WO2022218061A1 - 抗人masp-2抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

抗人masp-2抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了能够结合人MASP-2的抗体以及其制备方法和应用。本发明的抗人MASP-2抗体能够与人MASP-2特异性结合，具有很好的抑制C4的切割和C3b生成的生物学活性，可应用于治疗MASP-2相关疾病，例如IgA肾病等。

Description

抗人MASP-2抗体及其制备方法和应用 技术领域
本发明涉及抗体领域，更具体地，本发明涉及特异性结合人MASP-2的高亲和力抗体，及所述抗体作为治疗剂，特别是用于MASP-2相关病症。其中所述病症例如非典型溶血尿毒综合症，造血干细胞移植相关的血栓性微血管病(HSCT-TMA)，IgA肾病。
发明背景
补体系统是人体内在免疫力的重要因素。其能够识别并消除入侵病原微生物并通过调理作用和裂解改变宿主细胞，其也能对其他急性损伤做出免疫应答。补体是复杂的级联系统，其中丝氨酸蛋白酶以严格的顺序互相活化。目前，人们普遍认为补体系统可以通过三种不同的途径激活：经典途径，凝集素途径和替代途径。
中国大约有1.2亿慢性肾病(CKD)患者，IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)是其中最常见的肾病。IgAN也是全球范围内发病率最高的原发性肾小球疾病之一，在亚洲人群中发病率尤高。IgA肾病的远期预后不佳，10-25年内30-40％的患者会进入终末期肾病(肾衰竭)。IgA肾病的病因尚不完全清楚，Yeo等提出的IgAN致病模型中(Yeo et al.,Pediatr Nephrol 33:763–777,(2018))指出粘膜免疫系统失调引起粘膜B细胞过度增殖，误入到循环系统的粘膜B细胞使得分泌IgA进入血液循环，进而导致血清IgA水平升高。肾小球内这些IgA免疫复合物的积聚导致系膜细胞活化，释放促炎、促纤维化调节物和激活补体。
越来越多的证据表明IgAN肾小球损伤与补体系统的激活有关，这使得抑制补体激活成为治疗IgAN的一种有希望的方法。研究表明凝集素途径的改变有助于IgAN疾病的发生和进展。甘露糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2(MASP-2)是补体凝集素途径的激活所必需的一种效应酶，能够切割补体成分C4以形成C3转化酶C4b2b来激活补体，是一个潜在的药物靶点。目前Omeros公司针对MASP-2靶点开发的抗体Narsoplimab已经进入临床II、III期。该抗体的适应症为非典型溶血尿毒综合症、造血干细胞移植相关的血栓性微血管病(HSCT-TMA)、IgA肾病、狼疮性肾炎及其他肾脏疾病。相关的专利有 US9096676,US9475885,US20130344073。
本发明提供针对IgA肾病、狼疮性肾炎等疾病的新靶点开发的新抗体药物。本发明的新分子具有高亲和力、高药效、优异成药性的特性。
发明内容
本发明的发明人进行了大量试验，得到了一组高亲和力和特异性结合人MASP-2的单克隆抗体。其能够抑制凝集素途径的C4切割酶促反应，具有抑制补体激活的生物学活性。
第一方面，本申请提供了一种特异性结合人MASP-2的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区包含HCDR3序列，任选地还包含HCDR1和/或HCDR2序列。在一些实施方案中，其中所述HCDR3序列包含选自SEQ ID NOs:17，23，29，35，41，47和53的氨基酸序列；和/或所述HCDR2序列包含选自SEQ ID NOs:16，22，28，34，40，46和52的氨基酸序列；和/或所述HCDR1序列包含选自SEQ ID NOs:15，21，27，33，39，45和51的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性结合人MASP-2的抗体或其抗原结合片段还包含轻链可变区，其中所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和/或LCDR3序列。在一些实施方案中，所述LCDR1序列包含选自SEQ ID NOs:18，24，30，36，42，48和54的氨基酸序列。和/或所述LCDR2序列包含选自SEQ ID NOs:19，25，31，37，43，49和55的氨基酸序列。和/或所述LCDR3序列包含选自SEQ ID NOs:20，26，32，38，44，50和56的氨基酸序列。
在一些实施方案中，上述抗体为单克隆抗体；上述抗原结合片段选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段和单域抗体。
本发明提供的人MASP-2的抗体或其抗原结合片段，其包含至少1个CDR区，所述CDR区选自以下序列或者其突变序列或与其具有90％序列同一性的氨基酸序列：抗体重链可变区HCDR区：SEQ ID NOs:15，16，17，21，22，23，27，28，29，33，34，35，39，40，41，45，46，47，51，52和53；抗体轻链可变区LCDR区：SEQ ID NOs:18，19，20，24，25，26，30，31，32，36，37，38，42，43，44，48，49，50，54，55和56。
在本发明的一个优选实施方案中，上述抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其片段。所述的鼠源抗体轻链可变区包含与选自SEQ ID NOs:2，4，6，8，10， 12和14的氨基酸序列或与其具有至少95％同源性的氨基酸序列；重链可变区包含与选自SEQ ID NOs:1，3，5，7，9，11和13的氨基酸序列或与其具有至少95％同源性的氨基酸序列。
在本发明的一个优选实施方案中，提供如上所述的鼠源抗体或其片段，其进一步包含源自鼠源的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、或其变体的重链恒定区；其进一步包含源自鼠源的κ或λ链、或其变体的轻链恒定区。
在本发明的一个优选实施方案中，提供一种上述特异性结合人MASP-2的抗体或其抗原结合片段，其为嵌合抗体或人源化抗体或其片段。
在一些实施方案中，其中如上所述的MASP-2人源化抗体或其片段，其中所述的人源化抗体包含选自以下任一的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合：100-Hu的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：58所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：60所示；124-Hu的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：64所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：66所示；126-Hu的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：70所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：72所示；136-Hu的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：76所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：78所示。
