UA123759C2 - Застосування моноклонального антитіла, яке інгібує шлях пов'язаного з геном кальциноніну пептиду (cgrp), для лікування або зниження частоти випадків мігренозного головного болю у суб'єкта - Google Patents

Abstract

Винахід стосується застосування моноклонального антитіла, яке інгібує шлях пов’язаного з геном кальцитоніну пептиду (CGRP), для лікування або зниження частоти випадків мігренозного головного болю у суб'єкта, при цьому моноклональне антитіло вводять підшкірно суб’єкта один раз на місяць в дозі 225 мг.

Description

Перехресне посилання на споріднені заявки

Ця заявка заявляє пріоритет тимчасової патентної заявки США Мо 61/968897, поданої 21 березня 2014 р., тимчасової патентної заявки США Мо 62/083809, поданої 24 листопада 2014 р. та тимчасової патентної заявки США Мо 62/119778, поданої 23 лютого 2015 р., які включені до даного документу як посилання в повному обсязі в усіх відношеннях.

Відомий рівень техніки

СОКР (пептид, кодований геном кальцитоніну) є нейропептидом, що складається з 37 амінокислот, який належить до сімейства пептидів, що включає кальцитонін, адреномедулін та амілін. У людей існують дві форми СОКР (0-СОЕКР та Д-СОКР), які виявляють схожу активність.

Вони відрізняються трьома амінокислотами та демонструють диференціальний розподіл.

Щонайменше два субтипи рецепторів СОКР можуть також відповідати за відмінності в активності. СОКР є нейротрансмітером в центральній нервовій системі, та як було продемонстровано, є сильним вазодилататором в периферичній системі, де СОКР-вмісні нейрони щільно асоційовані з кровоносними судинами. СОКР-медійована вазодилатація також асоційована з нейрогенним запаленням, як частина каскаду подій, що приводить до транссудації плазми та вазодилатації мікроциркуляторної частини судинного русла, та присутня при мігрені.

Був відзначений можливий зв'язок СОКР з вазомоторними симптомами (Уууоп еї аїЇ. Зсапа.

У. ої. Мерпгої. 35: 92-96 (2001); М/уоп еї ам. Мепорайзе 7(1):25-30 (2000)). Вазомоторні симптоми (ММ5), такі як припливи крові та нічна пітливість, є найбільш розповсюдженими симптомами, асоційованими з менопаузою, спостережуваними у від 60 95 до 80 95 усіх жінок після природної або хірургічно індукованої менопаузи. Припливи крові ймовірно є адаптивною відповіддю центральної нервової системи (ЦНС) на зниження рівня статевих стероїдних гормонів (Егеєдтап Ат. У. Нитап Віо!. 13:453-464 (2001)). На сьогодні, найбільш ефективними видами терапії припливів є гормональні методи лікування, включаючи естрогени та/або деякі прогестини. Гормональні методи лікування можуть бути ефективними для полегшення припливів, але не є придатними для усіх жінок. Спостережувані психологічні та емоційні симптоми, такі як нервозність, втома, дратівливість, безсоння, депресія, втрата пам'яті, головний біль, тривога, нервозність або нездатність концентруватися вважаються викликаними втратою сну після припливів крові та нічної пітливості (Кгатег еї аї., в: МигрпуУ еї аї., 3.5!ир.га пе

Зутровішт оп Несепі Адмапсез іп ОгоІодіса! Сапсег Оіадпозіз апа Тгеаїтепі-Ргосеєдіпд5, Рагів,

Егапсе: ЗОЇ: 3-7 (1992)).

Чоловіки також зазнають припливів крові після відміни стероїдного гормону (андрогену). Це спостерігається у випадку вікового зниження андрогенів (Каїоміси, еї аї!., Ргосеєдіпд5 ої Ше зЗосієїу ог Ехрегітепіа! Віоїосду е Меадісіпе, 1990, 193(2): 129-35), а також в крайніх випадках виключення ендокринної функції, асоційованих з лікуванням раку простати (Вегепазеп, еї аї.,

Емгореап доштаї ої Рнаптасоіоду, 2001, 419(1): 47-54). Третина таких пацієнтів зазнає постійних та частих симптомів, достатньо тяжких для того, щоб викликати значний дискомфорт та незручності.

СОКР є сильним вазодилататором, який задіяний в патології інших вазомоторних симптомів, таких як форми судинного головного болю, включаючи мігрені (з аурою або без) та кластерний головний біль. бигпат, М. Епаї. У. Мед. 350:1073-1075, 2004. Рівні СОКР у сироватці в зовнішній яремній вені підвищені у пацієнтів під час нападів мігрені. бЗоаазру еї аї., Апп.

Мешго!. 28:183-7, 1990. Внутрішньовенне введення людського а-СОЕР індукувало головний біль та мігрень у пацієнтів, хворих на мігрень без аури, дозволяючи припустити, що СОЕР відіграє причинну роль при мігрені. Газзеп еїаї., Серпаїа|діа 22:54-61, 2002.

Можлива участь СОКР в мігрені послужило основою для розробки та тестування ряду сполук, які інгібують вивільнення СОБР (наприклад, суматриптан), антагонізують рецептор

ССОРЕР (наприклад, дипептидна похідна ВІВМ4096В5 (Воегптгіпдег ІпдеІйпеїйт); СОКР(8-37)), або взаємодіють з одним або декількома асоційованими з рецептором білками, такими як мембранний білок рецепторної активності (КАМР) або білковий компонент рецептора (РСР), які обидва впливають на зв'язування СОКР з його рецепторами. Вгаїп, 5. еї аї., Тгепав5 іп

РіпаптасоіодісаІ! Зсієпсев 23:51-53, 2002. Субтипи альфа-2 адренорецептора та рецептори аденозину АТ також контролюють (інгібують) вивільнення СОЕР та збудження трійчастого нерва (Соадеру єї аї., Вгаійп 125:1392-401, 2002). Агоніст рецептора аденозину Аї ОК79236 (метрафаділ), який, як було продемонстровано, інгібує нейрогену вазодилатацію та тригемінальну ноцицепцію у людей, може також виявляти протимігреневу активність (АгиЇїтапі еї а!., СернаїаІдіа 25:1082-1090, 2005; Сніп еї а!., Серпаїадіа 23:287-292, 2003.)

Цій теорії суперечить спостереження, що лікування сполуками, які інгібують виключно (610) нейрогенне запалення (наприклад, антагоністами рецептора тахікініну МК!) або збудження трійчастого нерва (наприклад, агоністами рецептора 5НТ:о), як було продемонстровано, є відносно неефективним засобом купування нападів мігрені, що примусило деяких дослідників висловлювати сумніви в тому, що інгібування вивільнення СОКР є первинним механізмом дії ефективних протимігреневих терапій. Агитапі еї аї., Єнпг. У. Рпаптасої. 500:315-330, 2004.

Мігрень є комплексним розповсюдженим неврологічним станом, що характеризується тяжкими епізодичними нападами головного болю та асоційованими ознаками, які можуть включати нудоту, блювоту, чутливість до світла, звуків або руху. У деяких пацієнтів, головному болю передує, або він супроводжується, аурою. Головний біль може бути тяжким, і може також бути однобічним у певних пацієнтів.

Напади мігрені чинять руйнівний вплив на повсякденне життя. В США та Західній Європі загальна кількість людей, що потерпають від мігрені, складає 11 95 від населення в цілому (6 95 чоловіків; 15-18 95 жінок). Крім того, медіанна частота нападів у індивідуума складає 1,5/місяць.

Хоча існує ряд способів лікування, призначених для пом'якшення або ослаблення симптомів, пацієнтам, які зазнають більше 3-4 нападів мігрені на місяць, рекомендується превентивна терапія. Соаазбру еї аЇ. Мем Епа|. У. Мей. 346(4): 257-275, 2002.

Різні способи фармакологічного втручання, які використовувалися для лікування мігрені, та різноманітність реакцій у відповідь у пацієнтів свідчать про розмаїтий характер цього розладу.

Таким чином, такі відносно неселективні лікарські засоби, як алкалоїди ріжків (наприклад, ерготамін, дигідроерготамін, метисергід), що виявляють серотонінергічну, а також адренергічну, норадренергічну та допамінергічну активність, використовувалися протягом більш ніж вісімдесяти років для лікування мігрені. Інші способи лікування включають опіати (наприклад, оксикодон) та р-адренергічні антагоністи (наприклад, пропранолол). Деякі пацієнти, звичайно, з більш м'якими симптомами, є здатними контролювати свої симптоми за допомогою ліків, що відпускаються без рецепта, таких як один або декілька нестероїдних протизапальних агентів (МЗАЇІЮ5), таких як комбінація аспірину, ацетамінофену та кофеїну (наприклад, ЕхсеагіпФ

Мідгаіпе (екседрин-мігрень)).

Останнім часом, деяких пацієнтів з мігренню лікували топіраматом, протисудомним засобом, який блокує потенціал-залежні натрієві канали, та певні глутаматні рецептори (АМРА-каїнат), потенціює активність рецептора САВА-А, та блокує карбоангідразу. Відносно недавній успіх агоністів рецептора серотоніну 5НТ-18/10 та/або 5НТ-1а, таких як суматриптан, у деяких пацієнтів, підштовхнув дослідників до припущення про серотонінергічну етіологію розладу. На жаль, хоча деякі пацієнти добре відкликалися на цей спосіб лікування, інші були відносно несприйнятливими до нього.

Було припущено, що в основі розладу лежить дисфункція іонного каналу в амінергічних ядрах стовбура мозку, однак точна патофізіологія мігрені досліджена недостатньо. Було показано, що одна з форм мігрені, родинна геміплегічна мігрень, асоційована з місенс- мутаціями в «а1-субодиниці потенціал-керованих кальцієвих каналах Р/О-типу, та вважається імовірним, що інші мутації іонних каналів також будуть знайдені в інших популяціях пацієнтів.

Хоча дилатація кровоносних судин асоційована з та підсилює больові симптоми мігрені, такі нервово-судинні події зараз вважаються результатом, а не причиною стану. Загалом, об'єднувальною ознакою мігрені вважається дисфункція шляхів стовбура мозку, які модулюють сенсорний вхід. Соаазру, Р... еї аї., Мем Епа|. У. Мей. 346(4): 257-275, 2002.

Стислий опис суті винаходу

В деяких аспектах, винахід, розкритий в даному документі, стосується антагоністичних антитіл анти СОКР та способів використання антагоністичних антитіл анти СОЕР для лікування або профілактики вазомоторних симптомів. Приклади вазомоторних симптомів наведені в даному документі, такі як приплив крові. В деяких випадках, антагоністичні антитіла анти СОКР використовуються для лікування або профілактики головного болю, такого як мігрень з аурою або без неї, геміплегічна мігрень, кластерні головні болі, мігренозна невралгія, хронічні головні болі, головні болі напруги та головні болі, викликані іншими медичними станами (такими як інфекція або підвищений внутрішньочерепний тиск внаслідок пухлини).

В одному аспекті, даний винахід передбачає спосіб лікування або профілактики щонайменше одного вазомоторного симптому у особи, який включає введення особі ефективної кількості антагоністичного антитіла анти СОКР.

В одному аспекті, даний винахід передбачає спосіб лікування або профілактики головного болю (наприклад, мігрені та кластерного головного болю) у особи, який включає введення особі ефективної кількості антагоністичного антитіла анти СОКР.

В іншому аспекті, винахід передбачає спосіб полегшення, контролю, зниження частоти, або затримання розвитку або прогресування головного болю (наприклад, мігрені та кластерного (610) головного болю) у особи, який включає введення особі ефективної кількості антагоністичного антитіла анти СОКР.

В одному аспекті, винахід передбачає спосіб лікування або зниження частоти щонайменше одного вазомоторного симптому та/або головного болю у суб'єкта. В одному варіанті реалізації, спосіб включає введення суб'єкту протягом багатьох днів певної кількості моноклонального антитіла (наприклад, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), яке модулює шлях СОКР, причому кількість, що вводиться в кожний з багатьох днів, становить менш ніж 1000 мг. В одному варіанті реалізації, спосіб включає введення суб'єкту протягом багатьох днів певної кількості моноклонального антитіла (наприклад, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), яке модулює шлях СОКР, причому кількість, що вводиться в кожний з багатьох днів, має значення в діапазоні 100-2000 мг. В деяких варіантах реалізації, головний біль є мігренню (наприклад, хронічною мігренню або епізодичною мігренню). В деяких варіантах реалізації, два з багатьох днів розділені інтервалом у більш ніж сім днів. В деяких варіантах реалізації, частота головного болю знижується на щонайменше сім днів після однократного введення. В деяких варіантах реалізації, кількість моноклонального антитіла, що вводиться в перший день, відрізняється від (наприклад, перевищує) кількість моноклонального антитіла, що вводиться на другий день. В деяких варіантах реалізації, суб'єкту вводять менш ніж З дози на місяць. В деяких варіантах реалізації, введення є підшкірним введенням. В деяких варіантах реалізації, введення є внутрішньовенним введенням. В деяких варіантах реалізації, введення включає використання попередньо наповненого шприца, що містить певну кількість моноклонального антитіла. В деяких варіантах реалізації, композицію моноклонального антитіла готують в концентрації 150 мг/мл. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло вводять в об'ємі менше 2 мл. В деяких варіантах реалізації, кількість моноклонального антитіла становить менш ніж 1000 мг. В деяких варіантах реалізації, місячна кількість годин головного болю, який відчуває суб'єкт, знижується після зазначеного введення на 40 або більше годин (наприклад, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 або більше) порівняно з рівнем, який спостерігався у суб'єкта до введення. Місячна кількість годин головного болю може бути зменшена більш ніж на 60 годин. В деяких варіантах реалізації, місячна кількість годин головного болю, який відчуває суб'єкт, після зазначеного введення знижується на 25 965 або більше (наприклад, 3095, 3595, 4095, 45965, 50 95, або більше) порівняно з рівнем, який спостерігався у суб'єкта до введення. Місячна кількість годин головного болю може бути зменшена на 40 95 або більше. В деяких варіантах реалізації, місячна кількість днів головного болю, який відчуває суб'єкт, знижується після зазначеного введення на З або більше днів (наприклад, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше днів) порівняно з рівнем, який спостерігався у суб'єкта до введення. В деяких варіантах реалізації, спосіб додатково включає введення суб'єкту другого агента одночасно або послідовно з моноклональним антитілом. Другий агент може бути будь-яким з агоністів 5-НТІ1, триптанів, алкалоїдів ріжків та нестероїдних протизапальних лікарських засобів. В деяких варіантах реалізації, другий агент є агентом, який приймається суб'єктом профілактично. В деяких варіантах реалізації, місячне застосування другого агента суб'єктом знижується на щонайменше 15 95 після введення моноклонального антитіла. В деяких варіантах реалізації, другий агент є триптаном. В деяких варіантах реалізації, суб'єкт є людиною. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло є людським або гуманізованим моноклональним антитілом. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло включає (а) антитіло, що має СОК НІ, як представлено в ЗЕО ІЮО МО: 3; СОК Н2, як представлено в 5ЕО ІЮ МО: 4; СОК НЗ, як представлено в 5ЕБЕО ІЮ МО: 5; СОК 11, як представлено в 5ЕО ІО МО: 6; СОК 12, як представлено в 5ЕО ІЮО МО: 7; та СОК ІЗ, як представлено в ЗЕО ІЮ МО: 8; або (Б) варіант антитіла згідно з (а), як показано в Таблиці 6.

В одному аспекті, винахід передбачає спосіб зменшення величини місячної кількості годин головного болю, який відчуває суб'єкт. В одному варіанті реалізації, спосіб включає введення суб'єкту кількості моноклонального антитіла, яка модулює шлях СоОКР, де кількість моноклонального антитіла ефективно знижує величину місячної кількості годин головного болю на щонайменше 20 (наприклад, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 або більше годин головного болю) після разової дози. В деяких варіантах реалізації, величина місячної кількості годин головного болю знижується на щонайменше близько 50 годин. В одному варіанті реалізації, спосіб включає введення суб'єкту кількості моноклонального антитіла, яка модулює шлях

СОР, де кількість моноклонального антитіла ефективно знижує величину місячної кількості годин головного болю на щонайменше 15 95 (наприклад, 20 95, 25 95, 30 96, 35 Зо, 40 95, або більше) після разової дози. В деяких варіантах реалізації, величина місячної кількості годин головного болю знижується на щонайменше близько 30 95. В деяких варіантах реалізації, 10) моноклональне антитіло є антагоністичним антитілом анти СОКР. В деяких варіантах реалізації, кількість моноклонального антитіла становить менш ніж 1000 мг. В деяких варіантах реалізації, суб'єкту вводять менш ніж З дози на місяць. В деяких варіантах реалізації, введення є підшкірним або внутрішньовенним введенням. В деяких варіантах реалізації, композицію моноклонального антитіла готують в концентрації щонайменше 150 мг/мл. В деяких варіантах реалізації, (у яких) моноклональне антитіло вводять в об'ємі менше 2 мл. В деяких варіантах реалізації, суб'єкт є людиною. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло є людським або гуманізованим. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло включає (а) антитіло, що має СОК НІ, як представлено в 5ЕО ІЮО МО: 3; СОК Н2, як представлено в БЕО

ІО МО: 4; СОК НЗ, як представлено в 5ЕО ІЮ МО: 5; СОК 11, як представлено в 5ЕО ІЮО МО: 6;

СОК 17, як представлено в ЗЕО ІЮО МО: 7; та СОК ІЗ, як представлено в 5ЕО ІЮО МО: 8; або (Б) варіант антитіла згідно з (а), як показано в Таблиці 6.

В одному аспекті, винахід передбачає спосіб зменшення величини місячної кількості днів головного болю, який відчуває суб'єкт. В одному варіанті реалізації, спосіб включає введення суб'єкту кількості моноклонального антитіла, яка модулює шлях СоОКР, де кількість моноклонального антитіла ефективно знижує величину місячної кількості днів головного болю на щонайменше 3 (наприклад, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше днів головного болю) після разової дози. В деяких варіантах реалізації, величина місячної кількості днів головного болю знижується на щонайменше близько 6 днів головного болю. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло є антагоністичним антитілом анти

СОРР. В деяких варіантах реалізації, кількість моноклонального антитіла становить менш ніж 1000 мг. В деяких варіантах реалізації, суб'єкту вводять менш ніж З дози на місяць. В деяких варіантах реалізації, введення є підшкірним або внутрішньовенним введенням. В деяких варіантах реалізації композицію моноклонального антитіла готують в концентрації щонайменше 150 мг/мл. В деяких варіантах реалізації, "у яких) моноклональне антитіло вводять в об'ємі менше 2 мл. В деяких варіантах реалізації, суб'єкт є людиною. В деяких варіантах реалізації моноклональне антитіло є людським або гуманізованим. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло включає (а) антитіло, що має СОК НІ, як представлено в

ЗЕБЕО ІЮ МО: 3; СОК Не, як представлено в ЗЕО ІО МО: 4; СОК НЗ, як представлено в 5ЕО ІЮ

МО: 5; СОК 11, як представлено в 5ЕО ІО МО: 6; СОК 12, як представлено в ЗЕО ІО МО: 7; та

СО ІЗ, як представлено в ЗЕО ІО МО: 8; або (Б) варіант антитіла згідно з (а), як показано в

Таблиці 6.

В одному аспекті, винахід передбачає спосіб зменшення використання суб'єктом лікарського препарату проти головного болю, який включає введення суб'єкту моноклонального антитіла (наприклад, антагоністичного антитіла анти СОКР), яке модулює шлях СОБКР, де кількість моноклонального антитіла ефективно знижує місячне застосування суб'єктом лікарського препарату проти головного болю на щонайменше 15 95 (наприклад, 20 95, 2595, ЗО Ус, 35 Об, 95, або більше). В деяких варіантах реалізації, лікарський препарат проти головного болю вибирають з групи, що складається з агоністів 5-НТІ1, триптанів, опіатів, В-адренергічних антагоністів, алкалоїдів ріжків, та нестероїдних протизапальних лікарських засобів (М5АЇІО5). В 40 деяких варіантах реалізації, лікарським препаратом проти головного болю є триптан. В деяких варіантах реалізації, кількість моноклонального антитіла становить менш ніж 1000 мг. В деяких варіантах реалізації, суб'єкту вводять менш ніж З дози на місяць. В деяких варіантах реалізації, введення є підшкірним або внутрішньовенним введенням. В деяких варіантах реалізації, композицію моноклонального антитіла готують в концентрації щонайменше 150 мг/мл. В деяких варіантах реалізації, (у яких) моноклональне антитіло вводять в об'ємі менше 2 мл. В деяких варіантах реалізації, суб'єкт є людиною. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло є людським або гуманізованим. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло включає (а) антитіло, що має СОК НІ, як представлено в 5ЕО ІЮО МО: 3; СОК Н2, як представлено в БЕО

ІО МО: 4; СОК НЗ, як представлено в 5ЕО ІЮ МО: 5; СОК 11, як представлено в 5ЕО ІЮ МО: 6;

СОК 17, як представлено в ЗЕО ІЮО МО: 7; та СОК ІЗ, як представлено в ЗЕО ІЮ МО: 8; або (Б) варіант антитіла згідно з (а), як показано в Таблиці 6.

В одному аспекті, винахід передбачає спосіб лікування або зменшення частоти головного болю (наприклад, мігрені) у суб'єкта, який включає введення суб'єкту разової дози моноклонального антитіла (наприклад, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР) в кількості, яка модулює шлях СОКР, причому кількість моноклонального антитіла має значення в діапазоні 100-2000 мг.

В додатковому варіанті реалізації, винахід передбачає способи полегшення, контролю, зниження частоти, або затримання розвитку або прогресування головного болю (наприклад, мігрені та кластерного головного болю) у особи, які включають введення особі ефективної 10) кількості антагоністичного антитіла анти СОЕР в комбінації з щонайменше одним додатковим агентом, придатним для лікування головного болю. Такі додаткові агенти включають 5-НТ1- подібні агоністи (та агоністи, які діють на інші сайти 5-НТІ1), та нестероїдні протизапальні лікарські засоби (МЗАЇІЮ5).

Приклади агоністів 5-НТ1, які можуть бути використані в комбінації з антитілом анти СОРБР, включають клас сполук, відомих як триптани, такі як суматриптан, золмітриптан, наратриптан, ризатриптан, елетриптан, алмотриптан та фроватриптан. Відомо, що алкалоїди ріжків та споріднені сполуки також виявляють агоністичну активність до 5-НТ та використовувалися для лікування головного болю, такого як мігрень. Такі сполуки включають, зокрема, ерготамін тартрат, ергоновін малеат та ерголоїд мезилати (наприклад, дигідроергокорнін, дигідроергокристин, дигідроергокриптин та дигідроерготамін мезилат (ОНЕ 45)).

Приклади М5АЇЮ»5, які можуть бути використані в комбінації з антитілом анти СОКР, включають аспірин, диклофенак, дифлусинал, етодолак, фенбуфен, фенопрофен, флуфенісад, флурбіпрофен, ібупрофен, індометацин, кетопрофен, кеторолак, меклофенамову кислоту, мефенамову кислоту, набуметон, напроксен, оксапрозин, фенілбутазон, піроксикам, суліндак, толметин або зомепірак, інгібітори циклооксигенази-2 (СОХ-2), целекоксиб; рофекоксиб; мелоксикам; УТЕ-522; І -745,337; М5398; або їх фармацевтично прийнятні солі.

В іншому аспекті, винахід передбачає спосіб полегшення, контролю, зниження частоти, або затримання розвитку або прогресування припливів крові у особи, який включає введення особі ефективної кількості антагоністичного антитіла анти СОКР.

В іншому аспекті, винахід передбачає способи полегшення, контролю, зниження частоти, або затримання розвитку або прогресування припливів крові у особи, які включають введення особі ефективної кількості антагоністичного антитіла анти СОКР в комбінації з щонайменше одним додатковим агентом, придатним для лікування припливів крові. Такі додаткові агенти включають, без обмежень, гормональні методи лікування, включаючи естрогени та/або прогестини.

В одному варіанті реалізації, антагоністичне антитіло анти СОЕР, використовуване в будь- якому з описаних вище способів, є будь-яким з антитіл, описаних в даному документі.

В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР розпізнає людський

ССОРР. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР зв'язується з обома з людських а-СОКР та ВД-СОКР. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти

СОКР зв'язується з людським та щурячим СОКР. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР зв'язує С-кінцевий фрагмент, що містить амінокислоти 25-37 СОКР. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР зв'язує С-кінцевий епітоп в межах амінокислот 25-37 СОВР.

В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР є моноклональним антитілом. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР є гуманізованим.

В деяких варіантах реалізації, антитіло є людським. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР є антитілом 1 (як описано в даному документі). В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР включає одну або декілька СО (гіперваріабельних ділянок), наприклад, одну, дві, три, чотири, п'ять або, в деяких варіантах реалізації, усі шість СОК) антитіла 1 або варіантів С1, представлених в Таблиці 6. В інших варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР містить амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, представлену на Фігурі 5 (ЗБО ІЮО МО: 1), та амінокислотну послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, представлену на Фігурі 5 (ЗЕО ІО МО: 2).

В деяких варіантах реалізації, антитіло містить модифіковану константну область, таку як константну область, яка є імунологічно інертною (включаючи частково імунологічно інертну), наприклад, не ініціює медійований комплементом лізис, не стимулює опосередковану антитілами клітинну цитотоксичність (АОСС), не активує мікроглію, або виявляє знижену одну або декілька із зазначених активностей. В деяких варіантах реалізації, константна область є модифікованою, як описано в Еиг. У. ІттипоїЇ. (1999) 29:2613-2624; заявці РСТ Мо

РСТ/5899/01441; та/або патентній заявці Великобританії Мо 9809951.8. В інших варіантах реалізації, антитіло містить константну область важкого ланцюга людського Їдс2, що містить такі мутації: АЗЗОРЗ331 на 53305331 (нумерація амінокислот згідно з послідовністю Ідс2 дикого типу). Еншг. У. Іттипої. (1999) 29:2613-2624. В деяких варіантах реалізації, константна область важкого ланцюга антитіла є важким ланцюгом людського ЇдСс1 з будь-якими з таких мутацій: 1)

АЗ27АЗЗОРЗ31 на 532753305331; 2) Е233І 2341 23505236 (5ЕО ІЮ МО: 48) на Р233М234А235 з делецією (3236; 3) Е233І 2341 235 на Р233У234А235; 4) Е233І 234Ї 23505236А327АЗЗ30РЗ331 (ЗЕО

ІЮ МО: 49) на Р2г33у234А2350532753305331 (5БО ІО МО: 50) з делецією (0236; 5) (610) Е233І 234Ї 235А327АЗЗОРЗЗ1 (5ЕБО ІО МО: 51) на Р233М234А2350532753305331 (5БО ІЮ МО:

50); і 6) М297 на А297 або будь-яку іншу амінокислоту крім М. В деяких варіантах реалізації, константна область важкого ланцюга антитіла є важким ланцюгом людського Ідсе4 з будь-якими з таких мутацій: Е233Р234123505236 (5БО ІО МО: 52) на Р233М234А235 з делецією 236;

Е233Е2341 235 на Р233М234А235; та 52281 235 на Р228Е235.

В інших варіантах реалізації, константна область аглікозильована для М-зв'язаного глікозилювання. В деяких варіантах реалізації, константна область аглікозильована для М- зв'язаного глікозилювання шляхом мутації залишку приєднання олігосахариду (такого як

А5п297) та/або фланкуючих залишків, які є частиною послідовності розпізнавання М- глікозилювання в константній області. В деяких варіантах реалізації, константна область аглікозильована для М-зв'язаного глікозилювання. Константна область може бути аглікозильована для М-зв'язаного глікозилювання ферментативно або шляхом експресії в дефіцитній по глікозилюванню клітині-хазяїні.

Афінність зв'язування (Ко) антагоністичного антитіла анти СОКР з СОКР (такого як людський а0-СОКР при вимірюванні методом поверхневого плазмонного резонансу при відповідній температурі, такій як 25 або 37 "С) може становити від близько 0,02 до близько 200

НМ. В деяких варіантах реалізації, афінність зв'язування має будь-яке значення з близько 200

НМ, близько 100 нМ, близько 50 нМ, близько 10 нМ, близько 1 нМ, близько 500 пМ, близько 100

ПМ, близько 60 пМ, близько 50 пМ, близько 20 пМ, близько 15 пМ, близько 10 пМ, близько 5 пМ, або близько 2 пМ. В деяких варіантах реалізації, афінність зв'язування має значення менше будь-якої величини з близько 250 нМ, близько 200 нМ, близько 100 нМ, близько 50 нМ, близько 10 нМ, близько 1 нМ, близько 500 пМ, близько 100 пМ, або близько 50 пМ. В деяких варіантах реалізації, афінність зв'язування має значення менше близько 50 нМ.

Антагоністичне антитіло анти СОКР може бути введено до, під час та/або після головного болю. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР вводять перед нападом головного болю (наприклад, мігрені та кластерного головного болю). Введення антагоністичного антитіла анти СОКР може здійснюватися будь-якими засобами, відомими фахівцям, включаючи: орально, внутрішньовенно, підшкірно, інтраартеріально, внутрішньом'язово, інтраназально (наприклад, з інгаляцією або без неї), інтракардіально, інтраспінально, інтраторакально, інтраперитонеально, інтравентрикулярно, сублінгвально, трансдермально, та/або шляхом інгаляції. Введення може бути системним, наприклад, внутрішньовенним, або локалізованим.

В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР може бути введено у сполученні з іншим агентом, таким як інший агент для лікування головного болю.

В іншому аспекті, винахід передбачає використання антагоністичного антитіла анти СОКР для виробництва лікарського засобу, призначеного для використання в будь-якому із способів, описаних в даному документі, наприклад, для лікування або профілактики головного болю.

В іншому аспекті, винахід передбачає фармацевтичну композицію для попередження або лікування головного болю (наприклад, мігрені та кластерного головного болю), що містить ефективну кількість антагоністичного антитіла анти СОКР, в комбінації з одним або декількома фармацевтично прийнятними допоміжними речовинами.

В іншому аспекті, винахід передбачає набір для використання в будь-якому із способів, описаних в даному документі. В деяких варіантах реалізації, набір включає контейнер, композицію, що містить антагоністичне антитіло анти СОКР, описане в даному документі, в комбінації з фФбармацевтично прийнятним носієм, та інструкції з використання композиції в будь- якому із способів, описаних в даному документі.

Даний винахід також передбачає антагоністичні антитіла анти СОКР та поліпептиди, одержані з антитіла 51 або його варіантів, представлених в Таблиці 6. Відповідно, в одному аспекті, винахід передбачає антитіло С1 (взаємозамінно позначуване "с51"), яке продукується експресійними векторами, що мають номери доступу АТСС РТА-6866 та РТА-6867. Наприклад, в одному варіанті реалізації передбачається антитіло, що містить важкий ланцюг, продукований експресійним вектором з номером доступу АТСС РТА-6867. В додатковому варіанті реалізації передбачається антитіло, що містить легкий ланцюг, продукований експресійним вектором з номером доступу АТСС РТА-6866. Амінокислотні послідовності варіабельних ділянок важкого ланцюга та легкого ланцюга (31 представлені на Фігурі 5. Ділянки, що визначають комплементарність (гіперваріабельні ділянки, СОК) антитіла 51 (включаючи СОК за системами нумерації Споїпіа та Кара) також представлені на Фігурі 5. Слід розуміти, що посилання на будь-яку частину або цілу область 51 охоплює послідовності, продуковані експресійними векторами, що мають номери доступу АТСС РТА-6866 та РТА-6867, та/або послідовності, зображені на Фігурі 5. В деяких варіантах реалізації, винахід також передбачає варіанти 10) антитіла 21 з амінокислотними послідовностями, представленими в Таблиці 6.

В одному аспекті, винахід передбачає антитіло, що містить домен Ун, який на щонайменше 8595, щонайменше 8695, щонайменше 8795, щонайменше 8895, щонайменше 89 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 9565, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 9795 щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичний амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1.

В іншому аспекті, винахід передбачає антитіло, що містить домен Мі, який на щонайменше 8595, щонайменше 8695, щонайменше 8795, щонайменше 8895, щонайменше 89 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 9565, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 9795 щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичний амінокислотній послідовності ХЕО ІЮ МО: 2.

В іншому аспекті, винахід передбачає антитіло, що містить фрагмент або область антитіла

С1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6. В одному варіанті реалізації, фрагмент є легким ланцюгом антитіла 51. В іншому варіанті реалізації, фрагмент є важким ланцюгом антитіла С1. У ще одному варіанті реалізації, фрагмент містить одну або декілька варіабельних областей з легкого ланцюга та/або важкого ланцюга антитіла 51. У ще одному варіанті реалізації, фрагмент містить одну або декілька варіабельних областей з легкого ланцюга та/або важкого ланцюга, представлених на Фігурі 5. У ще одному варіанті реалізації, фрагмент містить один або декілька СОК з легкого ланцюга та/або важкого ланцюга антитіла 1.

В іншому аспекті, винахід передбачає поліпептиди (які можуть бути або не бути антитілом), що містять Мн СОКЗ, як представлено в 5ЕО ІО МО: 5, або послідовність, яка відрізняється від

ЗЕО ІЮ МО: 5 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними заміщеннями. В конкретному варіанті реалізації, такі амінокислотні замещення є консервативними заміщеннями.

В іншому аспекті, винахід передбачає поліпептиди (які можуть бути або не бути антитілом), що містять М СОКЗ, як представлено в 5ЕО ІЮО МО: 8, або послідовність, яка відрізняється від

ЗЕО ІО МО: 8 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними заміщеннями. В конкретному варіанті реалізації, такі амінокислотні замещення є консервативними заміщеннями.

В іншому аспекті, винахід передбачає поліпептиди (які можуть бути або не бути антитілом), що містять будь-який один або декілька з таких: а) один або декілька СОК(5) антитіла 1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; Б) СОК НЗ з важкого ланцюга антитіла 1 або його варіантів, представлених в Таблиці б; с) СОК ІЗ з легкого ланцюга антитіла 51 або його варіантів, представлених в Таблиці б; 4) три СОМ з легкого ланцюга антитіла 51 або його варіантів, представлених в Таблиці б; е) три СОК з важкого ланцюга антитіла 51 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; ) три СОК з легкого ланцюга та три СОК з важкого ланцюга антитіла 1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6. В деяких варіантах реалізації, винахід додатково передбачає поліпептиди (які можуть бути або не бути антитілом), що містять будь-який один або декілька з таких: а) один або декілька (один, два, три, чотири, п'ять або шість) СОК(5), виділених з антитіла 1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; р) СОК, виділений з СОК НЗ з важкого ланцюга антитіла 1; та/або с) СОК, виділений з СОК І З з легкого ланцюга антитіла С1. В деяких варіантах реалізації СОК є СОК, представлений на

Фігурі 5. В деяких варіантах реалізації, один або декілька СОЕ, виділених з антитіла С1 або його варіантів, представлених в Таблиці б, є на щонайменше близько 85 95, щонайменше близько 86965, щонайменше близько 87 96, щонайменше близько 8895, щонайменше близько 89 95, щонайменше близько 9095, щонайменше близько 9195, щонайменше близько 92 95, щонайменше близько 93595, щонайменше близько 9495, щонайменше близько 95 95, щонайменше близько 969565, щонайменше близько 9795, щонайменше близько 98 95, або щонайменше близько 99 95 ідентичними по відношенню до щонайменше одного, щонайменше двох, щонайменше трьох, щонайменше чотирьох, щонайменше п'яти, або щонайменше шести

СОК С1 або його варіантів.

В деяких варіантах реалізації, СОК є СОК за системою КаБбаї. В інших варіантах реалізації,

СО є СОК за системою Споїйпіа. В інших варіантах реалізації СОМ є комбінацією СОМ за системами Кабраї та Споїйпіа (також називаною "об'єднаний СОК" або "розширений СОК").

Іншими словами, для будь-якого даного варіанта реалізації, що містить більше одного СОК, причому СОК можуть бути будь-якими з Кабаї, Споїпіа, та/або об'єднаних.

В деяких варіантах реалізації, поліпептид (такий як антитіло) містить амінокислотну послідовність КАЗКХаауУХаа ту (5ЕО ІЮО МО: 53), де Хаа в положенні 5 позначає К, УМ, о, І, або М); і де Хаа в положенні 7 позначає Т, А, 0, с, К, 5, МУ, або У. В деяких варіантах реалізації, амінокислотна послідовність КАЗ5КХаауУХаатуМ5 (5БО ІО МО: 53) є СОКІ легкого ланцюга антитіла.

В деяких варіантах реалізації, поліпептид (такий як антитіло) містить амінокислотну 10) послідовність ХааХаазМмКУХаа (5ЕО ІЮО МО: 54), де Хаа в положенні 1 позначає С або А; де Хаа в положенні 2 позначає А або Н; і де Хаа в положенні 7 позначає І, Т, І або 5. В деяких варіантах реалізації, амінокислотна послідовність ХааХаазМКУХаа (5ЕО ІЮ МО: 54) є СОК2 легкого ланцюга антитіла.

В деяких варіантах реалізації, поліпептид (такий як антитіло) містить амінокислотну послідовність ЕІК5ХаазОХааХааАТХаауАХаадмкОо (5ЕБО ІЮО МО: 55), де Хаа в положенні 5 позначає Е, Е, К, О, або М; де Хаа в положенні 8 позначає А,С, МЕ, Н, 5,1, Б, С, БЕ, М, М, 0, або Р; де Хаа в положенні 9 позначає 5, б, Т, М, С,Е, ГГ, А, Р, І, М, Е, М, 0, або М; де Хаа в положенні 12 позначає Н або Е; де Хаа в положенні 15 позначає Е або 0. В деяких варіантах реалізації, амінокислотна послідовність ЕІК5ХаазОХааХааАТХаатАХаадмксо (5ЕО ІЮО МО: 55) є СОК2 важкого ланцюга антитіла.

В деяких варіантах реалізації, поліпептид (такий як антитіло) містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:1, у якій амінокислотний залишок в положенні 99 5ЕО ІЮ МО 1 позначає ГІ. або заміщений на А, М, 5, Т, М, або К; та у якій амінокислотні залишки в положенні 100 5ЕО ІО МО:1 позначають А або заміщені на Ї, К, 5, М, М, С, б, Т, К, або Р.

В деяких варіантах реалізації, антитіло є людським антитілом. В інших варіантах реалізації, антитіло є гуманізованим антитілом. В деяких варіантах реалізації, антитіло є моноклональним.

В деяких варіантах реалізації, антитіло (або поліпептид) є виділеним. В деяких варіантах реалізації, антитіло (або поліпептид) є по суті чистим.

Константна область важкого ланцюга антитіл може належати до будь-яких типів константної області, таких як Іде, І9М, дО, ІдА, та ІДЕ; та будь-яких ізотипів, таких як Іде, Ідс2, ІдСЗ, та

ІС.

В деяких варіантах реалізації, антитіло містить модифіковану константну область, як описано в даному документі.

В іншому аспекті, винахід передбачає полінуклеотид (який може бути виділеним), що містить полінуклеотид, кодуючий фрагмент або область антитіла (1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6. В одному варіанті реалізації, фрагмент є легким ланцюгом антитіла

С1. В іншому варіанті реалізації, фрагмент є важким ланцюгом антитіла 51. У ще одному варіанті реалізації, фрагмент містить одну або декілька варіабельних областей з легкого ланцюга та/(або важкого ланцюга антитіла 1. У ще одному варіанті реалізації, фрагмент містить один або декілька (тобто, одну, дві, три, чотири, п'ять або шість) ділянок, що визначають комплементарність (СОК), з легкого ланцюга та/або важкого ланцюга антитіла с1.

В іншому аспекті, винахід передбачає полінуклеотид (який може бути виділеним), що містить полінуклеотид, який кодує антитіло 51 або його варіанти, представлені в Таблиці 6. В деяких варіантах реалізації, полінуклеотид містить будь-який з або обидва полінуклеотиди, представлені БЕО ІЮ МО:9 та 5ЕО ІЮ МО:10.

В іншому аспекті, винахід передбачає полінуклеотиди, кодуючі будь-які з антитіл (включаючи фрагменти антитіл) або поліпептидів, описаних в даному документі.

В іншому аспекті, винахід передбачає вектори (включаючи експресійні та клонуючі векторі) та клітини-хазяї, що містять будь-який полінуклеотид, розкритий в даному документі. В деяких варіантах реалізації, вектор є РОБ.СОКР.ПЕСОІ, який має Мо АТСС РТА-6867. В інших варіантах реалізації, вектор є РЕБ.СОКР.ПКОІ, який має Мо АТСОС РТА-6866.

В іншому аспекті, винахід передбачає клітину-хазяїна, що містить полінуклеотид, кодуючий будь-яке з антитіл, описаних в даному документі.

В іншому аспекті, винахід передбачає комплекс СОКР, зв'язаний з будь-яким з антитіл або поліпептидів, описаних в даному документі. В деяких варіантах реалізації, антитіло є антитілом

С1 або його варіантами, представленими в Таблиці 6.

В іншому аспекті, винахід передбачає фармацевтичну композицію, що містить ефективну кількість будь-якого з поліпептидів (включаючи антитіла, такі як антитіло, що містить один або декілька СОК антитіла (01) або полінуклеотидів, описаних в даному документі, та фармацевтично прийнятну допоміжну речовину.

В іншому аспекті, винахід передбачає спосіб одержання антитіла (1, який включає культивацію клітини-хазяїна або її потомства в умовах, що дозволяють продукувати антитіла

СІ, де клітина-хазяїн містить експресійний вектор, який кодує антитіло 1; і, в деяких варіантах реалізації, очистку антитіла С1. В деяких варіантах реалізації, експресійний вектор містить одну або обидві полінуклеотидні послідовності, представлені 5ЕО ІЮ МО:9 та 5ЕО ІЮ МО:10.

В іншому аспекті, винахід передбачає способи одержання будь-яких антитіл або поліпептидів, описаних в даному документі, шляхом експресії одного або декількох полінуклеотидів, кодуючих антитіло (яке може експресуватися роздільно у вигляді окремих легкого або важкого ланцюгів, або легкий та важкий ланцюги експресуються разом з одного 10) вектора) або поліпептид в придатній клітині звичайно з подальшим видобуванням та/або виділенням антитіла або поліпептидів, що представляють інтерес.

Антагоністичне антитіло анти СОКР і поліпептиди та полінуклеотиди, що кодують антитіла та поліпептиди за даним винаходом, можуть бути використані для лікування, попередження, полегшення, контролю або зниження частоти хвороб, асоційованих з аномальною функцією

СОКР, таких як головний біль (наприклад, мігрень, кластерний головний біль, хронічний головний біль, та тензіонний головний біль) та інші стани, які можуть лікуватися або попереджуватися шляхом антагонізації активності СОКР.

В іншому аспекті, винахід передбачає набори та композиції, що містять будь-яку одну або декілька композицій, описаних в даному документі. Такі набори, звичайно в придатній упаковці та з відповідними інструкціями, придатні для використання в будь-якому із способів, описаних в даному документі.

В одному аспекті, винахід передбачає композицію для використання згідно з будь-яким із способів, описаних в даному документі.

В одному аспекті, винахід передбачає композицію для використання в лікуванні або для зниження частоти щонайменше одного вазомоторного симптому та/(або головного болю у суб'єкта. В одному варіанті реалізації використання включає введення суб'єкту протягом багатьох днів певної кількості моноклонального антитіла (наприклад, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), яке модулює шлях СОКР, причому кількість, що вводиться в кожний з багатьох днів, становить менш ніж 1000 мг. В одному варіанті реалізації, використання включає введення суб'єкту протягом багатьох днів певної кількості моноклонального антитіла (наприклад, моноклонального антагоністичного антитіла анти

ССРЕР), яке модулює шлях СОКР, причому кількість, що вводиться в кожний з багатьох днів, має значення в діапазоні 100-2000 мг. В деяких варіантах реалізації, головний біль є мігренню (наприклад, хронічною мігренню або епізодичною мігренню). В деяких варіантах реалізації, два з багатьох днів розділені інтервалом у більш ніж сім днів. В деяких варіантах реалізації, частота головного болю знижується на щонайменше сім днів після однократного введення. В деяких варіантах реалізації, кількість моноклонального антитіла, що вводиться в перший день, відрізняється від (наприклад, перевищує) кількість моноклонального антитіла, що вводиться в другий день. В деяких варіантах реалізації, суб'єккгу вводять менш ніж З дози на місяць. В деяких варіантах реалізації, введення є підшкірним введенням. В деяких варіантах реалізації, введення є внутрішньовенним введенням. В деяких варіантах реалізації, введення включає використання попередньо наповненого шприца, що містить певну кількість моноклонального антитіла. В деяких варіантах реалізації, композицію моноклонального антитіла готують в концентрації 150 мг/мл. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло вводять в об'ємі менше 2 мл. В деяких варіантах реалізації, кількість моноклонального антитіла становить менш ніж 1000 мг. В деяких варіантах реалізації, місячна кількість годин головного болю, який відчуває суб'єкт, знижується після зазначеного введення на 40 або більше годин (наприклад, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 або більше) порівняно з рівнем, який спостерігався у суб'єкта до введення. Місячна кількість годин головного болю може бути зменшена більш ніж на 60 годин. В деяких варіантах реалізації, місячна кількість годин головного болю, який відчуває суб'єкт, після зазначеного введення, знижується на 25 95 або більше (наприклад, 30 95, 35 о, 40 У, 45 Ор, 50 95, або більше) порівняно з рівнем, який спостерігався у суб'єкта до введення. Місячна кількість годин головного болю може бути зменшена на 40 95 або більше. В деяких варіантах реалізації, місячна кількість днів головного болю, який відчуває суб'єкт, знижується після зазначеного введення на З або більше днів (наприклад, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше днів) порівняно з рівнем, який спостерігався у суб'єкта до введення. В деяких варіантах реалізації, використання додатково включає введення суб'єкту другого агента одночасно або послідовно з моноклональним антитілом. Другий агент може бути будь-яким з агоністів 5-НТІ1, триптанів, алкалоїдів ріжків та нестероїдних протизапальних лікарських засобів. В деяких варіантах реалізації, другий агент є агентом, який приймається суб'єктом профілактично. В деяких варіантах реалізації, місячне застосування другого агента суб'єктом знижується на щонайменше 15 95 після введення моноклонального антитіла. В деяких варіантах реалізації, другий агент є триптаном. В деяких варіантах реалізації, суб'єкт є людиною. В деяких варіантах реалізації моноклональне антитіло є людським або гуманізованим моноклональним антитілом. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло включає (а) антитіло, що має СОК НІ, як представлено в 5ЕО ІЮ МО: 3; СОР НІ, як представлено в 5ЕО ІЮ МО: 4; СОМ НЗ, як представлено в 5БО ІЮ МО: 5; СОК 11, як представлено в 5ЕО ІЮО МО: 6; СОК 12, як представлено в 5ЕБЕО І МО: 7; та СОК ІЗ, як представлено в 5ЕО ІО МО: 8; або (р) варіант антитіла згідно з (а), як показано в Таблиці 6. 10) В одному аспекті, винахід передбачає композицію, використовувану для зниження величини місячної кількості годин головного болю, який відчуває суб'єкт. В одному варіанті реалізації, використання включає введення суб'єкту кількості моноклонального антитіла, яка модулює шлях СОКР, де кількість моноклонального антитіла ефективно знижує величину місячної кількості годин головного болю на щонайменше 20 (наприклад, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 або більше годин головного болю) після разової дози. В деяких варіантах реалізації, величина місячної кількості годин головного болю знижується на щонайменше близько 50 годин. В одному варіанті реалізації використання включає введення суб'єкту кількості моноклонального антитіла, яка модулює шлях СОКР, де кількість моноклонального антитіла ефективно знижує величину місячної кількості годин головного болю на щонайменше 15 95 (наприклад, 20 9, 25 Ув, ЗО 90, 35 Фо, 40 9», або більше) після разової дози. В деяких варіантах реалізації, величина місячної кількості годин головного болю знижується на щонайменше близько 3095. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло є антагоністичним антитілом анти СОКР. В деяких варіантах реалізації, кількість моноклонального антитіла становить менш ніж 1000 мг. В деяких варіантах реалізації, суб'єкту вводять менш ніж З дози на місяць. В деяких варіантах реалізації, введення є підшкірним або внутрішньовенним введенням.

В деяких варіантах реалізації, композицію моноклонального антитіла готують в концентрації щонайменше 150 мг/мл. В деяких варіантах реалізації, "у яких) моноклональне антитіло вводять в об'ємі менше 2 мл. В деяких варіантах реалізації, суб'єкт є людиною. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло є людським або гуманізованим. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло включає (а) антитіло, що має СОК НІ, як представлено в

ЗЕБЕО ІЮ МО: 3; СОК Не, як представлено в ЗЕО ІО МО: 4; СОК НЗ, як представлено в 5ЕО ІЮ

МО: 5; СОК 11, як представлено в 5ЕО ІО МО: 6; СОК 12, як представлено в 5ЕО ІЮО МО: 7; та

СО ІЗ, як представлено в ЗЕО ІО МО: 8; або (Б) варіант антитіла згідно з (а), як показано в

Таблиці 6.

В одному аспекті, винахід передбачає композицію, використовувану для зниження величини місячної кількості днів головного болю, який відчуває суб'єкт. В одному варіанті реалізації, використання включає введення суб'єкту кількості моноклонального антитіла, яка модулює шлях СОКР, де кількість моноклонального антитіла ефективно знижує величину місячної кількості днів головного болю на щонайменше 3 (наприклад, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше днів головного болю) після разової дози. В деяких варіантах реалізації, величина місячної кількості днів головного болю знижується на щонайменше близько б днів головного болю. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло є антагоністичним антитілом анти СОКР. В деяких варіантах реалізації, кількість моноклонального антитіла становить менш ніж 1000 мг. В деяких варіантах реалізації, суб'єкту вводять менш ніж З дози на місяць. В деяких варіантах реалізації, введення є підшкірним або внутрішньовенним введенням. В деяких варіантах реалізації, композицію моноклонального антитіла готують в концентрації щонайменше 150 мг/мл. В деяких варіантах реалізації, (у яких) моноклональне антитіло вводять в об'ємі менше 2 мл. В деяких варіантах реалізації, суб'єкт є людиною. В деяких варіантах реалізації моноклональне антитіло є людським або гуманізованим. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло включає (а) антитіло, що має СОК НІ, як представлено в ЗЕО ІЮО МО: 3; СОК На2, як представлено в 5ЕО ІЮ МО: 4; СОК

НЗ, як представлено в 5ЕО ІЮ МО: 5; СОК 11, як представлено в 5ЕО ІЮ МО: 6; СОК 12, як представлено в 5ЕО ІЮО МО: 7; та СОК ІЗ, як представлено в ЗЕО ІЮ МО: 8; або (Б) варіант антитіла згідно з (а), як показано в Таблиці 6.

В одному аспекті, винахід передбачає композицію, використовувану для зниження використання лікарського препарату проти головного болю суб'єктом, який включає введення суб'єкту моноклонального антитіла (наприклад, антагоністичного антитіла анти СОКР), яке модулює шлях СОКР, де кількість моноклонального антитіла ефективно знижує місячне застосування суб'єктом лікарського препарату проти головного болю на щонайменше 15 95 (наприклад, 20 95, 25965, З0 95, 3595, 4095, або більше). В деяких варіантах реалізації, лікарський препарат проти головного болю вибирають з групи, що складається з агоністів 5-

НТ, триптанів, опіатів, В-адренергічних антагоністів, алкалоїдів ріжків, та нестероїдних протизапальних лікарських засобів (М5АІЮ»5). В деяких варіантах реалізації, лікарським препаратом проти головного болю є триптан. В деяких варіантах реалізації, кількість моноклонального антитіла становить менш ніж 1000 мг. В деяких варіантах реалізації, суб'єкту вводять менш ніж З дози на місяць. В деяких варіантах реалізації, введення є підшкірним або внутрішньовенним введенням. В деяких варіантах реалізації, композицію моноклонального антитіла готують в концентрації щонайменше 150 мг/мл. В деяких варіантах реалізації, (у яких) моноклональне антитіло вводять в об'ємі менше 2 мл. В деяких варіантах реалізації, суб'єкт є 10) людиною. В деяких варіантах реалізації моноклональне антитіло є людським або гуманізованим. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло включає (а) антитіло, що має СОК НІ, як представлено в ЗЕО ІЮО МО: 3; СОК На2, як представлено в 5ЕО ІЮ МО: 4; СОК

НЗ, як представлено в 5ЕО ІЮ МО: 5; СОК 11, як представлено в 5ЕО ІЮ МО: 6; СОК 12, як представлено в 5ЕО ІЮО МО: 7; та СОК ІЗ, як представлено в ЗЕО ІЮ МО: 8; або (Б) варіант антитіла згідно з (а), як показано в Таблиці 6.

В одному аспекті, винахід передбачає композицію, використовувану для лікування або зниження частоти головного болю (наприклад, мігрені) у суб'єкта, який включає введення суб'єкту разової дози моноклонального антитіла (наприклад, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР) в кількості, яка модулює шлях СОКР, причому кількість моноклонального антитіла має значення в діапазоні 100-2000 мг.

Стислий опис креслень

Фігура 1 є таблицею, яка показує афінності зв'язування 12 мишачих антитіл для фрагментів людського а-СОЕР з різними заміщеннями аланіну. Афінності зв'язування вимірювали при 25 С з використанням Віасоге шляхом пропускання Бар5 над СОКР»5 на чипі. Значення в рамці відображають втрату афінності аланінових мутантів у порівнянні з вихідним фрагментом, 25-37 (виділено курсивом), за винятком КЗ5А, який був одержаний з 19-37 вихідного фрагмента. "а" вказує афінності для фрагментів 19-37 та 25-37, представлені як середнє х стандартний відхил для двох незалежних вимірів на різних сенсорних чипах. "г" вказує взаємодії, що відхиляються від моделі простої бімолекулярної взаємодії внаслідок двофазової дисоціації, афінності яких визначалися з використанням моделі конформаційних змін. Значення величин, виділені сірим фоном різної інтенсивності: білий (1,0) позначає вихідну афінність; світло-сірий (менше 0,5) позначає афінність, підвищену у порівнянні з вихідною; темно-сірий (більше 2) позначає афінність нижче вихідної; і чорний вказує, що зв'язування не спостерігалося.

Фігури 2А та 28 демонструють ефект введення СОКР 8-37 (400 нмоль/кг), антитіла 4901 (25 мг/кг) та антитіла 7011 (25 мг/кг) на шкірний кровотік, виміряний як потік кров'яних клітин після електроіїмпульсної стимуляції протягом 30 секунд. СОВР 8-37 вводили внутрішньовенно (в/в) за 3-5 хв до електроіїмпульсної стимуляції. Антитіла вводили інтраперитонеально (ІР) за 72 години до електроімпульсної стимуляції. Кожна точка на графіках відповідає значенню АОС (площа під кривою) для одного щура, що отримував препарати в зазначених умовах. Кожна лінія на графіках позначає середнє значення АС для щурів, що отримували зазначений препарат. АОС (площа під кривою) дорівнює добутку Дпотік на Дчас. "Дпотік" позначає зміну величини потоку, вираженої в одиницях потоку після електроімпульсної стимуляції; і "Ачас" позначає період часу, необхідний для повернення величини потоку кров'яних клітин до рівня перед електроіїмпульсною стимуляцією.

Фігура З показує ефект введення різних доз антитіла 4901 (25 мг/кг, 5 мг/кг, 2,5 мг/кг, або 1 мг/кг) на шкірний кровотік, виміряний як потік кров'яних клітин після електроімпульсної стимуляції протягом 30 секунд. Антитіла вводили внутрішньовенно (ІМ) за 24 години до електроіїмпульсної стимуляції. Кожна точка на графіку відповідає величині АОС для одного із щурів, що отримували зазначений препарат. Лінія на графіку показує середнє значення АОС для щурів, що отримували зазначений препарат.

Фігури 4А та 48 демонструють ефект введення антитіла 4901 (1 мг/кг або 10 мг/кг, в/в), антитіла 7Е9 (10 мг/кг, в/в), та антитіла 886 (10 мг/кг, в/в) на шкірний кровотік, виміряний як потік кров'яних клітин після електроїмпульсної стимуляції протягом 30 секунд. Антитіла вводили внутрішньовенно (в/в) з подальшою електроїмпульсною стимуляцією в моменти часу 30 хв, 60 хв, 90 хв, та 120 хв після введення антитіла. Вісь У показує величину АОС в процентах від рівня

АЦС без введення антитіла (момент часу 0). Вісь Х показує період часу (хвилин) між введенням антитіл та електроїмпульсною стимуляцією. "" позначає Р « 0,05, і "и" позначає Р« 0,01, у порівнянні з моментом часу 0. Дані аналізували з використанням однофакторного дисперсійного аналізу з тестом множинного порівняння Даннета.

Фігура 5 показує амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга (5ЕО ІЮ

МО':1) та варіабельної ділянки легкого ланцюга (5ЕО ІЮ МО:2) антитіла 51. СОРК за системою

Кабаї виділені жирним шрифтом, і СОК за системою Споїйіа - підкреслюванням. Амінокислотні залишки варіабельних ділянок важкого ланцюга та легкого ланцюга пронумеровані послідовно.

Фігура 6 зображує картування епітопа антитіла 51 методом пептидного конкурентного аналізу з використанням Віасоге. М-Біотинільований людський о0-СОКР захоплювали на сенсорному чипі ЗА. Потік баб 1 (50 нМ) за відсутності конкурентного пептиду або попередньо інкубуваний протягом 1 год. з 10 мкМ конкурентного пептиду пропускали над чипом.

Вимірювали зв'язування Бар с1 з людським а-СОКР на чипі. Вісь М показує процент зв'язування, блокований в присутності конкурентного пептиду у порівнянні із зв'язуванням за (610) відсутності конкурентного пептиду.

Фігура 7 показує ефект введення антитіла 1 (1 мг/кг або 10 мг/кг, в/в) або носія (РВ5 (фосфатно-сольовий буфер), 0,01 95 Тмеєеп 20) на шкірний кровотік, виміряний як потік кров'яних клітин після електроіїмпульсної стимуляції протягом 30 секунд. Антитіло (31 або носій вводили внутрішньовенно (в/в) з подальшою електроіїмпульсною стимуляцією нерва в моменти часу 30 хв, 60 хв, 90 хв, та 120 хв після введення антитіла. Вісь М показує величину АОС в процентах від рівня АОС без введення антитіла або носія (приймався за 100 95) (момент часу 0).

Вісь Х показує період часу (хвилин) між введенням антитіл та електроїмпульсною стимуляцією. "" позначає Р « 0,05, і "и" позначає Р « 0,01, у порівнянні з носієм. Дані аналізували з використанням двофакторного дисперсійного аналізу та апостеріорних тестів Бонферроні.

Фігура ВА показує ефект введення антитіла С1 (1 мг/кг, З мг/кг або 10 мг/кг, в/в) або носія (РВ5, 0,01 95 Тмжееп 20) на шкірний кровотік, виміряний як потік кров'яних клітин після електроіїмпульсної стимуляції протягом 30 секунд через 24 години після введення дози.

Антитіло їз1 або носій вводили внутрішньовенно (в/в) за 24 години до електроімпульсної стимуляції нерва. Вісь М показує загальну площу під кривою (зміна потоку кров'яних клітин, помножена на час від моменту стимуляції до повернення потоку до базової лінії, АОС). Вісь Х показує різні дози антитіла 1. "" позначає Р « 0,05, і "й" позначає Р « 0,01, у порівнянні з носієм. Дані аналізували з використанням однофакторного дисперсійного аналізу та тесту множинного порівняння Данна.

Фігура 88 показує ефект введення антитіла (1 (0,3 мг/кг, 1 мг/кг, З мг/кг або 10 мг/кг, в/в) або носія (РВ5, 0,01 96 Тмеєп 20) на шкірний кровотік, виміряний як потік кров'яних клітин після електроімпульсної стимуляції протягом 30 секунд через 7 днів після введення дози. Антитіло 1 або носій вводили внутрішньовенно (в/в) за 7 днів до електроімпульсної стимуляції нерва. Вісь

У показує загальну АОС. Вісь Х показує різні дози антитіла 1. "и" позначає Р « 0,01, і позначає Р « 0,001, у порівнянні з носієм. Дані аналізували з використанням однофакторного дисперсійного аналізу та тесту множинного порівняння Данна.

Фігура 8С показує аналіз даних, представлених на Фігурах 8А та 88, шляхом апроксимації кривих. Антитіло 51 або носій вводили внутрішньовенно (в/в) за 24 години або за 7 днів до електроіїмпульсної стимуляції нерва. Вісь М показує загальну АОС. Вісь Х показує різні дози антитіла С1 в "мг/кг" на логарифмічній шкалі для визначення ЕсСово.

Фігура 9 показує ефект антитіла ти7Е9 (10 мг/кг), ВІВМ4096В5 або носія (РВ5, 0,01 95 Тмеєп 20) на зміну діаметра середньої менінгеальної артерії після стимуляції електричним полем.

Антитіло ти7Е9, ВІВМ4096В5 або носій вводили внутрішньовенно (в/в) в момент часу 0 хвилин після встановлення відгуку на електричну стимуляцію. Вісь У показує зміни діаметра середньої менінгеальної артерії після стимуляції електричним полем. Діаметр в стані покою відповідає

О 95. Вісь Х показує час (хвилин) електроїмпульсної стимуляції. "" позначає Р « 0,05, 1" позначає Р « 0,01, у порівнянні з носієм. Дані аналізували з використанням однофакторного дисперсійного аналізу та тесту множинного порівняння Даннета.

Фігура 10 показує ефект різних доз антитіла С1 (1 мг/кг, З мг/кг або 10 мг/кг, в/в) або носія (РВ5, 0,01 95 Туееп 20) на зміну діаметра середньої менінгеальної артерії після стимуляції електричним полем. Антитіло (531 або носій вводили внутрішньовенно (в/в) за 7 днів до стимуляції електричним полем. Вісь У показує зміни діаметра середньої менінгеальної артерії.

