TWI476003B - 能夠特異性結合tfpi之k2域的單株抗體、表現其的真核細胞、包含其的醫藥組成物、及其醫藥用途 - Google Patents

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Description

能夠特異性結合TFPI之K2域的單株抗體、表現其的真核細胞、包含其的醫藥組成物、及其醫藥用途
本發明係關於一種可特異性結合組織因子路徑抑制子(TFPI)之抗體。
在患有凝血障礙之個體中，諸如在患有A型及B型血友病之人類中，凝血級聯之多個步驟由於例如凝血因子缺乏或凝血因子存在不足而變得功能異常。凝血級聯中之一部分之此功能異常引起凝血不足及可能危脅生命之出血，或對內部器官(諸如關節)之損害。患有A型及B型血友病之個體(諸如人類)可分別接受諸如外生FVIIIa或FIXa之凝血因子置換療法。然而，此等患者處於產生針對此等外生因子之「抑制子」(抗體)的風險中，致使先前有效之療法無效。此外，外生凝血因子僅可靜脈內投予，此對患者相當不便及不適。舉例而言，對嬰兒及學步童須以手術方式將靜脈內導管插入胸部靜脈中以確保通入靜脈。此使得其處於產生細菌感染之巨大風險中。患有凝血障礙之個體僅會在已開始出血之後接受治療，而非當作預防措施，此往往影響其總體生活品質。
因此，尤其在血友病群體中，及一般在患有凝血障礙之個體中仍存在許多未滿足之醫學需要。
當血管壁受損時，組織因子(TF)暴露於循環血液之內含物且TF與因子Vll/活化之因子VII(FVII/FVIIa)在帶有TF之細胞表面上形成複合物。此使得因子X(FX)活化為FXa，FXa與FVa一起產生有限量之凝血酶(FIIa)。少量凝血酶活化血小板，引起磷脂暴露於表面，促進由FVIIIa/FIXa組成之因子X酶複合物之結合。
因子X酶複合物產生大量FXa，隨後促進大量凝血酶產生。大量凝血酶產生係形成機械穩固之血纖維蛋白結構及止血栓穩定化所必需。血友病患者中缺乏或存在低含量之FVIII或FIX，且由於缺乏因子X酶活性而產生FXa之能力較低且不足以促進傳播期之凝血。相反，TF介導之初始期並不依賴於因子X酶複合物之形成。然而，TF路徑在初始FXa產生之後不久被血漿抑制子阻斷。
組織因子路徑抑制子(TFPI)藉由中和FXa之催化活性且藉由在FXa存在下抑制TF-FVIIa複合物來下調正在進行之凝血。TFPI抑制細胞表面上之TF/FVIIa/FXa複合物或抑制FXa釋放，繼而抑制FVIIa/TF。
本發明之發明人已鑑定出可特異性結合組織因子路徑抑制子(「TFPI」，有時稱作「TFPI1」)且從而調節其活性之單株抗體。本發明係關於此等抗體及衍生自此等抗體或與此等抗體具有類似結合特性之其他相關抗體。
因此，本發明係關於一種可特異性結合組織因子路徑抑制子(TFPI)且減少例如(a)人類FVIII不足血漿及/或(b)人類全血之凝結時間之抗體。
一種抗體包含SEQ ID NO: 4之輕鏈可變區及SEQ ID NO: 8之重鏈可變區。另一種抗體包含SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區及SEQ ID NO: 18之重鏈可變區。
本發明亦提供編碼本發明之抗體的聚核苷酸，諸如編碼本發明之抗體輕鏈及/或抗體重鏈之聚核苷酸。
本發明亦提供醫藥組成物，其包含本發明之抗體或聚核苷酸，及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
本發明之抗體、聚核苷酸及組成物亦可供(a)治療或預防凝血障礙(出血病症)或(b)刺激凝血使用。亦即，本發明提供一種(a)治療或預防凝血障礙(出血病症)或(b)刺激凝血之方法，該方法包含向有需要之患者投予治療或預防有效量之本發明之抗體、聚核苷酸或組成物。
此外，本發明提供本發明之該單株抗體的給藥攝生法。
序列表簡單說明
SEQ ID NO: 1顯示人類TFPI之胺基酸序列(信號肽序列省略)。
SEQ ID NO: 2顯示測定抗體之結合性抗原決定基所用的構築體之胺基酸序列。該構築體包含人類TFPI的胺基酸91至150及C端His6 標記。
SEQ ID NO: 3、5及4顯示MuTFPI4F36(TFPI-4F36A1B2)單株抗體之輕鏈可變域(VL)之聚核苷酸(有義及反義)及多肽序列。SEQ ID NO: 6顯示MuTFPI4F36(TFPI-4F36A1B2)單株抗體之輕鏈的胺基酸序列。信號肽序列省略。
SEQ ID NO: 7、9及8顯示MuTFPI4F36(TFPI-4F36A1B2)單株抗體之重鏈可變域(VH)之聚核苷酸(有義及反義)及多肽序列。SEQ ID NO: 10顯示MuTFPI4F36(TFPI-4F36A1B2)單株抗體之重鏈的胺基酸序列。信號肽序列省略。
SEQ ID NO: 11顯示用於重鏈可變域擴增之反向引子之序列且SEQ ID NO: 12顯示用於輕鏈擴增之反向引子之序列。
SEQ ID NO: 13-15分別提供人類化單株抗體HzTFPI4F36(mAbTFPI2021)之輕鏈可變域(VL)之有義聚核苷酸、反義聚核苷酸及多肽序列。信號肽序列省略。
SEQ ID NO: 16-18分別提供人類化單株抗體HzTFPI4F36(mAbTFPI2021)之重鏈可變域(VH)之有義聚核苷酸、反義聚核苷酸及多肽序列。
SEQ ID NO: 19-21分別提供人類化單株抗體HzTFPI4F36(mAbTFPI2021)之輕鏈(LC)之有義聚核苷酸、反義聚核苷酸及多肽序列。
SEQ ID NO: 22-24分別提供人類化單株抗體HzTFPI4F36(mAbTFPI2021)之重鏈(HC)之有義聚核苷酸、反義聚核苷酸及多肽序列。信號肽序列省略。
SEQ ID NO: 25-26分別提供CDR移植HzTFPI4F36之輕鏈可變域的核酸及胺基酸序列。信號肽序列省略。
SEQ ID NO: 27-28分別提供CDR移植HzTFPI4F36之重鏈可變域的核酸及胺基酸序列。信號肽序列省略。
SEQ ID NO: 29提供CDR移植HzTFPI4F36(人類κ鏈)之輕鏈的胺基酸序列。信號肽序列省略。
SEQ ID NO: 30提供CDR移植HzTFPI4F36(為人類IgG4(S241P))之重鏈的胺基酸序列。信號肽序列省略。
SEQ ID NO: 31提供用於MuTFPI4F36之輕鏈人類化的生殖系序列VKII_A18/JK4。信號肽序列省略。
SEQ ID NO: 32提供用於MuTFPI4F36之重鏈人類化的生殖系序列VH3_21/JH6。信號肽序列省略。
SEQ ID NO: 33提供MuTFPI4F36A1B2重鏈Fab之胺基酸序列。信號肽省略。
SEQ ID NO: 34提供HzTFPI4F36重鏈Fab之胺基酸序列。信號肽省略。
本發明係關於可結合TFPI之抗體。抗體較佳特異性結合TFPI，亦即其可結合TFPI，但不結合其他分子或以較低親和力結合其他分子。特定言之，本發明係關於可結合TFPI且調節其活性之抗體。本發明之抗體因此可具有縮短凝血時間之能力。舉例而言，本發明之抗體可具有縮短人類FVIII不足血漿之凝結時間或減少人類全血之凝結時間(如在血栓彈力圖(thromboelastography，TEG)分析中所量測的)之能力。本發明亦關於此等抗體之用途，諸如治療及醫藥用途。
如本文中所用，術語TFPI涵蓋可來源於任何適合生物體的任何天然存在形式之TFPI。舉例而言，用於如本文所述之用途的TFPI可為哺乳動物TFPI，諸如人類、小鼠、大鼠、靈長類動物、牛、羊或豬TFPI。TFPI較佳為人類TFPI。TFPI可為成熟形式之TFPI，諸如已在適合細胞內經歷轉譯後加工之TFPI蛋白質。此成熟TFPI蛋白質可例如經糖基化。TFPI可為全長TFPI蛋白質。術語TFPI亦涵蓋此等TFPI分子之變異體、同功異構物及其他同源物。變異體TFPI分子一般特徵在於與天然存在之TFPI具有相同類型之活性，諸如中和FXa之催化活性的能力，或抑制TF-FVIIa/FXa複合物之能力。
本發明之抗體具有與TFPI結合之能力。本發明之抗體較佳特異性結合TFPI。亦即，本發明之抗體結合TFPI的親和力較佳大於其結合另一種分子之結合親和力。本發明之抗體能夠結合或特異性結合如本文所述之TFPI分子，諸如本文所述之任何標靶分子。
術語「結合親和力」在本文中用作兩種分子(例如抗體或其片段與抗原)之間非共價相互作用力之度量。術語「結合親和力」用以描述單價相互作用(固有活性)。
兩種分子(例如抗體或其片段與抗原)之間經由單價相互作用的結合親和力可藉由測定解離常數(KD )來定量。KD 又可藉由量測複合物形成及解離之動力學(例如藉由SPR方法(Biacore))來測定。對應於單價複合物之結合及解離之速率常數分別稱作結合速率常數ka (或kon )及解離速率常數kd (或koff )。KD 經由等式KD =kd /ka 與ka 及kd 關聯。
依據上述定義，可藉由比較個別抗體/抗原複合物之KD 值來比較與不同分子間相互作用相關之結合親和力，例如比較不同抗體對給定抗原之結合親和力。
類似地，可藉由測定及比較相關相互作用(例如抗體與抗原之間的特異性相互作用)之KD 值與不相關相互作用之KD 值來評估相互作用之特異性。
典型地，抗體對於標靶之KD 為對於其他非標靶分子(諸如環境中之無關物質或隨附物質)之KD 的1/2，較佳1/5，更佳1/10。KD 更佳為1/50，諸如1/100，或1/200；甚至更佳1/500，諸如1/1,000，或1/10,000。
此解離常數值可藉由熟知方法直接測定，且即使對於複雜混合物，可藉由諸如Caceci等人(Byte 9:340-362,1984)中所述之方法計算。舉例而言，可使用雙濾膜硝化纖維素濾膜結合檢定(諸如Wong及Lohman(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,5428-5432,1993)所揭示者)來確定KD 。評估諸如抗體之配位體對標靶之結合能力的其他標準檢定在此項技術中已知，包括例如ELISA、西方墨點法(Western blot)、RIA及流式細胞量測分析。亦可藉由此項技術中已知之標準檢定(諸如表面電漿共振(SPR)，例如使用BiacoreTM 系統)評估抗體之結合動力學及結合親和力。
可進行競爭結合檢定，其中將抗體對標靶之結合與該標靶之另一種配位體(諸如另一種抗體)對該標靶之結合比較。發生50%抑制之濃度稱為Ki。在理想條件下，Ki等於KD 。Ki值決不會小於KD ，因此宜將Ki量測值代入以提供KD 上限。
本發明之抗體對其標靶可具有1×10-7 M或1×10-7 M以下、1×10-8 M或1×10-8 M以下或1×10-9 M或1×10-9 M以下或1×10-10 M或1×10-10 M以下或1×10-11 M或1×10-11 M以下或1×10-12 M或1×10-12 M以下之KD (或Ki)。
特異性結合其標靶之抗體可以高親和力(亦即，呈現如上所述之低KD )結合其標靶，且可以較低親和力結合其他非標靶分子。舉例而言，抗體可以1×10-6 M或1×10-6 M以上，更佳1×10-5 M或1×10-5 M以上，更佳1×10-4 M或1×10-4 M以上，更佳1×10-3 M或1×10-3 M以上，甚至更佳1×10-2 M或1×10-2 M以上之KD (或Ki)結合非標靶分子。本發明之抗體能夠結合其標靶的親和力較佳為結合其他非標靶分子之親和力的至少2倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或1000倍以上。
標靶分子可為如本文所述之任何TFPI分子，諸如天然存在之TFPI分子、完全成熟TFPI分子或全長TFPI分子。較佳TFPI分子為完全成熟、天然存在之全長哺乳動物TFPI分子。舉例而言，TFPI分子可由如本文所述之SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或其片段或其他變異體組成或可包含如本文所述之SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或其片段或其他變異體。
標靶分子可為TFPI分子之變異體，諸如TFPI分子之片段。舉例而言，標靶分子可為保留適於抗體結合之抗原決定基的TFPI片段或其他變異體。舉例而言，標靶分子可為保留如本文所述之抗原決定基的TFPI片段或其他變異體。標靶分子可包含此抗原決定基。
在一具體實例中，標靶分子為全長TFPI分子。全長TFPI分子可包含如本文所述之第一、第二及第三Kunitz域。全長TFPI分子可包含如本文所述之第一、第二及第三Kunitz域以及如本文所述之羧基端區域。全長TFPI分子可為天然存在之TFPI分子，諸如自TFPI基因表現或由TFPI表現細胞分泌之全長TFPI多肽。全長TFPI分子可為發現呈自由形式在血漿中循環或與細胞(諸如內皮細胞)結合的天然存在之TFPI分子。全長TFPI分子不為截斷TFPI分子，諸如本文所述之天然存在之截斷TFPI分子。
在一具體實例中，標靶分子為截斷TFPI分子。舉例而言，截斷TFPI分子可包含羧基端截斷。舉例而言，已知許多天然存在之截斷形式之TFPI。此等形式可包含TFPI之部分或所有羧基端部分之截斷。其可進一步包含一或多個Kunitz域之一部分或所有者之截斷。舉例而言，截斷形式TFPI可包含羧基端部分及部分或所有第三Kunitz域之缺失。
舉例而言，一種天然存在之截斷形式之TFPI僅包含全長TFPI分子之胺基酸1至161(本文中稱作TFPI(1-161))。TFPI(1-161)為活性形式之TFPI，其活性低於全長分子。TFPI(1-161)在結構上不同於全長TFPI且針對TFPI(1-161)標靶分子產生之抗體因此可不同於針對全長TFPI產生之抗體。
當需要抗體靶向全長TFPI之存在於TFPI(1-161)中之區域時，截斷形式之TFPI可為適當標靶分子。然而，當需要抗體靶向特定截斷形式之TFPI(諸如天然存在之截斷TFPI)時，較佳將截斷TFPI用作標靶分子。
在一具體實例中，標靶分子為天然存在形式之TFPI。其可以其活體內存在之形式使用。舉例而言，標靶分子可為如上文所討論之全長天然存在之TFPI。標靶分子可為如上文所討論的截斷之天然存在之TFPI。標靶分子可為其活體內存在於血漿中之形式的TFPI。標靶分子可為結合脂蛋白之方式與活體內存在於血漿中之TFPI相同的TFPI。標靶分子可為結合細胞之方式與活體內存在之TFPI相同的TFPI，諸如結合內皮細胞之TFPI。本發明之抗體可結合任一種或多種此等天然存在形式之TFPI。本發明之抗體能夠結合所有此等天然存在形式之TFPI，或能夠區分此等不同形式，從而結合一些TFPI而非其他者。
在一具體實例中，標靶分子為或包含TFPI之第二Kunitz域。此標靶分子可包含SEQ ID NO: 1之胺基酸97至147或SEQ ID NO: 1之胺基酸91至150，或來自另一TFPI多肽之等效Kunitz域2區域。此標靶分子可包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 2之胺基酸3至58或10至50。標靶分子可為或可包含TFPI之第二Kunitz域之片段。舉例而言，標靶分子可包含五個或五個以上、八個或八個以上、十個或十個以上、十二個或十二個以上，或十五個或十五個以上來自第二Kunitz域之胺基酸。
標靶分子可包含TFPI或TFPI之特定區域(諸如TFPI之特定Kunitz域或C端部分)的五個或五個以上、八個或八個以上、十個或十個以上、十二個或十二個以上，或十五個或十五個以上表面可達殘基。表面可達殘基為具有大於40%相對可達性之殘基。舉例而言，對於TFPI之Kunitz 2域(SEQ ID NO:1)，以下胺基酸具有大於40%相對可達性：94-95、98、100-110、118-121、123-124、131、134、138-142及144-145(參看圖5)。標靶分子可包含五個或五個以上、八個或八個以上、十個或十個以上、十二個或十二個以上，或十五個或十五個以上此等殘基，諸如包括五個或五個以上、八個或八個以上、十個或十個以上、十二個或十二個以上，或十五個或十五個以上此等殘基的TFPI片段。
標靶分子可包含來自TFPI之已知抗原決定基。
如本文中所用，術語「抗原決定基」係在「抗原結合多肽」(Ab)與其相應「抗原」(Ag)之間之分子間相互作用的情形下加以定義。如本文中所用，術語Ab包含特異性結合相應Ag之抗體或其片段。抗原結合片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)S、Fv(典型地為抗體之單臂的VL及VH域)、單鏈Fv(scFv；參看例如Bird等人,Science 1988;242:42S-426；及Huston等人,PNAS 1988;85:5879-5883)、dsFv、Fd(典型地為VH及CHI域)，及dAb(典型地為VH域)片段；VH、VL、VhH，及V-NAR域；包含單VH鏈及單VL鏈之單價分子；微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體，及κ體(參看例如Ill等人，Protein Eng 1997;10:949-57)；駱駝IgG；IgNAR；以及一或多種分離之CDR或功能性互補位，其中分離之CDR或抗原結合殘基或多肽可結合或連接在一起以便形成功能性抗體片段。各種類型之抗體片段已描述或評述於例如Holliger及Hudson,Nat Biotechnol 2005;2S: 1126-1136；WO2005 040219，及公開之美國專利申請案20050238646及20020161201中。
可使用習知重組或蛋白質工程技術獲得抗體片段，且可針對抗原結合或其他功能、以與完整抗體相同之方式篩選片段。
術語抗原(Ag)係指用於使免疫力健全脊椎動物免疫以產生識別Ag之抗體(Ab)的分子實體。在本文中，Ag為泛稱且一般意欲包括由Ab特異性識別之標靶分子，因此包括用於產生Ab之免疫方法中的分子之片段或模擬物。因此，Ab可結合的TFPI之第二kunitz域(K2)、分離之K2、全長TFPI(包括截斷TFPI)與TFPI之其他變異體稱作Ag。
術語「抗原決定基」一般係指Ag上可供Ab特異性結合之之區域或區，亦即與Ab實體接觸之區域或區。蛋白質抗原決定基可包含Ag中直接涉及結合Ab之胺基酸殘基(亦稱為抗原決定基之免疫顯性組份)，及不直接涉及結合之其他胺基酸殘基，諸如Ag中被Ab有效封阻之胺基酸殘基(換言之，胺基酸殘基位於Ab之「溶劑排斥表面」及/或「足跡」內)。在本文中，除非另作說明(例如在有些情形下，本發明係關於可直接結合特定胺基酸殘基之抗體)，否則術語抗原決定基包括可特異性結合抗TFPI抗體或本發明之另一種K2特定藥劑之TFPI之K2之任何特定區域中的兩種類型結合位點。K2可包含許多不同抗原決定基，其可包括(不限於)(1)線性肽抗原決定子、(2)由一或多個以成熟K2構形彼此靠近定位之非鄰接胺基酸組成的構形抗原決定子；及(3)轉譯後抗原決定子，其完全或部分地由與K2共價連接之分子結構(諸如碳水化合物基團)組成。
給定抗體(Ab)/抗原(Ag)對之抗原決定基可使用多種實驗及計算性抗原決定基定位法、在不同細微層面加以定義及特性化。實驗方法包括突變誘發、X射線結晶學、核磁共振(NMR)光譜學、氫氘交換質譜分析(HX-MS)及各種競爭結合法。因為各種方法所依賴的原理獨特，所以抗原決定基之描述與測定其之方法緊密關聯。因此，視所採用之抗原決定基定位法而定，給定Ab/Ag對之抗原決定基將以不同方式加以定義。
在其最細微之層面上，用於Ag與Ab之間相互作用的抗原決定基可依據定義Ag-Ab相互作用中存在之原子接觸的空間座標以及有關其對結合熱力學之相對作用的資訊加以定義。在較不細微之層面上，抗原決定基可依據定義Ag與Ab之間原子接觸的空間座標加以特性化。在更不細微之層面上，抗原決定基可依據其所包含之胺基酸殘基加以特性化，如依據特定標準(例如Ab與Ag中原子之間的距離)加以定義。在更不細微之層面上，抗原決定基可經由功能(例如與其他Ab競爭結合)加以特性化。抗原決定基亦可更一般性地定義為所包含的胺基酸殘基經另一胺基酸取代將改變Ab與Ag之間的相互作用特徵。
在Ab(例如Fab片段)與其Ag之間之複合物的X射線衍生晶體結構依據空間座標定義的情形下，除非另有規定或與上下文抵觸，否則術語抗原決定基在本文中特定地定義為特徵在於其中重原子(亦即非氫原子)與Ab中重原子之距離小於4的K2殘基。
根據抗原決定基之說明及定義(視所用抗原決定基定位法而定)可在不同細微層面獲得之事實，可得出結論：相同Ag上針對不同Ab之抗原決定基可類似地在不同細微層面加以比較。
在胺基酸層面描述之抗原決定基(例如依據X射線結構所測定)若含有同類胺基酸殘基則可稱為相同。若抗原決定基共有至少一個胺基酸，則稱抗原決定基可重疊。若抗原決定基無共同的胺基酸殘基，則稱抗原決定基為獨立的(唯一的)。
由競爭結合加以特性化之抗原決定基若相應Ab之結合具互斥性(亦即，一種Ab之結合排斥另一種Ab之同時結合)則稱為重疊。若Ag能夠供兩種相應Ab同時結合，則抗原決定基稱為獨立的(唯一的)。
反過來看，可自上文「抗原決定基」之定義獲得術語「互補位(paratope)」之定義。因此，術語「互補位」係指Ab上可供Ag特異性結合(亦即可與Ag實體接觸)之區域或區。
在Ab(例如Fab片段)與其Ag之間之複合物之X射線衍生晶體結構依據空間座標加以定義的情形下，除非另有規定或與上下文有抵觸，否則術語互補位在本文中特定地定義為特徵在於其中重原子(亦即非氫原子)與K2中重原子之距離小於4的Ag殘基。
給定抗體(Ab)/抗原(Ag)對之抗原決定基及互補位可藉由常規方法鑑定。舉例而言，抗原決定基之一般位置可藉由評估抗體與不同片段或變異體TFPI多肽結合之能力來測定。TFPI內可接觸抗體之特定胺基酸(抗原決定基)及抗體內可接觸TFPI之特定胺基酸(互補位)亦可使用常規方法(諸如實施例中所述者)來測定。舉例而言，可將抗體與標靶分子組合且可使Ab/Ag複合物結晶。複合物之晶體結構可加以測定且用以鑑定在抗體與其標靶之間相互作用的特異性位點。
本發明之發明人已對本文所述之鼠類MuTFPI4F36抗體以及人類化HzTFPI4F36抗體與TFPI之Kunitz 2域(K2)之間之相互作用執行過此分析。此分析詳述於實施例中。
本發明之抗體的互補位可如下加以定義：該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO: 15之殘基E31、S32、D33、Y37、A96、T97及F99，且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO 18之殘基N31、S52、R53、S54、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103及D106。
本發明之抗體的輕鏈因此可包含以下胺基酸殘基：
‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置31的位置包含E，
‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置32的位置包含S，
‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置33的位置包含D，
‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置37的位置包含Y，
‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置96的位置包含A，
‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置97的位置包含T，及
‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置99的位置包含F；
且該抗體之重鏈可包含以下胺基酸殘基：
‧在對應於SEQ ID NO 18之位置31的位置包含N，
‧在對應於SEQ ID NO 18之位置53的位置包含R，
‧在對應於SEQ ID NO 18之位置54的位置包含S，
‧在對應於SEQ ID NO 18之位置57的位置包含Y，
‧在對應於SEQ ID NO 18之位置59的位置包含Y，
‧在對應於SEQ ID NO 18之位置60的位置包含F，
‧在對應於SEQ ID NO 18之位置61的位置包含P，
‧在對應於SEQ ID NO 18之位置62的位置包含D，
‧在對應於SEQ ID NO 18之位置65的位置包含Q，
‧在對應於SEQ ID NO 18之位置102的位置包含Y，
‧在對應於SEQ ID NO 18之位置103的位置包含D，及
‧在對應於SEQ ID NO 18之位置106的位置包含D。
重鏈可進一步在對應於SEQ ID NO: 18之位置52的位置包含S。
本發明之抗體的輕鏈可進一步在對應於SEQ ID NO: 15之位置98的位置包含H，且重鏈可進一步在對應於SEQ ID NO: 18之位置56的位置包含S。
針對MuTFPI4F36(實施例4)之抗原決定基經發現由以下者構成：SEQ ID NO: 1之胺基酸E100、E101、P103、R107、Y109、T111、Y113、Q118、Q121、E123、R124、F125、K126及L140，其對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸E10、E11、P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36及L50。互補位經發現由以下者構成：SEQ ID NO: 4之輕鏈胺基酸殘基E31、S32、D33、Y37、A96、T97、H98及F99，及SEQ ID NO 8之重鏈胺基酸殘基N31、R53、S54、S56、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103及D106。
針對HzTFPI4F36(實施例5)之抗原決定基經發現由以下者構成：SEQ ID NO: 1之胺基酸E100、E101、D102、P103、R107、Y109、T111、Y113、F114、N116、Q118、Q121、C122、E123、R124、F125、K126及L140，其對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、K36及L50。互補位經發現由以下者構成：SEQ ID NO: 15之輕鏈胺基酸殘基E31、S32、D33、Y37、A96、T97及F99，及SEQ ID NO 18之重鏈胺基酸殘基N31、S52、R53、S54、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103及D106。