在本发明的一个优选实施方案中，提供一种如上所述的MASP-2人源化抗体或其片段，其重链恒定区包含人源的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、或其变体，其进一步包含人源的κ或λ链、或其变体的轻链恒定区。更优选地包含人源的IgG4、或其变体的重链恒定区。恒定区也可以做一些如“YTE”之类改变性能的修饰。
在更优选的实施方案中，其中所述的人源化抗体包含选自以下任一的重链全长序列和轻链全长序列的组合：124-Hu的重链全长氨基酸序列如SEQ ID NO：67所示，轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO：68所示；126-Hu的重链全长氨基酸序列如SEQ ID NO：73所示，轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO：74所示。
第二方面，本发明提供了一种编码上述MASP-2抗体或其抗原结合片段的核苷酸分子。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有如上所述的核苷酸分子。
在一些实施方案中，所述表达载体为pTT5、pUC57、pDR1、pcDNA3.1(+)、 pDHFF或pCHO 1.0等。
第四方面，本发明提供了一种用上述表达载体转化的宿主细胞。在所述宿主细胞为HEK293、COS、CHO、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1等，优选为CHO细胞。
第五方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的特异性结合人MASP-2的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在使得第四方面所述的宿主细胞能够产生所述抗体或其抗原结合片段的表达条件下，培养所述的宿主细胞，从而表达所述抗体或其抗原结合片段；以及
b)分离并纯化a)表达的所述抗体或其抗原结合片段。
第六方面，本发明提供了一种药物组合物，所述组合物包含第一方面所述的抗人MASP-2抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些实施方案中，所述组合物用于治疗MASP-2相关的疾病。
第七方面，本发明提供了第一方面所述的抗人MASP-2抗体或其抗原结合片段、或第六方面所述的组合物用于预防或治疗MASP-2相关疾病。
在其他方面，本发明提供了预防或治疗MASP-2相关疾病的方法，包括给予有需要的个体第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第六方面所述的药物组合物。所述MASP-2相关疾病包括：非典型溶血尿毒综合症，造血干细胞移植相关的血栓性微血管病(HSCT-TMA)，狼疮性肾炎，IgA肾病等；其中所述的疾病优选为IgA肾病。
附图说明
图1为人源化的抗人MASP-2单克隆抗体与人MASP-2结合的ELISA检测结果。
图2为人源化的抗人MASP-2单克隆抗体抑制4％人血清中MASP-2催化的C4切割作用的实验结果。
图3为人源化的抗人MASP-2单克隆抗体抑制MASP-2介导的C3b生成的实验结果
图4为人源化的抗人MASP-2抗体在90％人血清中抑制MASP-2催化的C4切割作用的实验结果。
图5为人源化的抗人MASP-2抗体在90％食蟹猴血清中抑制MASP-2催化的C4切割作用的实验结果。
具体实施方式
本发明提供了特异性结合于人MASP-2的新的抗人MASP-2抗体或其抗原结合片段。在优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段以高亲和力结合于人MASP-2且抑制MASP-2的酶活性。本申请还提供了编码该抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法以及所述抗体或其抗原结合片段的医学和生物学应用，例如预防或治疗MASP-2相关疾病。本发明还涵盖使用所述抗体或其抗原结合片段来检测MASP-2及调节MASP-2活性的方法。
为容易地理解本申请，首先定义本文中使用的某些术语。
本文所用术语“抗体”指包含四条多肽链，即通过双硫键互连的两条重链(H)链及两条轻链(L)的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如IgM)。各重链包含重链可变区(缩写为VH)及重链恒定区(缩写为CH)。重链恒定区包含三个域，即CH1、CH2及CH3。各轻链包含轻链可变区(缩写为VL)及轻链恒定区(缩写为CL)。轻链恒定区包含一个域(CL1)。VH及VL区可进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其中穿插有称为构架区(FR)的保守区。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区段。抗原结合域可以包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)或上述两者。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术从完整抗体分子制备，所述标准技术包括蛋白水解消化或重组遗传工程化技术等。抗原结合片段的非限制性实例包括：Fab片段；F(ab')2片段；Fd片段；Fv片段；单链Fv(scFv)分子；单域抗体；dAb片段及由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如分离的CDR)。术语“抗原结合片段”也包括其它工程化的分子，如双抗体、三抗体、四抗体及微型抗体等。
如本文所用，术语“重链可变区(VH)”及“轻链可变区(VL)”分别指单一抗体可变重链及轻链区，其包含FR1、2、3及4及CDR 1、2及3。
本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即Kabat定义和Chothia定义(参见Kabat et al.,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，National Institutes of Health,Bethesda，Md.(1991)；A1-Lazikani et al.，JMB.273:927-948(1997)；Martin  et al.，PNAS.USA86:9268-9272(1989))。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。在本文中，重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为HCDR1、HCDR2及HCDR3；轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为LCDR1、LCDR2及LCDR3。
对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。
如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合，例如抗体以比其对非特异性抗原的亲和性大至少两倍的亲和性结合于特异性抗原的能力。然而应了解，抗体能够特异性结合于两种或更多其序列相关的抗原。例如，本发明的抗体可特异性结合于人类与非人类(例如小鼠或非人类灵长动物)的MASP-2。
本文所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(参见，美国专利号4,816,567；和Morrison et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
如本文所用，术语“同源性”被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。本文所述的“至少90％同源性”是指同源性为90％至100％中的任一值，例如91％、93％、95％、99％等。
