KR20180128941A

KR20180128941A - 혈관 형성의 억제를 필요로 하는 대상체에서 혈관 형성을 억제하는 방법

Info

Publication number: KR20180128941A
Application number: KR1020187030563A
Authority: KR
Inventors: 그레고리 에이. 데모풀로스; 한스-윌헬름 쉬웨블; 토마스 두들러; 래리 조엘커
Original assignee: 오메로스 코포레이션; 유니버시티 오브 레스터
Priority date: 2016-03-31
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2018-12-04
Also published as: JP2019513715A; EP3436072A4; SG11201808242UA; CN117582494A; JP6865767B2; AU2017240129B2; MA44518A; IL305200A; US20210189009A1; EP3436072A1; US20170283508A1; MY195432A; US10870708B2; SG10202009886SA; CA3096270A1; AU2020201633A1; JP2022110159A; KR20200113290A; AU2017240129A1; CA3096270C

Abstract

한 양태에서, 본 발명은 혈관 형성-의존적 질환 또는 병태를 앓고 있거나, 또는 그것에 걸릴 위험이 있는 포유동물 대상체에서 혈관 형성을 예방하고, 치료하고, 회복시키고 및/또는 지연시키는 방법을 제공하며, 대상체에게 혈관 형성을 억제하는데 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 이러한 양태들의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 이것의 단편이다.

Description

혈관 형성의 억제를 필요로 하는 대상체에서 혈관 형성을 억제하는 방법

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2016년 3월 31일에 출원된 가출원 번호 62/315,857의 이익을 주장하며, 그 전문은 본원에 참고로 포함된다.

서열 목록에 관한 진술

본 출원과 관련된 서열 목록은 서류 사본 대신에 텍스트 포맷으로 제공되며 본 명세서 내에 참고로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 명칭은 MP_1_0239_PCT_Sequence_Listing_20170321_ST25이다. 텍스트 파일은 115 KB이고, 2017년 3월 21일에 생성되었으며, 본 명세서의 출원과 함께 제출되었다.

보체 시스템은 인간 및 다른 척추동물에서 미생물 감염 및 다른 급성 손상에 대한 면역 반응을 시작하고, 증폭시키고 조정하기 위한 조기 작동 메커니즘을 제공한다 (M.K. Liszewski and J.P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E. Paul, Raven Press, Ltd., New York). 보체 활성화는 잠재적 병원체에 대한 중요한 제1 선 방어를 제공하는 한편, 보호적 면역 반응을 촉진하는 보체의 활성화는 또한 숙주에 대한 잠재적인 위협을 나타낸다 (K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994). 예를 들어, C3 및 C5 단백질 가수분해 생성물은 호중구를 모집하여 활성화시킨다. 숙주 방어에 필수적이긴 하지만, 활성화된 호중구는 무차별적으로 파괴적인 효소를 방출하며 장기 손상을 유발할 수도 있다. 이에 더하여, 이에 더하여, 보체 활성화는 인근의 숙주 세포, 뿐만 아니라 미생물 표적 상에 용해성 보체 구성요소의 침착을 유발하여, 숙주 세포 용해를 초래할 수도 있다.

보체 시스템은 또한 심근 경색(myocardial infarction), 뇌졸중(stroke), ARDS, 재관류 손상, 패혈성 쇼크(septic shock), 열 화상 후 모세관 누출, 후심폐 바이패스 염증(postcardiopulmonary bypass inflammation), 이식 거부 반응, 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 다발성 관절염(multiple sclerosis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 및 알츠하이머 병(Alzheimer's disease)을 포함하는 많은 급성 및 만성 질환 상태의 발병과 관련이 있다. 거의 모든 이러한 병태들에서, 보체는 그 원인이 아니라 발병에 수반된 여러 요인들 중 하나이다. 그럼에도 불구하고, 보체 활성화는 주요한 병리학적 메커니즘일 수도 있으며 이러한 질환 상태들 중 다수에서 임상적 제어에 효과적인 점을 나타낸다. 다양한 질환 상태에서 보체-매개된 조직 손상의 중요성에 대한 인식의 증가는 효과적인 보체 억제제에 대한 필요성을 강조한다. 지금까지, 보체 구성요소 C5에 대한 항체인 에쿨리쥬맙 (Solaris®)이 인간에서의 사용에 대하여 승인된 유일한 보체-표적화 약물이다. 하지만, C5는 보체 활성화 캐스케이드의 "다운스트림"에 위치한 여러 효과기 분자 중 하나이고, C5의 차단이 보체 시스템의 활성화를 억제하는 것은 아니다. 그러므로, 보체 활성화의 시작 단계의 억제자는 "다운스트림" 보체 억제자보다 상당한 이점을 가질 것이다.

현재, 보체 시스템은 세 개의 별개의 경로를 통해 활성화될 수 있다는 것이 널리 받아들여지고 있다: 고전적 경로, 렉틴 경로, 및 대체 경로. 고전적 경로는 보통 외래 입자 (즉, 항원)에 결합된 숙주 항체로 구성된 복합체에 의해 촉발되며 따라서 특이적 항체 반응의 생성을 위한 항원으로의 사전 노출을 필요로 한다. 고전적 경로의 활성화는 숙주에 의한 사전 적응성 면역 반응에 의존적이기 때문에, 고전적 경로는 후천적 면역 시스템의 일부이다. 그에 반해, 렉틴 및 대체 경로는 둘 다 적응성 면역력에 독립적이고 선천적 면역 시스템의 일부이다.

보체 시스템의 활성화는 세린 프로테아제 치모겐의 순차적 활성화를 유발한다. 고전적 경로 활성화의 첫 번째 단계는 항원-결합된 IgG 및 IgM 분자로의 특이적 인식 분자, C1q의 결합이다. C1q는 Cl이라고 불리는 복합체로서 Clr 및 Cls 세린 프로테아제 전구효소와 회합된다. 면역 복합체로의 C1q의 결합시, Clr의 Arg-Ile 부위의 자가 단백질 가수분해 분열은 Clr-매개된 분열 및 Cls의 활성화로 이어지며, 이로 인해 그것은 C4 및 C2를 분열시키는 능력을 획득한다. C4는 C4a 및 C4b로 지정된 두 개의 단편으로 분열되고, 유사하게, C2는 C2a 및 C2b로 분열된다. C4b 단편은 인접한 하이드록실 또는 아미노 기와 공유 결합을 형성하고 활성화된 C2의 C2a 단편과의 비공유 상호작용을 통해 C3 컨버타제 (C4b2a)를 생성할 수 있다. C3 컨버타제 (C4b2a)는 C3a 및 C3b 하위 구성요소로의 단백질 가수분해 분열에 의해 C3를 활성화시켜 C5 컨버타제 (C4b2a3b)의 생성을 유도하며, 이것은, C5를 분열시킴으로써, 세포막을 붕괴시켜 세포 용해를 일으킬 수 있는 막 공격 복합체 (C6, C7, C8 및 C-9 폴리머와 조합된 C5b, "MAC"로도 불림)의 형성을 유도한다. 활성화된 형태의 C3 및 C4 (C3b 및 C4b)는 외래 표적 표면 상에 공유 결합에 의해 침착되며, 이것은 다수의 포식세포 상의 보체 수용체에 의해 인식된다.

렉틴 경로를 통한 보체 시스템 활성화의 첫 번째 단계는 표적 리간드로의 렉틴 경로-특이적 패턴 인식 분자의 결합이다. 이 과정은 차례로 보체 캐스케이드를 시작하는 렉틴 경로-특이적 세린 프로테아제 전구효소의 활성화를 시작한다. 렉틴 경로의 패턴 인식 분자는 탄수화물-결합 C형 렉틴, 즉, 만난-결합 렉틴 (MBL), 콜렉틴-11 (CL-11, CL-K1으로도 알려져 있음), 콜렉틴-10 (CL-10, CL-L1으로도 알려져 있음), 및 피브리노겐-유사 결합 도메인을 통해 탄수화물 및 단백질의 아세틸화된 구조에 결합하는 세 개의 상이한 피콜린, 즉, H-피콜린, M-피콜린 및 L-피콜린의 군을 포함한다 (J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, (2002); Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000), J. Luet et al., Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Hansen et al, J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010), 및 Hendriksen et al., J Immunol 191(12):6117-27, 2013).

Ikeda, 등은 처음에, C1q와 유사하게, MBL이 C4-의존적 방식으로 효모 만난-코팅된 적혈구에 결합시 보체 시스템을 활성화시킬 수 있다는 것을 입증하였다 (Ikeda et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, (1987)). 콜렉틴 단백질 패밀리의 구성원인 MBL은 피라노스 고리의 적도면에 배향된 3- 및 4-하이드록시 기를 가진 탄수화물과 결합하는 칼슘-의존적 렉틴이다.

따라서 MBL에 대한 중요한 리간드는 D-만노스 및 N-아세틸-D-글루코사민인 한편, 이 입체구조적 요건을 충족하지 못하는 탄수화물은 MBL에 대하여 검출 불가능한 친화도를 갖는다 (Weis et al., Nature 360:127-134, (1992)). MBL 및 1가 당 간의 상호작용은 매우 약하며, 해리 상수는 전형적으로 한 자릿 수의 밀리몰 범위이다. MBL은 결합력에 의해, 즉, 서로 근접하여 위치한 다수의 단당류 잔기와 동시에 상호작용함으로써 글리칸 리간드로의 단단하고, 특이적인 결합을 달성한다 (Lee et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, (1992)). MBL은 일반적으로 박테리아, 효모, 기생충 및 특정 바이러스와 같은 미생물을 장식하는 탄수화물 패턴을 인식한다. 그에 반해, MBL은 보통 포유동물 혈장 및 세포 표면 당단백질 상에 존재하는 "성숙한" 복합 당컨쥬게이트를 장식하는 뒤에서 두 번째 및 최후의 당인 D-갈락토스 및 시알산을 인식하지 못 한다. 이 결합 특이성은 "외래" 표면의 인식을 촉진하고 "자가-활성화"로부터의 보호를 돕는 것으로 생각된다. 하지만, MBL은 포유동물 세포의 소포체 및 골지에서 격리된 N-결합된 당단백질 및 당지질 상의 고-만노스 "전구체" 글리칸의 클러스터에 높은 친화도로 결합한다 (Maynard et al., J. Biol. Chem. 257:3788-3794, (1982)). 그러므로, 손상된 세포는 MBL 결합을 통한 렉틴 경로 활성화에 대한 잠재적인 표적이고 더 최근의 작업은 CL-11이 허약한(distressed) 또는 손상된 세포에서 렉틴 경로 활성화를 시작하는 또 다른 렉틴 경로 인식 하위 구성요소임을 보여주었다 (Farar et al., J Clin Invest 126:1911-1925, 2016).

피콜린은 피브리노겐-유사 도메인이라고 불리는, MBL과 상이한 유형의 렉틴 도메인을 가지고 있다. 피콜린은 Ca⁺⁺-독립적 방식으로 당 잔기에 결합한다. 인간에서, 세 가지 종류의 피콜린 (L-피콜린, M-피콜린 및 H-피콜린)이 확인되었다. 두 가지 혈청 피콜린, L-피콜린 및 H-피콜린은 공통적으로 N-아세틸-D-글루코사민에 대한 특이성을 갖는다; 하지만, H-피콜린은 또한 N-아세틸-D-갈락토사민에 결합한다. L-피콜린, H-피콜린, CL-11, 및 MBL의 당 특이성의 차이는 상이한 렉틴들이 상보적일 수도 있고, 중첩되지만, 상이한 당컨쥬게이트를 표적화한다는 것을 의미한다. 이 개념은 렉틴 경로의 공지된 렉틴 중에서, 단지 L-피콜린만이 모든 그람-양성(Gram-positive) 박테리아에서 발견되는 세포벽 당컨쥬게이트인 리포테이코산에 특이적으로 결합한다는 최근의 보고서에 의해 지지된다 (Lynch et al., J. Immunol. 172:1198-1202, (2004)). 콜렉틴 (즉, MBL, CL-11, CL-10 및 CL-11/CL-10 복합체) 및 피콜린은 아미노산 서열의 유의한 유사성을 갖지 않는다. 하지만, 두 군의 단백질은 유사한 도메인 조직을 갖고, C1q와 유사하게, 올리고머 구조로 조립되며, 이것은 다중 부위 결합의 가능성을 극대화한다.

MBL의 혈청 농도는 건강한 집단에서 매우 가변적이고 이것은 MBL 유전자의 프로모터 및 암호화 영역 둘 다에서 다형성/돌연변이에 의해 유전적으로 제어된다. 급성기 단백질로서, MBL의 발현은 염증 동안에 더 상향조절된다. L-피콜린은 MBL과 유사한 농도로 혈청 내에 존재한다. 그러므로, 렉틴 경로의 L-피콜린 분지(branch)는 잠재적으로 생리학적 중요성이 MBL 암(arm)과 비슷하다. MBL 및 피콜린은 또한 옵소닌으로 기능할 수 있으며, 포식세포가 MBL- 및 피콜린-장식된 표면을 표적화할 수 있게 한다 (Jack et al., J Leukoc Biol., 77(3):328-36 (2004), Matsushita and Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 (2002), Aoyagi et al., J Immunol, 174(1):418-25(2005 참조). 이 옵소닌화는 이러한 단백질들과 포식세포 수용체의 상호작용을 필요로 하며 (Kuhlman et al., J. Exp. Med. 169:1733, (1989); Matsushita et al., J. Biol. Chem. 271:2448-54, (1996)), 이것의 정체성은 확립되어 있지 않다.

인간 MBL은 콜라겐-유사 도메인을 통해, MBL-회합된 세린 프로테아제 (MASP)라고 불리는, 고유한 C1r/Cls-유사 세린 프로테아제와의 특이적이고 고-친화도 상호작용을 형성한다. 지금까지, 세 개의 MASP가 기술되었다. 첫 번째로, 단일 효소 "MASP"는 보체 캐스케이드의 시작의 원인인 (즉, C2 및 C4를 분열시키는) 효소로서 확인되고 특징지어졌다 (Matsushita et al., J Exp Med 176(6):1497-1502 (1992); Ji et al., J. Immunol. 150:571-578, (1993)). 그 이후 MASP 활성이 실제로는 두 개의 프로테아제, MASP-1 및 MASP-2의 혼합물이라는 것이 결정되었다 (Thiel et al., Nature 386:506-510, (1997)). 하지만, MBL-MASP-2 복합체는 단독으로 보체 활성화에 충분하다는 것이 입증되었다 (Vorup-Jensen et al., J. Immunol. 165:2093-2100, (2000)). 게다가, 단지 MASP-2만이 높은 비율로 C2 및 C4를 분열시켰다 (Ambrus et al., J. Immunol. 170:1374-1382, (2003)). 그러므로, MASP-2는 C3 컨버타제, C4b2a를 생성하기 위해 C4 및 C2를 활성화시키는 원인이 되는 프로테아제이다. 이것은 고전적 경로의 C1 복합체와는 큰 차이점이며, 두 개의 특이적 세린 프로테아제 (C1r 및 C1s)의 협조된 작용이 보체 시스템의 활성화를 유도한다. 이에 더하여, 세 번째 신규의 프로테아제, MASP-3이 단리되었다 (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:127-35, 2001). MASP-1 및 MASP-3은 같은 유전자의 대안으로 스플라이싱된 생성물이다.

MASP는 Cl 복합체의 효소적 구성요소인 Clr 및 Cls와 동일한 도메인 조직을 공유한다 (Sim et al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, (2000)). 이러한 도메인들은 N-말단 Clr/Cls/성게 VEGF/골 형태 발생 단백질 (CUB) 도메인, 상피 성장 인자-유사 도메인, 제2 CUB 도메인, 보체 제어 단백질 도메인의 탠덤(tandem), 및 세린 프로테아제 도메인을 포함한다. C1 프로테아제에서와 같이, MASP-2의 활성화는 세린 프로테아제 도메인에 인접한 Arg-I1e 결합의 분열을 통해 일어나는데, 이것은 효소를 이황화-결합된 A 및 B 사슬로 분할하며, 후자는 세린 프로테아제 도메인으로 구성된다.

MBL는 MASP-2의 촉매 활성이 없는 19 kDa (MAp19)의 MBL-회합된 단백질 또는 작은 MBL-회합된 단백질 (sMAP)로 알려져 있는, 대안으로 스플라이싱된 형태의 MASP-2와 회합할 수 있다 (Stover, J. Immunol. 162:3481-90, (1999); Takahashi et al., Int. Immunol. 11:859-863, (1999)). MAp19는 MASP-2의 처음 두 개의 도메인에 이어서, 네 개의 고유한 아미노산의 추가 서열을 포함한다. Map19의 기능은 불분명하다 (Degn et al., J Immunol. Methods, 2011). MASP-1 및 MASP-2 유전자는 각각 인간 염색체 3 및 1에 위치한다 (Schwaeble et al., Immunobiology 205:455-466, (2002)).

여러 방면의 증거들은 상이한 MBL-MASP 복합체가 존재하고 혈청 내 MASP의 큰 분획은 MBL과 복합체를 형성하지 않는다는 것을 시사한다 (Thiel, et al., J. Immunol. 165:878-887, (2000)). H- 및 L-피콜린은 둘 다 MBL이 그러한 바와 같이 모든 MASP에 결합하고 렉틴 보체 경로를 활성화시킨다 (Dahl et al., Immunity 15:127-35, (2001); Matsushita et al., J. Immunol. 168:3502-3506, (2002)). 텍틴 및 고전적 경로는 둘 다 공통의 C3 컨버타제 (C4b2a)를 형성하고 두 경로는 이 단계에서 통합된다.

렉틴 경로는 나이브(naive) 숙주에서 감염에 대한 숙주 방어에 있어서 중요한 역할을 갖는 것으로 널리 생각된다. 숙주 방어에 있어서 MBL의 관여에 대한 강력한 증거는 기능적 MBL의 혈청 수준이 감소된 환자의 분석에서 비롯된다 (Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, (2002)). 이러한 환자는 재발성 박테리아 및 균류 감염에 대한 민감성을 나타낸다. 이러한 증상들은 보통 인생의 초기에, 모체로부터 유래된 항체 역가가 감소함에 따라 취약성이 명백한 기간 동안, 하지만 항체 반응의 전체 레퍼토리가 발달하기 전에 분명하다. 이 증상은 종종 MBL 올리고머의 적절한 형성을 방해하는, MBL의 콜라겐 부분의 여러 부위에서의 돌연변이로부터 발생한다. 하지만, MBL은 보체에 독립적인 옵소닌으로 기능할 수 있기 때문에, 감염에 대한 민감성의 증가가 손상된 보체 활성화로 인한 것이 어느 정도인지는 알려지지 않았다.

고전적 및 렉틴 경로와는 달리, 대체 경로의 시작물질(initiator)은 C1q 및 렉틴이 다른 두 개의 경로에서 수행하는 인식 기능을 이행하지 않는 것으로 발견되었다. 현재 대체 경로는 자발적으로 낮은 수준의 턴오버(turnover) 활성화를 거치며, 이것은 자발적 보체 활성화를 억제하는 적절한 분자적 요소가 없는 외래의 또는 다른 비정상적인 표면 (박테리아, 효모, 바이러스 감염된 세포, 또는 손상된 조직) 상에서 쉽게 증폭될 수 있다는 것이 널리 받아들여지고 있다. 대체 경로의 활성화에 직접적으로 관련된 네 개의 혈장 단백질이 존재한다: C3, 인자 B 및 D, 및 프로퍼딘.

고전적 및 대체 보체 경로 둘 다가 비-감염성 인간 질환의 발병에 관련이 있음을 보여주는 광범위한 증거가 존재하지만, 렉틴 경로의 역할은 이제 막 평가되기 시작했다. 최근의 연구는 렉틴 경로의 활성화가 허혈(ischemia)/재관류 손상에서 보체 활성화 및 관련된 염증의 원인이 될 수 있다는 증거를 제공한다. Collard et al. (2000)은 산화 스트레스를 받은 배양된 내피 세포가 MBL에 결합하고 인간 혈청에 노출시 C3의 침착을 나타낸다는 것을 보고하였다 (Collard et al., Am. J. Pathol. 156:1549-1556, (2000)). 이에 더하여, 차단 항-MBL 단클론성 항체로의 인간 혈청의 처리는 MBL 결합 및 보체 활성화을 억제하였다. 이러한 결과들은 심근 허혈-재관류의 래트 모델로 연장되었으며, 여기서 래트 MBL에 대한 차단 항체로 처리된 래트는 대조군 항체로 처리된 래트보다 관상 동맥의 폐색시 훨씬 더 적은 심근 손상을 나타냈다 (Jordan et al., Circulation 104:1413-1418, (2001)). 산화 스트레스 이후 혈관 내피 세포로의 MBL 결합의 분자적 메커니즘은 불분명하다; 최근의 연구는 산화 스트레스 이후 렉틴 경로의 활성화가 당컨쥬게이트가 아니라 혈관 내피 사이토케라틴로의 MBL 결합에 의해 매개될 수 있다는 것을 시사한다 (Collard et al., Am. J. Pathol. 159:1045-1054, (2001)). 그 밖의 연구는 고전적 및 대체 경로가 허혈/재관류 손상의 발병에 관련이 있음을 보여주었고 이 질환에서 렉틴 경로의 역할은 여전히 논쟁의 여지가 있다 (Riedermann, N.C., et al., Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003).

최근의 연구는 MASP-1 (및 아마도 MASP-3 또한)이 대체 경로 활성화 효소 인자 D를 치모겐 형태로부터 효소적 활성 형태로 전환시키는데 필요하다는 것을 보여주었다 (Takahashi M. et al., J Exp Med 207(1):29-37 (2010) 참조). 이 과정의 생리학적 중요성은 MASP-1/3-결핍 마우스의 혈장에서 대체 경로 기능적 활성의 부재에 의해 강조된다. 고유한 C3으로부터 단백질 가수분해에 의한 C3b의 생성은 대체 경로가 기능하는데 필요하다. 대체 경로 C3 컨버타제 (C3bBb)는 필수적인 서브유닛으로서 C3b를 함유하기 때문에, 대체 경로를 통한 첫 번째 C3b의 기원에 관한 질문은 난해한 문제를 제기하였고 상당한 연구를 자극하였다.

C3은 티오에스터 결합으로 알려져 있는 드문 번역 후 변형을 함유하는 단백질의 패밀리에 속한다 (C4 및 α-2 마크로글로불린과 함께). 티오에스터 기는 말단 카보닐 기가 세 개의 아미노산 떨어진 시스테인의 설피드릴 기와 티오에스터 공유 결합을 형성하는 글루타민으로 구성되어 있다. 이 결합은 불안정하고 친전자성 글루타밀-티오에스터는 친핵성 모이어티, 예컨대 하이드록실 또는 아미노 기와 반응하여 다른 분자와 공유 결합을 형성할 수 있다. 티오에스터 결합은 온전한 C3의 소수성 포켓 내에서 격리될 때 상당히 안정하다. 하지만, C3a 및 C3b로의 C3의 단백질 가수분해 분열은 C3b에서 고도로 반응성인 티오에스터 결합의 노출을 초래하고, 하이드록실 또는 아미노 기를 포함하는 인접한 모이어티에 의한 친핵성 공격 이후, C3b는 표적에 공유 결합된다. 보체 표적으로의 C3b의 공유 결합에 의한 부착에서의 잘 기록되어 있는 역할들 외에도, C3 티오에스터는 또한 대체 경로를 촉발시키는데 중추적인 역할을 하는 것으로 생각된다. 널리 받아들여지고 있는 "틱-오버 이론(tick-over theory)"에 따르면, 대체 경로는 유체상 컨버타제, iC3Bb의 생성에 의해 시작되며, 이것은 가수분해된 티오에스터를 가진 C3 (iC3; C3(H₂O)) 및 인자 B로부터 형성된다 (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopathol. 7:143-162, (1984)). C3b-유사 C3(H₂O)는 단백질에서 내부 티오에스터의 느린 자발적 가수분해에 의해 고유한 C3으로부터 생성된다 (Pangburn, M.K., et al., J. Exp. Med. 154:856-867, 1981). C3(H₂O)Bb 컨버타제의 활성을 통해, C3b 분자는 표적 표면 상에 침착되며 이로 인해 대체 경로를 시작한다.

대체 경로의 활성화의 시작물질에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 활성화제는 효모 세포벽 (치모산), 많은 순수한 다당류, 토끼 적혈구, 특정 면역글로불린, 바이러스, 균류, 박테리아, 동물 종양 세포, 기생충, 및 손상된 세포를 포함하는 것으로 생각된다. 이들 활성화제에 공통적인 유일한 특징은 탄수화물의 존재이지만, 탄수화물 구조의 복잡성 및 다양성은 인식되는 공유된 분자적 결정요인을 확립하는 것을 힘들게 만들었다. 대체 경로 활성화는 이 경로의 억제 조절 구성요소, 예컨대 인자 H, 인자 I, DAF, 및 CR1과 대체 경로의 유일한 양성 조절자인 프로퍼딘 사이의 미세한 균형을 통해 제어된다는 것이 널리 받아들여지고 있다. (Schwaeble W.J. and Reid K.B., Immunol Today 20(1):17-21 (1999) 참조).

상기 기술된 명확하게 조절되지 않는 활성화 메커니즘 외에도, 생성된 임의의 C3b가 추가적인 대체 경로 C3 컨버타제 (C3bBb)를 형성하는데 인자 B와 함께 참여할 수 있기 때문에, 대체 경로는 또한 렉틴/고전적 경로 C3 컨버타제 (C4b2a)에 대한 강력한 증폭 루프를 제공할 수 있다. 대체 경로 C3 컨버타제는 프로퍼딘의 결합에 의해 안정화된다. 프로퍼딘은 대체 경로 C3 컨버타제 반감기를 6 내지 10배 연장시킨다. 대체 경로 C3 컨버타제로의 C3b의 추가는 대체 경로 C5 컨버타제의 형성을 유도한다.

세 가지 경로 (즉, 고전적, 렉틴 및 대체 경로)는 모두 C5에서 통합되는 것으로 생각되어 왔으며, 이것은 분열되어 다수의 전염증 효과를 가진 생성물을 형성한다. 통합된 경로는 말단 보체 경로라고 불린다. C5a는 가장 강한 아나필라톡신이며, 평활근 및 혈관 긴장도, 뿐만 아니라 혈관 투과성의 변화를 유도한다. 그것은 또한 강력한 케모탁신이고 호중구 및 단핵구 둘 다의 활성화제이다. C5a-매개된 세포 활성화는 사이토카인, 가수분해 효소, 아라키돈산 대사산물, 및 활성 산소 종(reactive oxygen species)을 포함하는 다수의 추가적인 염증 매개물질의 방출을 유도함으로써 염증 반응을 크게 증폭시킬 수 있다. C5 분열은 막 공격 복합체 (MAC)로도 알려져 있는 C5b-9의 형성을 유도한다. 현재 저용해(sublytic) MAC 침착이 용해성 기공-형성 복합체로서의 역할 외에도 염증에서 중요한 역할을 할 수도 있다는 강력한 증거가 있다.

면역 방어에서의 필수적인 역할에 더하여, 보체 시스템은 많은 임상적 병태에서 조직 손상에 기여한다. 따라서, 이러한 부작용들을 예방하기 위해 치료적으로 효과적인 보체 억제자를 개발하는 것이 절실하게 필요하다.

혈관 형성이 고형 종양 및 전이, 및 안구 신생혈관 질환, 예컨대 나이-관련 황반 변성 (age-related macular degeneration; AMD), 증식성 당뇨성 망막증(proliferative diabetic retinopathy) 및 신생 혈관 녹내장(neovascular glaucoma)을 포함한 다양한 장애의 발병과 관련되어 있다는 것이 잘 확립되어 있다.

많은 질환 및 장애에서 혈관 형성의 역할을 고려하면, 치료적으로 효과적인 혈관 형성 억제자를 개발하는 것이 또한 절실하게 필요하다.

이 개요는 하기 상세한 설명에서 추가로 기술된 단순화된 형태의 개념의 선택을 소개하기 위해 제공된다. 이 개요는 청구된 주제의 주요 특징들을 확인하려는 것이 아니고, 또한 청구된 주제의 범위를 결정하는데 도움을 주려는 것도 아니다.

한 양태에서, 본 발명은 혈관 형성-의존적 질환 또는 병태를 앓고 있거나, 또는 걸릴 위험이 있는 포유동물 대상체에서 혈관 형성을 예방하고, 치료하고, 회복시키고 및/또는 지연시키는 방법을 제공하며, 혈관 형성을 억제하는데 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 이러한 양태들의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 이것의 단편이다. 추가의 구체예에서, MASP-2 항체는 감소된 효과기 기능을 갖는다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 억제 펩타이드 또는 비-펩타이드 MASP-2 억제자이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 MASP-2 억제제의 치료적 유효량 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 혈관 형성의 부작용을 억제하는 조성물을 제공한다. 또한 약학적 담체 중에 MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 포함하는, 필요로 하는 살아있는 대상체에서 혈관 형성의 부작용을 억제하는데 사용하기 위한 의약을 제조하는 방법이 제공된다. 또한 본원에서 하기 기술된 각각의 병태, 질환 및 장애의 치료를 위해 혈관 형성을 억제하는데 사용하기 위한 의약을 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명의 방법, 조성물 및 의약은 본원에서 추가로 기술된 바와 같이 급성 또는 만성 병리학적 병태 또는 손상을 앓고 있는 인간을 포함한 포유동물 대상체의 생체 내에서(in vivo) 혈관 형성의 부작용을 억제하는데 유용하다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 혈관 형성-의존적 질환 또는 병태를 앓고 있는 포유동물 대상체에서 혈관 형성을 억제하는 방법이 제공되며, 혈관 형성을 억제하는데 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 혈관 형성-의존적 질환 또는 병태는 혈관 형성-의존적 암, 예를 들어, 고형 종양(들), 혈액 매개 종양, 고위험 유암종, 및 종양 전이로 구성된 군으로부터 선택된 혈관 형성-의존적 암이다. 일부 구체예에서, 혈관 형성-의존적 질환 또는 병태는, 예를 들어, 혈관종(hemangioma), 청신경 종양(acoustic neuroma), 신경섬유종(neurofibroma), 트라코마(trachoma), 유암종, 및 화농성 육아종(pyogenic granuloma)으로 구성된 군으로부터 선택된 혈관 형성-의존적 양성 종양과 같은 혈관 형성-의존적 양성 종양이다. 일부 구체예에서, 혈관 형성-의존적 질환 또는 병태는, 예를 들어, 나이-관련 황반 변성 (AMD), 포도막염(uveitis), 안구 흑색종(ocular melanoma), 각막 혈관 신생(corneal neovascularization), 원발성 익상편(primary pterygium), HSV 기질 각막염(HSV stromal keratitis), HSV-1-유도된 각막 림프관 형성(HSV-1-induced corneal lymphangiogenesis), 증식성 당뇨성 망막증, 미숙아 망막증(retinopathy of prematurity), 망막 정맥 폐색(retinal vein occlusion), 각막 이식 거부 반응, 신생 혈관 녹내장, 및 홍색증(rubeosis)으로 구성된 군으로부터 선택된 안구 혈관 형성 질환 또는 병태와 같은 안구 혈관 형성 질환 또는 병태이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 AMD, 포도막염, 안구 흑색종, 각막 혈관 신생, 원발성 익상편, HSV 기질 각막염, HSV-1-유도된 각막 림프관 형성, 증식성 당뇨성 망막증, 당뇨병성 황반 부종(diabetic macular edema), 미숙아 망막증, 망막 정맥 폐색, 각막 이식 거부 반응, 신생 혈관 녹내장, 증식성 당뇨성 망막증에 부차적인 초자체 출혈(vitreous hemorrhage), 시속척수염(neuromyelitis optica) 및 홍색증으로 구성된 군으로부터 선택된 안구 혈관 형성 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 혈관 형성을 억제하는데 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 혈관 형성을 억제하는데 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 암에 걸린 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양 혈관 형성을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 언급된 양태 및 다수의 수반되는 이점들은, 첨부된 도면과 함께 취해질 때, 다음 상세한 설명을 참조하여 더 잘 이해되는 것처럼 더 쉽게 인정될 것이다.
도 1은 인간 MASP-2의 게놈 구조를 도시하는 도표이다.
도 2A는 인간 MASP-2 단백질의 도메인 구조를 도시하는 개략도이다.
도 2B는 인간 MAp19 단백질의 도메인 구조를 도시하는 개략도이다.
도 3은 쥐 MASP-2 넉아웃(knockout) 전략을 도시하는 도표이다.
도 4는 인간 MASP-2 꼬마유전자 구조를 도시하는 도표이다.
도 5A는 실시예 2에서 기술된 바와 같이 MASP-2-결핍이 만난 상의 C4b 침착의 결핍으로 측정된 바와 같이 렉틴-경로-매개된 C4 활성화의 손실을 유도한다는 것을 입증하는 결과를 나타낸다.
도 5B는 실시예 2에서 기술된 바와 같이 MASP-2-결핍이 치모산 상의 C4b 침착의 결핍으로 측정된 바와 같이 렉틴-경로-매개된 C4 활성화의 손실을 유도한다는 것을 입증하는 결과를 나타낸다.
도 5C는 실시예 2에서 기술된 바와 같이 만난 및 치모산 상의 C4b 침착으로 측정된 바와 같이 MASP-2+/-; MASP-2-/- 및 야생형 계통으로부터 얻어진 혈청 샘플의 상대적인 C4 활성화 수준을 입증하는 결과를 나타낸다.
도 6은 실시예 2에서 기술된 바와 같이 만난 상의 C4b 침착으로 측정된 바와 같이 MASP-2-/- 혈청 샘플에 쥐 재조합 MASP-2의 추가가 단백질 농도 의존적 방식으로 렉틴-경로-매개된 C4 활성화를 회복한다는 것을 입증하는 결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 8에서 기술된 바와 같이 고전적 경로가 MASP-2-/- 계통에서 기능적이라는 것을 입증하는 결과를 나타낸다.
도 8A는 실시예 10에서 기술된 바와 같이 항-MASP-2 Fab2 항체 #11이 C3 컨버타제 형성을 억제한다는 것을 입증하는 결과를 나타낸다.
도 8B는 실시예 10에서 기술된 바와 같이 항-MASP-2 Fab2 항체 #11이 고유한 래트 MASP-2에 결합한다는 것을 입증하는 결과를 나타낸다.
도 8C는 실시예 10에서 기술된 바와 같이 항-MASP-2 Fab2 항체 #41은 C4 분열을 억제한다는 것을 입증하는 결과를 나타낸다.
도 9는 실시예 10에서 기술된 바와 같이 C3 컨버타제 형성을 억제한, 테스트된 모든 항-MASP-2 Fab2 항체가 또한 C4 분열을 억제하는 것으로 발견되었다는 것을 입증하는 결과를 나타낸다.
도 10은 실시예 11에서 기술된 바와 같이 MASP-2 차단 Fab2 항체의 에피토프 맵핑에 사용된 래트 MASP-2로부터 유래된 재조합 폴리펩타이드를 도시하는 도표이다.
도 11은 실시예 11에서 기술된 바와 같이 래트 MASP-2 폴리펩타이드로의 항-MASP-2 Fab2 #40 및 #60의 결합을 입증하는 결과를 나타낸다.
도 12A는 실시예 12에서 기술된 바와 같이 야생형 (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스로부터 분리된 RPE-맥락막 복합체에서 베이스라인 VEGF 단백질 수준을 보여주는 결과를 나타낸다.
도 12B는 실시예 12에서 기술된 바와 같이 황반 변성 모델에서레이져 유도된 손상 이후 제3 일에 야생형 (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스의 RPE-맥락막 복합체에서 VEGF 단백질 수준을 보여주는 결과를 나타낸다.
도 13은 실시예 12에서 기술된 바와 같이 야생형 (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 레이져 유도된 손상 이후 제7 일에 평균 맥락막 혈관 신생 (CNV) 부피를 보여주는 결과를 나타낸다.
도 14는 실시예 13에서 기술된 바와 같이 WT 마우스에서 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg의 마우스 항-MASP-2 단클론성 항체의 피하 (SC) 주입 후 다양한 시점에 채취된 샘플에서 대조군의 %로서 측정된 C4b 침착의 수준을 그래프로 도시한다.
도 15는 실시예 13에서 기술된 바와 같이 WT 마우스에서 0.6 mg/kg의 마우스 항-MASP-2 단클론성 항체의 복강내 (IP) 주입 후 다양한 시점에 채취된 샘플에서 대조군의 %로서 측정된 C4b 침착의 수준을 그래프로 도시한다.
도 16은 실시예 14에서 기술된 바와 같이 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg 마우스 항-MASP-2 단클론성 항체의 단일 IP 주사로 전처리된 WT (+/+) 마우스에서 레이져 유도된 손상 후 제7 일에 평균 맥락막 혈관 신생 (CNV) 부피를 그래프로 도시한다.
도 17A는 실시예 15에서 기술된 바와 같이 렉틴 경로-특이적 검정 조건 하에서 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시하며, OMS646이 대략 1 nM의 IC₅₀ 값으로 렉틴-매개된 MAC 침착을 억제한다는 것을 입증한다.
도 17B는 실시예 15에서 기술된 바와 같이 고전적 경로-특이적 검정 조건 하에서 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시하며, OMS646이 고전적 경로-매개된 MAC 침착을 억제하지 않는다는 것을 입증한다.
도 17C는 실시예 15에서 기술된 바와 같이 대체 경로-특이적 검정 조건 하에서 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시하며, OMS646이 대체 경로-매개된 MAC 침착을 억제하지 않는다는 것을 입증한다.
도 18는 실시예 15에서 기술된 바와 같이 마우스에서 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 약동학적 (PK) 프로파일을 그래프로 도시하며, 지시된 용량으로 투여 후 시간의 함수로서 OMS646 농도 (n=3 동물/군의 평균)를 나타낸다.
도 19A는 실시예 15에서 기술된 바와 같이 정맥내 투여 이후의 마우스에서 전신성 렉틴 경로 활성의 하락으로 측정된 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 약역학적 (PD) 반응을 그래프로 도시한다.
도 19B는 실시예 15에서 기술된 바와 같이 피하 투여 이후의 마우스에서 전신성 렉틴 경로 활성의 하락으로 측정된 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 약역학적 (PD) 반응을 그래프로 도시한다.
도 20은 실시예 16에서 기술된 바와 같이 SC 투여된 2mg/kg, 5mg/kg 또는 20mg/kg 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646), 또는 IP 투여된 항-VEGF 항체로 전처리된 WT (+/+) 마우스에서 손상 후 제7 일에 레이져-유도된 병변의 면적의 퍼센트로서 맥락막 혈관 신생 (CNV) 면적을 그래프로 도시한다.

서열 목록의 설명

서열 번호:1 인간 MAp19 cDNA

서열 번호:2 인간 MAp19 단백질 (선도 서열을 가지고 있음)

서열 번호:3 인간 MAp19 단백질 (성숙)

서열 번호:4 인간 MASP-2 cDNA

서열 번호:5 인간 MASP-2 단백질 (선도 서열을 가지고 있음)

서열 번호:6 인간 MASP-2 단백질 (성숙)

서열 번호:7 인간 MASP-2 gDNA (엑손 1-6)

항원: (MASP-2 성숙한 단백질에 관하여)

서열 번호:8 CUBI 서열 (aa 1-121)

서열 번호:9 CUBEGF 서열 (aa 1-166)

서열 번호:10 CUBEGFCUBII (aa 1-293)

서열 번호:11 EGF 영역 (aa 122-166)

서열 번호:12 세린 프로테아제 도메인 (aa 429 - 671)

서열 번호:13 비활성 세린 프로테아제 도메인 (Ala로의 Ser618 돌연변이를 가지고 있는 aa 610-625)

서열 번호:14 TPLGPKWPEPVFGRL (CUB1 펩타이드)

서열 번호:15

TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ (CUBI 펩타이드)

서열 번호:16 TFRSDYSN (MBL 결합 영역 코어)

서열 번호:17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF (MBL 결합 영역)

서열 번호:18 IDECQVAPG (EGF 펩타이드)

서열 번호:19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV (세린 프로테아제 결합 코어)상세한 설명

펩타이드 억제자:

서열 번호:20 MBL 전장 cDNA

서열 번호:21 MBL 전장 단백질

서열 번호:22 OGK-X-GP (공통 결합)

서열 번호:23 OGKLG

서열 번호:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G

서열 번호:25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO

서열 번호:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOG

서열 번호:27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO (인간 h-피콜린)

서열 번호:28

GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGAOGEO (인간 피콜린 p35)

서열 번호:29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI (C4 분열 부위)

발현 억제자:

서열 번호:30 CUBI-EGF 도메인의 cDNA (서열 번호:4의 뉴클레오타이드 22-680)

서열 번호:31

5' CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC 3'

MASP-2 번역 시작 부위 (센스)를 포함하는 서열 번호:4의 뉴클레오타이드 12-45

서열 번호:32

5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3'

MASP-2 MBL 결합 부위 (센스)를 포함하는 영역을 암호화하는 서열 번호:4의 뉴클레오타이드 361-396

서열 번호:33

5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3'

CUBII 도메인을 포함하는 영역을 암호화하는 서열 번호:4의 뉴클레오타이드 610-642

클로닝 프라이머:

서열 번호:34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC (CUB에 대한 5' PCR)

서열 번호:35 GGAATTCCTAGGCTGCATA (CUB에 대한 3' PCR)

서열 번호:36 GGAATTCCTACAGGGCGCT (CUBIEGF에 대한 3' PCR)

서열 번호:37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT (CUBIEGFCUBII에 대한 3' PCR)

서열 번호:38-47은 인간화 항체에 대한 클로닝 프라이머이다.

서열 번호:48은 9개 aa 펩타이드 결합이다.

발현 벡터:

서열 번호:49은 MASP-2 꼬마유전자 인서트(insert)이다

서열 번호: 50은 쥐 MASP-2 cDNA이다

서열 번호: 51은 쥐 MASP-2 단백질 (선도 서열 없음)이다

서열 번호: 52는 성숙한 쥐 MASP-2 단백질이다

서열 번호: 53 래트 MASP-2 cDNA

서열 번호: 54는 래트 MASP-2 단백질 (선도 서열 없음)이다

서열 번호: 55는 성숙한 래트 MASP-2 단백질이다

서열 번호: 56-59는 인간 MASP-2A를 생성하는데 사용된 인간 MASP-2의 부위-특이적 돌연변이 유발을 위한 올리고뉴클레오타이드이다

서열 번호: 60-63은 쥐 MASP-2A를 생성하는데 사용된 쥐 MASP-2의 부위-특이적 돌연변이 유발을 위한 올리고뉴클레오타이드이다

서열 번호: 64-65는 래트 MASP-2A를 생성하는데 사용된 래트 MASP-2의 부위-특이적 돌연변이 유발을 위한 올리고뉴클레오타이드이다

서열 번호:66 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 중쇄 가변 영역 (VH) (신호 펩타이드 없음)을 암호화하는 DNA

서열 번호:67 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩타이드

서열 번호:68 17N16mc 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩타이드

서열 번호:69 17D20_dc21N11VL (OMS644) 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩타이드

서열 번호:70 17N16_dc17N9 (OMS641) 경쇄 가변 영역 (VL) (신호 펩타이드 없음)을 암호화하는 DNA

서열 번호:71 17N16_dc17N9 (OMS641) 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩타이드

상세한 설명

본 발명은 고전적 경로를 온전하게 유지하면서 렉틴 매개된 MASP-2 경로를 억제할 수 있다는 발명자들의 놀라운 발견을 기반으로 한다. 본 발명은 또한 면역 시스템의 고전적 (C1q-의존적) 경로 구성요소를 온전하게 유지하면서 렉틴-매개된 보체 경로 활성화와 관련된 세포 손상을 억제하기 위한 치료 표적으로서 MASP-2의 사용을 기술한다.

I. 정의

본원에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어는 본 발명의 당업자에게 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 본 발명을 기술하기 위해 명세서 및 청구범위에서 사용된 용어에 관하여 명확성을 제공하기 위해 다음 정의가 제공된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "MASP-2-의존적 보체 활성화"는 렉틴 경로 C3 컨버타제 C4b2a의 형성을 유도하는 생리학적 조건 하에서 (즉, Ca⁺⁺의 존재 하에서) 및 C5 컨버타제 C4b2a(C3b)n 이후 C3 분열 생성물 C3b의 축적시 발생하는 렉틴 경로의 MASP-2-의존적 활성화를 포함하며, 이것은 주로 옵소닌화를 유발하는 것으로 결정되었다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대체 경로"는, 예를 들어, 균류 및 효모 세포벽의 치모산, 그람 음성(Gram negative) 외막, 및 토끼 적혈구, 뿐만 아니라 많은 순수한 다당류, 토끼 적혈구, 바이러스, 박테리아, 동물 종양 세포, 기생충 및 손상된 세포의 지질다당류 (LPS)에 의해 촉발되는 보체 활성화를 지칭하며, 이것은 전통적으로 보체 인자 C3으로부터 C3b의 자발적 단백질 가수분해에 의한 생성으로부터 발생하는 것으로 생각되어 왔다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "렉틴 경로"는 혈청 및 만난-결합 렉틴 (MBL), CL-11 및 피콜린 (H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)을 포함하는 비-혈청 탄수화물-결합 단백질의 특이적 결합을 통해 발생하는 보체 활성화를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "고전적 경로"는 외래 입자에 결합된 항체에 의해 촉발되고 인식 분자 C1q의 결합을 필요로 하는 보체 활성화를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "MASP-2 억제제"는 항-MASP-2 항체 및 이것의 MASP-2 결합 단편, 천연 및 합성 펩타이드, 소분자, 가용성 MASP-2 수용체, 발현 억제자 및 단리된 천연 억제자를 포함하는, MASP-2에 결합하거나 이것과 직접적으로 상호작용하여 MASP-2-의존적 보체 활성화를 효과적으로 억제하는 임의의 작용제를 지칭하고, 또한 렉틴 경로에서 또 다른 인식 분자 (예를 들어, MBL, H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)로의 결합에 대하여 MASP-2와 경쟁하는 펩타이드를 포함하지만, 이러한 다른 인식 분자에 결합하는 항체를 포함하지는 않는다. 본 발명의 방법에서 유용한 MASP-2 억제제는 20% 초과, 예컨대 50%, 예컨대 90% 초과만큼 MASP-2-의존적 보체 활성화를 감소시킬 수도 있다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 90% 초과만큼 MASP-2-의존적 보체 활성화를 감소시킨다 (즉, 단지 10% 이하의 MASP-2 보체 활성화를 초래함).

