ES2846878T3

ES2846878T3 - Prevenir, tratar y reducir el dolor de cabeza post-traumático (persistente)

Info

Publication number: ES2846878T3
Application number: ES16778888T
Authority: ES
Inventors: Marcelo Bigal
Original assignee: Teva Pharmaceuticals International GmbH
Current assignee: Teva Pharmaceuticals International GmbH
Priority date: 2015-09-24
Filing date: 2016-09-23
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2036-09-23
Also published as: HK1258474A1; EP3353202B1; EA201890578A1; WO2017051385A1; EP3353202A1; US20220048986A1; HK1258385A1; CA2999809A1; JP2020002172A; AU2019261726A1; CN108473560A; KR20180058777A; US20170088612A1; US20200148761A1; KR20200035163A; JP2018532728A; MX2018003713A; IL258008A; AU2016325738A1

Abstract

Una composición que comprende un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal para su uso en el tratamiento o reducción de la incidencia de dolor de cabeza postraumático en un sujeto, en donde el anticuerpo monoclonal tiene una CDR H1 como se establece en la SEQ ID NO: 3; una CDR H2 como se expone en SEQ ID NO: 4; una CDR H3 como se expone en SEQ ID NO: 5; una CDR L1 como se expone en SEQ ID NO: 6; una CDR L2 como se expone en SEQ ID NO: 7; y una CDR L3 como se expone en SEQ ID NO: 8.

Description

DESCRIPCIÓN

Prevenir, tratar y reducir el dolor de cabeza post-traumático (persistente)

Antecedentes

[0001] El péptido relacionado con el gen calcitonina (CGRP) es un neuropéptido de aminoácido 37, que pertenece a una familia de péptidos que incluye calcitonina, adrenomedulina, adrenomedulina 2 (intermedina), y amilina (Russell et al, Physiol Rev. 94: 1099-1142, 2014). En los seres humanos, existen dos formas de CGRP (a-cGRP y p-CGRP) y tienen actividades similares. Varían por tres aminoácidos y exhiben distribución diferencial. Al menos dos subtipos de receptores CGRP también pueden explicar las actividades diferenciales. CGRP es un neurotransmisor en el sistema nervioso central y se ha demostrado que es un potente vasodilatador en la periferia, donde las neuronas que contienen CGRP están estrechamente asociadas con los vasos sanguíneos. Mediado por CGRP la vasodilatación también se asocia con inflamación neurogénica, como parte de una cascada de eventos que resulta en extravasación de plasma y vasodilatación de la microvasculatura.

[0002] El dolor de cabeza es una complicación común de la lesión cerebral traumática (TBI), especialmente después de una TBI leve (repetitiva) (mTBI) o una lesión en la cabeza cerrada leve (mCHI). Estos dolores de cabeza pueden ser difíciles de controlar. Los dolores de cabeza pueden ser de alta frecuencia, si no todos los días. Reconociendo la complejidad de los dolores de cabeza postraumáticos (PTH), la Internationa1Headache Society, en la International Classification of Headache Disorders (ICHD) tiene una clasificación separada específica para estos dolores de cabeza (Headache Classification Subcommittee of the International Headache Society, 2004 y la edición actualizada, 2013). Ver Riechers et al. (Handbook of Clinical Neurology 128: 567-78, 2015). La segunda edición (ICHD-II) y la tercera edición (ICHD-3 beta) definen la PTH como un dolor de cabeza que se desarrolla dentro de los 7 días posteriores al evento traumático o al surgimiento del estado comatoso. Estos dolores de cabeza pueden definirse como agudos en los primeros tres meses posteriores a la lesión; sin embargo, si persisten más allá de esto, se definen como crónicos. La gravedad del traumatismo craneoencefálico se puede utilizar además para subdividir las categorías de PTH en PTH resultante de un traumatismo craneoencefálico leve (puntuación de la escala de coma de Glasgow (GCS) 13-15, pérdida del conocimiento en menos de 30 minutos u otros síntomas de conmoción cerebral) o PTH como resultado de un traumatismo craneoencefálico grave (GCS menor de 13, pérdida del conocimiento mayor de 30 minutos, amnesia mayor de 48 horas o imágenes anormales). Una categoría diagnóstica adicional agregada a la ICHD-II es la de dolor de cabeza debido a hematoma intracraneal, siendo los hematomas epidurales y subdurales los hematomas primarios en cuestión. Para cumplir con los criterios de la ICHD, estos hematomas deben verse en las imágenes y, en el caso del hematoma epidural, deben desarrollarse dentro de las 24 horas posteriores al hematoma y resolverse dentro de los 3 meses posteriores a la intervención quirúrgica, mientras que la cefalea por hematoma subdural debe desarrollarse dentro de las 24-72 horas y no existen criterios de resolución específicos.

[0003] Daiutolo et al., Department of Neurosurgery Faculty Papers, Paper 65 (2014), considera la modulación de la vía del dolor por la lesión cortical parcialmente a través de óxido nítrico sintasa inducible.

[0004] Bigal et al, CNS Drugs 28 (5): 389-399 (2014) considera anticuerpos monoclonales para la migraña.

Resumen de la invención

[0005] La invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo antagonista monoclonal de anti-CGRP para su uso en el tratamiento o la reducción de la incidencia de dolor de cabeza postraumático en un sujeto, en donde el anticuerpo monoclonal tiene una CDR H1 como se expone en SEQ ID NO: 3; una CDR H2 como se expone en SEQ ID NO: 4; una CDR H3 como se expone en SEQ ID NO: 5; una CDR L1 como se expone en SEQ ID n O: 6; una CDR L2 como se expone en SEQ ID NO: 7; y una CDR L3 como se expone en SEQ ID NO: 8.

Resumen

[0006] En el presente documento se describen anticuerpos anti-antagonistas de CGRP y métodos de uso de los mismos para prevenir, tratar o reducir la incidencia de dolor de cabeza postraumático (persistente). También se describen en el presente documento métodos para prevenir, tratar o reducir la incidencia de dolor de cabeza postraumático (persistente) en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP.

[0007] Esquemas de administración adecuados incluyen, pero no se limitan a una dosis mensual, trimestral, o única. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal se puede administrar mensualmente. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal se puede administrar mensualmente durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más meses. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal se puede administrar mensualmente durante tres o más meses. Cuando se administra mensualmente, la dosis del anticuerpo monoclonal administrada al paciente puede ser de aproximadamente 225 mg a aproximadamente 900 mg.

[0008] El anticuerpo monoclonal se puede administrar como una dosis única. Cuando se administra como una dosis única, la dosis del anticuerpo monoclonal administrada al paciente puede ser de aproximadamente 675 mg a aproximadamente 1000 mg.

[0009] El tratamiento o reducción puede comprender la reducción del número de horas de dolor de cabeza de cualquier gravedad, reduciendo el número de días con cefalea mensuales de cualquier gravedad, reduciendo el uso de cualquier medicación de dolor de cabeza agudo, reduciendo una puntuación de discapacidad de 6-item Headache Impact Test (HIT-6), mejorando la puntuación de la 12-Item Short Form Health Survey (SF-12) (Ware et al., Med Care 4: 220-233, 1996), reduciendo la puntuación del Patient Global Impression of Change (PGIC) (Hurst et al., J Manipulative Physiol Ther 27: 26-35, 2004), mejorando la puntuación de la Sport ConCuSSion ASSeSment tool 3 (SCAT-3) (McCrory et al. British Journal of Sports Medicine 47: 263-266, 2013), o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el número de días de dolor de cabeza mensuales se puede reducir durante al menos siete días después de una sola administración.

[0010] En algunas realizaciones, las horas mensuales de dolor de cabeza experimentadas por el sujeto después de dicha administración se reducen por 40 o más horas (p. ej., 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, o más) a partir de un nivel anterior a la administración en el sujeto. Las horas mensuales de dolor de cabeza pueden reducirse en más de 60 horas. En algunas realizaciones, las horas mensuales de dolor de cabeza experimentadas por el sujeto después de dicha administración se reducen en un 25% o más (p. ej., 30%, 35%, 40%, 45%, 50% o más) en relación con un nivel de preadministración en el sujeto. Las horas mensuales de dolor de cabeza pueden reducirse en un 40% o más. En algunas realizaciones, los días de dolor de cabeza mensuales experimentados por el sujeto después de dicha administración se reducen en tres o más días (p. ej., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más días) desde un nivel previo a la administración en el sujeto. En algunas realizaciones, el número de días de dolor de cabeza mensuales se puede reducir en al menos aproximadamente un 50% desde el nivel previo a la administración en el sujeto. Por tanto, en algunos aspectos, el número de días de dolor de cabeza mensuales se puede reducir en al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente el 80% o al menos aproximadamente el 90%.

[0011] En algunas realizaciones, la administración puede ser administración subcutánea. En algunas realizaciones, la administración puede ser por vía intravenosa. En algunas realizaciones, la administración puede comprender la utilización de una jeringa precargada, una jeringa precargada con un dispositivo de seguridad de aguja, una pluma de inyección o un autoinyector que comprende una dosis del anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal se puede formular a una concentración de al menos 150 mg/ml. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal se puede administrar en un volumen de menos de 2 ml, por ejemplo, aproximadamente 1,5 ml.

[0012] En algunas realizaciones, el tratamiento o reducción además comprende la administración al sujeto de un segundo agente de forma simultánea o secuencial con el anticuerpo monoclonal para su uso en la invención. El segundo agente puede ser cualquiera de los agonistas de 5-HT1, triptanos, alcaloides del cornezuelo de centeno y fármacos antiinflamatorios no esteroideos. En algunas realizaciones, el segundo agente es un agente tomado por el sujeto de forma profiláctica. En algunas realizaciones, el uso mensual del segundo agente por parte del sujeto se reduce en al menos aproximadamente un 15%, por ejemplo, al menos un 16%, 17%, 18%, 20%, 22%, 25%, 28%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o al menos aproximadamente 95%, después de administrar el anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el segundo agente es un triptano.

[0013] En algunas realizaciones, el sujeto es un humano.

[0014] El anticuerpo monoclonal es un anticuerpo antagonista anti-CGRP. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal humano o humanizado. El anticuerpo monoclonal tiene una CDR H1 como se establece en SEQ ID NO: 3; una CDR H2 como se expone en SEQ ID NO: 4; una CDR H3 como se expone en SEQ ID NO: 5; una CDR L1 como se expone en SEQ ID n O: 6; una CDR L2 como se expone en SEQ ID NO: 7; y una CDR L3 como se expone en SEQ ID NO: 8.

[0015] En una realización, el anticuerpo monoclonal para su uso en la invención se administra al sujeto como una sola dosis en una cantidad que modula la vía de c Gr P, en donde la cantidad del anticuerpo monoclonal es de aproximadamente 225 mg a aproximadamente 1000 mg, por ejemplo,, aproximadamente 675 mg o aproximadamente 900 mg.

[0016] En una realización adicional, el anticuerpo antagonista anti-CGRP para su uso en la invención se administra en combinación con al menos un agente adicional útil para tratar el dolor de cabeza post-traumático. Dichos agentes adicionales incluyen agonistas similares a 5-HT1 (y agonistas que actúan en otros sitios 5-HT1) y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE).

[0017] Los ejemplos de agonistas de 5-HT1 que se pueden usar en combinación con un anticuerpo anti-CGRP incluyen una clase de compuestos conocidos como triptanos, tales como sumatriptán, zolmitriptán, naratriptán, rizatriptán, eletriptán, almotriptán y frovatriptán. También se sabe que los alcaloides del cornezuelo de centeno y los compuestos relacionados tienen actividad agonista de 5-HT. Entre estos compuestos se incluyen tartrato de ergotamina, maleato de ergonovina y mesilatos de ergoloide (p. ej., dihidroergocornina, dihidroergocristina, dihidroergocriptina y mesilato de dihidroergotamina (DHE 45)).

[0018] Los ejemplos de AINE que se pueden usar en combinación con un anticuerpo anti-CGRP incluyen aspirina, diclofenaco, diflusinal, etodolaco, fenbufeno, fenoprofeno, flufenisal, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, cetorolaco, ácido meclofenámico, ácido mefenámico, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tolmetina o zomepirac, inhibidores de la ciclooxigenasa-2 (COX-2), celecoxib; rofecoxib; meloxicam; JTE-522; L-745,337; NS398; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

[0019] En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP reconoce un CGRP humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP se une tanto a a-CGRP como a p-CGRP humanos. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP se une al CGRP humano y de rata. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP se une al fragmento C-terminal que tiene los aminoácidos 25-37 de CGRP. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP se une a un epítopo C-terminal dentro de los aminoácidos 25-37 de CGRP.

[0020] El anticuerpo antagonista anti-CGRP es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP está humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo es humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP es el anticuerpo G1 (como se describe en el presente documento). El anticuerpo antagonista anti-CGRP comprende seis CDR del anticuerpo G1. En otras realizaciones más, el anticuerpo antagonista anti-CGRP comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada mostrada en la Figura 5 (SEQ ID NO:1) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera mostrada en la Figura 5 (SEQ ID NO: 2).

[0021] En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante modificada, tal como una región constante que es inmunológicamente inerte (incluyendo parcialmente inmunológicamente inerte), por ejemplo, no desencadena la lisis mediada por el complemento, no estimula la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), no activa la microglía o ha reducido una o más de estas actividades. En algunas realizaciones, la región constante se modifica como se describe en Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624; Solicitud PCT n° PCT/GB99/01441; y/o la Solicitud de Patente del Reino Unido N° 9809951.8. En otras realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de IgG2 de cadena pesada humana que comprende las siguientes mutaciones: A330P331 a S330S331 (numeración de aminoácidos con referencia a la secuencia de IgG2 de tipo silvestre). EUR. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624. En algunas realizaciones, la región constante de cadena pesada del anticuerpo es una IgG1 de cadena pesada humana con cualquiera de las siguientes mutaciones: 1) A327A330P331 a G327S330S331; 2) E233L234L235G236 (SEQ ID NO: 48) a P233V234A235 con G236 eliminado; 3) E233L234L235 a P233V234A235; 4) E233L234L235G236A327A330P331 (SEQ ID NO: 49) a P233V234A235G327S330S331 (SEQ ID NO: 50) con G236 eliminado; 5) E233L234L235A327A330P331 (SEQ ID NO: 51) a P233V234A235G327S330S331 (SEQ ID NO: 50); y 6) N297 a A297 o cualquier otro aminoácido excepto N. En algunas realizaciones, la región constante de cadena pesada del anticuerpo es una IgG4 de cadena pesada humana con cualquiera de las siguientes mutaciones: E233F234L235G236 (SEQ ID NO: 52) a P233V234A235 con G236 eliminado; E233F234L235 a P233V234A235; y S228L235 a P228E235.

[0022] En otras realizaciones, la región constante es aglicosilada para la glicosilación ligada a N. En algunas realizaciones, la región constante se aglicosila para la glicosilación ligada a N mutando el residuo de unión de oligosacárido (tal como Asn297) y/o los residuos flanqueantes que son parte de la secuencia de reconocimiento de N-glicosilación en la región constante. En algunas realizaciones, la región constante se aglicosila para la glicosilación ligada a N. La región constante se puede aglicosilar para la glicosilación ligada a N enzimáticamente o mediante expresión en una célula huésped deficiente en glicosilación.

[0023] La afinidad de unión (KD) de un anticuerpo antagonista anti-CGRP para CGRP (tal como a-CGRP humano como se mide por resonancia de plasmón de superficie a una temperatura adecuada, tal como 25 o 37°C) puede ser de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 200 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es cualquiera de aproximadamente 200 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 5 pM o aproximadamente 2 pM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es menor que cualquiera de aproximadamente 250 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM o aproximadamente 50 pM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es inferior a aproximadamente 50 nM.

[0024] El anticuerpo antagonista anti-CGRP se puede administrar antes de, durante y/o después de la cefalea postraumática. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP se administra antes del ataque de dolor de cabeza postraumático (p. ej., después de un trauma o lesión en la cabeza y/o cuello). La administración de un anticuerpo antagonista anti-CGRP puede ser por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo: por vía oral, intravenosa, subcutánea, intraarterial, intramuscular, intranasal (p. ej., con o sin inhalación), intracardial, intraespinal, intratorácica, intraperitoneal, intraventricular, por vía sublingual, transdérmica y/o por inhalación. La administración puede ser sistémica, por ejemplo, intravenosa o localizada. En algunas realizaciones, una dosis inicial y una o más dosis adicionales se administran de la misma manera, es decir, por vía subcutánea o intravenosa. En algunas realizaciones, la una o más dosis adicionales se administran de una manera diferente a la dosis inicial, es decir, la dosis inicial se puede administrar por vía intravenosa y la una o más dosis adicionales se pueden administrar por vía subcutánea.

[0025] En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP se puede administrar en conjunción con otro agente, tal como otro agente para el tratamiento de dolor de cabeza post-traumático.

[0026] En el presente documento se describe una composición farmacéutica para prevenir, tratar o reducir el dolor de cabeza postraumático que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista anti-CGRP, en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

[0027] En el presente documento se describe un kit para su uso en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. En algunos casos, el kit comprende un recipiente, una composición que comprende un anticuerpo antagonista anti-CGRP descrito en este documento, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, e instrucciones para usar la composición en cualquiera de los métodos descritos en este documento.

[0028] En el presente documento se describen anticuerpos y polipéptidos anti-antagonistas de CGRP derivados del anticuerpo G1 o sus variantes que se muestran en la Tabla 6. Por consiguiente, en una realización, la invención puede usar un anticuerpo G1 (denominado indistintamente "G1" y "TEV-48125") que se produce mediante vectores de expresión que tienen los números de acceso ATCC PTA-6866 y PTA-6867. Por ejemplo, en una realización es un anticuerpo que comprende una cadena pesada producida por el vector de expresión con el número de acceso ATCC PTA-6867. En una realización adicional, es un anticuerpo que comprende una cadena ligera producida por el vector de expresión con el número de acceso ATCC PTA-6866. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de G1 se muestran en la Figura 5. Las porciones de la región determinante de complementariedad (CDR) del anticuerpo G1 (incluidas las CDR de Chothia y Kabat) también se muestran en la Figura 5. Se entiende que una referencia a cualquier parte o región entera de G1 abarca secuencias producidos por los vectores de expresión que tienen Nos de acceso ATCC PTA-6866 y PTA- 6867, y/o las secuencias representadas en la Figura 5.

[0029] En una realización, la invención puede usar un anticuerpo que comprenda un dominio VH que sea al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idénticos en la secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 1.

[0030] En otra realización, la invención puede utilizar un anticuerpo que comprende un dominio Vl que es al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntico en la secuencia de aminoácidos a SEQ ID NO: 2.

[0031] En otra realización, la invención puede utilizar un anticuerpo que comprende un fragmento o una región del anticuerpo G1. En una realización, el fragmento es una cadena ligera del anticuerpo G1. En otra realización, el fragmento es una cadena pesada del anticuerpo G1. En otra realización más, el fragmento contiene una o más regiones variables de una cadena ligera y/o una cadena pesada del anticuerpo G1. En aún otra realización, el fragmento contiene una o más variables de las regiones de una cadena ligera y/o una cadena pesada mostrada en la Figura 5.

[0032] En algunas realizaciones, la CDR es una CDR de Kabat. En otras realizaciones, la CDR es una CDR de Chothia. En otras realizaciones, la CDR es una combinación de una CDR de Kabat y una Chothia (también denominada "CDR combinada" o "CDR extendida”). En otras palabras, para cualquier realización dada que contenga más de una CDR, las CDR pueden ser cualquiera de Kabat, Chothia y/o combinadas.

[0033] En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo es monoclonal. En algunas realizaciones, se aísla el anticuerpo (o polipéptido). En algunas realizaciones, el anticuerpo (o polipéptido) es sustancialmente puro.

[0034] La región constante de cadena pesada de los anticuerpos puede ser de cualquier tipo de región constante, tales como IgG, IgM, IgD, IgA e IgE; y cualquier isotipo, como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

[0035] En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante modificada como se describe aquí.

[0036] También se describe aquí un polinucleótido (que puede estar aislado) que comprende un polinucleótido que codifica un fragmento o una región del anticuerpo G1 o sus variantes se muestran en la Tabla 6.

[0037] También se describe en el presente documento un polinucleótido (que puede ser aislado) que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo G1 o sus variantes mostradas en la Tabla 6. El polinucleótido puede comprender uno o ambos de los polinucleótidos mostrados en SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.

[0038] También se describen en el presente documento vectores (incluyendo vectores de expresión y clonación) y células huésped que comprenden cualquiera de los polinucleótidos descritos aquí. En algunos casos, el vector es pDb.CGRP.hFcGI que tiene ATCC N° PTA-6867. En otros casos, el vector es pEb.CGRP.hKGI que tiene ATCC N° PTA-6866.

[0039] En una realización, la composición para uso en la invención se administra al sujeto como una sola dosis en una cantidad que modula la vía de CGRP, en donde la cantidad del anticuerpo monoclonal administrado al paciente es de aproximadamente 675 mg a aproximadamente 1000 mg.

Breve descripción de los dibujos

[0040]

La Figura 1 es una tabla que muestra las afinidades de unión de 12 anticuerpos murinos por diferentes fragmentos de a-CGRP humanos sustituidos con alanina. Las afinidades de unión se midieron a 25°C usando Biacore haciendo fluir Fabs a través de CGRP en el chip. Los valores encuadrados representan la pérdida de afinidad de los mutantes de alanina en relación con el fragmento parental, 25-37 (cursiva), excepto K35A, que se derivó de un parental 19-37. "a" indica afinidades por 19-37 y los fragmentos 25-37 son la desviación estándar promedio ± de dos mediciones independientes en diferentes chips sensores. "b" indica que estas interacciones se desviaron de un modelo de interacción bimolecular simple debido a una tasa bifásica, por lo que sus afinidades se determinaron usando un modelo de cambio conformacional. Clave de escala de grises: blanco (1,0) indica afinidad parental; gris claro (menos de 0,5) indica mayor afinidad que el padre; gris oscuro (más de 2) indica menor afinidad que el padre; y el negro indica que no se detectó unión.

Las Figuras 2A y 2B muestran el efecto de administrar CGRP 8-37 (400 nmol/kg), anticuerpo 4901 (25 mg/kg) y anticuerpo 7D11 (25 mg/kg) sobre el flujo sanguíneo de la piel medido como flujo de células sanguíneas después de la estimulación del pulso eléctrico durante 30 segundos. Se administró CGRP 8-37 por vía intravenosa (iv) 3-5 minutos antes de la estimulación de pulso eléctrico. Los anticuerpos se administraron por vía intraperitoneal (IP) 72 horas antes de la estimulación por pulso eléctrico. Cada punto de los gráficos representa el AUC de una rata tratada en las condiciones indicadas. Cada línea en los gráficos representa el a Uc promedio de las ratas tratadas en las condiciones indicadas. AUC (área bajo la curva) es igual a Aflujo x Atiempo. "Aflujo" representa el cambio de unidades de flujo después de la estimulación del pulso eléctrico; y "Atiempo" representa el período de tiempo que tarda el nivel de flujo de células sanguíneas en volver al nivel anterior a la estimulación del pulso eléctrico.

La Figura 3 muestra el efecto de administrar diferentes dosis de anticuerpo 4901 (25 mg/kg, 5 mg/kg, 2,5 mg/kg o 1 mg/kg) sobre el flujo sanguíneo de la piel medido como flujo de células sanguíneas después de la estimulación por pulso eléctrico durante 30 segundos. Los anticuerpos se administraron por vía intravenosa (IV) 24 horas antes de la estimulación por pulso eléctrico. Cada punto del gráfico representa el AUC de una rata tratada en las condiciones indicadas. La línea del gráfico representa el AUC medio de las ratas tratadas en la condición indicada.

Las Figuras 4A y 4B muestran el efecto de administrar el anticuerpo 4901 (1 mg/kg o 10 mg/kg, i.v.), el anticuerpo 7E9 (10 mg/kg, i.v.) y el anticuerpo 8B6 (10 mg/kg, i.v.) en el flujo de sangre de la piel medido como flujo de células sanguíneas después de la estimulación del pulso eléctrico durante 30 segundos. Los anticuerpos se administraron por vía intravenosa (i.v.) seguido de estimulación de pulso eléctrico a los 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos y 120 minutos después de la administración de anticuerpos. El eje Y representa el porcentaje de AUC en comparación con el nivel de AUC cuando no se administró ningún anticuerpo (tiempo 0). El eje X representa el período de tiempo (minutos) entre la administración de anticuerpos y la estimulación por pulso eléctrico. "*" indica P <0,05 y "**" indica P <0,01, en comparación con el tiempo 0. Los datos se analizaron usando ANOVA de una vía con una prueba de comparación múltiple de Dunnett.

La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:1) y la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 2) del anticuerpo G1. Las CDR de Kabat están en negrita y las CDR de Chothia están subrayadas. Los residuos de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y cadena ligera se numeran secuencialmente.

La Figura 6 muestra el mapeo de epítopos del anticuerpo G1 por competencia de péptidos usando Biacore. Se capturó a-CGRP humano N-biotinilado en un chip sensor Sa . Se hizo fluir sobre el chip G1 Fab (50 nM) en ausencia de un péptido competidor o preincubado durante 1 hora con 10 mM de un péptido competidor. Se midió la unión de G1 Fab al a-CGRP humano en el chip. El eje Y representa el porcentaje de unión bloqueada por la presencia del péptido competidor en comparación con la unión en ausencia del péptido competidor.

La Figura 7 muestra el efecto de administrar anticuerpo G1 (1 mg/kg o 10 mg/kg, i.v.) o vehículo (PBS, Tween 20 al 0,01%) sobre el flujo sanguíneo de la piel medido como flujo de células sanguíneas después de la estimulación por pulso eléctrico durante 30 segundos. El anticuerpo G1 o vehículo se administró por vía intravenosa (i.v.) seguido de estimulación del pulso eléctrico del nervio a los 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos y 120 minutos después de la administración del anticuerpo. El eje Y representa el porcentaje de AUC en comparación con el nivel de AUC cuando no se administró ningún anticuerpo o vehículo (definido como 100%) (tiempo 0). El eje X representa el período de tiempo (minutos) entre la administración de anticuerpos y la estimulación por pulso eléctrico. "*" indica P <0,05 y "**" indica P <0,01, en comparación con el vehículo. Los datos se analizaron mediante ANOVA bidireccional y pospruebas de Bonferroni.

La Figura 8A muestra el efecto de la administración de anticuerpo G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg, i.v.) o vehículo (PBS, Tween 20 al 0,01%) sobre el flujo sanguíneo de la piel medido como flujo de células sanguíneas después de la estimulación por pulso eléctrico durante 30 segundos 24 horas después de la dosificación. El anticuerpo G1 o vehículo se administró por vía intravenosa (iv) 24 horas antes de la estimulación del pulso eléctrico del nervio. El eje Y representa el área total bajo la curva (cambio en el flujo de células sanguíneas multiplicado por el cambio en el tiempo desde la estimulación hasta que el flujo vuelve a la línea de base, AUC). El eje X representa dosis variables de anticuerpo G1. "*" indica P <0,05 y "**" indica P <0,01, en comparación con el vehículo. Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Dunn

La Figura 8B muestra el efecto de administrar el anticuerpo G1 (0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg, i.v.) o el vehículo (PBS, Tween 20 al 0,01%) sobre el flujo sanguíneo de la piel medido como flujo de células sanguíneas después de la estimulación de pulso eléctrico durante 30 segundos 7 días después de la dosificación. El anticuerpo G1 o el vehículo se administró por vía intravenosa (i.v.) 7 días antes de la estimulación del pulso eléctrico del nervio. El eje Y representa el AUC total. El eje X representa dosis variables de anticuerpo g 1. "**" indica P <0,01 y "***" indica P <0,001, en comparación con el vehículo. Los datos se analizaron utilizando ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Dunn.

La Figura 8C es un análisis de ajuste de curva de los datos de las figuras 8A y 8B. El anticuerpo G1 o vehículo se administró por vía intravenosa (i.v.) 24 horas o 7 días antes de la estimulación del pulso eléctrico del nervio. El eje Y representa el AUC total. El eje X representa dosis variables de anticuerpo G1 en "mg/kg" en una escala logarítmica para determinar la CE50.

La Figura 9 muestra el efecto del anticuerpo mu7E9 (10 mg/kg), BIBN4096BS o vehículo (PBS, Tween 20 al 0,01%) sobre el cambio de diámetro de la arteria meníngea media después de la estimulación del campo eléctrico. El anticuerpo mu7E9, BIBN4096BS o el vehículo se administraron por vía intravenosa (i.v.) en el momento 0 minutos después de que se estableciera una respuesta inicial a la estimulación eléctrica. El eje Y representa el cambio de diámetro de la arteria meníngea media después de la estimulación del campo eléctrico. El diámetro de reposo corresponde al 0%. El eje X representa el tiempo (minutos) de estimulación por pulso eléctrico. "*" indica P <0,05 y "**" indica P <0,01, en comparación con el vehículo. Los datos se analizaron utilizando ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Dunett.

La Figura 10 muestra el efecto de dosis variables de anticuerpo G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg, i.v.) o vehículo (PBS, Tween 20 al 0,01%) sobre el cambio de diámetro de la arteria meníngea media después e estimulación del campo eléctrico. El anticuerpo G1 o vehículo se administró por vía intravenosa (i.v.) 7 días antes de la estimulación del campo eléctrico. El eje Y representa el cambio de diámetro de la arteria meníngea media. El diámetro de reposo corresponde al 0%. El eje X representa el voltaje de estimulación. "*" indica P <0,05, "**" indica P <0,01 y "***" indica P <0,001, en comparación con el vehículo. Los datos se analizaron mediante ANOVA bidireccional y pospruebas de Bonferroni.

La Figura 11A muestra el efecto del anticuerpo mu4901 (10 mg/kg) o vehículo (PBS, Tween 20 al 0,01%), administrado por vía intravenosa (i.v.) 24 horas antes, sobre la disminución de la temperatura central inducida por la inyección subcutánea de naloxona (1 mg/kg) en ratas adictas a la morfina. El eje Y representa la diferencia de temperatura desde la línea de base. El eje X representa el tiempo medido desde el punto de inyección de naloxona.

La Figura 11B muestra el efecto del anticuerpo mu4901 (10 mg/kg) o vehículo (PBS, Tween 20 al 0,01%), administrado por vía intravenosa (i.v.) 24 horas antes, sobre el aumento de la temperatura de la superficie de la cola inducida por la inyección subcutánea de naloxona (1 mg/kg) en ratas adictas a la morfina. El eje Y representa la diferencia de temperatura desde la línea de base. El eje X representa el tiempo medido desde el punto de inyección de naloxona.

Las Figuras 12A y 12B son dos gráficos de barras que muestran el efecto de mCHI sobre (12A) actividad exploratoria vertical y el reconocimiento de objetos novedosos (12B). Los datos son media SEM (n=8) *p<0,05 vs simulacro.

Las Figuras 13A a 13D son gráficos de cuatro líneas que muestran el umbral de respuesta cefálica (13A y 13C) y de la pata trasera (13B y 13D) y la puntuación nociceptiva acumulada a la estimulación mecánica de más de 14 días después de mCHI. Los datos son la media SEM (n=6). *p<0,05 vs simulacro.

Las Figuras 14A a 14D son gráficos de cuatro líneas que muestran el efecto del tratamiento agudo con sumatriptán (Figuras 14A y 14B) o anticuerpo anti-CGRP murino crónico (Figuras 14C y 14D) sobre el umbral de respuesta y la puntuación nociceptiva acumulada a la estimulación mecánica después de mCHI. Los datos son la media s Em (n=6-8). *p<0,05 simulado frente a mCHI, n° p <0,05 mCHI frente a mCHI Suma p <0,05 IgG de control frente a mAb anti-CGRP.

Las Figuras 15A y 15B muestran el protocolo de tratamientos para la preferencia de lugar condicionada durante el día de acondicionamiento (Figura 15A) y que sumatriptán produce CPP en animales 7 días después de mCHI pero no en animales simulados (Figura 15B). Los datos son la media SEM (n=8). **p<0,001 solución salina emparejada frente a sumatriptán emparejada.

Las Figuras 16A a 16D son cuatro gráficos de barras que muestran el efecto de la administración de GTN el día 15 y el día 30 después de mCHI sobre la hipersensibilidad mecánica cefálica. Los datos son la media SEM (n=8) *p<0,05, **p<0,01 ***p<0,001 vs simulacro.

Las Figuras 17A a 17D son cuatro gráficos de barras que muestran el efecto de la administración de GTN el día 15 y el día 30 después de mCHI sobre la hipersensibilidad mecánica de las patas traseras. Los datos son media SEM (n=8) *p<0,05 vs simulacro.

Las Figuras 18A a 18D son cuatro gráficos de barras que muestran el efecto del tratamiento agudo con sumatriptán o la administración crónica de mAb anti-CGRP y sus tratamientos de control sobre el % de disminución en los umbrales de respuesta (Figuras 18A y 18C) o el % de aumento en las puntuaciones nociceptivas (Figura 18B y 18D) a las 4 h después de la GTN en comparación con los valores correspondientes del día 14 anteriores a la GTN. Los datos son la media SEM (n=8) *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 frente a GTN Veh o GTN IgG.

Las Figuras 19A y 19B muestran el protocolo de tratamientos para la aversión al lugar condicionado durante el día de acondicionamiento (Figura 19A) y que GTN produjo aversión al lugar en los animales mCHI inyectados con IgG el día 14 después de la lesión, pero no en los animales mCHI tratados con el mAb anti-CGRP (Figura 19B). Los datos son la media SEM (n=8). *p<0,05 cámara emparejada pre-GTN vs cámara emparejada GTN.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Técnicas generales

[0041] La práctica de los distintos aspectos de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, convencionales técnicas de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía, tales como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths y D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Vectores de transferencia de genes para células de mamíferos (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., Eds., 1987); PCR: The Polimerase Chain Reaction, (Mullis et al., Eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., Eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., Ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti. y J. D. Capra, eds, Harwood Academic Publishers, 1995).

Definiciones

[0042] Tal como se usa en este documento, "aproximadamente" cuando se usa en referencia a rangos numéricos, límites o valores específicos se usa para indicar que los valores enumerados pueden variar hasta en un 10% del valor enumerado. Por lo tanto, el término "aproximadamente" se usa para abarcar las variaciones de ± 10% o menos, variaciones de ± 5% o menos, variaciones de ± 1% o menos, variaciones de ± 0,5% o menos, o variaciones de ± 0,1% o menos del valor especificado.

[0043] Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a una diana, como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, ubicado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. En el presente documento, el término abarca no solo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos (como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), monocatenario (ScFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo (como anticuerpos de dominio) y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígenos. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, como IgG, IgA o IgM (o una subclase de las mismas), y el anticuerpo no necesita ser de ninguna clase en particular. Dependiendo de la secuencia ácida del anticuerpo amino del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

[0044] Como se usa en el presente documento, "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones en estado natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante del antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizarán de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256: 495, o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante como los descritos en la Patente de EE.UU. n° 4.816.567. Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse de bibliotecas de fagos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., 1990, Nature, 348: 552-554, por ejemplo.

[0045] Como se usa en el presente documento, anticuerpos "humanizados" se refieren a formas de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) que son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata, o conejo que tiene la especificidad, afinidad y actividad biológica deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias marco o CDR importadas, pero que se incluyen para refinar y optimizar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá de manera óptima al menos una parte de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Los anticuerpos pueden tener regiones Fc modificadas como se describe en WO 99/58572. Otras formas de anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco, seis) que están alteradas con respecto al anticuerpo original, que también se denominan una o más CDR "derivadas" de una o más CDR de el anticuerpo original.

[0046] Como se usa en el presente documento, "anticuerpo humano" significa un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha realizado utilizando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos conocidos en la técnica o descritos aquí. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada humana o al menos un polipéptido de cadena ligera humana. Un ejemplo de este tipo es un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena ligera murina y de cadena pesada humana. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14: 309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (EE. UU.) 95: 6157-6162; Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227: 381; Marks y col., 1991, J. Mol. Biol., 222: 581). Los anticuerpos humanos también se pueden preparar introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena se han inactivado parcial o completamente. Este enfoque se describe en las Patentes de Estados Unidos N° 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016. Alternativamente, el anticuerpo humano puede prepararse inmortalizando linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (tales linfocitos B pueden recuperarse de un individuo o pueden haber sido inmunizados in vitro). Véase, por ejemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner y col., 1991, J. Immunol., 147 (1): 86-95; y Patente de Estados Unidos N° 5.750,373.

[0047] Tal como se utiliza aquí, el término "péptido relacionado por el gen calcitonina" y "CGRP" se refiere a cualquier forma de péptido relacionado por el gen calcitonina y variantes del mismo que retienen al menos parte de la actividad del CGRP. Por ejemplo, CGRP puede ser a-CGRP o p-CGRP. Como se usa en este documento, CGRP incluye todas las especies de mamíferos de CGRP de secuencia nativa, por ejemplo, humano, canino, felino, equino y bovino.

[0048] Como se usa en este documento, un "anticuerpo antagonista anti-CGRP" (denominado intercambiablemente "anticuerpo anti-CGRP") se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a CGRP e inhibir la actividad biológica CGRP y/o vía de corriente abajo mediada por señalización CGRP. Un anticuerpo antagonista anti-CGRP abarca anticuerpos que modulan, bloquean, antagonizan, suprimen o reducen (incluyendo significativamente) la actividad biológica de CGRP, o antagonizan de otro modo la vía de CGRP, incluidas las vías posteriores mediadas por la señalización de CGRP, como la unión al receptor y/o la provocación de una respuesta celular a CGRP. Para los fines de la presente invención, se entenderá explícitamente que el término "anticuerpo antagonista anti-CGRP" abarca todos los términos, títulos y estados y características funcionales por las cuales el propio CGRP, la actividad biológica del CGRP (incluida, entre otras, su capacidad para mediar en cualquier aspecto el dolor de cabeza), o las consecuencias de la actividad biológica, se anulan, disminuyen o neutralizan sustancialmente en cualquier grado significativo. En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista anti-CGRP se une a CGRP y evita la unión de CGRP a un receptor CGRP. En otras realizaciones, un anticuerpo anti-CGRP se une a CGRP y evita la activación de un receptor de CGRP. Se proporcionan aquí ejemplos de anticuerpos antagonistas anti-CGRP.

[0049] Como se usa en este documento, los términos "G1", "anticuerpo G1" y "TEV-48125" se utilizan indistintamente para referirse a un anticuerpo antagonista anti-CGRP producido por los vectores de expresión con un número de depósito de ATCC PTA-6867 y ATCC PTA 6866. La secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera se muestra en la Figura 5. Las porciones de CDR del anticuerpo G1 (incluidas las CDR de Chothia y Kabat) se representan esquemáticamente en la Figura 5. Los polinucleótidos que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera son mostrados en SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. La caracterización de G1 se describe en los Ejemplos.

[0050] Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en este documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede interrumpirse por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, como la conjugación con un componente de marcaje. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, debido a que los polipéptidos de esta invención se basan en un anticuerpo, los polipéptidos pueden presentarse como cadenas simples o cadenas asociadas.

[0051] "Polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usa indistintamente en este documento, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificadas y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse a un polímero mediante ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación de la estructura de nucleótidos puede impartirse antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, por ejemplo mediante conjugación con un componente de marcaje. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "tapas", sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (p. ej., metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (p. ej., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos que contienen restos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (p. ej., nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, pli-L-lisina, etc.), los que tienen intercaladores (p. ej., acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (p. ej., metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), los que contienen alquilantes, los que tienen enlaces modificados (p. ej., ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del (de los) polinucleótido(s). Además, cualquiera de los grupos hidroxilo normalmente presentes en los azúcares puede reemplazarse, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse con grupos protectores estándar o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o puede conjugarse con soportes sólidos. El OH terminal 5' y 3' puede fosforilarse o sustituirse con aminas o restos de grupos protectores orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. También se pueden derivar otros hidroxilos a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que se conocen generalmente en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metilo-, 2'-O-alilo, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares a-anoméricos, azúcares epiméricos como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos como metilo ribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden reemplazarse por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a realizaciones en las que el fosfato se reemplaza por P(O)S("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en donde cada R o R' es independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace de éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucleótido sean idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos mencionados en este documento, incluidos el ARN y el ADN.

[0052] Como se usa en el presente documento, "dolor de cabeza post-traumático" es una cefalea por trauma o lesión en la cabeza y/o cuello, como se describe adicionalmente en The International Classification of Headache Disorders, 3a edición (versión beta), Cephalalgia, 33 (9): 629-808 (2013). Por ejemplo, los dolores de cabeza postraumáticos pueden parecerse a los de tipo tensional o migraña. En consecuencia, su diagnóstico depende en gran medida de la estrecha relación temporal entre el trauma o la lesión y el inicio del dolor de cabeza. De acuerdo con los de ICHD-II, los criterios de diagnóstico de ICHD-3 beta para todos los subtipos requieren que se informe que el dolor de cabeza se ha desarrollado dentro de los 7 días posteriores al trauma o lesión, o dentro de los 7 días posteriores a la recuperación de la conciencia y/o la capacidad de sentir e informar el dolor cuando se haya perdido después de un traumatismo o lesión. Aunque este intervalo de 7 días es algo arbitrario, y aunque algunos expertos argumentan que el dolor de cabeza puede desarrollarse después de un intervalo más largo en una minoría de pacientes, no hay evidencia suficiente en este momento para cambiar este requisito.

[0053] Los médicos expertos serán fácilmente capaces de reconocer un sujeto con un dolor de cabeza post traumático. Por ejemplo, ha ocurrido una lesión traumática en la cabeza y se informa que se ha desarrollado un dolor de cabeza dentro de los siete días posteriores a una de las siguientes: la lesión en la cabeza, recuperación de la conciencia después de la lesión en la cabeza, o suspensión de medicamentos que afectan la capacidad de sentir o informar dolor de cabeza después de la lesión en la cabeza. En algunos casos, el dolor de cabeza se ha resuelto dentro de los 3 meses posteriores a la lesión en la cabeza, o el dolor de cabeza aún no se ha resuelto, pero aún no han pasado 3 meses desde la lesión en la cabeza.

[0054] Los criterios de diagnóstico para los dolores de cabeza agudos atribuidos a lesión traumática de la cabeza, que pueden incluir dolores de cabeza de duración de menos de 3 meses causada por lesión traumática de la cabeza, pueden incluir:

A. Cualesquiera criterios C y D del dolor de cabeza

B. Se ha producido una lesión traumática en la cabeza

C. Se informa que el dolor de cabeza se ha desarrollado dentro de los 7 días posteriores a una de las siguientes situaciones:

1. la lesión en la cabeza

2. recuperación del conocimiento después de la lesión en la cabeza

3. suspensión de la(s) medicación(es) que afecta(n) la capacidad de sentir o informar dolor de cabeza después de la lesión en la cabeza

D. Cualquiera de los siguientes:

1. El dolor de cabeza se ha resuelto dentro de los 3 meses posteriores a la lesión en la cabeza 2. El dolor de cabeza aún no se ha resuelto pero aún no han pasado 3 meses desde la lesión en la cabeza

E. No se explica mejor por otro diagnóstico de ICHD-3.

[0055] Los criterios de diagnóstico para los dolores de cabeza agudos atribuidos a lesión moderada o traumática grave en la cabeza pueden incluir lesiones en la cabeza asociadas con al menos uno de los siguientes:

1. pérdida de conciencia durante >30 minutos

2. puntuación de Glasgow Coma Scale (GCS) <13

3. amnesia postraumática1 que dura >24 horas

4. alteración en el nivel de conciencia durante >24 horas

5. pruebas de imagen de una lesión traumática en la cabeza, como hemorragia intracraneal y/o contusión cerebral.

[0056] Los criterios de diagnóstico para la cefalea postraumática atribuido a lesión traumática leve en la cabeza puede incluir una lesión en la cabeza cumpliendo los siguientes:

1. asociados con ninguno de los siguientes:

a) la pérdida de conciencia durante >30 minutos

b) puntuación de Glasgow Coma Scale <13 (GCS)

c) amnesia postraumática que dura >24 horas

d) alteración del nivel de conciencia durante >24 horas

e) evidencia de imagen de una lesión traumática en la cabeza, como hemorragia intracraneal y/o contusión cerebral

2. asociados, inmediatamente después de la lesión en la cabeza, con uno o más de los siguientes síntomas y/o signos:

a) confusión transitoria, desorientación o deterioro de la conciencia

b) pérdida de memoria por eventos inmediatamente antes o después de la lesión en la cabeza c) dos o más otros síntomas sugestivos de lesión cerebral traumática leve: náuseas, vómitos, alteraciones visuales, mareos y/o vértigo, deterioro de la memoria y/o concentración.

[0057] El dolor de cabeza postraumático persistente atribuido a una lesión traumática en la cabeza es un dolor de cabeza de más de tres meses de duración causado por una lesión traumática en la cabeza y se informa que el dolor de cabeza se desarrolló dentro de los 7 días posteriores a una de las siguientes situaciones: la lesión en la cabeza, recuperación del conocimiento después de la lesión en la cabeza, o suspensión de medicamentos que afectan la capacidad de sentir o informar dolor de cabeza después de la lesión en la cabeza. En algunos casos, el dolor de cabeza persiste durante más de tres meses después de la lesión en la cabeza.

