CN115137816A - 抑制有需要的受试者的血管发生的方法 - Google Patents

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Abstract

在一个方面，本发明提供在患有或有风险发生血管发生‑依赖性疾病或病况的哺乳动物受试者中预防、治疗、逆转和/或延迟血管发生的方法，包括给予受试者有效抑制血管发生的量的MASP‑2抑制剂。在本发明的这些方面的一些实施方案中，MASP‑2抑制剂是MASP‑2抗体或其片段。

Description

抑制有需要的受试者的血管发生的方法
本申请是原案申请日为2017年3月31日、申请号为201780021420.X (国际申请号为PCT/US2017/025411)、发明名称为“抑制有需要的受试者的血管发生的方法”的专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月31日提交的临时申请号62/315,857的权益，其全部通过引用以其整体结合到本文中。
关于序列表的说明
本申请随附的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并由此通过引用结合到本说明书中。包含序列表的文本文件的名称为MP_1_0239_PCT_Sequence_Listing_20170321_ST25。文本文件为115 KB；创建于2017年3月21日；和经过EFS-Web随本说明书的申请一起提交。
背景
补体系统提供在人和其它脊椎动物中起始、扩大和协调对微生物感染和其它急性损伤的免疫反应的早期作用机制(M.K. Liszewski和J.P. Atkinson, 1993, Fundamental Immunology, 第三版, 由W.E. Paul编辑, Raven Press, Ltd., New York)。尽管补体活化对潜在的病原体提供重要的第一线防御，但促进防护性免疫反应的补体活性也可代表对宿主的潜在威胁(K.R. Kalli等, Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994;B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994)。例如，C3和C5蛋白水解产物募集和激活中性粒细胞。尽管对宿主防御是必不可少的，但激活的中性粒细胞无差别地释放破坏性的酶并可导致器官损伤。另外，补体活化可引起溶解的补体组分沉积在邻近的宿主细胞上以及微生物靶上，导致宿主细胞溶解。
补体系统还涉及许多急性和慢性疾病状态的发病机理，包括：心肌梗死、中风、ARDS、再灌注损伤、感染性休克、热烧伤后的毛细管渗漏、心肺分流术后的炎症、移植物排斥、类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力和阿尔茨海默氏病。在几乎所有的这些病况中，补体不是原因，而是涉及发病机理的数个因素之一。然而，补体活化可能是主要的病理机制和代表在许多这些疾病状态中临床控制的有效点。越来越承认在各种疾病状态中补体-介导的组织损伤的重要性，强调了对有效的补体抑制性药物的需求。迄今为止，艾库组单抗(eculizumab)(Solaris®)，一种针对补体组分C5的抗体，是唯一的补体-靶向药物，其已被批准用于人。然而，C5是在补体活化级联中位于“下游”的数个效应分子之一，并且C5的阻断并不抑制补体系统的活化。因此，与“下游”补体抑制剂相比，补体活化的起始步骤的抑制剂将具有显著的优势。
目前，广为接受的是，补体系统可通过三个不同的途径激活：经典途径、凝集素途径和替代途径。经典途径通常通过包含与外来颗粒(即，抗原)结合的宿主抗体的复合物触发，因此需要在先暴露于抗原以产生特异性抗体反应。因为经典途径的活化依赖于通过宿主的在先的适应性免疫反应，因此经典途径是获得性免疫系统的一部分。相比之下，凝集素和替代途径两者均不依赖于适应性免疫，并且是先天性免疫系统的一部分。
补体系统的活化导致丝氨酸蛋白酶酶原的序贯活化。经典途径活化的第一步骤是特定的识别分子C1q与抗原-结合的IgG和IgM分子的结合。C1q与Clr和Cls丝氨酸蛋白酶酶原作为称为Cl的复合物缔合。在C1q与免疫复合物结合后，Clr的Arg-Ile位点的自体蛋白水解裂解之后是Clr-介导的Cls的裂解和活化，其由此需要裂解C4和C2的能力。C4被裂解成两个片段，称为C4a和C4b，并且类似地，C2被裂解成C2a和C2b。C4b片段能够与邻近的羟基或氨基形成共价键和通过与激活的C2的C2a片段的非共价相互作用产生C3转化酶(C4b2a)。C3转化酶(C4b2a)通过蛋白水解裂解成C3a和C3b亚组分来激活C3，导致产生C5转化酶(C4b2a3b)，其通过裂解C5导致形成膜攻击复合物(与C6、C7、C8和C-9聚合物组合的C5b，亦称为“MAC”)，其可破坏细胞膜，导致细胞溶解。激活形式的C3和C4 (C3b和C4b)共价地沉积在外来靶标表面上，其被多个吞噬细胞上的补体受体识别。
补体系统通过凝集素途径活化的第一个步骤是凝集素途径-特异性的模式识别分子与其靶配体的结合。该过程起始凝集素途径-特异性的丝氨酸蛋白酶酶原的活化，其进而起始补体级联。凝集素途径中的模式识别分子包括一组糖-结合C型凝集素，即，甘露聚糖-结合凝集素(MBL)、胶原凝集素-11 (CL-11，亦称为CL-K1)、胶原凝集素-10 (CL-10，亦称为CL-L1)和三种不同的纤维胶凝蛋白，即，H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白和L-纤维胶凝蛋白，其通过纤维蛋白原-样结合结构域结合糖和蛋白的乙酰化结构(J. Lu等, Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, (2002); Holmskov等, Annu. Rev. Immunol. 21:547-578 (2003); Teh等, Immunology 101:225-232 (2000), J. Luet等, Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Hansen等, J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010)和Hendriksen等, J Immunol 191(12) :6117-27, 2013)。
Ikeda等首先证实，像C1q一样，在以C4-依赖性方式结合至酵母甘露聚糖-包被的红细胞时，MBL能够激活补体系统(Ikeda等, J. Biol. Chem. 262:7451-7454, (1987))。MBL，胶原凝集素蛋白家族的一个成员，是钙-依赖性凝集素，其结合具有位于吡喃糖环的赤道面中的3-和4-羟基的糖。因此，MBL的主要配体是D-甘露糖和N-乙酰基-D-葡糖胺，而不适应该立体要求的糖具有对MBL不可检出的亲和力(Weis等, Nature 360:127-134,(1992))。MBL和单价糖之间的相互作用非常弱，解离常数通常在单位数毫摩尔范围内。通过亲合力，即通过同时与彼此紧密靠近的多个单糖残基相互作用，MBL实现与聚糖配体紧密的特异性结合(Lee等, Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, (1992))。MBL识别通常装饰微生物例如细菌、酵母、寄生虫和某些病毒的糖模式。相比之下，MBL不识别D-半乳糖和唾液酸，次末端和末端的糖，其通常装饰在哺乳动物血浆和细胞表面糖蛋白上存在的"成熟的"复杂糖缀合物。认为该结合特异性促进“外来”表面的识别和有助于保护免于“自-活化”。然而，MBL以高亲和力结合至在哺乳动物细胞的内质网和高尔基体中隔离的N-连接的糖蛋白和糖脂上的高-甘露糖"前体"聚糖簇(Maynard等, J. Biol. Chem. 257:3788-3794, (1982))。因此，损坏的细胞是经过MBL结合的凝集素途径活化的潜在靶标，并且较近期的研究表明，CL-11是另一种凝集素途径识别亚组分，其在损伤或受伤细胞上起始凝集素途径活化(Farar等, J Clin Invest 126:1911-1925, 2016)。
纤维胶凝蛋白具有与MBL不同类型的凝集素结构域，称为纤维蛋白原-样结构域。纤维胶凝蛋白以Ca++-非依赖性的方式结合糖残基。在人中，已经鉴定了三类纤维胶凝蛋白(L-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白)。两类血清纤维胶凝蛋白，L-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白，共同具有对N-乙酰基-D-葡糖胺的特异性；然而，H-纤维胶凝蛋白还结合N-乙酰基-D-半乳糖按。L-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白、CL-11和MBL的糖特异性的差异意味着通过交错的糖缀合物，不同的凝集素可以是互补的和靶标不同的。这一概念得到了最近报道的支持，即，在凝集素途径的已知凝集素中，仅L-纤维胶凝蛋白特异性结合至脂磷壁酸，一种在所有革兰氏阳性细菌上存在的细胞壁糖缀合物(Lynch 等, J. Immunol. 172:1198-1202, (2004))。胶原凝集素(即，MBL、CL-11、CL-10和CL-11/CL-10复合物)和纤维胶凝蛋白在氨基酸序列中具有不显著的相似性。然而，这两类蛋白具有相似的结构域组织，并且像C1q一样，装配成寡聚体结构，其使多位点结合的可能性最大化。
MBL的血清浓度在健康群体中高度可变，这在遗传上受到MBL基因的启动子和编码区中的多态性/突变控制。作为急性期蛋白，MBL的表达还在炎症期间被增量调节。L-纤维胶凝蛋白以类似于MBL的浓度存在于血清中。因此，凝集素途径的L-纤维胶凝蛋白分支在生理重要性上潜在地与MBL臂相当。MBL和纤维胶凝蛋白也可作为调理素起作用，其允许吞噬细胞靶向MBL-和纤维胶凝蛋白-装饰的表面(参见Jack等, J Leukoc Biol., 77(3):328-36(2004), Matsushita和Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 (2002), Aoyagi等, J Immunol, 174(1):418-25(2005)。这种调理素作用需要这些蛋白与吞噬细胞受体的相互作用(Kuhlman 等, J. Exp. Med. 169:1733, (1989); Matsushita等, J. Biol. Chem. 271:2448-54, (1996))，其身份尚未确定。
人MBL通过其胶原-样结构域与独特的C1r/Cls-样丝氨酸蛋白酶(称为MBL-相关丝氨酸蛋白酶(MASP))形成特异性和高-亲和力相互作用。迄今为止，描述了三种MASP。首先，单一酶"MASP"被鉴定和表征为负责补体级联起始(即，裂解C2和C4)的酶(Matsushita等, J Exp Med 176(6):1497-1502 (1992); Ji等, J. Immunol. 150:571-578, (1993))。随后确定MASP活性事实上是两种蛋白酶的混合物：MASP-1和MASP-2 (Thiel等, Nature 386:506-510, (1997))。然而，已证实MBL-MASP-2复合物单独足以补体活化(Vorup-Jensen等,J. Immunol.165:2093-2100, (2000))。此外，MASP-2单独以高速裂解C2和C4(Ambrus等,J. Immunol. 170:1374-1382, (2003))。因此，MASP-2是负责活化C4和C2以产生C3转化酶C4b2a的蛋白酶。这与经典途径的C1复合物显著不同，在经典途径中两种特异性丝氨酸蛋白酶(C1r和C1s)的协调作用导致补体系统的活化。另外，第三种新的蛋白酶MASP-3已经分离(Dahl, M.R.等, Immunity 15:127-35, 2001)。MASP-1和MASP-3是相同基因的可变剪接产物。
MASP与Cl复合物的酶组分Clr和Cls共有相同的结构域组织(Sim等, Biochem. Soc. Trans. 28:545, (2000))。这些结构域包括N-末端Clr/Cls/海胆VEGF/骨形态发生蛋白(CUB)结构域、表皮生长因子-样结构域、第二CUB结构域、串联的补体控制蛋白结构域和丝氨酸蛋白酶结构域。如在C1蛋白酶中，MASP-2的活化通过裂解邻近丝氨酸蛋白酶结构域的Arg-I1e键发生，这将所述酶分成二硫键连接的A和B链，后者由丝氨酸蛋白酶结构域组成。
MBL还可与MASP-2的可变剪接形式(称为19 kDa的MBL-相关蛋白(MAp19)或小MBL-相关蛋白(sMAP)，其缺少MASP-2的催化活性)缔合(Stover, J. Immunol. 162:3481-90,(1999); Takahashi等, Int. Immunol. 11:859-863, (1999))。MAp19包括MASP-2的起始两个结构域，接着是四个独特氨基酸的额外序列。Map19的功能尚不清楚(Degn 等, J Immunol.方法, 2011)。MASP-1和MASP-2基因分别位于人第3和1号染色体上(Schwaeble等,Immunobiology 205:455-466, (2002))。
若干条证据表明，存在不同的MBL-MASP复合物和在血清中大部分的MASP不与MBL复合(Thiel等, J. Immunol. 165:878-887, (2000))。H-和L-纤维胶凝蛋白两者均结合所有的MASP和激活凝集素补体途径，如MBL一样(Dahl等, Immunity 15:127-35, (2001);Matsushita等, J. Immunol. 168:3502-3506, (2002))。凝集素和经典途径两者形成共同的C3转化酶(C4b2a)，这两个途径在该步骤处汇合。
广泛认为在首次感染的宿主中，凝集素途径在宿主防御感染方面具有重要作用。MBL参与宿主防御的有力证据来自功能MBL的血清水平降低的患者的分析(Kilpatrick,Biochim. Biophys. Acta1572:401-413, (2002))。这样的患者显示对复发细菌和真菌感染的易感性。在生命的早期，因为母体来源的抗体滴度减弱，在易损性的表观窗口期间，但在抗体反应的完全库发展之前，这些症状通常是明显的。该综合征经常因为MBL的胶原部分的数个位点的突变导致，其干扰MBL寡聚体的正确形成。然而，因为MBL可起不依赖于补体的调理素的作用，尚不清楚对感染的易感性增加归因于受损的补体活化的程度。
与经典和凝集素途径相反，未发现替代途径的引发剂实现C1q和凝集素在其它两个途径中进行的识别功能。目前广泛公认的是，替代途径自发地经历低水平的更新活化(turnover activation)，其可容易地在外来或其它异常表面(细菌、酵母、病毒感染的细胞或受损组织)上被放大，所述表面缺少控制自发补体活化的适当分子元件。存在四种血浆蛋白直接参与替代途径的活化：C3、因子B和D、和备解素。
尽管广泛的证据表明在非感染性人类疾病的发病机理中牵涉到经典和替代补体途径两者，但凝集素途径的作用仅刚开始评估。最近的研究提供了凝集素途径的活化可能是在缺血/再灌注损伤中补体活化和相关炎症的原因的证据。Collard等(2000)报道了经受氧化应激的培养的内皮细胞结合MBL和在暴露于人血清时显示C3沉积(Collard等, Am. J. Pathol. 156:1549-1556, (2000))。另外，用封闭性抗-MBL单克隆抗体处理人血清抑制MBL结合和补体活化。这些发现延伸到心肌缺血-再灌注的大鼠模型，其中与用对照抗体处理的大鼠相比，用针对大鼠MBL的封闭性抗体处理的大鼠显示在冠状动脉阻塞后显著较低的心肌损伤(Jordan等, Circulation 104:1413-1418, (2001))。在氧化应激后MBL与血管内皮结合的分子机制尚不清楚；最近的研究表明在氧化应激后凝集素途径的活化可通过MBL结合血管内皮细胞角蛋白和不结合糖缀合物而被介导(Collard等, Am. J. Pathol. 159:1045-1054, (2001))。其它研究在缺血/再灌注损伤的发病机理中牵涉到经典和替代途径，并且凝集素途径在该疾病中的作用仍有争议(Riedermann, N.C.等, Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003)。
最近的研究表明，需要MASP-1 (和可能还有MASP-3)以将替代途径活化酶因子D从其酶原形式转化成其酶活性形式(参见Takahashi M.等, J Exp Med 207(1):29-37(2010))。该过程的生理学重要性通过在MASP-1/3-缺陷小鼠的血浆中缺少替代途径功能活性来说明。从天然C3蛋白水解产生C3b对于替代途径发挥功能是必需的。因为替代途径C3转化酶(C3bBb)包含C3b作为基本亚基，关于经过替代途径的第一C3b的来源的疑问提出了令人困扰的问题和引起了大量的研究。
C3属于包含罕见的称为硫酯键的翻译后修饰的蛋白(以及C4和α-2巨球蛋白)的家族。硫酯基团包含谷氨酰胺，其末端羰基与远离三个氨基酸的半胱氨酸的巯基形成共价硫酯键。该键是不稳定的和亲电子谷氨酰基-硫酯可与亲核部分例如羟基或氨基反应，因此与其它分子形成共价键。当隔离在完整C3的疏水袋内时，硫酯键是相当稳定的。然而，C3蛋白水解裂解成C3a和C3b导致高反应性硫酯键暴露在C3b上，并且在包括羟基或氨基的邻近部分亲核攻击后，C3b变成与靶标共价地连接。除了其在C3b与补体靶标共价连接中的充分证明的作用之外，还认为C3硫酯在触发替代途径中具有关键的作用。根据广泛公认的"tick-over理论"，替代途径通过产生液相转化酶iC3Bb而开始，其自具有水解的硫酯的C3 (iC3；C3(H2O))和因子B形成(Lachmann, P.J.等, Springer Semin. Immunopathol. 7:143-162, (1984))。C3b-样C3(H2O)通过蛋白的内部硫酯的缓慢自发水解，自天然C3产生(Pangburn, M.K.等, J. Exp. Med. 154:856-867, 1981)。通过C3(H2O)Bb转化酶的活性，C3b分子沉积在靶标表面上，从而引发替代途径。
关于替代途径的活化的引发剂了解甚少。认为激活剂包括酵母细胞壁(酵母聚糖)、许多纯的多糖、兔红细胞、某些免疫球蛋白、病毒、真菌、细菌、动物肿瘤细胞、寄生虫和受损的细胞。这些激活剂共同的唯一特征是存在糖，但糖结构的复杂性和多样性使得其难以建立共有的被识别的分子决定簇。广泛公认的是，替代途径活化通过在该途径的抑制性调节组分(例如因子H、因子I、DAF和CR1以及作为替代途径的唯一正调节剂的备解素)之间的精细平衡得到控制(参见Schwaeble W.J.和Reid K.B., Immunol Today 20(1):17-21(1999))。
除了上述明显未调节的活化机制之外，替代途径还可为凝集素/经典途径C3转化酶(C4b2a)提供有力的扩增环，因为产生的任何C3b可与因子B一起参与形成另外的替代途径C3转化酶(C3bBb)。替代途径C3转化酶通过结合备解素而稳定。备解素延长替代途径C3转化酶的半寿期6-10倍。将C3b添加至替代途径C3转化酶导致形成替代途径C5转化酶。
认为所有三个途径(即，经典、凝集素和替代)在C5处汇合，其经裂解形成具有多种促炎效应的产物。汇合的途径被称为末端补体途径。C5a是最有效的过敏毒素，诱发平滑肌和血管紧张度以及血管通透性的改变。它也是有力的化学吸引素以及中性粒细胞和单核细胞的活化剂。C5a-介导的细胞活化可通过诱导释放多种另外的炎性介质，包括细胞因子、水解酶、花生四烯酸代谢物和活性氧物质，显著放大炎性反应。C5裂解导致形成C5b-9，亦称为膜攻击复合物(MAC)。现在存在有力的证据表明，除了其作为溶解孔-形成复合物的作用之外，亚溶解的(sublytic) MAC沉积还可在炎症中起重要作用。
除了其在免疫防御中的基本作用之外，在许多临床条件下补体系统还有助于组织损伤。因此，对开发治疗上有效的补体抑制剂以预防这些不良作用存在迫切的需要。
非常确定的是，血管发生参与各种病症的发病机制，所述病症包括实体瘤和转移，和眼睛新血管疾病，例如年龄相关性黄斑变性(AMD)、增生性糖尿病视网膜病和新生血管性青光眼。
考虑到血管发生在许多疾病和病症中的作用，还对开发治疗上有效的血管发生抑制剂存在迫切的需要。
简述
提供本简述，以简单的形式介绍所选择的概念，其在下文的详细描述中进一步描述。本简述不意欲鉴别所要求保护的主题的关键特征，也不意欲用作确定所要求保护的主题的范围的辅助。
在一个方面，本发明提供在患有或有风险发生血管发生-依赖性疾病或病况的哺乳动物受试者中预防、治疗、逆转和/或延迟血管发生的方法，包括给予受试者有效抑制血管发生的量的MASP-2抑制剂。在本发明的这些方面的一些实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其片段。在进一步的实施方案中，MASP-2抗体具有减少的效应子功能。在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2抑制性肽或非-肽MASP-2抑制剂。
在另一方面，本发明提供用于抑制血管发生的不良作用的组合物，其包含治疗有效量的MASP-2抑制剂和药学上可接受的载体。还提供用于制造用于在有需要的活受试者中抑制血管发生的不良作用的药物的方法，其包含在药用载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂。还提供用于制造用于抑制血管发生以治疗下文所述的每一种病况、疾病和病症的药物的方法。
本发明的方法、组合物和药物可用于抑制患有本文进一步描述的急性或慢性病理状态或损伤的哺乳动物受试者(包括人)体内的血管发生的不良作用。
在本发明的另一方面，提供了在患有血管发生-依赖性疾病或病况的哺乳动物受试者中抑制血管发生的方法，包括给予受试者包含有效抑制血管发生的量的MASP-2抑制剂的组合物。在一些实施方案中，血管发生-依赖性疾病或病况是血管发生-依赖性癌症，例如选自实体瘤、血荷肿瘤、高风险类癌肿瘤和肿瘤转移的血管发生-依赖性癌症。在一些实施方案中，血管发生-依赖性疾病或病况是血管发生-依赖性良性肿瘤，例如选自血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼、类癌肿瘤和脓性肉芽肿的血管发生-依赖性良性肿瘤。在一些实施方案中，血管发生-依赖性疾病或病况是眼睛血管发生性疾病或病况，例如选自年龄相关性黄斑变性(AMD)、葡萄膜炎、眼睛黑素瘤、角膜新生血管形成、原发性翼状胬肉、HSV间质性角膜炎、HSV-1诱导的角膜淋巴血管发生、增生性糖尿病视网膜病、早产儿视网膜病、视网膜静脉闭塞、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼和潮红的眼睛血管发生性疾病或病况。
在另一方面，本发明提供治疗受试者的方法，所述受试者患有选自AMD、葡萄膜炎、眼睛黑素瘤、角膜新生血管形成、原发性翼状胬肉、HSV间质性角膜炎、HSV-1诱导的角膜淋巴血管发生、增生性糖尿病视网膜病、糖尿病黄斑水肿、早产儿视网膜病、视网膜静脉闭塞、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼、增生性糖尿病视网膜病继发性玻璃体出血、视神经脊髓炎和潮红的眼睛血管发生性疾病或病况，包括给予受试者有效抑制血管发生的量的MASP-2抑制剂。
在另一方面，本发明提供抑制肿瘤血管发生的方法，包括给予具有癌症的受试者有效抑制血管发生的量的MASP-2抑制剂。
附图简述
当结合附图时，本发明的前述方面和许多附带的优势将变得更易理解，如同参考下面的详细描述将变得更好理解一样，其中：
图1是说明人MASP-2的基因组结构的图示；
图2A是说明人MASP-2蛋白的结构域结构的示意图；
图2B是说明人MAp19蛋白的结构域结构的示意图；
图3是说明鼠MASP-2敲除策略的图示；
图4是说明人MASP-2微基因构建体的图示；
图5A表示证明MASP-2-缺陷导致凝集素-途径-介导的C4活化的丢失的结果，如实施例2中所述的通过在甘露聚糖上缺乏C4b沉积所测量的；
图5B表示证明MASP-2-缺陷导致凝集素-途径-介导的C4活化的丢失的结果，如实施例2中所述的通过在酵母聚糖上缺乏C4b沉积所测量的；
图5C表示证明获自MASP-2+/-、MASP-2-/-和野生型品系的血清样品的相对C4活化水平的结果，如实施例2中所述的通过在甘露聚糖和酵母聚糖上的C4b沉积所测量的；
图6表示证明添加鼠重组MASP-2至MASP-2-/-血清样品以蛋白浓度依赖性方式恢复凝集素-途径-介导的C4活化的结果，如实施例2中所述的通过在甘露聚糖上的C4b沉积所测量的；
图7表示证明经典途径在MASP-2-/-品系中起作用的结果，如实施例8中所述的；
图8A表示证明抗-MASP-2 Fab2抗体#11抑制C3转化酶形成的结果，如实施例10中所述的；
图8B表示证明抗-MASP-2 Fab2抗体#11结合天然大鼠MASP-2的结果，如实施例10中所述的；
图8C表示证明抗-MASP-2 Fab2抗体#41抑制C4裂解的结果，如实施例10中所述的；
图9表示证明还发现抑制C3转化酶形成的所有测试的抗-MASP-2 Fab2抗体抑制C4裂解的结果，如实施例10中所述的；
图10是说明用于抗-MASP-2封闭Fab2抗体的表位作图的源自大鼠MASP-2的重组多肽的图示，如实施例11中所述的；
图11表示证明抗-MASP-2 Fab2 #40和#60结合大鼠MASP-2多肽的结果，如实施例11中所述的；
图12A表示显示在分离自野生型(+/+)和MASP-2 (-/-)小鼠的RPE-脉络膜复合物中基线VEGF蛋白水平的结果，如实施例12中所述的；
图12B表示显示在黄斑变性模型中在激光诱导的损伤后在第3天在野生型(+/+)和MASP-2 (-/-)小鼠中在RPE-脉络膜复合物中VEGF蛋白水平的结果，如实施例12中所述的；
图13表示显示在野生型(+/+)和MASP-2 (-/-)小鼠中在激光诱导的损伤后在第7天平均脉络膜新血管形成(CNV)体积的结果，如实施例12中所述的；
图14图示说明了在WT小鼠中皮下(SC)给予0.3 mg/kg或1.0 mg/kg的小鼠抗-MASP-2单克隆抗体后在多个时间点获得的样品中按对照的%测量的C4b沉积的水平，如实施例13中所述的；
图15图示说明了在WT小鼠中在腹膜内(IP)给予0.6 mg/kg的小鼠抗-MASP-2单克隆抗体后在多个时间点获得的样品中按对照的%测量的C4b沉积的水平，如实施例13中所述的；
图16图示说明了在用单次IP注射0.3 mg/kg或1.0 mg/kg小鼠抗-MASP-2单克隆抗体预处理的WT (+/+)小鼠中在激光诱导的损伤后第7天平均脉络膜新血管形成(CNV)体积，如实施例14中所述的；
图17A图示说明了在人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的存在或不存在下在凝集素途径-特异性测定条件下MAC沉积的水平，证明OMS646抑制凝集素-介导的MAC沉积，IC50值为大约1 nM，如实施例15中所述的；
图17B图示说明了在人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的存在或不存在下在经典途径-特异性测定条件下MAC沉积的水平，证明OMS646不抑制经典途径-介导的MAC沉积，如实施例15中所述的；
图17C图示说明了在人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的存在或不存在下在替代途径-特异性测定条件下MAC沉积的水平，证明OMS646不抑制替代途径-介导的MAC沉积，如实施例15中所述的；
图18图示说明了在小鼠中人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的药代动力学(PK)概况，显示OMS646浓度(平均值，n=3只动物/组)作为以指定剂量给予后时间的函数，如实施例15中所述的；
图19A图示说明了人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的药效学(PD)反应，作为在静脉内给予后在小鼠中系统凝集素途径活性的下降测量，如实施例15中所述的；
图19B图示说明了人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的药效学(PD)反应，作为在皮下给予后在小鼠中系统凝集素途径活性的下降测量，如实施例15中所述的；和
图20图示说明了脉络膜新血管形成(CNV)面积，作为在用SC给予的2mg/kg、5mg/kg或20mg/kg人MASP-2单克隆抗体(OMS646)或IP给予的抗-VEGF抗体预处理的WT (+/+)小鼠中在激光诱导的损伤后第7天的损伤面积的百分比，如实施例16中所述的。
序列表描述
SEQ ID NO:1 人MAp19 cDNA
SEQ ID NO:2 人MAp19蛋白(具有前导序列)
SEQ ID NO:3 人MAp19蛋白(成熟)
SEQ ID NO:4 人MASP-2 cDNA
SEQ ID NO:5 人MASP-2蛋白(具有前导序列)
SEQ ID NO:6 人MASP-2蛋白(成熟)
SEQ ID NO:7 人MASP-2 gDNA (外显子1-6)
抗原：(参考MASP-2成熟蛋白)
SEQ ID NO:8 CUBI序列(aa 1-121)
SEQ ID NO:9 CUBEGF序列(aa 1-166)
SEQ ID NO:10 CUBEGFCUBII (aa 1-293)
SEQ ID NO:11 EGF区(aa 122-166)
SEQ ID NO:12 丝氨酸蛋白酶结构域(aa 429 – 671)
SEQ ID NO:13 无活性的丝氨酸蛋白酶结构域(aa 610-625，具有Ser618至Ala突变)
SEQ ID NO:14 TPLGPKWPEPVFGRL (CUB1肽)
SEQ ID NO:15 TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ (CUBI肽)
SEQ ID NO:16 TFRSDYSN (MBL结合区核心)
SEQ ID NO:17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF (MBL结合区)
SEQ ID NO:18 IDECQVAPG (EGF肽)
SEQ ID NO:19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV (丝氨酸蛋白酶结合核心)详细描述
肽抑制剂：
SEQ ID NO:20 MBL全长cDNA
SEQ ID NO:21 MBL全长蛋白
SEQ ID NO:22 OGK-X-GP (共有结合)
SEQ ID NO:23 OGKLG
SEQ ID NO:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G
SEQ ID NO:25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO
SEQ ID NO:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOG
SEQ ID NO:27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO (人h-纤维胶凝蛋白)
SEQ ID NO:28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGAOGEO (人纤维胶凝蛋白 p35)
SEQ ID NO:29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI (C4裂解位点)
表达抑制剂：
SEQ ID NO:30 CUBI-EGF结构域的cDNA (SEQ ID NO:4的核苷酸22-680)
SEQ ID NO:31
5' CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC 3' SEQ ID NO:4的核苷酸12-45，包括MASP-2翻译起始位点(有义)
SEQ ID NO:32
5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3' SEQ ID NO:4的核苷酸361-396，编码包括MASP-2 MBL结合位点的区域(有义)
SEQ ID NO:33
5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3' SEQ ID NO:4的核苷酸610-642，编码包括CUBII结构域的区域