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "혈관 형성"은 기존의 혈관으로부터 새로운 미세혈관의 성장을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "신생 혈관 형성(neo-angiogenesis)"은 생리학적이거나 병리학적이 아닌 질환 또는 병태에 수반될 때의 혈관 형성을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 임의의 항체-생산 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 및 인간을 포함한 영장류), 또는 하이브리도마(hybridoma), 파지 선택, 재조합 발현 또는 트랜스제닉(transgenic) 동물 (또는 항체 또는 항체 단편을 생산하는 다른 방법)로부터 유래된 항체 및 이것의 항체 단편을 포함하며, 이것은 표적 폴리펩타이드, 예를 들어, MASP-2, 폴리펩타이드 또는 이것의 일부에 특이적으로 결합한다. 용어 "항체"는 항체의 공급원 또는 제조되는 방식 (예를 들어, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 트랜스제닉 동물, 펩타이드 합성, 등에 의해)에 관하여 제한하려는 것은 아니다. 예시의 항체는 다클론성, 단클론성 및 재조합 항체; 팬(pan)-특이적, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체); 인간화 항체; 쥐 항체; 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 단클론성 항체; 및 항-이디오타입(idiotype) 항체를 포함하고, 임의의 온전한 항체 또는 이것의 단편일 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 다클론성 또는 단클론성 항체, 뿐만 아니라 이것의 단편 (예컨대 dAb, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단일 사슬 (ScFv), 이것의 합성 변이체, 자연 발생 변이체, 요구되는 특이성의 항원-결합 단편을 가진 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 요구되는 특이성의 항원-결합 부위 또는 단편 (에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성형태를 포함한다.

"단클론성 항체"는 균질한 항체 집단을 지칭하며 단클론성 항체는 에피토프의 선택적 결합에 수반된 아미노산 (자연 발생 및 비-자연 발생)으로 구성된다. 단클론성 항체는 표적 항원에 고도로 특이적이다. 용어 "단클론성 항체"는 온전한 단클론성 항체 및 전장 단클론성 항체, 뿐만 아니라 이것의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단일 사슬 (ScFv), 이것의 변이체, 항원-결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화 단클론성 항체, 키메라 단클론성 항체, 및 요구되는 특이성 및 에피토프에 결합하는 능력의 항원-결합 단편 (에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성형태를 포함한다. 항체의 공급원 또는 제조되는 방식 (예를 들어, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 트랜스제닉 동물, 등에 의해)에 관하여 제한하려는 것은 아니다. 용어는 "항체"의 정의 하에 전체 면역글로불린, 뿐만 아니라 상기 기술된 단편, 등을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은, 예를 들어, 항-MASP-2 항체와 같은 전장 항체로부터 유래되거나 또는 이것과 관련된 부분을 지칭하며, 일반적으로 항원 결합 또는 이것의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예시적인 예는 Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂ 및 Fv 단편, scFv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함하며, 이러한 도메인들은 단일 폴리펩타이드 사슬 내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 V_H 및 V_L 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 더 포함하며, 이것은 scFv가 항원 결합에 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "키메라 항체"는 가변 도메인 및 비-인간 종 (예를 들어, 설치류) 항체로부터 유래된 상보성 결정 영역을 함유하는 한편, 항체 분자의 나머지는 인간 항체로부터 유래된 재조합 단백질이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "인간화 항체"는 인간 항체 프레임워크로 이식된 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 특이적 상보성 결정 영역에 따르는 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 인간화 항체는 전형적으로 단지 항체 상보성 결정 영역만이 비-인간 기원의 것인 재조합 단백질이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "만난-결합 렉틴" ("MBL")은 만난-결합 단백질 ("MBP")과 동등하다.

본원에서 사용된 바와 같이, "막 공격 복합체" ("MAC")는 막에 들어가서 막을 붕괴시키는 마지막 다섯 개의 보체 구성요소 (C6, C7, C8 및 C-9와 조합된 C5b)의 복합체 (C5b-9라고도 불림)를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "대상체"는 제한없이 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 말, 양, 염소, 소, 토끼, 돼지 및 설치류를 포함하는 모든 포유동물을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산 잔기는 다음과 같이 축약된다: 알라닌 (Ala;A), 아스파라긴 (Asn;N), 아스파르트산 (Asp;D), 아르기닌 (Arg;R), 시스테인 (Cys;C), 글루탐산 (Glu;E), 글루타민 (Gln;Q), 글리신 (Gly;G), 히스티딘 (His;H), 아이소류신 (Ile;I), 류신 (Leu;L), 리신 (Lys;K), 메티오닌 (Met;M), 페닐알라닌 (Phe;F), 프롤린 (Pro;P), 세린 (Ser;S), 트레오닌 (Thr;T), 트립토판 (Trp;W), 티로신 (Tyr;Y), 및 발린 (Val;V).

가장 일반적인 의미에서, 자연 발생 아미노산은 각각의 아미노산의 측쇄의 화학적 특징에 기초하여 군들로 나누어질 수 있다. "소수성" 아미노산은 Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys 또는 Pro을 의미한다. "친수성" 아미노산은 Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His을 의미한다. 아미노산의 이 군들은 다음과 같이 하위 분류로 더 나누어질 수 있다. "비대전 친수성" 아미노산은 Ser, Thr, Asn 또는 Gln을 의미한다. "산성" 아미노산은 Glu 또는 Asp을 의미한다. "염기성" 아미노산은 Lys, Arg 또는 His을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이 용어 "보존적 아미노산 치환"은 각각 다음 군 내 아미노산 중에서의 치환으로 예시된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신, (2) 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파테이트 및 글루타메이트, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 리신, 아르기닌 및 히스티딘.

용어 "올리고뉴클레오타이드"는 본원에서 사용된 바와 같이 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머 또는 이것들의 모방체를 지칭한다. 이 용어는 또한 자연 발생 뉴클레오타이드, 당 및 공유 뉴클레오사이드 간 (백본) 결합 뿐만 아니라 비-자연 발생 변형을 가진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 상기 올리고핵염기를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "에피토프"는 항체에 의해 결합된 단백질 (예를 들어, 인간 MASP-2 단백질) 상의 부위를 지칭한다. "중첩 에피토프"는 적어도 하나의 (예를 들어, two, three, four, five, 또는 six) 공통 아미노산 잔기(들)을 포함하며, 선형 및 비-선형 에피토프를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 교체 가능하게 사용되고 길이 또는 번역 후 변형에 관계없이 아미노산의 임의의 펩타이드-결합된 사슬을 의미한다. 본원에서 기술된 MASP-2 단백질은 야생형 단백질을 함유하거나 야생형 단백질일 수도 있거나 또는 50개 이하 (예를 들어, 하나, 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개, 일곱 개, 여덟 개, 아홉 개, 열 개, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개 이하)의 보존적 아미노산 치환을 가진 변이체일 수도 있다. 보존적 치환은 전형적으로 다음 군 내에서의 치환을 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 아이소류신, 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 리신, 히스티딘 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신.

일부 구체예에서, 인간 MASP-2 단백질은 서열 번호: 5에서 제시된 아미노산 서열을 가진 인간 MASP-2 단백질과 70 (예를 들어, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100) % 이상 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 펩타이드 단편은 길이가 적어도 6개 (예를 들어, 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 또는 600개 이상)의 아미노산 잔기 (예를 들어, 서열 번호: 5의 적어도 6개의 인접한 아미노산 잔기)일 수도 있다. 일부 구체예에서, 인간 MASP-2 단백질의 항원성 펩타이드 단편은 길이가 500개 미만 (예를 들어, 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 또는 6개 미만)의 아미노산 잔기 (예를 들어, 서열 번호: 5 중 어느 하나에서 500개 미만의 인접한 아미노산 잔기)이다.

퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성은 서열을 정렬시키고, 필요한 경우, 최대의 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭(gap)을 도입한 후 참고 서열의 아미노산과 동일한 후보 서열의 아미노산의 퍼센트로 정의된다. 퍼센트 서열 동일성을 결정할 목적을 위한 정렬은 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로, 예를 들어, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 정렬을 측정하기에 적절한 파라미터는, 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대한의 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하며, 공지된 방법으로 결정될 수 있다.

II. 본 발명의 개요

렉틴 (MBL, M-피콜린, H-피콜린, L-피콜린 및 CL-11)은 선천적 보체 시스템을 촉발시키는 특이적 인식 분자이고 시스템은 렉틴 시작 경로 및 말단 보체 효과기 분자의 렉틴-시작된 활성화를 증폭시키는 관련 말단 경로 증폭 루프를 포함한다. C1q은 후천적 보체 시스템을 촉발시키는 특이적 인식 분자이고 시스템은 고전적 시작 경로 및 말단 보체 효과기 분자의 C1q-시작된 활성화를 증폭시키는 관련 말단 경로 증폭 루프를 포함한다. 발명자들은 두 개의 주요 보체 활성화 시스템을 각각 렉틴-의존적 보체 시스템 및 C1q-의존적 보체 시스템으로 지칭한다.

면역 방어에 있어서 그것의 본질적인 역할에 더하여, 보체 시스템은 많은 임상적 병태에서 조직 손상에 기여한다. 따라서, 이들 부작용을 방지하기 위해 치료적으로 효과적인 보체 억제자를 개발하는 것이 절실하게 필요하다. 고전적 경로를 온전하게 유지하면서 렉틴 매개된 MASP-2 경로를 억제하는 것이 가능하다는 인식과 함께, 보체의 면역 방어 능력을 완전히 정지시키지 않으면서 특정 병리 상태를 유발하는 보체 활성화 시스템만을 특이적으로 억제하는 것이 매우 바람직하다는 것을 인식하게 된다. 예를 들어, 보체 활성화가 대부분 렉틴-의존적 보체 시스템에 의해 매개되는 질환 상태에서, 이 시스템만을 특이적으로 억제하는 것이 이로울 것이다. 이것은 C1q-의존적 보체 활성화 시스템을 온전하게 유지하여 면역 복합체 프로세싱(processing)을 처리하고 감염에 대한 숙주 방어를 도울 것이다.

렉틴-의존적 보체 시스템을 특이적으로 억제하기 위한 치료제의 개발에서 목표로 하는 바람직한 단백질 구성요소는 MASP-2이다. 렉틴-의존적 보체 시스템의 공지된 모든 단백질 구성요소 (MBL, H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린, MASP-2, C2-C9, 인자 B, 인자 D, 및 프로퍼딘) 중에서, 단지 MASP-2만이 렉틴-의존적 보체 시스템에 고유하고 시스템이 기능하는데 필요하다. 렉틴 (MBL, H-피콜린, M-피콜린,L-피콜린 및 CL-11)이 또한 렉틴-의존적 보체 시스템의 고유한 구성요소이다. 하지만, 렉틴의 중복으로 인해 렉틴 구성요소 중 어느 하나의 손실이 반드시 시스템의 활성화를 억제하는 것은 아닐 것이다. 렉틴-의존적 보체 활성화 시스템의 억제를 보장하기 위해서는 다섯 개의 렉틴 모두를 억제하는 것이 필요할 것이다. 게다가, MBL 및 피콜린은 또한 보체 독립적인 옵소닌 활성을 가진 것으로 알려져 있기 때문에, 렉틴 기능의 억제는 감염에 대한 이 유익한 숙주 방어 메커니즘의 손실을 초래할 것이다. 그에 반해, 이 보체-독립적 렉틴 옵소닌 활성은 MASP-2가 억제 표적인 경우 온전하게 유지될 것이다. 렉틴-의존적 보체 활성화 시스템을 억제하기 위한 치료 표적으로서 MASP-2의 부가된 이점은 MASP-2의 혈장 농도가 임의의 보체 단백질 중에서 가장 낮다는 것이다 (

500 ng/ml); 그러므로, MASP-2의 고-친화도 억제자의 상응하는 낮은 농도는 충분한 억제를 얻기에 충분할 수도 있다 (Moller-Kristensen, M., et al., J. Immunol Methods 282:159-167, 2003).

본원에서 기술된 바와 같이, MASP-2 억제자, 예컨대 인간 MASP-2 항체 (OMS646)가 마우스에 전신으로 전달될 때 나이-관련 황반 변성 (AMD)의 마우스 모델에서 맥락막 혈관 신생 (CNV)을 감소시키는데 있어서 적어도 항-VEGF 항체만큼 효과적인 것으로 예상 외로 결정되었다. 그러므로, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체는 또한 혈관 형성 방지제로서 혈관 형성-의존적 암, 예를 들어, 고형 종양(들), 혈액 매개 종양, 고위험 유암종, 및 종양 전이로 구성된 군으로부터 선택된 혈관 형성-의존적 암을 억제하는데 사용하기에 효과적일 것으로 예상된다. 또한 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체는 혈관 형성 방지제로서, 예를 들어, 혈관종, 청신경 종양, 신경섬유종, 트라코마, 유암종, 및 화농성 육아종으로 구성된 군으로부터 선택된 혈관 형성-의존적 양성 종양과 같은 혈관 형성-의존적 양성 종양을 억제하기에 효과적일 것으로 예상된다. 또한 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체는 혈관 형성 방지제로서 AMD 및 포도막염, 안구 흑색종, 각막 혈관 신생, 원발성 (각막) 익상편, HSV 기질 각막염, HSV-1-유도된 각막 림프관 형성, 증식성 당뇨성 망막증, 미숙아 망막증, 망막 정맥 폐색, 각막 이식 거부 반응, 신생 혈관 녹내장, 및 홍색증과 같은 다른 안구 혈관 형성 질환 또는 장애에서 혈관 형성을 억제하는데 사용하기에 효과적일 것으로 예상된다.

III. 혈관 형성-의존적 질환 및 병태에서 MASP-2의 역할 및 MASP-2 억제제를 사용하는 치료 방법

혈관 형성-의존적 질환 또는 병태는 새로운 혈관이 부적절한 위치 (예컨대 망막 색소 상피)에서 과도하게 성장하거나 또는 새로운 혈관이 누출(leakiness)과 같은 원치 않는 특징을 갖고 질환, 예컨대 안구의 암 또는 질환을 포함할 때 발생한다. 이러한 질환들에서, 새로운 혈관은 병든 조직을 공급하고, 새로운 조직을 파괴할 수도 있으며, 암의 경우에, 새로운 혈관은 종양을 성장시키고 종양 세포가 순환계로 들어가서 다른 장기로 전이되게 한다. 과도한 혈관 형성은 병든 세포가 비정상적인 양의 혈관 형성 성장 인자를 생산하여, 자연 발생 혈관 형성 억제자의 효과를 압도할 때 일어날 수도 있다.

혈관 형성에서 보체 활성화에 대한 잠재적인 역할은 나이-관련 황반 변성 (AMD)에서 나타나있다. AMD는 수백만 명의 성인을 괴롭히는 눈을 멀게하는 질환이지만, AMD의 발달을 유도하는 생화학적, 세포적, 및/또는 분자적 이벤트는 잘 이해되어 있지 않다. AMD는 황반의 점진적인 파괴를 유발하며, 이것은 황반 및 그 주위에, 망막 뒤에 및 망막 색소 상피 (RPE) 및 맥락막 사이에 위치하는, 드루젠이라고 불리는, 단백질 및 지질-풍부 세포 외 침착물의 형성과 연관성이 있다. 드루젠은 초기 및 중기 AMD의 특징이다. 많은 환자가 후기 AMD로 진행되며, 이것은 두 가지 형태, 지도모양 위축(geographic atrophy) 및 혈관 신생 또는 "습성(wet)" AMD를 포함한다. 용어 "건성(dry) AMD"는 일반적으로 초기 및 중기 AMD, 뿐만 아니라 지도모양 위축을 지칭한다. 질환의 초기 및 중기 형태로 존재하고 잠재적으로 병리상태인 동안, 드루젠은 또한 후기 형태가 지속된다 (van Lookeren-Campagne et al., J. Pathol. 232:151, 2014; Ambati et al., Nat. Rev. Immunol. 13:438, 2013). 최근 연구는 염증 및 면역-매개된 공정과 관련된 단백질이 드루젠-관련 구성요소들 사이에서 일반적이라는 것을 나타냈다. 많은 이러한 분자들을 암호화하는 전사물은 망막, RPE, 및 맥락막 세포에서 검출되었다. 이러한 데이터들은 또한 강력한 항원-제공 세포인 수지상세포가 드루젠 발달과 밀접하게 연관되어 있으며, 보체 활성화가 드루젠 내에서 및 RPE-맥락막 계면을 따라 활성인 주요 경로임을 입증한다 (Hageman, G.S., et al., Prog. Retin. Eye Res. 20:705-732, 2001; Ebrahimi and Handa, J. Lipid 2011:802059, 2011). 이러한 관찰들은 국소적 염증이 AMD의 조기 발병에서 중요한 요인일 가능성이 크다는 것을 나타낸다.

여러 독립적인 연구에서는 위험 대립 유전자에 대하여 동형 접합성인 개체에서 AMD의 가능성이 7.4배만큼 증가된 보체 인자 H (CFH)에 대한 유전자의 유전적 다형성과 AMD 간의 밀접한 연관성을 나타냈다 (Klein, R.J. et al., Science 308:362-364, 2005; Haines et al., Science 308:362-364. 2005; Edwards et al., Science 308:263-264, 2005). CFH 유전자는 여섯 번의 독립적인 연결 스캔에 의해 AMD에 관련된 영역인 염색체 1q31에 맵핑되었다 (예를 들어, Schultz, D.W., et al., Hum. Mol. Genet. 12:3315, 2003 참조). CFH는 보체 시스템의 주요 조절자인 것으로 알려져 있다. 세포 및 순환계에서 CFH는 C3a 및 C3b로의 C3의 활성화를 억제하고, 기존의 C3b를 비활성화시킴으로써 보체 활성을 조절하는 것을 나타냈다. C5b-9의 침착은 AMD를 앓고 있는 환자에서 브루크 막(Bruch's membrane), 모세관 사이 기둥에서 및 드루젠 내에서 관찰되었다 (Klein et al., Science 308:362-364, 2005). 면역 형광 실험은 AMD에서 CFH의 다형성이 맥락막 모세혈관 및 맥락막 혈관에서 보체 침착을 일으킬 수도 있다는 것을 시사한다 (Klein et al., Science 308:362-364, 2005).

막-회합된 보체 수용체 1은 또한 드루젠에도 위치하지만, RPE 세포에서는 면역조직화학적으로 검출되지 않는다. 그에 반해, 막 보조인자 단백질인 제2 막-회합된 보체 억제자는 드루젠-회합된 RPE 세포 뿐만 아니라 드루젠 내 작은 구형 하부구조 요소에 존재한다. 이러한 이전에 확인되지 않은 요소들은 또한 보체 활성화 부위에 특징적으로 침착되는 보체 구성요소 C3의 단백질 가수분해 단편에 대한 강력한 면역 반응을 나타낸다. 이러한 구조들은 보체 공격의 표적인 퇴화 RPE 세포의 잔류 데브리(debris)를 나타내는 것으로 제안된다 (Johnson, L.V., et al., Exp. Eye Res. 73:887-896, 2001).

이러한 다수의 보체 조절자, 뿐만 아니라 보체 활성화 생성물 (C3a, C5a, C3b, C5b-9)의 확인 및 국소화는 조사자들이 만성 보체 활성화가 드루젠 생물 발생(biogenesis) 과정 및 AMD의 병인에 중요한 역할을 한다는 결론을 내리게했다 (Hageman et al., Progress Retinal Eye Res. 20:705-32, 2001). 드루젠에서 C3 및 C5 활성화 생성물의 확인은 본 발명에 따라 이해되는 바와 같이 보체가 고전적 경로, 렉틴 경로 또는 대체 증폭 루프를 통해 활성화되는지에 대한 통찰력을 제공하는 것은 아닌데, C3 및 C5 둘 다가 세 가지 경로 모두에 공통적이기 때문이다. 하지만, 두 가지 연구에서 고전적 경로의 활성화에 필수적인 인식 구성요소인 C1q에 특이적인 항체를 사용하여 드루젠 면역-라벨링을 찾았다 (Mullins et al., FASEB J. 14:835-846, 2000; Johnson et al., Exp. Eye Res. 70:441-449, 2000). 두 연구는 모두 C1q 면역-라벨링이 드루젠에서 일반적으로 관찰되지 않는다는 결론을 내렸다. C1q를 이용한 이러한 부정적인 결과는 드루젠에서 보체 활성화가 고전적 경로를 통해 일어나지 않는다는 것을 시사한다. 이에 더하여, 면역-복합체 구성요소 (IgG 경쇄, IgM)에 대한 드루젠의 면역-라벨링은 Mullins et al., 2000 연구에서 가변성에 약한 것으로 보고되어 있으며, 고전적 경로가 이 질환 과정에서 일어나는 보체 활성화에서 작은 역할을 한다는 것을 추가로 나타낸다. 그러므로, 렉틴 및/또는 대체 경로는 AMD와 관련된 보체-매개된 드루젠 생물 발생의 전부는 아니더라도, 대부분을 설명할 수 있다.

드루젠과 보체 활성화의 관계는 특히 초기 및 중기 AMD 뿐만 아니라 지도모양 위축에서 밀접하다. 실제로, 크고 융합성인 드루젠은 지도모양 위축에 대한 중요한 위험 인자를 나타낸다 (van Lookeren-Campagne et al., ibid). 하지만, 보체 활성화는 드루젠 환경에 제한되지 않는다. 두 가지 최근 발표된 연구는 인간 CNV의 모델인 마우스에서 레이져-유도된 맥락막 혈관 신생 (CNV)의 발달에서의 보체의 역할을 평가하였다. 면역조직학적 방법을 사용하여, Bora와 그 동료들은 (2005) 레이져 처리 후 신생 혈관 복합체에서 보체 활성화 생성물 C3b 및 C5b-9 (MAC)의 상당한 침착을 발견하였다 (Bora et al., J. Immunol. 174:491-7, 2005). 중요하게는, CNV는 모든 보체 활성화 경로에 필요한 필수 구성요소인 C3가 유전적으로 결핍된 (C3-/- 마우스)에서는 발달하지 않았다. CNV와 관련된 세 가지 혈관 형성 인자인 VEGF, TGF-β₂, 및 β-FGF에 대한 RNA 메세지 수준은 레이져-유도된 CNV 이후 마우스의 안구 조직에서 평가되었다. 중요하게는, 보체 고갈은 이러한 혈관 형성 인자들의 RNA 수준의 현저한 감소를 초래하였다.

ELISA 방법을 사용하여, Nozaki와 그 동료들은 강력한 아나필라톡신 C3a 및 C5a가 레이져-유도된 CNV의 과정의 초기에 생성된다는 것을 입증하였다 (Nozaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:2328-33, 2006). 게다가, C3 및 C5의 이들 두 개의 생체 활성 단편은 야생형 마우스에서 유리체내 주사 이후 VEGF 발현을 유도하였다. 이들 결과와 일치하도록, Nozaki와 그 동료들은 또한 C3a 및 C5a에 대한 수용체의 유전적인 제거가 레이져 손상 이후 VEGF 발현 및 CNV 형성을 감소시키고 C3a 또는 C5a의 항체-매개된 중화 또는 그 수용체들의 약리학적 차단이 또한 CNV를 감소시킨다는 것을 보여주었다. 이전의 연구는 백혈구, 및 특히 대식세포의 모집이 레이져-유도된 CNV에 중추적인 역할을 한다는 것을 확립하였다 (Sakurai et al., Invest. Opthomol. Vis. Sci. 44:3578-85, 2003; Espinosa-Heidmann, et al., Invest. Opthomol. Vis. Sci. 44:3586-92, 2003). 그들의 2006년 논문에서, Nozaki와 그 동료들은 백혈구 모집이 C3aR(-/-) 및 C5aR(-/-) 마우스에서 레이져 손상 이후 현저히 감소된다는 것을 보고하였다.

렉틴 경로는 망막 색소 상피에서 산화에 의해 변형된 인지질의 자연 항체 인식 이후 CNV 모델에서 보체 캐스케이드를 시작하는 역할을 한다는 것을 나타낸다 (Joseph et al. J. Biol. Chem. 288:12753, 2013). 대체 경로는 또한 이 모델에서 망막 손상에 대하여 중요하지만, 단독으로는 충분하지 않다 (Rohrer et al., Mol Immunol. 48:e1, 2011). 중요하게는, Kunchithapautham 및 Rohrer (J. Biol. Chem. 286:23717, 2011)는 이 보체 활성화가 망막 색소 상피 세포에 의해 VEGF 분비를 촉발시킨다는 것을 입증하였다. VEGF는 혈관 신생의 주요 매개물질이다.

본원에서 실시예 12에서 기술된 바와 같이, MASP-2(-/-) 마우스의 쥐 황반 변성 모델에서 야생형 대조군 마우스에 비해 MASP-2 (-/-) 마우스에서 VEGF의 베이스라인 수준이 감소하였고, 또한 레이져 유도된 손상 이후 야생형 마우스에서는 VEGF 수준이 크게 증가하는 한편, 레이져 유도된 손상 이후 MASP-2 (-/-) 마우스에서는 매우 낮은 수준의 VEGF를 볼 수 있다는 것이 결정되었다. 이에 더하여, MASP-2 (-/-) 마우스가 제7 일에 레이져 유도된 손상 이후 야생형 마우스와 비교하여 CNV 면역의 30% 감소를 나타냈다는 것이 결정되었다. 실시예 14에서 추가로 기술된 바와 같이, 보체 활성화의 렉틴 경로를 특이적으로 차단하는 항-MASP-2 단클론성 항체로 전처리된 마우스에서는, 레이져 처리 후 7일에 미처리 마우스와 비교하여 CNV의 통계적으로 유의한 (p<0.01) 대략 50%의 감소가 관찰되었으며, MASP-2단클론성 항체와 같은 억제자로의 MASP-2의 차단이 황반 변성의 치료에 예방적 및/또는 치료적 효과를 갖는다는 것을 입증하였다. 실시예 16에서 추가로 기술된 바와 같이, 보체 활성화의 렉틴 경로를 특이적으로 차단하는 인간 MASP-2 단클론성 항체로 전처리된 마우스에서, 20% 내지 50%의 범위의 상대적인 CNV 면적 감소로 테스트된 모든 용량 수준에서 CNV의 통계적으로 유의한 감소가 관찰된 반면, VEGF 항체는 CNV 면적의 보통의 (대략 15%) 상대적 감소를 나타냈다. MASP-2 항체와 같은 MASP-2 억제자가 전신으로 전달될 때 AMD의 마우스 모델에서 CNV를 감소시키는데 있어서 적어도 VEGF 항체만큼 효과적이라는, 실시예 16에서 개시된 예상치 못한 결과를 고려하면, MASP-2 억제제는 하기 기술된 바와 같이 혈관 형성 방지제로서 안구 혈관 형성 질환 또는 장애, 혈관 형성-의존적 암, 및 혈관 형성-의존적 양성 종양과 같은 혈관 형성-의존적 질환 및 병태를 치료하는데 사용하기에 효과적일 것으로 예상된다.

안구 혈관 형성 질환 또는 장애의 치료를 위한 MASP-2 억제자

안구 혈관 형성 질환 또는 장애는 눈에서 비정상적인 또는 과도한 혈관 형성이 발생하는 안구 질환 또는 장애이며, 이것은 시력 상실, 출혈, 또는 눈의 다른 기능적 장애, 예를 들어, AMD, 또는 포도막염, 안구 흑색종, 각막 혈관 신생, 원발성 (각막) 익상편, HSV 기질 각막염, HSV-1-유도된 각막 림프관 형성, 증식성 당뇨성 망막증, 당뇨병성 황반 부종, 미숙아 망막증, 망막 정맥 폐색, 각막 이식 거부 반응, 신생 혈관 녹내장, 증식성 당뇨성 망막증에 부차적인 초자체 출혈, 시속척수염, 및 홍색증으로 구성된 군으로부터 선택된 안구 혈관 형성 질환 또는 장애에 기여할 수도 있다 (예를 들어 Rivera et al., Neonatology 100(4):343-53, 2011; Hosseini et al., Cornea 31:322-34, 2012; Leyvraz et al., Curr Opin Oncol 162-9 (2012); Bock et al., Prog Retin Eye Res 34:89-124, 2013 및 Kim et al., Am J Pathol 181(2):376-9, 2012 참조).

실시예 14 및 16에서 기술된 바와 같이, 본 출원은 보체 활성화의 렉틴 경로를 특이적으로 억제하는 MASP-2 항체의 전신성 투여가 신생 혈관 AMD을 치료하는데 효과적인 요법을 제공한다는 것을 입증한다. 안구 병태에 대하여 현재 승인된 항-혈관 형성 요법은 VEGF를 억제하는 생물학적 작용제이다. 현재 안구 질환에 대하여 세 개의 항-혈관 형성 치료제가 승인되어 있다: 항-VEGF 압타머 (페가프타닙, Macugen®), VEGF-A에 대한 단클론성 항체의 Fab 단편 (라니비쥬맙, Lucentis®), 및 VEGF-A, VEGF-B 및 성장 인자에 결합하는 융합 단백질 (아플리버셉트, Eylea®) (이것들 모두는 유리체내 주사를 통해 투여된다). 그러므로, 유리체내 주사가 요구되는 AMD 및 다른 안구 혈관 형성 질환 및 장애에 대한 현재 및 새로운 치료제와는 달리, MASP-2 항체 처리는 피하 투여시 효과적이다.

따라서 본 발명의 양태는 안구 혈관 형성 질환 또는 장애를 치료하기 위해 혈관 형성을 억제하는 방법을 제공하며 필요로 하는 대상체에게 약학적 담체 중의 MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 안구 혈관 형성 질환 또는 장애는 AMD, 포도막염, 안구 흑색종, 각막 혈관 신생, 원발성 익상편, HSV 기질 각막염, HSV-1-유도된 각막 림프관 형성, 증식성 당뇨성 망막증, 당뇨병성 황반 부종, 미숙아 망막증, 망막 정맥 폐색, 각막 이식 거부 반응, 신생 혈관 녹내장, 증식성 당뇨성 망막증에 부차적인 초자체 출혈, 시속척수염 및 홍색증으로 구성된 군으로부터 선택된다. MASP-2 억제 조성물은, 예컨대 겔, 연고 또는 안약의 형태로 조성물의 직접 주사, 관주 또는 도포에 의해 눈에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안으로, MASP-2 억제제는, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제의 경구 투여에 의해 대상체에게 전신으로 투여될 수 있다. MASP-2 억제제 조성물은 하나 이상의 추가적인 치료제, 예컨대 추가적인 혈관 형성 방지제와 조합될 수도 있다. 투여는 병태가 완화되거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.

혈관 형성-의존적 암의 치료를 위한 MASP-2 억제자

혈관 형성이 암의 발달에 있어서 중요한 역할을 한다는 것은 잘 확립되어 있다. 종양은 혈관 형성 촉진 인자(pro-angiogenic factor)를 생산하여 혈관 신생을 자극하며, 이것은 고형 종양의 진행을 위한 주요 메커니즘 중 하나이고 또한 종양 세포의 이동이 전신 순환계에 접근하여 먼 거리의 전이를 확립할 수 있게 한다. 종양 혈관 형성의 과정은 성장하는 종양의 질량이 산소 및 영양소의 확산에 의해 유지될 수 있는 최대 부피를 초과할 때 주로 활성화된다. 증가된 혈관 형성 및 종양 공격성 간의 연관성이 관찰되었다 (Ferrara et al., Curr Top Microbiol Immunol 237:1-30, 1999). 혈관 형성은 또한 백혈병(leukemia) 및 다른 혈액학적 악성 종양의 성장 및 생존에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Ribatti et al., Neoplasia 15(3):231-238, 2013; Vacca et al., Br J Haematol 87:503-508, 1994). 다른 세포 유형이 혈관 신생에 기여하는 한편, 내피 세포는 일반적으로 혈관 형성 과정에서 중심 역할을 하는 것으로 인정된다.

VEGF가 종양 혈관 형성에서 중요한 역할을 한다는 것이 잘 확립되어 있다. VEGF는 종양 세포에 의해 분비되는 혈관 투과 인자로서 확인되었고 (Mattei et al., Genomics 32:168-169, 1996), 내피 세포 이동 및 증식을 자극함으로써, 뿐만 아니라 내피 세포에서 혈관 형성-관련 유전자의 발현을 자극함으로써 혈관 형성에서 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 인간 결장, 망막 및 폐암에서 가용성 VEGF 아이소폼(isoform) 189 발현은 증가된 미세 혈관, 암 전이 및 불량한 예후와 밀접한 연관성이 있다 (Tokunaga et al., Br J Cancer 77:998-1002, 1998; Yuan et al., J Clin Oncol 19:432-441, 2001). 높은 수준의 VEGF 아이소폼 165는 난소암의 불량한 생존률과 연관성이 있다 (Mahner et al., BMC Cancer 10:139, 2010). 3기 임상 시험에서, VEGF-A를 억제하는 인간화 단클론성 항체인 베바시쥬맙이 난소암을 앓고 있는 여성에서 무진행 생존을 개선한다는 것이 입증되었다 (Perren et al., N Engl J Med 365:2484-2496, 2011).

암의 맥락에서, 연구원들은 전통적으로 종양 세포의 태깅(tagging) 및 제거에서 보체의 역할에 초점을 맞추었다. 하지만, 최근 연구는 이러한 관점에 도전하였다. 예를 들어, Markiewski et al. (Nature Immunol vol 9:1225-1235, 2008)은 보체 단백질 C3, C4 및 C5a가 면역억제성 미세환경을 촉진함으로써 종양 성장을 도울 수도 있다는 예상치 못한 결과를 보고하였다. Markiewski et al.에서 기술된 바와 같이, 종양 미세환경에서 보체 C5a의 생성은 항-종양 CD8+ T 세포-매개된 반응을 억제함으로써 종양 성장을 향상시켰다. Markiewski et al.에서 더 기술된 바와 같이, C5aR 안타고니스트(antagonist), 헥사펩타이드 AcF(OP(D)ChaWr)는 야생형 마우스의 종양 성장을 손상시키는데 있어서 파클리탁셀 (Taxol)만큼 효과적이어서, 암의 치료에서 보체 억제를 위한 치료적 기능을 확립하였다. Gunn et al. (J Immunol 189:2985, 2012)에서 기술된 바와 같이, 고 C5a-생산 동계 림프종(lymphoma) 세포를 가지고 있는 야생형 마우스는 비장에서 더 많은 골수-유래된 억제자 세포 (MDSC) 및 종양, 종양-배출 림프절(tumor-draining lymph node), 및 비장에서 전체적으로 감소된 CD4+ 및 CD8+ T 세포로 종양 진행을 크게 가속화시켰다. 그에 반해, 저 C5a-생산 림프종 세포를 가지고 있는 종양 함유 마우스는 비장 및 종양-배출 림프절에서 증가된 인터페론-γ-생산 CD4+ 및 CD8+ T 세포로 종양 크기를 크게 감소시켰다. Corrales et al. (J Immunol 189:4674-4683, 2012)에서 추가로 기술된 바와 같이 비-소세포 폐암 (non-small cell lung cancer; NSCLC)을 앓고 있는 환자의 혈장에서 건강한 대상체와 비교하여 C5a의 상당한 증가가 발견되었다. 또한 C5a는 내피 세포 주화성 및 혈관 형성을 유도한다는 것이 결정되었다. 루이스 폐암 모델(Lewis lung cancer model)에서, 마우스 루이스 폐 암종(Lewis lung carcinoma) (3LL) 세포의 동계 종양은 C5a 수용체의 안타고니스트로 처리된 마우스에서 더 느리게 성장하였다.

Nunez-Cruz et al. (Neoplasia 14:994-1004, 2012)에서 추가로 기술된 바와 같이, 난소암 진행 중에 보체의 역할을 평가하기 위해서, C3에서 보체 결핍된 마우스의 계통, 또는 C5a 수용체 (C5aR)에서 보체 결핍된 마우스의 계통을 상피 난소암을 발달시키는 마우스의 계통 (TgMISIIR-TAg)과 교배시켰다. C3이 완전히 또는 부분적으로 결핍되거나 또는 C5aR이 완전히 결핍된 TgMISIIR-Tag 마우스는 난소 종양을 발생시키지 않거나 또는 야생형 TgMISIIR-TAg 한배 새끼(littermate)와 비교하여 작고 혈관 발달이 제대로 되지 않은 종양을 발달시켰으며, 이로 인해 C3 또는 C5aR의 결핍이 난소 종양 표현형을 크게 약화시킨다는 것을 입증한다. 혈관 형성에서 CD31+ 내피 세포 기능은 C3 (-/-) 및 C5aR (-/-) 마우스 둘 다에서 손상되었다는 것이 더 입증되었다.

보체 시스템의 활성화는 또한 악성 종양의 발병과 관련이 있을 수도 있다. C5b-9 보체 복합체의 신생항원, IgG, C3, C4, S-단백질/비트로넥틴, 피브로넥틴, 및 대식세포는 다클론성 또는 단클론성 항체 및 스트렙타비딘-비오틴-퍼옥시다제 기술을 사용하여 유방암의 17개의 샘플 및 양성 유방 종양의 6개의 샘플에 국한되었다. 각 TNM 병기의 암종을 가진 모든 조직 샘플은 종양 세포의 막 상의 C5b-9 침착물, 세포 잔부 상의 얇은 과립, 및 괴사 영역의 확산 침착물을 제공하였다 (Niculescu, F., et al., Am. J. Pathol. 140:1039-1043, 1992). Rutkowski et al. (Mol Cancer Res 8:1453, 2010)에서 추가로 기술된 바와 같이, 종양 혈관 형성, 침습 및 이동을 포함하는 잠재적인 종양 유전자의 역할은 보체 단백질 C3, C3a, C5a 및 MAC에 대하여 기술되어 있다. 보체 활성화의 렉틴 경로는 건강한 대상체와 비교하여 결장직장암 환자의 혈청에서 유의하게 증가된 것으로 발견되었고 (Ytting et al., 2004, Scand J. Gastroenterol 39:674) MASP-2 활성의 높은 수준은 결장암 재발 및 낮은 생존률을 예측하는 독립적인 예후적 생체마커인 것으로 보고되었다 (Ytting et al., Clin Cancer Res 11:1441, 2005).

또한 혈청 MBL 및/또는 MASP-2는 급성 림프아구성 백혈병 (acute lymphoblastic leukaemia; ALL), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), CNS-종양, 및 CNS 외부의 고형 종양을 포함하는 특정 소아암에서 증가된다는 것이 결정되었다 (Fisch et al., 2011, Swiss Med Wkly 141:w13191). 또한 MASP-2는 식도 편평세포 암종 (ESCC) 및 이형성 (전암성) 조직 샘플에서 과발현된다는 것이 결정되었다 (Verma et al., Int J Cancer 118:2930, 2006).

상기 언급된 연구 외에도, 많은 연구들이 MBL 다형성과 암의 관계를 보고하였다. 예를 들어, Swierzko et al., Mol Immunol 55:16, 2013에서 요약된 바와 같이, MBL과 MBL2 유전자 다형성의 관계는 위암 (Baccarelli et al, International J Cancer 119:1970-1975, 2006; Scudiero et al., Clin Chem 52:1625-1626, 2006; Wang et al., Digestive Diseases and Sciences 53:2904-2908, 2008); 간장암 (Eurich et al., Liver International 31:1006-1012, 2011); 췌장암 (Rong et al., BMC Gastroenterology 10:68, 2010); 결장암/결장직장암 (Ytting et al., Scan J Gastroenterology 39:670-674, 2004; Ytting et al., Scan J Gastroenterology 73:122-127, 2011; Zanetti et al., Cancer Res 72:1467-1677, 2012); 난소암 (Swierzko et al., Immunotherapy 56:959-971, 2007); Nevadunsky et al., European J of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology 163:216-218, 2012); 유방암 (Bernig et al., Carcinogenesis 28:828-836, 2007); 폐암 (Pine et al., Journal of NCI 99:1401-1409, 2007; Olivo-Marston et al., Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention 18:3375-3383, 2009); 및 급성 림프아구성 백혈병 (Schmiegelow et al., Blood 100:3757-3760, 2002)에 대하여 보고되었다.

또한 보체 구성요소는 인간 암 환자 생체액(biofluid)에서 상향조절된다는 것이 결정되었으며, 하기 표 1에서 나타난 바와 같다.

인간 암 환자 생체액에서 상향조절된 보체 구성요소

보체 구성요소	암	생체표본	참고문헌
C3a/C3a(desArg)	유방암	혈청	Fan et al., J Can Res Clin Oncol 136:1243, 2010;Solassol et al., Oncogene 29:550, 2010; Li et al., Clin Chem 51:2229, 2005
C3a/C3a(desArg)	HCV-관련 간세포 암종	혈청	Kanmura et al., J Gastroenterol 45:459, 2010;Lee et al., Proteomics 6:2865, 2006
C3a/C3a(desArg)	결장직장암	혈청	Fenz et al., Proteomics Clin Appl 1:536, 2007;Habermann et al., Gastroenterol 131:1020, 2006
C3a	만성 림프성 백혈병 (CLL)	혈청	Miguet et al., J Proteome Res 5:2258, 2006;
C4a	CLL	혈청	Miguet et al., J Proteome Res 5:2258, 2006;
C3a	난소암	복수 대 혈청	Bjorge et al., Br J Cancer 92(5):895-905, 2005
C5b-9	난소암	복수 대 혈청	Bjorge et al., Br J Cancer 92(5):895-905, 2005
C5a	비-소세포 폐암 (NSCLC)	혈청	Corrales et al., J Immunol 189:4674, 2012
C1 억제자, CD59, CD46, 인자 H	난소암	복수 대 혈청	Bjorge et al., Br J Cancer 92(5):895-905, 2005
인자 H	급성 골수성 백혈병	혈청	Lee et al., Electrophoresis 33:1863, 2012
인자 H	폐암	기관지폐포세척 (BAL), 가래	Pio et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 19:2665, 2010

이에 더하여, 보체 활성화는 화학요법 또는 방사선 요법의 결과일 수도 있으며 따라서 보체 활성화의 억제는 의원성 염증을 감소시키기 위한 악성 종양의 치료에서 부가물로서 유용할 것이다. 화학요법 및 방사선 요법이 수술에 선행할 때, C5b-9 침착물은 더 강렬하고 확장되었다. 양성 병변을 가진 모든 샘플에서는 C5b-9 침착물이 없었다. S-단백질/비트로넥틴은 연결 조직 매트릭스에서 미소섬유 침착물로서 및 종양 세포 주위의 확산 침착물로서 존재하였으며, 피브로넥틴보다 덜 강렬하고 덜 확장되었다. IgG, C3, 및 C4 침착물은 암종 샘플에서만 존재하였다. C5b-9 침착물의 존재는 보체 활성화 및 유방암에서의 그것의 후속적인 병인론적 효과를 나타낸다 (Niculescu, et al., Am. J. Pathol. 140:1039-1043, 1992).

보체 활성화의 렉틴 경로를 특이적으로 억제하는 MASP-2 항체의 전신 투여가 적어도 항-VEGF 항체만큼 효과적으로 혈관 신생을 억제한다는 실시예 16에서 기술된 데이터를 고려하면, MASP-2 억제제의 전신 전달이 종양 혈관 형성을 억제하는데 있어서 효과적이며, 이로 인해 혈관 형성-의존적 암을 앓고 있는 대상체에서 종양 성장 및/또는 전이를 감소시킨다는 것이 예상된다.

혈관 형성-의존적 암은 상피 기원 또는 뉴런 기원의 암 또는 암종 또는 고형 종양 또는 육종 또는 액체 종양, 예컨대 백혈병 또는 림프종을 포함한다. 혈관 형성 억제 화합물 (예를 들어, VEGF 안타고니스트)로 치료되는 것으로 이미 알려져 있거나, 또는 이것으로 치료되도록 개발 중인 어떤 암도 본 발명의 방법의 범위 내에 포함된다. 이 맥락에서 바람직한 암은 다음을 포함한다: 결장직장암, 유방암 (전이성 유방암, 염증성 유방 암종 포함), 폐암, 신장암, 간세포암, 식도암, 난소암, 췌장암, 전립선암 및 위암, 뿐만 아니라 신경교종(glioma), 위장관 간질성 종양, 림프종, 흑색종 및 유암종 (NCI 임상 시험 데이터베이스: www_cancer_gov_clinicaltrials/search에서 찾을 수 있음, 3/25/2014에 접근 가능). 이들 암 중 다수는 수용체로의 VEGF의 결합을 차단하고 종양 혈관 형성을 억제하는 인간화 단클론성 항체인 베바시쥬맙 (Avastin®)으로의 처리에 반응성인 것으로 나타났다 (예를 들어, Amit et al., PLoS One 8(1):e51780 (2013).

상기 언급된 바에 따르면, 본 발명의 또 다른 양태에서, 혈관 형성-의존적 암을 앓고 있는 대상체에서 종양 혈관 형성 및/또는 종양 전이를 억제하는 방법이 제공된다. 이 방법은 혈관 형성-의존적 암을 앓고 있는 대상체에게 종양 혈관 형성 및/또는 종양 전이를 억제하는데 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 결장직장, 유방, 폐암, 신장암, 간세포암, 식도암, 난소암, 췌장암, 전립선암 및 위암, 뿐만 아니라 신경교종, 위장관 간질성 종양, 림프종, 흑색종 및 유암종으로 구성된 군으로부터 선택된 혈관 형성-의존적 암을 앓고 있다. 일부 구체예에서, 혈관 형성-의존적 암은 항-VEGF 작용제, 예컨대 항-VEGF 항체 Avastin® (베바시쥬맙, Genentech, CA)에 의한 치료에 의해 이익을 얻을 것으로 예상되는 암의 유형, 예를 들어, 혈관 형성 억제 화합물 (예를 들어, VEGF 안타고니스트)로 치료되는 것으로 이미 알려져 있거나, 또는 이것으로 치료되도록 개발 중인 임의의 암이며, 간으로 전이된 후기 암, 흑색종, 난소암, 신경아세포종(neuroblastoma), 췌장암, 간세포 암종, 자궁체부암, 전립선암, 혈관육종(angiosarcoma), 전이성 또는 절제 불가능 혈관육종, 재발성 난소 성기삭 간질성 종양(relapsed ovarian sex-cord stromal tumour), 식도암, 위암, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma), 확산 큰 B-세포 림프종, 재발성 또는 전이성 두경부암, 신생물 수막염(neoplastic meningitis), 자궁경부암, 자궁암, 후기 복막 암종증(advanced peritoneal carcinomatosis), 신경아교육종(gliosarcoma), 신경내분비계 암종(neuroendocrine carcinoma), 두개외 유잉 육종(extracranial Ewing sarcoma), 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 두개내 수막종(두개내 meningioma), 후기 카포시 육종(advanced Kaposi's sarcoma), 중피종(mesothelioma), 담도암, 전이성 유암종, 및 후기 요로암을 포함한다. 이 맥락에서 바람직한 암은 다음을 포함한다: 결장직장암, 유방암 (전이성 유방암, 염증성 유방 암종 포함), 폐암, 신장암, 간세포암, 식도암, 난소암, 췌장암, 전립선암 및 위암, 뿐만 아니라 신경교종, 위장관 간질성 종양, 림프종, 흑색종 및 유암종.

