CN102325795A - 针对组织因子途径抑制剂的抗体 - Google Patents

针对组织因子途径抑制剂的抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN102325795A
CN102325795A CN2009801571572A CN200980157157A CN102325795A CN 102325795 A CN102325795 A CN 102325795A CN 2009801571572 A CN2009801571572 A CN 2009801571572A CN 200980157157 A CN200980157157 A CN 200980157157A CN 102325795 A CN102325795 A CN 102325795A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
seq
tfpi
amino acid
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2009801571572A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102325795B (zh
Inventor
I.希尔登
B.O.克罗
J.T.克劳森
O.H.奥尔森
J.布雷因霍尔特
B.劳里特曾
B.B.索伦森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40639722&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN102325795(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novo Nordisk AS filed Critical Novo Nordisk AS
Publication of CN102325795A publication Critical patent/CN102325795A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102325795B publication Critical patent/CN102325795B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/38—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及特异性地结合组织因子途径抑制剂(TFPI)并减少血液凝固时间的抗体。这种抗体可以用于治疗具有凝血病的受试者。

Description

针对组织因子途径抑制剂的抗体
技术领域
本发明涉及特异性地结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的抗体。
背景技术
在具有凝血病的受试者中，诸如在具有A型和B型血友病的人类中，凝固级联的不同步骤出现功能障碍，这是由于例如凝血因子不存在或存在不足。凝固级联的一部分的这种功能障碍导致不充分的血液凝固和可能威胁生命的出血或对内部器官（诸如关节）的损伤。诸如具有A型和B型血友病的人类等受试者可以接受凝血因子补偿疗法，分别诸如外源性FVIIIa或FIXa。但是，这样的患者处于形成对这样的外源性因子的“抑制剂” (抗体)的危险中，使得以前有效的治疗失效。此外，外源性凝血因子仅可以静脉内施用，这对于患者而言相当不便和不适。例如，婴儿和幼儿可能必须具有手术地插入胸静脉内的静脉内导管，以便保证静脉使用（venous access）。这使他们处于形成细菌感染的高危中。具有凝血病的受试者只有在已经开始出血以后才能接受治疗，而不是作为预防性措施，这经常影响他们的一般生活质量。
因而，一般而言，在血友病群体中，具体地在具有凝血病的受试者中，仍然存在许多未获得满足的医学需要。
当血管壁受损伤时，组织因子(TF) 会被暴露于循环血液的内容物，TF在携带TF的细胞的表面上与因子VII/活化的因子VII (FVII/FVIIa)形成复合物。这导致因子X (FX)向Fxa的活化，所述Fxa与Fva一起产生有限量的凝血酶(FIIa)。小量凝血酶会活化血小板，这导致磷脂的表面暴露，所述表面暴露会支持由FVIIIa/FIXa组成的tenase复合物的结合。
所述tenase复合物产生大量的Fxa，所述Fxa随后促进全凝血酶爆发（burst）。机械上强的纤维蛋白结构的形成和止血塞的稳定化，需要全凝血酶爆发。FVIII或FIX在血友病患者中缺失或以低水平存在，且由于tenase活性的缺失，产生Fxa的能力较低，且不足以支持凝固的传播期（propagation phase）。相反，TF-介导的开始期（initiation phase）不依赖于tenase复合物的形成。但是，在最初的FXa产生后不久，TF-途径被血浆抑制剂阻断。
通过中和Fxa的催化活性，并通过在Fxa存在下抑制TF-FVIIa复合物，组织因子途径抑制剂(TFPI)会下调节正在进行的凝固。TFPI抑制在细胞表面上的TF/FVIIa/FXa复合物，或者抑制释放的Fxa（继之为FVIIa/TF抑制）。
发明内容
发明人已经鉴别出特异性地结合组织因子途径抑制剂(“TFPI”，有时称作“TFPI1”)并从而调节它的活性的单克隆抗体。本发明涉及这些抗体和从这些抗体衍生出的或具有与这些抗体类似的结合性质的其它有关的抗体。
因此，本发明涉及这样的抗体，其特异性地结合组织因子途径抑制剂(TFPI)，并减少在例如(a)人FVIII-缺乏的血浆和/或(b)人全血中的凝固时间。
一种抗体包含SEQ ID NO: 4的轻链可变区和SEQ ID NO: 8的重链可变区。另一种抗体包含SEQ ID NO: 15的轻链可变区和SEQ ID NO: 18的重链可变区。
本发明也提供了编码本发明抗体的多核苷酸，诸如编码本发明的抗体轻链和/或抗体重链的多核苷酸。
本发明也提供了药物组合物，其包含本发明的抗体或多核苷酸和药学上可接受的载体或稀释剂。
还提供本发明的抗体、多核苷酸和组合物用于：(a)治疗或预防凝血病(出血障碍)，或(b)刺激血液凝固。也就是说，本发明提供了(a)治疗或预防凝血病(出血障碍)的方法，或(b)刺激血液凝固的方法，所述方法包括，给有此需要的患者施用治疗或预防有效量的本发明的抗体、多核苷酸或组合物。
此外，本发明提供了本发明的所述单克隆抗体的给药方案。
附图说明
图1显示了小鼠抗-TFPI4F36A1B2 (在本文中也称作MuTFPI4F36或4F36)的VH (A)和VL (B)结构域的序列，其与人源化的TFPI4F36的人种系和最初的CDR移植形式的序列相比对。在序列的上面指出了Kabat编号方案。
图2显示了鼠抗体TFPI4F36A1B2 (MuTFPI4F36)的VH和VL序列的核苷酸序列和翻译的多肽序列。
图3显示了鼠4F36抗体MuTFPI4F36的Fab 片段的轻(A)和重(B)链的氨基酸序列。在序列上面显示了根据Kabat的编号。在Kabat编号中，用粗体带有下划线的文字突出与CDR环对应的位置。用粗体带有下划线的文字突出构成互补位的氨基酸残基。从MuTFPI4F36 Fab和TFPI K2结构域之间的复合物的X-射线结构，确定互补位，并定义为这样的Fab残基，其具有离K2中的重原子在小于4 Å距离内的重原子。
图4显示了TFPI的序列(省略信号肽序列)。用粗体显示Kunitz结构域：TFPI Kunitz结构域1 =氨基酸26-76；TFPI Kunitz结构域2=氨基酸97-147；TFPI Kunitz结构域3 =氨基酸188-238。用斜体显示TFPI的C-端部分氨基酸240-276。
图5显示了TFPI中的残基的相对可及性。具有大于40%可及性的残基是氨基酸94-95、98、100-110、118-121、123-124、131、134、138-142和144-145。
图6显示了TFPI Kunitz结构域2 (K2)和MuTFPI4F36 Fab片段 (Fab)之间的复合物的SEC HPLC分析。在280 nm紫外线检测到游离K2 (实线, rt 13.1 min，显示在13.134处的峰)、游离Fab (破折线, rt 11.7 min，显示在11.676处的峰)和复合物(点线, rt 11.5 min，显示在11.496处的峰)的SEC-HPLC色谱图。复合物样品含有~20%过量的K2。
图7显示了MuTFPI4F36 Fab:K2复合物的总结构。用淡灰色显示轻链，用深灰色显示重链。根据Kabat方案定义的CDR环被标记为L1-L3和H1-H3。
图8显示了当与MuTFPI4F36 Fab络合时，TFPI的K2结构域的结构(Fab分子未显示)。标记了N-和C-末端和二级结构元件。
图9显示了K2 结构的主链重叠。显示了K2溶液、与MuTFPI4F36 Fab络合的K2和与猪胰蛋白酶络合的K2之间的结构差异。
图10显示了在K2上的MuTFPI4F36结合表位。(A) TFPI的K2结构域的图像表示，用球和棒代表在结合表位中包含的残基的侧链。(B) 与A一样，但是添加了表面。(C) 映射到基本序列上的结合表位。大写的粗体、斜体和带有下划线的字母分别对应着接触MuTFPI4F36 Fab的仅重链(位置10、11、13、28、31、33和35)、仅轻链(位置21、23和50)和重链和轻链二者(17、19、34和36)的K2-结合表位中的残基。指示了二级结构元件(h = 螺旋，s = 折叠) (在位置5-8和50-56处的螺旋，和在位置20-26和31-37处的折叠)。用灰色突出的残基(位置1-2和59-66)存在于表达的蛋白中，但是在晶体结构中没有观察到（因为N-和C-末端是柔性的）。
图11显示了K2:MuTFPI4F36 Fab和K2:HzTFPI4F36 Fab复合物的主链痕迹的对比，证实了鼠MuTFPI4F36和人源化的HzTFPI4F36 Fab 片段的相同结合模式。用灰色显示K2:MuTFPI4F36 Fab，用黑色显示K2:HzTFPI4F36 Fab。使结构重叠，以优化Fab 片段的可变区之间的匹配。
图12显示了抗-TFPI单克隆抗体(mAb)对在用TNFα/IL1β刺激的HUVEC的表面上的TF/FVIIa-诱导的FX活化的影响。在有在缓冲液中的0-20 nM mAB (mAbTFPI 2021或mAb 2974)、50 pM FVIIa (NovoSeven®)和50 nM FX存在下，测量FX的活化，所述缓冲液含有25 mM HEPES、137 mM NaCl、3.5 mM KCl、5 mM CaCl2、1 mg/ml BSA (0.1%) pH 7.4，其覆盖在HUVEC单层上。在酰胺分解（amidolytic）试验中，测定产生的FXa活性，通过在405 nM的吸光度增加测量S-2765。
图13显示了抗-TFPI mAb对在MDA-MB 231细胞的表面上的TF/FVIIa-诱导的FX活化的TFPI抑制的影响。在有在缓冲液中的0-20 nM mAb (Hz mAbTFPI 2021或mAb 2974)、2.5 nM fl-TFPI、100 pM FVIIa和50 nM FX存在下，测量FX的活化，所述缓冲液含有25 mM HEPES、137 mM NaCl、3.5 mM KCl、5 mM CaCl、1 mg/ml BSA (0.1%) pH 7.4，其覆盖在MDA-MB 231细胞单层上。在酰胺分解试验中，测定产生的FXa活性，通过在405 nM的吸光度增加测量S-2765。
图14显示了在TFPI Kunitz 2结构域内的选择的残基的单个氨基酸丙氨酸置换对与mAbTFPI 2021 (“mAb4F36”)和mAb2974 (n=2)的结合的影响。选择的残基是mABTFPI 2021结合表位的一部分。在图10C中指出了氨基酸残基的编号。
图15显示了在用对照IgG (血友病)或用鼠抗-TFPI抗体TFPI-4F36A1B2 (“4F36”，MuTFPI4F36)治疗后，在暂时患血友病的兔中测得的表皮出血时间和失血。
图16显示了在诱导出血后5分钟用HzTFPI4F36 (“抗-TFPI”，mAbTFPI 2021) (2 mg/kg)或NovoSeven (9mg/kg)治疗的具有抗体-诱导的血友病的兔的“根据需要”治疗中的表皮出血时间 (单一观测; 平均值 ± SEM)和失血 (平均值+SEM)。观察出血1小时(3600秒)。
图17显示了当在诱导出血之前35分钟用HzTFPI4F36 (“抗-TFPI”，mAbTFPI 2021) (剂量: 0.5、1、2 mg/kg)或同种型对照抗体预治疗时，在具有抗体-诱导的血友病的兔中的表皮出血时间 (单一观测; 平均值± SEM)和失血 (平均值+SEM)。观察出血1小时(3600秒)。
图18显示了在用抗-FVIII抗体刺激、施用抗-TFPI-抗体(“抗-TFPI ab”、MuTFPI4F36)、随后使其出血单个动物中测量的血小板数目。这在对照血友病模型中和在有本文所述的鼠抗-TFPI抗体4F36 (MuTFPI4F36)存在下进行。
图19显示了在第0小时施用20 mg/kg HzTFPI4F36的兔中的游离HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)的血浆浓度。在96小时 (4天)、168小时 (7天)和240小时 (10天)，进行表皮出血实验。点线指示在剂量响应研究中发现的HzTFPI4F36的‘有效浓度’范围(参见图17)。
图20: 左图: 血浆HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021) (左轴：
Figure 899960DEST_PATH_IMAGE001
)和表皮出血时间 (平均值± SEM；■)。右图： 血浆HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021) (左轴)和失血 (平均值+SEM；■)，当在诱导出血之前4、7或10天用20 mg/kg HzTFPI4F36 (n=8)或同种型对照抗体(n=12)预处理时，在具有抗体-诱导的血友病的兔中。观察出血1小时(3600秒)。
图21显示了在静脉内和皮下给猴施用HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)以后的血浆浓度水平。在下面的3个图中，给2只猴施用3剂量的HzTFPI4F36，间隔2周。在左下图中，施用3个剂量2、20和80 mg/kg，在中下图中，施用3个剂量20、80和160 mg/kg；在右下图中，施用3个剂量80、160和200 mg/kg。在左上图中，给3只猴施用单次剂量的20 mg/kg；在右上图中，给3只猴施用单次静脉内剂量。在图中，点代表单个观察结果，而线代表模型拟合。
图22显示了每天皮下施用的1 mg/kg HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)的模拟。水平实线代表模拟的血浆浓度水平，水平点线代表从效果数据推导出的有效浓度上限。
图23显示了每3周静脉内施用的15 mg/kg HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)的模拟。水平实线代表模拟的血浆浓度水平，水平点线代表从效果数据推导出的有效浓度上限。
图24显示了每2周静脉内施用的20 mg/kg HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)的模拟。水平实线代表模拟的血浆浓度水平，水平点线代表从效果研究推导出的预期的靶物饱和度。
序列表简述
SEQ ID NO: 1给出了人TFPI的氨基酸序列(信号肽序列被省略)。
SEQ ID NO: 2给出了用于测定抗体的结合表位的构建体的氨基酸序列。所述构建体包含来自人TFPI的氨基酸91-150和C-端His6标签。
SEQ ID NO: 3、5和4给出了MuTFPI4F36 (TFPI-4F36A1B2)单克隆抗体的轻链可变结构域 (VL)的多核苷酸(有义和反义)和多肽序列。SEQ ID NO: 6给出了MuTFPI4F36 (TFPI-4F36A1B2)单克隆抗体的轻链的氨基酸序列。信号肽序列被省略。
SEQ ID NO: 7、9和8给出了MuTFPI4F36 (TFPI-4F36A1B2)单克隆抗体的重链可变结构域 (VH)的多核苷酸(有义和反义)和多肽序列。SEQ ID NO: 10给出了MuTFPI4F36 (TFPI-4F36A1B2)单克隆抗体的重链的氨基酸序列。信号肽序列被省略。
SEQ ID NO: 11给出了用于重链可变结构域扩增的反向引物的序列，SEQ ID NO: 12给出了用于轻链扩增的反向引物的序列。
SEQ ID NO: 13-15分别提供了人源化的单克隆抗体HzTFPI4F36 (mAbTFPI2021)的轻链可变结构域 (VL)的有义多核苷酸、反义多核苷酸和多肽序列。信号肽序列被省略。
SEQ ID NO: 16-18分别提供了人源化的单克隆抗体HzTFPI4F36 (mAbTFPI2021)的重链可变结构域 (VH)的有义多核苷酸、反义多核苷酸和多肽序列。
SEQ ID NO: 19-21分别提供了人源化的单克隆抗体HzTFPI4F36 (mAbTFPI2021)的轻链(LC)的有义多核苷酸、反义多核苷酸和多肽序列。
SEQ ID NO: 22-24分别提供了人源化的单克隆抗体HzTFPI4F36 (mAbTFPI2021)的重链(HC)的有义多核苷酸、反义多核苷酸和多肽序列。信号肽序列被省略。
SEQ ID NO: 25-26分别提供了CDR-移植的HzTFPI4F36的轻链可变结构域的核酸和氨基酸序列。信号肽序列被省略。
SEQ ID NO: 27-28分别提供了CDR-移植的HzTFPI4F36的重链可变结构域的核酸和氨基酸序列。信号肽序列被省略。
SEQ ID NO: 29提供了CDR-移植的HzTFPI4F36 (人κ 链)的轻链的氨基酸序列。信号肽序列被省略。
SEQ ID NO: 30提供了CDR-移植的HzTFPI4F36（它是人IgG4 (S241P)）的重链的氨基酸序列。信号肽序列被省略。
SEQ ID NO: 31提供了种系序列VKII_A18/JK4，其用于MuTFPI4F36的轻链的人源化。信号肽序列被省略。
SEQ ID NO: 32提供了种系序列VH3_21/JH6，其用于MuTFPI4F36的重链的人源化。信号肽序列被省略。
SEQ ID NO: 33提供了MuTFPI4F36A1B2 重链Fab的氨基酸序列。信号肽被省略。
SEQ ID NO: 34提供了HzTFPI4F36 重链Fab的氨基酸序列。信号肽被省略。
具体实施方式
本发明涉及结合TFPI的抗体。所述抗体优选地特异性地结合TFPI，即它们结合TFPI，但是它们不结合或以较低的亲和力结合其它分子。具体地，本发明涉及结合TFPI并调节它的活性的抗体。本发明的抗体因而可以具有缩短凝固时间的能力。例如，本发明的抗体可以具有缩短在人FVIII-缺乏的血浆中的凝固时间或减少凝固所需时间（通过人全血的凝血弹性描记术(TEG) 分析来测量）的能力。本发明也涉及这种抗体的应用，诸如治疗和药物用途。
本文使用的术语TFPI包括TFPI的任意天然存在形式，其可以源自任意合适的生物体。例如，用于本文所述用途的TFPI可以是哺乳动物TFPI，诸如人、小鼠、大鼠、灵长类动物、牛、羊或猪TFPI。优选地，所述TFPI是人TFPI。所述TFPI可以是TFPI的成熟形式，诸如已经在合适的细胞内经历翻译后加工的TFPI蛋白。这样的成熟的TFPI蛋白可以例如被糖基化。所述TFPI可以是全长TFPI蛋白。术语TFPI 也包括这样的TFPI分子的变体、同种型和其它同系物。变体TFPI分子通常特征在于具有与天然存在的TFPI相同类型的活性，诸如中和FXa的催化活性的能力，或抑制TF-FVIIa/FXa的复合物的能力。
本发明抗体具有结合TFPI的能力。优选地，本发明抗体会特异性地结合TFPI。也就是说，与它结合另一种分子的亲和力相比，本发明抗体优选地以更大的结合亲和力结合TFPI。本发明的抗体可以具有结合或特异性地结合本文所述的TFPI分子的能力，诸如本文所述的任意靶分子。
术语“结合亲和力”在本文中用作2个分子（例如抗体或其片段和抗原）之间的非共价相互作用的强度的度量。术语“结合亲和力”用于描述单价相互作用(内在活性)。
通过测定解离常数 (KD)，可以定量2个分子（例如抗体或其片段和抗原）之间通过单价相互作用的结合亲和力。通过测量复合物形成和解离的动力学，例如通过 SPR 方法(Biacore)，又可以测定KD。与单价复合物的结合和解离相对应的速率常数分别称作结合速率常数 ka (或k开)和解离速率常数kd (或k关)。通过方程KD = kd / ka，将KD与ka和kd相关联。
按照上面的定义，通过对比单个抗体/抗原复合物的KD值，可以对比与不同的分子相互作用有关的结合亲合力，例如对比不同抗体对给定的抗原的结合亲和力。
类似地，通过测定和对比目标相互作用（例如抗体和抗原的特异性相互作用）的KD值和非目标相互作用的KD值，可以评估相互作用的特异性。
通常，抗体相对于靶物的KD为相对于其它非靶分子（诸如无关物质或在环境中的伴随物质）的KD的1/2、优选的1/5、更优选的1/10。更优选地，所述KD为相对于其它非靶分子（诸如无关物质或在环境中的伴随物质）的Kd的1/50，诸如1/100或1/200；甚至更优选地1/500，诸如1/1000或1/10,000。
通过众所周知的方法，可以直接地测定该解离常数的值，且可以通过下述方法，甚至计算复合混合物的该解离常数的值：诸如在例如Caceci 等人 (Byte 9:340-362, 1984)中所述的方法。例如，使用双滤器硝酸纤维素滤器结合试验，诸如Wong & Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993)所公开的试验，可以建立KD。用于评价诸如抗体等配体与靶物的结合能力的其它标准试验是本领域已知的，包括例如，ELISA、蛋白印迹、RIA和流式细胞术分析。通过本领域已知的标准试验，诸如表面等离子体共振 (SPR)，例如通过使用Biacore™ 系统，也可以评估抗体的结合动力学和结合亲和力。
可以进行竞争结合试验，其中将所述抗体对靶物的结合和该靶物的另一种配体（诸如另一种抗体）对该靶物的结合相对比。发生50%抑制时的浓度称作Ki。在理想条件下，Ki等同于KD。Ki值绝不会小于KD，所以可以方便地用Ki的测量替代，以提供KD的上限。
本发明的抗体对于它的靶物可以具有1 x 10-7M或更小、1 x 10-8M或更小或1 x 10-9M或更小或 1 x 10-10M或更小、1 x 10-11M或更小或1 x 10-12M或更小的KD。
特异性地结合它的靶物的抗体可以以高亲和力结合它的靶物，也就是说，表现出上面讨论的低KD，且可以以更低的亲和力结合其它的非靶分子。例如，所述抗体可以以1 x 10-6M或更大、更优选1 x 10-5 M或更大、更优选1 x 10-4 M或更大、更优选1 x 10-3 M或更大、甚至更优选1 x 10-2 M或更大KD结合非靶分子。与其结合其它非靶分子的亲和力相比，本发明抗体优选地能以至少2-倍、10-倍、50-倍、100-倍 200-倍、500-倍、1,000-倍或10,000-倍或更大的亲和力结合它的靶物。
所述靶分子可以是本文所述的任意TFPI分子，诸如天然存在的TFPI分子、完全成熟的TFPI分子或全长TFPI分子。优选的TFPI分子是完全成熟的、天然存在的、全长哺乳动物TFPI分子。例如，所述TFPI分子可以包含本文所述的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其片段或其它变体，或由其组成。
所述靶分子可以是TFPI分子的变体，诸如TFPI分子的片段。例如，所述靶分子可以是TFPI的片段或其它变体，其维持适合抗体结合的表位。例如，所述靶分子可以是TFPI的片段或其它变体，其保留本文所述的表位。所述靶分子可以包含这样的表位。
在一个实施方案中，所述靶分子是全长TFPI分子。所述全长TFPI分子可以包含本文所述的第一、第二和第三Kunitz结构域。所述全长TFPI分子可以包含本文所述的第一、第二和第三Kunitz结构域以及本文所述的羧基端区域。所述全长TFPI分子可以是天然存在的TFPI分子，诸如从TFPI基因表达的或由表达TFPI的细胞分泌的全长TFPI多肽。所述全长TFPI分子可以是天然存在的TFPI分子，发现其以游离形式在血浆中循环，或结合在诸如内皮细胞等细胞上。所述全长TFPI分子不是截短的TFPI分子，诸如本文所述的天然存在的截短的TFPI分子。
在一个实施方案中，所述靶分子是截短的TFPI分子。例如，所述截短的TFPI分子可以包含羧基端截短。例如，TFPI的许多天然存在的截短形式是已知的。这些可以包括TFPI的羧基端部分的一部分或全部的截短。它们可以进一步包括Kunitz结构域中的一个或多个的一部分或全部的截短。例如，TFPI的截短形式可以包括羧基端部分和第三Kunitz结构域的一部分或全部的删除。
例如，一种天然存在的TFPI截短形式仅包含全长TFPI分子的氨基酸1-161(在本文中称作TFPI (1-161))。TFPI (1-161)是TFPI的一种活性形式，其具有与全长分子相比降低的活性。TFPI (1-161)在结构上不同于全长TFPI，针对TFPI (1-161)作为靶分子产生的抗体因此可以不同于针对全长TFPI产生的抗体。
在需要针对在TFPI中存在的全长TFPI区域(1-161)的靶抗体的情况下，TFPI的截短形式可以是适当的靶分子。但是，当希望抗体针对TFPI 的特定截短形式（诸如天然存在的截短的TFPI）时，截短的TFPI优选地用作靶分子。
在一个实施方案中，所述靶分子是TFPI的天然存在形式。这可以以其中它存在于体内的形式使用。例如，所述靶分子可以是上面讨论的全长天然存在的TFPI。所述靶分子可以是上面讨论的截短的天然存在的TFPI。所述靶分子可以是以它在体内存在于血浆中的形式的TFPI。所述靶分子可以是这样的TFPI，其以在体内存在于血浆中相同的方式结合脂蛋白。所述靶分子可以是这样的TFPI，其以与在体内发生的相同方式结合细胞，诸如结合内皮细胞的TFPI。本发明的抗体可以结合这些TFPI天然存在形式中的任意一种或多种。本发明的抗体可以能结合所有这些TFPI天然存在形式，或可以能辨别这些不同形式，结合某些形式，但是不结合其它形式。
在一个实施方案中，所述靶分子是或包含TFPI的第二Kunitz结构域。这样的靶分子可以包含SEQ ID NO: 1的氨基酸97-147或SEQ ID NO: 1的氨基酸91-150或来自另一种TFPI多肽的等效Kunitz结构域2区域。这样的靶分子可以包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 2的氨基酸3-58或10-50。所述靶分子可以是或可以包含TFPI的第二Kunitz结构域的片段。例如，所述靶分子可以包含5个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、12个或更多个、或15个或更多个来自第二Kunitz结构域的氨基酸。
所述靶分子可以包含TFPI或TFPI的特定区域（诸如特定Kunitz结构域或TFPI的C端部分）的5个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、12个或更多个、或15个或更多个表面可及的残基（surface accessible residue）。表面可接近的残基是具有超过40%相对可及性（relative accessibility）的残基。例如，对于TFPI (SEQ ID NO: 1)的Kunitz 2结构域，下述氨基酸具有超过40%相对可及性: 94-95、98、100-110、118-121、123-124、131、134、138-142和144-145 (参见图5)。所述靶分子可以包含这些残基中的5个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、12个或更多个、或15个或更多个，诸如包含这些残基中的5个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、12个或更多个、或15个或更多个的TFPI片段。
所述靶分子可以包含来自TFPI的已知表位。
在“结合抗原的多肽” (Ab)和它的对应“抗原” (Ag)之间的分子相互作用的背景下定义本文使用的术语“表位”。本文使用的术语Ab包含特异性地结合对应的Ag的抗体或其片段。抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)S、Fv (通常抗体的单臂的VL和VH结构域)、单链Fv (scFv; 参见例如Bird 等人, Science 1988; 242:42S-426；和Huston 等人 PNAS 1988; 85:5879-5883)、dsFv、Fd (通常VH和CHI结构域)和dAb (通常VH结构域) 片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；包含单个VH和单个VL链的单价分子；微体、双体、三体、四体和κ体 (参见，例如，Ill 等人. Protein Eng 1997;10:949-57)；骆驼IgG；IgNAR；以及一种或多种分离的CDR或功能互补位，其中分离的CDR或结合抗原的残基或多肽可以结合或连接到一起，从而形成功能抗体片段。不同类型的抗体片段已经描述或综述在例如，Holliger和Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136；WO2005040219,和公开的美国专利申请20050238646和20020161201中。
使用常规的重组或蛋白工程技术，可以得到抗体片段，且可以以与完整抗体相同的方式，筛选所述片段的抗原结合功能或其它功能。
术语抗原(Ag)表示用于免疫免疫感受态脊椎动物以生产识别该Ag的抗体(Ab)的分子实体。在本文中，Ag是更宽泛的术语，通常意在包括被Ab特异性地识别的靶分子，因而包括在制备Ab的免疫过程中使用的分子的片段或模拟物。因而，对于Ab与TFPI的第二kunitz结构域(K2)的结合，分离的K2、全长TFPI（包括TFPI的截短变体和其它变体）都称作Ag。
通常，术语“表位”表示Ag上的Ab所特异性地结合的范围或区域，即与Ab物理接触的范围或区域。蛋白表位可以包含Ag的直接参与结合Ab的氨基酸残基(也称作表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，诸如Ag的被Ab有效阻断的氨基酸残基(换而言之，所述氨基酸残基是在Ab 的“溶剂排斥表面”和/或“足迹”内)。术语表位在本文中包括在K2的任意特定区域中的两类结合部位，所述K2是在特异性地结合抗-TFPI抗体的TFPI中，或在根据本发明的另一种K2-特异性试剂中，除非另有说明 (例如，在有些上下文中，本发明涉及直接结合特定氨基酸残基的抗体)。K2可以包含许多不同的表位，所述表位可以包括、但不限于， (1) 线性肽抗原决定簇，(2) 构象抗原决定簇，其由一个或多个在成熟K2构象中位置彼此靠近的不连续氨基酸组成；和(3) 翻译后抗原决定簇，其全部或部分地由共价地连接到K2上的分子结构（诸如碳水化合物基团）组成。
使用多种实验和计算表位作图方法，可以在不同的详细水平定义和表征给定的抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位。所述实验方法包括诱变、X-射线晶体学、核磁共振 (NMR) 波谱学、氢化的氘交换质谱法 (HX-MS)和不同的竞争结合方法。由于每种方法依赖于独特的原理，表位的描述与已经用于测定它的方法紧密关联。因而，根据采用的表位作图方法，不同地定义给定的 Ab/Ag对的表位。
在它的最详细的水平，通过定义在Ag-Ab 相互作用中存在的原子接触的空间坐标，以及关于它们对结合热力学的相对贡献的信息，可以定义Ag和Ab之间的相互作用的表位。在详细度更低的水平，通过定义Ag和Ab之间的原子接触的空间坐标，可以表征表位。在详细度进一步更低的水平，通过由特定轨范（例如在Ab和Ag中的原子之间的距离）定义的氨基酸残基，可以表征表位。在详细度进一步更低的水平，通过功能（例如通过与其它Ab的竞争结合），可以表征表位。也可以更属类地把表位定义为包含这样的氨基酸残基，另一种氨基酸对所述残基的置换会改变Ab和Ag之间的相互作用特征。
在由Ab（例如Fab片段）和它的Ag之间的复合物的空间坐标定义的X-射线衍生晶体结构的背景下，除非另外指出或上下文冲突，术语表位在本文中具体地定义为这样的K2残基，其特征在于，具有离Ab中的重原子在4 Å距离内的重原子(即非氢原子)。
在以不同详细水平得到表位的描述和定义（依赖于使用的表位作图方法）的事实以后，可以类似地在不同详细水平对比在相同Ag上对不同Ab的表位。
如果它们含有相同的氨基酸残基集合，则在氨基酸水平描述的（例如从X-射线结构测定的）表位被认为是相同的。如果表位共有至少一个氨基酸，则表位被认为是重叠的。如果表位不共有氨基酸残基，则表位被认为是单独的(独特的)。
如果对应的Ab的结合相互排斥（即一种Ab的结合排斥其它Ab的同时结合），则通过竞争结合表征的表位被认为是重叠的。如果Ag能够适应两种对应Ab的同时结合，则表位被认为是单独的(独特的)。
通过反转视角，从上面的“表位”的定义衍生出术语“互补位”的定义。因而，术语“互补位”表示在Ab上的Ag所特异性地结合（即与Ag物理接触）的范围或区域。
在由Ab（例如Fab片段）和它的Ag之间的复合物的空间坐标定义的X-射线衍生晶体结构的背景下，除非另外指出或上下文冲突，术语互补位在本文中具体地定义为这样的Ag残基，其特征在于，具有离K2中的重原子在4 Å距离内的重原子(即非氢原子)。
通过常规方法，可以鉴别给定的抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位和互补位。例如，通过评估抗体的结合不同片段或变体TFPI多肽的能力，可以确定表位的一般位置。使用常规方法，诸如在实施例中所述的方法，也可以确定在TFPI内与抗体(表位)接触的具体氨基酸和在抗体内与TFPI (互补位)接触的具体氨基酸。例如，可以组合抗体和靶分子，且可以使Ab/Ag复合物结晶。可以确定复合物的晶体结构，并用于鉴别抗体和它的靶物之间的相互作用的特异位点。
发明人已经对本文所述的鼠MuTFPI4F36抗体以及人源化的HzTFPI4F36抗体和TFPI的Kunitz 2结构域(K2)之间的相互作用进行了这样的分析。在实施例中，更详细地描述了该分析。