克隆引物：
SEQ ID NO:34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC (用于CUB的5' PCR)
SEQ ID NO:35 GGAATTCCTAGGCTGCATA (的用于CUB3' PCR)
SEQ ID NO:36 GGAATTCCTACAGGGCGCT (用于CUBIEGF的3' PCR)
SEQ ID NO:37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT (用于CUBIEGFCUBII的3' PCR)
SEQ ID NOS:38-47是用于人源化的抗体的克隆引物
SEQ ID NO:48是9 aa肽键
表达载体：
SEQ ID NO:49是MASP-2微基因插入片段
SEQ ID NO: 50是鼠MASP-2 cDNA
SEQ ID NO: 51是鼠MASP-2蛋白(含前导序列)
SEQ ID NO: 52是成熟的鼠MASP-2蛋白
SEQ ID NO: 53是大鼠MASP-2 cDNA
SEQ ID NO: 54是大鼠MASP-2蛋白(含前导序列)
SEQ ID NO: 55是成熟的大鼠MASP-2蛋白
SEQ ID NO: 56-59是用于人MASP-2的定点诱变的寡核苷酸，其用于产生人MASP-2A
SEQ ID NO: 60-63是用于鼠MASP-2的定点诱变的寡核苷酸，其用于产生鼠MASP-2A
SEQ ID NO: 64-65是用于大鼠MASP-2的定点诱变的寡核苷酸，其用于产生大鼠MASP-2A
SEQ ID NO: 66 编码17D20_dc35VH21N11VL (OMS646)重链可变区(VH) (不含信号肽)的DNA
SEQ ID NO: 67 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646)重链可变区(VH)多肽
SEQ ID NO: 68 17N16mc重链可变区(VH)多肽
SEQ ID NO:69 17D20_dc21N11VL (OMS644)轻链可变区(VL)多肽
SEQ ID NO:70 编码17N16_dc17N9 (OMS641)轻链可变区(VL) (不含信号肽)的DNA
SEQ ID NO:71 17N16_dc17N9 (OMS641)轻链可变区(VL)多肽
详细描述
本发明基于本发明人的出人意料的发现，即有可能抑制凝集素介导的MASP-2途径，同时保留经典途径完整。本发明还描述了MASP-2作为用于抑制与凝集素-介导的补体途径活化有关的细胞损伤，同时保留免疫系统的经典(C1q-依赖性)途径组分完整的治疗靶标的用途。
I. 定义
除非本文明确定义，否则本文使用的所有术语具有与本发明技术领域的普通技术人员所理解的相同的含义。当术语用于说明书和权利要求书中以描述本发明时，为提供关于术语的清楚性，提供以下定义。
如本文所用的，术语“MASP-2-依赖性补体活化”包括凝集素途径的MASP-2-依赖性活化，其在生理学条件下发生(即，在Ca++存在的情况下)，导致形成凝集素途径C3转化酶C4b2a和在C3裂解产物C3b积聚时，随后形成C5转化酶C4b2a(C3b)n，其已经确定主要引起调理素作用。
如本文所用的，术语"替代途径"是指补体活化，其例如通过来自真菌和酵母细胞壁的酵母聚糖、来自革兰氏阴性细菌外膜的脂多糖(LPS)和兔红细胞，以及许多纯的多糖、兔红细胞、病毒、细菌、动物肿瘤细胞、寄生虫和受损的细胞触发，并且其在传统上被认为自补体因子C3自发蛋白水解产生C3b而产生。
如本文所用的，术语"凝集素途径"是指补体活化，其经过血清和非-血清糖结合蛋白的特异性结合发生，所述糖结合蛋白包括甘露聚糖-结合凝集素(MBL)、CL-11和纤维胶凝蛋白 (H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白)。
如本文所用的，术语"经典途径"是指补体活化，其通过与外来颗粒结合的抗体触发并且需要结合识别分子C1q。
如本文所用的，术语"MASP-2抑制剂"是指与MASP-2结合或直接相互作用的任何试剂，其有效抑制MASP-2-依赖性补体活化，包括抗-MASP-2抗体和其MASP-2结合片段、天然和合成肽、小分子、可溶性MASP-2受体、表达抑制剂和分离的天然抑制剂，还包括与MASP-2竞争结合凝集素途径中的另一识别分子(例如，MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白)的肽，但不包括结合这样的其它识别分子的抗体。可用于本发明的方法的MASP-2抑制剂可减少MASP-2-依赖性补体活化超过20%，例如超过50%，例如超过90%。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂减少MASP-2-依赖性补体活化超过90% (即，导致仅10%或更小的MASP-2补体活化)。
如本文所用的，术语“血管发生”是指从先存在的血管中新的微血管生长。
如本文所用的，术语“新-血管发生”是指当其参与并非生理的或是病理的疾病或病况时的血管发生。
如本文所用的，术语"抗体"包括源自任何产生抗体的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔和灵长类动物包括人)或杂交瘤、噬菌体筛选、重组表达或转基因动物(或产生抗体或抗体片段的其它方法)的抗体和其抗体片段，其特异性对结合靶多肽，例如MASP-2、多肽或其部分。术语“抗体”不意欲受限于抗体的来源或其制备方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体筛选、重组表达、转基因动物、肽合成等)。示例性的抗体包括多克隆、单克隆和重组抗体；泛-特异性、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、三特异性抗体)；人源化的抗体；鼠抗体；嵌合的小鼠-人、小鼠-灵长类动物、灵长类动物-人单克隆抗体；和抗-个体型抗体，和可以是任何完整的抗体或其片段。如本文所用的，术语“抗体”不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且包括其片段(例如dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(ScFv)、其合成变体、天然存在的变体、包括具有所需特异性的抗原-结合片段的抗体部分的融合蛋白、人源化的抗体、嵌合抗体和包括具有所需特异性的抗原-结合位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。
“单克隆抗体"是指同质抗体群，其中所述单克隆抗体包括参与表位的选择性结合的氨基酸(天然存在和非天然存在的)。单克隆抗体对靶抗原具有高度特异性。术语"单克隆抗体"不仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且包括其片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(ScFv)、其变体、包括抗原-结合部分的融合蛋白、人源化的单克隆抗体、嵌合的单克隆抗体和包括具有所需特异性和结合表位的能力的抗原-结合片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。不意欲限制抗体的来源或其制备方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体筛选、重组表达、转基因动物等)。该术语包括完整的免疫球蛋白以及上述在"抗体"的定义下的片段等。
如本文所用的，术语"抗体片段"是指源自全长抗体或与全长抗体有关的部分，例如抗-MASP-2抗体，通常包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的说明性实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和Fv片段、scFv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和自抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用的，"单链Fv"或"scFv"抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。一般而言，Fv多肽还包括VH和VL结构域之间的多肽接头，其能够使scFv形成抗原结合所需的结构。
如本文所用的，"嵌合抗体"是包含源自非-人物种(例如，啮齿动物)抗体的可变结构域和互补决定区的重组蛋白，而抗体分子的其余部分源自人抗体。
如本文所用的，"人源化的抗体"是嵌合抗体，其包括符合源自移植到人抗体框架中的非-人免疫球蛋白的特异性互补决定区的最小序列。人源化的抗体通常是重组蛋白，其中仅抗体互补决定区是非-人来源。
如本文所用的，术语"甘露聚糖-结合凝集素" ("MBL")等同于甘露聚糖-结合蛋白("MBP")。
如本文所用的，"膜攻击复合物" ("MAC")是指插入到膜中并破坏膜的末端5种补体组分(C5b与C6、C7、C8和C-9组合)的复合物(亦称为C5b-9)。
如本文所用的，"受试者"包括所有哺乳动物，包括而不限于人、非-人灵长类动物、狗、猫、马、绵羊、山羊、牛、兔、猪和啮齿动物。
如本文所用的，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(Ala;A)、天冬酰胺(Asn;N)、天冬氨酸(Asp;D)、精氨酸(Arg;R)、半胱氨酸(Cys;C)、谷氨酸(Glu;E)、谷氨酰胺(Gln;Q)、甘氨酸(Gly;G)、组氨酸(His;H)、异亮氨酸(Ile;I)、亮氨酸(Leu;L)、赖氨酸(Lys;K)、甲硫氨酸(Met;M)、苯丙氨酸(Phe;F)、脯氨酸(Pro;P)、丝氨酸(Ser;S)、苏氨酸(Thr;T)、色氨酸(Trp;W)、酪氨酸(Tyr;Y)和缬氨酸(Val;V)。
在最广泛的意义上，根据各个氨基酸的侧链的化学性质，天然存在的氨基酸可分成多个组。"疏水"氨基酸是指Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、Cys或Pro。"亲水"氨基酸是指Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His。氨基酸的这种分组可进一步如下细分。"不带电荷亲水"氨基酸是指Ser、Thr、Asn或Gln。"酸性"氨基酸是指Glu或Asp。"碱性"氨基酸是指Lys、Arg或His。
如本文所用的，术语"保守氨基酸置换"通过在以下各组内的氨基酸中置换来说明：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(3)丝氨酸和苏氨酸；(4)天冬氨酸和谷氨酸；(5)谷氨酰胺和天冬酰胺；和(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
如本文所用的术语"寡核苷酸"是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚体或多聚体。该术语还涵盖了包含天然存在的核苷酸、糖和共价核苷间(主链)键以及具有非天然存在的修饰的寡核苷酸的那些寡核苷碱基。
如本文所用的，"表位"是指抗体所结合的蛋白(例如，人MASP-2蛋白)上的位点。"重叠表位"包括至少一个(例如，2、3、4、5或6个)共同氨基酸残基，包括线性和非线性表位。
如本文所用的，术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"可互换使用，意指任何肽-连接的氨基酸链，无论长度或翻译后修饰如何。本文所述的MASP-2蛋白可包含或可以是野生型蛋白，或可以是具有不超过50个(例如，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40或50个)保守氨基酸置换的变体。保守置换通常包括在以下组内的置换：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。
在一些实施方案中，人MASP-2蛋白可具有这样的氨基酸序列，其与具有SEQ IDNO: 5中所示的氨基酸序列的人MASP-2蛋白具有等于或大于70 (例如，71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)%同一性。
在一些实施方案中，肽片段可以是至少6个(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500或600个或更多个)氨基酸残基长度(例如，SEQ ID NO: 5的至少6个连续的氨基酸残基)。在一些实施方案中，人MASP-2蛋白的抗原肽片段少于500个(例如，少于450、400、350、325、300、275、250、225、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6个)氨基酸残基长度(例如，SEQ ID NOS: 5的任一个中少于500个连续的氨基酸残基)。
百分比(%)氨基酸序列同一性定义为在比对序列和引入缺口(如果需要的话)以实现最大百分比序列同一性后，在候选序列中与参比序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分比。为确定百分比序列同一性的目的，比对可以本领域技术内的各种方法实现，例如使用公众可得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)软件。用于测量比对的合适参数，包括在待比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法，可通过已知的方法确定。
II. 发明概述
凝集素(MBL、M-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白和CL-11)是触发先天性补体系统的特异性识别分子，和该系统包括凝集素起始途径和放大凝集素-引发的末端补体效应分子活化的相关末端途径放大环。C1q是触发获得性补体系统的特异性识别分子，和该系统包括经典起始途径和放大C1q-引发的末端补体效应分子活化的相关末端途径放大环。我们分别称这两种主要补体活化系统为凝集素-依赖性补体系统和C1q-依赖性补体系统。
除了其在免疫防御中的基本作用之外，补体系统还在许多临床情况下有助于组织损伤。因此，对开发治疗有效补体抑制剂以预防这些不良作用存在迫切需要。由于认识到有可能抑制凝集素介导的MASP-2途径同时保留经典途径完整，因此认识到特异性地仅抑制引起特定病理学的补体活化系统而不完全关闭补体的免疫防御能力是特别需要的。例如，在其中补体活化主要由凝集素-依赖性补体系统介导的疾病状态中，特异性地仅抑制该系统将是有利的。这将保持C1q-依赖性补体活化系统完整，以处理免疫复合物加工和有助于宿主防御感染。
在特异性抑制凝集素-依赖性补体系统的治疗剂的开发中优选的靶向蛋白组分是MASP-2。在凝集素-依赖性补体系统的所有已知的蛋白组分(MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白、MASP-2、C2-C9、因子B、因子D和备解素)中，仅MASP-2是凝集素-依赖性补体系统独特的，并且是该系统行使功能所需要的。凝集素(MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白和CL-11)也是凝集素-依赖性补体系统中的独特组分。然而，所述凝集素组分的任一个的损失由于凝集素冗余而将不必然抑制该系统的活化。抑制所有5种凝集素以保证凝集素-依赖性补体活化系统的抑制将是必要的。此外，因为还已知MBL和纤维胶凝蛋白具有不依赖于补体的调理素活性，所以凝集素功能的抑制将导致损失该有利的宿主防御感染机制。相比之下，如果MASP-2是抑制性靶标的话，该补体-非依赖性凝集素调理素活性将保持完整。MASP-2作为抑制凝集素-依赖性补体活化系统的治疗靶标的额外益处是MASP-2的血浆浓度是任何补体蛋白中最低的(大约500 ng/ml)；因此，相对低浓度的MASP-2高-亲和力抑制剂可足以获得完全抑制(Moller-Kristensen, M.等, J. Immunol Methods 282:159-167, 2003)。
如本文所述的，出人意料地确定，MASP-2抑制剂，例如人MASP-2抗体(OMS646)，在年龄相关性黄斑变性(AMD)的小鼠模型中当全身递送至小鼠时对减少脉络膜新血管形成(CNV)至少与抗-VEGF抗体一样有效。因此，预期MASP-2抑制剂，例如MASP-2抑制性抗体，作为抗-血管发生剂用于抑制血管发生-依赖性癌症，例如选自实体瘤、血荷肿瘤、高风险类癌肿瘤和肿瘤转移的血管发生-依赖性癌症，也将有效。还预期，MASP-2抑制剂，例如MASP-2抑制性抗体，作为抗-血管发生剂用于抑制血管发生-依赖性良性肿瘤，例如选自血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼、类癌肿瘤和脓性肉芽肿的血管发生-依赖性良性肿瘤，将是有效的。还预期，MASP-2抑制剂，例如MASP-2抑制性抗体，作为抗-血管发生剂用于在AMD和其它眼睛血管发生性疾病或病症，例如葡萄膜炎、眼睛黑素瘤、角膜新生血管形成、原发性(角膜)翼状胬肉、HSV间质性角膜炎、HSV-1诱导的角膜淋巴血管发生、增生性糖尿病视网膜病、早产儿视网膜病、视网膜静脉闭塞、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼和潮红中抑制血管发生，将是有效的。
III. MASP-2在血管发生-依赖性疾病和病况中的作用和使用MASP-2抑制剂的治疗方法
当新血管在不适当的位置(例如视网膜色素上皮)过度生长或当新血管具有不需要的特征例如泄漏时，血管发生-依赖性疾病和病况产生，和包括疾病例如癌症和眼睛的疾病。在这些病况中，新血管供给患病组织，可破坏新组织，并且在癌症的情况下，新血管允许肿瘤生长和肿瘤细胞进入循环和转移至其它器官。当患病细胞产生异常量的血管发生性生长因子，从而压倒天然存在的血管发生抑制剂的作用时，过度血管发生可发生。
已在年龄相关性黄斑变性(AMD)中表明补体活化在血管发生中的潜在作用。AMD是一种致盲疾病，其影响数百万的成人，但导致发展AMD的生物化学、细胞和/或分子事件的后遗症尚未理解。AMD导致黄斑的进行性破坏，这与富含蛋白和脂质的细胞外沉积物的形成有关，所述沉积物称为玻璃疣，位于黄斑内和周围、视网膜后以及在视网膜色素上皮(RPE)和脉络膜之间。玻璃疣是早期和中间AMD特有的。许多患者发展至晚期AMD，其包括两种形式，地理学萎缩和新血管或“湿性” AMD。术语“干性AMD”通常是指早期和中间AMD，以及地理学萎缩。尽管在早期和中间形式的疾病中存在和是潜在病理的，但玻璃疣也在两种晚期形式中持续(van Lookeren-Campagne等, J. Pathol. 232:151, 2014; Ambati等, Nat. Rev. Immunol. 13:438, 2013)。最近的研究表明，与炎症和免疫介导的过程有关的蛋白在玻璃疣相关的成分中是普遍的。编码许多这些分子的转录物已在视网膜、RPE和脉络膜细胞中检出。这些数据还证实，树突细胞，其是有效的抗原呈递细胞，与玻璃疣发展密切相关，和补体活化是在玻璃疣内和沿RPE-脉络膜界面有活性的关键途径(Hageman, G.S.,等, Prog. Retin. Eye Res. 20:705-732, 2001); Ebrahimi和Handa, J. Lipid 2011:802059,2011)。这些观察结果表明，局部炎症可能是AMD的早期发病机制中的重要因素。
数个独立研究已表明在AMD和补体因子H (CFH)的基因的遗传多态性之间强相关，其中在对于风险等位基因为纯合的个体中AMD的可能性增加7.4倍(Klein, R.J.等,Science 308:362-364, 2005; Haines等, Science 308:362-364. 2005; Edwards等,Science 308:263-264, 2005)。CFH基因已被定位到染色体1q31，该区域通过六次独立的连锁扫描而牵连AMD (参见例如，Schultz, D.W.,等, Hum. Mol. Genet. 12:3315, 2003)。已知CFH是补体系统的关键调节剂。已表明在细胞上和在循环中的CFH通过抑制C3活化为C3a和C3b，和通过失活已有的C3b，调节补体活性。已在AMD患者的布鲁赫氏膜、毛细管间支柱中和玻璃疣内观察到C5b-9的沉积(Klein等, Science 308:362-364, 2005)。免疫荧光实验表明，在AMD中CFH的多态性可在脉络膜毛细管和脉络膜血管中引起补体沉积(Klein等, Science 308:362-364, 2005)。
膜相关补体受体1也位于玻璃疣中，但它在RPE细胞中通过免疫组织化学未被检出。相比之下，第二种膜相关补体抑制剂，膜辅蛋白，存在于玻璃疣相关RPE细胞中以及玻璃疣内的小的球形亚结构元件中。这些之前未鉴定的元件还对在补体活化位点处特征性沉积的补体组分C3的蛋白水解片段显示强的免疫反应性。提议这些结构代表了作为补体攻击的靶标的退化RPE细胞的残留碎片(Johnson, L.V.等, Exp. Eye Res. 73:887-896, 2001)。
这些多种补体调节剂以及补体活化产物(C3a, C5a, C3b, C5b-9)的鉴定和定位使研究者得出结论，慢性补体活化在玻璃疣生物发生过程和AMD的病因学中起重要作用(Hageman等, Progress Retinal Eye Res. 20:705-32, 2001)。在玻璃疣中C3和C5活化产物的鉴定没有提供对补体通过经典途径、凝集素途径还是替代扩增环活化的见解，如根据本发明所理解的，因为C3和C5对所有三者均是共同的。然而，两个研究使用对C1q (经典途径活化的重要识别组分)特异性的抗体，寻找玻璃疣免疫标记(Mullins等, FASEB J. 14:835-846, 2000; Johnson等, Exp. Eye Res. 70:441-449, 2000)。两个研究得出结论，通常未观察到玻璃疣中的C1q免疫标记。C1q的这些阴性结果表明，玻璃疣中的补体活化不通过经典途径发生。此外，对于免疫复合物组分(IgG轻链、IgM)的玻璃疣免疫标记在Mullins等, 2000研究中报道为变化弱的，进一步表明经典途径在该疾病过程中发生的补体活化中起较小作用。因此，凝集素和/或替代途径可能负责大部分(如果不是全部)与AMD有关的补体介导的玻璃疣生物发生。
在玻璃疣和补体活化之间的关系是强的，特别是在早期和中间AMD中以及在地理学萎缩中。事实上，大且汇合的玻璃疣代表了地理学萎缩的显著风险因素(van Lookeren-Campagne等，同上)。然而，补体活化不限于玻璃疣环境。两个最近公布的研究在小鼠(一种人CNV模型)中评价了补体在激光诱导的脉络膜新血管形成(CNV)的发展中的作用。使用免疫组织学方法，Bora和同事们(2005)发现在激光处理后在新血管复合物中补体活化产物C3b和C5b-9 (MAC)的明显沉积(Bora等, J. Immunol. 174:491-7, 2005)。重要的是，CNV在C3 (所有补体活化途径需要的重要组分)遗传缺陷的小鼠(C3-/-小鼠)中不发生。VEGF、TGF-β2和β-FGF (CNV中涉及的三种血管发生因子)的RNA信使水平在来自激光诱导CNV后的小鼠的眼睛组织中升高。重要地，补体损耗导致这些血管发生因子的RNA水平显著减少。
使用ELISA方法，Nozaki和同事们证实了有效的过敏毒素C3a和C5a在激光诱导的CNV的过程中早期产生(Nozaki等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:2328-33,2006)。此外，在野生型小鼠中玻璃体内注射后，C3和C5的这两种生物活性片段诱导VEGF表达。与这些结果一致，Nozaki和同事们还证明，在激光损伤后C3a和C5a的受体的遗传消除减少VEGF表达和CNV形成，和C3a或C5a的抗体介导的中和或其受体的药理学阻断也减少CNV。之前的研究确定了白细胞(特别是巨噬细胞)的募集在激光诱导的CNV中起关键作用(Sakurai等, Invest. Opthomol. Vis. Sci. 44:3578-85, 2003; Espinosa-Heidmann等, Invest. Opthomol. Vis. Sci. 44:3586-92, 2003)。在他们2006年的论文中，Nozaki和同事们报道了在激光损伤后白细胞募集在C3aR(-/-)和C5aR(-/-)小鼠中显著减少。
在视网膜色素上皮上的氧化修饰的磷脂的天然抗体识别后，凝集素途径似乎在CNV模型中负责起始补体级联(Joseph等 J. Biol. Chem. 288:12753, 2013)。在该模型中对于视网膜损伤，替代途径也是关键的，但它不是独自能胜任的(Rohrer等, Mol Immunol.48:e1, 2011)。重要地，Kunchithapautham和Rohrer (J. Biol. Chem. 286:23717, 2011)证实了该补体活化触发通过视网膜色素上皮细胞的VEGF分泌。VEGF是新血管化的重要介质。
如本文实施例12所述，在MASP-2(-/-)小鼠的鼠黄斑变性模型中确定，相对于野生型对照小鼠，在MASP-2 (-/-)小鼠中VEGF的基线水平降低，并且此外，尽管在激光诱导的损伤后在野生型小鼠中VEGF水平显著增加，但令人惊讶地发现在激光诱导的损伤后在MASP-2(-/-)小鼠中低水平的VEGF。此外，确定与野生型小鼠相比，MASP-2 (-/-)小鼠显示在激光诱导的损伤后在第7天CNV面积的约30%减少。如实施例14进一步描述的，与未处理的小鼠相比，在用特异性阻断补体活化的凝集素途径的抗-MASP-2单克隆抗体预处理的小鼠中，激光处理后7天观察到CNV的统计学显著的(p<0.01)大约50%减少，证实了用抑制剂例如MASP-2单克隆抗体阻断MASP-2在黄斑变性的处理中具有预防性和/或治疗性作用。如实施例16进一步描述的，在用特异性阻断补体活化的凝集素途径的人MASP-2单克隆抗体预处理的小鼠中，在测试的所有剂量水平观察到CNV的统计学显著的减少，其中相对CNV面积减少范围为20%-50%，而VEGF抗体显示CNV面积的适度(大约15%)相对减少。根据实施例16公开的出人意料的结果，即在AMD小鼠模型中在减少CNV方面MASP-2抑制剂例如MASP-2抗体当全身递送时至少与VEGF抗体一样有效，预期MASP-2抑制剂作为抗-血管发生剂将有效用于治疗血管发生-依赖性疾病和病况，例如眼睛血管发生性疾病或病症、血管发生-依赖性癌症和血管发生-依赖性良性肿瘤，如下文所述。
用于治疗眼睛血管发生性疾病或病症的MASP-2抑制剂
眼睛血管发生性疾病或病症是一种眼睛疾病或病症，其中异常或过度血管发生在眼睛中出现，这可能促成视觉丢失、出血或眼睛的其它功能性病症，例如AMD，或选自葡萄膜炎、眼睛黑素瘤、角膜新生血管形成、原发性(角膜)翼状胬肉、HSV间质性角膜炎、HSV-1诱导的角膜淋巴血管发生、增生性糖尿病视网膜病、糖尿病黄斑水肿、早产儿视网膜病、视网膜静脉闭塞、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼、增生性糖尿病视网膜病继发性玻璃体出血、视神经脊髓炎和潮红的眼睛血管发生性疾病或病症(参见例如Rivera等, Neonatology100(4):343-53, 2011; Hosseini等, Cornea 31:322-34, 2012; Leyvraz等, Curr Opin Oncol 162-9 (2012); Bock等, Prog Retin Eye Res 34:89-124, 2013和Kim等, Am J Pathol 181(2):376-9, 2012)。
如实施例14和16所述的，本申请证实了特异性抑制补体活化的凝集素途径的MASP-2抗体的全身给予提供一种治疗新血管AMD的有效疗法。对于眼科病况当前批准的抗-血管发生性疗法是抑制VEGF的生物制剂。对于眼科疾病目前有三种批准的抗-血管发生性治疗：抗-VEGF适体(pegaptanib, Macugen®)、针对VEGF-A的单克隆抗体的Fab片段(ranibizumab, Lucentis®)和结合VEGF-A、VEGF-B和胎盘生长因子的融合蛋白(aflibercept, Eylea®)，其全部通过玻璃体内注射给予。因此，不像对AMD和其它眼睛血管发生性疾病和病症的当前和新出现的治疗(其需要玻璃体内注射)，MASP-2抗体治疗在皮下给予时是有效的。
本发明的一个方面因此提供一种抑制血管发生以治疗眼睛血管发生性疾病或病症的方法，包括给予有需要的受试者组合物，所述组合物包含在药用载体中治疗有效量的MASP-2抑制剂。在一些实施方案中，眼睛血管发生性疾病或病症选自AMD、葡萄膜炎、眼睛黑素瘤、角膜新生血管形成、原发性翼状胬肉、HSV间质性角膜炎、HSV-1诱导的角膜淋巴血管发生、增生性糖尿病视网膜病、糖尿病黄斑水肿、早产儿视网膜病、视网膜静脉闭塞、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼、增生性糖尿病视网膜病继发性玻璃体出血、视神经脊髓炎和潮红。MASP-2抑制性组合物可局部给予至眼睛，例如通过直接注射、冲洗或施用呈凝胶、药膏或滴剂形式的组合物。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它肠胃外给予，或对于非肽能药剂可能通过口服给予。MASP-2抑制剂组合物可与一种或多种其它治疗剂，例如其它抗-血管发生剂组合。给予可重复进行，由医生确定，直到病况已被消除或受到控制。
用于治疗血管发生-依赖性癌症的MASP-2抑制剂
非常确定血管发生在癌症的发展中起重要作用。肿瘤产生促-血管发生因子以刺激新血管化，这是实体瘤进展的主要机制之一，和还允许肿瘤细胞通过进入全身循环迁移以建立远端转移。肿瘤血管发生的过程主要在生长中的肿瘤块超过可通过氧和营养素的扩散维持的最大体积时被激活。已观察到在增加的血管发生和肿瘤侵袭性之间的关联(Ferrara等, Curr Top Microbiol Immunol 237:1-30, 1999)。还已知血管发生在白血病和其它血液学恶性肿瘤的生长和存活中起作用(Ribatti等, Neoplasia 15(3):231-238,2013; Vacca等, Br J Haematol 87:503-508, 1994)。尽管不同的细胞类型促进新血管化，但众所周知在血管发生过程中内皮细胞是重要的参与者。
非常确定VEGF在肿瘤血管发生中起重要作用。VEGF被鉴定为由肿瘤细胞分泌的血管通透性因子(Mattei等, Genomics 32:168-169, 1996)，和已证实通过刺激内皮细胞迁移和增殖，以及通过刺激内皮细胞中血管发生-相关基因的表达，在血管发生中起作用。例如，在人结肠、肾和肺癌中可溶性VEGF同工型189表达与增加的微血管、癌症转移和差的预后强相关(Tokunaga等, Br J Cancer 77:998-1002, 1998; Yuan等, J Clin Oncol 19:432-441, 2001)。高水平的VEGF同工型165与卵巢癌的差的存活率相关(Mahner等, BMC Cancer 10:139, 2010)。在3期临床试验中，证实了贝伐单抗，一种抑制VEGF-A的人源化单克隆抗体，改善卵巢癌女性的无进展存活(Perren等, N Engl J Med 365:2484-2496,2011)。
在癌症的情况下，传统上研究者集中在补体标记和消除肿瘤细胞的作用上。然而，最近的研究对此观点提出质疑。例如，Markiewski等(Nature Immunol vol 9:1225-1235,2008)报道了出人意料的发现，即补体蛋白C3、C4和C5a可通过促进免疫抑制微环境来帮助肿瘤生长。如Markiewski等所述的，在肿瘤微环境中补体C5a的产生通过抑制抗-肿瘤CD8+T细胞介导的反应提高肿瘤生长。如Markiewski等进一步描述的，C5aR拮抗剂，六肽AcF(OP(D)ChaWr)，与紫杉醇(泰素)一样有效削弱野生型小鼠的肿瘤生长，从而确立补体抑制在治疗癌症中的治疗功能。如Gunn等(J Immunol 189:2985, 2012)所述，具有高C5a产生的同基因淋巴瘤细胞的野生型小鼠显著加速肿瘤进展，在脾中具有更多的骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)，和在肿瘤、肿瘤-引流淋巴结和脾中总体上减少的CD4+和CD8+ T细胞。相比之下，具有低C5a产生的淋巴瘤细胞的带肿瘤小鼠具有显著减少的肿瘤负荷，在脾和肿瘤-引流淋巴结中具有增加的干扰素-γ产生的CD4+和CD8+ T细胞。如Corrales等(J Immunol 189:4674-4683, 2012)进一步描述的，发现与健康受试者相比，在来自非小细胞肺癌(NSCLC)患者的血浆中C5a的显著增加。还确定，C5a诱导内皮细胞趋化性和血管形成。在Lewis肺癌模型中，小鼠Lewis肺癌(3LL)细胞的同基因肿瘤在用C5a受体的拮抗剂处理的小鼠中生长更慢。