MASP-2 억제 조성물은, 예컨대 직접적으로 또는 원격으로 수술 중 조성물의 국소적 도포 또는 국소적 주사에 의해, 예를 들어, 카테터에 의해 종양(들)의 영역에 국소적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-2 억제제는, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로는 비-펩타이드성 작용제에 대하여 경구 투여에 의해 대상체에게 전신으로 투여될 수도 있다. MASP-2 억제제 조성물은 하나 이상의 추가적인 치료제, 예컨대 추가적인 혈관 형성 방지제 및/또는 추가적인 화학치료제와 조합될 수도 있다. 투여는 병태가 완화되거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바와 같이 반복될 수도 있다.

OMS646이 테스트된 모든 용량 수준으로 마우스에게 전신으로 전달될 때 CNV를 감소시키는데 있어서 적어도 항-VEGF 항체만큼 효과적이라는 것을 입증하는 본 연구의 데이터를 고려하면, OMS646과 같은 MASP-2 억제제는 또한 혈관 형성 방지제로서 골수섬유증(myelofibrosis) 및 유전성 출혈성 모세혈관 확장증(hereditary hemorrhagic telangiesctasia)과 같은 혈관 형성-의존적 병태를 억제하는데 사용하기에 효과적이라는 것이 또한 예상된다.

IV. MASP-2 억제제

다양한 양태에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에게 MASP-2 억제제를 투여함으로써 혈관 형성의 부작용을 억제하는 방법을 제공한다. MASP-2 억제제는 살아있는 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양으로 투여된다. 본 발명의 이 양태의 실시에 있어서, 대표적인 MASP-2 억제제는 다음을 포함한다: MASP-2의 생물학적 활성을 억제하는 분자 (예컨대 MASP-2와 상호작용하거나 또는 단백질-단백질 상호작용을 방해하는 소분자 억제자, 항-MASP-2 항체 또는 차단 펩타이드), 및 MASP-2의 발현을 감소시켜, MASP-2가 렉틴 보체 경로를 활성화시키는 것을 방지하는 분자 (예컨대 MASP-2 안티센스 핵산 분자, MASP-2 특이적 RNAi 분자 및 MASP-2 리보자임). MASP-2 억제제는 1차 요법으로서 단독으로 또는 다른 의학적 치료의 치료적 이점을 향상시키기 위해 보조 요법으로서 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다.

MASP-2-의존적 보체 활성화의 억제는 본 발명의 방법에 따라 MASP-2 억제제의 투여의 결과로서 발생하는 보체 시스템 구성요소의 다음 변화 중 적어도 하나를 특징으로 한다: MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템 생성물 C4b, C3a, C5a 및/또는 C5b-9 (MAC)의 생성 또는 생산의 억제 (예를 들어, 실시예 2에서 기술된 바와 같이 측정됨), C4 분열 및 C4b 침착의 감소 (예를 들어, 실시예 2에서 기술된 바와 같이 측정됨), 또는 C3 분열 및 C3b 침착의 감소 (예를 들어, 실시예 2에서 기술된 바와 같이 측정됨).

본 발명에 따르면, 혈관 형성을 억제하고 검출 가능한 항-혈관 형성 활성을 나타내며 및/또는 신생 혈관 형성의 감소를 유도하는데 효과적인 MASP-2 억제제가 이용된다. 본 발명의 맥락 내에서, 항-혈관 형성 활성은 다음 중 적어도 하나 이상을 포함할 수도 있다: 신생 혈관 형성의 축소 또는 감소, 혈관의 정상화, 및/또는 병원성 영역에서 혈관 수의 감소.

신생 혈관 형성 및 혈관 형성 방지제, 예컨대 MASP-2 억제제의 평가는 당업자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 신생 혈관 형성 및 혈관 형성 방지제의 평가는 동물의 CNV의 레이져-유도된 손상 모델에서 (본원에서 실시예 12, 14 및 16에서 기술된 바와 같음), 또는 PET (양전자 방사 단층촬영), MRI (자기 공명 이미지화), DCE-MRI (동적 조영 증강, MRI) 또는 CT (컴퓨터 단층촬영) 이미지화와 같은 비-침습성 기술에 의해 환자 또는 종양의 제자리에서(in situ) 평가될 수도 있다. 이러한 기술들은 종양에서 혈관 구조의 증가된 누출에 기초하여 종양 크기를 모니터링하는데 사용될 수도 있다. MRI 또는 PET를 사용하여, 혈관 형성 마커, 예컨대, 예를 들어, α5β3-인테그린, 혈장 VEGF 또는 bFGF의 존재를 추적할 수 있다.

대안으로, 신생 혈관 형성은 활성을 평가하고 건강한 대상체의 정상 내피 세포 또는 환자의 내피 세포이긴 하지만, 신체의 상이한 곳에서 분리된 내피 세포의 활성과 비교하기 위해 혈관 형성-의존적 병태를 앓고 있는 환자로부터 채취된 종양 생검 또는 절편 및 후속적인 면역-조직화학적 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 면역-조직화학적 분석은 미세혈관 밀도를 평가하기 위해 팬-내피 세포 항체, 예컨대 항-CD31 및 항-CD34를 사용하여 실행될 수도 있다. 조직 절편은 조직에서 종양 내피 세포와 종양 증식 세포 간의 비율을 분석하기 위해, 증식 마커와 조합된 내피 세포에 대한 마커로 염색될 수 있다. 내피 마커의 예는 CD31 및 CD34이다. 증식 마커의 예는 Ki67이며, 주어진 세포 집단의 성장분율을 결정하는데 훌륭한 마커이다. Ki-67-양성 종양 세포의 분율 (Ki-67 라벨링 지수)은 종종 암의 임상적인 과정과 연관성이 있다. 미세혈관 밀도 (MVD)는, 예를 들어, 항-CD31로 염색된 종양 절편에서 및 MVD를 정량화하기 위한 염색의 강도를 사용하여 평가될 수도 있다. MVD의 정량화는 바람직하게는 종양 절편 당 네 개 내지 다섯 개의 대표적인 이미지에서 양성 염색된 루멘 구조를 계수함으로써 실행된다. 종양 절편 당 적어도 네 개 내지 다섯 개의 대표적인 이미지에서 평가된 MVD의 감소, 바람직하게는 통계적으로 유의한 감소는 바람직하게는 투여된 분자가 항-혈관 형성 활성을 갖거나 또는 신생 혈관 형성의 감소를 유도할 수 있다는 표시로 볼 수 있다.

신생 혈관 형성은 또한 세포, 바람직하게는 종양, 건강한 대상체, 또는 내피 세포주의 내피 세포를 사용하여 평가될 수도 있다. 종양의 내피 세포는 바람직하게는 종양 내피로 지정된다. 종양 내피 세포는 내피 마커로서 CD31을 사용하여 종양 조직의 FACS (형광 활성화 세포 분류)에 의해 분리될 수도 있다. 이것은 van Beijnum et al., Nat Protoc. 3(6):1085-91, 2008에서 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 시험관 내에서 (in vitro) 신생 혈관 형성을 평가하기 위해 바람직한 내피 세포는 HUVEC 및 RF24이다. 시험관 내에서 신생 혈관 형성의 평가는 내피 세포의 증식성 활성의 평가를 위한 MTS (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐-)-2H-테트라졸륨) 검정을 사용하여 수행될 수도 있다. 대안으로, MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드), 크리스탈 바이올렛 및 WST-1 (수용성 테트라졸륨)과 같은 당업자에게 공지된 다른 생존력 검정이 사용될 수도 있다.

이에 더하여, 회전타원체 발아 검정(spheroid sprouting assay) 및 매트리겔 튜브 형성 검정(matrigel tube formation assay)과 같은 다른 유형의 혈관 형성 활성 검정이 사용될 수 있다. 매트리겔 튜브 형성 검정에서, 세포, 특히 내피 세포는 합성 반-자연적 겔 매트릭스 (예컨대 BD Biosciences의 Matrigel 또는 콜라겐-겔, 또는 어떤 경우에는 피브린 겔) 상에 분주된다. 두 검정에서, 내피 세포, 바람직하게는 HUVEC가 사용되고 있다. 일정 기간 이후, 세포 배양 조건에 따라 세포는 튜브-유사 구조를 형성하기 시작한다. 튜브-유사 구조의 형성은 새로운 혈관 생성에 대한 첫 번째 단계로 간주된다. 판독 파라미터는 면적 단위 당 혈관-결절(vessel-knot)의 수이다. 회전타원체 발아 검정을 위해, 세포 회전타원체 (예를 들어, 내피 세포)는 겔 (예를 들어, 매트리겔 및 콜라겐 및) 상에 배치된다. 일정 기간 이후 발아 형성이 관찰될 수 있다. 발아의 정도는 세포의 혈관 형성 가능성의 평가에 대한 기준으로 간주된다. 판독 파라미터는 회전타원체 당 발아의 수이다. 항-혈관 형성 활성은 미처리 세포의 회전타원체 당 발아의 수와 비교하여 처리된 세포에서 회전타원체 당 발아의 수가 주어진 기간 동안 줄어들거나 감소될 때 존재할 수도 있다. 감소 또는 축소는 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 감소일 수도 있다. 종양 조직에서 항-혈관 형성 활성은 또한 혈관의 정상화가 가시화될 때 및/또는 병원성 영역에서 혈관의 수가 감소될 때 존재할 수도 있다.

바람직한 구체예에서, 병원성 영역의 혈관 수가 치료 시작 시점의 혈관 수와 비교하여 감소된 것으로 발견되는 즉시, 항-혈관 형성 활성이 검출 가능하다. 감소는 병원성 영역의 혈관 수의 검출 가능한 감소 또는 병원성 영역의 혈관의 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%의 감소일 수도 있다. 병원성 영역은 주변 조직을 포함한 종양의 영역이며, 종양 영역에 가까이 위치한다. 이 맥락에서 가까이는 최대 몇 센티미터를 의미할 수도 있다.

혈관의 정상화는 바람직하게는 혈관 또는 미세혈관의 3차원 구조의 변화이다. 예를 들어, 종양 내피에서 신생 혈관 형성 활성과 관련된 병리학적 혈관 또는 미세혈관은 대조군 혈관 또는 미세혈관보다 덜 규칙적일 수도 있고 및/또는 더 구불구불하게 보일 수도 있고 및/또는 더 누출되는 것으로 보일 수도 있다. 대조군 혈관은 건강한 개체의 혈관 또는 환자의 혈관이긴 하지만, 상기 환자의 병원성 영역에 위치하지 않은 혈관일 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 혈관의 3차원 구조가 대조군 혈관보다 더 규칙적이고, 덜 구불구불하고 및/또는 덜 누출되는 것으로 보이는 즉시, 항-혈관 형성 활성이 검출되었다고 한다. 바람직하게는, 병원성 영역에서 치료 시작 시점보다 덜 불규칙하고, 구불구불하고 및/또는 누출되는 혈관이 검출된다. 더 바람직하게는, 덜한 것은 5% 덜한 것, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 덜한 것을 의미한다. 가장 바람직하게는, 병원성 영역에서 불규칙하고, 구불구불하고 및/또는 누출되는 혈관이 검출되지 않는다. 병원성 영역에서 혈관 및/또는 혈관 수의 정상화는 비-침습성 이미지화 기술, 예컨대 PET, MRI 또는 CT 이미지화를 사용하여 평가될 수도 있다.

신생 혈관 형성과 관련된 안구 질환 또는 병태의 경우에, 검출 가능한 항-혈관 형성 활성 및/또는 테스트되는 약물, 예컨대 MASP-2 억제제에 의해 유도된 신생 혈관 형성의 축소 또는 감소를 평가하기 위한 여러 검정이 개발되었다. 이들 상이한 질환 모델에서, 혈관 형성은 트랜스제닉 마우스에서 육체적 손상 (레이져 유도된 브루크 막 파열)과 같은 상이한 자극 (Shen et al, 2006 Gene therapy 13: 225-234) 또는 VEGF와 같은 특이적 혈관 성장 인자의 과발현 (Miki et al, 2009, Ophthalmology 2009 September 116(9): 1748-1754)에 의해 촉발될 수 있다. 검출 가능한 항-혈관 형성 활성 및/또는 혈관 형성의 축소 또는 감소가 MASP-2 억제제를 사용하여 평가된 경우, 이러한 MASP-2 억제제는 혈관 형성 또는 혈관 형성과 관련된 질환 또는 병태를 예방하고, 치료하고, 회복시키고, 치유하고 및/또는 지연시키기 위한 의약으로서 사용된다고 한다.

신생 혈관 형성 및/또는 항-혈관 형성 활성의 평가는 주기적으로, 예를 들어, 매주 또는 매달 수행될 수 있다. 그러므로 신생 혈관 형성의 증가/감소 및/또는 항-혈관 형성 활성의 존재는 주기적으로, 예를 들어, 매주 또는 매달 평가될 수 있다. 이 평가는 바람직하게는 주어진 대상체에 대하여 여러 시점에서 또는 주어진 대상체 및 건강한 대조군에 대하여 하나 또는 여러 시점에서 수행된다. 평가는 규칙적인 시간 간격으로, 예를 들어 매주, 또는 매달 수행될 수 있다. MASP-2 억제제에 관련된 신생 혈관 형성 또는 혈관 형성 활성의 한 번의 평가가 신생 혈관 형성 감소의 결과 또는 항-혈관 형성 활성의 존재로 이어질 때, MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체는 검출 가능한 항-혈관 형성 활성을 나타내고 및/또는 신생 혈관 형성의 축소 또는 감소를 유도한다고 한다.

신생 혈관 형성 활성의 검출 가능한 감소 및/또는 항-혈관 형성 활성의 존재는 바람직하게는, 적어도 한 시점에 대하여, 신생 혈관 형성의 감소 및/또는 항-혈관 형성 활성의 존재가 검출될 때 검출되었다. 바람직하게는, 신생 혈관 형성의 감소 및/또는 항-혈관 형성 활성의 존재는 적어도 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개의 시점에 대하여 검출되었다.

본 발명의 이 양태의 실시에 유용한 MASP-2 억제제는, 예를 들어, MASP-2 항체 및 그 단편, MASP-2 억제 펩타이드, 소분자, MASP-2 가용성 수용체 및 발현 억제자를 포함한다. MASP-2 억제제는 MASP-2의 생물학적 기능을 차단함으로써 MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템을 억제할 수도 있다. 예를 들어, 억제제는 MASP-2 단백질 대 단백질(protein-to-protein) 상호작용을 효과적으로 차단하거나, MASP-2 다이머화 또는 조립을 방해하거나, Ca²⁺ 결합을 차단하거나, MASP-2 세린 프로테아제 활성 부위를 방해하거나, 또는 MASP-2 단백질 발현을 감소시킬 수도 있다.

일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 보체 활성화를 선택적으로 억제하여, C1q-의존적 보체 활성화 시스템을 기능적으로 온전하게 유지한다.

한 구체예에서, 본 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제제는 보체 시스템에서 다른 항원보다 적어도 10배 더 높은 친화도로 서열 번호:6을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 특이적 MASP-2 억제제이다. 또 다른 구체예에서, MASP-2 억제제는 보체 시스템에서 다른 항원보다 적어도 100배 더 높은 친화도로 서열 번호:6을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 (i) MASP-2의 CCP1-CCP2 도메인 (서열 번호:6의 aa 300-431) 또는 세린 프로테아제 도메인 (서열 번호:6의 aa 445-682) 중 적어도 하나에 특이적으로 결합하고 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2에 특이적으로 결합하는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 이것의 단편이다. MASP-2 억제제의 결합 친화도는 적합한 결합 검정을 사용하여 결정될 수 있다.

MASP-2 폴리펩타이드는 C1 보체 시스템의 프로테아제인 MASP-1, MASP-3, 및 C1r 및 C1s와 유사한 분자 구조를 나타낸다. 서열 번호:4에서 제시된 cDNA 분자는 MASP-2의 대표적인 예 (서열 번호:5에서 제시된 아미노산 서열로 구성됨)를 암호화하고 인간 MASP-2 폴리펩타이드에 선도 서열 (aa 1-15)을 제공하며 분비 후 분열되어, 성숙한 형태의 인간 MASP-2 (서열 번호:6)를 발생시킨다. 도 2에서 도시된 바와 같이, 인간 MASP 2 유전자는 12개의 엑손을 포함한다. 인간 MASP-2 cDNA는 엑손 B, C, D, F, G, H, I, J, K 및 L에 의해 암호화된다. 대안의 스플라이싱은 도 2에서 도시된 바와 같이 엑손 B, C, D 및 E로부터 발생하는 (서열 번호:1)에 의해 암호화되는 MBL-회합된 단백질 19 ("MAp19", "sMAP"로도 불림)라고 불리는 20 kDa 단백질 (서열 번호:2)을 발생시킨다. 서열 번호:50에서 제시된 cDNA 분자는 쥐 MASP-2 (서열 번호:51에서 제시도니 아미노산 서열로 구성됨)를 암호화하고 쥐 MASP-2 폴리펩타이드에 선도 서열을 제공하며 분비 후 분열되어, 성숙한 형태의 쥐 MASP-2 (서열 번호:52)를 발생시킨다. 서열 번호:53에서 제시된 cDNA 분자는 래트 MASP-2 (서열 번호:54에서 제시된 아미노산 서열로 구성됨)를 암호화하고 래트 MASP-2 폴리펩타이드에 선도 서열을 제공하며 분비 후 분열되어, 성숙한 형태의 래트 MASP-2 (서열 번호:55)를 발생시킨다.

당업자들은 서열 번호:4, 서열 번호:50 및 서열 번호:53에서 개시된 서열이 각각 인간, 쥐 및 래트 MASP-2의 단일 대립 유전자를 나타내고, 대립 유전자의 변화 및 대안의 스플라이싱이 발생할 것으로 예상된다는 것을 인식할 것이다. 침묵(silent) 돌연변이를 함유하는 것 및 돌연변이가 아미노산 서열 변화를 초래하는 것을 포함한, 서열 번호:4, 서열 번호:50 및 서열 번호:53에서 나타난 뉴클레오타이드 서열의 대립 유전자 변이체는 본 발명의 범위 내에 있다. MASP-2 서열의 대립 유전자 변이체는 표준 절차에 따라 상이한 개체의 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 탐침함으로써 클로닝될 수 있다.

인간 MASP-2 단백질 (서열 번호:6)의 도메인은 도 1 및 2A에서 도시되고 N-말단 C1r/C1s/성게 Vegf/골 형태 발생 단백질 (CUBI) 도메인 (서열 번호:6의 aa 1-121), 상피 성장 인자-유사 도메인 (aa 122-166), 제2 CUBI 도메인 (aa 167-293), 뿐만 아니라 보체 조절 단백질 도메인 및 세린 프로테아제 도메인의 탠덤(tandem)을 포함한다. MASP 2 유전자의 대안의 스플라이싱은 도 1에서 도시된 MAp19를 발생시킨다. MAp19는 도 1에서 도시된 바와 같이 엑손 E로부터 유래된 네 개의 추가적인 잔기 (EQSL)를 가진 MASP-2의 N-말단 CUB1-EGF 영역을 함유하는 비효소 단백질이다.

여러 단백질들이 단백질 대 단백질 상호작용을 통해 MASP-2에 결합하거나, 또는 이것과 상호작용하는 것으로 나타났다. 예를 들어, MASP-2는 렉틴 단백질 MBL, H-피콜린 및 L-피콜린에 결합하고, 이것들과 함께 Ca²⁺ 의존적 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 각각의 MASP-2/렉틴 복합체는 단백질 C4 및 C2의 MASP-2-의존적 분열을 통해 보체를 활성화시키는 것으로 나타났다 (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., et al., J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). 연구는 MASP-2의 CUB1-EGF 도메인이 MBL과 MASP-2의 회합에 필수적인 것으로 나타났다 (Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166:5068, 2001). 또한 CUB1EGFCUBII 도메인은 활성 MBL 복합체의 형성에 필요한 MASP-2의 다이머화를 매개하는 것으로 나타났다 (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 275:30962-30969, 2000). 그러므로, MASP-2-의존적 보체 활성화에 중요한 것으로 알려져 있는 MASP-2 표적 영역에 결합하거나 또는 이것을 방해하는 MASP-2 억제제가 확인될 수 있다.

항-MASP-2 항체

본 발명의 이 양태의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템을 억제하는 항-MASP-2 항체를 포함한다. 본 발명의 이 양태에 유용한 항-MASP-2 항체는 임의의 항체 생산 포유동물로부터 유래된 다클론성, 단클론성 또는 재조합 항체를 포함하고 다중특이적, 키메라, 인간화, 항-이디오타입, 및 항체 단편일 수도 있다. 항체 단편은 본원에서 추가로 기술된 바와 같이 Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂, Fv 단편, scFv 단편 및 단일 사슬 항체를 포함한다.

MASP-2 항체는 본원에서 기술된 검정을 사용하여 MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템을 억제하는 능력 및 항-혈관 형성 활성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 여러 MASP-2 항체는 문헌에서 기술되어 있고 일부는 새롭게 생성되었으며, 그 중 일부는 하기 표 2에서 나열되어 있다. 예를 들어, 본원에서 실시예 10 및 11에서 기술된 바와 같이, MASP-2-의존적 보체 활성화를 차단하는 항-래트 MASP-2 Fab2 항체가 확인되었고, 실시예 14에서 나타난 바와 같이, 항-래트 MASP-2 Fab2 항체로부터 유래된 단클론성 항체는 레이져-유도된 CNV의 마우스 모델에서 항-혈관 형성 활성을 갖는다. 실시예 15에서 추가로 기술된 바와 같이, 및 본원에 참고로 포함되는 US2012/0282263에서 추가로 기술된 바와 같이, MASP-2-의존적 보체 활성화를 차단하는 완전한 인간 MASP-2 scFv 항체가 확인되었고, 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 레이져-유도된 CNV의 마우스 모델에서 렉틴 경로의 기능을 차단하는 대표적인 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)는 항-혈관 형성 활성을 갖는다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 MASP-2 억제제는, 예를 들어, OMS646과 같은 인간 항체를 포함한다. 따라서, 한 구체예에서, 청구된 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 MASP-2 억제제는 인간 MASP-2 (서열 번호:6)로 구성된 폴리펩타이드에 결합하는 인간 항체를 포함하며, 항체는

I) a) i) 서열 번호: 67 또는 서열 번호:68의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 및 ii) 서열 번호: 67 또는 서열 번호:68의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 iii) 서열 번호:67 또는 서열 번호:68의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

b) i) 서열 번호:69 또는 서열 번호:71의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 및 ii) 서열 번호:69 또는 서열 번호:71의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 iii) 서열 번호:69 또는 서열 번호:71의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 II) 상기 중쇄 가변 영역의 상기 CDR 영역 내에서 최대 총 6개의 조합된 아미노산 치환 및 상기 경쇄 가변 영역의 상기 CDR 영역 내에서 최대 총 6개의 조합된 아미노산 치환을 제외하면, 상기 가변 도메인과 동일한 이것들의 변이체를 포함하며, 항체 또는 이것의 변이체는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제한다. 한 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 MASP-2 억제제는 인간 항체 OMS646을 포함한다.

예시의 MASP-2 특이적 항체

항원	항체 유형	참고문헌
재조합 MASP-2	래트 다클론성	Peterson, S.V., et al., Mol. Immunol. 37:803-811, 2000
재조합 인간 CCP1/2-SP 단편 (MoAb 8B5)	래트 MoAb (하위 분류 IgG1)	Moller-Kristensen, M., et al., J. of Immunol. Methods 282:159-167, 2003
재조합 인간 MAp19 (MoAb 6G12) (MASP-2와 교차 반응함)	래트 MoAb (하위 분류 IgG1)	Moller-Kristensen, M., et al., J. of Immunol. Methods 282:159-167, 2003
hMASP-2	마우스 MoAb (S/P) 마우스 MoAb (N-말단)	Peterson, S.V., et al., Mol. Immunol. 35:409, April 1998
hMASP-2 (CCP1-CCP2-SP 도메인	래트 MoAb: Nimoab101, 하이브리도마 세포주 03050904 (ECACC)에 의해 생산됨	WO 2004/106384
hMASP-2 (전장-his 태그됨)	쥐 MoAb: NimoAb104, 하이브리도마 세포주 M0545YM035 (DSMZ)에 의해 생산됨 NimoAb108, 하이브리도마 세포주 M0545YM029 (DSMZ)에 의해 생산됨 하이브리도마 세포주 M0545YM046 (DSMZ)에 의해 생산된 NimoAb109 하이브리도마 세포주 M0545YM048 (DSMZ)에 의해 생산된 NimoAb110	WO 2004/106384
래트 MASP-2 (전장)	MASP-2 Fab2 항체 단편	실시예 10
hMASP-2 (전장)	완전한 인간 scFv 클론	실시예 15 및 US2012/0282263

효과기 기능이 감소된 항-MASP-2 항체

본 발명의 이 양태의 일부 구체예에서, 항-MASP-2 항체는 고전적 보체 경로의 활성화를 발생시킬 수도 있는 염증을 감소시키기 위해 감소된 효과기 기능을 갖는다. IgG 분자가 고전적 보체 경로를 촉발시킬 수 있는 능력은 분자의 Fc 부분 내에 존재하는 것으로 나타탔다 (Duncan, A.R., et al., Nature 332:738-740 1988). 분자의 Fc 부분이 효소 분열에 의해 제거된 IgG 분자는 이 효과기 기능이 전혀 없다 (Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988 참조). 따라서, 효과기 기능이 감소된 항체는 효과기 기능을 최소화시키는 유전적으로 조작된 Fc 서열을 갖거나, 또는 인간 IgG₂ 또는 IgG₄ 아이소타입 중 하나인 것으로 인해 분자의 Fc 부분이 결핍된 결과로서 생성될 수 있다.

효과기 기능이 감소된 항체는 본원에서 실시예 9에서 기술되고 또한 Jolliffe et al., Int'l Rev. Immunol. 10:241-250, 1993, 및 Rodrigues et al., J. Immunol. 151:6954-6961, 1998에서 기술된 바와 같이 IgG 중쇄의 Fc 부분의 표준 분자 생물학적 조작에 의해 생산될 수 있다. 효과기 기능이 감소된 항체는 또한 보체를 활성화시키고 및/또는 Fc 수용체와 상호작용하는 능력이 감소된 인간 IgG2 및 IgG4 아이소타입을 포함한다 (Ravetch, J.V., et al., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991; Isaacs, J.D., et al., J. Immunol. 148:3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G., et al., Immunol. Today 14:215-221, 1993). IgG2 또는 IgG4 아이소타입으로 구성된 인간 MASP-2에 특이적인 인간화 또는 완전한 인간 항체는 당업자에게 공지된 여러 방법 중 하나에 의해 생산될 수 있으며, Vaughan, T.J., et al., Nature Biotechnical 16:535-539, 1998에서 기술된 바와 같다.

항-MASP-2 항체의 생산

항-MASP-2 항체는 MASP-2 폴리펩타이드 (예를 들어, 전장 MASP-2)를 사용하여 또는 항원성 MASP-2 에피토프-함유 펩타이드 (예를 들어, MASP-2 폴리펩타이드의 일부)를 사용하여 생산될 수 있다. 면역원성 펩타이드는 다섯 개의 아미노산 잔기만큼 작을 수도 있다. 예를 들어, 서열 번호:6의 전체 아미노산 서열을 포함하는 MASP-2 폴리펩타이드는 본 발명의 방법에서 유용한 항-MASP-2 항체를 유도하는데 사용될 수 있다. 단백질-단백질 상호작용에 수반된 것으로 알려져 있는 특정 MASP-2 도메인, 예컨대 CUBI, 및 CUBIEGF 도메인, 뿐만 아니라 세린-프로테아제 활성 부위를 포함하는 영역은 실시예 3에서 기술된 바와 같이 재조합 폴리펩타이드로서 발현되고 항원으로 사용될 수도 있다. 이에 더하여, MASP-2 폴리펩타이드 (서열 번호:6)의 적어도 6개의 아미노산의 일부를 포함하는 펩타이드는 또한 MASP-2 항체를 유도하는데 유용하다. MASP-2 항체를 유도하는데 유용한 MASP-2 유래된 항원의 추가적인 예는 하기 표 2에서 제공된다. 항체를 발생시키는데 사용되는 MASP-2 펩타이드 및 폴리펩타이드는, 실시예 5-7에서 추가로 기술된 바와 같이, 천연 폴리펩타이드, 또는 재조합 또는 합성 펩타이드 및 촉매 반응에 의한 비활성 재조합 폴리펩타이드, 예컨대 MASP-2A로서 단리될 수도 있다. 본 발명의 이 양태의 일부 구체예에서, 항-MASP-2 항체는 실시예 8 및 9에서 기술되고 하기 추가로 기술된 바와 같이 트랜스제닉 마우스 계통을 사용하여 얻어진다.

항-MASP-2 항체를 생산하는데 유용한 항원은 또한 융합 폴리펩타이드, 예컨대 면역글로불린 폴리펩타이드 또는 말토스-결합 단백질과의 MASP-2 또는 그 일부의 융합체를 포함한다. 폴리펩타이드 면역원은 전장 분자 또는 그 일부일 수도 있다. 폴리펩타이드 일부가 합텐-유사인 경우, 이러한 부분은 유리하게는 면역화를 위해 거대분자 담체 (예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin; KLH), 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 파상풍 변독소)와 결합되거나 또는 이것에 연결될 수도 있다.

MASP-2 유래된 항원

서열 번호:	아미노산 서열
서열 번호:6	인간 MASP-2 단백질
서열 번호:51	쥐 MASP-2 단백질
서열 번호:8	인간 MASP-2의 CUBI 도메인 (서열 번호:6의 aa 1-121)
서열 번호:9	인간 MASP-2의 CUBIEGF 도메인 (서열 번호:6의 aa 1-166)
서열 번호:10	인간 MASP-2의 CUBIEGFCUBII 도메인 (서열 번호:6의 aa 1-293)
서열 번호:11	인간 MASP-2의 EGF 도메인 (서열 번호:6의 aa 122-166)
서열 번호:12	인간 MASP-2의 세린-프로테아제 도메인 (서열 번호:6의 aa 429-671)
서열 번호:13 GKDSCRGDAGGALVFL	세린-프로테아제 비활성화된 돌연변이 형태 (돌연변이된 Ser 618을 가지고 있는 서열 번호:6의 aa 610-625)
서열 번호:14 TPLGPKWPEPVFGRL	인간 CUBI 펩타이드
서열 번호:15: TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ	인간 CUBI 펩타이드
서열 번호:16: TFRSDYSN	인간 CUBI 도메인의 MBL 결합 영역
서열 번호:17: FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF	인간 CUBI 도메인의 MBL 결합 영역
서열 번호:18 IDECQVAPG	EGF 펩타이드
서열 번호:19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV	세린-프로테아제 활성 부위의 펩타이드

다클론성 항체

MASP-2에 대한 다클론성 항체는 당업자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 MASP-2 폴리펩타이드 또는 이것의 면역원성 부분으로 동물을 면역화시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera," in Immunochemical Protocols (Manson, ed.), page 105를 참고하면 된다. MASP-2 폴리펩타이드의 면역원성은 미네랄 겔, 예컨대 수산화 알루미늄 또는 프로인트 보조제(Freund's adjuvant) (완전 또는 불완전), 표면 활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다음이온, 유성 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 다이나이트로페놀을 포함하는 보조제의 사용을 통해 증가될 수 있다. 다클론성 항체는 전형적으로는 말, 소, 개, 닭, 래트, 마우스, 토끼, 기니피그, 염소, 또는 양과 같은 동물에서 발생된다. 대안으로, 본 발명에서 유용한 항-MASP-2 항체는 또한 인간 이하의 영장류로부터 유래될 수도 있다. 개코 원숭이에서 진단적으로 및 치료적으로 유용한 항체를 발생시키기 위한 일반적인 기술은, 예를 들어, Goldenberg et al., 국제 특허 공개 번호 WO 91/11465, 및 Losman, M.J., et al., Int. J. Cancer 46:310, 1990에서 찾을 수 있다. 면역학적으로 활성인 항체를 함유하는 혈청은 업계에 널리 공지된 표준 절차를 사용하여 이러한 면역화된 동물의 혈액으로부터 생산된다.

단클론성 항체

일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 단클론성 항체이다. 항-MASP-2 단클론성 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 MASP-2 에피토프로 향하게 된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 수식어 "단클론성"은 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 얻어지는 것으로서 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 단클론성 항체는 Kohler, G., et al., Nature 256:495, 1975에 의해 기술된 하이브리도마 방법과 같이, 배양 중인 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 기술을 사용하여 얻어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 만들어질 수도 있다 (예를 들어, Cabilly의 미국 특허 번호 4,816,567 참조). 단클론성 항체는 또한 Clackson, T., et al., Nature 352:624-628, 1991, 및 Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991에서 기술된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD를 포함하는 임의의 면역글로불린 분류 및 이것의 임의의 하위 분류의 것일 수도 있다.

예를 들어, 단클론성 항체는 MASP-2 폴리펩타이드 또는 그 일부를 포함하는 조성물을 적합한 포유동물 (예를 들어, BALB/c 마우스)에 주사함으로써 얻어질 수 있다. 사전 결정된 기간 이후, 비장 세포는 마우스로부터 제거되고 세포 배양 배지에 현탁된다. 그 다음에 비장 세포는 불멸 세포주와 융합되어 하이브리도마를 형성한다. 형성된 하이브리도마는 세포 배양액에서 키워지고 MASP-2에 대한 단클론성 항체를 생산하는 능력에 대하여 스크리닝된다. 항-MASP-2 단클론성 항체의 생산을 추가로 기술하는 예들이 본원에서 제공된다 (예를 들어, 실시예 10 및 13). (또한 Current Protocols in Immunology, Vol. 1., John Wiley & Sons, pages 2.5.1-2.6.7, 1991. 참고).

인간 단클론성 항체는 항원 시도에 대한 반응으로 특이적 인간 항체를 생산하도록 조작된 트랜스제닉 마우스의 사용을 통해 얻어질 수도 있다. 이 기술에서, 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소가 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 붕괴를 함유하는 배아 줄기 세포주로부터 유래된 마우스의 계통으로 도입된다. 트랜스제닉 마우스는 인간 항원, 예컨대 본원에서 기술된 MASP-2 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 마우스는 실시예 7에서 추가로 기술된 바와 같이 통상적인 쾰러-밀스타인 기술(Kohler-Milstein technology)을 사용하여 이러한 동물의 B-세포를 적합한 골수종(myeloma) 세포주에 융합시켜 인간 MASP-2 항체-분비 하이브리도마를 생산하는데 사용될 수 있다. 인간 면역글로불린 게놈을 가진 트랜스제닉 마우스는 상업적으로 이용 가능하다 (예를 들어, Abgenix, Inc., Fremont, CA, 및 Medarex, Inc., Annandale, N.J.). 트랜스제닉 마우스로부터 인간 항체를 얻기 위한 방법은, 예를 들어, Green, L.L., et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg, N., et al., Nature 368:856, 1994; 및 Taylor, L.D., et al., Int. Immun. 6 :579, 1994에 의해 기술되어 있다.

단클론성 항체는 잘 확립된 다양한 기술에 의해 하이브리도마 배양물로부터 단리되고 정제될 수 있다. 이러한 단리 기술은 단백질-A 세파로스를 이용한 친화도 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다 (예를 들어, Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 및 pages 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", in Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol. 10, pages 79-104, 1992 참고).

생산되면, 다클론성, 단클론성 또는 파지-유래된 항체가 먼저 특이적 MASP-2 결합에 대하여 테스트된다. 당업자에게 알려져 있는 다양한 검정이 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하는데 이용될 수도 있다. 예시의 검정은 웨스턴 블롯(Western blot) 또는 표준 방법에 의한 면역침강 분석 (예를 들어, Ausubel et al.에서 기술된 바와 같다), 면역전기영동, 효소-결합 면역-흡착 검정, 도트 블롯(dot blot), 억제 또는 경쟁 검정 및 샌드위치 검정(sandwich assay) (Harlow and Land, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988에서 기술된 바와 같다)을 포함한다. MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체가 확인되면, 항-MASP-2 항체는, 예를 들어, 렉틴-특이적 C4 분열 검정 (실시예 2에서 기술됨), C3b 침착 검정 (실시예 2에서 기술됨) 또는 C4b 침착 검정 (실시예 2에서 기술됨)과 같은 여러 검정 중 하나에서 MASP-2 억제제로서 기능하는 능력에 대하여 테스트된다.

항-MASP-2 단클론성 항체의 친화도는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다 (예를 들어, Scatchard, A., NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949 참고). 한 구체예에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-MASP-2 단클론성 항체는 <100 nM, 바람직하게는 <10 nM 및 가장 바람직하게는 <2 nM의 결합 친화도로 MASP-2에 결합한다.

키메라/인간화 항체

본 발명의 방법에 유용한 단클론성 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 분류 또는 하위 분류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 사슬(들)의 나머지가 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 분류 또는 하위 분류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 키메라 항체, 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편을 포함한다 (Cabilly의 미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison, S.L., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984).

본 발명에서 유용한 키메라 항체의 한 형태는 인간화 단클론성 항-MASP-2 항체이다. 비-인간 (예를 들어, 쥐) 항체의 인간화 형태는 키메라 항체이며, 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소한의 서열을 함유한다. 인간화 단클론성 항체는 비-인간 (예를 들어, 마우스) 상보성 결정 영역 (CDR)을 마우스 면역글로불린의 가변 중쇄 및 경쇄에서 인간 가변 도메인으로 전송함으로써 생산된다. 전형적으로, 인간 항체의 잔류물은 비-인간 대응물의 프레임워크 영역에서 치환된다. 게다가, 인간화 항체는 수령체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔류물을 포함할 수도 있다. 항체 성능을 더 개량하기 위해 이러한 변형들이 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나의, 및 전형적으로는 두 개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 초가변 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 Fv 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 Fv 프레임워크 영역이다. 인간화 항체는 또한 선택적으로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 더 상세한 설명을 위해서는, Jones, P.T., et al., Nature 321:522-525, 1986; Reichmann, L., et al., Nature 332:323-329, 1988; 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992를 참고하면 된다.

본 발명에 유용한 인간화 항체는 적어도 MASP-2 결합 CDR3 영역을 포함하는 인간 단클론성 항체를 포함한다. 이에 더하여, Fc 부분은 IgA 또는 IgM 뿐만 아니라 인간 IgG 항체를 생산하기 위해 대체될 수도 있다. 이러한 인간화 항체는 인간 MASP-2를 특이적으로 인식하지만 인간에서 항체 자체에 대한 면역 반응을 일으키지 않기 때문에 특별한 임상적 유용성을 가질 것이다. 결론적으로, 그것들은 인간에서, 특히 반복되거나 장기간 투여가 필요할 때 생체 내 투여에 더 적합하다.

쥐 항-MASP-2 단클론성 항체로부터의 인간화 항-MASP-2 항체의 생성의 예는 본원에서 실시예 6에서 제공된다. 인간화 단클론성 항체를 생산하기 위한 기술은, 예를 들어, Jones, P.T., et al., Nature 321:522, 1986; Carter, P., et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992; Singer, I.I., et al., J. Immun. 150:2844, 1993; Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., 1995; Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies," in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., pages 399-434, 1996; 및 Queen, 1997의 미국 특허 번호 5,693,762에 의해서도 기술되어 있다. 이에 더하여, 특이적 쥐 항체 영역으로부터 인간화 항체를 합성하는 상업적 실체, 예컨대 Protein Design Labs (Mountain View, CA)가 존재한다.

재조합 항체

항-MASP-2 항체는 또한 재조합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 인간 항체는 인간 항체의 단편 (V_H, V_L, Fv, Fd, Fab 또는 F(ab')₂)을 생산하기 위해 인간 면역글로불린 발현 라이브러리 (예를 들어, Stratagene, Corp., La Jolla, CA로부터 이용 가능함)를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 단편들은 키메라 항체를 생산하기 위한 것과 유사한 기술을 사용하여 전체 인간 항체를 구성하는데 사용된다.

항-이디오타입 항체

항-MASP-2 항체가 원하는 억제 활성을 가진 것으로 확인되면, 이러한 항체들은 업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 MASP-2의 일부와 유사한 항-이디오타입 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Greenspan, N.S., et al., FASEB J. 7:437, 1993을 참고하면 된다. 예를 들어, MASP-2에 결합하여 보체 활성화에 필요한 MASP-2 단백질 상호작용을 완전히 억제하는 항체는 MASP-2 단백질 상의 MBL 결합 부위와 유사하며, 그러므로, 예를 들어, MBL과 같은 MASP-2의 결합 리간드에 결합하여 이것을 중화시키는 항-이디오타입을 생성하는데 사용될 수 있다.

면역글로불린 단편

본 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제제는 온전한 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라 Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂ 및 Fv 단편, scFv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하는 널리 공지된 단편을 포함한다.

항체 분자의 작은 부분인 파라토프만이 에피토프로의 항체의 결합에 수반된다는 것은 널리 공지되어 있다 (예를 들어, Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986 참고). 항체의 pFc' 및 Fc 영역은 고전적 보체 경로의 효과기이지만, 항원 결합에 수반되지 않는다. pFc' 영역이 효소에 의해 분열되거나, 또는 pFc' 영역 없이 생산된 항체는 F(ab')₂ 단편으로 지정되고 온전한 항체의 항원 결합 부위 둘 다를 보유한다. 단리된 F(ab')₂ 단편은 그것의 두 개의 항원 결합 부위 때문에 2가 단클론성 단편이라고 불린다. 유사하게, Fc 영역이 효소에 의해 분열되거나, 또는 Fc 영역 없이 생산된 항체는 Fab 단편으로 지정되고, 온전한 항체 분자의 항원 결합 부위 중 하나를 보유한다.

항체 단편은 단백질 가수분해에 의해, 예컨대 통상적인 방법에 의한 전체 항체의 펩신 또는 파파인 분해에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 F(ab')₂로 표시되는 5S 단편을 제공하기 위해 펩신으로의 항체의 효소적 분열에 의해 생산될 수 있다. 이 단편은 티올 환원제를 사용하여 추가로 분열되어 3.5S Fab' 1가 단편을 생산할 수 있다. 선택적으로, 분열 반응은 이황화 결합의 분열로부터 발생한 설피드릴 기에 대한 차단 기를 사용하여 수행될 수 있다. 대안으로, 펩신을 사용하는 효소적 분열은 두 개의 1가 Fab 단편 및 Fc 단편을 직접 생산할 수 있다. 이러한 방법들은, 예를 들어, Goldenberg의 미국 특허 번호 4,331,647; Nisonoff, A., et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, R.R., Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman, et al., in Methods in Enzymology 1:422, Academic Press, 1967; 및 Coligan at pages 2.8.1-2.8.10 및 2.10.-2.10.4에서 기술된다.

일부 구체예에서, Fc 영역이 없는 항체 단편의 사용은 Fc를 Fcγ 수용체에 결합시킬 때 시작되는 고전적 보체 경로의 활성화를 방지하는데 바람직하다. Fcγ 수용체 상호작용을 방지하는 MoAb를 생산할 수 있는 여러 방법이 존재한다. 예를 들어, 단클론성 항체의 Fc 영역은 단백질 가수분해 효소에 의한 부분적 분해 (예컨대 피신 분해)를 사용하여 화학적으로 제거될 수 있으며, 이로 인해, 예를 들어, 항원-결합 항체 단편, 예컨대 Fab 또는 F(ab)₂ 단편을 생성한다 (Mariani, M., et al., Mol. Immunol. 28:69-71, 1991). 대안으로, Fcγ 수용체에 결합하지 않는 인간 γ4 IgG 아이소타입은 본원에서 기술된 바와 같이 인간화 항체의 구성 중에 사용될 수 있다. 항체, Fc 도메인이 없는 단일 사슬 항체 및 항원-결합 도메인은 또한 본원에서 기술된 재조합 기술을 사용하여 조작될 수 있다.

단일 사슬 항체 단편

대안으로, 중쇄 및 경쇄 Fv 영역이 연결된 MASP-2에 특이적인 단일 펩타이드 사슬 결합 분자를 생성할 수 있다. Fv 단편은 펩타이드 링커에 의해 연결되어 단일 사슬 항원 결합 단백질 (scFv)을 형성할 수 있다. 이러한 단일 사슬 항원 결합 단백질들은 올리고뉴클레오타이드에 의해 연결된 V_H 및 V_L 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 구조 유전자를 구성함으로써 제조된다. 구조 유전자는 발현 벡터로 삽입되며, 그 이후 숙주 세포, 예컨대 대장균(E. coli)으로 도입된다. 재조합 숙주 세포는 두 개의 V 도메인을 연결하는 링커 펩타이드를 가진 단일 폴리펩타이드 사슬을 합성한다. scFv를 생산하는 방법은, 예를 들어, Whitlow, et al., "Methods: A Companion to Methods in Enzymology" 2:97, 1991; Bird, et al., Science 242:423, 1988; Ladner의 미국 특허 번호 4,946,778; Pack, P., et al., Bio/Technology 11:1271, 1993에 의해 기술되어 있다.

예시적인 예로서, MASP-2 특이적 scFv는 시험관 내에서 림프구를 MASP-2 폴리펩타이드에 노출시키고 파지 또는 유사한 벡터의 항체 디스플레이 라이브러리를 선택함으로써 (예를 들어, 고정화된 또는 라벨링된 MASP-2 단백질 또는 펩타이드의 사용을 통해) 얻어질 수 있다. 잠재적 MASP-2 폴리펩타이드 결합 도메인을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 파지 또는 박테리아, 예컨대 대장균에 디스플레이된 무작위 펩타이드 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 이러한 무작위 펩타이드 디스플레이 라이브러리는 MASP-2와 상호작용하는 펩타이드에 대하여 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이러한 무작위 펩타이드 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 기술은 업계에 널리 공지되어 있고 (Lardner의 미국 특허 번호 5,223,409; Ladner의 미국 특허 번호 4,946,778; Lardner의 미국 특허 번호 5,403,484; Lardner의 미국 특허 번호 5,571,698; 및 Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996) 무작위 펩타이드 디스플레이 라이브러리 및 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 키트는, 예를 들어, CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.), New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.), 및 Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, N.J.)에서 상업적으로 이용 가능하다.

