TWI640538B - 組織因子途徑抑制劑（ｔｆｐｉ）抗體類及彼等之用途 - Google Patents

組織因子途徑抑制劑（ｔｆｐｉ）抗體類及彼等之用途 Download PDF

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Abstract

本發明關於特異結合組織因子途徑抑制劑(TFPI)並抑制其活性之抗體類及彼等之抗原結合片段。該等抗體類及片段可用於治療出血性病症並縮短凝血時間。

Description

組織因子途徑抑制劑(TFPI)抗體類及彼等之用途
本發明關於結合組織因子途徑抑制劑(TFPI)之抗體類。
A型和B型血友病為分別由血漿蛋白第VIII因子(FVIII)或第IX因子(FIX)功能缺陷所引起之X性聯遺傳疾病。血友病之臨床嚴重性與凝血因子活性之殘留水準有關。因子活性<1%與嚴重表型有關，中度血友病與2%至5%之因子活性有關，輕度血友病與5%至40%之因子活性有關。
這些疾病之護理標準為透過靜脈內輸注來替代缺失之凝血因子。該替代因子通常為重組蛋白，諸如Xyntha(第VIII因子)或BeneFIX(FIX)，但仍使用各種純度之血漿衍生產品。以替代因子進行之治療可為偶發性地在出血發生時根據需要來治療出血或預防性地經由將因子水準保持在保護範圍內來預防出血。有明顯證據表明預防性治療可防止出血及為血友病患者之主要病態的相關之關節 損傷。有效之預防性治療需要每周靜脈內注射因子3至4次，這導致順應性的困難並降低生活品質。由於製造凝血因子之複雜性，治療成本亦昂貴。此外，不少患者，高達32%之重度A型血友病患者對所投予之因子發展出中和抗體，這被那些在這些基因中具有突變之患者視為外源蛋白。這些患者需要替代之治療方式，諸如旁路因子，第VIIa因子(NovoSeven)。
替代之治療方法為藉由擴充完整的外在途徑來繞過對替代因子的需求。血友病患者具有一些透過其完整之外在途徑來停止出血的能力；然而這不足以停止大量出血或防止自發性出血。該外在途徑不足以提供保護，因為其被組織因子途徑抑制劑(TFPI)快速關閉。
雖然WO 2010/017196(拜耳公司(Bayer))、WO 2011/109452(拜耳公司)、WO 2014/144577(拜耳公司)、WO 2010/072687(諾和諾德公司(Novo Nordis))、WO 2012/001087(諾和諾德公司)、WO 2014/140240(諾和諾德公司)和WO 2015/007880(諾和諾德公司)揭示結合人類TFPI之抗體，它們並未提供如本發明抗體般具有使該抗體成為新穎之血友病潛在治療劑的特性。
能夠提供預防性保護同時降低凝血因子之給藥頻率、減少因子之使用量、允許替代之遞送途徑(例如皮下)及具有較低之產生中和抗體的風險之產品將可滿足血友病患者未被滿足之重大需求。
本發明揭示及示例結合組織因子途徑抑制劑(TFPI)之抗體(及其抗原結合片段)。
本技藝之技術熟習人士僅使用常規實驗將可察知或能夠確定本文所描述之本發明之具體實施態樣的許多等效物。該類等效物預期包含在下列實施態樣(E)中。
E1. 一種特異結合組織因子途徑抑制劑(TFPI)之Kunitz結構域2(K2)的抗原決定部位之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位包含殘基Ile105、Arg107及Leu131(根據SEQ ID NO：2編號)。
E2. 如實施態樣第1項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不結合TFPI之Kunitz結構域1(K1)。
E3. 如實施態樣第1或2項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位進一步包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：Cys106、Gly108、Cys130、Leu131及Gly132(根據SEQ ID NO：2編號)。
E4. 如實施態樣第1至3項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位進一步包含殘基Cys106、Gly108、Cys130、Leu131及Gly132(根據SEQ ID NO：2編號)。
E5. 如實施態樣第1至4項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位進一步包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：Asp102、Arg112、Tyr127、 Gly129、Met134及Glu138(根據SEQ ID NO：2編號)。
E6. 如實施態樣第1至5項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位進一步包含Asp102、Arg112、Tyr127、Gly129、Met134及Glu138(根據SEQ ID NO：2編號)。
E7. 如實施態樣第1至6項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位不包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：E100、E101、P103、Y109、T111、Y113、F114、N116、Q118、Q121、C122、E123、R124、F125、K126及L140(根據SEQ ID NO：2編號)。
E8. 如實施態樣第1至7項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位不包含：E100、E101、P103、Y109、T111、Y113、F114、N116、Q118、Q121、C122、E123、R124、F125、K126及L140(根據SEQ ID NO：2編號)。
E9. 如實施態樣第1至6項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位不包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：D31、D32、P34、C35、K36、E100、E101、P103、Y109、K126及G128(根據SEQ ID NO：2編號)。
E10. 如實施態樣第1至6項及第9項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位不包含：D31、D32、P34、C35、K36、E100、E101、P103、Y109、K126及G128(根據SEQ ID NO：2編號)。
E11. 如實施態樣第1至10項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：Asp102、Gly104、Ile105、Cys106、Arg107、Gly108、Arg112、Tyr127、Gly129、Cys130、Leu131、Gly132、Asn133、Met134及Glu138(根據SEQ ID NO：2編號)，其中該抗原決定部位殘基由於與該抗體或其抗原結合片段交互作用而在掩藏之表面積(BSA)中具有非零變化。
E12. 如實施態樣第11項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位包含：Asp102、Gly104、Ile105、Cys106、Arg107、Gly108、Arg112、Tyr127、Gly129、Cys130、Leu131、Gly132、Asn133、Met134及Glu138(根據SEQ ID NO：2編號)。
E13. 如實施態樣第1至12項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：Asp102、Arg107、Arg112、Tyr127及Leu131(根據SEQ ID NO：2編號)，其中該抗原決定部位殘基與一來自該抗體或其抗原結合片段之殘基參與氫鍵。
E14. 如實施態樣第13項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位包含：Asp102、Arg107、Arg112、Tyr127及Leu131(根據SEQ ID NO：2編號)。
E15. 如實施態樣第1至14項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位包含一或多個選自由下 列所組成之群組的接觸殘基：Asp102、Gly104、Ile105、Cys106、Arg107、Gly108、Arg112、Tyr127、Gly129、Cys130、Leu131、Gly132、Met134及Glu138(根據SEQ ID NO：2編號)。
E16. 如實施態樣第15項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位包含：Asp102、Gly104、Ile105、Cys106、Arg107、Gly108、Arg112、Tyr127、Gly129、Cys130、Leu131、Gly132、Met134及Glu138(根據SEQ ID NO：2編號)。
E17. 如實施態樣第1至16項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含下列由於與TFPI交互作用而在BSA中具有非零變化之重(H)鏈和輕(L)鏈抗體結合部位(paratope)殘基(根據Kabat編號)：H33 Ala、H58 Tyr、H95 Leu、H96 Gly、H97 Ala、H98 Thr、H99 Ser、H100 Leu、H100A Ser、L29 Ala、L31 Tyr、L91 Tyr、L95A Ser及L95B Gly。
E18. 如實施態樣第1至17項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含下列接觸殘基(根據Kabat編號)：(1)H47為Trp或Tyr；(b)H58為Tyr；及(c)L91為Tyr或Arg；並可選擇地包含：(d)L96為Gly或Asn。
E19. 如實施態樣第1至18項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含下列接觸殘基(根據Kabat編號)：(a)H33為Ala、Asn、Gly、His、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Val；(b)H47為Trp或Tyr；(c)H50 為Ala、Arg、Gly、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr或Val；(d)H51為Ile、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、HIS、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；(e)H52為Ser、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly HIS、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr或Val；(f)H56為Ser、Arg、Gly、HIS、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；(g)H58為Tyr；(h)H95為Leu、Gln、Ile、Phe或Tyr；(i)H96為Gly、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr或Val；(j)H97為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、HIS、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；(k)H98為Thr、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、HIS、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；(l)H99為Ser、Ala、Gly、Phe或Pro；(m)H100為Leu、Arg、HIS、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Trp、Tyr或Val；(n)H100A為Ser、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、HIS、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr或Trp；(o)L29為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、HIS、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr或Trp、Tyr、Val；(p)L31為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、HIS、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；(q)L91為Tyr或Arg，(r)L95A為Ser、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、HIS、Leu、 Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；(s)L95B為Ser、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、HIS、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；及(t)L95C為Ser、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、HIS、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；並可選擇地包含下列殘基：(u)L93為Tyr、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；及(v)L96為Gly或Asn。
E20. 如實施態樣第1至18項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含下列接觸殘基(根據Kabat編號)：(a)H33為Ala或Val；(b)H47為Trp；(c)H50為Ala；(d)H51為Ile；(e)H52為Ser、Arg、Lys、Phe或Tyr；(f)H56為Ser、Arg或Lys；(g)H58為Tyr；(h)H95為Leu；(i)H96為Gly、Ala、Arg、Asn、Lys、Pro、Ser或Val；(j)H97為Ala；(k)H98為Thr、His、Ile、Leu、Met、Phe或Tyr；(l)H99為Ser；(m)H100為Leu、Phe、Trp或Tyr；(n)H100A為Ser、Arg、Asn、Gln、Glu、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro或Trp；(o)L29為Ala；(p)L31為Tyr；(q)L91為Tyr；(r)L95A為Ser、Phe、Trp或Tyr；(s)L95B為Gly；及(t)L95C為Ser、Arg、Asn、Gln、Glu、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Trp、Tyr或Val；並可選擇地包含下列殘基：(u)L93為Ser；及(v)L96為Gly。
E21. 如實施態樣第1至18項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含下列接觸殘基(根據Kabat編號)：(a)H33為Ala、Val、His或Phe；(b)H47為Trp或Tyr；(c)H50為Ala、Thr、Ser或Phe；(d)H51為Ile、Arg、Lys或Pro；(e)H52為Ser、Phe、Arg或Tyr；(f)H56為Ser、Lys、Tyr或Phe；(g)H58為Tyr；(h)H95為Leu、Ile、Gln或Phe；(i)H96為Gly、Arg、Asn或Lys；(j)H97為Ala、Leu、Tyr或Ile；(k)H98為Thr、Tyr、Phe或His；(l)H99為Ser、Pro、Ala或Phe；(m)H100為Leu、Tyr、Trp或Phe；(n)H100A為Ser、Arg、Leu或Trp；(o)L29為Ala、Glu、Asp或Gln；(p)L31為Tyr、Glu、Asp或Trp；(q)L 91為Ty或Arg；(r)L95A為Ser、Phe、Tyr或His；L95B為Gly、Glu、Asp或Pro；及(t)L95C為Ser、Trp、Tyr或Phe；並可選擇地包含下列殘基：(u)L93為Ser、Glu、Asp或His；及(v)L96為Gly或Asn。
E22. 如實施態樣第1至18項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含下列接觸殘基(根據Kabat編號)：H33 Ala、H47 Trp、H50 Ala、H51 Ile、H52 Ser、H56 Ser、H58 Tyr、H95 Leu、H96 Gly、H97 Ala、H98 Thr、H99 Ser、H100 Leu、H100A Ser、L29 Ala、L31 Tyr、L91 Tyr、L95A Ser、L95B Gly及L95C Ser；並可選擇地包含下列殘基：L93 Ser及L96 Gly。
E23. 如實施態樣第1至22項中任一項之抗體或其抗 原結合片段，其包含含有下列群組之重鏈可變區(VH)：(a)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的VH互補決定區1(CDR-H1)；(b)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的VH互補決定區2(CDR-H2)；及(c)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的VH互補決定區3(CDR-H3)。
E24. 如實施態樣第1至22項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：41之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。
E25. 如實施態樣第1至24項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH3框架序列。
E26. 如實施態樣第1至24項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH1框架序列。
E27. 如實施態樣第1至24項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH5框架序列。
E28. 如實施態樣第1至24項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGHV3-23或IGHV1-69之VH框架序列。
E29. 如實施態樣第1至24項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGHV3-7之VH框架序列。
E30. 如實施態樣第1至24項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH種系共有框架序列。
E31. 如實施態樣第1至30項中任一項之抗體或其抗 原結合片段，其包含含有與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VH：SEQ ID NO：41、63及65。
E32. 如實施態樣第1至31項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之VH：SEQ ID NO：41、63及65。
E33. 如實施態樣第1至32項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：41之胺基酸序列的VH。
E34. 如實施態樣第1至32項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：63之胺基酸序列的VH。
E35. 如實施態樣第1至32項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：65之胺基酸序列的VH。
E36. 如實施態樣第1至35項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有下列群組之輕鏈可變區(VL)：(a)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VL互補決定區1(CDR-L1)；(b)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的VL互補決定區2(CDR-L2)；及(c)包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的VL互補決定區3(CDR-L3)。
E37. 如實施態樣第1至35項中任一項之抗體或其抗 原結合片段，其包含SEQ ID NO：36之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。
E38. 如實施態樣第1至37項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VK框架序列。
E39. 如實施態樣第1至37項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類V λ 框架序列。
E40. 如實施態樣第1至37項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGKV3-20之VL框架序列。
E41. 如實施態樣第1至37項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGKV1-39之VL框架序列。
E42. 如實施態樣第1至37項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VL種系共有框架序列。
E43. 如實施態樣第1至42項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：36具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VL。
E44. 如實施態樣第1至43項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：36之胺基酸序列之VL。
E45. 如實施態樣第1至44項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：20具有至少90%之同一性的胺基酸序列之重鏈恆定區(CH)。
E46. 如實施態樣第1至45項中任一項之抗體或其抗 原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CH。
E47. 如實施態樣第1至46項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：26具有至少90%之同一性的胺基酸序列之輕鏈恆定區(CL)。
E48. 如實施態樣第1至47項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：26之胺基酸序列的CL。
E49. 如實施態樣第1至48項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含Fc結構域。
E50. 如實施態樣第49項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgA之Fc結構域。
E51. 如實施態樣第50項之抗體或其抗原結合片段，其中該IgA為IgA1或IgA2。
E52. 如實施態樣第49項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgD之Fc結構域。
E53. 如實施態樣第49項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgE之Fc結構域。
E54. 如實施態樣第49項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgM之Fc結構域。
E55. 如實施態樣第49項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgG之Fc結構域。
E56. 如實施態樣第55項之抗體或其抗原結合片段，其中該IgG為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
E57. 如實施態樣第1至56項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈。
E58. 如實施態樣第1至56項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：64之胺基酸序列的重鏈。
E59. 如實施態樣第1至56項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：66之胺基酸序列的重鏈。
E60. 如實施態樣第1至59項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：37之胺基酸序列的輕鏈。
E61. 如實施態樣第1至60項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含由存在於寄存在ATCC編號為PTA-122329之質體中的插入子編碼的VH序列。
E62. 如實施態樣第1至61項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含由存在於寄存在ATCC編號為PTA-122328之質體中的插入子編碼的VL序列。
E63. 如實施態樣第1至4項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位進一步包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：Glu 100、Glu 101、Asp 102、Gly 104及Tyr 109(根據SEQ ID NO：2編號)。
E64. 如實施態樣第1至4項及63項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位進一步包含Glu 100、Glu 101、Asp 102、Gly 104及Tyr 109(根據SEQ ID NO：2編號)。
E65. 如實施態樣第1至4項及63至64項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位不包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：P103、T111、Y113、F114、N116、Q118、Q121、C122、E123、R124、F125、K126及L140(根據SEQ ID NO：2之編號)。
E66. 如實施態樣第1至4項及63至65項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位不包含：P103、T111、Y113、F114、N116、Q118、Q121、C122、E123、R124、F125、K126及L140(根據SEQ ID NO：2之編號)。
E67. 如實施態樣第1至4項及63至64項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位不包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：D31、D32、P34、C35、K36、P103、K126、Y127、G128(根據SEQ ID NO：2之編號)。
E68. 如實施態樣第1至4項、63至64項及67項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位不包含：D31、D32、P34、C35、K36、P103、K126、Y127、G128(根據SEQ ID NO：2之編號)。
E69. 如實施態樣第1至4項及63至68項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含下列殘基(根據Kabat編號)：H33 Ala、H35 Gln、H52 Ser、H53 Asn、H55 Arg、H56 Ser、H95 Phe、H96 Leu、H97 His、H99 Ser、H101 Asp、L31 Met、L32 Tyr、L34 His、L36 Tyr、L50 Arg、L91 Trp及L96 Tyr。
E70. 如實施態樣第1至4項及63至69項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有下列群組之VH：(a)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR-H3。
E71. 如實施態樣第1至4項及63至69項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：51之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。
E72. 如實施態樣第1至4項及63至71項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH3、VH1或VH5框架序列。
E73. 如實施態樣第1至4項及63至72項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGHV3-23或IGHV1-69之VH框架序列。
E74. 如實施態樣第1至4項及63至72項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGHV3-7之VH框架序列。
E75. 如實施態樣第1至4項及63至71項中任一項 之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH種系共有框架序列。
E76. 如實施態樣第1至4項及63至75項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VH：SEQ ID NO：67、69、51及79。
E77. 如實施態樣第1至4項及63至76項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之VH：SEQ ID NO：67、69、51及79。
E78. 如實施態樣第1至4項及63至77項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的VH。
E79. 如實施態樣第1至4項及63至77項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的VH。
E80. 如實施態樣第1至4項及63至77項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：51之胺基酸序列的VH。
E81. 如實施態樣第1至4項及63至77項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：79之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)。
E82. 如實施態樣第1至4項及63至81項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有下列群組之VL： (a)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的CDR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列的CDR-L3。
E83. 如實施態樣第1至4項及63至81項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：46之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。
E84. 如實施態樣第1至4項及63至83項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VK或V λ 框架序列。
E85. 如實施態樣第1至4項及63至84項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGKV3-20或IGKV1-39之VL框架序列。
E86. 如實施態樣第1至4項及63至83項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VL種系共有框架序列。
E87. 如實施態樣第1至4項及63至86項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與選自由下列所組成之群組的序列具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VL：SEQ ID NO：46、71、73、75及77。
E88. 如實施態樣第1至4項及63至87項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之VL：SEQ ID NO：46、71、73、75及77。
E89. 如實施態樣第1至4項及63至88項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：46之胺基酸序列的VL。
E90. 如實施態樣第1至4項及63至88項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：71之胺基酸序列的VL。
E91. 如實施態樣第1至4項及63至88項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：73之胺基酸序列的VL。
E92. 如實施態樣第1至4項及63至88項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：75之胺基酸序列的VL。
E93. 如實施態樣第1至4項及63至88項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：77之胺基酸序列的VL。
E94. 如實施態樣第1至4項及63至93項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：20具有至少90%之同一性的胺基酸序列的CH。
E95. 如實施態樣第1至4項及63至94項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CH。
E96. 如實施態樣第1至4項及63至95項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：26具有至少90%之同一性的胺基酸序列之CL。
E97. 如實施態樣第1至4項及63至96項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：26之胺基酸序列的CL。
E98. 如實施態樣第1至4項及63至97項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含Fc結構域。
E99. 如實施態樣第98項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgA之Fc結構域。
E100. 如實施態樣第99項之抗體或其抗原結合片段，其中該IgA為IgA1或IgA2。
E101. 如實施態樣第98項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgD、IgE或IgM之Fc結構域。
E102. 如實施態樣第98項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgG之Fc結構域。
E103. 如實施態樣第102項之抗體或其抗原結合片段，其中該IgG為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
E104. 如實施態樣第1至4項及63至103項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：52之胺基酸序列的重鏈。
E105. 如實施態樣第1至4項及63至103項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的重鏈。
E106. 如實施態樣第1至4項及63至103項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：70之胺基酸序列的重鏈。
E107. 如實施態樣第1至4項及63至103項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：80之胺基酸序列的重鏈。
E108. 如實施態樣第1至4項及63至107項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的輕鏈。
E109. 如實施態樣第1至4項及63至107項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：72之胺基酸序列的輕鏈。
E110. 如實施態樣第1至4項及63至107項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：74之胺基酸序列的輕鏈。
E111. 如實施態樣第1至4項及63至107項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：76之胺基酸序列的輕鏈。
E112. 如實施態樣第1至4項及63至107項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：78之胺基酸序列的輕鏈。
E113. 一種特異結合組織因子途徑抑制劑(TFPI)之Kunitz結構域2(K2)中之抗原決定部位之經分離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位包含殘基Glu101、Pro103、Tyr109、Thr111、Ser119、Gln121、Glu123、Arg124、Lys126及Leu140(根據SEQ ID NO：2編號)。
E114. 如實施態樣第113項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不結合TFPI之Kunitz結構域1(K1)。
E115. 如實施態樣第113或114項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位不包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：E100、D102、R107、Y113、F114、N116、Q118及C122(根據SEQ ID NO：2編號)。
E116. 如實施態樣第113至115項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位不包含：E100、D102、R107、Y113、F114、N116、Q118及C122(根據SEQ ID NO：2之編號)。
E117. 如實施態樣第113或114項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位不包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：D31、D32、P34、C35、K36、E100、I105、R107、G108、Y127及G128(根據SEQ ID NO：2之編號)。
E118. 如實施態樣第113至114項及117項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位不包含：D31、D32、P34、C35、K36、E100、I105、R107、G108、Y127及G128(根據SEQ ID NO：2之編號)。
E119. 如實施態樣第113至118項之抗體或其抗原結合片段，其包含下列殘基(根據Kabat編號)：H50 Asp、H57 Thr、H58 Leu、H59 Tyr、H61 Gln、H98 Asp、H99 Tyr、H100 Asp、L30 His、L50Trp、L92Tyr、L93 Thr、 L94 Thr及L96 Tyr。
E120. 如實施態樣第113至119項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有下列群組之VH：(a)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列的CDR-H3。
E121. 如實施態樣第113至119項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：90之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。
E122. 如實施態樣第113至121項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH3、VH1或VH5框架序列。
E123. 如實施態樣第113至122項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGHV3-23、IGHV1-69或IGHV3-7之VH框架序列。