本發明之抗體可與本文具體揭示之本發明抗體結合TFPI之相同抗原決定基或域。舉例而言，其他尚未鑑定之本發明抗體可如下鑑定：比較其與TFPI之結合和單株抗體、MuTFPI4F36及/或HzTFPI4F36與TFPI之結合；或比較尚未鑑定之抗體的功能與MuTFPI4F36及/或HzTFPI4F36之功能。可用於此鑑定目的的分析及檢定包括TFPI中和檢定，諸如：實施例6中所述之FXa抑制檢定及實施例7中所述之FVIIa/TF/FXa抑制檢定；結合相互作用分析，諸如實施例8中所述之表面電漿共振分析；細胞檢定，諸如中和人類臍血管內皮細胞(HUVEC)上TFPI(實施例9中所述)，及中和TFPI對MDA-MB 231人類乳癌細胞上TF/FVIIa活性之抑制(實施例10中所述)。
在一具體實例中，本發明之抗體可與本文所述之MuTFPI4F36或HzTFPI4F36抗體結合相同抗原決定基或區域。MuTFPI4F36及HzTFPI4F36與TFPI之結合詳述於本文中。本發明之抗體可為與MuTFPI4F36或HzTFPI4F36抗體結合TFPI中之相同抗原決定基的抗體。此可包括其與如上所述之TFPI的特定胺基酸接觸。舉例而言，本發明之抗體可以其與SEQ ID NO:2之胺基酸E10、E11、P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36及L50接觸之方式或以其與SEQ ID NO: 2之胺基酸E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、K36及L50接觸之方式結合TFPI。
本發明之抗體能夠結合包含一或多個殘基之抗原決定基，該等殘基選自由SEQ ID NO: 2之E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、F35、K36及L50所組成之群組。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基E10的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基E11的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基D12的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基P13的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基R17的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基Y19的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基T21的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基Y23的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基F24的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO:2之殘基N26的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO:2之殘基Q28的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO:2之殘基Q31的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO:2之殘基C32的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO:2之殘基E33的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO:2之殘基R34的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO:2之殘基F35的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO:2之殘基K36的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO:2之殘基L50的抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO:2之殘基E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、K36及L50之抗原決定基。
本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO:2之殘基E10、E11、P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36及L50之抗原決定基。
本發明之抗體可具有與本發明之另一種抗體競爭結合TFPI或如本文所述之另一適當標靶之能力。舉例而言，本發明之抗體可與本文所述之MuTFPI4F36或HZTFPI4F36抗體交叉競爭結合TFPI，或結合與MuTFPI4F36或HzTFPI4F 36抗體結合之TFPI適合片段或變異體。此等交叉競爭抗體可依據其在標準結合檢定中與本發明之已知抗體交叉競爭之能力來鑑定。舉例而言，可使用SPR(例如使用BiacoreTM 系統)、ELISA檢定或流式細胞量測術顯示交叉競爭。此交叉競爭可表明兩種抗體可結合相同、重疊或相似之抗原決定基。
因此，本發明之抗體能夠以高於任一或多種以下市售單株抗體之親和力結合TFPI之K2域：mAb0281(Ab systems)及/或mAb4904(American Diagnostica)及/或mAb2974(R＆D systems)及/或mAb29741(R＆D systems)。
本發明之抗體因此可藉由包含結合檢定之方法鑑定，該結合檢定評估測試抗體是否能夠與本發明之已知抗體競爭標靶分子上之結合位點。進行競爭結合檢定之方法在此項技術中已熟知。舉例而言，其可包括使用抗體可與標靶分子結合之條件使本發明之已知抗體結合標靶分子。接著可使抗體/標靶複合物暴露於測試抗體且可評估測試抗體能夠自抗體/標靶複合物置換本發明抗體之程度。一種替代性方法可包括使測試抗體與標靶分子在允許抗體結合之條件下接觸，接著添加能夠結合該標靶分子之本發明抗體，且評估本發明抗體能夠自抗體/標靶複合物置換測試抗體之程度。
測試抗體抑制本發明抗體與標靶結合之能力顯示該測試化合物可與本發明抗體競爭結合標靶，且從而顯示測試抗體與本發明之已知抗體結合TFPI蛋白質之相同抗原決定基或區域。經此方法鑑定可與本發明之已知抗體競爭的測試抗體亦為本發明之潛在抗體。測試抗體可與本發明之已知抗體結合TFPI之相同區域且與本發明之已知抗體競爭的事實表明，測試抗體可與已知抗體充當相同結合位點之配位體且測試抗體因此可模擬已知抗體之作用。此可藉由評估TFPI在如本文所述之測試化合物存在下之活性來確定。
本發明之已知抗體可為如本文所述之抗體，諸如鼠類TFPI-4F36A1B2(亦稱作4F36及MuTFPI4F36)抗體，或如本文所述之保留與TFPI結合之能力的其任何變異體或片段，諸如人類化TFPI-4F36A1B2抗體，其中一者在本文中稱作HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)。本發明之抗體可與本文所述之MuTFPI4F36抗體或與本文所述之保留與TFPI結合之能力的其任何變異體或片段(諸如HzTFPI4F36)結合相同抗原決定基。
本發明之抗體可結合與實施例中進一步描述之MuTFPI4F36抗原決定基相同、重疊或相似的抗原決定基。本發明之抗體可結合與實施例中進一步描述之HzTFPI4F36抗原決定基相同、重疊或相似的抗原決定基。本發明之抗體可結合(較佳特異性結合)一或多個屬於MuTFPI4F36及/或HzTFPI4F36之抗原決定基的胺基酸殘基。舉例而言，本發明之抗體可結合五個或五個以上、六個或六個以上、七個或七個以上、八個或八個以上，或十個或十個上文針對MuTFPI4F36或HzTFPI4F36之結合所述的胺基酸殘基。舉例而言，本發明之抗體當接觸SEQ ID NO: 2之多肽時，可結合該多肽且接觸胺基酸E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、F35、K36及L50，或彼等胺基酸之亞群，諸如至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個或至少18個彼等胺基酸。
可參考抗體與非標靶分子的結合來評估特異性結合。可藉由比較抗體結合標靶之能力與結合另一種分子之能力進行此比較。此比較可如上所述依據KD 或Ki評估來進行。用於此比較中之其他分子可為非標靶分子之任何分子。其他分子較佳與標靶分子不相同。標靶分子較佳不為標靶分子之片段。
本發明之抗體的KD 可小於0.8nM，諸如小於0.7nM，諸如小於0.6nM，諸如小於0.5nM，諸如小於0.4nM，諸如小於0.3nM，諸如小於0.2nM，諸如小於0.1nM，諸如小於0.05nM，諸如小於0.025nM，諸如小於0.015nM，諸如在0.015nM與0nM之間。
用以測定特異性結合之其他分子在結構或功能上可與標靶無關。舉例而言，其他分子可為環境中之無關物質或隨附物質。
用以測定特異性結合之其他分子可為所涉及之活體內路徑與標靶分子相同的另一種分子。舉例而言，當標靶為TFPI或其片段或變異體時，用於比較之其他分子可為形成凝血級聯之一部分的蛋白質。藉由確保本發明之抗體具有針對TFPI(而非另一種此類分子)之特異性，可避免不期望有之活體內交叉反應性。
用於比較之其他分子可與標靶分子有關。舉例而言，當需要鑑定僅結合特異性抗原決定基之抗體時，供比較之其他分子可為該抗原決定基缺乏或被破壞之TFPI分子。用於比較之其他分子因此可為不同於所討論之抗體結合之標靶分子的另一種標靶分子。
本發明之抗體可保留結合一些與標靶分子有關之分子的能力。舉例而言，可將全長成熟人類TFPI用作標靶，但抗體亦能夠結合例如未成熟形式之人類TFPI、片段或截斷形式之人類TFPI、與脂蛋白結合之TFPI，或來自其他物種之細胞或TFPI(諸如其他哺乳動物TFPI)。
或者，本發明之抗體可對特定標靶分子具有特異性。舉例而言，其可結合一種如本文所述之標靶分子，但可不結合或可以顯著降低之親和力結合如本文所述之不同標靶分子。舉例而言，可將全長成熟人類TFPI用作標靶，但結合該標靶之抗體可不能結合或可以較小親和力結合例如未成熟形式之人類TFPI、片段或截斷形式之人類TFPI、與脂蛋白結合之TFPI或來自其他物種之細胞或TFPI，諸如其他哺乳動物TFPI。
本發明之抗體可結合TFPI且因此可抑制TFPI活性。
如上文所說明，TFPI下調凝血。此舉藉由抑制FXa活性及藉由在FXa存在下抑制TF-FVIIa複合物來進行。本發明抗體抑制TFPI活性可為任何此等活性或其任何下游效應。舉例而言，本發明之抗體可引起凝血增強，FXa存在或含量提高或TF-FVIIa活性提高。本發明之抗體當與(a)人類FVIII不足血漿或(b)人類全血接觸時較佳減少凝血時間。
TFPI活性量測可包含在抑制血液樣本之凝血或減少血液樣本之凝結時間方面評估TFPI活性。舉例而言，此方法可包含使TFPI與血液樣本或血液產品(諸如包含凝血因子之血漿或血清)在發生凝血之條件下接觸，且測定是否因存在TFPI而凝血受抑制或凝血時間減少。接著可將此樣本之凝血程度或凝血時間與亦存在測試抗體之同等樣本之凝血程度或凝血時間相比較。若抗體樣本之凝血程度提高或凝血時間減少，則此表明抗體抑制樣本中TFPI之活性。
可藉由檢查血液本身之凝結、血漿之凝結，或位於TFPI作用點下游之凝血級聯之一或多種特徵來偵測凝血。舉例而言，該方法可評估樣本中FXa含量或TF-FVIIa活化。
評估凝血及凝血時間之各種其他方法在此項技術中已熟知。舉例而言，可使用如實施例中所述之稀釋凝血酶原時間分析法(dPT分析法)評估抗體對凝血時間之任何影響。簡言之，使人類血漿與人類凝血活素接觸。在測試抗體存在及不存在下量測血漿凝結所花費之時間。此分析中可使用陽性對照物，諸如添加預計可減少凝血時間之FVIIa(NovoSeven)。本發明之抗體應能夠在此方法中減少凝血時間。本發明之抗體較佳應能夠以劑量依賴性方式減少凝血時間。
本發明之抗體能夠在基於血漿之凝血檢定(諸如dPT分析法)中抑制TFPI，顯著優於任一或多種以下市售單株抗體：mAb0281(Ab systems)及/或mAb4904(American Diagnostica)及/或mAb2974(R&D systems)及/或mAb29741(R&D systems)。
血栓彈力圖可用以評估全血樣本中之凝血形成及纖維蛋白溶解之動力學。因此抗體在全血樣本中減少凝血時間或刺激凝血之能力可類似地藉由比較在抗體存在與不存在下凝塊形成所花費之時間來評估。
評估本發明抗體之功能性作用的方法因此可在試管內進行。此等方法較佳係對人類血液或血漿樣本進行。此等樣本可為正常人類血液或血漿或可缺乏或補充有一或多種涉及凝血之因子。舉例而言，此等方法可使用正常人類全血、正常人類血漿或FVIII不足血漿或全血來進行。FVIII不足血液或血漿可藉由使適合血液或血漿樣本與中和性抗FVIII抗體接觸來產生。此等試管內方法可為結合相互作用分析法或TFPI中和分析法，諸如實施例6-11中所述者。
本發明之抗體能夠抑制血小板相關TFPI。
本發明之抗體能夠抑制可溶性TFPI。
本發明之抗體能夠抑制結合脂蛋白之TFPI。
本發明之抗體能夠抑制結合細胞之TFPI，諸如與內皮細胞結合之TFPI。
本發明之抗體能夠結合TFPI，使得FXa保留其活性之至少91%、諸如至少92%、諸如至少93%、諸如至少94%、諸如至少95%、諸如至少96%、諸如至少97%、諸如至少 98%、諸如至少99%、諸如99-100%，如在FXa抑制檢定中所量測的。
當本發明抗體使TFPI飽和時，該抗體能夠將結合膜之FVIIa/TF/FXa之TFPI抑制中和至少55%、諸如至少60%、諸如至少65%、諸如至少70%、諸如至少75%、諸如至少80%、諸如至少85%、諸如至少90%、諸如至少95%、諸如多至100%，諸如100%，如在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中所量測的。
本發明之抗體較佳能夠在(a)人類全血、(b)人類血漿、(c)FVIII不足之人類全血、(d)FVIII不足之人類血漿、(e)FIX不足之人類全血或(f)FIX不足之人類血漿的樣本中減少凝血時間及/或刺激凝血。
測定抗體刺激凝血或減少凝血時間之能力的方法亦可活體內進行。舉例而言，活體內研究可如實施例中所述在暫時性血友病兔中進行。簡言之，可藉由投予抗FVIII抗體使得兔患有暫時性血友病。接著可投予測試抗體且評估表皮出血時間及/或血小板數目。在測試抗體存在下表皮出血時間減少表明抗體能夠減少凝血時間且刺激凝血。因此，具有此作用之抗體可為本發明之抗體。
本發明之抗體能夠結合TFPI之k2域，使得個體體內自由TFPI之百分比減少至小於30%，諸如小於29%、諸如小於28%、諸如小於27%、諸如小於26%、諸如小於25%、諸如小於24%、諸如小於23%、諸如小於22%、諸如小於21%、諸如小於20%、諸如小於19%、諸如小於18%、諸如小於17%、諸如小於16%、諸如小於15%、諸如小於14%、諸如小於13%、諸如小於12%、諸如小於11%、諸如小於10%、諸如小於9%、諸如小於8%、諸如小於7%、諸如小於6%、諸如小於5%、諸如小於4%、諸如小於3%、諸如小於2%、諸如小於1%、諸如0%。
此外，本發明之抗體能夠結合TFPI之K2域，使得個體體內自由TFPI之量在向該個體投予該單株抗體後之頭28天期間減少，諸如在頭27天期間、諸如在頭26天期間、諸如在頭25天期間、諸如在頭24天期間、諸如在頭23天期間、諸如在頭22天期間、諸如在頭21天期間、諸如在頭20天期間、諸如在頭19天期間、諸如在頭18天期間、諸如在頭17天期間、諸如在頭16天期間、諸如在頭15天期間、諸如在頭14天期間、諸如在頭13天期間、諸如在頭12天期間、諸如在頭11天期間、諸如在頭10天期間、諸如在頭9天期間、諸如在頭8天期間、諸如在頭7天期間、諸如在頭6天期間、諸如在頭5天期間、諸如在頭4天期間、諸如在頭3天期間、諸如在頭2天期間、諸如在第1天期間減少。
本發明之抗體亦可不引起血小板數目顯著降低。詳言之，本發明之抗體能夠在(a)人類全血、(b)人類血漿、(c)FVIII不足之人類全血、(d)FVIII不足之人類血漿、(e)FIX不足之人類全血或(f)FIX不足之人類血漿的樣本中，或在動物活體內減少凝血時間及/或刺激凝血而不引起血小板數目之任何顯著降低。血小板數目可如上文討論之其他作用在相同樣本或動物中評估，或可分別評估。舉例而言，可評估血液樣本(諸如獲自患者或實驗動物之血液樣本)中之血小板數目。血小板數目可在向如上所述之暫時性血友病兔投予抗體之後評估。本發明之抗體能夠減少表皮出血時間而不引起血小板數目同時降低，如對暫時性血友病兔之活體內研究所例證。血小板數目之變化可藉由比較投予抗體之前與之後的血小板數目或藉由比較經相關抗體處理之樣本或動物與未經抗體處理之對照樣本或動物之間的血小板數目來評估。本發明之抗體能夠結合TFPI之K2域，使得個體之活體內凝血時間減少而不使該個體之血小板數顯著減少。舉例而言，該個體之血小板數可不降至初始血小板數之約80%，諸如約75%、諸如約70%、諸如約65%、諸如約60%、諸如約55%、諸如約50%、諸如約45%、諸如約40%、諸如約35%、諸如約30%、諸如約25%。當進行此等比較時，血小板數目較佳不存在差異或不存在統計學顯著差異。亦即，本發明之抗體不會導致血小板數目之任何減少。
如本文中所提及，術語「抗體」包括完整抗體及其任何抗原結合片段(亦即「抗原結合部分」)或單鏈。抗體係指包含藉由雙硫鍵互連之至少兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)之醣蛋白，或其抗原結合部分。各重鏈包含重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區(CH)。各輕鏈包含輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區(CL)。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。VH及VL區域可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散置有較保守區域，稱為框架區(FR)。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白結合宿主組織或因子，包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組份(Clq)。
術語「互補決定區」或「高變區(hypervariable region)」當用於本文中時係指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。互補決定區或「CDR」一般包含輕鏈可變域中之胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)，及重鏈可變域中之31-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)；(Kabat等人,(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，美國衛生與人類服務部(U.S. Department of Health and Human Services),NIH公告第91-3242號)及/或來自「高變環(hypervariable loop)」之彼等殘基(輕鏈可變域中之殘基26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)，及重鏈可變域中之26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)；Chothia及Lesk,J. Mol. Biol 1987;196:901-917)。典型地，此區域中之胺基酸殘基係依據Kabat等人(見上)所述之方法編號。諸如「Kabat位置」、「Kabat殘基」及「根據Kabat」等詞在本文中係指重鏈可變域或輕鏈可變域之此編號系統。使用Kabat編號系統，肽之實際線性胺基酸序列可含有減少或添加之胺基酸(與可變域之FR或CDR縮短或插入對應)。舉例而言，重鏈可變域可在CDRH2之殘基52之後包括胺基酸插入(殘基52a、52b及52c，根據Kabat)，且在重鏈FR殘基82之後包括插入之殘基(例如殘基82a、82b及82c等，根據Kabat)。給定抗體之殘基的Kabat編號可藉由在抗體序列之同源區與Kabat編號之「基準」序列排比來確定。
術語「框架區(framework region)」或「FR」殘基係指不位於如本文所定義之CDR內的彼等VH或VL胺基酸殘基。
本發明之抗體可為單株抗體或多株抗體。在一具體實例中，本發明之抗體為單株抗體。本發明之抗體可為嵌合抗體、CDR移植抗體、人類抗體或人類化抗體或其任一者之抗原結合部分。用於產生單株抗體與多株抗體的實驗動物為適合哺乳動物，諸如(但不限於)山羊、兔、大鼠或小鼠。
多株抗體為源自不同B細胞系之抗體。多株抗體可包含針對特異性抗原之不同免疫球蛋白分子之混合物。多株抗體可包含可結合抗原分子內之一或多種不同抗原決定基之不同免疫球蛋白分子的混合物。可藉由常規方法(諸如以相關抗原使適合動物免疫)製得多株抗體。隨後可自動物移除血液且純化免疫球蛋白部分。
單株抗體為彼此相同且對特定抗原決定基具有單一結合特異性及親和力之免疫球蛋白分子。本發明之單株抗體(mAb)可藉由多種技術製得，該等技術包括習知單株抗體方法，例如Kohler及Milstein(1975)Nature 256 : 495之標準體細胞雜交技術，或B淋巴細胞之病毒或致癌轉型法。製備融合瘤之較佳動物系統為鼠類系統。在小鼠中產生融合瘤為非常成熟之程序。分離供融合之免疫脾細胞之免疫方案及技術在此項技術中已為人所知。融合搭配物(例如鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序亦已知。
為形成產生本發明之單株抗體的融合瘤，可自免疫小鼠分離脾細胞及/或淋巴結細胞且使其與適當不朽化細胞系(諸如小鼠骨髓瘤細胞系)融合。所得融合瘤可經篩選以用於產生抗原特異性抗體。可再接種、再次篩選抗體分泌融合瘤，且若對於適合IgG仍呈陽性，則可藉由限制稀釋法次選殖單株抗體至少兩次。接著可在試管內培養穩定次純系以在組織培養基中產生少量抗體以便特性化。
術語抗體之「抗原結合部分」係指抗體之一或多個片段，該等片段保留與抗原(諸如本文所述之TFPI或另一種標靶蛋白質)特異性結合之能力。已展示抗體之抗原結合功能可藉由全長抗體之片段來進行。術語抗體之「抗原結合部分」內所涵蓋之結合片段的實例包括Fab片段、F(ab')2 片段、Fab'片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段及分離之互補決定區(CDR)。諸如scFv之單鏈抗體及諸如VHH之重鏈抗體及駱駝抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」中。此等抗體片段可使用熟習此項技術者習知之技術獲得，且可篩選使用方式與完整抗體相同的片段。
本發明之抗體可由重組方式製備、表現、產生或分離，諸如(a)自相關免疫球蛋白基因轉殖基因或轉染色體之動物(例如小鼠)或由其製備之融合瘤分離抗體，(b)自經轉型以表現相關抗體之宿主細胞(例如自轉染瘤)分離抗體，(c)自重組、組合抗體文庫分離抗體，及(d)藉由包括將免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他方式製備、表現、產生或分離抗體。
本發明之抗體可為人類抗體或人類化抗體。如本文中所用，術語「人類抗體」意欲包括具有框架區與CDR區均源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區的抗體。此外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦源自人類生殖系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由試管內隨機或特定位點突變誘發或藉由活體內體細胞突變所引入之突變)。然而，如本文中所用，術語「人類抗體」不意欲包括源自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植於人類框架序列上之抗體。
此人類抗體可為人類單株抗體。此人類單株抗體可由融合瘤產生，該融合瘤包含B細胞與不朽化細胞之融合，該B細胞獲自轉殖基因非人類動物(例如轉殖基因小鼠)且具有包含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因組。
人類抗體可自序列文庫中分離，序列文庫係根據經各種天然及合成序列進一步多樣化之人類生殖系序列之選擇建構。
人類抗體可藉由在試管內使人類淋巴細胞免疫，接著以艾普斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)使淋巴細胞轉型來製備。
術語「人類抗體衍生物」係指任何修飾形式之人類抗體，例如抗體與另一種試劑或抗體之結合物。
術語「人類化抗體」意欲指含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列(CDR區)的人類/非人類嵌合抗體。因此，人類化抗體為人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者之高變區之殘基已置換為來自具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)(供體抗體)之高變區的殘基。在一些情況下，人類免疫球蛋白之FR殘基可置換為相應非人類殘基。此修飾之實例為引入一或多種所謂回復突變(back-mutation)，諸如實施例2中所述。
此外，人類化抗體可包含接受者抗體或供體抗體中不存在之殘基。進行此等修飾可進一步改進抗體效能。一般而言，人類化抗體包含實質上所有(至少一個且典型為兩個)可變域，其中所有或實質上所有高變環均對應於非人類免疫球蛋白之彼等高變環且所有或實質上所有FR殘基均為人類免疫球蛋白序列之彼等FR殘基。人類化抗體視情況亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)(典型為人類免疫球蛋白之恆定區)之至少一部分。
