ES2974803T3 - Anticuerpos antagonistas dirigidos contra el péptido relacionado con el gen de la calcitonina y métodos para utilizarlos - Google Patents

Abstract

La invención presenta métodos para prevenir o tratar trastornos asociados al CGRP tales como síntomas vasomotores y/o dolores de cabeza (por ejemplo, migraña, cefalea en racimos y dolor de cabeza tensional) mediante la administración de un anticuerpo antagonista anti-CGRP. También se proporcionan composiciones para uso en los métodos divulgados. También se describen el anticuerpo antagonista G1 y los anticuerpos derivados de G1 dirigidos al CGRP. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos antagonistas dirigidos contra el péptido relacionado con el gen de la calcitonina y métodos para utilizarlos

Antecedentes

El CGRP (péptido relacionado con el gen de la calcitonina) es un neuropéptido de 37 aminoácidos que pertenece a una familia de péptidos que incluye la calcitonina, la adrenomedulina y la amilina. En los seres humanos, existen dos formas de CGR<p>(a-CGRp y p-CGRP) que tienen actividades similares. Varían en tres aminoácidos y presentan una distribución diferencial. Al menos dos subtipos de receptores CGRP también pueden explicar las actividades diferenciales. El CGRP es un neurotransmisor del sistema nervioso central, y se ha demostrado que es un potente vasodilatador en la periferia, donde las neuronas que contienen CGRP están estrechamente asociadas a los vasos sanguíneos. La vasodilatación mediada por CGRP también está asociada a la inflamación neurogénica, como parte de una cascada de acontecimientos que da lugar a la extravasación de plasma y la vasodilatación de la microvasculatura y está presente en la migraña.

El CGRP se ha señalado por su posible relación con los síntomas vasomotores (Wyon et al. Scand. J. Urol. Nephrol.

35: 92-96 (2001); Wyon et al. Menopause 7(1):25-30 (2000)). Los síntomas vasomotores (SVM), como los sofocos y los sudores nocturnos, son los síntomas más comunes asociados a la menopausia, y se presentan en el 60% al 80% de todas las mujeres tras una menopausia natural o inducida quirúrgicamente. Es probable que los sofocos sean una respuesta adaptativa del sistema nervioso central (SNC) a la disminución de los esteroides sexuales (Freedman Am. J. Human Biol. 13:453-464 (2001)). Hasta la fecha, las terapias más eficaces para los sofocos son los tratamientos basados en hormonas, incluidos los estrógenos y/o algunas progestinas. Los tratamientos hormonales pueden ser eficaces para aliviar los sofocos, pero no son adecuados para todas las mujeres. Se considera que los síntomas psicológicos y emocionales observados, como nerviosismo, fatiga, irritabilidad, insomnio, depresión, pérdida de memoria, cefalea, ansiedad, nerviosismo o incapacidad para concentrarse, están causados por la privación de sueño tras el sofoco y los sudores nocturnos (Kramer et al., In: Murphy et al., 3.sup.rd Int'l Symposium on Recent Advances in Urological Cancer Diagnosis and Treatment-Proceedings, París, Francia: SCI: 3-7 (1992)).

Los hombres también experimentan sofocos tras la abstinencia de hormonas esteroideas (andrógenos). Esto es cierto en los casos de disminución androgénica asociada a la edad (Katovich, et al., Proceedings of the Society for Experimental Biology & Medicine, 1990, 193(2): 129-35), así como en casos extremos de privación hormonal asociada a tratamientos contra el cáncer de próstata (Berendsen, et al., European Journal of Pharmacology, 2001, 419(1): 47 54). Hasta un tercio de estos pacientes experimentarán síntomas persistentes y frecuentes lo suficientemente graves como para causar molestias e inconvenientes significativos.

El CGRP es un potente vasodilatador que se ha implicado en la patología de otros síntomas vasomotores, como las formas de cefalea vascular, incluidas las migrañas (con o sin aura) y la cefalea en racimos. Durham, N. Engl. J. Med.

350:1073-1075, 2004. Los niveles séricos de CGRP en la vena yugular externa son elevados en pacientes con migraña. Goadsby et al., Ann. Neurol. 28:183-7, 1990. La administración intravenosa de a-CGRP humano indujo cefalea y migraña en pacientes que padecían migraña sin aura, lo que sugiere que el CGRP tiene un papel causal en la migraña. Lassen et al., Cephalalgia 22:54-61, 2002.

La posible implicación del CGRP en la migraña ha sido la base para el desarrollo y ensayo de una serie de compuestos que inhiben la liberación de CGRP (por ejemplo, sumatriptán), antagonizan en receptor CGRP (por ejemplo, derivado dipéptido BIBN4096BS (Boerhringer Ingelheim); CGRP(8-37)), o interactúan con una o más proteínas asociadas al receptor, como la proteína de membrana de la actividad del receptor (RAMP) o la proteína componente del receptor (RCP), que afectan a la unión del CGRP a sus receptores. Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51-53, 2002. Los subtipos de adrenoceptores alfa-2 y los receptores A1 de adenosina también controlan (inhiben) la liberación de CGRP y la activación trigeminal (Goadsby et al., Brain 125:1392-401,2002). El agonista del receptor A1 de la adenosina GR79236 (metrafadil), que ha demostrado inhibir la vasodilatación neurogénica y la nocicepción trigeminal en humanos, también puede tener actividad antimigrañosa (Arulmani et al., Cephalalgia 25:1082-1090, 2005; Giffin et al., Cephalalgia 23:287-292, 2003).

En contra de esta teoría está la observación de que el tratamiento con compuestos que inhiben exclusivamente la inflamación neurogénica (p. ej., antagonistas del receptor NK1 de la taquiquinina) o la activación trigeminal (p. ej., agonistas del receptor 5HT1D ) han demostrado ser relativamente ineficaces como tratamientos agudos de la migraña, lo que ha llevado a algunos investigadores a preguntarse si la inhibición de la liberación de CGRP es el mecanismo de acción primario de los tratamientos antimigrañosos eficaces. Arulmani et al., Eur. J. Pharmacol. 500:315-330, 2004.

La migraña es una afección neurológica compleja y común que se caracteriza por ataques episódicos graves de cefalea y rasgos asociados, que pueden incluir náuseas, vómitos, sensibilidad a la luz, al sonido o al movimiento. En algunos pacientes, la cefalea va precedida o acompañada de un aura. La cefalea puede ser intensa y también unilateral en algunos pacientes.

Las crisis de migraña perturban la vida cotidiana. En Estados Unidos y Europa Occidental, la prevalencia global de migrañosos es del 11% de la población general (6% hombres; 15-18% mujeres). Además, la frecuencia media de ataques en un individuo es de 1,5/mes. Aunque existen varios tratamientos disponibles para aliviar o reducir los síntomas, se recomienda una terapia preventiva para aquellos pacientes que tengan más de 3-4 ataques de migraña al mes. Goadsby et al. New Engl. J. Med. 346(4): 257-275, 2002.

La variedad de intervenciones farmacológicas que se han utilizado para tratar la migraña y la variabilidad de las respuestas entre los pacientes son un testimonio de la naturaleza diversa de este trastorno. Así, durante más de ochenta años se han utilizado para tratar la migraña fármacos relativamente no selectivos como los alcaloides del cornezuelo del centeno (por ejemplo, ergotamina, dihidroergotamina, metisergida), que presentan actividad serotoninérgica, así como adrenérgica, noradrenérgica y dopaminérgica. Otros tratamientos incluyen opiáceos (por ejemplo, oxicodona) y antagonistas p-adrenérgicos (por ejemplo, propranolol). Algunos pacientes, normalmente los que presentan síntomas más leves, son capaces de controlar sus síntomas con remedios sin receta, como uno o varios antiinflamatorios no esteroideos (AINE), como una combinación de aspirina, paracetamol y cafeína (por ejemplo, Excedrin® Migraine).

Más recientemente, algunos pacientes migrañosos han sido tratados con topiramato, un anticonvulsivo que bloquea los canales de sodio dependientes de voltaje y ciertos receptores de glutamato (AMPA-cainato), potencia la actividad de los receptores GABA-A y bloquea la anhidrasa carbónica. El éxito relativamente reciente de los agonistas de los receptores de serotonina 5HT-1B/1D y/o 5HT-1a, como el sumatriptan, en algunos pacientes ha llevado a los investigadores a proponer una etiología serotoninérgica del trastorno. Por desgracia, aunque algunos pacientes responden bien a este tratamiento, otros son relativamente resistentes a sus efectos.

Se ha postulado que una disfunción de un canal iónico en los núcleos aminérgicos del tronco encefálico subyace al trastorno; sin embargo, la fisiopatología precisa de la migraña aún no se conoce bien. Se ha demostrado que una forma de migraña, la migraña hemipléjica familiar, está asociada a mutaciones sin sentido en la subunidad a1 del canal de calcio tipo P/Q dependiente de voltaje, y se cree probable que también se encuentren otras mutaciones de canales iónicos en otras poblaciones de pacientes. Aunque la dilatación de los vasos sanguíneos se asocia a los síntomas dolorosos de la migraña y los exacerba, en la actualidad se considera que estos fenómenos neurovasculares son consecuencia de la migraña y no su causa. En general, la disfunción de las vías del tronco encefálico que modulan la entrada sensorial se considera una característica unificadora de la migraña. Goadsby, PJ. et al., New Engl. J. Med.

346(4): 257-275, 2002.

El documento US 2013/216535 analiza los anticuerpos antagonistas anti-CGRP en el tratamiento o la prevención de síntomas vasomotores en un individuo. Bigal, M. E. et al. (Cephalalgia, 34(7): 483-492, 2014) analiza un ensayo clínico de fase 1 de LBR-101 destinado al tratamiento de la migraña episódica y crónica. Bigal, M. E. et al. (CNS Drugs, 28(5): 389-399, 2014) analiza los ensayos clínicos de cuatro anticuerpos monoclonales dirigidos a la vía del CGRP.

Breve Resumen de la Invención

La invención proporciona un anticuerpo monoclonal para su uso en un método de tratamiento o reducción de la incidencia de cefalea migrañosa en un sujeto, en el que el anticuerpo monoclonal modula la vía CGRP, en el que el anticuerpo monoclonal tiene una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVAE

IRSESDASATHYAEAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCLAYFDYGL

AIQNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS

WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVD

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GLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES

NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT

QKSLSLSPGK (SEQ ID NO:11)

y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGAS

NRYLGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIKRT

VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDIMALQSGNSQESVT

EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID

NO:12),

y en el que el anticuerpo se administra una vez al mes por vía subcutánea a una dosis de 225 mg.

La cefalea es migrañosa (por ejemplo, cefalea migrañosa crónica o cefalea migrañosa episódica). En algunas realizaciones, la administración comprende la utilización de una jeringa precargada que comprende la cantidad del anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal se formula a una concentración de 150 mg/ml. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal se administra en un volumen inferior a 2 ml. El método puede comprender además la administración al sujeto de un segundo agente simultánea o secuencialmente con el anticuerpo monoclonal. El segundo agente puede ser cualquiera de los agonistas 5-HT1, triptanos, alcaloides del cornezuelo de centeno y antiinflamatorios no esteroideos. En algunas realizaciones - no reivindicadas - el segundo agente es un agente tomado por el sujeto profilácticamente. En algunas realizaciones -no reivindicadas- el uso mensual del segundo agente por el sujeto disminuye al menos un 15% tras la administración del anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, no reivindicadas, el segundo agente es un triptano. En algunas formas de realización, el sujeto es un ser humano. Ejemplos de agonistas 5-HT1 que pueden utilizarse en combinación con un anticuerpo anti-CGRP incluyen una clase de compuestos conocidos como triptanos, como sumatriptán, zolmitriptán, naratriptán, rizatriptán, eletriptán, almotriptán y frovatriptán. También se sabe que los alcaloides del cornezuelo de centeno y compuestos afines tienen actividad agonista 5-HT y se han utilizado para tratar cefaleas como la migraña. Entre estos compuestos se encuentran el tartrato de ergotamina, el maleato de ergonovina y los mesilatos ergoloides (por ejemplo, dihidroergocornina, dihidroergocristina, dihidroergocriptina y mesilato de dihidroergotamina (DHE 45)).

Ejemplos de NSAID que pueden usarse en combinación con un anticuerpo anti-CGRP incluyen aspirina, diclofenaco, diflusinal, etodolaco, fenbufeno, fenoprofeno, flufenisal, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, ketorolaco, ácido meclofenámico, ácido mefenámico, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, sulindaco, tolmetina o zomepirac, inhibidores de la ciclooxigenasa-2 (COX-2), celecoxib; rofecoxib; meloxicam; JTE-522; L-745.337; NS398; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

El anticuerpo antagonista anti-CGRP reconoce un CGRP humano. El anticuerpo antagonista anti-CGRP se une tanto a la a-CGRp como a la p-CGRP humanas. El anticuerpo antagonista anti-CGRP se une al CGRP humano y de rata. El anticuerpo antagonista anti-CGRP puede unirse al fragmento C-terminal que tiene los aminoácidos 25-37 de CGRP. El anticuerpo antagonista anti-CGRP puede unirse a un epítopo C-terminal dentro de los aminoácidos 25-37 de la CGRP.

El anticuerpo antagonista anti-CGRP para uso según la presente invención es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo antagonista anti-CGRP para su uso según la presente invención es el anticuerpo G1 (como se describe en el presente documento).

La afinidad (KD) de un anticuerpo antagonista anti-CGRP a CGRP (tal como a-CGRP humano medido por resonancia de plasmón superficial a una temperatura apropiada, tal como 25 o 37 °C) puede ser de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 200 nM. La afinidad de unión puede ser cualquiera de aproximadamente 200 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 5 pM o aproximadamente 2 pM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es menor que cualquiera de aproximadamente 250 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM o aproximadamente 50 pM. La afinidad de unión puede ser inferior a unos 50 nM.

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento o diagnóstico in vivo se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o para diagnóstico in vivo.

El anticuerpo antagonista anti-CGRP puede administrarse antes, durante y/o después de la cefalea. El anticuerpo antagonista anti-CGRP puede administrarse antes del ataque de migraña.

El anticuerpo antagonista anti-CGRP puede administrarse junto con otro agente, como otro agente para tratar la cefalea.

Se divulga en el presente documento una composición farmacéutica para prevenir o tratar la cefalea (por ejemplo, migraña y cefalea en racimos) que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista anti-CGRP, en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Un anticuerpo G1 (denominado indistintamente "G1") para su uso en la invención puede producirse mediante vectores de expresión que tengan los números de acceso ATCC. PTA-6866 and PTA-6867. Por ejemplo, en una realización, el anticuerpo para uso en la invención comprende una cadena pesada producida por el vector de expresión con el N.° de acceso ATCC PTA-6867 y una cadena ligera producida por el vector de expresión con el N.° de acceso ATCC PTA-6866. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de G1 se muestran en la Figura 5. Las porciones de la región determinante de la complementariedad (CDR) del anticuerpo G1 (incluidas las CDR de Chothia y Kabat) también se muestran en la Figura 5. Se entiende que la referencia a cualquier parte o a toda la región de G1 abarca las secuencias producidas por los vectores de expresión que tienen los números de acceso ATCC. PTA-6866 y PTA-6867, y/o las secuencias representadas en la Figura 5.

El anticuerpo es monoclonal. El anticuerpo puede aislarse. El anticuerpo (o polipéptido) puede ser sustancialmente puro.

Breve Descripción de los Dibujos

La Figura 1 es una tabla que muestra las afinidades de unión de 12 anticuerpos murinos para diferentes fragmentos humanos de a-CGRP sustituidos por alanina. Las afinidades de unión se midieron a 25°C utilizando Biacore haciendo fluir Fabs a través de CGRPs en el chip. Los valores en recuadro representan la pérdida de afinidad de los mutantes de alanina en relación con el fragmento parental, 25-37 (cursiva), excepto K35A, que se derivó de un parental 19-37. "a" indica que las afinidades para los fragmentos 19-37 y 25-37 son la media ± desviación estándar de dos mediciones independientes en diferentes chips sensores. "b" indica que estas interacciones se desviaron de un modelo de interacción bimolecular simple debido a una tasa de desactivación bifásica, por lo que sus afinidades se determinaron utilizando un modelo de cambio conformacional. Clave en escala de grises: blanco (1,0) indica afinidad parental; gris claro (menos de 0,5) indica mayor afinidad que la parental; gris oscuro (más de 2) indica menor afinidad que la parental; y negro indica que no se ha detectado ninguna unión.

Las Figuras 2A y 2B muestran el efecto de la administración de CGRP 8-37 (400 nmol/kg), anticuerpo 4901 (25 mg/kg) y anticuerpo 7D11 (25 mg/kg) sobre el flujo sanguíneo cutáneo medido como flujo de células sanguíneas tras la estimulación con impulsos eléctricos durante 30 segundos. Se administró CGRP 8-37 por vía intravenosa (iv) 3-5 min antes de la estimulación por impulsos eléctricos. Los anticuerpos se administraron por vía intraperitoneal (IP) 72 horas antes de la estimulación por impulsos eléctricos. Cada punto de los gráficos representa el AUC de una rata tratada en las condiciones indicadas. Cada línea de los gráficos representa el AUC medio de las ratas tratadas en las condiciones indicadas. AUC (área bajo la curva) es igual a Aflujo x Atiempo. "Aflujo" representa el cambio de unidades de flujo después de la estimulación del pulso eléctrico; y "Atiempo" representa el periodo de tiempo que tarda el nivel de flujo de células sanguíneas en volver al nivel anterior a la estimulación del pulso eléctrico.

La Figura 3 muestra el efecto de la administración de diferentes dosis del anticuerpo 4901 (25 mg/kg, 5 mg/kg, 2,5 mg/kg o 1 mg/kg) sobre el flujo sanguíneo cutáneo medido como flujo de células sanguíneas tras la estimulación con impulsos eléctricos durante 30 segundos. Los anticuerpos se administraron por vía intravenosa (IV) 24 horas antes de la estimulación por impulsos eléctricos. Cada punto del gráfico representa el AUC de una rata tratada en las condiciones indicadas. La línea del gráfico representa el AUC medio de las ratas tratadas en las condiciones indicadas.

Las figuras 4A y 4B muestran el efecto de la administración del anticuerpo 4901 (1 mg/kg o 10 mg/kg, i.v.), del anticuerpo 7E9 (10 mg/kg, i.v.), y del anticuerpo 8B6 (10 mg/kg, i.v.) sobre el flujo sanguíneo cutáneo medido como flujo de células sanguíneas después de la estimulación por impulsos eléctricos durante 30 segundos. Los anticuerpos se administraron por vía intravenosa (i.v.) seguidos de estimulación por impulsos eléctricos a los 30 min, 60 min, 90 min y 120 min de la administración de anticuerpos. El eje Y representa el porcentaje de AUC en comparación con el nivel de AUC cuando no se administró ningún anticuerpo (tiempo 0). El eje X representa el período de tiempo (minutos) entre la administración de anticuerpos y la estimulación por impulsos eléctricos. "*" indica P < 0,05, y "**" indica P < 0,01, en comparación con el tiempo 0. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional con una prueba de comparación múltiple de Dunnett.

La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID N.°:1) y de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID N.°:2) del anticuerpo G1. Los CDR de Kabat aparecen en negrita y los de Chothia, subrayados. Los residuos de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera están numerados secuencialmente.

La Figura 6 muestra el mapeo de epítopos del anticuerpo G1 mediante competición peptídica utilizando Biacore. La a-CGRP humana N-biotinilada se capturó en el chip sensor SA. G1 Fab (50 nM) en ausencia de un péptido competidor o preincubado durante 1 h con 10 uM de un péptido competidor. Se midió la unión de G1 Fab a la a-CGRP humana en el chip. El eje Y representa el porcentaje de unión bloqueada por la presencia del péptido competidor en comparación con la unión en ausencia del péptido competidor.

La Figura 7 muestra el efecto de la administración del anticuerpo G1 (1 mg/kg o 10 mg/kg, i.v.) o del vehículo (PBS, 0,01% Tween 20) sobre el flujo sanguíneo cutáneo medido como flujo de células sanguíneas tras la estimulación con impulsos eléctricos durante 30 segundos. El anticuerpo G1 o el vehículo se administraron por vía intravenosa (i.v.) seguidos de estimulación nerviosa por impulsos eléctricos a los 30 min, 60 min, 90 min y 120 min de la administración del anticuerpo. El eje Y representa el porcentaje de AUC en comparación con el nivel de AUC cuando no se administró anticuerpo o vehículo (definido como 100%) (tiempo 0). El eje X representa el período de tiempo (minutos) entre la administración de anticuerpos y la estimulación por impulsos eléctricos. "*" indica P < 0,05, y "**" indica P < 0,01, en comparación con el vehículo. Los datos se analizaron mediante ANOVA bidireccional y pruebas a posteriori de Bonferroni.

La Figura 8A muestra el efecto de la administración del anticuerpo G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg, i.v.) o del vehículo (PBS, 0,01 % Tween 20) sobre el flujo sanguíneo cutáneo medido como flujo de células sanguíneas tras la estimulación con impulsos eléctricos durante 30 segundos 24 horas después de la dosificación. El anticuerpo G1 o el vehículo se administraron por vía intravenosa (i.v.) 24 horas antes de la estimulación nerviosa por impulsos eléctricos. El eje Y representa el área total bajo la curva (cambio en el flujo de células sanguíneas multiplicado por el cambio en el tiempo desde la estimulación hasta que el flujo vuelve a la línea de base, AUC). El eje X representa dosis variables del anticuerpo G1. "*" indica P < 0,05, y "**" indica P < 0,01, en comparación con el vehículo. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional y la prueba de comparación múltiple de Dunn.

La Figura 8B muestra el efecto de la administración del anticuerpo G1 (0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg, i.v.) o del vehículo (PBS, 0,01% Tween 20) sobre el flujo sanguíneo cutáneo medido como flujo de células sanguíneas tras la estimulación con impulsos eléctricos durante 30 segundos 7 días después de la dosificación. El anticuerpo G1 o el vehículo se administraron por vía intravenosa (i.v.) 7 días antes de la estimulación nerviosa por impulsos eléctricos. El eje Y representa el AUC total. El eje X representa dosis variables del anticuerpo G1. "**" indica P < 0,01, y "***" indica P < 0,001, en comparación con el vehículo. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional y la prueba de comparación múltiple de Dunn.

La Figura 8C es un análisis de ajuste de curvas de los datos de las figuras 8A y 8B. El anticuerpo G1 o el vehículo se administraron por vía intravenosa (i.v.) 24 horas o 7 días antes de la estimulación nerviosa por impulsos eléctricos. El eje Y representa el AUC total. El eje X representa las dosis variables del anticuerpo G1 en "mg/kg" en una escala logarítmica para determinar la EC50.

La Figura 9 muestra el efecto del anticuerpo mu7E9 (10 mg/kg), el BIBN4096BS o el vehículo (PBS, 0,01% Tween 20) sobre el cambio de diámetro de la arteria meníngea media tras la estimulación del campo eléctrico. El anticuerpo mu7E9, el BIBN4096BS o el vehículo se administraron por vía intravenosa (i.v.) en el punto temporal 0 minutos después de que se estableciera una respuesta basal a la estimulación eléctrica. El eje Y representa el cambio en el diámetro de la arteria meníngea media tras la estimulación del campo eléctrico. El diámetro en reposo corresponde al 0%. El eje X representa el tiempo (minutos) de estimulación con impulsos eléctricos. "*" indica P < 0,05, y "**" indica P < 0,01, en comparación con el vehículo. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional y la prueba de comparación múltiple de Dunett.

La Figura 10 muestra el efecto de dosis variables del anticuerpo G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg, i.v.) o vehículo (PBS, 0,01 % Tween 20) sobre el cambio de diámetro de la arteria meníngea media tras la estimulación del campo eléctrico. El anticuerpo G1 o el vehículo se administraron por vía intravenosa (i.v.) 7 días antes de la estimulación del campo eléctrico. El eje Y representa el cambio en el diámetro de la arteria meníngea media. El diámetro en reposo corresponde al 0%. El eje X representa el voltaje de estimulación. "*" indica P < 0,05, "**" indica P < 0,01 y "***" indica P < 0,001, en comparación con el vehículo. Los datos se analizaron mediante ANOVA de dos vías y pruebas posteriores de Bonferroni.

La Figura 11A muestra el efecto del anticuerpo mu4901 (10mg/kg) o vehículo (PBS, 0,01% Tween 20), administrados por vía intravenosa (i.v.) 24 horas antes, sobre la disminución de la temperatura central inducida por la inyección subcutánea de naloxona (1mg/kg) en ratas adictas a la morfina. El eje Y representa la diferencia de temperatura con respecto a la línea de base. El eje X representa el tiempo medido desde el punto de inyección de la naloxona.

La Figura 11B muestra el efecto del anticuerpo mu4901 (10mg/kg) o vehículo (PBS, 0,01% Tween 20), administrados por vía intravenosa (i.v.) 24 horas antes, sobre el aumento de la temperatura de la superficie de la cola inducido por la inyección subcutánea de naloxona (1mg/kg) en ratas adictas a la morfina. El eje Y representa la diferencia de temperatura con respecto a la línea de base. El eje X representa el tiempo medido desde el punto de inyección de la naloxona.

La Figura 12 es un gráfico que ilustra los resultados de un estudio clínico en el que se comparan los efectos de diferentes dosis del anticuerpo G1 con un placebo.

La Figura 13 es un gráfico que ilustra los resultados de un estudio clínico en el que se comparan los efectos de diferentes dosis del anticuerpo G1 con un placebo.

La Figura 14 es un gráfico que ilustra los resultados de un estudio clínico en el que se comparan los efectos de diferentes dosis del anticuerpo G1 con un placebo.

La Figura 15 es un gráfico que ilustra los resultados de un estudio clínico en el que se comparan los efectos de diferentes dosis del anticuerpo G1 con un placebo.

