EA045598B1

EA045598B1 - Способы ингибирования ангиогенеза у пациента

Info

Publication number: EA045598B1
Application number: EA201892218
Authority: EA
Inventors: Грегори А. ДЕМОПУЛОС; Ханс-Вильхельм ШВЕБЛЕ; Томас Дадлер; Ларри Хьелкер
Original assignee: Омерос Корпорейшн; Юниверсити Оф Лестер
Priority date: 2016-03-31
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2023-12-11

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По заявке на настоящий патент испрашивается приоритет временной патентной заявки № 62/315857, поданной 31 марта 2016 г., полное содержание которой, таким образом, приведено в качестве ссылки.

Уровень техники

Система комплемента обеспечивает действующий на ранних этапах механизм инициации, усиления и координации иммунного ответа на инфекцию микроорганизмами и другие острые повреждения (M.K. Liszewski and J.P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E. Paul, Raven Press, Ltd., New York) у человека и других позвоночных. В то время как активация комплемента обеспечивает значительную защиту первой линии против потенциальных патогенов, виды активности комплемента, которые стимулируют защитный иммунный ответ, также могут представлять потенциальную угрозу для хозяина (K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417 431, 19 94; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219 228, 1994). Например, протеолитические продукты C3 и C5 привлекают и активируют нейтрофилы. В то время как они являются неотъемлемой частью защиты хозяина, активированные нейтрофилы являются неизбирательными в своем высвобождении деструктивных ферментов и могут вызывать повреждение органов. Кроме того, активация комплемента может вызывать накопление литических компонентов комплемента поблизости от клеток-хозяев, так же как на микроорганизмахмишенях, приводя к лизису клетки-хозяина.

Система комплемента вовлечена также в патогенез многочисленных острых и хронических состояний заболевания, включая: инфаркт миокарда, инсульт, ARDS, реперфузионное повреждение, септический шок, синдром повышения проницаемости капилляров после термических ожогов, воспаление после операции в условиях искусственного кровообращения, отторжение трансплантата, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, миастению и болезнь Альцгеймера. Почти при всех этих состояниях, комплемент не является причиной, но является одним из нескольких факторов, вовлеченных в патогенез. Тем не менее, активация комплемента может являться главным патологическим механизмом и представляет собой эффективную точку для клинического контроля во многих из этих состояний заболевания. Растущее понимание важности опосредованного комплементом повреждения тканей во множестве состояний заболевания подчеркивает необходимость эффективных ингибирующих комплемент лекарственных средств. До настоящего времени, экулизумаб (Соларис®), антитело против компонента комплемента C5, является единственным нацеленным на комплемент лекарственным средством, одобренным для применения у человека. В то же время, C5 является одной из нескольких эффекторных молекул, локализованных ниже в каскаде активации комплемента, и блокирование C5 не ингибирует активацию системы комплемента. Таким образом, ингибитор начальных стадий активации комплемента может иметь значительные преимущества над нижестоящим ингибитором комплемента.

В настоящее время, является общепринятым, что систему комплемента можно активировать посредством трех отдельных путей: классического пути, лектинового пути и альтернативного пути. Классический путь обычно запускается посредством комплекса, состоящего из антител хозяина, связанных с чужеродной частицей (т.е. антигеном) и таким образом, требует предварительного воздействия антигена для получения специфического ответа антител. Поскольку активация классического пути зависит от предшествующего адаптивного иммунного ответа хозяина, классический путь является частью приобретенной иммунной системы. В отличие от этого, как лектиновый, так и альтернативный пути, являются независимыми от адаптивного иммунитета и являются частью врожденной иммунной системы.

Активация системы комплемента приводит к последовательной активации зимогенов - сериновых протеаз. Первой стадией в активации классического пути является связывание специфической узнающей молекулы, C1q, с антигеном, связанным с молекулами IgG и IgM. C1q является ассоциированным с проферментами сериновых протеаз Clr и Cls в форме комплекса, называемого Cl. После связывания C1q с иммунным комплексом, за аутопротеолитическим расщеплением участка Arg-Ile Clr следует опосредованное Clr расщепление и активация Cls, который, таким образом, приобретает способность расщеплять C4 и C2. C4 расщепляется на два фрагмента, обозначенные C4a и C4b, и, сходным образом, C2 расщепляется на C2a и C2b. Фрагменты C4b являются способными формировать ковалентные связи с соседними гидроксильными группами или аминогруппами и образуют конвертазу C3 (C4b2a) посредством нековалентного взаимодействия с фрагментом C2a активированного C2. Конвертаза C3 (C4b2a) активирует C3 посредством протеолитического расщепления на субкомпоненты C3a и C3b, что приводит к образованию конвертазы C5 (C4b2a3b), которая, посредством расщепления C5, приводит к формированию мембраноатакующего комплекса (C5b в комбинации с полимерами C6, C7, C8 и C9, также обозначаемого как MAC), который может разрушать клеточные мембраны, приводя к лизису клеток. Активированные формы C3 и C4 (C3b и C4b) ковалентным образом накапливаются на поверхностях чужеродных мишеней, которые узнают рецепторы комплемента на множестве фагоцитов.

Первой стадией активации системы комплемента посредством лектинового пути является связывание молекул, узнающих специфический для лектинового пути паттерн, с их лигандами-мишенями. Этот процесс инициирует активацию специфических для лектинового пути проферментов сериновых протеаз, которые, в свою очередь, инициируют каскад реакций комплемента. Узнающие паттерн молекулы в лек- 1 045598 тиновом пути содержат группу связывающих углеводы лектинов C-типа, т.е. связывающий маннан лектин (MBL), коллектин-11 (CL-11, также известный как CL-K1), коллектин-10 (CL-10, также известный как CL-L1), и три различных фиколина, т.е. H-фиколин, M-фиколин и L-фиколин, которые связываются с ацетилированными структурами углеводов и белков посредством подобных фибриногену связывающих доменов (J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572:387 400, (2002); Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. 21:547 578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225 232 (2000), J. Luet et al., Biochim Biophys Acta 1572:387400 (2002); Hansen et al., J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010), и Hendriksen et al., J Immunol 191(12):611727, 2013).

Ikeda et al. впервые показали что, подобно C1q, MBL может активировать систему комплемента при связывании с покрытыми маннаном дрожжей эритроцитами зависимым от C4 образом (Ikeda et al., J. Biol. Chem. 262:7451 7454, (1987)). MBL, член семейства белка коллектина, представляет собой кальцийзависимый лектин, который связывает углеводы с 3 и 4 гидрокси-группами, ориентированными в экваториальной плоскости пиранозного кольца. Выступающими лигандами для MBL, таким образом, являются D-манноза и N-ацетил-О-глюкозамин, в то время как углеводы, не удовлетворяющие этим стерическим требованиям, имеют не поддающуюся детекции аффинность для MBL (Weis et al., Nature 360:127 134, (1992)). Взаимодействие между MBL и моновалентными сахарами является необычайно слабым, с константами диссоциации, как правило, в однозначном миллимолярном диапазоне. MBL достигает тесного, специфического связывания с гликановыми лигандами посредством авидности, т.е. посредством одновременного взаимодействия с многочисленными моносахаридными остатками, локализованными в тесной близости друг от друга (Lee et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299:129 136, (1992)). MBL узнает углеводные паттерны, обычно покрывающие микроорганизмы, такие как бактерии, дрожжи, паразиты и определенные вирусы. В отличие от этого, MBL не узнает D-галактозу и сиаловую кислоту, предпоследний и последний сахара, обычно покрывающие зрелые комплексные гликоконъюгаты, присутствующие в гликопротеинах в плазме и на поверхности клеток млекопитающих. Считают, что эта специфичность связывания стимулирует узнавание чужеродных поверхностей и помогает защищать от аутоактивации. Однако, MBL не связывается с высокой аффинностью с кластерами предшественников гликанов с высоким содержанием маннозы на N-связанных гликопротеинах и гликолипидах, секвестрированных в эндоплазматическом ретикулюме и аппарате Гольджи клеток млекопитающих (Maynard et al., J. Biol. Chem. 257:3788 3794, (1982)). Таким образом, поврежденные клетки являются потенциальными мишенями для активации лектинового пути посредством связывания MBL, и в более недавней работе показано, что CL-11 представляет собой другой субкомпонент узнавания лектинового пути, который инициирует активацию лектинового пути на подвергнутых стрессу или поврежденных клетках (Farar et al., J Clin Invest 126:1911-1925, 2016).

Фиколины имеют тип лектинового домена, отличный от MBL, называемый подобным фибриногену доменом. Фиколины связывают остатки сахара независимым от Ca^ образом. У человека идентифицировано три вида фиколинов (L-фиколин, M-фиколин и H-фиколин). Два фиколина сыворотки, L-фиколин и H-фиколин, имеют общую специфичность для N-ацетил-О-глюкозамина; однако, H-фиколин связывает также N-ацетил-О-галактозамин. Различие в специфичности для сахаров L-фиколина, H-фиколина, CL11 и MBL означает, что различные лектины могут являться комплементарными и нацеленными на различные, хотя и перекрывающиеся, гликоконъюгаты. Эту концепцию поддерживает недавнее сообщение о том, что из известных лектинов в лектиновом пути, только L-фиколин связывается специфически с липотейхоевой кислотой, гликококонъюгатом клеточной стенки, обнаруженном на всех грамположительных бактериях (Lynch et al., J. Immunol. 172:1198 1202, (2004)). Коллектины (т.е., MBL, CL-11, CL-10 и комплексы CL-11/CL-10) и фиколины не несут значительного сходства в аминокислотной последовательности. Однако, эти две группы белков имеют сходные доменные организации и, подобно C1q, собираются в олигомерные структуры, которые максимизируют возможность связывания во множестве участков.

Концентрации MBL в сыворотке являются высоко изменчивыми в здоровых популяциях, и это генетически контролируется посредством полиморфизмов/мутаций как в промоторной, так и в кодирующей областях гена MBL. В качестве белка острой фазы, экспрессия MBL дополнительно подвергается повышающей регуляции в ходе воспаления. L-фиколин присутствует в сыворотке в концентрациях, сходных с концентрациями MBL. Таким образом, ветвь L-фиколина из лектинового пути потенциально сравнима с ветвью MBL по физиологической важности. MBL и фиколины могут также функционировать как опсонины, которые позволяют фагоцитам нацеливаться на покрытые MBL и фиколином поверхности (см. Jack et al., J Leukoc Biol., 77(3):328-36 (2004), Matsushita and Fujita, Immunobiology, 205 (4-5):490-7 (2002), Aoyagi et al., J Immunol, 174(1):418-25(2005). Эта опсонизация требует взаимодействия этих белков с рецепторами фагоцитов (Kuhlman et al., J. Exp. Med. 169:1133, (1989); Matsushita et al., J. Biol. Chem. 271:2448 54, (1996)), идентичность которых не была установлена.

MBL человека формирует специфическое и высокоаффинное взаимодействие посредством его подобного коллагену домена с уникальными подобными Clr/Cls сериновыми протеазами, названными ассоциированными с MBL сериновыми протеазами (MASP). До настоящего времени, описано три MASP. Сначала одиночный фермент MASP был идентифицирован и охарактеризован как фермент, ответст

- 2 045598 венный за инициацию каскада реакций комплемента (т.е., расщепление C2 и C4) (Matsushita et al., J Exp Med 176(6):1497-1502 (1992); Ji et al., J. Immunol. 150:571 578, (1993)). Впоследствии определили, что активность MASP фактически представляла собой смесь двух протеаз: MASP-1 и MASP-2 (Thiel et al., Nature 386:506 510, (1997)). Однако, показано, что комплекс MBL-MASP-2 сам по себе является достаточным для активации комплемента (Vorup Jensen et al., J. Immunol. 165:2093 2100, (2000)). Кроме того, только MASP-2 расщеплял C2 и C4 с высокой результативностью (Ambrus et al., J. Immunol. 170:1374 1382, (2003)). Таким образом, MASP-2 представляет собой протеазу, ответственную за активацию C4 и C2 для получения конвертазы C3, C4b2a. В этом заключается его значительное отличие от комплекса C1 классического пути, где скоординированная активность двух специфичных сериновых протеаз (Clr и Cls) приводит к активации системы комплемента. Кроме того, выделена третья новая протеаза, MASP-3 (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:121 35, 2001). MASP-1 и MASP-3 представляют собой продукты одного и того же гена, полученные в результате альтернативного сплайсинга.

MASP разделяют идентичную доменную организацию с доменами Clr и Cls, ферментными компонентам комплекса Cl (Sim et al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, (2 000)). Эти домены включают N-концевой домен Clr/Cls/VEGF морского ежа/костного морфогенетического белка (CUB), подобный эпидермальному фактору роста домен, второй домен CUB, тандем доменов белков, контролирующих комплемент, и домен сериновой протеазы. Как и в протеазах Cl, активация MASP-2 происходит посредством расщепления связи Arg-I1e, примыкающей к домену сериновой протеазы, что приводит к расщеплению фермента на связанные дисульфидными связями цепи A и B, последняя из которых состоит из домена сериновой протеазы.

MBL может также связываться с полученной посредством альтернативного сплайсинга формой MASP-2, известной как ассоциированный с MBL белок 19 кДа (MAp19) или малый ассоциированный с MBL белок (sMAP), у которой отсутствует каталитическая активность MASP-2. (Stover, J. Immunol. 162:3481 90, (1999); Takahashi et al., Int. Immunol. 11:859 863, (1999)). MAp19 содержит два первых домена MASP 2, за которыми следует дополнительная последовательность из четырех уникальных аминокислот. Функция Map19 является неясной (Degn et al., J Immunol. Methods, 2011). Гены MASP-1 и MASP-2 локализованы на хромосомах 3 и 1 человека, соответственно (Schwaeble et al., Immunobiology 205:455 466, (2002)).

Ряд свидетельств позволяет предполагать, что существуют различные комплексы MBL-MASP и большая фракция MASP в сыворотке не входит в комплекс с MBL (Thiel, et al., J. Immunol. 165:878 887, (2000)). Как H-, так и L-фиколин, связываются со всеми MASP и активируют лектиновый путь комплемента, также, как MBL (Dahl et al., Immunity 15:127 35, (2001); Matsushita et al., J. Immunol. 158:3502 3506, (2002)). Как лектиновый, так и классический пути, формируют общую конвертазу C3 (C4b2a), и оба пути активации сходятся на этой стадии.

Повсеместно считают, что лектиновому пути комплемента принадлежит ведущая роль в защите хозяина против инфекции для наивного хозяина. Надежные доказательства вовлеченности MBL в защиту хозяина вытекают из анализов пациентов с уменьшенными уровнями функционального MBL в сыворотке (Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572:401 413, (2002)). Для таких пациентов показана чувствительность к рецидивирующим бактериальным и грибковым инфекциям. Эти симптомы обычно проявляются в раннем возрасте, во время выраженного окна уязвимости, когда титр производных от материнских антител снижается, но до развития ответов полного репертуара антител. Этот синдром часто возникает в результате мутаций в нескольких участках в коллагеновой части MBL, которые мешают правильному формированию олигомеров MBL. Однако, поскольку MBL может функционировать в качестве независимого от комплемента опсонина, неизвестно, до какой степени увеличенная чувствительность к инфекции обусловлена нарушенной активацией комплемента.

В отличие от классического и лектинового путей, не было выявлено инициаторов альтернативного пути для осуществления функций узнавания, выполняемых C1q и лектинами в двух других путях. В настоящее время считается общепринятым, что альтернативный путь спонтанно подвергается низкому уровню переменной активации, которая легко может усиливаться на чужеродных или других аномальных поверхностях (бактерий, дрожжей, инфицированных вирусами клеток или поврежденных тканей), лишенных надлежащих молекулярных элементов, удерживающих спонтанную активацию комплемента под контролем. Существует четыре белка плазмы, напрямую вовлеченных в активацию альтернативного пути: C3, факторы B и D, и пропердин.

Несмотря на обширные доказательства участия как классического, так и альтернативного путей комплемента в патогенезе неинфекционных заболеваний человека, роль лектинового пути только начинают оценивать. Недавние исследования обеспечивают доказательство того, что активация лектинового пути может являться ответственной за активацию комплемента и связанное воспаление при ишемическом/реперфузионном повреждении. Collard et al. (2000) опубликовали, что культивируемые эндотелиальные клетки, подвергнутые окислительному стрессу, связываются с MBL и демонстрируют накопление C3 под воздействием человеческой сыворотки (Collard et al., Am. J. Pathol. 156:1549 1556, (2000)). Кроме того, обработка человеческой сыворотки блокирующими моноклональными антителами против MBL ингибировала связывание MBL и активацию комплемента. Эти обнаружения распространялись на

- 3 045598 модель миокардиальной ишемии-реперфузии на крысах, в которой у крыс, подвергнутых обработке блокирующим антителом, нацеленным против крысиного MBL, показано значительно меньшее повреждение миокарда после окклюзии коронарной артерии, чем у крыс, подвергнутых обработке контрольным антителом (Jordan et al., Circulation 104:1413 1418, (2001)). Молекулярный механизм связывания MBL с эндотелием сосудов после окислительного стресса остается неясным; недавнее исследование позволяет предполагать, что активация лектинового пути после окислительного стресса может быть опосредована связыванием MBL с цитокератинами эндотелия сосудов, а не с гликоконьюгатами (Collard et al., Am. J. Pathol. 159:1045 1054, (2001)). В других исследованиях выявлено вовлечение классического и альтернативного путей в патогенез ишемического/реперфузионного повреждения, и роль лектинового пути в этом заболевании остается спорной (Riedermann, N.C., et al., Am. J. Pathol. 162:363 367, 2003).

В недавнем исследовании показано, что MASP-1 (и возможно, также MASP-3) является необходимым для превращения фермента активации альтернативного пути фактора D из его зимогенной формы в его ферментативно активную форму (см. Takahashi M. et al., J Exp Med 207(1):29-37 (2010)). Физиологическая важность этого процесса подчеркнута отсутствием функциональной активности альтернативного пути в плазме мышей с недостаточностью MASP-1/3. Протеолитическое получение C3b из нативного C3 необходимо для функционирования альтернативного пути. Поскольку конвертаза C3 (C3bBb) альтернативного пути содержит C3b в качестве необходимой субъединицы, вопрос относительно происхождения первой C3b посредством альтернативного пути представляет собой озадачивающую проблему и побуждает к серьезным исследованиям.

C3 принадлежит к семейству белков (вместе с C4 и а2-макроглобулином), которое имеет редкую посттрансляционную модификацию, известную как тиоэфирная связь. Тиоэфирная группа состоит из глутамина, в котором концевая карбонильная группа формирует тиоэфирную связь с сульфгидрильной группой цистеина, который находится через три аминокислоты. Эта связь является нестабильной, и электрофильный глутамил-тиоэфир может вступать в реакцию с нуклеофильными группами, такими как гидроксильная группа или аминогруппа, и таким образом формирует ковалентную связь с другими молекулами. Тиоэфирная группа является достаточно стабильной при секвестрировании в гидрофобном кармане интактного C3. Однако протеолитическое расщепление C3 до C3a и C3b приводит к экспонированию высоко реакционноспособной тиоэфирной связи на C3b и, после нуклеофильной атаки соседних групп, содержащих гидроксильные группы или аминогруппы, C3b становится ковалентно присоединенным к мишени. В дополнение к его хорошо задокументированной роли в ковалентном присоединении C3b к мишеням комплемента, считают, что тиоэфир C3 также играет главную роль в запуске альтернативного пути. Согласно общепринятой теории холостой активации, альтернативный путь инициируется образованием растворимой конвертазы, iC3Bb, которая формируется из C3 с гидролизованным тиоэфиром (iC3; C3(H₂O)) и фактора B (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopathol. 7:143 162, (1984)). Подобный C3b C3(H₂O) образуется из нативного C3 посредством медленного спонтанного гидролиза внутреннего тиоэфира в белке (Pangburn, M.K., et al., J. Exp. Med. 154:856 867, 1981). За счет активности конвертазы C3(H2O)Bb, молекулы C3b накапливаются на поверхности мишени, таким образом, инициируя альтернативный путь.

Очень мало известно об инициаторах активации альтернативного пути. Считают, что активаторы включают клеточные стенки дрожжей (зимозан), множество чистых полисахаридов, эритроциты кролика, определенные иммуноглобулины, вирусы, грибы, бактерии, клетки опухолей животных, паразитов и поврежденные клетки. Единственным общим признаком этих активаторов является присутствие углевода, но сложность и разнообразие углеводных структур затрудняют установление общих молекулярных детерминант, которые распознаются. Является общепринятым, что активация альтернативного пути контролируется посредством точного равновесия между ингибирующими регуляторными компонентами этого пути, такими как фактор H, фактор I, DAF и CR1, и пропердин, который является единственным положительным регулятором альтернативного пути (см. Schwaeble W.J. and Reid K.B., Immunol Today 20(1):17-21 (1999)).

В дополнение к кажущемуся нерегулируемым механизму активации, описанному выше, альтернативный путь может также предоставлять мощную усиливающую петлю для конвертазы C3 (C4b2a) лектинового/классического пути, поскольку любой образованный C3b может вместе с фактором B участвовать в формировании дополнительной конвертазы альтернативного пути C3 (C3bBb). Конвертаза альтернативного пути C3 стабилизируется посредством связывания с пропердином. Пропердин увеличивает время полужизни конвертазы альтернативного пути C3 в шесть - десять раз. Добавление C3b к конвертазе C3 альтернативного пути приводит к формированию конвертазы C5 альтернативного пути.

Считали, что все три пути (т.е., классический, лектиновый и альтернативный) сходятся на C5, которая расщепляется с формированием продуктов с множественными провоспалительными эффектами. Объединенный путь обозначен как терминальный путь активации комплемента. C5a является наиболее сильным анафилатоксином, индуцирующим изменения в гладкой мускулатуре и сосудистом тонусе, также как в проницаемости сосудов. Он является также сильным хемотаксином и активатором как нейтрофилов, так и моноцитов. Опосредованная C5a клеточная активация может значительно усиливать воспалительные ответы посредством индукции высвобождения множества дополнительных медиаторов

- 4 045598 воспаления, включая цитокины, гидролитические ферменты, метаболиты арахидоновой кислоты и реакционноспособные формы кислорода. Расщепление C5 приводит к формированию C5b-9, также известного как мембраноатакующий комплекс (MAC). В настоящее время существуют веские доказательства того, что сублитическое накопление MAC может играть важную роль в воспалении в дополнение к его роли в качестве литического порообразующего комплекса.

В дополнение к ее важной роли в иммунной защите, система комплемента вносит вклад в повреждение тканей при множестве клинических состояний. Таким образом, существует настоятельная необходимость разработки терапевтически эффективных ингибиторов комплемента для предотвращения этих неблагоприятных эффектов.

Хорошо установлено, что ангиогенез вовлечен в патогенез множества нарушений, включая солидные опухоли и метастазирование, и неоваскулярные офтальмологические заболевания, такие как связанная с возрастом дегенерация желтого пятна (AMD), пролиферативная диабетическая ретинопатия и неоваскулярная глаукома.

С учетом роли ангиогенеза во множестве заболеваний и нарушений, существует также настоятельная необходимость разработки терапевтически эффективных ингибиторов ангиогенеза.

Сущность изобретения

Это краткое изложение сущности изобретения приведено для представления в упрощенной форме набора концепций, которые дополнительно описаны ниже в подробном описании. Это краткое изложение сущности изобретения как не предназначено для идентификации ключевых признаков заявленного объекта изобретения, так и не предназначено для использования в качестве вспомогательного средства для определения объема заявленного объекта изобретения.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам предотвращения, лечения, возвращения к прежнему состоянию и/или задержки ангиогенеза у пациента, который является млекопитающим, страдающим или подверженным риску развития, зависимого от ангиогенеза заболевания или состояния, включающим введение пациенту количества ингибирующего MASP-2 средства, эффективного для ингибирования ангиогенеза. В некоторых вариантах осуществления этих аспектов изобретения, ингибирующее MASP-2 средство представляет собой антитело против MASP-2 или его фрагмент. В следующих вариантах осуществления, антитело против MASP-2 имеет уменьшенную эффекторную функцию. В некоторых вариантах осуществления, ингибирующее MASP-2 средство представляет собой ингибирующий MASP-2 пептид или непептидный ингибитор MASP-2.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к композициям для ингибирования неблагоприятных эффектов ангиогенеза, содержащим терапевтически эффективное количество ингибирующего MASP-2 средства и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение относится также к способам изготовления лекарственного средства для использования для ингибирования неблагоприятных эффектов ангиогенеза у живых нуждающихся в этом пациентов, содержащего терапевтически эффективное количество ингибирующего MASP-2 средства в фармацевтическом носителе. Изобретение относится также к способам изготовления лекарственных средств для использования для ингибирования ангиогенеза для лечения каждого из состояний, заболеваний и нарушений, описанных в настоящем описании ниже.

Способы, композиции и лекарственные средства по изобретению можно использовать для ингибирования неблагоприятных эффектов ангиогенеза in vivo у пациента, который является млекопитающим, включая людей, страдающих от острого или хронического патологического состояния или повреждения, как описано далее в настоящем описании.

В другом аспекте изобретение относится к способам ингибирования ангиогенеза у пациента, который является млекопитающим, страдающим зависимым от ангиогенеза заболевания или состояния, включающим введение индивиду композиции, содержащей количество ингибирующего MASP-2 средства, эффективное для ингибирования ангиогенеза. В некоторых вариантах осуществления, зависимое от ангиогенеза заболевание или состояние представляет собой зависимую от ангиогенеза злокачественную опухоль, например, такую как зависимая от ангиогенеза злокачественная опухоль, выбранная из группы, состоящей из солидной опухоли(опухолей), передающихся через кровь опухолей, карциноидных опухолей высокого риска и метастазов опухолей. В некоторых вариантах осуществления, зависимое от ангиогенеза заболевание или состояние представляет собой зависимую от ангиогенеза доброкачественную опухоль, например, такую как зависимая от ангиогенеза доброкачественная опухоль, выбранная из группы, состоящей из гемангиом, неврином слухового нерва, нейрофибром, трахом, карциноидных опухолей и пиогенных гранулем. В некоторых вариантах осуществления, зависимое от ангиогенеза заболевание или состояние представляет собой офтальмологическое ангиогенное заболевание или состояние, например, такое как офтальмологическое ангиогенное заболевание или состояние, выбранное из группы, состоящей из связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD), увеита, меланомы глаза, неоваскуляризации роговицы, первичного птеригия, стромального кератита HSV, индуцированного HSV-1 лимфангиогенеза роговицы, пролиферативной диабетической ретинопатии, ретинопатии недоношенных, окклюзии вен сетчатки, отторжения трансплантата роговицы, неоваскулярной глаукомы и покраснения радужки.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения индивида, страдающего

- 5 045598 офтальмологическим ангиогенным заболеванием или состоянием, выбранным из группы, состоящей из AMD, увеита, меланомы глаз, неоваскуляризации роговицы, первичного птеригия, стромального кератита HSV, индуцированного HSV-1 лимфангиогенеза роговицы, пролиферативной диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, ретинопатии недоношенных, окклюзии вен сетчатки, отторжения трансплантата роговицы, неоваскулярной глаукомы, геморрагии стекловидного тела, вторичной по отношению к пролиферативной диабетической ретинопатии, нейромиелита зрительного нерва и покраснения радужки, включающим введение индивиду количества ингибирующего MASP-2 средства, эффективного для ингибирования ангиогенеза.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования ангиогенеза опухолей, включающим введение индивиду со злокачественной опухолью количества ингибирующего MASP2 средства, эффективного для ингибирования ангиогенеза.

Описание чертежей

Вышеупомянутые аспекты и множество сопутствующих преимуществ этого изобретения смогут быть быстрее оценены и станут более доступными для понимания путем ссылки на нижеследующее подробное описание, рассмотренное в сочетании с прилагаемыми чертежами, где:

фиг. 1 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую геномную структуру MASP-2 человека;

фиг. 2A представляет собой схематическую диаграмму, иллюстрирующую доменную структуру белка MASP-2 человека;

фиг. 2B представляет собой схематическую диаграмму, иллюстрирующую доменную структуру белка MAp19 человека;

фиг. 3 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую стратегию нокаута мышиного гена MASP2;

фиг. 4 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую конструкцию минигена MASP-2 человека;

на фиг. 5A представлены результаты, показывающие, что недостаточность MASP-2 приводит к потере опосредованной лектиновым путем активации C4, как измерено по отсутствию накопления C4b на маннане, как описано в примере 2;

на фиг. 5B представлены результаты, показывающие, что недостаточность MASP-2 приводит к потере опосредованной лектиновым путем активации C4, как измерено по отсутствию накопления C4b на зимозане, как описано в примере 2;

на фиг. 5C представлены результаты, показывающие относительные уровни активации C4 в образцах сыворотки, полученных из линий MASP-2+/-; MASP-2-/- и линий дикого типа, как измерено по накоплению C4b на маннане и на зимозане, как описано в примере 2;

на фиг. 6 представлены результаты, показывающие, что добавление мышиного рекомбинантного MASP-2 к образцам сыворотки MASP-2-/- восстанавливает опосредованную лектиновым путем активацию C4 зависимым от концентрации белка образом, как измерено по накоплению C4b на маннане, как описано в примере 2;

на фиг. 7 представлены результаты, показывающие, что классический путь является функциональным в линии MASP-2-/-, как описано в примере 8;

на фиг. 8A представлены результаты, показывающие, что антитело против MASP-2 Fab2 #11 ингибирует формирование конвертазы C3, как описано в примере 10;

на фиг. 8B представлены результаты, показывающие, что антитело против MASP-2 Fab2 #11 связывается с нативным MASP-2 крысы, как описано в примере 10;

на фиг. 8C представлены результаты, показывающие, что антитело против MASP-2 Fab2 #41 ингибирует расщепление C4, как описано в примере 10;

на фиг. 9 представлены результаты, показывающие, что обнаружено, что все тестированные антитела против MASP-2 Fab2, которые ингибируют формирование конвертазы C3, ингибируют также расщепление C4, как описано в примере 10;

фиг. 10 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую использование рекомбинантных полипептидов, полученных из крысиного MASP-2, для картирования эпитопов блокирующих антител против MASP-2 Fab2, как описано в примере 11;

на фиг. 11 представлены результаты, показывающие связывание антител против MASP-2 Fab2 #40 и #60 с полипептидами крысиного MASP-2, как описано в примере 11;

на фиг. 12A представлены результаты, показывающие исходные уровни белка VEGF в RPEхориоидальном комплексе, выделенном из мышей дикого типа (+/+) и мышей MASP-2(-/-), как описано в примере 12;

на фиг. 12B представлены результаты, показывающие уровни белка VEGF в RPE-хориоидальном комплексе у мышей дикого типа (+/+) и у мышей MASP-2(-/-) на сутки 3 после индуцированного лазером повреждения в модели дегенерации желтого пятна, как описано в примере 12;

на фиг. 13 представлены результаты, показывающие средний объем хориоидальной неоваскуляризации (CNV) на сутки семь после индуцированного лазером повреждения у мышей дикого типа (+/+) и у мышей MASP-2(-/-), как описано в примере 12;

на фиг. 14 графически проиллюстрирован уровень накопления C4b, измеренный как % от контроля,

- 6 045598 в образцах, отобранных в различные временные точки после подкожного (SC) дозирования либо 0,3 мг/кг, либо 1,0 мг/кг мышиного моноклонального антитела против MASP-2 у мышей WT, как описано в примере 13;

на фиг. 15 графически проиллюстрирован уровень накопления C4b, измеренный как % от контроля, в образцах, отобранных в различные временные точки после внутрибрюшинного (IP) дозирования 0,6 мг/кг мышиного моноклонального антитела против MASP-2 у мышей WT, как описано в примере 13;

на фиг. 16 графически проиллюстрирован средний объем хориоидальной неоваскуляризации (CNV) на сутки семь после индуцированного лазером повреждения у мышей WT (+/+), подвергнутых предварительной однократной IP инъекции 0,3 мг/кг или 1,0 мг/кг мышиного моноклонального антитела против MASP-2; как описано в примере 14;

на фиг. 17A графически проиллюстрирован уровень накопления MAC в присутствии или в отсутствие моноклонального антитела против MASP-2 человека (OMS646) в условиях анализа, специфических для лектинового пути, показывающий, что OMS646 ингибирует опосредованное лектином накопление MAC с значением IC₅₀ приблизительно 1 нМ, как описано в примере 15;

на фиг. 17B графически проиллюстрирован уровень накопления MAC в присутствии или в отсутствие моноклонального антитела против MASP-2 человека (OMS646) в условиях анализа, специфических для классического пути, показывающий, что OMS646 не ингибирует опосредованное классическим путем накопление MAC, как описано в примере 15;

на фиг. 17С графически проиллюстрирован уровень накопления MAC в присутствии или в отсутствие моноклонального антитела против MASP-2 человека (OMS646) в условиях анализа, специфических для альтернативного пути, показывающий, что OMS646 не ингибирует опосредованное альтернативным путем накопление MAC, как описано в примере 15;

на фиг. 18 графически проиллюстрирован фармакокинетический (PK) профиль моноклонального антитела против MASP-2 человека (OMS646) у мышей, показывающий концентрацию OMS646 (среднее из n=3 животных/группы) как функцию от времени после введения в указанной дозе, как описано в примере 15;

на фиг. 19A графически проиллюстрирован фармакодинамический (PD) ответ моноклонального антитела против MASP-2 человека (OMS646), измеренный как падение системной активности лектинового пути, у мышей после внутривенного введения, как описано в примере 15;

на фиг. 19B графически проиллюстрирован фармакодинамический (PD) ответ моноклонального антитела против MASP-2 человека (OMS646), измеренный как падение системной активности лектинового пути, у мышей после подкожного введения, как описано в примере 15; и на фиг. 20 графически проиллюстрирована площадь хориоидальной неоваскуляризации (CNV) как процент от площади индуцированных лазером очагов на сутки семь после повреждения у мышей WT (+/+), подвергнутых предварительной обработке с использованием 2 мг/кг, 5 мг/кг или 20 мг/кг моноклонального антитела против MASP-2 человека (OMS646), введенного SC, или антитела против VEGF, введенного IP, как описано в примере 16.

Описание списка последовательностей

SEQ ID NO: 1 кДНК MAp19 человека

SEQ ID NO: 2 человеческий белок MAp19 (с лидерной последовательностью)

SEQ ID NO: 3 человеческий белок MAp19 (зрелый)

SEQ ID NO: 4 кДНК MASP-2 человека

SEQ ID NO: 5 человеческий белок MASP-2 (с лидерной последовательностью)

SEQ ID NO: 6 человеческий белок MASP-2 белок (зрелый)

SEQ ID NO: 7 гДНК MASP-2 человека (экзоны 1-6)

Антигены: (по отношению к зрелому белку MASP-2)

SEQ ID NO: 8 последовательность CUBI (ак 1-121)

SEQ ID NO: 9 последовательность CUBEGF (ак 1-166)

SEQ ID NO: 10 CUBEGFCUBII (ак 1-293)

SEQ ID NO: 11 область EGF (ак 122-166)

SEQ ID NO: 12 домен сериновой протеазы (ак 429-671)

SEQ ID NO: 13 неактивный домен сериновой протеазы (ак 610-625 с мутацией Ser618 до Ala)

SEQ ID NO: 14 TPLGPKWPEPVFGRL (пептид CUBI)

SEQ ID NO: 15 TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ (пептид CUBI)

SEQ ID NO: 16 TFRSDYSN (кор связывающей MBL области)

SEQ ID NO: 17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF (связывающая MBL область)

SEQ ID NO: 18 IDECQVAPG (пептид EGF)

SEQ ID NO: 19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV (кор связывающей сериновую протеазу области)

Подробное описание

Пептидные ингибиторы:

SEQ ID NO: 20 полноразмерная кДНК MBL

- 7 045598

SEQ ID NO: 21 полноразмерный белок MBL

SEQ ID NO: 22 OGK-X-GP (консенсус связывания)

SEQ ID NO: 23 OGKLG

SEQ ID NO: 24 GLR GLQ GPO GKL GPO G

SEQ ID NO: 25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO

SEQ ID NO: 26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOG

SEQ ID NO: 27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO (h-фиколин человека)

SEQ ID NO: 28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGAOGEO (фиколин p35 человека)

SEQ ID NO: 29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI (участок расщепления C4)

Ингибиторы экспрессии:

SEQ ID NO: 30 кДНК домена CUBI-EGF (нуклеотиды 22-680 из SEQ ID NO: 4)

SEQ ID NO: 31

5' CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC 3'

Нуклеотиды 12-45 из SEQ ID NO: 4, включая участок старта трансляции MASP-2 (смысловые)

SEQ ID NO: 32

5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3'

Нуклеотиды 361-396 из SEQ ID NO: 4, кодирующие область, содержащую участок связывания MBL MASP-2 (смысловые)

SEQ ID NO: 33

5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3'

Нуклеотиды 610-642 из SEQ ID NO: 4, кодирующие область, содержащую домен CUBII

Праймеры для клонирования:

SEQ ID NO: 34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC (5' ПЦР для CUB)

SEQ ID NO: 35 GGAATTCCTAGGCTGCATA (3' ПЦР ДЛЯ CUB)

SEQ ID NO: 36 GGAATTCCTACAGGGCGCT (3' ПЦР ДЛЯ CUBIEGF)

SEQ ID NO: 37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT (3' ПЦР ДЛЯ CUBIEGFCUBII)

SEQ ID NO: 38-47 представляют собой праймеры для клонирования для гуманизированного антите ла

SEQ ID NO: 48 представляет собой пептидную связь из 9 ак

Экспрессирующий вектор:

SEQ ID NO: 49 представляет собой вставку минигена MASP-2

SEQ ID NO: 50 представляет собой кДНК MASP-2 мыши

SEQ ID NO: 51 представляет собой мышиный белок MASP-2 (с лидерной последовательностью)

SEQ ID NO: 52 представляет собой зрелый мышиный белок MASP-2 белок

SEQ ID NO: 53 представляет собой кДНК MASP-2 крысы

SEQ ID NO: 54 представляет собой крысиный белок MASP-2 (с лидерной последовательностью)

SEQ ID NO: 55 представляет собой зрелый крысиный белок MASP-2

SEQ ID NO: 56-59 представляют собой олигонуклеотиды для сайт-направленного мутагенеза человеческого MASP-2, используемые для получения человеческого MASP-2A

SEQ ID NO: 60-63 представляют собой олигонуклеотиды для сайт-направленного мутагенеза мышиного MASP-2, используемые для получения мышиного MASP-2A

SEQ ID NO: 64-65 представляют собой олигонуклеотиды для сайт-направленного мутагенеза крысиного MASP-2, используемые для получения крысиного MASP-2A

SEQ ID NO: 66 ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи (VH) 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) (без сигнального пептида)

SEQ ID NO: 67 полипептид вариабельной области тяжелой цепи (VH) 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646)

SEQ ID NO: 68 полипептид вариабельной области тяжелой цепи (VH) 17N16mc

SEQ ID NO: 69 полипептид вариабельной области легкой цепи (VL) 17D20_dc21N11VL (OMS644)

SEQ ID NO: 70 ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи (VL) 17N16_dc17N9 (OMS641) (без сигнального пептида)

SEQ ID NO: 71 полипептид вариабельной области легкой цепи (VL) 17N16_dc17N9 (OMS641)

Подробное описание

Настоящее изобретение основано на неожиданном обнаружении авторами настоящего изобретения того, что является возможным ингибирование опосредованного лектином пути MASP-2, в то же время оставляя классический путь интактным. Настоящее изобретение относится также к использованию MASP-2 в качестве терапевтической мишени для ингибирования клеточных повреждений, связанных с активацией опосредованного лектином пути комплемента, в то же время оставляя классический (зависимый от C1q) путь компонента иммунной системы интактным.

I. Определения.

Если конкретно не определено иное, все термины, применяемые в настоящем описании, имеют то

- 8 045598 же самое значение, которое понятно специалисту в области настоящего изобретения. Следующие определения представлены с целью внесения ясности в отношении терминов, как их используют в описании и формуле изобретения для описания настоящего изобретения.

В рамках изобретения, термин зависимая от MASP-2 активация комплемента относится к зависимой от MASP-2 активации лектинового пути, которая происходит в физиологических условиях (т.е., в присутствии Ca++), приводящих к формированию конвертазы C3 лектинового пути C4b2a и после накопления продукта расщепления C3 C3b, последовательно до конвертазы C5 C4b2a(C3b)n, которую определили в качестве первичной причины опсонизации.

В рамках изобретения, термин альтернативный путь относится к активации комплемента, которая запускается, например, посредством зимозана из клеточных стенок грибов и дрожжей, липополисахарида (LPS) из наружной мембраны грамотрицательных бактерий, и эритроцитов кролика, так же как из множества чистых полисахаридов, эритроцитов кролика, вирусов, бактерий, клеток опухолей животных, паразитов и поврежденных клеток, и которую традиционно считают возникающей из-за спонтанного протеолитического образования C3b из фактора комплемента C3.

В рамках изобретения, термин лектиновый путь относится к активации комплемента, которая происходит посредством специфического связывания сывороточных и несывороточных связывающих углеводы белков, включая связывающий маннан лектин (MBL), CL-11 и фиколины (H-фиколин, Mфиколин или L-фиколин).

В рамках изобретения, термин классический путь относится к активации комплемента, запускаемой посредством антитела, связанного с чужеродной частицей и требующей связывания узнающей молекулы C1q.

В рамках изобретения, термин ингибирующее MASP-2 средство относится к любому средству, которое связывается или непосредственно взаимодействует с MASP-2 и эффективно ингибирует зависимую от MASP-2 активацию комплемента, включая антитела против MASP-2 и их связывающие MASP-2 фрагменты, природные и синтетические пептиды, малые молекулы, растворимые рецепторы MASP-2, ингибиторы экспрессии и выделенные натуральные ингибиторы, и относится также к пептидам, которые конкурируют с MASP-2 за связывание с другой узнающей молекулой (например, MBL, H-фиколином, Mфиколином или L-фиколином) в лектиновом пути, но не относится к антителам, связывающим другие узнающие молекулы. Ингибирующие MASP-2 средства, которые можно использовать в способе по изобретению могут уменьшать зависимую от MASP-2 активацию комплемента более чем на 20%, например, более чем на 50%, например, более чем на 90%. В одном варианте осуществления, ингибирующее MASP-2 средство уменьшает зависимую от MASP-2 активацию комплемента более чем на 90% (т.е., в результате активация комплемента MASP-2 составляет только 10% или менее).

В рамках изобретения, термин ангиогенез относится к росту новых микрососудов из предсуществующих кровеносных сосудов.

В рамках изобретения, термин неоангиогенез относится к ангиогенезу, когда он вовлечен в заболевание или состояние, которое не является физиологическим или является патологическим.

В рамках изобретения, термин антитело относится к антителам и их фрагментам антител, происходящим из любого продуцирующего антитело млекопитающего (например, мыши, крысы, кролика и примата, включая человека), или из гибридомы, отбора фагов, рекомбинантной экспрессии или трансгенных животных (или других способов получения антител или фрагментов антител), которые специфически связываются с полипептидом-мишенью, например, такой как MASP-2, его полипептиды или части. Не предусмотрено, что термин антитело ограничен применительно к источнику антитела или способу, которым оно получено (например, посредством гибридомы, отбора фагов, рекомбинантной экспрессии, трансгенного животного, синтеза пептидов и т.д.). Иллюстративные антитела включают поликлональные, моноклональные и рекомбинантные антитела; панспецифические, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела, триспецифические антитела); гуманизированные антитела; мышиные антитела; химерные, мышино-человеческие, примато-мышиные, примато-человеческие моноклональные антитела; и антиидиотипические антитела, и могут представлять собой любое интактное антитело или его фрагмент. В рамках изобретения, термин антитело включает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также их фрагменты (такие как dAb, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), одноцепочечные антитела (ScFv), их синтетические варианты, природные варианты, слитые белки, содержащие часть антитела с антигенсвязывающим фрагментом требуемой специфичности, гуманизированные антитела, химерные антитела, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит антигенсвязывающий участок или фрагмент (узнающий эпитоп участок) требуемой специфичности.

Моноклональное антитело относится к гомогенной популяции антител, где моноклональное антитело состоит из аминокислот (природных и неприродных), вовлеченных в избирательное связывание эпитопа. Моноклональные антитела являются высоко специфическими для антигена-мишени. Термин моноклональное антитело включает не только интактные моноклональные антитела и полноразмерные моноклональные антитела, но также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), одноцепочечные антитела (ScFv), их варианты, слитые белки, содержащие антигенсвязывающую часть, гуманизированные

- 9 045598 моноклональные антитела, химерные моноклональные антитела, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит антигенсвязывающий фрагмент (узнающий эпитоп участок) требуемой специфичности и способна связываться с эпитопом. Он не является ограничивающим применительно к источнику антитела или способу, которым оно получено (например, посредством гибридомы, отбора фагов, рекомбинантной экспрессии, трансгенных животных и т.д.). Термин включает полноразмерные иммуноглобулины, так же как фрагменты и т.д., описанное выше под определением антитело.

В рамках изобретения, термин фрагмент антитела относится к части, происходящей из полноразмерного антитела или относящейся к полноразмерному антителу, например, такому как антитело против MASP-2, как правило, включающей его антигенсвязывающую или вариабельную область. Иллюстративные примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')2 и Fv, фрагменты scFv, диатела, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифические антитела, сформированные из фрагментов антител.

В рамках изобретения, одноцепочечный Fv или scFv фрагмент антитела содержит домены VH и V_L антитела, где эти домены присутствуют на одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид Fv далее включает в себя полипептидный линкер между доменами VH и V_L, который позволяет scFv формировать желательную структуру для связывания антигена.

В рамках изобретения, химерное антитело представляет собой рекомбинантный белок, содержащий вариабельные домены и определяющие комплементарность области, происходящие из антитела из не относящихся к человеку видов (например, грызунов), в то время как остальная часть молекулы антитела происходит из антитела человека.

В рамках изобретения, гуманизированное антитело представляет собой химерное антитело, содержащее минимальную последовательность, соответствующую специфическим определяющим комплементарность областям, происходящим из не относящегося к человеку иммуноглобулина, трансплантированным в каркас человеческого антитела. Гуманизированные антитела, как правило, представляют собой рекомбинантные белки, в которых только определяющие комплементарность области антитела происходят из не относящегося к человеку источника.

В рамках изобретения, термин связывающий маннан лектин (MBL) является эквивалентным связывающему маннан белку (МВР).

В рамках изобретения, мембраноатакующий комплекс (MAC) относится к комплексу из пяти терминальных компонентов комплемента (C5b в комбинации с C6, C7, C8 и C-9), который внедряется внутрь мембраны и разрушает ее (также обозначенному как C5b-9).

В рамках изобретения, индивид включает всех млекопитающих, включая, без ограничения, человека, нечеловекообразных приматов, собак, кошек, лошадей, овец, коз, коров, кроликов, свиней и грызунов.

В рамках изобретения, аминокислотные остатки имеют следующие сокращенные обозначения: аланин (Ala; A), аспарагин (Asn; N), аспарагиновая кислота (Asp; D), аргинин (Arg; R), цистеин (Cys; C), глутаминовая кислота (Glu; E), глутамин (Gln; Q), глицин (Gly; G), гистидин (His; H), изолейцин (Ile; I), лейцин (Leu; L), лизин (Lys; K), метионин (Met; M), фенилаланин (Phe; F), пролин (Pro; P), серин (Ser; S), треонин (Thr; T), триптофан (Trp; W), тирозин (Tyr; Y) и валин (Val; V).

В самом широком смысле, природные аминокислоты можно разделять на группы на основании химических характеристик боковых цепей соответствующих аминокислот. Под гидрофобной аминокислотой понимают Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys или Pro. Под гидрофильной аминокислотой понимают Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg или His. Эту группировку аминокислот далее можно разделить на подклассы следующим образом. Под незаряженной гидрофильной аминокислотой понимают Ser, Thr, Asn или Gln. Под кислой аминокислотой понимают Glu или Asp. Под основной аминокислотой понимают Lys, Arg или His.

В рамках изобретения, термин консервативная аминокислотная замена проиллюстрирован заменой среди аминокислот внутри каждой из следующих групп: (1) глицин, аланин, валин, лейцин, и изолейцин, (2) фенилаланин, тирозин, и триптофан, (3) серин и треонин, (4) аспартат и глутамат, (5) глутамин и аспарагин, и (6) лизин, аргинин и гистидин.

Термин олигонуклеотид, в рамках изобретения, относится к олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), или к их миметикам. Этот термин также относится к олигонуклеиновым основаниям, состоящим из природных нуклеотидов, сахаров и ковалентных между нуклеозидных связей (остова), так же как к олигонуклеотидам, имеющим неприродные модификации.

В рамках изобретения, эпитоп относится к участку белка (например, человеческого белка MASP2), с которым связывается антитело. Перекрывающиеся эпитопы включают по меньшей мере один (например, два, три, четыре, пять или шесть) общий аминокислотный остаток(остатки), включая линейные и не линейные эпитопы.

В рамках изобретения, термины полипептид, пептид и белок использованы взаимозаменяемо и означают любую связанную пептидными связями цепь аминокислот, независимо от длины или пост

- 10 045598 трансляционной модификации. Белок MASP-2, описанный в настоящем описании, может содержать или представлять собой белки дикого типа, или может представлять собой варианты, имеющие не более чем 50 (например, не более чем одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или 50) консервативных аминокислотных замен. Консервативные замены, как правило, включают замены внутри следующих групп: глицин и аланин; валин, изолейцин и лейцин; аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин, серин и треонин; лизин, гистидин и аргинин; и фенилаланин и тирозин.

В некоторых вариантах осуществления, человеческий белок MASP-2 может иметь аминокислотную последовательность, которая является на или является более чем на 70 (например, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100) % идентичной человеческому белку MASP-2, имеющему аминокислотную последовательность, указанную на SEQ ID NO: 5.

В некоторых вариантах осуществления, пептидные фрагменты могут иметь длину по меньшей мере 6 (например, по меньшей мере 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 или 600, или более) аминокислотных остатков (например, по меньшей мере 6 последовательных аминокислотных остатков из SEQ ID NO: 5). В некоторых вариантах осуществления, антигенный пептидный фрагмент человеческого белка MASP-2 имеет длину менее чем 500 (например, менее чем 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 или 6) аминокислотных остатков (например, менее чем 500 последовательных аминокислотных остатков из любой из SEQ ID NO: 5).

Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности определяют как процент аминокислот в последовательности-кандидате, которые являются идентичными аминокислотам в эталонной последовательности, после выравнивания последовательностей и введения пропусков, при необходимости, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента идентичности последовательностей можно осуществлять различными способами, находящимися в компетенции специалиста в данной области, например, с использованием публично доступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 или Megalign (DNASTAR). Подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания на протяжении полной длины сравниваемых последовательностей, можно определять известными способами.

II. Обзор изобретения.

Лектины (MBL, M-фиколин, H-фиколин, L-фиколин и CL-11) представляют собой специфические узнающие молекулы, запускающие врожденную систему комплемента, и эта система включает лектиновый путь инициации и ассоциированную усиливающую петлю терминального пути, которая усиливает инициированную лектином активацию терминальных эффекторных молекул комплемента. C1q представляет собой специфическую узнающую молекулу, запускающую приобретенную систему комплемента, и эта система включает классический путь инициации и ассоциированную усиливающую петлю терминального пути, которая усиливает инициированную C1q активацию терминальных эффекторных молекул комплемента. Авторы настоящего изобретения обозначили эти две главные системы активации комплемента как зависимую от лектина систему комплемента и зависимую от C1q систему комплемента, соответственно.

В дополнение к ее важной роли в иммунной защите, система комплемента вносит вклад в повреждение тканей при многих клинических состояниях. Таким образом, существует настоятельная необходимость разработки терапевтически эффективных ингибиторов комплемента для предотвращения этих неблагоприятных эффектов. С пониманием того, что является возможным ингибировать опосредованный лектином путь MASP-2, в то же время оставляя классический путь интактным, приходит понимание того, что является очень желательным специфически ингибировать только систему активации комплемента, вызывающую конкретную патологию, без полного отключения иммунозащитных способностей комплемента. Например, при состояниях заболевания, при которых активация комплемента опосредована преимущественно зависимой от лектина системой комплемента, может предоставлять преимущества специфическое ингибирования только этой системы. Это может оставлять зависимую от C1q систему активации комплемента интактной для управления активностью иммунного комплекса и для способствования защите хозяина против инфекции.