E124. 如實施態樣第113至121項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH種系共有框架序列。
E125. 如實施態樣第113至124項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VH：SEQ ID NO：90、95、97、99、101、103、105及 107。
E126. 如實施態樣第113至125項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之VH：SEQ ID NO：90、95、97、99、101、103、105及107。
E127. 如實施態樣第113至126項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：90之胺基酸序列的VH。
E128. 如實施態樣第113至126項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：95之胺基酸序列的VH。
E129. 如實施態樣第113至126項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：97之胺基酸序列的VH。
E130. 如實施態樣第113至126項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：99之胺基酸序列的VH。
E131. 如實施態樣第113至126項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：101之胺基酸序列的VH。
E132. 如實施態樣第113至126項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：103之胺基酸序列的VH。
E133. 如實施態樣第113至126項中任一項之抗體或 其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：105之胺基酸序列的VH。
E134. 如實施態樣第113至126項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：107之胺基酸序列的VH。
E135. 如實施態樣第113至134項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有下列群組之VL：(a)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的CDR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的CDR-L3。
E136. 如實施態樣第113至134項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：84之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。
E137. 如實施態樣第113至136項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VK或V λ 框架序列。
E138. 如實施態樣第113至137項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGKV3-20或IGKV1-39之VL框架序列。
E139. 如實施態樣第113至136項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VL種系共有框架序列。
E140. 如實施態樣第113至139項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列具有至少90%之同一性的胺基酸序列之 VL：SEQ ID NO：84、109及111。
E141. 如實施態樣第113至140項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之VL：SEQ ID NO：84、109及111。
E142. 如實施態樣第113至141項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：84之胺基酸序列的VL。
E143. 如實施態樣第113至141項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：109之胺基酸序列的VL。
E144. 如實施態樣第113至141項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：111之胺基酸序列的VL。
E145. 如實施態樣第113至144項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：20具有至少90%之同一性的胺基酸序列之CH。
E146. 如實施態樣第113至145項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CH。
E147. 如實施態樣第113至144項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：91具有至少90%之同一性的胺基酸序列之CH。
E148. 如實施態樣第113至144項及147項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：91 之胺基酸序列的CH。
E149. 如實施態樣第113至148項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：14具有至少90%之同一性的胺基酸序列之CL。
E150. 如實施態樣第113至149項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的CL。
E151. 如實施態樣第113至148項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：85具有至少90%之同一性的胺基酸序列之CL。
E152. 如實施態樣第113至148項及第151項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CL。
E153. 如實施態樣第113至152項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含Fc結構域。
E154. 如實施態樣第153項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgA(例如IgA1或IgA2)之Fc結構域。
E155. 如實施態樣第153項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgD、IgE或IgM之Fc結構域。
E156. 如實施態樣第153項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgG之Fc結構域。
E157. 如實施態樣第156項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該IgG為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
E158. 如實施態樣第113至157項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：92之胺基酸序列的重鏈。
E159. 如實施態樣第113至157項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：94之胺基酸序列的重鏈。
E160. 如實施態樣第113至157項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：96之胺基酸序列的重鏈。
E161. 如實施態樣第113至157項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：98之胺基酸序列的重鏈。
E162. 如實施態樣第113至157項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：100之胺基酸序列的重鏈。
E163. 如實施態樣第113至157項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：102之胺基酸序列的重鏈。
E164. 如實施態樣第113至157項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：104之胺基酸序列的重鏈。
E165. 如實施態樣第113至157項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：106之胺基酸序列的重鏈。
E166. 如實施態樣第113至157項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：108之胺基酸序列的重鏈。
E167. 如實施態樣第113至166項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：86之胺基酸序列的輕鏈。
E168. 如實施態樣第113至166項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：93之胺基酸序列的輕鏈。
E169. 如實施態樣第113至166項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：110之胺基酸序列的輕鏈。
E170. 如實施態樣第113至166項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：112之胺基酸序列的輕鏈。
E171. 一種特異結合TFPI之Kunitz結構域2(K2)之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含含有下列群組之VH：(a)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR-H3。
E172. 一種特異結合TFPI之K2結構域之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：19之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。
E173. 一種特異結合TFPI之K2結構域之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含含有下列群組之VL：(a)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的CDR-L3。
E174. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：13之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。
E175. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：(i)VH，其包含：(a)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR-H3；及(ii)VL，其包含：(a)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR-L2； 及(c)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的CDR-L3。
E176. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：19之CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列及SEQ ID NO：13之CDR-L1、CDR L3和CDR-L3序列。
E177. 如實施態樣第171至176項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH3、VH1或VH5框架序列。
E178. 如實施態樣第171至177項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGHV3-23、IGHV1-69或IGHV3-7之VH框架序列。
E179. 如實施態樣第171至176項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH種系共有框架序列。
E180. 如實施態樣第171至179項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：19具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VH。
E181. 如實施態樣第171至180項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的VH。
E182. 如實施態樣第171至181項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VK或V λ 框架序列。
E183. 如實施態樣第171至182項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGKV3-20或IGKV1- 39之VL框架序列。
E184. 如實施態樣第171至181項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VL種系共有框架序列。
E185. 如實施態樣第171至184項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：13具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VL。
E186. 如實施態樣第171至185項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的VL。
E187. 如實施態樣第171至186項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：20具有至少90%之同一性的胺基酸序列之CH。
E188. 如實施態樣第171至187項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CH。
E189. 如實施態樣第171至188項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：14具有至少90%之同一性的胺基酸序列之CL。
E190. 如實施態樣第171至189項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的CL。
E191. 如實施態樣第171至190項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含Fc結構域。
E192. 如實施態樣第191項之抗體或其抗原結合片 段，其中該Fc結構域為IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE或IgM之Fc結構域。
E193. 如實施態樣第191項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgG之Fc結構域。
E194. 如實施態樣第191項之抗體或其抗原結合片段，其中該IgG為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
E195. 如實施態樣第171至194項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：21之胺基酸序列的重鏈。
E196. 如實施態樣第171至195項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈。
E197. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含含有下列群組之VH：(a)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的CDR-H3。
E198. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：31之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。
E199. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之 抗體或其抗原結合片段，其包含含有下列群組之VL：(a)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的CDR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的CDR-L3。
E200. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：25之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。
E201. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：(i)VH，其包含：(a)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的CDR-H3；及(ii)VL，其包含：(a)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的CDR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的CDR-L3。
E202. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：31之CDR- H1、CDR-H2和CDR-H3序列及SEQ ID NO：25之CDR-L1、CDR L2及CDR-L3序列。
E203. 如實施態樣第197至202項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH3、VH1或VH5框架序列。
E204. 如實施態樣第197至203項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGHV3-23、IGHV1-69或IGHV3-7之VH框架序列。
E205. 如實施態樣第197至202項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH種系共有框架序列。
E206. 如實施態樣第197至205項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：31具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VH。
E207. 如實施態樣第197至206項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：31之胺基酸序列的VH。
E208. 如實施態樣第197至207項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VK或V λ 框架序列。
E209. 如實施態樣第197至208項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGKV3-20或IGKV1-39之VL框架序列。
E210. 如實施態樣第197至207項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VL種系共有框架序列。
E211. 如實施態樣第197至210項中任一項之抗體或 其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：25具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VL。
E212. 如實施態樣第197至211項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：25之胺基酸序列的VL。
E213. 如實施態樣第197至212項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：20具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VL。
E214. 如實施態樣第197至213項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的VL。
E215. 如實施態樣第197至214項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：26具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VL。
E216. 如實施態樣第197至215項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：26之胺基酸序列的VL。
E217. 如實施態樣第197至216項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含Fc結構域。
E218. 如實施態樣第217項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE或IgM之Fc結構域。
E219. 如實施態樣第217項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或 IgG4)之Fc結構域。
E220. 如實施態樣第197至219項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：32之胺基酸序列的重鏈。
E221. 如實施態樣第197至220項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈。
E222. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含含有下列群組之重鏈可變區(VH)：(a)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR-H3。
E223. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：61之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。
E224. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含含有下列群組之VL：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的CDR-L2；及 (c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR-L3。
E225. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：56之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。
E226. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：(i)VH，其包含：(a)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR-H3；及(ii)VL，其包含：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的CDR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR-L3。
E227. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：61之CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列及SEQ ID NO：56之CDR-L1、CDR L3和CDR-L3序列。
E228. 如實施態樣第222至227項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH3、VH1或VH5框架序 列。
E229. 如實施態樣第222至228項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGHV3-23、IGHV1-69或IGHV3-7之VH框架序列。
E230. 如實施態樣第222至227項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH種系共有框架序列。
E231. 如實施態樣第222至230項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：61具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VH。
E232. 如實施態樣第222至231項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：61之胺基酸序列的VH。
E233. 如實施態樣第222至232項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VK或V λ 框架序列。
E234. 如實施態樣第222至233項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGKV3-20或IGKV1-39之VL框架序列。
E235. 如實施態樣第222至232項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VL種系共有框架序列。
E236. 如實施態樣第222至235項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：56具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VL。
E237. 如實施態樣第222至236項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：56之胺基酸 序列的VL。
E238. 如實施態樣第222至237項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：20具有至少90%之同一性的胺基酸序列之CH。
E239. 如實施態樣第222至238項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CH。
E240. 如實施態樣第222至239項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：26具有至少90%之同一性的胺基酸序列之CL。
E241. 如實施態樣第222至240項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：26之胺基酸序列的CL。
E242. 如實施態樣第222至241項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含Fc結構域。
E243. 如實施態樣第222至242項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE或IgM之Fc結構域。
E244. 如實施態樣第242項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgG(例如gG1、IgG2、IgG3或IgG4)之Fc結構域。
E245. 如實施態樣第222至244項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：62之胺基酸序列的重鏈。
E246. 如實施態樣第222至245項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：57之胺基酸序列的輕鏈。
E247. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含含有下列群組之VH：(a)包含SEQ ID NO：118之胺基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列的CDR-H3。
E248. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：121之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。
E249. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含含有下列群組之VL：(a)包含SEQ ID NO：113之胺基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：114之胺基酸序列的CDR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：115之胺基酸序列的CDR-L3。
E250. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：116之 CDR-L1、CDR-L2 B CDR-L3序列。
E251. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：(i)VH，其包含：(a)包含SEQ ID NO：118之胺基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列的CDR-H3；及(ii)VL，其包含：(a)包含SEQ ID NO：113之胺基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：114之胺基酸序列的CDR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：115之胺基酸序列的CDR-L3。
E252. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：121之CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列，以及SEQ ID NO：116之CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
E253. 如實施態樣第247至253項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH3、VH1或VH5框架序列。
E254. 如實施態樣第247至253項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGHV3-23、IGHV1-69或IGHV3-7之VH框架序列。
E255. 如實施態樣第247至252項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH種系共有框架序列。
E256. 如實施態樣第247至255項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：121具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VH。
E257. 如實施態樣第247至256項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：121之胺基酸序列的VH。
E258. 如實施態樣第247至257項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VK或V λ 框架序列。
E259. 如實施態樣第247至258項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGKV3-20或IGKV1-39之VL框架序列。
E260. 如實施態樣第247至257項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VL種系共有框架序列。
E261. 如實施態樣第247至260項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：116具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VL。
E262. 如實施態樣第247至261項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：116之胺基酸序列的VL。
E263. 如實施態樣第247至262項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：91具有至少90%之同一性的胺基酸序列之CH。
E264. 如實施態樣第247至263項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：91之胺基酸序列的CH。
E265. 如實施態樣第247至264項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：85具有至少90%之同一性的胺基酸序列之CL。
E266. 如實施態樣第247至265項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CL。
E267. 如實施態樣第247至266項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含Fc結構域。
E268. 如實施態樣第267項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE或IgM之Fc結構域。
E269. 如實施態樣第267項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgG(例如gG1、IgG2、IgG3或IgG4)之Fc結構域。
E270. 如實施態樣第247至269項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：122之胺基酸序列的重鏈。
E271. 如實施態樣第247至270項中任一項之抗體或 其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：117之胺基酸序列的輕鏈。
E272. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含含有下列群組之VH：(a)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：130之胺基酸序列的CDR-H3。
E273. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：131之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。
E274. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含含有下列群組之VL：(a)包含SEQ ID NO：123之胺基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：124之胺基酸序列的CDR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：125之胺基酸序列的CDR-L3。
E275. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：126之CDR-L1、CDR L3和CDR-L3序列。
E276. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：(i)VH，其包含：(a)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：130之胺基酸序列的CDR-H3；及(ii)VL，其包含：(a)包含SEQ ID NO：123之胺基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：124之胺基酸序列的CDR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：125之胺基酸序列的CDR-L3。
E277. 一種特異結合TFPI之K2結構域的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：131之CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列及SEQ ID NO：126之CDR-L1、CDR L3和CDR-L3序列。
E278. 如實施態樣第272至277項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH3、VH1或VH5框架序列。
E279. 如實施態樣第272至278項中任一項之抗體或 其抗原結合片段，其包含人類IGHV3-23、IGHV1-69或IGHV3-7之VH框架序列。
E280. 如實施態樣第272至277項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VH種系共有框架序列。
E281. 如實施態樣第272至280項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：131具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VH。
E282. 如實施態樣第272至281項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：131之胺基酸序列的VH。
E283. 如實施態樣第272至282項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VK或V λ 框架序列。
E284. 如實施態樣第272至283項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類種系IGKV3-20或IGKV1-39之VL框架序列。
E285. 如實施態樣第272至282項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含人類VL種系共有框架序列。
E286. 如實施態樣第272至285項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：126具有至少90%之同一性的胺基酸序列之VL。
E287. 如實施態樣第272至286項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：126之胺基酸序列的VL。
E288. 如實施態樣第272至287項中任一項之抗體或 其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：91具有至少90%之同一性的胺基酸序列之CH。
E289. 如實施態樣第272至288項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：91之胺基酸序列的CH。
E290. 如實施態樣第272至289項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：85具有至少90%之同一性的胺基酸序列之CL。
E291. 如實施態樣第272至290項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CL。
E292. 如實施態樣第272至291項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含Fc結構域。
E293. 如實施態樣第292項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE或IgM之Fc結構域。
E294. 如實施態樣第292項之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc結構域為IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)之Fc結構域。
E295. 如實施態樣第272至294項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：132之胺基酸序列的重鏈。
E296. 如實施態樣第272至295項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO：127之胺基酸 序列的輕鏈。
E297. 一種特異結合TFPI之K2結構域之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與如實施態樣第1至296項中任一項之抗體或其抗原結合片段競爭結合TFPI。