La Figura 16 es un gráfico que ilustra los resultados de un estudio clínico en el que se comparan los efectos de diferentes dosis del anticuerpo G1 con un placebo.

La Figura 17 es un gráfico que ilustra los resultados de un estudio clínico en el que se comparan los efectos de diferentes dosis del anticuerpo G1 con un placebo.

La Figura 18 es un gráfico que ilustra los resultados de un estudio clínico en el que se comparan los efectos de diferentes dosis del anticuerpo G1 con un placebo.

Técnicas Generales

La práctica de los aspectos de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la habilidad del arte. Dichas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía, como por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather y PE. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, y D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway y P Travers, 1997); Antibodies (P Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Definiciones

Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a una diana, como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, situado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal como se utiliza en el presente documento, el término abarca no sólo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos (como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), de cadena simple (ScFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo (como anticuerpos de dominio) y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, como IgG, IgA o IgM (o subclase de las mismas), y no es necesario que el anticuerpo sea de una clase en particular. En función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a distintas clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse a su vez en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

Tal como se utiliza aquí, "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, ya que se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que suelen incluir diferentes anticuerpos dirigidos contra distintos determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante del antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse en el sentido de que requiera la producción del anticuerpo mediante un método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizarán de acuerdo con la presente divulgación pueden fabricarse por el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495, o pueden fabricarse por métodos de ADN recombinante como los descritos en U.S. Pat. de EE.UU. N.° 4,816,567. Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse a partir de bibliotecas de fagos generadas mediante las técnicas descritas en McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554, por ejemplo.

Tal como se utilizan en el presente documento, los anticuerpos "humanizados" se refieren a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) que son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como el ratón, la rata o el conejo con la especificidad, afinidad y actividad biológica deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de entramado (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias<c>D<r>o de entramado importadas, pero que se incluyen para refinar y optimizar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. De manera óptima, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Los anticuerpos pueden tener regiones Fc modificadas como se describe en el documento WO 99/58572. Otras formas de anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco, seis) que están alteradas con respecto al anticuerpo original, que también se denominan una o más CDR "derivadas de" una o más CDR del anticuerpo original.

Tal como se utiliza en el presente documento, "anticuerpo humano" significa un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o que se ha fabricado utilizando cualquiera de las técnicas para fabricar anticuerpos humanos conocidas en la técnica o divulgadas en el presente documento. Esta definición de anticuerpo humano incluye anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido humano de cadena pesada o al menos un polipéptido humano de cadena ligera. Un ejemplo de ello es un anticuerpo que comprende polipéptidos murinos de cadena ligera y humanos de cadena pesada. Los anticuerpos humanos pueden producirse mediante diversas técnicas conocidas en la técnica. El anticuerpo humano puede seleccionarse a partir de una biblioteca de fagos, en la que dicha biblioteca de fagos exprese anticuerpos humanos (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (EE.UU.) 95:6157-6162; Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Los anticuerpos humanos también pueden fabricarse introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena se han inactivado parcial o totalmente. Este planteamiento se describe en Patentes de EE.UU. N.° 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016. Alternativamente, el anticuerpo humano puede prepararse inmortalizando linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (dichos linfocitos B pueden recuperarse de un individuo o pueden haber sido inmunizados in vitro). Véanse, por ejemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; y Patente de EE. UU. N.° 5.750.373.

Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "péptido relacionado con el gen de la calcitonina" y "CGRP" se refieren a cualquier forma de péptido relacionado con el gen de la calcitonina y sus variantes que conservan al menos parte de la actividad del CGRP. Por ejemplo, el CGRP puede ser a-CGRP o p-CGRP Tal como se utiliza en el presente documento, el CGRP incluye todas las especies de mamíferos de secuencia nativa CGRP, por ejemplo, humanos, caninos, felinos, equinos y bovinos.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo antagonista anti-CGRP" (denominado indistintamente "anticuerpo anti-CGRP") se refiere a un anticuerpo capaz de unirse a CGRP e inhibir la actividad biológica de CGRP y/o la(s) vía(s) descendente(s) mediada(s) por la señalización de CGRP Un anticuerpo antagonista anti-CGRP abarca anticuerpos que modulan, bloquean, antagonizan, suprimen o reducen (incluso significativamente) la actividad biológica del CGRP, o antagonizan de otro modo la vía del CGRP, incluidas las vías descendentes mediadas por la señalización del CGRP, como la unión del receptor y/o la elicitación de una respuesta celular al CGRP A efectos de la presente divulgación, se entenderá explícitamente que el término "anticuerpo antagonista anti-CGRP" engloba todos los términos, títulos y estados funcionales y características previamente identificados por los que el propio CGRP, la actividad biológica del CGRP (incluida, entre otras, su capacidad para mediar en cualquier aspecto de la cefalea), o las consecuencias de la actividad biológica, se anulan, disminuyen o neutralizan sustancialmente en cualquier grado significativo. En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista anti-CGRP se une a CGRP e impide la unión de CGRP a un receptor de CGRP En otras realizaciones, un anticuerpo anti-CGRP se une a CGRP e impide la activación de un receptor de CGRP En el presente documento se describen ejemplos de anticuerpos antagonistas anti-CGRP

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "G1" y "anticuerpo G1" se utilizan indistintamente para referirse a un anticuerpo producido por vectores de expresión con números de depósito ATCC PTA-6867 y ATCC PTA-6866. La secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera se muestra en la Figura 5. Las porciones CDR del anticuerpo G1 (incluidas las CDR de Chothia y Kabat) se representan diagramáticamente en la Figura 5. Los polinucleótidos que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera se muestran en SEQ ID N.°:9 y SEQ ID N.°:10. La caracterización de G1 se describe en los Ejemplos.

Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, como la conjugación con un componente de marcación. También se incluyen en la definición, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que los polipéptidos pueden presentarse como cadenas simples o cadenas asociadas.

Los términos "polinucleótido" o "ácido nucleico", utilizados indistintamente en el presente documento, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen el ADN y el<a>R<n>. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda ser incorporado a un polímero por la ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación de la estructura nucleotídica puede impartirse antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse aún más después de la polimerización, por ejemplo, mediante conjugación con un componente de marcación. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, las "tapas", la sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, las modificaciones intemucleotídicas como, por ejemplo, las que tienen enlaces no cargados (vg, fosfonatos de metilo, fosfotriesteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), las que contienen elementos colgantes, como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, ply-L-lisina, etc.), los que contienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), los que contienen alquiladores, los que tienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido o polinucleótidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilo normalmente presentes en los azúcares puede sustituirse, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse mediante grupos protectores estándar o activarse para preparar enlaces adicionales con nucleótidos adicionales, o puede conjugarse con soportes sólidos. Los OH terminales 5' y 3' pueden fosforilarse o sustituirse con aminas o grupos orgánicos de cobertura de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivarse a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa generalmente conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares a-anoméricos, azúcares epiméricos como la arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosas, azúcares furanosas, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos abásicos de nucleósidos como el ribosido de metilo. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden sustituirse por grupos enlazantes alternativos. Estos grupos enlazantes alternativos incluyen, entre otros, casos en los que el fosfato se sustituye por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en los que cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces de un polinucleótido sean idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos mencionados en el presente documento, incluidos el ARN y el ADN.

Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o a la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, solas o combinadas. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera constan cada una de cuatro regiones de entramado (FR) conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR), también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR de cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar los CDR: (1) un enfoque basado en la variabilidad de secuencias entre especies (es decir, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Allazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Tal y como se utiliza aquí, un CDR puede referirse a CDR definidos por cualquiera de los dos enfoques o por una combinación de ambos.

Una "región constante" de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena ligera del anticuerpo o a la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, solas o combinadas.

Un epítopo que "se une preferentemente" o "se une específicamente" (utilizados indistintamente en el presente documento) a un anticuerpo o a un polipéptido es un término bien conocido en la técnica, y los métodos para determinar dicha unión específica o preferente también son bien conocidos en la técnica. Se dice que una molécula presenta una "unión específica" o una "unión preferente" si reacciona o se asocia con mayor frecuencia, rapidez, duración y/o afinidad con una célula o sustancia concreta que con otras células o sustancias alternativas. Un anticuerpo se "une específicamente" o "se une preferentemente" a una diana si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específica o preferentemente a un epítopo CGRP es un anticuerpo que se une a este epítopo con mayor afinidad, avidez, más fácilmente, y/o con mayor duración que se une a otros epítopos CGRP o epítopos no CGRP También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o fracción o epítopo) que se une específica o preferentemente a una primera diana puede o no unirse específica o preferentemente a una segunda diana. Como tal, la "vinculación específica" o "vinculación preferente" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) la vinculación exclusiva. En general, pero no necesariamente, la referencia a la vinculación significa vinculación preferente.

Tal y como se utiliza en el presente documento, "sustancialmente puro" se refiere a un material que tiene al menos un 50% de pureza (es decir, libre de contaminantes), más preferiblemente al menos un 90% de pureza, más preferiblemente al menos un 95% de pureza, más preferiblemente al menos un 98% de pureza, más preferiblemente al menos un 99% de pureza.

Una "célula huésped" incluye una célula individual o un cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor de vector(es) para la incorporación de insertos polinucleotídicos. Las células huésped incluyen la progenie de una única célula huésped, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN genómico) a la célula madre original debido a una mutación natural, accidental o deliberada. Una célula huésped incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido(s).

El término "región Fc" se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. La "región Fc" puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana suele definirse para que se extienda desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el carboxilo-terminal de la misma. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice UE como en Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 1991. La región Fc de una inmunoglobulina comprende generalmente dos dominios constantes, CH2 y CH3.

Tal como se utilizan en el presente documento, "receptor Fc" y "FcR" describen un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es el que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluidas las variantes alélicas y las formas empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplasmáticos. Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; y de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med. "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; y Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).

"Citotoxicidad dependiente del complemento" y "CDC" se refieren a la lisis de una diana en presencia de complemento. La vía de activación del complemento se inicia con la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) en complejo con un antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, se utiliza un ensayo CDC, por ejemplo el descrito en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

Una "región Fc funcional" posee al menos una función efectora de una región Fc de secuencia nativa. Las "funciones efectoras" ejemplares incluyen la unión a C1q; la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); la unión al receptor Fc; la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC); la fagocitosis; la regulación a la baja de receptores de la superficie celular (por ejemplo, el receptor de células B; BCR), etc. Tales funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y pueden evaluarse utilizando diversos ensayos conocidos en la técnica para evaluar tales funciones efectoras de anticuerpo.

Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácidos, pero que conserva al menos una función efectora de la región Fc de secuencia nativa. Preferiblemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido parental, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y preferiblemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido parental. La región Fc variante poseerá preferiblemente al menos un 80% de identidad de secuencia con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido parental, y más preferiblemente al menos un 90% de identidad de secuencia con la misma, más preferiblemente al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% de identidad de secuencia con la misma.

Tal como se utiliza en el presente documento, "citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas inespecíficas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, células natural killer (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente causan la lisis de la célula diana. La actividad ADCC de una molécula de interés puede evaluarse mediante un ensayo ADCC in vitro, como el descrito en U.S. Patente N.° 5.500.362 ó 5.821.337. Entre las células efectoras útiles para estos ensayos se incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células NK. Como alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el divulgado en Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.

Tal como se utiliza aquí, "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: mejora en cualquier aspecto de una cefalea, incluyendo la disminución de la gravedad, el alivio de la intensidad del dolor y otros síntomas asociados, la reducción de la frecuencia de recurrencia, el aumento de la calidad de vida de aquellos que sufren de cefalea, y la disminución de la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la cefalea. En el caso de la migraña, otros síntomas asociados incluyen, entre otros, náuseas, vómitos y sensibilidad a la luz, el sonido y/o el movimiento. En el caso de la cefalea en racimos, otros síntomas asociados son, entre otros, hinchazón debajo o alrededor de los ojos, lagrimeo excesivo, ojo rojo, rinorrea o congestión nasal y enrojecimiento de la cara.

"Reducir la incidencia" de la cefalea significa cualquiera de reducir la gravedad (que puede incluir reducir la necesidad y/o la cantidad de (por ejemplo, la exposición a) otros fármacos y/o terapias generalmente utilizados para esta afección, incluyendo, por ejemplo, ergotamina, dihidroergotamina o triptanos para la migraña), la duración y/o la frecuencia (incluyendo, por ejemplo, retrasar o aumentar el tiempo hasta el siguiente ataque episódico en un individuo). Como se entiende por los expertos en la materia, los individuos pueden variar en términos de su respuesta al tratamiento, y, como tal, por ejemplo, un "método de reducción de la incidencia de cefalea en un individuo" refleja la administración del anticuerpo antagonista anti-CGRP basado en una expectativa razonable de que dicha administración puede probablemente causar tal reducción de la incidencia en ese individuo en particular.

Por "mejorar" la cefalea o uno o más síntomas de cefalea se entiende una disminución o mejora de uno o más síntomas de cefalea en comparación con la no administración de un anticuerpo antagonista anti-CGRP. "Mejorar" también incluye acortar o reducir la duración de un síntoma.

Como se usa aquí, "controlar la cefalea" se refiere a mantener o reducir la severidad o duración de uno o más síntomas de cefalea o la frecuencia de ataques de cefalea en un individuo (en comparación con el nivel antes del tratamiento). Por ejemplo, la duración o gravedad del dolor de cabeza, o la frecuencia de los ataques se reduce al menos en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70% en el individuo en comparación con el nivel previo al tratamiento.

Como se usa aquí, una "hora de cefalea" se refiere a una hora durante la cual un sujeto experimenta cefalea. Las horas de cefalea pueden expresarse en horas completas (por ejemplo, una hora de cefalea, dos horas de cefalea, tres horas de cefalea, etc.) o en horas completas y parciales (por ejemplo, 0,5 horas de cefalea, 1,2 horas de cefalea, 2,67 horas de cefalea, etc.). Una o más horas de cefalea pueden describirse con respecto a un intervalo de tiempo concreto. Por ejemplo, "horas diarias de cefalea" puede referirse al número de horas de cefalea que experimenta un sujeto en un intervalo de un día (por ejemplo, un periodo de 24 horas). En otro ejemplo, "horas semanales de cefalea" puede referirse al número de horas de cefalea que experimenta un sujeto en un intervalo de una semana (por ejemplo, un periodo de 7 días). Como puede apreciarse, un intervalo de semanas puede corresponder o no a una semana natural. En otro ejemplo, "horas mensuales de cefalea" puede referirse al número de horas de cefalea que experimenta un sujeto en un intervalo de un mes. Como puede apreciarse, un intervalo de un mes (por ejemplo, un periodo de 28-31 días) puede variar en términos de número de días dependiendo del mes en particular y puede corresponder o no a un mes natural. En otro ejemplo, "horas anuales de cefalea" puede referirse al número de horas de cefalea que experimenta un sujeto en un intervalo de un año. Como puede apreciarse, un intervalo de un año (por ejemplo, un período de 365 o 366 días) puede variar en términos de número de días dependiendo del año en particular y puede corresponder o no a un año natural. Una hora de cefalea puede referirse a un tipo concreto de cefalea (por ejemplo, migraña, cefalea en racimos, cefalea crónica y cefalea tensional). Por ejemplo, una "hora de migraña" puede referirse a una hora durante la cual un sujeto experimenta migraña.

Como se usa aquí, un "día de cefalea" se refiere a un día durante el cual un sujeto experimenta cefalea. Los días de cefalea pueden expresarse en términos de días completos (por ejemplo, un día de cefalea, dos días de cefalea, tres días de cefalea, etc.) o en términos de días completos y parciales (por ejemplo, 0,5 días de cefalea, 1,2 días de cefalea, 2,67 días de cefalea, etc.). Uno o más días de cefalea pueden describirse con respecto a un intervalo de tiempo concreto. Por ejemplo, "días semanales de cefalea" puede referirse al número de días de cefalea que experimenta un sujeto en un intervalo de una semana (por ejemplo, un periodo de 7 días). Como puede apreciarse, un intervalo de semanas puede corresponder o no a una semana natural. En otro ejemplo, "días de cefalea mensuales" puede referirse al número de días de cefalea que experimenta un sujeto en un intervalo de un mes. Como puede apreciarse, un intervalo de un mes (por ejemplo, un periodo de 28-31 días) puede variar en términos de número de días dependiendo del mes en particular y puede corresponder o no a un mes natural. En otro ejemplo, "días de cefalea anuales" puede referirse al número de días de cefalea que experimenta un sujeto en un intervalo de un año. Como puede apreciarse, un intervalo de un año (por ejemplo, un período de 365 o 366 días) puede variar en términos de número de días dependiendo del año en particular y puede corresponder o no a un año natural. Un día de cefalea puede referirse a un tipo concreto de cefalea (por ejemplo, migraña, cefalea en racimos, cefalea crónica y cefalea tensional). Por ejemplo, un "día de migraña" puede referirse a un día durante el cual un sujeto experimenta migraña.

Tal como se utiliza en el presente documento, "retrasar" el desarrollo de la cefalea significa diferir, obstaculizar, ralentizar, retardar, estabilizar y/o posponer la progresión de la enfermedad. Este retraso puede ser de duración variable, en función de los antecedentes de la enfermedad y/o de las personas tratadas. Como es evidente para un experto en la materia, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar la prevención, en el sentido de que el individuo no desarrolle cefalea (por ejemplo, migraña). Un método que "retrasa" el desarrollo del síntoma es un método que reduce la probabilidad de desarrollar el síntoma en un plazo determinado y/o reduce la extensión de los síntomas en un plazo determinado, en comparación con la no utilización del método. Estas comparaciones suelen basarse en estudios clínicos, con un número de sujetos estadísticamente significativo.

Por "desarrollo" o "progresión" de la cefalea se entienden las manifestaciones iniciales y/o la progresión subsiguiente del trastorno. El desarrollo de la cefalea puede detectarse y evaluarse mediante técnicas clínicas estándar bien conocidas en la técnica. Sin embargo, el desarrollo también se refiere a la progresión que puede ser indetectable. A efectos de esta divulgación, desarrollo o progresión se refiere al curso biológico de los síntomas. "Desarrollo" incluye la aparición, la recurrencia y el inicio. En el presente documento, "aparición" o "aparición" de cefalea incluye la aparición inicial y/o la recurrencia.

Como se usa aquí, una "dosis efectiva" o "cantidad efectiva" de droga, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados. Para el uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados tales como eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar la aparición de la enfermedad, incluidos los síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para el uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos como la reducción de la intensidad del dolor, la duración o la frecuencia del ataque de cefalea y la disminución de uno o más síntomas derivados de la cefalea (bioquímicos, histológicos y/o conductuales), incluidas sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad, el aumento de la calidad de vida de quienes padecen la enfermedad, la disminución de la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, la potenciación del efecto de otro medicamento y/o el retraso de la progresión de la enfermedad de los pacientes. Una dosis eficaz puede administrarse en una o más administraciones. A efectos de la presente divulgación, una dosis eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para llevar a cabo un tratamiento profiláctico o terapéutico, ya sea directa o indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una dosis eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede o no lograrse en conjunción con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Así, una "dosis eficaz" puede considerarse en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y puede considerarse que un único agente se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o más agentes, puede obtenerse o se obtiene un resultado deseable.

Un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Los mamíferos también incluyen, entre otros, los animales de granja, los animales de deporte, los animales de compañía, los primates, los caballos, los perros, los gatos, los ratones y las ratas.

Como se usa aquí, "vector" significa una construcción, que es capaz de entregar, y preferiblemente expresar, uno o más gen(es) o secuencia(s) de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, entre otros, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores plásmidos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados a agentes condensadores catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y ciertas células eucariotas, como las células productoras.

Tal como se utiliza en el presente documento, "secuencia de control de expresión" significa una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Una secuencia de control de la expresión puede ser un promotor, como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. La secuencia de control de expresión está operablemente unida a la secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir.

Como se usa aquí, "portador farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que, cuando se combina con un ingrediente activo, permite que el ingrediente retenga la actividad biológica y no sea reactivo con el sistema inmunológico del sujeto. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión aceite/agua, y varios tipos de agentes humectantes. Los diluyentes preferidos para la administración parenteral o en aerosol son la solución salina tamponada con fosfato o la solución salina normal (0,9%). Las composiciones que comprenden dichos soportes se formulan mediante métodos convencionales bien conocidos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; y Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a Ed. Mack Publishing, 2000).

El término "kon", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de velocidad de asociación de un anticuerpo a un antígeno.

El término "koff ", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de velocidad de disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno.

El término "KD", tal como se utiliza aquí, se refiere a la constante de disociación de equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "síntoma vasomotor" se refiere a afecciones relacionadas con la vasodilatación. Dicha vasodilatación puede estar asociada o potencialmente asociada a cefaleas (como migraña con o sin aura; migraña hemipléjica; migraña crónica; migraña episódica; migraña episódica de alta frecuencia; cefaleas en racimo; neuralgia migrañosa; cefaleas crónicas; cefaleas tensionales; cefaleas derivadas de otras afecciones médicas (como infección o aumento de la presión en el cráneo debido a un tumor); hemicránea paroxística crónica; cefalea miscelánea no asociada a una lesión estructural; cefalea asociada a un trastorno intracraneal no vascular; cefalea asociada a la administración de una sustancia o a su retirada; cefalea asociada a una infección no cefálica; cefalea asociada a un trastorno metabólico; cefalea asociada a un trastorno del cráneo, el cuello, los ojos, las orejas, la nariz, los senos paranasales, los dientes, la boca u otra estructura facial o craneal; neuralgias craneales; y dolor en el tronco nervioso y dolor por desaferenciación), sofocos (o bochornos), sofocos, insomnio, trastornos del sueño, trastornos del estado de ánimo, irritabilidad, sudoración excesiva, sudores nocturnos, sudores diurnos, fatiga y similares, causados, entre otras cosas, por una disfunción termorreguladora.

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "sofoco", "sofoco" y "sofoco" son términos reconocidos en el arte que se refieren a una alteración episódica de la temperatura corporal que consiste típicamente en un enrojecimiento repentino de la piel, generalmente acompañado de transpiración en un sujeto.

A. Métodos para prevenir o tratar los síntomas vasomotores y/o la cefalea

La invención proporciona un anticuerpo monoclonal para su uso en un método de tratamiento o reducción de la incidencia de cefalea migrañosa en un sujeto, en el que el anticuerpo monoclonal modula la vía CGRP, en el que el anticuerpo monoclonal tiene una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.°:11 y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.°:12, y en el que el anticuerpo se administra una vez al mes por vía subcutánea a una dosis de 225 mg.

El método puede comprender la administración al individuo de al menos un agente adicional útil para tratar la cefalea.

Tales agentes adicionales incluyen, pero no se limitan a, agonistas 5-HT y NSAID. Por ejemplo, el anticuerpo y el al menos un agente adicional pueden administrarse de forma concomitante, es decir, pueden administrarse en una proximidad temporal lo suficientemente cercana como para permitir que sus efectos terapéuticos individuales se solapen. Por ejemplo, la cantidad de agonista 5-HT o AINE administrada en combinación con un anticuerpo anti-CGRP debería ser suficiente para reducir la frecuencia de recaída de la cefalea en los pacientes o producir una eficacia más duradera en comparación con la administración de uno de estos agentes en ausencia del otro. Este procedimiento puede utilizarse para tratar las cefaleas de una amplia variedad de clases, entre las que se incluyen: migraña con o sin aura; migraña hemipléjica; migraña crónica; migraña episódica; migraña episódica de alta frecuencia; cefaleas en racimo; neuralgia migrañosa; cefaleas crónicas; cefaleas tensionales; cefaleas resultantes de otras afecciones médicas (como infección o aumento de la presión en el cráneo debido a un tumor); hemicránea paroxística crónica; cefalea miscelánea no asociada a una lesión estructural; cefalea asociada a un trastorno intracraneal no vascular; cefalea asociada a la administración de una sustancia o a su retirada; cefalea asociada a una infección no cefálica; cefalea asociada a un trastorno metabólico; cefalea asociada a un trastorno del cráneo, el cuello, los ojos, las orejas, la nariz, los senos paranasales, los dientes, la boca u otra estructura facial o craneal; neuralgias craneales; y dolor del tronco nervioso y dolor por desaferenciación.

Ejemplos adicionales no limitantes de agentes adicionales que pueden administrarse en combinación con un anticuerpo antagonista anti-CGRP incluyen uno o más de:

(i) un analgésico opiáceo, por ejemplo morfina, heroína, hidromorfona, oximorfona, levorfanol, levalorfano, metadona, meperidina, fentanilo, cocaína, codeína, dihidrocodeína, oxicodona, hidrocodona, propoxifeno, nalmefeno, nalorfina, naloxona, naltrexona, buprenorfina, butorfanol, nalbufina o pentazocina;

(ii) un antiinflamatorio no esteroideo (AINE), por ejemplo aspirina, diclofenaco, diflusinal, etodolaco, fenbufeno, fenoprofeno, flufenisal, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, ketorolaco, ácido meclofenámico, ácido mefenámico, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, sulindaco, tolmetina o zomepirac, inhibidores de la ciclooxigenasa-2 (COX-2), celecoxib; rofecoxib; meloxicam; JTE-522; L-745.337; NS398; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos;

(iii) un sedante barbitúrico, por ejemplo, amobarbital, aprobarbital, butabarbital, butabital, mefobarbital, metarbital, metohexital, pentobarbital, fenobartital, secobarbital, talbutal, teamilal o tiopental o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos;

(iv) un analgésico barbitúrico, por ejemplo, butalbital o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición que comprenda butalbital.