Діаметр в стані покою відповідає 0 95. Вісь Х показує напругу стимуляції. """ позначає Р « 0,05, "ес" позначає Р « 0,01, і" позначає Р « 0,001, у порівнянні з носієм. Дані аналізували з використанням двофакторного дисперсійного аналізу та апостеріорних тестів Бонферроні.

Фігура 11А показує ефект антитіла ти4901 (10 мг/кг) або носія (РВ5, 0,01 95 Тууееп 20), при внутрішньовеному (в/в) введенні за 24 години, на зниження внутрішньої температури тіла, індуковане підшкірною іньекцією налоксону (1 мг/кг), у морфінзалежних щурів. Вісь У показує різницю температур у порівнянні з базовою лінією. Вісь Х показує час, який пройшов з моменту ін'єкції налоксону.

Фігура 118 показує ефект антитіла ти4901 (10 мг/кг) або носія (РВ5, 0,01 95 Тууееп 20), при внутрішньовенному (в/в) введенні за 24 години, на підвищення температури поверхні хвоста, індуковане підшкірною ін'єкцією налоксону (1 мг/кг) у морфінзалежних щурів. Вісь У показує різницю температур у порівнянні з базовою лінією. Вісь Х показує час, який пройшов з моменту ін'єкції налоксону.

Фігура 12 є графіком, що ілюструє результати клінічних досліджень, які порівнюють ефект різних доз антитіла С1 з плацебо.

Фігура 13 є графіком, що ілюструє результати клінічних досліджень, які порівнюють ефект різних доз антитіла С1 з плацебо.

Фігура 14 є графіком, що ілюструє результати клінічних досліджень, які порівнюють ефект (610) різних доз антитіла С1 з плацебо.

Фігура 15 є графіком, що ілюструє результати клінічних досліджень, які порівнюють ефект різних доз антитіла С1 з плацебо.

Фігура 16 є графіком, що ілюструє результати клінічних досліджень, які порівнюють ефект різних доз антитіла С1 з плацебо.

Фігура 17 є графіком, що ілюструє результати клінічних досліджень, які порівнюють ефект різних доз антитіла С1 з плацебо.

Фігура 18 є графіком, що ілюструє результати клінічних досліджень, які порівнюють ефект різних доз антитіла С1 з плацебо.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС

В деяких аспектах, винахід, розкритий в даному документі, передбачає способи лікування та/"або попередження вазомоторних симптомів (наприклад, припливів крові) у особи шляхом введення особі терапевтично ефективної кількості антагоністичного антитіла анти СОКР.

В деяких аспектах, винахід, розкритий в даному документі, передбачає способи лікування та/або попередження головного болю (наприклад, мігрені, кластерного головного болю, хронічного головного болю та головного болю напруги) у особи шляхом введення особі терапевтично ефективної кількості антагоністичного антитіла анти СОКР. В деяких випадках, головний біль є мігренню.

В деяких аспектах, винахід, розкритий в даному документі, також передбачає антагоністичні антитіла анти СОКР та поліпептиди, одержані з 1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6. В деяких варіантах реалізації, винахід також передбачає способи одержання та використання таких антитіл та поліпептидів.

В даній заявці наводяться посилання на різні публікації (включаючи патенти та патентні заявки). Описи цих публікацій в повному обсязі цим включені до даного документу як посилання.

Загальні методики

В практиці різних аспектів даного винаходу будуть використовуватися, якщо не вказано інше, звичайні методики молекулярної біології (включаючи рекомбінантні методики), мікробіології, біології клітини, біохимії та імунології, доступні кваліфікованим фахівцям в цій галузі техніки. Такі методики детально описані в літературі, наприклад, Моїесшаг Сіопіпд: А

І арогаїгу Мапиаї, зесопа єдіоп (Затьгоок еї а!., 1989) Соїа брііпа Нагброг Ргез5; ОіІїдописіеоїіде зЗупіпезів (М.). Саїй, ей., 1984); Меїйодвз іп МоїІесшаг Віоосду, Нитапа Ргевз5; Сеї! Віоіоду: А

І арогаїогу Моїеросок (9.Е. Сеїїв, ед., 1998) Асадетіс Ргез5; Апітаї! Сеїї Сийиге (В.І. ЕгезНнпеу, єд., 1987); Іпігодисійп іо СеїІ апа Тізвце Сийиге (9.Р. Маїйнег апа Р.Е. Вобетів5, 1998) Ріепит Ргезв5;

СеїІ апа Тіввиє СиПйиге: І арогаїюгу Ргоседитез (А. Юоуїе, У.В. Спінйнв, апа 0.2. МемуеїЇ, єадв., 1993- 1998) У. Міеу апа опе; Меїнодз іп Еплгутоіоду (Асадетіс Ргеввз, Іпс.); Напабсок ої Ехрегітепіаї

Іттипоїіоду (О.М. МУєїг апа 0.0. ВіасКууеїЇ, єдв.); Ссепе Тгапвіег Месіогїв Тог Маттаїїап Сеїїв (У.М.

МіПег апа М.Р. Саїоз, єдв., 1987); Ситепі Ргоїосої!в іп Моїесшіаг Віоіоду (Г.М. А!йзиеї еї аї., єдв., 1987); РСВ: Те Роїутегазе СНаіп Веасійп, (Миїйв еї аї., єдв., 1994); битепі Ргоюсої!5 іп

Ітітипоїоду (У.Е. Соїїдап еї аї., едв5., 1991); пог Ргоїюсої5 іп МоіІесшціаг Віоіоду (УМіеу апа 5опв, 1999); Іттипобіоіоду (С.А. дапемжау апа Р. Тгамег5, 1997); Апііродієз (Р. Ріпсн, 1997); Апііродієв: а ргасіїсаї арргоаси (0. Сацу., єд., ІВ Ргев5, 1988-1989); Мопосіопа! апііїбодієв: а ргасіїса! арргоаси (Р. Зперпега апа б. ЮОєап, ед5., Охіога Опімегейу Ргезв, 2000); Овіпуд апііродієв: а

Іарогаюту тапиа! (Е. Напом/ апа 0. Гапе (Соїй 5рігіпуд Нагбог Іарогаїогу Ргез5, 1999); ТНе

Апііродієз (М. 7апенйі апа 9.0. Сарга, ед5., Наглоса Асадетіс РибіїзНегв, 1995).

Визначення "Антитіло" є молекулою імуноглобуліну, здатною специфічно зв'язуваться з мішенню, такою як вуглевод, полінуклеотид, ліпід, поліпептид і т.д., за допомогою щонайменше одного сайта розпізнавання антигену, розташованого у варіабельній області молекули імуноглобуліну. У використовуваному в даному документі значенні, даний термін охоплює не тілько інтактні поліклональні або моноклональні антитіла, але також їх фрагменти (такі як Раб, Рар", Е(аб")»,

Ем), одноланцюгові (5сСЕм), їх мутанти, гібридні білки, що містять ділянку, яка є антитілом (таким як доменні антитіла), та будь-які інші модифіковані конфігурації молекули імуноглобуліну, що містять сайт розпізнавання антигену. Антитіло включає антитіла будь-якого класу, такого як до,

ІА або ІМ (або їх підкласу), і антитіло не повинно обов'язково належати до будь-якого конкретного класу. В залежності від амінокислотної послідовності константного домену важких ланцюгів антитіла, імуноглобуліни можуть бути віднесені до різних класів. Існують п'ять основних класів імуноглобулінів: ІА, 90, ІДЕ, їдс та ІДМ, і декілька з них можуть бути додатково розділені на підкласи (ізотипи), наприклад, Ідс1, Ід(е2, ІдсеЗ, Ідс4, ІА та ІдА2.

Константні домени важких ланцюгів, що відповідають різним класам імуноглобулінів, 10) називаються альфа, дельта, епсілон, гамма та мю, відповідно. Структури субодиниць та тривимірні конфігурації різних класів імуноглобулінів добре відомі.

У використовуваному в даному документі значенні, "моноклональне антитіло" стосується антитіла, одержаного з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто, індивідуальні антитіла, що складають популяцію, є ідентичними, за винятком можливих природних мутацій, які можуть бути присутніми в незначних кількостях. Моноклональні антитіла є високоспецифічними, будучи націленими на окремий антигенний сайт. Крім того, на відміну від препаратів поліклональних антитіл, які типово включають різні антитіла, націлені проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло націлено проти окремої детермінанти антигену. Визначення "моноклональний" вказує на характер антитіла як одержаного з по суті гомогенної популяції антитіл, та не повинно тлумачитися як таке, що потребує одержання антитіла будь-яким конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла для використання згідно з даним винаходом можуть бути одержані методом гібридом, уперше описаним КопПіег апа Міїєтеїп, 1975,

Маїсиге, 256:495, або можуть бути одержані способами рекомбінантних ДНК, такими як описані в патенті США Мо 4816567. Моноклональні антитіла можуть також бути виділені з фагових бібліотек, одержаних з використанням способів, описаних, наприклад, в МсоСайегіу еї аї., 1990,

Маїшиге, 348:552-554.

У використовуваному в даному документі значенні, "гуманізовані" антитіла стосуються форм не-людських (наприклад, мишачих) антитіл, які є специфічними химерними імуноглобулінами, ланцюгами імуноглобулінів, або їх фрагментами (такими як Ем, Раб, Раб, Е(аб)» або інші антигензв'язуючі субпослідовності антитіл), що містять минимальну послідовність, одержану з не-людського імуноглобуліну. здебільшого, гуманізовані антитіла є людськими імуноглобулінами (антитіло реципієнта), в яких залишки з ділянки, що визначає комплементарність (СОК), яка належить реципієнту, заміщені на залишки з СОК, що належить виду, який не є людиною (донорне антитіло), такому як миша, щур або кролик, і який має бажану специфічність, афінність та біологічну активність. В деяких випадках, залишки каркасної ділянки (ЕК) Ем людського імуноглобуліну заміщені на відповідні залишки, що не належать людині. Крім того, гуманізоване антитіло може містити залишки, які не є присутніми ані в антитілі реципієнта, ані в імпортованих послідовностях СОК або каркасної ділянки, але включені для додаткового уточнення та оптимізації характеристик антитіла. Загалом, гуманізоване антитіло буде містити по суті усі з щонайменше одного, та типово двох, варіабельних доменів, в яких усі або по суті усі з ділянок

СОК відповідають імуноглобуліну, який не належить людині, і усі або по суті усі з ділянок ЕК належать консенсусній послідовності людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло буде також містити щонайменше частину константної області або домену (Ес) імуноглобуліну, типово, людського імуноглобуліну. Антитіла можуть містити ділянки Ес, модифіковані, як описано в УМО 99/58572. Інші форми гуманізованих антитіл мають один або декілька СОК (один, два, три, чотири, п'ять, шість), які Є зміненими у порівнянні з вихідним антитілом, які також називаються одним або декількома СОК, "одержаними з" одного або декількох СОЄК. вихідного антитіла.

У використовуваному в даному документі значенні, "людське антитіло" означає антитіло, що має амінокислотну послідовність, яка відповідає антитілу, продукованому людиною, та/або одержану з використанням будь-яких способів одержання людських антитіл, відомих фахівцям або розкритих в даному документі. Це визначення людського антитіла включає антитіла, що містять щонайменше один поліпептид важкого ланцюга людини або щонайменше один поліпептид легкого ланцюга людини. Одним з таких прикладів є антитіло, що містить поліпептиди мишачого легкого ланцюга та людського важкого ланцюга. Людські антитіла можуть бути одержані з використанням різних методик, відомих фахівцям. В одному варіанті реалізації, людське антитіло вибирають з фагової бібліотеки, причому така фагова бібліотека експресує людські антитіла (Мацднап еї аї., 1996, Майшге Віоїесппоіоду, 14:309-314; Зпевів єї аї., 1998,

РМАБ5, (БА) 95:6157-6162; Ноодепроот апа УУіпівєг, 1991, У. Мої. ВіоїІ., 227:381; Маїкз5 вї аї., 1991, 9. Мої. Віої., 222:581). Людські антитіла також можуть бути одержані шляхом введення локусів людського імуноглобуліну в трансгенних тварин, наприклад, мишей, в яких ендогенні гени імуноглобуліну були частково або повністю інактивовані. Цей підхід описаний в патентах

США МоМо 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; та 5661016. Альтернативно, людське антитіло може бути одержано шляхом імморталізації людських В-лімфоцитів, які продукують антитіло, спрямоване проти антигена-мішені (такі В-лімфоцити можуть бути виділені у індивідуума або можуть бути імунізовані іп мійго). Див., наприклад, СоїЇе еї аїЇ., МопосіопаїЇ!

Апіїбодієз апа Сапсег ТНегару, Аїап В. І івв, р. 77 (1985); Воє!тег еї аї., 1991, 9. Іттипої., 147 (1):86-95; та патент США Ме 5750373.

У використовуваному в даному документі значенні, термін "пептид, кодований геном (610) кальцитоніну" та "СОКР" стосується будь-якої форми пептиду, кодованого геном кальцитоніну,

та його варіантів, які зберігають щонайменше частину активності СОКР. Наприклад, СОКР може бути а-СОКР або Д-СОКР. У використовуваному в даному документі значенні, СОКР включає нативні послідовності СОКР, які належать усім видам ссавців, наприклад, людині, собачим, кошачим, конячим та бичачим.

У використовуваному в даному документі значенні, "антагоністичне антитіло анти СОКР" (взаємозамінно називане "антитіло анти СОКР") стосується антитіла, здатного зв'язуватися з

ССОРР та інгібувати біологічну активність СОКР та/або метаболічний шлях (шляхи), медійовані сигналізацією СОКР. Антагоністичне антитіло анти СОКР охоплює антитіла, які модулюють, блокують, антагонізують, пригнічують або знижують (в тому числі істотно) біологічну активність

СОР, або інакше антагонізують шлях СОКР, включаючи метаболичні шляхи, медійовані сигналізацією СОКР, такою як зв'язування рецептора та/або викликання клітинної відповіді на

СОР. В цілях даного винаходу, слід чітко розуміти, що термін "антагоністичне антитіло анти

СОКР" охоплює усі раніше визначені терміни, назви і функційні стани та характеристики, за допомогою яких власне СОКР, біологічна активність СОКР (включаючи, без обмежень, його здатність медіювати будь-який аспект головного болю), або наслідки біологічної активності, по суті зводяться до нуля, зменшуються або нейтралізуються в будь-якому значущому ступені. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР зв'язує СОКР та запобігає зв'язуванню СОКР з рецептором СОКР. В інших варіантах реалізації, антитіло анти СОКР зв'язує СОКР та запобігає активації рецептора СОКР. Приклади антагоністичних антитіл анти

СОКЕР представлені в даному документі.

У використовуваному в даному документі значенні, терміни "1" та "антитіло (1" використовуються взаємозамінно по відношенню до антитіла, продукованого експресійними векторами, що мають номери депонування в АТСС РТА-6867 та АТОС РТА-6866. Амінокислотні послідовності варіабельних ділянок важкого ланцюга та легкого ланцюга представлені на Фігурі 5. Ділянки СОК антитіла 51 (включаючи СОК за системами Споїйіа та Кара) схематично зображен на Фігурі 5. Полінуклеотиди, що кодують варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів, представлені в ХЕО ІЮ МО:9 та 5ЕО ІЮО МО:10. Визначення характеристик 1 описано в Прикладах.

Терміни "поліпептид", "олігопептид", "пептид" та "білок" використовуються взаємозамінно в даному документі по відношенню до полімерів амінокислот будь-якої довжини. Полімер може бути лінійним або розгалуженим, він може містити модифіковані амінокислоти, і він може містити в ланцюзі ланки, які не є амінокислотами. Терміни також охоплюють полімер амінокислот, який був модифікований природним шляхом або шляхом втручання; наприклад, утворенням дисульфідного зв'язку, глікозилюванням, ліпідуванням, ацетилюванням, фосфорилюванням, або будь-якими іншими маніпуляціями або модифікаціями, такими як кон'югація з компонентом мітки. Це визначення також включає, наприклад, поліпептиди, що містять один або декілька аналогів амінокислоти (включаючи, наприклад, неприродні амінокислоти і т.д.), а також інші модифікації, відомі фахівцям. Слід розуміти, що, оскільки поліпептиди за даним винаходом основані на антитілі, поліпептиди можуть існувати у вигляді одиночного ланцюга або асоційованих ланцюгів. "Полінуклеотид", або "нуклеїнова кислота", використовувані взаємозамінно в даному документі, стосуються полімерів нуклеотидів будь-якої довжини, і включають ДНК та РНК.

Нуклеотиди можуть бути дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифікованими нуклеотидами або основами, та/або їх аналогами, або будь-яким субстратом, який може бути включений в полімер за допомогою ДНК- або РНК-полімерази. Полінуклеотид може містити модифіковані нуклеотиди, такі як метильовані нуклеотиди та їх аналоги. Модифікації структури нуклеотиду, якщо вони присутні, можуть бути введені до або після складання полімеру.

Послідовність нуклеотидів може включати компоненти, які не є нуклеотидами. Полінуклеотид може бути додатково модифікований після полімеризації, наприклад, шляхом кон'югації з компонентом мітки. Інші типи модифікацій включають, наприклад, "кепи", заміщення одного або декількох природних нуклеотидів на аналог, міжнуклеотидні модифікації, такі як, наприклад, з незарядженими зв'язками (наприклад, метилфосфонати, повні складні ефіри фосфорної кислоти, фосфоамідати, карбамати і т.д.) та із зарядженими зв'язками (наприклад, фосфоротіоати, фосфородитіоати і т.д.), ті, що містять приєднані фрагменти в бічних ланцюгах, такі як, наприклад, білки (наприклад, нуклеази, токсини, антитіла, сигнальні пептиди, ріу-Ї -лізин і т.д.), ті, що містять інтеркалятори (наприклад, акридин, псорален і т.д.), ті, що містять комплексоутворювачі (наприклад, метали, радіоактивні метали, бор, метали-окисники і т.д.), ті, що містять алкілувальні фрагменти, ті, що містять модифіковані зв'язки (наприклад, альфа- аномерні нуклеїнові кислоти і т.д.), а також немодифіковані форми полінуклеотиду (610) (полинуклеотидів). Додатково, будь-яка з гідроксильних груп, звичайно присутніх в цукрах, може бути заміщена, наприклад, на фосфонатні групи, фосфатні групи, захищена стандартними захисними групами або активована для одержання додаткових зв'язків з додатковими нуклеотидами, або може бути кон'югована з твердими носіями. 5'- та 3'-кінцеві ОН можуть бути фосфориловані або заміщені амінами або органічними фрагментами кепуючих груп, що містять від 1 до 20 атомів вуглецю. Інші гідроксили також можуть бути дериватизовані в стандартні захисні групи. Полінуклеотиди можуть також містити форми з аналогами рибозних або дезоксирибозних цукрів, які є загальновідомими для фахівців, включаючи, наприклад, 2'-0- метил-, 2-О-аліл, 2'-фтор- або 2'-азидо-рибозу, карбоциклічні аналоги цукрів, а-аномерні цукри, епімерні цукри, такі як арабіноза, ксилози або ліксози, піранозні цукри, фуранозні цукри, седогептулози, ациклічні аналоги та абазичні нуклеозидні аналоги, такі як метилрибозид. Один або декілька фосфодіефірних зв'язків можуть бути заміщені на альтернативні зв'язувальні групи. Такі альтернативні зв'язувальні групи включають, без обмежень, варіанти реалізації, в яких фосфат заміщений на Р(О)5 (тіоат"), Р(З)5 ("дитіоат"), (СОМЕ» ("амідат"), РІК, Р(ІФОК",

СО або СНо ("формацеталь"), в яких кожний К або ЕК" незалежно позначає Н або заміщений або незаміщений алкіл (1-20 С), який необов'язково містить простий ефірний (-О-) зв'язок, арил, алкеніл, циклоалкіл, циклоалкеніл або аралділ. Зв'язки в полінуклеотиді не повинні бути усі обов'язково ідентичними. Попередній опис стосується усіх полінуклеотидів, згадуваних в даному документі, включаючи РНК та ДНК. "Варіабельна область" антитіла стосується варіабельної області легкого ланцюга антитіла або варіабельної області важкого ланцюга антитіла, окремо або в комбінації. Варіабельні области важкого та легкого ланцюгів складаються кожна з чотирьох каркасних ділянок (ЕК), з'єднаних трьома ділянками, що визначають комплементарність (СОК), також відомими як гіперваріабельні області. СОК в кожному ланцюзі утримуються разом на невеликій відстані одна від одної за допомогою ЕЕ і, разом з СОЄ. іншого ланцюга, беруть участь в утворенні антиген- зв'язуючого сайта антитіл. Існує щонайменше два способи визначення СОР: (1) підхід, оснований на перехресно-видовій варіабельності послідовності (тобто, Кабаї єї аЇ. Зедпепсев ої

Ргоївіпо ої Іттипоїодісаї Іптегеві, (Бій едй., 1991, Майопаї Іпзійшез ої Неацй, Веїпезаа МО)); та (2) підхід, оснований на кристалографічних дослідженнях комплексів антиген-антитіло (АІ-Іагікапі єї а! (1997) 9. Моїес. Віої. 273:927-948)). У використовуваному в даному документі значенні, СОК можуть стосуватися СОК, визначених за допомогою будь-якого з подходів або комбінації обох підходів. "Константна область" антитіла стосується константної області легкого ланцюга антитіла або константної області важкого ланцюга антитіла, окремо або в комбінації.

Епітоп, який "переважно зв'язується" або "специфічно зв'язується" (використовуються в даному документі взаємозамінно) з антитілом або поліпептидом, є терміном, добре зрозумілим фахівцям, і способи визначення такого специфічного або переважного зв'язування також добре відомі фахівцям. Говорять, що молекула виявляє "специфічне зв'язування" або "переважне зв'язування", якщо вона реагує або асоціюється частіше, швидше, з більшою тривалістю та/або з більшою афінністю, з конкретною клітиною або речовиною, ніж з альтернативними клітинами або речовинами. Антитіло "специфічно зв'язується" або "переважно зв'язується" з мішенню, якщо воно зв'язується з більшою афінністю, авідніістю, легше, та/або з більшою тривалістю, ніж з іншими речовинами. Наприклад, антитіло, яке специфічно або переважно зв'язується з епітопом СОКР, є антитілом, яке зв'язує цей епітоп з більшою афінністю, авідністю, легше, та/або з більшою тривалістю, ніж інші епітопи СОКР або епітопи, що не належать до СОСЕР. При прочитанні цього визначення також зрозуміло, що, наприклад, антитіло (або фрагмент або епітоп), яке специфічно або переважно зв'язується з першою мішенню, може специфічно або переважно зв'язуваться або не зв'язуватися з другою мішенню. По суті, "специфічне зв'язування" або "переважне зв'язування" не потребує обов'язково (хоча й може включати) виключне зв'язування. Загалом, але не обов'язково, посилання на зв'язування припускає переважне зв'язування.

У використовуваному в даному документі значенні, "по суті чистий" стосується матеріалу, який є на щонайменше 50 95 чистим (тобто, не містить забруднень), ще краще, на щонайменше 90 95 чистим, ще краще, на щонайменше 95 95 чистим, ще краще, на щонайменше 98 9о чистим, ще краще, на щонайменше 99 95 чистим. "Клітина-хазяїн" включає індивідуальну клітину або культуру клітин, яка може бути або не бути реципієнтом для вектора (векторів) для включення полінуклеотидних вставок. Клітини- хазяї включають потомство окремої клітини-хазяїна, і потомство може не бути обов'язково повністю ідентичним (за морфологією або за комплементом геномній ДНК) вихідним батьківським клітинам внаслідок природної, випадкової або цілеспрямованої мутації. Клітина- (610) хазяїн включає клітини, трансфековані іп мімо полінуклеотидом (полінуклеотидами) за даним винаходом.

Термін "Рс-область" використовується для позначення С-кінцевої ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну. "Ро-область" може бути нативною послідовністю Ес-області або варіантом Ес- області. Хоча межі Ес-області важкого ланцюга імуноглобуліну можуть змінюватися, Ес-область важкого ланцюга людського дос звичайно визначається як така, що проходить від амінокислотного залишку в положенні Субз226, або від Рго230, до її карбоксильного конца.

Нумерація залишків в Ес-області відповідає ЕЮО-індексу, як в системі Кабраї. Кабаї еї аї.,

Зедиєпсевз ої Ргоївіп5 ої Ітипоіодіса! Іпіегеві, Бій Ей. Рибіїс Неайй бегмісе, Маїйопаї! Іпбійшев ої

Неаїйй, Веїйезада, Ма., 1991. Ес-область імуноглобуліну звичайно містить два константних домени, СН2 та СНЗ.

У використовуваному в даному документі значенні, "Ес-рецептор" та "БСК" описують рецептор, який зв'язується з Ес-областю антитіла. Кращим БСК є людський БСК з нативною послідовністю. Крім цього, кращим ЕсК є такий, що зв'язує антитіло до (гамма-рецептор) та включає рецептори підкласів ЕсукКІ, ЕсукіІ! та сук, включаючи алельні варіанти та альтернативно розщеплені форми цих рецепторів. Рецептори ЕсукКІІ включають ЕсукПА ("активуючий рецептор") та ЕсукКІІВ ("інгібуючий рецептор"), які мають схожі амінокислотні послідовності, які відрізняються переважно в цитоплазматичних доменах. Огляд ЕскК5 наведений в Камеїспй апа Кіпеї, 1991, Апп. Кем. Іттипої., 9:457-92; Саре! єї аї., 1994,

Іттипотвеїпоав5, 4:25-34; та дае Нааз еї аї., 1995, 9. гар. Сііп. Мей., 126:330-41. "БСК" також включає неонатальний рецептор, РсКп, який відповідає за перенесення материнських Ідсв плоду (сСиуег еї а!., 1976, У. Іттипої., 117:587; та Кіт еї а1ї., 1994, У. Ітітипої., 24:249). "Комплемент-залежна цитотоксичність" та "СОС" стосуються лізису мішені в присутності комплементу. Шлях активації комплементу ініціюється зв'язуванням першого компонента системи комплементу (С1д) з молекулою (наприклад, антитілом), що утворює комплекс зі своїм антигеном. Для оцінки активації комплементу може бути проведений аналіз СОС, наприклад, як описано в Са;77апо-Запіого еї аї., у. Іттипої. Меїноав5, 202:163 (1996). "Функціональна Ес-область" має щонайменше одну ефекторну функцію Ес-області з нативною послідовністю. Типові приклади "ефекторних функцій" включають зв'язування С1а4; комплемент-залежну цитотоксичність (СОС); зв'язування Ес-рецептора; опосередковану антитілами клітинну цитотоксичність (АОСС); фагоцитоз; знижувальну регуляцію рецепторів клітинної поверхні (наприклад, В-клітинних рецепторів; ВСК) і т.д. Такі ефекторні функції звичайно потребують об'єднання Ес-області зі зв'язувальним доменом (наприклад, варіабельним доменом антитіла) та можуть бути визначені з використанням різних аналізів, відомих фахівцям та використовуваних для оцінки таких ефекторних функцій антитіл. "Гсо-область з нативною послідовністю" включає амінокислотну послідовність, ідентичну амінокислотній послідовності Ес-області, що існує в природі. "Варіант Ес-області" включає амінокислотну послідовність, яка відрізняється від Ес-області з нативною послідовністю за рахунок щонайменше однієї модифікації амінокислоти, але зберігає щонайменше одну ефекторну функцію Ес-області з нативною послідовністю. Краще, варіант Ес-області має щонайменше одно амінокислотне заміщення у порівнянні з Ес-областю з нативною послідовністю або з Есо-областю вихідного поліпептиду, наприклад, від близько одного до близько десяти амінокислотних заміщень, і краще від близько одного до близько п'яти амінокислотних заміщень в Есо-області з нативною послідовністю або в Ес-області вихідного поліпептиду. Варіант Ес-області в даному документі буде краще мати щонайменше близько 80 95 ідентичності послідовності з Ес-областю з нативною послідовністю та/або з Ес-областю вихідного поліпептиду, і ще краще, щонайменше близько 90 95 ідентичності послідовності з нею, ще краще, щонайменше близько 95 95, щонайменше близько 96 95, щонайменше близько 97 95, щонайменше близько 98 95, щонайменше близько 99 95 ідентичності послідовності з нею.

У використовуваному в даному документі значенні "опосередкована антитілами клітинна цитотоксичність" та "АОСС" стосуються клітинно медійованої реакції, у якій неспецифічні цитотоксичні клітини, що експресують Ес-рецептори (ГСК5) (наприклад, природні клітини-вбивці (МК), нейтрофіли та макрофаги) розпізнають зв'язане антитіло на клітині-мішені і потім викликають лізис клітини-мішені. АЮОСС-активність молекули, що представляє інтерес, може бути оцінена з використанням іп міго аналізу АОСС, такого як описаний в патенті США Мо 5500362 або 5821337. Придатні ефекторні клітини для таких аналізів включають мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМСОС) та МК-клітини. Альтернативно або додатково, АОСС- активність молекули, що представляє інтерес, може бути оцінена іп мімо, наприклад, на тваринній моделі, такій як розкриті в СіІупез еї аї., 1998, РМАБЗ (ОА), 95:652-656.

У використовуваному в даному документі значенні, "лікування" є підходом, призначеним для (610) досягнення корисних або бажаних клінічних результатів. В цілях даного винаходу, корисні або бажані клінічні результати включають, без обмежень, один або декілька з таких: поліпшення будь-якого аспекту головного болю, включаючи зменшення тяжкості, ослаблення інтенсивності болю та інших асоційованих симптомів, зниження частоти рецидивів, підвищення якості життя осіб, які страждають від головного болю, та зменшення дози інших лікарських засобів, необхідних для лікування головного болю. Для мігрені, інші асоційовані симптоми включають, без обмежень, нудоту, блювоту та чутливість до світла, звуків та/або рухів. Для кластерного головного болю, інші асоційовані симптоми включають, без обмежень, припухлість під або навколо очей, надмірна слізливість, почервоніння очей, ринорея або закладений ніс, та розчервоніле обличчя. "Зниження частоти" головного болю означає будь-який результат із зниження тяжкості (яке може включати зменшення потреби в та/або кількості (наприклад, дії) інших лікарських засобів та/або терапій, звичайно використовуваних при цьому стані, включаючи, наприклад, ерготаміну, дигідроерготаміну або триптанів при мігрені), тривалості та/або частоти (включаючи, наприклад, затримку або збільшення періоду часу до наступного епізодичного нападу у особи). Як зрозуміло фахівцям в цій галузі техніки, індивідууми можуть відрізнятися за своїм відгуком на лікування і, по суті, наприклад, "спосіб зниження частоти головного болю у особи" відображає введення антагоністичного антитіла анти СОР на основі обгрунтованого очікування, що таке введення може ймовірно викликати таке зниження частоти у даного конкретного індивідуума. "Полегшення" головного болю або одного або декількох симптомів головного болю означає зменшення або поліпшення одного або декількох симптомів головного болю у порівнянні з відсутністю введення антагоністичного антитіла анти СОКР. "Полегшення" також включає скорочення або зменшення тривалості симптому.

У використовуваному в даному документі значенні, "контроль головного болю" стосується підтримання або зниження тяжкості або тривалості одного або декількох симптомів головного болю або частоти нападів головного болю у особи (порівняно з рівнем, що існував до проведення лікування). Наприклад, тривалість або тяжкість головного болю, або частоти нападів знижується у особи на будь-яку величину з щонайменше близько 10 95, 20 95, ЗО Об, 40 9, 50 Фо, 60 95 або 70 95, порівняно з рівнем до проведення лікування.

У використовуваному в даному документі значенні, "-одина головного болю" стосується часу, протягом которого суб'єкт відчуває головний біль. Години головного болю можуть бути виражені в цілих годинах (наприклад, одна година головного болю, дві години головного болю, три години головного болю і т.д.) або в цілих та дробових величинах годин (наприклад, 0,5 години головного болю, 1,2 години головного болю, 2,67 години головного болю і т.д.). Одна або декілька годин головного болю можуть бути вказані по відношенню до певного інтервалу часу.

Наприклад, "години головного болю на день" можуть стосуватися числа годин головного болю, який суб'єкт відчуває протягом дня (наприклад, за 24-годинний період часу). В іншому прикладі, "години головного болю на тиждень" можуть стосуватися числа годин головного болю, який суб'єкт відчуває протягом тижня (наприклад, за 7-денний період). Слід розуміти, що тижневий інтервал може відповідати або не відповідати календарному тижню. В іншому прикладі, "місячна кількість годин головного болю" може стосуватися числа годин головного болю, який суб'єкт відчуває протягом місяця. Слід розуміти, що місячний інтервал (наприклад, період, рівний 28-31 дням) може змінюватися за числом днів в залежності від конкретного місяця і може відповідати або не відповідати календарному місяцю. У ще одному прикладі, "річна кількість годин головного болю" може стосуватися числа годин головного болю, який суб'єкт відчуває протягом року. Слід розуміти, що річний інтервал (наприклад, період, рівний 365 або 366 дням) може змінюватися за числом днів в залежності від конкретного року і може відповідати або не відповідати календарному року. В деяких варіантах реалізації, година головного болю може (бути вказана) по відношенню до конкретного типу головного болю (наприклад, мігрень, кластерний головний біль, хронічний головний біль та тензіонний головний біль). Наприклад, "година мігрені" може стосуватися часу, протягом якого суб'єкт відчуває мігрень.

У використовуваному в даному документі значенні, "день головного болю" стосується дня, протягом якого суб'єкт відчуває головний біль. Дні головного болю можуть бути виражені в цілих днях (наприклад, один день головного болю, два дні головного болю, три дні головного болю і т.д.) або в цілих та дробових величинах днів наприклад, 0,5 дня головного болю, 1,2 дня головного болю, 2,67 днів головного болю і т.д.). Один або декілька днів головного болю можуть бути вказані по відношенню до конкретного інтервалу часу. Наприклад, "тижнева кількість днів головного болю" може стосуватися числа днів головного болю, який суб'єкт відчуває протягом тижня (наприклад, за 7-денний період). Слід розуміти, що тижневий інтервал може відповідати або не відповідати календарному тижню. В іншому прикладі, "місячна кількість днів головного (610) болю" може стосуватися числа днів головного болю, який суб'єкт відчуває протягом місяця. Слід розуміти, що місячний інтервал (наприклад, період, рівний 28-31 дням) може змінюватися за числом днів в залежності від конкретного місяця і може відповідати або не відповідати календарному місяцю. У ще одному прикладі, "годична кількість днів головного болю" може стосуватися числа днів головного болю, який суб'єкт відчуває протягом року. Слід розуміти, що річний інтервал (наприклад, період, рівний 365 або 366 дням) може змінюватися за числом днів в залежності від конкретного року і може відповідати або не відповідати календарному году. В деяких варіантах реалізації день головного болю може бути вказаний по відношенню до конкретного типу головного болю (наприклад, мігрені, кластерного головного болю, хронічного головного болю та головного болю напруги). Наприклад, "день мігрені" може стосуватися дня, протягом якого суб'єкт відчуває мігрень.

У використовуваному в даному документі значенні, "затримка" розвитку головного болю означає відстрочку, запобігання, уповільнення, гальмування, стабілізацію та/або затримку прогресування хвороби. Така затримка може мати різну тривалість за часом, в залежності від історії хвороби та/або осіб, що отримують лікування. Кваліфікованому фахівцю в цій галузі техніки зрозуміло, що достатня або значна затримка може, фактично, охоплювати запобігання, в тому розумінні, що у індивідуума не відбувається розвитку головного болю (наприклад, мігрені). Спосіб, який "затримує" розвиток симптому, є способом, що зменшує ймовірність розвитку симптому в даний період часу та/або знижує ступінь інтенсивності симптомів в даний період часу, у порівнянні з відсутністю використання способу. Такі порівняння типово основані на клінічних дослідженнях, що проводяться з використанням статистично значущого числа суб'єктів. "Развиток" або "прогресування" головного болю означає початкові прояви та/або подальше прогресування розладу. Розвиток головного болю може детектуватися та оцінюватися з використанням стандартних клінічних методик, добре відомих фахівцям. Однак, розвиток також стосується прогресування, яке може бути невиявним. В цілях даного опису, розвиток або прогресування стосується біологічної послідовності проявів симптомів. "Розвиток" включає епізод, рецидив та початкові прояви. У використовуваному в даному документі значенні "початкові прояви" або "епізод" головного болю включають первинні прояви та/або рецидив.

У використовуваному в даному документі значенні, "ефективна доза" або "ефективна кількість" лікарського препарату, сполуки або фармацевтичної композиції є кількістю, достатньою для забезпечення сприятливих або бажаних результатів. При профілактичному застосуванні, сприятливі або бажані результати включають такі результати, як усунення або зниження ризику, ослаблення тяжкості або затримка початкових проявів хвороби, включаючи біохімічні, гістологічні та/(або поведінкові симптоми хвороби, її ускладнення та проміжні патологічні фенотипи, що проявляються в процесі розвитку хвороби. При терапевтичному застосуванні, сприятливі або бажані результати включають клінічні результати, такі як зниження інтенсивності болю, тривалості або частоти нападів головного болю, та ослаблення одного або декількох симптомів, викликуваних головним болем (біохімічних, гістологічних та/або поведінкових), включаючи її ускладнення та проміжні патологічні фенотипи, що проявляються в ході розвитку хвороби, підвищення якості життя осіб, які страждають від хвороби, зниження дози інших лікарських засобів, необхідних для лікування хвороби, підсилення ефекту іншого лікарського засобу, та/або затримку прогресування хвороби у пацієнтів. Ефективна доза може бути введена в один або декілька прийомів. В цілях даного опису, ефективна доза лікарського препарату, сполуки або фармацевтичної композиції є кількістю, достатньою для проведення профілактичного або терапевтичного лікування, безпосередньо або опосередковано. Як має бути зрозуміло в клінічному контексті, ефективна доза лікарського препарату, сполуки або фармацевтичної композиції може бути досягнута або не досягнута у поєднанні з іншим лікарським препаратом, сполукою або фармацевтичною композицією. Таким чином, "ефективна доза" може розглядатися в контексті введення одного або декількох терапевтичних агентів, і окремий агент може розглядатися як введений в ефективній кількості, якщо, у поєднанні з одним або декількома іншими агентами, бажаний результат може бути досягнутий або досягається. "Індивідуум" або "суб'єкт" є ссавцем, ще краще, людиною. Ссавці також включають, без обмежень, сільськогосподарських тварин, спортивних тварин, домашніх питомців, приматів, коней, собак, кішок, мишей та щурів.

У використовуваному в даному документі значенні, "вектор" означає конструкт, здатний доставляти, і краще експресувати один або декілька генів або одну або декілька послідовностей, що представляють інтерес, в клітині-хазяїні. Приклади векторів включають, без обмежень, вірусні векторі, експресійні вектори "голих" ДНК або РНК, плазмідні, космидні або (610) фагові вектори, експресійні вектори ДНК або РНК, асоційовані з катіонними агентами конденсації, експресійні вектори ДНК або РНК, інкапсульовані в ліпосоми, та певні еукаріотичні клітини, такі як клітини-продуценти.

У використовуваному в даному документі значенні, "контрольна послідовність експресії" означає послідовність нуклеїнової кислоти, яка спрямовує транскрипцію нуклеїнової кислоти.

Контрольна послідовність експресії може бути промотором, таким як конститутивний або індукований промотор, або енхансером. Контрольна послідовність експресії функціонально зв'язана з послідовністю нуклеїнової кислоти, яка має бути транскрибована.

У використовуваному в даному документі значенні, "фармацевтично прийнятний носій" або "фармацевтично прийнятна допоміжна речовина" включає будь-який матеріал, який, в комбінації з активним інгредієнтом, дозволяє інгредієнту зберігати біологічну активність та є не- реактивним по відношенню до імунної системи суб'єкта. Приклади включають, без обмежень, будь-які стандартні фармацевтичні носії, такі як забуферений фосфатом сольовий розчин, воду, емульсії, такі як емульсія типу "масло у воді", та різні типи змочувальних агентів. Кращими розріджувачами для аерозольного або парентерального введення є фосфатно-сольовий буфер або нормальний (0,9 95) сольовий розчин. Композиції, що містять такі носії, складають добре відомими звичайними способами (див., наприклад, Кептіпдіоп'є Ріпаптасешіса! Зсіепсе5, 181 еаййоп, А. Сеппаго, ейа., Маск Рибіїхпіпд Со., Еавіоп, РА, 1990; та Кетіпдіоп, Те 5сіепсе апа

Ргасіїсе ої Рпагтасу 201 Еа. Маск Рибіїєпіпа, 2000).

Термін "Копї, у використовуваному в даному документі значенні, стосується константи швидкості асоціації антитіла з антигеном.

Термін "Кон ", у використовуваному в даному документі значенні, стосується константи швидкості дисоціації антитіла з комплексу антитіло/антиген.

Термін "Ко", у використовуваному в даному документі значенні, стосується константи рівноважної дисоціації взаємодії антитіло-антиген.

У використовуваному в даному документі значенні, термін "вазомоторний симптом" стосується станів, зв'язаних з вазодилатацією. Така вазодилатація може бути асоційована або потенційно асоційована з головним болем (таким як мігрень з аурою або без неї; геміплегічна мігрень; хронічна мігрень; епізодична мігрень; часта епізодична мігрень; кластерні головні болі; мігренозна невралгія; хронічні головні болі; головні болі напруги; головні болі, викликані іншими медичними станами (такими як інфекція або підвищений внутрішньочерепний тиск внаслідок пухлини); хронічна пароксизмальна гемікранія; змішаний головний біль, не зв'язаний зі структурними ушкодженнями; головний біль, зв'язаний з несудинними внутрішньочерепними ураженнями; головний біль, асоційований з введенням речовини або припиненням її введення; головний біль, зв'язаний з інфекцією поза головою; головний біль, зв'язаний з метаболічним розладом; головний біль, зв'язаний з ушкодженням черепа, шиї, очей, ушей, носа та навколоносових порожнин, зубів та порожнини рота або інших лицевих або черепних структур; черепні невралгії; та біль в нервовому стовбурі та деаферентаційний біль), припливами крові (або нападоподібним відчуттям жару), нападоподібним відчуттям холоду, безсонням, порушеннями сну, емоційними розладами, дратівливістю, надмірною пітливістю, нічною пітливістю, денною пітливістю, втомою тощо, викликаними, поміж іншим, терморегуляторною дисфункцією.

У використовуваному в даному документі значенні, терміни "приплив", "приплив крові" та "нападоподібне відчуття жару" є прийнятими в цій галузі техніки термінами, які стосуються епізодичних порушень температури тіла, що типово полягають в раптовому припливі крові до щкіри, звичайно супроводжуваному потінням суб'єкта.

А. Способи попередження або лікування вазомоторних симптомів та/або головного болю

В одному аспекті, винахід передбачає спосіб лікування або зниження частоти щонайменше одного вазомоторного симптому у суб'єкта. В іншому аспекті, винахід передбачає спосіб лікування або зменшення частоти головного болю (наприклад, мігрені) у суб'єкта. В деяких варіантах реалізації, спосіб включає введення особі ефективної кількості антитіла або поліпептидів, одержаних з антитіла, яке модулює шлях СОКР (наприклад, моноклональне антагоністичне антитіло анти СОКР). В деяких варіантах реалізації щонайменше один вазомоторний симптом може бути асоційований з головним болем (наприклад, мігренню) та/або припливами крові.

В іншому аспекті, винахід передбачає спосіб полегшення, контролю, зниження частоти, або затримання розвитку або прогресування щонайменше одного вазомоторного симптому у особи, який включає введення особі ефективної кількості антагоністичного антитіла анти СОКР. В деяких варіантах реалізації, щонайменше один вазомоторний симптом може бути асоційований з головним болем (наприклад, мігренню) та/або припливами крові. 10) В іншому аспекті, винахід передбачає способи полегшення, контролю, зниження частоти,

або затримання розвитку або прогресування головного болю (наприклад, мігрені) у особи, або симптомів, асоційованих з головним болем (наприклад, діареї або світлочутливості), який включає введення особі ефективної кількості антитіла, яке модулює шлях СОКР, або антагоністичного антитіла анти СОКР, в комбінації з щонайменше одним додатковим агентом, придатним для лікування головного болю.

Такі додаткові агенти включають, без обмежень, агоністи 5-НТ та М5АЇЮ. Наприклад, антитіло та щонайменше один додатковий агент можуть бути введені спільно, тобто, вони можуть бути надані з достатньо малим інтервалом часу, щоб забезпечити перекривання їх індивідуальних терапевтичних ефектів. Наприклад, кількість агоніста 5-НТ або М5АЇО, введеного в комбінації з антитілом анти СОКР, має бути достатньою для зниження частоти рецидивів головного болю у пацієнтів або продукування більш тривалої ефективності у порівнянні з введенням будь-якого одного з цих агентів за відсутності іншого. Ця процедура може бути використана для лікування головного болю, що належать до будь-якого з широкого спектра класів, включаючи: мігрень з аурою або без неї; геміплегічна мігрень; хронічна мігрень; епізодична мігрень; часта епізодична мігрень; кластерні головні болі; мігренозна невралгія; хронічні головні болі; головні болі напруги; головні болі, викликані іншими медичними станами (такими як інфекція або підвищений внутрішньочерепний тиск внаслідок пухлини); хронічна пароксизмальна гемікранія; змішаний головний біль, не зв'язаний зі структурними ушкодженнями; головний біль, зв'язаний з несудинними внутрішньочерепними ураженнями; головний біль, зв'язаний з введенням речовини або припиненням її введення; головний біль, зв'язаний з інфекцією поза головою; головний біль, зв'язаний з метаболічним розладом; головний біль, зв'язаний з ушкодженням черепа, шиї, очей, ушей, носа та навколоносових порожнин, зубів та порожнини рота або інших лицевих або черепних структур; черепні невралгії; та біль в нервовому стовбурі та деаферентаційний біль.

Додаткові Необмежуючі приклади додаткових агентів, які можуть бути введені в комбінації з антагоністичним антитілом анти СОРР, включають один або декілька з: (ї) опіоїдний анальгетик, наприклад, морфін, героїн, гідроморфон, оксиморфон, леворфанол, левалорфан, метадон, меперидин, фентаніл, кокаїн, кодеїн, дигідрокодеїн, оксикодон, гідрокодон, пропоксифен, налмефен, налорфін, налоксон, налтрексон, бупренорфін, буторфанол, налбуфін або пентазоцин; (ії) нестероїдний протизапальний лікарський засіб (М5А!ІЮ), наприклад, аспірин, диклофенак, дифлусинал, етодолак, фенбуфен, фенопрофен, флуфенісад, флурбіпрофен, ібупрофен, індометацин, кетопрофен, кеторолак, меклофенамова кислота, мефенамова кислота, набуметон, напроксен, оксапрозин, фенілбутазон, піроксикам, суліндак, толметин або зомепірак, інгібітори циклооксигенази-2 (СОХ-2), целекоксиб; рофекоксиб; мелоксикам; УТЕ-522;

ІЇ-745,337; М5398;, або його фармацевтично прийнятна сіль; (ії) барбітуратний седативний засіб, наприклад, амобарбітал, апробарбітал, бутабарбітал, бутабітал, мефобарбітал, метарбітал, метогекситал, пентобарбітал, фенобарбітал (рпепобрагійа!), секобарбітал, талбуттал, теамілал або тіопентал, або його фармацевтично прийнятна сіль; (ім) барбітуратний анальгетик, наприклад, буталбітал або його фармацевтично прийнятна сіль, або композиція, що містить буталбітал. (М) бензодіазепін, що виявляє седативну дію, наприклад, хлордіазепоксид, клоразепат, діазепам, флуразепам, лоразепам, оксазепам, темазепам або триазолам, або його фармацевтично прийнятна сіль; (м) Нт-антагоніст, що виявляє седативну дію, наприклад, дифенгідрамін, піриламін, прометазин, хлорфенірамін або хлорциклізин або його фармацевтично прийнятна сіль; (мі) седативний засіб, такий як глутетимід, мепробамат, метаквалон або дихлоралфеназон, або його фармацевтично прийнятна сіль; (мії) скелетний міорелаксант, наприклад, баклофен, каризопродол, хлорзоксазон, циклобензаприн, метокарбамол або орфренадін або його фармацевтично прийнятна сіль; (їх) антагоніст рецептора ММОА, наприклад, декстрометорфан ((к)-3-гідрокси-М- метилморфінан) або його метаболіт декстрорфан ((ї)-3-гідрокси-М-метилморфінан), кетамін, мемантин, піролохінолінхінон або цис-4-«(фосфонометил)-2-піперидинкарбонова кислота або його фармацевтично прийнятна сіль; (х) альфа-адренергічний засіб, наприклад, , доксазосин, тамсулозин, клонідин або 4-аміно- 6б,7-диметокси-2-(5-метансульфонамідо-1,2,3,4-тетрагідроіїзохінол-2-іл)-5-(2-піридил)хіназолін; (хі) трициклічний антидепресант, наприклад, дезипрамін, іміпрамін, амітриптилін або нортриптилін; (610) (хії) протисудомний засіб, наприклад, карбамазепін або вальпроат;

(хії) антагоніст тахікініну (МК), зокрема, антагоніст МК-3, МК-2 або МК-1, наприклад, (ам, 98)-7-ІЗ,5-біс(трифторметил)бензилі|-8,9,10,11-тетрагідро-9-метил-5-(4-метилфеніл)- 7 Н-

П,4Ідіазоциної|2,1-9111,7|Інафтиридин-6-13-діон (ТАК-637), 5-2, 35)-2-Ц18)-1-І3,5- біс(трифторметил)феніл|етокси-3-(4-фторфеніл)-4-морфолініл|метил|д|-1,2-дигідро-ЗН-1,2,4- триазол-3-он (МК-869), ланепітант, дапітант або 3-(2-метокси-5- (трифторметокси)феніл|метиламіно|-2-фенілпіперидин (25, 35); (хім) мускариновий антагоніст, наприклад, оксибутин, толтеродін, пропіверин, тропсіум хлорид або дарифенацин; (хм) інгібітор СОХ-2, наприклад, целекоксиб, рофекоксиб або валдекоксиб; (хмї) неселективний інгібітор СОХ (краще, із захистом шлунково-кишкового (СІ) тракту), наприклад, нітрофлурбіпрофен (НСТ-1026); (хмії) аналгетик, який є похідним аніліну, зокрема, парацетамол; (хмії) нейролептик, такий як дроперидол; (хіх) агоніст (наприклад, резинфератоксин) або антагоніст (наприклад, капсазепін) ванілоїдного рецептора; (хіх) бета-адренергетик, такий як пропранолол; (о) місцевий анестетик, такий як мексилетин; (ххі) кортикостероїд, такий як дексаметазон; (ххії) агоніст або антагоніст серотонінового рецептора; (ххіїї) холінергічний (нікотиновий) анальгетик; (ххім) трамадол (Тгатадої) (торговельна марка); (хху) інгібітор РОЕМ, такий як силденафіл, варденафіл або таладафіл; (ххуї) альфа-2-дельта ліганд, такий як габапентин або прегабалін; (ххмії) канабиноїд; і (ххуїї) антидепресант, такий як амітриптилін (елавіл), тразодон (дезирел) та іміпрамін (тофраніл) або протисудомні засоби, такі як фенітоїн (дилантин) або карбамазепін (тегретол).

Кваліфіковані фахівці в цій галузі техніки зможуть визначити придатні величини дозувань для конкретних агентів при використанні в комбінації з антитілом анти СОКР. Наприклад, суматриптан може бути введений в дозі від близько 0,01 до близько 300 мг. В деяких випадках, суматриптан може бути введений в дозі від 2 мг до 300 мг. При не-парентеральному введенні, типова доза суматриптану складає від близько 25 до близько 100 мг, причому близько 50 мг звичайно є кращою, а при парентеральному введенні краща доза складає близько 6 мг. Однак, ці дози можуть змінюватися згідно зі способами, які є стандартом в цій галузі техніки, з метою їх оптимізації для конкретного пацієнта або для конкретної комбінированої терапії. Додатково, наприклад, целекоксиб може бути введений в кількості від 50 до 500 мг.

В іншому аспекті, винахід передбачає способи полегшення, контролю, зниження частоти, або затримання розвитку або прогресування припливів крові у особи, який включає введення особі ефективної кількості антагоністичного антитіла анти СОКР в комбінації з щонайменше одним додатковим агентом, придатним для лікування припливів крові. Такі додаткові агенти включають, без обмежень, гормональні методи лікування, включаючи естрогени та/або деякі прогестини.

В іншому аспекті, винахід, що розкривається, передбачає спосіб лікування або зменшення частоти головного болю (наприклад, мігрені) у суб'єкта, який включає введення суб'єкту протягом багатьох днів кількості моноклонального антитіла (наприклад, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), яка модулює шлях СОКР. В деяких варіантах реалізації, кількість моноклонального антитіла, що вводиться в кожний з багатьох днів, може мати значення в діапазоні 0,1 мг - 5000 мг, 1 мг - 5000 мг, 10 мг - 5000 мг, 100 мг - 5000 мг, 1000 мг - 5000 мг, 0,1 мг - 4000 мг, 1 мг - 4000 мг, 10 мг - 4000 мг, 100 мг - 4000 мг, 1000 мг - 4000 мг, 0,1 мг - 3000 мг, 1 мг - 3000 мг, 10 мг - 3000 мг, 100 мг - 3000 мг, 1000 мг - 3000 мг, 0,1 мг - 2000 мг, 1 мг - 2000 мг, 10 мг - 2000 мг, 100 мг - 2000 мг, 1000 мг - 2000 мг, 0,1 мг - 1000 мг, 1 мг -1000 мг, 10 мг - 1000 мг або 100 мг - 1000 мг. В деяких варіантах реалізації, зазначена кількість має значення в діапазоні 100-2000 мг.

В іншому аспекті, винахід, що розкривається, передбачає спосіб лікування або зменшення частоти головного болю (наприклад, мігрені) у суб'єкта, який включає введення суб'єкту разової дози моноклонального антитіла (наприклад, моноклонального антагоністичного антитіла анти

СОР) в кількості, яка модулює шлях СОКР. В деяких варіантах реалізації, разова доза може бути кількістю антитіла в діапазоні 0,1 мг - 5000 мг, 1 мг - 5000 мг, 10 мг - 5000 мг, 100 мг - 5000 мг, 1000 мг - 5000 мг, 0,1 мг - 4000 мг, 1 мг - 4000 мг, 10 мг - 4000 мг, 100 мг - 4000 мг, 1000 мг - 4000 мг, 0,1 мг - 3000 мг, 1 мг - 3000 мг, 10 мг - 3000 мг, 100 мг - 3000 мг, 1000 мг - 3000 мг, 0,1 10) мг - 2000 мг, 1 мг - 2000 мг, 10 мг - 2000 мг, 100 мг - 2000 мг, 1000 мг - 2000 мг, 0,1 мг - 1000 мг, 1 мг -1000 мг, 10 мг - 1000 мг або 100 мг - 1000 мг. В деяких варіантах реалізації, разова доза може бути кількістю антитіла в діапазоні 100-2000 мг.

В іншому аспекті, винахід, що розкривається, передбачає спосіб лікування або зниження частоти щонайменше одного вазомоторного симптому у суб'єкта, який включає введення суб'єкту протягом багатьох днів кількості моноклонального антитіла (наприклад, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), яка модулює шлях СОКР. В деяких варіантах реалізації, кількість моноклонального антитіла, що вводиться в кожний з багатьох днів, може мати значення в діапазоні 0,1 мг - 5000 мг, 1 мг - 5000 мг, 10 мг - 5000 мг, 100 мг - 5000 мг, 1000 мг - 5000 мг, 0,1 мг - 4000 мг, 1 мг - 4000 мг, 10 мг - 4000 мг, 100 мг - 4000 мг, 1000 мг - 4000 мг, 0,1 мг - 3000 мг, 1 мг - 3000 мг, 10 мг - 3000 мг, 100 мг - 3000 мг, 1000 мг - 3000 мг, 01 мг - 2000 мг, 1 мг - 2000 мг, 10 мг - 2000 мг, 100 мг - 2000 мг, 1000 мг - 2000 мг, 0,1 мг - 1000 мг, 1 мг -1000 мг, 10 мг - 1000 мг або 100 мг - 1000 мг. В деяких варіантах реалізації, зазначена кількість має значення в діапазоні 100-2000 мг.

В іншому аспекті, винахід, що розкривається, передбачає спосіб зменшення величини місячної кількості годин головного болю, який відчуває суб'єкт, який включає введення суб'єкту кількості моноклонального антитіла (наприклад, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), що модулює шлях СОЕКР. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло може використовуватися в кількості, ефективній для зниження величини місячної кількості годин головного болю на щонайменше 0,1, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 або більше годин головного болю після разової дози. В деяких варіантах реалізації, моноклональне (антитіло) може використовуватися в кількості, ефективній для зниження величини місячної кількості годин головного болю на щонайменше 20 годин головного болю після разової дози. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло може використовуватися в кількості, ефективній для зниження величини місячної кількості годин головного болю на щонайменше 40 годин головного болю. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло може використовуватися в кількості, ефективній для зниження величини місячної кількості годин головного болю на щонайменше 0,1 95, 1 95, 2 У, З У, 4 Об,

Бов,б ою, 7 до, 8 90, 9 90,10 9, 15 90, 20 96, 25 до, 30 9о, 35 Уо, 40 9о, 45 90, 50 9, 55 о, 60 Фо, 65 95, 70 96, 75 95, 80 95, 85 95, 90 9, 95 95, 99 95 або більше після разової дози. В деяких варіантах реалізації, моноклональне (антитіло) може використовуватися в кількості, ефективній для зниження величини місячної кількості годин головного болю на щонайменше 15 95 після разової дози.

В іншому аспекті, винахід, що розкривається, передбачає спосіб зменшення величини місячної кількості днів головного болю, який відчуває суб'єкт, який включає введення суб'єкту кількості моноклонального антитіла (наприклад, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), яка модулює шлях СОР. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло може використовуватися в кількості, ефективній для зниження величини місячної кількості днів головного болю на щонайменше 3, 4, 5,6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше днів головного болю після разової дози. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло може використовуватися в кількості, ефективній для зниження величини місячної кількості днів головного болю на щонайменше З дні головного болю після разової дози. В деяких варіантах реалізації моноклональне антитіло може використовуватися в кількості, ефективній для зниження величини місячної кількості днів головного болю на щонайменше 016,19, 29, Зо, 49, 5 о, б о, 7 о, 8 о, 9 о, 10 905, 15 96, 20 95, 25 95, 30 9о, 35 Уо, 40 Ор, 45 то, 50 Зо, 55 о, 6о0 то, 65 то, 70 Зо, 75 ою, 80 то, 85 то, 90 то, 95 то, 99 95 або більше після разової дози.

В іншому аспекті, винахід, що розкривається, передбачає спосіб зменшення використання суб'єктом лікарського препарату проти головного болю, який включає введення суб'єкту моноклонального антитіла (наприклад, моноклонального антагоністичного антитіла анти

СОР), що модулює шлях СОКР. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло може використовуватися в кількості, ефективній для зниження місячного застосування суб'єктом лікарського препарату проти головного болю на щонайменше 0,1 95, 1 90, 2 90, З У, 4 У, 5 б, боб, 795, 890, 9 90, 10 90, 15 95, 20 96, 2595, ЗО 95, 35 Уо, 40 95, 45 96, 50 95, 55 95, 60 о, 65 95, 7095, 7596, 8095, 8595, 9095, 9595, 9995 або більше. В деяких варіантах реалізації, моноклональне антитіло може використовуватися в кількості, ефективній для зниження місячного застосування суб'єктом лікарського препарату проти головного болю на щонайменше 1595. Лікарський препарат проти головного болю може бути лікарським препаратом проти головного болю будь-якого типу, описаного будь-де в даному документі. Необмежуючі приклади лікарських препаратів проти головного болю включають агоністи 5-НТІ1 (та агоністи, що діють на (610) інші сайти 5-НТ1), триптани (наприклад, суматриптан, золмітриптан, наратриптан, ризатриптан,

елетриптан, алмотриптан, афроватриптан), алкалоїди ріжків (наприклад, ерготамін тартрат, ергоновін малеат, та ерголоїд мезилати (наприклад, дигідроергокорнін, дигідроергокристин, дигідроергокриптин, та дигідроерготамін мезилат (ОНЕ 45)), та нестероїдні протизапальні лікарські засоби (М5АЇІЮ5) (наприклад, аспірин, диклофенак, дифлусинал, етодолак, фенбуфен, фенопрофен, флуфенісад, флурбіпрофен, ібупрофен, індометацин, кетопрофен, кеторолак, меклофенамову кислоту, мефенамову кислоту, набуметон, напроксен, оксапрозин, фенілбутазон, піроксикам, суліндак, толметин або зомепірак, інгібітори циклооксигенази-2 (СОХ- 2), целекоксиб; рофекоксиб; мелоксикам; УТЕ-522; І-745,337; М5398;, або їх фармацевтично прийнятні солі), опіати (наприклад, оксикодон) та В-адренергічні антагоністи (наприклад, пропранолол).

Для усіх способів, описаних в даному документі, посилання на антитіла (наприклад, моноклональні антитіла, які модулюють шлях СОКР, антагоністичні антитіла анти СОБКР, моноклональні антагоністичні антитіла анти СОКР) також включають композиції, що містять один або декілька таких агентів. Відповідно, така композиція може бути використана згідно зі способом, що стосується антитіла, описаного в даному документі. Такі композиції можуть додатково містити придатні допоміжні речовини, такі як фармацевтично прийнятні допоміжні речовини, як описано в інших розділах даного документа. Даний винахід може бути використаний сам по собі або в комбінації з іншими звичайними способами лікування.