如Nunez-Cruz等(Neoplasia 14:994-1004, 2012)进一步描述的，为了评价在卵巢癌进展期间补体的作用，具有C3补体缺陷的小鼠品系或具有C5a受体(C5aR)补体缺陷的小鼠品系与发生上皮卵巢癌的小鼠品系杂交(TgMISIIR-TAg)。与野生型TgMISIIR-TAg同窝小鼠相比，完全或部分C3缺陷或完全C5aR缺陷的TgMISIIR-Tag小鼠均未发生卵巢肿瘤或发生小且血管化差的肿瘤，从而证实了C3或C5aR缺陷显著减弱卵巢肿瘤表型。还证实了在血管发生中CD31+内皮细胞功能在C3 (-/-)和C5aR (-/-)小鼠二者中减弱。
补体系统的活化还可涉及恶性肿瘤的发病机制。C5b-9补体复合物的新生抗原、IgG、C3、C4、S-蛋白/玻连蛋白、纤连蛋白和巨噬细胞在17个乳腺癌样品和6个良性乳腺肿瘤样品上使用多克隆或单克隆抗体和链霉亲和素-生物素-过氧化物酶技术定位。具有每个TNM阶段的癌的所有组织样品提供在肿瘤细胞的膜上的C5b-9沉积，在细胞残留物上的薄颗粒和在坏死区域中的弥漫性沉积(Niculescu, F.等, Am. J. Pathol. 140:1039-1043,1992)。如Rutkowski等(Mol Cancer Res 8:1453, 2010)进一步描述的，已描述了补体蛋白C3、C3a、C5a和MAC的潜在致癌作用，包括肿瘤血管发生、侵袭和迁移。发现当与健康受试者相比时，在结肠直肠癌患者的血清中补体活化的凝集素途径显著升高(Ytting等, 2004,Scand J. Gastroenterol 39:674)和已报道高水平的MASP-2活性是预测结肠癌复发和差的存活的独立的预后生物标记物(Ytting等, Clin Cancer Res 11:1441, 2005)。
还已确定，血清MBL和/或MASP-2在某些儿科癌症中升高，包括急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、CNS肿瘤和CNS外部的实体瘤(Fisch等, 2011, Swiss Med Wkly 141:w13191)。还已确定，MASP-2在食管鳞状细胞癌(ESCC)和发育异常(恶变前)组织样品中过表达(Verma等, Int J Cancer 118:2930, 2006)。
除了上述研究之外，许多研究也已报道了MBL多态性和癌症的关联。例如，如Swierzko等, Mol Immunol 55:16, 2013所概述的，对于胃癌(Baccarelli等,International J Cancer 119:1970-1975, 2006; Scudiero等, Clin Chem 52:1625-1626, 2006; Wang等, Digestive diseases and Sciences 53:2904-2908, 2008)；肝癌(Eurich等, Liver International 31:1006-1012, 2011)；胰腺癌(Rong等, BMCGastroenterology 10:68, 2010)；结肠癌/结肠直肠癌(Ytting等, Scan J Gastroenterology 39:670-674, 2004; Ytting等, Scan J Gastroenterology 73:122-127, 2011; Zanetti等, Cancer Res 72:1467-1677, 2012)；卵巢癌(Swierzko等,Immunotherapy 56:959-971, 2007); Nevadunsky等, European J of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology 163:216-218, 2012)；乳腺癌(Bernig等,Carcinogenesis 28:828-836, 2007)；肺癌(Pine等, Journal of NCI 99:1401-1409,2007; Olivo-Marston等, Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention 18:3375-3383, 2009)；和急性成淋巴细胞性白血病(Schmiegelow等, Blood 100:3757-3760,2002)，已报道了MBL和MBL2基因多态性的关联。
还已确定，补体组分在人癌症患者生物流体中上调，如下表1中所示。
表1：补体组分在人癌症患者生物流体中上调
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此外，补体活化可能是化学疗法或放射疗法的结果，因此抑制补体活化可用作治疗恶性肿瘤的辅助，以减少医源性炎症。当化学疗法和放射疗法先于手术时，C5b-9沉积是更强烈和延长的。C5b-9沉积在所有良性损伤样品中缺少。S-蛋白/玻连蛋白作为纤维状沉积存在于结缔组织基质中，和作为弥漫性沉积存在于肿瘤细胞周围，比纤连蛋白更不强烈和延长。IgG、C3和C4沉积仅存在于癌样品中。在乳腺癌中C5b-9沉积的存在指示补体活化和其随后的发病作用(Niculescu,等, Am. J. Pathol. 140:1039-1043, 1992)。
根据实施例16描述的数据，即全身给予特异性抑制补体活化的凝集素途径的MASP-2抗体至少与抗-VEGF抗体一样有效抑制新血管化，预期全身递送MASP-2抑制剂将有效抑制肿瘤血管发生，从而在患有血管发生-依赖性癌症的受试者中减少肿瘤生长和/或转移。
血管发生-依赖性癌症包括上皮来源或神经元来源的癌症，或癌或实体瘤或肉瘤或液体肿瘤，例如白血病或淋巴瘤。已知用血管抑制化合物(例如，VEGF拮抗剂)治疗或在开发中用血管抑制化合物(例如，VEGF拮抗剂)治疗的任何癌症包括在本发明的方法的范围内。在该情况下优选的癌症包括：结肠直肠癌、乳腺癌(包括转移性乳腺癌、炎性乳腺癌)、肺癌、肾癌、肝癌、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌，以及神经胶质瘤、胃肠间质肿瘤、淋巴瘤、黑素瘤和类癌肿瘤(NCI临床试验数据库：见于www_cancer_gov_clinicaltrials/search，访问于3/25/2014)。许多这些癌症已表明对用贝伐单抗(Avastin®)治疗有响应，贝伐单抗是一种阻断VEGF与其受体的结合和抑制肿瘤血管发生的人源化单克隆抗体(例如，Amit等, PLoS One 8(1):e51780 (2013)。
根据前述内容，在本发明的另一方面，提供了在患有血管发生-依赖性癌症的受试者中抑制肿瘤血管发生和/或肿瘤转移的方法。该方法包括给予患有血管发生-依赖性癌症的受试者包含有效抑制肿瘤血管发生和/或肿瘤转移的量的MASP-2抑制剂的组合物。在一些实施方案中，受试者患有血管发生-依赖性癌症，其选自结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌，以及神经胶质瘤、胃肠间质肿瘤、淋巴瘤、黑素瘤和类癌肿瘤。在一些实施方案中，血管发生-依赖性癌症是预期通过抗-VEGF剂例如抗-VEGF抗体Avastin® (贝伐单抗, Genentech, CA)治疗而获益的癌症类型，例如已知用血管抑制化合物(例如，VEGF拮抗剂)治疗或在开发中用血管抑制化合物(例如，VEGF拮抗剂)治疗的任何癌症，包括转移至肝的晚期癌症、黑素瘤、卵巢癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、肝细胞癌、子宫内膜癌、前列腺癌、血管肉瘤、转移性或不可切除的血管肉瘤、复发性卵巢生殖索间质肿瘤、食管癌、胃癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、复发性或转移性头颈癌、肿瘤性脑膜炎、宫颈癌、子宫癌、晚期腹膜癌扩散、神经胶质肉瘤、神经内分泌癌、颅外尤因肉瘤、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞性白血病、颅内脑膜瘤、晚期卡波西肉瘤、间皮瘤、胆管癌、转移性类癌肿瘤和晚期尿道癌。在此情况下优选的癌症包括：结肠直肠癌、乳腺癌(包括转移性乳腺癌、炎性乳腺癌)、肺癌、肾癌、肝癌、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌，以及神经胶质瘤、胃肠间质肿瘤、淋巴瘤、黑素瘤和类癌肿瘤。
MASP-2抑制性组合物可局部给予至肿瘤区域，例如通过在手术或局部注射期间直接或远距离(例如通过导管)局部施用组合物进行。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它肠胃外给予，或对于非肽能药剂可能通过口服给予进行。MASP-2抑制剂组合物可与一种或多种其它治疗剂，例如其它抗-血管发生剂和/或其它化学治疗剂组合。给予可重复进行，由医生确定，直到病况已被消除或受到控制。
根据证实OMS646在测试的所有剂量水平下当全身递送至小鼠时在减少CNV方面至少与抗-VEGF抗体一样有效的本研究的数据，还预期MASP-2抑制剂例如OMS646作为抗-血管发生剂也将有效用于抑制血管发生-依赖性病况，例如骨髓纤维化和遗传性出血性毛细血管扩张。
IV. MASP-2抑制剂
在各个方面中，本发明提供通过给予有需要的受试者MASP-2抑制剂，抑制血管发生的不良作用的方法。MASP-2抑制剂以在活的受试者中有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量给予。在本发明的该方面的实践中，代表性的MASP-2抑制剂包括：抑制MASP-2的生物学活性的分子(例如小分子抑制剂、抗-MASP-2抗体或与MASP-2相互作用或干扰蛋白-蛋白质相互作用的阻断肽)，和降低MASP-2表达的分子(例如MASP-2反义核酸分子、MASP-2特异性RNAi分子和MASP-2核酶)，从而防止MASP-2激活凝集素补体途径。MASP-2抑制剂可单独用作主要疗法，或作为辅助疗法与其它治疗剂组合使用以增强其它医学治疗的治疗益处。
MASP-2-依赖性补体活化的抑制的特征为由于根据本发明的方法给予MASP-2抑制剂而出现的在补体系统的组分中的以下变化的至少一个：MASP-2-依赖性补体活化系统产物C4b、C3a、C5a和/或C5b-9 (MAC)的形成或产生的抑制(例如按实施例2中所述测量)；C4裂解和C4b沉积的减少(例如按实施例2中所述测量)；或C3裂解和C3b沉积的减少(例如按实施例2中所述测量)。
根据本发明，使用有效抑制血管发生和显示可检测的抗-血管发生活性和/或诱导新血管发生减少的MASP-2抑制剂。在本发明的背景内，抗-血管发生性活性可包含以下至少一种或多种：减少或降低新血管发生，使血管正常化，和/或减少致病区域的血管数量。
新血管发生和抗-血管发生剂、例如MASP-2抑制剂的评价可使用技术人员已知的任何技术检测。例如，新血管发生和抗-血管发生剂的评价可在动物中在CNV的激光诱导的损伤模型中进行(如本文实施例12、14和16所述)，或通过非入侵技术例如PET (正电子发射断层扫描术)、MRI (磁共振成像)、DCE-MRI (动态反差增强型MRI)或CT (计算机体层摄影术)成像在患者中或在肿瘤中原位进行。这些技术可基于肿瘤中血管系统的渗漏增加，用于监测肿瘤负荷。使用MRI或PET，可追踪血管发生标记，例如α5β3-整联蛋白、血浆VEGF或bFGF的存在。
或者，新血管发生可使用从患有血管发生-依赖性病况的患者的致病区域获取的肿瘤活检或切片，和随后免疫组织化学分析内皮细胞以评价它们的活性和将其与来自健康受试者的正常内皮细胞或来自患者但在身体内不同位置分离的内皮细胞的活性比较，进行评价。这样的免疫组织化学分析可使用泛-内皮细胞抗体例如抗-CD31和抗-CD34进行，以评价微血管密度。组织切片可用内皮细胞的标记结合增殖标记染色，以研究组织中的肿瘤内皮细胞和肿瘤增殖细胞之间的比率。内皮标记的实例是CD31和CD34。增殖标记的实例是Ki67，其是一种检测给定细胞群体的生长分数的优秀标记。Ki-67阳性肿瘤细胞的分数(Ki-67标记指数)通常与癌症的临床过程有关。微血管密度(MVD)可例如，在用抗-CD31染色的肿瘤切片中和使用染色强度以定量MVD来评价。MVD的量化优选通过计数4-5个代表性图像/肿瘤切片中的阳性染色腔结构进行。在至少4-5个代表性图像/肿瘤切片中评价的MVD的减少、优选统计学显著减少优选地被视为指示给予的分子具有抗-血管发生活性或能够诱导新血管发生的减少。
新血管发生也可使用细胞，优选地来自肿瘤、健康受试者或内皮细胞系的内皮细胞评价。来自肿瘤的内皮细胞优选地被指定为肿瘤内皮。肿瘤内皮细胞可使用CD31作为内皮标记，通过肿瘤组织的FACS (荧光激活细胞分选)分离。这可按van Beijnum等, NatProtoc. 3(6):1085-91, 2008所述进行。体外评价新血管发生的优选的内皮细胞是HUVEC和RF24。体外评价新血管发生活性可使用用于评价内皮细胞的增殖活性的MTS (3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基-)-2H-四唑鎓)测定法进行。或者，可使用技术人员已知的其它成活力测定法，例如MTT (3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑鎓)、结晶紫和WST-1 (水溶性四唑鎓)。
此外，可使用其它类型的血管发生活性测定法，例如球状体萌发测定法和基质胶管形成测定法。在基质胶管形成测定法中，细胞，特别是内皮细胞，在合成的半-天然凝胶基质(例如来自BD Biosciences的基质胶，或胶原-凝胶，或在一些情况下为纤维蛋白凝胶)上接种。在两种测定法中，使用内皮细胞，优选地HUVEC。在一定时间后，根据细胞培养条件，细胞开始形成管状结构。管状结构的形成被视为产生新血管的第一步。读出参数是每面积单位的血管结的数量。对于球状体萌发测定法，细胞球状体(例如，内皮细胞)被置于凝胶(例如，基质胶和胶原凝胶)上。一定时间后，可观察到萌芽形成。萌发的程度被视为用于评价细胞的血管发生性潜力的标准。读出参数是每个球状体的萌芽的数量。当通过与在未处理的细胞中每个球状体的萌芽的数量比较，对于给定的时间段在处理的细胞中每个球状体的萌芽的数量降低或减少时，抗-血管发生性活性可存在。降低或减少可以是减少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。当见到血管正常化时和/或当致病区域中的血管数量减少时，在肿瘤组织中抗-血管发生性活性也可存在。
在优选的实施方案中，通过与处理开始时的血管数量比较，在发现致病区域中的血管数量减少时，存在可检测的抗-血管发生性活性。减少可以是致病区域中血管数量的可检测的减少，或致病区域中血管减少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%。致病区域是肿瘤区域，包括靠近肿瘤区域的周围组织。在此情况下，靠近可意指至多几厘米。
血管的正常化优选地是血管或微血管的三维结构的变化。例如，与对照血管或微血管相比，肿瘤内皮中与新血管发生活性有关的病理血管或微血管可能是更不规则的，和/或可能显示更加扭曲，和/或可能显示更加泄露。对照血管可以是来自健康个体的血管，或来自患者但不位于来自所述患者的致病区域的血管。在优选的实施方案中，当血管的三维结构显示比对照血管更加规则、更少扭曲和/或更少泄露时，认为已检测到抗-血管发生性活性。优选地，与治疗开始时相比，在致病区域中检测到更少不规则、扭曲和/或泄露的血管。更优选地，更少意思是少5%、少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。最优选地，无不规则、扭曲和/或泄露的血管在致病区域中被检测到。在致病区域中血管的正常化和/或血管数量可使用非入侵成像技术例如PET、MRI或CT成像评价。
在与新血管发生有关的眼睛疾病或病况的情况下，已开发数种测定法用于评价由测试的药物(例如MASP-2抑制剂)诱导的可检测的抗-血管发生活性和/或新血管发生的降低或减少。在这些不同的疾病模型中，血管发生可通过不同的刺激，例如物理损伤(激光诱导的布鲁赫氏膜破裂) (Shen等, 2006 Gene therapy 13: 225-234)或通过在转基因小鼠中特定血管生长因子例如VEGF的过表达(Miki等, 2009, Ophthalmology 2009年9月116(9): 1748-1754)触发。如果可检测的抗-血管发生活性和/或血管发生降低或减少使用MASP-2抑制剂评价，这样的MASP-2抑制剂被认为用作药物以预防、治疗、逆转、治愈和/或延迟血管发生或与血管发生有关的疾病或病况。
新血管发生和/或抗-血管发生性活性的评价可定期，例如，每周或每月进行。新血管发生的增加/减少和/或抗-血管发生性活性的存在可因此定期，例如每周或每月评价。该评价优选地对于给定的受试者在数个时间点进行，或对于给定的受试者和健康对照在一个或数个时间点进行。评价可以规则的时间间隔，例如每周或每月进行。当与MASP-2抑制剂有关的新血管发生或血管发生性活性的一次评价导致新血管发生的减少或抗-血管发生性活性的存在的发现结果时，MASP-2抑制剂，例如抗-MASP-2抗体，被认为显示可检测的抗-血管发生活性和/或诱导新血管发生的降低或减少。
当对于至少一个时间点，新血管发生的减少和/或抗-血管发生性活性的存在已被检出时，优选地已检出新血管发生活性的可检测的减少和/或抗-血管发生性活性的存在。优选地，对于至少2个、3个、4个、5个时间点，新血管发生的减少和/或抗-血管发生性活性的存在已被检出。
可用于实施本发明的该方面的MASP-2抑制剂包括例如，MASP-2抗体和其片段、MASP-2抑制性肽、小分子、MASP-2可溶性受体和表达抑制剂。MASP-2抑制剂可通过阻断MASP-2的生物功能抑制MASP-2-依赖性补体活化系统。例如，抑制剂可有效阻断MASP-2的蛋白质与蛋白质相互作用，干扰MASP-2二聚化或装配，阻断Ca2+结合，干扰MASP-2丝氨酸蛋白酶活性位点或可减少MASP-2蛋白表达。
在一些实施方案中，MASP-2抑制剂选择性抑制MASP-2补体活化，保留C1q-依赖性补体活化系统功能完整。
在一个实施方案中，用于本发明方法的MASP-2抑制剂是特异性MASP-2抑制剂，其特异性结合包括SEQ ID NO:6的多肽，其亲和力为对补体系统的其它抗原的至少10倍。在另一实施方案中，MASP-2抑制剂特异性结合包括SEQ ID NO:6的多肽，其结合亲和力为对补体系统的其它抗原的至少100倍。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂特异性结合(i) MASP-2的CCP1-CCP2结构域(SEQ ID NO:6的aa 300-431)或丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:6的aa445-682)的至少之一和抑制MASP-2-依赖性补体活化。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是特异性结合MASP-2的MASP-2单克隆抗体或其片段。MASP-2抑制剂的结合亲和力可使用合适的结合测定法测定。
MASP-2多肽显示类似于MASP-1、MASP-3和C1r和C1s (C1补体系统的蛋白酶)的分子结构。SEQ ID NO:4所示的cDNA分子编码MASP-2的一个代表性实例(由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成)和提供具有前导序列(aa 1-15)的人MASP-2多肽，其在分泌后裂解，产生成熟形式的人MASP-2 (SEQ ID NO:6)。如图2中所示，人MASP 2基因包括12个外显子。人MASP-2 cDNA由外显子B、C、D、F、G、H、I、J、K和L编码。可变剪接产生20 kDa蛋白，称为MBL-相关蛋白19 ("MAp19"，亦称为"sMAP") (SEQ ID NO:2)，其由自外显子B、C、D和E产生的(SEQID NO:1)编码，如图2中所示。SEQ ID NO:50所示的cDNA分子编码鼠MASP-2 (由SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列组成)和提供具有前导序列的鼠MASP-2多肽，其在分泌后裂解，产生成熟形式的鼠MASP-2 (SEQ ID NO:52)。SEQ ID NO:53所示的cDNA分子编码大鼠MASP-2 (由SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列组成)和提供具有前导序列的大鼠MASP-2多肽，其在分泌后裂解，产生成熟形式的大鼠MASP-2 (SEQ ID NO:55)。
本领域技术人员将认识到，SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:53中公开的序列分别表示人、鼠和大鼠MASP-2的单个等位基因，和预期存在等位基因改变和可变剪接。SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列的等位基因变体，包括包含沉默突变的那些和其中突变导致氨基酸序列改变的那些，在本发明的范围内。MASP-2序列的等位基因变体可根据标准程序通过探查来自不同个体的cDNA或基因组文库进行克隆。
人MASP-2蛋白(SEQ ID NO:6)的结构域显示在图1和2A中，包括N-末端C1r/C1s/海胆Vegf/骨形态发生蛋白(CUBI)结构域(SEQ ID NO:6的aa 1-121)、表皮生长因子-样结构域(aa 122-166)、第二CUBI结构域(aa 167-293)以及串联的补体控制蛋白结构域和丝氨酸蛋白酶结构域。MASP 2基因的可变剪接产生图1中所示的MAp19。MAp19是一种非酶蛋白，包含MASP-2的N-末端CUB1-EGF区以及源自外显子E的四个另外的残基(EQSL)，如图1中所示。
数种蛋白已经显示通过蛋白与蛋白相互作用，与MASP-2结合或相互作用。例如，MASP-2已知与凝集素蛋白MBL、H-纤维胶凝蛋白和L-纤维胶凝蛋白结合和与其形成Ca2+依赖性复合物。各MASP-2/凝集素复合物已经显示通过蛋白C4和C2的MASP-2-依赖性裂解激活补体(Ikeda, K.等, J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., 等, J. Exp. Med.176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., 等, J. Immunol. 168:3502-3506,2002)。研究表明，MASP-2的CUB1-EGF结构域是MASP-2与MBL缔合所必需的(Thielens, N.M.等, J. Immunol. 166:5068, 2001)。还表明，CUB1EGFCUBII结构域介导MASP-2的二聚化，其是形成活性MBL复合物所需要的(Wallis, R.等, J. Biol. Chem. 275:30962-30969,2000)。因此，可鉴定结合或干扰已知对MASP-2-依赖性补体活化是重要的MASP-2靶标区的MASP-2抑制剂。
抗-MASP-2抗体
在本发明的该方面的一些实施方案中，MASP-2抑制剂包括抑制MASP-2-依赖性补体活化系统的抗-MASP-2抗体。用于本发明的该方面的抗-MASP-2抗体包括源自任何产生抗体的哺乳动物的多克隆、单克隆或重组抗体，和可以是多特异性、嵌合的、人源化的、抗-个体型，和抗体片段。抗体片段包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv片段、scFv片段和单链抗体，如本文进一步描述的。
可使用本文所述的测定法筛选MASP-2抗体的抑制MASP-2-依赖性补体活化系统的能力和抗-血管发生性活性。文献中已描述了几种MASP-2抗体，和一些已新产生，其中一些列在下表2中。例如，如本文实施例10和11所述，已鉴定了阻断MASP-2-依赖性补体活化的抗-大鼠MASP-2 Fab2抗体，和如实施例14所示，源自抗-大鼠MASP-2 Fab2抗体的单克隆抗体在激光诱导的CNV的小鼠模型中具有抗-血管发生性活性。如实施例15进一步描述的，和如US2012/0282263 (其通过引用结合到本文中)中进一步描述的，已鉴定了阻断MASP-2-依赖性补体活化的全人MASP-2 scFv抗体，和如实施例16所述的，阻断凝集素途径的功能的代表性的人MASP-2单克隆抗体(OMS646)在激光诱导的CNV的小鼠模型中具有抗-血管发生性活性。因此，在一个实施方案中，用于本发明的方法的MASP-2抑制剂包含人抗体，例如OMS646。因此，在一个实施方案中，用于本发明的组合物和方法的MASP-2抑制剂包含结合由人MASP-2 (SEQ ID NO:6)组成的多肽的人抗体，其中所述抗体包含：I) a) 重链可变区，包含：i) 重链CDR1，包含SEQ ID NO: 67或SEQ ID NO:68的31-35的氨基酸序列；和ii) 重链CDR2，包含SEQ ID NO: 67或SEQ ID NO:68的50-65的氨基酸序列；和iii) 重链CDR3，包含SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的95-102的氨基酸序列；和
b) 轻链可变区，包含：i) 轻链CDR1，包含SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:71的24-34的氨基酸序列；和ii) 轻链CDR2，包含SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:71的50-56的氨基酸序列；和iii) 轻链CDR3，包含SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:71的89-97的氨基酸序列；或II) 除了在所述重链可变区的所述CDR区内至多组合总共6个氨基酸置换和在所述轻链可变区的所述CDR区内至多组合总和6个氨基酸置换之外，在其它方面与所述可变结构域相同的其变体，其中所述抗体或其变体抑制MASP-2-依赖性补体活化。在一个实施方案中，用于本发明的方法的MASP-2抑制剂包含人抗体OMS646。
表2：示例性的MASP-2特异性抗体
Figure DEST_PATH_IMAGE002
具有降低的效应器功能的抗-MASP-2抗体
在本发明的该方面的一些实施方案中，抗-MASP-2抗体具有降低的效应器功能，以减少可自经典补体途径的活化产生的炎症。已经显示IgG分子触发经典补体途径的能力位于该分子的Fc部分内(Duncan, A.R.等, Nature332:738-740 1988)。其中分子的Fc部分已通过酶裂解被除去的IgG分子没有该效应器功能(参见Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988)。因此，具有降低的效应器功能的抗体可因为通过具有使效应器功能最小化的基因工程改造的Fc序列而缺少分子的Fc部分，或属于人IgG2或IgG4同种型而产生。
具有降低的效应器功能的抗体可通过IgG重链的Fc部分的标准分子生物学操作产生，如本文实施例9中所述，亦描述于Jolliffe等, Int'l Rev. Immunol. 10:241-250,1993,和Rodrigues等, J. Immunol. 151:6954-6961, 1998。具有降低的效应器功能的抗体还包括人IgG2和IgG4同种型，其激活补体和/或与Fc受体相互作用的能力降低(Ravetch,J.V.等, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991; Isaacs, J.D.等, J. Immunol.148:3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G.等, Immunol. Today 14:215-221, 1993)。对人MASP-2具有特异性的人源化的或全人抗体，包括IgG2或IgG4同种型，可通过本领域普通技术人员已知的数种方法之一产生，如描述于Vaughan, T.J.等, Nature Biotechnical 16:535-539, 1998。
抗-MASP-2抗体的制备
抗-MASP-2抗体可使用MASP-2多肽(例如，全长MASP-2)或使用带有抗原性MASP-2表位的肽(例如，MASP-2多肽的一部分)制备。免疫原性肽可以小至5个氨基酸残基。例如，包括SEQ ID NO:6的全部氨基酸序列的MASP-2多肽可用于诱导用于本发明方法的抗-MASP-2抗体。已知参与蛋白-蛋白相互作用的特定MASP-2结构域，例如CUBI和CUBIEGF结构域，以及包括丝氨酸-蛋白酶活性位点的区域，可如实施例3中所述作为重组多肽表达并用作抗原。另外，包括MASP-2多肽(SEQ ID NO:6)的至少6个氨基酸的部分的肽亦可用于诱导MASP-2抗体。用于诱导MASP-2抗体的MASP-2来源的抗原的其它实例提供在下表2中。用于产生抗体的MASP-2肽和多肽可作为天然多肽、或重组或合成肽和催化失活的重组多肽分离，例如MASP-2A，如实施例5-7进一步描述的。在本发明该方面的一些实施方案中，抗-MASP-2抗体使用转基因小鼠品系获得，如实施例8和9中所述和下文进一步描述的。
用于产生抗-MASP-2抗体的抗原还包括融合多肽，例如MASP-2或其一部分与免疫球蛋白多肽或与麦芽糖-结合蛋白的融合物。多肽免疫原可以是全长分子或其一部分。如果多肽部分是半抗原-样，所述部分可有利地与大分子载体(例如匙孔
Figure DEST_PATH_IMAGE003
血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)结合或连接用于免疫。
表3：MASP-2来源的抗原
Figure DEST_PATH_IMAGE004
多克隆抗体
针对MASP-2的多克隆抗体可通过使用本领域普通技术人员众所周知的方法用MASP-2多肽或其免疫原部分免疫动物制备。参见例如，Green等, "Production ofPolyclonal Antisera," in Immunochemical Protocols (Manson编辑), 第105页。MASP-2多肽的免疫原性可通过使用佐剂，包括无机凝胶例如氢氧化铝或弗氏佐剂(完全或不完全)、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇、多聚阴离子、油乳剂、匙孔
Figure 484524DEST_PATH_IMAGE003
血蓝蛋白和二硝基苯酚而增加。多克隆抗体通常在动物例如马、牛、狗、鸡、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、山羊或绵羊中产生。或者，用于本发明的抗-MASP-2抗体也可源自低于人类的灵长类动物。用于在狒狒中产生诊断和治疗上有用的抗体的一般性技术可见于例如，Goldenberg等,International Patent Publication No. WO 91/11465和Losman, M.J.等, Int. J. Cancer 46:310, 1990。然后使用本领域众所周知的标准程序自这样免疫的动物的血液中产生包含免疫活性抗体的血清。
单克隆抗体
在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是抗-MASP-2单克隆抗体。抗-MASP-2单克隆抗体具有高度的特异性，针对单一MASP-2表位。如本文所用的，修饰词"单克隆"表示获自基本上均质抗体群的抗体的特征，和不应解释为要求通过任何特定的方法制备抗体。单克隆抗体可使用提供通过连续细胞系培养产生抗体分子的任何技术获得，例如描述于Kohler, G.等, Nature 256:495, 1975中的杂交瘤方法，或它们可通过重组DNA方法制备(参见例如，Cabilly的美国专利号4,816,567)。单克隆抗体也可使用描述于Clackson, T.等, Nature 352:624-628, 1991和Marks, J.D.等, J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991中的技术自噬菌体抗体库分离。这样的抗体可属于任何免疫球蛋白类型，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亚型。
