ES2795667T3 - Composiciones para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a MASP-2 humana e inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-2, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: a) una región variable de la cadena pesada que comprende el aminoácido expuesto en la SEQ ID NO: 20; y b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 24.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos inhibidores anti-MASP-2 y a composiciones que comprenden dichos anticuerpos, para su uso en la inhibición de los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de MASP-2.

Antecedentes

El sistema del complemento proporciona un mecanismo de acción temprano para iniciar, amplificar y orquestar la respuesta inmunitaria contra las infecciones bacterianas y otros ataques repentinos (M.K. Liszewski y J.P. Atkinson, 1993, en Fundamental Immunology, tercera edición, editado por W.E. Paul, Raven Press, Ltd., Nueva York) en seres humanos y otros vertebrados. Aunque la activación del complemento proporciona una valiosa defensa de primera línea contra posibles patógenos, las actividades del complemento que promueven una respuesta inmunoprotectora pueden representar también un posible riesgo para el hospedador (K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol.

15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994). Por ejemplo, los productos proteolíticos C3 y C5 reclutan y activan neutrófilos. Aunque indispensables para la defensa del hospedador, los neutrófilos activados no discriminan en su liberación de enzimas destructoras y pueden provocar lesiones en los órganos. Además, la activación del complemento puede provocar el depósito de componentes líticos del complemento sobre las células hospedadoras cercanas, así como en dianas microbianas, dando como resultado la lisis de las células hospedadoras.

El sistema del complemento también se ha implicado en la patogenia de numerosas enfermedades agudas y crónicas, incluyendo: infarto de miocardio, apoplejía, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), lesión por reperfusión, choque séptico, exudación capilar posterior a quemaduras térmicas, inflamación tras circulación extracorpórea, rechazo de trasplantes, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, miastenia grave y enfermedad de Alzheimer. En casi todas estas afecciones, el complemento no es la causa, sino uno de los varios factores implicados en la patogenia. No obstante, la activación del complemento puede ser un mecanismo patológico principal y representa un punto eficaz para el control clínico en muchas de estas enfermedades.

El creciente reconocimiento de la importancia de la lesión en los tejidos mediada por el complemento en una diversidad de enfermedades subraya la necesidad de fármacos inhibidores del complemento eficaces. Hasta ahora, el eculizumab (Soliris®), un anticuerpo contra C5, es el único fármaco dirigido al complemento cuyo uso está autorizado para uso en seres humanos. No obstante, C5 es una de las varias moléculas efectoras localizadas "posteriormente" en el sistema del complemento, y el bloqueo de C5 no inhibe la activación del sistema del complemento. Por lo tanto, un inhibidor de las etapas iniciales de la activación del complemento tendría ventajas importantes sobre un inhibidor del complemento "posterior".

En la actualidad, está ampliamente aceptado que el sistema del complemento se puede activar mediante tres rutas diferentes: la ruta clásica, la ruta de las lectinas y la ruta alternativa. La ruta clásica se activa habitualmente mediante un complejo compuesto por anticuerpos del hospedador unidos a una partícula exógena (es decir, un antígeno) y, por tanto, requiere exposición previa a un antígeno para la generación de una respuesta de anticuerpos específica. Puesto que la activación de la ruta clásica depende de una respuesta inmunitaria adaptativa previa del hospedador, la ruta clásica forma parte del sistema inmunitario adquirido. En cambio, tanto la ruta de las lectinas como la ruta alternativa son independientes de la inmunidad adaptativa y forman parte del sistema inmunitario innato.

La activación del sistema del complemento da como resultado la activación secuencial de los zimógenos de serina proteasa. La primera etapa en la activación de la ruta clásica es la unión de una molécula de reconocimiento específica, C1q, a complejos de IgG e IgM unidas al antígeno. C1q se asocia con las proenzimas C1r y C1s de serina proteasa como un complejo denominado C1. Tras la unión de C1q a un inmunocomplejo, la escisión autoproteolítica del sitio de Arg-Ile de C1r va seguida por la escisión mediada por C1 y la activación de C1s, que de ese modo adquiere la capacidad de escindir C4 y C2. C4 se escinde en dos fragmentos, denominados C4a y C4b y, de manera similar, C2 se escinde en C2a y C2b. Los fragmentos C4b pueden formar enlaces covalentes con grupos hidroxilo o amino adyacentes, y generan la C3 convertasa (C4b2a) mediante una interacción no covalente con el fragmento C2a de C2 activado. La C3 convertasa (C4b2a) activa C3 mediante escisión proteolítica en los subcomponentes C3a y C3b, que dan lugar a la generación de la C5 convertasa (C4b2a3b) que, por escisión de C5, da lugar a la formación del complejo de ataque a la membrana (C5b combinado con C6, C7, C8 y C9, también denominado "MAC") que puede alterar las membranas celulares dando lugar a lisis celular. Las formas activadas de C3 y C4 (C3b y C4b) se depositan covalentemente sobre las superficies diana exógenas, que las reconocen los receptores del complemento en múltiples fagocitos.

De manera independiente, la primera etapa en la activación del sistema del complemento a través de la ruta de las lectinas es también la unión de moléculas de reconocimiento específicas, que va seguida de la activación de las proenzimas de serina proteasa asociadas. Sin embargo, en lugar de la unión de inmunocomplejos por C1q, las moléculas de reconocimiento en la ruta de las lectinas comprenden un grupo de proteínas de unión a hidratos de carbono (lectina de unión a manano (MBL), H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina y lectina CL-11 de tipo C), denominadas en su conjunto lectinas. Véase J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, 2002; Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000)). Véase también J. Luet et al., Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Holmskov et al., Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000); Hansen S. et al., J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010).

Ikeda et al. demostraron por primera vez que, al igual que C1q, la MBL podía activar el sistema del complemento tras su unión a los eritrocitos recubiertos con manano de levadura de una manera dependiente de C4 (Ikeda et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987). La MBL, un miembro de la familia de la proteína colectina, es una lectina dependiente del calcio que se une a hidratos de carbono que tienen grupos 3-hidroxi y 4-hidroxi orientados en el plano ecuatorial del anillo de piranosa. Los ligandos principales de MBL son, por tanto, D-manosa y N-acetil-D-glucosamina, mientras que los hidratos de carbono que no se ajustan a este requisito estérico tienen afinidad indetectable por MBL (Weis, W.I., et al., Nature 360:127-134, 1992). La interacción entre la MBL y los glúcidos monovalentes es extremadamente débil, con constantes de disociación normalmente en el intervalo de un solo dígito milimolar. La MBL consigue una unión específica y fuerte a los ligandos de glucano por avidez, es decir, interactuando simultáneamente con múltiples residuos de monosacárido localizados muy próximos entre sí (Lee, R.T., et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, 1992). La MBL reconoce los patrones de hidratos de carbono que habitualmente recubren los microorganismos, tales como bacterias, levaduras, parásitos y determinados virus. En cambio, la MBL no reconoce la D-galactosa ni el ácido siálico, el penúltimo y último glúcidos que habitualmente recubren los glucoconjugados complejos "maduros" presentes en las glucoproteínas plasmáticas y de la superficie celular de los mamíferos. Se cree que esta especificidad de unión promueve el reconocimiento de superficies "exógenas" y ayuda a proteger contra la "autoactivación". Sin embargo, La MBL se une con alta afinidad a grupos de glucanos "precursores" con alto contenido de manosa en glucoproteínas con enlace a N y glucolípidos secuestrados en el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi de las células de mamífero (Maynard, Y., et al., J. Biol. Chem. 257:3788-3794, 1982). Por lo tanto, las células dañadas son posibles dianas para la activación de la ruta de las lectinas mediante la unión a MBL.

Las ficolinas tienen un tipo de dominio de lectina diferente al de la MBL, denominado dominio similar fibrinógeno. Las ficolinas se unen a los residuos glucídicos de una forma independiente de Ca++. En seres humanos, se han identificado tres tipos de ficolinas (L-ficolina, M-ficolina y H-ficolina). Las dos ficolinas séricas, L-ficolina y H-ficolina, tienen en común una especificidad por N-acetil-D-glucosamina; sin embargo, la H-ficolina también se une a N-acetil-D-galactosamina. La diferencia en la especificidad por el glúcido de L-ficolina, H-ficolina, CL-11 y MBL significa que las diferentes lectinas pueden ser complementarias y estar dirigidas a glucoconjugados diferentes, aunque solapantes. Este concepto está respaldado por un reciente informe en el que, de las lectinas conocidas de la ruta de las lectinas, solo la L-ficolina se une específicamente al ácido lipoteicoico, un glucoconjugado de la pared celular encontrado en todas las bacterias grampositivas (Lynch, N.J., et al., J. Immunol. 172:1198-1202, 2004). Las colectinas (es decir, MBL) y las ficolinas no tienen una similitud significativa en su secuencia de aminoácidos. Sin embargo, los dos grupos de proteínas tienen organizaciones de dominio similares y, al igual que C1q, se ensamblan en estructuras oligoméricas, lo que maximiza la posibilidad de una unión multisitio.

Las concentraciones séricas de la MBL son muy variables en poblaciones sanas y esto se controla genéticamente mediante los polimorfismos/mutaciones tanto en el promotor como en las regiones codificantes del gen de MBL. Como proteína de la fase aguda, la expresión de la MBL está además regulada por aumento durante la inflamación. La L-ficolina está presente en el suero en concentraciones similares a las de la MBL. Por lo tanto, la rama de la L-ficolina de la ruta de las lectinas es potencialmente comparable con la sección de la MBL en su capacidad. La MBL y las ficolinas también pueden funcionar como opsoninas, que permiten que los fagocitos se dirijan a superficies recubiertas con MBL y ficolina (véase Jack et al., J Leukoc Biol., 77(3):328-36 (2004); Matsushita y Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 (2002); Aoyagi et al., J Immunol 174(1):418-25 (2005). Esta opsonización requiere la interacción de estas proteínas con los receptores de fagocitos (Kuhlman, M., et al., J. Exp. Med. 169:1733, 1989; Matsushita, M., et al., J. Biol. Chem. 271:2448-54, 1996), cuya identidad no se ha establecido.

La MBL humana forma una interacción específica y de alta afinidad a través de su dominio similar colágeno con serina proteasas únicas similares a C1r/C1s, denominadas serina proteasas asociadas a MBL (MASP). Hasta ahora, se han descrito tres MASP. En primer lugar, se identificó una sola enzima "MASP" y se caracterizó como la enzima responsable del inicio de la cascada del complemento (es decir, la escisión de C2 y C4) (Matsushita M y Fujita T., J Exp Med 176(6):1497-1502 (1992), Ji, Y.H., et al., J. Immunol. 150:571-578, 1993). Posteriormente se determinó que la actividad de Ma SP era, de hecho, una mezcla de dos proteasas: MASP-1 y MAs P-2 (Thiel, S., et al., Nature 386:506-510, 1997). Sin embargo, se demostró que el complejo de MBL-MASP-2 en solitario es suficiente para la activación del complemento (Vorup-Jensen, T., et al., J. Immunol. 165:2093-2100, 2000). Además, solamente MASP-2 escindía C2 y C4 a altas tasas (Ambrus, G., et al., J. Immunol. 770:1374-1382, 2003). Por lo tanto, MASP-2 es la proteasa responsable de activar C4 y C2 para generar la C3 convertasa, C4b2a. Esta es una diferencia importante con respecto al complejo C1 de la ruta clásica, donde la acción coordinada de dos serina proteasas específicas (C1r y C1s) da lugar a la activación del sistema del complemento. Además, una tercera proteasa novedosa, MASP-3, se ha aislado (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:127-35, 2001). MASP-1 y MASP-3 son productos de corte y empalme alternativo del mismo gen.

Las MASP comparten organizaciones de dominio idénticas a las de C1r y C1s, los componentes enzimáticos del complejo C1 (Sim, R.B., et al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, 2000). Estos dominios incluyen un dominio N terminal de C1r/C1s/VEGF de erizo de mar/proteína morfogénica del hueso (CUB), un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico, un segundo dominio CUB, un tándem de dominios de proteína de control del complemento y un dominio serina proteasa. Como en las proteasas C1, la activación de MASP-2 se produce mediante escisión de un enlace de Arg-Ile adyacente al dominio serina proteasa, que divide la enzima en las cadenas A y B unidas por disulfuro, consistiendo la última en el dominio serina proteasa. Recientemente, se describió una deficiencia de MASP-2 determinada genéticamente (Stengaard-Pedersen, K., et al., New Eng. J. Med. 349:554-560, 2003). La mutación de un solo nucleótido da lugar a un intercambio de Asp-Gly en el dominio CUB1 y hace que la MASP-2 no pueda unirse a la MBL.

La MBL también puede asociarse con una forma de corte y empalme alternativo de MASP-2, conocida como proteína asociada a MBL de 19 kDa (MAp19) (Stover, C.M., J. Immunol. 162:3481-90, 1999) o proteína asociada a MBL pequeña (sMAP) (Takahashi, M., et al., Int. Immunol. 11:859-863, 1999), que carece de la actividad catalítica de MASP-2. La MAp19 comprende los dos primeros dominios de MASP-2, seguidos de una secuencia adicional de cuatro aminoácidos únicos. Los genes MASP 1 y MASP 2 genes están localizados en los cromosomas humanos 3 y 1, respectivamente (Schwaeble, W., et al., Immunobiology 205:455-466, 2002).

Varias líneas de evidencia sugieren que hay diferentes complejos de MBL-MASP y una gran fracción de las MASP en suero no está en complejo con la MBL (Thiel, S., et al., J. Immunol. 165:878-887, 2000). Tanto la H- como la L-ficolina se unen a todas las MASP y activan la ruta de las lectinas del complemento, como la MBL (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:127-35, 2001; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). Tanto la ruta clásica como la ruta de las lectinas forman una C3 convertasa común (C4b2a) y las dos rutas convergen en esta etapa.

Se cree ampliamente que la ruta de las lectinas tiene una función importante en la defensa del hospedador contra infecciones en hospedadores no expuestos. Las fuertes evidencias de la implicación de la MBL en la defensa del hospedador provienen del análisis de pacientes con niveles séricos disminuidos de MBL funcional (Kilpatrick, D.C., Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, 2002). Dichos pacientes presentan susceptibilidad a infecciones bacterianas y fúngicas recurrentes. Estos síntomas normalmente son evidentes en las primeras etapas de la vida, durante una ventana de vulnerabilidad evidente a medida que las concentraciones de anticuerpos derivados de la madre van desapareciendo, pero antes de que se desarrolle la gama completa de respuestas de anticuerpo. Este síndrome a menudo es el resultado de mutaciones en varios sitios de la parte colagenosa de la MBL, que impiden la correcta formación de los oligómeros de MBL. Sin embargo, como la m Bl puede funcionar como una opsonina independiente del complemento, no se sabe el grado en que la mayor susceptibilidad a infecciones se debe a una activación del complemento alterada.

A diferencia de la ruta clásica y la ruta de las lectinas, no se han descubierto iniciadores de la ruta alternativa que cumplan las funciones de reconocimiento que realizan C1q y las lectinas en las otras dos rutas. En la actualidad se acepta ampliamente que la ruta alternativa experimenta espontáneamente un nivel bajo de activación por renovación, que se puede amplificar fácilmente sobre superficies exógenas u otras superficies anómalas (bacterias, levaduras, células infectadas con virus o tejido dañado) que carecen de los elementos moleculares adecuados que mantengan la activación espontánea del complemento bajo control. Existen cuatro proteínas plasmáticas directamente implicadas en la activación de la ruta alternativa: C3, factores B y D, y properdina. Aunque existe una amplia evidencia que implica tanto la ruta clásica como la alternativa del complemento en la patogenia de enfermedades humanas no infecciosas, la función de la ruta de las lectinas apenas está empezando a evaluarse. Estudios recientes proporcionan evidencias de que la activación de la ruta de las lectinas puede ser responsable de la activación del complemento y de la inflamación relacionada en la lesión por reperfusión posterior a isquemia. Collard et al. (2000) informaron de que células endoteliales cultivadas sometidas a agresión oxidativa se unen a MBL y muestran depósito de C3 tras exposición a suero humano (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 156:1549-1556, 2000). Además, el tratamiento de suero humano con anticuerpos monoclonales anti-MBL bloqueantes inhibió la unión de MBL y la activación del complemento. Estos hallazgos se ampliaron a un modelo de rata de reperfusión posterior a isquemia en miocardio en que las ratas tratadas con un anticuerpo bloqueante dirigido contra la MBL de rata mostraron significativamente menos daño en el miocardio tras la oclusión de una arteria coronaria que ratas tratadas con un anticuerpo de control (Jordan, J.E., et al., Circulation 104:1413-1418, 2001). El mecanismo molecular de la unión de la MBL al endotelio vascular después de agresión oxidativa no está claro; un estudio reciente sugiere que la activación de la ruta de las lectinas después de agresión oxidativa puede esta mediada por la unión de la MBL a citoqueratinas del endotelio vascular y no a glucoconjugados (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 159:1045-1054, 2001). Otros estudios han implicado las rutas clásica y alternativa en la patogenia de la lesión por reperfusión posterior a isquemia y la función de la ruta de las lectinas en esta enfermedad sigue siendo motivo de controversia (Riedermann, N.C., et al., Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003).

Un estudio reciente ha mostrado que la MASP-1 (y posiblemente también la MASP-3) es necesaria para convertir la enzima de activación de la ruta alternativa, el Factor D, desde su forma zimógena en su forma enzimáticamente activa (véase Takahashi M. et al., J Exp Med 207(1):29-37 (2010)). La importancia fisiológica de este proceso está subrayada por la ausencia de actividad funcional de la ruta alternativa en el plasma de ratones deficientes en MASP-1/3. La generación proteolítica de C3b a partir de C3 natural es necesaria para que funcione la ruta alternativa. Puesto que la C3 convertasa de la ruta alternativa (C3bBb) contiene C3b como subunidad esencial, la cuestión relativa al origen de la primera C3b mediante la ruta alternativa supone un verdadero rompecabezas y ha fomentado mucha investigación.

C3 pertenece a una familia de proteínas (junto con C4 y a-2 macroglobulina) que contienen una modificación postraduccional infrecuente conocida como enlace tioéster. El grupo tioéster está compuesto de una glutamina cuyo grupo carbonilo del extremo forma un enlace tioéster covalente con el grupo sulfhidrilo de una cisteína situada a tres aminoácidos de distancia. Este enlace es inestable y el grupo glutamilo-tioéster electrófilo puede reaccionar con restos nucleófilos tales como grupos hidroxilo y amino y formar, por tanto, un enlace covalente con otras moléculas. El enlace tioéster es razonablemente estable cuando está incluido dentro de un bolsillo hidrófobo de C3 intacto. Sin embargo, la escisión proteolítica de C3 en C3a y C3b da como resultado la exposición del enlace tioéster fuertemente reactivo en C3b y, tras el ataque nucleófilo de los restos adyacentes que comprenden grupos hidroxilo o amino, C3b queda unido covalentemente a una diana. Además de su función bien documentada en la unión covalente de C3b a dianas del complemento, se cree también que el tioéster de C3 tiene una función fundamental en la estimulación de la ruta alternativa. De acuerdo con la "teoría del ralentí" ampliamente aceptada, la ruta alternativa se inicia mediante la generación de una convertasa en fase líquida, iC3Bb, que se forma a partir de C3 con el tioéster hidrolizado (iC3; C3(H2O)) y el factor B (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopathol. 7:143-162, 1984). El C3(H2O) similar a C3b se genera a partir de C3 natural mediante una hidrólisis espontánea lenta del tioéster interno de la proteína (Pangburn, M. K., et al., J. Exp. Med. 154:856-867, 1981). Mediante la actividad de la convertasa C3(H2O)Bb, las moléculas C3b se depositan sobre la superficie diana, iniciando de ese modo la ruta alternativa.

Se sabe muy poco sobre los iniciadores de la activación de la ruta alternativa. Se cree que los activadores incluyen paredes celulares de levadura (cimosano), muchos polisacáridos puros, eritrocitos de conejo, algunas inmunoglobulinas, virus, hongos, bacterias, células tumorales animales, parásitos y células dañadas. El único rasgo común a estos activadores es la presencia de hidrato de carbono, pero la complejidad y la variedad de las estructuras glucídicas han dificultado establecer los determinantes moleculares compartidos que se reconocen. Se admite ampliamente que la activación de la ruta alternativa se controla mediante el delicado equilibrio entre los componentes reguladores inhibidores de esta ruta, tales como el Factor H, el Factor I, DAF, CR1 and properdina, que es el único regulador positivo de la ruta alternativa. Véase Schwaeble W.J. y Reid K.B., Immunol Today 20(1):17-21 (1999)).

Además del mecanismo de activación aparentemente no regulado descrito anteriormente, la ruta alternativa también puede proporcionar un bucle de amplificación potente de la C3 convertasa de la ruta de las lectinas/clásica (C4b2a) ya que cualquier C3b generado puede participar con el factor B en la formación de la C3 convertasa adicional para la ruta alternativa (C3bBb). La C3 convertasa de la ruta alternativa se estabiliza mediante la unión de properdina. La properdina prolonga la semivida de la C3 convertasa de la ruta alternativa de seis a diez veces. La adición de C3b a la C3 convertasa de la ruta alternativa da lugar a la formación de la C5 convertasa de la ruta alternativa.

Las tres rutas (es decir, la clásica, de las lectinas y la alternativa) se cree que convergen en C5, que se escinde para formar productos con múltiples efectos proinflamatorios. Tras la convergencia, la ruta se denomina ruta del complemento terminal. C5a es la anafilotoxina más potente, que induce alteraciones en el músculo liso y en el tono vascular, así como en la permeabilidad vascular. Es también una quimiotaxina potente y un activador tanto de neutrófilos como de monocitos. La activación celular mediada por C5a puede amplificar significativamente las respuestas inflamatorias induciendo la liberación de múltiples mediadores inflamatorios adicionales, incluyendo citocinas, enzimas hidrolíticas, metabolitos de ácido araquidónico y especies de oxígeno reactivas. La escisión de C5 da lugar a la formación de C5b-9, también conocido como complejo de ataque a la membrana (MAC). Existe ahora una fuerte evidencia que el depósito de MAC sublítico puede tener una función importante en la inflamación, además de su función como complejo lítico formador de poros.

Además de su función fundamental en la defensa inmunitaria, el sistema del complemento contribuye al daño de tejidos en muchas situaciones clínicas. Por tanto, existe una necesidad apremiante de desarrollar inhibidores del complemento terapéuticamente eficaces para evitar estos efectos adversos.

El documento WO 2004/106384 divulga anticuerpos de rata anti-MASP-2 humana. El documento WO 2005/123128 muestra anticuerpos monoclonal murinos anti-MASP-2 de rata o humana. Schwaeble et al., 2001, PNAS vol. 108, n.° 18, 7523-7528 describen el anticuerpo humano anti-MASP-2 humana AbDH3.

Sumario

La invención se define por las reivindicaciones y cualquier otro aspecto o realización expuesto en este documento que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones es para información únicamente.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a MASP-2 humana, que comprende:(i) una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3; y (ii) una región variable de la cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, en el que la secuencia de CDR-H3 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 90, y modificaciones de secuencia conservativas de la misma, en el que la secuencia de CDR-L3 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 94, y modificaciones de secuencia conservativas de la misma, y en el que el anticuerpo aislado inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-2.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo humano que se une a MASP-2 humana, en el que el anticuerpo comprende: I) (a) una región variable de la cadena pesada que comprende: i) una CDR-H1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 31-35 de la SEQ ID NO: 21; y ii) una CDR-H2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-65 de la SEQ ID NO: 21; y iii) una CDR-H3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 95-102 de la SEQ ID NO: 21; y b) una región variable de la cadena ligera que comprende: i) una CDR-L1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 24­ 34 de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27; y ii) una CDR-L2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-56 de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27; y iii) una CDR-L3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 89-97 de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27; o II) una variante del mismo que por lo demás es idéntico a dichos dominios variables, excepto por hasta un total combinado de 10 sustituciones aminoacídicas dentro de dichas regiones CDR de dicha región variable de la cadena pesada y hasta un total combinado de 10 sustituciones aminoacídicas dentro de dichas regiones CDR de dicha región variable de la cadena ligera, en el que el anticuerpo o variante del mismo inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-2.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a MASP-2 humana, en el que el anticuerpo comprende: I) (a) una región variable de la cadena pesada que comprende: i) una CDR-H1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 31-35 de la SEQ ID NO: 20; y ii) una CDR-H2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-65 de la SEQ ID NO: 20; y iii) una CDR-H3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 95-102 de la SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20; y b) una región variable de la cadena ligera que comprende: i) una CDR-L1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 24-34 de la SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24; y ii) una CDR-L2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 50­ 56 de la SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24; y iii) una CDR-L3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 89-97 de la SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24; o II) una variante del mismo, que por lo demás es idéntico a dichos dominios variables, excepto por hasta un total combinado de 10 sustituciones aminoacídicas dentro de dichas regiones CDR de dicha cadena pesada y hasta un total combinado de 10 sustituciones aminoacídicas dentro de dichas regiones CDR de dicha región variable de la cadena ligera, en el que el anticuerpo o variante del mismo inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-2.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a MASP-2 humana, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a MASP-2 humana, que comprende una región variable de la cadena ligera que comprende una de las secuencia de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27.

En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-MASP-2, o fragmentos de los mismos, de la presente invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula que comprende al menos una de las moléculas de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-MASP-2, o fragmentos de los mismos, de la presente invención.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de generación de un anticuerpo contra MASP-2 aislado, que comprende cultivar células que comprenden las moléculas de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-MASP-2 de la presente invención en condiciones que permiten la expresión de las moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-MASP-2 y aislar dicho anticuerpo anti-MASP-2.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se disocia de MASP-2 humana con una K^d de 10 nM o menos determinada por resonancia de plasmones superficiales e inhibe la activación de C4 en un sustrato recubierto con manano con una CI⁵⁰ de 10 nM o menos en suero al 1 %. En algunas realizaciones, dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo reconoce específicamente al menos parte de un epítopo reconocido por un anticuerpo de referencia, en el que dicho anticuerpo de referencia comprende una región variable de la cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 20 y una región variable de la cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 24.

En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden los anticuerpos monoclonales completamente humanos anti-MASP-2 de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos de inhibición de la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto humano, que comprende administrar un anticuerpo monoclonal humano de la invención en una cantidad suficiente para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en dicho sujeto humano.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un artículo de fabricación que comprende una dosis unitaria de anticuerpo monoclonal humano contra MASP-2 de la invención adecuada para administración terapéutica a un sujeto humano, en el que la dosis unitaria está en el intervalo de 1 mg a 1000 mg.

