ES2672267T3 - Anticuerpo del factor tisular humano y usos del mismo - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo aislado que se une al factor tisular humano en donde el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 139 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 23.

Description

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Anticuerpo del factor tisular humano y usos del mismo
Descripción
Campo de la invención
La invención se refiere a anticuerpos adaptados humanos que se unen al factor tisular humano, un antígeno presente en tejidos vasculares extra que incluyen células tumorales, dichos anticuerpos no inhiben la coagulación sanguínea mediada por factores tisulares. La invención también se refiere a métodos para usar el anticuerpo para tratar afecciones como el cáncer que están asociadas con la presencia y las funciones receptoras del factor tisular humano.
Discusión del Campo
El factor tisular (TF), también conocido como factor de coagulación III (F3), tromboplastina tisular, o CD142 es una glicoproteína transmembrana que tiene un dominio extracelular de 219 aminoácidos que comprende dos dominios de fibronectina tipo III y un dominio intracelular corto con un residuo de serina capaz de ser fosforilado. El TF es el receptor celular para FVII/FVIIa.
El TF muestra una distribución específica del tejido con niveles elevados en el cerebro, el pulmón y la placenta normales y niveles bajos en el bazo, el timo, el músculo esquelético y el hígado en la forma de un receptor celular. También se encuentra en micropartículas derivadas de células y como una forma soluble alternativamente empalmada. Además de la expresión en tejido normal, se ha informado que el TF se sobreexpresa en la mayoría de los tipos de tumores principales y en muchas líneas celulares derivadas de tumores (Ruf W J Thromb Haemost. 5:1584-1587, 2007; Milsom et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29: 2005-2014, 2009).
La coagulación de proteínas séricas en respuesta a una lesión es una respuesta fisiológica importante a la lesión. La exposición de la sangre a proteínas incluyendo colágeno (vía intrínseca) y factor tisular (vía extrínseca) inicia cambios en las plaquetas sanguíneas y el fibrinógeno de la proteína plasmática, un factor de coagulación. Después del daño a un vaso sanguíneo, el factor VII (FVII) deja la circulación y entra en contacto con el factor tisular (TF) expresado en células portadoras del factor tisular (fibroblastos estromales y leucocitos), formando un complejo TF-FVIIa activado. El TF-FVIIa activa el factor IX (FIX) y el factor X (FX). El FVII puede activarse alostéricamente por TF y activarse por trombina, FXIa, plasmina, FXII y FXa. El TF-FVIIa forma un complejo ternario con FXa.
La expresión del factor tisular (TF) por células no vasculares desempeña un papel esencial en la hemostasia activando la coagulación sanguínea. El TF también se asocia con procesos distintos de la hemostasia y relacionados directamente con funciones en la superficie de las células en las que se expresa. El ensamblaje dependiente de TF de proteasas de coagulación en células vasculares y no vasculares activa los receptores activados por proteasa (PAR) que son receptores acoplados a proteína G. Por tanto, el complejo TF:VIIa es capaz de inducir la señalización celular, a través de PARs, principalmente PAR2 (Camerer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5255-5260, 2000; Riewald & Ruf, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7742-7747, 2001; Ruf et al, J Thromb Haemost 1: 1495-4503, 2003; Chen et al., Thromb Haemost 86: 334-45, 2001) contribuyendo a la tumorigénesis, angiogénesis, progresión tumoral y metástasis.
El complejo ternario TF/FVIIa/FXa está formado directamente por el complejo TF:VIIa que actúa sobre FX o indirectamente después de la escisión de TF:VIIa de FIX a FIXa que puede escindir FX a FXa. La formación del complejo TF/FVIIa/FXa puede dar como resultado la señalización o activar otros receptores como PAR1-4. La formación del complejo TF/FVIIa/FXa lleva a la inducción de interleuquina-8 (IL-8), que puede estimular la migración de células tumorales (Hjortor et al., Blood 103:3029-3037, 2004). Tanto PAR1 como PaR2 están implicados en la metástasis tumoral (Shi et al., Mol Cancer Res. 2:395-402, 2004), sin embargo, los complejos binarios y ternarios activados, TF-VIIa y TF-VIIa-FXa, son activadores de PAR2 que también llevan a la señalización celular (Rao & Pendurthi, Arterioscler. Thromb.Vasc. Biol. 25:47-56, 2005)). Por lo tanto, era de interés determinar si el papel oncogénico del factor tisular podría separarse del papel procoagulante, que también se ha sospechado durante mucho tiempo que estaba implicado en la migración tumoral, la extravasación y los mecanismos metastásicos.
Los anticuerpos monoclonales como los descritos porMorrisey (1988, Thromb Res 52(3):247-261; US5223427) y Magdolen (1996 Biol Chem 379: 157-165) para el factor tisular se han usado para explorar aspectos funcionales e inmunológicos de los sitios de unión de ligandos. Los anticuerpos monoclonales capaces de unirse al factor tisular pueden usarse para bloquear eventos trombóticos interfiriendo con la capacidad del TF para formar o mantener el complejo TF-VIIa o bloqueando la capacidad del complejo para activar FX. También se conocen anticuerpos que se unen al factor tisular y no bloquean la coagulación. El factor VIIa inició el bloqueo de la señalización de TF pero no se han descrito anticuerpos que bloqueen la coagulación como el anticuerpo 10H10 (Ahamed et al., 2006 Proc Natl Acad Sci USA 103 (38):13932-13937) y tales anticuerpos han proporcionado la oportunidad de estudiar el papel y la utilidad de un agente con dicha actividad en el tratamiento de tumores sólidos
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(Versteeg, et al 2008 Blood 111(1): 190-199). Ruf et al, en la solicitud publicada WO2007056352A3 divulga métodos y composiciones para inhibir la señalización del factor tisular sin interferir con la hemostasis en un paciente.
Como la progresión del cáncer es un proceso multifacético, sería deseable un candidato terapéutico que sea un anticuerpo de unión a TF capaz de bloquear funciones oncogénicas, metastásicas, angiogénicas y anti- apoptóticas en células tumorales sin interferir con la hemostasia en un paciente.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona un anticuerpo aislado que se une al factor tisular humano en donde el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 139 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 23.
La invención también proporciona una composición farmacéutica útil para tratar a un sujeto que comprende un anticuerpo de la invención en una preparación farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona un kit que comprende un anticuerpo de la invención en una forma estable e instrucciones de uso.
La invención también proporciona un ácido nucleico aislado que codifica los dominios de unión de anticuerpos de un anticuerpo de la invención.
La invención también proporciona un vector que comprende por lo menos un polinucleótido de la invención.
La invención también proporciona una célula huésped que comprende un vector de la invención.
También se divulga en la presente un anticuerpo específico para el factor tisular anti-humano adaptado humano para su uso como un agente terapéutico humano que retiene el epítopo de unión del anticuerpo murino 10H10, dicho anticuerpo no compite con el factor tisular para la unión a FVIIa y por lo tanto no bloquea sustancialmente el procoagulante, actividad amidolítica del complejo TF-VIIa pero que bloquea la señalización mediada por TF-VIIa y efectos oncogénicos cadena abajo como la liberación de citoquinas IL-8.
El anticuerpo adaptado humano divulgado escrito en la presente está construido de marcos de dominio variable de IgG humana en combinación con residuos variantes de CDR como se determina por referencia a la secuencia de las secuencias de CDR del anticuerpo murino 10H10 y representadas como las SEQ ID NO: 6-11 y 27. Se proporcionan marcos humanos FR1 y FR2 y FR3, combinadas con las CDR y variantes de CDR, con FR4, que permiten el ensamblaje de dominios de unión a anticuerpos con la inmunoespecificidad del anticuerpo murino 10H10. Las seis secuencias de CDR representadas por las SEQ ID NO: 6-11 o como el grupo representado por las SEQ ID NO: 6, 8-11 y 27 pueden combinarse con FRs de la línea germinal humana, definidas como las posiciones no CDR de un dominio variable de IgG humana, seleccionado de tal manera que se retenga la afinidad de unión de 10H10 para TF humano. Las FR de las región variable de HC humana pueden derivarse de un miembro de la familia génica 1, 3 ó 5 IGHV como se representa por la base de datos IMGT. Las FR de la región variable LC humana pueden derivarse de un miembro de la familia génica 2 ó 4 IGKV humana. En un caso, el anticuerpo Fv (región variable HC emparejada con una región variable LC) comprende un dominio variable HC seleccionado de las SEQ ID NO: 12-21 y un dominio variable LC seleccionado de las SEQ ID NO: 22-26.
Las FR humanas que forman un anticuerpo Fv (región variable HC emparejada con una región variable LC) comprenden FR de IGHV5 e IGKV2. Un anticuerpo divulgado en la presente comprende un dominio variable HC que tiene la H-CDR3 de la SEQ ID NO: 8; una H-CDR1 que tiene una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 6 y 6283; una H-CDR2 que tiene una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 7, 27 y 84-107; y una región HC de FR4, opcionalmente, seleccionada de IGVJ4 (SEQ ID NO: 60) o una variante de la misma. Los anticuerpos divulgados en la presente comprenden además aquellos que tienen un dominio variable de LC que tiene una L-CDR1 que tiene una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 9, 108-116; una L-CDR2 que tiene una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 10 y 117-120; y una L-CDR3 que tiene una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 11 y 121128; y una región LC de FR4, opcionalmente, seleccionada de IGKJ2 (SEQ ID NO: 61) o una variante de la misma. Las secuencias marco humanas se derivan de IGHV5_a e IGKV2D40_O1. El dominio variable creado comprende las secuencias de las SEQ ID NO: 139 y 23. También se divulgan secuencias marco humanas derivadas de IGHV5_a en las que el dominio variable creado comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 19, 129-138, 140-155. En otro caso, las secuencias marco humanas se derivan de IGKV2D40_O1 y el dominio variable creado comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 156-163.
Los anticuerpos divulgados en la presente pueden representarse en una forma como anticuerpos que tienen un dominio de unión derivado de marcos de IGHV5_a, definidos como posiciones no CDR, una H-CDR3 que tiene la secuencia SGYYGNSGFAY (SEQ ID NO: 8), en donde las secuencias en la posición de H-CDR-1 viene dada por la fórmula:
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H-CDR1 GYTFX1X2X3WIE (I) (SEQ ID NO: 83)
en la que X1 se selecciona de A, D, G, I, L, N, P, R, S, T, V, e Y; X2 se selecciona de A, P, S y T, y X3 se selecciona de F, H e Y; o la secuencia puede ser GFTFITYWIA (SEQ ID NO: 81); y la secuencia en la posición de H-CDR2 viene dada por la fórmula:
H-CDR2 DIX1PGX2GX3TX4 (II) (SEQ ID NO: 107)
en la que X1 se selecciona de I y L, X2 se selecciona de S y T, X3 se selecciona de A, F, H y w; y X4 se selecciona de D, H, I, L y N; excepto en H189 donde H-CDR2 es DILPASSSTN (SEQ ID NO: 105).
Los anticuerpos divulgados en la presente se representan como anticuerpos que tienen un dominio de unión derivado de marcos IGKV2D40_O1, definidos como posiciones no CDR, y en donde las secuencias en la L- CDR-1 y/o LCDR-2 y L-CDR3 tienen las secuencias dadas por las fórmulas:
L-CDR1 KSSQSLLX1X2X3X4QX5NYLT (III) (SEQ ID NO: 116)
en la que X1 se selecciona de F, P, S, T, W e Y; X2 se selecciona de F, S, T, R y V; X3 se selecciona de A, G, P, S, W, Y y V; X4 se selecciona de G, N y T; X5 se selecciona de K, R y S;
L-CDR2 X1ASTRX2S (IV) (SEQ ID NO: 120)
en la que X1 se selecciona de H y W; X2 se selecciona de D, E y S;
L-CDR3 QNDX1X2X3PX4T (V) (SEQ ID NO: 128)
en la que X1 se selecciona de D, F y L; X2 se selecciona de S, T e Y; X3 se selecciona de W e Y; X4 se selecciona de L y M.
Por tanto, los residuos de CDR de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo están sustancialmente modificados de las CDR murinas de 10H10. Por ejemplo, de acuerdo con la descripción enunciada anteriormente, la cadena pesada del anticuerpo puede ser solo un 70% (3/10 residuos alterados en la CDR1), y un 60% (4/10 residuos alterados en la CDR2) similares a las CDR murinas de 10H10 (la CDR 3 no se cambia). Los residuos de CDR de la cadena ligera son solo un 71% (5/17 cambiados)), (71%) (2/7 cambiados), o 55% (4/9 cambiados) similares a las CDR murinas de 10H10.
También se divulgan en la presente anticuerpos adaptados humanos que compiten por la unión al factor tisular humano y, por tanto se unen sustancialmente al mismo epítopo en TF-ECD humano que el anticuerpo 10H10 murino. También se divulgan en la presente métodos para usar dichos anticuerpos para tratar a un sujeto humano que padece una afección en la que la expresión de TF y la bioactividad local resultante de la expresión de TF están relacionadas directa o indirectamente con la afección a ser tratada.
También se divulgan en la presente métodos para preparar los anticuerpos así como preparaciones farmacéuticamente aceptables de los anticuerpos, un recipiente que comprende la preparación, y un kit que comprende el recipiente en el que un anticuerpo divulgado en la presente está disponible para los métodos de uso para tratar un sujeto humano.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra el epítopo revelado por análisis de difracción de rayos X de un co-cristal de Fab 10H10 o con una variante adaptada humana (Fab M1593) y residuos de TF-ECD humanos 5-208, donde se muestran los dos residuos de contacto que se cambiaron en H-CDR1 (T31P) y HCDR-2 (S57F) de M1593.
La Figura 2 es una alineamiento de los residuos de aminoácidos de humano (SEQ ID NO: 1, 1-219), cyno (SEQ ID NO: 2, 1-220), y TF-ECD de ratón (SEQ ID NO: 3, 1-221) que muestra las posiciones de los residuos contactadas por el anticuerpo murino TF8-5G9 (Huang et al., 1998 J Mol Biol 275:873-94) y 10H10 y aquellos residuos que se sabe que están en contacto con los factores de coagulación FVII/VIIa y FX.
La Figura 3 muestra la proyección tridimensional de TF-ECD humano con las áreas indicadas contactadas por los paratopos de 5G9 y 10H10 así como los factores de coagulación FVII y FX, donde solo los residuos L104 y T197 son contactados por tanto 10H10 como FX.
La Figura 4 muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de la cadena pesada (alineamiento superior) y la cadena ligera (alineamiento inferior) del anticuerpo murino 10H10 (SEQ ID NO: 4 y 5, respectivamente), las secuencias adaptadas al marco humano del anticuerpo M59 (SEQ
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ID NO: 19 y 23, respectivamente) y, dos secuencias del dominio variable maduradas por afinidad seleccionadas H116 (SEQ ID NO: 133) y H171 (SEQ ID NO: 139).
La Figura 5 muestra el porcentaje relativo de inhibición por los 27 mAbs madurados por afinidad para la liberación de IL-8 inducida por FVIIa a 0,24 |jg/ml por células de cáncer de mama MDB-MB-231 en comparación con el control de isotipo B37.
La Figura 6 muestra un gráfico del volumen tumoral durante los días posteriores a la implantación de células tumorales MDA-MB231 en ratones inmunocomprometidos donde el grupo dosificado con M1593 redujo el crecimiento de un tumor establecido.
La Figura 7 muestra un gráfico del volumen tumoral durante los días posteriores a la implantación de células tumorales escamosas humanas A431 en ratones inmunocomprometidos en los que el grupo dosificado con M1593 redujo el crecimiento de un tumor establecido.
La Figura 8 muestra un gráfico del porcentaje de lisis de células objetivo (células MDA-MB231) por PBMC humano frente a concentraciones de MAb para la IgG1 humana del dominio variable murino (M1), IgG4 humana del dominio variable murino con sustitución de alanina en las posiciones 234 y 235, M1593 como la IgG1 de tipo salvaje producida en CHO no modificadas, como M1593-LF producida en una línea de CHO seleccionada para producir glicano con bajo contenido de fucosa, y M1593-DE con sustituciones en la posición Kabat en s239D e I332E.
DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS
SEQ ID NO:
Descripción Características u Origen
1
Cadena Madura de Factor Tisular Humano ECD = 1-219
2
ECD de Factor Tisular de Mono Cynomolgous ECD solo 1-220
3
Factor de tejido Mus musculus (P20352) ECD = 1-221
4
Región variable de la cadena pesada (HC) de 10H10
5
Región variable de cadena ligera (LC) de 10H10
6
H-CDR1 de 10H10
7
H-CDR2de 10H10
8
H-CDR3de 10H10
9
L-CDR1 de 10H10
10
L-CDR2 de 10H10
11
L-CDR3 de 10H10
12
H15 IGHV5-in
13
H16 IGHV1-46
14
H17 IGHV1-3
15
H18 IGHV3-74
16
H19 IGHV1-69
17
H20 IGHV1-18
18
H21 IGHV1-f
19
H22 s1_IGHV5-a
20
H23 s1_IGHV1-69
21
H24 s1_IGHV1-f
5
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65
SEQ ID NO:
Descripción Características u Oriaen
22
L2 IGKV4-1_B3
23
L3 IGKV2D40_O1
24
L4 IGKV2D-28_A3
25
L5 IGKV2D-29_A2
26
L7 IGKV2-24_A23
27
H-CDR2 de H22, H23 y H24 Murino, Kabat -7
28
FR1 de H15 y H22 IGHV5-in
29
FR1 de H16, H17 y H20 IGHV1-46, IGHV1-3, IGHV1-18
30
FR1 de H18 IGHV3-74
31
FR1 de H19 y H23 IGHV1-69
32
FR1 de H21 y H24
33
FR2 de H15 y H22 IGHV5-in
34
FR2 de H16, H19, H20 y H23_s1_IGHV1-69 FR2 de IGHV1-46, IGHV1-18 y s1_IGHV1-69
35
FR2 de H17 IGHV1-3
36
FR2 de H18 IGHV3-74
37
FR2 de H21 y H24 IGHV1-f
38
FR3 de H15 IGHV5-in
39
FR3 de H16 IGHV1-46
40
FR3 de H17 IGHV1-3
41
FR3 de H18 IGHV3-74
42
FR3 de H19 IGHV1-69
43
FR3 de H20 IGHV1-18
44
FR3 de H21 IGHV1-f
45
FR3 de H22 s1_IGHV5-a
46
FR3 de H23 s1_IGHV1-69_
47
FR3 de H24 s1_IGHV1-f
48
FR1 de L2 IGKV4-1_B3
49
FR1 de L3 IGKV2D40_O1
50
FR1 de L4 IGKV2D-28_A3
51
FR1 de L5 IGKV2D-29_A2
52
FR1 de L7 IGKV2-24_A23
53
FR2 de L2 IGKV4-1_B3
54
FR2 de L3 y L4 IGKV2D-28_A3
5
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60
65
SEQ ID NO:
Descripción Características u Oriaen
55
FR2 de L5 IGKV2D-29_A2
56
FR2 de L7 IGKV2-24_A23
57
FR3 de L2 IGKV4-1_B3
58
FR3 de L3, L4 y L5 IGKV2D40 O1, IGKV2D-28 A3, IGKV2D- 29_A2
59
FR3 de L7 IGKV2-24_A23
60
FR4 HC IGHJ4
61
FR4 LC IGKJ2
62
H-CDR1 de H106 en M1602
63
H-CDR1 de H116 en M1587
64
H-CDR1 de H117 en M1590
65
H-CDR1 de H122 en M1591
66
H-CDR1 de H133 en M1612
67
H-CDR1 de H134 en M1597
68
H-CDR1 de H136 en M1613 y H185 de M1596
69
H-CDR1 de H136 en M1613
70
H-CDR1 de H139 en M1585
71
H-CDR1 de H158 en M1594
72
H-CDR1 de H160 en M1595 M1595
73
H-CDR1 de H164 en M1586
74
H-CDR1 de H165 en M1592
75
H-CDR1 de H168 en M1605
76
H-CDR1 de H171 en M1593
77
H-CDR1 de H173 en M1584
78
H-CDR1 de H179 en M1588
79
H-CDR1 de H181 en M1606
80
H-CDR1 de H187 en M1589
81
H-CDR1 de H189 en M1607
82
H-CDR1 de H177, H130, H105 y H128
83
Variantes H-CDR1
84
H-CDR2 de H106 en M1602
85
H-CDR2 de H115 en M1610
86
H-CDR2 de H116 en M1587
5
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60
65
SEQ ID NO:
Descripción Características u Origen
87
H-CDR2 de H117 en M1590
88
H-CDR2 de H128 en M1611
89
H-CDR2 de H130 en M1599
90
H-CDR2 de H134 en M1597
91
H-CDR2 de H136 en M1613
92
H-CDR2 de H137 en M1598
93
H-CDR2 de H138 en M1604
94
H-CDR2 de H160 en M1595
95
H-CDR2 de H164 en M1586
96
H-CDR2 de H165 en M1592
97
H-CDR2 de H168 en M1605
98
H-CDR2 de H171 en M1593
99
H-CDR2 de H173 en M1584
100
H-CDR2 de H177 en M1583
101
H-CDR2 de H179 en M1588
102
H-CDR2 de H181 en M1606
103
H-CDR2 de H185 en M1596
104
H-CDR2 de H187 en M1589
105
H-CDR2 de H189 en M1607
106
H-CDR2 de H207 en M1608
107
Variantes H-CDR2
108
L-CDR1 de L138 en ambos M1646 y M1638
109
L-CDR1 de L162 en ambos M1651 y M1643
110
L-CDR1 de L225 en ambos M1652 y M1644
111
L-CDR1 de L283 en ambos M1653 y M1645
112
L-CDR1 de L320 en ambos M1647 y M1639
113
L-CDR1 de L327 en ambos M1648 y M1640
114
L-CDR1 de L335 en ambos M1649 y M1641
115
L-CDR1 de L369 en ambos M1650 y M1642
116
Variantes de L-CDR1
117
L-CDR2 de L138 en ambos M1646 y M1638
118
L-CDR2 de L320 en ambos M1647 y M1639
119
L-CDR2 de L335 en ambos M1649 y M1641
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
SEQ ID NO:
Descripción Características u Origen
120
Variantes L-CDR2
121
L-CDR3 de L162 en ambos M1651 y M1643
122
L-CDR3 de L225 en ambos M1652 y M1644
123
L-CDR3 de L283 en ambos M1653 y M1645
124
L-CDR3 de L320 en ambos M1647 y M1639
125
L-CDR3 de L327 en M1648 y M1640
126
L-CDR3 de L335 en ambos M1649 y M1641
127
L-CDR3 de L369 en M1650 y M1642
128
Variantes L-CDR3
129
H177
130
H173
131
H139
132
H164
133
H116
134
H179
135
H187
136
H117
137
H122
138
H165
139
H171
140
H158
141
H160
142
H185
143
H134
144
H137
145
H130
146
H105
147
H106
148
H138
149
H168
150
H181
151
H189
152
H207
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
SEQ ID NO:
Descripción Características u Origen
153
H115
154
H128
155
H133
156
H136
157
L138
158
L320
159
L327
160
L335
161
L369
162
L162
163
L225
164
L283
165
Cadena ligera de longitud completa de M1593
166
Cadena pesada de longitud completa de M1593
167
Cadena pesada de longitud completa de M1593-DE
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Abreviaturas
TF = Factor tisular, huTF = Factor Tisular Humano, muTF = Factor Tisular Murino, cynoTF = Factor Tisular de Cynomolgus, TF-FVIIa = Complejo Factor Tisular-Factor VIIa, TF/FVIIa = Complejo Factor Tisular-Factor VIIa, HC = Cadena pesada, LC = cadena ligera, región-v = región variable, VH = región variable de cadena pesada, VL = región variable de cadena ligera, CCD = Dispositivo acoplado a carga, CDR = Región determinante de la complementariedad, CHES = ácido 2-(N-ciclohexilamino)-etanosulfónico, EDTA = ácido etilendiaminotetraacético, ECD = dominio extracelular, HEPES = ácido N-(2-hidroxietil) -piperazina-N'-2-etanosulfónico, HEK = células de riñón embrionarias humanas, MES = ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico , PAR = Receptor activado de proteasa, PBMC = células mononucleares de sangre periférica, PBS = Solución salina tamponada con fosfato, PDB = Banco de Datos de Proteínas, PEG = polietilenglicol, SDS PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, SEC = Cromatografía de exclusión por tamaño, MAb = Anticuerpo monoclonal, FR = Marco en anticuerpo, HFA = Adaptación de marco humano.
Definiciones y Explicación de la Terminología
Como se usa en la presente, un "anticuerpo" incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión al antígeno o una cadena individual de los mismos. Por tanto, el anticuerpo incluye cualquier molécula que contiene proteínas o péptidos que comprende por lo menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, como, pero no limitado a, por lo menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una porción de unión a ligando de la misma, una región variable de cadena pesada o ligera, una región constante de cadena pesada o ligera, una región marco (FR), o cualquier porción de las mismas, o por lo menos una porción de una proteína de unión, que puede incorporarse en un anticuerpo del presente invención. El término "anticuerpo" se pretende que incluya además anticuerpos, fragmentos de digestión, porciones especificadas y variantes de los mismos, incluyendo miméticos de anticuerpos o que comprenden porciones de anticuerpos que imitan la estructura y/o función de un anticuerpo o un fragmento o porción especificada del mismo, que incluyen anticuerpos de cadena sencilla y de dominio único y fragmentos de los mismos. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de unión al antígeno a un objetivo preseleccionado. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH; (ii) un fragmento F(ab') 2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH; (iv)
5
10
15
20
25
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55
60
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un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, mediante un conector sintético que les permita formarse como una cadena de proteínas individual en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); ver, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426, y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena sencilla también se pretende que estén incluidos dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se examinan por su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. Por el contrario, las bibliotecas de constructos de scFv se pueden usar para examinar la capacidad de unión a antígeno y luego, usando técnicas convencionales, empalmar con otro aDn que codifica secuencias de genes de la línea germinal humana. Un ejemplo de tal biblioteca es la "HuCAL: Human Combinatorial Antibody Library" (Knappik, A. et al. J Mol Biol (2000) 296(1):57-86).
El término "CDR" se refiere a la región determinante de la complementariedad o a los residuos de aminoácidos de la región hipervariable de un anticuerpo que participa en o es responsable de la unión al antígeno. La región hipervariable o CDR del subtipo de IgG humana del anticuerpo comprende residuos de aminoácidos de los residuos 24-34 (L-CDR1), 50-56 (L-CDR2) y 89-97 (L-CDR3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H-CDR1), 50-65 (H-CDR2) y 95-102 (H-CDR3) en el dominio variable de la cadena pesada como se describe por Kabat et al. (1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) y/o aquellos residuos de un giro hipervariable (es decir, residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (HI), 52-56 (H2), y 95-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada como se describe por (Chothia y Lesk, 1987 J. Mol. Biol. 196: 901917). Chothia y Lesk se refieren a giros hipervariables estructuralmente conservados como "estructuras canónicas". Los residuos marco o FR1-4 son aquellos residuos del dominio variable distintos de y que delimitan las regiones hipervariables. El sistema de numeración de Chothia y Lesk tiene en cuenta las diferencias en el número de residuos en un giro mostrando la expansión en residuos especificados indicados con anotacionesde letras pequeñas, por ejemplo, 30a, 30b, 30c, etc. Más recientemente, se ha desarrollado y adoptado ampliamente un sistema de numeración universal, international ImMunoGeneTics information system® (IMGT) (LaFranc, et al. 2005. Nucl Acids Res. 33:D593-D597).
En la presente, se hace referencia a las CDR en términos tanto de secuencia de aminoácidos como de la localización dentro de la cadena ligera o pesada mediante numeración secuencial. Como la "localización" de las CDR dentro de la estructura del dominio variable de inmunoglobulina se conserva entre especies y está presente en estructuras llamadas giros, mediante el uso de sistemas de numeración que alinean secuencias de dominios variables de acuerdo con características estructurales, CDR y residuos de marco y se identifican fácilmente. Esta información se usa en el injerto y la sustitución de residuos de CDR de inmunoglobulinas de una especie en un marco aceptor de, típicamente, un anticuerpo humano.
Los términos "Fc", "proteína que contiene Fc" o "molécula que contiene Fc" como se usan en la presente se refieren a una proteína monomérica, dimérica o heterodímera que tiene por lo menos un dominio de inmunoglobulina CH2 y CH3. Los dominios CH2 y CH3 pueden formar por lo menos una parte de la región dimérica de la proteína/molécula (por ejemplo, anticuerpo).
El término "epítopo" significa un determinante de proteínas capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítopos consisten habitualmente de agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque se pierde la unión al primero pero no al último en presencia de solventes desnaturalizantes.
Como se usa en la presente, Kd se refiere a la constante de disociación, específicamente, la Kd del anticuerpo para un antígeno predeterminado, y es una medida de la afinidad del anticuerpo por un objetivo específico. Los anticuerpos de alta afinidad tienen una Kd de 10'8M o menos, más preferiblemente 10'9 M o menos e incluso más preferiblemente 10‘1° M o menos, para un antígeno predeterminado. El recíproco de Kd es Ka , la constante de asociación. El término "kdis" o 'V ,o "kd" como se usa en la presente, se pretende que se refiera a la velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. La "Kd" es la proporción de la velocidad de disociación (k2), también denominada la "disociación (koff)" para la velocidad de asociación (k-i) o" asociación (kon)". Por lo tanto, Kd es igual a k2/k1 o koff/kon y se expresa como una concentración molar (M). Se deduce que cuanto menor es la Kd, más fuerte es la unión. Por tanto, una Kd de 10‘6M (o 1 microM) indica unión débil en comparación con 10‘9 M (o 1nM).
Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" tal como se usan en la presente se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpos de composición molecular única. Una
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composición de anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad para un epítopo particular. El término también incluye "anticuerpo recombinante" y "anticuerpo monoclonal recombinante" ya que todos los anticuerpos se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, como (a) anticuerpos aislados de un animal o un hibridoma preparado por la fusión de células animales secretoras de anticuerpos y un compañero de fusión, (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos o de otras especies recombinante, combinatoria, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que impliquen el corte y empalme de las secuencias del gen de inmunoglobulina a otras secuencias de ADN. Un "anticuerpo aislado", como se usa en la presente, se pretende que se refiera a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de TF humano puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homólogos de especies de TF). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos. En una realización de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" que tienen especificidades diferentes se combinan en una composición bien definida.
Como se usa en la presente, "unión específica", "unión inmunoespecífica" y "se une inmunoespecíficamente" se refiere a la unión del anticuerpo a un antígeno predeterminado. Típicamente, el anticuerpo se une con una constante de disociación (Kd) de 10-7 M o menos, y se une al antígeno predeterminado con una Kd que es por lo menos dos veces menor que su Kd para la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína, o cualquier otro polipéptido especificado) distinto del antígeno predeterminado. Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan de manera intercambiable en la presente con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno". Como se usa en la presente, unión "altamente específica" significa que la Kd del anticuerpo para el epítopo objetivo específico es por lo menos 10 veces menor que la Kd para la unión de ese anticuerpo a otros ligandos.
Como se usa en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG) que está codificada por genes de la región constante de la cadena pesada. Algunas clases de anticuerpos abarcan además subclases que también están codificadas por las regiones constantes de la cadena pesada y decoradas además por oligosacáridos en residuos específicos dentro de los dominios de la región constante (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) que imparten además funciones biológicas al anticuerpo. Por ejemplo, en los isotipos de anticuerpos humanos IgG1, IgG3 y, en menor medida, IgG2 muestran funciones efectoras como lo hacen los anticuerpos murinos IgG2a.