可藉由例如標準ELISA或西方墨點法測試本發明之抗體對標靶蛋白質之結合。亦可使用ELISA檢定篩選與標靶蛋白質展示陽性反應性的融合瘤。亦可藉由監測抗體對表現標靶蛋白質之細胞的結合(例如藉由流式細胞量測術)來測定抗體之結合特異性。
可藉由測定抗體是否與其他蛋白質結合來進一步研究本發明抗體對標靶蛋白質之特異性。舉例而言，當需要產生特異性結合TFPI或TFPI之特定部分(例如抗原決定基)的抗體時，抗體之特異性可藉由測定抗體是否亦結合其他分子或缺乏相關部分之修飾形式之TFPI來評估。
如上文解釋，本發明之抗體可調節TFPI活性。因此可進一步測試具有所需結合特性之抗體以測定其對TFPI活性之影響。因此，該等方法可用以鑑定能夠與TFPI結合且能夠調節(特定而言，降低)其活性之適合抗體。
適合抗體一經鑑定及選擇，即可藉由此項技術中已知之方法鑑定抗體之胺基酸序列。可使用特定及/或簡并性引子選殖編碼抗體之基因。抗體可藉由常規方法以重組方式產生。
「多肽」在本文中以其最廣泛之意義使用且係指具有兩個或兩個亞單位以上胺基酸、胺基酸類似物或其他肽模擬物之化合物。術語「多肽」因此包括短肽序列以及較長多肽及蛋白質。如本文中所用，術語「胺基酸」可指天然及/或非天然或合成之胺基酸，D及/或L光學異構體，及胺基酸類似物及肽模擬物。
本發明之發明人已鑑定如實施例中所述之鼠類抗體。此抗體在本文中稱作TFPI-4F36A1B2(或者4F36或MuTFPI4F36)。本發明涵蓋此抗體、其變異體及片段(包括嵌合抗體及人類化抗體)，其保留鼠類抗體之一或多種活性且亦描述於實施例中。此抗體之活性包括與TFPI結合之能力、與TFPI分子中之特定位置結合之能力及抑制TFPI活性之能力。
此抗體之適合片段或變異體保留與TFPI結合之能力。其較佳將保留與TFPI特異性結合之能力。其較佳將保留與其所來源之抗體(MuTFPI4F36)特異性結合TFPI分子之相同或相似抗原決定基或區域之能力。其較佳將保留其所來源之抗體之一或多種額外功能，諸如抑制TFPI活性之能力或減少凝血時間之能力，視情況不引起血小板數目降低。
本發明之多肽或抗體「片段」可藉由截斷(例如藉由自多肽之N端及/或C端移除一或多個胺基酸)來製得。可以此方式自N端及/或C端移除多至10個、多至20個、多至30個、多至40個或40個以上胺基酸。亦可藉由一或多個內部缺失來產生片段。
本發明之抗體可為或可包含MuTFPI4F36抗體之片段或其變異體。本發明之抗體可為或可包含如上文進一步討論之此抗體之抗原結合部分或其變異體。舉例而言，本發明之抗體可為此抗體之Fab片段或其變異體，或可為源自此抗體或其變異體之單鏈抗體。
MuTFPI4F36抗體之輕鏈及重鏈之胺基酸序列分別以SEQ ID NO: 6及10顯示。MuTFPI4F36抗體之VL及VH鏈之胺基酸序列分別以SEQ ID NO: 4及8顯示。一種人類化抗體HzTFPI4F36之輕鏈及重鏈之胺基酸序列分別以SEQ ID NO: 21及24顯示。HzTFPI4F36之VL及VH鏈之胺基酸序列分別以SEQ ID NO: 15及18顯示。
本發明之抗體可包含SEQ ID NO: 6中所示之MuTFPI4F36輕鏈胺基酸序列或其片段或變異體。或者或另外，抗體可包含SEQ ID NO: 10中所示之MuTFPI4F36重鏈胺基酸序列或如本文所述之其片段或變異體。
本發明之抗體可包含SEQ ID NO: 4之VL胺基酸序列，或其片段或變異體。本發明之抗體可包含SEQ ID NO:8之VH胺基酸序列，或其片段或變異體。本發明之抗體可包含(a)SEQ ID NO: 4之VL胺基酸序列，或其片段或變異體，與(b)SEQ ID NO: 8之VH胺基酸序列，或其片段或變異體。
本發明之抗體可包含圖2中所示之VL或VH胺基酸序列之一的片段。舉例而言，本發明之抗體可包含至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少12個、至少15個、至少18個、至少20個或至少25個來自SEQ ID NO: 4或8之連續胺基酸的片段。此片段較佳將保留一或多種上述功能，諸如與TFPI結合之能力。
任何此等VH或VL序列之適合片段或變異體保留與TFPI結合之能力。其較佳將保留與TFPI特異性結合之能力。其較佳將保留與其所來源之抗體(MuTFPI4F36)特異性結合TFPI分子之相同或相似抗原決定基或區域之能力。其較佳將保留其所來源之抗體之一或多種額外功能，諸如抑制TFPI活性之能力或減少凝血時間之能力，視情況不引起血小板數目降低。
適合片段或變異體VL序列較佳將保留SEQ ID NO: 4之位置E31、S32、D33、Y37、A96、T97、H98及F99之胺基酸。適合片段或變異體VH序列較佳將保留SEQ ID NO: 8之位置N31、R53、S54、S56、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103及D106之胺基酸。適合片段或變異體抗體較佳將保留SEQ ID NO: 4之位置E31、S32、D33、Y37、A96、T97、H98及F99之胺基酸及SEQ ID NO: 8之位置N31、R53、S54、S56、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103及D106之胺基酸。如圖3中所鑑定，MuTFPI4F36輕鏈及重鏈序列中存在之殘基所具有之重原子與當MuTFPI4F36與TFPI之K2域結合時之重原子的距離小於4。
本發明之抗體可包含本文中所鑑定之特異性抗體之CDR區，諸如SEQ ID NO: 4或8內之CDR區。此抗體較佳將保留與如本文所述之TFPI結合之能力。舉例而言，如圖3中所示，使用Kabat定義，MuTFPI4F36之輕鏈內之CDR序列可經鑑定位於SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6之胺基酸24至39、55至61及94至102。MuTFPI4F36之重鏈內之CDR序列可經鑑定位於SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 10之胺基酸31至35、50至66及99至110。本發明之抗體可包含一或多個如圖3中所示之CDR序列。舉例而言，本發明之抗體可包含SEQ ID NO: 6之殘基24至69、55至61及94至102處所示之一、二或所有三個胺基酸序列。本發明之抗體或者或另外可包含SEQ ID NO: 10之殘基31至35、50至66及99至110處所示之一、二或所有三個胺基酸序列。本發明之抗體可包含SEQ ID NO: 6之殘基24至109、55至61及94至102處及SEQ ID NO: 10之31至35、50至66及99至110處所示之所有六個胺基酸序列。
本發明之抗體可為人類化抗體，諸如本文中稱作HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)之抗體。此抗體可包含一或多個來自SEQ ID NO: 15或18之CDR區。
本發明之抗體的重鏈可包含SEQ ID NO: 18之胺基酸31至35(NYAMS)之CDR1序列，其中此等胺基酸之一可經不同胺基酸取代。
本發明之抗體的重鏈可包含SEQ ID NO: 18之胺基酸50至66(TISRSGSYSYFPDSVQG)之CDR2序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
本發明之抗體的重鏈可包含SEQ ID NO: 18之胺基酸99至110(LGGYDEGDAMDS)之CDR3序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
本發明之抗體的輕鏈可包含SEQ ID NO: 15之胺基酸24至39(KSSQSLLESDGKTYLN)之CDR1序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
本發明之抗體的輕鏈可包含SEQ ID NO: 15之胺基酸55至61(LVSILDS)之CDR2序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
本發明之抗體的輕鏈可包含SEQ ID NO: 15之CDR3胺基酸序列94至102(LQATHFPQT)，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
更特定言之，本發明之抗體可具有包含以下者之重鏈：
‧CDR1序列，其又包含SEQ ID NO: 18之胺基酸31至35(NYAMS)；及
‧CDR2序列，其又包含SEQ ID NO: 18之胺基酸50至66(TISRSGSYSYFPDSVQG)；及
‧CDR3序列，其又包含SEQ ID NO: 18之胺基酸99至110(LGGYDEGDAMDS)。
本發明之抗體可具有包含以下者之輕鏈：
‧CDR1序列，其又包含SEQ ID NO: 15之胺基酸24至39(KSSQSLLESDGKTYLN)；及
‧CDR2序列，其又包含SEQ ID NO: 15之胺基酸55至61(LVSILDS)；及
‧CDR3序列，其又包含SEQ ID NO: 15之胺基酸94至102(LQATHFPQT)。
本發明之抗體可包含上述CDR區之任何組合。
更特定言之，本發明抗體之重鏈的框架區2(FR2)可包含以下者胺基酸：
‧在對應於SEQ ID NO:18之位置40的位置包含T，‧在對應於SEQ ID NO:18之位置42的位置包含E，‧在對應於SEQ ID NO:18之位置44的位置包含R，及‧在對應於SEQ ID NO:18之位置49的位置包含A。
或者，重鏈之該FR2可包含SEQ ID NO:18之胺基酸36至49。
本發明之抗體可包含以下任一者：‧SEQ ID NO:15之VL胺基酸序列。
‧SEQ ID NO:18之VH胺基酸序列。
‧SEQ ID NO:15及18。
‧SEQ ID NO:21之輕鏈胺基酸序列。
‧SEQ ID NO:24之重鏈胺基酸序列。
‧SEQ ID NO:21及24。
本發明之抗體或者可為或可包含此等特定序列之一的變異體，諸如MuTFPI4F36抗體之變異體或HZTFPI4F36之變異體。舉例而言，變異體可為任一上述胺基酸序列之取代、缺失或添加變異體。
本發明之變異體可為不包含以下者之抗體：‧在對應於SEQ ID NO:18之CDR1區之位置31的位置不包含N；‧在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置53的位置不包含R；‧在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置54的位置不包含S；‧在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置56的位置不包含S；‧在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置57的位置不包含Y；‧在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置59的位置不包含Y；‧在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置60的位置不包含F；‧在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置61的位置不包含P；‧在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置62的位置不包含D；及‧在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置65的位置不包含Q；‧在對應於SEQ ID NO: 18之CDR3區之位置102的位置不包含Y；‧在對應於SEQ ID NO: 18之CDR3區之位置103的位置不包含D；及‧在對應於SEQ ID NO: 18之CDR3區之位置106的位置不包含D。
‧在對應於SEQ ID NO: 15之CDR1區之位置31的位置不包含E；‧在對應於SEQ ID NO: 15之CDR1區之位置32的位置不包含S；‧在對應於SEQ ID NO: 15之CDR1區之位置33的位置不包含D；及‧在對應於SEQ ID NO: 15之CDR1區之位置37的位置不包含Y；‧在對應於SEQ ID NO: 15之CDR3區之位置96的位置不包含A；‧在對應於SEQ ID NO: 15之CDR3區之位置97的位置不包含T；‧在對應於SEQ ID NO: 15之CDR3區之位置98的位置不包含H；及‧在對應於SEQ ID NO: 15之CDR3區之位置99的位置不包含F。
變異體抗體可包含上述特定序列及片段的1個、2個、3個、4個、5個、多至10個、多至20個、多至30個或30個以上的胺基酸取代及/或缺失及/或插入。「缺失(Deletion)」變異體可包含缺失個別胺基酸、缺失小型胺基酸群組(諸如2、3、4或5個胺基酸)，或缺失較大胺基酸區域，諸如缺失特定胺基酸域或其他特徵。「插入」變異體可包含插入個別胺基酸、插入小型胺基酸群組(諸如2、3、4或5個胺基酸)，或插入較大胺基酸區域，諸如插入特定胺基酸域或其他特徵。「取代」變異體較佳包括一或多個胺基酸經相同數目之胺基酸置換且產生保守性胺基酸取代。舉例而言，胺基酸可經具有類似特性之替代性胺基酸取代，該替代性胺基酸例如為另一鹼性胺基酸、另一酸性胺基酸、另一中性胺基酸、另一帶電胺基酸、另一親水性胺基酸、另一疏水性胺基酸、另一極性胺基酸、另一芳族胺基酸或另一脂族胺基酸。可用於選擇適合取代基的20種主要胺基酸之一些特性係如下：
較佳「衍生物」或「變異體」包括代替天然存在之胺基酸出現於序列中之胺基酸為其結構類似物的彼等者。用於序列中之胺基酸亦可經衍生化或修飾，例如經標記，限制條件為抗體功能未受到顯著不利地影響。
取代可為(但不限於)保守性取代。
如上所述之衍生物及變異體可在合成抗體期間或藉由產生後修飾來製備，或當抗體呈重組形式時使用定點誘變發、隨機誘變或酶促裂解及/或核酸接合之已知技術製備。
在另一態樣中，本發明展示本發明之包含抗TFPI抗體或其抗原片段之多特異性分子。此等多特異性分子包括雙特異性分子，其包含至少一種針對TFPI之第一結合特異性及針對第二標靶抗原決定基之第二結合特異性。一種類型之雙特異性分子為此項技術中已知之雙特異性抗體。雙特異性抗體或實際多特異性抗體可以本文所述之全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2 雙特異性抗體)或任何其他抗原結合片段之形式加以製備。
在一態樣中，本發明展示抗體衍生物(或免疫結合物)，諸如與第二藥劑結合或共價結合之抗TFPI抗體。可使用熟習此項技術者已知之多種可用方法中之任一者使第二藥劑與抗體直接或間接連接。舉例而言，藥劑可使用諸如N-丁二醯基S-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)之交聯劑、經由雙硫鍵之形成、在被還原之抗體組份之鉸鏈區連接，或經由抗體之Fc區中之碳水化合物部分連接。
在一態樣中，本發明之抗體經工程改造可在Fc區內包括修飾，以典型地改變抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合、蛋白質穩定性及/或抗原依賴性細胞的細胞毒性，或其之缺乏。此外，本發明之抗體可經化學修飾(例如可使一或多個化學部分與抗體連接)或經修飾以改變其糖基化，以再次改變抗體之一或多種功能特性。
必要時，可藉由已知技術「轉換(switched)」抗體種類。舉例而言，最初以IgM分子形式產生之抗體可轉換為IgG抗體種類。種類轉換技術亦可用以將一種IgG子類轉換為另一種IgG子類，例如：IgG1轉換為IgG2或IgG4；IgG2轉換為IgG1或IgG4；或IgG4轉換為IgG1或IgG2。亦可藉由將不同IgG子類之區域組合來對抗體進行工程改造以產生恆定區嵌合分子。
在一具體實例中，CHI之鉸鏈區經修飾以改變(例如增加或減少)鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數目。此方法進一步描述於例如Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。
恆定區可進一步修飾以使抗體穩定，例如以降低二價抗體分裂成兩個單價VH-VL片段之風險。舉例而言，在IgG4恆定區中，殘基S241可突變為脯胺酸(P)殘基以允許在鉸鏈處形成完整二硫橋(參看例如Angal等人,MolImmunol.199S;30:105-8)。
本發明之變異體抗體可具有與SEQ ID NO: 4或8大於60%，或大於65%，或大於70%，或大於75%，或大於80%，較佳大於85%，諸如大於90%，諸如大於95%一致之胺基酸序列或其片段。本發明之其他變異抗體可具有與SEQ ID NO: 15或18大於60%，或大於65%，或大於70%，或大於75%，或大於80%，較佳大於85%，諸如大於90%，諸如大於95%一致之胺基酸序列或其片段。視全長多肽之尺寸而定，胺基酸之此一致程度可存在於相關SEQ ID NO序列之全長或存在於該序列之一部分中，諸如存在於20、30、40、50、60、70、75、80、90、100、150、200或200個以上胺基酸中。
就胺基酸序列而言，「序列一致性」係指當使用ClustalW法(Thompson等人,1994,見上)、用以下參數評估時具有規定值之序列：逐對排比參數-方法：精確，矩陣：PAM，間隙空缺罰分(Gap open penalty)：10.00，間隙延長罰分(Gap extension penalty)：0.10；多重排比參數-矩陣：PAM，間隙空缺罰分：10.00，延遲一致性%：30，末端間隙受罰：開，間隙分隔距離：0，負矩陣：無，間隙延長罰分：0.20，特定殘基間隙罰分：開，親水性間隙罰分：開，親水性殘基：GPSNDQEKR。特定殘基處之序列一致性意欲包括已簡單衍生化之一致殘基。
因此，本發明提供具有特定VH及VL胺基酸序列的抗體及其保持此等VH及VL域之功能或活性之變異體及片段。
因此，本發明之抗體可包含：
(a)SEQ ID NO: 4之輕鏈可變區胺基酸序列；
(b)保留與TFPI特異性結合之能力的(a)之至少7個胺基酸之片段；或
(c)與(a)之序列具有至少70%胺基酸序列一致性且保留與TFPI特異性結合之能力的(a)之變異體。本發明之抗體可包含：
(a)SEQ ID NO: 8之重鏈可變區胺基酸序列；
(b)保留與TFPI特異性結合之能力的(a)之至少7個胺基酸之片段；或
(c)與(a)之序列具有至少70%胺基酸序列一致性且保留與TFPI特異性結合之能力的(a)之變異體。
本發明之抗體可包含SEQ ID NO: 4之輕鏈可變區及SEQ ID NO:8之重鏈可變區。
本發明之抗體可包含
(a) SEQ ID NO:4之輕鏈可變區及SEQ ID NO:8之重鏈可變區；
(b)(a)之變異體，其中重鏈及輕鏈序列中之一或兩者係經修飾，使得其包含(a)中指定之序列的至少7個胺基酸之片段；或
(c)(a)或(b)之變異體，其中重鏈及輕鏈序列中之一或兩者係經修飾，使得其與(a)或(b)之序列具有至少70%胺基酸序列一致性；
其中抗體保留與TFPI特異性結合之能力。抗體亦可保留一或多種如本文所述之本發明抗體之額外功能或活性，諸如抑制TFPI之能力或縮短凝血時間之能力(視情況不引起血小板數目降低)。
SEQ ID NO:4之較佳片段及變異體將包含(i) SEQ ID NO:6之胺基酸24至39；及/或(ii) SEQ ID NO:6之胺基酸55至61；及/或(iii) SEQ ID NO:6之胺基酸94至102。SEQ ID NO:8之較佳片段及變異體將包含(i) SEQ ID NO:10之胺基酸31至35；及/或(ii) SEQ ID NO:10之胺基酸50至66；及/或(iii) SEQ ID NO:10之胺基酸99至110。
SEQ ID NO:4之其他較佳變異體將包含SEQ ID NO:6之胺基酸31至33、37及96至99。SEQ ID NO:8之其他較佳變異體將包含SEQ ID NO:10之胺基酸31、53、54、56、57、59、60、61、62、65、102、103及106。
本發明之抗體可包含：
(a) SEQ ID NO:15之輕鏈可變區胺基酸序列；
(b)保留與TFPI特異性結合之能力的(a)之至少7個胺基酸之片段；或
(c)與(a)之序列具有至少70%胺基酸序列一致性且保留與TFPI特異性結合之能力的(a)之變異體。
本發明之抗體可包含：(a)SEQ ID NO: 18之重鏈可變區胺基酸序列；(b)保留與TFPI特異性結合之能力的(a)之至少7個胺基酸之片段；或(c)與(a)之序列具有至少70%胺基酸序列一致性且保留與TFPI特異性結合之能力的(a)之變異體。
本發明之抗體可包含SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區及SEQ ID NO: 18之重鏈可變區。
本發明之抗體可包含：(a)SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區及SEQ ID NO: 18之重鏈可變區；(b)(a)之變異體，其中重鏈及輕鏈序列中之一或兩者係經修飾，使得其包含(a)中指定之序列的至少7個胺基酸之片段；或(c)(a)或(b)之變異體，其中重鏈及輕鏈序列中之一或兩者係經修飾，使得其與(a)或(b)之序列具有至少70%胺基酸序列一致性；其中抗體保留與TFPI特異性結合之能力。抗體亦可保留一或多種如本文所述之本發明抗體之額外功能或活性，諸如抑制TFPI之能力或縮短凝血時間之能力(視情況不引起血小板數目降低)。
如上文解釋，本發明之抗體可與本發明之另一種抗體結合相同的抗原決定基或區域。因此，此抗體顯然可與本文所述之任何特異性抗體、片段及變異體結合相同之TFPI抗原決定基或區域。
本發明亦關於編碼本發明之抗體的聚核苷酸。因此，本發明之聚核苷酸可編碼如本文所述之任何抗體。術語「核酸分子」及「聚核苷酸」在本文中可互換使用且係指任何長度之聚合型核苷酸(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物)。聚核苷酸之非限制性實例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重組聚核苷酸、質體、載體、分離之任何序列之DNA、分離之任何序列之RNA、核酸探針及引子。本發明之聚核苷酸可以分離形式或純化形式提供。
「編碼」所選多肽之核酸序列為一種核酸分子，其在適當調控序列控制下置放時可活體內轉錄(在DNA之情況下)及轉譯(在mRNA之情況下)成多肽。編碼序列之邊界依據位於5'(胺基)端之起始密碼子及位於3'(羧基)端之轉譯終止密碼子來確定。出於本發明之目的，此等核酸序列可包括(但不限於)來自病毒之cDNA、原核或真核mRNA、來自病毒之基因組序列，或原核DNA或RNA，及甚至合成DNA序列。轉錄終止序列可定位於編碼序列之3'。
在一具體實例中，本發明之聚核苷酸包含編碼如上所述之VH或VL胺基酸序列的序列。舉例而言，本發明之聚核苷酸可編碼包含SEQ ID NO:4或8之序列的多肽或如上所述之其變異體或片段。此聚核苷酸可由SEQ ID NO: 3、5、7及9中任一者之核酸序列組成，或包含SEQ ID NO: 3、5、7及9中任一者之核酸序列。適合聚核苷酸序列或者可為此等特定聚核苷酸序列之一的變異體。舉例而言，變異體可為任一上述核酸序列之取代、缺失或添加變異體。變異體聚核苷酸可包含序列表中所示之序列的1個、2個、3個、4個、5個、多至10個、多至20個、多至30個、多至40個、多至50個、多至75個或75個核酸取代及/或缺失。
適合變異體可與SEQ ID NO: 3、5、7及9中任一者之聚核苷酸至少70%同源，較佳至少80%或90%及更佳至少95%、97%或99%同源。量測同源性之方法在此項技術中已熟知，且熟習此項技術者將瞭解，在本上下文中，同源性係依據核酸一致性計算。此同源性可存在於至少15個，較佳至少30個，例如至少40、60、100、200個或200個以上鄰接核苷酸之區域。此同源性可存在於未修飾之聚核苷酸序列之整個長度。
量測聚核苷酸同源性或一致性之方法在此項技術中已為人所知。舉例而言，UWGCG套裝提供可用以計算同源性(例如根據其預設設定使用)之BESTFIT程式(Devereux等人,(1984)Nucleic Acids Research 12,第387-395頁)。
PILEUP及BLAST演算法亦可用以計算同源性或對準序列(典型地根據其預設設定)，例如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul,S,F等人,(1990)J Mol Biol 215:403-10中所述。
執行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。此演算法包括首先藉由鑑定查詢序列中長度W之短字來鑑定高分序列對(HSP)，該等短字當與資料庫序列中相同長度之字排比時匹配或滿足一些正值臨限分數T。T稱作鄰近字臨限分數(Altschul等人，前述)。此等最先選中鄰近字充當開始搜尋的種子以發現含有彼等之HSP。該等選中字沿各序列雙向延伸，只要可提高累積排比分數。當出現以下情況時，中止選中字沿各方向延伸：累積排比分數因一或多個負分殘基排比之累積而歸零或零以下；或達到任一序列之末端。BLAST演算法參數W、T及X決定排比之敏感性及速度。BLAST程式使用以下者作為預設值：字長(W)為11，BLOSUM62評分矩陣(參看Henikoff及Henikoff(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919)排比(B)為50，期望值(E)為10，M=5，N=4，及雙股對比。
BLAST演算法可對兩種序列之間相似性進行統計分析；參看例如Karlin及Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787。BLAST演算法所提供之一種相似性度量為最小和概率(P(N))，其提供兩種核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配之概率指標。舉例而言，若在第一序列對第二序列之比較中最小和概率小於約1，較佳小於約0.1，更佳小於約0.01，且最佳小於約0.001，則序列與另一序列視為相似。
同源物與相關聚核苷酸序列不同之處在於可小於3、5、10、15、20個或20個以上突變(各突變可為取代、缺失或插入)。此等突變可分配於同源物之至少30個，例如至少40、60、100個或100個以上鄰接核苷酸的區域。