Предпочтительным белковым компонентом для нацеливания в разработке лекарственных средств для специфического ингибирования зависимой от лектина системы комплемента является MASP-2. Из всех известных белковых компонентов зависимой от лектина системы комплемента (MBL, H-фиколина, фиколина M, L-фиколина, MASP-2, C2 C9, фактора B, фактора D и пропердина), только MASP-2 является как уникальным для зависимой от лектина система комплемента, так и необходимым для функциони

- 11 045598 рования системы. Лектины (MBL, H-фиколин, M-фиколин, L-фиколин и CL-11) также являются уникальными компонентами в зависимой от лектина системе комплемента. Однако, потеря любого одного из этих лектиновых компонентов необязательно ингибирует активацию системы из-за избыточности лектинов. Было бы необходимым ингибировать все пять лектинов для гарантированного ингибирования зависимой от лектина системы активации комплемента. Кроме того, поскольку известно также, что MBL и фиколины имеют независимую от комплемента опсоническую активность, ингибирование функции лектина может привесит к потере этого обеспечивающего преимущества механизма защиты хозяина против инфекции. В отличие от этого, эта независимая от комплемента опсоническая активность лектина может оставаться интактной, если MASP-2 является мишенью для ингибирования. Дополнительным преимуществом MASP-2 в качестве терапевтической мишени для ингибирования зависимой от лектина системы активации комплемента является то, что концентрация MASP-2 в плазме является одной из самых низких по сравнению с другими белками комплемента (~500 нг/мл); таким образом, соответственно, низкие концентрации высокоафинных ингибиторов MASP-2 могут являться достаточными для получения полного ингибирования (Moller Kristensen, M., et al., J. Immunol Methods 282:159 167, 2003).

Как описано в настоящем описании, неожиданно определили, что ингибитор MASP-2, такой как антитело против MASP-2 человека (OMS646), является по меньшей мере настолько же эффективным, как антитело против VEGF, при уменьшении хориоидальной неоваскуляризации (CNV) в модели связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD) на мышах при системной доставке мышам. Таким образом, ожидают, что ингибирующее MASP-2 средство, такое как ингибирующее MASP-2 антитело, может также являться эффективным в качестве антиангиогенного средства для использования для ингибирования зависимой от ангиогенеза злокачественной опухоли, например, такой как зависимая от ангиогенеза злокачественная опухоль, выбранная из группы, состоящей из солидной опухоли(опухолей), передающихся через кровь опухолей, карциноидных опухолей высокого риска и метастазов опухолей. Ожидают также, что ингибирующее MASP-2 средство, такое как ингибирующее MASP-2 антитело, может являться эффективным в качестве антиангиогенного средства для ингибирования зависимой от ангиогенеза доброкачественной опухоли, например, такой как зависимая от ангиогенеза доброкачественная опухоль, выбранная из группы, состоящей из гемангиом, неврином слухового нерва, нейрофибром, трахом, карциноидных опухолей и пиогенных гранулем. Ожидают также, что ингибирующее MASP-2 средство, такое как ингибирующее MASP-2 антитело, может являться эффективным в качестве антиангиогенного средства для использования в ингибировании ангиогенеза при AMD и других офтальмологических ангиогенных заболеваний или нарушений, таких как увеит, меланома глаза, неоваскуляризация роговицы, первичный птеригий (роговицы), стромальный кератит HSV, индуцированный HSV-1 лимфангиогенез роговицы, пролиферативная диабетическая ретинопатия, ретинопатия недоношенных, окклюзия вен сетчатки, отторжение трансплантата роговицы, неоваскулярная глаукома и покраснение радужки.

III. Роль MASP-2 в зависимых от ангиогенеза заболеваниях и состояниях, и терапевтические способы с использованием ингибирующих MASP-2 средств.

Зависимые от ангиогенеза заболевания или состояния возникают в результате того, что новые кровеносные сосуды избыточно растут в неподходящих локализациях (таких как пигментный эпителий сетчатки), или того, что новые кровеносные сосуды имеют нежелательные характеристики, такие как подтекание, и включают такие заболевания, как злокачественная опухоль и заболевания глаз. При этих состояниях, новые кровеносные сосуды подпитывают пораженную заболеванием ткань, могут разрушать новую ткань и, в случае злокачественной опухоли, новые кровеносные сосуды позволяют опухоли расти, и клеткам опухолей входить в кровоток и метастазировать к другим органам. Избыточный ангиогенез может возникать, когда пораженные заболеванием клетки продуцируют аномальные количества ангиогенных факторов роста, таким образом, преодолевая эффекты природных ингибиторов ангиогенеза.

Потенциальная роль активации комплемента в ангиогенезе показана при связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD). AMD представляет собой связанное с потерей зрения заболевание, поражающее миллионы взрослых людей, хотя последствия биохимических, клеточных и/или молекулярных событий, приводящих к развитию AMD, мало понятны. AMD приводит к прогрессирующему разрушению желтого пятна, что связано с формированием внеклеточных отложений, богатых белками и липидами, называемых друзами, локализованных внутри и вокруг желтого пятна, позади сетчатки и между пигментным эпителием сетчатки (RPE) и хороидом. Друзы являются характерными для ранней и промежуточной AMD. Многие пациенты подвержены прогрессированию до AMD на поздних стадиях, которая включает две формы, географическую атрофию и неоваскулярную или влажную AMD. Термин сухая AMD в общем относится к ранней и промежуточной AMD, так же как к географической атрофии. В то время как они присутствуют и являются потенциально патологическими при ранних и промежуточных формах заболевания, друзы персистируют также при обеих поздних формах (van Lookeren-Campagne et al., J. Pathol. 232:151, 2014; Ambati et al., Nat. Rev. Immunol. 13:438, 2013). Недавние исследования выявили, что белки, ассоциированные с воспалением и иммунно-опосредованными процессами, преобладают среди ассоциированных с друзами составляющих. Транскрипты, кодирующие ряд этих молекул, детектированы в клетках сетчатки, RPE и хороида. Эти данные показывают также, что дендритные клетки, являющиеся активными антиген-представляющими клетками, находятся в тесной связи с развитием

- 12 045598 друз, и что активация комплемента является ключевым путем, который является активным как внутри друз, так и вдоль поверхности раздела RPE и хороида (Hageman, G.S., et al., Prog. Retin. Eye Res. 20:705

732, 2001); Ebrahimi and Handa, J. Lipid 2011:802059, 2011). Эти наблюдения показывают, что локальное воспаление, вероятно, является значительным фактором в раннем патогенезе AMD.

В нескольких независимых исследованиях показана сильная ассоциация между AMD и генетическим полиморфизмом в гене фактора комплемента H (CFH), где вероятность AMD увеличена в 7,4 раза у индивидуумов, гомозиготных по аллелю риска (Klein, R.J. et al., Science 308:362 364, 2005; Haines et al., Science 308:362 364. 2005; Edwards et al., Science 308:263 264, 2005). Ген CFH картирован на хромосоме 1q31, в области, вовлеченной в AMD по результатам шести независимых сканирований сцепления (см., например, Schultz, D.W., et al., Hum. Mol. Genet. 12:3315, 2003). Известно, что CFH является ключевым регулятором системы комплемента. Показано, что CFH на клетках и в кровотоке регулирует активность комплемента посредством ингибирования активации расщепления C3 до C3a и C3b, и посредством инактивации существующего C3b. Накопление C5b-9 наблюдали в мембране Бруха, интеркапиллярных перетяжках и внутри друз у пациентов с AMD (Klein et al., Science 308:362 364, 2005). Результаты экспериментов с использованием иммунофлуоресценции позволяют предполагать, что при AMD полиморфизм CFH может вызывать накопление комплемента хориоидальных капиллярах и хориоидальных сосудах (Klein et al., Science 308:362 364, 2005).

Ассоциированный с мембраной рецептор комплемента 1 также локализован в друзах, однако он не был детектирован в клетках RPE иммуногистохимически. В отличие от этого, второй ассоциированный с мембраной ингибитор комплемента, мембранный кофакторный белок, присутствует в клетках RPE, ассоциированных с друзами, так же как в малых сферических структурных элементах внутри друз. Показано также, что эти ранее не идентифицированные элементы имеют сильную иммунореакционную способность по отношению к протеолитическим фрагментам компонента комплемента C3, которые характерным образом накапливаются в участках активации комплемента. Предположили, что эти структуры представляют собой остаточный дебрис от дегенерирующих клеток RPE, которые являются мишенями атаки комплемента (Johnson, L.V., et al., Exp. Eye Res. 73:887 896, 2001).

Идентификация и локализация этих многочисленных регуляторов комплемента, так же как продуктов активации комплемента (C3a, C5a, C3b, C5b-9) привели исследователей к заключению, что хроническая активация комплемента играет важную роль в процессе биогенеза друз и этиологии AMD (Hageman et al., Progress Retinal Eye Res. 20:105 32, 2001). Идентификация продуктов активации C3 и C5 в друзах не дает информации о том, активируется ли комплемент посредством классического пути, лектинового пути или альтернативной усиливающей петли, поскольку, как понятно в соответствии с настоящим изобретением, оба C3 и C5 являются общими для всех трех. Однако, проведены два исследования иммунного мечения друз с использованием антител, специфических для C1q, важного компоненту узнавания для активации классического пути (Mullins et al., FASEB J. 14:835 846, 2000; Johnson et al., Exp. Eye Res. 70:441 449, 2000). В результате обоих исследований заключили, что иммунное мечение C1q в друзах в основном не обнаружено. Эти отрицательные результаты для C1q позволяют предполагать, что активация комплемента в друзах не происходит посредством классического пути. Кроме того, в исследовании Mullins et al., 2000, опубликовано, что иммунное мечение в друзах составляющих иммунного комплекса (легких цепей IgG, IgM) слабо меняется, дополнительно указывая на то, что классический путь играет незначительную роль в активации комплемента, возникающей в процессе данного заболевания. Таким образом, лектиновый и/или альтернативный пути, по-видимому, ответственны за большую часть, если не за весь опосредованный комплементом биогенез друз, ассоциированный с AMD.

Взаимосвязь между друзами и активацией комплемента является сильной, в частности, при ранней и промежуточной AMD, так же как при географической атрофии. Фактически, крупные и конфлюэнтные друзы представляют значительный фактор риска для географической атрофии (van Lookeren-Campagne et al., там же). Однако, активация комплемента не является ограниченной окружением друз. В двух недавно опубликованных исследованиях оценивали роль комплемента в развитии индуцируемой лазером хориоидальной неоваскуляризации (CNV) у мышей, в модели CNV человека. С использованием иммуногистологических способов, Bora и соавторы (2005) обнаружили значительное накопление продуктов активации комплемента C3b и C5b 9 (MAC) в неоваскулярном комплексе после лазерной терапии (Bora et al., J. Immunol. 174:491 7, 2005). Важно, что CNV не развивалась у мышей с генетической недостаточностью C3 (C3-/- мышей), необходимого компонента, требуемого для всех путей активации комплемента. Уровни матричной РНК для VEGF, TGF-e2, и β-FGF, трех ангиогенных факторов, вовлеченных в CNV, были повышены в ткани глазного яблока у мышей после индуцированной лазером CNV. Важно, что истощение комплемента приводило к значительному уменьшению уровней РНК этих ангиогенных факторов.

С использованием способов ELISA, Nozaki и коллеги показали, что мощные анафилатоксины C3a и C5a образуются рано в ходе индуцированной лазером CNV (Nozaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:2328 33, 2006). Более того, эти два биоактивных фрагмента C3 и C5 индуцировали экспрессию VEGF после их инъекции в стекловидное тело у мышей дикого типа. В соответствии с этими результатами, Nozaki и коллеги также показали, что генетическая абляция рецепторов для C3a и C5a уменьшает экспрессию VEGF и формирование CNV после лазерного повреждения, и что опосредованная антителами ней- 13 045598 трализация C3a или C5a или фармакологическая блокада их рецепторов также уменьшает CNV. В предшествующих исследованиях установили, что привлечение лейкоцитов, и особенно макрофагов, играет главную роль в индуцированной лазером CNV (Sakurai et al., Invest. Opthomol. Vis. Sci. 44:3578 85, 2003; Espinosa Heidmann, et al., Invest. Opthomol. Vis. Sci. 44:3586 92, 2003). В своей работе от 2006 г., Nozaki и коллеги опубликовали, что привлечение лейкоцитов значительно уменьшено у мышей C3aR(-/-) и C5aR(/-).

Лектиновый путь, по-видимому, является ответственным за инициацию каскада реакций комплемента в модели CNV после узнавания природными антителами окислительно модифицированных фосфолипидов на пигментном эпителии сетчатки (Joseph et al. J. Biol. Chem. 288:12753, 2013). Альтернативный путь также является критическим для повреждения сетчатки в этой модели, но он один не является достаточным (Rohrer et al., Mol Immunol. 48:el, 2011). Важно, что Kunchithapautham and Rohrer (J. Biol. Chem. 286:23717, 2011) показали, что эта активация комплемента запускает секрецию VEGF клетками пигментного эпителия сетчатки. VEGF является ключевым медиатором неоваскуляризации.

Как описано в настоящем описании в примере 12, в мышиной модели дегенерации желтого пятна на мышах MASP-2(-/-) определили, что уменьшение фоновых уровней VEGF у мышей MASP-2 (-/-) по сравнению с контрольными мышами дикого типа и, кроме того, что в то время как уровни VEGF были значимо увеличены у мышей дикого типа после индуцированного лазером повреждения, неожиданно низкие уровни VEGF наблюдали у мышей MASP-2 (-/-) после индуцированного лазером повреждения. Кроме того, определили, что для мышей MASP-2 (-/-) показано уменьшение на 30% площади CNV после индуцированного лазером повреждения на сутки 7 по сравнению с мышами дикого типа. Как далее описано в примере 14, у мышей, подвергнутых предварительной обработке с использованием моноклонального антитела против MASP-2, которое специфически блокирует лектиновый путь активации комплемента, наблюдали статистически значимое (p<0,01) уменьшение CNV приблизительно на 50% через семь суток после обработки лазером по сравнению с мышами без обработки, показывающее, что это блокирование MASP-2 с использованием ингибитора, такого как моноклональное антитело против MASP-2, оказывает профилактический и/или терапевтический эффект при лечении дегенерации желтого пятна. Как далее описано в примере 16, у мышей, подвергнутых предварительной обработке с использованием моноклонального антитела против MASP-2 человека, которое специфически блокирует лектиновый путь активации комплемента, статистически значимое уменьшение CNV наблюдали при всех тестированных уровнях дозирования с относительным уменьшением площади CNV в диапазоне от 20% до 50%, в то время как для антитела против VEGF показано умеренное (приблизительно на 15%) относительное уменьшение площади CNV. С учетом неожиданных результатов, описанных в примере 16, показывающих, что ингибитор MASP-2, такой как антитело против MASP-2, является по меньшей мере настолько же эффективным, как антитело против VEGF, в уменьшении CNV в модели AMD на мышах, при системной доставке, ожидают, что ингибирующее MASP-2 средство может являться эффективным в качестве антиангиогенного средства для использования в лечении зависимых от ангиогенеза заболеваний и состояний, таких как офтальмологические ангиогенные заболевания или нарушения, зависимые от ангиогенеза злокачественные опухоли, и зависимые от ангиогенеза доброкачественные опухоли, как описано ниже.

Ингибиторы MASP-2 для лечения офтальмологических ангиогенных заболеваний или нарушений.

Офтальмологическое ангиогенное заболевание или нарушение представляет собой заболевание или нарушение глаз, при котором аномальный или избыточный ангиогенез происходит в глазу, что может вносить вклад в потерю зрения, геморрагию или другие функциональные нарушения глаз, например, такие как AMD, или офтальмологическое ангиогенное заболевание или нарушение, выбранное из группы, состоящей из увеита, меланомы глаз, неоваскуляризации роговицы, первичного птеригия (роговицы), стромального кератита HSV, индуцированного HSV-1 лимфангиогенеза роговицы, пролиферативной диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, ретинопатии недоношенных, окклюзии вен сетчатки, отторжения трансплантата роговицы, неоваскулярной глаукомы, геморрагии стекловидного тела, вторичной по отношению к пролиферативной диабетической ретинопатии, нейромиелита зрительного нерва и покраснения радужки (см., например, Rivera et al., Neonatology 100(4):343-53, 2011; Hosseini et al., Cornea 31:322-34, 2012; Leyvraz et al., Curr Opin Oncol 162-9 (2012); Bock et al., Prog Retin Eye Res 34:89-124, 2013 и Kim et al., Am J Pathol 181(2):376-9, 2012).

Как описано в примерах 14 и 16, в настоящей заявке показано, что системное введение антитела против MASP-2, которое специфически ингибирует лектиновый путь активации комплемента, обеспечивает эффективную терапию для лечения неоваскулярной AMD. Одобренные в настоящее время антиангиогенные лекарственные средства для офтальмологических состояний представляют собой биологические средства, которые ингибируют VEGF. В настоящее время существует три одобренных антиангиогенных лекарственных средства против офтальмологических заболеваний: аптамер против VEGF (пегаптаниб, Макуген®), фрагмент Fab моноклонального антитела, направленного против VEGF-A (ранибизумаб, Люцентис®), и слитый белок, который связывается с VEGF-A, VEGF-B и плацентарным фактором роста (афлиберцепт, Эйлеа®), все из которых вводят посредством инъекции в стекловидное тело. Таким

- 14 045598 образом, в отличие от современных и появляющихся лекарственных средств против AMD и других офтальмологических ангиогенных заболеваний и нарушений, требующих инъекции в стекловидное тело, лечение антителом против MASP-2 является эффективным при подкожном введении.

В одном аспекте изобретение, таким образом, относится к способу ингибирования ангиогенеза для лечения офтальмологического ангиогенного заболевания или нарушения, включающему введение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество ингибирующего MASP-2 средства в фармацевтическом носителе нуждающемуся в этом индивиду. В некоторых вариантах осуществления, ангиогенное заболевание или нарушение глаз выбрано из группы, состоящей из AMD, увеита, меланомы глаз, неоваскуляризации роговицы, первичного птеригия, стромального кератита HSV, индуцированного HSV-1 лимфангиогенеза роговицы, пролиферативной диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, ретинопатии недоношенных, окклюзии вен сетчатки, отторжения трансплантата роговицы, неоваскулярной глаукомы, геморрагии стекловидного тела, вторичной по отношению к пролиферативной диабетической ретинопатии, нейромиелита зрительного нерва и покраснения радужки. Ингибирующую MASP-2 композицию можно вводить местно в глаз, например, посредством прямой инъекции, промывания или нанесения композиции в форме геля, мази или капель. Альтернативно, ингибирующее MASP-2 средство можно вводить индивиду системно, например, посредством внутриартериального, внутривенного, внутримышечного, ингаляционного, назального, подкожного или другого парентерального введения, или потенциально, посредством перорального введения для непептидергических средств. Композицию ингибирующего MASP-2 средства можно комбинировать с одним или несколькими дополнительными лекарственными средствами, такими как дополнительное антиангиогенное средство. Введение можно повторять, как определено терапевтом, пока состояние не будет устранено или взято под контроль.

Ингибиторы MASP-2 для лечения зависимых от ангиогенеза злокачественных опухолей.

Хорошо установлено, что ангиогенез играет критическую роль в развитии злокачественных опухолей. Опухоли продуцируют проангиогенные факторы для стимуляции неоваскуляризации, которая является одним из основных механизмов прогрессирования солидных опухолей, а также позволяет миграцию клеток опухолей для образования отдаленных метастазов посредством доступа в системный кровоток. Процесс ангиогенеза опухолей впервые активируется, когда растущая опухолевая масса превышает максимальный объем, который можно поддерживать посредством диффузии кислорода и питательных веществ. Наблюдали корреляцию между увеличением ангиогенеза и агрессивностью опухолей (Ferrara et al., Curr Top Microbiol Immunol 237:1-30, 1999). Известно также, что ангиогенез играет роль в росте и выживании лейкозов и других гематологических злокачественных новообразований (Ribatti et al., Neoplasia 15(3):231-238, 2013; Vacca et al., Br J Haematol 87:503-508, 1994). В то время как различные типы клеток вносят вклад в неоваскуляризацию, в общем известно, что эндотелиальные клетки играют центральную роль в процессе ангиогенеза.

Хорошо установлено, что VEGF играет важную роль в ангиогенезе опухолей. VEGF идентифицирован как фактор проницаемости сосудов, секретируемый клетками опухолей (Mattei et al., Genomics 32:168-169, 1996), и показано, что он играет роль в ангиогенезе посредством стимуляции миграции и пролиферации эндотелиальных клеток, так же как посредством стимуляции экспрессии связанных с ангиогенезом генов в эндотелиальных клеток. Например, экспрессия растворимой изоформы 189 VEGF при злокачественных опухолях ободочной кишки, почек и легкого человека сильно ассоциирована с увеличением количества микрососудов, метастазированием злокачественных опухолей и плохими прогнозами (Tokunaga et al., Br J Cancer 77:998-1002, 1998; Yuan et al., J Clin Oncol 19:432-441, 2001). Высокие уровни изоформы 165 VEGF ассоциированы с плохими показателями выживаемости при раке яичника (Manner et al., BMC Cancer 10:139, 2010). В клинических исследованиях фазы 3 показано, что бевацизумаб, гуманизированное моноклональное антитело, ингибирующее VEGF-A, улучшало выживаемость без прогрессирования при раке яичника у женщин (Perren et al., N Engl J Med 365:2484-2496, 2011).

В контексте злокачественных опухолей, исследователи традиционно фокусировались на роли комплемента в мечении и уничтожении клеток опухолей. Однако, недавние исследования подвергли сомнению эту точку зрения. Например, Markiewski et al. (Nature Immunol vol 9:1225-1235, 2008), опубликовали неожиданное открытие, что белки комплемента C3, C4 и C5a могут способствовать росту опухоли посредством стимуляции иммуносупрессивного микроокружения. Как описано в Markiewski et al., образование C5a комплемента в микроокружении опухоли усиливает рост опухоли посредством супрессии опосредованного CD8+ T-клетками противоопухолевого ответа. Как дополнительно описано в Markiewski et al., антагонист C5aR, гексапептид AcF(OP(D)ChaWr), являлся настолько же эффективным, как паклитаксел (Таксол) в нарушении роста опухолей у мышей дикого типа, таким образом, устанавливая терапевтическую функцию ингибирования комплемента в лечении злокачественных опухолей. Как описано в Gunn et al. (J Immunol 189:2985, 2012), мыши дикого типа с сингенными клетками лимфомы с высокой продукцией C5a имели значительно ускоренное прогрессирование опухолей с большим количеством супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC) в селезенке и общим увеличением количества CD4+ и CD8+ T-клеток в опухоли, дренирующих опухоль лимфатических узлах и в селезенке. В отличие от этого, несущие опухоль мыши с клетками лимфомы с низкой продукцией C5a имели значительно

- 15 045598 уменьшенную опухолевую нагрузку с продуцирующими увеличенное количество интерферона-γ CD4+ и CD8+ T-клетками в селезенке и дренирующих опухоль лимфатических узлах. Как дополнительно описано в Corrales et al. (J Immunol 189:4674-4683, 2012), обнаружено значительное увеличение количества C5a в плазме от пациентов с немелкоклеточным раком легкого (NSCLC) по сравнению со здоровым индивидом. Определили также, что C5a индуцировал хемотаксис эндотелиальных клеток и формирование кровеносных сосудов. В модели рака легкого на Lewis, клетки сингенных опухолей карциномы легкого мышей Lewis (3LL) росли медленнее у мышей, подвергнутых обработке антагонистом рецептора C5a.

Как дополнительно описано в Nunez-Cruz et al. (Neoplasia 14:994-1004, 2012), для оценки роли комплемента в ходе прогрессирования рака яичника, линию мышей с недостаточностью C3 в комплементе, или линию мышей с недостаточностью рецептора C5a (C5aR) в комплементе скрещивали с линией мышей, у которых развивается эпителиальный рак яичника (TgMISIIR-TAg). У мышей TgMISIIR-Tag, имевших полную или частичную недостаточность C3 или полную недостаточность C5aR, либо не развивались опухоли яичника, либо опухоли были небольшими и слабо васкуляризированными по сравнению с однопометными животными с диким типом TgMISIIR-TAg, таким образом, показывая, что недостаточность C3 или C5aR значительно ослабляла фенотип опухоли яичника. Кроме того, показано, что функция эндотелиальных клеток CD31+ в ангиогенезе была нарушена как у мышей C3 (-/-), так и у мышей C5aR (-/-).

Активация системы комплемента также может быть вовлечена в патогенез злокачественных новообразований. Неоантигены из комплекса комплемента C5b-9, IgG, C3, C4, S-белка/витронектина, фибронектина и макрофагов были локализованы на 17 образцах злокачественных опухолей молочной железы и на 6 образцах доброкачественных опухолей молочной железы с использованием поликлональных или моноклональных антител и способа с стрептавидином-биотином-пероксидазой. Во всех образцах тканей с карциномой на каждой стадии TNM присутствовали накопления C5b-9 на мембранах клеток опухолей, небольшие гранулы на остатках клеток и диффузные накопления в областях некроза (Niculescu, F., et al., Am. J. Pathol. 140:1039 1043, 1992). Как дополнительно описано в Rutkowski et al. (Mol Cancer Res 8:1453, 2010), для белков комплемента C3, C3a, C5a и MAC описаны потенциальные онкогенные роли, включая ангиогенез, инвазию и миграцию опухолей. Обнаружено, что лектиновый путь активации комплемента являлся значительно усиленным в сыворотке пациентов с колоректальным раком по сравнению со здоровыми индивидами (Ytting et al., 2004, Scand J. Gastroenterol 39:674), и опубликовано, что высокие уровни активности MASP-2 являются независимым прогностическим биомаркером, прогнозирующим рецидив и плохую выживаемость при раке толстого кишечника (Ytting et al., Clin Cancer Res 11: 1441, 2005).

Определили также, что уровни MBL и/или MASP-2 в сыворотке повышены в определенных злокачественных опухолях у детей, включая острый лимфобластный лейкоз (ALL), неходжкинскую лимфому, опухоли ЦНС, и солидные опухоли вне ЦНС (Fisch et al., 2011, Swiss Med Wkly 141:w13191). Определили также, что MASP-2 является сверхэкспрессированным в образцах ткани плоскоклеточной карциномы (ESCC) и дисплазии (предзлокачественной) пищевода (Verma et al., Int J Cancer 118:2930, 2006).

В дополнение к вышеупомянутым исследованиям, опубликованы многочисленные исследования по ассоциации полиморфизмов MBL и злокачественных опухолей. Например, как обобщено в Swierzko et al., Mol Immunol 55:16, 2013, опубликована ассоциация полиморфизмов генов MBL и MBL2 с раком желудка (Baccarelli et al., International J Cancer 119:1970-1975, 2006; Scudiero et al., Clin Chem 52:1625-1626, 2006; Wang et al., Digestive Diseases and Sciences 53:2904-2908, 2008); раком печени (Eurich et al., Liver International 31:1006-1012, 2011); раком поджелудочной железы (Rong et al., BMC Gastroenterology 10:68, 2010); раком ободочной кишки/колоректальным раком (Ytting et al., Scan J Gastroenterology 39:670-674, 2004; Ytting et al., Scan J Gastroenterology 73:122-127, 2011; Zanetti et al., Cancer Res 72:14 67-1677, 2012); раком яичника (Swierzko et al., Immunotherapy 56:959-971, 2007); Nevadunsky et al., European J of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology 163:216-218, 2012); раком молочной железы (Bernig et al., Carcinogenesis 28:828-836, 2007); раком легкого (Pine et al., Journal of NCI 99:1401-1409, 2007; OlivoMarston et al., Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention 18:3375-3383, 2009); и острым лимфобластным лейкозом (Schmiegelow et al., Blood 100:3757-3760, 2002).

Определили также, что компоненты комплемента подвержены повышающей регуляции в биологических жидкостях от пациентов-людей со злокачественными опухолями, как показано ниже в табл. 1.

- 16 045598

Таблица 1

Компоненты комплемента, подверженные повышающей регуляции в биологических жидкостях от пациентов-людей со злокачественными опухолями

Компонент комплемента СЗа/СЗа(desArg) СЗа/СЗа(desArg) СЗа/СЗа(desArg)	Злокачественная опухоль Молочной железы Связанная с HCV Печеночноклеточная карцинома Колоректальная	Биологический образец Сыворотка Сыворотка Сыворотка	Ссылка Fan et al., J Can Res Clin Oncol 136:1243, 2010; Solassol et al., Oncogene 29:550, 2010; Li et al., Clin Chern 51:2229, 2005 Kanmura et al. , J Gastroenterol 45:459, 2010; Lee et al., Proteomics 6:2865, 2006 Fenz et al., Proteomics Clin Appl 1:536, 2007; Habermann et al., Gastroenterol 131:1020, 2006
СЗа	Хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL)	Сыворотка	Miguet et al., 5:2258, 2006;	J Proteome Res
С4а	CLL	Сыворотка	Miguet et al., 5:2258, 2006;	J Proteome Res
СЗа	Яичников	Асциты по сравнению с сывороткой	Вj orge et al., 92(5):895-905,	Br J Cancer 2005
С5Ь-9	Яичников	Асциты по сравнению с сывороткой	Вj orge et al., 92(5):895-905,	Br J Cancer 2005
С5а	Немелкоклеточный рак легкого (NSCLC)	Сыворотка	Corrales et al 189:4674, 2012	., J Immunol
С1 CD59, Фактор	ингибитор, CD46, Н	Яичников	Асциты по сравнению с сывороткой	Вj orge et al., 92(5):895-905,	Br J Cancer 2005
Фактор	Н	Острый миелоидный лейкоз	Сыворотка	Lee et al., El 33:1863, 2012	ectrophoresis
Фактор	Н	Легкого	Бронхоальвеол ярный лаваж (BAL) , мокрота	Pio et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 19:2665, 2010

Кроме того, активация комплемента может являться следствием химиотерапии или радиотерапии, и таким образом, ингибирование активации комплемента можно использовать в качестве вспомогательной терапии в лечении злокачественных новообразований для уменьшения ятрогенного воспаления. Когда химиотерапия и радиотерапия предшествовали хирургическому вмешательству, накопления C5b-9 были более интенсивными и обширными. Накопления C5b-9 отсутствовали во всех образцах доброкачественных новообразований. Белок S/витронектин присутствовал в форме фибриллярных отложений в соединительнотканном матриксе и в форме диффузных отложений вокруг клеток опухолей, менее интенсивных и обширных, чем фибронектин. Накопления IgG, C3, и C4 присутствовали только в образцах карциномы. Присутствие накоплений C5b-9 является показателем активации комплемента и его последующих патогенетических эффектов при раке молочной железы (Niculescu, et al., Am. J. Pathol. 140:1039 1043, 1992).

С учетом данных, описанных в примере 16, о том, что системное введение антитела против MASP2, специфически ингибирующего лектиновый путь активации комплемента, ингибирует неоваскуляризацию по меньшей мере настолько же эффективно, как антитело против VEGF, ожидают, что системная доставка ингибирующего MASP-2 средства, может являться эффективной для ингибирования ангиогенеза опухолей, таким образом, уменьшая рост и/или метастазирование опухолей у индивида, страдающего зависимой от ангиогенеза злокачественной опухолью.

Зависимые от ангиогенеза злокачественные опухоли включают злокачественную опухоль эпителиального происхождения или нейронального происхождения, или карциному, или солидную опухоль или саркому, или жидкую опухоль, такую как лейкоз или лимфома. Любая злокачественная опухоль, для которой уже известно лечение или находится в разработке лечение с использованием ангиостатического соединения (например, антагониста VEGF) включена в объем способов по изобретению. Предпочтительные злокачественные опухоли в этом контексте включают: колоректальные злокачественные опухоли, злокачественные опухоли молочной железы (включая метастазирующий рак молочной железы, воспалительную карциному молочной железы), легкого, почек, печени, пищевода, яичников, поджелудочной железы, предстательной железы и желудка, так же как глиому, стромальные опухоли желудочнокишечного тракта, лимфому, меланому и карциноидные опухоли (база данных клинических исследова- 17 045598 ний NCI: найдена на www_cancer_gov_clinicaltrials/search, доступ от 3/25/2014). Показано, что многие из этих злокачественных опухолей являлись отвечающими на лечение бевацизумабом (Авастином®), гуманизированным моноклональным антителом, блокирующим связывание VEGF с его рецепторами и ингибирующим ангиогенез опухолей (например, Amit et al., PLoS One 8(1):e51780 (2013).

В соответствии с вышеизложенным, другой аспект изобретения относится к способам ингибирования ангиогенеза опухолей и/или метастазирования опухолей у индивида, страдающего зависимой от ангиогенеза злокачественной опухолью. Этот способ включает введение композиции, содержащей количество ингибитора MASP-2, эффективного для ингибирования ангиогенеза опухолей и/или метастазирования опухолей, индивиду, страдающему зависимой от ангиогенеза злокачественной опухолью. В некоторых вариантах осуществления, индивид страдает зависимой от ангиогенеза злокачественной опухолью, выбранной из группы, состоящей из колоректальной злокачественной опухоли, злокачественной опухоли молочной железы, легкого, почек, печени, пищевода, яичников, поджелудочной железы, предстательной железы и желудка, так же как глиомы, стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта, лимфомы, меланомы и карциноидной опухоли. В некоторых вариантах осуществления, зависимые от ангиогенеза злокачественные опухоли относятся к злокачественным опухолям типов, которые, как ожидают, получают преимущество от лечения средством против VEGF, таким как антитело против VEGF Авастин® (бевацизумаб, Genentech, CA), например, таким как любая злокачественная опухоль, для которой уже известно лечение или находится в разработке лечение с использованием ангиостатического соединения (например, антагонист VEGF), включая злокачественные опухоли на поздних стадиях, метастазирующие в печень, меланому, рак яичника, нейробластому, рак поджелудочной железы, печеночно-клеточную карциному, рак эндометрия, рак предстательной железы, ангиосаркому, метастазирующую или неоперабельную ангиосаркому, рецидивирующие опухоли стромы полового тяжа яичников, рак пищевода, рак желудка, неходжскинскую лимфому, лимфому Ходжкина, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, рецидивирующий или метастазирующий рак головы и шеи, неопластический менингит, рак шейки матки, рак тела матки, перитонеальный карциноматоз на позних стадиях, глиосаркому, нейроэндокринную карциному, экстракраниальную саркому Юинга, острый миелоидный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, интракраниальную менингиому, саркому Капоши на поздних стадиях, мезотелиому, злокачественную опухоль желчевыводящих путей, метастазирующие карциноидные опухоли и злокачественную опухоль мочевыводящих путей на поздних стадиях. Предпочтительные злокачественные опухоли в этом контексте включают: колоректальные злокачественные опухоли, злокачественные опухоли молочной железы (включая метастазирующий рак молочной железы, воспалительную карциному молочной железы), легкого, почек, печени, пищевода, яичников, поджелудочной железы, предстательной железы и желудка, так же как глиому, стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта, лимфому, меланому и карциноидные опухоли.

Ингибирующую MASP-2 композицию можно вводить местно в область опухоли(опухолей), например, посредством местного введения композиции в ходе хирургического вмешательства или местной инъекции, либо напрямую, либо удаленно, например, посредством катетера. Альтернативно, ингибирующее MASP-2 средство можно вводить пациенту системно, например, посредством внутриартериального, внутривенного, внутримышечного, ингаляционного, назального, подкожного или другого парентерального введения, или потенциально, посредством перорального введения для непептидергических средств. Композицию ингибирующего MASP-2 средства можно комбинировать с одним или несколькими дополнительными лекарственными средствами, такими как дополнительное антиангиогенное средство и/или дополнительное химиотерапевтическое средство. Введение можно повторять, как определено терапевтом, пока состояние не будет устранено или взято под контроль.

С учетом данных настоящего исследования, показывающих, что OMS646 является по меньшей мере настолько же эффективным, как антитело против VEGF, для уменьшения CNV при системной доставке мышам при всех тестируемых уровнях дозирования, ожидают также, что ингибирующее MASP-2 средство, такое как OMS646, может также являться эффективным в качестве антиангиогенного средства для использования для ингибирования зависимого от ангиогенеза состояния, такого как миелофиброз и наследственная геморрагическая телеангиэктазия.

IV. Ингибирующие MASP-2 средства.

В различных аспектах, настоящее изобретение относится к способам ингибирования неблагоприятных эффектов ангиогенеза посредством введения ингибирующего MASP-2 средства нуждающемуся в этом пациенту. Ингибирующие MASP-2 средства вводят в количествах, эффективных для ингибирования зависимой от MASP-2 активации комплемента у живого индивида. Для практического осуществления этого аспекта изобретения, репрезентативные ингибирующие MASP-2 средства включают: молекулы, ингибирующие биологическую активность MASP-2 (такие как низкомолекулярные ингибиторы, антитела против MASP-2 или блокирующие пептиды, которые взаимодействуют с MASP-2 или препятствуют белок-белковому взаимодействию), и молекулы, уменьшающие экспрессию MASP-2 (такие как молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты MASP-2, специфические для MASP-2 молекулы РНКи и рибозимы MASP-2), таким образом, предотвращая активацию посредством MASP-2 лектинового пути ком- 18 045598 племента. Ингибирующие MASP-2 средства можно использовать отдельно в качестве первичной терапии или в комбинации с другими терапевтическими средствами в качестве вспомогательной терапии для увеличения терапевтического преимущества использования другого медицинского лечения.

Ингибирование зависимой от MASP-2 активации комплемента характеризуется по меньшей мере одним из следующих изменений в компоненте системы комплемента, которые происходят в результате введения ингибирующего MASP-2 средства в соответствии со способами по изобретению: ингибирование образования или продукции продуктов зависимой от MASP-2 системы активации комплемента C4b, C3a, C5a и/или C5b 9 (MAC) (измеренных, например, как описано в примере 2), уменьшение расщепления C4 и накопления C4b (измеренных, например, как описано в примере 2), или уменьшение расщепления C3 и накопления C3b (измеренных, например, как описано в примере 2).

В соответствии с настоящим изобретением, используют ингибирующие MASP-2 средства, которые являются эффективными для ингибирования ангиогенеза и имеют поддающуюся детекции антиангиогенную активность и/или индуцируют уменьшение неоангиогенеза. В контексте изобретения, антиангиогенная активность может включать по меньшей мере одно или несколько из следующего: снижение или уменьшение неоангиогенеза, нормализация сосудов, и/или уменьшение количества сосудов в патогенной области.

Неоангиогенез и оценку антиангиогенного средства, такого как ингибирующее MASP-2 средство, можно детектировать с использованием любого способа, известного специалисту в данной области. Например, неоангиогенез и оценку антиангиогенного средства можно оценивать в модели CNV у животных с индуцированным лазером повреждением (как описано в примерах 12, 14 и 16 в настоящем описании), или in situ у пациента или в опухоли посредством неинвазивных способов, таких как визуализация посредством PET (позитронной эмиссионной томографии), MRI (магнитно-резонансной томографии), DCE-MRI (MRI с динамическим контрастным усилением) или CT (компьютерной томографии). Эти способы можно использовать для мониторирования опухолевой нагрузки на основании увеличенного подтекания сети кровеносных сосудов в опухолях. С использованием MRI или PET, можно отслеживать присутствие маркеров ангиогенеза, например, таких как, а5в3-интегрин, VEGF или bFGF в плазме.

Альтернативно, неоангиогенез можно оценивать с использованием биопсии опухолей или срезов, полученных из патогенной области от пациента, страдающего зависимым от ангиогенеза состоянием, и последующих иммуногистохимических анализов эндотелиальных клеток для оценки из активности и ее сравнения с активностью нормальных эндотелиальных клеток от здорового индивида или эндотелиальных клеток от пациента, но выделенных из другого участка организма. Такие иммуногистохимические анализы можно выполнять с использованием антител против пан-эндотелиальных клеток, таких как антитела против CD31 и против CD34, для оценки плотности микрососудов. Срезы тканей можно окрашивать с использованием маркеров эндотелиальных клеток, в комбинации с маркерами пролиферации, для исследования соотношения между эндотелиальными клетками опухоли и пролиферирующими клетками опухоли в ткани. Примерами эндотелиальных маркеров являются CD31 и CD34. Одним из примеров маркера пролиферации является Ki67, который является превосходным маркером для определения растущей фракции из данной популяции клеток. Фракция положительных по Ki-67 клеток опухолей (индекс мечения Ki-67) часто коррелирует с клиническим течением злокачественной опухоли. Можно оценивать плотность микрососудов (MVD), например, в срезе опухоли, окрашенном с использованием антитела против CD31, и с использованием интенсивности окрашивания для количественной оценки MVD. Количественную оценку MVD предпочтительно выполняют посредством подсчета положительно окрашенных структур просвета в четырех - пяти репрезентативных изображениях на срез опухоли. Уменьшение, предпочтительно, статистически значимое уменьшение, MVD, оцененное по меньшей мере в четырех пяти репрезентативных изображениях на срез опухоли, предпочтительно, наблюдают в качестве показателя того, что введенная молекула имеет антиангиогенную активность или является способной уменьшать неоангиогенез.

Неоангиогенез можно также оценивать с использованием клеток, предпочтительно, эндотелиальных клеток, из опухоли, от здорового индивида или из линий эндотелиальных клеток. Эндотелиальные клетки из опухоли предпочтительно обозначают как эндотелий опухоли. Эндотелиальные клетки опухоли можно выделять посредством FACS (сортировки клеток с активацией флуоресценции) из ткани опухоли с использованием CD31 в качестве эндотелиального маркера. Это можно проводить, как описано в van Beijnum et al., Nat Protoc. 3(6):1085-91, 2008. Предпочтительными эндотелиальными клетками для оценки неоангиогенеза in vitro являются HUVEC и RF24. Оценку активности неоангиогенеза in vitro можно проводить с использованием анализа с MTS (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил-)-2H-тетразолием) для оценки пролиферативной активности эндотелиальных клеток. Альтернативно, можно использовать другие анализы жизнеспособности, известные специалисту в данной области, такие как анализы с MTT (бромидом 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенилтетразолия), кристаллическим фиолетовым и WST-1 (растворимым в воде тетразолием).

Кроме того, можно использовать другие типы анализов активности ангиогенеза, такие как анализ прорастания сфероидов и анализ формирования трубочек в матригеле. В анализе формирования трубочек в матригеле, клетки, особенно эндотелиальные клетки, высевают на синтетический полунатуральный

- 19 045598 гелевый матрикс (такой как Матригель из BD Biosciences или коллаген-гель, или, в некоторых случаях, фибриновые гели). В обоих анализах, используют эндотелиальные клетки, предпочтительно, HUVEC. После определенного периода времени, в зависимости от условий культивирования клеток, клетки начинают формировать подобные трубочкам структуры. Формирование подобных трубочкам структур рассматривают как первую стадию на пути образования новых сосудов. Считываемый параметр представляет собой количество сосудов-узлов на единицу площади. Для анализа прорастания сфероидов, клеточные сфероиды (например, эндотелиальных клеток) помещают в гель (например, матригель и коллагеновые гели). После определенного периода времени, можно наблюдать формирование отростков. Степень прорастания рассматривают как критерий для оценки ангиогенного потенциала клеток. Считываемый параметр представляет собой количество отростков на сфероид. Антиангиогенная активность может присутствовать, когда количество отростков на сфероид снижается или уменьшается в обработанных клетках в течение данного периода времени по сравнению с количеством отростков на сфероид в необработанных клетках. Снижение или уменьшение может представлять собой уменьшение на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%. Антиангиогенная активность в ткани опухоли также может присутствовать, когда визуализируют нормализацию сосудов и/или когда количество сосудов в патогенной области уменьшается.

В предпочтительном варианте осуществления, как только обнаруживают уменьшение количества сосудов в патогенной области по сравнению с количеством сосудов на начало лечения, присутствует поддающаяся детекции антиангиогенная активность. Уменьшение может представлять собой поддающееся детекции уменьшение количества сосудов в патогенной области или уменьшение на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% количества сосудов в патогенной области. Патогенная область представляет собой область опухоли, включая окружающую ткань, локализованную близко к области опухоли. Близко в этом контексте может означать вплоть до нескольких сантиметров.

Нормализация сосудов предпочтительно представляет собой изменение в трехмерной структуре сосуда или микрососуда. Например, патологические сосуды или микрососуды, ассоциированные с активностью неоангиогенеза в эндотелии опухоли, могут являться менее равномерными и/или могут выглядеть более извилистыми, и/или могут выглядеть более подтекающими, чем контрольный сосуд или микрососуд. Контрольный сосуд может представлять собой сосуд от здорового индивидуума или сосуд от пациента, но не локализованный в патогенной области указанного пациента. В предпочтительном варианте осуществления, как только трехмерная структура сосуда начинает выглядеть более равномерной, менее извилистой и/или менее подтекающей, чем контрольный сосуд, говорят, что детектирована антиангиогенная активность.

Предпочтительно, меньше неравномерных, извилистых и/или подтекающих сосудов детектируют в патогенной области, чем на начало лечения. Более предпочтительно, меньше означает меньше на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или меньше на 100%. Наиболее предпочтительно, неравномерных, извилистых и/или подтекающих сосудов не детектируют в патогенной области. Нормализацию сосудов и/или количество сосудов в патогенной области можно оценивать с использованием неинвазивного способа визуализации, такого как визуализация PET, MRI или CT.

В случае заболевания или состояния глаз, ассоциированного с неоангиогенезом, разработано несколько анализов для оценки поддающейся детекции антиангиогенной активности и/или снижения или уменьшения неоангиогенеза, индуцированного лекарственным средством, подлежащим тестированию, таким как ингибирующее MASP-2 средство. В этих различных моделях заболевания, ангиогенез можно запускать посредством различных стимулов, таких как физическое повреждение (индуцированный лазером разрыв мембраны Бруха) (Shen et al., 2006 Gene therapy 13:225-234), или посредством сверхэкспрессии специфических факторов роста кровеносных сосудов, таких как VEGF у трансгенных мышей (Miki et al., 2009, Ophthalmology 2009 September 116(9):1748-1754). Если поддающуюся детекции антиангиогенную активность и/или снижение или уменьшение ангиогенеза оценивают с использованием ингибирующего MASP-2 средства, говорят, что такое ингибирующее MASP-2 средство используют в качестве лекарственного средства для предотвращения, лечения, возвращения к прежнему состоянию, излечения и/или задержки ангиогенеза или заболевания или состояния, ассоциированного с ангиогенезом.

Оценку неоангиогенеза и/или антиангиогенной активности можно проводить периодически, например, каждую неделю или каждый месяц. Увеличение/уменьшение неоангиогенеза и/или присутствие антиангиогенной активности можно, таким образом, оценивать периодически, например, каждую неделю или месяц. Эту оценку предпочтительно проводят в нескольких временных точках для данного индивида или в одной или нескольких временных точках для данного индивида и здорового контрольного индивидуума. Оценку можно проводить в регулярные интервалы времени, например, каждую неделю, или каждый месяц. Когда одна из оценок неоангиогенеза или ангиогенной активности, связанной с ингибирующим MASP-2 средством, приводит к обнаружению уменьшения неоангиогенеза или присутствия антиангиогенной активности, говорят, что ингибирующее MASP-2 средство, такое как антитело против MASP2, имеет поддающуюся детекции антиангиогенную активность и/или индуцирует снижение или уменьшение неоангиогенеза.

Поддающееся детекции уменьшение активности неоангиогенеза и/или присутствие антиангиоген- 20 045598 ной активности, предпочтительно, является детектированным, когда, по меньшей мере для одной временной точки, детектировано уменьшение неоангиогенеза и/или присутствие антиангиогенной активности. Предпочтительно, уменьшение неоангиогенеза и/или присутствие антиангиогенной активности детектируют по меньшей мере для двух, трех, четырех, пяти временных точек.

Ингибирующие MASP-2 средства, которые можно использовать в практическом осуществлении этого аспекта изобретения, включают, например, антитела против MASP-2 и их фрагменты, ингибирующие MASP-2 пептиды, малые молекулы, растворимые рецепторы и ингибиторы экспрессии MASP-2. Ингибирующие MASP-2 средства могут ингибировать зависимую от MASP-2 систему активации комплемента посредством блокирования биологической функции MASP-2. Например, ингибирующее средство может эффективно блокировать белок-белковые взаимодействия MASP-2, создавать помехи для димеризации или сборки MASP-2, блокировать связывание Ca²⁺, создавать помехи для активного участка сериновой протеазы MASP-2, или может уменьшать экспрессию белка MASP-2.

В некоторых вариантах осуществления, ингибирующие MASP-2 средства избирательно ингибируют активацию комплемента MASP-2, оставляя зависимую от C1q систему активации комплемента функционально интактной.

В одном варианте осуществления, ингибирующее MASP-2 средство, которое можно использовать в способах по изобретению, представляет собой специфическое ингибирующее MASP-2 средство, которое специфически связывается с полипептидом, содержащим SEQ ID NO: 6, с аффинностью, по меньшей мере в десять раз более высокой, чем для других антигенов в системе комплемента. В другом варианте осуществления, ингибирующее MASP-2 средство специфически связывается с полипептидом, содержащим SEQ ID NO: 6, с аффинностью связывания, по меньшей мере в 100 раз более высокой, чем для других антигенов в системе комплемента. В одном варианте осуществления, ингибирующее MASP-2 средство специфически связывается по меньшей мере с одним из (i) домена CCP1-CCP2 (ак 300-431 из SEQ ID NO: 6) или домена сериновой протеазы MASP-2 (ак 445-682 из SEQ ID NO: 6) и ингибирует зависимую от MASP-2 активацию комплемента. В одном варианте осуществления, ингибирующее MASP-2 средство представляет собой моноклональное антитело против MASP-2, или его фрагмент, которые специфически связываются с MASP-2. Аффинность связывания ингибирующего MASP-2 средства можно определять с использованием подходящего анализа связывания.

Полипептид MASP-2 имеет молекулярную структуру, сходную с MASP-1, MASP-3, и Clr и Cls,, протеазами Cl системы комплемента. Молекула кДНК, представленная в SEQ ID NO: 4, кодирует репрезентативный пример MASP-2 (состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5), и обеспечивает образование человеческого полипептида MASP-2 с лидерной последовательностью (ак 1-15), которая отщепляется после секреции, приводя к образованию зрелой формы человеческого MASP-2 (SEQ ID NO: 6). Как показано на фиг. 2, ген MASP-2 человека содержит двенадцать экзонов. кДНК MASP-2 человека кодирована экзонами B, C, D, F, G, H, I, J, K и L. Альтернативный сплайсинг приводит к образованию белка 20 кДа, названного ассоциированным с MBL белком 19 (MAp19, также обозначенного как sMAP) (SEQ ID NO: 2), кодированного (SEQ ID NO: 1), образованного из экзонов B, C, D и E, как показано на фиг. 2. Молекула кДНК, представленная в SEQ ID NO: 50, кодирует мышиный MASP-2 (состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 51) и обеспечивает образование мышиного полипептида MASP-2 с лидерной последовательностью, которая отщепляется после секреции, приводя к образованию зрелой формы мышиного MASP-2 (SEQ ID NO: 52). Молекула кДНК, представленная в SEQ ID N0:53, кодирует крысиный MASP2 (состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 54) и обеспечивает образование крысиного полипептида MASP-2 с лидерной последовательностью, которая отщепляется после секреции, приводя к образованию зрелой формы крысиного MASP-2 (SEQ ID NO: 55).

Специалисту в данной области понятно, что последовательности, описанные в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 53, представляют собой единичные аллельные варианты человеческого, мышиного и крысиного MASP-2, соответственно, и что можно ожидать появления аллельные вариантов и альтернативного сплайсинга. Аллельные варианты нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 53, включая последовательности, содержащие молчащие мутации, и последовательности, в которых мутации вызывают изменения аминокислотных последовательностей, включены в объем настоящего изобретения. Аллельные варианты последовательности MASP-2 можно клонировать с помощью зондов из библиотек кДНК или геномных библиотек от различных индивидуумов, в соответствии со стандартными способами.

Домены человеческого белка MASP-2 (SEQ ID NO: 6) показаны на фиг. 1 и 2A, и включают Nконцевой домен Clr/Cls/Vegf морского ежа/ костного морфогенетического белка (CUBI) (ак 1-121 из SEQ ID NO: 6), домен, подобный эпидермальному фактору роста (ак 122 166), второй домен CUBI (ак 167 293), так же тандем доменов контрольных белков комплемента и домен сериновой протеазы. Альтернативный сплайсинг гена MASP-2 приводит к образованию MAp19, показанного на фиг. 1. MAp19 представляет собой неферментный белок, содержащий N-концевую область CUB1-EGF из MASP-2 с четырьмя дополнительными остатками (EQSL), происходящими из экзона E, как показано на фиг. 1.

