JP6584397B2 - 凝血促進活性を誘発することができる組織因子経路インヒビターのn末端部分を認識する抗体 - Google Patents
凝血促進活性を誘発することができる組織因子経路インヒビターのn末端部分を認識する抗体 Download PDFInfo
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Description
配列番号1は、ヒトTFPIαのアミノ酸配列を表す。
配列番号2は、TFPI(1〜79)のアミノ酸配列を表す。
配列番号3は、TFPI(1〜161)のアミノ酸配列を表す。
配列番号4は、モノクローナル抗体(mAb)2F3の可変重鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号5は、モノクローナル抗体(mAb)2F3の可変軽鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号6は、モノクローナル抗体(mAb)2F22の可変重鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号7は、モノクローナル抗体(mAb)2F22の可変軽鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号8は、モノクローナル抗体(mAb)2F45の可変重鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号9は、モノクローナル抗体(mAb)2F45の可変軽鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号10は、モノクローナル抗体(mAb)1F91の可変重鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号11は、モノクローナル抗体(mAb)1F91の可変軽鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号12は、モノクローナル抗体(mAb)2F35の可変重鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号13は、モノクローナル抗体(mAb)2F35の可変軽鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号14は、抗体重鎖をクローニングするために使用したプライマーの核酸配列を表す。
配列番号15は、抗体軽鎖をクローニングするために使用したプライマーの核酸配列を表す。
配列番号16は、Fab 0296の短縮型マウス-ヒトキメラ重鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号17は、モノクローナル抗体mAb 0294及びFab 0296のマウス-ヒトキメラの軽鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号18は、タグ付けされたTFPI KPI-1/N末端のアミノ酸配列を表す。
配列番号19は、モノクローナル抗体mAb 0294のマウス-ヒトキメラ重鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号20は、Fab 0295の短縮型マウス-ヒトキメラ重鎖のアミノ酸配列を表す。
・配列番号4のアミノ酸31〜35(SYGVH)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号4のアミノ酸50〜65(VIWRGGSTDFNAAFMS)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号4のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つ又は2つが、異なるアミノ酸によって置換されてもよい配列を含む重鎖を有することができる。
・配列番号5のアミノ酸24〜34(KASENVGAAVA)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号5のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号5のアミノ酸89〜96(QQYTNYPT)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列を含む軽鎖を有することができる。
・配列番号6のアミノ酸31〜35(NYGVH)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号6のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号6のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つ又は2つが、異なるアミノ酸によって置換されてもよい配列を含む重鎖を有することができる。
・配列番号7のアミノ酸24〜34(KASQSVGPAVA)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号7のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号7のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列を含む軽鎖を有することができる。
・配列番号8のアミノ酸31〜35(GYGVH)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号8のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号8のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つ又は2つが、異なるアミノ酸によって置換されてもよい配列を含む重鎖を有することができる。
・配列番号9のアミノ酸24〜34(KASQNVGTAVA)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号9のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号9のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列を含む軽鎖を有することができる。
・配列番号10のアミノ酸31〜36(SDYAWN)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号10のアミノ酸51〜66(YISYSGSTSYNPSLKS)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号10のアミノ酸99〜104(WAYDGP)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸によって置換されてもよい配列を含む重鎖を有することができる。