본 발명의 이 양태에서 유용한 항-MASP-2 항체 단편의 또 다른 형태는 MASP-2 항원 상의 에피토프에 결합하고 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 단일 상보성 결정 영역 (CDR)을 암호화하는 펩타이드이다. CDR 펩타이드 ("최소 인식 단위")는 관심있는 항체의 CDR을 암호화하는 유전자를 구성함으로써 얻어질 수 있다. 이러한 유전자는, 예를 들어, 항체-생산 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성하기 위한 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 제조된다 (예를 들어, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166, Cambridge University Press, 1995; 및 Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), page 137, Wiley-Liss, Inc., 1995 참고).

본원에서 기술된 MASP-2 항체는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기 위해 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 효과기 기능이 감소된 고-친화도 인간 또는 인간화 단클론성 항-MASP-2 항체이다.

펩타이드 억제자

본 발명의 이 양태의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 단리된 MASP-2 펩타이드 억제자를 포함하며, MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템을 억제하는 단리된 천연 펩타이드 억제자 및 합성 펩타이드 억제자를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 MASP-2 펩타이드 억제자"는 MASP-2에 결합하고, 렉틴 경로에서 또 다른 인식 분자 (예를 들어, MBL, H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)로의 결합에 대하여 MASP-2와 경쟁하고, 및/또는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기 위해 MASP-2와 직접적으로 상호작용함으로써 MASP-2 의존적 보체 활성화를 억제하는 펩타이드를 지칭하며, 이것들은 실질적으로 순수하고 의도된 용도에 실용적이고 적절한 정도로 자연에서 발견될 수도 있는 다른 물질이 본질적으로 없다.

펩타이드 억제자는 생체 내에서 단백질-단백질 상호작용 및 촉매 부위를 성공적으로 방해하는데 사용되었다. 예를 들어, LFA-1와 구조적으로 관련이 있는 부착 분자에 대한 펩타이드 억제자는 최근 응고 장애시 임상적 사용에 대하여 승인되었다 (Ohman, E.M., et al., European Heart J. 16:50-55, 1995). 인테그린-의존적 부착을 방지하거나 방해하는 짧은 선형 펩타이드 (<30개 아미노산)가 기술되었다 (Murayama, O., et al., J. Biochem. 120:445-51, 1996). 길이가 25 내지 200개의 아미노산 잔기의 범위에 있는 더 긴 펩타이드는 또한 인테그린-의존적 부착을 성공적으로 차단하는데 사용되었다 (Zhang, L., et al., J. Biol. Chem. 271(47):29953-57, 1996). 일반적으로, 더 긴 펩타이드 억제자는 짧은 펩타이드보다 더 높은 친화도 및/또는 더 느린 유출 속도(off-rate)를 가지며 그러므로 더 강력한 억제자일 수 있다. 환형 펩타이드 억제자는 또한 생체 내에서 인간 염증 질환의 치료를 위한 인테그린의 효과적인 억제자인 것으로 나타났다 (Jackson, D.Y., et al., J. Med. Chem. 40:3359-68, 1997). 환형 펩타이드를 생산하는 한 가지 방법은 펩타이드의 말단 아미노산이 시스테인이며, 이로 인해 펩타이드가 말단 아미노산 사이의 이황화 결합에 의해 환형 형태로 존재하게 하는 펩타이드의 합성을 수반하는데, 이것은 생체 내에서 조혈성 신생물의 치료를 위해 친화도 및 반감기를 개선하는 것으로 나타났다 (예를 들어, Larson의 미국 특허 번호 6,649,592).

합성 MASP-2 펩타이드 억제자

본 발명의 이 양태의 방법에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 MASP-2 기능에 중요한 표적 영역을 모방하는 아미노산 서열에 의해 예시된다. 본 발명의 방법의 실시에 유용한 억제 펩타이드는 크기가 약 5개의 아미노산 내지 약 300개의 아미노산의 범위에 있다. 표 4는 본 발명의 이 양태의 실시에 유용할 수도 있는 예시의 억제 펩타이드의 목록을 제공한다. 후보 MASP-2 억제 펩타이드는, 예를 들어, 렉틴 특이적 C4 분열 검정 (실시예 2에서 기술됨), 및 C3b 침착 검정 (실시예 2에서 기술됨)을 포함한 여러 검정 중 하나에서 MASP-2 억제제로서 기능하는 능력에 대하여 테스트될 수도 있다.

일부 구체예에서, MASP-2 억제 펩타이드는 MASP-2 폴리펩타이드로부터 유래되고 전장 성숙한 MASP-2 단백질 (서열 번호:6), 또는, 예를 들어, CUBI 도메인 (서열 번호:8), CUBIEGF 도메인 (서열 번호:9), EGF 도메인 (서열 번호:11), 및 세린 프로테아제 도메인 (서열 번호:12)과 같은 MASP-2 단백질의 특정 도메인으로부터 선택된다. 이전에 기술된 바와 같이, CUBEGFCUBII 영역은 MBL과의 다이머화 및 결합에 필요한 것으로 나타났다 (Thielens et al., supra). 특히, MASP-2의 CUBI 도메인에서 펩타이드 서열 TFRSDYN (서열 번호:16)은 Asp105에서 Gly105로의 동형 접합성 돌연변이를 가지고 있는 인간을 확인한 연구에서 MBL에 대한 결합에 수반되며, MBL 복합체로부터 MASP-2의 손실을 초래하는 것으로 나타났다 (Stengaard-Pedersen, K., et al., New England J. Med. 349:554-560, 2003).

일부 구체예에서, MASP-2 억제 펩타이드는 MASP-2에 결합하는 렉틴 단백질로부터 유래되고 렉틴 보체 경로에 수반된다. 이 경로에 수반된 여러 상이한 렉틴이 확인되었으며, 만난-결합 렉틴 (MBL), L-피콜린, M-피콜린 및 H-피콜린을 포함한다 (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., et al., J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). 이러한 렉틴들은 호모트라이머 서브유닛의 올리고머로서 혈청 내에 존재하며, 각각은 탄수화물 인식 도메인을 가진 N-말단 콜라겐-유사 섬유를 갖는다. 이러한 상이한 렉틴들은 MASP-2에 결합하는 것으로 나타났고, 렉틴/MASP-2 복합체는 단백질 C4 및 C2의 분열을 통해 보체를 활성화시킨다. H-피콜린은 24개의 아미노산의 아미노-말단 영역, 11개의 Gly-Xaa-Yaa 반복 부위를 가진 콜라겐-유사 도메인, 12개의 아미노산의 넥(neck) 도메인, 및 207개의 아미노산의 피브리노겐-유사 도메인을 갖는다 (Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). H-피콜린은 GlcNAc에 결합하고 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium), 살모넬라 미네소타(S. minnesota) 및 대장균으로부터 유래된 LPS로 코팅된 인간 적혈구를 응집시킨다. H-피콜린은 MASP-2 및 MAp19와 회합되고 렉틴 경로를 활성화시키는 것으로 나타났다. Id. L-피콜린/P35는 또한 GlcNAc에 결합하고 인간 혈청에서 MASP-2 및 MAp19와 회합되는 것으로 나타났으며 이 복합체는 렉틴 경로를 활성화시키는 것으로 나타났다 (Matsushita, M., et al., J. Immunol. 164:2281, 2000). 따라서, 본 발명에서 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 MBL 단백질 (서열 번호:21), H-피콜린 단백질 (Genbank 수납 번호 NM_173452), M-피콜린 단백질 (Genbank 수납 번호 O00602) 및 L-피콜린 단백질 (Genbank 수납 번호 NM_015838)로부터 선택된 적어도 5개의 아미노산의 영역을 포함한다.

더 구체적으로는, 과학자들은 MBL 상에서 MASP-2 결합 부위가 MBP의 콜라겐-유사 도메인의 C-말단 부분에서 힌지(hinge) 및 넥 사이에 있는 12개의 Gly-X-Y 삼자 복합물 "GKD GRD GTK GEK GEP GQG LRG LQG POG KLG POG NOG PSG SOG PKG QKG DOG KS" (서열 번호:26) 내에 있는 것을 확인하였다 (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 279:14065, 2004). 이 MASP-2 결합 부위 영역은 또한 인간 H-피콜린 및 인간 L-피콜린에서 고도로 보존된다. 아미노산 서열 "OGK-X-GP" (서열 번호:22)를 포함하는 세 개의 렉틴 단백질 모두에 존재하는 공통 결합 부위가 기술되었으며 여기서 문자 "O"는 하이드록시프롤린을 나타내고 문자 "X"는 소수성 잔기이다 (Wallis et al., 2004, supra). 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 이 양태에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 길이가 적어도 6개의 아미노산이고 서열 번호:22를 포함한다. 아미노산 서열 "GLR GLQ GPO GKL GPO G" (서열 번호:24)를 포함하는 MBL로부터 유래된 펩타이드는 시험관 내에서 MASP-2에 결합하는 것으로 나타났다 (Wallis, et al., 2004, supra). MASP-2로의 결합을 향상시키기 위해서, 고유한 MBL 단백질에서 발견되는 삼중 나선의 형성을 향상시키도록 고유한 MBL 단백질에서 발견된 바와 같이 각 단부에서 두 개의 GPO 삼자 복합물 ("GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GGP OGP O" 서열 번호:25)에 의해 플랭킹된 (flanked) 펩타이드가 합성될 수 있다 (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 279:14065, 2004에서 추가로 기술된 바와 같음).

MASP-2 억제 펩타이드는 또한 H-피콜린의 공통 MASP-2 결합 영역의 서열 "GAO GSO GEK GAO GPQ GPO GPO GKM GPK GEO GDO" (서열 번호:27)를 포함하는 인간 H-피콜린으로부터 유래될 수도 있다. 또한 L-피콜린의 공통 MASP-2 결합 영역의 서열 "GCO GLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPN GAO GEO" (서열 번호:28)을 포함하는 인간 L-피콜린으로부터 유래된 펩타이드가 포함된다.

MASP-2 억제 펩타이드는 또한 항트롬빈 III의 C-말단 부분에 연결된 C4 분열 부위인 "LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI" (서열 번호:29)와 같은 C4 분열 부위로부터 유래될 수도 있다 (Glover, G.I., et al., Mol. Immunol. 25:1261 (1988)).

예시의 MASP-2 억제 펩타이드

서열 번호	공급원
서열 번호:6	인간 MASP-2 단백질
서열 번호:8	MASP-2의 CUBI 도메인 (서열 번호:6의 aa 1-121)
서열 번호:9	MASP-2의 CUBIEGF 도메인 (서열 번호:6의 aa 1-166)
서열 번호:10	MASP-2의 CUBIEGFCUBII 도메인 (서열 번호:6의 aa 1-293)
서열 번호:11	MASP-2의 EGF 도메인 (aa 122-166)
서열 번호:12	MASP-2의 세린-프로테아제 도메인 (aa 429-671)
서열 번호:16	MASP-2의 MBL 결합 영역
서열 번호:3	인간 MAp19
서열 번호:21	인간 MBL 단백질
서열 번호:22 OGK-X-GP, 여기서 "O" = 하이드록시프롤린이고 "X"는 소수성 아미노산 잔기이다.	인간 MBL 및 인간 피콜린의 합성 펩타이드 공통 결합 부위
서열 번호:23 OGKLG	인간 MBL 코어 결합 부위
서열 번호:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G	인간 MBP 삼자 복합물 6-10-은 MASP-2로의 결합을 입증하였다
서열 번호:25 GPOGPOGLRGLQGPOGKLGPOGGPOGPO	삼중 나선의 형성을 향상시키기 위해 추가된 GPO를 가진 인간 MBP 삼자 복합물
서열 번호:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOGNOGPSGSOGPKGQKGDOGKS	인간 MBP 삼자 복합물 1-17
서열 번호:27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO	인간 H-피콜린 (Hataka)
서열 번호:28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGAOGEO	인간 L-피콜린 P35
서열 번호:29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI	인간 C4 분열 부위

주: 문자 "O"는 하이드록시프롤린을 나타낸다. "X"는 소수성 잔기이다.

C4 분열 부위로부터 유래된 펩타이드 뿐만 아니라 MASP-2 세린 프로테아제 부위를 억제하는 다른 펩타이드는 비가역적 프로테아제 억제자가 되도록 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 적절한 변형은 C-말단, Asp 또는 Glu에서, 또는 기능적 측쇄에 부가된 할로메틸 케톤 (Br, Cl, I, F); 아미노 기 또는 다른 기능적 측쇄 상의 할로아세틸 (또는 그 밖의 α-할로아세틸) 기; 아미노 또는 카르복시 말단 또는 기능적 측쇄 상의 에폭시드 또는 이민-함유 기; 또는 아미노 또는 카르복시 말단 또는 기능적 측쇄 상의 이미데이트 에스터를 포함할 수도 있지만, 반드시 이것들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 변형은 펩타이드의 공유 부착에 의해 효소를 영구적으로 억제하는 이점을 제공할 것이다. 그 결과 이것은 펩타이드 억제자의 더 낮은 용량 및/또는 덜 빈번한 투여의 필요성을 유발할 수 있다.

상기 기술된 억제 펩타이드에 더하여, 본 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 본원에서 기술된 바와 같이 얻어진 항-MASP-2 MoAb의 MASP-2-결합 CDR3 영역을 함유하는 펩타이드를 포함한다. 펩타이드를 합성하는데 사용하기 위한 CDR 영역의 서열은 업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 중쇄 가변 영역은 일반적으로 길이가 100 내지 150개의 아미노산의 범위에 있는 펩타이드이다. 경쇄 가변 영역은 일반적으로 길이가 80 내지 130개의 아미노산의 범위에 있는 펩타이드이다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내 CDR 서열은 당업자에 의해 쉽게 시퀀싱될 수 있는 대략 3-25개의 아미노산 서열만을 포함한다.

당업자는 상기 기술된 MASP-2 억제 펩타이드의 실질적으로 상동성인 변화가 또한 MASP-2 억제 활성을 나타낸다는 것을 인식할 것이다. 예시의 변화는 대상 펩타이드의 카르복시-말단 또는 아미노-말단 부분에서 삽입, 결실, 대체, 및/또는 추가적인 아미노산 및 이것의 혼합을 가진 펩타이드를 포함하지만, 반드시 이것으로 제한되는 것은 아니다. 따라서, MASP-2 억제 활성을 가진 상기 상동성 펩타이드는 본 발명의 방법에 유용한 것으로 간주된다. 기술된 펩타이드는 또한 복제 모티프 및 보존적 치환을 가진 다른 변형을 포함할 수도 있다. 보존적 변이체는 본원의 다른 곳에서도 기술되어 있으며, 아미노산을 유사한 전하, 크기 또는 소수성 등의 또 다른 아미노산과 교환하는 것을 포함한다.

MASP-2 억제 펩타이드는 온전한 단백질의 세그먼트와 더 유사해지기 위해서 가용성을 증가시키고 및/또는 양전하 또는 음전하를 극대화하도록 변형될 수도 있다. 유도체가 기능적으로 MASP-2 억제의 원하는 성질을 보유하는 한 유도체는 본원에서 개시된 펩타이드의 정확한 1차 아미노산 구조를 가질 수도 있거나 갖지 않을 수도 있다. 변형은 흔히 알려져 있는 20개의 아미노산 중 하나 또는 또 다른 아미노산, 효소에 의한 분해에 대한 저항성과 같이 부수적인 바람직한 특성을 가진 유도체화되거나 또는 치환된 아미노산 또는 D-아미노산으로의 아미노산 치환 또는 아미노산, 아미노산들 또는 펩타이드의 자연적 입체구조 및 기능을 모방하는 또 다른 분자 또는 화합물, 예컨대 탄수화물로의 치환; 아미노산 결실; 흔히 알려져 있는 20개의 아미노산 중 하나 또는 또 다른 아미노산, 효소에 의한 분해에 대한 저항성과 같이 부수적인 바람직한 특성을 가진 유도체화되거나 또는 치환된 아미노산 또는 D-아미노산으로의 아미노산 삽입 또는 아미노산, 아미노산들 또는 펩타이드의 자연적 입체구조 및 기능을 모방하는 또 다른 분자 또는 화합물, 예컨대 탄수화물로의 치환; 또는 모체 펩타이드의 모체 펩타이드의 자연적 입체구조, 전하 분포 및 기능을 모방하는 또 다른 분자 또는 화합물, 예컨대 탄수화물 또는 핵산 모노머로의 치환을 포함할 수 있다. 펩타이드는 아세틸화 또는 아미드화에 의해 변형될 수도 있다.

유도체 억제 펩타이드의 합성은 펩타이드 생합성, 탄수화물 생합성 등의 공지된 기술에 의존할 수 있다. 시작점으로서, 당업자는 관심있는 펩타이드의 입체구조를 결정하기 위해 적합한 컴퓨터 프로그램에 의존할 수도 있다. 본원에서 개시된 펩타이드의 입체구조가 공지되면, 당업자는 모체 펩타이드의 근본적인 입체구조 및 전하 분포를 보유하지만 모체 펩타이드에 존재하지 않거나 모체 펩타이드에서 발견된 것보다 향상된 특징을 가지고 있을 수도 있는 유도체를 제조하기 위해 하나 이상의 부위에서 어떤 종류의 치환이 이루어질 수 있는지를 합리적인 설계 방식으로 결정할 수 있다. 후보 유도체 분자가 확인되면, 유도체는 본원에서 기술된 검정을 사용하여 MASP-2 억제제로서 기능하는지를 결정하기 위해 테스트될 수 있다.

MASP-2 억제 펩타이드에 대한 스크리닝

MASP-2의 주요 결합 영역의 분자 구조를 모방하고 MASP-2의 보체 활성을 억제하는 펩타이드를 생성하고 이것에 대하여 스크리닝하기 위해 분자 모델링 및 합리적인 분자적 설계를 사용할 수도 있다. 모델링에 사용된 분자 구조는 항-MASP-2 단클론성 항체의 CDR 영역, 뿐만 아니라 이전에 기술된 바와 같이, 다이머화에 필요한 영역, MBL로의 결합에 수반되는 영역, 및 세린 프로테아제 활성 부위를 포함하는, MASP-2에 중요한 것으로 알려져있는 표적 영역을 포함한다. 특정 표적에 결합하는 펩타이드를 확인하는 방법은 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 분자 각인이 특정 분자에 결합하는 펩타이드와 같은 거대분자 구조의 데 노보(de novo) 구성에 사용될 수 있다. 예를 들어, Shea, K.J., "Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sties," TRIP 2(5) 1994를 참고하면 된다.

예시적인 예로서, MASP-2 결합 펩타이드의 모방체를 제조하는 한 가지 방법은 다음과 같다. 공지된 MASP-2 결합 펩타이드의 기능적 모노머 또는 MASP-2 억제를 나타내는 항-MASP-2 항체의 결합 영역 (주형)이 폴리머화된다. 그 다음에 주형이 제거되고, 이어서 주형에 의해 남겨진 공간에서 제2 분류의 모노머가 폴리머화되어, 주형과 유사한 하나 이상의 원하는 성질을 나타내는 새로운 분자를 제공한다. 이 방식으로 펩타이드를 제조하는 것에 더하여, MASP-2 억제제인 다른 MASP-2 결합 분자, 예컨대 다당류, 뉴클레오사이드, 약물, 핵단백질, 지질단백질, 탄수화물, 당단백질, 스테로이드, 지질 및 그 밖의 생물학적으로 활성인 물질들이 또한 제조될 수 있다. 이 방법은 천연 대응물보다 더 안정한 다양한 생물학적 모방체를 설계하는데 유용한데, 그것들이 전형적으로 기능적 모노머의 유리기 폴리머화에 의해 제조되어, 비생분해성 백본을 가진 화합물을 발생시키기 때문이다.

펩타이드 합성

MASP-2 억제 펩타이드는 초기에 Merrifield, in J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963에 의해 기술된 고체상 합성 기술과 같이 업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 자동화된 합성은, 예를 들어, 제조사에 의해 제공된 지시에 따라 Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Foster City, Calif.)를 사용하여 달성될 수도 있다. 다른 기술은, 예를 들어, Bodanszky, M., et al., Peptide Synthesis, second edition, John Wiley & Sons, 1976, 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 다른 참고 작업에서 발견될 수도 있다.

펩타이드는 또한 당업자에게 공지되어 있는 표준 유전자 조작 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 펩타이드를 암호화하는 핵산을 발현 벡터로 삽입하고, DNA를 발현시키고, 필요한 아미노산의 존재 하에 DNA를 펩타이드로 번역함으로써 효소에 의해 생산될 수 있다. 그 다음에 펩타이드는 크로마토그래피 또는 전기영동 기술을 사용하여, 또는 서열을 암호화하는 펩타이드와 함께 담체 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 발현 벡터로 삽입함으로써 펩타이드에 융합되고, 그 이후 펩타이드로부터 분열될 수 있는 담체 단백질에 의해 정제된다. 융합 단백질-펩타이드는 크로마토그래피, 전기영동 또는 면역학적 기술 (예컨대 담체 단백질에 대한 항체를 통한 레진으로의 결합)을 사용하여 단리될 수도 있다. 펩타이드는 화학적 방법론을 사용하여 또는 효소에 의해, 예를 들어, 가수분해효소에 의해 분열될 수 있다.

본 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 또한 통상적인 기술에 따라 재조합 숙주 세포에서 생산될 수 있다. MASP-2 억제 펩타이드 암호화 서열을 발현시키기 위해서, 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자는 발현 벡터에서 전사적 발현을 제어하는 조절 서열에 작동 가능하게 결합되어 숙주 세포로 도입되어야 한다. 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서에 더하여, 발현 벡터는 번역 조절 서열 및 발현 벡터를 가지고 있는 세포의 선택에 적합한 마커 유전자를 포함할 수 있다.

MASP-2 억제 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자는 포스포르아미디트 방법과 같은 프로토콜을 사용하여 "유전자 합성기(gene machine)"로 합성될 수 있다. 화학적으로 합성된 이중-가닥 DNA가 유전자 또는 유전자 단편의 합성과 같은 용도에 필요한 경우, 각각의 상보성 가닥은 별도로 만들어진다. 짧은 유전자 (60 내지 80개의 염기쌍)의 생산은 기술적으로 간단하고 상보성 가닥을 합성한 다음 그것들을 어닐링(annealing)함으로써 달성될 수 있다. 더 긴 유전자의 생산을 위해서, 합성 유전자 (이중-가닥)는 길이가 20 내지 100개의 뉴클레오타이드인 단일-가닥 단편으로부터 모듈 형태로 조립된다. 폴리뉴클레오타이드 합성에 대한 검토를 위해서는, 예를 들어, Glick and Pasternak, "Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA", ASM Press, 1994; Itakura, K., et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323, 1984; and Climie, S., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633, 1990을 참고하면 된다.

소분자 억제자

일부 구체예에서, MASP-2 억제제는, 예를 들어, 펩타이드, 펩티도모방체(peptidomimic) 및 비펩타이드 억제자 (올리고뉴클레오타이드 및 유기 화합물 포함)와 같이 낮은 분자량을 갖는, 천연 및 합성 물질을 포함하는 소분자 억제자이다. MASP-2의 소분자 억제자는 항-MASP-2 항체의 가변 영역의 분자 구조에 기초하여 생성될 수 있다.

소분자 억제자는 또한 컴퓨터 약물 설계를 사용하여 MASP-2 결정 구조를 기초로 설계되고 생성될 수 있다 (Kuntz I.D., et al., Science 257:1078, 1992). 래트 MASP-2의 결정 구조가 기술되어 있다 (Feinberg, H., et al., EMBO J. 22:2348-2359, 2003). Kuntz et al.에 의해 기술된 방법을 사용하여, MASP-2 결정 구조 좌표는 DOCK과 같은 컴퓨터 프로그램에 대한 입력값으로 사용되며, MASP-2에 결합할 것으로 예상되는 소분자 구조의 목록을 산출한다. 이러한 컴퓨터 프로그램의 사용은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, HIV-1 프로테아제 억제자의 결정 구조는 프로그램 DOCK을 사용하여 효소의 결합 부위에 대하여 Cambridge Crystallographic 데이터베이스에서 발견되는 화합물의 적합성을 평가함으로써 HIV-1 프로테아제 억제자인 독특한 비펩타이드 리간드를 확인하는데 사용되었다 (Kuntz, I.D., et al., J. Mol. Biol. 161:269-288, 1982; DesJarlais, R.L., et al., PNAS 87:6644-6648, 1990).

잠재적 MASP-2 억제자로서 컴퓨터 방법에 의해 확인되는 소분자 구조의 목록은 실시예 10에서 기술된 MASP-2 결합 검정을 사용하여 스크리닝된다. 이어서 MASP-2에 결합하는 것으로 발견되는 소분자는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는지를 결정하기 위해 실시예 2에서 기술된 기능적 검정으로 분석된다.

MASP-2 가용성 수용체

다른 적합한 MASP-2 억제제는 MASP-2 가용성 수용체를 포함하는 것으로 생각되며, 이것은 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 생산될 수도 있다.

MASP-2의 발현 억제자

본 발명의 이 양태의 또 다른 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제할 수 있는 MASP-2 발현 억제자이다. 본 발명의 이 양태의 실시에서, 대표적인 MASP-2 발현 억제자는 MASP-2 안티센스 핵산 분자 (예컨대 안티센스 mRNA, 안티센스 DNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드), MASP-2 리보자임 및 MASP-2 RNAi 분자를 포함한다.

안티센스 RNA 및 DNA 분자는 MASP-2 mRNA에 혼성체화되고 MASP-2 단백질의 번역을 방지함으로써 MASP-2 mRNA의 번역을 직접적으로 차단하는 작용을 한다. 안티센스 핵산 분자는 많은 다른 방법으로 구성될 수도 있으며 단 그것은 MASP-2의 발현을 방해할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산 분자는 보체의 전사를 허용하기 위해 전사에 대한 정상 배향에 관하여 MASP-2 cDNA (서열 번호:4)의 암호화 영역 (또는 이것의 일부)을 반전시킴으로써 구성될 수 있다.

안티센스 핵산 분자는 보통 표적 유전자 또는 유전자들의 적어도 일부와 실질적으로 동일하다. 하지만, 핵산은 발현을 억제하기 위해 완전히 동일할 필요는 없다. 일반적으로, 높은 상동성은 더 짧은 안티센스 핵산 분자의 사용을 보충하기 위해 사용될 수 있다. 최소한의 퍼센트 동일성은 전형적으로 약 65%보다 높지만, 더 높은 퍼센트 동일성은 내인성 서열의 발현의 더 효과적인 억제를 나타낼 수도 있다. 전형적으로 약 80%보다 실질적으로 더 높은 퍼센트 동일성이 바람직하지만, 약 95%의 절대적 동일성이 전형적으로 가장 바람직하다.

안티센스 핵산 분자는 반드시 표적 유전자와 같은 인트론 또는 엑손 패턴을 가질 필요가 없고, 표적 유전자의 비-암호화 세그먼트는 암호화 세그먼트로서 표적 유전자 발현의 안티센스 억제를 달성하는데 있어서 동일하게 효과적일 수도 있다. 적어도 약 8개 정도의 뉴클레오타이드의 DNA 서열은 안티센스 핵산 분자로서 사용될 수도 있지만, 더 긴 서열이 바람직하다. 본 발명에서, MASP-2의 유용한 억제제의 대표적인 예는 서열 번호:4에서 제시된 핵산 서열로 구성된 MASP-2 cDNA의 보체와 적어도 90 퍼센트 동일한 안티센스 MASP-2 핵산 분자이다. 서열 번호:4에서 제시된 핵산 서열은 서열 번호:5에서 제시된 아미노산 서열로 구성된 MASP-2 단백질을 암호화한다.

MASP-2 mRNA에 결합하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 표적화는 MASP-2 단백질 합성의 수준을 감소시키는데 사용될 수 있는 또 다른 메커니즘이다. 예를 들어, 폴리갈락투로나제 및 무스카린 2형 아세틸콜린 수용체의 합성은 각각의 mRNA 서열에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 억제된다 (Cheng의 미국 특허 번호 5,739,119, 및 Shewmaker의 미국 특허 번호 5,759,829). 게다가, 안티센스 억제의 예는 핵 단백질 사이클린, 다중 약물 저항성 유전자 (MDG1), ICAM-1, E-셀렉틴, STK-1, 선조체 GABA_A 수용체 및 인간 EGF으로 입증되었다 (예를 들어, Baracchini의 미국 특허 번호 5,801,154; Baker의 미국 특허 번호 5,789,573; Considine의 미국 특허 번호 5,718,709; 및 Reubenstein의 미국 특허 번호 5,610,288 참고).

당업자가 올리고뉴클레오타이드가 본 발명에서 유용한지를 결정할 수 있게 하는 시스템이 기술되었으며, 전사물 내 서열의 접근성에 대한 지표로서 Rnase H 분열을 사용하여 표적 mRNA에서 적합한 부위를 탐침하는 것을 수반한다. Scherr, M., et al., Nucleic Acids Res. 26:5079-5085, 1998; Lloyd, et al., Nucleic Acids Res. 29:3665-3673, 2001. MASP-2 전사물의 특정 영역에 대하여 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 혼합물은 MASP-2를 발현하는 세포 추출물, 예컨대 간 세포에 추가되고, 혼성체화되어 RNAseH 취약 부위를 생성한다. 이 방법은 숙주 세포에서 표적 mRNA로의 특이적 결합을 감소시키거나 또는 금지하는 다이머, 헤어핀, 또는 다른 2차 구조를 형성할 수 있는 상대적인 능력에 기초하여 안티센스 조성물에 대하여 최적인 서열 선택을 예측할 수 있는 컴퓨터-지원 서열 선택과 조합될 수 있다. 이러한 2차 구조 분석 및 표적 부위 선택의 고려사항들은 올리고 프라이머 분석 소프트웨어 (Rychlik, I., 1997) 및 BLASTN 2.0.5 알고리즘 소프트웨어 (Altschul, S.F., et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1997)를 사용하여 수행될 수 있다. 표적 서열에 대한 안티센스 화합물은 바람직하게는 길이가 약 8 내지 약 50개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 약 9 내지 약 35개 정도의 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 특히 바람직하다. 본 발명자들은 9 내지 35개의 범위의 뉴클레오타이드 (즉, 길이가 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35개 정도의 염기인 것)의 모든 올리고뉴클레오타이드 조성물이 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드-기반 방법의 실시에 매우 바람직하다는 것을 고려한다. MASP-2 mRNA의 매우 바람직한 표적 영역은 AUG 번역 시작 코돈에 또는 그 근처에 있는 것들, 및 mRNA의 5' 영역, 예를 들어, MASP-2 유전자 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호:4)의 -10 내지 +10개의 영역에 대하여 실질적으로 상보적인 상기 서열이다. 예시의 MASP-2 발현 억제자는 표 5에서 제공된다.

MASP-2의 예시의 발현 억제자

서열 번호:30 (서열 번호:4의 뉴클레오타이드 22-680)	CUBIEGF를 암호화하는 MASP-2 cDNA (서열 번호:4)의 핵산 서열
서열 번호:31 5'CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC3	MASP-2 번역 시작 부위 (센스)를 포함하는 서열 번호:4의 뉴클레오타이드 12-45
서열 번호:32 5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3'	MASP-2 MBL 결합 부위 (센스)를 포함하는 영역을 암호화하는 서열 번호:4의 뉴클레오타이드 361-396
서열 번호:33 5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3'	CUBII 도메인을 포함하는 영역을 암호화하는 서열 번호:4의 뉴클레오타이드 610-642

상기 언급된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 본원에서 사용된 바와 같이 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 그 모방체의 올리고머 또는 폴리머를 지칭한다. 이 용어는 또한 자연 발생 뉴클레오타이드, 당 및 공유 뉴클레오사이드 간 (백본) 결합 뿐만 아니라 비-자연 발생 변형을 가진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 상기 올리고핵염기를 포함한다. 이러한 변형들은 자연 발생 올리고뉴클레오타이드를 통해 제공되지 않는 어떤 원하는 성질, 예컨대 감소된 독성 성질, 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 안정성 및 향상된 세포 흡수를 도입할 수 있게 한다. 예시적인 구체예에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 포스페이트 치환기가 포스포로티오에이트로 대체된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 수명을 연장하기 위한 포스포다이에스터 백본의 변형에 의해 고유한 DNA가 다르다. 유사하게, 올리고뉴클레오타이드의 하나 또는 양 단부가 핵산 가닥 내에서 인접한 염기쌍 사이에 개재된 하나 이상의 아크리딘 유도체로 치환될 수도 있다.

안티센스에 대한 또 다른 대안은 "RNA 간섭" (RNA interference; RNAi)의 사용이다. 이중-가닥 RNA (dsRNA)는 포유동물 생체 내에서 유전자 침묵을 유발할 수 있다. RNAi 및 동시-억제의 자연적 기능은 활성이 되면 숙주 세포에서 이상 RNA 또는 dsRNA를 생산하는 레트로트랜스포손 및 바이러스와 같은 이동성 유전적 요소에 의한 침입에 대한 게놈의 보호인 것으로 보인다 (예를 들어, Jensen, J., et al., Nat. Genet. 21:209-12, 1999 참고). 이중-가닥 RNA 분자는 이중-가닥 RNA 분자를 형성할 수 있는 두 개의 RNA 가닥을 합성함으로써 제조될 수 있으며, 각각 약 19 내지 25개 (예를 들어, 19-23개의 뉴클레오타이드)를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 유용한 dsRNA 분자는 표 4에서 나열된 서열에 상응하는 RNA 및 그것의 보체를 포함할 수도 있다. 바람직하게는, RNA의 적어도 하나의 가닥은 1-5개의 뉴클레오타이드의 3' 돌출부(overhang)를 갖는다. 합성된 RNA 가닥은 이중-가닥 분자를 형성하는 조건 하에서 조합된다. RNA 서열은 25개 이하의 뉴클레오타이드의 총 길이를 가진 서열 번호:4의 적어도 8개의 뉴클레오타이드 부분을 포함할 수도 있다. 주어진 표적에 대한 siRNA 서열의 설계는 해당 분야의 통상의 기술범위 내에 있다. siRNA 서열을 설계하고 발현의 적어도 70% 넉다운(knockdown)을 보장하는 상업적 서비스가 이용 가능하다 (Qiagen, Valencia, Calif).

dsRNA는 약학적 조성물로서 투여되고 핵산은 원하는 표적 세포로 도입되는 공지된 방법에 의해 수행될 수도 있다. 일반적으로 사용되는 유전자 전송 방법은 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 전기천공, 현미주사 및 바이러스 방법을 포함한다. 이러한 방법은 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1993에서 교시된다.

리보자임, 예컨대 MASP-2 mRNA를 표적화하는 리보자임은 또한 MASP-2의 양 및/또는 생물학적 활성을 감소시키는데 이용될 수 있다. 리보자임은 리보자임의 서열에 대하여 완전히 또는 부분적으로 상동성인 서열을 가진 핵산 분자를 분열시킬 수 있는 촉매 RNA 분자이다. 표적 RNA와 특이적으로 쌍을 형성하고 특정 위치에서 포스포다이에스터 백본을 분열시키며, 이로 인해 표적 RNA를 기능적으로 비활성화시키는 RNA 리보자임을 암호화하는 리보자임 이식 유전자를 설계하는 것이 가능하다. 이 분열을 수행하는데 있어서, 리보자임은 그 자체로는 변화되지 않으며, 따라서 다른 분자를 재사용하고 분열시킬 수 있다. 안티센스 RNA 내에 리보자임 서열의 포함은 그것들에 대한 RNA-분열 활성을 부여하며, 이로 인해 안티센스 구조체의 활성을 증가시킨다.

본 발명의 실시에 유용한 리보자임은 전형적으로 뉴클레오타이드 서열이 표적 MASP-2 mRNA의 적어도 일부와 상보적인 적어도 약 9개의 뉴클레오타이드의 혼성체화 영역, 및 표적 MASP-2 mRNA를 분열시키도록 조정된 촉매 영역을 포함한다 (일반적으로 EPA No. 0 321 201; WO88/04300; Haseloff, J., et al., Nature 334:585-591, 1988; Fedor, M.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1668-1672, 1990; Cech, T.R., et al., Ann. Rev. Biochem. 55:599-629, 1986 참조).

리보자임은 리보자임 서열을 포함하는 RNA 올리고뉴클레오타이드의 형태로 세포에 직접적으로 표적화되거나, 또는 원하는 리보자임 RNA를 암호화하는 발현 벡터로서 세포로 도입될 수 있다. 리보자임은 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 대하여 기술된 바와 거의 같은 방식으로 사용되고 적용될 수 있다.

본 발명의 방법에 유용한 안티센스 RNA 및 DNA, 리보자임 및 RNAi 분자는 DNA 및 RNA 분자의 합성에 대하여 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이것들은, 예를 들어, 고체상 포스포르아미디트 화학적 합성과 같이 업계에 널리 공지된 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 및 올리고리보뉴클레오타이드를 화학적으로 합성하는 기술을 포함한다. 대안으로, RNA 분자는 안티센스 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열의 시험관 내 및 생체 내 전사에 의해 생성될 수 있다. 이러한 DNA 서열은 T7 또는 SP6 폴리머라제 프로모터와 같은 적합한 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 다양한 벡터로 통합될 수도 있다. 대안으로, 사용된 프로모터에 따라 구성적으로 또는 유도적으로 안티센스 RNA를 합성하는 안티센스 cDNA 구조체가 안정하게 세포주로 도입될 수 있다.

DNA 분자의 다양한 널리 공지된 변형은 안정성 및 반감기를 증가시키는 수단으로 도입될 수 있다. 유용한 변형은 분자의 5' 및/또는 3' 단부에 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드의 플랭킹 서열의 추가 또는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 백본 내 포스포다이에스테라제 결합 대신에 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

V. 약학적 조성물 및 전달 방법

투약

또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에서 개시된 바와 같이 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화의 부작용을 억제하기 위한 조성물을 제공하며, MASP-2 억제제의 치료적 유효량 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. MASP-2 억제제는 MASP-2-의존적 보체 활성화와 관련된 병태를 치료하거나 개선하기 위해 치료적 유효 용량으로 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 치료적 유효 용량은 질환 또는 병태와 관련된 증상의 개선을 유발하기에 충분한 MASP-2 억제제의 양을 지칭한다.

MASP-2 억제제의 독성 및 치료 효능은 실험 동물 모델, 예컨대 실시예 1에서 기술된 인간 MASP-2 이식 유전자를 발현하는 쥐 MASP-2 -/- 마우스 모델을 이용하는 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 이러한 동물 모델을 사용하여, NOAEL (관찰된 부작용 수준 없음) 및 MED (최소 유효 용량)는 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다. NOAEL 및 MED 효과 간의 용량 비율은 치료적 비율이며, NOAEL/MED 비율로 표현된다. 큰 치료 비율 또는 지수를 나타내는 MASP-2 억제제가 가장 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에 사용하기 위한 다양한 투약량을 제제화하는데 사용될 수 있다. MASP-2 억제제의 투약량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전혀 없는 MED를 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투약량은 이용되는 투약 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수도 있다.

임의의 화합물 제제에 대하여, 치료적 유효 용량은 동물 모델을 사용하여 추정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 동물 모델에서 MED를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 제제화될 수 있다. 혈장 내 MASP-2 억제제의 정량 수준은 또한, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

독성 연구에 더하여, 유효 투약량은 또한 살아있는 대상체에 존재하는 MASP-2 단백질의 양 및 MASP-2 억제제의 결합 친화도에 기초하여 추정될 수 있다. 정상 인간 대상체의 MASP-2 수준은 혈청에 500 ng/ml의 범위의 낮은 수준으로 존재하는 것으로 나타났고, 특정 대상체 내 MASP-2 수준은 Moller-Kristensen M., et al., J. Immunol. Methods 282:159-167, 2003에서 기술된 MASP-2에 대한 정량적 검정을 사용하여 결정될 수 있다.

일반적으로, MASP-2 억제제를 포함하는 투여되는 조성물의 투약량은 대상체의 나이, 체중, 키, 성별, 일반적인 의학적 상태, 및 이전 병력과 같은 요인에 따라 다르다. 예로서, MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체는 대상체 체중의 약 0.010 내지 10.0 mg/kg, 바람직하게는 0.010 내지 1.0 mg/kg, 더 바람직하게는 0.010 내지 0.1 mg/kg의 투약량 범위로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 항-MASP-2 항체 및 MASP-2 억제 펩타이드의 조합을 포함한다.

주어진 대상체에서 본 발명의 MASP-2 억제 조성물 및 방법의 치료 효능, 및 적절한 투약량은 당업자에게 널리 공지되어 있는 보체 검정에 따라 결정될 수 있다. 보체는 많은 특이적 생성물을 생성한다. 지난 10년 동안, 민감하고 특이적인 검정이 개발되었고 작은 활성화 단편 C3a, C4a, 및 C5a 및 큰 활성화 단편 iC3b, C4d, Bb, 및 sC5b-9를 포함하는 이러한 활성화 생성물 대부분에 대하여 상업적으로 이용 가능하다. 이러한 검정들 대부분은 단편이 형성되는 고유한 단백질이 아니라, 상기 단편에 노출된 새로운 항원 (신생항원)과 반응하는 단클론성 항체를 이용하여, 이러한 검정들을 매우 단순하고 특이적으로 만든다. 대부분은 ELISA 기술에 의존하지만, C3a 및 C5a에 대해서는 방사선면역검정이 여전히 때때로 사용되고 있다. 이러한 후자의 검정은 순환계에서 발견되는 주요 형태인 미가공 단편 및 그것들의 'desArg' 단편 둘 다를 측정한다. 미가공 단편 및 C5a_desArg는 세포 표면 수용체에 결합하여 신속하게 제거되며 따라서 매우 낮은 농도로 존재하는 반면, C3a_desArg는 세포에 결합하지 않고 혈장에 축적된다. C3a의 측정은 보체 활성화의 민감하고 경로-독립적인 지표를 제공한다. 대체 경로 활성화는 Bb 단편을 측정하여 평가될 수 있다. 막 공격 경로 활성화의 유체상 생성물, sC5b-9의 검출은 보체가 완성되기 위해 활성화되고 있다는 증거를 제공한다. 렉틴 및 고전적 경로는 같은 활성화 생성물, C4a 및 C4d를 생성하기 때문에, 이들 두 개의 단편의 측정은 이들 두 경로 중 어느 것이 활성화 생성물을 생성하는지에 대한 어떠한 정보도 제공하지 않는다.

MASP-2-의존적 보체 활성화의 억제는 본 발명의 방법에 따라 MASP-2 억제제의 투여의 결과로서 일어나는 보체 시스템의 구성요소의 다음 변화 중 적어도 하나를 특징으로 한다: MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템 생성물 C4b, C3a, C5a 및/또는 C5b-9 (MAC)의 생성 또는 생산의 억제 (예를 들어, 실시예 2에서 기술된 바와 같이 측정됨), C4 분열 및 C4b 침착의 감소 (예를 들어, 실시예 10에서 기술된 바와 같이 측정됨), 또는 C3 분열 및 C3b 침착의 감소 (예를 들어, 실시예 10에서 기술된 바와 같이 측정됨).

추가적인 작용제

MASP-2 억제제를 포함하는 조성물 및 방법은 선택적으로 하나 이상의 추가적인 치료제를 포함할 수도 있으며, 이것은 부가적인 또는 시너지 효과가 있는 방식으로 관련된 치료적 기능을 제공하는 MASP-2 억제제의 활성을 증가시킬 수도 있다. 예를 들어, 혈관 형성-의존적 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체를 치료하는 맥락에서, 하나 이상의 MASP-2 억제제는 하나 이상의 추가적인 혈관 형성 방지제 (혈관 형성 억제제로도 불림) 및/또는 하나 이상의 화학치료제와 조합하여 (동시-투여 포함) 투여될 수도 있다.

MASP-2 억제제는 다른 혈관 형성 방지제, 예를 들어, VEGF 안타고니스트, 예컨대 VEGF에 결합하는 항체, 예컨대 "베바시쥬맙 (BV)"으로 알려져 있는 항체 (AVASTIN®로도 알려져 있음), VEGF-A, 또는 VEGF-C, 또는 VEGF-A 수용체에 결합하는 항체 (예를 들어, KDR 수용체 또는 Flt-1 수용체), 항-PDGFR 억제자, 예컨대 Gleevec® (이마티닙 메실레이트), VEGF 수용체 신호전달을 차단하는 소분자 (예를 들어, PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT.RTM./SU11248 (수니티닙 말레이트)), AMG706, 또는, 예를 들어, 국제 특허 출원 WO 2004/113304에서 기술된 것들과 조합하여 사용될 수 있다. 혈관 형성 방지제는 또한 고유한 혈관 형성 억제자, 예를 들어, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 등을 포함한다. 예를 들어, Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179 (예를 들어, 악성 흑색종에서 항-혈관 형성 요법을 나열하는 표 3); Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (예를 들어, 공지된 항-혈관 형성 인자를 나열하는 표 2); 및 Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206 (예를 들어, 임상 시험에 사용된 혈관 형성 방지제를 나열하는 표 1) 참고.

MASP-2 억제제는, 예를 들어, 아바렐릭스, 액티노마이신 D, 아드리아마이신, 알데스류킨, 알렘투쥬맙, 알리트레티노인, 알로푸리놀, 알트레타민, 아미포스틴, 아나킨라, 아나스트로졸, 삼산화 비소, 아스파라기나제, 아자시티딘, 생 BCG, 베바쿠지맙, 벡사로텐, 블레오마이신, 보르테조밉, 부설판, 칼루스테론, 카페시타빈, 카보플라틴, 카무스틴, 셀레콕십, 세툭시맙, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로파라빈, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다카바진, 닥티노마이신, 알테파린 (예를 들어, 나트륨), 다르베포에틴 알파, 다사티닙, 다우노루비신, 다우노마이신, 데시타빈, 데니류킨, 데니류킨 디프티톡스, 덱스라족산, 도세탁셀, 독소루비신, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에쿨리쥬맙, 에피루비신 (예를 들어, HCl), 에포에틴 알파, 엘로티닙, 에스트라무스틴, 에토포시드 (예를 들어, 포스페이트), 엑세메스탄, 펜타닐 (예를 들어, 시트레이트), 필그라스팀, 플록슈리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 5-FU, 풀베스트란트, 제피티닙, 젬시타빈 (예를 들어, HCl), 젬투쥬맙 오조가마이신, 고세렐린 (예를 들어, 아세테이트), 히스트렐린 (예를 들어, 아세테이트), 하이드록시유레아, 이브리투모맙 티욱세탄, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙 (예를 들어, 메실레이트), 인터페론 알파-2b, 이리노테칸, 라파티닙 디토실레이트, 레날리도미드, 레트로졸, 류코보린, 류프롤리드 (예를 들어, 아세테이트), 레바미솔, 로무스틴, CCNU, 메클로레타민 (질소 머스타드), 메게스트롤, 멜팔란 (L-PAM), 머캅토퓨린 (6-MP), 메스나, 메토트렉세이트, 메톡살렌, 미토마이신 C, 미토탄, 미톡산트론, 난드롤론 펜프로피오네이트, 넬라라빈, 노페투모맙, 오프렐베킨, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 팔리퍼민, 팔리퍼민, 파미드로네이트, 파니투무맙, 페가데마제, 페그아스파가제, 페그필그라스팀, 페그인터페론 알파-2b, 페메트렉스드 (예를 들어, 이나트륨), 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신 (미트라마이신), 포피머 (예를 들어, 나트륨), 프로카바진, 퀴나크린, 라스부리카제, 리툭시맙, 사그라모스팀, 소라페닙, 스트렙토조신, 수니티닙 (예를 들어, 말레에이트), 탈크, 타목시펜, 테모졸로미드, 테니포시드 (VM-26), 테스토락톤, 탈리도미드, 티오구아닌 (6-TG), 티오테파, 테오테파, 티오테파, 토포테칸 (예를 들어, hcl), 토레미펜, 토시투모맙/I-131 (토시투모맙), 트라스투쥬맙, 트레티노인 (ATRA), 우라실 머스타드, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 보리노스타트, 졸레드로네이트, 및 졸레드론산과 같은 다른 항암제 및/또는 화학치료제와 조합하여 사용될 수 있다.