Por funciones "efectoras" o "efectoras positivas" se entiende que el anticuerpo comprende dominios distintos de los dominios de unión específicos del antígeno capaces de interactuar con receptores u otros componentes sanguíneos como el complemento, que llevan, por ejemplo, al reclutamiento de macrófagos y eventos que llevan a la destrucción de las células unidas por los dominios de unión al antígeno del anticuerpo. Los anticuerpos tienen varias funciones efectoras mediadas por la unión de moléculas efectoras. Por ejemplo, la unión del componente C1 del complemento a anticuerpos activa el sistema del complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y lisis de los patógenos celulares. La activación del complemento estimula la respuesta inflamatoria y también puede estar implicada en la hipersensibilidad autoinmune. Además, los anticuerpos se unen a las células a través de la región Fc, con un sitio del receptor de Fc en la región Fc del anticuerpo que se une a un receptor de Fc (FcR) en una célula. Hay varios receptores de Fc que son específicos para diferentes clases de anticuerpo, incluyendo IgG (receptores gamma), IgE (receptores eta), IgA (receptores alfa), e IgM (receptores mu). La unión del anticuerpo a los receptores de Fc en las superficies celulares desencadena una serie de respuestas biológicas importantes y diversas incluyendo la engullición y la destrucción de partículas recubiertas con anticuerpos, la depuración de complejos inmunes, la lisis de células objetivo recubiertas con anticuerpos por células asesinas (denominada citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos, o ADCC), liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de la producción de inmunoglobulinas.
Los términos "proteína del factor tisular", "factor tisular" y "TF" se usan para referirse a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un factor tisular humano de origen natural o a un factor tisular recombinante como se describe a continuación. El TF de origen natural incluye especies humanas así como otras especies animales como el factor tisular de conejo, rata, porcino, primate no humano, equino, murino y ovino (ver, por ejemplo Hartzell et al., (1989) Mol. Cell. Biol., 9:2567-2573; Andrews et al., (1991) Gene, 98:265-269; y Takayenik et al., (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm., 181:1145-1150). La secuencia de aminoácidos del factor tisular humano viene dada por el registro UniProt P13726 (SEQ ID NO: 1), mono cynomolgous (SEQ ID NO: 2) y murino por UniProt P20352 (SEQ ID NO: 3). La secuencia de aminoácidos de otras proteínas del factor tisular de mamífero es generalmente conocida o puede obtenerse mediante técnicas convencionales.
Los anticuerpos de la invención son útiles para su administración a un sujeto humano o para contactar con tejido humano cuando se desea bloquear las funciones del FT humano expresado en una célula, tejido u órgano resultante de la señalización de FT y en donde también se desea no alterar sustancialmente las funciones
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procoagulantes de TF que resultan de la formación de un complejo TF:FVIIa. Tales usos pueden encontrarse en el tratamiento de tumores, en particular, tumores sólidos primarios o secundarios de mama, próstata, pulmón, páncreas y ovario.
La invención también abarca ácidos nucleicos que codifican las secuencias de anticuerpos de la invención que pueden combinarse con aquellas secuencias que se sabe en la técnica que son útiles en la construcción y fabricación a través de medios recombinantes o transferencia de la información para la expresión de anticuerpos en un medio donde es deseable que se formen, como en cultivo, in situ e in vivo. Los medios para el funcionamiento de tales ácidos nucleicos con la intención de producir un anticuerpo de la invención son bien conocidos por los expertos en la técnica.
La invención proporciona además preparaciones tales como preparaciones farmacéuticamente aceptables o estables para la administración y almacenamiento de un anticuerpo de la invención en forma aislada.
1. Composición del anticuerpo
Propiedades
La presente invención se basa en el descubrimiento inesperado de que un anticuerpo murino que no bloquea la coagulación que se une al TF humano, conocido como 10H10 (Edgington, et al. US 5.223.427) es capaz de anular la señalización de TF en ciertas células (Ahmed, et al., 2006, citado anteriormente, WO2007/056352A2). Por lo tanto, un anticuerpo divulgado en la presente es uno que retiene el epítopo de unión del anticuerpo murino 10H10, cuyo anticuerpo no compite con el factor tisular para la unión de FVIIa y no bloquea sustancialmente la actividad procoagulante, amidolítica del complejo TF-VIIa y que no bloquea la señalización mediada por TF-VIIa y los efectos oncogénicos corriente abajo como la liberación de IL-8 de citoquinas. El anticuerpo está adaptado a genes de IgG de la línea germinal humana como se representa en la base de datos IMGT y retiene la unión a TF humano a la vez que no interfiere con la capacidad del TF para iniciar la coagulación en presencia de calcio en plasma humano.
Un anticuerpo que retiene el epítopo de unión del anticuerpo murino 10H10 puede evaluarse generalmente evaluando la capacidad del anticuerpo de unirse a TF y de competir con 10H10 por la unión a TF humano mientras que al mismo tiempo, cuando está presente en una muestra que comprende TF en presencia de plasma humano, no prolongará sustancialmente el tiempo requerido para la coagulación de plasma iniciada por TF en comparación con una muestra similar de plasma humano en ausencia del anticuerpo. En otro sentido, el epítopo del anticuerpo puede mapearse físicamente usando técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, pero no están limitadas a, mutagénesis por deleción, mutagénesis por sustitución, proteólisis limitada de TF unida por el anticuerpo seguido por identificación del fragmento del péptido, y métodos de co-cristalización y difracción de rayos X para mapear la proximidad de estructuras atómicas de las estructuras primarias del TF y los dominios de unión al anticuerpo definiendo de este modo una asociación tridimensional entre el anticuerpo y el TF humano (Fig. 1).
El epítopo, por tanto, puede definirse como no superpuesto con el sitio de unión de FVIIa (Fig. 2 y 3). Más específicamente, el epítopo unido por el anticuerpo puede contactar con uno o más residuos en el dominio N de TF (residuos 1-104 de la cadena madura como se representa por la SEQ ID NO: 1) no contactados por FVII, como los residuos 65-70, y no contactar con los residuos K165 y K166 en el dominio C, que son importantes para la unión al sustrato (Kirchofer et al., 2000 Thromb Haemostat 84: 1072-81) a la vez que no interfiere con la capacidad de TF para iniciar la coagulación en presencia de calcio en plasma humano.
En una realización, la asociación (ka en 1/Ms) del anticuerpo es mayor de 1 X 10'5. En otra realización, la disociación (kd en 1/s) del anticuerpo para TF es menor que 1,0 x 10'5 y la Kd resultante es inferior a 1 x 10'9 M (menos de 1 nM). En una realización particular, el anticuerpo es un anticuerpo adaptado al gen de la línea germinal humana con una Kd inferior a 0,5 * 10'9 M. El anticuerpo tiene dominios de unión de los emparejamientos de cadena pesada y ligera de M1593 como se muestra en la Tabla 11. También se divulgan anticuerpos que tienen dominios de unión de los emparejamientos de la cadena pesada y ligera como se muestra en la Tabla 11 comoM1639, M1645, M1647, M1652, M1641, M1644, M1587, M1604, , M1606, M1584, M1611, M1596, M1601, M1588, M1594, M1607, M1612, M1595, M1599, M1589, M1592, M1583, y M1610.
La composición del anticuerpo puede caracterizarse además como comprendiendo una secuencia de residuos de aminoácidos en el dominio de unión seleccionado de una o más de las secuencias de aminoácidos dadas por las SEQ ID NO: 6-166.
Variantes de anticuerpos con funciones de Fc Alteradas
A medida que el uso de anticuerpos monoclonales terapéuticos producidos por métodos recombinantes se expande, se están explorando las características y propiedades de estas composiciones complejas. Aunque las características inmunoespecíficas y dirigidas a antígenos residen generalmente en los dominios y subdominios
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variables, como los extremos de giros de las regiones hipervariables también conocidas como CDR, el complejo interactúa con otros receptores y componentes séricos proporcionados por las estructuras formadas por los dominios constantes, como la porción Fc de una IgG.
Los anticuerpos y otras proteínas que contienen Fc pueden compararse para la funcionalidad mediante varios ensayos in vitro bien conocidos. En particular, es interesante la afinidad para los miembros de la familia FcyRI, FcyRIl y FcyRIII de los receptores de Fcy. Estas mediciones podrían hacerse usando formas solubles recombinantes de los receptores o formas asociadas a células de los receptores. Adicionalmente, la afinidad para FcRn, el receptor responsable de la vida media circulante prolongada de las IgG, puede medirse, por ejemplo, mediante BIAcore usando FcRn soluble recombinante. Los ensayos funcionales basados en células, como los ensayos ADCC y los ensayos CDC, proporcionan comprensión sobre las consecuencias funcionales probables de las estructuras variantes particulares. En una realización, el ensayo ADCC está configurado para que las células NK sean la célula efectora primaria, reflejando de este modo los efectos funcionales en el receptor de FcyRIIIA. También pueden usarse ensayos de fagocitosis para comparar las funciones efectoras inmunes de diferentes variantes, así como ensayos que miden las respuestas celulares, como la liberación de superóxido o mediadores inflamatorios. También pueden usarse modelos in vivo, como, por ejemplo, en el caso de usar variantes de anticuerpos anti-CD3 para medir la activación de células T en ratones, una actividad que depende de dominios Fc que acoplan con ligandos específicos, como receptores de Fcy.
2. Generación de Anticuerpos Bloqueadores de la Señal del Factor Tisular
Un anticuerpo que tiene las características y la actividad biológica de un anticuerpo descrito en esta solicitud puede incluir o derivarse de cualquier mamífero, como, pero no limitado a, un humano, un ratón, un conejo, una rata, un roedor, un primate, una cabra, o cualquier combinación de los mismos e incluye anticuerpos de humanos, primates, roedores, mamíferos, quiméricos, adaptados a humanos o a primates, inmunoglobulinas, productos de escisión y otras porciones especificadas y variantes de los mismos aisladas. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse por cualquier método conocido en la técnica como la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495-497).) y métodos relacionados usando compañeros de fusión inmortalizados fusionados a células B. Los anticuerpos para su uso en la invención pueden generarse también usando métodos de anticuerpos de linfocitos individuales clonando y expresando ADNc de regiones variables de inmunoglobulina generados a partir de linfocitos individuales seleccionados para la producción de anticuerpos específicos mediante, por ejemplo los métodos descritos por Babcook, J. et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. uSa 93(15):7843-78481 ; la WO92/02551; la WO2004/051268 y la Solicitud de Patente Internacional número WO2004/106377.
Los anticuerpos, incluyendo los dominios o subdominios de unión al objetivo, los dominios constantes, y los dominios de unión no al objetivo funcionales como el dominio Fc, como se describen en la presente, pueden derivarse de varias maneras bien conocidas en la técnica. En un aspecto, las secuencias de dominios de anticuerpos de origen natural se obtienen convenientemente de documentos o bases de datos publicados o en línea, como la V-base (proporcionada por el MRC Centre for Protein Engineering), el National Center for Biologics Information (NCBI Ig blast), o la base de datos ImMunoGeneTics (IMGT) proporcionada por el International Immunogenetics Information System®.
Anticuerpos humanos
La invención proporciona además inmunoglobulinas (o anticuerpos) humanos que se unen a TF humano. Estos anticuerpos también pueden caracterizarse como diseñados o adaptados. Las inmunoglobulinas tienen región(es) variable(s) sustancialmente de una inmunoglobulina de la línea germinal humana e incluyen variaciones dirigidas en residuos que se sabe participan en el reconocimiento de antígeno, por ejemplo, las CDR de Kabat o los giros hipervariables como se definen estructuralmente. Las región(es) constante(s), si están presentes, también son sustancialmente de una inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanos muestran una Kd para TF de por lo menos aproximadamente 10'6 M (1 microM), aproximadamente 10'7M (100 nM), 10'9M (1 nM), o menos. Para afectar un cambio en la afinidad, por ejemplo, mejorar la afinidad o reducir la Kd, del anticuerpo humano para TF, pueden realizarse sustituciones o en los residuos de CDR o en otros residuos.
La fuente para la producción de anticuerpo humano que se une a TF es preferiblemente las secuencias proporcionadas en la presente como las regiones variables que comprenden una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 129-163, una FR seleccionada de las SEQ ID NO: 28-61, y CDR, donde las CDR se seleccionan de una o más de las SEQ ID NO: 6-11, 27, 62-128 identificadas como capaces de unirse a TF humano y reaccionar de forma cruzada con TF de mono cynomolgous usando un repertorio de Fab derivado de humano expuesto en partículas de fago filamentoso.
La sustitución de cualquiera de las CDR no humanas en cualquier FR de dominio variable humano puede no permitir la misma orientación espacial proporcionada por la conformación a la FR variable original de la que se originaron las CDR. Las regiones marco variables de cadena pesada y ligera a emparejar en el MAb final pueden derivarse de la misma o de diferentes secuencias de anticuerpos humanos. Las secuencias de anticuerpos humanos
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pueden ser las secuencias de anticuerpos humanos de origen natural, derivarse de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana, o pueden ser secuencias de consenso de varias secuencias de anticuerpos y/o línea germinal humanas.
Las secuencias de anticuerpos humanos adecuadas se identifican mediante comparaciones informáticas de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de ratón con las secuencias de anticuerpos humanos conocidos. La comparación se realiza por separado para cadenas pesadas y ligeras, pero los principios son similares para cada una.
Con respecto al método empírico, se ha encontrado que es particularmente conveniente crear una biblioteca de secuencias variantes que puedan examinarse para determinar la actividad deseada, la afinidad de unión o la especificidad. Un formato para la creación de dicha biblioteca de variantes es un vector de presentación de fagos. Alternativamente, las variantes pueden generarse usando otros métodos para el abigarramiento de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los residuos objetivo dentro del dominio variable.
Otro método para determinar si se requieren sustituciones adicionales, y la selección de residuos de aminoácidos para la sustitución, puede lograrse usando modelos informáticos. El hardware y el software informáticos para producir imágenes tridimensionales de moléculas de inmunoglobulina están ampliamente disponibles. En general, los modelos moleculares se producen partiendo de estructuras resueltas para cadenas de inmunoglobulinas o dominios de las mismas. Las cadenas a ser modeladas se comparan para la similitud de la secuencia de aminoácidos con cadenas o dominios de estructuras tridimensionales resueltas, y las cadenas o dominios que muestran la mayor similitud de secuencia se seleccionan como puntos de partida para la construcción del modelo molecular. Las estructuras de partida resueltas se modifican para permitir diferencias entre los aminoácidos reales en las cadenas de inmunoglobulinas o dominios que se están modelando, y los de la estructura de partida. Las estructuras modificadas se ensamblan luego en una inmunoglobulina compuesta. Finalmente, el modelo se refina por minimización de energía y verificando que todos los átomos estén dentro de las distancias apropiadas entre sí y que las longitudes y ángulos de los enlaces estén dentro de los límites químicamente aceptables.
Debido a la degeneración del código, una variedad de secuencias de ácidos nucleicos codificará cada secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina. Las secuencias de ácidos nucleicos deseadas pueden producirse mediante síntesis de ADN en fase sólida de novo o mediante mutagénesis por PCR de una variante preparada anteriormente del polinucleótido deseado.
Los segmentos variables de anticuerpos humanos producidos como se describe en la presente están ligados típicamente a por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina humana. El anticuerpo contendrá regiones constantes tanto de cadena ligera como de cadena pesada. La región constante de cadena pesada incluye habitualmente dominios CH1, bisagra, CH2, CH3 y, algunas veces, CH4.
Los anticuerpos humanos pueden comprender cualquier tipo de dominio constante de cualquier clase de anticuerpo, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier subclase (isotipo), incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Cuando se desea que el anticuerpo humanizado exhiba actividad citotóxica, el dominio constante es habitualmente un dominio constante de fijación del complemento y la clase es típicamente IgG-i. Cuando dicha actividad citotóxica no es deseable, el dominio constante puede ser de la clase IgG2. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo.
Los ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadena ligera y pesada humanizadas, opcionalmente ligadas a regiones constantes, se insertan en vectores de expresión. Las cadenas ligera y pesada se pueden clonar en los mismos o diferentes vectores de expresión. Los segmentos de ADN que codifican las cadenas de inmunoglobulina están ligados operativamente a secuencias de control en el vector(es) de expresión que aseguran la expresión de los polipéptidos de inmunoglobulina. Dichas secuencias de control incluyen una secuencia señal, un promotor, un potenciador y una secuencia de terminación de la transcripción (verQueen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989); WO 90/07861 ; Co et al., J. Immunol. 148, 1149 (1992)).