Антитіло, описане в даному документі (наприклад, моноклональне антитіло, антагоністичне антитіло анти СОКР, моноклональне антагоністичне антитіло анти СОКР) може бути введено індивідууму або суб'єкту в будь-якій терапевтичній дозі, будь-яким придатним шляхом та в будь- якій придатній композиції. Кваліфікованому фахівцю в цій галузі техніки має бути зрозуміло, що приклади, описані в даному документі, повинні розглядатися не як обмежувальні, а як такі, що ілюструють доступні методики. Відповідно, в деяких варіантах реалізації, антитіло, описане в даному документі, може бути введено індивідууму згідно з відомими способами, такими як внутрішньовенне введення, наприклад, у вигляді болюсу або шляхом безперервної інфузії протягом періоду часу, внутрішньом'язовим, інтраперитонеальним, інтрацереброспінальним, підшкірним, внутрішньосуглобовим, сублінгвальним, інтраартеріальним, інтрасиновіальним, за допомогою інсуфляції, інтратекальним, оральним, за допомогою інгаляції, інтраназальним (наприклад, з інгаляцією або без неї), букальним, ректальним, трансдермальним, інтракардіальним, внутрішньокістковим, інтрадермальним, трансмукозальним, вагінальним, інтравітреальним, периартикулярним, локальним, нашкірним або місцевим шляхами. Введення може бути системним, наприклад, внутрішньовенне введення, або локалізованим. Комерційно доступні розпилювачі для рідких композицій, включаючи струминні розпилювачі та ультразвукові розпилювачі, є придатними для введення. Рідкі композиції можуть розпилюватися безпосередньо, а ліофілізований порошок може бути розпилений після відновлення.

Альтернативно, антитіло, описане в даному документі, може бути переведено в форму аерозолю з використанням фторвуглецевої композиції та інгалятора з мірною дозою, або вводитися інгаляцією у вигляді ліофілізованого та розмеленого порошку.

В деяких варіантах реалізації, антитіло, описане в даному документі, може бути введено за допомогою методів сайт-специфічної або цільової місцевої доставки. Приклади методів сайт- специфічної або цільової місцевої доставки включають різні імплантовані у вигляді депо джерела антитіла або катетери для місцевої доставки, такі як інфузіонні катетери, постійний катетер, або голчастий катетер, штучні протези, адвентиціальні оболонки, шунти та стенти або інші імплантовані пристрої, сайт-специфічні носії, прямі ін'єкції, або пряме нанесення. Див., наприклад, публікацію РСТ Мо МО 00/53211 та патент США Мо 5981568.

Різні композиції антитіла, описані в даному документі, можуть бути використані для введення. В деяких варіантах реалізації, антитіло може бути введено в чистому вигляді. В деяких варіантах реалізації, антитіло та фармацевтично прийнятна допоміжна речовина можуть утворювати різні композиції. Фармацевтично прийнятні допоміжні речовини відомі фахівцям, та є відносно інертними речовинами, які полегшують введення фармакологічно ефективної речовини. Наприклад, допоміжна речовина може надавати форму або консистенцію, або діяти як розріджувач. Придатні допоміжні речовини включають, без обмежень, стабілізатори, змочувальні агенти та емульгатори, солі для зміни осмолярності, інкапсулюючі агенти, буфери, та засоби, що підвищують проникність шкіри. Допоміжні речовини, а також композиції для парентеральної та не-парентеральної доставки лікарського засобу описані в Кетіпдіоп, Те

Зсієпсе апа Ргасіїсе ої Рнаптасу 201п Ед. Маск Рибіїзпіпа (2000).

В деяких варіантах реалізації, композиції таких агентів, включаючи антитіла, описані в даному документі, можуть бути складені для введення шляхом ін'єкції (наприклад, (610) інтраперитонеально, внутрішньовенно, підшкірно, внутрішньом'язово тощо). Відповідно, такі агенти можуть бути скомбіновані з фармацевтично прийнятними носіями, такими як сольовий розчин, розчин Рингера, розчин декстрози тощо. Конкретна схема приймання, тобто, доза, розподіл за часом та повторення, буде залежати від конкретного індивідуума та історії хвороби цього індивідуума.

В деяких варіантах реалізації, композиції цих агентів, включаючи антитіла, описані в даному документі, можуть бути складені для периферичного введення. Такі композиції можуть бути введені периферично будь-яким придатним периферичним шляхом, включаючи внутрішньовенний та підшкірний. Агент, приготовлений для периферичного введення, може включати речовину, лікарський засіб та/або антитіло, які не доставляються центрально, спінально, інтратекально або безпосередньо в ЦНоС. Необмежуючі приклади шляхів периферичного введення включають шлях, який є оральним, сублінгвальним, букальним, місцевим, ректальним, інгаляцією, трансдермальним, підшкірним, внутрішньовенним, інтраартеріальним, внутрішньом'язовим, інтракардіальним, внутрішньокістковим, інтрадермальним, інтраперитонеальним, трансмукозальним, вагінальним, інтравітреальним, внутрішньосуглобовим, периартикулярним, локальним або нашкірним.

Терапевтичні композиції антитіл, використовувані згідно з розкриваним винаходом, можуть бути приготовлені для зберігання та/або застосування шляхом змішування антитіла, що має бажану ступінь чистоти, з необов'язковими фармацевтично прийнятними носіями, допоміжними речовинами або стабілізаторами (Кетіпдіоп, Те Зсіепсе апа Ргасіїсе ої Рпаптасу 20їп ЕаВа.

Маск Рибіїхпіпу (2000)), і можуть в деяких випадках мати форму ліофілізованнх композицій або водних розчинів. Прийнятні носії, допоміжні речовини або стабілізатори є нетоксичними для реципієнтів в використовуваних дозуваннях та концентраціях. Терапевтична композиція антитіла може містити один або декілька фармацевтично прийнятних носіїв, допоміжних речовин або стабілізаторів, причому Необмежуючі приклади таких речовин включають буфери, такі як фосфат, цитрат та інші органічні кислоти; солі, такі як хлорид натрію; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту та метіонін; консерванти (такі як октадецилдиметилбензиламонію хлорид; гексаметонію хлорид; бензалконію хлорид, бензетонію хлорид; фенол, бутиловий або бензиловий спирт; алкілларабени, такі як метил- або пропілпарабен; катехін; резорцин; циклогексанол; З-пентанол; та м-крезол); низькомолекулярні (менш ніж близько 10 залишків) поліпептиди; білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти (наприклад, в концентрації від 0,1 мМ до 100 мМ, від 0,1 мМ до 1 мМ, від 0,01 мМ до 50 мМ, від 1 мМ до 50

ММ, від 1 мМ до 30 мМ, від 1 мМ до 20 мМ, від 10 мМ до 25 мМ), такі як гліцин, глутамін, метіонін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, включаючи глюкозу, манозу або декстрини; хелатуючі агенти (наприклад, в концентрації від 0,001 мг/мл до 1 мг/мл, від 0,001 мг/мл до 1 мг/мл, від 0,001 мг/мл до 0,1 мг/мл, від 0,001 мг/мл до 0,01 мг/мл, від 0,01 мг/мл до 0,1 мг/мл), такі як ЕДТА (наприклад, динатрію ЕДТА дигідрат); цукри (наприклад, в концентрації від 1 мг/мл до 500 мг/мл, від 10 мг/мл до 200 мг/мл, від 10 мг/мл до 100 мг/мл, від 50 мг/мл до 150 мг/мл), такі як сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; солетвірні протиіони, такі як натрій; комплекси металів (наприклад, комплекси 7п-білок); та/або неіонні поверхнево-активні речовини (наприклад, в концентрації від 0,01 мг/мл до 10 мг/мл, від 0,01 мг/мл до 1 мг/мл, від 0,1 мг/мл до 1 мг/мл, від 0,01 мг/мл до 0,5 мг/мл) такі як твін (ТУ/ЕЕМТ"М) (наприклад, полісорбат (наприклад, полісорбат 20, полісорбат 40, полісорбат 60, полісорбат 80)), плюронік (Р ОБОМІС5 М) або поліеєтиленгліколь (ПЕГ).

Композиція антитіла може бути охарактеризована за будь-якою з різних фізичних властивостей. Наприклад, рідка композиція антитіла може мати будь-який придатний рН для забезпечення терапевтичної ефективності, безпеки та зберігання. Наприклад, рН рідкої композиції антитіла може мати значення від рН 4 до близько рН 9, відрН 5до рН 8, відрН 5 до рН 7, або від рН 6 до рН 8. В деяких варіантах реалізації, рідка композиція антитіла може мати

РН, рівний 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5,6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 або 10, або вище або нижче.

В іншому прикладі, рідка композиція антитіла може мати будь-яку придатну в'язкість для забезпечення терапевтичної ефективності, безпеки та зберігання. Наприклад, в'язкість рідкої композиції антитіла може мати значення від 0,5 сантипуаз (СП) до 100 сП, від 1 СП до 50 сП, від 1 СП до 20 сП, від 1 СП до 15 сП, або від 5 СП до 15 сП при 25 "С. В деяких варіантах реалізації, рідка композиція антитіла може мати в'язкість0,5 СП, 1 СП, 1,2 СП, 1,4 СП, 1,6 СП, 1,8 СП, 2,0 СП, 22сП,24сП,26сП,28сП,3,0сП,3,2сП,3,4 СП, 36 СП, 38 СП, 4,0сП, 4,2 СП, 4,4 СП, 4,6 СП, 4,8 СП, 5,0сП,5,2сП,54 сСП,56 сСП,5,сСП,6,0сП,6,2 СП, 6,4 СП, 6,6 СП, 6,8 СП, 7,0 СП, 7,2 СП, 7АСП,76сП, 7,8сСП,8,0сП,8,2сП,84 СП, 8,6 СП, 8,8СП,90сП, 9,2 СП, 9,4 СП, 9,6 СП, 9,8 сП, (610) 10,0 СП, 10,2 СП, 10,4 СП, 10,6 сП, 10,8 сП, 11,0 СП, 11,2 сП, 11,4 сП, 11,6 сП, 11,8 сП, 12,0 сП,

12,2 СП, 12,4 СП, 12,6 сП, 12,8 СП, 13,0 сП, 13,2 СП, 13,4 сП, 13,6 сП, 13,8 сП, 14,0 сП, 14,2 сП, 14,4 СП, 14,6 сП, 14,8 сП, або 15,0 сП при 25 "С, або в'язкість може бути вище або нижче.

В іншому прикладі, рідка композиція антитіла може мати будь-яку придатну провідність для забезпечення терапевтичної ефективності, безпеки та зберігання. Наприклад, провідність рідкої композиції антитіла може мати значення від 0,1 мілісименс на сантиметр (мСм/см) до 15 мСм/см, від 0,1 мСм/см до 10 мСм/см, від 0,1 мСм/см до 5 мСм/см, від 0,1 мСм/см до 2 мСм/см або від 0,1 мСм/см до 1,5 мСм/см. В деяких варіантах реалізації, рідка композиція антитіла може мати провідність, рівну 0,19 мСм/см, 0,59 мСм/см, 1,09 мСм/см, 1,19 мСм/см, 1,29 мСм/см, 1,39 мСм/см, 1,49 мСм/см, 1,59 мСм/см, 1,69 мСм/см, 1,79 мСм/см, 1,89 мСм/см, 1,99 мСм/см, 2,09 мСм/см, 2,19 мСм/см, 2,29 мСм/см, 2,39 мСм/см, 2,49 мСм/см, 2,59 мСм/см, 2,69 мСм/см, 2,19 мСм/см, 2,89 мСм/см, 2,99 мСм/см, 3,09 мСм/см, 3,19 мСм/см, 3,29 мСм/см, 3,39 мСм/см, 3,49 мСм/см, 3,59 мСм/см, 3,69 мСм/см, 3,79 мСм/см, 3,89 мСм/см, 3,99 мСм/см, 4,09 мСм/см, 4,19 мСм/см, 4,29 мСм/см, 4,39 мСм/см, 4,49 мСм/см, 4,59 мСм/см, 4,69 мСм/см, 4,79 мСм/см, 4,89 мСм/см, 4,99 мСм/см, 5,09 мСм/см, 6,09 мСм/см, 6,59 мСм/см, 7,09 мСм/см, 7,59 мСм/см, 8,09 мСм/см, 8,59 мСм/см, 9,09 мСм/см, 9,59 мСм/см, 10,09 мСм/см, 10,59 мСм/см, 11,09 мСм/см, 11,59 мСм/см, 12,09 мСм/см, 12,59 мСм/см, 13,09 мСм/см, 13,59 мСм/см, 14,09 мСм/см, 14,59 мСм/см або 15,09 мСм/см або провідність може бути вище або нижче.

В іншому прикладі, рідка композиція антитіла може мати будь-яку придатну осмоляльність для забезпечення терапевтичної ефективності, безпеки та зберігання. Наприклад, осмоляльність рідкої композиції антитіла може мати значення від 50 міліосмоль на кілограм (мОсм/кг) до 5000 моОсм/кг, від 50 мОсм/кг до 2000 мосм/кг, від 50 мОсм/кг до 1000 мОсм/кг, від 50 мОсм/кг до 750 моОсм/кг або від 50 мОсм/кг до 500 мОсм/кг. В деяких варіантах реалізації, рідка композиція антитіла може мати осмоляльність, рівну 50 мОсм/кг, 60 мОсм/кг, 70 мосм/кг, 80 мОсм/кг, 90 мОсм/кг, 100 мОсм/кг 120 мОсм/кг, 140 мОсм/кг, 160 мОсм/кг, 180 мОсм/кг, 200 мОсм/кг, 220 мОсм/кг, 240 мОсм/кг, 260 мОсм/кг, 280 мОсм/кг, 300 мОсм/кг, 320 мОсм/кг, 340 мОсм/кг, 360 мОсм/кг, 380 мОсм/кг, 400 мОсм/кг, 420 мОсм/кг, 440 мОсм/кг, 460 мОсм/кг, 480 мОсм/кг, 500 мОсм/кг, 520 мОсм/кг, 540 мОсм/кг, 560 мОсм/кг, 580 мОсм/кг, 600 мОсм/кг, 620 мОсм/кг, 640 мОсм/кг, 660 мОсм/кг, 680 мОсм/кг, 700 мОсм/кг, 720 мОсм/кг, 740 мОсм/кг, 760 мОсм/кг, 780 мОсм/кг, 800 мОсм/кг, 820 мОсм/кг, 840 мОсм/кг, 860 мОсм/кг, 880 мОсм/кг, 900 мОсм/кг, 920 мОсм/кг, 940 мОсм/кг, 960 мОсм/кг, 980 мОсм/кг, 1000 моОсм/кг, 1050 моОсм/кг, 1100 мОсм/кг, 1150 мОсм/кг, 1200 моОсм/кг, 1250 мОсм/кг, 1300 мОсм/кг, 1350 мОсм/кг, 1400 мОсм/кг, 1450 мОсм/кг, 1500 мОсм/кг або осмоляльність може бути вище або нижче.

Ліпосоми, що містять антитіло, можуть бути одержані способами, відомими фахівцям, такими як описані в Ерзіеїп, еї аїЇ., Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 82:3688 (1985); Нулапо, еї аї., Ргос.

Май Асад. Осі. ОБА 77:4030 (1980); і патенти США МоМо 4485045 та 4544545. Ліпосоми зі збільшеним часом циркуляції розкриті в патенті США Мо 5013556. Особливо придатні ліпосоми можуть бути одержані методом обернено-фазового випарювання з ліпідною композицією, що містить фосфатидилхолін, холестерин та ПЕГ-дериватизований фосфатидилетаноламін (ПЕГ-

ФЕ). Ліпосоми екструдують через фільтри з визначеним розміром пор для одержання ліпосом бажаного діаметра.

Активні інгредієнти також можуть бути приміщені в мікрокапсули, одержані, наприклад, методами коацервації або міжфазовой полімеризації, наприклад, гідроксиметилцелюлозні або желатинові мікрокапсули та полі(метилметакрилатні) мікрокапсули, відповідно, в колоїдних системах доставки лікарських засобів (наприклад, ліпосоми, альбумінові мікросфери, мікроемульсії, наночастинки та нанокапсули) або в макроемульсіях. Такі методики розкриті в

Ветіпдюп, Те 5сіепсє апа Ргасіїсе ої Рнаптасу 201й Ед. Маск Рибіїзпіпу (2000).

Можуть бути одержані препарати з уповільненим вивільненням. Придатні приклади препаратів з уповільненим вивільненням включають напівпроникні матриці твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло, причому матриці є формованими виробами, наприклад, плівками, або мікрокапсулами. Приклади матриць з уповільненим вивільненням включають складні поліефіри, гідрогелі (наприклад, полі-(2-гідроксіетилметакрилат) або полі(вініловий спирт)), полілактиди (патент США Мо 3773919), співполімери І -глутамінової кислоти та 7-етилч-ї - глутамату, недеградуючий етилен-вінілацетат, деградуючі співполімери молочної кислоти- гліколевої кислоти, такі як ГОРЕОМ ОЕРОТ"М (мікросфери для ін'єкцій, що складаються зі співполімеру молочної кислоти-гліколевої кислоти та лейпроліду ацетату), сахарози ацетат ізобутират та полі-О-(-)-3-гідроксимасляна кислота.

Композиції для використання при іп мімо введенні звичайно повинні бути стерильними. Це легко забезпечується, наприклад, фільтрацією через мембрани для стерильної фільтрації.

Терапевтичні композиції антитіла звичайно поміщають в контейнер, що має порт для (610) стерильного доступу, наприклад, пакет з розчином для внутрішньовенного введення або флакон з пробкою, яку проколюють голкою для підшкірних ін'єкцій.

Композиції, згідно з даним винаходом, можуть мати вигляд дозованих лікарських форм, таких як таблетки, пілюлі, капсули, порошки, гранули, розчини або суспензії, або супозиторії для орального, парентерального або ректального введення, або введення шляхом інгаляції або інсуфляції. В деяких випадках, дозована лікарська форма може постачатися в попередньо наповненій ємності (наприклад, попередньо наповнений шприц), придатній для введення разової дози суб'єкту.

Для приготування твердих композицій, таких як таблетки, основний активний інгредієнт може бути змішаний з фармацевтичним носієм, наприклад, звичайними інгредієнтами для виготовлення таблеток, такими як кукурудзяний крохмаль, лактоза, сахароза, сорбіт, тальк, стеаринова кислота, стеарат магнію, дикальційфосфат або камеді, та інші фармацевтичні розріджувачі, наприклад, вода, до одержання твердої попередньо підготовленої (ргеїоптшаїйоп) композиції, що містить гомогену суміш сполуки за даним винаходом, або її нетоксичної фармацевтично прийнятної солі. Коли такі попередньо приготовлені композиції називаються гомогенними, це означає, що активний інгредієнт рівномірно диспергований в композиції, так щоб композиція могла бути легко розділена на дозовані лікарські форми однакової ефективності, такі як таблетки, пілюлі та капсули. Цю тверду попередньо приготовлену композицію потім ділять на дозовані лікарські форми описаного вище типу, що містять від 0,1 до близько 500 мг активного інгредієнта за даним винаходом. На таблетки або пілюлі з нової композиції може бути нанесене покриття, або вони можуть бути інакше скомбіновані для одержання лікарської форми, що забезпечує перевагу пролонгованої дії. Наприклад, таблетка або пілюля може містити внутрішній компонент дози та зовнішній компонент дози, причому останній має форму оболонки першого. Два компоненти можуть бути розділені ентеросолюбільним шаром, який повинен перешкоджати руйнуванню в шлунку та дозволяти внутрішньому компоненту проходити в інтактному вигляді в дванадцятипалу кишку або вивільнятися уповільнено. Різні матеріали можуть бути використані для таких ентеросолюбільних шарів або покриттів, такі матеріали включають низку полімерних кислот та суміші полімерних кислот з такими матеріалами, як шелак, цетиловий спирт та ацетат целюлози.

Придатні поверхнево-активні агенти включають, зокрема, неіїонні агенти, такі як поліоксіеєтиленсорбітани (наприклад, твин (Тм'єеп'"М) 20, 40, 60, 80 або 85) та інші сорбітани (наприклад, Зрап'Мм 20, 40, 60, 80 або 85). Композиції з поверхнево-активним агентом будуть зручно містити від 0,05 до 5 95 поверхнево-активного агента, і можуть мати його вміст від 0,1 до 2,5 95. Слід розуміти, що у разі необхідності можуть бути додані інші інгредієнти, наприклад, маніт або інші фармацевтично прийнятні носії.

Придатні емульсії можуть бути одержані з використанням комерційно доступних жирових емульсій, таких як інтраліпід (Іпігаїїріа"М), ліпосин (Пірозуп"М), інфонутрол (Іпгопиїго!"М), ліпофундин (Гіроїшипаїп"М) та ліпіфізан (Гірірпузап'"М). Активний інгредієнт може бути або розчинений в попередньо змішаній емульсійній композиції або, альтернативно, він може бути розчинений в одії (наприклад, соєвій олії, сафлоровій олії, бавовняній олії, кунжутній олії, кукурудзяній олії або мигдалевій олії), і емульсію одержують в результаті змішування з фосфоліпідом (наприклад, фосфоліпідами яйця, соєвими фосфоліпідами або соєвим лецитином) та водою. Слід розуміти, що можуть бути додані інші інгредієнти, наприклад, гліцерин або глюкоза, для регулювання тонічності емульсії. Придатні емульсії будуть типово містити до 20 95 олії, наприклад, від 5 до 20 95. Жирова емульсія може містити краплинки жиру (розміром) від 0,1 до 1,0 Ім, зокрема, від 0,1 до 0,5 Ім, та мати рН в діапазоні значень від 5,5 до 8,0.

Емульсійні композиції можуть бути, таким чином (Шо5е), одержані шляхом змішування антитіла з інтраліпідом (Іпігаїйрій"М3) або його компонентами (соєвою олією, яєчними фосфоліпідами, гліцерином та водою).

Композиції для інгаляції або інсуфляції включають розчини та суспензії в фармацевтично прийнятних водних або органічних розчинниках, або їх сумішах, та порошки. Рідкі або тверді композиції можуть містити придатні фармацевтично прийнятні ексципієнти, як вказано вище. В деяких варіантах реалізації, композиції вводять оральним або назальним дихальним шляхом для локальної або системної дії. Композиції в краще стерильних фармацевтично прийнятних розчинниках можуть бути розпилені з використанням газів. Розпилюванні розчини можна вдихати безпосередньо з розпилювального пристрою, або розпилювальний пристрій може бути приєднаний до лицевої маски, тенту або дихального апарата з переривчастим позитивним тиском. Композиції розчину, суспензії або порошку можуть бути введені, краще, орально або 10) назально, з пристроїв, що здійснюють доставку композиції відповідним чином.

В деяких варіантах реалізації, композиція, що містить антитіло (наприклад, моноклональне антитіло, яке модулює шлях СОКР, антагоністичне антитіло анти СОКР, моноклональне антагоністичне антитіло анти СОЕР), описане в даному документі, може бути приготовлена для будь-якого придатного шляху введення з кількістю антитіла в діапазоні значень від 0,1 мг до 3000 мг, від 1 мг до 1000 мг, від 100 до 1000 мг, або від 100 до 500 мг. В деяких випадках, композиція, що містить антитіло (наприклад, моноклональне антитіло, яке модулює шлях

СОР, антагоністичне антитіло анти СОКР, моноклональне антагоністичне антитіло анти

СОКР), описане в даному документі, може містити кількість антитіла, що становить, щонайбільше, або щонайменше 0,1 мг, 1 мг, 100 мг, 1 мг, 10 мг, 25 мг, 50 мг, 75 мг, 100 мг, 125 мг, 150 мг, 175 мг, 200 мг, 225 мг, 250 мг, 275 мг, 300 мг, 325 мг, 350 мг, 375 мг, 400 мг, 450 мг, 475 мг, 500 мг, 525 мг, 550 мг, 575 мг, 600 мг, 625 мг, 650 мг, 675 мг, 700 мг, 725 мг, 750 мг, 775 мг, 800 мг, 825 мг, 850 мг, 875 мг, 900 мг, 925 мг, 950 мг, 975 мг, 1000 мг, 1100 мг, 1200 мг, 1300 мг, 1400 мг, 1500 мг, 1600 мг, 1700 мг, 1800 мг, 1900 мг, 2000 мг або 3000 мг.

В деяких варіантах реалізації, рідка композиція що містить антитіло (наприклад, моноклональне антитіло, яке модулює шлях СОКР, антагоністичне антитіло анти СОКР, моноклональне антагоністичне антитіло анти СОКР), описане в даному документі, може бути приготовлена для будь-якого придатного шляху введення з концентрацією антитіла в діапазоні значень від 0,1 до 500 мг/мл, від 0,1 до 375 мг/мл, від 0,1 до 250 мг/мл, від 0,1 до 175 мг/мл, від 0,1 до 100 мг/мл, від 1 мг/мл до 500 мг/мл, від 1 мг/мл до 375 мг/мл, від 1 мг/мл до 300 мг/мл, від 1 мг/мл до 250 мг/мл, від 1 мг/мл до 200 мг/мл, від 1 мг/мл до 150 мг/мл, від 1 мг/мл до 100 мг/мл, від 10 мг/ мл до 500 мг/мл, від 10 мг/мл до 375 мг/мл, від 10 мг/мл до 250 мг/мл, від 10 мг/мл до 150 мг/мл, від 10 мг/мл до 100 мг/мл, від 100 мг/мл до 500 мг/мл, від 100 мг/мл до 450 мг/мл, від 100 мг/мл до 400 мг/мл, від 100 мг/мл до 350 мг/мл, від 100 мг/мл до 300 мг/мл, від 100 мг/мл до 250 мг/мл, від 100 мг/мл до 200 мг/мл або від 100 мг/мл до 150 мг/мл. В деяких варіантах реалізації, рідка композиція може містити антитіло, описане в даному документі в концентрації, що складає, щонайбільше, щонайменше, або менш ніж 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 15 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 або 500 мг/мл.

Композиція антитіла може містити один або декілька компонентів, включаючи антитіло та інші речовини, описані будь-де в даному документі. Антитіло та інші компоненти можуть бути присутніми в будь-якій придатній кількості та/або будь-якій придатній концентрації, для забезпечення терапевтичної ефективності антитіла, безпеки та зберігання. В одному прикладі, композиція антитіла може бути розчином, що містить 51,4 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла

С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях

СОКР), 20 мМ гістидину, 0,1 мг/мл метіоніну, 84 мг/мл трегалози дигідрату, 0,05 мг/мл динатрію

ЕДТА дигідрату, та 0,2 мг/мл полісорбату 80.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 200 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 15 мМ аргініну, 78 мг/мл сахарози, 0,3 мг/мл ЕДТА, та 0,1 мг/мл полісорбату 80.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 175 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 20 мМ гліцину, 88 мг/мл трегалози дигідрату, 0,015 мг/мл ЕДТА та 0,25 мг/мл полісорбату 80.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 225 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОРБР), 23 мМ аспарагіну, 84 мг/мл сорбіту, 0,1 мг/мл ЕДТА та 0,15 мг/мл полісорбату 60.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 150 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 17 мМ аспарагіну, 74 мг/мл маніту, 0,025 мг/мл ЕДТА та 0,2 мг/мл полісорбату 80.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 100 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 16 мМ аргініну, 87 мг/мл маніту, 0,025 мг/мл ЕДТА та 0,15 мг/мл полісорбату 20.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 250 мг/мл антитіла (наприклад, 10) антитіла С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 25 мМ гістидину, 74 мг/мл маніту, 0,025 мг/мл ЕДТА та 0,25 мг/мл полісорбату 20.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 50 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла

С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях

СОР), 19 мМ аргініну, 84 мг/мл сахарози, 0,05 мг/мл ЕДТА та 0,3 мг/мл полісорбату 80.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 125 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 22 мМ гліцину, 79 мг/мл трегалози дигідрату, 0,15 мг/мл ЕДТА та 0,15 мг/мл полісорбату 80.

В іншому прикладі, композиція антитіла може бути розчином, що містить 175 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла 1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 20 мМ гістидину, 0,1 мг/мл метіоніну, 84 мг/мл трегалози дигідрату, 0,05 мг/мл динатрію ЕДТА дигідрату, та 0,2 мг/мл полісорбату 80.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 200 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 30 мМ аргініну, 78 мг/мл сахарози, 0,3 мг/мл ЕДТА, та 0,1 мг/мл полісорбату 80.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 175 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 20 мМ гліцину, 88 мг/мл трегалози дигідрату, 0,015 мг/мл ЕДТА та 0,15 мг/мл полісорбату 80.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 150 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла 1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 20 мМ гістидину, 84 мг/мл сахарози, 0,05 мг/мл ЕДТА та 0,2 мг/мл полісорбату 80.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 225 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 23 мМ гістидину, 84 мг/мл сорбіту, 0,1 мг/мл ЕДТА та 0,15 мг/мл полісорбату 60.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 150 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 17 мМ аспарагіну, 74 мг/мл маніту, 0,3 мг/мл ЕДТА та 0,2 мг/мл полісорбату 80.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 100 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 16 мМ аргініну, 87 мг/мл маніту, 0,025 мг/мл ЕДТА та 0,25 мг/мл полісорбату 20.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 250 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 25 мМ гістидину, 89 мг/мл маніту, 0,025 мг/мл ЕДТА та 0,25 мг/мл полісорбату 20.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 125 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 29 мМ аргініну, 84 мг/мл сахарози, 0,05 мг/мл ЕДТА та 0,3 мг/мл полісорбату 80.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 150 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 25 мМ аспарагіну, 84 мг/мл маніту, 0,05 мг/мл ЕДТА та 0,2 мг/мл полісорбату 80.

В іншому прикладі, композиція антитіла може містити 145 мг/мл антитіла (наприклад, антитіла С1, іншого антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР), 22 мМ гістидину, 72 мг/мл трегалози дигідрату, 0,05 мг/мл ЕДТА та 0,1 мг/мл полісорбату 80.

Антитіло, описане в даному документі, може бути введено з використанням будь-якого придатного способу, в тому числі шляхом ін'єкції (наприклад, інтраперитонеально, внутрішньовенно, підшкірно, внутрішньом'язово і т.д.). Антитіла також можуть бути введені шляхом інгаляції, як описано в даному документі. В деяких випадках, антитіло може бути введено назально з інгаляцією або без неї. Загалом, для введення антитіла, описаного в даному документі, початковий варіант дозування може складати близько 2 мг/кг. В цілях даного 10) винаходу, типова добова доза може становити близько від будь-якого значення з від З мкг/кг до

30 мкг/кг та до від 300 мкг/кг до З мг/кг, до від 30 мг/кг до 100 мг/кг або більше, в залежності від вищезгаданих факторів. Наприклад, може бути використана доза, що дорівнює близько 1 мг/кг, близько 2,5 мг/кг, близько 5 мг/кг, близько 10 мг/кг, і близько 25 мг/кг. Для повторного введення протягом декількох днів або довше, в залежності від стану, лікування проводять до досягнення бажаного пригнічення симптомів або до досягнення достатніх терапевтичних рівнів, наприклад, для зменшення болю. Типовий приклад схеми приймання включає введення початкової дози, рівної близько 8,5 мг/кг, з подальшим введенням щотижнево підтримувальної дози, рівної близько 2,8 мг/кг антитіла, або з подальшим введенням підтримувальної дози, рівної близько 2,8 мг/кг раз на два тижня. Інший типовий приклад схеми приймання включає введення дози 100 мг, 125 мг, 150 мг, 200 мг, 225 мг, 250 мг, 275 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 450 мг, 500 мг, 550 мг, 600 мг, 675 мг або 900 мг суб'єкту раз на місяць підшкірно. Інший типовий приклад схеми приймання включає введення початкової дози 675 мг підшкірно, з подальшою щомісячною дозою 225 мг антитіла підшкірно. Однак, можуть бути використані інші схеми приймання, в залежності від моделі фармакокінетичного розпаду, якої хоче досягти лікар-практик. Наприклад, в деяких варіантах реалізації, передбачається введення доз один-чотири рази на тиждень.

Прогрес цієї терапії легко контролюється звичайними способами та аналізами. Схема приймання (включаючи використовуваний антагоніст(и) СОКР) може змінюватися з часом.

В деяких варіантах реалізації, доза або кількість антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), що описано в даному документі та вводиться суб'єкту, може мати значення в діапазоні від 0,1 мкг до 3000 мг, від 1 мг до 1000 мг, від 100 до 1000 мг, від 100 до 500 мг, від 0,1 мг до 5000 мг, від 1 мг до 4000 мг, від 250 мг до 1000 мг, від 500 мг до 1000 мг, від 100 мг до 900 мг, від 400 мг до 900 мг, від 10 мг до 3000 мг, від 10 мг до 2000 мг, від 100 мг до 2000 мг, від 150 мг до 2000 мг, від 200 мг до 2000 мг, від 250 мг до 2000 мг, від 300 мг до 2000 мг, від 350 мг до 2000 мг, від 400 мг до 2000 мг, від 450 мг до 2000 мг, від 500 мг до 2000 мг, від 550 мг до 2000 мг, від 600 мг до 2000 мг, від 650 мг до 2000 мг, від 700 мг до 2000 мг, від 750 мг до 2000 мг, від 800 мг до 2000 мг, від 850 мг до 2000 мг, від 900 мг до 2000 мг, від 950 мг до 2000 мг, або від 1000 мг до 2000 мг. В деяких варіантах реалізації, доза або кількість антитіла, що описані в даному документі та вводяться суб'єкту, можуть становити, можуть становити щонайбільше, можуть становити менш ніж, або можуть становити щонайменше 0,1 мкг, 1 мкг, 100 мкг, 1 мг, 10 мг, 25 мг, 50 мг, 75 мг, 100 мг, 125 мг, 150 мг, 175 мг, 200 мг, 225 мг, 250 мг, 275 мг, 300 мг, 325 мг, 350 мг, 375 мг, 400 мг, 450 мг, 475 мг, 500 мг, 525 мг, 550 мг, 575 мг, 600 мг, 625 мг, 650 мг, 675 мг, 700 мг, 725 мг, 750 мг, 775 мг, 800 мг, 825 мг, 850 мг, 875 мг, 900 мг, 925 мг, 950 мг, 975 мг, 1000 мг, 1100 мг, 1200 мг, 1300 мг, 1400 мг, 1500 мг, 1600 мг, 1700 мг, 1800 мг, 1900 мг, 2000 мг або 3000 мг. В деяких варіантах реалізації, кількість має значення в діапазоні від 100 до 2000 мг.

В деяких варіантах реалізації, доза або кількість антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), що описано в даному документі та вводиться суб'єкту, можуть мати значення в діапазоні від 0,1 до 500, від 0,1 до 100, від 0,1 до 50, від 0,1 до 20, від 0,1 до 10, від 1 до 10, від 1 до 7, 1 до 5 або від 0,1 до З мг/кг ваги тіла. В деяких варіантах реалізації, доза або кількість антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОРЕР, антагоністичного антитіла анти СОЕР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОЕР), що описано в даному документі та вводиться суб'єкту, можуть становити, можуть становити щонайбільше, можуть становити менш ніж, або можуть становити щонайменше 0,1, 02,0,3,0,4,0,5,0,6,0,7,0,8,0,9,1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5,6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, З6, 37, 38, 39, 40, А1, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, АВ, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 або 500 мг/кг ваги тіла.

В деяких варіантах реалізації, частота, з якою доза або кількість антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР) описаного в даному документі, вводяться суб'єкту, можуть змінюватися. В деяких варіантах реалізації, разова доза антитіла може бути надана суб'єкту під час проведення терапії. В деяких варіантах реалізації, частота, з якою доза або кількість антитіла вводяться суб'єкту, є постійною (наприклад, вводиться раз на місяць). В деяких варіантах реалізації, частота, з якою доза або кількість антитіла, описані в даному документі, вводяться суб'єкту, є змінною (наприклад, початкова доза з наступною дозою (610) через місяць, з подальшими додатковими дозами через три місяці та сім місяців). В деяких ко)

варіантах реалізації, частота, з якою антитіло вводиться суб'єкту, становить, становить щонайменше, становить менш ніж, або становить щонайбільше один, два, три, чотири, п'ять або шість разів на день. В деяких варіантах реалізації, частота, з якою антитіло (наприклад, моноклональне антитіло, яке модулює шлях СОКР, антагоністичне антитіло анти СОБКР, моноклональне антагоністичне антитіло анти СОКР) вводиться суб'єкту, становить, становить щонайменше, становить менш ніж, або становить щонайбільше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість дозу (доз) на день.

В деяких варіантах реалізації, частота, з якою доза або кількість антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), описаного в даному документі, вводяться суб'єкту, становить, становить щонайменше, становить менш ніж, або становить щонайбільше один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять, вісімнадцять, дев'ятнадцять або двадцять разів на кожні один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять, вісімнадцять, дев'ятнадцять, двадцять, двадцять один, двадцять два, двадцять три, двадцять чотири, двадцять п'ять, двадцять шість, двадцять сім, двадцять вісім, двадцять дев'ять, тридцять, тридцять один, тридцять два, тридцять три, тридцять чотири, тридцять птт'ять, тридцять шість, тридцять сім, тридцять вісім, тридцять дев'ять, сорок, сорок один, сорок два, сорок три, сорок чотири, сорок п'ять, сорок шість, сорок сім, сорок вісім, сорок дев'ять, п'ятдесят, п'ятдесят п'ять, шістдесят, шістдесят п'ять, сімдесят, сімдесят п'ять, вісімдесят, вісімдесят п'ять, дев'яносто, дев'яносто п'ять, сто, сто двадцять п'ять, сто п'ятдесят, сто вісімдесят або двісті днів.

В деяких варіантах реалізації, частота, з якою доза або кількість антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), описаного в даному документі, вводяться суб'єкту, становить, становить щонайменше, становить менш ніж, або становить щонайбільше один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять, вісімнадцять, дев'ятнадцять або двадцять разів на кожні один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять, вісімнадцять, дев'ятнадцять, двадцять, двадцять один, двадцять два, двадцять три, двадцять чотири, двадцять п'ять, двадцять шість, двадцять сім, двадцять вісім, двадцять дев'ять, тридцять, тридцять один, тридцять два, тридцять три, тридцять чотири, тридцять птт'ять, тридцять шість, тридцять сім, тридцять вісім, тридцять дев'ять, сорок, сорок один, сорок два, сорок три, сорок чотири, сорок п'ять, сорок шість, сорок сім, сорок вісім, сорок дев'ять, п'ятдесят, п'ятдесят п'ять, шістдесят, шістдесят п'ять, сімдесят, сімдесят п'ять, вісімдесят, вісімдесят п'ять, дев'яносто, дев'яносто п'ять, або сто тижнів. В деяких варіантах реалізації, частота, з якою антитіло (наприклад, моноклональне антитіло, яке модулює шлях СОБКР, антагоністичне антитіло анти СОКР, моноклональне антагоністичне антитіло анти СОКР), описане в даному документі, вводяться суб'єкту, становить менш ніж одну, дві, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, або п'ятнадцять доз на тиждень.

В деяких варіантах реалізації, частота, з якою доза або кількість антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОРР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОСКР) вводяться суб'єкту, становить, становить щонайменше, становить менш ніж, або становить щонайбільше один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять, вісімнадцять, дев'ятнадцять або двадцять разів на кожний місяць, кожні два місяці, кожні три місяці, кожні чотири місяці, кожні п'ять місяців, кожні шість місяців, кожні сім місяців, кожні вісім місяців, кожні дев'ять місяців, кожні десять місяців, кожні одинадцять місяців, кожні дванадцять місяців, кожні тринадцять місяців, кожні чотирнадцять місяців, кожні п'ятнадцять місяців, кожні шістнадцять місяців, кожні сімнадцять місяців, або кожні вісімнадцять місяців. В деяких варіантах реалізації, частота, з якою антитіло (наприклад, моноклональне антитіло, яке модулює шлях СОЕКР, антагоністичне антитіло анти СОКР, моноклональне антагоністичне антитіло анти СОКР), описане в даному документі, вводяться суб'єкту, становить менш ніж один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, або п'ятнадцять доз на місяць. В деяких варіантах реалізації, доза або кількість антитіла може бути введена (610) (наприклад, підшкірно або внутрішньовенно) суб'єкту один раз, два рази, три рази, чотири рази,

п'ять разів, шість разів, сім разів, вісім разів, дев'ять разів, десять разів або більше на місяць.

В деяких варіантах реалізації, антитіло в дозі або кількості 50 мг, 100 мг, 150 мг, 200 мг, 250 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 450 мг, 500 мг, 550 мг, 600 мг, 650 мг, 700 мг, 750 мг, 800 мг, 850 мг, 900 мг, 950 мг, 1000 мг, 1050 мг, 1100 мг, 1150 мг, 1200 мг, 1250 мг, 1300 мг, 1350 мг, 1400 мг, 1450 мг, 1500 мг, 1550 мг, 1600 мг, 1650 мг, 1700 мг, 1750 мг, 1800 мг, 1850 мг, 1900 мг, 1950 мг, 2000 мг, 2050 мг, 2100 мг, 2150 мг, 2200 мг, 2250 мг, 2300 мг, 2350 мг, 2400 мг, 2450 мг, 2500 мг, 2550 мг, 2600 мг, 2650 мг, 2700 мг, 2750 мг, 2800 мг, 2850 мг, 2900 мг, 2950 мг, 3000 мг або більше може бути введено (наприклад, підшкірно або внутрішньовенно) суб'єкту раз на місяць.

В деяких варіантах реалізації, антитіло в дозі або кількості від 0,1 мг до 5000 мг, від 1 мг до 4000 мг, від 10 мг до 3000 мг, від 10 мг до 2000 мг, від 100 мг до 2000 мг, від 150 мг до 2000 мг, від 200 мг до 2000 мг, від 250 мг до 2000 мг, від 300 мг до 2000 мг, від 350 мг до 2000 мг, від 400 мг до 2000 мг, від 450 мг до 2000 мг, від 500 мг до 2000 мг, від 550 мг до 2000 мг, від 600 мг до 2000 мг, від 650 мг до 2000 мг, від 700 мг до 2000 мг, від 750 мг до 2000 мг, від 800 мг до 2000 мг, від 850 мг до 2000 мг, від 900 мг до 2000 мг, від 950 мг до 2000 мг, або від 1000 мг до 2000 мг, може бути введено (наприклад, підшкірно або внутрішньовенно) суб'єкту раз на місяць. В деяких варіантах реалізації, 1000-2000 мг антитіла вводять раз на місяць.

В деяких варіантах реалізації, антитіло в дозі або кількості 50 мг, 100 мг 150 мг, 200 мг, 250 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 450 мг, 500 мг, 550 мг, 600 мг, 650 мг, 700 мг, 750 мг, 800 мг, 850 мг, 900 мг, 950 мг, 1000 мг, 1050 мг, 1100 мг, 1150 мг, 1200 мг, 1250 мг, 1300 мг, 1350 мг, 1400 мг, 1450 мг, 1500 мг, 1550 мг, 1600 мг, 1650 мг, 1700 мг, 1750 мг, 1800 мг, 1850 мг, 1900 мг, 1950 мг, 2000 мг, 2050 мг, 2100 мг, 2150 мг, 2200 мг, 2250 мг, 2300 мг, 2350 мг, 2400 мг, 2450 мг, 2500 мг, 2550 мг, 2600 мг, 2650 мг, 2700 мг, 2750 мг, 2800 мг, 2850 мг, 2900 мг, 2950 мг, 3000 мг, або більше може вводитися (наприклад, підшкірно або внутрішньовенно) суб'єкту раз на три місяці.

В деяких варіантах реалізації, антитіло в дозі або кількості від 0,1 мг до 5000 мг, від 1 мг до 4000 мг, від 10 мг до 3000 мг, від 10 мг до 2000 мг, від 100 мг до 2000 мг, від 150 мг до 2000 мг, від 200 мг до 2000 мг, від 250 мг до 2000 мг, від 300 мг до 2000 мг, від 350 мг до 2000 мг, від 400 мг до 2000 мг, від 450 мг до 2000 мг, від 500 мг до 2000 мг, від 550 мг до 2000 мг, від 600 мг до 2000 мг, від 650 мг до 2000 мг, від 700 мг до 2000 мг, від 750 мг до 2000 мг, від 800 мг до 2000 мг, від 850 мг до 2000 мг, від 900 мг до 2000 мг, від 950 мг до 2000 мг, або від 1000 мг до 2000 мг може вводитися (наприклад, підшкірно або внутрішньовенно) суб'єкту раз на три місяці. В деяких варіантах реалізації, від 450 мг до 2000 мг вводять один раз на три місяці або менше.

В деяких варіантах реалізації, антитіло в дозі або кількості 50 мг, 100 мг 150 мг, 200 мг, 250 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 450 мг, 500 мг, 550 мг, 600 мг, 650 мг, 700 мг, 750 мг, 800 мг, 850 мг, 900 мг, 950 мг, 1000 мг, 1050 мг, 1100 мг, 1150 мг, 1200 мг, 1250 мг, 1300 мг, 1350 мг, 1400 мг, 1450 мг, 1500 мг, 1550 мг, 1600 мг, 1650 мг, 1700 мг, 1750 мг, 1800 мг, 1850 мг, 1900 мг, 1950 мг, 2000 мг, 2050 мг, 2100 мг, 2150 мг, 2200 мг, 2250 мг, 2300 мг, 2350 мг, 2400 мг, 2450 мг, 2500 мг, 2550 мг, 2600 мг, 2650 мг, 2700 мг, 2750 мг, 2800 мг, 2850 мг, 2900 мг, 2950 мг, 3000 мг, або більше може вводитися (наприклад, підшкірно або внутрішньовенно) суб'єкту через кожні шість місяців. В деяких варіантах реалізації, антитіло в дозі або кількості від 0,1 мг до 5000 мг, від 1 мг до 4000 мг, від 10 мг до 3000 мг, від 10 мг до 2000 мг, від 100 мг до 2000 мг, від 150 мг до 2000 мг, від 200 мг до 2000 мг, від 250 мг до 2000 мг, від 300 мг до 2000 мг, від 350 мг до 2000 мг, від 400 мг до 2000 мг, від 450 мг до 2000 мг, від 500 мг до 2000 мг, від 550 мг до 2000 мг, від 600 мг до 2000 мг, від 650 мг до 2000 мг, від 700 мг до 2000 мг, від 750 мг до 2000 мг, від 800 мг до 2000 мг, від 850 мг до 2000 мг, від 900 мг до 2000 мг, від 950 мг до 2000 мг, або від 1000 мг до 2000 мг може вводитися (наприклад, підшкірно або внутрішньовенно) суб'єкту через кожні шість місяців. В деяких варіантах реалізації, від 450 мг до 2000 мг вводять один разів на кожні шість місяців або менше.

В деяких варіантах реалізації, частота, з якою доза або кількість антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти ССР) вводяться суб'єкту (наприклад, підшкірно або внутрішньовенно), становить, становить щонайменше, становить менш ніж, або становить щонайбільше один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять, вісімнадцять, дев'ятнадцять або двадцять разів на кожний квартал. Слід розуміти, що "квартал" може стосуватися періоду часу, рівного чверті року, або може також стосуватися календарного кварталу, такого як період часу з 1 січня по 31 березня, з 1 квітня по 30 червня, з 1 липня по 30 вересня або з 1 жовтня по 31 грудня. В деяких випадках, "квартал" може стосуватися періоду часу, рівного приблизно трьом місяцям.

В деяких варіантах реалізації, антитіло в дозі або кількості 50 мг, 100 мг 150 мг, 200 мг, 250 10) мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 450 мг, 500 мг, 550 мг, 600 мг, 650 мг, 700 мг, 750 мг, 800 мг, 850 мг,

900 мг, 950 мг, 1000 мг, 1050 мг, 1100 мг, 1150 мг, 1200 мг, 1250 мг, 1300 мг, 1350 мг, 1400 мг, 1450 мг, 1500 мг, 1550 мг, 1600 мг, 1650 мг, 1700 мг, 1750 мг, 1800 мг, 1850 мг, 1900 мг, 1950 мг, 2000 мг, 2050 мг, 2100 мг, 2150 мг, 2200 мг, 2250 мг, 2300 мг, 2350 мг, 2400 мг, 2450 мг, 2500 мг, 2550 мг, 2600 мг, 2650 мг, 2700 мг, 2750 мг, 2800 мг, 2850 мг, 2900 мг, 2950 мг, 3000 мг, або більше може вводитися (наприклад, підшкірно або внутрішньовенно) суб'єкту кожний квартал. В деяких варіантах реалізації, антитіло в дозі або кількості від 0,1 мг до 5000 мг, від 1 мг до 4000 мг, від 10 мг до 3000 мг, від 10 мг до 2000 мг, від 100 мг до 2000 мг, від 150 мг до 2000 мг, від 200 мг до 2000 мг, від 250 мг до 2000 мг, від 300 мг до 2000 мг, від 350 мг до 2000 мг, від 400 мг до 2000 мг, від 450 мг до 2000 мг, від 500 мг до 2000 мг, від 550 мг до 2000 мг, від 600 мг до 2000 мг, від 650 мг до 2000 мг, від 700 мг до 2000 мг, від 750 мг до 2000 мг, від 800 мг до 2000 мг, від 850 мг до 2000 мг, від 900 мг до 2000 мг, від 950 мг до 2000 мг, або від 1000 мг до 2000 мг може вводитися (наприклад, підшкірно або внутрішньовенно) суб'єкту кожний квартал.

В деяких варіантах реалізації, частота, з якою вводиться доза або кількість антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), становить, становить щонайменше, становить менш ніж, або становить щонайбільше один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять, вісімнадцять, дев'ятнадцять або двадцять разів кожного року, кожні два роки, кожні три роки, кожні чотири роки, або кожні п'ять років. В деяких варіантах реалізації, частота, з якою антитіло (наприклад, моноклональне антитіло, яке модулює шлях

СОР, антагоністичне антитіло анти СОКР, моноклональне антагоністичне антитіло анти

ССРР) вводиться суб'єкту, становить менш ніж одна, дві, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять, вісімнадцять, дев'ятнадцять, двадцять, двадцять одна, двадцять дві, двадцять три, двадцять чотири або двадцять п'ять доз на рік.

В деяких варіантах реалізації, антитіло в дозі або кількості 50 мг, 100 мг 150 мг, 200 мг, 250 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 450 мг, 500 мг, 550 мг, 600 мг, 650 мг, 700 мг, 750 мг, 800 мг, 850 мг, 900 мг, 950 мг, 1000 мг, 1050 мг, 1100 мг, 1150 мг, 1200 мг, 1250 мг, 1300 мг, 1350 мг, 1400 мг, 1450 мг, 1500 мг, 1550 мг, 1600 мг, 1650 мг, 1700 мг, 1750 мг, 1800 мг, 1850 мг, 1900 мг, 1950 мг, 2000 мг, 2050 мг, 2100 мг, 2150 мг, 2200 мг, 2250 мг, 2300 мг, 2350 мг, 2400 мг, 2450 мг, 2500 мг, 2550 мг, 2600 мг, 2650 мг, 2700 мг, 2750 мг, 2800 мг, 2850 мг, 2900 мг, 2950 мг, 3000 мг, або більше може бути введено суб'єкту один раз на рік. В деяких варіантах реалізації, антитіло в дозі або кількості від 0,1 мг до 5000 мг, від 1 мг до 4000 мг, від 10 мг до 3000 мг, від 10 мг до 2000 мг, від 100 мг до 2000 мг, від 150 мг до 2000 мг, від 200 мг до 2000 мг, від 250 мг до 2000 мг, від З00 мг до 2000 мг, від 350 мг до 2000 мг, від 400 мг до 2000 мг, від 450 мг до 2000 мг, від 500 мг до 2000 мг, від 550 мг до 2000 мг, від 600 мг до 2000 мг, від 650 мг до 2000 мг, від 700 мг до 2000 мг, від 750 мг до 2000 мг, від 800 мг до 2000 мг, від 850 мг до 2000 мг, від 900 мг до 2000 мг, від 950 мг до 2000 мг, або від 1000 мг до 2000 мг може бути введено суб'єкту один раз на рік. В деяких варіантах реалізації, від 450 мг до 2000 мг вводять один раз на рік або менше.

В деяких варіантах реалізації, спосіб може включати введення антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти ССЕР), описаного в даному документі суб'єкту протягом багатьох днів. Два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім або більше днів з багатьох днів можуть бути розділені більш ніж 1, 2, 3,4,5,6, 7,8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 або більше днями. В деяких варіантах реалізації, два з багатьох днів розділені інтервалом у більш ніж один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять, вісімнадцять, дев'ятнадцять, двадцять, двадцять один, двадцять два, двадцять три, двадцять чотири, двадцять п'ять, двадцять шість, двадцять сім, двадцять вісім, двадцять дев'ять, тридцять або більше днів. Крім того, в деяких варіантах реалізації, кількість антитіла, що вводиться в перший день з багатьох днів, може відрізнятися (наприклад, бути більше або менше) від кількості антитіла, що вводиться в другий день.

В деяких варіантах реалізації, початкова доза (наприклад, ударна доза) антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), описаного в даному документі, може бути введена суб'єкту, з подальшим введенням однієї або декількох додаткових доз з бажаними інтервалами. В деяких варіантах реалізації, початкова доза та одна або декілька додаткових доз є однаковими. В деяких варіантах реалізації, одна або декілька 10) додаткових доз відрізняються від початкової дози. В деяких варіантах реалізації, частота, з якою вводяться одна або декілька додаткових доз, є постійною (наприклад, кожний місяць). В деяких варіантах реалізації, частота, з якою вводяться одна або декілька додаткових доз, змінюється (наприклад, одна додаткова доза вводиться через один місяць після початкової дози, з подальшим введенням іншої додаткової дози через три місяці після початкової дози).

Може використовуватися будь-яка бажана та/або терапевтична схема введення початкової ударної дози, додаткових доз, та частота додаткових доз (наприклад, включаючи описані в даному документі). Типовий приклад схеми лікування включає початкову ударну дозу 675 мг антагоністичного антитіла анти СОКР, що вводиться підшкірно, 3 подальшими підтримувальними дозами 225 мг антитіла, що вводяться підшкірно з інтервалами в один місяць.

В деяких варіантах реалізації, суб'єккгу може бути введена початкова доза антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), рівна 0,1 мкг, 1 мкг, 100 мкг, 1 мг, 10 мг, 25 мг, 50 мг, 75 мг, 100 мг, 125 мг, 150 мг, 175 мг, 200 мг, 225 мг, 250 мг, 275 мг, 300 мг, 325 мг, 350 мг, 375 мг, 400 мг, 450 мг, 475 мг, 500 мг, 525 мг, 550 мг, 575 мг, 600 мг, 625 мг, 650 мг, 675 мг, 700 мг, 725 мг, 750 мг, 775 мг, 800 мг, 825 мг, 850 мг, 875 мг, 900 мг, 925 мг, 950 мг, 975 мг, 1000 мг, 1500 мг, 2000 мг, або 3000 мг з подальшими одной або декількома додатковими дозами антитіла, рівними 0,1 мкг, 1 мкг, 100 мкг, 1 мг, 10 мг, 25 мг, 50 мг, 75 мг, 100 мг, 125 мг, 150 мг, 175 мг, 200 мг, 225 мг, 250 мг, 275 мг, 300 мг, 325 мг, 350 мг, 375 мг, 400 мг, 450 мг, 475 мг, 500 мг, 525 мг, 550 мг, 575 мг, 600 мг, 625 мг, 650 мг, 675 мг, 700 мг, 725 мг, 750 мг, 775 мг, 800 мг, 825 мг, 850 мг, 875 мг, 900 мг, 925 мг, 950 мг, 975 мг, 1000 мг, 1500 мг, 2000 мг, або 3000 мг.

В деяких варіантах реалізації, доза або кількість антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОЕР), описаного в даному документі, може бути розділена на піддози та введена у вигляді множини піддоз, в залежності, наприклад, від шляхів введення та/або конкретної композиції, що вводиться. Наприклад, у випадках, коли доза вводиться підшкірно, підшкірна доза може бути розділена на множину піддоз, і кожна піддоза вводиться в різні місця, щоб уникнути, наприклад, великої разової підшкірної ін'єкції в одно місце.

Наприклад, підшкірна доза 900 мг може бути розділена на чотири піддози по 225 мг кожна, і кожна доза 225 мг вводиться в різні місця, що допоможе мінімізувати об'єм ін'єкції в кожне місце. Піддози можуть бути поділені порівну (наприклад, на 4 рівні піддози) або можуть бути нерівними (наприклад, на 4 піддози, дві з яких удвічі більше інших піддоз3).

В деяких варіантах реалізації, число доз антитіла, що вводяться суб'єкту за курс лікування, може змінюватися в залежності від, наприклад, досягнення зниженої частоти вазомоторного симптому та/або головного болю у суб'єкта. В деяких варіантах реалізації, вазомоторний симптом асоційований з формою головного болю (наприклад, мігрені, хронічної мігрені, епізодичної мігрені, іншого типу головного болю і т.д.). Наприклад, число доз, що вводяться за курс лікування, може становити, може становити щонайменше, або може становити щонайбільше 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, А1, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, 48, 49 або 50. В деяких випадках (наприклад, у випадках, коли суб'єкт має хронічну мігрень), лікування може проводитися без обмежень за часом. В деяких випадках, лікування може бути невідкладним, так щоб суб'єкту для лікування вводили щонайбільше 1, 2, 3, 4, 5 або 6 доз.

В деяких варіантах реалізації, доза (або піддоза) або кількість антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОЕКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), описаного в даному документі, може бути складена у вигляді рідкої композиції та введена (наприклад, шляхом підшкірної ін'єкції, шляхом внутрішньовенної ін'єкції) суб'єкту. В таких випадках, об'єм рідкої композиції, що містить антитіло, може змінюватися в залежності від, наприклад, концентрації антитіла в рідкій композиції, бажаної дози антитіла, та/або використовуваного шляху введення. Наприклад, об'єм рідкої композиції, що містить антитіло, описане в даному документі, та введеної (наприклад, шляхом ін'єкції, такої як, наприклад, підшкірна ін'єкція або внутрішньовенна ін'єкція) суб'єкту, може мати значення від 0,001 мл до 10,0 мл, від 0,01 мл до 5,0 мл, від 0,1 мл до 5 мл, від 0,1 мл до З мл, від 0,5 мл до 2,5 мл або від 1 мл до 2,5 мл. Наприклад, об'єм рідкої композиції, що містить антитіло (наприклад, моноклональне антитіло, яке модулює шлях СОКР, антагоністичне антитіло анти СОКР, моноклональне антагоністичне антитіло анти СОКР), описане в даному документі, та введеної (наприклад, шляхом ін'єкції, такої як, наприклад, підшкірна ін'єкція або внутрішньовенна ін'єкція) суб'єкту, може становити, може становити щонайменше, може 6о0 становити менш ніж, або може становити щонайбільше 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05,

0,06, 0,07,0,08,0,09,0,10,0,2,0,3,0,4,0,5,0,6,0,7,0,8,0,951,1,1,1,2,1,3,1,4,1,5,1,6, 1,7, 1,8, 1,р952,0,2,1,22,2,3,2,4,2,5,2,6,2,7,2,8,2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 41, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,5,6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 або 10,0 мл.

В деяких варіантах реалізації, доза (або піддоза) або кількість антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОЕКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), описаного в даному документі, може постачатися в попередньо наповнених ємностях, придатних для введення антитіла суб'єкту.

Такі попередньо наповнені ємності можуть бути призначені для самовведення або для введення іншою особою. Наприклад, доза (або піддоза) або кількість антитіла, описані в даному документі, може постачатися у вигляді рідкої композиції в попередньо наповнених шприцах. В таких прикладах, попередньо наповнені шприци можуть бути призначені для самовведення або для введення іншою особою. В деяких випадках, попередньо наповнені шприци можуть бути призначені для підшкірного введення та/або внутрішньовенного введення.

В цілях даного винаходу, потрібна доза антитіла може залежати від використовуваного антитіла (або його композицій), типу та тяжкості вазомоторного симптому, типу та тяжкості головного болю (наприклад, мігрені) або іншого стану, що підлягає лікуванню, від того, з профілактичною або з терапевтичною метою вводиться агент, попередньої терапії, клінічної історії пацієнта та відгуку на агент, та думки лікаря-куратора. Типово, клінічний лікар буде вводити антитіло до досягнення дози, що забезпечує бажаний результат. Доза та/або частота можуть змінюватися під час лікування.

Емпіричні міркування, такі як період напіввиведення, звичайно будуть братися до уваги при визначенні дози. Наприклад, антитіла, сумісні з імунною системою людини, такі як гуманізовані антитіла або повністю людські антитіла, можуть бути використані для збільшення періоду напіввиведення антитіла та для попередження атаки антитіла з боку імунної системи хазяїна.

Частота введення може бути визначена та відкоригована по ходу терапії, і звичайно, але не обов'язково, основана на лікуванні та/(або пригніченні та/або полегшенні та/або затримці головного болю (наприклад, мігрені) або іншого стану. Альтернативно, пролонговане безперервне вивільнення композиції антитіл може бути придатним. Різні композиції та пристрої для досягнення пролонгованого вивільнення відомі фахівцям.

В одному варіанті реалізації, дози антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОЕР, антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), описаного в даному документі, можуть бути визначені емпірично у індивідуумів, які одержують один або декілька прийомів антитіла. Індивідуумам надають поступово зростаючі дози антитіла. Для оцінки ефективності антитіла може проводитися спостереження за показником хвороби.

Введення антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОБЕР, антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР) згідно зі способами за даним винаходом може бути безперервним або переривчастим, в залежності, наприклад, від фізіологічного стану реципієнта, незалежно від того, або є мета введення терапевтичною або профілактичною, та інших факторів, відомих кваліфікованим лікарям-практикам. Введення антитіла може бути по суті безперервним протягом попередньо заданого періоду часу, або може здійснюватися у вигляді послідовності розділених доз, наприклад, до, під час, або після виникнення головного болю (наприклад, мігрені); до; під час; до та після; під час та після; до та під час; або до, під час, та після виникнення головного болю.

Введення може здійснюватися до, під час та/або після будь-якої події, яка ймовірно призведе до виникнення головного болю.