Descripción de los dibujos

Los anteriores aspectos y muchas de las consiguientes ventajas de la presente invención se apreciarán más fácilmente según la misma llegue a entenderse mejor con referencia a la siguiente descripción detallada, cuando se toma conjuntamente con los dibujos adjuntos, en los que:

la figura 1A es un diagrama que ilustra la estructura genómica de MASP-2 humana;

la figura 1B es un diagrama que ilustra la estructura de dominios de la proteína MASP-2 humana;

la figura 2 ilustra gráficamente los resultados de un ensayo ELISA realizado sobre poblaciones policlonales seleccionadas de una colección de fagos de scFcv separados frente a diversos antígenos de MASP-2, como se describe en el ejemplo 2;

las figuras 3A y 3B muestran los resultados de ensayar 45 clones de scFv candidatos respecto a la actividad funcional en el ensayo del complemento, como se describe en el ejemplo 3;

la figura 4 ilustra gráficamente los resultados de un experimento que se realizó para comparar los niveles de C3c en los tres sueros (humano, de rata y NHP), como se describe en el ejemplo 4;

la figura 5A es una alineación de secuencias de aminoácidos de la región de la cadena pesada (residuos 1-120) de los clones más activos, que revela dos grupos distintos que pertenecen a la familia génica VH2 y VH6, respectivamente, como se describe en el ejemplo 4;

la figura 5B es una alineación de secuencias de aminoácidos de los clones de scFv 17D20, 17N16, 18L16 y 4D9, como se describe en el ejemplo 4;

la figura 6 ilustra gráficamente las actividades inhibidoras de preparaciones de clones originales convertidos de IgG4 en un ensayo de depósito de C3b usando plasma humano al 90 %, como se describe en el ejemplo 5; la figura 7A ilustra gráficamente los resultados del ensayo ELISA sobre el clon original 17N16 frente a los clones derivados valorados sobre huMASP2A, como se describe en el ejemplo 6;

la figura 7B ilustra gráficamente los resultados del ensayo ELISA sobre el clon original 17D20 frente a los clones derivados valorados sobre huMASP2A, como se describe en el ejemplo 6;

la figura 8 es una alineación de secuencias proteínicas del clon original 17N16 y el clon derivado 17N9, que muestra que las cadenas ligeras (empezando con SYE) tienen 17 residuos aminoacídicos que difieren entre los dos clones, como se describe en el ejemplo 6;

la figura 9 es una alineación de secuencias proteínicas de la región CDR-H3 de las secuencias de los clones n.° 35, n.° 59 y n.° 90 resultantes de mutagénesis en comparación con el clon original 17D20, como se describe en el ejemplo 7;

la figura 10A es una alineación de secuencias proteínicas de la región CDR3 del clon original 17D20 con el clon de cadena reordenada 17D20md21N11 y el clon de mutagénesis n.° 35, clon de CDR-H3 mostrado en la figura 9 combinado con la VL de 17D20md21N11 (VH35-VL21N11), como se describe en el ejemplo 7;

la figura 10B es una alineación de secuencias proteínicas de las regiones VL y VH del clon original 17D20 y el clon derivado 17D20md21N11, como se describe en el ejemplo 7;

la figura 11A ilustra gráficamente los resultados del ensayo de depósito de C3b realizado para las variantes de isotipo del clon derivado (MoAb n.° 1-3), derivado del clon original 17N16 del anticuerpo monoclonal humano anti-MASP-2, como se describe en el ejemplo 8;

la figura 11B ilustra gráficamente los resultados del ensayo de depósito de C3b realizado para las variantes de isotipo del clon derivado (MoAb n.° 4-6), derivado del clon original 17D20 del anticuerpo monoclonal humano anti-MASP-2, como se describe en el ejemplo 8;

las figuras 12A y 12B ilustran gráficamente el ensayo de los clones originales y MoAb n.° 1-6 en un ensayo de depósito de C3b en suero al 95 %, como se describe en el ejemplo 8;

la figura 13 ilustra gráficamente la inhibición del depósito de C4b en suero humano normal al 95 %, como se describe en el ejemplo 8;

la figura 14 ilustra gráficamente la inhibición del depósito de C3b en suero de mono verde africano al 95 %, como se describe en el ejemplo 8;

la figura 15 ilustra gráficamente la inhibición de la actividad de escisión de C4 del complejo de MBL-MASP2 preensamblado, por MoAb n.° 2-6, como se describe en el ejemplo 8;

la figura 16 ilustra gráficamente la unión preferente de MoAb n.° 6 a MASP2 humana en comparación con C1s, como se describe en el ejemplo 8;

la figura 17 ilustra gráficamente que la ruta de las lectinas se inhibía completamente después de administración intravenosa de MoAb n.° OMS646 contra ser humano en monos verdes africanos, como se describe en el ejemplo 10;

la figura 18A es un diagrama de supervivencia de Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de supervivencia a lo largo del tiempo después de exposición a 7,0 Gy de radiación en ratones de control y en ratones tratados con anticuerpo anti-MASP-2 murina (mAbM11) o anticuerpo anti-MASP-2 humana (mAbOMS646), como se describe en el ejemplo 11;

la figura 18A es un diagrama de supervivencia de Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de supervivencia a lo largo del tiempo después de exposición a 6,5 Gy de radiación en ratones de control y en ratones tratados con anticuerpo anti-MASP-2 murina (mAbM11) o anticuerpo anti-MASP-2 humana (mAbOMS646), como se describe en el ejemplo 11;

la figura 18c es un diagrama de supervivencia de Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de supervivencia a lo largo del tiempo después de exposición a 8,0 Gy de radiación en ratones de control y en ratones tratados con anticuerpo anti-MASP-2 humana (mAbOMS646), como se describe en el ejemplo 11;

la figura 19 ilustra gráficamente los resultados del análisis de resonancia de plasmones superficiales (Biacore) sobre el anticuerpo anti-MASP-2 OMS646 (unidades de respuesta (unión) frente al tiempo en segundos), que muestra que OMS646 inmovilizado se une a MASP-2 recombinante con una velocidad K^off de aproximadamente 1-3 x 10^{' 4} s^_1 y una velocidad K^on de aproximadamente 1,6-3 x 10⁶ M^{' 1} s^-1, como se describe en el ejemplo 12; la figura 20 ilustra gráficamente los resultados de un ensayo ELISA para determinar la afinidad de unión del anticuerpo anti-MASP-2 OMS646 a MASP-2 humana inmovilizada, que muestra que OMS646 se une a MASP-2 humana recombinante inmovilizada con una K^d de aproximadamente 100 pM, como se describe en el ejemplo 12; la figura 21A ilustra gráficamente el nivel de activación de C4 sobre una superficie recubierta con manano en presencia o ausencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646), que demuestra que OMS646 inhibe la activación de C4 sobre una superficie recubierta con manano con una CI⁵⁰ de aproximadamente 0,5 nM en suero humano al 1 %, como se describe en el ejemplo 12;

la figura 21B ilustra gráficamente el nivel de activación de C4 sobre una superficie recubierta con IgG en presencia o ausencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646), que muestra que OMS646 no inhibe la activación dependiente de la ruta clásica del componente C4 del complemento, como se describe en el ejemplo 12;

la figura 22A ilustra gráficamente el nivel de depósito de MAC en presencia o ausencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646) en condiciones de ensayo específicas de la ruta de las lectinas, que demuestra que OMS646 inhibe el depósito de MAC mediado por lectina con un valor de CI⁵⁰ de aproximadamente 1 nM, como se describe en el ejemplo 12;

la figura 22B ilustra gráficamente el nivel de depósito de MAC en presencia o ausencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646) en condiciones de ensayo específicas de la ruta clásica, que muestra que OMS646 no inhibe el depósito de MAC mediado por la ruta clásica, como se describe en el ejemplo 12;

la figura 22C ilustra gráficamente el nivel de depósito de MAC en presencia o ausencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646) en condiciones de ensayo específicas de la ruta alternativa, que demuestra que OMS646 no inhibe el depósito de MAC mediado por la ruta alternativa, como se describe en el ejemplo 12;

la figura 23A ilustra gráficamente el nivel de depósito de C3 en presencia o ausencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646) sobre un intervalo de concentraciones en suero humano al 90 % en condiciones específicas de la ruta de las lectinas, que demuestra que OMS646 bloquea el depósito de C3 en condiciones fisiológicas, como se describe en el ejemplo 12;

la figura 23B ilustra gráficamente el nivel de depósito de C4 en presencia o ausencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646) sobre un intervalo de concentraciones en suero humano al 90 % en condiciones específicas de la ruta de las lectinas, que demuestra que OMS646 bloquea el depósito de C4 en condiciones fisiológicas, como se describe en el ejemplo 12;

la figura 24A ilustra gráficamente el nivel de depósito de C4 en ausencia o presencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646) en suero de macaco cangrejero al 90 % en condiciones específicas de la ruta de las lectinas, que demuestra que OMS646 inhibe el depósito de C4 de la ruta de las lectinas en suero de macaco cangrejero de una manera sensible a la dosis con valores de CI⁵⁰ en el intervalo de 30 a 50 nM, como se describe en el ejemplo 12; y

la figura 24B ilustra gráficamente el nivel de depósito de C4 en ausencia o presencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646) en suero de mono verde africano al 90 % en condiciones específicas de la ruta de las lectinas, que demuestra que OMS646 inhibe el depósito de C4 de la ruta de las lectinas en suero de mono verde africano de una manera sensible a la dosis con valores de CI⁵⁰ en el intervalo de 15 a 30 nM, como se describe en el ejemplo 12.

Descripción del listado de secuencias

SEQ ID NO: 1 ADNc de MASP-2 humano

SEQ ID NO: 2 proteína MASP-2 humana (con líder)

SEQ ID NO: 3 proteína MASP-2 humana (madura)

SEQ ID NO: 4 ADNc de MASP-2 de rata

SEQ ID NO: 5 proteína MASP-2 de rata (con líder)

SEQ ID NO: 6 proteína MASP-2 de rata (madura)

ANTÍGENOS (en referencia a la proteína madura MASP-2 humana)

SEQ ID NO: 7 dominio CUBI de MASP-2 humana (aa 1-121)

SEQ ID NO: 8 dominios CUBI/EGF de MASP-2 humana (aa 1-166)

SEQ ID NO: 9 dominios CUBI/EGF/CUBII de MASP-2 humana (aa 1-277)

SEQ ID NO: 10 dominio EGF de MASP-2 humana (aa 122-166)

SEQ ID NO: 11 dominios CCPI/CCPII/SP de MASP-2 humana (aa 278-671)

SEQ ID NO: 12 dominios CCPI/CCPII de MASP-2 humana (aa 278-429)

SEQ ID NO: 13 dominio CCPI de MASP-2 humana (aa 278-347)

SEQ ID NO: 14 dominio CCPII/SP de MASP-2 humana (aa 348-671)

SEQ ID NO: 15 dominio CCPII de MASP-2 humana (aa 348-429)

SEQ ID NO: 16 dominio SP de MASP-2 humana (aa 429-671)

SEQ ID NO: 17: mutante inactivado de la serina proteasa (aa 610-625 con Ser 618 mutada)

CADENAS VH DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-MASP-2

SEQ ID NO: 18 polipéptido de la región variable de la cadena pesada (VH) de 17D20mc

SEQ ID NO: 19 a Dn que codifica la región variable de la cadena pesada (VH) de 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) (sin péptido señal)

SEQ ID NO: 20 polipéptido de la región variable de la cadena pesada (VH) de 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) SEQ ID NO: 21 polipéptido de la región variable de la cadena pesada (VH) de 17N16mc

CADENAS VL DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-MASP-2

SEQ ID NO: 22 polipéptido de la región variable de la cadena ligera (VL) de 17D20mc

SEQ ID NO: 23 A d N que codifica la región variable de la cadena ligera (VL) de 17D20_dc21N11VL (OMS644) (sin péptido señal) SEQ iD NO: 24 polipéptido de la región variable de la cadena ligera (VL) de 17D20_dc21N11VL (OMS644)

SEQ ID NO: 25 polipéptido de la región variable de la cadena ligera (VL) de 17N16mc

SEQ ID NO: 26 ADN que codifica la región variable de la cadena ligera (VL) de 17N16_dc17N9 (OMS641) (sin péptido señal)

SEQ ID NO: 27 polipéptido de la región variable de la cadena ligera (VL) de 17N16_dc17N9 (OMS641)

CDR DE LA CADENA PESADA DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-MASP-2

SEQ ID NO: 28-31 CDR-H1

SEQ ID NO: 32-35 CDR-H2

SEQ ID NO: 36-40 CDR-H3

CDR DE LA CADENA LIGERA DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-MASP-2

SEQ ID NO: 41-45 CDR-L1

SEQ ID NO: 46-50 CDR-L2

SEQ ID NO: 51-54 CDR-L3

Secuencias de anticuerpo contra MASP-2

SEQ ID NO: 55: polipéptido de longitud completa del clon original de scFv 17D20

SEQ ID NO: 56: polipéptido de longitud completa del clon original de scFv 18L16

SEQ ID NO: 57: polipéptido de longitud completa del clon original de scFv 4D9

SEQ ID NO: 58: polipéptido de longitud completa del clon original de scFv 17L20

SEQ ID NO: 59: polipéptido de longitud completa del clon original de scFv 17N16

SEQ ID NO: 60: polipéptido de longitud completa del clon original de scFv 3F22

SEQ ID NO: 61: polipéptido de longitud completa del clon original de scFv 9P13

SEQ ID NO: 62: Ad N que codifica la región constante de la cadena pesada de IgG4 natural

SEQ ID NO: 63: polipéptido de la región constante de la cadena pesada de IgG4 natural

SEQ ID NO: 64 Ad N que codifica la región constante de la cadena pesada de IgG4 con S228P mutante SEQ ID NO: 65: región constante de la cadena pesada de IgG4 con polipéptido S228P mutante

SEQ ID NO: 66: polipéptido de longitud completa del clon derivado de scFv 17N16m_d17N9

SEQ ID NO: 67: polipéptido de longitud completa del clon derivado de scFv 17D20m_d21N11

SEQ ID NO: 68: polipéptido de longitud completa del clon derivado de scFv 17D20m_d3521N11

SEQ ID NO: 69: Ad N que codifica la región constante de la cadena pesada de IgG2 natural

SEQ ID NO: 70: polipéptido de la región constante de la cadena pesada de IgG2 natural

SEQ ID NO: 71: secuencia génica de la cadena ligera de 17N16m_d17N9 (con péptido señal codificado por nt 1­ 57))

SEQ ID NO: 72: secuencia proteínica de la cadena ligera de 17N16m_d17N9 (con péptido señal aa 1-19) SEQ ID NO: 73: secuencia génica de la cadena pesada de IgG2 17N16m_d17N9 (con péptido señal codificado por nt 1-57)

SEQ ID NO: 74: secuencia proteínica de la cadena pesada de IgG2 17N16m_d17N9 (con péptido señal aa 1-19) SEQ ID NO: 75: secuencia génica de la cadena pesada de IgG4 17N16m_d17N9 (con péptido señal codificado por nt 1-57)

SEQ ID NO: 76: secuencia proteínica de la cadena pesada de IgG4 17N16m_d17N9 (con péptido señal aa 1-19) SEQ ID NO: 77: secuencia génica de la cadena pesada mutada de IgG4 17N16m_d17N9 (con péptido señal codificado por nt 1-57)

SEQ ID NO: 78: secuencia proteínica de la cadena pesada mutada de IgG4 17N17m_d17N9 (con péptido señal aa 1-19)

SEQ ID NO: 79: secuencia génica de la cadena ligera de 17D20_3521N11 (con péptido señal codificado por nt 1­ 57)

SEQ ID NO: 80: secuencia proteínica de la cadena ligera de 17D20_3521N11 (con péptido señal aa 1-19) SEQ ID NO: 81: secuencia génica de la cadena pesada de IgG2 17D20_3521N11 (con péptido señal codificado por nt 1-57)

SEQ ID n O: 82: secuencia proteínica de la cadena pesada de IgG2 17D20_3521N11 (con péptido señal aa 1-19) SEQ ID NO: 83: secuencia génica de la cadena pesada de IgG4 17D20_3521N11 (con péptido señal codificado por nt 1-57)

SEQ ID n O: 84: secuencia proteínica de la cadena pesada de IgG4 17D20_3521N11 (con péptido señal aa 1-19) SEQ ID NO: 85: secuencia génica de la cadena pesada mutada de IgG4 17D20_3521N11 (con péptido señal codificado por nt 1-57)

SEQ ID NO: 86: secuencia proteínica de la cadena pesada mutada de IgG4 17D20_3521N11 (con péptido señal aa 1-19)

SEQ ID NO: 87: ADN que codifica el polipéptido de longitud completa del clon derivado de scFv 17N16m_d17N9 (sin péptido señal)

SEQ iD NO: 88: ADN que codifica el polipéptido de longitud completa del clon derivado de scFv 17D20m_d21N11 (sin péptido señal)

SEQ ID NO: 89: ADN que codifica el polipéptido de longitud completa del clon derivado de scFv 17D20m_d3521N11 (sin péptido señal)

SEQ ID NO: 90: CDR-H3 de la cadena pesada consenso de 17D20m y d3521N11

SEQ ID NO: 91: CDR-L1 de la cadena ligera consenso de 17D20m y d3521N11

SEQ ID NO: 92: CDR-L1 de la cadena ligera consenso de 17N16m y d17N9

SEQ ID NO: 93: CDR-L2 de la cadena ligera consenso de 17D20m, d3521N11, 17N16m y d17N9

SEQ ID NO: 94: CDR-L3 de la cadena ligera consenso de 17N16m y d17N9

Descripción detallada

La presente invención se refiere a anticuerpos completamente humanos que se unen a MASP-2 humana e inhiben la activación del complemento mediada por lectina mientras dejan intacto el componente de la ruta clásica (dependiente de C1q) del sistema inmunitario. Los anticuerpos humanos anti-MASP-2 se han identificado por cribado de una colección de presentación en fagos, como se describe en los ejemplos 2-9. Como se describe en los ejemplos 10-12, se han identificado anticuerpos anti-MASP-2 de alta afinidad con la capacidad de inhibir la activación del complemento mediada por lectina, como se demuestra tanto en ensayos in vitro como in vivo. Los fragmentos variables de la cadena ligera y pesada de los anticuerpos se han asilado tanto en un formato de scFv como en un formato de IgG de longitud completa. Los anticuerpos humanos anti-MASP-2 son útiles para inhibir la lesión celular asociada con la activación de la ruta del complemento mediada por lectina mientras dejan intacto el componente de la ruta clásica (dependiente de C1q) del sistema inmunitario.

I. Definiciones

Salvo que se definan específicamente en este documento, todos los términos usados en este documento tienen el mismo significado que entenderían los expertos en la materia de la presente invención. Se proporcionan las siguientes definiciones para aclarar los términos que se utilizan en la memoria descriptiva y reivindicaciones para describir la presente invención.

Como se usa en este documento, la expresión "activación del complemento dependiente de MASP-2" comprende la activación dependiente de MASP-2 de la ruta de las lectinas, que se produce en condiciones fisiológicas (es decir, en presencia de Ca++) dando lugar a la formación de la C3 convertasa C4b2a de la ruta de las lectinas y, tras la acumulación del producto de escisión de C3, C3b, posteriormente a la C5 convertasa C4b2a(C3b)n.

Como se usa en este documento, la expresión "ruta alternativa" se refiere a la activación del complemento que se activa, por ejemplo, por el cimosano de las paredes celulares de hongos y levaduras, lipopolisacáridos (LPS) de las membranas externas gramnegativas y eritrocitos de conejo, así como de muchos polisacáridos puros, eritrocitos de conejo, virus, bacterias, células tumorales animales, parásitos y células dañadas, y que tradicionalmente se ha creído que surge de la generación proteolítica espontánea de C3b a partir del factor C3 del complemento.

Como se usa en este documento, la expresión "ruta de las lectinas" se refiere a la activación del complemento que se produce mediante la unión específica de las proteínas de unión a hidratos de carbono séricas y no séricas, incluyendo la lectina de unión a manano (MBL), CL-11 y las ficolinas (H-ficolina, M-ficolina, o L-ficolina).

Como se usa en este documento, la expresión "ruta clásica" se refiere a la activación del complemento que se activa por un anticuerpo unido a una partícula exógena y que requiere la unión de la molécula de reconocimiento C1q.

Como se usa en este documento, la expresión "anticuerpo inhibidor de MASP-2" se refiere a cualquier anticuerpo anti-MASP-2, o fragmento de unión a MASP-2 del mismo, que se une a o interactúa directamente con MASP-2 e inhibe de forma eficaz la activación del complemento dependiente de MASP-2. Los anticuerpos inhibidores de MASP-2 útiles en el método de la invención pueden reducir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en más de un 20 %, tal como más de un 30 %, o más de un 40 %, o más de un 50 %, o más de un 60 %, o más de un 70 %, o más de un 80 %, o más de un 90 %, o más de un 95 %.

Como se usa en este documento, la expresión "anticuerpo bloqueante de MASP-2" se refiere a anticuerpos inhibidores de MASP-2 que reducen la activación del complemento dependiente de MASP-2 en más de un 90 %, tal como más de un 95 %, o más de un 98 % (es decir, provocando una activación del complemento de MASP-2 de solamente un 10 %, tal como solamente un 9 %, o solamente un 8 %, o solamente un 7 %, o solamente un 6 %, tal como solamente un 5 % o menos, o solamente un 4 %, o solamente un 4 %, o solamente un 3 % o solamente un 2 % o solamente un 1 %).

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan indistintamente en este documento. Estos términos están bien comprendidos por los expertos del campo, y se refieren a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos que se unen específicamente a un antígeno. Una forma de anticuerpo constituye la unidad estructural básica de un anticuerpo. Esta forma es un tetrámero y consiste en dos pares idénticos de cadenas de anticuerpo, teniendo cada par una cadena ligera y una pesada. En cada par, las regiones variables de la cadena ligera y pesada son responsables conjuntamente de la unión a un antígeno, y las regiones constantes son responsables de las funciones efectoras de los anticuerpos.

Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" abarca anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de los mismos, derivados de cualquier mamífero productor de anticuerpos (por ejemplo, ratón, rata, conejo y primate, incluyendo el ser humano), o de un hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante o animales transgénicos (u otros métodos de producción de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo), que se unen específicamente a polipéptidos MASP-2 o partes de los mismos. No se pretende que el término "anticuerpo" esté limitado con respecto a la fuente del anticuerpo o la forma en que este se genera (por ejemplo, mediante hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante, animal transgénico, síntesis de péptidos, etc.). Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y anticuerpos recombinantes; anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos); anticuerpos humanizados; anticuerpos murinos; anticuerpos monoclonales quiméricos, de ratón-humanos, de ratón-de primate, de primate-humanos; y anticuerpos antidiotípicos, y pueden ser cualquier molécula intacta o fragmento de la misma. Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" abarca no solamente anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos (tales como dAb, Fab, Fab', F(ab')² , Fv), monocatenarios (scFv), variantes sintéticas de los mismos, variantes de origen natural, proteínas de fusión que comprenden una parte de anticuerpo con un fragmento de unión a antígeno de la especificidad requerida, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio o fragmento de unión a antígeno (sitio de reconocimiento de epítopo) de la especificidad requerida.

Como se usa en este documento, la expresión "fragmento de unión a antígeno" se refiere a un fragmento polipeptídico que contiene al menos una CDR de una cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina que se une a MASP-2 humana. A este respecto, un fragmento de unión a antígeno de los anticuerpos descritos en este documento puede comprender 1,2, 3, 4, 5 o las 6 CDR de una secuencia VH y VL expuesta en este documento de anticuerpos que se unen a MASP-2. Un fragmento de unión a antígeno de los anticuerpos específicos para MASP-2 descritos en este documento puede unirse a MASP-2. En determinadas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno, o un anticuerpo que comprende un fragmento de unión a antígeno, media la inhibición de la activación del complemento dependiente de MASP-2.

Como se usa en este documento, la expresión "anticuerpos monoclonales anti-MASP-2" se refiere a una población de anticuerpos homogénea, en la que el anticuerpo monoclonal está compuesto por aminoácidos que están implicados en la unión selectiva de un epítopo en MASP-2. Los anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 son muy específicos para el antígeno diana de MASP-2. La expresión "anticuerpo monoclonal" abarca no solo anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')² , Fv), monocatenarios (scFv), variantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una parte de unión a antígeno, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un fragmento de unión a antígeno (sitio de reconocimiento de epítopo) de la especificidad requerida y la capacidad de unión a un epítopo.

Como se usa en este documento, el modificador "monoclonal" indica la naturaleza del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se pretende que esté limitado en cuanto a la fuente del anticuerpo o la forma en que se genera (por ejemplo, mediante hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante, animales transgénicos, etc.). El término incluye inmunoglobulinas completas, así como los fragmentos, etc., descritos anteriormente en la definición de "anticuerpo". Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo, tal como el método del hibridoma descrito por Kohler, G., et al., Nature 256:495, 1975, o pueden generarse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4.816.567 de Cabilly). Los anticuerpos monoclonales también se pueden aislar a partir de colecciones de anticuerpos en fagos usando las técnicas descritas en Clackson, T., et al., Nature 352:624-628, 1991, y Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas.

Los polipéptidos de inmunoglobulina reconocidos incluyen las cadenas ligeras kappa y lambda light y las cadenas pesadas alfa, gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon y mu o equivalentes en otras especies. Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (de aproximadamente 25 kDa o aproximadamente 214 aminoácidos) comprenden una región variable de aproximadamente 110 aminoácidos en el extremo NH² y una región constante kappa o lambda en el extremo COOH. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (de aproximadamente 50 kDa o aproximadamente 446 aminoácidos) comprenden, asimismo, una región variable (de aproximadamente 116 aminoácidos) y una de las regiones constantes de la cadena pesada mencionadas anteriormente, por ejemplo, gamma (de aproximadamente 330 aminoácidos).

La unidad básica de cuatro cadenas del anticuerpo es una glucoproteína heterotetramérica compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Un anticuerpo IgM consiste en 5 de las unidades heterotetraméricas básicas junto con un polipéptido adicional denominado la cadena J y, por lo tanto, contiene 10 sitios de unión a antígeno. Los anticuerpos IgA secretados pueden polimerizar para formar conjuntos polivalentes que comprenden 2-5 de las unidades básicas de 4 cadenas junto con la cadena J. Cada cadena L se une a una cadena H mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H se unen entre sí mediante uno o más enlaces disulfuro, dependiendo del isotipo de la cadena H. Cada cadena H y L tiene puentes disulfuro intracatenarios a espacios regulares. El emparejamiento de una VH y VL juntas forma un solo sitio de unión a antígeno.

Cada cadena H tiene, en el extremo N, un dominio variable (VH), seguido de tres dominios constantes (CH) por cada de una de las cadenas a y y, y cuatro dominios CH (CH) para los isotipos p y £.

Cada cadena L tiene, en el extremo N, un dominio variable (VL) seguido de un dominio constante (CL) en su otro extremo. La VL se alinea con la VH y la CL se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1). La cadena L de cualquier especie de vertebrado puede asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (k) y lambda (A), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes (CL).

Dependiendo la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH), las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen cadenas pesadas denominadas alfa (a), delta (8), épsilon (£), gamma (y) y mu (p), respectivamente. Las clases Y y a se dividen además en subclases basándose en diferencias secundarias en la secuencia y función de CH, por ejemplo, los seres humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.

Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8.a edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds); Appleton y Lange, Norwalk, Conn., 1994, página 71 y capítulo 6.

El término "variable" se refiere al hecho de que determinados segmentos de los dominios V difieren ampliamente en su secuencia entre anticuerpos. El dominio V media la unión al antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente a lo largo del tramo de 110 aminoácidos de los dominios variables. En su lugar, las regiones V consisten en tramos relativamente invariables denominadas regiones flanqueantes (FR) de 15-30 aminoácidos separadas por regiones más cortas de mucha variabilidad denominadas "regiones hipervariables" que son, cada una, de 9-12 aminoácidos de longitud. Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden, cada uno, cuatro FR, que adoptan en gran parte una configuración de lámina beta, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de, la estructura de lámina beta. La regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en proximidad estrecha por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino que muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

Como se usa en este documento, la expresión "región hipervariable" se refiere a residuos aminoacídicos de un anticuerpos que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable en general comprende residuos aminoacídicos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (es decir, de aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera, y aproximadamente 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada cuando la numeración es de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat como se describe en Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)); y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera, y 26-32 (H1), 52-56 (H2) y 95-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada cuando se numera de acuerdo con el sistema de numeración de Chothia, como se describe en Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); y/o los residuos de un "bucle hipervariable"/CDR (por ejemplo, residuos 27-38 (L1), 56-65 (L2) y 105-120 (L3) en VL, y 27-38 (H1), 56-65 (H2) y 105-120 (H3) en VH cuando se numera de acuerdo con el sistema de numeración de IMGT como se describe en Lefranc, J.P., et al., Nucleic Acids Res 27:209-212; Ruiz, M., et al., Nucleic Acids Res 28:219-221 (2000)).

Como se usa en este documento, la expresión "fragmento de anticuerpo" se refiere a una parte derivada de o relacionada con un anticuerpo anti-MASP-2 de longitud completa, que incluye en general la región de unión a antígeno o variable del mismo. Los ejemplos ilustrativos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab)² , F(ab')² y fragmentos Fv, fragmentos scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenarias, anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Cuando se van a usar anticuerpos biespecíficos, estos pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales, que se pueden fabricar de diversas maneras (Holliger, P. y Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), por ejemplo, preparados químicamente o a partir de hibridomas híbridos, o pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpos biespecíficos mencionados anteriormente.

Como se usa en este documento, un fragmento de anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" comprende los dominios V^h y V^l de un anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. En general, el polipéptido de Fv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios V^h y V^l, que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pág. 269-315 (1994). "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento de y unión al antígeno. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de la cadena pesada y uno de la ligera en estrecha asociación, no covalente. Del plegamiento de estos dos dominios, surgen seis bucles hipervariables (tres bucles de la cadena H y tres de la L) que aportan los residuos aminoacídicos para la unión al antígeno y confieren al anticuerpo la especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

Como se usa en este documento, la expresión "unión específica" se refiere a la capacidad de un anticuerpo de unirse preferentemente a un analito particular que está presente en una mezcla homogénea de diferentes analitos. En determinadas realizaciones, una interacción de unión específica discriminará entre analitos deseables e indeseables en una muestra, en algunas realizaciones más de aproximadamente 10 a 100 veces o más (por ejemplo, más de aproximadamente 1000 o 10000 veces). En determinadas realizaciones, la afinidad entre un agente de captura y un analito, cuando se unen específicamente en un complejo de agente de captura/analito se caracteriza por una K^d (constante de disociación) de menos de aproximadamente 100 nM, o menos de aproximadamente 50 nM, o menos de aproximadamente 25 nM, o menos de aproximadamente 10 nM, o menos de aproximadamente 5 nM, o menos de aproximadamente 1 nM.

Como se usa en este documento, el término anticuerpo anti-MASP-2 "variante" se refiere a una molécula que difiere en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos del anticuerpo "precursor" o de referencia por la adición, eliminación y/o sustitución de uno o más residuos aminoacídicos en la secuencia del anticuerpo precursor. En una realización, un anticuerpo anti-MASP-2 variante se refiere a una molécula que contiene regiones variables que son idénticas a los dominios variables precursores, excepto por un total combinado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones aminoacídicas dentro de las regiones CDR de la región variable de la cadena pesada, y/o hasta un total combinado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones aminoacídicas dentro de dichas regiones CDR de la región variable de la cadena ligera. En algunas realizaciones, las sustituciones aminoacídicas son modificaciones de secuencia conservativas.

Como se usa en este documento, la expresión "anticuerpo precursor" se refiere a un anticuerpo que está codificado por una secuencia de aminoácidos usada para la preparación de la variante. Preferentemente, el anticuerpo precursor tiene una región flanqueante humana y, si está presente, tiene una o más regiones constantes de anticuerpo humano. Por ejemplo, el anticuerpo precursor puede ser un anticuerpo humanizado o completamente humano.

Como se usa en este documento, la expresión "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más de un 95 % en peso de anticuerpo determinado por el método de Lowry, y lo más preferentemente más de un 99 % en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos del extremo N o interna mediante el uso de un secuenciación de cubeta giratoria; o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

Como se usa en este documento, el término "epítopo" se refiere a la parte de un antígeno a la que se une específicamente un anticuerpo monoclonal. Los determinantes epitópicos habitualmente consisten en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas, tales como cadenas laterales de aminoácidos o glucídicas y, habitualmente, tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Más específicamente, la expresión "epítopo de MASP-2", como se usa en este documento, se refiere a una parte del polipéptido correspondiente al que se une inmunoespecíficamente un anticuerpo, como se determina por cualquier método bien conocido en la técnica, por ejemplo, mediante inmunoensayos. No es necesario que los epítopos antigénicos sean inmunógenos. Dichos epítopos pueden ser de naturaleza lineal o pueden ser un epítopo discontinuo. Por tanto, como se usa en este documento, la expresión "epítopo conformacional" se refiere a un epítopo discontinuo formado por una relación espacial entre aminoácidos de un antígeno distinta de una serie ininterrumpida de aminoácidos.

