JP2024515643A - 抗ヒトｍａｓｐ－２抗体、並びにその製造法及び使用 - Google Patents

抗ヒトｍａｓｐ－２抗体、並びにその製造法及び使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒトＭＡＳＰ－２に結合することができる抗体、並びにその製造方法及び使用を開示する。本発明の抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体は、ヒトＭＡＳＰ－２に特異的に結合することができ、Ｃ４切断及びＣ３ｂ産生の阻害において良好な生物学的活性を有し、ＩｇＡ腎症などのＭＡＳＰ－２関連疾患を治療するために使用することができる。【選択図】図３

Description

本発明は、抗体分野に関し、より具体的には、本発明はヒトＭＡＳＰ－２に特異的に結合する高親和性抗体、並びに特にＭＡＳＰ－２関連疾患に使用される治療剤としての前記抗体の使用に関する。ここで、前記病症は、例えば、非典型溶血性尿毒症症候群、造血幹細胞移植後の血栓性微小血管症（ＨＳＣＴ－ＴＭＡ）、ＩｇＡ腎症である。
補体系は、人体に内在する免疫の重要な要素である。それは、侵入する病原性微生物を認識して排除し、オプソニン作用と溶解により宿主細胞を変化させ、それは、また、他の急性損傷に対して免疫反応することもできる。補体は、セリンプロテアーゼが厳密な順序でお互いを活性化する複雑なカスケードシステムである。現在、補体系は古典経路、レクチン経路、副経路の３つの異なる経路によって活性化されることが広く受け入れられている。
中国には約１．２億人の慢性腎臓病（ＣＫＤ）患者がおり、その中でＩｇＡ腎症（ＩｇＡ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ、ＩｇＡＮ）は最も一般的な腎臓病である。ＩｇＡＮはまた、世界的に最も発症率の高い原発性糸球体疾患の一つであり、特にアジア人で発症率が高い。ＩｇＡ腎症の長期予後は不良で、患者の３０～４０％が１０～２５年以内に末期腎臓病（腎不全）に移行する。ＩｇＡ腎症の病因は完全には解明されておらず、Ｙｅｏらによって提出されたＩｇＡＮ発症モデル（Ｙｅｏら．， Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｐｈｒｏｌ ３３：７６３－７７７， （２０１８））によると、粘膜免疫系の障害により粘膜Ｂ細胞が過剰に増殖し、誤って循環系に侵入した粘膜Ｂ細胞が分泌されたＩｇＡを血液循環中入るようにさせ、血清ＩｇＡレベルの上昇を引き起こす。糸球体におけるこれらのＩｇＡ免疫複合体の蓄積は、メサンギウム細胞の活性化を引き起こし、炎症促進性、線維化促進性メディエーターを放出し、補体を活性化させる。
ＩｇＡＮの糸球体傷害が補体系の活性化と関連していることを示唆する証拠が増えており、補体系の活性化を阻害することがＩｇＡＮ治療の有望なアプローチとなっている。研究により、レクチン経路の変化がＩｇＡＮ疾患の発症と進行に有益であることが示されている。マンノース結合レクチンセリンプロテアーゼ２（ＭＡＳＰ－２）は補体レクチン経路の活性化に必需的なエフェクター酵素であり、補体成分Ｃ４を切断してＣ３転換酵素Ｃ４ｂ２ｂを形成し、補体を活性化することができ、薬物の標的となる可能性がある。ナルソプリマブ（Ｎａｒｓｏｐｌｉｍａｂ）は、オメロスが開発したＭＡＳＰ－２標的に対する抗体であり、現在臨床第ＩＩ相、第ＩＩＩ相段階に入っている。当該抗体の適応症は、非典型溶血性尿毒症症候群、造血幹細胞移植後の血栓性微小血管症（ＨＳＣＴ－ＴＭＡ）、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎及びその他の腎疾患である。関連特許はＵＳ９０９６６７６、ＵＳ９４７５８８５、ＵＳ２０１３０３４４０７３等がある。
本発明は、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎などの疾病における新たな標的に対して開発された新規抗体医薬を提供する。本発明の新規分子は、高い親和性、高い効力、優れた創薬可能性等の特徴を有する。
本発明の発明者は、大量の試験を実施して、高い親和性で特異的にヒトＭＡＳＰ－２に結合するモノクローナル抗体セットを得た。それはレクチン経路のＣ４切断酵素反応を阻害することができ、補体活性化を阻害する生物学的活性を有する。
第一の態様において、本願は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域がＨＣＤＲ３配列を含み、任意選択でＨＣＤＲ１および／またはＨＣＤＲ２配列を更に含む、ヒトＭＡＳＰ－２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、前記ＨＣＤＲ３配列は、配列番号１７、２３、２９、３５、４１、４７および５３から選択されるアミノ酸配列を含み；並びに／或いは前記ＨＣＤＲ２配列は、配列番号１６、２２、２８、３４、４０、４６および５２から選択されるアミノ酸配列を含み；並びに／或いは前記ＨＣＤＲ１配列は、配列番号１５、２１、２７、３３、３９、４５および５１から選択されるアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、ヒトＭＡＳＰ－２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域をさらに含み、前記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ＬＣＤＲ１配列は、配列番号１８、２４、３０、３６、４２、４８および５４から選択されるアミノ酸配列を含む。並びに／或いは前記ＬＣＤＲ２配列は、配列番号１９、２５、３１、３７、４３、４９および５５から選択されるアミノ酸配列を含む。並びに／或いは前記ＬＣＤＲ３配列は、配列番号２０、２６、３２、３８、４４、５０および５６から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記抗体はモノクローナル抗体であり；前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｄフラグメントおよび単一ドメイン抗体から選択される。
本発明によって提供されるヒトＭＡＳＰ－２抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも１つのＣＤＲ領域を含み、前記ＣＤＲ領域は下記の配列又はその突然変異配列、或いはそれらと９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択される：抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ領域：配列番号１５、１６、１７、２１、２２、２３、２７、２８、２９、３３、３４、３５、３９、４０、４１、４５、４６、４７、５１、５２および５３；抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ領域：配列番号１８、１９、２０、２４、２５、２６、３０、３１、３２、３６、３７、３８、４２、４３、４４、４８、４９、５０、５４、５５及び５６。
本発明の一つの好ましい実施態様において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウス由来抗体またはそのフラグメントである。前記マウス由来抗体軽鎖可変領域は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４から選択されるアミノ酸配列、或いはそれらと少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３から選択されるアミノ酸配列、或いはそれらと少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の一つの好ましい実施態様において、前記マウス由来抗体またはそのフラグメントを提供し、それは、更にマウス由来のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４、或いはそれらの変異体の重鎖定常領域を含み；それは、更にマウス由来κまたはλ鎖、或いはそれらの変異体軽鎖定常領域を含む。
本発明の一つの好ましい実施態様において、前記ヒトＭＡＳＰ－２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、それはキメラ抗体またはヒト化抗体或いはそれらのフラグメントである。
いくつかの実施形態において、ここで、前記ＭＡＳＰ－２ヒト化抗体またはそのフラグメントであり、ここで、前記ヒト化抗体は、下記のいずれか１つから選択される重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列の組み合わせを含む：１００－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５８に示され、並びに軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６０に示される；１２４－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６４に示され、並びに軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６６に示される；１２６－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７０に示され、並びに軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７２に示される；１３６－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７６に示され、並びに軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７８に示される。
本発明の一つの好ましい実施態様において、上記に記載のＭＡＳＰ－２ヒト化抗体またはそのフラグメントを提供し、その重鎖定常領域はヒト由来のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４、或いはそれらの変異体を含み、それは、更にヒト由来κまたはλ鎖、或いはそれらの変異体の軽鎖定常領域を含む。より好ましくは、ヒト由来のＩｇＧ４或いはその変異体の重鎖定常領域を含む。定常領域は、「ＹＴＥ」のような性能を変更する修飾をすることもできる。
より好ましい実施形態において、前記ヒト化抗体は、下記のいずれか１つから選択される重鎖全長配列および軽鎖全長配列の組み合わせを含む：配列番号６７に示される１２４－Ｈｕの重鎖全長アミノ酸配列、配列番号６８に示される軽鎖全長配列のアミノ酸配列；配列番号７３に示される１２６－Ｈｕの重鎖全長配列のアミノ酸配列、配列番号７４に示される軽鎖全長配列のアミノ酸配列。