Los anticuerpos o Fc o componentes y dominios de los mismos también pueden obtenerse seleccionando de bibliotecas de tales dominios o componentes, por ejemplo, una biblioteca de fagos. Se puede crear una biblioteca de fagos insertando una biblioteca de oligonucleótidos aleatorios o una biblioteca de polinucleótidos que contienen secuencias de interés, como las de células B de un animal o humano inmunizado (Hoogenboom, et al., 2000, Immunol. Today 21(8) 371-8). Las bibliotecas de fagos de anticuerpos contienen parejas de regiones variables de cadena pesada (H) y ligera (L) en un fago que permite la expresión de fragmentos Fv de cadena sencilla o fragmentos Fab (Hoogenboom, et al., 2000 supra.) La diversidad de una biblioteca de fagémidos puede manipularse para aumentar y/o alterar las inmunoespecificidades de los anticuerpos monoclonales de la biblioteca para producir y posteriormente identificar anticuerpos monoclonales humanos deseables adicionales. Por ejemplo, los genes que codifican las moléculas de inmunoglobulina de la cadena pesada (H) y la cadena ligera (L) pueden mezclarse aleatoriamente (cambiar el orden) para crear nuevas parejas de HL en una molécula de inmunoglobulina ensamblada. Adicionalmente, los genes que codifican cualquiera o ambas de la cadena H y L pueden mutagenizarse
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en una región determinante de la complementariedad (CDR) de la región variable del polipéptido de inmunoglobulina, y posteriormente examinarse para capacidades de afinidad y neutralización deseables. Las bibliotecas de anticuerpos también pueden crearse sintéticamente seleccionando una o más secuencias de FR humanas e introduciendo colecciones de casetes de CDR de repertorios de anticuerpos humanos o a través de variación diseñada (Kretzschmar y von Ruden 2000, Current Opinion in Biotechnology, 13: 598-602). Las posiciones de diversidad no están limitadas a CDR, sino que también pueden incluir los segmentos de FR de las regiones variables o pueden incluir otros que no sean regiones variables de anticuerpos, como péptidos.
Otras bibliotecas de componentes de unión a objetivos o no de unión a objetivos que pueden incluir otras regiones variables de anticuerpos son presentación de ribosomas, presentación de levaduras y presentaciones bacterianas. La presentación de ribosomas es un método de traducción de ARNm en sus proteínas afines mientras se mantiene la proteína unida al ARN. La secuencia que codifica el ácido nucleico se recupera mediante RT-PCR (Mattheakis, L.C. et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022). La presentación de levaduras se basa en la construcción de proteínas de fusión del receptor de adhesión a levadura alfa-aglutinina asociado a la membrana, aga1 y aga2, una parte del sistema de tipo de apareamiento (Broder, et al., 1997. Nature Biotechnology, 15:553- 7). La presentación bacteriana se basa en la fusión del objetivo con proteínas bacterianas exportadas que se asocian con la membrana celular o la pared celular (Chen y Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503).
La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican las composiciones de la invención como polinucleótidos aislados o como porciones de vectores de expresión que incluyen vectores compatibles con la expresión del fago procariota, eucariota o filamentosa, secreción y/o presentación de las composiciones o mutágenos dirigidos de los mismos.
3. Métodos para Producir el Anticuerpo de la Invención
Una vez que se ha identificado una molécula de anticuerpo de la invención de acuerdo con las características estructurales y funcionales descritas en la presente, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las porciones deseadas de, o las cadenas de anticuerpos completas, pueden clonarse, copiarse o sintetizarse químicamente y pueden aislarse y usarse para expresar el anticuerpo por métodos rutinarios. El anticuerpo de la invención puede purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, cromatografía en columna de intercambio iónico, afinidad y tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otro técnica estándar para la purificación de proteínas. Adicionalmente, los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos pueden fusionarse a secuencias polipeptídicas heterólogas descritas en la presente o conocidas de otro modo en la técnica, para facilitar la purificación.
Selección de Células Huésped o Diseño de Células Huésped
Como se describe en la presente, la célula huésped elegida para la expresión de la proteína o anticuerpo monoclonal que contiene Fc recombinante es un contribuyente importante a la composición final, incluyendo, sin limitación, la variación en la composición de las fracciones de oligosacáridos que decoran la proteína en el dominio CH2 de inmunoglobulina. Por tanto, un aspecto de la invención implica la selección de células huésped apropiadas para su uso y/o desarrollo de una célula de producción que expresa la proteína terapéutica deseada.
Además, la célula huésped puede ser de origen mamífero o puede seleccionarse de células COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, de mieloma, de linfoma, de levadura, de insecto o de planta, o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de las mismas.
Alternativamente, la célula huésped puede seleccionarse de una especie u organismo incapaz de glicosilar polipéptidos, por ejemplo, una célula u organismo procariota, como y de la E. coli spp, Klebsiella spp., o Pseudomonas spp naturales o diseñadas.
4. Métodos de Uso de un Anticuerpo Anti-TF
Las composiciones (anticuerpo, variantes de anticuerpo o fragmentos) generadas por cualquiera de los métodos descritos anteriormente se pueden usar para diagnosticar, tratar, detectar, o modular una enfermedad humana o patologías específicas en células, tejidos, órganos, fluidos o, en general, un huésped. Como se enseña en la presente, la modificación de la porción Fc de un anticuerpo, proteína de fusión Fc o fragmento Fc para proporcionar un intervalo de funciones efectoras más específicamente adecuado después de la unión al objetivo pero en donde el anticuerpo retiene las propiedades de dirección originales generará variantes del anticuerpo para aplicaciones específicas e indicaciones terapéuticas.
Las enfermedades o patologías que pueden ser susceptibles de tratamiento usando una composición proporcionada por la invención incluyen, pero no están limitadas a: cáncer; incluyendo tumores sólidos primarios y metástasis; carcinomas, adenocarcinomas, melanomas, tumores líquidos como linfomas, leucemias y mielomas y
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masas invasivas formadas a medida que progresa el cáncer; cánceres de tejidos blandos; sarcomas, osteosarcoma, timoma, linfosarcoma, fibrosarcoma, leiomiosarcoma, lipomas, glioblastoma, astrosarcoma, cáncer de próstata, mama, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parótida, tracto biliar, colon, recto, cuello uterino, útero, endometrio, tiroides, pulmón, riñón o vejiga.
En la medida en que el anticuerpo de la invención reduzca el medio pro-oncogénico en un tejido bloqueando la capacidad del TF para participar en la liberación corriente abajo de citoquinas como la citoquina inflamatoria, IL-8, el anticuerpo de la invención puede usarse profilácticamente o junto con otros tratamientos dirigidos a suprimir la proliferación tumoral y la angiogénesis. La mayoría de los cánceres relacionados con la edad se derivan de las células epiteliales de los tejidos renovables. Un elemento importante de los tejidos epiteliales es el estroma, la capa sub-epitelial compuesta de matriz extracelular y varios tipos de células que incluyen fibroblastos, macrófagos y células endoteliales. En tumores cancerosos el estroma es crítico para el crecimiento y la progresión tumoral y el TF puede expresarse en células estromales así como también en células epiteliales cancerosas. Por lo tanto, la presencia de los factores corriente abajo que resultan de la señalización TF:VIIa en el estroma pueden crear una ambiente de tejido pro-oncogénico que sinergiza con las mutaciones oncogénicas para impulsar la formación de tejido neoplásico.
De manera similar, cuando el TF se expresa en tejido adiposo, puede modificar la función del tejido en condiciones como la obesidad, el síndrome metabólico y la diabetes. El anticuerpo de la invención puede ser útil para tratar estas afecciones bloqueando la señalización TF:VIIa. Algunos de los factores producidos corriente abajo de la señalización TF:FVIIa, incluyendo IL-8 e IL-6, son mediadores potentes de la inflamación. Los usos adicionales del anticuerpo de la invención incluyen por lo tanto el tratamiento de afecciones inflamatorias como, pero no limitados a, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino y asma.
Como el anticuerpo de la invención inhibe la señalización TF:VIIa y reduce los efectos corriente abajo que promueven la angiogénesis, los anticuerpos de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de otras enfermedades, trastornos y/o afecciones, además de cánceres, que implican angiogénesis. Estas enfermedades, trastornos, y/o afecciones incluyen, pero no están limitadas a: tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas y granulomas piógenos; placas arterosclericas; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo a injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma, uveítis y Pterygia (crecimiento anormal de vasos sanguíneos) del ojo; artritis reumatoide; psoriasis; retraso en la curación de heridas; endometriosis; vasculogénesis; granulaciones; cicatrices hipertróficas (queloides); fracturas sin unión; esclerodermia; tracoma; adherencias vasculares; angiogénesis miocárdica; colaterales coronarios; colaterales cerebrales; malformaciones arteriovenosas; angiogénesis de la extremidad isquémica; Síndrome de Osler-Webber; neovascularización de placas; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma; displasia fibromuscular; granulación de heridas; enfermedad de Crohn; y aterosclerosis.
En la medida en que el anticuerpo de la invención inhibe la señalización de TF:VIIa, el anticuerpo puede usarse para tratar y/o diagnosticar enfermedades, trastornos y/o afecciones hiperproliferativas, incluyendo pero no limitadas a, neoplasmas. El anticuerpo puede inhibir la proliferación del trastorno a través de interacciones directas o indirectas. Los ejemplos de enfermedades, trastornos y/o afecciones hiperproliferativas que pueden tratarse y/o diagnosticarse mediante los anticuerpos de la invención incluyen enfermedades, trastornos y/o afecciones hiperproliferativas que incluyen, pero no están limitadas a, hipergammaglobulinemia, enfermedades linfoproliferativas, trastornos como la enfermedad de Castleman, y/o afecciones, paraproteinemias, púrpura, sarcoidosis, síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron, enfermedad de Gaucher, histiocitosis, y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa en un órgano, tejido o compartimento corporal de fluido.
Las maneras adicionales en las que los anticuerpos de la presente invención pueden usarse terapéuticamente incluyen, pero no están limitadas a, citotoxicidad dirigida del anticuerpo, por ejemplo, como mediada por complemento (CDC) o por células efectoras (ADCC), o por citotoxicidad indirecta del anticuerpo, por ejemplo, como inmunoconjugados.
Aunque la invención se ha descrito en términos generales, las realizaciones de la invención se divulgarán adicionalmente en los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitativos del alcance de las reivindicaciones. En las descripciones experimentales, se usaron ciertos reactivos y procedimientos para producir proteínas o un anticuerpo o un fragmento específico. Los métodos analíticos rutinariamente usados para caracterizar el anticuerpo se describen a continuación.
Materiales y Métodos
Estándares de Proteínas y Anticuerpos
El dominio extracelular recombinante (ECD) del FT humano se construyó de dos formas: por ensayos de unión directa basados en ELISA y Biacore, el aminoácido 1-219 de la cadena madura de TF (SEQ ID NO: 1) se
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expresó en un sistema mamífero con un péptido His6-etiquetado C-terminal; por estudios de co-cristalografía, el aminoácido 5-213 de la SEQ ID NO: 1 se expresó con un péptido His6-etiquetado C-terminal en un sistema bacteriano. Se biotiniló TF1-219 humano usando química de ésteres de NHS dirigida a residuos amina en la proteína. Para ensayos de coagulación, se usó Innovin® (Dade Behring Inc. N° de catálogo B4212), un factor tisular humano recombinante liofilizado combinado con fosfolípidos, calcio, tampones y estabilizadores para uso diagnóstico.
El TF-ECD de mono Cynomolgous (cyno) (SEQ ID NO: 2) se clonó usando PCR de ADNc aislado de tejido de testículos de cynomolgous obtenido del BioChain Institute (Hayward, CA).
Se usaron varios anticuerpos como anticuerpos de referencia: i) 10H10 clonado del hibridoma original TF9.10H10-3.2.2 (US 7223427) ii) una quimera de ratón-humano10H10, que comprende la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5 con regiones constantes IgG1/Kappa humanas, designadas M1 iii) M59, un anticuerpo adaptado de FR humano que comprende las seis CDR de 10H10 y sirve como el anticuerpo original para la maduración por afinidad, que comprende la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 23 con IgG1 humana y la región constante Kappa humana; iv) anticuerpo del factor tisular anti-humano murino TF8-5G9 (US 7223427); v) uno humanizado del anticuerpo 5G9, conocido como CNTO 860, como un IgG1/Kappa humano (US7605235); y vi) un anticuerpo de control de isotipo (IgG1/kappa humano) que se une a un antígeno irrelevante (VRS) denominado B37.
Expresión y Purificación de Anticuerpos
Se usaron procedimientos rutinarios para expresar y purificar los anticuerpos divulgados. Para el examen primario, el ADN que codifica estas moléculas se expresó transitoriamente en placas de 96 pocillos en células HEK 293E y se evaluó la actividad (unión) de los sobrenadantes 96 horas después de la transfección. Se identificaron los aciertos y se eligieron para la expresión y purificación a escala piloto. La expresión a escala piloto se hizo transitoriamente en células HEK 293F o CHO-S a un volumen de 750 ml. Los sobrenadantes recogidos se purificaron mediante cromatografía de proteína A y las proteínas purificadas se evaluaron por su afinidad y actividad funcional. Adicionalmente, las proteínas purificadas se sometieron a caracterización biofísica por SDS-PAGE, SE- HPLC y cromatografía de interacción cruzada (CIC). Los puntos isoeléctricos teóricos (pI) se calcularon también para cada variante. De las caracterizaciones de escala piloto, se transfectó un conjunto de candidatos principales finales en biorreactores WAVE y se purificaron mediante cromatografía de Proteína A.
Producción de Fab y ELISA de Fab monoclonal
Los stocks de glicerol de las rondas de adsorción de fagos se miniprepararon y el gen pIX se escindió mediante digestión con NheI/SpeI. Después de la religación, el ADN se transformó en células TG-1 y se cultivó en placas LB/Agar durante la noche. Al día siguiente, se recogieron las colonias, se cultivaron durante la noche, y los cultivos se usaron para (i) PCR de colonias y secuenciación de las regiones V, y (ii) inducción de la producción de Fab. Para la producción de Fab, el cultivo nocturno se diluyó 10-100 veces en medio nuevo y se cultivó durante 5-6 horas a 37° C. La producción de Fab se indujo mediante la adición de medio fresco que contenía IPTG y los cultivos se cultivaron durante la noche a 30 grados C. Al día siguiente, los cultivos se centrifugaron y los sobrenadantes, que contenían las proteínas Fab solubles, se usaron para ELISA de Fab.
Para el ELISA de Fab, los Fab se capturaron en placas mediante un anticuerpo policlonal anti- Fd(CH1). Después del lavado y el bloqueo apropiados, se añadió hTF biotinilado a una concentración de 0,2 nM. Esta concentración permite la clasificación de las variantes de Fab, definidas como el porcentaje de unión de la original, en la que el Fab original, presente como control en todas las placas, se define como 100% de unión. El hTF biotinilado se detectó mediante estreptavidina conjugada con HRP y lectura de quimioluminiscencia en un lector de placas.
ELISA basado en Mab de Unión a TF-ECDA
Se usó una solución ELISA de unión a TF de fase directa usando detección quimioluminiscente para clasificar los aglutinantes superiores de la biblioteca de adaptación de marco humano. Se recubrieron placas maxisorp negras de 96 pocillos con 100 pl de IgG de cabra antihumana 4ug/ml diluida en tampón carbonato- bicarbonato, pH 9,4 a 4° C durante la noche y luego se lavaron tres veces con tampón de lavado (PBS con solución de 0,05% de Tween-20) y se bloqueó con 300 pl de solución de 1% de BSA/PBS 10mM durante 1 hora seguido de un lavado como antes. Las muestras o estándares se diluyeron a 50 ng/ml Tampón de Ensayo (1% de BSA en PBS + 05% de Tween) y se añadieron 100 ul a la placa de ensayo a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación. Las placas se lavaron tres veces y se añadieron 100 pl por pocillo de TF-ECD humano o de cynomologus con etiqueta His a 100 ng/ml diluido en tampón de ensayo y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadieron 100 pl por pocillo de penta-his conjugado con peroxidasa de Qiagen a una dilución 1:2000 en tampón de ensayo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. El sustrato BM ChemiLum (BM Chemilum, POD, Roche) se hizo recientemente a una dilución 1:100 en tampón y se añadieron 100 ul a las placas después de un lavado final. Después de 10 minutos, las placas se leen en el programa Perkin Elmer Envision
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Reader, BM ChemiLum.