如本文所用，术语“MASP-2相关疾病”包括与MASP-2酶活性相关的疾病和/或症状。示例性MASP-2相关疾病或病症包括非典型溶血尿毒综合症，造血干细胞移植相关的血栓性微血管病(HSCT-TMA)，狼疮性肾炎，IgA肾病等。
如本文所用，术语“半衰期”和“血清半衰期”是指根据本公开的抗原结合蛋白的血清浓度在体内减少50％而花费的时间。
一方面，本申请提供了特异性结合人MASP-2的抗体或其抗原结合片段，其 包含重链可变区和/或轻链可变区。下表3-5中示例性列出了适用于本申请公开的抗体的CDR、VH、VL、重链和轻链氨基酸序列。在某些实施方案中，抗人MASP-2抗体或其抗原结合片段包含HCDR3、HCDR2和/或HCDR1序列，其独立地选自表4中所示的HCDR3、HCDR2或HCDR1序列中任一者。在某些实施方案中，本申请的抗人MASP-2抗体可进一步包含轻链CDR，其独立地选自表4中所示的轻链LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中任一者。举例而言，本申请的抗人MASP-2抗体可包含表3中所示的重链可变区和轻链可变区中的任一组合。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段的HCDR3选自SEQ ID NOs:17，23，29，35，41，47和53所示的氨基酸序列；HCDR2选自SEQ ID NOs:16，22，28，34，40，46和52所示的氨基酸序列；和/或所述HCDR1选自SEQ ID NOs:15，21，27，33，39，45和51所示的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，HCDR3选自SEQ ID NOs:23，41，47和53所示的氨基酸序列；HCDR2选自SEQ ID NOs:22，40，46和52所示的氨基酸序列；HCDR1选自SEQ ID NOs:21，39，45和51所示的氨基酸序列。在更优选的实施方案中，HCDR3选自SEQ ID NOs:41和47所示的氨基酸序列；HCDR2选自SEQ ID NOs:40和46所示的氨基酸序列；HCDR1选自SEQ ID NOs:39和45所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体重链可变区包含选自SEQ ID NOs:1，3，5，7，9，11，13，58，64，70和76的氨基酸序列。在优选的实施方案中，所述重链可变区由选自SEQ ID NOs:58，64，70和76的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本文公开的抗体重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NOs:1，3，5，7，9，11，13，58，64，70和76所示序列具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同源性。在优选的实施方案中，所述重链可变区与SEQ ID NOs:64和70所示的氨基酸序列具有99％以上的同源性。
本文公开的抗体或其抗原结合片段在包含重链可变区的基础上还可以进一步包含轻链可变区。
在一些实施方案中，所述轻链可变区的LCDR3选自SEQ ID NOs:20，26，32，38，44，50和56所示的氨基酸序列；LCDR2选自SEQ ID NOs:19，25，31，37，43，49和55所示的氨基酸序列；和/或所述LCDR1选自SEQ ID NOs:18，24，30，36，42，48和54所示的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，LCDR3选自SEQ ID NOs:26，44，50和56所示的氨基酸序列；LCDR2选自SEQ ID NOs:25，43，49和55所示的氨基酸序列；LCDR1选自SEQ ID NOs:24，42，48和54所示的氨基酸序列。在更优选的实施方案中，LCDR3选自SEQ ID NOs:44和50所示的氨基酸序列；LCDR2选自SEQ ID NOs:43和49所示的氨基酸序列；LCDR1选自SEQ ID NOs:42和48所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NOs:2，4，6，8，10，12，14，60，66，72和78所示序列具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同源性。在优选的实施方案中，所述重链可变区与SEQ ID NOs:66和72所示的氨基酸序列具有99％以上的同源性。
在一些实施方案中，本文公开的抗体的重链或重链可变区、轻链或轻链可变区可以在上述所列举的各自对应的具体氨基酸序列的基础上取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且得到的变体仍保持结合人MASP-2的活性。
在某些实施方案中，上述氨基酸取代、缺失或添加的数目为1-30个，优选为1-20个，更优选为1-10个。在优选的实施方案中，序列变体与原氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在更优选的实施方案中，序列变体与原氨基酸序列相差约1、2、3、4或5个氨基酸的取代、缺失或添加。在具体的实施方案中，所述氨基酸取代为保守性取代。
在优选的实施方案中，本文公开的抗体为抗体100-Hu、124-Hu、126-Hu或136-Hu。100-Hu的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：58所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：60所示，其中CDR序列与抗体100相同；124-Hu的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：64所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：66所示，其中CDR序列与抗体124相同；126-Hu的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：70所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：72所示，其中CDR序列与抗体126相同；136-Hu的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：76所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：78所示，其中CDR序列与抗体136相同。
在一些的实施方案中，本文公开的抗体为单克隆抗体。在具体的优选实施方案中，本文公开的抗体为人源化的抗体。
本文公开的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合人MASP-2。在具体的实 施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人MASP-2或猴MASP-2。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段以小于1nM的KD结合于人MASP-2。在优选实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段以小于0.35nM的KD结合于MASP-2，例如人MASP-2。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段能够抑制MASP-2催化的C4切割作用。在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段能够抑制C3切割作用。