第２の態様において、本発明は、上記のＭＡＳＰ－２抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド分子を提供する。
第３の態様において、本発明は上記のヌクレオチド分子を含む発現ベクターを提供する。
いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、ｐＴＴ５、ｐＵＣ５７、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐＤＨＦＦ、またはｐＣＨＯ１．０などである。
第４の態様において、本発明は上記の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。前記宿主細は、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ｓｆ９、ｓｆ２１、ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＴＧ１などであり、好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
第５の態様において、本発明は、第１の態様に記載のヒトＭＡＳＰ－２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを製造する方法を提供し、前記方法は下記のステップを含む：
ａ）第４の態様に記載の宿主細胞が抗体またはその抗原結合フラグメントを産生できる発現条件下で、前記宿主細胞を培養し、それによって抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させるステップ；と
ｂ）ａ）で発現された前記抗体またはその抗原結合フラグメントを分離・精製するステップ。
第６の態様において、本発明は、第１の態様に記載の抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体またはその抗原結合フラグメント、及び薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、ＭＡＳＰ－２関連疾患の治療に使用される。
第７の態様において、本発明は、ＭＡＳＰ－２関連疾患の予防または治療における、第１の態様に記載の抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体またはその抗原結合フラグメント、または第６の態様に記載の組成物の使用を提供する。
他の態様において、本発明は、必要とする個体に、第１の態様に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、または第６の態様に記載の医薬組成物を投与するステップを含むＭＡＳＰ－２関連疾患を予防または治療する方法を提供する。前記ＭＡＳＰ－２関連疾患は、非典型溶血性尿毒症症候群、造血幹細胞移植後の血栓性微小血管症（ＨＳＣＴ－ＴＭＡ）、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症などを含み；ここで、前記疾患は好ましくは、ＩｇＡ腎症である。
ヒト化抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体とヒトＭＡＳＰ－２との結合のＥＬＩＳＡ検査結果である。 ４％のヒト血清におけるＭＡＳＰ－２によって触媒されるＣ４切断を阻害するヒト化抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体の実験結果である。 ＭＡＳＰ－２によって媒介されるＣ３ｂの産生を阻害するヒト化抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体の実験結果である。 ９０％のヒト血清におけるＭＡＳＰ－２によって触媒されるＣ４切断を阻害するヒト化抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体の実験結果である。 ９０％のカニクイザル血清におけるＭＡＳＰ－２によって触媒されるＣ４切断を阻害するヒト化抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体の実験結果である。
本発明は、ヒトＭＡＳＰ－２に特異的に結合する新規な抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。好ましい実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＭＡＳＰ－２に高親和性で結合し、ＭＡＳＰ－２の酵素活性を阻害する。本願はまた、当該抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞、当該抗体を製造・精製する方法、ならびにＭＡＳＰ－２関連疾患の予防または治療など、前記抗体またはその抗原結合フラグメントの医学的および生物学的使用を提供する。本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを使用してＭＡＳＰ－２を検出し、ＭＡＳＰ－２活性を調節する方法も含む。
本願の理解を容易するために、まず、本明細書で使用される幾つかの用語を定義する。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、４本のポリペプチド鎖、即ち、ジスルフィド結合で連結された２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）からなる免疫グロブリン分子、およびその多量体（例えばＩｇＭ）を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと略す）と重鎖定常領域（ＣＨと略す）を含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬと略す）と軽鎖定常領域（ＣＬと略す）を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域とＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分でき、それらの間には、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存領域が点在している。
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語は、抗原に結合する役割を担う完全な抗体分子の一部またはセグメントを指す。抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、またはこれらの両方を含んでもよい。抗体の抗原結合フラグメントは、任意の適切な標準技術を用いて、完全な抗体分子から製造することができ、前記標準技術は、タンパク質加水分解消化又は組換え遺伝子工学技術などを含む。抗原結合フラグメントの非限定的な実例は、Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆｄフラグメント；Ｆｖフラグメント；単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；単一ドメイン抗体；ｄＡｂフラグメント、および抗体の高度可変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、単離されたＣＤＲ）を含む。「抗原結合フラグメント」という用語は、二抗体、三抗体、四抗体、マイクロ抗体などの他の人工分子も含む。
本明細書で使用される場合、「重鎖可変領域（ＶＨ）」および「軽鎖可変領域（ＶＬ）」という用語は、それぞれＦＲ１、２、３および４ならびにＣＤＲ１、２及び３からなる単一の抗体可変重鎖および軽鎖領域を指す。
相補性決定領域（ＣＤＲ、一般的にはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３である）は、抗体の親和性および特異性に最も大きな影響を与える可変領域における領域であることは、当業者によく知られている。ＶＨまたはＶＬのＣＤＲ配列の一般的な定義方法は、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の２つがある（Ｋａｂａｔら、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１）； Ａ１－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ＪＭＢ． ２７３：９２７－９４８ （１９９７）； Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ．ＵＳＡ８６：９２６８－９２７２ （１９８９）を参照）。所定の抗体の可変領域配列について、ＶＨおよびＶＬ配列におけるＣＤＲ領域配列は、Ｋａｂａｔ定義またはＣｈｏｔｈｉａ定義に従って決定することができる。本願の実施形態では、ＣＤＲ配列はＫａｂａｔを用いて定義される。本明細書において、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と略称され；軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と略称される。
所定の抗体の可変領域配列について、可変領域配列におけるＣＤＲ領域配列は様々な方法で分析することができ、例えばオンラインソフトウェアＡｂｙｓｉｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ／）を用いて決定することができる。
本明細書で使用される「特異的結合」という用語は、２つの分子間の非ランダムな結合反応、例えば、非特異的抗原に対する親和性よりも少なくとも２倍大きな親和性で特異的抗原に結合する等、抗原エピトープへの抗体の結合能力を指す。しかし、抗体はその配列に関連する２つ又は複数の抗原に特異的に結合できることを理解すべきである。例えば、本発明の抗体は、ヒトと非ヒト（例えば、マウスまたは非ヒト霊長類）のＭＡＳＰ－２に特異的に結合できる。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体群から得られた抗体を指し、すなわち、その群を構成する個々の抗体は、少数の個体に存在する可能性のある天然由来の突然変異を除いて同じである。本明細書に記載のモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、ここで、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、重鎖および／または軽鎖の残りの部分は、別の種に由来する抗体、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、また、それらが望ましい生物学的活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントも含まれる（米国特許４，８１６，５６７；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５ （１９８４）を参照）。
