RS65360B1 - Antagonistička antitela specifična za peptid genski srodan kalcitoninu i postupci njihove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] CGRP (peptid genski srodan kalcitoninu ) je neuropeptid sa 37 aminokiselina, koji pripada familiji peptida koja uključuje kalcitonin, adrenomedulin i amilin. Kod ljudi, postoje dva obІika CGRP (α-CGRP i β-CGRP) i imaju slicne aktivnosti. Oni se razlikuju u tri aminokiseline i ispoljavaju različitu distribuciju. Najamnje dva podtipa receptora za CGRP-a mogu takođe da imaju različite aktivnosti. CGRP je neurotransmiter u centralnom nervnom sistemu, i pokazano je da na periferiji deluje kao potentni vazodilatator, gde su neuroni koji sadrže CGRP u bliskoj vezi sa krvnim sudovima. Dilatacija koja je posredovana sa CGRP takođe је u vezi sa neurogenom inflamacijom, kao deo kaskadnih događaja koji dovode do ekstravazacije plazme i vazodilatacije mikrovaskulature i koja je prisutna u migreni.

[0002] CGRP je poznat po svojoj mogucoj vezi sa vazomotornim simptomima (Wyon et al. Scand. J. Urol. Nephrol. 35: 92-96 (2001); Wyon et al. Menopause 7(1):25-30 (2000)). Vazomotorni simptomi (VMS), kao što su valunzi i noćna preznojavanja, su najuobicajeni simptomi koji su povezani sa menopauzom, koji se pojavljuju u 60% do 80% svih žena nakon prirodne ili hirurški indukovane menopauze. Valunzi su verovatno adaptivni odgovor centralnog nervnog sistema (CNS) na smanjenje koncentracije polnih steroida (Freedman Am. J. Human Biol. 13:453-464 (2001)). Do danas, najefektivnije terapije za valunge su tremani koji se baziraju na hormonima, uključujuci estrogene i/ili neke progestine. Hormonski tretmani mogu da budu efikasni za ubІažavanje valunga, ali nisu odgovarajuci za sve žene. Smatra se da su uočeni fiziološki i emotivni simptomi, kao što је nervoza, umor, razdražljivost, insomnija, depresija, gubitak pamćenja, glavobolja, anksioznost, nervoza ili neposobnost skoncentrisanja prouzrokovani nedostatkom sna, nakon čega slede valunzi i noćna preznojavanja (Kramer et al., In: Murphy et al., 3.sup.rd Int'l Symposium on Recent Advances in Urological Cancer Diagnosis and Treatment-Proceedings, Paris, France: SCI: 3-7 (1992)).

[0003] Muškarci takođe prolaze kroz valunge nakon disbalansa steroidnog hormona (androgena). Ovo je se dešava u slučajevima opadanja nivoa androgena koje je u vezi sa starosnim dobom (Katovich, et al., Proceedings of the Society for Experimental Biology & Medicine, 1990, 193(2): 129-35) kao i u ekstremnim slučajevima hormonske deprivacije koja je u vezi sa tretmanima za karcinom prostate (Berendsen, et al., European Journal of Pharmacology, 2001, 419(1): 47-54). Čak jedna trećina tih pacijenata prolazi kroz trajne i česte simptome koji su dovoljno ozbiljni da prouzrokuju značaju nelagodu i neprijatnost.

[0004] CGRP je potentni vazodilatator koji je uključen u patologiju drugih vazomotornih simptoma, kao što su svi obІici vaskularne glavobolje, uključujuci migrene (sa ili bez aure) i klaster glavobolje Durham, N. Engl. J. Med.350:1073-1075, 2004.. Nivoi CGRP-a u serumu i u spoljašnjoj jugularnoj veni su povišeni kod pacijenata tokom migrenske glavobolje. Goadsby et al., Ann. Neurol.

28:183-7, 1990. lntravensko davanje humanog α-CGRP indukuje glavobolju i migrenu kod pacijenata koji pate od migrene bez aure, što ukazuje na to da CGRP ima uzrocnu ulogu u migrenama. Lassen et al., Cephalalgia 22:54-61, 2002.

[0005] Moguće uključivanje CGRP-a u migreni je osnova za razvoj i ispitivanja brojnih jedinjenja koja inhibiraju otpustanje CGRP-a (npr., sumatriptan), antagonizuju na nivou receptora za CGRP (npr., dipeptidni derivat BIBN4096BS (Boerhringer Ingelheim); CGRP(8-37)), ili interaguju sa jednim ili više proteina vezanih sa receptorima, kao što su, membranski protein receptorske aktivnosti (RAMP) ili proteinska komponenta receptora (RCP), oba koja utiču na vezivanje CGRP-a za njegove receptore Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51-53, 2002. Podtipovi alfa-2 adrenoceptora i adenozin A1 receptora takođe kontrolišu (inhibiraju) oslobađanje CGRP i aktivaciju trigeminusa (Goadsby et al., Brain 125:1392-401, 2002). Pokazano je da agonist adenozin A1 receptora GR79236 (metrafadil), koji inhibira neurogenu vazodilataciju i trigeminalnu nocicepciju kod ljudi, može takođe da ima anti-migrenoznu aktivnost (Arulmani et al., Cephalalgia 25:1082-1090, 2005; Giffin et al., Cephalalgia 23:287-292, 2003.)

[0006] Zbunjujuće u ovoj teoriji jeste opservacija da je lečenje jedinjenjima koji isključivo inhibiraju neurogenu inflamaciju (npr., tahikinin antagonisti NK1 receptora) ili trigeminalnu aktivaciju (npr., agonisti 5HT1Dreceptora) relativno nefikasno kao akutno lečenje migrena, što dovodi do toga da neki istrazivači razmatraju da li je inhibiranje otpuštanja CGRP-a primarni mehanizam delovanja efikasnih anti-migrenoznih tretmana. Arulmani et al., Eur. J. Pharmacol.500:315-330, 2004.

[0007] Migrena je kompleksno, opšte neurološko stanje koje se karakteriše ozbiljnim, epizodnim napadima glavobolje i povezanih karakteristika, u koje mogu da budu uključeni mučnina, povraćanje, osetljivost na svetlost, zvuk ili kretanje. Kod nekih pacijenata, glavobolja prethodi ili je praćena aurom. Воl tokom trajanja glavobolje može da bude ozbiljan i takođe kod nekih pacijenata može da bude unilateralan.

[0008] Napadi migrene ometaju svakodnevni život. U SAD-u i zapadnoj Evropi, sveukupna prevalenca ljudi koji pate od migrene je 11% ukupne populacije (6% muškaraca; 15-18% žena). Dalje, srednja učestalost napada kod individua je 1,5/mesečno. Dok su brojni tretmani dostupni za ublažavanje ili smanjenje simptoma, preventivna terapija se preporučuje za one pacijente koji imaju više od 3-4 napada migrene mesečno. Goadsby et al. New Engl. J. Med.346(4): 257-275, 2002.

[0009] Različite farmakološke intervencije koje se koriste za lečenje migrene i varijabilnost u odgovorima kod pacijenata su dokaz različite prirode ovog poremećaja. Prema tome, takvi relativno ne-selektivni lekovi kao što su ergot alkaloidi (npr., ergotamin, dihidroergotamin, metisergid), koji ispoljavaju serotonergičku, kao i adrenergičku, noradrenergičku i dopminergičku aktivnost, koriste se preko osam godina za lečenje migrene. Ostali tretmani uključuju opijate (npr., oksikodon) i β - adrenergičke antagoniste (npr., propranolol). Neki pacijenti, obično oni koji imaju blаzе simptome, mogu da kontrolišu svoje simptome sa lekovima koji se izdaju bez recepta kao što su jedan ili više ne- steroidnih antiinflamatornih agenasa (NSAID), kao što је kombinacija aspirina, acetaminofena i kofeina (npr., Excedrin<®>Migraine).

[0010] Nedavno, neki pacijenti sa migrenom su tretirani sa topiramatom, antikonvulzantom koji blokira voltažno zavisne natrijumske kanale i odredene receptore glutamata (АМРА- kainat), potencira aktivnost GABA-A receptora, i blokira karbonsku anhidrazu. Relativno nedavni uspeh primene agonista serotonin 5HT-1B/1D i/ili 5HT-1a receptora, kao što је sumatriptan, kod nekih pacijenata je usmerio istrazivače da predloze serotonergičku etiologiju poremećaja. Nažalost, dok neki pacijenti dobro reaguju na ovaj tretman, drugi su relativno otporni na njegove efekte.

[0011] Pretpostavljeno je da se u osnovi poremećaja nalazi disfunkcija jonskog kanala u aminergičkom jedru mozga, međutim, još uvek nije dovoljno razumljiva precizna patofiziologija migrene. Pokazano je da je jedan oblik migrene, porodična hemiplagična migrena, u vezi sa mutacijama koje imaju pogresan smisao (eng. „missense") u α1 subjednici naponom kontrolisanih kalcijumskih kanala Р/Q-tipa, i smatra se da je verovatno da ćе kod drugih populacija pacijenata biti prisutne druge mutacije jonskih kanala. Dok је širenje krvnih sudova povezano sa migrenom i dovodi do pogoršanja simptoma bola kod migrene, sada se smatra da su takvi neurovaskularni dogadaji rezultati, pre nego sam uzrok, stanja. Generalno, smatra se da je disfunkcija moždanih puteva koji vrše modulaciju senzornog ulaza jedinstvena karakteristika migrene. Goadsby, P.J. et al., New Engl. J. Med.346(4): 257-275, 2002.

[0012] US 2013/216535 prikazuje antagnoiste antitela receptora za CGRP za upotrebu ili prevenciji vazomotornih simptoma kod pojedinca. . Bigal, M. E. et al. (Cephalalgia, 34(7): 483-492, 2014) opisuje fazu 1 kliničkih ispitivanja LBR-101 namenjenih za lečenje epizodne i hronične migraine. Bigal, M. E. et al. (CNS Drugs, 28(5): 389-399, 2014) opisuje klinička ispitivanja četiri monoklonalna antitela koja su usmerena na CGRP putanju.

Kratak opis pronalaska

[0013] Pronalazak obezbeđuje monoklonsko antitelo za upotrebu u postupku lečenja ili smanjenja incidencije migrenske glavobolje kod subjekta, pri čemu monoklonsko antitelo moduliše CGRP put, pri čemu monoklonsko antitelo ima teški lanac sa sekvencom aminokiselina

i laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom

i pri čemu je antitelo administrirano jednom mesečno subkutano u dozi od 225 mg.

[0014] Glavobolja je migrenska glavobolja (npr. hronična migrenska glavobolja ili epizodična migrenska glavobolja). U nekim realizacijama, administracija obuhvata korišćenje prethodno napunjenog šprica koji sadrži količinu monoklonskog antitela. U nekim realizacijama, monoklonsko antitelo je formulisano u koncentraciji od 150 mg/mL. U nekim realizacijama, monoklonsko antitelo se primenjuje u zapremini manjoj od 2 mL. Postupak može dalje da obuhvati administriranje drugog agensa subjektu istovremeno ili uzastopno sa monoklonskim antitelom. Drugi agens može biti bilo koji od agonista 5-HT1, triptana, ergot alkaloida i nesteroidnih antiinflamatornih lekova. U nekim realizacijama - za koje se ne traži zaštita - drugi agens je agens koji subjekt uzima profilaktički. U nekim realizacijama - za koje se ne traži - mesečna upotreba drugog agensa od strane subjekta se smanjuje za najmanje 15% nakon primene monoklonskog antitela. U nekim realizacijama - za koje se ne traži - drugi agens je triptan. U nekim realizacijama, subjekt je čovek.Primeri agonista 5-HTl koji mogu da se koriste u kombinaciji sa anti-CGRP antitelom uključuju klasu jedinjenja koja je poznata pod imenom triptani, kao što su sumatriptan, zolmitriptan, naratriptan, rizatriptan, eletriptan, almotriptan, and frovatriptan. Ergot alkaloidi i srodna jedinjenja su takođe poznata po agonističkoj 5-HT aktivnost i koriste se za lečenje glavobolje kao što je migrena. U ova jedinjenja su uključeni ergotamin tartrat, ergonovin maleat, i ergoloid mezilati (npr., dihidroergokornin, dihidroergokristin, dihidroergokriptin, i dihidroergotamin mezilat (DHE 45)).

[0015] Primeri NSAID-a koji se mogu koristiti u kombinaciji sa anti-CGRP antitelom uključuju aspirin, diklofenak, diflusinal, etodolak, fenbufen, fenoprofen, flufenisal, flurbiprofen, ibuprofen, indometacin, ketoprofen, ketorolak, meklofenaminsku kiselinu, mefenaminsku kiselinu, nabumeton, naproksen oksaprozin, fenilbutazon, piroksikam, sulindak, tolmetin ili zomepirak, inhibitore ciklooksigenaze-2 (COX-2), celekoksib; rofekoksib; meloksikam; JTE-522; L-745,337; NS398; i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0016] Antagonističko antitelo na CGRP (anti-CGRP antagonističko antitelo) prepoznaje humani CGRP, anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje i za humani α-CGRP i β-CGRP. Anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje za humani i CGRP pacova. Anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje za C-terminalni fragment koji ima aminokiseline 25-37 u CGRP. Anti-CGRP antagonistiČKo antitelo se vezuje za C-terminalni epitop koji se nalazi u okviru aminokiselina 25-37 u CGRP.

[0017] Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu prema ovom pronalasku je monoklonsko antitelo. Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom je antitelo G1 (kao što je ovde opisano).

[0026] Afinitet vezivanja (KD) anti-CGRP antagonističkog antitela za CGRP (kao što je humano α -CGRP kao što se meri površinskom plazmon rezonancijom na odgovarajućoj temperaturi, kao što je 25 ili 37 °C) može da iznosi oko 0,02 do oko 200 nM. Afinitet vezivanja može de bude bilo koji od oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, a oko 500 pM, oko 100 pM, oko 60 pM, oko 50 pM, oko 20 pM, a oko 15 pM, oko 10 pM, oko 5 pM, ili oko 2 pM. U nekimrealiyacijama, afinitet vezivanja je manji od oko 250 nM, oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM, ili oko 50 pM. Afinitet vezivanja može da bude manji od oko 50 nM

[0019] Svaka referenca u opisu na metode lečenja in vivo dijagnoze odnosi se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ljudskog ili životinjskog tela terapijom ili za in vivo dijagnozu.

[0020] Anti-CGRP antagonističko antitelo se može administrirati pre, tokom i/ili posle glavobolje. Anti-CGRP antagonističko antitelo se može administrirati pre napada migrene.

[0021] Anti-CGRP antagonističko antitelo se može administrirati zajedno sa drugim agensom, kao što je drugi agens za lečenje glavobolje.

Ovde je otkrivena farmaceutska kompozicija za prevenciju ili lečenje glavobolje (npr. migrene i klaster glavobolje) koja sadrži efikasnu količinu anti-CGRP antagonističkog antitela, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata.

[0022] Antitelo G1 (naizmenicno nazvano "G1") za upotrebu u pronalasku može da se proizvode ekspresionim vektorima koji imaju ATCC pristupne brojeve PTA- 6866 i PTA-6867. Na primer, u jednom aspektu, antitelo za upotrebu u pronalasku sadrži teški lanac proizveden ekspresionim vektorom sa ATCC pristupnim brojem PTA-6867 i lakim lancem proizvedenim ekspresionim vektorom sa ATCC pristupnim brojem PTA-6866. Sekvence aminokiselina varijabilnih regiona teškog lanca i lakog lanca G1 su prikazane na Slici 5. Delovi hipervarijabilnih sekvenci (CDR) antitela Gl (Chothia and Kabat CDRs) su takođe prikazani na Slici 5. Podrazumeva se da referenca koja upućuje na bilo koji deo ili ukupan region G1 obuhvata sekvence koje su proizvedene ekspresionim vektorima koji imaju ATCC pristupne brojeve PTA-6866 i PTA-6867, i/ili sekvence predstavljene na Slici 5.

[0023] Antitelo je monoklonsko. Antitelo može biti izolovano. Antitelo (ili polipeptid) može da bude u osnovi čisto.

Kratak opis nacrta

[0024]

Slika 1 je tabela koja pokazuje afinitete vezivanja 12 mišjih antitela za različite humane α -CGRP fragmente supstituisane alaninom. Afiniteti vezivanja mereni su na 25°C upotrebom Biacore protokom Fab-a kroz CGRP-e na čipu. Uokvirene vrednosti predstavljaju gubitak mutanata alanina u odnosu na roditeljski fragment, 25-37 (italik), osim K35A, koji je izveden ad 19-37 roditelja.<"a">označava afinitete za fragmente 19-37 i 25-37 koji su srednja vrednost ± standardne devijacije dva nezavisna merenja na različitim senzor cipovima.<"b">ukazuje na to da su ove interakcije odstupile od jednostavnog modela bimolekulske interakcije zbog bifazne brzine disocijacije, tako da se njihovi afiniteti određuju upotrebom modela konformacione promene. Greyscale kljuc: bela (1,0) ukazuje na roditeljski afinitet; svetlo siva (manje od 0,5) ukazuje na veći afinitet u odnosu na roditelja; tamno sivo (veće od 2) ukazuje na niži afinitet u odnosu na roditelja; i crna ukazuje na to da nije uočeno vezivanje.

Slike 2A i 28 pokazuju efekat administriranja CGRP 8-37 (400 nmol/kg), antitela 4901 (25 mg/kg), i antitela 7D11 (25 mg/kg) na protok krvi u kozi koji se meri fluksom krvnih ćelija nakon stimulacije električnim pulsom u trajanju od 30 sekundi. CGRP 8-37 je administriran intravenozno (iv) 3-5 min pre stimulacije električnim pulsom. Antitela su administrirana intraperitonealno (IP) 72 časa pre stimulacije električnim pulsom. Svaka tačka u graficima predstavlja AUC jednog pacova koji se tretira pod uslovima koji su kao što je navedeno. Svaka linija u graficima predstavlja srednju vrednost AUC pacova koji se tretiraju pod uslovima kao što je navedeno. AUC (površina ispod krive) jednaka je Δflux x Δtime. "Δflux" predstavlja promenu u jednicama fluksa posle stimulacije električnim pulsem; i "Δtime" predstavlja vremenski period za koji nivo fluksa ćelija krvi vrati na nivo pre stimulacije električnim pulsom.

Slika 3 pokazuje efekat administriranja različitih doza antitela 4901 (25 mg/kg, 5 mg/kg, 2,5 mg/kg, ili 1 mg/kg) na protok krvi u koži mereno fluksom ćelija nakon stimulacije električnim pulsom u trajanju od 30 sekundi. Antitela su administrirana intravenozno (IV) 24 casa pre stimulacije električnim pulsom. Svak tačka na grafiku predstavlja AUC jednog pacova koji se tretira pod uslovima kao što je navedeno. Linija u grafiku predstavlja srednju AUC pacova koji se tretiraju pod uslovima kao što je navedeno.

Slike 4A i 48 pokazuju efekat administriranja antitela 4901 (1 mg/kg ili 10 mg/kg, i.v.), antitela 7E9 (10 mg/kg, i.v.), i antitela8B6 (10 mg/kg, i.v.) na protok krvi u koži koji je meren kao fluks krvnih ćelija nakon stimulacije elektricnim pulsom tokom 30 sekundi. Antitela su administrirana intravenozno (i.v.) nakon stimulacije elekričnim pulsom tokom 30 min, 60 min, 90 min, i 120 min nakon administriranja antitela. Y osa predstavlja procenat AUC u poređenju sa nivoom AUC kada antitelo nije administrirano (vreme 0). X osa prestavlja vremenski (minuti) period izmedu administriranja antitela i stimulacije električnim pulsom. "*" označava P < 0,05, i "**" označava P< 0,01, u poređenju sa vremenom 0. Podaci se analiziraju jednosmernim ANOVA testom sa Dunnetovim testom višestrukog poređenja.

Slika 5 pokazuje sekvencu aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca (SEQ ID NO:1) i varijabilnog regiona lakog lanca (SEQ ID NO:2) antitlea G1. Kabat CDR-e su napisane masnim slovima i Chothia CDR-e su podvučene. Ostaci aminokiselina za varijabilni region teškog i lakog lanca su sekvencijalno numerisani.

Slika 6 pokazuje mapiranje epitopa antitela G1 kompeticijom peptida upotrebom Biacore. N- biotinilovani humani α -CGRP se hvata na SA senzor čip. G1 Fab (50 nM) u odsustvu peptida za kompeticiju ili prethodno inkubira 1 h sa 10 µM peptidom za kompeticiju je stavljen čip. Mereno je vezivanje G1 Fab-a za humani α -CGRP na čipu. Y osa predstavlja procenat vezivanja koje je blokirano prisustvom kompetitivnog peptida u poređenju sa vezivanjem u odsustvu kompetitivnog peptida.

Slika 7 pokazuje efekat administriranja antitela G1 (1 mg/kg ili 10 mg/kg, i.v.) ili nosaca (PBS, 0,01% Tween 20) na krvotok kože mereno fluksom krvnih ćelija nakon stimulacije električnim pulsom u trajanju od 30 sekundi. Antitelo G1 ili nosač se daju intravenski (i.v.) nakon čega sledi električna stimulacija nerva na 30 min, 60 min, 90 min, i 120 min nakon administracije antitela. Y osa predstavlja procenat AUC u poređenju sa nivoom AUC kada nije administrirano antitela ili nosač (definisano kao 100%) (vreme 0). X osa predstavlja vremenski (minuti) period izmedu administracije antitela i stimulacije električnim pulsom. "*" označava P < 0,05, i "**" označava P < 0,01, u poređenju sa nosačem. Podaci se analiziraju dvosmernim ANOVA testom i Bonferroni post testom.

Slika 8A pokazuje efekat administriranja antitela G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg, i.v.) ili nosača (PBS, 0,01% Tween 20) u krvotok kože mereno kao fluks krvnih ćelija nakon stimulacije elektricnim pulsom tokom 30 sekundi, 24 časa nakon doziranja. Antitelo G1 ili nosač je administrirano intravenozno (i.v.) 24 časa pre stimulacije nerva električnim pulsom. Y osa predstavlja ukupnu površinu ispod krive (promena fluksa ćelija krvi pomnožena sa vremenom od početka stimulacije dok se fluks ne vrati na osnovni nivo, AUC). X osa predstavlja varirajuće doze antitela G1. "*" predstavlja P < 0,05, i "**" ukazuje na P < 0,01, u poredenju sa nosačem. Podaci se analiziraju upotrebom jednosmernog ANOVA i Dunovim testom višestrukog poređenja.

Slika 8B pokazuje efekat administracije antitela G1 (0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg, i.v.) ili nosača (PBS, 0,01% Tween 20) na krvotok kože mereno fluksom krvnih ćelija nakon stimulacije električnim pulsom 30 sekundi 7 dana nakon doziranja. Antitelo G1 ili nosač se administrirani su intravenski (i.v.) 7 dana pre nervne stimulacije električnim pulsom. Y osa predstavlja ukupni AUC. X osa predstavlja varirajuće doze antitela G1. "**" ukazuje na P < 0,01, i "***" ukazuje na P < 0,001, u odnosu na nosač. Podaci se analizuraju primenom jednosmernog ANOVA i Dunovog testa višestrukog poređenja.

Slika 8C je analiza uklapanja podataka u krivu sa slika 8A i 8B. Antitelo G1 ili nosač administrirani su intravenozno (i.v.) ili 24 sati ili 7 dana pre stimulacije nerava električnim pulsom. Y osa predstavlja ukupni AUC. X osa predstavlja varirajuće doze G1 u "mg/kg" na logaritamskoj skali za određivanje EC50.

Slika 9 pokazuje efekat antitela mu7E9 (10 mg/kg), BIBN4096BS ili nosača (PBS, 0,01% Tween 20) na promenu prečnika srednje meningealne arterije nakon stimulacije električnim poljem. Antitelo mu7E9, BIBN4096BS ili nosač su administrirani intravenozno (i.v.) u vremenskoj tački 0 minuta nakon uspostavljanja osnovnog odgovora na električnu stimulaciju. Y osa predstavlja promenu prečnika srednje meningealne arterije nakon stimulacije električnim poljem. Mirujući prečnik odgovara 0%. X osa predstavlja vreme (minuti) stimulacije električnim pulsom. "*" označava P < 0,05, i "**" punačava P < 0,01, u poređenju sa nosačem. Podaci se analizuraju upotrebom jednosmernog ANOVA i Dunetovim testom višestrukog poređenja.

Slika 10 pokazuje efekat varirajućih doza antitela G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg, i.v.) ili nosača (PBS, 0,01% Tween 20) na promenu prečnika srednje meningealne arterije nakon stimulacije električnim poljem. Antitelo G1 ili nosac administrirani su intravenozno (i.v.) 7 dana pre stimulacije električnim poljem. Y osa predstavlja promenu prečnika srednje meningealne arterije. Mirujući prečnik odgovara 0%. X osa predstavlja napon stimulacije. "*" ukazuje na P < 0,05, "**" ukazuje na P < 0,01, i "***" ukazuje na P < 0,001, u poređenju sa nosačem. Podaci se analiziraju upotrebom dvosmernog ANOVA i Bonferroni post-testova.

Slika 11A pokazuje efekat antitela mu4901 (lOmg/kg) ili nosača (PBS, 0,01% Tween 20), administrirani intravenozno (i.v.) 24 sati pre, pri smanjenju temperature u centru koja je indukovana subkutanom injekcijom naloksona (1 mg/kg) kod pacova koji su zavisnici od morfina. Y osa predstavlja razliku temperature u odnosu na osnovni nivo. X osa predstavlja vreme koje se meri od momenta injekcije naloksona.

Slika 11B pokazuje efekat antitela mu4901 (10mg/kg) ili nosača (PBS, 0,01% Tween 20), koji su administrirani intravenozno (i.v.) 24 sata pre, pri povećanju u površinskoj temperaturi repa koja je indukovana subkutanom injekcijom naloksona (1 mg/kg) kod pacova koji su zavisnici od morfina. Y osa predstavlja razliku temperature u odnosu na osnovni nivo. X osa predstavlja vreme koje se meri od momenta injekcije naloksona.

Slika 12 je grafikon koji ilustruje rezultate kliničkog ispitivanja koje poredi efekte različitih doza antitela G1 sa placebom.

Slika 13 je grafikon koji ilustruje rezultate kliničkog ispitivanja koje poredi efekte različitih doza antitela G1 sa placebom.

Slika 14 je grafikon koji ilustruje rezultate kliničkog ispitivanja koje poredi efekte različitih doza antitela G1 sa placebom.

Slika 15 je grafikon koji ilustruje rezultate kliničkog ispitivanja koje poredi efekte različitih doza antitela G1 sa placebom.

Slika 16 je grafikon koji ilustruje rezultate kliničkog ispitivanja koje poredi efekte različitih doza antitela G1 sa placebom.

Slika 17 je grafikon koji ilustruje rezultate kliničkog ispitivanja koje poredi efekte različitih doza antitela G1 sa placebom.

Slika 18 je grafikon koji ilustruje rezultate kliničkog ispitivanja koje poredi efekte različitih doza antitela G1 sa placebom.

Detaljan opis pronalaska

Opšte tehnike

[0025] Praksa predmetnog pronalaska će koristiti, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupke molekularne biologije (uključujući rekombinatnte tehnike), mikrobiologije, ćelijske biologije, biohemije i imunologije, koji su obuhvaćeni tom oblasti tehnike. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi, kao što su, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press, Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Definicije

[0026] "Antitelo" je imunoglobulinski molekul koji može da se specifično vezuje za cilj, kao što je ugljeni hidrat, polinukleotid, lipid, polipeptid, itd., preko najmanje jednog mesta za prepoznavanje antigena, koje se nalazi u varijabilom regionu imunoglobilinskog molekula. Kao što se ovde koristi, termin obuhvata ne samo intaktna poliklonska ili monoklonska antitela, već i njihove fragmente (kao što su Fab, Fab', F(ab')2, Fv), jednolančani (ScFv), njihove mutirane oblike, kombinovane proteine koji sadrže deo antitela (kao što je domen antitela), i bilo koju drugu modifikovanu konfiguraciju molekula imunoglobulina koja sadrži mesto za prepoznavanje antigena. Antitelo uključuje antitelo bilo koje klase, kao što su IgG, IgA, ili IgM (iii njihove podklase), i antitelo ne mora da bude iz bilo koje posebne klase. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena teških lanaca antitela, imunoglobulini mogu da budu dodeljeni u razlicite klase. Postoji pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, i nekoliko od njih može da bude podeljeno u podklase (izotipove), npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina se zovu alfa, delta, ipsilon, gama, i mu, tim redom. Dobro su poznate subjedinične strukture i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina.

