag agg tct ggg gag ctc agc agc cct gaa tac cca 627 Gln Val Phe Thr Gln Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro 190 195 200 cgg ccg tat ccc aaa ctc tcc agt tgc act tac agc atc agc ctg gag 675 Arg Pro Tyr Pro Lys Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu 205 210 215 gag ggg ttc agt gtc att ctg gac ttt gtg gag tcc ttc gat gtg gag 723 Glu Gly Phe Ser Val Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu 220 225 230 aca cac cct gaa acc ctg tgt ccc tac gac ttt ctc aag att caa aca 771 Thr His Pro Glu Thr Leu Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr 235 240 245 250 gac aga gaa gaa cat ggc cca ttc tgt ggg aag aca ttg ccc cac agg 819 Asp Arg Glu Glu His Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg 255 260 265 att gaa aca aaa agc aac acg gtg acc atc acc ttt gtc aca gat gaa 867 Ile Glu Thr Lys Ser Asn Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu 270 275 280 tca gga gac cac aca ggc tgg aag atc cac tac acg agc aca gcg cag 915 Ser Gly Asp His Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln 285 290 295 cct tgc cct tat ccg atg gcg cca cct aat ggc cac gtt tca cct gtg 963 Pro Cys Pro Tyr Pro Met Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val 300 305 310 caa gcc aaa tac atc ctg aaa gac agc ttc tcc atc ttt tgc gag act 1011 Gln Ala Lys Tyr Ile Leu Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr 315 320 325 330 ggc tat gag ctt ctg caa ggt cac ttg ccc ctg aaa tcc ttt act gca 1059 Gly Tyr Glu Leu Leu Gln Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala 335 340 345 gtt tgt cag aaa gat gga tct tgg gac cgg cca atg ccc gcg tgc agc 1107 Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser 350 355 360 att gtt gac tgt ggc cct cct gat gat cta ccc agt ggc cga gtg gag 1155 Ile Val Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu 365 370 375 tac atc aca ggt cct gga gtg acc acc tac aaa gct gtg att cag tac 1203 Tyr Ile Thr Gly Pro Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr 380 385 390 agc tgt gaa gag acc ttc tac aca atg aaa gtg aat gat ggt aaa tat 1251 Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr 395 400 405 410 gtg tgt gag gct gat gga ttc tgg acg agc tcc aaa gga gaa aaa tca 1299 Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser 415 420 425 ctc cca gtc tgt gag cct gtt tgt gga cta tca gcc cgc aca aca gga 1347 Leu Pro Val Cys Glu Pro Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly 430 435 440 ggg cgt ata tat gga ggg caa aag gca aaa cct ggt gat ttt cct tgg 1395 Gly Arg Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp 445 450 455 caa gtc ctg ata tta ggt gga acc aca gca gca ggt gca ctt tta tat 1443 Gln Val Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr 460 465 470 gac aac tgg gtc cta aca gct gct cat gcc gtc tat gag caa aaa cat 1491 Asp Asn Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His 475 480 485 490 gat gca tcc gcc ctg gac att cga atg ggc acc ctg aaa aga cta tca 1539 Asp Ala Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser 495 500 505 cct cat tat aca caa gcc tgg tct gaa gct gtt ttt ata cat gaa ggt 1587 Pro His Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly 510 515 520 tat act cat gat gct ggc ttt gac aat gac ata gca ctg att aaa ttg 1635 Tyr Thr His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu 525 530 535 aat aac aaa gtt gta atc aat agc aac atc acg cct att tgt ctg cca 1683 Asn Asn Lys Val Val Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro 540 545 550 aga aaa gaa gct gaa tcc ttt atg agg aca gat gac att gga act gca 1731 Arg Lys Glu Ala Glu Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala 555 560 565 570 tct gga tgg gga tta acc caa agg ggt ttt ctt gct aga aat cta atg 1779 Ser Gly Trp Gly Leu Thr Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met 575 580 585 tat gtc gac ata ccg att gtt gac cat caa aaa tgt act gct gca tat 1827 Tyr Val Asp Ile Pro Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr 590 595 600 gaa aag cca ccc tat cca agg gga agt gta act gct aac atg ctt tgt 1875 Glu Lys Pro Pro Tyr Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys 605 610 615 gct ggc tta gaa agt ggg ggc aag gac agc tgc aga ggt gac agc gga 1923 Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly 620 625 630 ggg gca ctg gtg ttt cta gat agt gaa aca gag agg tgg ttt gtg gga 1971 Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly 635 640 645 650 gga ata gtg tcc tgg ggt tcc atg aat tgt ggg gaa gca ggt cag tat 2019 Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr 655 660 665 gga gtc tac aca aaa gtt att aac tat att ccc tgg atc gag aac ata 2067 Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile 670 675 680 att agt gat ttt taa cttgcgtgtc tgcagtcaag gattcttcat ttttagaaat 2122 Ile Ser Asp Phe 685 gcctgtgaag accttggcag cgacgtggct cgagaagcat tcatcattac tgtggacatg 2182 gcagttgttg ctccacccaa aaaaacagac tccaggtgag gctgctgtca tttctccact 2242 tgccagttta attccagcct tacccattga ctcaagggga cataaaccac gagagtgaca 2302 gtcatctttg cccacccagt gtaatgtcac tgctcaaatt acatttcatt accttaaaaa 2362 gccagtctct tttcatactg gctgttggca tttctgtaaa ctgcctgtcc atgctctttg 2422 tttttaaact tgttcttatt gaaaaaaaaa aaaaaaaa 2460 <210> 5 <211> 686 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln Arg 180 185 190 Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Leu 195 200 205 Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val Ile 210 215 220 Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr Leu 225 230 235 240 Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln 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Gln Val Leu Ile Leu Gly 450 455 460 Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn Trp Val Leu Thr 465 470 475 480 Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala Ser Ala Leu Asp 485 490 495 Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala 500 505 510 Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Asp Ala Gly 515 520 525 Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn Lys Val Val Ile 530 535 540 Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Glu Ser 545 550 555 560 Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly Trp Gly Leu Thr 565 570 575 Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val Asp Ile Pro Ile 580 585 590 Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Pro Pro Tyr Pro 595 600 605 Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly 610 615 620 Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu 625 630 635 640 Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly 645 650 655 Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val 660 665 670 Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asp Phe 675 680 685 <210> 6 <211> 671 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala 1 5 10 15 Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp 20 25 30 Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His 35 40 45 Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu 50 55 60 Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser 85 90 95 Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe 100 105 110 Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln 115 120 125 Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His 130 135 140 Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg 145 150 155 160 Asn Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln 165 170 175 Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys 180 185 190 Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val 195 200 205 Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr 210 215 220 Leu Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His 225 230 235 240 Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser 245 250 255 Asn Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr 260 265 270 Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro 275 280 285 Met Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile 290 295 300 Leu Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu 305 310 315 320 Gln Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp 325 330 335 Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly 340 345 350 Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro 355 360 365 Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr 370 375 380 Phe Tyr Thr Met Lys 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gctggggttt ctcagggtcg gggggtcccc aaggagtagc 540 cagggttcag ggacacctgg gagcaggggc caggcttggc caggagggag atcaggcctg 600 ggtcttgcct tcactccctg tgacacctga ccccacagct gagctcgggg gccaaggtgc 660 tggccacgct gtgcgggcag gagagcacag acacggagcg ggcccctggc aaggacactt 720 tctactcgct gggctccagc ctggacatta ccttccgctc cgactactcc aacgagaagc 780 cgttcacggg gttcgaggcc ttctatgcag ccgagggtga gccaagaggg gtcctgcaac 840 atctcagtct gcgcagctgg ctgtgggggt aactctgtct taggccaggc agccctgcct 900 tcagtttccc cacctttccc agggcagggg agaggcctct ggcctgacat catccacaat 960 gcaaagacca aaacagccgt gacctccatt cacatgggct gagtgccaac tctgagccag 1020 ggatctgagg acagcatcgc ctcaagtgac gcagggactg gccgggcgcg gcagctcacg 1080 cctgtaattc cagcactttg ggaggccgag gctggcttga taatttgagg gtcaggagtt 1140 caaggccagc cagggcaaca cggtgaaact ctatctccac taaaactaca aaaattagct 1200 gggcgtggtg gtgcgcacct ggaatcccag ctactaggga ggctgaggca ggagaattgc 1260 ttgaacctgc gaggtggagg ctgcagtgaa cagagattgc accactacac tccacctggg 1320 cgacagacta gactccgtct caaaaaacaa aaaacaaaaa ccacgcaggg ccgagggccc 1380 atttacaagc tgacaaagtg ggccctgcca gcgggagcgc tgcaggatgt ttgattttca 1440 gatcccagtc cctgcagaga ccaactgtgt gacctctggc aagtggctca atttctctgc 1500 tccttagaag ctgctgcaag ggttcagcgc tgtagccccg ccccctgggt ttgattgact 1560 cccctcatta gctgggtgac ctcggccgga cactgaaact cccactggtt taacagaggt 1620 gatgtttgca tctttctccc agcgctgctg ggagcttgca gcgaccctag gcctgtaagg 1680 tgattggccc ggcaccagtc ccgcacccta gacaggacct aggcctcctc tgaggtccac 1740 tctgaggtca tggatctcct gggaggagtc caggctggat cccgcctctt tccctcctga 1800 cggcctgcct ggccctgcct ctcccccaga cattgacgag tgccaggtgg ccccgggaga 1860 ggcgcccacc tgcgaccacc actgccacaa ccacctgggc ggtttctact gctcctgccg 1920 cgcaggctac gtcctgcacc gtaacaagcg cacctgctca ggtgagggag gctgcctggg 1980 ccccaacgca ccctctcctg ggatacccgg ggctcctcag ggccattgct gctctgccca 2040 ggggtgcgga gggcctgggc ctggacactg ggtgcttcta ggccctgctg cctccagctc 2100 cccttctcag ccctgcttcc cctctcagca gccaggctca tcagtgccac cctgccctag 2160 cactgagact aattctaaca tcccactgtg tacctggttc cacctgggct ctgggaaccc 2220 ctcatgtagc cacgggagag tcggggtatc taccctcgtt ccttggactg ggttcctgtt 2280 ccctgcactg ggggacgggc cagtgctctg gggcgtgggc agccccaccc tgtggcgctg 2340 accctgctcc cccgactcgg tttctcctct cggggtctct ccttgcctct ctgatctctc 2400 ttccagagca gagcctctag cctcccctgg agctccggct gcccagcagg tcagaagcca 2460 gagccaggct gctggcctca gctccgggtt gggctgagat gctgtgcccc aactcccatt 2520 cacccaccat ggacccaata ataaacctgg ccccacccca cctgctgccg cgtgtctctg 2580 gggtgggagg gtcgggaggc ggtggggcgc gctcctctct gcctaccctc ctcacagcct 2640 catgaacccc aggtctgtgg gagcctcctc catggggcca cacggtcctt ggcctcaccc 2700 cctgttttga agatggggca ctgaggccgg agaggggtaa ggcctcgctc gagtccaggt 2760 ccccagaggc tgagcccaga gtaatcttga accaccccca ttcagggtct ggcctggagg 2820 agcctgaccc acagaggaga caccctggga gatattcatt gaggggtaat ctggtccccc 2880 gcaaatccag gggtgattcc cactgcccca taggcacagc cacgtggaag aaggcaggca 2940 atgttggggc tcctcacttc ctagaggcct cacaactcaa atgcccccca ctgcagctgg 3000 gggtggggtg gtggtatggg atggggacca agccttcctt gaaggataga gcccagccca 3060 acaccccgcc ccgtggcagc agcatcacgt gttccagcga ggaaggagag caccagactc 3120 agtcatgatc actgttgcct tgaacttcca agaacagccc cagggcaagg gtcaaaacag 3180 gggaaagggg gtgatgagag atccttcttc cggatgttcc tccaggaacc agggggctgg 3240 ctggtcttgg ctgggttcgg gtaggagacc catgatgaat aaacttggga atcactgggg 3300 tggctgtaag ggaatttagg ggagctccga aggggccctt aggctcgagg agatgctcct 3360 ctcttttccc gaattcccag ggacccagga gagtgtccct tcttcctctt cctgtgtgtc 3420 catccacccc cgccccccgc cctggcagag ctggtggaac tcagtgctct agcccctacc 3480 ctggggttgc gactctggct caggacacca ccacgctccc tgggggtgtg agtgagggcc 3540 tgtgcgctcc atcccgagtg ctgcctgttt cagctaaagc ctcaaagcaa gagaaacccc 3600 ctctctaagc ggcccctcag ccatcgggtg ggtcgtttgg tttctgggta ggcctcaggg 3660 gctggccacc tgcagggccc agcccaaccc agggatgcag atgtcccagc cacatccctg 3720 tcccagtttc ctgctcccca aggcatccac cctgctgttg gtgcgagggc tgatagaggg 3780 cacgccaagt cactcccctg cccttccctc cttccagccc tgtgctccgg ccaggtcttc 3840 acccagaggt ctggggagct cagcagccct gaatacccac ggccgtatcc caaactctcc 3900 agttgcactt acagcatcag cctggaggag gggttcagtg tcattctgga ctttgtggag 3960 tccttcgatg tggagacaca ccctgaaacc ctgtgtccct acgactttct caaggtctgg 4020 ctcctgggcc cctcatcttg tcccagatcc tcccccttca gcccagctgc accccctact 4080 tcctgcagca tggcccccac cacgttcccg tcaccctcgg tgaccccacc tcttcaggtg 4140 ctctatggag gtcaaggctg gggcttcgag tacaagtgtg ggaggcagag tggggagggg 4200 caccccaatc catggcctgg gttggcctca ttggctgtcc ctgaaatgct gaggaggtgg 4260 gttacttccc tccgcccagg ccagacccag gcagctgctc cccagctttc atgagcttct 4320 ttctcagatt caaacagaca gagaagaaca tggcccattc tgtgggaaga cattgcccca 4380 caggattgaa acaaaaagca acacggtgac catcaccttt gtcacagatg aatcaggaga 4440 ccacacaggc tggaagatcc actacacgag cacagtgagc aagtgggctc agatccttgg 4500 tggaagcgca gagctgcctc tctctggagt gcaaggagct gtagagtgta gggctcttct 4560 gggcaggact aggaagggac accaggttta gtggtgctga ggtctgaggc agcagcttct 4620 aaggggaagc acccgtgccc tcctcagcag cacccagcat cttcaccact cattcttcaa 4680 ccacccattc acccatcact catcttttac ccacccaccc tttgccactc atccttctgt 4740 ccctcatcct tccaaccatt catcaatcac ccacccatcc atcctttgcc acacaaccat 4800 ccacccattc ttctacctac ccatcctatc catccatcct tctatcagca tccttctacc 4860 acccatcctt cgttcggtca tccatcatca tccatccatc 4900 <210> 8 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala 130 135 <210> 9 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu 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230 235 240 Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly 245 250 255 Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser Asn 260 265 270 Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr Gly 275 280 285 Trp Lys Ile His Tyr 