Unión de Células Completas MDA-MB-231 de mAb de Factor Anti-Tisular por FACS
Este ensayo se usa para detectar la unión directa del anticuerpo al FT humano endógeno expresado en células de cáncer de mama. Preparar titulaciones de cuatro puntos de los mAb de prueba en tampón FACS (1% de FBS en PBS) por duplicado. Iniciar una titulación a 1.000 ng/ml con diluciones 1:4. M1, la molécula original, se usa como control positivo, mientras que B37, mAb anti-RSV, se usa como control negativo/de isotipo. Las células no teñidas y el anticuerpo secundario, anticuerpo de Fc IgG anti-humano de cabra Cy-5 conjugado en tampón FACS 1:200, se usa como controles y se prepara inmediatamente antes del uso.
Usando técnicas de cultivo de tejidos estándar, enjuagar las células MDA-MB-231 adherentes en un matraz de cultivo con una vez con PBS (sin Ca+ 2/Mg+2). Elevar las células con Versene y contar las células y sembrar 200,000 células por pocillo en una placa con fondo en V de poliestireno. Protocolo de análisis FACS: Unión de Factor Tisular. Sedimentar las células en una centrífuga Allegra X-15R a 450xg durante 3 minutos a 4° C, resuspender en tampón FACS (2% de FBS en PBS) y colocar en placas 200.000 células por pocillo en 200 ul. Sedimentar las células a 450xg durante 3 minutos a 4° C. Desechar los sobrenadantes y añadir 100 pL/pocillo de mAbs de prueba o control a pocillos designados e incubar en hielo o a 4° C durante 1 hora (+/- 10 minutos). Sedimentar las células a 450xg durante 3 minutos a 4° C. Desechar los sobrenadantes y lavar las células una vez en tampón FACS. Resuspender las células en tampón FACS a 200 ul/pocillo y sedimentar las células a 450xg durante 3 minutos a 4° C. Desechar los sobrenadantes y añadir 100 ul/pocillo de anticuerpo secundario a los pozos designados (triterato) e incubar en hielo durante 1 hora (+/- 10 minutos). Sedimentar las células a 450xg durante 3 minutos a 4° C. Desechar los sobrenadantes y lavar las células 2 veces en tampón FACS antes de resuspender las células en Tampón FACS a 200 ul/pocillo. Sedimentar las células a 450xg durante 3 minutos a 4° C. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en Tampón CytoFix a 100 ul/pocillo. Analizar las reacciones por citometría de flujo (BD FACSArray). Se usa el software FlowJo para el análisis de datos FACS activando la población principal de células en el pocillo de control sin teñir y aplicar la activación a todo el conjunto de datos. Los datos se exportan como una tabla de la intensidad de fluorescencia media geométrica (MFI) en el canal rojo para la activación aplicada.
Ensayo Termofluor
La tecnología termofluor es una medida cinética del despliegue de una molécula a medida que se calienta. A medida que la molécula se calienta, un colorante (ANS) puede unirse a la molécula a medida que se despliega. El colorante emitirá fluorescencia cuando se una a la molécula, y esta fluorescencia se mide a lo largo del tiempo. En este ensayo, el despliegue de los anticuerpos se midió de 37-95° C, y se detectó cada 0,5° C. También se midieron las Tms de las moléculas originales tanto en la forma murina como de quimera (10H10, M1, 5G9 y CNTO860), junto con 2 mAbs con Tms conocidas para ser usadas como controles del ensayo (Emmp 4A5, y Emmp 5F6).
Este ensayo se usó para predecir la estabilidad térmica de las variantes de la biblioteca de adaptación del marco humano. Diluir anticuerpos purificados a 0,5 mg/ml en PBS y añadir 2 ul de muestra a cada pocillo para un total de 1ug de muestra por pocillo. Cada muestra se añade por duplicado. El ANS de stock está a 500mM en DMSO. Diluir ANS de stock 1:12 en DMSO (a 40mM); Elaborarla solución Tinte/Tween combinando 20 ul de la solución ANS 40mM, 2,8 ul de 10% de Tween y 1,98ml de PBS; agregar 2ul de solución Tinte/Tween y 2ul de aceite. Centrifugar las placas (2 minutos a 450 rpm). Ajustes del termofluor: obturador configurado en manual, Temperatura de la rampa es 0,5C/seg., Rampa continua, Temperatura de la Rampa: 50-95° C. Espera seleccionada 15s a Temperatura alta, Tiempo de exposición 10s/1 rep., Ganancia normal = 2, Seleccionado "Imagen SC/placa individual".
Cromatografía de Interacción Cruzada (CID)
Para determinar la interacción de los varios anticuerpos con otros anticuerpos humanos, se realizaron experimentos de cromatografía usando una columna acoplada con IgG humana (Sigma Aldrich). Brevemente, se acoplaron 50 mg de IgG humana a una columna de NHS-Sefarosa de 1 ml (GE Healthcare) siguiendo las instrucciones del fabricante. La IgG no acoplada se eliminó mediante lavado con Tris 0,1 M, pH 8, NaCl 0,5 M y los grupos NHS sin reaccionar se bloquearon con el mismo tampón. La eficacia de acoplamiento se determinó midiendo la concentración de proteína restante en el tampón de acoplamiento sin reaccionar y se lava utilizando el kit de ensayo Coomassie Plus de Pierce (Thermo Pierce) y restando de la cantidad de proteína antes de la inmovilización. También se preparó una columna de control usando el mismo protocolo solo que no se añadió proteína a la resina.
La columna de control se ejecutó primero en un HPLC Dionex UltiMate 3000 después de equilibrar con PBS, pH 7 a un caudal de 0,1 ml/min. Se inyectaron primero 201 de la solución de proteína de stock para asegurar que los sitios de unión no específicos estaban bloqueados, seguido de 201 de 10% de de acetona para comprobar la
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integridad de la columna.
Las muestras a analizar se diluyeron a 0,1 mg/ml en PBS, pH 7. Se inyectaron 20 microl de cada muestra en cada columna y se dejó funcionar a 0,1 ml/min durante 30 min. Se registraron los tiempos de retención y se calculó el factor de retención (k') para cada variante.
El cálculo de k' es la diferencia en el tiempo de retención en una columna derivada de proteína (columna acoplada a IgG), tR, y el tiempo de retención en una columna sin proteína acoplada a ella. El cálculo también tiene en cuenta el tiempo de retención de la acetona en ambas columnas para estandarizar la columna. Los valores aceptables para k' son menores de 0,3.
Solubilidad
Para determinar la solubilidad de los varios anticuerpos a temperatura ambiente, se realizaron experimentos de concentración usando dispositivos de filtro centrífugos. Brevemente, se añadieron preparaciones de anticuerpos en PBS a dispositivos de filtro centrífugo Vivaspin-15 (15 ml) (30,000 MWCO, Sartorius, Goettingen, Alemania) a temperatura ambiente. Los filtros se centrifugaron a 3000 xg durante intervalos de 20 minutos en una centrífuga Beckman Allegra X15-R usando un rotor de cubo oscilante. Una vez que los volúmenes se redujeron a aproximadamente 2 ml, el sobrenadante se transfirió a un dispositivo de filtro Vivaspin-4 (4 ml) (30,000 MWCO) y se centrifugó a 4.000 xg durante intervalos de 20 minutos. Una vez que el volumen se redujo a 500 l, la muestra se transfirió a un dispositivo de filtro Vivaspin-500 y se centrifugó a 15.000 xg en una centrífuga Eppendorf 5424 durante 15 minutos. Esto se repitió hasta que la concentración de proteína alcanzó 100 mg/ml o más. La concentración de proteína se determinó mediante absorbancia a 280 nm y 310 nm en un espectrofotómetro BioTek SynergyHT TM con una dilución apropiada. En este punto, se detuvo la centrifugación y la muestra se mantuvo a temperatura ambiente durante la noche para alcanzar el equilibrio. A la mañana siguiente, se comprobó la muestra en busca de signos de precipitación. Si la concentración era superior a 100 mg/ml, se detuvo el proceso.
Ensayo de Inhibición de IL-8 Inducida por Factor VIIA
Este ensayo se usó para evaluar si los anticuerpos que se unen a TF neutralizan o no la liberación de IL-8 inducida por FVIIa de células humanas que expresan Tf. Se colocaron en placas células de adenocarcinoma de mama humano (MDA-MB-231) (ATCC: HTB-26), adaptadas para crecer en DMEM y 10% de SFB (Gibco: N° de catálogo 11995 y N° de catálogo 16140), en placas de cultivo celular de 96 pocillos (Nunc: N° de catálogo 167008) a una densidad de 20000 células por pocillo (100.000 células/ml) usando técnicas de cultivo celular estándar. Se permitió que las células se recuperasen durante dos días antes de comenzar el tratamiento con anticuerpos a 2 ug/ml y someterlas a una dilución en serie o 1:2 o 1:4 en DMEM sin FBS. El anticuerpo se añadió una hora antes del tratamiento con FVIIa humano (Innovative Research: N° de catálogo IHFVIIa, lote: 2824) a una concentración final de 50 nM en DMEM sin FBS. Las células se colocaron en la incubadora durante 24 horas. Después del tratamiento, se recogió el sobrenadante y se detectó la cantidad de IL-8 mediante ELISA de acuerdo con el protocolo del fabricante (R&D Systems: N° de catálogo D8000C). Brevemente, se leyó la densidad óptica (DO) de cada muestra de tratamiento a 450 nm y 540 nm. La lectura a 540 nm se usó para corregir la imperfección óptica en la placa de ensayo mientras que la lectura corregida a 450 nm (DO 450 menos DO 540) se usó para calcular el contenido de iL-8 en las muestras de tratamiento usando una Curva Estándar de IL-8 preparada de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los pocillos con células que no reciben tratamiento de anticuerpos y FVIIa se usaron para definir el nivel endógeno de IL-8 mientras que los pocillos con células que solo recibieron FVIIa se usaron para definir el nivel de IL-8 "sin inhibición", definiendo de esta manera los niveles de IL-8 mínimo y máximo, respectivamente. Las muestras de tratamiento de titulación de MAb se normalizaron a los niveles de IL-8máximo y mínimo como se ha definido con anterioridad y se expresaron como porcentaje de inhibición. Los datos normalizados se representaron o en gráficos de barras o se ajustaron a un ajuste de curva logística de cuatro parámetros para extraer los valores de EC50 para cada MAb.
Ensayo de coagulación
Este ensayo se usó para determinar si los anticuerpos de TF anti-humanos bloquean o no la coagulación in vitro usando plasma humano en presencia de calcio y preparación de TF humano recombinante añadida (Innovin, Dade Behring Inc). Los anticuerpos de TF anti-humano se diluyen a 2 mg/ml de anticuerpo en HBSS (Gibco, N° de catálogo 14175). El plasma humano agrupado con citrato de Na (George King Biomedical, Novi, MI) se centrifuga a 1000 rpm durante 5 minutos y el plasma despejado se transfiere a un tubo nuevo. En cada pocillo de una placa de ensayo de 96 pocillos despejada (NUNC, N° de catálogo 439454), se añaden 25 ul del anticuerpo diluido a 100 ul de plasma humano. La reacción se inicia añadiendo 125 pl de Innovin (Dade Behring Inc., N° de catálogo B4212) diluido 1:500 en HBSS con CaCl2 22 mM a cada pocillo que contiene plasma con o sin anticuerpo. La reacción de coagulación se monitoriza cinéticamente a OD 405, inmediatamente después del inicio de la reacción y durante 30 minutos a 37° C usando un lector SpectraMax M2e (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se determina T^ máximo para cada anticuerpo usando el software Softmax Pro como el tiempo en segundos que tarda en alcanzar el 50% de la densidad óptica máxima. El tiempo en segundos para las muestras se normalizó a una referencia en cada placa,
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sin embargo, estadísticamente no hubo diferencia entre las muestras listadas a 150 segundos y 200 segundos que fue el tiempo medio para las muestras sin anticuerpos, para 10H10, y todas las variantes derivadas de 10H10 y adaptadas humanas.
EJEMPLO 1: SECUENCIACIÓN DE 10H10
El anticuerpo murino conocido como 10H10 generado en The Scripps Research Institute en La Jolla, CA (US5223427, Morrisey et al. 1988 Thromb Res. 52(3): 247-261) se produce por el hibridoma TF9.10H10-3.2.2. No se había informado anteriormente de las secuencias del anticuerpo del clon de hibridoma 10H10.
Las secuencias se identificaron usando el método 5'RACE (Focus 25 (2):25-27, 2003; Maruyama 1994 Gene 138, 171-174) donde las dos cadenas de anticuerpos, VH y VL, se amplificaron utilizando 5' GeneRacer™ (InVitrogen), cebador, y cebador de consenso 3' complementario a una secuencia dentro de la región constante de IgG1 de ratón y la región constante Kappa de ratón, respectivamente. Se utilizó amplificación por PCR anidada usando cebador 5'GeneRacer Nested y un cebador de consenso 3' para generar productos de VL más adecuados para el análisis de secuencia.
Se seleccionaron por lo menos 16 clones para identificar la región variable de cada cadena. Se usaron cebadores para secuenciar a través de la región desconocida de los insertos. Los datos de la secuencia en bruto se descargaron del Secuenciador ABI DNA a Vector NTI (Invitrogen Informax) para el análisis de la secuencia. Se identificaron una VH funcional y una VL funcional. Ambos genes de VH y VL se analizaron adicionalmente para encontrar sus secuencias señal nativas, FR, CDR y segmentos J.
Las FR y CDR de 10H10 se numeran secuencialmente, y se segmentan siguiendo la definición de Kabat (Kabat et al., 5a edición, Public Health Service, NIH, Washington, DC, 1991), excepto en la región correspondiente a la CDR-1 de VH. Para esta región, se usó una combinación de definición de Kabat y Chothia (Raghunathan, G., US2009/0118127 A1; Chothia y Lesk, J Mol Biol 196(4): 901-17, 1987).
Tabla 1. Secuencia 10H10 de las regiones variables y sus estructuras de secuencia
Nombre de la Proteína
Secuencia de polipéptido
Subdominios
Región Variable de la Cadena Pesada de 10H10 (SEQ ID NO: 4)
QVHLQQSGAELMKPGASVKISCKAS
GYTFITYWIE
WVKQRPGHGLEWIG
DILPGSGSTNYNENFKG
KATFTADSSSNTAYMQLSSLTSEDSAV
YYCAR
SGYYGNSGFAY
WGQGTLVTVSA
FR1 = 1 a 25
CDR1 = 26 a 35 (SEQ ID NO: 6)
FR2 = 36 a 49
CDR2 = 50 a 66 (SEQ ID NO: 7)
FR3 = 67 a 98
CDR3 = 99 a 109 (SEQ ID NO: 8)
FR4 (JH3) = 110 a 120
Región Variable de la Cadena Ligera de 10H10 (SEQ ID NO: 5)
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSC
KSSQSLLSSGNQKNYLT
WYQQIPGQPPKLLIY
WASTRES
GVPDRFTGSGSGTDFTLTINSVQAEDLA
VYYC
QNDYTYPLT
FGAGTKLELK
FR 1 = 1 a 23
CDR1 = 24 a 40 (SEQ ID NO: 9)
FR2 = 41 a 55
CDR2 = 56 a 62 (SEQ ID NO: 10)
FR3 = 63 a 94
CDR3 = 95 a 103 (SEQ ID NO: 11)
FR4 (K5) = 104 a 113
Las regiones V clonadas se diseñaron con regiones constantes de IgG1/Kappa humanas y se clonaron en vectores de expresión de mamífero para la expresión recombinante en líneas celulares HEK293 o CHO creando un anticuerpo quimérico ratón-humano designado M1, que se usó en el desarrollo del ensayo como un anticuerpo de
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referencia. La región V de HC también se diseñó con dominio CH1 de IgG1 humana solamente y una hexahistidina C-terminal con el propósito de producir un 10H10Fab usado en el análisis de estructuras cristalinas.