[0058] Los criterios de diagnóstico para la cefalea persistente se atribuyen a lesión traumática moderada o grave en la cabeza puede incluir lesiones en la cabeza asociadas con al menos uno de los siguientes:

1. pérdida de la conciencia durante >30 minutos

2. puntuación de Glasgow Coma Scale (GCS) <13

3. amnesia postraumática1 que dura >24 horas

4. alteración en el nivel de conciencia durante >24 horas

5. evidencia de imagen de una lesión en la cabeza traumática como hemorragia intracraneal y/o contusión cerebral.

[0059] Los criterios de diagnóstico para la cefalea postraumática persistente atribuidos a la lesión traumática leve en la cabeza pueden incluir lesiones en la cabeza con ambos de los siguientes:

1. asociados con ninguno de los siguientes:

a) la pérdida de conciencia durante >30 minutos

b) puntuación de Glasgow Coma Scale (GCS) <13

c) amnesia postraumática que dura >24 horas

d) alteración del nivel de conciencia durante >24 horas

a) confusión transitoria, desorientación o deterioro de la conciencia

[0060] La lesión traumática a la cabeza se define como una lesión estructural o funcional resultante de la acción de fuerzas externas en la cabeza. Estas incluyen golpear la cabeza con un objeto o golpear la cabeza con un objeto, penetración en la cabeza de un cuerpo extraño, fuerzas generadas por estallidos o explosiones y otras fuerzas aún por definir.

[0061] Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o la región variable de la cadena pesada de anticuerpo, ya sea solo o en combinación. Las regiones variables de la cadena pesada y ligera constan cada una de cuatro regiones marco (FR) conectadas por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) un enfoque basado en la variabilidad de secuencia entre especies (es decir, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273: 927-948)). Como se usa en este documento, una CDR puede referirse a las CDR definidas por cualquier enfoque o por una combinación de ambos enfoques.

[0062] Una "región constante" de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena ligera del anticuerpo o la región constante de la cadena pesada de anticuerpo, ya sea solo o en combinación.

[0063] Un epítopo que "se une preferentemente" o "se une específicamente" (usados indistintamente en este documento) a un anticuerpo o un polipéptido es un término bien entendido en la técnica, y los métodos para determinar tal unión específica o preferencial son también bien conocidos en la técnica. Se dice que una molécula exhibe "unión específica" o "unión preferencial" si reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia particular que con células o sustancias alternativas. Un anticuerpo "se une específicamente" o "se une preferentemente" a una diana si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de la que se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une de forma específica o preferencial a un epítopo CGRP es un anticuerpo que se une a este epítopo con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que se une a otros epítopos CGRP o epítopos no CGRP. También se entiende por la lectura de esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epítopo) que se une específica o preferentemente a una primera diana puede o no unirse específica o preferentemente a una segunda diana. Como tal, la "vinculación específica" o la "vinculación preferencial" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) vinculación exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a unión significa unión preferencial.

[0064] Como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" se refiere a material que es al menos 50% puro (es decir, libre de contaminantes), más preferiblemente al menos 90% puro, más preferiblemente al menos 95% puro, más preferiblemente al menos 98% puro, y más preferiblemente al menos 99% puro.

[0065] Una "célula huésped" incluye una célula individual o cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor para el vector para la incorporación de insertos de polinucleótidos. Las células huésped incluyen la progenie de una única célula huésped, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN genómico) a la célula parental original debido a una mutación natural, accidental o deliberada. Una célula huésped incluye células transfectadas in vivo con uno o varios polinucleótidos de esta invención.

[0066] El término "región Fc" se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. La "región Fc" puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define normalmente para que se extienda desde un residuo de aminoácido en posición Cys226, o de Pro230, al extremo carboxilo terminal del mismo. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice UE como en Kabat. Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 1991. La región Fc de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, CH2 y CH3.

[0067] Como se usa en el presente documento, "receptor Fc" y "FcR" describen un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, que incluyen variantes alélicas y formas empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9: 457-92; Capel y col., 1994, Immunomethods, 4: 25-34; y de Haas y col., 1995, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41. "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., 1976, J. Immunol.,117: 587; y Kim y col., 1994, J. Immunol., 24: 249).

[0068] "Citotoxicidad dependiente de complemento" y "CDC" se refieren a la lisis de una diana en presencia del complemento. La vía de activación del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula (p. ej., un anticuerpo) complejada con un antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., se pueden realizar J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

[0069] Una "región Fc funcional" posee al menos una función efectora de una región Fc de secuencia nativa. Las "funciones efectoras" ejemplares incluyen la unión de C1q; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación a la baja de los receptores de la superficie celular (p. ej., receptor de células B; BCR), etc. Tales funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (p. ej., un dominio variable de anticuerpo) y se pueden evaluar usando varios ensayos conocidos en la técnica para evaluar tales funciones efectoras de anticuerpos.

[0070] Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácido de una región Fc encontrada en la naturaleza. Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácido, pero conserva al menos una función efectora de la región Fc de secuencia nativa. Preferiblemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido original, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y preferiblemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido original. La región Fc variante de la presente invención poseerá preferiblemente al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido parental, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con la misma, más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con los mismos.

[0071] Como se usa en el presente documento "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en donde células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (p. ej., asesinas naturales (NK), neutrófilos, y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la célula diana. La actividad de ADCC de una molécula de interés se puede evaluar usando un ensayo de ADCC in vitro, como el descrito en la patente de EE.UU. n° 5,500,362 o 5,821,337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células NK. Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al., 1998, PNAS (EE.UU.), 95: 652-656.

[0072] Como se usa en el presente documento, "prevenir" es un enfoque para evitar que PTH (persistente) se produzca o exista en un sujeto, que no tiene ya PTH (persistente). Como se usa en este documento, "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a uno o más de los siguientes: mejora en cualquier aspecto de un dolor de cabeza postraumático, incluida la disminución de la gravedad, el alivio de la intensidad del dolor y otros síntomas asociados, reducir la frecuencia de la recurrencia, aumentar la calidad de vida de quienes padecen el dolor de cabeza postraumático y disminuir la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar el dolor de cabeza postraumático.

[0073] "Reducir la incidencia" de dolor de cabeza postraumático significa cualquiera de la reducción de la gravedad (que puede incluir la reducción de necesidad y/o cantidad de (p. ej., exposición a) otros fármacos y/o terapias usados generalmente para esta condición, incluyendo, por ejemplo, ergotamina, dihidroergotamina o triptanos), duración y/o frecuencia (incluyendo, por ejemplo, retrasar o aumentar el tiempo hasta el siguiente ataque episódico en un individuo). Como entienden los expertos en la técnica, los individuos pueden variar en términos de su respuesta al tratamiento y, como tal, por ejemplo, un "método para reducir la incidencia de dolor de cabeza postraumático en un individuo" refleja la administración del anticuerpo antagonista anti-CGRP basado en una expectativa razonable de que tal administración probablemente pueda causar tal reducción en la incidencia en ese individuo en particular.

[0074] La "mejora" de la cefalea postraumática o uno o más síntomas de la cefalea postraumática significa una disminución o mejora de uno o más síntomas de la cefalea postraumática en comparación con no administrar un anticuerpo antagonista anti-CGRP. "Mejorar" también incluye acortar o reducir la duración de un síntoma.

[0075] Como se usa en el presente documento, "el control de dolor de cabeza postraumático" se refiere al mantenimiento o reducción de la gravedad o la duración de uno o más síntomas de dolor de cabeza post-traumático o frecuencia de ataques de dolor de cabeza postraumático en un individuo (en comparación con el nivel antes del tratamiento). Por ejemplo, la duración o la gravedad del dolor de cabeza y/o cuello, o la frecuencia de los ataques se reduce al menos en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70% en el individuo en comparación con el nivel antes del tratamiento.

[0076] Como se usa en este documento, una "hora de dolor de cabeza" se refiere a una hora durante la cual un sujeto experimenta dolor de cabeza. Las horas de dolor de cabeza se pueden expresar en términos de horas completas (p. ej., una hora de dolor de cabeza, dos horas de dolor de cabeza, tres horas de dolor de cabeza, etc.) o en términos de horas completas y parciales (p. ej., 0,5 horas de dolor de cabeza, 1,2 horas de dolor de cabeza, 2,67 horas de dolor de cabeza, etc.). Se pueden describir una o más horas de dolor de cabeza con respecto a un intervalo de tiempo particular. Por ejemplo, "horas diarias de dolor de cabeza" puede referirse al número de horas de dolor de cabeza que experimenta un sujeto dentro de un intervalo de un día (p. ej., un período de 24 horas). En otro ejemplo, "horas semanales de dolor de cabeza" puede referirse al número de horas de dolor de cabeza que experimenta un sujeto dentro de un intervalo de una semana (p. ej., un período de 7 días). Como se puede apreciar, un intervalo de una semana puede corresponder o no a una semana natural. En otro ejemplo, las "horas mensuales de dolor de cabeza" pueden referirse al número de horas de dolor de cabeza que experimenta un sujeto en un intervalo de un mes. Como se puede apreciar, un intervalo de un mes (p. ej., un período de 28, 29, 30 o 31 días) puede variar en términos de número de días dependiendo del mes particular y puede o no corresponder a un mes natural. En otro ejemplo más, "horas anuales de dolor de cabeza" puede referirse al número de horas de dolor de cabeza que experimenta un sujeto dentro de un intervalo de un año. Como puede apreciarse, un intervalo de un año (p. ej., un período de 365 o 366 días) puede variar en términos de número de días dependiendo del año particular y puede o no corresponder a un año natural.

[0077] Como se usa en este documento, un "día de dolor de cabeza" se refiere a un día durante el cual un sujeto experimenta dolor de cabeza. Los días de dolor de cabeza se pueden expresar en términos de días completos (p. ej., un día de dolor de cabeza, dos días de dolor de cabeza, tres días de dolor de cabeza, etc.) o en términos de días completos y parciales (p. ej., 0,5 días de dolor de cabeza, 1,2 días de dolor de cabeza, 2,67 días de dolor de cabeza, etc.). Se pueden describir uno o más días de dolor de cabeza con respecto a un intervalo de tiempo particular. Por ejemplo, "días de dolor de cabeza semanales" puede referirse al número de días de dolor de cabeza que experimenta un sujeto dentro de un intervalo de una semana (p. ej., un período de 7 días). Como se puede apreciar, un intervalo de una semana puede corresponder o no a una semana natural. En otro ejemplo, los "días de dolor de cabeza mensuales" pueden referirse al número de días de dolor de cabeza que experimenta un sujeto dentro de un intervalo de un mes. Como se puede apreciar, un intervalo de un mes (p. ej., un período de 28, 29, 30 o 31 días) puede variar en términos de número de días dependiendo del mes particular y puede o no corresponder a un mes natural. En otro ejemplo más, "días de dolor de cabeza anuales" pueden referirse al número de días de dolor de cabeza que experimenta un sujeto dentro de un intervalo de un año. Como puede apreciarse, un intervalo de un año (p. ej., un período de 365 o 366 días) puede variar en términos de número de días dependiendo del año particular y puede o no corresponder a un año natural.

[0078] Tal como se utiliza en el mismo, "retrasar" el desarrollo de cefalea postraumática significa aplazar, obstaculizar, ralentizar, retrasar, estabilizar, y/o posponer la progresión de la enfermedad. Este retraso puede ser de diferente duración, dependiendo de la historia de la enfermedad y/o de las personas que están siendo tratadas. Como es evidente para un experto en la técnica, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar la prevención, ya que el individuo no desarrolla cefalea postraumática. Un método que "retrasa" el desarrollo del síntoma es un método que reduce la probabilidad de desarrollar el síntoma en un período de tiempo determinado y/o reduce la extensión de los síntomas en un período de tiempo determinado, en comparación con no utilizar el método. Estas comparaciones se basan normalmente en estudios clínicos, utilizando un número de sujetos estadísticamente significativo.

[0079] El "desarrollo" o "progresión" de la cefalea postraumática significa manifestaciones iniciales y/o progresión subsiguiente del trastorno. El desarrollo de dolor de cabeza postraumático puede detectarse y evaluarse usando técnicas clínicas estándar bien conocidas en la técnica. Sin embargo, el desarrollo también se refiere a una progresión que puede ser indetectable. A los efectos de esta divulgación, el desarrollo o progresión se refiere al curso biológico de los síntomas. El "desarrollo" incluye la aparición, la recurrencia y la aparición. Como se usa en el presente documento, "aparición" o "ocurrencia" de dolor de cabeza postraumático incluye aparición inicial y/o recurrencia.

[0080] Como se usa en este documento, una "dosis efectiva" o "cantidad eficaz" de fármaco, compuesto, o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados. Para uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados como eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar la aparición de la enfermedad, incluidos los síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos tales como reducir la intensidad del dolor, la duración o la frecuencia del ataque de dolor de cabeza postraumático y disminuir uno o más síntomas resultantes del dolor de cabeza postraumático (bioquímico, histológico y/o conductual), incluyendo sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad, aumentando la calidad de vida de quienes la padecen, disminuyendo la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, mejorando el efecto de otro medicamento y/o retrasando la progresión de la enfermedad de los pacientes. Se puede administrar una dosis eficaz en una o más administraciones. Para los propósitos de esta divulgación, una dosis eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para lograr un tratamiento profiláctico o terapéutico, ya sea directa o indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una dosificación eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede conseguirse o no junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por tanto, se puede considerar una "dosis eficaz" en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y se puede considerar que un solo agente se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o más de otros agentes, se puede lograr o se logra un resultado deseable.

[0081] Un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Los mamíferos también incluyen, pero no se limitan a animales de granja, animales deportivos, mascotas, primates, caballos, perros, gatos, ratones y ratas.

[0082] Como se usa en este documento, "vector" significa una construcción, que es capaz de entregar, y preferiblemente expresar, uno o más gen(es) o secuencia(s) de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores de plásmidos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o a Rn asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucariotas, como las células productoras.

[0083] Como se usa en este documento, "secuencia de control de expresión" significa una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Una secuencia de control de la expresión puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. La secuencia de control de la expresión está operativamente ligada a la secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir.

[0084] Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que, cuando se combina con un ingrediente activo, permite que el ingrediente conserve actividad biológica y no es reactivo con el sistema inmune del sujeto. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como una emulsión de aceite/agua y varios tipos de agentes humectantes. Los diluyentes preferidos para la administración en aerosol o parenteral son solución salina tamponada con fosfato o solución salina normal (0,9%). Las composiciones que comprenden dichos vehículos se formulan mediante métodos convencionales bien conocidos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; y Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a Ed. Mack Publishing, 2000).

[0085] El término "kon", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de velocidad para la asociación de un anticuerpo a un antígeno.

[0086] El término "Koff", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de velocidad para la disociación de un anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno.

[0087] El término "K^d", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de equilibrio de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno.

A. Métodos para prevenir, tratar o reducir el dolor de cabeza postraumático y/o al menos un síntoma secundario asociado con el dolor de cabeza postraumático

[0088] Se describen en este documento métodos para prevenir, tratar o reducir la incidencia de dolor de cabeza postraumático (persistente) en un sujeto. También se describe en el presente documento un método para tratar o reducir la incidencia de al menos un síntoma secundario asociado con el dolor de cabeza postraumático en un sujeto.

[0089] También se describen aquí métodos para prevenir, mejorar, controlar, reducir la incidencia de, o retrasar el desarrollo o progresión de dolor de cabeza post-traumático (persistente) en un individuo o síntomas asociados con dolor de cabeza post-traumático (persistente) (p. ej., diarrea, sensibilidad a la luz, fiebre, rigidez en el cuello, náuseas, deterioro cognitivo y/o vómitos) que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo que modula la vía CGRP o un anticuerpo antagonista anti-CGRP en combinación con al menos un agente adicional útil para prevenir, tratar o reducir el dolor de cabeza postraumático (persistente).

[0090] Dichos agentes adicionales incluyen, pero no se limitan a agonistas de 5-HT y AINE. Por ejemplo, el anticuerpo y el al menos un agente adicional se pueden administrar de forma concomitante, es decir, se pueden administrar en una proximidad temporal suficientemente cercana para permitir que sus efectos terapéuticos individuales se superpongan. Por ejemplo, la cantidad de agonista de 5-HT o AINE administrada en combinación con un anticuerpo anti-CGRP debería ser suficiente para reducir la frecuencia de recaída (persistente) de la cefalea postraumática en los pacientes o producir una eficacia más duradera en comparación con la administración de cualquiera uno de estos agentes en ausencia del otro.

[0091] Los ejemplos adicionales no limitativos de agentes adicionales que se pueden administrar en combinación con un anticuerpo antagonista anti-CGRP incluyen uno o más de:

(i) un analgésico opioide, por ejemplo, morfina, heroína, hidromorfona, oximorfona, levorfanol, levalorfano, metadona, meperidina, fentanilo, cocaína, codeína, dihidrocodeína, oxicodona, hidrocodona, propoxifeno, nalmefeno, nalorfina, naloxona, naltrexona, buprenorfina, butorfanol, nalbufina o pentazocina;

(ii) un medicamento antiinflamatorio no esteroideo (AINE), por ejemplo, aspirina, diclofenaco, diflusinal, etodolaco, fenbufeno, fenoprofeno, flufenisal, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, cetorolaco, ácido meclofenámico, nabumeno, oxiprozona, piroxicam, sulindac, tolmetina o zomepirac, inhibidores de la ciclooxigenasa-2 (COX-2), celecoxib; rofecoxib; meloxicam; JTE-522; L-745,337; NS398; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(iii) un sedante barbitúrico, por ejemplo, amobarbital, aprobarbital, butabarbital, butabital, mefobarbital, metarbital, metohexital, pentobarbital, fenobartital, secobarbital, talbutal, teamilal o tiopental o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos;

(iv) un analgésico barbitúrico, por ejemplo, butalbital o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición que comprende butalbital;

(v) una benzodiazepina que tiene una acción sedante, por ejemplo, clordiazepóxido, clorazepato, diazepam, flurazepam, lorazepam, oxazepam, temazepam o triazolam o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(vi) un antagonista H1 que tiene una acción sedante, por ejemplo, difenhidramina, pirilamina, prometazina, clorfeniramina o clorciclizina o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas;

(vii) un sedante como glutetimida, meprobamato, metacualona o dicloralfenazona o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos;

(viii) un relajante del músculo esquelético, por ejemplo, baclofeno, carisoprodol, clorzoxazona, ciclobenzaprina, metocarbamol u orfrenadina o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos;

(ix) un antagonista del receptor de NMDA, por ejemplo, dextrometorfano ((+)-3-hidroxi-N-metilmorfinano) o su metabolito dextrorfano ((+)-3-hidroxi-N-metilmorfinano), ketamina, memantina, pirroloquinolina quinona o ácido cis-4-(fosfonometilo)-2-piperidincarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(x) un alfa-adrenérgico, por ejemplo, doxazosina, tamsulosina, clonidina o 4-amino-6,7-dimetoxi-2-(5-metanosulfonamido-1,2,3,4-tetrahidroisoquinol-2-ilo)-5-(2-piridilo)quinazolina;

(xi) un antidepresivo tricíclico, por ejemplo, desipramina, imipramina, amitriptilina o nortriptilina;

(xii) un anticonvulsivo, por ejemplo, carbamazepina o valproato;

(xiii) un antagonista de taquiquinina (NK), particularmente un antagonista de NK-3, NK-2 o NK-1, por ejemplo, (aR,9R)-7-[3,5-bis(trifluorometilo)bencilo]-8,9,10,11-tetrahidro-9-metilo-5-(4-metilfenilo)-7H-[1.4]diazocino[2.1-g][1.7]naftidina- 6-13-diona (TAK-637), 5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-bis(trifluorometilo)fenilo] etoxi-3-(4-fluorofenilo)-4-morfolinilo] metilo]-1,2-dihidro-3H-1,2,4-triazol-3-ona (MK-869), carrilpitant, dapitant o 3-[[2-metoxi-5-(trifluorometoxi)fenilo]metilamino]-2-fenilo-piperidina (2S, 3S);

(xiv) un antagonista muscarínico, por ejemplo, oxibutina, tolterodina, propiverina, cloruro de tropsio o darifenacina;

(xv) un inhibidor de COX-2, por ejemplo, celecoxib, rofecoxib o valdecoxib;

(xvi) un inhibidor de COX no selectivo (preferiblemente con protección GI), por ejemplo, nitroflurbiprofeno (HCT-1026);

(xvii) un analgésico de alquitrán de hulla, en particular paracetamol;

(xviii) un neuroléptico como droperidol;

(xix) un agonista del receptor vainilloide (p. ej., resinferatoxina) o antagonista (p. ej., capsazepina);

(xx) un beta-adrenérgico tal como propranolol;

(xxi) un anestésico local, como mexiletina;

(xxii) un corticosteroide, como dexametasona;

(xxiii) un agonista o antagonista del receptor de serotonina;

(xxiv) un analgésico colinérgico (nicotínico);

(xxv) tramadol (marca comercial);

(xxvi) un inhibidor de PDEV, como sildenafil, vardenafil o taladafil;

(xxvii) un ligando alfa-2-delta tal como gabapentina o pregabalina;

(xxviii) un canabinoide; y

(xxix) un antidepresivo, como amitriptilina (Elavil), trazodona (Desyrel) e imipramina (Tofranil) o anticonvulsivos como fenitoína (Dilantin) o carbamazepina (Tegretol).

[0092] Los expertos en la técnica serán capaces de determinar las cantidades de dosificación adecuadas para agentes particulares que deben utilizarse en combinación con un anticuerpo anti-CGRP. Por ejemplo, el sumatriptán se puede administrar en una dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 300 mg. En algunos casos, el sumatriptán se puede administrar en una dosis de aproximadamente 2 mg a aproximadamente 300 mg, por ejemplo, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 250 mg, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 200 mg, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 50 mg, o aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg. Cuando se administra por vía no parenteral, la dosis típica de sumatriptán es de aproximadamente 25 a aproximadamente 100 mg, prefiriéndose generalmente aproximadamente 50 mg, por ejemplo, aproximadamente 45 mg, aproximadamente 55 mg o aproximadamente 60 mg. Cuando se administra sumatriptán por vía parenteral, la dosis preferida es de aproximadamente 6 mg, por ejemplo, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 7 mg o aproximadamente 8 mg. Sin embargo, estas dosificaciones se pueden variar de acuerdo con métodos estándar en la técnica, de modo que se optimicen para un paciente particular o para una terapia de combinación particular. Además, por ejemplo, celecoxib se puede administrar en una cantidad de entre 50 y 500 mg, por ejemplo, aproximadamente 50 mg a aproximadamente 400 mg, aproximadamente 50 mg a aproximadamente 300 mg, aproximadamente 50 mg a aproximadamente 200 mg, aproximadamente 50 mg a aproximadamente 100 mg, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 400 mg, o aproximadamente 200 mg a aproximadamente 300 mg.

[0093] En algunas realizaciones, la cantidad del anticuerpo monoclonal se administra en cada uno de la pluralidad de días puede estar entre 0,1 mg - 5000 mg, 1 mg - 5000 mg, 10 mg - 5000 mg, 100 mg - 5000 mg, 1000 mg - 5000 mg, 0,1 mg - 4000 mg, 1 mg - 4000 mg, 10 mg - 4000 mg, 100 mg - 4000 mg, 1000 mg - 4000 mg, 0,1 mg - 3000 mg, 1 mg - 3000 mg, 10 mg - 3000 mg, 100 mg - 3000 mg, 1000 mg - 3000 mg, 0,1 mg - 2000 mg, 1 mg - 2000 mg, 10 mg -2000 mg, 100 mg - 2000 mg, 1000 mg - 2000 mg, 0,1 mg - 1000 mg, 1 mg - 1000 mg, 10 mg - 1000 mg o 100 mg -1000 mg. En algunas realizaciones, la cantidad está entre aproximadamente 225 mg y aproximadamente 1000 mg, por ejemplo, aproximadamente 675 mg o aproximadamente 900 mg. Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis de anticuerpo inicial de aproximadamente 675 mg por vía subcutánea, seguida de una dosis mensual de anticuerpo de aproximadamente 225 mg por vía subcutánea durante aproximadamente dos meses, p. ej., alrededor de tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o 12 meses. Otro régimen de dosificación más comprende administrar una dosis inicial de anticuerpos de aproximadamente 900 mg por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos, seguida de dosis de aproximadamente 900 mg administradas por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos cada trimestre durante un año, dos años, tres años., cuatro años o cinco años. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, dependiendo del patrón de deterioro farmacocinético que desee lograr el médico. En algunas realizaciones, la dosis inicial y una o más de las dosis adicionales se administran de la misma forma, por ejemplo, por vía subcutánea o intravenosa. En algunas realizaciones, la una o más dosis adicionales se administran de una manera diferente a la dosis inicial, por ejemplo, la dosis inicial puede administrarse por vía intravenosa y la una o más dosis adicionales pueden administrarse por vía subcutánea.

[0094] En algunas realizaciones, la dosis única puede ser una cantidad de anticuerpo entre 0,1 mg - 5000 mg, 1 mg -5000 mg, 10 mg - 5000 mg, 100 mg - 5000 mg, 1000 mg - 5000 mg, 0,1 mg - 4000 mg, 1 mg - 4000 mg, 10 mg - 4000 mg, 100 mg - 4000 mg, 1000 mg - 4000 mg, 0,1 mg - 3000 mg, 1 mg - 3000 mg, 10 mg - 3000 mg, 100 mg - 3000 mg, 1000 mg - 3000 mg, 0,1 mg - 2000 mg, 1 mg - 2000 mg, 10 mg - 2000 mg, 100 mg - 2000 mg, 1000 mg - 2000 mg, 0,1 mg - 1000 mg, 1 mg - 1000 mg, 10 mg - 1000 mg o 100 mg - 1000 mg. En algunas realizaciones, la dosis única puede ser una cantidad de anticuerpo entre 225 mg y aproximadamente 1000 mg, por ejemplo, aproximadamente 675 mg o aproximadamente 900 mg.

[0095] En algunas realizaciones, la dosis única puede ser una cantidad de anticuerpo entre 0,1 mg - 5000 mg, 1 mg -5000 mg, 10 mg - 5000 mg, 100 mg - 5000 mg, 1000 mg - 5000 mg, 0,1 mg - 4000 mg, 1 mg - 4000 mg, 10 mg - 4000 mg, 100 mg - 4000 mg, 1000 mg - 4000 mg, 0,1 mg - 3000 mg, 1 mg - 3000 mg, 10 mg - 3000 mg, 100 mg - 3000 mg, 1000 mg - 3000 mg, 0,1 mg - 2000 mg, 1 mg - 2000 mg, 10 mg - 2000 mg, 100 mg - 2000 mg, 1000 mg - 2000 mg, 0,1 mg - 1000 mg, 1 mg - 1000 mg, 10 mg - 1000 mg o 100 mg - 1000 mg. En algunas realizaciones, la dosis mensual puede ser una cantidad de anticuerpo entre aproximadamente 225 mg y aproximadamente 1000 mg, por ejemplo, aproximadamente 675 mg o aproximadamente 900 mg. Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis de anticuerpo inicial de aproximadamente 675 mg por vía subcutánea, seguida de una dosis mensual de anticuerpo de aproximadamente 225 mg por vía subcutánea durante aproximadamente dos meses, por ejemplo, aproximadamente tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o 12 meses. Otro régimen de dosificación más comprende administrar una dosis inicial de anticuerpos de aproximadamente 900 mg por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos, seguida de dosis de aproximadamente 900 mg administradas por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos cada trimestre durante un año, dos años, tres años., cuatro años o cinco años. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, dependiendo del patrón de deterioro farmacocinético que desee lograr el médico. En algunas realizaciones, la dosis inicial y una o más de las dosis adicionales se administran de la misma forma, por ejemplo, por vía subcutánea o intravenosa. En algunas realizaciones, la una o más dosis adicionales se administran de una manera diferente a la dosis inicial, por ejemplo, la dosis inicial puede administrarse por vía intravenosa y la una o más dosis adicionales pueden administrarse por vía subcutánea.

[0096] Con respecto a todos los métodos descritos aquí, las referencias a anticuerpos (p. ej., anticuerpos monoclonales que modulan la vía de CGRP, los anticuerpos antagonistas anti-CGRP, anticuerpos antagonistas anti-CGRP monoclonales) también incluyen composiciones que comprenden uno o más de estos agentes. Por consiguiente, dicha composición puede usarse de acuerdo con un método que se refiere a un anticuerpo descrito en este documento. Estas composiciones pueden comprender además excipientes adecuados, tales como excipientes farmacéuticamente aceptables como se describe en otra parte del presente documento. La presente invención puede usarse sola o en combinación con otros métodos de tratamiento convencionales.

[0097] Un anticuerpo antagonista monoclonal anti-CGRP puede administrarse a un individuo o sujeto en cualquier terapéutica de la dosis, a través de cualquier vía adecuada y en cualquier formulación adecuada. Debería ser evidente para una persona experta en la técnica que los ejemplos descritos en este documento no pretenden ser limitantes sino ilustrativos de las técnicas disponibles. En consecuencia, en algunas realizaciones, un anticuerpo descrito en el presente documento se puede administrar a un sujeto de acuerdo con métodos conocidos, como la administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por ejemplo, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 90 minutos, aproximadamente 120 minutos, aproximadamente 180 minutos o aproximadamente 240 minutos. El anticuerpo descrito en este documento también se puede administrar al sujeto por vía subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, intraarticular, sublingual, intraarterial, intrasinovial, vía insuflación, intratecal, oral, inhalación, intranasal (p. ej., con o sin inhalación), bucal, rectal, transdérmica, intracardíaca, intraósea intradérmica, transmucosa, vaginal, intravítrea, periarticular, local, epicutánea o tópica. La administración puede ser sistémica, por ejemplo, intravenosa, o localizada. Los nebulizadores disponibles comercialmente para formulaciones líquidas, incluidos los nebulizadores de chorro y los nebulizadores ultrasónicos, son útiles para la administración. Las formulaciones líquidas se pueden nebulizar directamente y el polvo liofilizado se puede nebulizar después de la reconstitución. Alternativamente, un anticuerpo descrito en el presente documento puede aerosolizarse usando una formulación de fluorocarbono y un inhalador de dosis medida, o inhalarse como un polvo liofilizado y molido.

[0098] En algunas realizaciones, un anticuerpo se puede administrar a través de sitio específico o técnicas de administración local dirigidas. Ejemplos de técnicas de administración local específicas o dirigidas al sitio incluyen varias fuentes de depósito implantables del anticuerpo o catéteres de administración local, como catéteres de infusión, un catéter permanente o un catéter de aguja, injertos sintéticos, envolturas adventicias, derivaciones y stents u otros dispositivos implantables, portadores específicos del sitio, inyección directa o aplicación directa. Véanse, por ejemplo, la publicación PCT n° WO 00/53211 y la patente de EE.UU. n° 5.981.568.

[0099] Diversas formulaciones de un anticuerpo se pueden usar para la administración. En algunas formas de realización, un anticuerpo puede administrarse puro. En algunas realizaciones, el anticuerpo y un excipiente farmacéuticamente aceptable pueden estar en diversas formulaciones. Los excipientes farmacéuticamente aceptables se conocen en la técnica y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o actuar como diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, tampones y potenciadores de la penetración cutánea. Los excipientes así como las formulaciones para la administración de fármacos por vía parenteral y no parenteral se exponen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20a Ed. Mack Publishing (2000).

[0100] En algunas realizaciones, estos agentes se pueden formular para la administración por inyección (p. ej., intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, etc.). Por consiguiente, estos agentes pueden combinarse con vehículos farmacéuticamente aceptables tales como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y similares. El régimen de dosificación particular, es decir, la dosis, el momento y la repetición, dependerá del individuo en particular y del historial médico de ese individuo.

[0101] En algunas realizaciones, estos agentes pueden formularse para administración periférica. Dichas formulaciones se pueden administrar periféricamente a través de cualquier ruta periférica adecuada, incluso por vía intravenosa y subcutánea. Un agente preparado para administración periférica puede incluir una sustancia, medicamento y/o anticuerpo que no se administra de forma central, espinal, intratecal o directamente al SNC. Los ejemplos no limitantes de vías de administración periférica incluyen una vía que es oral, sublingual, bucal, tópica, rectal, por inhalación, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intracardíaca, intraósea, intradérmica, intraperitoneal, transmucosa, vaginal, intravítrea, intraarticular, periarticular, local o epicutánea.

[0102] Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos utilizados de acuerdo con la presente divulgación se pueden preparar para el almacenamiento y/o uso mediante la mezcla de un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington, The Science y Practice of Pharmacy 20a Ed. Mack Publishing (2000)), y en algunos casos puede estar en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. Una formulación terapéutica de un anticuerpo puede comprender uno o más vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables con ejemplos no limitantes de tales especies que incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; sales como cloruro de sodio; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecil dimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metilo o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y mcresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos (p. ej., en concentraciones de 0,1 mM a 100 mM, 0,1 mM a 1 mM, 0,01 mM a 50 mM, 1 mM a 50 mM, 1 mM a 30 mM, 1 mM a 20 mM, 10 mM a 25 mM) tales como glicina, glutamina, metionina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes (p. ej., a concentraciones de 0,001 mg/ml a 1 mg/ml, 0,001 mg/ml a 1 mg/ml, 0,001 mg/ml a 0,1 mg/ml, 0,001 mg/ml a 0,01 mg/ml, 0,01 mg/ml a 0,1 mg/ml) como EDTA (p. ej., EDTA disódico dihidrato); azúcares (p. ej., en concentraciones de 1 mg/ml a 500 mg/ml, 10 mg/ml a 200 mg/ml, 10 mg/ml a 100 mg/ml, 50 mg/ml a 150 mg/ml) como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (p. ej., complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos (p. ej., en concentraciones de 0,01 mg/ml a 10 mg/ml, 0,01 mg/ml a 1 mg/ml, 0,1 mg/ml a 1 mg/ml, 0,01 mg/ml a 0,5 mg/ml) como TWEEN3(p. ej., polisorbato (p. ej., polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80)), PLURONICS3 o polietilenglicol (PEG).

[0103] Una formulación de anticuerpo se puede caracterizar en términos de cualquiera de una variedad de propiedades físicas. Por ejemplo, una formulación de anticuerpo líquido puede tener cualquier pH adecuado para la eficacia terapéutica, la seguridad y el almacenamiento. Por ejemplo, el pH de una formulación líquida de anticuerpos puede ser de pH 4 a aproximadamente pH 9, de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 8, de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 7 o de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 8. En algunas realizaciones, una formulación líquida de anticuerpo puede tener un pH de aproximadamente 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o aproximadamente 10 o superior o inferior.

[0104] En otro ejemplo, una formulación líquida del anticuerpo puede tener cualquier viscosidad adecuada para la eficacia terapéutica, seguridad y almacenamiento. Por ejemplo, la viscosidad de una formulación líquida de anticuerpos puede ser de aproximadamente 0,5 centipoises (cP) a aproximadamente 100 cP, aproximadamente 1 cP a aproximadamente 50 cP, aproximadamente 1 cP a aproximadamente 20 cP, aproximadamente 1 cP a aproximadamente 15 cP, o aproximadamente 5 cP a aproximadamente 15 cP a 25°C. En algunas realizaciones, una formulación líquida de anticuerpos puede tener una viscosidad de aproximadamente 0,5 cP, 1 cP, 1,2 cP, 1,4 cP, 1,6 cP, 1,8 cP, 2,0 cP, 2,2 cP, 2,4 cP, 2,6 cP, 2,8 cP, 3,0 cP, 3,2 cP, 3,4 cP, 3,6 cP, 3,8 cP, 4,0 cP, 4,2 cP, 4,4 cP, 4,6 cP, 4.8 cP, 5,0 cP, 5,2 cP, 5,4 cP, 5,6 cP, 5,8 cP, 6,0 cP, 6,2 cP, 6,4 cP, 6,6 cP, 6,8 cP, 7,0 cP, 7,2 cP, 7,4 cP, 7,6 cP, 7,8 cP, 8,0 cP, 8,2 cP, 8,4 cP, 8,6 cP, 8,8 cP, 9,0 cP, 9,2 cP, 9,4 cP, 9,6 cP, 9,8 cP, 10,0 cP, 10,2 cP, 10,4 cP, 10,6 cP, 10.8 cP, 11,0 cP, 11,2 cP, 11,4 cP, 11,6 cP, 11,8 cP, 12,0 cP, 12,2 cP, 12,4 cP, 12,6 cP, 12,8 cP, 13,0 cP, 13,2 cP, 13,4 cP, 13,6 cP, 13,8 cP, 14,0 cP, 14,2 cP, 14,4 cP, 14,6 cP, 14,8 cP o aproximadamente 15,0 cP a 25°C o la viscosidad puede ser mayor o menor.

[0105] En otro ejemplo, una formulación líquida del anticuerpo puede tener cualquier conductividad adecuada para la eficacia terapéutica, seguridad y almacenamiento. Por ejemplo, la conductividad de una formulación líquida de anticuerpo puede ser de aproximadamente 0,1 milisiemens por centímetro (mS/cm) a aproximadamente 15 mS/cm, 0,1 mS/cm a 10 mS/cm, 0,1 mS/cm a 5 mS/cm, 0,1 mS/cm a 2 mS/cm o 0,1 mS/cm a 1,5 mS/cm. En algunas realizaciones, una formulación de anticuerpo líquido puede tener una conductividad de 0,19 mS/cm, 0,59 mS/cm, 1,09 mS/cm, 1,19 mS/cm, 1,29 mS/cm, 1,39 mS/cm, 1,49 mS/cm, 1,59 mS/cm, 1,69 mS/cm, 1,79 mS/cm, 1,89 mS/cm, 1,99 mS/cm, 2,09 mS/cm, 2,19 mS/cm, 2,29 mS/cm, 2,39 mS/cm, 2,49 mS/cm, 2,59 mS/cm, 2,69 mS/cm, 2,79 mS/cm, 2,89 mS/cm, 2,99 mS/cm, 3,09 mS/cm, 3,19 mS/cm, 3,29 mS/cm, 3,39 mS/cm, 3,49 mS/cm, 3,59 mS/cm, 3,69 mS/cm, 3,79 mS/cm, 3,89 mS/cm, 3,99 mS/cm, 4,09 mS/cm, 4,19 mS/cm, 4,29 mS/cm, 4,39 mS/cm, 4,49 mS/cm, 4,59 mS/cm, 4,69 mS/cm, 4,79 mS/cm, 4,89 mS/cm, 4,99 mS/cm, 5,09 mS/cm, 6,09 mS/cm, 6,59 mS/cm, 7,09 mS/cm, 7,59 mS/cm, 8,09 mS/cm, 8,59 mS/cm, 9,09 mS/cm, 9,59 mS/cm, 10,09 mS/cm, 10,59 mS/cm, 11,09 mS/cm, 11,59 mS/cm, 12,09 mS/cm, 12,59 mS/cm, 13,09 mS/cm, 13,59 mS/cm, 14,09 mS/cm, 14,59 mS/cm o aproximadamente 15,09 mS/cm o la conductividad puede ser mayor o menor.

[0106] En otro ejemplo, una formulación líquida del anticuerpo puede tener cualquier osmolalidad adecuada para la eficacia terapéutica, seguridad y almacenamiento. Por ejemplo, la osmolalidad de una formulación de anticuerpo líquido puede ser de aproximadamente 50 miliosmoles por kilogramo (mOsm/kg) a aproximadamente 5000 mOsm/kg, aproximadamente 50 mOsm/kg a aproximadamente 2000 mOsm/kg, aproximadamente 50 mOsm/kg a aproximadamente 1000 mOsm/kg, aproximadamente 50 mOsm/kg a aproximadamente 750 mOsm/kg, o aproximadamente 50 mOsm/kg a aproximadamente 500 mOsm/kg. En algunas realizaciones, una formulación líquida de anticuerpos puede tener una osmolalidad de aproximadamente 50 mOsm/kg, 60 mOsm/kg, 70 mOsm/kg, 80 mOsm/kg, 90 mOsm/kg, 100 mOsm/kg, 120 mOsm/kg, 140 mOsm/kg, 160 mOsm/kg, 180 mOsm/kg, 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 240 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 340 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg, 400 mOsm/kg, 420 mOsm/kg, 440 mOsm/kg, 460 mOsm/kg, 480 mOsm/kg, 500 mOsm/kg, 520 mOsm/kg, 540 mOsm/kg, 560 mOsm/kg, 580 mOsm/kg, 600 mOsm/kg, 620 mOsm/kg, 640 mOsm/kg, 660 mOsm/kg, 680 mOsm/kg, 700 mOsm/kg, 720 mOsm/kg, 740 mOsm/kg, 760 mOsm/kg, 780 mOsm/kg, 800 mOsm/kg, 820 mOsm/kg, 840 mOsm/kg, 860 mOsm/kg, 880 mOsm/kg, 900 mOsm/kg, 920 mOsm/kg, 940 mOsm/kg, 960 mOsm/kg, 980 mOsm/kg, 1000 mOsm/kg, 1050 mOsm/kg, 1100 mOsm/kg, 1150 mOsm/kg, 1200 mOsm/kg, 1250 mOsm/kg, 1300 mOsm/kg, 1350 mOsm/kg, 1400 mOsm/kg, 1450 mOsm/kg, aproximadamente 1500 mOsm/kg, o la osmolalidad puede ser mayor o menor.

[0107] Los liposomas que contienen el anticuerpo se pueden preparar por métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82: 3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU. 77: 4030 (1980); y Patentes de Estados Unidos N° 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con un tiempo de circulación mejorado se describen en la patente de EE.UU. n° 5,013,556. Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado.

[0108] Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (p. ej., liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20a Ed. Mack Publishing (2000).

[0109] Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (p. ej., poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o alcohol poli(vinílico)), polilactidas (patente de EE. UU. N.° 3.773.919), copolímeros de ácido glutámico y 7 etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables como LUPRON DEPOT3 (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), acetato de sacarosa isobutirato y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

[0110] Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo debe ser generalmente estéril. Esto se logra fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Las composiciones de anticuerpos terapéuticos se colocan generalmente en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

[0111] Las composiciones para uso en la presente invención pueden estar en formas de dosificación unitarias tales como comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones, o supositorios, para administración oral, parenteral o rectal, o administración por inhalación o insuflación. En algunos casos, se puede suministrar una forma de dosificación unitaria en un receptáculo precargado (p. ej., una jeringa precargada) útil para administrar la dosificación unitaria a un sujeto.

[0112] Para preparar composiciones sólidas tales como comprimidos, el ingrediente activo principal se puede mezclar con un vehículo farmacéutico, por ejemplo, ingredientes de formación de comprimidos convencionales tales como almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, fosfato dicálcico, o gomas, y otros diluyentes farmacéuticos, por ejemplo, agua, para formar una composición de preformulación sólida que contiene una mezcla homogénea de un compuesto de la presente invención, o una sal no tóxica del mismo farmacéuticamente aceptable. Cuando se hace referencia a estas composiciones de preformulación como homogéneas, se quiere decir que el ingrediente activo se dispersa uniformemente por toda la composición de modo que la composición se puede subdividir fácilmente en formas de dosificación unitaria igualmente eficaces, tales como comprimidos, píldoras y cápsulas. Esta composición de preformulación sólida se subdivide luego en formas de dosificación unitaria del tipo descrito anteriormente que contienen de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo de la presente invención. Los comprimidos o píldoras de la nueva composición pueden recubrirse o componerse de otro modo para proporcionar una forma de dosificación que ofrezca la ventaja de una acción prolongada. Por ejemplo, el comprimido o píldora puede comprender un componente de dosificación interior y un componente de dosificación exterior, estando este último en forma de sobre sobre el primero. Los dos componentes pueden estar separados por una capa entérica que sirve para resistir la desintegración en el estómago y permite que el componente interno pase intacto al duodeno o que se retrase su liberación. Puede usarse una variedad de materiales para tales capas o recubrimientos entéricos, tales materiales incluyen varios ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con materiales tales como goma laca, alcohol cetílico y acetato de celulosa.

[0113] Los agentes tensioactivos adecuados incluyen, en particular, agentes, no iónicos, tales como polioxietilensorbitanos (p. ej., TWEEN320, 40, 60, 80, o 85) y otros sorbitanos (p. ej., SPAN320, 40, 60, 80, o 85). Las composiciones con un agente tensioactivo comprenderán convenientemente entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 5% de agente tensioactivo, y pueden estar entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 2,5%. Se apreciará que se pueden añadir otros ingredientes, por ejemplo manitol u otros vehículos farmacéuticamente aceptables, si es necesario.

[0114] Las emulsiones adecuadas se pueden preparar usando emulsiones grasas disponibles comercialmente, tales como INTRALIPID3, LIPOSYN3, INFONUTROL3, LIPOFUNDIN3, y LIPIPHYSAN3. El ingrediente activo puede disolverse en una composición de emulsión premezclada o alternativamente puede disolverse en un aceite (p. ej., aceite de soja, aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de maíz o aceite de almendras) y se puede formar una emulsión al mezclar con un fosfolípidos (p. ej., fosfolípidos de huevo, fosfolípidos de soja o lecitina de soja) y agua. Se apreciará que se pueden añadir otros ingredientes, por ejemplo glicerol o glucosa, para ajustar la tonicidad de la emulsión. Las emulsiones adecuadas contendrán normalmente hasta un 20% de aceite, por ejemplo, entre un 5 y un 20%. La emulsión de grasa puede comprender gotitas de grasa entre aproximadamente 0,1 y 1,0 1 m, particularmente entre aproximadamente 0,1 y 0,51 m, y tiene un pH en el intervalo de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente pH 8,0.

