ES2327830T3 - Anticuerpos monoclonales humanos anti-interleuquina-5 y metodos y composiciones que los contienen. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno que se une específicamente a IL-5, donde dicho anticuerpo o fragmento comprende: (i) una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2, con o sin el péptido señal; (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 6; (c) la secuencia de aminoácidos desde el resto 50-127 del SEQ ID NO: 2; y (d) las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID NOS: 8, 10, y 12, respectivamente; y (ii) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 4, con o sin el péptido señal; (b) la secuencia de aminoácidos desde el resto 23-130 del SEQ ID NO: 4; (c) la secuencia de aminoácidos desde el resto 46-119 del SEQ ID NO: 4; y (d) las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID NOS: 14, 16, y 18, respectivamente.

Description

Anticuerpos monoclonales humanos anti-interleuquina-5 y métodos y composiciones que los contienen.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales humanos y sus porciones de unión al antígeno que se unen específicamente a interleuquina-5 (IL-5) y a los métodos y composiciones que comprenden tales anticuerpos monoclonales o sus porciones de unión al antígeno.

Antecedentes de la invención

Los eosinófilos juegan un importante papel en la patogénesis del asma. Tanto la gravedad del asma como el grado de hipersensibilidad de las vías respiratorias se corresponden con el número de eosinófilos en sangre y esputos. Los estudios de biopsias bronquiales muestran que los eosinófilos son un componente prominente de la inflamación de las vías respiratorias asmáticas y que los contenidos de los gránulos de eosinófilos están presentes en concentraciones crecientes en el fluido de revestimiento de las vías respiratorias de los asmáticos. Estos contenidos de los gránulos consisten en numerosas proteínas que tienen efectos tóxicos directos sobre las células de las vías respiratorias por medio de múltiples mecanismos tales como desprendimiento de células epiteliales, ciliostasis, generación de radicales oxígeno y lesión de las fibras nerviosas de las vías respiratorias. Los eosinófilos también producen mediadores que pueden aumentar la liberación de histamina en los mastocitos. Este espectro de actividades contribuye directamente a la inflamación crónica de las vías respiratorias bronquiales que se manifiesta por hinchazón de las paredes de las vías respiratorias y generación de mucus en las vías respiratorias. Facilitando la penetración de agentes transmitidos por el aire a través del epitelio de las vías respiratorias dañadas, esta inflamación puede causar directamente un aumento de la sensibilidad neuronal y de la contracción de la musculatura lisa (Greenfeder et al. Respiratory Research 2:71-79, 2001).

La interleuquina 5 (IL-5) es el principal mediador de los eosinófilos y un factor crítico en la lesión inflamatoria de las vías respiratorias en el asma. Es producida principalmente por el subgrupo Th2 de las células T y, en un grado menor, por otros tipos de células incluyendo los eosinófilos. La IL-5 tiene una importancia crítica para la maduración de los eosinófilos en la médula ósea y una importancia menor para la respuesta quimiotáctica de los eosinófilos. La IL-5 también estimula la activación de los eosinófilos, prolonga la supervivencia, facilita la desgranulación en respuesta a estímulos específicos (tales como IgA o IgG), y es generalmente un mediador pro-inflamatorio. Se han medido aumentos de niveles de IL-5 en el asma clínica y en modelos de sensibilización con antígenos bronquiales humanos (Greenfeder et al. Respiratory Research 2:71-79, 2001).

El asma es tratada en la actualidad muy eficazmente mediante un régimen de esteroides inhalados u orales que suprime la expresión de numerosos mediadores clave en el asma, incluyendo la IL-5, dando como resultado una disminución de la inflamación pulmonar. Existen, sin embargo, impedimentos percibidos a largo plazo de la terapia con esteroides. Por estas razones, la terapia anti-IL-5 directa, es una diana atractiva en el control del asma.

De este modo, sería deseable obtener anticuerpos de alta afinidad, concretamente anticuerpos anti-IL-5 humanos, que pudieran ser utilizados para tratar las patologías mediadas por IL-5 en seres humanos.

Compendio de la descripción

La presente descripción proporciona anticuerpos o sus porciones de unión al antígeno, que se unen específicamente a IL-5 y que se definen en las reivindicaciones adjuntas. En ciertas realizaciones, los anticuerpos o porciones de unión al antígeno son aislados y puede ser policlonales o monoclonales. Los anticuerpos de la invención se unen específicamente a IL-5 humana. En realizaciones particularmente preferidas, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos.

Se describen las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno que comprenden una secuencia de aminoácidos derivada de las secuencias de aminoácidos de la línea germinal de un gen V3-23 humano, un gen D1-20 humano y un gen JH4B humano. La cadena pesada CDR2 de los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno pueden comprender una sustitución de aminoácido en comparación con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal y la cadena pesada CDR3 contiene dos sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal.

Se describen las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno que comprenden una secuencia de aminoácidos derivada de las secuencias de aminoácidos de la línea germinal de un gen VK08/018 humano y un gen JK4 humano. La cadena ligera CDR1, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 pueden comprender cada una sustitución de aminoácido en comparación con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal.

En un primer aspecto, la presente descripción proporciona un anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a IL-5, donde dicho anticuerpo o fragmento comprende: i) una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2, con o sin el péptido señal; (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 6; (c) la secuencia de aminoácidos desde el resto 50-127 del SEQ ID NO: 2; y (d) las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID NOS: 8, 10, y 12, respectivamente; y (ii) la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 4, con o sin el péptido señal; (b) la secuencia de aminoácidos desde el resto 23-130 del SEQ ID NO: 4; (c) la secuencia de aminoácidos desde el resto 46-119 del SEQ ID NO: 4; y (d) las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID NOS: 14, 16, y 18, respectivamente. De este modo en algunas realizaciones del primer aspecto, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada mostrada en el SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID NOS: 8, 10, y 12, respectivamente. En otra realización, la cadena pesada del anticuerpo comprende una porción contigua de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2 desde CDR1 a CDR3. En una realización adicional, la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada mostrada en el SEQ ID NO: 6. Cualquiera de los anticuerpos descritos antes comprende adicionalmente la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera mostrada en el SEQ ID NO: 4, o la región variable (restos aminoácido 23-130 del SEQ ID NO: 4), las CDR1 a CDR3 mostradas en la Tabla 3 (restos aminoácido 46-119 del SEQ ID NO: 4) o CDR1 (SEQ ID NO: 14), CDR2 (SEQ ID NO: 16) y CDR3 (SEQ ID NO: 18) de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera.