Показано, что некоторые белки связываются или взаимодействуют с MASP-2 посредством белок

- 21 045598 белковых взаимодействий. Например, известно, что MASP-2 связывается и формирует зависимые от Ca²⁺комплексы с лектиновыми белками MBL, H-фиколином и L-фиколином. Показано, что каждый комплекс MASP-2/лектин активирует комплемент посредством зависимого от MASP-2 расщепления белков C4 и C2 (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262:7451 7454, 1987; Matsushita, M., et al., J. Exp. Med. 176:1497 2284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502 3506, 2002). Исследования показали, что домены CUB1EGF из MASP-2 являются необходимыми для ассоциации MASP-2 с MBL (Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166:5068, 2001). Показано также, что домены CUB1EGFCUBII опосредуют димеризацию MASP-2, необходимую для формирования активного комплекса MBL (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 275:30962 30969, 2000). Таким образом, можно идентифицировать ингибирующие MASP-2 средства, которые связываются с участками-мишенями или создают помехи для участков-мишеней MASP-2, как известно, важными для зависимой от MASP-2 активации комплемента.

Антитела против MASP-2.

В некоторых вариантах осуществления этого аспекта изобретения, ингибирующее MASP-2 средство содержит антитело против MASP-2, которое ингибирует зависимую от MASP-2 систему активации комплемента. Антитела против MASP-2, которые можно использовать в этом аспекте изобретения, включают поликлональные, моноклональные или рекомбинантные антитела, происходящие из любого продуцирующего антитела млекопитающего, и могут представлять собой мультиспецифические, химерные, гуманизированные, антиидиотипические антитела и фрагменты антител. Фрагменты антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂, Fv, фрагменты scFv и одноцепочечные антитела, как описано далее в настоящем описании.

Можно проводить скрининг антител против MASP-2 по способности ингибировать зависимую от MASP-2 систему активации комплемента и по антиангиогенной активности с использованием анализов, описанных в настоящем описании. Несколько антител против MASP-2 описано в литературе, и несколько получены заново, некоторые из которых перечислены ниже в табл. 2. Например, как описано в примерах 10 и 11 в настоящем описании, идентифицированы антитела Fab2 против MASP-2 крысы, которые блокируют зависимую от MASP-2 активацию комплемента, и как показано в примере 14, моноклональное антитело, полученное из антитела Fab2 против MASP-2 крысы, имеет антиангиогенную активность в модели на мышах индуцированной лазером CNV. Как далее описано в примере 15, и как дополнительно описано в US2012/0282263, содержание которого приведено в настоящем описании в качестве ссылки, идентифицированы полностью человеческие антитела scFv против MASP-2, которые блокируют зависимую от MASP-2 активацию комплемента, и, как описано в примере 16, репрезентативное моноклональное антитело против MASP-2 человека (OMS646), которое блокирует функцию лектинового пути, имеет антиангиогенную активность в модели на мышах индуцированной лазером CNV. Соответственно, в одном варианте осуществления, ингибирующее MASP-2 средство для использования в способах по изобретению содержит человеческое антитело, например, такое как OMS646. Соответственно, в одном варианте осуществления, ингибирующее MASP-2 средство для использования в композициях и способах по заявленному изобретению, содержит антитело человека, которое связывает полипептид, состоящий из человеческого MASP-2 (SEQ ID NO: 6), где антитело содержит: I) a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую i) CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из 31-35 из SEQ ID NO: 67 или SEQ ID NO: 68; и ii) CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из 50-65 из SEQ ID NO: 67 или SEQ ID NO: 68; и iii) CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из 95-102 из SEQ ID NO: 67 или SEQ ID NO: 68; и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую: i) CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из 24-34 из любой из SEQ ID NO: 69 или SEQ ID NO: 71; и ii) CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из 50-56 из любой из SEQ ID NO: 69 или SEQ ID NO: 71; и iii) CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из 89-97 из любой из SEQ ID NO: 69 или SEQ ID NO: 71; или II) их вариант, в ином отношении идентичный указанным вариабельным доменам, за исключением вплоть до 6 суммарных аминокислотных замен внутри указанных областей CDR указанной вариабельной области тяжелой цепи и вплоть до 6 суммарных аминокислотных замен внутри указанных областей CDR указанной вариабельной области легкой цепи, где антитело или его вариант ингибирует зависимую от MASP-2 активацию комплемента. В одном варианте осуществления, ингибирующее MASP-2 средство для использования в способах по изобретению содержит человеческое антитело OMS646.

- 22 045598

Таблица 2

Иллюстративные специфические для MASP-2 антитела

АНТИГЕН	ТИП АНТИТЕЛА	ССЫЛКА
Рекомбинантный MASP-2	Крысиное поликлональное	Peterson, S.V., et al., Mol. Immunol. 37:803 811, 2000
Рекомбинантный	Крысиное МоАЬ (подкласс	Moller Kristensen, M., et al., J.
человеческий фрагмент ССР1/2 SP (MoAb 8В5)	IgGl)	of Immunol. Methods 282:159 167, 2003
Рекомбинантный	Крысиное МоАЬ (подкласс	Moller Kristensen, M., et al., J.
человеческий МАр19 (MoAb 6G12) (вступает в перекрестную реакцию с MASP-2)	IgGl)	of Immunol. Methods 282:159 167, 2003
hMASP-2	Мышиное MoAb (S/P) мышиное МоАЬ (N-конец)	Peterson, S.V., et al., Mol. Immunol. 35:409, April 1998
hMASP-2 (домен ССР1CCP2-SP)	крысиное МоАЬ: NimoablOl, продуцированное линией клеток гибридомы 03050904 (ЕСАСС)	WO 2004/106384
hMASP-2 (полноразмерный, с меткой his)	мышиные МоАЬ: NimoAbl04, продуцированное линией клеток гибридомы M0545YM035 (DSMZ) NimoAbl08, продуцированное линией клеток гибридомы M0545YM029 (DSMZ) NimoAbl09 продуцированное линией клеток гибридомы M0545YM046 (DSMZ) NimoAbllO, продуцированное линией клеток гибридомы M0545YM048 (DSMZ)	WO 2004/106384
Крысиный MASP-2 (полноразмерный)	фрагменты антител Fab2 против MASP-2	Пример 10
hMASP-2 (полноразмерный)	Клоны полностью человеческих scFv	Пример 15 и US2012/0282263

Антитела против MASP-2 с уменьшенной эффекторной функцией.

В некоторых вариантах осуществления этого аспекта изобретения, антитела против MASP-2 имеют уменьшенную эффекторную функцию для уменьшения воспаления, которое может возникать при активации классического пути активации комплемента. Показано, что способность молекул IgG запускать классический путь активации комплемента связана с участком Fc молекулы (Duncan, A.R., et al., Nature 332:738 740 1988). Молекулы IgG, в которых участок Fc удален посредством ферментного расщепления, лишены этой эффекторной функции (см. Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988). Соответственно, антитела с уменьшенной эффекторной функцией можно получать в результате отсутствия участка Fc молекулы в результате наличия генетически сконструированной последовательности Fc, которая минимизирует эффекторную функцию, или в результате принадлежности к изотипу IgG₂ или IgG₄ человека.

Антитела с уменьшенной эффекторной функцией можно получать посредством стандартных молекулярно-биологических манипуляций с участком Fc тяжелых цепей IgG, как описано в примере 9 в настоящем описании, и также описано в Jolliffe et al., Int'l Rev. Immunol. 10:241 250, 1993, и Rodrigues et al., J. Immunol. 151:6954 6961, 1998. Антитела с уменьшенной эффекторной функцией включают также изотипы IgG2 и IgG4 человека, обладающие сниженной способностью активировать комплемент и/или взаимодействовать с рецепторами Fc (Ravetch, J.V., et al., Аппи. Rev. Immunol. 9:457 492, 1991; Isaacs, J.D., et al., J. Immunol. 148:3062 3071, 1992; van de Winkel, J.G., et al., Immunol. Today 14:215 221, 1993). Гуманизированные или полностью человеческие антитела, специфические для MASP-2 человека, состоящие из изотипов IgG2 или IgG4, можно получать одним из нескольких способов, известных специалисту в данной области, как описано в Vaughan, T.J., et al., Nature Biotechnical 16:535 539, 1998.

Получение антител против MASP-2.

Антитела против MASP-2 можно получать с использованием полипептидов MASP-2 (например, полноразмерного MASP-2) или с использованием несущих антигенный эпитоп MASP-2 пептидов (например, части полипептида MASP-2). Иммуногенные пептиды могут являться настолько маленькими,

- 23 045598 как пять аминокислотных остатков. Например, полипептид MASP-2, включающий полную аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 6, можно использовать для индукции образования антител против MASP-2, которые можно использовать в способе по изобретению. Конкретные домены MASP-2, как известно, вовлеченные в белок-белковые взаимодействия, такие как домены CUBI, и CUBIEGF, так же как область, включающую активный участок сериновой протеазы, можно экспрессировать в форме рекомбинантных полипептидов, как описано в примере 3, и использовать в качестве антигенов. Кроме того, пептиды, содержащие участок из по меньшей мере 6 аминокислот полипептида MASP-2 (SEQ ID NO: 6), также можно использовать для индукции образования антител против MASP-2. Дополнительные примеры происходящих из MASP-2 антигенов, которые можно использовать для индукции образования антител против MASP-2, представлены ниже в табл. 2. Пептиды и полипептиды MASP-2, использованные для индукции образования антител, можно выделять в форме природных полипептидов, или рекомбинантных или синтетических пептидов и каталитически неактивных рекомбинантных полипептидов, таких как MASP-2A, как описано далее в примерах 5-7. В некоторых вариантах осуществления этого аспекта изобретения, антитела против MASP-2 получают с использованием трансгенной линии мышей, как описано в примерах 8 и 9 и далее описано ниже.

Антигены, который можно использовать для получения антител против MASP-2, включают также слитые полипептиды, такие как MASP-2 или его часть, слитые с полипептидом иммуноглобулина или со связывающим мальтозу белком. Полипептидный иммуноген может представлять собой полноразмерную молекулу или ее часть. Если часть полипептида является подобной гаптену, такая часть может быть преимущественно присоединена или связана с макромолекулярным носителем (таким как гемоцианин морского блюдечка (KLH), бычий сывороточный альбумин (BSA) или токсоид столбняка) для иммунизации.

Таблица 3 Происходящие из MASP-2 антигены

SEQ ID NO:	Аминокислотная последовательность
SEQ ID NO:6	Человеческий белок MASP-2
SEQ ID NO:51	Мышиный белок MASP-2
SEQ ID NO:8	Цомен CUBI человеческого MASP-2 (ак 1121 из SEQ ID NO:6)
SEQ ID NO:9	Домены CUBIEGF человеческого MASP-2 (ак 1-166 из SEQ ID NO:6)
SEQ ID NO:10	Домены CUBIEGFCUBII человеческого MASP2 (ак 1-293 из SEQ ID NO:6)
SEQ ID NO:11	Цомен EGF человеческого MASP-2 (ак 122 166 из SEQ ID NO:6)
SEQ ID NO:12	Цомен сериновой протеазы человеческого MASP-2 (ак 429 671 из SEQ ID NO:6)
SEQ ID NO:13 GKDSCRGDAGGALVFL	Мутантная форма с инактивированным доменом сериновой протеазы (ак 610 625 из SEQ ID NO:6 с мутантным Ser 618)
SEQ ID NO:14 TPLGPKWPEPVFGRL	Человеческий пептид CUBI
SEQ ID NO:15: TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLA TLCGQ	Человеческий пептид CUBI
SEQ ID NO:16: TFRSDYSN	Участок связывания MBL в человеческом домене CUBI
SEQ ID NO:17: FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF	Участок связывания MBL в человеческом домене CUBI
SEQ ID NO:18 IDECQVAPG	Пептид EGF
SEQ ID NO:19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV	Пептид из активного участка сериновой протеазы

Поликлональные антитела.

Поликлональные антитела против MASP-2 можно получать посредством иммунизации животных полипептидом MASP-2 или его иммуногенной частью с использованием способов, хорошо известных специалисту в данной области. См., например, Green et al., Production of Polyclonal Antisera, in Immunochemical Protocols (Manson, ed.), page 105. Иммуногенность полипептида MASP-2 можно увеличивать посредством использования адьюванта, включающего минеральные гели, такие как гидроксид алюминия или адъювант Фрейнда (полный или неполный), поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюрониловые полиолы, полианионы, масляные эмульсии, гемоцианин морского блюдечка и динитрофенол. Образование поликлональных антител, как правило, вызывают у таких животных, как лошади, коровы, собаки, куры, крысы, мыши, кролики, морские свинки, козы или овцы. Альтернативно, антитело против MASP-2, которое можно использовать по настоящему изобретению, можно также получать от человекообразной обезьяны. Общие способы получения диагностически и терапевтически полезных антител у бабуинов можно обнаружить, например, в Goldenberg et al., Международная публикация

- 24 045598 патента No. WO 91/11465, и в Losman, M.J., et al., Int. J. Cancer 46:310, 1990. Затем сыворотку, содержащую иммунологически активные антитела, получают из крови таких иммунизированных животных с использованием стандартных способов, хорошо известных в данной области.

Моноклональные антитела.

В некоторых вариантах осуществления, ингибирующее MASP-2 средство представляет собой моноклональное антитело против MASP-2. Моноклональные антитела против MASP-2 являются высоко специфическими, будучи направленными против единичного эпитопа MASP-2. В рамках изобретения, определение моноклональные указывает на характер антитела, как полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не подразумевает необходимость получения антител каким-либо конкретным способом. Моноклональные антитела можно получать с использованием любого способа, который относится к получению молекул антител в культуре стабильных клеточных линий, такого как способ гибридомы, описанный в Kohler, G., et al., Nature 256:495, 1975, или их можно получать способами рекомбинантной ДНК (см., например, Патент США No. 4816567 от Cabilly). Моноклональные антитела можно также выделять из фаговых библиотек антител с использованием способов, описанных в Clackson, T., et al., Nature 352:624 628, 1991, и Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222:581 597, 1991. Такие антитела могут принадлежать к любому классу иммуноглобулина, включая IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, и к любому их подклассу.

Например, моноклональные антитела можно получать посредством инъекции подходящему млекопитающему (например, мыши BALB/c) композиции, содержащей полипептид MASP-2 или его часть. После предопределенного периода времени, у мыши выделяют спленоциты и ресуспендируют их в культуральной среде. Затем спленоциты сливают с иммортализованной линией клеток для формирования гибридомы. Сформированные гибридомы выращивают в культуре клеток и подвергают скринингу по их способности продуцировать моноклональные антитела против MASP-2. Примеры, дополнительно описывающие получение моноклональных антител против MASP-2, представлены в настоящем описании (например, примеры 10 и 13) (см. также Current Protocols in Immunology, Vol. 1., John Wiley & Sons, pages 2, 5, 12, 6, 7, 1991).

Человеческие моноклональные антитела можно получать с использованием трансгенных мышей, сконструированных для продукции специфических человеческих антител в ответ на антигенный стимул. По этому способу, элементы локуса тяжелых и легких цепей иммуноглобулина человека вводят в линии мышей, полученные из линий эмбриональных стволовых клеток, содержащих направленные повреждения эндогенных локусов тяжелых и легких цепей иммуноглобулина. Трансгенные мыши могут синтезировать человеческие антитела, специфические для человеческих антигенов, таких как антигены MASP-2, описанные в настоящем описании, и этих мышей можно использовать для получения гибридом, секретирующих человеческие антитела против MASP-2, посредством слияния В-клеток таких животных с подходящими линиями клеток миеломы с использованием общепринятой технологии Келера-Мильштейна, как описано далее в примере 7. Трансгенные мыши с геномом иммуноглобулинов человека являются коммерчески доступными (например, от Abgenix, Inc., Fremont, CA, и Medarex, Inc., Annandale, N.J.). Способы получения человеческих антител от трансгенных мышей описаны, например, в Green, L.L., et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg, N., et al., Nature 368:856, 1994; и Taylor, L.D., et al., Int. Immun. 6:579, 1994.

Моноклональные антитела можно выделять и очищать из культур гибридом посредством множества хорошо разработанных способов. Такие способы выделения включают аффинную хроматографию с использованием сефарозы с белком A, эксклюзионной хроматографии и ионообменной хроматографии (см., например, Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 и pages 2.9.1-2.9.3; Baines et al., Purification of Immunoglobulin G (IgG), in Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol. 10, pages 79 104, 1992).

После получения, поликлональные, моноклональные или полученные с использованием фагов антитела сначала тестируют по специфическому связыванию с MASP-2. Множество анализов, известных специалистам в данной области, можно использовать для детекции антител, специфически связывающихся с MASP-2. Иллюстративные анализы включают анализ вестерн-блоттинга или иммунопреципитации посредством стандартных способов (например, как описано в Ausubel et al.), иммуноэлектрофорез, ферментный иммуносорбентный анализ, дот-блотинг, анализы ингибирования или конкуренции и сэндвич-анализы (как описано в Harlow and Land, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). После идентификации антител, которые специфически связываются с MASP-2, антитела против MASP-2 тестируют по способности функционировать в качестве ингибирующего MASP-2 средства в одном из нескольких анализов, например, таких как, анализ специфического для лектина расщепления C4 (описанный в примере 2), анализ накопления C3b (описанный в примере 2) или анализ накопления C4b (описанный в примере 2).

Аффинность моноклональных антител против MASP-2 может легко определить специалист в данной области (см., например, Scatchard, A., NY Acad. Sci. 51:660 672, 1949). В одном варианте осуществления, моноклональные антитела против MASP-2, которые можно использовать в способах по изобретению, связываются с MASP-2 с аффинностью связывания <100 нМ, предпочтительно, <10 нМ и наиболее предпочтительно, <2 нМ.

Химерные/гуманизированные антитела.

- 25 045598

Моноклональные антитела, который можно использовать в способе по изобретению, включают химерные антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время, как остальная часть цепи (цепей) является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных из других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, так же как фрагменты таких антител (патент США No. 4816567, от Cabilly; и Morrison, S.L., et al., Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 81:6851 6855, 1984).

Одной из форм химерного антитела, которое можно использовать по изобретению, является гуманизированное моноклональное антитело против MASP-2. Гуманизированные формы не относящихся к человеку (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из не относящегося к человеку иммуноглобулина. Гуманизированные моноклональные антитела получают посредством переноса не относящихся к человеку (например, мышиных) определяющих комплементарность областей (CDR), из тяжелых и легких вариабельных цепей иммуноглобулина мыши в человеческий вариабельный домен. Как правило, затем проводят замены на остатки человеческих антител в каркасных областях не относящихся к человеку эквивалентов. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, не обнаруженные в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации осуществляют для дополнительного уточнения активности антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит в основном все из по меньшей мере одного, и как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или в основном все из гипервариабельных петель соответствуют петлям из не относящегося к человеку иммуноглобулина, и все или в основном все из каркасных областей Fv представляют собой области из последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело, необязательно, содержит также по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, из человеческого иммуноглобулина. Дополнительные подробности, см. в Jones, P.T., et al., Nature 321:522 525, 1986; Reichmann, L., et al., Nature 332:323 329, 1988; и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 596, 1992.

Гуманизированные антитела, которые можно использовать по изобретению, включают человеческие моноклональные антитела, содержащие по меньшей мере связывающую MASP-2 область CDR3. Кроме того, части Fc можно заменять таким образом, чтобы получать IgA или IgM, так же как человеческие антитела IgG. Такие гуманизированные антитела могут иметь особенную клиническую полезность, поскольку они специфически узнают MASP-2 человека, но не провоцируют иммунный ответ у человека против самого антитела. Следовательно, они лучше подходят для введения человеку in vivo, особенно, когда необходимо повторяющееся или долгосрочное введение.

Пример получения гуманизированного антитела против MASP-2 из мышиного моноклонального антитела против MASP-2 представлен в настоящем описании в примере 6. Способы получения гуманизированных моноклональных антител описаны также, например, в Jones, P.T., et al., Nature 321:522, 1986; Carter, P., et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992; Singer, I.I., et al., J. Immun. 150:2844, 1993; Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., 1995; Kelley, Engineering Therapeutic Антитела, in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., pages 399 434, 1996; и в Патенте США No. 5693762, от Queen, 1997. Кроме того, существуют коммерческие организации, которые синтезируют гуманизированные антитела из специфических областей мышиного антитела, такие как Protein Design Labs (Mountain View, CA).

Рекомбинантные антитела.

Антитела против MASP-2 можно также получать с использованием рекомбинантных способов. Например, человеческие антитела можно получать с использованием экспрессирующих человеческие иммуноглобулины библиотек (доступных, например, из Stratagene, Corp., La Jolla, CA) для получения фрагментов человеческих антител (V_H, VL, Fv, Fd, Fab или F(ab')₂). Эти фрагменты затем используют для конструирования полностью человеческих антител с использованием способов, сходных со способами получения химерных антител.

Антиидиотипические антитела.

После идентификации антител против MASP-2 с желательной ингибирующей активностью, эти антитела можно использовать для получения антиидиотипических антител, напоминающих часть MASP-2, с использованием способов, хорошо известных в данной области. См., например, Greenspan, N.S., et al., FASEB J. 7:437, 1993. Например, антитела, которые связываются с MASP-2 и конкурентно ингибируют белковые взаимодействия MASP-2, необходимые для активации комплемента, можно использовать для получения антиидиотипических антител, которые напоминают участок связывания MBL на белке MASP2 и таким образом, связывают и нейтрализуют связывающий лиганд MASP-2 например, такой как MBL.

Фрагменты иммуноглобулинов.

Ингибирующие MASP-2 средства, которые можно использовать в способе по изобретению, включают не только интактные молекулы иммуноглобулинов, но также хорошо известные фрагменты, включая фрагменты Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂ и Fv, фрагменты scFv, диатела, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифические антитела, сформированные из фрагментов антител.

- 26 045598

В данной области хорошо известно, что только небольшая область молекулы антитела, паратоп, вовлечена в связывание антитела с его эпитопом (см., например, Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986). Области pFc' и Fc антитела являются эффекторами классического пути активации комплемента, но не вовлечены в связывание антигена. Антитело, из которого при помощи ферментов вырезана область pFc', или которое получено без области pFc', обозначено как фрагмент F(ab')2 и сохраняет оба антигенсвязывающих участка интактного антитела. Выделенный фрагмент F(ab')₂ относится к бивалентному моноклональному фрагменту из-за его двух антигенсвязывающих участков. Подобным образом, антитело, из которого при помощи ферментов вырезана область Fc, или которое получено без области Fc, обозначено как фрагмент Fab, и сохраняет один из антигенсвязывающих участков интактной молекулы антитела.

Фрагменты антител можно получать посредством протеолитического гидролиза, такого как расщепление полноразмерных антител пепсином или папаином посредством общепринятых способов. Например, фрагменты антител можно получать посредством ферментного расщепления антител с использованием пепсина для получения 5S фрагмента, обозначенного F(ab')2. Этот фрагмент можно далее расщеплять с использованием восстанавливающего тиол средства для получения 3,5S моновалентных фрагментов Fab'. Необязательно, реакцию расщепления можно проводить с использованием блокирующей группы для сульфгидрильных групп, которые образуются в результате расщепления дисульфидных связей. В качестве альтернативы, ферментное расщепление с использованием пепсина напрямую образует два моновалентных фрагмента Fab и фрагмент Fc. Эти способы описаны, например, в Патенте США No. 4331647 от Goldenberg; Nisonoff, A., et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, R.R., Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman, et al., in Methods in Enzymoiogy 1:422, Academic Press, 1967; и в Coligan at pages 2.8.1-2.8.10 and 2.10. 2.10.4.

В некоторых вариантах осуществления, использование фрагментов антител с отсутствием области Fc является предпочтительным для избегания активации классического пути активации комплемента, которая инициируется посредством связывания Fc с рецептором Fcy. Существует несколько способов, посредством которых можно получать MoAb, которые исключают взаимодействия рецептора Fcy. Например, область Fc моноклонального антитела можно удалять химически с использованием частичного расщепления протеолитическими ферментами (такого как расщепление фицином), с получением таким образом, например, антигенсвязывающих фрагментов антител, таких как фрагменты Fab или F(ab)₂(Mariani, M., et al., Mol. Immunol. 28:69 71, 1991). Альтернативно, изотип y4 IgG человека, не связывающий рецепторы Fcy, можно использовать в конструировании гуманизированного антитела, как описано в настоящем описании. Антитела, одноцепочечные антитела и антигенсвязывающие домены, лишенные домена Fc, также можно получать с использованием рекомбинантных способов, описанных в настоящем описании.

Одноцепочечные фрагменты антител.

Альтернативно, можно получать связывающие молекулы с единичной полипептидной цепью, специфические для MASP-2, в которых области Fv тяжелой и легкой цепи соединены. Фрагменты Fv можно соединять посредством пептидного линкера для формирования одноцепочечного антигенсвязывающего белка (scFv). Эти одноцепочечные антигенсвязывающие белки получают посредством конструирования структурного гена, содержащего последовательности ДНК, кодирующие домены VH и V_L, соединенные посредством олигонуклеотида. Структурный ген вставляют в экспрессирующий вектор, который затем вводят в клетку-хозяина, такую как E. coli. Рекомбинантные клетки-хозяева синтезируют одиночную полипептидную цепь с пептидным линкером, соединяющим два домена V. Способы получения scFv описаны, например, by Whitlow, et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97, 1991; Bird, et al., Science 242:423, 1988; патент США No. 4946778, to Ladner; Pack, P., et al., Bio/Technology 11:1271, 1993.

В качестве иллюстративного примера, специфический для MASP-2 scFv можно получать посредством подвергания лимфоцитов воздействию полипептида MASP-2 in vitro и отбора из библиотек дисплея антител в фаговых или сходных векторов (например, посредством использования иммобилизованных или меченых белков или пептидов MASP-2). Гены, кодирующие полипептиды, имеющие потенциальные связывающие полипептид MASP-2 домены, можно получать посредством скрининга библиотек случайных пептидов, экспонированных на фаге или на бактериях, таких как E. coli. Эти библиотеки дисплея случайных пептидов можно использовать для скрининга пептидов, которые взаимодействуют с MASP-2. Способы получения и скрининга таких библиотек дисплея случайных пептидов хорошо известны в данной области (патент США No. 5223409, от Lardner; патент США No. 4946778, от Ladner; патент США No. 5403484, от Lardner; патент США No. 5571698, от Lardner; и Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996) и библиотеки дисплея случайных пептидов и наборы для скрининга таких библиотек являются коммерчески доступными, например, из CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.), New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.), и Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, N.J.).

Другой формой фрагмента антитела против MASP-2, который можно использовать в этом аспекте изобретения, является пептид, кодирующий одиночную определяющую комплементарность область

- 27 045598 (CDR), которая связывается с эпитопом на антигене MASP-2 и ингибирует зависимую от MASP-2 активацию комплемента. Пептиды CDR (минимальные узнающие единицы) можно получать посредством конструирования генов, кодирующих CDR представляющего интерес антитела. Такие гены получают, например, с использованием полимеразной цепной реакции для синтеза вариабельной области по РНК из продуцирующих антитела клеток (см., например, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay Luck, Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies, in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166, Cambridge University Press, 1995; и Ward et al., Genetic Manipulation and Expression of Antibodies, in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), page 137, Wiley Liss, Inc., 1995).

Антитела против MASP-2, описанные в настоящем описании, вводят пациенту для ингибирования зависимой от MASP-2 активации комплемента. В некоторых вариантах осуществления, ингибирующее MASP-2 средство представляет собой высокоаффинное человеческое или гуманизированное моноклональное антитело против MASP-2 с уменьшенной эффекторной функцией.

Пептидные ингибиторы.

В некоторых вариантах осуществления этого аспекта изобретения, ингибирующее MASP-2 средство содержит выделенные пептидные ингибиторы MASP-2, включая выделенные природные пептидные ингибиторы и синтетические пептидные ингибиторы, которые ингибируют систему зависимой от MASP2 активации комплемента. В рамках изобретения, термин выделенные пептидные ингибиторы MASP-2 относится к пептидам, которые ингибируют зависимую от MASP-2 активацию комплемента посредством связывания, конкурирующего с MASP-2 за связывание, с другой узнающей молекулой (например, MBL, H-фиколином, M-фиколином или L-фиколином) в лектиновом пути, и/или непосредственного взаимодействия с MASP-2 для ингибирования зависимой от MASP-2 активации комплемента, которые являются в основном чистыми и являются в основном свободными от других веществ, вместе с которыми их можно обнаружить в природе, до степени, практически осуществимой и подходящей для предназначенного для них применения.

Пептидные ингибиторы успешно использовали in vivo для создания помех для белок-белковых взаимодействий и каталитических участков. Например, пептидные ингибиторы молекул адгезии, структурно родственные LFA-1, недавно одобрены для клинического использования при коагулопатиях (Ohman, E.M., et al., European Heart J. 16:50 55, 1995). Описаны короткие линейные пептиды (<30 аминокислот), которые предотвращают зависимую от интегринов адгезию или создают для нее помехи (Murayama, O., et al., J. Biochem. 120:445 51, 1996). Более длинные пептиды, с длиной в диапазоне от 25 до 200 аминокислотных остатков, также успешно использовали для блокирования зависимой от интегринов адгезии (Zhang, L., et al., J. Biol. Chem. 271(47):29953 57, 1996). Как правило, более длинные пептидные ингибиторы имеют более высокую аффинность и/или более низкие скорости диссоциации, чем короткие пептиды, и могут, таким образом, являться более сильными ингибиторами. Показано также, что циклические пептидные ингибиторы являются эффективными ингибиторами интегринов in vivo для лечения воспалительных заболеваний человека (Jackson, D.Y., et al., J. Med. Chem. 40:3359 68, 1997). Один из способов получения циклических пептидов включает синтез пептидов, в котором концевые аминокислоты пептида представляют собой цистеины, таким образом, позволяя пептиду существовать в циклической форме посредством дисульфидной связи между концевыми аминокислотами, для которой показано улучшение аффинности и времени полужизни in vivo для лечения гематопоэтических неоплазий (например, патент США No. 6649592, от Larson).

Синтетические пептидные ингибиторы MASP-2.

Ингибирующие MASP-2 пептиды, которые можно использовать в способах по этому аспекту изобретения, проиллюстрированы аминокислотными последовательностями, которые имитируют участкимишени, важные для функции MASP-2. Ингибирующие пептиды, которые можно использовать в практическом осуществлении способов по изобретению, имеют размер в диапазоне от приблизительно 5 аминокислоты до приблизительно 300 аминокислот. В табл. 4 представлен список иллюстративных ингибирующих пептидов, которые можно использовать в практическом осуществлении этого аспекта настоящего изобретения. Ингибирующий MASP-2 пептид-кандидат можно тестировать по способности функционировать в качестве ингибирующего MASP-2 средства в одном из нескольких анализов, включая, например, анализ специфического для лектина расщепления C4 (описан в примере 2) и анализ накопления C3b (описан в примере 2).

В некоторых вариантах осуществления, ингибирующие MASP-2 пептиды происходят из полипептидов MASP-2 и выбраны из полноразмерного зрелого белка MASP-2 (SEQ ID NO: 6), или из конкретного домена белка MASP-2, например, такого как домен CUBI (SEQ ID NO: 8), домен CUBIEGF (SEQ ID NO: 9), домен EGF (SEQ ID NO: 11) и домен сериновой протеазы (SEQ ID NO: 12). Как описано ранее, показано, что области CUBEGFCUBII являются необходимыми для димеризации и связывания с MBL (Thielens et al., выше). В частности, показано, что пептидная последовательность TFRSDYN (SEQ ID NO: 16) в домене CUBI MASP-2 вовлечена в связывание MBL, в исследовании, в котором идентифицировано наличие у человека гомозиготной мутации Asp105 до Gly105, приводящей к потере MASP-2 из комплекса MBL (Stengaard Pedersen, K., et al., New England J. Med. 349:554 560, 2003).

- 28 045598

В некоторых вариантах осуществления, ингибирующие MASP-2 пептиды происходят из лектиновых белков, которые связываются с MASP-2 и вовлечены в лектиновый путь комплемента. Идентифицировано несколько различных лектинов, вовлеченных в этот путь, включая связывающий маннан лектин (MBL), L-фиколин, M-фиколин и H-фиколин. (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262:7451 7454, 1987; Matsushita, M., et al., J. Exp. Med. 176:1497 2284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502 3506, 2002). Эти лектины присутствуют в сыворотке в форме олигомеров гомотримерных субъединиц, каждая из которых имеет N-концевые подобные коллагену волокна с узнающими углеводы доменами. Показано, что эти различные лектины связываются с MASP-2, и комплекс лектин/MASP-2 активирует комплемент посредством расщепления белков C4 и C2. H-фиколин имеет амино-концевую область из 24 аминокислот, подобный коллагену домен с 11 повторами Gly-Xaa-Yaa, шеечный домен из 12 аминокислот и подобный фибриногену домен из 207 аминокислот (Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502 3506, 2002). Hфиколин связывается с GlcNAc и вызывает агглютинацию человеческих эритроцитов, покрытых LPS, происходящими из S. typhimurium, S. minnesota и E. coli. Показано, что H-фиколин ассоциирован с MASP-2 и MAp19 и активирует лектиновый путь. Вышеупомянутый L-фиколин/P35 также связывается с GlcNAc и показано, что он ассоциирован с MASP-2 и MAp19 в сыворотке человека, и показано, что этот комплекс активирует лектиновый путь (Matsushita, M., et al., J. Immunol. 164:2281, 2000). Соответственно, ингибирующие MASP-2 пептиды, которые можно использовать по настоящему изобретению, могут содержать область по меньшей мере из 5 аминокислот, выбранных из белка MBL (SEQ ID NO: 21), белка H-фиколина (номер доступа в Genbank NM_173452), белка M-фиколина (номер доступа в Genbank О00602) и белка L-фиколина (номер доступа в Genbank NM_015838).

Более конкретно, ученые идентифицировали участок связывания MASP-2 на MBL, находящийся внутри 12 триплетов Gly-X-Y GKD-GRD-GTK-GEK-GEP-GQG-LRG-LQG-POG-KLG-POG-NOG-PSGSOG-PKG-QKG-DOG-KS (SEQ ID NO: 26), которые расположены между шарнирным и шеечным участками в C-концевой части подобного коллагену домена MBP (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 279:14065, 2004). Эта область участка связывания MASP-2 является также высоко консервативной в H-фиколине человека и L-фиколине человека. Описан консенсусный участок связывания, который присутствует во всех трех лектиновых белках, содержащий аминокислотную последовательность OGK-X-GP (SEQ ID NO: 22), где буквой O представлен гидроксипролин, и буквой X представлен гидрофобный остаток (Wallis et al., 2004, выше). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, ингибирующие MASP-2 пептиды, которые можно использовать в этом аспекте изобретения, имеют длину по меньшей мере 6 аминокислот и содержат SEQ ID NO: 22. Показано, что пептиды, происходящие из MBL, которые включают аминокислотную последовательность GLR-GLQ-GPO-GKL-GPO-G (SEQ ID NO: 24) связывают MASP-2 in vitro (Wallis, et al., 2004, выше). Для усиления связывания с MASP-2, можно синтезировать пептиды, фланкированные двумя триплетами GPO на каждом из концов (GPO-GPO-GLR-GLQGPO-GKL-GPO-GGP-OGP-O SEQ ID NO: 25), для улучшения формирования тройных спиралей в нативном белке MBL (как дополнительно описано в Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 279:14065, 2004).

Из H-фиколина человека можно также получать ингибирующие MASP-2 пептиды, включающие последовательность GAO-GSO-GEK-GAO-GPQ-GPO-GPO-GKM-GPK-GEO-GDO (SEQ ID NO: 27) из консенсусной области связывания MASP-2 в H-фиколине. Включены также пептиды, полученные из Lфиколина человека, включающие последовательность GCO-GLO-GAO-GDK-GEA-GTN-GKR-GERGPO-GPO-GKA-GPO-GPN-GAO-GEO (SEQ ID NO: 28) из консенсусной области связывания MASP-2 в L-фиколине.

Ингибирующие MASP-2 пептиды можно также получать из участка расщепления C4, такого как LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI (SEQ ID NO: 29), который представляет собой участок расщепления C4, связанный с C-концевой частью антитромбина III (Glover, G.I., et al., Mol. Immunol. 25:1261 (1988)).

- 29 045598

Таблица 4

Иллюстративные ингибирующие MASP-2 пептиды

SEQ ID NO	Источник
SEQ ID NO:6	Человеческий белок MASP-2
SEQ ID NO:8	Домен CUBI MASP-2 (ак 1-121 из SEQ ID NO:6)
SEQ ID NO:9	Домены CUBIEGF MASP-2 (ак 1-166 из SEQ ID NO:6)
SEQ ID NO:10	Домены CUBIEGFCUBII MASP-2 (ак 1-293 из SEQ ID NO: 6)
SEQ ID NO:11	Домен EGF MASP-2 (ак 122 166)
SEQ ID NO:12	Домен сериновой протеазы MASP-2 (ак 429 671)
SEQ ID NO:16	Участок связывания MBL в MASP-2
SEQ ID NO:3	Человеческий МАр19
SEQ ID NO:21	Человеческий белок MBL
SEQ ID NO:22 OGK X GP, где «О»=гидроксипролин и «X» представляет собой гидрофобный аминокислотный остаток	Синтетический пептид, консенсусный участок связывания MBL человека и фиколинов человека
SEQ ID NO:23 OGKLG	Кор участка связывания MBL человека
SEQ ID NO:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G	Человеческий МВР, триплеты 6-10, для которых показано связывание MASP-2
SEQ ID NO:25 GPOGPOGLRGLQGPOGKLGPOGGPOGP 0	Триплеты человеческого МВР с GPO, добавленным для улучшения формирования тройных спиралей
SEQ ID NO:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOG KLGPOGNOGPSGSOGPKGQKGDOGKS	Триплеты 1-17 человеческого МВР
SEQ ID NO:27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPK GEOGDO	Фиколин Н человека (Hataka)
SEQ ID NO:28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPO GPOGKAGPOGPNGAOGEO	Фиколин L человека Р35
SEQ ID NO:29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI	Участок расщепления С4 человека

Примечание: буквой O представлен гидроксипролин. Буквой X представлен гидрофобный остаток.

Пептиды, полученные из участка расщепления C4, так же как другие пептиды, ингибирующие участок сериновой протеазы MASP-2, можно химически модифицировать таким образом, что они становятся необратимыми ингибиторами протеаз. Например, соответствующие модификации могут включать, но без обязательного ограничения, галометилкетоны (Br, Cl, I, F) на C-конце, Asp или Glu, или присоединенные к функциональным боковым цепям; группы галоацетила (или другого α-галоацетила) на аминогруппах или других функциональных боковых цепях; содержащие эпоксид или имин группы на аминоили карбокси-концах или на функциональных боковых цепях; или сложные эфиры имидата на аминоили карбокси-концах или на функциональных боковых цепях. Такие модификации предоставляют преимущество постоянного ингибирования фермента посредством ковалентного присоединения пептида. Это может приводить к более низким эффективным дозам и/или к необходимости менее частого введения пептидного ингибитора.

В дополнение к ингибирующим пептидам, описанным выше, ингибирующие MASP-2 пептиды, которые можно использовать в способе по изобретению, включают пептиды, содержащие связывающую MASP-2 область CDR3 MoAb против MASP-2, полученного, как описано в настоящем описании. Последовательность областей CDR для использования в синтезе пептидов можно определять способами, известными в данной области. Вариабельная область тяжелой цепи представляет собой пептид, длина которого обычно лежит в диапазоне от 100 до 150 аминокислот. Вариабельная область легкой цепи представляет собой пептид, длина которого обычно лежит в диапазоне от 80 до 130 аминокислот. Последова- 30 045598 тельности CDR внутри вариабельных областей тяжелой и легкой цепей включают только последовательности из приблизительно 3-25 аминокислот, которые может легко секвенировать специалист в данной области.

Специалисту в данной области известно, что в основном гомологичные варианты ингибирующих MASP-2 пептидов, описанных выше, также имеют активность ингибирования MASP-2.

Иллюстративные варианты включают, но без обязательного ограничения, пептиды, имеющие вставки, делеции, замены и/или добавления аминокислот в карбокси-концевых или амино-концевых областях рассматриваемых пептидов и их смеси. Соответственно, считают, что эти гомологичные пептиды, имеющие активность ингибирования MASP-2, можно использовать в способах по этому изобретению. Описанные пептиды могут также включать дуплицированные мотивы и другие модификации с консервативными заменами. Консервативные варианты описаны в другом месте настоящего описания, и включают замену одной аминокислоты на другую с подобным зарядом, размером или гидрофобностью и т.п.

Ингибирующие MASP-2 пептиды можно модифицировать для увеличения растворимости и/или для максимизации положительного или отрицательного заряда для того, чтобы они более близко напоминали фрагмент интактного белка. Производное может иметь или может не иметь точную первичную аминокислотную структуру пептида, описанного в настоящем описании, при условии, что производное функционально сохраняет желательное свойство ингибирования MASP-2. Модификации могут включать замену аминокислоты на одну из общеизвестных двадцати аминокислот или на другую аминокислоту, на дериватизированную или замещенную аминокислоту с дополнительными желательными характеристиками, такими как устойчивость к ферментной деградации, или на D-аминокислоту, или замену на другую молекулу или соединение, такую как углевод, которая имитирует природную конформацию и функцию аминокислоты, аминокислот или пептида; делецию аминокислоты; вставку аминокислоты из одной из общеизвестных двадцати аминокислот или другой аминокислоты, дериватизированной или замещенной аминокислоты с дополнительными желательными характеристиками, такими как устойчивость к ферментной деградации, или D-аминокислоты, или с замещением другой молекулой или соединением, такой как углевод, которая имитирует природную конформацию и функцию аминокислоты, аминокислот или пептида; или замещение другой молекулой или соединением, такими как углевод или мономер нуклеиновой кислоты, которые имитируют природную конформацию, распределение заряда и функцию исходного пептида. Пептиды можно также модифицировать посредством ацетилирования или амидирования.

Синтез производных ингибирующих пептидов может быть основан на известных способах биосинтеза пептидов, биосинтеза углеводов и т.п. В качестве исходной точки, специалист в данной области может полагаться на подходящую компьютерную программу для определения конформации представляющего интерес пептида. После определения конформации пептида, описанного в настоящем описании, специалист в данной области может определить способ рационального дизайна, сортирующий замены, которые можно осуществлять в одном или нескольких участках для получения производного, которое сохраняет основную конформацию и распределение зарядов исходного пептида, но которое может иметь характеристики, которые у него отсутствуют, или которое усиливает характеристики, обнаруженные в исходном пептиде. После идентификации производных-кандидатов молекул, производные можно тестировать для определения того, функционируют ли они в качестве ингибирующих MASP-2 средств, с использованием анализов, описанных в настоящем описании.

Скрининг ингибирующих MASP-2 пептидов.

Можно также использовать молекулярное моделирование и рациональный молекулярный дизайн для получения и скрининга пептидов, которые имитируют молекулярные структуры ключевых областей связывания MASP-2 и ингибируют активность MASP-2 применительно к комплементу. Молекулярные структуры, используемые для моделирования, включают области CDR моноклональных антител против MASP-2, так же как области-мишени, как известно, важные для функции MASP-2, включая область, необходимую для димеризации, область, вовлеченную в связывание с MBL, и активный участок сериновой протеазы, как описано ранее. Способы идентификации пептидов, связывающих конкретную мишень, хорошо известны в данной области. Например, молекулярный импринтинг можно использовать для конструирования de novo макромолекулярных структур, таких как пептиды, связывающиеся с конкретной молекулой. См., например, Shea, K.J., Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sties, TRIP 2(5) 1994.

В качестве иллюстративного примера, один из способов получения миметиков связывающих MASP-2 пептидов является следующим. Функциональные мономеры известного связывающего MASP-2 пептида или связывающей области антитела против MASP-2, для которых показано ингибирование MASP-2 (матрицу) подвергают полимеризации. Затем матрицу удаляют, с последующей полимеризацией второго класса мономеров в пространстве, оставленном матрицей, для получения новой молекулы, имеющей одно или несколько желательных свойств, сходных со свойствами матрицы. В дополнение к получению пептидов этим способом, можно получать также связывающие MASP-2 молекулы, представляющие собой ингибирующие MASP-2 средства, такие как полисахариды, нуклеозиды, лекарственные средства, нуклеопротеины, липопротеины, углеводы, гликопротеины, стероиды, липиды и другие биологически активные материалы. Этот способ можно использовать для разработки широкого множества биоло- 31 045598 гических миметиков, которые являются более стабильными, чем их природные эквиваленты, поскольку их, как правило, получают посредством полимеризации функциональных мономеров с использованием свободных радикалов, получая в результате соединение с небиоразлагаемым остовом.

Синтез пептидов.

Ингибирующие MASP-2 пептиды можно получать с использованием способов, хорошо известных в данной области, таких как способ твердофазного синтеза, первоначально описанный в Merrifield, in J. Amer. Chem. Soc. 85:2149 2154, 1963. Автоматизированный синтез можно осуществлять, например, с использованием синтезатора пептидов Applied Biosystems 431A (Foster City, Calif.), в соответствии с инструкциями производителя. Другие способы можно обнаружить, например, в Bodanszky, M., et al., Peptide Synthesis, second edition, John Wiley & Sons, 1976, так же как в ссылках на другие работы, известные специалистам в данной области.

Пептиды можно также получать с использованием стандартных способов генной инженерии, известных специалистам в данной области. Например, пептид можно получать ферментным способом, посредством вставки нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, в экспрессирующий вектор, экспрессирующий ДНК, и трансляции ДНК в пептид в присутствии необходимых аминокислот. Затем пептид очищают с использованием хроматографических или электрофоретических способов, или посредством белка-носителя, который можно сливать с этим пептидом и впоследствии отщеплять от него, посредством вставки в экспрессирующий вектор, с совпадением по фазе с кодирующей пептид последовательностью, последовательности нуклеиновой кислоты кодирующей белок-носитель. Слитый с пептидом белок можно выделять с использованием хроматографических, электрофоретических или иммунологических способов (таких как связывание со смолой посредством антитела против белка-носителя). Пептид можно расщеплять с использованием химических способов или ферментативно, например, посредством гидролаз.

Ингибирующие MASP-2 пептиды, которые можно использовать в способе по изобретению, можно также получать в рекомбинантных клетках-хозяевах, следуя общепринятым способам. Для экспрессии последовательностей, кодирующих ингибирующие MASP-2 пептиды, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид, должна быть функционально связана с регуляторными последовательностями, контролирующими экспрессию на уровне транскрипции в экспрессирующем векторе, и затем введена в клетку-хозяина. В дополнение к регулирующим транскрипцию последовательностям, таким как промоторы и энхансеры, экспрессирующие векторы могут включать регулирующие трансляцию последовательности и маркерный ген, пригодные для отбора клеток, несущих экспрессирующий вектор.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие ингибирующий MASP-2 пептид, можно синтезировать с использованием генных машин с использованием таких способов, как фосфорамидитный способ. Если химически синтезированная двухцепочечная ДНК необходима для такого применения, как синтез гена или фрагмента гена, тогда каждую комплементарную цепь получают отдельно. Получение коротких генов (60-80 пар оснований) не вызывает технических затруднений, и его можно осуществлять посредством синтеза комплементарных цепей и затем их гибридизации. Для получения более длинных генов, синтетические гены (двухцепочечные) собирают в модульную форму из одноцепочечных фрагментов длиной 20-100 нуклеотидов. Обзор синтеза полинуклеотидов, см., например, в Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, 1994; Itakura, K., et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323, 1984; и Climie, S., et al., Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 87:633, 1990.

Низкомолекулярные ингибиторы.

В некоторых вариантах осуществления, ингибирующие MASP-2 средства представляют собой низкомолекулярные ингибиторы, включая природные и синтетические вещества, имеющие низкую молекулярную массу, например, такие как пептиды, пептидомиметики и непептидные ингибиторы (включая олигонуклеотиды и органические соединения). Низкомолекулярные ингибиторы MASP-2 можно получать на основе молекулярной структуры вариабельных областей антител против MASP-2.

Низкомолекулярные ингибиторы можно также разрабатывать и получать на основе кристаллической структуры MASP-2 с использованием компьютерного дизайна лекарственных средств (Kuntz I.D., et al., Science 257:1078, 1992). Описана кристаллическая структура крысиного MASP-2 (Feinberg, H., et al., EMBO J. 22:2348 2359, 2003). С использованием способа, описанного в Kuntz et al., координаты кристаллической структуры MASP-2 используют в качестве вводных данных для компьютерной программы, такой как DOCK, которая на выходе выдает список низкомолекулярных структур с ожидаемой способностью связывания с MASP-2. Использование таких компьютерных программ хорошо известно специалисту в данной области. Например, кристаллическую структуру ингибитора протеазы HIV-1 использовали для идентификации уникальных непептидных лигандов, которые являются ингибиторами протеазы HIV-1, посредством оценки совместимости соединений, обнаруженных в базе данных Cambridge Crystallographic, с участком связывания фермента с использованием программы DOCK (Kuntz, I.D., et al., J. Mol. Biol. 161:269 288, 1982; DesJarlais, R.L., et al., PNAS 87:6644 6648, 1990).

Список низкомолекулярных структур, идентифицированных компьютерным способом в качестве потенциальных ингибиторов MASP-2, подвергали скринингу с использованием анализа связывания MASP-2, как описано в примере 10. Затем малые молекулы, как обнаружено, связывающие MASP-2, ана- 32 045598 лизировали в функциональном анализе, таком, как описано в примере 2, для определения того, ингибируют ли они зависимую от MASP-2 активацию комплемента.

Растворимые рецепторы MASP-2.

Считают, что другие подходящие ингибирующие MASP-2 средства включают растворимые рецепторы MASP-2, которые можно получать с использованием способов, известных специалисту в данной области.

Ингибиторы экспрессии MASP-2.

В другом варианте осуществления этого аспекта изобретения, ингибирующее MASP-2 средство представляет собой ингибитор экспрессии MASP-2, способный ингибировать зависимую от MASP-2 активацию комплемента. В практическом осуществлении этого аспекта изобретения, репрезентативные ингибиторы экспрессии MASP-2 экспрессии включают молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты MASP-2 (такие как антисмысловая мРНК, антисмысловая ДНК или антисмысловые олигонуклеотиды), рибозимы MASP-2 и молекулы РНКи MASP-2.

Антисмысловые молекулы РНК и ДНК действуют для непосредственного блокирования трансляции мРНК MASP-2 посредством гибридизации с мРНК MASP-2 и предотвращения трансляции белка MASP-2. Антисмысловую молекулу нуклеиновой кислоты можно конструировать посредством ряда различных способов, при условии, что она является способной препятствовать экспрессии MASP-2. Например, антисмысловую молекулу нуклеиновой кислоты можно конструировать посредством инвертирования кодирующей области (или ее части) кДНК MASP-2 (SEQ ID NO: 4) относительно его нормальной ориентации для транскрипции, что позволяет осуществить транскрипцию ее комплемента.

Обычно антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты является по существу идентичной по меньшей мере части гена или генов-мишеней. Однако нуклеиновая кислота, не обязательно должна быть абсолютно идентичной для ингибирования экспрессии. Как правило, более высокую гомологию можно использовать для компенсации использования более короткой антисмысловой молекулы нуклеиновой кислоты. Минимальный процент идентичности, как правило, составляет боле приблизительно 65%, однако более высокий процент идентичности может оказывать более эффективную репрессию экспрессии эндогенной последовательности. По существу, более высокий процент идентичности более чем приблизительно 80%, как правило, является предпочтительным, хотя значения от приблизительно 95% до полной идентичности, как правило, являются наиболее предпочтительными.

Антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты не обязательно должна иметь такой же интронный или экзонный паттерн, как ген-мишень, и некодирующие фрагменты гена-мишени могут являться равным образом эффективными в достижении антисмысловой супрессии экспрессии гена-мишени, как и кодирующие фрагменты. Последовательность ДНК из по меньшей мере приблизительно 8 или подобного количества нуклеотидов можно использовать в качестве антисмысловой молекулы нуклеиновой кислоты, хотя более длинная последовательность является предпочтительной. По настоящему изобретению, репрезентативным примером ингибирующего MASP-2 средства, которое можно использовать, является антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты MASP-2, которая является по меньшей мере на девяносто процентов идентичной последовательности, комплементарной кДНК MASP-2, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 4. Последовательность нуклеиновой кислоты, представленная в SEQ ID NO: 4, кодирует белок MASP-2, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5.