Como se usa en este documento, la expresión "lectina de unión a manano" ("MBL") es equivalente a proteína de unión a manano ("MBP").

Como se usa en este documento, el "complejo de ataque a la membrana" ("MAC") se refiere a un complejo de los cinco componentes del complemento terminal (C5-C9) que se inserta en y altera las membranas. También se denomina C5b-9.

Como se usa en este documento, "un sujeto" incluye todos los mamíferos, incluyendo sin limitación, seres humanos, primates no humanos, perros, gatos, caballos, ovejas, cabras, vacas, conejos, cerdos y roedores.

Como se usa en este documento, los residuos aminoacídicos se abrevian de la siguiente forma: alanina (Ala; A), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), arginina (Arg; R), cisteína (Cys; C), ácido glutámico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).

En el sentido más amplio, los aminoácidos naturales se pueden dividir en grupos según las características químicas de la cadena lateral de los aminoácidos respectivos. Por "aminoácido hidrófobo" se entiende cualquiera de Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys o Pro. Por "aminoácido hidrófilo" se entiende cualquiera de Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg o His. Este agrupamiento de aminoácidos se puede subdividir además de la siguiente forma. Por aminoácido "hidrófilo sin carga" se entiende cualquiera de Ser, Thr, Asn o Gln. Por "aminoácido ácido" se entiende cualquiera de Glu o Asp. Por "aminoácido básico" se entiende cualquiera de Lys, Arg o His.

Como se usa en este documento, la expresión "sustitución de aminoácido conservativa" se ilustra por una sustitución entre aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina y triptófano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina.

Como se usa en este documento, una "molécula de ácido nucleico aislada" es una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un polinucleótido) que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un factor de crecimiento que se ha separado del ADN genómico de una célula es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico sintetizada químicamente que no está integrada en el genoma de un organismo. Una molécula de ácido nucleico que se ha aislado de una especie concreta es más pequeña que la molécula de ADN completa de un cromosoma de esa especie.

Como se usa en este documento, una "construcción de una molécula de ácido nucleico" es una molécula de ácido nucleico, monocatenaria o bicatenaria, que se ha modificado mediante intervención humana para que contenga segmentos de ácido nucleico combinados y yuxtapuestos en una disposición que no existe en la naturaleza.

Como se usa en este documento, un "vector de expresión" es una molécula de ácido nucleico que codifica un gen que se expresa en una célula hospedadora. Típicamente, un vector de expresión comprende un promotor de la transcripción, un gen y un terminador de la transcripción. La expresión génica normalmente se pone bajo el control de un promotor, y se dice que dicho gen está "unido de manera funcional" al promotor. Asimismo, un elemento regulador y un promotor central están unidos de manera funcional si el elemento regulador modula la actividad del promotor central.

Como se usa en este documento, el término "aproximadamente", con referencia a un número, en general se acepta que incluye números que están dentro de un intervalo de un 5 % en cualquier dirección (mayor que o menor que) del número salvo que se indique lo contrario o sea evidente lo contrario por el contexto (excepto cuando dicho número excediera el 100 % de un valor posible). Cuando se indican intervalos, los extremos están incluidos dentro del intervalo salvo que se indique lo contrario o sea evidente lo contrario por el contexto.

Como se usan en este documento, las formas singulares "un/o", "una" y "el/la" incluyen aspectos plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una sola célula, así como dos o más células; la referencia a "un agente" incluye un agente, así como dos o más agentes; la referencia a "un anticuerpo" incluye una pluralidad de dichos anticuerpos y la referencia a "una región flanqueante" incluye la referencia a una o más regiones flanqueantes y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, y así sucesivamente.

En la presente memoria descriptiva, cada realización tiene que aplicarse mutatis mutandis a todas las demás realizaciones, salvo que se indique expresamente lo contrario.

Pueden usarse técnicas convencionales para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Pueden realizarse reacciones enzimáticas y técnicas de purificación de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se consigue normalmente en la técnica o como se describe en este documento. Estas técnicas y procedimientos y relacionados en general pueden realizarse de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan en toda la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2001, "MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL", 3.a ed., "Cold Spring Harbor Laboratory Press", Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Current Protocols in Immunology (editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); u otras publicaciones de Current Protocol relevantes y otras referencias similares. Salvo que se proporcionen definiciones específicas, la terminología utilizada vinculada con, y los procedimientos de laboratorio y las técnicas de, biología molecular, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica que se describen en este documento son los conocidos y comúnmente usados en la técnica. Pueden usarse técnicas convencionales para tecnología recombinante, biología molecular, microbiología, síntesis química, análisis químico, preparación farmacéutica, formulación y suministro y tratamiento de pacientes.

Se contempla que cualquier realización analizada en la presente memoria descriptiva se puede implementar con respecto a cualquier método, kit, reactivo o composición de la invención y viceversa. Además, las composiciones de la invención se pueden usar para conseguir los métodos de la invención.

II. Visión general

Las lectinas (MBL, M-ficolina, H-ficolina, L-ficolina y CL-11) son las moléculas de reconocimiento específicas que activan el sistema del complemento innato y el sistema incluye la ruta de inicio de las lectinas y el bucle de amplificación asociado de la ruta terminal que amplifica la activación iniciada por las lectinas de las moléculas efectoras del complemento terminal. C1q es la molécula de reconocimiento específica que activa el sistema del complemento adquirido y el sistema incluye la ruta de inicio clásica y el bucle de amplificación asociado de la ruta terminal que amplifica la activación iniciada por C1q de las moléculas efectoras del complemento terminal. Estos dos sistemas de activación del complemento principales se denominan el sistema del complemento dependiente de lectinas y el sistema del complemento dependiente de C1q, respectivamente.

Además de su función fundamental en la defensa inmunitaria, el sistema del complemento contribuye al daño de tejidos en muchas situaciones clínicas. Por tanto, existe una necesidad apremiante de desarrollar inhibidores del complemento terapéuticamente eficaces para evitar estos efectos adversos.

Como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 7.919.094, el documento US 2011/0091450 y el documento US2011/0311549, cada uno de ellos adjudicado a Omeros Corporation, el cesionario de la presente solicitud, se determinó mediante el uso de un modelo de ratón MASP-2 -/- que es posible inhibir la ruta de MASP-2 mediada por lectinas mientras deja intacta la ruta clásica. Con el reconocimiento de que es posible inhibir la ruta de MASP-2 mediada por lectinas dejando intacta la ruta clásica se deduce que sería muy deseable inhibir de manera específica solamente el sistema de activación del complemento que provoca una patología particular sin desactivar completamente las capacidades de defensa inmunitaria del complemento. Por ejemplo, en enfermedades en que la activación del complemento está mediada predominantemente por el sistema del complemento dependiente de lectinas, sería ventajoso inhibir de manera específica solamente este sistema. Esto dejaría intacto el sistema de activación del complemento dependiente de C1q para gestionar el procesamiento de inmunocomplejos y ayudar a defender el hospedador contra infecciones.

El componente proteínico preferido a abordar en el desarrollo de agentes terapéuticos para inhibir específicamente el sistema del complemento dependiente de lectinas es MASP-2. De todos los componentes proteínicos conocidos del sistema del complemento dependiente de lectinas (MBL, H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina, MASP-2, C2-C9, Factor B, Factor D y properdina), solo MASP-2 es tanto única para el sistema del complemento dependiente de lectinas como necesaria para el funcionamiento del sistema. Las lectinas (MBL, H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina y CL-11) son también componentes únicos del sistema del complemento dependiente de lectinas. Sin embargo, la pérdida de uno cualquiera de los componentes de lectina no inhibiría necesariamente la activación del sistema debido a la redundancia de las lectinas. Sería necesario inhibir las cinco lectinas para garantizar la inhibición del sistema de activación del complemento dependiente de lectinas. Además, como la MBL y las ficolinas también son conocidas por tener actividad opsonizante independiente del complemento, la inhibición de la función de las lectinas daría como resultado la pérdida de este beneficioso mecanismo de defensa del hospedador contra las infecciones. En cambio, esta actividad opsonizante de las lectinas independiente del complemento permanecería intacta si MASP-2 fuera la diana inhibidora. Una ventaja añadida de MASP-2 como diana terapéutica para inhibir el sistema de activación del complemento dependiente de lectinas es que la concentración en plasma de MASP-2 está entre las más bajas de cualquier proteína del complemento (= 500 ng/ml); por lo tanto, concentraciones consecuentemente bajas de inhibidores de alta afinidad de MASP-2 son suficientes para obtener inhibición completa, como se demuestra en los ejemplos de este documento.

De acuerdo con lo anterior, como se describe en este documento, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales completamente humanos anti-MASP-2 que se unen a MASP-2 humana con alta afinidad y que pueden inhibir la activación de la ruta del complemento mediada por lectina.

III. Anticuerpos inhibidores de MASP-2

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano anti-MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a MASP-2 humana es inhibe o bloquea la activación del complemento dependiente de MASP-2. Los anticuerpos inhibidores de MASP-2 pueden inhibir de manera eficaz o bloquear de manera eficaz el sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2 inhibiendo o bloqueando la función biológica de MASP-2. Por ejemplo, un anticuerpo inhibidor puede inhibir o bloquear de manera eficaz las interacciones entre proteínas de MASP-2, impedir la dimerización o el ensamblaje de MASP-2, bloquear la unión de Ca2+ o interferir en el sitio activo de serina proteasa de MASP-2.

Epítopos de MASP-2

La invención proporciona anticuerpos completamente humanos que se unen específicamente a MASP-2 humana. El polipéptido MASP-2 presenta una estructura molecular similar a la de MASP-1, MASP-3 y C1r y C1s, las proteasas del sistema del complemento C1. La molécula de ADNc expuesta en la SEQ ID NO: 1 codifica un ejemplo representativo de MASP-2 (que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2) y proporciona el polipéptido MASP-2 humano con una secuencias líder (aa 1-15) que se escinde después de la secreción, dando como resultado la forma madura de MASP-2 humana (SEQ ID NO: 3). Como se muestra en la figura 1A, el gen MASP 2 humano abarca doce exones. El ADNc de MASP-2 humana está codificado por los exones B, C, D, F, G, H, I, J, K y L. La molécula de ADNc expuesta en la SEQ ID NO: 4 codifica la MASP-2 de rata (que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5) y proporciona el polipéptido MASP-2 de rata con una secuencia líder que se escinde después de la secreción, dando como resultado la forma madura de MASP-2 de rata (SEQ ID NO: 6).

Los expertos en la materia reconocerán que las secuencias divulgadas en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 4 representan alelos individuales de MASP-2 humana y de rata, respectivamente, y que se espera que se produzca variación alélica y corte y empalme alternativo. Las variantes alélicas de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 4, incluyendo las que contienen mutaciones sinónimas y las que tienen mutaciones que dan como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos, están dentro del alcance de la presente invención. Las variantes alélicas de la secuencia de MASP-2 se pueden clonar sondeando colecciones de ADNc o genómicas procedentes de diferentes individuos de acuerdo con procedimientos convencionales.

Los dominios de la proteína MASP-2 humana (SEQ ID NO: 3) se muestran en la figura 1B y la tabla 1 a continuación, e incluyen el dominio N terminal de C1r/C1s/VEGF de erizo de mar/proteína morfogénica del hueso (CUBI), un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico, un segundo dominio CUB (CUBII), así como un tándem de dominios de proteína de control del complemento CCP1 y CCP2 y un dominio serina proteasa. El corte y empalme alternativo del gen de MASP-2 da como resultado MAp19. MAp19 es una proteína no enzimática que contiene la región N terminal CUB1-EGF de MASP-2 con cuatro residuos adicionales (EQSL).

Se ha demostrado que varias proteínas se unen a o interactúan con MASP-2 mediante interacciones entre proteínas. Por ejemplo, se sabe que la MASP-2 se una a y forma complejos dependientes de Ca2+ con, las proteínas lectinas MBL, H-ficolina y L-ficolina. Se ha demostrado que cada complejo de MASP-2/lectina activa el complemento mediante la escisión dependiente de MASP-2 de las proteínas C4 y C2 (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., et al., J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). Estudios han demostrado que los dominios CUB1-EGF de MASP-2 son esenciales para la asociación de MASP-2 con MBL (Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166:5068, 2001). También se ha demostrado que los dominios CUB1EGFCUBII median la dimerización de MASP-2, que es necesario para la formación de un complejo de MBL activo (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 275:30962-30969, 2000). Por lo tanto, pueden identificarse anticuerpos inhibidores de MASP-2 que se unen a o interfieren en las regiones diana de MASP-2 que se sabe que con importantes para la activación del complemento dependiente de MASP-2.

TABLA 1: Dominios polipeptídicos de MASP-2

En una realización, los anticuerpos inhibidores anti-MASP-2 de la invención se unen a una parte de la proteína MASP-2 humana de longitud completa (SEQ ID NO: 3), tal como CUBI, EGF, CUBII, CCPI, CCPII o el dominio SP de MASP-2. En algunas realizaciones, los anticuerpos inhibidores anti-MASP-2 de la invención se unen a un epítopo en el dominio CCP1 (SEQ ID NO: 13 (aa 278-347 de la SEQ ID NO: 3)). Por ejemplo, se han identificado anticuerpos anti-MASP-2 (por ejemplo, OMS646) que solamente se unen a fragmentos de mAs P-2 que contienen el dominio CCP1 e inhiben la activación del complemento dependiente de MASP-2, como se describe en el ejemplo 9.

Afinidad de unión de anticuerpos inhibidores de MASP-2

Los anticuerpos inhibidores anti-MASP-2 se unen específicamente a MASP-2 humana (expuesta como la SEQ ID NO: 3, codificada por la SEQ ID NO: 1), con una afinidad al menos diez veces mayor que a otros antígenos del sistema del complemento. En algunas realizaciones, los anticuerpos inhibidores de MASP-2 se unen específicamente a MASP-2 humana con una afinidad de unión al menos 100 veces mayor que a otros antígenos del sistema del complemento.

En algunas realizaciones, los anticuerpos inhibidores de MASP-2 se unen específicamente a MASP-2 humana con una K^d (constante de disociación) de menos de aproximadamente 100 nM, o menos de aproximadamente 50 nM, o menos de aproximadamente 25 nM, o menos de aproximadamente 10 nM, o menos de aproximadamente 5 nM, o menos de o igual a aproximadamente 1 nM, o menos de o igual a 0,1 nM. La afinidad de unión de los anticuerpos inhibidores de MASP-2 puede determinarse usando un ensayo de unión adecuado conocido en la técnica, tal como un ensayo ELISA, como se describe en los ejemplos 3-5 de este documento.

Potencia de los anticuerpos inhibidores de MASP-2

En una realización, un anticuerpo inhibidor de MASP-2 es suficientemente potente para inhibir la activación del complemento dependiente de mAs P-2 a una CI⁵⁰ á 30 nM, preferentemente menor de o de aproximadamente 20 nM, o menor de aproximadamente 10 nM o menor de aproximadamente 5 nM, o menor de o igual a aproximadamente 3 nM, o menor de o igual a aproximadamente 1 nM cuando se mide en suero al 1 %.

En una realización, un anticuerpo inhibidor de MASP-2 es suficientemente potente para inhibir la activación del complemento dependiente de mAs P-2 a una CI⁵⁰ á 30 nM, preferentemente menor de o de aproximadamente 20 nM, o menor de aproximadamente 10 nM o menor de aproximadamente 5 nM, o menor de o igual a aproximadamente 3 nM, o menor de o igual a aproximadamente 1 nM, cuando se mide en suero al 90 %.

La inhibición de la activación del complemento dependiente de MASP-2 se caracteriza por al menos uno de los siguientes cambios en un componente del sistema del complemento que se produce como resultado de la administración de un anticuerpo inhibidor de MASP-2: la inhibición de la generación o la producción de los productos del sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2 C4a, C3a, C5a y/o C5b-9 (MAC) (medido, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 2 de la patente de Estados Unidos n.° 7.919.094), así como sus productos de degradación catabólica (por ejemplo, C3desArg), la reducción de la escisión de C4 y el depósito de C4b (medido, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 5) y sus posteriores productos de degradación catabólica (por ejemplo, C4bc o C4d), o la reducción de la escisión de C3 y el depósito de C3b (medido, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 5) o sus posteriores productos de degradación catabólica (por ejemplo, C3bc, C3d, etc.).

En algunas realizaciones, los anticuerpos inhibidores de MASP-2 de la invención pueden inhibir el depósito de C3 en suero completo a menos de un 80 %, tal como menos de un 70 %, tal como menos de un 60 %, tal como menos de un 50 %, tal como menos de un 40 %, tal como menos de un 30 %, tal como menos de un 20 %, tal como menos de un 15 %, tal como menos de un 10 % del depósito de C3 de control.

En algunas realizaciones, los anticuerpos inhibidores de MASP-2 de la invención pueden inhibir el depósito de C4 en suero completo a menos de un 80 %, tal como menos de un 70 %, tal como menos de un 60 %, tal como menos de un 50 %, tal como menos de un 40 %, tal como menos de un 30 %, tal como menos de un 20 %, tal como menos de un 15 %, tal como menos de un 10 % del depósito de C4 de control.

En algunas realizaciones, los anticuerpos inhibidores anti-MASP-2 inhiben selectivamente la activación del complemento de MASP-2 (es decir, se unen a MASP-2 con una afinidad de al menos 100 veces o mayor que a C1r o C1s), dejando funcionalmente intacto el sistema de activación del complemento dependiente de C1q (es decir, se retiene al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o al menos un 95 %, o al menos un 98 %, o un 100 % de la actividad de la ruta clásica).

En algunas realizaciones, los presentes anticuerpos inhibidores anti-MASP-2 tienen las siguientes características: (a) alta afinidad por MASP-2 humana (por ejemplo, una K^d de 10 nM o menos, preferentemente una K^d de 1 nM o menos), y (b) inhiben la actividad del complemento dependiente de MASP-2 en suero humano al 90 % con una CI⁵⁰ de 30 nM o menos, preferentemente una CI⁵⁰ de 10 nM o menos).

Como se describe en los ejemplos 2-12, se han identificado anticuerpos completamente humanos que se unen con alta afinidad a MASP-2 e inhiben la activación del complemento mediada por lectinas mientras dejan intacto el componente de la ruta clásica (dependiente de C1q) del sistema inmunitario. Los fragmentos variables de la cadena ligera y pesada de los anticuerpos se han secuenciado, aislado y analizado tanto en un formato de scFv como en un formato de IgG de longitud completa. La figura 5A es una alineación de secuencias de aminoácidos de siete clones de scFv anti-MASP-2 que se identificaron por tener alta afinidad de unión a MASP-2 y la capacidad de inhibir la actividad dependiente de MASP-2. La figura 5B es una alineación de secuencias de aminoácidos de cuatro de los clones originales de scFv 17D20, 17N16, 18L16 y 4D9, que muestra las regiones flanqueantes y las regiones CDR. Los clones originales de scFv 17D20 y 17N16 se sometieron a maduración de la afinidad, que da lugar a la generación de clones derivados con mayor afinidad y potencia aumentada en comparación con los clones originales, como se describe en los ejemplos 6 y 7. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada (VH) (aa 1-120) y las regiones variables de la cadena ligera (VL) (aa 148-250) de los clones de scFv mostrados en las figuras 5A y 5B y los clones derivados resultantes, se proporcionan a continuación en la tabla 2.

Las posiciones sustituibles de un anticuerpo humano inhibidor anti-MASP-2, así como la elección de aminoácidos que pueden sustituirse en esas posiciones, se revelan alineando las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos inhibidores anti-MASP-2 analizados anteriormente, y determinando los aminoácidos que existen en dichas posiciones de esos anticuerpos. En una realización ejemplar, las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de las figuras 5A y 5B se alinean, y se determina la identidad de los aminoácidos en cada posición de los anticuerpos ejemplares. Como se ilustra en las figuras 5A y 5B (que ilustran los aminoácidos presentes en cada posición de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos inhibidores de MASP-2 ejemplares), varias posiciones sustituibles, así como los residuos aminoacídicos que pueden sustituirse en esas posiciones, se identifican fácilmente. En otra realización ejemplar, las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de los clones originales y derivados se alinean y se determina la identidad de los aminoácidos en cada posición de los anticuerpos ejemplares para determinar las posiciones sustituibles, así como los residuos aminoacídicos que pueden sustituirse en estas posiciones.

TABLA 2: n i ni r ni-MA P-2 r r n iv

continuación

En determinadas realizaciones, un presente anticuerpo monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 tiene un dominio variable de la cadena pesada que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente un 70 %, al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, o al menos aproximadamente un 96 % idéntico, o al menos aproximadamente un 97 % idéntico, o al menos aproximadamente un 98 % idéntico, o al menos un 99 % idéntico), al de cualquiera de las secuencias del dominio variable de la cadena pesada expuestas en la tabla 2.

En algunas realizaciones, un presente anticuerpo monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 tiene un dominio variable de la cadena pesada que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente un 70 %, al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, o al menos aproximadamente un 96 % idéntico, o al menos aproximadamente un 97 % idéntico, o al menos aproximadamente un 98 % idéntico, o al menos un 99 % idéntico) a 17D20 (VH), expuesto como la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, el presente anticuerpo monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 tiene un dominio variable de la cadena pesada que comprende, o consiste en la SEQ ID NO: 18.

En algunas realizaciones, un presente anticuerpo monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 tiene un dominio variable de la cadena pesada que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente un 70 %, al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 % idéntico, al menos aproximadamente un 97 % idéntico, al menos aproximadamente un 98 % idéntico, o al menos un 99 % idéntico) a 17D20_cd35VH2N11 (VH), expuesto como la SEQ ID NO: 20. En algunas realizaciones, el presente anticuerpo monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 tiene un dominio variable de la cadena pesada que comprende, o consiste en la SEQ ID NO: 20.

En algunas realizaciones, un presente anticuerpo monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 tiene un dominio variable de la cadena pesada que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente un 70 %, al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, o al menos aproximadamente un 96 % idéntico, o al menos aproximadamente un 97 % idéntico, o al menos aproximadamente un 98 % idéntico, o al menos un 99 % idéntico) a 17N16 (VH), expuesto como la SEQ ID NO: 21. En algunas realizaciones, el presente anticuerpo monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 tiene un dominio variable de la cadena pesada que comprende, o consiste en la SEQ ID NO: 21.

En algunas realizaciones, un presente anticuerpo monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 tiene un dominio variable de la cadena ligera que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente un 70 %, al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, o al menos aproximadamente un 96 % idéntico, o al menos aproximadamente un 97 % idéntico, o al menos aproximadamente un 98 % idéntico, o al menos un 99 % idéntico), al de cualquiera de las secuencias del dominio variable de la cadena ligera expuestas en la tabla 2.

En algunas realizaciones, un presente anticuerpo monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 tiene un dominio variable de la cadena ligera que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente un 70 %, al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, o al menos aproximadamente un 96 % idéntico, o al menos aproximadamente un 97 % idéntico, o al menos aproximadamente un 98 % idéntico, o al menos un 99 % idéntico) a 17D20 (VL), expuesto como la SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, el presente anticuerpo monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 tiene una cadena ligera que comprende, o consiste en la SEQ ID NO: 22.

En algunas realizaciones, un presente anticuerpo monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 tiene un dominio variable de la cadena ligera que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente un 70 %, al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, o al menos aproximadamente un 96 % idéntico, o al menos aproximadamente un 97 % idéntico, o al menos aproximadamente un 98 % idéntico, o al menos un 99 % idéntico) a 17D20_35VH-21N11VL (VL), expuesto como la SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el presente anticuerpo monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 tiene una cadena ligera que comprende, o consiste en la SEQ ID NO: 24.

En algunas realizaciones, un presente anticuerpo monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 tiene un dominio variable de la cadena ligera que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente un 70 %, al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, o al menos aproximadamente un 96 % idéntico, o al menos aproximadamente un 97 % idéntico, o al menos aproximadamente un 98 % idéntico, o al menos un 99 % idéntico) a 17N16 (VL), expuesto como la SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el presente anticuerpo monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 tiene una cadena ligera que comprende, o consiste en la SEQ ID NO: 25.

En algunas realizaciones, un presente anticuerpo monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 tiene un dominio variable de la cadena ligera que es sustancialmente idéntico (por ejemplo, al menos aproximadamente un 70 %, al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, o al menos aproximadamente un 96 % idéntico, o al menos aproximadamente un 97 % idéntico, o al menos aproximadamente un 98 % idéntico, o al menos un 99 % idéntico) a 17N16_17N9 (VL), expuesto como la SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el presente anticuerpo monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 tiene una cadena ligera que comprende, o consiste en la SEQ ID NO: 27.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-MASP-2 contienen una cadena pesada o ligera que está codificada por una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de alta rigurosidad con una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada o ligera, como se expone en la tabla 2. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen incubación a 50 °C o más en SSC 0,1x (solución salina 15 mM/citrato de sodio 0,15 mM).

En algunas realizaciones, los anticuerpos inhibidores anti-MASP-2 tienen una región variable de la cadena pesada que comprende una o más CDR (CDR1, CDR2 y/o CDR3) que son sustancialmente idénticas (por ejemplo, al menos aproximadamente un 70 %, al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, o al menos aproximadamente un 96 % idénticas, o al menos aproximadamente un 97 % idénticas, o al menos aproximadamente un 98 % idénticas, o al menos aproximadamente un 99 % idénticas), o comprenden o consisten en la secuencia idéntica en comparación con la secuencia de aminoácidos de las CDR de cualquiera de las secuencias variables de la cadena pesada mostradas en las figuras 5A o 5B, o descritas a continuación en las tablas 3A-F y la tabla 4.

En algunas realizaciones, los anticuerpos inhibidores anti-MASP-2 tienen una región variable de la cadena ligera que comprende una o más CDR (CDR1, CDR2 y/o CDR3) que son sustancialmente idénticas (por ejemplo, al menos aproximadamente un 70 %, al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, o al menos aproximadamente un 96 % idénticas, o al menos aproximadamente un 97 % idénticas, o al menos aproximadamente un 98 % idénticas, o al menos aproximadamente un 99 % idénticas), o comprenden o consisten en la secuencia idéntica en comparación con la secuencia de aminoácidos de las CDR de cualquiera de las secuencias variables de la cadena ligera mostradas en las figuras 5A o 5B, o descritas a continuación en las tablas 4A-F y la tabla 5.

Región variable de la cadena pesada

-

A continuación se presentan las secuencias de la región variable de la cadena pesada (VH) para los clones originales y los clones derivados enumerados anteriormente en la tabla 2 y las tablas 3A-F.

Las CDR de Kabat (31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3)) están en negrita; y las CDR de Chothia (26-32 (H1), 52-56 (H2) y 95-101 (H3)) están subrayadas.

Región variable de la cadena pesada (VH) de 17D20 (SEQ ID NO: 18):

O VTLKE S GP VL VKPTETLTLT CT V S GF SLSRGKMG V S WIROPPGKALE WL

AHIFSSDEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNOVVLTMTNMDPVDTATYYCARIRAGG

IDYWGQGTLVTVSS

Región variable de la cadena pesada (VH) de 17D2035VH-21N11VL (SEQ ID NO: 20)

O VTLKE S GPVL VKPTETLTLT CT V S GF SLSRGKMG V S WIROPPGKALE WL

AHIFSSDEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNOVVLTMTNMDPVDTATYYCARIRRGG

IDYWGQGTLVTVSS

Región variable de la cadena pesada (VH) de 17N16 (SEQ ID NO: 21)

OVOLOOSGPGLVKPSOTLSLTCAISGDSVSSTSAAWNWIROSPSRGLEWL

GRTYYRSKWYND YAV S VKSRITINPDTSKNOFSLOLN S VTPEDT AVYY C ARDPF

G VPFDIW GQGTM VT V S S TABLA 4: DR l n

continuación

Regiones variables de la cadena ligera

TABLA A: n ^ li r 1-2

TABLA 5B: Cadena ligera (aa 21-40)

A continuación se presentan las secuencias de la región variable de la cadena ligera (VL) para los clones originales y los clones derivados enumerados anteriormente en la tabla 2 y las tablas 5A-F.

Las CDR de Kabat (24-34 (H1); 50-56 (L2); y 89-97 (L3) están en negrita; y las CDR de Chothia (24-34 (L1); 50-56 (L2) y 89-97 (L3) están subrayadas. Estas regiones son las mismas tanto si se numeran mediante el sistema de Kabat como mediante el sistema de Chothia.

Región variable de la cadena ligera (VL) de 17D20m (SEQ ID NO: 22)

OPVLTOPPSVSVSPGOTASITCSGDKLGDKFAYWYOOKPGHSPVLVIYOD

NKRPSGIPGRFSGSNSGNTATLTISGTOAMDEADYYCOAWDSSTAVFGTGTKVT

VLA

Región variable de la cadena ligera (VL) de 17D20m d3521N11 (SEQ ID NO: 24)

OPVLTOPPSLSVSPGOTASITCSGEKLGDKYAYWYOOKPGOSPVLVMYO

DKORPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTOAMDEADYYCOAWDSSTAVFGGGTKL

TVL

Región variable de la cadena ligera (VL) de 17N16m (SEQ ID NO: 25)

SYVLTOPPSVSVAPGOTARITCGGNNIGSKNVHWYOOKPGOAPVLVVYD

DSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTVSRVEAGDEADYYCOVWDTTTDHVVFGGG

TKLTVLAAAGSEQKLISE

Región variable de la cadena ligera (VL) de 17N16m d17N9 (SEQ ID NO: 27)

SYELIOPPSVSVAPGOTATITCAGDNLGKKRVHWYOORPGOAPVLVIYD

DSDRPSGIPDRFSASNSGNTATLTITRGEAGDEADYYCOVWDIATDHVVFGGGT

KLTVLAAAGSEQKLISE

TABLA : DR l n li r K h hi

continuación

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a MASP-2 humana, que comprende:

(i) una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3; y (ii) una región variable de la cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, en el que la secuencia de CDR-H3 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 90, y modificaciones de secuencia conservativas de la misma, en el que la secuencia de CDR-L3 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 94, y modificaciones de secuencia conservativas de la misma, y en el que el anticuerpo aislado inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-2.