[0027] Kao što se ovde koristi, "monoklonsko antitelo" se odnosi na antitelo koji se dobija iz populacije u osnovi homogenih antitela, tj., individualna antitela koja čine populaciju su identična osim mogućih mutacija koje se prirodno pojavljuju koje mogu da budu prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična, a specifično su usmerena prema jednom antigenskom mestu. Dalje, u suprotnosti sa preparatima koji sadrže poliklonska antitela, koji obično uključuju različita antitela koja su spečificno usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo je usmereno prema jednoj determinanti na antigenu. Modifikator "monoklonsko" ukazuje na karakter antitela koje se dobija iz u osnovi homogene populacije antitela, i ne treba tumačiti kao neophodnu proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja se koriste prema predmetnom pronalasku mogu da se dobiju postupkom hibridoma koji su prvo opisali Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495,, ili mogu da se dobiju postupcima rekombinantne DNK kao što je opisano u U.S. Pat. No.4,816,567. Monoklonska antitela mogu takođe da se izoluju iz biblioteka faga koje se dobijaju upotrebom tehnika koje su opisane u McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554, na primer.

[0028] Kao što se ovde koristi, "humanizovana" antitela se odnose na oblike ne-humanih (tj. mišjih) antitela koja su specifični himerni imunoglobulini, lanci imunoglobulina, ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab', F(ab')2ili druge podsekvence antitela za vezivanje antigena) koje sadrže minimalnu sekvencu koja je izvedena iz ne-humanog imunoglobulina. U većini slučajeva, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (recipijentno antitelo) u kojima su ostaci hipervarijabilnih sekvenci (CDR) recipijenta zamenjeni ostacima CDR ne-humanih vrsta (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov, ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet, i biološku aktivnost. U nekim slučajevima ostaci Fv okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni sa odgovarajućim ostacima koji nisu humanog porekla. Dalje, humanizovano antitelo može da sadrži ostatke koji nisu prisutni ni kod recipijentnog antitela niti u uvedenom/importovanom CDR ili okvirnim sekvencama, ali su uključne kako bi dalje poboljšale i optimizovale performanse antitela. Generalno, humanizovano antitelo u osnovi sadrži najmanje jedan, i obično dva, variabilna domena, u kojima sve ili u osnovi sve CDR sekvence odgovaraju onima u ne-humanom imunoglobulinu i svi ili u osnovi svi FR regioni su oni koji pripadaju konseznus sekvenci humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo takođe sadrži najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina ili domena (Fc), obično od humanog imunoglobilina. Antitela mogu da imaju Fc regione koji su modifikovani kao što se opisuje u WO 99/58572. Drugi oblici humanizovanih antitela imaju jedanili više CDR (jedan, dva, tri, četiri, pet, šest) koji su izmenjeni u odnosu na originalno antitelo, koji se takođe nazivaju jedan ili više CDR " izveden od" jednog ii više CDR iz originalnag antitela.

[0029] Kao što se ovde koristi, "humano antitelo" označava antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara antitelu koje je proizveo čovek i/ili je dobijeno upotrebom postupaka za dobijanje humanih antitela koji su poznati iz oblasti tehnike ili su ovde prikazani. Ova definicija humanog antitela uključuje antitela koja sadrže najmanje jedan polipeptid humanog teškog lanca ili najmanje jedan polipeptid humanog lakog lanca. Jedan takav primer je antitelo koje sadrži polipeptide mišjeg lakog lanca i humanog teškog lanca. Humana antitela mogu da se proizvedu upotrebom različitih postupaka koji su poznati u tehnici. Humano antitelo može da bude odabrano iz biblioteke faga, gde bibiloteka faga eksprimira humana antitela (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Humana antitela takođe mogu da se dobiju uvođenjem lokusa humanog imunoglobulina u transgene životinje, tj., miševe kod kojih su endogeni imunoglobulinski geni parcijalno ili u potpunosti inaktivirani. Ovaj pristup je opisan u U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016. Alternativno, humano antitelo može da se dobije imortalizovanjem humanih B limfocita koji proizvode antitelo koje je specifično za ciljani antigen (tako da B limfociti mogu da se dobiju od pojedinca ili mogu da se imunizuju in vitro). Videti, npr., Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; i U.S. Patent No.5,750,373.

[0030] Kao što se ovde koristi, termin " peptid genski srodan kalcitoninu " i"CGRP" odnosi se na bilo koji oblik peptida koji je povezan sa genom za kalcitonin i njegovih varijanti koje najmanje delom zadržavaju aktivnost CGRP. Na primer, CGRP može da bude α-CGRP ili β-CGRP. Kao što se ovde koristi, CGRP uključuje sve nativne sekvence CGRP sisarskih vrsta, npr., čoveka, psa, mačke, konja, i govečeta.

[0031] Kao što se ovde koristi, "anti-CGRP antagonističko antitelo" (naizmenično nazvano "anti-CGRP antitelo") se odnosi na antitelo koje može da se veže za CGRP i da inhibira biološku aktivnost CGRP-a i/ili nishodni put(eve) koji je posredovan signalizacijom CGRP. Anti-CGRP antagonističko antitelo obuvata antitela koja moduliraju, blokiraju, antagonizuju, suprimiraju/potisukuju ili redukuju (uključujući značajnu) biološku aktivnost CGRP, ili na drugi način antagonizuju CGRP putanju, uključujuci nishodne puteve koji su posredovani signalizacijom CGRP, kao što je vezivanje za receptor i/ili pokretanje ćelijskog odgovora na CGRP. U svrhu predmetnog pronalaska, izričito treba razumeti da termin "anti-CGRP antagonističko antitelo" obuvata sve prethodno identifikovane termine, naslove, i funkcionalna stanja i karakteristike gde CGRP sâm, biološka aktivnost CGRP-a (uključujući, ali ne ograničavajući se na njegovu sposobnost da posreduje glavobolje u bilo kom aspektu), ili posledice biološke aktivnosti, su u osnovi oništene, smanjene, ili neutralizovane u bilo kom značajnom stepenu. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje za CGRP i sprečava vezivanje CGRP-a za receptor za CGRP. U drugim izvođenjima, anti- CGRP antitelo se vezuje za CGRP i sprečava aktivaciju receptora za CGRP. Primeri anti-CGRP antagonističkih antitela su ovde opisani.

[0032] Kao što se ovde koristi, termini " G1" i "antitelo G1" se koriste naizmenično da označe antitela koja su proizveli ekspresioni vektori deponovani pod brojevima ATCC PTA-6867 i ATCC PTA-6866. Sekvence aminokiselina varijabilnih regiona teškog i lakog lanca su prikazan na Slici 5. CDR delovi antitela G1 (uključujuci Chothia i Kabat CDR) su predstavljene dijagramom na Slici 5. Polinukleotidi koji kodiraju varijabilne regione teškog i lakog lanca su prikazani na SEQ ID NO:9 i SEQ ID NO:10. Karakterizacija G1 opisana je u Primerima.

[0033] Termini "polipeptid", "oligopeptid", "peptid" i "protein" ovde se koriste naizmenično i odnose se na polimere aminokiselina bilo koje dužine. Polimer može da bude linearan ili razgranat, može da sadrži modifikovane aminokiseline, i može da bude prekinut drugim entitetima koji nisu aminokiseline. Termini takođe obuhvataju amino kiselinski polimer koji je modifikovan prirodno ili intervencijom; na primer, obrazovanjem disulfidne veze, glikozilacijom, lipidacijom, acetilacijom, fosforilacijom, ili bilo kojom drugom manipulacijom ili modifikacijom, kao što je konjugovanje sa komponentom za obeležavanje. U definiciju su takođe uključeni, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga aminokiselina (uključujući, na primer, aminokiseline koje nisu prirodne, itd.), kao i druge modifikacije koje su poznate u oblasti tehnike. Treba nalgasiti da se polipeptidi mogu javiti kao jednolačani ili kao bočni lanci.

[0034] "Polinukleotid," ili "nukleinska kiselina," kao što se ovde naizmenično koristi, odnosi se na polimere nukleotida bilo koje dužine, i uključuje DNK i RNK. Nukleotidi mogu da budu dezoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze, i/ili njihovi analozi, ili bilo koji supstrat koji može da bude inkorporiran u polimer delovanjem DNK ili RNK polimeraze. Polinukleotid može da sadrži modifikovane nukleotide, kao što su metilovani nukleotidi i njihovi analozi. Ukoliko je prisutna, modifikacija nikleotidne strukture može da se doda pre ili nakon sklapanja polimera. Sekvenca nukleotida može da bude prekinuta komponentama koje nisu nukleotidi. Polinukleotid može dalje da bude modifikovan nakon polimerizacije, kao što je konjugacija sa komponentom za obeležavanje. Drugi tipovi modifikacija uključuju, na primer, "kape", supstituciju jednog ili više nukleotida koji se pojavljuje u prirodi analogom, internukleotidnim modifikacijama kao što su, na primer, oni sa zaštićenim vezama (npr., metil fosfonati, fosfotriestri, fosfoamidati, karbamati, itd.) i sa zaštićenim vezama (npr., fosforotioati, fosforoditioati, itd.), oni koji sadrže bočne grupe, kao što su, na primer, proteini (npr., nukleaze, toksini, antitela, signalni peptidi, ply-L-lizin, itd.), oni sa interkalirajućim agensima (npr., akridin, psoralen, itd.), oni koji sadrže helirajuće agense (npr., metali, radioaktivni metali, bor, oksidativni metali, itd.), oni koji sadrže agense za alkilovanje, oni sa modifikovanim vezama (npr., alfa anomerne nukleinske kiseline, itd.), kao i nemodifikovane oblike polinukleotida. Dalje, bilo koja od hidroksilnih grupa koja se obično nalazi u šećerima može da bude zamenjena, na primer, fosfonatnim grupama, fosfatnim grupama, koje su zaštićene standardnim zaštitnim grupama, ili koje su aktivirane dodatnim vezama sa dodatnim nukelotidima, ili mogu da budu konjugovane sa čvrstim nosačima.5' i 3' terminalna OH može da bude fosforilovana ili supstituisana aminima ili organskim grupama za kapovanje koje sadrže oko 1 do 20 ugljenikovih atoma. Drugi hidroksili mogu takođe da budu derivatizovani do standardnih zaštitnih grupa. Polinukleotidi mogu takođe da sadrže analogne oblike šećera riboze ili dezoksiriboze koji su generalno poznati u oblasti tehike, uključujući, na primer, 2'-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-fluor- ili 2'-azido- ribozu, karbociklične analoge šećera, α -anomerne šećere, epimerne šećere kao što je arabinoza, ksiloza ili liksoza, piranozne šećere, furanozne šećere, sedoheptuloze, aciklične analoge i abazne nukleotidne analoge kao što je metilribozid. Jedna ii više fosfodiestarskih veza može da bude zamenjena sa alternativnim grupama za vezivanje. Ove alternativne grupe za vezivnje uključuju, ali bez ograničenja, izvođenja u kojima se fosfat zamenjuje sa P(O)S("tioat"), P(S)S ("ditioat"), (O)NR2("amidat"), P(O)R, P(O)OR', CO ili CH2("formacetal"), gde svaki R ili R' je nezavisno H ili supstituisani ili nesupstituisani alkil (1-20 C) koji opciono sadrži etarsku (-O-) vezu, aril, alkenil, cikloalkil, cikloalkenil ili araldil. Ne moraju sve veze u polinukleotidu da budu identične. Prethodni opis se odnosi na sve ovde navede polinukleotide, uključujući RNK i DNK.

[0035] "Varijabilni region" antitela se odnosi na varijabilni region lakog lanca antitela ili varijabilni region teškog lanca antitela, ili zasebno ili u kombinaciji. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca se svaki zasebno odnose na četiri okvirna regiona (FR) koja su povezana za tri regiona koja određuju komplementarnost (CDR), a koji su takođe poznati pod imenom hipervarijabilni regioni. CDR u svakom lancu su vezani zajedno u neposrednoj blizini pomoću FR i, sa CDR iz drugog lanca, doprinose formiranju mesta za vezivanje antigena kod antitela. Postoje najmanje dve tehnike za određivanje CDR: (1) pristup koji je zasnovan na varijabilnosti sekvenci unakrsnih vrsta (tj., Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); i (2) pristup koji je zasnovan na kristalografskim ispitivanjima komleksa antigena i antitela (Allazikani et al (1997) J. Molec. Biol.273:927-948)). Kao što se ovde koristi, CDR mogu da se odnose na CDR definisani bilo kojim pristupom ili kombinacijom oba pristupa.

[0036] "Konstantni region" antitela odnosi se na konstantni region lakog lanca antitela ili konstantni region teškog lanca antitela, ili zasebno ili u kombinaciji.

[0037] Epitop koji se "preferencijalno vezuje" ili "specifično vezuje" (ovde se koristi naizmenično) za antitelo ili polipeptid je termin koji je dobro poznat u oblasti tehnike, i postupci za određivanje takvog specfičnog ili preferentnog vezivanja su takođe dobro poznati u tehnici. Kaže se da molekul ispoljava "specifično vezivanje" ili "preferencijalno vezivanje" ukoliko reaguje ili se povezuje frekventno, brže, sa dužim trajanjem i/ili sa većim afiniteom sa određenom ćelijom ili supstancom nego sa alternativnim ćelijama ili supstancama. Antitelo se ciljano "specifično vezuje" ili "preferentno vezuje" ukoliko se vezuje sa većim afinitetom, aviditetom, brže, i/ili sa dužim trajanjem u odnosu kada se vezuje za druge supstance. Na primer, antitelo koje se specifično ili preferentno vezuje za CGRP epitop je antitelo koje se vezuje za ovaj epitop sa većim afinitetom, aviditetom, brže, i/ili sa dužim trajanjem u odnosu kada se vezuje za druge CGRP epitope ili epitope koji nisu CGRP. Čitanjem ove definicije takođe se može razumeti da, na primer, antitelo (iii ostatak ili epitop) koje se specifično ili preferencijalno vezuje za prvi cilj može ili ne mora specifično ili preferentno da se vezuje za drugi cilj. Kao takvo, "specifično vezivanje" ili "preferentno vezivanje" nužno ne zahteva (iako moze da uključi) isključivo vezivanje. Generalno, ali ne i nužno, referenca za vezivanje označava preferentno vezivanje.

[0038] Kao sto se ovde koristi, "u osnovi čisto" se odnosi na matrijal koji je najmanje 50% čist (tj., bez nečistoća), poželjnije najmanje 90 % čist, bolje najmanje 95% čist, poželjnije najmanje 98% čist, poželjnije najmanje 99% čist.

[0039] "Ćelija domaćin" uključuje individualnu ćeliju ili ćelijsku kulturu koja može da bude ili jeste primalac vektor(a) za uključivanje polinukleotidnih inserata. Ćelije domaćina uključuju potomstvo jedne ćelije domaćina, i potomstvo ne mora u potpunosti da bude identično (u morfologiji ili u komplementu genomske DNK) sa originalnom roditeljskom ćelijom usled prirodne, slučajne, ii namerno indukovane mutacije. Ćelija domaćina uključuje ćelije u kojima je in vivo izvršena transfekcija sa polinukleotidom(a).

[0040] Termin "Fc region" se koristi za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina. "Fc region" može da bude nativna sekvenca Fc regiona ili varijanta Fc regiona.

lako granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu da se razlikuju, Fc region teškog lanca humanog lgG se obično definiše tako da se proteže od aminokiselinskog ostatka na položaju Cys226, ili od Pro230, do njegovog karboksilnog kraja. Numeracija ostataka u Fc regionu je prema EU indeksu kao u Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. Fc region imunogloblina generalno sadrži dva konstantna domena, CH2 i CH3.

[0041] Kao što se ovde koristi, "Fc receptor" i "FcR" opisuju receptor koji se vezuje za Fc region antitela. Poželjni FcR je nativna sekvenca humanog FcR. Osim toga, poželjni FcR je onaj koji vezuje lgG antitelo (gama receptor) i uključuje receptore podklasa FcγRI, FcγRII, i FcγRIII, uključujući varijante alela i alternativno splajsovane oblike ovih receptora. FcγRII receptori uključuju FcγRIIA ("aktivirajući receptor") i FcγRIIB ("inhibirajući receptor"), koji imaju slične sekvence aminokiselina koje se prvenstveno razlikuju po njihovim citoplazmatskim domenima. Pregled FcR se nalazi u Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; and de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. „FcR“ takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za prenos majčinih IgG na fetus (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; and Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).

[0042] "Citotoksičnost zavisna od komplementa" i "CDC" se odnose na ciljanu lizu u prisustvu komlementa. Put aktivacije komplementa je iniciran vezivanjem prve komponente sistema komplementa (C1q) za molekul (npr. antitelo) u kompleksu sa srdonim antigenom. Za ispitivanje aktivacije komplementa, može se izvesti CDC test, npr. kao što je opisano Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

[0043] "Funkcionalni Fc region" sadrži najmanje jednu efektorsku funkciju nativne sekvence Fc regiona. Primeri "efektorskih funkcija" uključuju vezivanje C1q; citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC); vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju receptora na ćelijskoj površini (npr. B ćelijski receptor; BCR), itd. Takve efektorske funkcije generalno zahtevaju kombinovanje Fc regiona sa vezujućim domenom (npr. varijabilnim domenom antitela) i može da se ispita upotrebom različitih testova koji su u oblasti tehnike poznati za evaluaciju takvih efektorskih funkcija antitela.

[0044] "Nativna sekvenca Fc regiona" sadrži sekvencu aminokiselina koja je identična sa sekvencom aminokiselina Fc regiona koja može da se nađe u prirodi. "Varijanta Fc regiona" sadrži sekvencu aminokiselina koja se razlikuju u odnosu na nativnu sekvencu Fe regiona na osnovu najmanje jedne modifikacije aminokiseline, dok zadržava najmanje jednu efektorsku funkciju nativne sekvence Fc regiona. Poželjno, varijanta Fc regiona ima najmanje jednu supstituciju aminokiseline u poređenju sa nativnom sekvencom Fc regiona ili sa Fc regionom roditeljskog polipeptida, npr. od oko jedne do oko deset supstitucija aminokiselina, i poželjno od oko jedne do oko pet supstitucija aminokiselina u nativnoj sekvenci Fc regiona ili u Fc regionu roditeljskog polipeptida. Varijanta Fc regiona ovde pozeljno ima najmanje oko 80% sličnosti sekvence sa nativnom sekvencom Fc regiona i/ili sa Fc regionom roditeljskog polipeptida, i najpoželjnije najmanje oko 90% identičnosti sekvence sa njim, poželjnije najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa njim.

[0045] Kao što se ovde koristi "citotoksičnost posredovana ćelijama koja je zavisna od antitela" i "ADCC" se odnosi na reakciju koja je posredovna ćelijama u kojoj nespecificne citotksične ćelije koje eksprimiraju Fc receptore (FcR) (npr. prirodne (NK) ćelije ubice, neutrofili, i makrofagi) prepoznaju antitelo koje je vezano za ciljanu ćeliju i nakon toga prouzrokuju lizu ciljane ćelije. ADCC aktivnost molekula od interesa može da se ispita upotrebom ADCC testa, kao što je opisano u U.S. Patent No. 5,500,362 or 5,821,337. Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) i NK ćelije. Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost molekula od interesa može da se ispita in vivo, npr., u životinjskom modelu kao što je prikazano u Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.

[0046] Kao što se ovde koristi, "tretman" je pristup za dobijanje korisnih ili željenih kliničkih rezultata. Za svrhe ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali bez ograničenja, jedno ili više od sledećih: poboljšanje u bilo kom aspektu glavobolje uključujući slabljenje simptoma, ublažavanje intenziteta bola, i drugih povezanih simptoma, smanjenje učestalosti ponovnog pojavljivanja, povećanja kvaliteta života onih pojedinaca koje boluju od glavobolje, i smanjenja doze drugih lekova koji su neophodni za lečenje glavobolje. Za migrenu, drugi povezani simptomi uključuju, ali bez ograničenja, mučninu, povraćanje, i osetljivost na svetlost, zvuk, i/ili kretanje. Za klaster glavobolju, drugi povezani simptomi uključuju, ali bez ograničenja na oticanje ispod ili oko očiju, intenzivno suzenje očiju, crvenilo očiju, Rinoreju ili nazalnu kongenstiju, i crvenilo lica.

[0047] "Smanjenje učestalosti" glavobolje označava bilo koje smanjenja ozbiljnosti simptoma (koje može da uključuje smanjenje potrebe za i/ili količine za (npr., izlaganja) drugim lekovima i/ili terapijama koje se generalno koriste za ova stanje, uključujući, na primer, ergotamin, dihidroergotamin, ili triptane za migrenu), trajanje, i/ili učestalost (uključujući, na primer, odlaganje ili povećavanje vremena do sledeće epizode napada kod pojedinca). Kao što je jasno prosečnim stručnjacima u tehnici, pojedinici mogu da se razlikuju u pogledu svog odgovora na tretman, i, kao takvo, na primer, "postupak za smanjenje učestalosti glavobolje kod individue" odražava administraciju antitela na CGRP antagoniste koje se zasniva na razumnom očekivanju da takvo davanje može najverovatnije da prouzrokuje dato smanjenje u učestalosti kod određenog pojedinca.

[0048] "Ublažavanje" glavobolje ili jednog ili više simptoma glavobolje označava slabljenje ili poboljšanje jednog ili više simptoma glavobolje u u odnosu kada se ne administrira antagonističko anti- CGRP antitelo. "Ublažavanje" takođe uključuje skaraćenje trajanja ili umanjenje trajanja simptoma.

[0049] Kao sto se ovde koristi, "kontrolisanje glavobolje" se odnosi na održavanje ili smanjenje ozbiljnosti ili trajanja jednog ili više simptoma glavobolje ili učestalosti napada glavobolje kod pojedinca (u odnosu na nivo pre tretmana). Na primer, trajanje ili ozbiljnost glavobolje, ili ucestalost napada glavobolje je smanjena za najmanje od oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, ili 70% kod pojedinca u odnosu na nivo pre tretmana.

[0050] Kako se ovde koristi, "sat glavobolje" se odnosi na sat tokom kojeg subjekt doživljava glavobolju. Sati sa glavoboljom se mogu izraziti u vidu celih sati (npr. jedan sat glavobolje, dva sata glavobolje, tri sata glavobolje, itd.) ili u smislu celih i delimičnih sati (npr.0,5 sati glavobolje, 1,2 sata glavobolje, 2,67 sati glavobolje , itd.). Jedan ili više sati glavobolje se može opisati u odnosu na određeni vremenski interval. Na primer, „dnevni sati glavobolje“mogu da se odnose na broj sati glavobolje koje subjekt doživi u dnevnom intervalu (npr. u periodu od 24 sata). U drugom primeru, "nedeljni sati glavobolje" se mogu odnositi na broj sati glavobolje koje subjekt doživi u intervalu od nedelju dana (npr. period od 7 dana). Kao što se može shvatiti, nedeljni interval može ili ne mora odgovarati kalendarskoj nedelji. U drugom primeru, "mesečni sati glavobolje" se mogu odnositi na broj sati glavobolje koje subjekt doživi u intervalu od jednog meseca. Kao što se može shvatiti, mesečni interval (npr. period od 28-31 dan) može da varira u smislu broja dana u zavisnosti od određenog meseca i može, ali ne mora da odgovara kalendarskom mesecu. U još jednom primeru, "godišnji sati glavobolje" se mogu odnositi na broj sati glavobolje koje subjekt doživi u jednogodišnjem intervalu. Kao što se može shvatiti, godišnji interval (npr. period od 365 ili 366 dana) može da varira u smislu broja dana u zavisnosti od određene godine i može ili ne mora odgovarati kalendarskoj godini. Sat glavobolje može da se odnosi na određenu vrstu glavobolje (npr. migrena, klaster glavobolja, hronična glavobolja i tenziona glavobolja). Na primer, "sat migrene" može se odnositi na sat tokom kojeg subjekt doživljava migrenu.

[0051] Kako se ovde koristi, "dan glavobolje" se odnosi na dan tokom kojeg subjekt doživljava glavobolju. Dani sa glavoboljom mogu se izraziti kao celi dani (npr. jedan dan sa glavoboljom, dva dana sa glavoboljom, tri dana sa glavoboljom, itd.) ili kao celi i delimični dani (npr.0,5 dana sa glavoboljom, 1,2 dana sa glavoboljom, 2,67 dana sa glavoboljom , itd.). Jedan ili više dana sa glavoboljom može se opisati u odnosu na određeni vremenski interval. Na primer, „nedeljni dani sa glavoboljom“ se mogu odnositi na broj dana glavobolje koje subjekt doživi u intervalu od nedelju dana (npr. period od 7 dana). Kao što se može shvatiti, nedeljni interval može ili ne mora odgovarati kalendarskoj nedelji. U drugom primeru, "mesečni dani glavobolje" se mogu odnositi na broj dana glavobolje koje subjekt doživi u jednom mesečnom intervalu. Kao što se može shvatiti, mesečni interval (npr. period od 28-31 dan) može da varira u smislu broja dana u zavisnosti od određenog meseca i može, ali ne mora da odgovara kalendarskom mesecu. U još jednom primeru, "godišnji dani glavobolje" se mogu odnositi na broj dana glavobolje koje subjekt doživi u intervalu od jedne godine. Kao što se može shvatiti, godišnji interval (npr. period od 365 ili 366 dana) može varirati u smislu broja dana u zavisnosti od određene godine i može ili ne mora odgovarati kalendarskoj godini. Dan sa glavoboljom može se odnositi na određenu vrstu glavobolje (npr. migrena, klaster glavobolja, hronična glavobolja i tenziona glavobolja). Na primer, "dan migrene" se može odnositi na dan tokom kojeg subjekt doživljava migrenu.

[0052] Kao sto se ovde koristi, "odlaganje" razvijanja glavobolje znači odlaganje, sprečavanje, usporavanje razvijanja, odugovlačenje razvoja, stabilizaciju, i/ili odgađanje progresije bolesti. Ovo odlaganje može da bude u različitim vremenskim trajanjima, u zavisnosti od istorije bolesti i/ili pojedinca koji se leči. Kao sto je očigledno prosečnom stručnjaku iz oblasti tehnike, dovoljna ili značajna količina odlaganja može , u stvari, da obuhvati prevenciju, u kojoj ne dolazi do razvijanja glavobolje (npr., migrenu) kod pojedinca. Postupak koji "odlaže" razvijanje simptoma je postupak koji smanjuje verovatnoću razvijanja simptoma u datom vremenskom okviru i/ili smanjuje obim simptoma u datom vremenskom okviru, u odnosu na to kada se ovaj postupak ne koristi. Takva poređenja su obično zasnovana na kliničkim ispitivanjima, koristeći statistički značajan broj subjekata.

[0053] "Napredovanje" ili "progresija" glavobolje označava početne manifestacije i/ili narednu progresiju poremećaja. Razvijanje glavobolje može da se otkrije i ispita upotrebom standardnih kliničkih postupaka koji su dobro poznati iz oblasti tehnike. Međutim, razvijanje se takođe odnosi na progresiju koja može da prođe neopaženo. Za potrebe ovog pronalaska, razvijanje ili progresija se odnosi na biološki tok simptoma. "Razvijanje" ukljuluje pojavu, ponovno javljivanje, i početak. Kao sto se ovde koristi "početak" ili "pojava" glavobolje uključuje inicijalni početak i/ili ponovno pojavljivanje.

[0054] Kao što se ovde koristi, "efikasna doza" ili "efikasna količina" leka, jedinjenja, ili farmaceutske kompozicije je količina koja je dovoljna da pokrene korisne ili željene rezultate. Za profilaktičku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju rezultate kao što je eliminacija ili smanjenje rizika, smanjenje ozbiljnosti simptoma, ili odlaganje početka razvoja bolesti, uključujući biohemijske, histološke i/ili bihevioralne simptome bolesti, komplikacije u vezi sa bolešću i intermedijerne patološke fenotipove koji su prisutni u toku razvoja bolesti. Za terapeutsku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju kliničke rezultate kao što su smanjenje intenziteta bola, trajanje, ili učestalost napada glavobolje, i smanjenje jednog ili više simptoma koji se razvijaju iz glavobolje (biohemijski, histološki i/ili biohevioralni), uključujući njihove komplikacije i intermedijerne patološke fenotipove koji su prisutni u toku razvoja bolesti, povećanjem kvaliteta života obolelih individua, smanjenjem doze drugih lekova koji su neophodni za lečenje bolesti, pojačavanjem efekta drugih lekova, i/ili odlaganjem napredovanja bolesti kod pacijenta. Efikasna doza može da se administrira u jednoj ili više administracija. Za svrhu ovog pronalaska, efikasna doza leka, jedinjenja, ili farmaceutske kompozicije je dovoljna da se postigne profilaktički ili terapeutski tretman ili direktno ili indirektno. Kao što je jasno i kliničkog konteksta, efikana doza leka, jedinjenja, ili farmaceutske kompozicije može ili ne mora da se postigne zajedno sa drugim lekom, jedinjenjem, ili farmaceutskom kompozicijom. Prema tome, "efikasna doza" može da se razmatra u kontekstu davanja jednog ili više terapeutskih sredstava, i smatra se da jedno sredstvo može da se daje u efikasnoj količini ukoliko, zajedno sa jednim ili više drugih sredstava, može da se postigne željeni rezultat ili je on postignut.