・配列番号11のアミノ酸24〜33(RASSSVSHMH)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つ又は2つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号11のアミノ酸49〜55(ATSNLAS)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号11のアミノ酸88〜96(QQWSSNPFT)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列を含む軽鎖を有することができる。
・配列番号12のアミノ酸31〜35(DYYIH)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号12のアミノ酸50〜66(WIDPENGNTIFDPKFQG)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号12(RWYAMDY)のアミノ酸99〜105に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸によって置換されてもよい配列を含む重鎖を有することができる。
・配列番号13のアミノ酸24〜39(KSSQSLLYTNGKTYLN)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号13のアミノ酸55〜61(LVSKLDS)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号13のアミノ酸94〜102(LQSTHFPWT)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列を含む軽鎖を有することができる。
が、結合競合物として機能するのに十分に抗原を別個に結合できるように、設計されなければならない。
実施形態
1.ヒトTFPI(配列番号1)のアミノ酸残基1〜79に存在するエピトープに特異的に結合することができる抗体又はそのフラグメント。
2.ヒトTFPIのアミノ酸残基26〜76(KPI-1)に存在するエピトープを結合することができる、実施形態1に記載の抗体又はそのフラグメント。
3.表面プラズモン共鳴を使用して決定される場合、1E-08M以下のKdを有する、実施形態1又は2のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント。
4.重鎖が、
・配列番号4のアミノ酸31〜35(SYGVH)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号4のアミノ酸50〜65(VIWRGGSTDFNAAFMS)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号4のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つ又は2つが、異なるアミノ酸によって置換されてもよい配列
を含む、実施形態1から3のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント。
5.重鎖が、
・配列番号6のアミノ酸31〜35(NYGVH)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号6のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号6のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つ又は2つが、異なるアミノ酸によって置換されてもよい配列
を含む、実施形態1から3のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント。
6.重鎖が、
・配列番号8のアミノ酸31〜35(GYGVH)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号8のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号8のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つ又は2つが、異なるアミノ酸によって置換されてもよい配列
を含む、実施形態1から3のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント。
7.軽鎖が、
・配列番号5のアミノ酸24〜34(KASENVGAAVA)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号5のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号5のアミノ酸89〜96(QQYTNYPT)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列
を含む、実施形態4から6のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント。
8.軽鎖が、
・配列番号7のアミノ酸24〜34(KASQSVGPAVA)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号7のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号7のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列
を含む、実施形態4から6のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント。
9.軽鎖が、
・配列番号9のアミノ酸24〜34(KASQNVGTAVA)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号9のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号9のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列
を含む、実施形態4から6のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント。
10.重鎖が、
・配列番号10のアミノ酸31〜36(SDYAWN)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号10のアミノ酸51〜66(YISYSGSTSYNPSLKS)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号10のアミノ酸99〜104(WAYDGP)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸によって置換されてもよい配列
を含む、実施形態1から3のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント。
11.軽鎖が、
・配列番号11のアミノ酸24〜33(RASSSVSHMH)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つ又は2つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号11のアミノ酸49〜55(ATSNLAS)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号11のアミノ酸88〜96(QQWSSNPFT)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列