En una realización, la secuencia de CDR-H2 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 32 o 33, y modificaciones de secuencia conservativas de la misma. En una realización, la secuencia de CDR-H1 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29, y modificaciones conservativas de la misma. En una realización, la secuencia de CDR-L2 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 93 y modificaciones conservativas de la misma. En una realización, la secuencia de CDR-L1 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 91 o SEQ ID NO: 92 y modificaciones conservativas de la misma. En una realización, la CDR-H1 de la región variable de la cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 28.

En una realización, la CDR-H2 de la región variable de la cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 32. En una realización, la CDR-H3 de la región variable de la cadena pesada comprende la s Eq ID NO: 90, (como se muestra en la tabla 4). En una realización, la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 90 contiene una R (Arg) en la posición 8.

En una realización, la CDR-L1 de la región variable de la cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 91 (como se muestra en la tabla 6). En una realización, el aminoácido expuesto en la SEQ ID NO: 91 contiene un E (Glu) en la posición 2. En una realización, la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 91 contiene una Y (Tyr) en la posición 8.

En una realización, la CDR-L2 de la región variable de la cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 93 (como se muestra en la tabla 6), y en la que la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 93 contiene una K (Lys) en la posición 2. En una realización, la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 93 contiene una Q (Gln) en la posición 3.

En una realización, la CDR-L3 de la región variable de la cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 51.

En una realización, dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a MASP-2 humana con una K^d de 10 nM o menos. En una realización, dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la activación de C4 en un ensayo in vitro en suero humano al 1 % a una CI⁵⁰ de 10 nM o menos. En una realización, dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la activación de C4 en suero humano al 90 % con una CI⁵⁰ de 30 nM o menos. En una realización, las modificaciones de secuencia conservativas de la misma comprenden o consisten en una molécula que contiene regiones variables que son idénticas al uno o más dominios variables indicados, excepto por un total combinado de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones aminoacídicas dentro de las regiones CDR de la región variable de la cadena pesada, y/o hasta un total combinado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones aminoacídicas dentro de dichas regiones CDR de la región variable de la cadena ligera.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a MASP-2 humana, en el que el anticuerpo comprende: I) (a) una región variable de la cadena pesada que comprende: i) una CDR-H1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 31-35 de la SEQ ID NO: 21; y ii) una CDR-H2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-65 de la SEQ ID NO: 21; y iii) una CDR-H3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 95-102 de la SEQ ID NO: 21; y b) una región variable de la cadena ligera que comprende: i) una CDR-L1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 24-34 de la SEQ iD NO: 25 o SEQ ID NO: 27; y ii) una CDR-L2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-56 de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27; y iii) una CDR-L3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 89-97 de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27; o II) una variante del mismo que por lo demás es idéntico a dichos dominios variables, excepto por hasta un total combinado de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones aminoacídicas dentro de dichas regiones Cd R de dicha región variable de la cadena pesada y hasta un total combinado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones aminoacídicas dentro de dichas regiones c Dr de dicha región variable de la cadena ligera, en el que el anticuerpo o variante del mismo inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-2. En una realización, dicha variante comprende una sustitución aminoacídica en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en la posición 31, 32, 33, 34, 35, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 95, 96, 97, 98, 99, 100 o 102 de dicha región variable de la cadena pesada. En una realización, dicha variante comprende una sustitución aminoacídica en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en la posición 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 51, 52, 89, 92, 93, 95, 96 o 97 de dicha región variable de la cadena ligera. En una realización, la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 21. En una realización, la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 25. En una realización, la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 27.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une a MASP-2 humana, en el que el anticuerpo comprende: I) (a) una región variable de la cadena pesada que comprende: i) una CDR-H1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 31-35 de la SEQ ID NO: 20; y ii) una CDRH-2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-65 de la SEQ ID NO: 20; y iii) una CDR-H3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de 95-102 de la SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20; y b) una región variable de la cadena ligera que comprende: i) una CDR-L1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 24-34 de la SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24; y ii) una CDR-L2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-56 de la SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24; y iii) una CDR-L3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de 89-97 de la SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24; o II) una variante del mismo que por lo demás es idéntico a dichos dominios variables, excepto por hasta un total combinado de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones aminoacídicas dentro de dichas regiones CDR de dicha región variable de la cadena pesada y hasta un total combinado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones aminoacídicas dentro de dichas regiones CDR de dicha región variable de la cadena ligera, en el que el anticuerpo o variante del mismo inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-2. En una realización, dicha variante comprende una sustitución aminoacídica en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en la posición 31, 32, 33, 34, 35, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 95, 96, 97, 98, 99, 100 o 102 de dicha región variable de la cadena pesada. En una realización, dicha variante comprende una sustitución aminoacídica en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en la posición 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 51, 52, 89, 92, 93, 95, 96 o 97 de dicha región variable de la cadena ligera. En una realización, la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 20, o una variante de la misma que comprende al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 20 (por ejemplo, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 20). En una realización, la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 18, o una variante de la misma que comprende al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 18 (por ejemplo, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad con la SEQ iD NO: 18). En una realización, la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 22, o una variante de la misma que comprende al menos un 80 % de identidad con la SEQ Id NO: 22 (por ejemplo, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 22). En una realización, la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 24, o una variante de la misma que comprende al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 24 (por ejemplo, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 24).

En una realización, dicho anticuerpo se une a un epítopo en el dominio CCP1 de MASP-2.

En una realización, dicho anticuerpo se une a MASP-2 humana con una K^d de 10 nM o menos. En una realización, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en un ensayo in vitro en suero humano al 1 % a una CI⁵⁰ de 10 nM o menos. En una realización, dicho anticuerpo inhibe el depósito de C3b en suero humano al 90 % con una CI⁵⁰ de 30 nM o menos.

En una realización, dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, Fab', F(ab)² y F(ab')². En una realización, dicho anticuerpo es una molécula monocatenaria. En una realización, dicho anticuerpo es una molécula de IgG2. En una realización, dicho anticuerpo es una molécula de IgG1. En una realización, dicho anticuerpo es una molécula de IgG4. En una realización, dicha molécula de IgG4 comprende una mutación S228P.

En una realización, dicho anticuerpo no inhibe sustancialmente la ruta clásica (es decir, la actividad de la ruta clásica está al menos un 80 %, o al menos un 90 % o al menos un 95 %, o al menos un 95 % intacta).

En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se disocia de MASP-2 humana con una K^d de 10 nM o menos determinada por resonancia de plasmones superficiales e inhibe la activación de C4 en un sustrato recubierto con manano con una CI⁵⁰ de 10 nM o menos en suero al 1 %. En algunas realizaciones, dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo reconoce específicamente al menos parte de un epítopo reconocido por un anticuerpo de referencia que comprende una región variable de la cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 20 y una región variable de la cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 24, tal como el anticuerpo de referencia OMS646 (véase la tabla 22). De acuerdo con lo anterior, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con determinadas realizaciones preferidas de la presente solicitud puede ser uno que compita por la unión a MASP-2 humana con un anticuerpo descrito en este documento que (i) se une específicamente al antígeno y también (ii) comprende un dominio VH y/o VL divulgado en este documento, o comprende una CDR-H3 divulgada en este documento, o una variante de cualquiera de estos. La competición entre ligandos puede ensayarse fácilmente in vitro, por ejemplo, usando ELISA y/o marcando con una molécula indicadora específica un ligando que se puede detectar en presencia de uno o más ligandos adicionales no marcados, para permitir la identificación de ligandos específicos que se unen al mismo epítopo o un epítopo solapado. Por tanto, se proporciona en el presente documento un anticuerpo específico o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende un sitio de unión a antígeno de anticuerpo humano que compite con un anticuerpo descrito en este documento que se une a MASP-2 humana, tal como uno cualquiera de OMS641 a OMS646 como se expone en la tabla 24, por la unión a MASP-2 humana.

Anticuerpos inhibidores de MASP-2 variantes

Los anticuerpos monoclonales humanos descritos anteriormente pueden modificarse para proporcionar anticuerpos variantes que inhiben la activación del complemento dependiente de MASP-2. Los anticuerpos variantes pueden generarse sustituyendo, añadiendo o eliminando al menos un aminoácido de un anticuerpo monoclonal humano descrito anteriormente. En general, estos anticuerpos variantes tienen las características generales de los anticuerpos humanos descritos anteriormente y contienen al menos las CDR de un anticuerpo humano descrito anteriormente o, en determinadas realizaciones, CDR que son muy similares a las CDR de un anticuerpo humano descrito anteriormente.

En la realización preferida, la variante comprende una o más sustituciones aminoacídicas en una o más regiones hipervariables del anticuerpo precursor. Por ejemplo, la variante puede comprender al menos una, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez, tal como al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 sustituciones, y preferentemente de aproximadamente dos a aproximadamente seis, sustituciones en una o más regiones CDR del anticuerpo precursor. En una realización, dicha variante comprende una sustitución aminoacídica en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en la posición 31, 32, 33, 34, 35, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 95, 96, 97, 98, 99, 100 o 102 de dicha región variable de la cadena pesada. En una realización, dicha variante comprende una sustitución aminoacídica en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en la posición 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 51, 52, 89, 92, 93, 95, 96 o 97 de dicha región variable de la cadena ligera.

En algunas realizaciones, los anticuerpos variantes tienen una secuencia de aminoácidos que por lo demás es idéntica al dominio variable de un presente anticuerpo expuesto en la tabla 2, excepto por hasta un total combinado de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones aminoacídicas dentro de dichas regiones CDR de dicha región variable de la cadena pesada y/o hasta un total combinado de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones aminoacídicas dentro de dichas regiones CDR de dicha región variable de la cadena ligera, en el que el anticuerpo o variante del mismo inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-2.

Normalmente, la variante tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias del dominio variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo precursor, más preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 %, y lo más preferentemente al menos un 95 %, o al menos un 96 %, o al menos un 97 %, o al menos un 98 %, o al menos un 99 % de identidad. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define en este documento como el porcentaje de residuos aminoacídicos en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos del anticuerpo precursor, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Ninguna de las prolongaciones, eliminaciones o inserciones N terminales, C terminales o internas en la secuencia del anticuerpo (tales como, por ejemplo, secuencias de péptido señal, secuencias conectoras o marcas, tales como marcas de HIS) se interpretarán como modificadoras de la identidad u homología de secuencia. La variante retiene la capacidad de unirse a MASP-2 humana y preferentemente tiene propiedades que son superiores a las del anticuerpo precursor. Por ejemplo, la variante puede tener una afinidad de unión más fuerte y/o una capacidad potenciada de inhibir o bloquear la activación del complemento dependiente de MASP-2.

Para analizar dichas propiedades, se debe comparar una forma de Fab de la variante con una forma de Fab del anticuerpo precursor o una forma de longitud completa de la variante con una forma de longitud completa del anticuerpo precursor, por ejemplo, ya que se ha descubierto que el formato del anticuerpo anti-MASP-2 influye en su actividad en los ensayos de actividad biológica divulgados en este documento. El anticuerpo variante de interés particular de este documento es uno que presenta al menos aproximadamente 10 veces, preferentemente al menos aproximadamente 20 veces y lo más preferentemente al menos aproximadamente 50 veces, de potenciación en la actividad biológica cuando se compara con el anticuerpo precursor.

Los anticuerpos de la invención puede modificarse para potenciar propiedades deseables, tal como puede ser deseable para controlar la semivida en suero del anticuerpo. En general, las moléculas de anticuerpo completas tienen un persistencia en suero muy larga, mientras que los fragmentos (< 60-80 kDa) se filtran muy rápidamente a través del riñón. Por tanto, si se desea una acción de larga duración del anticuerpo MASP-2, el anticuerpo contra MASP-2 es preferentemente un anticuerpo IgG completo de longitud completa (tal como IgG2 o IgG4), mientras que si se desea acción más corta del anticuerpo contra MASP-2, puede preferirse un fragmento de anticuerpo. Como se describe en el ejemplo 5, se ha determinado que una sustitución S228P en la región de bisagra de IgG4 aumenta la estabilidad en suero. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el presente anticuerpo contra MASP-2 es un anticuerpo IgG4 de longitud completa con una sustitución S228P.

Anticuerpos monocatenarios

En una realización de la presente invención, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo monocatenario, definido como una molécula genomanipulada que contiene la región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena pesada, unidas por un conector polipeptídico adecuado como una molécula monocatenaria fusionada genéticamente. Dichos anticuerpos monocatenarios también se denominan fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenarios" o "scFv". En general, el polipéptido Fv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL que posibilita que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Los anticuerpos scFv que se unen a MASP-2 pueden orientarse con la región ligera variable en el extremo amínico de la región pesada variable o en el extremo carboxílico de la misma. Se exponen anticuerpos scFv ejemplares en este documento como las SEQ ID NO: 55-61 y las SEQ ID NO: 66-68.

Métodos para producir anticuerpos

En muchas realizaciones, los ácidos nucleicos que codifican un presente anticuerpo monoclonal se introducen directamente en una célula hospedadora, y la célula se incuba en condiciones suficientes para inducir la expresión del anticuerpo codificado.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-MASP-2, o fragmento del mismo, de la invención, tal como un anticuerpo o fragmento del mismo expuesto en la tabla 2. En algunas realizaciones, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 89.

En algunas realizaciones, la invención proporciona una célula que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-MASP-2 de la invención.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un casete de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-MASP-2 de la invención.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un método de producción de anticuerpos anti-MASP-2, que comprende cultivar una célula que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-MASP-2 de la invención.

De acuerdo con determinadas realizaciones relacionadas, se proporciona una célula hospedadora recombinante que comprende una o más construcciones como se describe en este documento; un ácido nucleico que codifica cualquier anticuerpo, CDR, dominio VH o VL, o fragmento de unión a antígeno del mismo; y un método de producción del producto codificado, que es un método que comprende la expresión a partir del ácido nucleico codificante del mismo. La expresión se puede lograr convenientemente cultivando en condiciones apropiadas células hospedadoras recombinantes que contienen el ácido nucleico. Después de la producción por expresión, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede aislarse y/o purificarse usando cualquier técnica adecuada, y después usarse según se desee.

Por ejemplo, puede usarse como célula hospedadora cualquier célula adecuada para la expresión de casetes de expresión, por ejemplo, células de levadura, insecto, vegetales, etc. En muchas realizaciones, se usa una línea de células hospedadoras de mamífero que normalmente no produce anticuerpos, cuyos ejemplos son los siguientes: células de riñón de mono (células COS), células CVI de riñón de mono transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 165 1); células de riñón embrionario humano (HEK-293, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216, (1980); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CVI ATCC Cc L 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC Cr L-1587); células de carcinoma cervicouterino humanas (HELA, ATCC, CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón (Mm T 060562, At Cc CCL 51); células t Ri (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci 383:44-68 (1982)); células NIH/3T3 (ATCC CRL-1658); y células L de ratón (ATCC CCL-1). Llegarán a ser evidentes para los expertos en la materia líneas celulares adicionales. Está disponible una amplia diversidad de líneas celulares en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va.

20110-2209.

Los métodos de introducción de ácidos nucleicos en células son bien conocidos en la técnica. Los métodos adecuados incluyen electroporación, tecnología de cañón de partículas, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa y similares. La elección de método en general depende del tipo de célula que se esté transformando y de las circunstancias en las que esté teniendo lugar la transformación (es decir, in vitro, ex vivo o in vivo). Puede encontrarse un análisis general de estos métodos en Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3.a ed., Wiley & Sons, 1995. En algunas realizaciones, se usan tecnologías de transferencia génica mediada por Lipofectamine y calcio.

Después de haber introducido los presentes ácidos nucleicos en una célula, habitualmente se incuba la célula, normalmente a 37 °C, a veces bajo selección, durante un tiempo adecuado para permitir la expresión del anticuerpo. En la mayoría de las realizaciones, el anticuerpo normalmente se secreta al sobrenadante del medio en que se está cultivando la célula.

En células hospedadoras de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus para expresar un presente anticuerpo. En casos donde se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificante del anticuerpo de interés se puede ligar a un complejo de control de la transcripción/traducción adenovírico, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. A continuación, se puede insertar este gen quimérico en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción de una región no esencial del genoma del virus (por ejemplo, región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y puede expresar la molécula de anticuerpo en hospedadores infectados. (Por ejemplo, véase Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984)). La eficacia de expresión se puede potenciar mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados, terminadores de la transcripción, etc. (Véase Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)).

Para la producción de alto rendimiento, de larga duración de anticuerpos recombinantes, puede usarse expresión estable. Por ejemplo, se pueden diseñar líneas celulares que expresen de forma estable la molécula de anticuerpo. En lugar de usar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación víricos, la células hospedadoras pueden transformarse con casetes de expresión de inmunoglobulina y un marcador de selección. T ras la introducción del ADN exógeno, las células manipuladas pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido y, a continuación, cambiarse a un medio selectivo. El marcador de selección en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en un cromosoma y crezcan hasta formar focos que, a su vez, puedan clonarse y expandirse en líneas celulares. Dichas líneas celulares manipuladas pueden ser particularmente útiles en el cribado y evaluación de compuestos que interactúan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.

Una vez se ha producido una molécula de anticuerpo de la invención, puede purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, de intercambio de iones, de afinidad, particularmente mediante afinidad por el antígeno específico después de la proteína A y cromatografía en columna de exclusión por tamaños), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. En muchas realizaciones, los anticuerpos se secretan de la célula en el medio de cultivo y se recogen del medio de cultivo. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico codificante de un péptido señal puede incluirse adyacente a la región codificante del anticuerpo o fragmento, por ejemplo, como se proporciona en los nucleótidos 1-57 de la SEQ ID NO: 71, que codifican el péptido señal que se proporciona en los aminoácidos 1-19 de la SEQ ID NO: 72. Dicho péptido señal puede incorporarse adyacente al extremo 5' de las secuencias de aminoácidos expuestas en este documento para los presentes anticuerpos para facilitar la producción de los presentes anticuerpos.

Excipientes farmacéuticos y vehículos de administración

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de Ma SP-2, que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humano inhibidor anti-MASP-2 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En general, las composiciones de anticuerpo humano inhibidor de MASP-2 de la presente invención, combinadas con cualquier otro agente terapéutico seleccionado, están contenidas de forma adecuada en un excipiente farmacéuticamente aceptable. El excipiente es atóxico, biocompatible y se selecciona para que no afecte de forma perjudicial a la actividad biológica del anticuerpo inhibidor de MASP-2 (y cualquier otro agente terapéutico combinado con el mismo). Los excipientes farmacéuticamente aceptables ejemplares para polipéptidos se describen en la patente de los Estados Unidos n.° 5.211.657 de Yamada. Los anticuerpos anti-MASP-2 puede formularse en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, de gel, líquidas o gaseosas tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, depósitos, inhalantes e inyecciones para administración oral, parenteral o quirúrgica. La divulgación también contempla la administración local de las composiciones mediante el recubrimiento de dispositivos mecánicos y similares.

Los excipientes adecuados para administración parental mediante inyectables, infusión o irrigación y administración tópica incluyen agua destilada, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer normal o con lactato, solución de dextrosa, solución de Hank o propanodiol. Además, pueden emplearse aceites fijos, estériles como disolvente o un medio de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite biocompatible, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico, encuentran uso en la preparación de inyectables. El excipiente y el agente se pueden formular como un líquido, suspensión, gel polimerizable o no polimerizable, pasta o bálsamo.

El excipiente también puede comprender un vehículo de administración para mantener (es decir, prolongar, retardar o regular) la administración del uno o más agentes o potenciar la administración, captación, estabilidad o farmacocinética del uno o más agentes terapéuticos. Dicho vehículo de administración puede incluir, a modo de ejemplo no limitante, micropartículas, microesferas, nanoesferas o nanopartículas compuestas de proteínas, liposomas, hidratos de carbono, compuestos orgánicos sintéticos, compuestos inorgánicos, hidrogeles poliméricos o copoliméricos y micelas poliméricas. Los sistemas de administración a base de hidrogel y micelas adecuados incluyen los copolímeros PEO:PHB:PEO y complejos de copolímero/ciclodextrina divulgados en el documento WO 2004/009664 A2 y el PEO y complejos de PEO/ciclodextrina divulgados en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2002/0019369 A1. Dichos hidrogeles se pueden inyectar localmente en el sitio de acción previsto, o por vía subcutánea o intramuscular para formar un depósito de liberación mantenida.

Para administración intraarticular, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se puede transportar en los excipientes líquidos o de gel descritos anteriormente que son inyectables, los vehículos de administración mantenida descritos anteriormente que son inyectables, o un ácido hialurónico o derivado de ácido hialurónico.

Para administración intratecal (IT) o intracerebroventricular (ICV), se pueden usar sistemas de administración convenientemente estériles (por ejemplo, líquidos; geles, suspensiones, etc.) para administrar la presente invención.

Las composiciones de la presente invención también pueden incluir excipientes biocompatibles, tales como agentes dispersantes o humectantes, agentes de suspensión, diluyentes, tampones, potenciadores de la penetración, emulsionantes, aglutinantes, espesantes, agentes aromatizantes (para administración oral).

Para conseguir altas concentraciones de anticuerpos anti-MASP-2 para administración local, los anticuerpos pueden formularse como una suspensión de partículas o cristales en solución para su posterior inyección, tal como para inyección intramuscular de un medicamento de absorción lenta.

Más específicamente con respecto a los anticuerpos anti-MASP-2, las formulaciones ejemplares se pueden administrar por vía parenteral como dosis inyectables de una solución o suspensión del compuesto en un diluyente fisiológicamente aceptable con un excipiente farmacéutico que puede ser un líquido estéril tal como agua, aceites, solución salina, glicerol o etanol. Adicionalmente, sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponantes del pH y similares pueden estar presentes en composiciones que comprenden anticuerpos anti-MASP-2. Los componentes adicionales de las composiciones farmacéuticas incluyen petróleo (tal como de origen animal, vegetal o sintético), por ejemplo, aceite de soja y aceite de vaselina. En general, los glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son excipientes líquidos preferidos para soluciones inyectables.

Los anticuerpos anti-MASP-2 también se pueden administrar en forma de una inyección de medicamento de absorción lenta o preparación de implante que se puede formular de tal forma que permita una liberación mantenida o temporalizada de los principios activos.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos inhibidores de MASP-2 se pueden administrar de varias formas dependiendo de si un modo de administración local o sistémico es más apropiado para la afección que se esté tratando. Adicionalmente, como se describe en este documento anteriormente con respecto a los procedimientos de reperfusión extracorpórea, los anticuerpos inhibidores de MASP-2 se pueden administrar mediante la introducción de las composiciones de la presente invención en la sangre o plasma en recirculación. Además, las composiciones de la presente invención se pueden administrar por recubrimiento o incorporación de las composiciones sobre o dentro de un dispositivo médico implantable.

ADMINISTRACIÓN SISTÉMICA

Como se usa en este documento, las expresiones "suministro sistémico" y "administración sistémica" pretenden incluir, aunque no de forma limitante, las vías oral y parenteral que incluyen la intramuscular (IM), subcutánea, intravenosa (IV), intraarterial, por inhalación, sublingual, bucal, tópica, transdérmica, nasal, rectal, vaginal y otras vías de administración que dan como resultado eficaz la dispersión del anticuerpo administrado a uno o varios sitos de acción terapéutica prevista. Las vías preferidas de administración sistémica para las presentes composiciones incluyen la intravenosa, intramuscular, subcutánea y por inhalación. Se apreciará que la vía de administración sistémica exacta para los agentes seleccionados utilizados en las composiciones concretas de la presente invención se determinará en parte para tener en cuenta la susceptibilidad del agente a las rutas metabólicas de transformación asociadas con una vía de administración dada.

Los anticuerpos y polipéptidos inhibidores de MASP-2 se puede administrar a un sujeto que lo necesite por cualquier medio adecuado. Los métodos de administración de anticuerpos y polipéptidos contra MASP-2 incluyen administración por vía oral, pulmonar, parenteral (por ejemplo, inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutánea), por inhalación (tal como mediante una formulación de polvo fino), transdérmica, nasal, vaginal, rectal o sublingual de administración, y pueden formularse en formas farmacéuticas apropiadas para cada vía de administración.

Como ejemplo representativo, los anticuerpos y polipéptidos inhibidores de MASP-2 se pueden introducir en un organismo vivo mediante su aplicación a una membrana del organismo que pueda absorber los polipéptidos, por ejemplo, la membrana nasal, gastrointestinal y rectal. Los polipéptidos se aplican normalmente a la membrana absortiva junto con un potenciador de la penetración. (Véase, por ejemplo, Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5:69, 1988; Lee, V.H.L., J. Controlled Release 13:213, 1990; Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, Nueva York (1991); DeBoer, A.G., et al., J. Controlled Release 13:241, 1990.) Por ejemplo, STDHF es un derivado sintético del ácido fusídico, un tensioactivo esteroideo que tiene una estructura similar a las sales biliares, y que se ha usado como potenciador de la penetración para administración nasal. (Lee, W.A., Biopharm. 22, Nov./Dic.

1990.)

Los anticuerpos y polipéptidos inhibidores de MASP-2 se pueden introducir asociados a otra molécula, tal como un lípido, para proteger los polipéptidos de la degradación enzimática. Por ejemplo, la unión covalente de polímeros, especialmente polietilenglicol (PEG), se ha usado para proteger determinadas proteínas de la hidrólisis enzimática en el organismo y, por tanto, prolongar la semivida (Fuertges, F., et al., J. Controlled Release 11:139, 1990). Se han informado de muchos sistemas poliméricos para la administración de proteínas (Bae, Y.H., et al., J. Controlled Release 9:271, 1989; Hori, R., et al., Pharm. Res. 6:813, 1989; Yamakawa, I., et al., J. Pharm. Sci. 79:505, 1990; Yoshihiro, I., et al., J. Controlled Release 10:195, 1989; Asano, M., et al., J. Controlled Release 9:111, 1989; Rosenblatt, J., et al., J. Controlled Release 9:195, 1989; Makino, K., J. Controlled Release 12:235, 1990; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci.

78:117, 1989; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:219, 1989).

Recientemente, se han desarrollado liposomas con una estabilidad en suero y semividas en circulación mejoradas (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.741.516, de Webb). Además, se han revisado diversos tipos de liposomas y preparaciones similares a liposomas como posibles vehículos de fármacos (véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.567.434, de Szoka; la patente de Estados Unidos n.° 5.552.157, de Yagi; la patente de Estados Unidos n.° 5.565.213, de Nakamori; la patente de Estados Unidos n.° 5.738.868, de Shinkarenko; y la patente de Estados Unidos n.° 5.795.587, de Gao).

Para aplicaciones transdérmicas, los anticuerpos y polipéptidos inhibidores de MASP-2 se pueden combinar con otros ingredientes adecuados, tales como excipientes y/o adyuvantes. No hay limitaciones sobre la naturaleza de dichos otros ingredientes, salvo que deben ser farmacéuticamente aceptables para su administración prevista, y que no pueden degradar la actividad de los principios activos de la composición. Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen pomadas, cremas, geles o suspensiones, con o sin colágeno purificado. Los anticuerpos y polipéptidos inhibidores de MASP-2 también se pueden impregnar sobre parches transdérmicos, esparadrapos y vendas, preferentemente en forma líquida o semilíquida.

Las composiciones de la presente divulgación se pueden administrar sistémicamente de forma periódica a intervalos determinados para mantener un nivel deseado de efecto terapéutico. Por ejemplo, las composiciones se pueden administrar, tal como mediante inyección subcutánea, cada dos a cuatro semanas o en intervalos menos frecuentes. El médico determinará la pauta posológica teniendo en cuenta diversos factores que pueden afectar a la acción de la combinación de agentes. Estos factores incluirán el alcance del progreso de la afección que se esté tratando, la edad del paciente, el sexo y el peso, y otros factores clínicos. La dosificación para cada agente individual variará como una función del anticuerpo contra MASP-2 que esté incluido en la composición, así como de la presencia y la naturaleza de cualquier vehículo de administración de fármaco (por ejemplo, un vehículo de administración de liberación mantenida). Además, la cantidad de dosificación se puede ajustar para tener en cuenta la variación en la frecuencia de administración y el comportamiento farmacocinético del uno o más agentes administrados.

ADMINISTRACIÓN LOCAL

Como se usa en este documento, el término "local" abarca la aplicación de un fármaco en o cerca de un sitio de acción localizado previsto y puede incluir, por ejemplo, la administración tópica en la piel u otros tejidos afectados, administración oftálmica, intratecal (IT), intracerebroventricular (ICV), intraarticular, intracavitaria, intracraneal o administración intravesicular, colocación o irrigación. Puede preferirse la administración local para permitir la administración de una dosis más baja, para evitar efectos secundarios sistémicos y para un control más preciso del momento de liberación y de la concentración de los principios activos en el sitio de administración local. La administración local proporciona una concentración conocida en el sitio diana, independientemente de la variabilidad del metabolismo entre los pacientes, el flujo sanguíneo, etc. El modo de administración directo también proporciona un control mejorado de la dosificación.