EJEMPLO 2: MAPEO DE EPITOPO DE UN ANTICUERPO DE FACTOR TISULAR NO ANTICOAGULANTE
El mapeo de epítopos para 10H10 se realizó mediante determinación de estructuras cristalinas de un complejo entre el ECD de TF humano y el fragmento Fab correspondiente. El ECD de TF humano His-etiquetado (residuos 5-213 de la SEQ ID NO: 1) se expresó en Escherichia coli y se purificó por cromatografía de afinidad y intercambio de iones usando una columna HisTrap HP (GE Healthcare) y una columna Q HP (GE Healthcare), respectivamente. Las versiones quiméricas His-etiquetadas (regiones V de ratón, dominios constantes humanos) de Fab de 10H10 se expresaron en células HEK y se purificaron usando cromatografía por afinidad (columna TALON, GE Healthcare) y de exclusión por tamaño (una columna HiLoad Superdex 200, GE Healthcare).
El complejo se preparó mezclando el Fab con el ECD de TF humano en la relación molar 1:1,2 (exceso de TF). La mezcla se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente y se cargó en una columna Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con HEPES 20 mM, pH 7.5 y NaCl 0,1 M. Las fracciones correspondientes al pico principal se agruparon, se concentraron a 10 mg/ml, y se usaron para la cristalización. El complejo se cristalizó por el método de difusión de vapor a 20° C. El complejo 10H10:TF se cristalizó de una solución que contenía 18% de PEG 8000 en CHES 0,1 M, pH 9.5. Para la recogida de datos por rayos X, se empapó un cristal del complejo durante unos segundos en el licor madre suplementado con 20% de glicerol, y se congeló instantáneamente en la corriente de nitrógeno a 100 K. Las intensidades de difracción de rayos X se midieron usando un generador de rayos X de microfoco Rigaku MicroMaxTM-007HF equipado con un detector de CCD Saturn 944 y un sistema de crioenfriamiento X-stream™ 2000 (Rigaku). La estructura se determinó mediante reemplazo molecular usando el paquete de programas CCP4 para cristalografía macromolecular (Collaborative Computational Project, Número 4. 1994. Acta Cryst. D50, 760-763).
El ECD de TF consiste de dos dominios topológicamente idénticos con el pliegue de inmunoglobulina. El dominio N-terminal abarca los residuos 1-103, y el dominio C-terminal abarca los residuos 104-210 (del ECD, SEQ ID NO: 1). Se descubrió que el epítopo de 10H10 estaba centrado en los residuos K149-D150 del ECD, que llega a una cavidad profunda entre los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de 10H10. La interfaz entre 10H10 y TF es extensa e involucra los seis giros de la CDR (Fig. 1).
Los descubrimientos notables son que el epítopo de TF de 10H10 no se superpone con los sitios de unión a FVII y FX (Figs. 2 y 3). Además, los epítopos de 10H10 y 5G9 (otro anticuerpo de unión a TF-humano murino con capacidad para bloquear la coagulación y cuyo epítopo se ha publicado anteriormente, Huang et al., 1998 J Mol Biol 275:873-94) se superponen parcialmente explicando la unión competitiva entre estos dos anticuerpos para TF humano (Fig. 2 y 3).
Interfaz ECD:10H10 de TF humano
10H10 se une a TF en la interfaz entre los dominios N- y C- terminales del ECD. La superficie convexa de TF se ajusta a la superficie cóncava de la CDR del anticuerpo. El área total cubierta tras la formación del complejo es de más de 1.100 Á2 en cada una de las moléculas que interactúan. Las seis CDR están implicadas en contactos directos con TF (contactos definidos como una distancia interatómica de 4 Á). En total, hay 24 residuos de epítopos y 25 residuos de paratopos. Los L1, H1 y H3 de CDR forman la mayoría de los contactos. Los residuos que forman el epítopo y el paratopo del complejo 10H10:TF se muestran esquemáticamente en la FIG. 1.
El epítopo de 10H10 incluye dos segmentos del dominio N y tres segmentos del dominio C del ECD de TF. Los dos segmentos del dominio N interactúan con el anticuerpo: los residuos 65-70 interactúan con H-CDR1 y H- CDR3 y el residuo 104 interactuando con H-CDR1. Los tres segmentos en el dominio C interactúan con el anticuerpo: los residuos 195 y 197 interactúan con H-CDR1 y H-CDR2, los residuos 171-174 interactúan con L- CDR1 y L-CDR3, y los residuos 129-150 interactúan con L- CDR1, L-CDR3, H-CDR1 y H-CDR3; Los residuos de TF K149-D150 están en el centro del epítopo; alcanzando una cavidad profunda formada entre los dominios de VL y VH donde sus compañeros primarios son D97 de la región variable de LC (SEQ ID NO: 5) y W33 de la región variable de HC (SEQ ID NO: 4) de 10H10, respectivamente.
B. Especificidad de Anticuerpos
Las secuencias de aminoácidos del ECD de TF de humano, de mono cynomolgus (cyno) (SEQ ID NO: 2) y de ratón (SEQ ID NO: 3) se alinean en la FIG. 2. Hay una gran similitud entre las secuencias de ECD de TF humano y de cynomolgus, y las dos son solo un residuo diferentes en los residuos de contacto de 10H10: posición 197 de la SEQ ID NO: 1, que es R(Arg) en la secuencia de cyno. Como el T197 en la secuencia humana es contactado por un único residuo de H-CDR2, es explicable el alto nivel de reactividad cruzada observado para el presente conjunto de anticuerpos derivados de 10H10.
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Alineando las secuencias de TF humano y de ratón, los residuos del epítopo que determinan la especificidad de especie de 10H10 eran evidentes ya que se producen diferencias de aminoácidos significativas en los residuos del epítopo: entre los 24 contactos de residuos de 10H10 en TF humano, las secuencias humana y de ratón difieren en las posiciones 68, 69, 70 y 104; en el dominio N y las posiciones 136, 142, 145 y 197 en el dominio C de la SEQ ID NO: 1 frente a la SEQ ID NO: 3. Las diferencias son consistentes con la afinidad de unión disminuida de 10H10 para TF de ratón.
La FIG. 2 también indica los sitios de interacción en TF humanos para FVII y FX en base a un modelo 3D teórico (FIG. 3) que describe su asociación en un complejo ternario (Norledge et al., Proteins 53:640-648, 2003). El anticuerpo 5G9 se une a TF en un epítopo que se solapa parcialmente con el sitio de unión de FX. Por lo tanto 5G9 compite con FX y esto provoca el bloqueo de la cascada de coagulación. El 10H10 difiere del 5G9 en que no bloquea la coagulación mientras que efectivamente interrumpe la señalización a través de los PAR asociados a TF. En base al modelo del complejo TF/FVII/FX ternario, se esperaba que el epítopo de 10H10 estuviera en la superficie libre del TF y centrado alrededor de los residuos K149-D150. La unión de 10H10 mapeado por mutagénesis y el mapeo de epítopos peptídicos proporcionó evidencia temprana de que este era el caso.
La presente estructura cristalina del complejo entre ECD de TF y Fab de10H10 proporciona un mapeo espacial de la manera en que el anticuerpo puede unirse a TF sin impedir la interacción de FVII y FX con TF o entre sí. El epítopo de 10H10 como se revela por la estructura cubre la superficie libre de TF, ya que teóricamente existe en el complejo ternario. Además, el epítopo de 10H10 se solapa parcialmente con el epítopo 5G9 MAb de bloqueo de la coagulación (Huang 1998 supra), los residuos comunes son K149 y N171. Ni 10H10 ni 5G9 bloquean la unión de FVII a TF. Los epítopos de 10H10 y FX tampoco se superponen, pero se produce un choque estérico entre el dominio constante del Fab y el dominio de la proteasa (globular) de FX en el modelo actual. Debe tenerse en cuenta sine embargo, que la orientación de FX puede de hecho diferir del modelo y que la asociación entre FX y TF puede permitir cierta flexibilidad en el dominio de proteasa. También hay una flexibilidad considerable en el ángulo de codo entre los dominios variable y constante de Fab que pueden permitir evitar el choque sobre la unión de 10H10 al complejo ternario.
EJEMPLO 3: ADAPTACIÓN DE LOS DOMINIOS DE UNIÓN PARA SU USO EN HUMANOS
La eficacia de una proteína terapéutica puede estar limitada por reacciones inmunes no deseadas. Los anticuerpos monoclonales no humanos pueden tener tramos sustanciales de secuencias de aminoácidos lineales y conformaciones estructurales locales que pueden provocar una respuesta inmune en humanos. La transferencia de los residuos responsables de la inmunoespecificidad de la unión al objetivo de un MAb no humano a un andamiaje de anticuerpo humano da como resultado la mayoría de las veces una pérdida sustancial de afinidad de unión para el antígeno objetivo. Por lo tanto, es muy valioso usar principios de diseño de sonido para crear moléculas de anticuerpos que provocan reacciones inmunogénicas mínimas a la vez que se retienen los perfiles de unión y biofísicos de la molécula no humana original cuando se inyectan en humanos.
Como se ha descrito anteriormente en la US20090118127A1 y ejemplificado en Fransson et al. 2010 J Mol Biol 398:214-231 , se usó un proceso de dos pasos para tanto humanizar y restaurar o mejorar la afinidad de unión para generar una especie de anticuerpos que muestre los efectos objetivo del anticuerpo murino 10H10 cuando se acopla a TF humano. El proceso de dos pasos, denominado adaptación de marco humano (HFA), consiste de 1) selección de marco humano y 2) un paso de maduración por afinidad.
En el proceso de HFA, los residuos del sitio de unión (CDR) se combinan con genes de la línea germinal humana seleccionados en base a la similitud de secuencia y consideraciones estructurales. Los dos sistemas de asignaciones de CDR para anticuerpos son: la definición de Kabat que se basa en la variabilidad de la secuencia del anticuerpo y la definición de Chothia basada en los análisis de las estructuras tridimensionales de anticuerpos. Entre las seis CDR, uno u otro sistema puede usarse cuando divergen. En el caso de las CDR de cadena ligera, se usa la definición de Kabat.
En el caso de CDR3 de la cadena pesada, tanto la definición de Kabat como la de Chothia son idénticas. En el caso de CDR1 de la cadena pesada, la definición de Chothia se usó para definir el inicio y la definición de Kabat como el final (patrón definido por W seguido de un aminoácido hidrófobo como V, I o A). En el caso de VH-CDR2, se usó la definición de Kabat. Sin embargo, en la mayoría de estructuras de anticuerpos, esta definición basada en la secuencia asigna una porción de FR3 como perteneciente a CDR2. Por tanto, también podría usarse una versión más corta de esta CDR, que finaliza con siete (7) residuos antes en la región C-terminal de esta CDR, denominada Kabat-7 en la presente.
Selección de FR Humano
Las FR humanas, definidas como las regiones en las regiones V no comprendidas en el sitio de unión al antígeno, se seleccionaron del repertorio de los genes de la línea germinal humana IGHV e IGHJ funcionales. El repertorio de secuencias de genes de la línea germinal humana se obtuvo buscando en la base de datos IMGT
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(Lefranc 2005) y compilando todos los alelos "01". De esta compilación, se eliminaron de la compilación los genes redundantes (100% idénticos a nivel de aminoácido) y aquellos con residuos de cisteína desemparejdos. La última actualización de la compilación de genes se realizó el 1 de octubre de 2007.
La selección inicial de secuencias humanas para HFA de VH se basó en la similitud de secuencia de los genes de la línea germinal VH humana con la longitud completa de la región VH de ratón que incluye FR-1 a 3 así como H-CDR-1 y H-CDR-2. En la etapa siguiente, las secuencias humanas seleccionadas se ordenaron por rango usando una puntuación que tiene en cuenta tanto la longitud de las CDR como las similitudes de secuencia entre las CDR de las secuencias de ratón y humanas. Se usó una matriz de mutación estándar, como la matriz de sustitución BLOSUM 62 (Henikoff y Henikoff 1992 Proc Natl Acad Sci USA 15;89(22):10915-9) para puntuar alineamientos de las CDR de secuencias de ratón y humanas y se aplicó una penalización grande si había una inserción y/o eliminación en los giros de las CDR. La FR-4 humana se seleccionó en base a la similitud de secuencia de los genes de la línea germinal IGHJ (Lefranc 2005) con la secuencia de 10H10 de ratón, IGHJ4 (SEQ ID NO: 60).
Se usó un procedimiento similar para seleccionar FR humanas para VL. En este caso IGVK, los genes de la línea germinal seleccionados usando el mismo procedimiento que el usado para los genes de IGHV, sirvieron como genes para seleccionar FR 1-3 y L-CDR 1 - 3. Se seleccionó el gen IGJ-K2 humano (SEQ ID NO: 61) como FR4 para todas las variantes.
Se seleccionaron once VH y siete VL cadenas de línea germinal. Los genes de VH seleccionados fueron predominantemente de la familia de genes IGVH-1: 6 secuencias de IGVH1 con IGVH1-69 e IGVH1-f usadas con H- CDR2 más largas y más cortas, 2 de IGVH3 y, un gen de IGVH5 usado con H-CDR2 tanto larga como corta. Los genes de VL representaron seis de IGVK2 y uno de IGVK4de la familia de genes.
Por lo tanto, las variantes H15, H19 y H21 de VH que tienen la H-CDR2 más larga (SEQ ID NO: 7) se corresponden a H22, H23 y H24, respectivamente, donde se usó la CDR-H2 de ratón más corta (SEQ ID NO: 27). El prefijo "s" denota variantes de prueba con menos residuos de ratón y más residuos humanos en la región de cadena beta. La designación de la región V usada y las secuencias de genes usadas se muestran en las Tablas 2 y 3 a continuación.
Tabla 2.
ID del Polipéptido
Gen de IMGT Usado
H13
VH-10H10
H14
IGHV1-2
H15
IGHV5-in
H16
IGHV1-46
H17
IGHV1-3
H18
IGHV3-74
H19
IGHV1-69
H20
IGHV1-18
H21
IGHV1-f
H22
s1_IGHV5-a
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s1_IGHV1-69
H24
s1_IGHV1-f
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Tabla 3.
ID del Péptido
Nombre del Gen de IMGT
L1
VL-10H10
L2
IGKV4-1_B3
L3
O1 IGKV2D40_
L4
IGKV2D-28_A3
L5
IGKV2D-29_A2
L6
IGKV2-30_17
L7
IGKV2-24_A232
L8
IGKV2D-26_A21
Se expresó una biblioteca de 96 Mabs, que representa las 11 variantes de FR humanas de cadena pesada y 7 de cadena ligera más las cadenas quiméricas de 10H10 murinas en células HEK 293E en un formato de 96 pocillos para proporcionar sobrenadantes para el examen primario. Para el examen primario, usando métodos recombinantes estándar, el ADN que codifica los dominios variables seleccionados se recombinó para formar MAbs completos que se expresaron transitoriamente en placas de 96 pocillos en células HEK 293E. El fluido sobrenadante de los cultivos se probó para la actividad (unión) 96 horas después de la transfección.
Se eligieron diecinueve variantes para la expresión a escala piloto en células HEK 293-F y la purificación basada en los resultados del examen primario. La expresión a escala piloto se realizó transitoriamente en células HEK 293F o CHO-S a un volumen de 750 ml. Los sobrenadantes recogidos se purificaron mediante cromatografía de Proteína A y las proteínas purificadas se evaluaron por su afinidad y actividad funcional. Adicionalmente, las proteínas purificadas se sometieron a caracterización biofísica mediante SDS-PAGE, SE-HPLC y cromatografía de interacción cruzada (CIC). Se calcularon también los puntos isoeléctricos teóricos (pI) para cada variante. A partir de las caracterizaciones a escala piloto, se transfectó un conjunto de candidatos principales finales en biorreactores WAVE y se purificaron mediante cromatografía de Proteína A,
Evaluación de la Unión
La unión de las variantes del anticuerpo quimérico original, M1, y HFA tanto a TF humano como de cyno se realizó como un formato de ELISA directo usando detección quimioluminiscente. Para el examen primario de las variantes de la biblioteca en sobrenadantes crudos, las muestras o controles se normalizaron a 50 ng/ml en medio FreeStyle 293 HEK gastado (Gibco) y se ensayaron en determinaciones de concentración individuales. En el presente ensayo, la concentración de anticuerpo fue de 5 ng (0,1 ml usado) y el ECD de TF y el antígeno fue His6- TF-ECD1-219 usado a una concentración final de 10 ng/pocillo.