を含む、実施形態10に記載の抗体又はそのフラグメント。
12.重鎖が、
・配列番号12のアミノ酸31〜35(DYYIH)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号12のアミノ酸50〜66(WIDPENGNTIFDPKFQG)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号12のアミノ酸99〜105(RWYAMDY)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸によって置換されてもよい配列
を含む、実施形態1から3のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント。
13.軽鎖が、
・配列番号13のアミノ酸24〜39(KSSQSLLYTNGKTYLN)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号13のアミノ酸55〜61(LVSKLDS)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号13のアミノ酸94〜102(LQSTHFPWT)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列
を含む、実施形態12に記載の抗体又はそのフラグメント。
14.重鎖が、
・配列番号4のアミノ酸31〜35(SYGVH)、配列番号6のアミノ酸31〜35(NYGVH)又は配列番号8のアミノ酸31〜35(GYGVH)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号4のアミノ酸50〜65(VIWRGGSTDFNAAFMS)、配列番号6のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)又は配列番号8のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号4のアミノ酸98〜110、配列番号6のアミノ酸98〜110又は配列番号8のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列
を含み、
軽鎖が、
・配列番号5のアミノ酸24〜34(KASENVGAAVA)、配列番号7のアミノ酸24〜34(KASQSVGPAVA)又は配列番号9のアミノ酸24〜34(KASQNVGTAVA)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号5のアミノ酸50〜56、配列番号7のアミノ酸50〜56又は配列番号9のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号5のアミノ酸89〜96(QQYTNYPT)、配列番号7のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)又は配列番号9のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)に対応するCDR3配列
を含む、実施形態1から3のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント。
15.重鎖が、
・配列番号10のアミノ酸31〜36(SDYAWN)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号10のアミノ酸51〜66(YISYSGSTSYNPSLKS)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号10のアミノ酸99〜104(WAYDGP)に対応するCDR3配列
を含み、
軽鎖が、
・配列番号11のアミノ酸24〜33(RASSSVSHMH)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号11のアミノ酸49〜55(ATSNLAS)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号11のアミノ酸88〜96(QQWSSNPFT)に対応するCDR3配列
を含む、実施形態10に記載の抗体又はそのフラグメント。
16.重鎖が、
・配列番号12のアミノ酸31〜35(DYYIH)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号12のアミノ酸50〜66(WIDPENGNTIFDPKFQG)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号12のアミノ酸99〜105(RWYAMDY)に対応するCDR3配列
を含み、
軽鎖が、
・配列番号13のアミノ酸24〜39(KSSQSLLYTNGKTYLN)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号13のアミノ酸55〜61(LVSKLDS)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号13のアミノ酸94〜102(LQSTHFPWT)に対応するCDR3配列
を含む、実施形態12に記載の抗体又はそのフラグメント。
17.バイオレイヤー干渉法を使用して決定される場合、TFPI(1〜79)への結合について実施形態1から16のいずれか1つに記載の抗体と競合する抗体又はそのフラグメント。
18.バイオレイヤー干渉法を使用して決定される場合、実施形態1から17のいずれか1つに記載の抗体と同じビンに属する抗体又はそのフラグメント。
19.モノクローナル抗体である、実施形態1から18のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント。
20.ヒト化抗体である実施形態1から19のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント。
21.Fab、Fab'、Fab2、Fab'2及びscFvフラグメントからなる群から選択される、実施形態1から19のいずれか1つに記載の抗体フラグメント。
22.実施形態1から21のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント及び少なくとも1つの薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬製剤。
23.医薬としての使用のための、実施形態1から21のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント又は実施形態22に記載の医薬製剤。
24.凝血障害の対象の治療に使用する実施形態1から21のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント又は実施形態22に記載の医薬製剤。
25.前記対象が、インヒビター保有又は非保有A型血友病及びインヒビター保有又は非保有B型血友病などの任意の先天性、後天性及び/又は医原性凝血障害を有する、実施形態24に規定の使用のための抗体又はそのフラグメント。
26.前記対象に実施形態1から21のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメントを投与することを含む、凝血障害の対象を治療する方法。