本申请的发明人对本文公开的抗人MASP-2单克隆抗体进行了一系列生物学验证实验，结果表明此抗体能够很好地与人MASP-2进行结合并具备相应的生物活性。
具体地，本申请的发明人对抗人MASP-2单克隆抗体进行了亲和力检测、MASP-2催化的C4切割作用、体外抑制C3切割作用等实验。实验结果表明，本文公开的抗人MASP-2单克隆抗体可以结合人的MASP-2，抑制凝集素途径的补体激活信号传导，有助于抑制补体过度激活引起的炎症反应发生。
本申请还提供了编码本文公开的抗体或其抗原结合片段的核苷酸分子、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、以及制备和纯化该抗体的方法。
在一些实施方案中，编码所述抗体或其抗原结合片段的核苷酸分子可操作地连接到调控序列，调控序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。
在一些实施方案中，任何合适的表达载体都可以用于本申请。例如，所述表达载体可以为pTT5、pUC57、pDR1、pcDNA3.1(+)、pDHFF及pCHO 1.0中的一种。表达载体中可以包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。
在一些实施方案中，可用的宿主细胞为含有上述表达载体的细胞，可以是真核细胞，如哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统均可用于本申请的抗体或其抗原结合片段的表达。例如，HEK293细胞、COS、CHO、NS0、sf9及sf21等均可适用于本发明。所述宿主细胞也可以为含有上述表达载体的原核细胞，例如可以为DH5α、BL21(DE3)或TG1等。
在一些实施方案中，本文公开的抗人MASP-2单克隆抗体的制备方法包括：在表达条件下，培养宿主细胞，从而表达抗人MASP-2单克隆抗体；分离和纯化表达抗人MASP-2单克隆抗体。利用上述方法，可以将重组蛋白纯化为基本均一 的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。
在一些实施方案中，可以利用亲和层析的方法对本文公开的抗人MASP-2抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的抗人MASP-2抗体。
在一些实施方案中，本文公开的人源化的抗人MASP-2单克隆抗体是通过以下方法得到的：利用实验室制备的MASP-2抗原免疫Balb/c小鼠，在多次免疫小鼠滴度较高后取小鼠脾细胞与杂交瘤细胞融合并筛选出具有抑制C4切割功能活性的杂交瘤细胞株。更具体地，本申请的发明人通过大量实验，首先分别表达了MASP-2抗原，在此基础上利用不同的佐剂与MASP-2抗原混合免疫小鼠，然后进一步将上述小鼠的脾细胞与杂交瘤细胞株sp2/0融合，融合后的杂交瘤利用MASP-2抗原筛选出阳性细胞株，在验证其对C4切割功能的抑制后获得目标细胞株。对优选的目标分子进行人源化改造后，将轻链和重链基因同时克隆到真核表达载体pCHO1.0中。将上述表达载体通过脂质体法转染CHO细胞，然后用嘌呤霉素和甲胺蝶呤筛选阳性细胞克隆，将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱分离或纯化人源化的抗人MASP-2单克隆抗体。
在另外一些实施方案中，可以使用本领域的常规技术，例如PCR诱变进一步改变鼠源的亲本抗体来产生抗体的嵌合或人源化形式或其他变异形式。本申请的亲本抗体可以在例如抗原互补决定区(CDR)结构域内被诱变来产生变异抗体，可筛选其目的性质的存在，例如结合亲和力(更低的KD)、IC50、特异性、优先结合等等。优选地，变异抗体中目的性质是相对于亲本抗体中性质的改善。优选氨基酸替代变异抗体，并且亲本抗体分子的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基被去除且在它的位置上插入不同的残基。用于替代诱变的最感兴趣的位点是一个或更多个CDR区，但是也考虑框架区(FR)改变。优选保守的氨基酸替代，也可引入非保守氨基酸改变并用获得的变异抗体筛选目的性质。
在一些实施方案中，通过在抗体的Fc区域进行改造以增加抗体的血清半衰期。已确定的可以提高人FcRn与抗体结合能力的突变位点主要有T250Q、M252Y、S254T、T256E、V308P、M428L、N434A、N434S，在本实施方案中通过这些位置氨基酸的突变可以实现抗体血清半衰期的延长。
本申请提供了药物组合物，其包含本文公开的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。本文公开的上述抗人MASP-2单克隆抗体，可以和药学上可 接受的载体一起配制成药物制剂，从而更稳定地发挥疗效。在一些实施方案中，这些制剂可以保证本文公开的抗人MASP-2单克隆抗体的氨基酸核心序列的构象完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱酰胺或氧化)。在一些实施方案中，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年。在一些实施方案中，对于冻干制剂，在30℃下至少六个月保持稳定。
在一些实施方案中，所述抗人MASP-2单克隆抗体制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本文公开的抗人MASP-2单克隆抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括但不限于：表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液或其组合。在一些实施方案中，表面活性剂包括但不限于：非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)，泊洛沙姆(如泊洛沙姆188)，Triton，十二烷基硫酸钠(SDS)，月桂硫酸钠，十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸，Pluronics，MONAQUATTM等，其加入量应使抗人MASP-2单克隆抗体的颗粒化趋势最小。在一些实施方案中，溶液稳定剂包括但不限于以下列举的一种或其组合：糖类，例如还原性糖和非还原性糖；氨基酸类，例如谷氨酸单钠或组氨酸；醇类，例如三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇等。溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态。等渗调节剂包括但不限于氯化钠、甘露醇或其组合。缓冲液包括但不限于：Tris、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或其组合。
本申请还提供了预防或治疗MASP-2相关疾病的方法，其包括给予个体抗人MASP-2抗体、或者包含抗人MASP-2单克隆抗体的组合物。
本申请还提供了抗人MASP-2抗体、或者包含抗人MASP-2抗体的组合物在制备用于预防或治疗MASP-2相关疾病或症状的药物中的用途。在一些实施方案中，所述MASP-2相关疾病或症状为补体激活介导的疾病。
在一些实施方案中，上述MASP-2相关疾病包括但不限于：非典型溶血尿毒综合症，造血干细胞移植相关的血栓性微血管病(HSCT-TMA)，狼疮性肾炎，IgA肾病等。
本文公开的抗人MASP-2单克隆抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重、疾病特性和严重性以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和综合情况，总给药量不能超过一定范围。