根据本发明的抗体的互补位可以定义如下：所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 15的残基E31、S32、D33、Y37、A96、T97和F99，且所述抗体的重链包含SEQ ID NO 18的残基N31、S52、R53、S54、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103和D106。
根据本发明的抗体的轻链因而可以包含氨基酸残基：
• E，其在与SEQ ID NO：15的位置31相对应的位置，
• S，其在与SEQ ID NO：15的位置32相对应的位置，
• D，其在与SEQ ID NO：15的位置33相对应的位置，
• Y，其在与SEQ ID NO：15的位置37相对应的位置，
• A，其在与SEQ ID NO：15的位置96相对应的位置，
• T，其在与SEQ ID NO：15的位置97相对应的位置，和
• F，其在与SEQ ID NO：15的位置99相对应的位置；
且所述抗体的重链可以包含氨基酸残基：
• N，其在与SEQ ID NO 18的位置31相对应的位置，
• R，其在与SEQ ID NO 18的位置53相对应的位置，
• S，其在与SEQ ID NO 18的位置54相对应的位置，
• Y，其在与SEQ ID NO 18的位置57相对应的位置，
• Y，其在与SEQ ID NO 18的位置59相对应的位置，
• F，其在与SEQ ID NO 18的位置60相对应的位置，
• P，其在与SEQ ID NO 18的位置61相对应的位置，
• D，其在与SEQ ID NO 18的位置62相对应的位置，
• Q，其在与SEQ ID NO 18的位置65相对应的位置，
• Y，其在与SEQ ID NO 18的位置102相对应的位置，
• D，其在与SEQ ID NO 18的位置103相对应的位置，和
• D，其在与SEQ ID NO 18的位置106相对应的位置。
所述重链可以另外包含S，其在与SEQ ID NO: 18的位置52相对应的位置。
根据本发明的抗体的轻链可以另外包含H，其在与SEQ ID NO: 15的位置98相对应的位置，且所述重链可以另外包含S，其在与SEQ ID NO: 18的位置56相对应的位置。
对于MuTFPI4F36 (实施例4)，发现表位由SEQ ID NO: 1的氨基酸E100、E101、P103、R107、Y109、T111、Y113、Q118、Q121、E123、R124、F125、K126和L140组成，它们对应着SEQ ID NO: 2的氨基酸E10、E11、P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36和L50。发现互补位由SEQ ID NO: 4的轻链氨基酸残基E31、S32、D33、Y37、A96、T97、H98和F99和SEQ ID NO 8的重链氨基酸残基N31、R53、S54、S56、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103和D106组成。
对于HzTFPI4F36 (实施例5)，发现表位由SEQ ID NO: 1的氨基酸E100、E101、D102、P103、R107、Y109、T111、Y113、F114、N116、Q118、Q121、C122、E123、R124、F125、K126和L140组成，它们对应着SEQ ID NO: 2的氨基酸E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、K36和L50。发现互补位由SEQ ID NO: 15的轻链氨基酸残基E31、S32、D33、Y37、A96、T97和F99和SEQ ID NO 18的重链氨基酸残基N31、S52、R53、S54、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103和D106组成。
根据本发明的抗体可以结合与本文具体公开的本发明抗体相同的TFPI表位或结构域。可以如下鉴别其它尚未鉴别的本发明抗体：例如，通过对比它们对TFPI的结合和单克隆抗体MuTFPI4F36和/或HzTFPI4F36的结合；或通过对比尚未鉴别的抗体的功能和MuTFPI4F36和/或HzTFPI4F36的功能。可以用于这样的鉴别目的的分析和试验包括TFPI 中和试验，诸如：在实施例6中所述的FXa抑制试验和在实施例7中所述的FVIIa/TF/FXa抑制试验；结合相互作用分析，诸如在实施例8中所述的表面等离子体共振分析；细胞试验，诸如在实施例9中所述的TFPI对人脐血管内皮细胞(HUVEC)的中和，和在实施例10中所述的TF/FVIIa活性的TFPI抑制对MDA-MB 231 人乳腺癌细胞的中和。
在一个实施方案中，本发明的抗体可以结合与本文所述的MuTFPI4F36或HzTFPI4F36抗体相同的表位或区域。在本文中更详细地描述了MuTFPI4F36和HzTFPI4F36对TFPI的结合。本发明的抗体可以是结合与MuTFPI4F36或HzTFPI4F36抗体相同的TFPI表位的抗体。这可以包括，它在接触上述的TFPI的特定氨基酸。例如，本发明的抗体可以以下述方式结合TFPI：它接触SEQ ID NO: 2的氨基酸E10、E11、P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36和L50，或它接触SEQ ID NO: 2的氨基酸E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、K36和L50。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 2的E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、F35、K36和L50。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基E10。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基E11。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基D12。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基P13。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基R17。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基Y19。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基T21。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基Y23。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基F24。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基N26。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基Q28。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基Q31。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基C32。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基E33。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基R34。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基F35。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基K36。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基L50。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、K36和L50。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基E10、E11、P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36和L50。
本发明的抗体可以具有与本发明的另一种抗体竞争结合TFPI或本文所述的另一种适当靶物的能力。例如，本发明的抗体可以与本文所述的MuTFPI4F36或HzTFPI4F36抗体交叉竞争结合TFPI或被MuTFPI4F36或HzTFPI4F36抗体结合的TFPI的适当片段或变体。基于它们在标准结合试验中与本发明的已知抗体交叉竞争的能力，可以鉴别这样的交叉竞争抗体。例如，SPR（诸如通过使用Biacore™ 系统）、ELISA试验或流式细胞术可以用于证实交叉竞争。这样的交叉竞争可以提示两种抗体结合相同的、重叠的或类似的表位。
因而，本发明的抗体可以能够以比任意一种或多种下述可商业得到的单克隆抗体更高的亲和力结合TFPI的K2结构域：mAb0281 (Ab systems)和/或mAb4904 (American Diagnostica)和/或mAb2974 (R&D systems)和/或mAb29741 (R&D systems)。
因此，通过下述方法，可以鉴别本发明的抗体，所述方法包括这样的结合试验，该试验评估实验抗体是否能与本发明的已知抗体竞争靶分子上的结合部位。进行竞争结合试验的方法是本领域众所周知的。例如，它们可以包括，在抗体可以结合靶分子的条件下，使本发明的已知抗体结合靶分子。然后可以使抗体/靶物复合物暴露于实验抗体，并可以评估实验抗体能够从抗体/靶物复合物中置换出本发明抗体的程度。一种替代方法可以包括，在允许抗体结合的条件下，使实验抗体接触靶分子，然后加入能结合该靶分子的本发明抗体，并评估本发明的抗体能够从抗体/靶物复合物中置换出实验抗体的程度。
实验抗体的抑制本发明抗体结合靶物的能力证实：实验化合物可以与本发明抗体竞争结合靶物，因而实验抗体结合与本发明的已知抗体相同的在TFPI蛋白上的表位或区域。在这样的方法中被鉴别为与本发明的已知抗体竞争的实验抗体也是根据本发明的潜在抗体。实验抗体可以在与本发明的已知抗体相同的区域结合TFPI并与本发明的已知抗体竞争的事实提示，实验抗体可以在与已知抗体相同的结合部位作为配体，且实验抗体因此可以模仿已知抗体的行为。这可以通过在有本文所述的实验化合物存在下评估TFPI的活性来确认。
本发明的已知抗体可以是本文所述的抗体，诸如鼠TFPI- 4F36A1B2 (也称作4F36和MuTFPI4F36)抗体，或保留结合TFPI的能力的本文所述的其任意变体或片段，诸如人源化的TFPI-4F36A1B2抗体，其中之一在本文中称作HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)。本发明的抗体可以结合与本文所述的MuTFPI4F36抗体相同的表位，或保留结合TFPI的能力的本文所述的其任意变体或片段，诸如HzTFPI4F36。
本发明的抗体可以结合与MuTFPI4F36 表位（其在实施例中进一步描述）相同、重叠或类似的表位。本发明的抗体可以结合与HzTFPI4F36表位（其在实施例中进一步描述）相同、重叠或类似的表位。本发明的抗体可以结合、优选特异性地结合一个或多个属于MuTFPI4F36和/或HzTFPI4F36表位的氨基酸残基。例如，本发明的抗体可以结合5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个或10个或更多个上面关于MuTFPI4F36或HzTFPI4F36的结合所述的氨基酸残基。例如，当接触SEQ ID NO: 2的多肽时，本发明的抗体可以结合该多肽，并接触氨基酸E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、F35、K36和L50、或那些氨基酸的子集，诸如那些氨基酸中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个或至少18个。
参照抗体对非靶物的分子的结合，可以评估特异性结合。通过对比抗体结合靶物的能力和结合另一种分子的能力，可以进行该对比。可以如上所述，在KD或Ki的评估中，进行该对比。在这样的对比中使用的其它分子可以是非靶分子的任意分子。优选地，其它分子不同于靶分子。优选地，所述靶分子不是靶分子的片段。
本发明的抗体的KD可以小于0.8 nM，诸如小于0.7 nM、诸如小于0.6 nM、诸如小于0.5 nM、诸如小于0.4 nM、诸如小于0.3 nM、诸如小于0.2 nM、诸如小于0.1 nM、诸如小于0.05 nM、诸如小于0.025 nM、诸如小于0.015 nM、诸如在0.015 nM至0 nM之间。
用于测定特异性结合的其它分子可以在结构或功能上与靶物无关。例如，其它分子可以是无关物质或在环境中的伴随物质。
用于测定特异性结合的其它分子可以是参与与靶分子相同的体内途径的另一种分子。例如，在所述靶物是TFPI或其片段或变体的情况下，用于对比的其它分子可以是形成血液凝固级联的一部分的蛋白。通过确保本发明的抗体具有对TFPI的特异性（胜过另一种这样的分子），可以避免不希望的体内交叉反应性。
用于对比的其它分子可以与靶分子有关。例如，在希望鉴别仅结合特定表位的抗体的情况下，用于对比的其它分子可以是其中该表位缺失或被破坏的TFPI分子。用于对比的其它分子因而可以是另一种靶分子，其不同于被目标抗体（the antibody in question）结合的靶分子。
本发明的抗体可以保留结合与靶分子有关的某些分子的能力。例如，全长成熟人TFPI可以用作靶物，但是所述抗体也可以能够结合例如人TFPI的未成熟形式、人TFPI的片段或截短形式、结合到脂蛋白或细胞上的TFPI或来自其它物种的TFPI（诸如其它哺乳动物TFPI）。
或者，本发明的抗体可以具有对特定靶分子的特异性。例如，它可以结合本文所述的一种靶分子，但是不结合或以明显降低的亲和力结合本文所述的不同靶分子。例如，全长成熟人TFPI可以用作靶物，但是结合该靶物的抗体不能结合或以更低亲和力结合例如人TFPI的未成熟形式、人TFPI的片段或截短形式、结合到脂蛋白或细胞上的TFPI或来自其它物种的TFPI（诸如其它哺乳动物TFPI）。
本发明的抗体可以结合TFPI，且在如此进行时，可以抑制TFPI的活性。
如上面解释的，TFPI会下调节血液凝固。它通过抑制Fxa的活性和通过在Fxa存在下抑制TF-FVIIa复合物来进行。被本发明的抗体抑制的TFPI的活性可以是这些活性中的任一种或其任意下游效应。例如，本发明的抗体可以导致血液凝固增加、Fxa的存在或水平增加、或TF-FVIIa的活性增加。优选地，当接触(a)人FVIII缺乏的血浆或(b) 人全血时，本发明的抗体会减少凝固时间。
TFPI活性的测量可以包括评估TFPI在血液样品中抑制凝固或减少凝固时间的活性。例如，这样的方法可以包括：在会发生凝固的条件下，使TFPI接触包含凝血因子的血液样品或血液产品样品（诸如血浆或血清），并测定TFPI的存在是否抑制血液的凝固或减少凝固时间。然后可以将这样的样品中的血液凝固水平或凝固时间与其中也存在实验抗体的等效样品相对比。如果在抗体样品中的凝固水平增加或凝固时间减少，这表明所述抗体正抑制该样品中的TFPI活性。
通过寻找血液本身的凝固、血浆的凝固或位于TFPI作用点下游的一种或多种凝固级联特征，可以检测血液凝固。例如，所述方法可以评估样品中Fxa的水平或TF-FVIIa的活化。
用于评估血液凝固和凝固时间的各种其它方法是本领域众所周知的。例如，使用在实施例中所述的稀释凝血酶原时间分析(dPT 分析)，可以评估抗体对血液凝固时间的任何作用。简而言之，使人血浆接触人促凝血酶原激酶。在有和没有实验抗体存在下，测量血浆到凝块所需的时间。可以在这样的分析中使用阳性对照，诸如添加预期会减少凝固时间的FVIIa (NovoSeven®)。本发明的抗体应当能够在这样的方法中减少凝固时间。优选地，本发明的抗体应当能够以剂量依赖性的方式减少凝固时间。
本发明的抗体可以能够在基于血浆的凝固试验（诸如dPT 分析）中抑制TFPI，显著优于任意一种或多种下述可商业得到的单克隆抗体: mAb0281 (Ab systems)和/或mAb4904 (American Diagnostica)和/或mAb2974 (R&D systems)和/或mAb29741 (R&D systems)。
凝血弹性描记术可以用于评估全血样品中的血块形成和纤维蛋白溶解的动力学。因而，通过对比在有和没有抗体存在下血块形成所需的时间，可以在全血样品中类似地评估抗体的减少凝固时间或刺激血液凝固的能力。
因而可以在体外进行评估本发明抗体的功能作用的方法。这样的方法优选地在人血液或血浆样品上进行。这样的样品可以是正常的人血液或血浆，或可以缺少或添加了一种或多种参与血液凝固的因子。例如，使用正常的人全血、正常的人血浆或FVIII-缺乏的血浆或全血，可以进行这些方法。通过使合适的血液或血浆样品接触中和抗-FVIII抗体，可以产生FVIII-缺乏的血液或血浆。这样的体外方法可以是结合相互作用分析或TFPI中和分析，诸如在实施例6-11中所述的那些。
本发明的抗体可以能够抑制血小板-相关的TFPI。
本发明的抗体可以能够抑制可溶的TFPI。
本发明的抗体可以能够抑制脂蛋白-结合的TFPI。
本发明的抗体可以能够抑制细胞-结合的TFPI，诸如结合到内皮细胞上的TFPI。
本发明的抗体可以能够结合TFPI，使得FXa保留它的活性至少91%、诸如至少92%、诸如至少93%、诸如至少94%、诸如至少95%、诸如至少96%、诸如至少97%、诸如至少98%、诸如至少99%、诸如99-100%，如在FXa抑制试验中所测得的。
当TFPI被所述抗体饱和时，本发明的抗体可以能够中和膜-结合的FVIIa/TF/FXa的TFPI抑制至少55%、诸如至少60%、诸如至少65%、诸如至少70%、诸如至少75%、诸如至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如多达100%、诸如100%，如在FVIIa/TF/FXa抑制剂试验中所测得的。
优选地，本发明抗体能在下述样品中减少凝固时间和/或刺激血液凝固：(a) 人全血、(b) 人血浆、(c) FVIII-缺乏的人全血、(d) FVIII-缺乏的人血浆、(e) FIX-缺乏的人全血或(f) FIX-缺乏的人血浆。
也可以在体内进行测定抗体的刺激血液凝固或减少凝固时间的能力的方法。例如，可以在实施例中所述的暂时患血友病的兔中进行体内研究。简而言之，通过施用抗-FVIII抗体，使兔暂时患血友病。然后可以施用实验抗体，并评估表皮出血时间和/或血小板数目。在有实验抗体存在下表皮出血时间的减少指示，该抗体能减少凝固时间和刺激血液凝固。具有这样的效应的抗体因此可以是本发明的抗体。
本发明的抗体可以能够结合TFPI的K2结构域，使得受试者中的游离TFPI的百分比减少至小于30%、诸如小于29%、诸如小于28%、诸如小于27%、诸如小于26%、诸如小于25%、诸如小于24%、诸如小于23%、诸如小于22%、诸如小于21%、诸如小于20%、诸如小于19%、诸如小于18%、诸如小于17%、诸如小于16%、诸如小于15%、诸如小于14%、诸如小于13%、诸如小于12%、诸如小于11%、诸如小于10%、诸如小于9%、诸如小于8%、诸如小于7%、诸如小于6%、诸如小于5%、诸如小于4%、诸如小于3%、诸如小于2%、诸如小于1%、诸如0%。
此外，本发明的抗体可以能够结合TFPI的K2结构域，使得受试者中的游离TFPI的量在将所述单克隆抗体施用给所述受试者以后的前28天中、诸如在前27天中、诸如在前26天中、诸如在前25天中、诸如在前24天中、诸如在前23天中、诸如在前22天中、诸如在前21天中、诸如在前20天中、诸如在前19天中、诸如在前18天中、诸如在前17天中、诸如在前16天中、诸如在前15天中、诸如在前14天中、诸如在前13天中、诸如在前12天中、诸如在前11天中、诸如在前10天中、诸如在前9天中、诸如在前8天中、诸如在前7天中、诸如在前6天中、诸如在前5天中、诸如在前4天中、诸如在前3天中、诸如在前2天中、诸如在前1天中减少。
本发明的抗体也可以不导致血小板数目的显著减少。具体地，本发明的抗体可以能在下述样品中或在动物体内减少凝固时间和/或刺激血液凝固而不导致血小板数目的任何显著减少：(a) 人全血、(b) 人血浆、(c) FVIII-缺乏的人全血、(d) FVIII-缺乏的人血浆、(e) FIX-缺乏的人全血或(f) FIX-缺乏的人血浆。可以在与上面讨论的其它效应相同的样品或动物中，评估血小板数目，或可以单独评估。例如，可以在血液样品（诸如从患者或实验动物得到的血液样品）中，评估血小板数目。可以在将抗体施用给如上所述的暂时患血友病的兔以后，评估血小板数目。本发明的抗体可以能够减少暂时患血友病的兔的表皮出血时间，而不导致血小板数目的并行减少，如通过体内研究所例证的。通过对比施用抗体之前和之后的血小板数目，或通过对比用目标抗体处理的样品或动物和没有用该抗体处理的对照样品或动物之间的血小板数目，可以评估血小板数目的变化。本发明的抗体可以能够结合TFPI的K2结构域，使得受试者的体内凝固时间减少，且所述受试者的血小板数没有显著减少。例如，所述受试者的血小板数可以没有下降至起始血小板数的大约80%、诸如大约75%、诸如大约70%、诸如大约65%、诸如大约60%、诸如大约55%、诸如大约50%、诸如大约45%、诸如大约40%、诸如大约35%、诸如大约30%、诸如大约25%。优选地，当进行这样的对比时，血小板数目没有差异或没有统计上显著的差异。也就是说，本发明的抗体不会造成血小板数目的任何减少。
本文提及的术语“抗体”包括完整抗体及其任意抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或单链。抗体表示包含通过二硫键相连的至少2个重链(HC)和2个轻链(LC)的糖蛋白或其抗原结合部分。每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(CH)。每个轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区(CL)。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。VH和VL区域可以进一步分成高变异性区域（称作互补性决定区(CDR) ），所述区域内夹杂着更保守的区域（称作框架区(FR)）。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子（包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分 (Clq)）的结合。
当在本文中使用时，术语“互补性决定区”或“高变区”表示抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。互补性决定区或“CDR”通常包含在轻链可变结构域中的氨基酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)和89-97 (L3) 以及在重链可变结构域中的31-35 (H1)、50-65 (H2)和95-102 (H3)；(Kabat 等人 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美国健康和人类服务部, NIH公开号91-3242)和/或来自“高变环”的那些残基(在轻链可变结构域中的残基26-32 (L1)、50-52 (L2)和91-96 (L3)以及在重链可变结构域中的26-32 (H1)、53-55 (H2)和96-101 (H3)；Chothia和Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917)。通常，通过上面的Kabat 等人所述的方法，进行该区域中的氨基酸残基的编号。诸如“Kabat 位置”、“Kabat残基”和“根据Kabat”等短语在本文中表示重链可变结构域或轻链可变结构域的该编号系统。使用Kabat编号系统，肽的实际的线性氨基酸序列可以含有更少的或额外的氨基酸，它们对应着可变结构域的FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可以包括在CDR H2的残基52之后的氨基酸插入(根据Kabat，残基52a、52b和52c)和在重链FR残基82之后插入的残基(例如，根据Kabat，残基82a、82b和82c等)。通过在抗体序列的同源性区域与“标准的”Kabat编号的序列比对，可以确定给定的抗体的残基的Kabat编号。
术语“框架区”或“FR”残基表示不在本文定义的CDR内的那些VH或VL氨基酸残基。
本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。本发明的抗体可以是嵌合抗体、CDR-移植的抗体、人或人源化的抗体或其任一种的抗原结合部分。关于单克隆和多克隆抗体的生产，实验动物是合适的哺乳动物，例如，但不限于，山羊、兔、大鼠或小鼠。
多克隆抗体是源自不同B细胞系的抗体。多克隆抗体可以包含针对特定抗原的不同免疫球蛋白分子的混合物。多克隆抗体可以包含结合抗原分子内的一种或多种不同表位的不同免疫球蛋白分子的混合物。通过常规方法，诸如用目标抗原免疫适当的动物，可以生产多克隆抗体。随后，可以从该动物取出血液，并纯化免疫球蛋白级分（fraction）。
单克隆抗体是彼此相同且对特定表位具有单一结合特异性和亲和力的免疫球蛋白分子。通过多种技术，包括常规单克隆抗体方法，例如， Kohler和Milstein (1975) Nature 256: 495的标准体细胞杂交技术，或B 淋巴细胞的病毒或致癌性转化，可以生产本发明的单克隆抗体(mAb)。优选的制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。在小鼠中的杂交瘤生产是非常确定的步骤。免疫方法和用于融合的免疫化的脾细胞的分离技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合步骤也是已知的。
为了制备生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤，可以从免疫的小鼠分离脾细胞和/或淋巴结细胞，并与适当的永生化的细胞系（诸如小鼠骨髓瘤细胞系）融合。可以针对抗原特异性的抗体的生产来筛选得到的杂交瘤。可以将分泌抗体的杂交瘤重新涂布平板，再次筛选，且如果仍然是合适的IgG阳性的，则通过有限稀释，将该单克隆抗体亚克隆至少2次。然后可以在体外培养该稳定的亚克隆，以在组织培养基中制备小量抗体用于表征。
术语抗体的“抗原结合部分”表示保留特异性地结合抗原（诸如TFPI或本文所述的另一种靶蛋白）的能力的一种或多种抗体片段。已经证实：抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实现。被包括术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括Fab片段、F(ab')2片段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段和分离的互补性决定区 (CDR)。单链抗体（诸如scFv）和重链抗体（诸如VHH）和骆驼抗体也意图被包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规技术，可以得到这些抗体片段，且可以以与完整抗体相同的方式，筛选所述片段的效用。
通过重组方法，可以制备、表达、建立或分离本发明的抗体，例如：(a) 从对于目标免疫球蛋白基因是转基因的或转染色体的动物(例如，小鼠) 或由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b) 从转化成表达目标抗体的宿主细胞（例如，从转染瘤）分离的抗体，(c) 从重组的、组合抗体文库分离的抗体，和(d) 通过包含剪接免疫球蛋白基因序列至其它DNA序列的任意其它方法制备、表达、建立或分离的抗体。
本发明的抗体可以是人抗体或人源化的抗体。本文使用的术语“人抗体” 意在包括具有可变区的抗体，其中构架区和CDR区都源自人种系（germline）免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，那么该恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变而导入的突变)。但是，本文使用的术语“人抗体”无意包括这样的抗体，其中源自另一哺乳动物物种（如小鼠）种系的CDR序列已经被移植到人构架序列上。
这样的人抗体可以是人单克隆抗体。这样的人单克隆抗体可以由杂交瘤生产，所述杂交瘤包括从转基因的非人动物（例如转基因小鼠）得到的B细胞，其具有包含与永生化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
人抗体可以分离自这样的序列文库，其建立在人种系序列的选择上，并用天然的和合成的序列多样性进一步多样化。
通过体外免疫人淋巴细胞，并随后用EB病毒转化淋巴细胞，可以制备人抗体。
术语“人抗体衍生物”表示人抗体的任意修饰形式，例如，抗体和另一种试剂或抗体的缀合物。
术语“人源化的抗体”意在表示含有源自非人免疫球蛋白的最小序列(CDR区)的人/非人嵌合抗体。人源化的抗体因而是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区残基被替换为来自非人物种（诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物）的具有希望的特异性、亲和力和能力的高变区残基(供体抗体)。在有些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被替换为对应的非人残基。这样的修饰的实例是导入一个或多个所谓的回复突变，诸如在实施例2中所述。
此外，人源化的抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中不存在的残基。做出这些修饰，以进一步优化抗体性能。一般而言，人源化的抗体包含基本上所有的至少1个和通常2个可变结构域，其中所有的或基本上所有的高变环对应着非人免疫球蛋白的那些，且所有的或基本上所有的FR残基是人免疫球蛋白序列的那些。人源化的抗体还可以任选地至少包含免疫球蛋白恒定区 (Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的一部分。
可以测试本发明的抗体对靶蛋白的结合，例如，通过标准的ELISA或蛋白印迹法来进行。ELISA试验也可以用于筛选表现出与靶蛋白具有正反应性的杂交瘤。通过监测抗体对表达靶蛋白的细胞的结合，例如通过流式细胞术，也可以测定抗体的结合特异性。
通过测定抗体是否结合其它蛋白，可以进一步研究本发明抗体对靶蛋白的特异性。例如，在希望生产特异性地结合TFPI或TFPI的特定部分（例如表位）的抗体的情况下，通过测定抗体是否也结合缺少目标部分的其它分子或TFPI的修饰形式，可以评估抗体的特异性。
如上面解释的，本发明的抗体可以改变TFPI的活性。因而可以进一步测试具有需要的结合性质的抗体，以确定它们对TFPI活性的影响。因而，可以使用方法来鉴别合适的抗体，所述抗体能够结合TFPI，且能够改变、尤其是降低它的活性。
一旦已经鉴别和选择出合适的抗体，通过本领域已知的方法，可以鉴别抗体的氨基酸序列。使用特异性的和/或简并的引物，可以克隆编码抗体的基因。通过常规方法，可以重组地生产抗体。
“多肽”在本文中以它的最广泛的含义使用，表示2个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或其它肽拟似物的化合物。术语“多肽”因而包括短肽序列以及更长的多肽和蛋白。本文使用的术语“氨基酸” 可以表示天然的和/或非天然的或合成的氨基酸、D和/或L光学异构体和氨基酸类似物和肽拟似物。
本发明人已经鉴别出在实施例中描述的鼠抗体。该抗体在本文中称作TFPI-4F36A1B2 (或者，4F36或MuTFPI4F36)。本发明包括该抗体、其变体和片段（包括嵌合抗体和人源化的抗体），它们保留鼠抗体的一种或多种活性，且也描述在实施例中。该抗体的活性包括结合TFPI的能力、结合TFPI分子中的特定位置的能力和抑制TFPI活性的能力。
该抗体的合适的片段或变体会保留结合TFPI的能力。优选地保留特异性地结合TFPI的能力。优选地保留特异性地结合与它的来源抗体(MuTFPI4F36)结合的相同或类似的TFPI分子表位或区域的能力。优选地保留它的来源抗体的一种或多种另外功能，诸如抑制TFPI活性的能力或减少凝固时间的能力，任选地不会导致血小板数目的下降。
可以如下制备根据本发明的多肽或抗体“片段”：通过截短，例如通过从多肽的N和/或C-端末端去除一个或多个氨基酸。以此方式，可以从N和/或C端去除多达10、多达20、多达30、多达40或更多个氨基酸。通过一个或多个内部缺失，也可以产生片段。
本发明抗体可以是或可以包含MuTFPI4F36抗体的片段或其变体。本发明的抗体可以是或可以包含如上面进一步讨论的该抗体的抗原结合部分或其变体。例如，本发明的抗体可以是该抗体的Fab片段或其变体，或可以是源自该抗体的单链抗体或其变体。
MuTFPI4F36抗体的轻链和重链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO: 6和10中给出。MuTFPI4F36抗体的VL和VH链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO: 4和8给出中。一种人源化的抗体HzTFPI4F36的轻链和重链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO: 21和24中给出。HzTFPI4F36的VL和VH链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO: 15和18中给出。
本发明的抗体可以包含在SEQ ID NO: 6中所示的MuTFPI4F36 轻链氨基酸序列或其片段或变体。抗体可以额外地或替换地包含本文所述的在SEQ ID NO: 10中所示的MuTFPI4F36 重链氨基酸序列或其片段或变体。
本发明的抗体可以包含SEQ ID No: 4的VL氨基酸序列或其片段或变体。本发明的抗体可以包含SEQ ID No: 8的VH氨基酸序列或其片段或变体。本发明的抗体可以包含(a) SEQ ID No: 4的VL氨基酸序列或其片段或变体和(b) SEQ ID No: 8的VH氨基酸序列或其片段或变体。