Los resultados del examen de la biblioteca combinatoria completa mostraron que, excepto H14, todos las demás VH se unen a hTF con fuerzas variables. Hay varias variantes de HFA que dieron una señal de unión más alta que el 10H10 original (H13, LI), particularmente algunas combinaciones de L3 y L5. H18 y H21 no se unen al antígeno humano así como a otras VH y mostraron unión insignificante al antígeno de cyno. Entre las VL, L6 y L8 tampoco se unieron a ningún antígeno mientras que otras se unieron a niveles detectables. H14 y L8 también produjeron expresión baja cuando se combinaron con cualquier VL. Hubo 50 de los 77 anticuerpos (combinaciones VH, VL) que demostraron la unión a TF como se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4. ID de secuencias de VH y VL para las 50 variantes de FR humanas de unión a TF humano
ID del Anticuerpo
ID del Péptido de Cadena Ligera ID del Péptido de Cadena Pesada
Cadena Ligera
SEQ ID NO: Cadena Pesada SEQ ID NO:
M1
L1 5 H13 4
M9
L2 22 H15 12
M10
L3 23 H15 12
M11
L4 24 H15 12
M12
L5 25 H15 12
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ID del Anticuerpo
ID del PéDtido de Cadena Liaera ID del PéDtido de Cadena Pesada
Cadena Liaera
SEQ ID NO: Cadena Pesada SEQ ID NO:
M14
L7 26 H15 12
M16
L2 22 H16 13
M17
L3 23 H16 13
M18
L4 24 H16 13
M19
L5 25 H16 13
M21
L7 26 H16 13
M23
L2 22 H17 14
M24
L3 23 H17 14
M25
L4 24 H17 14
M26
L5 25 H17 14
M28
L7 26 H17 14
M30
L2 22 H18 15
M31
L3 23 H18 15
M32
L4 24 H18 15
M33
L5 25 H18 15
M35
L7 26 H18 15
M37
L2 22 H19 16
M38
L3 23 H19 16
M39
L4 24 H19 16
M40
L5 25 H19 16
M42
L7 26 H19 16
M44
L2 22 H20 17
M45
L3 23 H20 17
M46
L4 24 H20 17
M47
L5 25 H20 17
M49
L7 26 H20 17
M51
L2 22 H21 18
M52
L3 23 H21 18
M53
L4 24 H21 18
M54
L5 25 H21 18
M56
L7 26 H21 18
M58
L2 22 H22 19
M59
L3 23 H22 19
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ID del Anticuerpo
ID del Péptido de Cadena Ligera SEQ ID del Péptido de Cadena Pesada SEQ
Cadena Ligera
ID NO: Cadena Pesada ID NO:
M60
L4 24 H22 19
M61
L5 25 H22 19
M63
L7 26 H22 19
M65
L2 22 H23 20
M66
L3 23 H23 20
M67
L4 24 H23 20
M68
L5 25 H23 20
M70
L7 26 H23 20
M72
L2 22 H24 21
M73
L3 23 H24 21
M74
L4 24 H24 21
M75
L5 25 H24 21
M77
L7 26 H24 21
En base a la afinidad de unión relativa para TF usando un ELISA, se seleccionaron diez variantes para ampliar a escala la expresión y la purificación. Un resumen de las Kd medidas por BIAcore, datos de ensayo ELISA, unión de células completas, inhibición de inducción de IL-8 de de células MDA-MB231 por FVIIa 50 nM por 2 ug/ml de Mab, y TMS como se miden por el ensayo Termofluor son se muestra en la Tabla 5.
Tabla 5.
MAb
VH VL Biacore Kd (nM) Humano Cyno Hu TF EC50 (ng/ml) Cyno TF EC50 (ng/ml) Unión de Células Completas, % Medio Inducción de IL-8, Inhibición % Media O O E H
M1
H13 L1 0.56 1.34 11.71 17.33 101% 106% 74.18
M10
H15 L3 0.77 1.57 10.47 19.63 98% 104% 75.01
M11
H15 L4 0.37 1.52 9.94 18.69 114% 93% 75.86
M12
H15 L5 0.55 2.24 10.05 22.8 124% 102% 79.72
M16
H16 L2 0.66 1.96 9.31 23.39 109% 109% 78.56
M19
H16 L5 0.41 2.81 9.22 29.61 111% 106% 77.58
M58
H22 L2 0.2 1.18 9.03 19.81 94% 106% 82.18
M59
H22 L3 0.4 1.28 8.8 18.67 95% 103% 75.94
M60
H22 L4 0.47 1.31 8.35 17.79 101% 106% 76.77
M61
H22 L5 0.21 1.71 8.3 24.07 111% 112% 81.16
M9
H15 L2 0.61 1.55 9.8 19.93 107% 106% 79.43
Varias de las nuevas variantes de MAb humanas mostraron mayor afinidad para TF que para M1 (que tenía las cadenas variables de 10H10: H13 y L1) y algunas eran inferiores. La Kd para M61 (0,21 nM) es 2,5 veces menor que la del MAb original murino (Kd = 0,56 nM). Los datos en la Tabla 5 incluyen cuatro Mabs que comprenden H15 y cuatro con H22 ambos construidos a partir del mismo gen de línea germinal (IGHV5-a). Aquellos con H22, y la H-
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CDR2 más corta, mostraron generalmente una afinidad de unión mayor que las moléculas correspondientes con H15. Aunque muchas de las nuevas variantes se unieron a TF de cyno, la clasificación de la afinidad de unión a cyno difería de la de la unión a TF humano.
La Tm de MAb de 10H10 de ratón fue de 74,2° C. La Tm de las moléculas seleccionadas varió de Tms de 75 a 82,2° C. Por tanto, el proceso de HFA dio como resultado la creación de constructos de anticuerpos con nuevas regiones Fd que tienen afinidad de unión aumentada para TF de primate humano y no humano y también produjo variantes de anticuerpos completos estables con dominios humanos.
La caracterización adicional de los nuevos constructos de anticuerpos verificó que los anticuerpos eran capaces de reconocer TF nativo en células originarias de tejido tumoral humano (células derivadas de cáncer de mama MDA-MB231), y señalización de TF reducida en presencia de VIIa como se mide por inducción suprimida de IL-8 de MDA-MB231.
La caracterización biofísica adicional (cromatografía de solubilidad y de interacción cruzada) y los resultados del ensayo condujeron a la selección de M59, compuesto por las regiones variables H22 y L3, para la maduración de la afinidad.
EJEMPLO 4: MADURACIÓN DE ANTICUERPOS
Las bibliotecas de Fab se construyeron en un sistema de presentación de fagos pIX como se describe en la Patente US N° 6.472.147 (Scripps) y los solicitantes de la solicitud en trámite publicada como WO2009/085462 con modificaciones menores a los sitios de enzimas de restricción.
En base a la estructura experimental de 10H10 en complejo con hTF, se diseñaron dos bibliotecas comenzando con el emparejamiento M59 de H116 (SEQ ID NO: 19) y l3 (SEQ ID NO: 23) para la diversificación de ambas Vl y Vh. Las bibliotecas difirieron en cuanto a las posiciones apuntadas para la diversificación, así como en los aminoácidos usados para diversificar las posiciones apuntadas. Una biblioteca diversificó un total de ocho de las posiciones que representan cada CDR, que se había demostrado anteriormente que estaban en contacto con TF. El énfasis en el diseño se puso en L1, L3, H1 y H2. Las posiciones en contacto en L2 no se diversificaron ni en la mayoría de las posiciones en H3. Se evitaron aminoácidos lábiles o reactivos como Cys y Met.
Se diseñó un segundo conjunto de bibliotecas para diversificar los aminoácidos en la periferia del sitio de unión al antígeno determinado calculando las accesibilidades de solvente de la estructura cristalina de Fab unida y no unida. Los residuos cubiertos tras la unión pero también en contacto con las moléculas de solventes se dirigieron para diversificación. Se identificaron un total de 12 residuos (6 en Vl y 6 en Vh) usando este método, que se diversificó con un conjunto reducido de ocho aminoácidos, que incluyen: Arg (R), Asn (N), Asp (D) , Gly (G), His (H), Ser (S), Trp (W) y Tyr (Y). El tamaño de las bibliotecas combinadas se estimó en 812 o 1010 variantes, que pueden cubrirse usando técnicas de clonación de restricción de bibliotecas estándar.
Para la biblioteca de residuos de contacto de CDR, las posiciones se diversificaron con 15 aminoácidos (todos excepto Met, Cys, Lys, Gln y Glu) usando un enfoque sintético de dímero de nucleótido (dímero N).
Las bibliotecas Fab mostradas en la proteína cubierta de fago IX se adsorbieron frente a hT-ECD biotinilada de acuerdo con esquemas de adsorción, conocidos en la técnica, dirigidos a aumentar la afinidad seleccionando para una disociación más lenta (aumento en el valor de disociación) o una asociación más rápida (disminución en el valor de asociación), o se usaron ambos. La adsorción usó TF tanto humano como de cyno como antígeno objetivo. El fago fue producido mediante infección por fago auxiliar. Los aglutinantes se recuperaron mediante la adición de perlas SA para formar un complejo perla/antígeno/fago. Después del lavado final, el fago se rescató por infección de células de Escherichia coli tG-1 en crecimiento exponencial. El fago se produjo de nuevo y se sometió a rondas adicionales de adsorción.
El gen pIX se escindió por digestión con NheI/SpeI a partir de los clones seleccionados y, después de la religación, el aDn se transformó en células TG-1 y se cultivó en placas LB/Agar durante la noche. Los cultivos nocturnos se usaron para (i) PCR de colonias y secuenciación para las regiones V, y (ii) producción de Fab solubles. Las proteínas Fab solubles se capturaron en placas mediante un anticuerpo policlonal anti- Fd(CH1). Después de lavado y bloqueo apropiados, se añadió hTF biotinilado a una concentración de 0,2 nM y se detectó hTF biotinilado mediante estreptavidina conjugada con HRP y lectura de quimioluminiscencia como antes. En esta concentración de hTF, es posible la clasificación de las variantes de Fab, definida como el porcentaje de unión del original, en la que el Fab original presente como control en todas las placas, se define como un 100% de unión.
Mediante este criterio, se seleccionaron 381 Fab que se unen a TF humano al 100% o más en relación con el Fab M59.
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Un análisis de los clones seleccionados indicó que ciertos cambios en Y2, 15, T6 e Y7 de la CDR1 de la cadena pesada (SEQ ID NO: 6) correspondiente a las posiciones 27 y 30-32 de la región V (SEQ ID NO: 4 o 19) tuvieron éxito. Aunque no es un residuo de contacto, la posición 27 solo permitía un aminoácido aromático (Tyr y Phe). Para las posiciones 30-32, que tienen contacto directo con K68, T101, Y103 y L104 de TF humano sEq iD NO: 1 en el Fab de 10H10 (FIG. 1), la posición 30 era relativamente permisiva, pero las 31 y 32 estaban restringidas (Tabla 6).
En L-CDR2, los cambios en L3, S6 y S8 (SEQ ID NO: 7) corresponden a las posiciones L52, S55 y S57 de la SEQ ID NO: 4 o 19, que son residuos que tienen contacto directo con P194, S195 y T197 de TF humano SEQ ID NO: 1 en el Fab de 10H10 (FIG. 1) hubo un conjunto algo restringido de sustituciones permitidas.
En H-CDR3, la posición N6 (SEQ ID NO: 8) correspondiente a N104 de la SEQ ID NO: 4 o 19, que hace contacto directo con F147, G148 y K149 de TF-ED humano (SEQ ID NO: 1) parecía estar restringida.
Los cambios de aminoácidos permitidos en cada una de las posiciones de la biblioteca seleccionadas por adsorción de fagos y detección por afinidad de unión comparable en el ensayo de captura en fase sólida usando TF- ECD1-219 humano 0,2 nM se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6.
HC_CDR1 HC_CDR2 HC_CDR3
Contacto con Antígeno en
No Sí Sí Sí Sí No Sí No Sí No Sí No
Posición en HC (SEQ ID NO: 19)
Y27 130 T31 Y32 L52 G54 S55 G56 S57 N59 N104 S105
Y I T Y L G S G S N N S
F V P H I W T N Y V S A
G A F V A V S W T
Diversidad de Secuencia
N S H P L F L
A V R A I
T Y H H
R F W
S A
L D
O R
Y F
A
D
H
Para VL en los clones seleccionados, se muestran en la Tabla 7 como relativamente permisivos cambios en S9, G10, N11 y K13 de L-CDR1 (SEQ ID NO: 9) correspondientes a las posiciones 32, 33, 34 y 36 de la región variable de LC (SEQ ID NO: 5 o 23), que se muestran por mapeo de epítopos para contactar con E174, D129, S142, R144 y D145 de TF humano SEQ ID NO: 1 (FIG. 1). Para L-CDR2, el residuo W1, posición 56 en la SEQ ID NO: 5 o 23 (número de residuo de Kabat 50), es un residuo de contacto mientras que el residuo E61 mostró tolerabilidad limitada para la sustitución. En la cadena ligera de CDR3 (SEQ ID NO: 9) correspondiente a las posiciones de residuos 97-100 de la SEQ ID NO: 5 o 23, que tienen contacto directo con K149, D150, N171 y T172 de TF humano SEQ ID NO: 1 (FIG. 1), la posición D97 (posición de Kabat 91) estaba restringida. La selección basada en la unión de afinidad con el uso de aminoácidos permisivos del clon TF-ECD1-219 humano se resume en la Tabla 7.
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Tabla 7.
LC-CDR1 LC-CDR2 LC-CDR3
Contacto con Antígeno
Sí Sí Sí Sí Sí Sí No Sí Sí Sí Sí
Posición en LC (SEQ ID NO: 23)
S31 S32 G33 N34 K36 W56 E61 D97 Y98 T99 Y100
A A A A A A A D A A F
Diversidad de Secuencia
D F F F H G D D D H
F G G G I H E F F I
G H H I L w G G G L
H I I L N H H H N
I L L N P N I L W
L N N P R P L N Y
N P P R S S N R
P R R S V T S S
S S S T V T T
T T T V Y V V
V V V Y Y Y
W W W
Y Y Y
En resumen, se identificaron una serie de variantes de Fab mejoradas por afinidad mediante la construcción de una biblioteca de fagos basada en el abigarramiento dirigido de posiciones de CDR de aminoácido en las posiciones de contacto con TF humano de antígeno para los dominios variables H22 (SEQ ID NO: 19) y L3 (SEQ ID NO: 23), seguido de adsorción y selección de especies con afinidad en el ensayo de examen de unión comparable o mejor en comparación con las secuencias de partida.
En general, se obtuvieron aumentos modestos en la afinidad para el emparejamiento de VH y VL seleccionado de las bibliotecas de HFA diseñadas. Sin embargo, de la biblioteca de VH donde se abigarraron los residuos de contacto, el aminoácido original se re-seleccionó después de una adsorción de fagos rigurosa. Solo se cambiaron significativamente dos posiciones de paratopos, como se explica a partir del análisis estructural. Estos dos reemplazos de aminoácidos introducidos en las CDR durante la maduración por afinidad, T31P y S57F, implican residuos de contacto. La mejora de 5 veces de la afinidad puede atribuirse a la interfaz aumentada de F57 que está en contacto con S195 de TF. La interacción de VL con TF parece ser plástica, permitiendo que muchos cambios en los residuos de contacto así como en los residuos colindantes.
De los 381 emparejamientos de VH y VL, 43 fueron seleccionados para caracterización adicional. Los 43 MAbs seleccionados representaban 27 VH y 8 VL diferentes (ver la Tabla 8 para el emparejamiento de las secuencias de cadena pesada y cadena ligera) y podrían clasificarse en tres subgrupos: las variantes del Grupo 1 tienen la misma cadena ligera (L3, SEQ ID NO: 23), y el Grupo 2 y el Grupo 3 están representados por ocho cadenas ligeras emparejadas con dos cadenas pesadas diferentes (H116 y H171, SEQ ID NO: 131 y 67, respectivamente).