抗体或其组合物的施用剂量和频率可根据对疾病进行预防或治疗而变化。在预防性应用中，向尚未处于疾病状态的患者施用含有本申请的抗体或其混合物的组合物以增强患者抵抗力，此量定义为“预防性有效剂量”。在此用途中，具体的剂量又视患者健康状况及全身免疫性而定。通常以相对不频繁的间隔施用相对较低剂量较长时间。在治疗性应用中，有时需要以相对较短间隔施用相对较高剂量直至疾病进展减缓或终止为止，且优选直至患者显示疾病症状部分或完全改善为止。此后，可向患者施用预防性方案。本领域普通技术人员可以容易地根据实际需要掌握具体的剂量和频率。
本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。
应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
上述公开内容总体上描述了本发明。以下具体的实施例是对本发明作进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统常规方法的详细描述，这样的方法对于本领域具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如分子克隆手册、冷泉港的抗体技术实验手册。未注明试剂来源的为常规试剂。
实施例
实施例1 可溶性人MASP-2-CCS蛋白、食蟹猴MASP-2-CCS蛋白、参比抗体Narsoplimab的制备
人MASP-2-CCS抗原序列来自于UniProt(O00187)，按照Homo sapiens的密码子使用偏好进行密码子优化并进行N端第1-686位氨基酸的基因合成，将序列亚克隆到pUC57载体中，得到了pUC57-hMASP-2。通过PCR法将monohFc片段(Gly119-Gly329 of IGHG1,P01857,S247N/Y290N/K292T)和Flag标签(DYKDDDDK)分别插入到hMASP-2-CCS片段(Tyr293-Phe686,O00187)和hMASP-2A-CCS片段(Tyr293-Phe686,S633A，O00187)的N端，并构建至pTT5表达载体(实验室保存)上，获得Fc-hMASP-2-CCS、Flag-hMASP-2-CCS、Fc-hMASP-2A-CCS和Flag-hMASP-2A-CCS的表达载体，上述载体构建完成后进行测序，选取序列完全 正确的克隆进行质粒大量抽提用于细胞转染。
食蟹猴MASP-2序列来自于UniProt(F6SW75)，N端第293-686位氨基酸按照Homo sapiens的密码子使用偏好进行密码子优化和基因合成，在优化序列前添加monohFc标签后，克隆到pTT5载体中，得到Fc-cyno-MASP-2-CCS的表达载体，质粒大量抽提后用于细胞瞬时转染。
通过PEI法将质粒转染至HEK293E细胞系。利用含3mM的丙戊酸的Freestyle293培养基(购自Gibco公司)培养5天后，利用Protein A亲和层析柱(购自GE公司)或Flag亲和层析(购自Sigma公司)从细胞培养上清中纯化目的蛋白。蛋白的定量通过二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)方法进行，纯化得到的蛋白用于以下的小鼠免疫及进一步分析与研究。
Narsoplimab(IgG4，λ)的氨基酸序列来自IMGT数据库，按照Homo sapiens密码子优化后全基因合成核苷酸序列，克隆到pTT5表达载体，获得了pTT5(Narsoplimab-HC),pTT5(Narsoplimab-LC)。将这两个载体同时瞬时转染至HEK293E细胞系，利用含3mM的丙戊酸的Freestyle293培养基培养5天后，利用Protein A亲和层析柱(购自GE公司)从细胞培养上清中纯化Narsoplimab抗体蛋白。
实施例2 抗人MASP-2单克隆抗体的产生
抗人MASP-2单克隆抗体通过免疫小鼠获得。将100μg/鼠的Fc-hMASP-2-CCS、Fc-hMASP-2A-CCS两种抗原分别用生理盐水稀释成75μl后，与等体积的弗氏完全佐剂混合，并经超声乳化完全后对4-5周龄的Balb/c小鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0018)进行皮下多点注射。三周后，将50μg/鼠的蛋白同样稀释成75μl后与等体积弗氏不完全佐剂混合，超声乳化完全后对小鼠进行皮下多点注射，两周后再次重复此免疫。所有小鼠在第三次免疫后一周剪尾取血分离血清，利用包被Fc-hMASP-2-CCS、Fc-hMASP-2A-CCS抗原的ELISA进行血清滴度的检测。对于血清抗体效价>10000的小鼠，在取血后一周进行冲击免疫：尾静脉注射10μg抗原/100μl生理盐水/鼠。
滴度的检测通过ELISA方法进行：利用Fc-hMASP-2A-CCS或者Fc-hMASP-2-CCS抗原包被ELISA板，包被浓度为1μg/ml，每孔100μl，4℃包 被过夜。PBST(含0.5％Tween-20的PBS)洗板2次后拍干。每孔加入含1％BSA的包被液封闭200μl，常温下封闭4小时后拍干，至-20℃冰箱中保存待用。检测时在ELISA板中每孔加入不同浓度的小鼠血清100μl，设2个复孔，室温孵育1.5小时。PBST洗涤3次后拍干。加入用PBST1:10000倍稀释的HRP标记的兔抗鼠Ig抗体(购自Sigma公司)100μl，室温孵育1小时。PBST洗涤3次后拍干。每孔加100μl显色液(临用前将ELISA显色A液与显色B液按照1:1的体积比混匀)显色，随后每孔加入100μl 2M H 2SO 4终止液终止反应。立即用酶标仪(Molecular Device)在450nm波长处测量各孔OD值。
实施例3 杂交瘤融合和筛选
杂交瘤sp2/0细胞(来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，保藏号为TCM-18)在37℃、5％CO 2培养箱中培养，融合前一天换液。小鼠冲击免疫三天后取小鼠脾细胞进行融合。融合与筛选方法如下：取小鼠脾脏，研磨洗涤后进行脾细胞计数。将脾细胞和sp2/0细胞以2:1的比例混合，1000rpm离心7分钟。洗去上清液。1分钟内加入1ml PEG(1450)，轻摇90秒，在2.5分钟内加入无血清DMEM培养液5ml，再一次性加5ml无血清培养液终止反应，静置5分钟，1280rpm离心8分钟。按照一块96孔板两百万个sp2/0细胞的数量，将细胞均匀接种入96孔板，每孔200μl。先用含次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、甲胺蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)的HAT培养基筛选，每3-4天半量换液，第10天改用HT培养基。10天后，待杂交瘤细胞铺满96孔板底部大于10％时，取上清用Fc-hMASP-2A-CCS抗原包被的酶标板进行ELISA检测。ELISA检测方法如实施例2中所述方法相同。挑选出阳性杂交瘤克隆于24孔板中扩大培养，有限稀释法进行亚克隆，获得稳定表达目的抗体的杂交瘤株后进行保种建库。
实施例4 杂交瘤上清对MASP-2催化的C4切割的抑制
MASP-2催化对C4的切割，在MASP-2存在时，C4被切割成C4a和C4b两个部分。在此催化体系中，利用抗C4b特异性抗体检测C4b的浓度将能评价MASP-2的活性。