在一具體實例中，變異體序列與序列表中所示之特定序列不同之處為遺傳密碼冗餘。DNA密碼具有4個一級核酸殘基(A、T、C及G)且使用此等殘基「拼成」三字母密碼子，以表示生物體基因所編碼之蛋白質中之胺基酸。沿DNA分子之密碼子線性序列轉譯為由彼等基因所編碼之蛋白質中之胺基酸線性序列。密碼具高度簡并性，其中61個密碼子編碼20種天然胺基酸且3個密碼子表示「中止」信號。因此，大多數胺基酸係由一個以上密碼子編碼，實際上多種胺基酸係由四個或四個以上不同密碼子編碼。本發明之變異體聚核苷酸因此不僅可編碼與本發明之另一種聚核苷酸相同的多肽序列，而且可因使用編碼相同胺基酸之不同密碼子而具有不同核酸序列。
本發明之聚核苷酸「片段」可藉由截斷，例如藉由自聚核苷酸之一端或兩端移除一或多個核苷酸來製得。可以此方式自聚核苷酸之3'端及/或5'端移除多至10個、多至20個、多至30個、多至40個、多至50個、多至75個、多至100個、多至200個或200個以上胺基酸。亦可藉由一或多個內部缺失來產生片段。此等片段可源自SEQ ID NO: 3、5、7及9之序列或可源自如本文所述之變異體聚核苷酸。此等片段長度較佳介於30與300個殘基之間，例如30至300、30至200、30至100、100至200或200至300個殘基。或者，本發明之片段可為較長序列，例如包含本發明之全長聚核苷酸的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
本發明之抗體因此可自編碼其且能夠表現其之聚核苷酸產生，或以編碼其且能夠表現其之聚核苷酸的形式釋放。當抗體包含兩條或兩條以上鏈時，本發明之聚核苷酸可編碼一或多條抗體鏈。舉例而言，本發明之聚核苷酸可編碼抗體輕鏈、抗體重鏈或兩者。可提供兩種聚核苷酸，一者編碼抗體輕鏈且另一者編碼相應抗體重鏈。此聚核苷酸或聚核苷酸對可一起表現，以便產生本發明之抗體。
本發明之聚核苷酸可根據此項技術中熟知之方法合成，如Sambrook等人(1989,Molecular Cloning-a laboratory manual;Cold Spring Harbor Press)中舉例所述。
本發明之核酸分子可以表現卡匣之形式提供，該表現卡匣包含控制序列、可操作地連接至插入序列之信號肽序列，從而允許本發明之抗體活體內表現。此等表現卡匣又典型地提供於載體(例如質體或重組病毒載體)內。可向宿主個體直接投予此表現卡匣。或者，可向宿主個體投予包含本發明聚核苷酸之載體。較佳使用遺傳載體製備及/或投予聚核苷酸。適合載體可為能夠攜帶足量遺傳資訊且允許本發明多肽表現之任何載體。
因此，本發明包括包含此等聚核苷酸序列之表現載體。此等表現載體在分子生物學技術中以常規方式構築且可例如包括使用質體DNA及適當引子、啟動子、強化子、信號太序列及其他元件，諸如可能需要且以正確位向定位的聚腺苷酸化信號，以允許本發明之肽表現。其他適合載體對於熟習此項技術者而言顯而易知。與此相關之其他實例可參考Sambrook等人。
本發明亦包括經修飾可表現本發明抗體之細胞。此等細胞包括短暫性或較佳穩定性高等真核細胞系，諸如哺乳動物細胞或昆蟲細胞，低等真核細胞，諸如酵母或原核細胞，諸如細菌細胞。可藉由插入編碼本發明抗體之載體或表現卡匣加以修飾之細胞的特定實例包括哺乳動物HEK293T、CHO、BHK、NSO及人類視網膜細胞。所選細胞系較佳將為不僅穩定而且允許對多肽進行成熟糖基化及細胞表面表現的細胞系。
本發明之此等細胞系可使用製備本發明抗體的常規方法培養，或可治療或預防性使用以向個體傳遞本發明之抗體。或者，可將本發明之聚核苷酸、表現卡匣或載體活體外投予個體之細胞中，且接著將細胞返回個體之體內。
在另一態樣中，本發明提供包含本發明分子(諸如本文所述之抗體、聚核苷酸、載體及細胞)之組成物及調配物。舉例而言，本發明提供一種醫藥組成物，其包含一或多種本發明分子(諸如一或多種本發明之抗體)，該等本發明分子係與醫藥學上可接受之載劑一起調配。
如本文中所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑，及其類似物。載劑較佳適於非經腸投予，例如靜脈內、肌肉內、皮下投予(例如藉由注射或輸注)。視投予途徑而定，抗體可以保護抗體以防酸作用及其他可使抗體失活或變性之天然條件作用的材料包覆包衣。
醫藥學上可接受之較佳載劑包含水性載劑或稀釋劑。可用於本發明醫藥組成物中之適合水性載劑的實例包括水、緩衝性水及生理食鹽水。其他載劑之實例包括乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)，及其適合混合物、植物油(諸如橄欖油)，及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。可保持適當流動性，例如使用包衣材料(諸如卵磷脂)、在分散液情況下保持所需粒度，及使用界面活性劑來保持適當流動性。在許多情況下，組成物中較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)或氯化鈉。
本發明之醫藥組成物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化劑。此等組成物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。可藉由消毒程序(前述)及藉由包括各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及其類似物)來確保預防微生物存在。在組成物中亦可能需要包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，可藉由包括延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來實現可注射醫藥形式之延長吸收。
治療組成物典型地必須無菌且在製造及儲存條件下穩定。可將組成物調配為溶液、微乳液、脂質體，或其他適於高藥物濃度之有序結構。
無菌可注射溶液可藉由將所需量之活性劑(例如抗體)併入具有上列成份之一或組合的適當溶劑中，視需要隨後進行無菌微濾來製備。一般而言，分散液可藉由將活性劑併入含有鹼性分散介質及來自上列藥劑之所需其他成份的無菌媒劑中來製備。在供製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，從而自其預先無菌過濾之溶液產生活性劑外加任何額外所需成份之粉末。
本發明之醫藥組成物可包含額外活性成份以及本發明之抗體。如上所述，本發明之組成物可包含一或多種本發明抗體。其亦可包含額外治療劑或預防劑。舉例而言，當本發明之醫藥組成物意欲用於治療出血病症時，其可另外包含一或多種意欲減少出血病症之症狀的藥劑。舉例而言，組成物可包含一或多種凝血因子。組成物可包含一或多種意欲改善患者病狀之其他組份。舉例而言，當組成物意欲用於治療罹患不期望之出血的患者(諸如經歷手術之患者或罹患外傷之患者)時，組成物可包含一或多種止痛劑、麻醉劑、免疫抑制劑或消炎劑。包含本發明之抗體或其他組成物及使用說明書的套組亦屬於本發明之範疇內。該套組可進一步含有一或多種額外試劑，諸如上文所討論之額外治療劑或預防劑。
本發明之抗體、其他分子及組成物具有眾多試管內及活體內治療效用，包括治療及預防凝血相關病症。舉例而言，可向培養中之細胞(試管內或活體外)或向人類個體(例如活體內)投予此等抗體及組成物以預防或治療多種病症。
詳言之，本發明提供治療出血病症或增強凝血之方法，其包含向有需要之患者投予有效量的本發明之抗體或其他分子或組成物。舉例而言，此等方法可用於治療凝血因子缺乏症，諸如A型血友病、B型血友病、因子XI缺乏症、因子VII缺乏症、血小板減少症或溫韋伯氏疾病(von Willebrand's disease)。此等方法可用於治療伴隨凝血因子抑制子存在時發生之病狀。此等方法可用於治療過量出血。本發明之抗體及組成物可用以在手術或抗凝血治療之前、期間或之後或在外傷之後治療患者。本文所述之抗體及組成物可用於任何此治療或可用於製造供任何此治療用之藥物。
本發明之抗體及組成物可針對預防性及/或治療性處理投予。
在治療應用中，抗體或組成物係以足以治癒、緩解或部分抑制病狀或一或多種其症狀之量投予已患有如上所述之病症或病狀的個體。此治療性處理可降低疾病症狀之嚴重度，或增加無症狀期之頻率或持續時間。足以實現治療之量係定義為「治療有效量」。舉例而言，當治療係針對不期望之出血時，治療可定義為出血量降低或完全中止出血的適當凝結。
在預防性應用中，抗體或組成物係以足以預防或減少病狀或其一或多種症狀之隨後影響之量投予處於上述病症或病狀之風險中的個體。足以實現預防之量係定義為「預防有效量」。舉例而言，當處理係預防不期望之出血時，預防性作用可定義為預防出血或出血時間或出血量減少(與不存在調節劑時存在之出血時間或出血量相比)。
用於各種目的之有效量將視疾病或損傷之嚴重度以及個體之體重及一般狀況而定。
如本文中所用，術語「個體(subject)」包括任何人類或非人類動物。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。
本發明之抗體或組成物可經由一或多種投予途徑，使用此項技術中已知之多種方法中之一或多者來投予。如熟習此項技術者所瞭解，投予途徑及/或模式將視所需結果而不同。本發明之抗體或組成物之較佳投予途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、脊椎或其他非經腸投予途徑，例如注射或輸注。如本文中所用，「非經腸投予」一詞意謂除腸內及局部投予外之投予模式，通常為注射。或者，本發明之抗體或組成物可經由非經腸途徑(諸如局部、表皮或黏膜投予途徑)來投予。
類似地，本發明之抗體可用於製造適於非經腸投予之藥物。
本發明之抗體可用於製造適於靜脈內投予之藥物。
本發明之抗體可用於製造適於肌肉內投予之藥物。
本發明之抗體可用於製造適於皮下投予之藥物。
本發明抗體之適合劑量可由熟習醫務者判定。本發明之醫藥組成物中活性成份之實際劑量可變化，以便獲得針對特定患者、組成物及投予模式有效達成所需治療反應之活性成份之量。所選劑量將視多種藥物動力學因素而定，該等因素包括所用特定抗體之活性、投予途徑、投予時間、抗體之排泄速率、治療持續期間、與所用特定組成物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史，及醫學技術中熟知之類似因素。
本發明抗體之適合劑量可例如在每公斤待治療患者體重約0.1μg至約100mg之範圍內。舉例而言，適合劑量可為每日每公斤體重約1μg至約10mg或每日每公斤體重約1mg至約5mg。本發明抗體之適合劑量的範圍可為2mg/kg至200mg/kg，諸如約150-200mg/kg，諸如約150-170mg/kg，諸如約100-150mg/kg，諸如約50-100mg/kg，諸如約70-90mg/kg，諸如約10-50mg/kg，諸如約10-30mg/kg。
其他適合劑量可為約0.1-10mg/kg，諸如約0.1-1mg/kg，諸如約1-2mg/kg，或約2-3mg/kg，或約4-5mg/kg，或約5-6mg/kg，或約6-7mg/kg，或約7-8mg/kg，或約8-9mg/kg，或約9-10mg/kg；或約10-21mg/kg，諸如約10-11mg/kg，或約11-12mg/kg，或約12-13mg/kg，或約13-14mg/kg，或約14-15mg/kg，或約15-16mg/kg，或約16-17mg/kg，或約17-18mg/kg，或約18-19mg/kg，或約19-20mg/kg或約20-21mg/kg。
投予個體之單株抗體之量可使得其投予所產生的個體血漿濃度為約1oμg/ml至約40μg/ml，諸如約15-35μg/ml，諸如約10-15μg/ml，諸如約15-20μg/ml，諸如約20-25μg/ml，諸如約25-30μg/ml，諸如約30-35μg/ml，諸如約35-40μg/ml該單株抗體。可調整劑量攝生法以提供最佳所需反應(例如治療反應)。舉例而言，可投予單次劑量，可隨時間投予多個分次劑量，或可依據治療情況之迫切性所指示按比例減小或增大劑量。將非經腸組成物調配成便於投予及均一劑量之單位劑型尤其有利。如本文中所用之單位劑型係指適用於均一給予欲治療之受體的實體不連續單位；各單位劑型含有經計算可產生所需治療作用之預定量之活性化合物，以及所需醫藥載劑。
抗體可以單次劑量或多次劑量投予。多次劑量可經由相同或不同途徑投予相同或不同位置。或者，抗體可以持續釋放型調配物形式投予，在該情況下很少需要頻繁投藥。劑量及頻率可視抗體在患者中之半衰期及所需治療持續時間而變化。投予劑量及頻率亦可視治療為預防性或治療性而變化。在預防性應用中，可長期以相對不頻繁之間隔投予相對較低之劑量。在治療性應用中，可投予相對較高劑量，例如直至患者顯示疾病症狀部分或完全改善為止。
因此，本發明之抗體可如下投予：約每天、約每隔一天、約每隔兩天、約每隔三天、約每隔四天、約每隔五天；約每週，諸如每5、6、7、8、9或10天；約每隔一週，諸如每11、12、13、14、15、16或17天；約每隔兩週，諸如每18、19、20、21、22、23或24天；約每隔三週，諸如每25、26、27、28、29、30或31天。本發明之抗體亦可應需投予。
如上所述，本發明之抗體可與一或多種其他治療劑共投予。其他藥劑可為將增強調節劑作用之藥劑。其他藥劑可為起增強凝血作用之藥劑，諸如凝血因子。特定而言，本發明之調節劑可與因子VII(a)或FVIII(a)共投予。其他藥劑可旨在治療患者之其他症狀或病狀。舉例而言，其他藥劑可為止痛劑、麻醉劑、免疫抑制劑或消炎劑。
兩種或兩種以上藥劑可以多種不同方式組合投予。在一具體實例中，抗體與其他藥劑可於單一組成物中一起投予。在另一具體實例中，抗體及其他藥劑可於作為組合療法之一部分的不同組成物中投予。舉例而言，調節劑可在其他藥劑之前、之後或同時投予。
如本文中所用，術語「治療」係指對任何有需要之人類或其他動物個體之醫治。該個體估計已由醫務者或獸醫醫務者進行過身體檢查，其已給出暫定性或明確性診斷，診斷表明使用該特定治療有利於該人類個體或其他動物個體之健康。根據個體健康現狀，該治療之時機選擇及目的可因個體而異。因此，該治療可具預防性、緩解性、徵兆性及/或洽愈性。就本發明而言，預防性、緩解性、徵兆性及/或洽愈性治療可代表本發明之不同態樣。
因此，本發明之抗體可非經腸投予。
本發明之抗體可靜脈內投予。
本發明之抗體可肌肉內投予。
本發明之抗體可皮下投予。
本發明之抗體可預防性投予，本發明之抗體可治療性(應需)投予。
本發明之抗體能夠顯著減少失血。
本發明之抗體能夠顯著減少出血時間。
因此，本發明亦為一種以能夠結合TFPI之K2域之單株抗體治療有需要之個體的方法，其中單株抗體之投予量為使其標靶飽和之量。單株抗體之投予量可為使可溶性TFPI飽和之量。單株抗體之投予量可為使結合內皮之TFPI飽和之量。
如本文中所用，術語「凝血障礙」係指因正常凝血級聯之任何促凝組份之任何定性或定量不足，或纖維蛋白溶解之任何上調所引起的出血趨勢增強。此等凝血障礙可為先天性及/或後天性及/或醫原性凝血障礙且可由熟習此項技術者鑑定。
先天性低凝血病(congenital hypocoagulopathies)之非限制性實例為A型血友病、B型血友病、因子VII缺乏症、因子XI缺乏症、溫韋伯氏疾病及血小板減少症，諸如格蘭茲曼血小板無力症(Glanzmann's thombasthenia)及伯-蘇症候群(Bernard-Soulier syndrome)。
後天性凝血障礙之非限制性實例為由維生素K缺乏引起之絲胺酸蛋白酶缺乏症；此維生素K缺乏症可由投予維生素K拮抗劑(諸如華法林(warfarin))引起。後天性凝血障礙亦可在大範圍外傷之後發生。在此情況(或者稱為「血液惡性循環(bloody vicious cycle)」)下，其特徵在於血稀釋(haemodilution)(稀釋性血小板減少症及凝血因子稀釋)、體溫過低、凝血因子耗盡及代謝紊亂(酸中毒)。液體療法及提高之纖維蛋白溶解會使此情況惡化。該出血可來自身體之任何部分。
具有「抑制子」(亦即，針對因子VIII之同種異體抗體)之A型血友病及具有「抑制子」(亦即，針對因子IX之同種異體抗體)之B型血友病為部分先天性及部分後天性凝血障礙之非限制性實例。
醫原性凝血障礙之非限制性實例為經指定可治療血栓栓塞性疾病之抗凝血劑藥物(諸如肝素(heparin)、阿司匹林(aspirin)、華法林及其他血小板聚集抑制劑)之過度給藥。醫原性凝血障礙之第二非限制性實例為由過度及/或不適當之液體療法誘發之凝血障礙，諸如可由輸血誘發之凝血障礙。
在本發明之一具體實例中，出血係與A或B型血友病相關。在另一具體實例中，出血係與具有獲得性抑制子之A或B型血友病相關。在另一具體實例中，出血係與血小板減少症相關。在另一具體實例中，出血係與溫韋伯氏疾病相關。在另一具體實例中，出血係與嚴重組織損害相關。在另一具體實例中，出血係與嚴重外傷相關。在另一具體實例中，出血係與手術相關。在另一具體實例中，出血係與出血性胃炎及/或腸炎相關。在另一具體實例中，出血為子宮血崩(profuse uterine bleeding)，諸如胎盤早期剝離時。在另一具體實例中，出血發生於機械止血可能性受到限制的器官(諸如顱內、耳內或眼內)中。在另一具體實例中，出血與抗凝療法相關。
本發明之抗體可用以治療患有凝血障礙之個體。因此，本發明亦為能夠結合TFPI之K2域的單株抗體用於治療有需要之個體的用途；以及該抗體用於製造供治療有需要之個體之藥物的用途。此外，本發明為一種能夠結合TFPI之K2域之單株抗體治療有需要之個體的方法。
使用本發明之該單株抗體可顯著減少失血。
使用本發明之該單株抗體可顯著減少出血時間。
此外，使用本發明之該單株抗體可減少活體內凝血時間而不引起暫時性血小板減少症。
具體實例
以下為本發明具體實例之非限制性清單：具體實例1：能夠特異性結合TFPI之K2域的單株抗體，其中該抗體能夠結合的抗原決定基包含一或多個選自由以下者所組成之群組的殘基：SEQ ID NO:2之E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、F35、K36及L50。
具體實例2：如具體實例1之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合的抗原決定基包含含有SEQ ID NO: 2之殘基E10的抗原決定基。
具體實例3：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合的抗原決定基包含含有SEQ ID NO: 2之殘基E11的抗原決定基。
具體實例4：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基D12的抗原決定基。
具體實例5：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基P13的抗原決定基。
具體實例6：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基R17的抗原決定基。
具體實例7：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基Y19的抗原決定基。
具體實例8：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基T21的抗原決定基。
具體實例9：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基Y23的抗原決定基。
具體實例10：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基F24的抗原決定基。
具體實例11：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基N26的抗原決定基。
具體實例12：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基Q28的抗原決定基。
具體實例13：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基Q31的抗原決定基。
具體實例14：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基C32的抗原決定基。
具體實例15：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基E33的抗原決定基。
具體實例16：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基R34的抗原決定基。
具體實例17：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基F35的抗原決定基。
具體實例18：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基K36的抗原決定基。
具體實例19：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基L50的抗原決定基。
具體實例20：如具體實例1至16及18至19中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合的抗原決定基包含SEQ ID NO: 2之殘基E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、K36及L50。
具體實例21：如具體實例1至3、5至9、12至13及15至19中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合的抗原決定基包含SEQ ID NO: 2之殘基E10、E11、P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36及L50。
具體實例22：能夠結合TFPI之K2域的單株抗體，其中該抗體之輕鏈包含以下胺基酸殘基:‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置31的位置包含E，‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置32的位置包含S，‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置33的位置包含D，‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置37的位置包含Y，‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置96的位置包含A，‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置97的位置包含T，及‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置99的位置包含F；且其中該抗體之重鏈包含以下胺基酸殘基：‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置31的位置包含N，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置53的位置包含R，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置54的位置包含S，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置57的位置包含Y，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置59的位置包含Y，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置60的位置包含F，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置61的位置包含P，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置62的位置包含D，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置65的位置包含Q，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置102的位置包含Y，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置103的位置包含D，及‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置106的位置包含D。具體實例23：如具體實例1至21中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體之輕鏈包含以下胺基酸殘基：‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置31的位置包含E，‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置32的位置包含S，‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置33的位置包含D，‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置37的位置包含Y，‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置96的位置包含A，‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置97的位置包含T，及‧在對應於SEQ ID NO: 15之位置99的位置包含F；且其中該抗體之重鏈包含以下胺基酸殘基：‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置31的位置包含N，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置53的位置包含R，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置54的位置包含S，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置57的位置包含Y，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置59的位置包含Y，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置60的位置包含F，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置61的位置包含P，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置62的位置包含D，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置65的位置包含Q，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置102的位置包含Y，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置103的位置包含D，及‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置106的位置包含D。