[0115] Las composiciones de emulsión pueden ser las preparadas mediante la mezcla de un anticuerpo con INTRALIPID3 o los componentes de los mismos (aceite de soja, fosfolípidos de huevo, glicerol y agua).

[0116] Las composiciones para inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en disolventes acuosos u orgánicos farmacéuticamente aceptables, o mezclas de los mismos, y polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados como se indica anteriormente. En algunas realizaciones, las composiciones se administran por vía respiratoria oral o nasal para un efecto local o sistémico. Las composiciones en disolventes farmacéuticamente aceptables preferiblemente estériles se pueden nebulizar mediante el uso de gases. Las soluciones nebulizadas se pueden respirar directamente desde el dispositivo nebulizador o el dispositivo nebulizador se puede conectar a una mascarilla, tienda de campaña o respirador de presión positiva intermitente. Las composiciones en solución, suspensión o polvo se pueden administrar, preferiblemente por vía oral o nasal, desde dispositivos que administran la formulación de una manera apropiada.

[0117] En algunas realizaciones, una formulación que comprende un anticuerpo antagonista monoclonal anti-CGRP se puede preparar por cualquier vía de administración adecuada con una cantidad de anticuerpo que varía de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 3000 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1000 mg, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 1000 mg, o aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg. En algunos casos, una formulación que comprende un anticuerpo (p. ej., Anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP, anticuerpo antagonista anti-CGRP, anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal) descrito en este documento puede comprender una cantidad de anticuerpo de, como máximo, o al menos aproximadamente 0,1 mg, 1 mg, 100 mg, 1 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 125 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg, 400 mg, 450 mg, 475 mg, 500 mg, 525 mg, 550 mg, 575 mg, 600 mg, 625 mg, 650 mg, 675 mg, 700 mg, 725 mg, 750 mg, 775 mg, 800 mg, 825 mg, 850 mg, 875 mg, 900 mg, 925 mg, 950 mg, 975 mg, 1000 mg, 1100 mg, 1200 mg, 1300 mg, 1400 mg, 1500 mg, 1600 mg, 1700 mg, 1800 mg, 1900 mg, 2000 mg o aproximadamente 3000 mg.

[0118] En algunas realizaciones, una formulación líquida que comprende un anticuerpo antagonista monoclonal anti-CGRP puede ser preparado para cualquier vía de administración adecuada con una concentración de anticuerpo que varía de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 375 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml, aproximadamente 0,1 a aproximadamente 175 mg/ml, aproximadamente 0,1 a 100 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 375 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a 250 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a 200 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a 150 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml a 500 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 375 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml a 250 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 150 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml a 100 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml a 500 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml a 450 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml a 400 mg/ml, alrededor de 100 mg/ml a alrededor de 350 mg/ml, alrededor de 100 mg/ml a alrededor de 300 mg/ml, alrededor de 100 mg/ml a alrededor de 250 mg/ml, 100 mg/ml a 200 mg/ml, o alrededor de 100 mg/ml a alrededor de 150 mg/ml. En algunas realizaciones, una formulación líquida puede comprender un anticuerpo descrito en el presente documento a una concentración de, como máximo, al menos o menos de aproximadamente 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 o aproximadamente 500 mg/ml.

[0119] Una formulación de anticuerpo puede comprender uno o más componentes que incluyen el anticuerpo y otras especies descritas en otra parte del presente documento. El anticuerpo y otros componentes pueden estar en cualquier cantidad adecuada y/o en cualquier concentración adecuada para la eficacia terapéutica, la seguridad y el almacenamiento del anticuerpo. En un ejemplo, una formulación de anticuerpo puede ser una solución que comprende aproximadamente 51,4 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), histidina 16-20 mM, 0,1 mg/ml de metionina, 84 mg/ml de trehalosa dihidrato, 0,05 mg/ml de EDTA disódico dihidrato y 0,2 mg/ml de polisorbato 80.

[0120] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), arginina 15 mM, 78 mg/ml de sacarosa, 0,3 mg/ml EDTA y 0,1 mg/ml de polisorbato 80.

[0121] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender aproximadamente 175 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), glicina 20 mM, 88 mg/ml de trehalosa dihidrato, 0,015 mg/ml de EDTA y 0,25 mg/ml de polisorbato 80.

[0122] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender aproximadamente 225 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), asparagina 23 mM, 84 mg/ml de sorbitol, 0,1 mg/ml EDTA, y 0,15 mg/ml de polisorbato 60.

[0123] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender aproximadamente 150 mg/ml de anticuerpo por ejemplo, anticuerpo G1, (otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, o un anticuerpo monoclonal que modula la Vía CGRP), asparagina 17 mM, 74 mg/ml de manitol, 0,025 mg/ml de EDTA y 0,2 mg/ml de polisorbato 80.

[0124] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender aproximadamente 100 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), arginina 16 mM, 87 mg/ml de manitol, EDTA 0,025 mg/ml y 0,15 mg/ml de polisorbato 20.

[0125] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender aproximadamente 250 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), histidina 25 mM, 74 mg/ml de manitol, 0,025 mg/ml EDTA, y 0,25 mg/ml de polisorbato 20.

[0126] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender aproximadamente 50 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), arginina 19 mM, 84 mg/ml de sacarosa, 0,05 mg/ml de EDTA y 0,3 mg/ml de polisorbato 80.

[0127] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender aproximadamente 125 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), glicina 22 mM, 79 mg/ml trehalosa dihidrato, 0,15 mg/ml de EDTA, y 0,15 mg/ml de polisorbato 80.

[0128] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede ser una solución que comprende aproximadamente 175 mg/ml de anticuerpo por ejemplo, (anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), histidina 20 mM, 0,1 mg/ml de metionina, 84 mg/ml trehalosa dihidrato, 0,05 mg/ml de EDTA disódico dihidrato, y 0,2 mg/ml de polisorbato 80.

[0129] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), arginina 30 mM, 78 mg/ml de sacarosa, 0,3 mg/ml de EDTA, y 0,1 mg/ml de polisorbato 80.

[0130] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender aproximadamente 175 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP o un anticuerpo monoclonal que modula la vía de CGRP), glicina 20 mM, 88 mg/ml de trehalosa dihidrato, 0,015 mg/ml de EDTA y 0,15 mg/ml de polisorbato 80.

[0131] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender aproximadamente 150 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), histidina 20 mM, 84 mg/ml de sacarosa, 0,05 mg/ml de EDTA y 0,2 mg/ml de polisorbato 80.

[0132] En otro ejemplo, una fórmula de anticuerpos puede comprender aproximadamente 225 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), histidina 23 mM, 84 mg/ml de sorbitol, 0,1 mg/ml de EDTA y 0,15 mg/ml de polisorbato 60.

[0133] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender aproximadamente 150 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), asparagina 17 mM, 74 mg/ml de manitol, 0,3 mg/ml de EDTA, y 0,2 mg/ml de polisorbato 80.

[0134] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender aproximadamente 100 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), arginina 16 mM, 87 mg ml de manitol, 0,025 mg/ml EDTA, y 0,25 mg/ml de polisorbato 20.

[0135] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender aproximadamente 250 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), histidina 25 mM, 89 mg/ml de manitol, 0,025 mg/ml de EDTA, y 0,25 mg/ml de polisorbato 20.

[0136] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 125 mg/ml de anticuerpo (p. ej., G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP, o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), arginina 29 mM, 84 mg/ml de sacarosa, 0,05 mg/ml de EDTA y 0,3 mg/ml de polisorbato 80.

[0137] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 150 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), asparagina 25 mM, 84 mg/ml de manitol, 0,05 mg/ml EDTA y 0,2 mg/ml de polisorbato 80.

[0138] En otro ejemplo, una formulación de anticuerpo puede comprender 145 mg/ml de anticuerpo (p. ej., anticuerpo G1, otro anticuerpo antagonista anti-CGRP o un anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP), histidina 22 mM, 72 mg/ml de trehalosa dihidrato, 0,05 mg/ml de EDTA y 0,1 mg/ml de polisorbato 80.

[0139] Un anticuerpo se puede administrar usando cualquier método adecuado, incluso mediante inyección (p. ej., por vía intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, etc.). Los anticuerpos también se pueden administrar por inhalación, como se describe aquí. En algunos casos, se puede administrar un anticuerpo por vía nasal con o sin inhalación. Generalmente, para la administración de un anticuerpo descrito en el presente documento, una dosis candidata inicial puede ser de aproximadamente 2 mg/kg. Para el propósito de la presente invención, una dosis diaria típica puede variar de aproximadamente 3 pg/kg a 30 pg/kg a 300 pg/kg a 3 mg/kg, a 30 mg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Por ejemplo, se puede utilizar una dosis de aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2,5 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas o hasta que se alcanzan niveles terapéuticos suficientes, por ejemplo, para reducir el dolor. Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis inicial de aproximadamente 8,5 mg/kg, o aproximadamente 10 mg/kg, seguida de una dosis de mantenimiento de aproximadamente 2,8 mg/kg de un anticuerpo, o seguida de una dosis de mantenimiento de aproximadamente 2,8 mg/kg en semanas alternas. Otro régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis de aproximadamente 100 mg, 125 mg, 150 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 275 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, aproximadamente 675 mg, o aproximadamente 900 mg a un sujeto una vez al mes por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente una hora, o por vía subcutánea. Otro régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis de anticuerpo inicial de aproximadamente 675 mg por vía subcutánea, seguida de una dosis mensual de anticuerpo de aproximadamente 225 mg por vía subcutánea durante aproximadamente dos meses, por ejemplo, aproximadamente tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o 12 meses. Otro régimen de dosificación más comprende la administración de una dosis inicial de aproximadamente 900 mg por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos, seguida de dosis de aproximadamente 900 mg administradas por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos cada trimestre durante un año, dos años, tres años, cuatro años o cinco años. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, dependiendo del patrón de deterioro farmacocinético que desee lograr el médico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se contempla la dosificación de aproximadamente una a aproximadamente cuatro veces por semana. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. El régimen de dosificación (incluidos los antagonistas de CGRP utilizados) puede variar con el tiempo.

[0140] En algunas realizaciones, la dosis o cantidad de un anticuerpo anti-CGRP monoclonal antagonista puede variar desde aproximadamente 0,1 pg a aproximadamente 3000 mg, 1 mg a 1000 mg, 100 mg a 1000 mg, 100 mg y 500 mg, 0,1 mg a 5000 mg, 1 mg a 4000 mg, 250 mg a 1000 mg, 500 mg a 1000 mg, 100 mg a 900 mg, 400 mg a 900 mg, 10 mg a 3000 mg, 10 mg a 2000 mg, 100 mg a 2000 mg, 150 mg a 2000 mg, 200 mg a 2000 mg, 250 mg a 2000 mg, 300 mg a 2000 mg, 350 mg a 2000 mg, 400 mg a 2000 mg, 450 mg a 2000 mg, 500 mg a 2000 mg, 550 mg a 2000 mg, 600 mg a 2000 mg, 650 mg a 2000 mg, 700 mg a 2000 mg, 750 mg a 2000 mg, 800 mg a 2000 mg, 850 mg a 2000 mg, 900 mg a 2000 mg, 950 mg a 2000 mg, o 1000 mg a 2000 mg. En algunas realizaciones, la dosis o cantidad de un anticuerpo puede ser, puede ser como máximo, puede ser menor o puede ser al menos de aproximadamente 0,1 pg, 1 pg, 100 pg, 1 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg., 75 mg, 100 mg, 125 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg, 400 mg, 450 mg, 475 mg, 500 mg, 525 mg, 550 mg, 575 mg, 600 mg, 625 mg, 650 mg, 675 mg, 700 mg, 725 mg, 750 mg, 775 mg, 800 mg, 825 mg, 850 mg, 875 mg, 900 mg, 925 mg, 950 mg, 975 mg, 1000 mg, 1100 mg, 1200 mg, 1300 mg, 1400 mg, 1500 mg, 1600 mg, 1700 mg, 1800 mg, 1900 mg, 2000 mg o aproximadamente 3000 mg. En algunas realizaciones, la cantidad está entre aproximadamente 225 mg y aproximadamente 1000 mg, por ejemplo, aproximadamente 675 mg o aproximadamente 900 mg. Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis de anticuerpo inicial de aproximadamente 675 mg por vía subcutánea, seguida de una dosis mensual de anticuerpo de aproximadamente 225 mg por vía subcutánea durante aproximadamente dos meses, por ejemplo, aproximadamente tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o 12 meses. Otro régimen de dosificación más comprende la administración de una dosis inicial de aproximadamente 900 mg por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos, seguida de dosis de aproximadamente 900 mg administradas por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos cada trimestre durante un año, dos años, tres años, cuatro años o cinco años. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, dependiendo del patrón de deterioro farmacocinético que desee lograr el médico.

[0141] En algunas realizaciones, la dosis o cantidad de un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal puede variar de aproximadamente 0,1 a 500, 0,1 a 100, 0,1 a 50, 0,1 a 20, 0,1 a 10, 1 a 10, 1 a 7, 1 a 5 o 0,1 a 3 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la dosis o cantidad de un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal puede ser, puede ser como máximo, puede ser menor que, o puede ser al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, o aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal.

[0142] En algunas realizaciones, la frecuencia a la que una dosis o cantidad de un anticuerpo antagonista monoclonal anti-CGRP se administra a un sujeto puede variar. En algunas realizaciones, se puede administrar una sola dosis de anticuerpo a un sujeto a través de la terapia. En algunas realizaciones, la frecuencia a la que se administra una dosis o cantidad de un anticuerpo a un sujeto es constante (p. ej., se administra aproximadamente una vez al mes o aproximadamente una vez al trimestre). En algunas realizaciones, la frecuencia con la que se administra una dosis o cantidad de un anticuerpo a un sujeto es aproximadamente cada trimestre durante aproximadamente un año, dos años, tres años, cuatro años o cinco años. En algunas realizaciones, la frecuencia con la que se administra una dosis o cantidad de un anticuerpo descrito en el presente documento a un sujeto es variable (p. ej., una dosis inicial seguida de una dosis una vez al mes, seguida de dosis adicionales aproximadamente a los tres meses y aproximadamente a las siete meses). En algunas realizaciones, la frecuencia en donde se administra un anticuerpo a un sujeto es, es al menos, es menor que, o es como mucho aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis veces al día. En algunas realizaciones, la frecuencia a la que se administra un anticuerpo (p. ej., anticuerpo monoclonal que modula la vía CGRP, anticuerpo antagonista anti-CGRP, anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal) a un sujeto es, es al menos, es menor que, o es como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco o seis dosis por día.

[0143] En algunas realizaciones, la frecuencia a la que se administra una dosis o cantidad de un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal a un sujeto es, es al menos, es menor que, o es como máximo aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciseis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte veces por cada una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciseis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro, veinticinco, veintiseis, veintisiete, veintiocho, veintinueve, treinta, treinta y uno, treinta y dos, treinta y tres, treinta y cuatro, treinta y cinco, treinta y seis, treinta y siete, treinta y ocho, treinta y nueve, cuarenta, cuarenta y uno, cuarenta y dos, cuarenta y tres, cuarenta y cuatro, cuarenta y cinco, cuarenta y seis, cuarenta y siete, cuarenta y ocho, cuarenta y nueve, cincuenta, cincuenta y cinco, sesenta, sesenta y cinco, setenta, setenta y cinco, ochenta, ochenta y cinco, noventa, noventa y cinco, cien, cien d veinticinco, ciento cincuenta, ciento ochenta o doscientos día(s).

[0144] En algunas realizaciones, la frecuencia a la que se administra una dosis o cantidad de un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal a un sujeto es, es al menos, es menor que, o es como máximo aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciseis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte veces por cada una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciseis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro, veinticinco, veintiseis, veintisiete, veintiocho, veintinueve, treinta, treinta y uno, treinta y dos, treinta y tres, treinta y cuatro, treinta y cinco, treinta y seis, treinta y siete, treinta y ocho, treinta y nueve, cuarenta, cuarenta y uno, cuarenta y dos, cuarenta y tres, cuarenta y cuatro, cuarenta y cinco, cuarenta y seis, cuarenta y siete, cuarenta y ocho, cuarenta y nueve, cincuenta, cincuenta y cinco, sesenta, sesenta y cinco, setenta, setenta y cinco, ochenta, ochenta y cinco, noventa, noventa y cinco o cien semana(s). En algunas realizaciones, la frecuencia a la que se administra un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal a un sujeto es menor o aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince dosis por semana.

[0145] En algunas realizaciones, la frecuencia a la que se administra una dosis o cantidad de un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal a un sujeto es, es al menos, es menor que, o es como máximo aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciseis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte veces por cada mes, cada dos meses, cada tres meses, cada cada cuatro meses, cada cinco meses, cada seis meses, cada siete meses, cada ocho meses, cada nueve meses, cada diez meses, cada once meses, cada doce meses, cada trece meses, cada catorce meses, cada quince meses, cada dieciseis meses, cada diecisiete meses, o cada dieciocho meses. En algunas realizaciones, la frecuencia con la que se administra una dosis o cantidad de un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal a un sujeto es aproximadamente una vez cada mes. En algunas realizaciones, la frecuencia con la que se administra una dosis o cantidad de un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal a un sujeto es aproximadamente una vez cada tres meses. En algunas realizaciones, la frecuencia a la que se administra un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal a un sujeto es menor que aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince dosis por mes. En algunas realizaciones, se puede administrar una dosis o cantidad de un anticuerpo (p. ej., por vía subcutánea o intravenosa en una infusión) a un sujeto una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más al mes.

, 1300 0 mg, , 2450

0 mg, pueden administrar (p. ej., por vía subcutánea o intravenosa en una infusión) a un sujeto una vez al mes. En algunas realizaciones, un anticuerpo en una dosis o cantidad de entre aproximadamente 0,1 mg a 5000 mg, 1 mg a 4000 mg, 10 mg a 3000 mg, 10 mg a 2000 mg, 100 mg a 2000 mg, 150 mg a 2000 mg, 200 mg a 2000 mg, 250 mg a 2000 mg, 300 mg a 2000 mg, 350 mg a 2000 mg, 400 mg a 2000 mg, 450 mg a 2000 mg, 500 mg a 2000 mg, 550 mg a 2000 mg, 600 mg a 2000 mg, 650 mg a 2000 mg, 700 mg a 2000 mg, 750 mg a 2000 mg, 800 mg a 2000 mg, 850 mg a 2000 mg, 900 mg a 2000 mg, 950 mg a 2000 mg o aproximadamente 1000 mg a 2000 mg se pueden administrar (p. ej., por vía subcutánea o intravenosa en una infusión) a un sujeto una vez al mes. En algunas realizaciones, se administran entre aproximadamente 225 mg y aproximadamente 1000 mg, por ejemplo, aproximadamente 225 mg de anticuerpo una vez al mes. Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis de anticuerpo inicial de aproximadamente 675 mg por vía subcutánea, seguida de una dosis mensual de anticuerpo de aproximadamente 225 mg por vía subcutánea durante aproximadamente dos meses, por ejemplo, aproximadamente tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o 12 meses. Otro régimen de dosificación más comprende la administración de una dosis inicial de aproximadamente 900 mg por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos, seguida de dosis de aproximadamente 900 mg administradas por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos cada trimestre durante un año, dos años, tres años, cuatro años o cinco años. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, dependiendo del patrón de deterioro farmacocinético que desee lograr el médico.

[0147] En algunas realizaciones, un anticuerpo en una dosis o cantidad de aproximadamente 50 mg, 100 mg 150 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 675 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg, 1000 mg, 1050 mg, 1100 mg, 1150 mg, 1200 mg, 1250 mg, 1300 mg, 1350 mg, 1400 mg, 1450 mg, 1500 mg, 1550 mg, 1600 mg, 1650 mg, 1700 mg, 1750 mg, 1800 mg, 1850 mg, 1900 mg, 1950 mg, 2000 mg, 2050 mg, 2100 mg, 2150 mg, 2200 mg, 2250 mg, 2300 mg, 2350 mg, 2400 mg, 2450 mg, 2500 mg, 2550 mg, 2600 mg, 2650 mg, 2700 mg, 2750 mg, 2800 mg, 2850 mg, 2900 mg, 2950 mg, 3000 mg o más se pueden administrar (p. ej., por vía subcutánea o intravenosa en una infusión) a un sujeto cada tres meses. En algunas realizaciones, un anticuerpo en una dosis o cantidad de entre aproximadamente 0,1 mg a 5000 mg, 1 mg a 4000 mg, 10 mg a 3000 mg, 10 mg a 2000 mg, 100 mg a 2000 mg, 150 mg a 2000 mg, 200 mg a 2000 mg, 250 mg a 2000 mg, 300 mg a 2000 mg, 350 mg a 2000 mg, 400 mg a 2000 mg, 450 mg a 2000 mg, 500 mg a 2000 mg, 550 mg a 2000 mg, 600 mg a 2000 mg, 650 mg a 2000 mg, 700 mg a 2000 mg, 750 mg a 2000 mg, 800 mg a 2000 mg, 850 mg a 2000 mg, 900 mg a 2000 mg, 950 mg a 2000 mg o 1000 mg a 2000 mg se pueden administrar (p. ej., por vía subcutánea o intravenosa en una infusión) a un sujeto cada tres meses. En algunas realizaciones, se administran entre aproximadamente 225 mg y aproximadamente 1000 mg una vez cada tres meses o menos, por ejemplo, se administran aproximadamente 900 mg cada tres meses por vía intravenosa en una infusión. Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis de anticuerpo inicial de aproximadamente 675 mg por vía subcutánea, seguida de una dosis mensual de anticuerpo de aproximadamente 225 mg por vía subcutánea durante aproximadamente dos meses, por ejemplo, aproximadamente tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o 12 meses. Otro régimen de dosificación más comprende la administración de una dosis inicial de aproximadamente 900 mg por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos, seguida de dosis de aproximadamente 900 mg administradas por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos cada trimestre durante un año, dos años, tres años, cuatro años o cinco años. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, dependiendo del patrón de deterioro farmacocinético que desee lograr el médico.

[0148] En algunas realizaciones, un anticuerpo en una dosis o cantidad de aproximadamente 50 mg, 100 mg 150 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 675 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg, 1000 mg, 1050 mg, 1100 mg, 1150 mg, 1200 mg, 1250 mg, 1300 mg, 1350 mg, 1400 mg, 1450 mg, 1500 mg, 1550 mg, 1600 mg, 1650 mg, 1700 mg, 1750 mg, 1800 mg, 1850 mg, 1900 mg, 1950 mg, 2000 mg, 2050 mg, 2100 mg, 2150 mg, 2200 mg, 2250 mg, 2300 mg, 2350 mg, 2400 mg, 2450 mg, 2500 mg, 2550 mg, 2600 mg, 2650 mg, 2700 mg, 2750 mg, 2800 mg, 2850 mg, 2900 mg, 2950 mg, 3000 mg, o más se pueden administrar (p. ej., por vía subcutánea o intravenosa en una infusión) a un sujeto cada seis meses. En algunas realizaciones, un anticuerpo en una dosis o cantidad de entre aproximadamente 0,1 mg a 5000 mg, 1 mg a 4000 mg, 10 mg a 3000 mg, 10 mg a 2000 mg, 100 mg a 2000 mg, 150 mg a 2000 mg, 200 mg a 2000 mg, 250 mg a 2000 mg, 300 mg a 2000 mg, 350 mg a 2000 mg, 400 mg a 2000 mg, 450 mg a 2000 mg, 500 mg a 2000 mg, 550 mg a 2000 mg, 600 mg a 2000 mg, 650 mg a 2000 mg, 700 mg a 2000 mg, 750 mg a 2000 mg, 800 mg a 2000 mg, 850 mg a 2000 mg, 900 mg a 2000 mg, 950 mg a 2000 mg o 1000 mg a 2000 mg Se pueden administrar (p. ej., por vía subcutánea o intravenosa en una infusión) a un sujeto cada seis meses. En algunas realizaciones, se administran entre 225 mg y 1000 mg una vez cada seis meses o menos. Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis de anticuerpo inicial de aproximadamente 675 mg por vía subcutánea, seguida de una dosis mensual de anticuerpo de aproximadamente 225 mg por vía subcutánea durante aproximadamente dos meses, por ejemplo, aproximadamente tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o 12 meses. Otro régimen de dosificación más comprende la administración de una dosis inicial de aproximadamente 900 mg por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos, seguida de dosis de aproximadamente 900 mg administradas por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos cada trimestre durante un año, dos años, tres años, cuatro años o cinco años. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, dependiendo del patrón de deterioro farmacocinético que desee lograr el médico.

[0149] En algunas realizaciones, la frecuencia a la que se administra una dosis o cantidad de un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal a un sujeto (p. ej., por vía subcutánea o intravenosa) es, es al menos, es menor que, o es como máximo uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciseis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte veces por cada trimestre. Como se puede apreciar, un "trimestre" puede referirse a un período de un trimestre o también puede referirse a un trimestre natural, como un período de tiempo del

1 de enero al 31 de marzo, del 1 de abril al 30 de junio, del 1 de julio al 30 de septiembre, o del 1 de octubre al 31 de diciembre. En algunos casos, un "trimestre" puede referirse a un período de aproximadamente tres meses.

[0150] En algunas realizaciones, un anticuerpo en una dosis o cantidad de aproximadamente 50 mg, 100 mg 150 mg,

200 mg, 225 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 675 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg, 1000 mg, 1050 mg, 1100 mg, 1150 mg, 1200 mg, 1250 mg, 1300 mg, 1350 mg, 1400 mg, 1450 mg, 1500 mg, 1550 mg, 1600 mg, 1650 mg, 1700 mg, 1750 mg, 1800 mg, 1850 mg, 1900 mg, 1950 mg, 2000 mg, 2050 mg, 2100 mg, 2150 mg, 2200 mg, 2250 mg, 2300 mg, 2350 mg, 2400 mg, 2450 mg, 2500 mg, 2550 mg, 2600 mg, 2650 mg, 2700 mg, 2750 mg, 2800 mg, 2850 mg, 2900 mg, 2950 mg, 3000 mg, o se pueden administrar más (p. ej., por vía subcutánea o intravenosa en una infusión) a un sujeto cada trimestre. En algunas realizaciones, un anticuerpo en una dosis o cantidad de entre aproximadamente 0,1 mg a 5000 mg, 1 mg a 4000 mg,

10 mg a 3000 mg, 10 mg a 2000 mg, 100 mg a 2000 mg, 150 mg a 2000 mg, 200 mg a 2000 mg, 250 mg a 2000 mg,

300 mg a 2000 mg, 350 mg a 2000 mg, 400 mg a 2000 mg, 450 mg a 2000 mg, 500 mg a 2000 mg, 550 mg a 2000 mg, 600 mg a 2000 mg, 650 mg a 2000 mg, 700 mg a 2000 mg, 750 mg a 2000 mg, 800 mg a 2000 mg, 850 mg a 2000 mg, 900 mg a 2000 mg, 950 mg a 2000 mg o 1000 mg a 2000 mg se pueden administrar(p. ej., por vía subcutánea o intravenosa en una infusión) a un sujeto cada trimestre. Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis de anticuerpo inicial de aproximadamente 675 mg por vía subcutánea, seguida de una dosis mensual de anticuerpo de aproximadamente 225 mg por vía subcutánea durante aproximadamente dos meses, por ejemplo, aproximadamente tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o 12 meses. Otro régimen de dosificación más comprende la administración de una dosis inicial de aproximadamente 900 mg por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos, seguida de dosis de aproximadamente 900 mg administradas por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos cada trimestre durante un año, dos años, tres años, cuatro años o cinco años. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, dependiendo del patrón de deterioro farmacocinético que desee lograr el médico.

[0151] En algunas realizaciones, la frecuencia a la que una dosis o cantidad de un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal se administra es, es al menos, es menor que, o es como máximo alrededor de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciseis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte veces por cada año, cada dos años, cada tres años, cada cuatro años, o cada cinco años. En algunas realizaciones, la frecuencia con la que se administra un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal a un sujeto es menor que uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciseis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro o veinticinco dosis por año.

[0152] En algunas realizaciones, un anticuerpo en una dosis o cantidad de aproximadamente 50 mg, 100 mg 150 mg,

200 mg, 225 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 675 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg, 1000 mg, 1050 mg, 1100 mg, 1150 mg, 1200 mg, 1250 mg, 1300 mg, 1350 mg, 1400 mg, 1450 mg, 1500 mg, 1550 mg, 1600 mg, 1650 mg, 1700 mg, 1750 mg, 1800 mg, 1850 mg, 1900 mg, 1950 mg, 2000 mg, 2050 mg, 2100 mg, 2150 mg, 2200 mg, 2250 mg, 2300 mg, 2350 mg, 2400 mg, 2450 mg, 2500 mg, 2550 mg, 2600 mg, 2650 mg, 2700 mg, 2750 mg, 2800 mg, 2850 mg, 2900 mg, 2950 mg, 3000 mg, o pueden administrar a un sujeto una vez al año. En algunas realizaciones, un anticuerpo en una dosis o cantidad de entre aproximadamente 0,1 mg a 5000 mg, 1 mg a 4000 mg, 10 mg a 3000 mg, 10 mg a 2000 mg, 100 mg a 2000 mg,

150 mg a 2000 mg, 200 mg a 2000 mg, 250 mg a 2000 mg, 300 mg a 2000 mg, 350 mg a 2000 mg, 400 mg a 2000 mg, 450 mg a 2000 mg, 500 mg a 2000 mg, 550 mg a 2000 mg, 600 mg a 2000 mg, 650 mg a 2000 mg, 700 mg a 2000 mg, 750 mg a 2000 mg, 800 mg a 2000 mg, 850 mg a 2000 mg, 900 mg a 2000 mg, 950 mg a 2000 mg o 1000 mg a 2000 mg se pueden administrar a un sujeto una vez al año. En algunas realizaciones, se administran entre aproximadamente 450 mg y aproximadamente 2000 mg una vez al año o menos.

[0153] En algunas realizaciones, el tratamiento o reducción puede comprender administrar un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal a un sujeto en una pluralidad de días. Dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más días de la pluralidad de días pueden ser más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,

24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 o más días de diferencia. En algunas realizaciones, dos de la pluralidad de días son más de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciseis, diecisiete, dieciocho, diecinueve., veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro, veinticinco, veintiséis, veintisiete, veintiocho, veintinueve, treinta o más días de diferencia. Además, en algunas realizaciones, la cantidad de anticuerpo administrada en un primer día de la pluralidad de días puede ser diferente (p. ej., mayor o menor) que la cantidad de anticuerpo administrada en un segundo día.

[0154] En algunas realizaciones, una dosis inicial (p. ej., una dosis de carga) de un anticuerpo antagonista monoclonal anti-CGRP se puede administrar a un sujeto, seguido de la administración de una o más dosis adicionales a intervalos deseados. En algunas realizaciones, la dosis inicial y una o más de las dosis adicionales son la misma dosis. En algunas realizaciones, una o más dosis adicionales son una dosis diferente a la dosis inicial. En algunas realizaciones, la dosis inicial y una o más de las dosis adicionales se administran de la misma forma, es decir, por vía subcutánea o intravenosa. En algunas realizaciones, la una o más dosis adicionales se administran de una manera diferente a la dosis inicial, por ejemplo, la dosis inicial puede administrarse por vía intravenosa y la una o más dosis adicionales pueden administrarse por vía subcutánea. En algunas realizaciones, la frecuencia a la que se administran una o más dosis adicionales es constante (p. ej., cada mes o cada tres meses). En algunas realizaciones, la frecuencia a la que se administran una o más dosis adicionales es variable (p. ej., una dosis adicional administrada un mes después de la dosis inicial, seguida de otra dosis adicional tres meses después de la dosis inicial). Puede usarse cualquier régimen deseable y/o terapéutico de dosis de carga inicial, dosis adicionales y frecuencia (p. ej., incluidas las descritas en este documento) de dosis adicionales. Un régimen ejemplar incluye una dosis de carga inicial de aproximadamente 675 mg de anticuerpo antagonista anti-CGRP administrado por vía subcutánea, seguido de dosis de mantenimiento posteriores de aproximadamente 225 mg del anticuerpo administrado por vía subcutánea a intervalos de un mes. Otro régimen ejemplar más incluye una dosis inicial de aproximadamente 900 mg de anticuerpo antagonista anti-CGRP administrada por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos, seguida de dosis de mantenimiento posteriores de aproximadamente 900 mg de anticuerpo antagonista anti-CGRP administradas por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos a intervalos de tres meses.

[0155] En algunas realizaciones, una dosis inicial de un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal de aproximadamente 0,1 |jg, 1 |jg, 100 |jg, 1 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 125 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg, 400 mg, 450 mg, 475 mg, 500 mg, 525 mg, 550 mg, 575 mg, 600 mg, 625 mg, 650 mg, 675 mg, 700 mg, 725 mg, 750 mg, 775 mg, 800 mg, 825 mg, 850 mg, 875 mg, 900 mg, 925 mg, 950 mg, 975 mg, 1000 mg, 1500 mg, 2000 mg, o aproximadamente 3000 mg pueden administrarse a un sujeto seguido de una o más dosis adicionales del anticuerpo de aproximadamente 0,1 mg, 1 mg, 100 mg, 1 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 125 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg, 400 mg, 450 mg, 475 mg, 500 mg, 525 mg, 550 mg, 575 mg, 600 mg, 625 mg, 650 mg, 675 mg, 700 mg, 725 mg, 750 mg, 775 mg, 800 mg, 825 mg, 850 mg, 875 mg, 900 mg, 925 mg, 950 mg, 975 mg, 1000 mg, 1500 mg, 2000 mg o aproximadamente 3000 mg. Un régimen ejemplar incluye una dosis de carga inicial de aproximadamente 675 mg de anticuerpo antagonista anti-CGRP administrado por vía subcutánea, seguido de dosis de mantenimiento posteriores de aproximadamente 225 mg del anticuerpo administrado por vía subcutánea a intervalos de un mes. Otro régimen ejemplar más incluye una dosis inicial de aproximadamente 900 mg de anticuerpo antagonista anti-CGRP administrada por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos, seguida de dosis de mantenimiento posteriores de aproximadamente 900 mg de anticuerpo antagonista anti-CGRP administradas por vía intravenosa en una infusión durante aproximadamente 60 minutos a intervalos de tres meses.

[0156] En algunas realizaciones, una dosis o cantidad de anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal se puede dividir en subdosis y administrarse como múltiples subdosis, dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración y/o formulación particular administrada. Por ejemplo, en los casos en los que una dosis se administra por vía subcutánea, la dosis subcutánea puede dividirse en múltiples subdosis y cada subdosis administrada en un sitio diferente para evitar, por ejemplo, una inyección subcutánea única más grande en un solo sitio. Por ejemplo, una dosis intravenosa de 900 mg se puede dividir en cuatro subdosis de 225 mg cada una. Como otro ejemplo, una dosis subcutánea de 675 mg puede dividirse en tres subdosis de 225 mg cada una y cada dosis de 225 mg puede administrarse en un sitio diferente, lo que puede ayudar a minimizar el volumen inyectado en cada sitio. La división de subdosis puede ser igual (p. ej., tres subdosis iguales) o puede ser desigual (p. ej., tres subdosis, dos de las subdosis dos veces más grandes que las otras subdosis).

[0157] En algunas realizaciones, el número de dosis de anticuerpo administradas a un sujeto durante el curso del tratamiento puede variar dependiendo, por ejemplo, de lograr una incidencia reducida de un dolor de cabeza postraumático y/o síntoma secundario asociado con un dolor de cabeza postraumático en el sujeto. Por ejemplo, el número de dosis administradas durante el transcurso del tratamiento puede ser, puede ser al menos o puede ser como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, o el tratamiento se puede administrar de forma indefinida. En algunos casos, el tratamiento puede ser agudo de modo que se administren como máximo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 dosis a un sujeto para el tratamiento.

[0158] En algunas realizaciones, una dosis (o sub-dosis) o la cantidad de un anticuerpo antagonista monoclonal anti-CGRP puede formularse en una formulación líquida y administrarse (p. ej., a través de inyección subcutánea, mediante inyección intravenosa) a un sujeto. En tales casos, el volumen de la formulación líquida que comprende el anticuerpo puede variar dependiendo, por ejemplo, de la concentración de anticuerpo en la formulación líquida, la dosis deseada de anticuerpo y/o la vía de administración utilizada. Por ejemplo, el volumen de formulación líquida que comprende un anticuerpo descrito en este documento y administrado (p. ej., mediante una inyección, como, por ejemplo, una inyección subcutánea o una infusión intravenosa) a un sujeto puede ser de aproximadamente O,o0l ml a aproximadamente 10,0 ml, aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 5,0 ml, aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 5 ml, aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 3 ml, aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 2,5 ml o aproximadamente 1 ml a aproximadamente 2,5 ml. Por ejemplo, el volumen de formulación líquida que comprende un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal y administrado (p. ej., mediante una inyección, tal como, por ejemplo, una inyección subcutánea o una infusión intravenosa) a un sujeto puede ser, puede ser al menos, puede ser menor que, o puede ser como máximo aproximadamente 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2,2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3,3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3,4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o aproximadamente 10,0 ml.

[0159] En algunas realizaciones, se puede suministrar una dosis (o subdosis) o cantidad de un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal en receptáculos precargados útiles para administrar el anticuerpo a un sujeto. Dichos receptáculos precargados pueden diseñarse para la autoadministración o para que otros los administren. Por ejemplo, una dosis (o subdosis) o cantidad de anticuerpo descrita en el presente documento puede suministrarse como una formulación líquida en jeringas precargadas, jeringas precargadas con un dispositivo de seguridad para agujas, bolígrafos de inyección o autoinyectores. En tales ejemplos, las jeringas precargadas pueden diseñarse para la autoadministración o para que las administre otra persona. En algunos casos, las jeringas precargadas o los autoinyectores pueden diseñarse para la administración subcutánea y/o intravenosa.

[0160] Para el propósito de la presente invención, la dosificación apropiada de un anticuerpo puede depender del anticuerpo (composiciones o de la misma) empleado, el tipo y la gravedad del síntoma secundario, el tipo y gravedad del dolor de cabeza post-traumático (persistente) u otra afección a tratar, ya sea que el agente se administre con fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al agente y la discreción del médico tratante. Normalmente, el médico administrará un anticuerpo, hasta que se alcance una dosis que logre el resultado deseado. La dosis y/o la frecuencia pueden variar durante el transcurso del tratamiento.

[0161] Consideraciones empíricas, tales como la vida media, generalmente contribuirán a la determinación de la dosificación. Por ejemplo, los anticuerpos que son compatibles con el sistema inmunológico humano, como los anticuerpos humanizados o los anticuerpos completamente humanos, pueden usarse para prolongar la vida media del anticuerpo y evitar que el anticuerpo sea atacado por el sistema inmunológico del huésped. La frecuencia de administración se puede determinar y ajustar durante el curso de la terapia, y es generalmente, pero no necesariamente, en base al tratamiento y/o supresión y/o mejoría y/o retraso del dolor de cabeza postraumático u otra afección. Alternativamente, pueden ser apropiadas las formulaciones de anticuerpos de liberación continua sostenida. Se conocen en la técnica diversas formulaciones y dispositivos para lograr una liberación sostenida.

[0162] En una realización, las dosificaciones para un anticuerpo antagonista monoclonal anti-CGRP se pueden determinar empíricamente en individuos que han recibido una o más administración(es) del anticuerpo. Los individuos reciben dosis incrementales de un anticuerpo. Para evaluar la eficacia de un anticuerpo, se puede seguir un indicador de la enfermedad.

[0163] La administración de un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, de la condición fisiológica del receptor, si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico y otros factores conocidos por los médicos expertos. La administración de un anticuerpo puede ser esencialmente continua durante un período de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis espaciadas, por ejemplo, antes, durante o después de desarrollar (persistente) cefalea postraumática; antes de; durante; antes y después de; durante y después; antes y durante; o antes, durante y después de desarrollar (persistente) dolor de cabeza postraumático. La administración puede ser antes, durante y/o después de cualquier evento que pueda dar lugar a cefalea postraumática (persistente).

[0164] En algunas realizaciones, puede estar presente más de un anticuerpo. Pueden estar presentes al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco anticuerpos diferentes o más. Generalmente, esos anticuerpos pueden tener actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. También se puede usar un anticuerpo anti-antagonista de CGRP monoclonal junto con otros antagonistas de CGRP o antagonistas del receptor de CGRp . Por ejemplo, se pueden usar uno o más de los siguientes antagonistas de CGRP: una molécula antisentido dirigida a un CGRP (que incluye una molécula antisentido dirigida a un ácido nucleico que codifica CGRP), un compuesto inhibidor de CGRP, un análogo estructural de CGRP, una mutación dominante negativa de un receptor CGRP que se une a un CGRP y un anticuerpo anti-receptor CGRP. También se puede usar un anticuerpo junto con otros agentes que sirven para mejorar y/o complementar la eficacia de los agentes.

[0165] El diagnóstico o evaluación del dolor de cabeza postraumático está bien establecido en la técnica. La evaluación se puede realizar con base en medidas subjetivas, como la caracterización de los síntomas por parte del paciente. En algunas realizaciones, la evaluación del dolor de cabeza postraumático puede realizarse mediante horas de dolor de cabeza, como se describe en otra parte del presente documento. Por ejemplo, la evaluación del dolor de cabeza postraumático puede realizarse en términos de horas diarias de dolor de cabeza, horas semanales de dolor de cabeza, horas mensuales de dolor de cabeza y/o horas anuales de dolor de cabeza. En algunos casos, las horas de dolor de cabeza pueden ser las informadas por el sujeto.

[0166] La eficacia del tratamiento se puede evaluar mediante métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede evaluar el alivio del dolor. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el alivio del dolor se observa subjetivamente después de 1, 2 o unas pocas horas después de administrar un anticuerpo anti-CGRP. En algunas realizaciones, la frecuencia de ataques de dolor de cabeza postraumáticos (persistentes) se observa subjetivamente después de administrar un anticuerpo anti-CGRP.

[0167] En algunas realizaciones, la composición para uso en el tratamiento o reducción de la incidencia de dolor de cabeza postraumático en un sujeto puede reducir la incidencia de dolor de cabeza post-traumático después de una sola administración de un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal durante un período prolongado de tiempo. Por ejemplo, la incidencia de cefalea postraumática (persistente) puede reducirse durante al menos 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más días después de una sola administración.

[0168] En algunas realizaciones, la composición para uso en el tratamiento o reducción de la incidencia de dolor de cabeza postraumático en un sujeto puede reducir el número de horas de dolor de cabeza experimentadas por un sujeto de un nivel anterior a la administración después de la administración de una o más dosis de un anticuerpo anti antagonista de CGRP monoclonal contra el sujeto. Por ejemplo, las horas diarias de dolor de cabeza experimentadas por el sujeto después de administrar una o más dosis de un anticuerpo al sujeto pueden reducirse en 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas de cefalea desde un nivel previo a la administración en el sujeto. En algunos casos, las horas diarias de dolor de cabeza experimentadas por el sujeto después de administrar una o más dosis de un anticuerpo al sujeto pueden reducirse en un 0,5%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o más en relación con un nivel previo a la administración en el sujeto. En otro ejemplo, las horas semanales de dolor de cabeza experimentadas por el sujeto después de administrar una o más dosis de un anticuerpo al sujeto pueden reducirse en 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50., 55, 60, 65, 70, 75 o más horas de dolor de cabeza desde un nivel previo a la administración en el sujeto. En algunos casos, las horas semanales de dolor de cabeza experimentadas por el sujeto después de administrar una o más dosis de un anticuerpo al sujeto pueden reducirse en un 0,5%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o más en relación con un nivel de administración en la asignatura. En otro ejemplo, las horas mensuales de dolor de cabeza experimentadas por el sujeto después de administrar una o más dosis de un anticuerpo al sujeto pueden reducirse en 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50., 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125 o más horas de dolor de cabeza desde un nivel previo a la administración. En algunos casos, las horas semanales de dolor de cabeza experimentadas por el sujeto después de administrar una o más dosis de un anticuerpo al sujeto pueden reducirse en un 0,5%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o más en relación con un nivel anterior a la administración en el sujeto.

[0169] En algunas realizaciones, la composición para uso en el tratamiento o reducción de la incidencia de dolor de cabeza post-traumático (persistente) en un sujeto puede reducir el número de días con cefalea experimentados por un sujeto a partir de un pre-administración después de la administración de una o más dosis de un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal al sujeto. Por ejemplo, los días de dolor de cabeza semanales experimentados por el sujeto después de administrar una o más dosis de un anticuerpo al sujeto pueden reducirse en 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5 ó 7 días de cefalea desde el nivel previo a la administración en el sujeto. En algunos casos, los días de dolor de cabeza semanales experimentados por el sujeto después de administrar una o más dosis de un anticuerpo al sujeto pueden reducirse en un 0,5%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o más en relación con una administración previa nivel en el sujeto. En otro ejemplo, los días de dolor de cabeza mensuales experimentados por el sujeto después de administrar una o más dosis de un anticuerpo al sujeto pueden reducirse en 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más días de dolor de cabeza desde el nivel previo a la administración.

[0170] En algunas realizaciones, un método puede comprender administrar a un sujeto uno o más agentes adicional(es) simultáneamente o secuencialmente con un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal. En algunas realizaciones, un agente adicional puede ser una medicación contra el dolor de cabeza tal como un ejemplo de medicación contra el dolor de cabeza (p. ej., agonistas 5-HT1, triptanos, alcaloides del cornezuelo de centeno, opiáceos, antagonistas p-adrenérgicos, AlNE) descritos en otra parte del presente documento. En algunas realizaciones, un efecto terapéutico puede ser mayor en comparación con el uso de un anticuerpo o uno o más agentes adicionales solos. Por consiguiente, se puede lograr un efecto sinérgico entre un anticuerpo y uno o más agentes adicionales. En algunas realizaciones, el sujeto puede tomar uno o más agentes adicionales de forma profiláctica.