약학적 담체 및 전달 비히클

일반적으로, 본 발명의 MASP-2 억제제 조성물은, 임의의 다른 선택된 치료제와 조합되어, 약학적으로 허용 가능한 담체에 적합하게 함유된다. 담체는 비-독성이고, 생체 적합성이며 MASP-2 억제제 (및 그것과 조합된 임의의 다른 치료제)의 생물학적 활성에 해로운 영향을 미치지 않도록 선택된다. 펩타이드에 대한 예시의 약학적으로 허용 가능한 담체는 Yamada의 미국 특허 번호 5,211,657에 기술되어 있다. 본 발명에 유용한 항-MASP-2 항체 및 억제 펩타이드는 경구, 비경구 또는 수술 투여를 허용하는 타블렛, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌제, 흡입제 및 주사제와 같은 고체, 반고체, 겔, 액체 및 기체 형태의 조제물로 제제화될 수도 있다. 본 발명은 또한 의료 장비 등을 코팅하여 조성물의 국소 투여를 고려한다.

주사 가능한 주입 또는 관주 및 국부적 전달을 통한 비경구 전달에 적합한 담체는 증류수, 생리학적 포스페이트-완충된 식염수, 정상 또는 젖산 처리된 링거 용액(Ringer's solution), 덱스트로스 용액, 행크 용액(Hank's solution), 또는 프로판디올을 포함한다. 이에 더하여, 멸균 고정유는 용매 또는 현탁 배지로서 이용될 수 있다. 이 목적을 위해서 합성 모노- 또는 다이글리세리드를 포함하는 임의의 생체 적합성 오일이 이용될 수도 있다. 이에 더하여, 올레산과 같은 지방산은 주사제의 제조에 사용된다. 담체 및 작용제는 액체, 현탁액, 폴리머화 또는 비-폴리머화 겔, 페이스트 또는 고약으로서 합성될 수 있다.

담체는 또한 작용제(들)의 전달을 지속시키기 위해 (즉, 연장시키거나, 지연시키거나 또는 조절하기 위해) 또는 치료제(들)의 전달, 흡수, 안정성 또는 약동학을 향상시키기 위해 전달 비히클을 포함할 수도 있다. 이러한 전달 비히클은, 비-제한적 예로서, 단백질, 리포솜, 탄수화물, 합성 유기 화합물, 무기 화합물, 폴리머 또는 코폴리머 하이드로겔 및 폴리머 미셀로 구성된 마이크로입자, 미소구체, 나노구체 또는 나노입자를 포함할 수도 있다. 적합한 하이드로겔 및 미셀 전달 시스템은 WO 2004/009664 A2에서 개시된 PEO:PHB:PEO 코폴리머 및 코폴리머/사이클로덱스트린 복합체 및 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0019369 A1에서 개시된 PEO 및 PEO/사이클로덱스트린 복합체를 포함한다. 이러한 하이드로겔은 의도된 작용 부위에, 또는 피하로 또는 근육내로 국소적으로 주사되어 서방형 방출 디폿(sustained release depot)을 형성할 수도 있다.

관절내 전달을 위해, MASP-2 억제제는 주사 가능한 상기 기술된 액체 또는 겔 담체, 주사 가능한 상기 기술된 서방형 방출 전달 비히클, 또는 히알루론산 또는 히알루론산 유도체로 운반될 수도 있다.

비-펩타이드성 작용제의 경구 투여를 위해, MASP-2 억제제는 수크로스, 옥수수 전분, 또는 셀룰로스와 같은 불활성 충전제 또는 희석제로 운반될 수도 있다.

국부적 투여를 위해, MASP-2 억제제는 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이, 액체 또는 분말로, 또는 경피성 패치를 통한 겔 또는 마이크로캡슐 전달 시스템으로 운반될 수도 있다.

에어로졸, 계량 흡입기, 건식 분말 흡입기, 및 네뷸라이져(nebulizer)를 포함하는 다양한 비강 및 폐 전달 시스템이 개발 중이며 각각 에어로졸, 흡입제, 또는 분무된 전달 비히클로의 본 발명의 전달에 맞춰 적합하게 조정될 수 있다.

척추강내 (IT) 또는 뇌실내 (ICV) 전달을 위해, 적절한 멸균 전달 시스템 (예를 들어, 액체; 겔, 현탁액, 등)이 본 발명을 투여하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 생체 적합성 부형제, 예컨대 분산제 또는 습윤제, 현탁화제, 희석제, 버퍼, 침투 증강제, 에멀젼화제, 바인더, 점증제, 향미제 (경구 투여용)를 포함할 수도 있다.

항체 및 펩타이드에 대한 약학적 담체

항-MASP-2 항체 및 억제 펩타이드에 관하여 더 구체적으로는, 예시의 제제가 물, 오일, 식염수, 글리세롤 또는 에탄올과 같은 멸균 액체일 수도 있는 약학적 담체가 들어있는 생리학적으로 허용 가능한 희석제 중의 화합물의 용액 또는 현탁액의 주사 가능한 투약량으로서 비경구로 투여될 수 있다. 추가적으로, 습윤제 또는 에멀젼화제, 계면활성제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질은 항-MASP-2 항체 및 억제 펩타이드를 포함하는 조성물 내에 존재할 수 있다. 약학적 조성물의 추가적인 구성요소는 석유 (예컨대 동물성, 식물성 또는 합성 기원), 예를 들어, 대두 오일 및 미네랄 오일을 포함한다. 일반적으로, 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜은 주사 가능 용액에 대하여 바람직한 액체 담체이다.

항-MASP-2 항체 및 억제 펩타이드는 또한 활성제의 서방형 또는 박동성 방출을 허용하는 방식으로 제제화될 수 있는 디폿 주사액 또는 이식 조제물의 형태로 투여될 수 있다.

발현 억제자에 대한 약학적으로 허용 가능한 담체

본 발명의 방법에 유용한 발현 억제자에 관하여 더 구체적으로는, 상기 기술된 발현 억제자 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 콜로이드 분산 시스템을 더 포함할 수도 있다.

발현 억제자를 포함하는 약학적 조성물은 용액, 에멀젼, 및 리포솜-함유 제제를 포함할 수도 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 조성물들은, 제한되는 것은 아니지만, 사전 형성된 액체, 자가-에멀젼화 고체 및 자가-에멀젼화 반고체를 포함하는 다양한 구성요소로부터 생성될 수 있다. 이러한 조성물의 제조는 전형적으로 발현 억제자를 다음 중 하나 이상과 조합하는 것을 수반한다: 버퍼, 항산화제, 저분자량 폴리펩타이드, 단백질, 아미노산, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트린을 포함하는 탄수화물, 킬레이트화제, 예컨대 EDTA, 글루타티온 및 다른 안정화제 및 부형제. 중성 완충된 식염수 또는 비-특이적 혈청 알부민과 혼합된 식염수가 적합한 희석제의 예이다.

일부 구체예에서, 조성물은 전형적으로 점적의 형태로 또 다른 것 중에서 분산된 한 액체의 불균질 시스템인 에멀젼으로서 제조되고 제제화될 수 있다 (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Vol. 1, Rieger and Banker (eds.), Marcek Dekker, Inc., N.Y., 1988 참고). 에멀젼 제제에 사용된 자연 발생 에멀젼화제의 예는 아카시아, 비즈왁스, 라놀린, 레시틴 및 포스파티드를 포함한다.

한 구체예에서, 핵산을 포함하는 조성물은 마이크로에멀젼으로 제제화될 수 있다. 마이크로에멀젼은 본원에서 사용된 바와 같이 물, 오일, 및 양친매성 물질을 지칭하며, 이것은 광학적으로 등방성 및 열역학적으로 안정한 단일 액체 용액이다 (Rosoff in Pharmaceutical Dosage Forms, Vol. 1 참고). 본 발명의 방법은 또한 원하는 부위로의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 전송 및 전달을 위해 리포솜을 사용할 수도 있다.

국부적 투여를 위한 발현 억제자의 약학적 조성물 및 제제는 경피성 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수도 있다. 통상적인 약학적 담체, 뿐만 아니라 수성, 분말 또는 유성 염기 및 점증제 등이 사용될 수 있다.

투여 방식

MASP-2 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 국소 또는 전신 투여 방식이 치료되는 병태에 대하여 가장 적절한지에 따라 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 조성물을 이식 가능한 의료 장비에 코팅하거나 상기 의료 장비로 통합시킴으로써 전달될 수 있다.

전신성 전달

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전신성 전달" 및 "전신성 투여"는 의도된 치료 작용의 단일 또는 다수의 부위로 전달된 작용제의 분산을 효과적으로 유도하는 근육내 (IM), 피하, 정맥내 (IV), 동맥내, 흡입, 설하, 볼, 국부적, 경피성, 비강, 직장, 질 및 다른 투여 경로를 포함한 경구 및 비경구 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 것으로 의도된다. 본 조성물에 바람직한 전신 전달 경로는 정맥내, 근육내, 피하 및 흡입을 포함한다. 본 발명의 특정 조성물에서 이용되는 선택된 작용제에 대한 정확한 전신 투여 경로는 부분적으로는 주어진 투여 경로와 관련된 대사 변형 경로에 대한 작용제의 민감성을 설명하기 위해 결정될 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 펩타이드성 작용제는 경구 이외의 경로에 의해 가장 적합하게 투여될 수 있다.

MASP-2 억제 항체 및 폴리펩타이드는 임의의 적합한 수단에 의해 필요로 하는 대상체로 전달될 수 있다. MASP-2 항체 및 폴리펩타이드의 전달 방법은 경구, 폐, 비경구 (예를 들어, 근육내, 복강내, 정맥내 (IV) 또는 피하 주사), 흡입 (예컨대 미세 분말 제제를 통해), 경피성, 비강, 질, 직장, 또는 설하 투여 경로를 포함하고, 각각의 투여 경로에 적절한 투약 형태로 제제화될 수 있다.

대표적인 예로서, MASP-2 억제 항체 및 펩타이드는 폴리펩타이드를 흡수할 수 있는 체막, 예를 들어, 비강, 위장 및 직장 막으로의 도포에 의해 살아있는 신체로 도입될 수 있다. 폴리펩타이드는 전형적으로는 침투 증강제와 함께 흡수 막에 도포된다 (예를 들어, Lee, V.H.L., Crit . Rev. Ther . Drug Carrier Sys. 5 :69, 1988; Lee, V.H.L., J. Controlled Release 13:213, 1990; Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991); DeBoer, A.G., et al., J. Controlled Release 13 :241, 1990 참고). 예를 들어, STDHF는 담즙산염과 구조가 유사한 스테로이드성 계면활성제인 푸시딘산의 합성 유도체이고, 비강 전달용 침투 증강제로서 사용되었다 (Lee, W.A., Biopharm. 22, Nov./Dec. 1990.)

MASP-2 억제 항체 및 폴리펩타이드는 효소에 의한 분해로부터 폴리펩타이드를 보호하기 위해서 또 다른 분자, 예컨대 지질과 함께 도입될 수도 있다. 예를 들어, 폴리머, 특히 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 공유 부착은 신체에서 효소 가수분해로부터 특정 단백질을 보호하여 반감기를 연장시키는데 사용되었다 (Fuertges, F., et al., J. Controlled Release 11:139, 1990). 많은 폴리머 시스템이 단백질 전달에 대하여 보고되었다 (Bae, Y.H., et al., J. Controlled Release 9:271, 1989; Hori, R., et al., Pharm. Res. 6:813, 1989; Yamakawa, I., et al., J. Pharm. Sci. 79:505, 1990; Yoshihiro, I., et al., J. Controlled Release 10:195, 1989; Asano, M., et al., J. Controlled Release 9:111, 1989; Rosenblatt, J., et al., J. Controlled Release 9:195, 1989; Makino, K., J. Controlled Release 12:235, 1990; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:117, 1989; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:219, 1989).

최근, 혈청 안정성 및 순환 반감기가 개선된 리포솜이 개발되었다 (예를 들어, Webb의 미국 특허 번호 5,741,516 참고). 게다가, 잠재적 약물 담체로서 리포솜 및 리포솜-유사 조제물의 다양한 방법이 재검토되었다 (예를 들어, Szoka의 미국 특허 번호 5,567,434; Yagi의 미국 특허 번호 5,552,157; Nakamori의 미국 특허 번호 5,565,213; Shinkarenko의 미국 특허 번호 5,738,868; 및 Gao의 미국 특허 번호 5,795,587 참고).

경피 적용을 위해, MASP-2 억제 항체 및 폴리펩타이드는 다른 적합한 성분, 예컨대 담체 및/또는 보조제와 조합될 수 있다. 의도된 투여에 약학적으로 허용 가능해야 하고, 조성물의 활성 성분의 활성을 저하시킬 수 없다는 것을 제외하면, 이러한 다른 성분의 성질에 대한 제한은 없다. 적합한 비히클의 예는 정제된 콜라겐의 유무에 관계없이 연고, 크림, 겔, 또는 현탁액을 포함한다. MASP-2 억제 항체 및 폴리펩타이드는 또한 경피성 패치, 회반죽, 및 붕대 및, 바람직하게는 액체 또는 반액체 형태로 함침될 수 있다.

본 발명의 조성물은 원하는 수준의 치료 효과를 유지하도록 결정된 간격으로 주기적으로 전신에 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은, 예컨대 피하 주사에 의해 2주 내지 4주마다 또는 덜 빈번한 간격으로 투여될 수도 있다. 투약 요법은 작용제의 조합의 작용에 영향을 줄 수도 있는 다양한 요인들을 고려하여 의사에 의해 결정될 것이다. 이러한 요인들은 치료되는 병태의 진행 정도, 환자의 나이, 성별 및 체중, 및 그 밖의 임상적 요인을 포함할 것이다. 각각의 작용제에 대한 투약량은 조성물에 포함된 MASP-2 억제제의 기능, 뿐만 아니라 임의의 약물 전달 비히클 (예를 들어, 서방형 방출 전달 비히클)의 존재 및 성질에 따라 달라질 것이다. 이에 더하여, 투약량은 전달된 작용제(들)의 투여 빈도의 변화 및 약동학적 행동을 설명하기 위해 조정될 수도 있다.

국소 전달

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "국소적"은 의도된 국소화된 작용 부위 및 그 주위에 약물의 적용을 포함하고, 예를 들어, 피부 또는 다른 영향을 받는 조직로의 국부적 전달, 안구 전달, 척추강내 (IT), 뇌실내 (ICV), 관절내, 공동내, 두개내 또는 방광내 투여, 배치 또는 관주를 포함할 수도 있다. 국소 투여는 더 작은 용량의 투여를 가능하게 하고, 전신의 부작용을 방지하고, 및 국소 전달 부위에서 전달 시기 및 활성제의 농도를 더 정확하게 제어하는데 바람직할 수도 있다. 국소 투여는 대사, 혈류, 등의 환자 간 가변성에 관계없이, 표적 부위에 공지된 농도를 제공한다. 개선된 투약량 제어는 또한 직접적 전달 방식에 의해 제공된다.

MASP-2 억제제의 국소 전달은, 예를 들어, 눈 수술 또는 암-관련 수술과 같은 수술 동안에 혈관 형성-의존적 질환 또는 병태를 치료하기 위한 수술 방법의 맥락에서 달성될 수도 있다.

치료 양생법

예방적 적용에서, MASP-2 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 혈관 형성-의존적 질환 또는 병태에 취약하거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 혈관 형성을 억제하기에 충분한 양으로 투여되며 이로 인해 병태의 증상에 걸릴 위험을 제거하거나 감소시킨다. 일부 구체예에서, 약학적 조성물은 혈관 형성-의존적 질환 또는 병태로 의심되거나, 또는 이미 이것을 앓고 있는 대상체에게 병태의 증상을 완화하거나, 또는 적어도 부분적으로 감소시키기에 충분한 치료적 유효량으로 투여된다. 예방적 및 치료적 양생법 둘 다에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상체에서 충분한 치료적 결과가 달성될 때까지 다회수 투약으로 달성될 수도 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 혈관 형성과 관련된 급성 병태의 치료를 위해 조성물의 단일 투여에 의해, 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 혈관 형성과 관련된 만성 병태의 치료를 위해 연장된 기간에 걸쳐 주기적인 간격으로 투여될 수도 있다.

예방적 및 치료적 양생법 둘 다에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상체에서 충분한 치료적 결과가 달성될 때까지 다회수 투약으로 투여될 수도 있다. 본 발명의 한 구체예에서, MASP-2 억제제는

성인 환자 (예를 들어, 70 kg의 평균 성인 체중)에게 적합하게 투여될 수 있는 MASP-2 항체를 포함하며, 이것은 적합하게는 0.1 mg 내지 10,000 mg, 더 적합하게는 1.0 mg 내지 5,000 mg, 더 적합하게는 10.0 mg 내지 2,000 mg, 더 적합하게는 10.0 mg 내지 1,000 mg 및 더 적합하게는 50.0 mg 내지 500 mg의 투약량으로 성인 환자에게 투여될 수도 있다. 소아 환자에 대해서는, 환자의 체중에 비례하여 투약량이 조정될 수 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 혈관 형성-의존적 암, 혈관 형성-의존적 양성 종양 또는 안구 혈관 형성 질환 또는 병태와 같은 혈관 형성-의존적 질환 또는 병태를 앓고 있거나 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 조성물의 단일 투여에 의해, 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 혈관 형성-의존적 암, 혈관 형성-의존적 양성 종양 또는 안구 혈관 형성 질환 또는 병태와 같은 혈관 형성-의존적 질환 또는 병태를 앓고 있거나 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 연장된 기간에 걸쳐 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 주 2회, 매주, 격주, 매달 또는 격월 투여될 수 있다.

예방적 및 치료적 양생법 둘 다에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상체에서 충분한 치료적 결과가 달성될 때까지 다회수 투약으로 투여될 수 있다.

한 구체예에서, MASP-2 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 안구 혈관 형성 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에게 혈관 형성을 억제하기에 효과적인 양으로 투여된다. 한 구체예에서, 안구 혈관 형성 질환 또는 병태는 AMD, 포도막염, 안구 흑색종, 각막 혈관 신생, 원발성 익상편, HSV 기질 각막염, HSV-1-유도된 각막 림프관 형성, 증식성 당뇨성 망막증, 미숙아 망막증, 망막 정맥 폐색, 각막 이식 거부 반응, 신생 혈관 녹내장, 및 홍색증으로 구성된 군으로부터 선택된다.

또 다른 구체예에서, MASP-2 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 혈관 형성-의존적 암을 앓고 있는 대상체에게 혈관 형성을 억제하기에 효과적인 양으로 투여된다. 한 구체예에서, 혈관 형성-의존적 암은 고형 종양(들), 혈액 매개 종양, 고위험 유암종, 및 종양 전이로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 조성물은 종양 혈관 형성을 억제하기에 효과적인 양으로 투여된다. 한 구체예에서, 대상체는 종양 전이를 앓고 있거나 또는 이것에 걸릴 위험이 있고 조성물은 종양 전이를 억제하기에 효과적인 양으로 투여된다. 한 구체예에서, 대상체는 결장직장암, 유방암, 폐암, 신장암, 간장암, 식도암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위암, 신경교종, 위장관 간질성 종양, 림프종, 흑색종 및 유암종으로 구성된 군으로부터 선택된 혈관 형성-의존적 암을 앓고 있다. 한 구체예에서, 대상체는 양성 종양을 앓고 있고 조성물은 양성 종양의 혈관 형성을 억제하기에 효과적인 양으로 투여된다.

VI. 실시예

다음 실시예는 단지 본 발명을 실시하기 위해 고려되는 현재 최상의 방식을 예시하지만, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 모든 인용 문헌은 분명히 본원에 참고로 포함된다.

실시예 1

이 실시예는 MASP-2 (MASP-2-/-)가 결핍되었지만 MAp19 (MAp19+/+)는 충분한 마우스 계통의 발생을 기술한다.

재료 및 방법 : 도 3에서 도시된 바와 같이, 세린 프로테아제 도메인을 암호화하는 엑손을 포함하는, 쥐 MASP-2의 C-말단 단부를 암호화하는 세 개의 엑손을 붕괴시키도록 표적화 벡터 pKO-NTKV 1901을 설계하였다. PKO-NTKV 1901을 사용하여 쥐 ES 세포주 E14.1a (SV129 Ola)를 트랜스펙션하였다. 네오마이신-저항성 및 티미딘 키나제-민감성 클론을 선택하였다. 600개의 ES 클론을 스크리닝하였고, 이것들 중에서, 네 개의 상이한 클론을 도 3에서 도시된 바와 같이 예상된 선택적 표적화 및 재조합 이벤트를 함유하는지 서던 블롯에 의해 확인 및 입증하였다. 배 이식에 의해 이러한 네 개의 양성 클론으로부터 키메라를 발생시켰다. 이어서 키메라를 유전적 배경 C57/BL6에서 역교배시켜 트랜스제닉 수컷을 생성하였다. 트랜스제닉 수컷을 암컷과 교배시켜 F1을 발생시켰으며 자손 중 50%는 붕괴된 MASP-2 유전자에 대하여 이형 접합성을 나타냈다. 이형 접합성 마우스를 이종 교배시켜 동형 접합성 MASP-2 결핍 자손을 발생시켰으며, 그 결과 각각 1:2:1의 비율로 이형 접합성 및 야생형 마우스를 발생시켰다.

결과 및 표현형 : 결과로 생성된 동형 접합성 MASP-2-/- (즉, 유전자-표적화된-결핍) 마우스가 생존 가능하고 수정 가능하다는 것을 발견하였고 MASP-2 결핍이라는 것을 올바른 표적화 이벤트를 확인하기 위해 서던 블롯으로, MASP-2 mRNA의 부재를 확인하기 위해 노던 블롯으로, 및 MASP-2 단백질의 부재를 확인하기 위해 웨스턴 블롯으로 입증하였다 (데이터 미도시). MAp19 mRNA의 존재 및 MASP-2 mRNA의 부재를 LightCycler 기기에서 시간-분해능(time-resolved) RT-PCR을 사용하여 추가로 확인하였다. MASP-2-/- 마우스는 예상된 바와 같이 MAp19, MASP-1, 및 MASP-3 mRNA 및 단백질을 계속해서 발현하였다 (데이터 미도시). MASP-2-/- 마우스에서 프로퍼딘, 인자 B, 인자 D, C4, C2, 및 C3에 대한 mRNA의 존재 및 풍부함을 LightCycler 분석으로 평가하였고 야생형 한배 새끼 대조군과 동일하다는 것을 발견하였다 (데이터 미도시). 동형 접합성 MASP-2-/- 마우스의 혈장은 실시예 2에서 추가로 기술된 바와 같이 렉틴-경로-매개된 보체 활성화가 완전히 결핍되어 있다.

순수한 C57BL6 백그라운드의 MASP-2-/- 계통의 생성: MASP-2-/- 마우스를 실험 동물 모델로서 MASP-2-/- 계통의 사용 전에 9 세대 동안 순수한 C57BL6 혈통과 역교배시켰다.

쥐 MASP-2-/-, MAp19+/+이고 인간 MASP-2 이식 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스 계통 (쥐 MASP-2 넉아웃 및 인간 MASP-2 넉인(knock-in))을 또한 다음과 같이 발생시켰다:

재료 및 방법 : 도 4에서 도시된 바와 같이, "미니(mini) hMASP-2"라고 불리는, 인간 MASP-2를 암호화하는 꼬마유전자 (서열 번호:49)를 구성하였으며 이것은 처음 3개의 엑손 (엑손 1 내지 엑손 3)에 이어서 다음 8개의 엑손의 암호화 서열을 나타내는 cDNA 서열을 포함하며, 이로 인해 내인성 프로모터에 의해 구동되는 전장 MASP-2 단백질을 암호화하는 인간 MASP 2 유전자의 프로모터 영역을 포함한다. 결핍된 쥐 MASP 2 유전자를 트랜스제닉에 의해 발현된 인간 MASP-2로 대체하기 위해 미니 hMASP-2 구조체를 MASP-2-/-의 수정란에 주입하였다.

실시예 2

이 실시예는 MASP-2가 렉틴 경로를 통한 보체 활성화에 필요하다는 것을 입증한다.

방법 및 재료:

렉틴 경로 특이적 C4 분열 검정: C4 분열 검정은 Petersen, et al., J. Immunol. Methods 257:107 (2001)에 의해 기술되어 있으며 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)에서 L-피콜린에 결합하는 리포테이코산 (LTA)으로부터 발생하는 렉틴 경로 활성화를 측정한다. Petersen et al., (2001)에 의해 기술된 검정을 하기 기술된 바와 같이 MASP-2 -/- 마우스의 혈청을 추가하기 전에 LPS 및 만난 또는 치모산으로 플레이트를 코팅하여 MBL에 의한 렉틴 경로 활성화를 측정하도록 조정하였다. 검정을 또한 고전적 경로로 인한 C4 분열 가능성을 제거하도록 변형시켰다. 이것을 리간드로의 렉틴 경로 인식 구성요소의 고친화도 결합을 허용하지만 내인성 C4의 활성화를 방지하며, 이로 인해 C1 복합체를 해리시킴으로써 고전적 경로의 참여를 배제하는, 1 M NaCl을 함유하는 샘플 희석 버퍼를 사용하여 달성하였다. 간략히 기술하면, 변형된 검정에서 혈청 샘플 (고염도 (1 M NaCl) 버퍼에 희석됨)을 리간드-코팅된 플레이트에 추가한 후 이어서, 염의 생리학적 농도를 가진 버퍼 중의 일정한 양의 정제된 C4를 추가하였다. MASP-2를 함유하는 결합된 인식 복합체는 C4를 분열시켜, C4b 침착을 유발한다.

검정 방법:

1) Nunc Maxisorb 미세역가 플레이트 (Maxisorb, Nunc, 제품 번호 442404, Fisher Scientific)를 코팅 버퍼 (15 mM Na₂CO₃, 35 mM NaHCO₃, pH 9.6)에 희석된 1 μg/ml 만난 (M7504 Sigma) 또는 임의의 다른 리간드 (예를 들어, 하기 나열된 것들)로 코팅하였다.

다음 시약을 검정에 사용하였다:

a. 만난 (100 μl 코팅 버퍼 중의 1 μg/웰 만난 (M7504 Sigma)):

b. 치모산 (100 μl 코팅 버퍼 중의 1 μg/웰 치모산 (Sigma));

c. LTA (100 μl 코팅 버퍼 중의 1μg/웰 또는 20 μl 메탄올 중의 2 μg/웰)

d. 코팅 버퍼 중의 1 μg H-피콜린 특이적 Mab 4H5

e. 에어로코쿠스 비리단스(Aerococcus viridans)의 PSA (100 μl 코팅 버퍼 중의 2 μg/웰)

f. 코팅 버퍼 중의 100 μl/웰의 포르말린-고정된 스타필로코쿠스 아우레우스 DSM20233 (OD₅₅₀=0.5)

2) 플레이트를 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다.

3) 밤새도록 인큐베이션한 후, 0.1% HSA-TBS 차단 버퍼 (10 mM Tris-CL, 140 mM NaCl, 1.5 mM NaN₃, pH 7.4 중의 0.1% (w/v) HSA)가 들어있는 플레이트를 1-3시간 동안 인큐베이션한 다음, 플레이트를 TBS/tween/Ca²⁺ (0.05% Tween 20 및 5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH 7.4가 들어있는 TBS)으로 3회 세척하여 잔류 단백질 결합 부위를 포화시켰다.

4) 테스트되는 혈청 샘플을 MBL-결합 버퍼 (1 M NaCl)에 희석하였고 희석된 샘플을 플레이트에 추가하고 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 버퍼만 들어있는 웰을 음성 대조군으로 사용하였다.

5) 4℃에서 밤새도록 인큐베이션한 후, 플레이트를 TBS/tween/Ca2+로 3회 세척하였다. 이어서 인간 C4 (BBS (4 mM 바비탈, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH 7.4)에 희석된 1 μg/ml의 100 μl/웰)을 플레이트에 추가하고 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 TBS/tween/Ca²⁺로 3회 세척하였다.

6) C4b 침착을 알칼리 포스파타제-컨쥬게이션된 닭 항-인간 C4c (TBS/tween/Ca²⁺에 1:100으로 희석됨)로 검출하였으며, 이것을 플레이트에 추가하고 실온에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 다시 TBS/tween/Ca²⁺로 3회 세척하였다.

7) p-나이트로페닐 포스페이트 기질 용액 100 μl를 추가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하고, 미세역가 플레이트 판독기에서 OD₄₀₅를 판독하여 알칼리 포스파타제를 검출하였다.

결과 : 도 5A-B는 MASP-2+/+ (X표), MASP-2+/- (폐쇄 원) 및 MASP-2-/- (폐쇄 삼각형)의 혈청 희석액 중 만난 (도 5A) 및 치모산 (도 5B) 상의 C4b 침착의 양을 도시한다. 도 5C는 야생형 혈청에 대하여 표준화된 C4b 침착의 양을 측정하는 것에 기초하여 야생형 마우스와 관하여 MASP-2-/+ 마우스 (n=5) 및 MASP-2-/- 마우스 (n=4)의 치모산 (흰색 막대) 또는 만난 (음영 막대)으로 코팅된 플레이트 상의 상대적인 C4 컨버타제 활성을 도시한다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 5A-C에서 도시된 바와 같이, MASP-2-/- 마우스의 혈장은 만난 및 치모산 코팅된 플레이트 상에서 렉틴-경로-매개된 보체 활성화가 완전히 결핍된다. 이러한 결과들은 MASP-2가 렉틴 경로의 효과기 구성요소임을 분명하게 입증한다.

재조합 MASP-2는 MASP-2-/- 마우스의 혈청에서 렉틴 경로-의존적 C4 활성화를 복원한다.

MASP-2의 부재가 MASP-2-/- 마우스에서 렉틴 경로-의존적 C4 활성화의 손실의 직접적인 원인임을 확립하기 위해서, 혈청 샘플에 재조합 MASP-2 단백질을 추가하는 것의 효과를 상기 기술된 C4 분열 검정으로 검사하였다. 기능적 활성 쥐 MASP-2 및 촉매 비활성 쥐 MASP-2A (여기서 세린 프로테아제 도메인의 활성-부위 세린 잔기가 알라닌 잔기로 치환됨) 재조합 단백질을 생산하였고 하기 실시예 3에서 기술된 바와 같이 정제하였다. 모아진 4마리의 MASP-2 -/- 마우스의 혈청을 증가하는 단백질 농도의 재조합 쥐 MASP-2 또는 비활성 재조합 쥐 MASP-2A와 함께 사전-인큐베이션하였고 상기 기술된 바와 같이 C4 컨버타제 활성을 분석하였다.

결과 : 도 6에서 도시된 바와 같이, MASP-2 -/- 마우스로부터 얻어진 혈청으로의 기능적 활성 쥐 재조합 MASP-2 단백질 (개방 삼각형으로 도시됨)의 추가는 단백질 농도 의존적 방식으로 렉틴 경로-의존적 C4 활성화를 복원하는 반면, 촉매 비활성 쥐 MASP-2A 단백질 (별표로 도시됨)은 C4 활성화를 복원하지 않았다. 도 6에서 도시된 결과를 모집된 야생형 마우스 혈청 (점선으로 도시됨)으로 관찰된 C4 활성화에 대하여 표준화한다.

실시예 3

이 실시예는 재조합 전장 인간, 래트 및 쥐 MASP-2, MASP-2 유래된 폴리펩타이드, 및 촉매에 의해 비활성화된 돌연변이 형태의 MASP-2의 재조합 발현 및 단백질 생산을 기술한다.

전장 인간, 쥐 및 래트 MASP-2의 발현:

인간 MASP-2의 전장 cDNA 서열 (서열 번호: 4)을 또한 CMV 인핸서/프로모터 영역의 제어 하에 진핵세포 발현을 구동하는 포유동물 발현 벡터 pCI-Neo (Promega)로 서브클로닝하였다 (Kaufman R.J. et al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)에서 기술됨). 전장 마우스 cDNA (서열 번호:50) 및 래트 MASP-2 cDNA (서열 번호:53)을 각각 pED 발현 벡터로 서브클로닝하였다. 이어서 MASP-2 발현 벡터를 Maniatis et al., 1989에서 기술된 표준 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 과정을 사용하여 부착 중국 햄스터 난소 세포주 DXB1으로 트랜스펙션하였다. 이러한 구조체로 트랜스펙션된 세포는 매우 느리게 성장하며, 암호화된 프로테아제가 세포독성임을 나타낸다.

또 다른 접근법에서, 내인성 프로모터에 의해 구동되는 MASP-2의 인간 cDNA를 함유하는 꼬마유전자 구조체 (서열 번호:49)를 중국 햄스터 난소 세포 (CHO)로 일과성으로 트랜스펙션한다. 인간 MASP-2 단백질은 배양 배지로 분비되고 하기 기술된 바와 같이 단리된다.

전장 촉매 비활성 MASP-2의 발현:

근거: MASP-2는 인식 하위 구성요소 MBL 또는 피콜린 (L-피콜린, H-피콜린 또는 M-피콜린)이 각각의 탄수화물 패턴에 결합한 후 자가 촉매 분열에 의해 활성화된다. MASP-2의 활성화를 유도하는 자가 촉매 분열은 종종 혈청으로부터 MASP-2의 단리 과정 동안에, 또는 재조합 발현 후 정제 동안에 일어난다. 항원으로서 사용하기 위한 더 안정한 단백질 조제물을 얻기 위해서, MASP-2A로 지정된, 촉매 비활성 형태의 MASP-2를 래트 (서열 번호:55 Ser617을 Ala617로); 마우스 (서열 번호:52 Ser617을 Ala617로); 또는 인간 (서열 번호:3 Ser618을 Ala618로)에서 프로테아제 도메인의 세 작용기 촉매(catalytic triad)에 존재하는 세린 잔기를 알라닌 잔기로 대체함으로써 생성하였다.

촉매 비활성 인간 및 쥐 MASP-2A 단백질을 생성하기 위해, 부위-특이적 돌연변이 유발을 표 6에서 나타난 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행하였다. 표 6의 올리고뉴클레오타이드를 효소 활성 세린을 암호화하는 인간 및 쥐 cDNA의 영역에 어닐링하도록 설계하였고 올리고뉴클레오타이드는 세린 코돈을 알라닌 코돈으로 변화시키기 위해 미스매치(mismatch)를 함유한다. 예를 들어, PCR 올리고뉴클레오타이드 서열 번호:56-59를 인간 MASP-2 cDNA (서열 번호:4)와 조합으로 사용하여 개시 코돈에서 효소 활성 세린까지 및 세린에서 종결 코돈까지의 영역을 증폭시켜 Ser618의 Ala618로의 돌연변이를 함유하는 돌연변이된 MASP-2A의 완전한 오픈 리딩 프레임을 생성하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동 및 밴드 제조 후 정제하였고 단일 아데노신 중첩 부분을 표준 테일링(tailing) 과정을 사용하여 생성하였다. 이어서 아데노신 테일링된 MASP-2A를 pGEM-T easy 벡터로 클로닝하여, 대장균으로 형질전환시켰다.

서열 번호:64 및 서열 번호:65의 올리고뉴클레오타이드를 등몰량으로 조합하고, 100℃에서 2분 동안 가열하고 서서히 실온으로 냉각시킴으로써 서열 번호:64 및 서열 번호:65를 키나제 처리하고 어닐링하여 촉매 비활성 래트 MASP-2A를 생성하였다. 결과로 생성된 어닐링된 단편은 Pst1 및 Xba1 호환성 단부를 가지며 야생형 래트 MASP-2 cDNA (서열 번호:53)의 Pst1-Xba1 단편을 대신해서 삽입되어 래트 MASP-2A를 생성한다.

5' GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3' (서열 번호:64)

5' CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA 3' (서열 번호:65)

인간, 쥐 및 래트 MASP-2A를 하기 기술된 바와 같이 각각 포유동물 발현 벡터 pED 또는 pCI-Neo 중 하나로 추가로 서브클로닝하였고 중국 햄스터 난소 세포주 DXB1으로 트랜스펙션하였다.

또 다른 접근법에서, MASP-2의 촉매 비활성 형태를 Chen et al., J. Biol. Chem., 276(28):25894-25902, 2001에서 기술된 방법을 사용하여 구성하였다. 간략히 말하면, 전장 인간 MASP-2 cDNA를 함유하는 플라스미드 (Thiel et al., Nature 386:506, 1997에서 기술됨)를 Xho1 및 EcoR1으로 분해하고 MASP-2 cDNA (본원에서 서열 번호:4로 기술됨)를 pFastBac1 바큘로바이러스(baculovirus) 전송 벡터 (Life Technologies, NY)의 상응하는 제한 부위로 클로닝한다. 이어서 펩타이드 영역 아미노산 610-625 (서열 번호:13)를 암호화하는 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드를 고유한 영역 아미노산 610 내지 625로 치환함으로써 Ser618의 MASP-2 세린 프로테아제 활성 부위를 Ala618로 변화시켜 비활성 프로테아제 도메인을 가진 MASP-2 전장 폴리펩타이드를 생성하였다.

인간 Masp-2로부터 유래된 폴리펩타이드 영역을 함유하는 발현 플라스미드의 구성.

MASP-2의 다양한 도메인을 분비하도록 MASP-2 신호 펩타이드 (서열 번호:5의 잔기 1-15)를 사용하여 다음 구조체를 생산하였다. 인간 MASP-2 CUBI 도메인 (서열 번호:8)을 발현하는 구조체를 MASP-2의 잔기 1-121 (서열 번호:6)을 암호화하는 영역 (N-말단 CUB1 도메인에 상응함)을 증폭시키는 PCR에 의해 제조하였다. 인간 MASP-2 CUBIEGF 도메인 (서열 번호:9)을 발현하는 구조체를 MASP-2의 잔기 1-166 (서열 번호:6)을 암호화하는 영역 (N-말단 CUB1EGF 도메인에 상응함)을 증폭시키는 PCR에 의해 제조하였다. 인간 MASP-2 CUBIEGFCUBII 도메인 (서열 번호:10)을 발현하는 구조체를 MASP-2의 잔기 1-293 (서열 번호:6)을 암호화하는 영역 (N-말단 CUBIEGFCUBII 도메인에 상응함)을 증폭시키는 PCR에 의해 제조하였다. 상기 언급된 도메인을 확립된 PCR 방법에 따라 Vent_R 폴리머라제 및 주형으로서 pBS-MASP-2를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다. 센스 프라이머의 5' 프라이머 서열 (5'-CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' 서열 번호:34)은 PCR 생성물의 5' 단부에 BamHI 제한 부위 (밑줄)를 도입한다. 각각의 MASP-2 도메인에 대한 안티센스 프라이머를 표 6에서 나타난 바와 같이 각 PCR 생성물의 단부에 종결 코돈 (볼드체 활자)에 이어서 EcoRI 부위 (밑줄)를 도입하도록 설계한다. 증폭되면, DNA 단편을 BamHI 및 EcoRI으로 분해하고 pFastBac1 벡터의 상응하는 부위로 클로닝한다. 결과로 생성된 구조체는 제한 효소 맵핑에 의해 특징지어 지고 dsDNA 시퀀싱에 의해 확인된다.

MASP-2 PCR 프라이머

MASP-2 도메인	5' PCR 프라이머	3' PCR 프라이머
서열 번호:8 CUBI (서열 번호:6의 aa 1-121)	5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (서열 번호:34)	5'GGAATTCCTAGGCTGCATA (서열 번호:35)
서열 번호:9 CUBIEGF (서열 번호:6의 aa 1-166)	5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (서열 번호:34)	5'GGAATTCCTACAGGGCGCT-3' (서열 번호:36)
서열 번호:10CUBIEGFCUBII (서열 번호:6의 aa 1-293)	5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (서열 번호:34)	5'GGAATTCCTAGTAGTGGAT 3' (서열 번호:37)
서열 번호:4 인간 MASP-2	5'ATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTC 3' (서열 번호: 56) hMASP-2_정방향	5'TTAAAATCACTAATTATGTTCTCGATC 3' (서열 번호: 59) hMASP-2_역방향
서열 번호:4 인간 MASP-2 cDNA	5'CAGAGGTGACGCAGGAGGGGCAC 3' (서열 번호: 58) hMASP-2_ala_정방향	5'GTGCCCCTCCTGCGTCACCTCTG 3' (서열 번호: 57) hMASP-2_ala_역방향
서열 번호:50 쥐 MASP-2 cDNA	5'ATGAGGCTACTCATCTTCCTGG3' (서열 번호: 60) mMASP-2_정방향	5'TTAGAAATTACTTATTATGTTCTCAATCC3' (서열 번호: 63) mMASP-2_역방향
서열 번호:50 쥐 MASP-2 cDNA	5'CCCCCCCTGCGTCACCTCTGCAG3' (서열 번호: 62) mMASP-2_ala_정방향	5'CTGCAGAGGTGACGCAGGGGGGG 3' (서열 번호: 61) mMASP-2_ala_역방향

MASP-2의 재조합 진핵세포 발현 및 효소 비활성 마우스, 래트, 및 인간 MASP-2A의 단백질 생산

상기 기술된 MASP-2 및 MASP-2A 발현 구조체를 표준 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 과정을 사용하여 DXB1 세포로 트랜스펙션하였다 (Maniatis et al., 1989). MASP-2A를 무혈청 배지에서 생산하여 조제물이 다른 혈청 단백질로 오염되지 않았음을 보장하였다. 배지를 융합성 세포로부터 이틀마다 (총 4회) 수확하였다. 재조합 MASP-2A의 수준은 각각의 세 종에 대한 배양 배지의 대략 1.5 mg/리터를 평균으로 하였다.

MASP-2A 단백질 정제: MASP-2A (상기 기술된 Ser-Ala 돌연변이)를 MBP-A-아가로스 컬럼 상에서 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이 전략은 무관한 태그를 사용하지 않는 신속한 정제를 가능하게 하였다. MASP-2A (동일한 부피의 로딩 버퍼 (150 mM NaCl 및 25 mM CaCl₂를 함유하는 50 mM Tris-Cl, pH 7.5)로 희석된 배지 100-200 ml)를 10 ml의 로딩 버퍼로 사전 평형화된 MBP-아가로스 친화도 컬럼 (4 ml)에 로딩하였다. 추가의 로딩 버퍼 10 ml로 세척한 후, 단백질을 1.25 M NaCl 및 10 mM EDTA를 함유하는 50 mM Tris-Cl, pH 7.5로 1 ml 분획으로 용출하였다. MASP-2A를 함유하는 분획을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 확인하였다. 필요한 경우, MASP-2A를 MonoQ 컬럼 (HR 5/5) 상에서 이온-교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 단백질을 50 mM NaCl을 함유하는 50 mM Tris-Cl pH 7.5로 투석하였고 같은 버퍼로 평형화된 컬럼에 로딩하였다. 세척 후, 결합된 MASP-2A를 10 ml 초과의 0.05-1 M NaCl 구배로 용출하였다.

결과 : MASP-2A 단백질의 0.25-0.5 mg의 수율을 배지 200 ml로부터 얻었다. MALDI-MS에 의해 결정된 77.5 kDa의 분자 질량은 글리코실화로 인해 변형되지 않은 폴리펩타이드 (73.5 kDa)의 계산치보다 더 크다. 각각의 N-글리코실화 부위에 글리칸의 부착은 관찰된 질량을 설명한다. MASP-2A는 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 상에서 단일 밴드로서 이동하며, 그것이 생합성 동안에 단백질 가수분해에 의해 가공되지 않는다는 것을 입증한다. 평형 초원심분리에 의해 결정된 중량-평균 분자 질량은 글리코실화된 폴리펩타이드의 호모다이머에 대한 계산치와 일치한다.

재조합 인간 Masp-2 폴리펩타이드의 생산

재조합 MASP-2 및 MASP2A 유래된 폴리펩타이드를 생산하기 위한 또 다른 방법은 Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166:5068-5077, 2001에 기술되어 있다. 간략히 말하면, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 곤충 세포 (Novagen, Madison, WI로부터 얻어진 Ready-Plaque Sf9 세포)를 50 IU/ml 페니실린 및 50 mg/ml 스트렙토마이신 (Life Technologies)으로 보충된 Sf900II 무혈청 배지 (Life Technologies)에서 키우고 유지한다. 트리코플러시아 니(Trichoplusia ni) (High Five) 곤충 세포 (Jadwiga Chroboczek, Institut de Biologie Structurale, Grenoble, France에 의해 제공됨)를 50 IU/ml 페니실린 및 50 mg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 10% FCS (Dominique Dutscher, Brumath, France)를 함유하는 TC100 배지 (Life Technologies)에서 유지한다. 재조합 바큘로바이러스를 Bac-to-Bac 시스템 (Life Technologies)을 사용하여 생성한다. 백미드(bacmid) DNA를 Qiagen 미디프렙(midiprep) 정제 시스템 (Qiagen)을 사용하여 정제하고 제조사의 프로토콜에 기술된 바와 같이 Sf900 II SFM 배지 (Life Technologies) 중의 셀펙틴(cellfectin)을 사용하여 Sf9 곤충 세포를 트랜스펙션하는데 사용한다. 재조합 바이러스 입자를 4일 후 수거하고, 바이러스 플라크(plaque) 검정에 의해 적정하고, King and Possee, in The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., London, pp. 111-114, 1992에 의해 기술된 바와 같이 증폭시킨다.