本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、配列アラインメントおよびギャップの導入後の、アミノ酸またはヌクレオチド配列変異体において同一である残基のパーセンテージとして定義され、必要に応じて最大の相同性パーセンテージに達する。比較のための方法およびコンピュータプログラムは当技術分野でよく知られている。本明細書で使用される「少なくとも９０％の相同性」とは、相同性が９０％～１００％までの任意の値を指し、例えば、９１％、９３％、９５％、９９％などである。
本明細書で使用される場合、「ＭＡＳＰ－２関連疾患」という用語は、ＭＡＳＰ－２酵素活性に関連する疾患および／または病状を含む。例示的なＭＡＳＰ－２関連疾患は、非典型溶血性尿毒症症候群、造血幹細胞移植後の血栓性微小血管症（ＨＳＣＴ－ＴＭＡ）、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症などを含む。
本明細書で使用される場合、「半減期」および「血清半減期」という用語は、本開示による抗原結合タンパク質の血清濃度が体内で５０％減少するまでかかる時間を指す。
一態様において、本願は、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む、ヒトＭＡＳＰ－２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。本願に開示される抗体に適したＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、下記の表３～５に例示的に列挙する。幾つかの実施形態において、抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体またはその抗原結合フラグメンは、表４に示されるＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２、またはＨＣＤＲ１配列のいずれか１つから独立して選択されるＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２、および／またはＨＣＤＲ１配列を含む。幾つかの実施形態において、本願の抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体は、表４に示される軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、またはＬＣＤＲ３配列のいずれか１つから独立して選択される軽鎖ＣＤＲをさらに含み得る。例えば、本願の抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体は、表３に示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域の任意の組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態において、本願に開示される抗体またはその抗原結合フラグメンのＨＣＤＲ３配列は、配列番号１７、２３、２９、３５、４１、４７、および５３に示されるアミノ酸配列から選択され；ＨＣＤＲ２配列は、配列番号１６、２２、２８、３４、４０、４６、および５２に示されるアミノ酸配列から選択され；並びに／或いは前記ＨＣＤＲ１配列は、配列番号１５、２１、２７、３３、３９、４５および５１に示されるアミノ酸配列から選択される。
好ましい実施形態において、ＨＣＤＲ３は、配列番号２３、４１、４７および５３に示されるアミノ酸配列から選択され；ＨＣＤＲ２配列は、配列番号２２、４０、４６および５２に示されるアミノ酸配列から選択され；前記ＨＣＤＲ１配列は、配列番号２１、３９、４５および５１に示されるアミノ酸から選択される。より好ましい実施形態において、ＨＣＤＲ３は、配列番号４１および４７に示されるアミノ酸配列から選択され；ＨＣＤＲ２配列は、配列番号４０および４６に示されるアミノ酸配列から選択され；前記ＨＣＤＲ１配列は、配列番号３９および４５に示されるアミノ酸から選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体重鎖可変領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、５８、６４、７０および７６から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記重鎖可変領域は、配列番号５８、６４、７０および７６から選択されるアミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、５８、６４，７０及び７６に示される配列と少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の相同性を有する。好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は、配列番号６４および７０に示されるアミノ酸配列と９９％以上の相同性を有する。
本明細書に開示される抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域に加えて軽鎖可変領域をさらに含み得る。
いくつかの実施形態において、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ３は、配列番号２０、２６、３２、３８、４４、５０および５６に示されるアミノ酸配列から選択され；ＬＣＤＲ２配列は、配列番号１９、２５、３１、３７、４３、４９および５５に示されるアミノ酸配列から選択され；並びに／或いは前記ＬＣＤＲ１配列は、配列番号１８、２４、３０、３６、４２、４８および５４に示されるアミノ酸配列から選択される。
好ましい実施形態において、ＬＣＤＲ３は、配列番号２６、４４、５０および５６に示されるアミノ酸配列から選択され；ＬＣＤＲ２は、配列番号２５、４３、４９および５５に示されるアミノ酸配列から選択され；並びに／或いは前記ＬＣＤＲ１は、配列番号２４、４２、４８および５４に示されるアミノ酸配列から選択される。さらい好ましい実施形態において、ＬＣＤＲ３は、配列番４４および５０に示されるアミノ酸配列から選択され；ＬＣＤＲ２は、配列番号４３および４９に示されるアミノ酸配列から選択され；ＬＣＤＲ１は、配列番号４２および４８に示されるアミノ酸配列から選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、６０、６６、７２及び７８に示される配列と少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の相同性を有する。好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は、配列番号６６および７２に示されるアミノ酸配列と９９％以上の相同性を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体の重鎖または重鎖可変領域、軽鎖または軽鎖可変領域は、上記に列挙されたそれぞれの対応する特定のアミノ酸配列に基づいて、少なくとも１つアミノ酸が置換、欠失または付加され得、得られた変異体は依然としてヒトＭＡＳＰ－２への結合活性を保持している。
幾つかの実施形態において、上記アミノ酸の置換、欠失または付加の数は、１～３０個であり、好ましくは１～２０個であり、より好ましくは１～１０個である。好ましい実施形態において、配列変異体は元のアミノ酸配列と比較して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加される。より好ましい実施形態において、配列変異体は元のアミノ酸配列と比較して、約１、２、３、４または５個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加される。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換は保存的置換である。
好ましい実施形態において、本明細書に開示される抗体は、抗体１００－Ｈｕ、１２４－Ｈｕ、１２６－Ｈｕまたは１３６－Ｈｕである。１００－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５８に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６０に示され、ここで、ＣＤＲ配列は、抗体１００と同じであり；１２４－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６４に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６６に示され、ここで、ＣＤＲ配列は抗体１２４と同じであり；１２６－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７０に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号７２に示され、ここで、ＣＤＲ配列は、抗体１２６と同じであり；１３６－Ｈｕの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７６に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号７８に示され、ここで、ＣＤＲ配列は、抗体１３６と同じである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体はモノクローナル抗体である。特定的な好ましい実施形態において、本明細書に開示される抗体はヒト化抗体である。
本明細書に開示される抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＭＡＳＰ－２に特異的に結合することができる。特定の実施形態において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＭＡＳＰ－２またはサルＭＡＳＰ－２に特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、１ｎＭ未満のＫＤでヒトＭＡＳＰ－２に結合する。好ましい実施形態において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、０．３５ｎＭ未満のＫＤでＭＡＳＰ－２、例えばヒトＭＡＳＰ－２に結合する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＭＡＳＰ－２によって触媒されるＣ４切断作用を阻害することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｃ３切断作用を阻害することができる。