B. Anticuerpos antagonistas anti-CGRP

[0171] La composición para uso en la invención comprende un anticuerpo antagonista anti-CGRP. Un anticuerpo antagonista anti-CGRP puede referirse a cualquier molécula de anticuerpo que bloquea, suprime o reduce (incluyendo significativamente) la actividad biológica del CGRP, incluidas las vías posteriores mediadas por la señalización del CGRP, como la unión al receptor y/o la provocación de una respuesta celular al CGRP.

[0172] Un anticuerpo antagonista anti-CGRP puede exhibir una o más de las siguientes características: (a) se unen a Cg r P; (b) bloquear CGRP para que no se una a su receptor o receptores; (c) bloquear o disminuir la activación del receptor CGRP (que incluye, pero no se limita a activación de cAMP); (d) inhibir la actividad biológica de CGRP o las rutas posteriores mediadas por la función de señalización de CGRP; (e) prevenir, mejorar o tratar cualquier aspecto del dolor de cabeza postraumático; (f) aumentar el aclaramiento de CGRP; e (g) inhibir (reducir) la síntesis, producción o liberación de CGRP. Los anticuerpos antagonistas anti-CGRP son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Tan et al., Clin. Sci. (Lond). 89: 565 - 73, 1995; Sigma (Missouri, EE.UU.), número de producto C71l3 (clon n° 4901); Plourde et al., Peptides 14: 1225-1229, 1993.

[0173] En algunas realizaciones, el anticuerpo reacciona con CGRP de una manera que inhibe CGRP y/o la ruta CGRP, incluidas las rutas corriente abajo mediadas por la función de señalización CGRP. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP reconoce el CGRP humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP se une tanto a a-CGRP como a p-CGRP humanos. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP se une al CGRP humano y de rata. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP se une al fragmento C-terminal que tiene los aminoácidos 25-37 de CGRP. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP se une a un epítopo C-terminal dentro de los aminoácidos 25-37 de CGRP.

[0174] El anticuerpo antagonista anti-CGRP es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP está humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo es humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP es el anticuerpo G1 (como se describe en el presente documento). El anticuerpo antagonista anti-CGRP comprende seis CDR del anticuerpo G1. En otras realizaciones más, el anticuerpo antagonista anti-CGRP comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada mostrada en la Figura 5 (SEQ ID NO:1) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera mostrada en la Figura 5 (SEQ ID NO: 2). QASQSVYHNTYLA (SEQ ID NO: 84).

[0175] En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante modificada, tal como una región constante que es inmunológicamente inerte descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la región constante se modifica como se describe en Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624; Solicitud PCT n° PCT/GB99/01441; y/o la Solicitud de Patente del Reino Unido N° 9809951.8. En otras realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de IgG2 de cadena pesada humana que comprende las siguientes mutaciones: A330P331 a S330S331 (numeración de aminoácidos con referencia a la secuencia de IgG2 de tipo silvestre). EUR. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de IgG4 que comprende las siguientes mutaciones: E233F234L235 a P233V234A235. En otras realizaciones más, la región constante se aglicosila para la glicosilación ligada a N. En algunas realizaciones, la región constante se aglicosila para la glicosilación ligada a N mutando el residuo de unión de oligosacárido (tal como Asn297) y/o los residuos flanqueantes que son parte de la secuencia de reconocimiento de N-glicosilación en la región constante. En algunas realizaciones, la región constante se aglicosila para la glicosilación ligada a N. La región constante se puede aglicosilar para la glicosilación ligada a N enzimáticamente o mediante expresión en una célula huésped deficiente en glicosilación.

[0176] La afinidad de unión (K^d) de un anticuerpo antagonista anti-CGRP para CGRP (tal como a-CGRP humano) puede ser de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 200 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es cualquiera de aproximadamente 200 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 5 pM o aproximadamente 2 pM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es menor que cualquiera de aproximadamente 250 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM o aproximadamente 50 pM.

[0177] Una forma de determinar la afinidad de unión de los anticuerpos a CGRP es midiendo la afinidad de unión de fragmentos Fab monofuncionales del anticuerpo. Para obtener fragmentos Fab monofuncionales, un anticuerpo (p. ej., IgG) puede escindirse con papaína o expresarse de forma recombinante. La afinidad de un fragmento Fab anti-CGRP de un anticuerpo se puede determinar mediante resonancia de plasmón de superficie (sistema de resonancia de plasmón de superficie (SPR) Biacore3000™, Biacore, INC, Piscataway NJ) equipado con chips sensores de estreptavidina (Sa ) preinmovilizados utilizando HBS - Tampón de ejecución EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005% v/v). El CGRP humano biotinilado (o cualquier otro CGRP) se puede diluir en tampón HBS-EP a una concentración de menos de 0,5 pg/ml e inyectar a través de los canales de chip individuales usando tiempos de contacto variables, para lograr dos rangos de densidad de antígeno, ya sea 50-200 unidades de respuesta (RU) para estudios cinéticos detallados o 800-1.000 RU para ensayos de detección. Los estudios de regeneración han demostrado que el NaOH 25 mM en etanol al 25% v/v elimina eficazmente el Fab unido mientras mantiene la actividad de CGRP en el chip durante más de 200 inyecciones. Normalmente, se inyectan diluciones en serie (que abarcan concentraciones de 0,1 a 10x la K^destimada) de muestras de Fab purificadas durante 1 min a 100 pl/minuto y se permiten tiempos de disociación de hasta 2 horas. Las concentraciones de las proteínas Fab se determinan mediante ELISA y/o electroforesis SDS-PAGE usando un Fab de concentración conocida (determinada por análisis de aminoácidos) como estándar. Las tasas de asociación cinética (kon) y las tasas de disociación (kf se obtienen simultáneamente ajustando los datos globalmente a un modelo de unión de Langmuir 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) utilizando el programa BIAevaluation. Los valores de la constante de disociación de equilibrio (K^d) se calculan como kof/kon. Este protocolo es adecuado para determinar la afinidad de unión de un anticuerpo a cualquier CGRP, incluido CGRP humano, CGRP de otro mamífero (como CGRP de ratón, CGRP de rata, CGRP de primates), así como diferentes formas de CGRP (como forma a y p). La afinidad de unión de un anticuerpo se mide generalmente a 25°C, pero también se puede medir a 37°C.

[0178] Los anticuerpos, incluyendo anticuerpos antagonistas anti-CGRP, se pueden hacer por cualquier método conocido en la técnica. La ruta y el programa de inmunización del animal huésped están generalmente de acuerdo con las técnicas establecidas y convencionales para la estimulación y producción de anticuerpos, como se describe adicionalmente en el presente documento. Las técnicas generales para la producción de anticuerpos humanos y de ratón se conocen en la técnica y se describen en el presente documento.

[0179] Se contempla que cualquier sujeto mamífero incluyendo seres humanos o células productoras de anticuerpos de los mismos se pueden manipular para servir como la base para la producción de mamíferos, incluidas las líneas celulares de hibridoma humano,. Normalmente, el animal huésped se inocula por vía intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutánea, intraplantar y/o intradérmica con una cantidad de inmunógeno, incluido como se describe en el presente documento.

[0180] Los hibridomas se pueden preparar a partir de linfocitos y células de mieloma inmortalizadas usando la técnica de hibridación de células somáticas generales de Kohler, B. y Milstein, C. (1975) Nature 256: 495-497 o según lo modificado por Buck, DW, et al., In Vitro, 18: 377 - 381 (1982). Las líneas de mieloma disponibles, que incluyen pero no se limitan a X63-Ag8.653 y las del Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, California, EE. UU., pueden usarse en la hibridación. Generalmente, la técnica implica fusionar células de mieloma y células linfoides usando un fusógeno tal como polietilenglicol, o por medios eléctricos bien conocidos por los expertos en la técnica. Después de la fusión, las células se separan del medio de fusión y se cultivan en un medio de crecimiento selectivo, como medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), para eliminar las células parentales no hibridadas. Cualquiera de los medios descritos en el presente documento, complementado con o sin suero, puede usarse para cultivar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales. Como otra alternativa a la técnica de fusión celular, las células B inmortalizadas con EBV pueden usarse para producir anticuerpos monoclonales (p. ej., anticuerpos monoclonales anti-CGRP) de la presente invención. Los hibridomas se expanden y subclonan, si se desea, y los sobrenadantes se analizan para determinar la actividad antiinmunógena mediante procedimientos de inmunoensayo convencionales (p. ej., radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático o inmunoensayo de fluorescencia).

[0181] Los hibridomas que pueden usarse como fuente de anticuerpos abarcan todos los derivados, las células progenitoras de los hibridomas parentales que producen anticuerpos monoclonales específicos para CGRP, o una porción de los mismos.

[0182] Los hibridomas que producen tales anticuerpos pueden cultivarse in vitro o in vivo usando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse de los medios de cultivo o fluidos corporales, mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como precipitación con sulfato de amonio, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía y ultrafiltración, si se desea. La actividad no deseada, si está presente, puede eliminarse, por ejemplo, pasando la preparación sobre adsorbentes hechos del inmunógeno unido a una fase sólida y eluyendo o liberando los anticuerpos deseados del inmunógeno. Inmunización de un animal huésped con un CGRP humano, o un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos diana conjugada con una proteína que es inmunogénica en la especie que se va a inmunizar, p. ej., hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaradehído, anhídrido succínico, SOCI2 o R1 N = C = NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes, puede producir una población de anticuerpos (p. ej., anticuerpos monoclonales).

[0183] Si se desea, un anticuerpo (p. ej., anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal o policlonal) de interés puede ser secuenciado y la secuencia de polinucleótido puede entonces clonarse en un vector para expresión o propagación. La secuencia del documento que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula huésped y la célula huésped puede luego expandirse y congelarse para uso futuro. Como alternativa, la secuencia de polinucleótidos puede usarse para manipulación genética para "humanizar" el anticuerpo o para mejorar la afinidad, u otras características del anticuerpo. Por ejemplo, la región constante puede diseñarse para que se parezca más a las regiones constantes humanas para evitar la respuesta inmune si el anticuerpo se usa en ensayos clínicos y tratamientos en humanos. Puede ser deseable manipular genéticamente la secuencia del anticuerpo para obtener una mayor afinidad por CGRP y una mayor eficacia en la inhibición de CGRP. Será evidente para un experto en la técnica que se pueden realizar uno o más cambios de polinucleótidos en el anticuerpo antagonista anti-CGRP y aún mantener su capacidad de unión a CGRP.

[0184] Humanizar un anticuerpo monoclonal puede comprender cuatro pasos generales. Estos son: (1) determinar la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos predicha de los dominios variables ligeros y pesados del anticuerpo inicial (2) diseñar el anticuerpo humanizado, es decir, decidir qué región marco del anticuerpo usar durante el proceso de humanización (3) las metodologías/técnicas de humanización reales y (4) la transfección y expresión del anticuerpo humanizado. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6,331,415; 5,530,101; 5,693,761; 5,693,762; 5,585,089; y 6,180,370.

[0185] Se ha descrito un número de moléculas "humanizadas" de anticuerpos que comprenden un sitio de unión a antígeno derivado de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones de roedor o roedor V modificadas y sus regiones asociadas determinantes de la complementariedad (CDR) fusionadas a dominios constantes humanos. Véase, por ejemplo, Winter et al., Nature 349: 293-299 (1991), Lobuglio et al., Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 86: 4220-4224 (1989), Shaw y col., J Immunol. 138: 4534-4538 (1987), y Brown y col., Cancer Res. 47: 3577 - 3583 (1987). Otras referencias describen CDR de roedor injertadas en una región marco de soporte (FR) humana antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado. Véase, por ejemplo, Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239: 1534-1536 (1988), y Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986). Otra referencia describe CDR de roedor soportadas por regiones de estructura de roedor revestidas de forma recombinante. Véase, por ejemplo, la publicación de patente europea n° 0519596. Estas moléculas "humanizadas" están diseñadas para minimizar la respuesta inmunológica no deseada hacia moléculas de anticuerpos antihumanos de roedores que limitan la duración y la eficacia de las aplicaciones terapéuticas de esos restos en receptores humanos. Por ejemplo, la región constante del anticuerpo puede modificarse por ingeniería genética de modo que sea inmunológicamente inerte (p. ej., no desencadena la lisis del complemento). Véanse, por ejemplo, la publicación PCT n° PCT/GB99/01441; Solicitud de patente del Reino Unido n° 9809951.8. Otros métodos de humanización de anticuerpos que también pueden utilizarse se describen en Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19: 2471-2476 (1991) y en las Patentes de Estados Unidos N° 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; 5,866,692; 6,210,671; y 6,350,861; y en la Publicación PCT N° WO 01/27160.

[0186] En otra alternativa, los anticuerpos completamente humanos se pueden obtener mediante el uso de ratones disponibles comercialmente que han sido manipulados para expresar proteínas específicas de inmunoglobulina humana. Los animales transgénicos que están diseñados para producir una respuesta inmune más deseable (p. ej., anticuerpos completamente humanos) o más robusta también pueden usarse para la generación de anticuerpos humanizados o humanos. Ejemplos de dicha tecnología son XENOMOUSE™ de Abgenix, Inc. (Fremont, c A) y HuMAb-Mouse® y TC Mouse™ de Medarex, Inc. (Princeton, NJ).

[0187] En una alternativa, los anticuerpos se pueden preparar de forma recombinante y expresar usando cualquier método conocido en la técnica. En otra alternativa, los anticuerpos se pueden producir de forma recombinante mediante tecnología de presentación en fagos. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; y 6,265,150; y Winter y col., Annu. Rev. Immunol. 12: 433 - 455 (1994). Alternativamente, la tecnología de presentación de fagos (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)) puede usarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes del dominio V del anticuerpo se clonan en marco en un gen de la proteína de la cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se muestran como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe esas propiedades. Por tanto, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La visualización de fagos se puede realizar en una variedad de formatos; para revisión véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Se pueden usar varias fuentes de segmentos del gen V para la presentación de fagos. Clackson y col., Nature 352: 624-628 (1991) aislaron una serie diversa de anticuerpos anti-oxazolona de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos contra una serie diversa de antígenos (incluidos los autoantígenos) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Mark et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), o Griffith y col., EMBO J. 12: 725-734 (1993). En una respuesta inmune natural, los genes de anticuerpos acumulan mutaciones a un ritmo elevado (hipermutación somática). Algunos de los cambios introducidos conferirán una mayor afinidad, y las células B que muestran inmunoglobulina de superficie de alta afinidad se replican y diferencian preferentemente durante la exposición posterior al antígeno. Este proceso natural se puede imitar empleando la técnica conocida como "mezcla de cadenas". Marks y col., Bio/Technol. 10: 779 - 783 (1992)). En este método, la afinidad de los anticuerpos humanos "primarios" obtenidos por presentación de fagos se puede mejorar reemplazando secuencialmente los genes de la región V de la cadena pesada y ligera con repertorios de variantes naturales (repertorios) de genes de dominio V obtenidos de donantes no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades en el rango pM-nM. Una estrategia para fabricar repertorios de anticuerpos de fagos muy grandes (también conocida como "la mejor de todas las bibliotecas") ha sido descrita por Waterhouse et al., Nucl. Acids Res.

21: 2265 - 2266 (1993). La mezcla de genes también puede usarse para derivar anticuerpos humanos a partir de anticuerpos de roedor, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo de roedor inicial. Según este método, que también se denomina "impresión de epítopo", el gen del dominio V de cadena pesada o ligera de anticuerpos de roedor obtenido mediante la técnica de presentación en fagos se reemplaza con un repertorio de genes del dominio V humano, creando quimeras humano-roedor. La selección del antígeno da como resultado el aislamiento de regiones variables humanas capaces de restaurar un sitio de unión al antígeno funcional, modelos animales de dolores de cabeza postraumáticos para probar la eficacia de anticuerpos o polipéptidos antagonistas. Reuter, et al., Functional Neurology (15) Supl. 3, 2000. Algunos de los métodos para identificar y caracterizar anticuerpos o polipéptidos antagonistas anti-CGRP se describen en detalle en los Ejemplos.

[0194] Los anticuerpos, incluyendo anticuerpos antagonistas anti-CGRP, se pueden caracterizar usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método consiste en identificar el epítopo al que se une, o "mapeo de epítopos". Hay muchos métodos conocidos en la técnica para mapear y caracterizar la ubicación de epítopos en proteínas, incluida la resolución de la estructura cristalina de un complejo anticuerpo-antígeno, ensayos de competencia, ensayos de expresión de fragmentos de genes y ensayos basados en péptidos sintéticos, como se describe, ejemplo, en el capítulo 11 de Harlow y Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1999. En un ejemplo adicional, el mapeo de epítopos se puede utilizar para determinar la secuencia a la que un anticuerpo antagonista anti-CGRP se une. El mapeo de epítopos está disponible comercialmente de diversas fuentes, por ejemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Países Bajos). El epítopo puede ser un epítopo lineal, es decir, contenido en un solo tramo de aminoácidos, o un epítopo conformacional formado por una interacción tridimensional de aminoácidos que puede no estar necesariamente contenido en un solo tramo. Pueden aislarse o sintetizarse péptidos de diferentes longitudes (p. ej., al menos 4-6 aminoácidos de longitud) (p. ej., de forma recombinante) y usarse para ensayos de unión con un anticuerpo antagonista anti-CGRP. En otro ejemplo, el epítopo al que se une el anticuerpo antagonista anti-CGRP se puede determinar en un cribado sistemático utilizando péptidos solapantes derivados de la secuencia CGRP y determinando la unión por el anticuerpo antagonista anti-CGRP. De acuerdo con los ensayos de expresión de fragmentos génicos, el marco de lectura abierto que codifica CGRP se fragmenta al azar o mediante construcciones genéticas específicas y se determina la reactividad de los fragmentos expresados de CGRP con el anticuerpo a ensayar. Los fragmentos de genes pueden, por ejemplo, producirse mediante PCR y luego transcribirse y traducirse en proteína in vitro, en presencia de aminoácidos radiactivos. A continuación, se determina la unión del anticuerpo a los fragmentos de CGRP marcados radiactivamente mediante inmunoprecipitación y electroforesis en gel. Ciertos epítopos también pueden identificarse usando grandes bibliotecas de secuencias de péptidos aleatorias presentadas en la superficie de las partículas de fagos (bibliotecas de fagos). Alternativamente, se puede probar una biblioteca definida de fragmentos de péptidos solapantes para determinar la unión al anticuerpo de prueba en ensayos de unión simples. En un ejemplo adicional, se pueden realizar mutagénesis de un dominio de unión a antígeno, experimentos de intercambio de dominios y mutagénesis de exploración de alanina para identificar los residuos requeridos, suficientes y/o necesarios para la unión del epítopo. Por ejemplo, se pueden realizar experimentos de intercambio de dominios usando un CGRP mutante en donde se han reemplazado (intercambiado) varios fragmentos del polipéptido CGRP con secuencias de una proteína estrechamente relacionada, pero antigénicamente distinta (como otro miembro de la familia de proteínas neurotrofinas). Al evaluar la unión del anticuerpo al CGRP mutante, se puede evaluar la importancia del fragmento de CGRP particular para la unión del anticuerpo.

[0195] Sin embargo, otro método que puede ser utilizado para caracterizar un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo antagonista anti-CGRP, es usar ensayos de competición con otros anticuerpos conocidos por unirse al mismo antígeno, es decir, diversos fragmentos sobre CGRP, para determinar si el anticuerpo antagonista anti-CGRP se une al mismo epítopo que otros anticuerpos. Los expertos en la técnica conocen bien los ensayos de competición.

[0196] Un vector de expresión puede usarse para dirigir la expresión de un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo antagonista anti-CGRP. Un experto en la técnica está familiarizado con la administración de vectores de expresión para obtener la expresión de una proteína exógena in vivo. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 6,436,908; 6,413,942; y 6,376,471. La administración de vectores de expresión incluye la administración local o sistémica, que incluye inyección, administración oral, pistola de partículas o administración por cateterismo y administración tópica. En otra realización, el vector de expresión se administra directamente al tronco o ganglio simpático, o en una arteria coronaria, aurícula, ventrículo o pericardio.

[0197] También se puede utilizar la administración dirigida de composiciones terapéuticas que contienen un vector de expresión, o polinucleótidos subgenómicos. Las técnicas de administración de ADN mediadas por receptores se describen en, por ejemplo, Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11: 202; Chiou y col., Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer (JA Wolff, ed.)(1994); Wu y col., J. Biol. Chem. (1988) 263: 621; Wu y col., J. Biol. Chem. (1994) 269: 542; Zenke y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1990) 87: 3655; Wu y col., J. Biol. Chem. (1991) 266: 338. Las composiciones terapéuticas que contienen un polinucleótido se administran en un intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 mg de ADN para la administración local en un protocolo de terapia génica. También se pueden usar rangos de concentración de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 50 mg, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 2 mg, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 500 mg y aproximadamente 20 mg a aproximadamente 100 mg de ADN durante un protocolo de terapia génica. Los polinucleótidos y polipéptidos terapéuticos se pueden administrar usando vehículos de administración de genes. El vehículo de administración de genes puede ser de origen viral o no viral (ver en general, Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5: 845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1: 185; y Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6: 148). La expresión de tales secuencias codificantes puede inducirse usando promotores endógenos de mamíferos o heterólogos. La expresión de la secuencia codificante puede ser constitutiva o regulada.

[0198] Los vectores basados en virus para la entrega de un polinucleótido deseado y la expresión en una célula deseada son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de vehículos basados en virus incluyen, pero no se limitan a retrovirus recombinantes (véanse, por ejemplo, los números de publicación PCT WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; Patentes de Estados Unidos Nos 5,219,740 y 4,777,127; Patente de GB N° 2,200,651; y Patente de EP N° 0 345242), basado en vectores de alfavirus (p. ej., vectores del virus Sindbis, virus del bosque Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus Ross River (ATCC v R- 373; ATCC VR-1246) y virus de la encefalitis equina venezolana (ATCC VR - 923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) y vectores de virus adenoasociados (AAV) (véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT Nos WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655). También se puede emplear la administración de ADN unido a adenovirus muerto como se describe en Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147.

[0199] Vehículos y métodos de entrega no víricos también se pueden emplear, incluyendo, pero no limitado a ADN condensado policatiónico unido o no a adenovirus muerto solo (véase, por ejemplo, Curiel, Hum Gene Ther (1992) 3:.

147); ADN unido por ligando (véase, por ejemplo, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985); células portadoras de células eucarióticas (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 5.814,482; las publicaciones PCT n° WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; y WO 97/42338) y neutralización de la carga nucleica o fusión con membranas celulares. También se puede emplear ADN desnudo. Los métodos de introducción de ADN desnudo ejemplares se describen en la publicación PCT n° WO 90/11092 y la patente estadounidense n° 5.580.859. Los liposomas que pueden actuar como vehículos de suministro de genes se describen en la Patente de Estados Unidos N° 5,422.120; Publicaciones PCT Nos WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; y EP 0524968. Se describen enfoques adicionales en Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14: 2411 y en Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581.

C. Anticuerpo G1 y anticuerpos, polipéptidos, polinucleótidos, vectores y células huésped relacionados.

[0200] Esta invención abarca composiciones, que incluyen composiciones farmacéuticas, que comprenden el anticuerpo G1 para su uso en la invención. Estas composiciones pueden comprender además excipientes adecuados, tales como excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyen tampones, que son bien conocidos en la técnica.

[0201] En algunas realizaciones, los anticuerpos antagonistas anti-CGRP usados en la invención se caracterizan por cualquier (una o más) de las siguientes características: (a) se unen a CGRP; (b) bloquear CGRP para que no se una a su receptor o receptores; (c) bloquear o disminuir la activación del receptor CGRP (incluida la activación del cAMP); (d) inhibir la actividad biológica de CGRP o las rutas posteriores mediadas por la función de señalización de CGRP; (e) prevenir, mejorar o tratar cualquier aspecto del dolor de cabeza postraumático; (f) aumentar el aclaramiento de CGRP; e (g) inhibir (reducir) la síntesis, producción o liberación de CGRP.

[0202] En algunas realizaciones, la invención utiliza cualquiera de los siguientes, o composiciones farmacéuticas (incluidas las composiciones) que comprenden cualquiera de los siguientes: (a) anticuerpo G1; (b) un fragmento o una región del anticuerpo G1; (c) una cadena ligera del anticuerpo G1; (d) una cadena pesada del anticuerpo G1; (e) una o más regiones variables de una cadena ligera y/o una cadena pesada del anticuerpo G1; (f) seis CDR del anticuerpo G1; (k) tres CDR de la cadena ligera y tres CDR de la cadena pesada, del anticuerpo G1.

[0203] Las porciones de CDR de anticuerpo G1 (incluyendo Chothia y Kabat CDRs) se representan esquemáticamente en la Figura 5. La determinación de regiones CDR está dentro de la experiencia de la técnica. Se entiende que en algunas realizaciones, las CDR pueden ser una combinación de las CDR de Kabat y Chothia (también denominadas "CDR combinadas" o "CDR extendidas"). En algunas realizaciones, las CDR son las CDR de Kabat. En otras realizaciones, las CDR son las CDR de Chothia. En otras palabras, en realizaciones con más de una CDR, las CDR pueden ser cualquiera de Kabat, Chothia, CDR de combinación o combinaciones de las mismas.

[0204] En el presente documento se describe un polipéptido (que puede ser o no un anticuerpo) que comprende al menos una CDR, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro, al menos cinco o las seis CDR que son sustancialmente idénticas a al menos una CDR, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o las seis CDR de G1 o sus variantes mostradas en la Tabla 6. También se describen anticuerpos que tienen al menos dos, tres, cuatro, cinco, o seis CDR(s) que son sustancialmente idénticas a al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de G1 o derivadas de G1. Las al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR(s) son al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de G1 o sus variantes que se muestran en la Tabla 6. Se entiende que la especificidad de unión y/o la actividad general generalmente se retiene, aunque el grado de actividad puede variar en comparación con G1 o sus variantes que se muestran en la Tabla 6 (puede ser mayor o menor).

[0205] También se describe aquí un polipéptido (que puede o no ser un anticuerpo) que comprende un aminoácido de secuencia de G1 o sus variantes se muestra en la Tabla 6 que tiene cualquiera de las siguientes: al menos 5 aminoácidos contiguos, al menos 8 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 25 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de una secuencia de G1 o sus variantes que se muestran en la Tabla 6, en las que al menos 3 de los aminoácidos son de una región variable de G1 (Figura 5) o sus variantes que se muestran en la Tabla 6. Un polipéptido ejemplar tiene aminoácidos contiguos (longitudes descritas anteriormente) tanto de las regiones variables de cadena pesada como ligera de G1.

[0206] La a f in id a d d e u n ió n (Kd) d e un a n t ic u e rp o a n ta g o n is ta a n t i-C G R P y e l p o lip é p tid o d e C G R P ( ta le s c o m o a -h u m a n o C G R P ) p u e d e s e r d e a p ro x im a d a m e n te 0 ,06 a a p ro x im a d a m e n te 200 n M . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la a f in id a d d e u n ió n e s c u a lq u ie ra d e a p ro x im a d a m e n te 200 n M , 100 n M , a p ro x im a d a m e n te 50 n M , a p ro x im a d a m e n te 10 n M , a p ro x im a d a m e n te 1 n M , a p ro x im a d a m e n te 500 p M , a p ro x im a d a m e n te 100 p M , a p ro x im a d a m e n te 60 p M , a p ro x im a d a m e n te 50 p M , a p ro x im a d a m e n te 20 pM , a p ro x im a d a m e n te 15 p M , a p ro x im a d a m e n te 10 pM , a p ro x im a d a m e n te 5 pM o a p ro x im a d a m e n te 2 p M . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la a fin id a d d e u n ió n e s m e n o r q u e c u a lq u ie ra d e a p ro x im a d a m e n te 250 n M , a p ro x im a d a m e n te 200 n M , a p ro x im a d a m e n te 100 n M , a p ro x im a d a m e n te 50 n M , a p ro x im a d a m e n te 10 n M , a p ro x im a d a m e n te 1 n M , a p ro x im a d a m e n te 500 p M , a p ro x im a d a m e n te 100 p M o a p ro x im a d a m e n te 50 pM .

[0207] S e d e s c r ib e n e n e s te d o c u m e n to m é to d o s p a ra p re p a ra r c u a lq u ie ra d e e s to s a n t ic u e rp o s o p o lip é p t id o s . L o s a n t ic u e rp o s u til iz a d o s en e s te d o c u m e n to p u e d e n p re p a ra rs e m e d ia n te p ro c e d im ie n to s c o n o c id o s en la té c n ic a . L o s p o lip é p tid o s s e p u e d e n p ro d u c ir m e d ia n te d e g ra d a c ió n p ro te o lít ic a o d e o tro t ip o d e lo s a n tic u e rp o s , m e d ia n te m é to d o s re c o m b in a n te s (e s d e c ir, p o lip é p t id o s ú n ic o s o d e fu s ió n ) c o m o se d e s c r ib e a n te r io rm e n te o m e d ia n te s ín te s is q u ím ic a . L o s p o lip é p t id o s d e lo s a n tic u e rp o s , e s p e c ia lm e n te lo s p o lip é p t id o s m á s c o r to s d e h a s ta a p ro x im a d a m e n te 50 a m in o á c id o s , se p re p a ra n c o n v e n ie n te m e n te m e d ia n te s ín te s is q u ím ic a . L o s m é to d o s d e s ín te s is q u ím ic a so n c o n o c id o s e n la té c n ic a y e s tá n d is p o n ib le s c o m e rc ia lm e n te . P o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o p o d r ía p ro d u c irs e m e d ia n te un s in te t iz a d o r d e p o lip é p t id o s a u to m á tic o e m p le a n d o e l m é to d o d e fa s e s ó lid a . V é a n s e ta m b ié n la s P a te n te s d e E E .U U . N os 5 ,807 ,715 ; 4 ,816 ,567 ; y 6 ,331 ,415.

[0208] E n o tra a lte rn a t iv a , lo s a n tic u e rp o s s e p u e d e n p re p a ra r d e fo rm a re c o m b in a n te u s a n d o p ro c e d im ie n to s q u e s o n b ie n c o n o c id o s e n la té c n ic a . E n u n a re a liz a c ió n , un p o lin u c le ó t id o c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia q u e c o d if ic a la s re g io n e s v a r ia b le s d e c a d e n a p e s a d a y /o c a d e n a lig e ra d e l a n t ic u e rp o G 1 m o s tra d a s e n S E Q ID N O : 9 y S E Q ID N O : 10. E n o tra re a liz a c ió n , e l p o lin u c le ó t id o q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e n u c le ó t id o s m o s tra d a en S E Q ID N O : 9 y S E Q ID N O : 10 se c lo n a n en u n o o m á s v e c to re s p a ra e x p re s ió n o p ro p a g a c ió n . La s e c u e n c ia q u e c o d if ic a el a n t ic u e rp o d e in te ré s p u e d e m a n te n e rs e en un v e c to r en u n a c é lu la h u é s p e d y la c é lu la h u é s p e d p u e d e lu e g o e x p a n d irs e y c o n g e la rs e p a ra u s o fu tu ro . L o s v e c to re s ( in c lu id o s lo s v e c to re s d e e x p re s ió n ) y la s c é lu la s h u é s p e d s e d e s c r ib e n co n m á s d e ta lle e n e l p re s e n te d o c u m e n to .

[0209] En a lg u n a s re a liz a c io n e s , la in v e n c ió n ta m b ié n u t iliz a f ra g m e n to s d e re g ió n v a r ia b le d e c a d e n a ú n ic a ( "s c F v " ) d e a n t ic u e rp o s , ta le s c o m o G 1. L o s f ra g m e n to s d e re g ió n v a r ia b le d e c a d e n a s e n c il la s e p re p a ra n u n ie n d o re g io n e s v a r ia b le s d e c a d e n a lig e ra y /o p e s a d a m e d ia n te e l u s o d e un p é p tid o d e u n ió n c o rta . B ird y c o l. (1988 ) S c ie n c e 242 : 42 3 -426. U n e je m p lo d e un p é p tid o d e e n la c e e s (G G G G S )3 (S E Q ID N O : 57 ) q u e fo rm a un p u e n te de a p ro x im a d a m e n te 3 ,5 n m e n tre el té rm in o c a rb o x i d e u n a re g ió n v a r ia b le y e l té rm in o a m in o d e la o tra re g ió n v a r ia b le . S e h a n d is e ñ a d o y u t i l iz a d o e n la z a d o re s d e o tra s s e c u e n c ia s . B ird y co l. (1988 ) . A s u v e z , lo s e n la z a d o re s p u e d e n m o d if ic a rs e p a ra fu n c io n e s a d ic io n a le s , c o m o la u n ió n d e m e d ic a m e n to s o la u n ió n a s o p o r te s s ó lid o s . L a s v a r ia n te s d e c a d e n a s e n c il la se p u e d e n p ro d u c ir d e fo rm a re c o m b in a n te o s in té tic a . P a ra la p ro d u c c ió n s in té t ic a d e s c F v , se p u e d e u t i l iz a r un s in te t iz a d o r a u to m á tic o . P a ra la p ro d u c c ió n re c o m b in a n te d e s c F v , s e p u e d e in t ro d u c ir un p lá s m id o a d e c u a d o q u e c o n te n g a p o lin u c le ó t id o q u e c o d if iq u e e l s c F v e n u n a c é lu la h u é s p e d a d e c u a d a , y a s e a e u c a r io ta , c o m o ^{c é lu la s d e le v a d u ra , p la n ta s , in s e c to s o m a m ífe ro s , o p ro c a r io ta s , c o m o} E. coli. ^{L o s p o lin u c le ó t id o s q u e c o d if ic a n el}s c F v d e in te ré s s e p u e d e n p re p a ra r m e d ia n te m a n ip u la c io n e s ru t in a r ia s ta le s c o m o lig a c ió n d e p o lin u c le ó tid o s . E l s c F v re s u lta n te p u e d e a is la rs e u s a n d o té c n ic a s e s tá n d a r d e p u r if ic a c ió n d e p ro te ín a s c o n o c id a s en la té c n ic a .

[0210] T a m b ié n s e in c lu y e n o tra s fo rm a s d e a n t ic u e rp o s d e c a d e n a s e n c il la , ta le s c o m o d ia c u e rp o s . L o s d ia c u e rp o s s o n a n t ic u e rp o s b iv a le n te s , b ie s p e c íf ic o s en lo s q u e lo s d o m in io s V H y V L se e x p re s a n en u n a s o la c a d e n a p o lip e p t íd ic a , p e ro q u e u tiliz a n un e n la z a d o r q u e e s d e m a s ia d o c o r to p a ra p e rm it ir e l e m p a re ja m ie n to e n tre lo s d o s d o m in io s e n la m is m a c a d e n a , lo q u e o b lig a a lo s d o m in io s a e m p a re ja rs e c o n d o m in io s c o m p le m e n ta r io s . d e o tra c a d e n a y c re a n d o d o s s it io s d e u n ió n a l a n t íg e n o (v é a s e , p o r e je m p lo , H o llig e r , P., e t al. (1993 ) P ro c . N a tl. A c a d S c i. E E .U U . 90 : 6444 -6448 ; P o lja k , R J, e t a l. (1994 ) S tru c tu re 2: 1121 -1123 ).

[0211] P o r e je m p lo , lo s a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s , lo s a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s q u e t ie n e n e s p e c if ic id a d e s d e u n ió n p a ra a l m e n o s d o s d ife re n te s a n t íg e n o s , s e p u e d e n p re p a ra r u s a n d o lo s a n t ic u e rp o s d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to . L o s m é to d o s p a ra p re p a ra r a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s se c o n o c e n en la té c n ic a (v é a s e , p o r e je m p lo , S u re s h e t a l., 1986 , M e th o d s in E n z y m o lo g y 121 : 210 ). T ra d ic io n a lm e n te , la p ro d u c c ió n re c o m b in a n te d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s se b a s a b a en la c o e x p re s ió n d e d o s p a re s d e c a d e n a p e s a d a -c a d e n a lig e ra d e in m u n o g lo b u lin a , te n ie n d o la s d o s c a d e n a s p e s a d a s d ife re n te s e s p e c if ic id a d e s (M ills te in y C u e llo , 1983 , N a tu re 305 , 537 -539 ).

[0212] D e a c u e rd o c o n un e n fo q u e p a ra p re p a ra r a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s , lo s d o m in io s v a r ia b le s d e a n tic u e rp o s co n la s e s p e c if ic id a d e s d e u n ió n d e s e a d a s (s it io s d e c o m b in a c ió n a n t ic u e rp o -a n t íg e n o ) se fu s io n a n a s e c u e n c ia s d e d o m in io c o n s ta n te d e in m u n o g lo b u lin a . L a fu s ió n p re fe r ib le m e n te e s c o n un d o m in io c o n s ta n te d e c a d e n a p e s a d a d e in m u n o g lo b u lin a , q u e c o m p re n d e a l m e n o s p a rte d e la b is a g ra , re g io n e s C H 2 y C H 3. S e p re fie re te n e r la p r im e ra re g ió n c o n s ta n te d e c a d e n a p e s a d a (C H 1 ), q u e c o n t ie n e e l s it io n e c e s a r io p a ra la u n ió n d e c a d e n a lig e ra , p re s e n te en a l m e n o s u n a d e la s fu s io n e s . L o s A D N q u e c o d if ic a n la s fu s io n e s d e la c a d e n a p e s a d a d e in m u n o g lo b u lin a y, si se d e s e a , la c a d e n a lig e ra d e in m u n o g lo b u lin a , s e in s e r ta n en v e c to re s d e e x p re s ió n s e p a ra d o s y se c o tra n s fe c ta n e n un o rg a n is m o h u é s p e d a d e c u a d o . E s to p ro p o rc io n a u n a g ra n fle x ib il id a d p a ra a ju s ta r la s p ro p o rc io n e s m u tu a s d e lo s tre s fragmentos polipeptídicos en las realizaciones cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no tienen un significado particular.

[0213] En un enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda unión de especificidad) en el otro brazo. Esta estructura asimétrica, con una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo la mitad de la molécula biespecífica, facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas. Este enfoque se describe en la Publicación PCT N° WO 94/04690, publicada el 3 de marzo de 1994.

[0214] Los anticuerpos heteroconjugados, que comprenden dos anticuerpos unidos covalentemente, se pueden utilizar en la invención. Dichos anticuerpos se han utilizado para dirigir células del sistema inmunológico a células no deseadas (patente de EE.UU. n° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (publicaciones de solicitud PCT n° WO 91/00360 y WO 92/200373; EP 03089). Pueden prepararse anticuerpos heteroconjugados usando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes y técnicas de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica, y se describen en la patente de EE.UU. n° 4.676.980.

[0215] Los anticuerpos quiméricos o híbridos se pueden preparar también in vitro mediante el uso de métodos conocidos de química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metilo-4-mercaptobutirimidato.

[0216] El anticuerpo humanizado que comprende una o más CDR del anticuerpo G1 o sus variantes mostradas en la Tabla 6, o una o más CDR derivadas del anticuerpo G1 o sus variantes mostradas en la Tabla 6 pueden prepararse usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar cuatro pasos generales para humanizar un anticuerpo monoclonal.

[0217] En algunas realizaciones, la invención abarca modificaciones a anticuerpo G1, incluyendo los anticuerpos funcionalmente equivalentes que no afectan de manera significativa sus propiedades y variantes que han mejorado o disminuido la actividad y/o afinidad. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo G1 se puede mutar para obtener un anticuerpo con la afinidad de unión deseada a CGRP. La modificación de polipéptidos es una práctica rutinaria en la técnica y no es necesario que se describa en detalle en el presente documento. La modificación de polipéptidos se ejemplifica en los Ejemplos. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos, una o más deleciones o adiciones de aminoácidos que no cambian significativamente de forma perjudicial la actividad funcional, o el uso de análogos químicos.

[0218] Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a una etiqueta de epítopo. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión con el extremo N o C del anticuerpo de una enzima o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo.

[0219] Las variantes de sustitución tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo eliminado y un diferente residuo insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan las alteraciones de FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el título de "sustituciones conservadoras". Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe adicionalmente a continuación en referencia a clases de aminoácidos, y se pueden seleccionar los productos.

Tabla 1: Sustituciones de aminoácidos

_________

(Continuación)

[0220] Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se realizan seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura del respaldo de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una hoja o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) No polares: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) Polares sin cargo: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) Ácido (cargado negativamente): Asp, Glu;

(4) Básico (cargado positivamente): Lys, Arg;

(5) Residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y

(6) Aromático: Trp, Tyr, Phe, His.

[0221] Las sustituciones no conservadoras son hechas por intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

[0222] Cualquier residuo de cisteína que no participe en el mantenimiento de la conformación adecuada del anticuerpo también puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación aberrante. Por el contrario, se pueden añadir enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad, particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, como un fragmento Fv.

[0223] Modificaciones de aminoácidos pueden variar desde cambiar o modificar uno o más aminoácidos a rediseño completo de una región, tal como la región variable. Los cambios en la región variable pueden alterar la afinidad y/o especificidad de unión.

[0224] Las modificaciones también incluyen polipéptidos glicosilados y no glicosilados, así como polipéptidos con otras modificaciones post-traduccionales, tales como, por ejemplo, la glicosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación. Los anticuerpos se glicosilan en posiciones conservadas en sus regiones constantes (Jefferis y Lund, 1997, Chem. Immunol. 65: 111-128; Wright y Morrison, 1997, TibTECH 15: 26-32). Las cadenas laterales de oligosacáridos de las inmunoglobulinas afectan la función de la proteína (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe y Howard, 1990, Biochem. 29: 4175-4180) y la interacción intramolecular entre porciones de la glicoproteína, que puede afectar la conformación y presentaba una superficie tridimensional de la glicoproteína (Hefferis y Lund, supra; Wyss y Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7: 409-416). Los oligosacáridos también pueden servir para dirigir una glicoproteína determinada a ciertas moléculas basándose en estructuras de reconocimiento específicas. También se ha informado que la glicosilación de anticuerpos afecta la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En particular, se informó que las células CHO con expresión regulada por tetraciclina de p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una glicosiltransferasa que cataliza la formación de GIcNAc bisectante, tienen una actividad ADCC mejorada (Umana et al., 1999, Mature Biotech. 17: 176-180).

[0225] La glicosilación de anticuerpos está típicamente unida a N o a O. Ligado a N se refiere a la unión del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina y asparagina-X-cisteína, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

[0226] La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación unidos a N). La alteración también se puede realizar mediante la adición o sustitución de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glicosilación ligados a O).

[0227] El patrón de glicosilación de anticuerpos también se puede alterar sin alterar la secuencia de nucleótidos subyacente. La glicosilación depende en gran medida de la célula huésped utilizada para expresar el anticuerpo. Dado que el tipo de célula utilizado para la expresión de glicoproteínas recombinantes, por ejemplo, anticuerpos, como potencial terapéutico rara vez es la célula nativa, se pueden esperar variaciones en el patrón de glicosilación de los anticuerpos (véase, por ejemplo, Hse et al., 1997, J. Biol Chem. 272: 9062-9070).

[0228] Además de la elección de las células huésped, los factores que afectan a la glicosilación durante la producción recombinante de anticuerpos incluyen el modo de crecimiento, la formulación del medio, la densidad del cultivo, la oxigenación, el pH, los esquemas de purificación y similares. Se han propuesto varios métodos para alterar el patrón de glicosilación logrado en un organismo huésped particular, incluida la introducción o sobreexpresión de ciertas enzimas involucradas en la producción de oligosacáridos (Patentes de Estados Unidos Nos 5,047,335; 5,510,261 y 5,278,299). La glicosilación, o ciertos tipos de glicosilación, se pueden eliminar enzimáticamente de la glicoproteína, por ejemplo, usando endoglicosidasa H (Endo H), N-glicosidasa F, endoglicosidasa F1, endoglicosidasa F2, endoglicosidasa F3. Además, la célula huésped recombinante puede modificarse por ingeniería genética para que sea defectuosa en el procesamiento de ciertos tipos de polisacáridos. Estas y otras técnicas similares son bien conocidas en la técnica.

[0229] Otros métodos de modificación incluyen el uso de técnicas de acoplamiento conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a medios enzimáticos, sustitución oxidativa y quelación. Se pueden usar modificaciones, por ejemplo, para la unión de etiquetas para inmunoensayo. Los polipéptidos G1 modificados se pueden preparar usando procedimientos establecidos en la técnica y se pueden cribar usando ensayos estándar conocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen a continuación y en los Ejemplos.