本发明的抗体可以包含在图2中所示的VL或VH氨基酸序列之一的片段。例如，本发明的抗体可以包含来自SEQ ID No: 4或8的至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少18、至少20或至少25个连续氨基酸的片段。这样的片段优选地保留一种或多种上面讨论的功能，诸如结合TFPI的能力。
任一个这样的VH或VL序列的合适的片段或变体会保留结合TFPI的能力。优选地保留特异性地结合TFPI的能力。优选地保留特异性地结合与它的来源抗体(MuTFPI4F36)结合的相同或类似的TFPI分子表位或区域的能力。优选地保留它的来源抗体的一种或多种另外功能，诸如抑制TFPI活性的能力或减少凝固时间的能力，任选地不会导致血小板数目的下降。
合适的片段或变体VL序列优选地保留在SEQ ID NO: 4中的位置E31、S32、D33、Y37、A96、T97、H98和F99处的氨基酸。合适的片段或变体VH序列优选地保留在SEQ ID NO: 8中的位置N31、R53、S54、S56、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103和D106处的氨基酸。合适的片段或变体抗体优选地保留在SEQ ID NO: 4中的位置E31、S32、D33、Y37、A96、T97、H98和F99处的氨基酸和在SEQ ID NO: 8中的位置N31、R53、S54、S56、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103和D106处的氨基酸。如在图3中所鉴别出的，这些是在MuTFPI4F36轻链和重链序列中的残基，当MuTFPI4F36结合TFPI的K2结构域时，所述残基具有离重原子在4 Å距离内的重原子。
本发明的抗体可以包含来自本文鉴别出的具体抗体的CDR区，诸如来自SEQ ID NO: 4或8的CDR区。这样的抗体优选地保留本文所述的结合TFPI的能力。例如，如图3所示，使用Kabat定义，在SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6的氨基酸24-39、55-61和94-102处，可以鉴别出在MuTFPI4F36的轻链内的CDR序列。在SEQ IS NO: 8或SEQ ID NO: 10的氨基酸31-35、50-66和99-110处，可以鉴别出在MuTFPI4F36的重链内的CDR序列。本发明的抗体可以包含一个或多个在图3中所示的CDR序列。例如，本发明的抗体可以包含1、2或所有3个在SEQ ID NO: 6的残基24-39、55-61和94-102处所示的氨基酸序列。本发明的抗体可以可替换地或附加地包含1、2或所有3个在SEQ ID NO: 10的残基31-35、50-66和99-110处所示的氨基酸序列。本发明的抗体可以包含所有6个在SEQ ID NO: 6的残基24-39、55-61和94-102处和在SEQ ID NO: 10的31-35、50-66和99-110处所示的氨基酸序列。
本发明的抗体可以是人源化的抗体，诸如在本文中称作HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)的抗体。这样的抗体可以包含一个或多个来自SEQ ID NO: 15或18的CDR区。
根据本发明的抗体的重链可以包含SEQ ID NO: 18的氨基酸31-35 (NYAMS)的 CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换。
根据本发明的抗体的重链可以包含SEQ ID NO: 18的氨基酸50-66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)的 CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。
根据本发明的抗体的重链可以包含SEQ ID NO: 18的氨基酸99-110 (LGGYDEGDAMDS)的 CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。
根据本发明的抗体的轻链可以包含SEQ ID NO: 15的氨基酸24-39 (KSSQSLLESDGKTYLN)的 CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。
根据本发明的抗体的轻链可以包含SEQ ID NO: 15的氨基酸55-61 (LVSILDS)的 CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。
根据本发明的抗体的轻链可以包含SEQ ID NO: 15的氨基酸94-102 (LQATHFPQT)的 CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。
更具体地，本发明的抗体可以具有这样的重链，其包含：
• CDR1序列，其又包含SEQ ID NO:18的氨基酸31-35 (NYAMS)；和
• CDR2序列，其又包含SEQ ID NO:18的氨基酸50-66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)；和
• CDR3序列，其又包含SEQ ID NO:18的氨基酸99-110 (LGGYDEGDAMDS)。
本发明的抗体可以具有这样的轻链，其包含：
• CDR1序列，其又包含SEQ ID NO: 15的氨基酸24-39 (KSSQSLLESDGKTYLN)；和
• CDR2序列，其又包含SEQ ID NO: 15的氨基酸55-61 (LVSILDS)；和
• CDR3序列，其又包含SEQ ID NO: 15的氨基酸94-102 (LQATHFPQT)。
本发明的抗体可以包含上述CDR区的任意组合。
更具体地，本发明的抗体的重链的框架区2 (FR2)可以包含氨基酸：
• T，其在与SEQ ID NO：18的位置40相对应的位置，
• E，其在与SEQ ID NO：18的位置42相对应的位置，
• R，其在与SEQ ID NO：18的位置44相对应的位置，和
• A，其在与SEQ ID NO：18的位置49相对应的位置。
或者，重链的所述FR2可以包含SEQ ID NO: 18的氨基酸36-49。
本发明的抗体可以包含下述的任一个：
• SEQ ID NO: 15的VL氨基酸序列，
• SEQ ID NO: 18的VH氨基酸序列，
• SEQ ID NO: 15和18，
• SEQ ID NO: 21的轻链氨基酸序列，
• SEQ ID NO: 24的重链氨基酸序列，
• SEQ ID NO: 21和24。
或者，本发明的抗体可以是或可以包含这些具体序列之一的变体，诸如MuTFPI4F36抗体的变体或HzTFPI4F36的变体。例如，变体可以是任一个上述氨基酸序列的置换、缺失或添加变体。
根据本发明的变体可以是这样的抗体，其不包含：
• N，其在与SEQ ID NO：18的CDR1区的位置31相对应的位置；
• R，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置53相对应的位置；
• S，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置54相对应的位置；
• S，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置56相对应的位置；
• Y，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置57相对应的位置；
• Y，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置59相对应的位置；
• F，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置60相对应的位置；
• P，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置61相对应的位置；
• D，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置62相对应的位置；和
• Q，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置65相对应的位置；
• Y，其在与SEQ ID NO：18的CDR3区的位置102相对应的位置；
• D，其在与SEQ ID NO：18的CDR3区的位置103相对应的位置；和
• D，其在与SEQ ID NO：18的CDR3区的位置106相对应的位置；
• E，其在与SEQ ID NO：15的CDR1区的位置31相对应的位置；
• S，其在与SEQ ID NO：15的CDR1区的位置32相对应的位置；
• D，其在与SEQ ID NO：15的CDR1区的位置33相对应的位置；和
• Y，其在与SEQ ID NO：15的CDR1区的位置37相对应的位置；
• A，其在与SEQ ID NO：15的 CDR3区的位置96相对应的位置；
• T，其在与SEQ ID NO：15的 CDR3区的位置97相对应的位置；
• H，其在与SEQ ID NO：15的 CDR3区的位置98相对应的位置；和
• F，其在与SEQ ID NO：15的 CDR3区的位置99相对应的位置。
变体抗体可以包含来自上面讨论的具体序列和片段的1、2、3、4、5、多达10、多达20、多达30或更多个氨基酸置换和/或缺失和/或插入。“缺失”变体可以包含单个氨基酸的缺失、小氨基酸组（诸如2、3、4或5个氨基酸）的缺失或更大的氨基酸区域的缺失，诸如特定氨基酸结构域或其它特征的缺失。“插入”变体可以包含单个氨基酸的插入、小氨基酸集合（诸如2、3、4或5个氨基酸）的插入或更大氨基酸区域的插入，诸如特定氨基酸结构域或其它特征的插入。“置换”变体优选地包含用相同数目的氨基酸替换一个或多个氨基酸，和进行保守氨基酸置换。例如，可以将一个氨基酸置换为一个具有类似性质的替代氨基酸，例如，另一个碱性氨基酸、另一个酸性氨基酸、另一个中性氨基酸、另一个带电荷的氨基酸、另一个亲水氨基酸、另一个疏水氨基酸、另一个极性氨基酸、另一个芳族氨基酸或另一个脂族氨基酸。可以用于选择合适的取代基的20种主要氨基酸的某些性质如下：
Figure 659154DEST_PATH_IMAGE002
。
优选的“衍生物”或“变体”包括这样的那些“衍生物”或“变体”，其中出现在序列中的氨基酸不是天然存在的氨基酸，而是它们的结构类似物。也可以衍生化或修饰（例如标记）在序列中使用的氨基酸，只要抗体的功能不会显著地受到不利影响即可。
置换可以是但不限于保守置换。
在抗体合成过程中，或通过生产后修饰，或当使用定位诱变、随机诱变或核酸的酶切割和/或连接的已知技术生产重组形式的抗体时，可以制备上述的衍生物和变体。
在另一个方面，本发明表征了多特异性的分子，其包含本发明的抗-TFPI抗体或其抗原片段。这样的多特异性的分子包括双特异性的分子，其包含至少一种对TFPI的第一结合特异性和对第二种靶表位的第二结合特异性。一类双特异性的分子是本领域已知的双特异性的抗体。双特异性的抗体或实际的多特异性的抗体可以制备成全长抗体或抗体片段 (例如F(ab')2 双特异性的抗体)或本文所述的任意其它抗原结合片段。
在一个方面，本发明表征了抗体衍生物 (或免疫缀合物)，诸如与第二种试剂缀合或共价结合的抗-TFPI抗体。使用本领域技术人员已知的众多可利用的方法中的任一种，可以将第二种试剂直接地或间接地连接到抗体上。例如，通过二硫键形成，使用诸如N-琥珀酰 S-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)等交联剂，或通过在抗体的Fc区中的碳水化合物部分，可以将试剂连接在还原的抗体组分的铰链区处。
在一个方面，可以将本发明的抗体工程化成包含在Fc区内的修饰，通常是为了改变抗体的一种或多种功能性质，诸如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、蛋白稳定性和/或抗原-依赖性的细胞的细胞毒性或其缺失。此外，可以化学地修饰本发明的抗体(例如，可以使一个或多个化学部分连接到抗体上)，或进行修改以改变它的糖基化，再次改变抗体的一种或多种功能性质。
如果需要，通过已知的技术，可以“转换”抗体的类别。例如，可以将最初生产成IgM分子的抗体类别转换成IgG抗体。类别转换技术也可以用于将一个IgG亚类转化成另一个，例如：从IgG1至IgG2或IgG4；从IgG2至IgG1或IgG4；或从IgG4至IgG1或IgG2。还可以通过组合来自不同IgG亚类的区域，工程化抗体，以制备恒定区嵌合分子。
在一个实施方案中，修饰CHI的铰链区，从而改变（例如，增加或减少）铰链区中的半胱氨酸残基的数目。该方案进一步描述在例如Bodmer 等人的美国专利号5,677,425中。
可以进一步修饰恒定区，以稳定化抗体，例如，减少二价抗体分离成2个单价VH-VL 片段的风险。例如，在lgG4 恒定区中，可以将残基S241突变成脯氨酸(P)残基，以允许在铰链处的完全二硫键形成(参见，例如，Angal 等人, Mol Immunol. 199S；30:105-8)。
根据本发明的变体抗体可以具有与SEQ ID NO: 4或8具有超过60%、或超过65%、或超过70%、或超过75%、或超过80%、优选地超过85%、诸如超过90%、诸如超过95%同一性的氨基酸序列或其片段。根据本发明的其它变体抗体可以具有与SEQ ID NO: 15或18具有超过60%、或超过65%、或超过70%、或超过75%、或超过80%、优选地超过85%、诸如超过90%、诸如超过95%同一性的氨基酸序列或其片段。可以在有关的SEQ ID NO序列的全长上或在该序列的一部分上（诸如20、30、40、50、60、70、75、80、90、100、150、200或更多个氨基酸，取决于全长多肽的大小），观察该氨基酸同一性水平。
与氨基酸序列相关，“序列同一性”表示，当使用具有下述参数的ClustalW (Thompson 等人, 1994, 同上)评估时，具有所述值的序列：
逐对比对参数-方法：准确的，矩阵：PAM，间隙开口罚分：10.00，间隙延伸罚分：0.10；
多重比对参数-矩阵：PAM，间隙开口罚分：10.00，延迟的%同一性：30，处罚末端间隙：开启，间隙分隔距离：0，负矩阵：无，间隙延伸罚分：0.20，残基特异性的间隙罚分：开启，亲水间隙罚分：开启，亲水残基：GPSNDQEKR。在特定残基处的序列同一性意在包括已经简单地衍生化的相同残基。
本发明因而提供了具有特定VH和VL氨基酸序列的抗体及其保留这些VH和VL结构域的功能或活性的变体和片段。
因此，本发明的抗体可以包含：
(a) SEQ ID NO: 4的轻链可变区氨基酸序列；
(b) 保留特异性地结合TFPI的能力的(a)的至少7个氨基酸的片段；或
(c) 与(a)的序列具有至少70%氨基酸序列同一性并保留特异性地结合TFPI的能力的(a)的变体。
本发明的抗体可以包含：
(a) SEQ ID NO: 8的重链可变区氨基酸序列；
(b) 保留特异性地结合TFPI的能力的(a)的至少7个氨基酸的片段；或
(c) 与(a)的序列具有至少70%氨基酸序列同一性并保留特异性地结合TFPI的能力的(a)的变体。
本发明的抗体可以包含SEQ ID NO: 4的轻链可变区和SEQ ID NO: 8的重链可变区。
本发明的抗体可以包含：
(a) SEQ ID NO: 4的轻链可变区和SEQ ID NO: 8的重链可变区；
(b) (a)的变体，其中重链和轻链序列之一或二者被修饰，使得它包含在(a)中指出的序列的至少7个氨基酸的片段；或
(c) (a)或(b)的变体，其中重链和轻链序列之一或二者被修饰，使得它与(a)或(b)的序列具有至少70%氨基酸序列同一性，
其中所述抗体保留特异性地结合TFPI的能力。所述抗体也可以保留本文所述的本发明抗体的一种或多种额外功能或活性，诸如抑制TFPI的能力或缩短凝固时间的能力，任选地不会导致血小板数目的下降。
SEQ ID NO: 4的优选片段和变体包含：(i) SEQ ID NO: 6的氨基酸24-39；和/或(ii) SEQ ID NO: 6的氨基酸55-61；和/或(iii) SEQ ID NO: 6的氨基酸94-102。SEQ ID NO: 8的优选片段和变体包含：(i) SEQ ID NO: 10的氨基酸31-35；和/或(ii) SEQ ID NO: 10的氨基酸50-66；和/或(iii) SEQ ID NO: 10的氨基酸99-110。
SEQ ID NO: 4的其它优选的变体包含SEQ ID NO: 6的氨基酸31-33、37和96-99。SEQ ID NO: 8的其它优选的变体包含SEQ ID NO: 10的氨基酸31、53、54、56、57、59、60、61、62、65、102、103和106。
本发明的抗体可以包含：
(a) SEQ ID NO: 15的轻链可变区氨基酸序列；
(b) 保留特异性地结合TFPI的能力的(a)的至少7个氨基酸的片段；或
(c) 与(a)的序列具有至少70%氨基酸序列同一性并保留特异性地结合TFPI的能力的(a)的变体。
本发明的抗体可以包含：
(a) SEQ ID NO: 18的重链可变区氨基酸序列；
(b) 保留特异性地结合TFPI的能力的(a)的至少7个氨基酸的片段；或
(c) 与(a)的序列具有至少70%氨基酸序列同一性并保留特异性地结合TFPI的能力的(a)的变体。
本发明的抗体可以包含SEQ ID NO: 15的轻链可变区和SEQ ID NO: 18的重链可变区。
本发明的抗体可以包含：
(a) SEQ ID NO: 15的轻链可变区和SEQ ID NO: 18的重链可变区；
(b) (a)的变体，其中重链和轻链序列之一或二者被修饰，使得它包含在(a)中指出的序列的至少7个氨基酸的片段；或
(c) (a)或(b) 的变体，其中重链和轻链序列之一或二者被修饰，使得它与(a)或(b)的序列具有至少70%氨基酸序列同一性；
其中所述抗体保留特异性地结合TFPI的能力。所述抗体也可以保留本文所述的本发明抗体的一种或多种额外功能或活性，诸如抑制TFPI的能力或缩短凝固时间的能力，任选地不会导致血小板数目的下降。
如上面解释的，本发明的抗体可以结合与本发明的另一种抗体结合的相同的表位或区域。因而可以看出，这样的抗体可以结合与本文所述的任一种具体抗体、片段和变体结合的相同的TFPI表位或区域。
本发明也涉及编码本发明抗体的多核苷酸。因而，本发明的多核苷酸可以编码本文所述的任一种抗体。术语“核酸分子”和“多核苷酸” 在本文中互换地使用，表示任意长度的核苷酸（脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物）的聚合形式。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA、任意序列的分离的RNA、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸可以以分离的或纯化的形式提供。
“编码”选择的多肽的核酸序列是这样的核酸分子，当置于适当调节序列的控制下时，其在体内被转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽。编码序列的边界由在5' (氨基)末端的起始密码子和在3' (羧基)末端的翻译终止密码子确定。为了本发明的目的，这样的核酸序列可以包括、但不限于：来自病毒、原核或真核 mRNA的cDNA，来自病毒或原核DNA或RNA的基因组序列，和甚至合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3'。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含编码上述VH或VL氨基酸序列的序列。例如，本发明的多核苷酸可以编码这样的多肽，其包含SEQ ID NO: 4或8的序列或上述的它们的变体或片段。这样的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 3、5、7和9中任一个的核酸序列，或由其组成。或者，合适的多核苷酸序列可以是这些具体多核苷酸序列之一的变体。例如，变体可以是任一上述核酸序列的置换、缺失或添加变体。变体多核苷酸可以包含来自在序列表中给出的序列的1、2、3、4、5、多达10、多达20、多达30、多达40、多达50、多达75或更多个核酸置换和/或缺失。
合适的变体可以与SEQ ID NO: 3、5、7和9中的任一个多核苷酸具有至少70%同源性。优选与其具有至少80或90%和更优选至少95%、97%或99%同源性。测量同源性的方法是本领域众所周知的，且本领域技术人员会理解：在本上下文中，以核酸同一性为基础来计算同源性。这样的同源性可能存在于至少15、优选至少30、例如至少40、60、100、200或更多个连续核苷酸的区域。这样的同源性可能存在于未修饰的多核苷酸序列的整个长度中。
测量多核苷酸同源性或同一性的方法是本领域已知的。例如UWGCG程序包提供了BESTFIT程序，它可用于计算同源性(例如以它的默认设置使用) (Devereux 等人 (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395)。
PILEUP和BLAST 算法也可以用于计算同源性或比对（line up）序列(一般以它们的默认设置)，例如描述在Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F 等人 (1990) J Mol Biol 215:403-10中。
用于执行BLAST 分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法包括首先识别高评分序列对(HSP)，这通过识别待查询序列中长度为W的短字段来实现，该字段在与数据库序列中相同长度的字段比对时，匹配或满足某种正值的阈评分T。T表示相邻字段评分阈(Altschul 等人, 同上)。这些最初的相邻字段命中（word hits）作为开始检索的种子，以查找含有它们的HSP。字段命中沿每个序列的两个方向延伸，使累积比对评分尽量增加。在以下情形时，停止字段命中在每个方向的延伸：由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积比对评分为零或小于零；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用默认值：字段长度(W)为11，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919)比对值(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4且两条链比较。
BLAST 算法执行两个序列之间的相似性的统计分析；参见例如，Karlin和Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787。由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小总和概率(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间随机出现匹配的概率的指标。例如，若一个序列和另一个序列相比较时最小总和概率小于约1、优选小于约0.1、更优选小于约0.01和最优选小于约0.001，则认为第一个序列与第二个序列类似。
同源物可与相关多核苷酸序列存在少于3、5、10、15、20或更多个突变(每一突变可以是置换、缺失或插入)的差异。这些突变可以在同源物的至少30、例如至少40、60或100或更多个连续核苷酸的区域中测量。
在一个实施方案中，由于遗传密码的冗余，变体序列可能不同于在序列表中给出的具体序列。DNA代码具有4种基本核酸残基(A、T、C和G)，并使用它们来“拼写”3字母密码子，所述密码子代表在生物体的基因中编码的蛋白的氨基酸。沿着DNA分子的密码子的线性序列被翻译成由那些基因编码的蛋白中的氨基酸的线性序列。所述代码是高度简并的，61种密码子编码20种天然氨基酸，且3种密码子代表“终止”信号。因而，大多数氨基酸由超过一种密码子编码——实际上，几种氨基酸由4种或更多种不同的密码子编码。本发明的变体多核苷酸因此可以编码与本发明的另一种多核苷酸编码的相同的多肽序列，但是可以具有不同的核酸序列（由于使用不同的密码子来编码相同的氨基酸）。
可以如下制备根据本发明的多核苷酸“片段”： 通过截短，例如通过从多核苷酸的一端或两端去除一个或多个核苷酸。以此方式，可以从多核苷酸的3’和/或5’末端去除多达10、多达20、多达30、多达40、多达50、多达75、多达100、多达200或更多个氨基酸。通过一个或多个内部缺失，也可以产生片段。这样的片段可以源自SEQ ID NO: 3、5、7和9的序列，或可以源自本文所述的变体多核苷酸。优选地，这样的片段的长度是30至300个残基，例如30-300、30-200、30-100、100-200或200-300残基。或者，本发明的片段可以是更长的序列，例如包含本发明的全长多核苷酸的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
本发明的抗体因而可以从多核苷酸生产或以多核苷酸的形式递送，所述多核苷酸编码且能表达它。在所述抗体包含2个或更多个链的情况下，本发明的多核苷酸可以编码一个或多个抗体链。例如，本发明的多核苷酸可以编码抗体轻链、抗体重链或二者。可以提供2种多核苷酸，其中之一编码抗体轻链，另一种编码对应的抗体重链。这样的多核苷酸或多核苷酸对可以一起表达，从而生产本发明的抗体。
根据本领域众所周知的方法，可以合成本发明的多核苷酸，所述方法例如描述在Sambrook 等人 (1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)中。
本发明的核酸分子可以以表达盒的形式提供，所述表达盒包括可操作地连接到插入的序列上的控制序列、信号肽序列，因而允许本发明的抗体在体内表达。这些表达盒又通常提供在载体(例如，质粒或重组病毒载体)内。这样的表达盒可直接施用给宿主受试者。或者，可以将包含本发明的多核苷酸的载体施用给宿主受试者。优选地，使用遗传载体，制备和/或施用多核苷酸。合适的载体可以是能够携带足够量的遗传信息并允许表达本发明多肽的任意载体。
本发明因而包括包含这样的多核苷酸序列的表达载体。在分子生物学领域中常规地构建这样的表达载体，且可以例如包括使用质粒DNA和适当的起始子、启动子、增强子、信号肽序列和其它元件，例如聚腺苷酸化信号（其可能是必要的，且以正确的方向放置，以允许表达本发明的肽）。其它合适的载体是本领域技术人员显而易见的。作为这方面的其它实例，参见Sambrook 等人。
本发明也包括已经修饰成表达本发明抗体的细胞。这样的细胞包括瞬时的或优选稳定的高等真核细胞系（诸如哺乳动物细胞或昆虫细胞）、低等真核细胞（诸如酵母）或原核细胞（诸如细菌细胞）。可以通过插入编码本发明抗体的载体或表达盒而修饰的细胞的特定实例包括哺乳动物HEK293、CHO、BHK、NSO和人视网膜细胞。优选地，选择的细胞系是这样的细胞系，其不仅是稳定的，而且允许多肽的成熟糖基化和细胞表面表达。
可以使用常规方法培养本发明的这种细胞系以生产本发明抗体，或可以治疗地或预防地用于给受试者递送本发明的抗体。或者，本发明的多核苷酸、表达盒或载体可以离体地施用给来自受试者的细胞，然后使细胞返回受试者体内。
在另一个方面，本发明提供了组合物和制剂，其包含本发明的分子，诸如本文所述的抗体、多核苷酸、载体和细胞。例如，本发明提供了药物组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的一种或多种本发明的分子，诸如一种或多种本发明的抗体。
本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任意和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适合肠胃外（例如静脉内、肌肉内或皮下）施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用途径，所述抗体可以用材料包衣，以保护抗体免于酸和可能使抗体失活或变性的其它自然条件的作用。
优选的药学上可接受的载体包括水性载体或稀释剂。可以用于本发明的药物组合物中的合适的水性载体的实例包括水、缓冲的水和盐水。其它载体的实例包括乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其合适的混合物、植物油（诸如橄榄油）和可注射的有机酯（诸如油酸乙酯）。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣材料（诸如卵磷脂），通过维持所需的粒度（在分散体的情况下），和通过使用表面活性剂。在许多情况下，优选地在组合物中包含等渗剂，例如，糖类、多元醇（诸如甘露醇、山梨醇）或氯化钠。
本发明的药物组合物也可以包括药学上可接受的抗氧化剂。这些组合物还可以含有佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以如下防止微生物的存在：通过如上的消毒程序，和通过包括不同的抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等。还希望在组合物中包括等渗剂，诸如糖类、氯化钠等。此外，通过包括延迟吸收的试剂（诸如单硬脂酸铝和明胶），可以造成可注射药物形式的延长吸收。
治疗组合物在生产和保存条件下通常必须是无菌的和稳定的。可以将组合物配制成溶液剂、微乳剂、脂质体或适合高药物浓度的其他有序结构。
可以如下制备无菌注射溶液：通过将活性剂(例如抗体)以所需的量在合适的溶剂中与上面列举的一种成分或成分的组合掺和（根据需要），接着微滤除菌。通常，如下制备分散体：通过将活性剂掺入无菌载体中，所述载体含有基础分散介质和所需的来自上面列举的那些的其它成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性剂加上来自其之前的无菌过滤溶液的任何额外的所需成分的粉末。
本发明的药物组合物可以包含额外的活性成分以及本发明的抗体。如上所述，本发明的组合物可以包含一种或多种本发明的抗体。它们还可以包含额外的治疗剂或预防剂。例如，在本发明的药物组合物预期用于治疗出血障碍的情况下，它可以额外地包含一种或多种预期会减轻出血障碍症状的药剂。例如，所述组合物可以包含一种或多种凝固因子。所述组合物可以包含一种或多种预期会改善患者状况的其它组分。例如，在所述组合物预期用于治疗遭受不希望的出血的患者（诸如正在接受手术的患者或遭受创伤的患者）的情况下，所述组合物可以包含一种或多种止痛剂、麻醉剂、免疫抑制剂或抗炎剂。包含本发明的抗体或其它组合物以及使用说明书的试剂盒，也落入本发明的范围内。这样的试剂盒可以另外含有一种或多种额外的药剂，诸如上面讨论的额外的治疗剂或预防剂。
本发明的抗体、其它分子和组合物具有许多体外和体内治疗效应，包括治疗和预防凝固相关障碍。例如，这些抗体和组合物可以在体外或离体地施用给培养的细胞，或施用给人受试者（例如，在体内），以预防或治疗多种障碍。
具体地，本发明提供了用于治疗出血障碍或用于促进血液凝固的方法，所述方法包括，给有此需要的患者施用有效量的本发明的抗体或其它分子或组合物。例如，这样的方法可以用于治疗凝固因子缺乏诸如A型血友病、B型血友病、因子XI缺乏、因子VII缺乏、血小板减少症或冯威里氏病。这样的方法可以用于治疗伴有凝固因子抑制剂存在的病症。这样的方法可以用于治疗过量出血。本发明的抗体和组合物可以用于在手术或抗凝治疗之前、过程中或之后或在创伤之后治疗患者。本文所述的抗体和组合物可以用于任一种这样的治疗中，或可以用于药物的生产中，所述药物用于任一种这样的治疗。
本发明的抗体和组合物可以施用用于预防性/防止性和/或治疗性处理。
在治疗性应用中，以足以治愈、减轻或部分地阻止病症或其一种或多种症状的量，将抗体或组合物施用给已经遭受上述障碍或病症的受试者。这样的治疗性处理可以导致疾病症状严重性的降低或无症状时期的频率或持续时间的增加。足以实现该目的的量被定义为“治疗有效量”。例如，在治疗是用于不希望的出血的情况下，可以将治疗定义为出血量的减少或完全停止出血的适当凝固。
在预防性或阻止性应用中，以足以预防或减轻病症或其一种或多种症状的后作用的量，将抗体或组合物施用给处于上述障碍或病症危险中的受试者。足以实现该目的的量被定义为“预防有效量”。例如，在治疗是防止不希望的出血的情况下，可以将预防效果定义为出血的防止，或与在没有调节剂存在下所看到的结果相比出血时间或量减少。
每种目的的有效量取决于疾病或损伤的严重性以及受试者的体重和一般状况。
本文使用的术语“受试者”包括任意的人或非人动物。术语非人动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物和爬行动物等。
使用本领域已知的多种方法中的一种或多种，通过一种或多种施用途径，可以施用本发明的抗体或组合物。如技术人员会理解的，施用途径和/或方式随所希望的结果而异。本发明抗体或组合物的优选施用途径包括静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。本文使用的短语“肠胃外施用”是指除了肠和局部施用以外的施用方式，通常通过注射。或者，通过非肠胃外途径（诸如局部、表皮或粘膜施用途径），可以施用本发明的抗体或组合物。
类似地，本发明的抗体可以用于生产适合肠胃外给药的药物。
本发明的抗体可以用于生产适合静脉内给药的药物。
本发明的抗体可以用于生产适合肌肉内给药的药物。
本发明的抗体可以用于生产适合皮下给药的药物。
本发明抗体的合适剂量可以由熟练的医学从业人员确定。本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变，从而得到有效地实现对于特定患者、组合物和施用方式而言所希望的治疗应答、而对该患者无毒性的活性成分的量。所选的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括：使用的特定抗体的活性，施用途径，施用时间，抗体的排泄速率，治疗持续时间，与所用的具体组分组合使用的其它药物、化合物和/或物质，被治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和以前的医疗史，和医学领域中公知的类似因素。
本发明抗体的合适剂量可以是例如对于要治疗的患者体重在从约0.1µg/kg至约100mg/kg的范围内。例如，合适的剂量可以是从约1µg/kg至约10mg/kg体重/天或从约1 mg/kg至约5 mg/kg体重/天。本发明抗体的合适剂量可以是在2-200 mg/kg的范围内，诸如约150-200 mg/kg、诸如约150-170 mg/kg、诸如约100-150 mg/kg、诸如约50-100 mg/kg、诸如约70-90 mg/kg、诸如约10-50 mg/kg、诸如约10-30 mg/kg。