Los anticuerpos o sus porciones pueden ser una molécula de inmunoglobulina G (IgG), una IgM, una IgE, una IgA o una IgD. En una realización preferida, el anticuerpo humano es una IgG y es un subtipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En una realización más preferida, el anticuerpo humano es un subtipo IgG4. En una realización aún más preferida, el anticuerpo humano es 20.13.3. En otra realización, el anticuerpo o su porción de unión al antígeno deriva de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')_{2}, un fragmento F_{v}, un anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo quimérico. En otra realización, el anticuerpo o su porción de unión al antígeno forma una proteína de fusión.

En otro aspecto, la descripción proporciona moléculas de polinucleótido que comprenden secuencias que codifican moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada o ligera o sus porciones, concretamente secuencias de nucleótidos que codifican regiones variables de la cadena pesada y ligera, secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera contiguas de CDR1 a CDR3 y CDR individuales. Las moléculas de polinucleótido de la invención se definen en las reivindicaciones adjuntas.

De acuerdo con otro objeto, la descripción proporciona un anticuerpo anti-IL-5 humano o una de sus porciones de unión al antígeno que está marcada o derivatizada. En una realización, el anticuerpo o su porción están marcados con una marca radiactiva, una marca enzimática, una toxina, un agente magnético o un producto conjugado con un fármaco. En otra realización, el anticuerpo o su porción están derivatizados para mejorar una o más de sus características, tales como la vida media, la biodisponibilidad o la actividad. En una realización preferida, el anticuerpo o su porción son derivatizados con polietilenglicol, al menos un grupo metilo o etilo o al menos un radical hidrocarbonado. En otra realización preferida, el anticuerpo o su porción marcados o derivatizados se utilizan en métodos diagnósticos o terapéuticos.

De acuerdo con otro objeto, la descripción proporciona un anticuerpo anti-IL-5 o su porción de unión al antígeno que se caracteriza por uno o más de los siguientes: inhibe o disminuye la inflamación mediada por IL-5, la maduración, la activación, la desgranulación o la infiltración de los eosinófilos en un tejido in vivo o in Vitro, inhibe la hiper-sensibilidad inducida por IL-5 de la musculatura lisa, y disminuye los niveles de IL-5 en pulmones, vías respiratorias o sangre. En una realización preferida, el anticuerpo humano inhibe o disminuye la infiltración de eosinófilos en un tejido in vivo. En una realización preferida, el tejido es el pulmón o el tejido que reviste las vías respiratorias.

De acuerdo con otro aspecto, la descripción proporciona composiciones farmacéuticas y kits que comprenden el anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, la composición farmacéutica o kit comprende otro componente, tal como un reactivo de formación de imágenes o un agente terapéutico. En las realizaciones preferidas, la composición farmacéutica o kit se utiliza en métodos diagnósticos o terapéuticos.

Asimismo se describen en la presente memoria, métodos diagnósticos, p. ej. un método para diagnosticar la presencia o localización de un tejido que expresa IL-5. En un caso preferido, en el método se utiliza un anticuerpo marcado o una de sus porciones. El método se puede utilizar in vivo o in vitro. En otro caso, se proporciona en método diagnóstico que comprende determinar si un anticuerpo anti-IL-5 humano inhibe o disminuye la infiltración eosinofílica en un tejido, p. ej. el pulmón.

En un aspecto adicional, la descripción proporciona el uso de un anticuerpo anti-IL-5 o una de sus porciones de unión al antígeno en la fabricación de un medicamento como se define en las reivindicaciones adjuntas. En una realización, el método terapéutico comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz del anticuerpo a un sujeto que lo necesite. En una realización preferida, el sujeto padece asma, exacerbaciones del asma, episodios que empeoran el asma, neumonía crónica, rinitis alérgica, rinitis alérgica perenne, aspergilosis broncopulmonar alérgica, hipereosinofilia, síndrome de Churo-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por Onchocerca, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica, enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones helmínticas, enfermedad de Hodgkins, pólipos nasales, síndrome de Loeffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis nodosa, sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica, esofagitis eosinofílica alérgica, conjuntivitis alérgica. En una realización más preferida, el método inhibe o disminuye la infiltración eosinofílica en el pulmón. El anticuerpo o su porción pueden ser administrados de tres veces al día a una vez cada seis meses, y pueden ser administrados por ruta intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral o tópica. En otra realización, el método se realiza junto con cirugía u otra inmunoterapia. En otra realización más, el anticuerpo está marcado con una marca radiactiva, un producto conjugado con fármaco, una inmunotoxina o una toxina, o es una proteína de fusión que comprende un péptido tóxico.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona métodos para producir un anticuerpo de la memoria o una de sus porciones de unión al antígeno, incluyendo la producción por una célula inmortalizada, métodos sintéticos, expresión recombinante o presentación en fagos.

Otro objeto es proporcionar ácidos nucleicos como los definidos por las reivindicaciones adjuntas que codifican la cadena pesada y/o ligera, sus porciones de unión al antígeno o sus derivados de un anticuerpo anti-IL-5. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico deriva de una célula o una línea celular que expresa un anticuerpo anti-IL-5. En una realización más preferida, el ácido nucleico deriva de un hibridoma. En una realización aún más preferida, el hibridoma es 20.13.3. En otra realización, la descripción proporciona vectores y células anfitrionas que comprenden una o varias de las moléculas de ácido nucleico descritas. En una realización adicional, la descripción proporciona un método de producción recombinante de la cadena pesada y/o ligera, sus porciones de unión al antígeno o sus derivados.