[0055] "lndividua" iii "subjekat" je sisar, poželjnije čovek. Sisari takode uključuju, ali bez ograničenja, domaće životinje, sportske životinje, ljubimce, primate, konje, pse, mačke, miševe i pacove.

[0056] Kao što se ovde koristi, "vektor" označava konstrukt, pomoću koga mogu da se isporuče, i poželjno ekprimiraju, jedan iii više gen(a) iii sekvenca(sekvenci) u ćeliji domaćinu. Primeri vektora uključuju, ali bez ograničenja, virusne vektore, čiste DNK iii RNK ekspresione vektore, plazmid, kozmid iii fagne vektore, DNK iii RNK ekspresione vektore koji su povezani sa katjonskim sredstvima za kondenzovanje, DNK iii RNK ekspresione vektore koji su inkapsulirani u lipozomima, i određene eukariotske ćelije, kao sto su ćelije proizvođači.

[0057] Kao što se ovde koristi, "ekspresiona kontrolna sekvenca" označava sekvencu nukleinske kiseline koja usmerava transkripciju nukleinske kiseline. Ekspresiona kontrolna sekvenca moze da bude promoter, kao što je konstitutivni iii inducibilni promoter, iii pojačivač. Ekspresiona kontrolna sekvenca je operativno vezana sa sekvencom nukleinske kiseline koja treba da se transkribuje.

[0058] Kao što se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljivi nosač" iii "farmaceutski prihvatljivi ekscipijens" uključuje bilo koji materijal koji, kada se kombinuje sa aktivnim sastojkom, omogućava sastojku da zadrži biološku aktivnost i da ne interaguje sa imunskim sistemom domaćina. Primeri uključuju, ali bez ograničenja, bilo koje standardne farmaceutske nosaše kao što je rastvor fosfatnog pufera, vodu, emulzije kao što je emulzija ulja u vodi, i razlišiti tipovi okvašivača. Poželjni rastvaraši za administraciju u obliku aerosola iii parenteralnu administraciju su rastvor fosfatnog pufera ili normalnog (0,9 %) rastvora soli. Kompozicije koje sadrže takve nosače su formulisane dobro poznatim konvencionalnim postupcima (videti, na primer, , Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; and Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000).

[0059] Izrazi "kon", kao što se ovde koristi, je namenjen da se odnosi na konstantu brzine za spajanje antitela sa antigenom.

[0060] Termin term "koff", kao što se ovde koristi, je namenjen da upućuje na konstantu brzine dioscijacije antitela iz kompleksa antitelo/antigen.

[0061] Termin term "KD", kao što se ovde koristi, je namenjen da upućuje na ravnotežnu konstantu disocijacije interakcije antitela i antigena.

[0062] Kao sto se ovde koristi, termin "vazomotorni simptom," je namenjen da se odnosi na stanja koja su u vezi sa vazodilatacijom. Takva vazodilatacija može biti povezana ili potencijalno povezana sa glavoboljom (kao što je migrena sa aurom ili bez aure; hemiplegična migrena; hronična migrena; epizodna migrena; migrena visoke frekvencije; klaster glavobolje; migrenska neuralgija; hronične glavobolje; glavobolje usled napetosti; glavobolje koje su posledica drugih medicinskih stanja (kao što su infekcija ili povećan pritisak u lobanji zbog tumora); hronična paroksizmalna hemikranija; različite glavobolje koje nisu povezane sa strukturnom lezijom; glavobolja povezana sa nevaskularnim intrakranijalnim poremećajem; glavobolja povezana sa administracijim supstance ili odvikavanjem; glavobolja povezana sa necefalnom infekcijom; glavobolja povezana sa metaboličkim poremećajem; glavobolja povezana sa poremećajem lobanje, vrata, očiju, ušiju, nosa, sinusa, zuba, usta ili druge strukture lica ili lobanje; kranijalne neuralgije; i nervni bol u trupu i bol od deaferencijacije), navale vrućine (ili valunge), navale hladnoće, nesanica, poremećaji spavanja, poremećaji raspoloženja, razdražljivost, prekomerno znojenje, noćno znojenje, dnevno znojenje, umor i slično, uzrokovani, između ostalog, termoregulatornom disfunkcijom.

[0063] Kako se ovde koristi, termini "nalet", "nalet vrućine" i "valung" su poznati termini koji se odnose na epizodni poremećaj telesne temperature koji se tipično sastoji od iznenadnog crvenila kože, obično praćeno znojenjem kod subjekta.

A. Postupci za prevenciju iii lečenje vazomotronih simptoma i/ili glavobolja

[0064] Pronalazak obezbeđuje monoklonsko antitelo za upotrebu u postupku lečenja ili smanjenja incidencije migrenske glavobolje kod subjekta, pri čemu monoklonsko antitelo modulira CGRP putanju, pri čemu monoklonsko antitelo ima teški lanac sa sekvencom amino kiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO:11 i laki lanac sa sekvencom aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO:12, i gde se antitelo primenjuje jednom mesečno subkutano u dozi od 225 mg.

Postupak može da obuhvata davanje pojedincu najmanje jednog dodatnog agensa korisnog za lečenje glavobolje.

[0065] Takva dodatna sredstva uključuju, ali bez ograničenja, agoniste 5-HT i NSAID. Na primer, antitelo i najmanje jedno dodatno sredstvo može da se daje istovremeno, tj., mogu da se daju u neposrednoj vremenskoj blizini da se omogući prekapanje njihovih individualnih terapeutskih efekata. Na primer, količina agonista 5-HT iii NSAID koji se daju u kombinaciji sa anti-CGRP antitelom treba da bude dovoljna da smanji ušestalnost relapsa glavobolje kod pacijenata ili da proizvede efikasnost koja ima duže trajanje u poređenju sa davanjem bilo kog od ovih sredstava u odsustvu drugog. Ovaj postupak moze da se koristi za lečenje glavobolja koje se nalaze u širokom opsegu klasa: migrena sa iii bez aure; hemiplegične migrene; klaster glavobolje; migrenozne neuralgije; hronične glavobolje; tenzione glavobolje; glavobolje koje nastaju kao rezultat drugih medicinskih stanja (kao što je infekcija ili pojačani pritisak u lobanji usled prisustva tumora); hronična paroksizmalna hemikranija; različite glavobolje koje nisu povezane sa strukturnom lezijom; glavobolja koja je povezana sa intrakranijalnim poremećajem koji nije vaskularne prirode; glavobolja koja je povezana sa administracijom supstance iii odvikavanjem; glavobolja koja je povezana sa necefaličnom infekcijom; glavobolja koja je povezana sa metaboličkim poremećajem; glavobolja povezana sa poremećajem lobanje, vrata, očiju, ušiju, nosa, sinusa, zuba, usta ili druge strukture lica ili lobanje; kranijalne neuralgije; i bol u nervnom trupu i bol od deaferencijacije.

[0066] Dodatni neograničavajući primeri dodatnih agenasa koji se mogu primeniti u kombinaciji sa anti-CGRP antagonističkim antitelom uključuju jedno ili više od:

(i) opioidni analgetik, npr., morfijum, heroin, hidromorfon, oksimorfon, levorfanol, levallorphan, metadon, meridin, fentanil, kokain, kokain, kodein, dihidrokodein, oksikodon, hidrokodon, propoksifen, nalmefen, nalorfin, nalokhen, nalorfin, buprenorfin, naltrekon, buprenorfin , nalbufin ili pentazocin;

(ii) nesteroidni antiinflamatorni lek (NSAID), na primer, aspirin, diklofenak, diflusinal, etodolak, fenbufen, fenoprofen, flufenisal, flurbiprofen, ibuprofen, indometacin, ketoprofen, ketorolak, meklofenaminska kiselina, meklofenaminska kiselina, naklofenametna kiselina ilbutazon , piroksikam, sulindak, tolmetin ili zomepirak, inhibitori ciklooksigenaze-2 (COX-2), celekoksib; rofecokib; meloksikam; JTE-522; L-745,337; NS398;, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so;

(iii) barbituratni sedativ, npr., amobarbital, aprobarbital, butabarbital, butabital, mefobarbital, metarbital, metoheksital, pentobarbital, fenobartital, sekobarbital, talbutal, teamilal ili tiopentalna so, koja se može prihvatiti

(iv) barbituratni analgetik, npr. butalbital ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili kompozicija koja sadrži butalbital.

(v) benzodiazepin koji ima sedativno dejstvo, npr. hlordiazepoksid, klorazepat, diazepam, flurazepam, lorazepam, oksazepam, temazepam ili triazolam ili njegova farmaceutski prihvatljiva so;

(vi) antagonist H1koji ima sedativno dejstvo, npr., difenhidramin, pirilamin, prometazin, hlorfeniramin ili hlorciklizin ili njihova farmaceutski prihvatljiva so;

(vii) sedativ kao što je glutetimid, meprobamat, metakvalon ili dihloralfenazon ili njihova farmaceutski prihvatljiva so;

(viii) relaksant skeletnih mišića, npr. baklofen, karizoprodol, hlorzoksazon, ciklobenzaprin, metokarbamol ili orfrenadin ili njihova farmaceutski prihvatljiva so;

(ix) antagonist NMDA receptora, npr., dekstrometorfan ((+)-3-hidroksi-N-metilmorfinan) ili njegov metabolit dekstrorfan ((+)-3-hidroksi-N-metilmorfin), ketamin, memantin, pirolokinolin ili kinolin -4-(fosfonometil)-2-piperidinkarboksilna kiselina ili njena farmaceutski prihvatljiva so;

(x) alfa-adrenergik, npr. ,doksazosin, tamsulozin, klonidin ili 4-amino-6,7-dimetoksi-2-(5-metansulfonamido-1,2,3,4-tetrahidroizohinol-2-il)-5-(2-piridil) hinazolin;

(xi) triciklični antidepresiv, npr. dezipramin, imipramin, amitriptilin ili nortriptilin;

(xii) antikonvulzan, npr. karbamazepine ili valproat;

(xiii) antagonist tahikinina (NK), posebno NK-3, NK-2 ili NK-1 antagonist, npr. (αR,9R)-7-[3,5-bis(trifluormetil)benzil]-8,9,10,11-tetrahidro-9-metil-5-(4-metilfenil)-7H-[1,4]diazocino [2,1-g][1,7]naftridin-6-13-dion (TAK-637), 5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-bis (trifluormetil)fenil]etoksi-3-(4-fluorfenil)-4-morfolinil]metil]-1,2-dihidro-3H-1,2,4-triazol-3-on (MK-869), lanepitant, dapitant ili 3-[[2-metoksi-5-(trifluormetoksi)fenil]metilamino]-2-fenil-piperidin (2S,3S);

(xiv) muskarinski antagonist, npr., oksibutin, tolterodin, propiverin, tropsijum hlorid ili darifenacin;

(xv) inhibitor COX-2, npr. celekoksib, rofekoksib ili valdekoksib;

(kvi) neselektivni inhibitor COX (poželjno sa GI zaštitom), npr. nitroflurbiprofen (HCT-1026);

(xvii) analgetik katranski derivati, posebno paracetamol;

(xviii) neuroleptik kao što je droperidol;

(xix) agonist vaniloidnog receptora (npr. resinferatoksin) ili antagonist (npr. kapsazepin);

(xix) beta-adrenergik kao što je propranolol;

(xx) lokalni anestetik, kao što je meksiletin;

(xxi) kortikosteroid, kao što je deksametazon;

(xxii) agonist ili antagonist serotonin receptora;

(xxiii) holinergički (nikotinski) analgetik;

(xxiv) Tramadol (žig);

(xxv) PDEV inhibitor, kao što je sildenafil, vardenafil ili taladafil;

(xxvi) alfa-2-delta ligand kao što je gabapentin ili pregabalin;

(xxvii) kanabinoid; i

(xxviii) antidepresiv, kao što je amitriptilin (Elavil), trazodon (Desirel) i imipramin (Tofranil) ili antikonvulzanti kao što su fenitoin (Dilantin) ili karbamazepine (Tegretol).

[0067] Prosečni stručnjak će moći da odredi odgovarajuće količine doze za određene agense koji će se koristiti u kombinaciji sa anti-CGRP antitelom. Na primer, sumatriptan se može administrirati u dozama od oko 0,01 do oko 300 mg. U nekim slučajevima, sumatriptan se može administrirati u dozama od 2 mg do 300 mg. Kada se administrira neparenteralno, tipična doza sumatriptana je od oko 25 do oko 100 mg, sa oko 50 mg koje je generalno poželjno, a kada se administrira parenteralno, poželjna doza je oko 6 mg. Međutim, ove doze mogu da variraju u skladu sa standardnim metodama u tehnici tako da budu optimizovane za određenog pacijenta ili za određenu kombinovanu terapiju. Dalje, na primer, celekoksib se može administrirati u količini između 50 i 500 mg.

[0068] U pogledu svih metoda koje su ovde opisane, reference na antitela (npr. monoklonska antitela koja moduliraju CGRP put, anti-CGRP antagonistička antitela, monoklonalna anti-CGRP antagonistička antitela) takođe uključuju kompozicije koje sadrže jedan ili više ovih agenasa. Shodno tome, takva kompozicija se može koristiti u skladu sa metodom koja se odnosi na ovde opisano antitelo. Ove kompozicije mogu dalje da sadrže pogodne ekscipijense, kao što su farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi kao što je ovde opisano. Ovaj pronalazak se može koristiti sâm ili u kombinaciji sa drugim konvencionalnim metodama lečenja

[0069] Različite formulacije anti-CGRP antagonističkog antitela mogu da se koriste za administranje. U nekim izvođenjima, moze da se administrira čisto. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonisticko antitelo i farmaceutski prihvatljivi ekscipijens mogu da budu u različitim formulacijama. U oblasti tehnike su poznati farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi, koji su relativno inertne supstance koje olakšavaju davanje farmakološki efikasne supstance. Na primer, eksipijens moze da daje oblik iii konzistenciju, iii moze da deluje kao rastvarač. Pogodni ekscipijenti uključuju, ali bez ograničenja, agensi za stabilizaciju, okvašivači i agensi za emulgovanje, soli za različitu osmolarnost, agensi za inkapsulaciju, puferi, i pojačivači za prodiranje kroz kožu. Ekscipijensi kao i formulacije za parenteralnu i neparenteralnu distribuciju leka su predstavljeni u Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).

[0070] Shodno tome, ovi agensi se mogu kombinovati sa farmaceutski prihvatljivim nosačima kao što su fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, rastvor dekstroze i slično.

[0071] Terapijske formulacije antitela koje se koriste u skladu sa ovim otkrićem mogu se pripremiti za skladištenje i/ili upotrebu mešanjem antitela koji ima željeni stepen čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)), a u nekim slučajevima može biti u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, ekscipijenti ili stabilizatori su netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama.

Terapeutska formulacija antitela može da sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, ekscipijenasa ili stabilizatora sa neograničavajućim primerima takvih vrsta koje uključuju pufere kao što su fosfatni, citratni i drugih organskih kiselina; soli kao što je natrijum hlorid; antioksidansi uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervansi (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni, kao što su metil ili propil paraben; katehol; rezorkolpen-ciklo-3-heksol; ciklo-3-heksol); polipeptidi male molekularne težine (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline (npr. u koncentracijama od 1 mM do 100 mM, 0,1 mM do 1 mM, 0,01 mM do 50 mM, 1 mM do 50 mM, 1 mM do 30 mM, 1 mM do 20 mM, 10 mM do 25 mM) kao što su glicin, glutamin, metionin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatni agensi (npr. u koncentracijama od 0,001 mg/mL do 1 mg/mL, 0,001 mg/mL do 1 mg/mL, 0,001 mg/mL do 0,1 mg/mL, 0,001 mg/mL do 0,01 mg/mL, 0,01 mg/mL do 0,1 mg/mL) kao što je EDTA (npr. dinatrijum EDTA dihidrat); šećeri (npr. u koncentracijama od 1 mg/mL do 500 mg/mL, 10 mg/mL do 200 mg/mL, 10 mg/mL do 100 mg/mL, 50 mg/mL do 150 mg/mL) kao što je saharoza , manitol, trehaloza ili sorbitol; protivjoni koji stvaraju soli kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr. kompleksi Zn-proteina); i/ili nejonski surfaktanti (npr. u koncentracijama od 0,01 mg/mL do 10 mg/mL, 0,01 mg/mL do 1 mg/mL, 0,1 mg/mL do 1 mg/mL, 0,01 mg/mL do 0,5 mg/mL) kao što je TWEEN<™>(e.g., polisorbat (npr. polisorbat 20, polisorbat 40, polisorbat 60, polisorbat 80)), PLURONICS<™>ili polietilen glikol (PEG).

[0072] Formulacija antitela se može okarakterisati u smislu bilo koje od raznih fizičkih svojstava. Na primer, tečna formulacija antitela može imati bilo koji odgovarajući pH za terapeutsku efikasnost, bezbednost i skladištenje. Na primer, pH tečne formulacije antitela može da iznosi od pH 4 do oko pH 9, od pH 5 do pH 8, od pH 5 do pH 7 ili od pH 6 do pH 8. Tečna formulacija antitela može imati pH od 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 ili 10 ili više ili manje.

[0073] U drugom primeru, tečna formulacija antitela može imati bilo koji pogodan viskozitet za terapeutsku efikasnost, bezbednost i skladištenje. Na primer, viskoznost tečne formulacije antitela može da iznosi od 0,5 centipoaza (cP) do 100 cP, 1 cP do 50 cP, 1 cP do 20 cP, 1 cP do 15 cP ili 5 cP do 15 cP na 25°C. Tečna formulacija antitela može imati viskozitet od 0,5 cP, 1 cP, 1,2 cP, 1,4 cP, 1,6 cP, 1,8 cP, 2,0 cP, 2,2 cP, 2,4 cP, 2,6 cP, 2,8 cP, 3,0 cP, 3,2 cP, 3,4 cP, 3,6 cP, 3,8 cP, 4,0 cP, 4,2 cP, 4,4 cP, 4,6 cP, 4,8 cP, 5,0 cP, 5,2 cP, 5,4 cP, 5,6 cP, 5,8 cP, 6,0 cP, 6,2 cP, 6,4 cP, 6,6 cP, 6,8 cP, 7,0 cP, 7,2 cP, 7,4 cP, 7,6 cP, 7,8 cP, 8,0 cP, 8,2 cP, 8,4 cP, 8,6 cP, 8,8 cP, 9,0 cP, 9,2 cP, 9,4 cP, 9,6 cP, 9,8 cP, 10,0 cP, 10,2 cP, 10,4 cP, 10,6 cP, 10,8 cP, 11,0 cP, 11,2 cP, 11,4 cP, 11,6 cP, 11,8 cP, 12,0 cP, 12,2 cP, 12,4 cP, 12,6 cP, 12,8 cP, 13,0 cP, 13,2 cP, 13,4 cP, 13,6 cP, 13,8 cP, 14,0 cP, 14,2 cP, 14,4 cP, 14,6 cP, 14,8 cP, ili 15,0 cP na 25°C ili viskozitet može da bude niži ili viši.

[0074] Na primer, provodljivost tečne formulacije antitela može biti od 0,1 milisimensa po centimetru (mS/cm) do 15 mS/cm, 0,1 mS/cm do 10 mS/cm, 0,1 mS/cm do 5 mS/cm, 0,1 mS/cm do 2 mS/cm ili 0,1 mS/cm do 1,5 mS/cm. U nekim relizacijama, tečna formulacija antitela može da ima provodljivost od 0,19 mS/cm, 0,59 mS/cm, 1,09 mS/cm, 1,19 mS/cm, 1,29 mS/cm, 1,39 mS/cm, 1,49 mS/cm, 1,59 mS/cm, 1,69 mS/cm, 1,79 mS/cm, 1,89 mS/cm, 1,99 mS/cm, 2,09 mS/cm, 2,19 mS/cm, 2,29 mS/cm, 2,39 mS/cm, 2,49 mS/cm, 2,59 mS/cm, 2,69 mS/cm, 2,79 mS/cm, 2,89 mS/cm, 2,99 mS/cm, 3,09 mS/cm, 3.19 mS/cm, 3,29 mS/cm, 3,39 mS/cm, 3,49 mS/cm, 3,59 mS/cm, 3,69 mS/cm, 3,79 mS/cm, 3,89 mS/cm, 3,99 mS/cm, 4,09 mS/cm, 4.19 mS/cm, 4,29 mS/cm, 4,39 mS/cm, 4,49 mS/cm, 4,59 mS/cm, 4,69 mS/cm, 4,79 mS/cm, 4,89 mS/cm, 4,99 mS/cm, 5,09 mS/cm, 6,09 mS/cm, 6,59 mS/cm, 7,09 mS/cm, 7,59 mS/cm, 8,09 mS/cm, 8,59 mS/cm, 9,09 mS/cm, 9,59 mS/cm, 10,09 mS/cm, 10,59 mS/cm, 11,09 mS/cm, 11,59 mS/cm, 12,09 mS/cm, 12,59 mS/cm, 13,09 mS/cm, 13,59 mS/cm, 14,09 mS/cm, 14,59 mS/cm ili 15,09 mS/cm ili provodljivost može biti viša ili niža.

[0075] U drugom primeru, tečna formulacija antitela može imati bilo koju odgovarajuću osmolalnost za terapeutsku efikasnost, bezbednost i skladištenje. Na primer, osmolalnost tečne formulacije antitela može biti od 50 milliosmola po kilogramu (mOsm/kg) do 5000 mOsm/kg, 50 mOsm/kg do 2000 mOsm/kg, 50 mOsm/kg do 1000 mOsm/kg, 50 mOsm/kg do 750 mOsm/kg ili 50 mOsm/kg do 500 mOsm/kg. Tečna formulacija antitela može imati osmolalnost od 50 mOsm/kg, 60 mOsm/kg, 70 mOsm/kg, 80 mOsm/kg, 90 mOsm/kg, 100 mOsm/kg 120 mOsm/kg, 140 mOsm/kg, 160 mOsm/kg, 180 mOsm/kg, 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 240 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 340 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg, 400 mOsm/kg, 420 mOsm/kg, 440 mOsm/kg, 460 mOsm/kg, 480 mOsm/kg, 500 mOsm/kg, 520 mOsm/kg, 540 mOsm/kg, 560 mOsm/kg, 580 mOsm/kg, 600 mOsm/kg, 620 mOsm/kg, 640 mOsm/kg, 660 mOsm/kg, 680 mOsm/kg, 700 mOsm/kg, 720 mOsm/kg, 740 mOsm/kg, 760 mOsm/kg, 780 mOsm/kg, 800 mOsm/kg, 820 mOsm/kg, 840 mOsm/kg, 860 mOsm/kg, 880 mOsm/kg, 900 mOsm/kg, 920 mOsm/kg, 940 mOsm/kg, 960 mOsm/kg, 980 mOsm/kg, 1000 mOsm/kg, 1050 mOsm/kg, 1100 mOsm/kg, 1150 mOsm/kg, 1200 mOsm/kg, 1250 mOsm/kg, 1300 mOsm/kg, 1350 mOsm/kg, 1400 mOsm/kg, 1450 mOsm/kg, 1500 mOsm/kg ili osmolalnost može biti viša ili niža.

[0076] Lipozomi koji sadrže antitelo se dobijaju postupcima koji su poznati iz oblasti tehnike, kao što je opisano u Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); and U.S. Pat. Nos. 4,485,045 i 4,544,545. Lipozomi sa poboljšanim vremenom u krvotoku su prikazani u U.S. Patent br. 5,013,556. Posebno korisni lipozomi mogu da se dobiju postupkom evaporacije reverzne faze sa lipidnom kompozicijom koja sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEGPE). Lipozomi su ekstrudovani kroz filtere sa definisanim veličinama pora dajući tako lipozomi sa željenim prečnikom.

[0077] Aktivni sastojci takode mogu da budu zarobljeni u mikrokapsulama koje se pripremaju, na primer, postupcima koacervacije iii međuprostornom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilceluloze iii želatinskih mikrokapsula i poli-(metilmetacilatnim) mikrokapsulama, tim redom, u koloidalnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomima, mikrosferama albumina, microemulzijama, nano-česticama i nanokapsulama) iii u makroemulzijama. Takvi postupci su prikazani u Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).

[0078] Mogu da se dobiju preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropustljive matrikse čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, gde su matrice u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmovi, iii mikrokapsule. Primeri matriksa sa produženim oslobađanjem uključuju include poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil- metakrilat), iii 'poli(v nilalkohol)), polilaktide (U.S. Pat. No. 3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i 7 etil-L-glutamat, ne-razgradivi etilen-vinil acetat, razgradive polimere mlečne kiseline-glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT<™>(injektibilne mikrosfere koje se sastoje iz kompolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolid acetat), saharoza acetat izobutirat, i poli-D-(-)-3- hidroksibuterna kiselina.

[0079] Formulacije koje se koriste za in vivo davanja moraju da budu sterilne. Ovo se lako postiže, na primer, ceđenjem kroz sterilne membrane za ceđenje. Kompozicije terapeutskog antitela se generalno čuvaju u kontejneru koji ima sterilni pristupni ulaz, na primer, kesica sa intravenoznim rastvorom iii bočica koja ima zatvarač koji je probušen sa hipodermnom iglom za injekcije.

[0080] Kompozicije mogu biti u jediničnim doznim oblicima. U nekim slučajevima, jedinični dozni oblik može biti isporučen u prethodno napunjenoj posudi (npr., prethodno napunjenom špricu) korisnom za administraciju jedinične doze subjektu.

[0081] Pogodna površinski aktivna sredstva uključuju, posebno, nejonske agense, kao što su polioksietilensorbitani (npr. Tween™ 20, 40, 60, 80 ili 85) i drugi sorbitani (npr. Span™ 20, 40, 60, 80 ili 85). Kompozicije sa površinski aktivnim agensom pogodno će sadržati između 0,05 i 5% površinski aktivnog agensa, a mogu biti između 0,1 i 2,5%. Biće cenjeno da se drugi sastojci mogu dodati, na primer manitol ili drugi farmaceutski prihvatljivi nosači, ako je potrebno.

[0082] Pogodne emulzije se mogu pripremiti korišćenjem komercijalno dostupnih emulzija masti, kao što Intralipid<™>, Liposyn<™>, Infonutrol<™>, Lipofundin<™>i Lipiphysan<™>. Aktivni sastojak može biti rastvoren u prethodno pomešanoj kompoziciji emulzije ili alternativno može biti rastvoren u ulju (npr. sojino ulje, ulje šafranike, ulje semena pamuka, ulje susama, kukuruzno ulje ili bademovo ulje) i emulzija koja se formira mešanjem sa fosfolipidom (npr. fosfolipidi jaja, sojini fosfolipidi ili sojin lecitin) i vode. Prosečan stručnjak će ceniti činjenicu da se mogu dodati i drugi sastojci, na primer glicerol ili glukoza, da bi se podesila toničnost emulzije. Odgovarajuće emulzije će tipično sadržati do 20% ulja, na primer, između 5 i 20%. Emulzija masti može da sadrži kapljice masti između 0,1 i 1,0 Im, posebno 0,1 i 0,5 Im, i ima pH u opsegu od 5,5 do 8,0.

[0083] Kompozicije emulzije mogu biti one pripremljene mešanjem antitela sa Intralipid™. ili njihove komponente (sojino ulje, fosfolipidi jaja, glicerol i voda).

[0084] Ovde opisana tečna formulacija koja sadrži antitelo (npr. monoklonsko antitelo koje modulira put CGRP, anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko anti-CGRP antagonističko antitelo) može se pripremiti za bilo koji pogodan put administracije sa koncentracijom antitela u rasponu od 0,1 do 500 mg/mL, 0,1 do 375 mg/mL, 0,1 do 250 mg/mL, 0,1 do 175 mg/mL, 0,1 do 100 mg/mL, 1 mg/mL do 500 mg/mL, 1 mg/mL do 375 mg/mL, 1 mg/mL do 300 mg/mL, 1 mg/mL do 250 mg/mL, 1 mg/mL do 200 mg/mL, 1 mg/mL do 150 mg/mL, 1 mg/mL do 100 mg/mL, 10 mg/mL do 500 mg/mL, 10 mg/mL do 375 mg/mL, 10 mg/mL do 250 mg/mL, 10 mg/mL do 150 mg/mL, 10 mg/mL do 100 mg/mL, 100 mg/mL do 500 mg/mL, 100 mg/mL do 450 mg/mL, 100 mg/mL do 400 mg/mL, 100 mg/mL do 350 mg/mL, 100 mg/mL do 300 mg/mL, 100 mg/mL do 250 mg/mL, 100 mg/mL do 200 mg/mL ili 100 mg/mL do 150 mg/mL. Tečna formulacija može sadržati ovde opisano antitelo u koncentraciji od, najviše, najmanje ili manje od 0,1, 0,5, 1, 5, 10,1520, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, ili 500 mg/mL.

