BR112013028429B1

BR112013028429B1 - Anticorpo monoclonal humano, molécula de ácido nucleico, cassete de expressão, célula de um microrganismo transgênico, método para gerar um anticorpo isolado, composição, uso de um anticorpo, e, artigo de fabricação

Info

Publication number: BR112013028429B1
Application number: BR112013028429-3A
Authority: BR
Inventors: Thomas Dudler; Wayne R. Gombotz; James Brian Parent; Clark E. Tedford; Anita Kavlie; Urs Beat Hagemann; Herald Reiersen; Sergej Kiprijanov
Original assignee: Omeros Corporation
Priority date: 2011-05-04
Filing date: 2012-05-04
Publication date: 2022-11-08
Also published as: KR101641057B1; CA3025762C; JP2018123148A; EP3725811A3; US9475885B2; US20170088632A1; KR101882830B1; SI2704743T1; US10683367B2; CA3131223C; US10047165B2; KR20140006096A; PL2704743T3; JP2015227380A; RU2725958C2; LT2704743T; KR20160087917A; BR112013028429A2; NZ617487A; RU2020120539A

Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, CASSETE DE EXPRESSÃO, CÉLULA, MÉTODO PARA GERAR UM ANTICORPO ISOLADO, COMPOSIÇÃO, USO DE UM ANTICORPO, E, ARTIGO DE FABRICAÇÃO A presente invenção refere-se a anticorpos inibidores anti-MASP-2 e composições que compreendem tais anticorpos para o uso na inibição dos efeitos adversos da ativação de complemento dependente de MASP-2. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonal humano isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que se liga à MASP- 2, que compreende: (i) uma região variável da cadeia pesada que compreende as sequências de CDR-HI, CDR -H2 e CDR -H3; e (ii) uma região variável da cadeia leve que compreende CDR -LI, CDR -L2 e CDR -L3, em que a sequência de CDR -H3 da região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido ajustado com fator B na formação da C3 convertase da via alternativa adicional (C3bBb). A C3 convertase da via alternativa é estabilizada pela ligação de properdina. A properdina prolonga a meia-vida da C3 convertase da via alternativa em seis a dez vezes. A adição de C3b à C3 convertase da via alternativa leva à formação da C5 convertase da via (...).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos inibidores anti- MASP-2 e composições que compreendem tais anticorpos para o uso na inibição dos efeitos adversos da ativação de complemento dependente de MASP-2.

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO

[0002] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No. 61/482.567 depositado em 4 de maio de 2011, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

DECALARAÇÃO COM RELAÇÃO À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0003] A listagem de sequência associada com este pedido é fornecida no formato de texto em vez de uma cópia em papel e é por meio deste incorporada por referência no relatório descritivo. O nome do arquivo texto contendo a listagem de sequência é MP_1_0115_PCT_SequenceListingasFiled_20120504_ST25. O arquivo texto tem 158 KB; foi criado em 4 de maio de 2012; e está sendo submetido por intermédio da EFS-Web com o depósito do relatório descritivo.

FUNDAMENTOS

[0004] O sistema de complemento fornece um mecanismo de ação precoce para iniciar, amplificar e coordenar a resposta imune à infecção microbiana e outros insultos agudos (M. K. Liszewski e J. P. Atkinson, 1993, em Fundamental Immunology, Terceira Edição, editado por W. E. Paul, Raven Press, Ltd., Nova Iorque) em seres humanos e outros vertebrados. Embora a ativação de complemento forneça uma defesa de primeira linha valiosa contra patógenos potenciais, as atividades de complemento que promovem uma resposta imune protetora também podem representar uma ameaça para o hospedeiro (K. R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15: 417-431, 1994; B. P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24: 219-228, 1994). Por exemplo, os produtos proteolíticos C3 e C5 recrutam e ativam neutrófilos. Embora indispensáveis para a defesa do hospedeiro, os neutrófilos ativados são indiscriminados na sua liberação de enzimas destrutivas e podem causar dano a órgão. Além disso, a ativação de complemento pode causar a deposição de componentes de complemento lítico nas células hospedeiras vizinhas assim como nos alvos microbianos, que resultam na lise da célula hospedeira.

[0005] O sistema de complemento também foi implicado na patogênese de numerosos estados de doença agudos e crônicos, incluindo: infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, síndrome da angústia respiratória aguda (ARDS), lesão de reperfusão, choque séptico, vazamento capilar que segue queimaduras térmicas, inflamação após o desvio cardiopulmonar, rejeição a transplante, artrite reumatóide, esclerose múltipla, miastenia grave, e doença de Alzheimer. Em quase todas estas condições, o complemento não é a causa mas é um de vários fatores envolvidos na patogênese. Não obstante, a ativação de complemento pode ser um mecanismo patológico principal e representa um ponto eficaz para o controle clínico em muitos destes estados de doença. O reconhecimento crescente da importância da lesão de tecido mediada por complemento em uma variedade de estados de doença enfatiza a necessidade quanto aos medicamentos inibidores de complemento eficazes. Até agora, Eculizumab (Soliris®), um anticorpo contra C5, é o único medicamento que alveja complemento que foi aprovado para o uso humano. Até o momento, C5 é uma de várias moléculas efetoras localizadas “a jusante” no sistema de complemento, e o bloqueio de C5 não inibe a ativação do sistema de complemento. Portanto, um inibidor das etapas de iniciação da ativação de complemento teriam vantagens significantes em relação a um inibidor de complemento “a jusante”.

[0006] Correntemente, é amplamente aceito que o sistema de complemento pode ser ativado através de três vias distintas: a via clássica, a via da lectina, e a via alternativa. A via clássica é usualmente ativada por um complexo composto de anticorpos hospedeiros ligados a uma partícula estranha (isto é, um antígeno) e assim requer exposição anterior a um antígeno para a geração de uma resposta de anticorpo específica. Visto que a ativação da via clássica depende de uma resposta imune adaptativa anterior pelo hospedeiro, a via clássica é parte do sistema imune adquirido. Ao contrário, tanto a lectina quanto as vias alternativas são independentes da imunidade adaptativa e são parte do sistema imune inato.

[0007] A ativação do sistema de complemento resulta na ativação sequencial de zimogênios da serina protease. A primeira etapa na ativação da via clássica é a ligação de uma molécula de reconhecimento específica, C1q, aos complexos IgG e IgM ligados a antígeno. A C1q está associada com as pró-enzimas de serina protease Clr e Cls como um complexo chamado de Cl. Na ligação de C1q a um complexo imune, a clivagem autoproteolítica do sítio Arg-Ile de Clr é seguida pela clivagem mediada por Clr e ativação de Cls, que por meio disso adquire a capacidade para clivar C4 e C2. C4 é clivado em dois fragmentos, designados C4a e C4b, e, de modo similar, C2 é clivado em C2a e C2b. Os fragmentos C4b são capazes de formar ligações covalentes com grupos hidroxila ou amino adjacentes e geram a C3 convertase (C4b2a) através de interação não covalente com o fragmento C2a de C2 ativado. A C3 convertase (C4b2a) ativa C3 pela clivagem proteolítica em subcomponentes C3a e C3b que levam à geração da C5 convertase (C4b2a3b), que, pela clivagem de C5 leva à formação do complexo de ataque à membrana (C5b combinado com C6, C7, C8 e C9, também aludido como “MAC”) que pode romper membranas celulares levando à lise de célula. As formas ativadas de C3 e C4 (C3b e C4b) são covalentemente depositadas nas superfícies alvo estranhas, que são reconhecidas pelos receptores de complemento nos fagócitos múltiplos.

[0008] Independentemente, a primeira etapa na ativação do sistema de complemento através da via da lectina também é a ligação de moléculas de reconhecimento específicas, que é seguida pela ativação de pró-enzimas da serina protease associadas. Entretanto, ao invés da ligação de complexos imunes pela C1q, as moléculas de reconhecimento na via da lectina compreendem um grupo de proteínas de ligação de carboidrato (lectina de ligação de manana (MBL), H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina e lectina tipo C CL-11), coletivamente aludidas como lectinas. Ver J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572: 387-400, 2002; Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. 21: 547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101: 225-232 (2000)). Ver também J. Luet et al., Biochim Biophys Acta 1572: 387-400 (2002); Holmskov et al, Annu Rev Immunol 21: 547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101: 225-232 (2000); Hansen S. et al, J. Immunol 185(10): 60966104 (2010).

[0009] Ikeda et al. primeiro demonstraram que, como C1q, MBL pode ativar o sistema de complemento na ligação aos eritrócitos revestidos da levedura manana em uma Maneira dependente de C4 (Ikeda et al., J. Biol. Chem. 262: 7451-7454, 1987). MBL, um membro da família da proteína colectina, é uma lectina dependente de cálcio que liga carboidratos com grupos 3- e 4-hidróxi orientados no plano equatorial do anel de piranose. Os ligandos prominentes para MBL são assim D-manose e N-acetil-D- glicosamina, enquanto que os carboidratos que não se ajustam nesta exigência estérica têm afinidade indetectável para MBL (Weis, W. I., et al., Nature 360: 127-134, 1992). A interação entre MBL e açúcares monovalentes é extremamente fraca, com constantes de dissociação tipicamente na faixa milimolar de dígito único. MBL alcança ligação firme, específica aos ligandos de glicano pela avidez, isto é, pela interação simultânea com resíduos de monossacarídeo múltiplos localizados em proximidade imediata entre si (Lee, R. T., et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299: 129-136, 1992). MBL reconhece os padrões de carboidrato que habitualmente decoram os microorganismos tais como bactérias, leveduras, parasitas e certos vírus. Ao contrário, MBL não reconhece D-galactose e ácido siálico, o penúltimo e último açúcares que usualmente decoram glicoconjugados complexos “maduros” presentes no plasma de mamífero e glicoproteínas de superfície celular. Esta especificidade de ligação é considerada promover o reconhecimento de superfícies “estranhas e ajudam a proteger da “auto-ativação.” Entretanto, MBL não liga com alta afinidade aos grupos de glicanos “precursores” de manose alta nas glicoproteínas ligadas em N e glicolipídeos sequestrados no retículo endoplasmático e complexo de Golgi de células de mamífero (Maynard, Y., et al., J. Biol. Chem. 257: 3788-3794, 1982). Portanto, as células danificadas são alvos potenciais para a ativação da via de lectina por intermédio da ligação de MBL.

[00010] As ficolinas possuem um tipo diferente de domínio de lectina do que MBL, chamado de domínio igual ao do fibrinogênio. As ficolinas ligam resíduos de açúcar em uma maneira independente do Ca++. Nos seres humanos, três tipos de ficolinas (L-ficolina, M-ficolina e H-ficolina) foram identificados. As duas ficolinas séricas, L-ficolina e H-ficolina, têm em comum uma especificidade para a N-acetil-D-glicosamina; entretanto, a H- ficolina também liga N-acetil-D-galactosamina. A diferença na especificidade do açúcar de L-ficolina, H-ficolina, CL-11, e MBL significa que as lectinas diferentes podem ser complementares e alvejam glicoconjugados diferentes, se bem que sobrepostos. Este conceito é sustentado pelo relato recente de que, das lectinas conhecidas na via da lectina, a L-ficolina única liga-se especificamente ao ácido lipoteicóico, um glicoconjugado da parede celular encontrado em todas as bactérias Gram-positivas (Lynch, N. J., et al., J. Immunol. 172: 1198-1202, (2004)). As colectinas (isto é, MBL) e as ficolinas não carregam nenhuma similaridade significante na sequência de aminoácido. Entretanto, os dois grupos de proteínas têm organizações de domínio similares e, como C1q, se juntam em estruturas oligoméricas, que maximizam a possibilidade de ligação multi-sítio.

[00011] As concentrações séricas de MBL são altamente variáveis nas populações saudáveis e isto é geneticamente controlado pelos polimorfismos/ mutações tanto no promotor quanto nas regiões codificadoras do gene MBL. Como uma proteína de fase aguda, a expressão de MBL é suprarregulada ainda durante a inflamação. A L-ficolina está presente no soro em concentrações similares a aquelas de MBL. Portanto, a ramificação da L- ficolina da via da lectina é potencialmente comparável com o ramo de MBL em força. MBL e ficolinas também podem funcionar como opsoninas, que permitem que os fagócitos alvejem superfícies decoradas com MBL e ficolina (ver Jack et al., J Leukoc Biol., 77(3): 328-36 (2004), Matsushita e Fujita, Immunobiology, 205(4-5): 490-7 (2002), Aoyagi et al., J Immunol, 174(1): 418-25(2005). Esta opsonização requer a interação destas proteínas com receptores fagocíticos (Kuhlman, M., et al., J. Exp. Med. 169: 1733, 1989; Matsushita, M., et al., J. Biol. Chem. 271: 2448-54, 1996), a identidade dos quais não foi estabelecida.

[00012] As formas de MBL humana uma interação específica e de alta afinidade através do seu domínio igual o de colágeno com serina proteases iguais a C1r/Cls únicas, denominadas serina proteases associadas com MBL (MASPs). Até agora, três MASPs foram descritas. Primeiro, uma única enzima “MASP” foi identificada e como a enzima responsável pelo início da cascata de complemento (isto é, clivagem de C2 e C4) (Matsushita M, e Fujita T., J Exp Med 176(6): 1497-1502 (1992); Ji, Y. H., et al., J. Immunol. 150: 571-578, 1993). Foi subsequentemente determinado que a atividade de MASP foi, de fato, uma mistura de duas proteases: MASP-1 e MASP-2 (Thiel, S., et al., Nature 386: 506-510, 1997). Entretanto, foi demonstrado que o complexo de MBL-MASP-2 sozinho é suficiente para a ativação de complemento (Vorup-Jensen, T., et al., J. Immunol. 165: 2093-2100, 2000). Além disso, a MASP-2 única clivou C2 e C4 em altas taxas (Ambrus, G., et al., J. Immunol. 170: 1374-1382, 2003). Portanto, MASP-2 é a protease responsável pela ativação de C4 e C2 para gerar a C3 convertase, C4b2a. Isto é uma diferença significante do complexo C1 da via clássica, onde a ação coordenada de duas serina proteases específicas (C1r e C1s) leva à ativação do sistema de complemento. Além disso, uma terceira nova protease, MASP-3, foi isolada (Dahl, M. R., et al., Immunity 15: 127-35, 2001). MASP-1 e MASP-3 são alternativamente produtos de junção do mesmo gene.

[00013] MASPs compartilham organizações de domínio idênticas com aquelas de Clr e Cls, os componentes enzimáticos do complexo Cl (Sim, R.B., et al., Biochem. Soc. Trans. 28: 545, 2000). Estes domínios incluem um domínio de terminal N de Clr/Cls/VEGF de ouriço do mar/proteína morfogênica óssea (CUB), um domínio igual ao do fator de crescimento epidérmico, um segundo domínio CUB, um tandem de domínios de proteína de controle de complemento, e um domínio de serina protease. Como nas C1 proteases, a ativação de MASP-2 ocorre através da clivagem de uma ligação Arg-Ile adjacente ao domínio da serina protease, que divide a enzima em cadeias A e B ligadas a dissulfeto, a última consistindo do domínio da serina protease. Recentemente, uma deficiência geneticamente determinada de MASP-2 foi descrita (Stengaard-Pedersen, K., et al., New Eng. J. Med. 349: 554-560, 2003). A mutação de um único nucleotídeo leva a uma troca de Asp- Gly no domínio CUB 1 e torna MASP-2 incapaz de ligação a MBL.

[00014] MBL também pode associado com uma forma alternativamente dividida de MASP-2, conhecida como proteína associada a MBL de 19 kDa (MAp19) (Stover, C. M., J. Immunol. 162: 3481-90, 1999) ou proteína associada a MBL pequena (sMAP) Takahashi, M., et al., Int. Immunol. 11: 859-863, 1999) que carece da atividade catalítica de MASP2. MAp19 compreende os primeiros dois domínios de MASP-2, seguido por uma sequência extra de quatro aminoácidos únicos. Os genes MASP-1 e MASP-2 estão localizados nos cromossomas humanos 3 e 1, respectivamente (Schwaeble, W., et al., Immunobiology 205: 455-466, (2002)).

[00015] Várias linhas de evidência sugerem que existem complexos de MBL-MASP diferentes e uma fração grande das MASPs no soro não é complexada com MBL (Thiel, S., et al., J. Immunol. 165: 878-887, 2000). A ficolina tanto H quanto L se ligam a todas as MASPs e ativam a via de complemento da lectina, como a MBL (Dahl, M. R., et al., Immunity 15: 12735, 2001; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168: 3502-3506, 2002). Tanto a via da lectina quanto o clássico formam uma C3 convertase comum (C4b2a) e as duas vias convergem nesta etapa.

[00016] A via da lectina é amplamente considerada ter um papel principal na defesa do hospedeiro contra a infecção no hospedeiro ingênuo. Evidência forte para o envolvimento de MBL na defesa do hospedeiro resulta da análise de pacientes com níveis séricos diminuídos de MBL funcional (Kilpatrick, D. C., Biochim. Biophys. Acta 1572: 401-413, 2002). Tais pacientes demonstram susceptibilidade às infecções bacterianas e fúngicas recorrentes. Estes sintomas são usualmente evidentes na juventude, durante uma janela evidente de vulnerabilidade conforme os títulos de anticorpo maternalmente derivados diminuem, mas antes um repertório completo de respostas de anticorpo se desenvolve. Esta síndrome frequentemente resulta de mutações em vários sítios na porção de colágeno de MBL, que interfere com a formação apropriada de oligômeros de MBL. Entretanto, visto que MBL pode funcionar como uma opsonina independente de complemento, não se sabe em qual grau a susceptibilidade aumentada à infecção é devida à ativação de complemento prejudicada.

[00017] Ao contrário das vias clássico e de lectina, nenhum iniciador da via alternativa foi encontrado para preencher as funções de reconhecimento que C1q e lectinas realizam nas outras duas vias. Correntemente é amplamente aceito que a via alternativa espontaneamente passe por um nível baixo de ativação de metabolização, que pode ser facilmente amplificado nas superfícies estranhas ou outras anormais (bactérias, levedura, células viralmente infectadas, ou tecido danificado) que carece dos elementos moleculares apropriados que mantêm a ativação de complemento espontânea na checagem. Existem quatro proteínas plasmáticas diretamente envolvidas na ativação da via alternativa: C3, fatores B e D, e properdina.

[00018] Embora haja evidência extensiva implicando as vias de complemento tanto clássico quanto alternativo na patogênese de doenças humanas não infecciosas, o papel da via da lectina está apenas começando ser avaliado. Estudos recentes fornecem evidência de que a ativação da via da lectina pode ser responsável pela ativação de complemento e inflamação relacionada na isquemia/lesão de reperfusão. Collard et al. (2000) relataram que as células endoteliais cultivadas submetidas ao estresse oxidativo ligam MBL e mostram a deposição de C3 na exposição ao soro humano (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 156: 1549-1556, 2000). Além disso, o tratamento de soros humanos com anticorpos monoclonais anti-MBL bloqueadores inibiram a ligação de MBL e a ativação de complemento. Estas descobertas foram estendidas a um modelo de rato de isquemia-reperfusão miocárdicas em que os ratos tratados com um anticorpo bloqueador direcionado contra a MBL de rato mostrou significantemente menos dano miocárdico na oclusão de uma artéria coronária do que ratos tratados com um anticorpo de controle (Jordan, J. E., et al., Circulation 104: 1413-1418, 2001). O mecanismo molecular de ligação de MBL ao endotélio vascular depois do estresse oxidativo é incerto; um estudo recente sugere que a ativação da via da lectina depois do estresse oxidativo pode ser mediada pela ligação de MBL às citoqueratinas endoteliais vasculares, e não aos glicoconjugados (Collard, C. D., et al., Am. J. Pathol. 159: 1045-1054, 2001). Outros estudos têm implicado as vias clássica e alternativa na patogênese de isquemia/lesão de reperfusão e o papel da via da lectina nesta doença permanece controverso (Riedermann, N. C., et al., Am. J. Pathol. 162: 363-367, 2003).

[00019] Um estudo recente tem mostrado que MASP-1 (e possivelmente também MASP-3) é requerido para converter o Fator D da enzima de ativação da via alternativa a partir da sua forma de zimogênio na sua forma enzimaticamente ativa (Ver Takahashi M. et al., J Exp Med 207(1): 29-37 (2010)). A importância fisiológica deste processo é enfatizada pela ausência de atividade funcional da via alternativa no plasma de camundongos deficientes em MASP-1/3. A geração proteolítica de C3b da C3 nativa é requerida para a via alternativa funcionar. Visto que a C3 convertase (C3bBb) da via alternativa contém C3b como uma subunidade essencial, a questão que refere-se à origem do primeiro C3b por intermédio da via alternativa tem apresentado um problema intrincado e tem estimulado pesquisa considerável.

[00020] A C3 pertence a uma família de proteínas (junto com C4 e α-2 macroglobulina) contendo uma modificação pós-traducional rara conhecida como uma ligação de tioéster. O grupo de tioéster é composto de uma glutamina cujo grupo carbonila terminal forma uma ligação de tioéster covalente com o grupo sulfidrila de uma cisteína três aminoácidos adiante. Esta ligação é instável e a glutamil-tioéster eletrofílica pode reagir com porções nucleofílicas tais como grupos hidroxila ou amino e assim forma uma ligação covalente com outras moléculas. A ligação de tioéster é razoavelmente estável quando sequestrado dentro de uma bolsa hidrofóbica de C3 intacta. Entretanto, a clivagem proteolítica de C3 para C3a e C3b resulta na exposição da ligação de tioéster altamente reativa em C3b e, a seguir do ataque nucleofílico pelas porções adjacentes que compreendem grupos hidroxila ou amino, C3b torna-se covalentemente ligado a um alvo. Além do seu papel bem documentado na ligação covalente de C3b aos alvos de complemento, o tioéster de C3 também é considerado ter um papel central na ativação da via alternativa. De acordo com a “teoria tick-over” amplamente aceita, a via alternativa é iniciada pela geração de uma convertase de fase fluida, iC3Bb, que é formada de C3 com tioéster hidrolisado (iC3; C3(H2O)) e fator B (Lachmann, P. J., et al., Springer Semin. ImmunoPathol. 7: 143-162, 1984). A C3(H2O) como C3b é gerada a partir da C3 nativa por uma hidrólise espontânea lenta do tioéster interno na proteína (Pangburn, M. K., et al., J. Exp. Med. 154: 856-867, 1981). Através da atividade da C3(H2O)Bb convertase, as moléculas de C3b são depositadas na superfície alvo iniciando por meio disso a via alternativa.

[00021] Muito pouco é conhecido acerca dos iniciadores de ativação da via alternativa. Os ativadores são considerados incluir paredes de célula de levedura (zimosan), muitos polissacarídeos puros, eritrócitos de coelho, certas imunoglobulinas, vírus, fungos, bactérias, células de tumor de animal, parasitas, e as células danificadas. O único traço comum para estes ativadores é a presença de carboidrato, mas a complexidade e variedade de estruturas de carboidrato tem tornado difícil estabelecer os determinantes moleculares compartilhados que são reconhecidos. É amplamente aceito que a ativação de via alternativa é controlada através do equilíbrio fino entre componentes reguladores de inibidor desta via, tal como Fator H, Fator I, DAF, CR1 e properdina, que é o único regulador positivo da via alternativa (Ver Schwaeble W. J. e Reid K. B., Immunol Today 20(1): 17-21 (1999)).

[00022] Além do mecanismo de ativação aparente desregulado descrito acima, a via alternativa também pode fornecer um laço de amplificação poderosa para a C3 convertase (C4b2a) da via da lectina/clássico visto que qualquer C3b gerado pode participar com o fator B na formação da C3 convertase (C3bBb) da via alternativa adicional. A C3 convertase da via alternativa é estabilizada pela ligação de properdina. A properdina prolonga a meia-vida da C3 convertase da via alternativa de seis a dez vezes. A adição de C3b para a C3 convertase da via alternativa leva à formação da C5 convertase da via alternativa.

[00023] Todos as três vias (isto é, o clássico, da lectina e alternativo) foram considerados convergir para C5, que é clivada para formar produtos com efeitos pró-inflamatórios múltiplos. A via convergida foi aludida como a via de complemento terminal. C5a é a anafilatoxina mais potente, induzindo alterações no músculo liso e tônus vascular, assim como permeabilidade vascular. A mesma também é uma quimiotaxina poderosa e ativadora tanto de neutrófilos quanto de monócitos. A ativação celular mediada por C5a pode significantemente amplificar respostas inflamatórias pela indução da liberação de mediadores inflamatórios adicionais múltiplos, incluindo citocinas, enzimas hidrolíticas, metabólitos do ácido araquidônico, e espécies de oxigênio reativas. A clivagem de C5 leva à formação de C5b-9, também conhecido como o complexo de ataque à membrana (MAC). Existe agora evidência forte de que a deposição de MAC sublítica pode desempenhar um papel importante na inflamação além do seu papel como um complexo lítico que forma poro.

[00024] Além do seu papel essencial na defesa imune, o sistema de complemento contribui para o dano ao tecido em muitas condições clínicas. Assim, existe uma necessidade urgente para desenvolver inibidores de complemento terapeuticamente eficazes para prevenir estes efeitos adversos.

SUMÁRIO

[00025] Este resumo é fornecido para introduzir uma seleção de conceitos em uma forma simplificada que são descritos ainda abaixo na Descrição Detalhada. Este resumo não é intencionado a identificar características chave da matéria objeto reivindicada, nem é intencionado a ser usado como um auxílio na determinação do escopo da matéria objeto reivindicada.

[00026] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonal humano isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que se liga à MASP-2 humana, que compreende: (i) uma região variável da cadeia pesada que compreende as sequências de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3; e (ii) uma região variável da cadeia leve que compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que a sequência da região variável da cadeia pesada de CDR-H3 compreende uma sequência de aminoácido apresentada como SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 90, e modificações de sequência conservativas das mesmas, em que a sequência da região variável da cadeia leve de CDR-L3 compreende uma sequência de aminoácido apresentada como SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 94, e modificações de sequência conservativas das mesmas, e em que o anticorpo isolado inibe a ativação de complemento dependente de MASP-2.

[00027] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humano que se liga à MASP-2 humana, em que o anticorpo compreende: I) a) uma região variável da cadeia pesada que compreende: i) uma cadeia pesada CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácido de 31 a 35 da SEQ ID NO: 21; e ii) uma cadeia pesada CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácido de 50 a 65 da SEQ ID NO: 21; e iii) uma cadeia pesada CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácido de 95 a 102 da SEQ ID NO: 21; e b) uma região variável da cadeia leve que compreende: i) uma cadeia leve CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácido de 24 a 34 da SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27; e ii) uma cadeia leve CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácido de 50 a 56 da SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27; e iii) uma cadeia leve CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácido de 89 a 97 da SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27; ou II) uma variante da mesma que é de outro modo idêntica aos ditos domínios variáveis, exceto até um total combinado de 10 substituições de aminoácido dentro das ditas regiões de CDR da dita região variável da cadeia pesada e até um total combinado de 10 substituições de aminoácido dentro das ditas regiões de CDR da dita região variável da cadeia leve, em que o anticorpo ou variante do mesmo inibem a ativação de complemento dependente de MASP-2.

[00028] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal humano isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga MASP-2 humana, em que o anticorpo compreende: I) a) uma região variável da cadeia pesada que compreende: i) uma cadeia pesada CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácido de 31 a 35 da SEQ ID NO: 20; e ii) uma cadeia pesada CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácido de 50 a 65 da SEQ ID NO: 20; e iii) uma cadeia pesada CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácido de 95 a 102 da SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 20; e b) uma região variável da cadeia leve que compreende: i) uma cadeia leve CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácido de 24 a 34 da SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 24; e ii) uma cadeia leve CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácido de 50 a 56 da SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 24; e iii) uma cadeia leve CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácido de 89 a 97 da SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 24; ou II) uma variante da mesma, que é de outro modo idêntica aos ditos domínios variáveis, exceto até um total combinado de 10 substituições de aminoácido dentro das ditas regiões de CDR da dita cadeia pesada e até um total combinado de 10 substituições de aminoácido dentro das ditas regiões de CDR da dita região variável da cadeia leve, em que o anticorpo ou variante do mesmo inibem a ativação de complemento dependente de MASP-2.

[00029] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que se liga à MASP-2 humana, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende qualquer uma das sequências de aminoácido apresentadas na SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 21.

[00030] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que se liga à MASP-2 humana, que compreende uma região variável da cadeia leve que compreende uma das sequências de aminoácido apresentadas na SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27.

[00031] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico que codificam as sequências de aminoácido dos anticorpos anti-MASP-2, ou fragmentos dos mesmos, da presente invenção, tais como aqueles apresentados na TABELA 2.

[00032] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula que compreende pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico que codificam as sequências de aminoácido dos anticorpos anti-MASP-2, ou fragmentos dos mesmos, da presente invenção, tais como aqueles apresentados na TABELA 2.

[00033] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para gerar um anticorpo de MASP-2 isolado que compreende cultivar células que compreendam pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico que codificam as sequências de aminoácido dos anticorpos anti-MASP-2 da presente invenção sob condições que permitam a expressão das moléculas de ácido nucleico que codificam o anticorpo anti-MASP-2 e isolar o dito anticorpo anti-MASP-2.

[00034] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonal humano totalmente isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se dissocia da MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos como determinado pela ressonância de plasmon de superfície e inibe a ativação de C4 em um substrato revestido com manana com uma IC50 de 10 nM ou menos em 1 % de soro. Em algumas formas de realização, o dito anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo especificamente reconhece pelo menos parte de um epítopo reconhecido por um anticorpo de referência, em que o dito anticorpo de referência compreende uma região variável da cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 20 e uma região variável da cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 24.

[00035] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece composições que compreendem os anticorpos anti-MASP-2 monoclonais totalmente humanos da invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00036] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em um indivíduo humano que compreende administrar um anticorpo monoclonal humano da invenção em uma quantidade suficiente para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 no dito indivíduo humano.