其它合适的剂量可以是大约0.1-10 mg/kg、诸如大约0.1-1 mg/kg、诸如大约1-2 mg/kg、或大约2-3 mg/kg、或大约4-5 mg/kg、或大约5-6 mg/kg、或大约6-7 mg/kg、或大约7-8 mg/kg、或大约8-9 mg/kg、或大约9-10 mg/kg；或大约10-21 mg/kg、诸如大约10-11 mg/kg、或大约11-12 mg/kg、或大约12-13 mg/kg、或大约13-14 mg/kg、或大约14-15 mg/kg、或大约15-16 mg/kg、或大约16-17 mg/kg、或大约17-18 mg/kg、或大约18-19 mg/kg、或大约19-20 mg/kg或大约20-21 mg/kg。
施用给受试者的单克隆抗体的量可以使得，它的施用导致受试者血浆浓度为约10 μg/ml至约40 μg/ml、诸如约15-35 μg/ml、诸如约10-15 μg/ml、诸如约15-20 μg/ml、诸如约20-25 μg/ml、诸如约25-30 μg/ml、诸如约30-35 μg/ml、诸如约35-40 μg/ml所述单克隆抗体。可以调整给药方案，以提供最佳的目标应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单次大剂量（bolus），可以随时间施用几个分份剂量，或者可以根据治疗情况的紧迫性成比例地减小或增加剂量。特别有利的是，以剂量单位形式配制肠胃外组合物，以容易施用和剂量统一。本文使用的剂量单位形式表示适合作为待治疗受试者的单元剂量的物理上分散的单位；每个单位含有与所需的药学载体相组合的预定量的活性化合物，所述量经计算会产生希望的治疗效果。
可以在单次剂量中或在多次剂量中施用抗体。多次剂量可以通过相同或不同的途径施用，并施用到相同或不同的位置。或者，抗体可以作为持续释放制剂来施用，在该情况下，需要更低的施用频率。剂量和频率可以随抗体在患者中的半衰期和希望的治疗持续时间而异。施用的剂量和频率也可以随治疗是预防性的还是治疗性的而异。在预防性应用中，可以在长时间段内在相对低频的间隔施用相对较低的剂量。在治疗性应用中，可以施用相对较高的剂量，例如直到患者显示出疾病症状的部分或彻底改善。
因而，可以如下施用本发明的抗体：大约每天、大约隔天、大约每3天、大约每4天、大约每5天、大约每6天；大约每周、诸如每5、6、7、8、9或10天；大约隔周、诸如每11、12、13、14、15、16或17天；大约每3周、诸如每18、19、20、21、22、23或24天；大约每4周、诸如每25、26、27、28、29、30或31天。也可以根据需要施用本发明的抗体。
如上所述，本发明的抗体可以与一种或多种其它治疗剂共同施用。其它药剂可以是增强调节剂的作用的药剂。其它药剂可以是起增强血液凝固作用的药剂，诸如凝血因子。具体地，本发明的调节剂可以与因子VII(a)或FVIII(a)共同施用。其它药剂可以意图治疗患者的其它症状或病症。例如，其它药剂可以是止痛剂、麻醉剂、免疫抑制剂或抗炎剂。
可以以许多不同的方式实现2种或更多种药剂的联合施用。在一个实施方案中，所述抗体和其它药剂可以在单一组合物中一起施用。在另一个实施方案中，所述抗体和其它药剂可以在分开的组合物中施用，作为联合治疗的一部分。例如，所述调节剂可以在其它药剂之前、之后或同时施用。
本文使用的术语“治疗”表示有此需要的任意人或其它动物受试者的医学治疗。所述受试者预期已经经历过医学从业人员或兽医学从业人员的体检，所述从业人员已经给出假定的或确定的诊断，该诊断指示所述特定治疗的应用有益于所述人或其它动物受试者的健康。所述治疗的时机和目的可以随个体不同而异，取决于受试者健康的现状。因而，所述治疗可以是预防性的、治标的（palliative）、针对症状的（symptomatic）和/或治愈的（curative）。以本发明的观点，预防性的、治标的、针对症状的和/或治愈的治疗可以代表本发明的单独的方面。
因而，本发明的抗体可以肠胃外地施用。
本发明的抗体可以静脉内地施用。
本发明的抗体可以肌肉内地施用。
本发明的抗体可以皮下地施用。
本发明的抗体可以预防性地施用。
本发明的抗体可以治疗性地施用(根据需要)。
本发明的抗体可以能够显著减少失血。
本发明的抗体可以能够显著减少出血时间。
因而，本发明也是用能结合TFPI的K2结构域的单克隆抗体治疗有此需要的受试者的方法，其中施用的单克隆抗体的量会诸如饱和它的靶物。施用的单克隆抗体的量可以诸如饱和可溶的TFPI。施用的单克隆抗体的量可以诸如饱和内皮-结合的TFPI。
本文使用的术语“凝血病”表示增加的出血趋势，其成因可以是正常凝固级联的任意促凝固组分的任意定性或定量缺乏或纤维蛋白溶解的任意向上调节。这样的凝血病可以是先天性的和/或获得性的和/或医源性的，且由本领域技术人员鉴别。
先天性低凝血病（hypocoagulopathies）的非限制性实例是A型血友病、B型血友病、因子VII缺乏、因子XI缺乏、冯威里氏病和血小板减少症诸如格兰茨曼氏血小板无力症和Bernard-Soulier综合征。
获得性凝血病的一个非限制性实例是由维生素K缺乏造成的丝氨酸蛋白酶缺乏；这样的维生素K-缺乏的成因可以是施用维生素K拮抗剂诸如华法林。获得性的凝血病也可能发生在大创伤以后。在另外称作“血液的恶性循环”的这个情况下，其特征在于血稀释(稀释性血小板减少症和凝固因子的稀释)、体温过低、凝固因子的消耗和代谢紊乱(酸中毒)。输液疗法和增加的纤维蛋白溶解可能恶化该情形。所述出血可以来自身体的任意部分。
具有“抑制剂” (也就是说，针对因子VIII的同种异体抗体)的A型血友病和具有“抑制剂” (也就是说，针对因子IX的同种异体抗体)的B型血友病是部分先天性和部分获得性的凝血病的非限制性实例。
医源性凝血病的一个非限制性实例是可能开处方用于治疗血栓栓塞性疾病的抗凝血药（诸如肝素、阿司匹林、华法林和其它血小板聚集抑制剂）的超剂量。医源性凝血病的第二个非限制性实例是由过度的和/或不适当的输液疗法诱发的凝血病，诸如由输血诱发的凝血病。
在本发明的一个实施方案中，出血与A型或B型血友病有关。在另一个实施方案中，出血与具有获得性抑制剂的A型或B型血友病有关。在另一个实施方案中，出血与血小板减少症有关。在另一个实施方案中，出血与冯威里氏病有关。在另一个实施方案中，出血与严重组织损伤有关。在另一个实施方案中，出血与严重创伤有关。在另一个实施方案中，出血与手术有关。在另一个实施方案中，出血与出血性胃炎和/或肠炎有关。在另一个实施方案中，出血是血崩，诸如在胎盘早剥中。在另一个实施方案中，出血发生在具有有限的机械性止血可能性的器官中，诸如颅内地、耳内地或眼内地。在另一个实施方案中，出血与抗凝治疗有关。
本发明的抗体可以用于治疗具有凝血病的受试者。因而，本发明也是能结合TFPI的K2结构域的单克隆抗体用于治疗有此需要的受试者的应用；以及所述抗体用于生产药物的应用，所述药物用于治疗有此需要的受试者。此外，本发明是使用能结合TFPI的K2结构域的单克隆抗体治疗有此需要的受试者的方法。
所述本发明的单克隆抗体的用途可以显著减少失血。
所述本发明的单克隆抗体的用途可以显著减少出血时间。
此外，所述本发明的单克隆抗体的用途可以减少体内凝固时间，而不造成暂时性血小板减少症。
实施方案
下面是本发明的实施方案的非限制性列表：
实施方案1: 一种能够特异性地结合TFPI的K2结构域的单克隆抗体，其中所述抗体能够结合包含一个或多个选自下述的残基的表位：SEQ ID NO: 2的E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、F35、K36和L50。
实施方案2: 根据实施方案1所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合表位，包括包含SEQ ID NO: 2的残基E10的表位。
实施方案3: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合表位，包括包含SEQ ID NO: 2的残基E11的表位。
实施方案4: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基D12的表位。
实施方案5: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基P13的表位。
实施方案6: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基R17的表位。
实施方案7: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基Y19的表位。
实施方案8: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基T21的表位。
实施方案9: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基Y23的表位。
实施方案10: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基F24的表位。
实施方案11: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基N26的表位。
实施方案12: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基Q28的表位。
实施方案13: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基Q31的表位。
实施方案14: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基C32的表位。
实施方案15: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基E33的表位。
实施方案16: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基R34的表位。
实施方案17: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基F35的表位。
实施方案18: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基K36的表位。
实施方案19: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基L50的表位。
实施方案20: 根据实施方案1-16和18-19中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、K36和L50的表位。
实施方案21: 根据实施方案1-3、5-9、12-13和15-19中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基E10、E11、P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36和L50的表位。
实施方案22: 一种能够结合TFPI的K2结构域的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链包含氨基酸残基：
• E，其在与SEQ ID NO：15的位置31相对应的位置，
• S，其在与SEQ ID NO：15的位置32相对应的位置，
• D，其在与SEQ ID NO：15的位置33相对应的位置，
• Y，其在与SEQ ID NO：15的位置37相对应的位置，
• A，其在与SEQ ID NO：15的位置96相对应的位置，
• T，其在与SEQ ID NO：15的位置97相对应的位置，和
• F，其在与SEQ ID NO：15的位置99相对应的位置；
且其中所述抗体的重链包含氨基酸残基：
• N，其在与SEQ ID NO: 18的位置31相对应的位置，
• R，其在与SEQ ID NO: 18的位置53相对应的位置，
• S，其在与SEQ ID NO: 18的位置54相对应的位置，
• Y，其在与SEQ ID NO: 18的位置57相对应的位置，
• Y，其在与SEQ ID NO: 18的位置59相对应的位置，
• F，其在与SEQ ID NO: 18的位置60相对应的位置，
• P，其在与SEQ ID NO: 18的位置61相对应的位置，
• D，其在与SEQ ID NO: 18的位置62相对应的位置，
• Q，其在与SEQ ID NO: 18的位置65相对应的位置，
• Y，其在与SEQ ID NO: 18的位置102相对应的位置，
• D，其在与SEQ ID NO: 18的位置103相对应的位置，和
• D，其在与SEQ ID NO: 18的位置106相对应的位置。
实施方案23: 根据权利要求1-21中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链包含氨基酸残基：
• E，其在与SEQ ID NO: 15的位置31相对应的位置，
• S，其在与SEQ ID NO: 15的位置32相对应的位置，
• D，其在与SEQ ID NO: 15的位置33相对应的位置，
• Y，其在与SEQ ID NO: 15的位置37相对应的位置，
• A，其在与SEQ ID NO: 15的位置96相对应的位置，
• T，其在与SEQ ID NO: 15的位置97相对应的位置，和
• F，其在与SEQ ID NO: 15的位置99相对应的位置；
且其中所述抗体的重链包含氨基酸残基：
• N，其在与SEQ ID NO: 18的位置31相对应的位置，
• R，其在与SEQ ID NO: 18的位置53相对应的位置，
• S，其在与SEQ ID NO: 18的位置54相对应的位置，
• Y，其在与SEQ ID NO: 18的位置57相对应的位置，
• Y，其在与SEQ ID NO: 18的位置59相对应的位置，
• F，其在与SEQ ID NO: 18的位置60相对应的位置，
• P，其在与SEQ ID NO: 18的位置61相对应的位置，
• D，其在与SEQ ID NO: 18的位置62相对应的位置，
• Q，其在与SEQ ID NO: 18的位置65相对应的位置，
• Y，其在与SEQ ID NO: 18的位置102相对应的位置，
• D，其在与SEQ ID NO: 18的位置103相对应的位置，和
• D，其在与SEQ ID NO: 18的位置106相对应的位置。
实施方案24: 根据实施方案22或实施方案23所述的单克隆抗体，其中所述重链另外包含S，其在与SEQ ID NO: 18的位置52相对应的位置。
实施方案25: 根据实施方案22-23中任一个所述的单克隆抗体，其中所述轻链另外包含在与SEQ ID NO: 15的位置98相对应的位置的H，且所述重链另外包含在与SEQ ID NO: 18的位置56相对应的位置的S。
实施方案26: 一种能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域的单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸31-35 (NYAMS)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换。
实施方案27: 根据权利要求1-21中任一项所述的单克隆抗体，其能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸31-35 (NYAMS)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换。
实施方案28: 一种能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域的单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO: 18的氨基酸50-66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。
实施方案29: 根据权利要求1-21中任一项所述的单克隆抗体，其能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO: 18的氨基酸50-66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。
实施方案30: 一种能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域的单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO: 18的氨基酸99-110 (LGGYDEGDAMDS)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。
实施方案31: 根据权利要求1-21中任一项所述的单克隆抗体，其能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO: 18的氨基酸99-110 (LGGYDEGDAMDS)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。
实施方案32: 一种能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 15的氨基酸24-39 (KSSQSLLESDGKTYLN)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。
实施方案33: 根据权利要求1-21中任一项所述的单克隆抗体，其能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 15的氨基酸24-39 (KSSQSLLESDGKTYLN)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。
实施方案34: 一种能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 15的氨基酸55-61 (LVSILDS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。
实施方案35: 根据权利要求1-21中任一项所述的单克隆抗体，其能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 15的氨基酸55-61 (LVSILDS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。
实施方案36: 一种能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 15的氨基酸94-102 (LQATHFPQT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。
实施方案37: 根据权利要求1-21中任一项所述的单克隆抗体，其能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 15的氨基酸94-102 (LQATHFPQT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。
实施方案38: 一种能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域的单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含：
• SEQ ID NO:18的氨基酸31-35 (NYAMS)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO:18的氨基酸50-66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO:18的氨基酸99-110 (LGGYDEGDAMDS)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。
实施方案39: 根据权利要求1-21中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含：
• SEQ ID NO:18的氨基酸31-35 (NYAMS)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO:18的氨基酸50-66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO:18的氨基酸99-110 (LGGYDEGDAMDS)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。
实施方案40: 一种能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链包含：
• SEQ ID NO: 15的氨基酸24-39 (KSSQSLLESDGKTYLN)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO: 15的氨基酸55-61 (LVSILDS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO: 15的氨基酸94-102 (LQATHFPQT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。
实施方案41: 根据权利要求1-21中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链包含：
• SEQ ID NO: 15的氨基酸24-39 (KSSQSLLESDGKTYLN)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO: 15的氨基酸55-61 (LVSILDS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO: 15的氨基酸94-102 (LQATHFPQT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。
实施方案42: 一种能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域的单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含：
• SEQ ID NO:18的氨基酸31-35 (NYAMS)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO:18的氨基酸50-66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO:18的氨基酸99-110 (LGGYDEGDAMDS)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；
且其中所述抗体的轻链包含：
• SEQ ID NO: 15的氨基酸24-39 (KSSQSLLESDGKTYLN)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO: 15的氨基酸55-61 (LVSILDS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO: 15的氨基酸94-102 (LQATHFPQT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。
实施方案43: 根据权利要求1-21中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含：
• SEQ ID NO:18的氨基酸31-35 (NYAMS)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO:18的氨基酸50-66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO:18的氨基酸99-110 (LGGYDEGDAMDS)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；
且其中所述抗体的轻链包含：
• SEQ ID NO: 15的氨基酸24-39 (KSSQSLLESDGKTYLN)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO: 15的氨基酸55-61 (LVSILDS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO: 15的氨基酸94-102 (LQATHFPQT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。
实施方案44: 根据实施方案26-43中任一个所述的单克隆抗体，其中所述氨基酸置换不包含氨基酸:
• N，其在与SEQ ID NO: 18的CDR1区的位置31相对应的位置；
• R，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置53相对应的位置；
• S，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置54相对应的位置；
• S，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置56相对应的位置；
• Y，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置57相对应的位置；
• Y，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置59相对应的位置；
• F，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置60相对应的位置；
• P，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置61相对应的位置；
• D，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置62相对应的位置；和
• Q，其在与SEQ ID NO：18的CDR2区的位置65相对应的位置;
• Y，其在与SEQ ID NO：18的CDR3区的位置102相对应的位置；
• D，其在与SEQ ID NO：18的CDR3区的位置103相对应的位置；和
• D，其在与SEQ ID NO：18的CDR3区的位置106相对应的位置；
• E，其在与SEQ ID NO：15的CDR1区的位置31相对应的位置；
• S，其在与SEQ ID NO：15的CDR1区的位置32相对应的位置；
• D，其在与SEQ ID NO：15的CDR1区的位置33相对应的位置；和
• Y，其在与SEQ ID NO：15的CDR1区的位置37相对应的位置；
• A，其在与SEQ ID NO：15的 CDR3区的位置96相对应的位置；
• T，其在与SEQ ID NO：15的 CDR3区的位置97相对应的位置；
• H，其在与SEQ ID NO：15的 CDR3区的位置98相对应的位置；和
• F，其在与SEQ ID NO：15的 CDR3区的位置99相对应的位置；
实施方案45: 根据实施方案26-44中任一个所述的单克隆抗体，其中所述氨基酸置换是保守置换。
实施方案46: 根据实施方案26-45中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含：
• CDR1序列，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸31-35 (NYAMS)；和
• CDR2序列，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸50-66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)；和
• CDR3序列，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸99-110 (LGGYDEGDAMDS)。
实施方案47: 根据实施方案26-46中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链包含：
• CDR1序列，其包含SEQ ID NO: 15的氨基酸24-39 (KSSQSLLESDGKTYLN)；和
• CDR2序列，其包含SEQ ID NO: 15的氨基酸55-61 (LVSILDS)；和
• CDR3序列，其包含SEQ ID NO: 15的氨基酸94-102 (LQATHFPQT)。
实施方案48: 根据实施方案46-47中任一个所述的单克隆抗体，其中所述重链包含：
• CDR1序列，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸31-35 (NYAMS)；和
• CDR2序列，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸50-66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)；和
• CDR3序列，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸99-110 (LGGYDEGDAMDS)；
且其中所述轻链包含：
• CDR1序列，其包含SEQ ID NO: 15的氨基酸24-39 (KSSQSLLESDGKTYLN)；和
• CDR2序列，其包含SEQ ID NO: 15的氨基酸55-61 (LVSILDS)；和
• CDR3序列，其包含SEQ ID NO: 15的氨基酸94-102 (LQATHFPQT)。
实施方案49: 根据前述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 15。
实施方案50: 根据前述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO: 18。
实施方案51: 根据前述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 18。
实施方案52: 根据前述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO: 21的轻链。
实施方案53: 根据前述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO: 24的重链。
实施方案54: 根据实施方案52-53中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 24。
实施方案55: 根据前述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，它是人源化的抗体。
实施方案56: 根据实施方案55所述的单克隆抗体，其中所述重链的框架区2包含氨基酸：
• T，其在与SEQ ID NO: 18的位置40相对应的位置，
• E，其在与SEQ ID NO: 18的位置42相对应的位置，
• R，其在与SEQ ID NO: 18的位置44相对应的位置，和
• A，其在与SEQ ID NO: 18的位置49相对应的位置。
实施方案57: 根据实施方案55所述的单克隆抗体，其中所述重链的框架区2包含与SEQ ID NO: 18的位置36-49 (WVRQTPEKRLEWVA)相对应的氨基酸。
实施方案58: 根据实施方案1-54中任一个所述的单克隆抗体，它是人抗体。
实施方案59: 根据实施方案1-54中任一个所述的单克隆抗体，它是嵌合抗体。
实施方案60: 根据前述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体的同种型是IgG。
实施方案61: 根据实施方案60所述的单克隆抗体，其中所述同种型是IgG1、IgG2或IgG4。
实施方案62: 根据实施方案61所述的单克隆抗体，其中所述抗体的同种型是IgG4。
实施方案63: 根据实施方案60-62中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体的Fc区的至少一个氨基酸已经被另一个氨基酸置换。
实施方案64: 根据前述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体的Fc区与SEQ ID NO: 24的氨基酸122-448具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如95-100%同一性。
实施方案65: 一种单克隆抗体，其能够以比mAb0281更高的亲和力结合TFPI的K2结构域。
实施方案66: 根据实施方案1-64中任一个所述的单克隆抗体，其能够以比mAb0281更高的亲和力结合TFPI的K2结构域。
实施方案67: 一种单克隆抗体，其能够以比mAb4904更高的亲和力结合TFPI的K2结构域。
实施方案68: 根据实施方案1-66中任一个所述的单克隆抗体，其能够以比mAb4904更高的亲和力结合TFPI的K2结构域。
实施方案69: 一种单克隆抗体，其能够以比mAb2974更高的亲和力结合TFPI的K2结构域。
实施方案70: 根据实施方案1-68中任一个所述的单克隆抗体，其能够以比mAb2974更高的亲和力结合TFPI的K2结构域。
实施方案71: 一种单克隆抗体，其能够以比mAb29741更高的亲和力结合TFPI的K2结构域。
实施方案72: 根据实施方案1-70中任一个所述的单克隆抗体，其能够以比mAb29741更高的亲和力结合TFPI的K2结构域。
实施方案73: 一种能够结合TFPI的K2结构域的单克隆抗体，其中所述抗体的KD小于0.8 nM、诸如小于0.7 nM、诸如小于0.6 nM、诸如小于0.5 nM、诸如小于0.4 nM、诸如小于0.3 nM、诸如小于0.2 nM、诸如小于0.1 nM、诸如小于0.05 nM、诸如小于0.025 nM。