杂交瘤细胞培养基提前一天用含2.5％灭活FBS的SFM培养基(购自Gibco 公司)换液，将DMEM换成SFM，然后取培养上清，跟1×TBS 1:1混合后用于C4检测实验，具体操作如下：1)甘露糖(100μl/孔,10μg/ml；Sigma)包被96孔板，4℃过夜后TBS洗涤，封闭液37℃封闭2小时后拍干，至-20℃冰箱中保存待用；2)人的血清(MILLIPORE,S1-100ml)用结合缓冲液(TBS,1M NaCl,10mM CaCl 2,0.05％Triton X-100,pH 7.4)稀释至4％后加入到上述甘露糖包被的96孔板中，4℃过夜后洗涤缓冲液(TBS,5mM CaCl 2；0.05％Tween 20,pH7.4)洗涤3次；3)杂交瘤上清加到GVB++缓冲液(GVB buffer,5mM CaCl 2,2.5mM MgCl 2；1:3.5稀释；50μl/孔)中室温放置0.5小时，加入人的C4组分(Calbiochem；GVB++buffer；50μl/孔,3μg/ml)后37℃反应1.5小时，冰上放置10分钟终止酶反应；4)PBST洗涤3次96孔板后，加入anti-C4b抗体(Assay Pro；1:4000)37℃放置1小时，洗涤后加入用PBST 1:5000倍稀释的HRP标记抗体(购自BD Pharmingen)，室温孵育1小时,PBST洗涤3次后拍干。每孔加100μl显色液(临用前将ELISA显色A液与显色B液按照1:1的体积比混匀)显色，随后每孔加入100μl 2M H 2SO 4终止液终止反应。立即用酶标仪(Molecular Device)在450nm波长处测量各孔OD值，使用Graphpad Prism软件进行数据分析。
实施例5 鼠源抗人MASP-2单克隆抗体对人和食蟹猴MASP-2的结合
按照上述筛选方法获得优选的鼠源抗体。通过Protein G亲和层析柱亲和纯化鼠源抗人MASP-2单克隆抗体后，BCA法完成抗体定量。抗人MASP-2单克隆抗体与Fc-hMASP-2A-CCS或者Fc-cyno-MASP-2-CCS结合的EC50利用ELISA进行检测。检测方法可参考实施例2。将96孔ELISA板用1μg/ml的Fc-hMASP-2A-CCS或者Fc-cyno-MASP-2-CCS包被，加入不同浓度的鼠源抗人MASP-2单克隆抗体进行检测。表1所列为部分优选抗体的EC50数据，这些抗体对人MASP-2的亲和力较高，EC50在140-190pM之间。部分抗体也同时识别食蟹猴的MASP-2蛋白，例如60，120，124号。
表1：示例性鼠源的抗人MASP-2单克隆抗体对人和食蟹猴MASP-2-CCS的结合
Figure PCTCN2022079499-appb-000001
实施例6 鼠源抗人MASP-2单克隆抗体对MASP-2催化的C4切割的抑制
按照实施例5方法获得纯化的鼠源抗人MASP-2单克隆抗体。参考实施例4方法分析上述抗体对MASP-2催化的C4切割的抑制作用，Narsoplimab为参比抗体。表2所列为部分优选抗体的IC50数据，实验结果表明优选抗体均显著抑制MASP-2催化的C4切割的能力，IC50在75pM到280pM之间。绝大部分优选抗体的抑制活性明显高于参比抗体Narsoplimab。
表2：示例性鼠源的抗人MASP-2单克隆抗体对MASP-2催化的C4切割的抑制
鼠源抗体编号 IC50(pM)
60 160.670
100 238.436
115 82.573
120 275.255
124 149.804
126 77.400
136 75.683
Narsoplimab 286.676
实施例7 鼠源的抗人MASP-2单克隆抗体可变区序列的测定
使用Trizol提取各杂交瘤细胞株的总RNA，用逆转录试剂盒(购自Takara公司)将mRNA逆转录成cDNA。以文献报道的引物通过PCR扩增获得鼠源的抗人MASP-2单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区基因，然后将PCR产物克隆入 pGEM-T载体，测序并分析可变区基因序列。根据多种功能实验和早期成药性分析结果，我们最终挑取了表2所列7个抗体作为先导抗体，测序获取了其轻重链可变区核苷酸序列。在GenBank中对转化而来的氨基酸序列进行比对分析，所有序列均符合小鼠IgG可变区基因的特征。各候选抗体的可变区序列信息见表3。60号抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。100号抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。115号抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。120号抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。124号抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。126号抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。136号抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。根据Kabat法则对鼠源的抗人MASP-2单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列进行分析并确定了3个CDR和4个FR。以126号抗体为例，其重链互补决定区的氨基酸序列为HCDR1：SFGMH(SEQ ID NO：45)，HCDR2：YISSGSSSSFYVDTVKG(SEQ ID NO：46)和HCDR3：GDRNFEV(SEQ ID NO：47)，轻链互补决定区的氨基酸序列为LCDR1：RASQSVSSSRYSYMH(SEQ ID NO：48)，LCDR2：HASNLES(SEQ ID NO：49)和LCDR3：QQSWEVPWT(SEQ ID NO：50)。各候选抗体的CDR序列信息见表4。
表3：示例性鼠源抗人MASP-2抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列
Figure PCTCN2022079499-appb-000002
表4：示例性鼠源抗人MASP-2抗体的重链和轻链CDR氨基酸序列
Figure PCTCN2022079499-appb-000003
实施例8 抗人MASP-2单克隆抗体的人源化
根据序列分析结果，挑取100、124、126和136号抗体进行了嵌合抗体和人源化抗体的构建。嵌合抗体的构建通过截取鼠源抗体的重链可变区和轻链可变区，利用overlapping PCR分别与人IgG4的重链恒定区和人κ链的恒定区连接而成。
根据Kabat法则对鼠源的抗人MASP-2单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列进行分析并确定了3个CDR和4个FR。以126号抗体为例，通过在NCBI IgBlast与人IgG胚系序列(Germline)进行同源性比较，选择IGHV3-30*03为重链CDR移植模板，将鼠源的抗人MASP-2单克隆抗体126的重链CDR区移植入IGHV3-30*03骨架区，构建成重链的CDR移植抗体。同样地，经过与人IgG胚系序列同源性比较，选择IGKV1-39*01为轻链CDR移植模板，将鼠源的抗人MASP-2单克隆抗体126的轻链CDR区移植入IGKV1-39*01的骨架区，构建成轻链的CDR移植抗体。上述可变区基因序列由生工生物按照Homo sapiens的密码子使用偏好进行密码子优化并合成。将合成的人源化可变区序列与人IgG4恒定区相连。同时，在此基础上对一些框架区的氨基酸位点进行了回复突变。在进行回复突变时，将氨基酸序列进行了Kabat编码，位点的位置由Kabat码指示。经过一系列的回复突变的筛选，优选地，对于轻链可变区序列，将Kabat编码第36位的Y回复为鼠源的F。重链可变区没有回复突变。此抗体定义为126号抗体的人源化抗体(126-Humanization，126-Hu)。
利用上述相同原理，对其余3个抗体同样进行了人源化，人源化抗体的序列信息见表5。利用pTT5载体分别构建人源化重链、轻链的瞬时表达载体，将上 述轻重链组合利用HEK293系统进行瞬时转染并表达抗体。HEK293细胞在Free Style 293 Expression Medium(购自Gibco公司)培养基中培养，利用PEI转染法将质粒转入细胞5天后收取细胞上清，利用Protein A纯化后获得人源化抗体。