[00037] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um artigo de fabricação que compreende uma dose unitária de anticorpo de MASP-2 monoclonal humano da invenção adequada para a administração terapêutica a um indivíduo humano, em que a dose unitária está na faixa de 1 mg a 1000 mg.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00038] Os aspectos precedentes e muitas das vantagens anexas desta invenção tornar-se-ão mais facilmente avaliadas conforme a mesma se torna melhor entendida por referência à descrição detalhada que segue, quando considerada em conjunção com os desenhos anexos, em que:

[00039] A FIGURA lA é um diagrama que ilustra a estrutura genômica da MASP-2 humana; a FIGURA 1B é um diagrama que ilustra a estrutura de domínio da proteína de MASP-2 humana;

[00040] A FIGURA 2 graficamente ilustra os resultados de um ensaio de ELISA realizado nas populações policlonais selecionadas de uma biblioteca de fago de scFcv garimpada contra vários antígenos de MASP-2, como descrito no Exemplo 2;

[00041] A FIGURA 3A e 3B mostram resultados de teste de 45 clones de scFv candidatos para a atividade funcional no ensaio de complemento, como descrito no Exemplo 3;

[00042] A FIGURA 4 graficamente ilustra os resultados de um experimento que foi realizado para comparar níveis de C3c nos três soros (humano, de rato e NHP), como descrito no Exemplo 4;

[00043] A FIGURA 5A é um alinhamento de sequência de aminoácido da região de cadeia pesada (resíduos 1 a 120) dos clones mais ativos revela dois grupos distintos que pertencem à família de genes VH2 e VH6, respectivamente, como descrito no Exemplo 4;

[00044] A FIGURA 5B é um alinhamento de sequência de aminoácido dos clones de scFv 17D20, 17N16, 18L16 e 4D9, como descrito no Exemplo 4;

[00045] A FIGURA 6 graficamente ilustra as atividades inibidoras das preparações de clones precursores convertidos em IgG4 em um ensaio de deposição de C3b usando 90 % de plasma humano, como descrito no Exemplo 5;

[00046] A FIGURA 7A graficamente ilustra os resultados do ensaio de ELISA sobre o clone mãe 17N16 versus clones filhas titulados na huMASP2A, como descrito no Exemplo 6;

[00047] A FIGURA 7B graficamente ilustra os resultados do ensaio de ELISA no clone mãe 17D20 versus clones filhas titulados na huMASP2A, como descrito no Exemplo 6;

[00048] A FIGURA 8 é um alinhamento de sequência de proteína do clone mãe 17N16 e do clone filha 17N9 que mostra que as cadeias leves (que começam com SYE) tem 17 resíduos de aminoácido que diferem entre os dois clones, como descrito no Exemplo 6;

[00049] A FIGURA 9 é um alinhamento de sequência de proteína da região CDR-H3 das sequências dos Clones #35, #59 e #90 que resultam da mutagênese em comparação com o clone mãe17D20, como descrito no Exemplo 7;

[00050] A FIGURA 10A é um alinhamento de sequência de proteína da região CDR3 do clone mãe 17D20 com o clone de cadeia embaralhada 17D20md21N11 e o clone de mutagênese clone CDR-H3 #35 mostrado na FIGURA 9 combinado com a VL de 17D20md21N11 (VH35-VL21N11), como descrito no Exemplo 7;

[00051] A FIGURA 10B é um alinhamento de sequência de proteína das regiões VL e VH do clone mãe 17D20 e do clone filha 17D20md21N11, como descrito no Exemplo 7;

[00052] A FIGURA 11A graficamente ilustra os resultados do ensaio de deposição C3b realizado para as variantes de isotipo do clone filha (MoAb#1-3), derivadas do clone mãe 17N16 do anticorpo anti-MASP-2 monoclonal humano, como descrito no Exemplo 8;

[00053] A FIGURA 11B graficamente ilustra os resultados do ensaio de deposição de C3b realizado para as variantes de isotipo do clone filha (MoAb#4-6), derivadas do clone mãe 17D20 do anticorpo anti-MASP-2 monoclonal humano, como descrito no Exemplo 8;

[00054] FIGURAS 12A e 12B graficamente ilustram os teste dos clones mães e MoAb#1-6 em um ensaio de deposição de C3b em 95 % de soro, como descrito no Exemplo 8;

[00055] A FIGURA 13 graficamente ilustra a inibição da deposição de C4b em 95 % de soro humano normal, como descrito no Exemplo 8;

[00056] A FIGURA 14 graficamente ilustra a inibição da deposição de C3b em 95 % de soro do macaco verde africano, como descrito no Exemplo 8;

[00057] A FIGURA 15 graficamente ilustra a inibição da atividade de clivagem de C4 do complexo MBL-MASP2 pré-montado pelo MoAb#2-6, como descrito no Exemplo 8;

[00058] A FIGURA 16 graficamente ilustra a ligação preferencial de MoAb#6 à MASP2 humana quando comparada com Cls, como descrito no Exemplo 8;

[00059] A FIGURA 17 graficamente ilustra que a via da lectina foi completamente inibida a seguir da administração intravenosa de MoAb#OMS646 anti-humano em macacos Verdes Africanos, como descrito no Exemplo 10;

[00060] A FIGURA 18A é uma plotagem de sobrevivência de um Kaplan-Meier que mostra sobrevivência percentual com o tempo depois da exposição à radiação de 7,0 Gy em camundongos de controle e em camundongos tratados com anticorpo de MASP-2 antimurino (mAbM11) ou anticorpo anti-MASP-2 humana (mAbOMS646) como descrito no Exemplo 11;

[00061] A FIGURA 18B é uma plotagem de sobrevivência de um Kaplan-Meier que mostra a sobrevivência percentual com o tempo depois da exposição a 6,5 Gy de radiação em camundongos de controle e em camundongos tratados com anticorpo MASP-2 antimurino (mAbM11) ou anticorpo anti-MASP-2 humana (mAbOMS646), como descrito no Exemplo 11;

[00062] A FIGURA 18C é uma plotagem de sobrevivência de um Kaplan-Meier que mostra a sobrevivência percentual com o tempo depois da exposição a 8,0 Gy de radiação em camundongos de controle e em camundongos tratados com anticorpo anti-MASP-2 humana (mAbOMS646), como descrito no Exemplo 11;

[00063] A FIGURA 19 graficamente ilustra os resultados da análise de ressonância de plasmon de superfície (Biacore) on anticorpo anti-MASP-2 OMS646 (unidades de resposta (ligação) versus tempo em segundos), que mostra que OMS646 imobilizado se liga à MASP-2 recombinante com uma taxa de Kdissociação de cerca de 1 a 3 x 10-4 S-1 e uma taxa de Kassociação de cerca de 1 ,6 a 3 x 106 M-1 S-1, como descrito no Exemplo 12;

[00064] A FIGURA 20 graficamente ilustra os resultados de um ensaio de ELISA para determinar a afinidade de ligação de anticorpo anti-MASP-2 OMS646 à MASP-2 humana imobilizada, que mostra que OMS646 se liga à MASP-2 humana recombinante imobilizada com um KD de aproximadamente 100 μM, como descrito no Exemplo 12;

[00065] A FIGURA 21A graficamente ilustra o nível de ativação de C4 em uma superfície revestida com manana na presença ou ausência de anticorpo anti-MASP-2 (OMS646), que demonstra que OMS646 inibe a ativação de C4 em uma superfície revestida com manana com uma IC50 de aproximadamente 0,5 nM em 1 % de soro humano, como descrito no Exemplo 12;

[00066] A FIGURA 21B graficamente ilustra o nível de ativação de C4 em uma superfície revestida com IgG na presença ou ausência de anticorpo anti-MASP-2 (OMS646), que mostra que OMS646 não inibe a ativação dependente da via clássica do componente C4 de complemento, como descrito no Exemplo 12;

[00067] A FIGURA 22A graficamente ilustra o nível de deposição de MAC na presença ou ausência do anticorpo anti-MASP-2 (OMS646) sob condições de ensaio específicas da via da lectina, demonstrando que OMS646 inibe a deposição de MAC mediada pela lectina com um valor IC50 de aproximadamente 1 nM, como descrito no Exemplo 12;

[00068] A FIGURA 22B graficamente ilustra o nível de deposição de MAC na presença ou ausência de anticorpo anti-MASP-2 (OMS646) sob condições de ensaio específicas da via clássica, demonstrando que OMS646 não inibe a deposição de MAC mediada pela via clássica, como descrito no Exemplo 12;

[00069] A FIGURA 22C graficamente ilustra o nível de deposição de MAC na presença ou ausência do anticorpo anti-MASP-2 (OMS646) sob condições de ensaio específicas da via alternativa, demonstrando que OMS646 não inibe a deposição de MAC mediada pela via alternativa, como descrito no Exemplo 12;

[00070] A FIGURA 23A graficamente ilustra o nível de deposição de C3 na presença ou ausência de anticorpo anti-MASP-2 (OMS646) em uma faixa de concentrações em 90 % de soro humano sob condições específicas da via da lectina, demonstrando que OMS646 bloqueia a deposição de C3 sob condições fisiológicas, como descrito no Exemplo 12;

[00071] A FIGURA 23B graficamente ilustra o nível de deposição de C4 na presença ou ausência de anticorpo anti-MASP-2 (OMS646) em uma faixa de concentrações em 90 % de soro humano sob condições específicas da via da lectina, demonstrando que OMS646 bloqueia a deposição de C4 sob condições fisiológicas, como descrito no Exemplo 12;

[00072] A FIGURA 24A graficamente ilustra o nível de deposição de C4 na ausência ou presença de anticorpo anti-MASP-2 (OMS646) em 90 % de soro de macaco Cinomolgo sob condições específicas da via da lectina, demonstrando que OMS646 inibe a deposição de C4 na via da lectina em Soro de macaco Cinomolgo em uma maneira responsiva com a dose com valores de IC50 na faixa de 30 a 50 nM, como descrito no Exemplo 12; e

[00073] A FIGURA 24B graficamente ilustra o nível de deposição de C4 na ausência ou presença de anticorpo anti-MASP-2 (OMS646) em 90 % de soro de macaco Verde Africano sob condições específicas da via da lectina, demonstrando que OMS646 inibe a deposição de C4 na via da lectina em soro de macaco Verde Africano em um maneira responsiva com a dose com valores de IC50 na faixa de 15 a 30 nM, como descrito no Exemplo 12.

DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[00074] SEQ ID NO: 1 cDNA de MASP-2 humana

[00075] SEQ ID NO: 2 proteína de MASP-2 humana (com líder)

[00076] SEQ ID NO: 3 proteína de MASP-2 humana (madura)

[00077] SEQ ID NO: 4 cDNA de MASP-2 de rato

[00078] SEQ ID NO: 5 proteína de MASP-2 de rato (com líder)

[00079] SEQ ID NO: 6 proteína de MASP-2 de rato (madura)

ANTÍGENOS (em referência à proteína de MASP-2 humana madura)

[00080] SEQ ID NO: 7 domínio CUBI de MASP-2 humana (aa 1-121)

[00081] SEQ ID NO: 8 domínios CUBI/EGF de MASP-2 humana (aa 1-166)

[00082] SEQ ID NO: 9 domínios CUBI/EGF/CUBII de MASP-2 humana (aa 1-277)

[00083] SEQ ID NO: 10 domínio EGF de MASP-2 humana (aa 122166)

[00084] SEQ ID NO: 11 domínios CCPI/CCPII/SP de MASP-2 humana (aa 278-671)

[00085] SEQ ID NO: 12 domínios CCPI/CCPII de MASP-2 humana (aa 278-429)

[00086] SEQ ID NO: 13 domínio CCPI de MASP-2 humana (aa 278347)

[00087] SEQ ID NO: 14 domínio CCPII/SP de MASP-2 humana (aa348-671)

[00088] SEQ ID NO: 15 domínio CCPII de MASP-2 humana (aa 348429)

[00089] SEQ ID NO: 16 domínio SP de MASP-2 humana (aa 429-671)

[00090] SEQ ID NO: 17: mutante inativado pela serina protease (aa 610-625 com Ser 618 mutado)

ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-MASP-2 cadeias VH

[00091] SEQ ID NO: 18 polipeptídeo 17D20mc região variável da cadeia pesada (VH)

[00092] SEQ ID NO: 19 DNA que codifica 17D20 da região variável da cadeia pesada (VH) dc35VH21N11VL (OMS646) (sem peptídeo de sinal)

[00093] SEQ ID NO: 20 polipeptídeo de 17D20 da região variável da cadeia pesada (VH) dc35VH21N11VL (OMS646)

[00094] SEQ ID NO: 21 polipeptídeo 17N16mc da região variável da cadeia pesada (VH)

ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-MASP-2 cadeias VL

[00095] SEQ ID NO: 22 polipeptídeo 17D20mc da região variável da cadeia leve (VL)

[00096] SEQ ID NO: 23 DNA que codifica 17D20 da região variável da cadeia leve (VL) dc21N11VL (OMS644) (sem peptídeo de sinal)

[00097] SEQ ID NO: 24 polipeptídeo 17D20 da região variável da cadeia leve (VL) dc21N11VL (OMS644)

[00098] SEQ ID NO: 25 polipeptídeo 17N16mc da região variável da cadeia leve (VL)

[00099] SEQ ID NO: 26 DNA que codifica 17N16dc da região variável da cadeia leve (VL) 17N9 (OMS641) (sem peptídeo de sinal)

[000100] SEQ ID NO: 27 polipeptídeo 17N16 da região variável da cadeia leve (VL) dcl7N9 (OMS641)

CDRS DE CADEIA PESADA DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-MASP-2

[000101] SEQ ID NOS: 28-31 CDR-H1

[000102] SEQ ID NOS: 32-35 CDR-H2

[000103] SEQ ID NOS: 36-40 CDR-H3

CDRS DE CADEIA LEVE DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-MASP-2

[000104] SEQ ID NOS: 41-45 CDR-L1

[000105] SEQ ID NOS: 46-50 CDR-L2

[000106] SEQ ID NOS: 51-54 CDR-L3

Sequências de anticorpo de MASP-2

[000107] SEQ ID NO: 55: polipeptídeo de tamanho natural de ScFv clone mãe 17D20

[000108] SEQ ID NO: 56: polipeptídeo de tamanho natural 18L16 de ScFv clone mãe

[000109] SEQ ID NO: 57: polipeptídeo de tamanho natural 4D9 de ScFv clone mãe

[000110] SEQ ID NO: 58: polipeptídeo de tamanho natural 17L20 de ScFv clone mãe

[000111] SEQ ID NO: 59: polipeptídeo de tamanho natural 17N16 de ScFv clone mãe

[000112] SEQ ID NO: 60: polipeptídeo de tamanho natural 3F22 de ScFv clone mãe

[000113] SEQ ID NO: 61: polipeptídeo de tamanho natural 9P13 de ScFv clone mãe

[000114] SEQ ID NO: 62: DNA que codifica a região constante da cadeia pesada de IgG4 do tipo selvagem

[000115] SEQ ID NO: 63: polipeptídeo da região constante da cadeia pesada de IgG4 do tipo selvagem

[000116] SEQ ID NO: 64 DNA que codifica a região constante da cadeia pesada de IgG4 com 5228P mutante

[000117] SEQ ID NO: 65: região constante da cadeia pesada de IgG4 com polipeptídeo 5228P mutante

[000118] SEQ ID NO: 66: polipeptídeo de tamanho natural 17N16m dl7N9 ScFv clone filha

[000119] SEQ ID NO: 67: polipeptídeo de tamanho natural 17D20m d21N11 ScFv clone filha

[000120] SEQ ID NO: 68: ScFv clone filha 17D20m d3521N11 polipeptídeo de tamanho natural

[000121] SEQ ID NO: 69: DNA que codifica região constante da cadeia pesada de IgG2 do tipo selvagem

[000122] SEQ ID NO: 70: polipeptídeo da região constante de cadeia pesada da IgG2 do tipo selvagem

[000123] SEQ ID NO: 71: sequência de gene de cadeia leve 17N16m dl7N9 (com peptídeo de sinal codificado pelos nt 1-57))

[000124] SEQ ID NO: 72: sequência de proteína de cadeia leve 17N16m dl7N9 (com peptídeo de sinal aa l-19)

[000125] SEQ ID NO: 73: sequência de gene da cadeia pesada de IgG2 17N16m dl7N9 (com peptídeo de sinal codificado pelos nt 1-57)

[000126] SEQ ID NO: 74: sequência de proteína de cadeia pesada da IgG2 17N16m dl7N9 (com peptídeo de sinal aa 1-19)

[000127] SEQ ID NO: 75: sequência de gene da cadeia pesada de IgG4 17N16m dl7N9 (com peptídeo de sinal codificado pelos nt 1-57)

[000128] SEQ ID NO: 76: sequência da proteína de cadeia pesada da IgG4 17N16m dl7N9 (com peptídeo de sinal aa 1-19)

[000129] SEQ ID NO: 77: sequência de gene da cadeia pesada mutada de IgG4 17N16m dl7N9 (com peptídeo de sinal codificado pelos nt 1-57)

[000130] SEQ ID NO: 78: sequência de proteína de cadeia pesada mutada de IgG4 17N17m dl7N9 (com peptídeo de sinal aa 1-19)

[000131] SEQ ID NO: 79: sequência de gene de cadeia leve 17D20_3521N11 (com peptídeo de sinal codificado pelos nt 1-57)

[000132] SEQ ID NO: 80: sequência de proteína de cadeia leve 17D20_3521N11 (com peptídeo de sinal aa 1-19)

[000133] SEQ ID NO: 81: sequência de gene de cadeia pesada da IgG2 17D20_3521N11 (com peptídeo de sinal codificado pelos nt 1-57)

[000134] SEQ ID NO: 82: sequência de proteína de cadeia pesada da IgG2 17D20_3521N11 (com peptídeo de sinal aa 1-19)

[000135] SEQ ID NO: 83: sequência de gene de cadeia pesada da IgG4 17D20_3521N11 (com peptídeo de sinal codificado pelos nt 1-57)

[000136] SEQ ID NO: 84: sequência de proteína de cadeia pesada da IgG4 17D20_3521N11 (com peptídeo de sinal aa 1-19)

[000137] SEQ ID NO: 85: sequência de gene de cadeia pesada mutada da IgG4 17D20_3521N11 (com peptídeo de sinal codificado pelos nt 1-57)

[000138] SEQ ID NO: 86: sequência de proteína de cadeia pesada mutada da IgG4 17D20_3521N11 (com peptídeo de sinal como 1-19)

[000139] SEQ ID NO: 87: DNA que codifica polipeptídeo de tamanho natural do clone filha de ScFv 17N16m _d17N9 (sem peptídeo de sinal)

[000140] SEQ ID NO: 88: DNA que codifica polipeptídeo de tamanho natural do clone filha de ScFv 17D20m d21N11 (sem peptídeo de sinal)

[000141] SEQ ID NO: 89: DNA que codifica polipeptídeo de tamanho natural do clone filha de ScFv 17D20m_d3521N11 (sem peptídeo de sinal)

[000142] SEQ ID NO: 90: CDR-H3 da cadeia pesada de consenso de 17D20m e d3521N11

[000143] SEQ ID NO: 91: CDR-L1 da cadeia leve de consenso de 17D20m e d3521N11

[000144] SEQ ID NO: 92: CDR-L1 da cadeia leve de consenso de 17N16m e d17N9

[000145] SEQ ID NO: 93: CDR-L2 da cadeia leve de consenso de 17D20m, d3521N11, 17N16m e d17N9

[000146] SEQ ID NO: 94: CDR-L3 da cadeia leve de consenso de 17N16m e d17N9

DESCRIÇÃO DETALHADA

[000147] A presente invenção fornece anticorpos totalmente humanos que se ligam à MASP2 humana e inibem a ativação de complemento mediada pela lectina enquanto deixa o componente da via clássica (dependente de Clq) do sistema imune intacto. Os anticorpos humanos anti-MASP-2 foram identificados pela triagem de uma biblioteca de demonstração de fago, como descrito nos Exemplos 2-9. Como descrito nos Exemplos 10-12, anticorpos anti-MASP-2 de alta afinidade foram identificados com a capacidade para inibir a ativação de complemento mediada pela lectina, como demonstrado em ensaios tanto in vitro quanto in vivo. Os fragmentos dos anticorpos de cadeia leve e pesada variáveis foram isolados tanto em um formato de scFv quanto em um formato de IgG de tamanho natural. Os anticorpos anti-MASP- 2 humanos são úteis para a inibição da lesão celular associada com a ativação da via de complemento mediada pela lectina enquanto deixa o componente da via clássica (dependente de Clq) do sistema imune intacto.

I. DEFINIÇÕES

[000148] A menos que especificamente aqui definido, todos os termos aqui usado têm o mesmo significado como seria entendido por aqueles de habilidade comum na técnica da presente invenção. As definições que seguem são fornecidas de modo a fornecer clareza com relação aos termos como eles são usados no relatório descritivo e reivindicações para descrever a presente invenção.

[000149] Como aqui usado, o termo “ativação de complemento dependente de MASP-2” compreende a ativação dependente de MASP-2 da via da lectina, que ocorre sob condições fisiológicas (isto é, na presença de Ca++) levando à formação da via da lectina C3 convertase C4b2a e no acúmulo do produto de clivagem de C3, C3b subsequentemente à C5 convertase C4b2a(C3b)n.

[000150] Como aqui usado, o termo “via alternativa” refere-se à ativação de complemento que é ativado, por exemplo, pelo zimosan a partir das paredes de célula fúngica e de levedura, lipopolissacarídeo (LPS) das membranas externas Gram negativas, e eritrócitos de coelho, assim como de polissacarídeos muito puros, eritrócitos de coelho, vírus, bactérias, células de tumor de animal, parasitas e as células danificadas, e que tradicionalmente foi considerado surgir da geração proteolítica espontânea de C3b a partir do fator de complemento C3.

[000151] Como aqui usado, o termo “via da lectina” refere-se à ativação de complemento que ocorre por intermédio da ligação específica de proteínas de ligação de carboidrato séricas e não séricas incluindo lectina de ligação de manana (MBL), CL-11 e as ficolinas (H-ficolina, M-ficolina, ou L-ficolina).

[000152] Como aqui usado, o termo “via clássica” refere-se à ativação de complemento que é ativada por um anticorpo ligado a uma partícula estranha e requer a ligação da molécula de reconhecimento C1q.

[000153] Como aqui usado, o termo “anticorpo inibidor de MASP-2” refere-se a qualquer anticorpo anti-MASP-2 ou fragmento do mesmo que liga MASP-2 que se liga a ou diretamente interage com MASP-2 e eficazmente inibe a ativação de complemento. Os anticorpos inibidores de MASP-2 úteis no método da invenção pode reduzir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em mais do que 20 %, tal como mais do que 30 %, ou maior do que 40 %, ou maior do que 50 %, ou maior do que 60 %, ou maior do que 70 %, ou maior do que 80 %, ou maior do que 90 %, ou maior do que 95 %.

[000154] Como aqui usado, o termo “anticorpo que bloqueia MASP-2” refere-se a anticorpos inibidores de MASP-2 que reduzem a ativação de complemento dependente de MASP-2 em mais do que 90 %, tal como maior do que 95 %, ou maior do que 98 % (isto é, que resulta na ativação de complemento de MASP-2 de apenas 10 %, tal como apenas 9 %, ou apenas 8 %, ou apenas 7 %, ou apenas 6 %, tal como apenas 5 % ou menos, ou apenas 4 %, ou apenas 4 %, ou apenas 3 % ou apenas 2 % ou apenas 1 %).

[000155] Os termos “anticorpo” e “imunoglobulina” são aqui usados intercambiavelmente. Estes termos são bem entendidos por aqueles no campo, e referem-se a uma proteína que consiste de um ou mais polipeptídeos que especificamente liga um antígeno. Uma forma do anticorpo constitui a unidade estrutural básica de um anticorpo. Esta forma é um tetrâmero e consiste de dois pares idênticos das cadeias de anticorpo, cada par tendo uma cadeia leve e uma pesada. Em cada par, as regiões variáveis da cadeia leve e pesada são juntas responsáveis pela ligação a um antígeno, e as regiões constantes são responsáveis pelas funções efetoras de anticorpo.

[000156] Como aqui usado, o termo “anticorpo” abrange anticorpos e fragmentos de anticorpo dos mesmos, derivados de qualquer mamífero que produza anticorpo (por exemplo, camundongo, rato, coelho, e primata incluindo o ser humano), ou de um hibridoma, seleção de fago, expressão recombinante ou animais transgênicos (ou outros métodos de produzir anticorpos ou fragmentos de anticorpo), que especificamente se ligam a polipeptídeos de MASP-2 ou porções do mesmo. Não é intencionado que o termo “anticorpo” seja limitado com relação à fonte do anticorpo ou maneira em que o mesmo é fabricado (por exemplo, por hibridoma, seleção de fago, expressão recombinante, animal transgênico, síntese de peptídeo, etc). Os anticorpos exemplares incluem anticorpos policlonais, monoclonais e recombinantes; anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos); anticorpos humanizados; anticorpos de murino; anticorpos monoclonais quiméricos, camundongo-ser humano, camundongo-primata, primata-ser humano; e anticorpos anti-idiotípico, e pode ser qualquer molécula intacta ou fragmento da mesma. Como aqui usado, o termo “anticorpo” abrange não apenas anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, mas também fragmentos do mesmo (tais como dAb, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), cadeia única (ScFv), variantes sintéticas do mesmo, variantes que ocorrem naturalmente, proteínas de fusão que compreendem uma porção de anticorpo com um fragmento de ligação de antígeno da especificidade requerida, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de ligação de antígeno ou fragmento (sítio de ligação de antígeno) da especificidade requerida.

[000157] Como aqui usado, o termo “fragmento de ligação de antígeno” refere-se a um fragmento de polipeptídeo que contém pelo menos uma CDR de uma cadeia pesada e/ou leve da imunoglobulina que se liga à MASP-2 humana. A este respeito, um fragmento de ligação de antígeno dos anticorpos aqui descritos pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, ou todas as 6 CDRs de uma sequência VH e VL aqui apresentada de anticorpos que se ligam a MASP-2. Um fragmento de ligação de antígeno dos anticorpos específicos de MASP-2 aqui descritos é capaz de ligação a MASP-2. Em certas formas de realização, um fragmento de ligação de antígeno ou um anticorpo que compreende um fragmento de ligação de antígeno, medeiam a inibição da ativação de complemento dependente de MASP-2.

[000158] Como aqui usado o termo “anticorpos monoclonais anti- MASP-2” refere-se a uma população de anticorpo homogênea, em que o anticorpo monoclonal é compreendido de aminoácidos que estão envolvidos na ligação de seleção de um epítopo em MASP-2. Anticorpos monoclonais anti-MASP-2 são altamente específicos para o antígeno alvo de MASP-2. Um “anticorpo monoclonal” refere-se a uma população de anticorpo homogêna em que o anticorpo monoclonal é compreendido de aminoácidos (que ocorrem naturalmente e que não ocorrem naturalmente) que são envolvidos na ligação seletiva de um epítopo. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos para o antígeno alvo. O termo “anticorpo monoclonal” abrange não apenas anticorpos monoclonais intactos e anticorpos monoclonais de tamanho natural, mas também fragmentos dos mesmos (tais como Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), de cadeia única (ScFv), variantes dos mesmos, proteínas de fusão que compreendem uma porção de ligação de antígeno, anticorpos monoclonais humanizados, anticorpos monoclonais quiméricos, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um fragmento de ligação de antígeno (sítio de reconhecimento de epítopo) da especificidade requerida e a capacidade para ligar-se a um epítopo.

[000159] Como aqui usado, o modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como que é obtido a partir de uma população substancialmente homogênea do anticorpos, e não é intencionado estar limitado com relação à fonte do anticorpo ou à maneira na qual o mesmo é fabricado (por exemplo, por hibridoma, seleção de fago, expressão recombinante, animais transgênicos, etc.). O termo inclui imunoglobulinas inteiras assim como os fragmentos etc. descritos acima sob a definição de “anticorpo”. Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos usando qualquer técnica que forneça a produção das moléculas de anticorpo pela linhagem de células contínua em cultura, tal como o método de hibridoma descrito por Kohler, G., et al., Nature 256: 495, 1975, ou eles podem ser fabricados pelos métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, Patente U.S. No. 4.816.567 concedida a Cabilly). Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas em Clackson, T., et al., Nature 352: 624-628, 1991, e Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991. Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina que inclui IgG, IgM, IgE, IgA, IgD e qualquer subclasse das mesmas.

[000160] Os polipeptídeos de imunoglobulina reconhecidos incluem as cadeias leves capa e lambda e as cadeia pesadas alfa, gama (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon e mu ou equivalentes em outras espécies. As “cadeias leves” de imunoglobulina de tamanho natural (de cerca de 25 kDa ou cerca de 214 aminoácidos) compreendem uma região variável de cerca de 110 aminoácidos no terminal NH2 e uma região constante capa ou lambda no terminal COOH.

[000161] As “cadeias pesadas” de imunoglobulina de tamanho natural (de cerca de 50 kDa ou de cerca de 446 aminoácidos) similarmente compreendem uma região variável (de cerca de 116 aminoácidos) e uma das regiões constantes de cadeia pesada anteriormente mencionadas, por exemplo, gama (de cerca de 330 aminoácidos).

[000162] A unidade de anticorpo de quatro cadeias básica é uma glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Um anticorpo de IgM consiste de 5 das unidades heterotetraméricas básicas junto com um polipeptídeo adicional chamado de cadeia J, e portanto contém 10 sítios de ligação de antígeno. Os anticorpos IgA secretados podem polimerizar para formar montagens polivalentes que compreendem de 2 a 5 das unidades de 4 cadeias básicas junto com a cadeia J. Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto que as duas cadeias H são ligadas umas às outras por uma ou mais ligações de dissulfeto, dependendo do isotipo da cadeia H. Cada uma das cadeias H e L também tem pontes de dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. O emparelhamento de uma VH e VL juntas forma um único sítio de ligação de antígeno.

[000163] Cada cadeia H tem no terminal N, um domínio variável (VH), seguido por três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias α e Y, e quatro domínios CH (CH) para os isotipos μ e ε.

[000164] Cada cadeia L tem no terminal N, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante (CL) na sua outra extremidade. O VL é alinhado com o VH e o CL é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode ser designada a um de dois tipos claramente distintos, chamados capa (K) e lambda (X), com base nas sequências de aminoácido dos seus domínios constantes (CL).

[000165] Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser designadas a classes ou isotipos diferentes. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, tendo cadeias pesadas designadas alfa (α), delta (δ), épsilon (ε), gama (y) e mu (μ), respectivamente. As classes Y e α são divididas ainda em subclasses com base em diferenças menores na sequência CH e função, por exemplo, as humanas expressam as subclasses que seguem: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2.

[000166] Para a estrutura e propriedades das diferentes classes dos anticorpos, ver, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8a Edição, Daniel P. Stites, Abba I. Terr e Tristram G. Parslow (eds); Appleton e Lange, Norwalc, Conn., 1994, página 71 e Capítulo 6.

[000167] O termo “variável” refere-se ao fato de que certos segmentos do domínio V difere extensivamente em sequência entre os anticorpos. O domínio V medeia a ligação de antígeno e define a especificidade de um anticorpo particular ao seu antígeno particular. Entretanto, a variabilidade não é unifirmemente distribuída através do intervalo de 110 aminoácidos dos domínios variáveis. Ao invés, as regiões V consistem de trechos relativamente invariantes chamados de regiões de matriz (FRs) de 15 a 30 aminoácidos separados pelas regiões mais curtas de variabilidade extrema chamadas de “regiões hipervariáveis” que tem cada um de 9 a 12 aminoácidos de comprimento. Os domínios variáveis de cadeias pesada e leve nativas cada um compreende quatro FRs, adotando amplamente uma configuração de folha beta, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam laços que conectam à estrutura de folha n e em alguns casos formam parte da mesma. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em intimidade imediata pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribui para a formação do sítio de ligação de antígeno dos anticorpos (ver Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Betesda, Md (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

[000168] Como aqui usado, o termo “região hipervariável” refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígeno. A região hipervariável no geral compreende resíduos de aminoácido de uma “região determinadora de complementaridade” ou “CDR” (isto é, em torno de cerca dos resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve, e em torno de cerca de 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada quando da numeração de acordo com o sistema de numeração de Kabat como descrito em Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Betesda, Md (1991)); e/ou aqueles resíduos de uma “laço hipervariável” (isto é, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve, e 26-32 (H1), 52-56 (H2) e 95-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada quando numerados de acordo com o sistema de numeração de Chotia, como descrito em Chotia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901917 (1987)); e/ou aqueles resíduos de uma “laço hipervariável”/CDR (por exemplo, resíduos 27-38 (L1), 56-65 (L2) e 105-120 (L3) no VL, e 27-38 (H1), 56-65 (H2), e 105-120 (H3) no VH quando numerados de acordo com o sistema de numeração de IMG DET como descrito em Lefranc, J.P., et al., Nucleic Acids Res 27: 209-212; Ruiz, M., et al., Nucleic Acids Res 28: 219-221 (2000)).

[000169] Como aqui usado, o termo “fragmento de anticorpo” refere-se a uma porção derivada de ou relacionada com um anticorpo anti-MASP-2 de tamanho natural, no geral incluindo a região de ligação de antígeno ou variável do mesmo. Os exemplos ilustrativos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab’, F(ab)2, F(ab’)2 e Fv, fragmentos scFv, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única e anticorpos biespecíficos e multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.

[000170] Onde anticorpos biespecíficos devam ser usados, estes podem ser anticorpos biespecíficos convencionais, que podem ser fabricados em uma variedade de modos (Holliger, P. e Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), por exemplo quimicamente preparados ou a partir de hibridomas híbridos, ou podem ser qualquer um dos fragmentos de anticorpo biespecíficos mencionados acima.

[000171] Como aqui usado, um fragmento de anticorpo “Fv de cadeia única” ou “scFv” compreende os domínios VH e VL de um anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. No geral, o polipeptídeo Fv compreende ainda um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL, que permitem que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação de antígeno. Ver Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonals Antibodies, Vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994). “Fv” é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de reconhecimento e ligação de antígeno completo. Este fragmento consiste de um dímero de um domínio da região variável de cadeia pesada e leve em associação firme, não covalente. A partir da dobra destes dois domínios emanam seis laços hipervariáveis (três laços de cada uma da cadeia H e L) que contribui com os resíduos de aminoácido para a ligação de antígeno e confere especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. Entretanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicas para um antígeno) tem a capacidade para reconhecer e ligar antígeno, embora em uma afinidade inferior do que o sítio de ligação inteiro.