本願の発明者は、本明細書に開示される抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体対して一連の生物学的検証実験を実施し、結果、この抗体がヒトＭＡＳＰ－２によく結合でき、対応する生物学的活性を有していることが示された。
具体的には、本願の発明者は、抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体に対して親和性を検出し、ＭＡＳＰ－２によって触媒されるＣ４切断作用、インビトロでのＣ３切断作用の阻害などの実験を実行した。実験結果により、本願で開示される抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体がヒトＭＡＳＰ－２に結合でき、レクチン経路における補体活性化シグナル伝達を阻害し、過剰な補体活性化によって引き起こされる炎症反応の発生を阻害するのに役立つことが示された。
本願はまた、本願で開示される抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞、及び当該抗体を製造・精製する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド分子は調節配列に作動可能に連結され、調節配列は前記ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される。
いくつかの実施形態において、任意の適切な発現ベクターはいずれも本出願に用いられることができる。例えば、前記発現ベクターは、ｐＴＴ５、ｐＵＣ５７、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐＤＨＦＦ及びｐＣＨＯ１．０の１つであってもよい。発現ベクターは適切な転写および翻訳調節配列が連結された融合ＤＮＡ配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、利用可能な宿主細胞は、上述の発現ベクターを含む細胞であり、本願の抗体またはその抗原結合フラグメントの発現に使用できる、哺乳類または昆虫の宿主細胞培養系などの真核細胞であり得る。例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ｓｆ９、ｓｆ２１などはすべて本発明に適用可能である。前記宿主細胞は、上記の発現ベクターを含む原核細胞であってもよく、例えば、ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＴＧ１などであってもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体の製造方法は、発現条件下で宿主細胞を培養して、抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体を発現させるステップ；発現された抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体を分離・精製するステップを含む。上記の方法を使用すると、組換えタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動上の単一のバンドである基本的に均一な物質に精製することができる。
いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、本明細書に開示される抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体を分離・精製することができ、使用されるアフィニティーカラムの特性に応じて、高塩濃度緩衝液、ｐＨの変更などの従来の方法を使用して、アフィニティーカラムに結合した抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体を溶出できる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるヒト化抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体は、実験室で製造されたＭＡＳＰ－２抗原でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫させ、高力価でマウスを複数回免疫させた後、マウス脾臓細胞を取ってハイブリドーマ細胞と融合させ、Ｃ４切断を阻害する機能的活性を有するハイブリドーマ細胞株をスクリーニングして得られる。より具体的には、本願の発明者は、大量の実験を通じて、まずＭＡＳＰ－２抗原をそれぞれ発現させ、これに基づいて、異なるアジュバントとＭＡＳＰ－２抗原とを混合してマウスを免疫させ、その後、上記マウスの脾臓細胞をさらにハイブリドーマ細胞株ｓｐ２／０と融合させ、融合したハイブリドーマから、ＭＡＳＰ－２抗原を使用して陽性細胞株をスクリーニングし、それがＣ４切断機能に対する阻害を確認した後に標的細胞株を得る。好ましい標的分子をヒト化させた後、軽鎖および重鎖遺伝子を真核生物発現ベクターｐＣＨＯ１．０に同時にクローニングする。上記発現ベクターをリポソーム法によりＣＨＯ細胞に導入し、次に、ピューロマイシンとアミノプテリンを用いて陽性細胞クローンをスクリーニングし、スクリーニングして得られた高発現クローンを無血清培地で増殖培養し、プロテインＡアフィニティーカラムを使用して、ヒト化抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体を単離・精製する。
もう１つの実施形態において、ＰＣＲ突然変異誘発などの当技術分野の従来の技術を使用して、さらにマウス由来の親抗体を改変して、抗体のキメラ型、ヒト化型、または他の変異型を生成することができる。本願の親抗体は、例えば、抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインに変異を導入して変異抗体を生成させることで、結合親和性（より低いＫＤ）、ＩＣ５０、特異性、優先的結合などの標的特性の存在をスクリーニングできる。好ましくは、変異体抗体における標的特性は、親抗体における特性と比較した改善である。好ましくは、アミノ酸置換変異体抗体であり、親抗体分子の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基を挿入する。置換突然変異誘発で最も重要な部位は１つ又は複数のＣＤＲ領域であるが、フレームワーク領域（ＦＲ）の変化も考慮される。保存的アミノ酸置換が好ましいが、非保存的アミノ酸変化を導入することもでき、得られた変異体抗体を使用して標的特性をスクリーニングすることができる。
いくつかの実施形態において、抗体の血清半減期は、抗体のＦｃ領域を改変することによって延長される。同定された抗体へのヒトＦｃＲｎの結合能を向上させることができる変異部位としては、主にＴ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｖ３０８Ｐ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｓがあり、本実施形態では、抗体の血清半減期の延長は、これらの位置におけるアミノ酸の突然変異によって実現できる。
本願は、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合フラグメントと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。本明細書に開示される上記抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体は、薬学的に許容される担体とともに製剤化することにより、より安定的に治療効果を発揮することができる。いくつかの実施形態において、これらの製剤は、本明細書に開示される抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体のアミノ酸コア配列の立体構造の完全性を確保すると同時に、タンパク質の多官能基を分解（凝集、脱アミド化、または酸化を含むがこれらに限定されない）から保護する。いくつかの実施形態において、液体製剤は一般に、２℃～８℃で保存した場合、少なくとも１年間安定である。いくつかの実施形態において、凍結乾燥製剤の場合、３０℃で少なくとも６か月間安定である。
いくつかの実施形態において、前記抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体製剤は、懸濁液、水注射液、凍結乾燥製剤等の製薬分野で一般的に使用される製剤であってもよく、好ましくは、水注射液または凍結乾燥製剤であり、本明細書に開示される抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体の水性注射剤または凍結乾燥製造について、薬学的に許容される賦形剤は、界面活性剤、溶液安定剤、等張調節剤および緩衝液、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０または８０）、ポロキサマー（ポロキサマー１８８など）、トリトン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、テトラデシル、リノレイルまたはオクタデシルサルコシン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＭＯＮＡＱＵＡＴＴＭなどの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されなく、その添加量は抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体が顆粒化する傾向を最小限に抑える必要がある。いくつかの実施形態において、溶液安定剤は、還元糖及び非還元糖などの糖類；グルタミン酸ナトリウム又はヒスチジンなどのアミノ酸系；トリオール、高級糖アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのアルコール系の１つまたは組み合わせを含むが、これらに限定されない。溶液安定剤の添加量は、最終形成製剤が、当業者によって安定であるべきと考えられる期間にわたって安定のままの量である。等張性調整剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。緩衝液は、トリス、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
本願はまた、個体に抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体、または抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体を含む組成物を投与することを含む、ＭＡＳＰ－２関連疾患を予防または治療する方法を提供する。