Puede conseguirse administración local de un anticuerpo inhibidor de MASP-2 en el contexto de métodos quirúrgicos para tratar una enfermedad o afección, tal como, por ejemplo, durante procedimientos tales como cirugía de derivación arterial, ateroctomía, procedimientos con láser, procedimientos ultrasónicos, angioplastia con balón y colocación de stent. Por ejemplo, se puede administrar un inhibidor de MASP-2 a un sujeto con un procedimiento de angioplastia con globo. Un procedimiento de angioplastia con globo implica insertar un catéter que tiene un globo desinflado en una arteria. El globo desinflado se coloca en proximidad a la placa ateroesclerótica y se infla de tal manera que la placa se comprime contra la pared vascular. Como resultado, la superficie del globo está en contacto con la capa de células endoteliales vasculares en la superficie del vaso sanguíneo. El anticuerpo inhibidor de MASP-2 puede unirse al catéter de angioplastia con globo de una manera que permita la liberación del agente en el sitio de la placa ateroesclerótica. El agente puede unirse al catéter de globo de acuerdo con procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, el agente puede almacenarse en un compartimento del catéter de globo hasta que el globo se infla, momento en el que se libera en el entorno local. Como alternativa, el agente puede impregnarse en la superficie del globo, de tal manera que entra en contacto con las células de la pared arterial a medida que el globo se infla. El agente también puede administrarse en un catéter de globo perforado tal como los divulgados en Flugelman, M.Y., et al., Circulation 85:1110-1117, 1992. Véase también la solicitud PCT WO 95/23161 de un procedimiento ejemplar para unir una proteína terapéutica a un catéter de angioplastia con globo. Asimismo, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 puede incluirse en un gel o recubrimiento polimérico aplicado a un stent, o puede incorporarse en el material del stent, de modo que el stent eluya el anticuerpo inhibidor de MASP-2 después de su colocación vascular.

Pautas de tratamiento

Las composiciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 usadas en el tratamiento de las artritis y otros trastornos musculoesqueléticos pueden administrarse localmente mediante inyección intraarticular. Dichas composiciones pueden incluir de forma adecuada un vehículo de administración de liberación mantenida. Como ejemplo adicional de casos en los que puede desearse la administración local, las composiciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 usadas en el tratamiento de las afecciones urogenitales pueden instilarse de forma adecuada intravesicalmente o en otra estructura urogenital.

En aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto susceptible de, o de otra forma en riesgo de, una afección asociada con la activación del complemento dependiente de MASP-2 en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo de desarrollar los síntomas de la afección. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto con sospecha de, o que ya padece, una afección asociada con la activación del complemento dependiente de MASP-2 en una cantidad terapéuticamente eficaz suficiente para aliviar o al menos reducir parcialmente, los síntomas de la afección. En pautas profilácticas y terapéuticas, se pueden administrar composiciones que comprenden anticuerpos inhibidores de MASP-2 en varias dosificaciones hasta que se ha conseguido un resultado terapéutico suficiente en el sujeto. La aplicación de las composiciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de la presente invención puede llevarse a cabo mediante una sola administración de la composición, o una secuencia limitada de administraciones, para el tratamiento de una afección aguda, por ejemplo, lesión por reperfusión u otra lesión traumática. Como alternativa, la composición puede administrarse a intervalos periódicos durante un periodo prolongado de tiempo para el tratamiento de afecciones crónicas, por ejemplo, artritis o psoriasis.

Las composiciones inhibidoras de MASP-2 usadas en la presente invención pueden administrarse inmediatamente o poco después de un episodio agudo que provoca la activación de la ruta de las lectinas, tal como después de un episodio isquémico y reperfusión del tejido isquémico. Los ejemplos incluyen reperfusión de miocardio posterior a isquemia, reperfusión renal posterior a isquemia, reperfusión cerebral posterior a isquemia, trasplante de órganos y reimplante de dedos o extremidades. Otros ejemplos agudos incluyen síndrome séptico. Una composición inhibidora de MASP-2 de la presente invención puede administrarse lo antes posible después de un episodio agudo que activa la ruta de las lectinas, preferentemente a las doce horas y más preferentemente a las dos a tres horas de un suceso activador, tal como mediante la administración sistémica de la composición inhibidora de MASP-2.

Los métodos y composiciones de la presente invención pueden usarse para inhibir la inflamación y los procesos relacionados que normalmente son el resultado de procedimientos médicos de diagnóstico y terapéuticos y quirúrgicos. Para inhibir dichos procesos, la composición inhibidora de MASP-2 de la presente invención puede aplicarse periprocedimentalmente. Como se usa en este documento, "periprocedimentalmente" se refiere a la administración de la composición inhibidora preprocedimentalmente y/o intraprocedimentalmente y posprocedimentalmente, es decir, antes del procedimiento, antes y durante el procedimiento, antes y después del procedimiento, antes, durante y después del procedimiento, durante el procedimiento, durante y después del procedimiento, o después del procedimiento. La aplicación periprocedimental puede llevarse a cabo mediante la administración local de la composición en el sitio quirúrgico o procedimental, tal como mediante inyección o irrigación continua o intermitente del sitio o mediante administración sistémica. Los métodos adecuados para la administración perioperatoria local de las soluciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 se divulgan en las patentes de Estados Unidos n.° 6.420.432 de Demopulos y 6.645.168 de Demopulos. Los métodos adecuados para la administración local de composiciones condroprotectoras que incluyen anticuerpos inhibidores de MASP-2 se divulgan en la solicitud de patente PCT internacional WO 01/07067 A2. Los métodos y composiciones adecuadas para la administración sistémica dirigida de composiciones condroprotectoras que incluyen anticuerpos inhibidores de MASP-2 se divulgan en la solicitud de patente PCT internacional WO 03/063799 A2.

Dosificaciones

Los anticuerpos inhibidores de MASP-2 se pueden administrar a un sujeto que lo necesita, en dosis terapéuticamente eficaces para tratar o mejorar las afecciones asociadas con la activación del complemento dependiente de MASP-2. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad del anticuerpo inhibidor de MASP-2 suficiente para provocar la mejora de los síntomas de la afección.

La toxicidad y eficacia terapéutica de los anticuerpos inhibidores de MASP-2 se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales empleando modelos animales experimentales, tales como el mono verde africano, como se describe en este documento. Usando dichos modelos animales, se pueden determinar el NOAEL (nivel de efectos adversos no observados) y la MED (la dosis mínimamente eficaz, ambos por sus singlas en inglés) usando métodos convencionales. La relación de dosis entre el NOAEL y la MED es el índice terapéutico, que se expresa como el cociente NOAEL/MED. Los anticuerpos inhibidores de MASP-2 que presentan cocientes o índices terapéuticos grandes son los más preferidos. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y de estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación del anticuerpo inhibidor de MASP-2 preferentemente está dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluye la MED con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la vía de administración utilizada.

Para cualquier formulación de compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar usando modelos animales. Por ejemplo, se puede formular una dosis en un modelo animal para conseguir una concentración en plasma en circulación que incluya la MED. También pueden medirse los niveles cuantitativos del anticuerpo inhibidor de MASP-2 en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento.

Además de los estudios de toxicidad, la dosificación eficaz también se puede estimar dependiendo de la cantidad de proteína MASP-2 presente en un sujeto vivo y la afinidad de unión del anticuerpo inhibidor de MASP-2. Se ha demostrado que los niveles de MASP-2 en sujetos humanos normales presentes en suero son bajos, en el intervalo de 500 ng/ml, y los niveles de MASP-2 en un sujeto concreto se pueden determinar usando un ensayo cuantitativo para MASP-2 descrito en Moller-Kristensen M., et al., J. Immunol. Methods 282:159-167, 2003.

En general, la dosificación de las composiciones administradas que comprenden anticuerpos inhibidores de MASP-2 varía dependiendo de factores tales como la edad del sujeto, el peso, la estatura, el sexo, el estado médico general y los antecedentes médicos previos. Como ilustración, los anticuerpos inhibidores de MASP-2, se pueden administrar en intervalos de dosificación de aproximadamente 0,010 a 10,0 mg/kg, preferentemente de 0,010 a 1.0 mg/kg, más preferentemente de 0,010 a 0,1 mg/kg del peso corporal del sujeto.

La eficacia terapéutica de las composiciones inhibidoras de MASP-2 y los métodos de la presente divulgación en un sujeto dado, y las dosificaciones adecuadas, se pueden determinar de acuerdo con ensayos del complemento bien conocidos por los expertos en la materia. El complemento genera numerosos productos específicos. En la última década, se han desarrollado ensayos sensibles y específicos que están disponibles en el mercado para la mayoría de estos productos de activación, incluyendo los fragmentos activación pequeños C3a, C4a y C5a y los fragmentos de activación grandes iC3b, C4d, Bb y sC5b-9. La mayoría de estos ensayos utiliza anticuerpos que reaccionan con antígenos nuevos (neoantígenos) expuestos sobre el fragmento, pero no sobre las proteínas naturales a partir de las que se forman, haciendo que estos ensayos sean muy simples y específicos. La mayoría se basan en tecnología ELISA, aunque todavía se usa radioinmunoensayo en ocasiones para C3a y C5a. Estos últimos ensayos miden tanto los fragmentos sin procesar como sus fragmentos "desArg", que son las formas principales que aparecen en circulación. Los fragmentos sin procesar y el C5adesArg se depuran rápidamente por unión a los receptores de superficie celular y, por tanto, están presentes en concentraciones muy bajas, mientras que C3adesArg no se une a las células y se acumula en el plasma. La medición de C3a proporciona un indicador sensible independiente de la ruta de activación del complemento. La activación de la ruta alternativa se puede evaluar midiendo el fragmento Bb. La detección del producto de activación de la ruta de ataque a la membrana en fase líquida, sC5b-9, proporciona evidencias de que el complemento se ha activado hasta su finalización. Puesto que tanto la ruta de las lectinas como la ruta clásica generan los mismos productos de activación, C4a y C4d, la medición de estos dos fragmentos no proporciona ninguna información sobre la ruta, entre estas dos, que ha generado los productos de activación.

La inhibición de la activación del complemento dependiente de MASP-2 se caracteriza por al menos uno de los siguientes cambios en un componente del sistema del complemento que se produce como resultado de la administración de un anticuerpo anti-MASP-2 de acuerdo con la presente invención: la inhibición de la generación o la producción de los productos del sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2 C4b, C3a, C5a y/o C5b-9 (MAC), la reducción de la escisión de C4 y el depósito de C4b, o la reducción de la escisión de C3 y el depósito de C3b.

Artículos de fabricación

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un artículo de fabricación que contiene un anticuerpo inhibidor de MASP-2 humana, o fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe en este documento, en una forma farmacéutica unitaria adecuada para administración terapéutica a un sujeto humano, tal como, por ejemplo, una dosificación unitaria en el intervalo de 1 mg a 5000 mg, tal como de 1 mg a 2000 mg, tal como de 1 mg a 1000 mg, tal como 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 500 mg o 1000 mg. En algunas realizaciones, el artículo de fabricación comprende un envase y una etiqueta o prospecto sobre o asociado al envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, etc. Los envases pueden formarse a partir de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El envase aloja una composición que es eficaz para el tratamiento de la afección y puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un principio activo en la composición es un anticuerpo inhibidor de MASP-2 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección particular. La etiqueta o prospecto comprenderá además instrucciones para administrar la composición de anticuerpo al paciente. También se contemplan artículos de fabricación y kits que comprenden tratamientos combinados descritos en este documento.

Usos terapéuticos de los anticuerpos inhibidores anti-MASP-2

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método de inhibición de la activación del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto humano, que comprende administrar un anticuerpos monoclonal humano inhibidor anti-MASP-2 de la invención en una cantidad suficiente para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en dicho sujeto humano.

De acuerdo con este aspecto de la invención, como se describe en el ejemplo 10, los anticuerpos inhibidores de MASP-2 de la presente invención pueden inhibir la ruta de las lectinas en monos verdes africanos después de administración intravenosa. Como se muestra en la tabla 24, ejemplo 8, el anticuerpo usado en este estudio, OMS646, se descubrió que era más potente en suero humano. Como saben los expertos en la materia, a menudo se usan primates no humanos como modelo para evaluar anticuerpos terapéuticos.

Como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 7.919.094, la solicitud de patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente, con n.° de serie 13/083441, y la solicitud de patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente, con n.° de serie 12/905972 (cada una de ellas adjudicada a Omeros Corporation, el cesionario de la presente solicitud), la activación del complemento dependiente de MASP-2 se ha implicado como participante en la patogenia de numerosas enfermedades agudas y crónicas, incluyendo la afección vascular mediada por el complemento dependiente de MASP-2, una lesión por reperfusión posterior a isquemia, ateroesclerosis, trastorno gastrointestinal inflamatorio, una afección pulmonar, un procedimiento de reperfusión extracorpórea, una afección musculoesquelética, una afección renal, una afección de la piel, un trasplante de órgano o tejido, trastorno o lesión del sistema nervioso, un trastorno hemático, una afección urogenital, diabetes, quimioterapia o radioterapia, neoplasia, un trastorno endocrino, un trastorno de la coagulación o una afección oftálmica. Por lo tanto, los anticuerpos inhibidores de MASP-2 de la presente invención pueden usarse para tratar las enfermedades y afecciones mencionadas anteriormente.

Como se describe adicionalmente en el ejemplo 11, los anticuerpos inhibidores de MASP-2 de la presente invención son eficaces en el tratamiento de un sujeto mamífero en riesgo de, o que padece, los efectos perjudiciales del síndrome por radiación aguda, demostrando de este modo la eficacia terapéutica in vivo.

Los siguientes ejemplos ilustran simplemente el mejor modo previsto para llevar a la práctica la invención, pero no deben considerarse como una limitación de la invención.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la expresión recombinante y la producción de proteína de MASP-2 recombinante de longitud completa humana, de rata y murina, polipéptidos derivados de MASP-2 y formas mutantes de MASP-2 catalíticamente inactivadas.

Expresión de MASP-2 de longitud completa humana y de rata:

La secuencia de ADNc de longitud completa de MASP-2 humana (SEQ ID NO: 1), que codifica el polipéptido MASP-2 humano con la secuencia líder (SEQ ID NO: 2) se subclonó en el vectores de expresión de mamífero pCI-Neo (Promega), que dirige la expresión eucariota bajo el control de la región potenciadora/promotora de CMV (descrita en Kaufman R.J. et al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)). El ADNc de longitud completa de MASP-2 de rata (SEQ ID NO: 4), que codifica el polipéptido Ma SP-2 de rata con la secuencia líder (SEQ ID NO: 5) se subclonó en el vector de expresión pED. Los vectores de expresión de MASP-2 se transfectaron entonces en la línea de células de ovario de hámster chino DXB1 adherente usando el procedimiento convencional de transfección con fosfato de calcio descrito en Maniatis et al., 1989. Las células transfectadas con estas construcciones crecieron muy lentamente, lo que implica que la proteasa codificada es citotóxica. La forma madura de la proteína MASP-2 humana (SEQ ID NO: 3) y la forma madura de la proteína MASP-2 de rata (SEQ ID NO: 6) se secretaron al medio de cultivo y se aislaron como se describe a continuación.

Expresión de MASP-2 de longitud completa catalíticamente inactiva:

Fundamento:

La MASP-2 se activa por escisión autocatalítica después del reconocimiento de los subcomponentes MBL, lectina de tipo C CL-11 o ficolinas (L-ficolina, H-ficolina o M-ficolina), denominadas colectivamente lectinas, se une a su patrón de hidratos de carbono respectivo. La escisión autocatalítica que da como resultado la activación de MASP-2 se produce a menudo durante el procedimiento de aislamiento de MASP-2 del suero, o durante la purificación tras la expresión recombinante. Para obtener una preparación de la proteína más estable para su uso como un antígeno, se creó una forma catalíticamente inactiva de MASP-2, denominada MASP-2A, remplazando el residuo de serina que está presente en la tríada catalítica del dominio proteasa con un residuo de alanina en la proteína MASP-2 de rata madura (SEQ ID NO: 6 Ser617 a Ala617); o en la proteína MASP-2 humana madura (SEQ ID NO: 3 Ser618 a Ala618).

Para generar proteínas MASP-2A humanas y de rata catalíticamente inactivas, se llevó a cabo mutagénesis dirigida al sitio como se describe en el documento US2007/0172483, incorporado en este documento por referencia. Los productos de PCR se purificaron tras la electroforesis en gel de agarosa y la preparación de las bandas y se generaron salientes de adenosinas individuales usando un procedimiento de prolongación convencional. A continuación, se clonó la MASP-2A con prolongación de adenosina en el vector pGEM-T easy, se transformó en E. coli. La MASP-2A humana y la de rata se subclonaron cada una adicionalmente en los vectores de expresión de mamífero pED o pCI-Neo y se transfectaron en la línea de células de ovario de hámster chino DXB1 como se describe a continuación.

Construcción de plásmidos de expresión que contienen regiones polipeptídicas derivadas de Masp-2 humana.

Se produjeron las siguientes construcciones usando el péptido señal de MASP-2 (residuos 1-15 de la SEQ ID NO: 2) para secretar diversos dominios de MASP-2. Una construcción que expresaba el dominio CUBI (SEQ ID NO: 7) de MASP-2 humana se generó amplificando por PCR la región codificante de los residuos 1-121 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (correspondientes al dominio CUB1 del extremo N). Una construcción que expresaba el dominio CUBI/EGF (SEQ ID NO: 8) de MASP-2 humana se generó amplificando por PCR la región codificante de los residuos 1-166 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (correspondientes al dominio CUBI/EGF del extremo N). Una construcción que expresaba el dominio Cu BI/EGF/CUBII (SEQ ID NO: 9) de MASP-2 human se generó amplificando por PCR la región codificante de los residuos aa 1-277 de MASP-2 (Se Q ID NO: 3) (correspondientes al dominio Cu B i/EGF/CUBII del extremo N). Una construcción que expresaba el dominio EGF (SEQ ID NO: 10) de MASP-2 humana se generó amplificando por PCR la región codificante de los residuos aa 122-166 de MASP-2 (Se Q ID NO: 3) (correspondientes al dominio EGF). Una construcción que expresaba los dominios CCPI/CCPII/SP (SEQ ID NO: 11) de Ma SP-2 humana se generó amplificando por PCR la región codificante de los residuos aa 278-671 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (correspondientes a los dominios CCPI/CCPII/SP). Una construcción que expresaba los dominios Cc PI/CCPII (SEQ ID No : 12) de MASP-2 humana se generó amplificando por PCR la región codificante de los residuos aa 278-429 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (correspondientes a los dominios CCPI/CCPII). Una construcción que expresaba el dominio CCPI de MASP-2 (SEQ ID NO: 13) se generó amplificando por PCR la región codificante de los residuos aa 278-347 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (correspondientes al dominio CCPI). Una construcción que expresaba los dominios CCPII/SP de MASP-2 (SEQ ID NO: 14) se generó amplificando por Pc R la región codificante de los residuos aa 348-671 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (correspondientes a los dominios CCPII/SP). Una construcción que expresaba el dominio CCPII de MASP-2 (SEQ iD NO: 15) se generó amplificando por PCR la región codificante de los residuos aa 348-429 de MASP-2 (SEQ ID NO: 3) (correspondientes al dominio CCPII). Una construcción que expresaba el dominio SP de MASP-2 (SEQ ID NO: 16) se generó amplificando por PCR la región codificante de los residuos aa 429-671 de MASP-2 (SEQ iD NO: 3) (correspondientes al dominio SP).

Los dominios de MASP-2 mencionados anteriormente se amplificaron por PCR usando la polimerasa VentR y pBS-MASP-2 como molde, de acuerdo con métodos de PCR establecidos. La secuencia del cebador 5' del cebador de sentido introdujo un sitio de restricción BamHI (subrayado) en el extremo 5' de los productos de PCR. Los cebadores de antisentido para cada uno de los dominios de MASP-2 se diseñaron para introducir un codón de parada seguido de un sitio EcoRI en el extremo de cada producto de PCR. Una vez amplificados, los fragmentos de a Dn se digirieron con BamHI y EcoRI y se clonaron en los sitios correspondientes del vector pFastBac1. Las construcciones resultantes se caracterizaron mediante cartografía de restricción y se confirmaron mediante secuenciación del ADNbc.

Expresión eucariota recombinante de MASP-2 y producción de proteína de MASP-2A de rata y humana enzimáticamente inactiva.

Las construcciones de expresión de MASP-2 y MASP-2A descritas anteriormente se transfectaron en células DXB1 usando el procedimiento convencional de transfección con fosfato de calcio (Maniatis et al., 1989). Se produjo MASP-2A en medio sin suero para garantizar que las preparaciones no estuvieran contaminadas con otras proteínas séricas. Se recogieron los medios de células confluyentes cada dos días (cuatro veces en total). El nivel de MASP-2A recombinante promedió aproximadamente 1,5 mg/litro de medio de cultivo para cada una de las dos especies.

Purificación de la proteína MASP-2A: Se purificó MASP-2A (mutante Ser-Ala descrito anteriormente) mediante cromatografía de afinidad en columnas de MBP-A-agarosa. Esta estrategia permitió una rápida purificación sin el uso de marcas exógenas. La MASP-2A (100-200 ml de medio diluido con un volumen igual de tampón de carga (Tris-Cl 50 mM, pH 7,5, que contenía NaCl 150 mM and CaCb 25 mM) se cargó en una columna de afinidad de MBP-agarosa (4 ml) preequilibrada con 10 ml de tampón de carga. Después de lavar con 10 ml más de tampón de carga, la proteína se eluyó en fracciones de 1 ml con Tris-Cl 50 mM, pH 7,5, que contenía NaCl 1,25 M y EDTA 10 mM. Las fracciones que contenían MASP-2A se identificaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Cuando era necesario, la MASP-2A se purificó adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico en una columna MonoQ (HR 5/5). La proteína se dializó con Tris-Cl 50 mM pH 7,5, que contenía NaCl 50 mM y se cargó en la columna equilibrada con el mismo tampón. Tras lavar, la MASP-2A unida se eluyó con un gradiente de NaCl de 0,05-1 M sobre 10 ml.

Resultados: Se obtuvieron rendimientos de 0,25-0,5 mg de proteína MASP-2A a partir de 200 ml de medio. La masa molecular de 77,5 kDa determinada mediante MALDI-MS es mayor que el valor calculado del polipéptido sin modificar (73,5 kDa) debido a la glucosilación. La unión de glucanos en cada uno de los sitios de W-glucosilación representa la masa observada. La MASP-2A migra como una sola banda en geles de poliacrilamida-SDS, lo que demuestra que no se procesa proteolíticamente durante la biosíntesis. La masa molecular promedio en peso determinada mediante ultracentrifugación en equilibrio está de acuerdo con el valor calculado para los homodímeros del polipéptido glucosilado.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe el método de cribado usado para identificar candidatos de anticuerpo scFv completamente humano anti-MASP-2 de alta afinidad que bloqueen la actividad funcional de MASP-2 para su progresión a la maduración de la afinidad.

Antecedentes y fundamento:

La MASP-2 es una proteína completa con muchos dominios funcionales separados, incluyendo: uno o más sitios de unión para MBL y ficolinas, un sitio catalítico serina proteasa, un sitio de unión para el sustrato proteolítico C2, un sitio de unión para el sustrato proteolítico C4, un sitio de escisión de MASP-2 para la autoactivación del zimógeno MASP-2, y dos sitios de unión a Ca++. Se identificaron fragmentos de anticuerpo scFv que se unían con alta afinidad a MASP-2, y los fragmentos Fab2 identificados se ensayaron en un ensayo funcional para determinar su podían bloquear la actividad funcional de MASP-2.

Para bloquear la actividad funcional de MASP-2, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo scFv o Fab2 debe unirse e interferir con un epítopo estructural de MASP-2 que sea necesario para la actividad funcional de MASP-2. Por lo tanto, es posible que muchos o todos los scFv o Fab2 anti-MASP-2 de unión de alta afinidad no inhiban la actividad funcional de MASP-2 salvo que se unan a los epítopos estructurales de MASP-2 que están directamente implicados en la actividad funcional de MASP-2.

Se usó un ensayo funcional que mide la inhibición de la formación de la C3 convertasa de la ruta de las lectinas para evaluar la "actividad bloqueante" de los scFv anti-MASP-2. Se sabe que la función fisiológica principal de MASP-2 en la ruta de las lectinas es generar el siguiente componente funcional de la ruta del complemento mediada por lectinas, concretamente la C3 convertasa de la ruta de las lectinas. La C3 convertasa de la ruta de las lectinas es un complejo enzimático (C4b2a) fundamental que escinde proteolíticamente C3 en C3a y C3b. La MASP-2 no es un componente estructural de la C3 convertasa de la ruta de las lectinas (C4b2a); sin embargo, la actividad funcional de MASP-2 es necesaria para generar los dos componentes proteínicos (C4b, C2a) que comprende la C3 convertasa de la ruta de las lectinas. Además, todas las actividades funcionales independientes de MASP-2 enumeradas anteriormente parecen ser necesarias para que la MASP-2 genere la C3 convertasa de la ruta de las lectinas. Por estas razones, se considera que un ensayo preferido a usar para evaluar la "actividad bloqueante" de fragmentos de anticuerpo Fab2 y scFv anti-MASP-2 es un ensayo funcional que mida la inhibición de la formación de la C3 convertasa de la ruta de las lectinas.

El perfil diana para los anticuerpos terapéuticos anti-MASP-2 que se prevé que produzcan >90 % de anulación de la ruta de las lectinas in vivo después de administración de 1 mg/kg a un ser humano es una CI⁵⁰ <5 nM en plasma al 90 %. La relación entre la actividad famacológica in vitro en estos formatos de ensayo y la farmacodinámica in vivo se validó experimentalmente usando anticuerpos anti-MASP-2 de roedor.

Los criterios de selección de anticuerpos bloqueantes de MASP-2 de primera generación para uso terapéutico fueron los siguientes: alta afinidad por MASP-2 y valores funcionales de CI⁵⁰ de hasta ~25 nM. Además, los candidatos se cribaron por su reactividad cruzada con suero de primate no humano, y con suero de rata.

Métodos:

Cribado de colección de fagómidos de scFv frente a antígeno de MASP-2

Antígenos:

La MASP-2A humana con una marca de 5X His N terminal, y la MASP-2A de rata con una marca de 6X His N terminal se generaron usando los reactivos descritos en el ejemplo 1 y se purificaron de los sobrenadantes de cultivo por cromatografía de afinidad por níquel, como se describe previamente (Chen et al., J. Biol. Chem. 276:25894-02 (2001)). OMS100, un anticuerpo humano anti-MASP-2 en formato de Fab2, se usó como control positivo para la unión de MASP-2.

Descripción de la colección de fagómidos:

Una colección de presentación en fagos de las secuencias de la región variable de la cadena ligera y pesada de inmunoglobulina humana se sometió a separación de antígenos seguida de cribado automatizado de anticuerpos y selección para identificar anticuerpos scFv de alta afinidad contra la proteína MASP-2 de rata y la proteína MASP-2 humana.

Métodos de separación:

Visión general: Se usaron dos estrategias de separación para aislar los fagos de la colección de fagómidos que se unían a MASP-2 en un total de tres rodas de separación. Ambas estrategias implicaban separación en solución y recuperación del fago unido a MASP-2. La MASP-2 se inmovilizó en microesferas magnéticas mediante la marca de His (usando microesferas de NiNTA) o mediante una biotina (usando microesferas de estreptavidina) sobre la diana. Las dos primeras rondas de separación implicaron elución alcalina (TEA), y la tercera ronda de separación en primer lugar se eluyó de manera competitiva con MBL antes de una etapa de elución alcalina (TEA) convencional. Se realizó selección negativa antes de las rondas 2 y 3, y esta fue frente a los análogos funcionales, C1s y C1r de la ruta clásica del complemento. Después de la separación, se controló el enriquecimiento específico de los fagos con fragmentos scFv contra MASP-2A, y se determinó que la estrategia de separación había sido satisfactoria (datos no mostrados). Los genes de scFv procedentes de la ronda 3 de separación se clonaron en un vector de expresión pHOG y se analizaron en un cribado mediante filtro a escala pequeña para observar los clones específicos contra MASP-2A, como se describe con detalle más adelante.

TABLA 7: Métodos de se aración de fa os biotina/estre tavidina

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TABLA 8: Métodos de se aración de fa os HIS/NiNTA

Reactivos de separación:

MASP-2A humana

Anticuerpo OMS100 (control positivo)

Anticuerpo de cabra anti-IgG (H+L) humana (Pierce n.° 31412)

Microesferas de NiNTA (Qiagen n.° LB13267)

Dynabeads® M-280 Estreptavidina, 10 mg/ml (LB12321)

Suero humano normal (LB 13294)

Anticuerpos policlonal de conejo anti-C3c humano (LB13137)

Anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo, HRP (American Qualex n.° A102PU)

Para ensayar el antígeno de MASP-2A marcado, se realizó un experimento para capturar el anticuerpo OMS100 de control positivo (200 ng/ml) preincubado con MASP-2A marcada con biotina o antígeno de MASP-2A marcado con HIS (10 |jg), con 50 j l de microesferas de NiNTA en leche al 4 % en PBS o 200 j l de microesferas de estreptavidina, respectivamente. El anticuerpo OMS100 unido a MASP-2A se detectó con anticuerpo de cabra anti-IgG (H+L) humana - HRP (1:5000) y sustrato t Mb (3,3',5,5'-tetrametilbencidina).

Ensayo ELISA con microesferas de NiNTA

Se bloquearon 50 j l de microesferas de NiNTA con 1 ml de leche al 4 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron en un rotor de rueda durante 1 hora a temperatura ambiente. En paralelo, se preincubaron 10 jg de MASP-2A y anticuerpo OMS100 (diluido hasta 200 ng/ml en leche al 4 % en PBS) durante una hora. Las microesferas entonces se lavaron tres veces con 1 ml de PBS-T usando un imán entre cada etapa. La MASP-2A preincubada con anticuerpo OMS100 se añadió a las microesferas lavadas. La mezcla se incubó en un rotor de rueda durante 1 h a TA, después se lavó tres veces con 1 ml de PBS-T usando un imán como se describe anteriormente. Los tubos se incubaron durante 1 h a TA con anticuerpo de cabra anti-IgG (H+L) humana - HRP diluido 1:5000 en leche al 4 % en PBS. Para los controles negativos, Se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG (H+L) humana - HRP (1:5000) a las microesferas de NiNTA lavadas y bloqueadas en un tubo separado.