[000172] Como aqui usado, o termo “ligação específica” refere-se à capacidade de um anticorpo para preferencialmente ligar-se a um analito particular que está presente em uma mistura homogênea de analitos diferentes. Em certas formas de realização, uma interação específica de ligação discriminará entre analitos desejáveis e indesejáveis em uma amostra, em algumas formas de realização mais do que cerca de 10 a 100 vezes ou mais (por exemplo, mais do que cerca de 1000 ou 10.000 vezes). Em certas formas de realização, a afinidade entre um agente de captura e o analito quando eles são especificamente ligados um complexo de agente de captura/analito é distinguido por uma KD (constante de dissociação) de menos do que cerca de 100 nM, ou menos do que cerca de 50 nM, ou menos do que cerca de 25 nM, ou menos do que cerca de 10 nM, ou menos do que cerca de 5 nM, ou menos do que cerca de 1 nM.

[000173] Como aqui usado, o termo anticorpo anti-MASP-2 “variante” refere-se a uma molécula que difere em sequência de aminoácido de um sequência de aminoácido de anticorpo “precursor” ou de referência em virtude da adição, deleção, e/ou substituição de um ou mais resíduo(s) de aminoácido na sequência de anticorpo precursor. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-MASP-2 variante refere-se a uma molécula que contém regiões variáveis que são idênticas aos domínios variáveis precursores, exceto para um total combinado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 9 ou 10 substituições de aminoácido dentro das regiões de CDR da região variável da cadeia pesada, e/ou até um total combinado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições de aminoácido com as ditas regiões de CDR da região variável da cadeia leve. Em algumas formas de realização, as substituições de aminoácido são modificações de sequência conservativas.

[000174] Como aqui usado, o termo “anticorpo precursor” refere-se a um anticorpo que é codificado por uma sequência de aminoácido usada para a preparação da variante. Preferivelmente, o anticorpo precursor tem uma região de matriz humana e, se presente, tem região(ões) constante(s) de anticorpo humano. Por exemplo, o anticorpo precursor pode ser um anticorpo humanizado ou totalmente humano.

[000175] Como aqui usado, o termo “anticorpo isolado” refere-se a um anticorpo que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com usos de diagnóstico ou terapêutico para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em formas de realização preferidas, o anticorpo será purificado (1) a mais do que 95 % em peso do anticorpo como determinado pelo método de Lowry, e o mais preferivelmente mais do que 99 % em peso; (2) a um grau suficiente para se obter pelo menos 15 resíduos de terminal N ou sequência de aminoácido interna pelo uso de um sequenciador de copo giratório; ou (3) até a homogeneidade pela SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras usando azul de Coomassie ou, preferivelmente, mancha de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes visto que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Ordinariamente, entretanto, anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[000176] Como aqui usado, o termo “epítopo” refere-se à porção de um antígeno ao qual um anticorpo monoclonal especificamente se liga. Os determinantes epitópicos usualmente consistem de agrupamentos de superfície quimicamente ativa de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e usualmente têm características estruturais tri dimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Mais especificamente, o termo “epítopo de MASP-2,” como aqui usado refere-se a uma porção do polipeptídeo correspondente à qual um anticorpo imunoespecificamente se liga como determinado por qualquer método bem conhecido na técnica, por exemplo, pelos imunoensaios. Os epítopos antigênicos não precisam ser necessariamente imunogênicos. Tais epítopos podem ser lineares por natureza ou podem ser um epítopo descontínuo. Assim, como aqui usado, o termo “epítopo conformacional” refere-se a um epítopo descontínuo formado por uma relação espacial entre aminoácidos de um antígeno outros que não uma série contínua de aminoácidos.

[000177] Como aqui usado, o termo “lectina de ligação de manana” (“MBL”) é equivalente à proteína de ligação de manana (“M BP”).

[000178] Como aqui usado, o “complexo de ataque à membrana” (“MAC”) refere-se a um complexo dos componentes de complemento cinco terminal (C5-C9) que insere dentro e rompe as membranas. Também aludido como C5b-9).

[000179] Como aqui usado, “um indivíduo” inclui todos os mamíferos, incluindo sem limitação seres humanos, primatas não humanos, cães, gatos, cavalos, ovelha, cabras, vacas, coelhos, porcos e roedores.

[000180] Como aqui usado, os resíduos de aminoácido são abreviados como segue: alanina (Ala; A), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), arginina (Arg; R), cisteína (Cys; C), ácido glutâmico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptofano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y), e valina (Val; V).

[000181] No sentido mais amplo, os aminoácidos que ocorrem naturalmente podem ser divididos em grupos com base na característica química da cadeia lateral dos respectivos aminoácidos. por aminoácido “hidrofóbico” é intencionado Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys ou Pro. Por aminoácido “hidrofílico” é intencionado Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg ou His. Este agrupamento de aminoácidos pode ser subclassificado ainda como segue. Por “hidrofílicos não carregados” aminoácido é intencionado Ser, Thr, Asn ou Gln. Por aminoácido “ácido” é intencinado Glu ou Asp. Por aminoácido “básico” é intencinado Lys, Arg ou His.

[000182] Como aqui usado o termo “substituição de aminoácido conservativa” é ilustrada por uma substituição entre aminoácidos dentro de cada um dos grupos que seguem: (1) glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina, e triptofano, (3) serina e treonina, (4) aspartato e glutamato, (5) glutamina e asparagina, e (6) lisina, arginina e histidina.

[000183] Como aqui usado, uma “molécula de ácido nucleico isolada” é uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um polinucleotídeo) que não é integrado no DNA genômico de um organismo. Por exemplo, uma molécula de DNA que codifica um fator de crescimento que foi separado do DNA genômico de uma célula é uma molécula de DNA isolada. Um outro exemplo de uma molécula de ácido nucleico isolada é uma molécula de ácido nucleico quimicamente sintetizada que não é integrada no genoma de um organismo. Uma molécula de ácido nucleico que foi isolada de uma espécie particular é menor do que a molécula de DNA completa de um cromossoma desta espécie.

[000184] Como aqui usado, uma “construção de molécula de ácido nucleico” é uma molécula de ácido nucleico, de filamento único ou duplo, que foi modificada através da intervenção humana para conter segmentos de ácido nucleico combinados e justapostos em um arranjo não existe na natureza.

[000185] Como aqui usado, um “vetor de expressão” é uma molécula de ácido nucleico que codifica um gene que é expressado em uma célula hospedeira. Tipicamente, um vetor de expressão compreende um promotor de transcrição, um gene, e um terminador de transcrição. A expressão de gene é usualmente colocada sob o controle de um promotor, e um tal gene é dito ser “operavelmente ligado ao” promotor. Similarmente, um elemento regulador e um promotor de núcleo são operavelmente ligados se o elemento regulador modula a atividade do promotor de núcleo.

[000186] Como aqui usado, os termos “aproximadamente” ou “de cerca de” em referência a um número são no geral considerados incluir números que caem dentro de uma faixa de 5 % em cada direção (maior do que ou menor do que) do número a menos que de outro modo estabelecido ou de outro modo evidente a partir do contexto (exceto onde tal número excederia 100 % de um valor possível). Onde faixas são estabelecidas, os pontos finais são incluídos dentro da faixa a menos que de outro modo estabelecido ou de outro modo evidente a partir do contexto.

[000187] Como aqui usado as formas singulares “um”, “uma” e “o”, “a” incluem aspectos plurais a menos que o contexto claramente dite de outro modo. Assim, por exemplo, referência a “uma célula” inclui uma célula única, assim como duas ou mais células; referência a “um agente” inclui um agente, assim como dois ou mais agentes; referência a “um anticorpo” inclui uma pluralidade de tais anticorpos e referência a “uma região de matriz” inclui referência a uma ou mais regiões de matriz e equivalentes da mesma conhecidos por aqueles habilitados na técnica, e assim por diante.

[000188] Cada forma de realização neste relatório descritivo deve ser aplicada mutatis mutandis a cada outra forma de realização a menos que expressamente estabelecido de outro modo.

[000189] Técnicas padrão podem ser usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeo, e cultura e transformação de tecido (por exemplo, eletroporação, lipofecção). As reações enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como habitualmente realizado na técnica ou como aqui descrito. Estas e técnicas e procedimentos relacionados podem ser no geral realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e debatidas por todo o presente relatório descritivo. Ver por exemplo, Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Current Protocols in Immunology (Editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Etan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); ou outras publicações de Protocolo Corrente relevantes e outras referências equivalentes. A menos que definições específicas sejam fornecidas, a nomenclatura utilizada em conexão com, e os procedimentos e técnicas de laboratório de, biologia molecular, química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica aqui descrita são aquelas bem conhecidas e habitualmente usadas na técnica. Técnicas padrão podem ser usadas para a tecnologia recombinante, biológica molecular, microbiológica, síntese química, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação, e liberação, e tratamento de pacientes.

[000190] É considerado que qualquer forma de realização debatida neste relatório descritivo pode ser implementada com relação a qualquer método, kit, reagente, ou composição da invenção, e vice e versa. Além disso, as composições da invenção podem ser usadas para se obter os métodos da invenção.

II. Vista Geral

[000191] As lectinas (MBL, M-ficolina, H-ficolina, L-ficolina e CL-11) são as moléculas de reconhecimento específicas que ativam o sistema de complemento inato e o sistema inclui a via da iniciação da lectina e o laço de amplificação da via terminal que amplifica a ativação iniciada pela lectina das moléculas efetoras de complemento terminal. C1q é a molécula de reconhecimento específica que ativa o sistema de complemento adquirido e o sistema inclui a via de iniciação clássico e o laço de amplificação de via terminal associada que amplifica a ativação iniciada por C1q de moléculas efetoras de complemento terminal. Nós nos referimos a estes dois sistemas de ativação de complemento principais como o sistema de complemento dependente da lectina e o sistema de complemento dependente de C1q, respectivamente.

[000192] Além do seu papel essencial na defesa imune, o sistema de complemento contribui para o dano a tecido em muitas condições clínicas. Assim, existe uma necessidade urgente para desenvolver inibidores de complemento terapeuticamente eficazes para prevenir estes efeitos adversos.

[000193] Como descrito na Patente U.S. No. 7.919.094, Pedido de Patente U.S. copendente No. de Série 12/905.972 (publicado como US 2011/0091450), e Pedido de Patente U.S. copendendente No. de Série 13/083.441 (publicado como US2011/0311549), cada um dos quais é designado à Omeros Corporation, o cessionário do presente pedido, e cada um dos quais é por meio deste incorporado por referência, foi determinado através do uso de um modelo de camundongo MASP2 -/- que é possível inibir a via de MASP-2 mediada pela lectina enquanto deixa a via clássica intacta. Com o reconhecimento de que é possível inibir a via de MASP-2 mediada pela lectina enquanto se deixa a via clássica intacta vem a compreensão de que seria altamente desejável inibir especificamente apenas o sistema de ativação de complemento que causa uma patologia particular sem paralisar completamente as capacidades de defensa imune de complemento. Por exemplo, em estados de doença em que a ativação de complemento é mediada predominantemente pelo sistema de complemento dependente de lectina, seria vantajoso especificamente inibir apenas este sistema. Isto deixaria o sistema de ativação de complemento dependente de C1q intacto para manusear no processamento imune do complexo e para ajudar na defesa do hospedeiro contra infecção.

[000194] O componente de proteína preferido para alvejar no desenvolvimento de agentes terapêuticos para especificamente inibir o sistema de complemento dependente de lectina é MASP-2. De todos os componentes de proteína conhecida do sistema de complemento dependente de lectina (MBL, H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina, MASP-2, C2-C9, Fator B, Fator D, e properdina), apenas MASP-2 é tanto única para o sistema de complemento dependente de lectina quanto requerida para o sistema funcionar. As lectinas (MBL, H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina e CL-11) também são componentes únicos no sistema de complemento dependente de lectina. Entretanto, a perda de qualquer um dos componentes de lectina não necessariamente inibiria a ativação do sistema devido à redundância da lectina. Seria necessário inibir todas as cinco lectinas de modo a garantir a inibição do sistema de ativação de complemento dependente de lectina. Além disso, visto que MBL e as ficolinas também são conhecidas ter atividade opsônica independente de complemento, a inibição da função da lectina resultaria na perda deste mecanismo de defesa benéfico do hospedeiro contra infecção. Ao contrário, esta atividade opsônica da lectina independente de complemento permaneceria intacta se MASP-2 fosse o alvo da inibição. Um benefício adicionado de MASP-2 como o alvo terapêutico para inibir o sistema de ativação de complemento dependente de lectina é que a concentração plasmática de MASP-2 está entre as mais baixas de qualquer proteína de complemento (~ 500 ng/ml); portanto, correspondentemente concentrações baixas de inibidores de alta afinidade de MASP-2 são suficientes para se obter a inibição completa, como aqui demonstrado nos exemplos.

[000195] De acordo com o precedente, como aqui descrito, a presente invenção fornece anticorpos anti-MASP-2 monoclonal totalmente humano que se liga à MASP-2 humana com alta afinidade e são capaz de inibir a ativação da via de complemento mediado por lectina.

III. ANTICORPOS INIBIDORES DE MASP-2

[000196] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-MASP- 2 monoclonal totalmente humano, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que especificamente se liga à MASP-2 humana e inibe ou bloqueia a ativação de complemento dependente de MASP-2. Os anticorpos inibidores de MASP-2 podem eficazmente inibir ou eficazmente bloquear o sistema de ativação de complemento dependente de MASP-2 pela inibição ou bloqueio da função biológica de MASP-2. Por exemplo, um anticorpo inibidor pode eficazmente inibir ou bloquear interação de proteína à proteína de MASP-2, interferir com a dimerização ou montagem de MASP-2, bloquear a ligação de Ca2+, ou interferir com o sítio ativo da serina protease de MASP-2. Epítopos de MASP-2

[000197] A invenção fornece anticorpos totalmente humanos que especificamente se ligam à MASP-2 humana. O polipeptídeo de MASP-2 exibe uma estrutura molecular similar ao MASP-1, MASP-3, e C1r e C1s, as proteases do sistema de complemento C1. A molécula de cDNA apresentada na SEQ ID NO: 1 codifica um exemplo representativo de MASP-2 (que consiste da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 2) e fornece o polipeptídeo de MASP-2 humano com uma sequência líder (aa 1 a 15) que é clivada depois da secreção, resultando na forma madura da MASP-2 de ser humano (SEQ ID NO: 3). Como mostrado na FIGURA 1A, o gene MASP 2 de ser humano abrange doze exons. O cDNA de MASP-2 de ser humano é codificado pelos exons B, C, D, F, G, H, I, J, K E L. A molécula de cDNA apresentada na SEQ ID NO: 4 codifica a MASP-2 de rato (que consiste da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 5) e fornece o polipeptídeo de MASP-2 de rato com uma sequência líder que é clivada depois da secreção, que resulta na forma madura de MASP-2 de rato (SEQ ID NO: 6).

[000198] Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que as sequências divulgadas na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 4 representam alelos únicos de MASP-2 de ser humano e rato respectivamente, e que a variação alélica e junção alternativa são esperadas ocorrer. As variantes alélicas das sequências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 4, incluindo aquelas que contém mutações silenciosas e aquelas em que as mutações resultam nas mudanças da sequência de aminoácido, estão dentro do escopo da presente invenção. As variantes alélicas da sequência de MASP-2 podem ser clonadas pela sondagem de bibliotecas de cDNA ou genômicas de indivíduos diferentes de acordo com procedimentos padrão.

[000199] Os domínios da proteína MASP-2 de ser humano (SEQ ID NO: 3) são mostrados na FIGURA 1B e Tabela 1 abaixo e incluem um domínio de terminal N da proteína morfogênica C1r/C1s/VEGF de ouriço do mar/ proteína morfogênica óssea (CUBI), um domínio equivalente ao fator de crescimento epidérmico, um segundo domínio CUB (CUBII), assim como um tandem de domínios de proteína de controle de complemento CCP1 e CCP2, e um domínio de serina protease. A junção alternativa do gene MASP 2 resulta em MAp19. MAp19 é uma proteína não enzimática que contém a região CUB1-EGF de terminal N de MASP-2 com quatro resíduos adicionais (EQSL).

[000200] Várias proteínas foram mostradas ligar-se a, ou interagir com MASP-2 através das interações de proteína para proteína. Por exemplo, MASP-2 é conhecido ligar-se a, e forma complexos dependentes de Ca2+ com, as proteínas MBL da lectina, H-ficolina e L-ficolina. Cada complexo de MASP-2/lectina foi mostrado ativar complemento através da clivagem dependente de MASP-2 das proteínas C4 e C2 (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262: 7451-7454, 1987; Matsushita, M., et al., J. Exp. Med. 176: 14972284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168: 3502-3506, 2002). Os estudos têm mostrado que os domínios CUB1-EGF de MASP-2 são essenciais para a associação de MASP-2 com MBL (Thielens, N. M., et al., J. Immunol. 166: 5068, 2001). Também foi mostrado que os domínios CUB1EGFCUBII medeiam a dimerização de MASP-2, que é requerida para a formação de um complexo de MBL ativo (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 275: 30962-30969, 2000). Portanto, os anticorpos inibidores de MASP-2 podem ser identificados que se ligam à ou interferem com as regiões alvo de MASP-2 conhecidas por serem importantes para a ativação de complemento dependente de MASP-2. TABELA 1: Domínios de Polipeptídeo de MASP-2

[000201] Em uma forma de realização, os anticorpos inibidores anti- MASP-2 da invenção se ligam a uma porção da proteína de MASP-2 humana de tamanho natural (SEQ ID NO: 3), tal como os domínios CUBI, EGF, CUBII, CCPI, CCPII, ou SP de MASP-2. Em algumas formas de realização, os anticorpos inibidores anti-MASP-2 da invenção se ligam a um epítopo no domínio CCP1 (SEQ ID NO: 13 (aa 278-347 da SEQ ID NO: 3)). Por exemplo, anticorpos anti-MASP-2 (por exemplo, OMS646) foram identificados que apenas se ligam as fragmentos de MASP-2 que contém o domínio CCP1 e inibe a ativação de complemento dependente de MASP-2, como descrito no Exemplo 9.

Afinidade de Ligação de Anticorpos Inibidores de MASP-2

[000202] Os anticorpos inibidores anti-MASP-2 especificamente se ligam à MASP-2 humana (apresentada como a SEQ ID NO: 3, codificada pela SEQ ID NO: 1), com uma afinidade de pelo menos dez vezes maior do que aos outros antígenos no sistema de complemento. Em algumas formas de realização, os anticorpos inibidores de MASP-2 especificamente se ligam à MASP-2 humana com uma afinidade de ligação de pelo menos 100 vezes maior do que a outros antígenos no sistema de complemento.

[000203] Em algumas formas de realização, os anticorpos inibidores de MASP-2 especificamente se ligam a MASP-2 humana com um KD (constante de dissociação) de menos do que cerca de 100 nM, ou menos do que cerca de 50 nM, ou menos do que cerca de 25 nM, ou menos do que cerca de 10 nM, ou menos do que cerca de 5 nM, ou menos do que ou igual a cerca de 1 nM, ou menos do que ou igual a 0,1 nM. A afinidade de ligação dos anticorpos inibidores de MASP-2 pode ser determinada usando um ensaio de ligação adequado conhecido na técnica, tal como um ensaio de ELISA, como descrito nos Exemplos 3-5 aqui.

Potência dos Anticorpos Inibidores de MASP-2

[000204] Em uma forma de realização, um anticorpo inibidor de MASP- 2 é suficientemente potente para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em uma IC50 < 30 nM, preferivelmente menor do que ou de cerca de 20 nM, ou menor do que cerca de 10 nM ou menor do que cerca de 5 nM, ou menor do que ou igual a cerca de 3 nM, ou menor do que ou igual a cerca de 1 nM quando medida em 1 % de soro.

[000205] Em uma forma de realização, um Anticorpo inibidor de MASP-2 é suficientemente potente para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em uma IC50 < 30 nM, preferivelmente menor do que ou de cerca de 20 nM, ou menor do que cerca de 10 nM ou menor do que cerca de 5 nM, ou menor do que ou igual a cerca de 3 nM, ou menor do que ou igual a cerca de 1 nM, quando medida em 90 % de soro.

[000206] A inibição da ativação de complemento dependente de MASP- 2 é caracterizada por pelo menos uma das mudanças que seguem em um componente do sistema de complemento que ocorre como um resultado da administração de um anticorpo inibidor de MASP-2: a inibição da geração ou produção de produtos do sistema de ativação de complemento dependente de MASP-2 C4a, C3a, C5a e/ou C5b-9 (MAC) (medida, por exemplo, como descrito no Exemplo 2 da Patente US No. 7.919.094) assim como os seus produtos de degradação catabólica (por exemplo, C3desArg), a redução da clivagem de C4 e deposição de C4b (medida, por exemplo, como descrito no Exemplo 5) e os seus produtos da degradação catabólica subsequente (por exemplo, C4bc ou C4d), ou a redução da clivagem de C3 e deposição de C3b (medida, por exemplo, como descrito no Exemplo 5), ou os seus produtos de degradação catabólica subsequentes (por exemplo, C3bc, C3d, etc).

[000207] Em algumas formas de realização, os anticorpos inibidores de MASP-2 da invenção são capazes de inibir a deposição de C3 em soro integral a menos do que 80 %, tal como menor do que 70 %, tal como menor do que 60 %, tal como menor do que 50 %, tal como menor do que 40 %, tal como menor do que 30 %, tal como menor do que 20 %, tal como menor do que 15 %, tal como menor do que 10 % da deposição de C3 de controle.

[000208] Em algumas formas de realização, os anticorpos inibidores de MASP-2 da invenção são capazes de inibir a deposição de C4 em soro integral a menos do que 80 %, tal como menor do que 70 %, tal como menor do que 60 %, tal como menor do que 50 %, tal como menor do que 40 %, tal como menor do que 30 %, tal como menor do que 20 %, tal como menor do que 15 %, tal como menor do que 10 % da deposição de C4 de controle.

[000209] Em algumas formas de realização, os anticorpos inibidores anti-MASP-2 seletivamente inibem a ativação de complemento de MASP-2 (isto é, ligam-se a MASP-2 com afinidade de pelo menos 100 vezes ou maior do que a Clr ou Cls), deixando o sistema de ativação de complemento dependente de Clq funcionalmente intacto (isto é, pelo menos 80 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 98 %, ou 100 % da atividade da via clássica é retida).

[000210] Em algumas formas de realização, os anticorpos inibidores anti-MASP-2 objetos têm as características que seguem: (a) alta afinidade para MASP-2 humana (por exemplo, um KD de 10 nM ou menos, preferivelmente um KD de 1 nM ou menos), e (b) inibe a atividade de complemento dependente de MASP-2 em 90 % de soro humano com uma IC50 de 30 nM ou menos, preferivelmente uma IC50 de 10 nM ou menos).

[000211] Como descrito nos Exemplos 2-12, anticorpos totalmente humanos foram identificados que se ligam com alta afinidade a MASP-2 e inibe a ativação de complemento mediada por lectina enquanto deixa o componente da via clássica (dependente de Clq) do sistema imune intacto. Os fragmentos de cadeia leve e pesada variável dos anticorpos foram sequenciados, isolados e analisados tanto em um formato scFv e em um formato IgG de tamanho natural. A FIGURA 5A é um alinhamento de sequência de aminoácido de sete clones scFv anti-MASP-2 que foram identificados como tendo alta afinidade de ligação a MASP-2 e a capacidade para inibir a atividade dependente de MASP-2. A FIGURA 5B é um alinhamento de sequência de aminoácido de quatro dos clones mães de scFv 17D20, 17N16, 18L16 e 4D9, que mostram as regiões de matriz e as regiões de CDR. Os clones mães de scFv 17D20 e 17N16 foram submetidos à maturação de afinidade, levando à geração de clones filhas com afinidade mais alta e potência aumentada quando comparada com clones mães, como descrito nos Exemplos 6 e 7. As sequências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada (VH) (aa 1-120) e das regiões variáveis das cadeias leves (VL) (aa 148-250) dos clones scFv mostrados nas FIGURAS 5A e 5B e os clones filhas resultantes, são fornecidas abaixo na TABELA 2.

[000212] As posições substituíveis de um inibidor de anticorpo anti- MASP-2 humana, assim como a escolha de aminoácidos que podem ser substituídos nestas posições, são reveladas pelo alinhamento das sequências de aminoácido de cadeia pesada e leve dos anticorpos inibidores anti-MASP-2 debatidas acima, e determinando que os aminoácidos ocorrem nestas posições destes anticorpos. Em uma forma de realização exemplar, as sequências de aminoácido de cadeia pesada e leve das FIGURAS 5A e 5B são alinhadas, e a identidade dos aminoácidos em cada posição dos anticorpos exemplares é determinada. Como ilustrado nas FIGURAS 5A e 5B (que ilustram os aminoácidos presentes em cada posição das cadeias pesadas e leves dos anticorpos inibidores de MASP-2 exemplares), várias posições substituíveis, assim como os resíduos de aminoácido que podem ser substituídos nestas posições, são facilmente identificadas. Em uma outra forma de realização exemplar, as sequências de aminoácido da cadeia leve dos clones mães e filhas são alinhadas e a identidade dos aminoácidos em cada posição dos anticorpos exemplares é determinada de modo a determinar as posições substituíveis, assim como os resíduos de aminoácido que podem ser substituídos nestas posições. TABELA 2: Sequências de anticorpos anti-MASP-2 representativos

[000213] Em certas formas de realização, um anticorpo inibidor monoclonal anti-MASP-2 humano objeto tem um domínio variável de cadeia pesada que é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 % idêntico, ou pelo menos cerca de 97 % idêntico, ou pelo menos cerca de 98 % idêntico, ou pelo menos 99 % idêntico), a aquele de qualquer uma das sequências de domínio variável da cadeia pesada apresentada na TABELA 2.

[000214] Em algumas formas de realização, um anticorpo inibidor monoclonal anti-MASP-2 humano objeto tem um domínio variável de cadeia pesada que é substancialmente idêntico (por exemplo, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 % idêntico, ou pelo menos cerca de 97 % idêntico, ou pelo menos cerca de 98 % idêntico, ou pelo menos 99 % idêntico) a 17D20 (VH), apresentada como a SEQ ID NO: 18. Em algumas formas de realização, o anticorpo inibidor monoclonal anti-MASP-2 humano objeto tem um domínio variável de cadeia pesada que compreende, ou consiste da SEQ ID NO: 18.

[000215] Em algumas formas de realização, um anticorpo inibidor monoclonal anti-MASP-2 humano objeto tem um domínio variável de cadeia pesada que é substancialmente idêntico (por exemplo pelo menos cerca de 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 % idêntico, pelo menos cerca de 97 % idêntico, pelo menos cerca de 98 % idêntico, ou pelo menos 99 % idêntico) à 17D20 cd35VH2N11 (VH), apresentada como SEQ ID NO: 20. Em algumas formas de realização, o anticorpo inibidor monoclonal anti-MASP-2 humano objeto tem um domínio variável de cadeia pesada que compreende, ou consiste da SEQ ID NO: 20.

[000216] Em algumas formas de realização, um anticorpo inibidor monoclonal anti-MASP-2 humano objeto tem um domínio variável de cadeia pesada que é substancialmente idêntico (por exemplo, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 % idêntico, ou pelo menos cerca de 97 % idêntico, ou pelo menos cerca de 98 % idêntico, ou pelo menos 99 % idêntico) à 17N16 (VH), apresentada como a SEQ ID NO: 21. Em algumas formas de realização, o anticorpo inibidor monoclonal anti-MASP-2 humano objeto tem um domínio variável de cadeia pesada que compreende, ou consiste da SEQ ID NO: 21.

[000217] Em algumas formas de realização, um anticorpo inibidor monoclonal anti-MASP-2 humano objeto tem um domínio variável da cadeia leve que é substancialmente idêntico (por exemplo, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 % idêntico, ou pelo menos cerca de 97 % idêntico, ou pelo menos cerca de 98 % idêntico, ou pelo menos 99 % idêntico), a aquele de qualquer uma das sequências de domínio variável de cadeia leve apresentadas na TABELA 2.

[000218] Em algumas formas de realização, um anticorpo inibidor monoclonal anti-MASP-2 humano objeto tem um domínio variável da cadeia leve que é substancialmente idêntico (por exemplo, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 % idêntico, ou pelo menos cerca de 97 % idêntico, ou pelo menos cerca de 98 % idêntico, ou pelo menos 99 % idêntico) à 17D20 (VL), apresentada como a SEQ ID NO: 22. Em algumas formas de realização, o anticorpo inibidor monoclonal anti-MASP-2 humano objeto tem uma cadeia leve que compreende, ou consiste da SEQ ID NO: 22.

[000219] Em algumas formas de realização, um anticorpo inibidor monoclonal anti-MASP-2 humano objeto tem um domínio variável da cadeia leve que é substancialmente idêntico (por exemplo, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 % idêntico, ou pelo menos cerca de 97 % idêntico, ou pelo menos cerca de 98 % idêntico, ou pelo menos 99 % idêntico) à 17D20 35VH-21N11VL (VL), apresentada como a SEQ ID NO: 24. Em algumas formas de realização, o anticorpo inibidor monoclonal anti-MASP-2 humano objeto tem uma cadeia leve que compreende, ou consiste da SEQ ID NO: 24.

[000220] Em algumas formas de realização, um anticorpo inibidor monoclonal anti-MASP-2 humano objeto tem um domínio variável da cadeia leve que é substancialmente idêntico (por exemplo, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 % idêntico, ou pelo menos cerca de 97 % idêntico, ou pelo menos cerca de 98 % idêntico, ou pelo menos 99 % idêntico) à 17N16 (VL), apresentada como a SEQ ID NO: 25. Em algumas formas de realização, o anticorpo inibidor monoclonal anti-MASP-2 humano objeto tem uma cadeia leve que compreende, ou consiste da SEQ ID NO: 25.

[000221] Em algumas formas de realização, um anticorpo inibidor monoclonal anti-MASP-2 humano objeto tem um domínio variável da cadeia leve que é substancialmente idêntico (por exemplo, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 % idêntico, ou pelo menos cerca de 97 % idêntico, ou pelo menos cerca de 98 % idêntico, ou pelo menos 99 % idêntico) à 17N16 17N9 (VL), apresentada como a SEQ ID NO: 27. Em algumas formas de realização, o anticorpo inibidor monoclonal anti-MASP-2 humano objeto tem uma cadeia leve que compreende, ou consiste da SEQ ID NO: 27.

[000222] Em algumas formas de realização, os anticorpos anti-MASP-2 da invenção contêm uma cadeia pesada ou leve que é codificada por uma sequência de nucleotídeo que hibridiza sob condições de alta severidade a uma sequência de nucleotídeo que codifica uma cadeia pesada ou leve, como apresentada na TABELA 2. As condições de alta severidade incluem incubação a 50 °C ou mais alta em 0,1 x SSC (15 mM de solução salina/0,15 mM de citrato de sódio).

[000223] Em algumas formas de realização, os anticorpos inibidores anti-MASP-2 da invenção têm uma região variável da cadeia pesada que compreende uma ou mais CDRs (CDR1, CDR2 e/ou CDR3) que são substancialmente idênticas (por exemplo, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 % idênticas, ou pelo menos cerca de 97 % idênticas, ou pelo menos cerca de 98 % idênticas, ou pelo menos 99 % idênticas), ou compreendem ou consistem da sequência idêntica quando comparadas com a sequência de aminoácido das CDRs de qualquer uma das sequências de cadeia pesada variável mostradas nas FIGURAS 5A ou 5B, ou descritas abaixo nas TABELAS 3A-F e TABELA 4.

[000224] Em algumas formas de realização, os anticorpos inibidores anti-MASP-2 da invenção têm uma região variável da cadeia leve que compreende uma ou mais CDRs (CDR1, CDR2 e/ou CDR3) que são substancialmente idênticas (por exemplo, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 % idênticas, ou pelo menos cerca de 97 % idênticas, ou pelo menos cerca de 98 % idênticas, ou pelo menos 99 % idênticas), ou compreendem ou consistem da sequência idêntico quando comparada com a sequência de aminoácido das CDRs de qualquer uma das sequências de cadeia leve variável mostradas nas FIGURAS 5A ou 5B, ou descritas abaixo nas TABLES 4A-F e TABELA 5. Região variável da cadeia pesada TABELA 3A: Cadeia pesada (aa 1-20)

TABELA 3B: Cadeia Pesada (aa 21-40)

TABELA 3C: Cadeia pesada (aa 41-60)

TABELA 3D: Cadeia pesada (aa 61-80)

TABELA 3E: Cadeia pesada (aa 81-100)

TABELA 3F: cadeia pesada (aa 101-118)

[000225] Apresentados abaixo estão as sequências da região variável da cadeia pesada (VH) para os clones mães e clones filhas listados acima na TABELA 2 e TABELAS 3A-F.