具體實例24：如具體實例22或具體實例23之單株抗體，其中該重鏈進一步在對應於SEQ ID NO: 18之位置52的位置包含S。
具體實例25：如具體實例22至23中任一具體實例之單株抗體，其中該輕鏈進一步在對應於SEQ ID NO: 15之位置98的位置包含H；且該重鏈進一步在對應於SEQ ID NO: 18之位置56的位置包含S。
具體實例26：一種單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子(TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之重鏈包含SEQ ID NO: 18之胺基酸31至35(NYAMS)之CDR1序列，其中此等胺基酸之一可經不同胺基酸取代。
具體實例27：如具體實例1至21中任一具體實例之單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子(TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之重鏈包含SEQ ID NO:18之胺基酸31至35(NYAMS)之CDR1序列，其中此等胺基酸之一可經不同胺基酸取代。
具體實例28：一種單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子(TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之重鏈包含SEQ ID NO: 18之胺基酸50至66(TISRSGSYSYFPDSVQG)之CDR2序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
具體實例29：如具體實例1至21中任一具體實例之單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子(TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之重鏈包含SEQ ID NO: 18之胺基酸50至66(TISRSGSYSYFPDSVQG)之CDR2序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
具體實例30：一種單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子(TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之重鏈包含SEQ ID NO: 18之胺基酸99至110(LGGYDEGDAMDS)之CDR3序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
具體實例31：如具體實例1至21中任一具體實例之單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子(TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之重鏈包含SEQ ID NO:18之胺基酸99至110(LGGYDEGDAMDS)之CDR3序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
具體實例32：一種單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子(TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO:15之胺基酸24至39(KSSQSLLESDGKTYLN)之CDR1序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
具體實例33：如具體實例1至21中任一具體實例之單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子(TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO:15之胺基酸24至39(KSSQSLLESDGKTYLN)之CDR1序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
具體實例34：一種單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子(TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO:15之胺基酸55至61(LVSILDS)之CDR2序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
具體實例35：如具體實例1至21中任一具體實例之單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子(TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO:15之胺基酸55至61(LVSILDS)之CDR2序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
具體實例36：一種單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子(TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO: 15之胺基酸94至102(LQATHFPQT)之CDR3序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
具體實例37：如具體實例1至21中任一具體實例之單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子(TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO: 15之胺基酸94至102(LQATHFPQT)之CDR3序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
具體實例38：一種單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子(TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之重鏈包含：‧SEQ ID NO: 18之胺基酸31至35(NYAMS)之CDR1序列，其中此等胺基酸之一可經不同胺基酸取代；及/或‧SEQ ID NO: 18之胺基酸50至66(TISRSGSYSYFPDSVQG)之CDR2序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或‧SEQ ID NO: 18之胺基酸99至110(LGGYDEGDAMDS)之CDR3序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
具體實例39：如具體實例1至21中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體之重鏈包含：‧SEQ ID NO: 18之胺基酸31至35(NYAMS)之CDR1序列，其中此等胺基酸之一可經不同胺基酸取代；及/或‧SEQ ID NO: 18之胺基酸50至66(TISRSGSYSYFPDSVQG)之CDR2序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或‧SEQ ID NO: 18之胺基酸99至110(LGGYDEGDAMDS)之CDR3序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
具體實例40：一種單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子(TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之輕鏈包含:‧SEQ ID NO: 15之胺基酸24至39(KSSQSLLESDGKTYLN)之CDR1序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或‧SEQ ID NO: 15之胺基酸55至61(LVSILDS)之CDR2序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或‧SEQ ID NO: 15之胺基酸94至102(LQATHFPQT)之CDR3序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
具體實例41：如具體實例1至21中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體之輕鏈包含：‧SEQ ID NO: 15之胺基酸24至39(KSSQSLLESDGKTYLN)之CDR1序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或‧SEQ ID NO: 15之胺基酸55至61(LVSILDS)之CDR2序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或‧SEQ ID NO: 15之胺基酸94至102(LQATHFPQT)之CDR3序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
具體實例42：一種單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子(TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之重鏈包含：‧SEQ ID NO: 18之胺基酸31至35(NYAMS)之CDR1序列，其中此等胺基酸之一可經不同胺基酸取代；及/或‧SEQ ID NO: 18之胺基酸50至66(TISRSGSYSYFPDSVQG)之CDR2序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或‧SEQ ID NO: 18之胺基酸99至110(LGGYDEGDAMDS)之CDR3序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；且其中該抗體之輕鏈包含：‧SEQ ID NO: 15之胺基酸24至39(KSSQSLLESDGKTYLN)之CDR1序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或‧SEQ ID NO: 15之胺基酸55至61(LVSILDS)之CDR2序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或‧SEQ ID NO: 15之胺基酸94至102(LQATHFPQT)之CDR3序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
具體實例43：如具體實例1至21中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體之重鏈包含：‧SEQ ID NO: 18之胺基酸31至35(NYAMS)之CDR1序列，其中此等胺基酸之一可經不同胺基酸取代；及/或‧SEQ ID NO: 18之胺基酸50至66(TISRSGSYSYFPDSVQG)之CDR2序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或‧SEQ ID NO: 18之胺基酸99至110(LGGYDEGDAMDS)之CDR3序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；且其中該抗體之輕鏈包含：‧SEQ ID NO: 15之胺基酸24至39(KSSQSLLESDGKTYLN)之CDR1序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或‧SEQ ID NO: 15之胺基酸55至61(LVSILDS)之CDR2序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或‧SEQ ID NO: 15之胺基酸94至102(LQATHFPQT)之CDR3序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
具體實例44：如具體實例26至43中任一具體實例之單株抗體，其中該等胺基酸取代不包含以下胺基酸：‧在對應於SEQ ID NO: 18之CDR1區之位置31的位置不包含N；‧在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置53的位置不包含R；‧在對應於SEQ ID NO:18之CDR2區之位置54的位置不包含S；‧在對應於SEQ ID NO:18之CDR2區之位置56的位置不包含S；‧在對應於SEQ ID NO:18之CDR2區之位置57的位置不包含Y；‧在對應於SEQ ID NO:18之CDR2區之位置59的位置不包含Y；‧在對應於SEQ ID NO:18之CDR2區之位置60的位置不包含F；‧在對應於SEQ ID NO:18之CDR2區之位置61的位置不包含P；‧在對應於SEQ ID NO:18之CDR2區之位置62的位置不包含D；及‧在對應於SEQ ID NO:18之CDR2區之位置65的位置不包含Q；‧在對應於SEQ ID NO:18之CDR3區之位置102的位置不包含Y；‧在對應於SEQ ID NO:18之CDR3區之位置103的位置不包含D；及‧在對應於SEQ ID NO:18之CDR3區之位置106的位置不包含D；‧在對應於SEQ ID NO:15之CDR1區之位置31的位置不包含E；‧在對應於SEQ ID NO:15之CDR1區之位置32的位置不包含S；‧在對應於SEQ ID NO: 15之CDR1區之位置33的位置不包含D；及‧在對應於SEQ ID NO: 15之CDR1區之位置37的位置不包含Y；‧在對應於SEQ ID NO: 15之CDR3區之位置96的位置不包含A；‧在對應於SEQ ID NO: 15之CDR3區之位置97的位置不包含T；‧在對應於SEQ ID NO: 15之CDR3區之位置98的位置不包含H；及‧在對應於SEQ ID NO: 15之CDR3區之位置99的位置不包含F。
具體實例45：如具體實例26至44中任一具體實例之單株抗體，其中該胺基酸取代為保守性取代。
具體實例46：如具體實例26至45中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體之重鏈包含：‧包含SEQ ID NO: 18之胺基酸31至35(NYAMS)之CDR1序列；及‧包含SEQ ID NO: 18之胺基酸50至66(TISRSGSYSYFPDSVQG)之CDR2序列；及‧包含SEQ ID NO: 18之胺基酸99至110(LGGYDEGDAMDS)的CDR3序列。
具體實例47：如具體實例26至46中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體之輕鏈包含：‧　包含SEQ ID NO: 15之胺基酸24至39(KSSQSLLESDGKTYLN)之CDR1序列；及‧　包含SEQ ID NO: 15之胺基酸55至61(LVSILDS)之CDR2序列；及‧包含SEQ ID NO: 15之胺基酸94至102(LQATHFPQT)之CDR3序列。
具體實例48：如具體實例46至47中任一具體實例之單株抗體，其中該重鏈包含：‧包含SEQ ID NO: 18之胺基酸31至35(NYAMS)之CDR1序列；及‧　包含SEQ ID NO: 18之胺基酸50至66(TISRSGSYSYFPDSVQG)之CDR2序列；及‧　包含SEQ ID NO: 18之胺基酸99至110(LGGYDEGDAMDS)的CDR3序列；且其中該輕鏈包含：‧　包含SEQ ID NO: 15之胺基酸24至39(KSSQSLLESDGKTYLN)之CDR1序列；及‧　包含SEQ ID NO: 15之胺基酸55至61(LVSILDS)之CDR2序列；及‧包含SEQ ID NO: 15之胺基酸94至102(LQATHFPQT)之CDR3序列。
具體實例49：如前述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO: 15。
具體實例50：如前述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體之重鏈包含SEQ ID NO: 18。
具體實例51：如前述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 18。
具體實例52：如前述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO: 21之輕鏈。
具體實例53：如前述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO: 24之重鏈。
具體實例54：如具體實例52至53中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO: 21及SEQ ID NO: 24。
具體實例55：如前述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其為人類化抗體。
具體實例56：如具體實例55之單株抗體，其中重鏈之框架區2包含以下胺基酸：‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置40的位置包含T，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置42的位置包含E，‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置44的位置包含R，及‧在對應於SEQ ID NO: 18之位置49的位置包含A。
具體實例57：如具體實例55之單株抗體，其中重鏈之框架區2包含對應於SEQ ID NO: 18之位置36至49(WVRQTPEKRLEWVA)的胺基酸。
具體實例58：如具體實例1至54中任一具體實例之單株抗體，其為人類抗體。
具體實例59：如具體實例1至54中任一具體實例之單株抗體，其為嵌合抗體。
具體實例60：如前述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體之同型為IgG。
具體實例61：如具體實例60之單株抗體，其中該同型為IgG1、IgG2或IgG4。
具體實例62：如具體實例61之單株抗體，其中該抗體之同型為IgG4。
具體實例63：如具體實例60至62中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體之Fc區中之至少一個胺基酸已被另一個胺基酸取代。
具體實例64：如前述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體之Fc區與SEQ ID NO: 24之胺基酸122-448至少80%一致，諸如至少85%，諸如至少90%，諸如至少95%，諸如95-100%一致。
具體實例65：一種單株抗體，其能夠以高於mAb0281之親和力結合TFPI之K2域。
具體實例66：如具體實例1至64中任一具體實例之單株抗體，其能夠以高於mAb0281之親和力結合TFPI之K2域。
具體實例67：一種單株抗體，其能夠以高於mAb4904之親和力結合TFPI之K2域。
具體實例68：如具體實例1至66中任一具體實例之單株抗體，其能夠以高於mAb4904之親和力結合TFPI之K2域。
具體實例69：一種單株抗體，其能夠以高於mAb2974之親和力結合TFPI之K2域。
具體實例70：如具體實例1至68中任一具體實例之單株抗體，其能夠以高於mAb2974之親和力結合TFPI之K2域。
具體實例71：一種單株抗體，其能夠以高於mAb29741之親和力結合TFPI之K2域。
具體實例72：如具體實例1至70中任一具體實例之單株抗體，其能夠以高於mab29741之親和力結合TFPI之K2域。
具體實例73：一種單株抗體，其能夠結合TFPI之K2域，其中該抗體之KD 小於0.8nM，諸如小於0.7nM，諸如小於0.6nM，諸如小於0.5nM，諸如小於0.4nM，諸如小於0.3nM，諸如小於0.2nM，諸如小於0.1nM，諸如小於0.05nM，諸如小於0.025nM。
具體實例74：如具體實例1至73中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體之KD 小於0.8nM，諸如小於0.7nM，諸如小於0.6nM，諸如小於0.5nM，諸如小於0.4nM，諸如小於0.3nM，諸如小於0.2nM，諸如小於0.1nM，諸如小於0.05nM，諸如小於0.025nM。具體實例75：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其能夠結合血小板相關TFPI之K2域。
具體實例76：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其能夠抑制可溶性TFPI。
具體實例77：如具體實例76之單株抗體，其中該可溶性TFPI可完全受抑制。
具體實例78：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其能夠抑制結合脂蛋白之TFPI。
具體實例79：如上述具體實例中任一具體實例之單株抗體，其能夠抑制結合內皮細胞之TFPI。
具體實例80：一種單株抗體，其能夠結合TFPI之K2域，使得FXa保留其活性之至少91%，諸如至少92%、諸如至少93%、諸如至少94%、諸如至少95%、諸如至少96%、諸如至少97%、諸如至少98%、諸如至少99%、諸如99-100%，如在FXa抑制檢定中所量測的。
具體實例81：如具體實例1至79中任一具體實例之單株抗體，其能夠結合TFPI，使得FXa保留其活性之至少91%，諸如至少92%、諸如至少93%、諸如至少94%、諸如至少95%、諸如至少96%、諸如至少97%、諸如至少98%、諸如至少99%、諸如99-100%，如在FXa抑制檢定中所量測的。
具體實例82：一種單株抗體，其能夠結合TFPI之K2域，使得個體中自由TFP1之百分比減少至小於30%，諸如小於29%、諸如小於28%、諸如小於27%、諸如小於26%、諸如小於25%、諸如小於24%、諸如小於23%、諸如小於22%、諸如小於21%、諸如小於20%、諸如小於19%、諸如小於18%、諸如小於17%、諸如小於16%、諸如小於15%、諸如小於14%、諸如小於13%、諸如小於12%、諸如小於11%、諸如小於10%、諸如小於9%、諸如小於8%、諸如小於7%、諸如小於6%、諸如小於5%、諸如小於4%、諸如小於3%、諸如小於2%、諸如小於1%、諸如在1%與0%之間。
具體實例83：如具體實例1至81中任一具體實例之單株抗體，其能夠結合TFPI之K2域，使得個體中自由TFPI之百分比減少至小於30%，諸如小於29%、諸如小於28%、諸如小於27%、諸如小於26%、諸如小於25%、諸如小於24%、諸如小於23%、諸如小於22%、諸如小於21%、諸如小於20%、諸如小於19%、諸如小於18%、諸如小於17%、諸如小於16%、諸如小於15%、諸如小於14%、諸如小於13%、諸如小於12%、諸如小於11%、諸如小於10%、諸如小於9%、諸如小於8%、諸如小於7%、諸如小於6%、諸如小於5%、諸如小於4%、諸如小於3%、諸如小於2%、諸如小於1%、諸如在1%與0%之間。
具體實例84：如具體實例83之單株抗體，其中在向該個體投予該單株抗體之後的頭28天期間，諸如在頭27天期間、諸如在頭26天期間、諸如在頭25天期間、諸如在頭24天期間、諸如在頭23天期間、諸如在頭22天期間、諸如在頭21天期間、諸如在頭20天期間、諸如在頭19天期間、諸如在頭18天期間、諸如在頭17天期間、諸如在頭16天期間、諸如在頭15天期間、諸如在頭14天期間、諸如在頭13天期間、諸如在頭12天期間、諸如在頭11天期間、諸如在頭10天期間、諸如在頭9天期間、諸如在頭8天期間、諸如在頭7天期間、諸如在頭6天期間、諸如在頭5天期間、諸如在頭4天期間、諸如在頭3天期間、諸如在頭2天期間、諸如在第1天期間，個體中自由TFPI之量減少至該百分比。
具體實例85：一種單株抗體，其能夠結合TFPI之K2 域且當TFPI以該抗體飽和時，該抗體能夠將結合膜之FVIIa/TF/FXa之TFPI抑制中和至少55%，諸如至少60%、諸如至少65%、諸如至少70%、諸如至少75%、諸如至少80%、諸如至少85%、諸如至少90%、諸如至少95%、諸如多至100%、諸如100%，如在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中所量測的。