[0085] Formulacija antitela može da sadrži jednu ili više komponenti uključujući antitelo i druge vrste opisane na drugom mestu. Antitelo i druge komponente mogu biti u bilo kojoj pogodnoj količini i/ili bilo kojoj pogodnoj koncentraciji za terapeutsku efikasnost antitela, bezbednost i skladištenje. U jednom primeru, formulacija antitela može biti rastvor koji sadrži 51,4 mg/mL antitela (npr. antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 20 mM histidin, 0,1 mg/mL metionin, 84 mg/mL trehaloza dihidrat, 0,05 mg/mL dinatrijum EDTA dihidrat i 0,2 mg/mL polisorbat 80.

[0086] U drugom primeru, formulacija antitela može da sadrži 200 mg/mL antitela (npr., antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje modulira CGRP put), 15 mM arginin, 78 mg/mL saharoze, 0,3 mg/mL EDTA i 0,1 mg/mL polisorbat 80.

[0087] U drugom primeru, formulacija antitela može da sadrži 175 mg/mL antitela (npr. antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 20 mM glicin, 88 mg/mL trehaloza dihidrat , 0,015 mg/mL EDTA i 0,25 mg/mL polisorbat 80.

[0088] U drugom primeru, formulacija antitela može da sadrži 225 mg/mL antitela (npr., antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 23 mM asparagin, 84 mg/mL sorbitol, 0,1 mg/mL EDTA i 0,15 mg/mL polisorbat 60.

[0089] U drugom primeru, formulacija antitela može da sadrži 150 mg/mL antitela (npr. antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 17 mM asparagin, 74 mg/mL manitol, 0,025 mg/mL EDTA i 0,2 mg/mL polisorbat 80.

[0090] U drugom primeru, formulacija antitela može da sadrži 100 mg/mL antitela (npr., antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 16 mM arginin, 87 mg/mL manitol, 0,025 mg/mL EDTA i 0,15 mg/mL polisorbat 20.

[0091] U drugom primeru, formulacija antitela može da sadrži 250 mg/mL antitela (npr., antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 25 mM histidin, 74 mg/mL manitol, 0,025 mg/mL EDTA i 0,25 mg/mL polisorbat 20.

[0092] U drugom primeru, formulacija antitela može da sadrži 50 mg/mL antitela (npr. antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 19 mM arginin, 84 mg/mL saharoze, 0,05 mg/mL EDTA i 0,3 mg/mL polisorbat 80.

[0093] U drugom primeru, formulacija antitela može da sadrži 125 mg/mL antitela (npr. antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 22 mM glicin, 79 mg/mL trehaloza dihidrat , 0,15 mg/mL EDTA i 0,15 mg/mL polisorbat 80.

[0094] U drugom primeru, formulacija antitela može biti rastvor koji sadrži 175 mg/mL antitela (npr. antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 20 mM histidin, 0,1 mg/ mL metionin, 84 mg/mL trehalozu dihidrat, 0,05 mg/mL dinatrijum EDTA dihidrat i 0,2 mg/mL polisorbat 80.

[0095] U drugom primeru, formulacija antitela može da sadrži 200 mg/mL antitela (npr. antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 30 mM arginin, 78 mg/mL saharozu, 0,3 mg/mL EDTA i 0,1 mg/mL polisorbat 80.

[0096] U drugom primeru, formulacija antitela može da sadrži 175 mg/mL antitela (npr., antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 20 mM glicin, 88 mg/mL trehaloza dihidrat, 0,015 mg/mL EDTA i 0,15 mg/mL polisorbat 80.

[0097] U drugom primeru, formulacija antitela može da sadrži 150 mg/mL antitela (npr. antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 20 mM histidin, 84 mg/mL saharozu, 0,05 mg/mL EDTA i 0,2 mg/mL polisorbat 80.

[0098] U drugom primeru, formulacija antitela može da sadrži 225 mg/mL antitela (npr., antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 23 mM histidin, 84 mg/mL sorbitol, 0,1 mg/mL EDTA i 0,15 mg/mL polisorbat 60.

[0099] U narednom primeru, formulacija antitela može da sadrži 150 mg/mL antitela (npr. antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 17 mM asparagin, 74 mg/mL manitol, 0,3 mg/mL EDTA i 0,2 mg/mL polisorbat 80.

[0100] U drugom primeru, formulacija antitela može da sadrži 100 mg/mL antitela (npr. antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 16 mM arginin, 87 mg/mL manitol, 0,025 mg/mL EDTA i 0,25 mg/mL polisorbat 20.

[0101] U sledećem primeru, formulacija antitela može da sadrži 250 mg/mL antitela (npr., antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 25 mM histidin, 89 mg/mL manitol, 0,025 mg/mL EDTA i 0,25 mg/mL polisorbat 20.

[0102] U drugom primeru, formulacija antitela može da sadrži 125 mg/mL antitela (npr. antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 29 mM arginin, 84 mg/mL saharozu, 0,05 mg/mL EDTA i 0,3 mg/mL polisorbat 80.

[0103] U sledećem primeru, formulacija antitela može da sadrži 150 mg/mL antitela (npr., antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 25 mM asparagin, 84 mg/mL manitol, 0,05 mg/mL EDTA i 0,2 mg/mL polisorbat 80.

[0104] U narednom primeru, formulacija antitela može da sadrži 145 mg/mL antitela (npr., antitelo G1, drugo anti-CGRP antagonističko antitelo, monoklonsko antitelo koje moduliše CGRP put), 22 mM histidin, 72 mg/mL trehaloze dihidrat, 0,05 mg/mL EDTA i 0,1 mg/mL polisorbat 80.

[0105] Režim doziranja obuhvata administraciju doze od 225 mg subjektu jednom mesečno subkutano. Drugi primerni režim doziranja obuhvata administriranje početne doze od 675 mg subkutano, nakon čega sledi mesečna doza od 225 mg antitela subkutano. Napredak ove terapije se lako prati konvencionalnim tehnikama i testovima.

[0106] Učestalost pri kojoj se doza ili količina antitela administrira subjektu je konstantna (jednom mesečno). Doza ili količina antitela može se administrirati subkutano subjektu jednom mesečno.

[0107] U nekim realizacijama, početna doza (npr. puna doza) antitela za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom može da se administrira subjektu, nakon čega sledi administracija jedne ili više dodatnih doza u željenim intervalima koji se koriste u pronalasku. U nekim realizacijama, početna doza i jedna ili više dodatnih doza su iste doze. U nekim realizacijama, jedna ili više dodatnih doza su različite doze od početne doze. Učestalost administracije jedne ili više dodatnih doza je svakog meseca. Primer režima obuhvata početnu dozu punjenja od 675 mg anti-CGRP antagonističkog antitela administriranu supkutano, nakon čega slede naknadne doze održavanja od 225 mg antitela koje se administriraju subkutano u jednomesečnim intervalima.

[0108] Doza ili količina antitela za upotrebu u pronalasku može se podeliti u više doze i primeniti kao višestruke doze. Subkutana doza se može podeliti na više podeljenih doza i svaka od ovih doza se primenjuje na različito mesto da bi se izbegla, na primer, veća, pojedinačna subkutana injekcija na jednom mestu. Podela u više podeljenih doza može biti jednaka (npr. 4 jednake podeljene doze) ili može biti nejednaka (npr. 4 doze, dve podeljene doze dvostruko veće od ostalih podeljenih doza).

[0109] Broj doza antitela za upotrebu administriranih subjektu tokom lečenja može da varira u zavisnosti od, na primer, postizanja smanjene incidencije migrenske glavobolje kod subjekta. Na primer, broj doza administriranih tokom lečenja može biti, može biti najmanje, ili može biti najviše 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili 50. U nekim slučajevima (npr. u slučajevima kada subjekt ima hroničnu migrenu), lečenje se može davati na neodređeno vreme. U nekim slučajevima, lečenje može biti akutno tako da se subjektu za lečenje administrira najviše 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 doza.

[0110] Doza (ili više podeljenih doza) ili količina antitela za upotrebu može se formulisati u tečnoj formulaciji i administrirati subkutanom injekcijom subjektu. U takvim slučajevima, zapremina tečne formulacije koja sadrži antitelo može da varira u zavisnosti od, na primer, koncentracije antitela u tečnoj formulaciji, željene doze antitela i/ili primenjenog načina administracije. Na primer, zapremina tečne formulacije koja sadrži antitelo za upotrebu i koja se administrira subjektu može biti od 0,001 mL do 10,0 mL, 0,01 mL do 5,0 mL, 0,1 mL do 5 mL, 0,1 mL do 3 mL, 0,5 mL do 2,5 mL, ili 1 mL do 2,5 mL. Na primer, zapremina tečne formulacije koja sadrži antitelo za upotrebu i administriran subjektu može biti, može biti najmanje, može biti manja od, ili može biti najviše 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, ili 10,0 mL.

[0111] U nekim realizacijama, doza (ili više podeljenih doza) ili količina antitela za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom može biti isporučena kao tečna formulacija u prethodno napunjenim špricevima. U takvim primerima, prethodno napunjeni špricevi mogu biti dizajnirani za samoadministriranje ili za administraciju od strane drugog lica. U nekim slučajevima, prethodno napunjeni špricevi mogu biti dizajnirani za subkutanu administraciju u i/ili intravensku administraciju.

[0112] Administracija antitela za upotrebu može biti kontinuirana ili povremena, u zavisnosti, na primer, od fiziološkog stanja primaoca, da li je svrha administracije terapeutska ili profilaktička, i drugih faktora poznatih iskusnim praktičarima. Asministracija antitela može biti u suštini kontinuirana tokom unapred odabranog vremenskog perioda ili može biti u nizu vremenski raspoređenih doza, npr., bilo pre, tokom ili posle razvoja glavobolje (npr. migrene); pre; u toku; pre i posle; tokom i posle; pre i tokom; ili pre, tokom i posle razvoja glavobolje. Primena može biti pre, tokom i/ili posle bilo kog događaja koji može izazvati glavobolju.

[0113] Može biti prisutno više od jednog antitela. Može biti prisutno najmanje jedno, najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet različitih ili više antitela. Generalno, ta antitela mogu imati komplementarne aktivnosti koje ne utiču negativno jedna na drugu. Antitelo za upotrebu prema ovom pronalasku se takođe može koristiti zajedno sa drugim antagonistima CGRP ili antagonistima CGRP receptora. Na primer, može se koristiti jedan ili više od sledećih CGRP antagonista: antisens molekul usmeren na CGRP (uključujući antisens molekul usmeren na nukleinsku kiselinu koja kodira CGRP), CGRP inhibitorno jedinjenje, strukturni analog CGRP, dominantno-negativna mutacija CGRP receptora koji vezuje CGRP i antitela na receptor anti-CGRP. Antitelo se takođe može koristiti u kombinaciji sa drugim agensima koji služe za poboljšanje i/ili dopunu efikasnosti agenasa.

[0114] Dijagnoza ili procena glavobolje je dobro utvrđena u tehnici. Procena se može izvršiti na osnovu subjektivnih mera, kao što je karakterizacija simptoma pacijenta. Na primer, migrena se može dijagnostikovati na osnovu sledećih kriterijuma: 1) epizodni napadi glavobolje koji traju 4 do 72 sata; 2) sa dva od sledećih simptoma: jednostrani bol, pulsiranje, pogoršanje pri kretanju i bol umerenog ili jakog intenziteta; i 3) jedan od sledećih simptoma: mučnina ili povraćanje i fotofobija ili fonofobija. Goadsbi et al., N. Engl. J. Med.346:257-270, 2002. U nekim realizacijama, procena migrene može biti putem sati trajanja glavobolje, kao što je opisano na drugom mestu ovde. Na primer, procena migrene može biti u smislu dnevnih sati trajanja glavobolje, nedeljnih sati trajanja glavobolje, mesečnih sati trajanja glavobolje i/ili godišnjih sati trajanja glavobolje. U nekim slučajevima, sati trajanja glavobolje mogu biti kao što je prijavio subjekt.

[0115] Efikasnost tretmana se može proceniti metodama dobro poznatim u tehnici. Na primer, može se proceniti olakšanje bola. Shodno tome, ublažavanje bola se može subjektivno primetiti nakon 1, 2 ili nekoliko sati nakon primene anti-CGRP antitela. Učestalost napada glavobolje može se subjektivno posmatrati nakon primene anti-CGRP antitela za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom.

[0116] Antitelo za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom može se administrirati sa jednim ili više dodatnih agenasa(a) istovremeno ili uzastopno. Dodatni agens može da bude lek protiv glavobolje, kao što je primer leka protiv glavobolje (npr., 5-HT1 agonisti, triptani, ergot alkaloidi, opijati, β -adrenergički antagonisti, NSAID) opisani negde drugde. Terapeutski efekat može biti veći u poređenju sa upotrebom samog antitela ili jednog ili više dodatnih agenasa. Shodno tome, može se postići sinergistički efekat između antitela i jednog ili više dodatnih agenasa. Jedan ili više dodatnih agenasa(a) subjekt može uzeti profilaktički.

B. Anti-CGRP antagonistička antitela

[0117] Anti-CGRP antagonističko antitelo može se odnositi na bilo koji molekul antitela koji blokira, potiskuje ili smanjuje (uključujući značajno) biološku aktivnost CGRP, uključujući nishodne puteve posredovane CGRP signalizacijom, kao što je vezivanje receptora i/ili izazivanje ćelijskog odgovora na CGRP.

[0118] Anti-CGRP antagonističko antitelo može da pokaže bilo koju jednu ili više od sledećih karakteristika: (a) vezuje se za CGRP; (b) blokira CGRP od vezivanja za njegov(e) receptor(e); (c) blokira ili smanje aktivaciju CGRP receptora (uključujući aktivaciju cAMP); (d) inhibira biološku aktivnost CGRP ili nishodne puteve koji su posredovani CGRP signalnom funkcijom; (e) prevencija, ublažavanje ili lečenje bilo kog aspekta glavobolje (npr. migrene); (f) povećanje klirensa CGRP-a; i (g) inhibira (smanje) sintezu, proizvodnju ili oslobađanje CGRP. Anti-CGRP antagonistička antitela su poznata u tehnici. Videti npr. Tan et al., Clin. Sci. (Lond). 89:565-73, 1995; Sigma (Misuri, SAD), broj proizvoda C7113 (klon #4901); Plourde et al., Peptides 14:1225-1229, 1993

[0119] Antitelo može da reaguje sa CGRP na način koji inhibira CGRP i/ili CGRP put, uključujući nidhodne puteve koji su posredovani signalnom funkcijom CGRP. Anti-CGRP antagonističko antitelo prepoznaje humani CGRP. Anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje za humani a-CGRP i b-CGRP. Anti-CGRP antagonističko antitelo vezuje CGRP ljudi i pacova. Anti-CGRP antagonističko antitelo može da veže C-terminalni fragment koji ima aminokiseline 25-37 CGRP. Anti-CGRP antagonističko antitelo može da veže epitop C-terminala unutar aminokiselina 25-37 CGRP.

[0120] Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu prema ovom pronalasku je monoklonsko antitelo. Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom je antitelo G1 (kao što je ovde opisano).

[0121] Afinitet vezivanja (KD) antitela antagonista anti-CGRP za CGRP (kao što je humani α -CGRP) može biti oko 0,02 do oko 200 nM. Afinitet vezivanja može biti bilo koji od oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM, oko 60 pM, oko 50 pM, oko 20 pM, oko 15 pM , oko 10 pM, oko 5 pM ili oko 2 pM. U nekim realizacijama, afinitet vezivanja je manji od bilo kog od oko 250 nM, oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM ili oko 50 pM.

[0122] Jedan način određivanja afiniteta vezivanja antitela za CGRP je merenje afiniteta vezivanja monofunkcionalnih Fab fragmenata antitela. Da bi se dobili monofunkcionalni Fab fragmenti, antitelo (na primer, IgG) može da se odcepi papainom ili da se ekspresuje rekombinantno. Afinitet anti-CGRP Fab fragmenta antitela može se odrediti površinskom plazmonskom rezonancom (Biacore3000<™>sistem površinske plazmonske rezonance (SPR), , Biacore, INC, Piscataway NJ) opremljen sa prethodno imobilizovanim streptavidinskim senzorskim čipovima (SA) koristeći HBS -EP pufer (0,01M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCl, 3mM EDTA, 0,005% v/v Surfactant P20). Biotinilovani humani CGRP (ili bilo koji drugi CGRP) se može razblažiti u HBS-EP puferu do koncentracije manje od 0,5 ug/mL i ubrizgati kroz pojedinačne kanale čipa koristeći promenljivo vreme kontakta, da bi se postigla dva opsega gustine antigena, bilo 50-200 jedinica odgovora (RU) za detaljne kinetičke studije ili 800-1000 RU za skrining testove. Studije regeneracije su pokazale da 25 mM NaOH u 25% v/v etanolu efikasno uklanja vezani Fab dok zadržava aktivnost CGRP na čipu za preko 200 injekcija. Tipično, serijska razblaženja (u rasponu koncentracija od 0,1-10x procenjenih KD) prečišćenih Fab uzoraka se injektiraju tokom 1 min pri 100 µL/min i dozvoljeno je vreme disocijacije do 2 sata. Koncentracije Fab proteina se određuju pomoću ELISA i/ili SDS-PAGE elektroforeze korišćenjem poznate koncentracije Fab (kako je određeno analizom amino kiselina) kao standarda. Kinetičke brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) dobijaju se istovremeno tako što se podaci globalno uklapaju u 1:1 Langmuir binding model (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) korišćenjem programa BIAevaluation. Vrednosti ravnotežne konstante disocijacije (KD) se izračunavaju kao koff/kon. Ovaj protokol je pogodan za upotrebu u određivanju afiniteta vezivanja antitela za bilo koji CGRP, uključujući humani CGRP, CGRP drugog sisara (kao što je CGRP miša, CGRP pacova, CGRP primata), kao i različite oblike CGRP (kao što su α i β oblik). Afinitet vezivanja antitela se generalno meri na 25°C, ali se može meriti i na 37°C.

[0123] Antitela, uključujući anti-CGRP antagonistička antitela, mogu se napraviti bilo kojim metodom poznatim u tehnici. Put i raspored imunizacije životinje domaćina su generalno u skladu sa utvrđenim i konvencionalnim tehnikama za stimulaciju i proizvodnju antitela, kao što je dalje opisano ovde. Opšte tehnike za proizvodnju humanih i mišjih antitela su poznate u tehnici i ovde su opisane.

[0124] Predviđeno je da se bilo kojim subjektom sisara, uključujući ljude ili ćelije koje proizvode antitela, može manipulisati da posluži kao osnova za proizvodnju ćelijskih linija hibridoma sisara, uključujući humane. Tipično, životinja domaćin je inokulisana intraperitonealno, intramuskularno, oralno, subkutano, intraplantarno i/ili intradermalno sa količinom imunogena, uključujući kako je ovde opisano.

[0125] Hibridomi se mogu pripremiti od limfocita i besmrtnih ćelija mijeloma koristeći opštu tehniku hibridizacije somatskih ćelija Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497 ili kao što su modifikovali Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982). Dostupne linije mijeloma, uključujući ali ne ograničavajući se na X63-Ag8,653 i one sa Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA, mogu se koristiti u hibridizaciji. Generalno, tehnika uključuje fuziju ćelija mijeloma i limfoidnih ćelija korišćenjem fuzogena kao što je polietilen glikol, ili pomoću električnih sredstava koja su dobro poznata stručnjacima u ovoj oblasti. Posle fuzije, ćelije se odvajaju od fuzionog medijuma i uzgajaju u medijumu za selektivni rast, kao što je hipoksantin-aminopterintimidin (HAT) medijum, da bi se eliminisale nehibridizovane ćelije roditelja. Bilo koji od medijuma koji je ovde opisan, dopunjen sa ili bez seruma, može se koristiti za kultivisanje hibridoma koji luče monoklonska antitela. Kao druga alternativa tehnici ćelijske fuzije, EBV besmrtne (ovekovečene) B ćelije mogu se koristiti za proizvodnju monoklonskih antitela (npr. monoklonskih anti-CGRP antitela) predmetnog pronalaska. Hibridomi se proširuju i subkloniraju, po želji, a supernatanti se testiraju na anti-imunogenu aktivnost konvencionalnim postupcima imunoeseja (npr. radioimunoesej, enzimski imunoesej ili fluorescentni imunoesej).

[0126] Hibridomi koji se mogu koristiti kao izvor antitela obuhvataju sve derivate, ćelije potomstva roditeljskih hibridoma koje proizvode monoklonalna antitela specifična za CGRP, ili njihov deo.

[0127] Hibridomi koji proizvode takva antitela mogu se uzgajati in vitro ili in vivo korišćenjem poznatih procedura. Monoklonska antitela se mogu izolovati iz medijuma kulture ili telesnih tečnosti, konvencionalnim postupcima prečišćavanja imunoglobulina kao što su precipitacija amonijum sulfatom, gel elektroforeza, dijaliza, hromatografija i ultrafiltracija, po porebi. Neželjena aktivnost, ako je prisutna, može se ukloniti, na primer, stavljanjem preparata preko adsorbenata napravljenih od imunogena vezanog za čvrstu fazu i eluiranjem ili otpuštanjem željenih antitela sa imunogena. Imunizacija životinje domaćina humanim CGRP-om ili fragmentom koji sadrži ciljnu aminokiselinsku sekvencu konjugovanu sa proteinom koji je imunogen za vrstu koja se imunizuje, npr.

hemocijanin morskog puža, serumski albumin, goveđi tiroglobulin ili inhibitor tripsina soje koji koristi bifunkcionalni ili derivatizujući agens, na primer maleimidobenzoil sulfosukcinimid estar (konjugacija preko cisteinskih ostataka), N-hidroksi-sukcinimid sukcinimid (konjugacija preko ostataka lizina), glutaradhid, anhidrid sukcinske kiseline, SOCl2, ili R1N=C=NR, gde R i R1 su različite alkil grupe, može proizvesti populaciju antitela (npr. monoklonska antitela).

[0128] Popotrebi, antitelo (npr. monoklonsko ili poliklonsko anti-CGRP antagonističko antitelo) od interesa može da se sekvencirana i polinukleotidna sekvenca se zatim može klonirati u vektor za ekspresiju ili propagaciju. Sekvenca koja kodira antitelo od interesa može se održavati u vektoru u ćeliji domaćinu i ćelija domaćina se zatim može proširiti i zamrznuti za buduću upotrebu. Alternativno, antitela se mogu napraviti rekombinantno i eksprimovati korišćenjem bilo kog postupka poznatog u tehnici.

[0129] Antitela mogu biti napravljena rekombinantno tako što se prvo izoluju antitela i ćelije koje proizvode antitela od životinja domaćina, dobije se sekvenca gena i koristi se sekvenca gena za rekombinantnu ekspresiju antitela u ćelijama domaćina (npr., CHO ćelije). Drugi metod koji se može primeniti je ekspresija sekvence antitela u biljkama (npr. duvan) ili transgenom mleku. Otkriveni su postupci za ekspresiju antitela rekombinantno u biljkama ili mleku. Videti, na primer, , Peeters, et al. Vaccine 19:2756 (2001); Lonberg, N. and D. Huszar Int.Rev.lmmunol 13:65 (1995); and Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147(1999). Postupci za pravljenje derivata antitela, npr. humanizovanih, jednolančanih, itd. su poznati u tehnici.

[0130] Antitela se mogu vezati za brojne različite nosače. Nosači mogu biti aktivni i/ili inertni. Primeri dobro poznatih nosača uključuju polipropilen, polistiren, polietilen, dekstran, najlon, amilaze, staklo, prirodnu i modifikovanu celulozu, poliakrilamide, agaroze i magnetit. Priroda nosača može biti rastvorljiva ili nerastvorljiva. Stručnjaci će znati za druge pogodne nosače za vezivanje antitela, ili će biti u stanju da utvrde takve, koristeći rutinsko eksperimentisanje. U nekim realizacijama, nosač sadrži deo koji cilja miokard.

[0131] DNK koja kodira monoklonska antitela se lako izoluje i sekvencira korišćenjem konvencionalnih procedura (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance monoklonskih antitela). Hibridomske ćelije služe kao poželjni izvor takve DNK. Jednom izolovana, DNK se može staviti u ekspresione vektore (kao što su ekspresioni vektori otkriveni u PCT publikaciji br. WO 87/04462), koji se zatim transfektuju u ćelije domaćina kao što su ćelije E. coli, ćelije COS majmuna, jajnici kineskog hrčka ( CHO) ćelije, ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode imunoglobulinski protein, da bi se dobila sinteza monoklonskih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćinima. Videti, npr., PCT publikaciju br. WO 87/04462. DNK se takođe može modifikovati, na primer, zamenom kodirajuće sekvence za ljudske konstantne domene teškog i lakog lanca umesto homolognih mišjih sekvenci, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984), ili kovalentnim spajanjem celine ili dela kodirajuće sekvence imunoglobulina za neimunoglobulinski polipeptid. Na taj način se pripremaju "himerna" ili "hibridna" antitela koja imaju specifičnost vezivanja anti-CGRP monoklonskog antitela.

C. Antitelo G1 i srodna antitela, polipeptidi, polinukleotidi, vektori i ćelije domaćini [0132] Ovo otkriće obuhvata kompozicije, uključujući farmaceutske kompozicije, koje sadrže antitelo G1. Ove kompozicije mogu dalje da sadrže pogodne ekscipijente, kao što su farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti uključujući pufere, koji su dobro poznati u tehnici.

[0133] Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu karakteriše bilo koja (jedna ili više) od sledećih karakteristika: (a) vezuje se za CGRP; (b) blokira CGRP od vezivanja za njegov(e) receptor(e); (c) blokiraj ili smanjuje aktivaciju CGRP receptora (uključujući aktivaciju cAMP); (d) inhibira biološku aktivnost CGRP ili nishodne puteve posredovane CGRP signalnom funkcijom; (e) sprečava, ublažuje ili lečei bilo koji aspekt glavobolje (npr. migrene); (f) povećanje klirensa CGRP-a; i (g) inhibira (smanjuje sintezu, proizvodnju ili oslobađanje CGRP.

[0134] CDR delovi antitela G1 (uključujući Chothia i Kabat CDR) su dijagramski prikazani na Slici 5. Određivanje CDR regiona je u okviru veštine u oblasti tehnike. Podrazumeva se da CDR-ovi mogu biti kombinacija Kabat i Chothia CDR-a (koji se takođe nazivaju "kombinovani CDR-ovi" ili "prošireni CDR-ovi"). CDR-ovi mogu biti Kabat CDR-ovi. U drugim realizacijama, CDR-ovi su Chothia CDR-ovi. Drugim rečima, primeri sa više od jednog CDR, CDR-ovi mogu biti bilo koji od Kabat, Chothia, kombinovani CDR-ovi ili njihove kombinacije.

[0135] Ovde su takođe otkriveni postupci za pravljenje bilo kog od antitela korišćenih u pronalasku. Antitela korišćena u ovom pronalasku mogu se napraviti postupcima poznatim u tehnici. Na primer, antitelo se može proizvesti pomoću automatizovanog polipeptidnog sintetizatora koji koristi metod čvrste faze. Videti takođe, U.S. patent br.5,807,715; 4,816,567; i 6,331,415.

[0136] U drugoj alternativi, antitela se mogu napraviti rekombinantno korišćenjem procedura koje su dobro poznate u tehnici. U jednom aspektu, polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira varijabilne regione teškog lanca i/ili lakog lanca antitela G1 prikazane u SEQ ID NO:9 i SEQ ID NO:10. U drugom aspektu, polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:9 i SEQ ID NO:10.se klonira u jedan ili više vektora za ekspresiju ili propagaciju. Sekvenca koja kodira antitelo za upotrebu u ovom pronalasku može da se održava u vektoru u ćeliji domaćinu i ćelija domaćina se zatim može proširiti i zamrznuti za buduću upotrebu. Vektori (uključujući ekspresione vektore) i ćelije domaćini su opisani ovde u daljem tekstu.

[0137] Antitelo ili polipeptid mogu biti vezani za agens za obeležavanje (alternativno nazvano "oznaka/obeležavanje") kao što je fluorescentni molekul, radioaktivni molekul ili bilo koje druge oznake poznate u tehnici. U tehnici su poznate oznake koje generalno obezbeđuju (bilo direktno ili indirektno) signal.