[000226] As CDRs de Kabat (31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3)) estão em negrito; e as CDRs de Chotia (26-32 (H1), 52-56 (H2) e 95-101 (H3)) estão sublinhadas. Região variável da cadeia pesada (VH) 17D20 (SEQ ID NO: 18X QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKMGVSWIRQPPGKAL EWLAHIFSSDEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTAT YYCARIRAGGIDYWGQGTLVTVS S Região variável da cadeia pesada (VH) 17D20 35VH- 21N11VL (SEQ ID NO: 20) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKMGVSWIRQPPGKAL EWLAHIFSSDEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTAT YYCARIRRGGIDYWGQGTLVTVS S Região variável da cadeia pesada (VH) 17N16 (SEQ ID NO: 21 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTSAAWNWIRQSPSRGLE WLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTA VYYCARDPFGVPFDIWGQGTMVTVSS TABELA 4: CDRs da Cadeia Pesada

Região variável das cadeias leves TABELA 5A: Cadeia leve (aa 1-20)

TABELA 5B: Cadeia leve (aa 21-40)

TABELA 5C: Cadeia leve (aa 41-60)

TABELA 5D: Cadeia leve (aa 61-80)

TABELA 5E: Cadeia leve (aa 81-100)

TABELA 5F: Cadeia leve (aa 101-120)

[000227] São apresentadas abaixo as sequências da região variável da cadeia leve (VL) para os clones mães e clones filhas listados acima na TABELA 2 e TABELAS 5A-F.

[000228] As CDRs de Kabat (24-34 (L1); 50-56 (L2); e 89-97 (L3) estão em negrito; e as CDRs de Chotia (24-34 (L1); 50-56 (L2) e 89-97 (L3) estão sublinhadas. Estas regiões são as mesmas se numeradas pelo sistema de Kabat ou Chotia. Região variável da cadeia leve (VL) 17D20m (SEQ ID NO: 22) QPVLTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKFAYWYQQKPGHSPVLVI YQDNKRPSGIPGRFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSST AVFGTGTKVTVLA Região variável da cadeia leve (VL) 17D20m d3521N11 (SEQ ID NO: 24) QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCSGEKLGDKYAYWYQQKPGQSPVLV MYQDKQRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDS STAVFGGGTKLTVL Região variável da cadeia leve (VL) 17N16m (SEQ ID NO: 25 SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLV VYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTVSRVEAGDEADYYCQVWDT TTDHVVFGGGTKLTVLAAAGSEQKLISE Região variável da cadeia leve (VL) 17N16m d17N9 (SEQ ID NO: 27) SYELIQPPSVSVAPGQTATITCAGDNLGKKRVHWYQQRPGQAPVLVI YDDSDRPSGIPDRFSASNSGNTATLTITRGEAGDEADYYCQVWDIAT DHVVFGGGTKLTVLAAAGSEQKLISE TABELA 6: CDRs da Cadeia Leve (Kabat/chotia)

[000229] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonal humano isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que se liga à MASP-2 humana, que compreende: (i) uma região variável da cadeia pesada que compreende as sequências de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3; e (ii) uma região variável da cadeia leve que compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que a sequência da região variável da cadeia pesada CDR-H3 compreende uma sequência de aminoácido apresentada como a SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 90, e modificações de sequências conservativas do mesmo, em que a região variável da cadeia leve sequência de CDR-L3 compreende uma sequência de aminoácido apresentada como SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 94, e modificações de sequência conservativas do mesmo, e em que o anticorpo isolado inibe a ativação de complemento dependente de MASP-2.

[000230] Em uma forma de realização, a sequência da região variável da cadeia pesada de CDR-H2 compreende uma sequência de aminoácido apresentada como a SEQ ID NO: 32 ou 33, e modificações de sequência conservativas da mesma. Em uma forma de realização, a sequência da região variável da cadeia pesada de CDR-H1 compreende uma sequência de aminoácido apresentada como a SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29, e modificações conservativas da mesma. Em uma forma de realização, a sequência da região variável da cadeia leve de CDR-L2 compreende uma sequência de aminoácido apresentada como SEQ ID NO: 93 e modificações conservativas da mesma. Em uma forma de realização, a sequência da região variável da cadeia leve de CDR-L1 compreende uma sequência de aminoácido apresentada como a SEQ ID NO: 91 ou SEQ ID NO: 92 e modificações conservativas da mesma. Em uma forma de realização, a CDR- H1 da região variável da cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 28.

[000231] Em uma forma de realização, a CDR-H2 da região variável da cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 32. Em uma forma de realização, a CDR-H3 da região variável da cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 90, (como mostrada na TABELA 4). Em uma forma de realização, a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 90 contém um R (Arg) na posição 8.

[000232] Em uma forma de realização, a CDR-L1 da região variável da cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 91 (como mostrada na TABELA 6). Em uma forma de realização, o aminoácido apresentado na SEQ ID NO: 91 contém um E (Glu) na posição 2. Em uma forma de realização, a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 91 contém um Y (Tyr) na posição 8.

[000233] Em uma forma de realização, a CDR-L2 da região variável da cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 93 (como mostrada na TABELA 6), e em que a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 93 contém um K (Lys) na posição 2. Em uma forma de realização, a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 93 contém um Q (Gln) na posição 3.

[000234] Em uma forma de realização, a CDR-L3 da região variável da cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 51.

[000235] Em uma forma de realização, o dito anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo ligam-se à MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos. Em uma forma de realização, o dito anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inibem a ativação de C4 em um ensaio in vitro em 1 % de soro humano a uma IC50 de 10 nM ou menos. Em uma forma de realização, o dito anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inibe a ativação de C4 em 90 % de soro humano com uma IC50 de 30 nM ou menos. Em uma forma de realização, as modificações de sequência conservativas do mesmo compreendem ou consistem de uma molécula que contém regiões variáveis que são idênticas ao(s) domínio(s) variável(is) citada(s), exceto para um total combinado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 9 ou 10 substituições de aminoácido dentro das regiões de CDR da região variável da cadeia pesada, e/ou até um total combinado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições de aminoácido com as ditas regiões de CDR da região variável da cadeia leve.

[000236] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo isolado humano, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que se liga à MASP-2 humana em que o anticorpo compreende: I) a) uma região variável da cadeia pesada que compreende: i) uma cadeia pesada CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácido de 31-35 da SEQ ID NO: 21; e ii) uma cadeia pesada CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácido de 50-65 da SEQ ID NO: 21; e iii) uma cadeia pesada CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácido de 95-102 da SEQ ID NO: 21; e b) uma região variável da cadeia leve que compreende: i) uma cadeia leve CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácido de 24-34 da SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27; e ii) uma cadeia leve CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácido de 50-56 da SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27; e iii) uma cadeia leve CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácido de 89-97 da SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27; ou II) uma variante da mesma que é de outro modo idêntica aos ditos domínios variáveis, exceto até um total combinado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de aminoácido dentro das ditas regiões de CDR da dita região variável da cadeia pesada e até um total combinado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições de aminoácido dentro das ditas regiões de CDR da dita região variável da cadeia leve, em que o anticorpo ou variante do mesmo inibem a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma forma de realização, a dita variante compreende uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste da posição 31, 32, 33, 34, 35, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou 102 da dita região variável da cadeia pesada. Em uma forma de realização, a dita variante compreende uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste da posição 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 51, 52, 89, 92, 93, 95, 96 ou 97 da dita região variável da cadeia leve. Em uma forma de realização, a cadeia pesada do dito anticorpo compreende a SEQ ID NO: 21. Em uma forma de realização, a cadeia leve do dito anticorpo compreende a SEQ ID NO: 25. Em uma forma de realização, a cadeia leve do dito anticorpo compreende a SEQ ID NO: 27.

[000237] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonal humano isolado que se liga à MASP-2 humana, em que o anticorpo compreende: I) a) uma região variável da cadeia pesada que compreende: i) uma cadeia pesada CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácido de 31-35 da SEQ ID NO: 20; e ii) uma cadeia pesada CDRH-2 que compreende a sequência de aminoácido de 50-65 da SEQ ID NO: 20; e iii) uma cadeia pesada CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácido de 95-102 da SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 20; e b) uma região variável da cadeia leve que compreende: i) uma cadeia leve CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácido de 24-34 da SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 24; e ii) uma cadeia leve CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácido de 50-56 da SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 24; e iii) uma cadeia leve CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácido de 89-97 da SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 24; ou II) uma variante da mesma que é de outro modo idêntica aos ditos domínios variáveis, exceto até um total combinado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições de aminoácido dentro das ditas regiões de CDR da dita região variável da cadeia pesada e até um total combinado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições de aminoácido dentro das ditas regiões de CDR da dita região variável da cadeia leve, em que o anticorpo ou variante do mesmo inibe a ativação de complemento dependente de MASP-2. Em uma forma de realização, a dita variante compreende uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições selecionado do grupo que consiste das posições 31, 32, 33, 34, 35, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou 102 da dita região variável da cadeia pesada. Em uma forma de realização, a dita variante compreende uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste das posições 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 51, 52, 89, 92, 93, 95, 96 ou 97 da dita região variável da cadeia leve. Em uma forma de realização, a cadeia pesada do dito anticorpo compreende a SEQ ID NO: 20, ou uma variante da mesma que compreende pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO: 20 (por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 20). Em uma forma de realização, a cadeia pesada do dito anticorpo compreende a SEQ ID NO: 18, ou uma variante da mesma que compreende pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO: 18 (por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 18). Em uma forma de realização, a cadeia leve do dito anticorpo compreende a SEQ ID NO: 22, ou uma variante da mesma que compreende pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO: 22 (por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 22). Em uma forma de realização, a cadeia leve do dito anticorpo compreende a SEQ ID NO: 24, ou uma variante da mesma que compreende pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO: 24 (por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % de identidade com a SEQ ID NO: 24).

[000238] Em uma forma de realização, o dito anticorpo se liga a um epítopo no domínio CCP1 de MASP-2.

[000239] Em uma forma de realização, o dito anticorpo se liga à MASP- 2 humana com um KD de 10 nM ou menos. Em uma forma de realização, o dito anticorpo inibe deposição de C3b em um ensaio in vitro em 1 % de soro humano em uma IC50 de 10 nM ou menos. Em uma forma de realização, o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em 90 % de soro humano com uma IC50 de 30 nM ou menos.

[000240] Em uma forma de realização, o dito anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo que consiste de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2. Em uma forma de realização, o dito anticorpo é uma molécula de cadeia única. Em uma forma de realização, o dito anticorpo é uma molécula de IgG2. Em uma forma de realização, o dito anticorpo é uma molécula de IgG1. Em uma forma de realização, o dito anticorpo é uma molécula de IgG4. Em uma forma de realização, a dita molécula de IgG4 compreende uma mutação S228P.

[000241] Em uma forma de realização, o dito anticorpo não inibe substancialmente a via clássica (isto é, a atividade da via clássica é pelo menos 80 %, ou pelo menos 90 % ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 95 % intacta).

[000242] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonal humano totalmente isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se dissociam da MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos como determinado pela ressonância de plasmon de superfície e inibem a ativação de C4 em um substrato revestido com manana com uma IC50 de 10 nM ou menos em 1 % de soro. Em algumas formas de realização, o dito anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo especificamente reconhece pelo menos parte de um epítopo reconhecido por um anticorpo de referência que compreende uma região variável da cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 20 e uma região variável da cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 24, tal como anticorpo de referência OMS646 (ver a TABELA 22). De acordo com o precedente, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com certas formas de realização preferidas do presente pedido pode ser um que compete quanto à ligação à MASP-2 humana com qualquer anticorpo aqui descrito que tanto (i) especificamente se liga ao antígeno quanto (ii) compreende um domínio VH e/ou VL aqui divulgados, ou compreende uma CDR-H3 aqui divulgada, ou uma variante de qualquer uma destas. A competição entre membros de ligação pode ser ensaiada facilmente in vitro, por exemplo usando ELISA e/ou pela rotulação de uma molécula repórter específica a um membro de ligação que pode ser detectado na presença de outro(s) membro(s) de ligação não rotulado(s), para permitir que a identificação de membros específicos de ligação que se ligam ao mesmo epítopo ou um epítopo de sobreposição. Assim, é presentemente fornecido um anticorpo específico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que compreende um sítio de ligação de antígeno de anticorpo humano que compete com um anticorpo aqui descrito que se liga à MASP-2 humana, tal como qualquer um de OMS641 a OMS646 como apresentado na TABELA 24, quanto à ligação à MASP-2 humana.

Anticorpos inibidores de MASP-2

[000243] Os anticorpos monoclonais humanos acima descritos podem ser modificados para fornecer anticorpos variantes que inibem a ativação de complemento dependente de MASP-2. Os anticorpos variantes podem ser fabricados pela substituição, adição, ou deleção de pelo menos um aminoácido de um anticorpo monoclonal humano descrito acima. No geral, estes anticorpos variantes têm as características gerais dos anticorpo humanos descritos acima e contêm pelo menos as CDRs de um anticorpo humano descrito acima, ou, em certas formas de realização, CDRs que são muito similar às CDRs de um anticorpo humano descrito acima.

[000244] Na forma de realização preferida, a variante compreende uma ou mais substituições de aminoácido em uma ou mais regiões hipervariáveis do anticorpo precursor. Por exemplo, a variante pode compreender pelo menos um, por exemplo, de cerca de um a cerca de dez, tal como pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 substituições, e preferivelmente de cerca de dois a cerca de seis, substituições em uma ou mais regiões de CDR do anticorpo precursor. Em uma forma de realização, a dita variante compreende uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste das posições 31, 32, 33, 34, 35, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou 102 da dita região variável da cadeia pesada. Em uma forma de realização, a dita variante compreende uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste das posições 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 51, 52, 89, 92, 93, 95, 96 ou 97 da dita região variável da cadeia leve.

[000245] Em algumas formas de realização, os anticorpos variantes têm uma sequência de aminoácido que é de outro modo idêntico ao domínio variável de um anticorpo objeto apresentado na TABELA 2, exceto até um total combinado de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 substituições de aminoácido dentro das ditas regiões de CDR da dita região variável da cadeia pesada e/ou até um total combinado de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 substituições de aminoácido dentro das ditas regiões de CDR da dita região de cadeia leve variável, em que o anticorpo ou variante do mesmo inibe a ativação de complemento dependente de MASP-2.

[000246] Ordinariamente, a variante terá uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 75 % de identidade da sequência de aminoácido com as sequências de domínio variável de cadeia pesada ou leve do anticorpo precursor, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, e o mais preferivelmente pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade. A identidade ou homologia com relação a esta sequência são definidos aqui como a porcentagem de resíduos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos com os resíduos do anticorpo precursor, depois alinhar as sequências e introduzir intervalos, se necessário, para se obter a identidade de sequência percentual máxima. Nenhuma das extensões, deleções, ou inserções de terminal N, de terminal C, ou internas na sequência de anticorpo (tal como, por exemplo, sequências de peptídeo de sinal, sequências ligantes, ou rótulos, tais como rótulos HIS) devem ser interpretadas como afetando a identidade ou homologia de sequência. A variante retém a capacidade para ligar MASP-2 humana e preferivelmente tem propriedades que são superiores àquelas do anticorpo precursor. Por exemplo, a variante pode ter uma afinidade de ligação mais forte e/ou uma capacidade realçada para inibir ou bloquear a ativação de complemento dependente de MASP-2.

[000247] Para analisar tais propriedades, deve-se comparar uma forma de Fab da variante com uma forma de Fab do anticorpo precursor ou uma forma de tamanho natural da variante com uma forma de tamanho natural do anticorpo precursor, por exemplo, desde que foi descoberto que o formato do anticorpo anti-MASP-2 impacta a sua atividade nos ensaios de atividade biológica aqui divulgados. O anticorpo variante de interesse particular aqui é um que demonstra pelo menos cerca de 10 vezes, preferivelmente pelo menos cerca de 20 vezes, e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 50 vezes, o realce na atividade biológica quando comparado com o anticorpo precursor.

[000248] Os anticorpos da invenção podem ser modificados para realçar propriedades desejáveis, tais como podem ser desejáveis para controlar a meia-vida sérica do anticorpo. No geral, as moléculas de anticorpo completas têm uma persistência no soro muito longa, ao passo que fragmentos (<60-80 kDa) são filtrados muito rapidamente através dos rins. Consequentemente, se ação de longa duração do anticorpo de MASP-2 é desejável, o anticorpo de MASP-2 é preferivelmente um anticorpo de IgG de tamanho natural completo (tal como IgG2 ou IgG4), ao passo que se ação mais curta do anticorpo de MASP-2 é desejável, um fragmento de anticorpo pode ser preferido. Como descrito no Exemplo 5, foi determinado que uma substituição S228P na região de articulação de IgG4 aumenta a estabilidade sérica. Consequentemente, em algumas formas de realização, o anticorpo de MASP-2 objeto é um anticorpo IgG4 de tamanho natural com uma substituição S228P.

Anticorpos de Cadeia Única

[000249] Em uma forma de realização da presente invenção, o anticorpo inibidor de MASP-2 é um anticorpo de cadeia única, definido como uma molécula geneticamente engendrada que contém a região variável da cadeia leve, a região variável da cadeia pesada, ligadas por um ligante de polipeptídeo adequado como uma molécula de cadeia única geneticamente fundida. Tais anticorpos de cadeia única são também aludidos como fragmentos de anticorpo “Fv de cadeia única” ou “scFv”. No geral, o polipeptídeo Fv compreende ainda um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permitem que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação de antígeno. Os anticorpos scFv que se ligam a MASP-2 podem ser orientados com a região variável leve no terminal amino em relação à região variável pesada ou terminal carboxila em relação à mesma. Os anticorpos scFv exemplares da invenção são apresentados aqui como SEQ ID NOS: 5561 e SEQ ID NOS: 66-68.

Métodos para Produzir Anticorpos

[000250] Em muitas formas de realização, os ácidos nucleicos que codificam um anticorpo monoclonal objeto são introduzidos diretamente em uma célula hospedeira, e a célula incubada sob condições suficientes para induzir a expressão do anticorpo codificado.

[000251] Em algumas formas de realização, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-MASP-2, ou fragmento do mesmo, da invenção, tal como um anticorpo ou fragmento do mesmo apresentado na TABELA 2. Em algumas formas de realização a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 88 e SEQ ID NO: 89.

[000252] Em algumas formas de realização, a invenção fornece uma célula que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-MASP-2 da invenção.

[000253] Em algumas formas de realização, a invenção fornece um cassete de expressão que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-MASP-2 da invenção.

[000254] Em algumas formas de realização, a invenção fornece um método de produzir anticorpos anti-MASP2 que compreendem cultivar uma célula que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-MASP-2 da invenção.

[000255] De acordo com certas formas de realização relacionadas é fornecido uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções como aqui descritas; um ácido nucleico que codifica qualquer anticorpo, CDR, domínio VH ou VL, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo; e um método de produção do produto codificado, método este que compreende expressão do ácido nucleico que codifica para tal. A expressão pode ser conveniente obtida pelo cultivo de células hospedeiras recombinantes sob condições apropriadas que contém o ácido nucleico. A seguir da produção pela expressão, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, podem ser isolados e/ou purificados usando qualquer técnica adequada, e depois usados como desejado.

[000256] Por exemplo, qualquer célula adequada para a expressão de cassetes de expressão pode ser usada como uma célula hospedeira, por exemplo, células de levedura, inseto, planta, etc. Em muitas formas de realização, uma linhagem de célula hospedeira de mamífero que ordinariamente não produz anticorpos é usada, exemplos da qual são como segue: células renais de macaco (células COS), células CVI renais de macaco transformadas pela SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); células renais embrionárias humanas (HEK293, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); células renais de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células do ovário do hamster chinês (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4216, (1980); células de sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células renais de macaco (CVI ATCC CCL 70); células renais de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinomas cervicais humanas (HELA, ATCC CCL 2); células renais caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células hepáticas de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL 51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci 383: 44-68 (1982)); células NIH/3T3 (ATCC CRL-1658); e células L de camundongo (ATCC CCL-1). As linhagens de célula adicionais tornar- se-ão evidentes a aqueles de habilidade comum na técnica. Uma ampla variedade de linhagens de célula está disponível da American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209.

[000257] Métodos de introduzir ácidos nucleicos em células são bem conhecidos na técnica. Os métodos adequados incluem eletroporação, tecnologia de pistola de partícula, precipitação com fosfato de cálcio, microinjeção direta, e os semelhantes. A escolha do método é no geral dependente do tipo de célula que é transformada e das circunstâncias sob as quais a transformação está ocorrendo (isto é, in vitro, ex vivo, ou in vivo). Um debate geral destes métodos pode ser encontrado em Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., Wiley & Sons, 1995. Em algumas formas de realização, lipofectamina e as tecnologias de transferência de gene mediadas por cálcio são usadas.

[000258] Depois que os ácidos nucleicos objetos foram introduzidos em uma célula, a célula é tipicamente incubada, normalmente a 37 °C, algumas vezes sob seleção, por um tempo adequado para permitir a expressão do anticorpo. Na maioria das formas de realização, o anticorpo é tipicamente secretado no sobrenadante do meio em que a célula é cultivada.

[000259] Nas células hospedeiras de mamífero, vários sistemas de expressão com base viral podem ser utilizados para expressar um anticorpo objeto. Em casos onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, a sequência que codifica o anticorpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controle de transcrição/tradução de adenovírus, por exemplo, o promoter tardio e a sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode ser depois inserido no genoma de adenovírus pela recombinação in vitro ou in vivo. A inserção em uma região não essencial do genoma viral (por exemplo, região E1 ou E3) resultará em um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de anticorpo em hospedeiros infectados. (por exemplo, ver Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355-359 (1984)). A eficiência de expressão pode ser realçada pela inclusão de elementos realçadores de transcrição apropriadas, terminadores de transcrição, etc. (ver Bittner et al., Methods in Enzymol. 153: 51-544 (1987)).

[000260] Para a produção de longa duração, alto rendimento de anticorpos recombinantes, a expressão estável pode ser usada. Por exemplo, linhagens de célula, que estavelmente expressam a molécula de anticorpo, podem ser engendradas. Ao invés de usar os vetores de expressão que contenha origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com cassetes de expressão de imunoglobulina e um marcador selecionável. A seguir da introdução do DNA estranho, as células engendradas podem ser permitidas cultivar por 1 a 2 dias em um meio enriquecido, e depois são comutadas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem estavelmente o plasmídeo dentro de um cromossoma e cultivado para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhagens de célula. Tais linhagens de célula engendradas podem ser particularmente úteis na triagem e avaliação de compostos que interagem direta ou indiretamente com a molécula de anticorpo.

[000261] Uma vez que uma molécula de anticorpo da invenção foi produzida, ela pode ser purificada por qualquer método conhecido na técnica para a purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, pela cromatografia (por exemplo, troca de íon, afinidade, particularmente pela afinidade ao antígeno específico depois da cromatografia em coluna de Proteína A, e classificação por tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Em muitas formas de realização, anticorpos são secretados a partir da célula em meio de cultura e colhida do meio de cultura. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de sinal pode ser incluída adjacente à região codificadora do anticorpo ou fragmento, por exemplo como fornecido nos nucleotídeos 1-57 da SEQ ID NO: 71, que codifica o peptídeo de sinal como fornecido nos aminoácidos 1-19 da SEQ ID NO: 72. Um tal peptídeo de sinal pode ser incorporado adjacente à extremidade 5’ das sequências de aminoácido aqui apresentadas para os anticorpos objetos de modo a facilitar a produção dos anticorpos objetos.

Carreadores Farmacêuticos e Veículos de Liberação

[000262] Em um outro aspecto, a invenção fornece composições para a inibição dos efeitos adversos de ativação de complemento dependente de MASP-2 que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo inibidor anti-MASP-2 humano e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[000263] No geral, as composições de anticorpo inibidor de MASP-2 humana da presente invenção, combinadas com qualquer outro agente terapêutico selecionado, estão adequadamente contidas em um carreador farmaceuticamente aceitável. O carreador é não tóxico, biocompatível e é selecionado de modo a não afetar de maneira nociva a atividade biológica do anticorpo inibidor de MASP-2 (e quaisquer outros agentes terapêuticos combinados com este). Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis exemplares para os polipeptídeos são descritos na Patente U.S. No 5.211.657 para Yamada. Os anticorpos anti-MASP-2 podem ser formulados em preparações na forma sólida, semissólida, em gel, líquida ou gasosa tal como tabletes, cápsulas, pós, grânulos, unguentos, soluções, depósitos, inalantes e injeções permitindo a administração oral, parenteral ou cirúrgica. A invenção também considera a administração local das composições através do revestimento de dispositivos médicos e outros.

[000264] Os carreadores adequados para a liberação parenteral por intermédio da liberação injetável, infusão ou irrigação e tópica incluem água destilada, solução salina tamponada com fosfato fisiológico, soluções de Ringer normais ou lactadas, solução de dextrose, solução de Hank, ou propanodiol. Além disso, os óleos fixos estéreis podem ser utilizados como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito, qualquer óleo biocompatível pode ser utilizado incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, os ácidos graxos tal como ácido oleico encontram uso na preparação de injetáveis. O carreador e agente podem ser compostos como um líquido, suspensão, gel polimerizável ou não polimerizável, pasta ou pomada.

[000265] O carreador também pode compreender um veículo de liberação para sustentar (isto é, prolongar, atrasar ou regular) a liberação do(s) agente(s) ou para aumentar a liberação, absorção, estabilidade ou farmacocinéticas do(s) agente(s) terapêutico(s). Tal veículo de liberação pode incluir, por via de exemplo não limitantes, os compostos de micropartículas, microesferas, nanoesferas ou nanopartículas de proteínas, lipossomos, carboidratos, compostos orgânicos sintéticos, compostos inorgânicos, hidrogéis poliméricos ou copoliméricos e micelas poliméricas. O hidrogel adequado e sistemas de liberação de micelas incluem os copolímeros de PEO: PHB: PEO e complexes de copolímero/ciclodextrina divulgados na WO 2004/009664 A2 e o PEO e complexos de PEO/ciclodextrina divulgados na Publicação de Pedido de Patente U.S. No 2002/0019369 A1. Tais hidrogéis podem ser localmente injetados no lado de ação intencionado, de modo subcutâneo ou intramuscular para formar um depósito de liberação prolongada.

[000266] Para a liberação intra-articular, o anticorpo inibidor de MASP- 2 pode ser carregado nos carreadores líquidos ou em gel acima descritos que são injetáveis, veículos de liberação de liberação sustentada acima descritos que são injetáveis, ou um ácido hialurônico ou derivado do ácido hialurônico.

[000267] Para a liberação intratecal (IT) ou liberação intracerebro- ventricular (ICV), os sistemas de liberação apropriadamente estéreis (por exemplo, líquidos; géis, suspensões, etc.) podem ser usados para administrar a presente invenção.

[000268] As composições da presente invenção também podem incluir excipientes biocompatíveis, tal como agentes de dispersão ou umectação, agentes de suspensão, diluentes, tampões, intensificadores de penetração, emulsificadores, aglutinantes, agentes de engrossamento, agentes de sabor (para a administração oral).

[000269] Para se obter altas concentrações de anticorpos anti-MASP-2 para a liberação local, os anticorpos podem ser formulados como uma suspensão de particulados ou cristais em solução para a injeção subsequente, tal como para a injeção intramuscular de um depósito.

[000270] Mais especificamente com relação aos anticorpos anti-MASP- 2, as formulações exemplares podem ser administradas de modo parenteral como dosagens injetáveis de uma solução ou suspensão do composto em um diluente fisiologicamente aceitável com um carreador farmacêutico que pode ser um líquido estéril tal como água, óleos, solução salina, glicerol ou etanol. Adicionalmente, as substâncias auxiliares tal como agentes de umectação ou emulsificação, tensoativos, substâncias de tamponamento de pH e outros podem estar presentes nas composições que compreendem anticorpos anti- MASP-2. Os componentes adicionais de composições farmacêuticas incluem petróleo (tal como de origem, animal, vegetal ou sintética), por exemplo, óleo de soja e óleo mineral. Em geral, os glicóis tal como propileno glicol ou polietileno glicol são carreadores líquidos preferidos para soluções injetáveis.

[000271] Os anticorpos anti-MASP-2 também podem ser administrados na forma de uma injeção de depósito ou preparação de implante que pode ser formulada de tal maneira para permitir uma liberação prolongada ou pulsátil dos agentes ativos.

[000272] As composições farmacêuticas que compreende os anticorpos inibidores de MASP-2 podem ser administradas de várias maneiras dependendo se um local ou modo sistêmico de administração é mais apropriado para a condição sendo tratada. Adicionalmente, como descrito mais acima com relação aos procedimentos de procedimento de reperfusão extracorpóreo, os anticorpos inibidores de MASP-2 podem ser administrados por intermédio da introdução das composições da presente invenção para recircular sangue ou plasma. Além disso, as composições da presente invenção podem ser liberadas revestindo-se ou incorporando-se as composições no ou em um dispositivo médico implantável.

LIBERAÇÃO SISTÊMICA

[000273] Como aqui usado, os termos “liberação sistêmica” e “administração sistêmica” são intencionados incluir, mas não são limitados a vias orais e parenterais, incluindo intramuscular (IM), subcutânea, intravenosa (IV), intra-arterial, por inalação, sublingual, bucal, tópica, transdérmica, nasal, retal, vaginal e outras vias de administração que resultam eficazmente na dispersão do anticorpo liberado a um sítio local ou múltiplo de ação terapêutica intencionada. As vias de liberação sistêmica preferidas para as presentes composições incluem intravenosa, intramuscular, subcutânea e por inalação. Será apreciado que a via exata de administração sistêmica para os agentes selecionados utilizados nas composições particulares da presente invenção será determinada em parte para explicar a suscetibilidade do agente para as vias de transformação metabólica associadas com uma dada via de administração.

[000274] Os anticorpos inibidores de MASP-2 e polipeptídeos podem ser liberados em um indivíduo em necessidade do mesmo através de qualquer meio adequado. Os métodos de liberação dos anticorpos de MASP-2 e os polipeptídeos incluem a administração através da via oral, pulmonar, parenteral (por exemplo, injeção intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) ou subcutânea), inalação (tal como por intermédio de uma formulação de pó fino), transdérmica, nasal, vaginal, retal, ou sublingual de administração, e pode ser formulada em formas de dosagem apropriadas para cada via de administração.

[000275] Por via de exemplo representativo, os anticorpos inibidores de MASP-2 e peptídeos podem ser introduzidos em um corpo vivo através da aplicação a uma membrana corpórea capaz de absorver os polipeptídeos, por exemplo, as membranas nasais, gastrointestinais e retais. Os polipeptídeos são tipicamente aplicados à membrana de absorção em conjunto um intensificador de permeação. (Ver, por exemplo, Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5: 69, 1988; Lee, V.H.L., J. Controlled Delivery 13: 213, 1990; Lee, V.H.L., Ed., PEPTIDE and Proteína Drug Delivery, Marcel Dekker, Nova Iorque (1991); DeBoer, A.G., et al., J. Controlled Delivery 13: 241, 1990.) Por exemplo, STDHF é um derivado sintético de ácido fusídico, um tensoativo esteroidal que é similar em estrutura aos sais biliares, e tem sido usado como um intensificador de permeação para a liberação nasal. (Lee, W.A., Biopharm. 22, Nov./Dez. 1990.)

[000276] Os anticorpos inibidores de MASP-2 e polipeptídeos podem ser introduzidos em associação com outra molécula, tal como um lipídeo, para proteger os polipeptídeos da degradação enzimática. Por exemplo, a ligação covalente dos polímeros, especialmente polietileno glicol (PEG), foi usada para proteger algumas proteínas da hidrólise enzimática no corpo e deste modo prolongam a meia-vida (Fuertges, F., et al., J. Controlled Delivery 11: 139, 1990). Muito sistemas poliméricos foram indicados para a liberação de proteínas (Bae, Y.H., et al., J. Controlled Delivery 9: 271, 1989; Hori, R., et al., Pharm. Res. 6: 813, 1989; Yamakawa, I., et al., J. Pharm. Sci. 79: 505, 1990; Yoshihiro, I., et al., J. Controlled Delivery 10: 195, 1989; Asano, M., et al., J. Controlled Delivery 9: 111, 1989; Rosenblatt, J., et al., J. Controlled Delivery 9: 195, 1989; Makino, K., J. Controlled Delivery 12: 235, 1990; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78: 117, 1989; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78: 219, 1989).