(v) una benzodiazepina con acción sedante, por ejemplo, clordiazepóxido, clorazepato, diazepam, flurazepam, lorazepam, oxazepam, temazepam o triazolam o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos;

(vi) un antagonista H1 con acción sedante, por ejemplo, difenhidramina, pirilamina, prometazina, clorfeniramina o clorciclizina o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas;

(vii) un sedante como la glutetimida, el meprobamato, la metacualona o la dicloralfenazona o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos;

(viii) un relajante muscular esquelético, por ejemplo, baclofeno, carisoprodol, clorzoxazona, ciclobenzaprina, metocarbamol u orfrenadina o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos;

(ix) un antagonista del receptor NMDA, por ejemplo, dextrometorfano ((+)-3-hidroxi-N-metilmorfinano) o su metabolito dextrorfano ((+)-3-hidroxi-N-metilmorfinano), ketamina, memantina, pirroloquinolina quinona o ácido cis-4-(fosfonometil)-2-piperidinocarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos; (x) un alfa-adrenérgico, por ejemplo, doxazosina, tamsulosina, clonidina o 4-amino-6,7-dimetoxi-2-(5-metanosulfonamido-1,2,3,4-tetrahidroisoquinol-2-il)-5-(2-piridil) quinazolina;

(xi) un antidepresivo tricíclico, por ejemplo, desipramina, imipramina, amitriptilina o nortri ptilina;

(xii) un anticonvulsivo, por ejemplo, carbamazepina o valproato;

(xiii) un antagonista de la taquiquinina (NK), en particular un antagonista NK-3, NK-2 o NK-1, por ejemplo (aR,9R)-7-[3,5-bis(trifluoromethyl)benzyl]-8,9,10,11-tetrahydro-9-methyl-5-(4-methylphenyl)-7H-[1,4]diazocino[2,1-g][1,7]naphthridine-6-13-dione (TAK-637), 5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-bis(trifluorometil)fenil]etoxi-3-(4-fluorofenil)-4-morfolinil]metil]-1,2-dihidro-3H-1,2,4-triazol-3-ona (MK-869), lanepitant, dapitant o 3-[[2-metoxi-5-(trifluorometil)fenil]metilamino]-2-fenil-piperidina (2S,3S);

(xiv) un antagonista muscarínico, por ejemplo, oxibutina, tolterodina, propiverina, cloruro de tropsio o darifenacina;

(xv) un inhibidor de la COX-2, por ejemplo, celecoxib, rofecoxib o valdecoxib;

(xvi) un inhibidor no selectivo de la COX (preferiblemente con protección GI), por ejemplo, nitroflurbiprofeno (HCT-1026);

(xvii) un analgésico de alquitrán de hulla, en particular el paracetamol;

(xviii) un neuroléptico como el droperidol;

(xix) un agonista (por ejemplo, resinferatoxina) o antagonista (por ejemplo, capsazepina) de los receptores vanilloides;

(xix) un beta-adrenérgico como el propranolol;

(xx) un anestésico local, como la mexiletina;

(xxi) un corticosteroide, como la dexametasona;

(xxii) un agonista o antagonista de los receptores de serotonina;

(xxiii) un analgésico colinérgico (nicotínico);

(xxiv) Tramadol (marca registrada);

(xxv) un inhibidor de la PDEV, como el sildenafilo, el vardenafilo o el taladafilo;

(xxvi) un ligando alfa-2-delta como la gabapentina o la pregabalina;

(xxvii) un canabinoide; y

(xxviii) un antidepresivo, como amitriptilina (Elavil), trazodona (Desyrel) e imipramina (Tofranil) o anticonvulsivos como fenitoína (Dilantin) o carbamazepina (Tegretol).

Los expertos en la materia podrán determinar las cantidades de dosificación apropiadas para agentes particulares que se utilizarán en combinación con un anticuerpo anti-CGRP. Por ejemplo, el sumatriptán puede administrarse en una dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 300 mg. En algunos casos, el sumatriptán puede administrarse en una dosis de 2 mg a 300 mg. Cuando se administra por vía no parenteral, la dosis típica de sumatriptán es de unos 25 a unos 100 mg, siendo generalmente preferible unos 50 mg y, cuando se administra por vía parenteral, la dosis preferida es de unos 6 mg. Sin embargo, estas dosis pueden variarse según métodos habituales en la técnica, de modo que se optimicen para un paciente concreto o para una terapia combinada determinada. Además, por ejemplo, el celecoxib puede administrarse en una cantidad de entre 50 y 500 mg.

Con respecto a todos los métodos descritos en el presente documento, las referencias a anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales que modulan la vía de CGRP, anticuerpos antagonistas anti-CGRP, anticuerpos monoclonales antagonistas anti-CGRP) también incluyen composiciones que comprenden uno o más de estos agentes. En consecuencia, dicha composición puede utilizarse según un método referido a un anticuerpo descrito en el presente documento. Estas composiciones pueden comprender además excipientes adecuados, como los excipientes farmacéuticamente aceptables descritos en el presente documento. La presente invención puede utilizarse sola o en combinación con otros métodos convencionales de tratamiento.

Se pueden utilizar diversas formulaciones de un anticuerpo descrito en el presente documento para su administración. Puede administrarse un anticuerpo puro. El anticuerpo y un excipiente farmacéuticamente aceptable pueden presentarse en diversas formulaciones. Los excipientes farmacéuticamente aceptables son conocidos en la técnica, y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o actuar como diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, entre otros, agentes estabilizantes, humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, tampones y potenciadores de la penetración cutánea. Los excipientes, así como las formulaciones para la administración parenteral y no parenteral de fármacos, se exponen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).

En consecuencia, estos agentes pueden combinarse con vehículos farmacéuticamente aceptables como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y similares.

Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos utilizados de acuerdo con la presente divulgación pueden prepararse para su almacenamiento y/o uso mezclando un anticuerpo que tenga el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)), y en algunos casos pueden presentarse en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. Una formulación terapéutica de un anticuerpo puede comprender uno o más portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables, con ejemplos no limitativos de tales especies que incluyen tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; sales como cloruro sódico; antioxidantes como ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos, como el metil o el propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de unos 10 residuos); proteínas, como la seroalbúmina, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como la polivinilpirrolidona; aminoácidos (e.g., en concentraciones de 0,1 mM a 100 mM, 0,1 mM a 1 mM, 0.01 mM a 50 mM, 1 mM a 50 mM, 1 mM a 30 mM, 1 mM a 20 mM, 10 mM a 25 mM) como glicina, glutamina, metionina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono como glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes (p. ej., en concentraciones de 0,001 mg/ml a 1 mg/ml, 0,001 mg/ml a 1 mg/ml, 0,001 mg/ml a 0,1 mg/ml, 0,001 mg/ml a 0,01 mg/ml, 0,01 mg/ml a 0,1 mg/ml) como EDTA (p. ej., EDTA disódico dihidratado); azúcares (p. ej, en concentraciones de 1 mg/ml a 500 mg/ml, 10 mg/ml a 200 mg/ml, 10 mg/ml a 100 mg/ml, 50 mg/ml a 150 mg/ml) como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones formadores de sal como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos (por ejemplo, en concentraciones de 0,01 mg/ml a 10 mg/ml, 0,01 mg/ml a 1 mg/ml, 0,1 mg/ml a 1 mg/ml, 0,01 mg/ml a 0,5 mg/ml) como TWEEN™ (por ejemplo, polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80)), PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

Una formulación de anticuerpo puede caracterizarse en términos de una variedad de propiedades físicas. Por ejemplo, una formulación líquida de anticuerpos puede tener cualquier pH adecuado para la eficacia terapéutica, la seguridad y el almacenamiento. Por ejemplo, el pH de una formulación líquida de anticuerpos puede ser de pH 4 a aproximadamente pH 9, de pH 5 a pH 8, de pH 5 a pH 7 o de pH 6 a pH 8. Una formulación líquida de anticuerpos puede tener un pH de 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 o superior o inferior.

En otro ejemplo, una formulación líquida de anticuerpos puede tener cualquier viscosidad adecuada para la eficacia terapéutica, la seguridad y el almacenamiento. Por ejemplo, la viscosidad de una formulación líquida de anticuerpos puede ser de 0,5 centipoise (cP) a 100 cP, 1 cP a 50 cP, 1 cP a 20 cP, 1 cP a 15 cP o 5 cP a 15 cP a 25°C. Una formulación líquida de anticuerpos puede tener una viscosidad de 0,5 cP, 1 cP, 1,2 cP, 1,4 cP, 1,6 cP, 1,8 cP, 2,0 cP, 2.2 cP, 2,4 cP, 2,6 cP, 2,8 cP, 3,0 cP, 3,2 cP, 3,4 cP, 3,6 cP, 3.8 cP, 4.0 cP, 4.2 cP, 4.4 cP, 4.6 cP, 4.8 cP, 5.0 cP, 5.2 cP, 5.4 cP, 5.6 cP, 5.8 cP, 6.0 cP, 6.2 cP, 6.4 cP, 6.6 cP, 6.8 cP, 7.0 cP, 7.2 cP, 7.4 cP, 7.6 cP, 7.8 cP, 8.0 cP, 8.2 cP, 8,4 cP, 8,6 cP, 8,8 cP, 9,0 cP, 9,2 cP, 9,4 cP, 9,6 cP, 9,8 cP, 10,0 cP, 10,2 cP, 10,4 cP, 10,6 cP, 10,8 cP, 11,0 cP, 11,2 cP, 11,4 cP, 11,6 cP, 11,8 cP, 12,0 cP, 12,2 cP, 12.4 cP, 12.6 cP, 12.8 cP, 13.0 cP, 13.2 cP, 13.4 cP, 13.6 cP, 13.8 cP, 14.0 cP,

14.2 cP, 14.4 cP, 14.6 cP, 14.8 cP, o 15.0 cP a 25°C o la viscosidad puede ser mayor o menor.

Una formulación líquida de anticuerpos puede tener cualquier conductividad adecuada para la eficacia terapéutica, la seguridad y el almacenamiento. Por ejemplo, la conductividad de una formulación líquida de anticuerpos puede ser de

0,1 milisiemens por centímetro (mS/cm) a 15 mS/cm, de 0,1 mS/cm a 10 mS/cm, de 0,1 mS/cm a 5 mS/cm, de 0,1 mS/cm a 2 mS/cm o de 0,1 mS/cm a 1,5 mS/cm. En algunas realizaciones, una formulación líquida de anticuerpo puede tener una conductividad de 0,19 mS/cm, 0,59 mS/cm, 1,09 mS/cm, 1,19 mS/cm, 1,29 mS/cm, 1,39 mS/cm, 1,49 mS/cm, 1,59 mS/cm, 1,69 mS/cm, 1,79 mS/cm, 1,89 mS/cm, 1,99 mS/cm, 2,09 mS/cm, 2,19 mS/cm, 2,29 mS/cm, 2,39 mS/cm, 2,49 mS/cm, 2,59 mS/cm, 2,69 mS/cm.09 mS/cm, 2,19 mS/cm, 2,29 mS/cm, 2,39 mS/cm, 2,49 mS/cm, 2,59 mS/cm, 2,69 mS/cm, 2,79 mS/cm, 2,89 mS/cm, 2.99 mS/cm, 3,09 mS/cm, 3,19 mS/cm, 3,29 mS/cm, 3,39 mS/cm, 3,49 mS/cm, 3,59 mS/cm, 3,69 mS/cm, 3,79 mS/cm, 3.89 mS/cm, 3,99 mS/cm, 4,09 mS/cm, 4,19 mS/cm, 4,29 mS/cm, 4,39 mS/cm, 4,49 mS/cm, 4,59 mS/cm, 4,69 mS/cm, 4.79 mS/cm, 4,89 mS/cm, 4,99 mS/cm, 5,09 mS/cm, 6,09 mS/cm, 6,59 mS/cm, 7,09 mS/cm, 7,59 mS/cm, 8,09 mS/cm, 8.59 mS/cm, 9,09 mS/cm, 9,59 mS/cm, 10,09 mS/cm, 10,59 mS/cm, 11.09 mS/cm, 11,59 mS/cm, 12,09 mS/cm, 12,59 mS/cm, 13,09 mS/cm, 13,59 mS/cm, 14,09 mS/cm, 14,59 mS/cm o 15.09 mS/cm o la conductividad puede ser mayor o menor.

En otro ejemplo, una formulación líquida de anticuerpos puede tener cualquier osmolalidad adecuada para la eficacia terapéutica, la seguridad y el almacenamiento. Por ejemplo, la osmolalidad de una formulación líquida de anticuerpos puede ser de 50 miliosmol por kilogramo (mOsm/kg) a 5000 mOsm/kg, de 50 mOsm/kg a 2000 mOsm/kg, de 50 mOsm/kg a 1000 mOsm/kg, de 50 mOsm/kg a 750 mOsm/kg o de 50 mOsm/kg a 500 mOsm/kg. Una formulación líquida de anticuerpos puede tener una osmolalidad de 50 mOsm/kg, 60 mOsm/kg, 70 mOsm/kg, 80 mOsm/kg, 90 mOsm/kg, 100 mOsm/kg 120 mOsm/kg, 140 mOsm/kg, 160 mOsm/kg, 180 mOsm/kg, 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 240 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 340 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg, 400 mOsm/kg, 420 mOsm/kg, 440 mOsm/kg, 460 mOsm/kg, 480 mOsm/kg, 500 mOsm/kg, 520 mOsm/kg, 540 mOsm/kg, 560 mOsm/kg, 580 mOsm/kg, 600 mOsm/kg, 620 mOsm/kg, 640 mOsm/kg, 660 mOsm/kg, 680 mOsm/kg, 700 mOsm/kg, 720 mOsm/kg, 740 mOsm/kg, 760 mOsm/kg, 780 mOsm/kg, 800 mOsm/kg, 820 mOsm/kg, 840 mOsm/kg, 860 mOsm/kg, 880 mOsm/kg, 900 mOsm/kg, 920 mOsm/kg, 940 mOsm/kg, 960 mOsm/kg, 980 mOsm/kg, 1000 mOsm/kg, 1050 mOsm/kg, 1100 mOsm/kg, 1150 mOsm/kg, 1200 mOsm/kg, 1250 mOsm/kg, 1300 mOsm/kg, 1350 mOsm/kg, 1400 mOsm/kg, 1450 mOsm/kg, 1500 mOsm/kg o la osmolalidad puede ser superior o inferior.

Los liposomas que contienen anticuerpos pueden prepararse por métodos conocidos en la técnica, como los descritos en Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980);

y Patente de EE. UU. N.° 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con mayor tiempo de circulación se describen en la Patente de EE. UU. N.° 5.013.556. Pueden generarse liposomas particularmente útiles por el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado.

Los principios activos también pueden quedar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas coloidales de administración de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se describen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).

Pueden prepararse preparados de liberación controlada. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices se presentan en forma de artículos moldeados, por ej., películas, o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación controlada se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ej., poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(vinilalcohol)), polilactidas ( Pat. de EE.UU. N.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y 7 etil-L-glutamato, etilvinilacetato no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico y ácido glicólico como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico y ácido glicólico y acetato de leuprolidLaa), isobutirato de acetato de sacarosa y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

Las formulaciones que se utilizarán para la administración in vivo deben ser generalmente estériles. Esto se consigue fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. Las composiciones de anticuerpos terapéuticos se colocan generalmente en un recipiente con un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

Las composiciones pueden presentarse en formas farmacéuticas unitarias. En algunos casos, una forma farmacéutica unitaria puede suministrarse en un receptáculo precargado (por ejemplo, una jeringa precargada) útil para administrar la dosis unitaria a un sujeto.

Los agentes tensioactivos adecuados incluyen, en particular, agentes no iónicos, tales como polioxietilenosorbitanos (por ejemplo, Tween™ 20, 40, 60, 80 u 85) y otros sorbitanos (por ejemplo, Span™ 20, 40, 60, 80 u 85). Las composiciones con un agente tensioactivo comprenderán convenientemente entre el 0,05 y el 5% de agente tensioactivo, pudiendo estar entre el 0,1 y el 2,5%. Se apreciará que pueden añadirse otros ingredientes, por ejemplo manitol u otros vehículos farmacéuticamente aceptables, si es necesario.

Pueden prepararse emulsiones adecuadas utilizando emulsiones grasas disponibles en el mercado, como Intralipid ™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ y Lipiphysan™. El principio activo puede disolverse en una composición de emulsión premezclada o, alternativamente, puede disolverse en un aceite (por ej., aceite de soja, aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de maíz o aceite de almendras) y formarse una emulsión al mezclarse con un fosfolípido (por ej., fosfolípidos de huevo, fosfolípidos de soja o lecitina de soja) y agua. Se apreciará que pueden añadirse otros ingredientes, por ejemplo glicerol o glucosa, para ajustar la tonicidad de la emulsión. Las emulsiones adecuadas contendrán normalmente hasta un 20% de aceite, por ejemplo, entre un 5 y un 20%. La emulsión grasa puede comprender gotas de grasa de entre 0,1 y 1,0 Im, en particular de entre 0,1 y 0,5 Im, y tener un pH comprendido entre 5,5 y 8,0.

Las composiciones de emulsión pueden ser las preparadas mezclando un anticuerpo con Intralipid™. o los componentes del mismo (aceite de soja, fosfolípidos de huevo, glicerol y agua).

Una formulación líquida que comprende un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo monoclonal que modula la vía de CGRP, anticuerpo antagonista anti-CGRP, anticuerpo monoclonal antagonista anti-CGRP) descrito en el presente documento puede prepararse para cualquier vía de administración adecuada con una concentración de anticuerpo que oscila entre 0,1 y 500 mg/ml, 0,1 y 375 mg/ml, 0,1 y 250 mg/ml, 0,1 y 175 mg/ml, 0.1 a 100 mg/ml, 1 mg/ml a 500 mg/ml, 1 mg/ml a 375 mg/ml, 1 mg/ml a 300 mg/ml, 1 mg/ml a 250 mg/ml, 1 mg/ml a 200 mg/ml, 1 mg/ml a 150 mg/ml, 1 mg/ml a 100 mg/ml, 10 mg/ ml a 500 mg/ml, 10 mg/ml a 375 mg/ml, 10 mg/ml a 250 mg/ml, 10 mg/ml a 150 mg/ml, 10 mg/ml a 100 mg/ml, 100 mg/ml a 500 mg/ml, 100 mg/ml a 450 mg/ml, 100 mg/ml a 400 mg/ml, 100 mg/ml a 350 mg/ml, 100 mg/ml a 300 mg/ml, 100 mg/ml a 250 mg/ml, 100 mg/ml a 200 mg/ml o 100 mg/ml a 150 mg/ml. Una formulación líquida puede comprender un anticuerpo descrito en el presente documento en una concentración de, como máximo, de al menos, o inferior a 0,1, 0.5, 1, 5, 10,1520, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 o 500 mg/ml.

Una formulación de anticuerpo puede comprender uno o más componentes incluyendo el anticuerpo y otras especies descritas en otras partes del presente documento. El anticuerpo y otros componentes pueden estar en cualquier cantidad adecuada y/o cualquier concentración adecuada para la eficacia terapéutica del anticuerpo, la seguridad y el almacenamiento. En un ejemplo, una formulación de anticuerpo puede ser una solución que comprende 51,4 mg/ml de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), 20 mM de histidina, 0,1 mg/ml de metionina, 84 mg/ml de dihidrato de trehalosa, 0,05 mg/ml de EDTA dihidrato disódico, y 0,2 mg/ml de polisorbato 80.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 200 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), 15 mM de arginina, 78 mg/ml de sacarosa, 0,3 mg/ml de EDTA y 0,1 mg/ml de polisorbato 80.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 175 mg/ml de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), 20 mM de glicina, 88 mg/ml de dihidrato de trehalosa, 0,015 mg/ml de EDT<a>y 0,25 mg/ml de polisorbato 80.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 225 mg/ml de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía c Gr P), 23 mM de asparagina, 84 mg/ml de sorbitol, 0,1 mg/ml de EDTA y 0,15 mg/ml de polisorbato 60.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 150 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía de CGRP), 17 mM de asparagina, 74 mg/ml de manitol, 0,025 mg/ml de EDTA y 0,2 mg/ml de polisorbato 80.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 100 mg/ml de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), 16 mM de arginina, 87 mg/ml de manitol, 0,025 mg/ml de EDTA y 0,15 mg/ml de polisorbato 20.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 250 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía de CGRP), 25 mM de histidina, 74 mg/ml de manitol, 0,025 mg/ml de EDTA y 0,25 mg/ml de polisorbato 20.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 50 mg/ml de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía de CGRP), 19 mM de arginina, 84 mg/ml de sacarosa, 0,05 mg/ml de EDTA y 0,3 mg/ml de polisorbato 80.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 125 mg/ml de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), 22 mM de glicina, 79 mg/ml de dihidrato de trehalosa, 0,15 mg/ml de EDTA y 0,15 mg/ml de polisorbato 80.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede ser una solución que comprende 175 mg/ml de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), 20 mM de histidina, 0,1 mg/ml de metionina, 84 mg/ml de dihidrato de trehalosa, 0,05 mg/ml de EDTA dihidrato disódico, y 0,2 mg/ml de polisorbato 80.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 200 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), 30 mM de arginina, 78 mg/ml de sacarosa, 0,3 mg/ml de EDTA y 0,1 mg/ml de polisorbato 80.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 175 mg/ml de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), 20 mM de glicina, 88 mg/ml de dihidrato de trehalosa, 0,015 mg/ml de EDTa y 0,15 mg/ml de polisorbato 80.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 150 mg/ml de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), 20 mM de histidina, 84 mg/ml de sacarosa, 0,05 mg/ml de EDTA y 0,2 mg/ml de polisorbato 80.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 225 mg/ml de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), 23 mM de histidina, 84 mg/ml de sorbitol, 0,1 mg/ml de EDTA y 0,15 mg/ml de polisorbato 60.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 150 mg/ml de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía c Gr P), 17 mM de asparagina, 74 mg/ml de manitol, 0,3 mg/ml de EDTA y 0,2 mg/ml de polisorbato 80.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 100 mg/ml de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), 16 mM de arginina, 87 mg/ml de manitol, 0,025 mg/ml de EDTA y 0,25 mg/ml de polisorbato 20.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 250 mg/ml de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), 25 mM de histidina, 89 mg/ml de manitol, 0,025 mg/ml de EDTA y 0,25 mg/ml de polisorbato 20.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 125 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), 29 mM de arginina, 84 mg/ml de sacarosa, 0,05 mg/ml de EDTA y 0,3 mg/ml de polisorbato 80.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 150 mg/ml de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía c Gr P), 25 mM de asparagina, 84 mg/ml de manitol, 0,05 mg/ml de EDTA y 0,2 mg/ml de polisorbato 80.

En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 145 mg/ml de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), 22 mM de histidina, 72 mg/ml de dihidrato de trehalosa, 0,05 mg/ml de EDTA y 0,1 mg/ml de polisorbato 80.

El régimen de dosificación comprende la administración de una dosis de 225 mg a un sujeto una vez al mes por vía subcutánea. Otro régimen de dosificación ejemplar comprende la administración de una dosis inicial de 675 mg por vía subcutánea, seguida de una dosis mensual de 225 mg del anticuerpo por vía subcutánea. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

La frecuencia con la que se administra una dosis o cantidad de un anticuerpo a un sujeto es constante (una vez al mes). Una dosis o cantidad de un anticuerpo puede administrarse por vía subcutánea a un sujeto una vez al mes.

En algunas realizaciones, puede administrarse a un sujeto una dosis inicial (por ejemplo, una dosis de carga) del anticuerpo para uso según la presente invención, seguida de la administración de una o más dosis adicionales a intervalos deseados utilizados en la invención. En algunas realizaciones, la dosis inicial y una o más de las dosis adicionales son la misma dosis. En algunas realizaciones, la una o más dosis adicionales son una dosis diferente de la dosis inicial. La frecuencia de administración de una o más dosis adicionales es mensual. Un régimen ejemplar incluye una dosis inicial de carga de 675 mg de anticuerpo antagonista anti-CGRP administrado por vía subcutánea, seguido de dosis posteriores de mantenimiento de 225 mg del anticuerpo administrado por vía subcutánea a intervalos de un mes.

Una dosis o cantidad del anticuerpo para su uso en la invención puede dividirse en subdosis y administrarse como múltiples subdosis. La dosis subcutánea puede dividirse en múltiples subdosis y cada subdosis administrarse en un sitio diferente para evitar, por ejemplo, una inyección subcutánea única más grande en un solo sitio. La división de las subdosis puede ser igual (por ejemplo, 4 subdosis iguales) o puede ser desigual (por ejemplo, 4 subdosis, dos de las subdosis el doble de grandes que las otras subdosis).

El número de dosis del anticuerpo de uso administrado a un sujeto a lo largo del tratamiento puede variar en función de, por ejemplo, conseguir reducir la incidencia de una migraña en el sujeto. Por ejemplo, el número de dosis administradas a lo largo del tratamiento puede ser, puede ser al menos, o puede ser como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50. En algunos casos (por ejemplo, cuando un sujeto padece migraña crónica), el tratamiento puede administrarse indefinidamente. En algunos casos, el tratamiento puede ser agudo, de manera que se administran como máximo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 dosis a un sujeto para su tratamiento.

Una dosis (o subdosis) o cantidad del anticuerpo para su uso puede formularse en una formulación líquida y administrarse mediante inyección subcutánea a un sujeto. En tales casos, el volumen de la formulación líquida que comprende el anticuerpo puede variar dependiendo, por ejemplo, de la concentración de anticuerpo en la formulación líquida, la dosis deseada de anticuerpo y/o la vía de administración utilizada. Por ejemplo, el volumen de la formulación líquida que comprende el anticuerpo para su uso y administración a un sujeto puede ser de 0,001 ml a 10,0 ml, 0,01 ml a 5,0 ml, 0,1 ml a 5 ml, 0,1 ml a 3 ml, 0,5 ml a 2,5 ml, o 1 ml a 2,5 ml. Por ejemplo, el volumen de la formulación líquida que comprende el anticuerpo para su uso y administración a un sujeto puede ser, puede ser como mínimo, puede ser inferior a, o puede ser como máximo 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1,4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, o 10.0 ml.