290 <210> 11 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys 1 5 10 15 Asp His His Cys His Asn His Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg 20 25 30 Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn Lys 35 40 <210> 12 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn 20 25 30 Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala 35 40 45 Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His 50 55 60 Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr 65 70 75 80 His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn 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Gly Arg Leu 1 5 10 15 <210> 15 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp 1 5 10 15 Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln 35 40 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn 1 5 <210> 17 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr 1 5 10 15 Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe 20 25 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly 1 5 <210> 19 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys 1 5 10 15 Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val 20 25 <210> 20 <211> 960 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (51)..(797) <400> 20 attaactgag attaaccttc cctgagtttt ctcacaccaa ggtgaggacc atg tcc 56 Met Ser 1 ctg ttt cca tca ctc cct ctc ctt ctc ctg agt atg gtg gca gcg tct 104 Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala Ala Ser 5 10 15 tac tca gaa act gtg acc tgt gag gat gcc caa aag acc tgc cct gca 152 Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys Pro Ala 20 25 30 gtg att gcc tgt agc tct cca ggc atc aac ggc ttc cca ggc aaa gat 200 Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp 35 40 45 50 ggg cgt gat ggc acc aag gga gaa aag ggg gaa cca ggc caa ggg ctc 248 Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu 55 60 65 aga ggc tta cag ggc ccc cct gga aag ttg ggg cct cca gga aat cca 296 Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro 70 75 80 ggg cct tct ggg tca cca gga cca aag ggc caa aaa gga gac cct gga 344 Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly 85 90 95 aaa agt ccg gat ggt gat agt agc ctg gct gcc tca gaa aga aaa gct 392 Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala 100 105 110 ctg caa aca gaa atg gca cgt atc aaa aag tgg ctc acc ttc tct ctg 440 Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu 115 120 125 130 ggc aaa caa gtt ggg aac aag ttc ttc ctg acc aat ggt gaa ata atg 488 Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met 135 140 145 acc ttt gaa aaa gtg aag gcc ttg tgt gtc aag ttc cag gcc tct gtg 536 Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val 150 155 160 gcc acc ccc agg aat gct gca gag aat gga gcc att cag aat ctc atc 584 Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile 165 170 175 aag gag gaa gcc ttc ctg ggc atc act gat gag aag aca gaa ggg cag 632 Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln 180 185 190 ttt gtg gat ctg aca gga aat aga ctg acc tac aca aac tgg aac gag 680 Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu 195 200 205 210 ggt gaa ccc aac aat gct ggt tct gat gaa gat tgt gta ttg cta ctg 728 Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu 215 220 225 aaa aat ggc cag tgg aat gac gtc ccc tgc tcc acc tcc cat ctg gcc 776 Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala 230 235 240 gtc tgt gag ttc cct atc tga agggtcatat cactcaggcc ctccttgtct 827 Val Cys Glu Phe Pro Ile 245 ttttactgca acccacaggc ccacagtatg cttgaaaaga taaattatat caatttcctc 887 atatccagta ttgttccttt tgtgggcaat cactaaaaat gatcactaac agcaccaaca 947 aagcaataat agt 960 <210> 21 <211> 248 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Ser Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala 1 5 10 15 Ala Ser Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys 20 25 30 Pro Ala Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly 35 40 45 Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly 65 70 75 80 Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly 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represents hydrophobic residue <400> 22 Xaa Gly Lys Xaa Gly Pro 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Wherein X represents hydroxyproline <400> 23 Xaa Gly Lys Leu Gly 1 5 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(15) <223> Wherein X at positions 9 and 15 represents hydroxyproline <400> 24 Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly Lys Leu Gly Pro Xaa Gly 1 5 10 15 <210> 25 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(27) <223> Wherein X at positions 3, 6, 15, 21, 24, 27 represents hydroxyproline <400> 25 Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly 1 5 10 15 Lys Leu Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa 20 25 <210> 26 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 26 Gly Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly 1 5 10 15 Gln Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly Lys Leu Gly Pro Xaa 20 25 30 Gly Asn Xaa Gly Pro Ser Gly Ser Xaa Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly 35 40 45 Asp Xaa Gly Lys Ser 50 <210> 27 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(33) <223> Wherein X at positions 3, 6, 12, 18, 21, 30, 33 represents hydroxyproline <400> 27 Gly Ala Xaa Gly Ser Xaa Gly Glu Lys Gly Ala Xaa Gly Pro Gln Gly 1 5 10 15 Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Lys Met Gly Pro Lys Gly Glu Xaa Gly Asp 20 25 30 Xaa <210> 28 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(45) <223> Wherein X at positions 3, 6, 9, 27, 30, 36, 42, 45 represents hydroxyproline <400> 28 Gly Cys Xaa Gly Leu Xaa Gly Ala Xaa Gly Asp Lys Gly Glu Ala Gly 1 5 10 15 Thr Asn Gly Lys Arg Gly Glu Arg Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Lys 20 25 30 Ala Gly Pro Xaa Gly Pro Asn Gly Ala Xaa Gly Glu Xaa 35 40 45 <210> 29 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile Leu Pro Asn Arg Val Thr Ile Lys Ala 1 5 10 15 Asn Arg Pro Phe Leu Val Phe Ile 20 <210> 30 <211> 559 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 atgaggctgc tgaccctcct gggccttctg tgtggctcgg tggccacccc cttgggcccg 60 aagtggcctg aacctgtgtt cgggcgcctg gcatcccccg gctttccagg ggagtatgcc 120 aatgaccagg agcggcgctg gaccctgact gcaccccccg gctaccgcct gcgcctctac 180 ttcacccact tcgacctgga gctctcccac ctctgcgagt acgacttcgt caagctgagc 240 tcgggggcca aggtgctggc cacgctgtgc gggcaggaga gcacagacac ggagcgggcc 300 cctggcaagg acactttcta ctcgctgggc tccagcctgg acattacctt ccgctccgac 360 tactccaacg agaagccgtt cacggggttc gaggccttct atgcagccga ggacattgac 420 gagtgccagg tggccccggg agaggcgccc acctgcgacc accactgcca caaccacctg 480 ggcggtttct actgctcctg ccgcgcaggc tacgtcctgc accgtaacaa gcgcacctgc 540 tcagccctgt gctccggcc 559 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 cgggcacacc atgaggctgc tgaccctcct gggc 34 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 gacattacct tccgctccga ctccaacgag aag 33 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 