Нацеливание антисмысловых олигонуклеотидов на связывание с мРНК MASP-2 представляет собой другой механизм, который можно использовать для уменьшения уровня синтеза белка MASP-2. Например, синтез полигалактуроназы и мускаринового рецептора ацетилхолина типа 2 ингибируют посредством антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на соответствующие им последовательности мРНК (патент США No. 5739119, от Cheng, и Патент США No. 5759829, от Shewmaker). Кроме того, показаны примеры антисмыслового ингибирования для ядерного белка циклина, гена множественной лекарственной устойчивости (MDG1), ICAM-1, селектина E, STK-1, стриарного рецептора GABA_a и EGF человека (см., например, Патент США No. 5801154, от Baracchini; патент США No. 5789573, от Baker; патент США No. 5718709, от Considine; и Патент США No. 5610288, от Reubenstein).

Описана система, позволяющая специалисту в данной области определять, какие олигонуклеотиды можно использовать по изобретению, включающая анализ с использованием зондов подходящих участков в мРНК-мишени с использованием расщепления РНКазой H в качестве показателя доступности последовательностей внутри транскриптов. Scherr, M., et al., Nucleic Acids Res. 26:5079 5085, 1998; Lloyd, et al., Nucleic Acids Res. 29:3665 3673, 2001. Смесь антисмысловых олигонуклеотидов, являющихся комплементарными конкретным областям транскрипта MASP-2, добавляют к экстрактам клеток, экспрессирующих MASP-2, таких как гепатоциты, и гибридизуют для получения участка, чувствительного к РНКазе H. Этот способ можно комбинировать с компьютеризированным отбором последовательностей, который может прогнозировать оптимальный отбор последовательностей для антисмысловых композиций, на основании их относительной способности формировать димеры, шпильки или другие вторичные структуры, которые препятствуют специфическому связыванию с мРНК-мишенью в клетке-хозяине. Эти анализ вторичной структуры и отбор участка-мишени можно осуществлять с использованием программ- 33 045598 ного обеспечения для анализа праймеров OLIGO (Rychlik, I., 1997) и компьютерного алгоритма BLASTN 2.0.5 (Altschul, S.F., et al., Nucl. Acids Res. 25:3389 3402, 1997). Антисмысловые соединения, нацеленные на последовательность-мишень, предпочтительно, имеют длину от приблизительно 8 до приблизительно 50 нуклеотидов. Антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие от приблизительно 9 до приблизительно 35 или более нуклеотидов, являются особенно предпочтительными. Авторы настоящего изобретения рассматривают все олигонуклеотидные композиции в диапазоне от 9 до 35 нуклеотидов (т.е., композиции 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, или 35 или более) как высоко предпочтительные в практическом осуществлении способов на основе антисмыслового олигонуклеотида по изобретению. Высоко предпочтительными областями-мишенями мРНК MASP-2 являются те, которые расположены в кодоне инициации трансляции AUG или около него, и последовательности, которые являются в основном комплементарными 5'-областям мРНК, например, между областями -10 и +10 нуклеотидной последовательности гена MASP-2 (SEQ ID NO: 4). Иллюстративные ингибиторы экспрессии MASP-2 представлены в табл. 5.

Таблица 5 _____________Иллюстративные ингибиторы экспрессии MASP-2_____________

SEQ ID NO:30 (нуклеотиды 22 680 из SEQ ID NO:4)	Последовательность нуклеиновой кислоты кДНК MASP-2 (SEQ ID NO :4) , кодирующая CUBIEGF
SEQ ID NO:31 5'CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC3	Нуклеотиды 12-45 из SEQ ID NO:4, включая участок старта трансляции MASP-2 (смысловые)
SEQ ID NO:32 5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3'	Нуклеотиды 361 396 из SEQ ID NO:4, кодирующие область, содержащую участок связывания MBL MASP-2 (смысловые)
SEQ ID NO:33 5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3'	Нуклеотиды 610-642 из SEQ ID NO:4, кодирующие область, содержащую домен CUBII

Как отмечено выше, термин олигонуклеотид в рамках изобретения относится к олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или к их миметикам. Этот термин включает также олигонуклеиновые основания, состоящие из природных нуклеотидов, Сахаров и ковалентных межнуклеозидных связей (остова), также как олигонуклеотиды, имеющие неприродные модификации. Эти модификации позволяют вводить определенные желательные свойства, не предоставляемые природными олигонуклеотидами, такие как свойства уменьшенной токсичности, увеличение стабильности к нуклеазной деградации и улучшение поглощения клетками. В иллюстративных вариантах осуществления, антисмысловые соединения по изобретению отличаются от нативной ДНК вследствие модификации фосфодиэфирного остова для увеличения времени жизни антисмыслового олигонуклеотида, в котором фосфатные заместители заменены на фосфоротиоатные. Подобным образом, один или оба конца олигонуклеотида могут быть замещены одним или более акридиновыми производными, которые интеркалируют между соседними парами оснований в цепи нуклеиновой кислоты.

Другой альтернативой использования антисмысловых последовательностей является использование РНК-интерференции (РНКи). Двухцепочечные РНК (дцРНК) могут вызывать выключение гена у млекопитающих in vivo. Природной функцией РНКи и косупрессии, по-видимому, является защита генома от проникновения мобильных генетических элементов, таких как ретротранспозоны и вирусы, продуцирующие аберрантные РНК или дцРНК в клетке-хозяине при их активации (см., например, Jensen, J., et al., Nat. Genet. 21:209 12, 1999). Молекулу двухцепочечной РНК можно получать посредством синтеза двух цепей РНК, способных формировать молекулу двухцепочечной РНК, где каждая имеет длину приблизительно от 19 до 25 (например, 19-23 нуклеотидов). Например, молекула дцРНК, которую можно использовать в способах по изобретению, может содержать РНК, соответствующую последовательности и комплементарной ей последовательности, перечисленным в табл. 4. Предпочтительно, по меньшей мере одна цепь РНК имеет выступающий 3'-конец из 1-5 нуклеотидов. Синтезированные цепи РНК объединяют в условиях, позволяющих формирование двухцепочечной молекулы.

Последовательность РНК может содержать по меньшей мере часть из 8 нуклеотидов из SEQ ID NO: 4 с общей длиной 25 нуклеотидов или менее. Разработка последовательностей миРНК для данной мишени находится в компетенции специалиста в данной области. Доступны коммерческие услуги разработки последовательности миРНК, и они гарантируют по меньшей мере 70% нокдаун экспрессии (Qiagen, Valencia, Calif).

дцРНК можно вводить в форме фармацевтической композиции и осуществлять введение известными способами, где нуклеиновую кислоту вводится в желательную клетку-мишень. Общеизвестные способы переноса генов включают способы с использованием фосфата кальция, DEAE-декстрана, электропорации, микроинъекции и вирусов. Такие способы объяснены в Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1993.

- 34 045598

Для уменьшения количества и/или биологической активности MASP-2 можно использовать также рибозимы, такие как рибозимы, нацеленные на мРНК MASP-2. Рибозимы представляют собой каталитические молекулы РНК, способные расщеплять молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие последовательность, полностью или частично гомологичную последовательности рибозима. Можно разрабатывать рибозимные трансгены, кодирующие РНК-рибозимы, которые специфически спариваются с РНКмишенью и расщепляют фосфодиэфирный остов в специфическом положении, таким образом, функционально инактивируя РНК-мишень. При проведении этого расщепления, сам рибозим не изменяется, и таким образом, является способным к повторению цикла и расщеплению других молекул. Включение рибозимных последовательностей в антисмысловые РНК придает им активность расщепления РНК, таким образом, увеличивая активность антисмысловых конструкций.

Рибозимы, которые можно использовать в практическом осуществлении изобретения, как правило, содержат гибридизующуюся область из по меньшей мере приблизительно девяти нуклеотидов, которая является комплементарной по нуклеотидной последовательности по меньшей мере части мРНК-мишени MASP-2, и каталитическую область, адаптированную для расщепления мРНК-мишени MASP-2 (см. в общем, EPA No. 0 321 201; WO88/04300; Haseloff, J., et al., Nature 334:585 591, 1988; Fedor, M.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1668 1672, 1990; Cech, T.R., et al., Ann. Rev. Biochem. 55:599 629, 1986).

Рибозимы можно также нацеливать непосредственно на клетки в форме олигонуклеотидов РНК, включающих рибозимные последовательности, или вводить в клетку в форме экспрессирующего вектора, кодирующего желательную рибозимную РНК. Рибозимы можно использовать и вводить по большей части таким же способом, какой описан для антисмысловых полинуклеотидов.

Антисмысловые РНК и ДНК, рибозимы и молекулы РНКи, которые можно использовать в способах по изобретению, можно получать любым способом, известным в данной области для синтеза молекул ДНК и РНК. Эти способы включают способы химического синтеза олигодезоксирибонуклеотидов и олигорибонуклеотидов, хорошо известные в данной области, например, такие как твердофазный фосфорамидитный химический синтез. Альтернативно, молекулы РНК можно получать посредством транскрипции in vitro и in vivo последовательностей ДНК, кодирующих молекулу антисмысловой РНК. Такие последовательности ДНК можно вставлять в широкое множество векторов, включающих подходящие промоторы для РНК-полимеразы, такие как промоторы для полимеразы T7 или SP6. Альтернативно, конструкции антисмысловой кДНК, синтезирующие антисмысловую РНК конституитивным или индуцируемым образом, в зависимости от используемого промотора, можно стабильно вводить в линии клеток.

Различные хорошо известные модификации молекул ДНК можно вводить в качестве средств для увеличения стабильности и времени полужизни. Модификации, которые можно использовать, включают, но без ограничения, добавление фланкирующих последовательностей рибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов к 5'- и/или 3'-концам молекулы или использование фосфоротиоатных или 2'-O метильных вместо фосфодиэфирных связей внутри олигодезоксирибонуклеотидного остова.

V. Фармацевтические композиции и способы доставки.

Дозирование.

В другом аспекте изобретение относится к композициям для ингибирования неблагоприятных эффектов зависимой от MASP-2 активации комплемента у пациента, страдающего заболеванием или состоянием, как описано в настоящем описании, включая введение пациенту композиции, содержащей терапевтически эффективное количество ингибирующего MASP-2 средства и фармацевтически приемлемый носитель. Ингибирующие MASP-2 средства можно вводить пациенту, в терапевтически эффективных дозах для лечения или облегчения состояний, ассоциированных с зависимой от MASP-2 активацией комплемента. Терапевтически эффективная доза относится к количеству ингибирующего MASP-2 средства, достаточный для облегчения симптомов, ассоциированных с заболеванием или состоянием.

Токсичность и терапевтическую эффективность ингибирующих MASP-2 средств моно определять посредством стандартных фармацевтических способов с использованием экспериментальных моделей на животных, таких как мышиная модель на мышах MASP-2-/-, экспрессирующих человеческий трансген MASP-2, описанная в примере 1. С использованием таких моделей на животных, NOAEL (уровень отсутствия наблюдаемых неблагоприятных эффектов) и MED (минимальную эффективную дозу) можно определять с использованием стандартных способов. Соотношение дозы между эффектами NOAEL и MED представляет собой терапевтический индекс, который выражают как соотношение NOAEL/MED. Ингибирующие MASP-2 средства, имеющие большие терапевтические индексы или показатели, являются наиболее предпочтительными. Данные, полученные из анализов культур клеток и исследований на животных, можно использовать для составления диапазона доз для использования для человека. Доза ингибирующего MASP-2 средства предпочтительно лежит в диапазоне циркулирующих концентраций, включающем MED с небольшой токсичностью или отсутствием токсичности. Дозу можно менять в пределах этого диапазона в зависимости от формы используемой дозируемой формы и используемого способа введения.

Для получения состава любого соединения, терапевтически эффективную дозу можно оценивать с использованием моделей на животных. Например, дозу можно составлять в модели на животных для достижения диапазона циркулирующей в плазме концентрации, включающего MED. Количественные

- 35 045598 уровни ингибирующего MASP-2 средства в плазме также можно измерять, например, посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии.

В дополнение к исследованиям токсичности, эффективную дозу можно также оценивать на основании количества белка MASP-2, присутствующего в живом индивиде, и аффинности связывания ингибирующего MASP-2 средства. Показано, что MASP-2 у здоровых людей в сыворотке на низких уровнях в диапазоне около 500 нг/мл, и уровни MASP-2 у конкретного индивида можно определять с использованием количественного анализа MASP-2, описанного в Moller Kristensen M., et al., J. Immunol. Methods 282:159 167, 2003.

В общем, дозу вводимых композиций, содержащих ингибирующие MASP-2 средства, меняется в зависимости от таких факторов, как возраст, масса, рост, пол, общее медицинское состояние и предшествующий медицинский анамнез пациента. В качестве иллюстрации, ингибирующие MASP-2 средства, такие как антитела против MASP-2, можно вводить в дозе, лежащей в диапазоне приблизительно от 0,010 до 10,0 мг/кг, предпочтительно, от 0,010 до 1,0 мг/кг, более предпочтительно, от 0,010 до 0,1 мг/кг массы тела индивида. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит комбинацию антител против MASP-2 и ингибирующих MASP-2 пептидов.

Терапевтическую эффективность ингибирующих MASP-2 композиций и способов по настоящему изобретению для данного индивида, и подходящие дозы можно определять в соответствии с анализами комплемента, хорошо известными специалисту в данной области. Комплемент образует многочисленные специфические продукты. За последнее десятилетие разработаны чувствительные и специфические анализы, и они являются коммерчески доступными для большинства из данных продуктов активации, включая малые фрагменты активации C3a, C4a и C5a, и большие фрагменты активации iC3b, C4d, Bb и sC5b 9. В большинстве этих анализов используют моноклональные антитела, вступающие в реакцию с новыми антигенами (неоантигенами), экспонированными на этих фрагментах, но не на нативных белках, из которых они образованы, что делает эти анализы очень простыми и специфическими. Большинство основано на технологии ELISA, хотя радиоиммунный анализ еще иногда используют для C3a и C5a. В этих последних анализах измеряют как непроцессированные фрагменты, так и их фрагменты desArg, которые являются основными формами, обнаруживаемыми в кровотоке. Непроцессированные фрагменты и C5a_desArg быстро выводятся посредством связывания с рецепторами клеточной поверхности, и are таким образом, присутствуют в очень низких концентрациях, в то время как C3a_desArg не связывается с клетками и накапливается в плазме. Измерение C3a обеспечивает чувствительный, не зависимый от пути показатель активации комплемента. Активацию альтернативного пути можно оценивать посредством измерения количества фрагмента Bb. Детекция растворимого продукта активации мембраноатакующего пути, sC5b 9, предоставляет доказательства того, что комплемент активируется полностью. Поскольку как лектиновый, так и классический пути образуют одинаковые продукты активации, C4a и C4d, измерение количества этих двух фрагментов не предоставляет никакой информации о том, в каком из этих двух путей образованы продукты активации.

Ингибирование зависимой от MASP-2 активации комплемента характеризуется по меньшей мере одним из следующих изменений компонента системы комплемента, возникающим в результате введения ингибирующего MASP-2 средства в соответствии со способами по изобретению: ингибирование образования или продукции продуктов зависимой от MASP-2 системы активации комплемента C4b, C3a, C5a и/или C5b 9 (MAC) (измеренное, например, как описано в примере 2, уменьшение расщепления C4 и накопления C4b (измеренное, например, как описано в примере 10), или уменьшение расщепления C3 и накопления C3b (измеренное, например, как описано в примере 10).

Дополнительные средства.

Композиции и способы, включающие ингибирующие MASP-2 средства, могут, необязательно, содержать одно или несколько дополнительных лекарственных средств, которые могут усиливать активность ингибирующего MASP-2 средства, или которые обеспечивают родственные терапевтические функции аддитивным или синергическим образом. Например, в контексте лечения индивида, страдающего зависимым от ангиогенеза заболеванием или состоянием, одно или несколько ингибирующих MASP-2 средств можно вводить в комбинации (включая совместное введение) с одним или несколькими дополнительными антиангиогенными (также обозначенными как ангиостатическими) средствами и/или с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами.

Ингибирующие MASP-2 средства можно использовать в комбинации с другими антиангиогенными средствами, например, такими как антагонисты VEGF, такие как антитела, связывающиеся с VEGF, такие как антитело, известное как бевацизумаб (BV) (также известный как АВАСТИН®), антитела, связывающиеся с VEGF-A, или VEGF-C, или с рецептором VEGF-A (например, рецептором KDR или рецептором Flt-1), ингибиторы против PDGFR, такие как Гливек® (мезилат иматиниба), малые молекулы, блокирующие передачу сигнала рецептора VEGF (например, PTK787/ZK2284, SU6668,

SUTENT.RTM./SU11248 (сунитиниб малат)), AMG706, или описанные, например, в Международной патентной заявке WO 2004/113304. Антиангиогенные средства включают также природные ингибиторы ангиогенеза, например, ангиостатин, эндостатин и т.д. См., например, Klagsbrun and D'Amore (1991) An- 36 045598 nu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179 (например, табл. 3 с перечислением антиангиогенных лекарственных средств при злокачественной меланоме); Ferrara & Alitalo (1999)

Nature Medicine 5(12):1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (например, табл. 2 с перечислением известных антиангиогенных факторы); и Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206 (например, табл.

с перечислением антиангиогенных средств, использованных в клинических исследованиях).

Ингибирующие MASP-2 средства можно использовать в комбинации с другими противораковыми и/или химиотерапевтическими средствами, например, такими как абареликс, актиномицин D, адриамицин, альдеслейкин, алемтузумаб, алитретиноин, аллопуринол, алтретамин, амифостин, анакинра, анастрозол, триоксид мышьяка, аспарагиназа, азацитидин, BCG Live, бевацизумаб, бексаротен, блеомицин, бортезомиб, бусульфан, калюстерон, капецитабин, карбоплатин, кармустин, целекоксиб, цетуксимаб, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, клофарабин, циклофосфамид, цитарабин, декарбазин, дактиномицин, дальтепарин (например, натрия), дарбепоэтин-альфа, дазатиниб, даунорубицин, дауномицин, децитабин, денилейкин, денилейкин-дифтитокс, дексразоксан, доцетаксел, доксорубицин, пропионат дромостанолона, экулизумаб, эпирубицин (например, HCl), эпоэтин-альфа, эрлотиниб, эстрамустин, этопозид (например, фосфат), экземестан, фентанил (например, цитрат), филграстим, флоксуридин, флударабин, фторурацил, 5-FU, фулвестрант, гефитиниб, гемцитабин (например, HCl), гемтузумаб-озогамицин, гозерелин (например, ацетат), гистрелин (например, ацетат), гидроксимочевина, ибритутомаб тиуксетан, идарубицин, ифосфамид, иматиниб (например, мезилат), интерферон-альфа-2b, иринотекан, дитозилат лапатиниба, леналидомид, лектрозол, лейковорин, леупролид (например, ацетат), левамизол, ломустин, CCNU, мехлорэтамин (азотистый иприт), магестрол, мелфалан (L-PAM), меркаптопурин (6-MP), месна, метотрексат, метоксален, митомицин C, митотан, митоксантрон, фенпропионат нандролона, неларабин, нофетумомаб, опрелвекин, оксалиплатин, паклитаксел, палифермин, памидронат, панитумумаб, пегадемаза, пегаспаргаза, пэгфилграстим, пэгинтерферон-альфа-2b, пеметрексед (например, динатрия), пентостатин, пипоброман, пликамицин (митрамицин), порфимер (например, натрия), прокарбазин, хинакрин, расбуриказа, ритуксимаб, сарграмостим, сорафениб, стрептозоцин, сунитиниб (например, малеат), тальк, тамоксифен, темозололмид, тенипозид (VM-26), тестолактон, талидомид, тиогуанин (6-TG), тиотепа, топотекан (например, hcl), торемифен, ТозитумомабЛ-131 (тозитумомаб), трастузумаб, третиноин (ATRA), урамустин, валрубицин, винбластин, винкристин, винорелбин, вориностат, золедронат и золедроновая кислота.

Фармацевтические носители и средства для доставки.

Как правило, композиции ингибирующего MASP-2 средства по настоящему изобретению, в комбинации с любыми другими выбранными лекарственными средствами, подходящим образом содержатся в фармацевтически приемлемом носителе. Носитель является нетоксичным, биосовместимым, и выбранным таким образом, чтобы не оказывать неблагоприятное влияние на биологическую активность ингибирующего MASP-2 средства (и любых других лекарственных средств в комбинации с ним). Иллюстративные фармацевтически приемлемые носители для пептидов описаны в Патенте США No. 5211657 от Yamada. Антитела против MASP-2 и ингибирующие пептиды, которые можно использовать по изобретению, можно составлять в препараты в твердой, полужидкой, гелеобразной, жидкой или газообразной формах, таких как таблетки, капсулы, порошки, гранулы, мази, растворы, депозитарии, средства для ингаляций и инъекций, позволяющие пероральное, парентеральное или хирургическое введение. Изобретение относится также к местному введению композиций посредством покрытия медицинских инструментов и т.д.

Пригодные носители для парентеральной доставки посредством инъекции, инфузии или орошения и местной доставки, включают дистиллированную воду, забуференный фосфатом физиологический раствор, нормальный или содержащий лактат растворы Рингера, раствор декстрозы, раствор Хэнка или пропандиол. Кроме того, стерильные, жирные масла можно использовать в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели можно использовать любое биосовместимое масло, включая синтетические или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, можно использовать для получения средств для инъекций. Носитель и средство можно объединять в форме жидкости, суспензии, способного или не способного к полимеризации геля, пасты или бальзама.

Носитель может также содержать средство для доставки для замедления (т.е., продления, задержки или регуляции) доставки средства(средств) или для улучшения доставки, поглощения, стабильности или фармакокинетики лекарственного средства(средств). Такое средство для доставки может включать, в качестве неограничивающего примера, микрочастицы, микросферы, наносферы или наночастицы, состоящие из белков, липосом, углеводов, синтетические органические соединения, неорганические соединения, полимерные или сополимерные гидрогели и полимерные мицелл. Подходящие системы доставки на основе гидрогелей и мицелл включают сополимеры PEO:PHB:PEO и сополимерные/циклодекстриновые комплексы, описанные в WO 2004/009664 A2, и PEO и PEO/циклодекстриновые комплексы, описанные в Публикации патентной заявки США No. 2002/0019369 A1. Такие гидрогели можно инъецировать местно в участке намеченного воздействия, или подкожно или внутримышечно для формирования депо для замедленного высвобождения.

Для внутрисуставной доставки, носителем для ингибирующего MASP-2 средства могут являться

- 37 045598 вышеописанные жидкие или гелеобразные носители, пригодные для инъекций, вышеописанные средства для доставки с замедленным высвобождением, пригодные для инъекций, или гиалуроновая кислота или производное гиалуроновой кислоты.

Для перорального введения непептидергических средств, носителем для ингибирующего MASP-2 средства могут являться инертный наполнитель или разбавитель, такой как сахароза, кукурузный крахмал или целлюлоза.

Для местного введения, носителем для ингибирующего MASP-2 средства могут являться мазь, лосьон, крем, гель, капли, суппозиторий, спрей, жидкость или порошок, или гелевые или микрокапсульные системы доставки посредством чрескожного пластыря.

Различные назальные и легочные системы доставки, включая аэрозоли, дозирующие ингаляторы, ингаляторы сухого порошка и распылители, находятся на стадии разработки и могут быть соответствующим образом адаптированы для доставки по настоящему изобретению в аэрозольном, ингаляционном или распыленном средстве для доставки, соответственно.

Для инратекальной (IT) или интрацеребровентрикулярной (ICV) доставки, соответствующие стерильные системы доставки (например, жидкости; гели, суспензии и т.д.) можно использовать для доставки по настоящему изобретению.

Композиции по настоящему изобретению могут также включать биосовместимый наполнители, такие как диспергирующие или увлажняющие средства, суспендирующие средства, разбавители, буферы, усиливающие проникновение средства, эмульгаторы, связующие вещества, загустители, вкусовые добавки (для перорального введения).

Фармацевтические носители для антител и пептидов.

Более конкретно, применительно к антителам против MASP-2 и ингибирующим пептидам, иллюстративные составы можно вводить парентерально в форме пригодных для инъекций доз раствора или суспензии соединения в физиологически приемлемом разбавителе с фармацевтическим носителем, который может представлять собой стерильную жидкость, такую как вода, масла, солевой раствор, глицерин или этанол. Кроме того, вспомогательные вещества, такие как увлажняющие средства или эмульгаторы, поверхностно-активные вещества, забуферивающие pH вещества и т.п., могут присутствовать в композициях, содержащих антитела против MASP-2 и ингибирующие пептиды. Дополнительные компоненты фармацевтических композиций включают горючее и смазочные материалы (например, животного, растительного или синтетического происхождения), например, соевое масло и минеральное масло. Как правило, гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, являются предпочтительными жидкими носителями для пригодных для инъекций растворов.

Антитела против MASP-2 и ингибирующие пептиды можно также вводить в форме инъекций-депо или имплантируемого препарата, которые можно составлять таким образом, чтобы позволять замедленное или пульсирующее высвобождение действующих веществ.

Фармацевтически приемлемые носители для ингибиторов экспрессии.

Более конкретно, применительно к ингибиторам экспрессии, которые можно использовать в способах по изобретению, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим ингибитор экспрессии, как описано выше, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Композиция может дополнительно содержать коллоидную дисперсионную систему.

Фармацевтические композиции, содержащие ингибиторы экспрессии, могут включать, но без ограничения, растворы, эмульсии и содержащие липосомы составы. Эти композиции можно получать из множества компонентов, включающих, но без ограничения, заранее приготовленные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества. Получение таких композиций, как правило, включает объединение ингибитора экспрессии с одним или несколькими из следующих: буферы, антиоксиданты, низкомолекулярные полипептиды, белки, аминокислоты, углеводы, включая глюкозу, сахарозу или декстрины, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, глутатион и другие стабилизаторы и наполнители. Нейтральный забуференный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с неспецифическим сывороточным альбумином, представляют собой примеры подходящих разбавителей.

В некоторых вариантах осуществления, композиции можно получать и составлять в форме эмульсий, как правило, представляющих собой гетерогенные системы из одной жидкости, диспергированной в другой в форме капель (см., Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Vol. 1, Rieger and Banker (eds.), Marcek Dekker, Inc., N.Y., 1988). Примеры природных эмульгаторов, используемых в эмульсионных составах, включают гуммиарабик, пчелиный воск, ланолин, лецитин и фосфатиды.

В одном варианте осуществления, композиции, содержащие нуклеиновые кислоты, можно составлять в форме микроэмульсий. Микроэмульсия, в рамках изобретения, относится к системе из воды, масла и амфифильного вещества, которая представляет собой одиночный оптически однородный и термодинамически стабильный жидкий состав (см. Rosoff in Pharmaceutical Dosage Forms, Vol. 1). В способе по изобретению можно также использовать липосомы для переноса и доставки антисмысловых олигонуклеотидов в желательный участок.

Фармацевтические композиции и составы ингибиторов экспрессии для местного введения могут

- 38 045598 включать чрескожные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Можно использовать общепринятые фармацевтические носители, так же как водные, порошкообразные или масляные основы и загустители, и т.п.

Способы введения.

Фармацевтические композиции, содержащие ингибирующие MASP-2 средства, можно вводить множеством способов, в зависимости от того, местный или системный способ введения является наиболее подходящим для состояния, подвергаемого лечению. Кроме того, композиции по настоящему изобретению можно доставлять посредством покрытия композициями имплантируемого медицинского устройства или включения композиций в имплантируемое медицинское устройство.

Системная доставка.

В рамках изобретения, термины системная доставка и системное введение включают, но без ограничения, пероральный и парентеральный способы, включая внутримышечный (IM), подкожный, внутривенный (IV), внутриартериальный, ингаляционный, подъязычный, буккальный, местный, чрескожный, назальный, ректальный, вагинальный и другие способы введения, которые эффективно приводят к распределению доставляемого средства в одном или множестве участков намеченного терапевтического действия. Предпочтительные способы системной доставки настоящих композиций включают внутривенный, внутримышечный, подкожный и ингаляционный. Следует учитывать, что точный способ системного введения для выбранных средств, используемых в конкретных композициях по настоящему изобретению, можно определять частично с учетом чувствительности средства к путям метаболического превращения, ассоциированным с данным способом введения. Например, пептидергические средства можно наиболее подходящим образом вводить способами, отличными от перорального.

Ингибирующие MASP-2 антитела и полипептиды можно доставлять пациенту любыми подходящими способами. Способы доставки антител и полипептидов MASP-2 включают пероральное, легочное, парентеральное введение (например, внутримышечную, внутрибрюшинную, внутривенную (IV) или подкожную инъекцию), ингаляцию (например, в составе тонкоизмельченного порошка), чрескожный, назальный, вагинальный, ректальный или подъязычный способы введения, и можно получать составы лекарственных форм, подходящие для каждого способа введения.

В качестве репрезентативного примера, ингибирующие MASP-2 антитела и пептиды можно вводить в живой организм посредством нанесения на оболочку в организме, способную абсорбировать полипептиды, например, слизистые оболочки носа, желудочно-кишечного тракта и прямой кишки. Полипептиды, как правило, наносят на абсорбирующую оболочку в сочетании с усиливающим проникновение средством. (См., например, Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Лекарственное средство Носитель Sys. 5:69, 1988; Lee, V.H.L., J. Controlled Release 13:213, 1990; Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery,. Marcel Dekker, New York (1991); DeBoer, A.G., et al., J. Controlled Release 13:241, 1990.) Например, STDHF представляет собой синтетическое производное фусидовой кислоты, стероидное поверхностно-активное вещество, которое является сходным по структуре с солями желчных кислот желчных кислот, и которое использовали в качестве усиливающего проникновение средства для назальной доставки. (Lee, W.A., Biopharm. 22, Nov./Dec. 1990.)

Ингибирующие MASP-2 антитела и полипептиды можно вводить в сочетании с другой молекулой, такой как липид, для защиты полипептидов от ферментной деградации. Например, ковалентное присоединение полимеров, особенно полиэтиленгликоля (PEG), использовали для защиты конкретных белков от ферментного гидролиза в организме и таким образом, продления времени полужизни (Fuertges, F., et al., J. Controlled Release 11:139, 1990). Опубликовано множество полимерных систем для доставки белков (Bae, Y.H., et al., J. Controlled Release 9:271, 1989; Hori, R., et al., Pharm. Res. 5:813, 1989; Yamakawa, I., et al., J. Pharm. Sci. 79:505, 1990; Yoshihiro, I., et al., J. Controlled Release 10:195, 1989; Asano, M., et al., J. Controlled Release 9:111, 1989; Rosenblatt, J., et al., J. Controlled Release 9:195, 1989; Makino, K., J. Controlled Release 12:235, 1990; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:117, 1989; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:219, 1989).

Недавно разработаны липосомы с улучшенной стабильностью в сыворотке и временем полужизни в кровотоке (см., например, Патент США No. 5741516, от Webb). Кроме того, приведен обзор различных способов с использованием липосом и подобных липосомам препаратов в качестве потенциальных носителей для лекарственных средств (см., например, Патент США No. 5567434, от Szoka; патент США No. 5552157, от Yagi; патент США No. 5565213, от Nakamori; патент США No. 5738868, от Shinkarenko; и Патент США No. 5795587, от Gao).

Для чрескожных введений, ингибирующие MASP-2 антитела и полипептиды можно комбинировать с другими пригодными ингредиентами, такими как носители и/или адъюванты. Не существует ограничений применительно к природе таких других ингредиентов, за исключением того, что они должны являться фармацевтически приемлемыми для намеченного для них введения, и не могут нарушать активность активных ингредиентов композиции. Примеры пригодных средств включают мази, кремы, гели или суспензии, содержащие или не содержащие очищенный коллаген. Ингибирующие MASP-2 антитела и полипептиды можно также вкраплять в чрескожные накладки, пластыри и бандажи, предпочтительно, в жидкой или полужидкой форме.

- 39 045598

Композиции по настоящему изобретению можно вводить системно на периодической основе с интервалами, определенными для поддержания желательного уровня терапевтического эффекта. Например, композиции можно вводить, например, посредством подкожной инъекции, каждые две-четыре недели или с менее частыми интервалами. Режим дозирования определяет терапевт с учетом различных факторов, которые могут оказывать влияние на действие комбинации средств. Эти факторы включают степень прогрессирования подвергаемого лечению состояния, возраст, пол и массу пациента, и другие клинические факторы. Дозу для каждого индивидуального средства можно менять в зависимости от ингибирующего MASP-2 средства, включенного в композицию, так же как от присутствия и природы любого средства для доставки лекарственного средства (например, средства для доставки с замедленным высвобождением). Кроме того, уровень дозирования можно корректировать с учетом изменения частоты введения и фармакокинетического поведения доставляемого средства(средств).

Местная доставка.

В рамках изобретения, термин местное включает введение лекарственного средство в участок или около участка намеченного местного действия, и может включать, например, местную доставку на кожу или в другие пораженные ткани, офтальмологическую доставку, интратекальное (IT), интрацеребровентрикулярное (ICV), внутрисуставное, внутриполостное, интракраниальное или внутрипузырное введение, наложение или орошение. Местное введение может являться предпочтительным для обеспечения возможности введения более низкой дозы, для избегания системных побочных эффектов и для более точного контроля времени доставки и концентрации действующих веществ в участке местной доставки. Местное введение обеспечивает известную концентрацию в участке-мишени, вне зависимости от изменчивости между пациентами метаболизма, кровотока и т.д. Улучшенный контроль дозирования также обеспечивается посредством прямого способа доставки.

Местную доставку ингибирующего MASP-2 средства можно осуществлять в контексте хирургических способов лечения зависимого от ангиогенеза заболевания или состояния, например, в ходе таких процедур, как хирургическое вмешательство в глаз или связанное со злокачественной опухолью хирургическое вмешательство.

Режимы лечения.

При профилактических применениях, фармацевтические композиции, содержащие ингибирующее MASP-2 средство, вводят пациенту, чувствительному к зависимому от ангиогенеза заболеванию или состоянию, или иным образом подверженному риску развития зависимого от ангиогенеза заболевания или состояния, в количестве, достаточном для ингибирования ангиогенеза и таким образом, исключения или уменьшения риска развития симптомов этого состояния. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции вводят индивиду, у которого подозревают наличие, или который уже страдает от зависимого от ангиогенеза заболевания или состояния, в терапевтически эффективном количестве, достаточном для облегчения или по меньшей мере частичного уменьшения, симптомов этого состояния. Как в профилактических, так и в терапевтических режимах, композиции, содержащие ингибирующие MASP-2 средства, можно вводить в нескольких дозах до достижения удовлетворительного терапевтического исхода для пациента. Применение ингибирующих MASP-2 композиций по настоящему изобретению можно осуществлять посредством однократного введения композиции, или ограниченной серии введений, для лечения острого состояния, ассоциированного с ангиогенезом. Альтернативно, композицию можно вводить с периодическими интервалами в течение продолжительного периода времени для лечения хронического состояния, ассоциированного с ангиогенезом.

Как в профилактических, так и в терапевтических режимах, композиции, содержащие ингибирующие MASP-2 средства, можно вводить в нескольких дозах до достижения удовлетворительного терапевтического исхода для пациента. В одном варианте осуществления изобретения, ингибирующее MASP-2 средство содержит антитело против MASP-2, которое подходящим образом можно вводить взрослому пациенту (например, при средней массе взрослого 70 кг) в дозе от 0,1 мг до 10000 мг, более подходящим образом, от 1,0 мг до 5000 мг, более подходящим образом, от 10,0 мг до 2000 мг, более подходящим образом, от 10,0 мг до 1000 мг и еще более подходящим образом, от 50,0 мг до 500 мг. Для пациентов детского возраста, дозу можно корректировать пропорционально массе пациента. Применение ингибирующих MASP-2 композиций по настоящему изобретению можно осуществлять посредством однократного введения композиции, или ограниченной серии введений, для лечения пациента, страдающим или подверженным риску развития зависимого от ангиогенеза заболевания или состояния, такого как зависимая от ангиогенеза злокачественная опухоль, зависимая от ангиогенеза доброкачественная опухоль или ангиогенное заболевание или состояние глаз. Альтернативно, композицию можно вводить с периодическими интервалами, например, ежесуточно, дважды в неделю, один раз в неделю, каждую вторую неделю, раз в месяц или раз в два месяц в течение продолжительного периода времени для лечения индивида, страдающего или подверженного риску развития зависимого от ангиогенеза заболевания или состояния, такого как зависимая от ангиогенеза злокачественная опухоль, зависимая от ангиогенеза доброкачественная опухоль или ангиогенное заболевание или состояние глаз.

Как в профилактических, так и в терапевтических режимах, композиции, содержащие ингибирующие MASP-2 средства, можно вводить в нескольких дозах до достижения удовлетворительного терапев- 40 045598 тического исхода для индивида.

В одном варианте осуществления, фармацевтическую композицию, содержащую ингибирующее MASP-2 средство, вводят индивиду, страдающему от офтальмологического ангиогенного заболевания или состояния, в количестве, эффективном для ингибирования ангиогенеза. В одном варианте осуществления, офтальмологическое ангиогенное заболевание или состояние глаз выбрано из группы, состоящей из AMD, увеита, меланомы глаза, неоваскуляризации роговицы, первичного птеригия, стромального кератита HSV, индуцированного HSV-1 лимфангиогенеза роговицы, пролиферативной диабетической ретинопатии, ретинопатии недоношенных, окклюзии вен сетчатки, отторжения трансплантата роговицы, неоваскулярной глаукомы и покраснения радужки.

В другом варианте осуществления, фармацевтическую композицию, содержащую ингибирующее MASP-2 средство, вводят индивиду, страдающему от зависимой от ангиогенеза злокачественной опухоли, в количестве, эффективном для ингибирования ангиогенеза. В одном варианте осуществления, зависимая от ангиогенеза злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из солидной опухоли(опухолей), передающихся через кровь опухолей, карциноидных опухолей высокого риска и метастазов опухолей. В одном варианте осуществления, композицию вводят в количестве, эффективном для ингибирования ангиогенеза опухоли. В одном варианте осуществления, пациент страдает от или подвержен риску метастазирования опухолей, и композицию вводят в количестве, эффективном для ингибирования метастазирования опухолей. В одном варианте осуществления, пациент страдает от зависимой от ангиогенеза злокачественной опухоли, выбранной из группы, состоящей из колоректальной злокачественной опухоли, злокачественной опухоли молочной железы, легкого, почек, печени, пищевода, яичников, поджелудочной железы, предстательной железы, желудка, глиомы, стромальной опухоли желудочнокишечного тракта, лимфомы, меланомы и карциноидной опухоли. В одном варианте осуществления, пациент страдает от доброкачественной опухоли, и композицию вводят в количестве, эффективном для ингибирования ангиогенеза доброкачественной опухоли.

VI. Примеры.

Следующие примеры являются только иллюстрациями наилучшего способа практического осуществления изобретения, однако, их не следует рассматривать как ограничивающие изобретение. Содержание всех цитируемых литературных источников явным образом включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Пример 1.

В этом примере описано получение линии мышей с недостаточностью MASP-2 (MASP-2-/-), но полноценных по MAp19 (MAp19+/+).

Материалы и способы: Нацеливающий вектор pKO NTKV 1901 разработан для разрушения трех экзонов, кодирующих C-конец мышиного MASP-2, включая экзон, который кодирует домен сериновой протеазы, как показано на фиг. 3. PKO NTKV 1901 использовали для трансфекции линии клеток мышей ES E14.1a (SV129 Ola). Отобраны клоны, устойчивые к неомицину и чувствительные к тимидинкиназе. 600 ES клонов подвергнуты скринингу и из них идентифицировано четыре различных клона и посредством Саузерн-блоттинга верифицировано, что они содержат ожидаемые селективные нацеливающие и рекомбинантные события, как показано на фиг. 3. Из этих четырех положительных клонов получены химеры посредством переноса эмбрионов. Затем химеры подвергали обратному скрещиванию на генетическом фоне C57/BL6 для получения трансгенных самцов. Трансгенных самцов скрещивали с самками для получения потомков F1 с 50% потомства, проявляющего гетерозиготность по нарушенному гену MASP-2. Гетерозиготных мышей подвергали перекрестному скрещиванию для получения гомозиготного потомства с недостаточностью MASP-2, в результате чего получены гетерозиготные мыши и мыши дикого типа в соотношении 1:2:1, соответственно.

Результаты и фенотип: Обнаружено, что полученные в результате гомозиготные мыши MASP-2-/(т.е., с недостаточностью по гену-мишени) являются жизнеспособными и фертильными, и они были проверены на недостаточность MASP-2 посредством Саузерн-блоттинга для подтверждения правильного события нацеливания, посредством нозерн-блоттинга для подтверждения отсутствия мРНК MASP-2, и посредством вестерн-блоттинга для подтверждения отсутствия белка MASP-2 (данные не представлены). Присутствие мРНК MAp19 и отсутствие мРНК MASP-2 дополнительно подтверждены с использованием RT-ПЦР с разрешением во времени на устройстве LightCycler. Как и ожидалось, мыши MASP-2-/- действительно продолжали экспрессировать мРНК и белок MAp19, MASP-1 и MASP-3 (данные не представлены). Присутствие и относительное содержание мРНК пропердина, фактора B, фактора D, C4, C2 и C3 у мышей MASP-2-/- оценивали посредством анализа в LightCycler и обнаружили, что они идентичны этим данным для контрольных однопометных животных дикого типа (данные не представлены). Плазма от гомозиготных мышей MASP-2-/- обладает абсолютной недостаточностью опосредованной лектиновым путем активации комплемента, как описано далее в примере 2.

Получение линии MASP-2-/- на чистом фоне C57BL6: мышей MASP-2-/- подвергали обратному скрещиванию с чистой линией C57BL6 в течение девяти поколений перед использованием линии MASP2-/- в качестве экспериментальной модели на животных.

Трансгенную линию мышей, которая имеет мышиный MASP-2-/-, мышиный MAp19+/+, и которая

- 41 045598 экспрессирует человеческий трансген MASP-2 (с нокаутом мышиного MASP-2 и нокином человеческого

MASP-2) также получали следующим образом:

Материалы и способы. Сконструирован миниген, кодирующий человеческий MASP-2, названный мини-hMASP-2 (SEQ ID NO: 49), как показано на фиг. 4, включающий промоторную область человеческого гена MASP-2, включая первые 3 экзона (экзон 1 -экзон 3), за которой следует последовательность кДНК, представляющая кодирующую последовательность следующих 8 экзонов, таким образом, кодирующий полноразмерный белок MASP-2 под контролем его эндогенного промотора. Конструкцию миниhMASP-2 инъецировали в оплодотворенные яйцеклетки MASP-2-/- с целью замещения инактивированного мышиного гена MASP-2 на трансгенно экспрессируемый человеческий MASP-2.

Пример 2.

В этом примере показано, что MASP-2 является необходимым для активации комплемента посредством лектинового пути.

Способы и материалы.

Анализ специфического для лектинового пути расщепления C4: в Petersen, et al., J. Immunol. Methods 257:107 (2001) описан анализ расщепления C4, в котором измеряют активацию лектинового пути, происходящую в результате воздействия липотейхоевой кислоты (LTA) из S. Aureus, которая связывает L-фиколин. Анализ, описанный в Petersen et al., (2001), адаптирован для измерения уровня активации лектинового пути посредством MBL при помощи покрытия планшета LPS и маннаном или зимозаном перед добавлением сыворотки от мышей MASP-2-/-, как описано ниже. Анализ модифицировали также для исключения возможности расщепления C4 посредством классического пути. Этого достигали посредством использования буфера для разведения образцов, содержащего 1 М NaCl, который позволяет высокоаффинное связывание узнающих компонентов лектинового пути активации с их лигандами, но предотвращает активацию эндогенного C4, таким образом, исключая участие классического пути посредством диссоциации комплекса C1. В кратком описании, в модифицированном анализе образцы сыворотки (разведенные в буфере с большим содержанием соли (1 М NaCl)) добавляют в покрытые лигандом планшеты, с последующим добавлением постоянного количества очищенного C4 в буфере с физиологической концентрацией соли. Связанные узнающие комплексы, содержащие MASP-2, расщепляют C4, что приводит к накоплению C4b.

Способы анализа.

7) Микропланшеты для титрования Nunc Maxisorb (Maxisorb, Nunc, кат. No. 442404, Fisher Scientific) покрывали с использованием 1 мкг/мл маннана (M7504, Sigma) или любого другого лиганда (например, такого как перечисленные ниже), разведенного в покрывающем буфере (15 мМ Na₂CO₃, 35 мМ NaHCO₃, pH 9,6).

Следующие реагенты реагенты использованы в анализе:

a) маннан (1 мкг/лунку маннана (M7504, Sigma) в 100 мкл покрывающего буфера):

b) зимозан (1 мкг/лунку зимозан (Sigma) в 100 мкл покрывающего буфера);

c) LTA (1 мкг/лунку в 100 мкл покрывающего буфера или 2 мкг/лунку в 20 мкл метанола)

d) 1 мкг специфичного для H-фиколина Mab 4H5 в покрывающем буфере

e) PSA из Aerococcus viridans (2 мкг/лунку в 100 мкл покрывающего буфера)

f) 100 мкл/лунку фиксированного формалином S. Aureus DSM20233 (OD₅₅₀=0,5) в покрывающем буфере.

2) Планшеты инкубировали в течение ночи при 4°C.

3) После инкубации в течение ночи, остаточные участки связывания белков подвергали насыщению посредством инкубации планшетов с блокирующим буфером 0,1% HSA-TBS (0,1% (мас./об.) HSA в 10 мМ Трис-CL, 140 мМ NaCl, 1,5 мМ NaN₃, pH 7,4) в течение 1-3 часов, затем планшеты промывали 3Х с использованием TBS/tween/Ca²⁺ (TBS с 0,05% Tween 20 и 5 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, pH 7,4).

4) Образцы сыворотки для тестирования разводили в связывающем буфере MBL (1 М NaCl), и разведенные образцы добавляли в планшеты и инкубировали в течение ночи при 4°C. Лунки с добавлением только буфера использовали в качестве отрицательного контроля.

5) После инкубации в течение ночи при 4°C, планшеты промывали 3X с использованием TBS/tween/Ca²⁺. Затем C4 человека (100 мкл/лунку 1 мкг/мл, разведенного в BBS (4 мМ барбитал, 145 мМ NaCl, 2 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, pH 7,4)), добавляли в планшеты и инкубировали в течение 90 минут at 37°C. Планшеты снова промывали 3X с использованием TBS/tween/Ca²⁺.

6) Накопление C4b детектировали с использованием конъюгированных с щелочной фосфатазой антител курицы против C4c человека (разведенных 1:1000 в TBS/tween/Ca²⁺), которые добавляли в планшеты и инкубировали в течение 90 мин при комнатной температуре. Затем планшеты снова промывали 3X с использованием TBS/tween/Ca²⁺.

7) Щелочную фосфатазу детектировали посредством добавления 100 мкл раствора субстрата пнитрофенилфосфата, инкубации при комнатной температуре в течение 20 минут, и считывания OD₄₀₅ в считывателе для микропланшетов для титрования.

Результаты. На фиг. 5A В показан уровень накопления C4b на маннане (фиг. 5A) и зимозане (фиг. 5B) в разведениях сывороток от MASP-2+/+ (кресты), MASP-2+/- (сплошные круги) и MASP-2-/- 42 045598 (сплошные треугольники). На фиг. 5C показана относительная активность конвертазы C4 в планшетах, покрытых зимозаном (белые столбцы) или маннаном (заштрихованные столбцы) для мышей MASP-2 -/+ (n=5) и мышей MASP-2-/- (n=4) по сравнению с мышами дикого типа (n=5), на основании измерения уровня накопления C4b, нормализованного по сыворотке дикого типа. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение. Как показано на фиг. 5A С, плазма от мышей MASP-2-/- абсолютно лишена опосредованной лектиновым путем активации комплемента в покрытых маннаном и в покрытых зимозаном планшетах. Эти результаты явно показывают, что MASP-2 является эффекторным компонентом лектинового пути.

Рекомбинантный MASP-2 восстанавливает зависимую от лектинового пути активацию C4 в сыворотке от мышей MASP-2-/-.

Чтобы определить, что отсутствие MASP-2 являлось непосредственной причиной потери зависимой от лектинового пути активации C4 у мышей MASP-2-/-, эффект добавления рекомбинантного белка MASP-2 в образцы сыворотки исследовали в анализе расщепления C4, описанном выше. Функционально активный мышиный MASP-2 и каталитически неактивный мышиный MASP-2A (в котором активный участок остатка серина в домене сериновой протеазы заменен остатком аланина) рекомбинантные белки получены и очищены, как описано ниже в примере 3. Пулированную сыворотку от 4 мышей MASP-2-/предварительно инкубировали с увеличивающимися концентрациями рекомбинантного мышиного MASP-2 или неактивного рекомбинантного мышиного MASP-2A, и активность конвертазы C4 оценивали, как описано выше.

Результаты: Как показано на фиг. 6, добавление функционально активного мышиного рекомбинантного белка MASP-2 (показано незакрашенными треугольниками) в сыворотку, полученную от мышей MASP-2-/-, восстанавливало зависимую от лектинового пути активацию C4 зависимым от концентрации белка образом, в то время как каталитически неактивный мышиный белок MASP-2A (показано звездочками) не восстанавливал активацию C4. Результаты, показанные на фиг. 6, нормализованы по активации C4, наблюдаемой в пулированной сыворотке от мышей дикого типа (показано пунктирной линией).

Пример 3.

В этом примере описана рекомбинантная экспрессия и продукция белка для рекомбинантного полноразмерного человеческого, крысиного и мышиного MASP-2, происходящих из MASP-2 полипептидов и каталитически неактивных мутантных форм MASP-2.

Экспрессия полноразмерного человеческого, мышиного и крысиного MASP-2.

Полноразмерную последовательность кДНК человеческого MASP-2 (SEQ ID NO: 4) также субклонировали в экспрессирующий вектор для млекопитающих pCI Neo (Promega), который управляет эукариотической экспрессией под контролем энхансерной/промоторной области CMV (описанный в Kaufman R.J. et al., Nucleic Acids Research 19:4485 90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537 66 (1991)). Каждую из полноразмерных мышиной кДНК (SEQ ID NO: 50) и крысиной кДНК (SEQ ID NO: 53) MASP-2 субклонировали в экспрессирующий вектор pED. Затем экспрессирующими MASP-2 векторами трансфицировали адгерентную линию клеток яичника китайского хомяка DXB1 с использованием стандартного способа трансфекции с фосфатом кальция, описанного в Maniatis et al., 1989. Клетки, трансфицированные этими конструкциями, росли очень медленно, что объясняется цитотоксичностью кодируемой протеазы.

По другому способу, конструкцией минигена (SEQ ID NO: 49), содержащей кДНК MASP-2 человека, управляемую ее эндогенным промотором, временно трансфицировали клетки яичника китайского хомяка (CHO). Человеческий белок MASP-2 секретируется в культуральную среду, и его выделяют, как описано ниже.

Экспрессия полноразмерного каталитически неактивного MASP-2.

Обоснование: MASP-2 активируется посредством аутокаталитического расщепления после того, как узнающие субкомпоненты MBL или фиколины (L-фиколин, H-фиколин или M-фиколин) связываются с соответствующими им углеводными паттернами. Аутокаталитическое расщепление, приводящее к активации MASP-2, часто происходит во время процедуры выделения MASP-2 из сыворотки, или во время очистки после рекомбинантной экспрессии. Для получения более стабильного препарата белка для использования в качестве антигена, получена каталитически неактивная форма MASP-2, обозначенная как MASP-2A, посредством замены остатка серина, который присутствует в каталитической триаде домена протеазы, на остаток аланина у крысы (SEQ ID NO: 55, Ser617 на Ala617); у мыши (SEQ ID NO: 52, Ser617 на Ala617); или у человека (SEQ ID NO: 3, Ser618 на Ala618).

Для получения каталитически неактивных человеческих и мышиных белков MASP-2A, проводили сайт-направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, показанных в табл. 6.