本発明は、以下の態様によって更に、例示される:
2.ヒトTFPI(配列番号1)のアミノ酸残基26〜76(KPI-1)に存在するエピトープに特異的に結合する、態様1に記載の抗体又はそのフラグメント。
3.ヒトTFPIに存在するエピトープに特異的に結合し、前記エピトープが、配列番号1のL16、P17、L19、K20、L21、M22、F25、C35、A37、M39、R41、Y56、G57、G58、C59、E60、G61、N62、Q63、R65、F66、E67、E71及びM75のアミノ酸残基のうち少なくとも1つを含む、態様1に記載の抗体又はそのフラグメント。
4.ヒトTFPIに存在するエピトープに特異的に結合し、前記エピトープが、配列番号1のアミノ酸残基R41、R65及びE67のうち少なくとも1つを含む、態様3に記載の抗体又はそのフラグメント。
5.表面プラズモン共鳴を使用して決定される場合、1E-08M以下のKdを有する、態様1に記載の抗体又はそのフラグメント。
6.ヒトTFPIに特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体の重鎖が配列番号16のアミノ酸残基
2位に対応する位置にV、
27位に対応する位置にF、
32位に対応する位置にY、
52位に対応する位置にW、
53位に対応する位置にR、
54位に対応する位置にG、
55位に対応する位置にG、
56位に対応する位置にS、
57位に対応する位置にI、
58位に対応する位置にD、
59位に対応する位置にY、
61位に対応する位置にA、
64位に対応する位置にM、
97位に対応する位置にK、
99位に対応する位置にS、
100位に対応する位置にH、
102位に対応する位置にN、
103位に対応する位置にY、
104位に対応する位置にV、
105位に対応する位置にG、
及び106位に対応する位置にY
を含み、前記抗体の軽鎖が、配列番号17のアミノ酸残基
31位に対応する位置にP、
32位に対応する位置にA、
49位に対応する位置にY、
50位に対応する位置にS、
53位に対応する位置にN、
55位に対応する位置にY、
56位に対応する位置にT、
91位に対応する位置にY、
92位に対応する位置にT、
93位に対応する位置にS、
及び94位に対応する位置にY
を含む抗体。
7.重鎖が、
・配列番号4のアミノ酸31〜35(SYGVH)、配列番号6のアミノ酸31〜35(NYGVH)又は配列番号8のアミノ酸31〜35(GYGVH)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号4のアミノ酸50〜65(VIWRGGSTDFNAAFMS)、配列番号6のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)又は配列番号8のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号4のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)、配列番号6又は配列番号8のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つ又は2つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列
を含む、態様1に記載の抗体。
8.軽鎖が、
・配列番号5のアミノ酸24〜34(KASENVGAAVA)、配列番号7のアミノ酸24〜34(KASQSVGPAVA)又は配列番号9のアミノ酸24〜34(KASQNVGTAVA)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号5のアミノ酸50〜56(SASNRYT)、配列番号7又は配列番号9のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号5のアミノ酸89〜96(QQYTNYPT)、配列番号7のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)又は配列番号9のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列
を含む、態様1又は7に記載の抗体又はそのフラグメント。
9.重鎖が、
・配列番号4のアミノ酸31〜35(SYGVH)、配列番号6のアミノ酸31〜35(NYGVH)又は配列番号8のアミノ酸31〜35(GYGVH)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号4のアミノ酸50〜65(VIWRGGSTDFNAAFMS)、配列番号6のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)又は配列番号8のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号4、配列番号6又は配列番号8のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列
を含み、
軽鎖が、
・配列番号5のアミノ酸24〜34(KASENVGAAVA)、配列番号7のアミノ酸24〜34(KASQSVGPAVA)又は配列番号9のアミノ酸24〜34(KASQNVGTAVA)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号5、配列番号7又は配列番号9のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号5のアミノ酸89〜96(QQYTNYPT)、配列番号7のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)又は配列番号9のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)に対応するCDR3配列
を含む、態様1に記載の抗体又はそのフラグメント。
10.重鎖が、
・配列番号6のアミノ酸31〜35(NYGVH)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号6のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号6のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列
を含み、
軽鎖が、
・配列番号7のアミノ酸24〜34(KASQSVGPAVA)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号7のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号7のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)に対応するCDR3配列
を含む、態様1に記載の抗体又はそのフラグメント。
11.重鎖が、
・配列番号10のアミノ酸31〜36(SDYAWN)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号10のアミノ酸51〜66(YISYSGSTSYNPSLKS)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号10のアミノ酸99〜104(WAYDGP)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸によって置換されてもよい配列