agcagccctg aatacccacg gccgtatccc aaa 33 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 cgggatccat gaggctgctg accctc 26 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 ggaattccta ggctgcata 19 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 ggaattccta cagggcgct 19 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 ggaattccta gtagtggat 19 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 tgcggccgct gtaggtgctg tcttt 25 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 ggaattcact cgttattctc gga 23 <210> 40 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 tccgagaata acgagtg 17 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 cattgaaagc tttggggtag aagttgttc 29 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 cgcggccgca gctgctcaga gtgtaga 27 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 cggtaagctt cactggctca gggaaata 28 <210> 44 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 aagaagcttg ccgccaccat ggattggctg tggaact 37 <210> 45 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 cgggatcctc aaactttctt gtccaccttg g 31 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 aagaaagctt gccgccacca tgttctcact agctct 36 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 cgggatcctt ctccctctaa cactct 26 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 1 5 <210> 49 <211> 4960 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 49 ccggacgtgg tggcgcatgc ctgtaatccc agctactcgg gaggctgagg caggagaatt 60 gctcgaaccc cggaggcaga ggtttggtgg ctcacacctg taatcccagc actttgcgag 120 gctgaggcag gtgcatcgct ttggctcagg agttcaagac cagcctgggc aacacaggga 180 gacccccatc tctacaaaaa acaaaaacaa atataaaggg gataaaaaaa aaaaaaagac 240 aagacatgaa tccatgagga cagagtgtgg aagaggaagc agcagcctca aagttctgga 300 agctggaaga acagataaac aggtgtgaaa taactgcctg gaaagcaact tctttttttt 360 tttttttttt tttgaggtgg agtctcactc tgtcgtccag gctggagtgc agtggtgcga 420 tctcggatca ctgcaacctc cgcctcccag gctcaagcaa ttctcctgcc tcagcctccc 480 gagtagctgg gattataagt gcgcgctgcc acacctggat gatttttgta tttttagtag 540 agatgggatt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctcaaact cccaacctcg tgatccaccc 600 accttggcct cccaaagtgc tgggattaca ggtataagcc accgagccca gccaaaagcg 660 acttctaagc ctgcaaggga atcgggaatt ggtggcacca ggtccttctg acagggttta 720 agaaattagc cagcctgagg ctgggcacgg tggctcacac ctgtaatccc agcactttgg 780 gaggctaagg caggtggatc acctgagggc aggagttcaa gaccagcctg accaacatgg 840 agaaacccca tccctaccaa aaataaaaaa ttagccaggt gtggtggtgc tcgcctgtaa 900 tcccagctac ttgggaggct gaggtgggag gattgcttga acacaggaag tagaggctgc 960 agtgagctat gattgcagca ctgcactgaa gccggggcaa cagaacaaga tccaaaaaaa 1020 agggaggggt gaggggcaga gccaggattt gtttccaggc tgttgttacc taggtccgac 1080 tcctggctcc cagagcagcc tgtcctgcct gcctggaact ctgagcaggc tggagtcatg 1140 gagtcgattc ccagaatccc agagtcaggg aggctggggg caggggcagg tcactggaca 1200 aacagatcaa aggtgagacc agcgtagggc tgcagaccag gccaggccag ctggacgggc 1260 acaccatgag gtaggtgggc gcccacagcc tccctgcagg gtgtggggtg ggagcacagg 1320 cctgggccct caccgcccct gccctgccca taggctgctg accctcctgg gccttctgtg 1380 tggctcggtg gccaccccct tgggcccgaa gtggcctgaa cctgtgttcg ggcgcctggc 1440 atcccccggc tttccagggg agtatgccaa tgaccaggag cggcgctgga ccctgactgc 1500 accccccggc taccgcctgc gcctctactt cacccacttc gacctggagc tctcccacct 1560 ctgcgagtac gacttcgtca aggtgccgtc aggacgggag ggctggggtt tctcagggtc 1620 ggggggtccc caaggagtag ccagggttca gggacacctg ggagcagggg ccaggcttgg 1680 ccaggaggga gatcaggcct gggtcttgcc ttcactccct gtgacacctg accccacagc 1740 tgagctcggg ggccaaggtg ctggccacgc tgtgcgggca ggagagcaca gacacggagc 1800 gggcccctgg caaggacact ttctactcgc tgggctccag cctggacatt accttccgct 1860 ccgactactc caacgagaag ccgttcacgg ggttcgaggc cttctatgca gccgagggtg 1920 agccaagagg ggtcctgcaa catctcagtc tgcgcagctg gctgtggggg taactctgtc 1980 ttaggccagg cagccctgcc ttcagtttcc ccacctttcc cagggcaggg gagaggcctc 2040 tggcctgaca tcatccacaa tgcaaagacc aaaacagccg tgacctccat tcacatgggc 2100 tgagtgccaa ctctgagcca gggatctgag gacagcatcg cctcaagtga cgcagggact 2160 ggccgggcgc agcagctcac gcctgtaatt ccagcacttt gggaggccga ggctggctga 2220 tcatttgagg tcaggagttc aaggccagcc agggcaacac ggtgaaactc tatctccact 2280 aaaactacaa aaattagctg ggcgtggtgg tgcgcacctg gaatcccagc tactagggag 2340 gctgaggcag gagaattgct tgaacctgcg aggtggaggc tgcagtgaac agagattgca 2400 ccactacact ccagcctggg cgacagagct agactccgtc tcaaaaaaca aaaaacaaaa 2460 acgacgcagg ggccgagggc cccatttaca gctgacaaag tggggccctg ccagcgggag 2520 cgctgccagg atgtttgatt tcagatccca gtccctgcag agaccaactg tgtgacctct 2580 ggcaagtggc tcaatttctc tgctccttag gaagctgctg caagggttca gcgctgtagc 2640 cccgccccct gggtttgatt gactcccctc attagctggg tgacctcggg ccggacactg 2700 aaactcccac tggtttaaca gaggtgatgt ttgcatcttt ctcccagcgc tgctgggagc 2760 ttgcagcgac cctaggcctg taaggtgatt ggcccggcac cagtcccgca ccctagacag 2820 gacgaggcct cctctgaggt ccactctgag gtcatggatc tcctgggagg agtccaggct 2880 ggatcccgcc tctttccctc ctgacggcct gcctggccct gcctctcccc cagacattga 2940 cgagtgccag gtggccccgg gagaggcgcc cacctgcgac caccactgcc acaaccacct 3000 gggcggtttc tactgctcct gccgcgcagg ctacgtcctg caccgtaaca agcgcacctg 3060 ctcagccctg tgctccggcc aggtcttcac ccagaggtct ggggagctca gcagccctga 3120 atacccacgg ccgtatccca aactctccag ttgcacttac agcatcagcc tggaggaggg 3180 gttcagtgtc attctggact ttgtggagtc cttcgatgtg gagacacacc ctgaaaccct 3240 gtgtccctac gactttctca agattcaaac agacagagaa gaacatggcc cattctgtgg 3300 gaagacattg ccccacagga ttgaaacaaa aagcaacacg gtgaccatca cctttgtcac 3360 agatgaatca ggagaccaca caggctggaa gatccactac acgagcacag cgcacgcttg 3420 cccttatccg atggcgccac ctaatggcca cgtttcacct gtgcaagcca aatacatcct 3480 gaaagacagc ttctccatct tttgcgagac tggctatgag cttctgcaag gtcacttgcc 3540 cctgaaatcc tttactgcag tttgtcagaa agatggatct tgggaccggc caatgcccgc 3600 gtgcagcatt gttgactgtg gccctcctga tgatctaccc agtggccgag tggagtacat 3660 cacaggtcct ggagtgacca cctacaaagc tgtgattcag tacagctgtg aagagacctt 3720 ctacacaatg aaagtgaatg atggtaaata tgtgtgtgag gctgatggat tctggacgag 3780 ctccaaagga gaaaaatcac tcccagtctg tgagcctgtt tgtggactat cagcccgcac 3840 aacaggaggg cgtatatatg gagggcaaaa ggcaaaacct ggtgattttc cttggcaagt 3900 cctgatatta ggtggaacca cagcagcagg tgcactttta tatgacaact gggtcctaac 3960 agctgctcat gccgtctatg agcaaaaaca tgatgcatcc gccctggaca ttcgaatggg 4020 caccctgaaa agactatcac ctcattatac acaagcctgg tctgaagctg tttttataca 4080 tgaaggttat actcatgatg ctggctttga caatgacata gcactgatta aattgaataa 4140 caaagttgta atcaatagca acatcacgcc tatttgtctg ccaagaaaag aagctgaatc 4200 ctttatgagg acagatgaca ttggaactgc atctggatgg ggattaaccc aaaggggttt 4260 tcttgctaga aatctaatgt atgtcgacat accgattgtt gaccatcaaa aatgtactgc 4320 tgcatatgaa aagccaccct atccaagggg aagtgtaact gctaacatgc tttgtgctgg 4380 cttagaaagt gggggcaagg acagctgcag aggtgacagc ggaggggcac tggtgtttct 4440 agatagtgaa acagagaggt ggtttgtggg aggaatagtg tcctggggtt ccatgaattg 4500 tggggaagca ggtcagtatg gagtctacac aaaagttatt aactatattc cctggatcga 4560 gaacataatt agtgattttt aacttgcgtg tctgcagtca aggattcttc atttttagaa 4620 atgcctgtga agaccttggc agcgacgtgg ctcgagaagc attcatcatt actgtggaca 4680 tggcagttgt tgctccaccc aaaaaaacag actccaggtg aggctgctgt catttctcca 4740 cttgccagtt taattccagc cttacccatt gactcaaggg gacataaacc acgagagtga 4800 cagtcatctt tgcccaccca gtgtaatgtc actgctcaaa ttacatttca ttaccttaaa 4860 aagccagtct cttttcatac tggctgttgg catttctgta aactgcctgt ccatgctctt 4920 tgtttttaaa cttgttctta ttgaaaaaaa aaaaaaaaaa 4960 <210> 50 <211> 2090 <212> DNA <213> Murine <220> <221> CDS <222> (33)..