Tabla 8.
ID de MAb
ID de LC LC SEQ ID NO: ID de HC HC SEQ ID NO:
M1583
L3 23 H177 129
M1584
L3 23 H173 130
M1585
L3 23 H139 131
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ID de MAb
ID de LC LC SEQ ID NO: ID de HC HC SEQ ID NO:
M1586
L3 23 H164 132
M1587
L3 23 H116 133
M1588
L3 23 H179 134
M1589
L3 23 H187 135
M1590
L3 23 H117 136
M1591
L3 23 H122 137
M1592
L3 23 H165 138
M1593
L3 23 H171 139
M1594
L3 23 H158 140
M1595
L3 23 H160 141
M1596
L3 23 H185 142
M1597
L3 23 H134 143
M1598
L3 23 H137 144
M1599
L3 23 H130 145
M1601
L3 23 H105 146
M1602
L3 23 H106 147
M1604
L3 23 H138 148
M1605
L3 23 H168 149
M1606
L3 23 H181 150
M1607
L3 23 H189 151
M1610
L3 23 H115 153
M1611
L3 23 H128 154
M1612
L3 23 H133 155
M1613
L3 23 H136 156
M1638
L138 157 H22 19
M1639
L320 158 H22 19
M1640
L327 159 H22 19
M1641
L335 160 H22 19
M1642
L369 161 H22 19
M1643
L162 162 H22 19
M1644
L225 163 H22 19
M1645
L283 164 H22 19
M1646
L138 157 H171 139
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ID de MAb
ID de LC LC SEQ ID NO: ID de HC HC SEQ ID NO:
M1647
L320 158 H171 139
M1648
L327 159 H171 139
M1649
L335 160 H171 139
M1650
L369 161 H171 139
M1651
L162 162 H171 139
M1652
L225 163 H171 139
M1653
L283 164 H171 139
Del grupo de 27 anticuerpos que tienen la misma cadena ligera que M59 (L3, SEQ ID NO: 23), las 27 cadenas pesadas difieren en tres posiciones en H-CDR1 (GYTFX1X2X3WIE (SeQ ID NO: 83) donde X1 se selecciona de A, D, G, I, L, N, P, R, S, T, V, Y; y X2 se selecciona de A, P, S y T y X3 se selecciona de F, H, y Y); excepto en H189 donde H-CDR1 es GFTFITYWIA (SEQ ID NO: 81), y en cuatro posiciones en H-CDR2 (DIX1PGX2GX3TX4 (SEQ ID NO: 107) donde X1 se selecciona de I y L, X2 se selecciona de S y T, X3 se selecciona de A, F, H y w; y X4 se selecciona de D, H, I, L y N; excepto en H189 donde H-CDR2 es DILPASSSTN (SEQ ID NO: 105)) mientras que H-CDR3 y las FR no se alteraron de la secuencia de H22 (SEQ ID NO: 19) y es SGYYGNSGFAY (SEQ ID NO: 8). Las composiciones únicas de las cadenas pesadas para estos 27 Mabs se dan a continuación (Tabla 9).
Tabla 9.
MAb
LC SEQ ID ID de HC SEQ ID HC-CDR 1 SEQ ID NO: HC-CDR2 SEQ ID NO: para
NO: HC NO: para H-CDR1 H-CDR2
M1583
23 H177 129 GYTFGPYWIE 82 DIIPGSGWTN 100
M1584
23 H173 130 GYTFVTYWIE 77 DILPGTGYTV 99
M1585
23 H139 131 GYTFSPFWIE 70 DIIPGTGYTN 93
M1586
23 H164 132 GYTFPTYWIE 73 DIIPGTGWTN 95
M1587
23 H116 133 GYTFIPYWIE 63 DILPGSGFTT 86
M1588
23 H179 134 GYTFGPFWIE 78 DILPGSGYTN 101
M1589
23 H187 135 GYTFGPHWIE 80 DILPGTGYTN 104
M1590
23 H117 136 GYTFLPYWIE 64 DIIPGTGFTN 88
M1591
23 H122 137 GYTFRPYWIE 65 DIIPGTGYTN 93
M1592
23 H165 138 GYTFSPHWIE 74 DILPGSGYTI 96
M1593
23 H171 139 GYTFAPYWIE 76 DILPGTGFTT 98
M1594
23 H158 140 GYTFPPYWIE 72 DILPGTGYTV 99
M1595
23 H160 141 GYTFYPYWIE 72 DILPGTGFTN 94
M1596
23 H185 142 GYTFTPYWIE 68 DILPGSGHTT 103
M1597
23 H134 143 GYTFSSYWIE 70 DILPGTGATH 90
M1598
23 H137 144 GYTFTPYWIE 68 DILPGTGYTV 99
M1599
23 H130 145 GYTFGPYWIE 82 DILPGTGYTL 89
M1601
23 H105 146 GYTFGPYWIE 82 DILPGTGYTV 99
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MAb
LC SEQ ID ID de HC SEQ HC-CDR 1 SEQ ID NO: HC-CDR2 SEQ ID NO: para
NO: HC ID NO: para H-CDR1 H-CDR2
M1602
23 H106 147 GYTFDAHWIE 62 DILPGSGFTD 84
M1604
23 H138 148 GYTFAPYWIE 76 DILPGTGYTW 92
M1605
23 H168 149 GYTFGTYWIE 75 DILPGTGHTT 97
M1606
23 H181 150 GYTFIPHWIE 79 DILPGSGWTN 102
M1607
23 H189 151 GFTFITYWIA 81 DILPASSSTN 105
M1610
23 H115 153 GYTFAPYWIE 76 DIIPGTGYTT 85
M1611
23 H128 154 GYTFGPYWIE 82 DILPGSGYTT 88
M1612
23 H133 155 GYTFNPYWIE 66 DILPGTGYTN 104
M1613
23 H136 156 GYTFSSHWIE 69 DILPGSGFTH 91
H171 (SEQ ID NO: 139) comprende un cambio adicional en H-CDR1 y H-CDR2 en comparación con H116, que son 131A y S55T.
Dos grupos de Mabs están representados por ocho LC (Tabla 10) emparejados con uno de dos HC diferentes: cadena pesada de H22 (SEQ ID NO: 19) o de H171 (SEQ ID NO: 139). Las ocho cadenas ligeras tienen todas las FR de l3 (derivadas de IGKV240_O1) y tienen cambios de secuencia en cinco posiciones en L-CDR1 (KSSQSLLX1X2X3X4QX5NYLT (SEQ ID NO: 116) donde X1 se selecciona de F, P, S, T, W e Y; X2 se selecciona de F, S, T, R y V; X3 se selecciona de A, G, P, S, W, Y, y V; X4 se selecciona de G, N, y T; X5 se selecciona de K, R, y S), dos en L-CDR 2 (X1ASTRX2S (SEQ ID NO: 120), donde X1 se selecciona de entre H y W; X2 se selecciona de D, E y S) y cuatro en L-CDR3 (QNDX1X2X3PX4T (SEQ ID NO: 128) donde X1 se selecciona de D, F y L; X2 se selecciona de S, T e Y; donde X3 se selecciona de W e Y; X4 se selecciona de L y M). Las composiciones de las ocho LC se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10.
LC ID
LC SEQ ID SEQ ID NO: para L-CDR1 Secuencia de L-CDR1 SEQ ID NO: para L- Secuencia de L-CDR2 SEQ ID NO: para L-CDR3 Secuencia de L- CDR3
NO:
CDR2
L138
156 108 KSSQSLLWFVNQKNYLT 117 HASTRES 122 QNDDSYPLT
L162
161 109 KSSQSLLYVYGQKNYLT 10 WASTRES 121 QNDFSWPLT
L225
162 110 KSSQSLLFRPTQKNYLT 10 WASTRES 122 QNDDSYPLT
L283
163 111 KSSQSLLYTSNQKNYLT 10 WASTRES 123 QNDDYWPLT
L320
157 112 KSSQSLLYSGNQRNYLT 118 WASTRSS 124 QNDDTYPMT
L327
158 113 KSSQSLLPSWNQSNYLT 10 WASTRES 125 QNDFTYPLT
L335
159 114 KSSQSLLFSANQRNYLT 119 WASTRDS 126 QNDDTYPLT
L369
160 115 KSSQSLLTSYNQRNYLT 10 WASTRES 127 QNDLTYPLT
Algunos de estos Mab se sometieron a caracterización adicional y se probaron en modelos de xenoinjerto in vivo (Ejemplo 5).
EJEMPLO 5: CARACTERIZACIÓN DE MABS
Después de la adaptación del marco humano y la reselección de una biblioteca de variantes basadas en M59 que comprenden una única región variable de LC (L3, SEQ ID NO. 23) y una única región variable de HC (H22, SEQ ID NO: 19), con residuos alterados en algunos Residuos de CDR, los nuevos Mabs se sometieron a ensayos biofísicos y de bioactividad, y se utilizó un emparejamiento, M1587, con residuos de paratopos alterados para reexaminar si el epítopo originalmente caracterizado para una unión Fab 10H10 a TF-ECD (Ejemplo 2) se había
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alterado .
ECD de TF Humano: Interfaz M1587
La co-cristalización de anticuerpos adaptados a humanos y madurados por afinidad basados en CDRs de 10H10, M1587 (L3 y H116) con ECD de TF se realizó de la misma manera que para 10H10 (Ejemplo 3) excepto que el complejo M1587-Fab:TF se cristalizó de una solución que contenía un 16% de PEG 3350, acetato de amonio 0,2 M, acetato de sodio 0,1 M, pH 4.5.
La comparación de la estructura co-cristalina de ECD de TF humano con la de Fab M1587 madurado por afinidad indica que la adaptación humana y la maduración por afinidad de 10H10 no ha cambiado la huella del epítopo del anticuerpo como se muestra en la Fig. 2, ni ha alterado la conformación de las CDR. Se introdujeron tres sustituciones de aminoácidos (T31P, S57F y N59T) en H-CDR1 y H-CDR2 (SEQ ID NO: 6 y 27, respectivamente, usando las definiciones de CDR descritas en el Ejemplo 2) durante la adaptación del marco humano y la maduración por afinidad (las SEQ ID NO: 6 y 7 se reemplazaron con las SEQ ID NO: 63 y 86) que incluyen los residuos de contacto en los residuos 31 y 57 de H116 (SEQ ID NO: 133) que son T31P y S57F. Hubo una mejora de la afinidad de cinco veces que puede atribuirse a la interfaz aumentada de F57, que está en contacto con S195 de TF. La estructura del ECD de TF humano con Fab M1587 confirmó la conservación del epítopo durante el HFA y la maduración de afinidad incluso aunque se realizaron cambios en los residuos de paratopo de H-CDR1 y H-CDR2.
Resultados del Ensayo Biofísico y Biológico
Los datos resumidos para estos anticuerpos se muestran a continuación para el análisis de KD por Biacore (Tabla 11), el tiempo de coagulación de plasma humano por TF humano (Tabla 12) y el EC50 para la liberación de IL8 de células MD-MB-231 estimuladas con FVIIa (Tabla 13, 14 y Fig. 5).
La Kd para 43 Mabs maduros por afinidad seleccionados e incluye datos generados para el 10H10 murino y la versión quimérica de ese MAb (M1) con variantes adaptadas al marco humano seleccionado con CDR no modificada de 10H10 (números M menores que 100) se muestran en la Tabla 11. Por tanto, la combinación de selección de marco humano y sustitución de residuos de CDR produjo anticuerpos humanos con Kd en el intervalo de 80 a 950 pM con una disociación (Koff) en el intervalo de 2,2x10-5 seg-1 a 2,6x10- 3 seg-1; y con una asociación (Kon) en el intervalo de 104 M-1seg-1 a 2.3x105 M-1sec-1. Comparado con los valores para el 10H10 murino original o la construcción quimérica, los nuevos Mabs tienen hasta 10 veces menos en la constante de disociación de equilibrio (Kd), de 0,77 nM a 0,08 nM; muestran una asociación más rápida (Kon >105M-1seg-1), o tienen una disociación más lenta (Koff = 105 seg-1). Estas propiedades se pueden usar con ventaja en la selección de un MAb para aplicaciones particulares donde se desea o tiempo de residencia o capacidad de penetrar tejidos.
Tabla 11.
ID del Anticuerpo
ka (1/Ms) 104 kd (1/s) 10'4 Kd (nM)
M1639
4.69 3.71 0.08
M1645
5.21 4.12 0.08
M1647
3.87 4.02 0.1
M1652
4.44 4.82 0.11
M1641
4.56 5.46 0.12
M1644
5.81 7.19 0.12
M1587
15.7 0.23 0.14
M1604
15.2 0.22 0.14
M1653
2.31 3.76 0.16
M1649
3.85 6.46 0.17
M1593
13.8 0.25 0.18

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
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    50
    55
    60
    65
    Reivindicaciones
    1. Un anticuerpo aislado que se une al factor tisular humano en donde el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 139 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 23.
  2. 2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende una cadena ligera del anticuerpo de la SEQ ID NO: 165 y una cadena pesada del anticuerpo seleccionada de la SEQ ID NO: 166 y la SEQ ID NO: 167.
  3. 3. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación anterior para su uso en un método para tratar un sujeto humano que padece de una afección en la que la expresión de TF y la bioactividad local resultante de la expresión de TF está relacionada directa o indirectamente con la afección a ser tratada, en donde:
    (i) la afección es cáncer, opcionalmente en donde el cáncer se selecciona de tumores sólidos primarios, metástasis; carcinomas, adenocarcinomas, melanomas, tumores líquidos, linfomas, leucemias, mielomas, cánceres de tejidos blandos, sarcomas, osteosarcoma, timoma, linfosarcoma, fibrosarcoma, leiomiosarcoma, lipomas, glioblastoma, astrosarcoma, cáncer de próstata, mama, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parótida, tracto biliar, colon, recto, cuello uterino, útero, endometrio, tiroides, pulmón, riñón o vejiga;
    (ii) la afección se selecciona de tumores benignos, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas y granulomas piógenos; placas arterosclericas; enfermedades angiogénicas oculares, retinopatía diabética, retinopatía del precocidad, degeneración macular, rechazo de injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma, uveítis y Pterygia (crecimiento de vasos sanguíneos anormal) del ojo; artritis reumatoide; psoriasis; curación de heridas retardada; endometriosis; vasculogénesis; granulaciones; cicatrices hipertróficas (queloides); fracturas sin unión; esclerodermia; tracoma; adherencias vasculares; angiogénesis miocárdica; colaterales coronarios; colaterales cerebrales; malformaciones arteriovenosas; angiogénesis de la extremidad isquémica; Síndrome de Osler-Webber; neovascularización de placas; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma; displasia fibromuscular; granulación de heridas; enfermedad de Crohn; y aterosclerosis.
  4. 4. Una composición farmacéutica útil para tratar a un sujeto que comprende un anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en una preparación farmacéuticamente aceptable.
  5. 5. Un kit que comprende un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en una forma estable e instrucciones de uso.
  6. 6. Un ácido nucleico aislado que codifica los dominios de unión a anticuerpo de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
  7. 7. Un vector que comprende por lo menos un polinucleótido de la reivindicación 6.
  8. 8. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 7.
  9. 9. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, o fragmento de unión al antígeno del mismo que tiene un isotipo de IgG1 o IgG4, opcionalmente en donde la región Fc comprende el isotipo IgG1 humano donde las posiciones de Kabat 239 y 332 (que son las 242 y 335 de la SEQ ID nO: 167) se modifican a partir de los residuos S y D de tipo salvaje, a las mutaciones D y E en la región de Fc.
    imagen1
    R136
    L104
    R144
    D129
    D145
    G148
    K149
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    W33
    L52
    D97
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    112
    Humano
    Cyno
    Ratón
    Consenso
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    m Residuos de epítopo de TF en contacto con 10H10 A Residuos de epítopo de TF en contacto con 5G9
    imagen5
    imagen6
    115
    Anticuerpos Anti-TF
    imagen7
    Volumen Tumoral Medio (mm3, ±SEM)
    imagen8
    PBS
    M1593
    Volumen Tumoral Medio (mm3, ±SEM)
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    PBS
    M1593
    imagen10
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