例如，单克隆抗体可通过用包括MASP-2多肽或其部分的组合物注射合适的哺乳动物(例如，BALB/c小鼠)获得。在预定一段时间后，从小鼠取出脾细胞和悬浮在细胞培养基中。然后将脾细胞与永生细胞系融合，形成杂交瘤。将形成的杂交瘤在细胞培养中生长，并筛选它们产生针对MASP-2的单克隆抗体的能力。进一步描述生产抗-MASP-2单克隆抗体的实例提供在本文中(例如，实施例10和13)。(亦参见Current Protocols in Immunology,Vol. 1., John Wiley & Sons, 第2.5.1-2.6.7页, 1991)。
人单克隆抗体可通过使用转基因小鼠获得，所述小鼠已被工程改造以在响应抗原攻击时产生特异性人抗体。在该技术中，将人免疫球蛋白重链和轻链基因座的元件引入源自胚胎干细胞系的小鼠品系中，所述干细胞系包含内源免疫球蛋白重链和轻链基因座的靶向破坏。转基因小鼠可合成对人抗原具有特异性的人抗体，所述抗原例如本文描述的MASP-2抗原，和所述小鼠可用于使用常规的Kohler-Milstein技术，通过融合来自所述动物的B-细胞与合适的骨髓瘤细胞系，产生分泌人MASP-2抗体的杂交瘤，如实施例7中进一步描述的。具有人免疫球蛋白基因组的转基因小鼠是市售可得的(例如，来自Abgenix, Inc.,Fremont, CA和Medarex, Inc., Annandale, N.J.)。用于自转基因小鼠获得人抗体的方法描述于例如，Green, L.L.等, Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg, N.等, Nature 368:856, 1994;和Taylor, L.D.等, Int. Immun. 6:579, 1994。
单克隆抗体可通过各种充分建立的技术自杂交瘤培养物分离和纯化。这样的分离技术包括用蛋白-A Sepharose的亲和色谱、大小排阻色谱和离子交换色谱(参见例如，Coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页; Baines等, "Purification ofImmunoglobulin G (IgG)"，于Methods in Molecular Biology, The humana Press,Inc., Vol. 10, 第79-104页, 1992)。
一旦产生，首先测试多克隆、单克隆或噬菌体来源的抗体的特异性MASP-2结合。本领域技术人员已知的多种测定法可用于检测特异性结合MASP-2的抗体。示例性的测定法包括通过标准方法(例如，描述于Ausubel等)的蛋白质印迹或免疫沉淀分析、免疫电泳、酶联免疫吸附测定法、斑点印迹、抑制或竞争测定法和夹心测定法(如描述于Harlow和Land,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)。一旦鉴定特异性结合MASP-2的抗体，用数种测定法例如，凝集素-特异性C4裂解测定法(描述于实施例2)、C3b沉积测定法(描述于实施例2)或C4b沉积测定法(描述于实施例2)中的一种测试抗-MASP-2抗体作为MASP-2抑制剂的能力。
抗-MASP-2单克隆抗体的亲和力可通过本领域普通技术人员容易地确定(参见例如，Scatchard, A., NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949)。在一个实施方案中，用于本发明方法的抗-MASP-2单克隆抗体结合MASP-2，其结合亲和力为<100 nM，优选地<10 nM和最优选地<2 nM。
嵌合/人源化抗体
用于本发明方法的单克隆抗体包括嵌合抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的抗体的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类型或亚型的抗体的相应序列相同或同源；以及这样的抗体的片段(Cabilly的美国专利号4,816,567;和Morrison, S.L.等, Proc. Nat'l Acad. Sci.USA 81:6851-6855, 1984)。
用于本发明的一种形式的嵌合抗体是人源化的单克隆抗-MASP-2抗体。人源化形式的非-人(例如，鼠)抗体是嵌合抗体，其包含源自非-人免疫球蛋白的最小序列。人源化的单克隆抗体通过转移来自小鼠免疫球蛋白的重和轻可变链的非-人(例如，小鼠)互补决定区(CDR)至人可变结构域产生。通常，然后将人抗体的残基置换到非-人对应物的框架区。此外，人源化的抗体可包括在受体抗体或供体抗体中不存在的残基。可进行这些修饰以进一步精修抗体性能。通常，人源化的抗体将包括基本上所有的至少一个和通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非-人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的Fv框架区为人免疫球蛋白序列的那些。人源化的抗体任选还将包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的恒定区。对于进一步的细节，参见Jones, P.T.等, Nature 321:522-525, 1986; Reichmann, L., 等, Nature 332:323-329, 1988;和Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992。
用于本发明的人源化抗体包括包含至少MASP-2结合CDR3区的人单克隆抗体。另外，Fc部分可经替换以产生IgA或IgM以及人IgG抗体。这样的人源化抗体将具有特定的临床用处，因为它们将特异性识别人MASP-2，但在人中不针对抗体本身引发免疫反应。因此，它们更好地适合于在人中体内给予，尤其是当需要重复或长期给予时。
自鼠抗-MASP-2单克隆抗体产生人源化的抗-MASP-2抗体的实例提供在本文的实施例6中。用于产生人源化的单克隆抗体的技术还描述于例如，Jones, P.T.等, Nature 321:522, 1986; Carter, P., 等, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992; Singer, I.I.等, J. Immun. 150:2844, 1993; Sudhir (编辑)，Antibody Engineering Protocols, Humana Press,Inc., 1995; Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies"，于Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland等(编辑), John Wiley & Sons,Inc., 第399-434页, 1996;和Queen的美国专利号5,693,762, 1997。另外，存在从特异性鼠抗体区合成人源化抗体的商业机构，例如Protein Design Labs (Mountain View, CA)。
重组抗体
抗-MASP-2抗体还可使用重组方法制备。例如，人抗体可使用人免疫球蛋白表达文库(可获自例如，Stratagene, Corp., La Jolla, CA)制备，以产生人抗体的片段(VH、VL、Fv、Fd、Fab或F(ab')2)。这些片段然后用于使用类似于用于产生嵌合抗体的技术，构建完整的人抗体。
抗-个体型抗体
一旦抗-MASP-2抗体经鉴定具有所需的抑制活性，这些抗体可用于使用本领域众所周知的技术产生抗-个体型抗体，其模拟MASP-2的一部分。参见例如，Greenspan, N.S.等, FASEB J. 7:437, 1993。例如，结合MASP-2和竞争抑制补体活化所需的MASP-2蛋白相互作用的抗体可用于产生抗-个体型，其模拟在MASP-2蛋白上的MBL结合位点，因此结合并中和MASP-2的结合配体，例如MBL。
免疫球蛋白片段
用于本发明方法的MASP-2抑制剂不仅包括完整的免疫球蛋白分子，而且包括众所周知的片段，包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和Fv片段、scFv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和从抗体片段形成的多特异性抗体。
本领域众所周知，仅抗体分子的一小部分(互补位)参与抗体与其表位的结合(参见例如，Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley& Sons, Inc., NY, 1986)。抗体的pFc'和Fc区是经典补体途径的效应器，但不参与抗原结合。pFc'区从其经过酶裂解的抗体或没有pFc'区而产生的抗体，被称为F(ab')2片段和保留完整抗体的两个抗原结合位点。分离的F(ab')2片段因为其两个抗原结合位点而被称为二价单克隆片段。类似地，Fc区从其经过酶裂解的抗体或没有Fc区而产生的抗体，被称为Fab片段和保留完整抗体分子的一个抗原结合位点。
抗体片段可通过蛋白水解获得，例如通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体。例如，抗体片段可通过用胃蛋白酶经酶裂解抗体得到称为F(ab')2的5S片段产生。该片段可使用巯基还原剂进一步裂解以产生3.5S Fab'单价片段。任选地，裂解反应可使用二硫键裂解产生的巯基的封闭基团进行。或者，使用胃蛋白酶经酶裂解直接产生两个单价Fab片段和Fc片段。这些方法描述于例如，Goldenberg的美国专利号4,331,647;Nisonoff, A.等, Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, R.R., Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman等, 于Methods in Enzymology 1:422, Academic Press,1967;和Coligan第2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4页。
在一些实施方案中，优选使用缺少Fc区的抗体片段，以避免经典补体途径的活化，经典补体途径在Fc与Fcγ受体结合时起始。存在数种可产生避免Fcγ受体相互作用的MoAb的方法。例如，单克隆抗体的Fc区可使用蛋白水解酶部分消化(例如无花果蛋白酶消化)经化学除去，从而产生例如，抗原-结合抗体片段例如Fab或F(ab)2片段(Mariani, M.等,Mol. Immunol. 28:69-71, 1991)。或者，人γ4 IgG同种型，其不结合Fcγ受体，可在构建人源化抗体期间使用，如本文所述。缺少Fc结构域的抗体、单链抗体和抗原-结合结构域也可使用本文描述的重组技术经工程改造。
单链抗体片段
或者，可创建对MASP-2具有特异性的单一肽链结合分子，其中连接重链和轻链Fv区。Fv片段可通过肽接头连接以形成单链抗原结合蛋白(scFv)。这些单链抗原结合蛋白通过构建包括通过寡核苷酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因制备。结构基因插入到表达载体，其随后引入至宿主细胞，例如大肠杆菌。重组宿主细胞合成具有桥接两个V结构域的接头肽的单一多肽链。用于产生scFvs的方法描述于例如，Whitlow等, "Methods: A Companion to Methods in Enzymology" 2:97, 1991; Bird等, Science 242:423, 1988; 美国专利号4,946,778, to Ladner; Pack, P., 等, Bio/Technology 11:1271, 1993。
作为说明性的实例，MASP-2特异性scFv可通过将淋巴细胞体外暴露于MASP-2多肽，和在噬菌体或类似的载体中选择抗体展示文库获得(例如，通过使用固定的或标记的MASP-2蛋白或肽)。编码具有潜在的MASP-2多肽结合结构域的多肽的基因可通过筛选展示在噬菌体或细菌例如大肠杆菌上的随机肽文库获得。这些随机肽展示文库可用于筛选与MASP-2相互作用的肽。用于产生和筛选这样的随机肽展示文库的技术是本领域众所周知的(Lardner的美国专利号5,223,409; Ladner的美国专利号4,946,778; Lardner的美国专利号5,403,484; Lardner的美国专利号5,571,698;和Kay等, Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996)，随机肽展示文库和用于筛选这样的文库的试剂盒可市售获得，例如得自CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.)、Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.)、New England Biolabs, Inc. (Beverly,Mass.)和Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, N.J.)。
用于本发明的该方面的另一种形式的抗-MASP-2抗体片段是编码结合MASP-2抗原上的表位和抑制MASP-2-依赖性补体活化的单一互补决定区(CDR)的肽。CDR肽("最小识别单位")可通过构建编码目的抗体的CDR的基因获得。这样的基因，例如，通过使用聚合酶链反应从产生抗体的细胞的RNA合成可变区制备(参见例如，Larrick等, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "GeneticManipulation of Monoclonal Antibodies"，于Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter等(编辑), 第166页, CambridgeUniversity Press, 1995;和Ward等"Genetic Manipulation and Expression ofAntibodies", 于Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch等(编辑), 第137页, Wiley-Liss, Inc., 1995)。
将本文描述的MASP-2抗体给予有需要的受试者以抑制MASP-2-依赖性补体活化。在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是高-亲和力人或人源化的单克隆抗-MASP-2抗体，具有降低的效应器功能。
肽抑制剂
在本发明的该方面的一些实施方案中，MASP-2抑制剂包括分离的MASP-2肽抑制剂，其包括抑制MASP-2-依赖性补体活化系统的分离的天然肽抑制剂和合成的肽抑制剂。如本文所用的，术语"分离的MASP-2肽抑制剂"是指抑制MASP-2依赖性补体活化的肽，其通过与凝集素途径的另一识别分子结合、与MASP-2竞争结合凝集素途径的另一识别分子(例如，MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白)和/或直接与MASP-2相互作用以抑制MASP-2-依赖性补体活化，其是基本上纯的，并且基本上不含它们在自然界中可能一起存在的其它物质至对其预期应用实际和合适的程度。
肽抑制剂已经在体内成功用于干扰蛋白-蛋白相互作用和催化位点。例如，结构上涉及LFA-1的粘连分子的肽抑制剂最近已获批准用于凝血病的临床应用(Ohman, E.M.,等, European Heart J. 16:50-55, 1995)。已经描述了防止或干扰整联蛋白-依赖性粘连的短的线性肽(<30个氨基酸) (Murayama, O.等, J. Biochem. 120:445-51, 1996)。较长的肽，长度范围为25-200个氨基酸残基，已经成功用于阻断整联蛋白-依赖性粘连(Zhang,L.等, J. Biol. Chem. 271(47):29953-57, 1996)。通常，较长的肽抑制剂具有比短肽更高的亲和力和/或更慢的解离速率，因此可能是更有效的抑制剂。已经显示环状肽抑制剂是用于治疗人炎性疾病的整联蛋白的体内有效抑制剂(Jackson, D.Y.等, J. Med. Chem. 40:3359-68, 1997)。产生环状肽的一种方法包括合成其中肽的末端氨基酸是半胱氨酸的肽，从而允许肽通过在末端氨基酸之间的二硫键以环状形式存在，这已经表明改进亲和力和体内半寿期用于治疗生血肿瘤(例如，Larson的美国专利号6,649,592)。
合成的MASP-2肽抑制剂
用于本发明的该方面的方法的MASP-2抑制性肽通过模拟对MASP-2功能重要的靶标区的氨基酸序列举例说明。用于本发明的方法的实践的抑制性肽的大小范围是约5个氨基酸至约300个氨基酸。表4提供示例性的抑制性肽的列表，其可用于实践本发明的该方面。可在数种测定法之一中，包括例如，凝集素特异性C4裂解测定法(描述于实施例2)和C3b沉积测定法(描述于实施例2)，测试候选的MASP-2抑制性肽起MASP-2抑制剂作用的能力。
在一些实施方案中，MASP-2抑制性肽源自MASP-2多肽和选自全长成熟MASP-2蛋白(SEQ ID NO:6)，或选自MASP-2蛋白的特定的结构域，例如CUBI结构域(SEQ ID NO:8)、CUBIEGF结构域(SEQ ID NO:9)、EGF结构域(SEQ ID NO:11)和丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ IDNO:12)。如之前描述的，CUBEGFCUBII区已经表明对于二聚化和与MBL结合是必需的(Thielens等，同上)。具体而言，在鉴定带有在Asp105处纯合突变为Gly105的人的研究中，MASP-2的CUBI结构域中的肽序列TFRSDYN (SEQ ID NO:16)已经表明参与结合MBL，导致MASP-2从MBL复合物丢失(Stengaard-Pedersen, K.等, New England J. Med. 349:554-560, 2003)。
在一些实施方案中，MASP-2抑制性肽源自结合MASP-2和参与凝集素补体途径的凝集素蛋白。已经鉴定了参与该途径的数种不同的凝集素，包括甘露聚糖-结合凝集素(MBL)、L-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白。(Ikeda, K.等, J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., 等, J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000;Matsushita, M., 等, J. Immunol. 168:3502-3506, 2002)。这些凝集素作为同型三聚亚基的寡聚体存在于血清中，各自具有N-末端胶原-样纤维，其具有碳水化合物识别结构域。这些不同的凝集素已经显示结合MASP-2，和凝集素/MASP-2复合物通过蛋白C4和C2的裂解激活补体。H-纤维胶凝蛋白具有24个氨基酸的氨基-末端区、具有11个Gly-Xaa-Yaa重复的胶原-样结构域、12个氨基酸的颈结构域和207个氨基酸的纤维蛋白原-样结构域(Matsushita, M.等, J. Immunol. 168:3502-3506, 2002)。H-纤维胶凝蛋白结合GlcNAc和凝集用源自鼠伤寒沙门氏菌(S. Typhimurium)、明尼苏达沙门氏菌(S. Minnesota)和大肠杆菌的LPS包被的人红细胞。H-纤维胶凝蛋白已经显示与MASP-2和MAp19缔合，激活凝集素途径(同前)。L-纤维胶凝蛋白/P35还结合GlcNAc和已经显示与人血清中的MASP-2和MAp19缔合，和该复合物已经显示激活凝集素途径(Matsushita, M.等, J. Immunol. 164:2281, 2000)。因此，用于本发明的MASP-2抑制性肽可包括选自MBL蛋白(SEQ ID NO:21)、H-纤维胶凝蛋白(Genbank检索号NM_173452)、M-纤维胶凝蛋白(Genbank检索号O00602)和L-纤维胶凝蛋白(Genbank检索号NM_015838)的至少5个氨基酸的区。
更特别地，科学家已经鉴定在MBL上的MASP-2结合位点，其在12个Gly-X-Y三联体"GKD GRD GTK GEK GEP GQG LRG LQG POG KLG POGNOG PSG SOG PKG QKG DOG KS" (SEQID NO:26)内，位于MBP的胶原-样结构域的C-末端部分的铰链和颈区之间(Wallis, R.等,J. Biol. Chem. 279:14065, 2004)。该MASP-2结合位点区在人H-纤维胶凝蛋白和人L-纤维胶凝蛋白中亦是高度保守的。已经描述了存在于所有三种凝集素蛋白中的共有结合位点，包括氨基酸序列"OGK-X-GP" (SEQ ID NO:22)，其中字母"O"表示羟基脯氨酸和字母"X"是疏水残基(Wallis等, 2004，同上)。因此，在一些实施方案中，用于本发明的该方面的MASP-2抑制性肽为至少6个氨基酸长，并包括SEQ ID NO:22。源自MBL的肽，其包括氨基酸序列"GLR GLQ GPO GKL GPO G" (SEQ ID NO:24)，已经显示体外结合MASP-2(Wallis等,2004，同上)。为增强与MASP-2的结合，可合成在各末端上侧连两个GPO三联体的肽("GPOGPO GLR GLQ GPO GKL GPO GGP OGP O" SEQ ID NO:25)，以提高三重螺旋的形成，如天然MBL蛋白中发现的那样(进一步描述于Wallis, R.等, J. Biol. Chem. 279:14065,2004)。
MASP-2抑制性肽还可源自人H-纤维胶凝蛋白，其包括来自H-纤维胶凝蛋白中的共有MASP-2结合区的序列"GAO GSO GEK GAO GPQ GPO GPO GKM GPK GEO GDO" (SEQ ID NO:27)。还包括源自人L-纤维胶凝蛋白的肽，其包括来自在L-纤维胶凝蛋白中的共有MASP-2结合区的序列"GCO GLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPN GAO GEO" (SEQID NO:28)。
MASP-2抑制性肽还可源自C4裂解位点，例如"LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI" (SEQID NO:29)，其是与抗凝血酶III的C-末端部分连接的C4裂解位点(Glover, G.I.等, Mol. Immunol. 25:1261 (1988))。
表4：示例性的MASP-2抑制性肽
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注意：字母"O"表示羟基脯氨酸。字母"X"是疏水残基。
源自C4裂解位点的肽以及抑制MASP-2丝氨酸蛋白酶位点的其它肽可经化学修饰，以致它们是不可逆的蛋白酶抑制剂。例如，合适的修饰可包括但不必然限于在C-末端、Asp或Glu或附加到官能侧链上的卤代甲基酮(Br、Cl、I、F)；在氨基或其它官能侧链上的卤代乙酰基(或其它α-卤代乙酰基)；在氨基或羧基末端上或在官能侧链上包含环氧化物或亚胺的基团；或在氨基或羧基末端上或在官能侧链上的亚胺酸酯。这样的修饰将提供通过肽的共价连接而永久抑制酶的益处。这可导致较低的有效剂量和/或需要较低频率给予肽抑制剂。
除了上文所述的抑制性肽之外，用于本发明方法的MASP-2抑制性肽包括包含如本文所述获得的抗-MASP-2 MoAb的MASP-2-结合CDR3区的肽。用于合成肽的CDR区的序列可通过本领域已知的方法确定。重链可变区是通常范围为100-150个氨基酸长的肽。轻链可变区是通常范围为80-130个氨基酸长的肽。在重链和轻链可变区内的CDR序列仅包括大约3-25个氨基酸的序列，其可容易地由本领域普通技术人员测序。
本领域技术人员将认识到，上述的MASP-2抑制性肽的基本上同源变体也将显示MASP-2抑制活性。示例性的变体包括但不必然限于在所述主题肽的羧基末端或氨基末端部分上具有插入、缺失、置换和/或另外的氨基酸的肽和其混合物。因此，具有MASP-2抑制活性的那些同源肽被认为可用于本发明的方法。所述的肽还可包括重复基序和具有保守置换的其它修饰。保守变体在本文他处有所描述，包括氨基酸交换为具有类似电荷、大小或疏水性等的另一氨基酸。
MASP-2抑制性肽可经修饰以增加溶解度和/或使正电荷或负电荷最大化，以更接近地模拟完整蛋白中的区段。衍生物可以具有或可以不具有确切的本文公开的肽的一级氨基酸结构，只要衍生物在功能上保留所需的MASP-2抑制性质。修饰可包括用通常已知的20种氨基酸之一或用另一种氨基酸、用具有辅助需要特性(例如抵抗酶降解)的衍生的或取代的氨基酸或用D-氨基酸的氨基酸置换，或用另一种模拟一个氨基酸、多个氨基酸或肽的天然构象和功能的分子或化合物例如碳水化合物置换；氨基酸缺失；用通常已知的20种氨基酸之一或用另一种氨基酸、用具有辅助需要特性(例如抵抗酶降解)的衍生的或取代的氨基酸或用D-氨基酸的氨基酸插入，或用另一种模拟一个氨基酸、多个氨基酸或肽的天然构象和功能的分子或化合物例如碳水化合物置换；或用另一种模拟母体肽的天然构象、电荷分布和功能的分子或化合物例如碳水化合物或核酸单体置换。肽还可通过乙酰化或酰胺化修饰。
衍生物抑制性肽的合成可依赖于已知的肽生物合成、碳水化合物生物合成等技术。作为起点，技术人员可依赖于合适的计算机程序以确定目的肽的构象。一旦获知本文公开的肽的构象，则技术人员可以合理的设计方式确定可在一个或多个位点上进行什么类型的置换，以形成保留母体肽的基本构象和荷电分布但可具有母体肽中不存在或比母体肽中存在的那些提高的特性的衍生物。一旦候选衍生分子被鉴定，所述衍生物可使用本文描述的测定法经测试以确定它们是否作为MASP-2抑制剂起作用。
筛选MASP-2抑制性肽
还可使用分子建模和合理分子设计以产生和筛选模拟MASP-2的关键结合区的分子结构和抑制MASP-2的补体活性的肽。用于建模的分子结构包括抗-MASP-2单克隆抗体的CDR区，以及已知对MASP-2功能是重要的靶标区，包括二聚化所需要的区、参与结合MBL的区和丝氨酸蛋白酶活性位点，如先前所述。用于鉴定结合特定靶标的肽的方法是本领域众所周知的。例如，分子印迹可用于从头构建大分子结构，例如结合特定分子的肽。参见例如，Shea, K.J., "Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De Novosynthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sties," TRIP 2(5) 1994。
作为说明性的实例，一种制备MASP-2结合肽的模拟物的方法如下。将显示MASP-2抑制的已知的MASP-2结合肽或抗-MASP-2抗体的结合区的功能单体(模板)聚合。然后除去模板，接着在模板留下的空隙中聚合第二类单体，以提供显示类似于模板的一个或多个所需性质的新分子。除了以这种方式制备肽之外，也可制备作为MASP-2抑制剂的其它MASP-2结合分子例如多糖、核苷、药物、核蛋白、脂蛋白、碳水化合物、糖蛋白、类固醇、脂质和其它生物活性物质。该方法可用于设计比它们的天然对应物更稳定的各种生物模拟物，因为它们通常通过功能单体的自由基聚合制备，产生具有不可生物降解的主链的化合物。
肽合成
MASP-2抑制性肽可使用本领域众所周知的技术制备，例如固相合成技术，其最初由Merrifield在J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963中描述。自动合成可例如，按照制造商提供的说明书使用Applied Biosystems 431A肽合成仪(Foster City, Calif.)实现。其它技术可见于例如，Bodanszky, M.等, Peptide Synthesis, 第二版, JohnWiley & Sons, 1976以及本领域技术人员已知的其它参考文献。
肽还可使用本领域技术人员已知的标准基因工程改造技术制备。例如，肽可经酶促产生：将编码肽的核酸插入表达载体，表达DNA和在存在需要的氨基酸的情况下翻译DNA成肽。然后使用色谱或电泳技术，或借助可通过将编码载体蛋白的核酸序列与肽编码序列同相插入表达载体与肽融合和随后从肽裂解的载体蛋白将肽纯化。融合蛋白-肽可使用色谱、电泳或免疫学技术(例如通过载体蛋白的抗体与树脂结合)分离。肽可使用化学方法或经酶，例如水解酶裂解。
可用于本发明方法的MASP-2抑制性肽还可在重组宿主细胞中按常规技术产生。为了表达MASP-2抑制性肽编码序列，编码所述肽的核酸分子必须与在表达载体中控制转录表达的调节序列可操作连接，然后引入至宿主细胞。除了转录调节序列例如启动子和增强子之外，表达载体可包括翻译调节序列和标记物基因，其适合于选择带有表达载体的细胞。
编码MASP-2抑制性肽的核酸分子可用"基因机器"使用方案例如磷酸亚胺酸酯方法合成。如果化学合成的双链是应用例如合成基因或基因片段需要的，则各互补链单独制备。短基因(60-80个碱基对)的产生在技术上是简单的，可通过合成互补的链然后将它们退火实现。对于产生较长的基因，将合成的基因(双链)以模块形式从20-100个核苷酸长的单链片段装配。对于有关多核苷酸合成的综述，参见例如，Glick和Pasternak, "Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA", ASM Press,1994; Itakura, K.等, Annu. Rev. Biochem. 53:323, 1984;和Climie, S.等, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633, 1990。
小分子抑制剂
在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是具有低分子量的小分子抑制剂，包括天然和合成物质，例如肽、拟肽和非肽抑制剂(包括寡核苷酸和有机化合物)。MASP-2的小分子抑制剂可基于抗-MASP-2抗体的可变区的分子结构产生。
小分子抑制剂还可根据MASP-2晶体结构使用计算机药物设计而设计和产生(Kuntz I.D.等, Science 257:1078, 1992)。已经描述了大鼠MASP-2的晶体结构(Feinberg, H., 等, EMBO J. 22:2348-2359, 2003)。使用Kuntz等描述的方法，MASP-2晶体结构坐标用作计算机程序例如DOCK的输入，其输出预期结合MASP-2的小分子结构的列表。这样的计算机程序的使用是本领域技术人员众所周知的。例如，通过使用程序DOCK评价在Cambridge Crystallographic数据库中存在的化合物与酶的结合位点的配合度，HIV-1蛋白酶抑制剂的晶体结构用于鉴定作为HIV-1蛋白酶抑制剂的独特的非肽配体(Kuntz,I.D.等, J. Mol. Biol. 161:269-288, 1982; DesJarlais, R.L., 等, PNAS 87:6644-6648, 1990)。
通过计算机方法鉴定为潜在的MASP-2抑制剂的小分子结构的列表使用MASP-2结合测定法，例如实施例10中描述的测定法进行筛选。然后在功能测定法例如实施例2中描述的测定法中测定发现结合MASP-2的小分子，以确定它们是否抑制MASP-2-依赖性补体活化。
MASP-2可溶性受体
认为其它合适的MASP-2抑制剂包括MASP-2可溶性受体，其可使用本领域普通技术人员已知的技术产生。
MASP-2的表达抑制剂
在本发明的该方面的另一实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2表达抑制剂，其能够抑制MASP-2-依赖性补体活化。在本发明的该方面的实施中，代表性的MASP-2表达抑制剂包括MASP-2反义核酸分子(例如反义mRNA、反义DNA或反义寡核苷酸)、MASP-2核酶和MASP-2RNAi分子。
反义RNA和DNA分子用于通过与MASP-2 mRNA杂交和阻止MASP-2蛋白的翻译直接阻断MASP-2 mRNA的翻译。反义核酸分子可以许多不同的方式构建，条件是它能够干扰MASP-2的表达。例如，反义核酸分子可通过相对于其正常转录取向，使MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:4)的编码区(或其一部分)反转来构建，以允许转录其互补物。