(2090) <400> 50 ggcgctggac tgcagagcta tggtggcaca cc atg agg cta ctc atc ttc ctg 53 Met Arg Leu Leu Ile Phe Leu 1 5 ggt ctg ctg tgg agt ttg gtg gcc aca ctt ctg ggt tca aag tgg cct 101 Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro 10 15 20 gaa cct gta ttc ggg cgc ctg gtg tcc cct ggc ttc cca gag aag tat 149 Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val Ser Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr 25 30 35 gct gac cat caa gat cga tcc tgg aca ctg act gca ccc cct ggc tac 197 Ala Asp His Gln Asp Arg Ser Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr 40 45 50 55 cgc ctg cgc ctc tac ttc acc cac ttt gac ctg gaa ctc tct tac cgc 245 Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp Leu Glu Leu Ser Tyr Arg 60 65 70 tgc gag tat gac ttt gtc aag ttg agc tca ggg acc aag gtg ctg gcc 293 Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala 75 80 85 aca ctg tgt ggg cag gag agt aca gac act gag cag gca cct ggc aat 341 Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp Thr Glu Gln Ala Pro Gly Asn 90 95 100 gac acc ttc tac tca ctg ggt ccc agc cta aag gtc acc ttc cac tcc 389 Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser 105 110 115 gac tac tcc aat gag aag ccg ttc aca ggg ttt gag gcc ttc tat gca 437 Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala 120 125 130 135 gcg gag gat gtg gat gaa tgc aga gtg tct ctg gga gac tca gtc cct 485 Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Val Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro 140 145 150 tgt gac cat tat tgc cac aac tac ttg ggc ggc tac tat tgc tcc tgc 533 Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys 155 160 165 aga gcg ggc tac att ctc cac cag aac aag cac acg tgc tca gcc ctt 581 Arg Ala Gly Tyr Ile Leu His Gln Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu 170 175 180 tgt tca ggc cag gtg ttc aca gga aga tct ggg tat ctc agt agc cct 629 Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly Arg Ser Gly Tyr Leu Ser Ser Pro 185 190 195 gag tac ccg cag cca tac ccc aag ctc tcc agc tgc acc tac agc atc 677 Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile 200 205 210 215 cgc ctg gag gac ggc ttc agt gtc atc ctg gac ttc gtg gag tcc ttc 725 Arg Leu Glu Asp Gly Phe Ser Val Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe 220 225 230 gat gtg gag acg cac cct gaa gcc cag tgc ccc tat gac tcc ctc aag 773 Asp Val Glu Thr His Pro Glu Ala Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys 235 240 245 att caa aca gac aag ggg gaa cac ggc cca ttt tgt ggg aag acg ctg 821 Ile Gln Thr Asp Lys Gly Glu His Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu 250 255 260 cct ccc agg att gaa act gac agc cac aag gtg acc atc acc ttt gcc 869 Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser His Lys Val Thr Ile Thr Phe Ala 265 270 275 act gac gag tcg ggg aac cac aca ggc tgg aag ata cac tac aca agc 917 Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser 280 285 290 295 aca gca cgg ccc tgc cct gat cca acg gcg cca cct aat ggc agc att 965 Thr Ala Arg Pro Cys Pro Asp Pro Thr Ala Pro Pro Asn Gly Ser Ile 300 305 310 tca cct gtg caa gcc acg tat gtc ctg aag gac agg ttt tct gtc ttc 1013 Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val Leu Lys Asp Arg Phe Ser Val Phe 315 320 325 tgc aag aca ggc ttc gag ctt ctg caa ggt tct gtc ccc ctg aaa tca 1061 Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser 330 335 340 ttc act gct gtc tgt cag aaa gat gga tct tgg gac cgg ccg atg cca 1109 Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro 345 350 355 gag tgc agc att att gat tgt ggc cct ccc gat gac cta ccc aat ggc 1157 Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly 360 365 370 375 cat gtg gac tat atc aca ggc cct caa gtg act acc tac aaa gct gtg 1205 His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro Gln Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val 380 385 390 att cag tac agc tgt gaa gag act ttc tac aca atg agc agc aat ggt 1253 Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly 395 400 405 aaa tat gtg tgt gag gct gat gga ttc tgg acg agc tcc aaa gga gaa 1301 Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu 410 415 420 aaa ctc ccc ccg gtt tgt gag cct gtt tgt ggg ctg tcc aca cac act 1349 Lys Leu Pro Pro Val Cys Glu Pro Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr 425 430 435 ata gga gga cgc ata gtt gga ggg cag cct gca aag cct ggt gac ttt 1397 Ile Gly Gly Arg Ile Val Gly Gly Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe 440 445 450 455 cct tgg caa gtc ttg ttg ctg ggt caa act aca gca gca gca ggt gca 1445 Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly Gln Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala 460 465 470 ctt ata cat gac aat tgg gtc cta aca gcc gct cat gct gta tat gag 1493 Leu Ile His Asp Asn Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu 475 480 485 aaa aga atg gca gcg tcc tcc ctg aac atc cga atg ggc atc ctc aaa 1541 Lys Arg Met Ala Ala Ser Ser Leu Asn Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys 490 495 500 agg ctc tca cct cat tac act caa gcc tgg ccc gag gaa atc ttt ata 1589 Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala Trp Pro Glu Glu Ile Phe Ile 505 510 515 cat gaa ggc tac act cac ggt gct ggt ttt gac aat gat ata gca ttg 1637 His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu 520 525 530 535 att aaa ctc aag aac aaa gtc aca atc aac gga agc atc atg cct gtt 1685 Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile Asn Gly Ser Ile Met Pro Val 540 545 550 tgc cta ccg cga aaa gaa gct gca tcc tta atg aga aca gac ttc act 1733 Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser Leu Met Arg Thr Asp Phe Thr 555 560 565 gga act gtg gct ggc tgg ggg tta acc cag aag ggg ctt ctt gct aga 1781 Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr Gln Lys Gly Leu Leu Ala Arg 570 575 580 aac cta atg ttt gtg gac ata cca att gct gac cac caa aaa tgt acc 1829 Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile Ala Asp His Gln Lys Cys Thr 585 590 595 acc gtg tat gaa aag ctc tat cca gga gta aga gta agc gct aac atg 1877 Thr Val Tyr Glu Lys Leu Tyr Pro Gly Val Arg Val Ser Ala Asn Met 600 605 610 615 ctc tgt gct ggc tta gag act ggt ggc aag gac agc tgc aga ggt gac 1925 Leu Cys Ala Gly Leu Glu Thr Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp 620 625 630 agt ggg ggg gca tta gtg ttt cta gat aat gag aca cag cga tgg ttt 1973 Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe 635 640 645 gtg gga gga ata gtt tcc tgg ggt tcc att aat tgt ggg gcg gca ggc 2021 Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Ile Asn Cys Gly Ala Ala Gly 650 655 660 cag tat ggg gtc tac