В деяких варіантах реалізації можуть бути присутніми декілька антитіл. Можуть бути присутніми щонайменше одно, щонайменше два, щонайменше три, щонайменше чотири, щонайменше п'ять різних, або більше антитіл. Загалом, ці антитіла можуть мати комплементарні активності, які не чинять негативного впливу одна на одну. Антитіло (наприклад, моноклональне антитіло, яке модулює шлях СОЕКР, антагоністичне антитіло анти

СОКЕР, моноклональне антагоністичне антитіло анти СОКР), описане в даному документі, також може використовуватися у поєднанні з іншими антагоністами СОКР або антагоністами рецепторів СОКР. Наприклад, можуть бути використані один або декілька з таких антагоністів

СОКР: антисмислова молекула, націлена на СОКР (включаючи антисмислову молекулу, націлену на нуклеїнову кислоту, кодуючу СОКР), сполука, що інгібує СОКР, структурний аналог

СОКЕР, домінантно-негативна мутація рецептора СОКР, що зв'язує СОКР, та антитіло проти рецептора СОКР. Антитіло також може використовуватися у поєднанні з іншими агентами, що підсилюють та/або доповнюють ефективність агентів. (610) Діагностика або оцінка головного болю добре відома фахівцям в цій галузі техніки. Оцінка може проводитися на підставі суб'єктивних показників, таких як характеризація симптомів пацієнтом. Наприклад, мігрень може бути діагностована на підставі таких критеріїв: 1) епізодичні напади головного болю, що тривають від 4 до 72 годин; 2) з двома з таких симптомів: однобічний біль, пульсація, загострення при руху, та біль помірний або тяжкий за інтенсивністю; та 3) один з таких симптомів: нудота або блювота, і фотофобія або фонофобія. Соаазбу еї аї.,

М. ЕпаїЇ. У. Мей. 346:257-270, 2002. В деяких варіантах реалізації, оцінка головного болю (наприклад, мігрені) може здійснюватися за кількістю годин головного болю, як описано в інших розділах даного документа. Наприклад, оцінка головного болю (наприклад, мігрені) може здійснюватися за добовою кількістю годин головного болю, тижневою кількістю годин головного болю, місячною кількістю годин головного болю та/або річною кількістю годин головного болю. В деяких випадках, кількість годин головного болю може вказуватися суб'єктом.

Ефективність лікування може оцінюватися способами, добре відомими фахівцям.

Наприклад, може оцінюватися купування болю. Відповідно, в деяких варіантах реалізації, купування болю суб'єктивно визначається через 1, 2 або декілька годин після введення антитіла анти СОР. В деяких варіантах реалізації, частота нападів головного болю суб'єктивно визначається після введення антитіла анти СОКР.

В деяких варіантах реалізації, спосіб лікування або зниження частоти головного болю у суб'єкта, як описано в даному документі, може знижувати частоту головного болю після разового введення антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), описаного в даному документі, протягом тривалого періоду часу. Наприклад, частота головного болю може знижуватися протягом щонайменше 0,5, 1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, А8, 49, 50 або більше днів після разового введення.

В деяких варіантах реалізації, спосіб лікування або зниження частоти головного болю у суб'єкта, як описано в даному документі, може зменшувати число годин головного болю, який відчуває суб'єкт, порівняно з рівнем до введення, після введення суб'єкту однієї або декількох доз антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), описаного в даному документі. Наприклад, добова кількість годин головного болю, який відчуває суб'єкт, після введення суб'єкту однієї або декількох доз антитіла, може бути зменшена на 0,5, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 або 24 годин головного болю порівняно з рівнем, який спостерігався у суб'єкта до введення. В деяких випадках, добова кількість годин головного болю, який відчуває суб'єкт, після введення суб'єкту однієї або декількох доз антитіла, може бути зменшена на 0,5 Об, 1 У, 5 90, 10 96, 15 95, 20 90, 25 Фо, ЗО 9,

З5 9, 40 96, 45 9Уо, 50 90, 55 У, 60 Зо, 65 9о, 70 У, 75 Уо, 80 9Уо, 85 9о, 90 9, 95 90, 99 90 або більше, порівняно з рівнем, який спостерігався у суб'єкта до введення. В іншому прикладі, тижнева кількість годин головного болю, який відчуває суб'єкт, може бути зменшена після введення суб'єкту однієї або декількох доз антитіла на 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65, 70, 75 або більше годин головного болю порівняно з рівнем, який спостерігався у суб'єкта до введення. В деяких випадках, тижнева кількість годин головного болю, який відчуває суб'єкт, може бути зменшена після введення суб'єкту однієї або декількох доз антитіла на 0,5 9, 1 9,

Бо, 10 95,15 95, 20 96, 25 Уо, ЗО 90, 35 о, 40 Фо, 45 Уо, 50 90, 55 90, 60 бо, 65 бо, 70 9о, 75 Уо, 80 Фо, 8595, 90 95, 95 95, 9995 або більше, порівняно з рівнем, який спостерігався у суб'єкта до введення. В іншому прикладі, місячна кількість годин головного болю, який відчуває суб'єкт, може бути зменшена після введення суб'єкту однієї або декількох доз антитіла на 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125 або більше годин головного болю порівняно з рівнем до введення. В деяких випадках, тижнева кількість годин головного болю, який відчуває суб'єкт, може бути зменшена після введення суб'єкту однієї або декількох доз антитіла на 0,5 95, 195, 590, 1095, 1595, 20 95, 25 95, ЗО 95,

З5 9, 40 96, 45 9Уо, 50 90, 55 У, 60 Зо, 65 9о, 70 У, 75 Уо, 80 9Уо, 85 9о, 90 9, 95 90, 99 90 або більше, порівняно з рівнем, який спостерігався у суб'єкта до введення.

В деяких варіантах реалізації, спосіб лікування або зниження частоти головного болю у суб'єкта, як описано в даному документі, може зменшувати число днів головного болю, який відчуває суб'єкт, порівняно з рівнем до введення, після введення суб'єкту однієї або декількох доз антитіла (наприклад, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОКР, антагоністичного антитіла анти СОКР, моноклонального антагоністичного антитіла анти СОКР), описаного в даному документі. Наприклад, тижнева кількість днів головного болю, який відчуває суб'єкт, може бути зменшена після введення суб'єкту однієї або декількох доз антитіла на 0,5, 1, 1,5, 2, 10) 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, або 7 днів головного болю порівняно з рівнем, який спостерігався у суб'єкта до введення. В деяких випадках, тижнева кількість днів головного болю, який відчуває суб'єкт, може бути зменшена після введення суб'єкту однієї або декількох доз антитіла на 0,5 95, 196,5, 10 96, 15 95, 20 96, 25 в, ЗО У, 35 о, 40 Уо, 45 95, 50 бю, 55 90, 6О бо, 65 Уо, 70 90, 75 У, 80 Фо, 85 95, 90 о, 95 9, 99 95 або більше, порівняно з рівнем, який спостерігався у суб'єкта до введення. В іншому прикладі, місячна кількість днів головного болю, який відчуває суб'єкт, може бути зменшена після введення суб'єкту однієї або декількох доз антитіла на 0,5,1,2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 або більше днів головного болю, порівняно з рівнем до введення.

В деяких варіантах реалізації, спосіб може включати введення суб'єкту одного або декількох додаткових агентів одночасно або послідовно з антитілом (наприклад, моноклональним антитілом, яке модулює шлях СОЕКР, антагоністичним антитілом анти СОКР, моноклональним антагоністичним антитілом анти СОКР). В деяких варіантах реалізації, додатковий агент може бути лікарським препаратом проти головного болю, таким як наведенний в прикладі лікарський препарат проти головного болю (наприклад, агоністи 5-НТІ1, триптани, алкалоїди ріжків, опіати,

В-адренергічні антагоністи, М5АЇІЮ) описані будь-де в даному документі. В деяких варіантах реалізації, терапевтичний ефект може бути збільшений у порівнянні з використанням антитіла або одного або декількох додаткових агентів окремо. Відповідно, може бути досягнутий синергічний ефект між антитілом та одним або декількома додатковими агентами. В деяких варіантах реалізації один або декілька додаткових агентів можуть прийматися суб'єктом профілактично.

В. Антагоністичні антитіла анти СОКР

В деяких варіантах реалізації, в способах за винаходом використовується антитіло, яке може бути антагоністичним антитілом анти СОКР. Антагоністичне антитіло анти СОКР може стосуватися будь-якої молекули антитіла, яка блокує, пригнічує або знижує (в тому числі значно) біологічну активність СОКР, включаючи метаболічні шляхи, медійовані сигналізацією

СОР, такі як зв'язування рецептора та/або викликання клітинної відповіді на СОКР.

Антагоністичне антитіло анти СОКР може виявляти будь-яку одну або декілька з таких характеристик: (а) зв'язування з СОКР; (б) блокування зв'язування СОКР з його рецептором (рецепторами); (с) блокування або зниження активації рецептора СОЕР (включаючи активацію

САМР); (4) інгібування біологічної активності СОКР або метаболічних шляхів, медійованих сигнальною функцією СОР; (е) запобігання, полегшення або зцілення будь-якого аспекту головного болю (наприклад, мігрені); (Її) збільшення кліренсу СОКР; та (9) інгібування (зниження) синтезу СОКР, продукування або вивільнення. Антагоністичні антитіла анти СОКР відомі фахівцям. Див., наприклад, Тап еї аї., СіІіп. зсі. (опа). 89:565-73, 1995; 5ідта (Міссурі,

США), Номер продукту С7113 (клон Ме4901); Ріошгаеє еї аї., Рерііде5 14:1225-1229, 1993.

В деяких варіантах реалізації, антитіло взаємодіє з СОКР, інгібуючи СОКР та/або шлях

СОР, включаючи метаболічні шляхи, медійовані сигнальною функцією СОКР. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР розпізнає людський СОКР. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР зв'язується з обома з людських а-

СОКР та В-СОКР. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР зв'язується з людським та щурячим СОКР. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР зв'язує С-кінцевий фрагмент, що містить амінокислоти 25-37 СОКР. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР зв'язує С-кінцевий епітоп в межах амінокислот 25-37 СОВР.

Антитіла, придатні для використання за даним винаходом, можуть охоплювати моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, фрагменти антитіл (наприклад, Раб, Раб",

ЕК(ар"2, Рм, Ес ії т.д.), химерні антитіла, біспецифічні антитіла, гетерокон'юговані антитіла, одноланцюгові (СЕМ), їх мутанти, гібридні білки, що містять ділянку, яка є антитілом (наприклад, доменним антитілом), гуманізовані антитіла, та будь-які інші молекули імуноглобуліну з модифікованою конфігурацією, що містять сайт розпізнавання антигену потрібної специфічності, включаючи глікозильовані варіанти антитіл, амінокислотні послідовності варіантів антитіл, та ковалентно модифіковані антитіла. Антитіла можуть бути мишачими, щурячими, людськими, або мати будь-яке інше походження (включаючи химерні або гуманізовані антитіла).

В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР є моноклональним антитілом. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР є гуманізованим.

В деяких варіантах реалізації, антитіло є людським. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР є антитілом С1 (як описано в даному документі). В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР включає одну або декілька СОК (гіперваріабельних ділянок), наприклад, одну, дві, три, чотири, п'ять або, в деяких варіантах (610) реалізації, усі шість СОК антитіла 1 або варіантів С1, представлених в Таблиці 6. В інших варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР містить амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, представлену на Фігурі 5 (5БО ІЮО МО:1), та амінокислотну послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, представлену на Фігурі 5 (ЗЕО ІЮ МО:г).

В деяких варіантах реалізації, антитіло містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (СУК) та варіабельну ділянку важкого ланцюга (НСМК), вибрані з групи, що складається з: (а) Ї!СМК17 (ЗЕО ІО МО: 58) та НСМК22 (5ЕО ІО МО: 59); (в) ГСМК18 (ЗЕО ІЮ МО: 60) та НСМК23 (ЗЕО ІЮ

МО: 61); (с) /СМА19 (ЗЕО ІЮ МО: 62) та НСМК24 (ЗЕО ІЮО МО: 63); (4) ГСМК20 (ЗЕО ІЮ МО: 64) та НСМК25 (5ЕО ІЮ МО: 65); (е) ГСМК21 (5ЕБО ІО МО: 66) та НСМК26 (5ЕБО ІЮ МО: 67); ()

ГСМК27 (З5ЕО ІО МО: 68) та НСМК28 (5ЕО ІЮ МО: 69); (ду ГСМК29 (ЗЕО ІО МО: 70) та НСМАЗО (ЗЕО ІО МО: 71); (п) ГСМАЗ1 (ЗЕО ІЮ МО: 72) та НСМА32 (5ЕО ІО МО: 73); () І СУКЗ33 (ЗЕО ІЮ

МО: 74) та НСМАК34 (5ЕО ІЮ МО: 75); () ГОММАКЗ5 (ЗЕО ІЮО МО: 76) та НСМКЗ6 (ЗЕО ІО МО: 77); та (ю ГСМК37 (5ЕБО ІЮО МО: 78) та НСМКЗ38 (5ЕБО ІЮО МО: 79). Послідовності цих областей представлені в даному документі. Інші приклади антитіл описані в И520110305711,

О0520120294802, 0520120294797 та 0520100172895, які включені до даного документу як посилання.

В деяких варіантах реалізації, антитіло містить модифіковану константну область, таку як константна область, що є імунологічно інертною, описана в даному документі. В деяких варіантах реалізації, константна область є модифікованою, як описано в Єиг. 9. Іттипої. (1999) 29:2613-2624; заявці РСТ Мо РСТ/ЗВ99/01441; та/або патентній заявці Великобританії Мо 9809951.8. В інших варіантах реалізації, антитіло містить константну область важкого ланцюга людського Ідс2, що містить такі мутації: АЗЗОРЗ331 на 53305331 (нумерація амінокислот згідно з послідовністю Ідс2 дикого типу). Еиг. У. Іттипої. (1999) 29:2613-2624. В деяких варіантах реалізації, антитіло містить константну область Ідс4, що містить такі мутації: Е23З3Е2341 235 на

Р233М234А235. В інших варіантах реалізації, константна область аглікозильована для М- зв'язаного глікозилювання. В деяких варіантах реалізації, константна область аглікозильована для М-зв'язаного глікозилювання шляхом мутації залишку приєднання олігосахариду (такого як

А5п297) та/або фланкуючих залишків, які є частиною послідовності розпізнавання М- глікозилювання в константній області. В деяких варіантах реалізації, константна область аглікозильована для М-зв'язаного глікозилювання. Константна область може бути аглікозильована для М-зв'язаного глікозилювання ферментативно або шляхом експресії в дефіцитній щодо глікозилювання клітині-хазятїні.

Афінність зв'язування (Ко) антагоністичного антитіла анти СОКР з СОКР (таким як людський а-СОКР) може становити від близько 0,02 до близько 200 нМ. В деяких варіантах реалізації, афінність зв'язування має будь-яке значення з близько 200 нМ, близько 100 нМ, близько 50 нМ, близько 10 нМ, близько 1 нМ, близько 500 пМ, близько 100 пМ, близько 60 пМ, близько 50 пМ, близько 20 пМ, близько 15 пМ, близько 10 пМ, близько 5 пМ або близько 2 пМ. В деяких варіантах реалізації, афінність зв'язування має значення менше будь-якої величини з близько 250 нМ, близько 200 нМ, близько 100 нМ, близько 50 нМ, близько 10 нМ, близько 1 нМ, близько 500 пМ, близько 100 пМ або близько 50 пМ.

Одним із способів визначення афінності зв'язування антитіл з СОКР є вимірювання афінності зв'язування монофункціональних ЕРар-фрагментів антитіла. Для одержання монофункціональних Рар-фрагментів, антитіло (наприклад, дО) може бути гідролізовано папаїном або експресовано рекомбінантними методами. Афінність Рар-фрагмента антитіла анти СОКР може бути визначена методом поверхневого плазмонного резонансу (система поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК) ВіасогезоОО" М, Віасоге, ІМС, Різсайамжшау МУ), обладнана сенсорними чипами з попередньо іммобілізованим стрептавідином (ЗА), з використанням НВЗ-ЕР рухомого буфера (0,01М НЕРЕЗ, рН 7,4, 0,15 Масі, З мМ ЕДТА, 0,005 95 об./06б. Зи!игпасіапі Р20). Біотинільований людський СОКР (або будь-який інший СОКР) може бути розбавлений буфером НВЗ-ЕР до концентрації менше 0,5 мкг/мл та пропущений шляхом ін'єкції по індивідуальним каналам чипа з використанням різних часів контакту для одержання двох діапазонів щільності антигену - 50-200 одиниць відгуку (КО) для детальних кінетичних досліджень або 8000-1000 КИ для скринінгових аналізів. Дослідження регенерації показали, що 25 мМ Маон в 25 95 об./об. етанолі ефективно видаляє зв'язаний Раб, при зберіганні активності

СОКР на чипі протягом більше 200 ін'єкцій. Типово, серійні розбавлення (в діапазоні концентрацій 0,1-10х, розрахункове значення Ко) очищених зразків бар вводять на 1 хв при витраті 100 мкл/хвилину та спостерігають дисоціацію протягом до 2 годин. Концентрації білків

Еаб визначають методами ІФА та/або електрофорезом 505-РАСЕ (поліакриламідний гель з домішкою ДСН) з використанням відомої концентрації Раб (визначеної шляхом аналізу (610) амінокислот) як стандарту. Кінетичні константи асоціації (Кол) та константи дисоціації (Кок)

одержують одночасно шляхом апроксимації даних глобально з використанням 1:1 моделі зв'язування Ленгмюра (Кагіз5оп, К. Коо5, Н. Радегвіат, /. Реїег5зоп, В. (1994). Меїпоа5

Епгуто!оду 6. 99-110) за допомогою програми ВіАемаїшайоп. Значення рівноважної константи дисоціації (Ко) обчислюють як Кой/Кої. Цей протокол є придатним для використання при визначенні афінності зв'язування антитіла з будь-яких СОКР, включаючи людський СОР,

СОКР інших ссавців (таких як мишачий СОКР, щурячий СОКР, СОКР приматів), а також різних форм СОБР (таких як а- та В-форми). Афінність зв'язування антитіла звичайно вимірюють при 25 "С, але вона також може бути виміряна при 37 "С.

Антитіла, включаючи антагоністичні антитіла анти СОЕР, можуть бути одержані будь-яких способом, відомим фахівцям. Шлях введення та графік імунізації тварини-хазяїна звичайно відповідають прийнятим та звичайним методикам стимуляції антитілом та продукування, як додатково описано в даному документі. Загальні методики продукування людських та мишачих антитіл відомі фахівцям та описані в даному документі.

Передбачаєтся, що будь-який ссавець-суб'єкт, включаючи людей, або його антитіло- продукуючі клітини можуть бути за допомогою певних маніпуляцій використані як основа для продукування гібридомних клітинних ліній ссавця, включаючи людину. Типово, тварині-хазяїну інокулюють інтраперитонеально, внутрішньом'язово, орально, підшкірно, інтраплантарно та/або інтрадермально визначену кількість імуногену, включаючи способи, описані в даному документі.

Гібридоми можуть бути одержані з лімфоцитів та імморталізованих клітин мієломи з використанням загальної методики гібридизації соматичних клітин Копіег, В. апа Міїєтеїп, С. (1975) Майшге 256:495-497 або модифікованої відповідно до ВисК, Ю. МУ., еї аї., Іп міго, 18:377- 381 (1982). Для гібридизації можуть бути використані доступні лінії мієломи, включаючи, без обмежень, Х63-Ад8.653 та пропоновані заїК Іпзійше, Сеї! Оівігіршіоп Сепієї, Зап Оіедо, Саїїї.,

ОБА. Загалом, методика передбачає злиття клітин мієломи та лімфоїдних клітин з використанням речовини, що стимулює злиття, такої як гліколь, або електричних засобів, добре відомих кваліфікованим фахівцям в цій галузі техніки. Після злиття, клітини відокремлюють від середовища для злиття та вирощують в селективному живильному середовищі, такому як середовище з гіпоксантином-аміноптерином-тимідином (НАТ), для усунення негібридизованих батьківських клітин. Будь-яке з середовищ, описаних в даному документі, з домішкою сироватки або без неї, може бути використане для культивації гібридом, які секретують моноклональні антитіла. Як інша альтернатива методу злиття клітин, імморталізовані за допомогою ЕВМ (вірус

Епштейна-Барр) В-клітини можуть бути використані для продукування моноклональних антитіл (наприклад, моноклональних антитіл анти СОЕР) за даним винаходом. Гібридоми розтягають та субклонують, при необхідності, і супернатанти аналізують на активність по відношенню до імуногену за допомогою звичайних процедур імунологічного аналізу (наприклад, радіоїмуноаналіз, ферментний імунологічний аналіз, або флуоресцентний імунологічний аналіз).

Гібридоми, які можуть бути використані як джерела антитіл, охоплюють усі похідні, потомство клітин батьківських гібридом, що продукують моноклональні антитіла, специфічні до

ССОРР, або їх частину.

Гібридоми, що продукують такі антитіла, можуть вирощуватися іп мйго або іп мімо з використанням відомих процедур. Моноклональні антитіла можуть бути виділені з живильних середовищ або рідин організму за допомогою звичайних процедур очистки імуноглобулінів, таких як осадження за допомогою сульфату амонію, гель-електрофорез, діаліз, хроматографія, та ультрафільтрація, при необхідності. Небажана активність, якщо вона присутня, може бути усунена, наприклад, шляхом пропускання препарату над адсорбентами, що складаються з імуногену, приєднаного до твердої фази, та елюювання або вивільнення бажаного антитіла від імуногену. Імунізація тварини-хазяїна за допомогою людського СОКР, або фрагмента, що містить цільову амінокислотну послідовність, кон'юговану з білком, який є імуногенним для виду, що підлягає імунізації, наприклад, гемоціанін молюска фіссуреллі, сироватковий альбумін, бичачий тиреоглобулін, або інгібітор соєвого трипсину, з використанням біфункціонального або дериватизуючого агента, наприклад, малеіїмідобензоїлсульфосукцинімідного складного ефіру (кон'югація через цистеїнові залишки), М-гідроксисукциніміду (через лізинові залишки), глутаральдегіду, бурштинового альдегіду, БОСІ2, або КІМ-С-МЕ, де К та К1 позначають різні алкільні групи, може дати популяцію антитіл (наприклад, моноклональних антитіл).

При необхідності, антитіло (наприклад, моноклональне або поліклональне антагоністичне антитіло анти СОКР), що представляє інтерес, може бути секвеновано і полінуклеотидна послідовність може потім бути клонована у вектор для експресії або розмноження.

Послідовність, яка кодує антитіло, що представляє інтерес, може підтримуватися у векторі в клітині-хазяїні, і клітина-хазяїн може бути потім розмножена та заморожена для подальшого (610) використання. В альтернативі, полінуклеотидна послідовність може бути використана для генетичної маніпуляції з метою "гуманізації" антитіла або для поліпшення афінності або інших характеристик антитіла. Наприклад, константна область може бути генетично модифікована для надання більшої схожості з людськими константними областями, щоб уникнути імунної відповіді, якщо антитіло використовується в клінічних випробуваннях та лікуванні людей. Може бути бажаним проведення генетичних маніпуляцій з послідовністю антитіла для одержання більшої афінності до СОР та більшої ефективності інгібування СОКР. Кваліфікованому фахівцю в цій галузі техніки буде зрозуміло, що можна виконати одну або декілька змін полінуклеотиду в антагоністичному антитілі анти СОКР при збереженні його зв'язувальної здатності з СОЕР.

Гуманізація моноклонального антитіла може включати чотири загальних стадії. вони явлють собою: (1) визначення нуклеотидної та передбачуваної амінокислотної послідовності варіабельних доменів легкого та важкого ланцюгів вихідного антитіла; (2) проектування гуманізованого антитіла, тобто, визначення того, яку каркасну ділянку антитіла використати в процесі гуманізації; (3) методологія/методики власне гуманізації; і (4) трансфекція та експресія гуманізованого антитіла. Див., наприклад, патенти США МоМо 4816567; 5807715; 5866692; 6331415; 5530101; 5693761; 5693762; 5585089; та 6180370.

Був описаний ряд "гуманізованих" молекул антитіла, що містять антигензв'язуючий сайт, виділений з імуноглобуліну, який не належить людині, включаючи химерні антитіла, що мають

М-області гризунів або модифіковані М-області гризунів та їх асоційованих ділянок, що визначають комплементарність (СОК), злитих з людськими константними доменами. Див., наприклад, УмМіпіег еї аІ. Майте 349:293-299 (1991), Горидіїо еї а). Ргос. Маї. Асай. осі. ОБА 86:4220-4224 (1989), ЗНам вї аї. ) Іттипої. 138:4534-4538 (1987), та Вгоуп еї аІ. Сапсег Кев. 47:3577-3583 (1987). Інші посилання описують СОК гризунів, привиті до людської несучої каркасної ділянки (ЕК) перед злиттям з відповідним константним доменом людського антитіла.

Див., наприклад, Кіесптапп еї аї. Маїиге 332:323-327 (1988), Метовєуеп вї а. Зсієпсе 239:1534- 1536 (1988), та допев5 еї а. Майшге 321:522-525 (1986). Інше посилання описує СОК гризуна, підтримувані рекомбінантно сконструйованими каркасними ділянками гризуна. Див., наприклад, європейську патентну публікацію Мо 0519596. Такі "гуманізовані" молекули сконструйовані для мінімізації небажаної імунологічної відповіді на молекули антитіла гризуна проти людини, який обмежує тривалість та ефективність терапевтичного застосування таких речовин у реципієнтів - людей. Наприклад, константна область антитіла може бути модифікована таким чином, щоб вона була імунологічно інертною (наприклад, не ініціювала лізис комплементу). Див., наприклад, публікацію РСТ Мо РСТ/ЗВ99/01441; патентну заявку Великобританії Мо 9809951.8.

Інші способи гуманізації антитіл, які також можуть бути використані, розкриті в Оацдпегу еї аї.,

Мисі. Асід5 Нев5. 19:2471-2476 (1991) та в патентах США МоМо 6180377; 6054297; 5997867; 5866692; 6210671; та 6350861; і в публікації РСТ Мо УМО 01/27160.

В іншій альтернативі, повністю людські антитіла можуть бути одержані при використанні комерційно доступних мишей, які були модифіковані для експресії специфічних білків людських імуноглобулінів. Трансгенні тварини, призначені для продукування більш бажаної (наприклад, повністю людських антитіл) або сильнішої імунної відповіді, також можуть бути використані для одержання гуманізованих або людських антитіл. Прикладами такої технології є Хепотоиве "м фирми Абрдепіх, Іпс. (Егетопі, СА) та НиМмМАБбБ-МоизетФ та ТС Моизе"м фирми Меаагех, Іпс. (Ргіпсеюп, МУ).

В альтернативі, антитіла можуть бути одержані рекомбінантними методами та експресовані з використанням будь-якого способу, відомого фахівцям. В іншій альтернативі, антитіла можуть бути одержані рекомбінантно за технологією фагового дисплея. Див., наприклад, патенти США

МоМо 5565332; 5580717; 5733743; та 6265150; та Уміпіег еї аІ,, Аппи. Кеу. Іттипої. 12:433-455 (1994). Альтернативно, технологія фагового дисплея (МоСайепу еї аї., Маїшге 348:552-553 (1990)) може бути використана для продукування людських антитіл та фрагментів антитіл іп міго, з генних репертуарів варіабельного (У) домену імуноглобуліну від неімунізованих донорів.

Згідно з цією методикою, гени М-домену антитіла клонують в рамці в ген основного або мінорного білка оболонки ниткоподібного бактеріофага, такого як М13 або її, та презентуються як функціональні фрагменти антитіл на поверхні фагової частинки. Оскільки ниткоподібна частинка містить одноланцюгову копію ДНК фагового геному, селекція на основі функціональних властивостей антитіла також приводить до селекції гена, що кодує антитіло, яке демонструє такі властивості. Таким чином, фаг імітує деякі властивості В-клітини. Фаговий дисплей може проводитися в різних форматах; огляд наведений, наприклад, в УХопп5оп, Кеміп 5. апа Співуеїї, Оамідй 9У., Ситепі Оріпіоп іп Бітисіига! Віоїоду 3:564-571 (1993). Для фагового дисплея можуть бути використані декілька джерел сегментів М-гена. Сіаскхоп еї аї., Маїшге (610) 352:624-628 (1991) виділили широкий спектр антитіл проти оксазолону з невеликої випадкової комбінаторної бібліотеки М-генів, виділених з селезінок імунізованих мишей. Репертуар М-генів від неіїмунізованих людських донорів може бути сконструйований, і антитіла до широкого спектра антигенів (включаючи аутоантигени) можуть бути виділені по суті згідно методикам, описаним МагкК еї аї., У. Мої. Віої. 222:581-597 (1991), або сгіййп еї аІ.,, ЕМВО .. 12:725-734 (1993). При природній імунній відповіді, гени антитіла накопичують мутації з високою швидкістю (соматична гіпермутація). Деякі зі змін, що вносяться, будуть надавати більш високу афінність, і

В-клітини, що презентують високоафінний поверхневий імуноглобулін, краще реплікуються та диференціюються при подальшій антигенній стимуляції. Цей природний процес можна імітувати шляхом використання методики, відомої як "перетасовка ланцюга" (Магк», еї аї., Віо/Тесппої. 10:779-783 (1992)). В цьому способі, афінність "первинних" людських антитіл, одержаних за допомогою фагового дисплея, може бути поліпшена шляхом послідовної заміни генів М- областей важкого та легкого ланцюгів на репертуари природних варіантів (репертуари) генів М- домену, одержаних від неімунізованих донорів. Ця методика дозволяє продукувати антитіла та фрагменти антитіл з афінностями в діапазоні пМ-нМ. Стратегія одержання дуже великих репертуарів фагових антитіл (також відомих як "мати усіх бібліотек") була описана Ууаїетоизе еї а!., Мисі. Асіаз Рез. 21:2265-2266 (1993). Перетасовка генів також може бути використана для одержання людських антитіл з антитіл гризунів, коли людське антитіло має афінності та специфічності, схожі з вихідним антитілом гризуна. Згідно з цим способом, який також називається "імпринтинг епітопа", ген М-домену важкого або легкого ланцюгів антитіл гризунів, одержаних методом фагового дисплея, заміняють на репертуар генів людського М-домену, створюючи химери гризун-людина. Селекція по антигену приводить до виділення людських варіабельних областей, здатних відновлювати функціональний антигензв'язуючий сайт, тобто, епітоп визначає (вдруковує) вибір партнера. При повторенні процесу для заміни решти М- домену гризуна одержують людське антитіло (див. публікацію РОСТ Мо УУО 93/06213, опубліковану 1 квітня 1993 р.). На відміну від традиційної гуманізації антитіл гризунів методом трансплантації СОМ, ця методика забезпечує одержання повністю людських антитіл, які не мають залишків каркасних або СОК-ділянок гризуна.

Зрозуміло, що хоча наведений вище опис стосується гуманізованих антитіл, розглянуті загальні принципи є застосовними до спрямованої модифікації антитіл, призначених для використання, наприклад, для собак, кішок, приматів, коней та великої рогатої худоби.

Додатково зрозуміло, що один або декілька аспектів гуманізації антитіл, описаних в даному документі, можуть бути скомбіновані, наприклад, трансплантація СОК, мутація каркасної області та мутація СОК.

Антитіла можуть бути одержані рекомбінантними методами шляхом виділення спочатку антитіл та антитіло-продукуючих клітин у тварин-хазяїв, одержання генної послідовності, та використання генної послідовності для рекомбінантної експресії антитіла в клітинах-хазяях (наприклад, клітинах СНО). Інший спосіб, який може бути використаний, полягає в експресії послідовності антитіла в рослинах (наприклад, тютюну) або трансгенному молоці. Способи рекомбінантної експресії антитіл в рослинах або молоці розкриті в літературі. Див., наприклад,

Реє!егз5, єї а). Массіпе 19:2756 (2001); І опрего, М. апа 0. Низлгаг Іпі.Нем.Іттипої 13:65 (1995); та

РоПосК, еї аїЇ., У Іттипої Меїпод5 231:147(1999). Способи одержання похідних антитіл, наприклад, гуманізованих, одноланцюгових тощо відомі фахівцям.

Імунологічні аналізи та сортування методами протокової цитометрії, такими як активоване флуоресценцією сортування клітин (ЕАС5), також можуть бути використані для виділення антитіл, специфічних по відношенню до СОКР.

Антитіла можуть бути зв'язані з різними носіями. Носії можуть бути активними та/або інертними. Приклади носіїв включають поліпропілен, полістирол, поліетилен, декстран, нейлон, амілази, скло, природні та модифіковані целюлози, поліакриламіди, агарози та магнетит. Носій за природою може бути розчинним або нерозчинним. Кваліфіковані фахівці в цій галузі техніки знають інші придатні носії для зв'язування антитіл, або можуть визначити такі, використовуючи рутинні експерименти. В деяких варіантах реалізації, носій містить фрагмент, націлений на міокард.

ДНК, що кодує моноклональні антитіла, легко виділяється та секвенується з використанням звичайних процедур (наприклад, шляхом використання олігонуклеотидних зондів, здатних специфічно зв'язуватися з генами, кодуючими важкий та легкий ланцюги моноклональних антитіл). Клітини гібридом служать кращим джерелом такої ДНК. Після виділення, ДНК може бути приміщена в експресійні вектори (такі як експресійні вектори, розкриті в публікації РСТ Мо

УМО 87/04462), які потім трансфекують в клітини-хазяї, такі як клітини Е. соїї, клітини СО5 мавп, клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), або клітини мієломи, які інакше не продукують (610) білок імуноглобуліну, для забезпечення синтезу моноклональних антитіл в рекомбінантних клітинах-хазяях. Див., наприклад, публікацію РСТ Мо УМУ/О 87/04462. ДНК також може бути модифікована, наприклад, шляхом заміщення кодуючої послідовності на константні домени людських важкого та легкого ланцюгів замість гомологічних мишачих послідовностей, Моіїтізоп еї аї,, Ргос. Маї. Асай. 5сі. 81:6851 (1984), або шляхом ковалентного приєднання до кодуючої послідовності імуноглобуліну усієї або частини кодуючої послідовності поліпептиду, який не є імуноглобуліном. У такий спосіб одержують "химерні" або "гібридні" антитіла, що виявляють специфічність зв'язування по відношенню до будь-якого моноклонального антитіла анти СОЕР, описаного в даному документі.

Антитіла (наприклад, антагоністичні антитіла анти СОКР) та поліпептиди, одержані з антитіл, можуть бути ідентифіковані або охарактеризовані з використанням способів, відомих фахівцям, в яких детектується та/або вимірюється зниження, ослаблення або нейтралізація біологічної активності СОБР. Наприклад, антагоністичне антитіло анти СОКР також може бути ідентифіковано шляхом інкубації агента-кандидата з СОКР та контролю будь-якої однієї або декількох з таких характеристик: (а) зв'язування з СОКР; (Б) блокування зв'язування СОКР з його рецептором (рецепторами); (с) блокування або зниження активації рецептора СОКР (включаючи активацію САМР); (а) інгібування біологічної активності СОКР або метаболичних шляхів, медійованих сигнальною функцією СОКР; (е) запобігання, полегшення або зцілення будь-якого аспекту головного болю (наприклад, мігрені); () збільшення кліренсу СОБР; та (9) інгібування (зниження) синтезу СОКР, продукування або вивільнення. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти ССЕР або поліпептид ідентифікують шляхом інкубації агента-кандидата з СОКР та контролю зв'язування та/або супутнього зниження або нейтралізації біологічної активності СОКР. Аналіз зв'язування може проводитися з очищеним поліпептидом (поліпептидами) СОКР, або з клітинами, що експресують в природних умовах, або трансфекованих для забезпечення експресії, поліпептиду (поліпептидів) СОКР. В одному варіанті реалізації, аналіз зв'язування є конкурентним аналізом зв'язування, у якому оцінюється здатність антитіла-кандидата конкурувати з відомим антагоністом СОКР за зв'язування з СОКР.

Аналіз може проводитися в різних форматах, включаючи формат ІФА. В інших варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР ідентифікують шляхом інкубації агента- кандидата з СОКР і контролю зв'язування та супутнього інгібування активації рецептора СОКР, експресованого на поверхні клітини.

Після первинної ідентифікації, активність антитіла-кандидата (наприклад, антагоністичного антитіла анти ССРР) може бути додатково підтверджена та уточнена за допомогою біоаналізів, призначених для тестування цільових біологічних активностей. Альтернативно, біоаналізи можуть бути використані для прямого скринінгу кандидатів. Наприклад, СОКР промотує ряд вимірних змін в чутливих клітинах. Вони включають, без обмежень, стимуляцію САМР в клітинах (наприклад, клітинах ЗК-М-МСО). Антагоністична активність також може бути виміряна за допомогою тваринних моделей, таких як вимірювання вазодилатації шкіри, індукованої стимуляцією підшкірного нерва щура. Езсої еї аї., Вг. У. Рпагтасої. 110: 772-776, 1993. Тваринні моделі головного болю (таких як мігрень) можуть бути додатково використані для тестування ефективності антагоністичних антитіл або поліпептидів. Кешег, еї аІ., Рипсійопа! Мешигоіоду (15) зиррі, 3, 2000. Деякі із способів ідентифікації та характеризації антагоністичного антитіла анти

СОБЕР або поліпептиду описані детально в Прикладах.

Антитіла, включаючи антагоністичні антитіла анти СОРР, можуть бути охарактеризовані з використанням способів, добре відомих фахівцям. Наприклад, один спосіб полягає в ідентифікації епітопа, з яким воно зв'язується, або "картуванні епітопа". Існує багато відомих фахівцям способів картування та характеризації розташування епітопів в білках, включаючи визначення кристалічної структури комплексу антитіло-антиген, конкурентні аналізи, аналізи експресії генного фрагмента, та аналізи з використанням синтетичних пептидів, як описано, наприклад, в Главі 11, Нагіоуу апа І апе, О5іпд Апіїбодіє5, а І абогаїгу Мапиаї, Соїа Зргіпд Нагрог

Іарогаїогу Рге55, Соїй Зргіпд Нагрог, Мемж/ Могк, 1999. В додатковому прикладі, картування епітопа може бути використано для визначення послідовності, 3 якою зв'язується антагоністичне антитіло анти СОКР. Картування епітопа є комерційно доступним з різних джерел, наприклад, Рерзсап бувієтв (ЕдеІнепймеєд 15, 8219 РН Іеїувіад, Те МеїшШепапоаФв).

Епітоп може бути лінійним епітопом, тобто, складатися з одного відрізка послідовності амінокислот, або конформаційним епітопом, утвореним в результаті тривимірних взаємодій амінокислот, які не обов'язково будуть входити до складу одного відрізка. Пептиди різної довжини (наприклад, довжиною щонайменше 4-6 амінокислот) можуть бути виділені або синтезовані (наприклад, рекомбінантно) та використані в аналізах зв'язування з антагоністичним антитілом анти СОКР. В іншому прикладі, епітоп, з яким зв'язується (610) антагоністичне антитіло анти СОКР, може бути визначений за допомогою системного скринінгу шляхом використання перекривних пептидів, одержаних з послідовності СОКР, та визначення зв'язування з антагоністичним антитілом анти СОКР. Згідно з аналізами експресії генних фрагментів, відкрита рамка зчитування, що кодує СОКР, фрагментується або випадко, або за допомогою специфічних генетичних конструкцій, та визначається реакційна здатність експресованих фрагментів СОКР по відношенню до тестованого антитіла. Генні фрагменти можуть, наприклад, бути одержані методом ПЛР і потім транскрибовані та трансльовані в білок іп міго, в присутності радіоактивних амінокислот. Зв'язування антитіла з радіоактивно міченими фрагментами СОКР потім визначають методом імунопреципітації та електрофорезу на гелі.

Певні епітопи також можуть бути ідентифіковані шляхом використання великих бібліотек випадкових пептидних послідовностей, презентованих на поверхні фагових частинок (фагові бібліотеки). Альтернативно, певна бібліотека перекривних пептидних фрагментів може бути протестована на зв'язування з тестованим антитілом за допомогою простих аналізів зв'язування. В додатковому прикладі, мутагенез антигензв'язуючого домену, експерименти з обміном доменами та скануючий аланіном мутагенез можуть бути проведені для ідентифікації залишків, потрібних, достатніх та/або необхідних для зв'язування епітопа. Наприклад, експерименти з обміном доменами можуть бути проведені з використанням мутантного СОКР, у якому різні фрагменти поліпептиду СОКР заміщаються (обмінюються) на послідовності з близько спорідненого, але антигенно відмінного білка (такого як інший член сімейства білка нейротрофіну). За допомогою аналізу зв'язування антитіла з мутантним СОКР можна оцінити важність конкретного фрагмента СОКР для зв'язування антитіла.

Ще один спосіб, який може бути використаний для характеризації антитіла, включаючи антагоністичне антитіло анти СОКР, полягає в використанні конкурентних аналізів з іншими антитілами, про які відомо, що вони зв'язуються з цим самим антигеном, тобто, різними фрагментами СОРР, для визначення того, або зв'язується антагоністичне антитіло анти СОКР з тим самим епітопом, що й інші антитіла. Конкурентні аналізи добре відомі кваліфікованим фахівцям в цій галузі техніки.

Експресійний вектор може бути використаний для направлення експресії антитіла, включаючи антагоністичне антитіло анти СОКР. Кваліфікований фахівець в цій галузі техніки знайомий з введенням експресійних векторів для забезпечення експресії екзогенного білка іп мімо. Див., наприклад, патенти США Мо 6436908; 6413942; та 6376471. Введення експресійних векторів включає локальне або системне введення, включаючи ін'єкцію, оральне введення, введення за допомогою генної пушки або катетера, та місцеве введення. В іншому варіанті реалізації, експресійний вектор вводять безпосередньо в симпатичний стовбур або ганглій, або в коронарну артерію, передсердя, шлуночок або перикард.

Також може бути використана цільова доставка терапевтичних композицій, що містять експресійний вектор, або субгеномні полінуклеотиди. Методики рецептор-медійованої доставки

ДНК описані, наприклад, в Ріпаеї5 еї аї., Тгепах5 Віотесппої. (1993) 11:202; Спіои еї аїЇ.,, Сепе

Тпегарешіісв: Меїйоавз Апа Арріїсайопз ОЇ Оігесі Сепе Тгапвіег (9У.А. Моїй, ей.) (1994); Ми еї аї., 9.

Віо!. Спет. (1988) 263:621; Ми еї аї., у. Віої. Спет. (1994) 269:542; 7епкКе еї аї., Ргос. Май). Асад. збі. ОБА (1990) 87:3655; УМи еї аї., 9. Віої. Спет. (1991) 266:338. Терапевтичні композиції, що містять полінуклеотид, вводять в діапазоні від близько 100 нг до близько 200 мг ДНК для локального введення за протоколом генної терапії. Також можуть бути використані за протоколом генної терапії діапазони концентрацій від близько 500 нг до близько 50 мг, від близько 1 мкг до близько 2 мг, близько 5 мкг до близько 500 мкг, близько 20 мкг до близько 100 мкг ДНК. Терапевтичні полінуклеотиди та поліпептиди можуть бути доставлені з використанням носіїв для генної доставки. Носій для доставки генів може мати вірусне або невірусне походження (див., загалом, ЧУоПу, Сапсег Сепе ТПегару (1994) 1:51; Кітига, Нитап Сепе Тпегару (1994) 5:845; СоппеПу, Нитап Сепе Тпегару (1995) 1:185; та Карій, Маїшге Сепеїіс5 (1994) 6:148). Експресія таких кодуючих послідовностей може бути індукована за допомогою ендогенних промоторів, що належать ссавцям, або гетерологічних промоторів. Експресія кодуючої послідовності може бути конститутивною або регульованою.

Вектори на основі вірусів для доставки бажаного полінуклеотиду та експресії в бажаній клітині добре відомі фахівцям. Типові приклади носіїв на основі вірусів включають, без обмежень, рекомбінантні ретровіруси (див., наприклад, публікації РСТ МоМо УМО 90/07936; УМО 94/03622; МО 93/25698; МО 93/25234; МО 93/11230; МО 93/10218; МО 91/02805; патенти США

Мо5 219740 та 4777127; патент Великобританії Мо 2200651; та патент ЕР Мо 0345242), вектори на основі альфавірусу (наприклад, вектори на основі вірусу Зіпабі5, вірусу лісу Семлікі (АТСС

МА-67; АТСС МА-1247), вірусу ріки Росс (АТСС Мет-373; АТОСС МУв-1246) та вірусу венесуельского кінського енцефаліту (АТСС МК-923; АТС УМА-1250; АТОС УВА 1249; АТОС УВ- (610) 532)), та вектори на основі аденоасоційованого вірусу (ААМ) (див., наприклад, публікації РСТ

МоМо УМО 94/12649, МО 93/03769; УМО 93/19191; УМО 94/28938; УМО 95/11984 та УМО 95/00655).

Також може бути використано введення ДНК, одержаної з інактивованого аденовірусу, як описано в Сигієї, Нит. (зепе Тег. (1992) 3:147.

Також можуть бути використані невірусні носії для доставки та способи, включаючи, без обмежень, поліконденслвані ДНК, зв'язані або не зв'язані з окремо взятим інактивованим аденовірусом (див., наприклад, Сигієї, Нит. Сепе ТПег. (1992) 3:147); зв'язані з лігандами ДНК (див., наприклад, УМи, у. ВіоЇ. Спет. (1989) 264:16985); клітини-носії для доставки в еукаріотичні клітини (див., наприклад, патент США Мо 5814482; публікації РСТ Мо УМО 95/07994; УМО 96/17072; МО 95/30763; та МО 97/42338) та нейтралізацію ядерного заряду або злиття з клітинними мембранами. Також можуть бути використані "голі" ДНК. Типові приклади способів введення "голих" ДНК описані в публікації РСТ Мо УМО 90/11092 та патенті США Мо 5580859.

Ліпосоми, які можуть виступати як носії для доставки генів, описані в патенті США Мо 5422120; публікаціях РСТ Мо УМО 95/13796; УМО 94/23697; УМО 91/14445; та ЕР 0524968. Додаткові підходи описані в РпПйїр, Мої. Сеї! ВіоІ. (1994) 14:2411, та в УуоПепаїіп, Ргос. Май. Асад. Зсі. (1994) 91:1581.

С. Антитіло 01 та зв'язані з ним антитіла, поліпептиди, полінуклеотиди, вектори та клітини- хазяї

Даний винахід охоплює композиції, включаючи фармацевтичні композиції, що містять антитіло 1 та його варіанти, представлені в Таблиці 6, або поліпептид, одержаний з антитіла

С1 та його варіантів, представлених в Таблиці 6; та полінуклеотиди, що містять послідовності, кодуючі (31 та його варіанти або поліпептид. В деяких варіантах реалізації, композиції містять одно або декілька антитіл або поліпептидів (які можуть бути або не бути антитілом), які зв'язуються з СОКР, та/або один або декілька полінуклеотидів, що містять послідовності, кодуючі одно або декілька антитіл або поліпептидів, які зв'язуються з СОКР. Такі композиції можуть додатково містити придатні ексципієнти, такі як фармацевтично прийнятні ексципієнти, включаючи буфери, добре відомі фахівцям.

В деяких варіантах реалізації, антагоністичні антитіла анти СОКР та поліпептиди за винаходом виявляють будь-яку (одну або декілька) з таких характеристик: (а) зв'язування з

ССОРЕР; (Б) блокування зв'язування СОКР з його рецептором (рецепторами); (с) блокування або зниження активації рецептора СОСЕР (включаючи активацію САМР); (4) інгібування біологічної активності СОКР або метаболичних шляхів, медійованих сигнальною функцією СОКР; (є) запобігання, полегшення або зцілення будь-якого аспекту головного болю (наприклад, мігрені); (Її) збільшення кліренсу СОРБР; та (9) інгібування (зниження) синтезу СОКР, продукування або вивільнення.

В деяких варіантах реалізації, винахід передбачає будь-який з таких варіантів, або композиції (включаючи фармацевтичні композиції), що містять будь-який з таких варіантів: (а) антитіло 1 або його варіанти, представлені в Таблиці 6; (5) фрагмент або область антитіла 1 або його варіантів, представлених в Таблиці б; (с) легкий ланцюг антитіла 51 або його варіантів, представлених в Таблиці б; (4) важкий ланцюг антитіла 51 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; (е) одну або декілька варіабельних областей легкого ланцюга та/або важкого ланцюга антитіла 1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; (Її) один або декілька СОЄ (один, два, три, чотири, п'ять або шість СОК) антитіла 51 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; (4) СОК НЗ важкого ланцюга антитіла 1; (п) СОР 13 легкого ланцюга антитіла 1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; (її три СОК легкого ланцюга антитіла 51 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; () три СОК важкого ланцюга антитіла 51 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; (К) три СОК легкого ланцюга та три СОК важкого ланцюга, антитіла 1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; і (І) антитіло, що містить будь-який варіант з описаних в пунктах (Б) - (К). В деяких варіантах реалізації, винахід також передбачає поліпептиди, що містять будь-який один або декілька з вищевказаних варіантів.

Ділянки СОК антитіла 51 (включаючи СОК за системами Споїпіа та Кара)ю схематично зображені на фігурі 5. Визначення ділянок СОК добре відомо фахівцям в цій галузі техніки. Слід розуміти, що в деяких варіантах реалізації, СОМ можуть бути комбінацією СОР за системами

Кабраї та Споїйіа (також називаною "об'єднані СОК" або "розширені СОК"). В деяких варіантах реалізації СОМК є СОК за системою Кабраї. В інших варіантах реалізації СОК є СОК за системою СПоїпіа. Іншими словами, в варіантах реалізації з більш ніж одним СОК, СОК можуть бути будь-якими з Кабаї, Споїпіа, комбінованими СОК або їх комбінаціями.

В деяких варіантах реалізації, винахід передбачає поліпептид (який може бути або не бути антитілом), що містить щонайменше один СОК, щонайменше два, щонайменше три, або (610) щонайменше чотири, щонайменше п'ять, або усі шість СО, якій по суті ідентичний щонайменше одному СОК, щонайменше двом, щонайменше трьом, щонайменше чотирьом, щонайменше п'яти або усім шести СОК С1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6. Інші варіанти реалізації включають антитіла, що мають щонайменше два, три, чотири, п'ять або шість СОК(5), які по суті ідентичні щонайменше двом, трьом, чотирьом, п'яти або шести СО

С1, або одержані з С1. В деяких варіантах реалізації, щонайменше один, два, три, чотири, п'ять або шість СОК(5) є на щонайменше близько 85 95, 86 95, 87 95, 88 9, 89 9, 90 У, 95 о, 96 95, 97 95, 9895, або 99595 ідентичними по відношенню до щонайменше одного, двох, трьох, чотирьох, п'яти або шести СОК 1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6. Слід розуміти, що, в цілях даного винаходу, специфічність зв'язування та/або загальна активність звичайно зберігається, хоча ступінь прояву активності може змінюватися у порівнянні з 1 або його варіантами, представленими в Таблиці 6 (може бути більше або менше).

В деяких варіантах реалізації, винахід також передбачає поліпептид (який може бути або не бути антитілом), що містить амінокислотну послідовність С1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6, яка містить будь-який з таких варіантів: щонайменше 5 послідовно розташованих амінокислот, щонайменше 8 послідовно розташованих амінокислот, щонайменше близько 10 послідовно розташованих амінокислот, щонайменше близько 15 послідовно розташованих амінокислот, щонайменше близько 20 послідовно розташованих амінокислот, щонайменше близько 25 послідовно розташованих амінокислот, щонайменше близько 30 послідовно розташованих амінокислот з послідовності 1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6, де щонайменше 3 з амінокислот належать до варіабельної області 1 (Фігура 5) або його варіантів, представлених в Таблиці 6. В одному варіанті реалізації, варіабельна область належить до легкого ланцюга с1. В іншому варіанті реалізації, варіабельна область належить до важкого ланцюга 51. Типовий поліпептид містить послідовно розташовані амінокислоти (довжини вказані вище) з варіабельних ділянок як тяжкого, так і легкого ланцюгів 1. В іншому варіанті реалізації, 5 (або більше) послідовно розташованих амінокислот належать до ділянки, що визначає комплементарність (СОК) 1, представленої на Фігурі 5. В деяких варіантах реалізації, послідовно розташовані амінокислоти належать до варіабельної області 1.

Афінність зв'язування (Ко) антагоністичного антитіла анти СОКР та поліпептиду з СОКР (такого як людський а-СОКР) може становити від близько 0,06 до близько 200 нМ. В деяких варіантах реалізації, афінність зв'язування має будь-яке значення з близько 200 нМ, 100 нм, близько 50 нМ, близько 10 нМ, близько 1 нМ, близько 500 пМ, близько 100 пМ, близько 60 пМ, близько 50 пМ, близько 20 пМ, близько 15 пМ, близько 10 пМ, близько 5 пМ, або близько 2 пМ.

В деяких варіантах реалізації, афінність зв'язування має значення менше будь-якої величини з близько 250 нМ, близько 200 нМ, близько 100 нМ, близько 50 нМ, близько 10 нМ, близько 1 нМ, близько 500 пМ, близько 100 пМ, або близько 50 пМ.

В деяких варіантах реалізації, винахід також передбачає способи одержання будь-якого з таких антитіл або поліпептидів. Антитіла за даним винаходом можуть бути одержані з використанням процедур, відомих фахівцям. Поліпептиди можуть бути одержані шляхом протеолітичної або іншої деградації антитіл, рекомбінантними способами (наприклад, одноланцюгові (5зіпдіеє) або гібридні поліпептиди), як описано вище, або шляхом хімічного синтезу. Поліпептиди антитіл, особливо короткі поліпептиди довжиною до близько 50 амінокислот, зручно одержувати шляхом хімічного синтезу. Способи хімічного синтезу відомі фахівцям та є комерційно доступними. Наприклад, антитіло може бути одержано за допомогою автоматизованого поліпептидного синтезатора, що використовує твердофазовий метод. Див. також патенти США Мо 5807715; 4816567; та 6331415.

В іншій альтернативі, антитіла можуть бути одержані рекомбінантно з використанням процедур, добре відомих фахівцям. В одному варіанті реалізації, полінуклеотид містить послідовність, що кодує варіабельні ділянки важкого ланцюга та/або легкого ланцюга антитіла

С1, представленого в 5ЕБО ІО МО:9 та БО ІО МО:10. В іншому варіанті реалізації, полінуклеотид, що містить нуклеотидну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО:9 та 5ЕО ІО

МО:10, клонують в один або декілька векторів для експресії або розмноження. Послідовність, що кодує антитіло, яке представляє інтерес, може підтримуватися у векторі в клітині-хазянїні, і клітина-хазяїн може бути потім растягнута та заморожена для подальшого використання.

Вектори (включаючи експресійні вектори) та клітини-хазяї додатково описані в даному документі.

В деяких варіантах реалізації, винахід також охоплює одноланцюгові фрагменти варіабельної області ("5сЕм") антитіл за даним винаходом, таких як 1. Одноланцюгові фрагменти варіабельної області одержують шляхом зв'язування варіабельних областей легкого та/або важкого ланцюгів з використанням короткого зв'язувального пептиду. Віга еї аї. (1988) (610) осієпсе 242:423-426. Прикладом зв'язувального пептиду є (5005055)3 (ЗЕБО ІЮ МО: 57), який утворює місточок довжиною приблизно 3,5 нм між карбоксильним кінцем однієї варіабельної області та амінокінцем іншої варіабельної області. Були сконструйовані та використовувалися лінкери з іншими послідовностями. Вігі еї аї. (1988). Лінкери можуть бути, в свою чергу, модифіковані для забезпечення додаткових функцій, таких як приєднання лікарських засобів або приєднання до твердих підкладок. Одноланцюгові варіанти можуть бути одержані рекомбінантно або шляхом синтезу. Для одержання 5сЕм шляхом синтезу може бути використаний автоматизований синтезатор. Для рекомбінантного продукування 5сЕм, придатна плазміда, що містить полінуклеотид, кодуючий 5СЕм, може бути введена в придатну клітину- хазяїна, яка може бути еукаріотичною, такою як клітини дріжджів, рослин, комах або ссавців, або прокаріотичною, такою як Е. соїї. Полінуклеотиди, що кодують 5сЕм, який представляє інтерес, можуть бути одержані за допомогою рутинних маніпуляцій, таких як лігування полінуклеотидів. Одержаний 5сЕм може бути виділений з використанням стандартних методик очистки білків, відомих фахівцям.

Інші форми одноланцюгових антитіл, таких як діатела, також охоплені (даним документом).

Діатела є бівалентними, біспецифічними антитілами, у яких домени МН та Мі експресуються на одному поліпептидному ланцюзі, але з використанням лінкера, занадто короткого для того, щоб забезпечити можливість кон'югації двох доменів, розташованих в одному ланцюзі, тим самим примушуючи домени до кон'югації з комплементарними доменами іншого ланцюга та створюючи два антигензв'язуючих сайта (див. наприклад, Ноїїїдег, Р., еї аІ. (1993) Ргос. Маї!|. Асай 5сі. ОБА 90:6444-6448; Роак, В. »., єї а. (1994) бБігисішге 21121-1123).

Наприклад, біспецифічні антитіла, моноклональні антитіла, що виявляють специфічності зв'язування по відношенню до щонайменше двох різних антигенів, можуть бути одержані з використанням антитіла, розкритого в даному документі. Способи одержання біспецифічних антитіл відомі фахівцям (див., наприклад, Зигезі еї аї., 1986, МеїШйодз5 іп Еплутоїіоду 121:210).

Традиційно, рекомбінантне продукування біспецифічних антитіл було основано на коекспресії двох пар важкий ланцюг-легкий ланцюг імуноглобуліну, причому два важкі ланцюги мають різні специфічності (Міїїзівїіп апа Сиве, 1983, Маїиге 305, 537-539).

Згідно з одним підходом до одержання біспецифічних антитіл, варіабельні домени антитіла 3 бажаними специфічностями зв'язування (паратопи антитіло-антиген) зливають з послідовностями константного домену імуноглобуліну. Злиття краще проводять з константним доменом важкого ланцюга імуноглобуліну, що містить щонайменше частину шарнірної, СН2 та

СНЗ ділянок. Краще, щоб константна область першого важкого ланцюга (СНІ), що містить сайт, необхідний для зв'язування легкого ланцюга, була присутньою в щонайменше одному з (продуктів) злиття. ДНК, що кодують (продукти) злиття важкого ланцюга імуноглобуліну і, при необхідності, легкого ланцюга імуноглобуліну, вставляють в різні експресійні вектори та спільно трансфекують в придатний організм-хазяїн. Це забезпечує більшу гнучкість в регулюванні взаємного співвідношення трьох поліпептидних фрагментів у варіантах реалізації, коли нерівні співвідношення трьох поліпептидних ланцюгів, використовуваних при конструюванні, забезпечують оптимальний вихід. Однак, можна вставляти кодуючі послідовності двох або усіх трьох поліпептидних ланцюгів в один експресійний вектор, якщо експресія щонайменше двох поліпептидних ланцюгів в рівних співвідношеннях приводить до високого виходу, або якщо величини співвідношень не мають особливого значення.

В одном підході, біспецифічні антитіла складаються з важкого ланцюга гібридного імуноглобуліну з першою специфічністю зв'язування в одній гілці, та пари важкий ланцюг-легкий ланцюг гібридного імуноглобуліну (що забезпечує другу специфічність зв'язування) в іншій гілці.

Така асиметрична структура, з легким ланцюгом імуноглобуліну тільки в одній половині біспецифічної молекули, полегшує розділення бажаної біспецифічної сполуки та небажаних комбінацій імуноглобулінових ланцюгів. Цей підхід описаний в публікації РСТ Мо УМО 94/04690, опублікованій З березня 1994 р.

Гетерокон'юговані антитіла, що містять два ковалентно зв'язані антитіла, також входять до обсягу винаходу. Такі антитіла використовувалися для націлювання клітин імунної системи на небажані клітини (патент США Мо 4676980), та для лікування інфекції ВІЛ (публікації заявок РСТ

МоМо УМО 91/00360 та УМО 92/200373; ЕР 03089). Гетерокон'юговані антитіла можуть бути одержані з використанням будь-яких зручних способів зшивання. Придатні зшивальні агенти та методики добре відомі фахівцям, та описані в патенті США Мо 4676980.

Химерні або гібридні антитіла також можуть бути одержані іп міго з використанням відомих способів хімічного синтезу білків, включаючи способи, що передбачають використання зшивальних агентів. Наприклад, імунотоксини можуть бути сконструйовані з використанням реакції дисульфідного обміна або шляхом утворення тіоефірного зв'язку. Приклади реагентів, (610) придатних для цієї мети, включають імінотіолят та метил-4-меркаптобутирімідат.

Гуманізоване антитіло, що містить один або декілька СОЄК. антитіла С1 або його варіантів, представлених в Таблиці б, або один або декілька СОК, виділених з антитіла 51 або його варіантів, представлених в Таблиці б, можуть бути одержані з використанням будь-яких способів, відомих фахівцям. Наприклад, для гуманізації моноклонального антитіла можуть бути використані чотири загальних стадії.

В деяких варіантах реалізації, винахід охоплює модифікації антитіла С1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6, включаючи функціонально еквівалентні антитіла, які суттєво не відрізняються за своїми властивостями, та варіанти, що мають підвищену або знижену активність та/або афінність. Наприклад, амінокислотна послідовність антитіла 51 або його варіантів, представлених в Таблиці 6, може бути мутована для одержання антитіла з бажаною афінністю зв'язування з СОКР. Модифікація поліпептидів є рутинною практикою в цій галузі техніки та не потребує детального опису в даному документі. Типові приклади модифікації поліпептидів наведені в Прикладах. Приклади модифікованих поліпептидів включають поліпептиди з консервативними заміщеннями амінокислотних залишків, одну або декілька делецій або адицій амінокислот, які не погіршують в значному ступені функціональну активність, або використання хімічних аналогів.

Інсерції амінокислотних послідовностей включають аміно- та/або карбоксикінцеві злиття, що мають довжину в діапазоні від одного залишку до поліпептидів, що містять сто або більше залишків, а також інсерції одного або множини амінокислотних залишків усередині послідовності. Приклади термінальних інсерцій включають антитіло з М-кінцевим метіонільним залишком або антитіло, злите з епітопом-міткою. Інші інсерційні варіанти молекули антитіла включають приєднання до М- або С-кінця антитіла ферменту або поліпептиду, який збільшує період напіввиведення антитіла з сироватки.