反义核酸分子通常与一个或多个靶基因的至少一部分基本上相同。然而，核酸不需要完全相同以抑制表达。通常，较高的同源性可用于补偿较短的反义核酸分子的使用。最小的百分比同一性通常大于约65%，但较高的百分比同一性可对内源序列的表达产生更有效阻遏。超过约80%的显著较大的百分比同一性通常是优选的，尽管约95%的绝对同一性通常是最优选的。
反义核酸分子不需要具有与靶基因相同的内含子或外显子模式，和靶基因的非编码区段可与编码区段同样在实现靶基因表达的反义阻遏中有效。至少约8个左右的核苷酸的DNA序列可用作反义核酸分子，尽管更长的序列是优选的。在本发明中，有用的MASP-2抑制剂的代表性实例是与由SEQ ID NO:4所示的核酸序列组成的MASP-2 cDNA的互补序列具有至少90%同一性的反义MASP-2核酸分子。SEQ ID NO:4所示的核酸序列编码由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成的MASP-2蛋白。
反义寡核苷酸靶向结合MASP-2 mRNA是可用于降低MASP-2蛋白合成水平的另一机制。例如，多聚半乳糖醛酸酶和毒蕈碱2型乙酰胆碱受体的合成被针对它们各自的mRNA序列的反义寡核苷酸抑制(Cheng的美国专利号5,739,119和Shewmaker的美国专利号5,759,829)。此外，反义抑制的实例用核蛋白细胞周期蛋白、多药抗性基因(MDG1)、ICAM-1、E-选择蛋白、STK-1、纹状体GABAA受体和人EGF得到证实(参见例如，Baracchini的美国专利号5,801,154；Baker的美国专利号5,789,573；Considine的美国专利号 5,718,709；和Reubenstein的美国专利号5,610,288)。
已经描述了允许普通技术人员确定哪些寡核苷酸可用于本发明的系统，其包括使用Rnase H裂解作为转录物内的序列的可及性的指示剂，探查在靶标mRNA中的合适位点。Scherr, M.等, Nucleic Acids Res. 26:5079-5085, 1998; Lloyd, 等, Nucleic Acids Res. 29:3665-3673, 2001。将与MASP-2转录物的某些区互补的反义寡核苷酸的混合物加入至表达MASP-2的细胞提取物中，例如肝细胞，和杂交以产生RNAseH易感位点。该方法可与计算机辅助的序列选择组合，所述计算机辅助的序列选择可根据它们形成二聚体、发夹结构或其它二级结构的相对能力预测反义组合物的最佳序列选择，所述二级结构将降低或抑制与在宿主细胞中的靶标mRNA特异性结合。这些二级结构分析和靶标位点选择考虑可使用OLIGO引物分析软件(Rychlik, I., 1997)和BLASTN 2.0.5算法软件(Altschul, S.F.,等, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1997)进行。针对靶标序列的反义化合物优选地包括约8-约50个核苷酸长度。包括约9-约35个左右核苷酸的反义寡核苷酸是特别优选的。本发明人考虑了对于实施本发明的基于反义寡核苷酸的方法，范围为9-35个核苷酸(即，9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个左右碱基长的那些)的所有寡核苷酸组合物是高度优选的。MASP-2 mRNA的高度优选的靶标区是在AUG翻译起始密码子处或其附近的那些，和与mRNA的5'区基本上互补的那些序列，例如，在MASP-2基因核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的–10和+10区之间。示例性的MASP-2表达抑制剂提供在表5中。
表5：MASP-2的示例性的表达抑制剂
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如上文所述，如本文所用的术语"寡核苷酸"是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚体或聚合物。该术语还涵盖那些寡核苷碱基，包含天然存在的核苷酸、糖和共价核苷间(主链)键以及具有非-天然存在的修饰的寡核苷酸。这些修饰允许引入通过天然存在的寡核苷酸不能提供的某些需要的性质，例如毒性降低、针对核酸酶降解的稳定性增加和细胞摄取增加。在说明性的实施方案中，本发明的反义化合物不同于天然DNA之处在于修饰磷酸二酯主链以延长反义寡核苷酸的寿命，所述反义寡核苷酸中的磷酸酯取代基被置换为硫代磷酸酯。同样，寡核苷酸的一个或两个末端可被一个或多个吖啶衍生物取代，其嵌入在核酸链内的邻近的碱基对之间。
反义的另一选择方案是使用"RNA干扰" (RNAi)。双链RNA (dsRNA)可在哺乳动物体内引起基因沉默。RNAi的天然功能和共阻遏似乎是基因组针对移动性遗传元件例如反转座子和病毒入侵的保护，所述遗传元件当变得具有活性时在宿主细胞中产生异常RNA或dsRNA(参见例如，Jensen, J., 等, Nat. Genet. 21:209-12, 1999)。双链RNA分子可通过合成能够形成双链RNA分子的两条RNA链制备，每条链具有约19至25 (例如，19-23个核苷酸)的长度。例如，用于本发明方法的dsRNA分子可包括对应于表4中所列的序列和其互补序列的RNA。优选地，RNA的至少一条链具有1-5个核苷酸的3'突出。合成的RNA链在形成双链分子的条件下合并。RNA序列可包括SEQ ID NO:4的至少8个核苷酸的部分，其总长度为25个核苷酸或更小。设计给定靶标的siRNA序列在本领域普通技术的范围内。可使用设计siRNA序列和保证表达至少70%敲减的商业化服务(Qiagen, Valencia, Calif)。
dsRNA可作为药物组合物给予和通过已知方法进行，其中将核酸引入至所需的靶细胞中。通常使用的基因转移方法包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔、显微注射和病毒方法。这样的方法在Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley& Sons, Inc., 1993中教导。
核酶也可用于降低MASP-2的量和/或生物活性，例如靶向MASP-2 mRNA的核酶。核酶是催化性RNA分子，其可裂解具有完全或部分与核酶序列同源的序列的核酸分子。有可能设计编码RNA核酶的核酶转基因，其特异性地与靶标RNA配对和在特定位置上裂解磷酸二酯主链，从而在功能上灭活靶标RNA。在进行这种裂解时，核酶本身不改变，因此能够循环和裂解其它分子。在反义RNA内包含核酶序列，赋予它们RNA-裂解活性，从而增加反义构建体的活性。
用于实施本发明的核酶通常包括至少约9个核苷酸的杂交区，其在核苷酸序列上与靶标MASP-2 mRNA的至少一部分互补；和催化区，其适合裂解靶标MASP-2 mRNA (通常参见EPA No. 0 321 201; WO88/04300; Haseloff, J.等, Nature 334:585-591, 1988;Fedor, M.J., 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1668-1672, 1990; Cech, T.R.,等, Ann. Rev. Biochem.55:599-629, 1986)。
核酶可以掺有核酶序列的RNA寡核苷酸的形式直接靶向细胞，或作为编码所需核酶RNA的表达载体引入至细胞。核酶可以与对于反义多核苷酸所述的几乎相同的方式使用和应用。
用于本发明方法的反义RNA和DNA、核酶和RNAi分子可通过本领域已知用于合成DNA和RNA分子的任何方法制备。这些方法包括用于化学合成本领域众所周知的寡聚脱氧核糖核苷酸和寡聚核糖核苷酸的技术，例如固相磷酸亚胺酸酯化学合成。或者，RNA分子可通过编码反义RNA分子的DNA序列的体外和体内转录产生。这样的DNA序列可掺入至包含合适RNA聚合酶启动子例如T7或SP6聚合酶启动子的各种载体中。或者，组成地或诱导地(取决于使用的启动子)合成反义RNA的反义cDNA构建体可稳定地引入至细胞系。
DNA分子的各种众所周知的修饰可作为增加稳定性和半寿期的工具引入。有用的修饰包括但不限于添加核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的侧翼序列至分子的5'和/或3'端或在寡聚脱氧核糖核苷酸主链内使用硫代磷酸酯或2' O-甲基而非磷酸二酯酶键。
V. 药物组合物和递送方法
给药
在另一方面，本发明提供用于在患有本文公开的疾病或病况的受试者中抑制MASP-2-依赖性补体活化的不良作用的组合物，包括给予受试者包含治疗有效量的MASP-2抑制剂和药学上可接受的载体的组合物。MASP-2抑制剂可以治疗有效剂量给予有需要的受试者以治疗或改善与MASP-2-依赖性补体活化有关的病况。治疗有效剂量是指足以导致与所述疾病或病况有关的症状改善的MASP-2抑制剂的量。
MASP-2抑制剂的毒性和治疗功效可通过标准药学程序，使用实验动物模型，例如实施例1中描述的表达人MASP-2转基因的鼠MASP-2 -/-小鼠模型测定。使用这样的动物模型，NOAEL (未观察到不良作用水平)和MED (最小有效剂量)可使用标准方法测定。NOAEL和MED效果之间的剂量比率是治疗比，其表示为比率NOAEL/MED。显示大的治疗比或指数的MASP-2抑制剂是最优选的。获自细胞培养测定法和动物研究的数据可用于配制人用剂量范围。MASP-2抑制剂的剂量优选地在循环浓度的范围内，其包括几乎没有或没有毒性的MED。剂量可在该范围内改变，取决于使用的剂型和使用的给药途径。
对于任何化合物制剂，治疗有效剂量可使用动物模型进行评估。例如，剂量可在动物模型中配制以实现包括MED的循环血浆浓度范围。MASP-2抑制剂在血浆中的定量水平还可例如通过高效液相色谱测量。
除了毒性研究之外，有效剂量还可基于存在于活的受试者中的MASP-2蛋白的量和MASP-2抑制剂的结合亲和力估算。已经显示，在正常人受试者中MASP-2水平以范围为500ng/ml的低水平存在于血清中，和在具体的受试者中的MASP-2水平可使用用于MASP-2的定量测定法测定，其描述于Moller-Kristensen M.等, J. Immunol. Methods 282:159-167,2003。
通常，给予的包括MASP-2抑制剂的组合物的剂量根据以下因素而改变，例如所述受试者的年龄、体重、身高、性别、一般医学状况和之前的病史。作为示例，MASP-2抑制剂，例如抗-MASP-2抗体，可以约0.010至10.0 mg/kg、优选地0.010至1.0 mg/kg、更优选地0.010至0.1 mg/kg的受试者体重的剂量范围给予。在一些实施方案中，组合物包括抗-MASP-2抗体和MASP-2抑制性肽的组合。
本发明的MASP-2抑制性组合物和方法在给定受试者中的治疗功效和合适的剂量可根据本领域技术人员众所周知的补体测定法测定。补体产生许多特异性产物。在近十年来，已经开发了灵敏和特异的测定法，并且对于大多数这些活化产物，包括小活化片段C3a、C4a和C5a和大活化片段iC3b、C4d、Bb和sC5b-9，这些测定法为市售可得的。大多数这些测定法利用与在所述片段上，而不是在它们从其中形成的天然蛋白上暴露的新抗原(neoantigen)反应的单克隆抗体，这使得这些测定法非常简单和特异。大多数依赖于ELISA技术，尽管放射免疫测定法有时仍用于C3a和C5a。这些后来的测定法测量未处理的片段和它们的“脱Arg”片段，其是循环中存在的主要形式。未处理的片段和C5a脱Arg通过结合细胞表面受体被快速清除，因此以非常低的浓度存在，而C3a脱Arg不结合细胞和在血浆中积聚。C3a的测量提供补体活化的灵敏的、途径-非依赖性的指示剂。替代途径活化可通过测量Bb片段进行评价。膜攻击途径活化的液相产物sC5b-9的检测，提供补体被激活至完成的证据。因为凝集素和经典途径两者均产生相同的活化产物C4a和C4d，因此这两个片段的测量不提供关于这两个途径中哪一个产生所述活化产物的任何信息。
MASP-2-依赖性补体活化的抑制的特征为由于根据本发明的方法给予MASP-2抑制剂而出现的在补体系统的组分中的以下变化的至少一个：MASP-2-依赖性补体活化系统产物C4b、C3a、C5a和/或C5b-9 (MAC)的形成或产生的抑制(例如按实施例2中所述测量)、C4裂解和C4b沉积减少(例如按实施例10中所述测量)或C3裂解和C3b沉积减少(例如按实施例10中所述测量)。
其它试剂
包括MASP-2抑制剂的组合物和方法可任选地包括一种或多种其它治疗剂，其可增加MASP-2抑制剂的活性或以累加或协同的方式提供相关的治疗功能。例如，在治疗患有血管发生-依赖性疾病或病况的受试者的情况下，一种或多种MASP-2抑制剂可与一种或多种其它抗-血管发生剂(亦称为血管抑制剂)和/或一种或多种化学治疗剂组合给予(包括共-给予)。
MASP-2抑制剂可与其它抗-血管发生剂，例如VEGF拮抗剂，例如结合VEGF的抗体，例如称为“贝伐单抗(BV)” (亦称为AVASTIN®)的抗体，结合VEGF-A或VEGF-C、或结合VEGF-A受体(例如，KDR受体或Flt-1受体)的抗体，抗-PDGFR抑制剂例如Gleevec® (甲磺酸伊马替尼)，阻断VEGF受体信号转导的小分子(例如，PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT.RTM./SU11248 (苹果酸舒尼替尼))，AMG706或描述于例如，国际专利公布WO 2004/113304中的那些组合使用。抗-血管发生剂还包括天然的血管发生抑制剂，例如，血管生长抑素、内皮生长抑素等。参见例如，Klagsbrun和D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39;Streit和Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179 (例如，表3，列出恶性黑素瘤的抗-血管发生性疗法)；Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364; Tonini等(2003) Oncogene 22:6549-6556 (例如，表2，列出已知的抗血管发生因子)；和Sato(2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206 (例如，表1，列出临床试验中使用的抗-血管发生剂)。
MASP-2抑制剂可与其它抗癌剂和/或化学治疗剂组合使用，所述抗癌剂和/或化学治疗剂例如阿巴瑞克、放线菌素D、阿霉素、阿地白介素、阿仑单抗、阿利维A酸、别嘌醇、六甲蜜胺、阿米斯丁、阿那白滞素、阿那曲唑、三氧化二砷、天门冬酰胺酶、阿扎胞苷、BCG Live、贝伐单抗、贝沙罗汀、博来霉素、硼替佐米、白消安、卡普睾酮、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、塞来考昔、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、达肝素(例如，钠)、阿法达伯汀、达沙替尼、柔红霉素、道诺霉素、地西他滨、地尼白介素、地尼白介素-毒素连接物、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、丙酸屈他雄酮、艾库组单抗、表柔比星(例如，HCl)、阿法依伯汀、厄罗替尼、雌莫司汀、依托泊苷(例如，磷酸盐)、依西美坦、芬太尼(例如，柠檬酸盐)、非格司亭、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、5-FU、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨(例如，HCl)、吉姆单抗奥佐米星、戈舍瑞林(例如，乙酸盐)、组氨瑞林(例如，乙酸盐)、羟基脲、替伊莫单抗、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼(例如，甲磺酸盐)、干扰素α-2b、伊立替康、二甲苯磺酸拉帕替尼、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林(例如，乙酸盐)、左旋咪唑、洛莫司汀、CCNU、meclorethamine (氮芥)、甲地孕酮、美法仑(L-PAM)、巯嘌呤(6-MP)、美司钠、甲氨蝶呤、甲氧沙林、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、苯丙酸诺龙、奈拉滨、nofetumomab、oprelvekin、奥沙利铂、紫杉醇、palifermin、帕米膦酸盐、帕尼单抗、培加酶、培门冬酶、培非格司亭、peg干扰素α-2b、培美曲塞(例如，二钠)、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素(光神霉素)、卟吩姆(例如，钠)、丙卡巴肼、奎纳克林、拉布立酶、利妥昔单抗、沙格司亭、索拉非尼、链佐星、舒尼替尼(例如，马来酸盐)、滑石、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷(VM-26)、睾内酯、沙利度胺、硫鸟嘌呤(6-TG)、塞替派、塞替派、塞替派、托泊替康(例如，hcl)、托瑞米芬、托西莫单抗/I-131 (托西莫单抗)、曲妥单抗、维甲酸(ATRA)、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、vorinostat、唑来膦酸盐和唑来膦酸。
药用载体和递送媒介
通常，本发明的MASP-2抑制剂组合物，与任何其它选择的治疗剂组合，合适地包含在药学上可接受的载体中。所述载体是无毒的、生物相容的和经选择使得不会有害地影响MASP-2抑制剂(和与其组合的任何其它治疗剂)的生物活性。对于肽的示例性的药学上可接受的载体描述于Yamada的美国专利号5,211,657。用于本发明的抗-MASP-2抗体和抑制性肽可配制成呈固体、半固体、凝胶、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、贮库制剂、吸入剂和注射剂，其允许口服、胃肠外或手术给予。本发明还考虑了通过包覆医学装置等局部给予组合物。
用于通过注射、输注或灌洗的胃肠外递送和局部递送的合适载体包括蒸馏水、生理学磷酸缓冲盐水、正常或乳酸林格溶液、葡萄糖溶液、Hank溶液或丙二醇。另外，无菌的固定油可用作溶剂或悬浮介质。对于该目的，可使用任何生物相容的油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。另外，脂肪酸例如油酸可用于制备注射剂。可将载体和试剂混合为液体、混悬液、聚合或非聚合凝胶、糊剂或油膏。
载体还可包括递送媒介以维持(即，延长、延迟或调节)试剂的递送或增强治疗剂的递送、摄取、稳定性或药代动力学。通过非限制性实例的方式，这样的递送介质可包括包含蛋白的微粒、微球、纳米球或纳米粒；脂质体、碳水化合物、合成的有机化合物、无机化合物、聚合或共聚水凝胶和聚合胶束。合适的水凝胶和胶束递送系统包括WO 2004/009664 A2中公开的PEO:PHB:PEO共聚物和共聚物/环糊精复合物，和美国专利申请号2002/0019369A1中公开的PEO和PEO/环糊精复合物。这样的水凝胶可局部注射在预期作用的部位处，或经皮下或肌内注射形成延迟释放贮库。
对于关节内递送，MASP-2抑制剂可包含在上述可注射的液体或凝胶载体、上述可注射的持续释放递送媒介或透明质酸或透明质酸衍生物中。
对于口服给予非-肽能药，MASP-2抑制剂可包含在惰性填充剂或稀释剂中，例如蔗糖、玉米淀粉或纤维素。
对于局部给予，MASP-2抑制剂可保持在软膏剂、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体或粉剂中，或通过经皮贴剂在凝胶或微胶囊递送系统中。
各种经鼻和肺递送系统，包括气雾剂、计量吸入器、干粉吸入器和喷雾器，正在开发和可经合适改变用于分别在气雾剂、吸入剂或喷雾递送媒介中进行本发明的递送。
对于鞘内(IT)或脑室内(ICV)递送，合适的无菌递送系统(例如，液体、凝胶、混悬剂等)可用于给予本发明。
本发明的组合物还可包括生物相容的赋形剂，例如分散剂或湿润剂、助悬剂、稀释剂、缓冲剂、渗透促进剂、乳化剂、粘合剂、增稠剂、矫味剂(用于口服给予)。
用于抗体和肽的药用载体
关于抗-MASP-2抗体和抑制性肽更特别的是，示例性的制剂可在含有药用载体的生理学可接受的稀释剂中作为注射剂量的化合物溶液或混悬液经胃肠外给予，所述载体可以是无菌液体，例如水、油、盐水、甘油或乙醇。此外，辅助物质例如湿润剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等可存在于包括抗-MASP-2抗体和抑制性肽的组合物中。药物组合物的其它组分包括油(例如动物、植物或合成来源)，例如，大豆油和矿物油。通常，二醇例如丙二醇或聚乙二醇是用于注射溶液的优选的液体载体。
抗-MASP-2抗体和抑制性肽还可以贮库注射剂或植入制剂的形式给予，其可以允许活性剂的持续或脉动释放的方式配制。
用于表达抑制剂的药学上可接受的载体
关于用于本发明方法的表达抑制剂更特别的是，提供包括上述表达抑制剂和药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。组合物还可包括胶体分散系统。
包含表达抑制剂的药物组合物可包括但不限于溶液剂、乳剂和包含脂质体的制剂。这些组合物可自各种组分产生，包括但不限于预形成的液体、自乳化固体和自乳化半固体。这样的组合物的制备通常包括混合表达抑制剂与以下的一种或多种：缓冲剂、抗氧化剂、低分子量多肽、蛋白、氨基酸、碳水化合物包括葡萄糖、蔗糖或糊精；螯合剂例如EDTA、谷胱甘肽和其它稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或与非-特异性血清白蛋白混合的盐水是合适的稀释剂的实例。
在一些实施方案中，组合物可制备和配制为乳剂，其通常是一种液体以微滴形式分散在另一种液体中的异质系统(参见Idson, 于Pharmaceutical Dosage Forms, Vol.1, Rieger和Banker (编辑), Marcek Dekker, Inc., N.Y., 1988)。用于乳剂配制的天然存在的乳化剂的实例包括阿拉伯胶、蜂蜡、羊毛脂、卵磷脂和磷脂。
在一个实施方案中，包含核酸的组合物可配制为微乳剂。如本文所用的微乳剂是指水、油和两亲化合物的系统，其是单一的光学各向同性的和热力学稳定的液体溶液(参见Rosoff于Pharmaceutical Dosage Forms, Vol. 1)。本发明的方法还可使用脂质体用于传递和递送反义寡核苷酸至所需部位。
用于局部给予的表达抑制剂的药物组合物和制剂可包括经皮贴剂、软膏剂、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。可使用常规的药用载体以及水、粉或油性基质和增稠剂等。
给药方式
可以多种方式给予包含MASP-2抑制剂的药物组合物，这取决于是局部还是全身性给药方式最适于待治疗的病况。此外，本发明的组合物可通过将组合物涂布或掺入可植入的医疗装置上面或里面而递送。
全身递送
如本文所用，术语“全身递送”和“全身给药”意图包括但不限于口服和胃肠外途径，包括肌内(IM)、皮下、静脉内(IV)、动脉内、吸入、舌下、含服、局部、经皮、经鼻、直肠、阴道和其它给药途径，这将所递送的药物有效地分散到预期治疗作用的一个或多个部位。用于本发明组合物的全身递送的优选途径包括静脉内、肌内、皮下和吸入。应当理解，对于用于本发明具体组合物中所选用的药物，确切的全身给药途径将部分地考虑药物对与指定给药途径相关的代谢转化途径的敏感性加以确定。例如，肽能药物可能最适于通过口服以外的途径给药。
可通过任何合适的方法将MASP-2抑制性抗体和多肽递送到有需要的受试者中。递送MASP-2抗体和多肽的方法包括经口服、肺部、胃肠外(例如肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、吸入(例如经由微细粉制剂)、经皮、经鼻、阴道、直肠或者舌下给药途径给予，并且可将其配制成适于各种给药途径的剂型。
通过代表性实例的方式，可以通过将MASP-2抑制性抗体和肽应用到能够吸收多肽的身体膜上，例如鼻膜、胃肠膜和直肠膜，而将其引入活体内。通常将多肽和渗透促进剂一起应用到可吸收膜上(参见例如Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5:69, (1988)；Lee, V.H.L., J. Controlled Release13:213, (1990)；Lee, V.H.L.主编,Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991)；DeBoer,A.G.,等人, J. Controlled Release13:241, (1990)。例如，STDHF是梭链孢酸的合成衍生物，是结构上类似于胆盐的甾类表面活性剂，已被用作经鼻递送的渗透促进剂(Lee, W.A.,Biopharm. 22, 1990年11/12月)。
可以引入与其它分子(例如脂质)缔合的MASP-2抑制性抗体和多肽，以保护多肽不被酶降解。例如，共价连接聚合物、尤其是聚乙二醇(PEG)已被用来保护某些蛋白质不被体内的酶水解，从而延长半寿期(Fuertges, F.,等人, J. Controlled Release11:139,(1990))。已经报道了许多用于蛋白质递送的聚合物系统(Bae, Y.H.,等人, J. Controlled Release9:271, (1989)；Hori, R.,等人, Pharm. Res. 6:813, (1989)；Yamakawa, I.,等人, J. Pharm. Sci. 79:505, (1990)；Yoshihiro, I.,等人, J. Controlled Release10:195, (1989)；Asano, M.,等人, J. Controlled Release9:111,(1989)；Rosenblatt, J.,等人, J. Controlled Release9:195, (1989)；Makino, K., J. Controlled Release12:235, (1990)；Takakura, Y.,等人, J. Pharm. Sci. 78:117,(1989)；Takakura, Y.,等人, J. Pharm. Sci. 78:219, (1989))。
最近，开发出血清稳定性和循环半寿期得到改进的脂质体(参见例如Webb的美国专利号5,741,516)。而且，对脂质体和脂质体样制备物作为可能的药物载体的各种方法进行了综述(参见例如Szoka的美国专利号5,567,434；Yagi的美国专利号5,552,157；Nakamori的美国专利号5,565,213；Shinkarenko的美国专利号5,738,868以及Gao的美国专利号5,795,587)。
对于经皮应用，可将MASP-2抑制性抗体和多肽与其它合适的成分(例如载体和/或佐剂)混合。对这些其它成分的性质没有限制，只是对于其预期给药来说必须是药学上可接受的，并且不能降低组合物中活性成分的活性。合适媒介的实例包括含或不含纯化胶原的软膏、乳膏、凝胶或混悬液。MASP-2抑制性抗体和多肽还可被浸渍到经皮贴剂、膏药和绷带中，优选以液体或半液体形式。
可以在为维持治疗效果所需水平而确定的间隔的周期性基础上，全身给予本发明的组合物。例如，可按每2-4周或者以更低频率的间隔给予组合物(例如经皮下注射)。给药方案将由医师考虑可能影响药物联用的作用的各种因素来确定。这些因素包括待治疗疾病的进展程度、患者的年龄、性别和体重和其它临床因素。各独立药物的剂量将随组合物中所包含的MASP-2抑制剂以及任何递送媒介(例如缓释递送媒介)的存在和性质而变化。此外，可在考虑给药频率和所递送药物的药代动力学行为的变化后对剂量进行调整。
局部递送
本文所用术语“局部”包括药物在预期局部化作用部位上或其周围的应用，可包括例如局部递送到皮肤或其它受累组织；眼部递药；鞘内(IT)、脑室内(ICV)、关节内、腔内、颅内或肺泡内给药、安置或冲洗。可优选能够给予较低剂量的局部给药以避免全身性不良作用，以及更精确地控制递药时间和局部递药部位的活性剂浓度。不论患者之间在新陈代谢、血流等方面的变化，局部给药都在目标部位提供已知的浓度。通过直接递药方式亦提供改进的剂量控制。
MASP-2抑制剂的局部递送可在用于治疗血管发生-依赖性疾病或病况的手术方法的情况下，例如在程序例如眼睛手术或癌症相关手术期间实现。
治疗方案
在预防性应用中，以足以抑制血管发生的量将包含MASP-2抑制剂的药物组合物给予疑似或否则有风险发生血管发生-依赖性疾病或病况的受试者，从而消除或降低发生该病况的症状的风险。在一些实施方案中，以足以减轻或至少部分降低该病况的症状的治疗有效量，将药物组合物给予疑似或已经患有血管发生-依赖性疾病或病况的受试者。在预防性和治疗性两种方案中，包含MASP-2抑制剂的组合物可以数个剂量给予，直到在受试者中已实现足够的治疗结果。本发明的MASP-2抑制性组合物的施用可通过单次给予组合物，或有限的给予顺序进行，以治疗与血管发生有关的急性病况。或者，组合物可在长期时间内以定期间隔给予，以治疗与血管发生有关的慢性病况。
在预防性和治疗性两种方案中，包含MASP-2抑制剂的组合物可以数个剂量给予，直到在受试者中已实现足够的治疗结果。在本发明的一个实施方案中，MASP-2抑制剂包含MASP-2抗体，其可以0.1 mg-10,000 mg、更合适地1.0 mg-5,000 mg、更合适地10.0 mg-2,000 mg、更合适地10.0 mg-1,000 mg和还更合适地50.0 mg-500 mg的剂量，适当给予成人患者(例如，平均成人重量70 kg)。对于儿科患者，剂量可按患者重量的比例进行调整。本发明的MASP-2抑制性组合物的施用可通过单次给予组合物，或有限的给予顺序进行，以治疗患有或有风险发生血管发生-依赖性疾病或病况，例如血管发生-依赖性癌症、血管发生-依赖性良性肿瘤或眼睛血管发生性疾病或病况的受试者。或者，组合物可在长期时间内以定期间隔，例如每日、每周两次、每周、每隔一周、每月或每两月给予，以治疗患有或有风险发生血管发生-依赖性疾病或病况，例如血管发生-依赖性癌症、血管发生-依赖性良性肿瘤或眼睛血管发生性疾病或病况的受试者。
在预防性和治疗性两种方案中，包含MASP-2抑制剂的组合物可以数个剂量给予，直到在受试者中已实现足够的治疗结果。
在一个实施方案中，以有效抑制血管发生的量将包含MASP-2抑制剂的药物组合物给予患有眼睛血管发生性疾病或病况的受试者。在一个实施方案中，眼睛血管发生性疾病或病况选自AMD、葡萄膜炎、眼睛黑素瘤、角膜新生血管形成、原发性翼状胬肉、HSV间质性角膜炎、HSV-1诱导的角膜淋巴血管发生、增生性糖尿病视网膜病、早产儿视网膜病、视网膜静脉闭塞、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼和潮红。
在另一个实施方案中，以有效抑制血管发生的量将包含MASP-2抑制剂的药物组合物给予患有血管发生-依赖性癌症的受试者。在一个实施方案中，血管发生-依赖性癌症选自实体瘤、血荷肿瘤、高风险类癌肿瘤和肿瘤转移。在一个实施方案中，以有效抑制肿瘤血管发生的量给予组合物。在一个实施方案中，受试者患有肿瘤转移或有肿瘤转移的风险，和以有效抑制肿瘤转移的量给予组合物。在一个实施方案中，受试者患有血管发生-依赖性癌症，其选自结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、神经胶质瘤、胃肠间质肿瘤、淋巴瘤、黑素瘤和类癌肿瘤。在一个实施方案中，受试者患有良性肿瘤和以有效抑制良性肿瘤的血管发生的量给予组合物。
VI. 实施例
以下实施例仅说明目前预期实施本发明的最佳模式，而不应解释为限制本发明。本文的所有文献引述通过引用明确地予以结合。
实施例1
本实施例描述MASP-2缺陷(MASP-2-/-)但MAp19充足(MAp19+/+)的小鼠品系的产生。
材料和方法：设计靶向载体pKO-NTKV 1901以破坏编码鼠MASP-2的C-末端的三个外显子，包括编码丝氨酸蛋白酶结构域的外显子，如图3中所示。PKO-NTKV 1901用于转染鼠ES细胞系E14.1a (SV129 Ola)。选择新霉素-抗性和胸苷激酶-敏感性克隆。筛选600个ES克隆，和在这些克隆中，通过DNA印迹鉴定和验证4个不同的克隆，以包含预期的选择性靶向和重组事件，如图3中所示。从这4个阳性克隆中通过胚胎转移产生嵌合体。然后将嵌合体在遗传背景C57/BL6中回交，以产生转基因雄性。转基因雄性与雌性杂交，产生F1，其中50%的后代对于破坏的MASP-2基因显示杂合性。杂合小鼠互交，产生纯合MASP-2缺陷后代，以1:2:1的比率分别得到杂合和野生型小鼠。