Asimismo se describe en la presente memoria un método para tratar a un sujeto que lo necesite con una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada y/o ligera, sus porciones de unión al antígeno o sus derivados de un anticuerpo anti-IL-5. En una realización preferida, el método se utiliza para tratar, sin limitación, asma, exacerbaciones del asma, episodios de empeoramiento del asma, neumonía crónica, rinitis alérgica, rinitis alérgica perenne, aspergilosis broncopulmonar alérgica, hipereosinofilia, síndrome de Churo-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por Onchocerca, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica, enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones helmínticas, enfermedad de Hodgkins, pólipos nasales, síndrome de Loeffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis nodosa, sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica, esofagitis eosinofílica alérgica, conjuntivitis alérgica.

Descripción detallada de la invención Definiciones y Técnicas Generales

A menos que se defina de otro modo en la presente memoria, los términos científicos y técnicos utilizados con respecto a la presente invención tendrán los significados que comprenden comúnmente los expertos en la técnica. Adicionalmente, a menos que sea requerido de otro modo por el contexto, los términos en singular incluirán las pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas con respecto a, y las técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas en la presente memoria son aquellas bien conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica. Los métodos y técnicas se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y descritos en diversas referencias generales y más específicas que se citan y comentan a lo largo de la presente memoria a menos que se indique de otro modo. Véanse, p. ej., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor. Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con la especificación del fabricante, cumplidas comúnmente en la técnica o como se describe en la presente memoria. Las nomenclaturas utilizadas con respecto a, y los procedimientos y las técnicas de laboratorio, de la química analítica, la química orgánica sintética, y la química Médica y farmacéutica descritas en la presente memoria son aquellas bien conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica. Las técnicas convencionales se utilizan para las síntesis químicas, los análisis químicos, la preparación farmacéutica, la formulación, y la liberación, y el tratamiento de los pacientes.

Se deberá entender que los siguientes términos, a menos que se indique de otro modo, tienen los siguientes significados:

El término "polipéptido" abarca las proteínas nativas o artificiales, los fragmentos de proteínas, y los análogos polipeptídicos de una secuencia de proteína. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. Los polipéptidos preferidos de acuerdo con la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humana y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa humana, así como las moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera \kappa, así como sus fragmentos y análogos.

El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado" es una proteína o polipéptido que en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no está asociado con componentes asociados naturalmente que lo acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie diferente, o (4) no se encuentra en la naturaleza. De este modo, un polipéptido que es sintetizado químicamente o sintetizado en un sistema celular diferente de la célula a partir de la cual se origina naturalmente estará "aislado" de sus componentes asociados naturalmente. Una proteína también se puede volver sustancialmente libre de componentes asociados naturalmente por aislamiento, utilizando mecanismos de purificación de proteínas bien conocidos en la técnica.

Una proteína o polipéptido es "sustancialmente puro", "sustancialmente homogéneo" o "sustancialmente purificado" cuando al menos aproximadamente un 60 a 75% de la muestra exhibe una única especie de polipéptido. El polipéptido o proteína puede ser monomérico o multimérico. Un polipéptido o proteína sustancialmente puro comprenderá típicamente aproximadamente un 50%, 60, 70%, 80% o 90% P/P de una muestra de proteína, más usualmente aproximadamente 95%, y preferiblemente será pura en más del 99%. La pureza u homogeneidad de la proteína puede ser indicada por numerosos métodos bien conocidos en la técnica, tales como la electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteína, seguido de la visualización de una única banda de polipéptido tras la tinción del gen con un colorante bien conocido en la técnica. Para ciertos fines, se puede proporcionar una resolución superior utilizando HPLC u otros métodos bien conocidos en la técnica para la purificación.

El término "fragmento polipeptídico" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a un polipéptido que tiene una deleción amino terminal y/o carboxi terminal, pero donde el resto de la secuencia de aminoácidos es idéntica a las correspondientes posiciones de la secuencia de origen natural. Los fragmentos tienen típicamente al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de longitud, preferiblemente al menos 14 aminoácidos de longitud, más preferiblemente al menos al menos 20 aminoácidos de longitud, normalmente al menos 50 aminoácidos de longitud, e incluso más preferiblemente al menos 70 aminoácidos de longitud.

El término "análogo polipeptídico" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a un polipéptido que está comprendido por un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene una identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos y que se une específicamente a IL-5 en condiciones de unión adecuadas. Típicamente, los análogos polipeptídicos comprenden una sustitución de aminoácidos conservativa (o una inserción o deleción) con respecto a la secuencia de origen natural. Los análogos tienen típicamente al menos 20 aminoácidos de longitud, preferiblemente al menos 50 aminoácidos de longitud o más, y a menudo pueden ser tan largos como un polipéptido de origen natural completo.

Comúnmente se utilizan análogos no peptídicos en la industria farmacéutica como fármacos con propiedades análogas a las de péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se denominan "miméticos de péptidos" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS p.392 (1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), que se incorporan a la presente memoria como referencia. Tales compuestos se desarrollan a menudo con la ayuda de modelos moleculares computarizados. Los miméticos de péptidos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles pueden ser utilizados para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (esto es, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o una actividad farmacológica deseada), tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente sustituidos por un enlace seleccionado del grupo que consiste en: -CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, -CH_{2}-CH_{2}-, -CH=CH-(cis y trans), -COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2-}-, y -CH_{2}SO-, mediante métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso por un D-aminoácido del mismo tipo (p. ej., D-lisina en lugar de L-lisina) también se puede utilizar para generar péptidos más estables. Además, se pueden generar péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de la secuencia consenso sustancialmente idéntica mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992); por ejemplo, añadiendo restos cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

Una "inmunoglobulina" es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina de origen natural, cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras \kappa y \lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como \mu, \Delta, \gamma, \alpha, o \varepsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, y IgE, respectivamente. En las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen por medio de una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase generalmente, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2ª ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo de manera que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión.