Варіанти заміщення мають видалення щонайменше одного амінокислотного залишку в молекулі антитіла та вставку іншого залишку на його місце. Сайти, що представляють найбільший інтерес для замісного мутагенезу, включають гіперваріабельні області, але передбачаються також зміни каркасних областей (ЕК). Консервативні заміщення представлені в

Таблиці 1 під заголовком "консервативні заміщення". Якщо такі заміщення приводять до зміни біологічної активності, то можуть бути введені більш значні зміни, позначені як "типові заміщення" в Таблиці 1, або як додатково описано нижче з посиланням на класи амінокислот, і продукти можуть бути піддані скринінгу.

Таблиця 1:

Амінокислотні заміщення

Мед 77771717 ен (се; Маї; Меї; Аа; Рпє; норлейцин бе 77777171 Ме 77777711 |норлейцин; Пе; Маї; Меї; Аа; Рре

Суттєві модифікації біологічних властивостей антитіла здійснюються шляхом вибору заміщень, які значно відрізняються за своїм ефектом на зберігання (а) структури поліпептидного скелета в області заміщення, наприклад, такої як конформація листа або спіралі, (65) заряд або гідрофобність молекули в цільовому сайті, або (с) об'єм бічного ланцюга. Залишки, що зустрічаються в природі, розділені на групи на основі загальних властивостей бічних ланцюгів: (1) Неполярні: норлейцин, Меї, Аа, мМаї, Гей, Пе; (2) Полярні без заряду: Сув, Зег, ТПг, Авп, Сп; (3) Кислотні (негативно заряджені): А5р, Сім; (4) Основні (позитивно заряджені): Г ув, Ага; (5) Залишки, що впливають на орієнтацію ланцюга: Су, Рго; та (6) Ароматичні: Тгр, Туг, Ре, Нів.

Неконсервативні заміщення проводять шляхом заміни члена одного з цих класів на інший клас.

Будь-який цистеїновий залишок, що не бере участі в зберіганні належної конформації антитіла, також може бути заміщений, звичайно на серин, для поліпшення стійкості молекули до окиснення та попередження аберантного зшивання. Навпаки, цистеїновий зв'язок (зв'язки) може бути доданий в антитіло для поліпшення його стабільності, особливо в тих випадках, коли антитіло є фрагментом антитіла, таким як фрагмент Гу.

Амінокислотні модифікації можуть змінюватися від заміни або модифікації однієї або декількох амінокислот до повної перебудови області, такої як варіабельна область. Зміни у варіабельній області можуть змінювати афінність зв'язування та/або специфічність. В деяких варіантах реалізації, в СОК-домені виконується не більш ніж від одного до п'яти консервативних амінокислотних заміщень. В інших варіантах реалізації, в СОК-домені виконується не більш ніж від одного до трьох консервативних амінокислотних заміщень. В інших варіантах реалізації,

СОВ-домен є СОЕ НЗ та/або СОР 1 3.

Модифікації також включають глікозильовані та неглікозильовані поліпептиди, а також поліпептиди 3 іншими посттрансляційними модифікаціями, такими як, наприклад, глікозилювання різними цукрами, ацетилювання та фосфорилювання. Антитіла глікозилюють в консервативних положеннях в їх константних областях (депегі5 апа І ипа, 1997, Спет. Іттипої. 65:111-128; МУпйдні апа Моттізоп, 1997, ТІБТЕСН 15:26-32). Олігосахаридні бічні ланцюги імуноглобулінів впливають на функцію білка (Воуй еї аїЇ., 1996, Мої. Іттипої. 32:1311-1318;

ММіймше апа Номага, 1990, Віоспет. 29:4175-4180) та внутрішньомолекулярні взаємодії між частинами глікопротеїну, що може відбиватися на конформації та презентованій тривимірній поверхні глікопротеїну (НепПегіз апа ГГ ипа, зирга; Умуз5 апа М/адпег, 1996, Ситепі Оріп. Віотесп. 7:409-416). Олігосахариди можуть також служити для націлювання даного глікопротеїну на певні молекули на основі специфічних структур розпізнавання. Також повідомлялося, що глікозилювання антитіл впливає на опосередковану антитілами клітинну цитотоксичність (АОСС). Зокрема, повідомлялося, що клітини СНО з тетрациклін-регульованою експресією

ВО1,4)-М-ацетилглюкозамінілтрансферази ПІ (пт), яка є глікозилтрансферазою, що каталізує утворення СІСМАс в точках розгалуження, виявляють підвищену АЮОСС -активність (Штапа еї аї., 1999, Маште Віоїесн. 17:176-180).

Глікозилювання антитіл типово є М-зв'язаним або О-зв'язаним. М-зв'язаний стосується приєднання вуглеводного фрагмента до бічного ланцюга аспарагінового залишку. Трипептидні послідовності аспарагін-Х-серин, аспарагін-Х-треонін та аспарагін-Х-цистеїн, де Х позначає будь-яку амінокислоту за винятком проліну, є послідовностями розпізнавання для ферментативного приєднання вуглеводного фрагмента до аспарагінового бічного ланцюга.

Таким чином, присутність будь-якої з цих трипептидних послідовностей в поліпептиді створює потенційний сайт глікозилювання. О-зв'язане глікозилювання стосується приєднання одного з цукрів М-ацетилгалактозаміну, галактози або ксилози до оксіамінокислоти, найчастіше серину або треоніну, хоча можуть бути використані також 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин.

Додавання сайтів глікозилювання в антитіло зручно здійснюється шляхом зміни амінокислотної послідовності таким чином, щоб вона містила одну або декілька з вищеописаних трипептидних послідовностей (для сайтів М-зв'язаного глікозилювання). Альтернатива також може бути одержана шляхом адиції, або заміщення, одного або декількох серинових або треонінових залишків, в послідовності вихідного антитіла (для сайтів О-зв'язаного глікозилювання).

Характер глікозилювання антитіл також може бути змінений без зміни базової нуклеотидної послідовності. Глікозилювання в значному ступені залежить від клітини-хазяїна, використовуваної для експресії антитіла. Оскільки типи клітин, використовуваних для експресії рекомбінантних глікопротеїнів, наприклад, антитіл, як потенційних терапевтичних засобів, рідко (610) Є нативними клітинами, можна очікувати варіації в характері глікозилювання антитіл (див.,

наприклад, Нзе еї аї., 1997, 9. Віо!. Спет. 272:9062-9070).

На додаток до вибору клітин-хазяїв, фактори, що впливають на глікозилювання при рекомбінантному продукуванні антитіл, включають спосіб вирощування, рецептуру середовища, густину культури, оксигенацію, рН, схеми очистки тощо. Були запропоновані різні способи для зміни характеру глікозилювання, забезпечуваного в конкретному організмі-хазяїні, включаючи введення або надекспресію певних ферментів, що беруть участь в продукуванні олігосахариду (патенти США Мо 5047335; 5510261 та 5278299). Глікозилювання, або певні типи глікозилювання, можуть бути ферментативно видалені з глікопротеїну, наприклад, з використанням ендоглікозидази Н (Епдо Н), М-глікозидази Є, ендоглікозидази 1, ендоглікозидази Е2, ендоглікозидази ЕЗ. Додатково, рекомбінантна клітина-хазяїн може бути генетично модифікована для перетворення на дефектну щодо переробки певних типів полісахаридів. Ці та схожі методики добре відомі фахівцям.

Інші способи модифікації включають використання методик зв'язування, відомих фахівцям, включаючи, без обмежень, ферментативні способи, окисне заміщення та хелатоутворення.

Модифікації можуть бути використані, наприклад, для приєднання міток для імунологічного аналізу. Модифіковані поліпептиди 51 можуть бути одержані з використанням відпрацьованих процедур в цій галузі техніки та можуть бути піддані скринінгу з використанням стандартних методів аналізу, відомих фахівцям, деякі з яких описані нижче та в Прикладах.

В деяких варіантах реалізації винаходу, антитіло містить модифіковану константну область, таку як константна область, що є імунологічно інертною або частково інертною, наприклад, не ініціює медійований комплементом лізис, не стимулює опосередковану антитілами клітинну цитотоксичність (АБСС), або не активує мікроглію; або має знижені (у порівнянні з немодифікованим антитілом) будь-яку одну або декілька з таких активностей: інициювання медійованого комплементом лізису, стимулювання опосередкованої антитілами клітинної цитотоксичності (ОСС), або активування мікроглії. Різні модифікації константної області можуть бути використані для досягнення оптимального рівня та/або комбінації ефекторних функцій. Див., наприклад, Могдап еї аї., Іттипоіоду 86:31 9-324 (1995); І шипа еї а!., 9. ІттипоЇоду 157:4963-9 157 :4963-4969 (1996); Ідизодіє еї а!., 9У. Іттипоїоду 164:4178-4184 (2000); Тао еї аї.,

У. Тттипоіоду 143: 2595-2601 (1989); та Уеїегіз еї аї., Іттипоїодіса! Кеміем5 163:59-76 (1998). В деяких варіантах реалізації, константна область є модифікованою, як описано в Єиг. 9. Іттипої. (1999) 29:2613-2624; заявці РСТ Мо РСТ/5899/01441; та/або патентній заявці Великобританії Мо 9809951.8. В інших варіантах реалізації, антитіло містить константну область важкого ланцюга людського Ідс2, що містить такі мутації: АЗЗОРЗ331 на 53305331 (нумерація амінокислот згідно з послідовністю Ідс2 дикого типу). Еиг. У. Іттипої. (1999) 29:2613-2624. В інших варіантах реалізації, константна область аглікозильована для М-зв'язаного глікозилювання. В деяких варіантах реалізації, константна область аглікозильована для М-зв'язаного глікозилювання шляхом мутації глікозильованого амінокислотного залишку або фланкуючих залишків, які є частиною послідовності розпізнавання М-глікозилювання в константній області. Наприклад,

М297 сайта М-глікозилювання може бути мутований на А, 0, К, або Н. Див., Тао еї аї.,..

Іттипоїоду 143: 2595-2601 (1989); та УдеПегів еї аї!., Іттипоїодіса!І Кемем/5 163:59-76 (1998). В деяких варіантах реалізації константна область аглікозильована для /М-зв'язаного глікозилювання. Константна область може бути аглікозильована для /М-зв'язаного глікозилювання ферментативно (наприклад, шляхом видалення вуглеводу ферментом РМСазе (пептид-М-глікозидаза)), або шляхом експресії в дефіцитній щодо глікозилювання клітині-хазяїні.

Інші модифікації антитіла включають антитіла, модифіковані, як описано в публікації РСТ Мо

МО 99/58572, опублікованій 18 листопада 1999 р. Ці антитіла містять, на додаток до зв'язувального домену, націленого на молекулу-мішень, ефекторний домен, що має амінокислотну послідовність, по суті гомологічну всьому або частині константного домену важкого ланцюга людського імуноглобуліну. Такі антитіла здатні зв'язуваться з молекулою- мішенню без ініціювання значного комплементзалежного лізису, або клітинно-медійованої деструкції мішені. В деяких варіантах реалізації, ефекторний домен є здатним специфічно зв'язувати ЕГсКп та/або ЕсуКІІр. Вони типово основані на химерних доменах, виділених з двох або більше Сн2 доменів важкого ланцюга людського імуноглобуліну. Антитіла, модифіковані у такий спосіб, є особливо придатними для використання в хронічній терапії антитілами, щоб уникнути запальних та інших небажаних реакцій на звичайну терапію антитілами.

В деяких варіантах реалізації, винахід включає варіанти реалізації зі зрілою афінністю.

Наприклад, антитіла зі зрілою афінністю можуть бути одержані за допомогою процедур, відомих фахівцям (Магкз: еї аї., 1992, Віо/Гесппоїоду, 10:779-783; Вагбаз вї аї!., 1994, Ргос Маї. Асад. 5сі,

ИБА 91:3809-3813; ЗсНіег еї аЇ., 1995, Сепе, 169:147-155; Меп еї аї., 1995, у). Іттипої., (610) 155:1994-2004; даскзоп еї аї., 1995, 9. Іттипої., 154(7):3310-9; НамкКіпз еї аї, 1992, 9. Мої. Віо!.,

226:889-896; та УМО2004/058184).

Такі способи можуть бути використані для регуляції афінності антитіла та для характеризації

СОК. Один зі способів характеризації СОЕ антитіла та/або зміни (такої як поліпшення) афінності зв'язування поліпептиду, такого як антитіло, називається "мутагенез зі скануванням бібліотеки".

Загалом, мутагенез зі скануванням бібліотеки працює таким чином. Одно або декілька амінокислотних положень в СОК заміщають двома або більше (наприклад, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, або 20) амінокислотами з використанням відомих фахівцям способів. В результаті цього одержують маленькі бібліотеки клонів (в деяких варіантах реалізації, по одній для кожного аналізованого амінокислотного положення), кожна зі складністю в два або більше членів (якщо дві або більше амінокислот використовують для заміщення кожного положення). Звичайно, бібліотека також включає клон, що містить нативну (незаміщену) амінокислоту. Невелика кількість клонів, наприклад, близько 20-80 клонів (в залежності від складності бібліотеки), з кождої бібліотеки піддають скринінгу на афінність зв'язування з поліпептидом-мішенню (або іншою мішенню зв'язування), та ідентифікують кандидати з підвищеним, таким самим, зниженим, або без зв'язування. Способи визначення афінності зв'язування добре відомі фахівцям. Афінність зв'язування може бути визначена з використанням аналізу поверхневого плазмонного резонансу методом Віасоге, який детектує відмінності в афінності зв'язування близько в 2 рази або більше. Віасоге особливо корисний в тих випадках, коли вихідне антитіло вже зв'язується з відносно високою афінністю, наприклад, має Ко, рівну близько 10 нМ або менше. Скринінг з використанням поверхневого плазмонного резонансу Віасоге описаний в даному документі в Прикладах.

Афінність зв'язування може бути визначена з використанням Кіпеха Віосепвог, сцинтиляційних аналізів зближення, ІФА, імунологічного аналізу ОКІСЕМ (ІСЕМ), гасіння флуоресценції, перенесення флуоресценції, та/або дріжджового дисплея. Афінність зв'язування також може бути піддана скринінгу з використанням придатного біоаналізу.

В деяких варіантах реалізації, кожне амінокислотне положення в СОК заміщають (в деяких варіантах реалізації, по одному за раз) усіма 20 природними амінокислотами з використанням відомих фахівцям способів мутагенезу (деякі з яких описані в даному документі). В результаті цього одержують маленькі бібліотеки клонів (в деяких варіантах реалізації, по одній на кожне аналізоване амінокислотне положення), кожна зі складністю в 20 членів (якщо кожне положення заміщається усіма 20 амінокислотами).

В деяких варіантах реалізації, бібліотека для використання при скринінгу містить заміщення в двох або більше положеннях, які можуть знаходитися в одному СОК або в двох або більше

СОК. Таким чином, бібліотека може містити заміщення в двох або більше положеннях в одному

СОН. Бібліотека може містити заміщення в двох або більше положеннях в двох або більше

СОК. Бібліотека може містити заміщення в 3, 4, 5 або більше положеннях, причому зазначені положення розташовані в двох, трьох, чотирьох, п'яти або шести СОК. Заміщення може бути одержане з використанням кодонів з низькою надмірністю. Див., наприклад, Таблицю 2 в Ваїїпі еї а!., (1993) Сепе 137(1):109-18).

СОК може бути СОКНЗ та/або СОМКІ 3. СОК може бути одним або декількома з СОРКІ 1,

СОРІ2, СОКІ З, СОБНІ, СОКН?О, та/"або СОКНЗ. СОК може бути СОЕК за системою Кабаї, СОК за системою Споїпіа або розширеним СОН.

Кандидати з поліпшенним зв'язуванням можуть бути секвеновані, з ідентифікацією при цьому мутанта із заміщенням СОК, яке приводить до підвищеної афінності (також називаним "поліпшеним" заміщенням). Кандидати, здатні зв'язуватися, також можуть бути секвеновані, з ідентифікацією при цьому заміщень СОЕ, при яких зберігається зв'язування.

Може бути проведена множина раундів скринінгу. Наприклад, кандидати (кожний містить амінокислотне заміщення в одному або декількох положеннях одного або декількох СОК) з поліпшеним зв'язуванням також придатні для конструювання другої бібліотеки, що містить щонайменше вихідну та заміщену амінокислоту в кожному поліпшеному положенні СОЕК (тобто, амінокислотному положенні в СОК, у якому мутант із заміщенням продемонстрував поліпшене зв'язування). Приготування та скринінг або селекція такої бібліотеки додатково описані нижче.

Мутагенез зі скануванням бібліотеки також передбачає засоби для характеризації СОЕК, в тому ступені, у якому частота клонів з поліпшеним зв'язуванням, таким самим зв'язуванням, зниженим зв'язуванням або відсутністю зв'язування також містить інформацію о важливості кожного амінокислотного положення для стабільності комплексу антитіло-антиген. Наприклад, якщо певне положення СОК зберігає зв'язування при заміні на усі 20 амінокислот, то це положення ідентифікується як положення, яке з низькою ймовірністю є потрібним для зв'язування антигену. Навпаки, якщо певне положення СОК зберігає зв'язування тільки при (610) невеликій частці заміщень, то це положення ідентифікується як положення, важливе для 5О0 функції СОК. Таким чином, способи мутагенезу зі скануванням бібліотеки дають інформацію, що стосується положень в СОК, які можуть бути замінені на різні амінокислоти (включаючи усі 20 амінокислот), та положень в СОК, які не можуть бути змінені або які можуть бути замінені тільки на декілька амінокислот.

Кандидати з поліпшеною афінністю можуть бути об'єднані в другу бібліотеку, яка включає поліпшену амінокислоту, вихідну амінокислоту в даному положенні, та може додатково включати додаткові заміщення в даному положенні, в залежності від складності бібліотеки, що є бажаною або припустимою при використанні бажаного способу скринінгу або селекції.

Додатково, при необхідності, прилеглі амінокислотні положення можуть бути рандомізовані щонайменше двома або більше амінокислотами. Рандомізація прилеглих амінокислот може забезпечити додаткову конформаційну гнучкість мутантної СОК, яка може, в свою чергу, забезпечити можливість або сприяти введенню більшої кількості поліпшуючих мутацій.

Бібліотека може також містити заміщення в положеннях, які не демонструють поліпшеної афінності в першому раунді скринінгу.

Друга бібліотека піддається скринінгу або селекції членів бібліотеки з поліпшеною та/або зміненою афінністю зв'язування з використанням будь-якого способу, відомого фахівцям, включаючи скринінг з використанням аналізу поверхневого плазмонного резонансу методом

Віасоге, та селекцію з використанням будь-якого способу селекції, відомого фахівцям, включаючи фаговий дисплей, дріжджовий дисплей та рибосомальний дисплей.

В деяких варіантах реалізації, винахід також охоплює гібридні білки, що містять один або декілька фрагментів або областей антитіл (таких як С1) або поліпептидів за даним винаходом.

В одному варіанті реалізації, передбачається гібридний поліпептид, який містить щонайменше 10 послідовно розташованих амінокислот варіабельної області легкого ланцюга, представленої в ЗЕО ІЮ МО:2 (Фігура 5) та/"або щонайменше 10 амінокислот варіабельної області важкого ланцюга, представленої в ЗЕО ІЮ МО':1 (Фігура 5). В інших варіантах реалізації, передбачається гібридний поліпептид, який містить щонайменше близько 10, щонайменше близько 15, щонайменше близько 20, щонайменше близько 25, або щонайменше близько 30 послідовно розташованих амінокислот варіабельної області легкого ланцюга, представленої в ЗЕО ІЮ МО:2 (Фігура 5), талабо щонайменше близько 10, щонайменше близько 15, щонайменше близько 20, щонайменше близько 25, або щонайменше близько 30 послідовно розташованих амінокислот варіабельної області важкого ланцюга, представленої в 5ЗЕО ІЮ МО:1 (Фігура 5). В іншому варіанті реалізації, гібридний поліпептид містить варіабельну область легкого ланцюга та/або варіабельну область важкого ланцюга с1, як показано в ЗЕО ІЮ МО:2 та 5ЕО ІЮ МО:1 Фігури 5.

В іншому варіанті реалізації, гібридний поліпептид містить один або декілька СОК(5) 1. В інших варіантах реалізації, гібридний поліпептид містить СОМ НЗ та/або СОК ІЗ антитіла С1. В цілях даного винаходу, гібридний білок (31 містить одно або декілька антитіл 1 та іншу амінокислотну послідовність, 3 якою воно не зв'язано в нативній молекулі, наприклад, гетерологічну послідовність або гомологічну послідовність з іншої області. Типові приклади гетерологічних послідовностей включають, без обмежень, "мітку", таку як мітка ГГ Ас або мітка бНІі5 (ЗЕО І МО: 56). Мітки добре відомі фахівцям.

Гібридний поліпептид 51 може бути створений способами, відомими фахівцям, наприклад, шляхом синтезу або рекомбінантно. Типово, гібридні білки 1 за даним винаходом одержують шляхом приготування та (ап) експресії полінуклеотиду, що їх кодує, з використанням рекомбінантних способів, описаних в даному документі, хоча вони також можуть бути одержані іншими способами, відомими фахівцям, включаючи, наприклад, хімічний синтез.

В деяких аспектах, даний винахід також передбачає композиції, що містять антитіла або поліпептиди, одержані з (31, кон'югованого (наприклад, зв'язаного) з агентом, який сприяє зв'язуванню з твердою підкладкою (такою як біотин або авідин). Для простоти, звичайно буде робитися посилання на 1 або антитіла, припускаючи, що дані способи є застосовними до будь-яких варіантів реалізації зв'язування СОР, описаних в даному документі. Кон'югація звичайно стосується зв'язування таких компонентів, як описано в даному документі. Зв'язування (яке звичайно закріплює такі компоненти в щільному зв'язку щонайменше для введення) може бути здійснено будь-яким з ряду способів. Наприклад, можлива пряма реакція між агентом та антитілом, коли кожен з них має замісник, здатний реагувати з іншим. Наприклад, нуклеофільна група, така як аміно або сульфгідрильна група, на одному (з них) може бути здатною реагувати з карбонілвмісною групою, такою як ангідрид або галогеноангідрид, або з алкільною групою, що містить придатну відхідну групу (наприклад, галогенід) на іншому.

Антитіло або поліпептид можуть бути зв'язані з агентом-міткою (альтернативно називаним "мітка"), таким як флуоресцентна молекула, радіоактивна молекула або будь-які інші мітки, (610) відомі фахівцям. Фахівцям відомі мітки, які звичайно забезпечують (прямо або опосередковано)

сигнал.

В деяких варіантах реалізації, винахід також передбачає композиції (включаючи фармацевтичні композиції) та набори, що містять антитіло 51, та/або будь-яке з або усі антитіла або поліпептиди, описані в даному документі.

В деяких варіантах реалізації, винахід також передбачає виділені полінуклеотиди, що кодують антитіла та поліпептиди за винаходом (включаючи антитіло, що містить поліпептидні послідовності варіабельних областей легкого ланцюга та важкого ланцюга, представлені на

Фігурі 5), і вектори та клітини-хазяї, що містять полінуклеотид.

В деяких варіантах реалізації, винахід передбачає полінуклеотиди (або композиції, включаючи фармацевтичні композиції), які містять полінуклеотиди, що кодують будь-які матеріали з таких: (а) антитіло 51 або його варіанти, представлені в Таблиці 6; (Б) фрагмент або область антитіла 51 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; (с) легкий ланцюг антитіла С1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; (4) важкий ланцюг антитіла 1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; (є) одну або декілька варіабельних областей легкого ланцюга та/або важкого ланцюга антитіла 1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; (ї) один або декілька СОК (один, два, три, чотири, п'ять або шість СОК) антитіла 51 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; (9) СОК НЗ важкого ланцюга антитіла 51; (п) СОК І З легкого ланцюга антитіла С1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; (ї) три СОК легкого ланцюга антитіла 51 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; () три СОК важкого ланцюга антитіла 51 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; (Кк) три СОК легкого ланцюга та три СОК важкого ланцюга, антитіла 1 або його варіантів, представлених в Таблиці 6; і (І) антитіло, що містить будь-який варіант з описаних в пунктах (Б) - (К). В деяких варіантах реалізації, полінуклеотид містить будь-який з або обидва полінуклеотиди, представлені в ЗЕ

ІО МО: 9 та 5ЕО ІЮО МО: 10.

В іншому аспекті, винахід передбачає полінуклеотиди, що кодують будь-які антитіла (включаючи фрагменти антитіл) та поліпептиди, описані в даному документі, такі як антитіла та поліпептиди, що мають порушену ефекторну функцію. Полінуклеотиди можуть бути одержані за допомогою процедур, відомих фахівцям.

В іншому аспекті, винахід передбачає композиції (такі як фармацевтичні композиції), що містять будь-які полінуклеотиди за винаходом. В деяких варіантах реалізації, композиція містить експресійний вектор, що містить полінуклеотид, який кодує антитіло 51, як описано в даному документі. В іншому варіанті реалізації, композиція містить експресійний вектор, що містить полінуклеотид, який кодує будь-які антитіла або поліпептиди, описані в даному документі. В інших варіантах реалізації, композиція містить будь-який з або обидва полінуклеотиди, представлені ЗЕО ІЮ МО:9 та БЕО ІЮО МО:10. Експресійні вектори та введення полінуклеотидних композицій додатково описані в даному документі.

В іншому аспекті, винахід передбачає спосіб одержання будь-яких полінуклеотидів, описаних в даному документі.

Полинуклеотиди, комплементарні будь-яким таким послідовностям, також входять до обсягу даного винаходу. Полінуклеотиди можуть бути одноланцюговими (кодуючими або антисмисловими) або дволанцюговими, та можуть бути молекулами ДНК (геномними, кКДНК або синтетичними) або РНК. Молекули РНК включають молекули гетерогенної ядерної РНК (гяЯРНК), які містять інтрони та однозначно відповідають молекулі ДНК, та молекули мРНК, які не містять інтрони. Додаткові кодуючі або некодуючі послідовності можуть, але не обов'язково, бути присутніми в полінуклеотиді за даним винаходом, і полінуклеотид може, але не обов'язково, бути зв'язаний з іншими молекулами та/або матеріалами підкладки.

Полинуклеотиди можуть містити нативну послідовність (тобто, ендогенну послідовність, яка кодує антитіло або його частину) або можуть містити варіант такої послідовності. Варіанти полінуклеотидів містять одно або декілька заміщень, адицій, делецій та/або інсерцій таким чином, щоб імунореактивність кодованого поліпептиду не знижувалася у порівнянні з нативною імунореактивною молекулою. Ефект кодованого поліпептиду на імунореактивність можна звичайно оцінити, як описано в даному документі. Варіанти переважно виявляють щонайменше близько 70 95 ідентичності, ще краще, щонайменше близько 80 95 ідентичності, і ще краще, щонайменше близько 90 95 ідентичності з полінуклеотидною послідовністю, що кодує нативне антитіло або його частину.

Говорять, що дві полінуклеотидні або поліпептидні послідовності є "ідентичними", якщо порядок розташування нуклеотидів або амінокислот в двох послідовностях є однаковим при вирівнюванні з максимальною відповідністю, як описано нижче. Порівняння двох послідовностей типово проводять шляхом порівнювання послідовностей у вікні порівняння з 10) метою ідентифікації та порівняння подібності локальних ділянок послідовностей. "Вікно порівняння", у використовуваному в даному документі значенні, стосується сегменту, що складається з щонайменше близько 20 послідовно розташованих позицій, звичайно від 30 до близько 75, від 40 до близько 50, у якому послідовність може порівнюватися з референсною послідовністю, що складається з такого саме числа послідовно розташованих позицій після вирівнювання двох послідовностей.

Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути проведено з використанням програми Медаїїдп з пакету прикладних біоїнформаційних програм І азегдепе (ОМАЗТАК, Іпс., Майдізоп, УМ), з використанням параметрів за умовчанням. Ця програма реалізує декілька схем вирівнювання, описаних в таких літературних джерелах: Баупоїї, М.О. (1978) А тоабеї ої емоішіопагу спапде іп ргоївіп5-Маїгісез Тог аетесііпд аїєтапі геіайопзпірзв. в книге:

ОБаупойї, М.О. (ед.) АйШа5 ої Ргоївіп бедиепсе апа Зігисійге, Маїййопа! Віотедіса! Везеєагсп

Еоипаайоп, М/азпіпдіоп ОС Мої. 5, Биррі. 3, рр. 345-358; Неїп 9., 1990, Опійей Арргоасп юЮ

Аїїдптепі апа Рпуіодепез рр. 626-645 Меїпод5 іп Епгутоіоду мої. 183, Асадетіс Ргезв, Іпс., Зап

Оієдчо, СА; Ніддіп5, О.С. апа 5Нагр, Р.М., 1989, САВІОБ5 5:151-153; Муєгв, Е.М. апа МиПег МУ., 1988, САВІО5 4:11-17; Вобіпзоп, Е.О., 1971, ботбр. Тнеог. 11:105; Запіои, М., Мев, М., 1987, Мо).

Віо!. Емої. 4:406-425; Зпеаїй, Р.Н.А. апа 5окаї, В.В., 1973, Митеїгса! Тахопоту Пе Р'гіпсіріє5 апа

Ргасіїсе ої Митегіса!| Тахопоту, Егеетап Ргез5, Зап Егапсізсо, СА; МПритг, МУ.). апа Гіртап, 0.)., 1983, Ргос. Маї)!. Асад. 5сі. ОБА 80:726-730.

Краще, "процент ідентичності послідовностей" визначається шляхом порівняння двох вирівняних послідовностей у вікні порівняння, що складається з щонайменше 20 позицій, причому частина послідовності полінуклеотиду або поліпептиду у вікні порівняння може містити адиції або делеції (тобто пропуски), що складають 20 процентів або менше, звичайно від 5 до 15 процентів, або від 10 до 12 процентів, у порівнянні з референсними послідовностями (що не містять адиції або делеції) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Процент обчислюється шляхом визначення числа позицій, у яких в обох послідовностях знаходяться ідентичні основи нуклеїнових кислот або амінокислотні залишки, з одержанням числа співпадаючих позицій, ділення числа співпадаючих позицій на загальне число позицій в референсній послідовності (тобто розмір вікна), та множення результатів на 100, з одержанням процента ідентичності послідовностей.

Варіанти можуть також, або альтернативно, бути по суті гомологічними по відношенню до нативного гена, або його частини або комплементу. Такі полінуклеотидні варіанти здатні гібридизуватися в помірно жорстких умовах з природною послідовністю ДНК, що кодує нативне антитіло (або комплементарною послідовністю).

Придатні "помірно жорсткі умови" включають попередню промивку розчином 5х55С, 0,5 Фо 505, 1,0 мМ ЕДТА (рн 8,0); гібридизацію при 50-65 С, 5х55С, протягом ночі; з подальшою промивкою двічі при 65 "С протягом 20 хвилин кожним з 2х, 0,5х та 0,2х5552, що містить 0, 1 95

ОБ.

У використовуваному в даному документі значенні, "високожорсткими умовими" або "умовими високої жорсткости" є такі, у яких: (1) використовуються низька іонна сила та висока температура для промивки, наприклад, 0,015 М хлориду натрію/0,0015 М цитрату натрію/0,1 Фо додецилсульфату натрію при 50 "С; (2) використовується денатуруючий агент під час гібридизації, такий як формамід, наприклад, 5095 (о0б./06.) формаміду з 0,195 бичачого сироваткового альбуміну/0,1 95 фіколу/0,1 95 полівінілпіролідону/50 мМ натрійфосфатного буфера з рН 6,5, з 750 мМ хлориду натрію, 75 мМ цитрату натрію при 42 "С; або (3) використовуються 5095 формамід, 5х55С (0,75 М Масі, 0,075 М цитрату натрію), 50 мМ фосфату натрію (рН 6,8), 0,1 95 пірофосфату натрію, 5х розчин Денхардта, озвучена ДНК сперми лосося (50 мкг/мл), 0,1 96 505 (додецилсульфат натрію), та 10 96 сульфату декстрану при 42 "С, з промивками при 42 "С в 0,2х5552 (хлорид натрію/цитрат натрію) та 50 95 формаміді при 55 "С, з подальшою промивкою в умовах високої жорсткості, що складається з 0,1х55502, що містить ЕДТА, при 55 "С. Кваліфікованому фахівцю буде зрозуміло, як відрегулювати температуру, іонну силу і т.д. потрібним чином для враховування таких факторів, як довжина зонда тощо.

Рядовим фахівцям в цій галузі техніки буде зрозуміло, що в результаті виродженості генетичного коду, існує велика кількість нуклеотидних послідовностей, що кодують поліпептид, описаний в даному документі. Деякі з таких полінуклеотидів несуть мінімальну гомологію з нуклеотидною послідовністю будь-якого нативного гена. Тим не менш, полінуклеотиди, що відрізняються внаслідок відмінностей у використанні кодонів, конкретно передбачені даним винаходом. Додатково, алелі генів, що містять полінуклеотидні послідовності, передбачувані в даному документі, входять до обсягу даного винаходу. Алелі є ендогенними генами, зміненими (610) в результаті однієї або декількох мутацій, такі як делеції, адиції та/"або заміщення нуклеотидів.

Утворювані при цьому мРНК та білок можуть, але не обов'язково будуть, мати змінену структуру або функцію. Алелі можуть бути ідентифіковані з використанням стандартних методик (таких як гібридизація, ампліфікація та/або порівняння з базою даних послідовностей).

Полинуклеотиди за даним винаходом можуть бути одержані з використанням хімічного синтезу, рекомбінантних способів, або ПЛР. Способи хімічного синтезу полінуклеотидів добре відомі фахівцям та не потребують детального опису в даному документі. Кваліфікований фахівець в цій галузі техніки може використати послідовності, передбачувані в даному документі, та комерційний синтезатор ДНК для продукування бажаної ДНК-послідовності.

Для одержання полінуклеотидів з використанням рекомбінантних способів, полінуклеотид, що містить бажану послідовність, може бути вставлений в придатний вектор, і вектор в свою чергу може бути введений в придатну клітину-хазяїна для реплікації та ампліфікації, як додатково описано в даному документі. Полінуклеотиди можуть бути введені в клітини-хазяї будь-якими способами, відомими фахівцям. Клітини трансформують введенням екзогенного полінуклеотиду шляхом прямого поглинання, ендоцитозу, трансфекції, Е-спарювання або електропорації. Після введення, екзогенний полінуклеотид може підтримуватися в клітині як неінтегрований вектор (такий як плазміда) або бути інтегрований в геном клітини-хазяїна.

Ампліфікований у такий спосіб полінуклеотид може бути виділений з клітини-хазяїна способами, добре відомими в цій галузі техніки. Див., наприклад, Затрьгоок еї аї. (1989).

Альтернативно, ПЛР дозволяє репродукувати ДНК-послідовності. Технологія ПЛР добре відома фахівцям та описана в патентах США МоМо 4683195, 4800159, 4754065 та 4683202, а також в РОК: Те Роїутегазе Спаіп Кеасіоп, Миїї5 еї аї. еа5., Вігкаизмег Ргез5, Вовіоп (1994).

РНК може бути одержана шляхом використання виділеної ДНК у відповіднему векторі та введення його в придатну клітину-хазяїна. Коли клітина реплікується та ДНК транскрибується в

РНК, ця РНК може бути потім виділена з використанням способів, добре відомих кваліфікованим фахівцям в цій галузі техніки, як описано, наприклад, в затьгоок еї аї!., (1989).

Придатні клонуючі вектори можуть бути сконструйовані згідно зі стандартними методиками, або можуть бути вибрані з великого числа клонуючих векторів, доступних в цій галузі техніки.

Хоча вибраний клонуючий вектор може змінюватися в залежності від клітини-хазяїна, призначеної для використання, придатні клонуючі вектори звичайно будуть мати здатність до самореплікації, можуть мати один (сайт-)мішень для конкретної ендонуклеази рестрикції, та/або може нести гени маркера, який може бути використаний при селекції клонів, що містять вектор.

Придатні приклади включають плазміди та бактеріальні віруси, наприклад, риОсС18, рист19,

ВіІсезсгірі (наприклад, рВв5 ЗК) та його похідні, тр18, тр19, рРВК322, пмМВе, СОІЕ1, рСКкІ1, КРА, фагові ДНК, та човникові вектори, такі як р5АЗ та рАТа28. Ці та багато інших клонуючих векторів є доступним и від комерційних постачальників, таких як ВіоКай, 5іга(едепе та Іпмігодеп.

Експресійні вектори звичайно є реплікованими полінуклеотидними конструктами, що містять полінуклеотид згідно з будь-яким з різних аспектів винаходу. Припускається, що експресійний вектор повинен бути придатним для реплікації в клітинах-хазяях або як епісоми або як складова частина хромосомної ДНК. Придатні експресійні вектори включають, без обмежень, плазміди, вірусні вектори, включаючи аденовіруси, адено-асоційовані віруси, ретровіруси, косміди, та експресійний вектор (вектори), розкриті в публікації РСТ Мо УМО 87/04462. Компоненти векторів можуть звичайно включати, без обмежень, один або декілька з наступного переліку: сигнальна послідовність; точка початку реплікації; один або декілька маркерних генів; придатні контрольні елементи транскрипції (такі як промотори, енхансери та термінатор). Для експресії (тобто, трансляції) також звичайно потрібні один або декілька контрольних елементів трансляції, таких як сайти зв'язування рибосом, сайти ініціації трансляції, та стоп-кодони.

Вектори, які містять полінуклеотиди, що представляють інтерес, можуть бути введені в клітину-хазяїна за допомогою будь-якого з ряду відповідних способів, включаючи електропорацію, трансфекцію з використанням хлориду кальцію, хлориду рубідію, фосфату кальцію, ОЕАЕ-декстрану або інших речовин; бомбардування мікрочастинками; ліпофекцію; та інфекцію (наприклад, в тих випадках, коли вектор є інфекційним агентом, таким як вірус коров'ячої віспи). Вибір (способу) введення векторів або полінуклеотидів буде часто залежати від характеристик клітини-хазяїна.

В деяких аспектах, винахід також передбачає клітини-хазяї, що містять будь-які з полінуклеотидів, описаних в даному документі. Будь-які клітини-хазяї, здатні надекспресувати гетерологічні ДНК, можуть бути використані з метою виділення генів, які кодують антитіло, поліпептид або білок, що представляють інтерес. Необмежуючі приклади клітин-хазяїв ссавців включають, без обмежень, клітини СО5, Не а та СНО. Див. також публікацію РСТ Мо УМО 87/04462. Придатні клітини-хазяї, що не належать ссавцям, включають прокаріоти (такі як Е. соїї (610) або В. 5,ИиБійі5) та дріжджі (такі як 5. сегемізає, 5. ротре; або К. Іасіі5). Краще, клітини-хазяї експресують кДНК на рівні, близько в 5 разів вище, ще краще, в 10 разів вище, ще краще, в 20 разів вище, ніж для відповідного ендогенного антитіла або білка, що представляють інтерес, якщо вони присутні, в клітинах-хазяях. Скринінг клітин-хазяїв на специфічне зв'язування з А. | - 40 проводиться шляхом імунологічного аналізу або методом ЕРАС5. Клітина, яка надекспресує антитіло або білок, що представляють інтерес, може бути ідентифікована.

О. Композиції

В деяких варіантах реалізації, композиції, використовувані в способі за винаходом, містять ефективну кількість антитіла (наприклад, антагоністичного антитіла анти СОБКР, моноклонального антитіла, яке модулює шлях СОЕР) або антитіла, одержаного з поліпептиду, описаного в даному документі. Приклади таких композицій, а також способи складання, також описані в попередньому розділі та нижче. В одному варіанті реалізації, композиція додатково містить антагоніст СОЕР. В деяких варіантах реалізації, композиція містить один або декілька моноклональних антитіл, які модулюють шлях СОКР. В деяких варіантах реалізації, композиція містить один або декілька антагоністичних антитіл анти СОРБР. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР розпізнає людський СОКР. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР є гуманізованим. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОЕР включає константну область, яка не ініціює непотрібної або небажаної імунної відповіді, такої як медійований антитілом лізис або АОСС. В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР включає один або декілька СОК(5) антитіла 1 (наприклад, один, два, три, чотири, п'ять або, в деяких варіантах реалізації, усі шість СОМ С1).

В деяких варіантах реалізації, антагоністичне антитіло анти СОКР є людським.

Слід розуміти, що композиції можуть містити більше одного антитіла (наприклад, більше одного антагоністичного антитіла анти СОКР - суміш антагоністичних антитіл анти СОКР, що розпізнають різні епітопи СоОКР). Інші типові приклади композицій містять декілька антагоністичних антитіл анти СОКР, які розпізнають один й той самий епітоп (одні й ті самі епітопи), або різні види антагоністичних антитіл анти СОКР, які зв'язуються з різними епітопами

СаВвР.

Композиція може додатково містити фармацевтично прийнятні носії, ексципієнти або стабілізатори (Кетіпдіоп: Те Зсіепсе апа Ргасіїсе ої Рпаптасу 201 Еа. (2000) Іірріпсой

МУШіате апа УМіїКіп5, Ед. К. Е. Ноомег). Прийнятні носії, ексципієнти або стабілізатори є нетоксичними для реципієнтів в використовуваних дозуваннях та концентраціях. Терапевтична композиція антитіла може містити один або декілька фармацевтично прийнятних носіїв, ексципієнтів або стабілізаторів, причому Необмежуючі приклади таких речовин включають буфери, такі як фосфатний, цитратний, та на основі інших органічних кислот; солі, такі як хлорид натрію; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту та метіонін; консерванти (такі як октадецилдиметилбензиламонію хлорид; гексаметонію хлорид; бензалконію хлорид, бензетонію хлорид; фенол, бутиловий або бензиловий спирт; алкілларабени, такі як метил- або пропілпарабен; катехін; резорцин; циклогексанол; З-пентанол; та м-крезол); низькомолекулярні (менш ніж близько 10 залишків) поліпептиди; білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти (наприклад, в концентрації від 0,1 мМ до 100 мМ, від 0,1 мМ до 1 мМ, від 0,01 мМ до 50 мМ, від 1 мМ до 50

ММ, від 1 ММ до 30 мМ, від 1 мМ до 20 мМ, від 10 мМ до 25 мМ) такі як гліцин, глутамін, метіонін, аспарагін, гістидин, аргінін, або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, включаючи глюкозу, манозу, або декстрини; хелатуючі агенти (наприклад, в концентрації від 0,001 мг/мл до 1 мг/мл, від 0,001 мг/мл до 1 мг/мл, від 0,001 мг/мл до 0,1 мг/мл, від 0,001 мг/мл до 0,01 мг/мл), такі як ЕДТА (наприклад, динатрію ЕДТА дигідрат); цукри (наприклад, в концентрації від 1 мг/мл до 500 мг/мл, від 10 мг/мл до 200 мг/мл, від 10 мг/мл до 100 мг/мл, від мг/мл до 150 мг/мл), такі як сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; солетвірні протиіони, такі як натрій; комплекси металів (наприклад, комплекси 7п-білок); та/або неіїонні поверхнево- 50 активні речовини (наприклад, в концентрації від 0,01 мг/мл до 10 мг/мл, від 0,01 мг/мл до 1 мг/мл, від 0,1 мг/мл до 1 мг/мл, від 0,01 мг/мл до 0,5 мг/мл) такі як твін (ТУУЕЕМ М) (наприклад, полісорбат (наприклад, полісорбат 20, полісорбат 40, полісорбат 60, полісорбат 80)), плюронік (РІШВОМІС5"М) або поліетиленгліколь (ПЕГ). Фармацевтично прийнятні ексципієнти додатково описані в даному документі.

Антитіло (наприклад, антагоністичне антитіло анти СОКР) та його композиції також можуть використовуватися у поєднанні з іншими агентами, які служать для підсилення та/або доповнення ефективності агентів.

Е. Набори

В одному аспекті, винахід також передбачає набори для використання в способах за даним 10) винаходом. Набори можуть включати один або декілька контейнерів, що містять антитіло,

описане в даному документі (наприклад, антагоністичне антитіло анти СОКР (таке як гуманізоване антитіло)), або поліпептид, описаний в даному документі, та інструкції з використання згідно з будь-яким із способів, описаних в даному документі. Загалом, такі інструкції містять опис введення антитіла для лікування, полегшення або попередження головного болю (такого як мігрень) згідно з будь-яким із способів, описаних в даному документі.

Набір може додатково містити опис вибору індивідуума, придатного для лікування, основаного на ідентифікації індивідуума, що потерпає від головного болю або індивідуума з ризиком виникнення головного болю. В інших варіантах реалізації, інструкції містять опис введення антитіла (наприклад, антагоністичного антитіла анти СОКР) індивідууму з ризиком виникнення головного болю (такого як мігрень).

В деяких варіантах реалізації, антитіло є гуманізованим антитілом. В деяких варіантах реалізації, антитіло є людським. В інших варіантах реалізації, антитіло є моноклональним антитілом. В інших варіантах реалізації. В деяких варіантах реалізації, антитіло містить один або декілька СОМК(5) антитіла 51 (наприклад, один, два, три, чотири, п'ять або, в деяких варіантах реалізації, усі шість СОК С1).

Інструкції, що стосуються використання антитіла (наприклад, антагоністичного антитіла анти

СОР) звичайно включають інформацію про дозування, схему приймання, та шляхи введення для передбачуваного лікування. Контейнери можуть бути разовими дозами, упаковками великого розміру (наприклад, багатодозовими упаковками) або дробовими дозами. Інструкції, що вкладаються в набори, типово є письмовими інструкціями на ярлику або на вкладиші в упаковку (наприклад, паперовий лист, що входить в набір), але також прийнятними є машинозчитувані інструкції (наприклад, інструкції на магнітному або оптичному запам'ятовуючому диску).

Ярлик або вкладиш в упаковку вказує, що композиція використовується для лікування, полегшення та/або попередження головного болю (такого як мігрень). Можуть бути передбачені інструкції з реалізації будь-якого із способів, описаних в даному документі.

Набори за даним винаходом розміщені в придатній упаковці. Придатна упаковка включає, без обмежень, флакони, пляшки, банки, гнучку упаковку (наприклад, герметизовані лавсанові (Муїаг) або пластикові пакети) тощо. Також передбачаються упаковки для використання в комбінації з конкретним пристроєм, таким як інгалятор, пристрій для назального введення (наприклад, розпилювач) або інфузіонний пристрій, такий як помпа тіпірштр. Набір може мати стерильний вхідний порт (наприклад, контейнер може бути пакетом з розчином для внутрішньовенного введення або флаконом з пробкою, що протикається голкою для підшкірної ін'єкції). Контейнер може також мати стерильний вхідний порт (наприклад, контейнер може бути пакетом з розчином для внутрішньовенного введення або флаконом з пробкою, що протикається голкою для підшкірної ін'єкції). Щонайменше один активний агент в композиції є антагоністичним антитілом анти СОЕР та/або моноклональним антитілом, яке модулює шлях

СОР. Контейнер може додатково містити другий фармацевтично активний агент.

Набори можуть необов'язково передбачати додаткові компоненти, такі як буфери та інтерпретуюча інформація. Нормально, набір містить контейнер та ярлик або вкладищі(ї) в упаковку на контейнері або зв'язані з ним.

Наступні приклади наведені для ілюстрації винаходу, без його обмеження.

Приклади

Приклад 1: Одержання та характеризація моноклональних антитіл, спрямованих анти СОКР

Одержання антитіла анти СОКР. Для одержання антитіл анти СОКР, що виявляють перехресно-видову реактивність по відношенню до СОКР щура та людини, мишей імунізували 25-100 мкг людського а-СОКР або ВД-ССОКР, кон'югованого з КІН в ад'юванті (50 мкл на подушечку лапи, 100 мкл загалом на мишу) з різними інтервалами. Імунізація загалом проводилася, як описано в Сеегіїд5 Н.)/ еї аї., 1989, 9. Іттипої. Меїйпоаз 124:95-102; Кеппеу 95 єї а!., 1989, 9. Іттипої. МеїШйоа5 121:157-166; та УМіспег К еї аї., 1989, Іпі. Агсп. АїйПШегоду Аррі.

Іттипої. 89:128-135. Мишей спочатку імунізували 50 мкг людського а-СОКР або ВД-ССВР, кон'югованого з КІН в СЕА (повний ад'ювант Фрейнда). Через 21 день мишей імунізували повторно 25 мкг людського ВД-СОЕР (для мишей, спочатку імунізованих людським а-СОКР) або а-СОКР (для мишей, спочатку імунізованих людським ВД-СОКР), кон'югуваними з КІН в ІРА (неповний ад'ювант Фрейнда). Через двадцять три дні після повторної імунізації, проводили третю імунізацію 25 мкг а-СОКР щура, кон'югуваним з КІН в ІРА. Через десять днів, титри антитіла визначали методом ІФА. Четверту імунізацію проводили з використанням 25 мкг пептиду (щурячий а-СОВАР-КІН) в ІРА через 34 дні після третьої імунізації. Кінцеву бустерну імунізацію проводили з використанням 100 мкг розчинного пептиду (щурячий а-СОКР) через 32 (610) дні після четвертої імунізації.

Спленоцити одержували з імунізованої миші та зливали з клітинами мієломи МБО у співвідношенні 10:1, з поліетиленгліколем 1500. Гібриди висіювали на 96-лункові планшети в середовище ОМЕМ, що містить 20 9о сироватку коня та 2-оксалоацетат/піруват/інсулін (5ідта), та починали селекцію гіпоксантином/аміноптерином/тимідином. В день 8 в усі лунки додавали 100 мкл ОМЕМ, що містить 20 95 сироватку коня. Супернатанти гібридів піддавали скринінгу методом імунологічного аналізу з пасткою для антитіла. Визначення класу антитіла проводили з використанням клас-специфічних других антитіл.

Панель клітинних ліній, що продукують моноклональне антитіло, вибирали на підставі їх зв'язування з людським та щурячим СОКР для проведення додаткових аналізів. Ці антитіла та характеристики наведені нижче в Таблицях 2 та 3.

Очистка та одержання фрагмента Бар. Моноклональні антитіла, вибрані для проведення додаткових аналізів, були очищені від супернатантів гібридомних культур методом афінної хроматографії на білку А. Супернатанти врівноважували при рН 8. Супернатанти потім завантажували на колонку з білююм А Маббеїесі (Атег5Ппат Віозсіепсе5 Мо 17-5199-02), врівноважену за допомогою РВ5 (фосфатно-сольового буфера) при рН 8. Колонку промивали 5 об'ємами колонки РВ5, рН 8. Антитіла елюювали 50 мМ цитрат-фосфатним буфером, рН 3.

Елюйовані антитіла нейтралізовали 1М фосфатним буфером, рН 8. Очищені антитіла піддавали діалізу з РВ5, рН 7,4. Концентрації антитіла визначали методом ДСН-ПААГ (505-РАСЕ), з використанням калібрувальної кривої для мишачого моноклонального антитіла.

Бар одержували методом протеолізу папаїном повних антитіл з використанням набору

Ітітипориге Раб (Ріегсе Мо 44885) та очищали за допомогою хроматографії на білку А згідно з інструкціями виробника. Концентрації визначали методом ІФА та/або електрофорезу ДСН-ПААГ з використанням стандартного Бар з відомою концентрацією (визначеною шляхом амінокислотного аналізу), та по А280 з використанням 100 (1 одиниця оптичної густини)-0,6 мг/мл (або теоретичного еквівалента, визначуваного на основі амінокислотної послідовності).

Визначення афінності Бар5. Афінності моноклональних антитіл анти СОКР визначали при 25"С або при 37 "С з використанням системи поверхневого плазмонного резонансу (ЗРЕ)

Віасогез000 м (Віасоге, ІМС, Різсаїамау МУ) з рухомим буфером виробника, НВЗ-ЕР (10 мМ

НЕРЕЗ рн 7,4, 150 мМ Масі, З мМ ЕДТА, 0,005 95 об./об. полісорбату Р20). Афінність визначали шляхом зв'язування біотинільованих на М-кінці пептидів СОКР (синтезовані за спеціальним заказом фірмами Сепобсгірі Согрогайоп, Мем/ Уегзеу, або СіІобра! Рерііїде Зегмісе5, Соіогадо) попередньо іммобілізованих стрептавідином на чипі ЗА та вимірювання кінетики зв'язування антитіла РГар титруванням на поверхні СОКР. Біотинільований СОКР розбавляли НВ5-ЕР та наносили на чип в концентрації менше 0,001 мг/мл. Завдяки використанню змінного часу прохождення по індивідуальним каналам чипа були одержані два діапазони щільності антигену: «50 одиниць відгуку (КО) для детальних кінетичних досліджень та близько 800 КО для досліджень концентрування та скринінгу. Дво- або трикратні серійні розведення, типово в діапазоні концентрацій 1 мкМ-0,1 нМ (приблизно відповідають 0,1-10х очікуваним значенням

Ко), очищених фрагментів Бар вприскували на 1 хвилину при витраті 100 мкл/хв, та спостерігали дисоціацію протягом 10 хвилин. Після кожного циклу зв'язування, поверхні регенерували 25 мМ Маон в 25 95 об./0б. етанолі, що дозволяло проводити виміри протягом сотень циклів. Кінетичні константу асоціації (Коп) та константу дисоціації (Коб) одержували одночасно шляхом апроксимації даних за рівнянням моделі 1:1 зв'язування Ленгмюра (Кагізз5оп,

А. Ноовз, Н. Радегвіат, І. Реїег55оп, В. (1994). Меїйод5 Епгутоіоду 6. 99-110) за допомогою програми ВіАемаїнчайоп. Глобальні рівноважні константи дисоціації (Ко) або "афінності" обчислювали за співвідношенням Ко-Комй/Коп. Афінності мишачих фрагментів Бар представлені в

Таблицях 2 та 3.

Картування епітопів мишачого антитіла анти СОКР. Для визначення епітопа людського а-

СОР, з яким зв'язуються антитіла анти СОЕКР, афінності зв'язування фрагментів Раб з різними фрагментами СОЕР вимірювали, як описано вище, шляхом зв'язування фрагментів амінокислот 19-37 та амінокислот 25-37 біотинільованого на М-кінці СОЕР на сенсорному чипі ЗА. фігура 1 показує їх афінності зв'язування, виміряні при 25 "С. Як показано на Фігурі 1, усі антитіла, за винятком антитіла 4901, зв'язуються з фрагментами 19-37 та 25-37 людського а-СОКР з афінністю, схожою з їх афінністю зв'язування з повнорозмірним людським а-СОЯВР (1-37).

Антитіло 4901 зв'язується з фрагментом 25-37 людського а-СОКР з афінністю, в шість разів меншою, ніж при зв'язуванні з фрагментом повнорозмірного людського а-СОКР, переважно через зниження швидкості дисоціації. Дані показують, що ці антитіла анти СОКР звичайно зв'язуються з С-кінцевою областю СОКР.

Проводили аланінове сканування для додаткового визначення амінокислот людського а- (610) СОРР, що беруть участь в зв'язуванні антитіла анти СОЕР. Різні варіанти людського а-СОКР з одним заміщенням аланіну були одержані методом пептидного синтезу. Їх амінокислотні послідовності представлені в Таблиці 4 разом з усіма іншими пептидами, використовуваними в аналізі Віасоге. Афінності фрагментів Бар антитіл анти СОКР по відношенню до цих варіантів визначали з використанням Віасоге, як описано вище. Як показано на Фігурі 1, усі 12 антитіл націлені на С-кінцевий епітоп, причому амінокислота Е37 є найбільш важливим залишком.

Мутація Е37 на аланін значно знижувала афінність або навіть повністю інгібувала зв'язування антитіл анти СОКР з пептидом. Наступним за важливістю амінокислотним залишком є 33, однак, заміщення на аланін в цьому положенні впливало тільки на високоафінні антитіла (7Е9, 886, 10А8 та 7011). Амінокислотний залишок 534 також відіграє значну, але меншу, роль в зв'язуванні цих чотирьох високоафінних антитіл.

Таблиця 2

Характеристики зв'язування моноклональних антитіл анти СОКР з людським а0-СОБР та їх антагоністична активність

Ко з людським |Ко з людським) зв'язування людського а- |сайтів) при 25 "С (кімнатна

Антитіла | а-СОКР при | «-СОКР при | СОРВР з його рецептором | температура), виміряна 2576 (нм) 37 "С (НМ) при 25 "С (виміряне по шляхом аналізу активації САМР зв'язування радіолігандів. 79 | 10 | 09 | так | 25

ЛоАВ | 21 71301771 так7 |77171717171717171снв 701 | 44 | 54 | МБ так | 777777 нв л4єО | 80 | 71791. так | 77771717 нв 988 | ю.ю85 2 Щ| 1838 | хо ні | 777777 янв 713б2 | 94 2 ЮЩЮ| 379 | щхБ ні | 777777 нв о 14АЯ | 7148 | 581 17771717171717171711ні |777717171717171снв 605 | 210 | 647 | щхБ ні | 7777777 нв 105 | 296 | 62 | Х(Хх ні | 777777 нв

Примітка: антитіло 4901 є комерційно доступним (Зідта, Ргодисі Мо. С7113). н.в. - не визначено

Таблиця З

Характеристики зв'язування моноклональних антитіл анти СОКР з щурячим а-СОКР та антагоністична активність

ЕЕ те ян Чи

Антитіла СОР при 37"7С щурячого а-СОКР з його рецептором (аналізі на підшкірному (НМ) при 25 "С (виміряне по активації САМР) нерві

ЛоАВ | 74517711 Ні111111111111111111снв 7988. .ЮюЮюЮД876 17777171 Ні11111111111111Ї1111снвС пк ЕТ: г я о: У Я ПОН ГО КО ТО 13б2 | 51000171 Ні 11111снв пе ЕТ ПЕ ето Я ПОЛОН ГО КО ТО 605 | 51000171 Ні11111111111111Ї11111снв 7165 | 51000 | 77771717 Нні777111111111711111снв "н.в." вказує, що тестування антитіла не проводилося.

Таблиця 4

Амінокислотні послідовності фрагментів людського а-ССЯАР (5ЕО 10 МО5:15-40) та споріднені пептиди (5ЕО ІЮ МО5:41-47). Усі пептиди амідовані на С-кінці, за винятком 5ЕО ІЮ МО5:36-40.

Залишки, виділені жирним шрифтом, вказують точкові мутації.

Людський

Людський УВО5МММЕОСІ АВ5ЕССВЕСТСТМУОКІ АНОЇМОЕТОК адреномедулін (17 оКоМУАРАЗКІЗРОСУ 47

Приклад 2: Скринінг антагоністичних антитіл анти СОКР з використанням іп міїго аналізів

Мишачі антитіла анти СОКР були піддані додатковому скринінгу на антагоністичну активність іп міго з використанням аналізу клітинної активації САМР та аналізу зв'язування.

Антагоністичну активність вимірювали за допомогою аналізу САМР. П'ять мікролітрів людського або щурячого а-СОКР (кінцева концентрація 50 нМ) в присутності антитіла анти

ССОРР (кінцева концентрація 1-3000 нМ) або без нього, або щурячого а-СОКР або людського а-

СОР (кінцева концентрація 0,1 нмМ-10 мкМ; як позитивний контроль активації С-АМР) дозували на 384-лунковий планшет (Мипс, Саї. Мо 264657). Десять мікролітрів клітин (лодських ЗК-М-МС у випадку використання людського а-СОКР, або щурячих 16 від АТСС у випадку використання щурячого а-СОРР) в буфері для стимуляції (20 мМ НЕРЕЗ5, рн 7,4, 146 мМ Масі, 5 мМ КІ, 1

ММ Сасі», 1 мМ Масі», та 500 мкМ З3-ізобутил-1-метилксантину (ІВМХ)) додавали в лунки планшета. Планшет інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хв.

Після інкубації, проводили активацію САМР з використанням системи для аналізу НЕіНипіегтМ

Еплуте ЕРгадтепі Сотріетепіайоп Авзау (Арріїей Віозуєіетв) згідно з інструкціями виробника.

Аналіз оснований на використанні генетично модифікованого ферменту рД-галактозидази, який складається з двох фрагментів, називаних акцептор ферменту (ЕА) та донор ферменту (ЕВ).

Коли ці два фрагменти розділені, фермент неактивний. Коли фрагменти з'єднані, вони можуть спонтанно рекомбінувати з утворенням активного ферменту в результаті процесу, називаного комплементація. Платформа для аналізу ЕЕС використовує пептидний кон'югат ЕО-САМР, у якому САМР розпізнається (антитілом) проти САМР. Цей фрагмент ЕО є здатним до повторної асоціації з ЕА з утворенням активного ферменту. При аналізі, антитіло проти САМР оптимально титрують для зв'язування з кон'югатом ЕО-САМР та інгібування утворення ферменту. САМР, присутній в зразках клітинного лізату, конкурує з кон'юЮгатом ЕЮО-САМР за зв'язування з антитілом проти САМР. Кількість вільного кон'юЮгата ЕО в аналізі пропорційна концентрації

СсАМР. Таким чином, САМР вимірюють за утворениям активного ферменту, який кількісно визначається за перетворенням люмінесцентного субстрату В-галактозидази. Аналіз активації

САМР проводили шляхом додавання 10 мкл буфера для лізису та антитіла проти САМР (у співвідношенні 1:11) з подальшою інкубацією при кімнатній температурі протягом 60 хв. Потім додають 10 мкл реагенту ЕО-САМР в кожну лунку та інкубують протягом 60 хвилин при кімнатній температурі. Після інкубації, додають в кожну лунку 20 мкл реагенту ЕА та суміш СІ. (що містить субстрат) (у співвідношенні 1:1) та інкубують протягом 1-3 годин або протягом ночі при кімнатній температурі. Планшет зчитують зі швидкістю 1 секунда/лунку на інструменті РМТ або 30 секунд/ділянку на фотоприймачі (ітадег). Антитіла, які інгібують активацію САМР за допомогою а-СОРР, були ідентифіковані (позначені "Да") в Таблицях 2 та З вище. Дані в Таблицях 2 та З показують, що антитіла, які демонструють антагоністичну активність при аналізі, звичайно мають високу афінність. Наприклад, антитіла, що мають Ко (визначену при 25 "С), рівну близько 80 нМ або менше з людським а-СОЕР, або мають Ко (визначену при 37 "С), рівну близько 47 нм або менше із щурячим с-СОКР, виявляють антагоністичну активність в даному аналізі.