Las muestras se incubaron en un rotor de rueda durante 1 hora a temperatura ambiente, después se lavaron tres veces con 1 ml de PBS-T y una vez con PBS 1x usando el imán como se describe anteriormente. Se añadieron 100 j l de sustrato TMB y se incubaron durante 3 min a temperatura ambiente. Los tubos se colocaron en una gradilla magnética durante 2 min para concentrar las microesferas, después la solución de TMB se transfirió a una placa de microvaloración y la reacción se detuvo con 100 j l de H²SO⁴ 2 M. Se midió la absorbancia a 450 nm en el lector ELISA.

Ensayo ELISA con microesferas de estreptavidina

Este ensayo se realizó como se describe anteriormente para el ensayo ELISA con microesferas de NiNTA, pero usando 200 j l de microesferas de estreptavidina por muestra en su lugar, y antígenos no biotinilados.

Resultados: El antígeno de MASP-2A marcado con His y marcado con biotina, preincubado con el anticuerpo OMS100 de control positivo, se capturaron cada uno satisfactoriamente con microesferas de NiNTA, o microesferas de estreptavidina, respectivamente.

Separación

Se realizaron tres rondas de separación de la colección de fagos de scFv frente a MASP-2A marcada con HIS o marcada con biotina como se muestra en la tabla 7 o tabla 8, respectivamente. La tercera ronda de separación se eluyó en primer lugar con MBL, después con TEA (alcalina). Para controlar el enriquecimiento específico de fagos que presentan fragmentos de scFv frente a la MASP-2A diana, se realizó un ELISA sobre fagos policlonales frente a MASP-2A inmovilizada como se describe a continuación.

ELISA de MASP-2A sobre fagos policlonales enriquecidos después de separación

Después de tres rondas de separación de la colección de fagos de scFv frente a la MASP-2 humana como se describe anteriormente, se controló el enriquecimiento específico de los fagos con fragmentos scFv contra la MASP-2A diana realizando un ensayo ELISA sobre las poblaciones de fagos policlonales enriquecidas generadas por separación frente a MASP-2A inmovilizada como se describe a continuación.

Métodos:

Se inmovilizaron 5 ng/ml de MASP-2A en placas de ELISA maxisorp en PBS durante la noche a 4 °C. Los fagos empaquetados de las tres rondas de separación se diluyeron 1:3 en leche al 4 % en PBS y se valoraron con diluciones de factor 3. El control negativo fue el fago auxiliar M13.

El bloqueo fue leche al 4 % en PBS. Las placas se lavaron 3x en 200 pl de PBS-Tween al 0,05 % (v/v) entre cada etapa. El anticuerpo primario fue de conejo contra fd (proteína de cubierta M13), 1:5000 en leche al 4 % en PBS (p/v). El conjugado fue de conejo contra cabra-HRP a 1:10000 en leche al 4 % en PBS (p/v). El sustrato fue ABTS. Todos los volúmenes, excepto los lavados y el bloqueo, fueron 100 pl/pocillo. Todas las incubaciones fueron durante 1 hora con agitación a temperatura ambiente.

Resultados:

Los resultados del ELISA en fagos mostraron un enriquecimiento específico de los scFv contra MASP-2A para ambas estrategias de separación. Véase la figura 2. Como se muestra en la figura 2, la estrategia que implicaba la captura mediante microesferas magnéticas de NiNTA proporcionaba enriquecimiento de scFv en los fagos contra MASP-2A después de dos rondas de separación, mientras que ambas estrategias obtuvieron buenos enriquecimientos tanto en elución competitiva como en elución con TEA, después de la tercera ronda de separación. El fago de control negativo fue el fago auxiliar M13, que no mostró reacción cruzada contra MASP-2A en su dilución más baja. Estos resultados demuestran que la señal observada se debe a la unión específica de scFv a MASP-2A.

Cribado con filtro:

Se escogieron colonias bacterianas que contenían plásmidos que codificaban fragmentos scFv procedentes de la tercera ronda de separación, se distribuyeron en cuadrículas en membranas de nitrocelulosa y se hicieron crecer durante la noche en un medio no inductor para producir las placas principales. Se escogió un total de 18000 colonias y se analizaron a partir de la tercera ronda de separación, la mitad de la elución competitiva y la mitad de la elución con TEA posterior.

Las membranas de nitrocelulosa con colonias bacterianas se indujeron con IPTG para que expresaran y secretaran una proteína scFv soluble y se pusieron en contacto con una segunda membrana de nitrocelulosa recubierta con antígeno de MASP-2A junto con una membrana paralela recubierta con leche al 4 % en PBS (solución de bloqueo).

Los scFv que se unieron a MASP-2A se detectaron mediante su marca c-Myc con mAb de ratón contra c-Myc y de conejo contra ratón - HRP. Los resultados positivos correspondientes a clones de scFv que fueron positivos en MASP-2A y negativo en leche en PBS se seleccionaron para expresión adicional y posterior análisis por ELISA.

Resultados: La separación de la colección de fagómidos de scFv frente a MASP-2A seguida de la conversión de scFv y un cribado con filtro produjo 137 clones positivos. La mayoría de los clones positivos provenían de la elución competitiva con MBL, usando ambas estrategias, la de NiNTA y la de estreptavidina. Todos los clones positivos siguieron con microexpresión (escala de 200 pl) y posterior extracción. Los scFv se aislaron del periplasma de las bacterias incubando la suspensión de bacterias con tampón de lisis de sacarosa y lisozima durante una hora, tras lo que se aisló el sobrenadante mediante una etapa de centrifugación. El sobrenadante que contenía scFv secretado en el medio junto con los contenidos del periplasma se analizó mediante dos ensayos: ELISA usando MASP-2A físicamente adsorbida, y análisis de unión usando MASP-2A acoplada a amina en un chip CM5 de Biocore, como se describe con mayor detalle a continuación.

ELISA de MASP-2A en clones candidatos de scFv identificados mediante separación/conversión de scFv y cribado con filtro

Métodos:

Se inmovilizaron 4 |jg/ml de MASP-2A en placas de ELISA maxisorp (Nunc) en PBS durante la noche a 4 °C. El siguiente día, las placas se bloquearon lavando tres veces con PBS-Tween (0,05 %). El material de scFv en bruto (100 j l de medio-extracto de periplasma) de cada uno de los 137 candidatos de scFv (generados como se describe anteriormente) se añadió por pocillo a la placa. A continuación, se añadió anticuerpo anti-cMyc y, en la etapa final, se aplicó anticuerpo de conejo conjugado con HRP contra ratón para detectar el scFv unido. La reacción se reveló en sustrato de peroxidasa a Bt S de 1 etapa (Calbiochem). El control positivo fue OMS100 (un anticuerpo anti-MASP-2 en formato de Fab2) diluido hasta 10 jg/m l en PBS-Tween al 0,05 %. El control negativo fue medio-periplasma de XL1-Blue sin plásmido.

Se realizaron lavados de 3x 200 j l de PBS-Tween al 0,05 % (v/v) entre cada etapa.

El anticuerpo primario fue murino contra cMyc, 1:5000 en PBS-Tween al 0,05 % (p/v).

El conjugado fue de conejo contra cabra - HRP a 1:5000 en PBS-Tween al 0,05 % (p/v) o de cabra anti-IgG humana (H+L, Pierce 31412). El sustrato fue ABTS, con 15 de minutos de incubación a temperatura ambiente. Todos los volúmenes, excepto los lavados y el bloqueo, fueron 100 jl/pocillo. Todas las incubaciones fueron durante 1 hora con agitación a temperatura ambiente.

Resultados: 108 de 137 clones fueron positivos en este ensayo ELISA (datos no mostrados), de los que 45 clones se analizaron adicionalmente como se describe a continuación. El control positivo fue Fab2 OMS100 diluido hasta 10 jg/m l en PBS-Tween, y este clon fue positivo. El control negativo fue medio-periplasma de XL1-Blue sin plásmido, que fue negativo.

Ejemplo 3

Este ejemplo describe el método de cribado funcional de MASP-2 usado para analizar los candidatos de anticuerpo scFv completamente humano anti-MASP-2 de alta afinidad por la capacidad de bloquear la actividad de MASP-2 en suero humano normal.

Fundamento/antecedentes

Ensayo para medir la inhibición de la formación de la C3 convertasa de la ruta de las lectinas:

Se usó un ensayo funcional que mide la inhibición de la formación de la C3 convertasa de la ruta de las lectinas para evaluar la "actividad bloqueante" de los clones candidatos de scFv anti-MASP-2. La C3 convertasa de la ruta de las lectinas es el complejo enzimático (C4b2a) que escinde proteolíticamente C3 en dos fragmentos proinflamatorios potentes, la anafilatoxina C3a y C3b opsonizante. La formación de la C3 convertasa parece ser una etapa clave de la ruta de las lectinas en lo que respecta a la mediación de la inflamación. La MASP-2 no es un componente estructural de la C3 convertasa de la ruta de las lectinas (C4b2a); por lo tanto, los anticuerpos (o Fab2) anti-MASP-2 no inhibirán directamente la actividad de la C3 convertasa ya existente. Sin embargo, la actividad de serina proteasa de MASP-2 es necesaria para generar los dos componentes proteínicos (C4b, C2a) que comprende la convertasa C3 de la ruta de las lectinas. Por lo tanto, el scFv anti-MASP-2 que inhibe la actividad funcional de MASP-2 (es decir, un scFv bloqueante anti-MASP-2) inhibirá la formación de novo de la C3 convertasa de la ruta de las lectinas. C3 contiene un grupo tioéster inusual y fuertemente reactivo como parte de su estructura. T ras la escisión de C3 por la C3 convertasa de este ensayo, el grupo tioéster de C3b puede formar un enlace covalente con grupos hidroxilo o amino de las macromoléculas inmovilizadas en el fondo de los pocillos de plástico mediante enlaces éster o amida, facilitando, por tanto, la detección de C3b en el ensayo ELISA.

El manano de levaduras es un activador conocido de la ruta de las lectinas. En el siguiente método para medir la formación de la C3 convertasa, pocillos de plástico recubiertos con manano se incubaron con suero humano diluido para activar la ruta de las lectinas. A continuación, los pocillos se lavaron y se analizaron para determinar el C3b inmovilizado en los pocillos con métodos ELISA convencionales. La cantidad de C3b generado en este ensayo es un reflejo directo de la formación de novo de la C3 convertasa de la ruta de las lectinas. Se ensayaron scFv anti-MASP-2 a concentraciones seleccionadas para determinar su capacidad de inhibir la formación de la C3 convertasa y la consiguiente generación de C3b.

Métodos:

Los 45 clones candidatos identificados como se describe en el ejemplo 2 se expresaron, se purificaron y se diluyeron a la misma concentración de partida, que se diluyó de nuevo en tampón GVB que contenía Ca++ y Mg++ (barbital 4,0 mM, NaCl 141 mM, MgCb 1,0 mM, CaCb 2,0 mM, gelatina al 0,1 %, pH 7,4) para garantizar que todos los clones tenían la misma cantidad de tampón. Los clones de scFv se ensayaron cada uno por triplicado a la concentración de 2 jg/ml. El control positivo fue Fab2 OMS100 y se ensayó a 0,4 jg/ml. Se controló la formación de C3c en presencia y ausencia de los clones de scFv/IgG.

Se diluyó manano hasta una concentración de 20 jg/m l (1 jg/pocillo) en tampón de carbonato 50 mM (Na2CO315 mM + NaHCO335 mM NaN31,5 mM), pH 9,5 y se recubrió sobre una placa de ELISA durante la noche a 4 °C. El siguiente día, las placas recubiertas con manano se lavaron 3X con 200 |jl de PBS. A continuación se añadieron 100 |jl de una solución de bloqueo de HSA al 1 % a los pocillos y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3X con 200 j l de PBS y se almacenaron en hielo con 200 j l de PBS hasta la adición de las muestras.

Se diluyó suero humano normal al 0,5 % en tampón CaMgGVB, y se añadieron los clones de scFv o el Fab2 OMS100 de control positivo por triplicado a 0,01 jg/ml; 1 jg/m l (únicamente el OMS100 del control) y 10 jg/m l de este tampón y se preincubaron 45 minutos en hielo antes de la adición a la placa de ELISA bloqueada. La reacción se inició por incubación durante una hora a 37 °C y se detuvo al transferir las placas a un baño de hielo. El depósito de C3b se detectó con un anticuerpo de conejo contra C3c de ratón seguido de anticuerpo de cabra contra conejo - HRP. El control negativo fue tampón sin anticuerpo (sin OMS100 = depósito máximo de C3b), y el control positivo fue tampón con EDTA (sin depósito de C3b). El fondo se determinó realizando el mismo ensayo, pero en pocillos negativos para manano. La señal de fondo frente a las placas sin manano se sustrajo de las señalas positivas para manano. Se estableció un criterio de corte a la mitad de la actividad de un clon de scFv irrelevante (VZV) y tampón en solitario.

Resultados: Basándose en los criterios de corte, se descubrió que un total de 13 clones bloqueaban la actividad de MASP-2 como se muestra en las figuras 3A y 3B. Los 13 clones que producían una supresión > 50 % de la ruta se seleccionaron y secuenciaron, produciendo 10 clones únicos, como se muestra a continuación en la tabla 9. Se descubrió que los diez clones diferentes mostrados en la tabla 9 producían actividad funcional aceptable en el ensayo del complemento. Se descubrió que los tres clones tenían la misma subclase de cadena ligera, A3, pero tres subclases diferentes de cadena pesada, VH2, VH3 y VH6. La identidad de secuencia de los clones con respecto a las secuencias terminales también se muestra en la tabla 9.

_ Como se muestra anteriormente en la tabla 9, se eligieron 10 clones diferentes con actividad funcional aceptable y secuencias únicas para análisis adicional. Como se indica en la tabla 9, algunos de los clones se detectaron dos o tres veces, basándose en secuencias idénticas (véase la primera columna de la tabla 9 con los nombres del clon).

Expresión y purificación de diez clones candidatos de svFc

Los diez clones candidatos mostrados en la tabla 9 se expresaron a escala de un litro y se purificaron mediante intercambio iónico en cromatografía con níquel. Después de eso, se procesó una muestra de cada clon en una columna de cromatografía de exclusión molecular para evaluar el contenido de monómero y dímero. Como se muestra a continuación en la tabla 10, casi todos los clones de scFv estaban presentes en forma monomérica, y esta fracción de monómero se aisló para ensayo adicional y clasificación.

TABLA 10: Análisis del contenido de monómero

Ensayo de la fracción de monómero para la unión y actividad funcional

Los clones mostrados en la tabla 10 se expresaron a escala de 1 l, se purificaron en cromatografía de metales e intercambio iónico, se separaron en la fracción de monómero por cromatografía de exclusión molecular (SEC) y se repitieron los ensayos funcionales para determinar los valores de CI⁵⁰ y la reactividad cruzada.

Ensayo funcional sobre fracciones de monómero:

La fracción de monómero de los diez clones principales, mostrados en la tabla 10, se purificó y ensayó para la CI⁵⁰ funcional nM en una serie de dilución en que cada una recibió la misma concentración de tampón GVB con calcio y magnesio y suero humano. Los clones de scFv se ensayaron en 12 diluciones por triplicado. El control positivo fue Fab2 OMS100. El depósito de C3b se controló en presencia y ausencia de anticuerpo. Los resultados se muestran a continuación en la tabla 11.

Ensayo de unión:

La afinidad de unión K^d se determinó de dos maneras diferentes para fracciones de monómero purificadas de los diez clones de scFv candidatos. La MASP-2A se inmovilizó mediante acoplamiento de amina a un chip CM5, o en primer lugar se capturó una concentración fija de scFv (50 nM) con anticuerpo contra cMyc de alta afinidad acoplado a amina, y a continuación se pasó una serie de concentración de MASP-2A en solución sobre el chip. Los resultados se muestran a continuación en la tabla 11.

Resultados:

TABLA 11: Resumen de la actividad inhibidora funcional (CI⁵⁰) y afinidad de unión a MASP-2 (KD) para los diez clones de scFv candidatos ensa ados en el estado monomérico

continuación

Debate de resultados:

Como se muestra en la tabla 11, en el ensayo funcional, cinco de los diez clones de scFv candidatos proporcionaron valores nM de CI⁵⁰ menores que los criterios diana de 25 nM usando suero humano al 0,5 %. Como se describe a continuación, estos clones se ensayaron además en presencia de suero de primate no humano y suero de rata para determinar la actividad funcional en otras especies. Con respecto a la afinidad de unión, en solución, todas las afinidades de unión estuvieron en el intervalo nM bajo o mejor, mientras que en el ensayo convencional con MASP-2 inmovilizada, solamente dos clones (4D9 y 17D20) obtuvieron afinidades en el intervalo nM bajo. La observación de mayores afinidades en el ensayo basado en solución es probablemente un resultado del hecho de que el antígeno multimeriza cuando está en solución. Además, cuando la diana se inmoviliza en el chip (mediante acoplamiento orientado) el epítopo puede enmascararse, reduciendo de ese modo las afinidades observadas en el ensayo inmovilizado.

Ejemplo 4

Este ejemplo describe los resultados de ensayar los diez clones candidatos de scFv humano anti-MASP-2 para la reactividad cruzada con MASP-2 de rata y determinar los valores de CI⁵⁰ de estos clones de scFv en un ensayo funcional para determinar su capacidad de inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en suero humano, suero de primate no humano y suero de rata.

Métodos:

Reactividad cruzada con MASP-2 de rata

Los diez clones candidatos de scFv, mostrados en la tabla 9 del ejemplo 3, se ensayaron para la reactividad cruzada contra MASP-2A de rata en un ensayo ELISA convencional frente a MASP-2A de rata adsorbida. La MASP-2A de rata se diluyó hasta 4 pg/ml en PBS y se recubrió sobre una placa de ELISA Maxisorp (Nunc) durante la noche a 4 °C. El siguiente día, la placa se bloqueó lavando tres veces en PBS-Tween (0,05 %). Los clones de scFv (100 pl) diluidos en 20 pg/ml de PBS-Tween se añadieron a la placa y se valoraron adicionalmente con diluciones de factor 4 tres veces. Los clones de svFc específicos de MASP-2A (pocillos que contenían scFv unido) se detectaron con anticuerpo anticMyc y anticuerpo secundario de conejo contra ratón - HRP. La reacción se reveló en sustrato de peroxidasa TMB (Pierce). El control positivo fue Fab2 OMS100 diluido hasta 10 pg/ml en PBS-Tween. Todos los clones ensayados mostraron reacción cruzada con MASP-2A de rata, que se esperaba ya que la segunda ronda de separación fue con MASP-2 de rata (datos no mostrados).

Caracterización funcional de los diez clones candidatos de scFv en suero humano, suero de primate no humano (NHP) y suero de rata

Determinación de los niveles iniciales de C3c en diferentes sueros

En primer lugar, se realizó un experimento para comparar los niveles iniciales de C3b en los tres sueros (humano, de rata y NHP) de la siguiente manera.

Se diluyó manano hasta 20 pg/ml y se recubrió en una placa de ELISA durante la noche a 4 °C. El siguiente día, los pocillos se bloquearon con HSA al 1 %. Se diluyó suero normal humano, de rata y de mono verde africano (primate no humano "NHP") empezando a un 2 % con diluciones de factor dos en tampón CaMgGVB. La reacción se inició por incubación durante una hora a 37 °C, y se detuvo al transferir la placa a un baño de hielo. El depósito de C3b se detectó con un anticuerpo de conejo anti-C3c de ratón, seguido de anticuerpo de cabra contra conejo - HRP. El control negativo fue tampón sin anticuerpo (la ausencia de OMS100 provoca el máximo depósito de C3b) y el control positivo para la inhibición fue tampón con EDTA (sin depósito de C3b).

La figura 4 ilustra gráficamente los niveles iniciales de C3c en los tres sueros (humano, de rata y NHP). Como se muestra en la figura 4, los niveles de C3c fueron muy diferentes en los diferentes sueros ensayados. Cuando se comparan los niveles de C3c, parecía que el suero humano al 1 % proporcionaba niveles equivalentes a NHP al 0,2 % y suero de rata al 0,375 %. Basándose en estos resultados, las concentraciones de sueros se normalizaron de modo que los resultados de scFv pudieran compararse directamente en los tres tipos diferentes de sueros.

Ensayo funcional de los clones de scFv en diferentes sueros

Las fracciones de monómero purificadas de los diez clones de scFv candidatos entonces se ensayaron para la CI⁵⁰ funcional nM en suero humano, suero de rata y suero de mono verde africano (primate no humano "NHP"). El ensayo se realizó como se describe en el ejemplo 3, usando proteína purificada de scFv 1000 nM y suero humano normal que se diluyó hasta un 0,9 % en tampón CaMgGVB; suero de mono verde africano diluido hasta un 0,2 % en tampón CaMgGVB; o suero de rata diluido hasta un 0,375 % en tampón CaMgGVB. Los diez clones de scFv se ensayaron en una serie dilución en que recibieron la misma concentración de tampón GVB con calcio y magnesio y suero. Los clones de scFv se ensayaron en doce diluciones por triplicado. El control positivo fue Fab2 OMS100 a 100 ng/ml o adición de EDTA a la reacción. El control negativo fue un control de scFv irrelevante o PBS sin scFv. El depósito de C3b se controló en presencia y ausencia de anticuerpo scFv o Fab2. La señal de fondo de OMS100 a 100 ng/ml se sustrajo de todas las señales. La tabla 12 resumen los resultados de los ensayos funcionales en los tres sueros.

TABLA: 12: Actividad de CI⁵⁰ nM funcional de los clones de scFv en tres ti os diferentes de sueros.

Resumen de resultados para la actividad funcional en clones candidato de scFv en diferentes sueros:

Los diez clones de scFv mostraron función tanto en suero humano como en suero de primate no humano (NHP) después de haber normalizado los sueros con respecto a los niveles de depósito de C3b. Los seis clones más activos en suero humano fueron: 9P13>17N16>17D20>4D9>3F22>18L16, cuando se clasificaron de mejor a peor. En suero NHP, los clones se clasificaron (de mejor a peor): 17L20>17N16>17D20>9P13>18L16>3F22. Tanto 17N16 como 17D20 se clasificaron entre los tres mejores tanto para suero humano como para suero NHP. 17D20 también mostró algo de actividad en suero de rata.

Basándose en estos resultados, se determinó que los tres mejores clones de scFv son: 18L16, 17D20 y 17N16. Estos tres clones se analizaron adicionalmente en suero humano diluido (suero al 1 %) como se muestra a continuación en la tabla 13.

T ABLA 13: Ensa o de C3 de los tres clones candidatos: CI⁵⁰ nM en suero diluido 1 %)

La figura 5A es una alineación de secuencias de aminoácidos de los clones de scFv de longitud completa 17D20, 18L16, 4D9, 17L20, 17N16, 3F22 y 9P13. Los clones de scFv comprenden una región variable de la cadena pesada (aa 1-120), una región conectora (aa 121-145) y una región variable de la cadena ligera (aa 146-250). Como se muestra en la figura 5A, la alineación de la región de la cadena pesada (residuos 1-120) de los clones más activos revela dos grupos distintos que pertenecen a la familia génica VH2 y VH6, respectivamente. Como se muestra en la figura 5A, la región VH con respecto a los clones de la clase VH2: 17D20, 18L16 y 4D9 tiene una variabilidad en 20 posiciones aa en la región total de 120 aminoácidos (es decir, 83 % de identidad).

Como se muestra además en la figura 5A, la región VH con respecto a los clones de la clase VH6: 17L20, 17N16, 3F22 y 9P13, tiene una variabilidad en 18 posiciones aa en la región total de 120 aminoácidos (es decir, 85 % de identidad).

La figura 5B es una alineación de secuencias de los clones de scFv 17D20, 17N16, 18L16 y 4D9.

TABLA 14: Secuencia de clones candidatos de scFv mostrados en la fi ura 5A 5B

Las prioridades de clasificación fueron (1) potencia funcional en suero humano y bloqueo completo; (2) reactividad cruzada con NHP y (3) diversidad de secuencia. Se seleccionaron 17D20 y 17N16 como los mejores representantes de cada familia génica. Se seleccionó 18L16 como el tercer candidato con diversidad de secuencia de CDR3 apreciable.

17N16 y 17D20 fueron las dos mejores elecciones debido al bloqueo funcional completo, con las mejores potencias funcionales contra ser humano; reactividad cruzada apreciable con mono y diferentes familias génicas de VH. 3F22 and 9P13 se eliminaron debido a secuencias de VH casi idénticas a 17N16. 18P15, 4J9 y 21B17 se eliminaron debido a potencia moderada. 17L20 no se promovió porque era parcialmente bloqueante únicamente.

18L16 y 4D9 obtuvieron actividades similares y diversidad apreciable en comparación con 17D20. 18L16 se eligió debido a mayor reactividad cruzada con primate que 4D9.

Por lo tanto, basándose en estos criterios: los tres siguientes clones originales: 17D20, 17N16 y 18L16 prosiguieron a la maduración de la afinidad como se describe adicionalmente a continuación.

Ejemplo 5

Este ejemplo describe la clonación de los tres clones originales 17D20, 17N16 y 18L16 (identificados como se describe en los ejemplos 2-4) en formato de IgG4 natural, y la evaluación de la funcionalidad de los tres clones originales como IgG de longitud completa.

Fundamento:

Se identificaron anticuerpos scFv completamente humanos anti-MASP-2 con potencia funcional moderada usando presentación en fagos como se describe en los ejemplos 2-4. Tres de estos clones originales, 17D20, 17N16 y 18L16 se seleccionaron para maduración de la afinidad. Para evaluar la funcionalidad de estos clones originales como IgG de longitud completa, se produjeron formas naturales de IgG4 y mutantes S228P de IgG4 de la región de bisagra de estos anticuerpos. El mutante S228P de la región de bisagra se incluyó para aumentar la estabilidad en suero (véase Labrijn A.F. et al., Nature Biotechnology 27:767 (2009)).

La secuencia de aminoácidos de IgG4 natura se expone como SEQ ID NO: 63, codificada por la SEQ ID NO: 62. La secuencia de aminoácidos de IgG4 S228P se expone como SEQ ID NO: 65, codificada por la SEQ ID NO: 64. Las moléculas de IgG4 también se escindieron en formatos de F(ab')2 con digestión mediante pepsina y se fraccionaron por cromatografía de exclusión molecular para comparar los clones originales directamente con el anticuerpo de control OMS100, que es una molécula F(ab)2.

Métodos:

Generación de los clones en formato de longitud completa

Los tres clones originales se convirtieron en formato de IgG4 natura y en formato de IgG4 mutante S228P. Esto se consiguió mediante aislamiento por PCR de las regiones VH y VL apropiadas a partir de los clones originales mencionados anteriormente y clonándolos en vectores de expresión pcDNA3 que albergaban las regiones constantes de la cadena pesada apropiadas para crear fusiones sin desplazamiento del marco de lectura para producir el anticuerpo deseado. Los tres clones originales es formato de IgG4 mutante se escindieron entonces con pepsina para generar fragmentos F(ab')2 y estos últimos se purificaron mediante fraccionamiento en una columna de cromatografía de exclusión molecular.

Ensayo de unión

Los clones originales candidatos convertidos en formato de IgG4 se transfectaron de manera transitoria en células HEK 293 y los sobrenadantes de la transfección transitoria se valoraron en un ensayo ELISA. Los clones mostraron reactividad excelente con MASP-2A humana adsorbida físicamente y se clasificaron en el siguiente orden: 17N16>17D20>18L16 (datos no mostrados).

Los clones entonces se purificaron y se volvieron a ensayar en un ensayo ELISA y de actividad de la siguiente manera. La MASP-2A humana se recubrió a 3 pg/ml en PBS en una placa maxisorp, la IgG (45 pg/ml) y el Fab'2 (30 pg/ml) se diluyeron en PBS-Tween hasta una concentración de partida 300 nM, y adicionalmente con diluciones de factor 3. Las IgG se detectaron con anticuerpo de cabra conjugado con HRP contra IgG humana (Southern Biotech) y los F(ab')2 se detectaron con anticuerpo de cabra conjugado con HRP contra IgG H+L humana (Pierce 31412). La reacción se reveló con sustrato TMB y se detuvo con H²SO⁴2 M. Los resultados se muestran a continuación en la tabla 15.

TABLA 1 : Afini ni n r MA P-2 h m n

Ensayo funcional

El ensayo de C3 convertasa usando suero humano normal (NHS) al 1 %, como se describe en el ejemplo 4, se usó para comparar la actividad funcional de los clones originales de scFv y los equivalentes de IgG4 de longitud completa en NHS al 1 %. Se diluyó manano hasta una concentración de 20 pg/ml y se recubrió en una placa de ELISA durante la noche a 4 °C. El siguiente día, los pocillos se bloquearon con suero humano al 1 %. Se diluyó suero humano hasta un 1 % en tampón CaMgGVB y los anticuerpos purificados; scFv (900 nM), F(ab')2 (300 nM), IgG (300 nM) se añadieron por duplicado a una serie de diferentes diluciones a la misma cantidad de tampón, y se preincubaron durante 45 minutos en hielo antes de añadir la placa de ELISA bloqueada. La reacción se inició por incubación a 37 °C durante una hora y se detuvo colocando la placa en hielo. El depósito de C3b se determinó con un anticuerpo de conejo contra C3c de ratón seguido de anticuerpo de cabra contra conejo - HRP. El fondo de OMS100 a 50 nM sobre placas positivas a manano se sustrajo de las curvas. Se muestra un resumen de los resultados de este análisis a continuación en la tabla 16.

TABLA 16: Ensa o de C3 convertasa usando suero humano al 1 % CI⁵⁰ nM

La potencia funcional de los clones originales de IgG4 también se comparó con el formato mutante de la bisagra de IgG4 (S228P) para cada clon. Los valores numéricos de CI⁵⁰ para el ensayo de depósito de C3b usando NHS al 1 % se muestran a continuación en la tabla 17.