Олигонуклеотиды в табл. 6 разработаны для гибридизации с областью в человеческой и мышиной кДНК, кодирующей ферментативно активный серин, и олигонуклеотид содержит несовпадение для замены кодона серина на кодон аланина. Например, олигонуклеотиды для ПЦР SEQ ID NO: 56-59 использовали в комбинации с кДНК MASP-2 человека (SEQ ID NO: 4) для амплификации области от инициирующего кодона до ферментативно активного серина и от серина до стоп-кодона для получения полного

- 43 045598 открытой рамки считывания мутантного MASP-2A, содержащего мутацию Ser618 до Ala618. Продукты

ПЦР очищали после электрофореза в агарозном геле и получения полосы, и перекрывание одиночного аденозина получали с использованием стандартного способа получения хвостов. Затем снабженный аденозиновым хвостом MASP-2A клонировали в вектор pGEM T easy, трансформировали в E. coli.

Каталитически неактивный крысиный белок MASP-2A получали посредством обработки киназой и гибридизации SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 65 посредством объединения этих двух олигонуклеотидов в эквивалентных молярных количествах, нагрева при 100°C в течение 2 минут и медленного охлаждения до комнатной температуры. Полученный в результате гибридизации фрагмент имел совместимые концы для Pst1 и Xba1, и был вставлен вместо фрагмента Pst1-Xba1 кДНК MASP-2 крысы дикого типа (SEQ ID NO: 53) для получения крысиного MASP-2A.

’GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3’ (SEQ ID NO:64)

5’ CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA 3’ (SEQ ID NO:65)

Каждый из человеческого, мышиного и крысиного MASP-2A далее субклонировали в экспрессирующие векторы для млекопитающих pED или pCI Neo, и трансфицировали в линию клеток яичника китайского хомяка DXB1, как описано ниже.

В другом способе, каталитически неактивную форму MASP-2 конструировали с использованием способа, описанного в Chen et al., J. Biol. Chem., 276(28):25894 25902, 2001. Кратко, плазмиду, содержащую полноразмерную кДНК MASP-2 человека (описанную в Thiel et al., Nature 386:506, 1997), расщепляли с использованием Xho1 и EcoR1, и кДНК MASP-2 (описанную в настоящем описании как SEQ ID NO: 4) клонировали в соответствующие участки рестрикции бакуловирусного вектора для переноса pFastBac1 (Life Technologies, NY). Затем активный участок сериновой протеазы MASP-2 в Ser618 изменяли на Ala618 посредством замены области нативных аминокислот 610-625 с использованием двухцепочечных олигонуклеотидов, кодирующих область аминокислот пептида 610-625 (SEQ ID NO: 13), для получения полноразмерного полипептида MASP-2 с неактивным протеазным доменом. Конструирование экпрессирующих плазмид, содержащих полипептидные области, происходящие из человеческого Masp2.

Следующие конструкции получают с использованием сигнального пептида MASP-2 (остатки 1-15 из SEQ ID NO: 5) для секреции различных доменов MASP-2. Конструкцию, экспрессирующую домен CUBI человеческого MASP-2 (SEQ ID NO: 8) получают посредством амплификации ПЦР области, кодирующей остатки 1-121 MASP-2 (SEQ ID NO: 6) (соответствующей N-концевому домену CUB1). Конструкцию, экспрессирующую домен CUBIEGF человеческого MASP-2 (SEQ ID NO: 9), получают посредством амплификации ПЦР области, кодирующей остатки 1-166 MASP-2 (SEQ ID NO: 6) (соответствующей N-концевому домену CUB1EGF). Конструкцию, экспрессирующую домен CUBIEGFCUBII человеческого MASP-2 (SEQ ID NO: 10), получают посредством амплификации ПЦР области, кодирующей остатки 1-293 MASP-2 (SEQ ID NO: 6) (соответствующей N-концевому домену CUBIEGFCUBII). Вышеупомянутые домены амплифицируют посредством ПЦР с использованием полимеразы VentR и pBSMASP-2 в качестве матрицы, в соответствии с разработанными способами ПЦР.

Последовательность 5'-праймера для смыслового праймера (5 ’ - CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3 , seq id NO: 34) вводит участок рестрикции BamHI (подчеркнут) на 5'-конце продукта ПЦР. Антисмысловые праймеры для каждого из доменов MASP-2, показанные ниже в табл. 6, разработаны для введения стоп-кодона (полужирный шрифт), за которым следует участок EcoRI (подчеркнут) на конце каждого продукта ПЦР. После амплификации фрагменты ДНК расщепляют с использованием BamHI и EcoRI, и клонируют в соответствующие участки вектора pFastBac1. Полученные в результате конструкции характеризуют посредством рестрикционного картирования и подтверждают посредством секвенирования дцДНК.

- 44 045598

Таблица 6 Праймеры для ПЦР MASP-2

домен MASP-2 SEQ ID NO:8, CUBI (ак 1121 из SEQ ID NO:6) SEQ ID NO:9, CUBIEGF (ак 1-166 из SEQ ID NO:6)	5'-праймер для ПЦР 5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (SEQ ID NO:34) 5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (SEQ ID NO:34)	3'-праймер для ПЦР 5'GGAATTCCTAGGCTGCATA (SEQ ID NO:35) 5'GGAATTCCTACAGGGCGCT-3' (SEQ ID NO:36)
SEQ ID NO:10, CUBIEGFCUBII (ак 1-293 из SEQ ID NO:6)	5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (SEQ ID NO:34)	5'GGAATTCCTAGTAGTGGAT-3' (SEQ ID NO:37)
SEQ ID NO:4, MASP-2 человека	5'ATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTC- 3' (SEQ ID NO: 56) hMASP- 2 прямой	5'TTAAAATCACTAATTATGTTCTCGATC 3' (SEQ ID NO: 59) НМАЗР-2_обратный
SEQ ID NO:4, кДНК MASP-2 человека	5'CAGAGGTGACGCAGGAGGGGCAC 3' (SEQ ID NO: 58) hMASP2 ala прямой	5'GTGCCCCTCCTGCGTCACCTCTG 3' (SEQ ID NO: 57) ЦМАЗР-2_а1а_обратный
SEQ ID NO:50 кДНК MASP-2 мыши	5'ATGAGGCTACTCATCTTCCTGG3' (SEQ ID NO: 60) тМАЗР-2_прямой	5'TTAGAAATTACTTATTATGTTCTCAATCC3' (SEQ ID NO: 63) тМАЗР-2_обратный
SEQ ID NO:50 кДНК MASP-2 мыши	5'CCCCCCCTGCGTCACCTCTGCAG3' (SEQ ID NO: 62) mMASP- 2 ala прямой	5'CTGCAGAGGTGACGCAGGGGGGG-3' (SEQ ID NO: 61) тМАЗР-2_а1а_обратный

Рекомбинантная эукариотическая экспрессия MASP-2 и получение ферментативно неактивных белков мышиного, крысиного и человеческого MASP-2A.

Экспрессирующим MASP-2 и MASP-2A конструкциями, описанными выше, трансфицировали клетки DXB1 с использованием стандартного способа кальций-фосфатной трансфекции (Maniatis et al., 1989). MASP-2A получали в бессывороточной среде, чтобы исключить контаминацию препаратов другими сывороточными белками. Среду собирали с конфлюэнтных клеток каждые вторые сутки (всего четыре раза). Средний уровень рекомбинантного MASP-2A составлял приблизительно 1,5 мг/литр культуральной среды для каждого из трех видов.

Очистка белка MASP-2A: MASP-2A (мутант Ser-Ala, описанный выше) очищали посредством аффинной хроматографии на колонках с агарозой MBP-A. Этот способ позволяет быструю очистку без использования внешних меток. MASP-2A (100-200 мл среды, разведенной в равном объеме буфера для нанесения (50 мМ Трис-Cl, pH 7,5, содержащего 150 мМ NaCl и 25 мМ CaCl₂), наносили на аффинную коллонку с MBP-агарозой (4 мл), предварительно уравновешенную с использованием 10 мл буфера для нанесения. После промывки с использованием следующих 10 мл буфера для нанесения, белок элюировали в 1 мл фракциях с использованием 50 мМ Трис Cl, pH 7,5, содержащего 1,25 М NaCl и 10 мМ ЭДТА. Фракции, содержащие MASP-2A, идентифицировали посредством электрофореза в полиакриламидном геле с SDS. При необходимости, MASP-2A дополнительно очищали посредством ионообменной хроматографии на колонке MonoQ (HR 5/5). Белок диализировали с использованием 50 мМ Трис-Cl pH 7,5, содержащего 50 мМ NaCl, и наносили на колонку, уравновешенную тем же буфером. После промывки, связанный MASP-2A элюировали с использованием градиента 0,05-1 М NaCl в 10 мл.

Результаты: Получали выходы 0,25-0,5 мг белка MASP-2A из 200 мл среды. Молекулярная масса 77,5 кДа, определенные посредством MALDI-MS, превышает расчетное значение для немодифицированного полипептида (73,5 кДа) из-за гликозилирования. Присоединение гликанов к каждому из участков Nгликозилирования объясняет наблюдаемую массу. MASP-2A мигрирует в форме одиночной полосы в SDS-полиакриламидных гелях, что показывает, что он не подвергается протеолитическому процессингу в ходе биосинтеза. Средневзвешенная молекулярная масса, определенная посредством равновесного ультрацентрифугирования, согласуется с расчетным значением для гомодимеров гликозилированного полипептида.

Получение рекомбинантных полипептидов MASP-2 человека.

Другой способ получения рекомбинантных полипептидов, происходящих из MASP-2 и MASP2A,

- 45 045598 описан в Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166:5068 5077, 2001. Кратко, клетки насекомого Spodoptera frugiperda (клетки Ready Plaque Sf9, полученные от Novagen, Madison, WI) выращивают и поддерживают в бессывороточной среде Sf900II (Life Technologies), дополненной 50 МЕ/мл пенициллина и 50 мг/мл стрептомицина (Life Technologies). Клетки насекомого Trichoplusia ni (High Five) (полученные от Jadwiga Chroboczek, Institut de Biologie Structurale, Grenoble, France) поддерживали в среде TC100 (Life Technologies), содержащей 10% FCS (Dominique Dutscher, Brumath, France), дополненной 50 МЕ/мл пенициллина и 50 мг/мл стрептомицина. Рекомбинантные бакуловирусы получали с использованием системы Bac-toBac (Life Technologies). Бакмидную ДНК очищали с использованием системы очистки Qiagen midiprep (Qiagen) и использовали для трансфекции клеток насекомых Sf9 с использованием целфектина в среде Sf900 II SFM (Life Technologies), как описано в протоколе производителя. Рекомбинантные вирусные частицы собирают через 4 суток, титруют посредством анализа вирусных бляшек и амплифицируют, как описано в King and Possee, in The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., London, pp. 111 114, 1992.

Клетки Five (1,75x107 клеток/175 см² культуральный флакон) инфицируют рекомбинантными вирусами, содержащими полипептиды MASP-2 при множественности инфекции 2 в среде Sf900 II SFM при 28°C в течение 96 чс. Супернатанты собирают посредством центрифугирования и добавляют диизопропилфосфорофлуоридат до конечной концентрации 1 мМ.

Полипептиды MASP-2 секретируются в культуральную среду. Культуральные супернатанты подвергают диализу против 50 мМ NaCl, 1 мМ CaCl₂, 50 мМ гидрохлорида триэтаноламина, pH 8,1, и наносят при 1,5 мл/мин на колонку Q-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) (2,8x12 см), уравновешенную тем же буфером. Элюцию проводили посредством применения 1,2 литров линейного градиента до 350 мМ NaCl в этом же буфере. Фракции, содержащие рекомбинантные полипептиды MASP-2, идентифицируют посредством анализа вестерн-блоттинга, преципитировали посредством добавления (NH₄)₂SO₄ до 60% (мас./об.) и оставляли на ночь при 4°C. Осадки ресуспендируют в 145 мМ NaCl, 1 мМ CaCl₂, 50 мМ гидрохлориде триэтаноламина, pH 7,4, и наносят на колонку TSK G3000 SWG (7,5x600 мм) (Tosohaas, Montgomeryville, PA), уравновешенную тем же буфером. Затем очищенные полипептиды концентрируют до 0,3 мг/мл посредством ультрафильтрации в микроконцентраторах Microsep (порог отсечения m.w.=10000) (Filtron, Karlstein, Germany).

Пример 4.

В этом примере описан способ получения поликлональных антител против полипептидов MASP-2. Материалы и способы.

Антигены MASP-2. Поликлональную антисыворотку против MASP-2 человека получают посредством иммунизации кроликов следующими выделенными полипептидами MASP-2: человеческим MASP-2 (SEQ ID NO: 6), выделенным из сыворотки; рекомбинантным человеческим MASP-2 (SEQ ID NO: 6), MASP-2A, содержащим неактивный домен протеазы (SEQ ID NO: 13), как описано в примере 3; и рекомбинантными CUBI (SEQ ID NO: 8), CUBEGFI (SEQ ID NO: 9) и CUBEGFCUBII (SEQ ID NO: 10), экспрессированными, как описано выше в примере 3.

Поликлональные антитела: Кроликов в возрасте шести недель, примированных с использованием BCG (вакцины из бациллы Кальметта-Герена) иммунизировали посредством инъекции 100 мкг полипептида MASP-2 при 100 мкг/мл в стерильном солевом растворе. Инъекции проводили каждые 4 недели, с мониторированием титра антител посредством анализа ELISA, как описано в примере 5. Культуральные супернатанты собирают для очистки антител посредством аффинной хроматографии с белком A.

Пример 5.

В этом примере описан способ получения мышиных моноклональных антител против полипептидов MASP-2 крысы или человека.

Материалы и способы.

Самцам мышей A/J (Harlan, Houston, Tex.), в возрасте 8-12 недель, инъецируют подкожно 100 мкг человеческих или крысиных полипептидов rMASP-2 или rMASP-2A (полученных, как описано в примере 3) в полном адъюванте Фрейнда (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) в 200 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) pH 7,4. С двухнедельными интервалами мышам дважды инъецируют подкожно 50 мкг человеческого или крысиного полипептида rMASP-2 или rMASP-2A в неполном адъюванте Фрейнда. На четвертой неделе мышам инъецируют 50 мкг человеческого или крысиного полипептида rMASP-2 или rMASP2A в PBS, и слияние проводят через 4 суток.

Для каждого слияния, получают суспензии отдельных клеток селезенки иммунизированной мыши и используют для слияния с клетками миеломы Sp2/0. 5x108 клеток Sp2/0 и 5x108 клеток селезенки подвергают слиянию в среде, содержащей 50% полиэтиленгликоль (M.W. 1450) (Kodak, Rochester, N.Y.) и 5% диметилсульфоксид (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Затем концентрацию клеток селезенки доводят до 1,5x105 клеток селезенки на 200 мкл суспензии в среде Iscove (Gibco, Grand Island, N.Y.), дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,1 мМ гипоксантина, 0,4 мкМ аминоптерина и 16 мкМ тимидина. Двести микролитров суспензии клеток добавляют в каждую лунку из приблизительно двадцати 96-луночных микропланшетов. Через приблизи- 46 045598 тельно десять суток культуральные супернатанты отбирают для скрининга по реакционной способности по отношению к очищенному фактору MASP-2 в анализе ELISA.

Анализ ELISA. Лунки микропланшетов Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) покрывают посредством добавления 50 мкл очищенного hMASP-2 при 50 нг/мл или rMASP-2 (или rMASP-2A) крысы в течение ночи при комнатной температуре. Низкая концентрация MASP-2 для покрытия позволяет отбор высокоаффинных антител. После удаления покрывающего раствора посредством постукивания планшетов, 200 мкл BLOTTO (обезжиренного сухого молока) в PBS добавляют в каждую лунку на один час для блокирования неспецифических участков. Через один час, лунки затем промывают буфером PBST (PBS, содержащим 0,05% Tween 20). Пятьдесят микролитров культуральных супернатантов из каждой лунки после слияния собирают и смешивают с 50 мкл BLOTTO, и затем добавляют в индивидуальные лунки микропланшетов. После одного часа инкубации, лунки промывают PBST. Связанные мышиные антитела затем детектируют посредством реакции с антителом козы против IgG мыши (специфическим для Fc), конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.) и разведенным до 1:2000 в BLOTTO. Раствор субстрата пероксидазы, содержащий 0,1% 3,3,5,5-тетраметилбензидин (Sigma, St. Louis, Mo.) и 0,0003% пероксид водорода (Sigma), добавляют в лунки для проявления окрашивания в течение 30 минут. Реакцию останавливают посредством добавления 50 мкл 2М H₂SO₄ на лунку. Оптическую плотность реакционной смеси при 450 нм считывали с использованием считывателя BioTek ELISA Reader (BioTek Instruments, Winooski, Vt.).

Анализ связывания MASP-2.

Культуральные супернатанты с положительным тестом в анализе ELISA MASP-2, описанном выше, можно тестировать в анализе связывания для определения аффинности связывания, которую ингибирующие MASP-2 средства имеют для MASP-2. Сходный анализ можно использовать для определения того, связываются ли ингибирующие средства с другими антигенами в системе комплемента.

Лунки полистирольного 96-луночного микропланшета для титрования (96-well medium binding plates, Corning Costar, Cambridge, MA) покрывают с использованием MASP-2 (20 нг/100 мкл/лунку, Advanced Research Technology, San Diego, CA) в фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,4, в течение ночи при 4°C. После удаления раствора MASP-2, лунки блокируют с использованием PBS, содержащего 1% бычий сывороточный альбумин (BSA; Sigma Chemical) в течение 2 ч при комнатной температуре. Лунки без покрытия MASP-2 служат в качестве фонового контроля. Аликвоты супернатантов гибридомы или очищенных MoAb против MASP-2, в различных концентрациях в блокирующем растворе, добавляют в лунки. После инкубации в течение 2 ч при комнатной температуре, лунки интенсивно промывают PBS. Связанное с MASP-2 MoAb против MASP-2 детектируют посредством добавления антитела козы проотив IgG мыши, конъюгированного с пероксидазой (Sigma Chemical) блокирующем растворе, который инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшет снова тщательно промывают PBS, и добавляют 100 мкл субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Реакцию TMB останавливают посредством добавления 100 мкл 1М фосфорной кислоты, и планшет считывают при 450 нм в считывателе для микропланшетов (SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Культуральные супернатанты из положительных лунок затем тестируют по способности ингибировать активацию комплемента в функциональном анализе, таком как анализ расщепления C4, как описано в примере 2. Затем клетки из положительных лунок клонируют способом предельного разведения. MoAb снова тестируют по реакционной способности по отношению к hMASP-2 в анализе ELISA, как описано выше. Отобранные гибридомы выращивают во флаконах с перемешиванием, и истощенный культуральный супернатант собирают для очистки антитела посредством аффинной хроматографии с белком A.

Пример 6.

В этом примере описаны получение и продукция гуманизированных мышиных антител и фрагментов антител против MASP-2.

Мышиное моноклональное антитело против MASP-2 получают от самца мыши A/J, как описано в примере 5. Затем мышиное антитело гуманизируют, как описано ниже, для уменьшения его иммуногенности посредством замены мышиных константных областей их человеческими аналогами для получения химерного антитела IgG и фрагмента Fab антитела, которые можно использовать для ингибирования неблагоприятных эффектов зависимой от MASP-2 активации комплемента у пациента, который является человеком, по настоящему изобретению.

1. Клонирование генов вариабельных областей антител против MASP-2 из клеток мышиной гибридомы. Тотальную РНК выделяют из клеток гибридомы, секретирующих MoAb против MASP-2 (полученное, как описано в примере 7) с использованием RNAzol, следуя протоколу производителя (Biotech, Houston, Tex.). Первую цепь кДНК синтезируют на основе тотальной РНК с использованием олиго -dT в качестве праймера. ПЦР проводят с использованием 3' праймеров, выведенных из константной Cобласти иммуноглобулина, и наборов вырожденных праймеров, выведенных из лидерного пептида или первой каркасной области мышиных генов V_H или VK, в качестве 5'-праймеров. Заякоренную ПЦР осуществляют, как описано в Chen and Platsucas (Chen, P.F., Scand. J. Immunol. 35:539 549, 1992). Для клонирования гена VK, двухцепочечную кДНК получают с использованием праймера Not1-MAK1 (5'-

- 47 045598

TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3' SEQ ID NO: 38). Гибридизационные адаптеры AD1 (5'GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3' SEQ ID NO: 39) и AD2 (5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3' SEQ ID NO: 40) лигируют к обоим 5'- и 3'-концам двухцепочечной кДНК. Адаптеры на 3'-концах удаляют посредством расщепления Not1. Затем продукт расщепления используют в качестве матрицы в ПЦР с олигонуклеотидом AD1 в качестве 5'-праймера и MAK2 (5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3' SEQ ID NO: 41) в качестве 3'-праймера. Фрагменты ДНК приблизительно по 500 п.о., клонируют в pUC19. Несколько клонов выбирают для анализа последовательности с целью подтверждения того, что клонированная последовательность охватывает ожидаемую константную область мышиного иммуноглобулина. Олигонуклеотиды Not1-MAK1 и MAK2 получены из области V_K и расположены на 182 и 84 паре оснований, соответственно, ниже от первой пары оснований гена C каппа. Отбирают клоны, содержащие полноразмерную VK и лидерный пептид.

Для клонирования гена V_H, двухцепочечную кДНК получают с использованием праймера Not1 MAG1 (5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3' SEQ ID NO: 42). Гибридизационные адаптеры AD1 и AD2 лигируют к обоим 5'- и 3'-концам двухцепочной кДНК. Адаптеры на 3'-концах удаляют посредством расщепления Not1. Продукт расщепления используют в качестве матрицы в ПЦР с олигонуклеотидом AD1 и MAG2 (5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3' SEQ ID NO: 43) в качестве праймеров. Фрагменты ДНК длиной 500-600 п.о. клонируют в pUC19. Олигонуклеотиды Not1 MAG1 и MAG2 выведены из мышиной области Cy.7.1, и расположены на 180 и 93 п.о., соответственно, ниже первой п.о. мышиного гена Cy.7.1. Отбирают клоны, содержащие полноразмерную VH и лидерный пептид.

2. Конструирование экспрессирующих векторов для химерных IgG и Fab против MASP-2. Клонированные гены V_H и V_K, описанные выше, используют в качестве матриц в реакции ПЦР для добавления консенсусной последовательности Козака к 5'-концу и донора для сплайсинга к 3'-концу нуклеотидной последовательности. После анализа последовательностей для подтверждения отсутствия ошибок ПЦР, гены VH и V_K вставляют в кассеты экспрессирующих векторов, содержащих человеческие C.y1 и C. каппа, соответственно, с получением pSV2neoV_H huCy1 и pSV2neoV huCy. Очищенные в градиенте CsCl плазмидные ДНК векторов для тяжелой и легкой цепи используют для трансфекции клеток COS посредством электропорации. Через 48 часов, культуральный супернатант тестируют посредством ELISA для подтверждения наличия приблизительно 200 нг/мл химерного IgG. Клетки собирают и получают тотальную РНК. Первую цепь кДНК синтезируют на основе тотальной РНК с использованием олиго -dT в качестве праймера. Эту кДНК используют в качестве матрицы для ПЦР для получения фрагментов ДНК Fd и каппа. Для гена Fd, ПЦР проводят с использованием 5'AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3' (SEQ ID NO: 44) в качестве 5'-праймера и выведенного из СН1 3'-праймера (5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3' SEQ ID NO: 45). Подтверждают, что последовательность ДНК содержит полные V_H и домен СН1 человеческого IgG1. После расщепления соответствующими ферментами, фрагменты ДНК Fd вставляют в участки рестрикции HindIII и BamHI кассеты экспрессирующей векторной кассеты pSV2dhfr TUS для получения pSV2dhfrFd. Плазмида pSV2 является коммерчески доступной и состоит из фрагментов ДНК из различных источников: ДНК pBR322 (тонкая линия) содержит точку начала репликации ДНК pBR322 (pBR ori) и ген лактамазы для устойчивости к ампициллину (Amp); ДНК SV40, представленная более широкими штрихами и маркировкой, содержит точку начала репликации ДНК SV40 (SV40 ori), ранний промотор (5' от генов dhfr и neo), и сигнал полиаденилирования (3' от генов dhfr и neo). Происходящий из SV40 сигнал полиаденилирования (pA) также помещен на 3'-конец гена Fd.

Для гена каппа, ПЦР проводят с использованием 5'AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3' (SEQ ID NO: 46) в качестве 5'-праймера и выведенного из CK 3'-праймера (5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3' SEQ ID NO: 47). Подтверждено, что последовательность ДНК содержит полноразмерные человеческие области V_K и C_K. После расщепления соответствующими ферментами рестрикции, фрагменты ДНК каппа вставляют в участки рестрикции HindIII и BamHI экспрессирующей векторной кассеты pSV2neo TUS для получения pSV2neoK. Экспрессией генов Fd и каппа управляют посредством происходящих из HCMV энхансерных и промоторных элементов. Поскольку ген Fd не включает остаток цистеиновой аминокислоты, вовлеченный в межцепьевую дисульфидную связь, этот рекомбинантный химерный Fab содержит не связанные ковалентно тяжелые и легкие цепи. Этот химерный Fab обозначен как cFab.

Для получения рекомбинантного Fab с дисульфидной связью между тяжелой и легкой цепями, вышеуказанный ген Fd может быть расширен для включения последовательности, кодирующей 9 дополнительных аминокислот (EPKSCDKTH, SEQ ID NO: 48) из шарнирной области человеческого IgG1. Фрагмент ДНК BstEII-BamHI, кодирующий 30 аминокислот на 3'-конце гена Fd, можно заменять на фрагменты ДНК, кодирующие расширенный Fd, получая в результате pSV2dhfrFd/9aa.

3. Экспрессия и очистка химерного IgG против MASP-2.

Для получения линий клеток, секретирующих химерное IgG против MASP-2, клетки NSO трансфицируют с использованием плазмидных ДНК pSV2neoV_H huC.y1 и pSV2neoV huC каппа посредством электропорации. Трансфицированные клетки отбирают в присутствии 0,7 мг/мл G418. Клетки выращи

- 48 045598 вают в 250 мл колбе с перемешиванием с использованием содержащей сыворотку среды.

Культуральный супернатант из 100 мл культуры из колбы с перемешиванием наносят на 10 мл колонку PROSEP A (Bioprocessing, Inc., Princeton, N.J.). Колонку промывают 10 объемами слоя PBS. Связанное антитело элюируют с использованием 50 мМ цитратного буфера, pH 3,0. Равный объем 1 М Hepes, pH 8,0, добавляют к фракции, содержащей очищенное антитело, для доведения pH до 7,0. Остаточные соли удаляют посредством замены буфера на PBS посредством ультрафильтрации с мембраной Millipore (порог отсечения M.W.: 3000). Концентрацию белка очищенного антитела определяют способом BCA (Pierce).

4. Экспрессия и очистка химерного Fab против MASP-2.

Для получения линий клеток, секретирующих химерные Fab против MASP-2, клетки CHO трансфицируют очищеннымми плазмидными ДНК pSV2dhfrFd (или pSV2dhfrFd/9aa) и pSV2neokappa, посредством электропорации. Трансфицированные клетки отбирают в присутствии G418 и метотрексата. Отобранные линии клеток размножают при увеличивающихся концентрациях метотрексата. Клетки представляют собой отдельныек клетки, субклонированные посредством предельного разведения. Затем субклонированные линии клеток с высокой продукцией выращивают в 100 мл культуры в колбе с перемешиванием с использованием бессывороточной среды.

Химерный Fab против MASP-2 очищают посредством аффинной хроматографии с использованием мышиного анти-идиотипического MoAb к MoAb против MASP-2. Анти-идиотипическое антитело к MoAb против MASP-2 можно получать посредством иммунизации мышей мышиным MoAb против MASP-2, коньюгированным с гемоцианином морского блюдечка (KLH) и скрининга по специфическому связыванию MoAb, с которым может конкурировать человеческий MASP-2. Для очистки, 100 мл супернатанта из культур в колбе с перемешиванием клеток CHO, продуцирующих cFab или cFab/9aa, наносят на аффинную колонку с присоединенным антиидиотипическим антителом к MoAb против MASP-2. Затем колонку тщательно промывают с использованием PBS до элюции связанного Fab с использованием 50 мМ диэтиламина, pH 11,5. Остаточные соли удаляют посредством замены буфера, как описано выше. Концентрацию белка очищенного Fab определяют способом BCA (Pierce).

Способность химерных MASP-2 IgG, cFab, и cFAb/9aa ингибировать зависимые от MASP-2 пути комплемента можно определять с использованием анализов ингибирования, описанного в примере 2 или примере 7.

Пример 7.

В этом примере описан анализ расщепления C4 in vitro, используемый в качестве функционального скрининга для идентификации ингибирующих MASP-2 средств, способных блокировать зависимую от MASP-2 активацию комплемента посредством L-фиколина/P35, H-фиколина, M-фиколина или маннана.

Анализ расщепления C4. B Petersen, S.V., et al., J. Immunol. Methods 257:107, 2001, описан анализ расщепления C4, в котором измеряют активацию лектинового пути, вызванную липотейхоевой кислотой (LTA) из S. aureus, которая связывает L-фиколин.

Реагенты: Фиксированный формалином S. aureous (DSM20233) получают следующим образом: бактерии выращивают в течение ночи при 37°C в триптон-соевой кровяной среде, промывают три раза с использованием PBS, затем фиксируют в течение 1 ч при комнатной температуре в PBS/0,5% формалине, и промывают еще три раза с использованием PBS, перед ресуспендированием в покрывающем буфере (15 мМ Na₂Co₃, 35 мМ NaHCO₃, pH 9,6).

Анализ. Лунки микропланшета для титрования Nunc MaxiSorb (Nalgene Nunc International, Rochester, NY) покрывают с использованием: 100 мкл фиксированного формалином S. aureus DSM20233 (OD₅₅₀=0/5) в покрывающем буфере с 1 мкг L-фиколина в покрывающем буфере. После инкубации в течение ночи, лунки блокируют с использованием 0,1% человеческого сывороточного альбумина (HSA) в TBS (10 мМ Трис HCl, 140 мМ NaCl, pH 7,4), затем промыват с использованием TBS, содержащего 0,05% Tween 20 и 5 мМ CaCl₂ (wash буфер). Образцы человеческой сыворотки разводят в 20 мМ Трис HCl, 1 М NaCl, 10 мМ CaCl₂, 0,05% Triton X 100, 0,1% HSA, pH 7,4, которые предотвращают активацию эндогенного C4 и вызывают диссоциацию комплекса C1 (состоящего из C1q, Clr и Cls). Ингибирующие MASP-2 средства, включая MoAb против MASP-2 и ингибирующие пептиды, добавляют к образцам сыворотки в различных концентрациях. Разведенные образцы добавляют в планшет и инкубируют в течение ночи при 4°C. Через 24 ч планшеты тщательно промывают буфером для промывки, затем 0,1 мкг очищенного человеческого C4 (полученного, как описано в Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223:46, 1993) в 100 мкл 4 мМ барбитала, 145 мМ NaCl, 2 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, pH 7,4 добавляют в каждую лунку. Через 1,5 ч при 37°C, планшеты снова промывают, и накопление C4b детектируют с использованием конъюгированного с щелочной фосфатазой куриного антитела против C4c человека (полученного из Immunsystem, Uppsala, Sweden) и измеряют с использованием колориметрического субстрата пнитрофенилфосфата.

Анализ C4 на маннане. Вышеописанный анализ адаптирован для измерения активации лектинового пути с использованием MBL посредством покрытия планшета LSP и маннаном перед добавлением сыворотки, смешанной с различными ингибирующими MASP-2 средствами.

Анализ C4 на фиколине H (Hakata Ag): Вышеописанный анализ адаптирован для измерения актива- 49 045598 ции лектинового пути с использованием H-фиколина посредством покрытия планшета LPS и фиколином

H перед добавлением сыворотки, смешанной с различными ингибирующими MASP-2 средствами.

Пример 8.

Следующий анализ демонстрирует наличие активации классического пути у мышей дикого типа и мышей MASP-2-/-.

Способы. Иммунные комплексы получали in situ посредством покрытия микропланшетов для титрования (Maxisorb, Nunc, кат. No. 442404, Fisher Scientific) 0,1% человеческим сывороточным альбумином в 10 мМ Трис, 140 мМ NaCl, pH 7,4 в течение 1 ч при комнатной температуре с последующей инкубацией в течение ночи при 4°C с антисывороткой овцы против цельной сыворотки (Scottish Antibody Production Unit, Carluke, Scotland), разведенной 1:1000 в TBS/tween/Ca²⁺. Образцы сыворотки получали от мышей дикого типа и мышей MASP-2-/- и добавляли в покрытые планшеты. Получали контрольные образцы, в которых C1q был истощен, из образцов сыворотки дикого типа и MASP-2-/-. Истощенную по C1q мышиную сыворотку полцучали с использованием Dynabeads со связанным белком A (Dynal Biotech, Oslo, Norway), покрытых IgG кролика против C1q человека (Dako, Glostrup, Denmark), в соответствии с инструкциями поставщика. Планшеты инкубировали в течение 90 минут при 37°C. Связанный C3b детектировали с использованием поликлональных антител против C3c человека (Dako A 062), разведенных в TBS/tw/Ca⁺⁺ до 1:1000. Вторичное антитело представляет собой антитело козы против IgG кролика.

Результаты. На фиг. 7 показаны относительные уровни накопления C3b на планшетах, покрытых IgG, в сыворотке дикого типа, сыворотке MASP-2-/-, сыворотке дикого типа с истощенным C1q и сыворотке MASP-2-/- с истощенным C1q. Эти результаты показывают, что классический путь является интактным у мышей линии MASP-2-/-.

Пример 9.

Следующий анализ используют для тестирования того, блокирует ли ингибирующее MASP-2 средство классический путь, посредством анализа эффекта ингибирующего MASP-2 средства в условиях, при которых классический путь инициируется посредством иммунных комплексов.

Способы. Для тестирования эффекта ингибирующего MASP-2 средство в условиях активации комплемента, когда классический путь активации инициируется иммунными комплексами, образцы по 50 мкл, содержащие 90% NHS, в трех повторах, инкубируют при 37°C в присутствии 10 мкг/мл иммунного комплекса (IC) или PBS, и параллельно включают также образцы (+/- IC) в трех повторах, которые содержат 200 нМ моноклональное антитело против пропердина, в ходе инкубации при 37°C. После двухчасовой инкубации при 37°C, во все образцы добавляют 13 мМ ЭДТА для остановки дальнейшей активации комплемента, и образцы немедленно охлаждают до 5°C. Затем образцы сохраняют при 70°C до анализа продуктов активации комплемента (C3a и sC5b-9) с использованием наборов для ELISA (Quidel, каталожные No. A015 и A009), следуя инструкциями производителя.

Пример 10.

В этом примере описана идентификация высокоаффинных фрагментов антител Fab2 против MASP2, блокирующих активность MASP-2.

Уровень техники и обоснование. MASP-2 представляет собой комплексный белок со множеством отдельных функциональных доменов, включая: участок(участки) связывания для MBL и фиколинов, каталитический участок сериновой протеазы, участок связывания для протеолитического субстрата C2, участок связывания для протеолитического субстрата C4, участок расщепления MASP-2 для аутоактивации зимогена MASP-2, и два участка связывания Ca⁺⁺. Идентифицированы фрагменты антител Fab2, связывающиеся с высокой аффинностью с MASP-2, и идентифицированные фрагменты Fab2 тестировали в функциональном анализе для определения того, способны ли они блокировать функциональную активность MASP-2.

Для блокирования функциональной активности MASP-2, антитело или фрагмент антитела Fab2 должны связываться и создавать помехи для структурного эпитопа на MASP-2, необходимого для функциональной активности MASP-2. Таким образом, многие или все высокоаффинные связывающие Fab2 против MASP-2 могут не ингибировать функциональную активность MASP-2, если они не связываются со структурными эпитопами на MASP-2, которые непосредственно вовлечены в функциональную активность MASP-2.

Функциональный анализ, в котором измеряют ингибирование образования конвертазы C3 лектинового пути, использовали для оценки блокирующей активности Fab2 против MASP-2. Известно, что первичная физиологическая роль MASP-2 в лектиновом пути состоит в получении следующего функционального компонента опосредованного лектином пути комплемента, а именно, конвертазы C3 лектинового пути. Конвертаза C3 лектинового пути представляет собой критический ферментный комплекс (C4bC2a), который протеолитически расщепляет C3 на C3a и C3b. MASP-2 не является структурным компонентом конвертазы C3 лектинового пути (C4bC2a); однако, функциональная активность MASP-2 необходима для получения двух белковых компонентов (C4b, C2a), которые содержит конвертаза C3 лектинового пути. Кроме того, все отдельные виды функциональной активности MASP-2, перечисленные выше, по-видимому, являются необходимыми для MASP-2 для образования конвертазы C3 лектино- 50 045598 вого пути. По этой причине предпочтительным анализом для использования для оценки блокирующей активности Fab2 против MASP-2 считают функциональный анализ, в котором измеряют ингибирование формирования конвертазы C3 лектинового пути.

Получение высокоафинных Fab2. Библиотеку фагового дисплея вариабельных последовательностей легких и тяжелых цепей антител человека и технологию автоматизированного селекции антител для идентификации Fab2, которые взаимодействуют с избранными представляющими интерес лигандами, использовали для получения высокоаффинных Fab2 против крысиного белка MASP-2 (SEQ ID NO: 55). Известное количество крысиного белка MASP-2 (~1 мг, чистота >85%) использовали для скрининга антител. Три цикла амплификации использовали для отбора антител с наилучшей аффинностью. Приблизительно 250 различных наилучших кандидатов, экспрессирующих фрагменты антител, отобрали для скринига ELISA. Кандидаты с высокой аффинностью впоследствии секвенировали для определения уникальности различных антител.

Пятьдесят уникальных антител против MASP-2 были очищены, и 250 мкг каждого очищенного антитела Fab2 использовали для характеризации аффинности связывания MASP-2 и функционального тестирования пути активации комплемента, как более подробно описано ниже.

Анализы, используемые для оценки ингибирующей (блокирующей) активности Fab2 против MASP2.

1. Анализ для измерения ингибирования формирования конвертазы C3 лектинового пути.

Уровень техники. Конвертаза C3 лектинового пути представляет собой ферментный комплекс (C4bC2a), который протеолитически расщепляет C3 на два активных провоспалительных фрагмента, анафилатоксин C3a и опсонин C3b. Формирование конвертазы C3, по-видимому, является ключевой стадией в лектиновом пути в отношении опосредования воспаления. MASP-2 не является структурным компонентом конвертазы C3 лектинового пути (C4bC2a); таким образом, антитела против MASP-2 (или Fab2) не ингибируют напрямую активность предсуществующей конвертазы C3. Однако активность сериновой протеазы MASP-2 является необходимой для получения двух белковых компонентов (C4b, C2a), которые содержит конвертаза C3 лектинового пути. Таким образом, Fab2 против MASP-2, ингибирующий функциональную активность MASP-2 (т.е., блокирующий Fab2 против MASP-2), ингибирует формирование de novo конвертазы C3 лектинового пути. C3 содержит нетипичную и высоко реакционноспособную тиоэфирную группу в качестве части структуры. При расщеплении C3 посредством конвертазы C3 в этом анализе, тиоэфирная группа на C3b может формировать ковалентную связь с гидроксильной группой или аминогруппой на макромолекулах, иммобилизованных на дне пластиковых лунок, посредством сложноэфирных или амидных связей, таким образом, облегчая детекцию C3b в анализе ELISA.

Дрожжевой маннан является известным активатором лектинового пути. В следующем способе для измерения формирования конвертазы C3, пластиковые лунки, покрытые маннаном, инкубировали в течение 30 мин при 37°C с разведенной крысиной сывороткой для активации лектинового пути. Затем лунки промывали и анализировали C3b, иммобилизированный в лунках, посредством стандартных способов ELISA. Количество C3b, образованного в этом анализе, является прямым отражением формирования de novo конвертазы C3 лектинового пути. Fab2 против MASP-2 в выбранных концентрациях тестировали в этом анализе по их способности ингибировать формирование конвертазы C3 и последующее образование C3b.

Способы.

96-луночные планшеты Costar Medium Binding инкубировали в течение ночи при 5°C с маннаном, разведенном в 50 мМ карбонатном буфере, pH 9,5, при 1 мкг/50 мкл/лунку. После инкубации в течение ночи, каждую лунку промывали три раза с использованием 200 мкл PBS. Затем лунки блокировали с использованием 100 мкл/лунку 1% бычьего сывороточного альбумина в PBS и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. Затем каждую лунку промывали три раза с использованием 200 мкл PBS. Образцы Fab2 против MASP-2 разводили до выбранных концентраций в содержащем Са~ и Mg~ буфере GVB (4,0 мМ барбитал, 141 мМ NaCl, 1,0 мМ MgCl₂, 2,0 мМ CaCl₂, 0,1% желатин, pH 7,4) при 5°C. 0,5% крысиной сыворотки добавляли в вышеуказанные образцы при 5°C, и 100 мкл переносили в каждую лунку. Планшеты покрывали и инкубировали в течение 30 минут при 37°C в водяной бане для обеспечения активации комплемента. Реакцию останавливали посредством переноса планшетов из водяной бани с температурой 37°C в контейнер, содержащий смесь льда и воды. Каждую лунку промывали пять раз с использованием 200 мкл PBS Tween 20 (0,05% Tween 20 в PBS), затем промывали два раза с использованием 200 мкл PBS. 100 мкл /лунку первичного антитела в разведении 1:10000 (антитела кролика против C3c человека, DAKO A0062) добавляли в PBS, содержащем 2,0 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, и инкубировали 1 час при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. Каждую лунку промывали 5x200 мкл PBS. 100 мкл /лунку вторичного антитела в разведении 1:10000 (конъюгированного с пероксидазой антитела козы против IgG кролика, American Qualex A102PU) добавляли в PBS, содержащем 2,0 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре во встряхивателе с осторожным перемешиванием. Каждую лунку промывали пять раз с использованием 200 мкл PBS. 100 мкл/лунку субстрата пероксидазы TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) добавляли и инкубировали при комнатной температуре в

- 51 045598 течение 10 мин. Реакцию пероксидазы останавливали добавлением 100 мкл/лунку 1,0 М H₃PO₄, и измеряли OD₄₅₀.

2. Анализ для измерения ингибирования зависимого от MASP-2 расщепления C4.

Уровень техники. Активность сериновой протеазы MASP-2 является высоко специфической, и идентифицированы только два белковых субстрата для MASP-2; C2 и C4. Расщепление C4 образует C4a и C4b. Fab2 против MASP-2 может связываться со структурными эпитопами на MASP-2, напрямую вовлеченными в расщепление C4 (например, участок связывания MASP-2 для C4; каталитический участок сериновой протеазы MASP-2), и таким образом, ингибирует функциональную активность MASP-2 для расщепления C4.

Дрожжевой маннан представляет собой известный активатор лектинового пути. В следующем способе для измерения активности MASP-2 расщепления C4, пластиковые лунки, покрытые маннаном, инкубировали в течение 30 минут при 37°C с разведенной крысиной сывороткой для активации лектинового пути. Поскольку первичное антитело, используемое в этом ELISA, узнает только человеческий C4, разведенную крысиную сыворотку дополняли также человеческим C4 (1,0 мкг/мл). Затем лунки промывали и анализировали человеческий C4b, иммобилизированный в лунках, с использованием стандартных способов ELISA. Количество C4b, полученного в этом анализе, является показателем зависимой от MASP-2 активности расщепления C4. Fab2 против MASP-2 в выбранных концентрациях тестировали в этом анализе по их способности ингибировать расщепление C4.

Способы. 96-луночные планшеты Costar Medium Binding инкубировали в течение ночи при 5°C с маннаном, разведенном в 50 мМ карбонатном буфере, pH 9,5, при 1,0 мкг/50 мкл/лунку. Каждую лунку промывали 3X с использованием 200 мкл PBS. Затем лунки блокировали с использованием 100 мкл/лунку 1% бычьего сывороточного альбумина в PBS и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. Каждую лунку промывали 3X с использованием 200 мкл PBS. Образцы Fab2 против MASP-2 разводили до выбранных концентраций в содержащем Са~ и Mg⁺⁺ буфере GVB (4,0 мМ барбитал, 141 мМ NaCl, 1,0 мМ MgCl₂, 2,0 мМ CaCl₂, 0,1% желатин, pH 7,4) при 5°C. 1,0 мкг/мл человеческого C4 (Quidel) также включали в эти образцы. 0,5% крысиную сыворотку добавляли к вышеуказанным образцам при 5°C, и 100 мкл переносили в каждую лунку. Планшеты накрывали и инкубировали в течение 30 мин на водяной бане при 37°C для обеспечения активации комплемента. Реакцию останавливали посредством переноса планшетов из водяной бани с температурой 37°C в контейнер, содержащий смесь льда и воды. Каждую лунку промывали 5x200 мкл PBS Tween 20 (0,05% Tween 20 в PBS), затем каждую лунку промывали 2X с использованием 200 мкл PBS. 100 мкл/лунку конъюгированного с биотином антитела курицы против C4c человека в разведении 1:700 (Immunsystem AB, Uppsala, Sweden) добавляли в PBS, содержащем 2,0 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), и инкубировали один час при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. Каждую лунку промывали 5x200 мкл PBS. 100 мкл/лунку 0,1 мкг/мл конъюгированного с пероксидазой стрептавидина (Pierce Chemical #21126) добавляли в PBS, содержащем 2,0 мг/мл BSA, и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре во встряхивателе с осторожным перемешиванием. Каждую лунку промывали 5x200 мкл PBS. 100 мкл /лунку субстрата пероксидазы TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) добавляли и инкубировали при комнатной температуре в течение 16 мин. Реакцию пероксидазы останавливали добавлением 100 мкл/лунку 1,0 М H3PO4, и измеряли OD450.

3. Анализ связывания Fab2 против MASP-2 крысы с нативным крысиным MASP-2.

Уровень техники. MASP-2 обычно присутствует в плазме в форме диммерного комплекса MASP-2, который включает также специфические лектиновые молекулы (связывающий маннозу белок (MBL) и фиколины). Таким образом, при наличии интереса к исследованию связывания Fab2 против MASP-2 с физиологически значимой формой MASP-2, является важным разработать анализ связывания, в котором используют взаимодействие между Fab2 и нативным MASP-2 в плазме, а не очищенным рекомбинантным MASP-2. В этом анализе связывания нативный комплекс MASP-2-MBL из 10% крысиной сыворотки сначала иммобилизовали на покрытых маннаном лунках. Затем аффинность связывания различных Fab2 против MASP-2 с иммобилизованным нативным MASP-2 исследовали с использованием стандартного способа ELISA.

Способы. 96-луночные планшеты Costar High Binding инкубировали в течение ночи при 5°C с маннаном, разведенном в 50 мМ карбонатном буфере, pH 9,5, при 1 мкг/50 мкл/лунку. Каждую лунку промывали 3X с использованием 200 мкл PBS. лунки блокировали с использованием 100 мкл/лунку 0,5% обезжиренного сухого молока в PBST (PBS с 0,05% Tween 20) и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. Каждую лунку промывали 3X с использованием 200 мкл буфера для промывки TBS/Tween/Ca⁺⁺ (забуференный Трис солевой раствор, 0,05% Tween 20, содержащий 5,0 мМ CaCl₂, pH 7,4. 10% крысиную сыворотку в связывающем буфере с высоким содержанием солей (20 мМ Трис, 1,0 М NaCl, 10 мМ CaCl₂, 0,05% Triton X100, 0,1% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина, pH 7,4) подготавливали на льду. 100 мкл/лунку добавляли и инкубировали в течение ночи при 5°C. Лунки промывали 3X с использованием 200 мкл буфера для промывки TBS/Tween/Ca⁺⁺. Затем лунки промывали 2X с использованием 200 мкл PBS. 100 мкл/лунку Fab2 против

- 52 045598

MASP-2 в выбранной концентрации, разведенного в содержащем Са⁺⁺ и Mg⁺⁺ буфере GVB (4,0 мМ барбитал, 141 мМ NaCl, 1,0 мМ MgCl₂, 2,0 мМ CaCl₂, 0,1% желатин, pH 7,4) добавляли и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. Каждую лунку промывали 5x200 мкл PBS. 100 мкл /лунку коньюгированного с HRP антитела козы против Fab2 (Biogenesis, кат. No 0500 0099), разведенного 1:5000 в 2,0 мг/мл бычьего сывороточного альбумина в PBS добавляли и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. Каждую лунку промывали 5x200 мкл PBS. 100 мкл /лунку субстрата пероксидазы TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) добавляли и инкубировали при комнатной температуре в течение 70 мин. Реакцию пероксидазы останавливали добавлением 100 мкл /лунку 1,0 М H3PO₄, и измеряли OD₄₅₀.

Результаты.

Приблизительно 250 различных Fab2, вступавших в реакцию с высокой аффинностью с белком MASP-2 крысы, отбирали для скрининга ELISA. Эти высокоаффинные Fab2 секвенировали для определения уникальности различных антител, и 50 уникальных антител против MASP-2 очищали для дальнейшего анализа. 250 мкг каждого очищенного антитела Fab2 использовали для характеризации аффинности связывания MASP-2 и функционального тестирования пути комплемента. Результаты этого анализа показаны ниже в табл. 7.

Таблица 7

FAB2 против MASP-2, блокирующие лектиновый путь активации комплемента

Антитело Fab2 #	Конвертаза СЗ, 1С₅₀ (нМ)	K_d	Расщепление С4, 1С₅₀ (нМ)
88	0,32	4,1	ND
41	0,35	0,30	0, 81
11	0,46	0,86	<2 нМ
86	0,53	1,4	ND
81	0,54	2,0	ND
66	0, 92	4,5	ND
57	0, 95	3, 6	<2 нМ
40	1,1	7,2	0, 68
58	1,3	2, 6	ND
60	1, 6	3, 1	ND
52	1, 6	5, 8	<2 нМ
63	2,0	6, 6	ND
49	2,8	8,5	<2 нМ
89	3, 0	2,5	ND
71	3, 0	10,5	ND
87	6, 0	2,5	ND
67	10, 0	7,7	ND

Как показано выше в табл. 7, из 50 протестированных Fab2 против MASP-2, семнадцать Fab2 идентифицированы как Fab2, блокирующие MASP-2, которые потенциально ингибируют формирование конвертазы C3 с IC₅₀, равной или меньшей 10 нМ Fab2 (частота отбора положительных наилучших кандидатов 34%). Восемь из семнадцати идентифицированных Fab2 имеют IC₅₀ в субнаномолярном диапазоне. Кроме того, для всех семнадцати Fab2, блокирующих MASP-2, показанных в табл. 7, получили по существу полное ингибирование формирования конвертазы C3 в анализе конвертазы C3 лектинового пути. На фиг. 8A графически проиллюстрированы результаты анализа формирования конвертазы C3 для антитела Fab2 #11, которое является репрезентативным для других протестированных антител Fab2, результаты для которых показаны в табл. 7. Это важные сведения, поскольку теоретически возможно, что блокирующее Fab2 может только частично ингибировать функцию MASP-2, даже когда каждая молекула MASP-2 связывается с Fab2.

Хотя маннан является известным активатором лектинового пути, существует теоретическая возможность того, что присутствие антител против маннана в сыворотке крыс может также активировать классический путь и приводить к образованию C3b посредством конвертазы C3 классического пути. Однако каждое из семнадцати блокирующих Fab2 против MASP-2, перечисленных в этом примере, потенциально может ингибировать образование C3b (>95%), таким образом, показывая специфичность данного анализа для конвертазы C3 лектинового пути.