最终，100号抗体人源化后的重链可变区基因序列全长348bp，编码116个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：57所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：58所示；人源化后的轻链可变区基因序列全长333bp，编码111个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：59所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：60所示。与人IgG4恒定区相连后，最终得到443个氨基酸的100-Hu人源化重链(序列如SEQ ID NO：61所示)和218个氨基酸的100-Hu人源化轻链(序列如SEQ ID NO：62所示)。
124号抗体人源化后的重链可变区基因序列全长342bp，编码114个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：63所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：64所示；人源化后的轻链可变区基因序列全长321bp，编码107个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：65所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：66所示。与人IgG4恒定区相连后，最终得到441个氨基酸的124-Hu人源化重链(序列如SEQ ID NO：67所示)和214个氨基酸的124-Hu人源化轻链(序列如SEQ ID NO：68所示)。
126号抗体人源化后的重链可变区基因序列全长348bp，编码116个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：69所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：70所示；人源化后的轻链可变区基因序列全长333bp，编码111个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：71所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：72所示。与人IgG4恒定区相连后，最终得到443个氨基酸的126-Hu人源化重链(序列如SEQ ID NO：73所示)和218个氨基酸的126-Hu人源化轻链(序列如SEQ ID NO：74所示)。
136号抗体人源化后的重链可变区基因序列全长351bp，编码117个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：75所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：76所示；人源化后的轻链可变区基因序列全长333bp，编码111个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：77所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：78所示。与人IgG4恒定区相连后，最终得到444个氨基酸的136-Hu人源化重链(序列如SEQ ID NO：79所示)和218个氨基酸的136-Hu人源化轻链(序列如SEQ ID NO：80所示)。
表5：人源化抗体的序列信息
Figure PCTCN2022079499-appb-000004
实施例9 人源化的抗人MASP-2单克隆抗体体外活性评估
瞬时表达纯化100、124、126和136号的人源化抗体，BCA法定量后按照实施例5检测各抗体与人MASP-2-CCS的亲和力，实验结果见图1和表6。参考实施例4研究各抗体对MASP-2催化C4切割的抑制作用，实验结果见图2和表6。以上实验结果表明候选的人源化抗体的亲和力和体外生物活性与鼠源抗体保持基本一致。126-Hu抗体的生物活性显著优于参比抗体，抑制体外C4切割能力是参比抗体的3倍以上。
表6：人源化MASP-2抗体的体外活性
人源化抗体 人MASP-2EC50(pM) C4切割IC50(pM)
100-Hu 296.979 280.715
124-Hu 249.612 214.100
126-Hu 246.343 59.831
136-Hu 260.184 311.495
Narsoplimab 227.281 200.995
实施例10 人源化的抗人MASP-2抗体对MASP-2的亲和力
表达纯化上述4个候选的人源化抗体，其亲和力通过Biacore T200(GE healthcare)检测，参比抗体Narsoplimab作为对照。具体实验方法为：利用Protein-A CM5传感芯片(GE healthcare)，以FC1(Flow cell 1)为参照通道，FC2(Flow cell 2)为样品通道。在FC2通道分别捕获人源抗体或对照抗体，随后注射不同浓度的MASP-2-CCS-Flag。循环条件为：在FCs所有通道中以30μl/min注射4min分析物，解离时间为20min，以50μl/min速率注射Glycine pH 1.5(GE healthcare)30s进行表面再生，然后利用Biacore T200Evaluation Software Ver 1.0计算捕获抗体的信号和无捕获抗体的信号差值及相互作用的亲和力。如表7所显示，人源化后的候选抗体对MASP-2-CCS的亲和力均显著高 于参比抗体Narsoplimab。其中124-Hu亲和力是参比抗体的25倍，126-Hu亲和力是参比抗体的60倍。124-Hu可以和食蟹猴MASP-2结合，其亲和力为0.245nM。
表7:人源化抗体对人MASP-2的亲和力
抗体 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(nM)
100-Hu 4.285×10 5 2.985×10 -4 0.701
124-Hu 1.661×10 6 5.819×10 -4 0.350
126-Hu 4.281×10 5 6.329×10 -5 0.148
136-Hu 5.900×10 5 5.889×10 -4 0.998
Narsoplimab 1.924×10 6 1.700×10 -2 8.834
实施例11 人源化的抗人MASP-2抗体抑制C3b的生成
MASP-2催化的C4切割生成C4b后，C4b与C2a结合形成C3转化酶，将C3切割成C3b和C3a。利用抗C3b特异性抗体检测反应体系中的C3b浓度将能表征MASP-2的活性。
抗人MASP-2单克隆抗体抑制MASP-2介导的C3b生成的实验操作如下：1)用甘露糖(100μl/孔,10μg/ml；Sigma)包被96孔板,4℃过夜后TBS洗涤，封闭液37℃封闭2小时，TBS洗涤3次后GVB++缓冲液(150μl/孔,GVB,5mM CaCl 2,2.5mM MgCl 2)漂洗1次；2)将C1q去除人血清(Chemicon)用GVB++缓冲液稀释至4％后与3.5倍梯度稀释的候选抗体进行预混合，4℃放置1小时；3)冰上将4％血清和抗体的混合液加入到甘露糖包被的96孔板中(100μl/孔)37℃培养1.5小时，冰上放置10分钟终止反应后PBST洗涤3次；4)加入抗C3c的抗体(1:8000；Dako)37℃培养1小时后洗涤3次，再加入抗兔IgG-HRP(1:5000；Invitrogen)抗体，37℃培养1小时后洗涤3次；5)每孔加100μl显色液(临用前将ELISA显色A液与显色B液按照1:1的体积比混匀)显色，随后每孔加入100μl 2M H 2SO 4终止液终止反应。立即用酶标仪(Molecular Device)在450nm波长处测量各孔OD值。使用Graphpad Prism软件进行数据分析后结果详见图3，其中124-Hu，126-Hu和Narsoplimab的IC50分别是1.143nM,0.494nM,1.735nM。126-Hu抗体的生物活性显著优于参比抗体，抑制体外C3b生成是参比抗体的3.5倍左右。