实施方案74: 根据实施方案1-73中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体的KD小于0.8 nM、诸如小于0.7 nM、诸如小于0.6 nM、诸如小于0.5 nM、诸如小于0.4 nM、诸如小于0.3 nM、诸如小于0.2 nM、诸如小于0.1 nM、诸如小于0.05 nM、诸如小于0.025 nM。
实施方案75: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其能够结合血小板-相关的TFPI的K2结构域。
实施方案76: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其能够抑制可溶的TFPI。
实施方案77: 根据实施方案76所述的单克隆抗体，其中所述可溶的TFPI可以被完全抑制。
实施方案78: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其能够抑制脂蛋白-结合的TFPI。
实施方案79: 根据上述实施方案中任一个所述的单克隆抗体，其能够抑制内皮细胞-结合的TFPI。
实施方案80: 一种单克隆抗体，其能够结合TFPI的K2结构域，使得FXa保留它的活性至少91%、诸如至少92%、诸如至少93%、诸如至少94%、诸如至少95%、诸如至少96%、诸如至少97%、诸如至少98%、诸如至少99%、诸如99-100%，如在FXa抑制试验中所测得的。
实施方案81: 根据实施方案1-79中任一个所述的单克隆抗体，其能够结合TFPI，使得FXa保留它的活性至少91%、诸如至少92%、诸如至少93%、诸如至少94%、诸如至少95%、诸如至少96%、诸如至少97%、诸如至少98%、诸如至少99%、诸如99-100%，如在FXa抑制试验中所测得的。
实施方案82: 一种单克隆抗体，其能够结合TFPI的K2结构域，使得受试者中的游离TFPI的百分比降低至小于30%、诸如小于29%、诸如小于28%、诸如小于27%、诸如小于26%、诸如小于25%、诸如小于24%、诸如小于23%、诸如小于22%、诸如小于21%、诸如小于20%、诸如小于19%、诸如小于18%、诸如小于17%、诸如小于16%、诸如小于15%、诸如小于14%、诸如小于13%、诸如小于12%、诸如小于11%、诸如小于10%、诸如小于9%、诸如小于8%、诸如小于7%、诸如小于6%、诸如小于5%、诸如小于4%、诸如小于3%、诸如小于2%、诸如小于1%、诸如1%至0%之间。
实施方案83: 根据权利要求1-81中任一项所述的单克隆抗体，其能够结合TFPI的K2结构域，使得受试者中的游离TFPI的百分比降低至小于30%、诸如小于29%、诸如小于28%、诸如小于27%、诸如小于26%、诸如小于25%、诸如小于24%、诸如小于23%、诸如小于22%、诸如小于21%、诸如小于20%、诸如小于19%、诸如小于18%、诸如小于17%、诸如小于16%、诸如小于15%、诸如小于14%、诸如小于13%、诸如小于12%、诸如小于11%、诸如小于10%、诸如小于9%、诸如小于8%、诸如小于7%、诸如小于6%、诸如小于5%、诸如小于4%、诸如小于3%、诸如小于2%、诸如小于1%、诸如1%至0%之间。
实施方案84: 根据实施方案83所述的单克隆抗体，其中受试者中的游离TFPI的量在将所述单克隆抗体施用给所述个体以后的前28天中、诸如在前27天中、诸如在前26天中、诸如在前25天中、诸如在前24天中、诸如在前23天中、诸如在前22天中、诸如在前21天中、诸如在前20天中、诸如在前19天中、诸如在前18天中、诸如在前17天中、诸如在前16天中、诸如在前15天中、诸如在前14天中、诸如在前13天中、诸如在前12天中、诸如在前11天中、诸如在前10天中、诸如在前9天中、诸如在前8天中、诸如在前7天中、诸如在前6天中、诸如在前5天中、诸如在前4天中、诸如在前3天中、诸如在前2天中、诸如在前1天中降低至所述百分比。
实施方案85: 一种单克隆抗体，其能够结合TFPI的K2结构域，且当TFPI被所述抗体饱和时，能够将膜-结合的FVIIa/TF/FXa的TFPI抑制中和至少55%、诸如至少60%、诸如至少65%、诸如至少70%、诸如至少75%、诸如至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如多达100%、诸如100%，如在FVIIa/TF/FXa抑制剂试验中测得。
实施方案86: 根据实施方案1-84中任一个所述的单克隆抗体，其中当TFPI被所述抗体饱和时，所述抗体能够将膜-结合的FVIIa/TF/FXa的TFPI抑制中和至少55%、诸如至少60%、诸如至少65%、诸如至少70%、诸如至少75%、诸如至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如多达100%、诸如100%，如在FVIIa/TF/FXa抑制剂试验中测得。
实施方案87: 一种单克隆抗体，其能够结合TFPI的K2结构域，且减少体内凝固时间，而不显著减少血小板数。
实施方案88: 根据实施方案1-86中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体会减少体内凝固时间，而不显著减少血小板数。
实施方案89: 根据实施方案88所述的单克隆抗体，其中所述血小板数没有下降至起始血小板数的大约80%、诸如大约75%、诸如大约70%、诸如大约65%、诸如大约60%、诸如大约55%、诸如大约50%、诸如大约45%、诸如大约40%、诸如大约35%、诸如大约30%、诸如大约25%。
实施方案90: 一种单克隆抗体，其能够结合TFPI的K2结构域，并减少体内凝固时间，而不造成暂时性血小板减少症。
实施方案91: 根据实施方案1-89中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体会减少体内凝固时间，而不造成暂时性血小板减少症。
实施方案92: 根据前述实施方案中任一个所述的单克隆抗体的片段。
实施方案93: 根据实施方案92所述的片段，它是Fab片段、F(ab')2片段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段或dAb片段。
实施方案94: 根据实施方案中任一个所述的单克隆抗体的变体，它是缺失变体或插入变体。
实施方案95: 一种药物制剂，其包含根据实施方案1-94中任一个所述的单克隆抗体。
实施方案96: 一种药物制剂，其包含根据实施方案1-94中任一个所述的单克隆抗体，其中所述制剂适合肠胃外使用。
实施方案97: 一种药物制剂，其包含根据实施方案1-94中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体适合静脉内使用。
实施方案98: 一种药物制剂，其包含根据实施方案1-94中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体适合肌肉内使用。
实施方案99: 一种药物制剂，其包含根据实施方案1-94中任一个所述的单克隆抗体，其中所述抗体适合皮下使用。
实施方案100: 根据实施方案1-94中任一个所述的单克隆抗体用于生产药物的用途，所述药物适合肠胃外给药。
实施方案101: 根据实施方案1-94中任一个所述的单克隆抗体用于生产药物的用途，所述药物适合静脉内给药。
实施方案102: 根据实施方案1-94中任一个所述的单克隆抗体用于生产药物的用途，所述药物适合肌肉内给药。
实施方案103: 根据实施方案1-94中任一个所述的单克隆抗体用于生产药物的用途，所述药物适合皮下给药。
实施方案104: 根据实施方案1-94中任一个所述的单克隆抗体用于治疗具有凝血病的受试者的用途。
实施方案105: 根据实施方案104所述的用途，其中所述受试者具有任意的先天性的、获得性的和/或医源性的凝血病，诸如可以选自：具有或没有抑制剂的A型血友病，和具有或没有抑制剂的B型血友病。
实施方案106: 根据实施方案95-105中任一个所述的用途，其中所述单克隆抗体显著减少失血。
实施方案107: 根据实施方案95-106中任一个所述的用途，其中所述单克隆抗体显著减少出血时间。
实施方案108: 根据实施方案95-107中任一个所述的用途，其中施用的单克隆抗体的量导致血浆浓度为约10 μg/ml至约40 μg/ml、诸如约15-35 μg/ml、诸如约10-15 μg/ml、诸如约15-20 μg/ml、诸如约20-25 μg/ml、诸如约25-30 μg/ml、诸如约30-35 μg/ml、诸如约35-40 μg/ml所述单克隆抗体。
实施方案109: 一种治疗具有凝血病的受试者的方法，所述方法包括，给所述受试者施用根据实施方案1-94中任一个所述的单克隆抗体。
实施方案110: 根据实施方案109所述的方法，其中所述凝血病是任意的先天性的、获得性的和/或医源性的凝血病，诸如可以选自：具有或没有抑制剂的A型血友病，和具有或没有抑制剂的B型血友病。
实施方案111: 根据实施方案109-110中任一个所述的方法，其中所述单克隆抗体能够显著减少失血。
实施方案112: 根据实施方案109-111中任一个所述的方法，其中所述单克隆抗体能够显著减少出血时间。
实施方案113: 根据实施方案109-112中任一个所述的方法，其中施用的单克隆抗体的量会例如饱和它的靶物。
实施方案114: 根据实施方案109-113中任一个所述的方法，其中施用的单克隆抗体的量会例如饱和可溶的TFPI。
实施方案115: 根据实施方案109-114中任一个所述的方法，其中施用的抗体能够完全抑制可溶的TFPI。
实施方案116: 根据实施方案109-115中任一个所述的方法，其中以足以饱和内皮-结合的TFPI的量施用所述单克隆抗体。
实施方案117: 根据实施方案109-116中任一个所述的方法，其中施用的单克隆抗体的量导致血浆浓度为约10 μg/ml至约40 μg/ml、诸如约15-35 μg/ml、诸如约10-15 μg/ml、诸如约15-20 μg/ml、诸如约20-25 μg/ml、诸如约25-30 μg/ml、诸如约30-35 μg/ml、诸如约35-40 μg/ml所述单克隆抗体。
实施方案118: 根据实施方案109-117中任一个所述的方法，其中可以施用单次剂量。
实施方案119: 根据实施方案109-118中任一个所述的方法，其中可以施用多次剂量。
实施方案120: 根据实施方案109-119中任一个所述的方法，其中可以每天施用所述抗体。
实施方案121: 根据实施方案109-120中任一个所述的方法，其中可以隔日施用所述抗体。
实施方案122: 根据实施方案109-121中任一个所述的方法，其中可以每3天施用所述抗体。
实施方案123: 根据实施方案109-122中任一个所述的方法，其中可以每4天施用所述抗体。
实施方案124: 根据实施方案109-123中任一个所述的方法，其中可以每5天施用所述抗体。
实施方案125: 根据实施方案109-124中任一个所述的方法，其中可以每6天施用所述抗体。
实施方案126: 根据实施方案109-125中任一个所述的方法，其中可以大约每周施用所述单克隆抗体，诸如每5、6、7、8、9或10天。
实施方案127: 根据实施方案109-126中任一个所述的方法，其中可以大约隔周施用所述单克隆抗体，诸如每11、12、13、14、15、16或17天。
实施方案128: 根据实施方案109-127中任一个所述的方法，其中可以大约每3周施用所述单克隆抗体，诸如每18、19、20、21、22、23或24天。
实施方案129: 根据实施方案109-128中任一个所述的方法，其中可以大约每4周施用所述单克隆抗体，诸如每25、26、27、28、29、30或31天。
实施方案130: 根据实施方案109-129中任一个所述的方法，其中所述剂量可以是大约0.1-10 mg/kg、诸如大约0.1-1 mg/kg、诸如大约1-2 mg/kg、或大约2-3 mg/kg、或大约4-5 mg/kg、或大约5-6 mg/kg、或大约6-7 mg/kg、或大约7-8 mg/kg、或大约8-9 mg/kg、或大约9-10 mg/kg；或大约10-21 mg/kg、诸如大约10-11 mg/kg、或大约11-12 mg/kg、或大约12-13 mg/kg、或大约13-14 mg/kg、或大约14-15 mg/kg、或大约15-16 mg/kg、或大约16-17 mg/kg、或大约17-18 mg/kg、或大约18-19 mg/kg、或大约19-20 mg/kg、或大约20-21 mg/kg。
实施方案131: 根据实施方案109-130中任一个所述的方法，其中所述剂量可以是大约2-200 mg/kg、诸如约150-200 mg/kg、诸如约150-170 mg/kg、诸如约100-150 mg/kg、诸如约50-100 mg/kg、诸如约70-90 mg/kg、诸如约10-50 mg/kg、诸如约10-30 mg/kg。
实施方案132: 根据实施方案109-131中任一个所述的方法，其中可以肠胃外地施用所述单克隆抗体。
实施方案133: 根据实施方案132所述的方法，其中可以静脉内地施用所述单克隆抗体。
实施方案134: 根据实施方案133所述的方法，其中所述单克隆抗体的剂量可以是大约10-20 mg/kg。
实施方案135: 根据实施方案133-134中任一个所述的方法，其中可以隔周施用所述单克隆抗体。
实施方案136: 根据实施方案133-135中任一个所述的方法，其中可以每3周施用所述单克隆抗体。
实施方案137: 根据实施方案133-136中任一个所述的方法，其中可以每4周施用所述单克隆抗体。
实施方案138: 根据实施方案133所述的方法，其中所述单克隆抗体的剂量可以是大约10-20 mg/kg，且可以隔周施用所述单克隆抗体。
实施方案139: 根据实施方案133所述的方法，其中所述单克隆抗体的剂量可以是大约10-20 mg/kg，且可以每3周施用所述单克隆抗体。
实施方案140: 根据实施方案133所述的方法，其中所述单克隆抗体的剂量可以是大约10-20 mg/kg，且可以每4周施用所述单克隆抗体。
实施方案141: 根据实施方案132所述的方法，其中可以肌肉内地施用所述单克隆抗体。
实施方案142: 根据实施方案132所述的方法，其中可以皮下地施用所述单克隆抗体。
实施方案143: 根据实施方案132所述的方法，其中所述单克隆抗体的剂量可以是大约1 mg/kg。
实施方案144: 根据实施方案141-143中任一个所述的方法，其中可以每天施用所述单克隆抗体。
实施方案145: 根据实施方案141-144中任一个所述的方法，其中可以隔日施用所述单克隆抗体。
实施方案146: 根据实施方案141-145中任一个所述的方法，其中所述单克隆抗体的剂量可以是大约1 mg/kg，且其中可以每天施用所述单克隆抗体。
实施方案147: 根据实施方案141-146中任一个所述的方法，其中所述单克隆抗体的剂量可以是大约1 mg/kg，且其中可以隔日施用所述单克隆抗体。
实施方案148: 根据实施方案109-147中任一个所述的方法，其中可以预防性地施用所述抗体。
实施方案149: 根据实施方案109-148中任一个所述的方法，其中可以治疗性地施用所述抗体(根据需要)。
实施方案150: 根据实施方109-149案中任一个所述的方法，其中施用的抗体能够完全(100%)抑制可溶的TFPI。
实施方案151: 一种多核苷酸，其编码根据实施方案1-94中任一个所述的单克隆抗体。
实施方案152: 根据实施方案151所述的多核苷酸，其包含至少一个选自SEQ ID NO: 13、16、19和22的序列。
实施方案153: 根据实施方案152所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 19。
实施方案154: 根据实施方案152所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 22。
实施方案155: 根据实施方案152所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 19和22。
实施方案156: 一种真核细胞，其包含根据实施方案151-155中任一个所述的多核苷酸。
实施方案157: 一种真核细胞，其表达根据实施方案1-94中任一个所述的单克隆抗体或其片段。
实施方案158: 根据实施方案157所述的真核细胞，它是哺乳动物细胞。
实施方案159: 根据实施方案157所述的真核细胞，它是酵母细胞。
实施方案160: 根据实施方案158所述的哺乳动物细胞，其选自： HEK293、CHO、BHK、NSO和人视网膜细胞。
实施例
下面的实施例进一步例证了本发明，所述实施例不应当解释为进一步限制。在本申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容都特别地通过引用并入本文。
实施例 1 –针对 TFPI 的单克隆抗体的生产和表征
生产了针对组织因子途径抑制剂(TFPI)的单克隆抗体。对具有希望的结合特异性的单克隆抗体进行鉴别、克隆和测序。发现该抗体在体内会显著减少表皮出血时间，且不导致血小板数目的显著下降。
方法和结果
根据生产商的说明书，使用所有试剂盒。缩写：HC：重链；LC：轻链；VH：可变结构域 – 重链；VL：可变结构域 – 轻链；PCR：聚合酶 链式反应。
免疫和融合
使用全长TFPI和仅含有前2个Kunitz结构域的截短形式TFPIB161B ，免疫小鼠。将RBF小鼠用于免疫和生产小鼠单克隆抗体。在小鼠后背进行皮下注射。将20μg蛋白与完全弗氏佐剂混合，用于第一次注射。在以后的免疫中，不完全弗氏佐剂与相同浓度的抗原一起使用。在最后一次免疫后10天，针对TFPI特异性的抗体，通过ELISA筛选来自小鼠的眼血。通过静脉内注射，用10 μg TFPI强化具有正血清滴度的小鼠，并在3天后处死。无菌地取出脾，并分散成单细胞悬浮液。通过PEG-方法或通过电融合，进行脾细胞和骨髓瘤细胞的融合。
结合试验 : ELISA
用抗-小鼠IgG包被免疫平板。将来自杂交瘤细胞的培养上清液加入平板，洗涤后，加入可溶的生物素化的人TFPI或TFPIB161B，以测试特异性结合。
中和试验 : FXa 试验和 TF/FVIIa/FXa 试验
FXa抑制试验: 用含有抗TFPI单克隆抗体的来自杂交瘤细胞的培养上清液与引起FXa的90%抑制的固定浓度的TFPI预温育，并加入FXa + FXa-特异性的显色底物。该试验研究了TFPI与FXa的结合(更详细地描述在实施例6中)。
FVIIa/TF/FXa抑制试验: 1) 温育含有抗TFPI单克隆抗体的来自杂交瘤细胞的培养上清液和固定的TFPI (FVIIa/TF的90%抑制)；2) 温育TFPI + FVIIa + TF + FXa；3) 加入FX (FX>>FXa)，随后用FXa显色底物温育(更详细地描述在实施例7中)。
稀释凝血酶原时间 (dPT)
稀释凝血酶原(PT)分析：人血浆与稀释的人促凝血酶原激酶 (TF来源)的组合。在加入递增的蛋白A纯化的TFPI单克隆抗体浓度以后，测量血浆中的凝固时间，以研究凝固时间的剂量依赖性的减小。FVIIa (25 nM)是阳性对照，且必须缩短该凝固时间。
结合相互作用分析
通过在Biacore 3000中的表面等离子体共振，得到结合相互作用分析。用固定化的小鼠抗-IgG，捕获固定浓度的有关的单克隆抗体。测试了不同浓度的TFPI。假定TFPI和目标抗体的1:1相互作用，测定结合常数(k开、k关、KD) (更详细地描述在实施例8中)。
血栓弹力描记术
这记录全血中的血块形成和纤维蛋白溶解的动力学。通过用中和抗-FVIII IgG预温育血液，诱导A型血友病样病症。
抗体克隆和测序
从杂交瘤: TFPI-4F36A1B2 (在本文中缩写为4F36)，克隆抗-TFPI抗体的鼠重链和轻链序列。将总RNA（使用来自Qiagen的RNeasy-Mini 试剂盒，从杂交瘤细胞提取）用作cDNA合成的模板。使用来自Clontech的SMART™ RACE cDNA扩增试剂盒，在5’-RACE反应中合成cDNA。随后使用Phusion Hot Star 聚合酶 (Finnzymes)，并使用包含在SMART™ RACE 试剂盒中的通用引物混合物(UPM)作为正向引物，通过PCR进行HC和LC序列的靶物扩增。使用具有下述序列的反向引物进行HC (VH结构域)扩增: 5’-CCCTTGACCAGGCATCCCAG-3’ (引物#129)。使用具有下述序列的反向引物进行LC扩增: 5’-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3’ (引物#69)。
通过凝胶电泳分离出PCR产物，使用来自GE Healthcare Bio-Sciences的GFX PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒（Gel Band Purification Kit）进行提取，并使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒和来自Invitrogen的化学感受态TOP10大肠杆菌进行克隆，用于测序。使用来自Applied Biosystems的AmpliTaq Gold Mas-ter Mix和M13uni/M13rev引物，对选择的菌落进行菌落PCR。使用ExoSAP-IT酶混合物(usb)，进行菌落PCR净化。使用M13uni(-21)/M13rev(-29)或T3/T7测序引物，在德国Martinsried的MWG Biotech进行测序。使用VectorNTI程序，分析和注解序列。
从杂交瘤TFPI-4F36A1B2中，鉴别出单个独特的鼠κ型LC和单个独特的鼠HC亚类IgG1。LC序列给出在SEQ ID NO: 6中，HC序列给出在SEQ ID NO: 10中。VH和VL序列如图2所示，不包括先导肽序列。
表位
TFPI1包括3个Kunitz结构域 (参见图4)。从现有的TFPI1-2结构，鉴别出TFPI1的Kunitz结构域的表面可接近的残基。具体地，具有大于40%的相对可及性的残基被视作表面可接近的。对于TFPI1-2，这包含(参见图5)：氨基酸94-95、98、100-110、118-121、123-124、131、134、138-142和144-145。
实施例 2: 小鼠 TFPI4F36A1B2 mAb 的克隆和测序
本实施例描述了抗-TFPI抗体TFPI4F36A1B2的鼠重链和轻链序列的克隆和测序。
使用来自Qiagen的RNeasy-Mini 试剂盒，从杂交瘤细胞提取总RNA，并用作cDNA合成的模板。使用来自Clontech的SMART™ RACE cDNA扩增试剂盒，在5’-RACE反应中合成cDNA。随后使用Phusion Hot Start 聚合酶 (Finnzymes)和作为正向引物的包含在SMART™ RACE 试剂盒中的通用引物混合物(UPM)，通过PCR进行HC和LC序列的靶物扩增。将鉴别为SEQ ID NO: 11的反向引物用于HC (VH结构域)扩增，将鉴别为SEQ ID NO: 12的反向引物用于LC扩增。通过凝胶电泳分离PCR产物，并使用来自GE Healthcare Bio-Sciences的GFX PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒（Gel Band Purification Kit）进行提取，并使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒和化学感受态TOP10大肠杆菌 (Invitrogen)进行克隆，用于测序。使用AmpliTaq Gold Master Mix（购自Applied Biosystems）和M13uni/M13rev引物，在选择的菌落上进行菌落PCR。使用ExoSAP-IT酶混合物(USB)，进行菌落PCR净化。使用M13uni(-21)/M13rev(-29)或T3/T7测序引物，在德国Martinsried的MWG Biotech处进行测序。使用VectorNTI程序分析和注解序列。根据生产商的说明书，使用所有试剂盒和试剂。
鉴别出单个独特的鼠κ型LC和单个独特的鼠HC亚类IgG1。可变轻链的核酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 3和5所示。可变重链的核酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 7和9所示。前导肽序列未包含在这些序列中。
BLAST检索
将翻译的抗-TFPI4F36A1B2 VL和VH氨基酸序列用作待查询序列。使用BLASTp翻译程序，针对Uniprot数据库中的序列进行BLAST检索。抗-TFPI4F36A1B2 VH的输出产生比对，其中50个最高同一性评分中的超过20个是鼠Ig重链序列。针对小鼠Ig 重链的最高同一性评分是81%(99/121)。抗-TFPI4F36A1B2 VL的输出产生比对，其中50个最高同一性评分中的超过30个是鼠Ig κ 轻链序列。针对小鼠Ig κ 轻链的最高同一性评分是92%(105/113)。总之，抗-TFPI4F36A1B2的VH和VL序列代表新的独特序列。
小鼠抗-TFPI4F36A1B2 表达载体的制备
制备了一系列基于CMV 启动子的表达载体 (pTT 载体)，用于在Yves Durocher开发的基于HEK293-6E EBNA的表达系统中短暂表达小鼠TFPI4F36抗体 (Durocher 等人 Nucleic Acid Research, 2002)。除了CMV启动子以外，所述载体含有pMB1起点、EBV起点和Amp抗性基因。
使用对N和C-端序列特异性的引物，从起始TOPO测序克隆PCR扩增与全长抗-TFPI4F36A1B2 LC相对应的区域(包括起始信号肽序列)。同义引物含有末端HindIII 限制位点序列（用于克隆目的）和紧邻在ATG 起始密码子上游的Kozak序列(5’-GCCGCCACC-3’) 。反义引物含有紧邻在编码序列下游的终止密码子，其后面是XbaI 限制位点序列。限制酶切消化制备的PCR片段，克隆进线性化的基于pTT的载体的多克隆位点 (MCS)，并转化进大肠杆菌中进行选择。通过DNA测序，验证最终的构建体的序列。
使用对N-端序列和VH/CH变迁序列特异性的引物，从起始TOPO测序克隆PCR扩增与VH结构域相对应的区域(包括起始信号肽序列)。同义引物含有末端NotI 限制位点序列（用于克隆目的）和紧邻在ATG 起始密码子上游的Kozak序列(5’-GCCGCCACC-3’)。反义引物含有在VH/CH变迁序列下游的框架内NheI 限制位点。限制酶切消化制备的VH结构域PCR片段，克隆进线性化的含有鼠IgG1的CH结构域序列的载体中，并转化进大肠杆菌中进行选择。通过DNA测序，验证最终的构建体的序列。
在使用的所有试验中，克隆的和重组表达的抗-TFPI4F36A1B2抗体具有与起始杂交瘤衍生的抗体相同的特性和亲和力。在实施例3中，描述了用于在HEK293-6E细胞中短暂表达的规程。
实施例 3: 人源化的 TFPI4F36 mAb 的设计和构建
根据Kabat定义，注解小鼠抗-TFPI4F36A1B2 CDR序列，并发现为如下：
CDR-H1: NYAMS (SEQ ID NO: 8的氨基酸31-35)。
CDR-H2: TISRSGSYSYFPDSVQG (SEQ ID NO: 8的氨基酸50-66)。
CDR-H3: LGGYDEGDAMDS (SEQ ID NO: 8的氨基酸99-110)。
CDR-L1: KSSQSLLESDGKTYLN (SEQ ID NO:4的氨基酸24-39)。
CDR-L2: LVSILDS (SEQ ID NO:4的氨基酸55-61)。
CDR-L3: LQATHFPQT (SEQ ID NO:4的氨基酸94-102)。
基于结构模板2GJJ (针对Her2erbb2的mAB)和1X9Q (针对荧光素的hAB)，在Modeller (www.salilab.org/modeller/)中构建抗-TFPI4F36A1B2的3D模型。
使用抗-TFPI4F36A1B2 VL和VH，在人种系V数据库中进行BLASTp检索，返回下述的4个潜在种系序列：
重链: VH3_21或VH7183.9 (E-值< 1e-45)
轻链: VKII_A18或VKII_A1 (E-值< 3e-45)。
手工检查命中（hits）和比对后，分别选择VH3_21和VKII_A18 种系序列作为HC和LC人源化框架。基于序列比对，选择对应的种系J-区段作为JH6和JK4。与人源化的TFPI4F36的第一个CDR移植形式组合地显示抗-TFPI4F36A1B2和选择的种系序列之间的比对。抗-TFPI4F36A1B2和人支架(HC: VH3_21/JH6和LC: VKII_A18/JK4)之间的序列同一性非常高，如在序列下面的星号所指示的。每个星号标记着序列同一性的位置。根据最小CDR移植策略，设计最初的人源化的VH构建体，其中以比Kabat定义 (残基50-66)更短的形式(残基50-58)移植CDR-H2。根据Kabat定义，移植剩余的5个CDR。下面列出了移植的CDR (Kabat定义)；用粗体显示的CDR-H2的残基是人种系残基。
CDR-H1: NYAMS (SEQ ID NO: 18的氨基酸31-35)。
CDR-H2: TISRSGSYSYYADSVKG (SEQ ID NO: 28的氨基酸50-66)。
CDR-H3: LGGYDEGDAMDS (SEQ ID NO: 18的氨基酸99-110)。
CDR-L1: KSSQSLLESDGKTYLN (SEQ ID NO: 15的氨基酸24-39)。
CDR-L2: LVSILDS (SEQ ID NO: 15的氨基酸55-61)。
CDR-L3: LQATHFPQT (SEQ ID NO: 15的氨基酸94-102)。
下面列出了在最终的人源化的变体HzTFPI4F36中的CDR-H2的组成，并匹配为小鼠抗体抗-TFPI4F36A1B2列出的CDR-H2。
CDR-H2: TISRSGSYSYFPDSVQG (SEQ ID NO: 18的氨基酸50-66)。
图1显示了与人种系序列(分别是SEQ ID NO: 32和31)和CDR移植的人源化的TFPI4F36序列(分别是SEQ ID NO: 28和26)比对的小鼠抗-TFPI4F36A1B2的VH (A)和VL (B)结构域序列(分别是SEQ ID NO: 8和4)。如在图中序列上面所显示的，使用Kabat编号方案，并用粗体显示根据Kabat定义的CDR。在抗-TFPI4F36A1B2序列中，用灰色突出小鼠抗-TFPI4F36A1B2和种系序列之间的框架区差异。星号指示小鼠TFPI4F36和人种系序列之间的序列同一性位置。在HzTFPI4F36-CDRgrafted 序列(列出为hz4F36CDRgraft)中，用灰色突出潜在的回复突变。
基于在小鼠TFPI4F36和种系序列的框架区中发现的位置差异，鉴别出HzTFPI4F36-CDRgrafted 构建体的潜在回复突变。3D图形1显示了TFPI4F36 Fab片段的序列模型，也用于鉴别和区分潜在回复突变。分别在表2和3中显示了在人源化的TFPI4F36 LC和HC中产生的回复突变的列表。
人源化的TFPI4F36的表达载体的制备
根据上述抗体的人源化设计，合成(GENEART AG)了人源化的TFPI4F36 VH和VL区域的DNA序列。使用基础的最小CDR移植和没有额外的回复突变，得到所述序列。在构建体中包含各个LC和HC 种系前导肽序列以及紧邻在ATG 起始密码子上游的Kozak序列(5’-GCCGCCACC-3’)。
制备基于pTT的表达载体，用于短暂表达作为人κ/IgG4(S241P) 同种型的人源化的TFPI4F36抗体。将在位置 241 (根据Kabat编号，对应着按照EU编号系统(Edelman G.M. 等人, Proc. Natl. Acad. USA 63, 78-85 (1969))的残基228)处的脯氨酸突变导入IgG4铰链区，以消除单体抗体片段（即由1个LC和1个HC组成的“半抗体”）的形成。
从GENEART克隆载体切离VH片段，并克隆进线性化的基于pTT的载体中，该载体含有人IgG4(S241P) CH结构域序列，随后转化进大肠杆菌中进行选择。通过DNA测序，验证最终的构建体的序列。从GENEART克隆载体切离VL片段，并克隆进线性化的基于pTT的载体中，该载体含有人κ CL结构域序列，随后转化进大肠杆菌中进行选择。通过DNA测序，验证最终的构建体的序列。
在序列表 (SEQ ID NO: 26-30)中，提供了CDR-移植的HzTFPI4F36单克隆抗体(信号肽序列被省略)的VL、VH、LC和HC的核酸和氨基酸序列。
小鼠/人嵌合 TFPI4F36的表达载体的制备
为了尽可能好地评价人源化的TFPI4F36变体，构建了抗-TFPI4F36抗体(ChimTFPI4F36)的小鼠/人嵌合体形式，以便消除与恒定区起点和同种型有关的任意差异。制备基于pTT的表达载体，用于短暂表达嵌合的抗-TFPI4F36抗体，其具有在人κ/IgG4(S241P) 同种型支架上的鼠可变结构域。
使用一般的pTT特异性引物和对VH结构域C-端特异性的引物，从抗-TFPI4F36A1B2 HC 表达质粒，PCR扩增与VH结构域相对应的区域。同义引物对在HindIII 限制位点和ATG 起始密码子上游的序列段是特异性的。反义引物含有在VH/CH变迁序列中的框架内NheI 限制位点。对制备的PCR片段进行限制酶切消化，克隆进线性化的基于pTT的载体中，该载体含有人IgG4(S241P) CH结构域序列，并随后转化进大肠杆菌中进行选择。通过DNA测序，验证最终的构建体的序列。
使用一般的pTT特异性引物和对VL结构域C-端特异性的引物，从TFPI4F36A1B2 LC 表达质粒，PCR扩增与VL结构域相对应的区域。同义引物对在HindIII 限制位点和ATG 起始密码子上游的序列段是特异性的。反义引物含有在VL/CL变迁序列中的框架内BsiWI 限制位点。对制备的PCR片段进行限制酶切消化，克隆进线性化的基于pTT的载体中，该载体含有人κ CL结构域序列，并随后转化进大肠杆菌中进行选择。通过DNA测序，验证最终的构建体的序列。
mAb变体的重组表达
按照一般的抗体表达方法，在HEK293-6E细胞中，短暂表达鼠抗-TFPI4F36A1B2、嵌合的抗-TFPI4F36和人源化的TFPI4F36抗体变体。下面的规程描述了用于悬浮适应的HEK293-6E细胞的一般转染方法。
细胞维持
在FreeStyle™ 293表达培养基(Gibco)中，悬浮培养HEK293-6E细胞，所述培养基添加了25 μg/ml 遗传霉素 (Gibco)、0.1%v/v的表面活性剂 Pluronic F-68 (Gibco)和1%v/v 青霉素-链霉素 (Gibco)。在振荡培养箱中，在37℃、8 %CO2和125 rpm，在锥形（Erlenmeyer）摇瓶中培养细胞，并维持细胞密度在0.1-1.5 x 106细胞/ml。