Аналіз зв'язування радіоліганду. Аналіз зв'язування проводили для вимірювання ІСвзо антитіла анти СОКР при блокуванні зв'язування СОКР з рецептором, як описано вище. 7іттептапп єї аї., Реріїде5 16:421-4, 1995; Маїеє еї аї., У. Віої. Спет. 277:14294-8, 2002.

Мембрани (25 мкг) клітин 5К-М-МС інкубували протягом 90 хв при кімнатній температурі в буфері для інкубації (50 мМ Тті5-НСІ, рН 7,4, 5 мМ Масі», 0,1 95 БСА (бичачий сироватковий альбумін)), що містить 10 пМ 725І-людський а-СОКР, в загальному об'ємі 1 мл. Для визначення інгібуючих концентрацій (ІСзо), антитіла або немічений СОР (як контроль), з близько 100- кратно концентрованого маточного розчину розчиняли з різними концентраціями в буфері для інкубації та інкубували в той самий час з мембранами та 10 пМ "25І-людським а-СОЕР. Інкубацію припиняли фільтрацією через фільтр зі скляного мікроволокна (СБР/В, 1 мкм), блокований 0,5 95 поліетиленіміну. Будували графіки кривих доза-відповідь та значення К; визначали з використанням рівняння: К;-ІСво/(1--Іліганд|/Ко); де константа рівноважної дисоціації Ко-8 пМ для людського а-СОКР з рецептором СОКРІ, присутнім в клітинах 5К-М-МС, і Втах-0,025 пмоль/мг білка. Вказане значення ІСзо (для молекул дО) перераховували для зв'язувальних сайтів (шляхом його множення на 2), щоб його можна було порівнювати з афінностями (Коб), визначеними за допомогою Віасоге (див. Таблицю 2).

В Таблиці 2 наведені значення ІСбсо для мишачих антитіл 7ЕЯ, 886, 6Н2 та 4901. Дані показують, що афінність антитіла звичайно корелює з ІСво: антитіла з більш високою афінністю (більш низькими значеннями Ко) мають більш низькі значення ІСво в аналізі зв'язування радіоліганду.

Приклад 3: Ефект антагоністичних антитіл анти СОКР на вазодилатацію шкіри, індуковану стимуляцією підшкірного нерва щура

Для тестування антагоністичної активності антитіла анти СОКР, ефект антитіл на вазодилатацію шкіри шляхом стимуляції підшкірного нерва щура тестували з використанням щурячої моделі, описаної раніше. Е5соїй еї аї!., Вг. У. Рпаптасої. 110:772-776, 1993. В цій щурячій моделі, електрична стимуляція підшкірного нерва індукує вивільнення СОКР нервовими закінченнями, приводячи до підсилення шкірного кровотоку. Кровотік у шкірі лапи самців щурів

Зргадиє Оам/єу (170-300 г, з Спапев5 Кімег Ноїйєтег) вимірювали після стимуляції підшкірного нерва. Щурів підтримували під анестезією за допомогою 2 90 ізофлурану. Бретилію тозилат (30 мг/кг, внутрішньовенне (в/в) введення) давали на початку експерименту для мінімізації вазоконстрикції внаслідок супутньої стимуляції симпатичних волокон підшкірного нерва.

Температуру тіла підтримували при 37"С шляхом використання ректального зонда, термостатично з'єднаного з грілюьою-матрацом з контрольованою температурою. Сполуки, 6о0 включаючи антитіла, позитивний контроль (СОКР 8-37), та носій (РВ5, 0,01 95 Тмжеєп 20) бо вводили внутрішньовенно через праву стегнову вену, за винятком експерименту, представленого на Фігурі 3, тестовані сполуки та контроль вводили ін'єкцією через хвостову вену, і для експериментів, представлених на Фігурах 2А та 2В, антитіла 4901 та 7011 вводили ін'єкцією інтраперитонеально (ІР). Сполуку позитивного контролю СОКР 8-37 (антагоніст вазодилатації), через її короткий період напіввиведення, давали за 3-5 хв до стимуляції нерва в кількості 400 нмоль/кг (200 мкл). Тап еї аї., Сііп. 5сі. 89:656-73, 1995. Антитіла давали в різних дозах (1 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг та 25 мг/кг).

Для експериментів, представлених на Фігурах 2А та 2В, антитіло 4901 (25 мг/кг), антитіло 1011 (25 мг/кг), або контрольний носій (РВ5 з 0,01 95 Ту'ееп 20) вводили інтраперитонеально (ІР) за 72 години до електроіїмпульсної стимуляції. Для експерименту, представленого на Фігурі 3, антитіло 4901 (1 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг або 25 мг/кг) або контрольний носій (РВ5 з 0,01 95

Тмееп 20) вводили внутрішньовенно за 24 години до електроімпульсної стимуляції. Після введення антитіл або контрольного носія, підшкірний нерв правої задньої лапи оголювали хірургічно, перерізали проксимально та накривали полімерною плівкою для попередження висихання. Лазерний допплерівський зонд поміщали на медіодорсальну частину шкури задньої лапи, яка є областю, іннервованою підшкірним нервом. Шкірний кровотік, вимірюваний як потік кров'яних клітин, контролювали за допомогою лазерного допплерівського флоуметра. Після встановлення стабільного базового потоку (відхилення менше 5 95) протягом щонайменше 5 хв, нерв поміщали на платинові біполярні електроди та електрично стимулювали 60 імпульсами (2

Гу, 10 В, 1 мс, протягом 30 с) і потім (стимуляцію) повторяли через 20 хвилин. Кумулятивну зміну шкірного кровотоку оцінювали за площею під кривою залежності потоку від часу (АОС, дорівнює зміні потоку, помноженій на зміну часу) для кожного відгуку потоку на електроїмпульсну стимуляцію. Обчислювали середній відгук кровотоку на дві стимуляції.

Тварини перебували під анестезією протягом періоду часу від однієї до трьох годин.

Як показано на фігурі 2А та Фігурі 28, збільшення кровотоку, стимульоване шляхом впливу на підшкірний нерв електричними (еїесігопіс) імпульсами, інгібувалося в присутності СОЕР 8-37 (400 нмоль/кг, в/в введення), антитіла 4901 (25 мг/кг, ір (інтраперитонеальне) введення), або антитіла 7011 (25 мг/кг, ір введення) у порівнянні з контролем. СОКР 8-37 вводили за 3-5 хв до стимуляції підшкірного нерва; і антитіла вводили за 72 години до стимуляції підшкірного нерва.

Як показано на Фігурі 3, збільшення кровотоку, стимульоване дією на підшкірний нерв електричними імпульсами, інгібувалося в присутності антитіла 4901 в різних дозах (1 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг та 25 мг/кг), введеного внутрішньовенно за 24 год. до стимуляції підшкірного нерва.

Для експериментів, представлених на Фігурах 4А та 4В, підшкірний нерв оголювали хірургічно перед введенням антитіла. Підшкірний нерв правої задньої лапи оголювали хірургічно, перерізали проксимально та накривали полімерною плівкою для попередження висихання. Лазерний допплерівський зонд поміщали на медіодорсальну частину шкури задньої лапи, яка є областю, іннервованою підшкірним нервом. Шкірний кровотік, вимірюваний як потік кров'яних клітин, контролювали за допомогою лазерного допплерівського флоуметра. Через період часу від тридцяти до сорока п'яти хвилин після ін'єкції бретилію тозилату, коли встановлювався стабільний базовий потік (відхилення менше 5 95) протягом щонайменше 5 хв, нерв поміщали на платинові біполярні електроди та електрично стимулювали (2 Гц, 10 В, 1 мс, протягом 30 с) та (стимуляцію) повторяли через 20 хвилин. Середнє значення відгуку величини кровотоку на ці дві стимуляції використовували для визначення базового відгуку (момент часу 0) на електричну стимуляцію. Потім вводили внутрішньовенно (в/в) антитіло 4901 (1 мг/кг або 10 мг/кг), антитіло 7Е9 (10 мг/кг), антитіло 886 (10 мг/кг) або носій (РВ5 з 0,01 95 Туееп 20). Нерв потім стимулювали (2 Гц, 10 В, 1 мс, протягом 30 с) через 30 хв, 60 хв, 90 хв та 120 хв після введення антитіла або носія. Тварин витримували під анестезією протягом приблизно трьох годин. Кумулятивну зміну шкірного кровотоку оцінювали за площею під кривою залежності потоку від часу (АОС, дорівнює зміні потоку, помноженій на зміну часу) для кожного відгуку потоку на електроімпульсну стимуляцію.

Як показано на Фігурі 4А, збільшення кровотоку, стимульоване дією на підшкірний нерв електричними імпульсами, в значному ступені інгібувалося в присутності антитіла 4901, 1 мг/кг, введеного внутрішньовенно (в/в), при проведенні електроімпульсної стимуляції через 60 хв, 90 хв та 120 хв після введення антитіла, і збільшення кровотоку, стимульоване дією на підшкірний нерв електричними імпульсами, в значному ступені інгібувалося в присутності антитіла 4901, 10 мг/кг, введеного внутрішньовенно (в/в), при проведенні електроїмпульсної стимуляції через 30 хв, 60 хв, 90 хв, та 120 хв після введення антитіла. Фігура 4В показує, що збільшення кровотоку, стимульоване дією на підшкірний нерв електричними імпульсами, в значному ступені інгібувалося в присутності антитіла 7Е9 (10 мг/кг, в/в введення) при проведенні 10) електроімпульсної стимуляції через 30 хв, 60 хв, 90 хв, та 120 хв після введення антитіла, та в присутності антитіла 886 (10 мг/кг, в/в введення) при проведенні електроіїмпульсної стимуляції через 30 хв після введення антитіла.

Ці дані показують, що антитіла 4901, 7Е9, 7011 та 886 ефективно блокують активність

СОР, вимірювану за вазодилатацією шкіри, індукованою стимуляцією підшкірного нерва щура.

Приклад 4. Характеризація антитіла 51 анти СОКР та його варіантів

Амінокислотні послідовності варіабельної області важкого ланцюга та варіабельної області легкого ланцюга антитіла 1 анти СОКР представлені на Фігурі 5. Для експресії та характеризації антитіла С1 та його варіантів використовувалися такі способи.

Використовуваний експресійний вектор. Експресія фрагмента Раб антитіл перебувала під контролем промотора ІРТО Іас/7, схожого з описаним в Вагбраз (2001) Рпаде аїізріау: а Іарогаюгу тапиаї, Соїа 5ргіпд Нагбог, МУ, Соїд Зріїпд Нагтог І арогаїогу Ргез5 ро. 2.10. Месіогї рботр3ЗХ), однак, модифікації включали додавання та експресію таких додаткових доменів: людський константний домен легкого ланцюга каппа та константний домен СНІ людського імуноглобуліну

Ід92, область С ланцюга гамма-2 Ід, білок з номером доступу РО1859; легкий ланцюг каппа імуноглобуліну (Ното заріеп5), білок з номером доступу СААОУ9181.

Дрібномасштабне одержання Раб. З Е. соїї, трансформованих (з використанням або то компетентних для електропорації клітин ТО1, або то компетентних для хімічних методів клітин

Тор 10) за допомогою бібліотеки Бар, використовувалися окремі колонії для інокуляції як мастер-планшета (агар І В -- карбеніцилін (50 мкг/мл) - 2 95 глюкози), так і робочого планшета (2 мл/лунку, 96 лунок/планшет), де кожна лунка містила 1,5 мл І В «ж карбеніцилін (50 мкг/мл) ж 2 95 глюкози. Планшет покривали газопроникною клейкою герметизуючою плівкою (АВдепе, Зигтеу,

ОК). Обидва планшети інкубували при 30 "С протягом 12-16 год.; робочий планшет енергійно струшували. Мастер-планшет зберігали при 4 С до необхідності, в той час як клітини з робочого планшета осаджували центрифугуванням (4000 об/хв, 4 С, 20 мин) та ресуспендували в 1,0 мл І В «т карбеніцилін (50 мкг/мл) ж 0,5 мМ ІРТО для індукування експресії

Бар5 шляхом енергійного струшування протягом 5 год. при 30 "С. Індуковані клітини центрифугували при 4000 об/хв, 4 "С, протягом 20 хв, та ресуспендували в 0,6 мл буфера НВ-

ОЗЕР Віасоге (10 мМ Нере5 рН 7,4, 150 мМ Масі, З мМ ЕДТА, 0,005 95 об./0б. Р20). Лізис ресуспендуваннх в НВ-5ЕР клітин проводили шляхом заморожування (-807С) і потім відтаювання при 37 "С. Клітинні лізати центрифугували при 4000 об/хв, 4 "С, протягом 1 години для відокремлення уламків від супернатантів, що містять Раб, які потім фільтрували (0,2 мкм) з використанням аналітичної системи для фільтрації 9б-лункових планшетів Мійїроге МийкіЗсгеєеп

Авзау бЗузієт 96-УМеїЇ! Рійгайоп Ріаїе та вакуумного маніфолда. Для аналізу профільтрованих супернатантів використовували Віасоге шляхом їх пропускання над СОКР» на сенсорному чипі.

Вибрані за афінністю клони, що експресують Бар, виділяли з мастер-планшета, та використовували для одержання матричної ДНК для ПЛР, секвенування та приготування плазмід.

Великомасштабне одержання Бар. Для визначення кінетичних параметрів, Еаре експресували в більших масштабах наступним чином. К;олби Ерленмайера, що містять 150 мл

ЇВ ж карбеніцилін (50 мкг/мл) ж 2 95 глюкози, інокулювали 1 мл "закваски", яка є нічною культурою вибраного за афінністю клона, що експресує Раб Е. соїї. Залишок культури-закваски (близько З мл) використовували для приготування ДНК-плазміди (ОІАргер тіпі-ргер, набір фирми Оіадеп) для секвенування та додаткових маніпуляцій. Більшу культуру інкубували при 30 С при енергійному струшуванні до досягнення значення оптичної густини ОЮвоонм, рівного 1,0 (типово 12-16 год.). Осад клітин збирали центрифугуванням при 4000 об/хв, 4 "С протягом 20 хв, та ресуспендували в 150 мл І В « карбеніцилін (50 мкг/мл) ї- 0,5 мМ ІРТО. Після 5 год. експресії при 30 "С, клітини збирали центрифугуванням при 4000 об/хв, 4 "С протягом 20 хв, ресуспендували в 10 мл буфера НВ5-ЕР Віасоге, та лізували з використанням одного циклу заморожування (-80 "С)/відтаювання (37 "С). Осад клітинних лізатів збирали центрифугуванням при 4000 об/хв, 4 "С протягом 1 години, і супернатант збирали та фільтрували (0,2 мкм).

Профільтровані супернатанти завантажували на колонки з сефарозним сорбентом Мі-МТА зиретшом зерпагозе (Оіадеп, МаіІепсіа, СА), врівноважені РВ5, рН 8, потім промивали 5 об'ємами колонки РВ5, рН 8. Індивідуальні РГар5 елюювалися в різні фракції за допомогою РВ5З (рН 8) їх 300 мМ імидазолу. Фракції, що містять Рарх, об'єднували та діалізували в РВ5, потім кількісно визначали методом ІФА перед аналізами афінності.

Одержання повного антитіла. Для експресії повного антитіла, варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів клонували в експресійні вектори ссавців та трансфекували з використанням ліпофектаміну в клітини НЕК 293 для транзієнтної експресії. Антитіла очищали за допомогою білка А з використанням стандартних способів. (610) Вектор ррр.СОгКР.ПЕсСОІ є експресійним вектором, що містить важкий ланцюг антитіла с1,

та є придатним для транзієнтної або стабільної експресії важкого ланцюга. Вектор рорр.СОгР.ЛЕсСОІ має нуклеотидні послідовності, що відповідають таким областям: промоторна область мишачого цитомегаловірусу (нуклеотиди 7-612); синтетичний інтрон (нуклеотиди 613- 1679); кодуюча область ОНЕК (нуклеотиди 688-1253); сигнальний пептид людського гормону росту (нуклеотиди 1899-1976); варіабельна область важкого ланцюга 1 (нуклеотиди 1977- 2621); константна область важкого ланцюга людського Ідс2, що містить такі мутації: АЗЗОР331 на 53305331 (нумерація амінокислот згідно з послідовністю Ідс2 дикого типу; див. Еиг. «).

Іттипої. (1999) 29:2613-2624). Вектор рОрБ.СОКР.ЕсСОЇІ був депонований в АТСС 15 липня 2005 р., і йому був привласнений номер доступу АТСС РТА-6867.

Вектор рЕБ.СОКР.ПКОСЇІ є експресійним вектором, що містить легкий ланцюг антитіла 1, та є придатним для транзієнтної експресії легкого ланцюга. Вектор рЕБ.СОКР.НКОІ має нуклеотидні послідовності, що відповідають таким областям: промоторна область мишачого цитомегаловірусу (нуклеотиди 2-613); інтрон людського ЕЕ-1 (нуклеотиди 614-1149); сигнальний пептид людського гормону росту (нуклеотиди 1160-1237); варіабельна ділянка легкого ланцюга антитіла 1 (нуклеотиди 1238-1558); константна область людського ланцюга каппа (нуклеотиди 1559-1882). Вектор рРЕБ.СОКР.ЙКОЇ був депонований в АТСС 15 липня 2005 р., і йому був привласнений номер доступу АТСС РТА-6866.

Аналіз Віасоге для визначення афінності. Афінності моноклонального антитіла 51 та його варіантів визначали при 25 "С або 37 "С з використанням системи поверхневого плазмонного резонансу (5РЕК) ВіасогезООО тм (Віасоге, ІМС, Різсаїажау МУ). Афінність визначали шляхом зв'язування біотинільованого на М-кінці СОКР або фрагментів з попередньо іммобілізованим стрептавідином (сенсорний чип ЗА) та вимірювання кінетики зв'язування фрагментів Еар антитіла 51 або варіантів, титрованих СОКР або фрагментом на чипі. Усі аналізи Віасоге проводили в рухомому буфері НВЗ-ЕР (10 мМ НЕРЕЗ рн 7,4, 150 мМ Масі, З мМ ЕДТА, 0,005 95 об./о0б. полісорбату Р20). Поверхні з СОКР готувили шляхом разведення М-біотинільованого

ССОРЕР до концентрації менше 0,001 мг/мл в буфері НВ5-ЕР та впорскування на сенсорний чип

ЗА з використанням змінних значень часу контакту. Поверхні з низькою ємністю, що відповідає рівням зв'язування «50 одиниць відгуку (КО), використовувалися для кінетичних досліджень з високим розрізненням, в той час як поверхні з високою ємністю (близько 800 КІ зв'язаного

СОР) використовувалися для досліджень концентрацій, скринінгу та визначень афінності в розчині. Кінетичні дані були одержані шляхом серійного разведення Рар антитіла 1 з дво- або трикратним шагом в діапазоні концентрацій 1 мкм - 0,1 нМ (відповідає діапазону 0,1-10х розрахункових Ко). Зразки типово впорскують на 1 хвилину при об'ємній витраті 100 мкл/хв і час спостереження дисоціації становив щонайменше 10 хвилин. Після кожного циклу зв'язування, поверхні регенерували 25 мМ Маон в 25 95 об./о0б. етанолі, що дозволяло проводити сотні циклів вимірів. Повну концентраційну залежність, одержану в результаті титрування (типово для двох паралельних експериментів) глобально апроксимували рівнянням для моделі 1:1 зв'язування Ленгмюра з використанням програми ВіАемаїІчайоп. В результаті цього одержували унікальну пару кінетичних констант швидкості асоціації та дисоціації (відповідно, Коп та Кок) для кожної зв'язувальної взаємодії, співвідношення яких дає константу рівноважної дисоціації (Ко-Конв/Коп). Афінності (значення Коб), визначені таким чином, наведені в Таблицях 6 та 7.

Аналіз зв'язувальних взаємодій з високою роздільною здатністю для дуже низьких швидкостей дисоціації. Для взаємодій з вкрай низькими швидкостями дисоціації (зокрема, для зв'язування Бар антитіла 51 з людським с-СОКР на чипі при 25 "С) афінності одержували за допомогою двостадійного експерименту. Використовували описаний вище протокол з такими модифікаціями. Константу швидкості асоціації (Коп) визначали шляхом впорскування серійних розчинів для титрування з 2-кратним розведенням (два паралельних виміри) в діапазоні концентрацій 550 нМ-1 нМ протягом 30 с при об'ємній витраті 100 мкл/хв та тривалості фази дисоціації усього 30 с. Константу швидкості дисоціації (Коб визначали шляхом впорскування трьох концентрацій (високої, середньої та низької) з цієї самої серії розчинів для титрування з двома паралельними вимірами протягом 30 с при тривалості фази дисоціації 2 години.

Афінність (Ко) кожної взаємодії одержували шляхом об'єднання значень Коп та Кої, одержаних в обох типах експериментів, як показано в Таблиці 5.

Визначення афінності розчину методом Віасоге. Афінність антитіла (31 в розчині для щурячого а-СОКР та ЕЗ7А (19-37) людського д-СОКР вимірювали методом Віасоге при 37 "С.

Використовували поверхню СОКР-чипа з високою ємністю (для детектування був вибраний високоафінний людський а-СОКР) та рухомий буфер НВЗ-ЕР подавали з об'ємною витратою 5 мкл/хв. Фрагмент Рар антитіла С1 при постійній концентрації 5 НМ (яка має бути близькою до або нижче очікуваного для взаємодій в розчині значення Ко) попередньо інкубували з (610) конкуруючим пептидом, який є щурячим а-СОКР або ЕЗ7А (19-37) людського а-СОКР, при кінцевих концентраціях в діапазоні від 1 нМ до 1 мкМ, з З-кратними серійними розведеннями.

Розчини Раб антитіла С1, за відсутності або при присутності в розчині конкуруючого пептиду, впорскували на СоОКР на чипі та контролювали виснаження зв'язувальних відгуків, детектованих на поверхні чипа, в результаті конкуренції в розчині. Такі зв'язувальні відгуки перетворювали на "концентрації вільного Бар" з використанням калібрувальної кривої, яку будували шляхом титрування окремо взятого Рар антитіла (1 (5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,325 та 0 нм) на СОКР на чипі. Будували графік залежності "концентрацій вільного Рар" від концентрації конкуруючого в розчині пептиду, використовуваного для одержання кожної точки даних, та апроксимували рівнянням для моделі афінності в розчині з використанням програми

ВІіІАемаїІчайоп. Афінності в розчині, визначені (опосередковано) у такий спосіб, представлені в

Таблицях 5 та 7 та використовувалися для підтвердження афінностей, одержаних при впорскуванні арх безпосередньо на М-біотинільовані СОКР» на 5А-чипі. Близький збіг між значеннями афінності, визначеними цими двома способами, підтверджує, що фіксація М- біотинільованого варіанта СОКР на чипі не змінює його нативну активність зв'язування в розчині.

Таблиця 5 нижче показує афінності зв'язування антитіла 51 з людським а-СОКР, людським

В-СОКР, щурячим а-СОКР та щурячим ДВ-СОКР, визначені методом Віасоге шляхом пропускання потоку фрагментів баб над М-біотинільованим СОКР на ЗА-чипі. Для того, щоб краще розділити афінності зв'язувальних взаємодій, що мають вкрай низькі швидкості дисоціації, афінності були також визначені шляхом проведення двостадійного експерименту, що доповнює цей напрямок аналізу, і була також визначена афінність взаємодії щурячого а-ССАР в розчині (як описано вище). Близький збіг афінностей, виміряних в обох орієнтаціях аналізу, підтверджує, що афінність зв'язування нативного щурячого -СОКР в розчині не змінюється, якщо його М-біотинілювати та зафіксувати на ЗА-чипі.

Таблиця 5

Афінності зв'язування Рарз антитіла 1, визначені шляхом титрування СОКР» на чипі . їй 2,57" «Афінності а-СОКР» (щурячого та людського) визначали шляхом проведення двостадійного експерименту з високою роздільною здатністю, у якому фазу дисоціації контролювали протягом 2 годин (значення Коп, Коб і Ко є середніми для п паралельних вимірів, стандартний відхил виражений як процент дисперсії). Афінності для Д-СОКР» (щурячого та людського) визначали шляхом глобального аналізу з використанням фази дисоціації тривалістю усього 20 хв., який не дозволяв проводити точне кількісне визначення з вкрай (низьких) швидкостей дисоціації (їх швидкості дисоціації, ймовірно, є нижчими, ніж вказано в даному документі, тому їх афінності, ймовірно, мають ще більш високі значення). Раб антитіла 1 дисоціював вкрай повільно з усіма

СОР (за винятком щурячого а-СОЕР) та мав швидкості дисоціації, що наближаються до межі розрізнення аналізу Віасоге (особливо при 25 С). "«Афінність в розчині, визначена за вимірами виснаження відгуків зв'язування, детектованих для СОКР на чипі по відношенню до Рар антитіла 51, попередньо інкубованого з розчином конкурента щурячого а-СС АР.

В Таблиці 6 нижче наведені антитіла, що мають варіації амінокислотної послідовності у порівнянні з антитілом С1, та їх афінності по відношенню до щурячого а-СОКР та людського а-

СОР. Усі амінокислотні заміщення варіантів, представлених в Таблиці б, описуються у порівнянні з послідовністю (31. Афінності зв'язування фрагментів Бар визначали методом

Віасоге шляхом пропускання їх потоку над СОКР» на 5А-чипі.

Таблиця 6

Амінокислотні послідовності та дані щодо афінностей зв'язування для варіантів антитіла с1, визначених при 37 "С методом Віасоге. ві | 1 1 1 | звомо| 257 |з63х105| 0063 мб 17717717 1Аюо флломоєу 711171 злої, 1111 є 1171765, | зве з зн з в 1 17175 |з-ео жому; по ссУН НО НОЯ НАННЯ МАННЯ ПС НИСУУНИ НСС НСС є 1171 Щ1ЕА, тям зво заз»

СНИ НО НО НОЯ ка НЕ НЕННЯ НННСТТНН

Го НО НОЯ КОНЯ ЧОН НЕСЕ НС НЕ ННЕЧН

СН НО НОЯ ВОНО ЧОН НЕСЕ НОСУУНИ НСС НС НЯ

ГСННИ НО НОЯ МОНО с МАННЯ СН СУЯ НЯ НННСННЯ м 117115 ее; в

ГХОНИ НО НОЯ ВОНО с ЧОН ПЕ ВОСЕНИ Ес НЕК

СРО НО НОЯ ВОНО с МАННЯ ПС НОСИ НЕ НННСТНЯ

ССО НО НО НН УЧНЯ НЕ НОСИ НСС НННЕХСТН

ГЕС НО НОЯ КОНЯ ЧОН СН СУЯ НС ННИСННЯ

ГСЗНИ НО ННЯ ВОНО ЧОН НЕ НОСИ НЕ ННСХСТНЯ ме 11717105 1ееивва вив

ГЕНИ ННЯ НОЯ ВОНО ЕНН ПЕ НОСИ НЕ НЕК

ГСсНИ НО ННЯ ВОНО ННЯ Пов НС НЕ СтЯ НННСУЗНЯ

ГСсН НН ННЯ КОНЯ НОЯ СН СУЯ НС ННИСЕННЯ

ГСТНИССІ НІ НН сс НН ПЕ НС НЕ НСТУ мг! нав | 01995 | бохо | 152 | 142103 м2г |нг8М/| | 0п99т | їлохтоз | 61 | ливо | 073 може, | (Кб тео)

ПСЗОСтО НО НОЯ Ес ПЕ НОСИ НЕ ННСТННЯ мелені | (бу 1ї-ео ово ажво) 13 меоіен.! (ее|еум вані аа

І а-щурячий | а-щурячий | а-людський ном | | КМ кю Ком)

ВВ ї897 й Й ма |тоАЦ | (дом | моє| лам | авто

ВВ ЕБАВ ТТ 99Т й т мово |т3оо шх АТОМ 12519 99610

ВОМ Г997 з й ме (те | | (дмом | звемо | лева | звоко

ВОМ ЕБАК 1 99Т й 7

Мао т30о АБ АТОМ бвхто | 5 у вохо

ВОМ ЕБАК 1 99Т й 7 мат т3оо ше АТОМ МН Ин

ВОМ ЕБАК 1 99Т й 7

ЩЕ шх АТОМ 296х10 тв реко

ЕБЯК мазз /|В2вМ дБУМ 199Т 922х103 БІ22 | 750104 4,69 тзос АТОМ зас

ЕБАК мза /|В28М дБУМ 1991 2їтх103 | 4206 в4вх10- 4,04 тзос АТОМ

БТ

ВВ ЕБАК 1 99Т й 7 ма тоб АБ АТОМ звакот | или рфровеко

ВОМ Г997 й 7

ВВ Г997 й й ме? (та | Ага |дтюм | мо зво

ВОМ Г997 з й мав (тзом| 100 (дом | 5лмоє | вве | зивкто

СБОА ТАБИМ 1 99Т й 7

Ме вовк по врвм | А100М 9,95х10 5Б2,8 0 4о5х10 ав

СБОА ТЕБАК 11997 з

Мао вовк іБбт |АБЛІ. |АТО0М гово у тивко

ЕБЯК маї 0 Івовм УА | д57м | 1997 453х103 | 251,77. 2л10х105 1,81

ІБбТ АТОМ

Еб4О

ЕБАК

Мма2 |вовм УА | д57м | 1997 7,52х103 417,5. | 417104 2 81

ІБбТ АТОМ

Не

ЕБАК маз 0 |вовм УА | д57м | 1997 453х103 | 251,7. 2,63х105 1,64

ІБбТ АТОМ

Бас

ЕБАК

Мма4 вом о У5ОА дв | 99 ви13х103 443 2710х105 2,05

ІБбТ АТОМ

ЗБЕ

ЕБАК

СБОА |АБУМ 1997 з й

М45 вгвмМ ІБВТ е5ВЕ | АТ00М 5.38х103 259 2Лл1х107 185

Еб4О

ЕБАК

СБОА |АБУМ 1997 з й мав оововм бо свв | АЗО0М 2,94х10 163,3. | 5зох10 3,37

НЕ

ЕБАК ма47 вом УА | д57м | 1997 823х103 457,2 | 332104 2,08

ІБбТ АТОМ зас

ЕБАК мав о |вовм УА | д57м | 1997 0,0343 1905,6.... 8,42х105 5.26

ІБбТ АТОМ

БВ. ве

І а-щурячий | а-щурячий а-людський

КОВАЛЯ Й ВК А ВИ

ЕБЯК

СБОА |АБУМ 1997 мае ововм | ервм | АТО0М 0,0148 8222 | 5,9вх105 372

НЕ

СБОА ТЕБАК 1997 й у

МБО вв ему 5,3ох10 2944 | 40вх10

ЕБЯК 1997 з й мето |навмобеві дбуб АМС еКо тик

ЕБЯК | в9т

Мм52 Во28М о 15ВІ |АБ7М 2ах1оз | 427,2 | 281х104 1,76

АТОМ

ЗБВА

ЕБЯК |; дет

Мм53 В28М о 15БІ |АБМ те1їх103 | 06и 3,74х104 2,34

АТОМ

95805

ЕБЯК ма |НУВМ | свБод |АБ7М | 997 2ивх10з | 1200 | 1т9х10з 119

ТЗОА АТОМ

БР

ЕБЯК вгвм АБ7М 1997 з й

МБ Таб 565 срвЕ | АТО0М 5,85х10 325,0. | 478х10 2,99

Ев4О

ЕБЯК мб 128 565 |дБУМ | 997 9,35х103 | 54 | 4тох105 299 тор АТОМ

НеТЕ

ЕБЯК м57 |НЕВК |увв5 |дБМ | 997 0.0104 1200 | 322х10 3.08 тор АТОМ

ЗБЕ

ЕБЯК вгвм АБ7М 1997 Немає з

М5В тз0о 565 З58І ГТАТО0М зв'язування 1,95510 1219

НОТ

ЕБЯК вгвм АБ7М 1997 й ме 1855 565 ср АТО0М 0,0123 683,3. | 5,2ах10 3,28

НЕ

ЕБЯК вгвм АБ7М 1997 й мво 1855 565 сере | АТО0М 0,0272 ів1чя ОЇ витхто 5,в9

НОТ

ЕБЛО мві 1 Н2ВМ він |д5м | 997 5Б21х103 2894 | 45БОх10 2,87 тзос АТОМ

НЕ

ЕБЯК вгвм | АБІН 997 мб2 тзос І 56Т А57М АТОМ 5,15х103 242 5,51х107 5.86

ЗБЕ

ЕБЯК мез |Н2ВМ овод |д5м | 997 2в5х103 | 447,2. | 1,50х103 9,38 тзос АТОМ

БТ

ЕБЯК мва |Н2ВМ овод |д5м | 997 0,0234 1300,0..| 1,32х103 8,25 тзос врву АТО0М

В28М ГСБОА ТЕБАК 1997 й у ме о І5бІ АБС АТОМ 407х10 2261000) во3х10 гам ЕБЯК 1997 й у меє о вві АРК | А00М ви1х10 2839. | 520х10 гам ЕБЯК 1997 й у ме т3оо СББІ |дБув |Атобм Війни 820510

Й а-щурячий | а-щурячий | а-людський | а-людський нота Те ив | Кому ка. | Ко(нМ

ЕБАК дгвм А5Б7М |1 997 8 й

МВ тзос І 561 «5ВО | АТОМ 6,76х10 375,6 4,28х10 2,68

Еб40О

ЕБАК мве 1Н2ВМ уві |АБМ 997 181х103 300,6 | 7,33х105 4,58 тз0а АТООМ

ЗО8Е дгвм ЕБ5АК |1997 8 а мо оо І 561 АБУЄ АТО0М 6,07х10 337,2 5,59х10 дгвм ЕБ5АК |1997 8 8 мл І 561 АБУ АТО0М 2,12х10 117,8 1,28х10 дгвм 997 8 А ма о 1565 | ЕБАК АТ1О0М 3,95х10 219,4 4,00х10

ЕБАК дгвм А5Б7М |1 997 8 й

М7З тзос І 565 «БУ | АТОМ 3,00х10 166,7 2,55х10 1,59

Еб40О дгвм ЕБ5АК |1997 8 й мг оо І 565 дБ75 | АТ00М 6,03х10 335,0 5,97х10 дгвм ЕБ5АК |1997 їй 8 мо І 565 АБ7М | АТ00М 1,87х10 1038,9 1,16х10

В28М (а50А 997 8 А м тав свбт Абе |дтору | Тео зби

В28М ГОабобА |ЕБ5АК |1997 А мг оо іБбТ АБО | АТОМ 0,0143 тзаА | То

ЕБАК

В28М (а50А 997 8

В28М ГОабобА |ЕБ5АК |1997 8 мг тоо8 іБбТ |АБ7Р |АТООУ ТоБ556 1 Тлек1о вв ЕЗАЯК І д9т

Мо ІЇ561І |АБ7М 0,0993 5516,7 2,09х103 13,06 т305 А1То0У

З58У

ЕБАК ме: 1Н28М 565 |АБМ 997 429х103 | 238,3. | 4,90х104 3,06 т305 А1То0У

ЗО8Е

В8В28М ТАБІН 997 8 А ме Бу ІБбТ АБ7М АТ1О0М 6,99х10 388,3 8,77х10

ЕБАК

В28М ГТАБІН |А57М |1 997 Немає їй

М83 |т30у ІББТ |558МІАТО0М 00 зв'язування 9,33х10 5,83

НебТЕ

В28М ГТАБІН |ЕБ54М |1 997 їй 8 ме ЗУ і56Т |А5Б7М АТОМ 1,76хто зт фротовхто

Усі СОЖ, включаючи СОК за системами Караї та СпПпоїШіа. Амінокислотні залишки пронумеровані послідовно (див. Фігуру 5). Усі клони мають послідовності І3-Н1--Н3, ідентичні а.

Ко-Кон/Коп. Усі значення Кояє визначали в режимі скринінгу, за винятком виділених підкреслюванням, які були одержаня шляхом глобального аналізу рядів концентрацій Раб (1 аналізували в режимі високого розрізнення). Таким чином, виділені підкреслюванням значення

Ко були визначені експериментально шляхом вимірів Коп. Інші значення Коп були прийняті рівними значенням для М25. н.в. 5 не визначено

Для визначення епітопа людського (-СОКР, який розпізнається антитілом с1, використовували вищеописані аналізи Віасоге. Людський а-СОКР був придбаний у вигляді М- біотинільованого варіанта для забезпечення здатності до зв'язування з високою афінністю із сенсорними чипами 5А. Визначали зв'язування фрагмента Бар 1 з людським а-СОКР на чипі за відсутності або в присутності пептиду СОКР. Типово, розчин пептид/Бар з молярним співвідношенням 2000:1 (наприклад, 10 мкМ пептиду в 50 нМ ЕРабрб С1) вводили впорскуванням на людський а-СОРР на чипі. Фігура 6 показує процент зв'язування, блокований конкурентним пептидом. Дані, представлені на Фігурі б, показують, що пептидами, які блокують 100 95 зв'язування Бар с1 з людським а-СОКР, є 1-37 (ММ/Т (дикого типу)), 8-37, 26-37, Р29А (19-37),

КЗБА (19-37), КЗБЕ (19-37), та КЗ5М (19-37) людського а-СОВР; 1-37 Д-ССВР (М/Т); 1-37 щурячого а-СОКР (УМТ); та 1-37 щурячого ВД-СОКР (М/Т). Усі ці пептиди амідовані на С-кінці.

Пептиди ЕЗ7А (19-37) та 19-37 (останній не амідований на С-кінці) людського -СОКР також блокували близько від 80 95 до 90 95 зв'язування баб 51 з людським а-СОКР. Пептид 1-36 (не амідований на С-кінці) людського а-СОКР блокував близько 4095 зв'язування Раб 1 з людським а-СОКР. Пептидний фрагмент 19-36 (амідований на С-кінці) людського а-СагВР; пептидні фрагменти 1-13 та 1-19 людського а-СОРР (обидва не амідовані на С-кінці); та людські амілін, кальцитонін та адреномедулін (усі амідовані на С-кінці) не конкурують зі зв'язуванням

ЕРар 01 з людським с-СОКР на чипі. Ці дані демонструють, що 51 націлений на С-кінцевий епітоп СОКР, та що як ідентичність самого крайнього залишку (Е37), так і його амідування важливі для зв'язування.

Були також визначені афінності зв'язування Бар 1 з варіантами людського 6-СОКР (при 3772). В Таблиці 7 нижче наведені афінності, виміряні безпосередньо шляхом титрування зв'язування Бар 1 з М-біотинільованим людським а-СОКР та варіантами на чипі. Дані в

Таблиці 7 показують, що антитіло 1 зв'язується з С-кінцевим епітопом, причому Е37 та 533 є найбільш важливими залишками. 1 не зв'язується з СОКР, якщо на С-кінці (амідованому) додається додатковий амінокислотний залишок (аланін).

Таблиця 7

Афінності зв'язування Раб 1 з людським с-СОКР та варіантами, виміряні при 37 "С (їх амінокислотні послідовності див. в Таблиці 4) зВА(25-38А) | - | - | Зв'язуваннянедетектується./-:/ /:

Наведені вище дані показують, що епітоп, з яким зв'язується антитіло 51, розташований в

С-кінцевій області людського а-СОРР, і амінокислоти 33 та 37 людського а-СОКР є важливими для зв'язування антитіла 1. Для зв'язування також важливо амідування залишку Е37.

Приклад 5: Ефект антагоністичного антитіла 1 анти СОКР на вазодилатацію шкіри, індуковану стимуляцією підшкірного нерва щура

Для тестування антагоністичної активності антитіла 51 анти СОКР, ефект антитіла на вазодилатацію шкіри стимуляцією підшкірного нерва щура тестували з використанням щурячої моделі, описаної в Прикладі 3. Стисло, щурів підтримували під анестезією за допомогою 2 95 ізофлурану. Бретилію тозилат (30 мг/кг, внутрішньовенне (в/в) введення) давали на початку експерименту для мінімізації вазоконстрикції внаслідок супутньої стимуляції симпатичних волокон підшкірного нерва. Температуру тіла підтримували рівною 37 "С шляхом використання ректального зонда, підключеного за допомогою термостата до грілки-матраца з контрольованою температурою. Підшкірний нерв правої задньої лапи оголювали хірургічно,

перерізали проксимально та накривали полімерною плівкою для попередження висихання.

Лазерний допплерівський зонд поміщали на медіодорсальну частину шкури задньої лапи, яка є областю, іннервованою підшкірним нервом. Шкірний кровотік, вимірюваний як потік кров'яних клітин, контролювали за допомогою лазерного допплерівського флоуметра. В експериментах з визначення ефектів антитіла протягом двох годин після ін'єкції через від тридцяти до сорока п'яти хвилин після ін'єкції бретилію тозилату, після встановлення стабільного базового потоку (відхилення менше 5 95) протягом щонайменше 5 хв, нерв поміщали на платинові біполярні електроди та електрично стимулювали (2 Гц, 10 В, 1 мс, протягом 30 с), і (стимуляцію) повторювали через 20 хвилин. Середнє значення відгуку величини кровотоку на ці дві стимуляції використовували для визначення базового відгуку (момент часу 0) на електричну стимуляцію. Потім вводили внутрішньовенно (в/в) антитіло 1 (1 мг/кг або 10 мг/кг) або носій (РВ5 з 0,01 95 Тмееп 20 в об'ємі, рівному 10 мг/кг С1). Нерв потім стимулювали (2 Гц, 10 В, 1 мс, протягом 30 с) в моменти часу 30 хв, 60 хв, 90 хв та 120 хв після введення антитіла. Тварин витримували під анестезією протягом приблизно трьох годин. Кумулятивну зміну шкірного кровотоку оцінювали за площею під кривою залежності потоку від часу (АОС, дорівнює зміні потоку, помноженій на зміну часу) для кожного відгуку потоку на електроїмпульсну стимуляцію.

Як показано на Фігурі 7, збільшення кровотоку, стимульоване дією на підшкірний нерв електричними імпульсами, в значному ступені інгібувалося в присутності антитіла 1 в кількості 1 мг/кг (в/в введення) у порівнянні з носієм, при електричній стимуляції підшкірного нерва через 90 хв після введення антитіла. Збільшення кровотоку, стимульоване дією на підшкірний нерв електричними імпульсами, в значному ступені інгібувалося в присутності антитіла 1 в дозі 10 мг/кг (в/в введення) у порівнянні з носієм, при електричній стимуляції підшкірного нерва через 90 хвилин та 120 хвилин після введення антитіла.

В експериментах з визначення ефектів антитіл в більш віддалені моменти часу при аналізі на підшкірній вені, щурам вводили в/в ін'єкцією зазначені дози антитіла за 24 години або 7 днів до підготовки тварини до стимуляції підшкірного нерва, як описано вище. В цих експериментах було неможливо встановити базовий відгук індивідуальних щурів на електроімпульсну стимуляцію перед введенням дози, тому групи, що отримували лікування, порівнювали з тваринами, яким вводили носій (РВ5, 0,01 95 Тмееп 20) в моменти часу 24 години або 7 днів.

Як показано на Фігурах 8А та 88, збільшення кровотоку в дорсомедіальній області шкіри задньої лапи, викликане стимуляцією підшкірного нерва, в значному ступені інгібувалося в групах тварин, що отримували 10 мг/кг або З мг/кг С1 в момент часу за 24 години або 7 днів до стимуляції у порівнянні з групами носія, введення яким здійснювалося в ті самі моменти часу.

На Фігурі 8С ізображений аналіз методом апроксимації кривої даних залежності відгук-доза, представлених на Фігурах ВА та 8В, для визначення дози, потрібної для концентрації, що забезпечує 50 95 від максимально можливого ефекту (ЕСвзо). Значення ЕСво для моменту часу 24 години дорівнює 1,3 мг/кг, і ЕС5о для моменту часу 7 днів має трохи нижче значення (0,8 мг/кг).

Приклад 6: Гострий ефект антагоністичного антитіла ти7Е9 анти СОКР в аналізі на артерії твердої мозкової оболонки (закрите черепне вікно)

Модель закритого черепного вікна: Метою цього експерименту було визначення гострого ефекту антагоністичних антитіл анти СОКР та його порівняння з гострим ефектом антагоніста рецептора СОКР ВІВМ4096В5. Експерименти проводили, як описано вище (У/Шіатвхоп еї аї.,

Серпаїа!діа 17(4):518-24 (1997)), з такими модифікаціями. Щурів Зргадое Юаулеу (300-400 г) анестезували за допомогою 70 мг/кг пентобарбіталу і.р. (інтраперитонеально). Анестезію підтримували за допомогою 20 мг/кг/год. пентобарбіталу в/в (внутрішньовенно). Щурам вводили канюлю в яремну вену для доставки усіх лікарських препаратів. Кров'яний тиск контролювали за допомогою зонда (катетер тікКго-їїр, МіПаг Іпбігитепів), який вводили через стегнову артерію в черевну аорту. Щурам проводили трахеотомію та частоту дихання підтримували на рівні 75 вдихів на хвилину при об'ємі 3,5 мл. Після фиксації голови в стереотактичному інструменті та зняття скальпа, вікно розміром 2х6 мм в лівій тим'яній області латерально безпосередньо поряд з сагітальним швом було зроблено шляхом стоншення кістки за допомогою бормашини. За допомогою мікроманіпулятора, платиновий біполярний електрод опускали на поверхню та накривали тяжким мінеральним маслом. В латеральному положенні по відношенню до електродного вікна створювали інше вікно розміром 5хб мм, заповнене тяжким мінеральним маслом, через яке безперервно контролювали діаметр гілки середньої менінгеальної артерії (ММА) за допомогою ПЗЗ-камери та аналізатора розмірів відеозображення (І їміпд Зузіетв).

Після підготовки, щури відпочивали протягом не менше 45 хвилин. Визначали базовий відгук на електричну стимуляцію (15 В, 10 Гц, імпульси 0,5 мс, 30 секунд), і потім щурам вводили в/в тестовані сполуки (10 мг/кг ти7ЕЗУ, 300 мкг/кг ВІВМ4096В5 або РВЗ 0,0195 Тмеєп 20). (610) Додаткову електричну стимуляцію проводили в моменти часу 5 (ВІВМ4096В5), 30, 60, 90 та 120 хвилин після введення дози. Усі дані реєстрували з використанням прикладної програми СпПагі (АОіпвігпитепів).

Як показано на фігурі 9, ти7ЕЗ9 в дозі 10 мг/кг в значному ступені блокує дилатацію ММА, викликувану стимуляцією електричним полем протягом 60 хвилин після введення дози, та підтримує ефект протягом аналізу (120 хвилин). Для порівняння, ВІВМ4096В5 блокує дилатацію

ММА через 5 хвилин після введення дози, але ефект повністю щезав за 90 хвилин. Величина блокування є порівнянною для ВІВМ4096В5 та ти7Е9.

Приклад 7: Хронічний ефект антагоністичного антитіла 51 анти СОКР в аналізі на артерії твердої мозкової оболонки (закрите черепне вікно)

Метою цього експерименту було визначення того, або буде антитіло анти СОР продолжувати блокувати електростимульовану дилатацію ММА через 7 днів після введення дози. Підготовка щурів була ідентичною вищеописаному гострому експерименту (Приклад 6), за такими винятками. Щурам вводили шляхом в/в ін'єкції (10 мг/кг, З мг/кг або 1 мг/кг С1) за 7 днів до процедури створення закритого черепного вікна та стимуляції. Було неможливо встановити базовий дилатаційний відгук на електричну стимуляцію до введення дози, як і в гострому експерименті, тому групи, що отримували антитіло, порівнювали з дилатацією ММА в контрольній групі, що отримувала носій (РВ5, 0,0195 Тмуеєп 20). Після того, як щурам дозволяли відпочити не менше 45 хвилин, тверду мозкову оболонку електрично стимулювали з інтервалами 30 хвилин. Стимуляцію проводили при 2,5 В, 5 В, 10 В, 15 В та 20 В, усі при 10 Гу, імпульсами по 0,5 мс протягом 30 секунд.

Як показано на Фігурі 10, 51 в дозах 10 мг/кг та З мг/кг в значному ступені блокував дилатацію ММА, викликувану електричною стимуляцією в діапазоні значень від 10 до 20 вольт.

Ці дані демонструють, що (31 може блокувати стимульовану електричними імпульсами дилатацію ММА протягом до 7 днів після введення дози.

Приклад 8: Модель припливу крові після відміни морфіну

Модель відміни морфіну у щурів є прийнятою моделлю механізмів припливів крові при менопаузі на гризунах (Зіре еї аї., Вгаіїп Ке5. 1028(2):191-202 (2004); Мегспепіпаег еї аї.,

Магитіавз 30:307-316 (1998); Каїомісн еї аї!., Вгаіїп Рез. 494:85-94 (1989); БітрКіп5 єї аї., Ге

Зсіепсе5 32:1957-1966 (1983)). В основному, залежність щурів від морфіну створюють шляхом імплантації гранул морфіну під шкіру. Після встановлення залежності, тваринам роблять ін'єкцію налоксону (опіоїдний антагоніст), який негайно викликає у них абстинентний синдром.

Цей абстинентний синдром супроводжується підвищенням температури шкіри, зниженням температури усередині тіла, підвищенням частоти серцевих скорочень та підвищенням рівня лютеїнізуючого гормону в сироватці. Усі ці ознаки за величиною та часом прояву схожі зі спостережуваними при людських припливах крові (ЗітрКіп5 еї а!І., ЇШе Зсіеєпсе5 32:1957-1966 (1983)). Крім того, якщо щурам вводять естрадіол перед індукцією абстинентного синдрому, то симптоми припливу крові зменшуються (Мегспепіпаїйег еї а!., Маїшніав 30:307-316 (1998)). Саме тому вважається, що модель відміни морфіну імітує клінічний приплив крові.

Щурів з видаленими яєчниками замовляли у фірми СпВагіеє5 Кімег І арогайогіе5. Не раніше ніж через 7 днів після оваріоектомії викликали морфінову залежність шляхом імплантації підшкірно гранули морфіну (75 мг морфінової основи). Через два дні імплантували ще 2 гранули.

Наступного дня щурам вводили ін'єкцією внутрішньовенно 10 мг/кг 4901 Г" або носій (РВ5, 0,01 95 твін). Через два дні після другої імплантації гранул щурів анестезували кетаміном (90 мг/кг) та трохи обмежували в рухах (ІІдну гезігаіпед). Термопару для вимірювання температури поверхні тіла закріпляли клейкою стрічкою у основи хвоста та ректальну термопару використовували для вимірювання внутрішньої температури тіла. Дані реєстрували з використанням прикладної програми Спагі (Абіпзігитепів). Після запису протягом 15 хвилин стабільної базової температури вводили ін'єкцією налоксон (1 мг/кг) підшкірно. Температуру реєстрували безперервно протягом наступних 60 хвилин. Результати представлені на Фігурах 11А та 118.

Приклад 9: Лікування хронічної мігрені

Чоловік у віці 45 років був ідентифікований як такий, що потерпає від хронічної мігрені протягом щонайменше трьох місяців. Визначення наявності хронічної мігрені проводилося шляхом дослідження історії частого головного болю, що дозволяють припустити прояви хронічної мігрені (наприклад, 15 днів на місяць) протягом щонайменше трьох місяців перед проведенням скринінгу. Підтвердження частоти головного болю здійснювалося шляхом подальшого збирання базової інформації, що демонструє наявність головного болю у щонайменше 15 днів, причому щонайменше 8 днів на місяць відповидали будь-якому одному з таких критеріїв: і. відповідність характеристикам нападу мігрені; та/або ії. їм передують або вони (610) супроводжуються мігреневою аурою.

Для зниження частоти випадків мігрені у суб'єкта, суб'єкту вводили дозу 225 мг антагоністичного антитіла анти СОКР (наприклад, антитіла 1). Антагоністичне антитіло анти

СОКР постачалось у вигляді рідкої композиції в концентрації 150 мг/мл. Дозу 225 мг вводили підшкірною ін'єкцією 1,5 мл із задньої сторони плеча суб'єкта. Альтернативно, доза може бути введена суб'єкту шляхом внутрішньовенної інфузії. В таких випадках, 5,85 мл (розчину) 150 мг/мл антитіла анти СОКР може бути об'єднано з 0,9 95 розчину хлориду натрію (нормальний сольовий розчин) в пакеті для внутрішньовенного (ІМ) вливання із загальним об'ємом в пакеті 130 мл. 100 мл з об'єму пакета для внутрішньовенного (ІМ) вливання вводять суб'єкту шляхом внутрішньовенної інфузії протягом однієї години, при загальній дозі 225 мг. Введення доз повторяють через кожні двадцять вісім днів доти, поки не буде спостерігатися зниження частоти випадків мігрені. Знижену частоту хронічної мігрені аналізують з використанням різних критеріїв, які включають число днів головного болю, число годин, коли спостерігаються головні болі (наприклад, годин головного болю), тяжкість головного болю, та число днів мігрені, спостережуваних у суб'єкта.

Приклад 10: Лікування хронічної мігрені

Жінка у віці 37 років була ідентифікована як така, що потерпає від хронічної мігрені протягом щонайменше трьох місяців. Визначення наявності хронічної мігрені проводилося шляхом дослідження історії частого головного болю, що дозволяють припустити прояви хронічної мігрені (наприклад, 15 днів на місяць) протягом щонайменше трьох місяців перед проведенням скринінгу. Підтвердження частоти головного болю здійснювалося шляхом подальшого збирання базової інформації, що демонструє наявність головного болю у щонайменше 15 днів, причому щонайменше 8 днів на місяць відповидали будь-якому одному з таких критеріїв: і. відповідність характеристикам нападу мігрені; та/або ії. їм передують або вони супроводжуються мігреневою аурою.

Для зниження частоти випадків мігрені у суб'єкта, суб'єкту вводили початкову ударну дозу 675 мг антагоністичного антитіла анти СОКР (наприклад, антитіла 1). Антагоністичне антитіло анти СОКР постачалось у вигляді рідкої композиції в концентрації 150 мг/мл. Ударну дозу 675 мг вводили у вигляді трьох підшкірних ін'єкцій по 225 мг в 1,5 мл в різні області тіла суб'єкта (наприклад, задня сторона плеча, нижня частина живота/живіт/галія, передня частина стегна і т.д.). Введення повторяли через кожні двадцять вісім днів в дозах по 225 мг (наприклад, за допомогою однієї підшкірної ін'єкції 1,5 мл в руку суб'єкта) доти, поки не буде спостерігатися зниження частоти випадків мігрені. Знижену частоту хронічної мігрені аналізують з використанням різних критеріїв, які включають число днів головного болю, число годин, коли спостерігаються головні болі (наприклад, годин головного болю), тяжкість головного болю, та число днів мігрені, спостережуваних у суб'єкта.

Приклад 11: Лікування хронічної мігрені

Чоловік у віці 23 років був ідентифікований як такий, що потерпає від хронічної мігрені протягом щонайменше трьох місяців. Визначення наявності хронічної мігрені проводилося шляхом дослідження історії частого головного болю, що дозволяють припустити прояви хронічної мігрені (наприклад, 15 днів на місяць) протягом щонайменше трьох місяців перед проведенням скринінгу. Підтвердження частоти головного болю здійснювалося шляхом подальшого збирання базової інформації, що демонструє наявність головного болю у щонайменше 15 днів, причому щонайменше 8 днів на місяць відповідали будь-якому одному з таких критеріїв: і. відповідність характеристикам нападу мігрені; та/або ії. їм передують або вони супроводжуються мігреневою аурою.

Для зниження частоти випадків мігрені у суб'єкта, суб'єкту вводили дозу 900 мг антагоністичного антитіла анти СОКР (наприклад, антитіла 1). Антагоністичне антитіло анти

СОР постачалось у вигляді рідкої композиції в концентрації 150 мг/мл. Дозу 900 мг вводили у вигляді чотирьох підшкірних ін'єкцій по 225 мг в 1,5 мл в різні області тіла суб'єкта (наприклад, задня сторона плеча, нижня частина живота/живіт/талія, передня частина стегна тощо).

Введення доз повторяють через кожні двадцять вісім днів доти, поки не буде спостерігатися зниження частоти випадків мігрені. Знижену частоту хронічної мігрені аналізують з використанням різних критеріїв, які включають число днів головного болю, число годин, коли спостерігаються головні болі (наприклад, годин головного болю), тяжкість головного болю, та число днів мігрені, спостережуваних у суб'єкта.

Приклад 12: Лікування епізодичної мігрені

Чоловік у віці 28 був ідентифікований як такий, що потерпає від епізодичної мігрені з високою частотою (нападів). Суб'єктів ідентифікували як таких, що страждають від епізодичної мігрені з високою частотою нападів з використанням критеріїв, що включають: наявність історії (610) головного болю у більш ніж 8 днів на місяць протягом щонайменше З місяців до проведення скринінгу; та підтвердження частоти головного болю шляхом подальшого збирання базової інформації про прояви головного болю (будь-якого типу) протягом від 8 до 14 днів, причому щонайменше 8 днів відповідають щонайменше одному з таких критеріїв: і. мігрень; ії. імовірна мігрень; та/або ії. використання триптанів або сполук на основі ріжків.

Для зниження частоти випадків мігрені у суб'єкта, суб'єккту вводять дозу 675 мг антагоністичного антитіла анти СОКР (наприклад, антитіла 1). Антагоністичне антитіло анти

СОКР постачалось у вигляді рідкої композиції в концентрації 150 мг/мл. Дозу 675 мг вводили шляхом трьох 225 мг підшкірних ін'єкцій по 1,5 мл в різні області тіла суб'єкта (наприклад, задня сторона плеча, нижня частина живота/живіт/галія, передня частина стегна тощо). Введення доз повторяють через кожні двадцять вісім днів доти, поки не буде спостерігатися зниження частоти випадків мігрені. Знижену частоту епізодичної мігрені аналізують з використанням різних критеріїв, які включають число днів головного болю, число годин, коли спостерігаються головні болі (наприклад, годин головного болю), тяжкість головного болю, та число днів мігрені, спостережуваних у суб'єкта.

Приклад 13: Лікування епізодичної мігрені

Жінка у віці 52 була ідентифікована як така, що потерпає від епізодичної мігрені з високою частотою нападів. Суб'єктів ідентифікували як таких, що страждають від епізодичної мігрені з високою частотою нападів з використанням критеріїв, що включають: наявність історії головного болю у більш ніж 8 днів на місяць протягом щонайменше 3 місяців до проведення скринінгу; та підтвердження частоти головного болю шляхом подальшого збирання базової інформації про прояви головного болю (будь-якого типу) протягом від 8 до 14 днів, причому щонайменше 8 днів відповідають щонайменше одному з таких критеріїв: і. мігрень; ії. імовірна мігрень; та/або ії. використання триптанів або сполук на основі ріжків.

Для зниження частоти випадків мігрені у суб'єкта, суб'єкту вводили дозу 225 мг антагоністичного антитіла анти СОКР (наприклад, антитіла 1). Антагоністичне антитіло анти

СОКР постачалось у вигляді рідкої композиції в концентрації 150 мг/мл. Дозу 225 мг вводили підшкірною ін'єкцією 1,5 мл в задню частину плеча суб'єкта. Введення доз повторяють через кожні двадцять вісім днів доти, поки не буде спостерігатися зниження частоти випадків мігрені.

Знижену частоту епізодичної мігрені аналізують з використанням різних показників, які включають спостереження числа днів головного болю, числа годин, коли спостерігаються головні болі (наприклад, годин головного болю), тяжкості головного болю, та числа днів мігрені у суб'єкта.

Приклад 14: Неклінічна токсикологія та фармакокінетика

Антагоністичне антитіло анти СОКР 1 добре переносилося в ході проведення досліджень токсичності тривалістю 1 місяць при повторному внутрішньовенному (ІМ) введенні доз щурам

Зргадиє-Оаулеу (50) та яванським макакам, і вибіркова органна токсичність не спостерігалась в обох цих дослідженнях. Рівень відсутності небажаних ефектів (МОАЕЇГ) був визначений рівним 100 мг/кг/ тиждень за результатами досліджень як на щурах, так і на мавпах. Цей рівень доз відповідав системній експозиції з максимальними концентраціями (Стах), рівними 2570 та 3440 мкг/мл, та значеннями площ під кривою (АС(0-168ч)), рівними 194000 мкг"год./мл та 299000 мкг"год./мл (день 22) у щурів та мавп, відповідно.

В ІМ/5С (внутрішньовенне/підшкірне введення) дослідженнях на щурах тривалістю З місяці не спостерігалось вибіркової органної токсичності та 51 добре переносився до найвищої тестованої дози, рівної З00 мг/кг. В дослідженнях на »мавпах тривалістю З місяці, периваскулярне запалення війкової артерії в результаті відкладання імунних комплексів спостерігалось при 2100 мг/кг. Цей результат був пояснений імуногенною відповіддю мавп на гуманізоване антитіло та не був визнаний клінічно релевантним. Найбільша тестована доза в даних дослідженнях на мавпах, рівна 300 мг/кг, щонайменше в 10 разів перевищує найвищу очікувану клінічну дозу, що складає 2000 мг або 29 мг/кг в перерахунку на питомі величини (приймаючи середню вагу суб'єктів рівною 70 кг).

Приклад 15: Клінічна фармакокінетика

Фармакокінетику (РК) антитіла 1 після разового внутрішньовенного (ІМ) введення вивчали в чотирьох рандомізованих подвійних сліпих дослідженнях з контролем за плацебо для доз від 10 до 2000 мг. Максимальні концентрації в плазмі (Стах) досягалися незабаром після завершення внутрішньовенної (ІМ) інфузії тривалістю 1 година. Медіанний час до Стах (Ттах) мав значення в діапазоні від 1,0 до 3,0 годин, з подальшим багатоетапним зниженням. Стах та загальна експозиція збільшувалися приблизно лінійно з підвищенням дози 1. Кінцевий період напіввиведення (2) становив від 36,4 до 48,3 днів. Дані про метаболізм С1 в печінці відсутні, первинним є метаболізм шляхом протеосомальної деградації. 10) Одне з досліджень визначало фармакокінетику для доз 30 мг та 300 мг при введенні двічі, З інтервалом в два тижня. Максимальні концентрації та площа під профілем концентрація-час збільшувалися з підвищенням дози. Уявний кінцевий період напіввиведення (12) після другої дози становив 41,2 днів (30 мг) та 50,0 днів (300 мг) (середнє арифметичне). Співвідношення накопичення в плазмі 1 після двох ІМ доз, введених з інтервалом в 15 днів, становили 1,5 (30 мг) та 1,4 (300 мг).