High Five 세포 (1.75 x 10⁷ 세포/175-cm² 조직 배양 플라스크)를 Sf900 II SFM 배지에서 28℃에서 96 h 동안 2의 감염 다중도로 MASP-2 폴리펩타이드를 함유한 재조합 바이러스로 감염시킨다. 상층액을 원심분리에 의해 수거하고 다이아이소프로필 포스포로플루오리데이트를 최종 농도 1 mM로 추가한다.

MASP-2 폴리펩타이드가 배양 배지에 분비된다. 배양 상층액을 50 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 50 mM 트라이에탄올아민 하이드로클로라이드, pH 8.1에 대하여 투석하고, 같은 버퍼에서 평형화된 Q-Sepharose Fast Flow 컬럼 (Amersham Pharmacia Biotech) (2.8 x 12 cm)에 1.5 ml/분으로 로딩한다. 같은 버퍼 중의 350 mM NaCl로의 1.2 리터 선형 구배를 적용하여 용출을 실시한다. 재조합 MASP-2 폴리펩타이드를 함유하는 분획을 웨스턴 블롯 분석으로 확인하고, 60% (w/v)로 (NH₄)₂SO₄의 추가에 의해 침전시키고, 4℃에서 밤새도록 내버려 둔다. 펠릿을 145 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 50 mM 트라이에탄올아민 하이드로클로라이드, pH 7.4에서 재현탁시키고, 같은 버퍼에서 평형화된 TSK G3000 SWG 컬럼 (7.5 x 600 mm) (Tosohaas, Montgomeryville, PA)에 적용한다. 이어서 정제된 폴리펩타이드를 Microsep 미세농축기 (m.w. 컷-오프(cut-off) = 10,000) (Filtron, Karlstein, Germany) 상에서의 한외여과에 의해 0.3 mg/ml로 농축시킨다.

실시예 4

이 실시예는 MASP-2 폴리펩타이드에 대한 다클론성 항체를 생산하는 방법을 기술한다.

재료 및 방법 :

MASP-2 항원: 다음의 단리된 MASP-2 폴리펩타이드로 토끼를 면역화하여 다클론성 항-인간 MASP-2 항혈청을 생산한다: 혈청으로부터 단리된 인간 MASP-2 (서열 번호:6); 실시예 3에서 기술된 재조합 인간 MASP-2 (서열 번호:6), 여기서 MASP-2A는 비활성 프로테아제 도메인 (서열 번호:13)을 함유함; 및 상기 실시예 3에서 기술된 바와 같이 발현되는 재조합 CUBI (서열 번호:8), CUBEGFI (서열 번호:9), 및 CUBEGFCUBII (서열 번호:10).

다클론성 항체: BCG (바실루스 칼메트-게랑 백신(bacillus Calmette-Guerin vaccine))로 프라이밍된 6주령 토끼를 멸균 식염수 용액 중의 100 μg/ml로 MASP-2 폴리펩타이드 100 μg을 주사하여 면역화시킨다. 주사를 4주마다 실행하며, 실시예 5에서 기술된 바와 같이 ELISA 검정에 의해 항체 역가를 모니터링한다. 항체 정제를 위해 배양 상층액을 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 수거한다.

실시예 5

이 실시예는 래트 또는 인간 MASP-2 폴리펩타이드에 대한 쥐 단클론성 항체를 생산하는 방법을 기술한다.

재료 및 방법 :

8-12주령의 수컷 A/J 마우스 (Harlan, Houston, Tex.)에 포스페이트 완충된 식염수 (PBS) pH 7.4 200 μl 중의 완전 프로인트 보조제 (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) 중의 100 μg 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩타이드 (실시예 3에서 기술된 바와 같이 제조됨)를 피하로 주사한다. 2주 간격으로 마우스에 불완전 프로인트 보조제 중의 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩타이드 50 μg을 피하로 2회 주사한다. 제4 주에 마우스에 PBS 중의 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩타이드 50 μg을 주사하고 4일 후 융합시킨다.

각각의 융합을 위해, 단일 세포 현탁액을 면역화된 마우스의 비장으로부터 제조하고 Sp2/0 골수종 세포와의 융합에 사용한다. 5x10⁸개의 Sp2/0 및 5x10⁸개의 비장 세포를 50% 폴리에틸렌 글리콜 (M.W. 1450) (Kodak, Rochester, N.Y.) 및 5% 디메틸설폭시드 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)를 함유하는 배지에서 융합시킨다. 이어서 세포를 10% 소 태아 혈청, 100 유닛/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 0.1 mM 하이폭산틴, 0.4 μM 아미노프테린 및 16 μM 티미딘으로 보충된 Iscove 배지 (Gibco, Grand Island, N.Y.) 중의 현탁액 200 μl 당 1.5x10⁵개의 비장 세포의 농도로 조정한다. 세포 현탁액 200 마이크로리터를 약 20개의 96-웰 미량배양 플레이트의 각 웰에 추가한다. 약 10일 후 ELISA 검정에서 정제된 인자 MASP-2와의 반응성에 대하여 스크리닝하기 위해 배양 상층액을 회수한다.

ELISA 검정: Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) 마이크로테스트 플레이트의 웰을 50 ng/ml의 정제된 hMASP-2 또는 래트 rMASP-2 (또는 rMASP-2A) 50 μl를 추가하여 실온에서 밤새도록 코팅한다. 코팅을 위한 저농도의 MASP-2는 고-친화도 항체의 선택을 가능하게 한다. 플레이트를 털어서 코팅 용액을 제거한 후, 비-특이적 부위를 차단하기 위해 PBS 중의 BLOTTO (탈지 분유) 200 μl를 1시간 동안 각 웰에 추가한다. 1시간 후, 웰들을 버퍼 PBST (0.05% Tween 20을 함유하는 PBS)로 세척한다. 각각의 융합 웰로부터 배양 상층액 50 마이크로리터를 수거하고 BLOTTO 50 μl와 혼합한 다음 마이크로테스트 플레이트의 각 웰에 추가한다. 인큐베이션 1시간 후, 웰을 PBST로 세척한다. 이어서 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG (Fc 특이적) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.)와의 반응에 의해 결합된 쥐 항체를 검출하고 BLOTTO에서 1:2,000로 희석한다. 0.1% 3,3,5,5 테트라메틸 벤지딘 (Sigma, St. Louis, Mo.) 및 0.0003% 과산화수소 (Sigma)를 함유하는 퍼옥시다제 기질 용액을 발색을 위해 30분 동안 웰에 추가하였다. 웰 당 50 μl의 2M H₂SO₄의 추가에 의해 반응을 종결시킨다. 450 nm에서 반응 혼합물의 광학 밀도를 BioTek ELISA Reader (BioTek Instruments, Winooski, Vt.)로 판독한다.

MASP-2 결합 검정:

상기 기술된 MASP-2 ELISA 검정에서 양성으로 테스트된 배양 상층액을 MASP-2에 대하여 MASP-2 억제제가 가진 결합 친화도를 결정하기 위해 결합 검정으로 테스트할 수 있다. 보체 시스템에서 억제제가 다른 항원에 결합하는지를 결정하기 위해 유사한 검정을 또한 사용할 수 있다.

폴리스티렌 미세역가 플레이트 웰 (96-웰 배지 결합 플레이트, Corning Costar, Cambridge, MA)을 포스페이트-완충된 식염수 (PBS) pH 7.4 중의 MASP-2 (20 ng/100 μl/웰, Advanced Research Technology, San Diego, CA)로 4℃에서 밤새도록 코팅한다. MASP-2 용액을 빨아낸 후, 웰을 1% 소 혈청 알부민 (BSA; Sigma Chemical)을 함유하는 PBS로 실온에서 2 h 동안 블로킹한다. MASP-2 코팅이 없는 웰은 백그라운드 대조군의 역할을 한다. 하이브리도마 상층액 또는 정제된 항-MASP-2 MoAb의 앨리쿼트를 블로킹 용액 중의 다양한 농도로 웰에 추가한다. 실온에서 2 h 동안 인큐베이션한 후, 웰을 PBS로 광범위하게 헹군다. 실온에서 1 h 동안 인큐베이션시킨 차단 용액 중의 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG (Sigma Chemical)의 추가에 의해 MASP-2-결합된 항-MASP-2 MoAb를 검출한다. 플레이트를 다시 PBS로 철저하게 헹군 다음, 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB) 기질 (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) 100 μl를 추가한다. 1M 인산 100 μl의 추가로 TMB의 반응을 퀸칭하고(quench), 플레이트를 마이크로플레이트 판독기 (SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 450 nm에서 판독한다.

이어서 양성 웰의 배양 상층액을 실시예 2에서 기술된 바와 같이 C4 분열 검정과 같은 기능적 검정에서 보체 활성화를 억제하는 능력에 대하여 테스트한다. 양성 웰의 세포를 한계 희석에 의해 클로닝한다. MoAb를 상기 기술된 바와 같이 ELISA 검정에서 hMASP-2와의 반응에 대하여 다시 테스트한다. 선택된 하이브리도마를 스피너 플라스크(spinner flask)에서 성장시키고 소모된 배양 상층액을 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의한 항체 정제를 위해 수거한다.

실시예 6

이 실시예는 인간화 쥐 항-MASP-2 항체 및 항체 단편의 생성 및 생산을 기술한다.

쥐 항-MASP-2 단클론성 항체를 실시예 5에서 기술된 바와 같이 수컷 A/J 마우스에서 생성한다. 이어서 쥐 항체를 키메라 IgG 및 항체의 Fab 단편을 생성하기 위해 쥐 불변 영역을 인간 대응물로 대체하여 면역원성을 감소시키기 위해 하기 기술된 바와 같이 인간화하며, 이것은 본 발명에 따라 인간 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화의 부작용을 억제하는데 유용하다.

1. 쥐 하이브리도마 세포의 항-MASP-2 가변 영역 유전자의 클로닝. 전체 RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 RNAzol (Biotech, Houston, Tex.)을 사용하여 항-MASP-2 MoAb를 분비하는 하이브리도마 세포 (실시예 7에서 기술된 바와 같이 얻어짐)로부터 단리시킨다. 첫 번째 가닥 cDNA를 프라이머로서 올리고 dT를 사용하여 전체 RNA로부터 합성한다. 면역글로불린 불변 C 영역-유래된 3' 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고 5' 프라이머로서 쥐 V_H 또는 V_K 유전자의 선도 펩타이드 또는 제1 프레임워크 영역으로부터 유래된 프라이머 세트를 변성시킨다. 고정된 PCR을 Chen 및 Platsucas (Chen, P.F., Scand. J. Immunol. 35:539-549, 1992)에 의해 기술된 바와 같이 수행한다. V_K 유전자를 클로닝하기 위해서, 이중-가닥 cDNA를 Notl-MAK1 프라이머 (5'-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3' 서열 번호:38)를 사용하여 제조한다. 어닐링된 어댑터 AD1 (5'-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3' 서열 번호:39) 및 AD2 (5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3' 서열 번호:40)를 이중-가닥 cDNA의 5' 및 3' 말단 둘 다에 결찰시킨다. 3' 단부의 어댑터를 Notl 분해에 의해 제거한다. 이어서 분해된 생성물을 5' 프라이머로서 AD1 올리고뉴클레오타이드 및 3' 프라이머로서 MAK2 (5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3' 서열 번호:41)를 이용한 PCR에서 주형으로 사용한다. 대략 500 bp의 DNA 단편을 pUC19로 클로닝한다. 클로닝된 서열이 예상된 쥐 면역글로불린 불변 영역을 포함한다는 것을 입증하기 위한 서열 분석을 위해 여러 클론을 선택한다. Not1-MAK1 및 MAK2 올리고뉴클레오타이드는 V_K 영역으로부터 유래되고 각각 C 카파 유전자의 첫 번째 염기쌍으로부터 다운스트림에 있는 182 및 84 bp이다. 완전한 V_K 및 선도 펩타이드를 포함하는 클론을 선택한다. V_H 유전자를 클로닝하기 위해서, 이중-가닥 cDNA를 Not1 MAG1 프라이머 (5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3' 서열 번호:42)를 사용하여 제조한다. 어닐링된 어댑터 AD1 및 AD2를 이중-가닥 cDNA의 5' 및 3' 말단 둘 다에 결찰시킨다. 3' 단부의 어댑터를 Notl 분해에 의해 제거한다. 분해된 생성물을 프라이머로서 AD1 올리고뉴클레오타이드 및 MAG2 (5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3' 서열 번호:43)를 이용한 PCR에서 주형으로 사용한다. 길이가 500 내지 600 bp인 DNA 단편을 pUC19로 클로닝한다. Notl-MAG1 및 MAG2 올리고뉴클레오타이드는 쥐 Cγ.7.1 영역으로부터 유래되고, 각각 쥐 Cγ.7.1 유전자의 첫 번째 bp로부터 다운스트림에 있는 180 및 93 bp이다. 완전한 V_H 및 선도 펩타이드를 포함하는 클론을 선택한다.

2. 키메라 MASP-2 IgG 및 Fab에 대한 발현 벡터의 구성. 코자크 공통 서열(Kozak consensus sequence)를 뉴클레오타이드 서열의 5' 단부에 및 스플라이싱 공여체를 3' 단부에 추가하기 위해 상기 기술된 클로닝된 V_H 및 V_K 유전자를 PCR 반응에서 주형으로 사용한다. 서열을 분석하여 PCR 오류의 부재를 확인한 후, V_H 및 V_K 유전자를 각각 인간 C.γ1 및 C. 카파를 함유하는 발현 벡터 카세트에 삽입하여, pSV2neoV_H-huCγ1 및 pSV2neoV-huCγ를 제공한다. 중쇄- 및 경쇄 벡터의 CsCl 구배-정제된 플라스미드 DNA를 사용하여 전기천공에 의해 COS 세포를 트랜스펙션한다. 48시간 후, 배양 상층액을 ELISA로 테스트하여 키메라 IgG의 대략 200 ng/ml의 존재를 확인한다. 세포를 수확하여 전체 RNA를 제조한다. 첫 번째 가닥 cDNA를 프라이머로서 올리고 dT를 사용하여 전체 RNA로부터 합성한다. 이 cDNA를 PCR에서 주형으로 사용하여 Fd 및 카파 DNA 단편을 생성한다. Fd 유전자에 대하여, 5' 프라이머로서 5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3' (서열 번호:44) 및 CH1-유래된 3' 프라이머 (5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3' 서열 번호:45)를 사용하여 PCR을 수행한다. 인간 IgG1의 완전한 V_H 및 CH1 도메인을 함유하도록 DNA 서열을 확인한다. 적절한 효소로 분해 후, Fd DNA 단편을 발현 벡터 카세트 pSV2dhfr-TUS의 HindIII 및 BamHI 제한 부위에 삽입하여 pSV2dhfrFd를 제공한다. pSV2 플라스미드는 상업적으로 이용 가능하고 다양한 공급원의 DNA 세그먼트로 구성되어 있다: pBR322 DNA (가는 선)는 DNA 복제의 pBR322 기원 (pBR ori) 및 락타마제 앰피실린 저항성 유전자 (Amp)를 함유한다; 더 넓은 해칭(hatching)으로 대표되고 표시되는 SV40 DNA는 DNA 복제의 SV40 기원 (SV40 ori), 초기 프로모터 (dhfr 및 neo 유전자에 대하여 5'), 및 폴리아데닐화 신호 (dhfr 및 neo 유전자에 대하여 3')를 함유한다. SV40-유래된 폴리아데닐화 신호 (pA)는 또한 Fd 유전자의 3' 단부에 배치된다.

카파 유전자에 대하여, PCR을 5' 프라이머로서 5'- AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3' (서열 번호:46) 및 C_K-유래된 3' 프라이머 (5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3' 서열 번호:47)를 사용하여 수행한다. 완전한 V_K 및 인간 C_K 영역을 함유하도록 DNA 서열을 확인한다. 적절한 제한 효소로의 분해 후, 카파 DNA 단편을 발현 벡터 카세트 pSV2neo-TUS의 HindIII 및 BamHI 제한 부위에 삽입하여 pSV2neoK를 제공한다. Fd 및.카파 유전자 둘 다의 발현은 HCMV-유래된 인핸서 및 프로모터 요소에 의해 구동된다. Fd 유전자가 사슬 간 이황화 결합에 수반되는 시스테인 아미노산 잔기를 포함하지 않기 때문에, 이 재조합 키메라 Fab는 비-공유 결합된 중쇄 및 경쇄를 함유한다. 이 키메라 Fab는 cFab로 지정된다.

중쇄 및 경쇄 간 이황화 결합을 가진 재조합 Fab를 얻기 위해서, 상기 Fd 유전자는 인간 IgG1의 힌지 영역의 추가적인 9개의 아미노산 (EPKSCDKTH 서열 번호:48)에 대한 암호화 서열을 포함하도록 연장될 수도 있다. Fd 유전자의 3' 단부에서 30개의 아미노산을 암호화하는 BstEII-BamHI DNA 세그먼트를 연장된 Fd를 암호화하는 DNA 세그먼트로 대체하여, pSV2dhfrFd/9aa를 생성할 수 있다.

3. 키메라 항-MASP-2 IgG의 발현 및 정제

키메라 항-MASP-2 IgG를 분비하는 세포주를 생성하기 위해, NSO 세포를 전기천공에 의해 pSV2neoV_H-huC.γ1 및 pSV2neoV-huC 카파의 정제된 플라스미드 DNA로 트랜스펙션한다. 트랜스펙션된 세포를 0.7 mg/ml G418의 존재 하에서 선택한다. 세포를 혈청-함유 배지를 사용하여 250 ml 스피너 플라스크에서 성장시킨다.

100 ml 스피너 배양의 배양 상층액을 10-ml PROSEP-A 컬럼 (Bioprocessing, Inc., Princeton, N.J.)에 로딩한다. 컬럼을 10 충진 부피(bed volume)의 PBS로 세척한다. 결합된 항체를 50 mM 시트레이트 버퍼, pH 3.0로 용출시킨다. 동일한 부피의 1 M Hepes, pH 8.0을 정제된 항체를 함유하는 분획에 추가하여 pH를 7.0으로 조정한다. 잔류 염을 Millipore 막 한외여과 (M.W. 컷-오프: 3,000)에 의한 PBS로의 버퍼 교환에 의해 제거한다. 정제된 항체의 단백질 농도를 BCA 방법 (Pierce)에 의해 결정한다.

4. 키메라 항-MASP-2 Fab의 발현 및 정제

키메라 항-MASP-2 Fab를 분비하는 세포주를 생성하기 위해, CHO 세포를 전기천공에 의해 pSV2dhfrFd (또는 pSV2dhfrFd/9aa) 및 pSV2neokappa의 정제된 플라스미드 DNA로 트랜스펙션한다. 트랜스펙션된 세포를 G418 및 메토트렉세이트의 존재 하에서 선택한다. 선택된 세포주를 증가하는 메토트렉세이트 농도에서 증폭시킨다. 세포는 한계 희석에 의해 서브클로닝된 단일 세포이다. 이어서 고-생산 단일 세포 서브클로닝된 세포주를 무혈청 배지를 사용하여 100 ml 스피너 배양액에서 성장시킨다.

키메라 항-MASP-2 Fab를 MASP-2 MoAb에 대한 마우스 항-이디오타입 MoAb를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 정제한다. 항-이디오타입 MASP-2 MoAb를 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)과 컨쥬게이션된 쥐 항-MASP-2 MoAb로 마우스를 면역화시키고 인간 MASP-2로 완료될 수 있는 특이적 MoAb 결합에 대하여 스크리닝하여 제조할 수 있다. 정제를 위해, cFab 또는 cFab/9aa를 생산하는 CHO 세포의 스피너 배양액의 상층액 10 ml을 항-이디오타입 MASP-2 MoAb와 커플링된 친화도 컬럼에 로딩한다. 이어서 결합된 Fab를 50 mM 다이에틸아민, pH 11.5로 용출시키기 전에 컬럼을 PBS로 철저히 세척한다. 잔류 염을 상기 기술된 바와 같이 버퍼 교환에 의해 제거한다. 정제된 Fab의 단백질 농도를 BCA 방법 (Pierce)에 의해 결정한다.

키메라 MASP-2 IgG, cFab, 및 cFAb/9aa가 MASP-2-의존적 보체 경로를 억제하는 능력을 실시예 2 또는 실시예 7에서 기술된 억제 검정을 사용함으로써 결정할 수 있다.

실시예 7

이 실시예는 L-피콜린/P35, H-피콜린, M-피콜린 또는 만난을 통해 MASP-2-의존적 보체 활성화를 차단할 수 있는 MASP-2 억제제를 확인하기 위한 기능적 스크리닝으로 사용된 시험관 내 C4 분열 검정을 기술한다.

C4 분열 검정: C4 분열 검정은 Petersen, S.V., et al., J. Immunol. Methods 257:107, 2001에 의해 기술되어 있으며, L-피콜린에 결합하는 스타필로코쿠스 아우레우스의 리포테이코산 (LTA)으로부터 발생하는 렉틴 경로 활성화를 측정한다.

시약: 포르말린-고정된 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureous) (DSM20233)를 다음과 같이 제조한다: 박테리아를 트립신 처리된 대두 혈액 배지에서 37℃에서 밤새도록 성장시키고, PBS로 3회 세척한 다음, PBS/0.5% 포르말린에서 실온에서 1 h 동안 고정시키고, 코팅 버퍼 (15 mM Na₂Co₃, 35 mM NaHCO₃, pH 9.6)에 재현탁시키기 전에 PBS로 추가로 3회 세척한다.

검정: Nunc MaxiSorb 미세역가 플레이트 (Nalgene Nunc International, Rochester, NY)의 웰을 코팅 버퍼 중의 L-피콜린 1 ug과 함께 코팅 버퍼 중의 포르말린-고정된 스타필로코쿠스 아우레우스 DSM20233 (OD₅₅₀ = 0.5) 100 μl로 코팅한다. 밤새도록 인큐베이션한 후, 웰을 TBS (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, pH 7.4) 중의 0.1% 인간 혈청 알부민 (HSA)으로 블로킹한 다음, 0.05% Tween 20 및 5 mM CaCl₂를 함유하는 TBS (세척 버퍼)로 세척한다. 인간 혈청 샘플을 내인성 C4의 활성화를 방지하고 C1 복합체 (C1q, C1r 및 C1s로 구성됨)를 해리시키는 20 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 10 mM CaCl₂, 0.05% Triton X-100, 0.1% HSA, pH 7.4에 희석한다. 항-MASP-2 MoAb 및 억제 펩타이드를 포함하는 MASP-2 억제제를 다양한 농도로 혈청 샘플에 추가한다. 희석된 샘플을 플레이트에 추가하고 4℃에서 밤새도록 인큐베이션한다. 24시간 후, 플레이트를 세척 버퍼로 철저히 세척한 다음, 100 μl의 4 mM 바비탈, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH 7.4 중의 정제된 인간 C4 (Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223:46, 1993에서 기술된 바와 같이 얻어짐) 0.1 μg을 각 웰에 추가한다. 37℃에서 1.5 h 후, 플레이트를 다시 세척하고 C4b 침착을 알칼리 포스파타제-컨쥬게이션된 닭 항-인간 C4c (Immunsystem, Uppsala, Sweden으로부터 얻어짐)를 사용하여 검출하고 비색 기질 ρ-나이트로페닐 포스페이트를 사용하여 측정한다.

만난 상에서의 C4 검정: 상기 기술된 검정을 다양한 MASP-2 억제제와 혼합된 혈청을 추가하기 전에 LSP 및 만난으로 플레이트를 코팅하여 MBL을 통한 렉틴 경로 활성화를 측정하도록 조정한다.

H-피콜린 (Hakata Ag) 상에서의 C4 검정: 상기 기술된 검정을 다양한 MASP-2 억제제와 혼합된 혈청을 추가하기 전에 LSP 및 H-피콜린으로 플레이트를 코팅하여 H-피콜린을 통한 렉틴 경로 활성화를 측정하도록 조정한다.

실시예 8

다음 검정은 야생형 및 MASP-2-/- 마우스에서 고전적 경로 활성화의 존재를 입증한다.

방법: 실온에서 1시간 동안 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4 중의 0.1% 인간 혈청 알부민으로 미세역가 플레이트 (Maxisorb, Nunc, 제품 번호 442404, Fisher Scientific)를 코팅한 다음 TBS/tween/Ca²⁺에 1:1000으로 희석된 양 항 전체 혈청 항혈청 (Scottish Antibody Production Unit, Carluke, Scotland)과 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하여 면역 복합체를 제자리에서(in situ) 생성하였다. 혈청 샘플을 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻었고 코팅된 플레이트에 추가하였다. 야생형 및 MASP-2-/- 혈청 샘플로부터 C1q이 고갈된 대조군 샘플을 제조하였다. 공급자의 설명서에 따라 토끼 항-인간 C1q IgG (Dako, Glostrup, Denmark)로 코팅된 단백질-A-커플링된 Dynabeads (Dynal Biotech, Oslo, Norway)를 사용하여 C1q-고갈된 마우스 혈청을 제조하였다. 플레이트를 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 결합된 C3b를 TBS/tw/ Ca⁺⁺에 1:1000으로 희석된 다클론성 항-인간-C3c 항체 (Dako A 062)로 검출하였다. 2차 항체는 염소 항-토끼 IgG이다.

결과 : 도 7은 야생형 혈청, MASP-2-/- 혈청, C1q-고갈된 야생형 및 C1q-고갈된 MASP-2-/- 혈청 중의 IgG로 코팅된 플레이트에서 상대적인 C3b 침착 수준을 도시한다. 이러한 결과들은 고전적 경로가 MASP-2-/- 마우스 계통에서 온전하다는 것을 입증한다.

실시예 9

다음 검정을 고전적 경로가 면역 복합체에 의해 시작되는 조건 하에서 MASP-2 억제제의 효과를 분석하여 MASP-2 억제제가 고전적 경로를 차단하는지를 테스트하는데 사용한다.

방법: 고전적 경로가 면역 복합체에 의해 시작되는 보체 활성화 조건에 대한 MASP-2 억제제의 효과를 테스트하기 위해서, 90% NHS를 함유하는 3배수 50 μl 샘플을 10 μg/ml 면역 복합체 (IC) 또는 PBS의 존재 하에 37℃에서 인큐베이션하고, 37℃ 인큐베이션 동안에 200 nM 항-프로퍼딘 단클론성 항체를 함유하는 유사한 3배수 샘플 (+/-IC)을 또한 포함시킨다. 37℃에서 2시간 인큐베이션 후, 13 mM EDTA를 모든 샘플에 추가하여 추가의 보체 활성화를 중단시키고 샘플을 즉시 5℃로 냉각시킨다. 이어서 샘플을 제조사의 설명서에 따라 ELISA 키트 (Quidel, 제품 번호 A015 및 A009)를 사용하여 보체 활성화 생성물 (C3a 및 sC5b-9)에 대하여 분석하기 전에 -70℃에서 저장한다.

실시예 10

이 실시예는 MASP-2 활성을 차단하는 고 친화도 항-MASP-2 Fab2 항체 단편의 확인을 기술한다.

배경 및 근거 : MASP-2는 다음을 포함한 많은 별개의 기능적 도메인을 가진 복합 단백질이다: MBL 및 피콜린에 대한 결합 부위(들), 세린 프로테아제 촉매 부위, 단백질 가수분해 기질 C2에 대한 결합 부위, 단백질 가수분해 기질 C4에 대한 결합 부위, MASP-2 치모겐의 자가 활성화를 위한 MASP-2 분열 부위, 및 두 개의 Ca⁺⁺ 결합 부위. 높은 친화도로 MASP-2에 결합하는 Fab2 항체 단편을 확인하였고, 확인된 Fab2 단편을 그것들이 MASP-2 기능적 활성을 차단할 수 있는지를 결정하기 위해 기능적 검정에서 테스트하였다.

MASP-2 기능적 활성을 차단하기 위해, 항체 또는 Fab2 항체 단편은 MASP-2 기능적 활성에 필요한 MASP-2 상의 구조적 에피토프에 결합하여 이것을 방해해야 한다. 그러므로, 많은 또는 모든 고 친화도 결합 항-MASP-2 Fab2는 MASP-2 기능적 활성에 직접적으로 관련이 있는 MASP-2 상의 구조적 에피토프에 결합하지 않으면 MASP-2 기능적 활성을 억제하지 않을 수도 있다.

렉틴 경로 C3 컨버타제 형성의 억제를 측정하는 기능적 검정을 항-MASP-2 Fab2의 "차단 활성"을 평가하는데 사용하였다. 렉틴 경로에서 MASP-2의 주요 생리학적 역할이 렉틴-매개된 보체 경로의 그 다음 기능적 구성요소, 즉 렉틴 경로 C3 컨버타제를 생성하는 것임은 공지되어 있다. 렉틴 경로 C3 컨버타제는 C3를 C3a 및 C3b로 단백질 가수분해에 의해 분열시키는 중요한 효소 복합체 (C4bC2a)이다. MASP-2가 렉틴 경로 C3 컨버타제 (C4bC2a)의 구조적 구성요소는 아니다; 하지만, MASP-2 기능적 활성은 렉틴 경로 C3 컨버타제를 포함하는 두 개의 단백질 구성요소 (C4b, C2a)를 생성하기 위해 필요하다. 게다가, 상기 나열된 MASP-2의 별개의 기능적 활성 모두는 MASP-2가 렉틴 경로 C3 컨버타제를 생성하기 위해 필요한 것으로 보인다. 이러한 이유로, 항-MASP-2 Fab2의 "차단 활성"을 평가하는데 사용하기에 바람직한 검정은 렉틴 경로 C3 컨버타제 형성의 억제를 측정하는 기능적 검정인 것으로 생각된다.

고 친화도 Fab2의 생성: 인간 가변 경쇄 및 중쇄 항체 서열의 파지 디스플레이 라이브러리 및 관심있는 선택된 리간드와 반응하는 Fab2를 확인하기 위한 자동화된 항체 선택 기술을 사용하여 래트 MASP-2 단백질 (서열 번호:55)에 대한 고 친화도 Fab2를 생성하였다. 공지된 양의 래트 MASP-2 (~1 mg, >85% 순도) 단백질을 항체 스크리닝에 이용하였다. 세 라운드의 증폭을 최고의 친화도를 가진 항체의 선택에 이용하였다. 항체 단편을 발현하는 대략 250개의 상이한 히트(hit)를 ELISA 스크리닝을 위해 선별하였다. 고 친화도 히트를 나중에 시퀀싱하여 상이한 항체의 독특성을 결정하였다.

50개의 독특한 항-MASP-2 항체를 정제하였고 각각의 정제된 Fab2 항체 250 μg을 MASP-2 결합 친화도의 특성화 및 보체 경로 기능적 테스트에 사용하였으며, 하기 더 상세히 기술된다.

항-MASP-2 Fab2의 억제 (차단) 활성을 평가하는데 사용된 검정

1. 렉틴 경로 C3 컨버타제의 형성의 억제를 측정하기 위한 검정:

배경: 렉틴 경로 C3 컨버타제는 C3를 두 개의 강력한 전염증성 단편, 아나필라톡신 C3a 및 옵소닌 C3b로 단백질 가수분해에 의해 분열시키는 효소 복합체 (C4bC2a)이다. C3 컨버타제의 형성은 염증을 매개하는 것에 관하여 렉틴 경로의 주요 단계인 것으로 보인다. MASP-2가 렉틴 경로 C3 컨버타제 (C4bC2a)의 구조적 구성요소는 아니다; 그러므로 항-MASP-2 항체 (또는 Fab2)는 기존의 C3 컨버타제의 활성을 직접적으로 억제하지 않을 것이다. 하지만, MASP-2 세린 프로테아제 활성은 렉틴 경로 C3 컨버타제를 포함하는 두 개의 단백질 구성요소 (C4b, C2a)를 생성하는데 필요하다. 그러므로, MASP-2 기능적 활성을 억제하는 (즉, 항-MASP-2 Fab2를 차단하는) 항-MASP-2 Fab2는 렉틴 경로 C3 컨버타제의 데 노보(de novo) 형성을 억제할 것이다. C3는 구조의 일부로서 비정상적이고 고도로 반응성인 티오에스터 기를 함유한다. 이 검정에서 C3 컨버타제에 의한 C3의 분열시, C3b 상의 티오에스터 기는 에스터 또는 아미드 결합을 통해 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 고분자 상의 하이드록실 또는 아미노 기와 공유 결합을 형성할 수 있으며, 따라서 ELISA 검정에서 C3b의 검출을 용이하게 한다.

효모 만난은 렉틴 경로의 공지된 활성화제이다. C3 컨버타제의 형성을 측정하기 위한 다음 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 희석된 래트 혈청과 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 렉틴 경로를 활성화시켰다. 이어서 웰을 세척하였고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰에 고정된 C3b에 대하여 분석하였다. 이 검정에서 생성된 C3b의 양은 렉틴 경로 C3 컨버타제의 데 노보 형성의 직접적인 반영이다. 선택된 농도의 항-MASP-2 Fab2를 이 검정에서 C3 컨버타제 형성 및 결과로 일어난 C3b 생성을 억제하는 능력에 대하여 테스트하였다.

방법:

96-웰 Costar Medium Binding 플레이트를 1 ug/50 Tl/웰로 50 mM 카보네이트 버퍼, pH 9.5에 희석된 만난과 함께 5℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 밤새도록 인큐베이션한 후, 각 웰을 200 Tl PBS로 3회 세척하였다. 이어서 웰을 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민 100 Tl/웰로 차단하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 각 웰을 200 Tl의 PBS로 3회 세척하였다. 항-MASP-2 Fab2 샘플을 5℃에서 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 함유 GVB 버퍼 (4.0 mM 바비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl₂, 2.0 mM CaCl₂, 0.1% 젤라틴, pH 7.4) 중의 선택된 농도로 희석하였다. 0.5% 래트 혈청을 5℃에서 상기 샘플에 추가하였고 100 Tl을 각 웰로 옮겼다. 플레이트를 덮고 37℃ 수조에서 30분 동안 인큐베이션하여 보체 활성화시켰다. 플레이트를 37℃ 수조에서 얼음-물 혼합물을 함유하는 용기로 옮김으로써 반응을 중단시켰다. 각 웰을 PBS-Tween 20 (PBS 중의 0.05% Tween 20) 200 Tl로 5회 세척한 다음, 200 Tl PBS로 2회 세척하였다. 1차 항체 (토끼 항-인간 C3c, DAKO A0062)의 1:10,000 희석액의 100 Tl/웰을 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS에 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 5 x 200 Tl PBS로 세척하였다. 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS 중의 2차 항체 (퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG, American Qualex A102PU)의 1:10,000 희석액의 100 Tl/웰을 추가하였고 셰이커 위에서 실온에서 1시간 동안 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl PBS로 5회 세척하였다. 100 Tl/웰의 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)를 추가하였고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 퍼옥시다제 반응을 100 Tl/웰의 1.0 M H₃PO₄를 추가하여 중단시켰고 OD_450.를 측정하였다.

2. MASP-2-의존적 C4 분열의 억제를 측정하기 위한 검정

배경: MASP-2의 세린 프로테아제 활성은 MASP-2에 대하여 고도로 특이적이고 이것에 대한 단지 두 개의 단백질 기질, C2 및 C4만이 확인되었다. C4의 분열은 C4a 및 C4b를 생성한다. 항-MASP-2 Fab2는 C4 분열에 직접적으로 관련이 있는 MASP-2 상의 구조적 에피토프 (예를 들어, C4에 대한 MASP-2 결합 부위; MASP-2 세린 프로테아제 촉매 부위)에 결합하여 MASP-2의 C4 분열 기능적 활성을 억제할 수 있다.

효모 만난은 렉틴 경로의 공지된 활성화제이다. MASP-2의 C4 분열 활성을 측정하기 위한 다음 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 37℃에서 30분 동안 희석된 래트 혈청과 함께 인큐베이션하여 렉틴 경로를 활성화시켰다. 이 ELISA 검정에 사용된 1차 항체가 인간 C4만을 인식하기 때문에, 희석된 래트 혈청에 인간 C4 (1.0 Tg/ml)를 또한 공급하였다. 이어서 웰을 세척하였고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰에 고정된 인간 C4b에 대하여 분석하였다. 이 검정에서 생성된 C4b의 양은 MASP-2 의존적 C4 분열 활성의 측정값이다. 선택된 농도의 항-MASP-2 Fab2를 이 검정에서 C4 분열을 억제하는 능력에 대하여 테스트하였다.

방법: 96-웰 Costar Medium Binding 플레이트를 1.0 Tg/50 Tl/웰로 50 mM 카보네이트 버퍼, pH 9.5에 희석된 만난과 함께 5℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl PBS로 3회 세척하였다. 이어서 웰을 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민 100 Tl/웰로 블로킹하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl의 PBS로 3회 세척하였다. 항-MASP-2 Fab2 샘플을 5℃에서 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 함유 GVB 버퍼 (4.0 mM 바비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl₂, 2.0 mM CaCl₂, 0.1% 젤라틴, pH 7.4) 중의 선택된 농도로 희석하였다. 1.0 Tg/ml 인간 C4 (Quidel)를 또한 이들 샘플에 포함시켰다. 0.5% 래트 혈청을 5℃에서 상기 샘플에 추가하였고 100 Tl을 각 웰로 옮겼다. 플레이트를 덮고 37℃ 수조에서 30분 동안 인큐베이션하여 보체 활성화시켰다. 플레이트를 37℃ 수조에서 얼음-물 혼합물을 함유하는 용기로 옮김으로써 반응을 중단시켰다. 각 웰을 PBS-Tween 20 (PBS 중의 0.05% Tween 20) 200 Tl로 5회 세척한 다음, 각 웰을 200 Tl PBS로 2회 세척하였다. 비오틴-컨쥬게이션된 닭 항-인간 C4c (Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)의 1:700 희석액의 100 Tl/웰을 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS에 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl PBS로 5회 세척하였다. 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 스트렙타비딘 (Pierce Chemical #21126) 0.1 Tg/ml의 100 Tl/웰을 2.0 mg/ml BSA를 함유하는 PBS에 추가하였고 셰이커 위에서 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각 궤ㄹ을 200 Tl의 PBS로 5회 세척하였다. 100 Tl/웰의 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)을 추가하였고 실온에서 16분 동안 인큐베이션하였다. 퍼옥시다제 반응을 100 Tl/웰의 1.0 M H₃PO₄를 추가하여 중단시켰고 OD_450.을 측정하였다.

3. '고유한' 래트 MASP-2로의 항-래트 MASP-2 Fab2의 결합 검정

배경: MASP-2는 보통 특이적 렉틴 분자 (만노스-결합 단백질 (MBL) 및 피콜린)를 또한 포함하는 MASP-2 다이머 복합체로서 혈장 내에 존재한다. 그러므로, 생리학적으로 적절한 형태의 MASP-2로의 항-MASP-2 Fab2의 결합을 연구하는데 관심이 있다면, 정제된 재조합 MASP-2 대신에, 혈장 내 Fab2 및 '고유한' MASP-2 간의 상호작용이 사용되는 결합 검정을 개발하는 것이 중요하다. 이 결합 검정에서 10% 래트 혈청의 '고유한' MASP-2-MBL 복합체를 먼저 만난-코팅된 웰에 고정시켰다. 이어서 고정된 '고유한' MASP-2로의 다양한 항-MASP-2 Fab2의 결합 친화도를 표준 ELISA 방법을 사용하여 연구하였다.

방법 : 96-웰 Costar Medium Binding 플레이트를 1 Tg/50 Tl/웰로 50 mM 카보네이트 버퍼, pH 9.5에 희석된 만난과 함께 5℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl PBS로 3회 세척하였다. 웰을 PBST (0.05% Tween 20이 들어있는 PBS) 중의 0.5% 탈지 분유 100 Tl/웰로 블로킹하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl의 TBS/Tween/Ca⁺⁺ 세척 버퍼 (Tris-완충된 식염수, 0.05% Tween 20, 5.0 mM CaCl₂ 함유, pH 7.4)로 3회 세척하였다. 고염 결합 버퍼 (20 mM Tris, 1.0 M NaCl, 10 mM CaCl₂, 0.05% Triton-X100, 0.1% (w/v) 소 혈청 알부민, pH 7.4) 중의 10% 래트 혈청을 얼음 위에서 제조하였다. 100 Tl/웰을 추가하고 5℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 웰을 200 Tl의 TBS/Tween/Ca⁺⁺ 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 이어서 웰을 200 Tl PBS로 2회 세척하였다. Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 함유 GVB 버퍼 (4.0 mM 바비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl₂, 2.0 mM CaCl₂, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)에 희석된 선택된 농도의 항-MASP-2 Fab2 100 Tl/웰을 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl PBS로 5회 세척하였다. PBS 중의 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민에 1:5000으로 희석된 HRP-컨쥬게이션된 염소 항-Fab2 (Biogenesis 제품 번호 0500-0099) 100 Tl/웰을 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl PBS로 5회 세척하였다. 100 Tl/웰의 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)을 추가하였고 실온에서 70분 동안 인큐베이션하였다. 퍼옥시다제 반응을 100 Tl/웰의 1.0 M H₃PO₄를 추가하여 중단시켰고 OD_450.을 측정하였다.

결과 :

래트 MASP-2 단백질에 높은 친화도로 반응한 대략 250개의 상이한 Fab2를 ELISA 스크리닝을 위해 선별하였다. 이러한 고 친화도 Fab2를 시퀀싱하여 상이한 항체의 독특성을 결정하였고, 50개의 독특한 항-MASP-2 항체를 추가의 분석을 위해 정제하였다. 250 ug의 각각의 정제된 Fab2 항체를 MASP-2 결합 친화도의 특성화 및 보체 경로 기능적 테스트에 사용하였다. 이 분석의 결과는 하기 표 7에서 나타난다.

렉틴 경로 보체 활성화를 차단하는 항-MASP-2 FAB2

Fab2 항체 #	C3 컨버타제 (IC₅₀ (nM)	K_d	C4 분열 IC₅₀ (nM)
88	0.32	4.1	ND
41	0.35	0.30	0.81
11	0.46	0.86	<2 nM
86	0.53	1.4	ND
81	0.54	2.0	ND
66	0.92	4.5	ND
57	0.95	3.6	<2 nM
40	1.1	7.2	0.68
58	1.3	2.6	ND
60	1.6	3.1	ND
52	1.6	5.8	<2 nM
63	2.0	6.6	ND
49	2.8	8.5	<2 nM
89	3.0	2.5	ND
71	3.0	10.5	ND
87	6.0	2.5	ND
67	10.0	7.7	ND

상기 표 7에서 나타난 바와 같이, 테스트된 50개의 항-MASP-2 Fab2 중에서, 17개의 Fab2가 10 nM Fab2 이하 (34% 양성 히트율)의 IC₅₀으로 C3 컨버타제 형성을 강력하게 억제하는 MASP-2 차단 Fab2로 확인하였다. 확인된 17개의 Fab2 중 8개는 나노몰 범위 미만의 IC₅₀을 갖는다. 게다가, 표 7에서 나타난 MASP-2 차단 Fab2 17개 모두가 렉틴 경로 C3 컨버타제 검정에서 C3 컨버타제 형성의 근본적으로 완전한 억제를 제공하였다. 도 8A는 테스트된 다른 Fab2 항체를 대표하는는 Fab2 항체 #11에 대한 C3 컨버타제 형성 검정의 결과를 그래프로 나타내며, 그 결과는 표 7에서 나타나 있다. 이것은 이론적으로는 각각의 MASP-2 분자가 Fab2에 의해 결합될 때에도 "차단" Fab2가 MASP-2 기능을 단지 단편적으로만 억제할 수 있다는 것이 가능하기 때문에 중요한 고려사항이다.

만난은 렉틴 경로의 공지된 활성화제이지만, 이론적으로는 래트 혈청에서 항-만난 항체의 존재가 고전적 경로를 활성화시키고 고전적 경로 C3 컨버타제를 통해 C3b를 생성하는 것이 또한 가능하다. 하지만, 이 실시예에서 나열된 각각의 17개의 차단 항-MASP-2 Fab2가 C3b 생성을 강력하게 억제하며 (>95 %), 따라서 렉틴 경로 C3 컨버타제에 대한 이 검정의 특이성을 입증한다.

결합 검정을 또한 각각의 차단 Fab2에 대하여 분명한 K_d를 계산하기 위해 17개의 모든 차단 Fab2로 수행하였다. 차단 Fab2 중 6개에 대하여 고유한 래트 MASP-2로의 항-래트 MASP-2 Fab2의 결합 검정의 결과는 또한 표 7에서 나타난다. 도 8B는 Fab2 항체 #11로의 결합 검정의 결과를 그래프로 나타낸다. 다른 Fab2에 대하여 유사한 결합 검정을 또한 수행하였으며, 그 결과는 표 7에서 나타난다. 일반적으로, '고유한' MASP-2로의 6개의 Fab2 각각의 결합에 대하여 얻어진 분명한 K_d는 C3 컨버타제 기능적 검정에서 Fab2에 대한 IC₅₀과 합리적으로 상응한다. MASP-2가 프로테아제 활성의 활성화시 '비활성' 형태에서 '활성' 형태로의 입체구조적 변화를 거친다는 증거가 존재한다 (Feinberg et al., EMBO J 22:2348-59 (2003); Gal et al., J. Biol . Chem . 280:33435-44 (2005)). C3 컨버타제 형성 검정에 사용된 정상 래트 혈장에서, MASP-2는 주로 '비활성' 치모겐 입체구조로 존재한다. 그에 반해, 결합 검정에서는, MASP-2는 고정된 만난에 결합된 MBL과 복합체의 일부로서 존재한다; 그러므로, MASP-2는 '활성' 입체구조로 이루어져 있을 것이다 (Petersen et al., J. Immunol Methods 257:107-16, 2001). 그 결과, 각각의 검정에서 Fab2가 MASP-2의 상이한 입체구조 형태에 결합할 것이기 때문에 이들 두 가지 기능적 검정에서 테스트된 17개의 차단 Fab2 각각에 대한 IC₅₀ 및 K_d 간의 정확한 상응을 예상하지 않을 것이다. 그럼에도 불구하고, Fab2 #88을 제외하면, 두 검정에서 테스트된 다른 16개의 Fab2 각각에 대한 IC₅₀ 및 분명한 Kd 간의 합리적으로 밀접하게 상응하는 것으로 보인다 (표 7 참고).

여러 차단 Fab2를 C4의 MASP-2 매개 분열의 억제에 대하여 평가하였다. 도 8C를 C4 분열 검정의 결과를 그래프로 나타냈으며, Fab2 #41로의 억제를 나타냈고, IC₅₀=0.81 nM이었다 (표 7 참고). 도 9에서 도시된 바와 같이, 테스트된 모든 Fab2는 C3 컨버타제 검정에서 얻은 것과 유사한 IC₅₀로 C4 분열을 억제하는 것으로 발견되었다 (표 7 참고).