DNA 转染
•用于转染的培养物的细胞密度是 0.9-2.0 x 106 细胞 /ml 。
•每ml细胞培养物，使用0.5 µg LC 载体 DNA + 0.5 µg HC 载体 DNA的混合物。
•按照30µl培养基/µg DNA，在Opti-MEM培养基(Gibco)中稀释DNA，混合，并在室温 (23-25℃) 温育5 min。
• 293Fectin ™ (Invitrogen) 用作转染试剂，浓度为 1 μ l/µg DNA 。
•在Opti-MEM培养基(Gibco)中稀释293Fectin™ 30倍，混合，并在室温 (23-25℃) 温育5 min。
•混合DNA和293Fectin 溶液，在室温 (23-25℃) 温育25 min。
•然后将DNA-293Fectin混合物直接加入细胞培养物。
•将转染的细胞培养物转移至振荡培养箱，37℃、8 %CO2和125 rpm。
•转染后3-6天，通过离心，收获细胞培养物上清液，随后通过0.22 μm PES过滤器(Corning)进行过滤。
•使用FortéBio Octet 系统和蛋白A生物传感器或定量蛋白A HPLC，直接在澄清的细胞培养物上清液上，通过Biolayer干扰量度法定量分析抗体生产。
人源化的抗-TFPI4F36的CDR移植变体的活性分析
最小CDR移植的人源化导致亲和力的急剧降低，这由对结合和解离速率（on-和off-rate）的影响造成。人源化的TFPI4F36抗体的最初移植形式(HzTFPI4F36-CDRgrafted ，在表1中列出为人源化的TFPI4F36)的TFPI结合亲和力比起始的小鼠TFPI4F36抗体的~30 pM 亲和力低至少100-倍(参见表1)。在嵌合抗体中的亲和力保留，证实了人κ/IgG4(S241P) FC对抗体亲和力没有影响。使用下述的SRP，进行亲和力分析。
表1
Figure 54363DEST_PATH_IMAGE004
。
hzTFPI4F36-TFPI 相互作用的表面等离子体共振 (Biacore) 分析
使用2个不同的方案，通过在Biacore中的SPR 分析，确定重组人TFPI 与起始的鼠抗-TFPI4F36A1B2、嵌合的抗-TFPI4F36和人源化的TFPI4F36抗体的各种变体的相互作用的动力学参数。最初的动力学排序研究是基于在实施例1中所述的纯化的mAb的捕获程序。这些之后，在选择的mAb 构建体上进行直接的结合动力学程序，其中使用单克隆抗体，所述单克隆抗体通过游离胺基共价偶联到在传感器芯片表面上的羧甲化的葡聚糖膜(CM5)上。以各种浓度，注射重组人TFPI ，然后是解离阶段，其中使恒定的缓冲液在传感器芯片表面上流动，如实施例8所述。
定点诱变以将回复突变导入人源化的mAb
基于人源化的抗-TFPI4F36的CDR移植形式的低亲和力，在HzTFPI4F36-CDRgrafted的轻链(LC)和重链(HC)中，产生一系列27个人-至-小鼠回复性突变(称作回复突变)。通过Biacore，表达、纯化和分析这些突变体，作为单独的突变体或作为LC/HC组合突变体。分别在表2和3中显示了产生的突变的列表。
进行定点诱变，以在HzTFPI4F36-CDRgrafted LC/HC 构建体的特定残基处（如在人源化设计中突出显示的）导入人-至-小鼠回复性突变(此后称作回复突变)。通过2种不同的方法，导入突变：
1）使用来自Stratagene的QuickChange® 定点或多点定向诱变试剂盒，导入点突变和组合突变。根据生产商的说明书，使用试剂盒。
2）还使用标准的2-步重叠PCR方法，导入点突变和产生组合突变。
使用HzTFPI4F36-CDRgrafted的LC和HC 表达质粒作为模板，用于第一轮诱变。在以后几轮中，还使用以前突变的质粒作为模板，导入突变。通过DNA测序，验证所有最终的构建体的序列。
表2: HzTFPI4F36-CDRgrafted 轻链的突变变体
LC突变体 突变 KD (M)
HzTFPI4F36 LC-S63T S63T 7.8E-9
HzTFPI4F36 LC-P15I P15I 17.0E-9
HzTFPI4F36 LC-FR2 Y36L, K39R, Q42E, Q45K 6.3E-10
HzTFPI4F36 LC-P15I, FR2 P15I, Y36L, K39R, Q42E, Q45K 6.4E-10
HzTFPI4F36 LC-Y36L Y36L >3E-11
HzTFPI4F36 LC-K39R, Q42E,Q45K K39R, Q42E, Q45K >3E-11
表3: HzTFPI4F36-CDRgrafted 重链的突变变体
HC突变体 突变 KD (M)
HzTFPI4F36 HC-Q3E Q3E 5.8E-9
HzTFPI4F36 HC-G44R G44R 2.3E-9
HzTFPI4F36 HC-S49A S49A 3.0E-9
HzTFPI4F36 HC-Y59F Y59F 5.5E-9
HzTFPI4F36 HC-A60P A60P 2.2E-9
HzTFPI4F36 HC-K64Q K64Q 2.5E-9
HzTFPI4F36 HC-S77T S77T 1.5E-9
HzTFPI4F36 HC-A93T A93T 2.7E-9
HzTFPI4F36 HC-Y59F, A60P Y59F,A60P 2.3E-9
HzTFPI4F36 HC-KABAT CDR2 Y59F, A60P, K64Q 9.0E-10
HzTFPI4F36 HC-FR2, S49A A40T, G42E, G44R, S49A 1.3E-9
HzTFPI4F36 HC-FR3 N82aS, A84S, V89M 5.3E-9
HzTFPI4F36 HC-FR3, S77T S77T, N82aS, A84S, V89M 7.7E-9
HzTFPI4F36 HC-FR3, A93T N82aS, A84S, V89M, A93T 4.1E-9
HzTFPI4F36 HC-FR2 A40T, G42E, G44R 8.8E-10
HzTFPI4F36 HC-FR2, S49A, CDR2 A40T, G42E, G44R, S49A, Y59F, A60P, K64Q 2.6E-11
HzTFPI4F36 HC-G42E, G44R, CDR2 G42E, G44R, Y59F, A60P, K64Q 3.9E-11
HzTFPI4F36 HC-FR2, CDR2 A40T, G42E, G44R, Y59F, A60P, K64Q >3E-11
HzTFPI4F36 HC-G42E, G44R, S49A CDR2 G42E, G44R, S49A, Y59F, A60P, K64Q >3E-11
HzTFPI4F36 HC-G42E, G44R, A60P, K64Q G42E, G44R, A60P, K64Q 9.3E-11
HzTFPI4F36 HC-G44R, A60P, K64Q G44R, A60P, K64Q 3.0E-11
根据图1所示的Kabat编号方案，对在表2和3中列出的LC和HC的突变连续编号。
将在表2中列出的LC突变体表达为仅LC突变体和野生型HC HzTFPI4F36 CDRgrafted。将在表3中列出的HC突变体表达为仅HC突变体和野生型LC HzTFPI4F36 CDRgrafted。还通过组合不同的LC和HC突变体，表达LC-HC 组合突变体。在突变链后面一致地命名突变体，即用野生型HzTFPI4F36-CDRgrafted LC和突变的HzTFPI4F36 FR2、S49A、CDR2 HC表达最终的人源化的mAb变体。如上所述，进行暂时HEK293-6E 表达。
最初的9个点突变体集合 (HzTFPI4F36 LC-S63T和HzTFPI4F36 HC-Q3E；G44R；S49A；Y59F；A60P；K64Q；S77T；A93T) 是基于在人源化设计中突出显示的基本回复突变集合。所述点突变体都没有挽救抗体的亲和力，但是，证实了在第二人重链框架区(FR2，在CDR H1和CDR H2之间)和在CDR H2的C-端区域 (最小CDR移植方案中省略)中的突变对于TFPI结合而言是重要的。如上所述，通过Biacore 分析进行亲和力测量。
以后几轮诱变包括许多补片（patch）突变体，其中在单个区域中的所有残基共同地突变。突变体HzTFPI4F36 HC-Kabat CDR2具有在CDR H2的C-端区域中的3个突变Y59F、A60P、K64Q，所述C-端区域对应着移植CDR H2（根据Kabat定义，不根据用于最初的HzTFPI4F36-CDRgrafted变体的最小CDR移植方案）。该补片的突变体与在LC FR2和HC FR2中的补片突变体一起显著提高了人源化的TFPI4F36抗体的亲和力，但是3种补片突变体单独地不能恢复高TFPI4F36 亲和力。
具有在HC FR2和CDR2中的组合突变(A40T、G42E、G44R、S49A、Y59F、A60P、K64Q)的HC 突变体确实完全恢复了亲和力。该突变体将7个额外的鼠残基导入到抗体序列中。LC FR2突变体 (FR2 突变和Y36L)和HC FR2和/或CDR2突变体的组合也产生了高亲和力突变体。但是，这些LC/HC突变体的组合一致地导致与单独的HC突变体相比更低的表达产率。这些结果指示，LC突变体的包含对这些抗体变体的稳定性具有负面影响，因此提示，存在人源化的TFPI4F36 LC和HC之间的微妙相互作用模式。
在最后的突变体系列中，切掉了在HC FR2和CDR2中的7个突变(A40T、G42E、G44R、S49A、Y59F、A60P、K64Q)，以便消除潜在地不起作用的回复突变。为此制备了一系列5个突变体。
在3个突变体中，在FR2中排除了回复突变：
HzTFPI4F36 HC-G42E、G44R、CDR2
HzTFPI4F36 HC-FR2、CDR2
HzTFPI4F36 HC-G42E、G44R、S49A CDR2
在2个突变体中，也消除了在CDR2中的额外突变：
HzTFPI4F36 HC-G44R、A60P、K64Q
HzTFPI4F36 HC-G42E、G44R、A60P、K64Q。
但是，所述突变体都没有达到组合的HC FR2 CDR2突变体的标准（on par with）。亲和力或表达水平中的任一种(或二者)受到HC FR2 CDR2 突变体子集的任意减少的影响。挑取2个突变体 HzTFPI4F36 HC G42E、G44R、Y59F、A60P、K64Q（具有5个剩余的回复突变）和HzTFPI4F36 HC G42E、G44R、A60P、K64Q（具有4个残余的回复突变），用于与HzTFPI4F36 HC-FR2、S49A、CDR2的彻底对比。
◦ HzTFPI4F36 HC-G42E、G44R、A60P、K64Q和HzTFPI4F36 HC-FR2、S49A、CDR2在相当的水平表达，而HzTFPI4F36 HC-G42E、G44R、CDR2具有稍微更低的表达水平。加速的生物物理学稳定性研究没有证实3个变体的稳定性的任意差异。
◦ 在下面列出了通过Biacore测得的亲和力。
◦ 所有3个变体在dPT试验 (如下所述)中测得的体内效能相当。
表4: TFPI和人源化的TFPI4F36变体之间的相互作用的动力学参数
Figure 681785DEST_PATH_IMAGE005
。
基于上述数据，测得具有7个HC 回复突变(A40T、G42E、G44R、S49A、Y59F、A60P、K64Q)的起始HC FR2和CDR2 突变体优于其它变体；该变体在本文中称作HzTFPI4F36或mAbTFPI2021。
通过与抗原直接相互作用，CDR2 突变Y59F、A60P、K64Q 可能影响抗体亲和力。突变A40T、G42E、G44R位于连接CDRH1和CDR H2的FR2转角（turn）中，其远离抗原结合面，且可以用于稳定化LC-HC 相互作用。突变S49A埋入在非常疏水的侧链簇的中央，这可以解释为什么在该位置丙氨酸优于丝氨酸。有趣地，因此，作为提高直接抗原相互作用的突变和稳定化抗体的远离抗原结合区的突变的组合，得到HzTFPI4F36的高亲和力。
总之，HzTFPI4F36具有~25 pM的亲和力 (KD)，且含有35个源自小鼠抗体序列的氨基酸残基，对应着抗体中残基总数的5.2%。
分别在SEQ ID NO: 15、18、21和24中显示了选择的人源化构建体HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)的可变轻(VL)区、可变重(VH)区、轻链和重链的氨基酸序列。
体外效能试验
抗-TFPI4F36抗体能够中和TFPI-介导的凝血因子X(FX)以及组织因子(TF)和因子VII(FVII)的复合物的抑制。在稀释凝血酶原时间(dPT)实验中，测量了鼠和人源化的TFPI4F36抗体变体的活性。使用dPT试验，测量抗-TFPI抗体的促凝血活性。增加抗-TFPI抗体的血浆浓度，会缩短dPT 凝固时间。
实施例 4: MuTFPI4F36 的 Fab- 片段 (Fab) 和人组织因子途径抑制剂 (TFPI) 的第二 Kunitz 结构域 (K2) 的纯化、结晶和结构
将TFPI的包含它的第二Kunitz结构域(K2)和C-端His6-标签的片段(SEQ ID NO: 2) 与MuTFPI4F36 Fab片段 (Fab)共结晶。通过X-射线晶体学，分析复合物的结构。发现K2结合表位由残基E10、E11、P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36和L50组成。发现在Fab中的互补位包含MuTFPI4F36 轻链(SEQ ID NO: 4)的残基E31、S32、D33、Y37、A96、T97、H98和F99和MuTFPI4F36 重链(SEQ ID NO: 8)的残基N31、R53、S54、S56、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103和D106。
材料和方法
分析尺寸排阻色谱法。
使用Biosep S-3000 (300 × 7,80mm)柱 (Phenomenex)，进行分析尺寸排阻色谱法 (SEC)，用PBS-缓冲液 (10mM 磷酸盐, 150mM NaCl, 3mM KCl, pH 7,5)洗脱，流速为0.8 ml/min。
Fab/K2 复合物的制备和纯化。
通过在1:1.5的摩尔比(5.4 mg Fab和1.4 mg K2)，混合Fab (0.27mg/ml，在PBS 缓冲液中, pH 7.4)和K2 (0.29 mg/ml，在PBS中, pH 7.4)，制备Fab/K2复合物。在离心过滤器装置(Amicon, 10 kD分子量截止)上，浓缩复合物至~6.7 mg/ml的浓度。为了去除多余的K2，将浓缩的样品装载上Superdex 75 (CV300)凝胶过滤柱，用PBS-缓冲液pH 7.4洗脱，流速为1 ml/min。合并含有Fab/K2复合物的级分，并浓缩至9.2 mg/ml的蛋白浓度。该溶液用于结晶。
Fab/K2 复合物的结晶。
使用含有0.2 M柠檬酸三钾 (pH 8.0)和20 %w/v PEG 3,350的沉淀剂溶液，通过悬滴方法，将Fab/K2复合物结晶成棒。
晶体结构测定。
分别使用PDB结构1F8T和1TFX作为Fab和K2分子的模板，通过分子置换方法，分析Fab/K2复合物的结构。
结果
通过将过量的K2加入Fab溶液中，制备Fab和K2之间的复合物。图6显示了通过分析尺寸排阻色谱法 (SEC)监测的复合物形成。该方法根据它们的分子大小分离分子，大物质比小物质更早洗脱。与K2和Fab相对应的峰较好地分离，因为分子量的较大差异 (分子量分别是~8 kDa和48 kDa)。将K2加入到Fab溶液中，导致预期的峰位置向更短的保留时间的微小迁移。通过使用制备SEC分离多余的K2，容易地分离复合物，并以纯的形式得到。
使用几种商业的结晶筛（screen），筛选Fab/K2复合物的结晶条件。悬滴方法产生适合单晶X-射线分析的棒状晶体，使用储存在PDB中的结构作为模板，通过分子置换方法分析结构。图7显示了Fab/K2复合物的总结构。显示了轻链和重链，它们构成Fab分子，并表现出预期的抗体分子特有的免疫球蛋白β-夹心折叠。还显示了CDR环，其接触抗原，并界定抗体的特异性和亲和力。
抗原K2表现出特征性的单个反向平行β-折叠 (β1 (I20-N26)和β2 (Q31-Y37))和界定Kunitz-折叠的N-端 α-螺旋 (α1, L50-I56) (图8)。还显示了任选的在N-端附近的310-螺旋 (α0, D5-F8)，其后面是产生β1的环1 (L1, L9-Y19)，它通过短环(Lβ, N27-K30)连接到β2上。在C-端区段，环2 (L2, G38-T49)连接β2和α1。最后，特征性的3个二硫键 (C7-C57、C16-C40和C33-C53)分别连接α0和α1、L1和L2以及β2和α1。
K2的2种结构已经储存在全世界蛋白数据库(PDB)中。一种结构1ADZ通过NMR 波谱学测定，并代表游离溶液结构，而另一种结构1TFX通过X-射线晶体学测定，并代表与猪胰蛋白酶络合的K2。图9显示了由1ADZ、1TFX表示的K2以及与Fab络合的K2分子的结构重叠。在所有3种结构中，主链痕迹似乎非常相似，表明具有它的3个稳定化二硫键的Kunitz-折叠相当坚硬。
MuTFPI4F36 K2 结合表位的描述
在抗原K2上的结合表位（定义为K2中含有至少一个离Fab的重原子在4 Å或更小距离内的侧链重原子的残基）包含残基E10、E11、P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36和L50 (图10)。K2中的接触残基位于L1 (E10、E11、P13、R17、Y19)、β-折叠结构 (T21、Y23、Q31、E33、R34、F35、K36)和连接环Lβ (Q28)以及最后在α1中的单个环(L50)。图10 描述了映射到K2的3D-结构和基本氨基酸序列上的结合表位。
MuTFPI4F36 互补位的描述
从MuTFPI4F36 Fab和TFPI K2结构域之间的复合物的相同X-射线结构，测定MuTFPI4F36 Fab片段中的互补位。将互补位定义为MuTFPI4F36 Fab中具有离K2结构域的重原子在小于4Å距离内的重原子的那些残基。轻链中的接触残基位于SEQ ID NO: 4的残基E31、S32、D33、Y37、A96、T97、H98和F99处。重链中的接触残基位于SEQ ID NO: 8的残基N31、R53、S54、S56、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103和D106处。互补位的位置如图3所示。
实施例 5: K2/HzTFPI4F36 Fab 复合物的结构
使用与关于结合到K2上的MuTFPI4F36 Fab的三维结构测定所述类似的方法学，测定来自人源化的抗体HzTFPI4F36的Fab片段和K2之间的复合物的结构。如预期地，发现HzTFPI4F36的Fab与它的来源鼠Fab一样，会结合K2上的相同区域。在图11中显示了2种复合物的结构之间的总相似性，其中K2/TFPI4F36 Fab和K2/HzTFPI4F36 Fab复合物的主链（back bone）带痕迹重叠。对于HzTFPI4F36，发现在K2上的表位 (使用4 Å截止来定义)包含残基E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、K36和L50。与鼠起源的K2/MuTFPI4F36 Fab的结构相比，D12、F24、N26和C32是在人源化的K2/HzTFPI4F36复合物中，在4 Å截止之内，而F35是在之外。这反映了在K2/MuTFPI4F36 Fab和K2/HzTFPI4F36 Fab复合物的结合界面内的侧链朝向的微小差异，尽管事实上MuTFPI4F36和HzTFPI4F36中的CDR区是相同的。
实施例 6 – 8
对比HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)的功能和所有(4种)可商业得到的单克隆抗体的功能，在所述可商业得到的单克隆抗体中，有些据称会结合TFPI的K2结构域；有些没有关于结合的描述。
实施例 6: TFPI 中和试验 : FXa 抑制
在试验中使用的材料是BSA 缓冲液(50 mM Hepes；0.1 M NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1 mg/ml BSA, pH 7.4)和表5所示的试剂。
表5: 使用的材料
Figure 504248DEST_PATH_IMAGE006
。
方法 :
在BSA 缓冲液中混合重组全长人TFPI (终浓度 6 nM))和递增浓度的目标mAb (终浓度: 5-150 nM) 30 min。加入FXa，温育30 min，并将混合物温育另外30 min。加入显色底物S2765，在Spectramax中测量在405 nm的吸光度15 min。100%活性表示没有加入TFPI时的FXa 活性。
表6: FXa的TFPI抑制的中和
公司 mAb ID IC50 nM 在150 nM的TFPI的%中和
本发明 HzTFPI4F36 (mAbTFPI2021) 12.6 100%
AbNova mAb0281 nd < 10%
American Diagnotica mAb4904 nd < 10%
R&Dsystems mAb2974 29.4 90%
R&Dsystems mAb29741 nd < 10%
结论 :
在150 nM，HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021) 完全中和了FXa的TFPI抑制。几乎没有检测到mAb0281、mAb4904和mAb29741的活性。
实施例 7: TFPI 中和试验 : FVIIa/TF/FXa 抑制
使用的材料是BSA 缓冲液 (50 mM Hepes；0.1 M NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1 mg/ml BSA, pH 7.4) EDTA: 50 mM和在表7中列出的试剂。
表7
Figure 833598DEST_PATH_IMAGE007
。
方法 :
以在表中指出的终浓度，加入所有组分。加入25 µl FX、25 µl不同浓度的TFPI mAb、25 µl人TFPI、25 µl在微量滴定孔中的FVIIa-TF (innovin)。在室温温育40 min。加入50 µl EDTA，然后加入50 µl S-2765。混合，并在Spectramax中在405 nm读出平板15 min。100%活性是没有TFPI存在时得到的FVIIa/TF/FX活性。
表8: FVIIa/TF/FX的TFPI抑制的中和
公司 mAb ID IC50 在150 nM的TFPI的%中和
本发明 HzTFPI4F36 (mAbTFPI2021) 3.8 nM 100%
AbNova mAb0281 未检出 未检出
American Diagnotica mAb4904 未检出 未检出
R&Dsystems mAb2974 45.6 nM 53%
R&Dsystems mAb29741 未检出 未检出
结论 :
在150 nM的mAb 浓度，TFPI被mAbTFPI2021完全中和。mAb2974 也达到饱和，但是没有完全中和TFPI (53%中和)。
实施例 8: 结合相互作用分析
在表9中列出了使用的材料。
表9
。
方法 :
在Biacore T-100仪器中，通过表面等离子体共振，得到结合相互作用分析。通过在将mAb直接固定在CM5芯片上，达到500-1000 RU的水平，在10 mM 醋酸钠 pH 4.5-5.0中捕获固定浓度的有关的单克隆抗体。测试200 nM-0.2 nM 的重组人全长TFPI或人TFPI截短形式 (1-161氨基酸残基)的4倍稀释液对固定的mAb的结合。运行和稀释缓冲液: 10 mM HEPES, 150 mM, 0.005%p20, pH 7.4。通过10 mM 甘氨酸pH 1.7，实现再生。使用Biacore T100评价软件，假定TFPI和目标抗体的1:1 相互作用，测定动力学和结合常数(k开、k关、KD)。结果如表10所示。如下实现不同的mAb竞争结合TFPI（其结合在mAbTFPI2021 (“mAb2021”, HzTFPI4F36) 上）：在CM5芯片上固定mAbTFPI2021至5000 RU，然后结合50 nM TFPI，随后结合不同浓度的要测试竞争的mAb (2974、0281、4904、29741)。结果如表11所示。通过10 mM 甘氨酸pH 1.7，实现芯片的再生。
表10: 表面等离子体共振(SPR)分析。结合全长人TFPI。动力学和结合常数。
生产商 mAb ID ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) KD nM
本发明 mAb2021 2.39E+06 3.58E-05 1.50E-11 0.015
AbNova mAb0281 3.99E+05 0.001436 3.60E-09 3.60
American Diagnotica mAb4904 1.42E+05 00.1294 9.14E-09 9.14
R&Dsystems mAb2974 1.39E+06 0.001202 8.64E-10 0.864
R&Dsystems mAb29741 9.51E+05 0.003165 3.33E-09 3.33
表11: SPR 分析。结合全长人TFPI和TFPI161(K1和K2结构域)的结合常数。与mABTFPI 2021的竞争。
生产商 mAb ID KD (M) TFPI KD (M) TFPI161 与mAB 4F36的竞争
本发明 mAbTFPI2021 1.50E-11 4.55E-11 有
AbNova mAb0281 3.60E-09 7.28E-09 无
American Diagnotica mAb4904 9.14E-09 没有结合 无
R&Dsystems mAb2974 8.64E-10 3.12E-09 有
R&Dsystems mAb29741 3.33E-09 没有结合 无
结论
与测试的任何其它mAb相比，mAbTFPI2021以更高的亲和力结合TFPI (KD 15 pM)。仅mAb2974与mAb TFPI4F36竞争结合相同的位点。
实施例 9: 人脐血管内皮细胞 (HUVEC) 上的 TFPI 的中和
内皮细胞组成性地表达TFPI，它是通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚着点连接到细胞表面上的形式。当TF与TFPI在相同细胞上表达时，GPI-锚定的TFPI特异性地抑制TF-介导的活性。为了证实HzTFPI4F36 (mAbTFPI2021) 比mAb 2974远远更有效地中和细胞结合的TFPI的抑制，我们应用了人脐血管内皮细胞 HUVEC；且为了诱导TF表达，用TNFα (Sigma RBI)和IL1β (Roche)刺激这些细胞，然后测试FVIIa/TF催化的FX的活化。
在96 孔平板中，在EBM-2培养基(Clonetics)中，培养HUVEC细胞至汇合，并用20 ng/ml TNFα和20 ng/ml IL1β刺激2小时，然后测试。在25 mM HEPES、137 mM NaCl、3.5 mM KCl、5 mM CaCl、1 mg/ml BSA (0.1%) ph 7.4中进行测试，在有抗体(0 – 20 nM)存在下，并加入50 pM FVIIa和50 nM FX，进行FX活化。使用0.6 mM的显色底物S-2765 (Chromogenix)，测量FXa的产生，并相对于FXa 标准曲线进行校正。
图12显示了结果，此时0-20 nM的HzTFPI4F36或mAb 2974消除了细胞结合的TFPI的抑制。HzTFPI4F36 刺激了TF/FVIIa-介导的FX活化，具有半数最大效应浓度(EC50 ~ nM)，而使用20 nM的2974 mAb，几乎观察不到对FXa产生的任何刺激。
因而，本实施例证实，与mAb 2974相反，HzTFPI4F36会有效地中和细胞结合的TFPI对TF/FVIIa-介导的FX活化的抑制。
实施例 10: MDA-MB 231 人乳腺癌细胞上的 TF/FVIIa 活性的 TFPI 抑制的中和
MDA-MB 231细胞在表面上组成性地表达高水平的TF和轻微量的TFPI。外源性添加的TFPI可以抑制细胞表面TF/FVIIa介导的FX活化。为了证实HzTFPI4F36会比mAb 2974远远更有效地中和这类TFPI抑制，我们应用了MDA-MB 231细胞，并测试各种浓度的抗体的消除FVIIa/TF催化的FX活化的TFPI抑制的能力。
在96 孔平板中，在添加了10 %FCS和1 %P/S的DMEM（Gibco目录号 31966-021）中，培养MDA-MB 231细胞至汇合。在25 mM HEPES、137 mM NaCl、3.5 mM KCl、5 mM CaCl、1 mg/ml BSA (0.1%) ph 7.4中进行测试，在有抗体(0 – 20 nM)存在下，并加入2.5 nM 全长人重组TFPI、100 pM FVIIa和50 nM FX，进行FX活化。使用0.6 mM的显色底物S-2765 (Chromogenix)，测量FXa的产生。连续测量在405 nm的吸光度，在反应开始后15 min，通过测量发展曲线的斜率，测定FXa活性。
图13显示了结果，此时0-20 nM的HzTFPI4F36或mAb 2974消除了TFPI的抑制。HzTFPI4F36刺激了TF/FVIIa-介导的FX活化，具有半数最大效应浓度(EC50 ~ 2 nM)，然而在实质更高浓度的2974 mAb，得到FXa产生的刺激(EC50 > 20 nM)。
实施例 11: 使用 ELISA ，描绘抗 -TFPI 单克隆抗体 HzTFPI4F36 和 mAb2974 的结合表位
通过分析TFPI-K2/ HzTFPI4F36复合物的晶体结构，已经描绘了TFPI Kunitz-结构域 2 (K2)上的HzTFPI4F36 结合表位。通过ELISA，分析了突变在HzTFPI4F36的结合表位之内(E10、R17和Y19)和之外(D5)的TFPI的单个氨基酸残基对与HzTFPI4F36和mAb2974 (R&Dsystems)的结合亲和力的影响。在HEK293-F细胞中表达TFPI变体，并使用来自细胞培养物的条件培养基，进行ELISA。
通过ELISA，评估TFPI-WT和TFPI突变体的浓度，它们结合TFPI K1 (MAb4903, American Diagnostica)和K3 (MAb4F110, 自制)，因此不受突变的影响。使用MAb4903和HzTFPI4F36，在ELISA中分析了突变对HzTFPI4F36结合的影响。使用MAb2974和MAb4F110，通过ELISA测定了对MAb2974结合的影响。
相对于TFPI-WT (100%结合)，计算了TFPI- Kunitz 2中的突变分别对HzTFPI4F36和MAb2974结合的影响，且如图14所示。已经关于表达水平差异校正了数字。
结论:
在HzTFPI4F36的结合表位内的3个氨基酸残基的丙氨酸突变导致降低的HzTFPI4F36结合，而位于该表位之外的残基的丙氨酸置换(TFPI-D5A)没有影响。4个丙氨酸突变体中仅一个（TFPI-Y19A）具有减少的对MAb2974的结合。
总之，HzTFPI4F36和MAb2974具有不同的、但是重叠的位于TFPI-Kunitz 2上的结合表位。
实施例 12: 体内研究
通过静脉内施用2000 RBU/kg的单克隆抗-FVIII-抗体，使兔暂时患血友病。10分钟后，兔接受12000 U/kg的 抗-TFPI-抗体(4F36；1.93 mg/kg)。在抗-FVIII-抗体施用后45分钟，诱导表皮出血。
4F36抗体造成表皮出血时间的显著减少(图15)。4F36抗体的施用没有导致血小板数目的显著下降 (图18)。
重复类似的实验，其中在诱导表皮出血后5分钟，3组（每组8只）暂时患血友病的兔接受同种型对照抗体(阴性对照组)、2 mg/kg 抗-TFPI (mAb 4F36)或9 mg/kg NovoSeven (阳性对照组)。结果如图16所示：mAB 4F36的施用在所有受体中导致失血的大幅减少(大约85%)，证实了可以“根据需要”使用mAb4F36。
实施例 13: 兔中的剂量 - 效应关系的估测
在兔血友病模型中检查了人源化的mAb HzTFPI4F36的剂量-效应关系。通过静脉内施用单克隆抗-FVIII-抗体，使兔暂时患血友病。10分钟后， 兔接受0.5、1、2 mg/kg HzTFPI4F36或同种型对照抗体。另外35分钟后，诱导表皮出血，继之以60分钟观察期。当将剂量从0.5增加至2 mg/kg时，HzTFPI4F36 显著地且剂量-依赖性地减少出血时间以及失血(图17)。因而，使用1 mg/kg HzTFPI4F36（对应的血浆浓度为18780 ng/ml HzTFPI4F36），实现了出血时间和失血的显著减少。在2 mg/kg（对应的血浆浓度为30980 ng/ml HzTFPI4F36），实现出血的标准化。
这些数据指示，HzTFPI4F36的‘有效浓度’（ 例如在本模型中标准化所需的血浆浓度）是在18780至30980 ng/ml的范围内。
实施例 14: 在兔中的 PK/PD –“作用持续时间”
以20 mg/kg的剂量，在兔中进行HzTFPI4F36的药代动力学研究。在研究过程中的预定时点，从兔抽取血液样品，用于药代动力学研究，其中使用ELISA测量游离的HzTFPI4F36 (显示在下面的图3中)。在施用后4天(96小时)、7天(168小时)和10天(240小时)，使用在暂时患血友病的兔中的表皮出血模型，进行效应研究，效应时点如图19所指出的。
药代动力学曲线是靶物介导的清除的双相性指标。因而，在曲线的弯曲部上面，存在过量的游离mAb (mAB游离>TFPI总)，在弯曲部下面：mAb游离< TFPI总。与药代动力学曲线非常一致地，在静脉内施用20 mg/kg HzTFPI4F36后4和7天，出血时间和失血显著减少，而在10天后，没有观察到显著的效应(图20)。
这些数据证实，在患血友病的兔中的表皮出血模型中，HzTFPI4F36的有效血浆浓度是在18780至30980 ng/ml之间，这接近TFPI饱和限度(曲线弯曲部)。因此，单次静脉内施用的20 mg/kg HzTFPI4F36会减少表皮出血至少7天，这对应着在血浆浓度在‘有效浓度’以上的时期。
实施例 15: 基于猴 PK 数据的药代动力学模型
基于在猴中的药代动力学研究，进行药代动力学评价，其中施用单次和多次剂量(图21)。剂量水平范围是2-200 mg/kg。