[000277] Recentemente, os lipossomos foram desenvolvidos com estabilidade de soro melhorada e meias vidas de circulação (ver, por exemplo, a Patente U.S. No 5.741.516, para Webb). Além disso, vários métodos de lipossomo e preparações semelhantes a lipossomo como carreadores medicamentosos potenciais foram revistos (ver, por exemplo, a Patente U.S. No 5.567.434, para Szoka; Patente U.S. No 5.552.157, para Yagi; Patente U.S. No 5.565.213, para Nakamori; Patente U.S. No 5.738.868, para Shinkarenko; e Patente U.S. No 5.795.587, para Gao).

[000278] Para as aplicações transdérmicas, os anticorpos inibidores de MASP-2 e polipeptídeos podem ser combinados com outros ingredientes adequados, tal como carreadores e/ou adjuvantes. Não há limitações quanto a natureza de tais outros ingredientes, exceto que devem ser farmaceuticamente aceitáveis para sua administração intencionada, e não podem degradar a atividade dos ingredientes ativos da composição. Os exemplos de veículos adequados incluem unguentos, cremes, géis, ou suspensões, com ou sem colágeno purificado. Os anticorpos inibidores de MASP-2 e polipeptídeos também podem ser impregnados em emplastros transdérmicos, emplastros, e bandagens, preferivelmente na forma líquida ou semilíquidas.

[000279] As composições da presente invenção podem ser sistemicamente administradas em uma base periódica em intervalos determinados para manter um nível desejado de efeito terapêutico. Por exemplo, as composições podem ser administradas, tal como através da injeção subcutânea, a cada duas a quatro semanas ou em intervalos menos frequentes. O regime de dosagem será determinado pelo médico considerando vários fatores que podem influenciar a ação da combinação de agentes. Estes fatores incluirão o grau do progresso da condição sendo tratada, a idade, sexo e peso do paciente, e outros fatores clínicos. A dosagem para cada agente individual variará como uma função do anticorpo inibidor de MASP-2 que é incluído na composição, assim como a presença e natureza de qualquer veículo de liberação medicamentosa (por exemplo, um veículo de liberação de liberação sustentada). Além disso, a quantidade de dosagem pode ser ajustada para explicar a variação na frequência de administração e o comportamento farmacocinético do(s) agente(s) liberado(s).

LIBERAÇÃO LOCAL

[000280] Como aqui usado, o termo “local” abrange a aplicação de um medicamento em, ou em torno de um local de ação localizada intencionada, e pode incluir, por exemplo, a liberação tópica à pele ou outros tecidos afetados, liberação oftálmica, administração intratecal (IT), intracerebro- ventricular (ICV), intra-articular, intracavidade, intracraniana ou intravesicular, colocação ou irrigação. A administração local pode ser preferida para permitir a administração de uma dose mais baixa, para evitar os efeitos colaterais sistêmicos, e para o controle mais preciso do tempo de liberação e concentração dos agentes ativos no sítio da liberação local. A administração local fornece uma concentração conhecida no sítio alvo, sem levar em consideração a variabilidade interpaciente no metabolismo, fluxo sanguíneo, etc. o controle de dosagem melhorado também é fornecido através do modo direto de liberação.

[000281] A liberação local de um anticorpo inibidor de MASP-2 pode ser obtida no contexto de métodos cirúrgicos para tratar uma doença ou condição, tal como, por exemplo, durante os procedimentos tal como cirurgia de desvio arterial, aterectomia, procedimentos a laser, procedimentos ultrassônicos, angioplastia de balão e colocação de stent. Por exemplo, um inibidor de MASP-2 pode ser administrado a um indivíduo em conjunto com um procedimento de angioplastia de balão. Um procedimento de angioplastia de balão envolve inserir um cateter tendo um balão vazio em uma artéria. O balão vazio é posicionado em proximidade à placa aterosclerótica e é inflada tal que a placa é comprimida contra a parede vascular. Como um resultado, a superfície do balão está em contato com a camada de células endoteliais vasculares na superfície do vaso sanguíneo. O anticorpo inibidor de MASP-2 pode ser ligado ao cateter de angioplastia de balão de uma maneira que permite a liberação do agente no local da placa aterosclerótica. O agente pode ser ligado ao cateter do balão de acordo com os procedimentos padrão conhecidos na técnica. Por exemplo, o agente pode ser armazenado em um compartimento do cateter do balão até o balão ser inflado, no ponto em que é liberado no ambiente local. Alternativamente, o agente pode ser impregnado na superfície do balão, tal que este comunica as células da parede arterial conforme o balão é inflado. O agente também pode ser liberado em um cateter de balão perfurado tal como aquele divulgado em Flugelman, M.Y., et al., Circulation 85: 1110-1117, 1992. Ver também o Pedido PCT Publicado WO 95/23161 para um procedimento exemplar para ligar uma proteína terapêutica a um cateter de angioplastia de balão. Do mesmo modo, o anticorpo inibidor de MASP-2 pode ser incluído em um gel ou revestimento polimérico aplicado a um stent, ou pode ser incorporado no material do stent, tal que o stent elui o anticorpo inibidor de MASP-2 depois da colocação vascular.

Regimes de Tratamento

[000282] As composições de anticorpo inibidoras de MASP-2 usadas no tratamento de artrites e outros distúrbios musculoesqueletais podem ser localmente liberados através da injeção intra-articular. Tais composições podem adequadamente incluir um veículo de liberação sustentada. Como um outro exemplo de situações nas quais a liberação local pode ser desejada, as composições de anticorpo inibidoras de MASP-2 usadas no tratamento de condições urogenitais podem ser adequadamente intravesicalmente instilados ou dentro de uma outra estrutura urogenital.

[000283] Nas aplicações profiláticas, as composições farmacêuticas são administradas a um indivíduo suscetível a, ou de outro modo em risco de, uma condição associada com a ativação de complemento dependente de MASP-2 em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco de desenvolver sintomas da condição. Nas aplicações terapêuticas, as composições farmacêuticas são administradas a um indivíduo suspeito de, ou que já sofre de, uma condição associada com ativação de complemento dependente de MASP-2 em uma quantidade terapeuticamente eficaz suficiente para aliviar, ou pelo menos parcialmente reduzir, os sintomas da condição. Nos regimes tanto profiláticos quanto terapêuticos, as composições que compreendem os anticorpos inibidores de MASP-2 podem ser administrados em várias dosagens até que um resultado terapêutico suficiente fosse obtido no indivíduo. A aplicação das composições de anticorpo inibidor da MASP-2 da presente invenção pode ser realizada por uma administração única da composição, ou uma sequência limitada de administrações, para o tratamento de uma condição aguda, por exemplo, lesão de reperfusão ou outra lesão traumática. Alternativamente, a composição pode ser administrada em intervalos periódicos em um período prolongado de tempo para o tratamento de condições crônicas, por exemplo, artrites ou psoríase.

[000284] As composições inibidoras de MASP-2 usadas na presente invenção podem ser liberadas imediatamente ou logo depois de um evento agudo que resulta na ativação da via da lectina, tal como a seguir de um evento isquêmico e reperfusão do tecido isquêmico. Os exemplos incluem reperfusão de isquemia miocárdica, reperfusão de isquemia renal, reperfusão de isquemia cerebral, transplante de órgão e religação de dedo/extremidade. Outros exemplos agudos incluem septicemia. Uma composição inibidora de MASP-2 da presente invenção pode ser administrada tão logo quanto possível a seguir de um evento agudo que ativa a via da lectina, preferivelmente dentro de doze horas e mais preferivelmente dentro de duas a três horas de um evento ativador, tal como através da liberação sistêmica da composição inibidora de MASP-2.

[000285] Os métodos e as composições da presente invenção podem ser usados para inibir inflamação e os processos relacionados que tipicamente resultam dos procedimentos de diagnóstico e terapêuticos médicos e cirúrgicos. Para inibir tais processos, a composição inibidora de MASP-2 da presente invenção pode ser aplicada periproceduralmente. Como aqui usado “periproceduralmente” refere-se à administração da composição inibidora preproceduralmente e/ou intraproceduralmente e/ou posproceduralmente, isto é, antes do procedimento, antes e durante o procedimento, antes e depois do procedimento, antes, durante e depois do procedimento, durante o procedimento, durante e depois do procedimento, ou depois do procedimento. A aplicação periprocedural pode ser realizada pela administração local da composição ao sítio cirúrgico ou procedural, tal como pela injeção ou irrigação contínua ou intermitente do sítio ou pela administração sistêmica. Os métodos adequados para a liberação perioperatória de soluções de anticorpo inibidor de MASP-2 são divulgados nas Patentes US Nos. 6.420.432 concedida a Demopulos e 6.645.168 concedida a Demopulos. Os métodos adequados para a liberação do local das composições condroprotetoras incluindo os anticorpos inibidores de MASP-2 são divulgados no Pedido de Patente PCT Internacional WO 01/07067 A2. Os métodos e composições adquirido para a liberação sistêmica alvejada das composições condroprotetoras incluindo os anticorpos inibidores de MASP-2 são divulgados no Pedido de Patente PCT Internacional WO 03/063799 A2.

Dosagens

[000286] Os anticorpos inibidores de MASP-2 podem ser administrados a um indivíduo em necessidade do mesmo, em doses terapeuticamente eficazes para tratar ou melhorar condições associadas com a ativação de complemento dependente de MASP-2. Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se à quantidade do anticorpo inibidor de MASP-2 suficiente para resultar na melhora de sintomas da condição.

[000287] A toxicidade e eficácia terapêutica dos anticorpos inibidores de MASP-2 podem ser determinadas pelos procedimentos farmacêuticos padrão utilizando modelos experimentais de animal, tais como o Macaco Verde Africano, como aqui descrito. Usando tais modelos de animal, o NOAEL (nenhum nível de efeito adverso observado) e a MED (a dose minimamente eficaz) podem ser determinados usando métodos padrão. A razão de dose entre os efeitos NOAEL e MED é a razão terapêutica, que é expressada como a razão NOAEL/MED. Anticorpos inibidores de MASP-2 que exibem razões ou índices terapêuticos grandes são os mais preferidos. Os dados obtidos a partir dos ensaios de cultura de célula e estudos de animal podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagens para o uso em seres humanos. A dosagem do anticorpo inibidor de MASP-2 preferivelmente reside dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a MED com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem utilizada e da via de administração utilizada.

[000288] Para qualquer formulação de composto, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada usando modelos de animal. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em um modelo de animal para se obter uma faixa de concentração plasmática circulante que inclua a MED. Os níveis quantitativos do anticorpo inibidor de MASP-2 no plasma também podem ser medidos, por exemplo, pela cromatografia líquida de alto desempenho.

[000289] Além dos estudos de toxicidade, a dosagem eficaz também pode ser estimada com base na quantidade de proteína MASP-2 presente em um indivíduo vivo e a afinidade de ligação do anticorpo inibidor de MASP-2. Foi mostrado que os níveis de MASP-2 em indivíduos humanos normais está presente no soro em níveis baixos na faixa de 500 ng/ml, e níveis de MASP-2 em um indivíduo particular podem ser determinados usando um ensaio quantitativo para MASP-2 descrito em Moller-Kristensen M., et al., J. Immunol. Methods 282: 159-167, 2003, por meio deste aqui incorporada por referência.

[000290] No geral, a dosagem de composições administradas que compreendem os anticorpos inibidores de MASP-2 varia dependendo de fatores tais como a idade, peso, altura, sexo, condição médica geral, e histórico médico anterior do indivíduo. Como uma ilustração, os anticorpos inibidores de MASP-2, podem ser administrados nas faixas de dosagem de cerca de 0,010 a 10,0 mg/kg, preferivelmente de 0,010 a 1,0 mg/kg, mais preferivelmente de 0,010 a 0,1 mg/kg do peso corporal do indivíduo.

[000291] A eficácia terapêutica de composições inibidoras de MASP-2 e métodos da presente invenção em um dado indivíduo, e as dosagens apropriadas, podem ser determinadas de acordo com ensaios de complemento bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica. O complemento gera numerosos produtos específicos. Durante a última década, ensaios sensíveis e específicos foram desenvolvidos e são comercialmente disponíveis para a maioria destes produtos de ativação, que incluem os fragmentos de ativação pequenos C3a, C4a, e C5a e os fragmentos de ativação grandes iC3b, C4d, Bb, e sC5b-9. A maior parte destes ensaios utilizam anticorpos que reagem com novos antígenos (neoantígenos) expostos no fragmento, mas não nas proteínas nativas a partir das quais eles são formados, tornando estes ensaios muito simples e específicos. A maioria conta com a tecnologia ELISA, embora o radioimunoensaio seja ainda algumas vezes usado para C3a e C5a. Estes últimos ensaios para medir tanto os fragmentos não processados quanto os seus fragmentos ‘desArg’, que são as formas principais encontradas na circulação. Fragmentos não processados e C5adesArg são rapidamente depurados pela ligação aos receptores de superfície celular e estão consequentemente presentes em concentrações muito baixas, ao passo que C3adesArg não se liga às células e acumula-se no plasma. A medição de C3a fornece um indicador sensível, independente da via de ativação de complemento. A ativação da via alternativa pode ser avaliada pela medição do fragmento Bb. A detecção do produto da fase de fluido da ativação da via de ataque à membrana, sC5b-9, fornece evidência de que o complemento está sendo ativado até a conclusão. Porque as vias tanto da lectina quanto clássicos geram os mesmos produtos de ativação, C4a e C4d, a medição destes dois fragmentos não fornecem nenhuma informação a cerca de quais destes duas vias geraram os produtos de ativação. A inibição da ativação de complemento dependente de MASP-2 é distinguida em pelo menos uma das mudanças que seguem em um componente do sistema de complemento que ocorre como um resultado de administração de um anticorpo anti-MASP-2 de acordo com a presente invenção: a inibição da geração ou produção da ativação de complemento dependente dos produtos de sistema MASP-2 C4b, C3a, C5a e/ou C5b-9 (MAC), a redução da clivagem de C4 e deposição C4b, ou a redução da clivagem de C3 e deposição de C3b.

Artigos de Fabricação

[000292] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um artigo de fabricação que contém um anticorpo inibidor de MASP-2 humana, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, como aqui descrito em uma forma de dosagem unitária adequada para a administração terapêutica a um indivíduo humano, tal como, por exemplo, uma dosagem unitária na faixa de 1 mg a 5000 mg, tal como de 1 mg a 2000 mg, tal como de 1 mg a 1000 mg, tal como 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 500 mg, ou 1000 mg. Em algumas formas de realização, o artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo ou inserto de embalagem dentro ou associado com o recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringa, etc. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente mantém uma composição que é eficaz para tratar a condição e pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é o anticorpo inibidor de MASP-2 ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo da invenção. O rótulo ou inserto de embalagem indicam que a composição é usada para tratar a condição particular. O rótulo ou inserto de embalagem compreenderá ainda instruções para administrar a composição de anticorpo ao paciente. Artigos de fabricação e kits que compreendem terapias combinatórias aqui descritas também são consideradas. Usos Terapêuticos dos Anticorpos Inibidores Anti-MASP-2

[000293] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 em um indivíduo humano que compreende administrar um anticorpo inibidor anti-MASP-2 monoclonal humano da invenção em uma quantidade suficiente para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 no dito indivíduo humano.

[000294] De acordo com este aspecto da invenção, como descrito no Exemplo 10, os anticorpos inibidores de MASP-2 da presente invenção são capazes de inibir a via da lectina em macacos Verdes Africanos que seguem a administração intravenosa. Como mostrado na Tabela 24, Exemplo 8, o anticorpo usado neste estudo, OMS646, foi descoberto ser mais potente no soro humano. Como conhecido por aqueles de habilidade na técnica, primatas não humanos são frequentemente usados como um modelo para avaliar anticorpos terapêuticos.

[000295] Como descrito na Patente US No. 7.919.094, Pedido de Patente U.S. copendente No. de Série 13/083.441, e Pedido de Patente U.S. copendente No. de Série 12/905.972 (cada um dos quais é concedido à Omeros Corporation, o cessionário do presente pedido), cada um dos quais por meio deste incorporado por referência, a ativação de complemento dependente de MASP-2 foi implicada como contribuindo para a patogênese de numerosos estados de doença aguda e crônica, que incluem condição vascular mediada por complemento dependente de MASP-2, uma lesão de reperfusão de isquemia, aterosclerose, distúrbio gastrointestinal inflamatório, uma condição pulmonar, um procedimento de reperfusão extracorpórea, uma condição músculo-esqueletal, uma condição renal, uma condição de pele, transplante de órgão ou tecido, distúrbio ou lesão do sistema nervoso, um distúrbio sanguíneo, uma condição urogenital, diabete, quimioterapia ou terapia de radiação, malignidade, um distúrbio endócrino, um distúrbio de coagulação, ou uma condição oftalmológica. Portanto, os anticorpos inibidores de MASP-2 da presente invenção podem ser usados para tratar as doenças e condições dadas como referência acima.

[000296] Como ainda descrito no Exemplo 11, os anticorpos inibidores de MASP-2 da presente invenção são eficazes no tratamento de um indivíduo mamífero em risco para, ou que sofre dos efeitos nocivos da síndrome da radiação aguda, demonstrando deste modo eficácia terapêutica in vivo.

[000297] Os exemplos que seguem meramente ilustram o melhor modo agora considerado para a prática da invenção, mas não deve ser interpretado como limitando a invenção.

EXEMPLO 1

[000298] Este exemplo descreve a expressão recombinante e produção de proteína de MASP-2 recombinante de tamanho natural de ser humano, rato e murino, polipeptídeos derivados de MASP-2, e formas mutantes cataliticamente inativadas de MASP-2

Expressão de MASP-2 de tamanho natural de ser humano e rato:

[000299] A sequência de cDNA de tamanho natural de MASP-2 humano (SEQ ID NO: 1) que codifica o polipeptídeo de MASP-2 humano com a sequência líder (SEQ ID NO: 2) foi subclonado no vetor de expressão de mamífero pCI-Neo (Promega), que direciona a expressão eucariótica sob o controle da região realçadora/promotora de CMV (descrito em Kaufman R. J. et al., Nucleic Acids Research 19: 4485-90, 1991; Kaufman, Métodos in Enzymology, 185: 537-66 (1991)). O cDNA de MASP-2 de rato tamanho natural (SEQ ID NO: 4) que codifica o polipeptídeo de MASP-2 de rato com a sequência líder (SEQ ID NO: 5) foi subclonado no vetor de expressão pED. Os vetores de expressão MASP-2 foram depois transfectados dentro da linhagem de célula do ovário do hamster chinês DXB1 aderente usando o procedimento da transfecção com fosfato de cálcio padrão descrito em Maniatis et al., 1989. As células transfectadas com estas construções cresceram muito lentamente, implicando que a protease codificada é citotóxica. A forma madura da proteína de MASP-2 humana (SEQ ID NO: 3) e a forma madura da proteína de MASP-2 de rato (SEQ ID NO: 6) foram secretadas no meio de cultura e isoladas como descrito abaixo.

Expressão de MASP-2 de tamanho natural cataliticamente inativa: Análise Racional:

[000300] MASP-2 é ativado pela clivagem autocatalítica depois do reconhecimento da ligação dos subcomponentes MBL, lectina tipo C CL-11 ou ficolinas (L-ficolina, H-ficolina ou M-ficolina) coletivamente aludidas como lectinas, ligam-se aos seus respectivos padrões de carboidrato. A clivagem autocatalítica que resulta na ativação de MASP-2 frequentemente ocorre durante o procedimento de isolação de MASP-2 do soro, ou durante a purificação que segue a expressão recombinante. De modo a obter uma preparação de proteína mais estável para o uso como um antígeno, uma forma cataliticamente inativa de MASP-2, planejada como MASP-2A foi criada pela substituição do resíduo de serina que está presente na tríade catalítica do domínio da protease com um resíduo de alanina na proteína MASP-2 de rato madura (SEQ ID NO: 6 Ser617 para Ala617); ou na proteína MASP-2 humana madura (SEQ ID NO: 3 Ser618 para Ala618).

[000301] De modo a gerar proteínas MASP-2A de ser humano e rato cataliticamente inativas, a mutagênese direcionada ao sítio foi realizada como descrito na US2007/0172483, por meio deste aqui incorporada por referência. Os produtos de PCR foram purificados depois da eletroforese em gel de agarose e preparação de faixa e sobreposições de adenosina únicas foram geradas usando um procedimento de formação de cauda padrão. A MASP-2A de cauda de adenosina foi depois clonada no vetor pGEM-T easy, transformada na E. coli. A MASP-2A de ser humano e rato foram cada uma subclonadas ainda dentro dos vetores de expressão de mamífero pED ou pCI- Neo e transfectadas dentro da linhagem de célula DXB1 do ovário do hamster chinês como descrito abaixo.

Construção de Plasmídeos de Expressão Que Contém Regiões de Polipeptídeo Derivadas de MASP-2 Humana.

[000302] As construções que seguem foram produzidas usando o peptídeo de sinal de MASP-2 (resíduos de 1 a 15 da SEQ ID NO: 2) para secretar vários domínios de MASP-2. Uma construção que expressa o domínio CUBI de MASP-2 de ser humano (SEQ ID NO: 7) foi fabricada pela PCR que amplifica a região que codifica os resíduos 1 a 121 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (que corresponde ao domínio CUB1 de terminal N). Uma construção que expressa o domínio CUBI/EGF de MASP-2 de ser humano (SEQ ID NO: 8) foi fabricada pela PCR que amplifica a região que codifica os resíduos de 1 a 166 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (que corresponde ao terminal N do domínio CUB1/EGF). Uma construção que expressa o domínio CUBI/EGF/CUBII da MASP-2 humana (SEQ ID NO: 9) foi fabricada pela amplificação pela PCR da região que codifica os resíduos de aminoácido de 1 a 277 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (que corresponde ao domínio CUBIEGFCUBII de terminal N). Uma construção que expressa o domínio de EGF de MASP-2 humana (SEQ ID NO: 10) foi fabricada pela amplificação pela PCR da região que codifica os resíduos de aminoácido 122-166 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (que corresponde ao domínio EGF). Uma construção que expressa os domínios CCPI/CCPII/SP da MASP-2 humana (SEQ ID NO: 11) foi fabricada pela amplificação pela PCR da região que codifica os resíduos de aminoácido 278-671 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (que corresponde aos domínios CCPI/CCPII/SP). Uma construção que expressa os domínios CCPI/CCPII da MASP-2 humana (SEQ ID NO: 12) foi fabricada pela amplificação pela PCR da região que codifica os resíduos de aminoácido 278-429 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (que corresponde aos domínios CCPI/CCPII). Uma construção que expressa o domínio CCPI de MASP-2 (SEQ ID NO: 13) foi fabricada pela amplificação pela PCR da região que codifica os resíduos de aminoácido 278-347 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (que corresponde ao domínio CCPI). Uma construção que expressa os domínios CCPII/SP de MASP-2 (SEQ ID NO: 14) foi fabricada pela amplificação pela PCR da região que codifica os resíduos de aminoácido 348671 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (que corresponde aos domínios CCPII/SP). Uma construção que expressa o domínio CCPII de MASP-2 (SEQ ID NO: 15) foi fabricada pela amplificação pela PCR da região que codifica os resíduos de aminoácido 348-429 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (que corresponde ao domínio CCPII). Uma construção que expressa o domínio SP de MASP-2 (SEQ ID NO: 16) foi fabricada pela amplificação pela PCR da região que codifica os resíduos de aminoácido 429-671 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (que corresponde ao domínio SP).

[000303] Os domínios de MASP-2 mencionados acima foram amplificados pela PCR usando VentR polimerase e pBS-MASP-2 como um padrão, de acordo com os métodos de PCR estabelecidos. A sequência de iniciador 5’ do iniciador de sentido introduziu um sítio de restrição BamHI (sublinhado) na extremidade 5’ dos produtos de PCR. Os iniciadores de anti- sentido para cada um dos domínios de MASP-2 foram planejados para introduzir um códon de parada seguido por um sítio EcoRI no final de cada produto de PCR. Uma vez amplificado, os fragmentos de DNA foram digeridos com BamHI e EcoRI e clonados nos sítios correspondentes do vetor pFastBac1. As construções resultantes foram distinguidas pelo mapeamento de restrição e confirmadas pelo sequenciamento de dsDNA. Expressão eucariótica recombinante de MASP-2 e produção de proteína de MASP-2A de rato e ser humano enzimaticamente inativa.

[000304] As construções de expressão de MASP-2 e MASP-2A descritas acima foram transfectadas em células DXB1 usando o procedimento de transfecção do fosfato de cálcio padrão (Maniatis et al., 1989). MASP-2A foi produzida no meio isento de soro para garantir que as preparações não foram contaminadas com outras proteínas séricas. O meio foi colhido de células confluentes a cada segundo dia (quatro vezes no total). O nível de MASP-2A recombinante deu em média aproximadamente 1,5 mg/litro de meio de cultura para cada uma das duas espécies.

[000305] Purificação da proteína MASP-2A: A MASP-2A (mutante Ser- Ala descrito acima) foi purificada pela cromatografia de afinidade em colunas de MBP-A-agarose. Esta estratégia permitiu a purificação rápida sem o uso de rótulos estranhos. MASP-2A (100 a 200 ml de meio diluídos com um volume igual de tampão de carga (50 mM de Tris-Cl, pH 7,5, contendo 150 mM de NaCl e 25 mM de CaCl2) foi carregada em uma coluna de afinidade MBP- agarose (4 ml) pré-equilibrada com 10 ml de tampão de carga. A seguir da lavagem com mais 10 ml de tampão de carga, a proteína foi eluída em frações de 1 ml com 50 mM de Tris-Cl, pH 7,5, contendo 1,25 M de NaCl e 10 mM de EDTA. As frações contendo a MASP-2A foram identificadas pela eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida. Onde necessário, MASP-2A foi purificada ainda pela cromatografia de troca de íon em uma coluna MonoQ (HR 5/5). A proteína foi dialisada com 50 mM de Tris-Cl pH 7,5, contendo 50 mM de NaCl e carregada na coluna equilibrada no mesmo tampão. A seguir da lavagem, a MASP-2A ligada foi eluída com um gradiente de 0,05 a 1 M de NaCl em 10 ml.

[000306] Resultados: Rendimentos de 0,25 a 0,5 mg proteína de MASP- 2A foram obtidos a partir de 200 ml de meio. A massa molecular de 77,5 kDa determinada por MALDI-MS é maior do que o valor calculado do polipeptídeo não modificado (73,5 kDa) devido à glicosilação. A ligação de glicanos em cada um dos sítios de N-glicosilação é responsável pela massa observada. MASP-2A migra como uma faixa única nos géis de SDS- poliacrilamida, que demonstram que ela não é proteoliticamente processada durante a biossíntese. A massa molecular média ponderada determinada pela ultracentrifugação em equilíbrio está de acordo com o valor calculado para os homodímeros do polipeptídeo glicosilado.

EXEMPLO 2

[000307] Este exemplo descreve o método de triagem usado para identificar anticorpo scFv anti-MASP-2 completamente humano de alta afinidade que bloqueia atividade funcional MASP-2 para progressão na maturação da afinidade.

Fundamentos e Análise racional:

[000308] MASP-2 é uma proteína complexa com muitos domínios funcionais de separação, incluindo: sítio(s) de ligação para MBL e ficolinas, um sítio catalítico da serina protease, um sítio de ligação para o substrato proteolítico C2, um sítio de ligação para o substrato proteolítico C4, um sítio de clivagem de MASP-2 para a autoativação de zimogênio de MASP-2, e dois sítios de ligação de Ca++. Os fragmentos de anticorpo scFV foram identificados que se ligam com alta afinidade a MASP-2, e os fragmentos Fab2 identificados foram testados em um ensaio funcional para determinar se eles foram capazes de bloquear a atividade funcional de MASP-2.

[000309] Para bloquear a atividade funcional de MASP-2, um anticorpo ou fragmento de anticorpo scFv ou Fab2 deve ligar e interferir com um epítopo estrutural em MASP-2 que é requerido para a atividade funcional de MASP-2. Portanto, muitas ou todas das ligações de scFvs ou Fab2s anti- MASP-2 de alta afinidade podem não inibir a atividade funcional de MASP-2 a menos que eles se liguem a epítopos estruturais em MASP-2 que estão diretamente envolvidos na atividade funcional de MASP-2.

[000310] Um ensaio funcional que mede a inibição da formação da C3 convertase da via da lectina foi usado para avaliar a “atividade de bloqueio” de scFvs anti-MASP-2. É conhecido que o papel fisiológico primário de MASP-2 na via da lectina é gerar o componente funcional seguinte da via de complemento mediado pela lectina, a saber a C3 convertase da via da lectina. A C3 convertase da via da lectina é um complexo enzimático crítico (C4b2a) que proteoliticamente cliva C3 em C3a e C3b. MASP-2 não é um componente estrutural da C3 convertase da via da lectina (C4b2a); entretanto, a atividade funcional de MASP-2 é requerida de modo a gerar os dois componentes de proteína (C4b, C2a) que compreendem a C3 convertase da via da lectina. Além disso, todas as atividades funcionais separadas de MASP-2 listadas acima parecem ser requeridas de modo que MASP-2 gere a C3 convertase da via da lectina. Por estas razões, acredita-se que um ensaio preferido para o uso na avaliação da “atividade de bloqueio” de fragmentos de anticorpo Fab2s e scFvs anti-MASP-2 seja um ensaio funcional que mede a inibição da formação da C3 convertase da via da lectina.

[000311] O perfil alvo para os anticorpos terapêuticos anti-MASP-2 previram produzir > 90 % de remoção da via de lectina in vivo que segue a administração de 1 mg de/kg a um ser humano é um IC50 < 5 nM em 90 % de plasma. A relação entre a atividade farmacológica in vitro nestes formatos de ensaio e farmacodinâmicos in vivo foi validada de maneira experimental usando anticorpos MASP-2 anti-roedor.

[000312] O critério para seleção dos anticorpos que bloqueiam MASP-2 de primeira geração para o uso terapêutico foi como segue: alta afinidade para MASP-2 e valores funcionais de IC50 de até ~25 nM. Além disso, os candidatos foram triados quanto a reatividade cruzada com soro de primata não humano, e com soro de rato.

Métodos:

[000313] Triagem da biblioteca de fagomídeo scFv contra antígeno de MASP-2

Antígenos:

[000314] MASP-2 A humano com um rótulo de terminal N 5X His, e MASP-2A de rato com rótulos de terminal N 6X His foram gerados usando os reagentes descritos no Exemplo 1 e purificados a partir dos sobrenadantes de cultura através de um cromatógrafo de afinidade ao níquel, como previamente descrito (Chen et al., J. Biol. Chem. 276: 25894-02 (2001)).

[000315] OMS100, um anticorpo anti-MASP-2 humano no formato Fab2, foi usado como um controle positivo para ligar MASP-2.

Descrição de Biblioteca de Fagomídeo:

[000316] Uma biblioteca de exibição de fago de imunoglobulina humana leve e as sequências de região variável de cadeias pesadas foram submetidas à triagem de antígeno seguida pela triagem de anticorpo automatizada e seleção para identificar os anticorpos de scFv de alta afinidade para proteína de MASP-2 de rato e proteína de MASP-2 humana.

Métodos de Triagem:

[000317] Visão geral: Duas estratégias de triagem foram usadas para isolar fagos da biblioteca de fagomídeos que ligam ao MASP-2 em um total de três ciclos de triagem. Ambas estratégias envolveram a triagem na solução e remoção do fago ligado ao MASP-2. O MASP-2 foi imobilizado nas pérolas magnéticas por intermédio de His-tag (usando pérolas de NiNTA) ou por intermédio de uma biotina (usando pérolas de estreptavidina) no alvo.

[000318] Os dois primeiros ciclos de triagem envolveram uma eluição alcalina (TEA), e o terceiro ciclo de triagem foi primeiro eluído competitivamente com MBL antes de uma etapa de eluição alcalina convencional (TEA). A seleção negativa foi realizada antes dos ciclos 2 e 3, e isto foi contra os análogos funcionais, C1s e C1r da via de complemento clássico. Depois da triagem, o enriquecimento específico dos fagos com fragmentos de scFv contra MASP-2A foi monitorado, e foi determinado que a estratégia de triagem obteve sucesso (dado não mostrado).