本願はまた、ＭＡＳＰ－２関連疾患または症状を予防または治療するための医薬の製造における、抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体、または抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体を含む組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態において、前記ＭＡＳＰ－２関連疾患または症状は、補体活性化によって媒介される疾患である。
いくつかの実施形態において、上述のＭＡＳＰ－２関連疾患は、非典型溶血性尿毒症症候群、造血幹細胞移植関連血栓性細血管症（ＨＳＣＴ－ＴＭＡ）、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症などを含むが、これらに限定されない。
本明細書に開示される抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体およびその組成物がヒトを含む動物に投与される場合、投与量は患者の年齢および体重、疾患の特徴および重症度、および投与経路に応じて異なり、動物実験の結果及び総合的な状況を参照でき、総投与量は所定の範囲を超えることができない。
抗体またはその組成物の投与量および投与頻度は、疾患の予防に使用されるか、又は治療に使用されるかによって変化し得る。予防的使用では、本願の抗体またはその混合物を含む組成物を、まだ病状に陥っていない患者に投与して患者の抵抗力を増強し、この量を「予防有効量」と定義する。この使用では、具体的な投与量は、また、患者の健康状態と全身免疫によって異なる。通常、比較的低頻度の間隔で比較的低用量を長期間にわたって投与する。治療性使用では、場合によって、病気の進行が遅くなるか終息するまで、比較的高い用量を比較的短い間隔で投与する必要があり、好ましくは、患者が病気の症状の部分的または完全な改善を示すまでである。その後、予防療法を患者に施すことができる。当業者であれば、実際の必要に応じて具体的な投与量および頻度を容易に把握することができる。
本明細書および特許請求の範囲において、「含む」、「含まれる」および「含有する」という用語は、「含むがこれらに限定されない」ことを意味し、他の部分、添加物、組成分、またはステップを排除することを意図するものではない。
本願の特定の態様、実施形態または実施例で説明される特徴、特性、構成要素またはステップは、矛盾しない限り、本明細書で説明される他の態様、実施形態または実施例に適用可能であることが理解されたい。
上記の開示は、本発明を全体的に説明している。以下の特定の実施例は本発明をさらに説明するものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。実施例は従来の通常方法の詳細な説明は含まず、このような方法は当業者には周知であり、分子クローニングハンドブック、コールドスプリングハーバーの抗体技術実験室マニュアルなどの多数の出版物に記載されている。出所が示されていない試薬は従来の試薬である。
実施例１ 可溶性ヒトＭＡＳＰ－２－ＣＣＳタンパク質、カニクイザルＭＡＳＰ－２－ＣＣＳタンパク質、参照抗体ナルソプリマブの製造
ヒトＭＡＳＰ－２－ＣＣＳ抗原配列はＵｎｉＰｒｏｔ（Ｏ００１８７）に由来し、Ｎ末端の１～６８６位のアミノ酸をＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのコドン使用優先度に従ってコドン最適化を実行して、遺伝子合成を実行し、配列をｐＵＣ５７ベクターにサブクローニングして、ｐＵＣ５７－ｈＭＡＳＰ－２を得た。ｍｏｎｏｈＦｃフラグメント（Ｇｌｙ１１９－Ｇｌｙ３２９ ｏｆ ＩＧＨＧ１、Ｐ０１８５７、Ｓ２４７Ｎ／Ｙ２９０Ｎ／Ｋ２９２Ｔ）とＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）をそれぞれｈＭＡＳＰ－２－ＣＣＳフラグメント（Ｔｙｒ２９３－Ｐｈｅ６８６、Ｏ００１８７）及びｈＭＡＳＰ－２Ａ－ＣＣＳフラグメント（Ｔｙｒ２９３－Ｐｈｅ６８６、Ｓ６３３Ａ、Ｏ００１８７）のＮ末端にＰＣＲ法により挿入し、ｐＴＴ５発現ベクター（実験室の保存）に構築して、Ｆｃ－ｈＭＡＳＰ－２－ＣＣＳ、Ｆｌａｇ－ｈＭＡＳＰ－２－ＣＣＳ、Ｆｃ－ｈＭＡＳＰ－２Ａ－ＣＣＳ、およびＦｌａｇ－ｈＭＡＳＰ－２Ａ－ＣＣＳの発現ベクターを得、上記のベクターの構築が完了した後、配列決定を実行し、完全に正しい配列を有するクローンを選択して、細胞トランスフェクションに使用するための大規模なプラスミド抽出を実行した。
カニクイザルＭＡＳＰ－２配列はＵｎｉＰｒｏｔ（Ｆ６ＳＷ７５）に由来し、Ｎ末端の２９３～６８６位のアミノ酸をＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのコドン使用優先度に従ってコドン最適化を実行し、遺伝子合成を実行し、配列を最適化する前にｍｏｎｏｈＦｃタグを付けた後、ｐＴＴ５ベクターにクローニングしてＦｃ－ｃｙｎｏ－ＭＡＳＰ－２－ＣＣＳの発現ベクターを得、プラスミドを大量に抽出した後、細胞の一過性トランスフェクションに使用した。
プラスミドをＰＥＩ法によりＨＥＫ２９３Ｅ細胞株にトランスフェクトした。３ｍＭのバルプロ酸を含むＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地（Ｇｉｂｃｏから購入）で５日間培養した後、細胞培養上清からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥから購入）またはＦｌａｇアフィニティークロマトグラフィー（Ｓｉｇｍａから購入）を用いて標的タンパク質を精製した。タンパク質の定量はビシンコニン酸（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ、ＢＣＡ）法によって実行され、精製されたタンパク質は、次のマウスの免疫化およびさらなる分析と研究に使用された。
Ｎａｒｓｏｐｌｉｍａｂ（ＩｇＧ４、λ）のアミノ酸配列はＩＭＧＴデータベースに由来し、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに従ってコドンを最適化した後、全遺伝子のヌクレオチド配列の合成を実行し、ｐＴＴ５発現ベクターにクローンして、ｐＴＴ５（Ｎａｒｓｏｐｌｉｍａｂ－ＨＣ）、ｐＴＴ５（Ｎａｒｓｏｐｌｉｍａｂ－ＬＣ）を得た。これら２つのベクターをＨＥＫ２９３Ｅ細胞株に同時に一過性に導入し、３ｍＭのバルプロ酸を含むＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地で５日間培養した後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥから購入）を用いて細胞培養上清からナルソプリマブ抗体タンパク質を精製した。
実施例２ 抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体の産生
抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体は、マウスを免疫させて得た。１００μｇ／マウスのＦｃ－ｈＭＡＳＰ－２－ＣＣＳ、Ｆｃ－ｈＭＡＳＰ－２Ａ－ＣＣＳの二つの抗原を生理食塩水で７５μｌに希釈した後、等量のフロイント完全アジュバントと混合し、超音波による乳化が完了した後、４～５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、動物生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）２０１３－００１８）の複数の箇所に皮下注射した。３週後、５０μｇ／マウスのタンパク質を同じように７５μｌに希釈した後、等量のフロイント不完全アジュバントと混合し、超音波による乳化が完了した後、マウスの複数の箇所に皮下注射し、２週後にこの免疫を繰り返した。３回目の免疫から１週後、すべてのマウスの尾を切って血液を採取し、血清を分離し、Ｆｃ－ｈＭＡＳＰ－２－ＣＣＳ、Ｆｃ－ｈＭＡＳＰ－２Ａ－ＣＣＳ抗原でコーティングしたＥＬＩＳＡを使用して血清力価を検出した。血清抗体力価＞１００００のマウスについては、採血の１週後にパルス免疫：マウス１匹あたり１０μｇの抗原／１００μｌの生理食塩水の尾静脈注射を実行した。
力価はＥＬＩＳＡ法によって検出された：Ｆｃ－ｈＭＡＳＰ－２Ａ－ＣＣＳまたはＦｃ－ｈＭＡＳＰ－２－ＣＣＳ抗原を使用してＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌのコーティング濃度、１００μｌ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳＴ（０．５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）で２回洗浄し、軽くたたいて乾燥させた。１％のＢＳＡを含むコーティング溶液２００μｌを各ウェルに加えてブロックし、常温で４時間ブロックした後、軽くたたいて乾燥させ、使用するまで－２０℃の冷蔵庫に保管した。検出する時、異なる濃度のマウス血清１００μｌをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、２つの複製ウェルを設置し、室温で１．５時間培養した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、軽くたたいて乾燥させた。ＰＢＳＴで１：１００００倍に希釈したＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｉｇｍａから購入）１００μｌを加え、室温で１時間培養した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、軽くたたいて乾燥させた。各ウェルに１００μｌの発色液（使用前にＥＬＩＳＡ発色Ａ液とＥＬＩＳＡ発色Ｂ液を体積比１：１で均一に混合する）を加えて発色させた後、２ＭのＨ２ＳＯ４停止液１００μｌを各ウェルに加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して、波長４５０ｎｍにおける各ウェルのＯＤ値を直ちに測定した。
実施例３ ハイブリドーマ融合およびスクリーニング