Приклад 16: Клінічна безпека та фармакокінетика

В шести дослідженнях, антитіло 51 вводили 118 здоровим особам чоловічої та жіночої статі, а 57 осіб чоловічої та жіночої статі одержували плацебо. Дослідження включало разові внутрішньовенні (ІМ) дози в діапазоні значень від 0,2 мг до 2000 мг, дві ЇМ-дози до 300 мг з введенням раз в 14 днів, та підшкірне (5С) введення 225 та 900 мг. Шість досліджень включали: два дослідження фармакокінетики (РК) та фармакодинаміки (РО) при внутрішньовенному (ІМ) введенні разової дози з ескалацією здоровим чоловікам (дослідження ВО141001 та ВО141002); перехресне дослідження в двох когортах з контролем за плацебо для дослідження гострих ефектів ІМ введення антитіла 1 на реакцію викликаного капсаїцином почервоніння у здорових добровольців (80141006); дослідження з паралельними групами з повторним введенням доз антитіла 51 здоровим добровольцям чоловічої та жіночої статі (80141007); дослідження з оцінки безпеки та переносності при внутрішньовенному введенні разової дози до 2000 мг здоровим добровольцям-жінкам (80141008), та дослідження з порівняння відносної безпеки та біодоступності при внутрішньовенному (ІМ) та підшкірному (ЗС) введенні ((51-556-1М).

Результати шести досліджень зведені в Таблиці 11 нижче. З п'яти досліджень з внутрішньовенним введенням (80141001, 80141002, 80141006, 80141007 та ВО141008), три мали по суті ідентичні плани проведення та оцінки. В дослідженні ВО14100 тестували дози 0,2 мг, 1 мг та З мг, які вводили шляхом однієї внутрішньовенної (ІМ) інфузії тривалістю одна година. Дослідження мало дизайн з паралельними групами. Учасники перебували в клініці протягом семи днів після інфузії, з проведенням численних аналізів в кожний з цих днів. Після виписки, пацієнтів повторно оглядали через тиждень після виписки (день 14), і потім через один, два та три місяці після інфузії. В дослідженні ВО141002 тестували дози в діапазоні значень від 10 мг до 1000 мг при разовому введенні. Зрештою, в дослідженні В0141008 тестували дози 300 мг, 1000 мг, 1500 мг або 2000 мг. Дослідження ВО141006 відрізнялося від решти, тому що воно також було націлене на включення фармакодинамічних показників, одержаних шляхом вимірювання інгібування викликуваного капсаїцином почервоніння протягом періоду часу до одного тижня після внутрішньовенної інфузії антитіла с1.

Для досліджень з внутрішньовенним введенням, профілі небажаних ефектів (АЕ) реєструвалися тільки для періоду після першого введення. В дослідженні В0О141007 тестували повторні дози антитіла 51 по 30 або 300 мг внутрішньовенно з інтервалом в два тижня, з використанням дизайну з паралельними групами. Кожний придатний для включення в дослідження суб'єкт вносився в рандомізаційну послідовність через інтерактивну інтернет- систему, яка включала призначення лікування. Схема рандомізації була розроблена провідним статистиком. Учасники усіх досліджень звичайно були здоровими чоловіками та жінками (у віці від 18 до 65 років); усі учасники підписували форми інформованої згоди. Усі дослідження були схвалені спостережними радами з проведення досліджень (ІКВ). Небажані ефекти (АЕ) були визначені як будь-яке несприятливе медичне явище у учасників клінічних досліджень, при наявності причинного зв'язку з досліджуваним препаратом або без такового. Небажані ефекти, спостережувані після введення досліджуваного препарату або плацебо, називалися небажаними ефектами, що "виникають при лікуванні" (ТЕАЕ), незалежно від потенційної причинно-наслідкової залежності з досліджуваним препаратом. За усіма суб'єктами, що відчували ТЕАЕ, велося спостереження через відповідні інтервали часу до розв'язання ефекту або до стабілізації ефекту та/або до досягнення нової базової лінії. Усі ТЕАЕ ранжирували на слабкі, помірні або тяжкі. Серйозні небажані ефекти (ЗАЕ) були апріорно визначені як будь-яке небажане медичне явище, яке при будь-якій дозі призводило до смерті, було загрозливим для життя (тобто суб'єкт відчував безпосередню загрозу смерті під час явища), потребувало госпіталізації пацієнта або продовження вже проведеної госпіталізації, приводило до стійкої або значної інвалідності/непрацездатності (наприклад, значне порушення здатності суб'єкта виконувати нормальні життєві функції), приводило до пороку розвитку/уродженого дефекту, або будь-яке інше медично важливе явище. Зв'язані з лікуванням небажані ефекти (ТКАЕ) повинні були братися до уваги у випадку виникнення однієї з таких ситуацій: 1) може бути встановлений імовірний часовий взаємозв'язок між початком прояву небажаного ефекту та введенням досліджуваного продукту; 2) небажаний ефект не може бути легко пояснений клінічним станом пацієнта, інтеркурентним захворюванням, або супутніми терапіями; 3) небажаний ефект (610) слабшає при припиненні застосування досліджуваного продукту або зниженні дози.

Кров'яний тиск, частоту пульсу та температуру в ротовій порожнини вимірювали при скринінгу, перед введенням дози, негайно після завершення інфузії та багатократно під час перебування пацієнтів в клініках, а також при усіх відвідуваннях клініки. Лабораторні дослідження включали хімічні показники сироватки, гематологію та аналіз сечі. Лабораторні дослідження гематології, хімії, коагуляції та сечі проводили багатократно за час досліджень безпеки. ЕКГ реєстрували при скринінгу, перед введенням дози в день 1, негайно після завершення інфузії та ще п'ять разів протягом першого дня, а також при усіх відвідуваннях клініки. Значення інтервалу ОТ з коригуванням Фридериція (ОТСЕ) визначали з використанням поправкової формули частоти серцевих скорочень Фридериція. Абсолютні значення та відхилення від базової лінії для параметрів ЕКГ інтервал ОТ, частота серцевих скорочень, інтервал ОТСЕ, інтервал РЕ та інтервал ОКЗ оцінювали по когортам, способу лікування, та часі після введення дози. На додаток до оцінок безпеки, описаних вище, протокол ВО14008 включав повну офтальмологічну оцінку на базовій лінії та в три моменту часу після введення дози (день 28, день 84 та день 168).

Клінічні дані та основні життєві показники узагальнювали за допомогою описових таблиць та зведених статистичних даних. Лабораторні та інші дані з безпеки узагальнювали як функцію будь-якої зміни (значення, що виходять за межі нормальної області значень), а також будь-яких клінічно релевантних змін, які були визначені апріорно. Зведені таблиці були стратифіковані за дозами і дані для різних досліджень об'єднували. Додатково, порівняння консолідованих даних для усіх експозицій антитіла 51 порівнювали з плацебо. Плацебо також зіставляли з дозами антитіла 1 100 мг та вище (100 мг, 300 мг, 1000 мг, 1500 мг, та 2000 мг), та з дозами антитіла

С1 1000 мг та вище (1000 мг, 1500 мг, та 2000 мг).

В дослідженнях з внутрішньовенним/підшкірним (ІМ/5С) введенням ((1-50-ІМ), тридцять шість суб'єктів рандомізували за разовим введенням антитіла 1 (225 або 900 мг) або плацебо, які доставляли за допомогою підшкірної (ЗС) болісної ін'єкції або внутрішньовенної інфузії тривалістю 1 година. Суб'єкти перебували в клінічному дослідному підрозділі протягом семи днів після введення дози, та періодично поверталися до клініки при додаткових амбулаторних відвідуваннях до дня досліджень 90. ЕКГ проводили багатократно в день 1 (перед введенням дози, в часи 1, 6, 12), день 3, день 7, пока суб'єкти перебували в клініці, та один раз при завершенні досліджень (день 90). Основні життєві показники, включаючи температуру, кров'яний тиск та частоту серцевих скорочень, визначали перед введенням дози, в дні 1, 3, 7 та 90.

Таблиця 11

Здорові дорослі чоловіки Однократна внутрішньовенна (ІМ) інфузія 0,2, 1 80141001 (п-24) або З мг в когортах по вісім (шість/когорту, г активне лікування; два в когорті плацебо)

Здорові дорослі чоловіки Однократна ІМ інфузія 10, 30, 100, 300 або во141002 (п-40) 1000 мг в когортах по вісім (шість/когорту, г активне лікування; 10 в когорті плацебо)

Дві перехресно-модифіковані когорти, плацебо або ІМ інфузія 300 мг в когортах по шість. В

Здорові дорослі чоловікиперший період, усі учасники одержували вО141006 вДшй й (п-12) плацебо. В другому періоді (включений в дане дослідження), 12 учасників одержували плацебо та 11 одержували 300 мг.

Еш ОВ

Здорові дорослі чоловіки та|тижня по 30 або 300 мг в когортах по 10 або 11 80141007 : щ : : . ' жінки (п-:21) (шість/когорту, активне лікування; дев'ять в когорті плацебо)

Однократна ІМ інфузія 300, 1000, 1500, або во141008 Здорові дорослі жінки (п-31). | 2900 мг (п'ять в когорті 2000 мг; шість/когорту в решті експериментальних груп; вісім в когорті плацебо) п-36 однократна ІМ інфузія 225 або 900 мг

В широкому діапазоні аналізованих доз в п'яти дослідженнях з внутрішньовенним введенням (від 0,2 до 2000 мг), антитіло 51 внутрішньовенно мало прийнятну переносність. В

Таблиці 8 зібрані дані про загальну частоту небажаних ефектів (АЕ) по дозам для досліджень з внутрішньовенним введенням. На основі цих результатів визначення переносності явні загрози безпеки не виявлені. По усім випробуванням при дослідженнях з внутрішньовенним введенням, учасники, що отримували плацебо, повідомляли в середньому про 1,3 небажаних ефекти, що виникли при лікуванні (ТЕАЕ). Вони є усі зареєстрованими ефектами, незалежно від думки дослідників про взаємозв'язки з досліджуваним препаратом. По усім дозам 1 при внутрішньовенному введенні, цей показник становив 1,4 ТЕАЄЕ/суб'єкта. Суб'єкти, що отримували дози 1 100 мг або вище, мали в середньому 1,5 ТЕАЕ; ті, що отримували дози 1000 мг або вище, мали в середньому 1,6 ТЕАЕ.

Таблиця 8

Суб'єкти, Суб'єкти, Зниження й й , . , в дози або аналізовані! упо АЕ-п| Суб'єкти з Суб єкти із | Суб'єкти з |ЩО вийшли тиммчасове

У по (м) АЕ-п (М) серйозними| тяжкими | з випробу- припинення небажаним АєЕ-п (М) АЕ-П(М) |вань через прийому - п ефектам АБ-п (М) М

Плацебо | 45 | 57011) | 23065) | 0 | 0 | 201 0 боамг 6 | 50) | 20) | 0 | 0 | 0 | 0 їм 1 6 | 10) | з0) | 0 | 0 | 0 1 о

Змії 6 | 1002) | 40) | 0 | 0 | 0 | о ломг 6 | 50) | 40) | 0 | 0 1 0 1 0

Збмг | 12 | 2109 | 86) | 0 | 0 | 0 | о лобом у 6 | 50) | 40) | 0 | 0 | 0 1 о

З0бмг 29 | 47010) | го) | 10) | 100 | 0 | о лобом | 12 | 1704) | 854) | 0 | 0 | 0 | 0 л1500мг у 6 | 80) | з0) | 0 | 10) | 0 | 0 і г2гобомг | 5 | 1202) | 40) | 0 1 0 | 0 | 10

АЕ - небажані ефекти; п- будь-які ефекти, незалежно від того, зв'язані вони з лікуванням або ні; (М) - вважаються зв'язаними з лікуванням на думку дослідника. Примітка: Для протоколу

ВО141006 (плацебо та 300 мг) включені тільки дані для першого періоду активного лікування, через його перехресний характер

В дослідженнях з внутрішньовенним введенням, зв'язані з лікуванням небажані ефекти (ТКАЕ, або АЕ, які можуть бути зв'язані з терапією на думку головного дослідника) були зареєстровані у 21,2 95 суб'єктів, що отримували внутрішньовенно С1, у порівнянні з 17,7 95 у тих, що отримували плацебо. При дозах 100 мг 51 або вище, ТКАЕ спостерігались у 22,4 95 учасників. При дозах 1000 мг або вище, ТКАЕ спостерігались у 21,7 95 учасників. Антитіло 1, напевно, не асоційовано з будь-якими клінічно значущими змінами основних життєвих показників (систолічний та діастолічний кров'яний тиск ІВРІ, температура та частота серцевих скорочень ІНК)), аномалії на електрокардіограмі (ЕСО) (включаючи ОТСВ та ОТсСЕ), реакція в місці інфузії, або результати клінічних лабораторних аналізів. Спостерігались обмежені ефекти на тести функції печінки (аспартатамінотрансфераза (А5Т)І, аланінамінотрансфераза (АЇГТІ, загальний білірубін, та лужна фосфатаза) зі збільшенням першого ступеня (дгаде 1) загального білірубіну у одного суб'єкта, що отримував плацебо (дослідження ВО141001), та збільшенням першого ступеня АЇТ у одного суб'єкта, що отримував плацебо (дослідження ВО141002).

Клінічно значущі аномалії функції печінки не спостерігались у суб'єктів, що отримували будь-які досліджувані дози 1. Відсутні дані про відмінності між 1 та плацебо за гематологічними тестами оцінки функції нирок, електролітів, або за тестами сечі.

В дослідженні ІМ/5С (51-50-ІМ), безпека та переносність були порівнянними для підшкірного (5С) та внутрішньовенного (ІМ) шляхів доставки. Середня частота серцевих скорочень та кров'яний тиск (діастолічний та систолічний) не змінювалися при лікуванні антитілом 1, також були відсутні будь-які значущі зміни будь-яких серцево-судинних параметрів після лікування антитілом 1 підшкірно (5С). Зведені дані про ТКАЕ, спостережувані в ході досліджень з підшкірним введенням, наведені нижче в Таблиці 12.

Таблиця 12 11110100 900мг(м-6) | 225мг(М-6) | Плацебо(М-6) Щ вн гвмю 1 рю розлади щне 777777717117ї1117171717171717101111111171111110679) | щ- 0 г ДФ

Інфекцітаінвазїї | 07777777 Ї7777711711710111111111Ї111111110с1

Скелетно-м'язова система та сполучна тканина

Дихальнасистема.ї///| 077 ЇЇ 777771701117Ї11111110 с

Розлади репродуктивної системи та молочних заліз

Травми Ї777777171717101111111Ї11111111011111Ї111111101

Вагітність Ї7777777111701111111 11111101 0 иркиїд 77777777 1711711 106) Ї7777111101111111 11111101 (Судиннасистема.їд | 0 2...КЮ/7 ЇЇ 77717170 ЇЇ 7110 г

В дослідженнях з введенням разової дози (80141001, 80141002, 80141006 та ВО141008), фармакокінетичні (РК) параметри обчислювали для доз в діапазоні значень від 30 мг до 2000 мг. Середній по групі кінцевий період напіввиведення (ї-/2) мав значення в діапазоні приблизно від 40 до 48 днів. Стах та загальна експозиція (оцінювана по АШсіп) зростали зі збільшенням дози. Збільшення АС було приблизно пропорційним дозі між 30 та 1000 мг, та зростало швидше дози між 1000 та 2000 мг. Об'єм розподілу був низьким, від 6 до 10 л.

В дослідженні з введенням двох доз (80141007), уявний кінцевий період напіввиведення після другої дози мав значення в інтервалі від 41 до 50 днів. Концентрації в плазмі накопичувались після другої дози, з коефіцієнтом накопичення приблизно 1,5. Крім того, в дослідженнях ІМ/5С (51-50-ІМ), аналіз фармакокінетичних показників вказує на те, що 51 при підшкірній доставці має схожий період напіввиведення з внутрішньовенною доставкою.

Приклад 17: Попередження хронічної мігрені в клінічних дослідженнях антитіла 1

Багатоцентрові рандомізовані подвійні сліпі багатодозові дослідження з подвійною імітацією, з контролем за плацебо, з паралельними групами, з порівняння антагоністичного антитіла анти

СОКР 1 з плацебо проводили на суб'єктах з хронічною мігренню. Суб'єкти, допущені до відбору для участі в дослідженні, починали з базового 28-денного ввідного періоду. Одержувана від суб'єктів інформація про їх головний біль та стан здоров'я реєструвалась щодня протягом досліджень, з використанням системи електронного щоденника головного болю. Протягом ввідного періоду або досліджень не допускалися зміни в медикаментозному лікуванні мігрені.

Використовувалися такі критерії включення: (1) чоловіки або жінки у віці від 18 до 65 років; (2) підписаний та датований документ про інформовану згоду, який вказує, що суб'єкт був поінформований про усі суттєві аспекти досліджень, включаючи будь-які відомі та потенційні ризики та доступні альтернативні методи лікування; (3) хронічна мігрень, що відповідає діагностичним критеріям, переліченим в Міжнародній класифікації головного болю (Іпіегпайопаї

Сіаввіїйсайоп ої Неадасне Оізогдег5, ІСНО-П реїа мегвіоп, 2013); (4) суб'єкти можуть використовувати до двох різних щоденних лікарських засобів для профілактики мігрені (наприклад, топірамат, пропранолол, амітриптилін) або інших медичних станів (наприклад, пропранолол використовується при гіпертензії), якщо доза та схема приймання залишалися стабільними протягом щонайменше 2 місяців до початку 28-денного ввідного періоду; (5) індекс маси тіла (ІМТ) від 17,5 до 34,5 кг/м", та загальна маса тіла від 50 кг до 120 кг, включно; (б) суб'єкт не має репродуктивного потенціалу, як визначено в способах, або, якщо суб'єкти мають репродуктивний потенціал, то вони погоджуються або на стримування, або на використання (або на використання їх партнером) прийнятного методу контрацепції протягом передбачуваної тривалості досліджень; (7) продемонстроване дотримання умов використання електронного щоденника головного болю протягом ввідного періоду шляхом введення даних про головний біль мінімум в 24/28 днів (рівень дотримання 85 95). В пункті (3) вище використовувалися такі діагностичні критерії хронічної мігрені: (а) історія частих головного болю, що дозволяє припустити наявність хронічної мігрені (15 днів на місяць) протягом щонайменше трьох місяців до проведення скринінгу; (Б) підтвердження частоти головного болю шляхом подальшого збирання базової інформації протягом 28-денної ввідної фази, що демонструє головні болі в щонайменше 15 днів, причому щонайменше 8 днів на місяць відповідають будь-якому одному з таких критеріїв () можуть бути кваліфіковані як напад мігрені, (ії) їм передують або вони супроводжуються мігреневою аурою, або (ії) полегшуються за допомогою сполук ріжків або похідних триптану.

Критерії виключення потребували, щоб суб'єкти не відповідали одному з таких критеріїв: (1) початкові прояви хронічної мігрені після досягнення віку 50 років; (2) суб'єкт одержував ботокс (опабоїшіїпит (охіп А) для лікування мігрені або з будь-яких медичних або косметичних причин, що потребують ін'єкції в голову, обличчя або шию протягом шести місяців до проведення скринінгу; (3) суб'єкт використовує лікарські засоби, що містять опіоїди (включаючи кодеїн) або барбітурати (включаючи фіоринал (Ріогіпаке), фіорацет (Ріогасеке), або будь-яку іншу комбінацію, що містить буталбітал) протягом більш ніж 4 днів на місяць для лікування мігрені або з будь-якої іншої причини; (4) невдале використання 22 категорій лікарських засобів або »3 профілактичних засобів (в двох категоріях лікарських засобів) внаслідок відсутності ефективності при лікуванні епізодичної або хронічної мігрені після відповідного пробного курсу лікування; (5) клінічно значуща гематологічна, ниркова, ендокринна, легенева, шлунково- кишкова, сечостатева, неврологічна або очна хвороба, на розсуд дослідника; (б) суб'єкти зі свідоцтвами або історією клінічно значущих психіатричних проблем, включаючи глибоку депресію, панічний розлад, або генералізований тривожний розлад (згідно з критеріями

Діагностичного та статистичного посібника, 5-е видання (Оіадповіїс апа зіаїйвіїсаї Мапиаї 5 еайіоп (Ю5М-51)); (7) систолічний кров'яний тиск при скринінгу вище 160 мм рт.ст. або нижче 90 мм рт.ст.; (8) діастолічний кров'яний тиск при скринінгу вище 110 мм рт.ст. або нижче 50 мм рт.ст.; (9) історія клінічно значущої серцево-судинної хвороби або судинної ішемії (такої як міокардіальної, неврологічної Інаприклад, церебральна ішемія), периферична ішемія кінцівок, або інші ішемічні явища); (10) минула або поточна історія раку, за винятком суб'єктів з базальноклітинною карциномою, яка була видалена; (11) вагітні жінки або жінки, що годують; (12) історія гіперчутливих реакцій на ін'єкції білків, включаючи моноклональні антитіла; (13) лікування дослідним лікарським засобом протягом 30 днів перед включенням в дослідження; (14) клінічно значуща аномалія базової поверхневої ЕКГ в 12 відведеннях, включаючи синусові паузи 22 секунд, блокада серця другого або третього ступеня або інші аномалії, визнані клінічно значущими дослідником; (15) базова ЕКГ з 12 відведеннями, що демонструє ОТСЕ »450 мс для чоловіків та 470 мс для жінок при скринінгу (якщо ОТСЕ перевищує ці значення, ЕКГ повторяли та середнє з трьох значень ОТСЕ використовували для визначення потенційної придатності суб'єкта для участі в дослідженнях; ОТс визначали з використанням формули Фридериція); (16) будь-який результат, який на думку дослідника клінічно значущо відхиляється від норми, включаючи гематологічні показники, хімічні показники крові, проби на коагуляцію або аналіз сечі (тести з аномальними результатами було дозволено повторяти для підтвердження) (17) печінкові ферменти (аланінамінотрансфераза (АГ ТТ), аспартатамінотрансфераза |А5ТІ, лужна фосфатаза) більш ніж в 1,3 рази перевищують верхню межу норми (ЇМ), після підтвердження повторним тестом; (18) креатинін сироватки більш ніж в 1,5 рази перевищує ОЇМ, клінічно значуща протеїнурія (смужки для експрес-аналізу сечі 4) або свідоцтва хвороби нирок.

Суб'єктів з підтвердженою хронічною мігренню та високою готовністю до дотримання правил ведення щоденника головного болю протягом ввідного періоду рандомізували під час відвідування 2 (день 1) в одну з трьох гілок досліджень. Рандомізацію проводили з використанням електронної інтерактивної інтернет-системи. Суб'єктів стратифікували за статтю та базовим медикаментозним лікуванням мігрені. Лікарський препарат вводили раз на місяць (кожні 28 днів) для проведення загалом трьох сеансів лікування за період З місяці. Введення лікарського препарату проводилось при відвідуванні 2 (день 1; перша доза), відвідуванні З (день 29; друга доза), та відвідуванні 4 (день 57; третя та остання доза). Підсумкові оцінки при завершенні дослідження визначали при відвідуванні 5 (день 85), приблизно через 28 днів після третьої та останньої дози. Ін'єкції вводили підшкірно протягом З-місячного періоду (кожні 28 днів) суб'єктам в кожній з таких груп: (1) особи, рандомізовані в гілку 900 мг, одержували чотири активних ін'єкції кожні 28 днів; (2) особи, рандомізовані в гілку 675/225 мг, одержували три активних ін'єкції та одну ін'єкцію плацебо в першому варіанті курсу лікування, і одну активну ін'єкцію та три ін'єкції плацебо в другому та третьому варіантах курсу лікування; (3) особи, рандомізовані в групу плацебо, одержували чотири ін'єкції плацебо через кожні 28 днів. Активні ін'єкції містили 225 мг антитіла 1. Кінцеві точки визначали за електронним щоденником головного болю, який був інтерактивною інтернет-системою, що реєструє дані за попередній 24- годинний період. Загальна тривалість головного болю реєструвалась численно, в годинах, а також число годин головного болю з кожним рівнем тяжкості. Тяжкість головного болю (610) суб'єктивно оцінювалась суб'єктом в попередньо задані моменти часу таким чином: відсутність болю, слабкий біль, помірний біль та тяжкий біль. Суб'єктів також просили вказувати, були присутніми або ні такі супутні симптоми в попередньо задані моменти часу: фотофобія, фонофобія, нудота та блювота. Додаткову кінцеву точку визначали шляхом контролю використання триптанів (наприклад, суматриптану) як невідкладного лікарського засобу проти головного болю суб'єктами, що беруть участь в дослідженні, протягом досліджень. Зведені дані та демографічні відомості про суб'єктів, що беруть участь в дослідженні, наведені в Таблиці 9.

Таблиця 9 11111111 | Плацебо, | 6б75/225мгі | 900мг | Усьою

Післярандомізацї | 89 2 2 | 88 | 77/87 | 77264

Аналізувалися за призначеним 89 (100 Фо) 87 (98,9 Фо) 85 (97,7 95) 261 (98,9 95) лікуванням (ІТТ)

Вік (середнє

Число років Кк!

Середнє зменшення числа годин головного болю у порівнянні з базовою лінією в кожний з тижнів 1, 2 та З (М/1, М2 та МУЗ, відповідно) для кожної групи представлено графічно на Фіг. 15.

Результати показують значне зниження в обох групах лікування у порівнянні з групою плацебо в кожній з точок М/1, М/2 та МІ3, включаючи найперший тиждень.

Середнє зниження числа годин головного болю у порівнянні з базовою лінією в кожний з місяців 1, 2 та З (МІ, М2 та М3, відповідно) для кожної групи представлено графічно на Фіг. 12.

Результати показують значне зниження в обох групах лікування у порівнянні з групою плацебо в усі три моменти часу, включаючи після найпершої дози. Статистична значущість у порівнянні з групою плацебо для даних на Фіг. 12 вказана за допомогою наведених р-значень.

Середнє число годин головного болю в кожній групі на базовій лінії, та при відвідуваннях 2,

З, та 4 (М2, ММЗ та М4, відповідно) представлено графічно на Фіг. 13. Результати показують значне зниження в обох групах лікування у порівнянні з групою плацебо в усі три моменти часу, включаючи після найпершої дози.

Середнє зниження числа днів головного болю помірної або тяжкої інтенсивності у порівнянні з базовою лінією в кожний з місяців 1, 2 та З (М!І, М2 та М3, відповідно) для кожної групи представлено на фіг. 14. Результати показують статистично значуще зниження в обох групах лікування у порівнянні з групою плацебо в усі три моменти часу, включаючи після найпершої дози. Статистична значущість у порівнянні з групою плацебо вказана за допомогою наведених р-значень.

Середнє зниження числа випадків використання триптанів як невідкладного лікарського засобу у порівнянні з базовою лінією в кожний з місяців 1, 2 та З (МІ, М2 та М3, відповідно) для кожної групи представлено графічно на Фіг. 16. Результати показують значне зниження використання триптанів в обох групах лікування у порівнянні з групою плацебо в усі три моменти часу, включаючи після найпершої дози. Статистична значущість у порівнянні з групою плацебо вказана за допомогою наведених р-значень на Фіг. 16.

Значуще зниження числа годин головного болю також спостерігалось у суб'єктів з використанням профілактичних засобів (наприклад, топірамату та амітриптиліну або пропранололу) у порівнянні з групою плацебо.

Обидві дози добре переносились, і проблеми з безпекою не виникали. Зведені дані про небажані ефекти, що виникають при лікуванні (ТЕАЕ), по групах, наведені в Таблиці 10.

Відмінності між зв'язаними (із застосуванням препарату) ТЕАЕ майже повністю пояснюються слабкими ефектами, що виникаютьь при ін'єкціях (еритема, певний дискомфорт). Серйозні

ТЕАЕ не були зв'язані з лікарським препаратом (відсутність зв'язаних з препаратом небажаних ефектів).

Таблиця 10 --о8 15 (ЕГО

М (90 М (90 М (90

ТЕАЕ, що викликають припинення участі в 11) 6 (6,8) 5 (5,8) дослідженнях (Смерті ЇЇ 777771717170111111111711111111117101Ї1111110

Приклад 18: Попередження епізодичної мігрені з високою частотою нападів в клінічних дослідженнях антитіла 1

Багатоцентрове рандомізоване подвійне сліпе дослідження з контролем за плацебо, з паралельними групами, з порівняння антитіла анти СОКР С1 з плацебо проводили на суб'єктах з епізодичною мігренню з високою частотою нападів (НЕЕМ). План досліджень відповідав описаному в Прикладі 17, з двома відмінностями. По-перше, критерії включення (3) передбачали суб'єктів, що відповідають критеріям епізодичної мігрені згідно з другим виданням

Міжнародного товариства головного болю (Зесопа Едйіоп ої Те Іпіетаїйопаї Неадасне 5босіевїу) (ОІезеп апа 5іеїпег 2004), які відчувають мігрень з високою частотою нападів, викладеним таким чином: (а) історія головного болю в більш ніж 8 днів на місяць протягом щонайменше 3 місяців до проведення скринінгу; (Б) підтвердження частоти головного болю шляхом подальшого збирання базової інформації протягом 28-денної ввідної фази про прояви головного болю (будь-якого типу) протягом від 8 до 14 днів, причому щонайменше 8 днів відповідають критеріям щонайменше чогось одного з (і) мігрені, (ії) ймовірної мігрені, або (ії) використання триптанів або сполук на основі ріжків. По-друге, були змінені схеми приймання для груп, що отримували

С1. Конкретніше, ін'єкції вводили підшкірно протягом періоду З місяців (кожні 28 днів) суб'єктам в кожній з таких груп: (1) особи, рандомізовані в гілку 675 мг, одержували 675 мг 1 кожні 28 днів; (2) особи, рандомізовані в гілку 225 мг, одержували 225 мг 1 кожні 28 днів; та (3) особи, рандомізовані на плацебо, одержували ін'єкцію плацебо кожні 28 днів. Зведені вихідні дані та демографічні характеристики суб'єктів, що беруть участь в дослідженнях, наведені в Таблиці 13. Кінцеві точки досліджень включали зниження числа днів мігрені та зниження числа днів головного болю будь-якої тяжкості.

Таблиця 13 11111110 Плацебо,// | 225мг | б/бмг | Всею

Післярандомізації | 104 17777961 17111197 11111297

Аналізувались за призначенмм 104 (100 Ов) 95 (99 9) 96 (99 Об) 295 (99 9) лікуванням (ІТТ)

Вік (середнє

Середнє зниження числа днів мігрені у порівнянні з базовою лінією в кожний з місяців 1, 2, та З (МІ, М2 та М3, відповідно) для кожної групи представлено на Фіг. 17. Результати показують статистично значуще зниження в обох групах лікування у порівнянні з групою плацебо в усі три моменти часу, включаючи після найпершої дози. Статистична значущість у порівнянні з групою плацебо вказана за допомогою наведених р-значень.

Середнє зниження числа днів головного болю будь-якої тяжкості у порівнянні з базовою лінією в кожний з місяців 1, 2 та З (М1, М2 та М3, відповідно) для кожної групи представлено на

Фіг. 18. Результати показують статистично значуще зниження в обох групах лікування у порівнянні з групою плацебо в усі три моменти часу, включаючи після найпершої дози.

Статистична значущість у порівнянні з групою плацебо вказана за допомогою наведених р- значень.

Обидві дози добре переносились, і проблеми з безпекою не виникали. Зведені дані про небажані ефекти, що виникають при лікуванні (ТЕАЕ), по групах, наведені в Таблиці 14. Чотири серйозні випадки ТЕАЕ були зв'язані з одним випадком перелому малогомілкової кістки, одним випадком тремору внаслідок припинення приймання препарату та двома випадками мігрені, що потребувала лікування в палаті екстреної допомоги (ЕК).

Таблиця 14 -е8 1-8 1 5 1 5

М (90 М (90 М (90

Серйозні ТЕЛЕ /-: | -:(: 0777/1777 |11111сг(вю

Бех іа ННЯ ПОН ПОН НОТ серйозні ТЕАЕ

ТЕАЕ, що викликають припинення участі в 4 (4 У) 2 (2 96) дослідженнях (Смерті ЇЇ 7777771717170111111171Ї11111111011Ї1111110

Приклад 19: Неклінічна безпека

Два дослідження з оцінки безпеки антитіла 51 були проведені на яванських макаках. В першому дослідженні оцінювали безпеку разової дози антитіла 51. В другому дослідженні оцінювали безпеку повторних доз антитіла С1. Кожне з досліджень та їх результати додатково описані більш детально нижче. В дослідженнях як з разовою, так і повторними дозами, антитіло

С1 було приготовлено у вигляді композиції розчину 51,4 мг/мл в 20 мМ гістидину, 84 мг/мл трегалози дигідрату, 0,2 мг/мл полісорбату 80, 0,05 мг/мл динатрію ЕДТА дигідрату та 0,1 мг/мл

Ї-метіоніну, РН близько 5,5. Композиція носія мала ідентичний склад, але без антитіла с1.

Додатково, в обох дослідженнях, періодично брали зразки крові для аналізу концентрації антитіла С1 в плазмі з використанням валідованого методу ІФА.

Дані спочатку агрегували в зведені таблиці та фігури з використанням прикладних програм

СгарпРай Ртгізт (версія 6.0) та ЕхсеІ 2010 (Місго5оп). Для досліджень з однократною експозицією, телеметричні дані аналізували з використанням дисперсійного аналізу (АМОМА).

Аналіз проводили з використанням прикладної програми ЗАЗ КеїЇеазе 8.2. Для нормалізації інтервалу ОТ за діапазоном інтервалів К-К, для кожної тварини генерували коефіцієнти корекції для індивідуальних тварин (ІАСЕ5) шляхом зіставлення кожного КК-інтервалу з асоційованим з ним ОТ-інтервалом. Для набору даних визначали лінійну регресію цього співвідношення ОТ/КК- інтервалів. Тангенс кута нахилу цієї лінійної регресії використовували як ІАСЕ для відповідної тварини в усіх експериментах. Цей ІАСЕ використовували для розрахунку відкоригованого ОТ- інтервалу (ОТс) з використанням такого рівняння:

ОТ-Кс) - інтервал ОТ з поправкою на частоту серцевих скорочень - ОТ-І - КАВ-З00УТАСЕ)).

В дослідженнях з багатократними дозами для аналізу даних також використовували однофакторний дисперсійний аналіз. Якщо результат дисперсійного аналізу був значущим (Р « 0,05), для порівняння між групами використовували апостеріорний критерій Даннета. Для кожної статі, експериментальну групу порівнювали з контрольною групою (носій) при 595 рівні значущості двобічної ймовірності.

Телеметричні дослідження з разовою дозою

Восьми дорослим самцям яванських макак (Спагез Кімег Ргітагез) хірургічними методами встановлювали інструменти для телеметрії та давали щонайменше два тижня на відновлення.

Використовували імплантовані пристрої (051 ТІ11М2-070-РСТ) та приймачі (КМС-1) виробництва Ваїа Зсіепсез Іпіегпайіопаї|.

Тваринам давали акліматизуватися до кліток для збирання телеметричних даних щонайменше протягом ночі перед введенням дози. Під час акліматизації проводили попередній запис гемодинамічних параметрів для перевірки правильності функціонування перетворювачів та обладнання. Під час збирання телеметричних даних тварини були розміщені індивідуально в клітках, обладнаних приймачами телеметричних даних. В дні, коли збирання даних не проводилося, тварини перебували в клітках без приймачів телеметричних даних. Тварин утримували при денному циклі з 12 годинами освітлення, 12 годинами темряви, з вільним (ай

Пбйит) доступом до води та одержували сертифікований корм для приматів.

В першій фазі досліджень, тваринам (8 самців) вводили один лиши носій, і збирання телеметричних даних починали приблизно за 1 годину до введення дози та проводили протягом 22 годин після введення дози. Через шість днів після введення носія, ці самі тварини одержували однократне внутрішньовенне (ІМ) введення антитіла (31 (100 мг/кг, доза, що приблизно в 10 разів перевищує фармакологічну ЕС5О для яванських макакю).

Електрокардіографічні та гемодинамічні дані, що передавалися телеметрично, знов безперервно реєстрували для усіх тварин. Додатково, за цими тваринами вели спостереження протягом близько 24 годин в дні 3, 7, 10 та 14 після одержання ними разової дози антитіла с1.

Сигнали ЕКГ та дані кров'яного тиску, що передавалися телеметрично, надходили з імплантованих радіотелеметричних пристроїв на приймач. встановлений в кожній клітці.

Прийняті сигнали проходили через пристрій обміну даними (051 модель ОЕМ) та далі в систему збирання даних на основі ПК (051, програма Ропетай РЗ версія 3.4); для аналізу даних використовували програму ЕтКа Тесппоіодіе5 версія 2.4.0.20 (ЕтКа Тесппоїодіе5). Частота аналогово-цифрової дискретизації дорівнювала 1000 Гу для даних ЕКГ та 500 Гц для даних кров'яного тиску, що передаються телеметрично. Дані реєстрували у вигляді середніх значень за 1 хв.

Середній по групі систолічний кров'яний тиск (ЗВР) мав близькі значення до та після лікування антитілом (31 протягом першого дня після введення дози та в наступні дні (телеметричні дані тварин збирали в дні 3, 7, 10 та 14 з інтервалами часу, ідентичними використовуваним в день 1). В години 1--4 після введення дози, коли концентрації антитіла С1 в крові мали максимальні рівні (середня концентрація 3500 мкг/мл в момент часу 4 години), середній 5ВР дорівнював 111 мм рт.ст. У порівнянні з 113 мм рт.ст. в той самий інтервал часу після введення носія. Крім того, 5ВР дорівнював 110 мм рт.ст. в дні З та 7, 109 мм рт.ст. в день 10, та 110 мм рт.ст. в день 14 після введення антитіла 1. Аналогічні дані щодо 5ВР були зареєстровані для інших інтервалів часу. Оскільки ці дослідження проводились за перехресним (сго55омег) планом, тварини, що отримували препарат, служили своїми власними контролями.

При аналізі даних як різностей значень кров'яного тиску після введення антитіла 1 у порівнянні з введенням носія, були виявлені несуттєві статистично значущі зниження 5ВР в останній інтервал часу в дні 7, 10 та 14.

Було знайдено, що після лікування антитілом 1, діастолічний кров'яний тиск (ОВР) був приблизно на З мм рт.ст. нижче середніх значень, одержаних після введення носія. З годин 5-- 22, середні по групах значення для груп носія та антитіла 51 мали схожі значення. Така сама тенденція спостерігалась в інші дні, коли незначне зниження ОВР (в діапазоні значень 2,62-3,5 мм рт.ст.) спостерігалось в перший інтервал вимірів, з окремими змінами аналогічної величини, що спостерігалися нерегулярно в дні 7-10 в інтервалі 7-22 годин. Аналогічно результатам, що спостерігалися для ОВР, незначне зниження частоти серцевих скорочень спостерігалось при першій оцінці (часи 1-4) у порівнянні з введенням носія. Відмінності не детектувались при проміжних оцінках та знов з'являлись між годинами 18--22 в усі дні.

Крім того, стосовно результатів ЕКГ, не спостерігалось статистично значущих змін інтервалу

ОТс в будь-який момент часу у порівнянні з введенням носія. Хоча статистично значущі зміни

ЕЕ, РЕ, К5 та ОТ спостерігались протягом періоду 14 днів у порівнянні з носієм, вони усі були несуттєвими за абсолютною величиною.

Дослідження безпеки з повторними дозами

Дослідження безпеки з повторними дозами включали 48 дорослих наївних по відношенню до антитіла 01 яванських макак при рівному співвідношенні статей (по 6 особин кожної статі в групі) (СПпагеб5 Кімег Ргітаїе5). Тварини одержували носій або антитіло 1 у вигляді внутрішньовенної ін'єкції раз на тиждень протягом 14 тижнів в дозах 10 мг/кг, 100 мг/кг або 300 мг/кг. В кожній групі, двом тваринам, по одній кожної статі, давали додатково 4 місяці на відновлення після закінчення введення доз.

Вимірювання ЕКГ та кров'яного тиску реєстрували один раз в фазі попередніх досліджень, двічі після досягнення стабільного стану (до введення дози та через 4 години після введення дози в день 85) та один раз приблизно через 1 тиждень після закінчення введення доз (день 103 фази відновлення). Тварин анестезували кетаміном та ЕКГ записували з використанням восьми відведень. Вимірювання ЕКГ (включаючи частоту серцевих скорочень) проводили по зібраним даним з використанням системи прикладних програм І їе бсіепсе 5ийе Ропетай

РПпузіоїоду Ріацогт через О5І, з використанням відведень І, І, ам, СОо4КкІ та СМ4|! | як стандарту. Корекцію на частоту серцевих скорочень для інтервалу ОТ (ОТс) обчислювали з використанням формули Базетта.

Кров'яний тиск реєстрували перед першою дозою, після 12 тижнів введення доз (13 доз) та (610) приблизно через 1 тиждень після завершення введення доз. Не було помічено значних змін значень ЗВР або ЮВР в будь-який з груп тварин, що отримували препарат, у порівнянні з тваринами, що отримували носій. Середні по групам частоти серцевих скорочень були відносно постійними за групами дозувань та по моментах часу вимірів, без виявлених статистичних розбіжностей. Концентрації антитіла С1 в плазмі вимірювали протягом першого тижня введення доз та під час визначення кров'яного тиску та ЕКГ, і демонстрували кумулятивний ефект при повторному щотижневому введенні доз.

Крім того, стосовно результатів ЕКГ, не спостерігалось значних розбіжностей в значеннях інтервалу ОТс для усіх доз та моментів часу. Додатково, не спостерігалось ніяких значних або релевантних змін ЕКГ за будь-яким з параметрів ЕКГ, аналізованих в ході даних досліджень.

Загалом, антитіло 1 дуже добре переносилось в обох дослідженнях, при цьому не було помічено клінічно значущих змін будь-яких гемодинамічних параметрів або будь-яких релевантних змін будь-яких параметрів ЕКГ. У яванських макак, довготермінове інгібування

СОКР антитілом 1 очевидно не впливало на серцево-судинні та гемодинамічні параметри.

Слід розуміти, що приклади та варіанти реалізації, описані в даному документі, служать тільки ілюстративним цілям, і що, в світлі цього, особи, кваліфіковані в цій галузі техніки, будуть передбачати різні модифікації або зміни, які повинні бути включені до суті та об'єму даної заявки. Усі публікації, патенти та патентні заявки, згадувані в даному документі, цим включені до даного документу як посилання в повному обсязі по суті в такому саме ступені, якби для кожної індивідуальної публікації, патента або патентної заявки було конкретно та індивідуально вказано, що вони таким чином включені як посилання.

Депонування біологічного матеріалу

Наступні матеріали були депоновані в Американській коллекції типових культур (Атегісап

Туре Сишишгте СоїППесійоп, 10801 Опімег5йу Вошцемага, Мапаззав, Мігдіпіа 20110-2209, ОА (АТОС)):

Матеріал Антитіло Мо Номер доступу АТОС Дата депонування рорб.СаВР.НЕсаі важкий ланцюг с1 РТА-6867 15 липня 2005 р.

РЕБ.СОаВР.НКИї легкий ланцюг 1 РТА-6866 15 липня 2005 р.

Вектор рЕБ.ССОКР.ПКОЇ є полінуклеотидом, кодуючим варіабельну область легкого ланцюга

С1 та константну область каппа-легкого ланцюга; та вектор рорр.сОкР.ЕсСОЇ є полінуклеотидом, кодуючим варіабельну область важкого ланцюга 51 та константну область важкого ланцюга Ідс2, що містить такі мутації: АЗЗОРЗ331 на 53305331 (нумерація амінокислот згідно з послідовністю Ід52 дикого типу; див. Єиг. у). Іттипої. (1999) 29:2613-2624).

Вказане депонування було проведено згідно з положеннями Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів в цілях патентної процедури та правила його виконання (Будапештський договір). Це забезпечує зберігання життєздатної депонованої культури протягом 30 років з дати депонування. Депонований матеріал повинен бути доступним через АТСС згідно з умовами Будапештського договору, та згідно з угодою між Кіпаї

Меийгозсіепсе Согр. та АТСС, яка забезпечує постійну та необмежену доступність потомства депонованої культури для публіки після видання відповідного патенту США або після розкриття для публіки будь-якої патентної заявки США або іноземної патентної заявки, в залежності від того, яка з них появиться раніше, та гарантує доступність потомства для особи, визначеної комісаром з патентів та торговельних марок США такою, що має на це право згідно з розділом 122 Зводу законів США (35 О05С Зесіоп 122) та правилами дії комісара при цьому (включаючи розділ 1.14 Зводу федеральних постанов США (37 СЕК зЗесійоп 1.14) з конкретним посиланням на 886 ОС 638).

Правонаступник даної заявки погоджується з тим, що якщо культура депонованих матеріалів загине або буде втрачена або знищена при культивації в придатних умовах, то матеріали будуть негайно замінені після одержання повідомлення на інші такі саме. Доступність депонованих матеріалів не повинна тлумачитися як ліцензія на практичну реалізацію винаходу в порушення прав, наданих владою будь-якого уряду згідно з його патентним законодавством.

Послідовності антитіл

Амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга 1 (ЗЕО ІЮ МО:1)

ЕМОЇ МЕЗО, МОРОСБІ ВІ БСААЗОЕТЕЗМУУМІЗУМ УВО Рака ЕМУМАБІВЗЕЗОАВАТНУА

ЕАУКСОРЕТІЗБКОМАКМЗІ МІ ОММ5І КАЕДТАМУУСІ АМЕОУСІАІЮМУУУСОСТІ МТУ

Амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга 1 (5ЕО ІЮ МО:2)

ЕІММГТО5РАТІ 5І 5РОЕВАТІ БСКАЗКАУТТУУБУУООКРИОИОАРВА ПМС АЗМАМІ СІРАВЕЗОа5 азатТОеТТІЗЗІ ЕРЕОЕАУУМООБУМУРУТЕРаОСТКІ БІК ат СОВ НІ (розширений СОК) (ЗЕО ІЮ МО:3)

СЕТЕЗМУМІ5

1 СОК Н2 (розширений СОК) (5ЕО ІЮО МО:4)

ЕІВБЕБОАЗАТНУАЕАУКОИа

СІ СОВА НЗ (5ЕО ІО МО:5)

УгруаггАюмм

СІ СОВА 11 (З5ЕО ІЮ МО:6)

КАБКАУТТУУЗ

СІ СОВА 12 (5ЕО ІЮ МО:7)

САБЗМАХМІ

СІ СОВА ІЗ (5ЕО ІЮ МО:8)

ЗОБУМУРУТ

Нуклеотидна послідовність варіабельної області важкого ланцюга 1 (ЗЕО ІЮ МО:9) дааднсадсіддндааіссддіддіддісідайнсадссаддідансссідсдісіціссідсасідснесддісассісіссаасіас тддаїсіссідддісдісаддсіссіддіаааддісіддааддонодсідаааіїссойссдааіссдасдсдіссдсіасссайасодсюдаа дсюпНаааддісунісассаїсісссудідасаасдсіаадаасісссідіассідсададдаасісссюсаїдсідаадасассдсідщнкас їасюссіддснастодасіасодісіддсіаїссадаасіасіддддісаддаїасссідаНассущшесісс

Нуклеотидна послідовність варіабельної області легкого ланцюга 1 (5ЕО ІЮ МО:10) даааісонсідасссадіссссддсіасссідісссщіссссаддадаасдідсіасссдіссідсааадснссааасдданасса ссіасушссіддіассадсадааасссддісаддсіссісдісідсдаїсіасддідсносаассуЦНассісддіаїсссадсісашсісс дайссдднссддіассдаснсасссідассаїсіссісссіддаасссдаадаснсдсідШасіасідсадісадіссіасаасіассссі асассісддісаддаїассааасіддаааїсааа

Амінокислотна послідовність важкого ланцюга повного антитіла 1 (включаючи модифікований Ідс2, як описано в даному документі) (5ЕО ІЮ МО:11)

ЕМОЇ МЕЗО, МОРОИБІ ВІ БСААЗИЕТЕЗМУУМІ ЗУ УВО Рака ЕМУМАЕІВЗЕЗОАЗАТНУА

ЕАМКОКЕТІЗКОМАКМБІ МІ ОММЗІ-КАЕДТАМУУСІ АУБОМОЇ АІЮМУУОСТІ МГУ5ЗАЗТКОРБМ

ЕРГАРСЗАЗТЗЕБЗТААЇ СІ УКОМЕРЕРУТУБУУМЗИАІ ТЗаМНТЕРАМІ О5501І 51 55УМ ТУРЗЗМ

ЕатТОТУТСОММОнкРУЬМТКМОКТУЕАВКССМЕСРРОРАРРУАДОРБЗУН ЕРРКРКОТІ МІЗВАВТРЕМТСУМ

МОМЗ5НЕОРЕМОЕМУУУрамМЕМНМАКТКРАЕЄОЄМЗ ТЕМУ ТУУНОУМІ МСКЕУКСКУЗМКИаї.

РБЗОІЕКТІЗКТКЕООРАВЕРОМУМУТІ РРОВЕЕМТКМОМ5І ТОЇ УКИОЕМРЗОІАМЕМЕЗМООРЕММУКТТРР

МгоБООаБЕРМЗКІТУОКЗАМООСаММЕЗСЗММНЕАЇНМНУТОКБІ БІ Рак

Амінокислотна послідовність легкого ланцюга повного антитіла С1 (ЗЕО ІЮ МО:12)

ЕІММГТО5РАТІ 5І 5РОЕВАТІ БСКАЗКАУТТУУБМУ МООКРООАРВІ ПИСАЗМАМІ СІРАВЕЗИа5 сеБатоОвЕТІТІЗЗІЕРЕОРАМУУО5ОБУМУРУТРаОС,ТКГЕІКАТМААРБМЕІЕРРБЗОЕБОЇ КИ ТАБУМС

ГЕММЕМРАЕАКМОУМУКМОМАЇ О5БаМЗОЕЗУМТЕООЗКОБЗТУБІ 55ТІ ТІ ЗКАОМЕКНКУМАСЕУТНОС

І 55РУТКЗЕМАИаЕС

Нуклеотидна послідовність важкого ланцюга повного антитіла 1 (включаючи модифікований Ідс2, як описано в даному документі) (5ЕО ІЮ МО:13) дааднсадсіддндааіссддіддіддісідайнсадссаддідансссідсдісіціссідсасідснесддісассісіссаасіас тддаїсіссідддіедісаддсіссіддіаааддісіддааддоносідаааіссойссдааіссдасдсдіссдсіасссайасдсдаа дсюпНаааддісунісассаїсісссудідасаасдсіаадаасісссідіассідсададдаасісссюсаїдсідаадасассдсідщнкас їасюссіддснастодасіасодісіддсіаїссадаасіасіддддісадддіасссіданассуцпссіссдссіссассаадддсссаї сідісісссасіддссссаїдсісссдсадсассіссдададсасадссдсссідддсідссіддісааддасіасісссадаассююда ссдідіссіддаасісіддсдсісідассадсддсдідсасассіїсссадсідіссідсадіссісаддісісіасісссісадсадсоїдад ассдідссаїссадсааснсддсасссадассіасассідсаасдуіадаїсасаадссаадсаасассааддісдасаадассодідда дачааадіднаїюддадідіссассндіссадссссіссадіддссуддассаїссоіНсесіціїсссіссааадссазаддасасссід адаїсіссадаассссададдщдассідідіддідаддодасодідісссасдаддасссададдідсацдіїсаасіддіаїіддасддаді дааддідясасаасдссаадассаадссаадададдадсаднсаасіссассісададддідадсоадсідассдіддідсассадад асіддсідаасддаааддадіаіаадіціааддідієсаасаадддасідссаїссадсаїсдадаадассаїсіссаадассаадоада садссаадададссасаддідіаїіасссідсссссаїссадададдадаїдассаадаассадчдідісссідассідісїідддааддда

ПсіаїссаіїссдасаїсдссдаддадідддадіссаасддасадссададаасаасіаіаадассассссіссааіЇсіддасіссдасд даїсснсНссідіанссаадсідассоіддасаадіссададдсадсададааасдцісіспнссдідадсасдаддсссідсаса ассасіаїасссадаададссідісссідісіссаддааадіаа

Нуклеотидна послідовність легкого ланцюга повного антитіла 1 (ЗЕО ІЮ МО:14) даааісоднсідасссадіссссддсіасссідісссіссссаддідаасдідсіасссідіссідсааадсіссааасудуднасса ссіасушссіддіассадсадааасссддісаддсіссісдісідсдаїсіасддідсносаассуЦНассісддіаїсссадсісашсісс дайссдднссддіассдаснсасссідассаїсіссісссіддаасссдаадаснсдсідШасіасідсадісадіссіасаасіассссі асассісддісадддіассааасіддаааіїсааасдсасідюддсідсассаїсідісісаїсіїсссіссаїістаюдадсацдіїдаааїссд даасідссісінаїдідссідсіааїааснсіаїссдсдсдаддссааадіасадіддааддіоддаїаасдсссіссааіссддіаасісс саддададідісасададсаддасадсааддасадсассіасадссісадсадсасссідасссдадсааадсадасіасдадааа сасааацдісіасдссідсдаадісасссаїсадддссідаднсіссадісасазададсіїсаассдсддідадосіаа (610) Порівняння амінокислотних послідовностей людського та щурячого СОКР (людський а-

СОР (5ЕО ІО МО:15); людський ВД-СОКР (5ЕО ІЮ МО:43); щурячий а-СОКР (5ЕО ІО МО:41); та щурячий ВД-ССАР (5ЕО ІЮО МО:44)):

МН аСВТАТСУ ГНЕ АСПІВВОСУУКОМЕУВТМУЄЯКАВЯОМН» бпожевкнй ве

ССР

МНеАСВТАТСУ ТНК АСПІ ДВЗ ОН УКОМЕУРТІМУВУКАВЮМИ: фпошекнй

СК

МАСИ ТАТСУТНЕС АС ВУС УК УР МУ ВВА СОМНЬ Поу СОКе

МНеЦОЦТАТСУТИНК АСПЕК УЮ МЕРТУ АРМ; бвуричнв ПСОВУ

Амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга І СМК17 (ЗЕО ІО МО: 58)

РІОМТО5РББІ БАБМООВМТІТСВАБОВІОММІ МУ МООКРОКАРКО ІМУТ5ЕУНБаУРБЗАЕБОа5 азаторЕТЕТІЗ5І ОРЕПІАТУМСООССВАЇ РРТЕСОСТКІ БІК

Амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга НСМК22 (ЗЕО ІЮ МО: 59)

ОМОЇ МОБОАЕУККРОАБУКУЗСКАБИОМ ТРЕМУМУ МОМУМАВОА РОСС ЕУМОаАІМЕСТартвмІо КЕАСКМТМТКОТ5ТЗТУУМЕЇ 551 ВЗЕДТАМУУСАКІ БО УЗСЕБУМСОСТІ МТУ55

Амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга І СУК18 (ЗЕО ІО МО: 60)

РІОМТО5РББІ БАБМООВМТІТСВАБОВІОММІ МУ МООКРОКАРКО ІМУТ5ЕУНБаУРБЗАЕБОа5 азаторЕТЕТІЗ5І ОРЕПІАТУМСООССВАЇ РРТЕСОСТКІ БІК

Амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга НСМК23 (5ЕО ІЮ МО: 15. 11)

ОМОЇ МОБСАЕУККРОАБУКУЗСКАБИОМ ТРЕМУМУ МОМУМВОА РОСС ЕМ МОАІМЕСаТОакКТтУМІО

КЕАСКУТМТКОТЗТЗТУУМЕЇ! 551 КЗЕДТАМУУСАВІ 5БЮОУУЗОЕБМУСОСТІ МТ У55

Амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга І СМК19 (ЗЕО ІО МО: 62)

РІОМТО5РББІ БАБМООВМТІТСВАБКОЇІЗКМІ МУ МООКРОКАРКІ ІМУТЗСУНБамМРЗАЕБИа5 авБатореЕТІтТІЗБ ОРЕОБГАТУУСООССИВАІ РРТРЕЯССОИТКМУБІК

Амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга НСМК24 (5ЕО ІЮ МО: 63)

ОМОЇ МОБСАЕУККРОЗБЗУКУЗСКАБИОМ ТРЕМУМУ МОМ УВОАРООССІ ЕУМОаАІМЕаТактуУмІО

КЕАОКМТІТАОКЗТЗТАММЕЇ 551 КЗЕДТАМУУСАВІ БЮОМУЗОБєОУУМСОСТТУТУ55

Амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга ГСМУАК20 (ЗЕО ІЮО МО: 64)

РІОМТО5РББІ БАБМООВМТІТСВАБАРІОКМІ МУУООКРОКАРКИ ІМУТ5ЕМНОЗИаУРЗАЕ5Оа5 азаторЕТЕТІЗ5І ОРЕПІАТУМСООССВАЇ РРТЕСОСТКІ БІК

Амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга НСМК25 (5ЕО ІЮ МО: 65)

Зо ОМОІ МОБСАЕУККРОАБУКУЗСКАБИМ ТРЕМУМУ МОМ УВОАРООССІ ЕУМОаАІМЕСаТактУмІО

КЕАСКУТМТКОТЗТЗТУУМЕЇ! 551 КЗЕДТАУМУУСАВІ 5ОУУЗОЕСУУСОСТІ МТУ55

Амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга І СМУК21 (ЗЕО ІЮ МО: 66)

РІОМТО5РББІ БАБМООВМТІТСВАБОВІОКМІ МУУООКРОКАРКІ ІМУТОМНВОИаУРБЗАЕбБОа5 сБатоОвРТІтТІЗЗГОРЕОРАТУУСООСОАЇІ РРТРааСаИткКМв Кк

Амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга НСМК26 (5ЕО ІЮ МО: 67)

ОМОЇ МОБСАЕУККРОЗБЗУКУЗСКАБИОМ ТРЕМУМУ МОМ УВОАРООССІ ЕУМОаАІМЕаТактуУмІО

КЕАСКМТІТАОКЗТЗТАХУМЕЇ! 551 Е5ЕДТАМУУСАКІ БО УУБСгОСУУСОСТТУТУБ

Амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга І СМУК27 (ЗЕО ІЮ МО: 68)

ОМІ"ТО5РУОБІ БАБМОЮВМТІМСОАБОВМУНМТМ АММООКРОКУРКО ІМОАБТІ АБОМРУОВЕ5 азваваторЕТІ ТЗІ ОРЕОМАТУУО СаЗУОСТМаОСЕМгасаткМУєІКкА

Амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга НСМК28 (ЗЕО ІЮО МО: 69)

ЕМОЇ МЕЗО МОРОаБІ ВІ БСАУБИарі БОУУММУМУУВОАРОаКаИагеЕммМамістмаАТУМАБВУА

КОКкЕТІЗКОМЗКТТУМ ОММЗІ КАЕДТАМУЕСАКООІМСОСТІ МТУ

Амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга І СМУК29 (ЗЕО ІЮ МО: 70)

ОМІ ТОБРУОБІ БАБМОЮВМТІМСОАБОВУМОМММІ АМУМООКРОКУРКО ІМ5Т5ТІ АБОМРОВЕ5 сзвзаватов т ТІ ОРЕОМАТУМС азМмОоСЗзЗОрСЕМгасаткмМв кА

Амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга НСМКЗО (5ЕО ІЮ МО: 071)

ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІ ВІ БСАМУБаИї ОЇ 55 МОМ УВОАРОКИаїГЕММИамІСІМОМТ ММАБУА

КаАЕТІБКОМЗКТТУМ ОММ5І КАЕДТАМУЕСАКОСОІМУСОСТІ МТ УЗ

Амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга І СМКЗ1 (ЗЕО ІО МО: 72)

ОМІ"ТО5РУОБІ БАБМОЮВМТІМСОАБОВУМУ ОМММІ АМУМООКРОКУРКОЇ ІМТ АБОМРОВЕ5 сзвзаватов т ТІ ОРЕОМАТУМС азМмОоСЗзЗОрСЕМгасаткмМв кА

Амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга НСМКЗ32 (ЗЕО ІЮ МО: 73)

ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІ ВІ БСАМУБаИї ОЇ 55 МОМ УВОАРОКИаїГЕММИамІСІМОМТ ММАБУА

КОКЕТІЗКОМЗКТТУМ ОММЗІ КАЕДТАМУЕСАКООІМСОСТІ МТУ

Амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга / СУВЗЗ (ЗЕО ІО МО: 74)

ОМГТОТРУЬРУЗБААМазтУТтІМСОАБОЗУУНМТМ АМУУООКРООРРКО ІМОАБЗТІ АБСОМРЗАЕ5 сзваватог г тІвамМОсСМрАААМУСІ азУоСстчаОоСЕМгасаТтЕМУМКА

Амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга НСМК34 (5ЕО ІЮ МО: 75)

О5І ЕЕЗОИВІ МТРОТРІ ТІ ТОБУБЗаИрі БМ УММУУВОАРИаКагіг еємМІамісіМмаАТУМАБУМАКИ

КЕТІБКТ55ТТМОЇІ КМТ5І ТТЕДТАТУРСАКСОІМОРОСТІ МТУ55

Амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга І СМКЗ35 (ЗЕО ІО МО: 76)

ОМІ"ТО5РУОБІ БАБМОЮВМТІМСОАБОВМУНМТМ АММООКРОКУРКО ІМОАБТІ АБОМРУОВЕ5 сзвзаватов т ТІ ОРЕОМАТУМС СсЗУОСТМарСЕМгасаткмЕ кА

Амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга НСМКЗб (5ЕО ІЮ МО: 77)

ЕМОЇ МЕЗО МОРОаБІ ВІ БСАУБИарі БОУУММУМУУВОАРОаКаИагеЕммМамістмаАТУМАБВУА КОКкЕТІЗКОМЗКТТУМ ОММЗІ КАЕДТАМУЕСАКООІМСОСТІ МТУ

Амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга ГСУ37 (ЗЕО ІЮО МО: 78)

ОБМІ ТОРРБУБААРСОКМТІЗОЗИаввОМИаммимУвУмООІ РаТтТАРКО ІМОММКАРБЗИаІРОВЕЗа зкБатепата| отарЕАрУУСаТтмоЗВІЗАУУРасаткі ТМ

Амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга НСУКЗ8 (5ЕО ІЮ МО:

ДЮ 78)

ОМОГ МЕЗОСССУМОРОВБІ ВІ ЗСААЗИаЕТЕЗ5ЕЯМНУУВОАРаКангг ЕМ МАМІЗЕравІКУЗУО5

МКОКЕТІЗКОМЗКМТІ РІГ ОММ5І КАЕДТАУУУСАКОВКІ МУУО55СУУНУКУУОМАУУСОСТТУТУЗ

З

ПЕВЕЯК ПОСЛІДОВНОСТИЙ

«КО» АВКУВ ВКЕМОВКО ІМС. «ВО» АНТАНТИ АКТА СТЕНМОВАНЕПВОТИ ПЕПТИДУ, КОДОВАНОГО

ГЕНОМ КАНЛЬЦИТОВННУ, ТА СОКИ ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ

ЕВ НИ ХКЖЕАНУ

«МН ТД хх ЛОВИ «БО МІЯ В

МР ЛЕО ХЯ

«МК ІДЕ «іні» Ота «Мч ЕЗАЛНННЯУ «Ум БУ ННОВ ОЗ «ДВО ях «ВО» Бабелй верст що «Му ах І «ОМ НЕТ хз Мітучна послідовних

«ХО «ай» пн штучної паслідовност: СенТотичний пелет Яд ки 3 ма в іви УВЕСТИ дет М СПУ у ем УВС Его МУ Му ї 5 15 їх

Зеківн вен пе Уві СУ АВ Аів лек іму ве та ВНе мин Ах Ту що У І тер не вноітр ув Ате і ліз го Бу у Мам ВІ Тр Уа

ЩЕ Ки як

Ав Он Не Ате Чек (и ех Аз Аз бе Ав Тр виє Тут ЛЗ ФМ що КУ ї ма уайіув у Ернст вгИх дог Ак бор ах дів бух вжи ит

Ки та о бен бтугісь Бій МекАхи ет іа Атв ага Пи ар ТЕ АВ си) Ту

КЗ за ЗУ

ТугСує іо лізу НЕ дер Ту пу Хенм Ва Бе ша Аза Стук ТЕ

МЕ ЩУ цаеі су сну неза Уві Так У би ет 15 І «ау ках У «дах ПРЕ «МУ щЩтучма паслідоямть «це «ВАД Стих штучної пунсідовності: СиМмітичний вадіелуя ду, «ДК» сне уд інн твк В: Уч Рез дів ТНгіев гі єв бе Пуо Су ї З її 15 «ФА ТЕЗ ТНгідв Беєсує вух Аа богіуз Ата ЗЕ ПН ТЕ Ту 75 що хай Ті ТУ Кп ев то ЇХ СА АВ то Ат ів в Пе яв 33 ак

Чугену АХа ог Ага тв тує іви ЗК Но Бо ВІВ ЛУК Ве мн «у весну г сЧК ПМ Ахо Ба стак і яо Бе Не дек ле фан о ГО г М, ТУ 5

Опір дів Уві Ту: Туг сук би СИ 5сг тТуг Аза ТуЄ ка Тут

ЕЕ п 55 т РБК ЕМА МЕ ТВ ід еВ ПВ ух ак 5 «лЩ «ло сваА пе ей|й» Цітучна послІДОЗНИХО «ащх «аа ритає штучно поси НННУТі: СВНІЄтичНИй пептид «хх З

ТУ Ве ПВ РНе бик Али Тур тТгр цем й 5 хо ка «іїх їв каз ПЕТ «152 ЦрРучна посліциниль «ЕВ. «ТД ис мітучної ПОСЛУ Санта ч нива чий пий Іс митуча песо Нет Сет етечнамнннид ецхух й и пе Ага ет Си бе АЖ Ав ет Аа Тв ме Тух Лів «па АЛОЕ ї х ї2 їх маг уух щу хаб х хЕМе «ЗИ ПЕ «вій» ручна послуюавнит «ий «73» Описітучно посвідвемеєт синівтичний пет яд «АЮ У

Туг Еве Аз Туг Су тв АВ Не св Аа тує ї У їй

«ВІК «Вл «ЗК ПКУ «ВХ Штучна посліддавість «Ах «Аа Сніве штучної послідовне Синувчичний пеніад «КІ іук Ав агіув ати МВРУ ТВ Тут У щиу 1 Я їй «Щи

БУРЯ

«ВОІВ «аа» цітучна паслдовНнте «ВАМИ «Вияв нмк штучної пислідеанос Синустичнна пецтид,

ХМ ї су Аа хек Ази АгБ ТуУгіви

Й У че В хе ха ПЕТ «Кі й Цтучма послідавцить каже «ЕЗ5» пек ше ної пеаслідонННлИ СинТвТичииЙ ЯапгяД сх

Унрсйа зар тут Ахо тугу Туг ТВ

Ей 5 ками ку» 355

ХІТ» МК

УВУ Цітучма паслідовнить «АК: «Уха Опис шу после СЕнзетичннй подінунноотид

Би паависаро Кисла сиДінВнВе сорргезрс сни сне ОО зЗпковои вн спос КмЕ сви есаасіаствка стогін Мовіозшн ОО есривіаазе тва ЕЕ ЕСКВЗа ВОК яв Ву ДНАВОМНКХ ОО тезизсциа свИзЗа рр ово т воавсвс знає Я єс Ек зи Ева сові вазкнтесЕ Маса СМюЮ еп дасі вовЕН висів меВизас хасидів зр аос кА аксвя ЗБ цех зе хід: «Ех Зі «ої» ДНК «ВКХ» ручма ПОСІДОВНИТЬ «ЯЙО сте ли тучНОЇ ПОСПІММНИМЛИ СИНТЄТИЧНИЙ помінуклоютий, сх 3

ЕпаВІСВНКЕ Ес сАВ сссрЕКІВСС СІВіСССТКо ксссавЕМ аск ОБ сне аанспоссаа ск асслосіс ем стівоівсса вуавазниот ХО

ЕНКаДВСТО СТЕ кала ННі ВОМС Ко МИХ ОІВ

СЕМЕН Еванс ва соди Кене нацют МА зззвасчсв пЕрчаса сосен маса воосмиассисван ОМЮЕ квівссяаасівезавісзи а 323 щіне»

хи ЗВ «ЕВ ПР «і Цнучко послідавакль «ВХ «УМ імх тумний послідовно: кимтетичний волів яд « см Уа от ів ми 3 ет МУ У НЕ Без мВ си вто КНУ Ту 1 їх їй У:

Ппегіви тів век бух Ма Аа бе; «НУ КН Тв РНя Бек ох Ту о КК ЗО

ТСтв не Бест Уа дме Ма Бах сн іук му ін ЗВ: Тр ді

З р 35

АБ НА Аги бег би) Бет Авр Ага бек АБ МК НЕ ТУ З и що ЗУ 5 діз'єзіухам АТ На Тс пе мн Аг АЗр дла вій уз Аз пет - 7) її ВИ їем тує сем СВ МАЯ Ал Хотіли Ат Вів Не А» те ма Уві тує

Б 55

Теесувіви Мате пе Аза тугу Бц АР Не Ми би УК ТТ

НЕ ЕН ща а МУ Титгісоз уві Те УМ Бог йог Аа бат ТНК жу а

МЕ Ка 125 пегуві ква моні вій то Пух Ов Ага бек ПН Зв На бек ТЕ о їз 1 двома їсь шу вц У Аз туге а с ре У ТВх 135 35 155 їі че ти Ам бок СТУ Аіз ема ТАК ек Му Ка НІ ТВЕР Ре рух і ді і1т5 дів уві ви сни бе М КМУ Мем тує нім Пет бег Уа уВ п

ЇДЕ 155 35 чик ет Бе Ап Не шу Те НИ ТИ тує Те Сух Азв б ВИ

Б ще ХО

Нау РО бат Аз тіух Уа АзВ Ух Пе Ма НИ Ав ух Сук

РУ ЗІ У св Уві сн сує Був рт ух Ра дія бра че У Аа СПУ го Бех 53 ї5 ва майвпе зва йпе рт іух ета Бух АВ ОТ ви М Че ЗУ Ах да5 ХМ шо літ рих сна ві м су уві Мама бр суві ЗВ МУ Вк 2то

Й Ра Зо і Вона РНе дка тр ту Уа Аза УНН МА МІВ Ази Ада 7 ко ун

Му ТвРеуж ет Ага ОВ: ОВ А Кпевзиа зе Пе вне Ат ли М

ЗИ Кия З пах уагійвнм Мам Нові Яні те ее дк Ну Муз СН Тут

З 1 ЗІЗ ик ух Сузфух Март дол фуй СМ БЕц реа ба Бех Не М ух Ух

Зо 5 335

Ме декіше тн БУК НУ «а бо ам а РОКИ УВУ Пи Кв о за5 ЗА

Ете виз Заг АГЕ ОВ ОВ Ме ІМ ух деп Со Уві нтів ТВ Гух

ЗО З іно Ма іу Оу Бае тує Ра З Ахрв пе ма уві са ТРА СНИ Ме

З як Мо фату са Бгто СН бал Яхи Тут Мк КВУ ТВК Бо РО МЕЧ Ес Адо

ЗО 596 зп я

Зм АК ОУ Ме Бне рн Бе Бук бат тухіза Пе УЗ Ато ук г о БУХ 15

ДН ТгрВіме ЗВ «Ну Анп кві Во дит Суб ет Ві НИ НІМ дів чихО І ю цей ів Аква Ні ТуЄ ТП Сі іуз Зее мом ек інн ве БК Му ід

БЕЗ з 345 «А» 15 «КЕ Я «але «З135 Цихчиа послідовне в Ітжчкя пи їх ках хіз3х Опис вн учної потлідовності: Мимтетичний полпелтня «ау їх с Ве Уа ви Ум в дег Без А ТВ ув Бек ен Бег Рг у 1 У Та ї5 «И Атв Аа ТКрівипекСухіше Аа мн ух АрЕ УБЕ ТТ ПН ТУт

І У 35 зі Заг їти ут (Ми ів Муз Буд у ЯН ДЗ то Аг ілч іо Не зу щ ЩА туго Віз Зак А АРЕ Туга ШУ Ме Без Ар АтЕ Мне Зег (Му во ЗХ ща

Ме шиу Зак іх ТЕ дав ве ТВі іно ле не кер Бе інн ха реа

Ух та 75 йо сиро вна Мі уартує Тут уз мот іл ех Тут А Туга тут

ЗУ З я тра ОВ о Ж ТВгідівНіМми Не ук Агх ТВ май Аа дів ща» МЕ Мо та ек Маг ВВе Но Рне про Бо Ми АВ ші іви Зух Мет ку ме ГР ХХХ

Я Авіа УВ Сук інніз дя Дій КИ Ту ято АТ ОП Аа 135 140 ги ОН; трі Уа Ар Аза Ма іфяц и бат у дам ек СВЙ 135 м 155 і

Ме пек УЗ Пт ОН Ма дер ме іу До ет ТВСТуК Много Хег

ЗБ т НК бектвгіви Тикісн пегіма Аа Ахротує М; ух Нілу уд Ту іа 185 Мч кабує в ма тм МО Му ем уні У го Уві Аг ув ЗЕ 135 ще ра це дл Вт Му тів Мух злий зх «ЕМ

КУН

«вил дик «Хо Штуєма паслідоннить «АД «ЕЙД СН длучної послідеинеєт СнНтетичНий полінуклестид «А її нене и спори состав Кв ОО соска нмінхахв класна амскнмосв звіссвЗоВс нев ЗО санасюе занос зАИїсКи восафстесє вірасеаске базис. За седеаесис ад сСОДЕК Я ван В ЕН а сок ОКО хесийдаскзсивісівнс мнсвзивас коре вкі: винен вази ЗБ) іс ас пезполодве пса пив КОКО соБсвВНХх ОО онов арсв нені НИВИ Еіснп Ввести ва Вода ЗВО

ВЕД ЕКи ВСЕ силове ЕВ дсНха Спи ска НО зебр асіссві спвеесиоВів Вів ссвівс кате коза с десасс МО карассшсв ссновсні весен азс ссагвр ка гавкав БО каввЕнагрі ВИК НИпвКа вів ідістадоо тарі Каса У шен нава шо намнас ас аіва и ссашани повна яМіВ ЯВИ зссівівівв івВіЕвясВі ві пасвак восени новив івВіаНя ОВО аа їдігснасаз Кеу Кс Моз сИсв Кадвоові ста виасс МКУ огвинасзих сладзеннос азни вссстесссс см езкана всех ЗОБИ паванузни полка сне ВавЕК М ее ва кас 1140 вишів ваньспавсидаси вссадзаис засринава озоос є заіЕає МК ісвоасукат сс візова сів оріре воза кКоВЕсВи ХВО визласрівк сних скоса сід впав пясь Милсвдавк ЗМО звелів вавкіза ху «я А се Ве «из ДНК ехЯйе Пниучна песлІДОВНКЗЬ саКОе «тії Пиво плучнОї ПОСліравніКт Санти й палінуКЛОСТИ В кажу 14 шана уста ВЕС Ес спав вів мНИ ОО сві стЕсе пласти в аг подо сотка БКПЕВавссо 120 врісснЕсі ісвіг с каміни іно красні ссвн ЯВИ

Есе виствЕМо сервиса стае трас ОО чпасезснох сте та теслі осіасзастасисівсас стою ЗО

ЕКО тВНВасіБЕННИТМЯаВ пЕсАсТДІК ВІВАТ ДВК ков ЗМ ке нелнс ше ннст ска асво Мі встано ОО ЯЛВ севкксрни стазаріасв відн ан Кк вааасвосс фонах віжссев ЗО взкаміві а сивавсеве савсвадеВсавснксізса всстевсав сассстщасс ола тідзЕсаазк с аввсоквв кагзслезЗа В іасрогх вода ска арини ОО ттЕВрис савісвсгаз ходемезах сродвівве кеаа М

ХЕ хе1ї 7 «али» прі «РІЗ» они аарнших

АаДух ливу Амідований Кінець ка І ків схе АБ ПН АТ ТЕ КУ МТ; Ні; Агк бец МіЗ У БВ КИ ї к її Зк 5вгдти Мету Му Ма! Удіх Аза деп БВ У Мт Те деп Уа

КО У хі

Твері дів Пи хЕІйе 3 хі 56 «ій ПР «ВІ тих варі «Лх аВУух Амідований (КІМеЦЬ мЯКи ів

УВІ ТВК НІ Агвіви Ма їМбу інн зви мер Ат г (МУ СПУ Мн Ми ї т ІЙ ії іже вки Аза спа а ет Таг вкл уві Фу Мет Бу ВІВ Епе и 5 0

М

«лі» їі

УК АЯ

«ді 3» Наш хар

«КА «з Аміаваннй счанаци «ДЮ у

Хату у Ма Увіфуз Аля дви ва уві реа пи ду СЯБЕМу ет

Ї У ц І5

ТА ие хащі «ЕТВ З «и» пк «ЕІ» ото зна «ВЯП «ВІВ вжідовяНиЙй Счсанець сщх» мету УМУІ УЗ дсп вза вве Ма Ма ТМ бал уві Ку ЗАТ 1 х М 15 іх віз вне

«ато її хіх її хо ЕТ хої3» Ното заріепа «ее «ЕЙ АилідавВнНий Сукня» ях 19

Ме іх пір а маріух АУй вх Кпе уві ТІ АЗАВ УТ ще

І 5 15 15 дівавеня «ЩІ «МУЗ «же ПЕТ «Ве Нау вне сим

ЖЕ» АгідованиЙй Скіннер хАсКЕЄИ ще ОКО УВУ зх АБИ ПН Мт Бех Пе би Уа Оу Же і т М ї8

Мо АБЕБОВ «а І

БеаНеНе У «ап ка» Мило хамаця «оЛК хи 3х Аміуваним Соківеце ха хї чек Оу Сі УЗЕуУ мух Аа Ах РВе Уа БО ТВг Ази УВУ Заг 1 В ТІ ї15

МАВ ве «АНУ «іх 15

АЖТЕХ ВТ

«ЕІ» Ното зацвиЕ «Ек «ВЗ» Аюідавання Снець «ХХ

Звесіу су Маг Уві гуу Аза яп Бе уд РО Ту Аза МІ МУ бе і х 16 15 св Аза ге «аМе 3 «арк «ВА: Пе «ВАЗ Коли Вин сах «аа» Авлідовивяй сек кр й

Ме Оу УВУ ук ази деп вва Уві рт Ту дви МЛ пог 3 ія їй 35 із із Віз хЕМ а «12 А «йз0з Де «Іо Нет зценае сЕЖИ еЕЕЇ» вмідованнЙй С кінець аку а деп Аа ве узі вто ТВ да Уві су Бегіуу ва ве А ії Ку І «Ве 25 «ЕК ІЗ «ЕТ ПЕТ ха Но ЗНеНа

ЄЕЖИ» «ЛИЗ» Амідований Сокінеце «лок У

Ази дал Бра маси Тк АміУВЕіу ПОС тує Ма НЕ ї КЗ щ «вм» р г

Кан НН «АЛ» Нентка зарацх «Ох к2І3» Армідованнй СовінЕць

КОТе зп Ах А Уві БО ТАт сл УЗ су Заг Мух Аза Бе 1 5 10 «ВМО «ВІЗ «132 ПУ «КМЗ Непто знах сей «ей» Ммідаваний Сшнеце «АКУ І?

АЖИ АЕРО ді то Те Аз УЛ бегіу діз Бе

Х з 3

«ВНІ «вії» каз ПЕТ «її» мого заржих «У «ах Амідснаний пукімецх ке Кя деп аміРне ні Ват вх УВІ су Бек бух Ма не ї КЗ м «уро со ках 5 «хай пе «д33» Непо зауепх аю

ХІІІ Амідованнй боківець ке а деп ван ни Мн Бу Ліз бах ха «бу Бех зу Ма Ве ї Кк 1 хво о «ав ІЗ «ака пе «ам Нінтнх Са ко» коІ3х Атідованнй Соківеце «Ж М

Ази п ве уг РгО Тпг АВ Ха У МН АЖ АВ РІВ ї в за еВ 3. «вх «І» пит ед|д» Напо саріих село «ЛІЗ» Амідований СхВець ка Зі

Ав АЗИ вне Уа ВО ТАМИ АВ КНУ ХВ ул Ка ВН їх У їй

«Еге 3 «із «ЕК КУ «ВЕ Нотмо зви «ЕК «ВІЗ» АМІДОВВВЯВ Сачняць «Я ЗУ

Аза Ах вве мужі Рг: Ази Уві Ма хегіук ДІВ ВЛ 3 х М «Ек 33 «Ук» 33 «Ще пе «АЛЛО Но мивох сІДПх «ХХ Амідовиний Счанеці ех З

Ах ве а ва п АН МІ МУ Віа у АВ ня 3 5 КІ «КМ За

«дії іЗ сла ПЕТ еві3 Натео дари» «ВЕЦе «ВЕИеАмідовнНяВ С КІНаце «АІНЕ» За мех АБи Рв Ма ве НЕ ан Уа Оу бек ев Ах Ді» ї в хе «ан

ЯТІ» 3 «ІТИ ВТ

ХІІ х Мопка каре «Що» «ЕЕЩе Ам иканим сінець «ух

Ма вавув рик Пи Аа Маму чегіук АВ РНя 4 СУ г

А З во «МН Я «ух іа

«ХК ПЕУ «ВІН Німоз зарінві «ЯК» їй

Хату бі УМ УВУ Ап аа пе Зі ре Тег АЖ МА СУ БОГ ії 5 1 15

АБРНеЕ хе 37 хау: 18 «ТЕ РТ «ЕІ» Ното мНивиЗ «НК її бр Му Бу Ма Мі Кух Авп й Ра Мі рт ТІМ деп чаі КПУ Зв і 5 НЯ 15

МА

«Ех ав «КМ «Ек пвх хізух вхо зарівца

ХК» ЗА діа бух азртн віз ТЕО а Пн НЕ ЛІВІ АВ ОвЖівн ви 1 х То 15

Щет АР МИ Оу ія Ма У іЖ Ало Вам Ре МВ Без Пе Аз Ма! 13 «ал» «Гр «МР Пет

ІІ ото карідя «а 33

За Сук аю тн Лів м Суб У ЯР М; Аге бе ДіЗ у ем іт 1 т їй їх

БОГА ВОг ха ща ххх» 13 «ДІ ПИТ «ТІ» Натю звріна «ах я

АВ ух Азо ТВЕ АН ТВг су МН ВЕ МЕ АРЕ Би АВ

Н 5 10 а» Ях дМе Її? «ВІЗ Пет «ВЖИ Кан Зі сЕлПе «ХИа» амідовавий Сук оць «хе

Мер сх Ап ТЕ АВТ КУЮ М Тх Мі; АР ем АЙЯ СПУ Гм Б;

З з 18 1

Же Аг бето С Уві марку Бр хи тк: Уа го Тр Ав Ві че ї5 Б «уз с АВ ЕВЕ хе «ЯКО: 3 каже «иа пе «дя» Ка З. «АЖ

АТЗ Алидеваннй Сіна ць ху: ЗХ

БесЦіУУ УВЕ УВІ ух ЕВ Ахи Рі Ма! Бе ОК дом УДК ее 1 КІ за ї5 «НИ Дів НЯ «арх ЯЗ «ха? «Б НВК хЕВе Мат запових «си «АВ» Аідований КУХІНОоцо

«ами» У дівку Ан ів АВМ Сук ВЕ Тве Мі Ага ви ДВ Му Мен іо

З х їй 15

Как АТ ше Оу Ме ха ід Мн Ах Не Уа! то Ту ав мі о КУ Зо у ат ітух Аа вне «йо Я «із 8У «під ПВ кл1Ух Вами зр,

ДЛ КУх «ЕВА» Амідвазний Скінеце» «АК а ес суха Тр Аз Твесуюха г М АТЕ Кем Віа «Лу деп ів 1 В їв ЕЕ

ЗТ Агр дат іо у У мі іх ки хи ВНи Март Ту деп ді

ЗЕТАЦНН У Б У ші ех Ар ахи Ре Ма ЕТО Тв Ав Уді щі 75 за «Фу етіхз Ма КВе «ее й ке хх ха4и2 Пи «Дух Ніно авіа вДКУх кДВУх Агідовамий (КН еЦцЬ «НК 3

Пух йіу балів ов тлу пух Мекійн іє ТУ Тут УВУ МВ АЛІ вве 1 5 ЛИ. її дкпіувріи міх Те кве Бгоїми її дБ пе їну Уві су Вів вто шо ке З кацЕ 45 «ШУ.» 3 «де Пет «Йо Нолю зврівах

Не «ТІ» ймідавиний СУКІНкце «хв» в

ЩеР ЖЕ дви ТВ Ма ТК Єр Ма ТВЕН йо іве ва аби Рг їео ! 5 та 15

Уа НІ Оег бег Ат АЗЕ РМ У ВІВ мер би м ТНК АЖ МА го Її Зо яму ех хи ве їух

КК

«іга «АХ ЗЕ «хі пет

ХЕ» Ното ЗВ сЕДЕ ла Амідований Сн ецо «Ак Я

Туг Ат бів бог Мік Алі Яви Ре КИМ СВУ зе: дик СВК Не ОР ї 5 ху 15

Аре вве цу ре був тн майора ух кем Аа НІ КИ Бе тує я що 25 КЕ пе Пн Азот ух Ахр у Ал аи МВ АНКЕТ АГЕНТ Ух НЕ Бог зх п ЧЕ рго уні у Ту

М хе В «Ех а «ВІЗ ПРТ «ие Щрвучна послідоБНиТь «ЕЙ «ВИЙ пис адтузно ни тідовность бимтезичний педтна ек

Фівівнізв у ку За

«Вій» ПЕ «ві3»ЦНучня нослідОовисть хах «ІЗ» Опис цап учНи послІіЛОВМОТ Ємитатноний пептид, «юю

Ха іо КИу 3 «МОМ хм: З «ет

СА білу пусмігудзи ту «ТЗ ітучна посідав «Ве «ВЕН» Опис вити песлідовности Синунтимний педткя ом БО

Ро уві Ав з хануєву «Ух «ЕМВ «ВТаеЦітучна паслдовнть

«ДЛ» «дз вне штучної послідоеность синтетичний пегид «ке свівніва 4 хащі 5

Уа «Ті» пит «ТІ» Ніучна песопдовніть еЛУ «рад» блисітучих послумннмите Синтетненай пептид кл 52

Пів рпеінніму . «0: 53 хе «ка ПР «ВИ» ручна посліицимиють оду

Ева сис пучної поспоузанист свчуетачнам пептид

«ох «іх МО ЕХ «Ваше 5 ха У» Ав Тр; СУ, Кене адо ви «ВТ «ЕЕ» МИХ НК «вай ЛЯ «Ве ТВе Кі, Ащр, У, бен. Заг, Мао у «чхо ах іже Арбегіфх Хази Маг Хав м Туг Уві ЕЕ 4 5 13 «Ех Ба «ЩІ?

ХІІ цКТ «в33х Нтухна послідовність «Ех хви Опне нтучнаг песлідовноєть сивтетяений пепіяд «ХП» «ЖІ МК ЕХ «аа

«Ваз» му зо А «Ух «вка МКМ ВЕ «замі хх Ар ай Вк ее хау» МИ ЕК хЕшЕві7М Й «ЕЕ ен, ТМ, Не за Зах «м НА

Хив Ха Ми деп йти туг хв ї 5 «МИ Ух ке З. кепку хіх Шітузна нигблідсаність «Рух хай Оп п учної пеглудавності Синтетичний пептид

САМ» «ві М НЕХ кава ІБКАМ

«ТйВе МН, Ага. 1ул, Вів айо вм «а «ВТІМ Ей «Яд іВМ Ві «ЕЕ АМСУ, Ап, ИЦ, НИХ, Бех, Бе, ДЕ. Су. БР, ГИ, Ма, зване

ІДУ» «дз МОЮ ВЕ5 ож Не

КЕ бе. ТК. Тух, бух, хУні, Зм, Ав, Би, Не; ВКЛ, АВ, ві, Ар Ме

Хей «Іі: МОВ НЕ «ве ІА «ДЦ Ніко вве «ЛЕП стйі МО ВЕ сАВа ІЗ стй3» Він або Вр «аю ЗВ «Ми Пе гу бе Ха пох Бр Ххи Ха Аа Те хна Тут аа Ха Ада 3 їх Ку 15

Уві був слу хау: ЗВ «МЕ «152 ПЕТ «ВЗ» Цітучма послідоаниль «ие «АЖ НН жузної послідеаності: Синтетична мих БАН

Не нів кр НЕ НІВ ї 5 ха 5; «жі ката РЕ хе Штучиа послідеавкть «ВЕУ «аз опис лучної послідовною динтетичние воптид «ВИ 5 як З Зв сту Заг Му ФПУ СНУ СПУ ЕКЗ Вів Му ще

Х 5 Би їх

«ЕЕ «ЩІ» «ЕІ ПРІ «ВІВ» нучна посліДОВи Кт «Й» ее Мх йлисінтучНО ПОСВідеНоСті СВутТетичНниВ палнвитид вОчеКУ ди вм Мен СТ бі ет Вуз хе ба ни Зег АВ ет уві су 1 КЕ 1 її хв Ати маф Ті Бе Тр КК Аув Аа бер СНИ Ахр бе хр Аз Тух 7 її За

Мер Ази тв Туг бін іл муз Втз СНУ СУБ АМКУ Иге Кук іх о Не

ЗУ 5 ВУ

Тут Тут Тіж лег іМи Туг НЕ У су МЕ рима бе Аго Вне хат му ща 55 у

З (Ну суне Ку бен Кпе Те Ве Тни Не ет Заг фез щій во а й їх на

«и Ар Не Аа гм Ту Тут Сухі са СТУ Або Ма іно Бех вто

ЩЕ ЗИ чи т рве туту Твгіжк інн вх Не гук ли зл

М МК

«Аз 5 «АК аа ПРЕ я Плузна нослідовність халих «ВИЗ мас пиусно пасе нВинка М КИТИ ЗНИЙ поле гад аж с Уа сміло ми ма дек іМу Від Ме Уабіух ух Рг КОХ Ма 3 х їі 15 нег УЗ ух Ми ек ідеід Дів зве у Буг ЖК ВНа СИ Аза Тух 2 ї Зо

Тер мех бій утро маг те Ся Аа Був пу ін се ес ЗО Трр МЕ!

ЗУ БІ я

«ПУ Ага пе Туг То КНУ ТУ СПУ А ТБ АТХ Гук бе Км У КЕ що ЗМ 5 дів «Ну в увів ТвгАтТЕ бар Тл бех ТОг ет То Уві Ту;

БО 7 Т5 БУМ

Меч чВруви ог бог Бе Ат Ват Ха Ар Ту Ка жа КУЄ Тор УуХ

ЩЕ БІ ж

Мав іви нт Ало тує ма Зах «Ну ВБе ву тує Тв Оу со БУ цю МЕ ло

Явнівгс уз пе Ві ваг 115 сю едії2 У едахз ПРІ «МІ» Штучна вослідОЗНиЛЬ ча» «ух ме педеасний кінцеві гц сх с кешу пис певним пн иНнило СивІетваНнНИ ПОЛИН ТХ сМХе Во

Дер Не Ой Ме тк ОВ В го ех бер ісв Бек А Ук узі У 3 КІ З 15

АВ АТ Маг тн НЯ ТВ Кух Ахв Аа Ме ФА АБИ Не ВН АХА Ту т їх ЗИ іо дою тт Туг СО У Муз Був зву мух Аа га фу іеніви Не

Тут Ту Ту кегіМи Тук НЕ ОЗОР СЯПУ МІ ря Зет Агро пе ог іМу їі 55 2

Маг су Бег У Твг Ав нс ТЕ ве Ву Де г брів ЇМ о 53 то 75 що

ФВ: Аза Не дів ТВуУ Туг Ту Суз Щі СТВ СУ Ар дівіво мо о

У що п

ТВр не у п ОК ТЕ бу ва КИ» Пе їх ке м

«ЕВ «ве лі «Ме Ку «КМ тучна посвідавніть «аз» «да» Опис штучної пеклідиВНнест СинтетизНний велнет д, «ВМ са сів мм ба пет Му Від Ме Майіухіу тю Ку Дій

З 5 16 15

Ме уві зув ка бе Сус ік Ді Зиг Ну ТУТ ВУ Бе МУ АБИ тує хо ра Зо

Тев М НА ТВ Ві кВ Пе Аа бо у Пп у іно вх ігр ме

Як Оу Ах

Се Вів а Тут ін бу ТР КНУ Бу ТВУ УНІ Буг бе дів гух Рв

ЗО ВЕ о

А А НЕ тТвт Ми ТБ Атв Варте ме ТЕ еР МЕ Мі бух та 7 5

Мен іои бнт бвгуви т хег 1 АЗОТ ДІВ ХВ Буг Ту Су ях За вк дізАгвісз ог Ар ТУ ув бегону Ве Бог Ту прова Ох

Ко зах Ко

Увгізи ха тв Ум кв ех

Ме «ЕІ «ие Не «Хе ПЕТ «УЗ ШТУЧНО ПОСІДОВНХТЬ «ВИХ «аа Опис мпуммо песлідовност: СинІВтТичНиЙ ВОлЕМтТНОд «ИХЮ ВХ

Аза це С Мет твк си бат Ре би бе зем бу Дів Зах маму 1 5 з 15 кр Аг м Би пн тк був Атр ом Мет бул ор пе бат ух Тут ха її -

зви ах Тер Тут ХНН ує то Му Був Віа веж Зк ян Бех Не що ак

ТухТуг Тв Ми у тус НеКіМу Уа біо цес АК БИ ж МУ

Б 5 т

Хату лак б Так ахо Ве тв ен Те Пе мн МН КВН МА Рг жу та Їх о

Оз еня Аа то Тук Ту Сум Ми СУ Ахо а ів Кт га

С и з тіж вве Сіу су пгіуз уві біз пвіув

МЕ щ «ме кам» тв «Ве ПЕТ и В умм'діцеюфцій у хжки: гучна пОСНІДОЗеНИХе

КИТИ» «ВАВ МН; птн! паслідвеност: Синтетичний подіпептид

ДЮ ВІ ща УВЕСТИ ем Уві са Зв СТУ Дія СИ У рубіна ето Ку ще

З х їй їБ

Хек уві був Уві ет Пух Муз Ма хег Оу Тур їн КВесйу А тут

КІ Б з

ЗгрМмМессв тт УМ йтк Бій Ав бу у ши СНУ ем мн Та НИ 4 Я «МУ АВ Пе Те Не Му ТК Оу Бу ТНК Ма тує Пе я гу Кпе

ЩІ 55 5

Віз ААУ ТВ НЕ ТП А АБО Муз ас М чека тує

ЩЕ 7 ТУ З,

МТМ вен мер ит іви А Бог ОНР АБО ТА АВ МНЕ ТУг Тег Сух їх Зі як

АюАТЕ ев Бер Тут Ма ек у РН у Тур тр Му СПИ Му

МюЮ Зо о

ТВЕТНЕ УВК Тен Бег Бе

Ще «ВЕ» хі «ЕІ МЛЕГ «З13хітучніа посліДСВМННЯХМ

ХЕ

«ие Уе КН штучно песлідовности синтетичмий поліпелтни «НО Ка

Ако Несцн м те ун ве: Кетоег аг іви зн А Ба Уа ОМ ї 5 ЕС ї5

ЛІВА МІ ТЕ НЕ Тег Сух Ат Ма ек Ат го Пе Вхр гу Тут -О Ка З і Аа тр туги ів фе бо ту уз ДЕК Муіво зви бе 3 4 їх

Тустуг Тег Ми Тут Ні Хе 02у Уві го бер Ат КВ ба СПУ

КО ЩЕ ва ге бег ТУ ТА Ар яна Ту Ве Ту пе м ке земНо Кто та 75 Ей

Ін аго Не МЕ тут Тут Суб пап На Оу Ар АБ Бе бо го ї5 І У

Че вне МУ Ми шНу Тк уз Бе ка Не у кед що «а 55

АДЗІх ІВ ка НЕК зах Мітузна послідовність хЕАе «ВІЗ» Опис цип учна гмлідОВнОСтЬ СИмТиТичНий полін яд «НИ ще уя м фен уві с 5вт Ту АБЗ Ма Му Гуз Во СТУ АВ ї Кі їі ве

ЗВУ МІН Бук Уві бек БУХ Муз Ма же у Тут ПНО Ка Ну Аги Тут і їз 30 тТгр МН Вій Тер уві Аме КВУ АЇя Била СУ ЦИ СНУ ан З Тер Мен

ЗБ Я 5 «Ну Аж не бук Оп 0 Пн Ом БУК ТК Уві тує Пе ДН Ку Ме

ЩЕ 5У о дів су Аг Уа Те ВИХ Тпг Аг Ав твг Бек Тйг уог т МІ Тут 70 75 о

Мі ід ви пе жерівм ми мн хи Аз ТК АВ УЗ Ту БУК КУЄ не п БК

Ав яевівц Р Ахр Ту уві ех ПУ Ва ху Ту; ПИ ОМ ОПИ Оу

МюЮ ЗЕ їв

Тнгівм уві Тр Уві ве ет її «хащі

КО ну «ТЕМУ иУУ едідх Цеучні послідовне хто

«ляЗ» пис іНнтучНнОг посвіденност свити и подненихд «ВХ» ее

Авепе бів МА ТВі За: Ро 5ег бе іи бег Ма бе УВУ

З 5 ха 15 дзроагк ві тн ТВ ОУз Атв діа ет С Ах в Азвіу Ту

КІ 35 зо

Без Ахи срукіМи ЩА ух ро Су зу Ав Був іувінсіви бе в КН 45

Тук тує тру баг УУ Тру НИЗ деку УЖ РТ ЗОг АТЕ Ов ВГСУ 5 ВО

Зае су бвг сйЖ Не Ав Бве ТНК ееи Те Не че бетівніМми ра їх т їх БВ (нАкр ве АВС Тук Тук Суми СИ (У Аза ма інв Рг Ра

КЕ ЩІ 5 т Вне і Бі Тисі ВЕ со Пе зу

ІК ку

«ЛІВУ

УВК

«лад РІ «дух гучні песлідовнть «Це «ВИ» спис зштувної поплідДОВНОСТЕ Симтєтючний полрдептид, «Хо КІ щі ув іви ай спв ме су АВ СНИ Уві Бе уд Б У ЕМ

З Ку 1 їх

М УВІ ух Уді Мт Суз ув АБ ет У Тут ТАК Реве Му Ап Бут о хх що

Тур Мі хін Броєві дев сни Аа гу ОЛІМу іно Шо зо М

С СУ яв

ТУ Аа Не тут БУ су ТК НУ Ку ТВ Уа тує Но о дув КН

Б Зх а вану те мі тв пе тім Ата Ар був Бет ТВ ЗБ М АНЕТУХ їх ді 7 Во

Міехйм мно бе от і АЕН СО АЗК ТМ АВ УЗ Тут Тук Су»

У 55

АБАТВІВи ет Ар Туга ет іЗу Крему Тут го сНх Ка КНУ «адиа лих чай ме НУ їх

Таг не У Твг мамин ях 5 «ЕЕ «ЕЯІ» А «ВИ» ПРІ «ВА» ітучна послідавнить

Ку То У сАДз Опис цтузної послідов биміетичниЙ поліпептид, «ВІЗ БЕ

Сім ін тики Зег т баг егідою БН АБ Заг Уа у ди ї У І 15

Ар УВІ Тог Пе вм Ск Сі із Зв Сп мн Маі тут Ки ДВ НЕ 2 15 3

Чехіви ДЗ тв тує в нев бук Ето у ук Уві во Бу НИ а 13 4 лю

Це Тук дер ві без Тгрісв АреБег у Уві рго дет Ат рНе де а що щ5-

Ту пе ТМу Кег ЗМ Так ар рни Твг вени Тйг Не ві бесіва си то 75 во ізо їн зр уві літе Тут Тук бух іва Су Бех Туг б5р Сук ТА ях що А дез су кр Сук Кве уві РН МУ МУ Му ТВУ у МВ СНО йК ех

ТО НІ Ме

А

«Ам «ВЕК М хВІже ПЕТ

«ХУ» іМтучна поспідаинити оКке «Еяе Оле штучна послідовност Пинтеууми плати «аг СЯ

Ві мана ін ВОЮ чеку Ох (Му івн Уа гмМа Бу Му у 1 3 не 15

Мн івн Ат во бат Сук ДІВ бні баг у Пе Ан уво Зої КНУ Тут хо 25 ЗИ

Тут Мої щи їтр Уві АгЕ іп Іа ГО Кі «МУ ЦЕН; тр мл

КУ о ач їМУ Маг Пе су Ме вх СПУ Дів м Ту тує Ма бе тр а іх щ що

ФУТ вва Ве пе ке Аг Ар ав Заг бух ТИ ТТ Уа Тугіжні 5 ТО ТУ Бо о Мега Богіли АТ АБ АЛЬ ПИ Ма Уа Ту РН СУ Ав як зо че ве сну дл Це Тто Ну Ма Ну Кг іви УМ ТВ УЗЕ ми вт

МЕ 305 330 хами7й «ії хЕТти ПЕ «1 уЧНВ ПпПОСЛІДОВНКЧ З «ІДух «дй3У блислтучня послідовності синтетична й палки иид «де

Ме Майеч ве сіра ми о мноріва а Аа М УЗН Мей ї В 1 15

АЕН ТВ Не АВ Су КНТ АЇВ Мат Фі бег МВі тут Зара ей ке р 3

Тугувиа ДІВ Тер Бут хі: «кап зух Рез Ту ух Май бто Гу Діл 1 3 5 45

Ме Тук цер ТОК ОК ТВгідо Ацейегіу Уа! Бгто Хек Ат Ве бет що ря що су ет ніх Щек ЗУ УВх бар пе Твріва ПУ нен бо бен мя

Ух то Тх 5

Ето біз кр Ма АВТ: Гук тугу ем т Бег ГуЄ АщКує ог я ч5 чехів ска ве ув ре чУУ ОВО ТНкік ма и Ве де ню шк Зо ме

ЗА ННя «аж м «ДЛЯ» ПРІ «ах Штучна послудавнте ал овеча г У херес с т; ско ки ее, жаху» и тучних ПОеШВІДа нини минтІвтнамУ ПОПИ чих «АК

УФ ОВ во Ми) ТМ БЕКОНУ МУ ТМУ бно МЕМ Ре СНУ Су 1 5 їй 15 уирани ви бе Суд Віа уві Бе ШУ ГИ Авровм ех ет Гук т ї5 За

Тег п си тр ув Ага іа Аа го ЗК у Оу ем імн тв М

З я5 су ма несу Не дав ВБИВ Аз ВГ Бук Тек Віа бер тур, ві ух

У УУ Но

СПУ Атя це тв Пе бек ЧЕ Ар вал ми 5 ПН БЕ УЗ тугі -х ТА 75 БУМ уми дян мет з ец АЕС АВ СТВ АТ Ма тух Бве ух Ав

ЩЕ Зо У

АгвЙУ Ало Пе ТОНУ А МУ Тагіво мя) ту Ма Чех бог цю я їю «АНІ Я «втіх і «дах ПРЕ

ВІЩ» Цчна пОсДОвВНиТЬ сел «тла» лис інтуЧНОЇ ПОСЛІММТЬ СВТ ННЯ пали д «ака ій ув ін Тлге Зате Ме БР іви Щек Ва б МІ ОМу ДЕЮ ії 5 ї0 їх

В ма Тебе хи КУ КИ Абе бе Фа Зег УВЕ Тут АКА Ат

ТИ ха 30

Тугієз Ві тв тут св іп у рго Су зу М ит ух ВІВ їв

З У З»

Че туг чех Тв бе Твкінв Аа цегЯ Му Уагіто ег АгЕ ВН жи 59 55 СО

КНУ ет ТУ БЕК У ТЕ Ахв пе Тегі те Не бог бере а ж 7 5 ви

ТЕЗ МО АЛ МАГАТЕ: Тех Бут Суківн Ух Же Ту Азв ух Баг

НУ З щегіну ами Су ВМе ма! Бе СПУ СПУ Су ТК ух Уа а Не ух

Ме 5 їЩ

БУ

«ММКТЯ «Ве КА

ЕВ ПРТ

ХХХ» Штучна писдовмите «ЕМО» сИХЯз виє штучної Посла нНЕН КиНІеТичНКИ полійелтяА «З ТЕ «иа свй ів уві и зе су у СПУ ів Уа ІА Ето у Бу

З Х М іУ

Марівн Ат ем баг сук дів Уві ве Му ни Ар іо Баг пет Туг

КК 5 ща

Тук Мет Ми Тер ув АтЕ і АД Кг Му суху Кем Си Ттр уві

ЛВ Зо а

Зі Уві Не Су Це ви дже дви Те ту Туг ДБК ВАШІ 53 Б 5 аг ене іє Ве его ач Баку ТК У Ма Тугівм ха 5 я «ае аки ув ви пу Ва біз вки ТК Аа УВІ тую Ба Суха 55 во ЗБ де АЮ ни Тео і У ПЕ Уві Ти Уві Заг 103 М Що «хе Та «ке З «ЕХ ЕТ «ЕХ ітучна послідавнте

ХЕ хай Олне штучної посндовноОст Синтетичний помисдтвА «ВМО іп ЗЕ ец тв ТУ бе лит бо уві пет Аа Ата узі ху ет 3 Ку 16 їх ем Ум Пе дзн су Сп Аз Би суп ек ма! тує Ех Вже ус 85 У тугі ді тт Би із сни дух ба Оу Са тобто Ко Їм ви до ЗУ

Ме тує Ар АВ ми ТНгіви Аа мн «НУ УдЕ РО ЕТ АГ Ре ВЕ

ЗО 55 А

Ом Бак сну Ме Ну Те и Ві Сгне це ТАК Пе ет Ну Уві

БЕ У 75 до

Су Али ар Лів дів Ма Тут Ту: Суд ій му ДЕ Тут АВ ЖАН їх що ЗЕ фу зр ук Ре оці ве му СТ МУ ТИ Я УДЕ Уві МВ ух хі це 1 дж хеї02 з

«Ії ЦО «ІЛ РТ «вх Цеерчна пасндоВеНноть «Ще «ВЕЖ ну; дичної послі внут панни вд саху їв (а Бег бні а «ни ек КНУ НУ Ат ів Ма! РУ Бе у Тк рю х їх КІ 15 ізо вгідн г буз Заг жар ог СНУ По Акріоц мм Ну Тут туї їх 25 3

Мега МВА С АВ Рез Му Суху дез «Пи тр бе ду

М а 45

Уа пе Му Не Аля Су Аа ТВ: Тек Тук Аз пет Уха Ма ук»

Б 55 щі

АТ ЕВе ТЕ: Пе Бех бура ЗМК Ме: Тйх ТВ У хр і ги туз МН, м та 25 да

ТвтБегівн Тв Ті са Ар тл дія Та Тут Рі Су ДЗ ДЕК ОХ

К За 95 ка па еру го Фу гів У Тег Маг бог ут ща ЩІ «В» Тв «із «аа ке» учня поглідавність ве «ВАДУ лис пиучНо! послішннил СихтетичНий поліветтид «щи пе мя ізо Б сив ее то бер Зак ів Бек дів Ме У СНУ Аго ї Ву 1 її в УВУ Не Ахи Сук Фа Ада Он см бак Ві ук мя ви ТЕ о та Зо ук Еен Аа теВ тує ВІ ТИ у мо (НУ Су М рих улінт бех ру ЗУ

Не Тут Авр аа ме ТР емо АВ ет Лу мазі то ет Ага Вро бе

ЗВ І сту Заг сну Баг Му ТК Ар ве Те фян ВЕ бе сег ог Б я ща т Н Б

Бгто дор жа АБ ТВ; Ту тут Ху ан Му ох Туг дов КВТ й за Зо

АБО Ам суЮВЕ МН Ра їму ОВУ ГК Бу Уві ква Ве бук

Б5 305 о

АДНУх У ках М

ІІ НЕТ

«ІІ рах пслидовність хаАхх «ТЗ» Пам втучної пуслідеовности Синтпичний поліпнмд «АПИг т

СНР УН; мви ві Фа ие КНУ Яну Ну зви мяса У У НУ

Її 5 що 15

Жміга Ат іс) феу су АНУЮ ПЕТІМУ ПЕ ДБ МВМ МЕР СЛУ ТУТ за 5 ЗО

Туг Мек ди ігр А Ате ми а Ето Оу БУК КИК ви ОБ Ттр а їк 43 Б

Піх ма не ху На ами шу А» пк тут туга ми пр АВ Ця

За Ще У су че не Тк в зе тк АЗо Ал баг і ух Тв Те У Тр їв та 75 г

ФА МОХ ВжлсУунт ем Атк Ма ОТ Яи тт АТа аю Тут вле Су» вів

Б Б ЗВ

АТВІМх вза пе тт му й МУ Тах бе мете ні Заг бег м ЗУ ке «ЕМ В «Ма МО

«іш ПКУ «АБ Ух МЕбучна поклідовнють ха хе них ду гниліднаност: Симтетичник вола атнх «а їв пік бек уві бе Пе спа те уз Хек МВ ле Аа ді во У СА ї 5 в ї5 іх ММ тв Не ек Кух ит Ту Зк БИт ЗИР Аза Це СНУ Ах дай

Кк. хх ЗО

Ту Маг баг тв тує ср ціями Бгрз ху ТИ Дін о З уіви ен

Же ОМ че

Ме ту АЧ АП АБЗ Ух АТЕ ПК КК ЗВ, Не РТ Вар як Ве ще ма З за

Ще Баг іук ме ТМ; Зв МЕ Тв: фе Му пе тн у дек й

ВУ т У КЕ

Твг оту Ахр НИ Дів Авр Тут Ту Су Му ГНЕ то Аа мМ Ат ів

Кая вн З

Хе: Аз В У вав ОО Ох ТК ідківи тв утіво щю М 1 «КИМ ЇВ «хіх 130 «ВК ПВХ

ТІ Б тучна посліивавнить а» Штучна послудавните «вох «ЛІ» Опис штучної пе довните Синтетичний пенилелти кажу

Сі уВі білі Уді єни Заг ому БР ХМУ Уві маги фо «НУ Ах ї Е т 15

Хегієч АгЕ ей зт Су ВБа АВУ Мет СНУ Ра Тег рве бог ме ВВЕ 23 її Зо

РЕА НІ пр Аг ОН Аа ть о у сну шани бів тр ха!

З ги 5

АН Ма! Це бери Ар Му бат Де бух Туу Мат мі Ааромер МА

ІН УМ КО

ЕВ НУ Ар ЕВ Те пе дег ами Дво Вул мне уух дви Ткісн Ре їх 70 т ВО інв пи Ме ах Зетіви лук Віа бін Ома ТЗ АТ ха: тує тує Су»

Би З ж діа Ат Акр А і ла тує Тут Ази баг ле у Ту Тут НІВ Тут

Ки ме Мо

Бух Буг ТуК Ту еЯ Аз ХВ! Тер Ну 3 Ну ТЕ Те УВЕ ТК щі 335 123 125

Заг ех цо

Claims (14)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Застосування моноклонального антитіла, яке інгібує шлях пов'язаного з геном кальцитоніну пептиду (ССРР), для лікування або зниження частоти випадків мігренозного головного болю у суб'єкта, при цьому моноклональне антитіло вводять підшкірно суб'єкту один раз на місяць в дозі 225 мг та, де моноклональне антитіло містить важкий ланцюг з амінокислотною послідовністю, як представлено в 5ЕО І МО:11, та легкий ланцюг з амінокислотною послідовністю, як представлено в 5ЕО ІЮ МО:12.

2. Застосування за пунктом 1, де мігренозний головний біль являє собою хронічну мігрень.

3. Застосування за пунктом 1, де мігренозний головний біль являє собою епізодичну мігрень.

4. Застосування за пунктом 1, де моноклональне антитіло є сформованим в концентрації щонайменше 150 мг/мл.

5. Застосування за пунктом 4, де моноклональне антитіло вводять в об'ємі приблизно 1,5 мл.

6. Застосування за пунктом 1, де моноклональне антитіло вводять в об'ємі менше ніж 2 мл.

7. Застосування за пунктом б, де моноклональне антитіло є сформованим в концентрації щонайменше 150 мг/мл.

8. Застосування за пунктом 6, де моноклональне антитіло вводять в об'ємі приблизно 1,5 мл.

9. Застосування за пунктом 1, де введення включає застосування попередньо наповненого шприца, що містить певну кількість моноклонального антитіла.

10. Застосування за пунктом 1, де застосування додатково включає введення суб'єкту другого агента одночасно або послідовно з моноклональним антитілом.

11. Застосування за пунктом 10, де другий агент вибирають з групи, яка складається з: агоністів 5-НТІ, триптанів, алкалоїдів ріжків та нестероїдних протизапальних лікарських засобів.

12. Застосування за пунктом 11, де другий агент являє собою триптан.

13. Застосування за пунктом 1, де суб'єкт являє собою людину.

14. Застосування за пунктом 1, де моноклональне антитіло є людським або гуманізованим.

Жак о Жено БМР ЖОВ сх «ЯК; ІМТ е Кв совок коки Зк жожоквих ж дж жк Е: се ік «кою онне з ная ее Зк всю ок и Кк, іно а же Що я щЬЖУ ШУ" ОТЖеЬ ЩЕ КО ща Ех ше І ща що КН ще ла ме ззезеанм'е в с г ЯН їі ев ж п с З КОХ зіва За з зх З аш. же ФВ є М о. НАВ ОХ Ба ке МК З те с ЗХ с. . . КО о я в З СЕ іш 5 й. яке ОБ ку ес аа ва хх ше мо Б сижкиу КЕ соя пе Я щої 0 ОО КК МОККК ос ВВ за о ЗХ ЕК КО 1. 35 З с Б З виб з ав ва 0 55 Б? ве нн зи ща зе 8 о В вх Оз о й с мак оїе свем о знее вової НВ ОК шар З Бей БО БЖ ОБ яв щЦщ8з ЗОМ Ж а Ж ОЗ В нон они ин нен нн М нон я 6 ФГ, Зо ; ХУ ююьх соте З ?шж я 1 Е ен ока - екеоє ке оея ставах я «МО вва ДА вріке ЇВ За Та воло ХУ БА іа» ЯН ж НЕО З во ВІН «у ТО - БОНКК щі - водну ЯООВЮМ -неюнодрнх Яни Же не ! засни бака ше ШЕ Я Я Без антнтрв ки яки З мук ЇВ За ме же їй

ФІ. ЗВ

ОККО ВО а З З МАО і й ке у. і «г ОО » Вон: 2 «екон зе ве - ше ХЕХОВІ З | ай к-яА ї шк Зате обмеже ЖЕ імк о жефцхеі ФІГ ЩО лові пі втеікоту чех Щі зом різни Є З | ГЗК. Ковтосєть ЗВ мук МО як Ше Іше ше ї с. к - зна Еш ії нн я- вч в, Бо К. З ее КЗ З ЕЕ Ж. я З я Х жж У ж ВЗ Ж х п. й сш ВН КОХ х 5 я БК оф 5 же 5 ЗОБІ: в: 3 ОВ во "ЖК ТО Зх КК Я Зх КІ х Я В ЕЕ З 5; ї . з о ВО. х В БЕН ЕН ОУН ЕК ЕН В Ко що о чо Меса реж СЮ ФО Я х З З зав звссове й що .- т вищ В | пом З | х : -- же ОВ ке жк - ваш ши з ше Ко о. в В ве - і х : | де ще . шо х ДЗ я УНН ВН ща БО Ж їж я ще її. о о ЕЕ о го с ПК ВЕ ЮК ЗВ М Е ОК ШО рЗхя ОО КК. нин о "З ПИПОКИМЯ 9 Я ше. | й я а КОХ М "НН в НН Ж: с В ОВ і о. с с 0 ще і. 1 Її й - У хи НК Ж НЕ В їх З ВО Басов с п В КО БО КО я Б п щи п ОК В КО кОм УМ Не Ка і и в м. М. в Яас після ех Ор ФВ Внаізово журн вика я С за ВН Бизмено піхв ванням У СК за СНеННх шк панк СИ ї х ЩЕ хЕ щЩ- ЗЕ в У Ж я же БоЯ хх з М хе Ех вка кн ХВ Ван хх. ХЕ БУ ЗЕ х КЕ ех ВхавиУужксе:гІтТІвх,ниаїЇхІ:ч»вкиВих ЖЕ ЖЕ БЕУ Зах в н ЗЕ Я а В З В а В Я В ПЕ С ВУ Зезжей дання С - нк : ; ! Ж у. й Ж Ж У хх Ком хх щЕ х Е 55 ЗЕ ХЕ Зх ху вкЕхспЕсхскоигтіІвноЕРЕВЕКкУКЕКХ ВВ ХХ ше ТЕЖ: Ж ТЕ

І.

ще 5 зу щи шк ще ї зх: МЕ с ШК І ї БУХ Б : . ОО В У . п. її ОЩ ОХ ОКУ ОХ Зк ва ау з ОН А ен, маХеМ кое Кен внія ким ми ВУЖ ММ ВАТ ВджавькН ДЯ Я? дар 1-35 Вакувачни ут Мевкурукач пецптиам

«ЩЕ. В з : й «ВН зов

В. ї Ку Ж ХХ по Я КК ву Б чів . у Зк 0 зе ії БОЗРЕНЕ ОО вов я, У ех КК хх КІЗ ж: в в 53; я її ше ще мм І І ни КІ ВЕ. Е Я щи х ЩЕ : й 3 ОВТ ВО зи ОБО НЕ ви 53 МОХ КК ВЕК З ВЕ З МАК Я

ЕЕ . і 7 денне Мом. ас пісзх ук їхні ЕН

Анашіз на підикірнн вещй день з зу що їх хо ее в ТВО о сесох ве: і В зе и ВО ав на МНосйо іму ВЖК овслнк ве ще -а щеВ.

ЗЕ. БА днмпа на підкниенанв вові ВЕН ЗОВ» у ке Ше ма Шан еЕК іще | жк вай КД сс В ВВ ВБВВВКВВВВ ве Б Я 0 нів її че ее 00дДдДмД0 ше: КемЧВ. пд акукг Завине бацуюк Зону - ще -е Бей 885 ФВ дних на нов рене КН Днказння КУ Де е віро нь мк т Ж ДЕН Колу БЕ МК де ши хоожЖжодени? Єбоуи ох Ооаакект - УДК Те І й Ме че звево й я й з ее Ж авще | ТЕ Боно а В миша вні нн нене" І їі доза кін; НО їв з Її Я ей, - в ще 1 х їв : у І і чо г : М КЯ - і жк яко ос З хе їх : сш Ки яки Ши що КЕ а: жо ВО ши ШИК; р ване Хай р се ЗО МЕНЕ ХЕ що су Ше й БЕ о М Я х доле хх ЩЕ 5 Я хх «б фр тра?» шо ій з Зб кклнх Же В в ща 8 Еозо за Зіво ся НЕК Сх г. 85 І н вро Мате КВАЄВІ СЯ киш ННІ. пет З. аку. СРО ГУ чо щі Я то 5 З І я аши ШИ. секр пошук МВ ОО ми У ї ку вки В а г |! зхевес ДОБНЯ (МФ БА дикої ЖЕ І її що ї Я ї я не ї КУ Я як ГЗ Ж пику ге ее У Як ше сс в х сце ть в ШЕ Кк Хе ден сх нй ре В : : сепетеетессвосоюу дек а хек ее ій з ; ях ей ОВ а 5 зо г ва ва Море а самих

ФГ. Мицика пемпера ура тех Ї ее Мові ЖІ те фе схем ВЕК Голови В ЕК т й же ше Я ща ге ле у й З н Кк и Я А БО УМах ме се У СКУ сяЖ «З аж м, ек, ки Зех щен й Я 1А

Кроверюня квлеха шо ї сежюм ВЕЕКІВ СЕТ її : МОМ кети СК рої ті ї зе ВО ІК він КИТА ЩО ін т ве Н.

ШИ Кі ее, ! | - ШКО ж, Ж ТА Н може й І г Ж дея Її Ге; ЕІ Я ід найпинк ІВ и нак БО ж не чи МОХ ка и - Б ТЯ ХО фен ! ее «Же Я ф МЕТО ВИЯВИ Масідаі чГ ІВв Базова юні м ях ЗІ Ж ку ча : Б а нн а и м и и и и и и и п и о ши оо ї ОК пед, т і хх ї т ск, : у нт : в я Шо - у нання иа пранні пн опо оно : х ; "допов : х ; ндкенюнекикккюажнин ї з Н т с Анни ка м м и м о р а А шо ОК вий ї я ечежу : з йо К- сан Ше вен вед : Пе Се СМ Клин ах : ззіху лямок дали тими или ти тити ти их : нн и Й х й Ши ле . яке МОЖНКМ НИВИ вто ОД г сне х йз те З йо Те бе, тОх в : х й : и я : х ра хУмУх ї КЗ К. в ї оо в Ме ї я п КО Ме М : Ох у усу де : сл, Зееекклим кіт Я хни днк п НИ : юку, Кене поко Бизова ця Б У жа ефе жевцевбо «ех дао ее МК лях 13 Базова НК Гек м: зе і я з І ЕК те ї хх ж, ї хх ас -в ння Кч - з й Шу в, Н Ж Е Щ а св ї ко ре» ЯюВ І «У песню се ши ОД нн кн оон нн нн : х А Шо ч ї ЯН омюккк ве сих ах Н шо ГУЗКЕ Зх но ко : ве шко ВАНН «ВІВ ох КК ме Фа ї і: х - т. з. реж. ї схо хакочх КК че ке В ї Таеквн ЗО Еея У ЕОУЕ : х ї З й ї їх з ОО о о ї їв Н ох Я ск щої х Е - вон нн пр о ДОК мими яти ие жи ОТ Ж У : в Ше їх їв Н ша Хюкхнх ї Я ск ї ехо М кла її ї Ж МО ман З їх ї шо В ї Ж акя сх ї ї ОМ ї т х х ФО Ще че З х 1 ОО х що ї в'в : З ї ЕЕ ! з м : ї Ес х ї з Ж х ОВ зві дних Я, З ї хх ро г Ка хх ЗДУ ому м у Кк уча кннунничк и і Ву т натяк нти тн З й от й ом їх К це "у ч сь . ї КЕ і бу а Н З щ- «їі й ж : КЗ то -ох м ї ї й КУ ї пк : КУ ; о Е її ВЕ да бе шле З ще ; Ж Н ї ОО х ж 7 ОМ ож я Н Кі ї

5. е чл ск свй - є їх ї яри ллащете ефе ее КВ ї З З Її ес а и в и пу

ЗНГ. ІЗ 7 : ї ! х БЕН ДНК Я КОЗУ я ї ї їх. ЕХ х ож Зк ї їх ї вовни он нон он в ін нини нення ї і з Б 5 у : ел ї у : Ек: ї Її : З ЇХ У ся З ї : У ; З З : З ; ї ї ; ; Я ще Ех : : Зх ї ї ї З о КК ТУ вах х ЕМ х і: еВ мк ї ї . В х ї КжкЯ і; є . Я х КУ Я ож са. Її З : | хх ке КУ ке ї ї : Є х Ї : З А Її : Е й ї і ; М др жк в х ВО Як : х х х ї і Ох -е ОЗ ЯКИХ х ї ї Мк, Мох Т 1 ї ї З скдуя у аж, Ж ї : -к пваи ча Жде х ше вхо ЛЮВО я : и ШЕ меш м о нн по В В ї ВО ж Ж ВЗ х З Ї Ф СУДИ " х ї ї сс Ме ГУ ї Н "В ок У ї : ній й Я 3 я ї Ж хи КК ВК ВИМ опти уми із 3 Ди ВНУ пек : о В КИ КК КУ Ач У і ФГ