[000319] Os genes de scFv do ciclo de triagem 3 foram clonados em um vetor de expressão pHOG, e operados em uma triagem de filtro de escala pequena para procurar clones específicos contra MASP-2A, como também descrito abaixo. TABELA 7: Métodos de Triagem de Fagos (biotina/estreptavidina)

TABELA 8: Métodos de Triagem de Fago (HIS/NiNTA)

Reagentes da Triagem: MASP-2A humana anticorpo OMS100 (controle positivo) IgG de cabra anti-humano (H+L) (Pierce #31412) pérolas de NiNTA (Qiagen #LB13267) Estreptavidina Dynabeads® M-280, 10 mg/ml (LB12321) Soro humano Normal (LB 13294) IgG de coelho anti-humano policlonal C3c (LB13137) IgG de cabra anti-coelho, HRP (American Qualex #A102PU)

[000320] Para testar o antígeno de MASP-2A alvejado, um experimento foi realizado para capturar o anticorpo OMS 100 de controle positivo (200 ng/ml) pré-incubado com MASP-2A rotulado com biotina ou antígeno de MASP-2A rotulado com HIS (10 µg), com 50 µl de pérolas de NiNTA em PBS com 4 % de leite ou 200 µl de pérolas de Eestreptavidina, respectivamente. Mas o anticorpo de MASP-2A-OMS100 ligado foi detectado com IgG de cabra anti-humano (H+L) HRP (1: 5000) e substrato de TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina).

Ensaio ELISA com pérolas de NiNTA

[000321] 50 μl de pérolas de NiNTA foram bloqueados com 1 ml de leite a 4 % em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubada e em uma roda que gira por 1 hora na temperatura ambiente. Em paralelo, 10 μg de MASP-2A e anticorpo de OMS100 (diluídos a 200 ng/ml em PBS com 4 % de leite) foram pré-incubados por uma hora. As pérolas foram depois lavadas três vezes com 1 ml de PBS-T usando um ímã entre cada etapa. O MASP-2A pré-incubado com anticorpo de OMS100 foi adicionado às pérolas lavadas. A mistura foi incubada em uma roda que gira por 1 hora na temperatura ambiente, depois lavada três vezes com 1 ml de PBS-T usando um ímã como descrito acima. Os tubos foram incubados por 1 hora na temperatura ambiente com IgG de cabra anti-humano (H+L) HRP diluída 1: 5000 in PBS com 4 % de leite. Para os controles negativos, o IgG de cabra anti-humano (H+L) HRP (1:5000) foi adicionado às pérolas de Ni-NTA lavadas e bloqueadas em um tubo separado.

[000322] As amostras foram incubadas em um roda que gira por 1 hora na temperatura ambiente, depois lavadas três vezes com 1 ml de PBS-T e uma vez com 1 x PBS usando o ímã como descrito acima. 100 μl de substrato de TMB foram adicionados e incubados por 3 minutos na temperatura ambiente. Os tubos foram colocados em uma prateleira magnética durante 2 minutos para concentrar as pérolas, depois a solução de TMB foi transferida a uma placa de microtitulação e a reação foi interrompida com 100 μl de 2M de H2SO4. A absorvência a 450 nm foi lida no leitos de ELISA.

Pérolas de Estreptavidina no Ensaio de ELISA

[000323] Este ensaio foi realizado como descrito acima para Ensaio de ELISA com pérolas de NiNTA, mas ao invés disso usando 200 μl de pérolas de estreptavidina por amostra, e não antígenos biotinilados.

[000324] Resultados: O antígeno de MASP-2A rotulado com His e rotulado com biotina, pré-incubado com o anticorpo de OMS 100 de controle positivo, foram cada um capturado com sucesso com as pérolas de NiNTA, ou pérolas de estreptavidina, respectivamente.

Triagem

[000325] Três ciclos de triagem da biblioteca de fago scFv contra MASP-2A rotulado com HIS ou rotulado com biotina foram realizados como mostrado na TABELA 7 ou TABELA 8, respectivamente. O terceiro ciclo de triagem foi eluído primeiro com MBL, depois com TEA (alcalino). Para monitorar o enriquecimento específico dos fragmentos de scFv que demonstram fagos contra o MASP-2A alvo, um ELISA de fago policlonal contra MASP-2A imobilizado foi realizado como descrito abaixo.

ELISA de MASP-2A em fago policlonal enriquecido depois da Triagem

[000326] Depois de três ciclos de triagem, a biblioteca de fago scFv contra MASP-2 humano como descrito acima, o enriquecimento específico do fagos com fragmentos de scFv contra o MASP-2A alvo foi monitorando realizando-se um ensaio ELISA nas populações de fago policlonais enriquecidas geradas pela triagem contra MASP-2A imobilizado como descrito abaixo.

Métodos:

[000327] 5 ng/ml de MASP-2A foi imobilizado em placas de ELISA maxisorp em PBS durante a noite a 4° C. Os fagos empacotados de todos os três ciclos de triagem foram diluídos 1:3 em PBS com 4 % de leite e titulados com diluições de 3 vezes. O controle negativo foi um fago auxiliar M13.

[000328] O bloco foi PBS com 4 % de leite. As placas foram lavadas 3 x em μl de PBS-Tween a 0,05 % (v/v) entre cada etapa. O anticorpo primário foi α-fd de coelho (proteína de revestimento de M13), 1:5000 em PBS com 4 % de leite (p/v). O conjugado foi α-Cabra-HRP de coelho a 1:10.000 em PBS com 4 % de leite (p/v). O substrato foi ABTS. Todos os volumes, exceto lavagens e bloqueios, foram de 100 μl/reservat0rio. Todas as incubações foram de 1 hora com agitação na temperatura ambiente.

Resultados:

[000329] Os resultados do ELISA de fagos mostraram um enriquecimento específico de scFv contra MASP-2A para ambas estratégias de triagem. Ver a FIGURA 2. Como mostrado na FIGURA 2, a estratégia que envolve a captura por pérolas magnéticas de NiNTA forneceram o enriquecimento de scFv nos fagos contra MASP-2A depois de dois ciclos de triagem, ao passo que ambas estratégias tiveram um bom enriquecimento tanto na eluição competitiva quanto de TEA, depois do terceiro ciclo de triagem. O fago de controle negativo foi um fago auxiliar M13, que não mostrou reação cruzada contra MASP-2A na sua diluição mais baixa. Estes resultados demonstram que o sinal observado é devido ao scFv ligar-se especificamente ao MASP-2A.

Triagem de Filtro:

[000330] As colônias de bactérias que contêm plasmídeos que codificam os fragmentos de scFv a partir do terceiro ciclo de triagem foram selecionadas, nas membranas de nitrocelulose quadriculadas e cresceram durante a noite em um meio que não de indução para produzir as placas principais. Um total de 18.000 colônias foi selecionado e analisado a partir do terceiro ciclo de triagem, metade à partir da eluição competitiva e metade da eluição de TEA subsequente.

[000331] As membranas de nitrocelulose com colônias bacterianas foram induzidas com IPTG para expressar e secretar uma proteína de scFv solúvel e foram levadas em contato com uma membrana de nitrocelulose secundária revestida com antígeno de MASP-2A junto com uma membrana paralela revestida com PBS com 4 % de leite (solução de bloqueio).

[000332] Os ScFvs que ligaram a MASP-2A foram detectados por intermédio de seu rótulo c-Myc com mAb α-cMyc de Camundongo e HRP α- Camundongo de coelho. Os acertos que correspondem aos clones de scFv que foram positivos em MASP-2A e negativos em Leite-PBS foram selecionados para outra expressão, e uma subsequente análise ELISA.

[000333] Resultados: A triagem da biblioteca de fagomídeo scFv contra MASP-2A seguido pela conversão de scFv e uma triagem de filtro produziram 137 clones positivos. A maioria dos clones positivos veio da eluição competitiva com MBL, usando tanto estratégias de NiNTA quanto de estreptavidina. Todos os clones positivos foram continuados com micro expressão (escala de 200 μl) e extração subsequente. Os ScFv foram isolados do periplasma das bactérias incubando-se a suspensão bacteriana com tampão de sacarose de lise e lisossomo por uma hora, depois que o sobrenadante foi isolado por uma etapa de centrifugação. O sobrenadante que contém scFv secretado no meio junto com os conteúdos do periplasma foi analisado através de dois ensaios: ELISA usando MASP-2A adsorvido fisicamente, e análise de ligação usando MASP-2A ligado com amina a um chip CM5 no Biocore, como descrito em mais detalhes abaixo. ELISA DE MASP-2A em clones de ScFv candidatos identificados por triagem/conversão de scFv e tela de filtro.

Métodos:

[000334] 4 μg/ml de MASP-2A foram imobilizados em placas de ELISA maxisorp (Nunc) em PBS durante a noite a 4° C. No dia seguinte, as placas foram bloqueadas por lavagem três vezes com PBS-Tween (0,05 %). O material de scFv bruto (100 μl de extrato de meio-periplasma) de cada um dos 137 candidatos de scFv (gerado como descrito acima) foi adicionado por reservatório à placa. Em seguida, anti-cMyc foi adicionado, e na etapa final, anti-camundongo de coelho conjugado a HRP foi aplicado para detectar scFv de ligação. A reação foi desenvolvida em ABTS de 1 etapa de substrato de peroxidase (Calbiochem). O controle positivo foi OMS100 (um anticorpo anti-MASP-2 no formato Fab2) diluído até 10 μg/ml em PBS-Tween 0,05 %. O controle negativo foi meio-periplasma de XL1-Blue sem plasmídeo.

[000335] As lavagens de 3 x 200 μl de PBS-Tween 0,05 % (v/v) foram realizadas entre cada etapa.

[000336] O anticorpo primário foi α-cMyc de murino, 1:5000 em PBS- Tween 0,05 % (p/v).

[000337] O conjugado foi α-Cabra-HRP de coelho a 1:5000 em PBS- Tween 0,05 % (p/v) ou IgG de cabra anti-humano (H+L, Pierce 31412). O substrato foi ABTS, com incubação de 15 minutos na temperatura ambiente. Todos os volumes, exceto lavagens e bloqueios, foram de 100 μl/reservat0rio. Todas as incubações foram por 1 hora com agitação na temperatura ambiente.

[000338] Resultados: 108/137 clones foram positivos no ensaio de ELISA (dados não mostrados), dos quais 45 clones foram novamente analisados como descrito abaixo. O controle positivo foi OMS100 Fab2 diluído até 10 μg/ml em PBS-Tween, e este clone foi positivo. O controle negativo foi meio-periplasma de XL1-Blue sem plasmídeo, que foi negativo.

EXEMPLO 3

[000339] Este exemplo descreve o método de triagem funcional de MASP-2 usado para analisar os candidatos de anticorpos de scFv anti-MASP- 2 completamente humano de alta afinidade quanto a capacidade de bloquear a atividade de MASP-2 no soro humano normal. Análise Racional/Fundamento O ensaio para medir a inibição da formação da via de lectina C3 Convertase:

[000340] Um ensaio funcional que mede a inibição da formação da via de lectina C3 convertase foi usado para avaliar a “atividade de bloqueio” dos clones candidatos de scFv anti-MASP-2. A via da lectina C3 convertase é o complexo enzimático (C4b2a) que proteoliticamente cliva C3 nos dois fragmentos pró-inflamatórios potentes, anafilatoxina C3a e opsônico C3b. A formação de C3 convertase parece ser uma etapa chave na via da lectina em termos de mediação da inflamação. O MASP-2 não é um componente estrutural da C3 convertase da via da lectina (C4b2a); portanto, os anticorpos anti-MASP-2 (ou Fab2) não inibirão diretamente a atividade de C3 convertase pré-existente. Entretanto, a atividade da MASP-2 serina protease é requerida de modo a gerar os dois componentes de proteína (C4b, C2a) que compreendem a C3 convertase da via da lectina. Portanto, scFv anti-MASP-2 que inibe a atividade funcional de MASP-2 (isto é, bloqueia scFv anti-MASP- 2) inibirá a formação de novo dos via da lectina C3 convertase. C3 contém um grupo de tioéster não usual e altamente reativo como parte da sua estrutura. Na clivagem de C3 pela C3 convertase neste ensaio, o grupo de tioéster no C3b pode formar uma ligação covalente com grupos hidroxila ou amino nas macromoléculas imobilizadas no fundo dos reservatórios plásticos por intermédio das ligações de éster ou amida, facilitando assim a detecção de C3b no ensaio de ELISA.

[000341] A levedura manana é um ativador conhecido da via da lectina. No método que segue para medir a formação da C3 convertase, os reservatórios plásticos revestidos com manana foram incubados com soro humano diluído para ativar a via da lectina. Os reservatórios foram depois lavados e ensaiados quanto a C3b imobilizado nos reservatórios usando métodos de ELISA padrão. A quantidade de C3b gerada neste ensaio é uma reflexão direta da formação de novo da via da lectina C3 convertase. scFv’s anti-MASP-2 nas concentrações selecionadas foram testadas neste ensaio quanto a sua capacidade para inibir a formação da C3 convertase e consequente geração de C3b.

Métodos:

[000342] Os 45 clones candidatos identificados como descrito no Exemplo 2 foram expressados, purificados e diluídos até a mesma concentração de estoque, que foi novamente diluída em Ca++ e Mg++ que contém tampão de GVB (4,0 mM de barbital, 141 mM de NaC1, 1,0 mM de MgCl2, 2,0 mM de CaCl2, 0,1 % de gelatina, pH 7,4) para garantir que todos os tivessem a mesma quantidade de tampão. Os clones de scFv foram cada um testados em triplicata na concentração de 2 μg/ml. O controle positivo foi OMS100 Fab2 e foi testado em 0,4 μg/ml. A formação de C3c foi monitorada na presença e ausência dos clones de scFv/IgG.

[000343] A manana foi diluída até uma concentração de 20 μg/ml (1 μg/reservat0rio) em 50 mM de tampão de carbonato (15 mM de Na2CO3 + 35 mM de NaHCO3 + 1,5 mM de NaN3), pH 9,5 e revestida em uma placa de ELISA durante a noite a 4° C. No dia seguinte, as placas revestidas com manana foram lavadas 3X com 200 μl de PBS. 100 μl de solução de bloqueio de HSA a 1 % foram depois adicionados aos reservatórios e incubados por 1 hora na temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3X com 200 μl de PBS, e armazenadas em gelo com 200 μl de PBS até a adição das amostras.

[000344] O soro humano normal foi diluído até 0,5 % em CaMg de tampão de GVB, e os clones de scFv ou o controle positivo de OMS100 Fab2 foram adicionados em triplicatas a 0,01 μg/ml; 1 μg/ml (apenas controle de OMS100) e 10 μg/ml a este tampão e pré-incubado 45 minutos em gelo antes da placa de ELISA bloqueada. A reação foi iniciada através da incubação por uma hora a 37° C e foi interrompida transferindo-se as placas a um banho de gelo. A deposição de C3b foi detectada com um anticorpo C3c de α- Camundongo coelho seguido por HRP α-coelho de Cabra. O controle negativo foi tampão sem anticorpo (sem OMS100 = deposição de C3b máxima), e o controle positivo foi tampão com EDTA (sem deposição de C3b). O fundo foi determinado realizando-se mesmo ensaio, mas em reservatórios negativos de manana. O sinal de fundo contra as placas sem manana foi subtraído a partir dos sinais positivos de manana. Um critério de corte foi ajustado na metade da atividade de um clone de scFv irrelevante (VZV) e tampão sozinho.

[000345] Resultados: Com base no critério de corte, um total de 13 clones foi descoberto bloquear a atividade de MASP-2 como mostrado nas FIGURAS 3A e 3B. Todos os 13 clones produziram > 50 % da supressão de via e foram selecionados e sequenciados, rendendo 10 clones únicos, como mostrado abaixo na TABELA 9. Os dez diferentes clones mostrados na TABELA 9 foram descobertos resultar em uma atividade funcional adequada no ensaio de complemento. Todos os dez clones foram descobertos ter a mesma subclasse de cadeia leve, X3, além das três subclasses de cadeias pesadas diferentes, VH2, VH3 e VH6. A identidade de sequência do clones para as sequências da linha germinativa também é mostrada na TABELA 9. TABELA 9: 10 Clones Únicos com Atividade anti-MASP-2 Funcional

[000346] Como mostrado acima na TABELA 9, 10 clones diferentes com atividade funcional aceitável e sequências únicas foram escolhidos para uma análise adicional. Como observado na TABELA 9, alguns dos clones foram detectados duas ou três vezes, com base nas sequências idênticas (ver primeiro a coluna da TABELA 9 com os nomes dos clones).

Expressão e purificação de dez clones candidatos de svFc

[000347] Os dez clones candidatos mostradas na TABELA 9 foram expressados em uma escala de litro e purificados por intermédio de troca de íons na cromatografia de níquel. Depois que uma amostra de cada clone foi operada em uma coluna de cromatografia ou exclusão de tamanho para avaliar o teor de monômeros e dímeros. Como mostrado abaixo na TABELA 10, quase todos os clones de scFv estavam presentes na forma monomérica, e esta fração monomérica foi isolada para um outro teste e classificação. TABELA 10: Análise do Teor de Monômeros

Fração monomérica de teste para ligação e atividade funcional

[000348] Os clones mostrados na TABELA 10 foram expressados em escala de1 l, purificados em cromatografia metálica e troca de íons, separados em fração monomérica através da cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e ensaios funcionais foram repetidos para determinar os valores de IC50 e reatividade cruzada.

Ensaio funcional em frações monoméricas:

[000349] A fração monomérica dos dez clones de topo, mostrada na TABELA 10, foi purificada e testada quanto a IC50 nM funcional em uma série de diluição em que cada uma recebeu a mesma concentração de tampão de GVB com cálcio, magnésio e soro humano. Os clones de scFv foram testados em 12 diluições em triplicata. O controle positivo foi OMS100 Fab2. A deposição de C3b foi monitorado na presença e ausência do anticorpo. Os resultados são mostrados abaixo na TABELA 11.

Ensaio de Ligação:

[000350] A afinidade de ligação KD foi determinada de duas maneiras diferentes para as frações monoméricas purificadas dos dez clones candidatos de scFv. O MASP-2A foi imobilizado por amina ligando a um chip CM5, ou uma concentração fixa de scFv (50 nM) foi primeiro capturada com um anticorpo de α-cMyc ligado a amina de alta afinidade, e em seguida uma série de concentração de MASP-2A na solução foi passada através do chip. Os resultados são mostrados abaixo na TABELA 11. Resultados: TABELA 11: Sumário das atividades inibidoras funcionais (IC50) e afinidade de ligação de MASP-2 (KD) para os dez clones de scFv candidatos ensaiados

Descrição dos Resultados:

[000351] Como mostrado na TABELA 11, no ensaio funcional, cinco dos dez clones de scFv candidatos forneceram valores de IC50 nM menores do que o critério de alvo de 25 nM usando 0,5 % de soro humano.

[000352] Como descrito abaixo, estes clones também foram testados na presença de soro de primata não humano e soro de rato para determinar a atividade funcional em outra espécie. Com relação à afinidade de ligação, na solução, todas as afinidades de ligação foram na faixa de nM baixo ou melhor, ao passo que no ensaio convencional com MASP-2 imobilizado, apenas dois clones (4D9 e 17D20) tinham afinidades na faixa de nM baixa. A observação de afinidades maiores na solução com ensaio de base é semelhante a um resultado do fato de que o antígeno multimeriza quando em solução. Além disso, quando o alvo é imobilizado no chip (por intermédio da ligação orientada) o epítopo pode ser mascarado, deste modo reduzindo as afinidades observadas no ensaio imobilizado.

EXEMPLO 4

[000353] Este exemplo descreve os resultados de testar os dez clones de scFv anti-MASP-2 humano candidato quanto a reatividade cruzada com MASP-2 de rato e determinando os valores de IC50 destes clones de scFv em um ensaio funcional para determinar sua capacidade para inibir a ativação de complemento dependente de MASP-2 no soro humano, soro de primata não humano, e soro de rato.

Métodos: Reatividade cruzada com MASP-2 de rato

[000354] Os dez clones de scFv candidatos, mostrados na TABELA 9 do Exemplo 3, foram testados quanto a reatividade cruzada contra MASP-de rato 2A em um ensaio ELISA convencional contra MASP-2A de rato adsorvido. O MASP-2A de rato foi diluído to até 4 μg/ml em PBS e revestido em uma placa de ELISA Maxisorp (Nunc) durante a noite a 4° C. No dia seguinte, a placa foi bloqueada pela lavagem três vezes em PBS-Tween (0,05 %). Os clones de ScFv (100 μl) diluídos em 20 μg/ml em PBS-Tween foram adicionados à placa, e novamente titulados com três vezes diluições de 4 vezes. Os clones de svFc MASP-2A específicos (reservatórios que contêm scFv ligado) foram detectados com anti-cMyc e anticorpo secundário HRP de coelho anti-camundongo. A reação foi desenvolvida em substrato de peroxidase TMB (Pierce). O controle positivo foi de OMS 100 Fab2 diluído até 10 μg/ml em PBS-Tween. Todos os clones testados apresentaram uma reação cruzada com MASP-2A de rato, que foi esperada visto que o segundo ciclo de triagem foi com MASP-2 de rato (dado não mostrado). Caracterização funcional dos dez clones de scFv candidatos em soro humano, soro de primata não humano (NHP) e soro de rato Determinação dos níveis de C3c de linha de base em Diferentes Soros

[000355] Primeiro, um experimento foi realizado para comparar os níveis de C3b de linha de base nos três soros (humano, rato e NHP) como segue.

[000356] Manana foi diluída até 20 μg/ml e revestida em uma placa de ELISA durante a noite a 4° C. No dia seguinte os reservatórios foram bloqueados com 1 % de HSA. O soro humano, de rato e macaco verde africano normais (primata não humano “NHP”) foi diluído que começam a 2 % de diluições de 2 vezes em um tampão de CaMgGVB. A reação foi iniciada através da incubação por um hora a 37° C, e foi interrompida transferindo-se a placa a um banho de gelo. A deposição de C3b foi detectada com um anticorpo de C3c de coelho anti-camundongo, seguido por HRP de cabra anti-coelho. O controle negativo foi um tampão sem anticorpo (sem OMS100 resulta em uma deposição de C3b máxima) e o controle positivo para a inibição foi tampão com EDTA (sem deposição de C3b).

[000357] A FIGURA 4 ilustra graficamente os níveis de C3c de linha de base nos três soros (humano, rato e NHP). Como mostrado na FIGURA 4, os níveis de C3c foram muito diferentes nos diferentes soros testados. Quando comparando os níveis de C3c, parece que 1 % de soro humano forneceu níveis equivalentes a 0,2 % de NHP e 0,375 % de soro de rato. Com base nestes resultados, as concentrações de soro foram normalizadas de modo que os resultados de scFv podem ser diretamente comparados nos três diferentes tipos de soros.

Ensaio Funcional dos Clones de ScFv em Diferentes Soros

[000358] As frações monoméricas purificadas dos dez clones de scFv candidatos foram depois testados quanto o IC50 nM funcional no soro humano, soro de rato e soro de macaco verde africano (primata não humano “NHP”). O ensaio foi realizado como descrito no Exemplo 3, usando 1000 nM de proteína de scFv purificada e soro humano normal que foi diluído até 0,9 % em tampão de CaMgGVB; soro de macaco verde africano diluído até 0,2 % em um tampão de CaMgGVB; ou soro de rato diluído até 0,375 % em tampão de CaMgGVB. Todos os dez clones de scFv foram testados em uma série de diluição em que receberam a mesma concentração de tampão de GVB com cálcio, magnésio e soro. Os clones de scFv foram testados em doze diluições em triplicatas. O controle positivo foi OMS 100 Fab2 a 100 ng/ml ou adição de EDTA à reação. O controle negativo foi um controle de scFv irrelevante ou PBS sem nenhum scFv. A deposição de C3b foi monitorada na presença e ausência de anticorpo de scFv ou Fab2. O sinal de fundo de OMS100 a 100 ng/ml foi subtraído de todos os sinais. A TABELA 12 resume os resultados dos ensaios funcionais em todos os três soros. TABELA: 12: Atividade de IC50 funcional (nM) dos clones de scFv em três diferentes tipos de soro.

Nota: * o primeiro conjunto de dados no soro humano (Exp #1) foi feito em amostras de scFv que não foram concentradas, portanto, os clones com baixa concentração não podem ser totalmente titulados. Nos experimentos restantes, todos os clones foram concentrados e as titulações começaram em concentrações idênticas.

Resumo dos resultados para a atividade funcional em clones de scFv candidatos em diferentes soros:

[000359] Todos os dez dos clones de scFv mostraram função tanto em soro humano quanto de primata não humano (NHP) depois o soro foi normalizado com relação aos níveis de deposição de C3b. Os seis clones mais ativos no soro humano foram:

[000360] 9P13>17N16>17D20>4D9>3F22>18L16, quando classificados do melhor para o pior. No soro de NHP, os clones classificados (melhor para pior): 17L20>17N16>17D20>9P13>18L16>3F22. Tanto 17N16 quanto 17D20 foram classificados entre os três melhores tanto no soro humano quanto no soro de NHP. 17D20 também apresentou alguma atividade em soro de rato.

[000361] Com base nestes resultados, os três melhores clones de scFv foram determinados ser : 18L16, 17D20 e 17N16. Estes três clones também foram analisados no soro humano diluído (soro a 1 %) como mostrado abaixo na TABELA 13. TABELA 13: Ensaio C3 dos três clones candidatos: (IC50 nM) em soro diluído (1 %)

[000362] A FIGURA 5A é um alinhamento de sequência de aminoácido dos clones de scFv de tamanho natural 17D20, 18L16, 4D9, 17L20, 17N16, 3F22 e 9P13. Os clones de scFv compreendem uma região variável da cadeia pesada (aa1-120), uma região ligante (aa121-145), e uma região variável da cadeia leve (aa 146-250). Como mostrado na FIGURA 5A, o alinhamento da região de cadeia pesada (resíduos 1-120) dos clones mais ativos revelam dois grupos diferentes que pertencem à família dos genes VH2 e VH6, respectivamente. Como mostrado na FIGURA 5A, a região VH com relação aos clones da classe VH2: 17D20, 18L16 e 4D9 tem uma variabilidade nas 20 posições aa na região de 120 aminoácidos totais (isto é 83 % de identidade).

[000363] Como também mostrado na FIGURA 5A, a região de VH com relação aos clones da classe VH6: 17L20, 17N16, 3F22, e 9P13, tem uma variabilidade nas 18 posições de aa na região de 120 aminoácidos totais (isto é 85 % de identidade).

[000364] A FIGURA 5B é um alinhamento de sequências dos clones de scFv 17D20, 17N16, 18L16 e 4D9. TABELA 14: Sequência de clones de ScFv candidatos mostrada nas FIGURAS 5A e 5B

[000365] As prioridades de classificação foram (1) potência funcional do soro humano e bloqueio total; (2) reatividade cruzada de NHP e (3) diversidade de sequência. 17D20 e 17N16 foram selecionados como os melhores representantes de cada família genética. 18L16 foi selecionado como o terceiro candidato com uma diversidade de sequência CDR3 apreciável.

[000366] 17N16 e 17D20 foram as duas escolhas principais devido ao bloqueio funcional completo, com as melhores potências funcionais contra humano; reatividade cruzada de macaco apreciável e famílias genéticas de VH diferentes. 3F22 e 9P13 foram eliminados devido às sequências de VH quase idênticas a 17N16. 18P15, 4J9 e 21B17 foram eliminados devido à potência modesta. 17L20 não foi continuado porque bloqueou apenas parcialmente.

[000367] 18L16 e 4D9 tinham atividades similares e diversidade apreciável comparado ao 17D20. 18L16 foi escolhido devido à maior reatividade cruzada com primata do que 4D9.

[000368] Portanto, com base nestes critérios: seguem três clone mães: 17D20, 17N16 e 18L16 foram superiores em maturação de afinidade como descrito abaixo.

EXEMPLO 5

[000369] Este Exemplo descreve a clonagem de três clone mães 17D20, 17N16 e 18L16 (identificados como descrito nos Exemplos de 2 a 4) no formato IgG4 do tipo selvagem, e avaliando a funcionalidade dos três clones mães como IgGs de tamanho natural.

Análise Racional:

[000370] Os anticorpos de scFv anti-MASP-2 totalmente humanos com potência funcional moderada foram identificados usando exibição de fago como descrito nos Exemplos 2 a 4. Três tais clones mães, 17D20, 17N16 e 18L16 foram selecionados quanto maturação por afinidade. Para avaliar a funcionalidade destes clones mães como IgGs de tamanho natural, IgG4 do tipo selvagem e formas mutantes de IgG4 na região de articulação S228P destes anticorpos foram produzidos. A região de articulação S228P mutante foi incluída para aumentar a estabilidade do soro (ver Labrijn A.F. et al., Nature Biotecnology 27: 767 (2009)).

[000371] A sequência de aminoácido de IgG4 do tipo selvagem é apresentada como SEQ ID NO: 63, codificada pela SEQ ID NO: 62.

[000372] A sequência de aminoácido de IgG4 S228P é apresentada como SEQ ID NO: 65, codificada pela SEQ ID NO: 64.

[000373] As moléculas de IgG4 também foram clivadas em formatos F(ab’)2 com digestão de pepsina e fracionadas através de cromatografia de exclusão por tamanho de modo a comparar os clones mães diretamente ao anticorpo de controle OMS100, que é uma molécula de F(ab)2.

Métodos: Gerar os clones no formato de tamanho natural

[000374] Os três clones mães foram convertido em um formato de IgG4 do tipo selvagem e em um formato de S228P de IgG4 mutante. Isto foi efetuado através do isolamento de PCR das regiões de VH e VL apropriadas a partir dos clones mães acima indicados e clonando estes nos vetores de expressão pcDNA3 ancorando a região apropriada constante de cadeia pesadas para criar fusões na matriz para produzir o anticorpo desejado. Os três clones mães no formato de IgG4 mutante foram depois clivados com pepsina para gerar fragmentos de F(ab’)2 e foram purificados através do fracionamento em uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanho.

Ensaio de Ligação

[000375] Os clones mães candidatos convertidos ao formato IgG4 foram transitoriamente transfectados em células de HEK 293 e os sobrenadantes da transfecção transitória foram titulados em um ensaio de ELISA. Os clones apresentaram uma excelente reatividade com MASP-2 A humano fisicamente adsorvido, e classificados na ordem que segue: 17N16>17D20>18L16 (dados não mostrados).

[000376] Os clones foram depois purificados e retestados em ELISA e um ensaio de atividade como segue. O MASP-2 A humano foi revestido a 3 μg/ml em PBS em uma placa maxisorp, IgG (45 μg/ml) e Fab’2 (30 μg/ml) foram diluídos em PBS-Tween a uma concentração que começa de 300 nM, e novamente com diluições de 3 vezes. As IgGs foram detectadas com IgG de Cabra α-Humano conjugado a HRP (Southern Biotech) e o F(ab’)2 foi detectado com IgG H+L de Cabra α-Humano conjugado a HRP (Pierce 31412). A reação foi desenvolvido com substrato TMB e interrompida com 2M de H2SO4. Os resultados são mostrados abaixo na TABELA 15. TABELA 15: Afinidade de ligação para MASP-2 humano

Ensaio Funcional

[000377] O ensaio de C3 convertase usando 1 % de soro humano normal (NHS), como descrito no Exemplo 4, foi usado para comparar a atividade funcional dos clones de scFv mãe e as contrapartes de IgG4 de tamanho natural em 1 % de NHS. Manana foi diluída até uma concentração de 20 μg/ml e revestida em uma placa de ELISA durante a noite a 4° C. No dia seguinte, os reservatórios foram bloqueados com soro humano a 1 %. O soro humano foi diluído até 1 % em um tampão de CaMgGVB e os anticorpos foram purificados; scFv (900 nM), F(ab’)2 (300 nM), IgG (300 nM) foram adicionados em duplicatas em uma série de diferentes diluições até a mesma quantidade do tampão, e pré-incubado por 45 minutos em gelo antes de adicionar às placas de ELISA bloqueadas. A reação foi iniciada através da incubação a 37° C por uma hora e foi interrompida colocando-se a placa em gelo. A deposição de C3b foi determinada com um anticorpo de C3c de coelho α-camundongo seguido por um HRP de cabra α-coelho. O fundo de OMS100 a 50 nM nas placas de manana positivas foi subtraído das curvas. Um resumo dos resultados desta análise é mostrado abaixo na TABELA 16. TABELA 16: Ensaio de C3 convertase usando soro humano a 1 % (IC50 nM)

Nota: os dois valores mostrados nas colunas 2-4 da Tabela 16 se referem aos resultados dos dois experimentos separados.