ハイブリドーマｓｐ２／０細胞（Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、保蔵番号：ＴＣＭ－１８）を３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターで培養し、融合１日前に培地を交換した。マウスをパルス免疫した３日後、マウスの脾臓細胞を採取して融合した。融合およびスクリーニング方法：マウスの脾臓を採取し、粉砕し、洗浄した後、脾臓細胞をカウントした。脾臓細胞とｓｐ２／０細胞を２：１の比率で混合し、１０００ｒｐｍで７分間遠心分離した。上澄みを洗い流した。１分以内に１ｍｌのＰＥＧ（１４５０）を加え、９０秒間穏やかに振盪し、２．５分以内に無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌを加え、無血清培地５ｍｌを一度に加えて反応を停止させ、５分間放置し、１２８０ｒｐｍで８分間遠心分離した。１つの９６ウェルプレート当たり２００万個のｓｐ２／０細胞の数に従って、細胞を９６ウェルプレートに２００μｌ／ウェルで均等に播種した。まず、ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、Ｈ）、アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ、Ａ）及びチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ、Ｔ）を含むＨＡＴ培地を用いてスクリーニングし、３～４日ごとに半分ずつ培地を交換し、１０日目にはＨＴ培地の使用に変更した。１０日後、ハイブリドーマ細胞が９６ウェルプレートの底の１０％を超えて覆った時、上清を採取し、Ｆｃ－ｈＭＡＳＰ－２Ａ－ＣＣＳ抗原でコーティングされた酵素プレートを使用してＥＬＩＳＡ検出を実行した。ＥＬＩＳＡ検出方法は実施例２に記載の方法と同じであった。陽性ハイブリドーマクローンを選択して２４ウェルプレートで増殖培養し、限界希釈法を用いてサブクローニングし、標的抗体を安定に発現するハイブリドーマ株を取得した後、種の保存とデータベースの構築を実行した。
実施例４ ＭＡＳＰ－２によって触媒されるＣ４の切断に対するハイブリドーマ上清の阻害
ＭＡＳＰ－２はＣ４に対する切断を触媒し、ＭＡＳＰ－２の存在下で、Ｃ４はＣ４ａとＣ４ｂの２つの部分に切断された。この触媒系では、抗Ｃ４ｂ特異的抗体を使用してＣ４ｂの濃度を検出することでＭＡＳＰ－２の活性を評価できる。
１日前にハイブリドーマ細胞の培地を２．５％の不活化ＦＢＳを含むＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏから購入）に交換し、ＤＭＥＭをＳＦＭに交換した後、培養上清を取って、１×ＴＢＳと１：１で混合してＣ４検出実験で使用した。具体的な操作：１）９６ウェルプレートをマンノース（１００μｌ／ウェル、１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）でコーティングし、４℃で一晩放置した後、ＴＢＳで洗浄し、ブロッキング溶液で３７℃で２時間ブロックした後、軽くたたいて乾燥させ、使用するまで－２０℃の冷凍庫に保管した；２）ヒト血清（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｓ１－１００ｍｌ）を結合緩衝液（ＴＢＳ、１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ７．４）で４％に希釈した後、上記のマンノースでコーティングした９６ウェルプレートに加え、４℃で一晩放置した後、洗浄緩衝液（ＴＢＳ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で３回洗浄した；３）ハイブリドーマ上清をＧＶＢ＋＋緩衝液（ＧＶＢ緩衝液、５ｍＭのＣａＣｌ２、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；１：３．５で希釈；５０μｌ／ウェル）に加え、室温で０．５時間放置し、ヒトＣ４成分（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；ＧＶＢ＋＋緩衝液；５０μｌ／ウェル、３μｇ／ｍｌ）を加えた後、３７℃で１．５時間反応させ、氷上に１０分間置いて酵素反応を停止させた；４）９６ウェルプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、抗Ｃ４ｂ抗体（Ａｓｓａｙ Ｐｒｏ；１：４０００）を加えて３７℃で１時間放置し、洗浄した後、ＰＢＳＴで１：５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入）を加え、室温で１時間培養し、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、軽くたたいて乾燥させた。各ウェルに１００μｌの発色液（使用前にＥＬＩＳＡ発色Ａ液とＥＬＩＳＡ発色Ｂ液を体積比１：１で均一に混合する）を加えて発色させた後、２ＭのＨ２ＳＯ４停止液１００μｌを各ウェルに加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して、波長４５０ｎｍにおける各ウェルのＯＤ値を直ちに測定し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析した。
実施例５ ヒトおよびカニクイザルＭＡＳＰ－２へのマウス由来抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体の結合
上記のスクリーニング方法に従って、好ましいマウス由来抗体を得た。プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーカラムでマウス抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体をアフィニティー精製した後、ＢＣＡ法を使用して抗体の定量を完了させた。Ｆｃ－ｈＭＡＳＰ－２Ａ－ＣＣＳまたはＦｃ－ｃｙｎｏ－ＭＡＳＰ－２－ＣＣＳに結合する抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体のＥＣ５０をＥＬＩＳＡにより検出した。検出方法は実施例２を参照できる。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌのＦｃ－ｈＭＡＳＰ－２Ａ－ＣＣＳまたはＦｃ－ｃｙｎｏ－ＭＡＳＰ－２－ＣＣＳでコーティングし、検出のために異なる濃度のマウス抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体を加えた。表１に一部の好ましい抗体のＥＣ５０データを示したが、これらの抗体はヒトＭＡＳＰ－２に対する親和性が高く、ＥＣ５０は１４０～１９０ｐＭの範囲であった。６０、１２０、１２４番などの一部の抗体は、同時にカニクイザルのＭＡＳＰ－２タンパク質も認識した。
実施例６ ＭＡＳＰ－２によって触媒されるＣ４の切断に対するマウス由来抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体の阻害
実施例５の方法に従って、精製されたマウス由来抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体を得た。実施例４の方法を参照してＭＡＳＰ－２によって触媒されるＣ４切断に対する上記抗体の阻害効果を分析し、ナルソプリマブを参照抗体とした。表２は、いくつかの好ましい抗体のＩＣ５０データを列挙し、実験結果は、好ましい抗体のすべてがＭＡＳＰ－２によって触媒されるＣ４切断の能力を有意に阻害し、ＩＣ５０は７５ｐＭ～２８０ｐＭの範囲にあることを示した。ほとんどの好ましい抗体の阻害活性は、参照抗体であるナルソプリマブの阻害活性よりも有意に高かった。
実施例７ マウス由来抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体の可変領域配列の決定
Ｔｒｉｚｏｌを使用して各ハイブリドーマ細胞株から全ＲＮＡを抽出し、逆転写キット（Ｔａｋａｒａから購入）を使用してｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。マウス由来抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域遺伝子を、文献で報道されたプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって取得し、次に、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ－Ｔベクターにクローニングし、可変領域遺伝子配列を配列決定して解析した。さまざまな機能実験と初期の創薬可能性分析の結果に基づいて、最終的に表２に示される７つの抗体をリード抗体として選択し、配列決定により、その軽鎖および重鎖の可変領域のヌクレオチド配列を得た。変換されたアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋで比較および分析したところ、すべての配列がマウスＩｇＧ可変領域遺伝子の特徴と一致していた。各候補抗体の可変領域配列情報は表３に示される通りである。抗体番号６０の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２に示される。抗体番号１００の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号３に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４に示される。抗体番号１１５の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に示される。抗体番号１２０の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に示される。抗体番号１２４の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０に示される。抗体番号１２６の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１１に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１２に示される。抗体番号１３６の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１３に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に示される。マウス由来抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔ法則に従って解析し、３つのＣＤＲと４つのＦＲを決定した。抗体番号１２６を例に挙げると、その重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列はＨＣＤＲ１：ＳＦＧＭＨ（配列番号４５）、ＨＣＤＲ２：ＹＩＳＳＧＳＳＳＳＦＹＶＤＴＶＫＧ（配列番号４６）及びＨＣＤＲ３：ＧＤＲＮＦＥＶ（配列番号４７）であり、軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列はＬＣＤＲ１：ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＲＹＳＹＭＨ（配列番号４８）、ＬＣＤＲ２：ＨＡＳＮＬＥＳ（配列番号４９）及びＬＣＤＲ３：ＱＱＳＷＥＶＰＷＴ（配列番号５０）である。各候補抗体のＣＤＲ配列情報は表４に示された通りである。
実施例８ 抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体のヒト化