만난은 렉틴 경로의 공지된 활성화제이지만, 이론적으로는 래트 혈청에서 항-만난 항체의 존재가 고전적 경로를 활성화시키며 이로 인해 C4의 C1s-매개된 분열에 의해 C4b를 생성하는 것이 또한 가능하다. 하지만, C4b 생성을 강력하게 억제하는 (>95 %) 여러 항-MASP-2 Fab2를 확인하였으며, 따라서 MASP-2 매개된 C4 분열에 대한 이 검정의 특이성을 입증한다. C3과 유사하게, C4는 구조의 일부로서 비정상적이고 고도로 반응성인 티오에스터 기를 함유한다. 이 검정에서 MASP-2에 의한 C4의 분열시, C4b 상의 티오에스터 기는 에스터 또는 아미드 결합을 통해 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 고분자 상의 하이드록실 기 또는 아미노 기와 공유 결합을 형성할 수 있으며, 따라서 ELISA 검정에서 C4b의 검출을 용이하게 한다.

이러한 연구들은 C4 및 C3 컨버타제 활성 둘 다를 기능적으로 차단하며, 이로 인해 렉틴 경로 활성화를 방지하는 래트 MASP-2 단백질에 대한 고 친화도 FAB2의 생성을 분명하게 입증한다.

실시예 11

이 실시예는 실시예 10에서 기술된 바와 같이 생성된 여러 차단 항-래트 MASP-2 Fab2 항체에 대한 에피토프 맵핑을 기술한다.

방법:

도 10에서 도시된 바와 같이, 모두 N-말단 6X His 태그를 가진 다음 단백질을 pED4 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 발현시켰다:

래트 MASP-2A, 전장 MASP-2 단백질, 활성 중심에서 세린을 알라닌을 변화시킴으로써 (S613A) 비활성화됨;

래트 MASP-2K, 자가 활성화를 감소시키도록 변화된 (R424K) 전장 MASP-2 단백질;

CUBI-II, CUBI, EGF-유사 및 CUBII 도메인만을 함유하는 래트 MASP-2의 N-말단 단편; 및

CUBI/EGF-유사, CUBI 및 EGF-유사 도메인만을 함유하는 래트 MASP-2의 N-말단 단편.

이러한 단백질들을, 이전에 기술된 바와 같이 (Chen et al., J. Biol . Chem . 276:25894-02 (2001)), 니켈-친화도 크로마토그래피에 의해 배양 상층액으로부터 정제하였다.

래트 MASP-2의 CCPII 및 세린 프로테아제 도메인을 함유하는 C-말단 폴리펩타이드 (CCPII-SP)를 대장균에서 pTrxFus (Invitrogen)를 사용하여 티오레독신 융합 단백질로서 발현시켰다. 단백질을 Thiobond 친화도 수지를 사용하여 세포 용해물로부터 정제하였다. 음성 대조군으로서 티오레독신 융합 파트너를 빈 pTrxFus로부터 발현시켰다.

모든 재조합 단백질을 TBS 버퍼로 투석하였고 그 농도를 280 nm에서 OD를 측정함으로써 결정하였다.

도트 블롯 분석:

상기 기술되고 도 10에서 나타난 5개의 재조합 MASP-2 폴리펩타이드 (및 CCPII-세린 프로테아제 폴리펩타이드에 대한 음성 대조군으로서 티오레독신 폴리펩타이드)의 단계 희석액을 나이트로셀룰로스 막에 스폿팅하였다. 5배 단계에서, 스폿팅된 단백질의 양은 100 ng 내지 6.4 pg의 범위였다. 나중의 실험에서, 스폿팅된 단백질의 양은 다시 5배 단계에서 50 ng 미만 내지 16 pg의 범위였다. 막을 TBS 중의 5% 탈지 분유 (블로킹 버퍼)로 블로킹한 다음 블로킹 버퍼 (5.0 mM Ca² ⁺ 함유) 중의 1.0 μg/ml 항-MASP-2 Fab2와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 Fab2를 HRP-컨쥬게이션된 항-인간 Fab (AbD/Serotec; 1/10,000로 희석됨) 및 ECL 검출 키트 (Amersham)를 사용하여 검출하였다. 하나의 막을 양성 대조군으로서 다클론성 토끼-항 인간 MASP-2 Ab와 함께 인큐베이션하였다 (Stover et al., J Immunol 163:6848-59 (1999)에서 기술됨). 이 경우에, 결합된 Ab를 HRP-컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG (Dako; 1/2,000로 희석됨)를 사용하여 검출하였다.

MASP -2 결합 검정

ELISA 플레이트를 카보네이트 버퍼 (pH 9.0) 중의 1.0 μg/웰의 재조합 MASP-2A 또는 CUBI-II 폴리펩타이드로 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. 웰을 TBS 중의 1% BSA로 블로킹한 다음, 5.0 mM Ca² ⁺를 함유하는 TBS 중의 항-MASP-2 Fab2의 단계 희석액을 추가하였다. 플레이트를 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. TBS/tween/Ca²⁺로 3회 세척한 후, TBS/Ca² ⁺에 1/10,000으로 희석된 HRP-컨쥬게이션된 항-인간 Fab (AbD/Serotec)를 추가하였고 플레이트를 RT에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 TMB 퍼옥시다제 기질 키트 (Biorad)를 사용하여 검출하였다.

결과:

다양한 MASP-2 폴리펩타이드와의 Fab2의 반응성을 입증하는 도트 블롯 분석의 결과를 표 8에서 제공한다. 표 8에서 제공된 많은 값들은 대략 반-최대 신호 강도를 제공하는데 필요한 스폿팅된 단백질의 양을 나타낸다. 나타난 바와 같이, 모든 폴리펩타이드 (티오레독신 융합 파트너 단독을 제외하고)가 양성 대조군 Ab (다클론성 항-인간 MASP-2 혈청, 토끼에서 생성됨)에 의해 인식되었다.

도트 블롯에서 다양한 재조합 래트 MASP-2 폴리펩타이드와의 반응성

Fab2 항체 #	MASP-2A	CUBI-II	CUBI/EGF-유사	CCPII-SP	티오레독신
40	0.16 ng	NR	NR	0.8 ng	NR
41	0.16 ng	NR	NR	0.8 ng	NR
11	0.16 ng	NR	NR	0.8 ng	NR
49	0.16 ng	NR	NR	>20 ng	NR
52	0.16 ng	NR	NR	0.8 ng	NR
57	0.032 ng	NR	NR	NR	NR
58	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
60	0.4 ng	0.4 ng	NR	NR	NR
63	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
66	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
67	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
71	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
81	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
86	0.4 ng	NR	NR	10 ng	NR
87	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
양성 대조군	<0.032 ng	0.16 ng	0.16 ng	<0.032 ng	NR

NR = 무반응. 양성 대조군 항체는 다클론성 항-인간 MASP-2 혈청이며, 토끼에서 생성되었다.

모든 Fab2가 MASP-2A 뿐만 아니라 MASP-2K와 반응하였다 (데이터 미도시). 대부분의 Fab2는 CCPII-SP 폴리펩타이드를 인식하였지만 N-말단 단편을 인식하지 못했다. 두 가지 예외는 Fab2 #60 및 Fab2 #57이었다. Fab2 #60은 MASP-2A 및 CUBI-II 단편을 인식하지만, CUBI/EGF-유사 폴리펩타이드 또는 CCPII-SP 폴리펩타이드를 인식하지 못했으며, 그것이 CUBII의 에피토프에 결합하거나, 또는 CUBII 및 EGF-유사 도메인으로 이어진다는 것을 시사한다. Fab2 # 57은 MASP-2A를 인식하지만 테스트된 MASP-2 단편 중 어느 것도 인식하지 못했으며, 이 Fab2가 CCP1의 에피토프를 인식한다는 것을 나타낸다. Fab2 #40 및 #49는 완전한 MASP-2A에만 결합하였다. 도 11에서 도시된 ELISA 결합 검정에서, Fab2 #60은 약간 더 낮은 명백한 친화도를 갖지만, CUBI-II 폴리펩타이드에도 결합하였다.

이러한 발견은 MASP-2 단백질의 다수의 영역에 대하여 독특한 차단 Fab2의 확인을 입증한다.

실시예 12

이 실시예는 쥐 황반 변성 모델에서 MASP-2-/-의 결과를 기술한다.

배경/근거 : 나이-관련 황반 변성 (AMD)은 산업화된 세계에서 55세 이후에 실명의 주요 원인이다. AMD는 두 가지 주요 형태로 발생한다: 신생 혈관 (습성) AMD 및 위축성 (건성) AMD. AMD에 걸린 개체 중 단지 ~20%만이 습성 형태에 걸리지만, 신생 혈관 (습성) 형태는 AMD와 관련된 중증 시각 상실의 90%를 차지한다. AMD의 임상적 홀마크(hallmark)는 다수의 드루젠, 지도모양 위축, 및 맥락막 혈관 신생 (CNV)을 포함한다. 2004년 12월에, FDA는 AMD의 습성 (신생 혈관) 형태의 치료를 위해 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 특이적으로 표적화하고 그 효과를 차단하기 위한 새로운 분류의 안약인 Macugen (페가프타닙)을 승인하였다 (Ng et al., Nat Rev. Drug Discov 5:123-32 (2006)). Macugen이 AMD 환자의 하위 집단에 대한 유망한 새로운 치료 옵션을 나타내지만, 이 복합 질환에 대한 추가적인 치료를 개발하는 것이 절실하게 필요하다. 다수의 독립적인 조사 라인은 보체 활성화의 중심 역할이 AMD의 발병과 관련이 있음을 보여준다. AMD의 가장 심각한 형태인 맥락막 혈관 신생 (CNV)의 발병은 보체 경로의 활성화를 수반한다.

25년 이상 전에, Ryan은 동물의 CNV 레이져-유도된 손상 모델을 기술하였다 (Ryan, S.J., Tr . Am. Opth . Soc . LXXVII:707-745, 1979). 모델은 처음에는 붉은 털 원숭이(rhesus monkey)를 사용하여 계발되었지만, 그 이후로 상기 기술은 마우스를 포함한 다양한 연구 동물에서 CNV의 유사한 모델을 개발하는데 사용되었다 (Tobe et al., Am. J. Pathol . 153:1641-46, 1998). 이 모델에서, CNV-유사 막의 형성을 유도하는 작용인 레이져 광응고를 사용하여 브루크 막을 파괴하였다. 레이져-유도된 모델은 인간 병태의 많은 중요한 특징을 포착한다 (최근 재검토를 위해, Ambati et al., Survey Ophthalmology 48:257-293, 2003 참고). 레이져-유도된 마우스 모델은 현재 잘 확립되어 있고, 많은, 심지어 증가하는 수의 연구 과제에서 실험의 근거로 사용되고 있다. 일반적으로는 레이져-유도된 모델이 인간의 CNV와 충분한 생물학적 유사성을 공유하고 이 모델을 사용한 발병 및 약물 억제의 전임상적 연구가 인간의 CNV와 관련이 있는 것으로 받아들여진다.

방법 :

실시예 1에서 기술된 바와 같이 MASP-2-/- 마우스를 발생시켜 10세대 동안 C57Bl/6과 역교배시켰다. 현재의 연구는 MASP-2 (-/-) 및 MASP-2 (+/+) 수컷 마우스가 레이져-유도된 CNV의 과정, 조직 손상의 측정값으로서 스캐닝 레이져 공초점 현미경에 의해 레이져-유도된 CNV의 부피에 초점을 맞춘 신생 혈관 AMD의 가속화 모델 및 망막 색소 상피 (RPE)/맥락막에서 레이져 손상 이후 ELISA에 의한 CNV와 관련이 있는 강력한 혈관 형성 인자인 VEGF의 수준의 결정에서 평가될 때의 결과를 비교하였다.

맥락막 혈관 신생 ( CNV )의 유도: 레이져 광응고 (532 nm, 200 mW, 100 ms, 75μm; Oculight GL, Iridex, Mountain View, CA)를 약물군 할당이 감춰진 단일 개체에 의해 제0 일에 각 동물의 두 눈에서 수행하였다. 세극등 전달 시스템 및 콘택트 렌즈로서 커버슬립을 사용하여 표준화된 방식으로 시신경 주위에 레이져 스폿을 적용하였다. 레이져 손상의 형태학적 종점은 브루크 막의 붕괴와 연관성이 있는 것으로 생각되는 징후인 공동화 기포의 출현이었다. 상세한 방법 및 평가된 종점은 다음과 같다.

플루오레세인 혈관 조영술: 레이져 광응고 이후 1주일에 카메라 및 이미징 시스템 (TRC 50 1A 카메라; ImageNet 2.01 시스템; Topcon, Paramus, NJ)을 이용하여 플루오레세인 혈관 조영술을 수행하였다. 사진을 2.5% 플루오레세인 나트륨 0.1 ml의 복강내 주사 후 안저 카메라 렌즈와 접촉된 20-D 렌즈로 캡쳐하였다. 레이져 광응고 또는 혈관 조영술에 수반되지 않은 망막 전문가가 감춰진 방식으로 플루오레세인 혈관 조영도를 단 한 번에 평가하였다.

맥락막 혈관 신생 부피 ( CNV ): 레이져 손상 후 1주일에, 안구를 적출하고 4℃에서 30분 동안 4% 파라포름알데하이드로 고정하였다. 전안부를 제거하여 냉안배(eye cup)를 얻었고 PBS로 3회 세척한 후 이어서, 메탄올 계열을 통해 탈수 및 재수화시켰다. 실온에서 30분 동안 버퍼 (1% 소 혈청 알부민 및 0.5% Triton X-100을 함유하는 PBS)로 2회 블로킹시킨 후, 냉안배를 0.5% FITC-아이소렉틴 B4 (Vector laboratories, Burlingame, CA)와 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였고, 내피 세포의 표면 상의 말단 β-D-갈락토스 잔기에 결합하고 선택적으로 쥐 혈관 구조를 라벨링하는 0.2% BSA 및 0.1% Triton X-100을 함유하는 PBS로 희석하였다. 0.1% Triton X-100을 함유하는 PBS로 2회 세척한 후, 감각신경 망막을 부드럽게 떼어내고 시신경을 잘라냈다. 네 개의 이완 방사형 절개물을 제조하였고, 남아있는 RPE-맥락막-공막 복합체를 안티페이드(antifade) 배지 (Immu-Mount Vectashield Mounting Medium; Vector Laboratories)에 플랫마운팅하였고(flatmount) 커버슬립을 덮었다.

플랫마운팅된 것을 스캐닝 레이져 공초점 현미경 (TCS SP; Leica, Heidelberg, Germany)으로 검사하였다. 혈관을 파란 아르곤 파장 (488 nm)으로 여기시키고 515 내지 545 nm에서의 방출을 캡쳐하여 가시화하였다. 40X 유침용 대물렌즈를 모든 이미지화 연구에 사용하였다. 수평 광학 절편 (1 μm 단계)을 RPE-맥락막-공막 복합체의 표면으로부터 얻었다. 병변에 연결된 주위의 맥관 네트워크가 확인될 수 있는 가장 깊은 초점면을 병변의 바닥인 것으로 판단하였다. 레이져-표적화된 영역에 있고 이 참고면에 표면 상에 있는 임의의 혈관을 CNV로 판단하였다. 각각의 절편의 이미지를 디지털 방식으로 저장하였다. CNV-관련 형광 발광 면적을 현미경 소프트웨어 (TCS SP; Leica)를 이용한 컴퓨터 이미지 분석으로 측정하였다. 각각의 수평 절편의 전체 형광 발광 면적의 합계를 CNV의 부피에 대한 지표로 사용하였다. 처리군 할당이 감춰진 조작자에 의해 이미지화를 수행하였다.

각각의 레이져 병변이 CNV로 발달할 확률은 그것이 속한 군 (마우스, 눈, 및 레이져 스폿)에 의해 영향을 받기 때문에, 평균 병변 부피를 분할 플롯 반복-측정 디자인의 선형 혼합 모델을 사용하여 비교하였다. 전체 플롯 인자는 동물이 속한 유전군인 반면, 분할 플롯 인자는 눈이었다. 통계적 유의성을 0.05 수준에서 결정하였다. 평균의 사후(Post hoc) 비교를 다중 비교를 위해 본페로니 조정(Bonferroni adjustment)을 이용하여 구성하였다.

VEGF ELISA. 12개의 레이져 스폿에 의한 손상 3일 후, RPE-맥락막 복합체를 용해 버퍼 (프로테아제 억제자가 들어있는 20 mM 이미다졸 HCl, 10 mM KCl, 1 mM MgCL₂, 10 mM EGTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 1 mM Na 몰리브데이트, 및 1 mM EDTA) 중에서 얼음 위에서 15분 동안 초음파 처리하였다. 상층액 내 VEGF 단백질 수준을 450 내지 570 nm (Emax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 모든 스플라이싱 변종을 인식하는 ELISA 키트 (R&D Systems, Minneapolis, MN)에 의해 결정하였고 전체 단백질에 대하여 표준화하였다. 2배수 측정을 광응고, 이미지화, 또는 혈관 조영술과 관련이 없는 조작자에 의해 감춰진 방식으로 수행하였다. VEGF 수치를 적어도 3회의 독립적인 실험의 평균 +/- SEM으로 나타냈고 만-휘트니(Mann-Whitney) U 테스트를 사용하여 비교하였다. 귀무 가설을 P<0.05에서 거부하였다.

결과 :

VEGF 수준의 평가:

도 12A는 제0 일에 C57Bl6 야생형 및 MASP-2(-/-) 마우스로부터 분리된 RPE-맥락막 복합체의 VEGF 단백질 수준을 그래프로 나타낸다. 도 12A에서 도시된 바와 같이, VEGF 수준의 평가는 C57bl 야생형 대조군 마우스에 비해 MASP-2 (-/-) 마우스의 VEGF에 대한 베이스라인 수준의 감소를 나타낸다. 도 12B는 레이져 유도된 손상 후 제3 일에 측정된 VEGF 단백질 수준을 그래프로 나타낸다. 도 12B에서 도시된 바와 같이 VEGF 수준은 레이져 유도된 손상 후 3일에 야생형 (+/+) 마우스에서 크게 증가하였으며, 발표된 연구와 일치한다 (Nozaki et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 103:2328-33 (2006)). 하지만, 놀랍게도 MASP-2 (-/-) 마우스에서는 매우 낮은 수준의 VEGF를 볼 수 있다.

맥락막 혈관 신생 ( CNV )의 평가:

레이져 유도된 황반 변성 후 VEGF 수준의 감소에 더하여, 레이져 손상 전과 후의 CNV 면적을 결정하였다. 도 13은 레이져 유도된 손상 후 제7 일에 C57bl 야생형 마우스 및 MASP-2(-/-) 마우스에서 측정된 CNV 부피를 그래프로 나타낸다. 도 13에서 도시된 바와 같이, MASP-2 (-/-) 마우스는 야생형 대조군 마우스와 비교하여 제7 일에 레이져 유도된 손상 후 CNV 면적의 약 30% 감소를 나타냈다.

이러한 결과들은 야생형 (+/+) 대조군에 비해 MASP (-/-) 마우스에서 볼 수 있는 바와 같이 VEGF 및 CNV의 감소를 나타내고 억제자로 MASP-2의 차단이 황반 변성의 치료에서 예방적 또는 치료적 효과를 가질 것이라는 것을 나타낸다.

실시예 13

이 실시예는 실시예 10에서 기술된 바와 같이 확인된 대표적인 고 친화도 항-MASP-2 Fab2 항체의 약역학적 분석을 기술한다.

배경/근거 :

실시예 10에서 기술된 바와 같이, 래트 렉틴 경로를 차단하는 고-친화도 항체를 확인하기 위해, 래트 MASP-2 단백질을 이용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하였다(pan). 이 라이브러리를 높은 면역학적 다양성을 제공하도록 설계하였고 전체적으로 인간 면역글로빈 유전자 서열을 사용하여 구성하였다. 실시예 10에서 기술된 바와 같이, ELISA 스크리닝에 의해 래트 MASP-2 단백질에 높은 친화도로 결합하는 대략 250개의 개개의 파지 클론을 확인하였다. 이러한 클론들의 시퀀싱은 50개의 독특한 MASP-2 항체를 암호화하는 파지를 확인하였다. Fab2 단백질을 이들 클론들로부터 발현시키고, 정제하여 MASP-2 결합 친화도 및 렉틴 보체 경로 기능적 억제에 대하여 분석하였다.

실시예 10의 표 7에서 나타난 바와 같이, 기능적 차단 활성을 가진 17개의 항-MASP-2 Fab2를 이 분석의 결과로서 확인하였다 (차단 항체에 대하여 34% 히트율). Fab2에 의한 렉틴 보체 경로의 기능적 억제는 C4 침착의 수준에서 분명하였으며, 이것은 MASP-2에 의한 C4 분열의 직접적인 측정이다. 중요하게는, 억제는 C3 컨버타제 활성을 평가할 때 동일하게 나타났으며, 렉틴 보체 경로의 기능적 차단을 입증한다. 실시예 10에서 기술된 바와 같이 확인된 17개의 MASP-2 차단 Fab2는 10 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 C3 컨버타제 형성을 강력하게 억제한다. 확인된 17개의 Fab2 중 8개는 나노몰 미만의 범위 내의 IC₅₀ 값을 갖는다. 게다가, MASP-2 차단 Fab2 17개 모두는 도 8A-C에서 도시된 바와 같이 렉틴 경로 C3 컨버타제 검정에서 C3 컨버타제 형성의 본질적으로 완전한 억제를 제공하고, 실시예 10의 표 7에서 요약되었다. 더욱이, 표 7에서 나타난 각각의 17개의 차단 항-MASP-2 Fab2는 C3b 생성을 강력하게 억제하였으며 (>95%), 따라서 렉틴 경로 C3 컨버타제에 대한 이 검정의 특이성을 입증한다.

래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 전장 항체 아이소타입 변종은 Fab2 #11로부터 유래되었다. 이 실시예는 약역학적 파라미터에 대한 이들 아이소타입의 생체 내 특성화를 기술한다.

방법 :

실시예 10에서 기술된 바와 같이, 래트 MASP-2 단백질을 이용하여 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하였으며, Fab2#11로부터 확인하였다. 래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 전장 항체 아이소타입 변종은 Fab2 #11로부터 유래되었다. 래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 전장 항체 아이소타입 둘 다를 다음과 같이 약역학적 파라미터에 대하여 생체 내에서 특성화하였다.

마우스에서 생체 내 연구:

생체 내에서 혈장 렉틴 경로 활성에 대한 항-MASP-2 항체 투약의 효과를 조사하기 위해서 마우스에서 약역학적 연구를 수행하였다. 이 연구에서, 렉틴 경로 검정에서 마우스 항-MASP-2 MoAb (Fab2#11로부터 유래된 마우스 IgG2a 전장 항체 아이소타입) 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg의 피하 (SC) 및 복강내 (IP) 투여 후 다양한 시점에 C4 침착을 생체 외에서 측정하였다.

도 14는 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg의 마우스 항-MASP-2 MoAb의 피하 투약 후 다양한 시점에 마우스 (n=3 마우스/군)로부터 채취된 희석되지 않은 혈청 샘플에서 생체 외에서 측정된 렉틴 경로 특이적 C4b 침착을 그래프로 나타냈다. 항체 투약 전 수거된 마우스의 혈청 샘플은 음성 대조군 (100% 활성)의 역할을 하는 한편, 시험관 내에서 같은 차단 항-MASP-2 항체 100 nM이 보충된 혈청을 양성 대조군 (0% 활성)으로 사용하였다.

도 14에서 도시된 결과는 1.0 mg/kg 용량의 마우스 항-MASP-2 MoAb의 피하 투여 후 C4b 침착의 신속하고 완전한 억제를 입증한다. 0.3 mg/kg 용량의 마우스 항-MASP-2 MoAb의 피하 투여 후 C4b 침착의 부분적인 억제를 볼 수 있었다.

마우스에서 렉틴 경로 회복의 시간 경과는 0.6 mg/kg으로 마우스 항-MASP-2 MoAb의 1회 IP 투여 후 3주 동안 이어졌다. 도 15에서 도시된 바와 같이, 항체 투약 이후 렉틴 경로 활성의 급작스러운 하락이 발생하였고 이어서 완전한 렉틴 경로 억제가 IP 투여 후 약 7일 동안 지속되었다. 렉틴 경로 활성의 느린 복원을 제2 및 제3 주 동안 관찰하였으며, 렉틴 경로는 마우스에서 항-MASP-2 MoAb 투여 후 17일까지 완전히 복원되었다.

이러한 결과들은 Fab2 #11로부터 유래된 마우스 항-MASP-2 Moab가 전신으로 전달될 때 용량-반응성인 방식으로 마우스의 렉틴 경로를 억제한다는 것을 입증한다.

실시예 14

이 실시예는 나이-관련 황반 변성에 대한 마우스 모델에서의 효능에 대한 Fab2 #11로부터 유래된 마우스 항-MASP-2 Moab의 분석을 기술한다.

배경/근거 :

실시예 10에서 기술된 바와 같이, 래트 MASP-2 단백질을 이용하여 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하였으며, Fab2#11로부터 기능적으로 활성인 항체를 확인하였다. 래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 아이소타입의 전장 항체를 Fab2 #11로부터 생성하였다. 마우스 IgG2a 아이소타입의 전장 항-MASP-2 항체를 실시예 13에서 기술된 바와 같이 약역학적 파라미터에 대하여 특성화하였다. 이 실시예에서, Fab2 #11로부터 유래된 마우스 항-MASP-2 전장 항체를 Bora P.S. et al, J Immunol 174:491-497 (2005)에 의해 기술된 나이-관련 황반 변성 (AMD)의 마우스 모델에서 분석하였다.

방법 :

실시예 13에서 기술된 Fab2 #11로부터 유래된 마우스 IgG2a 전장 항-MASP-2 항체 아이소타입을 다음 변형을 가진 실시예 12에서 기술된 나이-관련 황반 변성 (AMD)의 마우스 모델에서 테스트하였다.

마우스-항- MASP -2 MoAb의 투여

아이소타입 대조군 MoAb 처리와 함께 두 가지 상이한 용량 (0.3 mg/kg 및 1.0 mg/kg)의 마우스 항-MASP-2 MoAb를 CNV 유도 전 16시간에 WT (+/+) 마우스 (군 당 n= 8 마우스)에 IP 주사하였다.

맥락막 혈관 신생 ( CNV )의 유도

맥락막 혈관 신생 (CNV)의 유도 및 CNV 부피 측정을 실시예 12에서 기술된 바와 같이 레이져 광응고를 사용하여 수행하였다.

결과 :

도 16은 아이소타입 대조군 MoAb, 또는 마우스 항-MASP-2 MoAb (0.3 mg/kg 및 1.0 mg/kg)로 처리된 마우스에서 레이져 손상 후 7일에 측정된 CNV 면적을 그래프로 나타낸다. 도 16에서 도시된 바와 같이, 1.0 mg/kg 항-MASP-2 MoAb로 전처리된 마우스에서, 통계적으로 유의한 (p <0.01) CNV의 대략 50% 감소를 레이져 처리 후 7일에 관찰하였다. 도 16에서 추가로 도시된 바와 같이, 0.3 mg/kg 용량의 항-MASP-2 MoAb가 CNV를 감소시키는데 효과적이지 않다는 것을 관찰하였다. 실시예 13에서 기술되고 도 14에서 도시된 바와 같이, 0.3 mg/kg 용량의 항-MASP-2 MoAb는 피하 투여 후 C4b 침착의 부분적이고 일시적인 억제를 나타내는 것으로 나타났다.

이 실시예에서 기술된 결과는 항-MASP-2 MoAb와 같은 억제자로의 MASP-2의 차단이 황반 변성의 치료시 예방적 및/또는 치료적 효과를 갖는다는 것을 입증한다. 이러한 결과들은 실시예 12에서 기술된, MASP-2 (-/-) 마우스에서 수행된 연구에서 관찰된 결과와 일치하며, 야생형 대조군 마우스와 비교하여 MASP-2 (-/-) 마우스에서 레이져 처리 후 7일에 CNV의 30% 감소를 관찰하였다. 더욱이, 이 실시예의 결과들은 전신으로 전달된 항-MASP-2 항체가 눈의 국소적인 치료적 이익을 제공하며, 이로 인해 AMD 환자를 치료하기 위한 전신 투여 경로에 대한 가능성을 강조한다는 것을 추가로 입증한다. 요약하면, 이러한 결과들은 AMD 치료시 MASP-2 MoAb의 사용을 지지하는 증거를 제공한다.

실시예 15

이 실시예는 파지 디스플레이를 사용하여 MASP-2에 결합하여 렉틴-매개된 보체 활성화를 억제하는 한편 면역 시스템의 고전적 (C1q-의존적) 경로 구성요소를 온전하게 남겨두는 완전한 인간 scFv 항체의 확인을 기술한다.

개요 :

완전한 인간, 고-친화도 MASP-2 항체를 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하여 확인하였다. 항체의 가변 경쇄 및 중쇄 단편을 scFv 포맷 및 전장 IgG 포맷 둘 다에서 단리시켰다. 인간 MASP-2 항체는 렉틴 경로-매개된 대체 보체 경로 활성화와 관련된 세포 손상을 억제하는데 유용하지만, 면역 시스템의 고전적 (C1q-의존적) 경로 구성요소를 온전하게 남겨둔다. 일부 구체예에서, 대상 MASP-2 억제 항체는 다음 특성을 갖는다: (a) 인간 MASP-2에 대한 높은 친화도 (예를 들어, 10 nM 이하의 K_D), 및 (b) 30 nM 이하의 IC₅₀으로 90% 인간 혈청의 MASP-2-의존적 보체 활성을 억제한다.

방법 :

전장 촉매 비활성 MASP -2의 발현 :

선도 서열 (서열 번호:5)을 가진 인간 MASP-2 폴리펩타이드를 암호화하는 인간 MASP-2의 전장 cDNA 서열 (서열 번호: 4)을 CMV 인핸서/프로모터 영역의 제어 하에서 진핵세포 발현을 구동하는 포유동물 발현 벡터 pCI-Neo (Promega)에 서브클로닝하였다 (Kaufman R.J. et al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)에서 기술됨).

촉매 비활성 인간 MASP-2A 단백질을 생성하기 위해, 부위-특이적 돌연변이 유발을 본원에 참고로 포함된 US2007/0172483에서 기술된 바와 같이 수행하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동 및 벤드 제조 후 정제하였고 표준 테일링 과정을 사용하여 단일 아데노신 중첩을 생성하였다. 이어서 아데노신-테일링된 MASP-2A를 pGEM-T easy 벡터에 클로닝하였고 대장균으로 형질전환시켰다. 인간 MASP-2A를 포유동물 발현 벡터 pED 또는 pCI-Neo 중 하나로 추가로 서브클로닝하였다.

상기 기술된 MASP-2A 발현 구조체를 표준 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 과정을 사용하여 DXB1 세포로 트랜스펙션하였다 (Maniatis et al., 1989). MASP-2A를 무혈청 배지에서 생산하여 조제물이 다른 혈청 단백질로 오염되지 않았음을 보장하였다. 배지를 융합성 세포로부터 이틀마다 (총 4회) 수확하였다. 재조합 MASP-2A의 수준은 대략 1.5 mg/리터의 배양 배지를 평균으로 하였다. MASP-2A (상기 기술된 Ser-Ala 돌연변이)를 MBP-A-아가로스 컬럼 상에서의 친화도 크로마토그래피로 정제하였다.

패닝 / scFv 전환 및 필터 스크리닝에 의해 확인된 ScFv 후보 클론에 대한 MASP-2A ELISA

인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열의 파지 디스플레이 라이브러리를 항원 패닝시킨 후 이어서 자동화된 항체 스크리닝 및 선택하여 인간 MASP-2 단백질에 대한 고-친화도 scFv 항체를 확인하였다. HIS-태그된 또는 비오틴-태그된 MASP-2A에 대한 scFv 파지 라이브러리의 3라운드의 패닝을 수행하였다. 세 번째 패닝 라운드를 먼저 MBL에 이어서 TEA (알칼리)로 용출시켰다. 표적 MASP-2A에 대한 파지 디스플레이 scFv 단편의 특이적 풍부화를 모니터링하기 위해, 고정된 MASP-2A에 대한 다클론성 파지 ELISA를 수행하였다. 패닝 라운드 3의 scFv 유전자를 pHOG 발현 벡터로 클로닝하고 소규모 필터 스크리닝을 수행하여 MASP-2A에 대한 특이적 클론을 찾았다.

패닝 제3 라운드의 scFv 단편을 암호화하는 플라스미드를 함유하는 박테리아 콜로니를 선별하고, 나이트로셀룰로스 막으로 그리드(grid)하고 비-유도성 배지에서 밤새도록 키워서 마스터 플레이트를 생산하였다. 총 18,000개의 콜로니를 선별하고 제3 패닝 라운드로부터, 절반은 경쟁적 용출로부터 다른 절반은 후속 TEA 용출로부터 분석하였다. MASP-2A에 대한 scFv 파지미드 라이브러리의 패닝에 이은 scFv 전환 및 필터 스크리닝은 137개의 양성 클론을 수득하였다. 108/137 클론은 ELISA 검정에서 MASP-2 결합에 대하여 양성이었으며 (데이터 미도시), 이것들 중에서 45개의 클론을 정상 인간 혈청에서 MASP-2 활성을 차단하는 능력에 대하여 추가로 분석하였다.

렉틴 경로 C3 컨버타제의 형성의 억제를 측정하기 위한 검정

렉틴 경로 C3 컨버타제 형성의 억제를 측정하는 기능적 검정을 사용하여MASP-2 scFv 후보 클론의 "차단 활성"을 평가하였다. 렉틴 경로 C3 컨버타제를 포함하는 두 개의 단백질 구성요소 (C4b, C2a)를 생성하기 위해 MASP-2 세린 프로테아제 활성이 필요하다. 그러므로, MASP-2 기능적 활성을 억제하는 MASP-2 scFv (즉, 차단 MASP-2 scFv)는 렉틴 경로 C3 컨버타제의 데 노보 형성을 억제할 것이다. C3는 구조의 일부로서 비정상적이고 고도로 반응성인 티오에스터 기를 함유한다. 이 검정에서 C3 컨버타제에 의한 C3의 분열시, C3b 상의 티오에스터 기는 에스터 또는 아미드 결합을 통해 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 고분자 상의 하이드록실 또는 아미노 기와의 공유 결합을 형성할 수 있으며, 따라서 ELISA 검정에서 C3b의 검출을 용이하게 한다.

효모 만난은 공지된 렉틴 경로 활성화제이다. C3 컨버타제의 형성을 측정하기 위한 다음 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 희석된 인간 혈청과 함께 인큐베이션하여 렉틴 경로를 활성화시킨다. 이어서 웰을 세척하고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰에 고정된 C3b에 대하여 분석하였다. 이 검정에서 생성된 C3b의 양은 렉틴 경로 C3 컨버타제의 데 노보 형성의 직접적인 반영이다. 선택된 농도의 MASP-2 scFv 클론을 이 검정에서 C3 컨버타제 형성 및 후속적인 C3b 생성을 억제하는 능력에 대하여 테스트하였다.

방법 :

상기 기술된 바와 같이 확인된 45개의 후보 클론을 발현시키고, 정제하고 같은 스톡 농도로 희석하였으며, 이것을 다시 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 함유 GVB 버퍼 (4.0 mM 바비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl₂, 2.0 mM CaCl₂, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)에서 희석하여 모든 클론이 같은 양의 버퍼를 갖는다는 것을 보장한다. scFv 클론을 각각 2 μg/mL의 농도에서 3배수로 테스트하였다. 양성 대조군은 OMS100 Fab2였고 0.4 μg/mL에서 테스트하였다. scFv/IgG 클론의 존재 및 부재시 C3c 형성을 모니터링하였다.

만난을 50mM 카보네이트 버퍼 (15mM Na₂CO₃ + 35mM NaHCO₃ + 1.5 mM NaN₃), pH 9.5 중의 20 μg/mL (1 μg/웰)의 농도로 희석하였고 4℃에서 밤새도록 ELISA 플레이트에서 코팅하였다. 그 다음 날, 만난-코팅된 플레이트를 200 μl PBS로 3회 세척하였다. 이어서 1% HSA 차단 용액 100 μl를 웰에 추가하였고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 200 μl PBS로 3회 세척하였고, 샘플을 추가할 때까지 200 μl PBS와 함께 얼음 위에서 저장하였다.

정상 인간 혈청을 CaMgGVB 버퍼에서 0.5%로 희석하였고, scFv 클론 또는 OMS100 Fab2 양성 대조군을 0.01 μg/mL; 1 μg/mL (OMS100 대조군 단독) 및 10 μg/mL로 3배수로 이 버퍼에 추가하였고 블로킹된 ELISA 플레이트에 추가하기 전에 얼음 위에서 45분 동안 사전 인큐베이션하였다. 반응을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 시작하였고 플레이트를 얼음 수조로 옮김으로써 중단시켰다. C3b 침착을 검출하였다. 토끼 α-마우스 C3c 항체에 이어서 염소 α-토끼 HRP로 검출하였다. 음성 대조군을 항체가 없는 버퍼이고 (항체 없음 = 최대 C3b 침착), 양성 대조군은 EDTA가 들어있는 버퍼이다 (C3b 침착 없음). 웰에 만난이 없다는 것을 제외하면 같은 검정을 수행함으로써 백그라운드를 결정하였다. 만난이 없는 플레이트에 대한 백그라운드 신호를 만난-함유 웰의 신호에서 뺐다. 컷-오프 기준을 무관한 scFv 클론 (VZV) 및 버퍼 단독의 활성의 절반으로 설정하였다.

결과 : 컷-오프 기준에 기초하여, 총 13개의 클론이 MASP-2 활성을 차단하는 것을 발견하였다. > 50% 경로 억제를 생산하는 13개의 클론 모두를 선택하고 시퀀싱하여, 10개의 독특한 클론을 수득하였다. 10개의 클론 모두가 같은 경쇄 하위 분류, λ3를 갖지만, 상이한 세 개의 중쇄 하위 분류, VH2, VH3 및 VH6을 갖는다는 것을 발견하였다. 기능적 검정에서, 10개의 후보 scFv 클론 중 5개가 0.5% 인간 혈청을 사용하는 25 nM 표적 기준보다 낮은 IC₅₀ nM 값을 제공하였다.

개선된 효능을 가진 항체를 확인하기 위해서, 상기 기술된 바와 같이 확인된 3개의 모체 scFv 클론을 경쇄 셔플링(shuffling)하였다. 이 공정은 6개의 건강한 공여체로부터 유래된 나이브, 인간 람다 경쇄 (VL)의 라이브러리와 쌍을 형성하는 각각의 모 클론의 VH로 구성된 조합 라이브러리의 생성을 수반하였다. 이어서 이 라이브러리를 개선된 결합 친화도 및/또는 기능성을 가진 scFv 클론에 대하여 스크리닝하였다.

선도 딸 클론 및 그것들의 각각의 모 클론 (모두 scFv 포맷)의 IC₅₀ (nM)에서 기능적 효능의 비교

scFv 클론	1% 인간 혈청 C3 검정 (IC ₅₀ nM)	90% 인간 혈청 C3 검정 (IC ₅₀ nM)	90% 인간 혈청 C4 검정 (IC ₅₀ nM)
17D20mc	38	nd	nd
17D20m_d3521N11	26	>1000	140
17N16mc	68	nd	nd
17N16m_d17N9	48	15	230

상기 표 9에서 나타난 모 클론 및 딸 클론에 대한 중쇄 가변 영역 (VH) 서열이 하기 제공된다.

카바트(Kabat) CDR (31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-107 (H3))은 볼드체이고; 쵸티아(Chothia) CDR (26-32 (H1), 52-56 (H2) 및 95-101 (H3))은 밑줄 그어져 있다.

17D20 _ 35VH - 21N11VL 중쇄 가변 영역 ( VH ) (서열 번호:67 , 서열 번호:66에 의해 암호화됨)

d17N9 중쇄 가변 영역 (VH) (서열 번호:68)

모 클론 및 딸 클론에 대한 경쇄 가변 영역 (VL) 서열이 하기 제공된다.

카바트 CDR (24-34 (L1); 50-56 (L2); 및 89-97 (L3)은 볼드체이고; 쵸티아 CDR (24-34 (L1); 50-56 (L2) 및 89-97 (L3)은 밑줄 그어져 있다. 이들 영역은 카바트 또는 쵸티아 시스템에 의해 넘버링되었는지 여부에 관계없이 동일하다.

17D20m _ d3521N11 경쇄 가변 영역 ( VL ) (서열 번호:69 )

17N16m _ d17N9 경쇄 가변 영역 ( VL ) (서열 번호:71 , 서열 번호:70에 의해 암호화됨)

둘 다 높은 친화도로 인간 MASP-2에 결합하고 기능적 보체 활성을 억제하는 능력을 가진 것으로 입증된 MASP-2 항체 OMS100 및 MoAb_d3521N11VL (서열 번호:67로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70으로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함함, "OMS646"으로도 불림)을 도트 블롯 분석에 의해 에피토프 결합에 관하여 분석하였다. 결과는 OMS646 및 OMS100 항체가 MASP-2에 고도로 특이적이지만 MASP-1/3에는 결합하지 않는다는 것을 보여준다. 어떠한 항체도 MASP-2의 CCP1 도메인을 함유하지 않는 MAp19 및 MASP-2 단편에 결합하지 않으며, 결합 부위가 CCP1을 포함한다는 결론으로 이어진다.

MASP-2 항체 OMS646은 재조합 MASP-2 (Kd 60-250pM)에 강력하게 결합하며, C1s, C1r 또는 MASP-1과 비교하여 >5000배 선택성을 갖는 것으로 결정되었다 (하기 표 10 참고):

고체상 ELISA 연구에 의해 평가된 OMS646 MASP-2 항체-MASP-2 상호작용의 친화도 및 특이성

항원	K_D (pM)
MASP-1	>500,000
MASP-2	62±23*
MASP-3	>500,000
정제된 인간 C1r	>500,000
정제된 인간 C1s	~500,000

*평균±SD; n=12

OMS646은 말단 보체 구성요소의 렉틴-의존적 활성화를 특이적으로 차단한다

방법:

막 공격 복합체 (MAC) 침착에 대한 OMS646의 효과를 렉틴 경로, 고전적 경로 및 대체 경로에 대한 경로-특이적 조건을 사용하여 분석하였다. 이 목적을 위해, Wieslab Comp300 보체 스크리닝 키트 (Wieslab, Lund, Sweden)를 제조사의 지시에 따라 사용하였다.

결과 :

도 17A는 렉틴 경로-특이적 검정 조건 하에 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 MAC 침착의 수준을 그래프로 나타낸다. 도 17B는 고전적 경로-특이적 검정 조건 하에 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 MAC 침착의 수준을 그래프로 나타낸다. 도 17C는 대체 경로-특이적 검정 조건 하에 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시 MAC 침착의 수준을 그래프로 나타낸다.

도 17A에서 나타난 바와 같이, OMS646은 대략 1nM의 IC₅₀ 값으로 MAC 침착의 렉틴 경로-매개된 활성화를 차단한다. 하지만, OMS646은 고전적 경로-매개된 활성화 (도 17B) 또는 대체 경로-매개된 활성화 (도 17C)로부터 생성된 MAC 침착에 대해서는 아무런 효과가 없었다.

마우스에게 정맥내 (IV) 또는 피하 (SC) 투여 후 OMS646의 약동학 및 약역학

OMS646의 약동학 (PK) 및 약역학 (PD)을 마우스의 28일 1회 용량 PK/PD 연구에서 평가하였다. 연구는 피하로 (SC) 투여된 5mg/kg 및 15mg/kg의 OMS646의 용량 수준, 뿐만 아니라 정맥내로 (IV) 투여된 5mg/kg OMS646의 용량 수준을 테스트하였다.

OMS646의 PK 프로파일에 관하여, 도 18은 표시된 용량으로 OMS646을 투여한 후 시간의 함수로서 OMS646 농도 (n=3 동물/군의 평균)를 그래프로 나타낸다. 도 18에서 도시된 바와 같이, 5mg/kg SC에서, OMS646은 투약 후 대략 1-2일에 5-6 ug/mL의 최대 혈장 농도에 도달하였다. 5 mg/kg SC에서 OMS646의 생물학적 이용 가능성은 대략 60%였다. 도 18에서 추가로 도시된 바와 같이, 15 mg/kg SC에서, OMS646은 투약 후 대략 1 내지 2일에 10-12 ug/mL의 최대 혈장 농도에 도달하였다. 모든 군에 대하여, OMS646을 전신 순환계로부터 서서히 제거하였으며 말단 반감기는 대략 8-10일이다. OMS646의 프로파일은 마우스에서 인간 항체에 대하여 전형적이다.

OMS646의 PD 활성은 도 19A 및 19B에서 그래프로 나타난다. 도 19A 및 19B는 5mg/kg IV (도 19A) 및 5mg/kg SC (도 19B) 군의 각각의 마우스에 대한 PD 반응 (전신성 렉틴 경로 활성의 하락)을 도시한다. 파선은 검정의 베이스라인을 나타낸다 (최대 억제; 나이브 마우스 혈청은 검정 전에 과도한 OMS646으로 시험관 내에서 급증하였다). 도 19A에서 도시된 바와 같이, 5mg/kg의 OMS646의 IV 투여 이후, 전신성 렉틴 경로 활성은 즉시 거의 검출 불가능한 수준으로 하락하였고, 렉틴 경로 활성은 28일 관찰 기간에 걸쳐 단지 보통의 회복만을 보여주었다. 도 19B에서 도시된 바와 같이, 5mg/kg의 OMS646 SC 투여된 마우스에서, 렉틴 경로 활성의 시간-의존적 억제를 관찰하였다. 렉틴 경로 활성은 약물 투여 24시간 내에 거의 검출 불가능한 수준으로 하락하였고 적어도 7일 동안 낮은 수준으로 유지되었다. 렉틴 경로 활성은 시간이 흐름에 따라 점점 증가하였지만, 28일 관찰 기간 내에 투여 전 수준으로 회복되지 않았다. 15mg/kg SC 투여 후 관찰된 시간 프로파일에 대한 렉틴 경로 활성은 5 mg/kg SC 투여와 유사했으며 (데이터 미도시), PD 종점의 포화를 나타낸다. 데이터는 마우스에서 IV 또는 SC 투여된 5mg/kg의 OMS646의 매주 투여가 전신성 렉틴 경로 활성의 지속적인 억제를 달성하기에 충분하다는 것을 추가로 나타냈다.

실시예 16

이 실시예는 나이-관련 황반 변성의 마우스 모델에서 렉틴 경로의 기능을 차단하는 인간 IgG4 항체인 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 효능의 분석을 기술한다.