结果和表型：发现得到的纯合MASP-2-/- (即，基因靶向缺陷)小鼠能存活并且可繁殖，并且通过DNA印迹证实正确的靶向事件，通过RNA印迹证实缺少MASP-2 mRNA，和通过蛋白质印迹证实缺少MASP-2蛋白(数据未显示)，验证是MASP-2缺陷的。使用时间解析RT-PCR在LightCycler仪器上进一步证实存在MAp19 mRNA和缺少MASP-2 mRNA。MASP-2-/-小鼠的确按期望地继续表达MAp19、MASP-1和MASP-3 mRNA和蛋白质(数据未显示)。在MASP-2-/-小鼠中备解素、因子B、因子D、C4、C2和C3的mRNA的存在和丰度通过LightCycler分析评价，和发现与野生型同窝对照相同(数据未显示)。来自纯合MASP-2-/-小鼠的血浆完全缺乏凝集素-途径-介导的补体活化，如实施例2中进一步描述的。
在纯C57BL6背景上MASP-2-/-品系的产生：在使用MASP-2-/-品系作为实验动物模型之前，将MASP-2-/-小鼠与纯C57BL6系回交九代。
还如下产生转基因小鼠品系，其是鼠MASP-2-/-、MAp19+/+和表达人MASP-2转基因(鼠MASP-2敲除和人MASP-2敲入)：
材料和方法：构建编码称为"微小hMASP-2"的人MASP-2的微基因(SEQ ID NO:49)，如图4中所示，其包括人MASP 2基因的启动子区，所述基因包括前3个外显子(外显子1至外显子3)，接着是表示随后8个外显子的编码序列的cDNA序列，从而编码通过其内源启动子驱动的全长MASP-2蛋白。将微小hMASP-2构建体注入MASP-2-/-的受精卵以通过转基因表达人MASP-2，替换缺陷的鼠MASP 2基因。
实施例2
本实施例证实MASP-2是通过凝集素途径的补体活化所需要的。
方法和材料：
凝集素途径特异性C4裂解测定法：C4裂解测定法描述于Petersen等, J. Immunol. Methods 257:107 (2001)，其测量由结合L-纤维胶凝蛋白的金黄色葡萄球菌的脂磷壁酸(LTA)导致的凝集素途径活化。Petersen等(2001)描述的该测定法通过用LPS和甘露聚糖或酵母聚糖包被板，然后加入来自MASP-2 -/-小鼠的血清，经改良以测量经过MBL的凝集素途径活化，如下文所述。该测定法还经改良，以除去由于经典途径导致的C4裂解的可能性。这通过使用包含1 M NaCl的样品稀释缓冲液实现，其允许凝集素途径识别组分与它们的配体高亲和力结合，但阻止内源C4的活化，从而通过解离C1复合物排除经典途径的参与。简言之，在改良的测定法中，将血清样品(在高盐(1 M NaCl)缓冲液中稀释)加入配体包被的板，接着加入在具有生理学浓度的盐的缓冲液中的恒定量的纯化的C4。包含MASP-2的结合的识别复合物裂解C4，导致C4b沉积。
测定方法：
1) Nunc Maxisorb微量滴定板(Maxisorb, Nunc, Cat. No. 442404, FisherScientific)用在包被缓冲液(15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6)中稀释的1 µg/ml甘露聚糖(M7504 Sigma)或任何其它配体(例如，下文列举的那些)包被。
测定法中使用以下试剂：
a. 甘露聚糖(1 µg/孔甘露聚糖(M7504 Sigma)，在100 µl包被缓冲液中)；
b. 酵母聚糖(1 µg/孔酵母聚糖(Sigma)，在100 µl包被缓冲液中)；
c. LTA (1µg/孔，在100 µl包被缓冲液中；或2 µg/孔，在20 µl甲醇中)；
d. 1 µg的H-纤维胶凝蛋白特异性Mab 4H5，在包被缓冲液中；
e. 来自绿色气球菌(Aerococcus viridans)的PSA (2 µg/孔，在100 µl包被缓冲液)；
f. 100 µl/孔的福尔马林固定的金黄色葡萄球菌DSM20233 (OD550=0.5)，在包被缓冲液中。
2) 将板在4℃孵育过夜。
3) 在孵育过夜后，残余的蛋白结合位点通过用0.1% HSA-TBS封闭缓冲液(0.1%(w/v) HAS，在10 mM Tris-CL, 140 mM NaCl, 1.5 mM NaN3中，pH 7.4)孵育板1-3小时来饱和，然后用TBS/tween/Ca2+ (TBS，含0.05% Tween 20和5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH7.4)洗涤板3X。
4) 待测试的血清样品在MBL-结合缓冲液(1 M NaCl)中稀释和将稀释的样品加入至板中，在4℃孵育过夜。仅接受缓冲液的孔用作阴性对照。
5) 在4℃孵育过夜后，用TBS/tween/Ca2+将板洗涤3X。然后将人C4 (100 µl/孔的1 µg/ml，在BBS (4 mM巴比妥, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4)中稀释)加入板中，和在37℃孵育90分钟。用TBS/tween/Ca2+将板再次洗涤3X。
6) C4b沉积用碱性磷酸酶-缀合的鸡抗-人C4c (在TBS/tween/Ca2+中1:1000稀释)检测，将其加入板中，和在室温下孵育90分钟。然后用TBS/tween/Ca2+将板再次洗涤3X。
7) 碱性磷酸酶通过加入100 µl的对硝基苯基磷酸酯底物溶液，在室温下孵育20分钟和在微量滴定板阅读器中读出OD405进行检测。
结果：图5A-B显示在来自MASP-2+/+ (十字), MASP-2+/- (实心圆)和MASP-2-/-(实心三角)的血清稀释液中，在甘露聚糖(图5A)和酵母聚糖(图5B)上C4b沉积的量。图5C显示根据测量标准化至野生型血清的C4b沉积的量，在用来自MASP-2-/+小鼠(n=5)和MASP-2-/-小鼠(n=4)的酵母聚糖(白色条)或甘露聚糖(阴影条)包被的板上，相对于野生型小鼠(n=5)的相对C4转化酶活性。误差棒表示标准偏差。如图5A-C中所示，在甘露聚糖和酵母聚糖包被的板上，来自MASP-2-/-小鼠的血浆完全缺乏凝集素-途径-介导的补体活化。这些结果清楚证实，MASP-2是凝集素途径的效应器组分。
在来自MASP-2-/-小鼠的血清中重组MASP-2重建凝集素途径-依赖性C4活化
为了确定MASP-2的缺乏是MASP-2-/-小鼠中凝集素途径-依赖性C4活化丧失的直接原因，用上述的C4裂解测定法检查添加重组MASP-2蛋白至血清样品中的作用。按下文实施例3所述，产生和纯化在功能上有活性的鼠MASP-2和催化失活的鼠MASP-2A (其中丝氨酸蛋白酶结构域中的活性位点丝氨酸残基被置换为丙氨酸残基)重组蛋白。用递增蛋白浓度的重组鼠MASP-2或失活的重组鼠MASP-2A预孵育来自4 MASP-2 -/-小鼠的合并的血清，按上文所述测定C4转化酶活性。
结果：如图6中所示，添加功能上有活性的鼠重组MASP-2蛋白(以空心三角形表示)至获自MASP-2 -/-小鼠的血清以蛋白浓度依赖性方式恢复凝集素途径-依赖性C4活化，而催化失活的鼠MASP-2A蛋白(以星号表示)未恢复C4活化。图6中显示的结果标准化至用合并的野生型小鼠血清观察到的C4活化(以虚线表示)。
实施例3
本实施例描述重组全长人、大鼠和鼠MASP-2、MASP-2衍生的多肽和MASP-2的催化失活的突变形式的重组表达和蛋白质产生。
全长人、鼠和大鼠MASP-2的表达：
将人MASP-2的全长cDNA序列(SEQ ID NO: 4)也亚克隆至哺乳动物表达载体pCI-Neo (Promega)，其在CMV增强子/启动子区的控制下驱动真核表达(描述于Kaufman R.J.等, Nucleic Acids Research19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology,185:537-66 (1991))。将全长小鼠cDNA (SEQ ID NO:50)和大鼠MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:53)各自亚克隆至pED表达载体。然后使用Maniatis等, 1989中描述的标准磷酸钙转染程序，将MASP-2表达载体转染至粘附的中国仓鼠卵巢细胞系DXB1。用这些构建体转染的细胞生长极慢，意味着编码的蛋白酶是细胞毒性的。
在另一方法中，将包含MASP-2的人cDNA的微基因构建体(SEQ ID NO:49) (通过其内源启动子驱动)瞬时转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。人MASP-2蛋白分泌至培养基，如下文所述分离。
全长的催化失活的MASP-2的表达：
原理：在识别亚组分MBL或纤维胶凝蛋白(L-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白或M-纤维胶凝蛋白)结合它们各自的碳水化合物模式后，MASP-2通过自身催化裂解来激活。导致MASP-2活化的自身催化裂解经常发生在自血清分离MASP-2的过程期间，或在重组表达后的纯化期间。为了获得较稳定的蛋白制备物用作抗原，催化失活形式的MASP-2，被称为MASP-2A，通过替代存在于蛋白酶结构域的催化三联体中的丝氨酸残基为大鼠(SEQ ID NO:55Ser617至Ala617)、小鼠(SEQ ID NO:52 Ser617至Ala617)或人(SEQ ID NO:3 Ser618至Ala618)中的丙氨酸残基产生。
为了产生催化失活的人和鼠MASP-2A蛋白，使用表6中显示的寡核苷酸进行定点诱变。表6中的寡核苷酸经设计以退火至编码有酶活性的丝氨酸的人和鼠cDNA区，和所述寡核苷酸包含错配以改变丝氨酸密码子为丙氨酸密码子。例如，PCR寡核苷酸SEQ ID NOS:56-59与人MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:4)组合使用，以扩增自起始密码子至有酶活性的丝氨酸和自丝氨酸至终止密码子的区域，以产生包含Ser618至Ala618突变的突变MASP-2A的完整开放阅读形式。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳和条带制备后纯化，和单一腺苷重叠使用标准加尾程序产生。然后将腺苷加尾的MASP-2A克隆至pGEM-T easy载体，转化至大肠杆菌。
催化失活的大鼠MASP-2A蛋白如下产生：以等摩尔量组合SEQ ID NO:64和SEQ IDNO:65、在100℃加热2分钟和缓慢冷却至室温，使这两种寡核苷酸经激酶激活(kinasing)和退火。得到的退火片段具有Pst1和Xba1相容末端，和将其插入，代替野生型大鼠MASP-2cDNA (SEQ ID NO:53)的Pst1-Xba1片段，以产生大鼠MASP-2A。
5 'GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3' (SEQ ID NO:64)
5' CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA 3' (SEQ ID NO:65)
将人、鼠和大鼠MASP-2A各自进一步亚克隆至哺乳动物表达载体pED或pCI-Neo的任一个中，和转染至中国仓鼠卵巢细胞系DXB1，如下文所述。
在另一方法中，催化失活形式的MASP-2使用描述于Chen 等, J. Biol. Chem.,276(28):25894-25902, 2001中的方法构建。简言之，包含全长人MASP-2 cDNA的质粒(描述于Thiel 等, Nature 386:506, 1997)用Xho1和EcoR1消化，将MASP-2 cDNA (本文称为SEQID NO:4)克隆至pFastBac1杆状病毒转移载体(Life Technologies, NY)的相应的限制位点。然后通过用编码肽区域氨基酸610-625 (SEQ ID NO:13)的双链寡核苷酸置换天然区域氨基酸610-625，将在Ser618处的MASP-2丝氨酸蛋白酶活性位点改变为Ala618，以产生具有失活的蛋白酶结构域的MASP-2全长多肽。
包含源自人Masp-2的多肽区域的表达质粒的构建。
以下构建体使用MASP-2信号肽(SEQ ID NO:5的残基1-15)产生以分泌MASP-2的各种结构域。表达人MASP-2 CUBI结构域(SEQ ID NO:8)的构建体通过PCR扩增编码MASP-2的残基1–121 (SEQ ID NO:6)的区域(对应于N-末端CUB1结构域)制备。表达人MASP-2CUBIEGF结构域(SEQ ID NO:9)的构建体通过PCR扩增编码MASP-2 (SEQ ID NO:6)的残基1–166的区域(对应于N-末端CUB1EGF结构域)制备。表达人MASP-2 CUBIEGFCUBII结构域(SEQID NO:10)的构建体通过PCR扩增编码MASP-2 (SEQ ID NO:6)的残基1-293的区域(对应于N-末端CUBIEGFCUBII结构域)扩增。上述的结构域使用VentR聚合酶和pBS-MASP-2作为模板，按照已建立的PCR方法，通过PCR进行扩增。有义引物的5'引物序列(5'-CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' SEQ ID NO:34)在PCR产物的5'末端引入BamHI限制位点(下划线)。下表6中显示的用于各MASP-2结构域的反义引物，经设计以在各PCR产物末端在EcoRI位点(下划线)之前引入终止密码子(粗体)。一旦扩增，DNA片段用BamHI和EcoRI消化，和克隆至pFastBac1载体的相应位点。得到的构建体通过限制性作图表征和通过dsDNA测序证实。
表6：MASP-2 PCR引物
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MASP-2的重组真核表达和酶失活小鼠、大鼠和人MASP-2A的蛋白质产生
使用标准磷酸钙转染程序将上述的MASP-2和MASP-2A表达构建体转染至DXB1细胞(Maniatis 等, 1989)。MASP-2A在无血清培养基中产生，以确保制备物未被其它血清蛋白污染。每2天自汇合的细胞收获培养基(总共四次)。对于三个物种的每一个，重组MASP-2A的水平平均为大约1.5 mg/升培养基。
MASP-2A蛋白纯化：MASP-2A (上述的Ser-Ala突变体)通过亲和色谱在MBP-A-琼脂糖柱上纯化。该策略能够快速纯化而不使用外源标签。将MASP-2A (100-200 ml的用等体积的上样缓冲液(50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 包含150 mM NaCl和25 mM CaCl2)稀释的培养基)上样到用10 ml的上样缓冲液预平衡的MBP-琼脂糖亲和柱(4 ml)上。在用另外10 ml的上样缓冲液洗涤后，蛋白用包含1.25 M NaCl和10 mM EDTA的50 mM Tris-Cl, pH 7.5以1ml流分洗脱。包含MASP-2A的流分通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。在必要时，MASP-2A通过在MonoQ柱(HR 5/5)上离子交换色谱进一步纯化。蛋白质用包含50 mM NaCl的50 mMTris-Cl pH 7.5透析，和上样到用相同缓冲液平衡的柱上。在洗涤后，结合的MASP-2A用经10 ml的0.05–1 M NaCl梯度洗脱。
结果：自200 ml培养基获得产量为0.25–0.5 mg的MASP-2A蛋白。由于糖基化，通过MALDI-MS测定的分子量77.5 kDa大于未修饰多肽的计算值(73.5 kDa)。在各个N-糖基化位点处聚糖的连接是观测的质量的原因。MASP-2A在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上作为单一条带迁移，证明在生物合成期间其未被蛋白水解加工。对于糖基化多肽的同二聚体，通过平衡超速离心测定的重均分子量与计算值一致。
重组人Masp-2多肽的产生
用于产生重组MASP-2和MASP2A衍生的多肽的另一方法描述于Thielens, N.M.,等, J. Immunol.166:5068-5077, 2001。简言之，Spodoptera frugiperda昆虫细胞(获自Novagen, Madison, WI的Ready-Plaque Sf9细胞)在添加有50 IU/ml青霉素和50 mg/ml链霉素(Life Technologies)的Sf900II无血清培养基(Life Technologies)中生长和维持。Trichoplusia ni (High Five)昆虫细胞(由Jadwiga Chroboczek, Institut deBiologie Structurale, Grenoble, France提供)在添加有50 IU/ml青霉素和50 mg/ml链霉素的包含10% FCS (Dominique Dutscher, Brumath, France)的TC100培养基(LifeTechnologies)中维持。重组杆状病毒使用Bac-to-Bac系统(Life Technologies)产生。使用Qiagen midiprep纯化系统(Qiagen)纯化杆粒DNA，并且使用cellfectin/Sf900 II SFM培养基(Life Technologies)按制造商的方案所述，将杆粒DNA用于转染Sf9昆虫细胞。4天后收集重组病毒颗粒，通过病毒斑测定法滴定，和按King和Possee在The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., London, 第111-114页, 1992中描述进行扩增。
High Five细胞(1.75 x 107个细胞/175-cm2组织培养瓶)用包含MASP-2多肽的重组病毒以2的多重性感染在Sf900 II SFM培养基中在28℃感染96 h。上清液通过离心收集，加入二异丙基氟代磷酸酯至终浓度1 mM。
MASP-2多肽分泌在培养基中。培养上清液针对50 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 50 mM三乙醇胺盐酸盐, pH 8.1透析，和以1.5 ml/min上样到用相同缓冲液平衡的Q-SepharoseFast Flow柱(Amersham Pharmacia Biotech) (2.8 x 12 cm)上。通过应用在相同缓冲液中至350 mM NaCl的1.2升线性梯度进行洗脱。包含重组MASP-2多肽的流分通过蛋白质印迹分析鉴定，通过加入(NH4)2SO4至60% (w/v)进行沉淀，和在4℃放置过夜。将沉淀重悬浮于145 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 50 mM三乙醇胺盐酸盐, pH 7.4中，并施加到用相同缓冲液平衡的TSK G3000 SWG柱(7.5 x 600 mm) (Tosohaas, Montgomeryville, PA)上。然后通过在Microsep微量浓缩器(m.w.截止= 10,000) (Filtron, Karlstein, Germany)上超滤将纯化的多肽浓缩至0.3 mg/ml。
实施例4
本实施例描述了产生针对MASP-2多肽的多克隆抗体的方法。
材料和方法：
MASP-2抗原：多克隆抗-人MASP-2抗血清通过用以下分离的MASP-2多肽免疫兔产生：分离自血清的人MASP-2 (SEQ ID NO:6)；重组人MASP-2 (SEQ ID NO:6)、包含无活性蛋白酶结构域的MASP-2A (SEQ ID NO:13)，如实施例3中所述；和如上文实施例3中所述表达的重组CUBI (SEQ ID NO:8)、CUBEGFI (SEQ ID NO:9)和CUBEGFCUBII (SEQ ID NO:10)。
多克隆抗体：6周龄兔，用BCG (杆菌Calmette-Guerin疫苗)引发，通过注射100 μg在无菌盐水溶液中的100 μg/ml的MASP-2多肽进行免疫。每4周进行注射，通过ELISA测定法监测抗体滴度，如实施例5中所述。收集培养上清液用于通过蛋白A亲和色谱进行抗体纯化。
实施例5
本实施例描述用于产生针对大鼠或人MASP-2多肽的鼠单克隆抗体的方法。
材料和方法：
雄性A/J小鼠(Harlan, Houston, Tex.)，8-12周龄，用在200 μl的磷酸缓冲盐水(PBS) pH 7.4中在完全弗氏佐剂(Difco Laboratories, Detroit, Mich)中100 μg人或大鼠rMASP-2或rMASP-2A多肽(按实施例3中所述制备)皮下注射。以两周间隔，小鼠用在不完全弗氏佐剂中的50 μg的人或大鼠rMASP-2或rMASP-2A多肽两次皮下注射。在第四周，小鼠用在PBS中的50 μg的人或大鼠rMASP-2或rMASP-2A多肽注射和4天后融合。
对于各融合，自免疫小鼠的脾制备单细胞悬浮液和用于与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。5x108个Sp2/0和5x108个脾细胞在包含50%聚乙二醇(M.W. 1450) (Kodak, Rochester,N.Y.)和5%二甲基亚砜(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)的培养基中融合。然后在添加有10%胎牛血清、100个单位/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、0.1 mM次黄嘌呤、0.4 μM氨基蝶呤和16 μM胸苷的Iscove培养基(Gibco, Grand Island, N.Y.)中将细胞调整至1.5x105个脾细胞/200 μl悬浮液的浓度。将200微升的细胞悬浮液加入至大约20个96-孔微量培养板的各孔。在大约10天后，吸出培养上清液用于在ELISA测定法中筛选与纯化的因子MASP-2的反应性。
ELISA测定法：Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.)微量测试板的各孔通过加入50 μl的50 ng/ml的纯化hMASP-2或大鼠rMASP-2 (或rMASP-2A)在室温下包被过夜。用于包被的低浓度的MASP-2能够选择高-亲和力抗体。在包被溶液通过轻弹板除去后，将200 μl含BLOTTO (脱脂奶粉)的PBS加入至各孔中1小时，以封闭非-特异性位点。在1小时后，然后用缓冲液PBST (包含0.05% Tween 20的PBS)洗涤各孔。自各融合孔的50微升的培养上清液经收集和与50 μl的BLOTTO混合，然后加入至微量测试板的各个孔中。在1小时孵育后，各孔用PBST洗涤。然后，结合的鼠抗体通过与辣根过氧化物酶(HRP)缀合和以1:2,000稀释在BLOTTO中的山羊抗-小鼠IgG (Fc特异性) (Jackson ImmunoResearchLaboratories, West Grove, Pa.)反应而检测。将包含0.1% 3,3,5,5四甲基联苯胺(Sigma, St. Louis, Mo.)和0.0003%过氧化氢(Sigma)的过氧化物酶底物溶液加入至各孔用于显色30分钟。通过每孔加入50 μl的2M H2SO4终止反应。反应混合物在450 nm的光密度用BioTek ELISA Reader (BioTek Instruments, Winooski, Vt.)读出。
MASP-2结合测定法：
在上述的MASP-2 ELISA测定法中测试阳性的培养上清液可在结合测定法中测试，以测定MASP-2抑制剂对MASP-2具有的结合亲和力。类似的测定法也可用于测定抑制剂是否结合在补体系统中的其它抗原。
聚苯乙烯微量滴定板的各孔(96-孔培养基结合板, Corning Costar,Cambridge, MA)用在磷酸缓冲盐水(PBS) pH 7.4中的MASP-2 (20 ng/100 μl/孔,Advanced Research Technology, San Diego, CA)在4℃包被过夜。在吸出MASP-2溶液后，各孔用包含1%牛血清白蛋白(BSA; Sigma Chemical)的PBS在室温下封闭2小时。没有MASP-2包被的各孔用作背景对照。将在封闭溶液中各种浓度的等份的杂交瘤上清液或纯化的抗-MASP-2 MoAb加入至各孔。在室温孵育2 h后，各孔用PBS充分漂洗。MASP-2-结合的抗-MASP-2 MoAb通过加入在封闭溶液中的过氧化物酶缀合的山羊抗-小鼠IgG (Sigma Chemical)，使其在室温下孵育1h而检测。再次用PBS充分漂洗板，和加入100 μl的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)。TMB的反应通过加入100 μl的1M磷酸淬灭，和在微板阅读器(SPECTRA MAX 250, Molecular Devices,Sunnyvale, CA)中在450 nm读出板。
然后在功能测定法例如实施例2所述的C4裂解测定法中测试来自阳性孔的培养上清液抑制补体活化的能力。然后通过有限稀释而克隆阳性孔中的细胞。在上述ELISA测定法中再次测试MoAb与hMASP-2的反应性。将选择的杂交瘤在旋转瓶中生长，和收集耗尽的培养上清液用于通过蛋白A亲和色谱进行抗体纯化。
实施例6
本实施例描述人源化的鼠抗-MASP-2抗体和抗体片段的形成和制备。
鼠抗-MASP-2单克隆抗体在雄性A/J小鼠中产生，如实施例5中所述。然后将鼠抗体按下文所述人源化，以通过替代鼠恒定区为它们的人对应物以产生抗体的嵌合IgG和Fab片段，降低其免疫原性，其根据本发明可用于抑制在人受试者中MASP-2-依赖性补体活化的不良作用。
1. 从鼠杂交瘤细胞克隆抗-MASP-2可变区基因。使用RNAzol按制造商的方案(Biotech, Houston, Tex.)，将总RNA自分泌抗-MASP-2 MoAb的杂交瘤细胞(如实施例7中所述获得)分离。第一链cDNA使用寡聚dT作为引物自总RNA合成。使用免疫球蛋白恒定C区衍生的3'引物和源自前导肽或鼠VH或VK基因的第一框架区的简并引物组作为5'引物进行PCR。锚定PCR按Chen和Platsucas (Chen, P.F., Scand. J. Immunol. 35:539-549,1992)所述进行。对于克隆VK基因，双链cDNA使用Notl-MAK1引物(5'-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3' SEQ ID NO:38)制备。将退火的接头AD1 (5'-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3' SEQ ID NO:39)和AD2 (5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3' SEQ IDNO:40)连接至双链cDNA的5'和3'末端。在3'末端的接头通过Notl消化除去。然后消化的产物用作PCR模板，用AD1寡核苷酸作为5'引物和MAK2 (5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3' SEQ ID NO:41)作为3'引物。将大约500 bp的DNA片段克隆至pUC19。选择数个克隆用于序列分析以验证克隆的序列包括预期的鼠免疫球蛋白恒定区。Not1-MAK1和MAK2寡核苷酸源自VK区和分别为在Cκ基因的第一碱基对下游182和84bp。选择包括完整VK和前导肽的克隆。
对于克隆VH基因，使用Not1 MAG1引物(5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3'SEQ ID NO:42)制备双链cDNA。将退火的接头AD1和AD2连接至双链cDNA的5'和3'末端。3'末端的接头通过Notl消化除去。消化的产物用作PCR模板，其中AD1寡核苷酸和MAG2 (5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3' SEQ ID NO:43)作为引物。将500-600 bp长度的DNA片段克隆至pUC19。Notl-MAG1和MAG2寡核苷酸源自鼠Cγ.7.1区，和分别为在鼠Cγ.7.1基因的第一碱基对的下游180和93 bp。选择包含完整VH和前导肽的克隆。
2. 用于嵌合MASP-2 IgG和Fab表达载体的构建。上文描述的克隆的VH和VK基因用作PCR反应的模板，以添加Kozak共有序列至核苷酸序列的5'末端和添加剪接供体至3'末端。在分析序列以证实PCR错误不存在后，将VH和VK基因插入分别包含人C.γ1和C.κ的表达载体盒，得到pSV2neoVH-huCγ1和pSV2neoV-huCγ。CsCl梯度纯化的重链和轻链载体的质粒DNA用于通过电穿孔转染COS细胞。在48小时后，培养上清液通过ELISA测试以证实存在大约200 ng/ml的嵌合IgG。收获细胞和制备总RNA。第一链cDNA自总RNA使用寡聚dT作为引物合成。该cDNA用作PCR模板以产生Fd和κ DNA片段。对于Fd基因，使用5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3' (SEQ ID NO:44)作为5'引物和CH1-衍生的3'引物(5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3' SEQ ID NO:45)进行PCR。DNA序列经证实包含人IgG1的完整的VH和CH1结构域。在用合适的酶消化后，将Fd DNA片段插入在表达载体盒pSV2dhfr-TUS的HindIII和BamHI限制位点，得到pSV2dhfrFd。pSV2质粒为市售可得的，并由来自各种来源的DNA区段组成：pBR322 DNA (细线)包含pBR322 DNA复制起点(pBR ori)和内酰胺酶氨苄青霉素抗性基因(Amp)；SV40 DNA，通过通过较宽阴影表示和标注，包含SV40DNA复制起点(SV40 ori)、早期启动子(5'至dhfr和neo基因)和多腺苷酸化信号(3'至dhfr和neo基因)。SV40-来源的多腺苷酸化信号(pA)还位于Fd基因的3'末端。
对于κ基因，使用5'- AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3' (SEQ ID NO:46)作为5'引物和CK-衍生的3'引物(5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3' SEQ ID NO:47)进行PCR。DNA序列证实包含完整的VK和人CK区。在用合适的限制酶消化后，将κDNA片段插入表达载体盒pSV2neo-TUS的HindIII和BamHI限制位点以得到pSV2neoK。Fd和κ基因的表达受HCMV-衍生的增强子和启动子元件驱动。因为Fd基因不包括参与链间二硫键的半胱氨酸氨基酸残基，该重组嵌合Fab包含非-共价地连接的重链和轻链。该嵌合Fab被称为cFab。
为了获得具有重链和轻链间二硫键的重组Fab，可延长上述的Fd基因以包括来自人IgG1的铰链区的另外9个氨基酸(EPKSCDKTH SEQ ID NO:48)的编码序列。编码Fd基因的3'末端的30个氨基酸的BstEII-BamHI DNA区段可置换为编码延长的Fd的DNA区段，产生pSV2dhfrFd/9aa。
3. 嵌合抗-MASP-2 IgG的表达和纯化
为了产生分泌嵌合抗-MASP-2 IgG的细胞系，NSO细胞用纯化的pSV2neoVH-huC.γ1和pSV2neoV-huCκ质粒DNA通过电穿孔转染。在存在0.7 mg/ml G418的情况下选择转染的细胞。使用包含血清的培养基在250 ml旋转瓶中培养细胞。
将100 ml旋转培养物的培养上清液上样到10-ml PROSEP-A柱(Bioprocessing,Inc., Princeton, N.J.)上。柱用10床体积的PBS洗涤。结合的抗体用50 mM柠檬酸盐缓冲液pH 3.0洗脱。将等体积的1 M Hepes, pH 8.0加入至包含纯化抗体的流分中，以调整pH至7.0。残留的盐通过用PBS通过Millipore膜超滤(M.W.截止：3,000)进行缓冲液交换而除去。纯化的抗体的蛋白浓度通过BCA方法(Pierce)测定。
4. 嵌合抗-MASP-2 Fab的表达和纯化
为了产生分泌嵌合抗-MASP-2 Fab的细胞系，CHO细胞用纯化的pSV2dhfrFd (或pSV2dhfrFd/9aa)和pSV2neokappa质粒DNA通过电穿孔转染。在存在G418和甲氨蝶呤的情况下选择转染的细胞。选择的细胞系在递增浓度的甲氨蝶呤中扩增。细胞是通过有限稀释亚克隆的单细胞。高产量的单细胞亚克隆细胞系然后在100 ml旋转培养物中使用无血清培养基进行培养。