[0138] Ovde su takođe otkriveni izolovani polinukleotidi koji kodiraju antitela za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom, i vektori i ćelije domaćini koje sadrže polinukleotid.

[0139] Za dve polinukleotidne ili polipeptidne sekvence se kaže da su "identične" ako je sekvenca nukleotida ili aminokiselina u dve sekvence ista kada su poređane za maksimalnu korespondenciju kao što je opisano u nastavku. Poređenja između dve sekvence se obično izvode upoređivanjem sekvenci preko prozora za poređenje da bi se identifikovali i uporedili lokalni regioni sličnosti sekvenci. „Prozor za poređenje“ kako se ovde koristi, odnosi se na segment od najmanje oko 20 susednih pozicija, obično od 30 do oko 75, 40 do oko 50, u kojima se sekvenca može uporediti sa referentnom sekvencom od istog broja susednih pozicija nakon što su dve sekvence optimalno poravnate.

[0140] Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može da se izvede korišćenjem programa Megalign u paketu bioinformatičkog softvera Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), koristeći podrazumevane parametre. Ovaj program obuhvata nekoliko šema poravnanja opisanih u sledećim referencama: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins -Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol.5, Suppl.3, pp.345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol.183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor.11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol.4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.

[0141] Poželjno je da se "procenat identiteta sekvence" određuje poređenjem dve optimalno poređane sekvence u okviru prozora poređenja od najmanje 20 pozicija, pri čemu deo polinukleotidne ili polipeptidne sekvence u prozoru za poređenje može da sadrži dodavanja ili delecije ( tj. praznine) od 20 procenata ili manje, obično 5 do 15 procenata, ili 10 do 12 procenata, u poređenju sa referentnim sekvencama (koje ne sadrže dodavanja ili delecij) za optimalno poravnanje dve sekvence. Procenat se izračunava određivanjem broja pozicija na kojima se identične baze nukleinske kiseline ili aminokiselinski ostaci pojavljuju u obe sekvence da bi se dobio broj podudarnih pozicija, deljenjem broja podudarnih pozicija sa ukupnim brojem pozicija u referentnoj sekvenci ( veličina prozora) i množenje rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identiteta sekvence.

[0142] Stručnjaci će razumeti da, kao rezultat degeneracije genetskog koda, postoji mnogo nukleotidnih sekvenci koje kodiraju polipeptid kao što je ovde opisano.

[0143] Polinukleotidi se mogu dobiti korišćenjem hemijske sinteze, rekombinantnih metoda ili PCR. Metode hemijske sinteze polinukleotida su dobro poznate u tehnici i ne moraju biti detaljno opisane ovde. Stručnjak u ovoj oblasti može da koristi sekvence ovde i komercijalni DNK sintetizator da proizvede željenu DNK sekvencu.

[0144] Za pripremu polinukleotida korišćenjem rekombinantnih metoda, polinukleotid koji sadrži željenu sekvencu može biti umetnut u odgovarajući vektor, a vektor zauzvrat može biti uveden u odgovarajuću ćeliju domaćina za replikaciju i amplifikaciju, kao što je dalje diskutovano ovde. Polinukleotidi se mogu ubaciti u ćelije domaćina na bilo koji način poznat u tehnici. Ćelije se transformišu uvođenjem egzogenog polinukleotida direktnim unosom, endocitozom, transfekcijom, F-parenjem ili elektroporacijom. Jednom uveden, egzogeni polinukleotid se može održavati unutar ćelije kao neintegrisani vektor (kao što je plazmid) ili integrisan u genom ćelije domaćina. Tako amplifikovani polinukleotid može biti izolovan iz ćelije domaćina metodama dobro poznatim u tehnici. Videti, npr., Sambrook et al. (1989).

[0145] Alternativno, PCR omogućava reprodukciju DNK sekvenci. PCR tehnologija je dobro poznata u tehnici i opisana je u U.S. Patent br.4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 i 4,683,202, kao i u PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston (1994).

[0146] RNK se može dobiti korišćenjem izolovane DNK u odgovarajućem vektoru i ubacivanjem u odgovarajuću ćeliju domaćina. Kada se ćelija replicira i DNK se transkribuje u RNK, RNK se zatim može izolovati korišćenjem metoda koje su dobro poznate stručnjacima, kao što je navedeno u Sambrook et al., (1989), na primer.

[0147] Pogodni vektori za kloniranje mogu biti konstruisani u skladu sa standardnim tehnikama, ili mogu biti izabrani od velikog broja vektora za kloniranje dostupnih u tehnici. Dok odabrani vektor za kloniranje može da varira u zavisnosti od ćelije domaćina koja je predviđena da se koristi, korisni vektori za kloniranje će generalno imati sposobnost samoreplikacije, mogu imati jednu metu (cilj) za određenu restrikcijsku endonukleazu i/ili mogu nositi gene za marker koji se može koristiti za odabir klonova koji sadrže vektor. Odgovarajući primeri uključuju plazmide i bakterijske viruse, npr., pUC18, pUC19, Bluescript (npr. pBS SK+) i njegove derivate, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNK faga i šatl vektori kao što su pSA i pSA8 šatl vektori. Ovi i mnogi drugi vektori za kloniranje dostupni su od komercijalnih proizvođača kao što su BioRad, Strategene i Invitrogen.

[0148] Ekspresioni vektori su generalno replikabilni polinukleotidni konstrukti koji sadrže polinukleotid. Podrazumeva se da ekspresioni vektor mora da budereplikabilan u ćelijama domaćina ili kao epizomi ili kao sastavni deo hromozomske DNK. Pogodni ekspresioni vektori obuhvataju, ali nisu ograničeni na plazmide, virusne vektore, uključujući adenoviruse, adenopovezane viruse, retroviruse, kozmide i ekspresione vektore otkrivene u PCT publikaciji br. WO 87/04462. Vektorske komponente mogu generalno uključivati, ali nisu ograničene na, jedno ili više od sledećeg: signalnu sekvencu; poreklo replikacije; jedan ili više gena markera; pogodni elementi za kontrolu transkripcije (kao što su promoteri, pojačivači i terminatori). Za ekspresiju (tj. translaciju), obično su takođe potrebni jedan ili više translacionih kontrolnih elemenata, kao što su mesta vezivanja ribozoma, mesta inicijacije translacije i stop kodoni.

[0149] Vektori koji sadrže polinukleotide mogu se uvesti u ćeliju domaćina bilo kojim od brojnih odgovarajućih načina, uključujući elektroporaciju, transfekciju upotrebom kalcijum hlorida, rubidijum hlorida, kalcijum fosfata, DEAE-dekstrana ili drugih supstanci; bombardovanje mikroprojektilom; lipofekcija; i infekcija (npr. gde je vektor infektivni agens kao što je virus vakcinije). Izbor uvođenja vektora ili polinukleotida često zavisi od karakteristika ćelije domaćina.

[0150] Ovde su takođe otkrivene ćelije domaćini koje sadrže bilo koji od polinukleotida opisanih ovde. Bilo koja ćelija domaćina sposobna za prekomernu ekspresiju heterologne DNK može se koristiti u svrhu izolovanja gena koji kodiraju antitelo od interesa. Neograničavajući primeri ćelija domaćina sisara uključuju, ali ne ograničavajući se na COS, HeLa i CHO ćelije. Videti takođe PCT publikaciju br. WO 87/04462. Pogodne ćelije domaćini nesisara uključuju prokariote (kao što su E. coli ili B. subtillis) i kvasce (kao što su S. cerevisae, S. pombe; ili K. lactis). Poželjno, ćelije domaćina eksprimiraju cDNK na nivou od oko 5 puta višem, poželjnije 10 puta višem, još poželjnije 20 puta višem od nivoa odgovarajućeg endogenog antitela ili proteina od interesa, ako je prisutan, u ćelijama domaćinu. Skrining ćelija domaćina za specifično vezivanje za A31-40 se vrši imunotestom ili FACS. Može se identifikovati ćelija koja prekomerno eksprimira antitelo ili protein od interesa.

D. Kompozicije

[0151] Kompozicije mogu da sadrže efikasnu količinu antitela za upotrebu prema ovom pronalasku. Primeri takvih kompozicija, kao i kako da se formulišu, takođe su opisani u ranijem odeljku i tekstu koji sledi.

[0152] Podrazumeva se da kompozicije mogu da sadrže više od jednog antitela (npr., više od jednog anti-CGRP antagonističkog antitela -- smeša anti-CGRP antagonističkih antitela koja prepoznaju različite epitope CGRP). Drugi primeri kompozicija sadrže više od jednog anti-CGRP antagonist antitela koja prepoznaju isti epitop(e), ili različite vrste anti-CGRP antagonističkih antitela koja se vezuju za različite epitope CGRP.

[0153] Kompozicija može dalje da sadrži farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijense ili stabilizatore (Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover). Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama. Terapeutska formulacija antitela može da sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, ekscipijenasa ili stabilizatora sa neograničavajućim primerima takvih vrsta koje uključuju pufere kao što su fosfatni, citratni i druge organske kiseline; soli kao što je natrijum hlorid; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni, kao što su metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol, 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline (npr. u koncentracijama od 0,1 mM do 100 mM, 0,1 mM do 1 mM, 0,01 mM do 50 mM, 1 mM do 50 mM, 1 mM do 30 mM, 1 mM do 20 mM, 10 mM do 25 mM) kao što su glicin, glutamin, metionin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helirajuće agense (npr. u koncentracijama od 0,001 mg/mL do 1 mg/mL, 0,001 mg/mL do 1 mg/mL, 0,001 mg/mL do 0,1 mg/mL, 0,001 mg/mL do 0,01 mg/mL) kao što je EDTA (npr. dinatrijum EDTA dihidrat); šećere (npr. u koncentracijama od 1 mg/mL do 500 mg/mL, 10 mg/mL do 200 mg/mL, 10 mg/mL do 100 mg/mL, 50 mg/mL do 150 mg/mL) kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; protivjoni koji stvaraju soli kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr. kompleksi Zn-proteina); i/ili nejonski surfaktanti (npr. u koncentracijama od 0,01 mg/mL do 10 mg/mL, 0,01 mg/mL do 1 mg/mL, 0,1 mg/mL do 1 mg/mL, 0,01 mg/mL do 0,5 mg/mL) kao što je TWEEN<™>(npr. polisorbat (npr. polisorbat 20, polisorbat 40, polisorbat 60, polisorbat 80)), PLURONICS<™>ili polietilen glikol (PEG). Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi su dalje opisani ovde.

[0154] Antitelo (npr., anti-CGRP antagonističko antitelo) i njegove kompozicije se takođe mogu koristiti u sprezi sa drugim agensima koji služe za poboljšanje i/ili dopunu efikasnosti agenasa.

[0155] Sledeći primeri su dati da ilustruju, ali ne i da ograničavaju pronalazak.

Primeri

Primer 1: Generisanje i karakterizacija monoklonskih antitela usmerenih protiv CGRP [0156] Stvaranje anti-CGRP antitela. Da bi se generisala anti-CGRP antitela koja imaju unakrsnu reaktivnost za CGRP pacova i ljudi, miševi su imunizovani sa 25-100 µg humanog α-CGRP ili β-CGRP konjugovanog sa KLH u adjuvansu (50 µl po jastučiću stopala, 100 µl ukupno po mišu) u različitim intervalima. Imunizacija je generalno izvedena kako je opisano u Geerligs HJ et al., 1989, J. Immunol. Methods 124:95-102; Kenney JS et al., 1989, J. Immunol. Methods 121:157-166; and Wicher K et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89:128-135. Miševi su prvo imunizovani sa 50 µg humanog α-CGRP ili β-CGRP konjugovanog sa KLH u CFA (kompletan Frojndov adjuvans). Posle 21 dana, miševi su drugi put imunizovani sa 25 µg humanog β-CGRP (za miševe koji su prvo imunizovani humanim α-CGRP) ili α-CGRP (za miševe koji su prvi imunizovani humanim β-CGRP) konjugovanim sa KLH u IFA (nepotpuni Frojndov adjuvans). Dvadeset tri dana kasnije nakon druge imunizacije, treća imunizacija je izvedena sa 25 µg α-CGRP pacova konjugovanog sa KLH u IFA. Deset dana kasnije, titri antitela su testirani pomoću ELISA. Četvrta imunizacija je izvedena sa 25 µg peptida (α-CGRP-KLH pacova) u IFA 34 dana nakon treće imunizacije. Konačna dopuna je izvedena sa 100 µg rastvornog peptida (α-CGRP pacova) 32 dana nakon četvrte imunizacije.

[0157] Splenociti su dobijeni od imunizovanog miša i fuzionisani sa NSO ćelijama mijeloma u odnosu 10:1, sa polietilen glikolom 1500. Hibridi su raspoređeni u ploče sa 96 ležista u DMEM koji sadrži 20% konjskog seruma i 2-oksaloacetat/piruvat/insulina (Sigma) i započeta je selekcija hipoksantin/aminopterin/timidinom. Osmog dana, 100 µl DMEM koji sadrži 20% konjskog seruma je dodato u sva ležišta. Supernatanti hibrida su pregledani korišćenjem imunoeseja za hvatanje antitela. Određivanje klase antitela urađeno je sa drugim antitelima specifičnim za klasu.

[0158] Panel ćelijskih linija koje proizvode monoklonska antitela je odabran na osnovu njihovog vezivanja za humani i pacovski CGRP za dalju karakterizaciju. Ova antitela i karakteristike su prikazane ispod u tabelama 2 i 3

[0159] Prečišćavanje i priprema Fab fragmenta. Monoklonska antitela odabrana za dalju karakterizaciju su prečišćena iz supernatanata kultura hibridoma korišćenjem afinitetne hromatografije za protein A. Supernatanti su ekvilibrisani na pH 8. Supernatanti su zatim naneti na kolonu MabSelect proteina A (Amersham Biosciences # 17-5199-02) ekvilibrisnu sa PBS do pH 8. Kolona je isprana sa 5 zapremina kolone PBS, pH 8. Antitela su eluirana sa 50 mM citratfosfatnim puferom, pH 3. Eluirana antitela su neutralizovana sa 1M fosfatnim puferom, pH 8. Prečišćena antitela su dijalizovana sa PBS, pH 7,4. Koncentracije antitela su određene pomoću SDS-PAGE, korišćenjem standardne krive mišjih monoklonskih antitela.

[0160] Fab su pripremljene papainskom proteolizom celih antitela korišćenjem kompleta Immunopure Fab (Pierce # 44885) i prečišćene protokom kroz protein A hromatografiju prema uputstvima proizvođača. Koncentracije su određene ELISA i/ili SDS-PAGE elektroforezom korišćenjem standardne Fab poznate koncentracije (određene analizom aminokiselina), i pomoću A280 korišćenjem 1OD=0,6 mg/ml (ili teorijskog ekvivalenta baziranog na aminokiselinskoj sekvenci) .

[0161] Određivanje afiniteta Fabs. Afiniteti anti-CGRP monoklonskih antitela su određeni na 25°C ili 37°C korišćenjem Biacore3000™ površinske plazmonske rezonance (SPR) sistema (Biacore, INC, Piscataway NJ) sa sopstvenim puferom za rad, HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v polisorbat P20). Afinitet je određen hvatanjem N-terminalno biotinilovanih CGRP peptida (po narudžbini od GenScript Corporation, New Jersey ili Global Peptide Services, Colorado) preko prethodno imobilizovanog streptavidina na SA čipu i merenjem kinetike vezivanja antitela Fab titriranih preko površine CGRP. Biotinilovani CGRP je razblažen u HBS-EP i ubrizgan preko čipa u koncentraciji manjoj od 0,001 mg/ml. Koristeći promenljivo vreme protoka kroz pojedinačne kanale čipa, postignuta su dva opsega gustine antigena: <50 jedinica odgovora (RU) za detaljne kinetičke studije i oko 800 RU za studije koncentracije i skrining. Dvostruka ili trostruka serijska razblaženja tipično u koncentracijama u rasponu od 1 µM - 0,1 nM (usmeren na 0,1-10x procenjenih KD) prečišćenih Fab fragmenata su injektirana tokom 1 minuta pri 100 µL/min i dozvoljeno je vreme disocijacije od 10 minuta. Posle svakog ciklusa vezivanja, površine su regenerisane sa 25 mM NaOH u 25% v/v etanolu, što je tolerisano tokom više stotina ciklusa. Kinetička brzina asocijacije (kon) i brzina disocijacije (koff) su dobijene istovremeno prilagođavanjem podataka Langmuir-ovom modelu vezivanja ((Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6.99-110) korišćenjem programa BIAevaluation. Ukupne ravnotežne konstante disocijacije (KD) ili "afiniteti" su izračunate iz odnosa KD= koff/kon. Afiniteti mišjih Fab fragmenata su prikazani u tabelama 2 i 3.

[0162] Mapiranje epitopa mišjih anti-CGRP antitela. Za određivanje epitopa za koji se anti-CGRP antitela vezuju na humani α -CGRP, mereni su afiniteti vezivanja Fab fragmenata za različite CGRP fragmente kako je gore opisano hvatanjem N-terminalno biotinilovanih CGRP fragmenata aminokiselina 19-37 i aminokiselina 25-37 na SA senzorskom čipu. Slika 1 prikazuje njihove afinitete vezivanja merene na 25°C. Kao što je prikazano na slici 1, sva antitela, osim antitela 4901, vezuju se za humane α -CGRP fragmente 19-37 i 25-37 sa afinitetom sličnim njihovom afinitetu vezivanja za humani α -CGRP pune dužine (1-37). Antitelo 4901 se vezuje za humani α -CGRP fragment 25-37 sa šest puta manjim afinitetom nego što se vezuje za ljudski α -CGRP fragment pune dužine, uglavnom zbog smanjenja veličine off-rate. Podaci pokazuju da se ova anti-CGRP antitela generalno vezuju za C-terminalni kraj CGRP.

[0163] Skeniranje alaninom je izvedeno da bi se dalje karakterisale aminokiseline u humanom α -CGRP uključenim u vezivanje anti-CGRP antitela. Različite varijante humanog α -CGRP sa pojedinačnim supstitucijama alanina generisane su sintezom peptida. Njihove aminokiselinske sekvence su prikazane u tabeli 4 zajedno sa svim ostalim peptidima korišćenim u Biacore analizi. Afiniteti Fab fragmenata anti-CGRP antitela prema ovim varijantama su određeni korišćenjem Biacore kao što je prethodno opisano. Kao što je prikazano na slici 1, svih 12 antitela cilja na C-terminalni epitop, pri čemu je aminokiselina F37 najvažniji ostatak. Mutacija F37 na alanin značajno je smanjila afinitet ili čak potpuno poništila vezivanje anti-CGRP antitela za peptid. Sledeći najvažniji aminokiselinski ostatak je G33, međutim, samo antitela visokog afiniteta (7E9, 8B6, 10A8 i 7011) su bila pogođena zamenom alanina na ovoj poziciji. Aminokiselinski ostatak S34 takođe igra značajnu, ali manju ulogu u vezivanju ova četiri visoko afinitetna antitela.

Tabela 2. Karakteristike vezivanja anti-CGRP monoklonskih antitela za humani α-CGRP i njihova antagonistička aktivnost

Tabela 3. Karakteristike vezivanja anti-CGRP monoklonskih antitela za α -CGRP pacova i aktivnost antagonista

Tabela 4. Sekvence aminokiselina humanih α -CGRP fragmenata (SEQ ID NOS:15-40) i srodnih peptida (SEQ ID NOS:41-47). Svi peptidi su C-terminalno amidovani izuzev SEQ ID NOS:36-40. Ostaci označeni masnim ukazuju na tačkaste mutacije.

ID

Primer 2: Pretraživanje anti-CGRP antagonističkih antitela upotrebom in vitro testova [0164] Mišja anti-CGRP antitela su dalje pretraživana za antagonističku aktivnost in vitro upotrebom testa ćelijski zasnovane aktivacije cAMP i testa vezivanja.

[0165] Aktivnost antagonista merena cAMP testom. Pet mikrolitara humanog ili pacovskog α -CGRP (konačna koncentracija 50 nM) u prisustvu ili odsustvu anti-CGRP antitela (finalna koncentracija 1-3000 nM), ili α -CGRP pacova ili humanog α -CGRP (konačna koncentracija 0,1 nM -10 µM; kao pozitivna kontrola za aktivaciju c-AMP) je raspoređeno na ploču sa 384 ležišta (Nunc, Cat. No. 264657). Deset mikrolitara ćelija (humani SK-N-MC ako se koristi humani α -CGRP, ili pacovski L6 iz ATCC ako se koristi α -CGRP pacova) u puferu za stimulaciju (20 mM HEPES, pH 7,4, 146 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2i 500 uM 3-izobutil-1-metilksantina (IBMKS)) su dodati u ležipta na ploči. Ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi 30 min.

[0166] Posle inkubacije, cAMP aktivacija je izvedena korišćenjem testa HitHunter<™>Enzyme Fragment Complementation Assay (Applied Biosystems) prema uputstvu proizvođača. Test se zasniva na genetski modifikovanom enzimu β -galaktozidaze koji se sastoji od dva fragmenta -nazvanih Enzim Akceptor (EA) i Enzim Donor (ED). Kada se dva fragmenta razdvoje, enzim je neaktivan. Kada su fragmenti zajedno, oni mogu spontano da se rekombinuju da bi formirali aktivni enzim procesom koji se naziva komplementacija. EFC platforma za analizu koristi ED-cAMP peptidni konjugat u kome se cAMP prepoznaje pomoću anti-cAMP. Ovaj ED fragment je sposoban da se ponovo poveže sa EA da bi formirao aktivni enzim. U testu, anti-cAMP antitelo je optimalno titrirano da veže konjugat ED-cAMP i inhibira formiranje enzima. Nivoi cAMP u uzorcima ćelijskog lizata se takmiče sa konjugatom ED-cAMP za vezivanje za anti-cAMP antitelo. Količina slobodnog ED konjugata u testu je proporcionalna koncentraciji cAMP. Prema tome, cAMP se meri formiranjem aktivnog enzima koji se kvantifikuje prometom luminiscentnog supstrata β -galaktozidaze. Test aktivacije cAMP je izveden dodavanjem 10 µl pufera za lizu i anti-cAMP antitela (odnos 1:1) nakon čega je usledila inkubacija na sobnoj temperaturi tokom 60 min. Zatim je u svako ležište dodato 10 µl ED-cAMP reagensa i inkubirano 60 minuta na sobnoj temperaturi. Posle inkubacije, 20 µl smeše EA reagensa i CL (koja sadrži supstrat) (odnos 1:1) je dodato u svaki bunar i inkubirano 1-3 sata ili preko noći na sobnoj temperaturi. Ploča je očitana pri 1 sekundi/ležištu na PMT instrumentu ili 30 sekundi/mestu na snimaču. Antitela koja inhibiraju aktivaciju cAMP pomoću α -CGRP su identifikovana (označena sa "da") u Tabelama 2 i 3 iznad. Podaci u tabelama 2 i 3 pokazuju da antitela koja su pokazala antagonističku aktivnost u testu generalno imaju visok afinitet. Na primer, antitela koja imaju KD(određena na 25°C) od oko 80 nM ili manje za humani α -CGRP ili koja imaju KD(određena na 37°C) od oko 47 nM ili manje za α -CGRP pacova, pokazala su antagonističku aktivnost u ovom esej.

[0167] Test vezivanja radioliganda. Test vezivanja je izveden da bi se izmerio IC50anti-CGRP antitela u blokiranju vezivanja CGRP za receptor kao što je prethodno opisano. Zimmermann et al., Peptides 16:421-4, 1995; Mallee et al., J. Biol. Chem.277:14294-8, 2002. Membrane (25 µg) iz SK-N-MC ćelija su inkubirane 90 minuta na sobnoj temperaturi u inkubacionom puferu (50 mM Tris-HCL, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 0,1% BSA ) koji sadrži 10 pM<125>I- humanog α -CGRP u ukupnoj zapremini od 1 mL. Da bi se odredile koncentracije inhibicije (IC50), antitela ili neobeleženi CGRP (kao kontrola), iz oko 100 puta većeg osnovnog rastvora rastvoreni su u različitim koncentracijama u inkubacionom puferu i inkubirani u isto vreme sa membranama i 10 pM<125>I -humanog α -CGRP. Inkubacija je prekinuta filtracijom kroz filter od staklenih mikrovlakana (GF/B, 1 µm) koji je blokiran dodatkom 0,5% polietilemimina. Krive odgovora na dozu su ucrtane i vrednosti Kisu određene korišćenjem jednačine: Ki= IC50/(1+([ligand]/KD); gde je konstanta ravnoteže disocijacije KD= 8 pM za humani α -CGRP prema CGRP1 receptoru kao što je prisutna u SK-N-MC ćelijama, i Bmax=0,025 pmol/mg proteina.Prijavljena vrednost IC50(u smislu IgG molekula) je pretvorena u mesta vezivanja (množenjem sa 2) tako da se može uporediti sa afinitetima (KD) koje je odredio Biacore (videti tabelu 2).

[0168] Tabela 2 pokazuje IC50mišjih antitela 7E9, 8B6, 6H2 i 4901. Podaci pokazuju da afinitet antitela generalno korelira sa IC50: antitela sa višim afinitetom (niže vrednosti KD) imaju niži IC50u testu vezivanja radioliganda.

Primer 3: Efekat anti-CGRP antagonističkih antitela na vazodilataciju kože koja je indukovana stimulacijom safenog nerva pacova

[0169] Da bi se testirala antagonistička aktivnost anti-CGRP antitela, efekat antitela na vazodilataciju kože stimulacijom safenog nerva pacova je testiran korišćenjem prethodno opisanog modela pacova. Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110:772-776, 1993. U ovom modelu pacova, električna stimulacija safenog nerva indukuje oslobađanje CGRP iz nervnih završetaka, što dovodi do povećanja protoka krvi u koži. Protok krvi u koži stopala mužjaka Sprague Dawley pacova (170-300 g, od Charles River Hollister) meren je nakon stimulacije safenog nerva. Pacovi su održavani pod anestezijom sa 2% izoflurana. Bretilijum tozilat (30 mg/kg, administriran i.v.) je dat na početku eksperimenta da bi se minimizirala vazokonstrikcija usled istovremene stimulacije simpatičkih vlakana safenoznog nerva. Telesna temperatura je održavana na 37°C upotrebom rektalne sonde koja je termostatski povezana sa grejnom podlogom sa kontrolisanom temperaturom. Jedinjenja uključujući antitela, pozitivnu kontrolu (CGRP 8-37) i nosač (PBS, 0,01% Tween 20) davani su intravenozno kroz desnu femoralnu venu, osim eksperimenta prikazanog na slici 3, kroz repnu venu ubrizgano je testirano jedinjenje i kontrola, a za eksperimente prikazane na slikama 2A i 2B, antitela 4901 i 7D11 su ubrizgana intraperitonealno (IP). Pozitivno kontrolno jedinjenje CGRP 8-37 (antagonist vazodilatacije), zbog svog kratkog poluživota, dato je 3-5 minuta pre nervne stimulacije kao 400 nmol/kg (200 µl). Tan et al., Clin. Sci. 89:656-73, 1995. Antitela su davana u različitim dozama (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, i 25 mg/kg).

[0170] Za eksperimente prikazane na slikama 2A i 2B, antitelo 4901 (25 mg/kg), antitelo 7D11 (25 mg/kg) ili nosač kao kontrola (PBS sa 0,01% Tween 20) je administrirano intraperitonealno (IP) 72 sati pre stimulacije električnim impulsom. Za eksperiment prikazan na slici 3, antitelo 4901 (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg ili 25 mg/kg) ili nosač kao kontrola (PBS sa 00,01% Tween 20) je administrirano intravenozno 24 sati pre stimulacije pulsnim električnim impulsom. Nakon administracije antitela ili kontrole nosača, safeni nerv desnog zadnjeg ekstremiteta je hirurški izložen, presečen proksimalno i prekriven plastičnom folijom da bi se sprečilo sušenje. Laserska Doppler sonda je postavljena preko medio-dorzalne strane kože zadnje šape, što je region inerviran safenoznim nervom. Protok krvi u koži, meren kao flux krvnih ćelija, praćen je laserskim Doppler meračem protoka. Kada je uspostavljen stabilan osnovni fluks (manje od 5% varijacije) u trajanju od najmanje 5 minuta, nerv je stavljen preko platinastih bipolarnih elektroda i električno stimulisan sa 60 impulsa (2 Hz, 10 V, 1 ms, tokom 30 sekundi) a zatim ponovo 20 minuta kasnije. Kumulativna promena protoka krvi u koži procenjena je površinom ispod krive fluks-vreme (AUC, koja je jednaka promeni fluksa pomnoženoj sa promenom u vremenu) za svaki odgovor fluksa na stimulaciju električnim impulsom. Uzet je prosek odgovora krvotoka na dve stimulacije. Životinje su držane pod anestezijom u periodu od jednog do tri sata.