を含み、
軽鎖が、
・配列番号11のアミノ酸24〜33(RASSSVSHMH)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つ又は2つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号11のアミノ酸49〜55(ATSNLAS)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号11のアミノ酸88〜96(QQWSSNPFT)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列
を含む、態様1に記載の抗体又はそのフラグメント。
12.重鎖が、
・配列番号10のアミノ酸31〜36(SDYAWN)に対応するCDR1配列;
・配列番号10のアミノ酸51〜66(YISYSGSTSYNPSLKS)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号10のアミノ酸99〜104(WAYDGP)に対応するCDR3配列
を含み、
軽鎖が、
・配列番号11のアミノ酸24〜33(RASSSVSHMH)に対応するCDR1配列;
・配列番号11のアミノ酸49〜55(ATSNLAS)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号11のアミノ酸88〜96(QQWSSNPFT)に対応するCDR3配列
を含む、態様11に記載の抗体又はそのフラグメント。
13.重鎖が、
・配列番号12のアミノ酸31〜35(DYYIH)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号12のアミノ酸50〜66(WIDPENGNTIFDPKFQG)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号12のアミノ酸99〜105(RWYAMDY)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸によって置換されてもよい配列
を含み、
軽鎖が、
・配列番号13のアミノ酸24〜39(KSSQSLLYTNGKTYLN)に対応するCDR1配列であり、これらアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号13のアミノ酸55〜61(LVSKLDS)に対応するCDR2配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列;及び/又は
・配列番号13のアミノ酸94〜102(LQSTHFPWT)に対応するCDR3配列であり、これらアミノ酸残基の1つが、異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい配列
を含む、態様1に記載の抗体又はそのフラグメント。
14.重鎖が、
・配列番号12のアミノ酸31〜35(DYYIH)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号12のアミノ酸50〜66(WIDPENGNTIFDPKFQG)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号12のアミノ酸99〜105(RWYAMDY)に対応するCDR3配列;を含み、
軽鎖が、
・配列番号13のアミノ酸24〜39(KSSQSLLYTNGKTYLN)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号13のアミノ酸55〜61に対応するCDR2配列(LVSKLDS);及び
・配列番号13のアミノ酸94〜102に対応するCDR3配列(LQSTHFPWT)
を含む、態様13に記載の抗体又はそのフラグメント。
15.バイオレイヤー干渉法を使用して決定される場合、TFPI(1〜79)への結合について態様3から10のいずれか1つに記載の抗体と競合する単離された抗体又はそのフラグメント。
16.バイオレイヤー干渉法を使用して決定される場合、態様1から14のいずれか1つに記載の抗体と同じビンに属する単離された抗体又はそのフラグメント。
17.態様1から16のいずれか1つに記載の少なくとも1つの抗体又はそのフラグメント及び少なくとも1つの薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬製剤。
18.医薬としての使用のための、態様1から16のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント又は態様17に記載の医薬製剤。
19.凝血障害の対象の治療に使用する態様1から16のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメント。
20.前記対象が、インヒビター保有又は非保有A型血友病及びインヒビター保有又は非保有B型血友病など先天性、後天性及び/又は医原性凝血障害を有する、態様19に規定の使用のための抗体又はそのフラグメント。
21.前記対象に態様1から16のいずれか1つに記載の抗体又はそのフラグメントを投与することを含む、凝血障害の対象を治療する方法。
免疫化、融合及びスクリーニング
RBFマウスを、ヒトTFPIα(配列番号1)又はTFPI(1〜161)(配列番号3)で免疫した。マウスは、皮下に注射した:1回目の注射用として20μgヒトTFPIをフロイント完全アジュバントと混合した。その後の免疫化用として、フロイント不完全アジュバントを同じ濃度の抗原と共に使用した。最後の免疫化の10日後に、ELISAを使用してヒトTFPI特異的抗体について、マウスの眼血液をスクリーニングした。陽性血清力価を持つマウスを、静注によって10μgヒトTFPIα又はTFPI(1〜161)で追加免疫し、3日後に屠殺した。脾臓を無菌的に取り出し、分散させて単一細胞懸濁液にした。脾臓細胞と骨髄腫細胞の融合を、PEG法又は電気融合によって行った。得られたハイブリドーマ細胞を、マイクロタイタープレート中での限界希釈によってクローニングした。個々のハイブリドーマからの上清を、全長TFPIα又はTFPI(1〜161)に結合できる抗体の発現についてELISAにより最初にスクリーニングした。TFPI(1〜79)に特異的な抗体を産生するハイブリドーマを同定するために、全長TFPIα又はTFPI(1〜161)への結合について陽性のハイブリドーマを、TFPI-KPI-2フラグメント(配列番号1のアミノ酸残基97〜147によって表される)への結合についてカウンタースクリーニングした。TFPI(1〜161)への結合について陽性でありTFPI-KPI-2フラグメントへの結合について陰性のハイブリドーマを、抗体産生のために単離し、増殖させた。
マウス抗ヒトTFPI(1〜79)特異的mAbのクローニング及びシーケンシング