[0230] En algunas realizaciones de la invención, el anticuerpo comprende una región constante modificada, tal como una región constante que es inmunológicamente inerte o parcialmente inerte, por ejemplo, no activa lisis mediada por complemento, no estimula la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), o no activa la microglía; o tienen actividades reducidas (en comparación con el anticuerpo no modificado) en uno o más de los siguientes: desencadenamiento de lisis mediada por complemento, estimulación de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o activación de microglia. Pueden usarse diferentes modificaciones de la región constante para lograr un nivel óptimo y/o una combinación de funciones efectoras. Véase, por ejemplo, Morgan et al., Immunology 86: 319-324 (1995); Lund y col., J. Immunology 157: 4963-9 157: 4963-4969 (1996); Idusogie y col., J. Immunology 164: 4178-4184 (2000); Tao y col., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); y Jefferis y col., Immunological Reviews 163: 59-76 (1998). En algunas realizaciones, la región constante se modifica como se describe en Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624; Solicitud PCT n° PCT/GB99/01441; y/o la Solicitud de Patente del Reino Unido N° 9809951.8. En otras realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de IgG2 de cadena pesada humana que comprende las siguientes mutaciones: A330P331 a S330S331 (numeración de aminoácidos con referencia a la secuencia de IgG2 de tipo silvestre). EUR. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624. En otras realizaciones más, la región constante se aglicosila para la glicosilación ligada a N. En algunas realizaciones, la región constante se aglicosila para la glicosilación ligada a N mutando el residuo de aminoácido glicosilado o los residuos flanqueantes que forman parte de la secuencia de reconocimiento de N-glicosilación en la región constante. Por ejemplo, el sitio de N-glicosilación N297 se puede mutar en A, Q, K o H. Véase, Tao y col., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); y Jefferis y col., Immunological Reviews 163: 59-76 (1998). En algunas realizaciones, la región constante se aglicosila para la glicosilación ligada a N. La región constante se puede aglicosilar para la glicosilación ligada a N enzimáticamente (tal como la eliminación de carbohidratos mediante la enzima PNGasa) o mediante expresión en una célula huésped deficiente en glicosilación.

[0231] Otras modificaciones de anticuerpos incluyen anticuerpos que han sido modificados tal como se describe en la Publicación PCT N° WO 99/58572, publicada el 18 de noviembre de 1999. Estos anticuerpos comprenden, además de un dominio de unión dirigido a la molécula diana, un dominio efector que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga a todo o parte de un dominio constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana. Estos anticuerpos son capaces de unirse a la molécula diana sin desencadenar una lisis dependiente del complemento significativa o la destrucción de la diana mediada por células. En algunas realizaciones, el dominio efector es capaz de unirse específicamente a FcRn y/o FcYRIIb. Estos se basan típicamente en dominios quiméricos derivados de dos o más dominios CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos modificados de esta manera son particularmente adecuados para su uso en terapia de anticuerpos crónica, para evitar reacciones inflamatorias y otras reacciones adversas a la terapia de anticuerpos convencional.

[0232] En algunas realizaciones, las realizaciones de afinidad madurada se utilizan en la invención. Por ejemplo, los anticuerpos madurados por afinidad se pueden producir mediante procedimientos conocidos en la técnica (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10: 779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, EE. UU. 91: 3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169: 147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154 (7): 3310-9; Hawkins y col., 1992, J. Mol. Biol., 226: 889-896; y WO2004/058184).

[0233] Los siguientes métodos se pueden utilizar para el ajuste de la afinidad de un anticuerpo y para la caracterización de una CDR. Una forma de caracterizar una CDR de un anticuerpo y/o alterar (como mejorar) la afinidad de unión de un polipéptido, tal como un anticuerpo, se denomina "mutagénesis de exploración de bibliotecas". Generalmente, la mutagénesis de exploración de bibliotecas funciona de la siguiente manera. Una o más posiciones de aminoácidos en la CDR se reemplazan con dos o más (como 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) aminoácidos utilizando métodos reconocidos en la técnica. Esto genera pequeñas bibliotecas de clones (en algunas realizaciones, una por cada posición de aminoácido que se analiza), cada una con una complejidad de dos o más miembros (si se sustituyen dos o más aminoácidos en cada posición). Generalmente, la biblioteca también incluye un clon que comprende el aminoácido nativo (no sustituido). Un pequeño número de clones, p. ej., aproximadamente 20-80 clones (dependiendo de la complejidad de la biblioteca), de cada biblioteca se seleccionan para determinar la afinidad de unión al polipéptido diana (u otra diana de unión), y los candidatos con un aumento del mismo, se identifica una unión disminuida o nula. Los métodos para determinar la afinidad de unión son bien conocidos en la técnica. La afinidad de unión se puede determinar usando análisis de resonancia de plasmón de superficie Biacore, que detecta diferencias en la afinidad de unión de aproximadamente 2 veces o más. Biacore es particularmente útil cuando el anticuerpo de partida ya se une con una afinidad relativamente alta, por ejemplo, una Kd de aproximadamente 10 nM o menos. El cribado usando resonancia de plasmón superficial Biacore se describe en los Ejemplos, en este documento.

[0234] La afinidad de unión puede determinarse usando KinExA Biocensor, ensayos de proximidad de centelleo, ELISA, ORIGEN inmunoensayo (IGEN), extinción de la fluorescencia, la transferencia de fluorescencia, y visualización de la levadura. La afinidad de unión también se puede cribar usando un bioensayo adecuado.

[0235] En algunas realizaciones, se sustituye cada posición de aminoácido en un CDR (en algunas realizaciones, uno a la vez) con los 20 aminoácidos naturales usando métodos de mutagénesis reconocidos en la técnica (algunos de los cuales se describen en este documento). Este documento genera pequeñas bibliotecas de clones (en algunas realizaciones, una por cada posición de aminoácido que se analiza), cada una con una complejidad de 20 miembros (si todos los 20 los aminoácidos se sustituyen en cada posición).

[0236] En algunas formas de realización, la biblioteca a ser proyectada comprende sustituciones en dos o más posiciones, que pueden estar en la misma CDR o en dos o más CDR. Por tanto, la biblioteca puede comprender sustituciones en dos o más posiciones en una CDR. La biblioteca puede comprender la sustitución en dos o más posiciones en dos o más CDR. La biblioteca puede comprender sustitución en 3,4, 5 o más posiciones, encontrando dichas posiciones en dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR. La sustitución se puede preparar utilizando codones de baja redundancia. Véase, por ejemplo, la Tabla 2 de Balint et al., (1993) Gene 137 (1): 109-18).

[0237] Los candidatos con unión mejorada pueden ser secuenciados, identificando con ello un mutante de sustitución CDR que resulta en la mejora de afinidad (también denominada una sustitución "mejorada"). Los candidatos que se unen también pueden secuenciarse, identificando así una sustitución de CDR que retiene la unión.

[0238] Se pueden realizar múltiples rondas de cribado. Por ejemplo, los candidatos (cada uno con una sustitución de aminoácidos en una o más posiciones de una o más CDR) con unión mejorada también son útiles para el diseño de una segunda biblioteca que contiene al menos el aminoácido original y sustituido en cada posición CDR mejorada (es decir, posición de aminoácido en la CDR en donde un mutante de sustitución mostró una unión mejorada). La preparación y el cribado o selección de esta biblioteca se comentan más adelante.

[0239] La mutagénesis de exploración de bibliotecas también proporciona un medio para caracterizar una CDR, en la medida en que la frecuencia de clones con unión mejorada, la misma unión, unión disminuida o sin unión también proporciona información relacionada con la importancia de cada posición de aminoácido para la estabilidad del complejo anticuerpo-antígeno. Por ejemplo, si una posición de la c Dr conserva la unión cuando se cambia a los 20 aminoácidos, esa posición se identifica como una posición que es poco probable que se requiera para la unión del antígeno. Por el contrario, si una posición de CDR conserva la unión en sólo un pequeño porcentaje de sustituciones, esa posición se identifica como una posición que es importante para la función de CDR. Por lo tanto, los métodos de mutagénesis de escaneo de bibliotecas generan información con respecto a las posiciones en las CDR que se pueden cambiar a muchos aminoácidos diferentes (incluidos los 20 aminoácidos), y las posiciones en las c Dr que no se pueden cambiar o que solo se pueden cambiar a unos pocos aminoácidos.

[0240] Los candidatos con afinidad mejorada se pueden combinar en una segunda biblioteca, que incluye el aminoácido mejorado, el aminoácido original en esa posición, y puede incluir además sustituciones adicionales en esa posición, dependiendo de la complejidad de la biblioteca que se desee, o se permite mediante el método de cribado o selección deseado. Además, si se desea, la posición de los aminoácidos adyacentes se puede aleatorizar a al menos dos o más aminoácidos. La aleatorización de aminoácidos adyacentes puede permitir una flexibilidad conformacional adicional en la CDR mutante, que a su vez puede permitir o facilitar la introducción de un mayor número de mutaciones de mejora. La biblioteca también puede comprender sustitución en posiciones que no mostraron una afinidad mejorada en la primera ronda de selección.

[0241] La segunda biblioteca se criba o selecciona para miembros de la biblioteca con afinidad de unión mejorada y/o alterada utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluido el cribado utilizando análisis de resonancia de plasmón superficial Biacore, y la selección utilizando cualquier método conocido en la técnica para la selección. incluyendo visualización de fagos, visualización de levaduras y visualización de ribosomas.

[0242] En algunas realizaciones, la invención también abarca proteínas de fusión que comprenden uno o más fragmentos o regiones de anticuerpos (tales como G1) o polipéptidos. En una realización, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de la región de cadena ligera variable mostrada en SEQ ID NO: 2 (Figura 5) y/o al menos 10 aminoácidos de la región de cadena pesada variable mostrada en SEQ ID NO:1 (Figura 5). En otras realizaciones, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25 o al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de la región de cadena ligera variable mostrada en SEQ ID NO: 2 (Figura 5) y/o al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, o al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de la región de cadena pesada variable mostrada en SEQ ID NO:1 (Figura 5). En otra realización, el polipéptido de fusión comprende una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada de G1, como se muestra en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO:1 de la Figura 5. Para los propósitos de esta invención, una proteína de fusión G1 contiene uno o más anticuerpos G1 y otra secuencia de aminoácidos a la que no está unida en la molécula nativa, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homóloga de otra región. Las secuencias heterólogas ejemplares incluyen, pero no se limitan a una "etiqueta" tal como una etiqueta FLAG o una etiqueta 6His (SEQ ID NO: 56). Las etiquetas son bien conocidas en la técnica.

[0243] Un polipéptido de fusión G1 puede ser creado por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, sintética o recombinantemente. Típicamente, las proteínas de fusión G1 de esta invención se preparan preparando y expresando un polinucleótido que las codifica usando métodos recombinantes descritos en el presente documento, aunque también pueden prepararse por otros medios conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, síntesis química.

[0244] En algunos aspectos, se utilizan composiciones que comprenden anticuerpos derivados de G1 conjugados (p. ej., unidos) a un agente que facilitan el acoplamiento a un soporte sólido (como biotina o avidina). Por simplicidad, se hará referencia en general a G1 o anticuerpos con el entendimiento de que estos métodos se aplican a cualquiera de las realizaciones de unión de CGRP descritas en este documento. La conjugación generalmente se refiere a unir estos componentes como se describe en este documento. La unión (que generalmente fija estos componentes en asociación próxima al menos para la administración) se puede lograr de varias formas. Por ejemplo, es posible una reacción directa entre un agente y un anticuerpo cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleófilo, como un grupo amino o sulfhidrilo, puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contiene carbonilo, como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contiene un buen grupo saliente (p. ej., un haluro) en el otro.

[0245] Un anticuerpo o polipéptido se puede unir a un agente de marcaje (denominado alternativamente "marcador") tal como una molécula fluorescente, una molécula radiactiva o cualquier otro marcador conocido en la técnica. Se conocen en la técnica etiquetas que generalmente proporcionan (directa o indirectamente) una señal.

[0246] En el presente documento se describen polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos y polipéptidos (incluido un anticuerpo que comprende las secuencias polipeptídicas de las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada mostradas en la Figura 5), y vectores y células huésped que comprenden el polinucleótido.

[0247] También se describen polinucleótidos complementarios a cualquiera de tales secuencias. Los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de ARNhn, que contienen intrones y corresponden a una molécula de ADN de manera uno a uno, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Pueden estar presentes secuencias codificantes o no codificantes adicionales dentro de un polinucleótido de la presente invención, pero no es necesario, y un polinucleótido puede, pero no es necesario, estar unido a otras moléculas y/o materiales de soporte.

[0248] Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un anticuerpo o una parte del mismo) o pueden comprender una variante de dicha secuencia. Las variantes de polinucleótidos contienen una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones de manera que la inmunorreactividad del polipéptido codificado no disminuye, con respecto a una molécula inmunorreactiva nativa. El efecto sobre la inmunorreactividad del polipéptido codificado puede evaluarse generalmente como se describe en el presente documento. Las variantes exhiben preferiblemente al menos aproximadamente un 70% de identidad, más preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de identidad y lo más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de identidad con una secuencia de polinucleótidos que codifica un anticuerpo nativo o una porción del mismo.

[0249] Se dice que dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para una correspondencia máxima como se describe a continuación. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan típicamente comparando las secuencias en una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", como se usa en este documento, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, generalmente de 30 a aproximadamente 75, de 40 a aproximadamente 50, en donde una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén alineadas de manera óptima.

[0250] La alineación óptima de secuencias para la comparación puede realizarse utilizando el programa Megalign en el Lasergene conjunto de software de bioinformática (DNASTAR, Inc., Madison, WI), utilizando parámetros por defecto. Este programa incorpora varios esquemas de alineación descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, MO (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, MO (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC vol. 5, Supl. 3, págs. 345 358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes págs. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, DG y Sharp, PM, 1989, CABIOS 5: 151-153; Myers, EW y Muller W., 1988, CABIOS 4: 11-17; Robinson, ED, 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4: 406 425; Sneath, PHA y Sokal, RR, 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, WJ y Lipman, DJ, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 80: 726-730.

[0251] Preferiblemente, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, donde la porción de la secuencia de polinucleótido o polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos, normalmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparecen bases de ácido nucleico o residuos de aminoácidos idénticos en ambas secuencias para obtener el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicar los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

[0252] Las variantes también pueden, o alternativamente, ser sustancialmente homólogas a un gen nativo, o una porción o complemento del mismo. Tales variantes de polinucleótidos son capaces de hibridar en condiciones moderadamente estrictas con una secuencia de ADN de origen natural que codifica un anticuerpo nativo (o una secuencia complementaria).

[0253] "Condiciones moderadamente rigurosas" adecuadas incluyen prelavado en una solución de 5 X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hibridar a 50°C-65°C, 5 X SSC, durante la noche; seguido de lavado dos veces a 65°C durante 20 minutos con SSC 2X, 0,5X y 0,2X que contienen SDS al 0,1%.

[0254] Como se usa en el presente documento, "condiciones altamente rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad" son aquellas que: (1) emplean baja resistencia iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo citrato de sodio 0,0015 M/cloruro de sodio 0,015 M/sodio dodecil sulfato al0,1% a 50°C; (2) emplear durante la hibridación un agente desnaturalizante, como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) emplee formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 mg/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42°C, con lavados a 42°C en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55°C, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55°C. El experto en la materia reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. según sea necesario para adaptarse a factores como la longitud de la sonda y similares.

[0255] Los expertos en la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como se describe en el presente documento. Algunos de estos polinucleótidos tienen una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, los polinucleótidos que varían debido a las diferencias en el uso de codones se contemplan específicamente en la presente invención. Además, los alelos de los genes que comprenden las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en este documento se describen en este documento. Los alelos son genes endógenos que se alteran como resultado de una o más mutaciones, como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes pueden, pero no es necesario, tener una estructura o función alterada. Los alelos pueden identificarse usando técnicas estándar (tales como hibridación, amplificación y/o comparación de secuencias de bases de datos).

[0256] Los polinucleótidos se pueden obtener usando síntesis química, métodos recombinantes o PCR. Los métodos d e s ín te s is q u ím ic a d e p o lin u c le ó t id o s s o n b ie n c o n o c id o s e n la té c n ic a y n o e s n e c e s a r io d e s c r ib ir lo s e n d e ta lle e n el p re s e n te d o c u m e n to . U n e x p e rto en la té c n ic a p u e d e u s a r la s s e c u e n c ia s p ro p o rc io n a d a s en e s te d o c u m e n to y un s in te t iz a d o r d e A D N c o m e rc ia l p a ra p ro d u c ir u n a s e c u e n c ia d e A D N d e s e a d a .

[0257] P a ra la p re p a ra c ió n d e p o lin u c le ó t id o s u t i l iz a n d o m é to d o s re c o m b in a n te s , un p o lin u c le ó t id o q u e c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e s e a d a p u e d e in s e rta rs e en un v e c to r a d e c u a d o , y el v e c to r a su v e z p u e d e s e r in tro d u c id o en u n a c é lu la h u é s p e d a d e c u a d a p a ra la re p lic a c ió n y la a m p lif ic a c ió n , c o m o s e d is c u te a d ic io n a lm e n te e n e s te d o c u m e n to . L o s p o lin u c le ó t id o s p u e d e n in s e r ta rs e e n c é lu la s h u e s p e d p o r c u a lq u ie r m e d io c o n o c id o e n la té c n ic a . L a s c é lu la s se tra n s fo rm a n m e d ia n te la in tro d u c c ió n d e un p o lin u c le ó t id o e x ó g e n o p o r c a p ta c ió n d ire c ta , e n d o c ito s is , t ra n s fe c c ió n , F -a p a re a m ie n to o e le c tro p o ra c ió n . U n a v e z in tro d u c id o , e l p o lin u c le ó t id o e x ó g e n o p u e d e m a n te n e rs e d e n tro d e la c é lu la c o m o un v e c to r n o in te g ra d o ( ta l c o m o un p lá s m id o ) o in te g ra d o en e l g e n o m a d e la c é lu la h u é s p e d . E l p o lin u c le ó t id o a s í a m p lif ic a d o p u e d e a is la rs e d e la c é lu la h u é s p e d m e d ia n te m é to d o s b ie n c o n o c id o s e n la té c n ic a . V é a s e , p o r e je m p lo , S a m b ro o k e t a l. (1989 ).

[0258] A lte rn a t iv a m e n te , la P C R p e rm ite la re p ro d u c c ió n d e s e c u e n c ia s d e A D N . La te c n o lo g ía d e P C R e s b ie n c o n o c id a e n la té c n ic a y s e d e s c r ib e en la s P a te n te s d e E s ta d o s U n id o s N ° 4 ,683 ,195 , 4 ,800 ,159 , 4 ,754 ,065 y 4 ,683 ,202 , a s í c o m o P C R : T h e P o lim e ra s e C h a in R e a c tio n , M u llis e t al. e d s ., B ir k a u s w e r P re s s , B o s to n (1994 ).

[0259] A R N se p u e d e o b te n e r m e d ia n te e l u s o d e A D N a is la d o e n un v e c to r a p ro p ia d o e in s e r tá n d o lo e n u n a c é lu la h u é s p e d a d e c u a d a . C u a n d o la c é lu la se re p lic a y e l A D N se t ra n s c r ib e en A R N , e n to n c e s e l A R N p u e d e a is la rs e u s a n d o m é to d o s b ie n c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a , c o m o se e s ta b le c e en S a m b ro o k e t a l., (1989 ), p o r e je m p lo .

[0260] L o s v e c to re s d e c lo n a c ió n a d e c u a d o s p u e d e n s e r c o n s tru id o s d e a c u e rd o c o n té c n ic a s e s tá n d a r , o se p u e d e n s e le c c io n a r d e un g ra n n ú m e ro d e v e c to re s d e c lo n a c ió n d is p o n ib le s e n la té c n ic a . S i b ie n e l v e c to r d e c lo n a c ió n s e le c c io n a d o p u e d e v a r ia r s e g ú n la c é lu la h u é s p e d q u e se p re te n d a u s a r, lo s v e c to re s d e c lo n a c ió n ú tile s g e n e ra lm e n te te n d rá n la c a p a c id a d d e a u to r re p lic a rs e , p u e d e n p o s e e r u n a ú n ic a d ia n a p a ra u n a e n d o n u c le a s a de re s tr ic c ió n p a r t ic u la r y /o p u e d e n p o r ta r g e n e s p a ra un m a r c a d o r q u e se p u e d e n u t i l iz a r p a ra s e le c c io n a r c lo n e s q u e c o n t ie n e n e l v e c to r . L o s e je m p lo s a d e c u a d o s in c lu y e n p lá s m id o s y v iru s b a c te r ia n o s , p o r e je m p lo , p U C 18 , p U C 19 , B lu e s c r ip t (p . e j., p B S S K ) y s u s d e r iv a d o s , m p 18 , m p 19 , p B R 322 , p M B 9 , C o IE 1 , p C R 1 , r P4, A d N d e fa g o s y v e c to re s la n z a d e ra c o m o p S A 3 y p A T 28. E s to s y m u c h o s o tro s v e c to re s d e c lo n a c ió n e s tá n d is p o n ib le s en p ro v e e d o re s c o m e rc ia le s c o m o B io R a d , S tra te g e n e e In v itro g e n .

[0261] L o s v e c to re s d e e x p re s ió n g e n e ra lm e n te s o n c o n s tru c c io n e s d e p o lin u c le ó t id o s re p lic a b le s q u e c o n t ie n e n un p o lin u c le ó t id o d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie ra d e lo s d iv e rs o s a s p e c to s d e la in v e n c ió n . S e d a a e n te n d e r q u e un v e c to r d e e x p re s ió n d e b e s e r re p lic a b le e n la s c é lu la s h u é s p e d c o m o e p is o m a s o c o m o p a rte in te g ra l d e l A D N c ro m o s ó m ic o . L o s v e c to re s d e e x p re s ió n a d e c u a d o s in c lu y e n , p e ro no s e lim ita n a p lá s m id o s , v e c to re s v ira le s , q u e in c lu y e n a d e n o v iru s , v iru s a d e n o a s o c ia d o s , re tro v iru s , c ó s m id o s y v e c to r (e s ) d e e x p re s ió n d e s c r ito s e n la p u b lic a c ió n P C T n° W O 87 /04462. L o s c o m p o n e n te s d e l v e c to r p u e d e n in c lu ir g e n e ra lm e n te , p e ro no s e lim ita n a u n o o m á s d e los s ig u ie n te s : u n a s e c u e n c ia s e ñ a l; un o r ig e n d e re p lic a c ió n ; u n o o m á s g e n e s m a rc a d o re s ; e le m e n to s d e c o n tro l d e la t ra n s c r ip c ió n a d e c u a d o s ( ta le s c o m o p ro m o to re s , p o te n c ia d o re s y te rm in a d o re s ) . P a ra la e x p re s ió n (e s d e c ir, t ra d u c c ió n ) , h a b itu a lm e n te ta m b ié n se re q u ie re n u n o o m á s e le m e n to s d e c o n tro l d e la t ra d u c c ió n , ta le s c o m o s it io s d e u n ió n a r ib o s o m a s , s it io s d e in ic io d e la t ra d u c c ió n y c o d o n e s d e te rm in a c ió n .

[0262] L o s v e c to re s q u e c o n t ie n e n lo s p o lin u c le ó t id o s d e in te ré s p u e d e n in t ro d u c irs e e n la c é lu la h u é s p e d m e d ia n te c u a lq u ie ra d e u n a s e r ie d e m e d io s a d e c u a d o s , in c lu y e n d o e le c tro p o ra c ió n , t ra n s fe c c ió n e m p le a n d o c lo ru ro d e c a lc io , c lo ru ro d e ru b id io , c a lc io fo s fa to , D E A E -d e x tra n o , u o tra s s u s ta n c ia s ; b o m b a rd e o d e m ic ro p ro y e c t ile s ; l ip o fe c c ió n ; e in fe c c ió n (p. e j., c u a n d o e l v e c to r e s un a g e n te in fe c c io s o c o m o e l v iru s v a c c in ia ) . La e le c c ió n d e in tro d u c ir v e c to re s o p o lin u c le ó t id o s d e p e n d e rá a m e n u d o d e la s c a ra c te r ís t ic a s d e la c é lu la h u é s p e d .

[0263] C u a lq u ie r c é lu la h u é s p e d c a p a z d e s o b re e x p re s a r A D N h e te ró lo g o s p u e d e u s a rs e c o n e l p ro p ó s ito d e a is la r lo s g e n e s q u e c o d if ic a n e l a n tic u e rp o , p o lip é p tid o o p ro te ín a d e in te ré s . L o s e je m p lo s n o lim ita n te s d e c é lu la s h u é s p e d d e m a m ífe ro in c lu y e n , p e ro no se lim ita n a c é lu la s C O S , H e L a y C H O . V é a s e ta m b ié n la p u b lic a c ió n P C T n ° W O ^{8 7 /04462 . L a s c é lu la s h u é s p e d n o m a m ífe ra s a d e c u a d a s in c lu y e n p ro c a r io ta s ( c o m o} E. coli ^{o B. s u b t ill is ) y le v a d u ra s}(c o m o S. c e re v is a e , S. p o m b e o K. la c tis ). P re fe r ib le m e n te , la s c é lu la s h u é s p e d e x p re s a n lo s A D N c a un n iv e l de a p ro x im a d a m e n te 5 v e c e s m á s a lto , m á s p re fe r ib le m e n te 10 v e c e s m á s a lto , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te 20 v e c e s m á s a lto q u e e l d e l c o r re s p o n d ie n te a n t ic u e rp o o p ro te ín a e n d ó g e n a d e in te ré s , s i e s tá p re s e n te , e n la s c é lu la s h u é s p e d . El c r ib a d o d e la s c é lu la s h u e s p e d en b u s c a d e u n a u n ió n e s p e c íf ic a a A 01 -40 se re a liz a m e d ia n te un in m u n o e n s a y o o F A C S . P u e d e id e n tif ic a rs e u n a c é lu la q u e s o b re e x p re s a e l a n t ic u e rp o o la p ro te ín a d e in te ré s .

D. C o m p o s ic io n e s

[0264] E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la s c o m p o s ic io n e s u t i l iz a d a s en la in v e n c ió n c o m p re n d e n u n a c a n t id a d e f ic a z d e un a n t ic u e rp o a n ta g o n is ta a n t i-C G R P . T a m b ié n s e d e s c r ib e n e je m p lo s d e ta le s c o m p o s ic io n e s , a s í c o m o c ó m o fo rm u la r , e n u n a s e c c ió n a n te r io r y a c o n t in u a c ió n . E n u n a re a liz a c ió n , la c o m p o s ic ió n c o m p re n d e a d e m á s un a n ta g o n is ta de C G R P . L a c o m p o s ic ió n c o m p re n d e u n o o m á s a n t ic u e rp o s a n ta g o n is ta s a n t i-C G R P . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , el anticuerpo antagonista anti-CGRP reconoce el CGRP humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP está humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP comprende una región constante que no desencadena una respuesta inmune no deseada o indeseable, tal como lisis mediada por anticuerpos o ADCC. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP comprende seis CDR de G1. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CGRP es humano.

[0265] Se entiende que las composiciones pueden comprender más de un anticuerpo (p. ej., más de un anticuerpo de antagonista anti-CGRP - una mezcla de anticuerpos anti-CGRP antagonista que reconocen diferentes epítopos de CGRP). Otras composiciones ejemplares comprenden más de un anticuerpo antagonista anti-CGRP que reconocen el (los) mismo(s) epítopo(s), o diferentes especies de anticuerpos antagonistas anti-CGRP que se unen a diferentes epítopos de CGRP.

[0266] Una composición puede comprender además portadores farmacéuticamente aceptables, excipientes o estabilizantes (Remington: The Science and practice of Pharmacy 20a Ed (2000) Lippincott Williams y Wilkins, Ed. K. E. Hoover). Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. Una formulación terapéutica de un anticuerpo puede comprender uno o más vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables con ejemplos no limitantes de tales especies que incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; sales como cloruro de sodio; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metilo o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos (p. ej., en concentraciones de 0,1 mM a 100 mM, 0,1 mM a 1 mM, 0,01 mM a 50 mM, 1 mM a 50 mM, 1 mM a 30 mM, 1 mM a 20 mM, 10 mM a 25 mM) tales como glicina, glutamina, metionina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes (p. ej., a concentraciones de 0,001 mg/ml a 1 mg/ml, 0,001 mg/ml a 1 mg/ml, 0,001 mg/ml a 0,1 mg/ml, 0,001 mg/ml a 0,01 mg/ml) como EDTA (p. ej., EDTA disódico dihidrato); azúcares (p. ej., en concentraciones de 1 mg/ml a 500 mg/ml, 10 mg/ml a 200 mg/ml, 10 mg/ml a 100 mg/ml, 50 mg/ml a 150 mg/ml) como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (p. ej., complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos (p. ej., en concentraciones de 0,01 mg/ml a 10 mg/ml, 0,01 mg/ml a 1 mg/ml, 0,1 mg/ml a 1 mg/ml, 0,01 mg/ml a 0,5 mg/ml) como TWEEN™ (p. ej., polisorbato (p. ej., polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80)), PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Los excipientes farmacéuticamente aceptables se describen adicionalmente en el presente documento.

[0267] Un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo antagonista anti-CGRP) y composiciones de los mismos también puede ser utilizado en conjunción con otros agentes que sirven para mejorar y/o complementar la eficacia de los agentes.

E. Kits

[0268] Los kits pueden incluir uno o más recipientes que comprenden un anticuerpo descrito en el presente documento (p. ej., un anticuerpo de antagonista anti-CGRP (tal como un anticuerpo humanizado)) o polipéptido descrito en el presente documento e instrucciones para su uso de acuerdo con cualquiera de los métodos descrito aquí. Generalmente, estas instrucciones comprenden una descripción de la administración del anticuerpo para tratar, mejorar o prevenir el dolor de cabeza postraumático según cualquiera de los métodos descritos en este documento. El kit puede comprender además una descripción de la selección de un individuo adecuado para el tratamiento basándose en la identificación de si ese individuo tiene dolor de cabeza postraumático o si el individuo tiene riesgo de tener dolor de cabeza postraumático. Las instrucciones comprenden una descripción de la administración de un anticuerpo (p. ej., anticuerpo antagonista anti-CGRP) a un individuo con riesgo de tener dolor de cabeza postraumático.

[0269] Las instrucciones relativas a la utilización de un anticuerpo (p. ej., anticuerpo antagonista anti-CGRP) generalmente incluyen información en cuanto a la dosificación, programa de dosificación, y vía de administración para el tratamiento pretendido. Los recipientes pueden ser dosis unitarias, paquetes a granel (p. ej., paquetes multidosis) o subunidades. Las instrucciones suministradas en los kits suelen ser instrucciones escritas en una etiqueta o prospecto (p. ej., una hoja de papel incluida en el kit), pero también se aceptan instrucciones legibles por máquina (p. ej., instrucciones en un disco de almacenamiento magnético u óptico).

[0270] La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar, mejorar y/o prevenir el dolor de cabeza post-traumático. Se pueden proporcionar instrucciones para practicar cualquiera de los métodos descritos en este documento.

[0271] Los kits están en envases adecuados. Los envases adecuados incluyen, pero no se limitan a viales, botellas, frascos, envases flexibles (p. ej., bolsas de plástico o Mylar selladas) y similares. También se contemplan envases para su uso en combinación con un dispositivo específico, como un inhalador, un dispositivo de administración nasal (p. ej., un atomizador) o un dispositivo de infusión como una minibomba. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril (p. ej., el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). El recipiente también puede tener un puerto de acceso estéril (p. ej., el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo antagonista anti-CGRP y/o un anticuerpo monoclonal que modula la ruta CGRP. El recipiente puede comprender además un segundo agente farmacéuticamente activo.

[0272] Los kits pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales tales como tampones e información interpretativa. Normalmente, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto(s) en el recipiente o asociados con él.

[0273] Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar pero no limitar la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación y caracterización de anticuerpos monoclonales dirigidos contra CGRP

[0274] Generación de anticuerpos anti-CGRP. Para generar anticuerpos anti-CGRP que tienen reactividad cruzada de especies para CGRP de rata y humano, se inmunizaron ratones con 25-100 mg de a-CGRP o p-CGRP humano conjugado con KLH en adyuvante (50 pl por almohadilla, 100 pl en total por ratón) en varios intervalos. La inmunización se realizó generalmente como se describe en Geerligs HJ et al., 1989, J. Immunol. Methods 124: 95-102; Kenney JS y col., 1989, J. Immunol. Methods 121:157-166; y Wicher K et al., 1989, Int. Arco. Alergia Appl. Immunol. 89: 128-135. Los ratones se inmunizaron primero con 50 pg de a-CGRP o p-CGRP humano conjugado con KLH en CFA (adyuvante completo de Freund). Después de 21 días, los ratones se inmunizaron en segundo lugar con 25 pg de p-CGRP humano (para los ratones inmunizados primero con a-CGRP humano) o a-CGRP (para los ratones inmunizados primero con p-CGRP humano) conjugado con KLH en IFA (incompleto de Freund auxiliar). Veintitrés días después de la segunda inmunización, se realizó la tercera inmunización con 25 pg de a-CGRP de rata conjugado con KLH en IFA. Diez días después, se probaron los títulos de anticuerpos mediante ELISA. La cuarta inmunización se realizó con 25 pg del péptido (a-CGRP-KLH de rata) en IFA 34 días después de la tercera inmunización. El refuerzo final se realizó con 100 pg de péptido soluble (a-CGRP de rata) 32 días después de la cuarta inmunización.

[0275] Los esplenocitos se obtuvieron del ratón inmunizado y se fusionaron con células de mieloma NSO en una proporción de 10:1, con polietilenglicol 1500. Los híbridos se sembraron en placas de 96 pocillos en DMEM que contenía 20% de suero de caballo y 2-oxaloacetato/piruvato/insulina (Sigma) e hipoxantina/aminopterina/timidina se inició la selección. El día 8, se añadieron a todos los pocillos 100 pl de DMEM que contenía suero de caballo al 20%. Los sobrenadantes de los híbridos se seleccionaron usando inmunoensayo de captura de anticuerpos. La determinación de la clase de anticuerpos se realizó con segundos anticuerpos de clase específica.

[0276] Un panel de líneas celulares productoras de anticuerpos monoclonales se selecciona basándose en su unión a CGRP humano y de rata para la caracterización adicional. Estos anticuerpos y las características se muestran a continuación en las Tablas 2 y 3.

[0277] Purificación y preparación de fragmento Fab. Los anticuerpos monoclonales seleccionados para caracterización adicional se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivos de hibridomas usando cromatografía de afinidad de proteína A. Los sobrenadantes se equilibraron a pH 8. Los sobrenadantes se cargaron luego en la columna de proteína A MabSelect (Amersham Biosciences n° 17-5199-02) equilibrada con PBS a pH 8. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de PBS, pH 8. Los anticuerpos se eluyeron con tampón citrato-fosfato 50 mM, pH 3. Los anticuerpos eluidos se neutralizaron con tampón fosfato 1 M, pH 8. Los anticuerpos purificados se dializaron con PBS, pH 7,4. Las concentraciones de anticuerpo se determinaron mediante SDS-PAGE, usando una curva estándar de anticuerpo monoclonal murino.

[0278] Los Fab se prepararon mediante proteólisis de papaína de los anticuerpos completos usando el kit Immunopure Fab (Pierce n° 44885) y se purificaron mediante cromatografía de flujo a través de proteína A siguiendo las instrucciones del fabricante. Las concentraciones se determinaron por ELISA y/o electroforesis SDS-PAGE usando un Fab estándar de concentración conocida (determinada por análisis de aminoácidos) y por A280 usando 1OD = 0,6 mg/ml (o equivalente teórico basado en la secuencia de aminoácidos).

[0279] Determinación de la afinidad de los Fabs. Las afinidades de los anticuerpos monoclonales anti-CGRP se determinaron a 25°C o 37°C utilizando el sistema de resonancia de plasmón de superficie (SPR) BIACORE30003 (Biacore, INC, Piscataway NJ) con el tampón de ejecución del fabricante, HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, polisorbato P20 al 0,005% v/v). La afinidad se determinó mediante la captura de péptidos CGRP biotinilados en el extremo N (pedido personalizado de GenScript Corporation, Nueva Jersey o Global Peptide Services, Colorado) mediante estreptavidina preinmovilizada en un chip SA y midiendo la cinética de unión del anticuerpo Fab titulado a través de la superficie del CGRP. Se diluyó CGRP biotinilado en HBSEP y se inyectó sobre el chip a una concentración de menos de 0,001 mg/ml. Usando un tiempo de flujo variable a través de los canales de chip individuales, se lograron dos rangos de densidad de antígeno: <50 unidades de respuesta (RU) para estudios cinéticos detallados y aproximadamente 800 RU para estudios de concentración y cribado. Se inyectaron diluciones seriadas de dos o tres veces típicamente a concentraciones que abarcan 1 mM - 0,1 nM (dirigidas a 0,1-10 veces la Kd estimada) de fragmentos Fab purificados durante 1 minuto a 100 ml/min y se dejaron tiempos de disociación de 10 minutos. Después de cada ciclo de unión, las superficies se regeneraron con NaOH 25 mM en etanol al 25% v/v, que se toleró durante cientos de ciclos. La tasa de asociación cinética (kon) y la tasa de disociación (koff) se obtuvieron simultáneamente ajustando los datos a un modelo de unión de Langmuir 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) utilizando el programa BIAevaluation. Las constantes de disociación de equilibrio global (Kd) o "afinidades" se calcularon a partir de la relación Kd = koff/kon. Las afinidades de los fragmentos Fab murinos se muestran en las Tablas 2 y 3.

[0280] Mapeo de epítopos de los anticuerpos anti-CGRP murinos. Para determinar el epítopo al que se unen los anticuerpos anti-CGRP en a-CGRP humano, se midieron las afinidades de unión de los fragmentos Fab a varios fragmentos de CGRP como se describe anteriormente mediante la captura de los fragmentos de CGRP biotinilados en el extremo N-terminal, aminoácidos 19-37 y aminoácidos 25-37 en un chip sensor SA. La Figura 1 muestra sus afinidades de unión medidas a 25°C. Como se muestra en la Figura 1, todos los anticuerpos, excepto el anticuerpo 4901, se unen a los fragmentos 19-37 y 25-37 de a-CGRP humano con una afinidad similar a su afinidad de unión a a-CGRP humano de longitud completa (1-37). El anticuerpo 4901 se une al fragmento 25-37 de a-CGRP humano con una afinidad seis veces menor que la unión al fragmento de a-CGRP humano de longitud completa, debido principalmente a una pérdida de velocidad. Los datos indican que estos anticuerpos anti-CGRP generalmente se unen al extremo C-terminal de CGRP.

[0281] El barrido de alanina se realizó para caracterizar aminoácidos en a-CGRP humano implicado en la unión de anticuerpos anti-CGRP. Se generaron diferentes variantes de a-CGRP humano con sustituciones de alanina simple mediante síntesis de péptidos. Sus secuencias de aminoácidos se muestran en la Tabla 4 junto con todos los demás péptidos usados en el análisis Biacore. Las afinidades de los fragmentos Fab de los anticuerpos anti-CGRP a estas variantes se determinaron usando Biacore como se describió anteriormente. Como se muestra en la Figura 1, los 12 anticuerpos se dirigen a un epítopo C-terminal, siendo el aminoácido F37 el residuo más crucial. La mutación de F37 a alanina redujo significativamente la afinidad o incluso eliminó por completo la unión de los anticuerpos anti-CGRP al péptido. El siguiente residuo de aminoácido más importante es G33, sin embargo, solo los anticuerpos de alta afinidad (7E9, 8B6, 10A8 y 7D11) se vieron afectados por el reemplazo de alanina en esta posición. El residuo de aminoácido S34 también juega un papel significativo, pero menor, en la unión de estos cuatro anticuerpos de alta afinidad.

Tabla 2. Características de la unión de los anticuerpos monoclonales anti-CGRP al a-CGRP humano y su actividad antagonista

Tabla 3. Características de la unión de los anticuerpos monoclonales anti-CGRP a a-CGRP de rata y actividad antagonista

(Continuación)

Tabla 4. Secuencias de aminoácidos de fragmentos de a-CGRP humanos (SEQ ID NOS: 15-40) y péptidos relacionados (SEQ ID NOS: 41-47). Todos los péptidos están amidados en el extremo C excepto SEQ ID NOS: 36

40. Los residuos en negrita indican mutaciones puntuales.

Ejemplo 2: Selección de anticuerpos antagonistas anti-CGRP usando ensayos in vitro.

[0282] Los anticuerpos anti-CGRP murinos se cribaron adicionalmente para determinar la actividad antagonista in vitro usando un ensayo de activación de cAMP basado en células y un ensayo de unión.

[0283] Actividad antagonista medida mediante ensayo de AMPc. Cinco microlitros de a-CGRP humano o de rata (concentración final 50 nM) en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-CGRP (concentración final 1-3000 nM), o a-CGRP de rata o a-CGRP humano (concentración final 0,1 nM -10 mM; como control positivo para la activación de c-AMP) se dispensó en una placa de 384 pocillos (Nunc, n° de cat. 264657). Diez microlitros de células (SK-N-MC humano si se usa a-CGRP humano, o L6 de rata de ATCC si se usa a-CGRP de rata) en tampón de estimulación (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 146 mM, KCl 5 mM, CaCh 1 mM, MgCh 1 mM y 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) 500 |jM) se añadieron a los pocillos de la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos.

[0284] Después de la incubación, la activación de cAMP se realizó utilizando HitHunter™ Enzyme Fragment Complementation Assay (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ensayo se basa en una enzima p-galactosidasa modificada genéticamente que consta de dos fragmentos denominados Enzyme Acceptor (EA) y Enzyme Donor (ED). Cuando se separan los dos fragmentos, la enzima está inactiva. Cuando los fragmentos están juntos, pueden recombinarse espontáneamente para formar una enzima activa mediante un proceso llamado complementación. La plataforma de ensayo EFC utiliza un conjugado de péptido ED-cAMP en donde cAMP es reconocido por anti-cAMP. Este fragmento de ED es capaz de reasociarse con EA para formar una enzima activa. En el ensayo, el anticuerpo anti-cAMP se titula de manera óptima para unirse al conjugado de ED-cAMP e inhibir la formación de enzimas. Los niveles de AMPc en muestras de lisado celular compiten con el conjugado ED-AMPc por unirse al anticuerpo anti-AMPc. La cantidad de conjugado de ED libre en el ensayo es proporcional a la concentración de cAMP. Por tanto, el AMPc se mide mediante la formación de enzima activa que se cuantifica mediante la renovación del sustrato luminiscente de p-galactosidasa. El ensayo de activación de cAMP se realizó añadiendo 10 j l de tampón de lisis y anticuerpo anti-cAMP (relación 1:1) seguido de incubación a temperatura ambiente durante 60 min. A continuación, se añadieron 10 j l de reactivo ED-cAMP a cada pocillo y se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, se añadieron 20 j l de reactivo EA y mezcla CL (que contiene el sustrato) (proporción 1:1) a cada pocillo y se incubaron durante 1-3 horas o durante la noche a temperatura ambiente. La placa se leyó a 1 segundo/pocillo en un instrumento PMT o 30 segundos/lugar en un generador de imágenes. Los anticuerpos que inhiben la activación de cAMP por a-CGRP se identificaron (denominados "sí") en las Tablas 2 y 3 anteriores. Los datos de las Tablas 2 y 3 indican que los anticuerpos que demostraron actividad antagonista en el ensayo generalmente tienen una alta afinidad. Por ejemplo, los anticuerpos que tienen Kd (determinado a 25°C) de aproximadamente 80 nM o menos para a-CGRP humano o que tienen Kd (determinado a 37°C) de aproximadamente 47 nM o menos para a-CGRP de rata mostraron actividad antagonista en este ensayo.

[0285] Ensayo de unión de radioligando. Se realizó un ensayo de unión para medir la CI50 del anticuerpo anti-CGRP al bloquear la unión del CGRP al receptor como se describió anteriormente. Zimmermann y col., Peptides 16: 421-4, 1995; Mallee y col., J. Biol. Chem. 277: 14294-8, 2002. Se incubaron membranas (25 jg ) de células SK-N-MC durante 90 min a temperatura ambiente en tampón de incubación (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, MgCh 5 mM, BSA al 0,1%) que contenían 10 pM de 125I-a-CGRP humano en un volumen total de 1 ml. Para determinar las concentraciones de inhibición (CI50), se disolvieron anticuerpos o CGRP sin marcar (como control) de una solución madre aproximadamente 100 veces mayor a concentraciones variables en el tampón de incubación y se incubaron al mismo tiempo con membranas y 10 pM de 125I-a-CGRP humano. La incubación se terminó mediante filtración a través de un filtro de microfibras de vidrio (GF/B, 1 jm ) que se había bloqueado con polietilemimina al 0,5%. Se trazaron las curvas de respuesta a la dosis y los valores de Ki se determinaron usando la ecuación: Ki = Cl50/(1+([ligando]/KD); donde la constante de disociación de equilibrio Kd = 8 pM para el receptor a - CGRP a CGRP1 humano presente en las células SK-N-MC, y Bmax = 0,025 pmol/mg de proteína. El valor de CI50 informado (en términos de moléculas de IgG) se convirtió en sitios de unión (multiplicando que por 2) de modo que se podría comparar con las afinidades (Kd) determinadas por Biacore (véase la Tabla 2).

[0286] la Tabla 2 muestra la CI50 de anticuerpos murinos 7E9, 8B6, 6H2 y 4901. Los datos indican que la afinidad del anticuerpo generalmente se correlaciona con CI50: los anticuerpos con mayor afinidad (valores Kd más bajos) tienen menor CI50 en el ensayo de unión de radioligando.