[000378] A potência funcional dos clones mães de IgG4 também foram comparadas ao formato mutante da articulação de IgG4 (S228P) para cada clone. Os valores numéricos de IC50 para o ensaio de deposição de usando NHS a 1 % são mostrados abaixo na TABELA 17. TABELA 17: (IgG4) tipo selvagem contra o formato mutante do tipo articulação (S228P) no ensaio de deposição de C3b em soro humano a 1 % (IC50 nM)

[000379] Como mostrado acima na TABELA 17, em alguns casos, uma farmacologia inesperada do agonista foi observada para os scFv derivados de IgGs antagonísticos. A base mecânica para esta observação não é entendida.

[000380] As atividades de clones mães convertidos em IgG4 com função inibidora em NHS a 1 % foram novamente avaliadas sob condições de ensaio mais restritas que imitam mais fielmente as condições fisiológicas. Para estimar a atividade de anticorpo sob condições fisiológicas, o teste das preparações de IgG4 de clone mãe foram conduzidos quanto sua capacidade para inibir a deposição de C3b dependente da via de lectina (LP) nas placas revestidas com manana sob condições de ensaio restritas usando plasma humano minimamente diluído (90 %).

[000381] Os resultados do ensaio de deposição de C3b em plasma humano a 90 % são mostrados na FIGURA 6. Visto que o MASP-2 e seus substratos estão presentes na mistura de ensaio em uma concentração aproximadamente 100 vezes maior do que no ensaio de soro diluído usando 1 % de soro humano normal, uma mudança à direita da curva de dose-resposta do antagonista é, em geral, esperada. Como mostrado na FIGURA 6, como esperado, uma mudança à direita para potenciais aparentes inferiores foi observada para OMS 100 e todos os anticorpos de MASP-2 testados. Entretanto, surpreendentemente, nenhuma redução na potência evidente foi observada para o mutante de região de articulação (5228P) de 17D20, e a potência neste formato foi comparável àquele medido em 1 % de plasma (ver a TABELA 17). No formato de ensaio de NHS a 90 %, a potência funcional de IgG4 17D20 (S228) foi descoberta ser modestamente inferior do que OMS100 Fab2, que é, em contraste aos resultados do ensaio em NHS a 1 % onde o OMS100 foi de 50 a 100 vezes mais potente do que o IgG4 5228P de 17D20 (dados não mostrados). A forma de IgG4 do tipo selvagem de 17N16 também apresentou uma inibição completa em NHS a 90 % mas de algum modo foi menos potente neste formato de ensaio (IC50 de l5nM) enquanto a forma de IgG4 do tipo selvagem de 18L16 foi menos potente e apenas parcialmente inibidora, como mostrado na FIGURA 6.

[000382] Com base nestas descobertas, a atividade dos clones mães convertidos em IgG4 foi novamente avaliada examinando-se a deposição de C4b sob condições de ensaio restritas (NHS a 90 %). Este formato de ensaio fornece uma medição direta da atividade de anticorpo na reação enzimática catalisada por MASP-2.

Ensaio para medir a Inibição da Clivagem de C4 dependente de MASP-2

[000383] Fundamentos: A atividade da serina protease de MASP-2 é altamente específica e dois substratos de proteína únicos para MASP-2 foram identificados; C2 e C4. A clivagem de C4 gera C4a e C4b. Fab2 anti-MASP-2 pode ligar-se aos epítopos estruturais em MASP-2 que estão diretamente envolvidos na clivagem de C4 (por exemplo, sítio de ligação de MASP-2 para C4; sítio catalítico da MASP-2 serina protease) e por meio disso inibir a atividade funcional da clivagem de C4 de MASP-2.

[000384] A levedura manana é um ativador da via da lectina conhecido. No método que segue para medir a atividade de clivagem de C4 de MASP-2, reservatórios de plástico revestidos com manana foram incubados por 90 minutos a 4 °C com soro humano a 90 % para ativar a via da lectina. Os reservatórios foram depois lavados e ensaiados quanto ao C4b de ser humano imobilizado nos reservatórios usando métodos de ELISA padrão. A quantidade de C4b gerado neste ensaio é uma medida da atividade da clivagem de C4 dependente de MASP-2. Anticorpos anti-MASP-2 nas concentrações selecionadas foi testado neste ensaio quanto a sua capacidade para inibir a clivagem de C4.

[000385] Métodos: Placas de ligação de meio de 96 reservatórios Costar foram incubadas durante a noite a 5 °C com manana diluída em 50 mM de tampão de carbonato, pH 9,5 a 1,0 μg/50 μl/reservat0rio. Cada reservatório foi lavado 3X com 200 μl de PBS. Os reservatórios foram depois bloqueados com 100 μl/reservatório de albumina sérica bovina a 1 % em PBS e incubadas por uma hora na temperatura ambiente com mistura suave. Cada reservatório foi lavado 3X com 200 μl de PBS. As amostras de anticorpo anti-MASP-2 foram diluídas até as concentrações selecionadas em Ca++ e mg++ contendo tampão GVB (4,0 mM de barbital, 141 mM de NaCl, 1,0 mM de mgCl2, 2,0 mM de CaCl2, 0,1 % de gelatina, pH 7,4) a 5° C. Soro humano a 90 % foi adicionado às amostras acima a 5° C e 100 μl foram transferidos para cada reservatório. As placas foram cobertas e incubadas por 90 min em um banho de água gelada para permitir a ativação de complemento. A reação foi interrompida pela adição de EDTA à mistura de reação. Cada reservatório foi lavado 5 x 200 μl com PBS-Tween 20 (0,05 % de Tween 20 em PBS), depois cada reservatório foi lavado com 2X com 200 μl de PBS. 100 μl/reservatório de diluição 1:700 de C4c anti-humano de galinha conjugado com biotina (Immunsystem AB, Uppsala, Suécia) foram adicionados em PBS contendo 2,0 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA) e incubados uma hora na temperatura ambiente com mistura suave. Cada reservatório foi lavado 5 x 200 μl de PBS. 100 μl/reservat0rio de 0,1 μg/ml de estreptavidina conjugada à peroxidase (Pierce Chemical #21126) foram adicionados em PBS contendo 2,0 mg/ml de BSA e incubados por uma hora na temperatura ambiente em um agitador com mistura suave. Cada reservatório foi lavado 5 x 200 μl com PBS. 100 μl/reservatório do substrato de peroxidase TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) foram adicionados e incubados na temperatura ambiente por 16 min. A reação da peroxidase foi interrompida pela adição de 100 μl/reservatório de H3PO4 1,0 M e a OD450foi medida.

Resultados:

[000386] Neste formato, ambas as formas de IgG4 de 17D20 inibiram a deposição de C4b direcionada pela via da Lectina, embora os valores de IC50 fossem -3 vezes mais altos comparados com o ensaio de deposição de C3b. De maneira interessante, 17N16 IgG4 tipo selvagem apresentou boa atividade neste ensaio com um valor de IC50 e perfil de dose-resposta comparável com o ensaio de deposição de C3b. 18L16 foi consideravelmente menos potente e não alcançou a inibição completa neste formato (dados não mostrados).

Debate:

[000387] Como descrito nos Exemplos 2-5, anticorpos scFv anti-MASP- 2 totalmente humanos com atividade de bloqueio funcional foram identificados usando a demonstração de fago. Três de tais clones, 17N16, 17D20 e 18L16, foram selecionados quanto à maturação de afinidade e testados ainda mais. Para avaliar a funcionalidade destes clones mães como IgGs de tamanho natural, IgG4 tipo selvagem e as formas mutantes da região de articulação S228P de IgG4 destes anticorpos foram produzidas. Como descrito neste Exemplo, a maioria das IgGs de tamanho natural tiveram atividade funcional melhorada quando comparadas com as suas contrapartes scFv quando testadas em um formato de ensaio funcional padrão com 1 % de plasma humano. Para estimar a atividade de anticorpo sob condições fisiológicas, o teste de preparações IgG4 de clone mãe foi conduzido sob condições de ensaio severas usando 90 % de plasma humano. Sob estas condições, vários anticorpos revelaram potências funcionais que foram substancialmente melhores do que o esperado com base no seu desempenho em ensaios funcionais em plasma (1 %) padrão.

EXEMPLO 6

[000388] Este Exemplo descreve o embaralhamento de cadeia e a maturação de afinidade dos clones mães 17D20, 17N16 e 18L16, e a análise dos clones filhas resultantes.

Métodos:

[000389] Para identificar anticorpos com potência melhorada, os três clones de scFv mãe, 17D20, 17N16 e 18L16, identificados como descrito nos Exemplos 2-5, foram submetidos ao embaralhamento da cadeia leve. Este processo envolveu a geração de uma biblioteca combinatória que consiste do VH de cada um dos clones mães emparelhados com uma biblioteca de cadeias leves lambdas ingênuas, humanas (VL) derivadas de seis doadores saudáveis. Esta biblioteca foi depois triada quanto aos clones scFv com afinidade de ligação e/ou funcionalidade melhoradas.

[000390] 9.000 clones filhas embaralhados na cadeia leve foram analisados por clone mãe, para um total de 27.000 clones. Cada clone filha foi induzido a expressar e secretar scFv solúvel, e foi triado quanto a capacidade para ligar-se à MASP-2A humana. ScFvs que se ligaram à MASP-2A humana foram detectados por intermédio de seu rótulo c-Myc. Esta triagem inicial resultou na seleção de um total de 119 clones, que incluíram 107 clones filhas da biblioteca de 17N16, 8 clones filhas da biblioteca de 17D20, e 4 clones filhas da biblioteca de 18L16.

[000391] Os 119 clones foram expressados em pequena escala, purificados em colunas NiNTA, e testados quanto a afinidade de ligação em um ensaio de ELISA contra MASP-2A humana fisicamente adsorvida. Resultados:

[000392] Os resultados do ensaio de ELISA sobre um subconjunto representativo dos 119 clones filhas são mostrados nas FIGURAS 7A e B. A FIGURA 7A graficamente ilustra os resultados do ensaio de ELISA no clone mãe 17N16 versus clones filhas titulados sobre huMASP-2A. A FIGURA 7B graficamente ilustra os resultados do ensaio de ELISA no clone mãe 17D20 versus clones filhas titulados sobre huMASP-2A.

[000393] Como mostrado na FIGURA 7A, clones filhas 17N16m dl6E12 e 17N16m dl7N9, derivados do clone mãe 17N16 tiveram afinidades que foram mais altas do que a do clone mãe. Também, como mostrado na FIGURA 7B, um clone derivado do clone mãe 17D20, 17D20m dl8M24, teve uma afinidade mais alta do que o clone mãe. Estes três clones, e três clones adicionais: 17N16m d13L12, 17N16m d16K5, 17N16m d1G5, e 17D20m d1824 que tiveram um nível de expressão baixo foram expressados na escala de 0,5 L, purificados na fração de monômero pela cromatografia de exclusão de tamanho e foram retestados em um ELISA e ensaio funcional. A biblioteca de 18L16 não produziu nenhum clone filha com a afinidade de ligação desejada.

[000394] Depois da purificação, os seis clones filhas foram testados em um ensaio de complemento quanto à atividade inibidora. Os resultados são mostrados na TABELA 18. TABELA 18: Ensaio de Complemento de clones mães e filhas

[000395] Como mostrado acima na TABELA 18, apenas um dos clones, 17N16m dl7N9, teve afinidade e atividade na mesma faixa como o clone mãe.

[000396] A FIGURA 8 é um alinhamento da sequência de aminoácido do clone mãe de scFv do tamanho natural 17N16 (SEQ ID NO: 59) e do clone filha 17N16m _d17N9 (SEQ ID NO: 66), que mostra que as cadeias leves (que começam com SYE) tiveram 17 resíduos de aminoácido que diferem entre os dois clones.

[000397] A retriagem da biblioteca de 17N16 lambda resultou em vários clones filhas candidatos adicionais, dos quais 17N16m d27E13 foi identificado em um ELISA e ensaio de complemento, e foi incluído no conjunto de clones filhas candidatos para mais análises.

Ensaiar clones filhas em soros diferentes

[000398] Os clones filhas candidatos foram analisados em soros diferentes como segue. Manana foi diluída a 20 μg/ml e revestida em uma placa de ELISA durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, os reservatórios foram bloqueados com 1 % de HSA. O soro de macaco Verde Africano foi diluído a 0,2 %, o soro de rato foi diluído a 0,375 % e o soro humano foi diluída a 1 % em tampão CaMgGVB. ScFv purificado de cada um dos clones filhas candidatos foi adicionado em duplicatas a uma série de concentrações diferentes à mesma quantidade de tampão e pré-incubados por 45 minutos em gelo antes da adição à placa de ELISA bloqueada. A reação foi iniciada pela incubação por uma hora a 37 °C, e foi interrompida pela transferência para a placa em um banho de gelo. A liberação de C3c foi detectada com um anticorpo de C3c α-Camundongo de Coelho seguido por um HRP α-Coelho de Cabra. O fundo de OMS100 a 0,1 μg/ml em placas negativas em manana foi subtraído destas curvas. Os resultados estão resumidos abaixo na TABELA 19. TABELA 19: Valores de IC50 para clone mãe 17N16 e clones filhas 17N16m d17N9 e 17N16m d27E13 em soros diferentes.

Nota: Os dois valores mostrados nas colunas 2-4 da Tabela 19 referem-se aos resultados de dois experimentos separados.

Debate dos resultados:

[000399] Como mostrado na TABELA 19, o clone filha 17N16m dl7N9 tem atividade funcional mais alta do que o clone mãe. A função melhorada em soro de rato além das dezessete diferenças de sequência de aminoácido na cadeia leve quando comparado com o clone mãe torna este clone um candidato positivo. Com base bestes dados, o clone filha 17N16m dl7N9 foi selecionado para mais análise.

EXEMPLO 7

[000400] Este Exemplo descreve a geração e análise do clone filha 17D20m d3521N11, derivado do clone mãe 17D20.

Fundamentos/Análise racional:

[000401] Para melhorar a afinidade do clone mãe candidato 17D20mc, uma “mutagênese por inserção” adicional foi realizada nos primeiros três aminoácidos na CDR3 da cadeia pesada (CDR-H3). Esta foi uma campanha de mutagênese em paralelo com o embaralhamento de cadeia leve normal de 17D20mc. Portanto, três bibliotecas de scFv diferentes foram construídas pela PCR onde as posições de aminoácido 1, 2 e 3 foram randomizadas ao conjunto de todos os 20 aminoácidos possíveis usando códons degenerados. Depois da clonagem das bibliotecas, a expressão em microescala foi realizada e a ligação de scFv foi monitorada em um chip CM5 revestido com MASP- 2A (não mostrado). A análise BlAcore da expressão em microescala foi realizada nas três bibliotecas diferentes em chips revestidos com MASP-2A, randomizados nas posições 1, 2, ou 3 e clones filhas potencialmente interessantes foram identificados.

[000402] Foi observado que para as posições de aminoácido 1 e 2 da CDR-H3, nenhum clone foi encontrado tendo uma taxa de dissociação melhorada em comparação com o clone mãe candidato 17D20m. Entretanto, uns poucos candidatos com mutações na posição de aminoácido 3 na CDR- H3 demonstraram taxas de dissociação melhoradas em comparação com o clone mãe 17D20m. Estes clones (#35, #59 e #90) foram sequenciados para identificar a mutação. As sequências de dois clones derivados da “mutagênese por inserção” são comparadas com 17D20mc (sequência original). De maneira interessante, todos os clones sequenciados exceto um (#90), abrigaram uma substituição Ala-Arg em comparação com o candidato mãe.

[000403] A FIGURA 9 é uma comparação de sequência da sequência de aminoácido da região da cadeia pesada do clone mãe scFv 17D20m (aa 61119 da SEQ ID NO: 18) e a sequência de aminoácido da região CRD-H3 de clones scFv com mutações na CDR-H3, clone #35 (aa 61-119 da SEQ ID NO: 20, tendo uma substituição de R no lugar de A na posição 102 da SEQ ID NO: 18), clone #59 (mesma sequência como o clone #35), e clone #90 (substituição de P no lugar de A na posição 102 da SEQ ID NO: 18).

Análise de clones mutantes #35 e #59

[000404] Os clones mutantes #35 e #59 foram expressados em escala pequena e testados ainda mais em comparação com o clone mãe candidato 17D20 em um ELISA de titulação sobre MASP-2A imobilizado (10 μg/ml). Os scFvs foram diluídos 5 vezes em série que começa de 20 μg/ml e a ligação foi detectada usando HRP anti-Myc (camundongo)/anti-camundongo. Ligação levemente melhorada foi observada no ensaio de ELISA para os clones candidato #35 e #59 em comparação com o clone mãe candidato 17D20 (dados não mostrados).

[000405] O clone #35 melhorado foi combinado com o melhor clone embaralhado na cadeia leve 17D20m d21N11. A mutação no VH do 17D20md35 candidato (Ala-Arg) foi combinada com a cadeia leve do 17D20m d21N11 candidato, resultando assim no clone chamado de VH35- VL21N11, de outro modo aludido como 3521N11.

[000406] A FIGURA 10A é um alinhamento da sequência de aminoácido da sequência da região CDR3 do clone mãe 17D20 (aa 61-119 da SEQ ID NO: 18), a mesmo região do clone filha 17D20m d21N11, tendo a mesma sequência, e a mesma região do clone de mutagênese #35 combinado com o VL de 17D20m d21N11, aludido como “ 3521N11” (aa 61-119 da SEQ ID NO: 20). As regiões da sequência VH salientadas compreendem a CDRH3, e a região de resíduo alvo mutado está sublinhada.

[000407] A FIGURA 10B é um alinhamento de sequência de proteína do scFv de tamanho natural que inclui as regiões VL e VH do clone mãe 17D20 (SEQ ID NO: 55) e do clone filha 17D20m d21N11 (SEQ ID NO: 67). O clone filha scFv 17D20m d3521N11 é apresentado como SEQ ID NO: 68. Nota: foi determinado que o resíduo X na FIGURA 10B na posição 220 é um “E”, como apresentado na SEQ ID NO: 68.

[000408] Um ensaio de ELISA de titulação do conjunto de scFvs mostrados na FIGURA 10 foi conduzido em MASP-2 (10 μg/ml). Os resultados são mostrados na TABELA 20. TABELA 20: ELISA na MASP-2 humana

[000409] O clone filha 17D20m d3521N11 foi analisado ainda quanto à atividade funcional como descrito abaixo no Exemplo 8.

EXEMPLO 8

[000410] Este Exemplo descreve a conversão e análise dos clones filhas candidatos 17N16m dl7N9 e 17D20m d3521N11 nos formatos IgG4, IgG4/S228P e IgG2.

Análise racional/Fundamentos

[000411] Os métodos de triagem de anticorpo descritos nos Exemplos 27 identificaram dois clones mães, 17N16 e 17D20, com funcionalidade adequada. A maturação de afinidade destes clones mães produziu clones filhas que mostraram melhoras de aproximadamente 2 vezes na potência quanto comparados com os clones mães em ensaios funcionais substitutos ao nível de scFv. Os clones filhas com as melhores atividades são 17N16m dl7N9 e 17D20m d3521N11. Como descrito no Exemplo 6, em uma comparação da atividade funcional do clone mãe 17N16 com clones filhas com cadeia leve embaralhada (formato scFv, ensaio com 1 % de NHS) foi determinado que 17N16m dl7N9 é levemente mais potente do que o clone mãe e tem a melhor potência funcional de todos os clones filhas testados neste ensaio.

Métodos:

[000412] Uma comparação da potência funcional dos clones de scFv candidatos foi realizada no ensaio de conversão de C3 (1 % de soro humano e 90 % de soro humano), e em um ensaio de conversão de C4 (90 % de soro humano), realizado como descrito no Exemplo 5.

[000413] Os resultados são mostrados abaixo na TABELA 21. TABELA 21: Comparação da potência funcional em IC50 (nM) dos clones filhas condutores e seus respectivos clones mães (todos no formato de scFv)

[000414] Como mostrado acima na TABELA 21, 17N16m_d17N9 tem boa atividade quando ensaiado em 90 % de soro humano normal (NHS) no ensaio C3 e é mais potente do que os outros clones filhas neste formato.

Conversão de Clones Candidatos no formato IgG4, IgG4/S228P e IgG2

[000415] Todos estes clones candidatos foram convertidos para o formato de IgG4, IgG4/S228P e IgG2 para outra análise.

[000416] SEQ ID NO: 62: cDNA que codifica IgG4 do tipo selvagem

[000417] SEQ ID NO: 63: polipeptídeo de IgG4 do tipo selvagem

[000418] SEQ ID NO: 64 cDNA que codifica IgG4 mutante S228P

[000419] SEQ ID NO: 65: polipeptídeo de IgG4 mutante S228P

[000420] SEQ ID NO: 69: cDNA que codifica IgG2 do tipo selvagem

[000421] SEQ ID NO: 70: polipeptídeo de IgG2 do tipo selvagem TABELA 22: Resumo dos clones candidatos:

[000422] Os anticorpos monoclonais #1-6 foram testados quanto a capacidade para reagir cruzado com uma proteína que não de MASP-2 humana (macaco Verde Africano (AG)) em um ensaio C3 para determinar se estes anticorpos podem ser usados para testar quanto à toxicidade em um modelo de animal que seria preditivo para os seres humanos. Anticorpos monoclonais #1-6 foram também testados em um ensaio de deposição de C3b e um ensaio de C4 em 90 % de soro humano. Os resultados são mostrados abaixo na TABELA 23. TABELA 23: MoAbs anti-MASP-2 humana (IC50 nM) em 90 % de soro humano

[000423] A FIGURA 11A ilustra graficamente os resultados do ensaio de deposição de C3b realizado para as variantes de isotipo do clone filha (MoAb#1-3), derivadas do clone mãe 17N16 do anticorpo monoclonal anti- MASP-2 humana.

[000424] A FIGURA 11B ilustra graficamente os resultados do ensaio de deposição de C3b realizado para as variantes de isotipo do clone filha (MoAb#4-6), derivado do clone mãe 17D20 do anticorpo anti-MASP-2 monoclonal humano.

[000425] Como mostrado na TABELA 23 e FIGURAS 11A e 11B, os anticorpos monoclonais anti-MASP-2 humana (MoAb#1-6) ligam MASP-2 com alta afinidade, e inibem a função da atividade de C3 e C4 em 90 % de soro humano. Também é observado que os MoAbs anti-MASP-2 humana reagem cruzado com a proteína que não de MASP-2 humana (macaco Verde Africano), que fornece um modelo de animal para os estudos de toxicidade que seriam preditivos para os seres humanos.

[000426] O MoAb#1-6 foram analisados ainda em 95 % de soro humano, 95 % de soro de verde africano. Os resultados estão resumidos abaixo na TABELA 24. TABELA 24

[000427] As FIGURAS 12A e 12B graficamente ilustram o teste dos clones mães e MoAb#1-6 em um ensaio de deposição de C3b em 95 % de soro humano normal.

[000428] A FIGURA 13 graficamente ilustra a inibição da deposição de C4b em 95 % de soro humano normal.

[000429] A FIGURA 14 graficamente ilustra a inibição da deposição de C3b em 95 % soro de macaco Verde Africano.

[000430] O MoAb#1-6 foi testado ainda quanto à capacidade para inibir seletivamente a via da lectina pelo ensaio da inibição de C3b de Rato, inibição de complexos de MBL-MASP-2 pré-montados; inibição da via clássica, e seletividade sobre Cls. Os resultados estão resumidos na TABELA 25. TABELA 25: Resumo de resultados do ensaio funcional

[000431] A FIGURA 15 graficamente ilustra a inibição da atividade de clivagem de C4 do complexo de MBL-MASP-2 pré-montado pelo MoAb# 2, 3, 5 e 6.

[000432] A FIGURA 16 graficamente ilustra a ligação preferencial de MoAb# 6 à MASP-2 humana quando comparada ao Cls. Tabela 26: Resumo de sequências de clones filhas em vários formatos:

EXEMPLO 9

[000433] Este Exemplo descreve o mapeamento de epítopo que foi realizado para vários dos MoAbs anti-MASP-2 humana bloqueadores.

Métodos:

[000434] As proteínas recombinantes que seguem foram produzidas como descrito no Exemplo 1: MAp 19 humana MASP2A human MASP-2 SP humana MASP-2 CCP2-SP humana MASP-2 CCP1-CCP2-SP humana MASP-1/3 CUB1-EGF-CUB2 humana MASP-1 CCP1-CCP2-SP humana

[000435] Os anticorpos anti-MASP-2 OMS100 e MoAb#6 (35VH- 21N11VL), que foram ambos demonstrados ligar à MASP-2 humana com alta afinidade e têm a capacidade para bloquear a atividade de complemento funcional (ver os Exemplos 6-8) foram analisados com relação à ligação de epítopo pela análise de ponto mancha.

ANÁLISE DE PONTO MANCHA:

[000436] Diluições em série dos polipeptídeos recombinantes de MASP- 2 descritos acima foram manchadas sobre uma membrana de nitrocelulose. A quantidade de proteína manchada variou de 50 ng a 5 pg, em etapas de cinco vezes. Em experimentos posteriores, a quantidade de proteína manchada variou de 50 ng até abaixo de 16 pg, de novo em etapas de cinco vezes. As membranas foram bloqueadas com 5 % de leite em pó desnatado em TBS (tampão de bloqueio) depois de incubadas com 1,0 μg/ml de Fab2s anti- MASP-2 em tampão de bloqueio (contendo 5,0 mM de Ca2+). Os Fab2s ligados foram detectados usando Fab anti-humano conjugada com HRP (AbD/Serotec; diluída 1/10.000) e um kit de detecção de ECL (Amersham). Uma membrana foi incubada com Ab de MASP-2 anti ser humano policlonal de coelho (descrito em Stover et al., J Immunol 163: 6848-59 (1999)) como um controle positivo. Neste caso, Ab ligado foi detectado usando IgG anticoelho de cabra conjugado a HRP (Dako; diluído 1/2.000). Resultados: Os resultados estão resumidos na TABELA 27. TABELA 27: Mapeamento de Epítopo

[000437] Os resultados mostram que os anticorpos MoAb#6 e OMS 100 são altamente específicos para MASP-2 e não se ligam a MASP-1 ou MASP- 3. Nenhum dos fragmentos de anticorpo ligaram a Map19 e MASP-2 que não contém o domínio CCP1 de MASP-2, levando à conclusão que os sítios de ligação abrangem o domínio CCP1.

EXEMPLO 10

[000438] Este Exemplo demonstra que MoAb#6 anti-MASP-2 humana inibe a via da lectina em macacos Verdes Africanos que seguem a administração intravenosa.

Métodos:

[000439] MoAb#6 foi administrado intravenosamente a um primeiro grupo de três macacos Verdes Africanos em uma dosagem de 1 mg/kg e a um segundo grupo de três macacos Verdes Africanos a uma dosagem de 3 mg/kg. As amostras de sangue foram obtidas 2, 4, 8, 10, 24, 48, 72 e 98 horas depois da administração e foram testadas quanto a presença de atividade da via da lectina.

[000440] Como mostrado na FIGURA 17, a via da lectina foi completamente inibida a seguir da administração intravenosa de MoAb#6 anti-humano.

EXEMPLO 11

[000441] Este Exemplo demonstra que um inibidor de MASP-2, tal como um anticorpo anti-MASP-2, é eficaz para o tratamento de exposição à radiação e/ou para o tratamento, melhora ou prevenção da síndrome da radiação aguda.

Análise Racional:

[000442] A exposição às altas doses de radiação ionizante causa mortalidade por dois mecanismos principais: toxicidade para a medula óssea e síndrome gastrointestinal. A toxicidade para a medula óssea resulta em uma queda em todas as células hematológicas, predispondo o organismo à morte pela infecção e hemorragia. A síndrome gastrointestinal é mais severa e é acionada por uma perda da função de barreira intestinal devido à desintegração da camada epitelial do intestino e uma perda da função endócrina intestinal. Isto leva à septicemia e síndrome da resposta inflamatória sistêmica associada que pode resultar em morte.

[000443] A via da lectina de complemento é um mecanismo imune inato que inicia a inflamação em resposta à lesão de tecido e exposição às superfícies estranhas (isto é, bactérias). O bloqueio deste via leva a resultados melhores em modelos de camundongo de lesão de tecido intestinal isquêmico ou choque séptico. É levantada a hipótese de que a via da lectina pode ativar inflamação excessiva e nociva em resposta à lesão de tecido induzida por radiação. O bloqueio da via da lectina pode assim reduzir a lesão secundária e aumentar a sobrevivência que segue a exposição aguda à radiação.

[000444] O objetivo do estudo realizado como descrito neste Exemplo foi para avaliar o efeito do bloqueio da via da lectina sobre a sobrevivência em um modelo de camundongo de lesão por radiação pela administração de anticorpos anti-MASP-2 de murino. Estudo #1

Métodos e Materiais:

[000445] Materiais. Os artigos de teste usados neste estudo foram (i) um anticorpo anti-MASP-2 de murino (mAbM11) de alta afinidade e (ii) um anticorpo MASP-2 anti-humano (mAbOMS646) de alta afinidade que bloqueia o componente de proteína MASP-2 da via de complemento da lectina que foi produzida nas células de mamífero transfectadas. As concentrações de dosagem foram de 1 mg/kg de anticorpo anti-MASP-2 de murino (mAbM11), 5 mg/kg de anticorpo anti-MASP-2 de ser humano (mAbOMS646), ou solução salina estéril. Para cada sessão de dosagem, um volume adequado de soluções de dosagem frescas foi preparado.

[000446] Animais. Camundongos Swiss-Webster machos adultos jovens foram obtidos da Harlan Laboratories (Houston, TX). Os animais foram alojados em gaiolas de fundo sólido com cama Alfa-Dri e fornecida Dieta de Roedor PMI 5002 certificada (Animal Specialties, Inc., Hubbard OU) e água ad libitum. A temperatura foi monitorada e a sala de contensão de animal operada com um ciclo de luz de 12 hora de luz/12 horas de escuro.

[000447] Irradiação. Depois de uma aclimatização de 2 semanas na instalação, os camundongos foram irradiados com 6,5, 7,0 e 8,0 Gy pela exposição de corpo inteiro em grupos de 10 a uma taxa de dose de 0,78 Gy/mem usando um sistema Therapax X-RAD 320 fornecido com um gerador de raio X de 320 kV de alta estabilidade, tubo de raio X de cerâmica metalizada, colimador de feixe de raio X variável e filtro (Precision X-ray Incorporated, East Haven, CT).

[000448] Formulação e Administração de Medicamento. O volume apropriado de soluções de estoque concentradas foi diluído com solução salina gelada para preparar soluções de dosagem de 0,2 mg/ml de anticorpo anti-MASP-2 de murino (mAbM11) ou 0,5 mg/ml de anticorpo anti-MASP-2 de ser humano (mAbOMS646) de acordo com o protocolo. A administração de anticorpo anti-MASP-2 mAbM11 e mAbOMS646 foi por intermédio da injeção IP usando uma base de agulha calibre 25 sobre o peso do animal para liberar 1 mg/kg de mAbM11, 5 mg/kg de mAbOMS646, ou veículo de solução salina.

[000449] Planejamento de Estudo. Os camundongos foram aleatoriamente designados aos grupos como descrito na Tabela 28. O peso corporal e a temperatura foram medidos e registrados diariamente. Os camundongos nos Grupos 7, 11 e 13 foram sacrificados no dia 7 após a irradiação e o sangue coletado pela punção cardíaca sob anestesia profunda. Os animais sobreviventes no dia 30 após a irradiação foram sacrificados da mesma maneira e o sangue coletado. O plasma foi preparado a partir das amostras de sangue coletado de acordo com o protocolo e retornaram para o Patrocinador para análise. TABELA 28: Grupos de Estudo

[000450] Análise estatística. As curvas de sobrevivência de Kaplan- Meier foram geradas e usadas para comparar o tempo de sobrevivência médio entre grupos de tratamento usando os métodos de log-Rank e Wilcoxon. As médias com desvios padrão, ou médias com erro padrão da média são relatadas. As comparações estatísticas foram feitas usando um teste t desemparelhado de duas caudas entre os animais irradiados controlados e grupos de tratamento individuais.