实施例12 90％血清中人源化的抗人MASP-2抗体抑制MASP-2催化的C4切割实验
为模拟体内环境，在反应体系中将血清浓度提高到90％血清。抗体抑制C4切割实验步骤如下：1)甘露糖(100μl/孔,10μg/ml；Sigma)包被96孔板，4℃过夜后TBS洗涤，封闭液37℃封闭2小时；TBS洗涤3次后GVB++缓冲液(150μl/孔,GVB,5mM CaCl 2,2.5mM MgCl 2)漂洗1次；2)候选抗体用GVB++缓冲液做3.5倍梯度稀释后，90％v/v人或者食蟹猴血清与10％v/v抗体4℃孵育1小时；3)上述预混液加到甘露糖包被的96孔板中37℃孵育1.5小时，冰上放置10分钟终止反应后PBST洗涤3次；4)PBST洗涤3次96孔板后，加入anti-C4b抗体(Assay Pro；1:4000)37℃放置1小时，洗涤后加入用PBST 1:5000倍稀释的HRP标记抗体(购自BD Pharmingen)，室温孵育1小时,PBST洗涤3次后拍干。每孔加100μl显色液(临用前将ELISA显色A液与显色B液按照1:1的体积比混匀)显色，随后每孔加入100μl 2M H 2SO 4终止液终止反应。立即用酶标仪(Molecular Device)在450nm波长处测量各孔OD值。实验数据分析后结果详见图4和图5。其中在90％人血清的实验中124-Hu，126-Hu和Narsoplimab的IC50分别是3.750nM,3.457nM,8.229nM；在90％食蟹猴血清的实验中124-Hu和Narsoplimab的IC50分别是167.600nM和94.050nM。结果表明在90％的血清中候选抗体同样具有很强的抑制C4切割的作用，在90％人血清中，124-Hu和126-Hu的抑制C4活性显著高于参比抗体，可能在人体内会有更优的生物活性。
结论：在亲和力测定和多种体外功能活性分析中，本发明的抗体均显示了一致的强于对照抗体Narsoplimab的生物活性。
可以理解，尽管本申请以某种形式被说明，但本申请并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本申请的范围的前提下还可对所述实施方式和/或某一特征或参数做出各种变化。这些变化都在本申请要求保护的范围内。

Claims (16)

  1. 特异性结合人MASP-2的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区包含HCDR3序列，任选地还包含HCDR2和/或HCDR1序列，其中所述HCDR3序列包含选自SEQ ID NOs:17，23，29，35，41，47和53的氨基酸序列；和/或所述HCDR2序列包含选自SEQ ID NOs:16，22，28，34，40，46和52的氨基酸序列；和/或所述HCDR1序列包含选自SEQ ID NOs:15，21，27，33，39，45和51的氨基酸序列。
  2. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和/或LCDR3序列，其中所述LCDR3序列包含选自SEQ ID NOs:20，26，32，38，44，50和56的氨基酸序列；和/或所述LCDR2序列包含选自SEQ ID NOs:19，25，31，37，43，49和55的氨基酸序列；和/或所述LCDR1序列包含选自SEQ ID NOs:18，24，30，36，42，48和54的氨基酸序列。优选地，所述抗原结合片段选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段和单域抗体。
  3. 如权利要求1和2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其抗原结合片段。
  4. 如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述鼠源抗体重链可变区包含SEQ ID NOs:1，3，5，7，9，11和13的氨基酸序列。其中所述鼠源抗体轻链可变区包含SEQ ID NOs:2，4，6，8，10，12和14的氨基酸序列。
  5. 如前述权利要求任一项所述的抗体或其抗原结合片段，优选地其中所述抗体或其抗原结合片段人源化后获得人源化抗体或其抗原结合片段。
  6. 如权力要求5所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体的重链可变区包含SEQ ID NOs:58，64，70和76；其中所述的人源化抗体的轻链可变区包含SEQ ID NOs:60，66，72和78。
  7. 如权力要求6所述的特异性结合人MASP-2的抗体或其抗原结合片段，其包含选自如下的任一的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合：SEQ ID NO:58的重链可变区序列和SEQ ID NO:60的轻链可变区序列；SEQ ID NO:64的重链可变区序列和SEQ ID NO:66的轻链可变区序列；SEQ ID NO:70的重链可变区序列和SEQ ID NO:72的轻链可变区序列；SEQ ID NO:76的重链可变区序列和SEQ ID NO:78的轻链可变区序列。
  8. 如权力要求7所述的特异性结合人MASP-2的抗体或其抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NOs:61，67，73和79任一序列所示的重链序列。
  9. 如权力要求7所述的特异性结合人MASP-2的抗体或其抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NOs:62，68，74和80任一序列所示的轻链序列。
  10. 如权力要求8或9所述的特异性结合人MASP-2的抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体选自以下的任一的重链序列和轻链序列的组合：SEQ ID NO:61的重链序列和SEQ ID NO:62的轻链序列；SEQ ID NO:67的重链序列和SEQ ID NO:68的轻链序列；SEQ ID NO:73的重链序列和SEQ ID NO:74的轻链序列；SEQ ID NO:79的重链序列和SEQ ID NO:80的轻链序列。
  11. 一种编码如权利要求1至10任一项所述的特异性结合人MASP-2的抗体或其抗原结合片段的DNA分子。
  12. 一种包含权利要求11中所述DNA分子的药学上可接受的表达载体。
  13. 一种宿主细胞，其包含权利要求11所述的DNA分子或权利要求12所述的表达载体。
  14. 一种药物组合物，其包含权力要求1至10任一项的抗体或其抗原结合片段，和多种药用赋形剂、稀释剂或载体。
  15. 如权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或者权利要求14所述的药物组合物在制备用于预防或治疗MASP-2相关疾病的药物中的用途，其中所述的疾病选自IgA肾病，狼疮性肾炎，非典型溶血尿毒综合症，造血干细胞移植相关的血栓性微血管病。
  16. 如权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或者权利要求14所述的药物组合物在制备用于预防或治疗MASP-2相关疾病的药物中的用途，其中所述的疾病为IgA肾病。
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