En algunas realizaciones, una dosis (o subdosis) o cantidad del anticuerpo para su uso según la presente invención puede suministrarse como una formulación líquida en jeringas precargadas. En tales ejemplos, las jeringas precargadas pueden estar diseñadas para la autoadministración o para que las administre otra persona. En algunos casos, las jeringas precargadas pueden estar diseñadas para la administración subcutánea y/o intravenosa.

La administración del anticuerpo para su uso puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, del estado fisiológico del receptor, de si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico, y de otros factores conocidos por los profesionales expertos. La administración del anticuerpo puede ser esencialmente continua durante un periodo de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis espaciadas, por ejemplo, antes, durante o después de desarrollar cefalea (por ejemplo, migraña); antes; durante; antes y después; durante y después; antes y durante; o antes, durante y después de desarrollar cefalea. La administración puede realizarse antes, durante y/o después de cualquier acontecimiento susceptible de provocar cefalea.

Puede haber más de un anticuerpo. Pueden estar presentes al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco anticuerpos diferentes o más. Por lo general, esos anticuerpos pueden tener actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. El anticuerpo para uso según la presente invención también puede utilizarse junto con otros antagonistas de CGRP o antagonistas del receptor de CGRP. Por ejemplo, pueden utilizarse uno o más de los siguientes antagonistas de CGRP: una molécula antisentido dirigida a un CGRP (incluida una molécula antisentido dirigida a un ácido nucleico que codifica CGRP), un compuesto inhibidor de CGRP, un análogo estructural de CGRP, una mutación dominante-negativa de un receptor de CGR<p>que se une a un CGRP, y un anticuerpo del receptor anti-CGRP. Un anticuerpo también puede utilizarse junto con otros agentes que sirven para potenciar y/o complementar la eficacia de los agentes.

El diagnóstico o evaluación de la cefalea está bien establecido en la técnica. La evaluación puede realizarse basándose en medidas subjetivas, como la caracterización de los síntomas por parte del paciente. Por ejemplo, la migraña puede diagnosticarse basándose en los siguientes criterios: 1) ataques episódicos de cefalea de 4 a 72 horas de duración; 2) con dos de los siguientes síntomas: dolor unilateral, pulsátil, agravación con el movimiento y dolor de intensidad moderada o grave; y 3) uno de los siguientes síntomas: náuseas o vómitos y fotofobia o fonofobia. Goadsby et al., N. Engl. J. Med. 346:257-270, 2002. En algunas realizaciones, la evaluación de la migraña puede realizarse a través de las horas de cefalea, tal y como se describe en el presente documento. Por ejemplo, la evaluación de la migraña puede hacerse en términos de horas de cefalea diaria, horas de cefalea semanal, horas de cefalea mensual y/o horas de cefalea anual. En algunos casos, las horas de cefalea pueden ser las indicadas por el sujeto.

La eficacia del tratamiento puede evaluarse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede evaluarse el alivio del dolor. En consecuencia, el alivio del dolor puede observarse subjetivamente después de 1, 2 o unas horas tras la administración de un anticuerpo anti-CGRP. La frecuencia de los ataques de cefalea puede observarse subjetivamente después de administrar el anticuerpo anti-CGRP para su uso según la presente invención.

El anticuerpo para uso según la presente invención puede administrarse con uno o más agente(s) adicional(es) simultánea o secuencialmente. Un agente adicional puede ser un medicamento contra la cefalea, como un ejemplo de medicamento contra la cefalea (p. ej., agonistas 5-HT1, triptanes, alcaloides del cornezuelo de centeno, opiáceos, antagonistas p-adrenérgicos, AINE) descritos en el presente documento. El efecto terapéutico puede ser mayor en comparación con el uso del anticuerpo o de uno o más agentes adicionales por sí solos. Por consiguiente, puede conseguirse un efecto sinérgico entre el anticuerpo y uno o más agentes adicionales. El sujeto puede tomar uno o más agentes adicionales de forma profiláctica.

B. Anticuerpos antagonistas anti-CGRP

Un anticuerpo antagonista anti-CGRP puede referirse a cualquier molécula de anticuerpo que bloquea, suprime o reduce (incluyendo significativamente) la actividad biológica de CGRP, incluyendo las vías descendentes mediadas por la señalización de CGRP, tales como la unión del receptor y/o la elicitación de una respuesta celular a CGRP.

Un anticuerpo antagonista anti-CGRP puede presentar una o más de las siguientes características: (a) unirse a CGRP; (b) bloquear la unión de CGRP a su(s) receptor(es); (c) bloquear o disminuir la activación del receptor de CGRP (incluida la activación de AMPc); (d) inhibir la actividad biológica de CGRP o las vías descendentes mediadas por la función de señalización de CGRP; (e) prevenir, mejorar o tratar cualquier aspecto de la cefalea (por ejemplo, migraña); (f) aumentar la eliminación de CGRP; e (g) inhibir (reducir) la síntesis, producción o liberación de CGRP. Los anticuerpos antagonistas anti-CGRP son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Tan et al, Clin. Sci. (Lond.) 89:565-73, 1995; Sigma (Missouri, EE.UU.), número de producto C7113 (clon N.° 4901); Plourde et al., Peptides 14:1225-1229, 1993.

El anticuerpo puede reaccionar con el CGRP de manera que inhiba el CGRP, y/o la vía del CGRP, incluidas las vías descendentes mediadas por la función de señalización del CGRP. El anticuerpo antagonista anti-CGRP reconoce el CGRP humano. El anticuerpo antagonista anti-CGRP se une tanto a la a-CGRP como a la p-CGRP humanas. El anticuerpo antagonista anti-CGRP se une al CGRP humano y de rata. El anticuerpo antagonista anti-CGRP puede unirse al fragmento C-terminal que tiene los aminoácidos 25-37 de CGRP. El anticuerpo antagonista anti-CGRP puede unirse a un epítopo C-terminal dentro de los aminoácidos 25-37 de la CGRP.

El anticuerpo antagonista anti-CGRP para uso según la presente invención es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo antagonista anti-CGRP para su uso según la presente invención es el anticuerpo G1 (como se describe en el presente documento).

La afinidad (KD) de un anticuerpo antagonista anti-CGRP a CGRP (como a-CGRP humano) puede ser de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 200 nM. La afinidad de unión puede ser cualquiera de aproximadamente 200 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 5 pM o aproximadamente 2 pM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es menor que cualquiera de aproximadamente 250 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM o aproximadamente 50 pM.

Una forma de determinar la afinidad de unión de anticuerpos a CGRP es midiendo la afinidad de unión de fragmentos Fab monofuncionales del anticuerpo. Para obtener fragmentos Fab monofuncionales, un anticuerpo (por ejemplo, IgG) puede escindirse con papaína o expresarse recombinantemente. La afinidad de un fragmento Fab anti-CGRP de un anticuerpo puede determinarse mediante resonancia de plasmón superficial (sistema de resonancia de plasmón superficial (SPR) Biacore3000™, Biacore, INC, Piscataway NJ) equipado con chips sensores de estreptavidina (SA) preinmovilizados utilizando tampón de funcionamiento HBS-EP (0,01M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCl, 3mM<e>D<t>A, 0,005% v/v Surfactante P20). El CGRP humano biotinilado (o cualquier otro CGRP) puede diluirse en tampón HBS-EP hasta una concentración inferior a 0,5 ug/ml e inyectarse a través de los canales individuales del chip utilizando tiempos de contacto variables, para alcanzar dos rangos de densidad de antígeno, bien 50-200 unidades de respuesta (RU) para estudios cinéticos detallados o 800-1.000 RU para ensayos de cribado. Los estudios de regeneración han demostrado que el NaOH 25mM en etanol 25% v/v elimina eficazmente el Fab unido manteniendo la actividad del CGRP en el chip durante más de 200 inyecciones. Normalmente, se inyectan diluciones seriadas (que abarcan concentraciones de 0,1-10x KD estimada) de muestras de Fab purificado durante 1 min a 100 pl/minuto y se permiten tiempos de disociación de hasta 2 horas. Las concentraciones de las proteínas Fab se determinan mediante ELISA y/o electroforesis SDS-PAGE utilizando como patrón una Fab de concentración conocida (determinada mediante análisis de aminoácidos). Las tasas cinéticas de asociación (kon) y de disociación (koff) se obtienen simultáneamente ajustando los datos globalmente a un modelo de unión Langmuir 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) utilizando el programa BIAevaluation. Los valores de la constante de disociación de equilibrio (KD) se calculan como koff/kon. Este protocolo es adecuado para su uso en la determinación de la afinidad de unión de un anticuerpo a cualquier CGRP, incluyendo CGRP humano, CGRP de otro mamífero (como CGRP de ratón, CGRP de rata, CGRp de primate), así como diferentes formas de CGRP (como la forma a y p). La afinidad de unión de un anticuerpo se mide generalmente a 25°C, pero también puede medirse a 37°C.

Los anticuerpos, incluidos los anticuerpos antagonistas anti-CGRP, pueden fabricarse por cualquier método conocido en la técnica. La ruta y el calendario de inmunización del animal huésped se ajustan generalmente a las técnicas establecidas y convencionales para la estimulación y producción de anticuerpos, como se describe más adelante. Las técnicas generales para la producción de anticuerpos humanos y de ratón son conocidas en la técnica y se describen en el presente documento.

Se contempla la posibilidad de manipular cualquier sujeto mamífero, incluidos los seres humanos, o células productoras de anticuerpos de los mismos, para que sirvan de base para la producción de líneas celulares de hibridoma de mamífero, incluidos los seres humanos. Típicamente, el animal huésped se inocula por vía intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutánea, intraplantar y/o intradérmica con una cantidad de inmunógeno, incluyendo como se describe en el presente documento.

Los hibridomas pueden prepararse a partir de los linfocitos y las células de mieloma inmortalizadas utilizando la técnica general de hibridación de células somáticas de Kohler, B. y Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497 o modificado por Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982). En la hibridación pueden utilizarse las líneas de mieloma disponibles, incluidas, entre otras, X63-Ag8.653 y las del Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, California (EE.UU.). Generalmente, la técnica consiste en fusionar células de mieloma y células linfoides utilizando un fusógeno como el polietilenglicol, o por medios eléctricos bien conocidos por los expertos en la materia. Tras la fusión, las células se separan del medio de fusión y se cultivan en un medio de crecimiento selectivo, como el medio de hipoxantinaaminopterina-timidina (HAT), para eliminar las células progenitoras no hibridadas. Cualquiera de los medios aquí descritos, suplementados con o sin suero, puede utilizarse para el cultivo de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales. Como otra alternativa a la técnica de fusión celular, pueden utilizarse células B inmortalizadas por el VEB para producir anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-CGRP) de la invención objeto de estudio. Los hibridomas se expanden y subclonan, si se desea, y los sobrenadantes se analizan para determinar la actividad antiinmunógena mediante procedimientos de inmunoensayo convencionales (por ejemplo, radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático o inmunoensayo de fluorescencia).

Los hibridomas que pueden usarse como fuente de anticuerpos abarcan todos los derivados, células progenitoras de los hibridomas padres que producen anticuerpos monoclonales específicos para CGRP, o una porción de los mismos.

Los hibridomas que producen tales anticuerpos pueden cultivarse in vitro o in vivo utilizando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse de los medios de cultivo o fluidos corporales, mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas como la precipitación con sulfato de amonio, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía y ultrafiltración, si se desea. La actividad no deseada, si está presente, puede eliminarse, por ejemplo, haciendo pasar la preparación sobre adsorbentes hechos del inmunógeno unido a una fase sólida y eluyendo o liberando los anticuerpos deseados del inmunógeno. Inmunización de un animal huésped con un CGRP humano, o un fragmento que contenga la secuencia de aminoácidos diana conjugado con una proteína que sea inmunógena en la especie a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa de ojo de cerradura, albúmina sérica, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaradehído, anhídrido succínico, SOCl2, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes, puede producir una población de anticuerpos (e.g., anticuerpos monoclonales).

Si se desea, puede secuenciarse un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo monoclonal o policlonal antagonista anti-CGRP) de interés y la secuencia polinucleotídica puede clonarse a continuación en un vector para su expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula huésped y ésta puede expandirse y congelarse para su uso futuro. Como alternativa, los anticuerpos pueden fabricarse de forma recombinante y expresarse mediante cualquier método conocido en la técnica.

Los anticuerpos pueden fabricarse recombinantemente aislando primero los anticuerpos y las células productoras de anticuerpos de los animales hospedadores, obteniendo la secuencia génica, y utilizando la secuencia génica para expresar el anticuerpo recombinantemente en células hospedadoras (por ejemplo, células CHO). Otro método que puede emplearse es expresar la secuencia de anticuerpos en plantas (por ejemplo, tabaco) o leche transgénica. Se han divulgado métodos para expresar anticuerpos de forma recombinante en plantas o leche. Véase, por ejemplo, Peeters, et al. Vaccine 19:2756 (2001); Lonberg, N. y D. Huszar Int.Rev.lmmunol 13:65 (1995); y Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147(1999). Los métodos para fabricar derivados de anticuerpos, por ejemplo, humanizados, de cadena única, etc. son conocidos en la técnica.

Los anticuerpos pueden unirse a muchos portadores diferentes. Los portadores pueden ser activos y/o inertes. Algunos ejemplos de soportes conocidos son el polipropileno, el poliestireno, el polietileno, el dextrano, el nailon, las amilasas, el vidrio, las celulosas naturales y modificadas, las poliacrilamidas, las agarosas y la magnetita. La naturaleza del portador puede ser soluble o insoluble. Los expertos en la materia conocerán otros soportes adecuados para la unión de anticuerpos, o podrán determinarlos mediante experimentación rutinaria. En algunas realizaciones, el portador comprende una fracción dirigida al miocardio.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como fuente preferente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión (como los vectores de expresión divulgados en la Publicación PCT N.° WO 87/04462), que luego se transfectan en células huésped tales como células E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otro modo no producen proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Véase, por ejemplo, la publicación PCT N.° WO 87/04462. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora de los dominios constantes de las cadenas pesadas y ligeras humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984), o mediante la unión covalente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulínico. De este modo, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal anti-CGRP.

C. Anticuerpo G1 y anticuerpos relacionados, polipéptidos, polinucleótidos, vectores y células huésped

La presente divulgación abarca composiciones, incluidas composiciones farmacéuticas, que comprenden el anticuerpo G1. Estas composiciones pueden comprender además excipientes adecuados, como excipientes farmacéuticamente aceptables, incluidos tampones, que son bien conocidos en la técnica.

El anticuerpo antagonista anti-CGRP para su uso se caracteriza por cualquiera (una o más) de las siguientes características: (a) se une a CGRP; (b) bloquea la unión de CGRP a su(s) receptor(es); (c) bloquea o disminuye la activación del receptor de CGRP (incluida la activación de AMPc); (d) inhibe la actividad biológica de CGRP o las vías descendentes mediadas por la función de señalización de CGRP; (e) previene, mejora o trata cualquier aspecto de la cefalea (p. ej., migraña); (f) aumentar la eliminación de CGRP; e (g) inhibir (reducir) la síntesis, producción o liberación de CGRP.

Las porciones CDR del anticuerpo G1 (incluyendo las CDR de Chothia y Kabat) se representan diagramáticamente en la Figura 5. La determinación de las regiones CDR está bien dentro de la habilidad del arte. Se entiende que los CDR pueden ser una combinación de los CDR de Kabat y Chothia (también denominados "CDR combinados" o "CDR ampliados"). Los CDR pueden ser los CDR de Kabat. En otras realizaciones, las CDR son las CDR de Chothia. En otras palabras, en los ejemplos con más de una CDR, las CDR pueden ser cualquiera de las CDR de Kabat, Chothia, combinadas, o combinaciones de las mismas.

También se divulgan en el presente documento métodos para fabricar cualquiera de los anticuerpos utilizados en la invención. Los anticuerpos utilizados en esta invención pueden fabricarse por procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo podría ser producido por un sintetizador automatizado de polipéptidos que emplee el método de fase sólida. Véase también Patentes de EE.UU. N.° 5,807,715; 4,816,567; y 6,331,415.

En otra alternativa, los anticuerpos pueden hacerse recombinantemente usando procedimientos bien conocidos en el arte. En una realización, un polinucleótido comprende una secuencia que codifica la cadena pesada y/o las regiones variables de la cadena ligera del anticuerpo G1 que se muestran en SEQ ID N.°:9 y SEQ ID N.°:10. En otra realización, el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID N.°:9 y SEQ ID N.°:10 se clona en uno o más vectores para su expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo para su uso en la presente invención puede mantenerse en un vector en una célula huésped y la célula huésped puede entonces expandirse y congelarse para su uso futuro. En el presente documento se describen con más detalle los vectores (incluidos los vectores de expresión) y las células huésped.

Un anticuerpo o polipéptido puede estar unido a un agente de marcación (alternativamente denominado "marcación") como una molécula fluorescente, una molécula radiactiva o cualquier otra marcación conocida en la técnica. Se conocen marcaciones en la técnica que generalmente proporcionan (directa o indirectamente) una señal.

También se divulgan en el presente documento polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos para su uso según la presente invención, y vectores y células huésped que comprenden el polinucleótido.

Se dice que dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para obtener la máxima correspondencia como se describe a continuación. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan normalmente comparando las secuencias a lo largo de una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. Una "ventana de comparación", tal y como se utiliza aquí, se refiere a un segmento de al menos unas 20 posiciones contiguas, normalmente de 30 a 75, de 40 a 50, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se hayan alineado de forma óptima.

La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede realizarse utilizando el programa Megalign de la suite de software bioinformático Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), utilizando los parámetros por defecto. Este programa incorpora varios esquemas de alineación descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O. (1978) Un modelo de cambio evolutivo en proteínas - Matrices para detectar relaciones distantes. En Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345 358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, PM., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Teor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. y Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.

Preferiblemente, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en la que la porción de la secuencia polinucleotídica o polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos, normalmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprende adiciones ni supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparecen bases de ácido nucleico o residuos de aminoácidos idénticos en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

Se apreciará por aquellos de habilidad ordinaria en el arte que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como se describe aquí.

Los polinucleótidos pueden obtenerse mediante síntesis química, métodos recombinantes o PCR. Los métodos de síntesis química de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica y no es necesario describirlos en detalle en el presente documento. Un experto en la materia puede utilizar las secuencias aquí descritas y un sintetizador de ADN comercial para producir la secuencia de ADN deseada.

Para preparar polinucleótidos utilizando métodos recombinantes, un polinucleótido que comprende una secuencia deseada puede insertarse en un vector adecuado, y el vector a su vez puede introducirse en una célula huésped adecuada para su replicación y amplificación, como se discute más adelante. Los polinucleótidos pueden insertarse en las células huésped por cualquier medio conocido en la técnica. Las células se transforman introduciendo un polinucleótido exógeno por captación directa, endocitosis, transfección, apareamiento F o electroporación. Una vez introducido, el polinucleótido exógeno puede mantenerse dentro de la célula como un vector no integrado (como un plásmido) o integrado en el genoma de la célula huésped. El polinucleótido así amplificado puede aislarse de la célula huésped por métodos bien conocidos en la técnica. See, e.g., Sambrook et al. (1989).

Alternativamente, la PCR permite la reproducción de secuencias de ADN. La tecnología PCR es bien conocida en la técnica y se describe en Patentes de Ee .UU. N.° 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 y 4.683.202, así como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston (1994).

El ARN puede obtenerse utilizando el ADN aislado en un vector apropiado e insertándolo en una célula huésped adecuada. Cuando la célula se replica y el ADN se transcribe en ARN, el ARN se puede aislar utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la materia, como se expone en Sambrook et al. (1989), por ejemplo.

Los vectores de clonación adecuados pueden construirse de acuerdo con técnicas estándar, o pueden seleccionarse de entre un gran número de vectores de clonación disponibles en la técnica. Aunque el vector de clonación seleccionado puede variar en función de la célula huésped que se pretenda utilizar, los vectores de clonación útiles tendrán generalmente la capacidad de autorreplicarse, pueden poseer una única diana para una endonucleasa de restricción particular, y/o pueden llevar genes para un marcador que pueda utilizarse en la selección de clones que contengan el vector. Ejemplos adecuados incluyen plásmidos y virus bacterianos, por ejemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por ejemplo, pBS SK+) y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, ADN de fagos y vectores lanzadera como pSA3 y pAT28. Estos y muchos otros vectores de clonación están disponibles en proveedores comerciales como BioRad, Strategene e Invitrogen.

Los vectores de expresión generalmente son construcciones polinucleotídicas replicables que contienen un polinucleótido. Se sobreentiende que un vector de expresión debe ser replicable en las células huésped, ya sea como episomas o como parte integrante del ADN cromosómico. Los vectores de expresión adecuados son, entre otros, los plásmidos, los vectores virales, incluidos los adenovirus, los virus adenoasociados, los retrovirus, los cósmidos y los vectores de expresión descritos en la publicación PCT N.° WO 87/04462. Por lo general, los componentes del vector pueden incluir, entre otros, uno o más de los siguientes: una secuencia señal; un origen de replicación; uno o más genes marcadores; elementos adecuados de control transcripcional (como promotores, potenciadores y terminadores). Para la expresión (es decir, la traducción), también suelen ser necesarios uno o más elementos de control de la traducción, como sitios de unión a ribosomas, sitios de iniciación de la traducción y codones de parada.

Los vectores que contienen polinucleótidos pueden introducirse en la célula huésped por cualquiera de los medios apropiados, incluyendo electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; e infección (por ejemplo, cuando el vector es un agente infeccioso como el virus vaccinia). La elección de introducir vectores o polinucleótidos dependerá a menudo de las características de la célula huésped.

También se divulgan en el presente documento células huésped que comprenden cualquiera de los polinucleótidos descritos en el presente documento. Para aislar los genes que codifican el anticuerpo de interés puede utilizarse cualquier célula huésped capaz de sobreexpresar ADN heterólogo. Ejemplos no limitantes de células huésped de mamífero incluyen, entre otras, las células COS, HeLa y CHO. Véase también la publicación PCT N.° WO 87/04462. Las células huésped no mamíferas adecuadas incluyen procariotas (como E. coli o B. subtillis) y levaduras (como S. cerevisae, S. pombe; o K. lactis). Preferiblemente, las células huésped expresan los ADNc a un nivel aproximadamente 5 veces superior, más preferiblemente 10 veces superior, incluso más preferiblemente 20 veces superior al del correspondiente anticuerpo endógeno o proteína de interés, si está presente, en las células huésped. El cribado de las células huésped para una unión específica a A31-40 se efectúa mediante un inmunoensayo o FACS. Se puede identificar una célula que sobreexprese el anticuerpo o la proteína de interés.

D. Composiciones

Las composiciones pueden comprender una cantidad eficaz del anticuerpo para su uso según la presente invención. Los ejemplos de tales composiciones, así como la forma de formularlas, se describen también en una sección anterior y a continuación.

Se entiende que las composiciones pueden comprender más de un anticuerpo (por ejemplo, más de un anticuerpo antagonista anti-CGRP -- una mezcla de anticuerpos antagonistas anti-CGRP que reconocen diferentes epítopos de CGRP). Otras composiciones ejemplares comprenden más de un anticuerpo antagonista anti-CGRP que reconoce(n) el(los) mismo(s) epítopo(s), o diferentes especies de anticuerpos antagonistas anti-CGRP que se unen a diferentes epítopos de CGRP

Una composición puede comprender además portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables (Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover). Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. Una formulación terapéutica de un anticuerpo puede comprender uno o más portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables, con ejemplos no limitativos de tales especies que incluyen tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; sales como cloruro sódico; antioxidantes como ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquilparabenos, como el metil o el propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de unos 10 residuos); proteínas, como la seroalbúmina, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como la polivinilpirrolidona; aminoácidos (e.g., en concentraciones de 0,1 mM a 100 mM, 0,1 mM a 1 mM, 0.01 mM a 50 mM, 1 mM a 50 mM, 1 mM a 30 mM, 1 mM a 20 mM, 10 mM a 25 mM) como glicina, glutamina, metionina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono como glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes (p. ej., en concentraciones de 0,001 mg/ml a 1 mg/ml, 0,001 mg/ml a 1 mg/ml, 0,001 mg/ml a 0,1 mg/ml, 0,001 mg/ml a 0,01 mg/ml) como EDTA (p. ej., EDTA disódico dihidratado); azúcares (p. ej, en concentraciones de 1 mg/ml a 500 mg/ml, 10 mg/ml a 200 mg/ml, 10 mg/ml a 100 mg/ml, 50 mg/ml a 150 mg/ml) como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones formadores de sal como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos (por ejemplo, en concentraciones de 0,01 mg/ml a 10 mg/ml, 0,01 mg/ml a 1 mg/ml, 0,1 mg/ml a 1 mg/ml, 0,01 mg/ml a 0,5 mg/ml) como TWEEN™ (por ejemplo, polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80)), PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Los excipientes farmacéuticamente aceptables se describen con más detalle en el presente documento.

Un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo antagonista anti-CGRP) y las composiciones del mismo también pueden usarse junto con otros agentes que sirven para mejorar y/o complementar la eficacia de los agentes.