具體實例86：如具體實例1至84中任一具體實例之單株抗體，其中TFPI以該抗體飽和時，該抗體能夠將結合膜之FVIIa/TF/FXa之TFPI抑制中和至少55%，諸如至少60%、諸如至少65%、諸如至少70%、諸如至少75%、諸如至少80%、諸如至少85%、諸如至少90%、諸如至少95%、諸如多至100%、諸如100%，如在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中所量測的。
具體實例87：一種單株抗體，其能夠結合TFPI之K2域且減少活體內凝血時間而不顯著降低血小板數。
具體實例88：如具體實例1至86中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體減少活體內凝血時間而不顯著降低血小板數。
具體實例89：如具體實例88之單株抗體，其中該血小板數未降至初始血小板數之約80%，諸如約75%、諸如約70%、諸如約65%、諸如約60%、諸如約55%、諸如約50%、諸如約45%、諸如約40%、諸如約35%、諸如約30%、諸如約25%。
具體實例90：一種單株抗體，其能夠結合TFPI之K2域且減少活體內凝血時間而未引起暫時性血小板減少症。
具體實例91：如具體實例1至89中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體減少活體內凝血時間而未引起暫時性血小板減少症。
具體實例92：一種如前述具體實例中任一具體實例之單株抗體的片段。
具體實例93：如具體實例92之片段，其為Fab片段、F(ab')2 片段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段或dAb片段。
具體實例94：一種如具體實例中任一具體實例之單株抗體之變異體，其為缺失變異體或插入變異體。
具體實例95：一種醫藥調配物，其包含如具體實例1至94中任一具體實例之單株抗體。
具體實例96：一種醫藥調配物，其包含如具體實例1至94中任一具體實例之單株抗體，其中該調配物適於非經腸使用。
具體實例97：一種醫藥調配物，其包含如具體實例1至94中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體適於靜脈內使用。
具體實例98：一種醫藥調配物，其包含如具體實例1至94中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體適於肌肉內使用。
具體實例99：一種醫藥調配物，其包含如具體實例1至94中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體適於皮下使用。
具體實例100：一種如具體實例1至94中任一具體實例之單株抗體的用途，其用於製造適於非經腸投予之藥物。
具體實例101：一種如具體實例1至94中任一具體實例之單株抗體的用途，其用於製造適於靜脈內投予之藥物。
具體實例102：一種如具體實例1至94中任一具體實例之單株抗體的用途，其用於製造適於肌肉內投予之藥物。
具體實例103：一種如具體實例1至94中任一具體實例之單株抗體的用途，其用於製造適於皮下投予之藥物。
具體實例104：一種如具體實例1至94中任一具體實例之單株抗體的用途，其用於治療患有凝血障礙之個體。
具體實例105：如具體實例104之用途，其中該個體患有任何先天性、後天性及/或醫原性凝血障礙，諸如可選自由A型血友病(有或無抑制子)及B型血友病(有或無抑制子)所組成之群組。
具體實例106：如具體實例95至105中任一具體實例之用途，其中該單株抗體顯著減少失血。
具體實例107：如具體實例95至106中任一具體實例之用途，其中該單株抗體顯著減少出血時間。
具體實例108：如具體實例95至107中任一具體實例之用途，其中單株抗體之投予量使得該單株抗體之血漿濃度為約10μg/ml至約40μg/ml，諸如約15-35μg/ml、諸如約10-15μg/ml、諸如約15-20μg/ml、諸如約20-25μg/ml、諸如約25-30 μg/ml、諸如約30-35μg/ml、諸如約35-40μg/ml。
具體實例109：一種治療患有凝血障礙之個體的方法，其包含向該個體投予如具體實例1至94中任一具體實例之單株抗體。
具體實例110：如具體實例109之方法，其中該凝血障礙為任何先天性、後天性及/或醫原性凝血障礙，諸如可選自由A型血友病(有或無抑制子)及B型血友病(有或無抑制子)所組成之群組。
具體實例111：如具體實例109至110中任一具體實例之方法，其中該單株抗體能夠顯著減少失血。
具體實例112：如具體實例109至111中任一具體實例之方法，其中該單株抗體能夠顯著減少出血時間。
具體實例113：如具體實例109至111中任一具體實例之方法，其中單株抗體之投予量為使其標靶飽和之量。
具體實例114：如具體實例109至113中任一具體實例之方法，其中單株抗體之投予量為使可溶性TFPI飽和之量。
具體實例115：如具體實例109至114中任一具體實例之方法，其中所投予之該抗體能夠完全抑制可溶性TFPI。
具體實例116：如具體實例109至115中任一具體實例之方法，其中該單株抗體之投予量足以使結合內皮之TFPI飽和。
具體實例117：如具體實例109至116中任一具體實例之方法，其中單株抗體之投予量使得該單株抗體之血漿濃度為約10μg/ml至約40μg/ml，諸如約15-35μg/ml、諸如約10-15μg/ml、諸如約15-20μg/ml、諸如約20-25μg/ml、諸如約25-30μg/ml、諸如約30-35μg/ml、諸如約35-40μg/ml。
具體實例118：如具體實例109至117中任一具體實例之方法，其中可投予單次劑量。
具體實例119：如具體實例109至118中任一具體實例之方法，其中可投予多次劑量。
具體實例120：如具體實例109至119中任一具體實例之方法，其中可每日投予該抗體。
具體實例121：如具體實例109至120中任一具體實例之方法，其中可每隔一天投予該抗體。
具體實例122：如具體實例109至121中任一具體實例之方法，其中可每隔兩天投予該抗體。
具體實例123：如具體實例109至122中任一具體實例之方法，其中可每隔三天投予該抗體。
具體實例124：如具體實例109至123中任一具體實例之方法，其中可每隔四天投予該抗體。
具體實例125：如具體實例109至124中任一具體實例之方法，其中可每隔五天投予該抗體。
具體實例126：如具體實例109至125中任一具體實例之方法，其中可大約每週(諸如每5、6、7、8、9或10天)投予該單株抗體。
具體實例127：如具體實例109至126中任一具體實例之方法，其中可大約每隔一週(諸如每11、12、13、14、15、16或17天)投予該單株抗體。
具體實例128：如具體實例109至127中任一具體實例之方法，其中可大約每隔兩週(諸如每18、19、20、21、22、23或24天)投予該單株抗體。
具體實例129：如具體實例109至128中任一具體實例之方法，其中可大約每隔三週(諸如每25、26、27、28、29、30或31天)投予該單株抗體。
具體實例130：如具體實例109至129中任一具體實例之方法，其中劑量可為約0.1-10mg/kg，諸如約0.1-1mg/kg，諸如約1-2mg/kg，或約2-3mg/kg，或約4-5mg/kg，或約5-6mg/kg，或約6-7mg/kg，或約7-8mg/kg，或約8-9mg/kg，或約9-10mg/kg；或約10-21mg/kg，諸如約10-11mg/kg，或約11-12mg/kg，或約12-13mg/kg，或約13-14mg/kg，或約14-15mg/kg，或約15-16mg/kg，約16-17mg/kg，或約17-18mg/kg，或約18-19mg/kg，或約19-20mg/kg或約20-21mg/kg。
具體實例131：如具體實例109至130中任一具體實例之方法，其中劑量可為約2至200mg/kg、諸如約150-200mg/kg、諸如約150-170mg/kg、諸如約100-150mg/kg、諸如約50-100mg/kg、諸如約70-90mg/kg、諸如約10-50mg/kg、諸如約10-30mg/kg。
具體實例132：如具體實例109至131中任一具體實例之方法，其中可非經腸投予該單株抗體。
具體實例133：如具體實例132之方法，其中可靜脈內投予該單株抗體。
具體實例134：如具體實例133之方法，其中該單株抗體之劑量可為約10-20mg/kg。
具體實例135：如具體實例133至134中任一具體實例之方法，其中可每隔一週投予該單株抗體。
具體實例136：如具體實例133至135中任一具體實例之方法，其中可每隔兩週投予該單株抗體。
具體實例137：如具體實例133至136中任一具體實例之方法，其中可每隔三週投予該單株抗體。
具體實例138：如具體實例133之方法，其中該單株抗體之劑量可為約10-20mg/kg且可每隔一週投予該單株抗體。
具體實例139：如具體實例133之方法，其中該單株抗體之劑量可為約10-20mg/kg且可每隔兩週投予該單株抗體。
具體實例140：如具體實例133之方法，其中該單株抗體之劑量可為約10-20mg/kg且可每隔三週投予該單株抗體。
具體實例141：如具體實例132之方法，其中可肌肉內投予該單株抗體。
具體實例142：如具體實例132之方法，其中可皮下投予該單株抗體。
具體實例143：如具體實例132之方法，其中該單株抗體之劑量可為約1mg/kg。
具體實例144：如具體實例141至143中任一具體實例之方法，其中可每日投予該單株抗體。
具體實例145：如具體實例141至144中任一具體實例之方法，其中可每隔一天投予該單株抗體。
具體實例146：如具體實例141至145中任一具體實例之方法，其中該單株抗體之劑量可為約1mg/kg且可每日投予該單株抗體。
具體實例147：如具體實例141至146中任一具體實例之方法，其中該單株抗體之劑量可為約1mg/kg且可每隔一天投予該單株抗體。
具體實例148：如具體實例109至147中任一具體實例之方法，其中可預防性地投予該抗體。
具體實例149：如具體實例109至148中任一具體實例之方法，其中可治療性地(應需)投予該抗體。
具體實例150：如具體實例109至149中任一具體實例之方法，其中所投予之該抗體能夠完全(100%)抑制可溶性TFPI。
具體實例151：一種聚核苷酸，其編碼如具體實例1至94中任一具體實例之單株抗體。
具體實例152：如具體實例151之聚核苷酸，其包含至少一個選自由SEQ ID NO: 13、16、19及22所組成之群組的序列。
具體實例153：如具體實例152之聚核苷酸，其包含SEQ ID NO: 19。
具體實例154：如具體實例152之聚核苷酸，其包含SEQ ID NO: 22。
具體實例155：如具體實例152之聚核苷酸，其包含SEQ ID NO: 19及22。
具體實例156：一種真核細胞，其包含如具體實例151至155中任一具體實例之聚核苷酸。
具體實例157：一種真核細胞，其表現如具體實例1至94中任一具體實例之單株抗體或其片段。
具體實例158：如具體實例157之真核細胞，其為哺乳動物細胞。
具體實例159：如具體實例157之真核細胞，其為酵母細胞。
具體實例160：如具體實例158之哺乳動物細胞，其係選自由HEK293、CHO、BHK、NSO及人類視網膜細胞所組成之群組。
實施例
本發明由以下實施例進一步說明，該等實施例不應視為對本發明之進一步限制。整篇本申請案中所引用之所有圖式及所有參考文獻、專利及已公開專利申請案之內容均以引用的方式明確併入本文中。
實施例1：產生及特性化針對TFPI之單株抗體
產生針對組織因子路徑抑制子(TFPI)之單株抗體。鑑定、選殖及定序具有所需結合特異性之單株抗體。發現此抗體可在活體內顯著減少表皮出血時間且不引起血小板數目顯著降低。
方法及結果
根據製造商說明書使用所有套組。縮寫：HC：重鏈；LC：輕鏈；VH：重鏈可變域；VL：輕鏈可變域；PCR：聚合酶鏈反應。
免疫及融合
以全長TFPI與僅含有前兩個Kunitz域之短型TFPIB161B使小鼠免疫。將RBF小鼠用於免疫及產生小鼠單株抗體。在小鼠背部進行皮下注射。將20μg蛋白質與完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant)混合用於首次注射。在後續免疫中，在相同濃度之抗原存在下使用弗氏不完全佐劑。在最後免疫之後十天，藉由ELISA篩選來自小鼠之眼睛血液的TFPI特異性抗體。以10μg TFPI藉由靜脈內注射來加強具有陽性血清效價之小鼠，且三天之後處死。無菌移除脾臟且分散成單細胞懸浮液。藉由PEG法或藉由電融合法將脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合。
結合檢定：ELISA
以抗小鼠IgG塗佈免疫培養盤。將融合瘤細胞之培養上清液添加至培養盤中且在洗滌之後，添加生物素標記之可溶性人類TFPI或TFPIB161B以測試特異性結合。
中和檢定：FXa檢定及TF/FVIIa/FXa檢定
FXa抑制檢定：將引起FXa 90%抑制之固定濃度之TFPI與含有抗TFPI單株抗體之融合瘤細胞之培養上清液一起預培育，且添加至FXa加FXa特異性發色受質中。此檢定係針對TFPI與FXa之結合(詳述於實施例6中)。
FVIIa/TF/FXa抑制檢定：1)培育含有抗TFPI單株抗體之融合瘤細胞之培養上清液及固定TFPI(FVIIa /TF之90%抑制)；2)培育TFPI+FVIIa+TF+FXa；3)添加FX(FX>>FXa)，接著與FXa發色受質一起培育(詳述於實施例7中)。
稀釋凝血酶原時間(dPT)
稀釋凝血酶原(PT)分析：將人類血漿與稀釋之人類凝血活素(來源於TF)合併。添加遞增濃度之蛋白質A純化TFPI單株抗體之後量測血漿之凝結時間以檢查凝血時間之劑量依賴性減少。FVIIa(25nM)為陽性對照物且必須縮短此凝血時間。
結合相互作用分析
在Biacore 3000中藉由表面電漿共振分析結合相互作用。以固著之小鼠抗IgG捕捉固定濃度之相關單株抗體。測試不同濃度之TFPI。假設TFPI與相關抗體1:1相互作用來測定結合常數(kon 、koff 、KD )(詳述於實施例8中)。
血栓彈力圖
血栓彈力圖記錄全血中凝塊形成及纖維蛋白溶解之動力學。藉由預培育血液與中和性抗FVIII IgG來誘發A型血友病樣病狀。
抗體選殖及定序
自融合瘤:TFPI-4F36A1B2(在本文中縮寫為4F36)選殖抗TFPI抗體之鼠類重鏈及輕鏈序列。總RNA(使用Qiagen之RNeasy-Mini套組自融合瘤細胞提取)用作cDNA合成之模板。使用Clontech之SMARTTM RACE cDNA擴增套組、以5'-RACE反應來合成cDNA。隨後使用Phusion Hot Star聚合酶(Finnzymes)及通用引子混合物(UPM)(包括於SMARTTM RACE套組中)作為正向引子、藉由PCR對HC及LC序列進行標靶擴增。具有以下序列之反向引子用於HC(VH域)擴增：5'-CCCTTGACCAGGCATCCCAG-3'(129號引子)。具有以下序列之反向引子用於LC擴增：5'-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3'(69號引子)。
藉由凝膠電泳分離PCR產物，使用GFXPCRDNA及Gel Band純化套組(來自GE Healthcare Bio-Sciences)來提取，且使用Zero Blunt TOPO PCR選殖套組及化學上勝任之TOP 10大腸桿菌(E.coli )(來自Invitrogen)來選殖以便定序。使用Applied Biosystems之AmpliTaq Gold Mas-ter Mix，及M13uni/M13rev引子對所選菌落進行菌落PCR。使用ExoSAP-I酶混合物(usb)來進行菌落PCR純化。使用M13uni(-21)/M13rev(-29)或T3/T7定序引子，在MWG Biotech,Martinsried German進行定序。使用VectorNTI程式分析及評注序列。
自融合瘤TFPI-4F36A1B2鑑定單一獨特鼠類κ型LC及單一獨特鼠類HC、子類IgG1。LC序列展示於SEQ ID NO: 6中且HC序列展示於SEQ ID NO: 10中。VH及VL序列展示於圖2中，不包括前導肽序列。
抗原決定基
TFPI1包括三個Kunitz域(參看圖4)。TFPI1之Kunitz域之表面可達殘基係依據TFPI1-2之現有結構加以鑑定。詳言之，相對可達性大於40%之殘基視為表面可達。對於TFPI1-2，表面可達殘基包含(參看圖5)：胺基酸94-95、98、100-110、118-121、123-124、131、134、138-142及144-145。
實施例2：小鼠TFPI4F36A1B2 mAb之選殖及定序
此實施例描述抗TFPI抗體：TFPI4F36A1B2之鼠類重鏈及輕鏈序列之選殖及定序。
使用Qiagen之RNeasy-Mini套組自融合瘤細胞提取總RNA且用作cDNA合成之模板。使用Clontech之SMARTTM RACE cDNA擴增套組、以5'-RACE反應來合成cDNA。隨後使用Phusion Hot Star聚合酶(Finnzymes)及通用引子混合物(UPM)(包括於SMARTTM RACE套組中)作為正向引子、藉由PCR對HC及LC序列進行標靶擴增。鑑定為SEQ ID NO: 11之反向引子用於HC(VH域)擴增且鑑定為SEQ ID NO: 12之反向引子用於LC擴增。藉由凝膠電泳分離PCR產物，使用GFX PCR DNA及Gel Band純化套組(來自GE Healthcare Bio-Sciences)來提取，且使用Zero Blunt TOPO PCR選殖套組及化學上勝任之TOP 10大腸桿菌(E.coli )(Invitrogen)來選殖以便定序。來自Applied Biosystems之AmpliTaq Gold Master Mix，及M13uni/M13rev引子對所選菌落進行菌落PCR。使用ExoSAP-IT酶混合物(USB)進行菌落PCR純化。使用M13uni(-21)/M13rev(-29)或T3/T7定序引子，在MWG Biotech,Martinsried German進行定序。使用VectorNTI程式分析及評注序列。根據製造商說明書使用所有套組及試劑。鑑定單一獨特鼠類κ型LC及單一獨特鼠類HC、子類IgGl。輕鏈可變域之核酸及胺基酸序列分別展示於SEQ ID NO: 3及5中。重鏈可變域之核酸及胺基酸序列分別展示於SEQ ID NO: 7及9中。此等序列中不包括前導肽序列。
BLAST搜尋
經轉譯之抗TFPI4F36A1B2 VL及VH胺基酸序列用作查詢序列。使用BLASTp轉譯程式對Uniprot資料庫中之序列進行BLAST搜尋。抗TFPI4F36A1B2 VH之輸出產生排比，其中50個最高一致性分數中>20個為鼠類Ig重鏈序列。相對於小鼠Ig重鏈的最高一致性分數為81%(99/121)。抗TFPI4F36A1B2 VL之輸出產生排比，其中50個最高一致性分數中>30個為鼠類Igκ輕鏈序列。相對於小鼠Igκ輕鏈的最高一致性分數為92%(105/113)。總之，抗TFPI4F36A1B2之VH及VL序列代表新穎獨特序列。
產生小鼠抗TFPI4F36A1B2表現載體
產生一系列基於CMV啟動子之表現載體(pTT載體)以便在Yves Durocher(Durocher等人,Nucleic Acid Research,2002)開發之基於HEK293-6E EBNA之表現系統中短暫表現小鼠TFPI4F36抗體。除CMV啟動子之外，載體還含有pMB1起點(pMB1 origin)、EBV起點(EBV origin)及Amp抗性基因。
使用對N端及C端序列具有特異性之引子，自初始TOPO定序純系對對應於全長抗TFPI4F36A1B2LC(包括初始信號肽序列)之區域進行PCR擴增。有義引子含有用於選殖目的之末端HindIII限制位點序列，及ATG起始密碼子上游最近的Kozak序列(5'-GCCGCCACC-3')。反義引子含有終止密碼子，繼之為編碼序列下游最近的XbaI限制位點序列。所產生之PCR片段經限制消化，選殖於基於線性化pTT之載體的多重選殖位點(multiple cloning site，MCS)內，且於大腸桿菌中轉型以便選擇。藉由DNA定序來檢驗最終構築體之序列。
使用對N端序列及VH/CH轉換序列(transition sequence)具有特異性之引子，自初始TOPO定序純系對對應於VH域(包括初始信號肽序列)之區域進行PCR擴增。有義引子含有用於選殖目的之末端NotI限制位點序列，及ATG起始密碼子上游最近之Kozak序列(5'-GCCGCCACC-3')。反義引子含有VH/CH轉換序列下游之同框(in-frame)NheI限制位點。所產生之VH域PCR片段經限制消化，選殖於含有針對鼠類IgG1之CH域序列的線性化載體中，且於大腸桿菌中轉型以便選擇。藉由DNA定序來檢驗最終構築體之序列。
經選殖及重組表現之抗TFPI4F36A1B2抗體在所有之所用檢定中、與自初始融合瘤產生之抗體具有相同特徵及親和力。用於在HEK293-6E細胞中短暫表現之程序描述於實施例3中。
實施例3：設計及建構人類化TFPI4F36 mAb
根據Kabat定義評注小鼠抗TFPI4F36A1B2 CDR序列且所得如下：CDR-H1：NYAMS(SEQ ID NO: 8之胺基酸31-35)。
CDR-H2：TISRSGSYSYFPDSVQG(SEQ ID NO: 8之胺基酸50-66)。
CDR-H3：LGGYDEGDAMDS(SEQ ID NO: 8之胺基酸99-110)。
CDR-L1：KSSQSLLESDGKTYLN(SEQ ID NO: 4之胺基酸24-39)。
CDR-L2：LVSILDS(SEQ ID NO: 4之胺基酸55-61)。
CDR-L3：LQATHFPQT(SEQ ID NO: 4之胺基酸94-102)。
基於結構性模板2GJJ(針對Her2erbb2之mAB)及1X9Q(針對螢光素之hAB)、以Modeller(www.salilab.org/modeller/)中建立抗TFPI4F36A1B2之3D模型。
在具有抗TFPI4F36A1B2 VL及VH的人類生殖系V資料庫中進行BLASTp搜尋獲得以下四種潛在生殖系序列：
重鏈：VH3_21或VH7183.9(E-值<1e-45)
輕鏈：VKII_A18或VKII_A1(E_值<3e-45)
在人工檢查選中字及排比之後，分別選擇VH3_21及VKII_A18生殖系序列作為HC及LC人類化框架。基於序列排比選擇相應生殖系J片段作為JH6及JK4。聯合人類化TFPI4F36之第一CDR移植型展示抗TFPI4F36A1B2與所選生殖系序列之間的排比。如序列下方之星號所說明，抗TFPI4F36A1B2與人類架構(HC：VH3_21/JH6及LC：VKII_A18/JK4)之間的序列一致性極高。各星號標記序列一致之位置。根據最小CDR移植策略(其中CDR_H2以比Kabat定義(殘基50-66)更短之型式(殘基50-58)移植)設計初始人類化VH構築體。其餘5個CDR根據Kabat定義移植。所移植之CDR(Kabat定義)列舉如下；以粗體展示之CDR-H2之殘基為人類生殖系殘基。
CDR-H1：NYAMS(SEQ ID NO: 18之胺基酸31-35)。
CDR-H2：TISRSGSYSYYADSVKG (SEQ ID NO: 28之胺基酸50-66)。
CDR-H3：LGGYDEGDAMDS(SEQ ID NO: 18之胺基酸99-110)。
CDR-L1：KSSQSLLESDGKTYLN(SEQ ID NO: 15之胺基酸24-39)。
CDR-L2：LVSILDS(SEQ ID NO: 15之胺基酸55-61)。
CDR-L3：LQATHFPQT(SEQ ID NO: 15之胺基酸94-102)。
最終人類化變異體HzTFPI4F36中之CDR-H2之組成列舉如下且與針對小鼠抗體抗TFPI4F36A1B2所列之CDR-H2匹配。
CDR-H2：TISRSGSYSYFPDSVQG(SEQ ID NO: 18之胺基酸50-66)。
圖1展示小鼠抗TFPI4F36A1B2之VH(A)及VL(B)域序列(分別為SEQ ID NO: 8及4)與人類生殖系序列(分別為SEQ ID NO: 32及31)及CDR移植人類化TFPI4F36序列(分別為SEQ ID NO: 28及26)之排比。使用Kabat編號系統(如圖中序列上方所示)，及根據Kabat定義之CDR係以粗體展示。小鼠抗TFPI4F36A1B2與生殖系序列之間的框架區差異係在抗TFPI4F36A1B2序列中以灰色突出顯示。星號表示小鼠TFPI4F36與人類生殖系序列之間之序列一致位置。潛在回復突變係在HzTFPI4F36-CDR移植序列(如hz4F36CDR移植序列所列)中以灰色突出顯示。
依據小鼠TFPI4F36與生殖系序列之框架區中存在之位置差異來鑑定HzTFPI4F36-CDR移植構築體之潛在回復突變。3D圖1展示TFPI4F36Fab片段之序列模型亦用以鑑定及優選潛在回復突變。人類化TFPI4F36LC及HC中所產生之回復突變之清單分別展示於表2及表3中。
產生人類化TFPI4F36之表現載體
根據上述抗體之人類化設計來合成(GENEARTAG)人類化TFPI4F36VH及VL區之DNA序列。獲得基本最小CDR移植且無額外回復突變之序列。構築體中包括各別LC及HC生殖系前導肽序列以及ATG起始密碼子上游最近的Kozak序列(5'-GCCGCCACC-3')。
產生基於pTT之表現載體以便短暫表現作為人類κ/IgG4(S241P)同型之人類化TFPI4F36抗體。將位置241(根據Kabat編號；按照EU編號系統(Edelman G.M.等人，Proc. Natl. Acad. USA 63,78-85(1969))對應於殘基228)之脯胺酸突變引入IgG4鉸鏈區中以免形成單體抗體片段，亦即，包含一條LC及一條HC之「半抗體」。
自GENEART選殖載體切除VH片段且選殖於含有人類IgG4(S241P) CH域之序列的基於線性化pTT之載體中，隨後於大腸桿菌中轉型以便選擇。藉由DNA定序來檢驗最終構築體之序列。自GENEART選殖載體切除VL片段且選殖於含有人類κCL域之序列的基於線性化pTT之載體中，且隨後於大腸桿菌中轉型以便選擇。藉由DNA定序來檢驗最終構築體之序列。
CDR移植HzTFPI4F36單株抗體之VL、VH、LC及HC之核酸及胺基酸序列(信號肽序列省略)提供於序列表(SEQ ID NO: 26-30)中。
產生小鼠/人類嵌合TFPI4F36之表現載體
為使人類化TFPI4F36變異體能夠得到可能最佳之評價，構築小鼠/人類嵌合型之抗TFPI4F36抗體(ChimTFPI4F36)以消除涉及恆定區來源及同型之任何差異。產生基於pTT之表現載體以便短暫表現在人類κ/IgG4(S241P)同型架構上具有鼠類可變域之嵌合抗TFPI4F36抗體。