Анализы связывания также проводили для всех семнадцати блокирующих Fab2 для расчета кажущейся K_d для каждого. Результаты анализов связывания Fab2 против MASP-2 крысы с нативным MASP-2 крысы для шести из блокирующих Fab2 также показаны в табл. 7. На фиг. 8B графически проиллюстрированы результаты анализа связывания с антителом Fab2 #11. Для других Fab2 также проводили подобные анализы связывания, результаты которых показаны в табл. 7. Как правило, кажущиеся Kd, полученные для связывания каждого из шести Fab2 с нативными MASP-2, сравнительно точно соответствуют IC₅₀ для Fab2 в функциональном анализе конвертазы C3. Существуют доказательства того, что MASP-2

- 53 045598 подвергается конформационным изменениям от неактивной до активной форме при активации ее протеазной активности (Feinberg et al., EMBO J 22:2348 59 (2003); Gal et al., J. Biol. Chem. 280:33435 44 (2005)). В нормальной плазме крыс, используемой в анализе формирования конвертазы C3, MASP-2 присутствует в первую очередь в неактивной конформации зимогена. В отличие от этого, в анализе связывания, MASP-2 присутствует как часть комплекса с MBL, связанным с иммобилизированным маннаном; таким образом, MASP-2 находится в активной конформации (Petersen et al., J. Immunol Methods 257:107 16, 2001). Следовательно, не следует ожидать точного соответствия между IC₅₀ и K_d для каждого из семнадцати блокирующих Fab2, тестированных в этих двух функциональных анализах, поскольку в каждом анализе Fab2 связывается с различными конформационными формами MASP-2. Тем не менее, за исключением Fab2 #88, по-видимому существует точное соответствие между IC₅₀ и кажущейся Kd для каждого из других шестнадцати Fab2, тестированных в двух анализах (см. табл. 7).

Несколько блокирующих Fab2 оценивали по ингибированию зависимого от MASP-2 расщепления C4. На фиг. 8C графически проиллюстрированы результаты анализа расщепления C4, показывающие ингибирование с использованием Fab2 #41, с IC₅₀=0,81 нМ (см. табл. 7). Как показано на фиг. 9, обнаружено, что все из тестированных Fab2 ингибируют расщепление C4 с IC₅₀, сходными с полученными в анализе конвертазы C3 (см. табл. 7).

Хотя маннан является известным активатором лектинового пути, существует теоретическая возможность того, что присутствие антител против маннан в сыворотке крыс может также активировать классический путь и, таким образом, приводить к образованию C4b посредством опосредованного C1 расщепления C4. Однако, идентифицировано несколько Fab2 против MASP-2, которые сильно ингибируют оразование C4b (>95%), таким образом, показывая специфичность этого анализа для опосредованного MASP-2 расщепления C4. C4, подобно C3, содержит необычные и высоко реакционноспособные тиоэфирные группы в качестве части структуры. При расщеплении C4 посредством MASP-2 в этом анализе, тиоэфирная группа на C4b может формировать ковалентную связь с гидроксильными группами или аминогруппами на макромолекулах, иммобилизованных на дне пластиковых лунок посредством эфирных или амидных связей, таким образом, облегчая детекцию C4b в анализе ELISA.

Эти исследования явно показывают получение высокоаффинных FAB2 против крысиного белка MASP-2, которые функционально блокируют активность конвертазы как C4, так и C3, таким образом, предотвращая активацию лектинового пути.

Пример 11.

В этом примере описано картирование эпитопов нескольких блокирующих антител Fab2 против MASP-2 крысы, полученных, как описано в примере 10.

Способы.

Как показано на фиг. 10, следующие белки, все с N-концевыми метками 6X His, экспрессировали в клетках CHO с использованием вектора pED4:

крысиный MASP-2A, полноразмерный белок MASP-2, инактивированный посредством замены серина в активном центре на аланин (S613A);

крысиный MASP-2K, полноразмерный белок MASP-2, измененный для уменьшения аутоактивации (R424K);

CUBI II, N-концевой фрагмент крысиного MASP-2, содержащий только домен CUBI, подобный EGF домен и домен CUBII; и

CUBI/подобный EGF домен, N-концевой фрагмент крысиного MASP-2 содержащий только домен CUBI и подобный EGF домен.

Эти белки очищали из культуральных супернатантов посредством никель-аффинной хроматографии, как описано ранее (Chen et al., J. Biol. Chem. 276:25894 02 (2001)).

А C-концевой полипептид (CCPII-SP), содержащий CCPII и домен сериновой протеазы крысиного MASP-2, экспрессировали E. coli в форме слитого с тиоредоксином белка с использованием pTrxFus (Invitrogen). Белок очищали из лизатов клеток с использованием аффинной смолы Thiobond. Партнер по слиянию тиоредоксин экспрессировали из пустого pTrxFus в качестве отрицательного контроля.

Все рекомбинантные белки подвергали диализу в буфере TBS, и их концентрации определяли посредством измерения OD при 280 нм.

Дот-блот анализ.

Серийные разведения пяти рекомбинантных полипептидов MASP-2, описанных выше и показанное на фиг. 10 (и полипептида тиоредоксина в качестве отрицательного контроля для полипептида CCPIIсериновой протеазы) наносили пятнами на нитроцеллюлозную мембрану. Количество нанесенного пятнами белка находилось в диапазоне от 100 нг до 6,4 пг, в пятикратных разведениях. В более поздних экспериментах, количество нанесенного пятнами белка находилось в диапазоне от 50 нг с понижением до 16 пг, снова в пятикратных разведениях. Мембраны блокированы с использованием 5% порошка снятого сухого молока в TBS (блокирующего буфера), затем инкубировали с 1,0 мкг/мл Fab2 против MASP-2 в блокирующем буфере (содержащем 5,0 мМ Ca²⁺). Связанные Fab2 детектировали с использованием коньюгированного с HRP антитела против Fab человека (AbD/Serotec; разведенного 1/10000) и набора для детекции ECL (Amersham). Одну мембрану инкубировали с поликлональными Ab кролика против

- 54 045598

MASP-2 человека (описано в Stover et al., J Immunol 163:6848 59 (1999)) в качестве положительного контроля. В этом случае, связанное Ab детектировали с использованием коньюгированного с HRP антитела козы против IgG кролика (Dako; разведенного 1/2000).

Анализ связывания MASP-2

Планшеты для ELISA покрывали с использованием 1,0 мкг/лунку рекомбинантного полипептид MASP-2A или CUBI II в карбонатном буфере (pH 9,0) в течение ночи при 4°C. Лунки блокировали с использованием 1% BSA в TBS, затем добавляли серийные разведения Fab2 против MASP-2 в TBS, содержащем 5,0 мМ Ca²⁺. Планшеты инкубировали в течение одного часа при RT. После промывки три раза с использованием TBS/tween/Ca²⁺, добавляли коньюгированное с HRP антитело против Fab человека (AbD/Serotec), разведенное 1/10000 в TBS/ Ca²⁺, и планшеты инкубировали в течение еще одного часа при RT. Связанное антитело детектировали с использованием набора субстрата пероксидазы TMB (Biorad).

Результаты.

Результаты дот-блот анализа, показывающие реакционную способность Fab2 по отношению к различным полипептидам MASP-2, представлены ниже в табл. 8. Численные значения, приведенные в табл. 8, указывают количество нанесенного пятнами белка, необходимое для получения приблизительно половины максимальной силы сигнала. Как показано, все полипептиды (за исключением только одного партнера по связыванию тиоредоксина) были распознаны посредством положительного контрольного Ab (поликлональной антисыворотки против MASP-2 человека, полученной от кроликов).

Таблица 8

Реакционная способность по отношению к различным рекомбинантным _______полипептидам крысиного MASP-2 в дот-блот анализах_______

Антитело Fab2 #	MASP-2A	CUBI II	CUBI/подобный EGF	CCPII SP	Тиоредоксин

40	0,16 нг	NR	NR	0,8 нг	NR
41	0,16 нг	NR	NR	0,8 нг	NR
11	0,16 нг	NR	NR	0,8 нг	NR
49	0,16 нг	NR	NR	>20 нг	NR
52	0,16 нг	NR	NR	0,8 нг	NR
57	0,032 нг	NR	NR	NR	NR
58	0,4 нг	NR	NR	2,0 нг	NR
60	0,4 нг	0,4 нг	NR	NR	NR
63	0,4 нг	NR	NR	2,0 нг	NR
66	0,4 нг	NR	NR	2,0 нг	NR
67	0,4 нг	NR	NR	2,0 нг	NR
71	0,4 нг	NR	NR	2,0 нг	NR
81	0,4 нг	NR	NR	2,0 нг	NR
86	0,4 нг	NR	NR	10 нг	NR
87	0,4 нг	NR	NR	2,0 нг	NR
Положительный контроль	<0,032 нг	0,16 нг	0,16 нг	<0,032 нг	NR

NR-нет реакции. Положительное контрольное антитело представляет собой поликлональную антисыворотку против MASP-2 человека, полученную от кроликов.

Все из Fab2 вступали в реакцию с MASP-2A, так же как с MASP-2K (данные не представлены). Большинство из Fab2 узнавали полипептид CCPII-SP, но не N-концевые фрагменты. Двумя исключениями являются Fab2 #60 и Fab2 #57. Fab2 #60 узнает MASP-2A и фрагмент CUBI-II, но не CUBI/подобный EGF полипептид или полипептид CCPII-SP, что позволяет предполагать его связывание с эпитопом в CUBII, или перекрывание домена CUBII и подобного EGF домена. Fab2 # 57 узнает MASP-2A, но ни один из тестированных фрагментов MASP-2, что указывает на то, что Fab2 узнает эпитоп в CCP1. Fab2 #40 и #49 связываются только с полным MASP-2A. В анализе связывания ELISA, показанном на фиг. 11, Fab2 #60 также связывался с полипептидом CUBI-II полипептид, хоть и с немного более низкой кажущейся аффинностью.

Эти обнаружения показывают идентификацию уникальных блокирующих Fab2 с множественными областями белка MASP-2.

Пример 12.

В этом примере описаны результаты для MASP-2-/- в модели на мышах дегенерации желтого пятна.

Уровень техники/Обоснование. Возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) является ведущей причиной слепоты после возраста 55 в промышленно развитых странах. AMD возникает в двух основных формах: неоваскулярная (влажная) AMD и атрофическая (сухая) AMD. Неоваскулярная (влажная) форма

- 55 045598 ответственна за 90% тяжелой потери зрения, ассоциированной с AMD, даже несмотря на то, что только у ~20% индивидуумов с AMD развивается влажная форма. Характерные клинические признаки AMD включают множественные друзы, географическую атрофию и хориоидальную неоваскуляризацию (CNV). В декабре 2004 г., FDA одобрило Макуген (пегаптаниб), новый класс офтальмологических лекарственных средств для специфического нацеливания на фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и блокирования его эффектов, для лечения влажной (неоваскулярной) формы AMD (Ng et al., Nat Rev. Drug Discov 5:123 32 (2006)). Несмотря на то, что Макуген представляет собой многообещающий новый вариант терапии для подгруппы пациентов с AMD, остается настоятельная необходимость разработки дополнительных видов лечения для этого комплексного заболевания. Множество независимых путей исследования указывают на центральную роль активации комплемента в патогенезе AMD. Патогенез хориоидальной неоваскуляризации (CNV), наиболее тяжелой формы AMD, может включать активацию путей комплемента.

Более двадцати пяти лет назад, Ryan описал модель CNV у животных с индуцированным лазером повреждением (Ryan, S.J., Tr. Am. Opth. Soc. LXXVII:707 745, 1979). Эта модель первоначально разработана с использованием макаков-резусов, однако, с тех пор такую же технологию использовали для разработки сходных моделей CNV на множестве лабораторных животных, включая мышей (Tobe et al., Am. J. Pathol. 153:1641 46, 1998). В этой модели, используют лазерную фотокоагуляцию для разрыва мембраны Бруха, это действие приводит к формированию мембран, подобных CNV. Индуцированная лазером модель изображает многие из важных признаков состояния у человека (недавний обзор, см. в Ambati et al., Survey Ophthalmology 48:257 293, 2003). В настоящее время хорошо разработана модель на мышах с индуцированным лазером повреждением, и ее используют в качестве экспериментальной основы для большого, и даже увеличивающегося, количества исследовательских проектов. Является общепринятым, что индуцированная лазером модель разделяет достаточное биологическое сходство с CNV у человека, чтобы доклинические исследования патогенеза и ингибирования посредством лекарственных средств с использованием этой модели, являются соответствующими CNV у человека.

Способы.

Мышь MASP-2-/- получали, как описано в примере 1, и подвергали обратному скрещиванию с C57Bl/6 в течение 10 поколений. В настоящем исследовании сравнивали результаты, когда самцов мышей MASP-2 (-/-) и MASP-2 (+/+) оценивали в ходе индуцированной лазером CNV, улучшенной модели неоваскулярной AMD, фокусируясь на объеме индуцированной лазером CNV, по сканирующей лазерной конфокальной микроскопии, в качестве показателя повредждения тканей, и определении уровней VEGF, сильного ангиогенного фактора, вовлеченного в CNV, в пигментном эпителии сетчатки (RPE)/хороидах посредством ELISA после лазерного повреждения.

Индукция хориоидальной неоваскуляризации (CNV). Лазерную фотокоагуляцию (532 нм, 200 мВт, 100 мс, 75 мкм; Oculight GL, Iridex, Mountain View, CA) проводил для обоих глаз каждого животного на сутки ноль один индивидуальный специалист, неосведомленный о распределении по группам лекарственных средств. Лазерные пятна наносили стандартизированным образом вокруг оптического нерва при использовании системы установки щелевой лампы и покровного стекла в качестве контактной линзы. Морфологической конечной точкой лазерного поражения являлось появление кавитационного пузырька, что считали признаком, коррелирующим с повреждением мембраны Бруха. Далее следует подробное описание способов и оцененных конечных точек.

Ангиография с флуоресцеином. Ангиографию с флуоресцеином проводили с использованием камеры и системы визуализации (камера TRC 50 1A; система ImageNet 2.01; Topcon, Paramus, NJ) через 1 неделю после лазерной фотокоагуляции. Фотографии получали с использованием линз 20-D в контакте с объективом съемочного аппарата с линзой фундус-камеры после внутрибрюшинной инъекции 0,1 мл 2,5% флуоресцеина натрия. Специалист по состоянию сетчатки, не участвующий в лазерной фотокоагуляции или ангиографии, оценивал флуоресцентные ангиограммы с флуоресцеином за один сеанс слепым способом.

Объем хориоидальной неоваскуляризации (CNV). Через одну неделю после лазерного повреждения, глаза вырезали и фиксировали с использованием 4% параформальдегида в течение 30 мин при 4°C. Глазное дно получали посредством удаления передних фрагментов и промывали три раза в PBS, с последующей дегидратацией и регидратацией с применением серий разведений метанола. После двукратного блокирования буфером (PBS, содержащим 1% бычий сывороточный альбумин и 0,5% Triton X 100) в течение 30 минут при комнатной температуре, глазное дно инкубировали в течение ночи при 4°C с 0,5% FITC-изолектином B4 (Vector laboratories, Burlingame, CA), разведенным в PBS, содержащем 0,2% BSA и 0,1% Triton X 100, который связывает концевые остатки e-D-галактозы на поверхности эндотелиальных клеток и избирательно помечает сосудистую сеть мыши. После двух промывок PBS, содержащим 0,1% Triton X 100, нейросенсорную сетчатку осторожно отслаивали и отделяли от оптического нерва. Затем выполняли четыре ослабляющих радиальных надреза, и оставшийся комплекс RPE-хороид-склера комплекс погружали в среду, препятствующую выгоранию флуоресценции (Immu Mount Vectashield Mounting Medium; Vector Laboratories) и накрывали покровным стеклом.

Погруженные образцы исследовали с использованием конфокального лазерного сканирующего

- 56 045598 микроскопа (TCS SP; Leica, Heidelberg, Germany). Сосуды визуализировали посредством возбуждения голубым аргоном с длиной волны (488 нм) и захвата излучения между 515 и 545 нм. Во всех исследованиях визуализации использовали 40X масляно-иммерсионный объектив. Горизонтальные оптические срезы (с шагом 1 мкм) получали с поверхности комплекса RPE-хороид-склера. Самую глубокую фокальная плоскость, в которой можно было идентифицировать окружающую хориоидальную сосудистую сеть, связанную с поражением, рассматривали в качестве основания поражения. Любой сосуд, находящийся в области-мишени для лазерного воздействия и расположенный на поверхности этой эталонной плоскости, оценивали как CNV. Изображения каждого среза сохраняли в цифровом виде. Площадь связанной с CNV флуоресценции измеряли посредством компьютеризированного анализа изображений с использованием программного обеспечения для электронного микроскопа (TCS SP; Leica). Суммирование всей флуоресцентной области в каждом горизонтальном срезе использовали как показатель объема CNV. Визуализацию проводил оператор, неосведомленный о распределении по группам лекарственных средств.

Поскольку на вероятность развития CNV для каждого лазерного поражения влияет группа, к которой оно принадлежит (мышь, глаз и лазерное пятно), средние объемы поражения сравнивали с использованием способа линейной смешанной модели, поделенной на делянки по принципу повторяющихся измерений. Фактор всего поля представлял собой генетическую группу, к которой принадлежали животные, в то время как фактор делянки представлял собой глаз. Статистическую значимость определяли на уровне 0,05. Апостериорные сравнения средних проводили с использованием поправки Бонферрони для множественных сравнений.

ELISA VEGF. Через трое суток после поражения посредством 12 лазерных пятен, комплекс RPEхороид обрабатывали ультразвуком в буфере для лизиса (20 мМ имидазол HCl, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCL₂, 10 мМ EGTA, 1% Triton X 100, 10 мМ NaF, 1 мМ молибдат Na, и 1 мМ ЭДТА с ингибиторами протеаз) на льду в течение 15 мин. Уровни белка VEGF в супернатанте определяли с использованием набора для ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN), узнающего все варианты сплайсинга, при 450-570 нм (Emax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA), и нормализовали по общему содержанию белка. Измерения в двух повторах выполнял слепым способом оператор, не участвующий в фотокоагуляции, визуализации или ангиографии. Количества VEGF представляли как среднее +/- SEM по меньшей мере для трех независимых экспериментов и сравнивали с использованием U-критерия Манна-Уитни. Нулевую гипотезу отклоняли при P<0,05.

Результаты.

Оценка уровней VEGF.

На фиг. 12A графически проиллюстрированы уровни белка VEGF в комплексе RPE-хороид, выделенном от мышей дикого типа C57Bl6 и мышей MASP-2(-/-)на сутки ноль. Как показано на фиг. 12A, оценка уровней VEGF показывает уменьшение фоновых уровней VEGF у мышей MASP-2 (-/-) по сравнению с контрольными мышами дикого типа C57bl. На фиг. 12B графически проиллюстрированы уровни белка VEGF, измеренные на сутки три после индуцированного лазером повреждения. Как показано на фиг. 12B, уровни VEGF значимо увеличивались у мышей дикого типа (+/+) через трое суток после индуцированного лазером повреждения, что согласуется с опубликованными исследованиями (Nozaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:2328 33 (2006)). Однако, неожиданно, очень низкие уровни VEGF наблюдали у мышей MASP-2 (-/-).

Оценка хориоидальной неоваскуляризации (CNV).

В дополнение к уменьшению уровней VEGF после индуцированной лазером дегенерации желтого пятна, площадь CNV определяли до и после лазерного повреждения. На фиг. 13 графически проиллюстрирован объем CNV, измеренный у мышей дикого типа C57bl и у мышей MASP-2(-/-) на сутки семь после индуцированного лазером повреждения. Как показано на фиг. 13, для мышей MASP-2 (-/-) показано уменьшение площади CNV приблизительно на 30% после индуцированного лазером повреждения на сутки семь по сравнению с контрольными мышами дикого типа.

Эти обнаружения указывают на уменьшение VEGF и CNV, как наблюдали у мышей MASP (-/-) по сравнению с контрольными мышами дикого типа (+/+), и на то, что блокирование MASP-2 с использованием ингибитора может оказывать профилактический или терапевтический эффект в лечении дегенерации желтого пятна.

Пример 13.

В этом примере описан фармакодинамический анализ репрезентативных высокоаффинных антител Fab2 против MASP-2, идентифицированных, как описано в примере 10.

Уровень техники/обоснование.

Как описано в примере 10, для идентификации высокоаффинных антител, которые блокируют лектиновый путь у крыс, крысиный белок MASP-2 использовали для пэннинга библиотеки фагового дисплея. Эту библиотеку разработали с целью обеспечения высокого иммунологического разнообразия и конструировали с использованием полностью человеческих последовательностей генов иммуноглобулинов. Как описано в примере 10, идентифицировано приблизительно 250 индивидуальных клонов фагов, которые связываются с высокой аффинностью с крысиным белком MASP-2 посредством скрининга ELISA. Секвенирование этих клонов идентифицировало 50 уникальных фагов, кодирующих антитело про- 57 045598 тив MASP-2. Белок Fab2 экспрессировали из этих клонов, очищали и анализировали по аффинности связывания MASP-2 и функционального ингибирования лектинового пути комплемента.

Как показано в табл. 7 из Примера 10, идентифицировали 17 Fab2 против MASP-2 с функциональной блокирующей активностью, идентифицированной в результате этого анализа (частота наилучших совпадений для блокирующих антител 34%). Функциональное ингибирование лектинового пути комплемента посредством Fab2 было заметно на уровне накопления C4, что является прямым показателем расщепления C4 посредством MASP-2. Важно, что ингибирование было в равной степени заметно при оценке активности конвертазы C3, показывающей функциональную блокаду лектинового пути комплемента. 17 идентифицированных блокирующих MASP-2 Fab2, идентифицированных, как описано в примере 10, сильно ингибируют образование конвертазы C3 с значениями IC₅₀, равными или меньшими чем 10 нМ. Восемь из 17 идентифицированных Fab2 имеют значения IC₅₀ в субнаномолярном диапазоне. Более того, для всех 17 Fab2, блокирующих MASP-2, получили по существу полное ингибирование в анализе образования конвертазы C3 лектинового пути, как показано на фиг. 8A-C, и обобщено в табл. 7 из Примера 10. Более того, каждое из 17 блокирующих Fab2 против MASP-2, показанных в табл. 7, сильно ингибирует образование C3b (>95%), таким образом, показывая специфичность данного анализа для конвертазы C3 лектинового пути.

Варианты изотипов крысиных IgG2c и мышиных IgG2a полноразмерных антител получали из Fab2 #11. В этом примере описана характеризация этих изотипов in vivo по фармакодинамическим параметрам.

Способы.

Как описано в примере 10, крысиный белок MASP-2 использовали для пэннинга библиотеки фагового дисплея Fab, из которой идентифицировали Fab2#ll. Варианты изотипов крысиных IgG2c и мышиных IgG2a полноразмерных антител получали из Fab2 #11. Изотипы как крысиных IgG2c, так и мышиных IgG2a полноразмерных антител характеризовали in vivo по фармакодинамическим параметрам следующим образом.

Исследование In vivo на мышах.

Фармакодинамическое исследование проводили на мышах для исследования эффекта дозирования антитела против MASP-2 на активность лектинового пути в плазме in vivo. В этом исследовании, накопление C4 измеряли ex vivo в анализе лектинового пути в различных временных точках после подкожного (SC) и внутрибрюшинного (IP) введения 0,3 мг/кг или 1,0 мг/кг мышиного MoAb против MASP-2 (мышиного полноразмерного антитела изотипа IgG2a, происходящего из Fab2#11).

На фиг. 14 графически проиллюстрировано специфическое для лектинового пути накопление C4b, измеренное ex vivo в неразбавленных образцах сыворотки, взятых у мышей (n=3 мыши/группу) в различных временных точках после подкожного дозирования либо 0,3 мг/кг, либо 1,0 мг/кг мышиного MoAb против MASP-2. Образцы сыворотки мышей, собранные перед дозированием антитела, служили в качестве отрицательного контроля (100% активность), в то время как сыворотку, дополненную in vitro 100 нМ такого же блокирующего антитела против MASP-2, использовали в качестве положительного контроля (0% активность).

Результаты, показанные на фиг. 14, демонстрируют быстрое и полное ингибирование накопления C4b после подкожного введения дозы 1,0 мг/кг мышиного MoAb против MASP-2. Частичное ингибирование накопления C4b наблюдали после подкожного введения дозы 0,3 мг/кг мышиного MoAb против MASP-2.

Зависимость от времени восстановления лектинового пути отслеживали в течение трех недель после однократного IP введения мышиного MoAb против MASP-2 при 0,6 мг/кг мышам. Как показано на фиг. 15, резкое снижение активности лектинового пути возникало после дозирования антитела с последующим полным ингибированием лектинового пути, которое продолжалось в течение приблизительно 7 суток после IP введения. Медленное восстановление активности лектинового пути наблюдали в течение второй и третьей недели с полным восстановлением лектинового пути у мышей через 17 суток после введения MoAb против MASP-2.

Эти результаты показывают, что мышиное Moab против MASP-2, происходящее из Fab2 #11, ингибирует лектиновый путь у мышей зависимым от дозы образом при системной доставке.

Пример 14.

В этом примере описан анализ мышиного MoAb против MASP-2, происходящего из Fab2 #11, по эффективности на мышиной модели связанной с возрастом дегенерации желтого пятна.

Уровень техники/обоснование.

Как описано в примере 10, крысиный белок MASP-2 использовали для пэннига библиотеки фагового дисплея Fab, из которой идентифицировали Fab2#11 в качестве функционально активного антитела. Полноразмерные антитела крысиного IgG2c и мышиного IgG2a изотипов получали из Fab2 #11. Полноразмерное антитело против MASP-2 мышиного изотипа IgG2a характеризовали по фармакодинамическим параметрам, как описано в примере 13. В этом примере, мышиное полноразмерное антитело против MASP-2, происходящее из Fab2 #11, анализировали в модели на мышах связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD), описанной в Bora P.S. et al., J Immunol 174:491-497 (2005).

- 58 045598

Способы.

Мышиное полноразмерное антитело изотипа IgG2a против MASP-2, происходящее из Fab2 #11 как описано в примере 13, тестировали в модели на мышах связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD), как описано в примере 12, со следующими модификациями.

Введение мышиных MoAb против MASP-2.

Две различные дозы (0,3 мг/кг и 1,0 мг/кг) мышиного MoAb против MASP-2 вместе с обработкой контрольным для изотипа MoAb, инъецировали IP мышам WT (+/+) (n=8 мышей на группу) за 16 часов до индукции CNV.

Индукция хориоидальной неоваскуляризации (CNV).

Индукцию хориоидальной неоваскуляризации (CNV) и измерение объема CNV проводили с использованием лазерной фотокоагуляции, как описано в примере 12.

Результаты.

На фиг. 16 графически проиллюстрирована площадь CNV, измеренная через 7 суток после лазерного повреждения у мышей, подвергнутых обработке либо контрольным для изотипа MoAb, либо мышиным MoAb против MASP-2 (0,3 мг/кг и 1,0 мг/кг). Как показано на фиг. 16, у мышей, подвергнутых предварительной обработке 1,0 мг/кг MoAb против MASP-2, наблюдали статистически значимое (p<0,01) уменьшение CNV приблизительно на 50% через 7 суток после обработки лазером. Как дополнительно показано на фиг. 16, наблюдали, что доза 0,3 мг/кг MoAb против MASP-2 не была эффективной для уменьшения CNV. Отмечено, что для дозы 0,3 мг/кг MoAb против MASP-2 показано частичное и временное ингибирование накопления C4b после подкожного введения, как описано в примере 13 и показано на фиг. 14.

Результаты, описанные в этом примере, показывают, что блокирование MASP-2 ингибитором, таким как MoAb против MASP-2, имеет профилактический и/или терапевтический эффект при лечении дегенерации желтого пятна. Отмечено, что эти результаты согласуются с результатами, наблюдаемыми в исследовании, проведенном на мышах MASP-2 (-/-), описанном в примере 12, в котором наблюдали уменьшение CNV на 30% через 7 суток после обработки лазером, у мышей MASP-2 (-/-), по сравнению с контрольными мышами дикого типа. Кроме того, результаты в этом примере дополнительно показывают, что антитело против MASP-2 при системной доставке обеспечивает местное терапевтическое преимущество для глаза, таким образом, подчеркивая потенциал системного способа введения для лечения пациентов с AMD пациенты. В общем эти результаты предоставляют доказательство, поддерживающее использование MASP-2 MoAb в лечении AMD.

Пример 15.

В этом примере описана идентификация, с использованием фагового дисплея, полностью человеческих антител scFv, которые связываются с MASP-2 и ингибируют опосредованную лектином активацию комплемента, в то же время оставляя в то же время оставляя компонент классического (зависимого от C1q) пути иммунной системы интактным.

Обзор.

Полностью человеческие, высокоаффинные антитела против MASP-2 идентифицировали посредством скринига библиотеки фагового дисплея. Вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепи антител выделяли как в формате scFv, так и в формате полноразмерного IgG. Человеческие антитела против MASP-2 можно использовать для ингибирования клеточного повреждения, ассоциированного с опосредованной лектиновым путем активацией альтернативного пути комплемента, в то же время оставляя компонент классического (зависимого от C1q) пути иммунной системы интактным. В некоторых вариантах осуществления, рассматриваемые ингибирующие MASP-2 антитела имеют следующие характеристики: (a) высокая аффинность для MASP-2 человека (например, K_D 10 нМ или менее), и (b) ингибирует зависимую от MASP-2 активность комплемента в 90% сыворотки человека с IC₅₀ 3 0 нМ или менее.

Способы.

Полноразмерную последовательность кДНК человеческого MASP-2 (SEQ ID NO: 4), кодирующего полипептид человеческого MASP-2 с лидерной последовательностью (SEQ ID NO: 5) субклонировали в экспрессирующий вектор для млекопитающих pCI Neo (Promega), управляющей эукариотической экспрессией под контролем энхансерной/промоторной области CMV (описанной в Kaufman R.J. et al., Nucleic Acids Research 19:4485 90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537 66 (1991)).

Для получения каталитически неактивного человеческого белка MASP-2A, проводили сайтнаправленный мутагенез, как описано в US2007/0172483, содержание которого приведено, таким образом, в настоящем описании в качестве ссылки. Продукты ПЦР очищали после электрофореза в агарозном геле и получения полосы, и перекрывание одиночного аденозина получали с использованием стандартного способа получения хвостов. Затем снабженный аденозиновым хвостом MASP-2A клонировали в вектор pGEM T easy и трансформировали в E. coli. Человеческий MASP-2A затем субклонировали в любой из экспрессирующих векторов для млекопитающих pED или pCI Neo.

Экспрессирующей MASP-2A конструкцией, описанной выше, трансфицировали клетки DXB1 с использованием стандартного способа трансфекции с фосфатом кальция (Maniatis et al., 1989). MASP-2A

- 59 045598 продуцировали в бессывороточной среде для обеспечения того, чтобы препараты не были загрязнены другими белками сыворотки. Собирали среды с конфлюэнтных клеток каждые вторые сутки (всего четыре раза). Средний уровень рекомбинантного MASP-2A составлял приблизительно 1,5 мг/литр культуральной среды. MASP-2A (мутант Ser-Ala, описанной выше) очищали посредством аффинной хроматографии на колонках с MBP-A агарозой.

ELISA MASP-2A для клонов-кандидатов ScFv, идентифицированных посредством пэннинга/конверсии scFv и скринига на фильтре.

Библиотеку фагового дисплея последовательностей вариабельной области легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов человека подвергали пэннинга с антигеном с последующим автоматическим скринингом и отбором антител для идентификации высокоаффинных антител scFv против человеческого белка MASP-2. Проводили три цикла пэннинга фаговой библиотеки scFv против меченного HIS или меченного биотином MASP-2A. После третьего цикла пэннинга проводили элюцию сначала с использованием MBL и затем с использованием TEA (щелочи). Для мониторирования специфического обогащения фагов, экспонирующих фрагменты scFv против мишени - MASP-2A, проводили поликлональный фаговый ELISA против иммобилизованного MASP-2A. Гены scFv из 3 цикла пэннинга клонировали в экспрессирующий вектор pHOG и проводили скрининг на фильтрах в малом масштабе для поиска специфических клонов против MASP-2A.

Бактериальные колонии, содержащие плазмиды, кодирующие фрагменты scFv из третьего цикла пэннинга, отбирали, наносили на сетку на нитроцеллюлозных мембранах и выращивали в течение ночи на неиндуцирующей среде для получения исходных планшетов. Всего 18000 отобрали и анализировали из третьего цикла пэннинга, половину после конкурентной элюции и половину после последующей элюции TEA. При пэннинге библиотеки фагмид scFv против MASP-2A с последующими конверсией scFv и скринингом на фильтрах выявили 137 положительных клонов. 108/137 клонов являлись положительными в анализе ELISA по связыванию с MASP-2 (данные не представлены), из них 45 дополнительно анализировали по способности блокировать активность MASP-2 в нормальной сыворотке человека.

Анализ для измерения ингибирования формирования конвертазы C3 лектинового пути.

Функциональный анализ, который измеряет ингибирование формирования конвертазы C3 лектинового пути, использовали для оценки блокирующей активности клонов-кандидатов scFv против MASP2. Активность сериновой протеазы MASP-2 является необходимой для образования двух белковых компонентов (C4b, C2a), которые содержит конвертаза C3 лектинового пути. Таким образом, scFv против MASP-2, ингибирующий функциональную активность MASP-2 (т.е., блокирующий MASP-2 scFv), ингибирует формирование de novo конвертазы C3 лектинового пути. C3 содержит нетипичную и высоко реакционноспособную тиоэфирную группу в качестве части структуры. При расщеплении C3 посредством конвертазы C3 в этом анализе, тиоэфирная группа на C3b может формировать ковалентную связь с гидроксильной группой или аминогруппой на макромолекулах, иммобилизованных на дне пластиковых лунок, посредством сложноэфирных или амидных связей, таким образом, облегчая детекцию C3b в анализе ELISA.

Дрожжевой маннан является известным активатором лектинового пути. В следующем способе для измерения формирования конвертазы C3, пластиковые лунки, покрытые маннаном, инкубировали с разведенной человеческой сывороткой для активации лектинового пути. Затем лунки промывали и анализировали C3b, иммобилизированный в лунках, с использованием стандартных способов ELISA. Количество C3b, образованного в этом анализе, является прямым отражением формирования de novo конвертазы C3 лектинового пути. Клоны scFv против MASP-2 в выбранных концентрациях тестировали в этом анализе по их способности ингибировать формирование конвертазы C3 и последующее образование C3b.

Способы.

клонов-кандидатов, идентифицированных, как описано выше, экспрессировали, очищали и разводили до одинаковой концентрации для хранения, которую снова разводили в содержащем Са++ и Mg~ буфере GVB (4,0 мМ барбитал, 141 мМ NaCl, 1,0 мМ MgCl₂, 2,0 мМ CaCl₂, 0,1% желатин, pH 7,4), чтобы убедиться, что все клоны имеют одно и то же количество буфера. Каждый из клонов scFv тестировали в трех повторах в концентрации 2 мкг/мл. Положительный контроль представлял собой Fab2 OMS100, и его тестировали при 0,4 мкг/мл. Формирование C3c мониторировали в присутствии и в отсутствие клонов scFv/IgG.

Маннан разводили до концентрации 20 мкг/мл (1 мкг/лунку) в 50 мМ карбонатном буфере (15 мМ Na₂CO₃+35 мМ NaHCO₃+1,5 мМ NaN₃), pH 9,5, и покрывали планшет для ELISA в течение ночи при 4°C. На следующие сутки, покрытые маннаном планшеты промывали 3 раза с использованием 200 мкл PBS. Затем 100 мкл блокирующего раствора 1% HSA добавляли в лунки и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали 3 раза с использованием 200 мкл PBS, и сохраняли на льду с 200 мкл PBS до добавления образцов.

Нормальную человеческую сыворотку разводили до 0,5% в буфере CaMgGVB, и клоны scFv или положительный контроль Fab2 OMS100 добавляли в трех повторах при 0,01 мкг/мл; 1 мкг/мл (только контроль OMS100) и 10 мкг/мл в этот буфер и предварительно инкубировали 45 минут на льду перед добавлением в блокированный планшет ELISA. Реакцию инициировали посредством инкубации в тече- 60 045598 ние одного часа при 37°C и останавливали посредством переноса планшетов в ледяную баню. Накопление C3b детектировали с использованием антитела кролика против C3c мыши, затем антитела козы против антитела кролика с HRP. Отрицательный контроль представлял собой буфер без антитела (отсутствие антитела=максимальное накопление C3b), и положительный контроль представлял собой буфер с ЭДТА (отсутствие накопления C3b). Фон определяли посредством проведения такого же анализа, за исключением того, что лунки не содержали маннана. Фоновый сигнал для планшетов без маннана вычитали из сигналов в содержащих маннан лунках. Критерий отсечения устанавливали на половину активности не имеющего отношения к делу клона scFv (VZV) и только буфера.

Результаты. На основании критерия отсечения, обнаружили, что всего 13 клонов блокируют активность MASP-2. Все 13 клонов, приводящие к > 50% супрессии пути, отбирали и секвенировали, получив 10 уникальных клонов. Обнаружили, что все десять клонов имеют одинаковый подкласс легких цепей, λ3, но три различных подкласса тяжелых цепей: VH2, VH3 и VH6. В функциональном анализе, для пяти из десяти клонов-кандидатов scFv получили значения IC₅₀ нМ, меньшие, чем целевой критерий 25 нМ с использованием 0,5% человеческой сыворотки.

Для идентификации антител с улучшенной активностью, три исходных клона scFv, идентифицированных, как описано выше, подвергали перетасовке легких цепей. Этот способ включает получение комбинаторной библиотеки, состоящей из VH из каждого из исходных клонов, спаренных с библиотекой наивных, человеческих легких цепей (VL) лямбда, полученных от шести здоровых доноров. Затем эту библиотеку подвергали скринигу по клонам scFv с улучшенной аффинностью связывания и/или функциональностью.

Таблица 9

Сравнение функциональной активности по IC₅₀ (нМ) лидирующих дочерних клонов и их соответствующих исходных клонов (все в формате scFv)

клон scFv	1% человеческая сыворотка анализ СЗ (1С₅₀ нМ)	90% человеческая сыворотка анализ СЗ (1С₅₀ нМ)	90% человеческая сыворотка анализ С 4 (1С₅₀ нМ)
17D2 Omc	38	nd	nd
17D20m d3521Nll	26	>1000	140
17N16mc	68	nd	nd
17N16m d!7N9	48	15	230

Ниже представлены последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) для исходных клонов и дочерних клонов, показанных выше в табл. 9.

CDR по Kabat (31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-107 (H3)) выделены жирным шрифтом; и CDR по Chothia (26-32 (H1), 52-56 (H2) и 95-101 (H3)) подчеркнуты.

Вариабельная область тяжелой цепи (VH) 17D20_35VH-21N11VL (SEQ ID NO: 67, кодирована SEQ ID NO: 66)

OVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKMGVSWIROPPGKALEWLAHIFSSDEK

SYRTSLKSRLTISKDTSKNOWL·TMTNMDPVDTATYYCARIRRGGIDYWGOGTLVTVSS

Вариабельная область тяжелой цепи (VH) d17N9 (SEQ ID NO: 68)

OVOLOQSGPGLVKPSOTLSLTCAISGDSVSSTSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKW

YNDYAVSVKSRITINPDTSKNOFSLOLNSVTPEDTAVYYCARDPFGVPFDIWGOGTMVTVSS

Ниже представлены последовательности вариабельной области легкой цепи (VL) последовательности для исходных клонов и дочерних клонов.

CDR по Kabat (24-34 (L1); 50-56 (L2); и 89-97 (L3) выделены жирным шрифтом; и CDR по Chothia (24-34 (L1); 50-56 (L2) и 89-97 (L3) подчеркнуты. Эти области являются одинаковыми, независимо от нумерации посредством системы Kabat или Chothia.

Вариабельная область легкой цепи (VL) 17D20m_d3521N11 (SEQ ID NO: 69)

OPVLTOPPSLSVSPGOTASITCSGEKLGDKYAYWYOOKPGOSPVLVMYQDKQRPSGIPE

RFSGSNSGNTATLTISGTOAMDEADYYCOAWDSSTAVFGGGTKLTVL

Вариабельная область легкой цепи (VL) 17N16m_d17N9 (SEQ ID NO: 71, кодирована SEQ ID NO: 70)

SYELIQPPSVSVAPGQTATITCAGDNLGKKRVHWYOORPGOAPVLVIYDDSDRPSGIPD

RFSASNSGNTATLTITRGEAGDEADYYCQVWDIATDHVVFGGGTKLTVLAAAGSEQKLISE

Антитела против MASP-2 OMS100 и MoAb_d3521N11VL, (содержащие вариабельную область тяжелой цепи, приведенную как SEQ ID NO: 67 и вариабельную область легкой цепи, приведенную как SEQ ID NO: 69, также обозначенную как OMS646), для обоих из которых показано связывание с MASP-2 человека с высокой аффинностью и наличие способности блокировать функциональную актив- 61 045598 ность комплемента, анализировали применительно к связыванию эпитопов посредством анализа дотблоттинга. Результаты показывают, что антитела OMS646 и OMS100 являются высоко специфическими для MASP-2 и не связываются с MASP-1/3. Ни одно из антител не связывалось ни с фрагментами

MAp19, ни с фрагментами MASP-2, которые не содержали домен CCP1 из MASP-2, что привело к заключению, что участки связывания включают CCP1.

Определили, что антитело против MASP-2 OMS646 авидно связывается с рекомбинантным MASP-2 (Kd 60-250 пМ) с >5000-кратной избирательностью по сравнению с Cls, Clr или MASP-1 (см. табл. 10 ниже).

Таблица 10

Аффинность и специфичность взаимодействия антитело OMS646 против MASP-2 MASP-2, как оценено посредством исследований твердофазного ELISA

Антиген	K_D (пМ)
MASP-1	>500000
MASP-2	62+23*
MASP-3	>500000
Очищенный человеческий Clr	>500000
Очищенный человеческий Cls	-500000

* Среднее±SD; n=12.

OMS646 специфически блокирует зависимую от лектина активацию терминальных компонентов комплемента.

Способы.

Эффект OMS646 на накопление мембраноатакующего комплекса (MAC) анализировали с использованием специфических для пути условий для лектинового пути, классического пути и альтернативного пути. Для этой цели, использовали набор для скрининга комплемента Wieslab Comp300 (Wieslab, Lund, Sweden), следуя инструкциям производителя.

Результаты.

На фиг. 17A графически проиллюстрирован уровень накопления MAC в присутствии или в отсутствие антитела против MASP-2 (OMS646) в условиях анализа, специфических для лектинового пути. На фиг. 17B графически проиллюстрирован уровень накопления MAC в присутствии или в отсутствие антитела против MASP-2 (OMS646) в условиях анализа, специфических для классического пути. На фиг. 17С графически проиллюстрирован уровень накопления MAC в присутствии или в отсутствие антитела против MASP-2 (OMS646) в условиях анализа, специфических для альтернативного пути.

Как показано на фиг. 17A, OMS646 блокирует опосредованную лектиновым путем активацию накопления MAC с значением IC50 приблизительно 1 нМ. Однако, OMS646 не оказывало эффекта на накопление MAC, полученное в результате опосредованной классическим путем активации (фиг. 17B) или в результате опосредованной альтернативным путем активации (фиг. 17С).

Фармакокинетика и фармакодинамика OMS6 4 6 после внутривенного (IV) или подкожного (SC) введения мышам.

Фармакокинетику (PK) и фармакодинамику (PD) OMS646 оценивали в 28-суточном исследовании PK/PD однократной дозы у мышей. В исследовании тестировали уровни дозирования 5 мг/кг и 15 мг/кг OMS646, введенные подкожно (SC), так же как уровень дозирования 5 мг/кг OMS646, введенный внутривенно (IV).

Применительно к профилю PK OMS646, на фиг. 18 графически проиллюстрирована концентрация OMS646 (среднее из n=3 животных/группы) как функцию от времени после введения OMS646 в указанной дозе. Как показано на фиг. 18, при 5 мг/кг SC, OMS646 достигало максимальной концентрации в плазме 5-6 мкг/мл приблизительно через 1-2 суток после дозирования. Биодоступность OMS646 при 5 мг/кг SC составляла приблизительно 60%. Как далее показано на фиг. 18, при 15 мг/кг SC, OMS646 достигало максимальной концентрации в плазме 10-12 мкг/мл приблизительно через 1-2 суток после дозирования. Для всех групп, OMS646 медленно выводилось из системного кровотока с терминальным временем полужизни приблизительно 8-10 суток. Профиль OMS646 является типичным для человеческих антител у мышей.

PD активность OMS646 графически проиллюстрирована на фиг. 19A и 19B. На фиг. 19A и 19B показан ответ PD (падение системной активности лектинового пути) для каждой мыши в группах 5 мг/кг IV (фиг. 19A) и 5 мг/кг SC (фиг. 19B). Пунктирной линией показан фон анализа (максимальное ингибирование; сыворотка наивных мышей с добавлением in vitro избытка OMS646 до анализа). Как показано на фиг. 19A, после IV введения 5 мг/кг OMS646, системная активность лектинового пути немедленно падала до почти не поддающихся детекции уровней, и для активности лектинового пути показано только умеренное восстановление в течение периода наблюдения 28 суток. Как показано на фиг. 19B, у мышей после дозирования 5 мг/кг OMS646 SC, наблюдали зависимое от времени ингибирование активности лектинового пути. Активность лектинового пути падала до почти не поддающихся детекции уровней в

- 62 045598 течение 24 часов после введения лекарственного средства и оставалась на низких уровнях в течение по меньшей мере 7 суток. Активность лектинового пути постепенно увеличивалась с течением времени, однако не возвращалась к уровням до дозирования в течение периода наблюдения 28 суток. Наблюдаемая активность лектинового пути в зависимости от профиля времени после введения 15 мг/кг SC являлась сходной с активностью для дозы 5 мг/кг SC dose (данные не представлены), показывая насыщение конечной точки PD. Эти данные дополнительно показывают, что еженедельные дозы 5 мг/кг OMS646, введенные либо IV, либо SC, являются достаточными для достижения постоянной супрессии системной активности лектинового пути у мышей.

Пример 16.

В этом примере описан анализ эффективности моноклонального антитела против MASP-2 (OMS646), человеческого антитела IgG4, которое блокирует функцию лектинового пути, в модели на мышах связанной с возрастом дегенерации желтого пятна.

Уровень техники/Обоснование.

Как описано в примере 15, получено полностью человеческое моноклональное антитело против MASP-2 (OMS646), которое специфически блокирует функцию лектинового пути человека. В этом примере, OMS646 анализировали в модели на мышах индуцированной лазером хориоидальной неоваскуляризации (CNV), общеупотребительной модели связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD), описанной в Bora et al. (J Immunol 174:491-497, 2005) вместе с антителом против VEGF в качестве сравнительного антитела.

Способы.

В этом исследовании оценивали эффект трех уровней дозирования OMS646 (2 мг/кг; 5 мг/кг и 20 мг/кг SC) по сравнению с обработкой носителем. mAb против MASP-2 мыши, происходящее из Fab2 #11 (3 мг/кг SC), полученное, как описано в примере 14, и крысиное моноклональное антитело, которое связывается с VEGF-A мыши и блокирует функцию VEGF-A (5 мг/кг IP, клон 2G11-2A05, закупленное из BioLegend®, San Diego, CA), включали в качестве положительной контрольной обработки и сравнительной обработки, соответственно. Исследование включало 9-10 мышей на экспериментальную группу, и его проводили слепым способом. Для оценки эффективности при постоянных и предсказуемых уровнях лекарственного средства, все обработки проводили за восемь суток до, и затем снова за одни сутки до индукции лазером, за исключением антитела против VEGF, которое инъецировали за одни сутки до и трое суток после индукции лазером. Через семь суток после лазерного повреждения, мышей подвергали анестезии, системной перфузии с использованием 0,75 мл FITC-декстрана и умерщвляли. Глаза фиксировали в формалине, получали срезы задней часть глаз, содержащей пораженные области, и погружали в реагент, препятствующий выгоранию флуоресценции, ProLong (Invitrogen). Проводили конфокальную микроскопию поврежденных областей, и получали изображения из каждой области. Измерения CNV и поврежденных областей проводили с использованием программы ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland USA). Площадь CNV нормализовали по отношению к размеру поврежденного пятна для каждого глаза, где % CNV представляет собой среднюю площадь неоваскуляризации на поврежденное пятно, рассчитанную как (площадь CNV /площадь пятна) X 100. Исследование проводили слепым способом с использованием кодированных растворов тестируемых веществ.

Результаты: Исход этого исследования показан на фиг. 20. Как показано на фиг. 20, по сравнению с группой, подвергнутой обработке носителем, для подвергнутых обработке OMS646 мышей показано поддающееся оценке ингибирование CNV при всех тестированных уровнях дозирования, с относительным уменьшением CNV в диапазоне от 29% до 50%. Для обработки антителом против VEGF показано меньшее (приблизительно на 15%) уменьшение CNV. mAb против MASP-2 мыши, происходящее из Fab2 #11, также уменьшало CNV приблизительно на 30% по сравнению с обработкой носителем (данные не представлены), что согласуется с результатами, наблюдаемыми в исследовании, проведенном на мышах MASP-2 (-/-), описанном в примере 12, в котором наблюдали уменьшение CNV на 30% через 7 суток после обработки лазером у мышей MASP-2 (-/-) по сравнению с контрольными мышами дикого типа.

Результаты этого исследования предоставляют доказательства того, что системное введение OMS646 обеспечивает эффективную терапию для лечения неоваскулярной AMD. В отличие от современных и появляющихся лекарственных средств против AMD и других офтальмологических ангиогенных заболеваний и нарушений, требующих инъекции в стекловидное тело, OMS646 является также эффективным при подкожном введении.

Можно дополнительно отметить, что ранее показано, что антитело против VEGF-A, используемое в этом исследовании (клон 2G11-2A05 из BioLegend®, San Diego, CA), уменьшают распространение сосудов в роговицу в модели на мышах индуцированного HSV-1 лимфангиогенеза роговицы при введении посредством субконъюнктивальной инъекции в концентрации 100 мкг/мл, как описано в Wuest et al. (J Exp Med 207:101, 2009). В другом исследовании Lu et al. (Cancer Res 72:2239-50, 2012), обработка антителом против VEGF (клон 2G11-2A05) мышей Ceacam 1 -/-, несущих опухоли B16, значимо уменьшало размер опухоли, так же как сосудистую сеть опухоли в модели опухоли ободочной кишки при введении IP при приблизительно 3 мг/кг дважды в неделю. С учетом данных настоящего исследования, показы

- 63 045598 вающих, что OMS646 является по меньшей мере настолько же эффективным, как антитело против VEGF, в уменьшении CNV при системной доставке мышам при всех тестированных уровнях дозирования, ожидают, что ингибирующее MASP-2 средство, такое как OMS646, может также являться эффективным в качестве антиангиогенного средства для использования для ингибирования зависимой от ангиогенеза злокачественной опухоли, например, такой как, зависимая от ангиогенеза злокачественная опухоль, выбранная из группы, состоящей из солидной опухоли(опухолей), передающиеся через кровь опухоли, карциноидные опухоли высокого риска и метастазы опухолей. Примерами зависимых от ангиогенеза злокачественных опухолей являются злокачественные опухоли типов, для которых одобрено лечение посредством средства против VEGF, такого как антитело против VEGF Авастин® (бевацизумаб, Genentech, CA). Например, бевацизумаб одобрен для лечения следующих зависимых от ангиогенеза злокачественных опухолей: метастазирующего колоректального рака, неплоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого, метастазирующего почечноклеточного рака и глиобластомы.

Дополнительными примерами зависимых от ангиогенеза злокачественных опухолей являются злокачественные опухоли типов, для которых ожидают получение преимущества от лечения посредством средства против VEGF, такого как антитело против VEGF Авастин® (бевацизумаб, Genentech, CA), например, такие как любая злокачественная опухоль, для которой уже известно лечение или находится в разработке лечение с использованием ангиостатического соединения (например, антагониста VEGF), включая злокачественные опухоли на поздних стадиях, метастазирующие в печень, меланому, рак яичника, нейробластому, рак поджелудочной железы, печеночноклеточную карциному, рак эндометрия, рак предстательной железы, ангиосаркому, метастазирующую или неоперабельную ангиосаркому, рецидивирующие опухоли стромы полового тяжа яичников, рак пищевода, рак желудка, неходжскинскую лимфому, лимфому Ходжкина, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, рецидивирующий или метастазирующий рак головы и шеи, неопластический менингит, рак шейки матки, рак тела матки, перитонеальный карциноматоз на позних стадиях, глиосаркому, нейроэндокринную карциному, экстракраниальную саркому Юинга, острый миелоидный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, интракраниальную менингиому, саркому Капоши на поздних стадиях, мезотелиому, злокачественную опухоль желчевыводящих путей, метастазирующие карциноидные опухоли и злокачественную опухоль мочевыводящих путей на поздних стадиях. Предпочтительные злокачественные опухоли в этом контексте включают: колоректальные злокачественные опухоли, злокачественные опухоли молочной железы (включая метастазирующий рак молочной железы, воспалительную карциному молочной железы), легкого, почек, печени, пищевода, яичников, поджелудочной железы, предстательной железы и желудка, так же как глиому, стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта, лимфому, меланому и карциноидные опухоли.