E298. 一種特異結合TFPI之K2結構域之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與選自由下列所組成之群組的抗體競爭結合TFPI：TFPI-3、TFPI-21、TFPI-23、TFPI-24、TFPI-26、TFPI-106、TFPI-107、TFPI-108、TFPI-109、TFPI-110、TFPI-111、TFPI-112、TFPI-113、TFPI-114、TFPI-115、TFPI-118、TFPI-119、TFPI-122、TFPI-123、TFPI-126、4D8.b1、mu-hu 4D8嵌合體、4D8-Vk1.0 x VH1.0、4D8-Vk1.0 x VH1.1、4D8-Vk1.0 x VH1.2、4D8-Vk1.0 x VH1.3、4D8-Vk1.0 x VH1.4、4D8-Vk1.0 x VH1.5、4D8-Vk1.0 x VH1.6、4D8-Vk1.1 x VH1.0、4D8-Vk1.1 x VH1.1、4D8-Vk1.1 x VH1.2、4D8-Vk1.1 x VH1.3、4D8-Vk1.1 x VH1.4、4D8-Vk1.1 x VH1.5、4D8-Vk1.1 x VH1.6、hz4D8、6B7.c5及7A4.D9。
E299. 一種特異結合TFPI之K2結構域之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與選自由下列所組成之群組的抗體競爭結合TFPI：TFPI-23、TFPI-24、TFPI-106及TFPI-118。
E300. 如實施態樣第299項之抗體或其抗原結合片 段，其中該抗體或其抗原結合片段與TFPI-23或TFPI-106競爭結合TFPI。
E301. 如實施態樣第299項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與TFPI-24或TFPI-118競爭結合TFPI。
E302. 一種特異結合TFPI之K2結構域之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與抗體4D8競爭結合TFPI。
E303. 一種特異結合TFPI之K2結構域之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與實施態樣第1至296項中任一項之抗體或其抗原結合片段結合至相同之TFPI抗原決定部位。
E304. 一種特異結合TFPI之K2結構域之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與選自由下列所組成之群組的抗體結合至相同之TFPI抗原決定部位：TFPI-3、TFPI-21、TFPI-23、TFPI-24、TFPI-26、TFPI-106、TFPI-107、TFPI-108、TFPI-109、TFPI-110、TFPI-111、TFPI-112、TFPI-113、TFPI-114、TFPI-115、TFPI-118、TFPI-119、TFPI-122、TFPI-123、TFPI-126、4D8.b1、mu-hu 4D8嵌合體、4D8-Vk1.0 x VH1.0、4D8-Vk1.0 x VH1.1、4D8-Vk1.0 x VH1.2、4D8-Vk1.0 x VH1.3、4D8-Vk1.0 x VH1.4、4D8-Vk1.0 x VH1.5、4D8-Vk1.0 x VH1.6、4D8-Vk1.1 x VH1.0、4D8-Vk1.1 x VH1.1、4D8-Vk1.1 x VH1.2、4D8-Vk1.1 x VH1.3、4D8- Vk1.1 x VH1.4、4D8-Vk1.1 x VH1.5、4D8-Vk1.1 x VH1.6、hz4D8、6B7.c5及7A4.D9。
E305. 一種特異結合TFPI之K2結構域之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與選自由下列所組成之群組的抗體結合至相同之TFPI抗原決定部位：TFPI-23、TFPI-24、TFPI-106及TFPI-118。
E306. 如實施態樣第305項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與TFPI-23或TFPI-106結合至相同之TFPI抗原決定部位。
E307. 如實施態樣第305項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與TFPI-24或TFPI-118結合至相同之TFPI抗原決定部位。
E308. 一種特異結合TFPI之K2結構域之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與抗體4D8結合至相同之TFPI抗原決定部位。
E309. 如實施態樣第297至308項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不與TFPI之K1結構域結合。
E310. 如實施態樣第1至309項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為Fc融合蛋白、單域抗體(monobody)、大型抗體(maxibody)、雙功能抗體、scFab、scFv、肽體(peptibody)或前述任何抗原結合片段。
E311. 如實施態樣第1至310項中任一項之抗體或其 抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以約1×10-7M至約1×10-12M之結合親和力(Kd)值結合TFPI。
E312. 如實施態樣第1至311項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以約5×10-7M至約5×10-11M之結合親和力(Kd)值結合TFPI。
E313. 如實施態樣第1至312項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以約1×10-8M至約1×10-10M之結合親和力(Kd)值結合TFPI。
E314. 如實施態樣第1至313項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段：(i)減少如在基於血漿之稀釋凝血酶原時間(dPT)分析中所測量之凝血時間；(ii)減少如藉由血栓消融術(thromboelastrography)或旋轉血栓彈性分析術(thromboelastometry)所測量之全血凝血時間；(iii)增加凝血酶生成；(iv)增加存有TFPI時之FXa活性；或(v)彼等之任何組合。
E315. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段減少如在基於血漿之稀釋凝血酶原時間分析中所測量之凝血時間。
E316. 如實施態樣第315項之抗體或其抗原結合片段，其中該如在基於血漿之稀釋凝血酶原時間分析中所測量之凝血時間減少為劑量依賴性。
E317. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段減少如藉由血栓消融術 或旋轉血栓彈性分析術所測量之全血凝血時間。
E318. 如實施態樣第317項之抗體或其抗原結合片段，其中該如藉由血栓消融術或旋轉血栓彈性分析術所測量之全血凝血時間減少為劑量依賴性。
E319. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段增加凝血酶生成。
E320. 如實施態樣第319項之抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶生成之增加為劑量依賴性。
E321. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段增加存有TFPI時之FXa活性。
E322. 如實施態樣第321項之抗體或其抗原結合片段，其中該存有TFPI時增加之FXa活性為劑量依賴性。
E323. 如實施態樣第322項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體增進存有TFPI時之血小板累積。
E324. 如實施態樣第323項之抗體或其抗原結合片段，其中該存有TFPI時增進之血小板累積為劑量依賴性。
E325. 如實施態樣第324項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體增加存有TFPI時之纖維蛋白生成。
E326. 如實施態樣第325項之抗體或其抗原結合片段，其中該存有TFPI時增加之纖維蛋白生成為劑量依賴性。
E327. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片 段，其中該全血凝血時間減少係使用從患有嚴重A型血友病之人類患者取得之全血測定。
E328. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該全血凝血時間減少係使用從患有嚴重A型血友病之人類患者取得之全血及針對人類第VIII因子之抑制性抗體測定。
E329. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該全血凝血時間減少係使用從患有中度A型血友病之人類患者取得之全血測定。
E330. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該全血凝血時間減少係使用從患有嚴重B型血友病之人類患者取得之全血測定。
E331. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該全血凝血時間減少係使用從患有嚴重B型血友病之人類患者取得之全血及針對人類第Ⅸ因子之抑制性抗體測定。
E332. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該全血凝血時間減少係使用從患有中度B型血友病之人類患者取得之全血測定。
E333. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該如在dPT分析中所測量之凝血時間減少係使用從患有嚴重A型血友病之人類患者取得之血漿測定。
E334. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該如在dPT分析中所測量之凝血時間減少係使用 從患有嚴重A型血友病之人類患者取得之血漿及針對人類第VIII因子之抑制性抗體測定。
E335. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該如在dPT分析中所測量之凝血時間減少係使用從患有中度A型血友病之人類患者取得之血漿測定。
E336. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該如在dPT分析中所測量之凝血時間減少係使用從患有嚴重B型血友病之人類患者取得之血漿測定。
E337. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該如在dPT分析中所測量之凝血時間減少係使用從患有嚴重B型血友病之人類患者取得之血漿及針對人類第Ⅸ因子之抑制性抗體測定。
E338. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該如在dPT分析中所測量之凝血時間減少係使用從患有中度B型血友病之人類患者取得之血漿測定。
E339. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶生成增加係使用從患有嚴重A型血友病之人類患者取得之血漿測定。
E340. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶生成增加係使用從患有嚴重A型血友病之人類患者取得之血漿及針對人類第VIII因子之抑制性抗體測定。
E341. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶生成增加係使用從患有中度A型血友病 之人類患者取得之血漿測定。
E342. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶生成增加係使用從患有嚴重B型血友病之人類患者取得之血漿測定。
E343. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶生成增加係使用從患有嚴重B型血友病之人類患者取得之血漿及針對人類第Ⅸ因子之抑制性抗體測定。
E344. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶生成增加係使用從患有中度B型血友病之人類患者取得之血漿測定。
E345. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中100nM之該抗體或其抗原結合片段在減少從患有嚴重A型血友病之人類患者取得之全血的凝血時間上至少與足以取得5%正常凝血活性之重組型人類第VIII因子之量同樣有效。
E346. 如實施態樣第314項之抗體或其抗原結合片段，其中100nM之該抗體或其抗原結合片段在增加從患有嚴重A型血友病之人類患者取得之富集血小板血漿之峰值凝血酶生成上至少與足以取得5%正常凝血活性之重組型人類第VIII因子之量同樣有效。
E347. 如實施態樣第1至346項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該TFPI為人類TFPI。
E348. 如實施態樣第1至347項中任一項之抗體或 其抗原結合片段，其中該TFPI包含SEQ ID NO：2之殘基91至147。
E349. 一種經分離之核酸分子或核酸分子類之，其包含一或多個編碼如實施態樣第1至348項中任一項之抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。
E350. 一種編碼特異性結合TFPI之抗體或其抗原結合片段之經分離的核酸分子，其中該核酸包含選自由下列所組成之群組的核酸序列：SEQ ID NO：175之核酸序列、SEQ ID NO：176之核酸序列、SEQ ID NO：177之核酸序列、SEQ ID NO：178之核酸序列、以mAb-TFPI-106 VL寄存在ATCC編號PTA-122328下之載體的插入子核酸序列及以mAb-TFPI-106 VH寄存在ATCC編號PTA-122329下之載體的插入子核酸序列。
E351. 一種載體，其包含如實施態樣第349及350項之核酸分子。
E352. 一種宿主細胞，其包含如實施態樣第349或350項之核酸分子或如實施態樣第351項之載體。
E353. 如實施態樣第352項之宿主細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
E354. 如實施態樣第353項之宿主細胞，其中該宿主細胞為CHO細胞、HEK-293細胞或Sp2.0細胞。
E355. 一種製造抗體或其抗原結合片段之方法，其包含在其中該抗體或其抗原結合片段係由該宿主細胞表現之條件下培養如實施態樣第352至354項中任一項之宿主細 胞。
E356. 如實施態樣第355項之方法，其進一步包含分離該抗體或其抗原結合片段。
E357. 一種抗體或其抗原結合片段，其係藉由如實施態樣第355或356項之方法取得。
E358. 一種醫藥組成物，其包含如實施態樣第1至347項及357項中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載體或賦形劑。
E359. 一種降低組織因子途徑抑制劑(TFPI)之活性的方法，其包含對有此需要之個體投予治療有效量之如實施態樣第1至347項及357項中任一項之抗體或其抗原結合片段或如實施態樣第358項之醫藥組成物。
E360. 一種縮短出血時間之方法，其包含對有此需要之個體投予治療有效量之如實施態樣第1至347項及357項中任一項之抗體或其抗原結合片段或如實施態樣第358項之醫藥組成物。
E361. 如實施態樣第358或360項之方法，其中該個體為人類。
E362. 如實施態樣第359至361項中任一項之方法，.其中該個體罹患或容易血液凝固不足。
E363. 如實施態樣第359至361項中任一項之方法，其中該個體罹患或容易罹患血小板病症。
E364. 如實施態樣第359至361項中任一項之方法，其中該個體罹患或容易罹患A型、B型或C型血友病。
E365. 如實施態樣第359至361項中任一項之方法，其中該個體罹患或容易罹患A型或B型血友病。
E366. 如實施態樣第359至361項中任一項之方法，其中該個體罹患或容易罹患類血友病(von Willebrand disease)(vWD)。
E367. 如實施態樣第360項之方法，其進一步包含投予治療有效量之FVII。
E368. 如實施態樣第367項之方法，其中該方法在存有TFPI時增加凝血酶生成。
E369. 如實施態樣第359至368項中任一項之方法，其包含經由靜脈內途徑投予該抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物。
E370. 如實施態樣第359至368項中任一項之方法，其包含經由皮下途徑投予該抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物。
E371. 如實施態樣第359至368項中任一項之方法，其該抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物係每3天投予一次、每4天投予一次、每5天投予一次、每6天投予一次、每週投予一次或每週投予二次。
E372. 如實施態樣第1至347項及357項中任一項之抗體或其抗原結合片段或如實施態樣第358項之醫藥組成物，其係作為藥物。
E373. 如實施態樣第1至347項及357項中任一項之抗體或其抗原結合片段或如實施態樣第358項之醫藥組成 物，其係用於降低個體之TFPI活性。
E374. 如實施態樣第1至347項及357項中任一項之抗體或其抗原結合片段或如實施態樣第358項之醫藥組成物，其係用於縮短個體之出血時間。
E375. 如實施態樣第372至374項中任一項之抗體或抗原結合片段或醫藥組成物，其中該個體為人類。
E376. 如實施態樣第372至375項中任一項之抗體或抗原結合片段或醫藥組成物，其中該個體罹患或容易血液凝固不足。
E377. 如實施態樣第372至375項中任一項之抗體或抗原結合片段或醫藥組成物，其中該個體罹患或容易罹患A型、B型或C型血友病。
E378. 如實施態樣第372至375項中任一項之抗體或抗原結合片段或醫藥組成物，其中該個體罹患或容易罹患A型或B型血友病。
E379. 如實施態樣第372至375項中任一項之抗體或抗原結合片段或醫藥組成物，其中該個體罹患或容易罹患類血友病(vWD)。
E380. 如實施態樣第372至375項中任一項之抗體或抗原結合片段或醫藥組成物，其中該個體罹患或容易罹患血小板病症。
E381. 一種如實施態樣第1至348項及357項中任一項之抗體或其抗原結合片段或如實施態樣第358項之醫藥組成物於降低個體之TFPI活性之用途。
E382. 一種如實施態樣第1至348項及357項中任一項之抗體或其抗原結合片段或如實施態樣第358項之醫藥組成物於製造用於降低個體之TFPI活性之藥物的用途。
E383. 一種如實施態樣第1至348項及357項中任一項之抗體或其抗原結合片段或如實施態樣第358項之醫藥組成物於縮短個體之出血時間的用途。
E384. 一種如實施態樣第1至348項及357項中任一項之抗體或其抗原結合片段或如實施態樣第358項之醫藥組成物於製造用於縮短個體之出血時間的藥物之用途。
E385. 如實施態樣第381至384項中任一項之用途，其中該個體為人類。
E386. 如實施態樣第381至384項中任一項之用途，其中該個體罹患或容易罹患血液凝固不足。
E387. 如實施態樣第381至384項中任一項之用途，其中該個體罹患或容易罹患A型、B型或C型血友病。
E388. 如實施態樣第381至384項中任一項之用途，其中該個體罹患或容易罹患A型或B型血友病。
E389. 如實施態樣第381至384項中任一項之用途，其中該個體罹患或容易罹患類血友病(vWD)。
E390. 如實施態樣第381至384項中任一項之用途，其中該個體罹患或容易罹患血小板病症。
第1A至1F圖之圖形顯示各種抗TFPI抗體及 TFPI之K2結構域的共晶體結構。尤其是，如第1F圖所示，與其他參考抗體相比較，本發明之示例性抗體TFPI-23、TFPI-24及4D8全部結合至K2結構域之非重疊抗原決定部位。TFPI-106與TFPI-23結合至同一位點，而TFPI-118與TFPI-24結合至同一位點。“R & D”或“R & D Fab”係指來自R & D系統之抗體Mab 2974。Novo2021抗體亦稱為“hz4F36”。“選殖株23”係指TFPI-23；“選殖株24”係指TFPI-24。
第2A至2E圖之圖形顯示在TFPI之K2結構域內之抗原決定部位殘基與來自各種抗TFPI抗體之抗體結合部位殘基之間的交互作用。“R & D”或“R & D Fab”係指來自R & D系統之抗體Mab 2974。“選殖株23”係指TFPI-23；“選殖株24”係指TFPI-24。
第3A至3E圖顯示在小鼠損傷模型中之各種抗TFPI抗體之體內效力。第3A和3B圖顯示當將2A8-200和2A8抗體(本研究中作為參考抗體)投予A型血友病第VIII因子缺乏(FVIII -/-)小鼠時，小鼠出血減少的持續時間。第3C圖顯示當將TFPI 4D8(對照組)、TFPI-21、TFPI-23及TFPI-24抗體投予A型血友病小鼠時抗體效力之持續時間。第3D和3E圖顯示當投予A型血友病小鼠TFPI-106和TFPI-118抗體時抗體效力之持續時間。在小鼠受傷前之指定時間點(小時(h))藉由靜脈內注射投予A型血友病小鼠(FVIII -/-)6mg/kg之抗體。然後在橫斷尾部後，測量失血的總體積(μL)。以經載劑(生理鹽水)治療之 A型血友病小鼠作為對照組。所有測量結果均以平均值±SEM呈現。*=P<0.05。FVIII +/+(野生型)小鼠接受鹽水。n=5/組。
第4圖顯示當投予B型血友病小鼠TFPI-106抗體時，小鼠在橫斷尾部後之出血持續時間。在小鼠受傷前之指定時間點(小時(h))藉由靜脈內注射投予B型血友病小鼠(FVIII -/-)6mg/kg之抗體。然後在橫斷尾部後，測量失血的總體積(μL)。以經載劑(生理鹽水)治療之A型血友病小鼠作為對照組。所有測量結果均以平均值±SEM呈現。*=P<0.05。n=4-5/組。
第5圖包含A表板和B表板，其各包含六個表板(第5A圖，1至6及第5B圖，1至6)，各表板顯示出活體顯微鏡檢查(IVM)之顯微照片，這些照片證明TFPI可在野生型小鼠體內血管損傷部位之血小板血栓及沿著內皮檢測到。第5A圖顯示使用結合血小板上之GP1bβ的經Dylight 649標記之CD42c所檢測到之損傷部位的血小板血栓增加。血小板是否存在係藉由表板1(0秒)；表板2(15秒)；表板3(30秒)；表板4(60秒)；表板5(90秒)；及表板6(120秒)中之檢測到的螢光信號證明。亦投予經Alexa 488標記之陰性對照IgG且並未檢測到螢光。包含表板1至6之第5B圖顯示出IVM之顯微照片，其證明藉由雷射在野生型小鼠中誘導血管損傷後，小鼠之血小板血栓及沿著內皮存有TFPI。在0秒(第5B圖，表板1)時並未檢測到經Alexa 488標記之TFPI(綠色信號以灰色顯 示)，而在15秒(第5B圖，表板2)時可以看到微弱信號。在30秒(第5B圖，表板3)時綠色螢光信號已增加並可看到微弱之紅色信號(經Dylight 649標記之CD42c)，其指示在約與檢測到TFPI之相同位點檢測到血小板累積。如第5B圖所示，表板4(60秒)顯示強烈之綠色及紅色螢光信號(二者均為淺灰，其中紅色螢光可在血管損傷位點之左側看到，而綠色信號主要在朝向損傷部位之右側檢測到)，其證明在損傷部位檢測到血小板積累及TFPI二者。第5B圖之表板5顯示出在60秒前可在損傷部位看到紅色(血小板)和綠色(TFPI)螢光信號，其中此二種信號都較30秒之信號強。第5B圖之表板6顯示出紅色(血小板)信號及綠色(TFPI)信號減弱，在120秒時仍可在損傷部位檢測到此二者。
第6A圖之圖形顯示利用IVM評估在A型血友病小鼠中經由雷射誘導血管損傷後TFPI-106之止血效果，其中該血小板血栓之量係以曲線下面積(AUC)表示(*=指示P<0.005)。第6A圖顯示與經投予鹽水之A型血友病小鼠在損傷後0.5小時缺乏血小板累積相比較，僅接受鹽水對照組之野生型小鼠(WT)在受傷後0.5小時在損傷部位之血小板累積。其中投予重組型第VIII因子(rFVIII)或TFPI-106之A型血友病小鼠在0.5小時可檢測血小板累積。經投予TFPI-106之A型血友病小鼠在168小時仍能檢測到血栓累積。
第6B圖之圖形顯示利用IVM評估在A型血 友病小鼠中經由雷射誘導血管損傷後TFPI-106之止血效果，其中該纖維蛋白生成量係以曲線下面積(AUC)表示(*=指示P<0.005)。相較於經投予鹽水之A型血友病小鼠在0.5小時缺乏可檢測到之纖維蛋白生成，第6B圖顯示與野生型小鼠(WT)在損傷後0.5小時的損傷位的纖維蛋白生成。其中投予重組型第VIII因子(rFVIII)或TFPI-106之A型血友病小鼠在0.5小時可檢測到纖維蛋白生成。經投予TFPI-106之A型血友病小鼠在168小時仍能檢測到纖維蛋白生成。
第7圖描繪之圖形顯示在1pm組織因子及4μM磷脂之存在下，在嚴重A型血友病血漿中投予TFPI-106及重組型VIIa因子(rFVIIa)對凝血酶生成分析(TGA)之影響。該圖形顯示具有單獨之TFPI-106(16μg/ml)及TFPI-106(16μg/ml)與rFVIIa(20μg/ml；2μg/ml；或0.2μg/ml)之組合的A型血友病血漿之凝血圖(thrombogram)。圖中亦顯示既不具有TFPI-106也不具有rFVIIa之A型血友病血漿及非血友病血漿的凝血圖。
第8A圖描繪之凝血圖顯示在1pM組織因子及4μM磷脂之存在下，當具有或不具有rFVIIa之TFPI-106，或僅有rFVIIa存在於A型血友病血漿中時對凝血酶生成的影響。包括非血友病血漿作為對照組。
第8B圖描繪之凝血圖顯示在三個貝塞斯達(Bethesda)單位(3BU)之抑制劑的存在下，當具有或不具有rFVIIa之TFPI-106，或僅有rFVIIa存在於檸檬酸化之 血小板貧乏的A型血友病血漿中時對凝血酶生成的影響。包括非血友病血漿作為對照組。圖中亦包括其中添加TFPI-106(16μg/ml)之非血友病血漿對照組。
第8C圖描繪之凝血圖顯示在三個貝塞斯達(Bethesda)單位(3BU)之抑制劑的存在下，當具有或不具有rFVIIa之TFPI-106，或僅有rFVIIa存在於檸檬酸化之血小板貧乏的B型血友病血漿中時對凝血酶生成的影響。包括非血友病血漿作為對照組。圖中亦包括其中添加TFPI-106(16μg/ml)之非血友病血漿對照組。
第9A圖顯示與對照組相比較，在斷尾後立即投予A型血友病小鼠抗體TFPI-106(6mg/kg)及分開之重組型第VIII因子(200單位/kg)對失血的影響。第9B圖顯示與對照組相比較，在斷尾後2分鐘投予A型血友病小鼠抗體TFPI-106(6mg/kg)及分開之重組型第VIII因子(200單位/kg)對失血的影響。
第10A圖顯示與重組型第VIII因子相比較，不同濃度之TFPI 106對來自患有嚴重A型血友病之人類患者的全血之凝血時間的影響。第10B圖顯示與重組型第VIII因子相比較，不同濃度之TFPI 106對來自患有嚴重A型血友病之人類患者之富含血小板血漿的峰值凝血酶生成之影響。
第11A圖顯示不同濃度之TFPI 106對來自具有嚴重A型血友病及針對FVIII之抑制劑的人類患者之全血凝血時間的影響。第11B圖顯示不同濃度之TFPI 106 對來自具有嚴重A型血友病及針對FVIII之抑制劑的人類患者之富含血小板血漿的峰值凝血酶生成之影響。第11C圖顯示不同濃度之TFPI 106對來自具有嚴重A型血友病及針對FVIII之抑制劑的人類患者之血小板貧乏血漿的凝血時間之影響。
第12A圖顯示與重組型第VIII因子相比較，不同濃度之TFPI 106對來自患有中度A型血友病之人類患者的全血凝血時間之影響。第12B圖顯示與重組型第VIII因子相比較，不同濃度之TFPI 106對來自患有中度A型血友病之人類患者之富含血小板血漿的峰值凝血酶生成之影響。第12C圖顯示不同濃度之TFPI 106對來自患有中度A型血友病之人類患者之血小板貧乏血漿的凝血時間之影響。
第13A圖顯示與重組型第IX因子相比較，不同濃度之TFPI 106對來自患有中度B型血友病之人類患者的全血凝血時間之影響。第13B圖顯示與重組型第IX因子相比較，不同濃度之TFPI 106對來自患有中度B型血友病之人類患者之富含血小板血漿的峰值凝血酶生成之影響。第13C圖顯示不同濃度之TFPI 106對來自患有中度B型血友病之人類患者的血小板貧乏血漿之凝血時間的影響。
第14A圖顯示與重組型第VIII因子相比較，不同濃度之TFPI 106對來自多位患有A型血友病之人類患者的全血凝血時間之影響。第14B圖顯示與重組型第 VIII因子相比較，不同濃度之TFPI 106對來自多位患有A型血友病之人類患者之富含血小板血漿的峰值凝血酶生成之影響。第14C圖顯示不同濃度之TFPI 106對來自多位患有B型血友病之人類患者的血小板貧乏血漿之凝血時間的影響。
發明之詳細說明
1. 概述
如上文所指，血友病患者透過其完整的外源性途徑可具有些許止血能力；然而該外源性途徑不足以提供保護，因其被組織因子途徑抑制劑(TFPI)迅速關閉。阻斷/中和這些患者中之TFPI抑制作用可彌補FXa生成不足並使出血素質標準化。因此，本發明揭示和示例特異性結合TFPI並抑制其活性之抗體類及彼等之抗原結合片段。
2. 定義
“降低TFPI之活性”一詞意指該抗體或其抗原結合片段可：(i)當藉由，例如基於血漿之稀釋凝血酶原時間分析測量時，與無該抗體存在時之凝固時間相比較，凝血時間減少；(ii)當藉由，例如血栓消融術或旋轉血栓彈性分析術測量時，與無該抗體存在時之凝固時間相比較，全血凝血時間減少；(iii)凝血酶生成增加；(iv)存有TFPI時增加FXa活性；(v)存有TFPI時增進血小板累積；(vi) 存有TFPI時增加纖維蛋白生成；或(vii)彼等之任何組合。抗體或抗原結合片段之抑制活性可，但不必定為劑量依賴性(例如當在基於血漿之稀釋凝血酶原時間分析中測量時引起凝血時間劑量依賴地減少)。
此外，依本發明所揭示及示例者，取得抗TFPI抗體與TFPI之Kunitz結構域2(K2結構域)的共晶體結構。結構分析顯示與其他公開揭示之TFPI抗體(其在實施例中作為參考抗體)相比較，本發明之示例性抗體識別TFPI之獨特抗原決定部位。例如，如第1A至1F圖和2A至2E圖中所示，與幾種參考TFPI抗體(R & D(Mab2479)Fab、Novo2021(亦稱為hz4F36)Fab、2A8 Fab)相比較，TFPI-23、TFPI-24及4D8抗體結合TFPI之K2結構域中的非重疊位點。
因此，於某些實施態樣中，本文所揭示之抗體(及抗原結合片段)識別位於TFPI之K2結構域的TFPI之獨特抗原決定部位。基於該共晶體結構及計算之丙胺酸掃描，此抗原決定部位包含三個對抗體-抗原交互作用重要的殘基：Ile105、Arg107及Leu131(根據SEQ ID NO：2中顯示之人類TFPI的編號)。將此三個殘基突變成丙胺酸會導致抗體結合喪失。例如，抗體TFPI-23及其變體(例如TFPI-106及TFPI-107)均識別此抗原決定部位。
於某些實施態樣中，識別本發明揭示之關鍵抗原決定部位殘基可允許該抗體(及其抗原結合片段)降低TFPI之活性。尤其是，該晶體結構顯示出TFPI之K2結 構域採用錐形結構，該錐體尖端(尤其Arg107)結合FXa。TFPI-23及TFPI-24二者均識別此錐形區之尖端並阻斷TFPI與FXa結合。抗體4D8識別K2結構域中之不同抗原決定部位。儘管不直接與該錐體尖端之殘基交互作用，但4D8阻斷TFPI與FXa結合。表15總結當與其他公知之TFPI抗體相比較時，被本發明之示例性抗體識別的非重疊抗原決定部位殘基。
此外，於某些實施態樣中，本發明之抗體類及彼等之抗原結合片段已顯示用於治療凝血缺陷(諸如血友病)及用於縮短出血時間之期望的藥理學活性和藥物動力學性質。
與一抗原決定部位“優先結合”或“特異性結合”(本文中可互換使用)之抗體為本技藝中所熟知之術語，而測定該等特異性或優先結合之方法亦為本技藝所熟知。相較於其與替代之細胞或物質反應或結合之持續時間及/或親和力，若分子以較長之持續時間及/或較大之親和力更頻繁、更迅速地與特定之細胞或物質反應或結合，則該分子被說是顯示出“特異性結合”或“優先結合”。相較於與其他物質之結合，若抗體以較大之親和力、結合性，更容易及/或以較長之持續時間與靶的結合，則該抗體為“特異性結合”或“優先結合”靶的。此外，相較於其與存在於樣本中之其他物質的結合，若抗體以較大之親和力、結合性、更容易及/或較長之持續時間與樣本中之靶的結合，則該抗體為“特異性結合”或“優先結合”靶的。例如，特異 性結合或優先結合TFPI抗原決定部位之抗體為以較其與其他TFPI抗原決定部位或非-TFPI抗原決定部位之結合而言更大之親和力、結合性、更容易及/或較長之持續時間結合此抗原決定部位的抗體。藉由閱讀此定義亦可理解，例如“特異性結合”或“優先結合”第一靶的之抗體(或部分或抗原決定部位)可能或可能不會特異性結合或優先結合第二靶的。因此，“特異性結合”或“優先結合”不一定需要(雖然其可包括)專一結合。一般而言，但不一定，提及結合意指優先結合。“特異性結合”或“優先結合”包括能識別並結合樣本中之特定分子，但基本上不識別或結合其他分子的化合物，例如蛋白質、核酸、抗體，等。例如，識別並結合樣本中之同源配體或結合伴侶(例如結合TFPI之抗TFPI抗體)，但基本上不識別或結合樣本中之其他分子的抗體或肽受體特異性結合該同源配體或結合伴侶。因此，在指定之分析條件下，該具體指明之結合部分(例如抗體或其抗原結合部分或受體或其配體結合部分)優先結合特定之靶的分子且不以顯著量結合存在於測試樣本中的其他組分。
多種分析格式可用來選擇特異性結合所欲分子之抗體或肽。例如固相ELISA免疫分析、免疫沉澱、BiacoreTM(GE Healthcare，紐澤西州Piscataway)、KinExA、螢光活化之細胞分選(FACS)、OctetTM(FortéBio公司，加州Menlo Park)及西方點墨分析為可用於鑑定與抗原或受體或其配體結合部分(其與同源配體或結合伴侶 特異性結合)特異性反應之抗體的許多分析之一。通常，特異性或選擇性反應將至少為背景信號或雜訊的二倍，更典型為超過背景10倍，再典型為超過背景50倍，再更典型為超過背景100倍，再更典型為超過背景500倍，甚至更典型為超過背景1000倍，且甚至更典型為超過背景10000倍。此外，當該平衡解離常數()7nM時，該抗體被說成“特異性結合”抗原。
本文中，術語“結合親和力”係作為二個分子(例如抗體或其片段與抗原)之間非共價交互作用強度之測量值。術語“結合親和性”係用來描述單價交互作用(內在活性)。
透過單價交互作用的二個分子(例如抗體或其片段與抗原)之間的結合親和力可藉由，例如測定解離常數(KD)定量。反過來，KD可藉由使用，例如表面等離子體共振(SPR)法(BIACORE)測量複合物形成和解離之動力學來測定。對應於該單價複合物之結合和解離的速率常數分別稱為結合速率常數k a (或k on )和解離速率常數k d (或k off )。KD透過程式KD=k d /k a 而與k a 和k d 相關聯。解離常數之數值可藉由為人周知之方法直接測定，且甚至可藉由，諸如闡述於例如Caceci等人(1984，Byte9：340-362)中之方法計算複雜的混合物。例如，KD可使用雙濾器硝化纖維素濾器結合分析建立，諸如由Wong & Lohman(1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5428-5432)所揭示者。其他用於評估配體(諸如針對靶抗原之抗體)之結合能 力的標準分析為本技藝所已知，包括，例如ELISA、西方點墨、RIA和流式細胞術分析，及本文中他處示例之其他分析。抗體之結合動力學和結合親和力亦可藉由本技藝已知之標準分析，諸如表面等離子體共振(SPR)(例如使用BiacoreTM系統或KinExA)評估。
可進行競爭性結合分析，其中將抗體與抗原之結合與靶的與該靶的之另一配體(諸如另一抗體或以其他方式結合該靶的之可溶性受體)之結合相比較。該發生50%抑制之濃度被稱為Ki。在理想情況下，該Ki等於KD。該Ki值將永遠不會少於KD，所以測量Ki可方便地被替代用來提供KD的上限。
根據上述定義，與不同分子交互作用相關的結合親和力(例如比較不同抗體對指定抗原之結合親和力)可藉由比較個別抗體/抗原複合物之KD值來比較。抗體或其他結合伴侶之KD值可使用本技藝已完善建立的方法來測定。一種用於測定該KD值之方法係使用表面離子體共振(通常係使用生物傳感器系統，諸如Biacore®系統)進行。
類似地，交互作用之特異性可藉由測定所欲之交互作用(例如抗體與抗原之間的特異性交互作用)之KD值並與非所欲之交互作用(例如已知不與TFPI結合之對照抗體)的KD值相比較來評估。
特異性結合其靶的之抗體可以高親和力(亦即，顯示如上文所討論之低KD值)結合其靶的，並以較低 之親和力結合非靶的分子。例如抗體可以1×10-6M或更高(較佳為1×10-5M或更高，更佳為1×10-4M或更高，更佳為1×10-3M或更高，再更佳為1×10-2M或更高)之KD值結合非靶的分子。較佳地，本發明之抗體能以高出其與另一非TFPI分子之結合親和力至少2倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000之親和力與其靶的結合。
一般而言，TFPI抗體需要以高親和力結合TFPI以有效地降低TFPI之活性。然而，當該抗體之結合親和力太高，該抗體可很快地被內在化並被宿主細胞降解。這可能導致半衰期很短和重複注射。例如抗體TFPI-23顯示出較TFPI-24低之結合親和力(Kd值)，而在某些情況下，因為其具有較低之內在化速率及較長的半衰期，似乎更有利於臨床使用。因此，結合親和力(Kd值)在5×10-7至約5×10-11M，尤其是約1×10-8至約1×10-10M通常是令人滿意的，尤其在用於治療需要重複注射之慢性疾病(例如血友病)時。不欲受限於任何特定理論，此親和力範圍被認為能取得介於(i)有效抑制TFPI之活性所需之結合親和力與(ii)較長半衰期及降低抗體內在化之間的平衡。
TFPI中之特異性胺基酸殘基位置係根據SEQ ID NO：2(人類TFPIαK1K2K3)編號。然而，本發明並不限於SEQ ID NO：2。來自其他TFPI同源物、同種型、變體或片段之對應殘基可根據本技藝已知之序列比對或結構 比對鑑別。例如，比對可藉由手工或使用為人熟知之序列比對程式，諸如ClustalW2或“BLAST 2序列”，利用預設參數完成。例如，SEQ ID NO：2之Arg107對應於小鼠TFPI K1K2(SEQ ID NO：4)之Arg104。
抗體之“抗原結合片段”係指保留特異性結合抗原之能力(較佳地，具有基本上相同之結合親和力)的全長抗體之片段。抗原結合片段之實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1結構域所組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含二個藉由鉸鏈區處之二硫鍵橋聯之Fab片段之二價片段；(iii)由VH和CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL和VH結構域組成的Fv片段，(v)由VH結構域組成之dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341：544-546)；及(vi)經分離之互補決定區(CDR)、經二硫鍵連接之Fv(dsFv)及抗獨特型(抗-Id)抗體和胞內抗體(intrabody)。此外，儘管該Fv片段的二個結構域，VL和VH係由分別基因編碼，其可利用重組方法，藉由能使它們被製成單一蛋白鏈(其中該VL和VH區配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv))之合成連接子連結；參見，例如Bird et al.Science 242：423-426(1988)及Huston et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)。亦包含其他形式之單鏈抗體，諸如雙抗體。雙抗體為二價、雙特異性抗體，其中VH和VL結構域表現在單一多肽鏈上，但使用之連接子太短以致於無法允許同一鏈上的二個結構域之間形成配對，從而迫使該結構域與另一條鏈之互補結 構域配對並創造二個抗原結合位點(參見，例如Holliger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)；Poljak et al.,1994,Structure 2：1121-1123)。
抗體“可變結構域”係指抗體輕鏈(VL)之可變區或抗體重鏈之可變區(VH)，無論是單獨或組合的。如本技藝中所已知，重鏈和輕鏈之可變區各自由四個藉由三個互補決定區(CDR)連接的框架區(FR)所組成，並促成形成抗體之抗原結合位點。
可變結構域中之殘基係根據Kabat編號，Kabat為用於匯編抗體之重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的編號系統。參見，Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)。使用此編號系統，實際之線性胺基酸序列可含有對應於該可變結構域之縮短的FR或CDR或插入該可變結構域之FR或CDR中之很少數或額外的胺基酸。例如重鏈可變結構域可在H2之殘基52之後包含單一胺基酸插入子(殘基52a(根據Kabat))及在重鏈FR殘基82之後包含插入之殘基(例如殘基82a、82b及82c(根據Kabat))。指定抗體之殘基的Kabat編號可藉由比對具有“標準”Kabat編號之序列的抗體之同源區來決定。用於指派Kabat編號的各種算法均可用。除非另有說明，本文使用2012年Abysis(www.abysis.org)發表之算法來指派可變區之Kabat編號。
抗體中之特異性胺基酸殘基位置(諸如本發明所揭示之抗體結合部位殘基)亦根據Kabat編號。
“互補決定區”(CDR)可根據Kabat、Chothia、Kabat與Chothia二者之累積定義、AbM、接觸及/或構形定義或本技藝所熟知之任何測定CDR的方法來識別。參見，例如Kabat et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.(高度可變區)；Chothia et al.,1989,Nature 342：877-883(結構環結構)。CDR之AbM定義為Kabat與Chothia之間的折衷並使用Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體(Accelrys®)。CDR之“接觸”定義係基於觀察到之抗原接觸(闡述於MacCallum et al.,1996,J.Mol.Biol.,262：732-745中)。CDR之“構形”定義係基於對抗原結合貢獻焓的殘基(參見，例如Makabe et al.,2008,Journal of Biological Chemistry,283：1156-與1166)。還有其他CDR邊界定義可能並不嚴格遵循上述方法其中之一，但仍將與至少一部分之Kabat CDR重疊，儘管它們可能鑑於預測或實驗發現特定殘基或殘基團或甚至整個CDR不會顯著影響抗原結合而被縮短或延長。如本文所使用者，CDR可能指藉由本技藝中已知之任何方法(包括方法之組合)定義之CDR。
在實施例中(參見表3和4)，該CDR之定義如下(根據Kabat編號；H：重鏈；L：輕鏈)：CDR-H1：H26-H35B；CDR-H2：H50-H65；CDR-H3：H95-H102 CDR-L1：L24-L34；CDR-L2：L50-L56；CDR-L3：L89-L97
“框架”(FR)殘基為除了CDR殘基外之抗體可 變結構域殘基。為下列結構之VH或VL結構域框架包含四個框架子區FR1、FR2、FR3和FR4，其間穿插蓄CDR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在實施例中(參見表3和4)，FR殘基包括下列者(根據Kabat編號；H：重鏈；L：輕鏈)：
“抗原決定部位”係指抗體所特異性結合之抗原(Ag)區或區域，例如包含與該抗體(Ab)交互作用之殘基的區或區域。抗原決定部位可為線性或構形。於一線性抗原決定部位中，該蛋白質與交互作用分子(諸如抗體)之間的所有交互作用的點係沿著該蛋白質之初級胺基酸序列線性出現。“非線性抗原決定部位”或“構形抗原決定部位”包含在該抗原性蛋白質內，特異於該抗原決定部位之抗體所結合之非連續性多肽(或胺基酸)。如本文所使用之術語“抗原決定部位”的定義為藉由本技藝所熟知之任何方法(例如藉由習知免疫分析)測定之與抗體特異性結合的抗原之一部分。或者，在發現過程中，抗體之生成和表徵可闡明與期望之抗原決定部位有關的信息。從這個信息，以競爭方式篩選結合相同抗原決定部位之抗體是可能的。用於達成此目的之方法為進行競爭和交叉競爭研究以找出彼此競爭或交叉競爭結合TFPI之抗體。亦即，該等抗體競爭結合該抗原，從而使該抗體競爭結合本發明之抗TFPI抗體的抗原結合位點。
術語“抗體結合部位”係經由逆轉上述“抗原決定部位”之定義的觀點而衍生出且係指參與抗原結合之抗體分子的區或區域，例如包含與抗原交互作用之殘基的區或區域。抗體結合部位可為線性或構形的(諸如在CDR中之不連續殘基)。
指定之抗體/抗原結合對之抗原決定部位/抗體結合部位可利用各種實驗和計算之抗原決定部位映像方法以不同詳細層級定義和表徵。實驗方法包括誘變、X射線晶體學、核磁共振(NMR)光譜學、氫/氘交換質譜(HX-MS)及各種競爭結合的方法。由於各方法係依賴獨特的原理，抗原決定部位之描述與測定彼等之方法緊密連結。因此，指定之抗體/抗原對的抗原決定部位/抗體結合部位將根據所採用之映像方法而有不同定義。
用於抗體和抗體之間的交互作用之抗原決定部位/抗體結合部位的定義可藉由界定存在於Ag-Ab交互作用中之原子接觸的空間坐標及關於彼等對結合熱力學之相對貢獻之信息來做最詳盡的定義。一種詳盡層級為抗原決定部位/抗體結合部位殘基係藉由界定Ag和Ab之間的原子接觸之空間坐標表徵。於一態樣中，該抗原決定部位/抗體結合部位殘基可藉由特定標準來定義，例如Ab和Ag中之原子之間的距離(例如該同源抗體之重原子及抗原之重原子之距離等於或小於4Å(“接觸”殘基))。於另一態樣中，抗原決定部位/抗體結合部位殘基之特徵為參與氫鍵來與該同源抗體/抗原交互作用或參與氫鍵來與水分子 交互作用，而該水分子亦與該同源抗體/抗原氫鍵結(水介導之氫鍵結)。於另一態樣中，抗原決定部位/抗體結合部位殘基之特徵為與該同源抗體/抗原之殘基形成鹽橋。再於另一態樣中，抗原決定部位/抗體結合部位殘基之特徵為由於與該同源抗體/抗原交互作用而在掩藏之表面積(BSA)中具有非零變化之殘基。在更不詳盡之程度下，抗原決定部位/抗體結合部位係透過功能(例如與其他Ab競爭結合)來表徵。該抗原決定部位/抗體結合部位亦可被更泛泛地定義為包含胺基酸殘基，當該胺基酸殘基被另一胺基酸取代時將會改變該Ab與Ag之間的交互作用特徵(例如丙胺酸掃描)。
在由抗體(例如Fab片段或二個Fab片段)與其抗原之間的複合物之空間坐標所定義的X射線衍生之晶體結構的背景下，除非另有說明，抗原決定部位殘基係指如下述之TFPI殘基(i)具有一重原子(即，非氫原子)距離該同源抗體之重原子的距離係在4Å之內(亦稱為“接觸”殘基)，(ii)參與與該同源抗體之殘基形成氫鍵或參與與水分子形成氫鍵，而此水分子亦與該同源抗體形成氫鍵結(由水介導之氫鍵結)，(iii)參與與該同源抗體之殘基形成鹽橋，及/或(iv)由於與該同源抗體交互作用而在掩藏之表面積(BSA)中具有非零變化。一般而言，對BSA施加截斷點，以避免包含具有最少交互作用之殘基。因此，除非另外具體指明，若該抗原決定部位殘基之BSA為20Å或更大或涉及抗體結合TFPI時之靜電交互作用，則選擇類別 (iv)之抗原決定部位殘基。類似地，除非另外具體說明或與上下文相抵觸，在X射線衍生之晶體結構的背景下，抗體結合部位殘基係指如下述之抗體殘基(i)具有一重原子(即，非氫原子)距離TFPI之重原子的距離係在4Å之內(亦稱為“接觸”殘基)，(ii)參與與TFPI殘基形成氫鍵或與水分子形成氫鍵，而此水分子亦與TFPI形成氫鍵結(由水介導之氫鍵結)，(iii)參與與TFPI之殘基形成鹽橋，及/或(iv)由於與TFPI交互作用而在掩藏之表面積(BSA)中具有非零變化。再者，除非另外具體指明，若該抗體結合部位殘基之BSA為20Å或更大或涉及抗體結合TFPI時之靜電交互作用，則選擇類別(iv)之抗體結合部位殘基。
根據所使用之抗原決定部位映像方法及以不同詳細程度取得之關於抗原決定部位之描述和定義的事實，其遵循在相同Ag上之用於不同Ab之抗原決定部位的比較工作可在不同的詳盡層級下以類似方法進行。例如以胺基酸層級描述之抗原決定部位(例如從X射線結構測定者)被認為若其含有相同的胺基酸殘基組則它們是完全相同的。若該抗原決定部位並未共用胺基酸殘基，則這些抗原決定部位被認為是獨立的(獨特的)。若與對應抗體之結合為互斥的(即，與一個抗體結合會排除同時或連續與其他抗體結合)，則其特徵為競爭結合之抗原決定部位被認為有重疊；而若該抗原能夠同時容納與二種對應抗體結合，則該等抗原決定部位被認是獨立的(獨特的)。
指定之抗體/抗原對的抗原決定部位和抗體結 合部位可藉由常規方法鑑定。例如，抗原決定部位之大致位置可藉由評估抗體結合不同片段或變體TFPI多肽之能力測定(此在前文他處有更完整的描述)。在TFPI內使TFPI與抗體內之特定殘基接觸的特定殘基亦可使用常規方法(諸如實施例中所描述者)測定。例如，抗體/抗原複合物可結晶化。該晶體結構可經過測定並用來鑑別該抗體與抗原之間交互作用的特定位點。
如本文所使用之關於抗體的術語“競爭”意指第一抗體或其抗原結合部分與抗原之結合減少隨後第二抗體或其抗原結合部分與該相同抗原之結合。一般而言，結合第一抗體會創造空間位阻、構形變化或結合至共通之抗原決定部位(或其部分)，從而使第二抗體與該相同抗原之結合減少。標準競爭分析可用於測定二種抗體是否彼此競爭。一種適合用於抗體競爭之分析涉及使用Biacore技術，該Biacore技術可利用表面離子體共振(SPR)技術(通常使用生物傳感器系統(諸如BIACORE®系統))測量交互作用的程度。例如，SPR可用於玻管內競爭性結合抑制分析以測定一種抗體抑制第二抗體結合的能力。另一用於測量抗體競爭之分析係使用基於ELISA的方法。此外，國際專利申請案第WO2003/48731號中描述一種基於抗體之競爭的用於“分組”抗體的高通量方法。若一種抗體(或片段)減少另一種抗體(或片段)與TFPI之結合則二者之關有競爭的存在。例如，可藉著依序添加不同抗體使用連續結合競爭分析。加入第一抗體可能達到接近飽和之結合。然 後，加入第二抗體。若未檢測到第二抗體與TFPI結合，或與無第一抗體存在時之平行分析(其數值可設定為100%)相比較，第二抗體與TFPI之結合顯著減少(例如減少至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、在至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%)，該二種抗體被認為是互相競爭。實施例6中提供藉由SPR進行之示例性抗體競爭分析(及重疊抗原決定部位分析)。
本發明之抗TFPI抗體可具有與本發明之另一抗體競爭或交叉競爭與如本文所描述之TFPI結合的能力。例如，本發明之抗體可與本文所描述之抗體競爭或交叉競爭結合TFPI，或與已與本發明之抗體結合之TFPI的合適片段或TFPI變體結合。
亦即，若第一抗TFPI抗體與第二抗體競爭結合TFPI，但當第二抗體先結合TFPI時它不競爭，則此第一抗體被認為是與第二抗體“競爭”(亦稱為單向競爭)。當一抗體與另一抗體競爭，不管何抗體先與TFPI結合，則該抗體與其他抗體“交叉競爭”結合TFPI。該等競爭或交叉競爭抗體可在標準結合分析中根據彼等與本發明之已知抗體競爭/交叉競爭之能力鑑定。例如，可使用SPR(例如藉由使用BiacoreTM系統)、ELISA分析或流式細胞術來證明競爭/交叉競爭。這類競爭/交叉競爭可能暗示該二種抗體結合至同一、重疊或相似之抗原決定部位。
因此，本發明之抗TFPI抗體可藉由包含結合 分析之方法鑑定，該結合分析評估測試抗體是否能夠與本發明揭示之參考抗體(例如TFPI-3、TFPI-21、TFPI-23、TFPI-24、TFPI-26、TFPI-106、TFPI-107、TFPI-108、TFPI-109、TFPI-110、TFPI-111、TFPI-112、TFPI-113、TFPI-114、4D8、6B7.c5、7A4.D9)競爭/交叉競爭該靶的分子上之結合位點。
“Fc融合”蛋白為其中一或多個多肽係可操作地連接Fc多肽之蛋白質。Fc融合蛋白以融合伴侶合併免疫球蛋白之Fc區。
抗體之結合親和力可以Kd值表示，其係指特定抗原-抗體交互作用之解離速率。Kd為解離之速率(亦稱為“解離速率(off-rate)(Koff)”)對結合之速率(或“on-rate(kon)”)之比值。因此，Kd值等於Koff/kon並以莫耳濃度(M)表示，且Kd值愈小，結合親和力越強。抗體之Kd值可使用本技藝中完善建立之方法測定。一種用於測量Kd之示例性方法為表面離子體共振(SPR)，其通常係使用生物傳感器系統，諸如BIACORE®系統。BIAcore動力學分析包含分析抗原與其表面上具有固定分子(例如包含抗原決定部位結合結構域之分子)之晶片結合及解離。另一用於測定抗體之Kd的方法係使用Bio-Layer干涉測量術，通常係使用OCTET®技術(Octet QKe系統，ForteBio)。另外或此外，亦可使用可從Sapidyne Instruments(印第安那州Boise)取得之KinExA®(動力學排除分析)分析。
術語“治療有效量”意指足以達到預期目的(諸如增加凝血，或在血友病之情況中為縮短凝固時間，或以其他方式在有需要之個體體內引起可測量之益處)之量的抗TFPI抗體或其片段或包含該等抗體或其片段之組合。該精確量將取決於許多因素，包括，但不限於該治療組成物之組分和物理特性、預定之患者群、個別患者之考量，等且可由本技藝之技術熟習人士決定。
術語“協同治療有效量”意指當與第二治療劑(例如凝血因子VIIa(FVIIa))一起提供時能提供高於經單獨投予之各治療劑或抗體之加成的可測量利益(例如減少凝血時間、減少出血時間、增加纖維蛋白生成、增強血小板累積，等)之抗TFPI抗體或其抗原結合片段的量。
術語“治療”包括預防性及/或治療性治療。若該治療係在病症之臨床表現之前施用，則其被認為是預防性的。治療性治療包括，例如改善或降低疾病之嚴重性或縮短疾病之長度。
如本文使用之術語“約”係指數值之+/- 10%。
3. 抗TFPI抗體
本發明所揭示和示例的為結合組織因子途徑抑制劑(TFPI)之抗體類(及其抗原結合片段)。該抗體類及抗體片段結合TFPI之獨特抗原決定部位。於某些實施態樣中，識別TFPI中之某些抗原決定部位殘基可允許該抗體類(及其抗原結合片段)降低TFPI之活性。此外，於某 些實施態樣中，本發明所揭示之抗體(及其抗原結合片段)已展示用於治療凝血缺陷和減少出血時間之令人滿意的藥學活性和藥物動力學性質。
A. 組織因子途徑抑制劑(TFPI)
TFPI為含有多價Kunitz結構域之蛋白酶抑制劑。表2中提供示例性人類、小鼠、食蟹猴、兔子和大鼠TFPI序列。
人類TFPI為胞外糖蛋白，其具有二種主要形式，TFPI-α和TFPI-β。TFPIα(其為具有276個胺基酸之糖基化蛋白(MW 43kD))為最大之TFPI形式且係由三個Kunitz樣結構域和基本羧基端區所組成。另一類剪接產生TFPI-β，其包含Kunitz結構域1(K1)和Kunitz結構域2(K2)，但含有缺乏Kunitz結構域3(K3)和基本區之替代的C端部分。TFPI-β以糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨透過轉譯後修飾錨定到細胞膜。
TFPI之主要靶的為蛋白酶第Xa因子(FXa)和第VIIa因子(FVIIa)，這些為凝血級聯起始階段中之關鍵因素。生物化學分析已透露K2為FXa之抑制劑，而K1抑制FVIIa-組織因子複合物。K3之作用不清楚，因為其似乎不具有直接之蛋白酶抑制活性，但可作為輔因子蛋白S之識別位點。該TFPI-α所特有之C端結構域可能參與血小板表面上凝血酶之識別。
Kunitz結構域1(K1)對應於SEQ ID NO：2之 胺基酸殘基26-76，而Kunitz結構域2(K2)對應於SEQ ID NO：2之殘基91至147。來自其他TFPI同源物、同種型、變體或片段之K1和K2結構域可藉由針對SEQ ID NO：2之序列比對或結構比對來鑑別。
本發明之TFPI包括TFPI之任何天然形式，這些天然形式可能源自任何合適之生物體。例如，TFPI可為哺乳動物TFPI，諸如人類、小鼠、大鼠、非人類靈長類動物、牛、羊、大、貓或豬TFPI。於某些實施態樣中，該TFPI為人類TFPI。該TFPI可為成熟形式之TFPI(即，已在合適之細胞中經歷轉譯後處理之TFPI蛋白)。該等成熟TFPI蛋白可，例如糖基化。
本發明之TFPI包括源自天然TFPI之任何功能片段或變體。TFPI之功能性片段可為保留TFPI之活性(諸如抑制第Xa因子(FXa)、抑制FVIIa-組織因子複合物之活性的能力及/或作為凝血或止血之負調控劑)的任何TFPI構成部分或一部分。例如，功能性片段可包含Kunitz結構域，諸如TFPI之K1結構域、K2結構域或K1和K2結構域二者。
與天然TFPI相比較，功能性變體可包含一或多個突變且仍然保留天然TFPI之活性，諸如抑制第Xa因子(FXa)之能力或抑制FVIIa組織因子複合物之活性的能力。例如，變體與SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6或7可具有不同程度之序列同一性，諸如與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7中所列之序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同一性。
本發明之TPFI片段、變體、同種型和同源物應保持重要之抗原決定部位殘基(諸如若使用TFPI-23和TFPI-24抗體則為Ile105、Arg107和Leu131)。此外，TFPI可包含5或更多個、8或更多個、10或更多個、12或更多個、或15或更多個TFPI之K2結構域的表面可達殘基。表面可達殘基為具有高於40%之相對可達性之殘基。
例如，在TFPI之K2結構域(參見，例如SEQ ID NO：2)方面，下列胺基酸殘基具有高於40%之相對可達性：94-95、98、100-110、118-121、123-124、131、134、138-142及144-145。該TFPI可包含5或更多個、8或更多個、10或更多個、12或更多個、或15或更多個這些殘基，諸如包括5或更多個、8或更多個、10或更多個、12或更多個、或15或更多個這些殘基之TFPI片段。
B. 抗TFPI抗體
本發明之抗體或其抗原結合片段特異性結合TFPI之K2結構域並能抑制其與FXa交互作用及/或降低TFPI之活性。
FPI-23及變體
於一態樣中，本發明包括經製造以增加人類框架種系殘基(“種系化”)之含量的抗體TFPI-23及TFPI-23之變體。例如，TFPI-106包含H1Q至E及H5V至L之突變(Kabat編號)，而TFPI-107包含H1Q至E、H5V至L和H94I至K之突變(Kabat編號)。在本發明之目的方面，TFPI-23親本抗體和TFPI-106種系變異體在其抗原決定部位殘基和抗體結合部位殘基交互作用中可以互換。
於一態樣中，本發明提供特異性結合組織因子途徑抑制劑(TFPI)之Kunitz結構域2(K2)中的抗原決定部位之經分離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位包含殘基Ile105、Arg107和Leu131(根據SEQ ID NO：2之編號)。於某些實施態樣中，該抗體或其抗原結合片段不結合TFPI之Kunitz結構域1(K1)。
如本發明所揭示及示例者，基於共晶體結構及計算之丙胺酸掃描已發現TFPI之K2結構域中的獨特抗原決定部位。尤其是，該晶體結構顯示出TFPI之K2結構域採用錐形結構，該錐體之尖端(尤其是Arg107)結合FXa。TFPI-23、TFPI-24及彼等之變體均識別接近此錐形區之尖端的殘基並阻斷TFPI與FXa結合。因此，識別位於該錐體尖端附近之抗原決定部位殘基對於抑制TFPI活性特別有用。
於某些實施態樣中，本發明揭示包含三個對抗體-抗原交互作用重要之殘基的TFPI抗原決定部位： Ile105、Arg107及Leu131(根據入類TFPI之編號，如SEQ ID NO：2所顯示者)。將此三個殘基突變成丙胺酸導致TFPI-23、TFPI-24及彼等之變體喪失結合。參見表28，其總結該丙胺酸掃描結果。
亦鑑定出另外之TPFI殘基參與抗體結合，但這些殘基可被突變成丙胺酸而不會顯著動搖效果。參見表28。因此，於某些實施態樣中，該TFPI抗原決定部位進一步包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：Cys106、Gly108、Cys130、Gly132(根據SEQ ID NO：2編號)及彼等之任何組合。這些抗原決定部位殘基可被TFPI-23、TFPI-24及彼等之變體識別。參見表27，其顯示出TFPI-23和TFPI-24所共有之共同的抗原決定部位殘基。
於某些實施態樣中，該抗原決定部位進一步包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：Asp102、Arg112、Tyr127、Gly129、Met134、Glu138(根據SEQ ID NO：2編號)及彼等之任何組合。這些抗原決定部位殘基可被TFPI-23及其變體(例如TFPI-106、TFPI-107)識別，但不被TFPI-24(及其變體)識別。參見表27。
於某些實施態樣中，該抗原決定部位不包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：E100、E101、P103、Y109、T111、Y113、F114、N116、Q118、Q121、C122、E123、R124、F125、K126、L140(根據SEQ ID NO：2編號)及彼等之任何組合。參見表27。根據 WO201007269(諾和諾德公司)，參考抗體4F36能識別包含下列群組之抗原決定部位：E100、E101、P103、Y109、T111、Y113、F114、N116、Q118、Q121、C122、E123、R124、F125、K126及L140。
於某些實施態樣中，該抗原決定部位不包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：D31、D32、P34、C35、K36、E100、E101、P103、Y109、K126、G128(根據SEQ ID NO：2編號)及彼等之任何組合。參見表27。根據表27，參考抗體2A8及2A8-200能識別包含下列群組之抗原決定部位：D31、D32、P34、C35、K36、E100、E101、P103、Y109、K126及G128。
於某些實施態樣中，該抗原決定部位可指一或多個TFPI“接觸”殘基(具有在距離同源抗體之重原子4Å內的重原子(即，非氫原子))並包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：Asp102、Gly104、Ile105、Cys106、Arg107、Gly108、Arg112、Tyr127、Gly129、Cys130、Leu131、Gly132、Met134、Glu138(根據SEQ ID NO：2編號)及彼等之任何組合。參見表29B。
於某些實施態樣中，該抗原決定部位可指一或多個參與與抗體之殘基或與水分子(其亦與同源抗體氫鍵結)形成氫鍵(水介導之氫鍵結)的TFPI殘基並包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：Asp102、Arg107、Arg 112、Tyr127及Leu131(根據SEQ ID NO：2編號)及彼等之任何組合。這些抗原決定部位殘基參與與同源抗體 形成氫鍵。參見表29B。
於某些實施態樣中，該抗原決定部位可指由於與該同源抗體交互作用而在掩藏之表面積(BSA)中包含非零變化的殘基並包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：：Asp102、Gly104、Ile105、Cys106、Arg107、Gly108、Arg112、Tyr127、Gly129、Cys130、Leu131、Gly132、Asn133、Met134、Glu138(根據SEQ ID NO：2編號)及彼等之任何組合。這些參見表29B。
這些不同類別之抗原決定部位殘基的任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，該抗原決定部位包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、或所有上述之抗原決定部位殘基、或上述各種類別之抗原決定部位殘基的任何組合。
TFPI-23(及變體)之抗體結合部位殘基可指如下列群組之接觸殘基(位於TFPI抗原決定部位殘基之4Å內)：H33 Ala、H47 Trp、H50 Ala、H51 Ile、H52 Ser、H56 Ser、H58 Tyr、H95 Leu、H96 Gly、H97 Ala、H98 Thr、H99 Ser、H100 Leu、H100A Ser、L29 Ala、L31 Tyr、L91 Tyr、L95A Ser、L95B Gly和L95C Ser；及可選擇地，L93 Ser和L96 Gly(根據Kabat編號)。L93 Ser(4.07Å)和L96 Gly(4.03Å)為可選擇的，因為該距離略微超過4Å，但足夠接近至被捨入成4Å。
需注意的是，上述接觸殘基為來自TFPI-23抗體之原始殘基。然而，基於結構分析和丙胺酸掃描，據信TFPI-23中之許多接觸殘基可被另一殘基取代而不會顯著影響抗原結合。例如，表29A顯示TFPI-23中之許多接觸殘基可被其他殘基取代而僅對結合或穩定性造成<0.5kcal/mol之影響(“<0.5kcal/mol”意指取代對結合具中性效果)。尤其是，如表29A，第4列所示，3個CDR位置及1個框架位置：H47、H58、L91及L96(根據Kabat編號)僅能容許一或二個殘基：(a)H47為Trp或Tyr；(b)H58為Tyr；(c)L91為Tyr或Arg；且(d)L96為Gly或Asn。如表29A，第4列中所歸納者，其他CDR位置可容納更多取代。
因此，於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含下列殘基(根據Kabat編號)：(a)H33為Ala、Asn、Gly、His、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Val；(b)H47為Trp或Tyr；(c)H50為Ala、Arg、Gly、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr或Val；(d)H51為Ile、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；(e)H52為Ser、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、 Trp、Tyr或Val；(f)H56為Ser、Arg、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；(g)H58為Tyr；(h)H95為Leu、Gln、Ile、Phe或Tyr；(i)H96為Gly、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr或Val；(j)H97為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；(k)H98為Thr、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；(l)H99為Ser、Ala、Gly、Phe或Pro；(m)H100為Leu、Arg、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Trp、Tyr或Val；(n)H100A為Ser、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr或Trp；(o)L29為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；(p)L31為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、 Trp、Tyr或Val；(q)L91為Tyr或Arg；(r)L95A為Ser、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；(s)L95B為Ser、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；及(t)L95C為Ser、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；並可選擇地包含(u)L93為Tyr、Ala、Arg、Asn'Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；及(v)L96為Gly或Asn。
在這些殘基中，H47為框架殘基；所有其他者均為CDR殘基。
當施加更嚴格之取代標準時-取代必須導致<-0.5kcal/mol之親和力，這意味著取代必須具有正面(中性/穩定)效果-接觸殘基如下(根據Kabat編號)(表29A，第5欄)：(a)H33為Ala或Val；(b)H47為Trp；(c)H50為Ala； (d)H51為Ile；(e)H52為Ser、Arg、Lys、Phe或Tyr；(f)H56為Ser、Arg或Lys；(g)H58為Tyr；(h)H95為Leu；(i)H96為Gly、Ala、Arg、Asn、Lys、Pro、Ser或Val；(j)H97為Ala；(k)H98為Thr、His、Ile、Leu、Met、Phe或Tyr；(l)H99為Ser；(m)H100為Leu、Phe、Trp或Tyr；(n)H100A為Ser、Arg、Asn、Gln、Glu、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro或Trp；(o)L29為Ala；(p)L31為Tyr；(q)L91為Tyr；(r)L95A為Ser、Phe、Trp或Tyr；(s)L95B為Gly；及(t)L95C為Ser、Arg、Asn、Gln、Glu、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Trp、Tyr或Val；及可選擇地：(u)L93為Ser；及(v)L96為Gly。
此外或另外，可接受之取代的選擇可基於表29A之第6列，其中前3個殘基係根據其對親和力之影響 (即，對親和力最具穩定作用之前3個預測位點)選定。根據此標準，接觸殘基為如下群組(根據Kabat編號)：(a)H33為Ala、Val、His或Phe；(b)H47為Trp或Tyr；(c)H50為Ala、Thr、ser或Phe；(d)H51為Ile、Arg、Lys或Pro；(e)H52為Ser、Phe、Arg或Tyr；(f)H56為Ser、Lys、Tyr或Phe；(g)H58為Tyr；(h)H95為Leu、Ile、Gln或Phe；(i)H96為Gly、Arg、Asn或Lys；(j)H97為Ala、Leu、Tyr或Ile；(k)H98為Thr、Tyr、Phe或His；(l)H99為Ser、Pro、Ala或Phe；(m)H100為Leu、Tyr、Trp或Phe；(n)H100A為Ser、Arg、Leu或Trp；(o)L29為Ala、Glu、Asp或Gln；(p)L31為Tyr、Glu、Asp或Trp；(q)L91為Ty或Arg；(r)L95A為Ser、Phe、Tyr或His；(s)L95B為Gly、Glu、Asp或Pro；及(t)L95C為Ser、Trp、Tyr或Phe；及可選擇地(u)L93為Ser、Glu、Asp或His；(v)L96為Gly或Asn。
TFPI-23(及變體)之抗體結合部位殘基亦可指參與與TFPI之殘基或與水分子(其亦與TFPI氫鍵結)形成氫鍵的殘基且包含下列群組：H58 Tyr、H96 Gly、H97 Ala、H98 Thr、H99 Ser、H100 Leu、L29 Ala、L31 Tyr和L95B Gly(根據Kabat編號)。參見表29B。
TFPI-23(及變體)之抗體結合部位殘基亦可指由於與TFPI交互作用而在BSA中具有非零變化之殘基且包含下列群組：(根據Kabat編號)：H33 Ala、H58 Tyr、H95 Leu、H96 Gly、H97 Ala、H98 Thr、H99 Ser、H100 Leu、H100A Ser、L29 Ala、L31 Tyr、L91 Tyr、L93 Ser、L95A Ser及L95B Gly。施用截斷(BSA為20Å2或更大，或涉及靜電交互作用)以避免包含具有最小交互作用之殘基。參見表29B。
若未施用BSA之截斷，抗體結合部位殘基包括下列群組：H33 Ala、H34 Met、H47 Trp、H50 Ala、H51 Ile、H52 Ser、H56 Ser、H58 Tyr；H95 Leu、H96 Gly、H97 Ala、H98 Thr、H99 Ser、H100 Leu、H100A Ser、L28 Gly、L29 Ala、L31 Tyr、L91 Tyr、L93 Ser、L94 Ser、L95A Ser、L95B Gly、L95C Ser及L96 Gly。參見表29C。
本發明之抗體或其抗原結合片段可結合與本文具體舉例之抗體所結合者相同的TFPI抗原決定部位或結構域。例如，抗體或其抗原結合片段可藉由比較其與TFPI之結合及TFPI-23或種系之變體(例如TFPI-106和 TFPI-107)與TFPI之結合來識別；或藉由比較這些抗體與TFPI-23及其變體之功能來識別。可用於該等鑑別目的之解析和分析包括評估競爭結合TFPI之分析並將在實施例中舉例說明。
於一實施態樣中，本發明之抗體或抗原結合片段可結合與本文所描述之抗體(諸如TFPI-23及其變體)所結合者相同之抗原決定部位或區域。此可包括其與如上述之特定TFPI殘基接觸。例如，本發明之抗體或抗原結合片段可藉著與選自由下列所組成之群組的殘基接觸(在4Å內)的方式與TFPI結合：Asp102、Gly104、Ile105、Cys106、Arg107、Gly108、Arg112、Tyr127、Gly129、Cys130、Leu131、Gly132、Met134、Glu138(根據SEQ ID NO：2編號)及彼等之任何組合。本發明之抗體或其抗原結合片段可能有能力與包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基之抗原決定部位結合：Asp102、Gly104、Ile105、Cys106、Arg107、Gly108、Arg112、Tyr127、Gly129、Cys130、Leu131、Gly132、Met134、Glu138(根據SEQ ID NO：2編號)及彼等之任何組合。
抗體及其抗原結合片段可如下述包含至少一個位於至少一個TFPI上之抗原決定部位殘基(根據SEQ ID NO：2編號)之4.0Å內的抗體結合部位殘基(根據Kabat編號)：抗原決定部位殘基102 Asp係位於抗體結合部位殘基H58 Tyr之4.0Å內；抗原決定部位殘基104 Gly係位於抗體結合部位殘基H58 Tyr之4.0Å內；抗原決定 部位殘基105 Ile係位於抗體結合部位殘基H33 Ala、H50 Ala、H51 Ile、H52 Ser、H56 Ser、H58 Tyr、H95 Leu之4.0Å內；抗原決定部位殘基106 Cys係位於抗體結合部位殘基H100 Leu和H100A Ser之4.0Å內；抗原決定部位殘基107 Arg係位於抗體結合部位殘基H96 Gly、H97 Ala、H98 Thr、H99 Ser、H100 Leu之4.0Å內；抗原決定部位殘基108 Gly係位於抗體結合部位殘基H100 Leu之4.0Å內；抗原決定部位殘基112 Arg係位於抗體結合部位殘基L29 Ala、L31 Tyr之4.0Å內；抗原決定部位殘基127 Tyr係位於抗體結合部位殘基L31 Tyr之4.0Å內；抗原決定部位殘基129 Gly係位於抗體結合部位殘基L31 Tyr之4.0Å內；抗原決定部位殘基130 Cys係位於抗體結合部位殘基L91 Tyr、L95B Gly之4.0Å內；抗原決定部位殘基131 Leu係位於抗體結合部位殘基H47 Trp、H50 Ala、H58 Tyr、L95A Ser、L95B Gly、L95C Ser之4.0Å內；抗原決定部位殘基132 Gly係位於抗體結合部位殘基H58 Tyr、L95A Ser、H58 Tyr、L95A Ser之4.0Å內；抗原決定部位殘基134 Met係位於抗體結合部位殘基L95A Ser之4.0Å內；且抗原決定部位殘基138 Glu係位於抗體結合部位殘基L29 Ala之4.0Å內。參見表29A和29B。
抗體或其抗原結合片段亦可如下述包含至少一個可與TFIP之抗原決定部位殘基(根據SEQ ID NO：2編號)形成氫鍵的抗體結合部位殘基(根據Kabat編號)：抗原決定部位殘基102 Asp可與抗體結合部位殘基H58 Tyr 形成氫鍵；抗原決定部位殘基107 Arg可與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基形成氫鍵：H96 Gly、H97 Ala、H98 Thr、H99 Ser及H100 Leu；抗原決定部位殘基112 Arg可與抗體結合部位殘基L29 Ala形成氫鍵；抗原決定部位殘基127 Tyr可與抗體結合部位殘基L31 Tyr形成氫鍵；且抗原決定部位殘基131 Leu可與抗體結合部位殘基L95B Gly形成氫鍵。參見表29B。
抗體或其抗原結合片段亦可如下述包含至少一個由於與抗原決定部位殘基(根據SEQ ID NO：2編號)交互作用而在BSA具有非零變化之抗體結合部位殘基(根據Kabat編號)：抗原決定部位殘基102 Asp與抗體結合部位殘基H58 Tyr交互作用；抗原決定部位殘基104 Gly與抗體結合部位殘基H58 Tyr交互作用；抗原決定部位殘基105 Ile與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：H33 Ala、H34 Met、H50 Ala、H51 Ile、H52 Ser、H56 Ser、H58 Tyr和H95 Leu；抗原決定部位殘基106 Cys與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：H95 Leu、H100 Leu、H100A Ser和L91 Tyr；抗原決定部位殘基107 Arg與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：H96 Gly、H97 Ala、H98 Thr、H99 Ser和H100 Leu；抗原決定部位殘基108 Gly與抗體結合部位殘基H100 Leu交互作用；抗原決定部位殘基112 Arg與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作 用：L29 Ala、L31 Tyr和L93 Ser；抗原決定部位殘基127 Tyr與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：L31 Tyr和L95B Gly；抗原決定部位殘基129 Gly與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：H100A Ser、L31 Tyr和L91 Tyr；抗原決定部位殘基130 Cys與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：H95 Leu、H100A Ser、L31 Tyr、L91 Tyr和L95B Gly；抗原決定部位殘基131 Leu與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：H47 Trp、H50 Ala、H58 Tyr、H95 Leu、L31 Tyr、L91 Tyr、L95A Ser、L95B Gly、L95C Ser和L96 Gly；抗原決定部位殘基132 Gly與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：H58 Tyr和L95A Ser；抗原決定部位殘基133 Asn與抗體結合部位殘基L95A Ser交互作用；抗原決定部位殘基134 Met與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：L93 Ser、L94 Ser和L95A Ser；且抗原決定部位殘基138 Glu與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：L28 Gly、L29 Ala和L93 Ser。
本發明之抗體或其抗原結合片段可為任何包含上述之與至少一個上列抗原決定部位殘基交互作用的任一抗體結合部位殘基之抗體或抗原結合片段。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其 抗原結合片段包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個或所有上述抗體結合部位殘基，或上述各種類別之抗體結合部位殘基的任何組合。此外，可在這些抗體結合部位殘基中引入保守型取代。例如，該抗體或其抗原結合片段可包含1、2、3、4、5、6、7、或8個根據表34之保守型取代。
本發明之抗體可能有能力與另一抗體競爭結合如本文所描述之TFPI。例如，本發明之抗體可與本文所描述之TFPI-23及其變體交叉競爭結合TFPI或已與該TFPI-23抗體結合之TFPI的適當片段或變體。該等交叉競爭抗體可根據其在標準結合分析中與本發明之示例性抗體交叉競爭的能力來鑑別。例如可使用SPR(例如經由使用BiacoreTM系統)、ELISA分所或流式細胞術來證明交叉競爭。該等交叉競爭可能暗示該二種抗體結合同一、重疊或類似之抗原決定部位。
因此，本發明之抗體可藉由包含結合分析之方法鑑定，該方法評估測試抗體是否能與本發明之示例性抗體(諸如本文所描述之TFPI-23或其任何變體或片段)競爭在靶的分子上之結合位點。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含下列重鏈CDR序列：(i)包含SEQ ID NO：38之CDR-H1、包含SEQ ID NO：39之CDR-H2和包含SEQ ID NO：40之CDR-H3；及/或(ii)下列輕鏈CDR序列：包含SEQ ID NO：33之CDR-L1、包含SEQ ID NO：34之CDR-L2和包含SEQ ID NO：35之CDR-L3。於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含下列重鏈CDR序列：(i)與SEQ ID NO：38具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H1、與SEQ ID NO：39具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H2和與SEQ ID NO：40具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H3；及/或(ii)下列輕鏈CDR序列：與SEQ ID NO：33具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L1、與SEQ ID NO：34具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L2和與SEQ ID NO：35具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L3。於某些實施態樣中，相對於SEQ ID NO：38、39、40、33、34和35，分別在各CDR中製造不超過10個、不超過9個、不超過8個、不超過7個、不超過6個、不超過5、不超過4個、不超過3 個、不超過2個或不超過1個取代。於某些實施態樣中，該取代為根據表34之保守型取代。於某些實施態樣中，該取代係根據表29A，第4列、第5列或第6列。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含人類框架序列。例如，重鏈框架序列可來自人類VH3種系、VH1種系、VH5種系或VH4種系。較佳之人類種系重鏈框架為源自VH1、VH3或VH5種系之框架。例如，可使用來自下列種系之VH框架：IGHV3-23、IGHV3-7或IGHV1-69(種系名稱係基於IMGT種系定義)。較佳之人類種系輕鏈框架為源自VK或Vλ種系之框架。例如，可使用來自下列種系之VL框架：IGKV1-39或IGKV3-20(種系名稱係基於IMGT種系定義)。此外或另外，該框架序列可為人類種系共有框架序列，諸如人類V λ 1共有序列、VK 1共有序列、VK 2共有序列、VK 3共有序列、VH3種系共有序列、VH1種系共有序列、VH5種系共有序列或VH4種系共有序列之框架。
人類種系框架之序列可從各種公開之資料庫取得，諸如V-base、IMGT、NCBI或Abysis。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)VH，其包含與選自由下列所組成之群組之胺基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性 的胺基酸序列：SEQ ID NO：41、63和65；及/或(ii)VL，其包含與SEQ ID NO：36具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些VL和VH序列之任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)CH，其包含與SEQ ID NO：20具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列；及/或(ii)CL，其包含與SEQ ID NO：26具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些CH和CL序列之任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含Fc結構域。該Fc結構域可源自IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG、IgE或IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其 抗原結合片段包含：(i)重鏈，其包含與SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：66具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈，其包含與SEQ ID NO：37具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些重鏈和輕鏈序列之任何組合亦包含在本發明內。
TFPI-24及變體
該共晶體結構顯示出TFPI-24(和其變體)與TFPI-23共享許多抗原決定部位殘基。其中，Ile105、Arg107和Leu131(根據人類TFPI編號，如SEQ ID NO：2中所示)被認為對抗體-抗原交互作用是重要的。其他共有之抗原決定部位殘基包括：Cys106、Gly108、C130、L131和G132(根據SEQ ID NO：2編號)。
特異於TFPI-24(和其變體)之抗原決定部位殘基包括：Glu100、Glu101、Asp102、Gly104和Tyr109。TFPI-23及其變體不與這些殘基結合。參見表27。因此，本發明提供特異性結合TFPI之K2中的抗原決定部位之 經分離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位(i)包含殘基Ile105、Arg107和Leu131；(ii)可選擇地包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：Cys106、Gly108、Cys130、Leu131和Gly132；及(iii)進一步可選擇地包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：Glu100、Glu101、Asp102、Gly104和Tyr109(根據SEQ ID NO：2編號)。
於某些實施態樣中，該抗原決定部位不包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：P103、T111、Y113、F114、N116、Q118、Q121、C122、E123、R124、F125、K126、L140(編號根據SEQ ID NO：2)及彼等之任何組合。參見表27。根據WO201007269(諾和諾德公司)，參考抗體4F36識別包含下列群組之抗原決定部位：P103、T111、Y113、F114、N116、Q118、Q121、C122、E123、R124、F125、K126和L140。
於某些實施態樣中，該抗原決定部位不包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：D31、D32、P34、C35、K36、P103、K126、Y127、G128(根據SEQ ID NO：2編號)及彼等之任何組合。參見表27。根據表27，參考抗體2A8和2A8-200識別包含下列群組之抗原決定部位：D31、D32、P34、C35、K36、P103、K126、Y127和G128。
亦決定來自TFPI-24之抗體結合部位殘基(基於BSA)的特徵(參見表24)且包括下列群組：H33 Ala、 H35 Gln、H52 Ser、H53 Asn、H55 Arg、H56 Ser、H95 Phe、H96 Leu、H97 His、H99 Ser、H101 Asp、L31 Met、L32 Tyr、L34 His、L36 Tyr、L50 Arg、L91 Trp及L96 Tyr。於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個或所有這些抗體結合部位殘基。此外，可在這些抗體結合部位殘基中引入保守型取代。例如，該抗體或其抗原結合片段可包含根據表34之1、2、3、4、5、6、7或8個保守型取代。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含下列重鏈CDR序列：(i)包含SEQ ID NO：48之CDR-H1、包含SEQ ID NO：49之CDR-H2和包含SEQ ID NO：50之CDR-H3；及/或(ii)下列輕鏈CDR序列：包含SEQ ID NO：43之CDR-L1、包含SEQ ID NO：44之CDR-L2及包含SEQ ID NO：45之CDR-L3。於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含下列重鏈CDR序列：(i)與SEQ ID NO：48具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H1、與SEQ ID NO：49具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H2和與SEQ ID NO：50具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H3；及/或(ii)下列輕鏈CDR序列：與SEQ ID NO：43具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L1、與SEQ ID NO：44 具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L2和與SEQ ID NO：45具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L3。於某些實施態樣中，相對於SEQ ID NO：48、49、50、43、44和45，分別在各CDR中製造不超過10個、不超過9個、不超過8個、不超過7個、不超過6個、不超過5、不超過4個、不超過3個、不超過2個或不超過1個取代。於某些實施態樣中，該取代為根據表34之保守型取代。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含人類框架序列。例如，重鏈框架序列可來自如上述之人類VH3種系、VH1種系、VH5種系或VH4種系。較佳之人類種系輕鏈框架為如上述之源自VK或V λ種系之框架。亦可使用如上述之共有的人類種系框架序列。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含(i)VH，其包含與選自由下列所組成之群組之胺基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列：SEQ ID NO：67、69、51和79；及/或(ii)VL，包其包含與選自由下列所組成之群組之胺基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至 少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列：SEQ ID NO：46、71、73、75和77。這些VL和VH序列之任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)CH，其包含與SEQ ID NO：20具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列；及/或(ii)CL，其包含與SEQ ID NO：26具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些CH和CL序列之任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含Fc結構域。該Fc結構域可源自IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG、IgE或IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)重鏈，其包含與SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：80具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、 至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈，其包含與SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：78具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些重鏈和輕鏈序列之任何組合亦包含在本發明內。
4D8及變體
共晶體結構亦揭露抗體4D8及變體之抗原決定部位和抗體結合部位信息。4D8及其變種之抗原決定部位殘基包括：Glu101、Pro103、Tyr109、Thr111、Ser119、Gln121、Glu123、Arg124、Lys126和Leu140(根據SEQ ID NO：2編號)。
於某些實施態樣中，該抗原決定部位不包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：E100、D102、R107、Y113、F114、N116、Q118、C122(根據SEQ ID NO：2編號)及彼等之任何組合。參見表27。根據WO201007269(諾和諾德公司)，參考抗體4F36識別包含E100、D102、R107、Y113、F114、N116、Q118和C122之抗原決定部位。
於某些實施態樣中，該抗原決定部位不包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：D31、D32、P34、C35、K36、E100、1105、R107、G108、Y127、G128(根據SEQ ID NO：2編號)及彼等之任何組合。參見表27。根據表27，參考抗體2A8和2A8-200識別包含D31、D32、P34、C35、K36、P103、K126、Y127和G128之抗原決定部位。
亦表徵來自4D8之抗體結合部位殘基(基於BSA)(參見表24)並包括下列群組：H50 Asp、H57 Thr、H58 Leu、H59 Tyr、H61 Gln、H98 Asp、H99 Tyr、H100 Asp、L30 His、L50 Trp、L92 Tyr、L93 Thr、L94 Thr和L96 Tyr。於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含至少8個，至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個或所有這些抗體結合部位殘基。再者，這些抗體結合部位殘基中可引入保守型取代。例如，該抗體或其抗原結合片段可包含根據表34之1、2、3、4、5、6、7或8個保守型取代。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含下列重鏈CDR序列：(i)包含SEQ ID NO：87之CDR-H1、包含SEQ ID NO：88之CDR-H2和包含SEQ ID NO：89之CDR-H3；及/或(ii)下列輕鏈CDR序列：包含SEQ ID NO：81之CDR-L1、包含SEQ ID NO：82之CDR-L2和包含SEQ ID NO：83之CDR-L3。於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合 片段包含下列重鏈CDR序列：(i)與SEQ ID NO：87具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H1、與SEQ ID NO：88具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H2和與SEQ ID NO：89具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H3；及/或(ii)下列輕鏈CDR序列：與SEQ ID NO：81具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L1、與SEQ ID NO：82具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L2和與SEQ ID NO：83具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L3。於某些實施態樣中，相對於SEQ ID NO：87、88、89、81、82和83，分別在各CDR中製造不超過10個、不超過9個、不超過8個、不超過7個、不超過6個、不超過5、不超過4個、不超過3個、不超過2個或不超過1個取代。於某些實施態樣中，該取代為根據表34之保守型取代。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含人類框架序列。例如，重鏈框架序列可來自如上述之人類VH3種系、VH1種系、VH5種系或VH4種系。較佳之人類種系輕鏈框架為源自如上述之VK或V λ種系之框架。亦可使用如上述之共有人類種系框架序列。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)VH，其包含與選自由下列所組成之群組之胺基酸序列具有至少50%、至少60%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列：SEQ ID NO：90、95、97、99、101、103、105和107；及/或(ii)VL，其包含與選自由下列所組成之群組之胺基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列：SEQ ID NO：84、109和111。這些VL和VH序列之任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)CH，其包含與SEQ ID NO：20具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列；及/或(ii)CL，其包含與SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：85具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些CH和CL序列之任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其 抗原結合片段包含Fc結構域。該Fc結構域可源自IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG、IgE或IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)重鏈，其包含與SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈，其包含與SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：110或SEQ ID NO：112具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些重鏈和輕鏈序列之任何組合亦包含在本發明內。
TFPI-3及變體
本發明亦提供TFPI-3及其變體。因此，基於TFPI-3之抗體或其抗原結合片段包含下列重鏈CDR序列：(i)包含SEQ ID NO：16之CDR-H1、包含SEQ ID NO：17之CDR-H2及包含SEQ ID NO：18之CDR-H3；及/或(ii)下列輕鏈CDR序列：包含SEQ ID NO：10之CDR-L1、包含SEQ ID NO：11之CDR-L2和包含SEQ ID NO：12之CDR-L3。於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含下列重鏈CDR序列：(i)與SEQ ID NO：16具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H1、與SEQ ID NO：17具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H2和與SEQ ID NO：18具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H3；及/或(ii)下列輕鏈CDR序列：與SEQ ID NO：10具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L1、與SEQ ID NO：11具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L2和與SEQ ID NO：12具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L3。於某些實施態樣中，相對於SEQ ID NO：16、17、18、10、11和12，分別在各CDR中製造不超過10個、不超過9個、不超過8個、不超過7個、不超過6個、不超過5、不超過4個、不超過3個、不超過2個或不超過1個取代。於某些實施態樣中，該取代為根據表34之保守型取代。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含人類框架序列。例如，重鏈框架序列可來自如上述之人類VH3種系、VH1種系、VH5種系或VH4種系。較佳之人類種系輕鏈框架為源自如上述之VK或V λ種系之框架。亦可使用如上述之共有人類種系框架 序列。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)VH，其包含與SEQ ID NO：19具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列，及/或(ii)VL，其包含與SEQ ID NO：13具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些VL和VH序列之任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)CH，其包含與SEQ ID NO：20具有至少50%、至少，60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列；及/或(ii)CL，其包含與SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：14具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些CH和CL序 列之任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含Fc結構域。該Fc結構域可源自IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG、IgE或IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)重鏈，其包含與SEQ ID NO：21具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈，其包含與SEQ ID NO：15具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些重鏈和輕鏈序列之任何組合亦包含在本發明內。
TFPI-21及變體
本發明亦提供TFPI-21及其變體。因此，基於TFPI-21之抗體或其抗原結合片段包含下列重鏈CDR序列：(i)包含SEQ ID NO：28之CDR-H1、包含SEQ ID NO：29之CDR-H2及包含SEQ ID NO：30之CDR-H3；及/或(ii)下列輕鏈CDR序列：包含SEQ ID NO：22之 CDR-L1、包含SEQ ID NO：23之CDR-L2和包含SEQ ID NO：24之CDR-L3。於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含下列重鏈CDR序列：(i)與SEQ ID NO：28具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H1、與SEQ ID NO：29具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H2和與SEQ ID NO：30具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H3；及/或(ii)下列輕鏈CDR序列：與SEQ ID NO：22具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L1、與SEQ ID NO：23具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L2和與SEQ ID NO：24具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L3。於某些實施態樣中，相對於SEQ ID NO：28、29、30、22、23和24，分別在各CDR中製造不超過10個、不超過9個、不超過8個、不超過7個、不超過6個、不超過5、不超過4個、不超過3個、不超過2個或不超過1個取代。於某些實施態樣中，該取代為根據表34之保守型取代。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含人類框架序列。例如，重鏈框架序列可來自如上述之人類VH3種系、VH1種系、VH5種系或VH4種系。較佳之人類種系輕鏈框架為如上述之源自VK或Vλ種系之框架。亦可使用如上述之共有人類種系框架序列。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其 抗原結合片段包含：(i)VH，其包含與SEQ ID NO：31具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列，及/或(ii)VL，其包含與SEQ ID NO：25具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些VL和VH序列之任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)CH，其包含與SEQ ID NO：20具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列；及/或(ii)CL，其包含與SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：26具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些CH和CL序列之任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其 抗原結合片段包含Fc結構域。該Fc結構域可源自IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG、IgE或IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)重鏈，其包含與SEQ ID NO：32具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈，其包含與SEQ ID NO：27具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些重鏈和輕鏈序列之任何組合亦包含在本發明內。
TFPI-26及變體
本發明亦提供TFPI-26及其變體。因此，基於TFPI-26之抗體或其抗原結合片段包含下列重鏈CDR序列：(i)包含SEQ ID NO：58之CDR-H1、包含SEQ ID NO：59之CDR-H2及包含SEQ ID NO：60之CDR-H3；及/或(ii)下列輕鏈CDR序列：包含SEQ ID NO：53之CDR-L1、包含SEQ ID NO：54之CDR-L2和包含SEQ ID NO：55之CDR-L3。於某些實施態樣中，本文所描述之 抗體或其抗原結合片段包含下列重鏈CDR序列：(i)與SEQ ID NO：58具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H1、與SEQ ID NO：59具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H2和與SEQ ID NO：60具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H3；及/或(ii)下列輕鏈CDR序列：與SEQ ID NO：53具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L1、與SEQ ID NO：54具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L2和與SEQ ID NO：55具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L3。於某些實施態樣中，相對於SEQ ID NO：58、59、60、53、54和55，分別在各CDR中製造不超過10個、不超過9個、不超過8個、不超過7個、不超過6個、不超過5、不超過4個、不超過3個、不超過2個或不超過1個取代。於某些實施態樣中，該取代為根據表34之保守型取代。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含人類框架序列。例如，重鏈框架序列可來自如上述之人類VH3種系、VH1種系、VH5種系或VH4種系。較佳之人類種系輕鏈框架為如上述之源自VK或V λ種系之框架。亦可使用如上述之共有人類種系框架序列。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)VH，其包含與SEQ ID NO：61具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列，及/或(ii)VL，其包含與SEQ ID NO：56具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些VL和VH序列之任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)CH，其包含與SEQ ID NO：20具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列；及/或(ii)CL，其包含與SEQ ID NO：26具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些CH和CL序列之任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含Fc結構域。該Fc結構域可源自IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG、IgE或IgG(例如IgG1、IgG2、 IgG3或IgG4)。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)重鏈，其包含與SEQ ID NO：62具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈，其包含與SEQ ID NO：57具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些重鏈和輕鏈序列之任何組合亦包含在本發明內。
6B7.c5及變體
本發明亦提供6B7.c5及其變體。因此，基於6B7.c5之抗體或其抗原結合片段包含下列重鏈CDR序列：(i)包含SEQ ID NO：118之CDR-H1、包含SEQ ID NO：119之CDR-H2及包含SEQ ID NO：120之CDR-H3；及/或(ii)下列輕鏈CDR序列：包含SEQ ID NO：113之CDR-L1、包含SEQ ID NO：114之CDR-L2和包含SEQ ID NO：115之CDR-L3。於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含下列重鏈CDR序列：(i)與SEQ ID NO：118具有至少85%、至少90%或至少 95%之同一性的CDR-H1、與SEQ ID NO：119具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H2和與SEQ ID NO：120具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H3；及/或(ii)下列輕鏈CDR序列：與SEQ ID NO：113具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L1、與SEQ ID NO：114具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L2和與SEQ ID NO：115具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L3。於某些實施態樣中，相對於SEQ ID NO：118、119、120、113、114和115，分別在各CDR中製造不超過10個、不超過9個、不超過8個、不超過7個、不超過6個、不超過5、不超過4個、不超過3個、不超過2個或不超過1個取代。於某些實施態樣中，該取代為根據表34之保守型取代。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含人類框架序列。例如，重鏈框架序列可來自如上述之人類VH3種系、VH1種系、VH5種系或VH4種系。較佳之人類種系輕鏈框架為如上述之源自VK或V λ種系之框架。亦可使用如上述之共有人類種系框架序列。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)VH，其包含與SEQ ID NO：121具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少 93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列，及/或(ii)VL，其包含與SEQ ID NO：116具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些VL和VH序列之任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)CH，其包含與SEQ ID NO：91具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列；及/或(ii)CL，其包含與SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：85具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些CH和CL序列之任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含Fc結構域。該Fc結構域可源自IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG、IgE或IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)重鏈，其包含與SEQ ID NO：122具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈，其包含與SEQ ID NO：117具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些重鏈和輕鏈序列之任何組合亦包含在本發明內。
7A4.D9及變體
本發明亦提供7A4.D9及其變體。因此，基於7A4.D9之抗體或其抗原結合片段包含下列重鏈CDR序列：(i)包含SEQ ID NO：128之CDR-H1、包含SEQ ID NO：129之CDR-H2及包含SEQ ID NO：130之CDR-H3；及/或(ii)下列輕鏈CDR序列：包含SEQ ID NO：123之CDR-L1、包含SEQ ID NO：124之CDR-L2和包含SEQ ID NO：125之CDR-L3。於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含下列重鏈CDR序列：(i)與SEQ ID NO：128有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H1、與SEQ ID NO：129具有至少 85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H2和與SEQ ID NO：130具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-H3；及/或(ii)下列輕鏈CDR序列：與SEQ ID NO：123具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L1、與SEQ ID NO：124具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L2和與SEQ ID NO：125具有至少85%、至少90%或至少95%之同一性的CDR-L3。於某些實施態樣中，相對於SEQ ID NO：128、129、130、123、124和125，分別在各CDR中製造不超過10個、不超過9個、不超過8個、不超過7個、不超過6個、不超過5、不超過4個、不超過3個、不超過2個或不超過1個取代。於某些實施態樣中，該取代為根據表34之保守型取代。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含人類框架序列。例如，重鏈框架序列可來自如上述之人類VH3種系、VH1種系、VH5種系或VH4種系。較佳之人類種系輕鏈框架為如上述之源自VK或V λ種系之框架。亦可使用如上述之共有人類種系框架序列。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)VH，其包含與SEQ ID NO：131具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列，及/或(ii)VL，其包含與SEQ ID NO：126具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些VL和VH序列之任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i)CH，其包含與SEQ ID NO：91具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列；及/或(ii)CL，其包含與SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：85具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些CH和CL序列之任何組合亦包含在本發明內。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含Fc結構域。該Fc結構域可源自IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG、IgE或IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。
於某些實施態樣中，本文所描述之抗體或其 抗原結合片段包含：(i)重鏈，其包含與SEQ ID NO：132具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈，其包含與SEQ ID NO：127具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之同一性的胺基酸序列。這些重鏈和輕鏈序列之任何組合亦包含在本發明內。
本發明亦揭示特異性結合TFPI之K2結構域並與本文所描述之任一抗體或其抗原結合片段(諸如表3中所列之任一抗體(或其抗原結合片段))競爭結合TFPI的抗體或其抗原結合片段。例如，若抗體或其抗原結合部分與TFPI之結合會阻礙後續TFPI-23或TFPI-106與TFPI結合，則該抗體或其抗原結合部分與TFPI-23或TFPI-106競爭結合TFPI。
本發明亦揭示特異性結合TFPI之K2結構域並與本文所描述之任一抗體或其抗原結合片段(諸如表3中所列之任一抗體(或其抗原結合片段))結合至相同之TFPI抗原決定部位的抗體或其抗原結合片段。
藉由SPR進行之示例性抗體競爭分析(及重疊抗原決定部位分析)提供於實施例6中。
本發明所揭示之抗體和抗原結合片段包括單株抗體、多株抗體、抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fc，等)、嵌合型抗體、雙特異性抗體、雜偶聯抗體(heteroconjugate antibody)、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部分之融合蛋白、結構域抗體(dAb)、人化抗體及包含具有所需特異性之抗原識別位點的免疫球蛋白分子之任何其他經修飾的構型(包括抗體之糖基化變體、抗體之胺基酸序列變體及經共價修飾之抗體)。抗體和抗原結合片段可為小鼠、大鼠、人類或任何其他來源(包括嵌合型或人化抗體)。於一些實施態樣中，該抗體為單株抗體。於一些實施態樣中，該抗體為嵌合型、人化或人類抗體。於某些實施態樣中，該抗體為人類抗體。於某些實施態樣中，該抗體為人化抗體。
於某些實施態樣中，本發明所揭示之抗體及其抗原結合片段之親和力(Kd)值不超過約1×10-3M，諸如不超過約5×10-4M、不超過約4×10-4M、不超過約3×10-4M、不超過約2×10-4M、不超過約1×10-4M、不超過約9×10-5M、不超過約8×10-5M、不超過約7×10-5M、不超過約6×10-5M、不超過約5×10-5M、不超過約4×10-5M、不超過約3×10-5M、不超過約2×10-5M、不超過約1×10-5M、不超過約9×10-6M、不超過約8×10-6M、不超過約7×10-6M、不超過約6×10-6M、不超過約5×10-6M、不超過約4×10-6M、不超過約3×10-6M、不超過約2×10-6M、不超過約1×10-6M、不超過約9×10-7M、不超過約8×10-7 M、不超過約7×10-7M、不超過約6×10-7M、不超過約5×10-7M、不超過約4×10-7M、不超過約3×10-7M、不超過約2×10-7M、不超過約1×10-7M、不超過約9×10-8M、不超過約8×10-8M、不超過約7×10-8M、不超過約6×10-8M、不超過約5×10-8M、不超過約4×10-8M、不超過約3×10-8M、不超過約2×10-8M、不超過約1×10-8M、不超過約9×10-9M、不超過約8×10-9M、不超過約7×10-9M、不超過約6×10-9M、不超過約5×10-9M、不超過約4×10-9M、不超過約3×10-9M、不超過約2×10-9M、不超過約1×10-9M、約1×10-3至約1×10-13M、1×10-4至約1×10-13M、1×10-5至約1×10-13M、約1×10-6至約1×10-13M、約1×10-7至約1×10-13M、約1×10-8至約1×10-13M、約1×10-9至約1×10-13M、1×10-3至約1×10-12M、1×10-4至約1×10-12M、約1×10-5至約1×100-12M、約1×10-6至約1×10-12M、約1×10-7至約1×10-12M、約1×10-8至約1×10-12M、約1×10-9至約1×10-12M、1×10-3至約1×10-11M、1×10-4至約1×10-11M、約1×10-5至約1×10-11M、約1×10-6至約1×10-11M、約1×10-7至約1×10-11M、約1×10-8至約1×10-11M、約1×10-9至約1×10-11M、1×10-3至約1×10-10M、1×10-4至約1×10-10M、約1×10-5至約1×10-10M、約1×10-6至約1×10-10M、約1×10-7至約1×10-10M、約1×10-8至約1×10-10M或約1×10-9至約1×10-10M。
於某些實施態樣中，該解離常數係使用表面 離子體共振(SPR)法(Biacore)測量。表面離子體共振係指一種光學現象，其係例如藉由使用BIACORETM系統撿測生物傳感器基質內之蛋白質濃度的改變而能實時分析生物特異性交互作用。於某些實施態樣中，該SPR測量係使用Biacore T100或T200儀器進行。
例如，用於表面離子體共振之標準分析條件可基於配體固定約100個IgG之反應單位(RU)在SPR晶片上。將純化之靶蛋白在緩衝液中稀釋至最終之濃度範圍並以必需之流速(例如10-100μl/min)注射，以允許計算Ka。允許離解進行以建立解離速率(Kd值)，再進行5秒之3M MgCl2(或20mM NaOH)脈衝以使晶片表面再生。然後，使用動力學評估軟體包分析感測圖(sensogram)。
於示例性實施態樣中，該SPR分析係根據實施例1中子標題“表面離子體共振(SPR)”下所提出之條件。
於某些實施態樣中，該解離常數係利用基於溶液之動力學排除分析(KinExATM)測量。於一特定之實施態樣中，該KinExA測量係使用KinExATM3200儀器(Sapidyne)進行。該動力學排除分析(KinExATM)為能夠測量抗原/抗體交互作用之平衡解離常數及結合和解離速率常數的通用免疫分析平台(基本上為流式螢光光譜儀(flow spectrofluorometer))。由於KinExATM係在已取得平衡後進行，其為用於測量高親和力交互作用之Kd的有利技術，其中該交互作用之解離速率可能很慢。該KinExATM方法可大致依Drake et al(2004)Analytical Biochemistry 328, 35-43中之描述進行。
一般而言，TFPI抗體需要以高親和力結合TFPI以有效地阻斷TFPI之活性。但是，由於TFPI亦表現在細胞表面上，當該抗體之結合親和力過高，該抗體可很快地被宿主細胞內化和降解。這可能導致半衰期很短及重複注射。例如，與TFPI-24相比較，抗體TFPI-23顯示出較低之結合親和力(Kd值)且在某些情況下更為理想，因為其具有較低之內化速率和較長之半衰期。因此，若較長之半衰期較理想，則結合親和力(Kd值)在5×10-7M至約5×10-11M，尤其是約1×10-8至約1×10-10M(0.1nM至10nM)通常較理想。咸信，此範圍可在(i)有效抑制TFPI之活性所需之結合親和力，及(ii)較長之半衰期和減少抗體內化之間取得平衡。
尤其是，咸信為了維持每週經由皮下給予3mg/kg之劑量，Kd值在約1×10-8M至約1×10-10M(0.1nM至10nM)是理想的。
抗體或其抗原結合片段是否降低TFPI之活性或減少TFPI與生理受質(例如FXa)結合可藉由測量TFPI與該生理受質之結合親和力的降低情形測定，例如經由比較(i)在抗TFPI抗體(或其抗原結合片段)之存在下，TFPI與其受質之結合親和力與(ii)無抗TFPI抗體存在時，TFPI與同一受質之結合親和力來進行。在抗TFPI抗體(或其抗原結合片段)之存在下，TFPI與生理受質(例如FXa)之結合可減少至少約10%、至少約20%、至少約 30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%。當無該抗體(或片段)存在時，TFPI與其生理受質之預期結合百分比可設為100%。
亦可在體內模型及/或在玻管內使用，例如血漿系統評估抗TFPI抗體或其抗原結合片段之TFPI抑制活性(本文中亦稱為“降低TFPI之活性”)。例如，抗體之抑制活性(或降低TFPI之活性的水準)可藉由下述者評估：(i)在基於血漿之稀釋凝血酶原時間分析中測量之凝血時間的減少情形；(ii)藉由血栓消融術測量之全血凝血時間的減少情形；(iii)凝血酶生成之增加情形；(iv)在TFPI之存在下，FXa活性之增加情形；(v)在TFPI之存在下，增進之血小板累積；(vi)在TFPI之存在下，增加之纖維蛋白生或；或(vii)彼等之任何組合。抗體或抗原結合片段之抑制活性可為劑量依賴性的(例如造成在基於血漿之稀釋凝血酶原時間分析中所測量之凝血時間呈劑量依賴性降低)。
幾種用於評估抗體之TFPI抑制活性的示例性分析在實施例中有詳細的描述。例如，該血漿稀釋凝血酶原時間(PT)分析為經修飾之PT分析，其利用經稀釋之凝血激酶(thromboplastin)或組織因子以延長該分析之凝血時間及動態範圍。抑制/中和抗TFPI抗體應可減少該稀釋凝血酶原時間。
用於測定TFPI抑制活性之另一示例性模型系 統為外源性X酶分析，其測試抗體或其抗原結合片段在TFPI之存在下回復由外源性複合物介導之FX活化的能力。另一用於表徵TFPI抑制活性之模型系統為FXa抑制測定法，其中係在TFPI之存在下測量FXa活性(參見Sprecher et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3353-3357(1994))。
亦可在基於血漿之分析中評估抗體或其抗原結合片段之抑制活性。在抗TFPI抗體或其抗原結合片段之存在下，可在基本上缺乏FVIII或FIX活性(例如殘餘之凝血因子活性低於1%)之血漿中觸發凝血酶形成。凝血酶形成可使用螢光受質或顯色受質檢測。凝血酶原轉化可利用，例如ThrombographTM(Thermo Scientific，美國麻薩諸塞州沃爾瑟姆)測量且所得數據可藉由從Thrombinoscope BV取得之ThrombinoscopeTM軟體編寫成自動校正凝血酶曲線法(Calibrated Automatic Thrombogram)。
例如，抗體或抗原結合片段可改善無FVIII存在時(例如在FVIII耗竭血漿中)之經TFPI調節的凝血酶生成達至少為正常血漿中之TFPI依賴性凝血酶生成水準的1%。一般而言，正常(未受擾動的)血漿中含有約0.5U/mL至約2U/ml之第VIII因子。因此，於一些情況中，本發明之抗體或抗原結合片段將可增進無FVIII存在時之凝血酶形成達至少為存有0.5U/ml至2U/ml之FVIII時所觀察到之水準的約1%。於進一步之實施態樣中，該抗體(或 其抗原結合片段)將可增進無FVIII存在時之凝血酶形成達正常血漿中(即，在生理水準之第VIII因子的存在下)之凝血酶形成水準之至少約2%、至少約3%、至少約5%、至少約7%或至少約10%。
該抗體或抗原結合片段亦可投予缺乏凝血酶或血友病之動物模型以決定TFPI之體內抑制活性特徵。該等體內模型為本技藝下所已知且包括，例如經投予抗FVIII抗體以誘導A型血友病之小鼠(Tranholm et al.,Blood,102,3615-3620(2003))；凝血因子基因剔除模型，諸如，但不限於FVIII剔除小鼠(Bi et al.,Nat.Genet.,10(1),119-121(1995))及FIX剔除小鼠(Wang et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 94(21)：11563-11566(1997)；兔子之經誘導的A型血友病(Shen et al.,Blood,42(4)：509-521(1973))；及Chapel Hill HA狗(Lozier et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99：12991-12996(2002))。
於某些實施態樣中，本發明揭示之抗體(或抗原結合片段)增強在TFPI之存在下的FXa活性，其半最大有效濃度(EC50)不超過1×10-4M、不超過1×10-5M、不超過1×10-6M、不超過1×10-7M、不超過1×10-8M、不超過1×10-9M、不超過1×10-10M、不超過1×10-11M或不超過1×10-12M。較佳地，該EC50為約5×10-7M至1×10-11M，諸如約1×10-7M至5×10-10M、約1×10-7M至1×10-10M、1×10-7M至5×10-9M、5×10-7M至5×10-10M、約5×10-7M至1×10-10M或約5×10-7M至5×10-9M。
於某些實施態樣中，本發明之抗體(或抗原結合片段)中和TFPI對由FVIIa/TF介導之FX活化的抑制作用，其半最大有效濃度(EC50)不超過1×10-4M、不超過1×10-5M、不超過1×10-6M、不超過1×10-7M、不超過1×10-8M、不超過1×10-9M、不超過1×10-10M、不超過1×10-11M或不超過1×10-12M。較佳地，該EC50為約5×10-7M至1×10-11M，諸如約1×10-7M至5×10-10M、約1×10-7M至1×10-10M、1×10-7M至5×10-9M、5×10-7M至5×10-10M、約5×10-7M至1×10-10M或約5×10-7M至5×10-9M。
於某些實施態樣中，如在基於血漿之稀釋凝血酶原時間分析中所測量者，本發明揭示之抗體(或抗原結合片段)減少凝血時間，其半最大有效濃度(EC50)不超過1×10-4M、不超過1×10-5M、不超過1×10-6M、不超過1×10-7M、不超過1×10-8M、不超過1×10-9M、不超過1×10-10M、不超過1×10-11M或不超過1×10-12M。較佳地，該EC50為約5×10-7M至1×10-11M，諸如約1×10-7M至5×10-10M、約1×10-7M至1×10-10M、1×10-7M至5×10-9M、5×10-7M至5×10-10M、約5×10-7M至1×10-10M或約5×10-7M至5×10-9M。
於某些實施態樣中，本發明揭示之抗體(或抗原結合片段)增加凝血酶生成速率指數，其半最大有效濃度(EC50)不超過1×10-4M、不超過1×10-5M、不超過1×10-6M、不超過1×10-7M、不超過1×10-8M、不超過1× 10-9M、不超過1×10-10M、不超過1×10-11M或不超過1×10-12M。較佳地，該EC50為約5×10-7M至1×10-11M，諸如約1×10-7M至5×10-10M、約1×10-7M至1×10-10M、1×10-7M至5×10-9M、5×10-7M至5×10-10M、約5×10-7M至1×10-10M或約5×10-7M至5×10-9M。
於某些實施態樣中，本發明揭示之抗體及抗體片段亦可進一步藉由，例如其他生物活性分析評定，以評估其效力、藥學活性及作為治療劑之潛在效力。該等分析為本技藝已知且取決於該靶的抗原和該抗體之所欲用途。實例包括，例如腫瘤細胞生長抑制分析；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及補體介導之細胞毒性(CDC)分析；激動活性或拮抗活性分析。
C. 多核苷酸，載體及宿主細胞
本發明亦提供編碼本發明之任一TFPI結合抗體的多核苷酸，包括本文所描述之抗體片段和經修飾之抗體，諸如，例如具有減弱之Fc效應子功能之抗體。於另一態樣中，本發明提供製造本文所描述之任一多核苷酸的方法。多核苷酸可藉由本技藝已知之程序製造及表現。因此，本發明提供多核苷酸或組成物(包括包含編碼本發明之任一TFPI抗體及其抗原結合片段之多核苷酸的醫藥組成物)。
於一實施態樣中，該VH和VL結構域、或彼等之抗原結合片段、或全長HC或LC係由個別多核苷酸 編碼。或者，VH和VL二者、或彼等之抗原結合片段、或HC和LC係由單一多核苷酸編碼。
本發明提供編碼本發明之任一TFPI抗體及其抗原結合片段之多核苷酸或包含該多核苷酸之組成物，本發明之TFPI抗體包括，但不限於TFPI-23、TFPI-24、TFPI-106、TFPI-107及4D8，其中該多核苷酸之序列包含SEQ ID NO：175(編碼TFPI-106 VH區)、SEQ ID NO：176(編碼TFPI-106 VL區)、SEQ ID NO：177(編碼TFPI-106重鏈)及SEQ ID NO：178(編碼TFPI-106輕鏈)之序列。
於另一態樣中，本發明提供編碼特異性結合TFPI之抗體的VH區或其抗原結合部分的經分離之核酸，其包含存在於寄存在ATCC編號為PTA-122329之質體中的插入子之核酸序列。
於另一態樣中，本發明提供編碼特異性結合TFPI之抗體的VL區或其抗原結合部分的經分離之核酸，其包含存在於寄存在ATCC編號為PTA-122328之質體中的插入子之核酸序列。
於另一態樣中，本發明提供編碼TFPI抗體或其部分之多核苷酸及其變體，其中該等變體多核苷酸包含與本發明揭示之任一特定核酸序列分享至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之序列 同一性的核酸序列。在任何長度之多核苷酸序列上的序列同一性程度可利用本技藝之一般技術人士所熟悉之方法計算。於一非限制性實施態樣中，二或多個相關核苷酸序列之間的序列同一性百分比可利用可從國立醫學圖書館取得之核苷酸BLAST伺服器(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)測定。該軟體提供不同的設置使得本技藝之一般技術人士可根據督如長度、複雜性之類的因素及其他因素來將序列比較最優化。
本發明提供包含如下述之核苷酸序列的核酸分子：該核苷酸序列編碼本發明之任一TFPI抗體及其抗原結合片段之胺基酸序列(包括，但不限於表33中提供之抗體或其抗原結合片段的胺基酸序列，例如SEQ ID NO：21-174之胺基酸序列)及與本發明抗體結合至相同之抗原決定部位及/或競爭結合TFPI的任一抗體。
於另一態樣中，本發明提供編碼TFPI抗體之多核苷酸及其變體，其中該等變體多核苷酸編碼與本發明揭示之任一TFPI抗體胺基酸序列分享至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、在至少87%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%之序列同一性的胺基酸序列。
於其他實施態樣中，介於包含編碼TFPI抗體或其部分之變體多核苷酸序列的核酸與包含本發明揭示之任何特定核苷酸序列的核酸之間的相關程度可藉由測試該 變體序列(或其補體)是否可與特定之核苷酸序列(或其補體)在中度或高度嚴格的條件下，在北方點墨或南方點墨分析形式中雜交。示例性和非限制性之“中度嚴格條件”包括在5×SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)之溶液中預洗；在50℃至65℃，5×SSC中雜交一整夜；接著再在65℃下以含有0.1%SDS之2X、0.5X和0.2X SSC各清洗20分鐘，二次。
示例性而非限制性的，“高度嚴格條件”或“高嚴格性條件”係指下列者：(1)採用低離子強度和高溫以用於清洗，例如在50℃下，0.015氯化鈉/0.0015檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉；(2)在42℃下，在雜交過程中採用變性劑，諸如甲醯胺(例如50%(v/v)甲醯胺)與0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/50mM磷酸鈉緩衝液，pH 6.5加750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉；或(3)在42℃下，採用50%甲醯胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH為6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5×Denhardt溶液、經超音波處理之鮭魚精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS及10%硫酸葡聚醣，並在42℃，0.2×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)及55℃，50%甲醯胺中清洗，隨後以55℃，含有EDTA之0.1×SSC的高度嚴格清洗液清洗。本技藝之技術熟習人士將察知如何依需要調整溫度，離子強度，等以適應諸如探針長度，等因素。本技藝之一般技術人士亦將熟悉用於進行北方或南方點墨分析之標準技術以檢測介於核苷酸序列變體與本發明之特定核 苷酸序列之間的相關程度。
本發明亦包含與任一該等序列互補之多核苷酸。多核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股且可為DNA(基因組、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括hnRNA分子(其含有內含子並以一對一的方式對應於DNA分子)及不含有內含子之mRNA分子。另外之編碼或非編碼序列可，但不一定存在於本發明之多核苷酸中。
或者，變體亦可基本上與天然基因、或其一部分或其補體同源。該等多核苷酸變體能夠在中等嚴格條件下與編碼天然抗體(或互補序列)之天然DNA序列雜交。
本技藝之一般技術人士將可察知由於遺傳密碼之簡併性，有許多核苷酸序列能夠編碼本發明所揭示之任一TFPI抗體或其部分。這些多核苷酸中有些可能與本發明所提供之TFPI抗體的任一特定核苷酸序列具有相當低之序列同一性，但編碼相同胺基酸序列。然而，由於密碼子用途之差異而有所變化的多核苷酸為本發明所特別考慮的。
本發明之多核苷酸可使用化學合成、重組方法或PCR來取得。化學多核苷酸合成方法為本技藝所周知，並不需要在本文中詳細地描述。本技藝之技術熟習人士可使用本文提供之序列及市售之DNA合成儀來產生所需之DNA序列。
在使用重組方法製備多核苷酸方面，可將包 含所需序列之多核苷酸插入合適之載體中，然後可將該載體引入適合用於複製和擴增之宿主細胞中(如本文所進一步討論者)。多核苷酸可藉由本技藝中已知之任何方法插入宿主細胞中。細胞可經由直接攝取、胞吞作用、轉染、F-交配或電穿孔引入外源多核苷酸來轉化。一旦引入後，可將該外源多核苷酸以非整合載體(例如質體)之形式保持在細胞內或被整合入宿主細胞基因組中。如此擴增之多核苷酸可藉由本技藝所周知之方法從宿主細胞中分離出。參見，例如Sambrook et al.,1989。
或者，PCR允許複製DNA序列。PCR技術為本技藝所周知且描述於美國專利案第4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202號以及PCR：The Polymerase Chain Reaction,Mullis et al.eds.,Birkauswer Press,Boston,1994中。
RNA可利用在合適之載體中的分離之DNA，並將其插入合適之宿主細胞來取得。當細胞複製而DNA轉錄成RNA時，該RNA可隨後利用本技藝之技術熟習人士所周知的方法(例如Sambrook et al.,1989(同上)中所列舉者)被分離出。
合適之選殖載體可根據標準技術構建或可從本技藝中可用之大量選殖載體中選擇。雖然所選定之選殖載體可根據欲使用之宿主細胞而變化，有用之選殖載體通常具有自我複製之能力、可能擁有用於特定之限制性內切酶的單一靶的及/或可能攜帶可用於選擇含有該載體之選 殖株的標記之基因。合適之實例包括質體和細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、PCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體，諸如PSA3和pAT28。這些和許多其他選殖載體可從商業供應商，諸如BioRad、Stratagene和Invitrogen公司取得。
進一步提供表現載體。表現載體通常為含有根據本發明之多核苷酸的可複製多核苷酸構建體。其暗示表現載體必須能在宿主細胞中或以游離基因(episome)或以染色體DNA之組成部分形式複製。合適之表現載體包括，但不限於質體、病毒載體，包括腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒、黏粒及PCT刊物第WO 87/04462號中所揭示之表現載體。載體組分通常可包括，但不限於一或多種下列物質：信號序列；複製起點；一或多個標記基因；合適之轉錄控制元件(諸如啟動子、增強子和終止子)。為了表現(即轉譯)，通常亦需要一或多個轉譯控制元件，諸如核糖體結合位點、轉譯起始位點及終止密碼子。
含有所欲多核苷酸之載體及/或該多核苷酸自身可藉由多種適當方式之任一種引入宿主細胞中，包括電穿孔、採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚醣或其他物質轉染；基因槍法(microprojectile bombardment)；脂質體轉染；及感染(例如其中該載體為感染劑，諸如牛痘病毒)。引入載體或多核苷酸之選擇通常係取決於該宿主細胞之特性。
本發明亦提供包含本文所描述之任一多核苷酸的宿主細胞。任何能過度表現異源DNA之宿主細胞均可用於分離編碼所欲抗體、多肽或蛋白質之基因。非限制性哺乳動物宿主細胞之實例包括，但不限於：猿COS、人HeLa、人胚胎腎(HEK)293、Sp2.0及中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。亦參見PCT刊物第WO 87/04462號。合適之非哺乳動物宿主細胞包括原核生物(諸如大腸桿菌(E.coli)或枯草芽孢桿菌(B.subtillis))和酵母(諸如釀酒酵母(S.cerevisae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)；或乳酸克魯維酵母(K.lactis))。表現TFPI抗體或其抗原結合部分之宿主細胞的篩選可使用免疫結合分析檢測，諸如ELISA、FACS或其他本技藝之一般技術人士熟悉之分析來檢測。
因此，本發明之抗體(或其抗原結合片段)可使用合適之宿主細胞來重組製造。編碼該抗體或其抗原結合片段之核酸可經選殖入表現載體中，然後可將其引入不會另外產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、COS細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞)中以達成在該重組宿主細胞中合成單株抗體。示例性宿主細胞包括CHO細胞、HEK 293及Sp2.0細胞。
表現載體可用於指導TFPI抗體之表現。本技藝之技術熟習人士熟悉如何投予表現載體以達到在體內表現外源蛋白。參見，例如美國專利案第6,436,908；6,413,942；及6,376,471號。表現載體之投予包括局部或全身性投予，包括注射、口服投予、粒子槍或插管投予及 局部投予。根據某些非限制性實施態樣，該表現載體係直接投予至肝臟、骨骼肌、骨髓或其他組織。
亦可使用靶向投遞之含有表現載體或亞基因組多核苷酸之治療組成物。由受體介導之DNA遞送技術描述於，例如Findeis et al.,Trends Biotechnol.,1993,11：202；Chiou et al.,Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer,J.A.Wolff,ed.,1994；Wu et al.,J.Biol.Chem.,1988,263：621；Wu et al.,J.Biol.Chem.,1994,269：542；Zenke et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87：3655；Wu et al.,J.Biol.Chem.,1991,266：338中。在基因療法方案中，用於局部投予之含有多核苷酸之治療組成物的投予量為約100ng至約200mg之DNA。在基因療法方案期間亦可使用濃度範圍在約500ng至約50mg、約1μg至約2mg、約5μg至約500μg、約20μg至約100μg之DNA。該治療性多核苷酸和多肽可使用基因遞送載體遞送。該基因遞送載體可為病毒或非病毒來源(一般參見Jolly,Cancer Gene Therapy,1994,1：51；Kimura,Human Gene Therapy,1994,5：845；Connelly,Human Gene Therapy,1995,1：185；及Kaplitt,Nature Genetics,1994,6：148)。該等編碼序列之表現可使用內源性哺乳動物啟動子或異源啟動子誘導。該編碼序列之表現可為組成型或經調節的。
用於遞送所需之多核苷酸並在理想之細胞中表現的基於病毒之載體為本技藝所周知。示例性之基於病 毒的載劑包括，但不限於重組逆轉錄病毒(參見，例如PCT刊物第WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805號；美國專利案第5,219,740和4,777,127號；GB專利案第2,200,651號；及EP專利案第0 345 242號)、基於α病毒屬之載體(例如新培斯病毒(Sindbis)載體、塞姆利基森林(Semliki forest)病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、羅斯河(Ross River)病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委內瑞拉馬腦炎(Venezuelan equine encephalitis)病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250、ATCC VR 1249；ATCC VR-532))及腺相關病毒(AAV)載體(參見，例如PCT刊物第WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655號)。亦可採用投予如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3：147中所描述之連接經滅殺之腺病毒的DNA。
亦可採用非病毒遞送載體和方法，包括，但不限於連接或未連接單獨之經滅殺的腺病毒之聚陽離子性縮聚DNA(參見，例如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3：147)；配體連接之DNA(參見，例如Wu,J.Biol.Chem.,1989,264：16985)；真核細胞遞送載劑細胞(參見，例如美國專利案第5,814,482號；PCT刊物第WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763；和WO 97/42338號)及核酸電荷中和或與細胞膜融合。亦可採用裸出之DNA。示例 性之裸出之DNA導入方法描述於PCT刊物第WO 90/11092號和美國專利案第5,580,859號中。可作為基因遞送載劑之脂質體描述於美國專利案第5,422,120號；PCT刊物第WO 95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445號；及EP 0524968中。另外之方法描述於Philip,Mol.Cell Biol.,1994,14：2411和Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.,1994,91：1581中。
所欲抗體(或其抗原結合片段)之序列及編碼該等抗體(或其抗原結合片段)之核酸可使用標準之測序技術測定。編碼所欲抗體(或片段)之核酸序列可插入用於重組製造及表徵之其他載體(例如選殖和表現載體)中。重鏈(或該重鏈之片段)和輕鏈(或該輕鏈之片段)可選殖在相同載體或不同載體中。
合適之選殖和表現載體可以包括各種組分，諸如啟動子、增強子及其他轉錄調節序列。該載體亦可經建構以允許抗體可變結構域在不同載體之間移動。
抗體片段可藉由蛋白水解抗體或其他抗體降解方法、藉由重組方法或藉由化學合成來製備。抗體之多肽，尤其是至多約50個胺基酸之較短多肽可方便地藉由化學合成製造。化學合成方法為本技藝中已知且可購得。
本發明揭示之抗體或其抗原結合片段可為親和力成熟的。例如，親和力成熟之抗體可藉由本技藝中已知之程序來製造(Marks et al.,1992,Bio/Technology,10：779-783；Barbas et al.,1994,Proc.Nat.Acad.Sci. USA 91：3809-3813；Schier et al.,1995,Gene,169：147-155；Yelton et al.,1995,J.Immunol.,155：1994-2004；Jackson et al.,1995,J.Immunol.,154(7)：3310-3319；Hawkins et al.,1992,J.Mol.Biol.,226：889-896；和WO2004/058184)。
4. 調製劑及用途
本文所描述之抗體或抗原結合片段可配製成醫藥調製劑。該呈凍乾調製劑或水溶液形式之醫藥調製劑可進一步包含醫藥上可接受之載體、賦形劑或穩定劑(Remington：The Science and practice of Pharmacy 20th Ed.,2000,Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。可接受之載體、賦形劑或穩定劑在該劑量和濃度下對接受者無毒且可包含緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁基或苄基醇；烷基對羥基苯甲酸酯，諸如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩胺醯胺、天門冬醯胺、組胺酸、精胺酸或賴胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖酐；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗 糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成鹽之抗衡離子，諸如鈉；金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物)；及/或非離子性表面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本文中進一步描述醫藥上可接受之賦形劑。
本文所描述之抗體或抗原結合片段可用於各種治療或診斷目的。例如該抗體或其抗原結合片段可作為親和性純化劑(例如用於在玻管內純化TFPI)、作為診斷劑(例如用於檢測特定細胞、組織或血清中之TFPI表現)。
本發明之抗體及抗體片段的示例性治療用途包括治療血小板減少症(thrombocytopenia)、血小板病症(血小板功能或數目之病症)及出血病症(例如A型血友病、B型血友病及C型血友病)。該抗體和抗體片段亦可用於治療適應症中之不受控制的出血，諸如創傷和出血性中風。該抗體和抗體片段亦可用於預防性治療(例如在外科手術之前)。
尤其是，本文所描述之抗體或抗原結合片段可用於治療凝血不足或凝血缺陷。例如，本文所描述之抗體或抗原結合片段可用於減少或抑制TFPI與FXa交互作用，或減少TFPI依賴性抑制TF/FVIIa/FXa活性之作用。
在治療應用方面，本文所描述之抗體或抗原結合片段可藉由習知技術投予哺乳動物，尤其是人類，諸如經由靜脈內(為大丸藥形式或在一段時間內藉由連續輸注)、肌肉內、腹膜內、腦脊內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、局部途徑或經由吸入。抗體或抗原結合 片段亦適合經由瘤內、腫瘤周圍、病灶內或病灶周圍途徑投予。
因此，於一態樣中，本發明提供降低組織因子途徑抑制劑(TFPI)活性之方法，其包含投予有此需要之個體治療有效量之本發明的抗體或抗原結合片段。於另一態樣中，本發明提供縮短出血時間之方法，其包含投予有此需要之個體治療有效量之本文描述的抗體或抗原結合片段。
於某些實施態樣中，該個體為人類。
於某些實施態樣中，該個體罹患或易發生凝血缺陷。凝血缺陷包括，例如類血友病(von Willebrand disease)(vWD)、A、B或C型血友病及其他血小板病症(諸如先天性血小板缺陷、先天及後天儲存池缺乏症、出血時間延長)。
於某些實施態樣中，本文描述之抗體或抗原結合片段係經由皮下投予。於某些實施態樣中，本文描述之抗體或抗原結合片段係經由靜脈內投予。
該醫藥組成物可以不同頻率投予有此需要之個體，該頻率可隨著出血事件之嚴重性而變化，在預防性療法之情況中，可能隨著患者凝血缺陷之嚴重性而變化。
該組成物可以大丸藥之形式或藉由連續輸注投予有需要之患者。例如，以Fab片段呈現之抗體當以大丸藥之形式投予時，投予量可為0.0025至100mg/kg(體重)、0.025至0.25mg/kg、0.010至0.10mg/kg或0.10至 0.50mg/kg。在連續輸注方面，以Fab片段呈現之抗體的投予量可為在1至24小時、1至12小時、2至12小時、6至12小時、2至8小時或1至2小時之期間內投遞0.001至100mg/kg(體重)/分鐘、0.0125至1.25mg/kg/分鐘、0.010至0.75mg/kg/分鐘、0.010至1.0mg/kg/分鐘或0.10至0.50mg/kg/分鐘。
在投予為全長抗體(具有完整之恆定區)形式之抗體方面，劑量可為約1mg/kg至約10mg/kg、約2mg/kg至約10mg/kg、約3mg/kg至約10mg/kg、約4mg/kg至約10mg/kg、約5mg/kg至約10mg/kg、約1mg/kg至約20mg/kg、約2mg/kg至約20mg/kg、約3mg/kg至約20mg/kg、約4mg/kg至約20mg/kg、約5mg/kg至約20mg/kg、約1mg/kg或更多、約2mg/kg或更多、約3mg/kg或更多、約4mg/kg或更多、約5mg/kg或更多、約6mg/kg以上、約7mg/kg或更多、約8mg/kg或更多、約9mg/kg或更多、約10mg/kg或更多、約11mg/kg或更多、約12mg/kg或更多、約13mg/kg或更多、約14mg/kg或更多、約15mg/kg或更多、約16mg/kg或更多、約17mg/kg或更多、約19mg/kg或更多或約20mg/kg或更多。投予頻率將取決於病況之嚴重程度。頻率範圍可為每週三次至每二週或每三週一次。
此外，該組成物可經由皮下注射投予患者。例如，可將劑量為1至100mg之抗TFPI抗體每天一次、 每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每週二次、每週、每二週、或每月一次經由皮下注射投予患者。
於某些實施態樣中，該醫藥組成物係按每週之時間表經由皮下投予約0.1mg/kg至約10mg/kg、約0.5mg/kg至約10mg/kg、約1mg/kg至約10mg/kg、約1.5mg/kg至約10mg/kg、約2mg/kg至約10mg/kg、約0.1mg/kg至約8mg/kg、約0.5mg/kg至約8mg/kg、約1mg/kg至約8mg/kg、約1.5mg/kg至約8mg/kg、約2mg/kg至約8mg/kg、約0.1mg/kg至約5mg/kg、約0.5mg/kg至約5mg/kg、約1mg/kg至約5mg/kg、約1.5mg/kg至約5mg/kg、約2mg/kg至約5mg/kg、約0.5mg/kg、約1.0mg/kg、約1.5mg/kg、約2.0mg/kg、約2.5mg/kg、約3.0mg/kg、約3.5mg/kg、約4.0mg/kg、約4.5mg/kg、約5.0mg/kg、約5.5mg/kg、約6.0mg/kg、約6.5mg/kg、約7.0mg/kg、約7.5mg/kg、約8.0mg/kg、約8.5mg/kg、約9.0mg/kg、約9.5mg/kg或約10.0mg/kg之劑量。
於某些實施態樣中，該醫藥組成物係按每週之時間表經由皮下投予約2.0mg/kg之劑量。於某些實施態樣中，該醫藥組成物係按每週之時間表經由皮下投予約3.0mg/kg之劑量。
本文描述之抗體和抗體片段可以單一療法或與其他療法組合使用來解決止血失調。例如，共同投予本 發明之一或多種本發明之抗體(或抗體片段)與凝血劑(諸如第VIIa因子、第VIII因子、第IX因子或傳明酸)對治療血友病是有用的。
於一實施態樣中，本發明提供用於治療凝血缺陷或縮短出血時間之方法，其包含投予(a)第一個量之本發明的抗體或抗原結合片段，及(b)第二個量之第VIII因子或第IX因子。可選擇地，不共同投予第VII因子。於另一實施態樣中，本發明提供用於治療凝血缺陷或縮短出血時間之方法，其包含投予(a)第一個量之本發明的抗體或抗原結合片段，及(b)第二個量之第VIII因子或第IX因子。可選擇地，不共同投予第VII因子。本技藝之技術熟習人士將察知於治療凝血缺陷時，縮短出血時間亦可稱為縮短凝血時間。
本發明亦包括包含治療有效量之本發明抗體(或抗體片段)與第VIII因子或第IX因子之組合物的醫藥組成物，其中該組合物不包含第VII因子。“第VII因子”包括第VII因子和第VIIa因子。
生物寄存
本發明之代表性物質於2015年7月22日寄存於美國典型培養物保藏中心(美國維吉尼亞州Manassas，大學大道10801號)。ATCC編號PTA-122329之質體載體mAb-TFPI-106 VH包含編碼抗體TFPI-106之重鏈可變區的DNA插入子，而ATCC編號PTA-122328 之質體載體mAb-TFPI-106 VL包含編碼抗體TFPI-106之輕鏈可變區的DNA插入子。該存放係根據國際間承認用於專利程序和規則項(布達佩斯條約)下有關微生物寄存之布達佩斯條約。這確保該寄存之培養物從寄存之日起30年可保持存活。該寄存物將根據布達佩斯條約之條款由ATCC提供並受輝瑞公司和ATCC之間的協議管制，此協議確保該寄存之培養物後代在相關的美國專利案發佈時或在任何美國或外國專利申請案(以先到者為準)開放給公眾時的永久和無限制可用性，並確保由美國專利和商標專員按照35 USC第122條及符合條件之專員規則(包括37 CFR 1.14節，特別參考886 OG 638)決定具有權利者可取得該後代。
本申請案之受讓人已同意若存放之培養物在合適之條件下培養時死亡或遺失或損壞，將在通知時及時更換另一相同物質。寄存之物質的可用性不應被理解為允許在違背任何政府當局根據其專利法之授權下實施本發明。
[實施例]
本發明藉由參考下列實施例做進一步之詳細描述。除非另有規定，這些實施例僅用於說明，而不意圖用於限制。因此，本發明不應在任一方面被解釋為限於下列實施例，而應被解釋為包含因本文所提供之教示而變得顯明之任何及所有變化。
實施例1. 實驗材料及方法
1. TFPI蛋白試劑
表1中列出用於致免疫、噬菌體展示選擇及表徵抗TFPI抗體之蛋白質試劑，而彼等之序列ID列於表2中。
使TFPI構建體(pSMED2載體)瞬時表現於HEK293F細胞中並在轉染後120小時收穫該條件培養基。使用鎳瓊脂糖HP(Nickel Sepharose HP)從條件培養基捕捉所欲之蛋白質並藉由尺寸排阻色層分析法進一步純化。從血液學技術公司取得第Xa因子及X因子。從Sekisui Diagnostics取得用於第Xa因子之醯胺水解分析的發色受質Spectrozyme®FXa。
2. 抗體試劑
用於比較目的之單株抗體(參考抗體2A8、2A8-200、3F18、hz4F36)列於表3中。抗體描述、來源及序列列於表4中(第5圖)。將輕鏈和重鏈序列選殖入適當之載體中並瞬時表現在人胚腎-293(HEK-293)細胞中，再藉由蛋白A瓊脂糖(Protein A Sepharose)及尺寸排阻色層 分析法純化。從R & D系統(目錄# MAB2974)取得Mab2974。
3. TFPI結合ELISA
利用AviTagTM系統將重組humTFPI K1K2、murTFPI K1K2、cynTFPI K1K2、ratTFPI K1K2、rabTFPI K1K2或TFPI2生物素化並捕捉在塗覆濃度為1×10-8M(在ELISA分析緩衝液中)之格瑞納(Greiner)鏈親和素(streptavidin)的96孔盤上。將純化之抗TFPI抗體在ELISA分析緩衝液中稀釋成1μg/ml，再連續稀釋3倍以產生8-點稀釋系列。在每一孔中加入體積為100μL之稀釋的抗體。將該96孔盤在室溫下溫育2小時。以PBS/0.05% Tween20清洗該96孔盤後，將該盤與稀釋10,000倍之與辣根過氧化物酶(Pierce)軛合之山羊抗小鼠IgG-Fc多株抗體一起溫育。溫育1小時後，藉由加入TMB受質溶液來檢測經結合之抗體。讀取在450nm之吸光度並藉由GraphPad Prism軟體分析數據。
4. 表面離子體共振(SPR)
藉由胺偶聯抗人類IgG抗體(目錄編號BR-1008-39，GE Healthcare)至經塗覆羧甲基化之葡聚醣的傳感器晶片(CM5)(目錄編號BR100530，GE Healthcare)上的所有四個流動池來製備抗人類Fc傳感器晶片。經由注射400mM 1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)之1：1混合物7分鐘，流速為10μl/分鐘來活化該流動池。將抗-人類IgG抗體在10mM醋酸鈉，pH 5.0中稀釋成25μg/ml並注射在所 有流動池上7分鐘，流速為10μl/分鐘。以1M乙醇胺HCL(ETH)阻斷所有流通池7分鐘，流速為10μl/分鐘。該捕捉抗體之最終固定水準為約10,000共振單位(RU)。用於固定和動力學之運行緩衝液為10mM HEPES，pH 7.4、150MM NaCl、3mM EDTA、0.05%(v/v)Tween-20(HBS-EP +)。為了表徵抗TFPI抗體與人類TFPI之結合，將該抗體在HBS-EP +中稀釋成0.5μg/ml，並由固定在流動池2、3和4中之抗人類IgG，以5μL/分鐘之流速捕捉30秒至1分鐘，以達到70至300RU之捕捉水準。使用流動池1作為參考表面。捕捉抗體後，將流速增加至50μL/分鐘並將緩衝液或在HBS-EP+中，濃度為0.2nM至200nM之人類TFPI注射在所有流動池上以結合1.0分鐘，再允許其解離10至15分鐘。使用所收集之每個捕捉抗體的緩衝液循環以供雙重參考(Myszka,D.G.J.Mol.Recognit.12,279-284(1999))。在每個週期結束時，藉由脈衝3M MgCl2 60秒使整個抗IgG表面再生。在25℃下，在BIAcore T200儀器(GE Healthcare)上以10Hz之收集速率進行動力學分析。經由將數據擬合至BIAcore T200評估軟體版本1.0(GE)之1：1模型來測定速率常數和親和力。
5. 第Xa因子TFPI抑制逆轉法
在玻管內評估在抑制性濃度之TFPI的存在下，經純化之抗TFPI抗體回復第Xa因子活性之能力。將 在PBS中稀釋之濃度為1nM至500nM的抗TFPI抗體與在活性緩衝液(20mM HEPES，pH值8.0、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.5mg/mL BSAT)中之10nM重組型人類TFPI K1K2或10nM兔子TFPI K1K2蛋白在37℃下預溫育30分鐘。加入2nM源自人類血漿之第Xa因子並將反應物在37℃下溫育30分鐘。將發色受質Spectrozyme Xa加入其中，使100μl之最終反應體積的最終濃度為500μM。對照反應包括不含第Xa因子以控制分析背景、不含TFPI以允許FXa之產量最大(100%活性)或不含抗TFPI抗體(單獨之PBS)之反應。立即在SpectraMax M5e多功能盤式分析儀上，在60分鐘之期間內，每隔2分鐘在405nm波長處讀取反應之吸光度。以Prism Graph Pad軟體計算EC50。
6. 二階段TF-FVIIa-FX抑制逆轉分析
在玻管內評估在抑制性濃度之TFPI的存在下，經純化之抗TFPI抗體回復第VIIa組織因子活性之能力。將濃度為1nM至500nM之抗TFPI抗體與在活性緩衝液中之10nM重組型TFPI K1K2蛋白在37℃下預溫育30分鐘。將約1pM之脂化的組織因子和1nM重組型第VIIa因子(NovoSeven)加入該反應物中並在37℃溫育5分鐘。將150nM之人類第X因子引入該反應物中。在每個孔中加入發色受質Spectrozyme Xa，使100μl之最終反應體積的最終濃度為500μM。對照反應包括不含第VIIa因子、不含第X因子、不含組織因子、不含TFPI或不含抗 TFPI抗體(單獨之PBS)之反應。立即在SpectraMax M5e多功能盤式分析儀上，在60分鐘之期間內，每隔2分鐘在405nm波長處讀取反應之吸光度。以Prism Graph Pad軟體計算EC50。
7. 凝血酶生成分析(TGA)
使用自動校準之凝血酶曲線(CAT)系統在凝血酶生成分析中評估經純化之抗TFPI抗體回復在第VIII因子活性衰減之血漿中之凝血酶生成的能力。將在PBS中稀釋之濃度為1nm至500nm的抗TFPI抗體引入含有人類第VIII因子缺乏血漿及PPP-低試劑、含有4μM磷脂及1pM組織因子的反應物中。對照反應物使用PBS，不含抗體。加入含有螢光生成凝血酶受質及CaCl2之Fluca緩衝液來觸發反應。立即使用Fluoroskan Ascent盤式分析儀，使用Thrombinoscope軟體在60分鐘內，每隔20秒讀取各反應物之螢光。將各反應物與含有PBS、凝血酶校準物、第VIII因子缺乏血漿及FLUCA緩衝液之校準對照孔相比較。使用Thrombinoscope軟體(Thrombinoscope BV版本)分析Thrombinoscope凝血酶生成曲線(nM凝血酶對時間)以推斷出延遲時間、波峰高度及達到峰值時間及曲線下面積或內源性凝血酶潛能(ETP)。使用這些數據來計算速度指數(峰值凝血酶濃度/達到峰值時間-延遲時間)。
亦評估經純化之抗TFPI抗體回復在第VIII因子活性衰減之兔子血漿中之凝血酶生成的能力。在37℃ 下，以最終濃度為100μg/mL之抗FVIII抗體(GM-8015)或濃度為100μg/mL之對照組小鼠抗人類IgG2a處理正常之紐西蘭白兔血漿60分鐘。在加入反應孔前不久，將兔子血漿在緩衝液(20mM HEPES，140mM NaCl)中稀釋3倍。依上述，以該FVIII中和之兔子血漿進行凝血酶生成分析。
8. 產生用於結構研究之食蟹猴(cynomolgus)TFPI K2結構域
將食蟹猴(cyno)TFPI K1K2(表1)表現在HEK293細胞中並在轉染後120小時收穫條件培養基。將純化之Cyno TFPI K1K2120與人類中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)以1：70(莫耳比HNE：TFPI)之比例在室溫下一起溫育120分鐘以發生裂解。在HQ50(Poros)上利用陰離子交換色層分析法將cyno K1從cyno K2分離。使用Superdex 75進行尺寸排阻色層分析來作為最終純化步驟。使用內蛋白酶AspN將殘基AviTag從cyno K2結構域之C端修剪掉。
9. 產生用於結構研究之抗體Fab/cyno TFPI K2複合物
依照製造商(Thermo/Pierce)之方案，以經固定之木瓜蛋白酶分解抗TFPI抗體4D8.b1、TFPI-23、TFPI-24、2A8-200(表3)及Mab 2974(R&D系統)。使用MabSelect SuRe純化來自該分解物之Fab，再將其與cyno TFPI K2形成複合物。然後，將Fab/cyno TFPI K2複合物濃縮成約16mg/ml。再使用該濃縮物篩選蛋白質結晶條件。
實施例2. 產生小鼠抗TFPI抗體
1. 小鼠免疫化和產生雜交瘤
經由皮下途徑以在完全弗氏佐劑中乳化之5μg之humTFPI K1K2和5μg之murTFPI K1K2蛋白的混合物將一群共5隻之BALB/c小鼠各自免疫化。隨後每週以在不完全弗氏佐劑中乳化或在PBS中稀釋之蛋白混合物輪流將小鼠免疫化2次。在第17天及27天(分別在第五和第七次免疫化之後)採取血液樣本，藉由ELISA測試血清中是否存有循環之抗TFPI抗體。在第27天前，每隻小鼠經由腹腹內注射接受最後一次蛋白質混合物(10μg)之加強注射。四天後，收穫引流之淋巴結(腋窩、腹股溝及膕)並將匯集之淋巴結細胞與P3X63.Ag8.653細胞以1：1之比例混合並進行電-細胞融合。將融合之細胞平皿接種在輔以FBS(25%)、NCTC-109(12.5%)、Glutamax(1%)、青黴素-鏈黴素(1%)、雜交瘤選殖補充劑(5%)和HAT(1×10-4M次黃嘌呤、4×10-7M胺基喋呤(aminopterin)及1.6×10-5M胸苷)之RPMI1640培養基中。14天後藉由ELISA測試該融合雜交瘤培養上清液與humTFPI K1K2之結合情形。根據其結合活性及其在功能分析中之效力，選擇來自三個雜交瘤4D8、6B7和7A4之抗體漢用於進一步表徵。
2. 源自雜交瘤之抗TFPI抗體的選殖和定序
製備來自雜交瘤4D8、6B7和7A4之RNA並藉由RT-PCR選殖取得來自該表現之抗體的可變區DNA序列。將PCR產物選殖入TOPO-TA選殖載體中，然後藉由常規方法測序。從雜交瘤6B7和7A4檢測到一個重鏈和輕鏈cDNA對。從4D8中檢測到二個重鏈和輕鏈cDNA。
實施例3. 小鼠雜交瘤抗TFPI抗體之表徵
藉由有限稀釋將親代雜交瘤4D8、6B7和7A4分殖以取得單株雜交瘤細胞株。藉由ELISA篩選與humTFPI K1K2之反應性以鑑定陽性分殖株並擴增之。將來自各雜交瘤的一個分殖株之純化的抗體進一步表徵。
1. 結合TFPI
藉由蛋白質結合ELISA測試經純化之抗TFPI抗體4D8.B1、6B7.C5和7A4.D9與重組型人類和兔TFPI蛋白之結合。各抗體對humTFPI K1K2-aviHis10及rabTFPI K1K2之EC50值顯示於表5中。
進行表面離子體共振實驗以評估該經純化之小鼠抗TFPI抗體對人類和兔子TFPI K1K2蛋白的親和力。各抗體與人類和兔子TFPI K1K2結合之ka、kd和KD值顯示於表6中。
2. 玻管內活性分析
在FXa和TF-FXa-FVIIa抑制逆轉分析及凝血酶生成分析(TGA)中測試該抗TFPI小鼠單株抗體之活性。選擇最有效的抗體4D8.B1進行進一步研究。
實施例4. 從選殖株4D8產生嵌合型及人化抗體
1. 產生小鼠人類嵌合型抗體4D8
將源自雜交瘤4D8之可變區cDNA分殖入哺乳動物表現載體中以產生其中該小鼠重鏈可變區與人類IgG1 3M(SEQ 20，表4)在框架中融合，而該小鼠輕鏈可變區與人類Igκ恆定區(SEQ 62，表4)在框架中融合的嵌合型抗體。將該嵌合型構建體瞬時轉染入HEK293細胞中。以所有可能之重和輕鏈組合進行共四次之瞬時轉染以鑑定來自雜交瘤4D8之正確的重和輕鏈對。從其中一次轉染產生之抗體被稱為hu-mu 4D8嵌合體(表3和4)。
2. 小鼠-人類嵌合型抗體4D8(hu-mu 4D8)之表徵
藉由蛋白質結合ELISA(表8)和SPR(表9)測試Mu-hu 4D8嵌合體與人類和兔子TFPI K1K2蛋白結合的能力。該KD和EC50值與那些以純化之小鼠Mab 4D8.B1測得的數值非常相似，證明移植到人類IgG1屬性之小鼠可變區的移植物可保留結合活性。
3. hu-mu 4D8嵌合體之人化
藉由CDR移植到人類受體框架序列上來將hu-mu 4D8嵌合體序列人化。選擇DP54框架和DPK9框架。然後表現該重和輕鏈構建體之組合(參見表3)。在ELISA結合分析中測試抗體與人類和兔子TFPI結合(表10)及在SPR結合分析中測試抗體與人類TFPI結合(表11)。
基於這些數據，選擇4D8 Vk 1.1 xVH 1.4進行進一步表徵且命名為hz4D8(表3)。在抑制逆轉分析、二階段TF-FVIIa-FX抑制分析和凝血酶生成分析中比較人化抗TFPI抗體(hz4D8)與小鼠4D8.B1FXa之活性。表12中之數據顯示出與小鼠抗體相比較，人化抗體在所有三個分析中均具有改善的活性，這指出TFPI結合活性被完全 保留在人化抗體中。
實施例5. 藉由噬菌體展示技術產生另外之抗TFPI抗體
1. 藉由噬菌體展示選擇抗TFPI抗體
使用源自未經免疫化之人類供體的scFv抗體片段之噬菌體展示庫進行4輪選擇後鑑定結合重組型人類和小鼠TFPI K1K2之單鏈片段可變(scFv)抗體。使用鏈親和素小珠在溶液中執行噬菌體選擇。經由與140mM之三乙醇胺(TEA)，pH 11.5或50mM之MES，pH 5.5在室溫下，旋轉振盪器上溫育10分鐘並以1M Tris-HCl，pH7.5中和之來洗提出經結合之噬菌體。
使用洗提出之噬菌體匯集體感染10mL已生長至中期對數期之大腸桿菌ER2738培養(相當於OD600為約0.5)。在37℃下，以噬菌體感染細菌30分鐘，不搖動，藉由離心濃縮並進行平皿接種，再在30℃下生長一整夜。在下一輪選擇方面，經由接種在25mL之2×TYAG/四環素達到OD600為約0.1，再令其在37℃下生長至OD600為0.3至0.5來救回噬菌體。以1：20細胞/輔助噬菌體之比率，以MK13K07輔助噬菌體超感染細胞並在37℃下溫育30分鐘，不搖動，再在150rpm搖動60分鐘。然後將 細胞離心並將沉澱小丸重新懸浮在含有卡那黴素/非葡萄糖之培養基中。令此培養物在25℃生長一整夜。離心後收穫上清液中之噬菌體並用於下一輪之選擇。
2. 製備用於ELISA分析之粗周質材料
根據所使用之生長條件，ScFv抗體片段可表現在噬菌體粒子表面上或在細菌周質空間之溶液中。為了誘導scFv抗體片段釋入周質中，將來自解凍之甘油貯存物接種在含有2X TY培養基與0.1%葡萄糖/100μg/mL胺苄青黴素之96深孔盤中，並在37℃下生長約4小時。藉由滲透性休克釋出細菌周質之內容物(peripreps)。將盤離心並收穫含有該scFv之上清液。
3. 藉由ELISA測量表現在周質中之scFv與人類和小鼠TFPI K1K2之結合
隨機從所有分支選擇之第2、3和4輪中挑出總共1984個選殖株。藉由周質製品(periprep)結合ELISA來鑑定TFPI scFv結合株。將在PBS中，濃度為1μg/mL之經生物素化的人類和小鼠TFPI K1K2塗覆在384孔Nunc Maxisorp鏈親和素盤上。將TFPI K1K2溶液移除並將該盤在室溫下，在0.05% Tween 20/1% BSA/PBS中阻斷1小時。製備周質製品並在室溫下，等體積之6%乳汁/1%BSA中阻斷1小時。將20μl/孔之經阻斷的周質scFv和對照抗體轉移至適當的盤中並在室溫下溫育1小時。加 入抗myc辣根過氧化物酶(HRP)之1：2,000稀釋液或山羊抗人類HRP二次抗體之1：10,000稀釋液以檢測經結合之scFv或抗TFPI對照抗體。使用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺發展信號並在Envision盤式分析儀(Perkin Elmer)上讀取在450nm之吸光度。共有883個scFV選殖株被鑑定為TFPI結合株。為該883個TFPI結合scFv進行測序以鑑定獨特之選殖株。選出288個獨特之選殖株來測試TFPI/FXa競爭性結合。
4. 藉由ELISA鑑定與FXa競爭結合人類和小鼠TFPI K1K2之scFv
在FXa/TFPI競爭性結合ELISA中共測試288個獨特選殖株。將在PBS中濃度為1μg/mL之人類FXa塗覆在384孔Nunc Maxisorp盤上一整夜。將FXa溶液移除並將該盤在室溫下，在0.05% Tween 20/1% BSA/PBS中阻斷1小時。製備週質製品並在室溫下，等體積之6%乳汁/1%BSA中阻斷1小時。將20μl/孔之經阻斷的週質scFv和對照抗體與經生物素化之humTFPI K1K2混合並在室溫下溫育1小時。將混合物轉移至經FXa塗覆之盤並在室溫下1溫育小時。加入鏈親和素辣根過氧化物酶之1：2000稀釋液以檢測經結合之TFPI。使用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺發展信號，在Envision盤式分析儀(Perkin Elmer)上，讀取在450nm之吸收度。共有48個scFV抗體被歸類為TFPI/FXa結合之競爭性抑制劑。
5. ScFv轉化成人類IgG
共選出48個顯示出結合TFPI及在TFPI/FXa競爭性ELISA中之抑制作用之具有獨特序列的scFV抗體以分殖到人類IgG-3M選殖載體中。簡單地說，藉由標準PCR擴增片段。將VH或VL片段進行凝膠純化並連接入含有人類IgG1-3M(VH)或κ或λ恆定區(VK/VL)之哺乳動物表現載體中。然後，使用VH和VK/VL配對之表現載體在HEK 293細胞中以供哺乳動物瞬時表現並純化。
6. 決定人類IgG-3M抗TFPI抗體之特徵
在各種分析(包括FXa和TF/FVII/FXa抑制逆轉分析)中將48種抗TFPI抗體分級。TFPI-3、TFPI-21、TFPI-23、TFPI-24和TFPI-26具有所期望之性質，諸如TFPI跨物種，與humTFPI2 K1K2K3之結合力低或無(表13)。此相同5種抗體之FXa和TF/FVIIa/FXa抑制逆轉分析數據顯示於表14中，而SPR結合數據顯示於表15中。
實施例6. 藉由SPR測繪抗TFPI抗體之抗原決定部位圖譜
使用三明治SPR分析來測繪本文件中發明及揭示之抗TFPI抗體(TFPI-21、TFPI-23、TFPI-24、4D8、6B7.c5和7A4.D9)的抗原決定部位之圖譜。其他已知之參考抗體(hz4F36、2A8-200和Mab2974)亦包括在抗原決定部位測繪實驗中。使用NHS化學將抗體1固定在CM5 biacore晶片上。首先將人類TFPI(humTFPI K1K2)注射在該晶片上直到結合接近表觀平衡。停止注射人類TFPI後不久，將抗體2注射在該晶片上。如果抗體2結合在該CM5晶片表面上之抗體1和人類TFPI的複合物，則抗體2相對於抗體1具有不同且非重疊之TFPI結合抗原決定部位(記為+)。若抗體2顯示出無結合，則其相對於抗體1被記為明顯重疊之抗原決定部位(負(-))與抗體1。若抗體2顯示出結合力弱，則抗體1和2被認為在TFPI抗原決定部位具有部分重疊(記為+/-)。如表16中所示，TFPI-21和TFPI-23具有類似之抗原決定部位且該數據亦顯示TFPI-21和TFPI-23具有與mab2974和hz4F36完全不同的抗原決定部位。
將抗體1固定在CM5晶片之表面上。然後將人類TFPI(humTFPI K1K2)注射到表面上，直到該測量值接近表觀平衡。停止TFPI注射後立即注射抗體2以測量與抗體1/TFPI複合物之結合。具有完全不同之抗原決定部位的抗體1和2配對給予“+”記號。具有強烈重疊之抗原決定部位的抗體配對給予“-”記號。若抗體2顯示出結合力弱，則抗體1和2被認為在TFPI抗原決定部位中有一些部分重疊(記為+/-)。
實施例7. 種系化TFPI-23抗體之人類框架
製造二種TFPI-23的變體以增加人類框架種系殘基之含量。TFPI-106含有H1Q至E及H5V至L之突變(Kabat編號)，而TFPI-107(表3和4)含有H1Q至E、H5V至L及H94I至K之突變(Kabat編號)。表現TFPI-106、TFPI-107和TFPI-23，純化後藉由SPR測試與humTFPI K1K2之結合。表17中之數據顯示出與TFPI-23親本抗體比較時，TFPI-106種系變體保留全部結合親和力。
當與親本TFPI-23抗體比較時，TFPI-106顯示出結合力適度改善。
實施例8. 種系化TFPI-24抗體之人類框架
製造四種TFPI-24 VL變體(TFPI-110、TFPI-111、TFPI-112、TFPI-113)並與TFPI-24 VH序列配對。製造三種TFPI-24 VH變體(TFPI-108、TFPI-109、TFPI-114)並與TFPI-24 VL序列配對。根據這些數據，將最佳之VL變體TFPI-113與最佳之VH變體TFPI-108配對以產生抗體TFPI-118。藉由SPR測試TFPI-118和TFPI-24與人類TFPI結合，表18中之結果顯示出相當之結合動力學。
TFPI-118顯示出與親本TFPI-23抗體相當之結合動力學。
實施例9. 抗TFPI抗體與來自不同物種之TFPI的SPR結合動力學
藉由SPR分析抗TFPI抗體(TFPI-106、TFPI-118及hz4F36)以測定對來自不同動物物種之TFPI(人類(huTFPI K1K2)、食蟹猴(cynTFPI K1K2)、兔子(rabTFPI K1K2)、小鼠(murTFPI K1K2)及大鼠(ratTFPI K1K2)；表1)的結合動力學。本實驗中亦包括三種比較抗體(hz4F36、2A8和2A8-200)。
實施例10. 抗TFPI抗體/TFPI複合物結構
1. 4D8.b1 Fab/cyno TFPI K2複合物結構
將4D8.b1 Fab和cyno TFPI K2以1：1之莫耳比混合以形成複合物。使用Superdex 200柱進行最後的純化。將複合物濃縮成12.6mg/ml以供結構研究。在100mM Tris-HCl pH8.5-20% PEG10000中取得TFPI K2+4D8 Fab複合物之晶體。其產生衍射達2.9Å之棒狀晶體。將晶體瞬時低溫保護並在Advanced Photon Source遠程執行同步加速器數據收集。使用軟體AutoPROC(Global Phasing有限公司)處理影像框。該數據屬於空間群P212121，單位晶胞如下：a=62.102Å，b=82.284Å，c=103.628Å，α=β=γ=90°，每一不對稱單位具有一個複合物。使用4D8 Fab之同源模型及可公開取得之TFPI K2結構域的結構(RSCB蛋白資料庫；PDB密碼1TFX和4DTG)進行分子置換搜索來產生令人信服之各組分的解答。使用軟體autoBUSTER(Global Phasing有限公司)進行細修，該在2.9Å之最終R/Rfree因子分別為0.1707和0.2424，鍵之RMSD為0.010Å，角度之RMSD為1.26°。基於Fab/TFPI K2界面處之殘基的掩藏之表面積(BSA)及BSA百分比(%BSA)，測定4D8 Fab之抗原決定部位及抗體結合部位。下列TFPI之K2結構域中的殘基涉及直接接觸4D8 Fab(根據BSA之抗原決定部位)：E101、P103、Y109、I110、T111、Y113、F114、S119、Q121、C122、 E123、R124、F125、K126和L140。下列4D8 Fab之重鏈中的殘基包含重鏈抗體結合部位：D50、T57、L58、Y59、Q61、K64、D98、Y99和D100。下列4D8 Fab之輕鏈中的殘基包含輕鏈抗體結合部位：H30、W50、H91、Y92、T93、T94、P95和Y96。該抗原決定部位和抗體結合部位殘基之BSA和%BSA值顯示於表20中。
2. 2A8和2A8-200 Fab/cyno K1K2複合物結構
將2A8 Fab和cyno TFPI K1K2以1：1之莫 耳比混合以形成複合物。使用Superdex 200柱進行最後的純化。將複合物濃縮成10.8mg/ml以供結構研究。在下列二個條件中取得含有2A8 Fab及TFPI K1K2之複合物的結晶：(1)100mM HEPES pH7.5、12.5% PEG8000，其產生衍射達3.0Å之針狀晶體；(2)100mM HEPES pH 7.5、1600mM硫酸銨、2% PEG1000，其產生衍射達3.3Å之塊狀晶體。將晶體瞬時低溫保護並在Advanced Photon Source遠程執行同步加速器數據收集。使用軟體AutoPROC(Global Phasing有限公司)處理影像框。該數據屬於空間群P3221，單位晶胞如下：a=b=196.146Å，c=41.262Å，α=β=90°，γ=120°，每一不對稱單位具有一個複合物。使用2A8 Fab之同源模型及可公開取得之TFPI K2結構域的結構(RSCB蛋白資料庫；PDB密碼1TFX和4DTG)進行分子置換搜索來產生各組分之令人類信服的解答。使用軟體PHENIX進行細修，該在3.0Å之最終R/Rfree因子分別為0.1667和0.2088，鍵之RMSD為0.011Å，角度之RMSD為1.474°。基於Fab TFPI K1K2界面處之殘基的掩藏之表面積(BSA)及BSA百分比(%BSA)測定該複合物之抗原決定部位及抗體結合部位。下列TFPI之TFPI K1K2結構域中的殘基涉及直接接觸2A8 Fab(根據BSA之抗原決定部位)：D31、D32、G33、P34、C35、K36、E100、E101、P103、G104、I105、C106、R107、G108、Y109、E123、K126、Y127和G128。下列2A8 Fab之重鏈中的殘基包含重鏈抗體結合部位：G26，T28，S31，Y32，Y96，R97， Y98，W99和D101(Kabat編號)。下列2A8 Fab之輕鏈中的殘基包含輕鏈抗體結合部位：L28、R29、N30、Y31、Y32、Y49、Y50、D51和N66(Kabat編號)。複抗原決定部位和抗體結合部位殘基之BSA和%BSA值顯示於表21中。亦使用基本上完全相同的方法解析在具有TFPI K1K2之複合物中之密切相關的抗體2A8-200。此抗體之抗原決定部位和抗體結合部位與2A8的一致。
3. Mab 2974 Fab/TFPI K2複合物結構
將Mab 2974(R & D系統)Fab和cyno TFPI K2以1：1.2之莫耳比混合以形成複合物。使用Superdex 200 柱進行最後的純化。將複合物濃縮成17.5mg/ml以供結構研究。在100mM檸檬酸鈉pH5.6、20%異丙醇、20% PEG4000中取得含有Mab 2974 Fab及TFPI K2之複合物的晶體，其產生衍射達2.15Å之塊形晶體。將晶體瞬時低溫保護並在Advanced Photon Source遠程執行同步加速器數據收集。使用軟體AutoPROC(Global Phasing有限公司)處理影像框。該複合物之數據屬於空間群P212121，單位晶胞如下：a=82.075Å，b=117.829Å，c=170.945Å，α=β=γ=90°，每一不對稱單位具有三個複合物。由於Mab 2974 Fab之序列無法取得，收集單獨之Fab(1.63Å)的高解析數據組，連同生物信息學分析以破譯蛋白序列。使用Mab 2974 Fab之結構及可公開取得之TFPI K2結構域的結構(RSCB蛋白資料庫；PDB密碼1TFX和4DTG)進行分子置換搜索可產生令人信服之各組分的解答。使用軟體autoBUSTER進行細修，該在2.15Å之最終R/Rfree因子分別為0.1702和0.2161，鍵之RMSD為0.010Å，角度之RMSD為1.13°。基於Fab TFPI K2界面處之殘基的掩藏之表面積(BSA)及BSA百分比(%BSA)，測定該複合物之抗原決定部位。下列TFPI之TFPI K2結構域中的殘基涉及直接接觸Mab 2974 Fab(根據BSA之抗原決定部位)：E100、E101、P103、R107、Y109、T111、N116、Q118、S119、Q121、E123、R124、F125。抗原決定部位殘基之BSA和%BSA值顯示於表22中。
4. TFPI-23 Fab/cyno TFPI K2複合物結構
將TFPI-23 Fab和cyno TFPI K2以1：2之莫耳比混合以形成複合物。使用Superdex 200柱進行最後的純化。將複合物濃縮成12.4mg/ml以供結構研究。在100mM Bis-Tris pH6.5、20% PEGMME5000中取得TFPI K2+4D8 Fab複合物之晶體。其產生衍射達2.9Å之纖維狀結晶。將晶體瞬時低溫保護並在Advanced Photon Source遠程執行同步加速器數據收集。使用軟體AutoPROC(Global Phasing有限公司)處理影像框。該數據屬於空間群P1，單位晶胞如下：a=74.669Å，b=101.372Å，c=119.275Å，α=101.83°，β=92.27°，γ=96.78°，每一不對稱單位具有六個複本。使用TFPI-23 Fab之同源模型及可公開取得之TFPI K2結構域的結構(RSCB蛋白資料庫； PDB密碼1TFX和4DTG)之分子置換搜索可產生各組分之令人類信服的解答。使用軟體autoBUSTER進行細修，且在2.9Å之最終R/Rfree因子分別為0.1961和0.2344，鍵之RMSD為0.010Å，角度之RMSD為1.22°。基於Fab TFPI K2界面處之殘基的BSA及BSA百分比(%BSA)，測定該複合物之抗原決定部位及抗體結合部位。下列TFPI之K2結構域中的殘基涉及直接接觸TFPI-23 Fab(根據BSA之抗原決定部位)：D102、I105、C106、R107、G108、R112、Y127、G129、C130、L131、G132、M134和E138。下列在4D8 Fab之重鏈中的殘基包含重鏈抗體結合部位：A33、W47、A50、I51、S52、S56、Y58、L95、G96、A97、T98、S99、L100和S100A。下列4D8 Fab之輕鏈中的殘基包含輕鏈抗體結合部位：A29、Y31、Y91、S95A、G95B及S95C。抗原決定部位和抗體結合部位殘基之BSA和%BSA值顯示於表23中。
5. TFPI-24 Fab/獼猴TFPI K2結構複雜
將TFPI-24 Fab和cyno TFPI K2以1：2之莫耳比混合以形成複合物。使用Superdex 200柱進行最後的純化。將複合物濃縮成12.2mg/ml以供結構研究。在20% PEG3350、200mM硝酸銨中取得TFPI K2/TFPI-24 Fab複合物之晶體。其產生衍射達1.75Å之晶體。將晶體瞬時低溫保護並在Advanced Photon Source遠程執行同步加速器數據收集。使用軟體AutoPROC處理影像框。該數據屬於空間群P212121，單位晶胞如下：a=42.817Å，B=71.362Å中，c=14 8.729Å，α=β=γ=90°，每一不對稱單位具有一個複合物。使用TFPI-24 Fab之同源模型及可公開取得之TFPI K2結構域的結構(RSCB蛋白資料庫；PDB密碼1TFX和4DTG)進行分子置換搜索可產生令人信服之各組分的解答。使用軟體autoBUSTER進行細修，該在1.75Å之最終R/Rfree因子分別為0.1900和0.2269，鍵之RMSD為0.010Å，角度之RMSD為1.18°。基於Fab/TFPI K2界面處之殘基的掩藏之表面積(BSA)及BSA百分比(%BSA)，測定該複合物之抗原決定部位及抗體結合部位。下列TFPI之K2結構域中的殘基涉及直接接觸TFPI-24 Fab(根據BSA之抗原決定部位)：E100、E101、D102、G104、I105、C106、R107、G108、Y109、I110、G129、C130、L131和G132。下列TFPI-24 Fab之重鏈中的殘基包含重鏈抗體結合部位：A33、Q35、W47、G50、I51、S52、N53、R55、S56、I57、G58、F95、L96、H97、S99和D101。下列TFPI-24 Fab之輕鏈中的殘基包含輕鏈抗體結合部位：M31、Y32、H34、Y36、L46、R50、W91和Y96。抗原決定部位和抗體結合部位殘基之BSA和%BSA值顯示於表24中。
6. hz4F36之抗原決定部位分析
具有人類TFPI K2結構域之複合物中的hz4F36fab之結構可從蛋白質資料庫取得(PDB登錄碼4DTG)。基於hz4F36/TFPI K2複合物結構中之界面殘基的 BSA和BSA百分比(%BSA)所界定之抗原決定部位殘基顯示於表25中。
7. 抗TFPI抗體抗原決定部位之比較
表26和表27中比較表20至25中所顯示之抗TFPI抗體的抗原決定部位。表26顯示特異於TFPI K2結構域之抗體的抗原決定部位。表27包括另外2個同時結合K1和K2結構域之抗體(2A8和2A8-200)。
X表示為該抗原決定部位之一部分的TFPI胺基酸殘基。X(粗體)表示本發明揭示之抗體的新穎抗原決定部位殘基。注意，TFPI-23不會與hz4F36、4D8或mab2974競爭結合TFPI，但確實與TFPI-24競爭結合TFPI。抗體2A8和2A8-200不包括在此表中，因為它們同時需要K1 & K2結構域以用於結合且不單獨結合K2結構域。
X表示為抗原決定部位之一部分的TFPI胺基酸殘基。X(粗體)表示本發明揭示之抗體的新穎抗原決定部位殘基。抗體2A8和2A8-200同時需要K1 & K2結構域二者以用於結合且不單獨結合K2或K1結構域。
根據>1kcal/mol之任意閾值，預測當3個TFPI殘基(Ile105、Arg107及Leu131)突變為丙胺酸時對TFPI-23與TFPI之結合具有顯著貢獻。
使用計算預測方法(Accelrys Discovery Studio 4.1)，亦顯示被預測不會負面影響TFPI-23之穩定性或對TFPI之親和力(<0.5kcal/mol，第4至6列)的各CDR/抗體結合部位殘基之可能的胺基酸取代。這些被分為三組：(1)對結合具有至少為中性之影響者(<0.5kcal/mol親和力，第4列)，(2)對結合具有中性/穩定之影響者(<-0.5kcal/mol親和力，第5列)及(3)對親和力具有最穩定之影響的前3個預測位點。所有殘基均使用Kabat編號(第6列)。138Glu/L93Ser和131Leu/L96Gly由於距離略微超過4Å(分別為4.07Å和4.03Å)，但足夠接近4Å(四捨五入後為4Å)，其被包括在內作為可選擇之接觸殘基。
實施例11. 稀釋凝血酶原時間(DPT)
利用稀釋凝血酶原時間(PT)分析來研究抗TFPI抗體抑制人類第FVIII因子缺乏之血漿(A型血友病)中的內源性TFPI之能力。稀釋PT為利用經稀釋之組織因子(Innovin)延長凝血時間之經修飾的PT檢測。
在人類第FVIII因子缺乏之血漿(George King生物醫學)中的dPT分析方面，將Innovin®試劑在稀釋緩衝液(咪唑50mM、氯化鈉0.1M、BSA 1mg/ml、CaCl2 8.34mM，pH 7.4)中稀釋1：3000並預溫育至3℃。在分析前不久，將血漿在37℃水浴中解凍5分鐘。在PBS中製備抗TFPI抗體之稀釋液並加入血漿中，再將該血漿在室溫下溫育20分鐘。溫育後，將50μL之血漿在37℃溫育1分鐘，加入50μL之暖至37℃的Innovin®試劑之1：3000稀釋液後立即起始凝血反應。在37℃下使用 STart®4凝血分析儀執行達到凝血之時間的分析。收集數據點，一式二份，將數據輸入Microsoft Excel並使用GraphPad Prism®估計50%有效濃度(EC50)。結果顯示於表30中。
TFPI下調凝血之外在FVIIa/TF/FXa途徑，減少產生FXa且最終減少凝血酶。dPT測量對外在凝血途徑之影響。數據顯示出在A型血友病血漿中添加抗TFPI抗體會劑量依賴地縮短凝血時間。300nM之對照IgG對凝血時間沒有影響。
實施例12 血栓彈力圖(THROMBOELASTOGRAPHY)(TEG)
血栓彈力圖(TEG)為測量全血中血塊形成之動力學的全面止血分析。從健康人類供體分離出全血並抽入含有3.2%檸檬酸鈉之塑料血液收集管中且盡量減少引進凝是活化劑，諸如組織因子，丟棄第一管抽出的血。以對照小鼠抗人類IgG2(100μg/ml)或以抑制性FVIII抗體(GM1805(Green Mountain)，100μg/ml)處理該檸檬酸化之全血1小時以抑制內源性FVIII，誘導出A型血友病樣表型。將給予抗TFPI抗體或IgG1對照抗體之劑量的全血(320μL)加入TEG®反應杯中，該反應杯中含有20μL之 0.2M氯化鈣及20μL之在20mM HEPES、150mM氯化鈉，pH 7.4中稀釋之脂化的組織因子(Innovin®)，而導致在每個反應中之稀釋200,000倍之最終的脂化組織因子稀釋液。以一式二份運行反應，並在將全血加入TEG杯時立即開始。根據製造商之指示以第I級和第II級對照組(Haemonetics)校準後利用TEG®軟體在TEG 5000止血分析儀上進行分析。在37℃下進行該反應60分鐘。參見表31。
表31顯示以FVIII抗體處理全血顯著延長TEG-R值達41.5分鐘。在全血之存在下，抗TFPI 106顯示出相對於2A8-200和4F36之有利的變化形廓。添加TFPI-106、2A8-200或4F36(300nM)導致TEG-R值分別縮短成17.85分鐘、20.4分鐘及24.05分鐘。由TEG-R值之下降及觀察到之TEG-α角度的增加顯示出抗TFPI 106促進血友病血液凝固。
實施例13. 中和TFPI及凝血酶生成
利用二種發色分析，直接第Xa因子活性分拆及基於TFPI抑制TF-FVIIa產生FXa之二階段FVIIa/TF/FXa分析來測量藉由TFPI抗體中和TFPI。在第一種分析中，將不同濃度(0至500nM)之TFPI-106、TFPI-118、hz4D8和二種參考抗體4F36或2A8-200分別與固定濃度之人類重組型TFPI K1K2和FXa預溫育以允許形成複合物。使用發色FXa受質評估FXa活性。在此分析中添加本發明之TFPI抗體會引起FXa活性劑量依賴性地增加(參見表32，Xa抑制分析，EC50值)。
在體內，二種主要形式之TFPI為TFPI-α(K1K2K3)及TFPI-β(K1K2)。在二階段FVIIa/TF/FXa分析中評估TFPI抗體抑制重組型TFPI K1K2或TFPI K1K2K3之能力。該分析測量中和該TFPI抑制FXa和FVIIa/TF/FXa二組的合併效果。將遞增濃度(0至500nM)之抗體與TFPI一起溫育，加入使用FXa生色受質來測量FVIIa/TF/FXa和FXa活性的分析中。本發明之TFPI抗體中和該TFPI K1K2對由FVIIa/TF介導之FX活化的抑制作用(參見，表32，FVIIa/TF/Xa EC50值)。本發明之示例性抗體亦能有效抑制TFPI K1K2K3(TFPI-106之用於中和TFPI K1K2K3對FVIIa/TF/FXa之抑制作用的EC50為8.47nM)。該數據證明抑制全長和截短之TFPI。
血友病之臨床嚴重性與凝血因子活性之殘留 水準有關。因子活性<1%與嚴重之表型相關，中度血友病與2至5%之因子活性相關，而輕度血友病與因子活性>5%至<40%相關)。血友病之內源性凝血途徑的缺陷導致凝血酶生成不足。利用凝血酶生成分析(TGA)來檢查對血小板貧乏之血友病血漿中的內源性TFPI的抑制作用。該TGA分析測量凝血酶生成之初始階段、活化階段和失活階段。利用自動校準之凝血酶(Calibrated Automated Thrombin)(CAT)生成分析測試TFPI抗體回復血小板貧乏之血友病血漿中的凝血酶生成之能力。將TFPI-106、TFPI-118、hz4D8和二種參考抗體4F36或2A8-200(0至500nM)在血友病血漿中溫育以中和TFPI，再加入該分析中。與正常人類之混合血漿相比較，人類血友病血漿中之凝血酶生成顯著減少。當將正常對照組FACT(其係經標準化為1U/mL FVIII)摻入A型血友病血漿中時可觀察到劑量依賴性反應。類似地，加入200ng/mL(1U/mL)之B結構域缺失型FVIII可回復凝血酶生成達100nM。在60分鐘之分析時程內，在血友病血漿中觀察到最少的凝血酶生成。將血漿與本發明之抗體一起溫育導致峰值凝血酶、內源性凝血酶潛能和速度指數劑量依賴地增加。亦分析參考抗體2A8-200和4F36以供比較(表32，TGA速度EC50值)。
實施例14. 在血友病小鼠模型中之體內效力
在血友病小鼠中利用急性斷尾分析測試某些抗 TFPI抗體作為促凝血劑之效力。在該分析中，將尾巴之遠端部分截斷導致大量失血，若在切斷前或切斷後不久投予止血劑可減少失血。經由尾靜脈給予血友病小鼠體積為4ml/kg之抗TFPI抗體(6mg/kg)、非特異性IgG對照組(6mg/kg)或鹽水載劑的單次靜脈內(IV)劑量。在給藥後不同的時間，依下述評估抗體對出血的影響。
經由腹膜內途徑以氯胺酮/甲苯噻嗪混合物將小鼠麻醉。將尾巴浸入37℃，50毫升預溫熱之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中2分鐘。製造3mm之斷尾並收集血液到PBS中共10分鐘。利用下列技術藉由測量該PBS之血紅素含量來定量失血量。將試管離心以收集紅血球，再懸浮於5毫升之細胞溶解緩衝液(8.3g/l氯化銨、1.0g/l碳酸氫鉀及0.037g/l EDTA)中並藉由分光光度計測量樣本在575nM的吸光度。利用標準曲線將吸光度數值轉化成總失血量(μL)。藉由方差分析(ANOVA)，再使用GraphPad Prism軟體進行Dunnett多重比較試驗以評估各種方式之間的差異之統計顯著性。結果以平均值±平均值之標準差(SEM)表示。在下文描述之附圖中，統計顯著性之定義為P值<0.05，並藉由數據上方星號指明。
第3A圖顯示與載劑對照組(鹽水)相比較，在斷尾前之不同時間給予2A8-200抗體劑量對A型血友病小鼠(表示為FVIII -/-)在斷尾後之失血的影響。第3B圖顯示與載劑對照組(鹽水)和非特異性人類IgG1(表示為hIgG1)相比較，在斷尾前之不同時間給予2A8抗體劑量對 A型血友病小鼠(表示為FVIII -/-)在斷尾後之失血的影響。第3B圖亦顯示在斷尾前之二個不同時間給予2A8抗體劑量對正常小鼠(表示為FVIII +/+)在斷尾後之失血的影響。第3C圖顯示與載劑對照組(鹽水)相比較，在斷尾前之不同時間給予抗體4D8、21、23、24劑量對A型血友病小鼠在斷尾後之失血的影響。第3D圖顯示與載劑對照組(鹽水)相比較，在斷尾前之不同時間給予抗體106劑量對A型血友病小鼠在斷尾後之失血的影響。第3E圖顯示與載劑對照組(鹽水)相比較，在斷尾前之不同時間給予抗體118劑量對A型血友病小鼠在斷尾後之失血的影響。第4圖顯示與載劑對照組(鹽水)相比較，在斷尾前之不同時間給予抗體106劑量對B型血友病小鼠在斷尾後之失血的影響。
如第3D圖和第4圖所示，在急性外傷性損傷模型中，當抗體係在斷尾受傷前之不同時間投予時，經投予6mg/kg之抗TFPI抗體106的A型血友病或B型血友病小鼠失血減少。在A型血友病小鼠中，該止血效果在投予後可持續至少長達189小時，雖然在投予後240小時該效果回復成對照組水準。在B型血友病小鼠中，該效果在投予後可持續至少長達72小時並在投予後192小時回復成基線水準。
上述之數據和結果表明該測試之抗體(包括抗體TFPI 106)可預防性地投予具有A型血友病或B型血友病之個體以在外傷或其他類型之出血發作前減少出血。
亦測試抗體TFPI 106在A型血友病小鼠中作為止血劑的效果以測定當在斷尾後不久投予時是否能減少出血。使用類似用於測試在斷尾前投予抗體之效果的方法進行這些實驗，但在斷尾後立即經由插入頸靜脈之導管注入TFPI 106(6mg/kg)或重組型第VIII因子(200單位/kg)的IV劑量，然後，收集血液10分鐘以用於定量失血。在第二組實驗中，在夾住尾巴後2分鐘分別投予A型血友病小鼠不同劑量之TFPI 106和第VIII因子(200U/kg)，然後，收集血10分鐘再定量失血。
第9A圖顯示出與載劑對照組相比較，斷尾後立即投予6mg/ml之抗體TFPI 106能有效減少A型血友病小鼠中之失血，雖然沒有達到以同樣方式投予之200U/kg之第VIII因子所取得的相同程度。第9B圖顯示出在斷尾後2分鐘投予A型血友病小鼠抗體TFPI 106可劑量反應性地減少A型血友病小鼠之出血，且當在斷尾後2分鐘同時投予抗體TFPI 106和重組型第VIII因子時，在所測試之最高劑量(6mg/kg)下TFPI 106約與200U/kg之重組型第VIII因子同樣有效。這些圖中所描述之數據和結果表明抗體TFPI 106可有效地作為已因為外傷或某些其他原因而開始出血之個體的需求性治療(on demand treatment)。
實施例15. 藥代動力學和產物代謝
經由靜脈(IV)及/或皮下(SC)途徑給予劑量後 在Wistar Han大鼠、紐西蘭白兔和食蟹猴中決定TFPI-106之藥代動力學(PK)及/或毒物動力學(TK)的特徵。
在Gyrolab上使用三明治免疫分析定量在檸檬酸鈉化之兔子血漿中之抗TFPI。藉由Gyrolab儀器，在1%光電倍增管(PMT)裝置讀取反應單位。藉由內插法從標準曲線測定樣本濃度，該標準曲線係使用配上1/y2反應加權之5參數邏輯曲線擬合。含有5%匯集之檸檬酸鈉化兔子血漿的分析緩衝液中之標準點範圍為0.78ng/ml至891ng/ml，而在100%兔子血漿基質中之定量範圍為90ng/ml至5500ng/ml。使用在含有5%匯集之檸檬酸鈉化兔子血漿的分析緩衝液中之五個抗TFPI樣本(濃度為0.45、8.0、47.15、153、275ng/ml)作為定性對照組。
依上述，亦在Gyrolab上使用三明治免疫分析定量在檸檬酸鈉化大鼠血漿中的抗TFPI。含有5%匯集之檸檬酸鈉化大鼠血漿的分析緩衝液中之標準點範圍為0.78ng/ml至891ng/ml，而在100%大鼠血漿基質中之定量範圍為90ng/ml至5500ng/ml。使用在含有5%匯集之檸檬酸鈉化大鼠血漿的分析緩衝液中之五個抗TFPI樣本(濃度為0.45、8.1、47.15、153、275ng/ml)作為定性對照組。
使用利用Meso Scale Discovery(MSD)分析平台之全人類ig定量性配體結合分析定量在食蟹猴血漿中之抗TFPI抗體。以經釕化之小鼠抗-人類IgG Fc抗體檢測經結合之抗TFPI抗體以在MSD儀器內產生電化學發光(electrochemiluminescence)信號。藉由內插法從使用5-參 數邏輯程式擬合之標準曲線測定樣本濃度，用於標準曲線之加權公式為1/y^ 2。在5%猴子血漿中之標準點範圍為0.999ng/ml至1156ng/ml之抗TFPI抗體，而在100%血漿中之定量範圍為64.8ng/ml至7136ng/ml。將五個在100%血漿中，濃度為64.8、117、680、3964及7136ng/ml之抗TFPI抗體樣本稀釋成MRD為1：20(在5%血漿中分別為3.24、5.83、34.0、198和357ng/ml)作為定性對照組。
與同種型對照單株抗體(mAb)相比較，TFPI-106在紐西蘭白兔中顯示出較快之清除率(CL)。在食蟹猴中，TFPI-106在低劑量下顯示出非線性PK動力學，與在抗TFPI抗體所觀察到之靶的介導之藥物分佈(TMDD)相一致。參見表32。
表32摘要本發明之示例性抗TFPI抗體(hum4D8、TFPI-106和TFPI-108)及二個參考抗體(4F36和2A8-200)之某些藥代動力學性質和藥理學活性。
實施例16. 抗體在由雷射誘導之血友病小鼠損傷模型中抑制TFPI之止血作用增強體內血小板累積及纖維蛋白生成
如本文他處之陳述，組織因子途徑抑制劑(TFPI)為直接結合並抑制組織因子(TF)/第VIIa因子/第Xa因子複合物並調控由TF誘導之凝血起始的血漿絲胺酸蛋白酶抑制劑。阻斷TFPI可能促進由TF/FVIIa起始之止血，補償在A型或B型血友病中第VIII因子(FVIII)或第 IX因子損失。本發明之抗體以廣泛之物種交叉反應性抑制TFPI。此處，使用活體顯微鏡(IVM)在A型和B型血友病小鼠中評估TFPI-106對體內血小板血栓形成及纖維蛋白沉積的止血效果。
材料與方法：依先前本文他處之描述製備TFPI-106抗體、重組型第VIII因子及載劑(磷酸鹽緩衝之鹽水)。從Emfret Analytica(德國)取得Dylight-649抗CD42c抗體。根據製造商之說明書(Life Technologies公司，加州Carlsbad)使用蛋白質標記套組，以Alexa Fluor 488標記纖維蛋白抗體選殖株59D8(Hui KY et al.(1983)Science 222(4628)：1129-1132)。從保持在Charles River實驗室(麻州Wilmington)之專有線取得平均體重為30至35克之雄性A型血友病小鼠(F8 KO)。在實驗程序前使小鼠至少適應環境3天。
經由靜脈內途徑給予雄性A型血友病、B型血友病或C57BL/6J野生型(WT)小鼠單次TFPI-106(6mg/kg)、載劑、重組型人類FVIII(rFVIII，200IU/kg)或經Alexa-488標記之TFPI-106(0.7mg/kg)劑量。使用IVM觀察經麻醉之小鼠的提睾肌微循環。在對提睾肌動脈之血管壁進行雷射熱傷害後定量血小板累積和纖維蛋白生成。使用Dylight-649抗CD42c(GP1bβ)將血小板可視化並藉由Alexa-488抗纖維蛋白選殖株59D8檢測纖維蛋白。
更具體地，為了準備用於活體顯微鏡成像之A型血友病小鼠，經由腹膜內遞送，以氯胺酮/甲苯噻嗪 混合物將動物麻醉。在頸靜脈插管並使用戊巴比妥鈉(5mg/kg，靜脈內)維持麻醉。在氣管插管以保持氣道通暢。然後，使提睾肌暴露以令微血管可視化。在整個照像期間將動物保持在溫暖的加熱墊上，以溫緩衝液浸泡暴露之提睾肌組織。經由頸部導管輸注針對血小板之經標記的抗體Dylight 649 CD42c(GP1bβ)及不會與纖維蛋白原交叉反應之纖維蛋白抗體(Alexa Fluor 488 anti-fibrin clone 59D8)。使用聚焦之雷射光束(532nM)在小鼠提睾肌微血管上起始損傷。每隻小鼠接受2次由雷射誘導之損傷。在未經處理之小鼠中製造第一個損傷作為對照組。在相同小鼠中製造第二個損傷並立即經由頸部導管靜脈內投予TFPI-106(6mg/kg)。從血小板累積和纖維蛋白沉積之螢光強度監測二個損傷中之血塊形成。
收集數據點(螢光強度)並使用SlideBook軟體分析(版本6.0)。繪製中位數螢光強度作為每一個別凝血之時間函數並使用GraphPad®Prism軟體(版本編號6.03)測量對應之曲線下面積。使用GraphPad®Prism軟體(版本編號6.03)，利用Mann-Whitney試驗測定統計之顯著性。
結果：使用經Alexa 488標記之TFPI-106檢測WT小鼠中血小板凝塊及內皮內膜中之血小板聚集部位的TFPI(第5圖)。第5A圖包含六個在上方的圖格(編號1至6)，其顯示出在經投予對照IgG(使用Alexa 488標記)之WT小鼠中，使用雷射誘導損傷後0秒(圖格5A-1)、15秒(圖格5A-2)、30秒(圖格5A-3)、60秒(圖格5A-4)、90 秒(圖格5A-5)和120秒(圖格5A-6)後以Dylight 649 CD42c檢測血小板。在損傷部位之血小板血栓中未檢測(使用Dylight 649 CD42c檢測)到Alexa 488標記。第5B圖包含在該圖形底部的六個圖格(編號1至6)，其顯示出使用雷射在WT小鼠中誘導損傷後約15秒，可在沿著內皮之血小板血栓中開始檢測到經Alexa 488標記之TFPI-106(圖格5B-2)，螢光強度從約30秒(圖格5B-3)、60秒(圖格5B-4)和90秒(圖格5B-5)逐漸增加，然後持續強度至約120秒(圖格5B-6)，其中該血小板係使用經Dylight 649標記之CD42c檢測。
約0.5小時與以載劑處理之A型血友病小鼠相比較，TFPI-106增進在A型血友病(F8 KO)小鼠中之血小板累積和纖維蛋白生成且該效果持續約168小時。更具體地，在以TFPI-106處理之F8 KO小鼠(A型血友病)中，IVM顯示出損傷部位在0.5小時左右綠色螢光(Alexa 488抗纖維蛋白選殖株59D8)和紅色螢光(Dylight 649標記之CD42c抗GP1bβ檢測血小板)增加，其持續約168小時且該螢光樣式類似於在以載劑處理之WT小鼠中所觀察到者。然而，在以載劑處理之A型血友病小鼠(其中既未觀察到血小板累積也未觀察到纖維蛋白生成)中並未檢測到這類螢光。
A型血友病小鼠顯示出在給予TFPI-106劑量後0.5小時左右血小板累積(第6A圖)和纖維蛋白沉積(第6B圖)增加，類似於藉由rFVIII所達到之水準(*=P <0.005指示在每個圖上)。以TFPI-106處理之A型血友病小鼠的止血效果持續達168小時。類似地，以TFPI-106處理之B型血友病小鼠同樣顯示出與載劑對照組相比較，在給藥後約30分鐘止血改善、血小板累積且纖維蛋白生成增加。接受TFPI-106和rFVIII劑量之血友病小鼠無一達到如在非血友病WT小鼠中所觀察到之纖維蛋白沉積的最高水準。因此，該數據表明在雷射傷害內皮後，TFPI可在損傷部位檢測到。更重要的是，該數據證明投予血友病小鼠TFPI-106可在雷射損傷模型中導致顯著且持久之止血改善。
實施例17. 抗TFPI凝血酶與FVII A 之組合在A型和B型血友病TGA中對凝血酶生成的影響
方法：凝血酶生成分析(TGA)
使用凝血酶生成分析(TGA)評估單獨之抗TFPI抗體TFPI-106及其與重組型FVIIa(rFVIIa)之組合在血友病血漿中對凝血酶生成的影響。從來自George King生物醫學公司(堪薩斯州Overland Park)和HRF(北卡羅來納州Raleigh)之先天不足的供體取得檸檬酸化之血小板貧乏之嚴重A型血友病(FVIII不足)、具有抑制劑之嚴重A型血友病或B型血友病(FIX不足)血漿。從George King生物醫學公司取得正常之混合血漿(非血友病)。凝血酶生成試劑；PPP-試劑LOW(在最終反應中為4μl磷脂及1pM組織因子)；FluCa緩衝液(含有氯化鈣和螢光受質)及從Diagnostica Stago(紐澤西州Parsippany)取得之凝血酶校準 劑。使用包括Fluoroskan Ascent螢光分析儀(Thrombinoscope BV，荷蘭馬斯特里赫特)之自動校準凝血酶圖(CAT)進行凝血酶生成分析。
將濃度達20μg/mL之重組型FVIIa(rFVIIa在20mM HEPES、150mM氯化鈉、1%牛血清白蛋白(BSA)，pH7.4)加入70μl之A型血友病血漿中。將20μl之PPP-試劑LOW和10μl之抗TFPI 106加入反應孔中，使最終濃度為16μg/mL。參考之經校準的對照反應包括20μl之凝血酶校準劑與70μl血漿。使用載劑(磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS))來測試濃度0μg/mL。將10μl載劑加入參考校準劑之孔中。在第二組反應中，將在HEPES緩衝液中之rFVIIa(5μl)或HEPES緩衝液(5μl)加入70μl之血友病血漿樣本(A型血友病、具有抑制劑之A型血友病或B型血友病)中，使血漿中之rFVIIa的最終濃度為2μg/ml。將20μl PPP試劑LOW和5μL之抗TFPI 106(在PBS中稀釋)或PBS(5μl)加入經給予rFVIIa劑量之血友病血漿樣本(75μl)及經HEPES緩衝液處理之血友病血漿(75μl)中，使最終濃度為16μg/mL。此外，分析在經HEPES緩衝液處理之非血友病血漿(75μl)中的抗TFPI 106(16μg/mL)。該分析中包括未經處理之對照組非血友病血漿(80μl)。同時運行參考之校準反應(添加20μl凝血酶校準劑與80μl載劑劑量之血友病或非血友病血漿或80μl未經處理之非血友病血漿)。所有反應均以一式二份運行。將樣本在37℃溫育5分鐘，然後經由添加20μl之FluCa使總反應體積為120μl 來起始反應。在Fluoroskan Ascent螢光計上，在37℃下每隔20秒讀取血漿反應之螢光並與參考凝血酶校準劑反應相比較，以測定凝血酶濃度。在37℃下，使用CAT持續監控螢光信號之強度。
結果：凝血因子FVIII(A型血友病)和FIX(B型血友病)不足富妨礙生成足夠之凝血酶來將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白以發展穩定之血凝塊。抗TFPI-106(一種特異性結合並抑制及/或中和TFPI之抑制活性的新穎單株抗體)靶向外在組織因子/FVIIa凝血途徑。接受TFPI-106之具有抑制劑的患者亦可接受rFVIIa以治療突破性出血。因此，在有或無rFVIIa之存在下，使用本技藝所認可之TGA(凝血酶生成分析)在玻管內檢查TFPI-106對血友病血漿中之凝血酶生成的影響。
在檸檬酸化之血小板貧乏的第VIII因子不足之人類血漿中使用凝血酶生成分析進行玻管內研究以研究在rFVIIa存在下之TFPI-106活性。在一項研究中，將固定濃度(16μg/mL)(已知此濃度之rFVIIa會增加A型血友病血漿中之凝血酶生成)之抗TFPI 106加入第VIII因子不足之人類血漿中。將高達20μg/mL之遞增濃度之rFVIIa加入分析中。令人驚訝地，TFPI-106和rFVIIa之組合物恢復凝血酶生成達到在正常血漿中所觀察到的水準。以TFPI-106與範圍在0.2、2和20μg/mL之rFVIIa(依他凝血素α)的組合物觀察到之峰值凝血酶水準相似。如第7圖中所示之數據證明TFPI-106可改善經給 予rFVIIa劑量之嚴重A型血友病血漿的凝血酶生成反應(第7圖，實心黑色、深灰色和淺灰色線)。
亦在非血友病血漿(其將具有充分補充之凝血因子)中測量TFPI-106(16μg/mL；第7圖，深灰色虛線)對凝血酶生成之影響。與TFPI-106之TFPI外源性途徑抑制活性一致，添加抗TFPI 106導致凝血酶生成增加，伴隨滯後時間減少及凝血酶峰值增加。添加TFPI-106和rFVIIa之峰值凝血酶~200nM係在正常非血友病血漿之報告範圍內。
在另外之A型血友病血漿(第8A圖；1pM組織因子及4μM磷脂)、B型血友病血漿(第8C圖；3BU抑制劑)及具有抑制劑之A型血友病血漿(第8B圖；3BU抑制劑)中進一步研究在有和無rFVIIa之存在下，TFPI-106對凝血酶生成之TFPI抑制活性且結果分別以圖形顯示於第8A圖、第8C圖和第8B圖中。將TFPI-106加入該血漿中使最終濃度為16μg/mL。在這些研究中，rFVIIa之最終濃度為2μg/ml。與載劑對照相比較，在血友病血漿中加入2μg/mL rFVIIa導致凝血酶生成適度增加。與添加單獨之rFVIIa相比較，加入單獨之16μg/mL TFPI-106或16μg/mL TFPI-106與rFVIIa之組合可導致凝血酶生成增加，包括較高之峰值凝血酶濃度及縮短之滯後時間。在以rFVIIa和TFPI-106共同治療後觀察到凝血酶生成之最小加成效果。以單獨之16μg/mL TFPI-106或16μg/mL TFPI-106與rFVIIa之組合所取得之峰值凝血酶水準與那 些在非血友病血漿中所觀察到者相當，且不超過在給予TFPI-106劑量之非血友病血漿中所觀察到之水準。這些數據證明TFPI-106能有效地繞過在A型血友病、B型血友病及具有抑制劑之A型血友病血漿中之凝血酶生成缺陷。
實施例18. 人類血友病血液和血漿中之促凝血活性
本實施例描述當使用從具有A和B型血友病之人類個體取得之全血和血漿測試時，抗體TFPI-106與重組型凝血因子VIII和因子IX之止血活性的比較。
材料和方法。在機構審查委員會批准之方案下，從年滿18歲之志願血友病患者取得全血和血漿(富含血小板及血小板貧乏的)。該個體具有中度或重度第VIII因子(FVIII)或第IX因子(FIX)不足、具有或不具有抑制性抗體，但在其他方面為健康且為非出血狀態。若志願者們在進入研究前48小時內曾使用任何因子替代療法、具有活動性出血或具有血栓形成之醫療史或家族史則將他們排除在外。在11位志願者中，5位為嚴重FVIII不足，2位為中度FVIII不足，1位為中度FIX不足且3位為具有FVIII抑制劑之嚴重FVIII不足。為了完成該研究的所有目標，經由無菌靜脈穿刺從每個志願者採集46mL之血液(10管血)入含有3.2%檸檬酸鈉之真空管中。
測試物包括TFPI 106、陰性對照組同種型匹配之抗人類IgG1、重組型人類第VIII因子及重組型人類 第IX因子，根據實驗，將彼等加入全血或血漿中。根據該分析，測試1、5、20、50或100nM之TFPI 106、100nM之對照IgG1抗體及可達到正常因子活性之5%、10%或40%的重組型FVIII或FIX水準(基於活化部分凝血活酶(thromboplastin)時間(aPTT)分析)。為了取得所需濃度，以稀釋緩衝液，pH 7.4(包含20mM HEPES、150mM NaCl及0.5%牛血清白蛋白)稀釋試驗品。
使用三種類型之分析來測定該試驗品之促凝血(procoagulant)效果，包括旋轉血栓彈性描記法(ROTEM)、凝血酶生成分析(TGA)及稀釋凝血酶原時間(dPT)分析。
ROTEM測量該全血樣本在低剪切條件下凝血時之黏彈性質。當凝血進行時，該樣本之黏度增加，此可藉由圖形分析。使用ROTEM分析儀(Pentapharm GmbH，德國慕尼黑)，利用Pentapharm軟體1.0.04進行ROTEM以評估全血中之凝血。經由在0.300mL之檸檬酸化的全血中添加0.020mL脂化組織因子(Innovin，西門子醫療公司)之1：2333稀釋液(使最終反應物稀釋42000倍)及添加0.020mL CaCl2來起始凝血。所有反應均以一式二份運行。監測ROTEM參數並分析ROTEM凝血時間(CT)。將藉由設備軟體收集之數據輸出到Microsoft Excel 2010及/或GraphPad Prism(第6版)以供分析。在每位志願者方面，相關於來自相同志願者之未經處理的樣本計算該經處理之樣本的ROTEM凝血時間之變化百分比。
使用凝血酶生成分析(TGA)，在富含血小板之血漿(PRP)和血小板貧乏之血漿(PPP)中評估凝血酶生成之動力學，該富含血小板之血漿(PRP)和血小板貧乏之血漿(PPP)係根據Hemker,et al.,Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma.Pathophysiolol Haemost Thromb,33：4-15(2003)之方法從志願者之血液製備。簡單地說，將給予試驗品之劑量的全血樣本在室溫下，在150 xg離心10分鐘以取得PRP，或在室溫下，在2500 xg離心15分鐘以取得PPP。將未使用之血漿冷凍並儲存在-80℃。在PRP血漿中，以自體PPP將血小板計數調整成每微升含150,000個血小板。立即在新鮮PRP中測量凝血酶生成。在PRP樣本方面，在96孔微量滴定盤的孔中添加20μl之1pM組織因子(PRP試劑，Diagnostica Stago公司，紐澤西州帕西帕尼)及80μl之PRP，一式三份。經由加入20μl之FLUCa緩衝液(16.7mmol/l CaCl2最終濃度及417mmol/l之Z-Gly-Gly-Arg-AMC螢光凝血酶受質)來起始凝血酶生成。使用Fluoroskan Ascent螢光儀檢測螢光強度。在PPP樣本方面，使用PPP試劑-LOW(最終濃度為1pM之組織因子及4微莫耳之促凝血磷脂)代替PRP-試劑並依PRP樣本之描述運行。使用Thrombinoscope軟體版本5.0.0.742(Thrombinoscope BV，荷蘭，馬斯特里赫特)計算凝血酶生成。將從Thrombinoscope軟體取得之數據輸出到Microsoft Excel 2010及/或GraphPad Prism(第6版)以供分析。在各志願 者方面，相關於來自同一志願者之未經處理的樣本計算經處理之樣本的TGA峰值凝血酶濃度的百分比變化。
在STart4凝血分析儀(Diagnostica Stago公司，紐澤西州帕西帕尼)上進行稀釋凝血酶原時間(dPT)分析。將冷凍之PPP解凍並給予濃度為1、5、20和100nM之抗TFPI 106劑量或濃度為100nM之同種型對照抗體濃度。在dPT測定分析前將經給予劑量之血漿在37℃溫育30分鐘。將50微升之血漿加入STart 4比色皿中並在37℃下溫育60秒。經由加入在稀釋緩衝液(50mM咪唑、0.1M氯化鈉、1mg/ml牛血清白蛋白及8.34mM CaCl2，pH7.4)中製備之稀釋6000倍的組織因子試劑(Innovin)來活化反應物並在37℃下預溫育。在37℃下測量達到凝血塊的時間，以一式二份運行反應。將凝血時間輸出到Microsoft Excel 2010或GraphPad Prism(第6版)以進行分析。相關於各志願者之未經處理的樣本之dPT凝血時間計算經測試品處理之樣本的dPT凝血時間之變化百分比。
如圖形中所描述者，如同使用ROTEM方法所測量者，抗體TFPI-106造成來自具有A型或B型血友病之志願者的全血之凝血呈劑量依賴地增加。具體地說，與陰性對照組相比較，該抗體縮短凝血時間並增加最大血塊硬度。此外，當添加在從血友病患者取得之富含血小板和血小板貧乏之血漿中，TFPI-0106導致凝血酶生成呈劑量依賴地增加，此可由與陰性對照組相比較，滯後時間減少及生成之凝血酶濃度峰值增加證明。
第10A和10B圖說明TFPI-106在從具有嚴重A型血友病之志願者取得之全血和血漿中的促凝效果。第10A圖顯示出與陰性對照組IgG和足以取得5%、10%和40%之正常活性的重組型FVIII濃度相比較，二種濃度之TFPI 106在ROTEM分析中對血液凝固的影響。第10B圖顯示出與陰性對照組和FVIII相比較，三種濃度之TFPI-106在富含血小板之血漿中之尖峰凝血酶生成。該分析顯示出由TFPI 106所導致之劑量依賴性凝血時間減少及尖峰凝血酶生成增加的效果。
第11A、11B及11C圖說明TFPI-106在來自具有嚴重A型血友病及針對FVIII之抑制性抗體(抑制劑)的志願者之全血和血漿中的促凝效果。第11A圖顯示出與陰性對照組IgG相比較，二種濃度之TFPI-106在ROTEM分析中對血液凝固的效果。第11B圖顯示出與陰性對照組相IgG比較，三種濃度之TFPI-106在富含血小板之血漿中之尖峰凝血酶生成。第11C圖顯示出與陰性對照組IgG相比較，四種濃度之TFPI-106在稀釋PT分析中對血小板貧乏血漿之血塊形成的影響。該分析顯示出由TFPI 106所導致之劑量依賴性凝血時間減少及尖峰凝血酶生成增加的效果。
第12A、12B及12C圖說明TFPI-106在來自具有中度A型血友病的志願者之全血和血漿中的促凝效果。第12A圖顯示出與陰性對照組IgG及足以取得5%、10%和40%之正常活性的重組型FVIII濃度相比較，二種 濃度之TFPI 106在ROTEM分析中對血液凝固的影響。第12B圖顯示出與陰性對照組和FVIII相比較，三種濃度之TFPI-106在富含血小板之血漿中之尖峰凝血酶生成。第12C圖顯示出與陰性對照組IgG相比較，四種濃度之TFPI-106在稀釋PT分析中對從血小板貧乏血漿形成血塊的影響。該分析顯示由TFPI 106所導致之劑量依賴性凝血時間減少及尖峰凝血酶生成增加的效果。
第13A、13B及13C圖說明TFPI-106在來自具有中度B型血友病的志願者之全血和血漿中的促凝效果。第13A圖顯示出與陰性對照組IgG及足以取得5%、10%和40%之正常活性之重組型FVIII濃度相比較，二種濃度之TFPI 106在ROTEM分析中對血液凝固的效果。第13B圖顯示出與陰性對照組和FIX相比較，三種濃度之TFPI-106對富含血小板之血漿中之凝血酶生成峰值的效果。第13C圖顯示出與陰性對照組IgG相比較，四種濃度之TFPI-106在稀釋PT分析中對從血小板貧乏血漿形成血塊的影響。該分析顯示由TFPI 106所導致之劑量依賴性凝血時間減少及尖峰凝血酶生成增加的效果。
第14A、14B及14C圖說明TFPI-106在來自具有中度A型血友病之志願者的全血和血漿中的促凝效果。第14A圖顯示出與陰性對照組IgG及足以取得5%、10%和40%之正常活性的重組型FVIII濃度相比較，三種濃度之TFPI 106在ROTEM分析中對血液凝固的效果。每個數據點代表相對於來自相同志願者之未經處理的血液樣 本之凝固時間，以TFPI-106或FVIII處理之單一志願者的血液樣本之凝血時間的減少百分比。代表每一處理之數據點之間的最寬水平棒條代表所有測試之志願者樣本之凝血時間的平均減少百分比。第14B圖顯示出與FVIII相比較，三種濃度之TFPI-106對富含血小板之血漿中之尖峰凝血酶生成的效果。每個數據點代表相對於來自相同志願者之未經處理的血液樣本之尖峰凝血酶生成，以TFPI-106或FVIII處理之單一志願者的血漿樣本之尖峰凝血酶生成的增加百分比。代表每一處理之數據點之間的最寬水平棒條代表所有測試之志願者樣本之尖峰凝血酶生成的增加百分比。第14C圖顯示出四種濃度之TFPI-106在稀釋PT分析中對從血小板貧乏血漿形成血塊的效果。每個數據點代表相對於來自相同志願者之未經處理的血液樣本的凝固時間，以TFPI-106處理之單一志願者的血漿樣本之凝血時間的減少百分比。每一處理之數據點之間的最寬水平棒條代表所有測試之志願者樣本之凝血時間的平均減少百分比。該稀釋PT分析顯示出由TFPI 106所導致之劑量依賴性凝血時間減少且該凝血酶生成分析顯示出由TFPI 106所導致之劑量依賴性尖峰凝血酶生成增加。
抗體SeqID(序列識別)號嗎之描述和序列組成(當指特定殘基時，使用Kabat編號。藉由使用Kabat定義來定義VH和VL CDR開始和結束點)
上文之個別章節中所提及之本發明之各種特徵和實施態樣如做適當變動，依適當情況亦適用於其他章節。因此，在一個章節中具體說明之特徵可與其他章節中具體說明之特徵依適當情況組合。本文所引用之所有參考資料，包括專利、專利申請案、論文、教科書和列舉之序列登錄號，及其中引用之參考文獻的全文以引用方式併入本文。當一或多個該併入之文獻及類似材料與本申請案不同或互相矛盾時(包括，但不限於定義之術語、術語用途、所描述之技術，等)，以本申請案為準。
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<213> 人工序列
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<223> 合成之構建體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成之構建體
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<220>
<223> 合成之構建體
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<212> PRT
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<223> 合成之構建體
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<211> 8
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成之構建體
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<223> 合成之構建體
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<223> 合成之構建體
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<220>
<223> 合成之構建體
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<211> 9
<212> PRT
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<220>
<223> 合成之構建體
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<211> 107
<212> PRT
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<220>
<223> 合成之構建體
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<223> 合成之構建體
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
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<211> 17
<212> PRT
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<220>
<223> 合成之構建體
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<211> 8
<212> PRT
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<220>
<223> 合成之構建體
<400> 150
<210> 151
<211> 117
<212> PRT
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<220>
<223> 合成之構建體
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<210> 152
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<220>
<223> 合成之構建體
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<220>
<223> 合成之構建體
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 合成之構建體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
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<210> 159
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
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<210> 160
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 160
<210> 161
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 161
<210> 162
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
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<210> 163
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
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<211> 7
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 165
<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 166
<210> 167
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 167
<210> 168
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 168
<210> 169
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
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<210> 170
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 170
<210> 171
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 171
<210> 172
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 172
<210> 173
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 173
<210> 174
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 174
<210> 175
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 175
<210> 176
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 176
<210> 177
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 177
<210> 178
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 178

Claims (26)

  1. 一種特異結合組織因子途徑抑制劑(TFPI)之Kunitz結構域2(K2)的抗原決定部位之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位包含根據SEQ ID NO：2編號之殘基Ile105、Arg107及Leu131，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該VH包含VH互補決定區1(CDR-H1)、CDR-H2及CDR-H3且該VL包含VL互補決定區1(CDR-L1)、CDR-L2及CDR-L3，該CDR-H1包含SEQ ID NO：38或48之胺基酸序列，該CDR-H2包含SEQ ID NO：39或49之胺基酸序列，該CDR-H3包含SEQ ID NO：40或50之胺基酸序列，該CDR-L1包含SEQ ID NO：33或43之胺基酸序列，該CDR-L2包含SEQ ID NO：34或44之胺基酸序列且該CDR-L3包含SEQ ID NO：35或45之胺基酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位包含根據SEQ ID NO：2編號之殘基Ile105、Cys106、Arg107、Gly108、Cys130、Leu131及Gly132。
  3. 如申請專利範圍第2項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該VH包含VH互補決定區1(CDR-H1)、CDR-H2及CDR-H3且該VL包含VL互補決定區1(CDR-L1)、CDR-L2及CDR-L3，該CDR-H1包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列，該CDR-H2包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列，該CDR-H3包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列，該CDR-L1包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列，該CDR-L2包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列且該CDR-L3包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第2項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位另包含根據SEQ ID NO：2編號之殘基Asp102、Arg112、Tyr127、Gly129、Met134及Glu138。
  5. 如申請專利範圍第4項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該VH包含VH互補決定區1(CDR-H1)、CDR-H2及CDR-H3且該VL包含VL互補決定區1(CDR-L1)、CDR-L2及CDR-L3，該CDR-H1包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列，該CDR-H2包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列，該CDR-H3包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列，該CDR-L1包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列，該CDR-L2包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列且該CDR-L3包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第1項之抗體或其抗原結合片段，其包含下列重(H)鏈及輕(L)鏈殘基(根據Kabat編號)：H33 Ala、H58 Tyr、H95 Leu、H96 Gly、H97 Ala、H98 Thr、H99 Ser、H100 Leu、H100A Ser、L29 Ala、L31 Tyr、L91 Tyr、L95A Ser及L95B Gly。
  7. 如申請專利範圍第1項之抗體或其抗原結合片段，其包含下列殘基(根據Kabat編號)：(a)H33為Ala或Val；(b)H47為Trp；(c)H50為Ala；(d)H51為Ile；(e)H52為Ser、Arg、Lys、Phe或Tyr；(f)H56為Ser、Arg或Lys；(g)H58為Tyr；(h)H95為Leu；(i)H96為Gly、Ala、Arg、Asn、Lys、Pro、Ser或Val；(j)H97為Ala；(k)H98為Thr、His、Ile、Leu、Met、Phe或Tyr；(l)H99為Ser；(m)H100為Leu、Phe、Trp或Tyr；(n)H100A為Ser、Arg、Asn、Gln、Glu、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro或Trp；(o)L29為Ala；(p)L31為Tyr；(q)L91為Tyr；(r)L95A為Ser、Phe、Trp或Tyr；(s)L95B為Gly；及(t)L95C為Ser、Arg、Asn、Gln、Glu、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Trp、Tyr或Val；並可選擇地包含下列殘基：(u)L93為Ser；(v)L96為Gly。
  8. 如申請專利範圍第3項之抗體或其抗原結合片段，其包含VH和VL，該VH包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列。
  9. 如申請專利範圍第8項之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列。
  10. 如申請專利範圍第5項之抗體或其抗原結合片段，其包含VH和VL，該VH包含SEQ ID NO：41或63之胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列。
  11. 如申請專利範圍第10項之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：42或64之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列。
  12. 如申請專利範圍第2項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定部位進一步包含一或多個選自由下列所組成之群組的殘基：Glu100、Glu101、Asp102、Gly104及Tyr109(根據SEQ ID NO：2之編號)。
  13. 如申請專利範圍第1項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係選自由下列所組成之群組：(a)包含至少一個抗體結合部位(paratope)殘基(根據Kabat編號)之抗體，該抗體結合部位殘基係如下述般位於TFPI之至少一個抗原決定部位殘基(根據SEQ ID NO：2編號)之4.0Å內：抗原決定部位殘基102 Asp係位於抗體結合部位殘基H58 Tyr之4.0Å內；抗原決定部位殘基104 Gly係位於抗體結合部位殘基H58 Tyr之4.0Å內；抗原決定部位殘基105 Ile係位於抗體結合部位殘基H33 Ala、H50 Ala、H51 Ile、H52 Ser、H56 Ser、H58 Tyr及H95 Leu之4.0Å內；抗原決定部位殘基106 Cys係位於抗體結合部位殘基H100 Leu和H100A Ser之4.0Å內；抗原決定部位殘基107 Arg係位於抗體結合部位殘基H96 Gly、H97 Ala、H98 Thr、H99 Ser及H100 Leu之4.0Å內；抗原決定部位殘基108 Gly係位於抗體結合部位殘基H100 Leu之4.0Å內；抗原決定部位殘基112 Arg係位於抗體結合部位殘基L29 Ala和L31 Tyr之4.0Å內；抗原決定部位殘基127 Tyr係位於抗體結合部位殘基L31 Tyr之4.0Å內；抗原決定部位殘基129 Gly係位於抗體結合部位殘基L31 Tyr之4.0Å內；抗原決定部位殘基130 Cys係位於抗體結合部位殘基L91 Tyr和L95B Gly之4.0Å內；抗原決定部位殘基131 Leu係位於抗體結合部位殘基H47 Trp、H50 Ala、H58 Tyr、L95A Ser、L95B Gly和L95C Ser之4.0Å內；抗原決定部位殘基132 Gly係位於抗體結合部位殘基H58 Tyr和L95A Ser之4.0Å內；抗原決定部位殘基134 Met係位於抗體結合部位殘基L95A Ser之4.0Å內；且，抗原決定部位殘基138 Glu係位於抗體結合部位殘基L29 Ala之4.0Å內；(b)包含至少一個抗體結合部位殘基(根據Kabat編號)之抗體，該抗體可如下述般與TFIP之抗原決定部位殘基(根據SEQ ID NO：2編號)形成氫鍵：抗原決定部位殘基102 Asp可與抗體結合部位殘基H58 Tyr形成氫鍵；抗原決定部位殘基107 Arg可與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基形成氫鍵：H96 Gly、H97 Ala、H98 Thr、H99 Ser和H100 Leu；抗原決定部位殘基112 Arg可與抗體結合部位殘基L29 Ala形成氫鍵；抗原決定部位殘基127 Tyr可與抗體結合部位殘基L31 Tyr形成氫鍵；且，抗原決定部位殘基131 Leu可與抗體結合部位殘基L95B Gly形成氫鍵；及(c)包含至少一個抗體結合部位殘基(根據Kabat編號)之抗體，該抗體結合部位殘基包含於掩藏的表面積中非零變化，該非零變化係由於如下述般與抗原決定部位殘基(根據SEQ ID NO：2編號)之交互作用：抗原決定部位殘基102 Asp與抗體結合部位殘基H58 Tyr交互作用；抗原決定部位殘基104 Gly與抗體結合部位殘基H58 Tyr交互作用；抗原決定部位殘基105 Ile與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：H33 Ala、H34 Met、H50 Ala、H51 Ile、H52 Ser、H56 Ser、H58 Tyr和H95 Leu；抗原決定部位殘基106 Cys與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：H95 Leu、H100 Leu、H100A Ser和L91 Tyr；抗原決定部位殘基107 Arg與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：H96 Gly、H97 Ala、H98 Thr、H99 Ser和H100 Leu；抗原決定部位殘基108 Gly與抗體結合部位殘基H100 Leu交互作用；抗原決定部位殘基112 Arg與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：L29 Ala、L31 Tyr和L93 Ser；抗原決定部位殘基127 Tyr與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：L31 Tyr和L95B Gly；抗原決定部位殘基129 Gly與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：H100A Ser、L31 Tyr和L91 Tyr；抗原決定部位殘基130 Cys與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：H95 Leu、H100A Ser、L31 Tyr、L91 Tyr和L95B Gly；抗原決定部位殘基131 Leu與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：H47 Trp、H50 Ala、H58 Tyr、H95 Leu、L31 Tyr、L91 Tyr、L95A Ser、L95B Gly、L95C Ser和L96 Gly；抗原決定部位殘基132 Gly與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：H58 Tyr和L95A Ser；抗原決定部位殘基133 Asn與抗體結合部位殘基L95A Ser交互作用；抗原決定部位殘基134 Met與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：L93 Ser、L94 Ser和L95A Ser；且，抗原決定部位殘基138 Glu與至少一個選自由下列所組成之群組的抗體結合部位殘基交互作用：L28 Gly、L29 Ala和L93 Ser。
  14. 如申請專利範圍第1項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以約1×10-8M至約1×10-10M之結合親和力(Kd)值結合TFPI。
  15. 如申請專利範圍第1項之抗體或其抗原結合片段，其中特異結合該抗原決定部位的該抗體或其抗原結合片段：(i)減少如基於血漿之稀釋凝血酶原時間分析所測量之凝血時間；(ii)減少如藉由血栓消融術(thromboelastrography)測量之全血凝血時間；(iii)增加凝血酶產生；(iv)增加在TFPI之存在下的FXa活性；(v)增強在TFPI之存在下的血小板積累；(vi)增加在TFPI之存在下的纖維蛋白(fibrin)產生；或(vii)彼等之任何組合。
  16. 如申請專利範圍第15項之抗體或其抗原結合片段，其中該血漿或全血缺乏第VIII因子或第IX因子。
  17. 一種經分離之核酸分子，其包含編碼如申請專利範圍第1至12項中任一項之抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。
  18. 如申請專利範圍第17項之核酸分子，其包含選自由下列所組成之群組的核苷酸序列：(a)SEQ ID NO：175之序列；(b)SEQ ID NO：176之序列；(c)SEQ ID NO：177之序列；及(d)SEQ ID NO：178之序列。
  19. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至12項中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載體或賦形劑。
  20. 一種如申請專利範圍第1項之抗體或其抗原結合片段於製備用於降低個體之組織因子途徑抑制劑(TFPI)的活性之藥物的用途。
  21. 一種如申請專利範圍第1至12項中任一項之抗體或其抗原結合片段於製備用於縮短個體之出血時間之藥物的用途。
  22. 如申請專利範圍第21項之用途，其中該個體罹患或易感於A型血友病(hemophilia)、B型血友病、類血友病(von Willebrand disease)(vWD)或血小板病症。
  23. 如申請專利範圍第20項之用途，其中該藥物進一步包含FVIIa。
  24. 如申請專利範圍第21項之用途，其中該藥物進一步包含FVIIa。
  25. 一種如申請專利範圍第1至12項中任一項之抗體或其抗原結合片段與凝血劑之組合於製備用於縮短個體之出血時間之藥物的用途。
  26. 如申請專利範圍第25項的用途，其中該個體罹患或易感於A型血友病或B型血友病且該凝血劑係選自由下列所組成之群組：第VIIa因子、第VIII因子、第IX因子及傳明酸(tranexamic acid)。
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