この実施例は、TFPI抗体mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F45、mAb 1F56、mAb 1F91及びmAb 2F35のマウス重鎖及び軽鎖配列のクローニング並びにシーケンシングについて説明する。全RNAを、Qiagen社製RNeasy Mini Kitを使用してハイブリドーマ細胞から抽出し、cDNA合成の鋳型に使用した。cDNAを、Clontech社製SMART(商標)RACE cDNA増幅キットを使用する5'-RACE反応で合成した。HC及びLC配列のその後の標的増幅は、Phusion Hot Startポリメラーゼ(Finnzymes社)並びにフォワードプライマーとしてSMART(商標) RACEキットに含まれるユニバーサルプライマー混合物(UPM)を使用して、PCRにより実施した。配列番号14に示される配列を持つリバースプライマーをHC(VHドメイン)増幅に使用し、配列番号15に示される配列を持つリバースプライマーをLC増幅に使用した。PCR産物を、ゲル電気泳動によって分離し、GE Healthcare Bio-Sciences社製のGFX PCR DNA & Gel Band Purification Kitを使用して抽出し、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit及び化学的にコンピテントにしたTOP10大腸菌(E. coli)(Life Technologies社)を使用してシーケンシングのためにクローニングした。コロニーPCRを、Applied Biosystems社製AmpliTaq Gold Master Mix及びM13uni/M13revプライマーを使用して、選択したコロニーに対して実施した。コロニーPCRのクリーンアップを、ExoSAP-IT酵素混合物(USB社)を使用して実施した。シーケンシングを、ドイツ、マーチンスリードのMWG Biotech社でM13uni(-21)/M13rev(-29)シーケンシングプライマーを使用して実施した。配列を、Vector NTI Advance 11プログラム(Life Technologies社)を使用して分析し、注釈付け(アノテーション)した。全てのキット及び試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。
mAb 2F22のマウスヒトキメラ版の一過性発現用としてCMVプロモータに基づく発現ベクター(pTTベクター)を生成した。pTTベクターは、Yves Durocherによって一過性のタンパク質発現用として開発される(Durocherら、Nucleic Acid Research、2002年)。pTTに基づくベクターは、CMVプロモータに加えて、pMB1複製起点、EBV複製起点及びAmp耐性遺伝子を含有する。
pTTに基づくLC並びにHC発現ベクターの同時トランスフェクションにより、抗TFPI抗体及びFabフラグメントを、EXPI293F細胞(Life Technologies社)の懸濁培養で一過性に発現させた。以下の手順は、懸濁適応EXPI293F細胞に使用する一般的なトランスフェクション手順について説明している。
1)別々のDNAの希釈及びトランスフェクション試薬を最初に調製する。
a)細胞培養1mL当たり合計1μgのベクターDNA(0.5μg LCベクター及び0.5μg HCベクター)を使用する。DNAをOpti-MEM培地(Gibco社)に50μL培地/μg DNAになるように希釈し、混合し、室温(23〜25℃)で5分間インキュベートする。
b)トランスフェクション試薬としてExpifectamin(商標)293(Life Technologies社)を1μg DNA当たり2.7μLの濃度で使用する。Opti-MEM培地(Gibco社)にExpifectamin(商標)溶液を18.5×希釈し、混合し、室温(23〜25℃)で5分間インキュベートする。
2)DNAとExpifectamin(商標)293希釈物とを混合し、放置して室温(23〜25℃)で10分間インキュベートする。
3)DNA-Expifectamin(商標) 293混合物をEXPI293F細胞培養に直接添加する。
a)トランスフェクション時に、EXPI293F培養の細胞密度は、2.8〜3.2×106個細胞/mLであるべきである。
4)トランスフェクションした細胞培養を36.5℃、8% CO2、85〜125rpmのオービタルシェイカーインキュベーターへ移す。
5)トランスフェクションの18時間後に、5μL Expifectamin(商標)293トランスフェクションエンハンサー1/mL培養及び50μL Expifectamin(商標)293トランスフェクションエンハンサー2/mL培養を添加し、36.5℃、8% CO2、85〜125rpmのオービタルシェイカーインキュベーターに培養を戻す。
6)トランスフェクションの5日後に、細胞培養上清を遠心分離によって採取し、その後0.22μmのPESフィルタ装置(Corning社)によって濾過する。
mAbバリアントを、GE Healthcare社製MabSelectSuRe樹脂を製造業者の説明書に従って使用する標準的なアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製した抗体を、PBS緩衝液pH7.2に緩衝液交換した。
結合相互作用分析
結合相互作用データを、Biacore T200機器で表面プラズモン共鳴により得た。ウサギポリクローナル抗マウス免疫グロブリン(Mouse Antibody Capture Kit、GE Healthcare社)を、Biacore T-200制御ソフトウェアバージョン2.0(GE Healthcare社)で利用可能なアミンカップリング手順及びAmine Coupling Kit(GE Healthcare社)で提供される試薬を使用して、Series S CM4センサーチップ(GE Healthcare社)のフローセル1〜4に固定した。関連するマウスモノクローナル抗体を、一定濃度でフローセル2、3又は4に捕捉した。異なる濃度のヒトTFPIα又はTFPI(1〜79)を、ランニングバッファー(10mM HEPES、pH7.4、300mM NaCl、5mM CaCl2、0.05% Surfactant P20、1mg/mL BSA)にサンプルを希釈することによって試験した。各サンプルを、30μL/分の流速で300秒間の接触時間、その後420〜600秒間の解離時間を使用してアッセイした。緩衝液ブランクも、アッセイした。センサー表面を、10mMグリシンpH1.7を用いて流速30μL/分で180秒間か又は流速30μL/分で30秒間をそれぞれ2サイクルかいずれかで再生した。
抗体ビニング
全長TFPIαへの結合についてTFPI抗体1F91、2F3、2F22、2F35、2F45、Bay 2A8-K95L、MBS532510(MyBioSource.com社)と10R-T141A(Fitzgerald Industries International社)との競合をバイオレイヤー干渉法(Fortebio Octet RED384 instrument、PALL Life Sciences社)を使用して測定した。mAb 1F91、mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F35、mAb 2F45及びBay 2A8-K95Lを、1:1.2のモルmAb:モルビオチン-試薬(Thermo Scientific社 cat #21335)比を使用してリジン残基においてビオチンでランダムに標識し、それ以外は製造業者の指定に従った。ビオチン標識化抗体を、Fortebio社ストレプトアビジンセンサーチップ(PALL Life Sciences社)に捕捉し、続いてヒトTFPIαを結合させ、続いてmAb 1F91、mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F35、mAb 2F45、Bay 2A8-K95L、MBS532510又は10R-T141Aを結合させた。結果を表4に示す(黒色は、mAbがTFPIへの結合について競合することを意味する。灰色は、mAbがTFPIへの結合について競合しないことを意味する)。これらのデータは、抗体が異なる4つのビンに分類されることを示し、それらが異なる結合エピトープを有することを指し示す。Bin 1: mAb 1F91、MBS532510及び10R-T141A。Bin 2: mAb 2F3、2F22及び2F45。Bin3: mAb 2F35。Bin4: Bay2A8 K95L。