[0171] Kao što je prikazano na Slici 2A i Slici 2B, povećanje protoka krvi stimulisano primenom elektronskih impulsa na safeni nerv je inhibirano prisustvom CGRP 8-37 (400 nmol/kg, administrirano i.v.), antitela 4901 (25 mg/kg). , administrirano ip) ili antitela 7D11 (25 mg/kg, primenjeno ip) u poređenju sa kontrolom. CGRP 8-37 je primenjen 3-5 min pre stimulacije safenog nerva; i antitela su administrirana 72 sata pre stimulacije safenog nerva. Kao što je prikazano na slici 3, povećanje protoka krvi stimulisano primenom elektronskih impulsa na nerv safenusa inhibirano je prisustvom antitela 4901 u različitim dozama (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg i 25 mg/ kg) primenjene intravenozno 24 h pre stimulacije safenog nerva.

[0172] Za eksperimente prikazane na slikama 4A i 4B, safeni nerv je hirurški izložen pre administracije antitela. Safeni nerv desnog zadnjeg ekstremiteta je hirurški otkriven, presečen proksimalno i prekriven plastičnom folijom da bi se sprečilo sušenje. Laserska Doppler sonda je postavljena preko medio-dorzalne strane kože zadnje šape, što je region inerviran safenim nervom. Protok krvi u koži, meren kao protok krvnih ćelija, praćen je laserskim Doppler meračem protoka. Trideset do četrdeset pet minuta nakon injekcije bretilijum tozilata, kada je uspostavljen stabilan osnovni fluks (manje od 5% varijacije) tokom najmanje 5 minuta, nerv je stavljen preko platinastih bipolarnih elektroda i električno stimulisan (2Hz, 10V, 1 ms, tokom 30 sekundi) i ponovo nakon 20 minuta. Prosek odgovora protoka krvi na ove dve stimulacije je korišćen da se utvrdi osnovni odgovor (vreme 0) na električnu stimulaciju. Antitelo 4901 (1 mg/kg ili 10 mg/kg), antitelo 7E9 (10 mg/kg), antitelo 8B6 (10 mg/kg) ili nosač (PBS sa 0,01% Tween 20) su zatim administrirani intravenski (i.v. ). Nerv je zatim stimulisan (2Hz, 10V, 1 ms, tokom 30 sekundi) na 30 min, 60 min, 90 min i 120 min nakon administracije antitela ili nosača. Životinje su držane pod anestezijom u periodu od približno tri sata. Kumulativna promena protoka krvi u koži procenjena je površinom ispod krive fluks-vreme (AUC, koja je jednaka promeni fluksa pomnoženoj sa promenom vremena) za svaki odgovor fluksa na stimulaciju električnog impulsa.

[0173] Kao što je prikazano na slici 4A, povećanje protoka krvi stimulisano primenom elektronskih impulsa na nerv safenusa je značajno inhibirano prisustvom antitela 4901 1 mg/kg administrirano i.v., kada je primenjena elektronska pulsna stimulacija na 60 min, 90 min i 120 min nakon administracije antitela, i povećanje protoka krvi stimulisano primenom elektronskih impulsa na nerv safenusa je značajno inhibirano prisustvom antitela 490110 mg/kg administriranog i.v., kada je primenjena elektronska pulsna stimulacija na 30 min, 60 min, 90 min. i 120 minuta nakon administriranog antitela. Slika 4B pokazuje da je povećanje protoka krvi stimulisano primenom elektronskih impulsa na nerv safenusa značajno inhibirano prisustvom antitela 7E9 (10 mg/kg, administrirano i.v.) kada je primenjena elektronska pulsna stimulacija na 30 min, 60 min, 90 min i 120 minuta nakon primene antitela, i prisustvom antitela 8B6 (10 mg/kg, administrirano i.v.) kada je primenjena elektronska pulsna stimulacija 30 minuta nakon administracije antitela.

[0174] Ovi podaci ukazuju na to da su antitela 4901, 7E9, 7D11 i 8B6 efikasna u blokiranju aktivnosti CGRP mereno vazodilatacijom kože izazvanom stimulacijom nerva safenusa pacova.

Primer 4. Karakterizacija anti-CGRP antitela G1 i njegovih varijanti

[0175] Aminokiselinske sekvence za varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca anti-CGRP antitela G1 prikazane su na Slici 5. Sledeće metode su korišćene za ekspresiju i karakterizaciju antitela G1 i njegovih varijanti.

[0176] Korišćen ekspresioni vektor. Ekspresija Fab fragmenta antitela bila je pod kontrolom IPTG inducibilnog lacZ promotora sličnog onom opisanom u Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg. 2,10. Vector pComb3X), međutim, modifikacije su uključivale dodavanje i ekspresiju sledećih dodatnih domena: konstantni domen humanog lakog lanca kapa i CH1 konstantni domen IgG2 humanog imunoglobulina, Ig gama-2 lanac C regiona, proteina pristupnog broja P01859; laki lanac kapa imunoglobulina (homosapiens), proteina pristupnog broja CAA09181.

[0177] Dobijanje Fab u maloj razmeri. Iz E. Coli transformisane (bilo korišćenjem TG1 ćelija kompetentnih za elektroporaciju ili hemijski kompetentnih Top 10 ćelija) sa bibliotekom Fab, pojedinačne kolonije su korišćene za inokulaciju obe matične ploče (agar LB karbenicilin (50 ug/mL) 2% glukoze) i radnu ploču (2 mL/ležištu, 96 otvora/ploči) gde je svako ležište sadržalo 1,5 mL LB karbenicilin (50 ug/mL) 2% glukoze. Na ploču je naneta lepljiva zaptivka koja propušta gas (ABgene, Surrey, UK). Obe ploče su inkubirane na 30°C tokom 12-16h; radna ploča je snažno protrešena. Glavna ploča je čuvana na 4°C do potrebe, dok su ćelije sa radne ploče peletirane (4000 rpm, 4°C, 20 min) i resuspendovane u 1,0 mL LB karbenicilin (50 ug/mL) 0 ,5 mM IPTG da izazove ekspresiju Fabs snažnim mućkanjem tokom 5 h na 30°C. Indukovane ćelije su centrifugirane na 4000 rpm, 4°C tokom 20 minuta i resuspendovane u 0,6 mL Biacore HB-SEP pufera (10 mM Hepes pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% P/v) . Liza resuspendovanih HB-SEP ćelija je postignuta zamrzavanjem (-80°C), a zatim odmrzavanjem na 37°C. Ćelijski lizati su centrifugirani na 4000 obrtaja u minuti, 4°C tokom 1 sata da bi se odvojili ostaci od supernatanata koji sadrže Fab, koji su zatim filtrirani (0,2 um) korišćenjem Millipore MultiScreen Assay System za filtriranje ploče sa 96-ležišta i vakuumskog kolektora. Biacore je korišćen za analizu filtriranih supernatanata ubrizgavanjem kroz CGRP na senzorskom čipu.

Afinitetno odabrani klonovi koji eksprimiraju Fabs su spašeni sa matične ploče, koja je obezbedila templat DNK za PCR, sekvenciranje i pripremu plazmida.

[0178] Dobijanje Fab u većoj razmeri. Da bi se dobili kinetički parametri, Fabs su eksprimirani u većoj razmeri na sledeći način. Erlenmajeri koje sadrže 150 mL LB karbenicilin (50 ug/mL) 2% glukoze su inokulisani sa 1 mL "starter" kulture preko noći iz afinitetno-selektovanog klona E. Coli koji eksprimira Fab. Ostatak starter kulture (~3 mL) je korišćen za pripremu plazmidne DNK (QIAprep mini-prep, Qiagen kit) za sekvenciranje i dalji rad. Velika kultura je inkubirana na 30°C uz snažno mućkanje dok nije postignut OD600nmod 1,0 (obično 12-16 h). Ćelije su peletirane centrifugiranjem na 4000 rpm, 4°C tokom 20 minuta, i resuspendovane u 150 mL LB karbenicilin (50 ug/mL) 0,5 mM IPTG. Posle 5 h eksprimovanja na 30°C, ćelije su peletirane centrifugiranjem na 4000 rpm, 4°C tokom 20 minuta, resuspendovane u 10 mL Biacore HBS-EP pufera i lizirane ciklusom jednog zamrzavanja(-80°C)/odmrzavanja (37 °C). Ćelijski lizati su peletirani centrifugiranjem na 4000 rpm, 4°C tokom 1 sata, a supernatant je sakupljen i profiltriran (0,2 um). Profiltrirani supernatanti su nanetii na Ni-NTA superflov sefaroze (Qiagen, Valencia. CA) kolone ekvilibrisane sa PBS, pH 8, zatim isprane sa 5 zapremina kolone PBS, pH 8. Pojedinačne Fabs eluirane u različitim frakcijama sa PBS (pH 8) 300 mM imidazola. Frakcije koje sadrže Fabs su objedinjene i dijalizirane u PBS, zatim kvantifikovane pomoću ELISA pre karakterizacije afiniteta.

[0179] Dobijanje celih antitela. Za ekspresiju celih antitela, varijabilni regioni teškog i lakog lanca su klonirani u ekspresionim vektorima sisara i transfektovani korišćenjem lipofektamina u HEK 293 ćelije za prolaznu ekspresiju. Antitela su prečišćena upotrebom proteina A korišćenjem standardnih metoda.

[0180] Vektor pDb.CGRP.hFcGI je ekspresioni vektor koji sadrži teški lanac G1 antitela, i pogodan je za prolaznu ili stabilnu ekspresiju teškog lanca. Vektor pDb.CGRP.hFcGI ima nukleotidne sekvence koje odgovaraju sledećim regionima: region promotera mišjeg citomegalovirusa (nukleotidi 7-612); sintetički intron (nukleotidi 613-1679); region kodiranja DHFR (nukleotidi 688-1253); signalni peptid humanog hormona rasta (nukleotidi 1899-1976); varijabilni region teškog lanca G1 (nukleotidi 1977-2621); konstantni region teškog lanca humanog IgG2 koji sadrži sledeće mutacije: A330P331 do S330S331 (numeracija aminokiselina u odnosu na sekvencu divljeg tipa IgG2; videti Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624). Vektor pDb.CGRP.hFcGI je deponovan u ATCC 15 jula 2005 i dodeljen mu je ATCC pristupni broj PTA-6867.

[0181] Vektor pEb.CGRP.hKGI je vektor ekspresije koji sadrži laki lanac G1 antitela, i pogodan je za prolaznu ekspresiju lakog lanca. Vektor pEb.CGRP.hKGI ima nukleotidne sekvence koje odgovaraju sledećim regionima: region promotera mišjeg citomegalovirusa (nukleotidi 2-613); humani EF-1 intron (nukleotidi 614-1149); signalni peptid humanog hormona rasta (nukleotidi 1160-1237); varijabilni region lakog lanca antitela G1 (nukleotidi 1238-1558); konstantni region humanog kapa lanca (nukleotidi 1559-1882). Vektor pEb.CGRP.hKGI je deponovan u ATCC 15 jula 2005 i dodeljen mu je ATCC pristupni broj PTA-6866.

[0182] Biacore test za određivanje afiniteta. Afiniteti G1 monoklonskog antitela i njegovih varijanti su određeni na 25°C ili 37°C korišćenjem Biacore3000™ površinskog plazmonskog rezonantnog (SPR) sistema (Biacore, INC, Piscataway NJ). Afinitet je određen hvatanjem N-terminalno biotinilovanog CGRP ili fragmenata preko preimobilizovanog streptavidina (SA senzorski čip) i merenjem kinetike vezivanja fragmenata antitela G1 Fab ili varijanti titriranih preko CGRP ili fragmenta na čipu. Svi Biacore testovi su izvedeni u HBS-EP puferu za analizu (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v polisorbata P20). Površine CGRP-a su pripremljene razblaživanjem N-biotinilovanog CGRP-a do koncentracije manje od 0,001 mg/mL u HBS-EP pufer i ubrizgavanjem preko SA senzorskog čipa koristeći promenljiva vremena kontakta. Površine niskog kapaciteta, koje odgovaraju nivoima hvatanja <50 jedinica odgovora (RU) korišćene su za kinetičke studije visoke rezolucije, dok su površine visokog kapaciteta (oko 800 RU uhvaćenog CGRP) korišćene za studije koncentracije, skrining i određivanje afiniteta rastvora. Kinetički podaci su dobijeni razblaživanjem antitela G1 Fab serijskim u porastu od dva ili tri puta do koncentracija u rasponu od 1 uM-0,1 nM (u cilju 0,1-10x procenjenih KD). Uzorci su tipično injektirani 1 minut pri 100 µL/min i dozvoljeno je vreme disocijacije od najmanje 10 minuta. Posle svakog ciklusa vezivanja, površine su regenerisane sa 25 mM NaOH u 25% v/v etanolu, što je tolerisano tokom nekoliko stotina ciklusa. Celokupna serija titracije (obično generisana u duplikatu) je generalno prilagođena 1:1 Langmuir-ovom modelu vezivanja korišćenjem programa BIAevaluation. Ovo je vratilo jedinstveni par konstanti kinetičke brzine asocijacije i disocijacije koni koff) za svaku interakciju vezivanja, čiji je odnos dao konstantu ravnoteže disocijacije (KD= koff/kon). Ovako utvrđeni afiniteti (vrednosti KD) navedeni su u tabelama 6 i 7.

[0183] Analiza visoke rezolucije interakcija sa ekstremno sporim brzinama vezivanjima molekula od interesa za ciljani molekul . Za interakcije sa ekstremno sporim vezivanjima (posebno, antitelo G1 Fab koje se vezuje za humani α -CGRP na čipu na 25°C), afiniteti su dobijeni u eksperimentu iz dva dela. Protokol koji je prethodno opisan je korišćen sa sledećim modifikacijama. Konstanta brzine asocijacije (kon) je određena ubrizgavanjem dvostrukih serija titracije (u duplikatu) koja obuhvata 550 nM-1 nM tokom 30 sekundi pri 100 uL/min i dozvoljavajući samo fazu disocijacije od 30 sekundi. Konstanta brzine disocijacije (koff) određena je ubrizgavanjem tri koncentracije (visoke, srednje i niske) iste serije titracije u duplikatu tokom 30 sekundi i omogućavanjem faze disocijacije od 2 sata. Afinitet (KD) svake interakcije je dobijen kombinovanjem vrednosti koni koffdobijenih u oba tipa eksperimenata, kao što je prikazano u tabeli 5.

[0184] Određivanje afiniteta rastvora pomoću Biacore. Afinitet rastvora antitela G1 za α -CGRP pacova i F37A (19-37) humani α -CGRP je meren pomoću Biacore na 37°C. Korišćena je površina CGRP čipa visokog kapaciteta (za potrebe detekcije izabran je humani α -CGRP visokog afiniteta) i HBS-EP pufer za analizu sa brzinom protoka od 5 uL/min. Fragment antitela G1 Fab u konstantnoj koncentraciji od 5 nM (sa ciljem da bude na ili ispod očekivanog KDinterakcije bazirane na rastvoru) je prethodno inkubiran sa kompetivnim peptidom, bilo α -CGRP pacova ili F37A (19-37) humanim α-CGRP, u konačnim koncentracijama koje se kreću od 1 nM do 1 uM u trostrukim serijskim razblaženjima. Rastvori antitela G1 Fab u odsustvu ili prisustvu konkurentnog peptida baziranog na rastvoru, ubrizgani su preko CGRP na čipu i praćena je deplecija odgovora vezivanja detektovano na površini čipa kao rezultat kompetitivnosti rastvora. Ovi odgovori vezivanja su konvertovani u " koncentracije koje ne sadrže Fab" korišćenjem kalibracione krive, koja je konstruisana titriracijom samo antitela G1 Fab (5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,325 i 0 nM) preko CGRP na čipu. " Koncentracije koje ne sadrže Fab" su ucrtane u odnosu na koncentraciju kometitivnog peptida baziranog na rastvoru koji se koristi za generisanje svake tačke podataka i fitovanje u afinitetni model rastvora korišćenjem softvera BIAevaluation. Afiniteti rastvora određeni (indirektno) na ovaj način prikazani su u tabelama 5 i 7 i korišćeni su za validaciju afiniteta dobijenih kada se Fabs ubrizgavaju direktno preko N-biotinilovanih CGRP na SA čipu. Blisko slaganje između afiniteta utvrđenih ovim dvema metodama potvrđuje da vezivanje N-biotinilovane verzije CGRP-a na čip ne menja njegovu aktivnost vezivanja nativnog rastvora.

[0185] Tabela 5 ispod pokazuje afinitete vezivanja antitela G1 za humani α -CGRP, humani β -CGRP, α -CGRP pacova i β -CGRP pacova koji su određeni pomoću Biacore, protokom Fab fragmenata kroz N-biotinilovane CGRP na SA čip. Da bi se bolje razrešili afiniteti interakcija vezivanja sa ekstremno sporim brzinama, afiniteti su takođe određeni u dvodelnom eksperimentu kako bi se dopunila ova orijentacija testa, afinitet za rastvor α - CGRP interakcije pacova je takođe određen (kao što je gore opisano). Blisko slaganje afiniteta izmerenih u obe orijentacije testa potvrđuje da se afinitet vezivanja prirodnog pacova α--CGRP u rastvoru ne menja kada je N-biotinilovan i vezan za SA čip.

Tabela 5. Afiniteti vezivanja antitela G1 Fabs titrirani preko CGRP-a na čipu

[0186] Tabela 6 ispod pokazuje antitela koja imaju varijaciju aminokiselinske sekvence u poređenju sa antitelom G1 i njihove afinitete prema α-CGRP pacova i humanom α-CGRP. Sve aminokiselinske supstitucije varijanti prikazanih u tabeli 6 su opisane u odnosu na sekvencu G1. Pomoću Biacore određeni su afiniteti vezivanja Fab fragmenata tako što ih je propustako kroz CGRP na SA čipu.

Tabela 6. Aminokiselinske sekvence i podaci o afinitetu vezivanja za varijante antitela G1 određene pmoću Biacore na 37°C

[0187] Da bi se odredio epitop na humanom α -CGRP koji je prepoznat od strane antitela G1, korišćeni su Biacore testovi opisani iznad. humani α -CGRP je kupljen kao N-biotinilovana verzija da bi se omogućilo njegovo hvatanje visokog afiniteta preko SA senzorskih čipova. Određeno je vezivanje G1 Fab fragmenta za humani α -CGRP na čipu u odsustvu ili prisustvu CGRP peptida. Tipično, rastvor 2000:1 mol peptid/Fab (npr., 10 uM peptida u 50 nM G1 Fab) je ubrizgan preko humanog α -CGRP na čipu. Slika 6 pokazuje procenat vezivanja blokiranog kompetitivnim peptidom. Podaci prikazani na slici 6 pokazuju da su peptidi koji blokiraju 100% vezivanje G1 Fab za humani a-CGRP 1-37 (WT), 8-37, 26-37, P29A (19-37), K35A (19-37) , K35E (19-37) i K35M (19-37) humanog α -CGRP: 1-37 β -CGRP (WT); 1-37 pacova α -CGRP (WT); i 1-37 pacova β -CGRP (WT). Svi ovi peptidi su amidovaani na C-kraju. Peptidi F37A (19-37) i 19-37 (ovi poslednji nisu amidovani na C-kraju) humanog α -CGRP takođe su blokirali oko 80% do 90% vezivanja G1 Fab za humani α -CGRP. Peptidni fragment 1-36 (nije amidovan na C-kraju) humanog α -CGRP blokirao je oko 40% vezivanja G1 Fab za humani α -CGRP. Peptidni fragment 19-36 (amidiran na C-kraju) humanog α -CGRP; peptidni fragmenti 1-13 i 1-19 humanog α -CGRP (od kojih nijedan nije amidovan na C-kraju); i humani amilin, kalcitonin i adrenomedulin (svi amidovani na C-kraju) nisu se takmičili sa vezivanjem G1 Fab za humani α -CGRP na čipu. Ovi podaci pokazuju da G1 cilja na C-terminalni epitop CGRP-a i da su i identitet najterminalnijeg ostatka (F37) i njegova amidacija važni za vezivanje.

[0188] Određeni su i afiniteti vezivanja G1 Fab za varijante humanog α -CGRP (na 37°C). Tabela 7 ispod prikazuje afinitete merene direktno titracijom G1 Fab preko N-biotinilovanog humanog α -CGRP i varijanti na čipu. Podaci u tabeli 7 pokazuju da se antitelo G1 vezuje za epitop Cterminala, pri čemu su F37 i G33 najvažniji ostaci. G1 se ne vezuje za CGRP kada se dodatni aminokiselinski ostatak (alanin) doda na C-terminal (koji je amidovan).

Tabela 7. Afiniteti vezivanja G1 Fab za humani α -CGRP i varijante merene na 37°C (videti tabelu 4 za njihove aminokiselinske sekvence)

[0189] Gore navedeni podaci ukazuju da se epitop koji antitelo G1 vezuje na C-terminalnom kraju humanog α -CGRP, a aminokiseline 33 i 37 na humanom α -CGRP su važne za vezivanje antitela G1. Takođe, amidacija ostatka F37 je važna za vezivanje.

Primer 5: Efekat anti-CGRP antagonističkog antitela G1 na vazodilataciju kože indukovanu stimulacijom safenog nerva pacova

[0190] Da bi se testirala antagonistička aktivnost anti-CGRP antitela G1, efekat antitela na vazodilataciju kože stimulacijom safenog nerva pacova je testiran korišćenjem modela pacova opisanog u Primeru 3. Ukratko, pacovima je održavana anestezija sa 2% izoflurana. Bretilijum tozilat (30 mg/kg, primenjen i.v.) je dat na početku eksperimenta da bi se minimizirala vazokonstrikcija usled istovremene stimulacije simpatičkih vlakana safenoznog nerva. Telesna temperatura je održavana na 37°C korišćenjem rektalne sonde termostatski spojene na temperaturski kontrolisan pokrivač za grejanje. Safeni nerv desnog zadnjeg ekstremiteta je hirurški otkriven, proksimalno presečen i prekriven plastičnom folijom da bi se sprečilo sušenje. Laserska Dopplervv sonda je postavljena preko medio-dorzalne strane kože zadnje šape, što je region inerviran safenoznim nervom. Protok krvi u koži, meren kao fluks krvnih ćelija, praćen je laserskim Doppler meračem protoka. U eksperimentima za određivanje efekata antitela u roku od dva sata od injektovanja, trideset do četrdeset pet minuta nakon injektovanja bretilijum tozilata, kada je uspostavljen stabilan osnovni fluks (manje od 5% varijacije) tokom najmanje 5 minuta, nerv je stavljen preko platinaste bipolarne elektrode i električno stimulisan (2Hz, 10V, 1 ms, tokom 30 sekundi) i ponovo posle 20 minuta. Prosek odgovora protoka krvi na ove dve stimulacije je korišćen da se utvrdi osnovni odgovor (vreme 0) na električnu stimulaciju. Antitelo G1 (1 mg/kg ili 10 mg/kg) ili nosač (PBS sa 0,01% Tween 20 jednake zapremine do 10 mg/kg G1) je zatim administrirani intravenozno (i.v.). Nerv je zatim stimulisan (2Hz, 10V, 1 ms, tokom 30 sekundi) na 30 min, 60 min, 90 min i 120 min nakon administracije antitela. Životinje su držane pod anestezijom u periodu od približno tri sata. Kumulativna promena protoka krvi u koži procenjena je površinom ispod krive fluks-vreme (AUC, koja je jednaka promeni fluksa pomnoženoj sa promenom vremena) za svaki odgovor fluksa na stimulaciju električnog impulsa.

[0191] Kao što je prikazano na slici 7, povećanje protoka krvi stimulisano primenom elektronskih impulsa na nerv safenusa je značajno inhibirano prisustvom antitela G1 od 1 mg/kg (primenjeno i.v.) u poređenju sa nosačem, kada je safeni nerv bio električno stimulisan 90 minuta nakon administracije antitela. Povećanje protoka krvi stimulisano primenom elektronskih impulsa na safeni nerv je značajno inhibirano prisustvom antitela G1 od 10 mg/kg (primenjeno i.v.) u poređenju sa nosačem, kada je safeni nerv bio električno stimulisan 90 minuta i 120 minuta nakon administracije antitela.

[0192] U eksperimentima za određivanje efekata antitela u dužim vremenskim tačkama u testu safenoze, pacovima je ubrizgano i.v. u naznačenim dozama antitelo 24 sata ili 7 dana pre pripreme životinje za stimulaciju safenog nerva kao što je gore opisano. U ovim eksperimentima nije bilo moguće utvrditi osnovni odgovor kod pojedinačnih pacova na stimulaciju električnim pulsom pre doziranja, pa su tretirane grupe upoređene sa životinjama kojima je doziran nosač (PBS, 0,01% Tween 20) nakon 24 sata ili 7 dana.

[0193] Kao što je prikazano na slikama 8A i 8B, povećanje protoka krvi u dorsomedijalnoj koži zadnje šape izazvano stimulacijom safenog nerva je značajno inhibirano u grupama životinja koje su primale dozu od 10 mg/kg ili 3 mg/kg G1 u 24 sata. ili 7 dana pre stimulacije u poređenju sa grupama nosača doziranih u istim vremenskim tačkama.

[0194] Slika 8C predstavlja analizu fitovanja krive primenjenu na podatke o odgovoru na dozu predstavljene na slikama 8A i 8B da bi se odredila doza potrebna za 50% maksimalnog efekta (EC50). EC50na 24 sata je 1,3 mg/kg, a EC50na 7 dana je nešto niži (0,8 mg/kg).

Primer 6: Akutni efekat anti-CGRP antagonističkog antitela mu7E9 u testiranju duralne arterije (zatvoreni lobanjski/kranijalni prozor)

[0195] Model zatvorenog kranijalnog prozora: Svrha ovog eksperimenta je bila da se utvrdi akutni efekat anti-CGRP antagonističkih antitela i uporedi sa akutnim efektom antagonista CGRP receptora BIBN4096BS. Eksperimenti su izvedeni kao što je prethodno opisano (Williamson et al., Cephalalgia 17(4):518-24 (1997)) sa sledećim modifikacijama. Sprague Dawley pacovi (300-400 g) su anestezirani sa 70 mg/kg i.p. pentobarbitala. Anestezija je održavana sa 20 mg/kg/h i.v. pentobarbitala. Pacovima su kroz jugularnu venu aplicirane kanule za isporuku svih lekova. Krvni pritisak je praćen sondom (mikro-vrh katetera, Millar Instruments) uvučenom kroz femoralnu arteriju u abdominalnu aortu. Pacovi su traheotomizovani i brzina disanja je održavana na 75 udisaja u minuti pri zapremini od 3,5 mL. Nakon fiksiranja glave u stereotaktički instrument i uklanjanja skalpa, stanjivanjem kosti zubnom bušilicom napravljen je otvor/prozor 2x6mm u levoj parijetalnoj oblasti, neposredno bočno od sagitalnog šava. Koristeći mikromanipulator, platinasta bipolarna elektroda je spuštena na površinu i prekrivena teškim mineralnim uljem. Lateralno od prozora elektrode napravljen je još jedan prozor veličine 5x6 mm koji je napunjen teškim mineralnim uljem kroz koji je kontinuirano praćen prečnik grane srednje meningealne arterije (MMA) CCD kamerom i analizatorom video dimenzija (Living Systems). Pacovi su mirovali ne manje od 45 minuta nakon pripreme. Ustanovljen je osnovni odgovor na električnu stimulaciju (15 V, 10 hz, 0,5 ms impulsi, 30 sekundi), a zatim su pacovi dozirani i.v. eksperimentalnim jedinjenjem (10mg/kg mu7E9, 300µg/kg BIBN4096BS ili PBS 0,01%Tween 20). Dodatne električne stimulacije su urađene na 5 (BIBN4096BS), 30, 60, 90 i 120 minuta nakon doziranja. Svi podaci su snimljeni pomoću softvera za grafikone (ADInstruments).

[0196] Kao što je prikazano na Slici 9, mu7E9 u dozi od 10 mg/kg značajno blokira MMA dilataciju izazvanu stimulacijom električnim poljem u roku od 60 minuta nakon doziranja i održava efekat tokom trajanja testa (120 minuta). Poređenja radi, BIBN4096BS blokira dilataciju MMA u roku od 5 minuta od doziranja, ali efekat je potpuno nestao za 90 minuta. Veličina bloka je uporediva između BIBN4096BS i mu7E9.