配列解析の結果に基づいて、抗体番号１００、１２４、１２６及び１３６を選択して、キメラ抗体およびヒト化抗体を構築した。キメラ抗体は、マウス由来抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域をインターセプトし、ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲを使用してそれらをヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域とヒトκ鎖の定常領域にそれぞれ連結することによって構築した。
マウス抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔの法則に従って解析し、３つのＣＤＲと４つのＦＲを決定した。抗体番号１２６を例に挙げると、ＮＣＢＩ ＩｇＢｌａｓｔとヒトＩｇＧ生殖系列配列（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ）間の相同性比較により、ＩＧＨＶ３－３０×０３を重鎖ＣＤＲ移植テンプレートとして選択し、マウス由来の抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体１２６の重鎖ＣＤＲ領域をＩＧＨＶ３－３０×０３フレームワーク領域に移植して、重鎖ＣＤＲ移植抗体を構築した。同じように、ヒトＩｇＧ生殖系列配列との相同性を比較して、軽鎖ＣＤＲ移植テンプレートとしてＩＧＫＶ１－３９×０１を選択し、マウス由来抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体１２６の軽鎖ＣＤＲ領域をＩＧＫＶ１－３９×０１のフレームワーク領域に移植して、軽鎖ＣＤＲ移植抗体を構築した。上記の可変領域遺伝子配列はＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈにより、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのコドン使用優先度に従ってコドン最適化され、合成された。合成したヒト化可変領域配列をヒトＩｇＧ４定常領域に連結した。同時に、これに基づいて、フレームワーク領域の一部のアミノ酸位置に対して復帰突然変異を実行した。復帰突然変異を実行する場合、アミノ酸配列はＫａｂａｔコード化され、その部位の位置はＫａｂａｔコードによって示された。一連の復帰突然変異スクリーニング後、好ましくは、軽鎖可変領域配列について、Ｋａｂａｔコード化の位置３６のＹをマウス由来のＦに復元させた。重鎖可変領域には復帰突然変異はなかった。この抗体を抗体番号１２６のヒト化抗体（１２６－Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ、１２６－Ｈｕ）と定義した。
上記と同じ原理を使用して、残りの３つの抗体もヒト化し、ヒト化抗体の配列情報は表５に示された通りである。ｐＴＴ５ベクターを使用してそれぞれヒト化重鎖、軽鎖を一過性発現するベクターを構築し、上記の軽鎖と重鎖の組み合わせをＨＥＫ２９３システムを使用して一時的にトランスフェクトし、抗体を発現した。ＨＥＫ２９３細胞をＦｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏから購入）で培養し、ＰＥＩトランスフェクション法を用いて細胞にプラスミドを導入し、５日後に細胞上清を回収し、プロテインＡを用いて精製してヒト化抗体を得た。
最後に、抗体番号１００のヒト化後の重鎖可変領域遺伝子配列の全長は３４８ｂｐであり、１１６個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号５７に示され、アミノ酸配列は配列番号５に示され；ヒト化後の軽鎖可変領域遺伝子配列の全長は３３３ｂｐであり、１１１個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号５９に示され、アミノ酸配列は配列番号６０に示される。ヒトＩｇＧ４定常領域に連結された後、最終的に４４３個のアミノ酸の１００Ｈｕヒト化重鎖（配列は配列番号６１に示される）および２１８個のアミノ酸の１００Ｈｕヒト化軽鎖（配列は配列番号６２に示される）を得た。
抗体番号１２４のヒト化後の重鎖可変領域遺伝子配列の全長は３４２ｂｐであり、１１４個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号６３に示され、アミノ酸配列は配列番号６４に示され；ヒト化後の軽鎖可変領域遺伝子配列の全長は３２１ｂｐであり、１０７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号６５に示され、アミノ酸配列は配列番号６６に示される。ヒトＩｇＧ４定常領域に連結された後、最終的に４４１個のアミノ酸の１２４ーＨｕヒト化重鎖（配列は配列番号６７に示される）および２１４個のアミノ酸の１２４ーＨｕヒト化軽鎖（配列は配列番号６８に示される）を得た。
抗体番号１２６のヒト化後の重鎖可変領域遺伝子配列の全長は３４８ｂｐであり、１１６個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号６９に示され、アミノ酸配列は配列番号７０に示され；ヒト化後の軽鎖可変領域遺伝子配列の全長は３３３ｂｐであり、１１１個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号７１に示され、アミノ酸配列は配列番号７２に示される。ヒトＩｇＧ４定常領域に連結された後、最終的に４４３個のアミノ酸の１２６ーＨｕヒト化重鎖（配列は配列番号７３に示される）および２１８個のアミノ酸の１２６ーＨｕヒト化軽鎖（配列は配列番号７４に示される）を得た。
抗体番号１３６のヒト化後の重鎖可変領域遺伝子配列の全長は３５１ｂｐであり、１１７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号７５に示され、アミノ酸配列は配列番号７６に示され；ヒト化後の軽鎖可変領域遺伝子配列の全長は３３３ｂｐであり、１１１個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号７７に示され、アミノ酸配列は配列番号７８に示される。ヒトＩｇＧ４定常領域に連結された後、最終的に４４４個のアミノ酸の１３６ーＨｕヒト化重鎖（配列は配列番号７９に示される）および２１８個のアミノ酸の１３６ーＨｕヒト化軽鎖（配列は配列番号８０に示される）を得た。
実施例９ ヒト化抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体のインビトロ活性の評価
ヒト化抗体１００、１２４、１２６及び１３６を一過性発現・精製し、ＢＣＡ法で定量した後、実施例５に従って各抗体のヒトＭＡＳＰ－２－ＣＣＳに対する親和性を検出し、実験結果は図１および表６に示された通りである。実施例４を参照してＭＡＳＰ－２によって触媒されるＣ４切断に対する各抗体の阻害効果を研究し、実験結果は図２および表６に示された通りである。上記の実験結果は、候補ヒト化抗体の親和性およびインビトロ生物学的活性が基本的にマウス由来抗体の親和性およびインビトロ生物学的活性と一致していることを示している。１２６－Ｈｕ抗体の生物活性は参照抗体の生物活性よりも有意に優れており、インビトロでのＣ４切断阻害能力は参照抗体の３倍以上である。
実施例１０ ＭＡＳＰ－２に対するヒト化抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体の親和性
上記の４つの候補ヒト化抗体を発現・精製し、その親和性をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出し、参照抗体ナルソプリマブを対照として使用した。具体的な実験方法：プロテイン－Ａ ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、ＦＣ１（Ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ１）を参照チャネルとし、ＦＣ２（Ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ２）を試料チャネルとした。ヒト由来抗体または対照抗体をＦＣ２チャネルで捕捉した後、さまざまな濃度のＭＡＳＰ－２－ＣＣＳ－Ｆｌａｇを注射した。サイクル条件：分析物をＦＣｓのすべてのチャネルに３０μｌ／ｍｉｎで４分間注入し、解離時間は２０分であり、表面再生のためにグリシンｐＨ１．５（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を５０μｌ／ｍｉｎの速度で３０秒間注入し、次に、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ １．０を使用して、捕捉抗体のシグナルと捕捉抗体のないシグナルの差および相互作用の親和性を計算した。表７に示されるように、ＭＡＳＰ－２－ＣＣＳに対するヒト化後の候補抗体の親和性は、いずれも参照抗体ナルソプリマブの親和性よりも有意に高かった。このうち、１２４－Ｈｕの親和性は参照抗体の２５倍であり、１２６－Ｈｕの親和性は参照抗体の６０倍であった。１２４－Ｈｕは、カニクイザルＭＡＳＰ－２に０．２４５ｎＭの親和性で結合できた。
実施例１１ ヒト化抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体のＣ３ｂ産生に対する阻害
ＭＡＳＰ－２がＣ４の切断を触媒してＣ４ｂを生成した後、Ｃ４ｂはＣ２ａと結合してＣ３転換酵素を形成し、Ｃ３をＣ３ｂとＣ３ａに切断した。抗Ｃ３ｂ特異的抗体を使用して反応系内のＣ３ｂ濃度を検出することで、ＭＡＳＰ－２の活性が特徴付けられた。
抗ヒトＭＡＳＰ－２モノクローナル抗体を使用してＭＡＳＰ－２によって媒介されるＣ３ｂの産生を阻害する実験の操作：１）９６ウェルプレートをマンノース（１００μｌ／ウェル、１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）でコーティングし、４℃で一晩放置した後ＴＢＳで洗浄し、ブロッキング溶液で３７℃で２時間ブロックし、ＴＢＳで３回洗浄した後、ＧＶＢ＋＋緩衝液（１５０μｌ／ウェル、ＧＶＢ、５ｍＭのＣａＣｌ２、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２）で１回注いだ；２）Ｃ１ｑ欠失ヒト血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）をＧＶＢ＋＋緩衝液で４％に希釈し、３．５倍に勾配希釈した候補抗体と予め混合し、４℃で１時間放置した；３）氷上で４％の血清と抗体の混合溶液をマンノースでコーティングした９６ウェルプレートに加え（１００μｌ／ウェル）、３７℃で１．５時間培養し、氷上に１０分間放置して反応を停止させ、ＰＢＳＴで３回洗浄した；４）抗Ｃ３ｃ抗体（１：８０００；Ｄａｋｏ）を加え、３７℃で１時間培養した後、３回洗浄し、さらに抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（１：５０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、３７℃で１時間培養した後、３回洗浄した；５）各ウェルに発色液（ＥＬＩＳＡ発色Ａ液とＥＬＩＳＡ発色Ｂ液を体積比１：１で混合して使用）１００μｌを加えて発色させた後、２ＭのＨ２ＳＯ４停止液１００μｌを各ウェルに加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して、波長４５０ｎｍにおける各ウェルのＯＤ値を直ちに測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータ分析を実行し、結果は図３に示された通りであり、その中で、１２４－Ｈｕ、１２６－Ｈｕ、およびナルソプリマブのＩＣ５０は、それぞれ１．１４３ｎＭ、０．４９４ｎＭ、１．７３５ｎＭであった。１２６－Ｈｕ抗体の生物活性は参照抗体の生物活性よりも有意に優れており、インビトロでのＣ３ｂ産生の阻害は参照抗体の約３．５倍であった。