Las cadenas de inmunoglobulina muestran la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean por medio de las regiones marco, permitiendo la unión a un epítopo específico. Desde el extremo N al extremo C, las cadenas tanto ligera como pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).

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Un "anticuerpo" hace referencia a una inmunoglobulina intacta, o a una porción de unión al antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica. Las porciones de unión al antígeno pueden ser producidas mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las porciones de unión al antígeno incluyen, inter alia, los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fv, dAb, y de la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, fragmentos bivalentes de anticuerpos "diabodies" y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión específica del antígeno al polipéptido. Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH I; un fragmento F(ab')_{2} es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv consiste en los dominios VL y VH de un brazo sencillo de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989) consiste en un dominio VH. Un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) es un anticuerpo en el que las regiones VL y VH están emparejadas para formar moléculas monovalentes por medio de un conector sintético que permite elaborarlas en forma de una cadena de proteína sencilla (Bird et al., Science 242:423-426, 1988 y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). Los fragmentos bivalentes de anticuerpos "diabodies" son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los cuales los dominios VH y VL son expresados sobre una única cadena polipeptídica, pero utilizando un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, forzando de ese modo a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígenos (véase p. ej., Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, y Poljak, R. J., et al., Structure 2:1121-1123, 1994). Se pueden incorporar una o más CDR a una molécula covalentemente o no covalentemente para hacer de ella una inmunoadhesina. Una inmunoadhesina puede incorporar las CDR como parte de una cadena polipeptídica mayor, puede unir covalentemente las CDR a otra cadena polipeptídica, o puede incorporar las CDR no covalentemente. Las CDR permiten que la inmunoadhesina se una específicamente a un antígeno particular de interés.

Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina de origen natural tiene dos sitios de unión idénticos, un anticuerpo de cadena sencilla o fragmento Fab tiene un sitio de unión, mientras un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden ser producidos mediante una variedad de métodos incluyendo la fusión de hibridomas o la conexión de fragmentos Fab'. Véase, p. ej., Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1553(1992).

Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que (1) no está asociado con componentes asociados naturalmente, incluyendo otros anticuerpos asociados naturalmente, que lo acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie diferente, o (4) no se encuentra en la naturaleza. Los ejemplos de los anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo anti-IL-5 que ha sido purificado por afinidad utilizando IL-5, un anticuerpo anti-IL-5 que ha sido sintetizado por un hibridoma u otra línea celular in vitro, y un anticuerpo anti-IL-5 humano derivado de un ratón transgénico.

El término "anticuerpo humano" incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas humanas. Estos anticuerpos pueden ser preparados de diversas formas, como se describe más abajo.

Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que está derivado de una especie no humana, en la cual ciertos aminoácidos de los dominios marco y constantes de las cadenas pesada y ligera han sido mutados con el fin de evitar o anular una respuesta inmunitaria en seres humanos. Alternativamente, se puede producir un anticuerpo humanizado fusionando los dominios constantes de un anticuerpo humano a los dominios variables de una especie no humana. Los ejemplos de cómo elaborar anticuerpos humanizados se pueden encontrar en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293.

El término "anticuerpo quimérico" hace referencia a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos distintos.

El término "K_{off}" hace referencia a la constante de la velocidad de disociación para la disociación de un anticuerpo a partir del complejo anticuerpo/antígeno.

El término "K_{d}" hace referencia a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno concreta.

El término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o un receptor de células T. Los determinantes epitópicos consisten normalmente en agrupamientos de moléculas de superficie químicamente activos tales como cadenas laterales de aminoácidos o azúcares y tienen normalmente características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es \leq1 \muM, preferiblemente \leq100 nM y muy preferiblemente \leq10 nM.

Los fragmentos o análogos de anticuerpo o moléculas de inmunoglobulina pueden ser preparados fácilmente por aquellos expertos en la técnica siguiendo las enseñanzas de esta memoria. Los extremos amino y carboxi preferidos de los fragmentos o análogos se encuentran cerca de los límites de los Dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden ser identificados mediante comparación de los datos de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o privadas. Preferiblemente, los métodos de comparación computarizados se utilizan para identificar motivos de la secuencia o dominios de conformación de proteínas pronosticados que existen en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Los métodos para identificar las secuencias de proteínas
que se pliegan en una estructura tridimensional conocida son conocidos. Bowie et al. Science 253:164 (1991).

Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran las afinidades de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia distinta de la secuencia peptídica de origen natural. Por ejemplo, las sustituciones de un único o de múltiples aminoácidos (preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservativas) se pueden realizar en la secuencia de origen natural (preferiblemente en la porción del polipéptido fuera de los dominios que forman los contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservativa no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia de origen (p. ej., una sustitución de un aminoácido no debe tender a romper una hélice que exista en la secuencia de origen, o interrumpir otros tipos de estructura secundaria que caractericen la secuencia de origen). Los ejemplos de las estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354:105 (1991).

Según se utiliza en la presente memoria, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2ª Edición, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)).

Los estereoisómeros (p. ej., D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, los aminoácidos no naturales tales como los aminoácidos \alpha,\alpha-disustituidos, los N-alquil-aminoácidos, el ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, \gamma-carboxiglutamato, \varepsilon-N,N,N-trimetillisina, \varepsilon-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (p. ej., 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos utilizada en la presente memoria, la dirección a mano izquierda es la dirección amino terminal y la dirección a mano derecha es la dirección carboxi terminal, de acuerdo con el uso normalizado y la convención.

El término "polinucleótido" referido en la presente memoria representa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas monocatenarias y bicatenarias de ADN.