Los siguientes Ejemplos se proporcionan para ilustrar pero no limitar la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación y caracterización de anticuerpos monoclonales dirigidos contra CGRP

Generación de anticuerpos anti-CGRP. Para generar anticuerpos anti-CGRP que tengan reactividad entre especies para CGRP de rata y humano, se inmunizó a ratones con 25-100 |jg de a-CGRP humano o p-CGRP conjugado con KLH en adyuvante (50 j l por almohadilla plantar, 100 j l en total por ratón) a diversos intervalos. La inmunización se realizó generalmente como se describe en Geerligs HJ et al., 1989, J. Immunol. Methods 124:95-102; Kenney JS et al., 1989, J. Immunol. Methods 121:157-166; and Wicher K et al., 1989, Int. Arco. Allergy Appl. Immunol. 89:128-135. Primero se inmunizó a los ratones con 50 jg de a-CGRP humana o p-CGRP conjugada con KLH en CFA (adyuvante completo de Freund). A los 21 días, los ratones fueron inmunizados por segunda vez con 25 jg de p-CGRP humano (para los ratones inmunizados por primera vez con a-CGRP humano) o a-CGRP (para los ratones inmunizados por primera vez con p-CGRP humano) conjugado con KLH en IFA (adyuvante incompleto de Freund). Veintitrés días después de la segunda inmunización, se realizó una tercera inmunización con 25 jg de a-CGRP de rata conjugada con KLH en IFA. Diez días después, se analizaron los títulos de anticuerpos mediante ELISA. La cuarta inmunización se realizó con 25 jg del péptido (a-CGRP-KLH de rata) en IFA 34 días después de la tercera inmunización. El refuerzo final se realizó con 100 jg de péptido soluble (a-CGRP de rata) 32 días después de la cuarta inmunización.

Se obtuvieron esplenocitos del ratón inmunizado y se fusionaron con células de mieloma NSO en una proporción de 10:1, con polietilenglicol 1500. Los híbridos se sembraron en placas de 96 pocillos en DMEM con un 20% de suero de caballo y 2-oxaloacetato/piruvato/insulina (Sigma), y se inició la selección con hipoxantina/aminopterina/timidina. El día 8, se añadieron 100 j l de DMEM con un 20% de suero de caballo a todos los pocillos. Los sobrenadantes de los híbridos se analizaron mediante inmunoensayo de captura de anticuerpos. La determinación de la clase de anticuerpo se realizó con segundos anticuerpos específicos de clase.

Se seleccionó un panel de líneas celulares productoras de anticuerpos monoclonales basándose en su unión a CGRP humano y de rata para su caracterización adicional. Estos anticuerpos y sus características se muestran a continuación en las Tablas 2 y 3.

Purificación y preparación de fragmentos Fab. Los anticuerpos monoclonales seleccionados para su posterior caracterización se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivos de hibridomas mediante cromatografía de afinidad con proteína A. Los sobrenadantes se equilibraron a pH 8. A continuación, los sobrenadantes se cargaron en la columna de proteína A MabSelect (Amersham Biosciences # 17-5199-02) equilibrada con PBS a pH 8. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de PBS, pH 8. Los anticuerpos se eluyeron con tampón citrato-fosfato 50 mM, pH 3. Los anticuerpos eluidos se neutralizaron con tampón fosfato 1M, pH 8. Los anticuerpos purificados se dializaron con PBS, pH 7,4. Las concentraciones de anticuerpos se determinaron por SDS-PAGE, utilizando una curva estándar de anticuerpos monoclonales murinos.

Los Fabs se prepararon mediante proteólisis con papaína de los anticuerpos completos utilizando el kit Immunopure Fab (Pierce # 44885) y se purificaron mediante cromatografía de flujo a través de proteína A siguiendo las instrucciones del fabricante. Las concentraciones se determinaron por ELISA y/o electroforesis SDS-PAGE utilizando un Fab estándar de concentración conocida (determinada por análisis de aminoácidos), y por A280 utilizando 1OD=0,6 mg/ml (o equivalente teórico basado en la secuencia de aminoácidos).

Determinación de la afinidad de los Fabs. Las afinidades de los anticuerpos monoclonales anti-CGRP se determinaron a 25°C o 37°C utilizando el sistema de resonancia de plasmón superficial (SPR) Biacore3000™ (Biacore, INC, Piscataway NJ) con el tampón de funcionamiento propio del fabricante, HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v polisorbato P20). La afinidad se determinó capturando péptidos CGRP biotinilados N-terminalmente (pedidos a GenScript Corporation, Nueva Jersey o Global Peptide Services, Colorado) mediante estreptavidina preinmovilizada en el chip SA y midiendo la cinética de unión del anticuerpo Fab titulado a través de la superficie CGRP. El CGRP biotinilado se diluyó en HBS-EP y se inyectó sobre el chip a una concentración inferior a 0. 001 mg/ml. Utilizando un tiempo de flujo variable a través de los canales individuales del chip, se lograron dos rangos de densidad de antígeno: <50 unidades de respuesta (RU) para estudios cinéticos detallados y alrededor de 800 RU para estudios de concentración y cribado. Se inyectaron diluciones seriadas dobles o triples, normalmente a concentraciones comprendidas entre 1 pM - 0,1 nM (dirigidas a 0,1-1 0x KD estimada) de fragmentos Fab purificados durante 1 minuto a 100 pL/min y se permitieron tiempos de disociación de 10 minutos. Después de cada ciclo de unión, las superficies se regeneraron con NaOH 25 mM en etanol 25% v/v, lo que se toleró durante cientos de ciclos. La velocidad cinética de asociación (kon) y la velocidad de disociación (koff) se obtuvieron simultáneamente ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 de Langmuir (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). ) utilizando el programa BIAevaluation. Las constantes de disociación de equilibrio global (KD) o "afinidades" se calcularon a partir de la relación KD = koff/kon. Las afinidades de los fragmentos Fab murinos se muestran en las Tablas 2 y 3.

Mapeo de epítopos de los anticuerpos murinos anti-CGRP Para determinar el epítopo al que se unen los anticuerpos anti-CGRP en la a-CGRP humana, se midieron las afinidades de unión de los fragmentos Fab a diversos fragmentos de CGRP, tal como se ha descrito anteriormente, capturando fragmentos de CGRP N-terminalmente biotinilados aminoácidos 19-37 y aminoácidos 25-37 en un chip sensor SA. La Figura 1 muestra sus afinidades de unión medidas a 25°C. Como se muestra en la Figura 1, todos los anticuerpos, excepto el anticuerpo 4901, se unen a los fragmentos 19-37 y 25-37 de a-CGRP humana con afinidad similar a su afinidad de unión a la a-CGRP humana de longitud completa (1-37). El anticuerpo 4901 se une al fragmento a-CGRP humano 25-37 con una afinidad seis veces menor que la unión al fragmento a-CGRP humano de longitud completa, debido principalmente a una pérdida en la tasa de desactivación. Los datos indican que estos anticuerpos anti-CGRP se unen generalmente al extremo C-terminal del CGRP

Se realizó un barrido de alanina para caracterizar aún más los aminoácidos de la a-CGRP humana implicados en la unión de anticuerpos anti-CGRP Se generaron diferentes variantes de a-CGRP humana con sustituciones únicas de alanina mediante síntesis peptídica. Sus secuencias de aminoácidos se muestran en la Tabla 4 junto con todos los demás péptidos utilizados en el análisis Biacore. Las afinidades de los fragmentos Fab de los anticuerpos anti-CGRP a estas variantes se determinaron utilizando Biacore como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en la Figura 1, los 12 anticuerpos se dirigen a un epítopo C-terminal, siendo el aminoácido F37 el residuo más crucial. La mutación de F37 a alanina redujo significativamente la afinidad o incluso anuló por completo la unión de los anticuerpos anti-CGRP al péptido. El siguiente residuo de aminoácido más importante es G33, sin embargo, sólo los anticuerpos de alta afinidad (7E9, 8B6, 10A8 y 7011) se vieron afectados por la sustitución de alanina en esta posición. El residuo de aminoácido S34 también desempeña un papel significativo, aunque menor, en la unión de estos cuatro anticuerpos de alta afinidad.

Tabla 2. Características de la unión de los anticuerpos monoclonales anti-CGRP a la a-CGRP humana y su actividad antagonista

Nota; Anticuerpo 4901 es comerclalmente disponible (Sigma., Producto No. C7113). N.d.= no determina da

Tabla 3. Características de la unión de los anticuerpos monoclonales anti-CGRP a la a-CGRP de rata y actividad antagonista

"n.d ™ indica no realizar prueba para el anticuerpo

Tabla 4. Secuencias de aminoácidos de fragmentos de a-CGRP humana (SEQ ID N.°S:15-40) y péptidos relacionados (SEQ ID N.°S:41-47). Todos los péptidos están amidados C-terminalmente excepto Se Q ID N.°S:36-40.

Los residuos en negrita indican mutaciones puntuales.

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Ejemplo 2: Cribado de anticuerpos antagonistas anti-CGRP mediante ensayos in vitro.

Los anticuerpos murinos anti-CGRP fueron examinados adicionalmente para actividad antagonista in vitro usando ensayo de activación de AMPc basado en células y ensayo de unión.

Actividad antagonista medida por ensayo de AMPc. Se dispensaron cinco microlitros de a-CGRP humana o de rata (concentración final 50 nM) en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-CGRP (concentración final 1-3000 nM), o de a-CGRP de rata o a-CGRP humana (concentración final 0,1 nM-10 pM; como control positivo de la activación del AMPc) en una placa de 384 pocillos (Nunc, Cat. N.° 264657). Se añadieron 10 microlitros de células (SK-N-MC humanas si se utiliza a-CGRP humana, o L6 de rata de ATCC si se utiliza a-CGRP de rata) en tampón de estimulación (20 mM HEPES, pH 7,4, 146 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, y 500 uM 3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)) en los pocillos de la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Tras la incubación, se realizó la activación del AMPc mediante el ensayo de complementación de fragmentos enzimáticos HitHunter™ (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ensayo se basa en una enzima p-galactosidasa modificada genéticamente que consta de dos fragmentos denominados aceptor enzimático (EA) y donante enzimático (ED). Cuando los dos fragmentos se separan, la enzima está inactiva. Cuando los fragmentos están juntos pueden recombinarse espontáneamente para formar una enzima activa mediante un proceso denominado complementación. La plataforma de ensayo EFC utiliza un conjugado péptido ED-cAMP en el que el cAMP es reconocido por el anti-cAMP. Este fragmento ED es capaz de reasociarse con EA para formar enzima activa. En el ensayo, el anticuerpo anti-cAMP se titula de forma óptima para unirse al conjugado ED-cAMP e inhibir la formación de la enzima. Los niveles de AMPc en muestras de lisado celular compiten con el conjugado ED-cAMP para unirse al anticuerpo anti-cAMP. La cantidad de conjugado ED libre en el ensayo es proporcional a la concentración de AMPc. Por lo tanto, el AMPc se mide por la formación de enzima activa que se cuantifica por el recambio del sustrato luminiscente p-galactosidasa. El ensayo de activación del AMPc se realizó añadiendo 10 j l de tampón de lisis y anticuerpo anti-AMPc (proporción 1:1), tras lo cual se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos. A continuación, se añadieron 10 j l de reactivo ED-cAMP en cada pocillo y se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, se añadieron 20 j l de reactivo EA y mezcla CL (que contiene el sustrato) (proporción 1:1) en cada pocillo y se incubaron durante 1-3 horas o toda la noche a temperatura ambiente. La placa se leyó a 1 segundo/pocillo en el instrumento PMT o a 30 segundos/pocillo en el generador de imágenes. Los anticuerpos que inhiben la activación de AMPc por a-CGRP se identificaron (denominados "sí") en las Tablas 2 y 3 anteriores. Los datos de las Tablas 2 y 3 indican que los anticuerpos que demostraron actividad antagonista en el ensayo suelen tener una alta afinidad. Por ejemplo, los anticuerpos con una KD (determinada a 25°C) de unos 80 nM o menos frente a la a-CGRP humana o con una KD (determinada a 37°C) de unos 47 nM o menos frente a la a-CGRP de rata mostraron actividad antagonista en este ensayo.

Ensayo de unión del radioligando. Se realizó un ensayo de unión para medir el IC50 del anticuerpo anti-CGRP en el bloqueo de la unión del CGRP al receptor como se ha descrito anteriormente. Zimmermann et al., Peptides 16:421-4, 1995; Mallee et al., J. Biol. Chem. 277:14294-8, 2002. Las membranas (25 jg ) de células SK-N-MC se incubaron durante 90 min a temperatura ambiente en tampón de incubación (50 mM Tris-HCL, pH 7,4, 5 mM MgCL2, 0,1% BSA) que contenía 10 pM de a-CGRP humana 125I en un volumen total de 1 ml. Para determinar las concentraciones de inhibición (IC50), se disolvieron anticuerpos o CGRP sin marcación (como control), procedentes de una solución madre aproximadamente 100 veces superior, a concentraciones variables en el tampón de incubación y se incubaron al mismo tiempo con membranas y 10 pM de a-CGRP humana 125I. La incubación se terminó por filtración a través de un filtro de microfibra de vidrio (GF/B, 1 jm ) que había sido bloqueado con polietilimina al 0,5%. Se trazaron curvas dosis-respuesta y se determinaron los valores Ki mediante la ecuación: Ki = IC50/(1+([ligando]/KD); donde la constante de disociación de equilibrio KD = 8 pM para a-CGRP humano al receptor CGRP1 presente en las células SK-N-MC, y Bmax = 0,025 pmol/mg de proteína. El valor IC50 notificado (en términos de moléculas de IgG) se convirtió en sitios de unión (multiplicándolo por 2) para poder compararlo con las afinidades (KD) determinadas por Biacore (véase la Tabla 2).

La Tabla 2 muestra el IC50 de los anticuerpos murinos 7E9, 8B6, 6H2 y 4901. Los datos indican que la afinidad de los anticuerpos está generalmente correlacionada con la IC50: los anticuerpos con mayor afinidad (valores KD más bajos) tienen una IC50 más bajo en el ensayo de unión del radioligando.

Ejemplo 3: Efecto de los anticuerpos antagonistas anti-CGRP sobre la vasodilatación cutánea inducida por la estimulación del nervio safeno de rata.

Para probar la actividad antagonista de los anticuerpos anti-CGRP, se probó el efecto de los anticuerpos sobre la vasodilatación cutánea por estimulación del nervio safeno de rata utilizando un modelo de rata descrito previamente. Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110:772-776, 1993. En este modelo de rata, la estimulación eléctrica del nervio safeno induce la liberación de CGRP de las terminaciones nerviosas, lo que provoca un aumento del flujo sanguíneo cutáneo. Se midió el flujo sanguíneo en la piel del pie de ratas macho Sprague Dawley (170-300 g, de Charles River Hollister) tras la estimulación del nervio safeno. Las ratas se mantuvieron anestesiadas con isoflurano al 2%. Se administró tosilato de bretilio (30 mg/kg, por vía intravenosa) al principio del experimento para minimizar la vasoconstricción debida a la estimulación concomitante de las fibras simpáticas del nervio safeno. La temperatura corporal se mantuvo a 37°C mediante el uso de una sonda rectal conectada termostáticamente a una almohadilla térmica de temperatura controlada. Los compuestos, incluidos los anticuerpos, el control positivo (CGRP 8-37) y el vehículo (PBS, 0,01% Tween 20) se administraron por vía intravenosa a través de la vena femoral derecha, excepto en el experimento mostrado en la Figura 3, en el que el compuesto de prueba y el control se inyectaron a través de la vena caudal, y en los experimentos mostrados en las Figuras 2A y 2B, los anticuerpos 4901 y 7D11 se inyectaron por vía intraperitoneal (IP). El compuesto de control positivo CGRP 8-37 (antagonista de la vasodilatación), debido a su corta vida media, se administró 3-5 min antes de la estimulación nerviosa a 400 nmol/kg (200 jl). Tan et al., Clin. Sci.

89:656-73, 1995. Los anticuerpos se administraron en diferentes dosis (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg y 25 mg/kg).

Para los experimentos mostrados en las Figuras 2A y 2B, el anticuerpo 4901 (25 mg/kg), el anticuerpo 7D11 (25 mg/kg), o el control del vehículo (PBS con 0,01% Tween 20) se administró por vía intraperitoneal (IP) 72 horas antes de la estimulación del pulso eléctrico. Para el experimento mostrado en la Figura 3, se administró por vía intravenosa el anticuerpo 4901 (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg o 25 mg/kg) o el vehículo de control (PBS con 0,01% de Tween 20) 24 horas antes de la estimulación por impulsos eléctricos. Tras la administración de los anticuerpos o del vehículo de control, se expuso quirúrgicamente el nervio safeno del miembro posterior derecho, se cortó proximalmente y se cubrió con una envoltura de plástico para evitar que se secara. Se colocó una sonda láser Doppler sobre la cara medio-dorsal de la piel de la pata trasera, que es la región inervada por el nervio safeno. El flujo sanguíneo cutáneo, medido como flujo de células sanguíneas, se controló con un flujómetro láser Doppler. Cuando se estableció un flujo de línea de base estable (menos del 5% de variación) durante al menos 5 min, el nervio se colocó sobre electrodos bipolares de platino y se estimuló eléctricamente con 60 pulsos (2 Hz, 10 V, 1 ms, durante 30 seg) y de nuevo 20 minutos después.

El cambio acumulativo en el flujo sanguíneo cutáneo se estimó mediante el área bajo la curva flujo-tiempo (AUC, que es igual al cambio en el flujo multiplicado por el cambio en el tiempo) para cada respuesta de flujo a la estimulación del pulso eléctrico. Se tomó la media de la respuesta del flujo sanguíneo a las dos estimulaciones. Se mantuvo a los animales bajo anestesia durante un periodo de una a tres horas.

Como se muestra en la Figura 2A y Figura 2B, el aumento del flujo sanguíneo estimulado por la aplicación de pulsos electrónicos en el nervio safeno fue inhibido por la presencia de CGRP 8-37 (400 nmol/kg, administrado i.v), anticuerpo 4901 (25 mg/kg, administrado ip), o anticuerpo 7D11 (25 mg/kg, administrado ip) en comparación con el control. El CGRP 8-37 se administró 3-5 min antes de la estimulación del nervio safeno; y los anticuerpos se administraron 72 horas antes de la estimulación del nervio safeno. Como se muestra en la Figura 3, el aumento del flujo sanguíneo estimulado mediante la aplicación de pulsos electrónicos en el nervio safeno se inhibió con la presencia del anticuerpo 4901 a diferentes dosis (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg y 25 mg/kg) administrado por vía intravenosa 24 h antes de la estimulación del nervio safeno.

Para los experimentos mostrados en las Figuras 4A y 4B, el nervio safeno fue expuesto quirúrgicamente antes de la administración del anticuerpo. Se expuso quirúrgicamente el nervio safeno del miembro posterior derecho, se cortó proximalmente y se cubrió con una envoltura de plástico para evitar que se secara. Se colocó una sonda láser Doppler sobre la cara medio-dorsal de la piel de la pata trasera, que es la región inervada por el nervio safeno. El flujo sanguíneo cutáneo, medido como flujo de células sanguíneas, se controló con un flujómetro láser Doppler. Treinta a cuarenta y cinco minutos después de la inyección de tosilato de bretilio, cuando se estableció un flujo de línea de base estable (menos del 5% de variación) durante al menos 5 min, el nervio se colocó sobre electrodos bipolares de platino y se estimuló eléctricamente (2 Hz, 10 V, 1 ms, durante 30 s) y de nuevo 20 minutos después. La media de la respuesta del flujo sanguíneo a estas dos estimulaciones se utilizó para establecer la respuesta basal (tiempo 0) a la estimulación eléctrica. A continuación, se administraron por vía intravenosa (i.v.) el anticuerpo 4901 (1 mg/kg o 10 mg/kg), el anticuerpo 7E9 (10 mg/kg), el anticuerpo 8B6 (10 mg/kg) o el vehículo (PBS con 0,01% de Tween 20). Posteriormente, se estimuló el nervio (2 Hz, 10 V, 1 ms, durante 30 segundos) a los 30, 60, 90 y 120 minutos de la administración del anticuerpo o del vehículo. Los animales se mantuvieron bajo anestesia durante un periodo aproximado de tres horas. El cambio acumulativo en el flujo sanguíneo cutáneo se estimó mediante el área bajo la curva flujo-tiempo (AUC, que es igual al cambio en el flujo multiplicado por el cambio en el tiempo) para cada respuesta de flujo a las estimulaciones de impulsos eléctricos.

Como se muestra en la Figura 4A, el aumento del flujo sanguíneo estimulado mediante la aplicación de pulsos electrónicos en el nervio safeno se inhibió significativamente por la presencia del anticuerpo 4901 1 mg/kg administrado i.v., cuando la estimulación por impulsos electrónicos se aplicó a los 60 min, 90 min y 120 min después de la administración del anticuerpo, y el aumento del flujo sanguíneo estimulado por la aplicación de impulsos electrónicos en el nervio safeno se inhibió significativamente por la presencia del anticuerpo 4901 10 mg/kg administrado i.v., cuando la estimulación por impulsos electrónicos se aplicó a los 30 min, 60 min, 90 min y 120 min después de la administración del anticuerpo. La figura 4B muestra que el aumento del flujo sanguíneo estimulado mediante la aplicación de pulsos electrónicos en el nervio safeno se inhibió significativamente por la presencia del anticuerpo 7E9 (10 mg/kg, administrado i.v.) cuando la estimulación por pulsos electrónicos se aplicó a los 30 min, 60 min, 90 min y 120 min después de la administración del anticuerpo, y por la presencia del anticuerpo 8B6 (10 mg/kg, administrado i.v.) cuando la estimulación por pulsos electrónicos se aplicó a los 30 min después de la administración del anticuerpo.

Estos datos indican que los anticuerpos 4901, 7E9, 7D11 y 8B6 son eficaces para bloquear la actividad de CGRP medida por la vasodilatación cutánea inducida por la estimulación del nervio safeno de rata.

Ejemplo 4. Caracterización del anticuerpo anti-CGRP G1 y sus variantes

Las secuencias de aminoácidos para la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-CGRP G1 se muestran en la Figura 5. Se utilizaron los siguientes métodos para la expresión y caracterización del anticuerpo G1 y sus variantes.

Vector de expresión utilizado. La expresión del fragmento Fab de los anticuerpos se realizó bajo el control de un promotor lacZ inducible por IPTG similar al descrito en Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg. 2.10. Vector pComb3X), sin embargo, las modificaciones incluyeron la adición y expresión de los siguientes dominios adicionales: el dominio constante de la cadena ligera Kappa humana y el dominio constante CH1 de la inmunoglobulina humana IgG2, región C de la cadena gamma-2 Ig, número de acceso proteico P01859; cadena ligera de la inmunoglobulina kappa (homosapiens), número de acceso proteico CAA09181.

Preparación de Fab a pequeña escala. A partir de E. Coli transformadas (utilizando células TG1 competentes para la electroporación o células Top 10 competentes químicamente) con una biblioteca Fab, se utilizaron colonias individuales para inocular tanto una placa maestra (agar LB carbenicilina (50 ug/ml) 2% de glucosa) como una placa de trabajo (2 ml/pocillo, 96 pocillos/placa) en la que cada pocillo contenía 1,5 ml LB carbenicilina (50 ug/ml) 2% de glucosa.

Se aplicó a la placa un sello adhesivo permeable a los gases (ABgene, Surrey, Reino Unido). Ambas placas se incubaron a 30°C durante 12-16h; la placa de trabajo se agitó enérgicamente. La placa maestra se almacenó a 4°C hasta que se necesitó, mientras que las células de la placa de trabajo se pelletearon (4000 rpm, 4°C, 20 min) y se resuspendieron en 1,0 ml LB carbenicilina (50 ug/ml) 0,5 mM IPT<g>para inducir la expresión de Fabs mediante agitación vigorosa durante 5h a 30°C. Las células inducidas se centrifugaron a 4000 rpm, 4°C durante 20 minutos y se resuspendieron en 0,6 ml de tampón Biacore HB-SEP (10 mM Hepes pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v P20). La lisis de las células HB-SEP resuspendidas se realizó mediante congelación (-80°C) y posterior descongelación a 37°C. Los lisados celulares se centrifugaron a 4000 rpm, 4°C durante 1 hora para separar los restos de los sobrenadantes que contenían Fab, que posteriormente se filtraron (0,2 um) utilizando una placa de filtración de 96 pocillos Millipore MultiScreen Assay System y un colector de vacío. Se utilizó Biacore para analizar sobrenadantes filtrados inyectándolos a través de CGRPs en el chip sensor. Los clones seleccionados por afinidad que expresaban Fabs se rescataron de la placa maestra, que proporcionó ADN molde para PCR, secuenciación y preparación de plásmidos.

Preparación de Fab a gran escala. Para obtener los parámetros cinéticos, los Fab se expresaron a mayor escala de la siguiente manera. Se inocularon matraces Erlenmeyer que contenían 150 ml de LB carbenicilina (50 ug/ml) 2% de glucosa con 1 ml de un cultivo "iniciador" de una noche de un clon de E. Coli que expresaba Fab seleccionado por afinidad. El resto del cultivo iniciador (~3 ml) se utilizó para preparar ADN plasmídico (kit QIAprep mini-prep, Qiagen) para secuenciación y manipulación posterior. El cultivo grande se incubó a 30°C con agitación vigorosa hasta alcanzar una DO600nm de 1,0 (normalmente 12-16 h). Las células se separaron por centrifugación a 4000 rpm, 4°C durante 20 minutos, y se resuspendieron en 150 ml de LB carbenicilina (50 ug/ml) 0,5 mM IPTG. Tras 5 h de expresión a 30°C, las células se pelletearon por centrifugación a 4000 rpm, 4°C durante 20mins, se resuspendieron en 10 ml de tampón Biacore HBS-EP, y se lisaron utilizando un único ciclo de congelación (-80°C)/descongelación (37°C). Los lisados celulares se precipitaron por centrifugación a 4000rpm, 4°C durante 1 hora, y el sobrenadante se recogió y filtró (0,2um). Los sobrenadantes filtrados se cargaron en sefarosa Ni-NTA superflow (Qiagen, Valencia. CA) equilibradas con PBS, pH 8, y luego lavadas con 5 volúmenes de columna de PBS, pH 8. Los Fabs individuales eluyeron en diferentes fracciones con PBS (pH 8) 300 mM de Imidazol. Las fracciones que contenían Fabs se agruparon y dializaron en PBS, luego se cuantificaron por ELISA antes de la caracterización por afinidad.