ヒトFVIII中和血漿におけるTF誘導トロンビン生成に対するTFPI(1〜79)特異的TFPI抗体の効果
トロンビン生成に対する抗体の効果を、正常ヒト血漿(NHP、CryoCheck Normal Plasma)において試験した。凝固の開始は、再石灰化及び4μMリン脂質小胞を伴う1pM TFの添加によって誘導された(PPP-Reagent low、Thrombinoscope社)。A型血友病様の血漿を、100μg/mLヒツジ抗ヒトFVIII抗体の添加によって得た(Haematologic Technologies Inc.社、PAHFVIII-S)。トロンビン活性を、Bachem社(ブーベンドルフ、スイス)製の発蛍光性基質Z-Gly-Gly-Arg-AMC.HCl(I-1140)の変換後に連続的に評価した。蛍光を、それぞれ368及び460nmの励起並びに発光波長設定でマイクロタイタープレートFluorskan Ascent蛍光測定器(Thermo Labsystems社、ヘルシンキ、フィンランド)で測定した。キャリブレーターを使用することにより、形成されたトロンビンの量の算出並びに内部フィルタ効果及び発蛍光性基質の消費について得られた相対的蛍光単位の補正が可能になった。加えて、トロンビン-α2-マクログロブリン複合体による基質変換への寄与を減算した。これらの補正を、Thrombinoscope BV社(マーストリヒト、オランダ)によって提供される校正自動化トロンボグラム(CAT)コンピュータソフトウェア(バージョン5.0.0.745)を用いて自動的に実施した。トロンビン生成曲線を得られるデータの一次導関数を取得することにより、i)遅延時間、ii)全曲線下面積、内在性トロンビン潜在性(ETP)、iii)トロンビンピーク高(ピーク)、iv)ピークに達する時間(ttピーク)及びv)トロンビン生成の最大速度(Rate)を算出できるようになる。
mAb 2F22のFabフラグメントとの複合体におけるTFPIクニッツプロテアーゼインヒビタードメイン1の結晶構造
mAb 2F22のFabフラグメント、Fab 0296(配列番号16及び17)との複合体における、酸性N末端領域及びクニッツ型プロテアーゼインヒビタードメイン1(KPI-1)(配列番号2)からなるヒトTFPI(1〜79)のN末端部分の三次元構造を、X線結晶構造解析を使用して高分解能に決定した。その結果は、抗体が、TFPIのKPI-1及び先行するN末端側の部分を結合できることを実証する。得られたヒトTFPIエピトープ残基は、Leu16、Pro17、Leu19、Lys20、Leu21、Met22、Phe25、Cys35、Ala37、Met39、Arg41、Tyr56、Gly57、Gly58、Cys59、Glu60、Gly61、Asn62、Gln63、Arg65、Phe66、Glu67、Glu71及びMet75(配列番号2)を含む。
結晶学的目的の場合、実施例2に記載の通り、結晶解析のためにCMVプロモータに基づく発現ベクター(pTTベクター)を、mAb 2F22抗体フラグメントに対応するFabフラグメントの一過性発現用として生成した。
CCP4プログラムセット[Collaborative Computational Project, N.、Acta crystallographica.Section D, Biological crystallography、(1994)、第50巻、760〜763頁]のソフトウェアプログラムAreaimol[Lee, B.ら、J Mol Biol、(1971)、第55巻、379〜400頁][Saff, E. B.ら、Math Intell、(1997)、第19巻、5〜11頁]によってペアワイズ相互作用において除外された平均面積を算出することにより、結晶構造1195Å2のヒトTFPIフラグメント/抗TFPI 2F22 Fab分子複合体を得た。
表面プラズモン共鳴によって測定される、FXaに対するTFPIの親和性及びFVIIa/可溶性TFに対するTFPIの親和性に対するTFPI(1〜79)特異的TFPI抗体の効果
TFPIとFXa又はTFPIとFVIIa/可溶性TF(FVIIa/sTF)との間の相互作用を阻害するTFPI抗体の能力を、Biacore T200機器によるSPRアッセイを使用して評価した。TFPI KPI-1抗体に結合しているTFPIに対するFXa又はFVIIa/sTFの親和性を、TFPI KPI-3 mAb 4F110(WO2012/001087)に結合しているTFPIに対するFXa又はFVIIa/sTFの親和性と比較した。対照として、TFPI KPI-2 mAb 4F36(WO2010/072691)に結合しているTFPIに対するFXa又はFVIIa/sTFの親和性を、アッセイに含めた。
FXaアミド分解活性のTFPIα阻害に対するTFPI(1〜79)に特異的な抗TFPI抗体の効果
発色性基質S-2765(Chromogenix社)に対するFXa(Enzyme Research Laboratories Ltd.社)アミド分解活性のTFPIα阻害への抗体の効果を、50mM HEPES、pH7.4、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1mg/mL BSAを含有する緩衝液中でアッセイした。抗TFPI mAb(32nM)を、8nM TFPIα(配列番号1)と室温で30分間インキュベートした。S-2765(0.5mM)を添加し、5分間インキュベートした。反応を、0.1nMの最終濃度になるようにFXaを添加することにより開始した。40分間インキュベーションした後に、生成物の形成を、Spectramax 340マイクロプレート分光光度計により405nmで測定した。TFPIαの非存在下の活性を100%に設定し、TFPIα存在下であるが抗体が非存在下の活性を0%に設定した。結果を、表12に示す。予想通り、TFPIαとKPI-2 mAb2021(WO2010/072691に開示されている)とのプレインキュベーションは、FXaに対するTFPIα活性を完全に中和した。TFPI KPI-1抗体の効果は、2つの群、即ちFXaのTFPIα阻害を部分的に中和した(>20%)1群(2F3、2F22、2F45)及びFXaのTFPIα阻害にあまり影響を及ぼさなかった(<20%)別の群に分けることができる。
sTF/FVIIaアミド分解活性及びFXaアミド分解活性によって測定されるTFPI(1〜79)に特異的な抗TFPI抗体によるTFPIα阻害の反転