TABLA 17: Formato natural (IgG4) frente a formato mutante de la bisagra (S228P) en el ensayo de depósito de C3b n r h m n l 1 I nM

Como se muestra anteriormente en la tabla 17, en algunos casos, se apreció farmacología agonista inesperada para las IgG derivadas de scFv antagonistas. La base según el mecanismo de acción para esta observación no se entiende.

Las actividades de los clones originales convertidos a IgG4 con función inhibidora en NHS al 1 % se evaluaron adicionalmente en condiciones de ensayo más rigurosas que imitaban mucho mejor las condiciones fisiológicas. Para estimar la actividad del anticuerpo en condiciones fisiológicas, se realizó ensayo de preparaciones de IgG4 de clones originales para su capacidad de inhibir el depósito de C3b dependientes de la ruta de las lectinas (LP) en placas recubiertas con manano en condiciones de ensayo rigurosas usando plasma humano mínimamente diluido (90 %).

Los resultados del ensayo de depósito de C3b en plasma humano al 90 % se muestran en la figura 6. Como la MASP-2 y sus sustratos están presentes en la mezcla de ensayo a una concentración aproximadamente 100 veces mayor que en el ensayo de suero diluido usando suero humano normal al 1 %, en general se espera un desplazamiento a la derecha de la curva de respuesta a dosis de antagonista. Como se muestra en la figura 6, como se esperaba, se observó un desplazamiento a la derecha a potencias aparentes más bajas para OMS100 y todos los anticuerpos contra MASP-2 ensayados. Sin embargo, sorprendentemente, no se observó reducción en la potencia aparente para el mutante de la región de bisagra (S228P) de 17D20, y la potencia en este formato fue comparable con la medida en plasma al 1 % (véase la tabla 17). En el formato de ensayo en NHS al 90 %, se descubrió que la potencia funcional de IgG417D20 (S228) era moderadamente menor que Fab2 OMS100, lo que es contrario a los resultados de ensayo en NHS al 1 %, donde OMS100 era de 50 a 100 veces más potente que IgG4 17D20 S228P (datos no mostrados). La forma de IgG4 natural de 17N16 también mostró inhibición completa en NHS al 90 %, pero fue algo menos potente en este formato de ensayo (CI⁵⁰ de “ 15 nM) mientras la forma de IgG4 natural de 18L16 era menos potente y parcialmente inhibidora únicamente, como se muestra en la figura 6.

Basándose en estos hallazgos, la actividad de los clones originales convertidos a IgG4 se evaluó adicionalmente examinando el depósito de C4b en condiciones de ensayo rigurosas (NHS al 90 %). Este formato de ensayo proporciona una medida directa de la actividad del anticuerpo sobre la reacción enzimática catalizada por MASP-2.

Ensayo para medir la inhibición de la escisión de C4 dependiente de MASP-2

Antecedentes: La actividad de serina proteasa de MASP-2 es muy específica, y solamente se han identificado dos sustratos proteínicos para MASP-2; c 2 y C4. La escisión de C4 genera C4a y C4b. Un Fab2 anti-MASP-2 se puede unir a los epítopos estructurales de MASP-2 que están directamente implicados en la escisión de C4 (por ejemplo, el sitio de unión de MASP-2 para C4; sitio catalítico de la serina proteasa de MASP-2) e inhibir de este modo la actividad funcional de la escisión de C4 en MASP-2.

El manano de levaduras es un activador conocido de la ruta de las lectinas. En el siguiente método para medir la actividad de escisión de C4 de MASP-2, pocillos de plástico recubiertos con manano se incubaron durante 90 minutos a 4 °C con suero humano al 90 % para activar la ruta de las lectinas. A continuación, los pocillos se lavaron y se analizaron para determinar la C4b humana inmovilizada sobre los pocillos con métodos de ELISA convencionales. La cantidad de C4b generada en este ensayo es una medida de la actividad de escisión de C4 dependiente de MASP-2. Se ensayaron anticuerpos anti-MASP-2 a concentraciones seleccionadas para determinar su capacidad de inhibir la escisión de C4.

Métodos: Placas de unión de medio Costar de 96 pocillos se incubaron durante la noche a 5 °C con manano diluido en tampón de carbonato 50 mM, pH 9,5 a 1,0 pg/50 pl/pocillo. Cada pocillo se lavó 3X con 200 pl de PBS. A continuación, los pocillos se bloquearon con 100 pl/pocillo de seroalbúmina bovina al 1 % en PBS y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente mezclando suavemente. Cada pocillo se lavó 3X con 200 pl de PBS. Las muestras de anticuerpo anti-MASP-2 se diluyeron hasta concentraciones seleccionadas en tampón GVB que contenía Ca++ y Mg++ (barbital 4,0 mM, NaCl 141 mM, MgCb 1,0 mM, CaCb 2,0 mM, gelatina al 0,1 %, pH 7,4) a 5 °C. Se añadió suero humano al 90 % a las muestras anteriores a 5 °C y se transfirieron 100 pl a cada pocillo. Las placas se cubrieron y se incubaron durante 90 min en un baño de agua con hielo para permitir la activación del complemento. La reacción se detuvo añadiendo EDTA a la mezcla de reacción. Cada pocillo se lavó 5 x 200 pl de PBS-Tween 20 (Tween 20 al 0,05 % en PBS), a continuación, cada pocillo se lavó 2X con 200 pl de PBS. Unos 100 pl/pocillo de dilución 1:700 de anticuerpo de conejo conjugado con biotina anti-C4c humana (Immunsystem AB, Uppsala, Suecia) se añadieron a PBS que contenía 2,0 mg/ml de seroalbúmina bovina (BSA) y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente mezclando suavemente. Cada pocillo se lavó con 5 x 200 pl de PBS. Unos 100 pl/pocillo de 0,1 g/ml de estreptavidina conjugada con peroxidasa (Pierce Chemical n.° 21126) se añadieron a PBS que contenía 2,0 mg/ml de BSA y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente en un agitador mezclando suavemente. Cada pocillo se lavó con 5 x 200 pl de PBS. Unos 100 pl/pocillo del sustrato de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) se añadieron y se incubaron a temperatura ambiente durante 16 min. La reacción de la peroxidasa se detuvo añadiendo 100 pl/pocillo de H³PO⁴1,0 M y se midió la DO⁴⁵⁰.

Resultados:

En este formato, ambas formas de IgG4 de 17D20 inhibían el depósito de C4b dirigido por la ruta de las lectivas, aunque los valores de CI⁵⁰ fueron “ 3 veces mayores en comparación con el ensayo de depósito de C3b. De forma interesante, la IgG4 natural 17N16 mostró buena actividad en este ensayo con un valor de CI⁵⁰ y un perfil de despuesta a la dosis comparable con el ensayo de depósito de C3b. 18L16 fue considerablemente menos potente y no consiguió inhibición completa en este formato (datos no mostrados).

Debate:

Como se describe en los ejemplos 2-5, se identificaron anticuerpos 2 scFv completamente humanos anti-MASP con función bloqueante funcional usando presentación en fagos. Tres de estos clones, 17N16, 17D20 y 18L16, se seleccionaron para maduración de la afinidad y se ensayaron adicionalmente. Para evaluar la funcionalidad de estos clones originales como IgG de longitud completa, Se produjeron formas de IgG4 natural y mutante S228P de IgG4 de la región de bisagra de estos anticuerpos. Como se describe en este ejemplo, la mayoría de IgG de longitud completa tenían actividad funcional mejorada en comparación con sus equivalentes de scFv cuando se ensayaban en un formato de ensayo funcional convencional con plasma humano al 1 %. Para estimar la actividad del anticuerpo en condiciones fisiológicas, se realizó ensayo de preparaciones de clones originales de IgG4 en condiciones de ensayo rigurosas usando plasma humano al 90 %. En estas condiciones, varios anticuerpos revelaron potencias funcionales que eran sustancialmente mejores que las esperadas, basándose en su rendimiento en ensayos funcionales en plasma convencionales (1 %).

Ejemplo 6

Este ejemplo describe el reordenamiento de cadenas y la maduración de la afinidad de los clones originales 17D20, 17N16 y 18L16, y el análisis de los clones derivados resultantes.

Métodos:

Para identificar anticuerpos con potencia mejorada, los tres clones originales de scFv, 17D20, 17N16 y 18L16, identificados como se describe en los ejemplos 2-5, se sometieron a reordenamiento de la cadena ligera. Este proceso implicó la generación de una colección combinatoria que consistía en la VH de cada clon original emparejado con una colección de cadenas ligeras lambda (VL) humanas no expuestas derivadas de seis donadores sanos. A continuación se cribó esta colección para los clones de scFv con afinidad y/o funcionalidad de unión mejorada.

Se analizaron 9000 clones derivados con la cadena ligera reordenada por clon original, para un total de 27000 clones. Cada clon derivado se indujo para que expresara o secretara scFv soluble, y se cribó por la capacidad de unirse a MASP-2A humana. Los scFv que se unieron a MASP-2A humana se detectaron mediante su marca c-Myc. Este cribado inicial provocó la selección de un total de 119 clones, que incluían 107 clones derivados de la colección 17N16, 8 clones derivados de la colección 17D20 y 4 clones derivados de la colección 18L16.

Los 119 clones se expresaron a pequeña escala, se purificaron en columnas de NiNTA y se ensayaron para la afinidad de unión en un ensayo ELISA frente a MASP-2A humana físicamente adsorbida.

Resultados:

Los resultados del ensayo ELISA sobre un subconjunto representativo de los 119 clones derivados se muestran en las figuras 7A and B. La figura 7A ilustra gráficamente los resultados del ensayo ELISA sobre el clon original 17N16 frente a los clones derivados valorados sobre huMASP-2A. La figura 7B ilustra gráficamente los resultados del ensayo ELISA sobre el clon original 17D20 frente a los clones derivados valorados sobre huMASP-2A.

Como se muestra en la figura 7A, los clones derivados 17N16m_d16E12 y 17N16m_d17N9, derivados del clon original 17N16, tenían afinidades que eran mayores que el clon original. Además, como se muestra en la figura 7B, un clon derivado del clon original 17D20, 17D20m_d18M24, tenían una afinidad mayor que el clon original. Estos tres clones, y tres clones adicionales: 17N16m_d13L12, 17N16m_d16K5, 17N16m_d1G5 y 17D20m_d1824 que tenían un bajo nivel de expresión se expresaron a escala de 0,5 l, se purificaron en la fracción de monómero por cromatografía de exclusión molecular y se volvieron a ensayar en un ensayo ELISA y funcional. La colección 18L16 no produjo ningún clon derivado con la afinidad de unión deseada.

Después de la purificación, los seis clones derivados se ensayaron en un ensayo del complemento para la actividad inhibidora. Los resultados se muestran en la tabla 18.

TABLA 18: En l m l m n l n ri in l y derivados

Como se muestra anteriormente en la tabla 18, solamente uno de los clones, 17N16m_d17N9, tuvo afinidad y actividad en el mismo intervalo que el clon original.

La figura 8 es una alineación de secuencias de aminoácidos del clon original de scFv de longitud completa 17N16 (SEQ ID NO: 59) y el clon derivado 17N16m_d17N9 (SEQ ID NO: 66), que muestra que las cadenas ligeras (empezando con s Ye ) tienen 17 residuos aminoacídicos que difieren entre los dos clones.

Un nuevo cribado de la colección 17N16 lambda produjo varios clones derivados candidatos adicionales, de los que 17N16m_d27E13 se identificó en un ensayo ELISA y del complemento, y se incluyó en el conjunto de clones derivados candidatos para análisis adicional.

Ensayo de clones derivados en diferentes sueros

Los clones derivados candidatos se analizaron en diferentes sueros de la siguiente manera. Se diluyó manano hasta 20 |jg/ml y se recubrió en una placa de ELISA durante la noche a 4 °C. El siguiente día, los pocillos se bloquearon con HSA al 1 %. Se diluyó suero de mono verde africano hasta un 0,2 %, se diluyó suero de rata hasta un 0,375 % y se diluyó suero humano hasta un 1 % en tampón CaMgGVB. El scFv purificado de cada uno de los clones derivado candidato se añadió por duplicado a una serie de concentraciones diferentes a la misma cantidad de tampón y se preincubaron durante 45 minutos en hielo antes de la adición a la placa de ELISA bloqueada. La reacción se inició por incubación durante una hora a 37 °C, y se detuvo al transferir la placa a un baño de hielo. La liberación de C3c se detectó con un anticuerpo de conejo contra C3c de ratón seguido de anticuerpo de cabra contra conejo - HRP. El fondo de OMS100 a 0,1 jg/m l sobre placas negativas a manano se sustrajo de estas curvas. Los resultados se resumen a continuación en la tabla 19.

TABLA 19: Valores de CI⁵⁰ para el clon original 17N16 y los clones derivados 17N16m_d17N9 y 17N16m_d27E13 en diferentes sueros.

Debate de resultados:

Como se muestra en la tabla 19, el clon derivado 17N16m_d17N9 tiene mayor actividad funcional que el clon original. La función mejorada en suero de rata, además de la diferencia de secuencia de diecisiete aminoácidos en la cadena ligera en comparación con el clon original hace que este clon sea un candidato positivo. Basándose en estos datos, el clon derivado 17N16m_d17N9 se seleccionó para análisis adicional.

Ejemplo 7

Este ejemplo describe la generación y análisis del clon derivado 17D20m_d3521N11, derivado del clon original 17D20.

Antecedentes/fundamentos:

Para mejorar la afinidad del clon original candidato 17D20mc, se realizó una "mutagénesis de comprobación" adicional sobre los tres primeros aminoácidos en la CDR3 de la cadena pesada (CDR-H3). Esta fue una campaña de mutagénesis en paralelo con el reordenamiento normal de la cadena ligera de 17D20mc. Por lo tanto, se construyeron tres colecciones de scFv diferentes por PCR donde las posiciones de los aminoácidos 1, 2 y 3 se aleatorizaron para el conjunto de los 20 posibles aminoácidos usando codones degenerados. Después de clonar las colecciones, se realizó expresión a microescala y se controló la unión de scFv en un chip CM5 recubierto con MASP-2A (no mostrado). Se realizó análisis BIAcore de expresión a microescala en las tres colecciones diferentes sobre chips recubiertos con MASP-2A, aleatorizados en la posición 1, 2 o 3 y se identificaron clones derivados posiblemente interesantes.

Se observó que, para las posiciones de los aminoácidos 1 y 2 de CDR-H3, no se encontró ningún clon que tuviera una velocidad de disociación mejorada en comparación con el otro clon original candidato 17D20m. Sin embargo, unos pocos candidatos con mutaciones en la posición del aminoácido 3 en la CDR-H3 mostraron velocidades de disociación mejoradas en comparación con el clon original 17D20m. Estos clones (n.° 35, n.° 59 y n.° 90) se secuenciaron para identificar la mutación. Las secuencias de dos clones derivados de "mutagénesis de comprobación" se comparan con 17D20mc (secuencia original). De forma interesante, todos los clones secuenciados excepto uno (n.° 90), albergaban una sustitución de Ala-Arg en comparación con el candidato original.

La figura 9 es una comparación de secuencias de la secuencia de aminoácidos de la región de la cadena pesada del clon original de scFv 17D20m (aa 61-119 de la SEQ ID NO: 18) y la secuencia de aminoácidos de la región CRD-H3 de clones de scFv sin mutaciones en CDR-H3, clon n.° 35 (aa 61-119 de la SEQ ID NO: 20, que tiene una sustitución de A por R en la posición 102 de la SEQ ID NO: 18), clon n.° 59 (misma secuencia que el clon n.° 35) y clon n.° 90 (sustitución de A por P en la posición 102 de la SEQ ID NO: 18).

Análisis de los clones mutantes n.° 35 y n.° 59

Los clones mutantes n.° 35 y n.° 59 se expresaron a pequeña escala y se ensayaron adicionalmente en comparación con el clon candidato original 17D20 en un ELISA de valoración sobre MASP-2A inmovilizada (10 pg/ml). Los scFv se diluyeron en serie con factor 5 empezando desde 20 pg/ml y la unión se detectó usando anticuerpo (de ratón) anti-Myc/anticuerpo contra ratón - HRp. Se observó unión ligeramente mejorada en el ensayo ELISA para los clones candidatos n.° 35 y n.° 59 en comparación con el otro clon candidato original 17D20 (datos no mostrados).

El clon mejorado n.° 35 se combinó con el mejor clon de cadena ligera reordenada 17D20m_d21N11. La mutación en la VH del candidato 17D20md35 (Ala-Arg) se combinó con la cadena ligera del candidato 17D20m_d21N11, produciendo, por tanto, el clon denominado VH35-VL21N11, mencionado de otro modo como 3521N11.

La figura 10A es una alineación de secuencias de aminoácidos de la secuencia de la región CDR3 del clon original 17D20 (aa 61-119 de la SEQ ID NO: 18), la misma región del clon derivado 17D20m_d21N11, que tiene la misma secuencia, y la misma región del clon de mutagénesis n.° 35 combinada con la VL de 17D20m_d21N11, denominada "3521N11" (aa 61-119 de la SEQ ID NO: 20). Las regiones de secuencia de VH destacadas comprenden la CDRH3, y la región de residuos diana mutados está subrayada.

La figura 10B es una alineación de secuencias proteínicas del scFv de longitud completa que incluye las regiones VL y VH del clon original 17D20 (SEQ ID NO: 55) y el clon derivado 17D20m_d21N11 (SEQ ID NO: 67). El clon derivado de scFv 17D20m_d3521N11 se expone como SEQ ID NO: 68. Nota: se ha determinado que el residuo X de la figura 10B en la posición 220 es un "E", como se expone en la SEQ ID NO: 68.

Se realizó un ensayo ELISA de valoración del conjunto de scFv mostrados en la figura 10 sobre MASP-2 (10 pg/ml). Los resultados se muestran en la tabla 20.

TABLA 20: ELISA en MASP-2 humana

El clon derivado 17D20m_d3521N11 se analizó adicionalmente para la actividad funcional como se describe a continuación en el ejemplo 8.

Ejemplo 8

Este ejemplo describe la conversión y el análisis de los clones derivados candidatos 17N16m_d17N9 y 17D20m_d3521N11 en formato de IgG4, IgG4/S228P e IgG2.

Fundamento/antecedentes

Los métodos de cribado de anticuerpos descritos en los ejemplos 2-7 han identificado dos clones originales, 17N16 y 17D20, con funcionalidad adecuada. La maduración de la afinidad de estos clones originales ha producido clones derivados que mostraban mejoras de aproximadamente 2 veces en la potencia en comparación con los clones originales en ensayos funcionales equivalentes a nivel de scFv. Los clones derivados con las mejores actividades son 17N16m_d17N9 y 17D20m_d3521N11. Como se describe en el ejemplo 6, en una comparación de actividad funcional del clon original 17N16 con clones derivados de cadena ligera reordenada (formato de scFv, ensayo en NHS al 1 %) se determinó que 17N16m_d17N9 es ligeramente más potente que el clon original y tiene la mejor potencia funcional de todos los clones derivados ensayados en este ensayo.

Métodos:

Se realizó una comparación de la potencia funcional de los clones de scFv candidatos en el ensayo de conversión de C3 (suero humano al 1 % y suero humano al 90 %), y en un ensayo de conversión de C4 (suero humano al 90 %), realizada como se describe en el ejemplo 5.

Los resultados se muestran a continuación en la tabla 21.

TABLA 21: Comparación de la potencia funcional en la CI⁵⁰ (nM) de los clones derivados principales y sus r iv l n ri in l n f rm F v

Como se muestra anteriormente en la tabla 21, 17N16m_d17N9 tiene buena actividad cuando se ensaya en suero humano normal (NHS) al 90 % en el ensayo de C3 y es más potente que los otros clones derivados en este formato.

Conversión de clones candidatos en formato de IgG4, IgG4/S228P e IgG2

Todos estos clones candidatos se convirtieron en formato de IgG4, IgG4/S228P e IgG2 para análisis adicional.

SEQ ID NO: 62: ADNc que codifica IgG4 natural

SEQ ID NO: 63: polipéptido IgG4 natural

SEQ ID NO: 64 Ad Nc que codifica el mutante S228P de IgG4

SEQ ID NO: 65: polipéptido mutante S228P de IgG4

SEQ ID NO: 69: Ad Nc que codifica IgG2 natural

SEQ ID NO: 70: polipéptido IgG2 natural

TABLA 22: Resumen de los clones candidatos:

Los anticuerpos monoclonales n.° 1-6 se ensayaron para la capacidad de reaccionar de forma cruzada con una proteína MASP-2 no humana (mono verde africano (AG)) en un ensayo de a C3 para determinar si estos anticuerpos podrían usarse para ensayar la toxicidad en un modelo animal que sería predictivos para seres humanos. Los anticuerpos monoclonales n.° 1-6 también se ensayaron en un ensayo de depósito de C3b y un ensayo de C4 en suero humano al 90 %. Los resultados se muestran a continuación en la tabla 23.

TABLA 23: MoAb humanos anti-MASP-2 CI⁵⁰ nM en suero humano al 90 %

La figura 11A ilustra gráficamente los resultados del ensayo de depósito de C3b realizado para las variantes de isotipo del clon derivado (MoAb n.° 1-3), derivado del clon original 17N16 del anticuerpo monoclonal humano anti-MASP-2.

La figura 11B ilustra gráficamente los resultados del ensayo de depósito de C3b realizado para las variantes de isotipo del clon derivado (MoAb n.° 4-6), derivado del clon original 17D20 del anticuerpo monoclonal humano anti-MASP-2.

Como se muestra en la tabla 23 y las figuras 11A y 11B, los anticuerpos monoclonales humanos anti-MASP-2 (MoAb n.° 1-6) se unen a MASP-2 con alta afinidad e inhiben la función de actividad de C3 y C4 en suero humano al 90 %. También se aprecia que los MoAb humanos anti-MASP-2 reaccionan de forma cruzada con la proteína MASP-2 no humana (mono verde africano), que proporciona un modelo animal para estudios de toxicidad que sería predictivo para seres humanos.

Los MoAb n.° 1-6 se analizaron adicionalmente en suero humano al 95 %, suero de mono verde africano al 95 %. Los resultados se resumen a continuación en la tabla 24.

TABLA 24

Las figuras 12A y 12B ilustran gráficamente el ensayo de los clones originales y MoAb n.° 1-6 en un ensayo de depósito de C3b en suero humano normal al 95 %.

La figura 13 ilustra gráficamente la inhibición del depósito de C4b en suero humano normal al 95 %.

La figura 14 ilustra gráficamente la inhibición del depósito de C3b en suero de mono verde africano al 95 %.

Los MoAb n.° 1-6 se ensayaron adicionalmente para la capacidad de inhibir selectivamente la ruta de las lectinas analizando la inhibición de C3b de rata, la inhibición de complejos de MBL-MASP-2 preensamblados; la inhibición de la ruta clásica y la selectividad sobre C1s. Los resultados se resumen en la tabla 25.

TABLA 25: Resumen de los resultados del ensa o funcional

La figura 15 ilustra gráficamente la inhibición de la actividad de escisión de C4 del complejo de MBL-MASP-2 preensamblado, por MoAb n.° 2, 3, 5 y 6.

La figura 16 ilustra gráficamente la unión preferente de MoAb n.° 6 a MASP-2 humana en comparación con C1s.

Tabla 26: Resumen de secuencias de clones derivados en diversos formatos:

Ejemplo 9

Este ejemplo describe la cartografía de epítopos que se realizó para varios de los MoAb humanos bloqueantes anti-MASP-2.

Métodos:

Se produjeron las siguientes proteínas recombinantes como se describe en el ejemplo 1:

MAp19 humana

MASP2A humana

MASP-2 SP humana

MASP-2 CCP2-SP humana

MASP-2 CCP1-CCP2-SP humana

MASP-1/3 CUB1-EGF-CUB2 humana

MASP-1 CCP1-CCP2-SP humana

Los anticuerpos anti-MASP-2 OMS100 y MoAb n.° 6 (35VH-21N11VL), que han demostrado ambos que se unen a MASP-2 humana con alta afinidad y que tienen la capacidad de bloquear la actividad del complemento funcional (véanse los ejemplos 6-8) se analizaron con respecto a la unión al epítopo por análisis de inmunotransferencia por puntos.

Análisis de inmunotransferencia por puntos

Se aplicaron diluciones en serie de los polipéptidos MASP-2 recombinantes descritos anteriormente en una membrana de nitrocelulosa. La cantidad de proteína aplicada varió de 50 ng a 5 pg, en etapas de factor diez. En experimentos posteriores, la cantidad de proteína aplicada fue de 50 ng a 16 pg, de nuevo en etapas de factor cinco. Las membranas se bloquearon con leche desnatada en polvo al 5 % en TBS (tampón de bloqueo), después se incubaron con 1,0 pg/ml de Fab2 anti-MASP-2 en tampón de bloqueo (que contenía Ca2+ 5,0 mM). Los Fab2 unidos se detectaron usando anticuerpo conjugado con HRP anti-Fab humano (AbD/Serotec; diluido 1/10000) y el kit de detección ECL (Amersham). Una membrana se incubó con Ab policlonal de conejo anti-MASP-2 humana (descrito en Stover et al., J Immunol 163:6848-59 (1999)) como control positivo. En este caso, el Ab unido se detectó con anticuerpo de cabra conjugado con HRP anti-IgG de conejo (Dako; diluido 1/2000).

Resultados:

Los resultados se resumen en la tabla 27.

TABLA 27: Carto rafía de e íto os

Los resultados muestran que los anticuerpos MoAb n.° 6 y OMS100 son muy específicos para MASP-2 y no se unen a MASP-1 o MASP-3. Ningún anticuerpo se unión a Map19 no a fragmentos de MASP-2 que no contuvieran el dominio CCP1 de MASP-2, lo que hace llegar a la conclusión de que los sitios de unión abarcan el dominio CCP1.

Ejemplo 10

Este ejemplo demuestra que el MoAb n.° 6 humano anti-MASP-2 inhibe la ruta de las lectinas en monos verdes africanos después de administración intravenosa.

Métodos:

El MoAb n.° 6 se administró por vía intravenosa a un primer grupo de tres monos verdes africanos a una dosificación de 1 mg/kg y a un segundo grupo de tres monos verdes africanos a una dosificación de 3 mg/kg. Se obtuvieron muestras de sangre 2, 4, 8, 10, 24, 48, 72 y 98 horas después de la administración y se ensayaron para la presencia de actividad de la ruta de las lectinas.

Como se muestra en la figura 17, la ruta de las lectinas se inhibió completamente después de administración intravenosa del MoAb n.° 6 contra seres humanos.

Ejemplo 11

Este ejemplo demuestra que un inhibidor de MASP-2, tal como un anticuerpo anti-MASP-2, es eficaz para el tratamiento de la exposición a la radiación y/o para el tratamiento, mejora o prevención del síndrome por radiación aguda.

Fundamento:

La exposición a altas dosis de radiaciones ionizantes produce mortalidad por dos mecanismos principales: toxicidad en la médula ósea y síndrome gastrointestinal. La toxicidad de la médula ósea da como resultado la disminución de todas las células sanguíneas, predisponiendo al organismo a la muerte por infección y hemorragia. El síndrome gastrointestinal es más grave y está fomentado por una pérdida de la función intestinal de barrera debido a la disgregación de la capa del epitelio intestinal y una pérdida de la función endocrina del intestino. Esto puede dar lugar a síndrome séptico y un síndrome sistémico de respuesta inflamatoria asociado que puede provocar la muerte.

La ruta de las lectinas del complemento es un mecanismo inmunitario innato que inicia la inflamación en respuesta a una lesión del tejido y la exposición a superficies exógenas (es decir, bacterias). El bloqueo de esta ruta da lugar a un mejor resultado en modelos de ratón de lesión de tejido intestinal isquémico o choque séptico. Se plantea la hipótesis de que la ruta de las lectinas puede activar una inflamación excesiva y perjudicial en respuesta a la lesión del tejido inducida por radiación. Por tanto, el bloqueo de la ruta de las lectinas puede reducir las lesiones secundarias y aumentar la supervivencia después de una exposición aguda a la radiación.

El objetivo del estudio realizado como se describe en este ejemplo era evaluar el efecto del bloqueo de la ruta de las lectinas sobre la supervivencia en un modelo de ratón de lesión por radiación, mediante la administración de anticuerpos anti-MASP-2 murina.

Estudio n.° 1

Métodos y materiales:

Materiales. Los artículos de ensayo usados en este estudio fueron (i) un anticuerpo anti-MASP-2 murina de alta afinidad (mAbM11) y (ii) un anticuerpo anti-MASP-2 humana de alta afinidad (mAbOMS646) que bloquean el componente de la proteína MASP-2 de la ruta del complemento de las lectinas que se produjeron en células de mamífero transfectadas. Las concentraciones de dosificación fueron 1 mg/kg de anticuerpo anti-MASP-2 murina (mAbM11), 5 mg/kg de anticuerpo anti-MASP-2 humana (mAbOMS646) o solución salina estéril. Para cada sesión de dosificación, se prepararon volúmenes adecuados de soluciones de dosificación recientes.

Animales. Ratones macho Swiss-Webster adultos jóvenes se obtuvieron de Harlan Laboratories (Houston, TX). Los animales se alojaron en jaulas de fondo sólido con lecho Alpha-Dri y recibieron dieta certificada PMI 5002 para roedores (Animal Specialties, Inc., Hubbard OR) y agua a voluntad. La temperatura se controló, y el animalario funcionó con un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad.

Irradiación. Después de una aclimatación de 2 semanas en la instalación, los ratones se irradiaron con 6,5, 7,0 y 8,0 Gy mediante exposición de todo el cuerpo en grupos de 10 con una tasa de dosis de 0,78 Gy/min usando un sistema Therapax X-RAD 320 provisto de un generador de 320 kV de rayos X de alta estabilidad, tubo de rayos X de metal cerámico, colimador del haz de rayos variable y filtro (Precision X-ray Incorporated, East Haven, CT).