Primer 7: Hronični efekat anti-CGRP antagonističkog antitela G1 u testiranju duralne arterije (zatvoreni lobanjski/kranijalni prozor)

[0197] Svrha ovog eksperimenta je bila da se utvrdi da li anti CGRP antitelo još uvek može da blokira električno stimulisanu dilataciju MMA 7 dana nakon doziranja. Priprema pacova bila je identična gore opisanom akutnom eksperimentu (Primer 6) sa sledećim izuzecima. Pacovima je ubrizgano i.v. (10mg/kg, 3mg/kg ili 1mg/kg G1) 7 dana pre kreiranja zatvorenog kranijalnog prozora za pripremu i stimulaciju. Nije bilo moguće utvrditi osnovni dilatacioni odgovor na električnu stimulaciju pre doziranja kao u akutnom eksperimentu, tako da su grupe antitela upoređene sa dilatacijom MMA u kontrolnoj grupi kojoj je doziran nosač (PBS, 0,01% Tween 20). Nakon što su pacovi ostavljeni da miruju najmanje 45 minuta, dura je električno stimulisana u intervalima od 30 minuta. Stimulacije su bile na 2,5V, 5V, 10V, 15V i 20V, sve na 10 Hz, impulsima od 0,5 ms u trajanju od 30 sekundi.

[0198] Kao što je prikazano na slici 10, G1 pri 10 mg/kg i 3 mg/kg značajno blokira dilataciju MMA izazvanu električnom stimulacijom u opsegu od 10 do 20 volti. Ovi podaci pokazuju da G1 može da blokira električno stimulisanu dilataciju MMA do 7 dana nakon doziranja.

Primer 8: Model odvikavanja od morfijuma za mehanizam valunga u menopauzi (za referencu)

[0199] Model odvikavanja od morfijuma na pacovim je uspostavljen model glodara za mehanizme valunge u menopauzi (Sipe et al., Brain Res. 1028(2):191-202 (2004); Merchenthaler et al., Maturitas 30:307-316 (1998); Katovich et al., Brain Res.494:85-94 (1989); Simpkins et al., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)). U osnovi, pacovi su postali zavisni od morfijuma implantacijom morfijumskih peleta pod kožu. Nakon uspotavljanja zavisnosti, životinjama se ubrizgava nalokson (opioidni antagonist) koji ih odmah šalje u fazu odvikavanja. Ovo odvikavanje je praćeno povećanjem temperature kože, smanjenjem unutrašnje telesne temperature, povećanjem srčane frekvencije i povećanjem serumskog luteinizirajućeg hormona. Svi su oni po veličini i vremenu slični onome što se dešava kod navale valunka kod ljudi (Simpkins et al., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)). Štaviše, ako se pacovi leče estradiolom pre indukovanja odvikavanja, simptomi navale valunga se smanjuju (Merchenthaler et al., Maturitas 30:307-316 (1998)). Zbog toga se veruje da model odvikavanja od morfijuma oponaša kliničke valunge.

[0200] Pacovi kojima su uklonjeni jajnici su naručeni iz Charles River Laboratories. Ne manje od 7 dana nakon ovariektomije zavisnost od morfijuma nastala je implantacijom pelete morfijuma (75 mg morfijumske baze) subkutano. Dva dana kasnije implantirane su još 2 pelete. Sledećeg dana pacovima je ubrizgano intravenozno ili 10 mg/kg 4901 [**] ili nosač (PBS, 0,01% Tween). Dva dana nakon drugog peletiranja pacovi su anestezirani ketaminom (90 mg/kg) i blago obuzdani. Termopar za površinsku temperaturu je zalepljen za bazu repa, a rektalni termoelement se koristi za merenje unutrašnje temperature. Podaci su snimljeni korišćenjem Chart softvera (ADInstruments). Nakon snimanja 15 minuta stabilne osnovne temperature, subkutano ubrizgan je nalokson (1 mg/kg). Temperatura se beleži neprekidno narednih 60 minuta. Rezultati su prikazani na slikama 11A i 11B.

Primer 9: Lečenje hronične migrene

[0201] Identifikovano je da je muškarac, muškarac star 45 godina sa hroničnom migrenom u trajanju od najmanje tri meseca. Identifikacija hronične migrene je postignuta posmatranjem postojanja čestih glavobolja koje ukazuju na hroničnu migrenu (npr.15 dana mesečno) najmanje tri meseca pre skrininga. Verifikacija učestalosti glavobolje je postignuta prospektivno prikupljenim osnovnim informacijama koje pokazuju glavobolje tokom najmanje 15 dana, pri čemu najmanje 8 dana mesečno ispunjava bilo šta od sledećeg: i. kvalifikovati kao napad migrene; i/ili ii. prethodila ili praćena aurom migrene.

[0202] Da bi se smanjila incidenca migrene kod subjekta, subjektu je administrirana doza od 225 mg anti-CGRP antagonističkog antitela (npr. antitelo G1). Anti-CGRP antagonističko antitelo je dostavljeno kao tečna formulacija u koncentraciji od 150 mg/mL. Doza od 225 mg se administrira kao potkožna injekcija od 1,5 mL u zadnji deo nadlaktice tela subjekta. Alternativno, doza se može administrirati subjektu putem intravenske infuzije. U takvim slučajevima, 5,85 mL anti-CGRP antitela od 150 mg/mL može se kombinovati sa 0,9% rastvorom natrijum hlorida (normalan fiziološki rastvor) u IV vrećici za ukupnu zapreminu od 130 mL u vrećici. 100 mL zapremine IV vrećice se intravenozno ubrizga subjektu tokom jednog sata, za ukupnu dozu od 225 mg. Doziranje je ponavljeno svakih dvadeset osam dana dok nije primećena smanjena incidencija migrene. Smanjena incidencija hronične migrene je ispitana primenom različitih kriterijuma koji uključuju broj dana sa glavoboljom, broj sati tokom kojih se glavobolja javlja (npr. sati glavobolje), jačinu glavobolje i broj dana migrene uočenih kod subjekta.

Primer 10: Lečenje hronične migrene

[0203] Identifikovano je da je ženska osoba stara 37 godina imala hroničnu migrenu najmanje tri meseca. Identifikacija hronične migrene je postignuta posmatranjem postojanja čestih glavobolja koje ukazuju na hroničnu migrenu (npr. 15 dana mesečno) najmanje tri meseca pre skrininga. Verifikacija učestalosti glavobolje je postignuta prospektivno prikupljenim osnovnih informacija koje pokazuju postojanje glavobolje tokom najmanje 15 dana, pri čemu najmanje 8 dana mesečno ispunjava bilo koje od sledećeg: i. kvalifikovana kao napad migrene; i/ili ii. prethodila ili praćena aurom migrene.

[0204] Da bi se smanjila incidenca migrene kod subjekta, subjektu se administrira početna doza od 675 mg anti-CGRP antagonističkog antitela (npr. antitelo G1). Anti-CGRP antagonističko antitelo je isporučeno kao tečna formulacija u koncentraciji od 150 mg/mL. Doza od 675 mg se daje kao tri potkožne injekcije od 225 mg od 1,5 mL u različite regione (npr. ruke, donji deo stomaka/stomaka/struka, prednji deo butina, itd.) tela subjekta. Doziranje je ponavljeno svakih dvadeset osam dana u dozi od 225 mg (npr. putem jedne potkožne injekcije od 1,5 mL u ruku subjekta) sve dok se ne primeti smanjena incidencija migrene. Smanjena incidencija hronične migrene se ispituje primenom različitih kriterijuma koji uključuju broj dana sa glavoboljom, broj sati tokom kojih se glavobolja javlja (npr. sati glavobolje), jačinu glavobolje i broj dana migrene uočenih kod subjekta.

Primer 11: Lečenje hronične migrene

[0205] Identifikovano je da je muškarac muškarac star 23 godine imao hroničnu migrenu najmanje tri meseca. Identifikacija hronične migrene je postignuta posmatranjem postojanja čestih glavobolja koje ukazuju na hroničnu migrenu (npr.15 dana mesečno) najmanje tri meseca pre skrininga. Verifikacija učestalosti glavobolje se postiže prospektivno prikupljenim osnovnim informacijama koje pokazuju glavobolje tokom najmanje 15 dana, pri čemu najmanje 8 dana mesečno ispunjava JEDNO od: i. kvalifikovati kao napad migrene; i/ili ii. Prethodi ili je praćena aurom migrene.

[0206] Da bi se smanjila incidenca migrene kod subjekta, subjektu je administrirana doza od 900 mg anti-CGRP antagonističkog antitela (npr., antitelo G1). Anti-CGRP antagonističko antitelo je isporučeno kao tečna formulacija u koncentraciji od 150 mg/mL. Doza od 900 mg je administrirana kao četiri potkožne injekcije od 225 mg od 1,5 mL u različite regione (npr. zadnji deo nadlaktica, donji deo stomaka/stomaka/struk, prednji deo butina, itd.) tela subjekta. Doziranje je ponavljeno svakih dvadeset osam dana dok nije zapaženo smanjene incidencija migrene. Smanjena incidencija hronične migrene je ispitana primenom različitih kriterijuma koji uključuju broj dana sa glavoboljom, broj sati tokom kojih se glavobolja javlja (npr. sati glavobolje), jačinu glavobolje i broj dana migrene uočenih kod subjekta.

Primer 12: Lečenje epizodne migrene

[0207] Identifikovano je da je muškarac, muškarac star 28 godina sa epizodnom migrenom visoke učestalosti. Subjekti su identifikovani sa epizodnim migrenama visoke učestalosti primenom kriterijuma koji uključuju: da postoji istorija glavobolje više od 8 dana mesečno najmanje 3 meseca pre skrininga; i verifikacija učestalosti glavobolje kroz prospektivno prikupljene osnovnih informacija koje pokazuju glavobolje (bilo koje vrste) u periodu od 8 do 14 dana sa najmanje 8 dana koji ispunjava kriterijume za najmanje jedno od: i. migrene; ii. verovatne migrene; i/ili iii. upotrebe triptana ili ergot jedinjenja.

[0208] Da bi se smanjila incidenca migrene kod subjekta, subjektu je administrirana doza od 675 mg anti-CGRP antagonističkog antitela (npr. antitelo G1). Anti-CGRP antagonističko antitelo je dostavljeno kao tečna formulacija u koncentraciji od 150 mg/mL. Doza od 675 mg je administrirana kao tri potkožne injekcije od 1,5 mL od 225 mg u različite regione (npr. zadnji deo nadlaktica, donji deo stomaka/stomaka/struk, prednji deo butina, itd.) tela subjekta. Doziranje se ponavlja svakih dvadeset osam dana dok se ne primeti smanjena incidencija migrene. Smanjena incidencija epizodične migrene se ispituje primenom različitih kriterijuma koji uključuju broj dana sa glavoboljom, broj sati tokom kojih se glavobolja javlja (npr. sati glavobolje), jačinu glavobolje i broj dana migrene uočenih kod subjekta.

Primer 13: Lečenje epizodne migrene

[0209] Identifikovano je da je ženska osoba stara 52 godine imala epizodne migrene visoke učestalosti. Subjekti su identifikovani sa epizodnim migrenama visoke učestalosti primenom kriterijuma koji uključuju: da postoji istorija glavobolje više od 8 dana mesečno najmanje 3 meseca pre skrininga; i verifikacija učestalosti glavobolje kroz prospektivno prikupljene osnovnih informacija koje pokazuju glavobolje (bilo koje vrste) u periodu od 8 do 14 dana sa najmanje 8 dana koji ispunjava kriterijume za najmanje jedno od: i. migrene; ii. verovatne migrene; i/ili iii. upotrebe triptana ili ergot jedinjenja.

[0210] Da bi se smanjila incidenca migrene kod subjekta, subjektu je administrirana doza od 225 mg anti-CGRP antagonističkog antitela (npr. antitelo G1). Anti-CGRP antagonističko antitelo je dostavljeno kao tečna formulacija u koncentraciji od 150 mg/mL. Doza od 225 mg je administrirana kao potkožna injekcija od 1,5 mL u zadnji deo nadlaktice tela subjekta. Doziranje je ponavleno na svakih dvadeset osam dana dok nije primećena smanjena incidencija migrene. Smanjena incidencija epizodne migrene se ispituje korišćenjem različitih opservacija koje uključuju posmatranje broja dana sa glavoboljom, broja sati tokom kojih se glavobolja javlja, jačine glavobolje i broja dana migrene kod ispitanika.

Primer 14: Neklinička toksikologija i farmakokinetika

[0211] Anti-CGRP antagonističko antitelo G1 se dobro podnosilo u 1-mesečnim IV studijama toksičnosti ponovljenih doza kod Sprague-Dawley (SD) pacova i cinomolgus majmuna i nije utvrđena toksičnost za ciljni organ ni u jednoj od ovih studija. Nivo bez neželjenih događaja (NOAEL) od 100 mg/kg/nedeljno je utvrđen i za studije na pacovima i majmunima. Ovaj nivo doze odgovara sistemskoj izloženosti sa maksimalnom koncentracijom (Cmax) od 2.570 i 3.440 µg/mL i površinama ispod krive (AUC(0-168h)) od 194.000 µg•h/mL i 299.000 µg•h/mL (Da. 22) kod pacova i majmuna, respektivno

[0212] U tromesečnoj IV/SC studiji na pacovima, nije identifikovana toksičnost za ciljni organ i G1 se dobro podnosio do najveće testirane doze, 300 mg/kg. U tromesečnoj studiji na majmunima, uočeno je perivaskularno zapaljenje cilijarne arterije, kao rezultat taloženja imunih kompleksa, pri ≥100 mg/kg. Ovaj nalaz je pripisan imunogenom odgovoru majmuna na humanizovano antitelo i nije se smatralo klinički relevantnim. Najveća testirana doza od 300 mg/kg u ovoj studiji na majmunima je najmanje 10 puta veća od najveće očekivane kliničke doze od 2000 mg ili 29 mg/kg na bazi mg/kg (pod pretpostavkom da je prosečna težina subjekta 70 kg) .

Primer 15: Klinička farmakokinetika

[0213] PK antitela G1 nakon jednokratnog izlaganja IV ispitivana je u četiri randomizovane, placebom kontrolisane, dvostruko slepe studije koje su ispitivale doze između 10 i 2.000 mg. Maksimalne koncentracije u plazmi (Cmax) dostignute su ubrzo nakon završetka 1-časovne IV infuzije. Srednje vreme do Cmax (Tmax) kretalo se od 1,0 do 3,0 sata, praćeno višefaznim opadanjem. Cmax i ukupna izloženost su se povećavali približno linearno sa povećanjem doze G1. Terminalni polu-život (t1⁄2) kretao se od 36,4 do 48,3 dana. Nema dokaza o metabolizmu G1 u jetri, primarni način metabolisanja je proteozomska degradacija.

[0214] Jedna studija je definisala farmakokinetiku doza od 30 mg i 300 mg datih dvaput, u razmaku od dve nedelje. Maksimalne koncentracije i površina ispod profila koncentracije i vremena su se povećavale sa povećanjem doze. Prividni terminalni polu-život (t1⁄2) nakon druge doze iznosio je 41,2 dana (30 mg) i 50,0 dana (300 mg) (aritmetička sredina). Odnosi akumulacije u plazmi G1 posle dve IV doze primenjene u razmaku od 15 dana iznosili su 1,5 (30 mg) i 1,4 (300 mg).

Primer 16: Klinička bezbednost i farmakokinetika

[0215] U šest studija, antitelo G1 je administrirano 118 zdravih muškaraca i žena, dok je 57 muškaraca i žena primalo placebo. Studija je uključivala pojedinačne IV doze u rasponu od 0,2 mg do 2.000 mg, dve IV doze do 300 mg date jednom svakih 14 dana i administraciju SC od 225 i 900 mg. Šest studija je uključivalo: dve IV studije eskalacije PK i farmakodinamike (PD) kod zdravih muškaraca (studije B0141001 i B0141002); dvokohortna, placebom kontrolisana unakrsna studija u cilju ispitivanja akutnih efekata IV primene antitela G1 na odgovor na pojavu kapsaicina kod zdravih dobrovoljaca (B0141006); paralelna grupna studija ponovljenih doza antitela G1 kod zdravih dobrovoljaca i žena (B0141007); studija sa jednom dozom koja procenjuje bezbednost i podnošljivost doza do 2.000 mg primenjenih IV zdravim dobrovoljcima (B0141008), i studija koja poredi relativnu bezbednost i bioraspoloživost između IV i administracije SC (G1-SC-IV).

[0216] Šest studija je sumarno dato u taljem tekstu u tabeli 11. Od pet IV studija (B0141001, B0141002, B0141006, B0141007 i B0141008), tri su imale praktično identičan dizajn i procene. Studija B014100 testirala je doze od 0,2 mg, 1 mg i 3 mg date u vidu jedne jednočasovne IV infuzije. Studija je imala paralelni dizajn. Učesnici su bili zatvoreni u klinici sedam dana nakon infuzije, sa višestrukim procenama svakog od ovih dana. Nakon otpuštanja, pacijenti su ponovo procenjeni nedelju dana nakon otpuštanja (14. dan), a zatim jedan, dva i tri meseca nakon infuzije. Studija B0141002 testirala je doze u rasponu od 10 mg do 1000 mg kao pojedinačna primena. Konačno, studija B0141008 testirala je doze od 300 mg, 1000 mg, 1500 mg ili 2000 mg. Studija B0141006 se razlikovala od ostalih jer je takođe imala za cilj da integriše farmakodinamička očitavanja kroz merenje inhibicije kapsaicina do jedne nedelje nakon IV infuzije antitela G1.

[0217] Za IV studije, profili neželjenih događaja (AEs) prijavljeni su samo za period prve doze. Studija B0141007 testirala je višestruke doze antitela G1 u dozi od 30 ili 300 mg IV date u razmaku od dve nedelje, koristeći paralelni dizajn. Svakom kvalifikovanom subjektu je dodeljena sekvenca randomizacije preko interaktivnog sistema zasnovanog na internetu koji je sadržao dodeljivanje tretmana. Šemu randomizacije razvio je vodeći statističar. Učesnici u svim studijama bili su uglavnom zdravi muškarci i žene (od 18 do 65 godina starosti); svi učesnici su potpisali obrasce za saglasnost. Sve studije su odobrili istražni odbori (IRB). Neželjeni efekti (AE) su definisani kao bilo koja neželjena medicinska pojava kod učesnika kliničke studije, sa ili bez uzročne veze sa ispitivanim lekom. Neželjeni neželjeni efekti primećeni nakon primene ispitivanog leka ili placeba nazvani su „nepovoljniji neželjeni efekti usled lečenja“ (TEAE) bez obzira na potencijalnu uzročnost sa ispitivanim lekom. Svi subjekti koji su imali TEAE praćeni su u odgovarajućim vremenskim intervalima sve dok se događaj nije razrešio ili dok se događaj nije stabilizovao i/ili dostigao novu početnu liniju. Svi TEAE su rangirani kao blagi, umereni ili teški. Ozbiljne neželjene reakcije (SAE) su a priori definisane kao svaka neželjena medicinska pojava koja je pri bilo kojoj dozi rezultirala smrću, bila opasna po život (tj. subjekt je bio u neposrednom riziku od smrti u vreme događaja), zahtevala bolničku hospitalizaciju ili produženje postojeće hospitalizacije, koja je rezultirala upornim ili značajnim invaliditetom/nesposobnošću (npr., značajno narušavanje sposobnosti subjekta da obavlja normalne životne funkcije), rezultirala urođenom anomalijom/defektom pri rođenju ili bilo kojim drugim medicinskim važnim događajem. AE u vezi sa lečenjem (TRAEs) je trebalo razmotriti kada je prisutna jedna od sledećih situacija: 1) moguće je identifikovati verovatan vremenski odnos između početka AE i primene ispitivanog proizvoda; 2) AE se nijem ogla lako objasniti kliničkim stanjem pacijenta, interkurentnom bolešću ili pratećim terapijama; 3) AE su ublažene prestankom uzimanja ispitivanog proizvoda ili smanjenjem doze.

0218] Mereni su krvni pritisak, brzina pulsa i oralna temperatura na skriningu, pre doze, neposredno po završetku infuzije i više puta tokom boravka pacijenata u klinici, kao i prilikom svih poseta klinici. Laboratorijski testovi uključivali su hemiju seruma, hematologiju i analizu urina. Laboratorijski testovi za hematologiju, hemiju, koagulaciju i bezbednost urina vršeni su u više vremenskih tačaka tokom ispitivanja. EKG su snimani na skriningu, pre doze prvog dana, odmah po završetku infuzije i pet drugih puta tokom prvog dana, kao i tokom svih poseta klinici. QTcF vrednosti su izvedene korišćenjem Fridericia (QTcF) formule za korekciju srčane frekvencije. Apsolutne vrednosti i promene u odnosu na početnu vrednost za EKG parametre QT intervala, srčane frekvencije, QTcF intervala, PR intervala i QRS intervala procenjene su prema kohorti, tretmanu i vremenu nakon doze. Pored gore opisanih bezbednosnih procena, Protokol B014008 je uključivao kompletne oftalmološke procene na početku i u tri vremenske tačke nakon doziranja (28. dan, 84. dan i 168. dan).

[0219] Klinički podaci i vitalni znaci su sumirani korišćenjem deskriptivnih tabela i zbirne statistike. Laboratorijski i drugi podaci o bezbednosti sumirani su kao funkcija svake promene (vrednosti izvan referentnog opsega), kao i svih klinički relevantnih promena, koje su definisane a priori. Zbirne tabele su stratifikovane prema dozi i podaci su objedinjeni u studijama. Pored toga, poređenja konsolidovanih podataka za sve izloženosti antitelu G1 su u poređenju sa placebom. Placebo je takođe bio u postavljen na suprot dozama antitela G1 od 100 mg i više (100 mg, 300 mg, 1000 mg, 1500 mg i 2000 mg) i sa dozama antitela G1 od 1000 mg i više (1000 mg, 1500 mg, i 2000 mg).

[0220] U IV/SC studiji (G1-SC-IV), trideset i šest subjekata je randomizirano da primaju jednokratnu administraciju antitela G1 (225 ili 900 mg) ili placeba, datog ili kao subkutanu (SC) bolus injekciju ili kao 1-časovnu IV infuziju. Subjekti su bili ograničenu na jedinicu za klinička istraživanja sedam dana nakon doziranja, i povremeno su se vraćali u kliniku radi dodatnih ambulantnih poseta do 90. dana studije. EKG su rađeni opsežno prvog dana (pre doze, sati 1, 6, 12), 3. dan, 7. dan dok su subjekti bili zatvoreni i jednom po završetku studije (90. dan). Vitalni znaci, uključujući temperaturu, krvni pritisak i broj otkucaja srca, prikupljeni su pre doze, 1., 3., 7. i 90. dana.

Tabela 11

[0221] U širokom opsegu doza procenjenih u pet IV studija (0,2 do 2,000 mg), IV antitelo G1 je prihvatljivo tolerisano. Tabela 8 sumira ukupnu stopu neželjenih događaja (AE) prema dozi za IV studije. Na osnovu ovih rezultata podnošljivosti, nisu se pojavile otvorene zabrinutosti za bezbednost. U svim ispitivanjima u IV studijama, učesnici koji su primali placebo prijavili su u proseku 1,3 neželjena dejstva koja su nastala zbog terapije (TEAE). Ovo su sve prijavljeni događaji, bez obzira na mišljenje istraživača o vezi sa ispitivanim lekom. Za sve doze IV G1, stopa je bila 1,4 TEAE po subjektu. Subjekti koji su primali G1 doze od 100 mg ili više imali su u proseku 1,5 TEAE; oni koji su primali doze od 1.000 mg ili više imali su u proseku 1,6 TEAE.

Tabela 8

[0222] U IV studijama, neželjeni događaji povezani sa lečenjem (TRAEs, ili AE koji bi mogli biti povezani sa terapijom prema primarnom istraživaču) su prijavljeni kod 21,2% ispitanika koji su primali IV G1, u poređenju sa 17,7% kod onih koji primaju placebo. Pri dozama od 100 mg G1 ili više, TRAE su se javile kod 22,4% učesnika. U dozama od 1.000 mg ili više, TRAE su se javile kod 21,7% učesnika. Izgleda da antitelo G1 nije povezano sa bilo kakvim klinički relevantnim obrascima promene vitalnih znakova (sistolni i dijastolni krvni pritisak [BP], temperatura i srčana frekvencija [HR]), abnormalnosti elektrokardiograma (EKG) (uključujući QTcB i QTcF), reakcija na mestu infuzije, ili kliničkih laboratorijskih nalaza. Bilo je ograničenih efekata na testove funkcije jetre (aspartat aminotransferaza [AST], alanin aminotransferaza [ALT], ukupni bilirubin i alkalna fosfataza) sa povećanjem ukupnog bilirubina stepena 1 kod jednog subjekta koji je primao placebo (Studija B0141001) i povećanje ALT stepena 1 kod jednog subjekta koji je primao placebo (Studija B0141002). Klinički značajne abnormalnosti funkcije jetre nisu primećene među subjektima koji su primali bilo koju od ispitivanih doza G1. Nije bilo dokaza o razlikama između G1 i placeba u hematološkim testovima za procenu funkcije bubrega, elektrolita ili u testovima urina.

[0223] U IV/SC studiji (G1-SC-IV), bezbednost i podnošljivost su bili uporedivi između SC i IV puteva isporuke. Tretman antitelom G1 nije uticao na srednju brzinu otkucaja srca i krvni pritisak (dijastolni i sistolni), niti je bilo značajnih promena u bilo kom kardiovaskularnom parametru nakon tretmana SC antitelom G1. Rezime TRAE uočenih tokom SC studije je prikazan ispod u tabeli 12.

Tabela 12

[0224] U studijama pojedinačnih doza (B0141001, B0141002, B0141006 i B0141008), farmakokinetički parametri (PK) su izračunati za doze u rasponu od 30 mg do 2,000 mg. Srednji polu-život terminalne grupe (t1/2) kretao se od približno 40 do 48 dana. Cmaxi ukupna izloženost (procenjena AUCinf) su se povećavala sa povećanjem doze. Činilo se da je povećanje AUCinfpribližno proporcionalno dozi između 30 i 1.000 mg i činilo se da je veće od proporcionalne dozi između 1.000 i 2.000 mg. Volumen distribucije je bio nizak, između 6-10 L.

[0225] U studiji sa dve doze (B0141007), prividni terminalni polu-život nakon druge doze iznosio je između 41 i 50 dana. Koncentracije u plazmi su se akumulirale nakon druge doze, sa odnosom akumulacije od približno 1,5. Dodatno, u IV/SC studiji (G1-SC-IV), farmakokinetičke procene su pokazale da je G1 imao sličan terminalni polu-život kada je SC dat kao IV.

Primer 17: Prevencija hronične migrene u kliničkoj studiji antitela G1

[0226] Izvedena je multicentrična, randomizovana, dvostruko slepa, sa dvostrukim placebom, placebo kontrolisana, paralelna grupa, studija sa višekarnim dozama koja je poredila anti-CGRP antagonističko antitelo G1 sa placebom kod subjekata koji imaju hroničnu migrenu. Kvalifikovani subjekti su ušli u osnovni period od 28 dana. Ispitanici su svakodnevno prikupljali informacije o glavobolji i zdravlju tokom čitave studije, koristeći sistem elektronskog dnevnika praćenja glavobolje. Nikakve promene u lekovima protiv migrene nisu bile dozvoljene tokom perioda uvođenja ili studije. Kriterijumi za uključivanje su bili sledeći: (1) muškarci ili žene starosti od 18 do 65 godina; (2) potpisan i datiran dokument o informisanoj saglasnosti koji pokazuje da je subjekt obavešten o svim relevantnim aspektima studije, uključujući sve poznate i potencijalne rizike i dostupne alternativne tretmane; (3) hronična migrena koja ispunjava dijagnostičke kriterijume navedene u Međunarodnoj klasifikaciji poremećaja glavobolje (ICHD-III beta verzija, 2013); (4) za migrenu subjekti mogu koristiti do dva različita dnevna leka za prevenciju migrene (npr. topiramat, propranolol, amitriptilin) ili za druga medicinska stanja (npr. propranolol koji se koristi za hipertenziju) ako su doza i režim bili stabilni najmanje 2 meseca pre početka perioda od 28 dana; (5) Indeks telesne mase (BMI) od 17,5 do 34,5 kg/m<2>i ukupna telesna težina između 50 kg i 120 kg, uključujući; (6) subjekt ili nije reproduktivnog potencijala kao što je definisano u metodama ili ako subjekt ima reproduktivni potencijal, oni se slažu ili da ostanu apstinentni ili da koriste (ili da njihov partner koristi) prihvatljiv metod kontrole rađanja u predviđenom trajanju studija; (7) pokazao usklađenost sa elektronskim dnevnikom praćenja glavobolje tokom perioda uvođenja unošenjem podataka o glavobolji za najmanje 24/28 dana (usaglašenost od 85%). Dijagnostički kriterijumi hronične migrene pod (3) gore su bili sledeći: (a) istorija čestih glavobolja koje sugerišu hroničnu migrenu (15 dana mesečno) najmanje tri meseca pre skrininga; (b) verifikaciju učestalosti glavobolje kroz prospektivno prikupljene osnovne informacije tokom 28-dnevne faze uvođenja, ispoljavajući glavobolje tokom najmanje 15 dana, sa najmanje 8 dana u mesecu koji ispunjava bilo koji od (i) koji se kvalifikuje kao napad migrene, (ii) kojoj prethodi ili prati aura migrene, ili (iii) ublažena derivatima ergota ili triptana.