El término "polinucleótido aislado" según se utiliza en la presente memoria debe representar un polinucleótido de origen genómico, de ADNc, o sintético o alguna de sus combinaciones, en virtud de cuyo origen el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con todo o una porción de un polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está conectado operablemente a un polinucleótido al que no está conectado en la naturaleza, o (3) no se encuentra en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.

El término "oligonucleótido" referido en la presente memoria incluye los nucleótidos de origen natural, y modificados conectados por medio de enlaces oligonucleotídicos naturales, y no naturales. Los oligonucleótidos son un subgrupo de polinucleótidos que comprenden generalmente una longitud de 200 bases o menos. Preferiblemente los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud y muy preferiblemente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son normalmente monocatenarios, p. ej. para sondas; aunque los oligonucleótidos pueden ser bicatenarios, p. ej. para su uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos efectores o antisentido.

El término "nucleótidos de origen natural" referido en la presente memoria incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" referido en la presente memoria incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces oligonucleotídicos" referido en la presente memoria incluye enlaces oligonucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y similares. Véanse p. ej., LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991), Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, págs. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press. Oxford Inglaterra (1991)); Stec et al. Patente de los Estados Unidos Núm. 5.151.510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Un oligonucleótido puede incluir una marca para su detección, si se desea.

A menos que se especifique de otro modo, el extremo izquierdo de las secuencias de polinucleótidos monocatenarias es el extremo 5'; la dirección izquierda de las secuencias de polinucleótidos bicatenarias es referida como dirección 5'. La dirección de la adición 5' a 3' de los transcritos de ARN nacientes es referida como la dirección de transcripción; las regiones de la secuencia sobre la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que son 5' con respecto al extremo 5' del transcrito de ARN son referidas como "secuencias aguas arriba"; las regiones de la secuencia sobre la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que son 3' con respecto al extremo 3' del transcrito de ARN son referidas como "secuencias aguas abajo".

Las secuencias "conectadas operablemente" incluyen tanto las secuencias de control de la expresión que son contiguas al gen de interés como las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a una distancia con respecto al gen de interés. El término "secuencia de control de la expresión" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de las secuencias codificantes a las cuales están conectadas. Las secuencias de control de la expresión incluyen las secuencias de inicio de la transcripción, terminación, promotoras e intensificadoras apropiadas; las señales de procesamiento de ARN eficaces tales como las señales de empalme y poliadenilación; las secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; las secuencias que intensifican la eficacia de traducción (esto es, la secuencia consenso de Kozak); las secuencias que intensifican la estabilidad de las proteínas; y cuando se desee, las secuencias que intensifican la secreción de proteínas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo anfitrión; en procariotas, tales secuencias de control incluyen generalmente el promotor, el sitio de unión al ribosoma, y la secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y la secuencia de terminación de la transcripción. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias compañeras de fusión.

Se pretende que el término "vector", según se utiliza en la presente memoria, haga referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido conectado. Un tipo de vector es un "plásmido", que hace referencia a un bucle de ADN bicatenario circular en el cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que los segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicar autónomamente en una célula anfitriona en la cual son introducidos (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (p. ej., vectores de mamífero no episómicos) pueden ser integrados en el genoma de una célula anfitriona tras la introducción en la célula anfitriona, y de ese modo replican junto con el genoma del anfitrión. Por otra parte, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están conectados operablemente. Tales vectores son referidos en la presente memoria como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria, "plásmido" y "vector" se pueden utilizar indistintamente ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada. Sin embargo, se pretende que la descripción incluya esas otras formas de vectores de expresión, tales como los vectores virales (p. ej., retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados), que sirven para funciones equivalentes.

El término "célula anfitriona recombinante" (o simplemente "célula anfitriona"), según se utiliza en la presente memoria, pretende hacer referencia a una célula en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante. Se debe entender que tales términos pretenden hacer referencia no solamente al sujeto concreto si no a la progenie de semejante célula.

El término "hibrida selectivamente" referido en la presente memoria significa que se une detectablemente y específicamente. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y sus fragmentos de acuerdo con la invención hibridan selectivamente con hebras de ácido nucleico en condiciones de hibridación y lavado que minimizan cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden utilizar condiciones de "alta restricción" o "muy restrictivas" para lograr condiciones de hibridación selectivas como es sabido en la técnica y se comenta en la presente memoria. Un ejemplo de condiciones de "alta restricción" o "muy restrictivas" es un método de incubación de un polinucleótido con otro polinucleótido, donde un polinucleótido puede ser fijado a una superficie sólida tal como una membrana, en un tampón de hibridación de 6X SSPE o SSC, formamida al 50%, 5X reactivo de Denhardt, SDS al 0,5%, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado a una temperatura de hibridación de 42ºC durante 12-16 horas, seguido de lavado dos veces a 55ºC utilizando un tampón de lavado de 1X SSC, SDS al 0,5%. Véase también Sambrook et al., supra, págs. 9.50-9.55.

Dos secuencias de aminoácidos son homólogas si existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, una homología del 85% significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias son alineadas para un emparejamiento máximo. Los espacios (que en cualquiera de las dos secuencias están emparejados) se dejan en el emparejamiento máximo; se prefieren longitudes de los espacios de 5 o menos, siendo más preferidas de 2 o menos. Alternativamente y preferiblemente, dos secuencias de proteínas (o secuencias de polipéptidos derivadas de ellas de al menos 30 aminoácidos de longitud) son homólogas, según se utiliza este término en la presente memoria, si tienen una puntuación de alineamiento de más de 5 (en unidades de desviación típica) utilizando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutaciones y una penalización del espacio de 6 o mayor. Véase Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, págs. 101-110 (Volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y el Suplemento 2 de este volumen, págs. 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son más preferiblemente homólogas si sus aminoácidos son idénticos en un 50% o más cuando se alinean óptimamente utilizando el programa ALIGN.