Formulación y administración del fármaco. El volumen adecuado de soluciones madre concentradas se diluyó con solución salina enfriada en hielo para preparar soluciones de dosificación de 0,2 mg/ml de anticuerpo anti-MASP-2 murina (mAbM11) o 0,5 mg/ml de anticuerpo anti-MASP-2 humana (mAbOMS646) de acuerdo con el protocolo. La administración del anticuerpo anti-MASP-2 mAbM11 y mAbOMS646 se realizó mediante inyección IP usando una aguja de calibre 25 según el peso del animal para administrar 1 mg/kg de mAbM11, 5 mg/kg de mAbOMS646 o vehículo salino.

Diseño del estudio. Los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos descritos en la tabla 28. El peso corporal y la temperatura se midieron y se registraron diariamente. Los ratones de los grupos 7, 11 y 13 se sacrificaron el día 7 después de la irradiación, y se recogió sangre por punción cardiaca con anestesia profunda. Los animales supervivientes el día 30 después de la irradiación se sacrificaron de la misma forma, y se recogió sangre. El plasma se preparó a partir de muestras de sangre recogidas de acuerdo con el protocolo y se devolvieron al patrocinador para su análisis.

TABLA 28: Gru os de estudio

continuación

Análisis estadístico. Se generaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y se usaron para comparar los tiempos medios de supervivencia entre grupos de tratamiento usando métodos del orden logarítmico y de Wilcoxon. Se notificaron los promedios con las desviaciones típicas, o las medias con el error típico de la media. Se realizaron comparaciones estadísticas usando un ensayo de la t para datos independientes bilateral entre animales irradiados controlados y grupos de tratamiento individuales.

Resultados del estudio n.° 1

Los diagramas de supervivencia de Kaplan-Meier para los grupos de exposición a 6,5, 7,0 y 8,0 Gy se proporcionan en las figuras 18A, 18B y 18C, respectivamente, y se resumen a continuación en la tabla 29. En general, el tratamiento con el ab anti-MASP-2 murina (mAbM11) antes de la irradiación aumentó la supervivencia de los ratones irradiados en comparación con los animales de control irradiados tratados con vehículo a niveles de exposición tanto de 6,5 (20 % de aumento) como de 7,0 Gy (30 % de aumento). Para el nivel de exposición de 6,5 Gy, el tratamiento posterior a la irradiación con el ab anti-MASP-2 murina dio como resultado un pequeño aumento en la supervivencia (15 %) en comparación con los animales de control irradiados tratados con vehículo.

En comparación, todos los animales tratados al nivel de exposición de 7,0 Gy y 8,0 Gy mostraron un aumento en la supervivencia en comparación con los animales de control irradiados tratados con vehículo. El mayor cambio en la supervivencia se produjo en animales que recibieron mAbOMS646, con un aumento del 45 % en la supervivencia en comparación con los animales de control al nivel de exposición de 7,0 Gy, y un aumento de un 12 % en la supervivencia al nivel de exposición 8,0 Gy. Además, para el nivel de exposición de 7,0 Gy, las mortalidades en el grupo tratado con mAbOMS646 se produjeron en primer lugar en el día 15 después de la irradiación, en comparación con el día 8 después de la irradiación para los animales de control irradiados tratados con vehículo, un aumento de 7 días respecto a los animales del control. El tiempo medio hasta la mortalidad para los ratones que recibieron mAbOMS646 (27,3 ± 1,3 días) aumentó significativamente (p = 0,0087) en comparación con los animales de control (20,7 ± 2,0 días) al nivel de exposición de 7,0 Gy.

El cambio porcentual en el peso corporal comparado con el día anterior a la irradiación (día -1) se registró durante la totalidad del estudio. Se produjo una pérdida de peso transitoria en todos los animales irradiados, sin evidencias de cambios diferenciales debidos al tratamiento con AbM11 o mAbOMS646 en comparación con los controles (datos no mostrados). A la finalización del estudio, todos los animales supervivientes mostraron un aumento en el peso corporal desde el peso corporal inicial (día -1).

TABLA 29: Tasas de su ervivencia de los animales ex erimentales ex uestos a radiación

continuación

Debate

El síndrome de radiación aguda consiste en tres subsíndromes definidos: hematopoyético, gastrointestinal y cerebrovascular. El síndrome observado depende de la dosis de radiación, donde los efectos hematopoyéticos se observan en seres humanos con una exposición significativa en todo o parte del cuerpo a exposiciones de radiación que superan 1 Gy. El síndrome hematopoyético se caracteriza por una depresión grave de la función de la médula ósea que da lugar a una pancitopenia con alteraciones en los hemogramas, glóbulos blancos y rojos, y plaquetas, que se produce en paralelo a los daños en el sistema inmunitario. Cuando se produce la cifra mínima, con pocos neutrófilos y plaquetas presentes en la sangre periférica, neutropenia, fiebre, complicaciones de síndrome séptico y hemorragia incontrolable producen la muerte.

En el presente estudio, se ha descubierto que la administración de mAbH6 aumenta la capacidad de supervivencia a una irradiación de cuerpo completo con rayos X en ratones macho Swiss-Webster irradiados a 7,0 Gy. De forma notable, para el nivel de exposición de 7,0 Gy, un 80 % de los animales que recibieron mAbOMS646 sobrevivieron a los 30 días en comparación con el 35 % de los animales de control irradiados tratados con vehículo. De forma importante, el primer día de muerte en este grupo tratado no se produjo hasta el día 15 después de la irradiación, un aumento de 7 días con respecto al observado en los animales de control irradiados tratados con vehículo. Curiosamente, para la exposición inferior a los rayos X (6,5 Gy), la administración de mAbOMS646 no pareció afectar a la capacidad de supervivencia ni retardar la mortalidad, en comparación con los animales de control irradiados tratados con vehículo. Podría haber múltiples razones para esta diferencia en la respuesta entre los niveles de exposición, aunque la comprobación de cualquiera de las hipótesis puede requerir estudios adicionales, incluyendo la recogida de muestras provisionales para cultivo microbiológico y parámetros hematológicos. Una explicación podría ser simplemente que el número de animales asignados a los grupos haya impedido observar alguna diferencia poco importante relacionada con el tratamiento. Por ejemplo, con tamaños de grupos de n = 20, la diferencia en la supervivencia entre un 65 %(mAbOMS646 a una exposición de 6,5 Gy) y un 80 %(mAbH6 a una exposición a 7,0 Gy) es de 3 animales. Por otro lado, la diferencia entre un 35 %(control con vehículo a una exposición de 7,0 Gy) y un 80 %(mAbOMS646 a una exposición de 7,0 Gy) es de 9 animales, y proporciona evidencias claras de una diferencia relacionada con el tratamiento.

Estos resultados demuestran que los anticuerpos anti-MASP-2 son eficaces en el tratamiento de un sujeto mamífero en riesgo, o que padece, los efectos perjudiciales del síndrome de radiación aguda.

Estudio n.° 2

Ratones Swiss Webster (n = 50) se expusieron a radiaciones ionizantes (8,0 Gy). El efecto del tratamiento con anticuerpos anti-MASP-2 (OMS646 5 mg/kg), administrados 18 horas antes y 2 horas después de la exposición a la radiación y, después de ello, semanalmente, se evaluó sobre la mortalidad.

Resultados del estudio n.° 2

Se determinó que la administración del anticuerpo anti-MASP-2 OMS646 aumentó la supervivencia en ratones expuestos a 8,0 Gy, con una mediana de la tasa de supervivencia ajustada de 4 a 6 días en comparación con los ratones que habían recibido el control con vehículo, y la mortalidad se redujo en un 12 % cuando se comparó con ratones que habían recibido el control con vehículo (ensayo del orden logarítmico, p = 0,040).

Estudio n.° 3

Ratones Swiss Webster (n = 50) se expusieron a radiaciones ionizantes (8,0 Gy) en los siguientes grupos: (I:vehículo) control con solución salina; (II: bajo) anticuerpo anti-MASP-2 OMS646 (5 mg/kg) administrado 18 horas antes de la irradiación y 2 horas después de la irradiación, III:alto) OMS646 (10 mg/kg) administrado 18 horas antes de la irradiación y 2 horas después de la irradiación; y (IV: alto posterior) OMS646 (10 mg/kg) administrado 2 horas después de la irradiación solamente.

Resultados del estudio n.° 3

Se determinó que la administración del anticuerpo anti-MASP-2 antes y después de la irradiación ajustó la supervivencia media de 4 a 5 días en comparación con los animales que recibieron el control con vehículo. La mortalidad entre los ratones tratados con el anticuerpo anti-MASP-2 se redujo en un 6-12 % en comparación con los ratones del control tratados con vehículo. Se apreció además que no se observaron efectos perjudiciales importantes del tratamiento.

En resumen, los resultados de este ejemplo demuestran que los anticuerpos anti-MASP-2 de la invención son eficaces en el tratamiento de un sujeto mamífero en riesgo de, o que padece los efectos perjudiciales del síndrome de radiación aguda.

Ejemplo 12

Este ejemplo describe la caracterización adicional del anticuerpo OMS646 (17D20m_d3521N11), anticuerpo IgG4 completamente humano anti-MASP-2 humana con una mutación en la región de bisagra).

Métodos:

El OMS646 (17D20m_d3521N11), anticuerpo IgG4 completamente humano anti-MASP-2 humana con una mutación en la región de bisagra) se generó como se describe anteriormente en los ejemplos 2-8. El anticuerpo OMS646 se purificó de los sobrenadantes de cultivo de una línea celular de expresión CHO transfectada de forma estable con construcciones de expresión que codifican las cadenas pesadas y ligeras de OMS646. Las células se cultivaron en medio PF-CHO durante 16 a 20 días y el sobrenadante sin células se recogió cuando la viabilidad celular bajó por debajo de un 50 %. El OMS646 se purificó por cromatografía de afinidad por proteína A después de intercambio iónico, concentración e intercambio del tampón a PBS.

1. OMS646 se une a MASP-2 humana con alta afinidad

Análisis por resonancia de plasmones superficiales (Biocore) de la unión de OMS646 inmovilizado a MASP-2 humana recombinante

Métodos:

Se inmovilizó OMS646 a diversas densidades mediante acoplamiento de amina a un chip CM5 y la asociación y disociación de MASP-2 humana recombinante disuelta a 9 nM, 3 nM, 1 nM o 0,3 nM se registró a lo largo del tiempo para determinar las constantes de velocidad de asociación (K^{o n} ) y disociación (K^{o f f}). La constante de unión en equilibrio (K^d ) se calculó basándose en los valores de K^on y K^{o ff} experimentales.

Resultados:

La figura 19 ilustra gráficamente los resultados del análisis por resonancia de plasmones superficiales (Biocore) sobre OMS646, que muestra que OMS646 inmovilizado se une a MASP-2 recombinante con una velocidad K^{o ff} de aproximadamente 1-3 x 10‘4 s_1 y una velocidad K^on de aproximadamente 1,6-3 x 106 M'1 s-1, lo que implica una afinidad (Kd de aproximadamente 92 pM) en estas condiciones experimentales. Dependiendo de la densidad de OMS646 inmovilizado y la concentración de MASP-2 en solución, se determinaron los valores de KD experimentales en el intervalo de 50 a 250 pM.

Ensayo ELISA de la unión de OMS646 a MASP-2 humana recombinante inmovilizada

Métodos: Se realizó un ensayo ELISA para evaluar la respuesta a la dosis de la unión de OMS646 a MASP-2 recombinante inmovilizada. Se inmovilizó MASP-2 humana recombinante (50 ng/pocillo) en placas de ELISA maxisorp (Nunc) en PBS durante la noche a 4 °C. El siguiente día, las placas se bloquearon lavando tres veces con PBS-Tween (0,05 %). Después se añadió una serie de dilución en serie de OMS646 en tampón de bloqueo (intervalo de concentración de 0,001 a 10 nM) a los pocillos recubiertos con MASP-2. Después de 1 hora de incubación para permitir la unión de OMS646 al antígeno inmovilizado, los pocillos se lavaron para eliminar el OMS646 no unido. El OMS646 unido se detectó usando anticuerpo de cabra marcado con HRP anti-IgG humana (Qualex; diluido 1:5000 en tampón de bloqueo) seguido de revelado con sustrato de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories). La reacción de peroxidasa se detuvo añadiendo 100 pl/pocillo de H³PO⁴ 1,0 M, y la conversión de sustrato se cuantificó fotométricamente a 450 nM usando un lector de placas de 96 pocillos (Spectramax). Se usó un algoritmo de ajuste de curva de un solo sitio de unión (Graphpad) para calcular los valores de Kd .

Resultados:

La figura 20 ilustra gráficamente los resultados del ensayo ELISA para determinar la afinidad de unión del OMS646 a MASP-2 humana inmovilizada. Como se muestra en la figura 20, se determinó que OMS646 se une a MASP-2 humana recombinante inmovilizada con una KD de 85 ± 5 pM, lo que es coherente con los resultados obtenidos en el análisis Biocore, como se muestra en la figura 19. Estos resultados demuestran que OMS646 tiene alta afinidad por MASP-2 humana, con una KD de aproximadamente 100 pM.

2. OMS646 inhibe la activación de C4 en una superficie recubierta con manano, pero no en una superficie recubierta con inmunocomplejo

Métodos:

La activación de C4 se midió sobre una superficial recubierta con manano o una superficie recubierta con inmunocomplejo en presencia o ausencia de OMS646 sobre el intervalo de concentración mostrado en las figuras 21A y 21B, respectivamente de la siguiente manera.

En el siguiente método para medir la actividad de escisión de C4 de MASP-2, pocillos de plástico recubiertos con manano se incubaron durante 60 minutos a 37 °C con suero humano al 1 % para activar la ruta de las lectinas. A continuación, los pocillos se lavaron y se analizaron para determinar la C4b humana inmovilizada sobre los pocillos con métodos de ELISA convencionales. La cantidad de C4b generada en este ensayo es una medida de la actividad de escisión de C4 dependiente de MASP-2. Se ensayaron anticuerpos anti-MASP-2 a concentraciones seleccionadas para determinar su capacidad de inhibir la escisión de C4.

Métodos:

Activación de C4 sobre superficies recubiertas con manano:

Para determinar el efecto de OMS646 sobre la ruta de las lectinas, se recubrieron placas de unión de medio Costar de 96 pocillos con manano por incubación durante la noche a 5 °C con 50 pl de una solución de 40 pg/ml de manano diluida en tampón de carbonato 50 mM, pH 9,5. Cada pocillo se lavó 3X con 200 pl de PBS. A continuación, los pocillos se bloquearon con 100 pl/pocillo de seroalbúmina bovina al 1 % en PBS y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente mezclando suavemente. Cada pocillo se lavó 3X con 200 pl de PBS. En una placa de 96 pocillos separada, se preincubaron diluciones en serie de anticuerpo contra MASP-2 (OMS646) con suero humano al 1 % en tampón GVB que contenía Ca++ y Mg++ (barbital 4.0 mM, NaCl 141 mM, MgCb 1,0 mM, CaCb 2,0 mM, gelatina al 0,1 %, pH 7,4) durante 1 hora a 5 °C. Estas mezclas de preincubación de anticuerpo-suero se transfirieron posteriormente a los pocillos correspondientes de la placa de ensayo recubierta con manano. La activación del complemento se inició por transferencia de la placa de ensayo a un baño de agua a 37 °C. Después de incubación de 60 minutos, la reacción se detuvo añadiendo EDTA a la mezcla de reacción. Cada pocillo se lavó 5 x 200 pl de PBS-Tween 20 (Tween 20 al 0,05 % en PBS), a continuación, cada pocillo se lavó 2X con 200 pl de PBS. Unos 100 pl/pocillo de dilución 1:100 de anticuerpo de conejo conjugado con biotina anti-C4c humana (Immunsystem AB, Uppsala, Suecia) se añadieron a PBS que contenía 2,0 mg/ml de seroalbúmina bovina (BSA) y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente mezclando suavemente. Cada pocillo se lavó con 5 x 200 pl de PBS. Unos 100 pl/pocillo de 0,1 g/ml de estreptavidina conjugada con peroxidasa (Pierce Chemical n.° 21126) se añadieron a PBS que contenía 2,0 mg/ml de BSA y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente en un agitador mezclando suavemente. Cada pocillo se lavó con 5 x 200 pl de PBS. se añadieron 100 pl/pocillo del sustrato de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. La reacción de peroxidasa se detuvo añadiendo 100 pl/pocillo de H³PO⁴ 1,0 M y se midió la DO⁴⁵⁰.

Activación de C4 sobre superficies recubiertas con inmunocomplejo

Para medir el efecto de OMS646 sobre la ruta clásica, el ensayo descrito anteriormente se modificó para usar placas recubiertas con inmunocomplejo. El ensayo se realizó como se detalla para la ruta de las lectinas anteriormente, con la diferencia de que los pocillos se recubrieron con IgG de oveja purificada usada para estimular la activación de C4 mediante la ruta clásica.

Resultados:

La figura 21A ilustra gráficamente el nivel de activación de C4 sobre una superficie recubierta con manano en presencia o ausencia de OMS646. La figura 21B ilustra gráficamente el nivel de activación de C4 sobre una superficie recubierta con IgG en presencia o ausencia de OMS646. Como se muestra en la figura 21A, OMS646 inhibe la activación de C4 sobre superficie recubierta con manano con una CI⁵⁰ de aproximadamente 0,5 nM en suero humano al 1 %. El valor de CI⁵⁰ obtenido en 10 experimentos independientes fue 0,52 ± 0,28 nM (promedio ± DT). En cambio, como se muestra en la figura 21B, OMS646 no inhibió la activación de C4 sobre una superficie recubierta con IgG. Estos resultados demuestran que OMS646 bloquea la activación dependiente de lectinas, pero no la dependiente de la ruta clásica, del componente C4 del complemento.

3. OMS646 bloquea específicamente la activación dependiente de lectinas de los componentes del complemento terminal

Métodos:

Se analizó el efecto de OMS646 sobre el depósito del complejo de ataque a la membrana (MAC) usando las condiciones específicas de la ruta para la ruta de las lectinas, la ruta clásica y la ruta alternativa. Para este fin, se usó el kit de cribado del complemento Wieslab Comp300 (Wieslab, Lund, Suecia ) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Resultados:

La figura 22A ilustra gráficamente el nivel de depósito de MAC en presencia o ausencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646) en condiciones de ensayo específicas de la ruta de las lectinas. La figura 22B ilustra gráficamente el nivel de depósito de MAC en presencia o ausencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646) en condiciones de ensayo específicas de la ruta clásica. La figura 22C ilustra gráficamente el nivel de depósito de MAC en presencia o ausencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646) en condiciones de ensayo específicas de la ruta alternativa.

Como se muestra en la figura 22A, OMS646 bloquea la activación mediada por la ruta de las lectinas del depósito de MAC con un valor de CI⁵⁰ de aproximadamente 1 nM. Sin embargo, OMS646 no tuvo efecto sobre el depósito de MAC generado por la activación mediada por la ruta clásica (figura 22B) o por la activación mediada por la ruta alternativa (figura 22C).

4. OMS646 inhibe de forma eficaz la activación de la ruta de las lectinas en condiciones fisiológicas

Métodos:

La activación de C3 y C4 dependiente de lectinas se evaluó en suero humano al 90 % en ausencia y en presencia de diversas concentraciones de OMS646 de la siguiente manera:

Ensayo de activación de C4

Para evaluar el efecto de OMS646 sobre la activación de C4 dependiente de lectinas, se recubrieron placas de unión de medio Costar de 96 pocillos durante la noche a 5 °C con 2 |jg de manano (50 j l de una solución de 40 jg/m l en tampón de carbonato 50 mM, pH 9,5. Las placas entonces se lavaron tres veces con 200 j l de PBS y se bloquearon con 100 jl/pocillo de seroalbúmina bovina al 1 % en PBS durante una hora a temperatura ambiente mezclando suavemente. En una placa de preincubación separada, se mezclaron concentraciones seleccionadas de OMS646 con suero humano al 90 % y se incubaron durante 1 hora en hielo. Estas mezclas de preincubación de anticuerpo-suero después se transfirieron a los pocillos recubiertos con manano de las placas de ensayo en hielo. Las placas de ensayo se incubaron a continuación durante 90 minutos en un baño de agua con hielo para permitir la activación del complemento. La reacción se detuvo añadiendo EDTA a la mezcla de reacción. Cada pocillo se lavó 5 veces con 200 j l de PBS-Tween 20 (Tween 20 al 0,05 % en PBS), a continuación, cada pocillo se lavó dos veces con 200 j l de PBS. Unos 100 jl/pocillo de dilución 1:1000 de anticuerpo de conejo conjugado con biotina anti-C4c humana (Immunsystem a B, Uppsala, Suecia) se añadieron a PBS que contenía 2,0 mg/ml de seroalbúmina bovina (BSA) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente mezclando suavemente. Cada pocillo se lavó 5 veces con 200 j l de PBS. Unos 100 jl/pocillo de 0,1 g/ml de estreptavidina conjugada con peroxidasa (Pierce Chemical n.° 21126) se añadieron a PBS que contenía 2,0 mg/ml de BSA y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador mezclando suavemente. Cada pocillo se lavó cinco veces con 200 j l de PBS. Unos 100 jl/pocillo del sustrato de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) se añadieron y se incubaron a temperatura ambiente durante 16 minutos. La reacción de peroxidasa se detuvo añadiendo 100 jl/pocillo de H³PO⁴ 1,0 M y se midió la DO⁴⁵⁰.

Ensayo de activación de C3

Para evaluar el efecto de OMS646 sobre la activación de C3 dependiente de lectinas, se realizaron ensayos de una manera idéntica al ensayo de activación de C4 descrito anteriormente, excepto que se evaluó el depósito de C3 como criterio de valoración. El depósito de C3 se cuantificó de la siguiente manera. Al final de la reacción de depósito del complemento, las placas se lavaron como se describe anteriormente y posteriormente se incubaron durante 1 hora con 100 jl/pocillo de dilución 1:5000 de anticuerpo de conejo anti-C3c humano (Dako) en PBS que contenía 2,0 mg/ml de seroalbúmina bovina (BSA). Cada placa se lavó cinco veces con 200 j l de PBS, y después se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con 100 jl/pocillo de anticuerpo de cabra marcado con HRP anti-IgG de conejo (American Qualex Antibodies) en PBS que contenía 2,0 mg/ml de BSA. Las placas se lavaron cinco veces con 200 |jl de PBS y después se añadieron 100 jl/pocillo del sustrato de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. La reacción de peroxidasa se detuvo añadiendo 100 jl/pocillo de H³PO⁴ 1,0 M y se midió la DO⁴⁵⁰. Los valores de CI⁵⁰ se derivaron aplicando un algoritmo de curva sigmoidea de respuesta a la dosis (GraphPad) a los conjuntos de datos experimentales.

Resultados:

La figura 23A ilustra gráficamente el nivel de depósito de C3 en presencia o ausencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646) sobre un intervalo de concentraciones en suero humano al 90 % en condiciones específicas de la ruta de las lectinas. La figura 23B ilustra gráficamente el nivel de depósito de C4 en presencia o ausencia de anticuerpo anti-MASP-2 (OMS646) sobre un intervalo de concentraciones en suero humano al 90 % en condiciones específicas de la ruta de las lectinas. Como se muestra en la figura 23A, OMS646 bloqueó el depósito de C3 en suero humano al 90 % con una CI⁵⁰ = 3 ± 1,5 nM (n = 6). Como se muestra en la figura 23B, OMS646 bloqueó el depósito de C4 con una CI⁵⁰ = 2,8 ± 1,3 nM (n = 6).

Estos resultados demuestran que OMS646 proporciona bloqueo potente y eficaz de la activación de la ruta de las lectinas en condiciones fisiológicas, proporcionando de este modo respaldo al uso de dosis terapéuticas bajas de OMS646. Basándose en estos datos, se espera que OMS646 bloquee > 90 % de la ruta de las lectinas en la circulación de un placiente a una concentración en plasma de 20 nM (3 jg/m l) o menos. Basándose en el volumen en plasma de un ser humano típico de aproximadamente 3 l, y el conocimiento de que la masa de material de anticuerpo administrado se retiene en el plasma (Lin Y.S. et al., JPET 288:371 (1999)), se espera que una dosis de OMS646 tan baja como 10 mg administrada por vía intravenosa será eficaz en el bloqueo de la ruta de las lectinas durante un periodo de tiempo breve (es decir, un periodo de tiempo transitorio, tal como de 1 a 3 días). En el contexto de una enfermedad crónica, puede ser ventajoso bloquear la ruta de las lectinas durante un periodo prolongado de tiempo para conseguir beneficio de tratamiento máximo. Por tanto, para dichas afecciones crónicas, puede preferirse una dosis de OMS646 de 100 mg, que se espera que sea eficaz en el bloqueo de la ruta de las lectinas en un sujeto humano adulto durante al menos una semana o más. Dada la lenta depuración y la larga semivida que se observa normalmente para los anticuerpos en seres humanos, es posible que una dosis de 100 mg de OMS646 pueda ser eficaz durante más tiempo que una semana, tal como durante 2 semanas, o incluso 4 semanas. Se espera que una dosis mayor de anticuerpo (es decir, mayor de 100 mg, tal como 200 mg, 500 mg o mayor, tal como 700 mg o 1000 mg), tenga una duración más larga de acción (por ejemplo, mayor de 2 semanas).

5. OMS646 bloquea la activación de la ruta de las lectinas en monos

Como se describe en el ejemplo 10 y como se muestra en la figura 17, se determinó que OMS646 anula la actividad sistémica de la ruta de las lectinas durante un periodo de tiempo de aproximadamente 72 horas después de administración intravenosa de OMS646 (3 mg/kg) en monos verdes africanos, seguida de recuperación de la actividad de la ruta de las lectinas.

Este ejemplo describe un estudio de seguimiento en que se evaluó la activación de C4 dependiente de lectinas en suero de mono verde africano al 90 % o en suero de macaco cangrejero al 90 % sobre un intervalo de concentraciones de OMS646 y en ausencia de OMS646, de la siguiente manera:

Para evaluar el efecto de OMS646 sobre la activación de C4 dependiente de lectinas en diferentes especies de primates no humanos, se recubrieron placas de unión de medio Costar de 96 pocillos durante la noche a 5 °C con 2 jg de manano (50 j l de una solución de 40 jg/m l en tampón de carbonato 50 mM, pH 9,5). Las placas entonces se lavaron tres veces con 200 j l de PBS y se bloquearon con 100 jl/pocillo de seroalbúmina bovina al 1 % en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente mezclando suavemente. En una placa de preincubación separada, se mezclaron concentraciones seleccionadas de OMS646 con suero al 90 % recogido de monos verdes africanos o macacos cangrejeros, y se incubaron 1 hora en hielo. Estas mezclas de preincubación de anticuerpo-suero después se transfirieron a los pocillos recubiertos con manano de las placas de ensayo en hielo. Las placas de ensayo se incubaron a continuación durante 90 minutos en un baño de agua con hielo para permitir la activación del complemento. La reacción se detuvo añadiendo EDTA a la mezcla de reacción. Cada pocillo se lavó cinco veces con 200 j l de PBS-Tween 20 (Tween 20 al 0,05 % en PBS), a continuación, cada pocillo se lavó dos veces con 200 j l de PBS. Unos 100 jl/pocillo de dilución 1:1000 de anticuerpo de conejo conjugado con biotina anti-C4c humana (Immunosystem Ab , Uppsala, Suecia) se añadieron a PBS que contenía 2,0 mg/ml de BSA y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente mezclando suavemente. Cada pocillo se lavó cinco veces con 200 j l de PBS. Unos 100 jl/pocillo de 0,1 g/ml de estreptavidina conjugada con peroxidasa (Pierce Chemical n.° 21126) se añadieron a PBS que contenía 2,0 mg/ml de BSA y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente en un agitador mezclando suavemente. Cada pocillo se lavó cinco veces con 200 j l de PBS. se añadieron 100 jl/pocillo del sustrato de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. La reacción de peroxidasa se detuvo añadiendo 100 jl/pocillo de H³PO⁴ 1,0 M y se midió la DO⁴⁵⁰. Los valores de CI⁵⁰ se derivaron aplicando un algoritmo de curva sigmoidea de respuesta a la dosis (GraphPad) a los conjuntos de datos experimentales.

Resultados:

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a MASP-2 humana e inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-2, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende:

a) una región variable de la cadena pesada que comprende el aminoácido expuesto en la SEQ ID NO: 20; y

b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 24.

2. Un anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en Fv, Fab, Fab', F(ab)² , F(ab')² , un anticuerpo monocatenario, un scFv, un anticuerpo univalente que carece de una región de bisagra y un anticuerpo completo.

3. Un anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en una molécula IgG2 y molécula IgG1 y una molécula IgG4.

4. Un anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 3, en el que la molécula IgG4 comprende una mutación S228P.

5. Una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo contra MASP-2, o fragmento de unión a antígeno del mismo, como se expone en la reivindicación 1.

6. Un casete de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo contra MASP-2 de la invención de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Una célula que comprende al menos una de las moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo contra MASP-2 de la reivindicación 1 de acuerdo con la reivindicación 5 o reivindicación 6.

8. Un método de generación de un anticuerpo anti-MASP-2 aislado, que comprende cultivar la célula de la reivindicación 7 en condiciones que permitan la expresión de las moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-MASP-2 de la reivindicación 1 y aislar dicho anticuerpo anti-MASP-2.

9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal humano anti-MASP-2, o fragmento del mismo, de la reivindicación 1 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

10. Una composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que la composición se formula para administración intraarterial, intravenosa, intracraneal, intramuscular, por inhalación, nasal o subcutánea.

11. Una composición farmacéutica de la reivindicación 9, que comprende una dosis unitaria de 1 mg a 1000 mg de un anticuerpo aislado o fragmento del mismo de la reivindicación 1.