배경/근거:

실시예 15에서 기술된 바와 같이, 인간 렉틴 경로의 기능을 특이적으로 차단하는 완전한 인간 단클론성 MASP-2 항체 (OMS646)를 생성하였다. 이 예에서, OMS646을, 비교기로서 항-VEGF 항체와 함께, 일반적으로 사용되는 나이-관련 황반 변성 (AMD)의 모델인, Bora et al. (J Immunol 174:491-497, 2005)에 의해 기술된 레이져-유도된 맥락막 혈관 신생 (CNV)의 마우스 모델에서 분석하였다.

방법 :

이 연구는 비히클 처리와 비교하여 OMS646의 3회 용량 수준 (2mg/kg; 5mg/kg 및 20mg/kg SC)의 효과를 평가하였다. 실시예 14에서 기술된 바와 같이 생성된 Fab2 #11 (3mg/kg SC)로부터 유래된 항-마우스 MASP-2 mAb 및 마우스 VEGF-A에 결합하고 VEGF-A 기능을 차단하는 래트 단클론성 항체 (5mg/kg IP, 클론 2G11-2A05, BioLegend®, San Diego, CA로부터 구입)를 각각 양성 대조군 및 비교기 처리로 포함시켰다. 연구는 실험군 당 9-10마리의 마우스를 포함하였고 맹검(blinded) 방식으로 실행하였다. 일정하고 예측 가능한 약물 수준에서 효능을 평가하기 위해서,레이져 유도 전 1일 및 유도 후 3일에 주사된 항-VEGF 항체를 제외하면, 모든 처리를 레이져 유도 전 8일에 투여한 다음, 1일 전에 다시 투여하였다. 레이져 손상 몇일 후, 마우스를 마취시키고, FITC-덱스트란 0.75 ml으로 전신으로 관류시키고 희생시켰다. 눈을 포르말린으로 고정하였고, 손상된 영역을 함유하는 눈의 후방부를 절개하여 ProLong 안티페이드 시약 (Invitrogen)에서 플랫마운팅하였다. 손상된 영역의 공초점 현미경 관찰을 수행하였고 이미지를 각 영역으로부터 캡쳐하였다. CNV 및 손상된 영역의 측정을 ImageJ 프로그램 (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland USA)으로 수행하였다. CNV 영역을 각 눈의 손상된 스폿 크기에 관하여 표준화하였으며, 여기서 % CNV는 손상된 스폿 당 평균 신생 혈관 면적을 나타내며, (CNV 면적/스폿 면적) X 100으로 계산하였다. 연구를 암호화된 테스트 물품 용액을 사용하여 맹검 방식으로 실행하였다.

결과 : 이 연구의 결과는 도 20에서 도시된다. 도 20에서 도시된 바와 같이, 비히클 처리군과 비교하여, OMS646-처리된 마우스는 테스트된 모든 용량 수준에서 CNV의 뚜렷한 억제를 나타냈으며, 29% 내지 50%의 범위의 상대적 CNV 감소를 나타냈다. 항-VEGF 처리는 CNV 감소가 더 작은 (대략 15%) 감소를 나타냈다. Fab2 #11로부터 유래된 항-마우스 MASP-2 mAb는 또한 비히클 처리와 비교하여 대략 30%만큼 CNV를 감소시켰으며 (데이터 미도시), 이것은 실시예 12에서 기술된 바와 같이 MASP-2 (-/-) 마우스에서 수행된 연구에서 관찰된 결과와 일치하고, 여기서 레이져 처리 후 7일에 야생형 대조군 마우스와 비교하여 MASP-2 (-/-) 마우스에서 CNV의 30% 감소를 관찰하였다.

이 연구의 결과는 OMS646의 전신 투여가 신생 혈관 AMD를 치료하는데 효과적인 요법을 제공한다는 증거를 제공한다. 유리체내 주사를 필요로 하는 AMD 및 다른 안구 혈관 형성 질환 및 장애에 대한 현재 및 신흥 치료제와는 달리, OMS646은 피하로 투여될 때에도 효과적이다.

또한 이 연구에서 사용된 VEGF-A 항체 (BioLegend®, San Diego, CA의 클론 2G11-2A05)는 이전에 Wuest et al. (J Exp Med 207:101, 2009)에서 기술된 바와 같이 100ug/mL의 농도로 결막하 주사에 의해 투여될 때 HSV-1-유도된 각막 림프관 형성의 마우스 모델에서 각막으로의 혈관 확장을 감소시키는 것으로 나타났다. Lu et al.에 의한 또 다른 연구 (Cancer Res 72:2239-50, 2012)에서는, B16 종양을 가지고 있는 Ceacam 1-/- 마우스의 항-VEGF 항체 (클론 2G11-2A05) 처리는 대략 3mg/kg으로 주 2회 IP 투여될 때 결장 종양 모델에서 종양 크기, 뿐만 아니라 종양 혈관 구조를 크게 감소시켰다. OMS646이 테스트된 모든 용량 수준으로 마우스에게 전신으로 전달될 때 CNV를 감소시키는데 있어서 적어도 항-VEGF 항체만큼 효과적이라는 것을 입증하는 본 연구의 데이터를 고려하면, OMS646과 같은 MASP-2 억제제는 혈관 형성 방지제로서 혈관 형성-의존적 암, 예를 들어, 고형 종양(들), 혈액 매개 종양, 고위험 유암종, 및 종양 전이로 구성된 군으로부터 선택된 혈관 형성-의존적 암을 억제하는데 사용하기에 효과적일 것으로 예상된다. 혈관 형성-의존적 암의 예는 항-VEGF 작용제, 예컨대 항-VEGF 항체 Avastin® (베바시쥬맙, Genentech, CA)에 의한 치료에 대하여 승인된 암 유형이다. 예를 들어, 베바시쥬맙은 다음 혈관 형성-의존적 암의 치료에 대하여 승인되었다: 전이성 결장직장암, 비-편평세포 비-소세포 폐암, 전이성 신세포 암종, 및 교아종(glioblastoma).

혈관 형성-의존적 암의 추가적인 예는 항-VEGF 작용제, 예컨대 항-VEGF 항체 Avastin® (베바시쥬맙, Genentech, CA)에 의한 치료에 의해 이익을 얻을 것으로 예상되는 암 유형, 예를 들어, 혈관 형성 억제 화합물 (예를 들어, VEGF 안타고니스트)로 치료되는 것으로 이미 알려져 있거나, 또는 이것으로 치료되도록 개발 중인 임의의 암이며, 간으로 전이된 후기 암, 흑색종, 난소암, 신경아세포종, 췌장암, 간세포 암종, 자궁체부암, 전립선암, 혈관육종, 전이성 또는 절제 불가능 혈관육종, 재발성 난소 성기삭 간질성 종양, 식도암, 위암, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 확산 큰 B-세포 림프종, 재발성 또는 전이성 두경부암, 신생물 수막염, 자궁경부암, 자궁암, 후기 복막 암종증, 신경아교육종, 신경내분비계 암종, 두개외 유잉 육종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 두개내 수막종, 후기 카포시 육종, 중피종, 담도암, 전이성 유암종, 및 후기 요로암을 포함한다. 이 맥락에서 바람직한 암은 결장직장암, 유방암 (전이성 유방암, 염증성 유방 암종 포함), 폐암, 신장암, 간세포암, 식도암, 난소암, 췌장암, 전립선암 및 위암, 뿐만 아니라 신경교종, 위장관 간질성 종양, 림프종, 흑색종 및 유암종을 포함한다.

또한 MASP-2 억제제, 예컨대 OMS646은 혈관 형성 방지제로서 혈관 형성-의존적 양성 종양, 예를 들어, 혈관종, 청신경 종양, 신경섬유종, 트라코마, 유암종, 및 화농성 육아종으로 구성된 군으로부터 선택된 혈관 형성-의존적 양성 종양을 억제하는데 효과적일 것으로 예상된다. 또한 OMS646과 같은 MASP-2 억제제는 혈관 형성 방지제로서 AMD 및 다른 안구 혈관 형성 질환 또는 장애, 예컨대 포도막염, 안구 흑색종, 각막 혈관 신생, 원발성 익상편, HSV 기질 각막염, HSV-1-유도된 각막 림프관 형성, 증식성 당뇨성 망막증, 당뇨병성 황반 부종, 미숙아 망막증, 망막 정맥 폐색, 각막 이식 거부 반응, 신생 혈관 녹내장, 증식성 당뇨성 망막증에 부차적인 초자체 출혈, 시속척수염 및 홍색증에서 혈관 형성을 억제하는데 사용하기에 효과적일 것으로 예상된다.

OMS646이 테스트된 모든 용량 수준으로 마우스에게 전신으로 전달될 때 CNV를 감소시키는데 있어서 적어도 항-VEGF 항체만큼 효과적이라는 것을 입증하는 본 연구의 데이터를 고려하면, OMS646과 같은 MASP-2 억제제는 또한 혈관 형성 방지제로서 혈관 형성-의존적 병태, 예컨대 골수섬유증 및 유전성 출혈성 모세혈관 확장증을 억제하는데 사용하기에 효과적일 것으로 예상된다.

실시예 17

이 실시예는 보체 활성화의 MASP-2 의존적 렉틴 경로의 억제가 대퇴부 동맥 결찰의 동물 모델에서 항-혈관 형성 효과를 유도한다는 것을 확인하기 위한 MASP-2 (-/-) 계통 및 MASP-2 억제 항체의 사용을 기술한다.

배경/근거:

인간 MASP-2 mAb OMS646이 AMD의 모델에서 VEGF-A 항체와 적어도 동등하거나 그렇지 않으면 더 큰 정도로 CNV를 억제하는 실시예 16에서 기술된 놀라운 결과를 고려하여, MASP-2 결핍 마우스에서 혈관 형성이 감소되고, 렉틴 경로를 차단하는 MASP-2 항체, 예컨대 OMS646이 전신으로 투여될 때 혈관 형성 억제제로서 생체 내에서 사용하기에 효과적임을 확인하기 위해 다음 연구를 수행하였다.

방법:

연구 #1: 동맥 신생(Arteriogenesis)을 MASP-2 (-/-) 마우스, 야생형 대조군 마우스, 및 MASP-2 억제 항체로 전처리된 야생형 마우스에서 대퇴부 동맥 결찰에 의해 유도하고, 측부 동맥 성장 과정이 MASP-2 결핍에 의해 영향을 받는지를 알기 위해 생체 내에서 레이져 도플러(Laser Doppler) 관류 측정을 수행한다. 관류 측정을 대퇴부 동맥 결찰 후 제21 일까지 수행한다.

면역조직화학법을 대퇴부 동맥 결찰 후 제3 일에 수행하여 다음을 분석한다:

(a) 동맥 신생이 발생한 윗다리에서, 혈관 주위 백혈구 침윤에 대한 MASP-2 결핍의 영향 (백혈구가 성장 인자, 사이토카인과 함께 성장하는 부수물을 제공하는 것을 고려하면 동맥 신생은 백혈구 침윤에 크게 의존적이다); 및

(b) 대퇴부 동맥 결찰로 인해 허혈이 일어나는 아랫다리에서, MASP-2 (-/-) 마우스, 항-MASP-2 항체-처리된 야생형 마우스, 및 대조군 야생형 마우스의 허혈성 조직 손상, 백혈구 침윤 및 혈관 형성의 심각도.

(c) RNA 및 단백질 수준에서의 유전자 발현 연구를 또한 분리된 부수물에서 MASP-2 (-/-) 마우스, 항-MASP-2 항체-처리된 야생형 마우스, 및 대조군 야생형 마우스에서 대퇴부 동맥 결찰 이후 12h 또는 24h에 수행하였다.

상기 기술된 항-혈관 형성 효과에 근거하여, MASP-2 억제는 윗다리에서 동맥 신생을 예방하거나 또는 25 내지 50%만큼 감소시킬 것으로 예상된다. 이에 더하여, MASP-2 억제는 허혈 후 보체 구동된 병리학적 반응을 25% 내지 50%만큼 감소시키는 것으로 입증되었다 (Schwaeble et al., PNAS 108(18):7523-7528). 따라서, MASP-2 억제는 또한 아랫다리에서 맥관 형성을 유사한 정도로 억제할 것으로 예상될 수 있다.

예시적인 구체예가 예시되고 기술되는 한편, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 그 안에서 다양한 변화가 이루어질 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Omeros Corporation University of Leicester Demopulos, Gregory A. Schwaeble, Hans-Wilhelm Dudler, Thomas Tjoelker, Larry W. <120> Methods for Inhibiting Angiogenesis in a Subject in Need Thereof <130> MP.1.0239.PCT <150> US 62/315,857 <151> 2016-03-31 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 725 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (27)..(584) <400> 1 ggccaggcca gctggacggg cacacc atg agg ctg ctg acc ctc ctg ggc ctt 53 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu 1 5 ctg tgt ggc tcg gtg gcc acc ccc ttg ggc ccg aag tgg cct gaa cct 101 Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro 10 15 20 25 gtg ttc ggg cgc ctg gca tcc ccc ggc ttt cca ggg gag tat gcc aat 149 Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn 30 35 40 gac cag gag cgg cgc tgg acc ctg act gca ccc ccc ggc tac cgc ctg 197 Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu 45 50 55 cgc ctc tac ttc acc cac ttc gac ctg gag ctc tcc cac ctc tgc gag 245 Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu 60 65 70 tac gac ttc 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Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln Arg 180 185 190 Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Leu 195 200 205 Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val Ile 210 215 220 Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr Leu 225 230 235 240 Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly 245 250 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Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asp Phe 675 680 685 <210> 6 <211> 671 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala 1 5 10 15 Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp 20 25 30 Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His 35 40 45 Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu 50 55 60 Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser 85 90 95 Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe 100 105 110 Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln 115 120 125 Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His 130 135 140 Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg 145 150 155 160 Asn Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln 165 170 175 Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro 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aaggagtagc 540 cagggttcag ggacacctgg gagcaggggc caggcttggc caggagggag atcaggcctg 600 ggtcttgcct tcactccctg tgacacctga ccccacagct gagctcgggg gccaaggtgc 660 tggccacgct gtgcgggcag gagagcacag acacggagcg ggcccctggc aaggacactt 720 tctactcgct gggctccagc ctggacatta ccttccgctc cgactactcc aacgagaagc 780 cgttcacggg gttcgaggcc ttctatgcag ccgagggtga gccaagaggg gtcctgcaac 840 atctcagtct gcgcagctgg ctgtgggggt aactctgtct taggccaggc agccctgcct 900 tcagtttccc cacctttccc agggcagggg agaggcctct ggcctgacat catccacaat 960 gcaaagacca aaacagccgt gacctccatt cacatgggct gagtgccaac tctgagccag 1020 ggatctgagg acagcatcgc ctcaagtgac gcagggactg gccgggcgcg gcagctcacg 1080 cctgtaattc cagcactttg ggaggccgag gctggcttga taatttgagg gtcaggagtt 1140 caaggccagc cagggcaaca cggtgaaact ctatctccac taaaactaca aaaattagct 1200 gggcgtggtg gtgcgcacct ggaatcccag ctactaggga ggctgaggca ggagaattgc 1260 ttgaacctgc gaggtggagg ctgcagtgaa cagagattgc accactacac tccacctggg 1320 cgacagacta gactccgtct caaaaaacaa aaaacaaaaa ccacgcaggg ccgagggccc 1380 atttacaagc tgacaaagtg ggccctgcca gcgggagcgc tgcaggatgt ttgattttca 1440 gatcccagtc cctgcagaga ccaactgtgt gacctctggc aagtggctca atttctctgc 1500 tccttagaag ctgctgcaag ggttcagcgc tgtagccccg ccccctgggt ttgattgact 1560 cccctcatta gctgggtgac ctcggccgga cactgaaact cccactggtt taacagaggt 1620 gatgtttgca tctttctccc agcgctgctg ggagcttgca gcgaccctag gcctgtaagg 1680 tgattggccc ggcaccagtc ccgcacccta gacaggacct aggcctcctc tgaggtccac 1740 tctgaggtca tggatctcct gggaggagtc caggctggat cccgcctctt tccctcctga 1800 cggcctgcct ggccctgcct ctcccccaga cattgacgag tgccaggtgg ccccgggaga 1860 ggcgcccacc tgcgaccacc actgccacaa ccacctgggc ggtttctact gctcctgccg 1920 cgcaggctac gtcctgcacc gtaacaagcg cacctgctca ggtgagggag gctgcctggg 1980 ccccaacgca ccctctcctg ggatacccgg ggctcctcag ggccattgct gctctgccca 2040 ggggtgcgga gggcctgggc ctggacactg ggtgcttcta ggccctgctg cctccagctc 2100 cccttctcag ccctgcttcc cctctcagca gccaggctca tcagtgccac cctgccctag 2160 cactgagact aattctaaca tcccactgtg tacctggttc cacctgggct ctgggaaccc 2220 ctcatgtagc cacgggagag tcggggtatc taccctcgtt ccttggactg ggttcctgtt 2280 ccctgcactg ggggacgggc cagtgctctg gggcgtgggc agccccaccc tgtggcgctg 2340 accctgctcc cccgactcgg tttctcctct cggggtctct ccttgcctct ctgatctctc 2400 ttccagagca gagcctctag cctcccctgg agctccggct gcccagcagg tcagaagcca 2460 gagccaggct gctggcctca gctccgggtt gggctgagat gctgtgcccc aactcccatt 2520 cacccaccat ggacccaata ataaacctgg ccccacccca cctgctgccg cgtgtctctg 2580 gggtgggagg gtcgggaggc ggtggggcgc gctcctctct gcctaccctc ctcacagcct 2640 catgaacccc aggtctgtgg gagcctcctc catggggcca cacggtcctt ggcctcaccc 2700 cctgttttga agatggggca ctgaggccgg agaggggtaa ggcctcgctc gagtccaggt 2760 ccccagaggc tgagcccaga gtaatcttga accaccccca ttcagggtct ggcctggagg 2820 agcctgaccc acagaggaga caccctggga gatattcatt gaggggtaat ctggtccccc 2880 gcaaatccag gggtgattcc cactgcccca taggcacagc cacgtggaag aaggcaggca 2940 atgttggggc tcctcacttc ctagaggcct cacaactcaa atgcccccca ctgcagctgg 3000 gggtggggtg gtggtatggg atggggacca agccttcctt gaaggataga gcccagccca 3060 acaccccgcc ccgtggcagc agcatcacgt gttccagcga ggaaggagag caccagactc 3120 agtcatgatc actgttgcct tgaacttcca agaacagccc cagggcaagg gtcaaaacag 3180 gggaaagggg gtgatgagag atccttcttc cggatgttcc tccaggaacc agggggctgg 3240 ctggtcttgg ctgggttcgg gtaggagacc catgatgaat aaacttggga atcactgggg 3300 tggctgtaag ggaatttagg ggagctccga aggggccctt aggctcgagg agatgctcct 3360 ctcttttccc gaattcccag ggacccagga gagtgtccct tcttcctctt cctgtgtgtc 3420 catccacccc cgccccccgc cctggcagag ctggtggaac tcagtgctct agcccctacc 3480 ctggggttgc gactctggct caggacacca ccacgctccc tgggggtgtg agtgagggcc 3540 tgtgcgctcc atcccgagtg ctgcctgttt cagctaaagc ctcaaagcaa gagaaacccc 3600 ctctctaagc ggcccctcag ccatcgggtg ggtcgtttgg tttctgggta ggcctcaggg 3660 gctggccacc tgcagggccc agcccaaccc agggatgcag atgtcccagc cacatccctg 3720 tcccagtttc ctgctcccca aggcatccac cctgctgttg gtgcgagggc tgatagaggg 3780 cacgccaagt cactcccctg cccttccctc cttccagccc tgtgctccgg ccaggtcttc 3840 acccagaggt ctggggagct cagcagccct gaatacccac ggccgtatcc caaactctcc 3900 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43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp 1 5 10 15 Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln 35 40 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn 1 5 <210> 17 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr 1 5 10 15 Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe 20 25 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly 1 5 <210> 19 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys 1 5 10 15 Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val 20 25 <210> 20 <211> 960 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (51)..(797) <400> 20 attaactgag attaaccttc cctgagtttt ctcacaccaa ggtgaggacc atg tcc 56 Met Ser 1 ctg ttt cca tca ctc cct ctc ctt ctc ctg agt atg gtg gca gcg tct 104 Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala Ala Ser 5 10 15 tac tca gaa act gtg acc tgt gag gat gcc caa aag acc tgc cct gca 152 Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys Pro Ala 20 25 30 gtg att gcc tgt agc tct cca ggc atc aac ggc ttc cca ggc aaa gat 200 Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp 35 40 45 50 ggg cgt gat ggc acc aag gga gaa aag ggg gaa cca ggc caa ggg ctc 248 Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu 55 60 65 aga ggc tta cag ggc ccc cct gga aag ttg ggg cct cca gga aat cca 296 Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro 70 75 80 ggg cct tct ggg tca cca gga cca aag ggc caa aaa gga gac cct gga 344 Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly 85 90 95 aaa agt ccg gat ggt gat agt agc ctg gct gcc tca gaa aga aaa gct 392 Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala 100 105 110 ctg caa aca gaa atg gca cgt atc aaa aag tgg ctc acc ttc tct ctg 440 Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu 115 120 125 130 ggc aaa caa gtt ggg aac aag ttc ttc ctg acc aat ggt gaa ata atg 488 Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met 135 140 145 acc ttt gaa aaa gtg aag gcc ttg tgt gtc aag ttc cag gcc tct gtg 536 Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val 150 155 160 gcc acc ccc agg aat gct gca gag aat gga gcc att cag aat ctc atc 584 Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile 165 170 175 aag gag gaa gcc ttc ctg ggc atc act gat gag aag aca gaa ggg cag 632 Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln 180 185 190 ttt gtg gat ctg aca gga aat aga ctg acc tac aca aac tgg aac gag 680 Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu 195 200 205 210 ggt gaa ccc aac aat gct ggt tct gat gaa gat tgt gta ttg cta ctg 728 Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu 215 220 225 aaa aat ggc cag tgg aat gac gtc ccc tgc tcc acc tcc cat ctg gcc 776 Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala 230 235 240 gtc tgt gag ttc cct atc tga agggtcatat cactcaggcc ctccttgtct 827 Val Cys Glu Phe Pro Ile 245 ttttactgca acccacaggc ccacagtatg cttgaaaaga taaattatat caatttcctc 887 atatccagta ttgttccttt tgtgggcaat cactaaaaat gatcactaac agcaccaaca 947 aagcaataat agt 960 <210> 21 <211> 248 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Ser Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala 1 5 10 15 Ala Ser Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys 20 25 30 Pro Ala Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly 35 40 45 Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly 65 70 75 80 Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp 85 90 95 Pro Gly Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg 100 105 110 Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe 115 120 125 Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu 130 135 140 Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala 145 150 155 160 Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn 165 170 175 Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu 180 185 190 Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp 195 200 205 Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu 210 215 220 Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His 225 230 235 240 Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile 245 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Wherein X at position 1 represents hydroxyproline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Wherein X at position 4 represents hydrophobic residue <400> 22 Xaa Gly Lys Xaa Gly Pro 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Wherein X represents hydroxyproline <400> 23 Xaa Gly Lys Leu Gly 1 5 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(15) <223> Wherein X at positions 9 and 15 represents hydroxyproline <400> 24 Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly Lys Leu Gly Pro Xaa Gly 1 5 10 15 <210> 25 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(27) <223> Wherein X at positions 3, 6, 15, 21, 24, 27 represents hydroxyproline <400> 25 Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly 1 5 10 15 Lys Leu Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa 20 25 <210> 26 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 26 Gly Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly 1 5 10 15 Gln Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly Lys Leu Gly Pro Xaa 20 25 30 Gly Asn Xaa Gly Pro Ser Gly Ser Xaa Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly 35 40 45 Asp Xaa Gly Lys Ser 50 <210> 27 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(33) <223> Wherein X at positions 3, 6, 12, 18, 21, 30, 33 represents hydroxyproline <400> 27 Gly Ala Xaa Gly Ser Xaa Gly Glu Lys Gly Ala Xaa Gly Pro Gln Gly 1 5 10 15 Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Lys Met Gly Pro Lys Gly Glu Xaa Gly Asp 20 25 30 Xaa <210> 28 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(45) <223> Wherein X at positions 3, 6, 9, 27, 30, 36, 42, 45 represents hydroxyproline <400> 28 Gly Cys Xaa Gly Leu Xaa Gly Ala Xaa Gly Asp Lys Gly Glu Ala Gly 1 5 10 15 Thr Asn Gly Lys Arg Gly Glu Arg Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Lys 20 25 30 Ala Gly Pro Xaa Gly Pro Asn Gly Ala Xaa Gly Glu Xaa 35 40 45 <210> 29 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile Leu Pro Asn Arg Val Thr Ile Lys Ala 1 5 10 15 Asn Arg Pro Phe Leu Val Phe Ile 20 <210> 30 <211> 559 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 atgaggctgc tgaccctcct gggccttctg tgtggctcgg tggccacccc cttgggcccg 60 aagtggcctg aacctgtgtt cgggcgcctg gcatcccccg gctttccagg ggagtatgcc 120 aatgaccagg agcggcgctg gaccctgact gcaccccccg gctaccgcct gcgcctctac 180 ttcacccact tcgacctgga gctctcccac ctctgcgagt acgacttcgt caagctgagc 240 tcgggggcca aggtgctggc cacgctgtgc gggcaggaga gcacagacac ggagcgggcc 300 cctggcaagg acactttcta ctcgctgggc tccagcctgg acattacctt ccgctccgac 360 tactccaacg agaagccgtt cacggggttc gaggccttct atgcagccga ggacattgac 420 gagtgccagg tggccccggg agaggcgccc acctgcgacc accactgcca caaccacctg 480 ggcggtttct actgctcctg ccgcgcaggc tacgtcctgc accgtaacaa gcgcacctgc 540 tcagccctgt gctccggcc 559 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 cgggcacacc atgaggctgc tgaccctcct gggc 34 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 gacattacct tccgctccga ctccaacgag aag 33 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 agcagccctg aatacccacg gccgtatccc aaa 33 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 cgggatccat gaggctgctg accctc 26 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 ggaattccta ggctgcata 19 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 ggaattccta cagggcgct 19 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 ggaattccta gtagtggat 19 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 tgcggccgct gtaggtgctg tcttt 25 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 ggaattcact cgttattctc gga 23 <210> 40 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 tccgagaata acgagtg 17 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 cattgaaagc tttggggtag aagttgttc 29 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 cgcggccgca gctgctcaga gtgtaga 27 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 cggtaagctt cactggctca gggaaata 28 <210> 44 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 aagaagcttg ccgccaccat ggattggctg tggaact 37 <210> 45 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 cgggatcctc aaactttctt gtccaccttg g 31 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 aagaaagctt gccgccacca tgttctcact agctct 36 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 cgggatcctt ctccctctaa cactct 26 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 1 5 <210> 49 <211> 4960 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 49 ccggacgtgg tggcgcatgc ctgtaatccc agctactcgg gaggctgagg caggagaatt 60 gctcgaaccc cggaggcaga ggtttggtgg ctcacacctg taatcccagc actttgcgag 120 gctgaggcag gtgcatcgct ttggctcagg agttcaagac cagcctgggc aacacaggga 180 gacccccatc tctacaaaaa acaaaaacaa atataaaggg gataaaaaaa aaaaaaagac 240 aagacatgaa tccatgagga cagagtgtgg aagaggaagc agcagcctca aagttctgga 300 agctggaaga acagataaac aggtgtgaaa taactgcctg gaaagcaact tctttttttt 360 tttttttttt tttgaggtgg agtctcactc tgtcgtccag gctggagtgc agtggtgcga 420 tctcggatca ctgcaacctc cgcctcccag gctcaagcaa ttctcctgcc tcagcctccc 480 gagtagctgg gattataagt gcgcgctgcc acacctggat gatttttgta tttttagtag 540 agatgggatt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctcaaact cccaacctcg tgatccaccc 600 accttggcct cccaaagtgc tgggattaca ggtataagcc accgagccca gccaaaagcg 660 acttctaagc ctgcaaggga atcgggaatt ggtggcacca ggtccttctg acagggttta 720 agaaattagc cagcctgagg ctgggcacgg tggctcacac ctgtaatccc agcactttgg 780 gaggctaagg caggtggatc acctgagggc aggagttcaa gaccagcctg accaacatgg 840 agaaacccca tccctaccaa aaataaaaaa ttagccaggt gtggtggtgc tcgcctgtaa 900 tcccagctac ttgggaggct gaggtgggag gattgcttga acacaggaag tagaggctgc 960 agtgagctat gattgcagca ctgcactgaa gccggggcaa cagaacaaga tccaaaaaaa 1020 agggaggggt gaggggcaga gccaggattt gtttccaggc tgttgttacc taggtccgac 1080 tcctggctcc cagagcagcc tgtcctgcct gcctggaact ctgagcaggc tggagtcatg 1140 gagtcgattc ccagaatccc agagtcaggg aggctggggg caggggcagg tcactggaca 1200 aacagatcaa aggtgagacc agcgtagggc tgcagaccag gccaggccag ctggacgggc 1260 acaccatgag gtaggtgggc gcccacagcc tccctgcagg gtgtggggtg ggagcacagg 1320 cctgggccct caccgcccct gccctgccca taggctgctg accctcctgg gccttctgtg 1380 tggctcggtg gccaccccct tgggcccgaa gtggcctgaa cctgtgttcg ggcgcctggc 1440 atcccccggc tttccagggg agtatgccaa tgaccaggag cggcgctgga ccctgactgc 1500 accccccggc taccgcctgc gcctctactt cacccacttc gacctggagc tctcccacct 1560 ctgcgagtac gacttcgtca aggtgccgtc aggacgggag ggctggggtt tctcagggtc 1620 ggggggtccc caaggagtag ccagggttca gggacacctg ggagcagggg ccaggcttgg 1680 ccaggaggga gatcaggcct gggtcttgcc ttcactccct gtgacacctg accccacagc 1740 tgagctcggg ggccaaggtg ctggccacgc tgtgcgggca ggagagcaca gacacggagc 1800 gggcccctgg caaggacact ttctactcgc tgggctccag cctggacatt accttccgct 1860 ccgactactc caacgagaag ccgttcacgg ggttcgaggc cttctatgca gccgagggtg 1920 agccaagagg ggtcctgcaa catctcagtc tgcgcagctg gctgtggggg taactctgtc 1980 ttaggccagg cagccctgcc ttcagtttcc ccacctttcc cagggcaggg gagaggcctc 2040 tggcctgaca tcatccacaa tgcaaagacc aaaacagccg tgacctccat tcacatgggc 2100 tgagtgccaa ctctgagcca gggatctgag gacagcatcg cctcaagtga cgcagggact 2160 ggccgggcgc agcagctcac gcctgtaatt ccagcacttt gggaggccga ggctggctga 2220 tcatttgagg tcaggagttc aaggccagcc agggcaacac ggtgaaactc tatctccact 2280 aaaactacaa aaattagctg ggcgtggtgg tgcgcacctg gaatcccagc tactagggag 2340 gctgaggcag gagaattgct tgaacctgcg aggtggaggc tgcagtgaac agagattgca 2400 ccactacact ccagcctggg cgacagagct agactccgtc tcaaaaaaca aaaaacaaaa 2460 acgacgcagg ggccgagggc cccatttaca gctgacaaag tggggccctg ccagcgggag 2520 cgctgccagg atgtttgatt tcagatccca gtccctgcag agaccaactg tgtgacctct 2580 ggcaagtggc tcaatttctc tgctccttag gaagctgctg caagggttca gcgctgtagc 2640 cccgccccct gggtttgatt gactcccctc attagctggg tgacctcggg ccggacactg 2700 aaactcccac tggtttaaca gaggtgatgt ttgcatcttt ctcccagcgc tgctgggagc 2760 ttgcagcgac cctaggcctg taaggtgatt ggcccggcac cagtcccgca ccctagacag 2820 gacgaggcct cctctgaggt ccactctgag gtcatggatc tcctgggagg agtccaggct 2880 ggatcccgcc tctttccctc ctgacggcct gcctggccct gcctctcccc cagacattga 2940 cgagtgccag gtggccccgg gagaggcgcc cacctgcgac caccactgcc acaaccacct 3000 gggcggtttc tactgctcct gccgcgcagg ctacgtcctg caccgtaaca agcgcacctg 3060 ctcagccctg tgctccggcc aggtcttcac ccagaggtct ggggagctca gcagccctga 3120 atacccacgg ccgtatccca aactctccag ttgcacttac agcatcagcc tggaggaggg 3180 gttcagtgtc attctggact ttgtggagtc cttcgatgtg gagacacacc ctgaaaccct 3240 gtgtccctac gactttctca agattcaaac agacagagaa gaacatggcc cattctgtgg 3300 gaagacattg ccccacagga ttgaaacaaa aagcaacacg gtgaccatca cctttgtcac 3360 agatgaatca ggagaccaca caggctggaa gatccactac acgagcacag cgcacgcttg 3420 cccttatccg atggcgccac ctaatggcca cgtttcacct gtgcaagcca aatacatcct 3480 gaaagacagc ttctccatct tttgcgagac tggctatgag cttctgcaag gtcacttgcc 3540 cctgaaatcc tttactgcag tttgtcagaa agatggatct tgggaccggc caatgcccgc 3600 gtgcagcatt gttgactgtg gccctcctga tgatctaccc agtggccgag tggagtacat 3660 cacaggtcct ggagtgacca cctacaaagc tgtgattcag tacagctgtg aagagacctt 3720 ctacacaatg aaagtgaatg atggtaaata tgtgtgtgag gctgatggat tctggacgag 3780 ctccaaagga gaaaaatcac tcccagtctg tgagcctgtt tgtggactat cagcccgcac 3840 aacaggaggg cgtatatatg gagggcaaaa ggcaaaacct ggtgattttc cttggcaagt 3900 cctgatatta ggtggaacca cagcagcagg tgcactttta tatgacaact gggtcctaac 3960 agctgctcat gccgtctatg agcaaaaaca tgatgcatcc gccctggaca ttcgaatggg 4020 caccctgaaa agactatcac ctcattatac acaagcctgg tctgaagctg tttttataca 4080 tgaaggttat actcatgatg ctggctttga caatgacata gcactgatta aattgaataa 4140 caaagttgta atcaatagca acatcacgcc tatttgtctg ccaagaaaag aagctgaatc 4200 ctttatgagg acagatgaca ttggaactgc atctggatgg ggattaaccc aaaggggttt 4260 tcttgctaga aatctaatgt atgtcgacat accgattgtt gaccatcaaa aatgtactgc 4320 tgcatatgaa aagccaccct atccaagggg aagtgtaact gctaacatgc tttgtgctgg 4380 cttagaaagt gggggcaagg acagctgcag aggtgacagc ggaggggcac tggtgtttct 4440 agatagtgaa acagagaggt ggtttgtggg aggaatagtg tcctggggtt ccatgaattg 4500 tggggaagca ggtcagtatg gagtctacac aaaagttatt aactatattc cctggatcga 4560 gaacataatt agtgattttt aacttgcgtg tctgcagtca aggattcttc atttttagaa 4620 atgcctgtga agaccttggc agcgacgtgg ctcgagaagc attcatcatt actgtggaca 4680 tggcagttgt tgctccaccc aaaaaaacag actccaggtg aggctgctgt catttctcca 4740 cttgccagtt taattccagc cttacccatt gactcaaggg gacataaacc acgagagtga 4800 cagtcatctt tgcccaccca gtgtaatgtc actgctcaaa ttacatttca ttaccttaaa 4860 aagccagtct cttttcatac tggctgttgg catttctgta aactgcctgt ccatgctctt 4920 tgtttttaaa cttgttctta ttgaaaaaaa aaaaaaaaaa 4960 <210> 50 <211> 2090 <212> DNA <213> Murine <220> <221> CDS <222> (33)..(2090) <400> 50 ggcgctggac tgcagagcta tggtggcaca cc atg agg cta ctc atc ttc ctg 53 Met Arg Leu Leu Ile Phe Leu 1 5 ggt ctg ctg tgg agt ttg gtg gcc aca ctt ctg ggt tca aag tgg cct 101 Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro 10 15 20 gaa cct gta ttc ggg cgc ctg gtg tcc cct ggc ttc cca gag aag tat 149 Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val Ser Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr 25 30 35 gct gac cat caa gat cga tcc tgg aca ctg act gca ccc cct ggc tac 197 Ala Asp His Gln Asp Arg Ser Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr 40 45 50 55 cgc ctg cgc ctc tac ttc acc cac ttt gac ctg gaa ctc tct tac cgc 245 Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp Leu Glu Leu Ser Tyr Arg 60 65 70 tgc gag tat gac ttt gtc aag ttg agc tca ggg acc aag gtg ctg gcc 293 Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala 75 80 85 aca ctg tgt ggg cag gag agt aca gac act gag cag gca cct ggc aat 341 Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp Thr Glu Gln Ala Pro Gly Asn 90 95 100 gac acc ttc tac tca ctg ggt ccc agc cta aag gtc acc ttc cac tcc 389 Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser 105 110 115 gac tac tcc aat gag aag ccg ttc aca ggg ttt gag gcc ttc tat gca 437 Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala 120 125 130 135 gcg gag gat gtg gat gaa tgc aga gtg tct ctg gga gac tca gtc cct 485 Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Val Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro 140 145 150 tgt gac cat tat tgc cac aac tac ttg ggc ggc tac tat tgc tcc tgc 533 Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys 155 160 165 aga gcg ggc tac att ctc cac cag aac aag cac acg tgc tca gcc ctt 581 Arg Ala Gly Tyr Ile Leu His Gln Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu 170 175 180 tgt tca ggc cag gtg ttc aca gga aga tct ggg tat ctc agt agc cct 629 Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly Arg Ser Gly Tyr Leu Ser Ser Pro 185 190 195 gag tac ccg cag cca tac ccc aag ctc tcc agc tgc acc tac agc atc 677 Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile 200 205 210 215 cgc ctg gag gac ggc ttc agt gtc atc ctg gac ttc gtg gag tcc ttc 725 Arg Leu Glu Asp Gly Phe Ser Val Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe 220 225 230 gat gtg gag acg cac cct gaa gcc cag tgc ccc tat gac tcc ctc aag 773 Asp Val Glu Thr His Pro Glu Ala Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys 235 240 245 att caa aca gac aag ggg gaa cac ggc cca ttt tgt ggg aag acg ctg 821 Ile Gln Thr Asp Lys Gly Glu His Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu 250 255 260 cct ccc agg att gaa act gac agc cac aag gtg acc atc acc ttt gcc 869 Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser His Lys Val Thr Ile Thr Phe Ala 265 270 275 act gac gag tcg ggg aac cac aca ggc tgg aag ata cac tac aca agc 917 Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser 280 285 290 295 aca gca cgg ccc tgc cct gat cca acg gcg cca cct aat ggc agc att 965 Thr Ala Arg Pro Cys Pro Asp Pro Thr Ala Pro Pro Asn Gly Ser Ile 300 305 310 tca cct gtg caa gcc acg tat gtc ctg aag gac agg ttt tct gtc ttc 1013 Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val Leu Lys Asp Arg Phe Ser Val Phe 315 320 325 tgc aag aca ggc ttc gag ctt ctg caa ggt tct gtc ccc ctg aaa tca 1061 Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser 330 335 340 ttc act gct gtc tgt cag aaa gat gga tct tgg gac cgg ccg atg cca 1109 Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro 345 350 355 gag tgc agc att att gat tgt ggc cct ccc gat gac cta ccc aat ggc 1157 Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly 360 365 370 375 cat gtg gac tat atc aca ggc cct caa gtg act acc tac aaa gct gtg 1205 His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro Gln Val Thr Thr Tyr Lys 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Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Gln Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro Ser 100 105 110 Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Val 130 135 140 Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu 145 150 155 160 Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Ile Leu His Gln Asn 165 170 175 Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly Arg 180 185 190 Ser Gly Tyr Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys Leu 195 200 205 Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Arg Leu Glu Asp Gly Phe Ser Val Ile 210 215 220 Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Ala Gln 225 230 235 240 Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Gly Glu His Gly 245 250 255 Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu 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Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys 65 70 75 ttg acc tca ggg acc aag gtg cta gcc acg ctg tgt ggg cag gag agt 291 Leu Thr Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser 80 85 90 aca gat act gag cgg gca cct ggc aat gac acc ttc tac tca ctg ggt 339 Thr Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly 95 100 105 110 ccc agc cta aag gtc acc ttc cac tcc gac tac tcc aat gag aag cca 387 Pro Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro 115 120 125 ttc aca gga ttt gag gcc ttc tat gca gcg gag gat gtg gat gaa tgc 435 Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys 130 135 140 aga aca tcc ctg gga gac tca gtc cct tgt gac cat tat tgc cac aac 483 Arg Thr Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn 145 150 155 tac ctg ggc ggc tac tac tgc tcc tgc cga gtg ggc tac att ctg cac 531 Tyr Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly Tyr Ile Leu His 160 165 170 cag aac aag cat acc tgc tca gcc ctt tgt tca ggc cag gtg ttc act 579 Gln Asn 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gat 915 Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp 290 295 300 cca acg gcg cca cct aat ggt cac att tca cct gtg caa gcc acg tat 963 Pro Thr Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr 305 310 315 gtc ctg aag gac agc ttt tct gtc ttc tgc aag act ggc ttc gag ctt 1011 Val Leu Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu 320 325 330 ctg caa ggt tct gtc ccc ctg aag tca ttc act gct gtc tgt cag aaa 1059 Leu Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys 335 340 345 350 gat gga tct tgg gac cgg ccg ata cca gag tgc agc att att gac tgt 1107 Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys 355 360 365 ggc cct ccc gat gac cta ccc aat ggc cac gtg gac tat atc aca ggc 1155 Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly 370 375 380 cct gaa gtg acc acc tac aaa gct gtg att cag tac agc tgt gaa gag 1203 Pro Glu Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu 385 390 395 act ttc tac aca atg agc agc aat ggt aaa tat 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Asp Ile 485 490 495 Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln Ala Trp 500 505 510 Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly Phe 515 520 525 Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile Asn 530 535 540 Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser Leu 545 550 555 560 Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr Gln 565 570 575 Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile Val 580 585 590 Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr Pro Gly 595 600 605 Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg Gly Gly 610 615 620 Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp 625 630 635 640 Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser 645 650 655 Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr 660 665 670 Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe 675 680 685 <210> 55 <211> 670 <212> PRT <213> Rat <400> 55 Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val 1 5 10 15 Ser Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly Asn His Gln Asp Arg Ser Trp 20 25 30 Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Phe Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His 35 40 45 Phe Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu 50 55 60 Thr Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro 85 90 95 Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe 100 105 110 Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg 115 120 125 Thr Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr 130 135 140 Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly Tyr Ile Leu His Gln 145 150 155 160 Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly 165 170 175 Arg Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys 180 185 190 Leu Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg Leu Glu Glu Gly Phe Ser Ile 195 200 205 Thr Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Met His Pro Glu Ala 210 215 220 Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Arg Glu Tyr 225 230 235 240 Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser 245 250 255 Asn Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr 260 265 270 Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp Pro 275 280 285 Thr Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val 290 295 300 Leu Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu 305 310 315 320 Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp 325 330 335 Gly Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly 340 345 350 Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro 355 360 365 Glu Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr 370 375 380 Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly 385 390 395 400 Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys Pro 405 410 415 Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly 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Claims

혈관 형성-의존적 질환 또는 병태를 앓고 있는 포유동물 대상체에서 혈관 형성을 예방하고, 치료하고, 회복시키고 및/또는 지연시키는 방법으로서, 대상체에게 혈관 형성을 억제하는데 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제1 항에 있어서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 이것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제2 항에 있어서, MASP-2 억제제는 서열 번호:6의 일부에 특이적으로 결합하는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 이것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항에 있어서, 혈관 형성-의존적 질환 또는 병태는 혈관 형성-의존적 암인 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항에 있어서, 혈관 형성-의존적 질환 또는 병태는 양성 종양인 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항에 있어서, 혈관 형성-의존적 질환 또는 병태는 안구 혈관 형성 질환 또는 병태인 것을 특징으로 하는 방법.
제4 항에 있어서, 대상체는 고형 종양(들), 혈액 매개 종양, 고위험 유암종, 및 종양 전이로 구성된 군으로부터 선택된 혈관 형성-의존적 암을 앓고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제7 항에 있어서, 대상체는 하나 이상의 고형 종양을 앓고 있고 방법은 종양 혈관 형성을 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8 항에 있어서, 대상체는 종양 전이를 앓고 있거나 또는 이것에 대한 위험이 있고 방법은 종양 전이를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제자의 양을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5 항에 있어서, 대상체는 혈관종, 청신경 종양, 신경섬유종, 트라코마, 유암종, 및 화농성 육아종으로 구성된 군으로부터 선택된 혈관 형성-의존적 양성 종양(들)을 앓고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제6 항에 있어서, 안구 혈관 형성 질환 또는 병태는 AMD가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
제6 항에 있어서, 안구 혈관 형성 질환 또는 병태는 포도막염, 안구 흑색종, 각막 혈관 신생, 원발성 익상편, HSV 기질 각막염, HSV-1-유도된 각막 림프관 형성, 증식성 당뇨성 망막증, 당뇨병성 황반 부종, 미숙아 망막증, 망막 정맥 폐색, 각막 이식 거부 반응, 신생 혈관 녹내장, 증식성 당뇨성 망막증에 부차적인 초자체 출혈, 시속척수염 및 홍색증으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제2 항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편은 재조합 항체, 효과기 기능이 감소된 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항에 있어서, 조성물은 피하로, 복강내로, 근육내로, 동맥내로, 정맥내로, 또는 흡입제로서 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
AMD, 포도막염, 안구 흑색종, 각막 혈관 신생, 원발성 익상편, HSV 기질 각막염, HSV-1-유도된 각막 림프관 형성, 증식성 당뇨성 망막증, 미숙아 망막증, 망막 정맥 폐색, 각막 이식 거부 반응, 신생 혈관 녹내장, 및 홍색증으로 구성된 군으로부터 선택된 안구 혈관 형성 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 혈관 형성을 억제하는데 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제15 항에 있어서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 이것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제16 항에 있어서, MASP-2 억제제는 서열 번호:6의 일부에 특이적으로 결합하는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 이것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제16 항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편은 재조합 항체, 효과기 기능이 감소된 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
암에 걸린 대상체에게 혈관 형성을 억제하는데 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 투여하는 단계를 포함하는, 종양 혈관 형성을 억제하는 방법.
제19 항에 있어서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 이것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제20 항에 있어서, MASP-2 억제제는 서열 번호:6의 일부에 특이적으로 결합하는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 이것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제20 항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편은 재조합 항체, 효과기 기능이 감소된 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.