El término "corresponde a" se utiliza en la presente memoria para significar que una secuencia de polinucleótidos es idéntica a toda o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia, o que una secuencia de polipéptidos es idéntica a una secuencia de polipéptidos de referencia. Por el contrario, el término "complementario a" se utiliza la presente memoria para significar que la secuencia complementaria es idéntica a toda o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia. Como ilustración, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".

Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de polinucleótidos o aminoácidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de la secuencia", e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subgrupo de una secuencia más grande, por ejemplo, en forma de un segmento de un ADNc o una secuencia génica completos dados en una lista de secuencias o puede comprender un ADNc o una secuencia génica completos. Generalmente, una secuencia de referencia tiene al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos de longitud, frecuentemente al menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos de longitud, y a menudo al menos 48 nucleótidos o 16 aminoácidos de longitud. Puesto que dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos pueden comprender cada una (1) una secuencia (esto es, una porción de la secuencia de polinucleótidos o aminoácidos completa) que es similar entre las dos moléculas, y (2) puede comprender adicionalmente una secuencia que es divergente entre las dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) moléculas se realizan típicamente comparando secuencias de las dos moléculas a lo largo de una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a un segmento conceptual de al menos 18 posiciones de nucleótidos contiguos o 6 aminoácidos donde una secuencia de polinucleótidos o una secuencia de aminoácidos se puede comparar con respecto a una secuencia de referencia de al menos 18 nucleótidos contiguos o secuencias de 6 aminoácidos y donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones, deleciones, sustituciones, y similares (esto es, espacios) de 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede realizar mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (paquetes de soporte lógico GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks, o MacVector), o mediante inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (esto es, dando como resultado
el mayor porcentaje de homología a lo largo de la ventana de comparación) generado mediante los diversos métodos.

El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos son idénticas (esto es, nucleótido por nucleótido o resto por resto) a lo largo de la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales aparece la base de ácido nucleico (p. ej., A, T, C, G, U, o I) o resto idéntico en ambas secuencias para dar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones de la ventana de comparación (esto es, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de la secuencia. El término "identidad sustancial" según se utiliza en la presente memoria indica una característica de una secuencia de polinucleótidos o aminoácidos, donde el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 por ciento, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 90 a 95 por ciento, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 98 por ciento, más normalmente una identidad de secuencia de al menos 99 por ciento en comparación con una secuencia de referencia a lo largo de una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótidos (6 aminoácidos), frecuentemente a lo largo de una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótidos (8-16 aminoácidos), donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir deleciones o adiciones que suman un 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia a lo largo de la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subgrupo de una secuencia mayor.

Aplicado a polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias peptídicas, cuando están óptimamente alineadas, por ejemplo mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando pesos de espacios por defecto, comparten al menos una identidad de secuencia de 80 por ciento, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 90 por ciento, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 95 por ciento, incluso más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 98 por ciento y muy preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 99 por ciento. Preferiblemente, las posiciones de los restos que no son idénticos difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones de aminoácidos conservativas hacen referencia a la intercambiabilidad de restos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas son glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales con hidroxilo alifáticas son serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida son asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas son fenilalanina, tirosina, y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alcalinas son lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, y asparagina-glutamina.

Según se utiliza en la presente memoria, los términos "marca" o "marcado" hacen referencia a la incorporación de otra molécula al anticuerpo. En una realización. La marca es un marcador detectable, p. ej., la incorporación de un aminoácido radiomarcado o el anclaje a un polipéptido de radicales biotinilados que pueden ser detectados por medio de avidina marcada (p. ej., estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o una actividad enzimática que puede ser detectada mediante métodos ópticos o colorimétricos). En otra realización, la marca o marcador puede ser terapéutica, p. ej., un producto conjugado con un fármaco o una toxina. Se conocen en la técnica y se pueden utilizar diversos métodos de marcaje de polipéptidos y glicoproteínas. Los ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, pero no están limitados a, los siguientes:

\quad

radioisótopos o radionúclidos (p. ej., H^{3}, C^{14}, N^{15}, S^{35}, Y^{90}, Tc^{99}, In^{111}, I^{125}, I^{131}), marcas fluorescentes (p. ej., FITC, rodamina, sustancias fosforescentes de lantánidos), marcas enzimáticas (p. ej., peroxidasa de rábano picante, \beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilados, epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un informador secundario (p. ej., secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas epitópicas), agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio, toxinas tales como toxina de pertusis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi-antracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y sus análogos u homólogos. En algunas realizaciones, las marcas son ancladas por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el potencial impedimento estérico.

El término "agente" se utiliza en la presente memoria para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto hecho de materiales biológicos.

El término "agente farmacéutico o fármaco" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente. Otros términos químicos de la presente memoria se utilizan de acuerdo con el uso convencional de la técnica, como se ilustra por medio del Diccionario McGraw-Hill de Términos Químicos (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))).

El término paciente incluye seres humanos y sujetos veterinarios.

En toda esta memoria y en las reivindicaciones, se entenderá que la palabra "comprenden", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" implican la inclusión de un número entero o un grupo de números enteros establecido pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros.

Anticuerpos Humanos y Humanización de Anticuerpos

Los anticuerpos humanos evitan ciertos problemas asociados con los anticuerpos que poseen las regiones variables y/o constantes de ratón o rata. La presencia de tales proteínas derivadas de ratón o rata puede conducir al rápido aclaramiento de los anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo por el paciente. Se espera que los anticuerpos anti-IL-5 totalmente humanos minimicen las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a Mabs de ratón o derivados de ratón y de este modo incrementen la eficacia y seguridad de los anticuerpos administrados. Se puede esperar que el uso de anticuerpos totalmente humanos proporcione una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como la inflamación y el cáncer, que pueden requerir administraciones repetidas de anticuerpos.