Ожидают также, что ингибирующее MASP-2 средство, такое как OMS646, может являться эффективным в качестве антиангиогенного средства для ингибирования зависимой от ангиогенеза доброкачественной опухоли, например, такой как, зависимая от ангиогенеза доброкачественная опухоль, выбранная из группы, состоящей из гемангиом, неврином слухового нерва, нейрофибром, трахом, карциноидных опухолей и пиогенных гранулем. Ожидают также, что ингибирующее MASP-2 средство, такое как OMS646, может являться эффективным в качестве антиангиогенного средства для использования в ингибировании ангиогенеза при AMD и других офтальмологических ангиогенных заболеваниях или нарушениях, таких как увеит, меланома глаза, неоваскуляризация роговицы, первичный птеригий, стромальный кератит HSV, индуцированный HSV-1 лимфангиогенез роговицы, пролиферативная диабетическая ретинопатия, диабетический отек желтого пятна, ретинопатия недоношенных, окклюзия вен сетчатки, отторжение трансплантата роговицы, неоваскулярная глаукома, геморрагия стекловидного тела, вторичная по отношению к пролиферативной диабетической ретинопатии, нейромиелит зрительного нерва и покраснение радужки.

С учетом данных настоящего исследования, показывающих, что OMS646 является по меньшей мере настолько же эффективным, как антитело против VEGF, в уменьшении CNV при системной доставке мышам при всех тестированных уровнях дозирования, ожидают также, что ингибирующее MASP-2 средство, такое как OMS646, может также являться эффективным в качестве антиангиогенного средства для использования для ингибирования зависимого от ангиогенеза состояния, такого как миелофиброз и наследственная геморрагическая телеангиэктазия.

Пример 17.

В этом примере описано использование линии MASP-2 (-/-)и ингибирующих MASP-2 антител для подтверждения того, что ингибирование зависимого от MASP-2 лектинового пути активации комплемента индуцирует антиангиогенный эффект в модели на животных лигирования бедренной артерии.

Уровень техники/Обоснование: С учетом неожиданных результатов, описанных в примере 16, показывающих, что человеческое mAb против MASP-2 OMS646 ингибирует CNV в модели AMD по меньшей мере в равной, если не в большей степени, чем антитело против VEGF-A, следующие исследования проводили для подтверждения того, что ангиогенез уменьшен у мышей с недостаточностью MASP-2, а также, что антитело против MASP-2, блокирующее лектиновый путь, такое как OMS646, является эффек- 64 045598 тивным для использования in vivo в качестве ингибирующего ангиогенез средства при системном введении.

Способы.

Исследование #1. Артериогенез индуцировали у мышей MASP-2 (-/-), контрольных мышей дикого типа и мышей дикого типа, подвергнутых предварительной обработке ингибирующим антителом против MASP-2, посредством лигирования бедренной артерии, и лазерные допплеровские измерения перфузии проводили in vivo, чтобы наблюдать, влияет ли на процесс роста коллатеральной артерии недостаточность MASP-2. Измерения перфузии проводили до суток 21 после лигирования бедренной артерии.

Иммуногистохимию проводили на сутки 3 после лигирования бедренной артерии.

(a) В верхней части конечности, где возникает артериогенез, для исследования влияния недостаточности MASP-2 на периваскулярную инфильтрацию лейкоцитов (артериогенез сильно зависит от инфильтрации лейкоцитов, принимая во внимание, что лейкоциты обеспечивают растущие коллатеральные сосуды факторами роста, цитокинами); и (b) В нижней части конечности, где возникает ишемия из-за лигирования бедренной артерии, для исследования тяжести ишемического повреждения ткани, инфильтрации лейкоцитов и ангиогенеза у мышей MASP-2 (-/-), У мышей дикого типа, подвергнутых обработке антителом против MASP-2, и у контрольных мышей дикого типа.

(c) Исследование экспрессии генов на уровнях РНК и белка также проводили на выделенных коллатеральных сосудах через 12 ч или 24 ч после лигирования бедренной артерии у мышей MASP-2 (-/-). У мышей дикого типа, подвергнутых обработке антителом против MASP-2, и у контрольных мышей дикого типа.

На основании антиангиогенного эффекта, описанного выше, ожидают, что ингибирование MASP-2 может предотвращать или уменьшать артериогенез в верхней части конечности на 25-50%. Кроме того, показано, что ингибирование MASP-2 уменьшает управляемый комплементом патологический ответ после ишемии на 25%-50% (Schwaeble et al., PNAS 108(18):7523-7528). Таким образом, можно также ожидать, что ингибирование MASP-2 может ингибировать васкулогенез в нижней части конечности до сходной степени.

В то время как иллюстративные варианты осуществления проиллюстрированы и описаны, следует понимать, что можно осуществлять различные изменения без отклонения от содержания и объема изобретения.

Список последовательностей < 110> Omeros Corporation

University of Leicester

Demopulos, Gregory A.

Schwaeble, Hans-Wilhelm

Dudler, Thomas Tjoelker, Larry W.

< 120> Способы ингибирования ангиогенеза у нуждающегося в этом субъекта < 130> MP.1.0239.PCT <150> US 62/315,857 <151> 2016-03-31 <160>71 <170> PatentIn версии 3.5 <210>1 <211>725 < 212> ДНК < 213> Homo sapiens <220>

< 221> CDS < 222> (27).. (584) < 400>1 ggccaggcca gctggacggg cacacc atg agg ctg ctg acc ctc ctg ggc ctt53

Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu 15 ctg tgt ggc tcg gtg gcc acc ccc ttg ggc ccg aag tgg cct gaa cct101

- 65 045598

Leu 10

Cys

Gly

Ser

Val

Ala 15

Thr

Pro

Leu

Gly

Pro 20

Lys

Trp

Pro

Glu

Pro 25

gtg

ttc

ggg

cgc

ctg

gca

tcc

ccc

ggc

ttt

cca

ggg

gag

tat

gcc

aat

Val

Phe

Gly

Arg

Leu 30

Ala

Ser

Pro

Gly

Phe 35

Pro

Gly

Glu

Tyr

Ala 40

Asn

gac

cag

gag

cgg

cgc

tgg

acc

ctg

act

gca

ccc

ggc

tac

cgc

ctg

Asp

Gln

Glu

Arg 45

Arg

Trp

Thr

Leu

Thr 50

Ala

Pro

Gly

Tyr 55

Arg

Leu

cgc

ctc

tac

ttc

acc

cac

ttc

gac

ctg

gag

ctc

tcc

cac

ctc

tgc

gag

Arg

Leu

Tyr 60

Phe

Thr

His

Phe

Asp 65

Leu

Glu

Leu

Ser

His 70

Leu

Cys

Glu

tac

gac

ttc

gtc

aag

ctg

agc

tcg

ggg

gcc

aag

gtg

ctg

gcc

acg

ctg

Tyr

Asp 75

Phe

Val

Lys

Leu

Ser 80

Ser

Gly

Ala

Lys

Val 85

Leu

Ala

Thr

Leu

tgc

ggg

cag

gag

agc

aca

gac

acg

gag

cgg

gcc

cct

ggc

aag

gac

act

Cys 90

Gly

Gln

Glu

Ser

Thr 95

Asp

Thr

Glu

Arg

Ala 100

Pro

Gly

Lys

Asp

Thr 105

ttc

tac

tcg

ctg

ggc

tcc

agc

ctg

gac

att

acc

ttc

cgc

tcc

gac

tac

Phe

Tyr

Ser

Leu

Gly 110

Ser

Leu

Asp

Ile 115

Thr

Phe

Arg

Ser

Asp 120

Tyr

tcc

aac

gag

aag

ccg

ttc

acg

ggg

ttc

gag

gcc

ttc

tat

gca

gcc

gag

Ser

Asn

Glu

Lys 125

Pro

Phe

Thr

Gly

Phe 130

Glu

Ala

Phe

Tyr

Ala 135

Ala

Glu

gac

att

gac

gag

tgc

cag

gtg

gcc

ccg

gga

gag

gcg

ccc

acc

tgc

gac

Asp

Ile

Asp 140

Glu

Cys

Gln

Val

Ala 145

Pro

Gly

Glu

Ala

Pro 150

Thr

Cys

Asp

cac

tgc

cac

aac

cac

ctg

ggc

ggt

ttc

tac

tgc

tcc

tgc

cgc

gca

His

His 155

Cys

His

Asn

His

Leu 160

Gly

Phe

Tyr

Cys 165

Ser

Cys

Arg

Ala

ggc

tac

gtc

ctg

cac

cgt

aac

aag

cgc

acc

tgc

tca

gag

cag

agc

ctc

Gly 170

Tyr

Val

Leu

His

Arg 175

Asn

Lys

Arg

Thr

Cys 180

Ser

Glu

Gln

Ser

Leu 185

tag cctcccctgg agctccggcc tgcccagcag gtcagaagcc agagccagcc tgctggcctc agctccgggt tgggctgaga tggctgtgcc ccaactccca ttcacccacc atggacccaa taataaacct ggccccaccc c

149

197

245

293

341

389

437

485

533

581

634

694

725 <210>2 <211>185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>2

Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu 1 5

Leu Cys Gly Ser Val Ala 10 15

Thr

Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro 20 25

Val Phe Gly Arg Leu Ala

Ser

Pro Gly Phe Pro Gly Glu 35

Tyr Ala

Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 45

Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr

Phe Thr His Phe

- 66 045598

55

Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr 65 70

Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys

90

Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe

100 105

Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser

115 120

Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp

130 135

Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His 145 150

Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly

165 170

Lys Arg Thr Cys Ser Glu Gln Ser Leu

180 185 <210>3 <211>170 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>3

Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro

510

Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn

25

Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu

40

Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu

55

Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu 65 70

Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr

90

Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr

100 105

Phe Val Lys Leu Ser 80

Gln Glu Ser Thr Asp 95

Ser Leu Gly Ser Ser 110

Glu Lys Pro Phe Thr 125

Asp Glu Cys Gln Val 140

Cys His Asn His Leu

160

Val Leu His Arg Asn

175

Phe Gly Arg Leu Ala 15

Gln Glu Arg Arg Trp 30

Leu Tyr Phe Thr His 45

Asp Phe Val Lys Leu 60

Gly Gln Glu Ser Thr

Tyr Ser Leu Gly Ser

Asn Glu Lys Pro Phe 110

- 67 045598 <210> 4 <211> 2460 <212> ДНК <213> Homo sapiens <220>

<221>

<222>

CDS (22) .

(2082) <400> 4 ggccagctgg acgggcacac c tgt ggc tcg gtg gcc acc Cys Gly Ser Val Ala Thr 15 ttc ggg cgc ctg gca tcc Phe Gly Arg Leu Ala Ser 30 cag gag cgg cgc tgg acc Gln Glu Arg Arg Trp Thr 45 ctc tac ttc acc cac ttc Leu Tyr Phe Thr His Phe 60 gac ttc gtc aag ctg agc Asp Phe Val Lys Leu Ser 75 80 ggg cag gag agc aca gac Gly Gln Glu Ser Thr Asp 95 tac tcg ctg ggc tcc agc Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 110 aac gag aag ccg ttc acg Asn Glu Lys Pro Phe Thr 125 att gac gag tgc cag gtg Ile Asp Glu Cys Gln Val 140 cac tgc cac aac cac ctg His Cys His Asn His Leu 155 160

Thr Gly Phe Glu Ala Phe

115

Val Ala Pro Gly Glu Ala

130

Leu Gly Gly Phe Tyr Cys

145 150

Asn Lys Arg Thr Cys Ser

165

Tyr	Ala 120	Ala	Glu	Asp	Ile	Asp 125	Glu	Cys	Gln
Pro 135	Thr	Cys	Asp	His	His 140	Cys	His	Asn	His
Ser	Cys	Arg	Ala	Gly 155	Tyr	Val	Leu	His	Arg 160
Glu	Gln	Ser	Leu 170

atg agg ctg ctg acc Met Arg Leu Leu Thr 1 5 ccc ttg ggc ccg aag Pro Leu Gly Pro Lys 20 ccc ggc ttt cca ggg Pro Gly Phe Pro Gly 35 ctg act gca ccc ccc Leu Thr Ala Pro Pro 50 gac ctg gag ctc tcc Asp Leu Glu Leu Ser 65 tcg ggg gcc aag gtg Ser Gly Ala Lys Val 85 acg gag cgg gcc cct Thr Glu Arg Ala Pro 100 ctg gac att acc ttc Leu Asp Ile Thr Phe 115 ggg ttc gag gcc ttc

Gly Phe Glu Ala Phe 130 gcc ccg gga gag gcg Ala Pro Gly Glu Ala 145 ggc ggt ttc tac tgc Gly Gly Phe Tyr Cys 165 ctc ctg ggc ctt ctg Leu Leu Gly Leu Leu 10 tgg cct gaa cct gtg Trp Pro Glu Pro Val 25 gag tat gcc aat gac Glu Tyr Ala Asn Asp 40 ggc tac cgc ctg cgc Gly Tyr Arg Leu Arg 55 cac ctc tgc gag tac His Leu Cys Glu Tyr 70 ctg gcc acg ctg tgc Leu Ala Thr Leu Cys 90 ggc aag gac act ttc Gly Lys Asp Thr Phe 105 cgc tcc gac tac tcc Arg Ser Asp Tyr Ser 120 tat gca gcc gag gac Tyr Ala Ala Glu Asp 135 ccc acc tgc gac cac Pro Thr Cys Asp His 150 tcc tgc cgc gca ggc Ser Cys Arg Ala Gly 170

147

195

243

291

339

387

435

483

531

- 68 045598 tac gtc ctg Tyr Val Leu cag gtc ttc

Gln Val Phe cgg ccg tat Arg Pro Tyr 205 cac cgt aac aag His Arg Asn Lys 175 acc cag agg tct Thr Gln Arg Ser 190 ccc aaa ctc tcc Pro Lys Leu Ser cgc acc tgc tca gcc Arg Thr Cys Ser Ala 180 ggg gag ctc agc agc Gly Glu Leu Ser Ser 195 agt tgc act tac agc Ser Cys Thr Tyr Ser 210 ctg tgc

Leu Cys cct gaa Pro Glu 200 atc agc Ile Ser 215 tcc ggc Ser Gly 185 tac cca Tyr Pro ctg gag

Leu Glu gag ggg ttc agt gtc att ctg gac ttt gtg gag tcc ttc gat gtg gag

Glu Gly Phe Ser Val Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu

220 225230 aca cac cct gaa acc ctg tgt ccc tac gac ttt ctc aag att caaaca

Thr His Pro Glu Thr Leu Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile GlnThr

235 240 245250 gac aga gaa gaa cat ggc cca ttc tgt ggg aag aca ttg ccc cacagg

Asp Arg Glu Glu His Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro HisArg

255 260265 att gaa aca aaa agc aac acg gtg acc atc acc ttt gtc aca gatgaa

Ile Glu Thr Lys Ser Asn Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr AspGlu

270 275280 tca gga gac cac aca ggc tgg aag atc cac tac acg agc aca gcgcag

Ser Gly Asp His Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr AlaGln

285 290295 cct tgc cct tat ccg atg gcg cca cct aat ggc cac gtt tca cctgtg

Pro Cys Pro Tyr Pro Met Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser ProVal

300 305310 caa gcc aaa tac atc ctg aaa gac agc ttc tcc atc ttt tgc gagact

Gln Ala Lys Tyr Ile Leu Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys GluThr

315 320 325330 ggc tat gag ctt ctg caa ggt cac ttg ccc ctg aaa tcc ttt actgca

Gly Tyr Glu Leu Leu Gln Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe ThrAla

335 340345 gtt tgt cag aaa gat gga tct tgg gac cgg cca atg ccc gcg tgcagc

Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala CysSer

350 355360 att gtt gac tgt ggc cct cct gat gat cta ccc agt ggc cga gtggag

Ile Val Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg ValGlu

365 370375 tac atc aca ggt cct gga gtg acc acc tac aaa gct gtg att cagtac

Tyr Ile Thr Gly Pro Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile GlnTyr

380 385390 agc tgt gaa gag acc ttc tac aca atg aaa gtg aat gat ggt aaatat

Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly LysTyr

395 400 405410 gtg tgt gag gct gat gga ttc tgg acg agc tcc aaa gga gaa aaatca

Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu LysSer

415 420425 ctc cca gtc tgt gag cct gtt tgt gga cta tca gcc cgc aca acagga

Leu Pro Val Cys Glu Pro Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr ThrGly

430 435440 ggg cgt ata tat gga ggg caa aag gca aaa cct ggt gat ttt cct tgg

579

627

675

723

771

819

867

915

963

1011

1059

1107

1155

1203

1251

1299

1347

1395

- 69 045598

Gly Arg Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp 445 450455 caa gtc ctg ata tta ggt gga acc aca gca gca ggt gca ctt tta tat Gln Val Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr 460 465470 gac aac tgg gtc cta aca gct gct cat gcc gtc tat gag caa aaacat

Asp Asn Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln LysHis

475 480 485490 gat gca tcc gcc ctg gac att cga atg ggc acc ctg aaa aga ctatca

Asp Ala Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg LeuSer

495 500505 cct cat tat aca caa gcc tgg tct gaa gct gtt ttt ata cat gaaggt

Pro His Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His GluGly

510 515520 tat act cat gat gct ggc ttt gac aat gac ata gca ctg att aaattg

Tyr Thr His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile LysLeu

525 530535 aat aac aaa gtt gta atc aat agc aac atc acg cct att tgt ctgcca

Asn Asn Lys Val Val Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys LeuPro

540 545550 aga aaa gaa gct gaa tcc ttt atg agg aca gat gac att gga actgca

Arg Lys Glu Ala Glu Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly ThrAla

555 560 565570 tct gga tgg gga tta acc caa agg ggt ttt ctt gct aga aat ctaatg

Ser Gly Trp Gly Leu Thr Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn LeuMet

575 580585 tat gtc gac ata ccg att gtt gac cat caa aaa tgt act gct gcatat

Tyr Val Asp Ile Pro Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala AlaTyr

590 595600 gaa aag cca ccc tat cca agg gga agt gta act gct aac atg ctttgt

Glu Lys Pro Pro Tyr Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met LeuCys

605 610615 gct ggc tta gaa agt ggg ggc aag gac agc tgc aga ggt gac agcgga

Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp SerGly

620 625630 ggg gca ctg gtg ttt cta gat agt gaa aca gag agg tgg ttt gtggga

Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe ValGly

635 640 645650 gga ata gtg tcc tgg ggt tcc atg aat tgt ggg gaa gca ggt cagtat

Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly GlnTyr

655 660665 gga gtc tac aca aaa gtt att aac tat att ccc tgg atc gag aacata

Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu AsnIle

670 675680 att agt gat ttt taa cttgcgtgtc tgcagtcaag gattcttcat ttttagaaat Ile Ser Asp Phe 685 gcctgtgaag accttggcag cgacgtggct cgagaagcat tcatcattac tgtggacatg gcagttgttg ctccacccaa aaaaacagac tccaggtgag gctgctgtca tttctccact tgccagttta attccagcct tacccattga ctcaagggga cataaaccac gagagtgaca gtcatctttg cccacccagt gtaatgtcac tgctcaaatt acatttcatt accttaaaaa

1443

1491

1539

1587

1635

1683

1731

1779

1827

1875

1923

1971

2019

2067

2122

2182

2242

2302

2362

- 70 045598 gccagtctct tttttaaact tttcatactg tgttcttatt gctgttggca gaaaaaaaaa tttctgtaaa aaaaaaaa ctgcctgtcc atgctctttg

2422

2460 <210>5 <211>686 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>5

Met

Arg

Leu

Thr 5

Leu

Gly

Leu

Leu 10

Cys

Gly

Ser

Val

Ala 15

Thr

Pro

Leu

Gly

Pro 20

Lys

Trp

Pro

Glu

Pro 25

Val

Phe

Gly

Arg

Leu 30

Ala

Ser

Pro

Gly

Phe 35

Pro

Gly

Glu

Tyr

Ala 40

Asn

Asp

Gln

Glu

Arg 45

Arg

Trp

Thr

Leu

Thr 50

Ala

Pro

Gly

Tyr 55

Arg

Leu

Arg

Leu

Tyr 60

Phe

Thr

His

Phe

Asp 65

Leu

Glu

Leu

Ser

His 70

Leu

Cys

Glu

Tyr

Asp 75

Phe

Val

Lys

Leu

Ser 80

Ser

Gly

Ala

Lys

Val 85

Leu

Ala

Thr

Leu

Cys 90

Gly

Gln

Glu

Ser

Thr 95

Asp

Thr

Glu

Arg

Ala

100

Pro

Gly

Lys

Asp

Thr

105

Phe

Tyr

Ser

Leu

Gly

110

Ser

Leu

Asp

Ile

115

Thr

Phe

Arg

Ser

Asp 120

Tyr

Ser

Asn

Glu

Lys

125

Pro

Phe

Thr

Gly

Phe

130

Glu

Ala

Phe

Tyr

Ala

135

Ala

Glu

Asp

Ile

Asp 140

Glu

Cys

Gln

Val

Ala

145

Pro

Gly

Glu

Ala

Pro

150

Thr

Cys

Asp

His

155

Cys

His

Asn

His

Leu

160

Gly

Phe

Tyr

Cys

165

Ser

Cys

Arg

Ala

Gly 170

Tyr

Val

Leu

His

Arg 175

Asn

Lys

Arg

Thr

Cys

180

Ser

Ala

Leu

Cys

Ser

185

Gly

Gln

Val

Phe

Thr

190

Gln

Arg

Ser

Gly

Glu

195

Leu

Ser

Pro

Glu

200

Tyr

Pro

Arg

Pro

Tyr 205

Pro

Lys

Leu

Ser

210

Cys

Thr

Tyr

Ser

Ile

215

Ser

Leu

Glu

Gly 220

Phe

Ser

Val

Ile

Leu

Asp

Phe

Val

Glu

Ser

Phe

Asp

Val

Glu

Thr

His

Pro

Glu

Thr

Leu

- 71 045598

240

225

230

235

Cys

Pro

Tyr

Asp

Phe

245

Leu

Lys

Ile

Gln

Thr

250

Asp

Arg

Glu

His

255

Gly

Pro

Phe

Cys

Gly

260

Lys

Thr

Leu

Pro

His

265

Arg

Ile

Glu

Thr

Lys

270

Ser

Asn

Thr

Val

Thr

275

Ile

Thr

Phe

Val

Thr

280

Asp

Glu

Ser

Gly

Asp 285

His

Thr

Gly

Trp

Lys 290

Ile

His

Tyr

Thr

Ser

295

Thr

Ala

Gln

Pro

Cys 300

Pro

Tyr

Pro

Met

Ala

305

Pro

Asn

Gly

His

310

Val

Ser

Pro

Val

Gln

315

Ala

Lys

Tyr

Ile

Leu

320

Lys

Asp

Ser

Phe

Ser

325

Ile

Phe

Cys

Glu

Thr

330

Gly

Tyr

Glu

Leu

335

Gln

Gly

His

Leu

Pro

340

Leu

Lys

Ser

Phe

Thr

345

Ala

Val

Cys

Gln

Lys 350

Asp

Gly

Ser

Trp

Asp 355

Arg

Pro

Met

Pro

Ala

360

Cys

Ser

Ile

Val

Asp 365

Cys

Gly

Pro

Asp 370

Asp

Leu

Pro

Ser

Gly 375

Arg

Val

Glu

Tyr

Ile

380

Thr

Gly

Pro

Gly

Val

385

Thr

Tyr

Lys

Ala

390

Val

Ile

Gln

Tyr

Ser

395

Cys

Glu

Thr

Phe

400

Tyr

Thr

Met

Lys

Val

405

Asn

Asp

Gly

Lys

Tyr 410

Val

Cys

Glu

Ala

Asp

415

Gly

Phe

Trp

Thr

Ser

420

Ser

Lys

Gly

Glu

Lys

425

Ser

Leu

Pro

Val

Cys 430

Glu

Pro

Val

Cys

Gly

435

Leu

Ser

Ala

Arg

Thr

440

Thr

Gly

Arg

Ile

445

Tyr

Gly

Gln

Lys

450

Ala

Lys

Pro

Gly

Asp

455

Phe

Pro

Trp

Gln

Val

460

Leu

Ile

Leu

Gly

Gly 465

Thr

Ala

Gly 470

Ala

Leu

Tyr

Asp

475

Asn

Trp

Val

Leu

Thr

480

Ala

His

Ala

Val

485

Tyr

Glu

Gln

Lys

His

490

Asp

Ala

Ser

Ala

Leu

495

Asp

Ile

Arg

Met

Gly

500

Thr

Leu

Lys

Arg

Leu

505

Ser

Pro

His

Tyr

Thr

510

Gln

Ala

- 72 045598

Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly

515 520

Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu

530 535

Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro 545 550

Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala

565 570

Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met

580 585

Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr

595 600

Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys

610 615

Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly 625 630

Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly

645 650

Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr

660 665

Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile

675 680 <210>6 <211>671 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>6

Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro

510

Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn

25

Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu

40

Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu

55

Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu 65 70

Thr His Asp Ala Gly

525

Asn Lys Val Val Ile 540

Lys Glu Ala Glu Ser

560

Gly Trp Gly Leu Thr

575

Val Asp Ile Pro Ile 590

Lys Pro Pro Tyr Pro 605

Gly Leu Glu Ser Gly 620

Ala Leu Val Phe Leu

640

Ile Val Ser Trp Gly

655

Val Tyr Thr Lys Val

670

Ser Asp Phe

685

Phe Gly Arg Leu Ala 15

Gln Glu Arg Arg Trp 30

Leu Tyr Phe Thr His 45

Asp Phe Val Lys Leu 60

Gly Gln Glu Ser Thr

- 73 045598

Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr 85 90

Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr

100 105

Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu

115 120

Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp

130 135

Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala

145 150

Asn Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser

165 170

Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr

180 185

Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu

195 200

Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val

210 215

Leu Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln

225 230

Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His

245 250

Asn Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp

260 265

Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala

275 280

Met Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro

290 295

Leu Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu

305 310

Gln Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr

325 330

Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys

340 345

Tyr Ser Leu Gly Ser 95

Asn Glu Lys Pro Phe 110

Ile Asp Glu Cys Gln

125

His Cys His Asn His 140

Tyr Val Leu His Arg

160

Gln Val Phe Thr Gln

175

Arg Pro Tyr Pro Lys 190

Glu Gly Phe Ser Val

205

Thr His Pro Glu Thr 220

Asp Arg Glu Glu His

240

Ile Glu Thr Lys Ser

255

Ser Gly Asp His Thr 270

Pro Cys Pro Tyr Pro

285

Gln Ala Lys Tyr Ile 300

Gly Tyr Glu Leu Leu

320

Val Cys Gln Lys Asp

335

Ile Val Asp Cys Gly 350

- 74 045598

Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val

355 360

Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln

370 375

Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys

385 390

Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys

405 410

Pro Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr

420 425

Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro

435 440

Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu

450 455

Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys

465 470

Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu

485 490

Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu

500 505

Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys

515 520

Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu

530 535

Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr

545 550

Thr Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu

565 570

Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala

580 585

Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu

595 600

Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser

610 615

Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val

625 630

Tyr Ile Thr Gly Pro

365

Ser Cys Glu Glu Thr 380

Val Cys Glu Ala Asp

400

Leu Pro Val Cys Glu

415

Gly Arg Ile Tyr Gly 430

Gln Val Leu Ile Leu

445

Asp Asn Trp Val Leu 460

Asp Ala Ser Ala Leu

480

Pro His Tyr Thr Gln

495

Tyr Thr His Asp Ala 510

Asn Asn Lys Val Val 525

Arg Lys Glu Ala Glu 540

Ser Gly Trp Gly Leu

560

Tyr Val Asp Ile Pro

575

Glu Lys Pro Pro Tyr 590

Ala Gly Leu Glu Ser 605

Gly Ala Leu Val Phe 620

Gly Ile Val Ser Trp

640

- 75 045598

Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val

645

Tyr Thr Lys

655

650

Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile

660665

Ile Ser Asp Phe

670 <210>7 <211>4900 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 7

cctgtcctgc	ctgcctggaa	ctctgagcag	gctggagtca	tggagtcgat	tcccagaatc	60
ccagagtcag	ggaggctggg	ggcaggggca	ggtcactgga	caaacagatc	aaaggtgaga	120
ccagcgtagg	actgcagacc	aggccaggcc	agctggacgg	gcacaccatg	aggtaggtgg	180
gcgccacagc	ctccctgcag	ggtgtggggt	gggagcacag	gcctgggcct	caccgcccct	240
gccctgccca	taggctgctg	accctcctgg	gccttctgtg	tggctcggtg	gccaccccct	300
taggcccgaa	gtggcctgaa	cctgtgttcg	ggcgcctggc	atcccccggc	tttccagggg	360
agtatgccaa	tgaccaggag	cggcgctgga	ccctgactgc	accccccggc	taccgcctgc	420
gcctctactt	cacccacttc	gacctggagc	tctcccacct	ctgcgagtac	gacttcgtca	480
aggtgccgtc	agacgggagg	gctggggttt	ctcagggtcg	gggggtcccc	aaggagtagc	540
cagggttcag	ggacacctgg	gagcaggggc	caggcttggc	caggagggag	atcaggcctg	600
ggtcttgcct	tcactccctg	tgacacctga	ccccacagct	gagctcgggg	gccaaggtgc	660
tggccacgct	gtgcgggcag	gagagcacag	acacggagcg	ggcccctggc	aaggacactt	720
tctactcgct	gggctccagc	ctggacatta	ccttccgctc	cgactactcc	aacgagaagc	780
cgttcacggg	gttcgaggcc	ttctatgcag	ccgagggtga	gccaagaggg	gtcctgcaac	840
atctcagtct	gcgcagctgg	ctgtgggggt	aactctgtct	taggccaggc	agccctgcct	900
tcagtttccc	cacctttccc	agggcagggg	agaggcctct	ggcctgacat	catccacaat	960
gcaaagacca	aaacagccgt	gacctccatt	cacatgggct	gagtgccaac	tctgagccag	1020
ggatctgagg	acagcatcgc	ctcaagtgac	gcagggactg	gccgggcgcg	gcagctcacg	1080
cctgtaattc	cagcactttg	ggaggccgag	gctggcttga	taatttgagg	gtcaggagtt	1140
caaggccagc	cagggcaaca	cggtgaaact	ctatctccac	taaaactaca	aaaattagct	1200
gggcgtggtg	gtgcgcacct	ggaatcccag	ctactaggga	ggctgaggca	ggagaattgc	1260
ttgaacctgc	gaggtggagg	ctgcagtgaa	cagagattgc	accactacac	tccacctggg	1320
cgacagacta	gactccgtct	caaaaaacaa	aaaacaaaaa	ccacgcaggg	ccgagggccc	1380
atttacaagc	tgacaaagtg	ggccctgcca	gcgggagcgc	tgcaggatgt	ttgattttca	1440
gatcccagtc	cctgcagaga	ccaactgtgt	gacctctggc	aagtggctca	atttctctgc	1500
tccttagaag	ctgctgcaag	ggttcagcgc	tgtagccccg	ccccctgggt	ttgattgact	1560
cccctcatta	gctgggtgac	ctcggccgga	cactgaaact	cccactggtt	taacagaggt	1620

- 76 045598

gatgtttgca	tctttctccc	agcgctgctg	ggagcttgca	gcgaccctag	gcctgtaagg	1680
tgattggccc	ggcaccagtc	ccgcacccta	gacaggacct	aggcctcctc	tgaggtccac	1740
tctgaggtca	tggatctcct	gggaggagtc	caggctggat	cccgcctctt	tccctcctga	1800
cggcctgcct	ggccctgcct	ctcccccaga	cattgacgag	tgccaggtgg	ccccgggaga	1860
ggcgcccacc	tgcgaccacc	actgccacaa	ccacctgggc	ggtttctact	gctcctgccg	1920
cgcaggctac	gtcctgcacc	gtaacaagcg	cacctgctca	ggtgagggag	gctgcctggg	1980
ccccaacgca	ccctctcctg	ggatacccgg	ggctcctcag	ggccattgct	gctctgccca	2040
ggggtgcgga	gggcctgggc	ctggacactg	ggtgcttcta	ggccctgctg	cctccagctc	2100
cccttctcag	ccctgcttcc	cctctcagca	gccaggctca	tcagtgccac	cctgccctag	2160
cactgagact	aattctaaca	tcccactgtg	tacctggttc	cacctgggct	ctgggaaccc	2220
ctcatgtagc	cacgggagag	tcggggtatc	taccctcgtt	ccttggactg	ggttcctgtt	2280
ccctgcactg	ggggacgggc	cagtgctctg	gggcgtgggc	agccccaccc	tgtggcgctg	2340
accctgctcc	cccgactcgg	tttctcctct	cggggtctct	ccttgcctct	ctgatctctc	2400
ttccagagca	gagcctctag	cctcccctgg	agctccggct	gcccagcagg	tcagaagcca	2460
gagccaggct	gctggcctca	gctccgggtt	gggctgagat	gctgtgcccc	aactcccatt	2520
cacccaccat	ggacccaata	ataaacctgg	ccccacccca	cctgctgccg	cgtgtctctg	2580
gggtgggagg	gtcgggaggc	ggtggggcgc	gctcctctct	gcctaccctc	ctcacagcct	2640
catgaacccc	aggtctgtgg	gagcctcctc	catggggcca	cacggtcctt	ggcctcaccc	2700
cctgttttga	agatggggca	ctgaggccgg	agaggggtaa	ggcctcgctc	gagtccaggt	2760
ccccagaggc	tgagcccaga	gtaatcttga	accaccccca	ttcagggtct	ggcctggagg	2820
agcctgaccc	acagaggaga	caccctggga	gatattcatt	gaggggtaat	ctggtccccc	2880
gcaaatccag	gggtgattcc	cactgcccca	taggcacagc	cacgtggaag	aaggcaggca	2940
atgttggggc	tcctcacttc	ctagaggcct	cacaactcaa	atgcccccca	ctgcagctgg	3000
gggtggggtg	gtggtatggg	atggggacca	agccttcctt	gaaggataga	gcccagccca	3060
acaccccgcc	ccgtggcagc	agcatcacgt	gttccagcga	ggaaggagag	caccagactc	3120
agtcatgatc	actgttgcct	tgaacttcca	agaacagccc	cagggcaagg	gtcaaaacag	3180
gggaaagggg	gtgatgagag	atccttcttc	cggatgttcc	tccaggaacc	agggggctgg	3240
ctggtcttgg	ctgggttcgg	gtaggagacc	catgatgaat	aaacttggga	atcactgggg	3300
tggctgtaag	ggaatttagg	ggagctccga	aggggccctt	aggctcgagg	agatgctcct	3360
ctcttttccc	gaattcccag	ggacccagga	gagtgtccct	tcttcctctt	cctgtgtgtc	3420
catccacccc	cgccccccgc	cctggcagag	ctggtggaac	tcagtgctct	agcccctacc	3480
ctggggttgc	gactctggct	caggacacca	ccacgctccc	tgggggtgtg	agtgagggcc	3540
tgtgcgctcc	atcccgagtg	ctgcctgttt	cagctaaagc	ctcaaagcaa	gagaaacccc	3600
ctctctaagc	ggcccctcag	ccatcgggtg	ggtcgtttgg	tttctgggta	ggcctcaggg	3660
gctggccacc	tgcagggccc	agcccaaccc	agggatgcag	atgtcccagc	cacatccctg	3720

- 77 045598

tcccagtttc	ctgctcccca	aggcatccac	cctgctgttg	gtgcgagggc	tgatagaggg	3780
cacgccaagt	cactcccctg	cccttccctc	cttccagccc	tgtgctccgg	ccaggtcttc	3840
acccagaggt	ctggggagct	cagcagccct	gaatacccac	ggccgtatcc	caaactctcc	3900
agttgcactt	acagcatcag	cctggaggag	gggttcagtg	tcattctgga	ctttgtggag	3960
tccttcgatg	tggagacaca	ccctgaaacc	ctgtgtccct	acgactttct	caaggtctgg	4020
ctcctgggcc	cctcatcttg	tcccagatcc	tcccccttca	gcccagctgc	accccctact	4080
tcctgcagca	tggcccccac	cacgttcccg	tcaccctcgg	tgaccccacc	tcttcaggtg	4140
ctctatggag	gtcaaggctg	gggcttcgag	tacaagtgtg	ggaggcagag	tggggagggg	4200
caccccaatc	catggcctgg	gttggcctca	ttggctgtcc	ctgaaatgct	gaggaggtgg	4260
gttacttccc	tccgcccagg	ccagacccag	gcagctgctc	cccagctttc	atgagcttct	4320
ttctcagatt	caaacagaca	gagaagaaca	tggcccattc	tgtgggaaga	cattgcccca	4380
caggattgaa	acaaaaagca	acacggtgac	catcaccttt	gtcacagatg	aatcaggaga	4440
ccacacaggc	tggaagatcc	actacacgag	cacagtgagc	aagtgggctc	agatccttgg	4500
tggaagcgca	gagctgcctc	tctctggagt	gcaaggagct	gtagagtgta	gggctcttct	4560
gggcaggact	aggaagggac	accaggttta	gtggtgctga	ggtctgaggc	agcagcttct	4620
aaggggaagc	acccgtgccc	tcctcagcag	cacccagcat	cttcaccact	cattcttcaa	4680
ccacccattc	acccatcact	catcttttac	ccacccaccc	tttgccactc	atccttctgt	4740
ccctcatcct	tccaaccatt	catcaatcac	ccacccatcc	atcctttgcc	acacaaccat	4800
ccacccattc	ttctacctac	ccatcctatc	catccatcct	tctatcagca	tccttctacc	4860
acccatcctt	cgttcggtca	tccatcatca	tccatccatc			4900

<210>8 <211>136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>8

Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu 15

Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr

15

Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro 20

Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala

30

Ser

Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr 35

Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp 40 45

Thr

Leu Thr Ala

Pro Pro

Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe

60

Asp Leu Glu 65

Leu Ser

His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 70 75 80

Ser Gly Ala

Lys Val 85

Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp

95

- 78 045598

Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe

100 105

Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser

115 120

Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala

130 135 <210>9 <211>181 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>9

Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu

510

Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val

25

Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp

40

Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg

55

Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr 65 70

Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys

90

Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe

100 105

Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser

115 120

Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp

130 135

Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His

145 150

Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly

165 170

Ser Leu Gly Ser Ser 110

Glu Lys Pro Phe Thr 125

Gly Ser Val Ala Thr 15

Gly Arg Leu Ala Ser 30

Glu Arg Arg Trp Thr 45

Tyr Phe Thr His Phe 60

Phe Val Lys Leu Ser 80

Gln Glu Ser Thr Asp 95

Ser Leu Gly Ser Ser 110

Glu Lys Pro Phe Thr 125

Asp Glu Cys Gln Val 140

Cys His Asn His Leu

160

Val Leu His Arg Asn

175

Lys Arg Thr Cys Ser

180 <210> 10

- 79 045598 <211> 293 <212> PRT <213> Homo <400> 10

Met Arg Leu 1 sapiens

Leu

Thr 5

Leu

Gly

Leu

Leu 10

Cys

Gly

Ser

Val

Ala 15

Pro Leu Gly

Pro

Lys

Trp

Pro

Glu

Pro

Val

Phe

Gly

Arg

Leu 30

Ala

Pro Gly Phe

Pro

Gly

Glu

Tyr

Ala 40

Asn

Asp

Gln

Glu

Arg 45

Arg

Trp

Leu Thr Ala

Pro

Gly

Tyr 55

Arg

Leu

Arg

Leu

Tyr 60

Phe

Thr

His

Asp Leu Glu 65

Leu

Ser

His 70

Leu

Cys

Glu

Tyr

Asp 75

Phe

Val

Lys

Leu

Ser Gly Ala

Lys

Val 85

Leu

Ala

Thr

Leu

Cys 90

Gly

Gln

Glu

Ser

Thr 95

Thr Glu Arg

Ala

100

Pro

Gly

Lys

Asp

Thr

105

Phe

Tyr

Ser

Leu

Gly

110

Ser

Leu Asp Ile

115

Thr

Phe

Arg

Ser

Asp

120

Tyr

Ser

Asn

Glu

Lys

125

Pro

Phe

Gly Phe Glu

130

Ala

Phe

Tyr

Ala

135

Ala

Glu

Asp

Ile

Asp

140

Glu

Cys

Gln

Ala Pro Gly 145

Glu

Ala

Pro

150

Thr

Cys

Asp

His

155

Cys

His

Asn

His

Gly Gly Phe

Tyr

Cys 165

Ser

Cys

Arg

Ala

Gly 170

Tyr

Val

Leu

His

Arg 175

Lys Arg Thr

Cys 180

Ser

Ala

Leu

Cys

Ser

185

Gly

Gln

Val

Phe

Thr

190

Gln

Ser Gly Glu

195

Leu

Ser

Pro

Glu

200

Tyr

Pro

Arg

Pro

Tyr 205

Pro

Lys

Ser Ser Cys

210

Thr

Tyr

Ser

Ile

215

Ser

Leu

Glu

Gly

220

Phe

Ser

Val

Leu Asp Phe

225

Val

Glu

Ser

230

Phe

Asp

Val

Glu

Thr

235

His

Pro

Glu

Thr

Cys Pro Tyr

Asp

Phe

245

Leu

Lys

Ile

Gln

Thr

250

Asp

Arg

Glu

His

255

Thr

Ser

Thr

Phe

Ser 80

Asp

Ser

Thr

Val

Leu 160

Asn

Arg

Leu

Ile

Leu 240

Gly

- 80 045598

Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg

260 265

Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu

275 280

Trp Lys Ile His Tyr 290 <210>11 <211>41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>11

Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro

510

Asp His His Cys His Asn His Leu Gly Gly

25

Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn Lys

40 <210>12 <211>242 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>12

Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly

510

Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly

25

Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr

40

Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu

55

Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe 65 70

His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala 85 90

Lys Val Val Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro

100 105

Glu Ala Glu Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp

115 120

Glu Thr Lys Ser Asn 270

Gly Asp His Thr Gly 285

Glu Ala Pro Thr Cys

Tyr Cys Ser Cys Arg 30

Phe Pro Trp Gln Val

Leu Leu Tyr Asp Asn 30

Gln Lys His Asp Ala 45

Arg Leu Ser Pro His 60

His Glu Gly Tyr Thr

Ile Lys Leu Asn Asn 95

Cys Leu Pro Arg Lys

110

Gly Thr Ala Ser Gly 125

- 81 045598

Trp Gly Leu Thr Gln Arg Gly Phe

130 135

Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val

140

Asp Ile Pro Ile Val Asp His Gln

145 150

Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys

155 160

Pro Pro Tyr Pro Arg Gly Ser Val

165

Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly

170 175

Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser

180

Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala

185 190

Leu Val Phe Leu Asp Ser Glu Thr

195 200

Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile

205

Val Ser Trp Gly Ser Met Asn Cys

210 215

Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val

220

Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile

225 230

Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser

235 240

Asp Phe <210> 13 < 211> 16 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая < 400>13

Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ala 15

Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu

15 < 210>14 < 211>15 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400>14

Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu

5 1015 <210>15 <211>43 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая < 400> 15

- 82 045598

Thr Ala Pro Pro 1

Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 5 10 15

Asp

Leu Glu Leu Ser

His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser

30

Ser

Gly Ala Lys Val 35

Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln 40 <210> 16 <211> 8 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая < 400> 16

Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn

5 <210> 17 <211> 25 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая <400> 17

Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp

5 10 15

Tyr

Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe

25 <210> 18 <211> 9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая <400> 18

Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly

5 <210> 19 <211> 25 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая <400> 19

Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser 1 5 10 15

Cys

- 83 045598

Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val

25 <210> 20 <211> 960 <212> ДНК <213> Homo sapiens <220>

< 221> CDS < 222> (51).. (797) < 400> 20 attaactgag attaaccttc cctgagtttt ctcacaccaa ggtgaggacc atg tcc Met Ser 1 ctg ttt cca tca ctc cct ctc ctt ctc ctg agt atg gtg gca gcg tct Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala Ala Ser 5 1015 tac tca gaa act gtg acc tgt gag gat gcc caa aag acc tgc cctgca

Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys ProAla

2530 gtg att gcc tgt agc tct cca ggc atc aac ggc ttc cca ggc aaagat

Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly LysAsp

40 4550 ggg cgt gat ggc acc aag gga gaa aag ggg gaa cca ggc caa gggctc

Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln GlyLeu

6065 aga ggc tta cag ggc ccc cct gga aag ttg ggg cct cca gga aatcca

Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly AsnPro

7580 ggg cct tct ggg tca cca gga cca aag ggc caa aaa gga gac cctgga

Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp ProGly

9095 aaa agt ccg gat ggt gat agt agc ctg gct gcc tca gaa aga aaagct

Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg LysAla

100 105110 ctg caa aca gaa atg gca cgt atc aaa aag tgg ctc acc ttc tctctg

Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe SerLeu

115 120 125130 ggc aaa caa gtt ggg aac aag ttc ttc ctg acc aat ggt gaa ataatg

Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu IleMet

135 140145 acc ttt gaa aaa gtg aag gcc ttg tgt gtc aag ttc cag gcc tctgtg

Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala SerVal

150 155160 gcc acc ccc agg aat gct gca gag aat gga gcc att cag aat ctcatc

Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn LeuIle

165 170175 aag gag gaa gcc ttc ctg ggc atc act gat gag aag aca gaa gggcag

Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu GlyGln

180 185190 ttt gtg gat ctg aca gga aat aga ctg acc tac aca aac tgg aac gag

104

152

200

248

296

344

392

440

488

536

584

632

680

- 84 045598

Phe 195

Val

Asp

Leu

Thr

Gly 200

Asn

Arg

Leu

Thr

Tyr 205

Thr

Asn

Trp

Asn

Glu 210

ggt

gaa

ccc

aac

aat

gct

ggt

tct

gat

gaa

gat

tgt

gta

ttg

cta

ctg

Gly

Glu

Pro

Asn

Ala

Gly

Ser

Asp

Glu

Asp

Cys

Val

Leu

215

220

225

aaa

aat

ggc

cag

tgg

aat

gac

gtc

ccc

tgc

tcc

acc

tcc

cat

ctg

gcc

Lys

Asn

Gly

Gln

Trp

Asn

Asp

Val

Pro

Cys

Ser

Thr

Ser

His

Leu

Ala

230

235

240

gtc tgt gag ttc cct atc tga agggtcatat cactcaggcc ctccttgtct

Val Cys Glu Phe Pro Ile

245 ttttactgca atatccagta aagcaataat acccacaggc ttgttccttt agt ccacagtatg tgtgggcaat cttgaaaaga cactaaaaat taaattatat gatcactaac caatttcctc agcaccaaca

728

776

827

887

947

960 <210>21 <211>248 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>21

Met Ser

Leu Phe

Ala Ser

Tyr Ser 20

Pro Ala

Val Ile 35

Lys Asp 50

Gly Arg

Gly Leu 65

Arg Gly

Asn Pro

Gly Pro

Pro Gly

Lys Ser

100

Lys Ala

Leu Gln

115

Ser Leu

130

Gly Lys

Ile Met

145

Thr Phe

Ser Val

Ala Thr

Pro Ser 5

Glu Thr

Ala Cys

Asp Gly

Leu Gln 70

Ser Gly 85

Pro Asp

Thr Glu

Gln Val

Glu Lys

150

Pro Arg

Leu Pro

Leu Leu

Ser Met

Val Thr

Cys Glu 25

Asp Ala

Gln Lys 30

Ser Ser

Thr Lys 55

Gly Pro

Ser Pro

Gly Asp

Met Ala

120

Gly Asn 135

Val Lys

Asn Ala

Pro Gly

Gly Glu

Pro Gly

Gly Pro 90

Ser Ser 105

Arg Ile

Lys Phe

Ala Leu

Ala Glu

Ile Asn

Gly Phe 45

Lys Gly 60

Glu Pro

Lys Leu 75

Gly Pro

Lys Gly

Gln Lys

Leu Ala

Lys Lys

Phe Leu

140

Cys Val 155

Asn Gly

Ala Ser

110

Trp Leu 125

Thr Asn

Lys Phe

Ala Ile

Val Ala 15

Thr Cys

Pro Gly

Gly Gln

Pro Gly 80

Gly Asp 95

Glu Arg

Thr Phe

Gly Glu

Gln Ala

160

Gln Asn

- 85 045598

165 170 175

Leu Ile Lys Glu

180

Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu

185

Gly Gln Phe Val

195

Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr

200 205

Lys Thr Glu 190

Thr Asn Trp

Asn Glu Gly Glu 210

Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp

215 220

Cys Val Leu

Leu Leu Lys Asn 225

Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser

230 235

Thr Ser His

240

Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile 245 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <220>

< 221> НЕОПРЕДЕЛЕННЫЙ ПРИЗНАК < 222> (1)..(1) < 223> Где X в положении 1 представляет собой гидроксипролин <220>

< 221> НЕОПРЕДЕЛЕННЫЙ ПРИЗНАК < 222> (4)..(4) < 223> Где X в положении 4 представляет собой гидрофобный остаток <400> 22

Xaa Gly Lys Xaa Gly Pro <210> 23 <211> 5 <212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая <220>

< 221> НЕОПРЕДЕЛЕННЫЙ ПРИЗНАК < 222> (1)..(1) < 223> Где X представляет собой гидроксипролин <400> 23

Xaa Gly Lys Leu Gly

5 <210> 24 <211> 16

- 86 045598 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая <220>

< 221> НЕОПРЕДЕЛЕННЫЙ ПРИЗНАК < 222> (9)..(15) < 223> Где X в положениях 9 и 15 представляет собой гидроксипролин < 400> 24

Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly Lys Leu Gly Pro Xaa 1 5 10 15

Gly <210> 25 <211> 27 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая <220>

< 221> НЕОПРЕДЕЛЕННЫЙ ПРИЗНАК < 222> (3)..(27) < 223> Где X в положениях 3, 6, гидроксипролин < 400> 25

Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Leu 1 5

15, 21, 24, 27 представляет собой

Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly

15

Lys Leu Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa 20

Gly Pro Xaa 25 <210> 26 <211> 53 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая <220>

< 221> неопределенный признак < 222> (26)..(26) < 223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту <220>

< 221> неопределенный признак < 222> (32)..(32) < 223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту <220>

< 221> неопределенный признак < 222> (35)..(35) < 223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту <220>

< 221> неопределенный признак < 222> (41)..(41)

- 87 045598 < 223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту < 220>

< 221> неопределенный признак < 222> (50).. (50) < 223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту < 400> 26

Gly Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr 1 5

Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly

15

Gln Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly 20

Pro Xaa Gly Lys Leu Gly Pro Xaa 25 30

Gly Asn Xaa Gly Pro Ser Gly Ser

40

Xaa Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly 45

Asp Xaa Gly Lys Ser < 210> 27 < 211> 33 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая <220>

< 221> НЕОПРЕДЕЛЕННЫЙ ПРИЗНАК < 222> (3)..(33) < 223> Где X в положениях 3, 6, 12, 18, 21, 30, 33 представляет собой гидроксипролин < 400>27

Gly Ala Xaa Gly Ser Xaa Gly Glu Lys Gly Ala Xaa Gly Pro Gln Gly

5 1015

Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Lys Met Gly Pro Lys Gly Glu Xaa Gly Asp 20 2530

Xaa < 210>28 < 211>45 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая <220>

< 221> НЕОПРЕДЕЛЕННЫЙ ПРИЗНАК < 222> (3)..(45) <223> Где X в положениях 3, 6, 9, 27, 30, 36, 42, 45 представляет собой гидроксипролин <400> 28

- 88 045598

Gly Cys Xaa Gly Leu Xaa Gly Ala Xaa 15

Thr Asn Gly Lys Arg Gly Glu Arg Gly

2025

Ala Gly Pro Xaa Gly Pro Asn Gly Ala

3540

Gly Asp Lys Gly Glu Ala Gly

15

Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Lys 30

Xaa Gly Glu Xaa 45 <210>29 <211>24 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400>29

Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile Leu Pro Asn Arg Val Thr 1 510