使用通用pTT特異性引子及對VH域C端具有特異性之引子、經由抗TFPI4F36A1B2 HC表現質體對對應於VH域之區域進行PCR擴增。有義引子對HindIII限制位點及ATG起始密碼子上游之序列段具有特異性。反義引子在VH/CH轉換序列中含有同框NheI限制位點。所產生之PCR片段經限制消化，選殖於含有人類IgG4(S241P) CH域之序列的基於線性化pTT之載體中，且隨後於大腸桿菌中轉型以便選擇。藉由DNA定序來檢驗最終構築體之序列。
使用通用pTT特異性引子及對VL域C端具有特異性之引子、經由TFPI4F36A1B2 LC表現質體對對應於VL域之區域進行PCR擴增。有義引子對HindIII限制位點及ATG起始密碼子上游之序列段具有特異性。反義引子在VL/CL轉換序列中含有同框BsiWI限制位點。所產生之PCR片段經限制消化，選殖於含有人類κCL域之序列的基於線性化pTT之載體中，且隨後於大腸桿菌中轉型以便選擇。藉由DNA定序來檢驗最終構築體之序列。
mAb變異體之重組表現
依據通用抗體表現方案，使鼠類抗TFPI4F36A1B2、嵌合抗TFPI4F36及人類化TFPI4F36抗體變異體短暫表現於HEK293-6E細胞中。以下程序描述用於懸浮適應型HEK293-6E細胞的通用轉染方案。
細胞維持
HEK293-6E細胞於FreeStyleTM 293表現培養基(Gibco)中懸浮生長，該培養基補充有25μg/ml遺傳黴素(Geneticin)(Gibco)、0.1% v/v界面活性劑Pluronic F-68(Gibco)及1% v/v青黴素-鏈黴素(Penicillin-Streptomycin)(Gibco)。細胞在37℃、8% CO2 及125rpm下於震盪培育箱中、於Erlenmeyer震盪燒瓶中培養且細胞密度保持在0.1-1.5×106 個細胞/毫升之間。
DNA轉染
‧用於轉染之培養物的細胞密度為0.9-2.0×10 6 個細胞/毫升。
‧每毫升細胞培養物使用0.5μg LC載體DNA+0.5μg HC載體DNA之混合物。
‧DNA於Opti-MEM培養基(Gibco)中(30μl培養基/μg DNA)稀釋，混合且在室溫(23-25℃)下培育5分鐘。
‧293Fectin TM (Invitrogen)用作轉染試劑，濃度為1μl/μg DNA。
‧293FectinTM 於Opti-MEM培養基(Gibco)中稀釋30倍，混合且在室溫(23-25℃)下培育5分鐘。
‧混合DNA與293Fectin溶液且在室溫(23-25℃)下培育25分鐘。
‧接著將DNA-293Fectin混合物直接添加至細胞培養物中。
‧將經轉染之細胞培養物轉移至37℃、8% CO2 及125rpm之震盪培育箱中。
‧轉染後3-6天，藉由離心收集細胞培養物上清液，接著經由0.22μm PES濾膜(Corning)過濾。
‧使用FortBio Octet系統及蛋白質A生物感測器或定量蛋白質A HPLC，藉由生物層干涉術(Biolayer Interferometry)直接對澄清之細胞培養物上清液之抗體產生進行定量分析。
人類化抗TFPI4F36之CDR移植變異體之活性分析
最小CDR移植之人類化導致親和力顯著降低，其係由對結合速率與解離速率之影響引起。初次移植型之人類化TFPI4F36抗體(HzTFPI4F36-CDR移植抗體，在表1中列為人類化TFPI4F36)之TFPI結合親和力為初始小鼠TFPI4F36抗體約30pM之親和力的至多1/100(參看表1)。嵌合抗體親和力之保持證明人類κ/IgG4(S241P)FC對抗體親和力無影響。使用如下所述之SRP進行親和力分析。
hzTFPI4F36-TFPI相互作用之表面電漿共振(Biacore)分析
藉由Biacore之SPR分析，使用兩種不同方法測定重組人類TFPI與初始鼠類抗TFPI4F36A1B2、嵌合抗TFPI4F36及人類化TFPI4F36抗體之各種變異體的相互作用之動力學參數。初始動力學分級研究係基於如實施例1中所述之純化mAb的捕捉程序。之後為針對所選mAb構築體之直接結合動力學程序，其中單株抗體經由自由胺基團與感測晶片表面上之羧甲基化葡聚糖膜(CM5)共價偶合。注射各種濃度之重組人類TFPI，接著為解離階段，其中使緩衝液恆定流過感測晶片表面，如實施例8中所述。
在人類化mAb中引入回復突變之定點突變誘發
依據CDR移植型之人類化抗TFPI4F36的低親和力，在HzTFPI4F36-CDR移植抗體之輕鏈(LC)及重鏈(HC)中產生一系列27個人類至小鼠回復突變(稱作回復突變)。此等突變體呈單獨突變體之形式或呈LC/HC組合突變體之形式加以表現、純化且藉由Biacore分析。所產生突變之清單分別展示於表2及表3中。
如人類化設計中所強調，進行定點突變誘發可在HzTFPI4F36-CDR移植LC/HC構築體中之特定殘基處引入人類至小鼠回復突變(下文稱作回復突變)。藉由兩種不同方法引入突變：
1)使用Stratagene之定點或多定點突變誘發套組引入點突變及組合突變。根據製造商方案使用套組。
2)亦使用標準2步重疊PCR法引入點突變及產生組合突變。
使用HzTFPI4F36-CDR移植抗體之LC及HC表現質體作為第一輪突變誘發之模板。在隨後數輪突變誘發中，亦使用預先突變之質體作為模板來引入突變。藉由DNA定序來檢驗所有最終構築體之序列。
根據如圖1中所示之Kabat編號系統對如表2及表3中所列之LC與HC中之突變一貫地加以編號。
表2中所列之LC突變體僅以野生型HC HzTFPI4F36 CDR移植抗體之LC突變體加以表現。表3中所列之HC突變體僅以野生型LC HzTFPI4F36 CDR移植抗體之HC突變體加以表現。LC-HC組合突變體亦藉由組合不同LC與HC突變體加以表現。突變體一貫地按照突變鏈命名，亦即，最終人類化mAb變異體係以野生型HzTFPI4F36-CDR移植LC及突變之HzTFPI4F36FR2、S49A、CDR2 HC加以表現。短暫HEK293-6E表現如上所述進行。
初始一組9點突變體(HzTFPI4F36 LC-S63T及 HzTFPI4F36HC-Q3E；G44R；S49A；Y59F；A60P；K64Q；S77T；A93T )係基於人類化設計中所強調之一組主要回復突變。點突變體皆不能補救抗體之親和力，然而在第二人類重鏈框架區(FR2，介於CDR H1與CDR H2之間)中及CDR H2之C端區域(在最小CDR移植系統中省略)中之突變因對於TFPI結合具有重要作用而被強調。如上所述藉由Biacore分析進行親和力量測。
隨後數輪之突變誘發包括許多補丁突變體(patch mutant)，其中個別區域中之所有殘基全體突變。突變體HzTFPI4F36 HC-Kabat CDR2 在CDR H2之C端區域具有3個突變Y59F、A60P、K64Q，該突變體根據Kabat定義而不根據用於初始HzTFPI4F36-CDR移植變異體之最小CDR移植系統係對應於移植CDR H2。此補丁化突變體(patched mutant)以及LC FR2及HC FR2中之補丁突變體顯著改良人類化TFPI4F36抗體之親和力，但三種補丁突變體中無一者能個別地恢復高TFPI4F36親和力。
HC FR2及CDR2(A40T、G42E、G44R、S49A、Y59F、A60P、K64Q)中具有組合突變之HC突變體可完全恢復親和力。此突變體將7個額外鼠類殘基引入抗體序列中。LC FR2突變體(FR2突變與Y36L )與HC FR2及/或CDR2突變體之組合亦產生高親和力突變體。然而，此等LC/HC突變體之組合一致地引起表現量低於單獨之HC突變體。此等結果表明LC突變體之包涵對此等抗體變異體之穩定性具有負面影響，因此說明在人類化TFPI4F36LC與HC之間存在脆弱之相互作用模式。
在最後一系列之突變體中，剖析HC FR2及CDR2(A40T、G42E、G44R、S49A、Y59F、A60P、K64Q)中之7個突變以消除潛在不起作用的回復突變。產生一系列5個突變體以尋定此點。
在3個突變體中，排除FR2中之以下回復突變：HzTFPI4F36 HC-G42E、G44R、CDR2 HzTFPI4F36 HC-FR2、CDR2 HzTFPI4F36 HC-G42E、G44R、S49A CDR2。
在2個突變體中，亦排除CDR2中之以下額外突變：HzTFPI4F36 HC-G44R、A60P、K64Q HzTFPI4F36 HC-G42E、G44R、A60P、K64Q。
然而，此等突變體皆無法與組合HC FR2 CDR2突變體同等。HC FR2 CDR2突變體亞群之任何減小均影響親和力或表現量(或兩者)。挑選兩種突變體HzTFPI4F36 HC G42E、G44R、Y59F、A60P、K64Q(具有5個殘餘回復突變)及HzTFPI4F36 HC G42E、G44R、A60P、K64Q(具有4個殘餘回復突變)以便與HzTFPI4F36 HC-FR2、S49A、CDR2 全面比較。
○HzTFPI4F36 HC-G42E、G44R、A60P、K64Q 與HzTFPI4F36 HC-FR2、S49A、CDR2 以類似量加以表現，而HzTFPI4F36 HC-G42E、G44R、CDR2 具有稍低之表現量。快速生物物理穩定性研究展示三種變異體之穩定性無任何差異。
○藉由Biacore量測之親和力列於下文中。
○dPT檢定(如下所述)中所量測之所有三種變異體的活體內功效均相當。
依據上述資料，所測試之初始HC FR2及具有7個HC回復突變(A40T、G42E、G44R、S49A、Y59F、A60P、K64Q)之CDR2突變體優於其他變異體；此變異體在本文中稱作HzTFPI4F36或mAbTFPI2021。
CDR2突變Y59F、A60P、K64Q很可能藉由與抗原直接相互作用來影響抗體親和力。突變A40T、G42E、G44R存在於連接CDRH1與CDRH2之FR2轉角中(遠離抗原結合面)且可保持平衡以穩定LC-HC相互作用。突變S49A包埋於側鏈之高度疏水簇中間，其可解釋為何在此位置丙胺酸優於絲胺酸。因此有趣的是，以突變組合之形式獲得HzTFPI4F36之高親和力，該等突變改良遠離抗原結合區域之直接抗原相互作用及突變，從而使抗體穩定。
總之，HzTFPI4F36具有約25pM之親和力(KD )且含有35個源自小鼠抗體序列之對應於抗體中殘基總數之5.2%的胺基酸殘基。
所選人類化構築體HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)之輕鏈可變區(VL)、重鏈可變區(VH)、輕鏈及重鏈之胺基酸序列分別展示於SEQ ID NO: 15、18、21及24中。
試管內功效檢定
抗TFPI4F36抗體能夠中和TFPI介導之對凝血因子Xa(FXa)及組織因子(TF)與因子VIIa(FVIIa)之複合物的抑制。在稀釋凝血酶原時間(dPT)測試中量測鼠類及人類化TFPI4F36抗體變異體之活性。使用dPT檢定量測抗TFPI抗體之促凝血活性。提高抗TFPI抗體之血漿濃度可縮短dPT凝血時間。
實施例4：MuTFPI4F36(Fab)之Fab片段及人類組織因子路徑抑制子(TFPI)之第二Kunitz域(K2)的純化、結晶及結構
使包括第二kunitz域(K2)及C端His6 標記(SEQ ID NO: 2)之TFPI片段與MuTFPI4F36 Fab片段(Fab)共結晶。藉由X射線結晶學解析複合物之結構。發現K2結合性抗原決定基由以下殘基構成：E10、E11、P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36及L50。發現Fab中之互補位由以下者構成：MuTFPI4F36輕鏈(SEQ ID NO: 4)之殘基E31、S32、D33、Y37、A96、T97、H98及F99，及MuTFPI4F36重鏈(SEQ ID NO: 8)之殘基N31、R53、S54、S56、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103及D106。
材料及方法
分析性尺寸排阻層析法。
以PBS緩衝液(10mM磷酸鹽、150mM NaCl、3mM KCl，pH 7,5)(流動速率為0.8ml/min)溶離、使用Biosep S-3000(300×7,80mm)管柱(Phenomenex)進行分析性尺寸排阻層析法(SEC)。
製備及純化Fab/K2複合物。
藉由以1:1.5莫耳比(5.4mg Fab與1.4mg K2)混合Fab(0.27mg/ml，含於PBS緩衝液中，pH 7.4)與K2(0.29mg/ml，含於PBS中，pH 7.4)來製備Fab/K2複合物。用離心過濾裝置(Amicon，10kD截止分子量)將複合物濃縮至約6.7mg/mL之濃度。為移除過量K2，將濃縮樣本施加於Superdex 75(CV300)凝膠過濾管柱上(以PBS緩衝液(pH 7.4)溶離，流動速率為1ml/min)。彙集含有Fab/K2複合物之溶離份且濃縮至9.2mg/ml之蛋白質濃度。將此溶液用於結晶。
Fab/K2複合物之結晶。
使用含有0.2M檸檬酸三鉀(pH 8.0)及20% w/v PEG 3,350之沈澱劑溶液、藉由懸滴法使Fab/K2複合物結晶(呈棒狀)。
晶體結構測定。
分別使用PDB結構1F8T及1TFX作為Fab及K2分子之模板、藉由分子置換法解析Fab/K2複合物之結構。
結果
藉由向Fab溶液中添加過量K2來製備Fab與K2之間的複合物。圖6展示藉由分析性尺寸排阻層析法(SEC)所監測之複合物形成。此方法係根據分子量來分離分子，較大物質早於較小物質溶離。對應於K2及Fab之峰因分子量差異大(分子量分別為約8kDa及48kDa)而良好分離。向Fab溶液中添加K2使得峰位預期地稍微移向較短滯留時間。複合物容易藉由使用製備型SEC分離過量K2加以分離且以純形式獲得。
使用若干商業結晶篩來篩選Fab/K2複合物之結晶條件。懸滴法得到適於單晶X射線分析之棒狀晶體，且使用寄存於PDB中之結構作為模板、藉由分子置換法解析結構。圖7展示Fab/K2複合物之總體結構。所顯示之輕鏈及重鏈構成Fab分子，且展現抗體分子之預期免疫球蛋白β夾層摺疊特徵。亦展示接觸抗原且限定抗體之特異性及親和力的CDR環。
抗原K2展現限定Kunitz摺疊之特徵單一反平行β摺疊(β1(I20-N26)及β2(Q31-Y37))及N端α螺旋(α1，L50-I56)(圖8)。N端附近亦存在可選310 -螺旋(α0，D5-F8)，繼之為環1(L1，L9-Y19)，從而產生β1，其係經由短環(Lβ，N27-K30)與β2連接。在C端片段中，環2(L2，G38-T49)使α1與β2連接。最終，三個特徵雙硫鍵(C7-C57、C16-C40及C33-C53)分別使α1與α0連接、使L2與L1連接且使α1與β2連接。
K2之兩種結構已寄存於全球蛋白質資料庫(Worldwide Protein DataBank，PDB)。一種結構1ADZ已藉由NMR光譜學測定且代表自由解析結構(free solution structure)，而另一種結構1TFX已藉由X射線結晶學測定且代表K2與豬胰蛋白酶之複合物。圖9展示1ADZ、1TFX及K2分子與Fab複合物所代表之K2的結構重疊。所有三種結構的骨架跡線顯得非常類似，表明具有其三個穩定雙硫鍵之Kunitz摺疊具有相當剛性。
MuTFPI4F36 K2結合性抗原決定基之描述
抗原K2上之結合性抗原決定基(定義為K2中之殘基，其含有至少一個側鏈重原子位於距Fab中重原子4或4以下之距離內)包含殘基E10、E11、P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36及L50(圖10)。K2中之接觸殘基係位於L1(E10、E11、P13、R17、Y19)、β摺疊結構(T21、Y23、Q31、E33、R34、F35、K36)及連接環Lβ(Q28)及最後α1中之單一環(L50)中。圖10描繪K2之3D結構與一級胺基酸序列上所定位之結合性抗原決定基。
M uTFPI4F36互補位之描述
依據MuTFP14F36Fab與TFPIK2域之間複合物之相同X射線結構來測定MuTFPI4F36Fab片段中之互補位。互補位係定義為MuTFPI4F36 Fab中具有重原子距K2域中重原子小於4之距離內的彼等殘基。輕鏈中之接觸殘基係位於SEQ ID NO: 4之殘基E31、S32、D33、Y37、A96、T97、H98及F99。重鏈中之接觸殘基係位於SEQ ID NO: 8之殘基N31、R53、S54、S56、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103及D106。互補位之位置說明於圖3中。
實施例5：K2/HzTFPI4F36 Fab複合物之結構
使用類似於針對測定與K2結合之MuTFPI4F36 Fab之三維結構所述的方法，測定來自人類化抗體HzTFPI4F36之Fab片段與K2之間複合物之結構。不出所料，發現HzTFPI4F36之Fab與其所來源之鼠類Fab結合K2上之相同區域。兩種複合物之結構之間的總體相似性在圖11中顯而易見，其中K2/TFP14F36 Fab與K2/HzTFPI4F36 Fab複合物的骨架帶跡線重疊。對於HzTFPI4F36，發現K2上之抗原決定基(使用4截止距離定義)包含殘基E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、K36及L50。與鼠類來源之K2/MuTFPI4F36 Fab之結構相比，D12、F24、N26及C32位於人類化K2/HzTFPI4F36複合物4截止距離內，而F35位於4截止距離外。此反映K2/MuTFPI4F36 Fab與K2/HzTFPI4F36 Fab複合物之結合介面內側鏈位向之微小差異，儘管MuTFPI4F36與HzTFPI4F36中之CDR區相同。
實施例6至8
比較HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)之功能與所有(四種)市售單株抗體之功能，其中一些據稱可結合TFPI之K2域；其中一些尚未有關於結合之描述。
實施例6： TFPI中和檢定：FXa抑制
檢定中所用之材料為BSA緩衝液(50mM Hepes；0.1M NaCl、5mM CaCl2 、0.1mg/ml BSA，pH 7.4)及表5中所示之試劑。
方法：重組全長人類TFPI(最終濃度6nM)與遞增濃度之相關mAb(最終濃度：5-150nM)於BSA緩衝液中混合30分鐘。添加FXa且與混合物一起再培育30分鐘。添加發色受質S2765且在Spectramax中量測405nm下之吸光度15分鐘。100%活性表示未添加TFPI時之FXa活性。
結論：在150nM下，HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)完全中和TFPI對FXa之抑制。對於mAb0281、mAb4904及mab29741幾乎未偵測到活性。
實施例7：TFPI中和檢定：FVIIa/TF/FXa抑制
所用材料為BSA緩衝液(50mM Hepes；0.1M NaCl、5mM CaCl2 、0.1mg/ml BSA，pH 7.4)、50mM EDTA及表7中所列之試劑。
方法：添加表中指定之最終濃度之所有組份。在微量滴定孔中添加25μl FX、25μl TFPI mAb(不同濃度)、25μl人類TFPI、25μl FVIIa-TF(innovin)。在室溫下培育40分鐘。依次添加50μl EDTA及50μl S-2765。混合且在Spectramax中、在405nm下讀盤15分鐘。100%活性為TFPI不存在時所得之FVIIa/TF/FX活性。
結論：在150nM之mAb濃度下，TFPI被mAbTFPI2021完全中和。mAb2974亦達到飽和，但並不能完全中和TFPI(53%中和)。
實施例8：結合相互作用分析
所用材料係如表9中所列。
方法：在Biacore T-100儀器中藉由表面電漿共振分析結合相互作用。固定濃度之相關單株抗體係在10mM乙酸鈉(pH 4.5-5.0)中藉由直接固著於mAb之CM5晶片來捕捉直至500-1000RU之含量。測試四倍稀釋之200nM至0.2nM重組人類全長TFPI或人類短型TFPI(1-161個胺基酸殘基)與所固著之mAb之結合。操作及稀釋緩衝液：10mM HEPES、150mM、0.005% p20(pH 7.4)。藉由10mM甘胺酸(pH 1.7)達成再生。假設TFPI與相關抗體1:1相互作用，使用Biacore T100評估軟體測定動力學及結合常數(kon 、koff 、KD )。結果展示於表10中。不同mAb競爭結合TFPI(當與mAbTFPI2021(「mAb2021」、HzTFPI4F36)結合時)係如下達成：將mAbTFPI2021固著於CM5晶片直至5000RU，接著結合50nM TFPI，接著改變待針對競爭所測試之mAb(2974、0281、4904、29741)的濃度。結果展示於表11中。藉由10mM甘胺酸(pH 1.7)達成晶片再生。
結論
mAbTFPI2021結合TFPI的親和力(KD 15 pM)高於任何其他所測試之mAb。僅mAb2974競爭結合與mAbTFPI4F36相同之位點。
實施例9：中和人類臍血管內皮細胞(HUVEC)上之TFPI
TFPI以經由糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨附著於細胞表面之形式受到內皮細胞構成性表現。當TF與TFPI表現於相同細胞上時，GPI錨定之TFPI特異性抑制TF介導之活性。為顯示HzTFPI4F36(mAbTFPI2021)中和與細胞結合之TFPI所引起的抑制比mAb 2974更加有效，應用人類臍血管內皮細胞HUVEC；且為誘導TF表現，在測試FVIIa/TF催化之FX活化之前，以TNFα(Sigma RBI)及IL1β(Roche)刺激此等細胞。
測試之前，HUVEC細胞於EBM-2培養基(Clonetics)中、於96孔培養盤中培養直至匯合且以20ng/ml TNFα及20ng/ml IL1β刺激2小時。在25mM HEPES、137mM NaCl、3.5mM KCl、5mM CaCl、1mg/ml BSA(0.1%)(pH 7.4)中進行測試，且在抗體(0-20nM)存在下及隨添加50pM FVIIa及50nM FX來追蹤FX活化。使用0.6mM發色受質、S-2765(Chromogenix)量測FXa之產生且針對FXa標準曲線校正。
圖12展示0-20nM HzTFPI4F36或mAb 2974消除細胞結合TFPI之抑制時之結果。HzTFPI4F36在一半最大效應濃度(EC50 ~nM)下可刺激TF/FVIIa介導FX活化，而對2974 mAb在20nM下幾乎未觀察到刺激FXa產生。
因此，此實施例說明HzTFPI4F36(與mAb 2974相反)有效中和細胞結合TFPI對TF/FVIIa介導FX活化之抑制。
實施例10：中和TFPI對MDA-MR 231人類乳癌細胞上之TF/FVIIa活性的抑制。
MDA-MB 231細胞構成性表現表面上高含量之TF及少量之TFPI。細胞表面TF/FVIIa介導之FX活化可被外源添加之TFPI抑制。為顯示HzTFPI4F36中和此類型TFPI抑制比mAb 2974更加有效，應用MDA-MB 231細胞且測試各種濃度之抗體消除TFPI對FVIIa/TF催化FX活化之抑制的能力。
MDA-MB 231細胞於補充有10% FCS及1% P/S之DMEM Gibco(目錄號31966-021)中、於96孔培養盤中培養直至匯合。在25mM HEPES、137mM NaCl、3.5mM KCl、5mM CaCl、1mg/ml BSA(0.1%)(pH 7.4)中進行測試，且在抗體(0-20nM)存在下及隨添加2.5nM全長人類重組TFPI、100pM FVIIa及50nM FX來追蹤FX活化。使用0.6mM發色受質、S-2765(Chromogenix)量測FXa之產生。連續量測405nm下之吸光度且在反應開始後15分鐘時，藉由量測進展曲線之斜率來測定FXa活性。
圖13展示0-20nM HzTFPI4F36或mAb 2974消除TFPI抑制時的結果。HzTFPI4F36在一半最大效應濃度(EC50 約2nM)下可刺激TF/FVIIa介導FX活化，而2974 mAb係在實質更高之濃度(EC50 >20nM)下達成刺激FXa產生。
實施例11：使用ELISA對抗TFPI單株抗體HzTFPI4F36及mAb2974之結合性抗原決定基進行定位。
已藉由解析TFPI-K2/HzTFPI4F36複合物之晶體結構來對TFPI Kunitz域2(K2)上針對HzTFPI4F36之結合性抗原決定基進行定位。藉由ELISA分析TFPI內位於針對HzTFPI4F36之結合性抗原決定基內部(E10、R17及Y19)及外部(D5)之單個胺基酸殘基突變對HzTFPI4F36及mAb2974(R&D systems)之結合親和力的影響。使TFPI變異體表現於HEK293-F細胞中且使用來自細胞培養物之條件培養基進行ELISA。
藉由ELISA估計TFPI-WT及TFPI突變體之濃度，其結合TFPI K1(MAb4903，American Diagnostica)及K3(MAb4F110，內部製備(in-house))且因此未受突變影響。在ELISA中使用MAb4903及HzTFPI4F36分析突變對結合HzTFPI4F36之影響。使用ELISA，在MAb2974及MAb4F110存在下測定對MAb2974結合之影響。
相對於TFPI-WT(100%結合)計算TFPI-Kunitz 2中突變分別對結合HzTFPI4F36及MAb2974之影響且說明於圖14中。表現量差異數已修正。
結論：針對HzTFPI4F36之結合性抗原決定基內之三個胺基酸殘基中之丙胺酸突變使得與HzTFPI4F36之結合降低，而位於抗原決定基(TFPI-D5A)外之殘基的丙胺酸取代無影響。四種丙胺酸突變體中僅一者TFPI-Y19A與MAb2974之結合降低。
總之，HzTFPI4F36與MAb2974具有不同但重疊之位於TFPI-Kunitz 2上之結合性抗原決定基。
實施例12：活體內研究
藉由靜脈內投予2000RBU/kg單株抗FVIII抗體使得兔產生暫時性血友病。10分鐘之後，使兔接受12000U/kg抗TFPI抗體(4F36；1.93mg/kg)。在抗FVIII抗體投予之後45分鐘誘發表皮出血。
4F36抗體使得表皮出血時間顯著減少(圖15)。投予4F36抗體未引起血小板數目顯著降低(圖18)。
重複類似實驗，其中三組八隻暫時性血友病兔在誘發表皮出血後5分鐘接受同型對照抗體(陰性對照組)、2mg/kg抗TFPI(mAb 4F36)或9mg/kg NovoSeven(陽性對照組)。結果說明於圖16中：在所有接受者中，投予mAB 4F36均引起失血大量減少(約85%)，說明可「應需」使用mAb4F36。
實施例13：評估兔劑量效應關係