Preparación completa de anticuerpos. Para la expresión de anticuerpos completos, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera se clonaron en vectores de expresión de mamíferos y se transfectaron utilizando lipofectamina en células HEK 293 para la expresión transitoria. Los anticuerpos se purificaron con proteína A utilizando métodos estándar.

El vector pDb.CGRP.hFcGI es un vector de expresión que comprende la cadena pesada del anticuerpo G1, y es adecuado para la expresión transitoria o estable de la cadena pesada. El vector pDb.CGRP.hFcGI tiene secuencias de nucleótidos correspondientes a las siguientes regiones: la región promotora del citomegalovirus murino (nucleótidos 7-612); un intrón sintético (nucleótidos 613-1679); la región codificante de la DHFR (nucleótidos 688-1253); el péptido señal de la hormona de crecimiento humana (nucleótidos 1899-1976); la región variable de la cadena pesada de G1 (nucleótidos 1977-2621); la región constante de la cadena pesada de IgG2 humana que contiene las siguientes mutaciones: A330P331 a S330S331 (numeración de aminoácidos con referencia a la secuencia IgG2 de tipo salvaje; véase Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624). El vector pDb.CGRP.hFcGI se depositó en el ATCC el 15 de julio de 2005 y se le asignó el número de acceso ATCC PTA-6867.

El vector pEb.CGRP.hKGI es un vector de expresión que comprende la cadena ligera del anticuerpo G1, y es adecuado para la expresión transitoria de la cadena ligera. El vector pEb.CGRP.hKGI tiene secuencias de nucleótidos correspondientes a las siguientes regiones: la región promotora del citomegalovirus murino (nucleótidos 2-613); el intrón EF-1 humano (nucleótidos 614-1149); el péptido señal de la hormona de crecimiento humana (nucleótidos 1160 1237); la región variable de la cadena ligera G1 del anticuerpo (nucleótidos 1238-1558); la región constante de la cadena kappa humana (nucleótidos 1559-1882). El vector pEb.CGRP.hKGI se depositó en el ATCC el 15 de julio de 2005 y se le asignó el número de acceso ATCC PTA-6866.

Ensayo Biacore para la determinación de la afinidad. Las afinidades del anticuerpo monoclonal G1 y sus variantes se determinaron a 25°C o 37°C utilizando el sistema de resonancia de plasmón superficial (SPR) Biacore3000™ (Biacore, INC, Piscataway NJ). La afinidad se determinó capturando CGRP o fragmentos biotinilados N-terminalmente mediante estreptavidina preinmovilizada (chip sensor SA) y midiendo la cinética de unión de los fragmentos o variantes del anticuerpo G1 Fab titulados a través del CGRP o fragmento en el chip. Todos los ensayos Biacore se realizaron en tampón HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v polisorbato P20). Las superficies de CGRP se prepararon diluyendo el CGRP N-biotinilado a una concentración inferior a 0,001 mg/ml en tampón HBS-EP e inyectándolo a través del chip sensor SA utilizando tiempos de contacto variables. Las superficies de baja capacidad, correspondientes a niveles de captura <50 unidades de respuesta (RU), se utilizaron para estudios cinéticos de alta resolución, mientras que las superficies de alta capacidad (unas 800 RU de CGRP capturado) se emplearon para estudios de concentración, cribado y determinaciones de afinidad de soluciones. Los datos cinéticos se obtuvieron diluyendo el anticuerpo G1 Fab en serie en incrementos de dos o tres veces hasta concentraciones que abarcaban 1uM-0,1nM (dirigidas a una KD estimada de 0,1-10x). Las muestras se inyectaban normalmente durante 1 minuto a 100 |jl/min y se permitían tiempos de disociación de al menos 10 minutos. Después de cada ciclo de unión, las superficies se regeneraron con NaOH 25mM en etanol 25% v/v, lo que se toleró durante cientos de ciclos. Se ajustó globalmente toda una serie de valoración (generada normalmente por duplicado) a un modelo de unión de Langmuir 1:1 utilizando el programa BIAevaluation. El resultado fue un par único de constantes de velocidad cinética de asociación y disociación (kon y koff, respectivamente) para cada interacción de unión, cuya relación dio la constante de disociación de equilibrio (KD = koff/kon). Las afinidades (valores KD ) así determinadas figuran en las tablas 6 y 7.

Análisis de alta resolución de las interacciones de unión con velocidades extremadamente lentas. En el caso de las interacciones con velocidades extremadamente lentas (en particular, la unión del anticuerpo G1 Fab a la a-CGRP humana en el chip a 25°C), las afinidades se obtuvieron en un experimento en dos partes. Se utilizó el protocolo descrito anteriormente con las siguientes modificaciones. La constante de velocidad de asociación (kon) se determinó inyectando una serie de valoración doble (por duplicado) que abarcaba 550 nM-1 nM durante 30 segundos a 100 ul/min y permitiendo sólo una fase de disociación de 30 segundos. La constante de velocidad de disociación (koff) se determinó inyectando tres concentraciones (alta, media y baja) de la misma serie de valoración por duplicado durante 30 s y permitiendo una fase de disociación de 2 horas. La afinidad (KD) de cada interacción se obtuvo combinando los valores kon y koff obtenidos en ambos tipos de experimentos, como se muestra en la Tabla 5.

Determinación de la afinidad de la solución por Biacore. La afinidad en solución del anticuerpo G1 por la a-CGRP de rata y la a-CGRP humana F37A (19-37) fue medida por Biacore a 37°C. Se utilizó una superficie de chip CGRP de alta capacidad (se eligió el a-CGRP humano de alta afinidad para fines de detección) y el tampón de funcionamiento HBS-EP se hizo fluir a 5 ul/min. Se preincubó el fragmento Fab del anticuerpo G1 a una concentración constante de 5 nM (con el objetivo de que fuera igual o inferior a la KD esperada de la interacción basada en solución) con el péptido competidor, bien a-CGRP de rata o a-CGRP humano F37A (19-37), a concentraciones finales que oscilaban entre 1 nM y 1 uM en diluciones seriadas de 3 veces. Se inyectaron soluciones de anticuerpo G1 Fab, en ausencia o presencia de un péptido competidor en solución, a través del CGRP en el chip y se monitorizó el agotamiento de las respuestas de unión detectadas en la superficie del chip como resultado de la competición en solución. Estas respuestas de unión se convirtieron en "concentraciones de Fab libre" utilizando una curva de calibración, que se construyó titulando el anticuerpo G1 Fab solo (5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,325 y 0 nM) a través del CGRP en el chip. Las "concentraciones de Fab libre" se trazaron frente a la concentración del péptido competidor en solución utilizado para generar cada punto de datos y se ajustaron a un modelo de afinidad en solución utilizando el software BIAevaluation. Las afinidades en solución determinadas (indirectamente) de este modo se muestran en las Tablas 5 y 7 y se utilizaron para validar las afinidades obtenidas cuando los Fabs se inyectan directamente a través de CGRPs N-biotinilados en un chip SA. La estrecha concordancia entre las afinidades determinadas por estos dos métodos confirma que la fijación de una versión N-biotinilada del CGRP al chip no altera su actividad de unión en solución nativa.

La Tabla 5 a continuación muestra las afinidades de unión del anticuerpo G1 a a-CGRP humano, p-CGRP humano, a-CGRP de rata y p-CGRP de rata determinadas por Biacore, haciendo fluir fragmentos Fab a través de CGRPs N-biotinilados en un chip SA. Para resolver mejor las afinidades de las interacciones de unión con velocidades de salida extremadamente lentas, también se determinaron las afinidades en un experimento de dos partes para complementar esta orientación del ensayo, también se determinó la afinidad en solución de la interacción a-CGRP de rata (como se ha descrito anteriormente). La estrecha concordancia de las afinidades medidas en ambas orientaciones del ensayo confirma que la afinidad de unión de la a-CGRP nativa de rata en solución no se altera cuando se N-biotinila y se une a un chip SA.

Tabla 5. Afinidades de unión de los Fabs del anticuerpo G1 valorados a través de CGRPs en el chip

Las afinidades para a-CGRPs (rata y humano) se determinaron en un experimento de alta resolución en dos partes, en el que la fase de disociación se monitorizó durante 2 horas (los valores para kon, koff y KD representan la media de n experimentos replicados con la desviación estándar expresada como varianza porcentual). Las afinidades para las p-CGRPs (rata y humano) se determinaron mediante un análisis global utilizando sólo una fase de disociación de 20 minutos, que no fue lo suficientemente precisa como para cuantificar sus tasas de disociación extremas (sus tasas de disociación son probablemente más lentas de lo que se indica aquí y, por lo tanto, sus afinidades son probablemente aún mayores). El anticuerpo G1 Fab se disoció muy lentamente de todos los CGRP (excepto a-rat CGRP) con tasas de disociación que se acercaban al límite de resolución del ensayo Biacore (especialmente a 25°C).

" Afinidad en solución determinada midiendo el agotamiento de las respuestas de unión detectadas en CGRP en el chip para el anticuerpo G1 Fab preincubado con un competidor a-CGRP de rata en solución.

La Tabla 6 a continuación muestra anticuerpos que tienen la variación de secuencia de aminoácidos en comparación con el anticuerpo G1 y sus afinidades tanto a a-CGRP de rata como a a-CGRP humana. Todas las sustituciones de aminoácidos de las variantes mostradas en la Tabla 6 se describen en relación con la secuencia de G1. Biacore determinó las afinidades de unión de los fragmentos Fab haciéndolos fluir a través de los CGRP en un chip SA.

Tabla 6. Secuencias de aminoácidos y datos de afinidad de unión de las variantes del anticuerpo G1 determinadas a 37°C por Biacore.

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

Todos los CDR, incluidos los de Kabat y Chothia. Los residuos de aminoácidos están numerados secuencialmente (véase la Figura 5). Todos los clones tienen secuencias L3+H1+H3 idénticas a G1.

KD = koff/kon. Todos los valores de koff se determinaron en modo de cribado, excepto los subrayados, que se obtuvieron mediante el análisis global de una serie de concentraciones de Fab (G1 se analizó en modo de alta resolución). Por lo tanto, los valores de KD subrayados se determinaron experimentalmente midiendo el kon. Los demás valores de kon se estimaron iguales a los de M25.

n.d. = no determinado

Para determinar el epítopo en a-CGRP humano que es reconocido por el anticuerpo G1, se utilizaron los ensayos Biacore descritos anteriormente. La a-CGRP humana se adquirió en una versión N-biotinilada para permitir su captura de alta afinidad mediante chips sensores SA. Se determinó la unión del fragmento G1 Fab al a-CGRP humano en el chip en ausencia o presencia de un péptido CGRP. Normalmente, se inyectaba una solución 2000:1 mol de péptido/Fab (por ejemplo, 10 uM de péptido en 50nM de G1 Fab) a través de la a-CGRP humana en el chip. La Figura 6 muestra el porcentaje de unión bloqueado por el péptido competidor. Los datos mostrados en la Figura 6 indican que los péptidos que bloquean al 100% la unión de G1 Fab a a-CGRP humana son 1-37 (WT), 8-37, 26-37, P29A (19-37), K35A (19-37), K35E (19-37) y K35M (19-37) de a-CGRP humana; 1-37 de p-CGRP (WT); 1-37 de a-CGRP de rata (WT); y 1-37 de p-CGRP de rata (WT). Todos estos péptidos están amidados en el extremo C. Los péptidos F37A (19 37) y 19-37 (este último no amidado en el extremo C) de la a-CGRP humana también bloquearon entre el 80% y el 90% de la unión del G1 Fab a la a-CGRP humana. El péptido 1-36 (no amidado en el extremo C) de la a-CGRP humana bloqueó aproximadamente el 40% de la unión del G1 Fab a la a-CGRP humana. El fragmento peptídico 19 36 (amidado en el C-terminal) de la a-CGRP humana; los fragmentos peptídicos 1-13 y 1-19 de la a-CGRP humana (ninguno de los cuales está amidado en el C-terminal); y la amilina, calcitonina y adrenomedulina humanas (todas amidadas en el C-terminal) no compitieron con la unión del G1 Fab a la a-CGRP humana en el chip. Estos datos demuestran que G1 se dirige a un epítopo C-terminal de CGRP y que tanto la identidad del residuo más terminal (F37) como su amidación son importantes para la unión.

También se determinaron las afinidades de unión de G1 Fab a variantes de a-CGRP humana (a 37°C). La Tabla 7 muestra las afinidades medidas directamente titulando G1 Fab a través de a-CGRP humana N-biotinilada y variantes en el chip. Los datos de la Tabla 7 indican que el anticuerpo G1 se une a un epítopo C-terminal siendo F37 y G33 los residuos más importantes. G1 no se une a CGRP cuando se añade un residuo de aminoácido extra (alanina) en el C-terminal (que está amidado).

Tabla 7. Afinidades de unión de G1 Fab a a-CGRP humana y variantes medidas a 37°C (véanse sus secuencias de aminoácidos en la Tabla 4).

Los datos anteriores indican que el epítopo al que se une el anticuerpo G1 se encuentra en el extremo C-terminal de la a-CGRP humana, y los aminoácidos 33 y 37 de la a-CGRP humana son importantes para la unión del anticuerpo G1. Además, la amidación del residuo F37 es importante para la unión.

Ejemplo 5: Efecto del anticuerpo antagonista anti-CGRP G1 sobre la vasodilatación cutánea inducida por la estimulación del nervio safeno de rata

Para probar la actividad antagonista del anticuerpo anti-CGRP G1, se probó el efecto del anticuerpo sobre la vasodilatación cutánea por estimulación del nervio safeno de rata usando un modelo de rata descrito en el Ejemplo 3. Brevemente, se mantuvo la anestesia de las ratas con isoflurano al 2%. Se administró tosilato de bretilio (30 mg/kg, por vía intravenosa) al principio del experimento para minimizar la vasoconstricción debida a la estimulación concomitante de las fibras simpáticas del nervio safeno. La temperatura corporal se mantuvo a 37°C mediante el uso de una sonda rectal conectada termostáticamente a una manta térmica de temperatura controlada. Se expuso quirúrgicamente el nervio safeno del miembro posterior derecho, se cortó proximalmente y se cubrió con una envoltura de plástico para evitar que se secara. Se colocó una sonda láser Doppler sobre la cara medio-dorsal de la piel de la pata trasera, que es la región inervada por el nervio safeno. El flujo sanguíneo cutáneo, medido como flujo de células sanguíneas, se controló con un flujómetro láser Doppler. En los experimentos para determinar los efectos del anticuerpo a las dos horas de la inyección, de treinta a cuarenta y cinco minutos después de la inyección de tosilato de bretilio, cuando se estableció un flujo de línea de base estable (menos del 5% de variación) durante al menos 5 min, se colocó el nervio sobre electrodos bipolares de platino y se estimuló eléctricamente (2 Hz, 10 V, 1 ms, durante 30 s) y de nuevo 20 minutos después. La media de la respuesta del flujo sanguíneo a estas dos estimulaciones se utilizó para establecer la respuesta basal (tiempo 0) a la estimulación eléctrica. A continuación, se administró por vía intravenosa (i.v.) el anticuerpo G1 (1 mg/kg o 10 mg/kg) o el vehículo (PBS con 0,01% de Tween 20 en volumen igual a 10 mg/kg de G1). Posteriormente, se estimuló el nervio (2 Hz, 10 V, 1 ms, durante 30 segundos) a los 30, 60, 90 y 120 minutos de la administración del anticuerpo. Los animales se mantuvieron bajo anestesia durante un periodo aproximado de tres horas. El cambio acumulativo en el flujo sanguíneo cutáneo se estimó mediante el área bajo la curva flujo-tiempo (AUC, que es igual al cambio en el flujo multiplicado por el cambio en el tiempo) para cada respuesta de flujo a las estimulaciones de impulsos eléctricos.

Como se muestra en la Figura 7, el aumento del flujo sanguíneo estimulado mediante la aplicación de pulsos electrónicos en el nervio safeno fue inhibido significativamente por la presencia del anticuerpo G1 a 1 mg/kg (administrado i.v.) en comparación con el vehículo, cuando el nervio safeno fue estimulado eléctricamente a los 90 min después de la administración del anticuerpo. El aumento del flujo sanguíneo estimulado mediante la aplicación de impulsos electrónicos en el nervio safeno se inhibió significativamente por la presencia del anticuerpo G1 a 10 mg/kg (administrado por vía i.v.) en comparación con el vehículo, cuando el nervio safeno se estimuló eléctricamente a los 90 minutos y 120 minutos después de la administración del anticuerpo.

En experimentos para determinar los efectos de los anticuerpos en puntos de tiempo más largos en el ensayo de safena, se inyectaron ratas i.v. con las dosis indicadas de anticuerpo 24 horas o 7 días antes de preparar al animal para la estimulación del nervio safeno como se describió anteriormente. En estos experimentos fue imposible establecer una respuesta basal en ratas individuales a la estimulación de impulsos eléctricos antes de la dosificación, por lo que los grupos tratados se compararon con animales dosificados con vehículo (PBS, 0,01% Tween 20) a las 24 horas o a los 7 días.

Como se muestra en las Figuras 8A y 8B, los aumentos del flujo sanguíneo en la piel dorso-medial de la pata trasera evocados por la estimulación del nervio safeno se inhibieron significativamente en los grupos de animales dosificados con 10 mg/kg o 3 mg/kg de G1 24 horas o 7 días antes de la estimulación, en comparación con los grupos de vehículos dosificados en los mismos puntos temporales.

La Figura 8C representa un análisis de ajuste de curva aplicado a los datos de respuesta de dosis representados en las figuras 8A y 8<b>para determinar la dosis requerida para un efecto máximo del 50% (EC50). La EC50 a las 24 horas es de 1,3 mg/kg y la EC50 a los 7 días es ligeramente inferior (0,8mg/kg).

Ejemplo 6: Efecto agudo del anticuerpo antagonista anti-CGRP mu7E9 en un ensayo de arteria dural (ventana craneal cerrada).

Modelo de ventana craneal cerrada: El propósito de este experimento era determinar el efecto agudo de los anticuerpos antagonistas anti-CGRP y compararlo con el efecto agudo del antagonista del receptor CGRP BIBN4096BS. Los experimentos se llevaron a cabo según lo descrito previamente (Williamson et al., Cephalalgia 17(4):518-24 (1997)) con las siguientes modificaciones. Las ratas Sprague Dawley (300-400g) fueron anestesiadas con 70mg/kg i.p. de pentobarbital. La anestesia se mantuvo con 20mg/kg/h i.v. de pentobarbital. Las ratas fueron canuladas a través de la vena yugular para la administración de todos los fármacos. La presión arterial se controló con una sonda (catéter mikro-tip, Millar Instruments) introducida a través de la arteria femoral hasta la aorta abdominal. Las ratas fueron traqueotomizadas y la frecuencia respiratoria se mantuvo en 75 respiraciones por minuto a un volumen de 3,5 ml. Tras fijar la cabeza en un instrumento estereotáctico y retirar el cuero cabelludo, se realizó una ventana de 2x6 mm en la zona parietal izquierda justo lateral a la sutura sagital mediante el adelgazamiento del hueso con una fresa dental. Utilizando un micromanipulador, se bajó un electrodo bipolar de platino sobre la superficie y se cubrió con aceite mineral pesado. Lateralmente a la ventana del electrodo se creó otra ventana de 5x6 mm y se rellenó con aceite mineral pesado a través de la cual se monitorizó continuamente el diámetro de una rama de la arteria meníngea media (AMM) con una cámara CCD y un analizador de dimensión de vídeo (Living Systems). Las ratas descansaron durante no menos de 45 minutos tras la preparación. Se estableció una respuesta de referencia a la estimulación eléctrica (15 V, 10 hz, pulsos de 0,5 ms, 30 segundos) y, a continuación, se administró a las ratas una dosis i.v. del compuesto experimental (10mg/kg mu7E9, 300|jg/kg BlBN4096BS o PBS 0,01%Tween 20). Se realizaron estimulaciones eléctricas adicionales a los 5 (BIBN4096BS), 30, 60, 90 y 120 minutos después de la dosificación. Todos los datos se registraron mediante un programa informático de gráficos (ADInstruments).

Como se muestra en la Figura 9 mu7E9 a 10mg/kg bloquea significativamente la dilatación de la MMA evocada por estimulación de campo eléctrico dentro de los 60 minutos después de la dosificación y mantiene el efecto durante toda la duración del ensayo (120 minutos). En comparación, el BIBN4096BS bloquea la dilatación de la MMA a los 5 minutos de la administración, pero el efecto desaparece por completo a los 90 minutos. La magnitud del bloqueo es comparable entre BIBN4096BS y mu7E9.

Ejemplo 7: Efecto crónico del anticuerpo antagonista anti-CGRP G1 en un ensayo de arteria dural (ventana craneal cerrada)

El propósito de este experimento fue determinar si el anticuerpo anti CGRP todavía podía bloquear la dilatación MMA estimulada eléctricamente 7 días después de la dosificación. La preparación de las ratas fue idéntica a la del experimento agudo descrito anteriormente (Ejemplo 6), con las siguientes excepciones. Las ratas fueron inyectadas i.v. (10mg/kg, 3mg/kg o 1 mg/kg G1) 7 días antes de crear la preparación y estimulación de la ventana craneal cerrada. Fue imposible establecer una respuesta de dilatación de referencia a la estimulación eléctrica antes de la dosificación como en el experimento agudo, por lo que los grupos de anticuerpos se compararon con la dilatación de la MMA en un grupo de control dosificado con vehículo (PBS, 0,01% Tween 20). Después de dejar descansar a las ratas durante no menos de 45 minutos, se estimuló eléctricamente la duramadre a intervalos de 30 minutos. Las estimulaciones fueron a 2,5 V, 5 V, 10 V, 15 V y 20 V, todas a 10 Hz, pulsos de 0,5 ms durante 30 segundos.

Como se muestra en la Figura 10 G1 a 10 mg/kg y 3 mg/kg bloqueó significativamente la dilatación de la MMA evocada por estimulación eléctrica en el rango de 10 a 20 voltios. Estos datos demuestran que G1 puede bloquear la dilatación de la MMA estimulada eléctricamente hasta 7 días después de la dosificación.

Ejemplo 8: Modelo de sofoco por abstinencia de morfina (como referencia)

El modelo de rata con síndrome de abstinencia de morfina es un modelo de roedor establecido para los mecanismos del sofoco menopáusico (Sipe et al., Brain Res. 1028(2):191-202 (2004); Merchenthaler et al., Maturitas 30:307-316 (1998); Katovich et al., Brain Res. 494:85-94 (1989); Simpkins et al., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)). Básicamente, las ratas se hacen adictas a la morfina implantándoles gránulos de morfina bajo la piel. Tras la adicción, se inyecta naloxona (antagonista opiáceo) a los animales, lo que les provoca un síndrome de abstinencia inmediato. Esta abstinencia va acompañada de un aumento de la temperatura cutánea, una disminución de la temperatura corporal central, un aumento de la frecuencia cardíaca y un aumento de la hormona luteinizante sérica. Todos ellos son similares en magnitud y tiempo a lo que ocurre en el sofoco humano (Simpkins et al., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)). Además, si se trata a las ratas con estradiol antes de inducirles el síndrome de abstinencia, se reducen los síntomas del sofoco (Merchenthaler et al., Maturitas 30:307-316 (1998)). Por eso se cree que el modelo de abstinencia de morfina imita el sofoco clínico.

Se encargaron ratas ovariectomizadas a Charles River Laboratories. No menos de 7 días después de la ovariectomía se creó dependencia a la morfina implantando un gránulo de morfina (75 mg de morfina base) por vía subcutánea. Dos días después se implantaron otros dos gránulos. Al día siguiente, se inyectó por vía intravenosa a las ratas 10 mg/kg de 4901 [**] o vehículo (PBS, 0,01% de tween). Dos días después de la segunda granulación, se anestesió a las ratas con ketamina (90 mg/kg) y se las sujetó ligeramente. Se pegó un termopar de temperatura superficial en la base de la cola y se utilizó un termopar rectal para medir la temperatura central. Los datos se registraron con el software Chart (ADInstruments). Tras registrar 15 minutos de temperatura basal estable, se inyectó naloxona (1mg/kg) por vía subcutánea. La temperatura se registró continuamente durante los 60 minutos siguientes. Los resultados se muestran en las figuras 11A y 11B.

Ejemplo 9: Tratamiento de la Migraña Crónica

Se identifica a un sujeto humano varón de 45 años que padece migraña crónica desde hace al menos tres meses. La identificación de haber padecido migraña crónica se consigue observando un historial de cefaleas frecuentes sugestivas de migraña crónica (por ejemplo, 15 días al mes) durante al menos tres meses antes del cribado. La verificación de la frecuencia de las cefaleas se consigue mediante información basal recogida prospectivamente que demuestre la existencia de cefaleas durante al menos 15 días, con al menos 8 días al mes que cumplan alguno de los siguientes requisitos: i. ser una crisis de migraña; y/o ii. ir precedidas o acompañadas de aura migrañosa.

Para reducir la incidencia de migraña en el sujeto, se administra al sujeto una dosis de 225 mg de anticuerpo antagonista anti-CGRP (por ejemplo, anticuerpo G1). El anticuerpo antagonista anti-CGRP se suministra como una formulación líquida a una concentración de 150 mg/ml. La dosis de 225 mg se administra como inyección subcutánea de 1,5 ml en la parte posterior de un brazo del cuerpo del sujeto. Alternativamente, la dosis puede suministrarse al sujeto mediante infusión intravenosa. En tales casos, 5,85 ml de 150 mg/ml de anticuerpo anti-CGRP pueden combinarse con solución de cloruro sódico al 0,9% (solución salina normal) en una bolsa IV para un volumen total de 130 ml en la bolsa. 100 ml del volumen de la bolsa IV se infunden por vía intravenosa al sujeto en el transcurso de una hora, para una dosis total de 225 mg. La dosificación se repite cada veintiocho días hasta que se observe una reducción de la incidencia de migraña. La reducción de la incidencia de la migraña crónica se examina utilizando diversos criterios que incluyen el número de días de cefalea, el número de horas durante las cuales se producen los dolores de cabeza (por ejemplo, horas de cefalea), la gravedad de los dolores de cabeza y el número de días de migraña observados en el sujeto.