FVIIa/sTF活性のTFPIα阻害に対する抗体の効果を、20mM HEPES、pH7.5、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.1% BSA中で試験した。反応混合物は、5nM FVIIa、10nM可溶性TF(sTF)及び0.5mM発色性基質S-2288(H-D-Ile-Pro-Arg-pNa、Chromogenix社)を含有した。可溶性組織因子1-219(sTF)を、公開されている手順に従って調製した(Freskgardら、1996年)。これまでに説明されているように、組換えFVIIaの発現及び精製を実施した(Thimら、1988年; Persson及びNielsen、1996年)。活性をOD405nmの変化によって室温で測定し、TFPIの非存在下の活性を100%に設定した。FVIIa/sTF活性は、150nM TFPIα(配列番号1)の添加により阻害され、阻害は、表13に示すようにTFPI(1〜79)に対する様々な抗体200nMによって逆転された。TFPI(1〜79)に対する一部の抗体(1F91、2F3、2F22、2F45)は、これらの条件下でFVIIa/sTFのTFPIα阻害を逆転させた。1つのTFPI(1〜79)抗体(2F35)及びKPI-2抗体(2021、WO2010/072691に開示されている)は、あまり効果がなかった。
FXa生成に対するTFPI(1〜79)に特異的な抗体の効果
FXa生成のTFPIα阻害に対する抗TFPI抗体の効果を、50mM HEPES、pH7.4、100mM NaCl、10mM CaCl2、1mg/mL BSA、0.1% PEG8000(w/v)を含有する緩衝液中でアッセイした。抗体(64nM)を、4nM TFPIαと室温で10分間インキュベートした後、プレインキュベート(5分間)したFVIIa(0.5nM)と30pM Dade Innovin(Dade Behring社)との混合物を添加した。これまでに説明されているように、組換えFVIIaの発現及び精製を実施した(Thimら、1988年; Persson及びNielsen、1996年)。160nM FX (Enzyme Research Laboratories Ltd社)の添加後に、反応物を、全容積100mLで30分間インキュベートした。反応を、停止緩衝液(50mM HEPES、pH7.4、100mM NaCl、80mM EDTA)50mLの添加によってクエンチし、生成したFXaの量を、2mM発色性基質S-2765(Chromogenix社)50mLの添加により決定した。S-2765の切断を、Spectramax 340マイクロプレート分光光度計を使用して405nmでモニタリングした。TFPIαの非存在下の活性を100%に設定し、TFPIα存在下であるが抗体が非存在下の活性を0%に設定した。結果は、抗TFPI(1〜79)抗体2F22及び2F3が、FXa生成のTFPIα阻害を最も効果的に中和することを示唆している(表14)。予想通り、TFPI KPI-2抗体(mAb 2021、WO2010/072691に開示されている)は、TFPI阻害を完全に中和した。
FVIII中和全血におけるトロンボエラストグラフィー(TEG)に対するTFPI(1〜79)特異的TFPI抗体の効果
クエン酸安定化した全血を、(最終濃度):100μg/mLヒツジ抗ヒトFVIII抗体(Haematologic Technologies Inc.社、PAHFVIII-S)及び0.3pM TF[Innovin(登録商標)、1:20,000]で補充した。この予混合物320μLを、0.2M CaCl2 20μLを含有するトロンボエラストグラフカップへ移したとき、100nM TFPI抗体の非存在下又は存在下で凝固が開始された。TEG出力波形を、最大120分間連続的に追跡した(5000シリーズTEG分析装置、Haemoscope Corporation社、ナイルズ、イリノイ州、米国)。以下のTEG変数を記録した:R時間(凝固時間、即ち凝固の開始から2mmの振幅が得られるまでの時間)、MTG(トロンビン生成の最大速度)、角度(R値とTEG出力波形の変曲点の間の角度として測定される凝血塊の発達)及びMA(凝血塊の最大機械強度を反映するTEG出力波形の最大振幅)。結果は、全てでないが一部のTFPI抗体が、凝固時間(R値)を短縮し、参照TFPI KPI-2抗体(mAb 2021、WO2010/072691に開示されている)のと同程度にトロンビン生成の最大速度(MTG)、角度及び最大振幅(MA)を高めたことを示す(表15)。
Claims (6)
- ヒトTFPI(配列番号1)のアミノ酸残基1〜79に存在するエピトープに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
重鎖が、
・配列番号4のアミノ酸31〜35(SYGVH)であるCDR1配列、
・配列番号4のアミノ酸50〜65(VIWRGGSTDFNAAFMS)であるCDR2配列、及び
・配列番号4のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)であるCDR3配列
を含み、
軽鎖が、
・配列番号5のアミノ酸24〜34(KASENVGAAVA)であるCDR1配列、
・配列番号5のアミノ酸50〜56(SASNRYT)であるCDR2配列、及び
・配列番号5のアミノ酸89〜96(QQYTNYPT)であるCDR3配列
を含み、前記抗原結合フラグメントが、ヒトTFPI(配列番号1)のアミノ酸残基1〜79に存在するエピトープに特異的に結合しTFPI活性を阻害する能力を維持している、抗体又はその抗原結合フラグメント。 - ヒトTFPI(配列番号1)のアミノ酸残基1〜79に存在するエピトープに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
重鎖が、
・配列番号6のアミノ酸31〜35(NYGVH)であるCDR1配列、
・配列番号6のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)であるCDR2配列、及び
・配列番号6のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)であるCDR3配列
を含み、
軽鎖が、
・配列番号7のアミノ酸24〜34(KASQSVGPAVA)であるCDR1配列、
・配列番号7のアミノ酸50〜56(SASNRYT)であるCDR2配列、及び
・配列番号7のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)であるCDR3配列
を含み、前記抗原結合フラグメントが、ヒトTFPI(配列番号1)のアミノ酸残基1〜79に存在するエピトープに特異的に結合しTFPI活性を阻害する能力を維持している、抗体又はその抗原結合フラグメント。 - Fab、Fab'、Fab2、Fab'2、FabS、Fv、単鎖Fv(scFv)、及びdsFvフラグメントからなる群から選択され、単離されたCDR又は抗原結合残基若しくはポリペプチドが、機能的な抗体フラグメントを形成するように、一緒に会合又は連結されることができる、請求項1又は2に記載の抗原結合フラグメント。
- 請求項1から3のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメントと、少なくとも1つの薬学的に許容できる賦形剤とを含む、医薬製剤。
- 医薬としての使用のための、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント又は請求項4に記載の医薬製剤。
- 先天性、後天性及び/又は医原性凝血障害を治療するための、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は請求項4に記載の医薬製剤。
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