在兔血友病模型中檢驗人類化mAb HzTFPI4F36之劑量效應關係。藉由靜脈內投予單株抗FVIII抗體使得兔產生暫時性血友病。10分鐘之後，使兔接受0.5、1、2mg/kg HzTFPI4F36或同型對照抗體。再過35分鐘後誘發表皮出血，接著為60分鐘觀測期。當劑量自0.5mg/kg增至2mg/kg時，HzTFPI4F36以劑量依賴方式顯著減少出血時間以及失血(圖17)。因此，1mg/kg HzTFPI4F36(對應於18780ng/ml HzTFPI4F36之血漿濃度)可達成出血時間與失血均顯著減少。在2mg/kg(對應於30980ng/ml HzTFPI4F36之血漿濃度)下達成出血之校正。
此等資料表明HzTFPI4F36之「有效濃度」(例如在本發明模型中為校正所需之血漿濃度)係在18780ng/ml與30980ng/ml之範圍內。
實施例14：兔PK/PD－「作用持續時間」
對給予20mg/kg HzTFPI4F36之兔進行藥物動力學研究。在研究期間之預定時點，自兔抽取血液樣本以便藉由量測自由HzTFPI4F36之ELISA進行藥物動力學特徵化(profiling)(下文圖3中所示)。在投予之後4天(96小時)、7天(168小時)及10天(240小時)使用暫時性血友病兔之表皮出血模型進行效應研究，效應時點於圖19中指示。
藥物動力學特徵為雙階段特徵，其指示標靶介導之清除。因此，在曲線彎曲上方，存在過量自由mAb(mABfree >TFPItotal )，在彎曲下方：mAbfree <TFPItotal 。與藥物動力學特徵良好地一致，在靜脈內投予20mg/kg HzTFPI4F36之後4及7天時，出血時間與失血均顯著減少，而在10天之後未觀察到顯著影響(圖20)。
此等資料證明HzTFPI4F36在血友病兔表皮出血模型中之有效血漿濃度係在18780ng/ml與30980ng/ml之間，其接近TFPI飽和極限(曲線彎曲)。因此，20mg/kg HzTFPI4F36之單次靜脈內劑量在至少7天期間使表皮出血減少，其對應於血漿濃度高於「有效濃度」之時段。
實施例15：基於猴PK資料之藥物動力學模型
基於對猴之藥物動力學研究進行藥物動力學評估，其中投予單次與多次劑量(圖21)。劑量範圍為2至200mg/kg。
猴之PK特徵(20mg/kg，上圖)類似於兔，表明可溶性TFPI與內皮結合TFPI存在類似分布。因此，此等資料表明可採用兔效應資料預測猴效應範圍。此外，HzTFPI4F36對人類、猴及兔TFPI之親和力類似(相同抗原決定基)且三個物種中之類似TFPI組織分布允許對猴及人類進行劑量預測。
實施例16：模擬
依據上述模型可進行一系列模擬。模擬之主要目的在於描述多劑量配置中之最佳給藥攝生法。標靶(TFPI)濃度未知，但上文兔效應資料允許假設若標靶接近飽和(在30000ng/ml之含量下)，則達成出血模型中之完整效應。因此，模擬之主要目的在於評估在一定期間何種劑量將產生完全飽和。圖22顯示皮下投予1mg/kg之模擬。圖23展示每三週靜脈內投予15mg/kg HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)之模擬。圖24展示每兩週靜脈內投予20mg/kg HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)之模擬。
總而言之，依據上述模擬可預測針對人類之以下劑量攝生法：
圖1展示小鼠抗TFPI4F36A1B2(在本文中亦稱作MuTFPI4F36或4F36)之VH(A)及VL(B)域之序列與人類生殖系及初始CDR移植型人類化TFPI4F36之序列的排比。Kabat編號系統於序列上方指示。
圖2展示鼠類抗體TFPI4F36A1B2(MuTFPI4F36)之VH及VL序列之核苷酸序列及經轉譯之多肽序列。
圖3展示鼠類4F36抗體MuTFPI4F36之Fab片段之輕鏈(A)及重鏈(B)的胺基酸序列。根據Kabat之編號展示於序列上方。對應於CDR環之位置在Kabat編號中以粗體加底線文字突出顯示。構成互補位之胺基酸殘基以粗體加底線文字突出顯示。互補位係根據MuTFPI4F36 Fab與TFPI K2域之間的複合物之X射線結構測定，且定義為其中重原子與K2中之重原子之距離小於4的Fab中之殘基。
圖4展示TFPI之序列(信號肽序列省略)。Kunitz域以粗體展示：TFPI Kunitz域1=胺基酸26至76；TFPI Kunitz域2=胺基酸97-147；TFPI Kunitz域3=胺基酸188-238。TFPI之C端部分以斜體字展示於胺基酸240至276。
圖5展示TFPI中之殘基的相對可達性。具有大於40%可達性之殘基為胺基酸94-95、98、100-110、118-121、123-124、131、134、138-142及144-145。
圖6展示對TFPI Kunitz域2(K2)與MuTFPI4F36 Fab片段(Fab)之間的複合物之SEC HPLC分析。自由K2(實線，rt 13.1分鐘，峰值示於13.134)、自由Fab(虛線，rt 11.7分鐘，峰值示於11.676)及複合物(點線，rt 11.5分鐘，峰值示於11.496)在UV 280nm下偵測之SEC-HPLC層析圖。複合物之樣本含有約20%過量K2。
圖7展示MuTFPI4F36 Fab:K2複合物之總體結構。輕鏈以淡灰色展示且重鏈以深灰色展示。根據Kabat系統定義之CDR環標示為L1至L3及H1至H3。
圖8展示當與MuTFPI4F36 Fab(圖中未示Fab分子)複合時TFPI之K2域的結構。N端及C端及二級結構元件標示於圖中。
圖9展示K2結構之骨架重疊。展示K2溶液、與MuTFPI4F36 Fab複合之K2和與豬胰蛋白酶複合之K2之間的結構差異。
圖10展示K2上之MuTFPI4F36結合性抗原決定基。(A )TFPI之K2域的卡通代表圖，其中包括於結合性抗原決定基中的殘基之側鏈係以球及棍表示之。(B )如同A，但加有表面。(C )定位於一級序列上之結合性抗原決定基。大寫粗體、斜體與加底線之字母分別對應於僅與MuTFPI4F36 Fab重鏈接觸(位置10、11、13、28、31、33及35)、僅與輕鏈接觸(位置21、23及50)、及與重鏈和輕鏈均接觸(17、19、34及36)之K2結合性抗原決定基中之殘基。二級結構元件(h=螺旋，s=摺疊)於圖中指示(螺旋位於位置5-8及50-56且摺疊位於位置20-26及31-37)。以灰色突出顯示之殘基(位置1-2及59-66)存在於所表現之蛋白質中，但由於N端及C端之柔性而在晶體結構中未觀察到。
圖11展示K2:MuTFPI4F36 Fab與K2:HzTFPI4F36 Fab複合物之骨架跡線之比較，其顯示鼠類MuTFPI4F36與人類化HzTFPI4F36 Fab片段之結合模式相同。K2:MuTFPI4F36 Fab以灰色展示且K2:HzTFPI4F36 Fab以黑色展示。結構經重疊以最優化Fab片段之可變區之間的匹配。
圖12展示抗TFPI單株抗體(mAb)對經TNFα/IL1β刺激之HUVEC表面上TF/FVIIa誘導FX活化的影響。在0-20nM mAB(mAbTFPI 2021或mAb 2974)、50pM FVIIa(NovoSeven)及50nM FX存在下量測含於緩衝液中之FX之活化，該緩衝液具有25mM HEPES、137mM NaCl、3.5mM KCl、5mM CaCl2 、1mg/ml BSA(0.1%)(pH 7.4)，且上覆有HUVEC單層。所產生之FXa活性係在醯胺分解檢定中、使用S-2765加以測定且依據405nM下之吸光度增幅加以度量。
圖13展示抗TFPI mAb對MDA-MB 231細胞表面上TFPI抑制TF/FVIIa誘導FX活化的影響。在0-20nM mAB(Hz mAbTFPI 2021或mAb 2974)、2.5nM fl-TFPI、100pM FVIIa及50nM FX存在下量測含於緩衝液中之FX之活化，該緩衝液具有25mM HEPES、137mM NaCl、3.5mM KCl、5mM CaCl、1mg/ml BSA(0.1%)(pH 7.4)且上覆有MDA-MB 231細胞單層。所產生之FXa活性係在醯胺分解檢定中、使用S-2765加以測定且依據405nM下之吸光度增幅加以度量。
圖14展示TFPI Kunitz 2域中所選殘基之單一胺基酸丙胺酸取代對與mAbTFPI 2021(「mAb4F36」)及mAb2974(n=2)之結合的影響。所選殘基為mABTFPI 2021結合性抗原決定基之一部分。胺基酸殘基之編號係如圖10C中所指示。
圖15展示經對照物IgG(血友病)或鼠類抗TFPI抗體TFPI-4F36A1B2(「4F36」，MuTFPI4F36)治療之後在暫時性血友病兔中所量測之表皮出血時間及失血量。
圖16展示「應需(on demand)」治療(誘發出血之後5分鐘以HzTFPI4F36(「抗TFPI」，mAbTFPI 2021)(2mg/kg)或NovoSeven(9mg/kg)治療)患有抗體誘發性血友病之兔中的表皮出血時間(單項觀測；平均值±SEM)及失血(平均值±SEM)。觀測出血1小時(3600秒)。
圖17展示當誘發出血前35分鐘以HzTFPI4F36(「抗TFPI」，mAbTFPI 2021)(劑量：0.5、1、2mg/kg)或同型對照抗體預治療時患有抗體誘發性血友病之兔中的表皮出血時間(單項觀測；平均值±SEM)及失血(平均值±SEM)。觀測出血1小時(3600秒)。
圖18展示在經抗FVIII抗體刺激、投予抗TFPI抗體(「抗TFPI抗體」，MuTFPI4F36)且接著致使出血之後個別動物中所量測到的血小板數目。此係在對照血友病模型中且在如本文所述之鼠類抗TFPI抗體4F36(MuTFPI4F36)存在下進行。
圖19展示在0小時給予20mg/kg HzTFPI4F36之兔中之自由HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)的血漿濃度。在96小時(4天)、168小時(7天)及240小時(10天)時進行表皮出血實驗。點線表示如劑量-反應研究中所見之HzTFPI4F36之「有效濃度」範圍(參看圖17)。
圖20：左圖：血漿HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)(左軸：○)及表皮出血時間(平均值±SEM；█)。右圖：當誘發出血前4、7或10天以20mg/kg HzTFPI4F36(n=8)或同型對照抗體(n=12)預治療時患有抗體誘發性血友病之兔中之血漿HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)(左軸○)及失血量(平均值+SEM；█)。觀測出血1小時(3600秒)。
圖21展示向猴靜脈內及皮下投予HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)後之血漿濃度。在下邊三幅圖上，隔兩週向兩隻猴投予三劑HzTFPI4F36。在左下圖上，投予2、20及80mg/kg三次劑量，在中下圖上，投予20、80及160mg/kg三次劑量；在右下圖上，給予80、160及200mg/kg三次劑量。在左上圖上，向三隻猴投予20mg/kg之單劑；在右上圖上，向三隻猴投予單一靜脈內劑。圖上各點表示個別觀測結果，而線表示所擬合的模型。
圖22展示每日皮下投予1mg/kg HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)之模擬。橫實線表示模擬血漿濃度且橫點線表示依據效應資料所推導之上有效濃度。
圖23展示每三週靜脈內投予15mg/kg HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)之模擬。橫實線表示模擬血漿濃度且橫點線表示依據效應資料所推導之上有效濃度。
圖24展示每兩週靜脈內投予20mg/kg HzTFPI4F36(mAbTFPI 2021)之模擬。橫實線表示模擬血漿濃度且橫點線表示依據效應資料所推導之預計標靶飽和濃度。

Claims (42)

  1. 一種單株抗體，其能夠特異性結合TFPI之K2域，其中該抗體結合包含SEQ ID NO：2之E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、K36及L50之抗原決定基。
  2. 如申請專利範圍第1項之單株抗體，其中使用表面電漿共振測定時該抗體之KD小於0.8nM。
  3. 如申請專利範圍第1項之單株抗體，其中該抗體之輕鏈：在對應於SEQ ID NO：15之位置31的位置包含胺基酸殘基E，在對應於SEQ ID NO：15之位置32的位置包含胺基酸殘基S，在對應於SEQ ID NO：15之位置33的位置包含胺基酸殘基D，在對應於SEQ ID NO：15之位置37的位置包含胺基酸殘基Y，在對應於SEQ ID NO：15之位置96的位置包含胺基酸殘基A，在對應於SEQ ID NO：15之位置97的位置包含胺基酸殘基T，及在對應於SEQ ID NO：15之位置99的位置包含胺基酸殘基F；且其中該抗體之重鏈：在對應於SEQ ID NO 18之位置31的位置包含胺基酸殘基 N，在對應於SEQ ID NO 18之位置53的位置包含胺基酸殘基R，在對應於SEQ ID NO 18之位置54的位置包含胺基酸殘基S，在對應於SEQ ID NO 18之位置57的位置包含胺基酸殘基Y，在對應於SEQ ID NO 18之位置59的位置包含胺基酸殘基Y，在對應於SEQ ID NO 18之位置60的位置包含胺基酸殘基F，在對應於SEQ ID NO 18之位置61的位置包含胺基酸殘基P，在對應於SEQ ID NO 18之位置62的位置包含胺基酸殘基D，在對應於SEQ ID NO 18之位置65的位置包含胺基酸殘基Q，在對應於SEQ ID NO 18之位置102的位置包含胺基酸殘基Y，在對應於SEQ ID NO 18之位置103的位置包含胺基酸殘基D，及在對應於SEQ ID NO 18之位置106的位置包含胺基酸殘基D。
  4. 如申請專利範圍第2項之單株抗體，其中該抗體之輕鏈： 在對應於SEQ ID NO：15之位置31的位置包含胺基酸殘基E，在對應於SEQ ID NO：15之位置32的位置包含胺基酸殘基S，在對應於SEQ ID NO：15之位置33的位置包含胺基酸殘基D，在對應於SEQ ID NO：15之位置37的位置包含胺基酸殘基Y，在對應於SEQ ID NO：15之位置96的位置包含胺基酸殘基A，在對應於SEQ ID NO：15之位置97的位置包含胺基酸殘基T，及在對應於SEQ ID NO：15之位置99的位置包含胺基酸殘基F；且其中該抗體之重鏈：在對應於SEQ ID NO 18之位置31的位置包含胺基酸殘基N，在對應於SEQ ID NO 18之位置53的位置包含胺基酸殘基R，在對應於SEQ ID NO 18之位置54的位置包含胺基酸殘基S，在對應於SEQ ID NO 18之位置57的位置包含胺基酸殘基Y，在對應於SEQ ID NO 18之位置59的位置包含胺基酸殘基Y， 在對應於SEQ ID NO 18之位置60的位置包含胺基酸殘基F，在對應於SEQ ID NO 18之位置61的位置包含胺基酸殘基P，在對應於SEQ ID NO 18之位置62的位置包含胺基酸殘基D，在對應於SEQ ID NO 18之位置65的位置包含胺基酸殘基Q，在對應於SEQ ID NO 18之位置102的位置包含胺基酸殘基Y，在對應於SEQ ID NO 18之位置103的位置包含胺基酸殘基D，及在對應於SEQ ID NO 18之位置106的位置包含胺基酸殘基D。
  5. 如申請專利範圍第3項之單株抗體，其中該重鏈進一步在對應於SEQ ID NO：18之位置52的位置包含S且/或其中該輕鏈進一步在對應於SEQ ID NO：15之位置98的位置包含H且該重鏈進一步在對應於SEQ ID NO：18之位置56的位置包含S。
  6. 如申請專利範圍第4項之單株抗體，其中該重鏈進一步在對應於SEQ ID NO：18之位置52的位置包含S且/或其中該輕鏈進一步在對應於SEQ ID NO：15之位置98的位置包含H且該重鏈進一步在對應於SEQ ID NO：18之位置56的位置包含S。
  7. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之單株抗體，其中 該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：18之胺基酸99至110(LGGYDEGDAMDS)之互補決定區3(CDR3)序列。
  8. 如申請專利範圍第7項之單株抗體，其中該抗體之重鏈進一步包含：SEQ ID NO：18之胺基酸31至35(NYAMS)之CDR1序列，其中此等胺基酸之一可經不同胺基酸取代；及/或SEQ ID NO：18之胺基酸50至66(TISRSGSYSYFPDSVQG)之CDR2序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及其中該抗體之輕鏈包含：SEQ ID NO：15之胺基酸24至39(KSSQSLLESDGKTYLN)之CDR1序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或SEQ ID NO：15之胺基酸55至61(LVSILDS)之CDR2序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或SEQ ID NO：15之胺基酸94至102(LQATHFPQT)之CDR3序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。
  9. 如申請專利範圍第8項之單株抗體，其中該胺基酸取代為保守性取代。
  10. 如申請專利範圍第7項之單株抗體，其中該抗體之重鏈包含：SEQ ID NO：18之胺基酸31至35(NYAMS)之CDR1序列及SEQ ID NO：18之胺基酸50至66(TISRSGSYSYFPDSVQG)之CDR2序列及 SEQ ID NO：18之胺基酸99至110(LGGYDEGDAMDS)之CDR3序列且其中該抗體之輕鏈包含：SEQ ID NO：15之胺基酸24至39(KSSQSLLESDGKTYLN)之CDR1序列；及SEQ ID NO：15之胺基酸55至61(LVSILDS)之CDR2序列；及SEQ ID NO：15之胺基酸94至102(LQATHFPQT)之CDR3序列。
  11. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之單株抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：15且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：18。
  12. 如申請專利範圍第7項之單株抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：15且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：18。
  13. 如申請專利範圍第8項之單株抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：15且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：18。
  14. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之單株抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：21且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：24。
  15. 如申請專利範圍第7項之單株抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：21且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：24。
  16. 如申請專利範圍第8項之單株抗體，其中該抗體之 輕鏈包含SEQ ID NO：21且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：24。
  17. 如申請專利範圍第9項之單株抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：21且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：24。
  18. 如申請專利範圍第10項之單株抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：21且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：24。
  19. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之單株抗體，其能夠以高於mAb2974之親和力結合TFPI之K2域。
  20. 如申請專利範圍第7項之單株抗體，其能夠以高於mAb2974之親和力結合TFPI之K2域。
  21. 如申請專利範圍第8項之單株抗體，其能夠以高於mAb2974之親和力結合TFPI之K2域。
  22. 如申請專利範圍第9項之單株抗體，其能夠以高於mAb2974之親和力結合TFPI之K2域。
  23. 如申請專利範圍第10項之單株抗體，其能夠以高於mAb2974之親和力結合TFPI之K2域。
  24. 如申請專利範圍第11項之單株抗體，其能夠以高於mAb2974之親和力結合TFPI之K2域。
  25. 如申請專利範圍第12項之單株抗體，其能夠以高於mAb2974之親和力結合TFPI之K2域。
  26. 如申請專利範圍第13項之單株抗體，其能夠以高於mAb2974之親和力結合TFPI之K2域。
  27. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之單株抗體，其 中當TFPI以該抗體飽和時，在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中量測，該抗體能夠將結合膜之FVIIa/TF/FXa之TFPI抑制中和至少55%。
  28. 如申請專利範圍第7項之單株抗體，其中當TFPI以該抗體飽和時，在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中量測，該抗體能夠將結合膜之FVIIa/TF/FXa之TFPI抑制中和至少55%。
  29. 如申請專利範圍第8項之單株抗體，其中當TFPI以該抗體飽和時，在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中量測，該抗體能夠將結合膜之FVIIa/TF/FXa之TFPI抑制中和至少55%。
  30. 如申請專利範圍第9項之單株抗體，其中當TFPI以該抗體飽和時，在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中量測，該抗體能夠將結合膜之FVIIa/TF/FXa之TFPI抑制中和至少55%。
  31. 如申請專利範圍第10項之單株抗體，其中當TFPI以該抗體飽和時，在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中量測，該抗體能夠將結合膜之FVIIa/TF/FXa之TFPI抑制中和至少55%。
  32. 如申請專利範圍第11項之單株抗體，其中當TFPI以該抗體飽和時，在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中量測，該抗體能夠將結合膜之FVIIa/TF/FXa之TFPI抑制中和至少55%。
  33. 如申請專利範圍第12項之單株抗體，其中當TFPI以該抗體飽和時，在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中量測，該 抗體能夠將結合膜之FVIIa/TF/FXa之TFPI抑制中和至少55%。
  34. 如申請專利範圍第13項之單株抗體，其中當TFPI以該抗體飽和時，在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中量測，該抗體能夠將結合膜之FVIIa/TF/FXa之TFPI抑制中和至少55%。
  35. 如申請專利範圍第14項之單株抗體，其中當TFPI以該抗體飽和時，在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中量測，該抗體能夠將結合膜之FVIIa/TF/FXa之TFPI抑制中和至少55%。
  36. 如申請專利範圍第15項之單株抗體，其中當TFPI以該抗體飽和時，在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中量測，該抗體能夠將結合膜之FVIIa/TF/FXa之TFPI抑制中和至少55%。
  37. 如申請專利範圍第16項之單株抗體，其中當TFPI以該抗體飽和時，在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中量測，該抗體能夠將結合膜之FVIIa/TF/FXa之TFPI抑制中和至少55%。
  38. 如申請專利範圍第17項之單株抗體，其中當TFPI以該抗體飽和時，在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中量測，該抗體能夠將結合膜之FVIIa/TF/FXa之TFPI抑制中和至少55%。
  39. 如申請專利範圍第18項之單株抗體，其中當TFPI以該抗體飽和時，在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中量測，該抗體能夠將結合膜之FVIIa/TF/FXa之TFPI抑制中和至少 55%。
  40. 一種真核細胞，其表現如申請專利範圍第1至26項中任一項之單株抗體。
  41. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至39項中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
  42. 一種如申請專利範圍第1至39項中任一項之單株抗體之用途，其係用於製造用於治療患有凝血障礙之個體的醫藥品。
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