Ejemplo 3: Efecto de los anticuerpos antagonistas anti-CGRP sobre la vasodilatación cutánea inducida por la estimulación del nervio safeno de rata

[0287] Para probar la actividad antagonista de anticuerpos anti-CGRP, efecto de los anticuerpos sobre la vasodilatación de la piel por estimulación de nervio safeno de rata se probó utilizando un modelo de rata descrito anteriormente. Escott y col., Br. J. Pharmacol. 110: 772-776, 1993. En este modelo de rata, la estimulación eléctrica del nervio safeno induce la liberación de CGRP de las terminaciones nerviosas, lo que da como resultado un aumento del flujo sanguíneo cutáneo. Se midió el flujo sanguíneo en la piel del pie de ratas macho Sprague Dawley (170-300 g, de Charles River Hollister) después de la estimulación del nervio safeno. Las ratas se mantuvieron bajo anestesia con isoflurano al 2%. Se administró tosilato de bretilio (30 mg/kg, administrado i.v.) al comienzo del experimento para minimizar la vasoconstricción debido a la estimulación concomitante de las fibras simpáticas del nervio safeno. La temperatura corporal se mantuvo a 37°C mediante el uso de una sonda rectal conectada termostáticamente a una almohadilla térmica de temperatura controlada. Los compuestos que incluyen anticuerpos, control positivo (CGRP 8 37) y vehículo (PBS, Tween 20 al 0,01%) se administraron por vía intravenosa a través de la vena femoral derecha, excepto para el experimento que se muestra en la Figura 3, el compuesto de prueba y el control se inyectaron a través de vena de la cola, y para los experimentos mostrados en las Figuras 2A y 2B, los anticuerpos 4901 y 7D11 se inyectaron intraperitonealmente (IP). El compuesto de control positivo CGRP 8-37 (antagonista de la vasodilatación), debido a su corta vida media, se administró 3-5 minutos antes de la estimulación nerviosa a 400 nmol/kg (200 jl). Tan y col., Clin. Sci. 89: 656-73, 1995. Los anticuerpos se administraron en diferentes dosis (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg y 25 mg/kg).

[0288] Para los experimentos mostrados en las Figuras 2A y 2B, el anticuerpo 4901 (25 mg/kg), anticuerpo 7D11 (25 mg/kg), o vehículo de control (PBS con 0,01% de Tween 20) se administró por vía intraperitoneal (IP) 72 horas antes la estimulación de pulso eléctrico. Para el experimento que se muestra en la Figura 3, el anticuerpo 4901 (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg o 25 mg/kg) o el control del vehículo (PBS con Tween 20 al 0,01%) se administró por vía intravenosa 24 horas antes de la administración eléctrica. estimulación del pulso. Después de la administración de los anticuerpos o del vehículo de control, se expuso quirúrgicamente el nervio safeno de la extremidad posterior derecha, se cortó en sentido proximal y se cubrió con una envoltura de plástico para evitar que se secara. Se colocó una sonda láser Doppler sobre el lado medio-dorsal de la piel de la pata trasera, que es la región inervada por el nervio safeno. El flujo sanguíneo de la piel, medido como flujo de células sanguíneas, se controló con un medidor de flujo láser Doppler. Cuando se estableció un flujo de línea base estable (menos del 5% de variación) durante al menos 5 minutos, el nervio se colocó sobre electrodos bipolares de platino y se estimuló eléctricamente con 60 pulsos (2 Hz, 10 V, 1 ms, durante 30 segundos) y luego de nuevo 20 minutos más tarde. El cambio acumulado en el flujo sanguíneo de la piel se estimó mediante el área bajo la curva de flujo-tiempo (AUC, que es igual al cambio en el flujo multiplicado por el cambio en el tiempo) para cada respuesta de flujo a la estimulación del pulso eléctrico. Se tomó el promedio de la respuesta del flujo sanguíneo a las dos estimulaciones. Los animales se mantuvieron bajo anestesia durante un período de una a tres horas.

[0289] Como se muestra en la Figura 2A y la Figura 2B, aumentar el flujo sanguíneo estimulado por la aplicación de pulsos electrónicos en el nervio safeno fue inhibido por la presencia de CGRP 8-37 (400 nmol/kg, administrado i.v.), el anticuerpo 4901 (25 mg/kg, administrado ip), o el anticuerpo 7D11 (25 mg/kg, administrado ip) en comparación con el control. Se administró CGRP 8-37 3-5 minutos antes de la estimulación del nervio safeno; y los anticuerpos se administraron 72 horas antes de la estimulación del nervio safeno. Como se muestra en la Figura 3, el aumento del flujo sanguíneo estimulado por la aplicación de pulsos electrónicos en el nervio safeno fue inhibido por la presencia del anticuerpo 4901 en diferentes dosis (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg y 25 mg/kg) administrado por vía intravenosa 24 horas antes de la estimulación del nervio safeno.

[0290] Para los experimentos mostrados en las Figuras 4A y 4B, el nervio safeno se expuso quirúrgicamente antes de la administración de anticuerpos. El nervio safeno de la extremidad posterior derecha se expuso quirúrgicamente, se cortó en sentido proximal y se cubrió con una envoltura de plástico para evitar que se secara. Se colocó una sonda láser Doppler sobre el lado medio-dorsal de la piel de la pata trasera, que es la región inervada por el nervio safeno. El flujo sanguíneo de la piel, medido como flujo de células sanguíneas, se controló con un medidor de flujo láser Doppler. Treinta a cuarenta y cinco minutos después de la inyección de tosilato de bretilio, cuando se estableció un flujo de línea base estable (menos del 5% de variación) durante al menos 5 minutos, el nervio se colocó sobre electrodos bipolares de platino y se estimuló eléctricamente (2 Hz, 10 V, 1 ms, durante 30 segundos) y nuevamente 20 minutos después. El promedio de la respuesta del flujo sanguíneo a estas dos estimulaciones se utilizó para establecer la respuesta inicial (tiempo 0) a la estimulación eléctrica. A continuación, se administraron por vía intravenosa (i.v.) el anticuerpo 4901 (1 mg/kg o 10 mg/kg), el anticuerpo 7E9 (10 mg/kg), el anticuerpo 8B6 (10 mg/kg) o el vehículo (PBS con Tween 20 al 0,01%). El nervio se estimuló posteriormente (2 Hz, 10 V, 1 ms, durante 30 segundos) a los 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos y 120 minutos después de la administración del anticuerpo o vehículo. Los animales se mantuvieron bajo anestesia durante un período de aproximadamente tres horas. El cambio acumulado en el flujo sanguíneo de la piel se estimó mediante el área bajo la curva de flujo-tiempo (AUC, que es igual al cambio en el flujo multiplicado por el cambio en el tiempo) para cada respuesta de flujo a las estimulaciones de pulso.

[0291] Como se muestra en la Figura 4A, el aumento del flujo sanguíneo estimulado mediante la aplicación de pulsos electrónicos en el nervio safeno fue significativamente inhibido por la presencia del anticuerpo 4,901 1 mg/kg administrado i.v., cuando la estimulación del pulso electrónico se aplica a los 60 minutos, 90 minutos, y 120 minutos después de la administración del anticuerpo, y el aumento del flujo sanguíneo estimulado mediante la aplicación de pulsos electrónicos en el nervio safeno se inhibió significativamente por la presencia del anticuerpo 4901 10 mg/kg administrado i.v., cuando se aplicó estimulación de pulso electrónico a los 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos y 120 minutos después de la administración del anticuerpo. La Figura 4B muestra que el aumento del flujo sanguíneo estimulado mediante la aplicación de pulsos electrónicos en el nervio safeno fue inhibido significativamente por la presencia del anticuerpo 7E9 (10 mg/kg, administrado i.v.) cuando se aplicó estimulación de pulso electrónico a los 30 min, 60 min, 90 min y 120 min después de la administración del anticuerpo, y por la presencia del anticuerpo 8B6 (10 mg/kg, administrado i.v.) cuando se aplicó estimulación de pulso electrónico 30 min después de la administración del anticuerpo.

[0292] Estos datos indican que los anticuerpos 4901, 7E9, 7D11, y 8B6 son eficaces en el bloqueo de la actividad de CGRP como se mide por la vasodilatación de la piel inducido por la estimulación del nervio safeno de ratas.

Ejemplo 4. Caracterización de anticuerpo G1 anti-CGRP y sus variantes

[0293] L a s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s p a ra la re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a p e s a d a y lig e ra d e la re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a d e a n t ic u e rp o a n t i-C G R P G1 se m u e s tra n en la F ig u ra 5. L o s s ig u ie n te s m é to d o s s e u tiliz a ro n p a ra la e x p re s ió n y c a ra c te r iz a c ió n d e l a n t ic u e rp o G1 y s u s v a r ia n te s .

[0294] V e c to r d e e x p re s ió n u ti l iz a d o . L a e x p re s ió n d e l f ra g m e n to F a b d e lo s a n t ic u e rp o s e s ta b a b a jo e l c o n tro l d e un p ro m o to r la c Z in d u c ib le p o r IP T G s im ila r a l d e s c r ito e n B a rb a s (2001 ) P h a g e d is p la y : a la b o ra to ry m a n u a l, C o ld S p r in g H a rb o r , N u e v a Y o rk , C o ld S p r in g H a rb o r L a b o ra to ry P re s s p á g . 2.10. V e c to r p C o m b 3 X ), s in e m b a rg o , las m o d if ic a c io n e s in c lu y e ro n la a d ic ió n y e x p re s ió n d e lo s s ig u ie n te s d o m in io s a d ic io n a le s : el d o m in io c o n s ta n te d e la c a d e n a lig e ra K a p p a h u m a n a y e l d o m in io c o n s ta n te C H 1 d e la in m u n o g lo b u lin a h u m a n a Ig G 2 , re g ió n C d e la c a d e n a Ig g a m m a -2 , n ú m e ro d e a c c e s o d e la p ro te ín a P 01859 ; C a d e n a lig e ra k a p p a d e in m u n o g lo b u lin a (H o m o s a p ie n s ) , p ro te ín a n ú m e ro d e a c c e s o C A A 09181.

[0295] ^{P re p a ra c ió n F a b a p e q u e ñ a e s c a la . A p a r t ir d e} E. coli ^{t r a n s fo rm a d a (y a s e a u s a n d o c é lu la s T G 1 c o m p e te n te s}p a ra e le c tro p o ra c ió n o c é lu la s T o p 10 q u ím ic a m e n te c o m p e te n te s ) c o n u n a b ib lio te c a F a b , s e u s a ro n c o lo n ia s in d iv id u a le s p a ra in o c u la r u n a p la c a m a e s tra (a g a r L B c a rb e n ic il in a (50 p g /m l) 2 % g lu c o s a ) y u n a p la c a d e tra b a jo (2 m l/p o c il lo , 96 p o c il lo s /p la c a ) d o n d e c a d a p o c il lo c o n te n ía 1 ,5 m l d e L B c a rb e n ic i l in a (50 p g /m l) g lu c o s a a l 2 % . S e a p lic ó a la p la c a un s e llo a d h e s iv o p e rm e a b le a l g a s (A B g e n e , S u r re y , R e in o U n id o ). A m b a s p la c a s s e in c u b a ro n a 30 ° C d u ra n te 12 -16 h o ra s ; la p la c a d e t r a b a jo s e a g itó v ig o ro s a m e n te . L a p la c a m a e s tra s e a lm a c e n ó a 4 ° C h a s ta q u e s e n e c e s itó , m ie n tra s q u e la s c é lu la s d e la p la c a d e t r a b a jo s e s e d im e n ta ro n (4000 rp m , 4 °C , 20 m in u to s ) y se re s u s p e n d ie ro n e n 1 ,0 m l d e L B c a rb e n ic il in a (50 p g /m l) IP T g 0 ,5 m M p a ra in d u c ir la e x p re s ió n d e F a b m e d ia n te a g ita c ió n v ig o ro s a d u ra n te 5 h o ra s a 30 °C . L a s c é lu la s in d u c id a s se c e n tr ifu g a ro n a 4000 rp m , 4 °C d u ra n te 20 m in u to s y s e re s u s p e n d ie ro n e n 0 ,6 m l d e ta m p ó n B ia c o re H B -S E P (H E P E S 10 m M p H 7 ,4 , N a C l 150 m M , E D T A 3 m M , P 20 a l 0 ,005 % v /v ) . La lis is d e la s c é lu la s re s u s p e n d id a s d e H B -S E P se lo g ró m e d ia n te c o n g e la c ió n ( -80 ° C ) y lu e g o d e s c o n g e la n d o a 37 °C . L o s lis a d o s c e lu la re s s e c e n tr ifu g a ro n a 4000 rp m , 4 ° C d u ra n te 1 h o ra p a ra s e p a ra r lo s re s id u o s d e lo s s o b re n a d a n te s q u e c o n te n ía n F a b , q u e p o s te r io rm e n te se f i l t ra ro n (0 ,2 p m ) u s a n d o u n a p la c a d e f i l t ra c ió n d e 96 p o c il lo s M illip o re M u lt iS c re e n A s s a y S y s te m y un c o le c to r d e v a c ío . S e u tiliz ó B ia c o re p a ra a n a liz a r lo s s o b re n a d a n te s f ilt ra d o s in y e c tá n d o lo s a t ra v é s d e C G R P e n el c h ip s e n s o r. L o s c lo n e s s e le c c io n a d o s p o r a f in id a d q u e e x p re s a n F a b s e re s c a ta ro n d e la p la c a m a e s tra , q u e p ro p o rc io n ó A D N m o ld e p a ra P C R , s e c u e n c ia c ió n y p re p a ra c ió n d e p lá s m id o s .

[0296] P re p a ra c ió n d e F a b a g ra n e s c a la . P a ra o b te n e r lo s p a rá m e tro s c in é tic o s , lo s F a b s e e x p re s a ro n a m a y o r e s c a la c o m o s ig u e . S e in o c u la ro n m a tra c e s E r le n m e y e r q u e c o n te n ía n 150 m l d e L B c a rb e n ic il in a (50 p g /m l) ^{g lu c o s a al 2 % c o n 1 m l d e un c u lt iv o n o c tu rn o " in ic ia d o r " d e un c lo n d e} E. coli ^{q u e e x p re s a b a F a b s e le c c io n a d o p o r}a f in id a d . E l re s to d e l c u lt iv o in ic ia d o r ( ~ 3 m l) s e u tiliz ó p a ra p re p a ra r A D N d e p lá s m id o (Q IA p re p m in i-p re p , k it de Q ia g e n ) p a ra la s e c u e n c ia c ió n y p o s te r io r m a n ip u la c ió n . E l c u lt iv o g ra n d e se in c u b ó a 30 °C c o n a g ita c ió n v ig o ro s a h a s ta q u e s e a lc a n z ó u n a O D 600nm d e 1 ,0 ( t íp ic a m e n te 12 -16 h). L a s c é lu la s se s e d im e n ta ro n m e d ia n te c e n tr ifu g a c ió n a 4000 rp m , 4 °C d u ra n te 20 m in u to s y s e re s u s p e n d ie ro n e n 150 m l d e L B c a rb e n ic il in a (50 p g /m l) IP T G 0 ,5 m M . D e s p u é s d e 5 h o ra s d e e x p re s ió n a 30 °C , la s c é lu la s se s e d im e n ta ro n c e n tr ifu g a n d o a 4000 rp m , 4 ° C d u ra n te 20 m in u to s , s e re s u s p e n d ie ro n en 10 m l d e ta m p ó n B ia c o re H B S -E P y s e lis a ro n u s a n d o un ú n ic o c ic lo d e c o n g e la c ió n (-8 0 ° C ) /d e s c o n g e la c ió n (37 °C ) . L o s l is a d o s c e lu la re s se s e d im e n ta ro n m e d ia n te c e n tr ifu g a c ió n a 4000 rp m , 4 °C d u ra n te u n a h o ra , y e l s o b re n a d a n te s e re c o g ió y f i l t ró (0 ,2 u m ). L o s s o b re n a d a n te s f i l t ra d o s s e c a rg a ro n en c o lu m n a s de s e fa ro s a d e s u p e r f lu jo N i-N T A (Q ia g e n , V a le n c ia , C A ) e q u ilib ra d a s c o n P B S , pH 8, lu e g o s e la v a ro n c o n 5 v o lú m e n e s d e c o lu m n a d e P B S , p H 8. F a b s in d iv id u a le s e lu id o s e n d ife re n te s f ra c c io n e s c o n P B S (p H 8 ) Im id a z o l 300 m M . L a s fra c c io n e s q u e c o n te n ía n F a b se c o m b in a ro n y d ia liz a ro n e n P B S , lu e g o s e c u a n tif ic a ro n m e d ia n te E L IS A a n te s d e la c a ra c te r iz a c ió n p o r a f in id a d .

[0297] P re p a ra c ió n d e a n t ic u e rp o c o m p le to . P a ra la e x p re s ió n d e a n t ic u e rp o s c o m p le to s , s e c lo n a ro n re g io n e s v a r ia b le s d e c a d e n a p e s a d a y lig e ra e n v e c to re s d e e x p re s ió n d e m a m ífe ro s y s e t r a n s fe c ta ro n u s a n d o lip o fe c ta m in a e n c é lu la s H E K 293 p a ra e x p re s ió n t ra n s ito r ia . L o s a n t ic u e rp o s se p u r if ic a ro n u s a n d o p ro te ín a A u s a n d o m é to d o s e s tá n d a r .

[0298] E l v e c to r p D b .C G R P .h F c G I e s un v e c to r d e e x p re s ió n q u e c o m p re n d e la c a d e n a p e s a d a d e l a n t ic u e rp o G1 y e s a d e c u a d o p a ra la e x p re s ió n tra n s ito r ia o e s ta b le d e la c a d e n a p e s a d a . E l v e c to r p D b .C G R P .h F c G I t ie n e s e c u e n c ia s d e n u c le ó t id o s c o r re s p o n d ie n te s a las s ig u ie n te s re g io n e s : la re g ió n p ro m o to ra d e l c ito m e g a lo v iru s m u r in o (n u c le ó t id o s 7 -612 ); un in tró n s in té t ic o (n u c le ó t id o s 613 -1679 ); la re g ió n c o d if ic a n te d e D H F R (n u c le ó t id o s 688 -1253 ); p é p tid o s e ñ a l d e la h o rm o n a d e l c re c im ie n to h u m a n a (n u c le ó t id o s 1899 -1976 ); re g ió n v a r ia b le d e c a d e n a p e s a d a d e G1 (n u c le ó t id o s 1 977 -2621 ); re g ió n c o n s ta n te d e Ig G 2 d e c a d e n a p e s a d a h u m a n a q u e c o n t ie n e la s s ig u ie n te s m u ta c io n e s : A 330 P 331 a S 330 S 331 (n u m e ra c ió n d e a m in o á c id o s c o n re fe re n c ia a la s e c u e n c ia d e Ig G 2 d e t ip o s ilv e s tre ; v é a s e E u r. J. Im m u n o l. (1999 ) 29 : 2613 -2624 ) . E l v e c to r p D b .C G R P .h F c G I se d e p o s itó en la A T C C el 15 d e ju l io d e 2005 y se le a s ig n ó e l n ú m e ro d e a c c e s o d e la A T C C P T A -6867.

[0299] E l v e c to r p E b .C G R P .h K G I e s un v e c to r d e e x p re s ió n q u e c o m p re n d e la c a d e n a lig e ra d e l a n t ic u e rp o G1 y e s a d e c u a d o p a ra la e x p re s ió n t ra n s ito r ia d e la c a d e n a lig e ra . E l v e c to r p E b .C G R P .h K G I t ie n e s e c u e n c ia s d e n u c le ó t id o s c o r re s p o n d ie n te s a la s s ig u ie n te s re g io n e s : la re g ió n p ro m o to ra d e l c ito m e g a lo v iru s m u r in o (n u c le ó t id o s 2 -613 ) ; in tró n d e E F -1 h u m a n o (n u c le ó t id o s 614 -1149 ); p é p tid o s e ñ a l d e la h o rm o n a d e l c re c im ie n to h u m a n a (n u c le ó t id o s 1160 1237); región variable de la cadena ligera del anticuerpo G1 (nucleótidos 1238-1558); región constante de la cadena kappa humana (nucleótidos 1559-1882). El vector pEb.CGRP.hKGI se depositó en la ATCC el 15 de julio de 2005 y se le asignó el número de acceso de la ATCC PTA-6866.

[0300] Ensayo Biacore para la determinación de la afinidad. Las afinidades del anticuerpo monoclonal G1 y sus variantes se determinaron a 25°C o 37°C utilizando el sistema de resonancia de plasmón de superficie (SPR) BIACORE30003 (Biacore, INC, Piscataway NJ). La afinidad se determinó capturando CGRP biotinilado N-terminalmente o fragmentos mediante estreptavidina preinmovilizada (chip sensor SA) y midiendo la cinética de unión de los fragmentos Fab de anticuerpo G1 o variantes tituladas a través del CGRP o fragmento en el chip. Todos los ensayos de Biacore se realizaron en tampón de ejecución HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, polisorbato P20 al 0,005% v/v). Las superficies de CGRP se prepararon diluyendo el CGRP N-biotinilado a una concentración de menos de 0,001 mg/ml en tampón HBS-EP e inyectándolo a través del chip sensor SA usando tiempos de contacto variables. Se utilizaron superficies de baja capacidad, correspondientes a niveles de captura <50 unidades de respuesta (RU) para estudios cinéticos de alta resolución, mientras que se utilizaron superficies de alta capacidad (aproximadamente 800 RU de CGRP capturado) para estudios de concentración, cribado y determinaciones de afinidad de solución. Los datos cinéticos se obtuvieron diluyendo el anticuerpo G1 Fab en serie en incrementos de dos o tres veces hasta concentraciones que abarcan 1 uM-0.1 nM (apuntadas a 0,1-10x Kd estimado). Las muestras se inyectaron típicamente durante 1 minuto a 100 pl/min y se dejaron tiempos de disociación de al menos 10 minutos. Después de cada ciclo de unión, las superficies se regeneraron con NaOH 25 mM en etanol al 25% v/v, que se toleró durante cientos de ciclos. Una serie de titulación completa (normalmente generada por duplicado) se ajustó globalmente a un modelo de unión de Langmuir 1:1 utilizando el programa BIAevaluation. Esto devolvió un par único de constantes de velocidad cinética de asociación y disociación (respectivamente, kon y koff) para cada interacción de unión, cuya relación dio la constante de disociación de equilibrio (Kd = koff/kon). Las afinidades (valores de Kd) determinadas de esta manera se enumeran en las Tablas 6 y 7.

[0301] Análisis de alta resolución de interacciones con velocidades extremadamente lentas de unión. Para interacciones con velocidades extremadamente lentas (en particular, el anticuerpo G1 Fab que se une a a-CGRP humano en el chip a 25°C), se obtuvieron afinidades en un experimento de dos partes. El protocolo descrito anteriormente se utilizó con las siguientes modificaciones. La constante de velocidad de asociación (kon) se determinó inyectando una serie de titulación de 2 veces (por duplicado) que abarca 550 nM-1 nM durante 30 segundos a 100 ml/min y permitiendo solo una fase de disociación de 30 segundos. La constante de velocidad de disociación (koff) se determinó inyectando tres concentraciones (alta, media y baja) de la misma serie de titulación por duplicado durante 30 segundos y dejando una fase de disociación de 2 horas. La afinidad (Kd) de cada interacción se obtuvo mediante la combinación de los valores kon y koff obtenidos en los dos tipos de experimentos, como se muestra en la Tabla 5.

[0302] La determinación de afinidad de solución por Biacore. La afinidad en solución del anticuerpo G1 por a-CGRP de rata y a-CGRP humano F37A (19-37) se midió mediante Biacore a 37°C. Se usó una superficie de chip CGRP de alta capacidad (se eligió el a-CGRP humano de alta afinidad para fines de detección) y el tampón de ejecución HBS-EP se hizo fluir a 5 pl/min. El fragmento Fab del anticuerpo G1 a una concentración constante de 5 nM (destinado a ser igual o inferior al Kd esperado de la interacción basada en solución) se preincubó con péptido competidor, ya sea a-CGRP de rata o F37A (19-37) humano a-CGRP, a concentraciones finales que abarcan de 1 nM a 1 mM en diluciones seriadas de 3 veces. Se inyectaron soluciones Fab de anticuerpo G1 en ausencia o presencia de péptido competidor basado en solución a través de CGRP en el chip y se controló el agotamiento de las respuestas de unión detectadas en la superficie del chip como resultado de la competencia de la solución. Estas respuestas de unión se convirtieron en "concentraciones de Fab libres" usando una curva de calibración, que se construyó titulando el anticuerpo G1 Fab solo (5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,325 y 0 nM) a través del CGRP en el chip. Las "concentraciones de Fab libres" se representaron gráficamente frente a la concentración de péptido basado en solución competidora usada para generar cada punto de datos y ajustarlo a un modelo de afinidad de solución usando el software BIAevaluation. Las afinidades de la solución determinadas (indirectamente) de esta manera se muestran en las Tablas 5 y 7 y se utilizaron para validar las afinidades obtenidas cuando los Fab se inyectan directamente a través de CGRP N-biotinilados en un chip SA. La estrecha concordancia entre las afinidades determinadas por estos dos métodos confirma que atar una versión N-biotinilada del CGRP al chip no altera su actividad de unión en solución nativa.

[0303] La Tabla 5 a continuación muestra las afinidades de unión del anticuerpo G1 a a-CGRP humano, p-CGRP humano, a-CGRP de rata y p-CGRP de rata determinadas por Biacore, haciendo fluir fragmentos Fab a través de CGRP N-biotinilados en un chip SA. Para resolver mejor las afinidades de las interacciones de unión con velocidades extremadamente lentas, también se determinaron las afinidades en un experimento de dos partes para complementar esta orientación del ensayo, también se determinó la afinidad en solución de la interacción a-CGRP de rata (como se describió anteriormente). La estrecha concordancia de las afinidades medidas en ambas orientaciones de ensayo confirma que la afinidad de unión del a-CGRP de rata nativo en solución no se altera cuando se N-biotinila y se une a un chip SA.

Tabla 5. Afinidades de unión de los Fabs del anticuerpo G1 titulados a través de CGRP en el chip

[0304] La tabla 6 a continuación muestra anticuerpos que tienen la variación de la secuencia de aminoácidos en comparación con el anticuerpo G1 y sus afinidades tanto por el a-CGRP de rata como por el a-CGRP humano. Todas las sustituciones de aminoácidos de las variantes mostradas en la Tabla 6 se describen en relación con la secuencia de G1. Biacore determinó las afinidades de unión de los fragmentos Fab haciéndolos fluir a través de los CGRP en un chip SA.

Tabla 6. Secuencias de aminoácidos y datos de afinidad de unión para variantes del anticuerpo G1 determinadas a 37°C por Biacore.

(C o n tin u a c ió n )

(C o n tin u a c ió n )

(C o n tin u a c ió n )

(Continuación)

[0305] Para determinar el epítopo en a-CGRP humano que es reconocido por el anticuerpo G1, se usaron los ensayos Biacore descritos anteriormente. El a-CGRP humano se compró como una versión N-biotinilada para permitir su captura de alta afinidad a través de chips sensores SA. Se determinó la unión del fragmento G1 Fab al a-CGRP humano en el chip en ausencia o presencia de un péptido CGRP. Típicamente, se inyectó una solución de péptido/Fab 2000:1 mol (p. ej., péptido 10 pM en Fab G1 50 nM) a través de a-CGRP humano en el chip. La Figura 6 muestra el porcentaje de unión bloqueada por el péptido competidor. Los datos que se muestran en la Figura 6 indican que los péptidos que bloquean el 100% de la unión de G1 Fab a a-CGRP humano son 1-37 (WT), 8-37, 26-37, P29A (19-37), K35A (19-37), K35E (19-37) y K35M (19-37) de a-CGRP humano; 1-37 de p-CGRP (WT); 1-37 de a-CGRP (WT) de rata; y 1-37 de p-CGRP (WT) de rata. Todos estos péptidos están amidados en el extremo C-terminal. Los péptidos F37A (19-37) y 19-37 (este último no amidado en el extremo C-terminal) del a-CGRP humano también bloquearon aproximadamente del 80% al 90% de la unión de G1 Fab al a-CGRP humano. El péptido 1-36 (no amidado en el extremo C-terminal) del a-CGRP humano bloqueó aproximadamente el 40% de la unión de G1 Fab al a-CGRP humano. Fragmento de péptido 19-36 (amidado en el extremo C-terminal) de a-CGRP humano; fragmentos de péptidos 1-13 y 1-19 de a-CGRP humano (ninguno de los cuales está amidado en el extremo C-terminal); y la amilina, calcitonina y adrenomedulina humanas (todas amidadas en el extremo C-terminal) no compitieron con la unión de G1 Fab a a-CGRP humano en el chip. Estos datos demuestran que G1 se dirige a un epítopo C-terminal de CGRP y que tanto la identidad del residuo más terminal (F37) como su amidación son importantes para la unión.

[0306] También se determinó afinidades de unión de G1 Fab a variantes de a-CGRP humano (a 37°C). La Tabla 7 siguiente muestra las afinidades medidas directamente titulando G1 Fab a través de a-CGRP humano N-biotinilado y variantes en el chip. Los datos de la Tabla 7 indican que el anticuerpo G1 se une a un epítopo C-terminal siendo F37 y G33 los residuos más importantes. G1 no se une a CGRP cuando se agrega un residuo de aminoácido adicional (alanina) en el C-terminal (que está amidado).

Tabla 7. Afinidades de unión de G1 Fab a a-CGRP humano y variantes medidas a 37°C (ver Tabla 4 para sus secuencias de aminoácidos)

[0307] Los datos anteriores indican que el epítopo que se une anticuerpo G1 es en el extremo C-terminal de a-CGRP humano, y los aminoácidos 33 y 37 en a-CGRP humano son importantes para la unión de anticuerpo G1. Además, la amidación del residuo F37 es importante para la unión.

Ejemplo 5: Efecto del anticuerpo G1 antagonista anti-CGRP sobre la vasodilatación de la piel inducida por la estimulación del nervio safeno de ratas

[0308] Para probar la actividad antagonista de anticuerpo G1 anti-CGRP, se ensayó el efecto del anticuerpo sobre la vasodilatación de la piel por estimulación del nervio safeno de ratas usando un modelo de rata descrito en el Ejemplo 3. Brevemente, las ratas se mantuvieron anestesiadas con isoflurano al 2%. Se administró tosilato de bretilio (30 mg/kg, administrado i.v.) al comienzo del experimento para minimizar la vasoconstricción debido a la estimulación concomitante de las fibras simpáticas del nervio safeno. La temperatura corporal se mantuvo a 37°C mediante el uso de una sonda rectal conectada termostáticamente a una manta calefactora de temperatura controlada. El nervio safeno de la pata trasera derecha se expuso quirúrgicamente, se cortó en sentido proximal y se cubrió con una envoltura de plástico para evitar que se secara. Se colocó una sonda láser Doppler sobre el lado medio-dorsal de la piel de la pata trasera, que es la región inervada por el nervio safeno. El flujo sanguíneo de la piel, medido como flujo de células sanguíneas, se controló con un medidor de flujo láser Doppler. En experimentos para determinar los efectos del anticuerpo dentro de las dos horas posteriores a la inyección, treinta a cuarenta y cinco minutos después de la inyección de tosilato de bretilio, cuando se estableció un flujo de línea base estable (menos del 5% de variación) durante al menos 5 minutos, el nervio se colocó sobre electrodos bipolares de platino y se estimuló eléctricamente (2Hz, 10V, 1 ms, durante 30 segundos) y nuevamente 20 minutos después. El promedio de la respuesta del flujo sanguíneo a estas dos estimulaciones se utilizó para establecer la respuesta inicial (tiempo 0) a la estimulación eléctrica. A continuación, se administraron por vía intravenosa (i.v.) el anticuerpo G1 (1 mg/kg o 10 mg/kg) o el vehículo (PBS con un volumen de Tween 20 al 0,01% igual a 10 mg/kg de G1). El nervio se estimuló posteriormente (2 Hz, 10 V, 1 ms, durante 30 segundos) a los 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos y 120 minutos después de la administración del anticuerpo. Los animales se mantuvieron bajo anestesia durante un período de aproximadamente tres horas. El cambio cumulativo en el flujo sanguíneo de la piel se estimó mediante el área bajo la curva de flujo-tiempo (AUC, que es igual al cambio en el flujo multiplicado por el cambio en el tiempo) para cada respuesta de flujo a estimulaciones de pulso eléctrico.

[0309] Como se muestra en la Figura 7, el aumento de flujo de sangre estimulado mediante la aplicación de pulsos electrónicos en nervio safeno fue inhibido significativamente por la presencia de anticuerpo G1 a 1 mg/kg (administrado i.v.) en comparación con el vehículo, cuando el nervio safeno era eléctricamente estimulado 90 min después de la administración del anticuerpo. El aumento del flujo sanguíneo estimulado mediante la aplicación de pulsos electrónicos en el nervio safeno se inhibió significativamente por la presencia de anticuerpo G1 a 10 mg/kg (administrado i.v.) en comparación con el vehículo, cuando el nervio safeno se estimuló eléctricamente a los 90 minutos y 120 minutos después de la administración del anticuerpo.

[0310] En los experimentos para determinar los efectos de los anticuerpos en los puntos de tiempo más largos en el ensayo safeno, las ratas se inyectaron i.v. con las dosis indicadas de anticuerpos 24 horas o 7 días antes de la preparación del animal para estimulación del nervio safeno como se describe anteriormente. En estos experimentos fue imposible establecer una respuesta inicial en ratas individuales a la estimulación de pulso eléctrico antes de la dosificación, por lo que los grupos tratados se compararon con los animales a los que se les administró vehículo (PBS, Tween 20 al 0,01%) a las 24 horas o 7 días.

[0311] Como se muestra en las figuras 8A y 8B, el flujo sanguíneo aumenta en la piel de pata trasera dorso-medial evocada por estimulación del nervio safeno se inhibieron significativamente en los grupos de animales dosificados con 10 mg/kg o 3 mg/kg G1 en 24 horas o 7 días antes de la estimulación en comparación con los grupos de vehículos dosificados en los mismos puntos de tiempo.

[0312] La figura 8C representa un análisis de ajuste de curva aplicado a los datos de respuesta a la dosis representados en las figuras 8A y 8B para determinar la dosis requerida para un efecto máximo del 50% (CE50). La CE50 a las 24 horas es de 1,3 mg/kg y la CE50 a los 7 días es ligeramente inferior (0,8 mg/kg).

Ejemplo 6: Efecto agudo del anticuerpo antagonista anti-CGRP mu7E9 en un ensayo de arteria dural (ventana craneal cerrada)

[0313] Modelo de ventana craneal cerrada: El propósito de este experimento fue determinar el efecto agudo de anticuerpos antagonistas anti-CGRP y compararlo con el efecto agudo del antagonista del receptor CGRP BIBN4096BS. Los experimentos se llevaron a cabo como se describió previamente (Williamson et al., Cephalalgia 17(4): 518-24 (1997)) con las siguientes modificaciones. Se anestesiaron ratas Sprague Dawley (300-400g) con 70 mg/kg de pentobarbital i.p. La anestesia se mantuvo con 20 mg/kg/h de pentobarbital iv. Las ratas se canularon a través de la vena yugular para administrar todos los fármacos. La presión arterial se controló con una sonda (catéter mikro-tip, Millar Instruments) introducida a través de la arteria femoral en la aorta abdominal. Las ratas fueron traqueotomizadas y la frecuencia respiratoria se mantuvo a 75 respiraciones por minuto a un volumen de 3,5 ml. Después de fijar la cabeza en un instrumento estereotáxico y retirar el cuero cabelludo, se hizo una ventana de 2x6 mm en el área parietal izquierda, justo lateral a la sutura sagital, adelgazando el hueso con un taladro dental. Usando un micromanipulador, se bajó un electrodo bipolar de platino sobre la superficie y se cubrió con aceite mineral pesado. Lateral a la ventana del electrodo se creó otra ventana de 5x6 mm y se llenó con aceite mineral pesado a través de la cual se monitoreó continuamente el diámetro de una rama de la arteria meníngea media (MMA) con una cámara CCD y un analizador de dimensiones de video (Living Systems). Las ratas se dejaron en reposo durante no menos de 45 minutos después de la preparación. Se estableció una respuesta inicial a la estimulación eléctrica (15 V, 10 hz, pulsos de 0,5 ms, 30 segundos) y luego se dosificó a las ratas por vía intravenosa con el compuesto experimental (10 mg/kg de mu7E9, 300 pg/kg de BIBN4096BS o PBS al 0,01%, Tween 20). Se realizaron estimulaciones eléctricas adicionales a los 5 (BIBN4096BS), 30, 60, 90 y 120 minutos después de la dosificación. Todos los datos se registraron utilizando un software de gráficos (ADInstruments).

[0314] Como se muestra en la Figura 9, mu7E9 a 10 mg/kg significativamente bloquea la dilatación de MMA evocada por la estimulación de campo eléctrico dentro de los 60 minutos después de la dosificación y mantiene el efecto durante toda la duración del ensayo (120 minutos). A modo de comparación, BIBN4096BS bloquea la dilatación de MMA dentro de los 5 minutos posteriores a la dosificación, pero el efecto ha desaparecido por completo a los 90 minutos. La magnitud del bloqueo es comparable entre BIBN4096BS y mu7E9.

Ejemplo 7: Efecto crónico del anticuerpo G1 antagonista anti-CGRP en un ensayo de arteria dural (ventana craneal cerrada)

[0315] El propósito de este experimento fue determinar si el anticuerpo anti CGRP todavía podría bloquear la dilatación MMA estimulada eléctricamente 7 días después de la dosificación. La preparación de las ratas fue idéntica al experimento agudo descrito anteriormente (Ejemplo 6) con las siguientes excepciones. Las ratas se inyectaron i.v. (10 mg/kg, 3 mg/kg o 1 mg/kg G1) 7 días antes de crear la preparación y estimulación de la ventana craneal cerrada. Fue imposible establecer una respuesta de dilatación inicial a la estimulación eléctrica antes de la dosificación como en el experimento agudo, por lo que los grupos de anticuerpos se compararon con la dilatación del MMA en un grupo de control dosificado con vehículo (PBS, Tween 20 al 0,01%). Después de dejar descansar a las ratas durante no menos de 45 minutos, la duramadre se estimuló eléctricamente a intervalos de 30 minutos. Las estimulaciones fueron a 2,5 V, 5 V, 10 V, 15 V y 20 V, todas a 10 Hz, pulsos de 0,5 ms durante 30 segundos.

[0316] Como se muestra en la Figura 10, G1 a 10 mg/kg y 3 mg/kg bloqueó significativamente la dilatación MMA evocada por estimulación eléctrica en el intervalo de 10 a 20 voltios. Estos datos demuestran que G1 puede bloquear la dilatación de MMA estimulada eléctricamente hasta 7 días después de la dosificación.

Ejemplo 8: Modelo de sofoco de retirada de morfina

[0317] El modelo de rata de retirada de morfina es un modelo de roedor establecido para mecanismos de sofoco de la menopausia (Sipe et al, Brain. Res. 1028 (2): 191-202 (2004); Merchenthaler y col., Maturitas 30: 307-316 (1998); Katovich y col., Brain Res. 494: 85-94 (1989); Simpkins y col., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)). Básicamente, las ratas son adictas a la morfina mediante la implantación de gránulos de morfina debajo de la piel. Tras la adicción, a los animales se les inyecta naloxona (antagonista opioide) que los envía a la abstinencia inmediatamente. Esta abstinencia se acompaña de un aumento de la temperatura de la piel, una disminución de la temperatura corporal central, un aumento de la frecuencia cardíaca y un aumento de la hormona luteinizante sérica. Todos estos son similares en magnitud y sincronización a lo que ocurre en los sofocos humanos (Simpkins et al., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)). Además, si las ratas se tratan con estradiol antes de inducir la abstinencia, los síntomas de los sofocos se reducen (Merchenthaler et al., Maturitas 30: 307-316 (1998)). Esta es la razón por la que se cree que el modelo de abstinencia de morfina imita los sofocos clínicos.

Se encargaron ratas ovariectomizadas a Charles River Laboratories. No menos de 7 días después de la ovariectomía se creó dependencia de la morfina mediante la implantación subcutánea de una pastilla de morfina (75 mg de base de morfina). Dos días después, se implantaron dos gránulos más. Al día siguiente, se inyectaron ratas por vía intravenosa con 10 mg/kg de 4901 [**] o vehículo (PBS, 0,01% de tween). Dos días después de la segunda granulación, las ratas se anestesiaron con ketamina (90 mg/kg) y se inmovilizaron ligeramente. Se pegó un termopar de temperatura superficial a la base de la cola y se utilizó un termopar rectal para medir la temperatura central. Los datos se registraron utilizando el software Chart (ADInstruments). Después de registrar 15 minutos de temperatura de referencia estable, se inyectó naloxona (1 mg/kg) por vía subcutánea. La temperatura se registró de forma continua durante los siguientes 60 minutos. Los resultados se muestran en las Figuras 11A y 11B.

Ejemplo 9: Toxicología no clínica y farmacocinética

[0318] Anticuerpo G1 antagonista anti-CGRP fue bien tolerado en estudios de toxicidad i.v. de dosis de repetición de 1 mes en ratas Sprague Dawley (SD) y monos cynomolgus y no se determinó toxicidad en órganos diana en cualquiera de estos estudios. Se estableció un nivel sin eventos adversos (NOAEL) de 100 mg/kg/semana para los estudios en ratas y monos. Este nivel de dosis correspondió a una exposición sistémica con una concentración máxima (Cmax) de 2.570 y 3.440 pg/ml y áreas bajo la curva (AUC (0-168h)) de 194.000 pgh/mL y 299.000 pgh/mL (Día 22) en ratas y monos, respectivamente.

[0319] En un estudio en ratas de 3 meses IV/SC, no se identificaron toxicidades de órgano diana y G1 fue bien tolerado hasta la dosis probada más alta, 300 mg/kg. En un estudio de 3 meses en monos, se observó inflamación perivascular de la arteria ciliar, como resultado de la deposición de complejos inmunes a > 100 mg/kg. Este hallazgo se atribuyó a la respuesta inmunogénica del mono a un anticuerpo humanizado y no se consideró clínicamente relevante. La dosis más alta probada de 300 mg/kg en este estudio con monos es al menos 10 veces mayor que la dosis clínica más alta anticipada de 2.000 mg o 29 mg/kg sobre una base de mg/kg (asumiendo un peso promedio del sujeto de 70 kg).

Ejemplo 10: Farmacocinética clínica

[0320] Se examinó la farmacocinética del anticuerpo G1 después de la exposición intravenosa única en cuatro estudios aleatorios, controlados con placebo, doble ciego que examinaron dosis entre 10 y 2.000 mg. Las concentraciones plasmáticas máximas (Cmax) se alcanzaron poco después del final de la perfusión intravenosa de 1 hora. La mediana del tiempo hasta la Cmax (Tmax) osciló entre 1,0 y 3,0 horas, seguida de una disminución multifásica. Cmax y la exposición total aumentaron aproximadamente de forma lineal con dosis crecientes de G1. La vida media terminal (t1^ ) osciló entre 36,4 y 48,3 días. No hay evidencia de metabolismo de G1 en el hígado, el modo principal de metabolismo es por degradación proteosómica.

[0321] Un estudio define la farmacocinética de dosis de 30 mg y 300 mg administrados dos veces, dos semanas de diferencia. Las concentraciones máximas y el área bajo el perfil concentración-tiempo aumentaron al aumentar la dosis. La vida media terminal aparente (t1^ ) después de la segunda dosis fue de 41,2 días (30 mg) y 50,0 días (300 mg) (media aritmética). Las proporciones de acumulación plasmática de G1 después de dos dosis i.v. administradas con 15 días de diferencia fueron 1,5 (30 mg) y 1,4 (300 mg).

Ejemplo 11: Seguridad clínica y farmacocinética

[0322] En seis estudios, el anticuerpo G1 se administró a 118 hombres y mujeres sanos, mientras que 57 sujetos masculinos y femeninos recibieron placebo. El estudio incluyó dosis i.v. únicas que van desde 0,2 mg hasta 2000 mg, dos dosis i.v. de hasta 300 mg administradas una vez cada 14 días y administración SC de 225 y 900 mg. Los seis estudios incluyeron: dos estudios de farmacodinamia (DP) y farmacodinámica (DP) de dosis única intravenosa en varones sanos (estudios B0141001 y B0141002); un estudio cruzado controlado con placebo de dos cohortes para examinar los efectos agudos de la administración intravenosa del anticuerpo G1 sobre la respuesta al brote de capsaicina en voluntarios sanos (B0141006); un estudio de dosis repetidas de grupos paralelos del anticuerpo G1 en voluntarios sanos masculinos y femeninos (B0141007); un estudio de dosis única que evalúa la seguridad y tolerabilidad de dosis de hasta 2.000 mg administradas por vía intravenosa a voluntarias sanas (B0141008), y un estudio que compara la seguridad relativa y la biodisponibilidad entre administración i.v. y SC (G1-SC-IV).

[0323] Los seis estudios se resumen a continuación en la Tabla 8. De los cinco estudios i.v. (B0141001, B0141002, B0141006, B0141007 y B0141008), tres tenían diseños y evaluaciones prácticamente idénticos. El estudio B014100 probó dosis de 0,2 mg, 1 mg y 3 mg administradas como una única infusión intravenosa de una hora. El estudio tuvo un diseño paralelo. Los participantes estuvieron confinados en la clínica durante siete días después de la infusión, con múltiples evaluaciones en cada uno de estos días. Después del alta, los pacientes fueron reevaluados una semana después del alta (día 14) y luego uno, dos y tres meses después de la infusión. El estudio B0141002 probó dosis que iban de 10 mg a 1000 mg como una sola administración. Finalmente, el estudio B0141008 probó dosis de 300 mg, 1000 mg, 1500 mg o 2000 mg. El estudio B0141006 fue distinto de los demás, ya que también tenía como objetivo integrar lecturas farmacodinámicas mediante la medición de la inhibición del brote de capsaicina hasta una semana después de la infusión intravenosa de anticuerpo G1.