aca aaa gtc atc aac tat att ccc tgg aat gag 2069 Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Asn Glu 665 670 675 aac ata ata agt aat ttc taa 2090 Asn Ile Ile Ser Asn Phe 680 685 <210> 51 <211> 685 <212> PRT <213> Murine <400> 51 Met Arg Leu Leu Ile Phe Leu Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Ala Asp His Gln Asp Arg Ser Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Gln Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro Ser 100 105 110 Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Val 130 135 140 Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu 145 150 155 160 Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Ile Leu His Gln Asn 165 170 175 Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly Arg 180 185 190 Ser Gly Tyr Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys Leu 195 200 205 Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Arg Leu Glu Asp Gly Phe Ser Val Ile 210 215 220 Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Ala Gln 225 230 235 240 Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Gly Glu His Gly 245 250 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Asn Tyr Ile Pro Trp Asn Glu Asn Ile Ile Ser Asn Phe 675 680 685 <210> 52 <211> 670 <212> PRT <213> Murine <400> 52 Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val 1 5 10 15 Ser Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Ala Asp His Gln Asp Arg Ser Trp 20 25 30 Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His 35 40 45 Phe Asp Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Thr Glu Gln Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro 85 90 95 Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe 100 105 110 Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg 115 120 125 Val Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr 130 135 140 Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Ile Leu His Gln 145 150 155 160 Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly 165 170 175 Arg Ser Gly Tyr Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro 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gac ttt gtc aag 243 His Phe Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys 65 70 75 ttg acc tca ggg acc aag gtg cta gcc acg ctg tgt ggg cag gag agt 291 Leu Thr Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser 80 85 90 aca gat act gag cgg gca cct ggc aat gac acc ttc tac tca ctg ggt 339 Thr Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly 95 100 105 110 ccc agc cta aag gtc acc ttc cac tcc gac tac tcc aat gag aag cca 387 Pro Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro 115 120 125 ttc aca gga ttt gag gcc ttc tat gca gcg gag gat gtg gat gaa tgc 435 Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys 130 135 140 aga aca tcc ctg gga gac tca gtc cct tgt gac cat tat tgc cac aac 483 Arg Thr Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn 145 150 155 tac ctg ggc ggc tac tac tgc tcc tgc cga gtg ggc tac att ctg cac 531 Tyr Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly Tyr Ile Leu His 160 165 170 cag aac aag cat acc tgc tca gcc ctt tgt tca ggc cag gtg ttc act 579 Gln Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr 175 180 185 190 ggg agg tct ggc ttt ctc agt agc cct gag tac cca cag cca tac ccc 627 Gly Arg Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro 195 200 205 aaa ctc tcc agc tgc gcc tac aac atc cgc ctg gag gaa ggc ttc agt 675 Lys Leu Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg Leu Glu Glu Gly Phe Ser 210 215 220 atc acc ctg gac ttc gtg gag tcc ttt gat gtg gag atg cac cct gaa 723 Ile Thr Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Met His Pro Glu 225 230 235 gcc cag tgc ccc tac gac tcc ctc aag att caa aca gac aag agg gaa 771 Ala Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Arg Glu 240 245 250 tac ggc ccg ttt tgt ggg aag acg ctg ccc ccc agg att gaa act gac 819 Tyr Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp 255 260 265 270 agc aac aag gtg acc att acc ttt acc acc gac gag tca ggg aac cac 867 Ser Asn Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp Glu Ser Gly Asn His 275 280 285 aca ggc tgg aag ata cac tac aca agc aca gca cag ccc tgc cct gat 915 Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp 290 295 300 cca acg gcg cca cct aat ggt cac att tca cct gtg caa gcc acg tat 963 Pro Thr Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr 305 310 315 gtc ctg aag gac agc ttt tct gtc ttc tgc aag act ggc ttc gag ctt 1011 Val Leu Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu 320 325 330 ctg caa ggt tct gtc ccc ctg aag tca ttc act gct gtc tgt cag aaa 1059 Leu Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys 335 340 345 350 gat gga tct tgg gac cgg ccg ata cca gag tgc agc att att gac tgt 1107 Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys 355 360 365 ggc cct ccc gat gac cta ccc aat ggc cac gtg gac tat atc aca ggc 1155 Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly 370 375 380 cct gaa gtg acc acc tac aaa gct gtg att cag tac agc tgt gaa gag 1203 Pro Glu Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu 385 390 395 act ttc tac aca atg agc agc aat ggt aaa tat gtg tgt gag gct gat 1251 Thr Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp 400 405 410 gga ttc tgg acg agc tcc aaa gga gaa aaa tcc ctc ccg gtt tgc aag 1299 Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys 415 420 425 430 cct gtc tgt gga ctg tcc aca cac act tca gga ggc cgt ata att gga 1347 Pro Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly 435 440 445 gga cag cct gca aag cct ggt gac ttt cct tgg caa gtc ttg tta ctg 1395 Gly Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu 450 455 460 ggt gaa act aca gca gca ggt gct ctt ata cat gac gac tgg gtc cta 1443 Gly Glu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu 465 470 475 aca gcg gct cat gct gta tat ggg aaa aca gag gcg atg tcc tcc ctg 1491 Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu 480 485 490 gac atc cgc atg ggc atc ctc aaa agg ctc tcc ctc att tac act caa 1539 Asp Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln 495 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Ala Gly Leu Asp Arg 610 615 620 ggt ggc aag gac agc tgc aga ggt gac agc gga ggg gca tta gtg ttt 1923 Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe 625 630 635 cta gac aat gaa aca cag aga tgg ttt gtg gga gga ata gtt tcc tgg 1971 Leu Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp 640 645 650 ggt tct att aac tgt ggg ggg tca gaa cag tat ggg gtc tac acg aaa 2019 Gly Ser Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys 655 660 665 670 gtc acg aac tat att ccc tgg att gag aac ata ata aat aat ttc taa 2067 Val Thr Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe 675 680 685 tttgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2091 <210> 54 <211> 685 <212> PRT <213> Rat <400> 54 Met Arg Leu Leu Ile Val Leu Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val Ser 20 25 30 Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly Asn His Gln Asp Arg Ser Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Phe Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asn Leu Glu Leu 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Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Met His Pro Glu Ala 210 215 220 Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Arg Glu Tyr 225 230 235 240 Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser 245 250 255 Asn Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr 260 265 270 Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp Pro 275 280 285 Thr Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val 290 295 300 Leu Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu 305 310 315 320 Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp 325 330 335 Gly Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly 340 345 350 Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro 355 360 365 Glu Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr 370 375 380 Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly 385 390 395 400 Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys Pro 405 410 415 Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly Gly 420 425 430 Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly 435 440 445 Glu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu Thr 450 455 460 Ala Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu Asp 465 470 475 480 Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln Ala 485 490 495 Trp Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly 500 505 510 Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile 515 520 525 Asn Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser 530 535 540 Leu Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr 545 550 555 560 Gln Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile 565 570 575 Val Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr Pro 580 585 590 Gly Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg Gly 595 600 605 Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu 610 615 620 Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly 625 630 635 640 Ser Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val 645 650 655 Thr Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe 660 665 670 <210> 56 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 56 atgaggctgc tgaccctcct gggccttc 28 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 57 gtgcccctcc tgcgtcacct ctg 23 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 58 cagaggtgac gcaggagggg cac 23 <210> 59 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 59 ttaaaatcac taattatgtt ctcgatc 27 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine <400> 60 atgaggctac tcatcttcct gg 22 <210> 61 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine <400> 61 ctgcagaggt gacgcagggg ggg 23 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine <400> 62 ccccccctgc gtcacctctg cag 23 <210> 63 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine <400> 63 ttagaaatta cttattatgt tctcaatcc 29 <210> 64 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat <400> 64 gaggtgacgc aggaggggca ttagtgttt 29 <210> 65 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat <400> 65 ctagaaacac taatgcccct cctgcgtcac ctctgca 37 <210> 66 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 66 caggtcacct tgaaggagtc tggtcctgtg ctggtgaaac ccacagagac cctcacgctg 60 acctgcaccg tctctgggtt ctcactcagc aggggtaaaa tgggtgtgag ctggatccgt 120 cagcccccag ggaaggccct ggagtggctt gcacacattt tttcgagtga cgaaaaatcc 180 tacaggacat cgctgaagag caggctcacc atctccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240 gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca cgtattactg tgcacggata 300 cgacgtggag gaattgacta ctggggccag ggaaccctgg tcactgtctc ctca 354 <210> 67 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 67 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Gly 20 25 30 Lys Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Ser Asp Glu Lys Ser Tyr Arg Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Arg Arg Gly Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 68 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 68 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Phe Gly Val Pro Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 69 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (246)..(246) <223> n is a, c, g, or t <400> 69 cagccagtgc tgactcagcc cccctcactg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60 acctgctctg gagagaaatt gggggataaa tatgcttact ggtatcagca gaagccaggc 120 cagtcccctg tgttggtcat gtatcaagat aaacagcggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240 gatgangctg actattactg tcaggcgtgg gacagcagca ctgcggtatt cggcggaggg 300 accaagctga ccgtccta 318 <210> 70 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 70 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Glu Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Met Tyr 35 40 45 Gln Asp Lys Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 71 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 71 Ser Tyr Glu Leu Ile Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ala Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Arg Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Arg Gly Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ile Ala Thr Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly 100 105 110 Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 115 120

Claims

혈전성 미세혈관병증 (TMA)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상에서 MASP-2-의존성 보체 활성화의 억제 방법으로서, 이때 TMA는 (i) 암에 이차적인 TMA; (ii) 화학요법에 이차적인 TMA 또는 (iii) 이식에 이차적인 TMA 중 적어도 하나이고, 상기 방법은 MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 대상은 암에 이차적인 TMA에 걸렸거나 걸릴 위험이 있고, MASP-2 억제제는 TMA에 걸릴 위험을 감소시키거나, 또는 TMA의 심각성을 감소시키기에 효과적인 양으로 대상에게 전신적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 대상은 화학요법에 이차적인 TMA에 걸렸거나 걸릴 위험이 있고, MASP-2 억제제는 TMA에 걸릴 위험을 감소시키거나, 또는 TMA의 심각성을 감소시키기에 효과적인 양으로, 화학요법 전에, 도중에 또는 후에 대상에게 전신적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 대상은 이식에 이차적인 TMA에 걸렸거나 걸릴 위험이 있고, MASP-2 억제제는 TMA에 걸릴 위험을 감소시키거나, 또는 TMA의 심각성을 감소시키기에 효과적인 양으로, 이식 전에, 중에 또는 후에 대상에게 전신적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, MASP-2 억제제는 SEQ ID NO:6의 일부에 특이적으로 결합하는 항-MASP-2 단클론성 항체 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 대상은 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제를 사용한 치료가 이전에 진행되었거나, 현재 진행중인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 방법은 추가로 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제를 대상에게 투여하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 말단 보체 억제제는 인간화된 항-C5 항체 또는 그것의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 말단 보체 억제제는 유클리주맙인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 감소된 이펙터 기능을 가지는 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 조성물은 피하로, 근육 내로, 동맥 내로, 정맥 내로 또는 흡입제로서 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 이식은 동종이계 조혈 줄기세포 이식인 것을 특징으로 하는 방법.