Ejemplo 10: Tratamiento de la Migraña Crónica

Se identifica a un sujeto humano femenino de 37 años de edad que padece migraña crónica desde hace al menos tres meses. La identificación de haber padecido migraña crónica se consigue observando un historial de cefaleas frecuentes sugestivas de migraña crónica (por ejemplo, 15 días al mes) durante al menos tres meses antes del cribado. La verificación de la frecuencia de las cefaleas se consigue mediante información basal recogida prospectivamente que demuestre la existencia de cefaleas durante al menos 15 días, con al menos 8 días al mes que cumplan alguno de los siguientes requisitos: i. ser una crisis de migraña; y/o ii. ir precedidas o acompañadas de aura migrañosa.

[0204] Para reducir la incidencia de migraña en el sujeto, se administra al sujeto una dosis de carga inicial de 675 mg de anticuerpo antagonista anti-CGRP (por ejemplo, anticuerpo G1). El anticuerpo antagonista anti-CGRP se suministra como una formulación líquida a una concentración de 150 mg/ml. La dosis de carga de 675 mg se administra en forma de tres inyecciones subcutáneas de 225 mg y 1,5 ml en varias regiones (por ejemplo, parte posterior de los brazos, parte inferior del abdomen/barriga/cintura, parte anterior de los muslos, etc.) del cuerpo del sujeto. La dosis se repite cada veintiocho días a 225 mg (por ejemplo, mediante una inyección subcutánea de 1,5 ml en el brazo del sujeto) hasta que se observe una reducción de la incidencia de migraña. La reducción de la incidencia de la migraña crónica se examina utilizando diversos criterios que incluyen el número de días de cefalea, el número de horas durante las cuales se producen los dolores de cabeza (por ejemplo, horas de cefalea), la gravedad de los dolores de cabeza y el número de días de migraña observados en el sujeto.

Ejemplo 11: Tratamiento de la Migraña Crónica

Se identifica a un sujeto humano varón de 23 años de edad que padece migraña crónica desde hace al menos tres meses. La identificación de haber padecido migraña crónica se consigue observando un historial de cefaleas frecuentes sugestivas de migraña crónica (por ejemplo, 15 días al mes) durante al menos tres meses antes del cribado. La verificación de la frecuencia de las cefaleas se consigue mediante información basal recogida prospectivamente que demuestre la existencia de cefaleas al menos 15 días, con al menos 8 días al mes que cumplan UNO de los siguientes requisitos: i. calificarse como crisis de migraña; y/o ii. ir precedidas o acompañadas de aura migrañosa.

Para reducir la incidencia de migraña en el sujeto, se administra al sujeto una dosis de 900 mg de anticuerpo antagonista anti-CGRP (por ejemplo, anticuerpo G1). El anticuerpo antagonista anti-CGRP se suministra como una formulación líquida a una concentración de 150 mg/ml. La dosis de 900 mg se administra en cuatro inyecciones subcutáneas de 225 mg y 1,5 ml en diversas regiones (por ejemplo, parte posterior de los brazos, parte inferior del abdomen/barriga/cintura, parte anterior de los muslos, etc.) del cuerpo del sujeto. La dosificación se repite cada veintiocho días hasta que se observe una reducción de la incidencia de migraña. La reducción de la incidencia de la migraña crónica se examina utilizando diversos criterios que incluyen el número de días de cefalea, el número de horas durante las cuales se producen los dolores de cabeza (por ejemplo, horas de cefalea), la gravedad de los dolores de cabeza y el número de días de migraña observados en el sujeto.

Ejemplo 12: Tratamiento de la Migraña Episódica

Se identifica a un sujeto humano varón de 28 años de edad con migraña episódica de alta frecuencia. Los sujetos son identificados con migraña episódica de alta frecuencia utilizando criterios que incluyen: tener un historial de cefaleas de más de 8 días al mes durante al menos 3 meses antes del cribado; y verificación de la frecuencia de las cefaleas mediante información basal recogida prospectivamente que demuestre cefaleas (de cualquier tipo) de 8 a 14 días con al menos 8 días que cumplan los criterios de al menos uno de los siguientes: i. migraña; ii. migraña probable; y/o iii. uso de triptanes o compuestos de cornezuelo de centeno.

Para reducir la incidencia de migraña en el sujeto, se administra al sujeto una dosis de 675 mg de anticuerpo antagonista anti-CGRP (por ejemplo, anticuerpo G1). El anticuerpo antagonista anti-CGRP se suministra como una formulación líquida a una concentración de 150 mg/ml. La dosis de 675 mg se administra en tres inyecciones subcutáneas de 225 mg y 1,5 ml en diversas regiones (por ejemplo, parte posterior de los brazos, parte inferior del abdomen/barriga/cintura, parte anterior de los muslos, etc.) del cuerpo del sujeto. La dosificación se repite cada veintiocho días hasta que se observe una reducción de la incidencia de migraña. La reducción de la incidencia de la migraña episódica se examina utilizando diversos criterios que incluyen el número de días de cefalea, el número de horas durante las cuales se producen los dolores de cabeza (por ejemplo, horas de cefalea), la gravedad de los dolores de cabeza y el número de días de migraña observados en el sujeto.

Ejemplo 13: Tratamiento de la Migraña Episódica

Se identifica un sujeto humano femenino de 52 años de edad que padece migraña episódica con alta frecuencia. Los sujetos son identificados con migraña episódica de alta frecuencia utilizando criterios que incluyen: tener un historial de cefaleas de más de 8 días al mes durante al menos 3 meses antes del cribado; y verificación de la frecuencia de las cefaleas mediante información basal recogida prospectivamente que demuestre cefaleas (de cualquier tipo) de 8 a 14 días con al menos 8 días que cumplan los criterios de al menos uno de los siguientes: i. migraña; ii. migraña probable; y/o iii. uso de triptanes o compuestos de cornezuelo de centeno.

Para reducir la incidencia de migraña en el sujeto, se administra al sujeto una dosis de 225 mg de anticuerpo antagonista anti-CGRP (por ejemplo, anticuerpo G1). El anticuerpo antagonista anti-CGRP se suministra como una formulación líquida a una concentración de 150 mg/ml. La dosis de 225 mg se administra como inyección subcutánea de 1,5 ml en la parte posterior de un brazo del cuerpo del sujeto. La dosificación se repite cada veintiocho días hasta que se observe una reducción de la incidencia de migraña. La reducción de la incidencia de la migraña episódica se examina mediante una serie de observaciones que incluyen la observación del número de días de cefalea, el número de horas durante las que se producen los dolores de cabeza, la gravedad de los dolores de cabeza y el número de días de migraña del sujeto.

Ejemplo 14: Toxicología No Clínica y Farmacocinética

El anticuerpo antagonista anti-CGRP G1 fue bien tolerado en estudios de toxicidad de dosis repetidas IV de 1 mes en ratas Sprague-Dawley (SD) y monos cynomolgus y no se determinó toxicidad en órganos diana en ninguno de estos estudios. Se estableció un nivel sin efectos adversos (NOAEL) de 100 mg/kg/semana tanto para los estudios con ratas como con monos. Este nivel de dosis correspondió a una exposición sistémica con una concentración máxima (Cmáx) de 2.570 y 3.440 pg/ml y áreas bajo la curva (AUC(0-168h)) de 194.000 pg-h/ml y 299.000 pg-h/ml (Día 22) en ratas y monos, respectivamente.

En un estudio IV/SC de 3 meses en ratas, no se identificaron toxicidades en órganos diana y G1 fue bien tolerado hasta la dosis más alta probada, 300 mg/kg. En un estudio con monos de 3 meses de duración, se observó inflamación perivascular de la arteria ciliar, como resultado de la deposición de complejos inmunes a >100 mg/kg. Este hallazgo se atribuyó a la respuesta inmunogénica del mono a un anticuerpo humanizado y no se consideró clínicamente relevante. La dosis más alta probada de 300 mg/kg en este estudio con monos es al menos 10 veces superior a la dosis clínica más alta prevista de 2.000 mg o 29 mg/kg (suponiendo un peso medio del sujeto de 70 kg).

Ejemplo 15: Farmacocinética Clínica

La FC del anticuerpo G1 tras una única exposición IV se examinó en cuatro estudios aleatorizados, controlados con placebo y doble ciego que examinaron dosis entre 10 y 2.000 mg. Las concentraciones plasmáticas máximas (Cmax) se alcanzaron poco después de finalizar la infusión intravenosa de 1 hora. La mediana del tiempo hasta la Cmax (Tmax) osciló entre 1,0 y 3,0 horas, seguida de un descenso multifásico. La Cmax y la exposición total aumentaron de forma aproximadamente lineal con dosis crecientes de G1. La semivida terminal (t1^ ) osciló entre 36,4 y 48,3 días. No hay evidencia de metabolismo G1 en el hígado, el modo primario de metabolismo es por degradación proteosómica.

Un estudio definió la farmacocinética de dosis de 30 mg y 300 mg administradas dos veces, con un intervalo de dos semanas. Las concentraciones máximas y el área bajo el perfil concentración-tiempo aumentaron con el incremento de la dosis. La semivida terminal aparente (t1^ ) tras la segunda dosis fue de 41,2 días (30 mg) y 50,0 días (300 mg) (media aritmética). Los coeficientes de acumulación plasmática de G1 tras dos dosis intravenosas administradas con 15 días de intervalo fueron de 1,5 (30 mg) y 1,4 (300 mg).

Ejemplo 16: Seguridad Clínica y farmacocinética

En seis estudios, se administró el anticuerpo G1 a 118 hombres y mujeres sanos, mientras que 57 sujetos masculinos y femeninos recibieron placebo. El estudio incluyó dosis intravenosas únicas de 0,2 mg a 2.000 mg, dos dosis intravenosas de hasta 300 mg administradas una vez cada 14 días, y la administración SC de 225 y 900 mg. Los seis estudios incluían: dos estudios PK y farmacodinámicos (PD) de escalada de dosis única IV en varones sanos (estudios B0141001 y B0141002); un estudio cruzado de dos cohortes controlado con placebo para examinar los efectos agudos de la administración IV del anticuerpo G1 sobre la respuesta a la llamarada de capsaicina en voluntarios sanos (B0141006); un estudio de grupos paralelos de dosis repetidas del anticuerpo G1 en voluntarios sanos de ambos sexos (B0141007); un estudio de dosis única para evaluar la seguridad y tolerabilidad de dosis de hasta 2.000 mg administradas por vía IV a voluntarias sanas (B0141008), y un estudio para comparar la seguridad y biodisponibilidad relativas entre la administración IV y SC (G1-SC-IV).

Los seis estudios se resumen a continuación en la Tabla 11. De los cinco estudios IV (B0141001, B0141002, B0141006, B0141007 y B0141008), tres tenían diseños y evaluaciones prácticamente idénticos. El estudio B014100 probó dosis de 0,2 mg, 1 mg y 3 mg administradas en una única infusión intravenosa de una hora. El estudio tenía un diseño paralelo. Los participantes permanecieron ingresados en la clínica durante siete días después de la infusión, con múltiples evaluaciones en cada uno de esos días. Tras el alta, se volvió a evaluar a los pacientes una semana después del alta (día 14), y luego uno, dos y tres meses después de la infusión. El estudio B0141002 probó dosis que oscilaban entre 10 mg y 1000 mg como administración única. Por último, el estudio B0141008 probó dosis de 300 mg, 1000 mg, 1500 mg o 2000 mg. El estudio B0141006 era distinto de los demás, ya que también pretendía integrar lecturas farmacodinámicas mediante la medición de la inhibición de la erupción de capsaicina hasta una semana después de la infusión IV del anticuerpo G1.

Para los estudios IV, los perfiles de eventos adversos (AE) fueron reportados sólo para el primer período de dosificación. El estudio B0141007 probó múltiples dosis del anticuerpo G1 a 30 o 300 mg IV administradas con dos semanas de intervalo, utilizando un diseño paralelo. A cada sujeto elegible se le asignó una secuencia de aleatorización a través de un sistema interactivo basado en la web que contenía la asignación del tratamiento. El esquema de aleatorización fue desarrollado por el estadístico jefe. Los participantes en todos los estudios eran, en general, hombres y mujeres sanos (de 18 a 65 años de edad); todos los participantes firmaron formularios de consentimiento informado. Todos los estudios fueron aprobados por juntas de revisión de investigaciones (IRB). Los AE se definieron como cualquier acontecimiento médico adverso en los participantes del estudio clínico, con o sin relación causal con el fármaco del estudio. Los AE observados tras la administración del fármaco del estudio o del placebo se denominaron AE "emergentes del tratamiento" (TEAE), independientemente de la posible causalidad con el fármaco del estudio. Todos los sujetos que experimentaron TEAE fueron seguidos a intervalos de tiempo apropiados hasta que el evento se había resuelto o hasta que el evento se había estabilizado y/o alcanzado un nuevo valor basal. Todos los TEAE se clasificaron como leves, moderados o graves. Los AE graves se definieron a priori como cualquier acontecimiento médico adverso que, a cualquier dosis, provocara la muerte, pusiera en peligro la vida (es decir, el sujeto estuviera en riesgo inmediato de muerte en el momento del acontecimiento), requiriera hospitalización o prolongación de la hospitalización existente, provocara una discapacidad/incapacidad persistente o significativa (por ejemplo, una alteración sustancial de la capacidad del sujeto para llevar a cabo las funciones vitales normales), provocara una anomalía congénita/defecto de nacimiento o cualquier otro acontecimiento médicamente importante. Los AE relacionados con el tratamiento (TRAE) debían considerarse cuando se daba una de las siguientes situaciones: 1) pudo identificarse una relación temporal plausible entre la aparición del AE y la administración del medicamento en investigación; 2) el AE no pudo explicarse fácilmente por el estado clínico del paciente, la enfermedad intercurrente o los tratamientos concomitantes; 3) el AE remitió al suspender el medicamento en investigación o al reducir la dosis.

La presión arterial, la frecuencia del pulso y la temperatura oral se midieron en el momento del cribado, antes de la dosis, inmediatamente después del final de la infusión y en múltiples ocasiones durante el internamiento de los pacientes en las clínicas, así como en todas las visitas clínicas. Las pruebas de laboratorio incluyeron bioquímica sérica, hematología y análisis de orina. Se realizaron pruebas de laboratorio de hematología, química, coagulación y seguridad de la orina en múltiples momentos del estudio. Se registraron ECG en el cribado, antes de la dosis el día 1, inmediatamente después de finalizar la infusión y otras cinco veces durante el primer día, así como en todas las visitas clínicas. Los valores de QTcF se obtuvieron utilizando la fórmula de corrección de la frecuencia cardíaca de Fridericia (QTcF). Se evaluaron los valores absolutos y los cambios respecto al valor basal de los parámetros ECG intervalo QT, frecuencia cardiaca, intervalo QTcF, intervalo PR e intervalo QRS por cohorte, tratamiento y tiempo tras la dosis. Además de las evaluaciones de seguridad descritas anteriormente, el Protocolo B014008 incluyó evaluaciones oftálmicas completas al inicio del estudio y en tres momentos tras la administración de la dosis (día 28, día 84 y día 168).

Los datos clínicos y los signos vitales se resumieron mediante tablas descriptivas y estadísticas de resumen. Los datos de laboratorio y otros datos de seguridad se resumieron en función de cualquier cambio (valores fuera del intervalo de referencia), así como de cualquier cambio clínico relevante, que se definieron a priori. Las tablas resumen se estratificaron por dosis y los datos se agruparon entre los estudios. Además, las comparaciones de los datos consolidados de todas las exposiciones al anticuerpo G1 se contrastaron con placebo. También se contrastó placebo con dosis de anticuerpo G1 de 100 mg y superiores (100 mg, 300 mg, 1000 mg, 1500 mg y 2000 mg), y con dosis de anticuerpo G1 de 1000 mg y superiores (1000 mg, 1500 mg y 2000 mg).

En el estudio IV/SC (G1-SC-IV), treinta y seis sujetos fueron aleatorizados para recibir una administración única del anticuerpo G1 (225 o 900 mg) o placebo, administrado como una inyección en bolo subcutánea (SC) o una infusión IV de 1 hora. Los sujetos permanecieron ingresados en la unidad de investigación clínica durante siete días tras la administración de la dosis, y volvieron a la clínica periódicamente para visitas ambulatorias adicionales hasta el día 90 del estudio. Se realizaron ECG exhaustivos el Día 1 (predosis, Horas 1, 6, 12), el Día 3, el Día 7 mientras los sujetos estaban recluidos y una vez al finalizar el estudio (Día 90). Las constantes vitales, incluidas la temperatura, la presión arterial y la frecuencia cardíaca, se recogieron antes de la dosis y los días 1, 3, 7 y 90.

Tabla 11

__________________

En la amplia gama de dosis evaluadas en los cinco estudios IV (0,2 a 2.000 mg), el anticuerpo IV G1 fue tolerado aceptablemente. La Tabla 8 resume la tasa global de acontecimientos adversos (AA) por dosis para los estudios IV. Basándose en estos resultados de tolerabilidad, no han surgido problemas manifiestos de seguridad. En todos los ensayos de los estudios IV, los participantes que recibieron placebo notificaron una media de 1,3 acontecimientos adversos emergentes del tratamiento (TEAE). Estos son todos los acontecimientos notificados, independientemente de la opinión del investigador sobre la relación con el fármaco del estudio. En todas las dosis de G1 IV, la tasa fue de 1,4 TEAE/sujeto. Los sujetos que recibieron dosis G1 de 100 mg o superiores presentaron una media de 1,5 TEAE; los que recibieron dosis de 1.000 mg o superiores presentaron una media de 1,6 TEAE.

Tabla 8

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EA = acontecimientos adversos; n= cualquier acontecimiento, relacionado o no con el tratamiento; (N) = considerado relacionado con el tratamiento por el investigador. Nota: Para el protocolo B0141006 (placebo y 300 mg), sólo se incluyeron los datos del primer periodo de tratamiento activo, debido a su naturaleza cruzada.

En los estudios IV, se notificaron acontecimientos adversos relacionados con el tratamiento (TRAE, o AE que podrían estar relacionados con la terapia según el investigador principal) en el 21,2% de los sujetos que recibieron G1 IV, en comparación con el 17,7% de los que recibieron placebo. A dosis de 100 mg de G1 o superiores, se produjeron TRAE en el 22,4% de los participantes. A dosis de 1.000 mg o superiores, se produjeron TRAE en el 21,7% de los participantes. El anticuerpo G1 no parece estar asociado con ningún patrón clínicamente relevante de cambio en los signos vitales (presión arterial sistólica y diastólica [BP], temperatura y frecuencia cardiaca [HR]), anomalías en el electrocardiograma (ECG) (incluyendo QTcB y QTcF), reacciones en el lugar de infusión o hallazgos clínicos de laboratorio. Hubo efectos limitados en las pruebas de función hepática (aspartato aminotransferasa [AST], alanina aminotransferasa [ALT], bilirrubina total y fosfatasa alcalina) con un aumento de grado 1 en la bilirrubina total en un sujeto que recibió placebo (Estudio B0141001), y un aumento de grado 1 en la ALT en un sujeto que recibió placebo (Estudio B0141002). No se observaron anomalías clínicamente significativas de la función hepática entre los sujetos que recibieron alguna de las dosis estudiadas de G1. No hubo pruebas de diferencias entre G1 y placebo en las pruebas hematológicas de evaluación de la función renal, electrolitos o en los análisis de orina.

En el estudio IV/SC (G1-SC-IV), la seguridad y tolerabilidad fueron comparables entre las vías de administración SC e IV. La frecuencia cardiaca media y la presión arterial (diastólica y sistólica) no se vieron afectadas por el tratamiento con el anticuerpo G1, ni se produjeron cambios significativos en ningún parámetro cardiovascular tras el tratamiento con el anticuerpo G1 SC. En la Tabla 12 figura un resumen de las TRAE observadas durante el estudio SC.

Tabla 12

En los estudios de dosis única (B0141001, B0141002, B0141006 y B0141008), se calcularon los parámetros farmacocinéticos (PK) para dosis que oscilaban entre 30 mg y 2.000 mg. La semivida terminal media del grupo (t 1 /2) osciló aproximadamente entre 40 y 48 días. La Cmax y la exposición total (evaluada por el AUCinf) aumentaron con el incremento de la dosis. El aumento del AUCinf parecía ser aproximadamente proporcional a la dosis entre 30 y 1.000 mg y parecía ser mayor que proporcional a la dosis entre 1.000 y 2.000 mg. El volumen de distribución fue bajo, entre 6-10 l.

En el estudio de dos dosis (B0141007), la semivida terminal aparente tras una segunda dosis fue de entre 41 y 50 días. Las concentraciones plasmáticas se acumularon tras la segunda dosis, con una relación de acumulación de aproximadamente 1,5. Además, en el estudio IV/SC (G1-SC-IV), las evaluaciones farmacocinéticas indicaron que G1 tenía una semivida terminal similar cuando se administraba SC que IV.

Ejemplo 17: Prevención de la migraña crónica en un estudio clínico del anticuerpo G1

Se realizó un estudio multicéntrico, aleatorizado, doble ciego, doble simulación, controlado con placebo, de grupos paralelos y de dosis múltiples, en el que se comparó el anticuerpo antagonista anti-CGRP G1 con placebo en sujetos que padecían migraña crónica. Los sujetos que cumplían los requisitos entraron en un periodo inicial de rodaje de 28 días. Durante todo el estudio, los sujetos registraron diariamente sus cefaleas e información sanitaria mediante un sistema de diario electrónico de cefaleas. No se permitieron cambios en la medicación para la migraña durante el periodo de rodaje ni durante el estudio. Los criterios de inclusión fueron los siguientes: (1) varones o mujeres de 18 a 65 años; (2) un documento de consentimiento informado firmado y fechado en el que se indique que el sujeto ha sido informado de todos los aspectos pertinentes del estudio, incluidos los riesgos conocidos y potenciales y los tratamientos alternativos disponibles; (3) migraña crónica que cumpla los criterios diagnósticos enumerados en la Clasificación Internacional de Trastornos de Cefalea (ICHD-III versión beta, 2013); (4) los sujetos pueden utilizar hasta dos medicamentos preventivos diarios diferentes para la migraña (por ejemplo, topiramato, propranolol, amitriptilina) o para otras afecciones médicas (por ejemplo, propranolol utilizado para la hipertensión) si la dosis y el régimen se han mantenido estables durante al menos 2 meses antes de comenzar el periodo de rodaje de 28 días; (5) Índice de masa corporal (IMC) de 17,5 a 34.5 kg/m2, y un peso corporal total entre 50 kg y 120 kg, ambos inclusive; (6) el sujeto no tiene potencial reproductivo según se define en los métodos o, si tiene potencial reproductivo, se compromete a permanecer abstinente o a utilizar (o hacer que su pareja utilice) un método anticonceptivo aceptable durante la duración prevista del estudio; (7) cumplimiento demostrado del diario electrónico de cefaleas durante el periodo de rodaje mediante la introducción de datos sobre cefaleas en un mínimo de 24/28 días (85% de cumplimiento). Los criterios de diagnóstico de la migraña crónica según el punto (3) anterior fueron los siguientes: (a) antecedentes de cefaleas frecuentes que sugirieran migraña crónica (15 días al mes) durante al menos tres meses antes del cribado; (b) verificación de la frecuencia de las cefaleas mediante información basal recogida prospectivamente durante la fase de rodaje de 28 días que demostrara cefaleas al menos 15 días, con al menos 8 días al mes que cumplieran alguna de las condiciones siguientes: (i) ser una crisis de migraña, (ii) ir precedidas o acompañadas de aura migrañosa, o (iii) aliviarse con derivados del cornezuelo del centeno o triptanes.

Los criterios de exclusión exigían que los sujetos no cumplieran ninguno de los siguientes requisitos: (1) Inicio de migraña crónica después de los 50 años; (2) el sujeto ha recibido toxina onabotulínica A para la migraña o por cualquier motivo médico o estético que requiera inyecciones en la cabeza, la cara o el cuello durante los seis meses anteriores al cribado; (3) el sujeto utiliza medicamentos que contienen opiáceos (incluida la codeína) o barbitúricos (incluidos Fiorinal®, Fioracet® o cualquier otra combinación que contenga butalbital) más de 4 días al mes para el tratamiento de la migraña o por cualquier otro motivo (4) no ha superado > 2 categorías de medicamentos o > 3 medicamentos preventivos (dentro de dos categorías de medicamentos) por falta de eficacia para el tratamiento profiláctico de la migraña episódica o crónica tras un ensayo terapéutico adecuado; (5) enfermedad hematológica, renal, endocrina, pulmonar, gastrointestinal, genitourinaria, neurológica u ocular clínicamente significativa, a discreción del investigador; (6) sujetos con evidencia o historia clínica de problemas psiquiátricos clínicamente significativos, incluyendo depresión mayor, trastorno de pánico o trastorno de ansiedad generalizada (según criterios del Manual Diagnóstico y Estadístico 5a edición [DSM-5]); (7) presión arterial sistólica en el momento del cribado superior a 160 mm Hg o inferior a 90 mm Hg; (8) presión arterial diastólica en el momento del cribado superior a 110 mm Hg o inferior a 50 mm Hg; (9) antecedentes de enfermedad cardiovascular o isquemia vascular clínicamente significativa (como infarto de miocardio, enfermedad neurológica [e.g., isquemia cerebral], isquemia de extremidades periféricas u otro acontecimiento isquémico); (10) antecedentes pasados o actuales de cáncer, a excepción de los sujetos con carcinoma basocelular que haya sido extirpado; (11) mujeres embarazadas o en período de lactancia; (12) antecedentes de reacciones de hipersensibilidad a las proteínas inyectadas, incluidos los anticuerpos monoclonales; (13) tratamiento con un fármaco en investigación en los 30 días anteriores al inicio del estudio; (14) anomalía clínicamente significativa en el ECG de superficie de 12 derivaciones basal, incluidas pausas sinusales >2 segundos, bloqueo cardíaco de segundo o tercer grado u otras anomalías consideradas clínicamente significativas por el investigador. (15) un ECG basal de 12 derivaciones que demuestre un QTcF >450 mseg para los varones y 470 mseg para las mujeres en el cribado (si el QTcF superaba estos valores, se repetía el ECG y se utilizaba la media de los tres valores de QTcF para determinar la elegibilidad del posible sujeto; QTc obtenido mediante el cálculo de Fridericia); (16) cualquier hallazgo que, a juicio del investigador, sea clínicamente anormal de forma significativa, incluidos los valores de hematología, química sanguínea, pruebas de coagulación o análisis de orina (se permitió la repetición de las pruebas anormales para su confirmación) (17) enzimas hepáticas (alanina aminotransferasa [ALT], aspartato aminotransferasa [AST], fosfatasa alcalina) > 1.3 veces el límite superior de la normalidad (LSN) tras confirmación en una prueba repetida; (18) creatinina sérica >1,5 veces el LSN, proteinuria clínicamente significativa (tira reactiva de orina 4) o evidencia de enfermedad renal.