[0324] Para los estudios de IV, los perfiles de eventos adversos fueron reportados (AES) para el primer período dosificado solamente. El estudio B0141007 probó múltiples dosis de anticuerpo G1 a 30 o 300 mg i.v. administrados con dos semanas de diferencia, utilizando un diseño paralelo. A cada sujeto elegible se le asignó una secuencia de aleatorización a través de un sistema interactivo en Internet que contenía la asignación del tratamiento. El esquema de aleatorización fue desarrollado por el estadístico principal. Los participantes en todos los estudios fueron en general hombres y mujeres sanos (de 18 a 65 años); todos los participantes firmaron formularios de consentimiento informado. Todos los estudios fueron aprobados por juntas de revisión de investigaciones (IRB). Los EA se definieron como cualquier acontecimiento médico adverso en los participantes del estudio clínico, con o sin relación causal con el fármaco del estudio. Los EA observados después de la administración del fármaco del estudio o del placebo se denominaron EA "de tratamiento emergente" (TEAE) independientemente de la posible causalidad con el fármaco del estudio. Todos los sujetos que experimentaron TEAE fueron seguidos a intervalos de tiempo apropiados hasta que el evento se resolvió o hasta que el evento se estabilizó y/o alcanzó una nueva línea de base. Todos los TEAE se clasificaron como leves, moderados o graves. Los EA graves (AAG) se definieron a priori como cualquier evento médico adverso que a cualquier dosis resultó en la muerte, fue potencialmente mortal (es decir, el sujeto estaba en riesgo inmediato de muerte en el momento del evento), requirió hospitalización o prolongación de hospitalización existente, resultó en una discapacidad/incapacidad persistente o significativa (p. ej., una interrupción sustancial de la capacidad del sujeto para llevar a cabo las funciones de la vida normal), resultó en una anomalía congénita/defecto congénito o cualquier otro evento de importancia médica. Los EA relacionados con el tratamiento (TRAE) debían considerarse cuando se presentaba una de las siguientes situaciones: 1) se pudo identificar una relación temporal plausible entre el inicio del EA y la administración del producto en investigación; 2) el EA no puede explicarse fácilmente por el estado clínico del paciente, la enfermedad intercurrente o las terapias concomitantes; y 3) el EA disminuyó al suspender el producto en investigación o reducir la dosis.

[0325] La presión arterial, frecuencia del pulso y temperatura oral se midieron en la selección, antes de la dosis, inmediatamente después de la final de la infusión y varias veces durante confinamientos de los pacientes en las clínicas, así como en todas las visitas clínicas. Las pruebas de laboratorio incluyeron química sérica, hematología y análisis de orina. Se realizaron pruebas de laboratorio de hematología, química, coagulación y seguridad urinaria en múltiples momentos de estudio. Los ECG se registraron en la selección, antes de la dosis el día 1, inmediatamente después del final de la infusión y otras cinco veces durante el primer día, así como en todas las visitas a la clínica. Los valores de QTcF se obtuvieron utilizando la fórmula de corrección de la frecuencia cardíaca de Fridericia (QTcF). Los valores absolutos y los cambios desde el inicio para el intervalo QT de parámetros ECG, frecuencia cardíaca, intervalo QTcF, intervalo PR e intervalo QRS se evaluaron por cohorte, tratamiento y tiempo después de la dosis. Además de las evaluaciones de seguridad descritas anteriormente, el Protocolo B014008 incluyó evaluaciones oftálmicas completas al inicio del estudio y en tres puntos temporales después de la dosificación (día 28, día 84 y día 168).

[0326] Se resumieron los datos clínicos y los signos vitales usando tablas descriptivas y estadísticas de resumen. Los datos de laboratorio y otros datos de seguridad se resumieron en función de cualquier cambio (valores fuera del rango de referencia), así como de cualquier cambio clínico relevante, que se definió a priori. Las tablas de resumen se estratificaron por dosis y los datos se agruparon entre los estudios. Además, las comparaciones de los datos consolidados para todas las exposiciones de anticuerpos G1 se contrastaron con placebo. El placebo también se contrastó con dosis de anticuerpo G1 de 100 mg y más (100 mg, 300 mg, 1000 mg, 1500 mg y 2000 mg) y con dosis de anticuerpo G1 de 1000 mg y más (1000 mg, 1500 mg y 2000 mg).

[0327] En el estudio IV/SC (G1-SC-IV), treinta y seis sujetos fueron asignados al azar para recibir una sola administración de anticuerpo G1 (225 o 900 mg) o placebo, administrado como una inyección en bolo subcutánea (SC) o una infusión intravenosa de 1 hora. Los sujetos fueron confinados en la unidad de investigación clínica durante siete días después de la dosificación y regresaron a la clínica periódicamente para visitas ambulatorias adicionales hasta el día 90 del estudio. Se realizaron ECG extensivamente el día 1 (antes de la dosis, horas 1,6, 12), El día 3 y el día 7 mientras los sujetos estaban confinados y una vez al finalizar el estudio (día 90). Los signos vitales, incluida la temperatura, la presión arterial y la frecuencia cardíaca, se recopilaron antes de la dosis, los días 1, 3, 7 y 90.

Tabla 8

[0328] A través de la amplia gama de dosificaciones evaluadas en los cinco estudios IV (0,2 a 2000 mg), anticuerpo G1 IV se toleró aceptablemente. La Tabla 9 resume la tasa general de eventos adversos (EA) por dosis para los estudios IV. Sobre la base de estos resultados de tolerabilidad, no han surgido preocupaciones evidentes sobre la seguridad. En todos los ensayos de los estudios IV, los participantes que recibieron placebo informaron un promedio de 1,3 eventos adversos emergentes del tratamiento (TEAE). Todos estos son eventos informados, independientemente de la opinión del investigador sobre la relación con el fármaco del estudio. En todas las dosis de G1 IV, la tasa fue de 1,4 TEAE/sujeto. Los sujetos que recibieron dosis de G1 de 100 mg o más tuvieron un promedio de 1,5 TEAE; los que recibieron dosis de 1.000 mg o más tuvieron un promedio de 1,6 TEAE.

Tabla 9

[0329] En los estudios IV, eventos adversos relacionados con el tratamiento (TRAEs, o EAs que podrían estar relacionados con la terapia según el investigador principal) fueron informados en 21,2% de los sujetos que recibieron IV G1, en comparación con 17,7% en los que recibieron placebo. A dosis de 100 mg de G1 o más, se produjeron TRAE en el 22,4% de los participantes. A dosis de 1000 mg o más, se produjeron TRAE en el 21,7% de los participantes. El anticuerpo G1 no parece estar asociado con ningún patrón clínicamente relevante de cambio en los signos vitales (presión arterial sistólica y diastólica [PA], temperatura y frecuencia cardíaca [FC]), anomalías del electrocardiograma (ECG) (incluidos QTcB y QTcF), reacciones en el sitio de infusión o hallazgos de laboratorio clínico. Hubo efectos limitados en las pruebas de función hepática (aspartato aminotransferasa [AST], alanina aminotransferasa [ALT], bilirrubina total y fosfatasa alcalina) con un aumento de grado 1 en la bilirrubina total en un sujeto que recibió placebo (Estudio B0141001), y un aumento de grado 1 en ALT en un sujeto que recibió placebo (Estudio B0141002). No se observaron anomalías clínicamente significativas de la función hepática entre los sujetos que recibieron cualquiera de las dosis estudiadas de G1. No hubo evidencia de diferencias entre G1 y placebo en las pruebas hematológicas que evalúan la función renal, los electrolitos o las pruebas de orina.

[0330] En el estudio IV/SC (G1-SC-IV), seguridad y tolerabilidad fueron comparables entre SC y rutas de administración IV. La frecuencia cardíaca y la presión arterial medias (diastólica y sistólica) no se vieron afectadas por el tratamiento con anticuerpo G1, ni hubo cambios significativos en ningún parámetro cardiovascular después del tratamiento con anticuerpo SC G1. En la Tabla 10 se muestra a continuación un resumen de los TRAE observados durante el estudio SC.

Tabla 10

[0331] En los estudios de dosis única (B0141001, B0141002, B0141006 y B0141008), se calcularon los parámetros farmacocinéticos (PK) para dosis que iban de 30 mg a 2000 mg. La vida media terminal media del grupo (t-io) varió de aproximadamente 40 a 48 días. La Cmax y la exposición total (evaluada por AUCinf) aumentaron al aumentar la dosis. El aumento de AUCinf pareció ser aproximadamente proporcional a la dosis entre 30 y 1000 mg y pareció ser mayor que la proporcional a la dosis entre 1000 y 2000 mg. El volumen de distribución fue bajo, entre 6-10 L.

[0332] En el estudio de dos dosis (B0141007), la vida media terminal aparente después de una segunda dosis estuvo entre 41 y 50 días. Las concentraciones plasmáticas se acumularon después de la segunda dosis, con un índice de acumulación de aproximadamente 1,5. Además, en el estudio IV/SC (G1-SC-IV), las evaluaciones farmacocinéticas indicaron que G1 tenía una vida media terminal similar cuando se administraba SC como IV.

Ejemplo 12: Seguridad no clínica

[0333] Se llevaron a cabo dos estudios evaluando la seguridad de G1 de anticuerpos en monos cynomolgus. En el primer estudio, se evaluó la seguridad de una sola dosis de anticuerpo G1. En el segundo estudio, se evaluó la seguridad de la dosificación repetida de anticuerpo G1. Cada uno de los estudios y sus resultados se describen con más detalle a continuación. Para los estudios de dosis única y repetida, el anticuerpo G1 se formuló como una solución de 51,4 mg/ml en histidina 20 mM, 84 mg/ml de trehalosa dihidrato, 0,2 mg/ml de polisorbato 80, 0,05 mg/ml de EDTA disódico dihidrato y 0,1 mg/ml L-metionina, pH ~ 5,5. El vehículo se formuló de forma idéntica sin el anticuerpo G1. Además, en ambos estudios, se tomaron muestras de sangre periódicamente para analizar la concentración plasmática del anticuerpo G1 utilizando un método ELISA validado.

[0334] Los datos se agregaron primero en tablas de resumen y figuras usando GraphPad Prism (versión 6.0) y Excel 2010 (Microsoft). Para el estudio de exposición única, los datos de telemetría se analizaron mediante ANOVA. El análisis se realizó utilizando SAS versión 8.2. Con el fin de normalizar el intervalo QT en un rango de intervalos R-R, se generaron factores de corrección de animales individuales (IACF) para cada animal relacionando cada intervalo RR con su intervalo QT asociado. La regresión lineal de esta relación de intervalo QT/RR se determinó para el conjunto de datos. La pendiente de esta regresión lineal se utilizó como IACF para el animal asociado en todos los tratamientos. Este IACF se utilizó para calcular el intervalo QT corregido (QTc) utilizando la siguiente ecuación:

QT-I(c) = Intervalo QT corregido por frequencia cardíaca = QT-I - [(RR - 300)*(IACF)].

[0335] Para el estudio de dosis múltiples, también se usó ANOVA unidireccional para analizar los datos. Si el ANOVA fue significativo (P < 0,05), se utilizó la prueba posterior de Dunnett para las comparaciones entre grupos. Para cada género, el grupo tratado se comparó con el grupo de control (vehículo) en el nivel de probabilidad de dos colas del 5%.

Dosis única de estudio de telemetría

[0336] Ocho monos cynomolgus adultos macho (Charles River Primates) fueron instrumentados quirúrgicamente con telémetros y se dejaron recuperar durante al menos dos semanas. Los implantes (DSI TL11M2-D70-PCT) y los receptores (RMC-1) fueron fabricados por Data Sciences International.

[0337] Los animales se aclimataron a las jaulas de adquisición de datos de telemetría al menos durante la noche antes de la dosificación. Durante la aclimatación, se realizó un registro previo al estudio de los parámetros hemodinámicos para verificar que los transductores y el equipo funcionaban correctamente. Durante la adquisición de datos telemedidos, los animales se alojaron individualmente en jaulas equipadas con receptores de telemetría. En los días de no recolección, los animales fueron alojados en jaulas sin receptores de telemetría. Los animales se mantuvieron en un ciclo diurno de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, con agua ad libitum y se alimentaron con una dieta certificada para primates.

[0338] Para la primera fase del estudio, se administró solo vehículo a animales (8 varones), y datos de telemetría fueron recogidos empezando ~1 hora pre-dosis a través de 22 horas después de la dosis. Seis días después de la administración del vehículo, los mismos animales recibieron una única administración intravenosa de anticuerpo G1 (100 mg/kg, una dosis ~ 10 veces mayor que la CE50 farmacológica en monos cynomolgus). Los datos electrocardiográficos y hemodinámicos telemedidos se registraron de nuevo continuamente de todos los animales. Además, estos animales se controlaron durante aproximadamente 24 horas los días 3, 7, 10 y 14 después de recibir su dosis única de anticuerpo G1. Las señales telemedidas de ECG y presión arterial se transmitieron a través de los dispositivos de radiotelemetría implantados a los receptores montados en cada jaula. Las señales adquiridas se pasaron a través de una matriz de intercambio de datos (modelo DSI DEM) y a un sistema de adquisición de datos basado en PC (software DSI Ponemah P3 versión 3,4); el software de análisis de datos fue Emka Technologies versión 2.4.0.20 (Emka Technologies). La frecuencia de muestreo analógica/digital fue de 1000 Hz para los datos de ECG telemedidos y de 500 Hz para los datos de la presión arterial. Los datos se registraron como medias de un minuto.

[0339] La presión arterial sistólica media (PAS) del grupo fue similar antes y después del tratamiento con el anticuerpo G1 durante el primer día después de la dosificación y en los días posteriores (los animales se midieron por telemedida los días 3, 7, 10 y 14 a intervalos de tiempo idénticos al día 1). En las horas 1-4 después de la dosificación, cuando las concentraciones sanguíneas de anticuerpo G1 estaban en niveles máximos (concentración media de 3.500 pg/ml a las 4 horas), la PAS media fue de 111 mmHg en comparación con 113 mmHg en el mismo intervalo de tiempo después de la administración del vehículo. Además, la pAs fue de 110 mmHg los días 3 y 7, 109 mmHg el día 10 y 110 mmHg el día 14 después de la administración del anticuerpo G1. Se registraron datos de PAS similares para otros intervalos de tiempo. Dado que este fue un estudio de diseño cruzado, los animales tratados sirvieron como sus propios controles. Cuando los datos se analizaron como diferencias en la presión sanguínea después de la administración anticuerpo G1 en comparación con el tratamiento con vehículo, hay reducciones menores estadísticamente significativas en la PAS en el intervalo de tiempo último en los días 7, 10 y 14.

[0340] Tras el tratamiento con anticuerpo G1, Se observó que la presión arterial diastólica (PAD) era aproximadamente 3 mmHg más baja que los valores medios obtenidos después de la administración del vehículo. Desde las horas 5-22, la media del grupo para el vehículo y el grupo de anticuerpos G1 fueron similares. La misma tendencia se observó en otros días, cuando se produjo una ligera disminución en la PAD (que van desde 2,62-3,5 mmHg) en el primer intervalo medido, con algunos cambios de magnitud similar observados esporádicamente en los días 7-10 en el intervalo de 7 22 horas. De manera similar a lo que se observó para el DBP, se observaron disminuciones menores en la frecuencia cardíaca durante la primera evaluación (horas 1-4) en relación con el tratamiento con vehículo. Las diferencias fueron indetectables durante las evaluaciones intermedias y se observaron una vez más entre las horas 18 y 22 en todos los días.

[0341] Por otra parte, con respecto a los hallazgos del ECG, no hubo cambios estadísticamente significativos en el intervalo QTc en cualquier punto de tiempo, en relación con el tratamiento con vehículo. Aunque se observaron cambios estadísticamente significativos en RR, PR, RS y QT durante el período de 14 días en comparación con el vehículo, todos fueron menores en valor absoluto.

Estudio de seguridad de la dosis de repetición

[0342] El estudio de seguridad de la dosis de repetición incluye 48 monos cynomolgus adultos, de género coincidente (6 por género por grupo) naíve de anticuerpo G1 (Charles River Primates). Los animales recibieron vehículo o anticuerpo G1 como una inyección intravenosa una vez a la semana durante 14 semanas en dosis de 10 mg/kg, 100 mg/kg o 300 mg/kg. En cada grupo, se permitió que dos animales de cada género se recuperaran durante 4 meses adicionales después del final de la dosificación.

[0343] Las mediciones de ECG y presión arterial se registraron una vez durante la fase previa al estudio, dos veces después de que se alcanzó el estado estable (antes de la dosificación y 4 horas después de la dosis el día 85) y una vez ~ 1 semana después del final de la dosificación (día 103 de la fase de recuperación). Los animales se anestesiaron con ketamina y se registraron los ECG utilizando ocho derivaciones. La medición de los ECG (incluida la frecuencia cardíaca) se realizó con los datos capturados utilizando el sistema de software Life Science Suite Ponemah Physiology Platform a través de DSI, utilizando las derivaciones I, II, aVF, CG4RL y CV4LL, como estándar. Se calculó una corrección de la frecuencia cardíaca para el intervalo QT (QTc) utilizando la fórmula de Bazett.

[0344] La presión arterial se registró antes de la primera dosis, después de 12 semanas de dosificación (13 dosis) y aproximadamente 1 semana después del final de la dosificación. No se observaron cambios significativos en SBP o DBP en ninguno de los grupos de animales tratados con respecto a los animales tratados con vehículo. Las frecuencias cardíacas medias de los grupos fueron relativamente consistentes entre los grupos de dosis y los puntos de tiempo medidos, sin diferencias estadísticas medidas. Las concentraciones plasmáticas de anticuerpo G1 se midieron durante la primera semana de dosificación y en el momento de las evaluaciones de la presión arterial y del ECG, demostrando acumulación con la dosificación semanal repetida.

[0345] Por otra parte, con respecto a los hallazgos del ECG, no hubo diferencias significativas en el intervalo QTc en todas las dosis y puntos de tiempo. Además, no se observaron cambios de ECG significativos o relevantes para ninguno de los parámetros de ECG evaluados durante el transcurso del estudio.

[0346] En resumen, el anticuerpo G1 fue muy bien tolerado en ambos estudios, sin cambios clínicamente significativos observados en ningún parámetro hemodinámico, ni los cambios pertinentes indicados en cualquier parámetro ECG. En los monos cynomolgus, los parámetros cardiovasculares y hemodinámicos no parecen verse afectados por la inhibición a largo plazo de CGRP con el anticuerpo G1.

Ejemplo 13: Estudio de fase 2

[0347] A la Fase 2, estudio de grupo paralelo controlado con placebo doble ciego multicéntrico aleatorizado, comparando la eficacia y seguridad de 4 regímenes de dosis de administración subcutánea de anticuerpo G1 (TEV-48125) versus placebo para el tratamiento de la cefalea postraumática

Criterio de valoración principal:

[0348] El criterio de valoración principal es el cambio medio desde el inicio (período de rodaje de 28 días) en el número de horas de dolor de cabeza de cualquier gravedad durante el período de 28 días después de la última (3a) dosis del fármaco del estudio.

Criterios de valoración secundarios:

[0349]

- Proporción de pacientes que alcanzan al menos una reducción del 50% en los días mensuales de cefalea de cualquier gravedad durante 3 meses de tratamiento con el fármaco del estudio

- Cambio medio desde el inicio (período de rodaje de 28 días) en el número de horas de dolor de cabeza de cualquier gravedad durante el período de 28 días después de la primera dosis del fármaco del estudio

- Cambio medio desde el inicio (período de rodaje de 28 días) en el uso de cualquier medicamento para el dolor de cabeza agudo durante el período de 28 días después de la última (3a) dosis del fármaco del estudio

- Cambio medio desde el inicio (día 0) en la puntuación de discapacidad, según lo medido por la prueba de impacto del dolor de cabeza de 6 ítems (HIT-6) a los 28 días después de la administración de la última (tercera) dosis del fármaco del estudio

Tamaño de muestra

[0350] 150 pacientes (30 por brazo).

Brazos del estudio

[0351]

- Brazo 1. Placebo

- Brazo 2. TEV-48125 SC 225 mg mensuales

- Brazo 3. TEV-48125 SC 675 mg mensuales

- Brazo 4. TEV-48125 IV 675 mg una dosis

- Brazo 5. TEV-48125 IV 1000 mg una dosis

Criterios de inclusión

[0352] Participantes con antecedentes de dolor de cabeza crónico postraumático según la ICHD-3.

Criterios de exclusión:

[0353]

- Inscripción actual o interrupción dentro de los últimos 30 días a partir de un ensayo clínico que involucre cualquier medicamento o dispositivo en investigación.

- Uso actual o exposición previa a cualquier anticuerpo de péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), cualquier anticuerpo contra el receptor CGRP o anticuerpo contra el factor de crecimiento nervioso (NGF). - Falló más de 4 ensayos adecuados de medicación preventiva

- Hipersensibilidad conocida a múltiples fármacos, anticuerpos monoclonales u otras proteínas terapéuticas. - Antecedentes o presencia de otra enfermedad médica que indique un problema médico que impediría la participación en el estudio.

- Evidencia de enfermedad psiquiátrica activa o inestable significativa, en opinión del investigador.

- Mujeres embarazadas o en período de lactancia

Tabla 11: Procedimientos y evaluaciones del estudio

Ejemplo 14: Estudio de fase 2

[0354] Un estudio de fase 2, multicéntrico, aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo, de grupos paralelos que compara la eficacia y seguridad de dos regímenes de dosis de TEV-48125 (uno subcutáneo y otro intravenoso) versus placebo para el tratamiento de la cefalea postraumática persistente (PPTH).

Población de estudio

[0355] La población de estudio estará compuesta por pacientes masculinos y femeninos, de 18 a 70 años, inclusive, con antecedentes de cefaleas postraumáticas persistentes (como se define en la Clasificación Internacional de Trastornos de Cefalea, tercera revisión [ICHD-3] criterios (IHS 2013).

[0356] Esto incluirá pacientes con dolor de cabeza persistente atribuido a una lesión traumática leve de la cabeza y pacientes con dolor de cabeza persistente atribuido a latigazo cervical. La lesión traumática en la cabeza se define como una lesión estructural o funcional resultante de la la acción de fuerzas externas en la cabeza. Estos incluyen golpear la cabeza con la cabeza o golpear un objeto, la penetración de la cabeza por un cuerpo extraño, las fuerzas generadas a partir de blastos o explosiones, y otras fuerzas aún por definir.

La duración de amnesia post-traumática se define como el tiempo que transcurre entre el traumatismo craneoencefálico y la recuperación de la memoria de los acontecimientos actuales y los que ocurren en las últimas 24 horas.

PPTH es un dolor de cabeza atribuido a un traumatismo craneoencefálico leve con una puntuación de la Escala de Coma de Glasgow (GCS) de 13 a 15, pérdida del conocimiento menor de 30 minutos y duración de la amnesia postraumática de menos de 24 horas definida como el tiempo entre el traumatismo craneoencefálico y la recuperación de la memoria de eventos actuales. Además, otros dos o más síntomas sugestivos de lesión cerebral traumática leve: náuseas, vómitos, alteraciones visuales, mareos y/o vértigo, deterioro de la memoria y/o concentración.

[0357] El dolor de cabeza persistente atribuido al latigazo es un dolor de cabeza que se ha desarrollado dentro de los 7 días posteriores al latigazo y con una duración de más de tres meses. Latigazo cervical, asociado en su momento a dolor de cuello y/o dolor de cabeza. El latigazo cervical se define como movimientos de aceleración/desaceleración repentinos e inadecuadamente restringidos de la cabeza con flexión/extensión del cuello. El latigazo cervical puede ocurrir después de fuerzas de impacto altas o bajas.

Criterios de valoración del estudio

[0358] Criterio de valoración principal: El criterio de valoración principal es el cambio medio desde el valor inicial (período de rodaje de 28 días) en el número promedio mensual de días con dolor de cabeza de gravedad al menos moderado durante el período de cuatro semanas después de la administración del fármaco del estudio.

[0359] Criterios de valoración secundarios: Los criterios de valoración secundarios son:

• proporción de pacientes que alcanzan al menos una reducción del 50% en el promedio mensual de días de dolor de cabeza de cualquier gravedad durante el período de 12 semanas de tratamiento con el fármaco del estudio • cambio medio desde el inicio (período de rodaje de 28 días) en el número de días con dolor de cabeza de cualquier gravedad durante el período de 5 a 8 semanas después de la primera dosis del fármaco del estudio

• cambio medio desde el valor inicial (período de rodaje de 28 días) en el número de días con dolor de cabeza de cualquier gravedad durante el período de 12 semanas después de la 1a dosis del fármaco del estudio

• cambio medio desde el inicio (día 0) en la puntuación de discapacidad, medido por la prueba de impacto del dolor de cabeza de 6 ítems (HIT-6) a las 12 semanas después de la administración del primer fármaco del estudio.

[0360] Criterios de valoración exploratorios: Los criterios de valoración exploratorios son los siguientes:

• cambio medio desde el inicio (período de rodaje de 28 días) en el número de días de dolor de cabeza de gravedad al menos moderada durante el período de 12 semanas después de la primera dosis del fármaco del estudio • proporción de pacientes que alcanzan al menos una reducción del 75% y una reducción total (100%) en el número promedio mensual de días con dolor de cabeza de cualquier gravedad durante el período de 12 semanas después de la primera dosis del fármaco del estudio

• proporción de pacientes que alcanzan al menos reducción del 50%, al menos reducción de un 75%, en el número de días con dolor de cabeza de cualquier gravedad durante el período de cuatro semanas después de la primera dosis del fármaco del estudio en relación con el período de referencia que mantiene este nivel de respuesta durante el período de 12 semanas después de la primera dosis de fármaco del estudio

• cambio medio desde el valor inicial (período de rodaje de 28 días) en el número promedio mensual de días con dolor de cabeza de cualquier gravedad durante el período de 12 semanas después de la primera dosis del fármaco del estudio

• cambio medio desde el valor inicial (período de rodaje de 28 días) en el número medio mensual de días con dolor de cabeza de gravedad al menos moderada durante el período de 4 semanas después de la primera dosis del fármaco del estudio

proporción de pacientes que alcanzan al menos una reducción del 50%, una reducción de al menos el 75% y una reducción total (100%) en el número medio mensual de días con dolor de cabeza de gravedad al menos moderada durante el período de ocho semanas después de la primera dosis del fármaco del estudio en relación con el período inicial

cambio medio desde el valor inicial (período de rodaje de 28 días) solo para pacientes con latigazo cervical, en el número promedio mensual de días de dolor de cuello de cualquier gravedad durante el período de 12 semanas después de la primera dosis del fármaco del estudio

cambio medio desde el inicio (período de rodaje de 28 días) en el uso de cualquier medicamento para el dolor de cabeza agudo (triptanos y compuestos del cornezuelo del centeno) durante el período de 12 semanas después de la administración del primer medicamento del estudio

cambio medio con respecto al valor inicial (período de rodaje de 28 días) en el uso de opioides, durante el período de 12 semanas después de la primera dosis de fármacos de estudio

el cambio medio desde el inicio (día 0) en la puntuación de discapacidad, según lo medido por la prueba de impacto de dolor de cabeza de 6 ítems (HIT-6) a las cuatro semanas después de la administración del primer fármaco de estudio

el cambio medio desde el inicio (día 0) en el estado de salud, medido por la salud física y mental de la encuesta de salud de formato corto de 12 elementos (SF-12), a las cuatro semanas después de la primera dosis de administración del fármaco en estudio

cambio medio desde el inicio (día 0) en la evaluación de la satisfacción del paciente, medido por la escala de Impresión Global del Cambio del Paciente (PGIC), a las 4, 8 y 12 semanas después de la administración de la primera dosis del fármaco del estudio

cambio medio desde el inicio (día 0), medido por el SCAT-3 "Herramienta de evaluación de conmociones cerebrales deportivas: 3a" hasta el final del período de evaluación, semana 12 después de la primera dosis del fármaco del estudio.

Diseño general y metodología:

Consulte la Tabla 12 para conocer los procedimientos y evaluaciones del estudio.

[0361] Un estudio de grupo paralelo controlado con placebo doble ciego multicéntrico aleatorizado, comparando la eficacia y seguridad de dos regímenes de administración de TEV-48125 (1 subcutánea y 1 intravenosa) versus placebo con un diagnóstico de dolor de cabeza postraumático persistente (PTH). El estudio consistirá en una visita de selección, un período de rodaje de 28 días y un período de tratamiento doble ciego que durará aproximadamente 12 semanas.

[0362] Los pacientes completarán una visita de selección (visita 1) después de proporcionar el consentimiento informado por escrito, y los pacientes elegibles entrarán en un periodo de rodaje que dura aproximadamente cuatro semanas (28 días) durante el cual van a introducir información de ataques de dolor de cabeza postraumático (PPTH) persistente en la línea de base en un dispositivo de diario de dolor de cabeza electrónico a diario. Los pacientes regresarán al centro del estudio después de completar el período de rodaje (visita 2). Los pacientes que cumplieron con los requisitos de elegibilidad en la visita de selección y después del período de rodaje de 28 días se asignaron al azar a uno de tres grupos de tratamiento:

un grupo de tratamiento recibió la primera dosis de TEV-48125 900 mg IV en una infusión durante una hora, trimestralmente;

un grupo de tratamiento recibió una primera dosis de TEV-48125 a 675 mg SC seguida de 225 mg SC en los dos meses siguientes; y

un grupo de tratamiento recibió tres dosis mensuales de placebo.

[0363] La aleatorización se realizará usando tecnología de respuesta interactiva electrónica (IRT).

[0364] El tratamiento a ciegas se administrará IV y SC el primer mes y SC el segundo y tercer mes para un total de tres dosis. La primera administración del tratamiento se producirá en la visita 2 y se administrarán dosis adicionales en las visitas 3 y 4. Los pacientes regresarán al centro del estudio aproximadamente cada cuatro semanas para el tratamiento ciego administrado SC para evaluaciones de seguridad y eficacia y muestras de sangre y orina para farmacocinética e inmunogenicidad, biomarcadores y análisis de farmacogenómica (a menos que lo prohíban las normativas locales). Las evaluaciones finales del estudio se realizarán en la visita final de este estudio (visita 5), aproximadamente 12 semanas después de la administración del fármaco del estudio.

Método de cegamiento y aleatorización:

[0365] El patrocinador, los investigadores, el personal del estudio (excepto el personal involucrado en los análisis bioanalíticos) y los pacientes estarán cegados a la asignación del tratamiento. Se proporcionará una lista maestra de aleatorización generada por computadora a las instalaciones de envasado de medicamentos. Los proveedores de envases empaquetarán el activo y el placebo en kits de visita única de acuerdo con los procedimientos de buenas prácticas de fabricación. Los kits serán idénticos en apariencia y contendrán un vial con el fármaco activo o placebo y jeringas precargadas (activo o placebo). El IRT gestionará el suministro adecuado de kits para las próximas visitas del estudio y se mantendrá (refrigerado entre 2°C y 8 °C) en el lugar.

[0366] Al final del período de selección, los pacientes serán aleatorizados si tienen al menos 6 o más días de dolor de cabeza de gravedad al menos moderada, durante el período de ejecución y al menos el 85% de cumplimiento del diario.

[0367] Este estudio es un estudio aleatorizado con estratificación en función del sexo, la gravedad de la lesión traumática en la cabeza (leve, moderada o grave) de acuerdo con la Clasificación IHS. Cada paciente se someterá a aleatorización en una proporción de 1:1:1 dentro del estrato al que pertenece para recibir TEV-48125 o placebo, según lo asignado por el IRT. El IRT administrará el suministro inicial de medicamentos, el mantenimiento de los suministros adecuados de medicamentos del estudio en el lugar y la aleatorización del estudio de manera centralizada.

Dosis de fármaco de estudio, modo de administración, y velocidad de administración:

[0368] Viales precargados (activo o placebo) estarán contenidos en kits con numeración única y se almacenarán (se refrigerarán entre 2°C y 8°C) en el lugar. Los viales activos para administración intravenosa (10 ml) contendrán TEV-48125 a una concentración de 150 mg/ml, y los viales de placebo (10 ml) contendrán el mismo vehículo y excipientes que los de la infusión e inyección activas. Las jeringas activas contendrán 150 mg/ml de TEV-48125 y las jeringas de placebo contendrán el mismo vehículo y excipientes que las de las inyecciones activas. Las jeringas precargadas (activas o placebo) y un vial estarán contenidos en kits numerados de forma única.

[0369] El fármaco del estudio será administrado por personal calificado del estudio y recuperará el kit debidamente numerado y extraerá un volumen del contenido del vial y lo agregará a 500 ml de solución salina normal, o inyecciones subcutáneas y se administrará de la siguiente manera:

• Pacientes aleatorizados para recibir TEV-48125 recibirán 900 mg de TEV-48125 como una infusión intravenosa de 1 hora y 3 (tres) inyecciones de placebo de 1,5 ml SC en la visita 2, e inyecciones SC únicas de 1,5 ml de placebo en las visitas 3 y 4.

• Pacientes aleatorizados para recibir TEV 41825 recibirán 675 mg en tres inyecciones activas (225 mg/1,5 ml) SC y placebo en una infusión intravenosa de 1 hora en la visita 2, e inyecciones activas únicas de 1,5 ml y 225 mg SC en las visitas 3 y 4.

[0370] Los pacientes asignados aleatoriamente para recibir placebo recibirán placebo como una infusión de 1 hora IV y tres 1,5 ml de inyecciones de placebo SC en la visita 2, y solo 1,5 ml de inyección de placebo SC en las visitas 3 y 4.

Investigación del producto: TEV-48125

Placebo: Mismo vehículo y mismos excipientes que los del activo

[0371] Duración de la participación del paciente: La participación del paciente tendrá una duración de aproximadamente 16 semanas (incluido un período de ejecución que dura aproximadamente cuatro semanas y un período de tratamiento doble ciego de 12 semanas). Se espera que los pacientes completen toda la duración del estudio.

[0372] Criterios de inclusión : Los pacientes pueden incluirse en el estudio si cumplen todos los criterios siguientes:

a. Participantes con un diagnóstico de cefalea postraumática persistente según los criterios de la ICHD-3 (versión beta)

b. Se ha producido una lesión traumática en la cabeza definida como una lesión estructural o funcional resultante de la acción de fuerzas externas sobre la cabeza. Estos incluyen golpear la cabeza con o golpear la cabeza con un objeto, penetración en la cabeza de un cuerpo extraño, fuerzas generadas por explosiones o explosiones y otras fuerzas aún por definir.

c. Se informa que el dolor de cabeza se desarrolló dentro de los siete días posteriores a una de las siguientes situaciones:

1. lesión traumática leve en la cabeza

2. recuperación del conocimiento después de la lesión en la cabeza

3. suspensión de medicamentos que afectan la capacidad de sentir o informar dolor de cabeza después de la lesión en la cabeza

d. El dolor de cabeza persiste durante más de 3 meses después de la lesión en la cabeza. El dolor de cabeza postraumático persistente (PPTH) atribuido a latigazo cervical se ha desarrollado dentro de los 7 días posteriores al latigazo cervical y con una duración superior a 3 meses. No habrá más del 30% de los pacientes con PPTH con latigazo cervical sin evidencia de lesión en la cabeza

e. El paciente firma y fecha el documento de consentimiento informado.

f. Hombres o mujeres de 18 a 70 años, inclusive

g. El paciente tiene al menos seis o más días de dolor de cabeza de gravedad al menos moderada durante el período de rodaje.

h. El paciente se encuentra en buen estado de salud, según lo determinado por su historial médico, examen médico, ECG, química sérica, hematología, análisis de orina y serología.

i. Todos los sujetos deben estar en edad fértil, definida como:

- mujeres quirúrgicamente estériles mediante histerectomía completa documentada, ooforectomía bilateral o ligaduras bitubales o confirmadas como posmenopáusicas (al menos un año desde la última menstruación y la hormona estimulador del folículo [FSH] por encima de 35 U/L);

- hombres quirúrgicamente estériles mediante vasectomía documentada; o

- si están en edad fértil, los sujetos deben cumplir cualquiera de los siguientes criterios:

* Los sujetos deben usar simultáneamente dos formas de métodos anticonceptivos altamente efectivos con sus parejas durante todo el período del estudio y durante 7,5 meses después de la última dosis del fármaco del estudio.

* La abstinencia sexual solo se considera un método muy eficaz si se define como abstenerse de tener relaciones heterosexuales en el período definido. La confiabilidad de la abstinencia sexual debe evaluarse en relación con la duración del estudio clínico y el estilo de vida preferido y habitual del sujeto. La abstinencia periódica (p. ej., métodos de calendario, ovulación, sintotérmicos, posovulación), declaración de abstinencia durante la duración del estudio y retiro no son métodos aceptables de la anticoncepción.

j. Las mujeres en edad fértil deben tener una prueba de embarazo de gonadotropina coriónica humana (p-HCG) en suero negativa en el momento de la selección (confirmada por la prueba de embarazo de p-HCG en suero en el momento del registro).

k. El paciente, si es hombre, es quirúrgicamente estéril o, si es capaz de producir descendencia, tiene exclusivamente parejas del mismo sexo o está utilizando actualmente un método anticonceptivo aprobado y acepta el uso continuo de este método durante la duración del estudio. Los métodos anticonceptivos aceptables incluyen la abstinencia, el uso de anticonceptivos esteroides por la pareja (oral, implantado o inyectado) junto con un método de barrera, el uso de un dispositivo intrauterino por la pareja o si la pareja es quirúrgicamente estéril. Además, los pacientes masculinos no pueden donar esperma mientras dure el estudio.

l. El paciente debe estar dispuesto y ser capaz de cumplir con las restricciones del estudio y permanecer en la clínica durante el tiempo requerido durante el período de estudio, y estar dispuesto a regresar a la clínica para la evaluación de seguimiento como se especifica en este protocolo.

[0373] Criterios de exclusión : los pacientes serán excluidos de participar en este estudio si cumplen con alguno de los siguientes criterios:

a. Antecedente de imagen cerebral que muestre evidencia de hemorragia intracraneal, hematomas subdurales o epidurales y hemorragias subaracnoideas como consecuencia del traumatismo craneoencefálico.

b. PPTH atribuido a craneotomía

c. El paciente tiene otro trastorno de dolor de cabeza no atribuible a un traumatismo craneoencefálico d. Pacientes con antecedentes (antes del traumatismo de la cefalea) de cualquier tipo de cefalea que tenga >6 días de cefalea al mes

e. El paciente está usando medicamentos que contienen opioides (incluida la codeína) y barbitúricos que contienen analgésicos en promedio más de 10 días al mes.

f. Inscripción actual o participación previa, dentro de los últimos 30 días, en un ensayo clínico que involucre cualquier medicamento o dispositivo en investigación, o 5,5 vidas medias, lo que sea más largo g. El uso actual o cualquier exposición previa a cualquier anticuerpo de péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), cualquier anticuerpo al receptor CGRP o anticuerpo al factor de crecimiento nervioso (NGF).

h. Hipersensibilidad conocida a múltiples fármacos, anticuerpos monoclonales u otras proteínas terapéuticas. i. Antecedentes o presencia de otra enfermedad médica que indique un problema médico que impediría la participación en el estudio.

j. Evidencia de enfermedad psiquiátrica activa o inestable significativa, en opinión del investigador.

k. El paciente es una mujer embarazada o en período de lactancia. (Cualquier mujer que quede embarazada durante el estudio será retirada del estudio).

l. El paciente ha participado anteriormente en un estudio clínico patrocinado por Teva con el fármaco del estudio.

m. Enfermedad hematológica, cardíaca, renal, endocrina, pulmonar, gastrointestinal, genitourinaria, neurológica, hepática u ocular clínicamente significativa, y el paciente tiene cualquier afección médica no controlada clínicamente significativa (tratada o no) a discreción del investigador.

n. El paciente no puede participar o completar con éxito el estudio, en opinión de su proveedor de atención médica o del investigador, por cualquiera de las siguientes razones:

- incapacitado mental o legalmente o incapaz de dar su consentimiento por cualquier motivo - bajo custodia debido a una causa administrativa o decisión legal, bajo tutela, o estar ingresado en un sanatorio o institución social

- imposibilidad de ser contactado en caso de emergencia

- tiene cualquier otra condición que, a juicio del investigador, haga al paciente inadecuado para su inclusión en el estudio

Medidas y puntos de tiempo:

[0374] Medida de eficacia primaria y punto de tiempo: el criterio de valoración principal de eficacia para este estudio se derivará de los datos de días de cefalea postraumática persistente (es decir, aparición de días de cefalea, duración de las cefaleas, gravedad de las cefaleas y uso de medicamentos específicos para el dolor de cabeza) recolectados diariamente usando un dispositivo electrónico de diario de dolor de cabeza.

[0375] Los pacientes elegibles recibirán capacitación sobre el uso del dispositivo de diario electrónico del dolor de cabeza y se le informará de los requisitos de cumplimiento en el cribado. Los pacientes completarán las entradas del diario de dolor de cabeza electrónico con preguntas sobre el día anterior todos los días, comenzando el día después de la visita de selección hasta la visita de EOT/retiro temprano. El dispositivo de diario electrónico de dolor de cabeza permitirá la entrada de información sobre el dolor de cabeza hasta 24 horas después de un día determinado.

[0376] Medidas de eficacia secundaria y puntos temporales: Los criterios de valoración secundarios de eficacia se derivarán de los datos de días de cefalea (es decir, aparición, duración de la cefalea, gravedad de la cefalea, y uso de medicación específica para el dolor de cabeza agudo recolectado diariamente usando un dispositivo electrónico de diario del dolor de cabeza. Además, la percepción del paciente de la mejoría será evaluada por la Prueba de Impacto del Dolor de Cabeza (HIT-6) después de 8 semanas de la primera dosis de administración del fármaco del estudio

[0377] Medidas de eficacia exploratoria y puntos temporales: Se evaluarán las siguientes medidas de eficacia exploratorias:

• criterios de valoración de eficacia exploratorios derivados de los datos de días de PTH (es decir, días de aparición de cefalea, duración, gravedad de la cefalea y uso de medicación específica para cefalea aguda, que se recopilan diariamente utilizando un dispositivo electrónico de registro de dolores de cabeza

• prueba de impacto del dolor de cabeza (cuestionario HIT-6)

• SF-12 salud física y mental

• cuestionario de impresión global del cambio del paciente (PGIC)

• SCAT-3 "herramienta de evaluación de conmociones cerebrales por deportes-3a:

Medida de seguridad y puntos temporales:

[0378] La seguridad y la tolerabilidad se evaluarán utilizando las siguientes medidas:

• consultas sobre eventos adversos

• consultas sobre el uso concomitante de medicamentos

• pruebas de laboratorio de seguridad (química sérica, hematología, coagulación y análisis de orina)

• prueba de p-HCG en suero/orina (solo mujeres en edad fértil)

• ECG de 12 derivaciones

• Mediciones de los signos vitales (presión arterial sistólica y diastólica, pulso y temperatura oral. La saturación de oxígeno debe medirse en casos de sospecha de anafilaxia. La frecuencia respiratoria también se medirá en estos casos (pero no como un signo vital estándar)

• exámenes físicos, incluido el peso corporal

• evaluación de la reacción de hipersensibilidad

• eC-SSRS

[0379] Medidas y puntos temporales de farmacocinética/biomarcadores/inmunogenicidad y de subestudio de biomarcadores: Medidas y puntos temporales de farmacocinética: Se recolectarán muestras de sangre para el análisis farmacocinético de TEV-48125 de todos los pacientes con el propósito de un enfoque de modelado farmacocinético poblacional y evaluación de la relación farmacocinética/farmacodinámica. Los parámetros farmacodinámicos serán las respuestas de eficacia.

[0380] La fecha y hora reales de cada muestra de sangre, así como la fecha y hora de la dosificación antes de cada muestra, se registrarán en el formulario de informe de caso. La concentración plasmática de TEV-48125 se medirá mediante un ensayo validado.

[0381] Medidas y puntos temporales de inmunogenicidad: se recogerán muestras de sangre para la inmunogenicidad.

[0382] Medidas y puntos Temporales de biomarcadores: Muestras de sangre y orina de biomarcadores se recogieron de todos los pacientes, y una muestra de sangre se recogieron de pacientes en la visita 2 o en cualquier visita a partir de entonces (a menos que esté prohibido por la regulación local).

Medicamentos permitidos y no permitidos antes y durante el estudio:

[0383] No más de 2 medicamentos independientemente de la indicación y sin restricciones en los agentes abortivos excepto opioides y barbitúricos (consulte los criterios de exclusión)

Consideraciones estadísticas:

[0384] Justificación de tamaño de la muestra: No se han realizado cálculos de potencia estadística prospectivos. Se elige un tamaño de muestra de 75 pacientes (25 pacientes por grupo de brazo de tratamiento) basándose en consideraciones clínicas y prácticas.