[0227] Kriterijumi isključenja su zahtevali da subjekti ne ispunjavaju bilo koji uslov od sledećeg: (1) Početak hronične migrene posle 50 godina starosti; (2) subjekt je primio onabotulinum toksin A zbog migrene ili iz bilo kojih medicinskih ili kozmetičkih razloga koji zahtevaju injekcije u glavu, lice ili vrat tokom šest meseci pre skrininga; (3) subjekt koristi lekove koji sadrže opioide (uključujući kodein) ili barbiturate (uključujući Fiorinal®, Fioracet® ili bilo koju drugu kombinaciju koja sadrži butalbital) više od 4 dana mesečno za lečenje migrene ili iz bilo kog drugog razloga (4) nije uspeo > 2 kategorije lekova ili > 3 preventivna leka (unutar dve kategorije lekova) zbog neefikasnosti za profilaktičko lečenje epizodne ili hronične migrene nakon adekvatnog terapijskog ispitivanja; (5) klinički značajna hematološka, bubrežna, endokrina, plućna, gastrointestinalna, genitourinarna, neurološka ili okularna bolest, u diskerciji istraživača; (6) subjekti sa dokazima ili medicinskom istorijom klinički značajnih psihijatrijskih problema uključujući veliku depresiju, panični poremećaj ili generalizovani anksiozni poremećaj (prema kriterijumima Diagnostic and Statistical Manual 5th izdanje [DSM-5]); (7) sistolni krvni pritisak pri skriningu iznad 160 mm Hg ili ispod 90 mm Hg; (8) dijastolni krvni pritisak pri skriningu iznad 110 mm Hg ili ispod 50 mm Hg; (9) istorija klinički značajne kardiovaskularne bolesti ili vaskularne ishemije (kao što je miokardna, neurološka [npr. cerebralna ishemija], ishemija perifernih ekstremiteta ili drugi ishemijski događaj); (10) prošla ili sadašnja istorija raka/karcinoma, sa izuzetkom onih subjekata sa karcinomom bazalnih ćelija koji je hirurski uklonjen; (11) trudnice ili dojilje; (12) Istorija reakcija preosetljivosti na ubrizgane proteine, uključujući monoklonska antitela; (13) tretman ispitivanim lekom u roku od 30 dana od ulaska u studiju (14) klinički značajna abnormalnost u osnovnoj liniji u konvencionalnom 12-kanalnom EKG-u, uključujući sinusne pauze >2 sekunde, srčani blok drugog ili trećeg stepena ili druge abnormalnosti za koje se istraživač proceni da su klinički značajne. (15) konvencionalni 12-kanalni EKG koji pokazuje QTcF >450 msec za muškarce i 470 msec za žene na skriningu (ako je QTcF premašio ove vrednosti, EKG je ponovljen i prosek od tri vrednosti za QTcF je korišćen za određivanje podobnosti potencijalnog subjekta; QTc dobijen primenom Fridericia izračunavanja); (16) svaki nalaz koji je, po proceni istraživača, klinički značajno abnormalan, uključujući hematološke vrednosti, hemikalije krvi, testove koagulacije ili analize urina (abnormalni testovi su dozvoljeni da se ponove radi potvrde) (17) enzimi jetre (alanin aminotransferaza [ ALT], aspartat aminotransferaza [AST], alkalna fosfataza) > 1,3 puta iznad gornje granice normale (ULN) nakon potvrde u ponovljenom testu; (18) kreatinin u serumu >1,5 puta veći od UGN, klinički značajna proteinurija (štapić za urin 4) ili dokaz bubrežne bolesti.

[0228] Subjekti za koje je potvrđeno da imaju hroničnu migrenu i visoku usklađenost sa dnevnim dnevnikom glavobolje tokom perioda uvođenja su nasumično raspoređeni u poseti 2 (dan 1) u jednu od tri grupe za lečenje. Randomizacija je izvršena korišćenjem elektronskog interaktivnog internet sistema za odgovor. Subjekti su raspoređeni na osnovu pȏla i početne upotrebe lekova protiv migrene. Tretman je administriran jednom mesečno (svakih 28 dana) za ukupno tri tretmana u periodu od 3 meseca. Administracija terapije se odvijala u poseti 2 (dan 1; prva doza), poseti 3 (dan 29; druga doza) i poseti 4 (dan 57; treća i poslednja doza). Konačne procene izlaza iz studije su obavljene prilikom posete 5 (dan 85), otprilike 28 dana nakon treće i poslednje doze. Injekcije su administrirane subjektima subkutano tokom perioda od 3 meseca (svakih 28 dana) u svakoj od sledećih grupa: (1) oni koji su nasumično postavljeni u grupu od 900 mg primili su četiri aktivne injekcije svakih 28 dana; (2) oni koji su nasumično postavljeni u grupu od 675/225 mg primili su tri aktivne i jednu placebo injekciju za prvi tretman, i jednu aktivnu i tri placebo injekcije za drugi i treći tretman; (3) oni koji su nasumično postavljeni u placebo grupu primili su četiri placebo injekcije svakih 28 dana. Aktivne injekcije su sadržavale 225 mg antitela G1. Krajnje tačke su izvedene iz elektronskog dnevnog dnevnika praćenja glavobolje, interaktivnog sistema zasnovanog na internetu koji je beležio podatke za prethodni period od 24 sata. Ukupno trajanje glavobolje je zabeleženo numerički, u satima, kao i broj sati sa glavoboljom na svakom stepenu težine. Ozbiljnost glavobolje subjekt je subjektivno ocenio u unapred definisanim vremenskim tačkama na sledeći način: bez bola, blag bol, umeren bol i jak bol. Ispitanici su takođe zamoljeni da zabeleže da li su sledeći prateći simptomi bili prisutni ili odsutni u unapred definisanim vremenskim tačkama: fotofobija, fonofobija, mučnina i povraćanje. Dodatna krajnja tačka je izvedena praćenjem upotrebe triptana (npr. sumatriptana) kao leka protiv akutne glavobolje od strane ispitanika tokom studije. Sažetak rasporeda i demografije subjekata u studiji dati su u tabeli 9.

Tabela 9

[0229] Prosečno smanjenje broja sati glavobolje u odnosu na početak u svakoj od nedelja 1, 2 i 3 (W1, W2, i W3, respektivno) za svaku od grupa je grafički predstavljeno na Sl. 15. Rezultati pokazuju značajno smanjenje u obe grupe tretmana u odnosu na placebo grupu na svakom od W1, W2 i W3, uključujući i prvu nedelju.

[0230] Prosečno smanjenje broja sati glavobolje u odnosu na početak u svakom od 1, 2 i 3 meseca (M1, M2, i M3, respektivno) za svaku od grupa je grafički predstavljeno na Sl. 12. Rezultati pokazuju značajno smanjenje u obe grupe tretmana u odnosu na placebo grupu u sve tri vremenske tačke, uključujući i posle prve doze. Statistički značaj u odnosu na placebo grupu za podatke na Sl.12 je obezbeđeno naznačenim p-vrednostima.

[0231] Prosečan broj sati glavobolje u svakoj grupi na početku, i na posetama 2, 3 i 4 (V2, V3, i V4, respektivno) je predstavljen grafički na Sl.13. Rezultati pokazuju značajno smanjenje u obe grupe tretmana u odnosu na placebo grupu u sve tri vremenske tačke, uključujući i posle prve doze.

[0232] Prosečno smanjenje broja dana glavobolje umerenog ili jakog intenziteta u odnosu na početnu liniju u svakom od meseca 1, 2 i 3 (M1, M2 i M3, respektivno) za svaku od grupa je predstavljeno na Sl.14. Rezultati pokazuju statistički značajno smanjenje u obe grupe tretmana u odnosu na placebo grupu u sve tri vremenske tačke, uključujući i posle prve doze. Statistički značaj u odnosu na placebo grupu obezbeđuju naznačene p-vrednosti.

[0233] Prosečno smanjenje broja upotreba triptana kao leka za akutnu pomoć u odnosu na početnu vrednost u svakom od meseca 1, 2 i 3 (M1, M2, i M3, respektivno) za svaku od grupa je grafički predstavljeno na Sl.16. Rezultati pokazuju značajno smanjenje upotrebe triptana u obe grupe tretmana u odnosu na placebo grupu u sve tri vremenske tačke, uključujući i posle prve doze. Statistički značaj u odnosu na placebo grupu je obezbeđen pomoću naznačenih p-vrednosti na Sl.16.

[0234] Značajno smanjenje broja sati glavobolje je takođe primećeno kod subjekata koji su koristili lekove za prevenciju (npr. topiramat i amitriptilin ili propranolol) u odnosu na placebo grupu.

[0235] Obe doze su se dobro tolerisale i nisu se pojavila bezbednosna pitanja. Rezime neželjenih događaja izazvanih lečenjem (TEAE) po grupama je dat u tabeli 10. Razlika u povezanim TEAE je skoro u potpunosti objašnjena blagim događajima povezanim sa injekcijom (eritem, izvesna nelagodnost). Ozbiljni TEAE nisu bili povezani sa lekom (nema neželjenih događaja vezanih za lek).

Tabela 10

Primer 18: Prevencija epizodne migrene visoke frekvencije u kliničkoj studiji antitela G1

[0236] Multicentrična, randomizovana, dvostruko slepa, placebom kontrolisana studija paralelnih grupa koja je upoređivala anti-CGRP antitelo G1 sa placebom izvedena je kod subjekata sa epizodičnom migrenom visoke frekvencije (HFEM). Dizajn studije je sledio model iz Primera 17, sa dve razlike. Prvo, kriterijumi za uključivanje (3) bili su za subjekte koji ispunjavaju kriterijume za epizodnu migrenu prema Second Edition of The International Headache Society (Olesen and Steiner 2004), koji imaju migrenu sa velikom učestalošću na sledeći način: (a) Istorija glavobolje na više od 8 dana mesečno najmanje 3 meseca pre skrininga; (b) verifikaciju učestalosti glavobolje kroz prospektivno prikupljene osnovne informacije tokom 28-dnevne faze uvođenja, pokazujući glavobolje (bilo koje vrste) tokom 8 do 14 dana sa najmanje 8 dana ispunjavanja kriterijuma za najmanje jedan od (i) migrene, (ii) verovatne migrene, ili (iii) upotrebe triptana ili jedinjenja ergota. Drugo, rasporedi doziranja su promenjeni za grupe koje su primale G1. Konkretno, injekcije su administrirane subkutano tokom perioda od 3 meseca (svakih 28 dana) subjektima u svakoj od sledećih grupa: (1) oni koji su nasumično raspoređeni u grupu od 675 mg, primali su 675 mg G1 svakih 28 dana; (2) oni koji su nasumično raspoređeni u grupu od 225 mg dobijali su 225 mg G1 svakih 28 dana; i (3) oni koji su nasumično raspoređeni u placebo grupu primali su placebo injekciju svakih 28 dana. Rezime dispozicije i demografije subjekata u studiji dat je u tabeli 13. Krajnje tačke studije uključivale su smanjenje broja dana migrene i smanjenje broja dana sa glavoboljom bilo koje težine.

Tabela 13

[0237] Prosečno smanjenje broja dana migrene u odnosu na početnu vrednost u svakom od meseca 1, 2 i 3 (M1, M2 i M3, respektivno) za svaku od grupa je predstavljeno na Sl.17. Rezultati pokazuju statistički značajno smanjenje u obe grupe tretmana u odnosu na placebo grupu u sve tri vremenske tačke, uključujući i posle prve doze. Statistički značaj u odnosu na placebo grupu obezbeđuju naznačene p-vrednosti.

[0238] Prosečno smanjenje broja dana glavobolje bilo koje težine u odnosu na početnu liniju u svakom od meseca 1, 2 i 3 (M1, M2, i M3, respektivno) za svaku od grupa je predstavljeno na Sl.

18. Rezultati pokazuju statistički značajno smanjenje u obe grupe tretmana u odnosu na placebo grupu u sve tri vremenske tačke, uključujući i posle prve doze. Statistički značaj u odnosu na placebo grupu obezbeđuju naznačene p-vrednosti.

[0239] Obe doze su bile dobro tolerisalne i nisu se pojavila bezbednosna pitanja. Rezime neželjenih događaja koji se javljaju prilikom lečenja (TEAE) po grupama dat je u tabeli 14. Četiri ozbiljna TEAE su nastala zbog jednog slučaja preloma fibule, jednog slučaja tremora zbog prestanka uzimanja lekova i dva slučaja migrene koja su zahtevala lečenje u hitnoj pomoći (ER).

Tabela 14

Primer 19: Neklinička bezbednost

[0240] Dve studije koje procenjuju bezbednost antitela G1 sprovedene su na cinomolgus majmunima. U prvoj studiji procenjena je bezbednost pojedinačne doze antitela G1. U drugoj studiji procenjena je bezbednost ponovljenog doziranja antitela G1. Svaka od studija i njihovi rezultati su detaljnije opisani u nastavku. I za studije pojedinačnih i ponovljenih doza, antitelo G1 je formulisano kao rastvor od 51,4 mg/mL u 20 mM histidina, 84 mg/mL trehaloze dihidrata, 0,2 mg/mL polisorbata 80, 0,05 mg/mL dinatrijum EDTA dihidrata i 0,1 mg/mL L-metionina, pH ~5,5. Nosač je formulisan identično bez antitela G1. Pored toga, u obe studije, uzorci krvi su uzimani periodično za analizu koncentracije antitela G1 u plazmi korišćenjem validirane ELISA metode.

[0241] Podaci su prvo sumirani u zbirnim tabelama i slikama koristeći GraphPad Prism (verzija 6,0) i Excel 2010 (Microsoft). Za studiju jednokratnog izlaganja, telemetrijski podaci su analizirani korišćenjem ANOVA. Analiza je izvršena korišćenjem SAS Release 8,2. Da bi se normalizovao interval QT u rasponu R-R intervala, generisani su faktori korekcije individualnih životinja (IACF) za svaku životinju povezujući svaki RR-interval sa pripadajućim QT-intervalom. Linearna regresija ovog QT/RR-interval odnosa je određena za skup podataka. Nagib ove linearne regresije je korišćen kao IACF za odgovarajuću životinju u svim tretmanima. Ovaj IACF je korišćen za izračunavanje korigovanog QT intervala (QTc) koristeći sledeću jednačinu:

QT-I(c) = QT interval korigovan za otkucaje srca = QT-I-[(RR-300)*(IACF)] [0242] Za studiju višestrukih doza, jednosmerna ANOVA je takođe korišćena za analizu podataka. Ako je ANOVA bila značajna (P ≤ 0,05), Dunnettov post-test je korišćen za poređenja između grupa. Za svaki pol, tretirana grupa je upoređena sa kontrolnom grupom (nosač) na 5% dvostranom nivou verovatnoće.

Telemetrijska studija sa jednom dozom

[0243] Osam odraslih mužjaka cinomolgus majmuna (Charles River Primates) je hirurški instrumentirano telemetrima i ostavljeni su da se oporave najmanje dve nedelje. Implantate (DSI TL11M2-D70-PCT) i prijemnike (RMC-1) proizvela je kompanija Data Sciences International.

[0244] Životinje su aklimatizovane na kaveze za prikupljanje telemetrijskih podataka najmanje preko noći pre doziranja. Tokom aklimatizacije, sprovedeno je snimanje hemodinamičkih parametara pre studije kako bi se proverilo da li transduktori i oprema ispravno funkcionišu. Tokom telemetrijskog prikupljanja podataka, životinje su bile smeštene pojedinačno u kaveze opremljene telemetrijskim prijemnicima. U dane bez sakupljanja podataka, životinje su bile smeštene u kavezima bez telemetrijskih prijemnika. Životinje su držane na dnevnom 12-časovnom ciklusu sa svetlom, 12-časovnom ciklusu u mraku, sa vodom ad libitum i hranjene sertifikovanom ishranom za primate.

[0245] Za prvu fazu studije, životinjama (8 mužjaka) je administriran samo nosač, a telemetrijski podaci su prikupljani počevši od ~1 sat pre doze do 22 sata posle doze. Šest dana nakon primene nosača, iste životinje su primile jednu IV administraciju antitela G1 (100 mg/kg, ~10 puta veća doza od farmakološke EC50 kod cinomolgus majmuna). Telemetrijski elektrokardiografski i hemodinamički podaci su ponovo kontinuirano beleženi kod svih životinja. Pored toga, ove životinje su praćene ~24 sata 3., 7., 10. i 14. dana nakon što su primile jednu dozu antitela G1. Telemetrijski EKG i signali krvnog pritiska su prenošeni preko implantiranih radio-telemetrijskih uređaja do prijemnika postavljenih u svaki kavez. Prikupljeni signali su prosleđeni kroz matricu za razmenu podataka (DSI model DEM) i na PC-bazirani sistem za prikupljanje podataka (DSI softver Ponemah P3 verzija 3,4); softver za analizu podataka je Emka Technologies verzija 2,4,0,20 (Emka Technologies). Brzina analognog/digitalnog uzorkovanja bila je 1.000 Hz za telemetarske EKG podatke i 500 Hz za podatke o krvnom pritisku. Podaci su evidentirani kao srednja vrednost od 1 min.

[0246] Srednji sistolni krvni pritisak (SBP) grupe bio je sličan pre i posle tretmana antitelom G1 tokom prvog dana nakon doziranja i narednih dana (životinje su telemetrizovane u dane 3, 7, 10 i 14 sa identičnim vremenskim intervalima kao i dan 1) . U satima 1-4 nakon doziranja kada su koncentracije antitela G1 u krvi bile na maksimalnim nivoima (srednja koncentracija od 3.500 µg/mL na 4 sata), srednji SBP je bio 111 mmHg u poređenju sa 113 mmHg u istom vremenskom intervalu nakon administracije nosača. Dalje, SBP iznosio je 110 mmHg 3. i 7. dana, 109 mmHg 10. dana i 110 mmHg 14. dana nakon primene antitela G1. Slični SBP podaci su zabeleženi i za druge vremenske intervale. Pošto je ovo bila unakrsno dizajnirana studija, tretirane životinje su služile i kao sopstvene kontrole. Kada su podaci analizirani kao razlike u krvnom pritisku nakon primene antitela G1 u poređenju sa tretmanom nosačem, postoje manja statistički značajna smanjenja SBP u poslednjem vremenskom intervalu 7, 10. i 14. dana.

[0247] Posle tretmana antitelom G1, primećeno je da je dijastolni krvni pritisak (DBP) oko 3 mmHg niži od srednjih vrednosti dobijenih nakon primene vehikuluma. Od časova 5-22, srednja vrednost grupe za vehikulum i grupu antitela G1 bila je slična. Isti trend je primećen i drugih dana, kada je došlo do blagog smanjenja DBP (u rasponu od 2,62-3,5 mmHg) u prvom izmerenom intervalu, sa nekoliko promena slične veličine primećene sporadično 7-10 dana u intervalu od 7-22 sata. Slično onome što je uočeno za DBP, manja smanjenja srčane frekvencije su primećena tokom prve procene (sati 1-4) u odnosu na tretman sa vozilom. Razlike su bile neotkrivene tokom srednjih procena i ponovo su primećene između 18-22 sata svih dana

[0248] Štaviše, u pogledu EKG nalaza, nije bilo statistički značajnih promena u KTc intervalu u bilo kojoj vremenskoj tački, u odnosu na tretman nosačem. Iako su statistički značajne promene u RR, PR, RS i QT primećene tokom perioda od 14 dana u poređenju sa vehikulom, sve su one bile minorne u apsolutnoj vrednosti.

Studija bezbednosti ponovljenih doza

[0249] Bezbednosna studija ponovljene doze uključivala je 48 odraslih, polno podudarnih (6 po polu po grupi) antitela na G1 naivnih majmuna cinomolgus (Charles River Primates). Životinje su primale nosač ili antitelo G1 kao intravensku injekciju jednom nedeljno tokom 14 nedelja u dozama od 10 mg/kg, 100 mg/kg ili 300 mg/kg. U svakoj grupi, po dve životinje svakog pola je dozvoljeno da se oporave još 4 meseca nakon završetka doziranja.

[0250] EKG i merenja krvnog pritiska su zabeležena jednom tokom faze pre studije, dva puta nakon što je postignuto stabilno stanje (pre doziranja i 4 sata posle doze 85. dana) i jednom ~1 nedelju nakon završetka doziranja ( 103. dan faze oporavka). Životinje su anestezirane ketaminom i EKG su snimljeni pomoću osam elektroda. Merenje EKG-a (uključujući broj otkucaja srca) je urađeno sa snimljenim podacima korišćenjem softverskog sistema Life Science Suite Ponemah Physiology Platform preko DSI, koristeći elektrode I, II, aVF, CG4RL i CV4LL, kao standard. Korekcija otkucaja srca za QT interval (QTc) je izračunata korišćenjem Bazetove formule.

[0251] Krvni pritisak je zabeležen pre prve doze, posle 12 nedelja doziranja (13 doza) i približno 1 nedelju nakon završetka doziranja. Nisu zabeležene značajne promene u SBP ili DBP ni u jednoj od tretiranih grupa životinja u odnosu na životinje tretirane nosačem. Prosečni broj otkucaja srca u grupi bio je relativno konzistentan u svim grupama doza i izmerenim vremenskim tačkama, bez izmerenih statističkih razlika. Koncentracije antitela G1 u plazmi merene su tokom prve nedelje doziranja i u vreme merenja krvnog pritiska i EKG, pokazujući akumulaciju pri ponovljenom nedeljnom doziranju.

[0252] Štaviše, u pogledu EKG nalaza, nije bilo značajnih razlika u QTc intervalu u svim dozama i vremenskim tačkama. Pored toga, nisu primećene nikakve značajne ili relevantne promene EKG-a za bilo koji od EKG parametara procenjenih tokom studije.

[0253] Ukratko, antitelo G1 je bilo veoma dobro tolerisano u obe studije, bez klinički značajnih promena u bilo kom hemodinamskom parametru, niti bilo kakve relevantne promene zabeležene u bilo kom EKG parametru. Kod cinomolgus majmuna, čini se da dugotrajna inhibicija CGRP antitelom G1 ne utiče na kardiovaskularne i hemodinamičke parametre.

Depozit biološkog materijala

[0254] Sledeći materijali su deponovani u American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA (ATCC):

[0255] Vektor pEb.CGRP.hKGI je polinukleotid koji kodira varijabilni region lakog lanca G1 i konstantni region lakog lanca kapa; i vektor pDb.CGRP.hFcGI je polinukleotid koji kodira varijabilni region teškog lanca G1 i konstantni region teškog lanca IgG2 koji sadrži sledeće mutacije: A330P331 do S330S331 (numeracija amino kiselina u odnosu na sekvencu divljeg tipa IgG2; videti Eur. J. Immunol (1999) 29:2613-2624).

[0256] Ovi depoziti su napravljeni u skladu sa odredbama Budimpeštanskog ugovora o međunarodnom priznavanju depozita mikroorganizama u svrhu patentnog postupka i propisa prema njemu (Budimpeštanski ugovor). Ovo osigurava održavanje održive kulture depozita tokom 30 godina od datuma depozita. Depozit će biti stavljen na raspolaganje od strane ATCC u skladu sa uslovima Budimpeštanskog sporazuma i podložno sporazumu između Rinat Neuroscience Corp. i ATCC, koji garantuje stalnu i neograničenu dostupnost potomaka kulture depozita javnosti nakon izdavanja relevantnog američkog patenta ili nakon objavljivanja za javnost bilo koje američke ili strane patentne prijave, šta god se prvo dogodi, i osigurava dostupnost potomstva za one koje je odredio Američki komesar za patente i žigove (U.S. Commissioner of Patents and Tradema) da imaju pravo na to u skladu sa 35. članom 122 USC i pravila Komesara u skladu sa njima (uključujući 37 CFR odeljak 1,14 sa posebnim osvrtom na 886 SG 638).

[0257] Nosilac ove prijave se složio da ako kultura materijala na depozitu ugine ili bude izgubljena ili uništena kada se kultiviše pod odgovarajućim uslovima, materijal će odmah biti zamenjen nakon obaveštenja drugom istom. Dostupnost deponovanog materijala ne treba tumačiti kao licencu za praktikovanje pronalaska u suprotnosti sa pravima koja su dodeljena pod ovlašćenjem bilo koje Vlade u skladu sa njenim zakonima o patentima.

Sekvence antitela

[0258]

G1 aminokiselinska sekvenca teškog lanca varijabilnog regiona (SEQ ID NO: 1)

G1 aminokiselinska sekvenca lakog lanca varijabilnog regiona (SEQ ID NO:10)

G1 teški lanac celog antitela aminokiselinske sekvence (uključujući modifikvan IgG2 kao što je ovde opisano) (SEQ ID NO:11)

G1 laki lanac celog antitela aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO:12)

G1 teški lanac celog antitela aminokiselinske sekvence ( uključujući modifikovan IgG2 kao što je ovde opisano) (SEQ ID NO:13)

G1 laki lanac celog antitela aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO:14)

poređenje aminokislinske sekvence čoveka i pacova CGRP (humani α-CGRP (SEQ ID NO:15); humani β-CGRP (SEQ ID NO:43)pacovski α-CGRP (SEQ ID NO:41); i pacovski

Varijabilan region lakog lanca LCVR17 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 58)

Varijabilan region teškog lanca HCVR22 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 59)

Varijabilan region lakog lanca LCVR18 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 60)

Varijabilan region teškog lanca HCVR23 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 61)

Varijabilan region lakog lanca LCVR19 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 62)

Varijabilan region teškog lanca HCVR24 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 63)

Varijabilan region lakog lanca LCVR20 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 64)

Varijabilan region teškog lanca HCVR25 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 65)

Varijabilan region lakog lanca LCVR21 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 66)

Varijabilan region teškog lanca HCVR26 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 67)

Varijabilan region lakog lanca LCVR27 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 68)

Varijabilan region teškog lanca HCVR28 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 69)

Varijabilan region lakog lanca LCVR29 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 70)

Varijabilan region teškog lanca HCVR30 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 71)

Varijabilan region lakog lanca LCVR31 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 72)

Varijabilan region teškog lanca HCVR32 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 73)

Varijabilan region lakog lanca LCVR33 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 74)

Varijabilan region teškog lanca HCVR34 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 75)

Varijabilan region lakog lanca LCVR35 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 76)

Varijabilan region teškog lanca HCVR36 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 77)

Varijabilan region lakog lanca LCVR37 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 78)

Varijabilan region teškog lanca HCVR38 aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 79)

Claims (7)

1. Patentni zahtevi 1. Monoklonsko antitelo za upotrebu u postupku lečenja ili smanjenja incidencije migrenske glavobolje kod subjekta, pri čemu monoklonsko antitelo moduliše CGRP put, gde monoklonsko antitelo ima teški lanac sa sekvencom aminokiselina

   i laki lanac sa sekvencom aminokiselina

   i pri čemu je antitelo administrirano jednom mesečno subkutano u dozi od 225 mg.
2. 2. Monoklonsko antitelo za upotrebu u postupku lečenja ili smanjenja incidencije migrenske glavobolje kod subjekta prema zahtevu 1, pri čemu migrenska glavobolja je hronična migrenska glavobolja.
3. 3. Monoklonsko antitelo za upotrebu u postupku lečenja ili smanjenja incidencije migrenske glavobolje kod subjekta prema zahtevu 1, pri čemu migrenska glavobolja je epizodna migrenska glavobolja.
4. 4. Monoklonsko antitelo za upotrebu u postupku lečenja ili smanjenja incidencije migrenske glavobolje kod subjekta prema zahtevu 1, pri čemu administracija obuhvata korišćenje prethodno napunjenog šprica koji sadrži količinu monoklonskog antitela.
5. 5. Monoklonsko antitelo za upotrebu u postupku lečenja ili smanjenja incidencije migrenske glavobolje kod subjekta prema zahtevu 1, pri čemu je monoklonsko antitelo formulisano u koncentraciji od najmanje 150 mg/mL.
6. 6. Monoklonsko antitelo za upotrebu u postupku lečenja ili smanjenja incidencije migrenske glavobolje kod subjekta prema zahtevu 1, pri čemu je monoklonsko antitelo administriano u zapremini manjoj od 2 mL.
7. 7. Monoklonsko antitelo za upotrebu u postupku lečenja ili smanjenja incidencije migrenske glavobolje kod subjekta prema zahtevu 1, pri čemu subjekt je čovek.