在猴中的PK特性(20 mg/kg，上图)类似于兔，指示存在可溶性的和内皮结合的TFPI的类似分布。因而，这些数据指示，可以采用兔效应数据来预测在猴中的效应范围。此外，HzTFPI4F36 对人、猴和兔TFPI的亲和力是类似的(相同表位)，且在3个物种中的类似的TFPI组织分布允许在猴和人中的剂量预测。
实施例 16: 模拟
基于上述的模型，可能做出一系列模拟。模拟的主要目的是，描述在多次剂量场合的最佳给药方案。靶物(TFPI)浓度是未知的，但是上面的兔效应数据允许假设，如果所述靶物在30000 ng/ml的水平接近饱和，则得到出血模型的完全效应。因此，模拟的主要目的是，评价在时段以上的哪个剂量水平会导致完全饱和。图22显示了皮下施用的1mg/kg的模拟。图23显示了每3周静脉内施用的15 mg/kg HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)的模拟。图24显示了每2周静脉内施用的20 mg/kg HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)的模拟。
总之，基于上面的模拟，可以对人类做出下述给药方案预测：
表12: 给药方案
给药类型 剂量 给药方案
皮下给药 1 mg/kg 每2天
静脉内给药 10-20 mg/kg 每2-4周
序列表
<110> Novo Nordisk
Novo Nordisk A/S
<120> 抗体
<130> 7788
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 276
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp
20 25 30
Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr
35 40 45
Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn
50 55 60
Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn
65 70 75 80
Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe
85 90 95
Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg
100 105 110
Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly
115 120 125
Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys
130 135 140
Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly
145 150 155 160
Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys
165 170 175
Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro
180 185 190
Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn
195 200 205
Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly
210 215 220
Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys
225 230 235 240
Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys
245 250 255
Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe
260 265 270
Val Lys Asn Met
275
<210> 2
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于表位作图的人工构建体
<400> 2
Gln Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys
1 5 10 15
Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys
20 25 30
Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu
35 40 45
Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly His His His His
50 55 60
His His
65
<210> 3
<211> 339
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 3
gatattgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcttcc 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gaaagtgatg gaaaaaccta tttaaattgg 120
ttattacaga ggccaggcga gtctccaaag ctcctaatct atctggtgtc tatactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac gctgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgtt tgcaagctac acattttcct 300
cagacgttcg gtggcggcac caagctggaa atcaaacgg 339
<210> 4
<211> 113
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Glu Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala
85 90 95
Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 5
<211> 339
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 5
ccgtttgatt tccagcttgg tgccgccacc gaacgtctga ggaaaatgtg tagcttgcaa 60
acaataataa actcccaaat cctcagcctc cactctgctg attttcagcg tgaaatctgt 120
ccctgatcca ctgccagtga acctgtcagg gactccagag tccagtatag acaccagata 180
gattaggagc tttggagact cgcctggcct ctgtaataac caatttaaat aggtttttcc 240
atcactttct aagaggctct gacttgactt gcaagagatg gaagctggtt gtccaatggt 300
aaccgacaaa gtgagtggag tctgggtcat cacaatatc 339
<210> 6
<211> 219
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Glu Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala
85 90 95
Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 7
<211> 363
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 7
gaggtggagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtcgta gtggtagtta ctcctacttt 180
ccagacagtg tgcagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgcg gtctgaggac acggccatgt attattgtac aagacttggg 300
ggttacgacg agggggatgc tatggactcc tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 8
<211> 121
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 8
Glu Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 363
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 9
tgaggagacg gtgactgagg ttccttgacc ccaggagtcc atagcatccc cctcgtcgta 60
acccccaagt cttgtacaat aatacatggc cgtgtcctca gaccgcagac tgctcatttg 120
caggtacagg gtgttcttgg cattgtctct ggagatggtg aatcgaccct gcacactgtc 180
tggaaagtag gagtaactac cactacgact aatggttgcg acccactcca gcctcttctc 240
cggagtctgg cgaacccaag acatggcata gttactgaaa gtgaatccag aggctgcaca 300
ggagagtttc agggaccctc caggcttcac taagcctccc ccagactcca ccagctccac 360
ctc 363
<210> 10
<211> 445
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 10
Glu Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly
210 215 220
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
290 295 300
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
305 310 315 320
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
340 345 350
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
355 360 365
Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly
385 390 395 400
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
405 410 415
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
420 425 430
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
cccttgacca ggcatcccag 20
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
gctctagact aacactcatt cctgttgaag ctcttg 36
<210> 13
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的可变轻链
<400> 13
gacatcgtga tgacccagac ccctctgtcc ctgtccgtga cccctggcca gcctgcctcc 60
atctcctgca agtcctccca gtccctgctg gaatccgacg gcaagaccta cctgaactgg 120
tatctgcaga agcctggcca gtcccctcag ctgctgatct acctggtgtc catcctggac 180
tccggcgtgc ctgaccggtt ctccggctcc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tcccgggtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgcc tgcaggccac ccacttccct 300
cagacctttg gcggcggaac aaaggtggag atcaagcgt 339
<210> 14
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的可变轻链
<400> 14
ctgtagcact actgggtctg gggagacagg gacaggcact ggggaccggt cggacggagg 60
tagaggacgt tcaggagggt cagggacgac cttaggctgc cgttctggat ggacttgacc 120
atagacgtct tcggaccggt caggggagtc gacgactaga tggaccacag gtaggacctg 180
aggccgcacg gactggccaa gaggccgagg ccgtcgccgt ggctgaagtg ggacttctag 240
agggcccacc tccggctcct gcacccgcac atgatgacgg acgtccggtg ggtgaaggga 300
gtctggaaac cgccgccttg tttccacctc tagttcgca 339
<210> 15
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的可变轻链
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala
85 90 95
Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 16
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的可变重链
<400> 16
gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgaagc ctggcggctc cctgcggctg 60
tcctgcgctg cctccggctt caccttctcc aactacgcca tgtcctgggt gcggcagacc 120
ccagaaaagc ggctggaatg ggtggccacc atctcccggt ccggctccta ctcctacttc 180
cctgactccg tgcagggccg gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa ctccctgtac 240
ctgcagatga actccctgag agccgaggac acagccgtgt actactgcgc caggctgggc 300
ggctacgacg agggcgacgc catggacagc tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtcc 360
tcc 363
<210> 17
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的可变重链
<400> 17
ctccacgtcg accagctcag accgccgcct gaccacttcg gaccgccgag ggacgccgac 60
aggacgcgac ggaggccgaa gtggaagagg ttgatgcggt acaggaccca cgccgtctgg 120
ggtcttttcg ccgaccttac ccaccggtgg tagagggcca ggccgaggat gaggatgaag 180
ggactgaggc acgtcccggc caagtggtag tcgtccctgt tgcggttctt gagggacatg 240
gacgtctact tgagggactc tcggctcctg tgtcggcaca tgatgacgcg gtccgacccg 300
ccgatgctgc tcccgctgcg gtacctgtcg accccggtcc cgtggtggca ctggcacagg 360
agg 363
<210> 18
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的可变重链
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 19
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的恒定轻链
<400> 19
gacatcgtga tgacccagac ccctctgtcc ctgtccgtga cccctggcca gcctgcctcc 60
atctcctgca agtcctccca gtccctgctg gaatccgacg gcaagaccta cctgaactgg 120
tatctgcaga agcctggcca gtcccctcag ctgctgatct acctggtgtc catcctggac 180
tccggcgtgc ctgaccggtt ctccggctcc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tcccgggtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgcc tgcaggccac ccacttccct 300
cagacctttg gcggcggaac aaaggtggag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 20
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的恒定轻链
<400> 20
ctgtagcact actgggtctg gggagacagg gacaggcact ggggaccggt cggacggagg 60
tagaggacgt tcaggagggt cagggacgac cttaggctgc cgttctggat ggacttgacc 120
atagacgtct tcggaccggt caggggagtc gacgactaga tggaccacag gtaggacctg 180
aggccgcacg gactggccaa gaggccgagg ccgtcgccgt ggctgaagtg ggacttctag 240
agggcccacc tccggctcct gcacccgcac atgatgacgg acgtccggtg ggtgaaggga 300
gtctggaaac cgccgccttg tttccacctc tagttcgcat gccaccgacg tggtagacag 360
aagtagaagg gcggtagact actcgtcaac tttagacctt gacggagaca acacacggac 420
gacttattga agatagggtc tctccggttt catgtcacct tccacctatt gcgggaggtt 480
agcccattga gggtcctctc acagtgtctc gtcctgtcgt tcctgtcgtg gatgtcggag 540
tcgtcgtggg actgcgactc gtttcgtctg atgctctttg tgtttcagat gcggacgctt 600
cagtgggtag tcccggactc gagcgggcag tgtttctcga agttgtcccc tctcaca 657
<210> 21
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的恒定轻链
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala
85 90 95
Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 22
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的恒定重链
<400> 22
gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgaagc ctggcggctc cctgcggctg 60
tcctgcgctg cctccggctt caccttctcc aactacgcca tgtcctgggt gcggcagacc 120
ccagaaaagc ggctggaatg ggtggccacc atctcccggt ccggctccta ctcctacttc 180
cctgactccg tgcagggccg gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa ctccctgtac 240
ctgcagatga actccctgag agccgaggac acagccgtgt actactgcgc caggctgggc 300
ggctacgacg agggcgacgc catggacagc tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtcc 360
tccgctagca ccaagggccc atccgtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc 420
gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag 600
acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660
tccaaatatg gtcccccatg cccaccatgc ccagcacctg agttcctggg gggaccatca 720
gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 840
gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg 900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020
aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac accctgcccc catcccagga ggagatgacc 1080
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200
tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag 1260
gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag 1320
agcctctccc tgtctctggg taaa 1344
<210> 23
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的恒定重链
<400> 23
ctccacgtcg accagctcag accgccgcct gaccacttcg gaccgccgag ggacgccgac 60
aggacgcgac ggaggccgaa gtggaagagg ttgatgcggt acaggaccca cgccgtctgg 120
ggtcttttcg ccgaccttac ccaccggtgg tagagggcca ggccgaggat gaggatgaag 180
ggactgaggc acgtcccggc caagtggtag tcgtccctgt tgcggttctt gagggacatg 240
gacgtctact tgagggactc tcggctcctg tgtcggcaca tgatgacgcg gtccgacccg 300
ccgatgctgc tcccgctgcg gtacctgtcg accccggtcc cgtggtggca ctggcacagg 360
aggcgatcgt ggttcccggg taggcagaag ggggaccgcg ggacgaggtc ctcgtggagg 420
ctctcgtgtc ggcgggaccc gacggaccag ttcctgatga aggggcttgg ccactgccac 480
agcaccttga gtccgcggga ctggtcgccg cacgtgtgga agggccgaca ggatgtcagg 540
agtcctgaga tgagggagtc gtcgcaccac tggcacggga ggtcgtcgaa cccgtgcttc 600
tggatgtgga cgttgcatct agtgttcggg tcgttgtggt tccacctgtt ctctcaactc 660
aggtttatac cagggggtac gggtggtacg ggtcgtggac tcaaggaccc ccctggtagt 720
cagaaggaca aggggggttt tgggttcctg tgagagtact agagggcctg gggactccag 780
tgcacgcacc accacctgca ctcggtcctt ctggggctcc aggtcaagtt gaccatgcac 840
ctaccgcacc tccacgtatt acggttctgt ttcggcgccc tcctcgtcaa gttgtcgtgc 900
atggcacacc agtcgcagga gtggcaggac gtggtcctga ccgacttgcc gttcctcatg 960
ttcacgttcc agaggttgtt tccggagggc aggaggtagc tcttttggta gaggtttcgg 1020
tttcccgtcg gggctctcgg tgtccacatg tgggacgggg gtagggtcct cctctactgg 1080
ttcttggtcc agtcggactg gacggaccag tttccgaaga tggggtcgct gtagcggcac 1140
ctcaccctct cgttacccgt cggcctcttg ttgatgttct ggtgcggagg gcacgacctg 1200
aggctgccga ggaagaagga gatgtcgtcc gattggcacc tgttctcgtc caccgtcctc 1260
cccttacaga agagtacgag gcactacgta ctccgagacg tgttggtgat gtgtgtcttc 1320
tcggagaggg acagagaccc attt 1344
<210> 24
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的恒定重链
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 25
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HzTFPI4F36-CDRgrafted VL 核酸序列 (省略信号肽序列)
<400> 25
gacatcgtga tgacccagac ccctctgtcc ctgtccgtga cccctggcca gcctgcctcc 60
atctcctgca agtcctccca gtccctgctg gaatccgacg gcaagaccta cctgaactgg 120
tatctgcaga agcctggcca gtcccctcag ctgctgatct acctggtgtc catcctggac 180
tccggcgtgc ctgaccggtt ctccggctcc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tcccgggtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgcc tgcaggccac ccacttccct 300
cagacctttg gcggcggaac aaaggtggag atcaagcgt 339
<210> 26
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HzTFPI4F36-CDRgrafted VL 氨基酸序列(省略信号肽序列)
<400> 26
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala
85 90 95
Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 27
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HzTFPI4F36-CDRgrafted VH 核酸序列(省略信号肽序列)
<400> 27
gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgaagc ctggcggctc cctgcggctg 60
tcctgcgctg cctccggctt caccttctcc aactacgcca tgtcctgggt gcggcaggcc 120
ccagggaagg gactggaatg ggtgtccacc atctcccggt ccggctccta ctcctactac 180
gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa ctccctgtac 240
ctgcagatga actccctgag agccgaggac acagccgtgt actactgcgc caggctgggc 300
ggctacgacg agggcgacgc catggacagc tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtcc 360
tcc 363
<210> 28
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HzTFPI4F36-CDRgrafted VH 氨基酸序列(省略信号肽序列)
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HzTFPI4F36-CDRgrafted LC 氨基酸序列, 人κ 链
(省略信号肽序列)
<400> 29
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala
85 90 95
Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 30
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HzTFPI4F36-CDRgrafted HC 氨基酸序列, 人IgG4(S241P)
(省略信号肽序列)
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 31
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Ile His Leu Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 32
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 33
<211> 224
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 33
Glu Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly
210 215 220
<210> 34
<211> 222
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220

Claims (15)

1.一种单克隆抗体，其能够特异性地结合TFPI的K2结构域，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基R17的表位。
2.一种单克隆抗体，其能够特异性地结合TFPI的K2结构域，其中所述抗体能够结合包含一个或多个选自下述的残基的表位：SEQ ID NO: 2的E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、F35、K36和L50。
3.一种单克隆抗体，其能够结合TFPI的K2结构域，其中所述抗体的轻链包含氨基酸残基：
• E，其在与SEQ ID NO: 15的位置31相对应的位置，
• S，其在与SEQ ID NO: 15的位置32相对应的位置，
• D，其在与SEQ ID NO: 15的位置33相对应的位置，
• Y，其在与SEQ ID NO: 15的位置37相对应的位置，
• A，其在与SEQ ID NO: 15的位置96相对应的位置，
• T，其在与SEQ ID NO: 15的位置97相对应的位置，和
• F，其在与SEQ ID NO: 15的位置99相对应的位置；
且其中所述抗体的重链包含氨基酸残基：
• N，其在与SEQ ID NO 18的位置31相对应的位置，
• R，其在与SEQ ID NO 18的位置53相对应的位置，
• S，其在与SEQ ID NO 18的位置54相对应的位置，
• Y，其在与SEQ ID NO 18的位置57相对应的位置，