Ile Lys Ala 15

Asn Arg Pro Phe Leu Val Phe Ile <210>30 <211>559 <212> ДНК <213> Homo sapiens

<400> 30 atgaggctgc	tgaccctcct	gggccttctg	tgtggctcgg	tggccacccc	cttgggcccg	60
aagtggcctg	aacctgtgtt	cgggcgcctg	gcatcccccg	gctttccagg	ggagtatgcc	120
aatgaccagg	agcggcgctg	gaccctgact	gcaccccccg	gctaccgcct	gcgcctctac	180
ttcacccact	tcgacctgga	gctctcccac	ctctgcgagt	acgacttcgt	caagctgagc	240
tcgggggcca	aggtgctggc	cacgctgtgc	gggcaggaga	gcacagacac	ggagcgggcc	300
cctggcaagg	acactttcta	ctcgctgggc	tccagcctgg	acattacctt	ccgctccgac	360
tactccaacg	agaagccgtt	cacggggttc	gaggccttct	atgcagccga	ggacattgac	420
gagtgccagg	tggccccggg	agaggcgccc	acctgcgacc	accactgcca	caaccacctg	480
ggcggtttct	actgctcctg	ccgcgcaggc	tacgtcctgc	accgtaacaa	gcgcacctgc	540
tcagccctgt	gctccggcc					559

<210>31 <211>34 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая <400> 31 cgggcacacc atgaggctgc tgaccctcct gggc 34

- 89 045598 <210> 32 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400>32 gacattacct tccgctccga ctccaacgag aag33 <210>33 <211>33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400>33 agcagccctg aatacccacg gccgtatccc aaa33 <210>34 <211>26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400>34 cgggatccat gaggctgctg accctc <210>35 <211>19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400>35 ggaattccta ggctgcata19 <210>36 <211>19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400>36 ggaattccta cagggcgct <210>37 <211>19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400> 37 ggaattccta gtagtggat

- 90 045598 <210> 38 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400>38 tgcggccgct gtaggtgctg tcttt <210>39 <211>23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400>39 ggaattcact cgttattctc gga23 <210>40 <211>17 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая < 400>40 tccgagaata acgagtg17 < 210>41 < 211>29 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая < 400>41 cattgaaagc tttggggtag aagttgttc29 < 210>42 < 211>27 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая <400>42 cgcggccgca gctgctcaga gtgtaga27 <210>43 <211>28 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая

- 91 045598 <400>43 cggtaagctt cactggctca gggaaata28 < 210>44 < 211>37 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая < 400>44 aagaagcttg ccgccaccat ggattggctg tggaact37 < 210>45 < 211>31 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая <400>45 cgggatcctc aaactttctt gtccaccttg g31 < 210>46 < 211>36 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая < 400>46 aagaaagctt gccgccacca tgttctcact agctct36 < 210>47 < 211>26 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая <400>47 cgggatcctt ctccctctaa cactct26 <210>48 <211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая < 400>48

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His <210>49 <211>4960 <212> ДНК <213> Homo Sapiens

- 92 045598

<400> 49
ccggacgtgg	tggcgcatgc	ctgtaatccc	agctactcgg	gaggctgagg	caggagaatt	60
gctcgaaccc	cggaggcaga	ggtttggtgg	ctcacacctg	taatcccagc	actttgcgag	120
gctgaggcag	gtgcatcgct	ttggctcagg	agttcaagac	cagcctgggc	aacacaggga	180
gacccccatc	tctacaaaaa	acaaaaacaa	atataaaggg	gataaaaaaa	aaaaaaagac	240
aagacatgaa	tccatgagga	cagagtgtgg	aagaggaagc	agcagcctca	aagttctgga	300
agctggaaga	acagataaac	aggtgtgaaa	taactgcctg	gaaagcaact	tctttttttt	360
tttttttttt	tttgaggtgg	agtctcactc	tgtcgtccag	gctggagtgc	agtggtgcga	420
tctcggatca	ctgcaacctc	cgcctcccag	gctcaagcaa	ttctcctgcc	tcagcctccc	480
gagtagctgg	gattataagt	gcgcgctgcc	acacctggat	gatttttgta	tttttagtag	540
agatgggatt	tcaccatgtt	ggtcaggctg	gtctcaaact	cccaacctcg	tgatccaccc	600
accttggcct	cccaaagtgc	tgggattaca	ggtataagcc	accgagccca	gccaaaagcg	660
acttctaagc	ctgcaaggga	atcgggaatt	ggtggcacca	ggtccttctg	acagggttta	720
agaaattagc	cagcctgagg	ctgggcacgg	tggctcacac	ctgtaatccc	agcactttgg	780
gaggctaagg	caggtggatc	acctgagggc	aggagttcaa	gaccagcctg	accaacatgg	840
agaaacccca	tccctaccaa	aaataaaaaa	ttagccaggt	gtggtggtgc	tcgcctgtaa	900
tcccagctac	ttgggaggct	gaggtgggag	gattgcttga	acacaggaag	tagaggctgc	960
agtgagctat	gattgcagca	ctgcactgaa	gccggggcaa	cagaacaaga	tccaaaaaaa	1020
agggaggggt	gaggggcaga	gccaggattt	gtttccaggc	tgttgttacc	taggtccgac	1080
tcctggctcc	cagagcagcc	tgtcctgcct	gcctggaact	ctgagcaggc	tggagtcatg	1140
gagtcgattc	ccagaatccc	agagtcaggg	aggctggggg	caggggcagg	tcactggaca	1200
aacagatcaa	aggtgagacc	agcgtagggc	tgcagaccag	gccaggccag	ctggacgggc	1260
acaccatgag	gtaggtgggc	gcccacagcc	tccctgcagg	gtgtggggtg	ggagcacagg	1320
cctgggccct	caccgcccct	gccctgccca	taggctgctg	accctcctgg	gccttctgtg	1380
tggctcggtg	gccaccccct	tgggcccgaa	gtggcctgaa	cctgtgttcg	ggcgcctggc	1440
atcccccggc	tttccagggg	agtatgccaa	tgaccaggag	cggcgctgga	ccctgactgc	1500
accccccggc	taccgcctgc	gcctctactt	cacccacttc	gacctggagc	tctcccacct	1560
ctgcgagtac	gacttcgtca	aggtgccgtc	aggacgggag	ggctggggtt	tctcagggtc	1620
ggggggtccc	caaggagtag	ccagggttca	gggacacctg	ggagcagggg	ccaggcttgg	1680
ccaggaggga	gatcaggcct	gggtcttgcc	ttcactccct	gtgacacctg	accccacagc	1740
tgagctcggg	ggccaaggtg	ctggccacgc	tgtgcgggca	ggagagcaca	gacacggagc	1800
gggcccctgg	caaggacact	ttctactcgc	tgggctccag	cctggacatt	accttccgct	1860
ccgactactc	caacgagaag	ccgttcacgg	ggttcgaggc	cttctatgca	gccgagggtg	1920
agccaagagg	ggtcctgcaa	catctcagtc	tgcgcagctg	gctgtggggg	taactctgtc	1980
ttaggccagg	cagccctgcc	ttcagtttcc	ccacctttcc	cagggcaggg	gagaggcctc	2040

- 93 045598 tggcctgaca tcatccacaa tgcaaagacc aaaacagccg tgacctccat tcacatgggc2100 tgagtgccaa ctctgagcca gggatctgag gacagcatcg cctcaagtga cgcagggact2160 ggccgggcgc agcagctcac gcctgtaatt ccagcacttt gggaggccga ggctggctga2220 tcatttgagg tcaggagttc aaggccagcc agggcaacac ggtgaaactc tatctccact2280 aaaactacaa aaattagctg ggcgtggtgg tgcgcacctg gaatcccagc tactagggag2340 gctgaggcag gagaattgct tgaacctgcg aggtggaggc tgcagtgaac agagattgca2400 ccactacact ccagcctggg cgacagagct agactccgtc tcaaaaaaca aaaaacaaaa2460 acgacgcagg ggccgagggc cccatttaca gctgacaaag tggggccctg ccagcgggag2520 cgctgccagg atgtttgatt tcagatccca gtccctgcag agaccaactg tgtgacctct2580 ggcaagtggc tcaatttctc tgctccttag gaagctgctg caagggttca gcgctgtagc2640 cccgccccct gggtttgatt gactcccctc attagctggg tgacctcggg ccggacactg2700 aaactcccac tggtttaaca gaggtgatgt ttgcatcttt ctcccagcgc tgctgggagc2760 ttgcagcgac cctaggcctg taaggtgatt ggcccggcac cagtcccgca ccctagacag2820 gacgaggcct cctctgaggt ccactctgag gtcatggatc tcctgggagg agtccaggct2880 ggatcccgcc tctttccctc ctgacggcct gcctggccct gcctctcccc cagacattga2940 cgagtgccag gtggccccgg gagaggcgcc cacctgcgac caccactgcc acaaccacct3000 gggcggtttc tactgctcct gccgcgcagg ctacgtcctg caccgtaaca agcgcacctg3060 ctcagccctg tgctccggcc aggtcttcac ccagaggtct ggggagctca gcagccctga3120 atacccacgg ccgtatccca aactctccag ttgcacttac agcatcagcc tggaggaggg3180 gttcagtgtc attctggact ttgtggagtc cttcgatgtg gagacacacc ctgaaaccct3240 gtgtccctac gactttctca agattcaaac agacagagaa gaacatggcc cattctgtgg3300 gaagacattg ccccacagga ttgaaacaaa aagcaacacg gtgaccatca cctttgtcac3360 agatgaatca ggagaccaca caggctggaa gatccactac acgagcacag cgcacgcttg3420 cccttatccg atggcgccac ctaatggcca cgtttcacct gtgcaagcca aatacatcct3480 gaaagacagc ttctccatct tttgcgagac tggctatgag cttctgcaag gtcacttgcc3540 cctgaaatcc tttactgcag tttgtcagaa agatggatct tgggaccggc caatgcccgc3600 gtgcagcatt gttgactgtg gccctcctga tgatctaccc agtggccgag tggagtacat3660 cacaggtcct ggagtgacca cctacaaagc tgtgattcag tacagctgtg aagagacctt3720 ctacacaatg aaagtgaatg atggtaaata tgtgtgtgag gctgatggat tctggacgag3780 ctccaaagga gaaaaatcac tcccagtctg tgagcctgtt tgtggactat cagcccgcac3840 aacaggaggg cgtatatatg gagggcaaaa ggcaaaacct ggtgattttc cttggcaagt3900 cctgatatta ggtggaacca cagcagcagg tgcactttta tatgacaact gggtcctaac3960 agctgctcat gccgtctatg agcaaaaaca tgatgcatcc gccctggaca ttcgaatggg4020 caccctgaaa agactatcac ctcattatac acaagcctgg tctgaagctg tttttataca4080 tgaaggttat actcatgatg ctggctttga caatgacata gcactgatta aattgaataa4140

- 94 045598

caaagttgta	atcaatagca	acatcacgcc	tatttgtctg	ccaagaaaag	aagctgaatc	4200
ctttatgagg	acagatgaca	ttggaactgc	atctggatgg	ggattaaccc	aaaggggttt	4260
tcttgctaga	aatctaatgt	atgtcgacat	accgattgtt	gaccatcaaa	aatgtactgc	4320
tgcatatgaa	aagccaccct	atccaagggg	aagtgtaact	gctaacatgc	tttgtgctgg	4380
cttagaaagt	gggggcaagg	acagctgcag	aggtgacagc	ggaggggcac	tggtgtttct	4440
agatagtgaa	acagagaggt	ggtttgtggg	aggaatagtg	tcctggggtt	ccatgaattg	4500
tggggaagca	ggtcagtatg	gagtctacac	aaaagttatt	aactatattc	cctggatcga	4560
gaacataatt	agtgattttt	aacttgcgtg	tctgcagtca	aggattcttc	atttttagaa	4620
atgcctgtga	agaccttggc	agcgacgtgg	ctcgagaagc	attcatcatt	actgtggaca	4680
tggcagttgt	tgctccaccc	aaaaaaacag	actccaggtg	aggctgctgt	catttctcca	4740
cttgccagtt	taattccagc	cttacccatt	gactcaaggg	gacataaacc	acgagagtga	4800
cagtcatctt	tgcccaccca	gtgtaatgtc	actgctcaaa	ttacatttca	ttaccttaaa	4860
aagccagtct	cttttcatac	tggctgttgg	catttctgta	aactgcctgt	ccatgctctt	4920
tgtttttaaa	cttgttctta	ttgaaaaaaa	aaaaaaaaaa			4960

<210> 50 <211> 2090 <212> ДНК <213> Мышиная <220>

<221> CDS <222> (33) .. (2090) <400> 50 ggcgctggac tgcagagcta tggtggcaca cc atg agg cta ctc atc ttc ctg 53

	Met 1	Arg	Leu	Leu	Ile 5	Phe	Leu
ggt ctg	ctg tgg agt ttg gtg gcc aca ctt	ctg	ggt	tca	aag	tgg	cct 101
Gly Leu	Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr Leu 10 15	Leu	Gly	Ser 20	Lys	Trp	Pro
gaa cct	gta ttc ggg cgc ctg gtg tcc cct	ggc	ttc	cca	gag	aag	tat 149
Glu Pro 25	Val Phe Gly Arg Leu Val Ser Pro 30	Gly	Phe 35	Pro	Glu	Lys	Tyr
gct gac	cat caa gat cga tcc tgg aca ctg	act	gca	ccc	cct	ggc	tac 197
Ala Asp 40	His Gln Asp Arg Ser Trp Thr Leu 45	Thr 50	Ala	Pro	Pro	Gly	Tyr 55
cgc ctg	cgc ctc tac ttc acc cac ttt gac	ctg	gaa	ctc	tct	tac	cgc 245
Arg Leu	Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp 60 65	Leu	Glu	Leu	Ser	Tyr 70	Arg
tgc gag	tat gac ttt gtc aag ttg agc tca	ggg	acc	aag	gtg	ctg	gcc 293
Cys Glu	Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser 75 80	Gly	Thr	Lys	Val 85	Leu	Ala
aca ctg	tgt ggg cag gag agt aca gac act	gag	cag	gca	cct	ggc	aat 341
Thr Leu	Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp Thr 90 95	Glu	Gln	Ala 100	Pro	Gly	Asn
gac acc	ttc tac tca ctg ggt ccc agc cta	aag	gtc	acc	ttc	cac	tcc 389
Asp Thr	Phe Tyr Ser Leu Gly Pro Ser Leu	Lys	Val	Thr	Phe	His	Ser

- 95 045598

437 gac Asp 120 gcg Ala tgt

Cys aga

Arg tgt

Cys gag Glu 200 cgc Arg gat

Asp att

Ile cct

Pro act Thr 280 aca Thr tca

Ser tgc

Cys ttc

Phe gag Glu 360 cat His

105 110115 tac tcc aat gag aag ccg ttc aca ggg ttt gag gcc ttc tatgca

Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe TyrAla

125 130135 gag gat gtg gat gaa tgc aga gtg tct ctg gga gac tca gtccct

Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Val Ser Leu Gly Asp Ser ValPro

140 145150 gac cat tat tgc cac aac tac ttg ggc ggc tac tat tgc tcctgc

Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys SerCys

155 160165 gcg ggc tac att ctc cac cag aac aag cac acg tgc tca gccctt

Ala Gly Tyr Ile Leu His Gln Asn Lys His Thr Cys Ser AlaLeu

170 175180 tca ggc cag gtg ttc aca gga aga tct ggg tat ctc agt agccct

Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly Arg Ser Gly Tyr Leu Ser SerPro

185 190195 tac ccg cag cca tac ccc aag ctc tcc agc tgc acc tac agcatc

Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys Leu Ser Ser Cys Thr Tyr SerIle

205 210215 ctg gag gac ggc ttc agt gtc atc ctg gac ttc gtg gag tccttc

Leu Glu Asp Gly Phe Ser Val Ile Leu Asp Phe Val Glu SerPhe

220 225230 gtg gag acg cac cct gaa gcc cag tgc ccc tat gac tcc ctcaag

Val Glu Thr His Pro Glu Ala Gln Cys Pro Tyr Asp Ser LeuLys

235 240245 caa aca gac aag ggg gaa cac ggc cca ttt tgt ggg aag acgctg

Gln Thr Asp Lys Gly Glu His Gly Pro Phe Cys Gly Lys ThrLeu

250 255260 ccc agg att gaa act gac agc cac aag gtg acc atc acc tttgcc

Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser His Lys Val Thr Ile Thr PheAla

265 270275 gac gag tcg ggg aac cac aca ggc tgg aag ata cac tac acaagc

Asp Glu Ser Gly Asn His Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr ThrSer

285 290295 gca cgg ccc tgc cct gat cca acg gcg cca cct aat ggc agcatt

Ala Arg Pro Cys Pro Asp Pro Thr Ala Pro Pro Asn Gly SerIle

300 305310 cct gtg caa gcc acg tat gtc ctg aag gac agg ttt tct gtcttc

Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val Leu Lys Asp Arg Phe Ser ValPhe

315 320325 aag aca ggc ttc gag ctt ctg caa ggt tct gtc ccc ctg aaatca

Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu Gln Gly Ser Val Pro Leu LysSer

330 335340 act gct gtc tgt cag aaa gat gga tct tgg gac cgg ccg atgcca

Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro MetPro

345 350355 tgc agc att att gat tgt ggc cct ccc gat gac cta ccc aatggc

Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro AsnGly

365 370375 gtg gac tat atc aca ggc cct caa gtg act acc tac aaa gctgtg

Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro Gln Val Thr Thr Tyr Lys AlaVal

380 385390

485

533

581

629

677

725

773

821

869

917

965

1013

1061

1109

1157

1205

- 96 045598 att cag tac

Ile Gln Tyr aaa tat gtg Lys Tyr Val 410 aaa ctc ccc Lys Leu Pro 425 ata gga gga Ile Gly Gly 440 cct tgg caa Pro Trp Gln ctt ata cat

Leu Ile His aaa aga atg Lys Arg Met 490 agg ctc tca Arg Leu Ser 505 cat gaa ggc His Glu Gly 520 att aaa ctc Ile Lys Leu tgc cta ccg Cys Leu Pro gga act gtg Gly Thr Val 570 aac cta atg Asn Leu Met 585 acc gtg tat Thr Val Tyr 600 ctc tgt gct Leu Cys Ala agt ggg ggg

Ser Gly Gly gtg gga gga Val Gly Gly 650 cag tat ggg Gln Tyr Gly agc tgt gaa gag act Ser Cys Glu Glu Thr 395 tgt gag gct gat gga Cys Glu Ala Asp Gly 415 ccg gtt tgt gag cct Pro Val Cys Glu Pro 430 cgc ata gtt gga ggg Arg Ile Val Gly Gly

445 gtc ttg ttg ctg ggt

Val Leu Leu Leu Gly 460 gac aat tgg gtc cta Asp Asn Trp Val Leu 475 gca gcg tcc tcc ctg Ala Ala Ser Ser Leu 495 cct cat tac act caa Pro His Tyr Thr Gln 510 tac act cac ggt gct Tyr Thr His Gly Ala 525 aag aac aaa gtc aca Lys Asn Lys Val Thr 540 cga aaa gaa gct gca Arg Lys Glu Ala Ala 555 gct ggc tgg ggg tta Ala Gly Trp Gly Leu 575 ttt gtg gac ata cca Phe Val Asp Ile Pro 590 gaa aag ctc tat cca Glu Lys Leu Tyr Pro 605 ggc tta gag act ggt Gly Leu Glu Thr Gly 620 gca tta gtg ttt cta Ala Leu Val Phe Leu 635 ata gtt tcc tgg ggt Ile Val Ser Trp Gly 655 gtc tac aca aaa gtc Val Tyr Thr Lys Val ttc tac aca Phe Tyr Thr 400 ttc tgg acg Phe Trp Thr gtt tgt ggg

Val Cys Gly cag cct gca Gln Pro Ala 450 caa act aca Gln Thr Thr 465 aca gcc gct Thr Ala Ala 480 aac atc cga Asn Ile Arg gcc tgg ccc Ala Trp Pro ggt ttt gac Gly Phe Asp 530 atc aac gga Ile Asn Gly 545 tcc tta atg Ser Leu Met 560 acc cag aag Thr Gln Lys att gct gac

Ile Ala Asp gga gta aga Gly Val Arg 610 ggc aag gac Gly Lys Asp 625 gat aat gag Asp Asn Glu 640 tcc att aat

Ser Ile Asn atc aac tat Ile Asn Tyr atg agc agc aat Met Ser Ser Asn 405 agc tcc aaa gga Ser Ser Lys Gly 420 ctg tcc aca cac Leu Ser Thr His 435 aag cct ggt gac Lys Pro Gly Asp gca gca gca ggt Ala Ala Ala Gly 470 cat gct gta tat His Ala Val Tyr 485 atg ggc atc ctc Met Gly Ile Leu 500 gag gaa atc ttt Glu Glu Ile Phe 515 aat gat ata gca Asn Asp Ile Ala agc atc atg cct Ser Ile Met Pro 550 aga aca gac ttc Arg Thr Asp Phe 565 ggg ctt ctt gct Gly Leu Leu Ala 580 cac caa aaa tgt His Gln Lys Cys 595 gta agc gct aac

Val Ser Ala Asn agc tgc aga ggt Ser Cys Arg Gly 630 aca cag cga tgg Thr Gln Arg Trp 645 tgt ggg gcg gca Cys Gly Ala Ala 660 att ccc tgg aat Ile Pro Trp Asn ggt 1253

Gly gaa 1301

Glu act 1349

Thr ttt 1397

Phe

455 gca 1445

Ala gag 1493

Glu aaa 1541

Lys ata 1589

Ile ttg 1637

Leu

535 gtt 1685

Val act 1733

Thr aga 1781

Arg acc 1829

Thr atg 1877

Met

615 gac 1925

Asp ttt 1973

Phe ggc 2021

Gly gag 2069

Glu

- 97 045598

2090

665 aac ata ata agt Asn Ile Ile Ser 680

670 aat ttc taa Asn Phe

685

675 <210>51 <211>685 <212> PRT <213> Мышиная <400>51

Met Arg Leu Leu 1

Leu Leu Gly Ser

Pro Gly Phe Pro 35

Leu Thr Ala Pro

Asp Leu Glu Leu 65

Ser Gly Thr Lys

Thr Glu Gln Ala

100

Ile Phe Leu Gly Leu 5

Lys Trp Pro Glu Pro

Glu Lys Tyr Ala Asp

Pro Gly Tyr Arg Leu 55

Ser Tyr Arg Cys Glu 70

Val Leu Ala Thr Leu 85

Pro Gly Asn Asp Thr

105

Leu 10	Trp	Ser	Leu	Val	Ala 15	Thr
Val	Phe	Gly	Arg	Leu 30	Val	Ser
His	Gln	Asp	Arg 45	Ser	Trp	Thr
Arg	Leu	Tyr 60	Phe	Thr	His	Phe
Tyr	Asp 75	Phe	Val	Lys	Leu	Ser 80
Cys 90	Gly	Gln	Glu	Ser	Thr 95	Asp
Phe	Tyr	Ser	Leu	Gly 110	Pro	Ser

Leu Lys Val Thr

115

Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr

120 125

Gly Phe Glu Ala 130

Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Val

135 140

Ser Leu Gly Asp 145

Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu

150 155 160

Gly Gly Tyr Tyr

Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Ile Leu His Gln Asn

165 170 175

Lys His Thr Cys

180

Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly Arg

185 190

Ser Gly Tyr Leu

195

Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys Leu

200 205

Ser Ser Cys Thr 210

Tyr Ser Ile Arg Leu Glu Asp Gly Phe Ser Val Ile

215 220

- 98 045598

Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu

225 230

Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr

245 250

Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg

260 265

Lys Val Thr Ile Thr Phe Ala Thr Asp Glu

275 280

Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Arg

290 295

Ala Pro Pro Asn Gly Ser Ile Ser Pro Val 305 310

Lys Asp Arg Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr

325 330

Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala

340 345

Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Glu Cys Ser

355 360

Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp

370 375

Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr 385 390

Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val

405 410

Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Leu Pro

420 425

Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ile Gly Gly

435 440

Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln

450 455

Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Leu Ile His

465 470

Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Lys Arg Met

485 490

Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser

500 505

His Pro Glu Ala Gln

240

Lys Gly Glu His Gly

255

Glu Thr Asp Ser His

270

Gly Asn His Thr Gly 285

Cys Pro Asp Pro Thr 300

Ala Thr Tyr Val Leu

320

Phe Glu Leu Leu Gln

335

Cys Gln Lys Asp Gly 350

Ile Asp Cys Gly Pro

365

Ile Thr Gly Pro Gln 380

Cys Glu Glu Thr Phe

400

Glu Ala Asp Gly Phe

415

Val Cys Glu Pro Val

430

Ile Val Gly Gly Gln

445

Leu Leu Leu Gly Gln 460

Asn Trp Val Leu Thr

480

Ala Ser Ser Leu Asn

495

His Tyr Thr Gln Ala

510

- 99 045598

Trp Pro Glu Glu

515

Ile

Phe

Ile

His

520

Glu

Gly

Tyr

Thr

His

525

Gly

Ala

Gly

Phe Asp Asn Asp 530

Ile

Ala

Leu

535

Ile

Lys

Leu

Lys

Asn

540

Lys

Val

Thr

Ile

Asn Gly Ser Ile 545

Met

Pro

550

Val

Cys

Leu

Pro

Arg 555

Lys

Glu

Ala

Ser

560

Leu Met Arg Thr

Asp

565

Phe

Thr

Gly

Thr

Val

570

Ala

Gly

Trp

Gly

Leu

575

Thr

Gln Lys Gly Leu

580

Leu

Ala

Arg

Asn

Leu

585

Met

Phe

Val

Asp

Ile

590

Pro

Ile

Ala Asp His Gln

595

Lys

Cys

Thr

600

Val

Tyr

Glu

Lys

Leu

605

Tyr

Pro

Gly

Val Arg Val Ser

610

Ala

Asn

Met

615

Leu

Cys

Ala

Gly

Leu

620

Glu

Thr

Gly

Lys Asp Ser Cys 625

Arg

Gly

630

Asp

Ser

Gly

Ala

635

Leu

Val

Phe

Leu

Asp

640

Asn Glu Thr Gln

Arg

645

Trp

Phe

Val

Gly

Gly 650

Ile

Val

Ser

Trp

Gly 655

Ser

Ile Asn Cys Gly

660

Ala

Gly

Gln

Tyr 665

Gly

Val

Tyr

Thr

Lys 670

Val

Ile

Asn Tyr Ile Pro

675

Trp

Asn

Glu

Asn

680

Ile

Ser

Asn

Phe

685 <210>52 <211>670 <212> PRT <213> Мышиная <400>52

Thr Leu Leu Gly 1

Ser 5

Lys

Trp

Pro

Glu

Pro 10

Val

Phe

Gly

Arg

Leu 15

Val

Ser Pro Gly Phe 20

Pro

Glu

Lys

Tyr

Ala 25

Asp

His

Gln

Asp

Arg 30

Ser

Trp

Thr Leu Thr Ala

Pro

Gly

Tyr 40

Arg

Leu

Arg

Leu

Tyr 45

Phe

Thr

His

Phe Asp Leu Glu 50

Leu

Ser

Tyr 55

Arg

Cys

Glu

Tyr

Asp 60

Phe

Val

Lys

Leu

Ser Ser Gly Thr

Lys

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Cys

Gly

Gln

Glu

Ser

Thr

- 100 045598

70

Asp Thr Glu Gln Ala Pro Gly Asn Asp Thr

90

Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr

100 105

Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu

115 120

Val Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp

130 135

Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Ala 145 150

Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser

165 170

Arg Ser Gly Tyr Leu Ser Ser Pro Glu Tyr

180 185

Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Arg Leu

195 200

Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val

210 215

Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln

225 230

Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro

245 250

His Lys Val Thr Ile Thr Phe Ala Thr Asp

260 265

Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala

275 280

Thr Ala Pro Pro Asn Gly Ser Ile Ser Pro

290 295

Leu Lys Asp Arg Phe Ser Val Phe Cys Lys

305 310

Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr

325 330

Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Glu Cys

340 345

Tyr Ser Leu Gly Pro 95

Asn Glu Lys Pro Phe 110

Val Asp Glu Cys Arg

125

Tyr Cys His Asn Tyr 140

Tyr Ile Leu His Gln

160

Gln Val Phe Thr Gly

175

Gln Pro Tyr Pro Lys 190

Asp Gly Phe Ser Val 205

Thr His Pro Glu Ala 220

Asp Lys Gly Glu His

240

Ile Glu Thr Asp Ser

255

Ser Gly Asn His Thr 270

Pro Cys Pro Asp Pro

285

Gln Ala Thr Tyr Val 300

Gly Phe Glu Leu Leu

320

Val Cys Gln Lys Asp

335

Ile Ile Asp Cys Gly 350

- 101 045598

Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val

355 360

Gln Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln

370 375

Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr

385 390

Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Leu

405 410

Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ile Gly

420 425

Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp

435 440

Gln Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Leu Ile

450 455

Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Lys Arg

465 470

Asn Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu

485 490

Ala Trp Pro Glu Glu Ile Phe Ile His Glu

500 505

Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys

515 520

Ile Asn Gly Ser Ile Met Pro Val Cys Leu

530 535

Ser Leu Met Arg Thr Asp Phe Thr Gly Thr

545 550

Thr Gln Lys Gly Leu Leu Ala Arg Asn Leu

565 570

Ile Ala Asp His Gln Lys Cys Thr Thr Val

580 585

Gly Val Arg Val Ser Ala Asn Met Leu Cys

595 600

Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly

610 615

Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly

Tyr Ile Thr Gly Pro

365

Ser Cys Glu Glu Thr 380

Cys Glu Ala Asp Gly

400

Pro Val Cys Glu Pro

415

Arg Ile Val Gly Gly 430

Val Leu Leu Leu Gly

445

Asp Asn Trp Val Leu 460

Ala Ala Ser Ser Leu

480

Pro His Tyr Thr Gln

495

Tyr Thr His Gly Ala 510

Lys Asn Lys Val Thr

525

Arg Lys Glu Ala Ala 540

Ala Gly Trp Gly Leu

560

Phe Val Asp Ile Pro

575

Glu Lys Leu Tyr Pro

590

Gly Leu Glu Thr Gly 605

Ala Leu Val Phe Leu 620

Ile Val Ser Trp Gly

- 102 045598

625 630 635640

Ser Ile Asn Cys Gly Ala Ala Gly Gln

645

Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Asn Glu Asn

660665

Tyr Gly Val 650

Tyr Thr Lys Val

655

Ile Ile Ser Asn Phe

670 <210>53 <211>2091 <212> ДНК <213> Крысиная <220>

<221> CDS <222> (10).. (2067) <400>53 tggcacaca atg agg cta ctg atc gtc ctg ggt ctg ctt tgg agt ttg gtg51

Met Arg Leu Leu Ile Val Leu Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val 1 510 gcc aca ctt ttg ggc tcc aag tgg cct gag cct gta ttc ggg cgc ctg99

Ala Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly ArgLeu

20 2530 gtg tcc ctg gcc ttc cca gag aag tat ggc aac cat cag gat cga tcc147

Val Ser Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly Asn His Gln Asp ArgSer

4045 tgg acg ctg act gca ccc cct ggc ttc cgc ctg cgc ctc tac ttc acc195

Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Phe Arg Leu Arg Leu Tyr PheThr

5560 cac ttc aac ctg gaa ctc tct tac cgc tgc gag tat gac ttt gtc aag243

His Phe Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe ValLys

7075 ttg acc tca ggg acc aag gtg cta gcc acg ctg tgt ggg cag gag agt291

Leu Thr Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln GluSer

8590 aca gat act gag cgg gca cct ggc aat gac acc ttc tac tca ctg ggt339

Thr Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser LeuGly

100 105110 ccc agc cta aag gtc acc ttc cac tcc gac tac tcc aat gag aag cca387

Pro Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu LysPro

115 120125 ttc aca gga ttt gag gcc ttc tat gca gcg gag gat gtg gat gaa tgc435

Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp GluCys

130 135140 aga aca tcc ctg gga gac tca gtc cct tgt gac cat tat tgc cac aac483

Arg Thr Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys HisAsn

145 150155 tac ctg ggc ggc tac tac tgc tcc tgc cga gtg ggc tac att ctg cac531

Tyr Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly Tyr Ile LeuHis

160 165170 cag aac aag cat acc tgc tca gcc ctt tgt tca ggc cag gtg ttc act579

Gln Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val PheThr

175 180 185190

- 103 045598 ggg agg tct

Gly Arg Ser aaa ctc tcc

Lys Leu Ser atc acc ctg Ile Thr Leu 225 gcc cag tgc Ala Gln Cys 240 tac ggc ccg Tyr Gly Pro 255 agc aac aag Ser Asn Lys aca ggc tgg

Thr Gly Trp cca acg gcg Pro Thr Ala 305 gtc ctg aag

Val Leu Lys 320 ctg caa ggt Leu Gln Gly 335 gat gga tct Asp Gly Ser ggc cct ccc

Gly Pro Pro cct gaa gtg Pro Glu Val 385 act ttc tac Thr Phe Tyr 400 gga ttc tgg Gly Phe Trp 415 cct gtc tgt Pro Val Cys gga cag cct Gly Gln Pro ggt gaa act Gly Glu Thr ggc ttt ctc agt agc Gly Phe Leu Ser Ser 195 agc tgc gcc tac aac Ser Cys Ala Tyr Asn 210 gac ttc gtg gag tcc Asp Phe Val Glu Ser 230 ccc tac gac tcc ctc Pro Tyr Asp Ser Leu 245 ttt tgt ggg aag acg Phe Cys Gly Lys Thr 260 gtg acc att acc ttt

Val Thr Ile Thr Phe 275 aag ata cac tac aca Lys Ile His Tyr Thr 290 cca cct aat ggt cac Pro Pro Asn Gly His 310 gac agc ttt tct gtc Asp Ser Phe Ser Val 325 tct gtc ccc ctg aag Ser Val Pro Leu Lys 340 tgg gac cgg ccg ata Trp Asp Arg Pro Ile 355 gat gac cta ccc aat Asp Asp Leu Pro Asn 370 acc acc tac aaa gct

Thr Thr Tyr Lys Ala 390 aca atg agc agc aat Thr Met Ser Ser Asn 405 acg agc tcc aaa gga Thr Ser Ser Lys Gly 420 gga ctg tcc aca cac Gly Leu Ser Thr His 435 gca aag cct ggt gac Ala Lys Pro Gly Asp 450 aca gca gca ggt gct Thr Ala Ala Gly Ala cct gag tac Pro Glu Tyr 200 atc cgc ctg Ile Arg Leu 215 ttt gat gtg Phe Asp Val aag att caa

Lys Ile Gln ctg ccc ccc

Leu Pro Pro 265 acc acc gac

Thr Thr Asp 280 agc aca gca

Ser Thr Ala 295 att tca cct

Ile Ser Pro ttc tgc aag

Phe Cys Lys tca ttc act Ser Phe Thr 345 cca gag tgc Pro Glu Cys 360 ggc cac gtg Gly His Val 375 gtg att cag

Val Ile Gln ggt aaa tat Gly Lys Tyr gaa aaa tcc Glu Lys Ser 425 act tca gga Thr Ser Gly 440 ttt cct tgg Phe Pro Trp 455 ctt ata cat

Leu Ile His cca cag cca tac Pro Gln Pro Tyr 205 gag gaa ggc ttc Glu Glu Gly Phe 220 gag atg cac cct Glu Met His Pro 235 aca gac aag agg Thr Asp Lys Arg 250 agg att gaa act Arg Ile Glu Thr gag tca ggg aac Glu Ser Gly Asn 285 cag ccc tgc cct Gln Pro Cys Pro 300 gtg caa gcc acg

Val Gln Ala Thr 315 act ggc ttc gag Thr Gly Phe Glu 330 gct gtc tgt cag Ala Val Cys Gln agc att att gac Ser Ile Ile Asp 365 gac tat atc aca Asp Tyr Ile Thr 380 tac agc tgt gaa Tyr Ser Cys Glu 395 gtg tgt gag gct

Val Cys Glu Ala 410 ctc ccg gtt tgc Leu Pro Val Cys ggc cgt ata att Gly Arg Ile Ile 445 caa gtc ttg tta Gln Val Leu Leu 460 gac gac tgg gtc Asp Asp Trp Val ccc 627

Pro agt 675

Ser gaa 723

Glu gaa 771

Glu gac 819

Asp 270 cac 867

His gat 915

Asp tat 963

Tyr ctt 1011

Leu aaa 1059

Lys

350 tgt 1107

Cys ggc 1155

Gly gag 1203

Glu gat 1251

Asp aag 1299

Lys

430 gga 1347

Gly ctg 1395

Leu cta 1443

Leu

- 104 045598

465

470

475 aca gcg Thr Ala 480 gac atc Asp Ile 495 gcc tgg Ala Trp ggt ttt

Gly Phe atc aac

Ile Asn gct cat gct gta tat ggg aaa aca Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr 485 cgc atg ggc atc ctc aaa agg ctc

Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu

500 cca gag gct gtc ttt atc cat gaa

Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu

515520 gac aat gat ata gca ctg attaaa

Asp Asn Asp Ile Ala Leu IleLys

530535 aga aac atc atg ccg att tgtcta

Arg Asn Ile Met Pro Ile CysLeu

545550 gag gcg atg tcc Glu Ala Met Ser 490 tcc ctc att tac Ser Leu Ile Tyr 505 ggc tac act cac Gly Tyr Thr His ctc aag aac aaa Leu Lys Asn Lys 540 cca aga aaa gaa Pro Arg Lys Glu 555 tcc ctg Ser Leu act caa Thr Gln 510 gga gct Gly Ala 525 gtc aca

Val Thr gct gca

Ala Ala

1491

1539

1587

1635

1683 tcc tta atg aaa aca gac ttc gtt gga

Ser Leu Met Lys Thr Asp Phe Val Gly

560 565 acc cag aag ggg ttt ctt gct aga aac

Thr Gln Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn

575 580 act gtg gct Thr Val Ala 570 cta atg ttt Leu Met Phe 585 ggc tgg

Gly Trp ggg tta

Gly Leu

1731 gtg gac

Val Asp ata cca Ile Pro 590

1779 att gtt gac cac caa aaa tgt gct Ile Val Asp His Gln Lys Cys Ala 595 act gcg tat aca aag cag ccc tac Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr 600 605

1827 cca gga gca aaa gtg act Pro Gly Ala Lys Val Thr 610 ggt ggc aag gac agc tgc Gly Gly Lys Asp Ser Cys 625 cta gac aat gaa aca cag Leu Asp Asn Glu Thr Gln 640 ggt tct att aac tgt ggg Gly Ser Ile Asn Cys Gly 655 660 gtc acg aac tat att ccc Val Thr Asn Tyr Ile Pro 675 gtt aac atg ctc tgt gct ggc cta

Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu 615 620 aga ggt gac agc gga ggg gca tta Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu 630635 aga tgg ttt gtg gga gga atagtt

Arg Trp Phe Val Gly Gly IleVal

645650 ggg tca gaa cag tat ggg gtc tac

Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr

665 tgg att gag aac ata ata aat aat

Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn

680 tttgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaa <210> 54 <211> 685 <212> PRT <213> Крысиная <400> 54

Met Arg Leu Leu 1

Ile Val Leu Gly Leu Leu

10

Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val

25 gac cgc

Asp Arg gtg ttt

Val Phe tcc tgg Ser Trp acg aaa Thr Lys 670 ttc taa

Phe

685

Trp Ser Leu Val Ala Thr

Phe Gly Arg Leu Val

Ser

1875

1923

1971

2019

2067

2091

- 105 045598

Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly Asn His

40

Leu Thr Ala Pro Pro Gly Phe Arg Leu Arg

55

Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr 65 70

Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys

90

Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe

100 105

Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser

115 120

Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp

130 135

Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His

145 150

Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly

165 170

Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly

180 185

Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro

195 200

Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg Leu Glu

210 215

Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu

225 230

Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr

245 250

Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg

260 265

Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp Glu

275 280

Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln

290 295

Asp Arg Ser Trp Thr 45

Tyr Phe Thr His Phe 60

Phe Val Lys Leu Thr 80

Gln Glu Ser Thr Asp

Ser Leu Gly Pro Ser 110

Glu Lys Pro Phe Thr 125

Asp Glu Cys Arg Thr 140

Cys His Asn Tyr Leu

160

Ile Leu His Gln Asn

175

Val Phe Thr Gly Arg

190

Pro Tyr Pro Lys Leu

205

Gly Phe Ser Ile Thr 220

His Pro Glu Ala Gln

240

Lys Arg Glu Tyr Gly

255

Glu Thr Asp Ser Asn 270

Gly Asn His Thr Gly 285

Cys Pro Asp Pro Thr 300

- 106 045598

Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val 305 310

Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr

325 330

Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala

340 345

Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser

355 360

Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp

370 375

Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr

385 390

Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val

405 410

Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu

420 425

Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly

435 440

Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln

450 455

Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp

465 470

Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala

485 490

Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu

500 505

Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr

515 520

Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys

530 535

Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg

545 550

Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala

565 570

Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe

580 585

Ala Thr Tyr Val Leu

320

Phe Glu Leu Leu Gln

335

Cys Gln Lys Asp Gly 350

Ile Asp Cys Gly Pro

365

Ile Thr Gly Pro Glu 380

Cys Glu Glu Thr Phe

400

Glu Ala Asp Gly Phe

415

Val Cys Lys Pro Val

430

Ile Ile Gly Gly Gln

445

Leu Leu Leu Gly Glu 460

Trp Val Leu Thr Ala

480

Ser Ser Leu Asp Ile

495

Tyr Thr Gln Ala Trp 510

His Gly Ala Gly Phe

525

Lys Val Thr Ile Asn 540

Glu Ala Ala Ser Leu

560

Trp Gly Leu Thr Gln

575

Asp Ile Pro Ile Val 590

- 107 045598

Asp His Gln Lys

595

Cys

Ala

Thr

Ala

600

Tyr

Thr

Lys

Gln

Pro

605

Tyr

Pro

Gly

Ala Lys Val Thr 610

Val

Asn

Met

615

Leu

Cys

Ala

Gly

Leu

620

Asp

Arg

Gly

Lys Asp Ser Cys 625

Arg

Gly

630

Asp

Ser

Gly

Ala

635

Leu

Val

Phe

Leu

Asp

640

Asn Glu Thr Gln

Arg

645

Trp

Phe

Val

Gly

650

Ile

Val

Ser

Trp

Gly 655

Ser

Ile Asn Cys Gly

660

Gly

Ser

Glu

Gln

Tyr 665

Gly

Val

Tyr

Thr

Lys

670

Val

Thr

Asn Tyr Ile Pro

675

Trp

Ile

Glu

Asn

680

Ile

Asn

Phe

685 <210>55 <211>670 <212> PRT <213> Крысиная <400>55

Thr Leu Leu Gly 1

Ser 5

Lys

Trp

Pro

Glu

Pro 10

Val

Phe

Gly

Arg

Leu 15

Val

Ser Leu Ala Phe

Pro

Glu

Lys

Tyr

Gly 25

Asn

His

Gln

Asp

Arg 30

Ser

Trp

Thr Leu Thr Ala

Pro

Gly

Phe 40

Arg

Leu

Arg

Leu

Tyr 45

Phe

Thr

His

Phe Asn Leu Glu

Leu

Ser

Tyr 55

Arg

Cys

Glu

Tyr

Asp 60

Phe

Val

Lys

Leu

Thr Ser Gly Thr 65

Lys

Val 70

Leu

Ala

Thr

Leu

Cys 75

Gly

Gln

Glu

Ser

Thr 80

Asp Thr Glu Arg

Ala 85

Pro

Gly

Asn

Asp

Thr 90

Phe

Tyr

Ser

Leu

Gly 95

Pro

Ser Leu Lys Val

100

Thr

Phe

His

Ser

Asp

105

Tyr

Ser

Asn

Glu

Lys

110

Pro

Phe

Thr Gly Phe Glu

115

Ala

Phe

Tyr

Ala

120

Ala

Glu

Asp

Val

Asp 125

Glu

Cys

Arg

Thr Ser Leu Gly 130

Asp

Ser

Val

135

Pro

Cys

Asp

His

Tyr 140

Cys

His

Asn

Tyr

Leu Gly Gly Tyr

Tyr

Cys

Ser

Cys

Arg

Val

Gly

Tyr

Ile

Leu

His

Gln

- 108 045598

160

145 150

Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser

165 170

Arg Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu Tyr

180 185

Leu Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg Leu

195 200

Thr Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val

210 215

Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln

225 230

Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro

245 250

Asn Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp

260 265

Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala

275 280

Thr Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro

290 295

Leu Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys

305 310

Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr

325 330

Gly Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys

340 345

Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val

355 360

Glu Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln

370 375

Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr 385 390

Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser

405 410

Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly

420 425

Gln Val Phe Thr Gly

175

Gln Pro Tyr Pro Lys 190

Glu Gly Phe Ser Ile

205

Met His Pro Glu Ala 220

Asp Lys Arg Glu Tyr

240

Ile Glu Thr Asp Ser

255

Ser Gly Asn His Thr 270

Pro Cys Pro Asp Pro

285

Gln Ala Thr Tyr Val 300

Gly Phe Glu Leu Leu

320

Val Cys Gln Lys Asp

335

Ile Ile Asp Cys Gly 350

Tyr Ile Thr Gly Pro

365

Ser Cys Glu Glu Thr 380

Cys Glu Ala Asp Gly

400

Pro Val Cys Lys Pro

415

Arg Ile Ile Gly Gly 430

- 109 045598

Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp

435 440

Glu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His

450 455

Ala Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu 465 470

Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser

485 490

Trp Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly

500 505

Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu

515 520

Asn Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro

530 535

Leu Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val 545 550

Gln Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met

565 570

Val Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr

580 585

Gly Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys

595 600

Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly

610 615

Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly

625 630

Ser Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr

645 650

Thr Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile

660 665

Val Leu Leu Leu Gly

445

Asp Trp Val Leu Thr 460

Met Ser Ser Leu Asp

480

Ile Tyr Thr Gln Ala

495

Thr His Gly Ala Gly 510

Asn Lys Val Thr Ile 525

Lys Glu Ala Ala Ser 540

Gly Trp Gly Leu Thr

560

Val Asp Ile Pro Ile

575

Lys Gln Pro Tyr Pro

590

Gly Leu Asp Arg Gly 605

Ala Leu Val Phe Leu 620

Ile Val Ser Trp Gly

640

Val Tyr Thr Lys Val

655

Asn Asn Phe

670 <210> 56 <211> 28 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Homo Sapiens < 400> 56

- 110 045598 atgaggctgc tgaccctcct gggccttc <210> 57 <211> 23 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Homo Sapiens < 400>57 gtgcccctcc tgcgtcacct ctg23 < 210>58 < 211>23 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Homo Sapiens < 400>58 cagaggtgac gcaggagggg cac23 < 210>59 < 211>27 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Homo Sapiens < 400>59 ttaaaatcac taattatgtt ctcgatc27 < 210>60 < 211>22 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Мышиная < 400>60 atgaggctac tcatcttcct gg22 < 210>61 < 211>23 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мышиная <400>61 ctgcagaggt gacgcagggg ggg23 <210>62 <211>23 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мышиная

- 111 045598 <400> 62 ccccccctgc gtcacctctg cag <210> 63 <211> 29 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Мышиная < 400> 63 ttagaaatta cttattatgt tctcaatcc <210> 64 <211> 29 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Крысиная < 400> 64 gaggtgacgc aggaggggca ttagtgttt <210> 65 <211> 37 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Крысиная < 400> 65 ctagaaacac taatgcccct cctgcgtcac ctctgca <210> 66 <211> 354 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400> 66 caggtcacct acctgcaccg cagcccccag tacaggacat gtccttacaa cgacgtggag tgaaggagtc tctctgggtt ggaaggccct cgctgaagag tgaccaacat gaattgacta tggtcctgtg ctcactcagc ggagtggctt caggctcacc ggaccctgtg ctggggccag ctggtgaaac aggggtaaaa gcacacattt atctccaagg gacacagcca ggaaccctgg ccacagagac tgggtgtgag tttcgagtga acacctccaa cgtattactg tcactgtctc cctcacgctg ctggatccgt cgaaaaatcc aaaccaggtg tgcacggata ctca

120

180

240

300

354 <210> 67 <211> 118 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая

- 112 045598 <400> 67

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val

5 10

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly

25

Lys Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro

40

Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Ser Asp Glu

55

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp 65 70

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val 85 90

Cys Ala Arg Ile Arg Arg Gly Gly Ile Asp

100 105

Leu Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 68 <211> 121 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая <400> 68

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly

5 10

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly

25

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser

40

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys

55

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn 65 70

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr

90

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Phe Gly Val

Val Lys Pro Thr Glu

Ser Leu Ser Arg Gly 30

Gly Lys Ala Leu Glu 45

Ser Tyr Arg Thr Ser 60

Ser Lys Asn Gln Val 80

Thr Ala Thr Tyr Tyr 95

Trp Gly Gln Gly Thr 110

Val Lys Pro Ser Gln

Ser Val Ser Ser Thr

Ser Arg Gly Leu Glu 45

Tyr Asn Asp Tyr Ala 60

Asp Thr Ser Lys Asn 80

Glu Asp Thr Ala Val 95

Phe Asp Ile Trp Gly

- 113 045598

100

105

110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115

120 <210> 69 <211> 106 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400>69

Gln 1

Pro

Val

Leu

Thr 5

Gln

Pro

Ser

Leu 10

Ser

Val

Ser

Pro

Gly 15

Gln

Thr

Ala

Ser

Ile 20

Thr

Cys

Ser

Gly

Glu 25

Lys

Leu

Gly

Asp

Lys 30

Tyr

Ala

Tyr

Trp

Tyr 35

Gln

Lys

Pro

Gly 40

Gln

Ser

Pro

Val

Leu 45

Val

Met

Tyr

Gln

Asp 50

Lys

Gln

Arg

Pro

Ser 55

Gly

Ile

Pro

Glu

Arg 60

Phe

Ser

Gly

Ser

Asn 65

Ser

Gly

Asn

Thr

Ala 70

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser 75

Gly

Thr

Gln

Ala

Met 80

Asp

Glu

Ala

Asp

Tyr 85

Tyr

Cys

Gln

Ala

Trp 90

Asp

Ser

Thr

Ala 95

Val

Phe

Gly

Gly 100

Thr

Lys

Leu

Thr

Val 105

Leu

<210>70 <211>324 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Синтетическая <400> 70 tcctatgagc tgatacagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaccatt acctgtgcgg gagacaacct tgggaagaaa cgtgtgcact ggtaccagca gaggccaggc caggcccctg tgttggtcat ctatgatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgaccga ttctctgcct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcactagggg cgaagccggg gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gacattgcta ctgatcatgt ggtcttcggc ggagggacca agctcaccgt ccta

120

180

240

300

324 <210> 71 <211> 120 <212> PRT

- 114 -

Claims

<213> Искусственная последовательность <220> <223> Синтетическая <400>71

Ser Tyr Glu Leu Ile Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 1015

Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ala Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Arg Val 20 2530

His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 4045

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser 50 5560

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Arg Gly Glu Ala Gly 65 70 7580

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ile Ala Thr Asp His 85 9095

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly

100 105110

Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 115120

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения пациента млекопитающего, страдающего зависимой от ангиогенеза злокачественной опухолью, выбранной из группы, состоящей из колоректального рака, рака молочной железы, легких, почек, печени, пищевода, яичников, поджелудочной железы, предстательной железы, рака желудка, глиомы, стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта, лимфомы, меланомы и карциноидной опухоли, или зависимой от ангиогенеза доброкачественной опухолью, выбранной из группы, состоящей из гемангиомы, акустической невриномы, нейрофибромы, трахомы, карциноидных опухолей и пиогенных гранулем, включающий введение пациенту композиции, содержащей моноклональное антитело или его фрагмент, ингибирующее MASP-2, которое специфически связывается с частью SEQ ID NO: 6, где моноклональное антитело или его фрагмент, ингибирующее MASP-2, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 67, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 69.
2. Способ по п.1, где у пациента имеется зависимая от ангиогенеза злокачественная опухоль, выбранная из группы, состоящей из: солидной(ых) опухоли(ей), распространяющихся через кровь опухолей, карциноидных опухолей высокого риска и метастазов опухолей.
3. Способ по п.2, где у пациента имеется одна или несколько солидных опухолей, и способ включает введение ингибитора MASP-2 в количестве, эффективном для ингибирования ангиогенеза опухолей.
4. Способ по п.3, где пациент страдает или подвержен риску метастазирования опухолей, и способ включает введение ингибитора MASP-2 в количестве, эффективном для ингибирования метастазирования опухолей.
5. Способ по п.1, где антитело или его фрагмент выбраны из группы, состоящей из рекомбинантного антитела, антитела со сниженной эффекторной функцией, химерного антитела, гуманизированного антитела и антитела человека.
6. Способ по п.1, где композицию вводят подкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно, внутриартериально или внутривенно.

- 115 -