実施例１２ ９０％の血清における、ヒト化抗ヒトＭＡＳＰ－２抗体がＭＡＳＰ－２によって触媒されるＣ４切断を阻害する実験
インビボ環境をシミュレートするために、反応系内の血清濃度を９０％まで増加させた。抗体がＣ４切断を阻害の実験のステップ：１）９６ウェルプレートをマンノース（１００μｌ／ウェル、１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）でコーティングし、４℃で一晩放置した後ＴＢＳで洗浄し、ブロッキング溶液で３７℃で２時間ブロックし；ＴＢＳで３回洗浄した後、ＧＶＢ＋＋緩衝液（１５０μｌ／ウェル、ＧＶＢ、５ｍＭのＣａＣｌ２、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２）で１回注いだ；２）候補抗体をＧＶＢ＋＋緩衝液で３．５倍に勾配希釈した後、９０％ ｖ／ｖ ヒトまたはカニクイザル血清と１０％ ｖ／ｖ 抗体を４℃で１時間培養した；３）上記プレミックスをマンノースでコーティングした９６ウェルプレートに加え、３７℃で１．５時間培養し、氷上に１０分間放置して反応を停止させ、ＰＢＳＴで３回洗浄した；４）９６ウェルプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、抗Ｃ４ｂ抗体（Ａｓｓａｙ Ｐｒｏ；１：４０００）を加えて３７℃で１時間放置し、洗浄した後、ＰＢＳＴで１：５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入）を加え、室温で１時間培養し、ＰＢＳＴで３回洗浄し、軽くたたいて乾燥させた。各ウェルに１００μｌの発色液（使用前にＥＬＩＳＡ発色Ａ液とＥＬＩＳＡ発色Ｂ液を体積比１：１で均一に混合する）を加えて発色させた後、２ＭのＨ２ＳＯ４停止液１００μｌを各ウェルに加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して、波長４５０ｎｍにおける各ウェルのＯＤ値を直ちに測定した。実験データを分析した後の結果の詳細は図４および５に示された通りである。その中で、９０％のヒト血清の実験における、１２４－Ｈｕ、１２６－Ｈｕ及びナルソプリマブのＩＣ５０はそれぞれ３．７５０ｎＭ、３．４５７ｎＭ、８．２２９ｎＭであり、９０％のカニクイザル血清の実験における、１２４－Ｈｕ及びナルソプリマブのＩＣ５０はそれぞれ１６７．６００ｎＭと９４．０５０ｎＭであって。結果は、９０％の血清において、候補抗体もＣ４切断に対して強力な阻害効果を持っていることを示しており、９０％のヒト血清において、１２４－Ｈｕおよび１２６－ＨｕのＣ４阻害活性は、参照抗体の活性よりも有意に高く、人体内でより優れた生物学的活性を有する可能性があることを示した。
結論：親和性測定および様々なインビトロ機能活性分析において、本発明の抗体はすべて、対照抗体ナルソプリマブよりも一貫して強い生物学的活性を示した。
本願は何らかの形で説明されるが、本願は本明細書に示され説明されるものに限定されないことが理解されたい。本願の範囲から逸脱することなく、説明された実施形態および／または特定の特徴もしくはパラメータに対して様々な変更を加えることができることは、当業者には明らかである。これらの変更は、本願によって主張される保護の範囲内にある。

Claims (16)

  1. ヒトＭＡＳＰ－２に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
    重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域はＨＣＤＲ３配列を含み、
    任意選択でＨＣＤＲ１及び／又はＨＣＤＲ２配列を更に含み、
    前記ＨＣＤＲ３配列は、配列番号１７、２３、２９、３５、４１、４７および５３から選択されるアミノ酸配列を含み；並びに／或いは前記ＨＣＤＲ２配列は、配列番号１６、２２、２８、３４、４０、４６および５２から選択されるアミノ酸配列を含み；並びに／或いは前記ＨＣＤＲ１配列は、配列番号１５、２１、２７、３３、３９、４５および５１から選択されるアミノ酸を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。
  2. 軽鎖可変領域をさらに含み、前記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３配列を含み、
    前記ＬＣＤＲ３配列は、配列番号２０、２６、３２、３８、４４、５０および５６から選択されるアミノ酸配列を含み；並びに／或いは前記ＬＣＤＲ２配列は、配列番号１９、２５、３１、３７、４３、４９および５５から選択されるアミノ酸配列を含み；並びに／或いは前記ＬＣＤＲ１配列は、配列番号１８、２４、３０、３６、４２、４８および５４から選択されるアミノ酸配列を含み、
    好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｄフラグメントおよび単一ドメイン抗体から選択される、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  3. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントがマウス由来抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  4. 前記マウス由来抗体の重鎖可変領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３のアミノ酸配列を含み、
    前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  5. 好ましくは、前記抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化された後、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントが得られる、上記請求項のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  6. 前記ヒト化抗体の重鎖可変領域は、配列番号５８、６４、７０および７６のアミノ酸配列を含み、
    前記ヒト化抗体の軽鎖可変領域は、配列番号６０、６６、７２および７８のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  7. 下記の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列の組み合わせのいずれか１つを含む、請求項６に記載のヒトＭＡＳＰ－２に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント：
    配列番号５８に示される重鎖可変領域および配列番号６０に示される軽鎖可変領域；配列番号６４に示される重鎖可変領域および配列番号６６に示される軽鎖可変領域；配列番号７０に示される重鎖可変領域および配列番号７２に示される軽鎖可変領域；配列番号７６に示される重鎖可変領域および配列番号７８に示される軽鎖可変領域。
  8. 配列番号６１、６７、７３及び７９のいずれか１つに示される重鎖配列を含む、請求項７に記載のヒトＭＡＳＰ－２に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
  9. 配列番号６２、６８、７４及び８０のいずれか１つに示される軽鎖配列を含む、請求項７に記載のヒトＭＡＳＰ－２に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
  10. 前記ヒト化抗体が下記の重鎖配列および軽鎖配列の組み合わせのいずれか１つから選択される、請求項８又は９に記載のヒトＭＡＳＰ－２に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント：
    配列番号６１に示される重鎖配列および配列番号６２に示される軽鎖配列；配列番号６７に示される重鎖配列および配列番号６８に示される軽鎖配列；配列番号７３に示される重鎖配列および配列番号７４に示される軽鎖配列；配列番号７９に示される重鎖配列および配列番号８０に示される軽鎖配列。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載のヒトＭＡＳＰ－２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、ＤＮＡ分子。
  12. 請求項１１に記載のＤＮＡ分子を含む薬学的に許容される、発現ベクター。
  13. 請求項１１に記載のＤＮＡ分子または請求項１２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  14. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと、様々な医薬的に許容される賦形剤、希釈剤または担体とを含む、医薬組成物。
  15. ＭＡＳＰ－２関連疾患を予防または治療するための医薬の製造における、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、或いは請求項１４に記載の医薬組成物の使用であって、
    前記疾病がＩｇＡ腎症、ループス腎炎、非典型溶血性尿毒症症候群、造血幹細胞移植後の血栓性微小血管症から選択される、使用。
  16. ＭＡＳＰ－２関連疾患を予防または治療するための医薬の製造における、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、或いは請求項１４に記載の医薬組成物の使用であって、
    前記疾患がＩｇＡ腎症である、使用。
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