嵌合抗-MASP-2 Fab通过亲和色谱使用小鼠抗-个体型MoAb纯化成MASP-2 MoAb。抗-个体型MASP-2 MoAb可通过用与匙孔
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血蓝蛋白(KLH)缀合的鼠抗-MASP-2 MoAb免疫小鼠和筛选可与人MASP-2竞争的特异性MoAb结合来制备。对于纯化，将来自产生cFab或cFab/9aa的CHO细胞的旋转培养物的100 ml上清液上样到与抗-个体型MASP-2 MoAb偶联的亲和柱上。然后用PBS充分洗涤柱，之后用50 mM二乙胺pH 11.5洗脱结合的Fab。残留的盐按上述通过缓冲液交换除去。纯化Fab的蛋白浓度通过BCA方法(Pierce)测定。
嵌合MASP-2 IgG、cFab和cFAb/9aa抑制MASP-2-依赖性补体途径的能力可通过使用实施例2或实施例7中描述的抑制性测定法测定。
实施例7
本实施例描述了体外C4裂解测定，用作功能性筛选，以鉴定能够经由L-纤维胶凝蛋白/P35、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或甘露聚糖而阻断MASP-2-依赖性补体活化的MASP-2抑制剂。
C4裂解测定：C4裂解测定已经描述于Petersen, S.V.,等人, J. Immunol. Methods 257:107, 2001，其检测了由结合L-纤维胶凝蛋白的来自金黄色葡萄球菌的脂磷壁酸(LTA)所致的凝集素途径活化。
试剂：福尔马林固定的金黄色葡萄球菌(DSM20233)制备如下：将细菌在胰胨大豆血培养基(tryptic Soy blood medium)中于37℃培养过夜，用PBS洗涤3次，然后在室温下在PBS / 0.5%福尔马林中固定1小时，再用PBS洗涤3次后，重悬浮于包被缓冲液(15 mMNa2CO3、35 mM NaHCO3, pH 9.6)中。
测定：Nunc MaxiSorb微量滴定板(Nalgene Nunc International, Rochester,NY)的各孔用以下成分包被：100 μl福尔马林固定的金黄色葡萄球菌DSM20233 (OD550=0.5)的包被缓冲液与1 ug L-纤维胶凝蛋白的包被缓冲液。孵育过夜后，各孔用0.1%人血清白蛋白(HSA)的TBS溶液(10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, pH 7.4)封闭，然后用含有0.05%Tween 20和5mM CaCl2的TBS溶液(洗涤缓冲液)洗涤。将人血清样品稀释于20 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Triton X-100, 0.1% HSA, pH 7.4中，这防止了内源C4的活化，并使Cl复合物(由Clq、Clr和Cls组成)解离。将不同浓度的MASP-2抑制剂(包括抗-MASP-2 MoAb和抑制性肽)加到血清样品中。将稀释的样品加到板中，在4℃下孵育过夜。24小时后，各板用洗涤缓冲液充分洗涤，然后向各孔中加入0.1μg经纯化的人C4 (按照Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223:46, 1993所述获得)/100μl 4 mM 巴比妥、145 mMNaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4。在37℃ 1.5小时后，各板再次经洗涤，使用碱性磷酸酶-缀合的鸡抗人C4c (获自Immunsystem, Uppsala, Sweden)，检测C4b沉积，并使用比色底物磷酸对硝基苯酯进行测定。
在甘露聚糖上的C4测定：在加入与各种MASP-2抑制剂混合的血清之前，通过用LSP和甘露聚糖包被测定板，修改上述测定法以测定经由MBL的凝集素途径活化。
在H-纤维胶凝蛋白(Hakata Ag)上的C4测定：在加入与各种MASP-2抑制剂混合的血清之前，通过用LSP和H-纤维胶凝蛋白包被测定板，修改上述测定法以测定经由H-纤维胶凝蛋白的凝集素途径活化。
实施例8
以下测定法证实在野生型和MASP-2-/-小鼠中存在经典途径活化。
方法：免疫复合物通过在室温下用在10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4中的0.1%人血清白蛋白包被微量滴定板(Maxisorb, Nunc, cat. No. 442404, FisherScientific) 1小时，接着在4℃用以1:1000在TBS/tween/Ca2+中稀释的绵羊抗全血清抗血清(Scottish Antibody Production Unit, Carluke, Scotland)孵育过夜来原位产生。血清样品获自野生型和MASP-2-/-小鼠和加入至包被的板中。制备对照样品，其中C1q从野生型和MASP-2-/-血清样品中耗尽。C1q-耗尽的小鼠血清使用包被有兔抗-人C1q IgG (Dako,Glostrup, Denmark)的蛋白-A-偶联的Dynabeads (Dynal Biotech, Oslo, Norway)根据供应商的说明书制备。板在37℃孵育90分钟。结合的C3b用在TBS/tw/ Ca++中以1:1000稀释的多克隆抗-人-C3c抗体(Dako A 062)检测。第二抗体是山羊抗-兔IgG。
结果：图7显示在包被有野生型血清、MASP-2-/-血清、C1q-耗尽的野生型和C1q-耗尽的MASP-2-/-血清的IgG的板上的相对C3b沉积水平。这些结果证实，在MASP-2-/-小鼠品系中经典途径是完整的。
实施例9
下面的测定法用来通过在经典途径被免疫复合物启动的条件下分析MASP-2抑制剂的作用，从而检测MASP-2抑制剂是否阻断了经典途径。
方法：为了测试MASP-2抑制剂对补体活化条件(其中经典途径被免疫复合物启动)的影响，在10 μg/mL免疫复合物(IC)或PBS存在时，将一式三份的含有90% NHS的50 μl样品在37℃孵育，并且还包括平行的一式三份的样品(+/-IC)，其在37℃孵育期间含有200 nM抗备解素单克隆抗体。在37℃孵育2小时后，将13 mM EDTA加到所有样品中以终止进一步的补体活化，并立即将样品冷却到5℃。再将样品保存于-70℃，然后按照生产商的说明书，使用ELISA试剂盒(Quidel，目录号A015和A009)进行补体活化产物(C3a和sC5b-9)的测定。
实施例10
本实施例描述了阻断MASP-2活性的高亲和性抗-MASP-2 Fab2抗体片段的鉴定。
背景和原理：MASP-2是具有许多独立功能结构域的复杂蛋白质，包括：MBL和纤维胶凝蛋白的结合位点、丝氨酸蛋白酶催化位点、蛋白水解底物C2的结合位点、蛋白水解底物C4的结合位点、MASP-2酶原自身活化的MASP-2裂解位点和两个Ca++结合位点。鉴定出与MASP-2高亲和性结合的Fab2抗体片段，并在功能测定法中测定所鉴定的Fab2片段，以确定它们是否能够阻断MASP-2功能活性。
为了阻断MASP-2功能活性，抗体或Fab2抗体片段必须结合并干扰MASP-2功能活性所需要的MASP-2上的结构表位。因此，许多或所有的高亲和性结合抗-MASP-2 Fab2可能不能抑制MASP-2功能活性，除非它们结合直接参与MASP-2功能活性的MASP-2上的结构表位。
测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的功能测定法被用来评价抗-MASP-2 Fab2的“阻断活性”。已知MASP-2在凝集素途径中的主要生理作用是产生凝集素介导的补体途径的下一个功能成分，即凝集素途径C3转化酶。凝集素途径C3转化酶是蛋白水解裂解C3成为C3a和C3b的关键酶复合物(C4bC2a)。MASP-2不是凝集素途径C3转化酶(C4bC2a)的结构成分；然而，需要MASP-2功能活性以产生组成凝集素途径C3转化酶的两个蛋白质成分(C4b、C2a)。此外，为了使MASP-2产生凝集素途径C3转化酶，似乎需要所有上述MASP-2的独立功能活性。出于这些原因，认为用于评价抗-MASP-2 Fab2的“阻断活性”优选的测定法是测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的功能测定法。
高亲和性Fab2的产生：应用人可变轻链和重链抗体序列的噬菌体展示文库以及用于鉴定与所选出的目标配体反应的Fab2的自动抗体筛选技术，来产生抗大鼠MASP-2蛋白(SEQ ID NO: 55)的高亲和性Fab2。利用已知量的大鼠MASP-2 (~1 mg，纯度>85%)蛋白进行抗体筛选。利用三轮扩增以选出具有最高亲和性的抗体。挑选约250个不同的表达抗体片段的目标(hit)用于ELISA筛选。随后对高亲和性目标进行测序以确定不同抗体的独特性。
将50个独特的抗-MASP-2抗体纯化，将250μg各经纯化的Fab2抗体用于表征MASP-2结合亲和性和补体途径功能测定，更详述如下。
用于评价抗-MASP-2 Fab2的抑制(阻断)活性的测定法
1. 测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的测定法：
背景：凝集素途径C3转化酶是蛋白水解裂解C3成为两个有效促炎片段过敏毒素C3a和调理素C3b的酶复合物(C4bC2a)。C3转化酶的形成似乎是在介导炎症方面的凝集素途径中的关键步骤。MASP-2不是凝集素途径C3转化酶(C4bC2a)的结构成分；因此，抗-MASP-2抗体(或Fab2)不会直接抑制之前已存在的C3转化酶的活性。然而，为了产生组成凝集素途径C3转化酶的两个蛋白质成分(C4b、C2a)，MASP-2丝氨酸蛋白酶活性是必需的。因此，抑制MASP-2功能活性的抗-MASP-2Fab2 (即阻断性抗-MASP-2Fab2)抑制凝集素途径C3转化酶从头形成。C3含有独特的高反应性硫酯基团作为其结构的部分。在该测定法中当C3转化酶裂解C3时，C3b上的硫酯基团可与通过酯键或酰胺键固定在塑料孔底部的大分子上的羟基或氨基形成共价键，从而有利于在ELISA测定法中检测出C3b。
酵母甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂。在测定C3转化酶形成的下列方法中，将用甘露聚糖包被的塑料孔与稀释的大鼠血清在37℃下孵育30分钟以激活凝集素途径。然后洗涤各孔，并采用标准ELISA方法测定固定在孔中的C3b。在该测定法中所产生的C3b的量直接反映了从头形成的凝集素途径C3转化酶。在该测定法中测定选定浓度的抗-MASP-2Fab2抑制C3转化酶形成和随后C3b产生的能力。
方法：
将96孔Costar培养基结合板与稀释于50 mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)的甘露聚糖以1μg/50 µl/孔在5℃下孵育过夜。过夜孵育后，各孔用200 μl PBS洗涤3次。然后各孔用100μl/孔的1%牛血清白蛋白的PBS溶液封闭，在室温下孵育1小时并温和搅动。然后各孔用200µlPBS洗涤3次。在5℃，将抗-MASP-2 Fab2样品稀释于含Ca++和Mg++的GVB 缓冲液(4.0 mM 巴比妥，141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1%明胶, pH 7.4)至选定浓度。在5℃，将0.5%大鼠血清加到上述样品中，将100μl转移到各孔。将板盖上，在37℃水浴中孵育30分钟以允许补体活化。将板从37℃水浴转移至装有冰-水混合物的容器中终止反应。各孔用200μl PBS-Tween 20 (0.05% Tween 20的PBS溶液)洗涤5次，再用200 μl PBS洗涤2次。加入100 μl /孔的1: 10,000稀释的第一抗体(兔抗人C3c，DAKO A0062)，该抗体溶于含有2.0mg / ml牛血清白蛋白的PBS中，在室温下轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔的1:10,000稀释的第二抗体(过氧化物酶-缀合的山羊抗兔IgG,American Qualex A102PU)，该抗体溶于含有2.0mg / ml牛血清白蛋白的PBS中，在室温下在振荡器中轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔的过氧化物酶底物TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)，在室温下孵育10分钟。通过加入100 μl/孔1.0 M H3PO4终止过氧化物酶反应，测定OD450。
2. 测量抑制MASP-2-依赖性C4裂解的测定法
背景：MASP-2的丝氨酸蛋白酶活性是高度特异性的，仅鉴定出用于MASP-2的两种蛋白质底物：C2和C4。C4裂解产生C4a和C4b。抗-MASP-2 Fab2可结合直接参与C4裂解的MASP-2的结构表位(例如C4的MASP-2结合位点；MASP-2丝氨酸蛋白酶催化位点)，从而抑制MASP-2的C4裂解功能活性。
酵母甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂。在测定MASP-2的C4裂解活性的下列方法中，将用甘露聚糖包被的塑料孔与稀释的大鼠血清在37℃下孵育30分钟以激活凝集素途径。因为用于该ELISA测定法中的第一抗体仅识别人C4，所以稀释的大鼠血清还补充了人C4(1.0 µg/mL)。然后洗涤各孔，采用标准ELISA方法测定固定到孔中的人C4b。在该测定法中所产生的C4b的量可衡量MASP-2-依赖性C4裂解活性。在该测定法中，测定选定浓度的抗-MASP-2 Fab2抑制C4裂解的能力。
方法：将96孔Costar培养基结合板与稀释于50 mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)的甘露聚糖以1 μg/50 µl/孔在5℃下孵育过夜。各孔用200 μl PBS洗涤3次。然后各孔用100μl/孔的1%牛血清白蛋白的PBS溶液封闭，并在室温下孵育1小时并温和搅动。各孔用200 μl PBS洗涤3次。在5℃，将抗-MASP-2 Fab2样品稀释于含Ca++和Mg++的GVB 缓冲液(4.0 mM 巴比妥，141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1%明胶, pH 7.4)至选定浓度。1.0 µg/mL人C4 (Quidel)也包括在这些样品中。在5℃，将0.5%大鼠血清加到上述样品中，将100μl转移到各孔。将板盖上，在37℃水浴中孵育30分钟以允许补体活化。将板从37℃水浴转移至装有冰-水混合物的容器中终止反应。各孔用200 μl PBS-Tween 20 (0.05% Tween 20的PBS溶液)洗涤5次，然后各孔再用200 μl PBS洗涤2次。加入100 μl /孔的1:700稀释的生物素-缀合的鸡抗人C4c (Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)，该抗体溶于含有2.0mg / ml牛血清白蛋白的PBS中，在室温下轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔的0.1 µg/mL过氧化物酶-缀合的链霉抗生物素(Pierce Chemical #21126)，其溶于含有2.0mg / ml BSA的PBS中，在室温下在振荡器中轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔的过氧化物酶底物TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)，在室温下孵育16分钟。通过加入100 μl /孔1.0 M H3PO4终止过氧化物酶反应，并测定OD450。
3. 抗大鼠MASP-2 Fab2与“天然”大鼠MASP-2的结合测定法
背景：MASP-2通常作为还包括特异性凝集素分子(甘露糖-结合蛋白(MBL)和纤维胶凝蛋白)的MASP-2二聚体复合物存在于血浆中。因此，如果有兴趣研究抗-MASP-2 Fab2与MASP-2生理学相关形式的结合，则重要的是开发出结合测定法，其中利用Fab2与血浆中的“天然”MASP-2之间，而不是与纯化的重组MASP-2之间的相互作用。在该结合测定法中，先将得自10%大鼠血清的“天然”MASP-2-MBL复合物固定在甘露聚糖包被的孔内。然后采用标准ELISA方法，对各种抗-MASP-2 Fab2与固定化“天然”MASP-2的结合亲和性进行了研究。
方法：将96孔Costar高结合板与稀释于50 mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)的甘露聚糖以1 μg/50 µl/孔在5℃下孵育过夜。各孔用200 μl PBS洗涤3次。然后各孔用100μl/孔的含0.5%脱脂奶粉的PBST (含0.05% Tween 20的PBS)封闭，并在室温下孵育1小时并温和搅动。各孔用200 µl TBS/Tween/Ca++洗涤缓冲液(Tris-缓冲盐水, 0.05% Tween 20, 含有5.0mM CaCl2, pH 7.4)洗涤3次。在冰上制备含10%大鼠血清的高盐结合缓冲液(20 mM Tris,1.0 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Triton-X100, 0.1% (w/v)牛血清白蛋白, pH 7.4)。加入100 µl/孔并在5℃孵育过夜。各孔用200 µl TBS/Tween/Ca++洗涤缓冲液洗涤3次。然后，各孔用200 μl PBS洗涤2次。加入100 µl/孔的稀释于含Ca++和Mg++的GVB缓冲液(4.0 mM巴比妥, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1%明胶, pH 7.4)的选定浓度的抗-MASP-2 Fab2，并在室温下孵育1小时并温和搅动。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入在2.0 mg/mL牛血清白蛋白的PBS中1:5000稀释的100 µl/孔的HRP-缀合的山羊抗Fab2(Biogenesis Cat No 0500-0099)，并在室温下孵育1小时并温和搅动。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 µl/孔的过氧化物酶底物TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)并在室温下孵育70分钟。通过加入100 μl /孔1.0 M H3PO4终止过氧化物酶反应，并测定OD450。
结果：
挑选了与大鼠MASP-2蛋白进行高亲和性反应的约250个不同的Fab2用于ELISA筛选。对这些高亲和性Fab2进行了测序以确定不同抗体的独特性，对50个独特的抗-MASP-2抗体进行纯化，用于进一步分析。250 μg各经纯化的Fab2抗体用来表征MASP-2结合亲和性及补体途径功能测定。该分析的结果见下表7。
表7：阻断凝集素途径补体活化的抗-MASP-2 FAB2
Fab2抗体# C3转化酶(IC50 (nM) Kd C4裂解IC50 (nM)
88 0.32 4.1 ND
41 0.35 0.30 0.81
11 0.46 0.86 <2 nM
86 0.53 1.4 ND
81 0.54 2.0 ND
66 0.92 4.5 ND
57 0.95 3.6 <2 nM
40 1.1 7.2 0.68
58 1.3 2.6 ND
60 1.6 3.1 ND
52 1.6 5.8 <2 nM
63 2.0 6.6 ND
49 2.8 8.5 <2 nM
89 3.0 2.5 ND
71 3.0 10.5 ND
87 6.0 2.5 ND
67 10.0 7.7 ND
如上表7所示，在所测的50个抗-MASP-2 Fab2中，17个Fab2被鉴定为MASP-2-阻断性Fab2，其有效抑制C3转化酶形成，IC50等于或小于10 nM Fab2 (34%阳性命中率)。所鉴定的17个Fab2中有8个的IC50范围为纳摩尔以下。此外，表7中所示的所有17个MASP-2阻断性Fab2在凝集素途径C3转化酶测定法中基本上完全抑制C3转化酶形成。图8A图示了对于Fab2抗体#11的C3转化酶形成测定法的结果，其代表了测试的其它Fab2抗体，结果显示在表7。这是重要的考虑因素，因为理论上可能的是，甚至当各MASP-2分子被Fab2结合时，“阻断性”Fab2可能仅微弱地抑制MASP-2功能。
尽管甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂，但是在大鼠血清中存在的抗甘露聚糖抗体也可能激活经典途径，并且通过经典途径C3转化酶产生C3b，这在理论上是可能的。然而，在本实施例所列的17个阻断性抗-MASP-2 Fab2中的每一个都有效地抑制了C3b产生(>95 %)，因此证明了该测定法对于凝集素途径C3转化酶的特异性。
为了计算各个Fab2的表观Kd，对所有17个阻断性Fab2都进行结合测定。对于6个阻断性Fab2，抗大鼠MASP-2 Fab2与天然大鼠MASP-2的结合测定的结果也见表7。图8B图示了用Fab2抗体#11的结合测定法的结果。对于其它Fab2也进行了类似的结合测定，其结果见表7。一般而言，对于6个Fab2的每一个结合“天然”MASP-2所获得的表观Kd与在C3转化酶功能测定中Fab2的IC50恰好适当对应。有证据表明，在激活其蛋白酶活性时，MASP-2经历了从“无活性”到“活性”形式的构象变化(Feinberg等人, EMBO J 22:2348-59 (2003)；Gal等人, J. Biol. Chem. 280:33435-44 (2005))。在用于C3转化酶形成测定法的正常大鼠血浆中，MASP-2主要以“无活性”酶原构象存在。相比之下，在结合测定法中，MASP-2作为与MBL(其结合到固定化甘露聚糖)的复合物的部分而存在；因此，MASP-2可能为“活性”构象(Petersen等人, J. Immunol Methods 257:107-16, 2001)。因此，对于这两个功能测定法中所测定的17个阻断性Fab2的每一个，不必预期IC50和Kd之间确切的对应性，因为在各个测定法中，Fab2可结合不同构象形式的MASP-2。尽管如此，除了Fab2#88以外，对于两种测定法中所测的其它16个Fab2的每一个，IC50和表观Kd之间显示出相当密切的对应性(参见表7)。
评价若干阻断性Fab2对于MASP-2-介导的C4裂解的抑制。图8C图示了C4裂解测定法的结果，显示用Fab2 #41的抑制，IC50为0.81 nM (见表7)。如图9所示，发现所有测试的Fab2都抑制C4裂解，IC50类似于C3转化酶测定法中所获得的IC50 (见表7)。
尽管甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂，但是大鼠血清中抗甘露聚糖抗体的存在理论上也可能激活经典途径，从而通过Cls介导的C4裂解而产生C4b。然而，已经鉴定出有效抑制C4b产生(>95%)的若干抗-MASP-2 Fab2，因此证明了该测定法对于MASP-2-介导的C4裂解的特异性。C4，如同C3一样，含有独特的高反应性硫酯基团作为其结构部分。在该测定法中当通过MASP-2裂解C4时，C4b上的硫酯基团可与通过酯键或酰胺键固定在塑料孔底部的大分子上羟基或氨基形成共价键，因此有利于在ELISA测定法中检测C4b。
这些研究清楚表明，大鼠MASP-2蛋白的高亲和性FAB2的产生，功能性地阻断C4和C3转化酶活性，从而防止了凝集素途径活化。
实施例11
本实施例描述了对若干按照实施例10所述方法产生的阻断性抗大鼠MASP-2 Fab2抗体进行的表位作图。
方法：
如图10所示，使用pED4载体，在CHO细胞中表达下列所有具有N端6个His标签的蛋白质：
大鼠MASP-2A，一种全长MASP-2蛋白，通过活性中心上的丝氨酸改变为丙氨酸(S613A)而失活；
大鼠MASP-2K，经改变降低了自身活化的全长MASP-2蛋白(R424K)；
CUBI-II，一种仅含有CUB1、EGF样和CUBII结构域的大鼠MASP-2的N端片段；和
CUBI/EGF样，一种仅含有CUBI和EGF样结构域的大鼠MASP-2的N端片段。
如前所述，将这些蛋白质通过镍-亲和层析从培养上清液中纯化(Chen等人, J. Biol. Chem. 276:25894-02 (2001))。
采用pTrxFus (Invitrogen)，使含有CCPII和大鼠MASP-2丝氨酸蛋白酶结构域的C端多肽(CCPII-SP)，在大肠杆菌中表达成为硫氧还蛋白融合蛋白。用Thiobond亲和树脂将蛋白质从细胞裂解物中纯化。硫氧还蛋白融合配偶体由pTrxFus空载体表达作为阴性对照。
将所有重组蛋白透析到TBS缓冲液中，通过测量OD (280nm)，测得其浓度。
斑点印迹分析:
将上述和图10中所示的连续稀释的5种重组MASP-2多肽(以及硫氧还蛋白多肽作为CCPII-丝氨酸蛋白酶多肽的阴性对照)点在硝酸纤维素膜上。蛋白质的点样量在5重步骤中的范围为100 ng至6.4 pg。在稍后的实验中，蛋白质的点样量再次在5重步骤中的范围由50 ng降至16 pg。该膜用含5%脱脂奶粉的TBS溶液(封闭缓冲液)封闭，然后与含1.0 μg/mL抗-MASP-2 Fab2的封闭缓冲液(含有5.0 mM Ca++)一起温育。用HRP-缀合的抗人Fab (AbD /Serotec ；1/10,000稀释)和ECL检测试剂盒(Amersham)检测结合的Fab2。一块膜与作为阳性对照的多克隆兔抗人MASP-2Ab (参见Stover等人, J Immunol 163:6848-59 (1999))一起温育。在这种情况下，用HRP-缀合的山羊抗兔IgG (Dako；1/2,000稀释)，检测结合的Ab。
MASP-2结合测定法:
ELISA板用含1.0 μg /孔的重组MASP-2A或CUBI-II多肽的碳酸盐缓冲液(pH9.0)在4℃下包被过夜。各孔用含1% BSA的TBS溶液封闭，然后加入含连续稀释的抗-MASP-2Fab2的TBS溶液(含有5.0mM Ca2+)。将各板在室温下孵育1小时。用TBS /Tween/ Ca2+洗涤3次后，加入按1/10,000稀释于TBS/Ca2+的HRP-缀合的抗人Fab (AbD/Serotec)，将各板再次在室温下孵育1小时。用TMB过氧化物酶底物试剂盒(Biorad)检测结合的抗体。
结果：
斑点印迹法分析的结果表明了Fab2与下表8中提供的各种MASP-2多肽的反应性。表8提供的数值表明，所需要的蛋白质点样量提供大约最大信号强度的一半。如表所示，所有多肽(仅硫氧还蛋白融合配偶体除外)均被阳性对照Ab (多克隆抗人MASP-2血清，在兔中产生)识别。
表8：斑点印迹法中与不同重组大鼠MASP-2多肽的反应性
Figure DEST_PATH_IMAGE009
NR =无反应。阳性对照抗体是在兔中产生的多克隆抗人MASP-2血清。
所有Fab2均与MASP-2A以及MASP-2K反应(数据未显示)。大多数Fab2识别CCPII-SP多肽但不识别N端片段。Fab2#60和Fab2#57是两个例外。Fab2#60识别MASP-2A和CUBI-II片段，但不识别CUBI / EGF样多肽或CCPII-SP多肽，提示它结合CUBII的表位，或者跨越CUBII和EGF样结构域。Fab2#57识别MASP-2A但不识别任何所测试的MASP-2片段，表明该Fab2识别CCP1的表位。Fab2#40和#49仅结合完整的MASP-2A。在图11所示的ELISA结合测定法中，Fab2#60还结合CUBI-II多肽，虽然只具有略微较低的表观亲和性。
这些发现表明对于MASP-2蛋白多个区域的独特阻断性Fab2的鉴定。
实施例12
本实施例描述了鼠黄斑变性模型中MASP-2-/-的结果。
背景/原理：在工业化国家，年龄相关性黄斑变性(AMD)是55岁之后失明的首要原因。AMD以两种主要形式发生：新生血管(湿性)AMD和萎缩性(干性) AMD。新生血管(湿性)形式占与AMD相关的严重视力丧失的90％，即使仅约20％的AMD个体发展湿形式。AMD的临床特点包括多个玻璃疣、地图样萎缩和脉络膜新生血管形成(CNV)。在2004年12月，FDA批准Macugen药物(哌加他尼(pegaptanib))，一类新的特异性靶向并阻断血管内皮生长因子(VEGF)作用的眼科药物，以治疗湿性(新生血管)形式的AMD(Ng等, Nat Rev. Drug Discov5:123-32 (2006))。虽然Macugen药物对于AMD患者亚群代表了有前景的新的治疗选择，但对于这种复杂疾病仍迫切需要开发其他治疗。多个独立系列的调查暗示了补体活化在AMD发病机制中的中心作用。最严重形式的AMD，脉络膜新生血管形成(CNV)的发病机制可涉及补体途径激活。
二十五年来，Ryan描述了CNV的激光诱导损伤的动物模型(Ryan, S.J., Tr. Am. Opth. Soc. LXXVII: 707-745, 1979)。最初使用恒河猴开发该模型，然而，同样的技术此后已被用于在各种研究动物包括小鼠中开发CNV的类似模型(Tobe等, Am. J. Pathol. 153:1641-46, 1998)。在该模型中，激光光凝用来破坏布鲁赫膜，该行为导致形成CNV样膜。激光诱导的模型包括人类病况的许多重要特征(最近的综述，参见Ambati等, Survey Ophthalmology 48:257-293, 2003)。激光诱导的小鼠模型现已确立，并且在一个大的且数目不断增加的研究项目中被用作试验基础。普遍认为，激光诱导的模型与人类CNV享有足够的生物相似性，以致使用这种模型进行发病机制和药物抑制的临床前研究与人类CNV相关。
方法：
如实施例1中所述生成MASP-2-/-小鼠，用C57Bl/6回交10代。目前的研究比较了当在激光诱导的CNV过程中评价MASP-2(-/-)和MASP-2(+/+)雄性小鼠时的结果，激光诱导的CNV是新生血管性AMD的加速模型，通过扫描激光共聚焦显微术集中于激光诱导的CNV的体积作为组织损伤的量度，并通过ELISA测定激光损伤后视网膜色素上皮细胞(RPE)/脉络膜中的VEGF水平，VEGF是CNV中涉及的强效血管生成因子。
诱导脉络膜新生血管生成(CNV)：激光光凝(532 nm, 200 mW, 100 ms, 75µm;Oculight GL, Iridex, Mountain View, CA)由对药物组分配掩盖的单个人在第0天对各动物的双眼进行。使用裂隙灯递送系统和盖玻片作为接触透镜，以标准化方式围绕视神经施加激光点。激光损伤的形态学终点是空化气泡的出现，认为该迹象与布鲁赫膜的破坏关联。进行评价的具体方法和终点如下。
荧光素血管造影：激光光凝后1周，用相机和成像系统进行荧光素血管造影(TRC50 1A camera; ImageNet 2.01 system; Topcon, Paramus, NJ)。在腹膜内注射0.1毫升的2.5％荧光素钠后，用与眼底照相机透镜接触的20-D透镜捕获照片。没有参与激光光凝或血管造影的视网膜专家以蒙面方式在单个位置评估了荧光素血管造影。
脉络膜新生血管形成(CNV)的体积：激光损伤后一周，摘出眼睛，并在4℃用4％多聚甲醛固定30分钟。通过去除前段获得眼杯，在PBS中洗涤三次，接着通过甲醇系列脱水和再水合。在室温下用缓冲液(含有1％牛血清白蛋白和0.5％的Triton X-100的PBS)封闭两次达30分钟后，在4℃用含有0.2％BSA和0.1％的Triton X-100的PBS稀释的0.5％的FITC-异凝集素B4 (Vector laboratories, Burlingame, CA)孵育眼杯过夜，其结合内皮细胞表面上的末端β-D-半乳糖残基并选择性标记鼠血管。经过两次用含有0.1％Triton X-100的PBS洗涤后，感觉神经视网膜被轻轻剥离，从视神经切断。产生四个松弛的放射状切口，其余RPE-脉络膜巩膜复合物平展安放在防褪色介质中(Immu-Mount Vectashield MountingMedium; Vector Laboratories)并用盖玻片盖上。
用扫描激光共聚焦显微镜(TCS SP; Leica, Heidelberg, Germany)检查了平展安放(flat-mount)。通过用蓝色氩波长(488纳米)激发并捕捉515和545纳米之间的发射，使血管可视化。40X油浸物镜被用于所有的成像研究。水平光学切片(1μm步长)获自RPE脉络膜巩膜复合物的表面。其中可识别连接到病变的周边脉络膜血管网的最深焦平面判定为病变层。在激光靶向区域和该基准面表面的任何血管判断为CNV。各切片的图像进行数字存储。CNV相关荧光面积通过计算机化图像分析与显微镜软件(TCS SP; Leica)进行测量。各水平切片中整个荧光区域的总和被用作CNV体积指数。成像通过对治疗组分配掩盖的操作员执行。