Resultados do estudo #1

[000451] As plotagens de sobrevivência de Kaplan-Meier para os grupos de exposição de 6,5, 7,0 e 8,0 Gy são fornecidas nas FIGURAS 18A, 18B e 18C, respectivamente, e resumidas abaixo na Tabela 29. No geral, o tratamento com ab anti-MASP-2 de murino (mAbM11) na pré-irradiação aumentou a sobrevivência de camundongos irradiados comparada com os animais de controle irradiados tratados com veículo tanto no nível de exposição de 6,5 (20 % de aumento) quanto 7,0 e 8,0 Gy (30 % de aumento). Ao nível de exposição de 6,5 Gy, após a irradiação o tratamento com ab anti- MASP-2 de murino resultou em um aumento modesto na sobrevivência (15 %) comparado aos animais irradiados de controle de veículo.

[000452] Em comparação, todos os animais tratados ao nível de exposição de 7,0 Gy mostraram um aumento na sobrevivência comparado com os animais de controle irradiados tratados com veículo. A maior mudança na sobrevivência ocorreu em animais que recebem mAbOMS646, com um aumento de 45 % na sobrevivência comparado com os animais de controle ao nível de exposição de 7,0 Gy, e um aumento de 12 % na sobrevivência no nível de exposição de 8,0 Gy. Além disso, ao nível de exposição de 7,0 Gy, as mortalidades no grupo tratado com mAbOMS646 primeiro ocorreram no dia 15 após a irradiação comparado com o dia 8 após a irradiação para os animais de controle irradiados tratados com veículo, um aumento de 7 dias em relação aos animais de controle. O tempo médio para a mortalidade para os camundongos que recebem mAbOMS646 (27,3 ± 1,3 dias) foi significantemente aumentado (p = 0,0087) comparado aos animais de controle (20,7 ± 2,0 dias) ao nível de exposição de 7,0 Gy.

[000453] A mudança percentual no peso corporal comparado com dia pré-irradiação (dia -1) foi registrada por todo o estudo. Uma perda de peso transitória ocorreu em todos os animais irradiados, sem nenhuma evidência de mudança diferencial devido ao tratamento com mAbM11 ou mAbOMS646 comparado aos controles (dados não mostrados). No término do estudo, todos os animais sobreviventes mostraram um aumento no peso corporal partindo do peso corporal de partida (dia -1). TABELA 29: Taxas de sobrevivência dos animais de teste expostos à radiação

*p = 0,0087 pelo teste t desemparelhado de duas caudas entre animais irradiados de controle e grupo de tratamento no mesmo nível de exposição à irradiação.

Debate

[000454] A síndrome da radiação aguda consiste de três subsíndromes definidas: hematopoiética, gastrointestinal, e cerebrovascular. A síndrome observada depende da dose de radiação, com os efeitos hematopoiéticos observados nos seres humanos com exposições à radiação parciais ou de corpo inteiro significantes excedendo 1 Gy. A síndrome hematopoiética é distinguida pela depressão severa da função da medula óssea levando à pancitopenia com mudanças nas contagens sanguíneas, células sanguíneas vermelhas e brancas, e plaquetas ocorrendo concomitante com o dano ao sistema imune. Como nadir ocorre, com poucos neutrófilos e plaquetas presentes no sangue periférico, neutropenia, febre, complicações de septicemia e hemorragia descontrolável levando à morte.

[000455] No presente estudo, a administração de mAbH6 foi descoberta aumentar a sobrevivência à irradiação de raio X de corpo inteiro em camundongos Swiss-Webster machos irradiados a 7,0 Gy. Novelmente, ao nível de exposição de 7,0 Gy, 80 % dos animais que recebem mAbOMS646 sobreviveram a 30 dias comparado a 35 % dos animais irradiados de controle tratados com veículo. De maneira importante, o primeiro dia de morte neste grupo tratado não ocorreu até dia 15 após a irradiação, um aumento de 7 dias em relação a aqueles observados em animais irradiados de controle tratados com veículo. Curiosamente, na exposição ao raio X mais baixa (6,5 Gy), a administração de mAbOMS646 não pareceu impactar a sobrevivência ou demora na mortalidade comparada com os animais irradiados de controle tratados com veículo. Haveria múltiplas razões para esta diferença na resposta entre os níveis de exposição, embora a verificação de qualquer hipótese pode requerer estudos adicionais, incluindo coleta de amostra nos intervalos para cultura microbiológica e parâmetros hematológicos. Uma explicação pode simplesmente ser que o número de animais designados aos grupos pode ter impossibilitado observar qualquer diferença sutil relacionada com o tratamento. Por exemplo, com tamanhos de grupos de n = 20, a diferença na sobrevivência entre 65 % (mAbOMS646 na exposição de 6,5 Gy) e 80 % (mAbOMS646 na exposição de 7,0 Gy) é de 3 animais. Por outro lado, a diferença entre 35 % (controle de veículo na exposição de 7,0 Gy) e 80 % (mAbH6 na exposição de 7,0 Gy) é de 9 animais, e fornece evidência sólida de uma diferença relacionada com o tratamento.

[000456] Estes resultados demonstram que os anticorpos anti-MASP-2 são eficazes no tratamento de um indivíduo mamífero em risco para, ou que sofre dos efeitos nocivos da síndrome da radiação aguda.

Estudo #2

[000457] Os camundongos Swiss Webster (n = 50) foram expostos à radiação ionizante (8,0 Gy).

[000458] O efeito da terapia de anticorpo anti-MASP-2 (OMS646 5 mg/kg), administrada 18 horas antes e 2 horas depois da exposição à radiação, e semanalmente em seguida, sobre a mortalidade foi avaliada.

Resultados do Estudo #2:

[000459] Foi determinado que a administração de anticorpo anti-MASP- 2 OMS646 aumentou a sobrevivência em camundongos expostos a 8,0 Gy, com uma taxa de sobrevivência média ajustada de 4 a 6 dias quando comparados aos camundongos que receberam controle de veículo, e uma mortalidade reduzida em 12 % quando comparado com os camundongos que receberam controle de veículo (teste de classificação de log, p = 0,040).

Estudo #3:

[000460] Os camundongos Swiss Webster (n = 50) foram expostos à radiação ionizante (8,0 Gy) nos grupos que seguem (I: veículo) controle de solução salina; (II: baixo) anticorpo anti-MASP-2 OMS646 (5 mg/kg) administrado 18 horas antes da irradiação e 2 horas depois da irradiação; (III: alta) OMS646 (10 mg/kg) administrada 18 horas antes da irradiação e 2 horas após a irradiação; e (IV: alta após) OMS646 (10 mg/kg) administrada 2 horas após a irradiação única.

Resultados do Estudo #3:

[000461] Foi determinado que a administração de anticorpo anti-MASP- 2 pré- e após a irradiação ajustou a sobrevivência média de 4 a 5 dias em comparação com animais que receberam controle de veículo. A mortalidade nos camundongos tratados com anticorpo anti-MASP-2 foi reduzida em 6 a 12 % em comparação com camundongos de controle de veículo. Foi mencionado ainda que nenhum efeito de tratamento nocivo significante foi observados.

[000462] Em resumo, os resultados neste Exemplo demonstram que anticorpos anti-MASP-2 da invenção são eficazes em tratar um indivíduo mamífero em risco para, ou que sofre dos efeitos nocivos de síndrome da radiação aguda.

EXEMPLO 12

[000463] Este Exemplo descreve outra caracterização do anticorpo OMS646 (17D20m d3521N11), anticorpo IgG4 anti-MASP-2 humana totalmente humano com uma mutação na região de articulação).

Métodos:

[000464] OMS646 (17D20m d3521N11), anticorpo IgG4 anti-MASP-2 humana totalmente humano com uma mutação na região de articulação) foi gerado como descrito acima no Exemplos 2-8. O anticorpo OMS646 foi purificado a partir dos sobrenadantes de cultura de uma linhagem de célula de expressão CHO estavelmente transfectada com construções de expressão que codificam as cadeias pesadas e leves de OMS646. As células foram cultivadas em meio PF-CHO por 16 a 20 dias e sobrenadante isento de célula foi coletado quando a viabilidade de célula caiu abaixo de 50 %. OMS646 foi purificado pela cromatografia de afinidade com a Proteína A seguida pela troca de íon, concentração e troca de tampão em PBS. 1. OMS646 se liga à MASP-2 humana com alta afinidade Análise de ressonância de plasmon de superfície (Biocore) de Ligação de OMS646 Imobilizado à MASP-2 humana recombinante

Métodos:

[000465] OMS646 foi imobilizado em várias densidades pela ligação de amina a uma lasca de CM5 e a associação e dissociação de MASP-2 humana recombinante dissolvida a 9 nM, 3 nM, 1 nM ou 0,3 nM foi registrada com o tempo para determinar as constantes de taxa de associação (Kligada) e dissociação (Kdesligada). A constante de ligação de equilíbrio (KD) foi calculada com base nos valores de Kligada e Kdesligada experimentais.

Resultados:

[000466] A FIGURA 19 graficamente ilustra os resultados da análise de ressonância de plasmon de superfície (Biocore) em OMS646, que mostra que OMS646 imobilizado se liga à MASP-2 recombinante com uma taxa Kdesligada de cerca de 1 a 3 x 10-4 s-1 e uma taxa de Kon de cerca de 1,6 a 3 x 106 M-1 s-1, implicando em uma afinidade (KD de cerca de 92 pM) sob estas condições experimentais. Dependendo da densidade de OMS646 imobilizado e da concentração de MASP-2 na solução, valores KD experimentais na faixa de 50 a 250 pM foram determinadas. Ensaio de ELISA de Ligação de OM5646 à MASP-2 humana recombinante imobilizada

[000467] Métodos: Um ensaio de ELISA foi realizado para avaliar a resposta à dose da ligação de OMS646 à MASP-2 recombinante imobilizada. A MASP-2 humana recombinante (50 ng/reservatório) foi imobilizada em placas maxisorp ELISA (Nunc) em PBS durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, as placas foram bloqueadas pela lavagem três vezes com PBS- Tween (0,05 %). Uma série de diluições em série de OMS646 em tampão de bloqueio (faixa de concentração de 0,001 a 10 nM) foi depois adicionada aos reservatórios revestidos com MASP-2. Depois de uma incubação de 1 hora para permitir a ligação de OMS646 ao antígeno imobilizado, os reservatórios foram lavados para remover o OMS646 não ligado. OMS646 ligado foi detectado usando anticorpo de IgG anti-humano de cabra rotulado com HRP (Qualex; diluído 1:5000 em tampão de bloqueio) seguido pelo desenvolvimento com substrato de TMB peroxidase (Kirkegaard & Perry Laboratories). A reação da peroxidase foi interrompida pela adição de 100 μl/reservat0rio de H3PO4 1,0 M, e a conversão de substrato foi quantificada fotometricamente a 450 nM usando uma leitora de placa de 96 reservatórios (Spectramax). Um algoritmo de ajuste de curva de sítio de ligação única (Graphpad) foi usado para calcular os valores KD.

Resultados:

[000468] A FIGURA 20 graficamente ilustra os resultados do ensaio de ELISA para determinar a afinidade de ligação de OMS646 à MASP-2 humana imobilizada. Como mostrado na FIGURA 20, foi determinado que OMS646 se liga à MASP-2 humana recombinante imobilizada com um KD de 85 ± 5 pM, que é compatível com os resultados obtidos na análise Biocore, como mostrado na FIGURA 19. Estes resultados demonstram que a OMS646 tem alta afinidade à MASP-2 humana, com um KD de aproximadamente 100 pM. 2. OMS646 inibe a ativação de C4 em uma superfície revestida com manana, mas não em uma superfície revestida com complexo imune Métodos:

[000469] A ativação de C4 foi medida em uma superfície revestida com manana ou uma superfície revestida com complexo imune na presença ou ausência de OMS646 na faixa de concentração mostrada nas FIGURAS 21A e 21B, respectivamente como segue.

[000470] No método que segue para medir a atividade de clivagem de C4 de MASP-2, reservatórios plásticos revestidos com manana foram incubados por 60 minutos a 37 °C com 1 % de soro humano para ativar a via da lectina. Os reservatórios foram depois lavados e ensaiados quanto à C4b humana imobilizada nos reservatórios usando métodos de ELISA padrão. A quantidade de C4b gerada neste ensaio é uma medida da atividade de clivagem de C4 dependente de MASP-2. Anticorpos anti-MASP-2 nas concentrações selecionadas foram testados neste ensaio quanto à sua capacidade para inibir a clivagem de C4.

Métodos: Ativação de C4 sobre as superfícies revestidas com manana:

[000471] De modo a determinar o efeito de OMS646 sobre a via da lectina, placas de Ligação de Meio Costar de 96 reservatórios foram revestidas com manana pela incubação durante a noite a 5 °C com 50 μl de uma solução 40 μg/ml de manana diluída em 50 mM de tampão de carbonato, pH 9,5. Cada reservatório foi lavado 3X com 200 μL de PBS. Os reservatórios foram depois bloqueados com 100 μl/reservatório de albumina sérica bovina a 1 % em PBS e incubados por uma hora na temperatura ambiente com mistura suave. Cada reservatório foi lavado 3X com 200 μl de PBS. Em uma placa de 96 reservatórios separada, diluições em série de anticorpo MASP-2 (OMS646) foram pré-incubadas com 1 % de soro humano em Ca ++ e mg ++ que contém tampão GVB (4,0 mM de barbital, 141 mM de NaCl, 1,0 mM de MgCl2, 2,0 mM de CaCl2, 0,1 % de gelatina, pH 7,4) por 1 hora a 5 °C. Estas misturas de pré-incubação de anticorpo-soro foram subsequentemente transferidas nos reservatórios correspondentes da placa de ensaio revestida com manana. A ativação de complemento foi iniciada pela transferência da placa de ensaio a um banho de água a 37 °C. A seguir de uma incubação de 60 minutos, a reação foi interrompida pela adição de EDTA à mistura de reação. Cada reservatório foi lavado 5 x 200 μl com PBS-Tween 20 (0,05 % de Tween 20 em PBS), depois cada reservatório foi lavado com 2X com 200 μl de PBS. 100 μL/reservat0rio de diluição 1:100 de C4c anti- humano de galinha conjugado com Biotina (Immunosystem AB, Uppsala, Suécia) foi adicionado em PBS que contém 2,0 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA) e incubada uma hora na temperatura ambiente com mistura suave. Cada reservatório foi lavado 5 x 200 μl de PBS. 100 μl/reservat0rio de 0,1 μg/ml de estreptavidina conjugado com peroxidase (Pierce Chemical #21126) foi adicionado em PBS que contém 2,0 mg/ml de BSA e incubada por uma hora na temperatura ambiente em um agitador com mistura suave. Cada reservatório foi lavado 5 x 200 μl com PBS. 100 μL/reservat0rio do substrato TMB de peroxidase (Kirkegaard & Perry Laboratories) foram adicionados e incubados na temperatura ambiente por 10 minutos. A reação da peroxidase foi interrompida pela adição de 100 μl/reservat0rio de 1,0 M de H3PO4 e a OD450 foi medida. Ativação de C4 em superfícies revestidas com complexo imune

[000472] De modo a medir o efeito de OMS646 sobre a via clássica, o ensaio descrito acima foi modificado para usar placas revestidas com o complexo imune. O ensaio foi realizado como detalhado para a via da lectina acima, com a diferença que os reservatórios foram revestidos com IgG de ovelha purificada usada para estimular a ativação de C4 por intermédio da via clássica.

Resultados:

[000473] A FIGURA 21A graficamente ilustra o nível de ativação de C4 sobre uma superfície revestida com manana na presença ou ausência de OMS646. A FIGURA 21B graficamente ilustra o nível de ativação de C4 sobre uma superfície revestida com IgG na presença ou ausência de OMS646. Como mostrado na FIGURA 21A, OMS646 inibe a ativação de C4 na superfície revestida com manana com uma IC50 de aproximadamente 0,5 nM em 1 % de soro humano. O valor IC50 obtido em 10 experimentos independentes foi de 0,52 ± 0,28 nM (média ± SD). Ao contrário, como mostrado na FIGURA 21B, OMS646 não inibe a ativação de C4 em uma superfície revestida com IgG. Estes resultados demonstram que OMS646 bloqueia a ativação dependente de lectina, mas não a dependente da via clássica de componente C4 de complemento.

3. OMS646 especificamente bloqueia a ativação dependente de lectina de componentes de complemento de terminal Métodos:

[000474] O efeito de OMS646 sobre a deposição do complexo de ataque á membrana (MAC) foi analisado usando condições específicas da via para a via da lectina, a via clássica e a via alternativa. Para este propósito, o kit de triagem de complemento Wieslab Comp300 (Wieslab, Lund, Suécia) foi usada seguindo as instruções do fabricante.

Resultados:

[000475] A FIGURA 22A graficamente ilustra o nível de deposição de MAC na presença ou ausência de anticorpo anti-MASP-2 (OMS646) sob condições de ensaio específicas da via da lectina. A FIGURA 22B graficamente ilustra o nível de deposição de MAC na presença ou ausência de anticorpo anti-MASP-2 (OMS646) sob condições de ensaio específicas da via clássica. A FIGURA 22C graficamente ilustra o nível de deposição de MAC na presença ou ausência de anticorpo anti-MASP-2 (OMS646) sob condições de ensaio específicas da via alternativa. Como mostrada na FIGURA 22A, OMS646 bloqueia a ativação mediada pela via da lectina da deposição de MAC com um valor de IC50 de aproximadamente 1 nM. Entretanto, OMS646 não teve nenhum efeito sobre a deposição de MAC gerado a partir da ativação mediada pela via clássica (FIGURA 22B) ou a partir da ativação mediada pela via alternativa (FIGURA 22C).

4. OMS646 eficazmente inibe a ativação da via da lectina sob condições fisiológicas Métodos:

[000476] A ativação de C3 e C4 dependente da lectina foi avaliada em 90 % de soro humano na ausência e na presença de várias concentrações de OMS646 como segue:

Ensaio de Ativação de C4

[000477] Para avaliar o efeito de OMS646 sobre a ativação de C4 dependente de lectina, placas de ligação de meio Costar de 96 reservatórios foram revestidas durante a noite a 5 °C com 2 μg de manana (50 μl de uma solução a 40 μg/ml em tampão de carbonato a 50 mM, pH 9,5. As placas foram depois lavadas três vezes com 200 μl de PBS e bloqueadas com 100 μl/reservat0rio de albumina sérica bovina a 1 % em PBS por uma hora na temperatura ambiente com mistura suave. Em uma placa de pré-incubação separada, concentrações selecionadas de OMS646 foram misturadas com 90 % de soro humano e incubadas por 1 hora em gelo. Estas misturas de pré- incubação de anticorpo-soro foram depois transferidas para dentro de reservatórios revestidos com manana das placas de ensaio em gelo. As placas de ensaio foram depois incubadas por 90 minutos em um banho de água gelada para permitir a ativação de complemento. A reação foi interrompida pela adição de EDTA à mistura de reação. Cada reservatório foi lavado 5 vezes com 200 μl de PBS-Tween 20 (0,05 % de Tween 20 em PBS), depois cada reservatório foi lavado duas vezes com 200 μl de PBS. 100 μL/reservat0rio de diluição 1:1000 de C4c anti-humano de galinha conjugado com Biotina (Immunosystem AB, Uppsala, Suécia) foi adicionado em PBS que contém 2,0 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA) e incubados 1 hora na temperatura ambiente com mistura suave. Cada reservatório foi lavado 5 vezes com 200 μl de PBS. 100 μL/reservat0rio de 0,1 μg/ml de estreptavidina conjugada com peroxidase (Pierce Chemical #21126) foi adicionado em PBS que contém 2,0 mg/ml de BSA e incubada por 1 hora na temperatura ambiente em um agitador com mistura suave. Cada reservatório foi lavado cinco vezes com 200 μl de PBS. 100 μL/reservat0rio do substrato de peroxidase TMB (Kirdegaard & Perry Laboratories) foi adicionado e incubados na temperatura ambiente por 16 minutos. A reação de peroxidase foi interrompida pela adição de 100 μl/reservat0rio de 1,0 M de H3PO4 e a OD450 foi medida.

Ensaio de Ativação de C3

[000478] Para avaliar o efeito de OMS646 sobre a ativação de C3 dependente da lectina, ensaios foram realizados em uma maneira idêntica ao ensaio de ativação de C4 descrito acima, exceto que a deposição de C3 foi avaliada como o ponto final. A deposição de C3 foi quantificada como segue.

[000479] No final da reação de deposição de complemento, as placas foram lavadas como descrito acima e subsequentemente incubadas por 1 hora com 100 μL/reservat0rio de diluição 1:5000 de anticorpo C3c anti-humano de coelho (Dako) em PBS que contém 2,0 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA). Cada placa foi lavada cinco vezes com 200 μl de PBS, e depois incubada por 1 hora na temperatura ambiente com 100 μL/reservat0rio de IgG anti-coelho de cabra rotulado com HRP (American Qualex Antibodies) em PBS que contém 2,0 mg/ml de BSA. As placas foram lavadas cinco vezes com 200 μl de PBS e depois 100 μL/reservat0rio do substrato de peroxidase TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) foram adicionados e incubados na temperatura ambiente por 10 minutos. A reação da peroxidase foi interrompida pela adição de 100 μL/reservat0rio de H3PO4 1,0 M e a OD450 foi medida. Os valores de IC50 foram derivados pela aplicação de um algoritmo de ajuste de curva de dose-resposta sigmoidal (GraphPad) aos conjuntos de dados experimentais.

Resultados:

[000480] A FIGURA 23A graficamente ilustra o nível de deposição de C3 na presença ou ausência de anticorpo anti-MASP-2 (OMS646) em uma faixa de concentrações em 90 % de soro humano sob condições específicas da via da lectina. A FIGURA 23B graficamente ilustra o nível de deposição de C4 na presença ou ausência de anticorpo anti-MASP-2 (OMS646) em uma faixa de concentrações em 90 % de soro humano sob condições específicas da via da lectina. Como mostrado na FIGURA 23A, OMS646 bloqueou a deposição de C3 em 90 % de soro humano com uma IC50 = 3 ± 1,5 nM (n = 6). Como mostrado na FIGURA 23B, OMS646 bloqueou a deposição de C4 com uma IC50 = 2,8 ± 1,3 nM (n = 6).

[000481] Estes resultados demonstram que OMS646 fornece bloqueio potente, eficaz da ativação da via da lectina sob condições fisiológicas, fornecendo deste modo suporte para o uso de doses terapêuticas baixas de OMS646. Com base nestes dados, é esperado que OMS646 bloqueará >90 % da via da lectina na circulação de um paciente em uma concentração plasmática de 20 nM (31 μg/ml) ou menos. Com base em um volume de plasma de um ser humano típico de aproximadamente 3 L, e o conhecimento de que o todo do material de anticorpo administrado é retido no plasma (Lin Y. S. et al., JPET 288: 371 (1999)), é esperado que uma dose de OMS646 tão baixa quanto 10 mg administrados intravenosamente será eficaz em bloquear a via da lectina durante um período de tempo agudo (isto é, um período de tempo transitório, tal como de 1 a 3 dias). No contexto de uma enfermidade crônica, pode ser vantajoso bloquear a via da lectina por um período prolongado de tempo para se obter benefício de tratamento máximo. Assim, para tais condições crônicas, uma dose de OMS646 de 100 mg pode ser preferida, que é esperada ser eficaz no bloqueio da via da lectina em um indivíduo humano adulto por pelo menos um semana ou mais longo. Dada a depuração lenta e meia vida longa que é habitualmente observada para os anticorpos em seres humanos, é possível que uma dose de 100 mg de OMS646 possa ser eficaz por mais tempo do que uma semana, tal como durante 2 semanas, ou mesmo 4 semanas. É esperado que uma dose mais alta do anticorpo (isto é, mais do que 100 mg, tal como 200 mg, 500 mg ou maior, tal como 700 mg ou 1000 mg), tenha uma duração mais longa de ação (por exemplo, maior do que 2 semanas).

5. OMS646 bloqueia a ativação da via da lectina em macacos

[000482] Como descrito acima no Exemplo 10 e mostrado na FIGURA 17, foi determinado que OMS646 remove a atividade da via da lectina sistêmica por um período de tempo de cerca de 72 horas que segue a administração intravenosa de OMS646 (3 mg/kg) em macacos Verdes Africanos, seguido pela recuperação da atividade da via da lectina.

[000483] Este Exemplo descreve um estudo de acompanhamento em que a ativação de C4 dependente da lectina foi avaliada em 90 % soro de macaco Verde Africano ou em 90 % de soro de macaco Cinomolgo em uma faixa de concentrações de OMS646 e na ausência de OMS646, como segue:

[000484] Para avaliar o efeito de OMS646 sobre a ativação de C4 dependente de lectina em espécies de primata não humano diferentes, placas de ligação de Costar de 96 reservatórios foram revestidas durante a noite a 5 °C com 2 μg de manana (50 μl de uma solução a 40 μg/ml em tampão de carbonato a 50 mM, pH 9,5). AS placas foram depois lavadas três vezes com 200 μl de PBS e bloqueadas com 100 μL/reservat0rio de 1 % de albumina sérica bovina em PBS por 1 hora na temperatura ambiente com mistura suave. Em uma placa de pré-incubação separada, concentrações selecionadas de OMS646 foram misturadas com 90 % de soro coletados de macacos Verdes Africanos ou Macacos Cinomolgos, e incubadas 1 hora em gelo. Estas misturas de pré-incubação de anticorpo-soro foram depois transferidas para dentro de reservatórios revestidos com manana das placas de ensaio em gelo. As placas de ensaio foram depois incubadas por 90 minutos em um banho de água gelada para permitir a ativação de complemento. A reação foi interrompida pela adição de EDTA à mistura de reação. Cada reservatório foi lavado cinco vezes com 200 μl de PBS-Tween 20 (0,05 % de Tween 20 em PBS), depois cada reservatório foi lavado duas vezes com 200 μl de PBS. 100 μL/reservat0rio de diluição 1:1000 de C4c anti-humano de galinha conjugado com Biotina (Immunosystem AB, Uppsala, Suécia) foram adicionados em PBS que contém 2,0 mg/ml de BSA e incubados uma hora na temperatura ambiente com mistura suave. Cada reservatório foi lavado cinco vezes com 200 μl de PBS. 100 μL/reservat0rio de 0,1 μg/ml de estreptavidina conjugada com peroxidase (Pierce Chemical #21126) foi adicionado em PBS que contém 2,0 mg/ml de BSA e incubados por uma hora na temperatura ambiente em um agitador com mistura suave. Cada reservatório foi lavado cinco vezes com 200 μl de PBS. 100 μL/reservat0rio do substrato de peroxidase TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) foram adicionados e incubados na temperatura ambiente por 10 minutos. A reação de peroxidase foi interrompida pela adição de 100 μL/reservat0rio de H3PO4 a 1,0 M e a OD450 foi medida. Os valores de IC50 foram derivados pela aplicação de um algoritmo de ajuste de curva de resposta à dose sigmoidal (GraphPad) aos conjuntos de dados experimentais.

Resultados:

[000485] Uma resposta de dose da inibição da via da lectina em 90 % de soro de macaco Cinomolgo (FIGURA 24A) e em 90 % de soro de macaco Verde Africano (FIGURA 24B) foi observada com valores de IC50 na faixa de 30 nM a 50 nM, e 15 nM a 30 nM, respectivamente.

[000486] Em resumo, OMS646, um anticorpo IgG4 anti-MASP-2 humana totalmente humano (com uma mutação na região de articulação) foi observado ter as propriedades vantajosas que seguem: ligação de alta afinidade à MASP-2 humana (KD na faixa de 50 a 250 pM, com uma taxa Kdesligamento na faixa de 1 a 3 x 10-4 s1 e uma taxa Kon na faixa de 1,6 a 3 x 106 M-1 s-1; a potência funcional em soro humano com inibição da deposição de C4 com uma IC50 de 0,52 ± 0,28 nM (n = 10) em 1 % de soro humano; e uma IC50 de 3 ± 1,5 nM em 90 % de soro); e a reatividade cruzada em macaco que mostra inibição da deposição de C4 com uma IC50 na faixa de 15 a 50 nM (90 % de soro de macaco).

[000487] Como descrito acima, doses tão baixas quanto 10 mg de OMS646 (que corresponde a 0,15 mg/kg para um ser humano médio) são esperadas serem eficazes no bloqueio acentuado da via da lectina na circulação humana (por exemplo, por um período de pelo menos 1 a 3 dias), enquanto que as doses de 100 mg de OMS646 (que corresponde a 1,5 mg/kg para um ser humano médio) são esperadas bloquear a via da lectina na circulação de um paciente por pelo menos uma semana ou mais longo. Doses maiores de OMS646 (por exemplo, doses maiores do que 100 mg, tais como pelo menos 200 mg, pelo menos 300 mg, pelo menos 400 mg, pelo menos 500 mg, ou maiores), e preferivelmente as vias subcutânea (sc) ou intramuscular (im) de administração podem ser utilizadas para prolongar ainda mais a janela de tempo da remoção da via da lectina eficaz para duas semanas e preferivelmente quatro semanas.

[000488] Por exemplo, como mostrado nos dados experimentais aqui, em primatas uma dose de 1 mg/kg de OMS646 resultou na inibição da via da lectina por 1 dia, e uma dose de 3 mg/kg de OMS646 resultou na inibição da via da lectina por cerca de 3 dias (72 horas). È portanto estimado que uma dosagem maior de 7 a 10 mg/kg seria eficaz para inibir a via da lectina por um período de tempo de cerca de 7 dias. Como aqui mostrado, o OMS646 tem uma potência 510 vezes maior contra MASP-2 humana quando comparado com MASP-2 de macaco. Assumindo farmacocinéticas comparáveis, as faixas de dosagens esperadas para se obter a remoção da via da lectina eficaz em seres humanos são mostradas na TABELA 30 abaixo. TABELA 30: Dosagem de OMS646 para inibir a via da lectina in vivo

[000489] Embora a forma de realização preferida da invenção tenha sido ilustrada e descrita, será avaliado que várias mudanças podem ser feitas na mesma sem divergir do espírito e escopo da invenção.

Claims

1. Anticorpo monoclonal humano isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que se liga à MASP-2 humana, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 20; e b) uma região variável da cadeia leve que compreende: SEQ ID NO: 24; e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inibem a ativação de complemento dependente de MASP-2.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos seguintes aplicar: (i) em que o dito anticorpo se liga à MASP-2 humana com um KD de 10 nM ou menos; (ii) o dito anticorpo se liga a um epítopo no domínio CCP1 de MASP-2; (iii) o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em um ensaio in vitro em 1 % de soro humano a uma IC50 de 10 nM ou menos; (iv) o dito anticorpo inibe a deposição de C3b em 90 % de soro humano com uma IC50 de 30 nM ou menos; ou (v) em que o anticorpo não substancialmente inibir a via clássica.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento de anticorpo selecionado do grupo que consiste de Fv, Fab, Fab’, F(ab)2, F(ab’)2, um anticorpo de cadeia única, um ScFv, um anticorpo univalente que não tem uma região de articulação e um anticorpo total.

4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é uma molécula de IgG2, e molécula de IgG1, e uma molécula de IgG4.

5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a molécula de IgG4 compreende uma mutação S228P.

6. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve de um anticorpo MASP2, ou fragmento do mesmo, em que a referida molécula de ácido nucléico compreende a SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 23.

7. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo MASP-2 da invenção como definido na reivindicação 6.

8. Célula de um microrganismo transgênico, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico que codificam um anticorpo MASP-2 da invenção como definida na reivindicação 6 ou 7.

9. Método para gerar um anticorpo isolado anti-MASP-2, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula como definida na reivindicação 8 sob condições que permitam a expressão das moléculas de ácido nucleico que codificam o anticorpo anti-MASP-2 e a isolação do dito anticorpo anti-MASP-2.

10. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo anti-MASP-2 monoclonal totalmente humano, ou fragmento do mesmo, como definido na reivindicação 1, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

11. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que composição é formulada para a administração intra-arterial, intravenosa, intracraniana, intramuscular, inalacional, nasal ou subcutânea.

12. Uso de um anticorpo MASP-2 como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para inibir ativação de complemento dependente de MASP-2 em um indivíduo em necessidade do mesmo.

13. Artigo de fabricação, caracterizado pelo fato de que compreende uma dose unitária de um anticorpo anti-MASP-2 monoclonal humano como definido na reivindicação 1, adequada para a administração terapêutica a um indivíduo humano, em que a dose unitária está na faixa de 1 mg a 1000 mg.

14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de DNA isolada que codifica a região variável da cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO:19 e uma sequência de DNA isolada que codifica a região variável da cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 23 do anticorpo, ou fragmento do mesmo, conforme definido na reivindicação 1.