Métodos de Producción de Anticuerpos y Líneas Celulares Productoras de Anticuerpos Inmunización

En una realización, los anticuerpos humanos son producidos inmunizando un animal no humano que comprende alguno o todos los loci de la inmunoglobulina humana con un antígeno IL-5 o uno de sus fragmentos inmunogénicos. En una realización preferida, el animal no humano es un XenoMouse®.

El XenoMouse® es una cepa de ratón diseñada genéticamente que comprende fragmentos grandes de los loci de la inmunoglobulina humana y tiene una producción deficiente de anticuerpos de ratón. Véanse, p. ej., Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994) y Patentes de los Estados Unidos 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598 y 6.130.364. Véanse también los documentos WO 91/10741, publicado el 25 de Julio de 1991, WO 94/02602, publicado el 3 de Febrero de 1994, WO 96/34096 y WO 96/33735, publicados ambos el 31 de Octubre de 1996, WO 98/16654, publicado el 23 de Abril de 1998, WO 98/24893, publicado el 11 de Junio de 1998, WO 98/50433, publicado el 12 de Noviembre de 1998, WO 99/45031, publicado el 10 de Septiembre de 1999, WO 99/53049, publicado el 21 de Octubre de 1999, WO 00 09560, publicado el 24 de Febrero de 2000 y WO 00/037504, publicado el 29 de Junio de 2000.

Las cepas XenoMouse® fueron diseñadas con cromosomas artificiales de levadura (YAC) que contenían fragmentos de configuración de la línea germinal de 245 kb y 190 kb del locus de la cadena pesada humana y el locus de la cadena ligera kappa, respectivamente, que contenían secuencias de la región variable y constante del núcleo. Id. XenoMouse® produce un repertorio humano de tipo adulto de anticuerpos totalmente humanos, y genera anticuerpos monoclonales humanos específicos de antígenos (Mab). Un XenoMouse® de segunda generación contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpos humanos por medio de la introducción de fragmentos YAC de configuración de la línea germinal, con un tamaño de megabases de los loci de la cadena pesada humana y los loci de la cadena ligera kappa. Véanse Méndez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), y Patente de los Estados Unidos Núm. US 7.064.244, presentada el 3 de Diciembre de 1996.

En otra realización, los animales no humanos que comprenden loci del gen de la inmunoglobulina humana son animales que tienen un "minilocus" de inmunoglobulinas humanas. En el enfoque del minilocus, se imita un locus de Ig exógeno por medio de la inclusión de genes individuales del locus de la Ig. De este modo, se forman uno o más genes V_{H}, uno o más genes D_{H}, uno o más genes J_{H}, una región constante mu, y una segunda región constante (preferiblemente una región constante gamma) en un constructo para la inserción en el animal. Este enfoque se describe, entre otras en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.545.807, 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215, y 5.643.763.

Una ventaja del enfoque del minilocus es la rapidez con la que se pueden generar los constructos que incluyen las porciones del locus de la Ig e introducir en los animales. Sin embargo, una desventaja potencial del enfoque del minilocus es que puede no haber suficiente diversidad de inmunoglobulina para soportar el desarrollo de células B completas, de manera que puede haber una producción de anticuerpo inferior.

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Ácidos Nucleicos, Vectores, Células Anfitrionas y Métodos Recombinantes para Enmascarar Anticuerpos Ácidos Nucleicos

También están incluidas las moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-IL-5 humanos como se definen en las reivindicaciones adjuntas. En una realización, la molécula de ácido nucleico codifica una cadena pesada y/o ligera de una inmunoglobulina anti-IL-5 humana intacta. En una realización preferida, una única molécula de ácido nucleico codifica una cadena pesada de una inmunoglobulina anti-IL-5 humana y otra molécula de ácido nucleico codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina anti-IL-5 humana. En una realización más preferida, la inmunoglobulina codificada es una IgG humana. La cadena ligera codificada puede ser una cadena \lambda o una cadena \kappa. En una realización aún más preferida, la cadena ligera codificada es una cadena \kappa.

En las realizaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada (VH) deriva de un gen de VH DP-47/3-11 humano. En diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica la VH contiene no más de diez, no más de seis o no más de tres cambios de aminoácido del gen DP-47/3-11 de la línea germinal. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la VH contiene al menos un cambio de aminoácido en comparación con la secuencia de la línea germinal que es idéntica al cambio de aminoácido de la secuencia de la línea germinal de la cadena pesada del anticuerpo 20.13.3. En una realización incluso más preferida, la VH contiene al menos tres cambios de aminoácidos en comparación con las secuencias de la línea germinal que son idénticas al menos a tres cambios de aminoácidos de la secuencia de la línea germinal de la VH del anticuerpo 20.13.3.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos derivada de un gen del segmento de diversidad D1-20 humano. En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos derivada de un JH4B humano.

En la Tabla 1 se enumeras las secuencias de ácido nucleico, y las correspondientes secuencias de aminoácidos que codifican, del anticuerpo 20.13.3 o sus porciones.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Lista de secuencias para Mab 20.13.3 o sus porciones

1

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En las realizaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la VH del anticuerpo 20.13.3 al menos de la CDR1 a la CDR3 como se muestra en la Tabla 2. También se describe en la presente memoria una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDR de la cadena pesada del anticuerpo 20.13.3. En otra realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 20.13.3 mostrado en el SEQ ID NO: 2. En otra realización, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 20.13.3 mostrado en el SEQ ID NO: 1. Asimismo se describe en la presente memoria una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de las CDR de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 20.13.3 mostrado en la Tabla 2 o mostrado en los SEQ ID NOS: 8, 10 y 12, respectivamente.

TABLA 2 Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 20.13.3

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2

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En otras realizaciones de la invención, las moléculas de ácido nucleico descritas antes pueden hibridar en condiciones muy restrictivas, tales como las descritas antes, con una cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas antes, con tal que estas estén incluidas en las reivindicaciones adjuntas.