Los sujetos con migraña crónica confirmada y alto cumplimiento del diario de cefaleas durante el periodo de rodaje fueron asignados aleatoriamente en la visita 2 (día 1) a uno de los tres brazos de tratamiento. La aleatorización se realizó mediante un sistema electrónico interactivo de respuesta web. Se estratificó a los sujetos en función del sexo y del uso inicial de medicación para la migraña. El tratamiento se administró una vez al mes (cada 28 días) para un total de tres tratamientos durante un periodo de 3 meses. El tratamiento se administró en la visita 2 (día 1; primera dosis), visita 3 (día 29; segunda dosis) y visita 4 (día 57; tercera y última dosis). Las evaluaciones finales de salida del estudio se realizaron en la visita 5 (día 85), aproximadamente 28 días después de la tercera y última dosis. Se administraron inyecciones subcutáneas durante un periodo de 3 meses (cada 28 días) a sujetos de cada uno de los siguientes grupos: (1) los aleatorizados al brazo de 900 mg recibieron cuatro inyecciones activas cada 28 días; (2) los aleatorizados al brazo de 675/225 mg recibieron tres inyecciones activas y una de placebo para el primer tratamiento, y una inyección activa y tres de placebo para el segundo y tercer tratamiento; (3) los aleatorizados al placebo recibieron cuatro inyecciones de placebo cada 28 días. Las inyecciones activas contenían 225 mg de anticuerpo G1. Los criterios de valoración se obtuvieron a partir de un diario electrónico de cefaleas, un sistema interactivo basado en Internet que registraba los datos del periodo de 24 horas anterior. La duración total de la cefalea se registró numéricamente, en horas, así como el número de horas con cefalea en cada nivel de gravedad. La gravedad de la cefalea fue valorada subjetivamente por el sujeto en puntos temporales predefinidos de la siguiente manera: sin dolor, dolor leve, dolor moderado y dolor intenso. También se pidió a los sujetos que registraran si los siguientes síntomas asociados estaban presentes o ausentes en puntos temporales predefinidos: fotofobia, fonofobia, náuseas y vómitos. Un criterio de valoración adicional se derivó del seguimiento del uso de triptanes (por ejemplo, sumatriptán) como medicación aguda contra la cefalea por parte de los sujetos del estudio a lo largo del mismo. En la Tabla 9 se ofrece un resumen de la disposición y los datos demográficos de los sujetos del estudio.

Tabla 9

La disminución media del número de horas de cefalea en relación con el valor basal en cada una de las semanas 1, 2 y 3 (W1, W2 y W3, respectivamente) para cada uno de los grupos se representa gráficamente en la FIG. 15. Los resultados muestran una disminución significativa en ambos grupos de tratamiento en relación con el grupo placebo en cada una de las W1, W2 y W3, incluida la primera semana.

La disminución media del número de horas de cefalea en relación con el valor basal en cada uno de los meses 1, 2 y 3 (M1, M2 y M3, respectivamente) para cada uno de los grupos se representa gráficamente en la FIG. 12. Los resultados muestran una disminución significativa en ambos grupos de tratamiento en relación con el grupo placebo en los tres puntos temporales, incluso después de la primera dosis. Significación estadística relativa al grupo placebo para los datos de la FIG. 12 lo proporcionan los valores p indicados.

El número medio de horas de cefalea en cada grupo al inicio del estudio y en las visitas 2, 3 y 4 (V2, V3 y V4, respectivamente) se representa gráficamente en la FIG. 13. Los resultados muestran una disminución significativa en ambos grupos de tratamiento en relación con el grupo placebo en los tres puntos temporales, incluso después de la primera dosis.

En la FIG. 14 se representa la disminución media del número de días de cefalea de intensidad moderada o grave en relación con el valor inicial en cada uno de los meses 1, 2 y 3 (M1, M2 y M3, respectivamente) para cada uno de los grupos. Los resultados muestran una disminución estadísticamente significativa en ambos grupos de tratamiento en relación con el grupo placebo en los tres puntos temporales, incluso después de la primera dosis. Los valores p indican la significación estadística en relación con el grupo placebo.

La disminución media en el número de usos de triptanes como medicación de rescate aguda en relación con el valor basal en cada uno de los meses 1, 2 y 3 (M1, M2 y M3, respectivamente) para cada uno de los grupos se representa gráficamente en la FIG. 16. Los resultados muestran una disminución significativa del consumo de triptanes en ambos grupos de tratamiento en relación con el grupo placebo en los tres puntos temporales, incluso después de la primera dosis. La significación estadística en relación con el grupo placebo viene dada por los valores p indicados en la FIG.

16.

También se observó una disminución significativa en el número de horas de cefalea en los sujetos que utilizaron medicamentos preventivos (por ejemplo, topiramato y amitriptilina o propranolol) en relación con un grupo placebo.

Ambas dosis fueron bien toleradas y no surgieron problemas de seguridad. En la Tabla 10 se presenta un resumen de los acontecimientos adversos emergentes del tratamiento (TEAE) por grupos. La diferencia en los TEAE relacionados se explica casi totalmente por los acontecimientos leves relacionados con la inyección (eritema, algunas molestias). Los TEAE graves no estaban relacionados con el fármaco (ningún acontecimiento adverso relacionado con el fármaco).

Tabla 10

Ejemplo 18 Prevención de la migraña episódica de alta frecuencia en un estudio clínico del anticuerpo G1

Se realizó un estudio multicéntrico, aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo y de grupos paralelos que comparaba el anticuerpo anti-CGRP G1 con placebo en sujetos con migraña episódica de alta frecuencia (HFEM). El diseño del estudio siguió el del ejemplo 17, con dos diferencias. En primer lugar, los criterios de inclusión (3) fueron para sujetos que cumplían los criterios de migraña episódica según la Segunda Edición de la Sociedad Internacional de Cefaleas (Olesen y Steiner 2004), que experimentan migraña con alta frecuencia de la siguiente manera: (a) Antecedentes de cefaleas durante más de 8 días al mes durante al menos 3 meses antes del cribado; (b) verificación de la frecuencia de las cefaleas mediante información de referencia recogida prospectivamente durante la fase de rodaje de 28 días que demostrara cefaleas (de cualquier tipo) entre 8 y 14 días, con al menos 8 días que cumplieran los criterios de al menos uno de los siguientes: (i) migraña, (ii) migraña probable, o (iii) uso de triptanes o compuestos del cornezuelo del centeno. En segundo lugar, se cambiaron los esquemas de dosificación para los grupos que recibían G1. Concretamente, se administraron inyecciones por vía subcutánea durante un periodo de 3 meses (cada 28 días) a sujetos de cada uno de los siguientes grupos: (1) los aleatorizados al brazo de 675 mg recibieron 675 mg de G1 cada 28 días; (2) los aleatorizados al brazo de 225 mg recibieron 225 mg de G1 cada 28 días; y (3) los aleatorizados al placebo recibieron una inyección de placebo cada 28 días. En la Tabla 13 se ofrece un resumen de la disposición y los datos demográficos de los sujetos del estudio. Los criterios de valoración del estudio incluían la disminución del número de días de migraña y la disminución del número de días de cefalea de cualquier gravedad.

Tabla 13.

La disminución media del número de días de migraña en relación con el valor basal en cada uno de los meses 1, 2 y 3 (M1, M2 y M3, respectivamente) para cada uno de los grupos se representa en la FIG. 17. Los resultados muestran una disminución estadísticamente significativa en ambos grupos de tratamiento en relación con el grupo placebo en los tres puntos temporales, incluso después de la primera dosis. Los valores p indican la significación estadística en relación con el grupo placebo.

La disminución media del número de días de cefalea de cualquier gravedad en relación con el valor inicial en cada uno de los meses 1, 2 y 3 (M1, M2 y M3, respectivamente) para cada uno de los grupos se representa en la FIG. 18. Los resultados muestran una disminución estadísticamente significativa en ambos grupos de tratamiento en relación con el grupo placebo en los tres puntos temporales, incluso después de la primera dosis. Los valores p indican la significación estadística en relación con el grupo placebo.

Ambas dosis fueron bien toleradas y no surgieron problemas de seguridad. En la Tabla 14 se presenta un resumen de los acontecimientos adversos emergentes del tratamiento (TEAE) por grupos. Los cuatro TEAe graves se debieron a un caso de fractura de peroné, un caso de temblor debido a la interrupción de la medicación y dos casos de migraña que requirieron tratamiento en urgencias.

Tabla 14

Ejemplo 19 Seguridad no clínica

Se realizaron dos estudios para evaluar la seguridad del anticuerpo G1 en monos cynomolgus. En el primer estudio, se evaluó la seguridad de una dosis única del anticuerpo G1. En el segundo estudio, se evaluó la seguridad de las dosis repetidas del anticuerpo G1. A continuación se describen detalladamente cada uno de los estudios y sus resultados. Tanto para el estudio de dosis única como para el de dosis repetidas, el anticuerpo G1 se formuló como una solución de 51,4 mg/ml en 20 mM de histidina, 84 mg/ml de dihidrato de trehalosa, 0,2 mg/ml de polisorbato 80, 0,05 mg/ml de EDTA dihidrato disódico y 0,1 mg/ml de L-metionina, pH ~5,5. El vehículo se formuló de forma idéntica sin el anticuerpo G1. Además, en ambos estudios se tomaron periódicamente muestras de sangre para analizar la concentración plasmática del anticuerpo G1 mediante un método ELISA validado.

Los datos se agregaron primero en tablas de resumen y figuras utilizando GraphPad Prism (versión 6.0) y Excel 2010 (Microsoft). Para el estudio de exposición única, los datos de telemetría se analizaron mediante ANOVA. Los análisis se realizaron con SAS versión 8.2. Con el fin de normalizar el intervalo QT en un rango de intervalos R-R, se generaron Factores de Corrección Individual por Animal (IACF) para cada animal relacionando cada intervalo RR con su intervalo QT asociado. Se determinó la regresión lineal de esta relación QT/RR-intervalo para el conjunto de datos. La pendiente de esta regresión lineal se utilizó como IACF para el animal asociado en todos los tratamientos. Este IACF se utilizó para calcular el intervalo QT corregido (QTc) mediante la siguiente ecuación:

Q T -I{c ) = Intervalo Q.T corregido en función de la frecuencia cardíaca = Q T-I - [(R R - 300)*{ÍA C F )].

Para el estudio de dosis múltiples, también se utilizó ANOVA unidireccional para analizar los datos. Si el ANOVA era significativo (P < 0,05), se utilizaba el postest de Dunnett para las comparaciones entre grupos. Para cada sexo, el grupo tratado se comparó con el grupo de control (vehículo) con un nivel de probabilidad de dos colas del 5%.

Estudio de telemetría de dosis única

Ocho monos cynomolgus machos adultos (Charles River Primates) fueron instrumentados quirúrgicamente con telémetros y se les permitió recuperarse durante al menos dos semanas. Los implantes (DSI TL11M2-D70-PCT) y los receptores (RMC-1) fueron fabricados por Data Sciences International.

Los animales fueron aclimatados a las jaulas de adquisición de datos telemétricos al menos una noche antes de la dosificación. Durante la aclimatación, se realizó un registro previo de los parámetros hemodinámicos para verificar que los transductores y el equipo funcionaban correctamente. Durante la adquisición de datos telemétricos, los animales se alojaron individualmente en jaulas equipadas con receptores telemétricos. Los días en que no hubo recogida, los animales se alojaron en jaulas sin receptores de telemetría. Los animales se mantuvieron en un ciclo diurno de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, con agua ad libitum y alimentados con dieta certificada para primates.

Para la primera fase del estudio, a los animales (8 machos) se les administró vehículo solamente, y se recolectaron datos de telemetría comenzando ~1 hora antes de la dosis hasta 22 horas después de la dosis. Seis días después de la administración del vehículo, los mismos animales recibieron una única administración IV del anticuerpo G1 (100 mg/kg, una dosis ~10 veces superior a la EC50 farmacológica en monos cynomolgus). Se volvieron a registrar continuamente datos electrocardiográficos y hemodinámicos telemétricos de todos los animales. Además, estos animales fueron monitorizados durante ~24 horas los días 3, 7, 10 y 14 después de recibir su dosis única de anticuerpo G1. Las señales telemétricas de ECG y presión arterial se transmitieron a través de los dispositivos de radiotelemetría implantados a receptores montados en cada jaula. Las señales adquiridas se pasaron a través de una matriz de intercambio de datos (DSI modelo DEM) y a un sistema de adquisición de datos basado en PC (software DSI Ponemah P3 versión 3.4); el software de análisis de datos fue Emka Technologies versión 2.4.0.20 (Emka Technologies). La frecuencia de muestreo analógico/digital fue de 1.000 Hz para los datos de ECG telemétricos y de 500 Hz para los datos de presión arterial. Los datos se registraron como medias de 1 minuto.

La presión arterial sistólica (SBP) media del grupo fue similar antes y después del tratamiento con el anticuerpo G1 a lo largo del primer día después de la dosificación y en los días siguientes (animales telemedidos en los días 3, 7, 10 y 14 a intervalos de tiempo idénticos a los del día 1). En las horas 1-4 posteriores a la administración de la dosis, cuando las concentraciones sanguíneas del anticuerpo G1 alcanzaron niveles máximos (concentración media de 3.500 |jg/ml a las 4 horas), la SBP media fue de 111 mmHg en comparación con 113 mmHg en el mismo intervalo de tiempo tras la administración del vehículo. Además, la SBP fue de 110 mmHg los días 3 y 7, de 109 mmHg el día 10 y de 110 mmHg el día 14 tras la administración del anticuerpo G1. Se registraron datos de SBP similares para otros intervalos de tiempo. Al tratarse de un estudio cruzado, los animales tratados sirvieron de control. Cuando se analizaron los datos como diferencias en la presión arterial tras la administración del anticuerpo G1 en comparación con el tratamiento con vehículo, se observaron pequeñas reducciones estadísticamente significativas de la SBP en el último intervalo de tiempo de los días 7, 10 y 14.

Tras el tratamiento con el anticuerpo G1, se observó que la presión arterial diastólica (DBP) era unos 3 mmHg inferior a los valores medios obtenidos tras la administración del vehículo. Entre las horas 5 y 22, la media de los grupos del vehículo y del anticuerpo G1 fue similar. La misma tendencia se observó otros días, cuando se produjo un ligero descenso de la DBP (que osciló entre 2,62 y 3,5 mmHg) en el primer intervalo medido, con algunos cambios de magnitud similar observados esporádicamente los días 7-10 en el intervalo de 7-22 horas. Al igual que en el caso de la DBP, se observaron ligeros descensos de la frecuencia cardiaca durante la primera evaluación (horas 1-4) en relación con el tratamiento con vehículo. Las diferencias fueron indetectables durante las evaluaciones intermedias y volvieron a observarse entre las horas 18 y 22 de todos los días.

[0248] Además, con respecto a los hallazgos ECG, no hubo cambios estadísticamente significativos en el intervalo QTc en ningún punto temporal, en relación con el tratamiento con vehículo. Aunque se observaron cambios estadísticamente significativos en RR, PR, RS y QT durante el periodo de 14 días en comparación con el vehículo, todos ellos fueron menores en valor absoluto.

Estudio de seguridad con dosis repetidas

El estudio de seguridad de dosis repetidas incluyó 48 monos cynomolgus adultos, emparejados por género (6 por género por grupo), sin anticuerpos G1 (Charles River Primates). Los animales recibieron vehículo o anticuerpo G1 en inyección intravenosa una vez por semana durante 14 semanas en dosis de 10 mg/kg, 100 mg/kg o 300 mg/kg. En cada grupo, se dejó que dos animales de cada sexo se recuperaran durante 4 meses más tras el final de la dosificación.

Las mediciones del ECG y la presión arterial se registraron una vez durante la fase previa al estudio, dos veces después de alcanzar el estado estacionario (antes de la dosis y 4 horas después de la dosis en el día 85) y una vez ~1 semana después de finalizar la dosis (día 103 de la fase de recuperación). Se anestesió a los animales con ketamina y se registraron los ECG utilizando ocho derivaciones. La medición de los ECG (incluida la frecuencia cardíaca) se realizó con los datos capturados mediante el sistema de software Life Science Suite Ponemah Physiology Platform a través de DSI, utilizando las derivaciones I, II, aVF, CG4RL y CV4LL, como estándar. Se calculó una corrección de la frecuencia cardiaca para el intervalo QT (QTc) mediante la fórmula de Bazett.

La presión arterial se registró antes de la primera dosis, después de 12 semanas de dosificación (13 dosis) y aproximadamente 1 semana después del final de la dosificación. No se observaron cambios significativos en la SBP o DBP en ninguno de los grupos de animales tratados en relación con los animales tratados con vehículo. Las frecuencias cardiacas medias de los grupos fueron relativamente constantes en todos los grupos de dosis y puntos temporales medidos, sin que se midieran diferencias estadísticas. Las concentraciones plasmáticas del anticuerpo G1 se midieron durante la primera semana de dosificación y en el momento de las evaluaciones de la presión arterial y el ECG, demostrando la acumulación con la dosificación semanal repetida.

Además, con respecto a los resultados del ECG, no hubo diferencias significativas en el intervalo QTc en todas las dosis y puntos temporales. Además, no se observaron cambios ECG significativos o relevantes en ninguno de los parámetros ECG evaluados a lo largo del estudio.

En resumen, el anticuerpo G1 fue muy bien tolerado en ambos estudios, sin que se observaran cambios clínicamente significativos en ningún parámetro hemodinámico, ni cambios relevantes en ningún parámetro del ECG. En los monos cynomolgus, los parámetros cardiovasculares y hemodinámicos no parecen verse afectados por la inhibición a largo plazo del CGRP con el anticuerpo G1.

Depósito de Material Biológico

Los siguientes materiales han sido depositados en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EE.UU. (ATCC):

El vector pEb.CGRP.hKGI es un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena ligera G1 y la región constante kappa de la cadena ligera; y el vector pDb.CGRP.hFcGI es un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena pesada G1 y la región constante IgG2 de la cadena pesada que contiene las siguientes mutaciones: A330P331 a S330S331 (numeración de aminoácidos con referencia a la secuencia IgG2 de tipo salvaje; véase Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624).

Estos depósitos se realizaron en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes y su Reglamento (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del yacimiento durante 30 años a partir de la fecha de depósito. El depósito será puesto a disposición por el ATCC en virtud de los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre Rinat Neuroscience Corp. y el ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo del depósito al público tras la emisión de la patente estadounidense pertinente o tras la puesta a disposición del público de cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, lo que ocurra primero, y asegura la disponibilidad de la progenie a una persona determinada por el ATCC. Comisionado de Patentes y Marcas a tener derecho a ello de acuerdo con 35 USC Sección 122 y las normas del Comisionado en virtud de la misma (incluyendo 37 CFR Sección 1.14 con especial referencia a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales depositados muriera o se perdiera o destruyera cuando se cultive en condiciones adecuadas, los materiales serán sustituidos rápidamente, previa notificación, por otro igual. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de conformidad con sus leyes de patentes.

Secuencias de anticuerpos

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada G1 (SEQ ID N.°: 1)

E V Q L V E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S N Y W IS W V R Q A P G K G L E W V A E IR S E S

D A S A T H Y A E A V K G R F T IS R D N A K N S L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C L A Y F D Y G L A IQ N Y

W G Q G T L V T V S S

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera G1 (SEQ ID N.°:2)

E IV L T Q S P A T L S L S P G E R A T L S C K A S K R V T T Y V S W Y Q Q K P G Q A P R L L IY G A S N R Y L

G IP A R F S G S G S G T D F T L T IS S L E P E D F A V Y Y C S Q S Y N Y P Y T F G Q G T K L E IK

G1 CDR H1 (CDR ampliada) (SEQ ID N.°:3)

GFTFSNYWIS

G1 CDR H2 (CDR ampliada) (SEQ ID N.°:4)

EIRSESDASATHYAEAVKG

G1 CDR H3 (SEQ ID N.°:5)

YFDYGLAIQNY

G1 CDR L1 (SEQ ID N.°:6)

KASKRVTTYVS

G1 CDR L2 (SEQ ID N.°:7)

GASNRYL

G1 CDR L3 (SEQ ID N.°:8)

SQSYNYPYT

Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada G1 (SEQ ID N.°:9)

Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena ligera G1 (SEQ ID N.°:10)

Secuencia completa de aminoácidos del anticuerpo de cadena pesada G1 (incluida la IgG2 modificada descrita en el presente documento) (SEQ ID N.°:11)

Secuencia completa de aminoácidos del anticuerpo contra la cadena ligera G1 (SEQ ID N.°:12)

Secuencia nucleotídica completa del anticuerpo de cadena pesada G1 (incluida la IgG2 modificada descrita en el presente documento) (SEQ ID N.°:13)

Secuencia nucleotídica completa del anticuerpo contra la cadena ligera G1 (SEQ ID N.°:14)

Comparación de la secuencia de aminoácidos del CGRP humano y de rata (a-CGRP humano (SEQ ID N.°:15); p-CGRP humano (SEQ ID N.°:43); a-CGRP de rata (SEQ ID N.°:41); y p-CGRP de rata (SEQ ID N.°:44)):

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera LCVR17 (SEQ ID N.°: 58)

D IQ M T Q S P S S L S A S V G D R V T IT C R A S Q D ID N Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L IY Y T S E Y H S G V P S R F S G S G S G T D F T F T IS S L Q P E D IA T Y Y C Q Q G D A L P P T F G Q G T K L E IK

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada HCVR22 (SEQ ID N.°: 59)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera LCVR18 (SEQ ID N.°: 60)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada HCVR23 (SEQ ID N.°: 61)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera LCVR19 (SEQ ID N.°: 62)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada HCVR24 (SEQ ID N.°: 63)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera LCVR20 (SEQ ID N.°: 64)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada HCVR25 (SEQ ID N.°: 65)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera LCVR21 (SEQ ID N.°: 66)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada HCVR26 (SEQ ID N.°: 67)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera LCVR27 (SEQ ID N.°: 68)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada HCVR28 (SEQ ID N.°: 69)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera LCVR29 (SEQ ID N.°: 70)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada HCVR30 (SEQ ID N.°: 71)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera LCVR31 (SEQ ID N.°: 72)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada HCVR32 (SEQ ID N.°: 73)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera LCVR33 (SEQ ID N.°: 74)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada HCVR34 (SEQ ID N.°: 75)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera LCVR35 (SEQ ID N.°: 76)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada HCVR36 (SEQ ID N.°: 77)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera LCVR37 (SEQ ID N.°: 78)

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada HCVR38 (SEQ ID N.°: 79)

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo monoclonal para uso en un método de tratamiento o reducción de la incidencia de cefalea migrañosa en un sujeto, en el que el anticuerpo monoclonal modula la vía del CGRP, en el que el anticuerpo monoclonal tiene una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de

   y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de

   y en el que el anticuerpo se administra una vez al mes por vía subcutánea a una dosis de 225 mg.
2. 2. El anticuerpo monoclonal para uso en un método de tratamiento o reducción de la incidencia de cefalea migrañosa en un sujeto según la reivindicación 1, en el que la cefalea migrañosa es cefalea migrañosa crónica.
3. 3. El anticuerpo monoclonal para uso en un método de tratamiento o reducción de la incidencia de cefalea migrañosa en un sujeto según la reivindicación 1, en el que la cefalea migrañosa es cefalea migrañosa episódica.
4. 4. El anticuerpo monoclonal para uso en un método de tratamiento o reducción de la incidencia de migraña en un sujeto según la reivindicación 1, en el que la administración comprende utilizar una jeringa precargada que comprende la cantidad del anticuerpo monoclonal.
5. 5. El anticuerpo monoclonal para uso en un método de tratamiento o reducción de la incidencia de cefalea migrañosa en un sujeto según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo monoclonal se formula a una concentración de al menos 150 mg/ml.
6. 6. El anticuerpo monoclonal para uso en un método de tratamiento o reducción de la incidencia de cefalea migrañosa en un sujeto según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo monoclonal se administra en un volumen inferior a 2 ml.
7. 7. El anticuerpo monoclonal para uso en un método de tratamiento o reducción de la incidencia de migraña en un sujeto según la reivindicación 1, en el que el sujeto es humano.