• Y，其在与SEQ ID NO 18的位置59相对应的位置，
• F，其在与SEQ ID NO 18的位置60相对应的位置，
• P，其在与SEQ ID NO 18的位置61相对应的位置，
• D，其在与SEQ ID NO 18的位置62相对应的位置，
• Q，其在与SEQ ID NO 18的位置65相对应的位置，
• Y，其在与SEQ ID NO 18的位置102相对应的位置，
• D，其在与SEQ ID NO 18的位置103相对应的位置，和
• D，其在与SEQ ID NO 18的位置106相对应的位置。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其中所述重链另外包含S，其在与SEQ ID NO: 18的位置52相对应的位置，和/或其中所述轻链另外包含H，其在与SEQ ID NO: 15的位置98相对应的位置，且所述重链另外包含S，其在与SEQ ID NO: 18的位置56相对应的位置。
5.一种单克隆抗体，其能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域，其中所述抗体的重链包含：
• SEQ ID NO:18的氨基酸31-35 (NYAMS)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO:18的氨基酸50-66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO:18的氨基酸99-110 (LGGYDEGDAMDS)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。
6.一种单克隆抗体，其能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域，其中所述抗体的轻链包含：
• SEQ ID NO: 15的氨基酸24-39 (KSSQSLLESDGKTYLN)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO: 15的氨基酸55-61 (LVSILDS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或
• SEQ ID NO: 15的氨基酸94-102 (LQATHFPQT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。
7.一种单克隆抗体，其能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz 2 (K2)结构域，其中所述抗体的重链包含：
• SEQ ID NO:18的氨基酸31-35 (NYAMS)的CDR1序列，和
• SEQ ID NO:18的氨基酸50-66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)的CDR2序列，和
• SEQ ID NO:18的氨基酸99-110 (LGGYDEGDAMDS)的CDR3序列
且其中所述抗体的轻链包含：
• SEQ ID NO: 15的氨基酸24-39 (KSSQSLLESDGKTYLN)的CDR1序列；和
• SEQ ID NO: 15的氨基酸55-61 (LVSILDS)的CDR2序列；和
• SEQ ID NO: 15的氨基酸94-102 (LQATHFPQT)的CDR3序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 15，且所述抗体的重链包含SEQ ID NO: 18。
9.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 21，且所述抗体的重链包含SEQ ID NO: 24。
10.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其能够以比mAb2974更高的亲和力结合TFPI的K2结构域。
11.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，当TFPI被所述抗体饱和时，所述抗体能够将膜-结合的FVIIa/TF/FXa的TFPI抑制中和至少55%、诸如至少60%、诸如至少65%、诸如至少70%、诸如至少75%、诸如至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如多达100%、诸如100%，这在FVIIa/TF/FXa抑制剂试验中测定。
12.一种真核细胞，其表达根据权利要求1-10中任一项的单克隆抗体或其片段。
13.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-10中任一项的抗体或根据权利要求11所述的多核苷酸和药学上可接受的载体或稀释剂。
14.根据权利要求1-10中任一项的单克隆抗体用于治疗具有凝血病的受试者的用途。
15.一种治疗具有凝血病的受试者的方法，所述方法包括，给所述受试者施用根据权利要求1-10中任一项所述的单克隆抗体。
CN200980157157.2A 2008-12-22 2009-12-18 针对组织因子途径抑制剂的抗体 Active CN102325795B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08172520 2008-12-22
EP08172520.2 2008-12-22
PCT/EP2009/067598 WO2010072691A1 (en) 2008-12-22 2009-12-18 Antibodies against tissue factor pathway inhibitor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102325795A true CN102325795A (zh) 2012-01-18
CN102325795B CN102325795B (zh) 2015-03-25

Family

ID=40639722

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980157157.2A Active CN102325795B (zh) 2008-12-22 2009-12-18 针对组织因子途径抑制剂的抗体

Country Status (19)

Country Link
US (5) US8361469B2 (zh)
EP (3) EP3260466A1 (zh)
JP (2) JP5714505B2 (zh)
KR (2) KR101600308B1 (zh)
CN (1) CN102325795B (zh)
AU (1) AU2009331570C1 (zh)
BR (1) BRPI0924058B1 (zh)
CA (1) CA2745317C (zh)
DK (1) DK2379600T4 (zh)
ES (1) ES2458665T5 (zh)
FR (1) FR24C1008I1 (zh)
IL (1) IL213356A (zh)
MX (1) MX2011006501A (zh)
PL (1) PL2379600T5 (zh)
PT (1) PT2379600E (zh)
RU (1) RU2562114C2 (zh)
TW (1) TWI476003B (zh)
WO (1) WO2010072691A1 (zh)
ZA (1) ZA201104599B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105026428A (zh) * 2013-12-12 2015-11-04 上海恒瑞医药有限公司 PD-l抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN105209496A (zh) * 2013-03-15 2015-12-30 拜尔健康护理有限责任公司 针对组织因子途径抑制剂的前体药物抗体
CN107922506A (zh) * 2015-08-19 2018-04-17 辉瑞公司 组织因子途径抑制剂抗体及其用途
WO2022002249A1 (zh) * 2020-07-02 2022-01-06 北京拓界生物医药科技有限公司 抗FXI/FXIa抗体、其抗原结合片段及医药用途

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110039218A (ko) 2008-06-30 2011-04-15 노보 노르디스크 에이/에스 항－인간 인터루킨－２０ 항체
UA112050C2 (uk) * 2008-08-04 2016-07-25 БАЄР ХЕЛСКЕР ЛЛСі Терапевтична композиція, що містить моноклональне антитіло проти інгібітора шляху тканинного фактора (tfpi)
CN102325795B (zh) * 2008-12-22 2015-03-25 诺沃—诺迪斯克有限公司 针对组织因子途径抑制剂的抗体
US8454956B2 (en) 2009-08-31 2013-06-04 National Cheng Kung University Methods for treating rheumatoid arthritis and osteoporosis with anti-IL-20 antibodies
EP3708190A1 (en) 2010-02-26 2020-09-16 Novo Nordisk A/S Stable antibody containing compositions
NZ602115A (en) 2010-03-01 2014-12-24 Bayer Healthcare Llc Optimized monoclonal antibodies against tissue factor pathway inhibitor (tfpi)
US20130136733A1 (en) * 2010-05-28 2013-05-30 Novo Nordisk A/S Stable Multi-Dose Compositions Comprising an Antibody and a Preservative
US9228022B2 (en) 2010-06-30 2016-01-05 Novo Nordisk A/S Antibodies that are capable of specifically binding tissue factor pathway inhibitor
TW201212938A (en) 2010-06-30 2012-04-01 Novo Nordisk As Antibodies that are capable of specifically binding tissue factor pathway inhibitor
MX2013011218A (es) * 2011-04-01 2013-10-17 Bayer Healthcare Llc Anticuerpos monoclonales frente al inhibidor de la ruta del factor tisular (tfpi).
WO2014015133A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 National Cheng Kung University Treatment of osteoarthritis using il-20 antagonists
US8603470B1 (en) 2012-08-07 2013-12-10 National Cheng Kung University Use of IL-20 antagonists for treating liver diseases
US8852588B2 (en) 2012-08-07 2014-10-07 National Cheng Kung University Treating allergic airway disorders using anti-IL-20 receptor antibodies
US9592297B2 (en) 2012-08-31 2017-03-14 Bayer Healthcare Llc Antibody and protein formulations
US9556280B2 (en) * 2013-03-15 2017-01-31 Bayer Healthcare Llc Anti-TFPI antibody variants with differential binding across PH range for improved pharmacokinetics
CN105209497B (zh) * 2013-03-15 2021-09-07 诺和诺德股份有限公司 能够特异性结合组织因子途径抑制物上的两个表位的抗体
WO2015007880A1 (en) * 2013-07-19 2015-01-22 Novo Nordisk A/S Antibodies recognizing the n-terminal part of tissue factor pathway inhibitor capable of eliciting pro-coagulant activity
EP3036005A4 (en) 2013-08-21 2017-04-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for targeting connexin hemichannels
MX366359B (es) * 2014-04-27 2019-07-05 Ccam Biotherapeutics Ltd Anticuerpos humanizados contra la molecula de adhesion celular relacionada al antigeno carcinoembrionico 1 (ceacam1).
JP6783754B2 (ja) * 2014-09-17 2020-11-11 ノヴォ ノルディスク アー／エス 組織因子経路インヒビター（１〜１６１）上の２つのエピトープに結合する能力がある抗体
EA036490B1 (ru) * 2015-02-25 2020-11-17 Могам Инститьют Фор Байомедикал Рисерч Антитела, связывающиеся с tfpi, и содержащая их композиция
US10889637B2 (en) 2016-02-26 2021-01-12 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods of treating an osteolytic tumor and spinal cord injury by administering connexin (Cx) 43 hemichannel-binding antibodies
TWI788321B (zh) * 2017-01-20 2023-01-01 美商健臻公司 骨靶向抗體
JP7094722B2 (ja) * 2018-02-28 2022-07-04 キヤノン株式会社 画像読取装置及び画像形成装置
KR102337683B1 (ko) * 2018-09-21 2021-12-13 주식회사 녹십자 고효율 항-tfpi 항체 조성물
MX2021004120A (es) * 2018-10-11 2021-09-10 Pfizer Regimen de dosificacion para antagonistas de tfpi.
CN112442127A (zh) * 2019-08-29 2021-03-05 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 针对tfpi的单克隆抗体
AU2020385048A1 (en) * 2019-11-13 2022-06-02 Pfizer Inc. Stable aqueous anti-TFPI antibody formulation
EP4216923A1 (en) 2020-09-24 2023-08-02 Novo Nordisk Health Care AG Pharmaceutical formulation of concizumab and method of production thereof
WO2023143559A1 (en) * 2022-01-30 2023-08-03 Westlake University Tfpi binding polypeptides and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992007584A1 (en) * 1990-10-31 1992-05-14 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical preparation for the treatment of prolonged coagulation time

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4966852A (en) * 1987-07-23 1990-10-30 Monsanto Company DNA clone of human tissue factor inhibitor
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
EP0539975A1 (en) † 1991-10-31 1993-05-05 Teijin Limited Method for immunological assay of free lipoprotein-associated coagulation inhibitor (LACI) and kit therefor
JPH06153985A (ja) * 1992-11-16 1994-06-03 Teijin Ltd モノクローナル抗体
JPH06153981A (ja) 1992-11-30 1994-06-03 Teijin Ltd Ｌａｃｉの免疫学的測定方法、それに用いるキット並びにモノクローナル抗体
US5455338A (en) * 1993-11-05 1995-10-03 Zymogenetics, Inc. DNA encoding novel human kunitz-type inhibitors and methods relating thereto
US5589359A (en) 1994-08-05 1996-12-31 Chiron Corporation Chimeric proteins
JPH0875736A (ja) 1994-09-06 1996-03-22 Chemo Sero Therapeut Res Inst ヒト組織因子凝固系インヒビターの定量法
US5902582A (en) * 1995-09-05 1999-05-11 Chiron Corporation Use of TFPI inhibitor for treatment of cancer
JP3681206B2 (ja) 1995-12-26 2005-08-10 株式会社三菱化学ヤトロン 抗ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モノクローナル抗体及びその使用
EP0981548A4 (en) 1997-04-30 2005-11-23 Enzon Inc SINGLE CHAIN PROTEINS FIXING ANTIGENS CAPABLE OF GLYCOSYLATION, PRODUCTION AND USES THEREOF
US6656467B2 (en) * 2000-01-27 2003-12-02 Medimmune, Inc. Ultra high affinity neutralizing antibodies
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
JP2007534631A (ja) 2003-10-28 2007-11-29 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ ラミニン−５γ２結合性ペプチド、その関連組成物およびその使用
US7585842B2 (en) 2004-04-16 2009-09-08 The Reagents Of The University Of California Human kunitz-type inhibitor with enhanced antifibrinolytic activity
US7015746B1 (en) * 2004-05-06 2006-03-21 National Semiconductor Corporation Bootstrapped bias mixer with soft start POR
JP2008531692A (ja) † 2005-03-04 2008-08-14 ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・イリノイ 凝固及び線維素溶解カスケードのモジュレーター
UA112050C2 (uk) † 2008-08-04 2016-07-25 БАЄР ХЕЛСКЕР ЛЛСі Терапевтична композиція, що містить моноклональне антитіло проти інгібітора шляху тканинного фактора (tfpi)
KR101977846B1 (ko) * 2008-12-19 2019-05-14 박스알타 인코퍼레이티드 Tfpi 억제제 및 사용 방법
CN102325795B (zh) 2008-12-22 2015-03-25 诺沃—诺迪斯克有限公司 针对组织因子途径抑制剂的抗体
EP2379599B1 (en) * 2008-12-22 2015-09-02 Novo Nordisk A/S Antibodies against tissue factor pathway inhibitor (tfpi)
US8965454B2 (en) 2009-03-04 2015-02-24 Andrew Llc Amplifier system for cell sites and other suitable applications
WO2011022427A1 (en) 2009-08-18 2011-02-24 Archemix Corp. Aptamers to tissue factor pathway inhibitor and their use as bleeding disorder therapeutics
US8598327B2 (en) 2009-08-18 2013-12-03 Baxter International Inc. Aptamers to tissue factor pathway inhibitor and their use as bleeding disorder therapeutics
NZ602115A (en) † 2010-03-01 2014-12-24 Bayer Healthcare Llc Optimized monoclonal antibodies against tissue factor pathway inhibitor (tfpi)
US8598008B2 (en) † 2010-10-20 2013-12-03 Texas Instruments Incorporated Stacked ESD clamp with reduced variation in clamp voltage
WO2012109675A1 (en) † 2011-02-11 2012-08-16 Baxter International Inc. Aptamers to tissue factor pathway inhibitor and their use as bleeding disorder therapeutics
MX2013011218A (es) † 2011-04-01 2013-10-17 Bayer Healthcare Llc Anticuerpos monoclonales frente al inhibidor de la ruta del factor tisular (tfpi).
AU2013235567A1 (en) † 2012-03-22 2014-10-09 Baxalta GmbH Aptamers to tissue factor pathway inhibitor and their use as bleeding disorder therapeutics
CN105209497B (zh) 2013-03-15 2021-09-07 诺和诺德股份有限公司 能够特异性结合组织因子途径抑制物上的两个表位的抗体
EA036490B1 (ru) † 2015-02-25 2020-11-17 Могам Инститьют Фор Байомедикал Рисерч Антитела, связывающиеся с tfpi, и содержащая их композиция
SG10201912817YA (en) † 2015-08-19 2020-02-27 Pfizer Tissue factor pathway inhibitor antibodies and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992007584A1 (en) * 1990-10-31 1992-05-14 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical preparation for the treatment of prolonged coagulation time

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BROZE GJJR: "Tissue factor pathway inhibitor and the revised theory of coagulation", 《ANNUAL REVIEW OF MEDICINE》 *
EDSTROM CS ET AL: "Expression of tissue factor pathway inhibitor in human fetal and placental tissues", 《EARLY HUMAN DEVELOPMENT》 *
ZHANG J ET AL: "Glycosyl phosphatidylinositol anchorage of tissue factor pathway inhibitor-", 《CIRCULATION》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105209496A (zh) * 2013-03-15 2015-12-30 拜尔健康护理有限责任公司 针对组织因子途径抑制剂的前体药物抗体
CN105026428A (zh) * 2013-12-12 2015-11-04 上海恒瑞医药有限公司 PD-l抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN105026428B (zh) * 2013-12-12 2018-01-16 上海恒瑞医药有限公司 PD‑l抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN107922506A (zh) * 2015-08-19 2018-04-17 辉瑞公司 组织因子途径抑制剂抗体及其用途
TWI640538B (zh) * 2015-08-19 2018-11-11 輝瑞股份有限公司 組織因子途徑抑制劑（ｔｆｐｉ）抗體類及彼等之用途
CN114163531A (zh) * 2015-08-19 2022-03-11 辉瑞公司 组织因子途径抑制剂抗体及其用途
WO2022002249A1 (zh) * 2020-07-02 2022-01-06 北京拓界生物医药科技有限公司 抗FXI/FXIa抗体、其抗原结合片段及医药用途

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201104599B (en) 2012-03-28
EP2746294A2 (en) 2014-06-25
DK2379600T4 (da) 2021-01-04
TW201026330A (en) 2010-07-16
JP2015178495A (ja) 2015-10-08
JP5714505B2 (ja) 2015-05-07
PT2379600E (pt) 2014-04-29
ES2458665T5 (es) 2021-06-30
IL213356A0 (en) 2011-07-31
US20170114147A1 (en) 2017-04-27
KR20110103432A (ko) 2011-09-20
ES2458665T3 (es) 2014-05-06
US9574011B2 (en) 2017-02-21
FR24C1008I1 (fr) 2024-04-19
MX2011006501A (es) 2011-07-12
RU2011129068A (ru) 2013-01-27
CA2745317C (en) 2019-03-05
US20110318356A1 (en) 2011-12-29
TWI476003B (zh) 2015-03-11
DK2379600T3 (da) 2014-04-28
EP2379600A1 (en) 2011-10-26
AU2009331570A1 (en) 2011-06-30
US20130251721A1 (en) 2013-09-26
AU2009331570B2 (en) 2013-10-17
US20190211112A1 (en) 2019-07-11
US8361469B2 (en) 2013-01-29
EP2746294A3 (en) 2015-01-07
AU2009331570C1 (en) 2024-04-18
KR101745394B1 (ko) 2017-06-09
PL2379600T5 (pl) 2021-03-08
JP2012513377A (ja) 2012-06-14
EP2379600B2 (en) 2020-10-14
IL213356A (en) 2017-06-29
US8652471B2 (en) 2014-02-18
US20130251722A1 (en) 2013-09-26
PL2379600T3 (pl) 2014-07-31
CN102325795B (zh) 2015-03-25
KR20160031028A (ko) 2016-03-21
EP2379600B1 (en) 2014-01-22
RU2562114C2 (ru) 2015-09-10
EP3260466A1 (en) 2017-12-27
BRPI0924058B1 (pt) 2021-08-17
JP6114326B2 (ja) 2017-04-12
WO2010072691A1 (en) 2010-07-01
CA2745317A1 (en) 2010-07-01
BRPI0924058A2 (pt) 2019-10-15
KR101600308B1 (ko) 2016-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102325795B (zh) 针对组织因子途径抑制剂的抗体
CN108715615B (zh) 抗pd1抗体及其作为治疗剂与诊断剂的用途
CN114539414B (zh) 抗凝血因子xi抗体
KR20160078499A (ko) 종양 괴사 인자-유사 리간드 1a 특이적 항체 및 그의 조성물 및 용도
KR20120102125A (ko) Ｇｐｖｉ에 대한 신규한 길항제 항체 및 그의 ｆａｂ 단편 및 그의 용도
TW201041594A (en) Compositions and methods for increasing muscle growth
TW200909447A (en) Antigen binding proteins that bind PAR-2
MX2012010198A (es) Anticuerpos monoclonales optimizados contra el inhibidor de la via del factor tisular (tfpi).
CN113234145A (zh) 特异性结合新型冠状病毒的抗体
US20190315886A1 (en) Thrombin antibody, antigen-binding fragment and pharmaceutical use thereof
TW201217524A (en) Anti-IL 12 Rbeta 1 antibodies and their use in treating autoimmune and inflammatory disorders
JP2014526886A (ja) マクロファージ遊走阻止因子（ｍｉｆ）とｄ−ドーパクロームトートメラーゼ（ｄ−ｄｔ）に交差反応性がある抗体
AU2014200227A1 (en) Antibodies against tissue factor pathway inhibitor
US20240010750A1 (en) Novel anti-a2ap antibodies and uses thereof
JP2024515643A (ja) 抗ヒトｍａｓｐ－２抗体、並びにその製造法及び使用
JP2024063234A (ja) 新規な抗ａ２ａｐ抗体およびその使用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant