DE69431750T2

DE69431750T2 - Multivesikuläre liposomen mit verkapseltem cyclodextrin und pharmakologisch wirksamen verbindungen sowie verfahren zu deren verwendung

Info

Publication number: DE69431750T2
Application number: DE69431750T
Authority: DE
Inventors: Sinil Kim
Original assignee: Skyepharma Inc
Current assignee: Pacira Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-04-22
Filing date: 1994-04-22
Publication date: 2003-04-03
Anticipated expiration: 2014-04-23
Also published as: US5759573A; JPH08509230A; DE69431750D1; ATE227979T1; EP0695169A4; DK0695169T3; EP0695169B1; CA2161225A1; CA2161225C; EP0695169A1; HK1013258A1; PT695169E; ES2188612T3; JP3545403B2; WO1994023697A1; AU6818094A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Liposomtechnologie und Pharmakotherapie. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neuartige Liposomen, die pharmakologische Komponenten und Cyclodextrine einkapseln, sowie Verfahren zu deren Verwendung.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Liposomen sind künstliche Lipid- oder Phospholipidvesikel, die wässrige innere Kammern umschließen, in welche Moleküle, z. B. Arzneimittel, zum Zweck des Erreichens einer langsamen Freisetzung des Arzneimittels nach der Verabreichung des Liposoms an ein Individuum eingekapselt werden können. In den letzten Jahren sind mehrere Typen von Liposomen beschrieben worden (US-Patentschrift Nr. 4,522,803, Lenk, 4,310,506, Baldeschwieler; 4,235,871, Papahadjopoulos; 4,224,179, Schneider; 4,078,052, Papahadjopoulos; 4,394,372, Taylor; 4,308,166, Marchetti; 4,485,054, Mezei; und 4,508,703, Redziniak; Szoka et al., 1980, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 465-508; Liposomes, Marc J. Ostro, Ed., Marcel-Dekker, Inc. New York, 1983; Poznansky and Juliano, Pharmacol. Rev. 36: 277-236, 1984: Kim, et al., Biochim. Biophys. Acta 728: 339-348, 1983; Kim et al., Biochim. Biophys. Acta 646: 1-10, 1981). Unilamellare Liposomen haben eine einzelne Doppelschichtmembran, die ein wässriges Volumen einschließt (Huang, 1969, Biochemistry 8: 334-352), während multilamellare Liposomen zahlreiche konzentrische Membranen haben (Bangham et al., 1965, J. Mol. Biol. 13: 238-252). Multivesikuläre Liposomen unterscheiden sich sowohl von unilamellaren als auch von multilamellaren Liposomen insoferne, als multivesikuläre Liposomen zahlreiche, nicht konzentrische wässrige Kammern haben (Kim et al., 1983, Biochim. Biophys. Acta 728: 339-348).
Liposomen-Abgabe-Systeme wurden für unterschiedliche pharmakologisch aktive Komponenten, einschließlich Antibiotika, Hormone und antineoplastische Mittel vorgeschlagen (Liposomes, Marc J. Ostro, Ed., Marcel-Dekker, Inc. New York, 1983). Die Verwendung von Liposomen zur Einkapselung pharmakologischer Mittel und die Effektivität von Liposomen-Abgabe-Systemen unterscheiden sich je nach Wasser- und Lipidlöslichkeit des Arzneimittels. Beispielsweise sind hydrophile Substanzen für das Einkapseln in multivesikulären Liposomen gut geeignet. Im Gegensatz dazu tendieren hydrophobe wasserunlösliche Komponenten dazu, in die Lipiddoppelschicht eingebaut zu werden. Diese Komponenten sind daher für eine Einkapselung in die wässrigen inneren Kammern eines Liposomen-Abgabe-Systems nicht gut geeignet. Die Substanzklasse der Cyclodextrine, besonders β-Cyclodextrin, wurden erfolgreich verwendet, um wasserunlösliche hydrophobe Substanzen in Lösung zu bringen (Strattan, Januar 1992, Pharm. Tech. 68-74, Strattan, Februar 1992, Pharm. Tech. 52-58; Stern, DN&P, 2: 410-415, 1989; Pagington, Chem. Brit. 23: 455-458, 1987).
Die Einkapselung von wasserlöslichen pharmakologischen Substanzen, wie beispielsweise Methotrexat, in unterschiedliche Arzneimittel-Abgabe-Systeme wurde früher berichtet. Die Freisetzungsraten von Methotrexat erwiesen sich allerdings als schnell und die früheren Einkapselungen führten nicht zu großen Veränderungen der Pharmakokinetik. Kimelberg et al. berichteten, dass die Halbwertszeit der liposomalen Methotrexatpräparation in der Zerebrospinalflüssigkeit extrem kurz sei (unter 1 Stunde) und dass sie sich nicht signifikant von dem nicht eingekapselten Arzneimittel unterschied.
Viele Experimentatoren haben mit der Absicht, die systemische Toxizität zu verringern und die Tumorzerstörung zu verstärken, versucht, pharmakologische Mittel, z. B. antineoplastische Arzneimittel wie Methotrexat, gezielt auf einen Tumor zu richten. Ein Ansatz ist, das Arzneimittel direkt in eine tumorenthaltende Kavität, wie die Peritonealhöhle oder den Subarachnoidalraum, zu instillieren. Eine solche intrakavitäre Therapie ist jedoch nicht immer erfolgreich. Eines der Probleme ist, dass die intrakavitäre Freigabe schnell ist, was zu einer kurzen Arzneimittelexposition führt. Bei einem zellzyklusphasenspezifischen Arzneimittel wie Methotrexat ist für optimale Wirksamkeit eine verlängerte Exposition erforderlich.
Im Stand der Technik fehlt noch immer ein wirksames Liposomen-Abgabe-System für einige wasserlösliche und biologisch aktive Substanzen, die zu schnell aus den Liposomen freigesetzt werden, um praktisch und nützlich zu sein. Im Stand der Technik fehlen auch wirksame Verfahren zur kontrollierten Freisetzung solcher Substanzen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine multivesikuläre Liposomenzusammensetzung nach Anspruch 1 und eine Verwendung, wie in Anspruch 9 offenbart.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine multivesikuläre Liposomenzusammensetzung bereitgestellt, welche eine wasserlösliche in dem Liposom eingekapselte Substanz aufweist, wobei die Liposomenzusammensetzung eingekapseltes Cyclodextrin enthält.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Behandeln eines pathophysiologischen Status in einem Individuum bereit gestellt, welches das Verabreichen einer Liposomenzusammensetzung, wie beansprucht, an das Individuum aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren des Erhöhens der Halbwertszeit einer Substanz in einem Tier bereit gestellt, welches den Schritt des Verabreichens einer Zumischung von Liposomen wie beansprucht aufweist.
Andere und weitere Gegenstände, Eigenschaften und Vorteile werden aus den folgenden Beschreibungen der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ersichtlich, die zum Zwecke der Offenbarung gegeben sind, und wenn sie in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen betrachtet werden.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Der Begriff "multivesikuläre Liposomen", wie durchgehend in der Patentbeschreibung und den Patentansprüchen verwendet, bedeutet von Menschen hergestellte, mikroskopische Lipidvesikel, die aus quervernetzten Lipidoppelschichtmembranen bestehen, viele nicht konzentrische wässrige Kammern einschließen und durch ein neutrales Lipid gekennzeichnet sind, das die Schichten einer Doppelschichtmembran trennt. Im Gegensatz dazu haben unilamellare Liposomen eine einzelne wässrige Kammer und multilamellare Liposomen haben viele konzentrische Membranen vom Typ einer "Zwiebelhaut", zwischen denen sich kapselartige konzentrische wässrige Kompartimente befinden.
Der Begriff "lösliche Kugel", wie durchgehend in der Patentbeschreibung und den Patentansprüchen verwendet, bedeutet einen mikroskopischen, kugelförmigen Tropfen eines organischen Lösungsmittels, in dem sich viele kleinere Tropfen einer wässrigen Lösung befinden. Die löslichen Kugeln sind suspendiert und vollkommen in eine zweite wässrige Lösung getaucht.
Der Begriff "MVL-CD-MTX" bedeutet eine Formulierung, die Methotrexat eingekapselt in multivesikuläre Liposomen in Gegenwart von Cyclodextrin enthält.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Zeichnungen sind nicht unbedingt zu skalieren. Bestimmte Merkmale der Erfindung können im Interesse der Deutlichkeit und der Schlüssigkeit im Maßstab übertrieben oder in schematischer Form dargestellt sein.
Fig. 1 zeigt die Konzentrationen von Methotrexat in Zerebrospinalflüssigkeit (ZSF) nach intrazisternaler Injektion von 100 ug (0,22 umol) multivesikuläre Liposomen mit eingekapselten Methotrexat und Cyclodextrin (MVL-CD-MTX) (gefüllte Kreise, frei; ungefüllte Quadrate, gesamt) oder nicht eingekapselten Methotrexat (gefüllte Quadrate). 3eder Datenpunkt repräsentiert den Durchschnitt und die Standardabweichung von drei Ratten.
Fig. 2 zeigt die Menge an verbleibendem Methotrexat im zentralen Nervensystem (ZNS) nach intrazisternaler Injektion von 100 ug Methotrexat als MVL-CD-MTX (ungefüllte Kreise, gesamt im ZNS; gefüllte Kreise, im kranialen Kompartiment) oder als nicht eingekapseltes Methotrexat (ungefüllte Quadrate, gesamt; gefüllte Quadrate, kranial). Jeder Datenpunkt repräsentiert den Durchschnitt und die Standardabweichung von drei Ratten.
Fig. 3 zeigt die Menge an nicht eingekapseltem Methotrexat (ungefüllte Kreise) und Methotrexat MVL-CD-MTX (gefüllte Kreise), die von der subkutanen Injektionsstelle zurückerhalten wurden.
Fig. 4 zeigt die Plasmakonzentration an Methotrexat nach subkutaner Injektion von nicht eingekapseltem Methotrexat (ungefüllte Kreise) und MVL-CD-MTX (gefüllte Kreise).
Fig. 5 zeigt die verlängerte Lebensdauer (VLD) in Prozent als Funktion des Logarithmus der verabreichten Dosis für nicht eingekapseltes Methotrexat (gefüllte Kreise) und für MVL-CD-MTX (ungefüllte Kreise).
Fig. 6 zeigt die volumenkorrigierte Größenverteilung der multivesikulären Liposomenformulierung von Methotrexat, MVL-CD-MTX. Der Durchmesser der Partikel wurde in Gruppen von 2 um-Intervallen von einem Photomikrographen gemessen. Die Anzahl der Partikel in jeder Größengruppe wurde multipliziert mit dem Quadrat des Radius, um relative Volumina einer jeden Größenkategorie zu erhalten, und dann durch die Summe der relativen Volumina aller Partikel dividiert, um den Prozentanteil des Gesamtvolumens zu erhalten, das von jeder Größenkategorie repräsentiert war. Das Füllvolumen war 12,9 ± 1,0 ul/umol an Lipiden.
Fig. 7 zeigt die Freisetzung von Methotrexat von MVL-CD-MTX, suspendiert in 0,9%iger NaCl-Lösung, aufbewahrt bei 4ºC (gefüllte Kreise); in 0,9%iger NaCl-Lösung bei 37ºC (ungefüllte Kreise) und in humanem Plasma bei 37ºC (gefüllte Kästchen). Jeder Punkt stellt den Mittelwert und die Standardabweichung aus drei Experimenten dar. Die Skala der Ordinate ist logarithmisch.
Fig. 8 zeigt die intraperitonealen Konzentrationen von Methotrexat nach intraperitonealer Injektion von 10 mg/kg (22 umol/kg) von Methotrexat als nicht eingekapseltes Methotrexat (ungefüllte Kreise), nicht eingekapselter Cyclodextrin-Methotrexat- Komplex (gefüllte Dreiecke) oder in multivesikuläre Liposome eingekapseltes Cyclodextrin- Methotrexat, MVL-CD-MTX (gefüllte Kreise, frei; ungefüllte Kästchen, gesamt). Jeder Punkt stellt den Mittelwert und die Standardabweichung aus von einer Gruppe von drei Mäusen dar.
Fig. 9 zeigt die Mengen von Methotrexat, die nach der Injektion von 10 mg/kg (22 umol/kg) Methotrexat als nicht eingekapseltes Methotrexat (ungefüllte Kreise), nicht eingekapselter Cyclodextrin-Methotrexat-Komplex (gefüllte Dreiecke) oder in multivesikuläre Liposomen eingekapseltes Methotrexat, MVL-CD-MTX (gefüllte Kästchen) verbleiben. Jeder Punkt stellt den Mittelwert und die Standardabweichung aus von einer Gruppe von drei Mäusen dar.
Fig. 10 zeigt die Überlebenskurve von Mäusen, die intraperitoneal an Tag 1 mit 0,9% NaCl-Lösung (gefüllte Dreiecke), 2000 mg/kg nicht eingekapseltem Methotrexat (gefüllte Kreise), 2500 mg/kg nicht eingekapseltem Methotrexat (ungefüllte Kreise), 15 mg/kg von MVL-CD-MTX (gefüllte Kästchen) und 20 mg/kg von MVL-CD-MTX (ungefüllte Kästchen) behandelt wurden.
Fig. 11 zeigt die verlängerte Lebensdauer (VLD) im Vergleich zur Dosis (mg/kg) von Mäusen, die an Tag 1 mit nicht eingekapseltem Methotrexat (ungefüllte Kreise) und mit MVL-CD-MTX (gefüllte Kreise) behandelt wurden. Jeder Datenpunkt repräsentiert die mittlere VLD einer Gruppe von fünf Mäusen. Ein Vergleich mit der optimalen Dosis an nicht eingekapseltem Methotrexat (2000 mg/kg) erfolgte durch den nonparametrischen Mann- Whitney-Test: *, p < 0,02; **, p < 0,01.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf das Bilden von Einschlusskomplexen von wasserlöslichen Substanzen, wie beispielsweise Methotrexat, mit Cyclodextrinen, vorzugsweise β-Cyclodextrin, und auf das Einkapseln des Einschlusskomplexes in Liposomen für eine kontrollierte Freisetzung. Zur Verwendung in der Ausführung dieser Erfindung formt das Cyclodextrin vorzugsweise einen Einschlusskomplex mit der wasserlöslichen Substanz, worin die apolare Kavität des Cyclodextrin von der Substanz besetzt wird oder die Substanz ausreichend bindet, um die Rate der Freisetzung von der Liposomzusammensetzung zu verlangsamen. Der Rand oder die Peripherie des Einschlusskomplexes ist hydrophil mit dem Ergebnis, dass der Einschlusskomplex in wässrigen Medien eine Lösung bildet. Die mit Cyclodextrin Komplexe bildende, wasserlösliche Substanz kann dann in Liposomen eingekapselt werden.
Zusätzlich zu dem Verhindern des Einbaus wasserlöslicher Substanzen in die Lipidschichten der Liposome während ihrer Bildung haben die Anmelder entdeckt, dass die Bildung eines Einschlusskomplexes zu einer Verringerung der Freisetzungsrate der hydrophilen Substanz aus dem Liposom führt und zwar im Vergleich zur Freisetzungsrate derselben Substanz, eingekapselt in Abwesenheit von Cyclodextrin.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Liposomenzusammensetzung bereit, die eine in dem Liposom eingekapselte pharmakologisch aktive Menge einer biologisch aktiven Substanz aufweist, worin die Liposomenzusammensetzung weiters eingekapseltes Cyclodextrin enthält. Vorzugsweise ist die biologisch aktive Substanz wasserlöslich. Bei der Ausübung dieser Erfindung hat die wasserlösliche Substanz im Allgemeinen eine Wasserlöslichkeit von über ca. 1 ug/ml, vorzugsweise über ca. 100 ug/ml und am meisten bevorzugt über ca. 1 mg/ml, in Abwesenheit von Cyclodextrin.
Wie hierin verwendet, wird der Begriff "pharmakologisch" oder "pharmakologisch aktiv" auswechselbar mit "biologisch" oder "biologisch aktiv" verwendet.
Cyclodextrine sind chirale, ringförmige Moleküle, die durch die Wirkung des Enzyms Cyclodextrintransglykosylase auf Stärke gebildet werden. Diese zyklische Oligomere enthalten 6 bis 12 Glukoseeinheiten, verbunden durch a-(1,4)-Bindungen. Die drei kleinsten Homologe, α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin und γ-Cyclodextrin sind kommerziell verfügbar; größere Homologe müssen hergestellt und einzeln isoliert werden. Die sekundären 2- und 3- Hydroxygruppen kleiden die Öffnung der Cyclodextrinhöhle aus und haben eine gestapelte Ausrichtung. Die primären 6-Hydroxyle befinden sich am entgegengesetzten Ende des Moleküls. Die Innenseite der Cyclodextrinhöhle ist relativ hydrophob, da alle Hydroxyle zur Außenseite des Moleküls hin ausgerichtet sind.
Es wird speziell überlegt, dass in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung viele unterschiedliche Typen von Cyclodextrinen nützlich wären. Beispielsweise kann die vorliegende Erfindung natürliche α-, β- oder γ-Cyclodextrine verwenden. In ähnlicher Weise kann die vorliegende Erfindung halbsynthetische substituierte Cyclodextrine wie beispielsweise Methylcyclodextrine, Ethylcyclodextrine, Hydroxyethylcyclodextrine, Hydroxypropylcyclodextrine, verzweigte Cyclodextrine, Cyclodextrin- Polymere oder Monosuccinyldimethyl-β-Cyclodextrin verwenden. Für die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung am meisten bevorzugt ist 2- Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin.
Im Allgemeinen ist die Konzentration von Cyclodextrin, die zum Herstellen der Liposomen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, die, welche die Freisetzung einer pharmakologischen Substanz aus dem Liposom nach der Verabreichung an ein Tier verlangsamt. Vorzugsweise ist das Cyclodextrin in der Liposomenzusammensetzung in einer Menge von etwa 10 Milligramm pro ml bis ca. 400 Milligramm pro ml vorhanden. Mehr bevorzugt beträgt die Menge an Cyclodextrin in dem Liposom etwa 100 mg/ml.
Im Allgemeinen kann das Liposom der vorliegenden Erfindung jedes sein, das, präpariert mit dem eingekapselten Cyclodextrin, eine langsame kontrollierte Freisetzung pharmakologischer Substanzen ergibt. Das Liposom ist aus der Gruppe von multivesikulären Liposomen ausgewählt.
Im Allgemeinen ist die biologisch aktive Substanz, die in dem Liposom der vorliegenden Erfindung eingekapselt ist, jede, deren Freisetzungsrate aus einem Liposom, das Cyclodextrin einkapselt, langsamer ist in Abwesenheit von Cyclodextrin. Therapeutische, biologisch aktive Substanzen können ausgewählt werden aus der allgemeinen Gruppe bestehend aus anti-neoplastischen Agentien, anti-infektiösen Agentien, Antidepressiva, Antivirus-Agentien, anti-nozizeptiven Agentien, Anxiolytika und Hormonen.
Repräsentative Beispiele für antineoplastische Agentien, die in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beinhalten Methotrexat, Taxol, Tumornekrosefaktor, Chlorambucil, Interleukine, Bleomycin, Etoposid, Fluorouracil und Vinblastin.
Repräsentative Beispiele für anti-infektiöse Agentien, die in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beinhalten Pentamidin, Metronidazol, Penicillin, Cephalexin, Tetracyclin und Chloramphenicol.
Repräsentative Beispiele für Antivirus-Agentien, die in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beinhalten Dideoxyoytidin, Zidovudin, Acyclovir, Interferone, Dideoxyinosin und Ganciclovir.
Repräsentative Beispiele für Anxiolytika und Sedative, die in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beinhalten Benzodiazepine wie beispielsweise Diazepam, Barbiturate wie Phenobarbital und andere Substanzen wie beispielsweise Buspiron und Haloperidol.
Repräsentative Beispiele für Hormone, die in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beinhalten Estradiol, Prednison, Insulin, Wachstumshormon, Erythropoietin und Prostaglandine.
Repräsentative Beispiele für Antidepressiva, die in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beinhalten Fluoxetin, Trazodon, Imipramin und Doxepin.
Repräsentative Beispiele für antinozeptive Agentien, die in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beinhalten Hydromorphin, Oxycodon, Fentanyl, Morphin und Meperidin.
Die Liste der therapeutischen, biologisch aktiven, oben beschriebenen Agentien ist nur beispielhaft und soll nicht den Umfang der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise einschränken. Viele andere Klassen von pharmakologischen Mitteln wären für die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich, einschließlich Lokalanästhetika, Vitamine, Impfstoffe, wundheilende Stimulatoren, Immunsuppressiva, Antiemetika, Antimalaria-Agentien, Fungizide, Antipsychotika, Antipyretika, Koagulanzien, Diuretika, Kalziumkanalblocker, bronchienerweiternde Agentien, etc.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Erhöhen der Halbwertszeit einer pharmakologischen Substanz in einem Tier bereit, das den Schritt des Verabreichens einer Zumischung von Liposomen aufweist, die die pharmakologische Substanz einkapseln, wobei das Liposom weiters Cyclodextrin einkapselt.
Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren zum Behandeln eines pathophysiologischen Zustands in einem Individuum bereit, welche das Verabreichen einer Liposomenzusammensetzung an das Individuum aufweist, wobei die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge einer in das Liposom eingekapselten Substanz enthält, wobei die Liposomenzusammensetzung weiters Cyclodextrin einkapselt. Der Begriff "therapeutisch wirksam", wie er für die Zusammensetzung der Erfindung gilt, bedeutet, dass das biologisch aktive, therapeutische Mittel in der wässrigen Phase in den Vesikeln in einer Konzentration vorhanden ist, die zum Erreichen eines speziellen medizinischen Effektes, für den das therapeutische Mittel vorgesehen ist, ausreichend ist. Nicht einschränkende Beispiele der wünschenswerten medizinischen Effekte, die erzielt werden können, sind Chemotherapie, Antibiotikatherapie und Regulation des Stoffwechsels. Die exakten Dosenmengen variieren je nach solchen Faktoren, wie dem einzelnen therapeutischen Mittel und dem wünschenswerten medizinischen Effekt, sowie je nach Patientenfaktoren, wie Alter, Geschlecht, allgemeiner Zustand. Fachleute können diese Faktoren sofort berücksichtigen und sie dazu verwenden, wirksame therapeutische Konzentrationen ohne Hinzuziehen unnötiger Experimente zu etablieren.
Im Allgemeinen beinhaltet der für eine Verwendung beim Menschen geeignete Dosierungsbereich den Bereich von 0,1-6000 mg/m² der Körperoberfläche. Für manche Anwendungen, wie beispielsweise die subkutane Anwendung, kann die erforderliche Dosis ziemlich klein sein, für andere Anwendungen jedoch, wie beispielsweise die intraperitoneale Verabreichung, kann die für eine Verwendung wünschenswerte Dosis sehr groß sein. Während Dosismengen gegeben werden können, die außerhalb des vorangegangenen Dosisbereichs liegen, beinhaltet dieser Bereich die Bandbreite der Verwendung für praktisch alle der biologisch aktiven Substanzen.
Die Liposomen gemäß vorliegender Erfindung können auf jedem gewünschten Weg verabreicht werden. Die Verabreichung kann beispielsweise intrathekal, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär, intravenös, intralymphatisch, oral und submukosal sein. Die Verabreichung kann auch an unterschiedliche Arten von Epithelien erfolgen, einschließlich dem Bronchialepithel, dem gastrointestinalen Epithel, dem Urogenitalepithel und verschiedenen anderen Schleimhautmembranen im Körper. Wie der Fachmann erkennt, hängt der beste Weg der Verabreichung von der ausgewählten biologischen Substanz ab. Obwohl beispielsweise Methotrexat oral verabreicht werden kann, hat die parenterale Verabreichung gewisse Vorteile. Die Absorptionsrate von Methotrexat nach oraler Verabreichung ist bei den Patienten hoch variabel und scheint sättigungsabhängig zu sein. Im Gegensatz dazu ist die Absorption des Arzneimittels nach Verabreichung i. m. oder s. c. sehr viel besser vorhersagbar und vollständig, was höhere Serumkonzentrationen ergibt als nach einer oralen Dosis.
Cyclodextrin enthaltende Liposomen sind beim zielgerichteten Transport von Arzneimitteln mit verlängerter Freisetzung von subkutan verabreichten pharmakologischen Mitteln aus mehreren Gründen nützlich. Sie sind bei der Lagerung ziemlich stabil. Darüber hinaus kann das Arzneimittel über verlängerte Zeiträume wirken, sowohl in vitro als auch in vivo. Deren schwammartige innere Struktur führt zu einer wirksamen Einkapselung in wässrige innere Kammern, zu Stabilität bei der Aufbewahrung und in vivo zu einer verlängerten Freisetzung. Die Halbwertszeit von Methotrexat im Plasma kann beispielsweise im Vergleich zu freiem Methotrexat um das 206-Fache erhöht werden, wobei die Höchstkonzentration im Plasma 126-mal geringer war als die von nicht eingekapseltem Methotrexat. Als Folge der signifikanten Modifikationen der durch die Einkapselung eines Arzneimittels in dem Liposom in Gegenwart von Cyclodextrin erzielten Pharmakokinetik kann die Arzneimittelpotenz um das über 100-Fache gesteigert werden. Die Potenz von Methotrexat beispielsweise kann durch die Verabreichung gemäß den Lehren dieser Erfindung um das 130-Fache erhöht werden, wobei die LD&sub5;&sub0; um das 110-Fache gesenkt werden kann. Diese Veränderungen in Potenz und LD&sub5;&sub0; weisen nicht auf signifkante Veränderung des therapeutischen Index aufgrund der Einführung der biologisch aktiven Substanz während der Einkapselung in die Liposomen hin.
Die liposomalen Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung können modifiziert werden, um die Targeting-Spezifität für Organe oder Zellen zu gewähren. Diese Modifikationen können besonders dann relevant sein, wenn die liposomale Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung dazu verwendet wird, pharmakologische Mittel zu verabreichen, die hochtoxisch sind oder die schwere Nebenwirkungen verursachen.
Das Targeting von Liposomen wurde auf der Basis von anatomischen und mechanistischen Faktoren klassifiziert. Die anatomische Klassifizierung beruht auf dem Grad der Selektivität, z. B. organspezifisch, zellspezifisch oder organellenspezifisch. Das mechanistische Targeting kann unterschieden werden je nachdem, ob es passiv oder aktiv ist. Ein passives Targeting nützt die natürliche Tendenz von Liposomen, sich bis zu den Zellen des retikuloendothelialen Systems in Organen mit sinusoidalen Kapillaren auszubreiten. Ein aktives Targeting dagegen involviert die Veränderung des Liposoms durch Koppeln des Liposoms an einen spezifischen Liganden wie beispielsweise einen monoklonalen Antikörper, Zucker, an ein Glykolipid, Protein oder durch Veränderung der Zusammensetzung oder Größe des Liposoms, um ein Targeting zu Organen und Zelltypen zu erreichen, die sich von den natürlich vorkommenden Stellen der Lokalisation unterscheiden. Siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, Gannaro, A. R., ed.., Mack Publishing, 18. Auflage, Seiten 1691- 1693. MVL-CD-MTX-Partikel können beispielsweise in großen Durchschnittsgrößen synthetisiert werden, um deren Aufnahme in die Lymphe und die systemische Zirkulation nach Injektion in Körperhöhlen oder in Gewebsräume, wie beispielsweise den subkutanen Raum, zu verringern. Deren große Größe kann auch die Aufnahme in Makrophagen hemmen.
Die Oberfläche des angestrebten Abgabe-Systems kann auf unterschiedliche Art und Weise modifiziert werden. In dem Fall einer liposomalen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung können Lipidgruppen in die Lipiddoppelschicht des Liposoms eingebaut werden, um den Targeting-Liganden in stabiler Verbindung mit der liposomalen Doppelschicht zu halten. Zur Anbindung der Lipidketten an den Targeting-Liganden können verschiedene Bindungsgruppen verwendet werden. Die an die Oberfläche des angestrebten Abgabe- Systems gebundenen Substanzen können von kleinen Haptenen mit einem Molekulargewicht von etwa 125-200 bis zu viel größeren Antigenen mit Molekulargewichten von mindestens 6000, jedoch im Allgemeinen von weniger als 1 Million, reichen.
Die folgenden Beispiele sind zum Zweck der Veranschaulichung verschiedener Ausführungsformen der Verfahren der vorliegenden Erfindung gegeben und sollen die vorliegende Erfindung in keiner Weise einschränken.

BEISPIEL 1

Synthese einer Formulierung mit multivesikulären Liposomen-Methotrexat-β- Cyclodextrin, MVL-CD-MTX

Multivesikuläre Liposomen, die in Gegenwart von Cyclodextrin Methotrexat einkapseln (MVL-CD-MTX) wurden unter Verwendung eines Verfahrens, beschrieben von Kim et al. (Cancer Treat. Rep. 71: 705, 1987), mit einigen Modifikationen hergestellt. Kurz beschrieben, bestand die diskontinuierliche wässrige Phase für jede Charge an MVL-CD-MTX aus 2- Hydroxypropyl-β-Cyclodextrinlösung (100 mg/ml), HCl (0,1 N) und Methotrexat (10 mg/ml). Ein ml der diskontinuierlichen wässrigen Phase wurde in ein kleines Gefäß, enthaltend 13,9 umol Dioleoyl-Lezithin, 3,15 umol Dipalmitoylphosphatidyl/Glyzerin, 22,5 umol Cholesterin, 2,7 umol Triolein und 1 ml Chloroform, hinzugegeben. Das Gefäß wurde horizontal am Kopf eines Vortex-Mischers angebracht und bei Höchstgeschwindigkeit 6 Minuten lang geschüttelt. Eine Hälfte der sich daraus ergebenden "Wasser in Öl"-Emulsion wurde schnell durch eine Pasteur-Pipette mit schmaler Spitze in jedes der beiden Gefäße gedrückt, von welchen jedes 2,5 ml Wasser, Glukose (32 mg/ml) und Lysin als freie Base (40 uM) enthielt. Jedes Gefäß wurde dann auf dem Vortexmischer 5 Sekunden lang bei Höchstgeschwindigkeit geschüttelt, um Chloroformkugeln zu bilden. Die Chloroformkugel- Suspensionen in den beiden Gefäßen wurden in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben überführt, der 5 ml Wasser, Glukose (32 mg/ml) und Lysin als freie Base (40 mM) enthielt. Es wurde ein Strom von Stickstoffgas von 7 Liter pro Minute verwendet, um das Chloroform über einen Zeitraum von 10-15 Minuten bei 37ºC zu verdunsten. Die MVL-CD-MTX-Partikel wurden dann durch Zentrifugation bei 600 · g 5 Minuten lang isoliert und drei Mal mit 0,9%iger NaCl-Lösung gewaschen.

BEISPIEL 2

Intrathekale pharmakokinetische Studien

Ratten wurden mit Ketamin-HCl (90 mg/kg) und Acetopromazinmaleat (2,2 mg/kg, intravenös injiziert) narkotisiert und in einem herkömmlichen stereotaktischen Rahmen befestigt. Mithilfe eines Nr. 15-Skalpells wurde ein Hauteinschnitt mit einer Länge von ca. 1 cm vom Hinterhauptsrücken bis direkt hinter die Augen entlang der Mittellinie vorgenommen. Das Muskelband entlang des Hinterhauptsrückens am Schädel wurde mit einem Skalpell auf jeder Seite der Mittellinie 4 mm weit gelöst. Unter Verwendung der scharfen und stumpfen Enden eines Raspatoriums wurde der Muskel vom Hinterhauptbein bis hinunter zur atlanto-occipitalen Membran freigelegt. In den Einschnitt wurde ein Retraktor platziert, um den Muskel zur Seite zu ziehen und freie Sicht auf die atlanto-occipitale Membran zu erhalten. Es wurden dann entweder 20 ul nicht eingekapseltes Methotrexat oder 20 ul MVL-CD-MTX in 0,9%iger NaCl, beide enthaltend 100 ug (0,22 umol) Methotrexat, über einen Zeitraum von 20 Sekunden durch eine 30-gauge-Kanüle durch die Membran injiziert. Die Kanüle wurde entfernt, die Haut wurde mit 3-0-Seide zugenäht und dem Tier wurden 10 ml laktierte Ringer-Lösung subkutan zur Hydration gegeben.
Zu geeigneten Zeitpunkten nach der Injektion wurde die atlanto-occipitale Membran unter Narkose erneut freigelegt und eine Probe der Zerebrospinalflüssigkeit im Bereich von 30 bis 60 ul durch eine 19-gauge-Kanüle entnommen. Zu jedem Zeitpunkt wurden von drei Ratten Proben der Zerebrospinalflüssigkeit entnommen: 1 Minute und 4, 24 und 48 Stunden nach der Injektion in der Gruppe, die nicht eingekapseltes Methotrexat erhalten hatte, und 1, 3, 7, 14 und 21 Tage nach der Injektion in der Depo-Methotrexat-Gruppe. Die ZSF-Proben aus der MVL-CD-MTX-Gruppe wurden mit 70 ul 0,9%iger NaCl-Lösung verdünnt und dann unmittelbar in einer Eppendorf-Mikrofuge 1 Minute lang zentrifugiert, um einen Überstand mit freigesetztem Methotrexat von einem Pellet mit eingekapseltem Methotrexat abzutrennen. Als Nächstes wurden zu dem Pellet nacheinander 50 ul Methanol und 50 ul steriles Wasser zugefügt und auf dem Vortex gemischt, um die MVL-CD-MTX-Partikel aufzubrechen. Die Zerebrospinalflüssigkeitsproben wurden dann gefroren bei -20ºC bis zur Analyse unter Verwendung eines High-Performance-Liquid-Chromatographie (HPLC)-Systems wie unten beschrieben, aufbewahrt.
Nach der Entnahme der Zerebrospinalflüssigkeitsproben wurden die Tiere mit einer Überdosis Ketamin (90 mg/kg) und Acetopromazin (20 mg/kg), intraperitoneal injiziert, getötet. Blutproben wurden über Punktion des Herzens gewonnen und es wurde eine gründliche Entblutung vorgenommen. Das Plasma wurde abgetrennt und gefroren bei -20ºC bis zur Analyse durch den Methotrexat-Assay Emit im COBAS-Fara-Analyser (Roche Diagnostic Systems) aufbewahrt. Daraufhin wurde das knöcherne Schädeldach exponiert und sorgfältig mit einem Knochen-Rongeur entfernt. Es wurde der gesamte Inhalt des kranialen Kompartiments entnommen und zwar durch Ausschaben des freigelegten Gehirns mit einem Spatel und durch gründliches Waschen des kranialen Gewölbes mit destilliertem Wasser. Der Inhalt des Rückenmarkskompartiments wurde getrennt gewonnen; Das Rückenmark wurde vorwärts in das Kranialgewölbe extrudiert, indem destilliertes Wasser schnell durch eine 19- gauge-Kanüle gedrückt wurde, welche an einer Stelle 2,5 cm rostral zum Schwanzansatz in den unteren Lumbarkanal des Rückenmarks eingeführt wurde. Der leere Wirbelkanal wurde gründlich mit destilliertem Wasser ausgewaschen, um die Gewinnung des Methotrexats in Wirbelkanal zu vervollständigen. Die Proben aus dem kranialen Kompartiment wurden getrennt von den Proben aus dem Wirbelkanal analysiert. Beide Gewebeproben wurden unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators mit Wasser homogenisiert.

BEISPIEL 3

Messung von Methotrexat

Die Menge an Methotrexat im Rückenmarkskompartiment wurde durch Zugeben der Menge aus der zisternalen Zerebrospinalflüssigkeitsprobe berechnet. Die homogenisierten Proben aus dem Gehirn oder dem Rückenmark wurden nach der Extraktion mit HPLC wie von Alkayal et al. Ther. Drug Monit. 12: 191 (1990) beschrieben, analysiert. Kurz beschrieben, wurden in ein Zentrifugenröhrchen aus Glas ein 500 ul Aliquot des Homogenats, 100 ul wässrige Theophyllin-Lösung (interner Standard, 2.0 mg/ml 10% in Wasser), 250 ul Trichloressigsäurelösung (10% in Wasser) und 250 ul Eisessig gegeben und gemischt. Dann wurde die freie Säure von Methotrexat mit 5 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Ethylacetat-Phase wurde dekantiert und unter Stickstoff bei 60ºC verdampft. Der extrahierte Rest wurde in 200 ul der mobilen Phase aufgelöst und 100 ul der sich daraus ergebenden Lösung in die HPLC injiziert. Die mobile Phase, bestehend aus H&sub3;PO&sub4; (10 mM) : Methanol im Verhältnis 180 : 540 : 280 (mit einem pH-Wert von 3 am Ende) wurde mit einer Flussgeschwindigkeit von 1 ml/min mit einer Waters-Pumpe Modell 510 durch eine Beckman-Säule vom Typ Ultrasphere ODS 5 um · 4,6 mm · 25 cm gepumpt (Beckman, Carlsbad, CA). Methotrexat wurde bei 303 nm erkannt und zwar mit einem programmierbaren Multiwellenlängen-UV-Detektor von Waters, Modell 490. Die Retentionsdauer von Theophyllin war 5,2 Minuten und die von Methotrexat war 7,2 Minuten. Das Erkennungslimit war 5 pmol des injizierten Methotrexat.

BEISPIEL 4

Pharmakokinetische Analyse

Um die pharmakokinetische Analyse durchzuführen, wurde das Computerprogramm RSTRIP (MicroMath Scientific Software, Salt Lake City, Utah) verwendet. Die Fläche unter der Kurve (FUK) wurde durch lineares trapezoidales Aufrunden auf die zuletzt gemessene Konzentration bestimmt und unendlich extrapoliert.

BEISPIEL 5

Charakterisierung von MVL-CD-MTX

Es wurde gefunden, dass der durchschnittliche volumengewichtete Durchmesser von MVL-CD-MTX 14,1 ± 3, 4 beträgt (± Standardabweichung, SA). Die Effizienz der Einkapselung war 64,5 ± 6% (n = 6) und das eingefangene Volumen war 12,9 ± 1,0 ul/umol Lipiden. Die Aufbewahrung von MVL-CD-MTX bei 4ºC in 0,9%iger NaCl-Lösung führte nach 4 Monaten zu einer Methotrexat-Freisetzung von weniger als 5%.

BEISPIEL 6

ZNS-Pharmakokinetik

Fig. 1 und 2 vergleichen die Pharmakokinetik des zentralen Nervensystems (ZNS) (hinsichtlich der Zerebrospinalflüssigkeit(ZSF)-Konzentration und der ZNS-Menge) für MVL-CD-MTX und nicht eingekapseltes Methotrexat. Die ZSF-Konzentration des freien Methotrexat erreichte ein Maximum an Tag 1 und nahm dann in einer biexponentiellen Weise ab, wobei die anfängliche Halbwertszeit 0,41 Tage und die terminale Halbwertszeit 5,4 Tage betrug. Die terminale Halbwertszeit war 18-Mal länger als die von nicht eingekapseltem Methotrexat.
Nach der Injektion von MVL-CD-MTX nahmen die Gesamtmengen an Arzneimittel im ZINS ab mit einer Halbwertszeit von 9 Tagen im Vergleich zu 0,03 Tagen für nicht eingekapseltes Methotrexat. Am Ende des Zeitraums von 21 Tagen verblieben 18%º des Methotrexats nach der MVL-CD-MTX-Injektion im ZNS.
Die pharmakokinetischen Parameter für Methotrexat und MVL-CD-MTX im ZNS sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Höchstkonzentration des freien Methotrexat nach der MVL-CD-MTX-Verabreichung war etwa 70 Mal geringer als die nach der Verabreichung von nicht eingekapseltem Methotrexat. Der Anteil der Gesamtmenge an Methotrexat im kranialen Kompartiment war 1 Minute nach Injektion von MVL-CD-MTX 12 ± 8%, 7 Tage nach Injektion von MVL-CD-MTX 65 ± 11%, 14 Tage nach Injektion von MVL-CD-MTX 51 + 40% und 21 Tage nach Injektion von MVL-CD-MTX 65 ± 36%, bzw. 4 ± 1% 1 Minute nach Injektion von nicht eingekapseltem Methotrexat und 23 ± 1% 4 Stunden nach Injektion von nicht eingekapseltem Methotrexat. TABELLE 1 Pharmakokinetische Parameter von Methotrexat im ZNS nach einer 100 ug- Injektion
Kmax Höchstkonzentration in der ZSF; t1/2 Halbwertszeit; FUK, Fläche unter der Kurve, Na, nicht anwendbar.
Die Analyse der Plasmakonzentrationen zeigte nicht erkennbare Spiegel von Methotrexat (Erkennungsgrenze war 0,02 uM), außer zu einem Zeitpunkt nach Verabreichung des nicht eingekapselten Arzneimittels (4 Stunden nach intrazisternaler Injektion: 0,11 ± 0,02 uM).

BEISPIEL 7

Toxizitäten

Im Verhalten der Ratten, denen Injektionen mit MVL-CD-MTX verabreicht worden waren, wurden keine Anomalien bemerkt. Drei Ratten, denen MVL-CD-MTX injiziert wurde, nahmen über die 3 Wochen von 343 ± 5 auf 383 ± 19 Gramm an Gewicht zu. Im Gegensatz dazu nahmen Ratten ohne Injektionen oder chirurgische Eingriffe von 340 ± 1 auf 400 ± 12 Gramm zu.
Die Einkapselung von Methotrexat in multivesikuläre Liposomen führte zu einer 18- fachen Steigerung der terminalen Halbwertszeit des freien Methotrexat aus der Zerebrospinalflüssigkeit. Die freien Methotrexatkonzentrationen blieben 7-14 Tage nach einer einzigen Injektion von MVL-CD-MTX über 0,5 uM, in Anbetracht der minimalen zytotoxischen Konzentrationen, die aus in vitro-Studien geschätzt wurden. Im Gegensatz dazu war die Dauer des nicht eingekapselten Arzneimittels etwa 1 Tag.
Die Fläche unter der Kurve der freien Konzentrationen für die MVL-CD-MTX-Gruppe betrug ein Drittel derjenigen der Gruppe, die nicht eingekapseltes Methotrexat erhalten hatte. Dies kann auf der Sättigung des Methotrexat-Clearance-Mechanismus in der Zerebrospinalflüssigkeit bei Auftreten von hohen freien Methotrexatkonzentrationen in der Gruppe, die nicht eingekapseltes Methotrexat erhalten hatte, zugeschrieben werden. Eine zweite Möglichkeit ist die, dass durch verlängerte Exposition eine höhere Fraktion des freien Methotrexat in das Gehirn und ins Rückenmarksparenchym dringt, und daher in der Zerebrospinalflüssigkeit eine kleinere Fraktion verbleibt. Noch eine andere Möglichkeit ist, dass die Fläche unter der Kurve für das MVL-CD-MTX aufgrund des Zeitplans der Probenentnahme unterschätzt wurde.
Der Vergleich der Gesamtmenge von Methotrexat und der Menge im kranialen Kompartiment (Fig. 2) zeigte eine gute Verteilung von MVL-CD-MTX im Rückenmarks und im Kranialkompartiment nach intrazisternaler Injektion. An Tag 21 beispielsweise war die Menge an Methotrexat im kranialen Kompartiment nur 65 ± 36% der Gesamt(kranial plus spinal)-Menge. Eine große Fraktion von Methotrexat in der zisternalen Probe lag jedoch nach dem ersten Tag der Injektion mit MVL-CD-MTX in der freien Form des Arzneimittels vor. Eine hohe Dichte von MVL-CD-MTX-Partikeln relativ zur Zerebrospinalflüssigkeit kann zu einem Absetzen der MVL-CD-MTX-Partikel durch die Schwerkraft abseits von der zisternalen Zerebrospinalflüssigkeit führen, wohingegen das freigesetzte freie Methotrexat frei diffundieren kann. Die verlängerte Freisetzungsdauer von Methotrexat aus MVL-CD- MTX, sowohl in vitro als auch in vivo, zeigt an, dass multivesikuläre Liposomen als Arzneimitteldepot für Methotrexat nützlich wären.
Mit MVL-CD-MTX kann die Neurotoxizität verringert werden, indem das Meiste des anfänglichen Bolus von Methotrexat innerhalb der multivesikulären Liposomen gehalten wird, wobei die Tumorzerstörung jedoch dennoch verstärkt wird, indem die Konzentration des freien Methotrexat für einen verlängerten Zeitraum nur knapp über der kleinsten zytotoxischen Konzentration gehalten wird. Die vorliegende Erfindung zeigt die Verwendbarkeit von Cyclodextrin-Liposomen als ein langsam-wirkendes Arzneimittel-Abgabe-System für biologisch aktive Substanzen wie Methotrexat. Die vorliegende Erfindung zeigt die Verwendbarkeit der weniger häufigen Intra-ZNS-Verabreichung zur Prophylaxe und Behandlung von leptomeningaler Leukämie oder Karzinomatose beim Menschen.

BEISPIEL 8

Subkutane Verabreichung von MVL-CD-MTX

BDF1- und DBA/2J-Mäuse waren von Simonsen Laboratories, Gilroy, CA. Die L1210- Leukämie wurde erhalten durch serielle intraperitoneale Passage in weibliche DBA/2J-Mäuse. MVL-CD-MTX wurde hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Subkutane (s. c.) pharmazeutische Studien wurden an männlichen BDF1-Mäusen mit einem Gewicht von 20-25 Gramm durchgeführt. Den Mäusen wurden mit einer 30-gauge Injektionsnadel 10 mg/kg (22 umol/kg) nicht eingekapseltes Standard-Methotrexat oder MVL-CD-MTX in 200 ul 0,9%iger NaCl-Lösung s.c. in die Haut in der Mitte des Abdomens injiziert. Aus der Jugularvene wurden unter Narkose Blutproben entnommen und zwar zu verschiedenen Zeitpunkten: nach 0, 0,25, I und 4 Stunden im Falle der Gruppe, die nicht eingekapseltes Methotrexat erhielt, und zu den Zeitpunkten 0, 1, 3, 7, 14 und 21 Tage im Falle der MVL-CD-MTX-Gruppe. Zu jedem Zeitpunkt wurden 3 Tiere getötet. Das Plasma wurde getrennt und bei -20ºC eingefroren aufbewahrt, bis es mit dem Methotrexat-Assay Emit® im COBAS-Fara-Analyser (Roche Diagnostic Systems, Montclair, NJ) analysiert wurde.
Es wurde dann aus dem kostalen Grenzbereich zum Inguinalbereich und von einer Flanke zur Anderen eine vollständige Wandstärke des Gewebes der Abdominalwand einschließlich der ganzen Haut und der darunter liegenden Peritonealmembran ausgeschnitten. Die gesamte Gewebsprobe wurde nach Zugabe von mindestens 20 ml destilliertem Wasser mit einem Polytron-Homogenisator homogenisiert. Das Homogenat wurde 60 Sekunden lang bei Höchsteinstellung mit einem Biosonic IV-Proben-Beschaller beschallt und durch eine YMT-Ultrafiltrationsmembran (Amicon Corp. Produkt #4104) gefiltert. Alle Proben wurden bis zur Analyse in der HPLC bei -20ºC aufbewahrt. Zur Kurvenanpassung wurde das Programm RSTRIP verwendet. Die FUK wurde durch lineare trapezoidale Aufrundung auf die zuletzt gemessene Konzentration bestimmt und unendlich extrapoliert.

BEISPIEL 9

HPLC-Assay

Eine mobile Phase, bestehend aus H&sub3;PO&sub4; (10 mM) : KH&sub2;PO&sub4; (10 mM) : Methanol im Verhältnis 162 : 488 : 350 (pH = 3) wurde mit einer Flussgeschwindigkeit von 1 ml/min mit einer Waters-Pumpe Modell 5I0 durch eine Beckman-Säule vom Typ Ultrasphere ODS 5 ul · 4,6 mm · 25 cm gepumpt. Methotrexat wurde bei 303 nm mit einem programmierbaren Multiwellenlängen-UV-Detektor von Waters, Modell 490, erkannt. Die Retentionsdauer von Methotrexat war 5 Minuten, und das Erkennungslimit war 5 umol des injizierten Methotrexat.

BEISPIEL 10

Toxizität und Wirksamkeitsstudien

BDF-1-Mäusen wurden an Tag 0 mit 10&sup6; L1210-Zellen in die Peritonealhöhle injiziert und s. c. mit einer Einzeldosis von eingekapseltem Methotrexat oder MVL-CD-MTX, suspendiert in 0,9%iger NaCl-Lösung an Tag 1, behandelt. In jeder Gruppe waren 5 Tiere, außer für die Kontrolle (der nur 0,9% NaCl gegeben wurde), in der 10 Tiere verwendet wurden. Jedes Tier wurde hinsichtlich des Überlebens beobachtet. Die mittlere Überlebensdauer wurde verwendet, um die "verlängerte Lebensdauer" (VLD) zu berechnen und zwar nach der Formel:
VLD = (T/C)/C · 100%
wobei T die mittlere Überlebensdauer der behandelten Gruppen ist und C die mittlere Überlebensdauer der Kontrollgruppen.

BEISPIEL 11

Pharmakokinetik von MVL-CD-MTX

Die pharmakokinetischen Parameter sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Nach einer subkutanen Injektion verringerte sich die Gesamtmenge an Methotrexat in der Haut exponentiell mit einer Halbwertszeit von 0,16 Stunden für nicht eingekapseltes Methotrexat und 50,4 Stunden für MVL-CD-MTX (Fig. 3). Im Plasma betrug die Halbwertszeit für nicht eingekapseltes Methotrexat 0,53 Stunden und 109 Stunden für MVL-CD-MTX. Die Plasmahöchstmengen waren 17,4 + 5,2 uM (SA) bei 15 Minuten für das nicht eingekapselte Methotrexat und 0,138 + 0,061 uM (SA) an Tag 3 für MVL-CD-MTX (Fig. 4). TABELLE 2 Pharmakokinetische Parameter

BEISPIEL 12

Wirksamkeit von MVL-CD-MTX s. c.

Fig. 5 zeigt die VLD-Kurven in einem L1210-Mausmodell. Die maximale Wirksamkeit (VLDmax) betrug 183% für nicht eingekapseltes Methotrexat und 217% for MVL-CD-MTX ( = 0,5 im Mann-Whitney U-Test). Die relative Potenz von MVL-CD-MTX in Einzeldosis gegen nicht eingekapseltes Methotrexat war 130 (durch PHARM/PCS-Programm, MicroComputer Specialists, Philadelphia, PA). Die LD&sub5;&sub0; wurde nach Probit-Transformation berechnet. Die LD&sub5;&sub0; für eine Einzeldosis an nicht eingekapseltem Methotrexat war 2650 mg/kg und die für MVL-CD-MTX war 24 mg/kg, ein Verhältnis von 110.
Die Halbwertszeit im Plasma war 206-mal länger und die Höchstkonzentration im Plasma war 126-mal geringer im Vergleich zu nicht verkapseltem Methotrexat, wohingegen die Fläche unter der Kurve im Wesentlichen unverändert war. Als Konsequenz der signifikanten Modifikationen der Pharmakokinetik war die Arzneimittelpotenz 130-fach erhöht und der Wert des LD&sub5;&sub0; zeigte keine signifikante Veränderung des therapeutischen Index.

BEISPIEL 13

Pharmakokinetik nach Verabreichung in die Peritonealhöhle In-vitro-Studien zur Arzneimittelfreisetzung

Methotrexatfreisetzungsstudien wurden unternommen, indem mindestens das 40-fache Volumen einer 0,9%igen NaCl-Lösung oder menschlichem Plasma aus der Blutbank zu gewaschenen MVL-CD-MTX-Pellets hinzugegeben und bei 4ºC oder 37ºC aufbewahrt wurde. Für die Inkubation bei 37ºC wurde 0,01% Natriumazid hinzugegeben, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern. Zu angemessenen Zeitpunkten wurden nach gründlichem Mischen Aliquots entnommen und in einer Eppendorfmikrofuge 1 Minute lang zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt wurde, wurden zu dem Pellet 200 ul Methanol zugegeben, um die MVL-CD-MTX-Partikel aufzubrechen, und die sich daraus ergebende Mischung wurde bis zur Analyse bei -20ºC aufbewahrt. Die Menge an Methotrexat im Pellet wurde durch HPLC analysiert und als Prozentanteil der anfänglichen Menge, als MVL-CD- MTX verbleibend, ausgedrückt. Methotrexat wurde durch HPLC, wie in Beispiel 9 beschrieben, gemessen.

BEISPIEL 14

Pharmakokinetische Studien

Die in-vivo-Studien wurden mit männlichen BDF 1-Mäusen durchgeführt, die 18-25 g wogen. Der Gruppe von Mäusen wurde i. p. mit 10 mg/kg Methotrexat in 1 ml 0,9%iger NaCl als nicht eingekapselte Methotrexatkontrolle, Cyclodextrin-Methotrexatkontrolle (Methotrexat 20 mg/ml; 2-Hydroxypropyll-β-Cyclodextrin, 2 mg/ml; Glukose, 6,4 mg/ml; Lysin als freie Base, 8 mM und HCl, 2 mM) oder MVL-CD-MTX injiziert. Drei Mäuse wurden getötet und es wurden aus der Jugularvene zum Zeitpunkt 0 Stunden (unmittelbar nach der Injektion), 1 Stunde und 4 Stunden nach Injektion des nicht eingekapselten Methotrexat oder des Cyclodextrin-Methotrexat-Komplexes sowie 1, 5, 10 und 20 Tage nach Injektion von MVL-CD-MTX Blutproben entnommen und in ein heparinisiertes Reaktionsröhrchen gegeben. Das Plasma wurde getrennt und bei -20ºC bis zur Analyse im Methotrexat-Assay Emit® im COBA-Fara-Analyser gefroren aufbewahrt. Der Emit®-Assay ist eine homogene Enzymimmunassaytechnik, die auf der Konkurrenzierung um Antikörperbindungsstellen zwischen dem in der Probe vorhandenen Arzneimittel und dem mit dem Enzym Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase markierten Arzneimittel beruht. Die Sensitivitätsgrenze war 0,02 uM.
Fünf ul der Proben aus der Peritonealflüssigkeit wurden in eine Glaskapillarpipette aufgenommen und in 140 ul einer 0,9%igen NaCl-Lösung verdünnt. Für die mit MVL-CD- MTX-injizierten Tiere wurden die Proben in einer Eppendorf-Mikrofuge 1 Minute lang zentrifugiert, um den Überstand (freies Methotrexat) und Pellet (eingekapseltes Methotrexat) zu trennen. Zum Pellet wurden fünfzig ul Methanol zugegeben und auf dem Vortex gemischt, um multivesikuläre Partikel aufzubrechen. Die Peritonealhöhlen wurden dann dreimal gründlich mit 2-3 ml einer 0,9%igen NaCl-Lösung ausgewaschen. Alle Proben wurden bis zur Untersuchung in der HPLC bei -20ºC gefroren aufbewahrt. Die Extraktion der Proben war nicht erforderlich, es wurde kein interner Standard verwendet und es gab keine interferierenden Spitzen. Zur Analyse der pharmakokinetischen Daten wurde das Computerprogramm RSTRIP verwendet. Die Fläche unter der Kurve wurde durch lineares trapezoidales Aufrunden auf die zuletzt gemessene Konzentration bestimmt und zu unendlich extrapoliert.

BEISPIEL 15

Studien zur Wirksamkeit und Toxizität

BDF1-Mäuse wurden an Tag 0 mit 10&sup6; L1210-Zellen i. p. inokuliert und ari Tag 1 mit einer einzelnen i. p. Injektion von nicht eingekapseltem Methotrexat, MVL-CD-MTX oder leeren multiveskulären Liposomen in 1 ml 0,9%iger NaCl-Lösung behandelt. In jeder Gruppe waren 5 Mäuse, und fünfzehn Mäuse wurden als unbehandelte Kontrollen verwendet (denen 1 ml der 0,9%igen NaCl-Lösung gegeben wurde). Das Ergebnis wurde als "verlängerte Lebensdauer" ausgedrückt.

BEISPIEL 16

In vitro-Freisetzungsstudien

Die resultierenden multivesikulären Liposomenpartikel hatten einen volumengewichteten durchschnittlichen Durchmesser (± SA) von 11,3 ± 3,3 uM (Fig. 6 und 7) und einen Prozentanteil der Einbindung von 64,5 ± 6,0% (n = 6). Die Aufbewahrung von MVL- CD-MTX in 0,9%iger NaCl-Lösung bei 4ºC führte zu einem Austritt von weniger als 5% nach 4 Monaten. Bei 37ºC in einer 0,9%igen NaCl-Lösung waren nach 3,5 Monaten 63 + 12% (Mittelwerte ± SA) der anfänglichen Mengen von Methotrexat innerhalb der multivesikulären Liposomenpartikel. In menschlichem Plasma betrug die Halbwertszeit der Arzneimittelfreisetzung bei 37ºC 40 Tage (Fig. 8).

BEISPIEL 17

Pharmakokinetik

Die intraperitonealen Pharmakokinetikparameter sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Nach der Injektion von MVL-CD-MTX i. p. erhöhte sich die Gesamtkonzentration an Methotrexat in der Peritonealhöhle innerhalb des ersten Tages um das Fünffache (Fig. 8). Während dieser Zeit verringerte sich die Flüssigkeitsmenge in der Höhle signifikant. Nach Tag 1 verringerte sich die Gesamtkonzentration mit einer Halbwertszeit von 1,9 Tagen (Fig. 9).

TABELLE 3

Pharmakokinetische Parameter von Methotrexat nach intraperitonealer Verabreichung

aCyclodextrin-Methotrexat
bHalbwertszeit
cHöchstkonzentrationen
dnicht anwendbar

BEISPIEL 18

Wirksamkeitsstudien

Fig. 10 zeigt die Überlebenskurven und Fig. 11 zeigt die VLD (verlängerte Lebensdauer) in dem L1210-Mausmodell. Die equipotenten Dosismengen (EPD) schienen für MVL-CD-MTX bei 6 mg/kg und für nicht eingekapseltes Methotrexat bei 2000 mg/kg zu liegen, berechnet bei der optimalen Dosis an nicht eingekapseltem Methotrexat. Daher erhöhte MVL-CD-MTX die Potenz des Methotrexat als Einzeldosis um das 334-Fache. Die maximale Wirksamkeit (VLDmax) wurde von 100% VLD für nicht eingekapseltes Methotrexat auf 217% VLD für MVL-CD-MTX erhöht, eine Erhöhung um mehr als das 2- Fache (mit p < 0,01 im nichtparametrischen Mann-Whitney-Test).
LD&sub5;&sub0; wurden nach Probit-Transformation mit dem Programm PHARM/PCS (MicroComputer Specialists, Philadelphia, PA) berechnet. Die LD&sub5;&sub0; für eine Einzeldosis an nicht eingekapseltem Methotrexat war 2755 mg/kg und die für MVL-CD-MTX war 17,5. Der therapeutische Index (TI) für eine einzelne i. p.-Dosierung wurde mit der Gleichung
TI = LD&sub5;&sub0;/EPD
berechnet. Der TI für nicht eingekapseltes Methotrexat war 1,4 und der für MVL-CD- MTX war 2,9. Die leeren multivesikulären Liposomen, die Glukose und kein Methotrexat enthielten, hatten keinen toxischen Effekt auf eine Gruppe von fünf Mäusen ohne Tumore.
MVL-CD-MTX ist bei 4ºC ziemlich stabil. Die Pharmakokinetikstudien zeigten durch Einkapselung in multivesikuläre Liposomen eine verlängerte Exposition. Die intraperitoneale Halbwertszeit der freien Methotrexatkonzentration nach der Verabreichung von MVL-CD- MTX war 73 Mal länger (39,6 Std. im Vergleich zu 0,54 Std.) als die nach Injektion des nicht eingekapselten Methotrexats.
Eigentlich erhöhte sich die Gesamtkonzentration an Methotrexat in der Peritonealhöhle nach einer Verabreichung von MVL-CD-MTX während des ersten Tages und blieb für die Dauer von einer Woche über der ursprünglichen Konzentration. Dieser initiale Anstieg der Konzentration kann auf unterschiedliche Clearance des suspendierenden Mediums im Vergleich zu den multivesikulären Liposomenpartikeln zurückzuführen sein.
Die Plasma-FUK nach der Injektion von MVL-CD-MTX war ähnlich wie die nach Injektion des nicht eingekapselten Methotrexats (18,4 und 11,2 uM/Std., respektiv). Dies zeigt an, dass das Methotrexat aus MVI-CD-MTX für die systemische Zirkulation vollständig biologisch verfügbar ist.

Claims

1. Multiversikuläre Liposomenzusammensetzung, die eine eingekapselte pharmakologisch aktive Menge einer biologisch aktiven Verbindung enthält, wobei die Liposomenzusammensetzung weiters eingekapseltes Cyclodextrin enthält.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die genannte Verbindung aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Anti-neoplastischen Agentien, Anti-infektiösen Agentien, Antidepressiva, Antivirus Agentien, Anxiolytika und Hormone besteht.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei Cyclodextrin in der genannten Zusammensetzung in einer Menge von 10 mg/ml bis 400 mg/ml enthalten ist.

4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das genannte Cyclodextrin aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin, γ- Cyclodextrin, Methylcyclodextrin, Ethylcyclodextrin, Hydroxyethylcyclodextrin, Hydroxypropylcyclodextrin, verzweigtes Cyclodextrin, Cyclodextrinpolymere und Monosuccinyldimethyl β-Cyclodextrin besteht.

5. Verbindung nach Anspruch 4, wobei das Cyclodextrin 2-Hydroxyproply-β- Cyclodextrin ist.

6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die genannte Liposomenzusammensetzung weiters Mitteln enthält, um auf eine gewünschte Stelle innerhalb eines lebendigen Organismus gerichtet zu sein.

7. Verbindung nach Anspruch 6, wobei die genannten Mittel durch Koppelung mit einer aus der Gruppe bestehend aus Zucker, einem Glycolipid und einem Protein ausgewählten Komponenten erhalten sind.

8. Verbindung nach Anspruch 7, wobei das genannte Protein ein Antikörper ist.

9. Verwendung der Liposomenzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die Herstellung einer pharmazeutischen Verbindung zur Behandlung eines pathophysiologischen Zustandes eines Individuums.