업쇼-슐만 증후군 (USS)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상에서 MASP-2-의존성 보체 활성화의 억제 방법으로서, MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
제 14항에 있어서, 방법은 USS에 걸릴 위험이 있는 대상을 치료하는 것을 포함하고, 그 방법은 TTP와 관련된 하나 또는 그 이상의 임상적 증상을 개선시키거나 예방하기에 효과적인 기간 동안 유효량의 MASP-2를 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항 또는 제 15항에 있어서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, MASP-2 억제제는 SEQ ID NO:6의 일부에 특이적으로 결합하는 항-MASP-2 단클론성 항체 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 대상은 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제를 사용한 치료가 이전에 진행되었거나, 현재 진행중인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 방법은 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제를 대상에게 투여하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 말단 보체 억제제는 인간화된 항-C5 항체 또는 그것의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 말단 보체 억제제는 유클리주맙인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항에 있어서, 방법은 대상을 주기적으로 모니터링하고 빈혈, 혈소판 감소증 또는 상승하는 크레아티닌의 존재가 측정될 때 MASP-2 억제제를 투여하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항에 있어서, 방법은 대상을 주기적으로 모니터링하고 TTP 임상적 증상들을 야기하는 것과 관련된 것으로 알려져 있는 사건이 존재할 때 MASP-2 억제제를 투여하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
데고스병에 걸린 대상에서 MASP-2-의존성 보체 활성화의 억제 방법으로서, MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
제 24항에 있어서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, MASP-2 억제제는 SEQ ID NO:6의 일부에 특이적으로 결합하는 항-MASP-2 단클론성 항체 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 24항에 있어서, 대상은 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제를 사용한 치료가 이전에 진행되었거나 현재 진행중인 것을 특징으로 하는 방법.
제 24항에 있어서, 방법은 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제를 대상에게 투여하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 28항에 있어서, 말단 보체 억제제는 인간화된 항-C5 항체 또는 그것의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 28항에 있어서, 말단 보체 억제제는 유클리주맙인 것을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 감소된 이펙터 기능을 가지는 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 24항에 있어서, 조성물은 피하로, 근육 내로, 동맥 내로, 정맥 내로 또는 흡입제로서 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
파국성 항인지질 증후군 (CAPS)에 걸린 대상에서 MASP-2-의존성 보체 활성화의 억제 방법으로서, MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
제 33항에 있어서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 34항에 있어서, MASP-2 억제제는 SEQ ID NO:6의 일부에 특이적으로 결합하는 항-MASP-2 단클론성 항체 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 34항에 있어서, 대상은 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제를 사용한 치료가 이전에 진행되었거나 현재 진행중인 것을 특징으로 하는 방법.
제 34항에 있어서, 방법은 보체 단백질 C5의 절단을 억제하는 말단 보체 억제제를 대상에게 투여하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 37항에 있어서, 말단 보체 억제제는 인간화된 항-C5 항체 또는 그것의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 37항에 있어서, 말단 보체 억제제는 유클리주맙인 것을 특징으로 하는 방법.
제 34항에 있어서, 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 감소된 이펙터 기능을 가지는 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 33항에 있어서, 조성물은 피하로, 근육 내로, 동맥 내로, 정맥 내로 또는 흡입제로서 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
비전형적인 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)에 걸린 대상에서 혈전 형성을 억제하는 방법으로서, MASP-2-의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
제 42항에 있어서, 상기 MASP-2 억제 항체는 SEQ ID NO:6의 일부에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, 상기 MASP-2 억제 항체는 10 nM 이하의 K_D로 인간 MASP-2에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, 상기 MASP-2 억제 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인의 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, 상기 MASP-2 억제 항체는 시험관 내 분석에서 1% 인간 혈청에서 10 nM 이하의 IC₅₀에서 C3b 침착을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, 상기 MASP-2 억제 항체는 30 nM 이하의 IC₅₀으로 90% 인간 혈청에서 C3b 침착을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, 상기 MASP-2 억제 항체는 Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ 및 F(ab')₂로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, 상기 MASP-2 억제 항체는 단일-사슬 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, 상기 MASP-2 억제 항체는 IgG1 분자, IgG2 분자 및 IgG4 분자로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 50항에 있어서, IgG4 분자는 S228P 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, 상기 MASP-2 억제 항체는 고전적 경로를 실질적으로 억제하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, MASP-2 억제 항체는 aHUS에 걸린 대상으로부터의 혈청에서 혈전 형성을 미처리 샘플에 비교하여 적어도 40% 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, MASP-2 억제 항체는 aHUS에 걸린 대상으로부터의 혈청에서 혈전 형성을 동일한 대상으로부터의 혈청에서 C5b-9 침착에 대한 억제 효과보다 적어도 20% 더 큰 수준으로 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, 대상은 aHUS의 급성기에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, 대상은 aHUS의 관해기에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 43항에 있어서, MASP-2 억제 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) i) SEQ ID NO:67의 31 내지 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) SEQ ID NO:67의 50 내지 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) SEQ ID NO:67의 95 내지 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및
(b) i) SEQ ID NO:70의 24 내지 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) SEQ ID NO:70의 50 내지 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) SEQ ID NO:70의 89 내지 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
제 43항에 있어서, MASP-2 억제 단클론성 항체는 SEQ ID NO:67에 제시된 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 43항에 있어서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:67에 제시된 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:70에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체에 의해 인식된 에피토프의 적어도 일부를 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.