[0385] Análisis del criterio de valoración principal: el criterio de valoración principal de eficacia, el cambio medio desde el valor inicial (período de ejecución de 28 días) en el número promedio mensual de días de dolor de cabeza de gravedad al menos moderada durante el período de cuatro semanas después de la administración del fármaco de estudio, se analizará mediante un método de análisis de covarianza (ANCOVA). El modelo incluirá el tratamiento, el sexo y la gravedad (leve, moderada o grave) de la lesión traumática en la cabeza como efectos fijos. Se construirán intervalos de confianza del noventa y cinco por ciento para las diferencias medias de mínimos cuadrados entre cada grupo de TEV - 48125 y el grupo de placebo.

[0386] Análisis de criterios de valoración secundarios y exploratorios: El mismo análisis utilizado para el criterio de valoración primario de eficacia se realizará para los criterios de valoración de eficacia secundarios y exploratorios continuos. Para la proporción de respondedores definidos como una reducción del 50% o más desde el inicio en el promedio mensual de días de cefalea, se utilizará la prueba de Cochran-Mantel-Haenszel.

[0387] Comparaciones múltiples y m ultiplicidad: no habrá comparaciones múltiples.

Análisis de seguridad:

[0388] Todos los eventos adversos se codificarán utilizando el diccionario médico para actividades reguladoras. Cada paciente se contará solo una vez en cada término preferido o categoría de sistema de clasificación de órganos para los análisis de seguridad. Se presentarán resúmenes de todos los eventos adversos (generales y por gravedad), los eventos adversos que el investigador determine que están relacionados con el fármaco del estudio (definidos como relacionados o con relación faltante) (en general y por gravedad), eventos adversos graves y eventos adversos que causan la retirada del estudio. Se presentarán listados de pacientes de eventos adversos graves y eventos adversos que llevaron al retiro.

[0389] Hallazgos de tolerancia local serán listados y resumidos en forma descriptiva.

[0390] Los cambios en los datos de laboratorio y de medición de signos vitales se resumirán de forma descriptiva. Todos los valores se compararán con límites preespecificados para identificar cambios o valores potencialmente significativos desde el punto de vista clínico, y se enumerarán dichos valores.

[0391] El uso de medicamentos concomitantes se resumirá por clase terapéutica usando estadísticas descriptivas. Los medicamentos concomitantes incluirán todos los medicamentos que se tomen mientras el paciente recibe tratamiento con el medicamento del estudio.

[0392] Los datos de seguridad se resumirán de forma descriptiva en general y por grupo de tratamiento. Para las variables continuas, se proporcionarán estadísticas descriptivas (n, media, DE, mediana, mínimo y máximo) para los valores reales y los cambios desde la línea de base hasta cada punto temporal. Para las variables categóricas, se proporcionarán recuentos y porcentajes de pacientes. También se proporcionarán resúmenes descriptivos de eventos adversos graves, abandonos de pacientes debido a eventos adversos y valores anormales potencialmente significativos (laboratorio clínico o signos vitales) basados en criterios predefinidos.

[0393] Si algún paciente muere durante el estudio, se proporcionará una lista de muertes y toda la información relevante se discutirá en la narrativa del paciente incluida en el informe del estudio clínico.

[0394] Análisis de inmunogenicidad: se proporcionará un resumen de los resultados de inmunogenicidad y se calculará la incidencia de inmunogenicidad. Se evaluará el impacto de la inmunogenicidad en el perfil farmacocinético, la eficacia del fármaco y la seguridad clínica. Este análisis se informará por separado.

[0395] Análisis de biomarcadores: el análisis de biomarcadores incluirá regresión logística, curvas de características operativas del receptor y estadísticas de resumen. Los resultados se informarán por separado. Las mediciones se realizarán utilizando ensayos validados.

Tabla 12: Procedimientos y evaluaciones del estudio

(Continuación)

Ejemplo 15: El desarrollo de comportamientos relacionados con el dolor de cabeza en un modelo de rata clínicamente relevante de dolor de cabeza postraumático está mediado por CGRP

Materiales y métodos

Animales

[0396] Ratas Sprague-Dawley machos (Taconic, EE.UU.) que pesaban 250-300 g en el momento de la llegada fueron utilizados en todos los estudios. Los animales se alojaron en parejas bajo un ciclo constante de luz/oscuridad de 12 horas (luces encendidas a las 07:00h) a temperatura ambiente. Los alimentos y el agua estaban disponibles ad libitum. En todos los experimentos, los animales se asignaron aleatoriamente a grupos de traumatismo craneoencefálico cerrado simulado o leve (mCHI), así como para los diferentes tratamientos, y el grupo se ensayó de forma ciega. Todos los experimentos fueron aprobados y realizados de conformidad con el Comité de Uso y Cuidado de Animales institucional del Beth Israel Deaconess Medical Center y la Escuela de Medicina de Harvard y cumplieron con las pautas ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments).

Leve lesión en la cabeza experimental

[0397] MCHI experimental se indujo usando el dispositivo de conmoción por caída de peso como se describió previamente (Marmarou et al, J of Neurosurgery 1994; 80 (2):. 291-300; Mychasiuk et al, J Neurotrauma 2014;31 (8):749-757). Brevemente, las ratas se anestesiaron con isoflurano al 3% y se colocaron con el pecho hacia abajo directamente debajo de un dispositivo de traumatismo craneoencefálico con conmoción por caída de peso. El dispositivo consistía en un tubo cilíndrico hueco (diámetro interior 2,54 cm) colocado verticalmente sobre la cabeza de la rata. Para inducir un traumatismo craneal, se dejó caer un peso de 250 g a través del tubo desde una altura de 80 cm, golpeando el centro de la cabeza. Se colocó una esponja de espuma (grosor de 3,81 cm, densidad de 1,1 g/cm3) debajo de los animales para sostener la cabeza mientras se permitía algún movimiento anteroposterior sin ningún movimiento de rotación en el momento del impacto. Inmediatamente después del impacto, los animales se devolvieron a sus jaulas de origen para su recuperación. Todos los animales recuperaron la conciencia a los 2 minutos de la lesión y se evaluaron neurológicamente en las primeras horas y días posteriores a la lesión para detectar cualquier anomalía de comportamiento que sugiriera un deterioro neurológico. Los animales simulados fueron anestesiados pero no sometidos a la caída de peso. Todos los animales sometidos a evaluaciones de comportamiento de PTH no mostraron ningún déficit neurológico importante.

Pruebas de comportamiento

Sistema de monitoreo de campo abierto

[0398] Sistema de monitoreo de actividad SOF-811 (Med Associates, Vermont, EE.UU.) se utilizó para medir la actividad locomotora en un entorno de campo abierto. El sistema consta de una configuración de dos áreas y evalúa el movimiento de los animales en los planos horizontal (eje X-Y) y vertical (eje Z). Cada plano fue monitoreado por 16 haces espaciados a 2,54 cm de distancia, y había un emisor de infrarrojos y un detector por haz ubicado a cada lado de cada arena para monitorear el movimiento a lo ancho de la arena. Los datos se enviaron desde los 3 conjuntos de detectores-emisores a una computadora central que muestra un rango de salidas preseleccionadas que incluyen la distancia total recorrida y la actividad vertical (crianza) durante intervalos de 60 segundos y se analizaron como un total durante 20 minutos. Cada estadio se iluminó con una única bombilla LED blanca en un regulador de intensidad para mantener una iluminación homogénea en todos los escenarios (80 lux). Las arenas se limpiaron con un detergente suave y se secaron para eliminar las señales de olor entre ratas sucesivas. Las pruebas se realizaron al inicio del estudio (24 horas antes del traumatismo craneoencefálico) y luego a las 48 horas, 72 horas, 7 y 14 días después de la mCHI.

Reconocimiento de objeto nuevo

[0399] La prueba de reconocimiento de objetos nuevos está diseñada para evaluar los déficits en la memoria de reconocimiento en los roedores, como una medida de la gravedad de la lesión cerebral. El procedimiento utilizado para la prueba de reconocimiento de objetos nuevos fue similar al descrito anteriormente (King et al., Neuropharmacology 2004; 47 (2): 195-204; Moriarty et al., Behavioral brain research 2016; 303: 61-70), con algunas modificaciones. El aparato se construyó con arena Perspex (45 cm2). Los objetos "familiares" utilizados eran dos formas idénticas compuestas por bloques de construcción "Lego DUPLO". Un tercer objeto, el "objeto novedoso" consistía en una botella de plástico cubierta con cinta verde. Los animales se habituaron a la arena en ausencia de objetos durante 30 minutos el día anterior al día del ensayo. El día de la prueba constaba de tres etapas: habituación (exposición de 5 minutos a la arena en ausencia de objetos), exposición 1 (familiarización de 5 minutos con objetos idénticos) y exposición 2 (exposición de 5 minutos a un objeto familiar y uno nuevo). La habituación y la exposición 1 se separaron por un intervalo entre ensayos de 5 minutos y las exposiciones 1 y 2 por un intervalo adicional de 5 minutos. La exploración de un objeto se definió como cualquier comportamiento dirigido hacia él (es decir, olfatear, encabritarse, inclinarse o trepar). Las tres etapas de prueba se registraron para un análisis posterior y la exploración de objetos se evaluó manualmente de manera ciega. La razón de discriminación para cada objeto se calculó como el tiempo dedicado a explorar cualquier objeto/tiempo dedicado a explorar ambos objetos. Un índice de preferencia por encima de 0,5 (es decir, 50%) indica una preferencia de objeto nuevo, por debajo de 0,5, preferencia de objeto familiar y 0,5 en sí mismo, sin preferencia.

Prueba de Von Frey

[0400] El método utilizado se utilizó anteriormente para estudiar los comportamientos relacionados con el dolor de cabeza (Edelmayer et al., Methods Mol Biol 2012; 851:109-120; Oshinsky, Headache 2007; 47 (7): 1026-1036; Yan et al., Mol Pain 2012; 8: 6, Zhao et al., Pain 2014; 155 (7): 1392-1400). Brevemente, los animales se colocaron en un aparato de sujeción acrílico transparente de fondo plano (20,4 cm x 8,5 cm). El aparato era lo suficientemente grande como para permitir a los animales escapar del estímulo. Los animales se habituaron a la arena durante 15 minutos antes de la prueba. Para determinar si los animales desarrollaron hipersensibilidad mecánica pericraneal después de mCHI, se estimuló la región de la piel, incluyendo el área de la línea media por encima de los ojos y 2 cm posterior, con diferentes filamentos de von Frey (0.6g-10g) (18011 Semmes-Weinstein Anesthesiometer Kit). El desarrollo de hipersensibilidad de la pata trasera se ensayó estimulando la parte media dorsal de la pata trasera. Los cambios en la sensibilidad táctil de la piel se evaluaron de forma similar a estudios anteriores (Levy et al., Brain, Behavior, and Immunity 2012; 26 (2): 311-317) registrando cuatro respuestas conductuales adaptadas de Vos et al. (Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 1994; 14 (5 Pt 1): 2708-2723) de la siguiente manera: 0) Sin respuesta: la rata no mostró ninguna respuesta a la estimulación 1) Detección: la rata volvió la cabeza hacia el objeto estimulador y éste se explora generalmente olfateando; 2) Retirada: la rata giró la cabeza o la alejó enérgicamente del objeto estimulador (generalmente seguido de rascado o acicalamiento de la región estimulada); 3) Escape/Ataque: la rata giró su cuerpo rápidamente en el aparato de sujeción para escapar de la estimulación o atacó (movimientos de morder y agarrar) el objeto estimulador. Partiendo del menor peso, cada filamento se aplicó tres veces con un intervalo intraaplicación de 5 segundos y se registró el comportamiento que se observó al menos dos veces. Para el análisis estadístico, la puntuación registrada se basó en el comportamiento más aversivo observado. La fuerza que provocó tres respuestas de abstinencia consecutivas se consideró el umbral de respuesta. Para evaluar el comportamiento del dolor además de los cambios en el umbral, para cada rata, en cada punto de tiempo, se determinó una puntuación de respuesta acumulada mediante combinando las puntuaciones individuales (0 - 3) para cada uno de los filamentos VF ensayados. Todas las pruebas se realizaron y evaluaron de forma ciega. Las respuestas a los estímulos de von Frey se probaron al inicio del estudio y también a las 48 horas, 72 horas a los 7 y 14 días después de la mCHI.

Preferencia de posición condicionada utilizando sumatriptán

[0401] El método empleado fue adaptado de los informes publicados previamente (Griggs et al, Neuroreport. 2015; 26 (9): 522-527). Se utilizaron dos cajas de CPP (Med Associates, Vermont, EE. UU.), que constan de dos cámaras separadas, para evaluar la preferencia de la cámara antes y después de la fase de acondicionamiento del fármaco. Se eligió sumatriptán para el experimento de caracterización inicial, ya que previamente ha demostrado eficacia con CPP en un modelo de migraña preclínico (De Felice et al., Annals of neurology 2013; 74 (2): 257-265). En el día de preacondicionamiento (día 6 después de mCHI) se colocaron ratas simuladas o mCHI en cajas de CPP con acceso a ambas cámaras durante un período de 20 minutos y se registró el tiempo pasado en cada cámara. Las cámaras se discriminaron según las señales visuales (paredes) y táctiles (suelos). En la mañana del día de acondicionamiento (día 7 después de mCHI), los animales recibieron un control de vehículo (solución salina i.p.) y 2 horas más tarde se confinaron a la cámara emparejada con el vehículo durante 20 minutos. Por la tarde, 4 horas después de la inyección del vehículo, los animales recibieron sumatriptán, y 2 horas más tarde fueron confinados en la cámara opuesta (cámara emparejada con sumatriptán) durante 20 minutos. Se eligió un período de 2 horas entre la administración de sumatriptán y el confinamiento en la cámara, ya que los datos sugieren que la eficacia óptima del sumatriptán se observa 2 horas después de la administración (Tfelt-Hansen et al., Headache 1998; 38 (10): 748-755). 24 horas más tarde (día 8 después de mCHI), los animales se colocaron en el aparato CPP con acceso libre a ambas cámaras durante 15 minutos y se registró el tiempo que permanecieron en cada cámara.

Hipersensibilidad mecánica evocada por GTN

[0402] Dosis bajas de GTN (100 mg/kg) fueron administradas en el Día 15 y 30 post MCHI para investigar si cualquier aumento de la susceptibilidad a los factores desencadenantes del dolor de cabeza comunes existía en animales MCHI después de resolución de la hipersensibilidad de dolor cefálico 2 semanas después de la mCHI. El desarrollo de hipersensibilidad mecánica pericraneal y de las patas traseras se evaluó como anteriormente 1 hora y 4 horas después de la administración de GTN. Se investigó la administración aguda de sumatriptán o el bloqueo crónico de la acción de CGRP usando un mAb murino por su capacidad para atenuar la hipersensibilidad al dolor inducida por GTN.

Aversión al lugar condicionado inducida por GTN

[0403] Se ensayó la aversión al lugar condicionado a GTN usando las dos cajas de CPP como se indicó anteriormente. El protocolo incluyó un día previo al acondicionamiento (Día 13 después de la mCHI), seguido de un día de acondicionamiento (Día 14) y un día posterior al acondicionamiento 24 horas después. En la mañana del día de acondicionamiento, los animales se confinaron primero durante 20 minutos a una cámara, antes de la administración de GTN (cámara apareada pre-GTN). A continuación, se administró a los animales GTN y 4 horas más tarde se confinaron a la cámara opuesta (cámara emparejada con GTN) durante 20 minutos. El día posterior al acondicionamiento, los animales volvieron a tener libre acceso a ambas cámaras. La aversión a GTN se determinó calculando las puntuaciones de diferencia entre los tiempos pasados en las diferentes cámaras durante los días de preacondicionamiento y poscondicionamiento en animales tratados con el mAb anti-CGRP murino o la IgG de control.

Fármacos

[0404] El sumatriptán (Sigma, EE. UU.) se disolvió recientemente en solución salina al 0,9% y se administró intraperitoneal (i.p.) a una dosis de 1 mg/kg en un volumen de 1 ml/kg. Todas las pruebas de comportamiento se realizaron 2 horas después de la administración de sumatriptán. La dosis del fármaco y los tiempos de administración se basaron en la farmacocinética de los fármacos, así como en el trabajo piloto interno y los estudios publicados que demuestran su eficacia en modelos animales de dolor del trigémino (Oshinsky et al., Headache 2012; 52 (9): 1336 1349; Winner y col., Mayo Clin Proc 2003; 78 (10): 1214-1222). Teva Pharmaceuticals proporcionó un mAb específico de murino dirigido a CGRP y su IgG de control y se administraron i.p. a una dosis de 30 mg/kg en un volumen de 0,54 ml/100 g (Kopruszinski et al., Cephalalgia: an International Journal of Headache 2016). La primera administración se realizó inmediatamente después de la inducción de mCHI y posteriormente cada 6 días. GTN (American Reagent, EE.UU.) se disolvió recientemente en solución salina al 0,9% y se administró intraperitoneal (i.p.) a una dosis de 100 mg/kg en un volumen de 1 ml/kg. La concentración de vehículo final para el GTN fue 0,6% de propilenglicol, 0,6% de etanol y 0,9% de solución salina. Trabajos anteriores no han mostrado ningún efecto sobre los umbrales mecánicos con una concentración de vehículo de propilenglicol y etanol al 6% (Pradhan et al., Pain 2014; 155 (2): 269-274).

Análisis de datos

[0405] Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Statview (SAS Institute, Nueva York, NY, EE. UU.). La normalidad y la homogeneidad de la varianza se evaluaron mediante las pruebas de Shapiro-Wilk y Levene, respectivamente. Se realizó un análisis de varianza de medidas repetidas bidireccionales (ANOVA) para determinar los efectos principales del tiempo, el traumatismo craneoencefálico y el tratamiento farmacológico, o su interacción, sobre la actividad locomotora en campo abierto o el desarrollo de hipersensibilidad pericraneal utilizando el aparato de von Frey. Se utilizaron la prueba post hoc de LSD de Fisher o las pruebas t de Student de dos colas no emparejadas, según corresponda, para evaluar las diferencias entre los grupos y entre puntos temporales. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media. p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Reducción de la actividad de levantamiento vertical, pero sin evidencia de déficits cognitivos en MCHI/animales conmocionados

[0406] Siguiendo MCHI, animales mostraron actividad exploratoria vertical reducida (cría) en el campo abierto (RM ANOVA tiempo: F (4,56) = 7,03, p <0,01, lesión F (1, 14) = 21,31, p <0,01). Las pruebas t de dos colas no aparejadas de Student revelaron que el grupo de mCHI mostró una actividad exploratoria vertical disminuida de manera constante en comparación con el grupo simulado a las 48 horas, 72 horas y el día 7 después de la mCHI (p <0,01) (Figura 12A), lo que indica un daño cerebral traumático leve. En estos momentos, sin embargo, no se detectaron cambios en la distancia total recorrida, la exploración de la zona central o la tigmotaxis (todos p >0,05). Tampoco hubo evidencia de déficits cognitivos importantes en animales con mCHI a los 7 días después de la lesión según lo medido por la prueba de reconocimiento de objetos novedosos (p >0,05) (Figura 12B).

Desarrollo de hipersensibilidad táctil en animales mCHI

[0407] Utilizando filamentos de von Frey, se identificó un desarrollo dependiente del tiempo de hipersensibilidad táctil cefálica en mCHI, pero no en animales simulados. ANOVA de medidas repetidas reveló un efecto significativo de tiempo (F (4,48) = 7,54, p <0,001) y una interacción tiempo x lesión (F (4,48) = 5,71, p <0,001). Las pruebas t de Student de dos colas no emparejadas revelaron que los umbrales de respuesta se redujeron significativamente y las puntuaciones nociceptivas en el grupo mCHI aumentaron significativamente a las 72 horas y el día 7 (ambos p <0,05) en comparación con el grupo simulado (Figuras 13A y 13C). En ninguno de los puntos temporales probados, mCHI no condujo al desarrollo de hipersensibilidad mecánica en la pata trasera (Figuras 13B y 13D).

Efectos del tratamiento agudo con sumatriptán y bloqueo crónico de CGRP sobre la hipersensibilidad táctil cefálica inducida por mCHI

[0408] En general, el tratamiento agudo con sumatriptán a las 72 h atenuó post-CHI la hipersensibilidad táctil cefálica. (ANOVa unidireccional F (2, 17) = 8,79, p <0,05) (Figuras 14A y 14B). La capacidad de bloqueo crónico de CGRP usando inyecciones de un mAb de bloqueo, o IgG de control, comenzando inmediatamente después de mCHI y cada 6 días posteriormente se evaluó en el desarrollo de hipersensibilidad táctil cefálica relacionada con mCHI. En general, el bloqueo de CGRP atenuó la hipersensibilidad mecánica inducida por mCHI (tiempo de RM ANOVA: F (3, 39) = 17,76, p <0,001). Las pruebas t de Student no emparejadas de dos colas revelaron que el grupo tratado con mAb anti-CGRP tenía un umbral de respuesta significativamente mayor y una puntuación nociceptiva reducida en comparación con el grupo de control tratado con IgG en el día 7 después de mCHI (Figuras 14C y 14D, p <0,05). El tratamiento crónico con mAb anti-CGRP no tuvo ningún efecto sobre el umbral de respuesta mecánica en animales simulados, de acuerdo con el hallazgo actual de Kopruszinski et al., Quienes también emplearon un mAb anti-CGRP (Kopruszinski et al., Cephalalgia: an International Journal of Headache 2016).

Preferencia de posición condicionada relacionada con Sumatriptán en animales MCHI

[0409] Para investigar la naturaleza aversiva del dolor PTH en animales MCHI, el paradigma CPP se utilizó para determinar si el fármaco anti-migraña sumatriptán podría producir CPP en ratas MCHI pero no en controles simulados en 7 días después de la lesión en la cabeza. Las puntuaciones de diferencia (poscondicionamiento - diferencia de tiempo de preacondicionamiento para cada cámara) para ratas individuales indican que las ratas mCHI mostraron un tiempo significativamente mayor (p <0,01) en la cámara de sumatriptán en comparación con los controles simulados (Figura 15B), lo que sugiere que el tratamiento sistémico con sumatriptán alivió la aversión, efecto similar al dolor de cabeza de mCHI.

Desarrollo de hipersensibilidad mecánica después de la administración de GTN a animales mCHI asintomáticos

[0410] Para el día 14 post-mCHI, no existían diferencias significativas en la sensibilidad táctil cefálica entre los grupos simulado y mCHI. Para determinar si las ratas sometidas a mCHI desarrollaron una mayor sensibilidad al dolor táctil a un evento desencadenante de migraña, luego de la resolución de los síntomas conductuales agudos, probamos los cambios en las respuestas cefálicas y extracefálicas a la estimulación mecánica luego de la administración del desencadenante común de migraña g Tn en los días 15 y 30 posteriores a la lesión. El día 15, la administración de GTN dio como resultado una hipersensibilidad mecánica cefálica renovada y pronunciada en animales con mCHI (tiempo RM ANOVA: F (1, 14) = 38,68, p <0,001, tiempo x tratamiento con GTN F (2, 14) = 5,18, p <0,05), pero no en animales de simulación. Las pruebas post-hoc de LSD de Fisher revelaron que el grupo mCHI mostró un umbral de respuesta cefálica significativamente reducido y una puntuación nociceptiva aumentada en 1 h (p <0,01) y 4 h (p <0,001) después de GTN y en comparación con los controles simulados (Figuras 16A y 16B). El día 30 después de la mCHI, la GTN también produjo una hipersensibilidad cefálica pronunciada (tratamiento con RM ANOVA: F (1, 13) = 9,7, p <0,05, tiempo x tratamiento con GTN: F (2, 26) = 3,24, p <0,05). Las pruebas post-hoc de LSD de Fisher revelaron que el grupo de mCHI mostró un umbral de respuesta cefálica significativamente reducido y 1 h y 4 h después de la GTN (p <0,05) en comparación con los controles simulados y una puntuación nociceptiva aumentada a las 4 h después de la GTN (Figuras 16C y 16D, p <0,05).

[0411] La administración de GTN también indujo hipersensibilidad mecánica en las patas traseras que, sin embargo, se limitó a umbrales mecánicos reducidos, selectivamente en animales mCHI el día 15 (tiempo de RM ANOVA: F (2, 26) = 8,27, p <0,01 y tratamiento con GTN: F (1, 14) = 8,12, p <0,05) y el día 30 (tiempo r M ANOVA: F (2, 26) = 37,04, p <0,05, y tratamiento con GTN: F (2, 26) = 3,24, p <0,05) post - lesión. Las pruebas post-hoc de LSD de Fisher revelaron que el grupo mCHI mostró umbrales mecánicos significativamente reducidos a las 4 h después de la GTN (p <0,05) el día 15 y 1 h después de la GTN el día 30, en comparación con los controles simulados (Figuras 17A y 17C, p <0,05).

Efectos del tratamiento agudo con sumatriptán y bloqueo CGRP crónico sobre la hipersensibilidad mecánica evoacada por GTN en animales MCHI

[0412] En el día 15 post MCHI, el tratamiento agudo con sumatriptán atenuó la hipersensibilidad cefálica mecánica evocada por GTN retardada (en 4 h) cuando se administra 1 h después de GTN. Las pruebas t de Student no apareadas de dos colas revelaron que el tratamiento agudo con sumatriptán redujo significativamente tanto la disminución del umbral de respuesta como el aumento de la puntuación nociceptiva en comparación con los animales tratados con vehículo (p <0,001 y p <0,05, Figuras 18A y 18B). El tratamiento con sumatriptán no atenuó la hipersensibilidad de la pata trasera provocada por GTN en animales mCHI. El tratamiento crónico con mAb anti-CGRP previno la hipersensibilidad mecánica inducida por GTN el día 15 después de la mCHI. Las pruebas t de Student no emparejadas de dos colas revelaron que el grupo de mAb anti-CGRP mostró un umbral de respuesta significativamente mayor y una puntuación nociceptiva reducida en comparación con el grupo de IgG de control (p <0,05, p <0,01 respectivamente, Figuras 18C y 18D). En comparación con el tratamiento con la IgG de control, el tratamiento con mAb anti-CGRP también fue eficaz para atenuar los umbrales mecánicos reducidos inducidos por GTN a los 30 días después de la lesión (p <0,05, pruebas t de Student de dos colas no emparejadas). Sin embargo, el tratamiento con mAb anti-CGRP fue ineficaz para bloquear la hipersensibilidad de la pata trasera provocada por GTN en animales mCHI.

Aversión al lugar condicionado a GTN

[0413] Utilizando el paradigma de aversión al lugar condicionado, se probó la administración de GTN después de mCHI para ver si podía inducir un comportamiento similar al dolor continuo que responde a tratamientos con mAb anti-CGRP. La administración de GTN a animales mCHI el día 14 después de mCHI dio como resultado una aversión al lugar condicionada, es decir, tiempo reducido en la cámara emparejada de GTN, en animales tratados con la IgG de control, lo que sugiere dolor evocado por GTN en animales mCHI en momentos en que la hipersensibilidad al dolor cefálico ya estaba resuelta. No hubo evidencia de una aversión al lugar condicionada evocada por GTN similar en animales mCHI tratados con el mAb anti-CGRP (Figuras 19A y 19B), lo que sugiere que el dolor provocado por GTN en animales mCHI es dependiente de CGRP.

Efecto del tratamiento crónico con mAb anti-CGRP sobre los comportamientos relacionados con la PTH

[0414] Los principales hallazgos del estudio son: 1) La conmoción cerebral a través de mCHI se asoció con una fase aguda de cría reducida (es decir, actividad exploratoria), pero no con déficits motores o cognitivos, lo que sugiere una forma leve y transitoria de lesión cerebral traumática (Kilbourne et al., J Neurotrauma 2009; 26 (12): 2233-2243), 2) Los animales con conmoción cerebral desarrollaron hipersensibilidad al dolor táctil cefálico que se resolvió 2 semanas después - lesión, y que fue atenuada por el tratamiento agudo con sumatriptán y la inhibición prolongada de CGRP a través de un mAb bloqueante, 3) Los animales sometidos a mCHI mostraron un comportamiento espontáneo/continuo similar al dolor en el paradigma CPP cuando se utilizó el tratamiento sistémico con sumatriptán como tratamiento analgésico, y 4) Después de la resolución de los comportamientos de dolor de cabeza/dolor, la administración del desencadenante del dolor de cabeza GTN dio como resultado una hipersensibilidad cefálica renovada y pronunciada, así como una aversión condicionada al lugar que fue inhibida por tratamientos de sumatriptán y mAb anti-CGRP.

[0415] En la actualidad, no existen pautas de tratamiento basadas en la evidencia para la gestión de PTH, por lo que es a menudo tratada similar a la cefalea primaria que se asemeja, con estudios que muestran la eficacia de sumatriptán en algunos pacientes PTH con características migrañosas (Abend et al., J Child Neurol 2008; 23 (4): 438-440; Lucas, Curr Pain Headache Rep 2015; 19 (10): 48). Sin embargo, debido a que una proporción significativa de pacientes no responde al tratamiento con triptanos (Visser et al., Headache 1996; 36 (8): 471-475), se necesitan otras opciones de terapia. Basado en el papel hipotético del CGRP en la migraña y el dolor de cabeza (Pietrobon et al., Annu Rev Physiol 2013; 75: 365-391; Russo, Annual review of pharmacology and toxicology 2015; 55: 533-552), una estrategia de terapia emergente prometedora se dirige al CGRP o su receptor utilizando mAbs de bloqueo (Mitsikostas et al., BMC Med 2015; 13: 279). Los ensayos de fase IIb de uno de estos mAb, TEV-48125, han demostrado resultados favorables en términos de seguridad, eficacia y tolerabilidad de este agente (Bigal et al., Lancet Neurol 2015; 14 (11): 1081-1090; Bigal et al., Lancet Neurol 2015; 14 (11): 1091-1100). Los resultados del estudio actual indican que la inhibición de CGRP a través de un mAb neutralizante específico para roedores puede reducir los síntomas de dolor de cabeza/dolor evocados por mCHI, lo que sugiere la participación de CGRP en la mediación del desarrollo del dolor por PTH. El tratamiento con mAb anti-CGRP también fue eficaz para atenuar la hipersensibilidad mecánica cefálica relacionada con GTN en animales mCHI y atenuó la aversión al lugar condicionado a GTN, lo que apunta a que CGRP también es un mediador del efecto de cebado hiperalgésico provocado por el traumatismo craneal. en particular la alodinia similar a un dolor de cabeza y el dolor continuo inducido por GTN. Dado que es poco probable que el mAb cruce la barrera hematoencefálica (debido a su gran peso molecular), su mecanismo de acción en animales mCHI probablemente implica un sitio periférico, potencialmente la interrupción de la respuesta inflamatoria meníngea o perióstica evocada por mCHI. Debido a que el tratamiento con mAb anti-CGRP fue ineficaz para mejorar el desarrollo de la sensibilización mecánica de la pata trasera provocada por GTN, propusimos que esta respuesta en animales mCHI está mediada centralmente.

Depósito de material biológico

[0416] Los siguientes materiales se han depositado en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, e E. UU. (ATCC):

Material N° de anticuerpo N° de acceso ATCC Fecha del depósito pDb.CGRP.hFcGI cadena pesada G1 PTA-6867 15 de julio de 2005 pEb.CGRP.hKGI cadena ligera G1 PTA-6866 15 de julio de 2005

[0417] El vector pEb.CGRP.hKGI es un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena ligera G1 y la región constante kappa de la cadena ligera; y el vector pDb.CGRP.hFcGI es un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena pesada G1 y la región constante de la cadena pesada IgG2 que contiene las siguientes mutaciones: A330P331 a S330S331 (numeración de aminoácidos con referencia a la secuencia de IgG2 de tipo silvestre; ver Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624).

[0418] Estos depósitos se hicieron bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento de Patentes y su Reglamento (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha del depósito. El depósito estará disponible por ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre Rinat Neuroscience Corp. y ATCC, que asegura la disponibilidad permanente e irrestricta de la progenie del cultivo del depósito al público tras la emisión de la patente de Ee . UU. pertinente o al abrir al público cualquier solicitud de patente de EE. UU. o extranjera, lo que ocurra primero, y asegura la disponibilidad de la progenie para una determinada por el Comisionado de Patentes y Marcas de EE. UU. para tener derecho a la misma de acuerdo con la Sección 122 de 35 USC y las reglas del Comisionado de conformidad con las mismas (incluida la Sección 1,14 del 37 CFR con especial referencia a 886 OG 638).

[0419] El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en depósito muere o se pierde o destruye cuando se cultiva en condiciones adecuadas, los materiales se reemplazarán rápidamente, previa notificación, por otro de los mismos. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

Secuencias de anticuerpo

[0420]

Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada G1 (SEQ ID NO:1)

EVQ LVESG G G LVQ PG G SLR LSC AASG FTFSN YW ISW VR Q APG KG LEW VAEIR SESD A

SATH YAEAVKG R FTISR D N AKN SLYLQ M N SLR AED TAVYYC LAYFD YG LAIQ N YW G Q G

TLVTVSS

Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera G1 (SEQ ID NO: 2)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYLGIP

ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIK

G1 CDR H1 (CDR extendido) (SEQ ID NO: 3)

GFTFSNYWIS

G1 CDR H2 (SEQ ID NO: 4)

EIRSESDASATHYAEAVKG

G1 CDR H3 (SEQ ID NO: 5)

YFDYGLAIQNY

G1 C D R L1 (S E Q ID N O : 6 )

K A S K R V T T Y V S

^{G1 C D R L 2 (S E Q ID N O :} 7)

G A S N R Y L

G1 C D R L 3 (S E Q ID N O : 8 )

S Q S Y N Y P Y T

S e c u e n c ia d e n u c le ó t id o s d e re g ió n v a r ia b le d e c a d e n a p e s a d a d e G1 (S E Q ID N O : 9 )

GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCCCTGC GT CT GT CCT GCGCTGCTT CCGGTTT CACCTT CT CCAACT ACT GGAT CT CCTGGGTT CGT C AGGCT CCT GGT AAAGGT CT GG AATGGGTT GCT G AA AT CCGTT CCG AAT CCG ACGCGT CCGCT ACCCATT ACGCT G AAGCT GTT AA AGGT CGTTT C ACC AT CT CCCGT G ACAACGCT A AG AACT CCCT GT ACCT GCAG AT G AACT CCCTGCGT GCT G AAG AC AC CGCT GTTT ACT ACTGCCT GGCTT ACTTTG ACT ACGGT CTGGCT AT CC AG AACT ACT GGGGT C AGGGT ACCCT GGTT ACCGTTT CCT CC

S e c u e n c ia d e n u c le ó t id o s d e re g ió n v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra G 1 (S E Q ID N O : 10 )

G AAAT CGTT CT G ACCC AGT CCCCGGCT ACCCT GT CCCT GT CCCCAGGT G AACGT GCT ACCCT GT CCT GCAAAGCTT CC AAACGGGTT ACC ACCT ACGTTT CCT GGT ACC AGC AG A AACCCGGT CAGGCT CCT CGT CTGCT GAT CT ACGGT GCTT CCAACCGTT ACCT CGGT AT

CCCAGCT CGTTT CT CCGGTT CCGGTT CCGGT ACCG ACTT C ACCCT G ACCAT CT CCT CC CT GGAACCCGAAGACTT CGCT GTTT ACT ACTGCAGT CAGT CCT ACAACT ACCCCT ACA CCTT CGGT C AGGGT ACC AA ACT GG A AAT C A AA

S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e l a n t ic u e rp o c o m p le to d e c a d e n a p e s a d a G1 (q u e in c lu y e Ig G 2 m o d if ic a d a c o m o s e d e s c r ib e e n e s te d o c u m e n to ) (S E Q ID N O : 11 )

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVAEIRSESDA SATHYAEAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCLAYFDYGLAIQNYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e l a n t ic u e rp o c o m p le to d e c a d e n a lig e ra G 1 (S E Q ID N O : 12 )

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRLUYGASNRYLGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Secuencia de nucleótidos de anticuerpo completo de cadena pesada G1 (que incluye IgG2 modificada como se describe en este documento) (SEQ ID NO: 13)

GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCCCTGC GTCTGTCCTGCGCTGCTTCCGGTTTCACCTTCTCCAACTACTGGATCTCCTGGGTT CGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCTGAAATCCGTTCCGAATCCG ACGCGT CCGCT ACCCATT ACGCT G AAGCT GTT AAAGGT CGTTT C ACC AT CT CCCGT G AC AACGCT A AG AACT CCCT GT ACCT GCAG AT G AACT CCCTGCGT GCT G AAG AC A CCGCT GTTT ACTACTGCCTGGCTT ACTTT GACT ACGGT CTGGCT AT CCAGAACTAC TGGGGT C AGGGT ACCCTGGTT ACCGTTTCCT CCGCCT CCACCAAGGGCCC AT CT G TCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGG GCTGCCT GGT C AAGG ACT ACTT CCCAG AACCT GT G ACCGT GT CCTGG AACT CT GG CGCT CT G ACCAGCGGCGT GCACACCTT CCCAGCT GT CCT GCAGT CCT CAGGT CT C T ACT CCCT CAGCAGCGTGGT GACCGTGCCAT CC AGCAACTT CGGCACCCAG ACCT ACACCTGC AACGTAGAT CACAAGCC AAGCAACACCAAGGT CGACAAG ACCGT GGA G AGAAAGT GTT GT GT GGAGT GT CCACCTT GT CCAGCCCCT CCAGT GGCCGG ACCA T CCGT GTT CCT GTT CCCT CCAAAGCCAAAGGACACCCT G AT G AT CT CCAG AACCCC AG AGGT G ACCT GT GT GGT GGT GG ACGT GT CCC ACG AGG ACCC AG AGGT GC AGTT C AACT GGT AT GT GG ACGG AGTGG AGGT GC AC AACGCC AAG ACC AAGCC AAG AG A GGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAG GACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCAT CCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGT GT AT ACCCT GCCCCCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC T GT CT GGT G AAGGG ATT CT AT CCAT CCG ACAT CGCCGT GGAGT GGG AGT CC AACG G ACAGCCAG AGAACAACT AT AAGACCACCCCT CCAAT GCT GGACT CCG ACGGAT C CTT CTT CCT GT ATT CC AAGCT G ACCGT GG ACAAGT CC AG AT GGCAGC AGGG AAAC GT GTT CT CTT GTT CCGT G AT GC ACG AGGCCCT GC AC AACCACT AT ACCC AG AAG AG CCT GT CCCT GT CT CCAGGAAAGTAA

Secuencia de nucleótidos de anticuerpo completo de cadena ligera G1 (SEQ ID NO: 14)

G AA AT CGTT CT G ACCC AGT CCCCGGCT ACCCT GT CCCT GT CCCC AGGT G A ACGT G CT ACCCT GT CCTGCAAAGCTT CCAAACGGGTT ACC ACCT ACGTTT CCTGGT ACCAG C AG AAACCCGGT CAGGCT CCT CGT CT GCT G AT CT ACGGT GCTT CC AACCGTT ACCT CGGT AT CCCAGCT CGTTT CT CCGGTT CCGGTT CCGGT ACCG ACTT CACCCT G ACC AT CT CCT CCCTGG AACCCG AAG ACTT CGCT GTTT ACT ACT GC AGT C AGT CCT ACAA CT ACCCCT AC ACCTT CGGT C AGGGT ACC AAACT GG A AAT C AAACGC ACT GTGGCT GC ACC AT CT GT CTT C AT CTT CCCT CCAT CT G AT G AGC AGTT G AA AT CCGG AACT GC CT CT GTT GT GT GCCT GCT G AAT AACTT CT AT CCGCGCG AGGCC AAAGT ACAGT GG A AGGT GG AT AACGCCCT CCAAT CCGGT AACT CCC AGG AG AGTGT C AC AG AGC AGG A CAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGAC T ACGAGAAACAC AAAGT CT ACGCCT GCG AAGT CACCC AT C AGGGCCT G AGTT CT C C AGT C AC AAAG AGCTT C AACCGCGGT G AGT GCT AA

Secuencias de aminoácidos en comparación con CGRP humano y de rata (a-CGRP humano (SEQ ID NO: 15); B-CGRP humano (SEQ ID NO: 43); a-CGRP de rata (SEQ ID NO: 41); y B-CGRP de rata (SEQ ID NO: 44)):

NH2-ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-CONH2 (human a-CGRP) NH2-ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-CONH2 (human p-CGRP) NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF-CONH2 (rat a-CGRP) NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSKAF-CONH2 (rat p-CGRP)

Secuencia de aminoácidos LCVR17 de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 58)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSEYHSGV

PSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALPPTFGQGTKLEIK

Secuencia de aminoácidos HCVR22 de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 59)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGT GDTRYIQKFAGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFSYWGQG TLVTVSS

Secuencia de aminoácidos LCVR18 de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 60)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSEYHSGV

PSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALPPTFGQGTKLEIK

Secuencia de aminoácidos HCVR23 de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 61)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGT GKTVYIQKFAGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFSYWGQG TLVTVSS

Secuencia de aminoácidos LCVR19 de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 62)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSGYHSGVP

SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDALPPTFGGGTKVEIK

Secuencia de aminoácidos HCVR24 de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 63)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGT GKTVYIQKFADRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFGYWGQGT TVTVSS

Secuencia de aminoácidos LCVR20 de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO:64)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIDKYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSEYHSGVP

SRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALPPTFGQGTKLEIK

Secuencia de aminoácidos HCVR25 de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 65)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGT GKTVYIQKFAGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFGYWGQG TLVTVSS

Secuencia de aminoácidos LCVR21 de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 66) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDKYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSGYHSGV

PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDALPPTFGGGTKVEIK

Secuencia de aminoácidos HCVR26 de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 67)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGT GKTVYIQKFAGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFGYWGQGT TVTVSS

Secuencia de aminoácidos LCVR27 de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 68)

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKR

Secuencia de aminoácidos HCVR28 de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 69)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGAT YYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS

Secuencia de aminoácidos LCVR29 de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 70)

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQUYSTSTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKR

Secuencia de aminoácidos HCVR30 de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 71)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDN TYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS

Secuencia de aminoácidos LCVR31 de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 72)

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKR

Pesada secuencia de aminoácidos HCVR32 de región variable de cadena (SEQ ID NO: 73)

Secuencia de aminoácidos LCVR33 de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 74)

QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGQPPKQLIYDASTLASG VPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCNDAAAYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTEVVVKR

Secuencia de aminoácidos HCVR34 de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 75)

QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCSVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWIGVIGINGATYY ASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS

Región variable de cadena ligera LCVR35 amino secuencia de ácido (SEQ ID NO: 76)

Secuencia de aminoácidos de HCVR36 de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 77)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGAT

YYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS

Secuencia de aminoácidos LCVR37 de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 78)

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSG

IPDRFSGSKSGTSTTLGITGLQTGDEADYYCGTWDSRLSAVVFGGGTKLTVL

Secuencia de aminoácidos HCVR38 de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 79)

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGS IKYSVDSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRLNYYDSSGYYHYKY YGMAVWGQGTTVTVSS

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un anticuerpo antagonista anti-CGRP monoclonal para su uso en el tratamiento o reducción de la incidencia de dolor de cabeza postraumático en un sujeto, en donde el anticuerpo monoclonal tiene una CDR H1 como se establece en la SEQ ID NO: 3; una CDR H2 como se expone en SEQ ID NO: 4; una CDR H3 como se expone en SEQ ID NO: 5; una CDR L1 como se expone en SEQ ID NO: 6; una CDR L2 como se expone en SEQ ID NO: 7; y una CDR L3 como se expone en SEQ ID NO: 8.

2. La composición para uso según la reivindicación 1, en donde la composición:

(a) comprende de 225 mg a 1000 mg del anticuerpo monoclonal;

(b) se administra mensualmente, por ejemplo en donde:

(i) la composición se administra mensualmente durante tres meses o más; y/o

(ii) la dosis del anticuerpo monoclonal administrada al sujeto es de 225 mg a 675 mg; y/o

(c) se administra como una dosis única; por ejemplo, en donde la dosis del anticuerpo monoclonal administrada al sujeto es de 675 mg a 1000 mg.

3. La composición para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el tratamiento o la reducción comprende la reducción del número de horas de dolor de cabeza de cualquier gravedad, la reducción del número de días mensuales de dolor de cabeza de cualquier gravedad, la reducción del uso de cualquier medicamento para el dolor de cabeza agudo, reducir una puntuación de discapacidad de la prueba de impacto del dolor de cabeza (HIT-6) de 6 ítems, o cualquier combinación de las mismas; por ejemplo, en donde el número de días de dolor de cabeza mensuales se reduce en al menos un 50% del nivel previo a la administración en el sujeto.

4. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:

(a) la composición se administra por vía subcutánea o intravenosa;

(b) la composición se administra utilizando una jeringa precargada que comprende una dosis del anticuerpo monoclonal;

(c) el anticuerpo monoclonal se formula a una concentración de al menos 150 mg/ml; y/o

(d) el anticuerpo monoclonal se administra en un volumen de menos de 2 ml.

5. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición se administra al sujeto con un segundo agente de forma simultánea o secuencial con el anticuerpo monoclonal; en particular, en donde el uso mensual del segundo agente por parte del sujeto se reduce en al menos un 15% después de administrar el anticuerpo monoclonal.

6. La composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:

(a) el sujeto es un ser humano;

(b) el anticuerpo monoclonal es humano o está humanizado; y/o

(c) un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

7. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena pesada como se establece en SEQ ID NO:1 y una región variable de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 2.

8. La composición para su uso según la reivindicación 7, en donde el anticuerpo monoclonal comprende una cadena pesada producida por el vector de expresión con el número de acceso ATCC PTA-6867 y una cadena ligera producida por el vector de expresión con el número de acceso ATCC PTA-6866.