因为每个发展CNV的激光病变概率受到其所属的组(小鼠、眼和激光点)影响，利用具有裂区重复测量设计的线性混合模型比较平均病变体积。整个区划因子是该动物所属的遗传组，而裂区因子是眼睛。统计显著性以0.05的水平来确定。用Bonferroni调整构建Post hoc均值比较，以供多重比较。
VEGF ELISA。在12个激光点损伤后三天，将RPE脉络膜复合物在裂解缓冲液(20mM咪唑HCl、10 mM KCl、1 mM MgCL2、10 mM EGTA、1% Triton X-100、10 mM NaF、1mM钼酸钠和1mM含蛋白酶抑制剂的EDTA)在冰上超声处理15分钟。通过识别所有剪接变体的ELISA试剂盒(Emax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA)在450至570纳米(R&D Systems,Minneapolis, MN)测定上清液中的VEGF蛋白水平，并标准化至总蛋白。以蒙面的方式，由不参与光凝、成像或血管造影的操作员执行重复测量。VEGF数字被表示为至少三个独立实验的平均值+/-SEM并使用Mann Whitney U检验比较。零假设在P <0.05拒绝。
结果：
VEGF水平的评估：
图12A图示了在第0天分离自C57Bl6野生型和MASP-2 (-/-)小鼠的RPE脉络膜复合物的VEGF蛋白水平。如图12A所示，VEGF水平的评估表明相对于C57Bl野生型对照小鼠，MASP-2 (-/-)小鼠中基线水平的VEGF降低。图12B图示了激光诱导损伤后第三天测得的VEGF蛋白水平。如图12B所示，激光诱导损伤后第三天，在野生型(+/+)小鼠中，VEGF水平显著增加，这与已发表的研究一致(Nozaki等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:2328 33(2006))。然而，在MASP-2 (-/-)小鼠中，观察到VEGF的令人惊讶的非常低的水平。
脉络膜新生血管形成(CNV)的评估：
除了激光诱导性黄斑变性后VEGF水平降低外，在激光损伤前和后测定CNV区域。图13图示了在激光诱导损伤后第7天在C57bl野生型小鼠和MASP-2(-/-)小鼠中测得的CNV体积。如图13所示，相比于野生型对照小鼠，在激光诱导损伤后第7天MASP-2(-/-)小鼠的CNV区域显示减少约30％。
这些结果表明与野生型(+/+)对照相比MASP (-/-)小鼠所见的VEGF和CNV减少，并且在黄斑变性的治疗中用抑制剂阻断MASP-2具有预防或治疗性效果。
实施例13
本实施例描述了如实施例10所述而鉴定的代表性的高亲和性抗-MASP-2 Fab2抗体的药效动力学分析。
背景/原理：
如实施例10所述，为了鉴定阻断大鼠凝集素途径的高亲和性抗体，大鼠MASP-2蛋白用于淘选噬菌体展示文库。该文库经设计以提供高免疫多样化，并使用完整人免疫球蛋白基因序列来构建。如实施例10所述，通过ELISA筛选鉴定了大约250个单个噬菌体克隆，其以高亲和性与大鼠MASP-2蛋白结合。对这些克隆测序，鉴定了50个编码独特MASP-2抗体的噬菌体。从这些克隆中表达Fab2蛋白，纯化并分析MASP-2结合亲和性和凝集素补体途径功能性抑制。
如实施例10的表7所示，该分析的结果是鉴定了17个具有功能阻断活性的抗-MASP-2 Fab2 (34%命中率，对于阻断性抗体)。Fab2对凝集素补体途径的功能性抑制在C4沉积水平上是明显的，其是MASP-2对C4裂解的直接度量。重要的是，当评价C3转化酶活性时，抑制同样明显，表明凝集素补体途径的功能性阻断。如实施例10所述鉴定的17个MASP-2封闭性Fab2有效抑制C3转化酶形成，IC50等于或小于10 nM。所鉴定的17个Fab2中有8个的IC50值的范围为纳摩尔以下。此外，如图8A-C所示和实施例10的表7所概述，所有17个MASP-2阻断性Fab2在凝集素途径C3转化酶测定法中基本上完全抑制C3转化酶形成。此外，表7所示的17个阻断性抗-MASP-2 Fab2的每一个有效抑制C3b产生(>95%)，因此证明了该测定法对凝集素途径C3转化酶的特异性。
大鼠IgG2c和小鼠IgG2a全长抗体同种型变体衍生自Fab2 #11。本实施例描述了在体内对这些同种型的药效动力学参数的表征。
方法：
如实施例10所述，大鼠MASP-2蛋白用于淘选Fab噬菌体展示文库，从中鉴定出Fab2#11。大鼠IgG2c和小鼠IgG2a全长抗体同种型变体衍生自Fab2 #11。如下在体内表征了大鼠IgG2c和小鼠IgG2a两者全长抗体同种型的药效动力学参数。
在小鼠中的体内研究：
在小鼠中进行药效动力学研究，以研究抗-MASP-2抗体剂量在体内对血浆凝集素途径活性的作用。在本研究中，在凝集素途径测定法中，在经皮下(SC)和腹膜内(IP)给予0.3 mg/kg或1.0 mg/kg小鼠抗-MASP-2 MoAb (衍生自Fab2#11的小鼠IgG2a全长抗体同种型)之后的不同时间点，离体测定C4沉积。
图14图示了在经皮下给予0.3 mg/kg或1.0 mg/kg小鼠抗-MASP-2 MoAb后的不同时间点，采自小鼠(n=3小鼠/组)的未稀释的血清样品中离体测定的凝集素途径特异性C4b沉积。在给予抗体前采自小鼠的血清样品作为阴性对照(100%活性)，在体外补充100 nM所述阻断性抗-MASP-2抗体的血清用作阳性对照(0%活性)。
图14所示的结果表明在经皮下给予1.0 mg/kg剂量的小鼠抗-MASP-2 MoAb后对C4b沉积的快速和完全的抑制。在经皮下给予0.3 mg/kg剂量的小鼠抗-MASP-2 MoAb后，见到对C4b沉积的部分抑制。
在小鼠中，在单次IP给予0.6 mg/kg小鼠抗-MASP-2 MoAb后，追踪检查了3周内的凝集素途径恢复的时间进程。如图15所示，在给予抗体后，发生凝集素途径活性的急剧下降，接着是在IP给予后持续大约7天的完全的凝集素途径抑制。在第二和第三周期间观察到凝集素途径活性的缓慢恢复，并且到给予抗-MASP-2 MoAb后17天时在小鼠中凝集素途径完全恢复。
这些结果证明当全身性递送时，衍生自Fab2 #11的小鼠抗-MASP-2 Moab以剂量-反应方式抑制小鼠的凝集素途径。
实施例14
本实施例描述了在年龄相关性黄斑变性的小鼠模型中，分析源自Fab2 #11的小鼠抗-MASP-2 Moab的功效。
背景/原理：
如在实施例10中所述，大鼠MASP-2蛋白用于淘选Fab噬菌体展示文库，从中鉴定出Fab2 #11为功能活性抗体。从Fab2 #11产生大鼠IgG2c和小鼠IgG2a同种型的全长抗体。表征了小鼠IgG2a同种型的全长抗-MASP-2抗体的药效动力学参数(如实施例13所述)。在该实施例中，在年龄相关性黄斑变性(AMD)的小鼠模型中，分析源自Fab2 #11的小鼠抗-MASP-2全长抗体，如Bora P.S.等, J Immunol 174:491-497 (2005)所述。
方法：
在如实施例12所述的年龄相关性黄斑变性(AMD)的小鼠模型中，测试如实施例13所述源自Fab2 #11的小鼠IgG2a全长抗-MASP-2抗体同种型，其中改动如下。
小鼠抗-MASP-2 MoAb的给药
CNV诱导前16小时，将两个不同剂量(0.3 mg/kg和1.0 mg/kg)的小鼠抗-MASP-2MoAb以及同种型对照MoAb处理IP注射入WT(+/+)小鼠(每组N =8只小鼠)。
诱导脉络膜新生血管形成(CNV)
如实施例12中所述，使用激光光凝进行脉络膜新生血管形成(CNV)的诱导和CNV体积的测量。
结果：
图16图示了在用同种型对照MoAb或小鼠抗-MASP-2 MoAb (0.3 mg/kg和1.0 mg/kg)处理的小鼠中，在激光损伤后7天测量CNV面积。如图16所示，在预先用1.0 mg/kg 抗-MASP-2 MoAb处理的小鼠中，在激光处理后7天观察到CNV约50％的统计学显著(P <0.01)减少。如在图16中进一步示出，观察到0.3 mg/kg剂量的抗-MASP-2 MoAb不能有效减少CNV。应该注意的是，0.3 mg/kg剂量的抗-MASP-2 MoAb显示出部分和瞬时抑制皮下给药后的C4b沉积，如实施例13中描述并在图14示出的。
本实施例中所述的结果证明用抑制剂例如抗-MASP-2 MoAb阻断MASP-2，在黄斑变性的治疗中具有预防和/或治疗性效果。应该注意的是，这些结果与实施例12中描述的在MASP-2(-/-)小鼠中进行的研究所观察到的结果一致，在实施例12中，相比于野生型对照小鼠，在激光处理后7天观察到MASP-2(-/-)小鼠的CNV减少30％。此外，本实施例结果进一步证明，全身性递送抗-MASP-2抗体提供眼睛的局部治疗益处，从而突出表明全身性给药途径治疗AMD患者的潜力。总之，这些结果提供了证据，支持在AMD的治疗中采用MASP-2 MoAb。
实施例15
本实施例描述使用噬菌体展示鉴定结合MASP-2和抑制凝集素-介导的补体活化，同时保留免疫系统的经典(C1q-依赖性)途径组分完整的全人scFv抗体。
概述：
完全人高-亲和力MASP-2抗体通过筛选噬菌体展示文库进行鉴定。抗体的可变轻链和重链片段以scFv形式和全长IgG形式分离。人MASP-2抗体可用于抑制与凝集素途径-介导的替代补体途径活化有关的细胞损伤，同时保留免疫系统的经典(C1q-依赖性)途径组分完整。在一些实施方案中，本发明的MASP-2 抑制性抗体具有以下特征：(a)对人MASP-2的高亲和力(例如，KD为10 nM或更小)；和(b)在90%人血清中抑制MASP-2-依赖性补体活性，其IC50为30 nM或更小。
方法：
全长催化失活的MASP-2的表达：
人MASP-2的全长cDNA序列(SEQ ID NO: 4)，其编码具有前导序列的人MASP-2多肽(SEQ ID NO:5)，被亚克隆至哺乳动物表达载体pCI-Neo (Promega)，其在CMV增强子/启动子区的控制下驱动真核表达(描述于Kaufman R.J. 等, Nucleic Acids Research19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991))。
为了产生催化失活的人MASP-2A蛋白，按US2007/0172483中所述进行定点诱变，其通过引用结合到本文中。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳和条带制备后纯化，和使用标准加尾程序产生单个腺苷重叠。然后将腺苷加尾的MASP-2A克隆至pGEM-T easy载体中和转化到大肠杆菌。将人MASP-2A进一步亚克隆至哺乳动物表达载体pED或pCI-Neo。
将上述MASP-2A表达构建体转染到DXB1细胞，使用标准磷酸钙转染程序(Maniatis等人, 1989)。在无血清培养基中产生MASP-2A，以确保制备物不被其它血清蛋白污染。每隔一天从汇集细胞中收获培养基(共4次)。重组MASP-2A水平平均为大约1.5 mg/升培养基。MASP-2A (上述Ser-Ala突变体)通过亲和色谱在MBP-A-琼脂糖柱上纯化。
在经淘选/scFv转化和过滤筛选而鉴定的ScFv侯选克隆的MASP-2A ELISA
对人免疫球蛋白轻链-和重链-可变区序列的噬菌体展示文库进行抗原淘选，接着经过自动化抗体筛选和选择，以鉴定针对人MASP-2蛋白的高亲和性scFv抗体。进行了针对HIS-标记的或生物素标记的MASP-2A的scFv噬菌体文库的三轮淘选。第三轮淘选先用MBL洗脱，再用TEA (碱性)洗脱。为了监测噬菌体展示scFv片段对靶MASP-2A的特异性富集，进行了针对固定化MASP-2A的多克隆噬菌体ELISA。将来自3轮淘选的scFv基因克隆到pHOG表达载体中并进行小规模过滤筛选，以寻找针对MASP-2A的特定克隆。
挑出含有编码来自第三轮淘选的scFv片段的质粒的细菌菌落，点在硝基纤维素膜上并在非诱导性培养基中培养过夜以产生母板。从第三轮淘选中总共挑出并分析了18,000个菌落，半数来自竞争性洗脱，半数来自随后的TEA洗脱。淘选针对MASP-2A的scFv噬菌粒文库，接着scFv转化和过滤筛选，得到137个阳性克隆。108/137克隆在ELISA测定法中对MASP-2结合呈阳性(数据未显示)，其中进一步分析了其中的45个克隆在正常人血清中阻断MASP-2活性的能力。
测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的测定法
测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的功能测定法用于评价MASP-2 scFv候选克隆的“阻断活性”。为了产生包含凝集素途径C3转化酶的两种蛋白成分(C4b、C2a)，需要MASP-2丝氨酸蛋白酶活性。因此，抑制MASP-2功能活性的MASP-2 scFv (即阻断性MASP-2 scFv)将抑制凝集素途径C3转化酶的从头形成。C3含有独特的高反应性硫酯基团作为其结构部分。在该测定法中当C3转化酶裂解C3时，C3b上的硫酯基团可与通过酯键或酰胺键固定在塑料孔底部的大分子上的羟基或氨基形成共价键，从而有利于在ELISA测定法中检测出C3b。
酵母甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂。在测定C3转化酶形成的下列方法中，将用甘露聚糖包被的塑料孔与稀释的人血清孵育以激活凝集素途径。然后洗涤各孔，并采用标准ELISA方法测定固定在孔中的C3b。在该测定法中所产生的C3b的量直接反映了从头形成的凝集素途径C3转化酶。在该测定法中测定选定浓度的MASP-2 scFv克隆抑制C3转化酶形成和随后C3b产生的能力。
方法：
将如上所述地鉴定的45个候选克隆表达、纯化并稀释至相同的储液浓度，再将其稀释在含Ca++和Mg++的GVB缓冲液(4.0 mM 巴比妥, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0mM CaCl2, 0.1%明胶, pH 7.4)中，以确保所有克隆都具有相同量的缓冲液。以一式三份，测定浓度为2 μg/mL的每个scFv克隆。阳性对照是OMS100 Fab2并以0.4 μg/mL测定。在有和没有scFv/IgG克隆存在时监测C3c形成。
将甘露聚糖在50mM碳酸盐缓冲液(15mM Na2CO3 + 35mM NaHCO3 + 1.5 mM NaN3,pH 9.5)中稀释至浓度20 μg/mL (1 μg/孔)并包被在ELISA板上，在4℃过夜。次日，将甘露聚糖-包被的板用200 μl PBS洗涤3次。再将100 μl 1% HSA封闭溶液加入各孔并在室温下孵育1小时。将各板用200 μl PBS洗涤3次，并贮存在冰上在200 μl PBS中，直到加入样品。
将正常人血清在CaMgGVB缓冲液中稀释至0.5%，并以一式三份，向该缓冲液中加入scFv克隆或OMS100 Fab2阳性对照，浓度为0.01 μg/mL、1 μg/mL (仅OMS100对照)和10 μg/mL，并在冰上预孵育45分钟，然后加入到封闭的ELISA板上。通过在37℃孵育1小时启动反应，并通过将各板移至冰浴而终止反应。用兔α-小鼠C3c抗体，接着是山羊α-兔HRP来检测C3b沉积。阴性对照是无抗体缓冲液(无抗体= 最大C3b沉积)，阳性对照是含EDTA的缓冲液(无C3b沉积)。通过进行同样的测定法来检测背景，除了各孔中无甘露聚糖之外。将无甘露聚糖板的背景信号从含甘露聚糖的孔的信号中减去。截止标准设置为仅无关scFv克隆(VZV)和缓冲液的活性的一半。
结果：基于截止标准，发现共13个克隆阻断MASP-2的活性。选择所有产生> 50%途径抑制的13个克隆并测序，获得10个独特的克隆。发现所有10个克隆具有相同的轻链亚类λ3，但有三个不同的重链亚类VH2、VH3和VH6。在功能测定法中，使用0.5%人血清，10个候选scFv克隆中有5个的IC50 nM值小于25 nM目标标准。
为了鉴定具有改善的效力的抗体，对如上所述鉴定的3个母scFv克隆进行轻链重排(shuffling)。此过程涉及由与源自六个健康供体的首次用于实验的人类λ轻链(VL)的文库配对的每个母克隆的VH组成的组合文库的生成。然后筛选此文库中具有改善的结合亲和性和/或功能性的scFv克隆。
表9：前导子克隆和它们各自的母克隆(都以scFv形式)的IC50 (nM)的功能效力的比较
Figure DEST_PATH_IMAGE010
以下给出的是上表9所示的母克隆和子克隆的重链可变区(VH)序列。
Kabat CDR (31-35 (H1)、50-65 (H2)和95-107 (H3))以粗体表示；Chothia CDR(26-32 (H1)、52-56 (H2)和95-101 (H3))以下划线表示。
17D20_35VH-21N11VL重链可变区(VH) (SEQ ID NO:67，由SEQ ID NO:66编码)
QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSSDEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARIRRGGIDYWGQGTLVTVSS
d17N9重链可变区(VH) (SEQ ID NO:68)
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDPFGVPFDIWGQGTMVTVSS
以下给出的是母克隆和子克隆的轻链可变区(VL)序列。
Kabat CDR (24-34 (L1)；50-56 (L2)；和89-97 (L3)以粗体表示；Chothia CDR(24-34 (L1)；50-56 (L2)和89-97 (L3)以下划线表示。这些区域是相同的，无论按照Kabat还是Chothia系统编号。
17D20m_d3521N11轻链可变区(VL) (SEQ ID NO:69)
QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCSGEKLGDKYAYWYQQKPGQSPVLVMYQDKQRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTAVFGGGTKLTVL
17N16m_d17N9轻链可变区(VL) (SEQ ID NO:71，由SEQ ID NO:70编码)
SYELIQPPSVSVAPGQTATITCAGDNLGKKRVHWYQQRPGQAPVLVIYDDSDRPSGIPDRFSASNSGNTATLTITRGEAGDEADYYCQVWDIATDHVVFGGGTKLTVLAAAGSEQKLISE
通过斑点印迹分析，对于表位结合，分析了MASP-2抗体OMS100和MoAb_d3521N11VL(包括SEQ ID NO:67所示的重链可变区和SEQ ID NO:70所示的轻链可变区，亦称为“OMS646”)，这两者已证明以高亲和性与人MASP-2结合并具有阻断功能性补体活性的能力。结果表明OMS646和OMS100抗体对MASP-2是高特异性，而不与MASP-1/3结合。抗体既不与MAp19结合，也不与不含MASP-2的CCP1结构域的MASP-2片段结合，得到以下结论：结合位点包含CCP1。
MASP-2抗体OMS646经测定强烈接合重组MASP-2 (Kd 60-250pM)，与C1s、C1r或MASP-1相比具有>5000倍的选择性(见下表10)：
表10：OMS646 MASP-2抗体-MASP-2相互作用的亲和力和特异性，如通过固相ELISA研究所评价
抗原 K<sub>D</sub> (pM)
MASP-1 >500,000
MASP-2 62±23*
MASP-3 >500,000
纯化的人C1r >500,000
纯化的人C1s ~500,000
*平均值±SD; n=12
OMS646特异性阻断末端补体组分的凝集素-依赖性活化
方法：
OMS646对膜攻击复合物(MAC)沉积的作用使用对于凝集素途径、经典途径和替代途径的途径-特异性条件进行分析。对于该目的，按照制造商的说明书使用WieslabComp300补体筛选试剂盒(Wieslab, Lund, Sweden)。
结果：
图17A图示说明了在存在或不存在抗-MASP-2抗体(OMS646)的情况下在凝集素途径-特异性测定条件下MAC沉积的水平。图17B图示说明了在存在或不存在抗-MASP-2抗体(OMS646)的情况下在经典途径-特异性测定条件下MAC沉积的水平。图17C图示说明了在存在或不存在抗-MASP-2抗体(OMS646)的情况下在替代途径-特异性测定条件下MAC沉积的水平。
如图17A中所示，OMS646阻断MAC沉积的凝集素途径-介导的活化，其IC50值为大约1nM。然而，OMS646对自经典途径-介导的活化(图17B)或自替代途径-介导的活化(图17C)产生的MAC沉积没有作用。
在静脉内(IV)或皮下(SC)给予小鼠后OMS646的药代动力学和药效学
在小鼠的28天单剂量PK/PD研究中评价OMS646的药代动力学(PK)和药效学(PD)。研究测试皮下(SC)给予的5mg/kg和15mg/kg的OMS646的剂量水平，以及静脉内(IV)给予的5mg/kg OMS646的剂量水平。
关于OMS646的PK概况，图18图示说明了OMS646浓度(n=3只动物/组的平均值)，其为给予指定剂量的OMS646后的时间的函数。如图18中所示，以5mg/kg SC，给药后大约1-2天，OMS646达到5-6 ug/mL的最大血浆浓度。以5 mg/kg SC，OMS646的生物利用度为大约60%。如图18中进一步显示的，以15 mg/kg SC，给药后大约1-2天，OMS646达到10-12 ug/mL的最大血浆浓度。对于所有组，OMS646从全身循环中被缓慢清除，具有大约8-10天的终末半寿期。OMS646的概况对于人抗体在小鼠中是典型的。
OMS646的PD活性图示在图19A和19B。图19A和19B显示对于5mg/kg IV (图19A)和5mg/kg SC (图19B)组的各小鼠的PD反应(系统性凝集素途径活性下降)。虚线表示测定基线(最大抑制；测定之前体外加入过量OMS646的幼稚小鼠血清)。如图19A中所示，在IV给予5mg/kg的OMS646后，系统性凝集素途径活性立刻下降至接近不可检测的水平，和经过28天的观察期凝集素途径活性显示仅适度恢复。如图19B中所示，在给予5mg/kg的OMS646 SC的小鼠中，观察到凝集素途径活性的时间-依赖性抑制。凝集素途径活性在给予药物24小时内下降至接近不可检测的水平和保持在低水平至少7天。凝集素途径活性随时间逐渐增加，但在28天观察期内未恢复至给药前水平。给予15mg/kg SC后观察到的凝集素途径活性vs时间曲线类似于5 mg/kg SC剂量(数据未显示)，表明PD终点的饱和。数据还表明，IV或SC给予的每周剂量5mg/kg的OMS646足以在小鼠中实现系统性凝集素途径活性的持续抑制。
实施例16
本实施例描述了在年龄相关性黄斑变性的小鼠模型中MASP-2单克隆抗体(OMS646) (一种阻断凝集素途径功能的人IgG4抗体)的功效分析。
背景/原理：
如实施例15所述，产生特异性阻断人凝集素途径功能的全人单克隆MASP-2抗体(OMS646)。在本实施例中，在Bora等(J Immunol 174:491-497, 2005)所述的激光诱导的脉络膜新血管形成(CNV)的小鼠模型(一种年龄相关性黄斑变性(AMD)的常用模型)中，分析OMS646以及作为比较物的抗-VEGF抗体。
方法：
本研究评价了与溶媒治疗相比，三个剂量水平的OMS646 (2mg/kg；5mg/kg和20mg/kg SC)的效果。按实施例14所述产生的源自Fab2 #11的抗-小鼠MASP-2 mAb (3mg/kg SC)，和结合小鼠VEGF-A和阻断VEGF-A功能的大鼠单克隆抗体(5mg/kg IP，克隆2G11-2A05，购自BioLegend®, San Diego, CA)被分别包括在内作为阳性对照和比较物治疗。本研究包括9-10只小鼠/实验组，和以盲法方式进行。为评价一致和可预测的药物水平的功效，在激光诱导前8天给予所有治疗，然后在激光诱导前1天再次给予所有治疗，除了抗-VEGF抗体之外，其在激光诱导前1天和激光诱导后3天注射。激光损伤后7天，将小鼠麻醉，用0.75 ml的FITC-葡聚糖全身灌注和处死。将眼睛固定在福尔马林中，切开包含损伤区域的眼睛后部和水平固定在ProLong抗衰减试剂(Invitrogen)中。进行损伤区域的共焦显微镜检查，和从每个区域捕获图像。用ImageJ程序(National Institutes of Health, Bethesda, MarylandUSA)进行CNV和损伤面积的测量。CNV面积相对于每个眼睛的损伤斑点尺寸标准化，其中%CNV表示平均新血管化面积/损伤斑点，计算为(CNV面积/斑点面积) X 100。以盲法方式使用编码的试验物溶液进行研究。
结果：本研究的结果显示在图20中。如图20所示，与溶媒治疗组相比，OMS646治疗的小鼠在测试的所有剂量水平下显示CNV的明显抑制，其中相对CNV减少范围为29%-50%。在CNV减少方面，抗-VEGF治疗显示较低(大约15%)减少。与溶媒治疗相比，源自Fab2 #11的抗-小鼠MASP-2 mAb也减少CNV大约30% (数据未显示)，这与在实施例12所述的MASP-2 (-/-)小鼠中进行的研究中观察到的结果一致，在后者中与野生型对照小鼠相比，激光处理后7天在MASP-2 (-/-)小鼠中观察到CNV的30%减少。
本研究的结果提供了全身给予OMS646提供治疗新血管AMD的有效疗法的证据。不像对于AMD和其它眼睛血管发生性疾病和病症的需要玻璃体内注射的当前和新出现的疗法，OMS646当皮下给予时也是有效的。
还注意，本研究中使用的VEGF-A抗体(克隆2G11-2A05，来自BioLegend®, SanDiego, CA)，之前已表明在HSV-1诱导的角膜淋巴血管发生的小鼠模型中当以浓度100ug/mL通过结膜下注射给予时，减少血管扩展至角膜，如Wuest等(J Exp Med 207:101, 2009)所述。在Lu等(Cancer Res 72:2239-50, 2012)的另一研究中，携带B16肿瘤的Ceacam 1-/-小鼠的抗-VEGF抗体(克隆2G11-2A05)治疗在结肠肿瘤模型中当以大约3mg/kg一周两次IP给予时，显著减少肿瘤尺寸以及肿瘤血管系统。根据本研究中证实OMS646当在测试的所有剂量水平下全身递送至小鼠时至少与抗-VEGF抗体一样有效减少CNV的数据，预期MASP-2抑制剂例如OMS646作为抗-血管发生剂也将有效用于抑制血管发生-依赖性癌症，例如选自实体瘤、血荷肿瘤、高风险类癌肿瘤和肿瘤转移的血管发生-依赖性癌症。血管发生-依赖性癌症的实例是已被批准通过抗-VEGF剂、例如抗-VEGF抗体Avastin® (贝伐单抗,Genentech, CA)治疗的癌症类型。例如，贝伐单抗已被批准治疗以下血管发生性-依赖性癌症：转移性结肠直肠癌、非鳞状非小细胞肺癌、转移性肾细胞癌和成胶质细胞瘤。
血管发生-依赖性癌症的其它实例是预期通过抗-VEGF剂、例如抗-VEGF抗体Avastin® (贝伐单抗, Genentech, CA)治疗而获益的癌症类型，例如已知用血管抑制化合物(例如，VEGF拮抗剂)治疗或在开发中用血管抑制化合物(例如，VEGF拮抗剂)治疗的任何癌症，包括转移至肝的晚期癌症、黑素瘤、卵巢癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、肝细胞癌、子宫内膜癌、前列腺癌、血管肉瘤、转移性或不可切除的血管肉瘤、复发性卵巢生殖索间质肿瘤、食管癌、胃癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、复发性或转移性头颈癌、肿瘤性脑膜炎、宫颈癌、子宫癌、晚期腹膜癌扩散、神经胶质肉瘤、神经内分泌癌、颅外尤因肉瘤、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞性白血病、颅内脑膜瘤、晚期卡波西肉瘤、间皮瘤、胆管癌、转移性类癌肿瘤和晚期尿道癌。在该情况下优选的癌症包括：结肠直肠癌、乳腺癌(包括转移性乳腺癌、炎性乳腺癌)、肺癌、肾癌、肝癌、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌，以及神经胶质瘤、胃肠间质肿瘤、淋巴瘤、黑素瘤和类癌肿瘤。
还预期MASP-2抑制剂，例如OMS646作为抗-血管发生剂将有效抑制血管发生-依赖性良性肿瘤，例如选自血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼、类癌肿瘤和脓性肉芽肿的血管发生-依赖性良性肿瘤。还预期，MASP-2抑制剂例如OMS646作为抗-血管发生剂，在AMD和其它眼睛血管发生性疾病或病症，例如葡萄膜炎、眼睛黑素瘤、角膜新生血管形成、原发性翼状胬肉、HSV间质性角膜炎、HSV-1诱导的角膜淋巴血管发生、增生性糖尿病视网膜病、糖尿病黄斑水肿、早产儿视网膜病、视网膜静脉闭塞、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼、增生性糖尿病视网膜病继发性玻璃体出血、视神经脊髓炎和潮红中将有效用于抑制血管发生。
根据本研究中证实OMS646当在测试的所有剂量水平下全身递送至小鼠时至少与抗-VEGF抗体一样有效减少CNV的数据，还预期MASP-2抑制剂例如OMS646作为抗-血管发生剂也将有效用于抑制血管发生-依赖性病况，例如骨髓纤维化和遗传性出血性毛细血管扩张。
实施例17
本实施例描述使用MASP-2 (-/-)品系和MASP-2抑制性抗体来证实在股动脉结扎的动物模型中补体活化的MASP-2依赖性凝集素途径的抑制诱导抗-血管发生性作用。
背景/原理：根据实施例16描述的令人惊讶的结果，即在AMD模型中人MASP-2 mAbOMS646抑制CNV，如果不大于，也至少等同于VEGF-A抗体，进行以下研究以证实在MASP-2缺陷小鼠中血管发生减少，和还证实阻断凝集素途径的MASP-2抗体，例如OMS646，当全身给予时有效用作体内的血管发生抑制剂。
方法：
研究#1：在MASP-2 (-/-)小鼠、野生型对照小鼠和用MASP-2抑制性抗体预处理的野生型小鼠中通过股动脉结扎诱导动脉生成，和体内进行激光多普勒灌注测量，以检查侧动脉生长的过程是否受MASP-2缺陷影响。进行灌注测量，直到股动脉结扎后第21天。
在股动脉结扎后第3天进行免疫组织化学以分析：
(a) 在其中发生动脉生成的大腿中，MASP-2缺陷对血管周围白细胞浸润的影响(鉴于白细胞给生长络脉提供生长因子、细胞因子，动脉生成强烈依赖于白细胞浸润)；和
(b) 在由于股动脉结扎而变得缺血的小腿中，在MASP-2 (-/-)小鼠、抗-MASP-2抗体处理的野生型小鼠和对照野生型小鼠中血管发生、白细胞浸润和缺血组织损伤的严重性。
(c) 在MASP-2 (-/-)小鼠、抗-MASP-2抗体处理的野生型小鼠和对照野生型小鼠中在股动脉结扎后12h或24h，还对分离的络脉在RNA和蛋白水平上进行基因表达研究。
基于上述的抗-血管发生性作用，预期在大腿中MASP-2抑制将阻止或减少动脉生成25-50%。此外，已证实MASP-2抑制减少缺血后补体驱动的病理反应25%-50% (Schwaeble等, PNAS 108(18):7523-7528)。因此，还可预期，在小腿中MASP-2抑制将抑制血管生成至类似程度。
尽管已经例举和描述了说明性的实施方案，但应理解，可在其中进行各种变化而不背离本发明的精神和范围。

Claims (5)

1. MASP-2抑制剂在制备用于治疗患有选自以下的眼睛血管发生性疾病或病况的受试者的药物中的用途：葡萄膜炎、眼睛黑素瘤、角膜新生血管形成、原发性翼状胬肉、HSV间质性角膜炎、HSV-1诱导的角膜淋巴血管发生、早产儿视网膜病、视网膜静脉闭塞、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼和潮红。
2.权利要求1所述的用途，其中所述MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其片段。
3. 权利要求2所述的用途，其中所述MASP-2抑制剂是特异性结合SEQ ID NO:6的一部分的MASP-2单克隆抗体或其片段。
4.权利要求2所述的用途，其中所述抗体或其片段选自重组抗体、效应子功能降低的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
5.权利要求1所述的用途，其中所述组合物经皮下、腹膜内、肌内、动脉内、静脉内或作为吸入剂给予。
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