En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende una secuencia de nucleótidos derivada de un gen 08/018 V_{\kappa} humano. Dicha molécula de ácido nucleico puede contener hasta diez, hasta 6 o hasta 3 cambios de aminoácidos a partir del gen 08/018 V_{\kappa} de la línea germinal. En las realizaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico contiene al menos tres cambios de aminoácidos en comparación con la secuencia V_{\kappa} de la línea germinal que son idénticos a los cambios con respecto a la línea germinal encontrados en el anticuerpo monoclonal 20.13.3. En realizaciones adicionales, cualquiera de las moléculas de ácido nucleico anteriores comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos derivada de un gen del segmento de unión a J_{\kappa}4 humano.

En realizaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal 20.133, al menos desde CDR1 a CDR3 como se muestra en la Tabla 3. Asimismo se describe en la presente memoria una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDR de la cadena ligera del anticuerpo 20.13.3. En otra realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal 20.13.3 (SEQ ID NO: 4). En otra realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 3. También se describe en la presente memoria una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDR mostradas en los SEQ ID NOS: 14, 16, y 18.

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TABLA 3 Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal 20.13.3

3

En otra realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una VL puede hibridar en condiciones muy restrictivas, tales como las descritas antes, con una secuencia de ácido nucleico que codifica una VL descrita inmediatamente antes, con tal que el ácido nucleico esté incluido en las reivindicaciones adjuntas.

Se puede obtener una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada completa o la ligera completa de un anticuerpo anti-IL-5 o sus regiones variables a partir de cualquier fuente que produzca un anticuerpo anti-IL-5. En una realización de la invención, se pueden obtener moléculas de ácido nucleico a partir de un hibridoma que expresa un anticuerpo anti-IL-5. Los métodos de aislamiento del ARNm que codifica un anticuerpo son bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Sambrook et al. Se puede utilizar el ARNm para producir ADNc para su uso en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la clonación de ADNc de genes del anticuerpo. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico deriva de un hibridoma que tiene como uno de sus compañeros de fusión una célula de un animal transgénico que expresa genes de inmunoglobulina humana. En una realización aún más preferida, la célula del animal compañero de fusión deriva de un animal Xenomouse®. En otra realización, el hibridoma deriva de un animal transgénico no ratón, no humano como se ha descrito antes.

En una realización preferida, se puede construir la cadena pesada de un anticuerpo anti-IL-5 fusionando una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de una cadena pesada con un dominio constante de una cadena pesada. De un modo similar, se puede construir la cadena ligera de un anticuerpo anti-IL-5 fusionando una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de una cadena ligera con un dominio constante de una cadena ligera. En una realización más preferida, el ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada codifica la secuencia de aminoácido del SEQ ID NO: 6, y la molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de las cadenas ligeras codifica la secuencia de aminoácidos desde el resto 23-130 del SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos desde el resto 139-465 del SEQ ID NO: 2 representa la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada de 20.13.3, y la secuencia de aminoácidos desde el resto 131-236 del SEQ ID NO: 4 representa la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena ligera de 20.13.3. La secuencia de ácido nucleico desde el nucleótido 415-709, 1102-1137, 1256-1585, y 1683-2002 del SEQ ID NO: 1 representa la secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de la cadena pesada de 20.13.3, y la secuencia de ácido nucleico desde el 391-708 del SEQ ID NO: 3 representa la secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de la cadena ligera de 20.13.3. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio constante de la cadena pesada codifica la secuencia de aminoácidos desde el resto 139-465 del SEQ ID NO: 2, y la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio constante de la cadena ligera codifica la secuencia de aminoácidos desde el resto 131-236 del SEQ ID NO: 4. En una realización aún más preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio constante de la cadena pesada tiene la secuencia de ácido nucleico desde el nucleótido 415-709, 1102-1137, 1256-1585, y 1683-2002 del SEQ ID NO: 1, y la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio constante de la cadena ligera tiene la secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico desde el 391-708 del SEQ ID
NO: 3.

En otra realización, se puede aislar la propia célula productora de anticuerpo anti-IL-5 de un animal no humano. El animal transgénico puede ser un ratón, tal como un ratón Xenomouse®, u otro animal transgénico no humano. En otra realización, la célula productora de anticuerpo anti-IL-5 deriva de un animal no transgénico.

En otra realización, se pueden utilizar las moléculas de ácido nucleico para elaborar vectores utilizando métodos conocidos por los expertos normales en la técnica. Véanse, p. ej., Sambrook et al. y Ausubel et al. En una realización, los vectores pueden ser vectores plasmídicos o cosmídicos. En otra realización, los vectores pueden ser vectores virales. Los vectores virales incluyen, sin limitación, adenovirus, retrovirus, virus adeno-asociados y otros picornavirus, virus de la hepatitis y baculovirus. Los vectores también pueden ser bacteriófagos incluyendo, sin limitación, M13.

Las moléculas de ácido nucleico se pueden utilizar para expresar recombinantemente grandes cantidades de anticuerpos anti-IL-5, como se describe más abajo. Las moléculas de ácido nucleico también se pueden utilizar para producir anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, inmunoadhesinas, fragmentos bivalentes de anticuerpos, anticuerpos mutados y derivados de anticuerpos, como se describe adicionalmente más abajo.

En una realización, las moléculas de ácido nucleico que codifican la región variable de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) se convierten en genes de anticuerpos completos. En una realización, tales moléculas de ácido nucleico se insertan en vectores de expresión que ya comprenden secuencias que codifican las regiones constantes de la cadena pesada o de la cadena ligera, respectivamente, de manera que el segmento VH o VL está conectado operativamente al segmento o los segmentos CH o CL, respectivamente, dentro del vector. En otra realización, las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas VH y/o VL se convierten en genes de anticuerpos completos conectando la molécula de ácido nucleico que codifica una cadena VH con una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena CH utilizando técnicas de la biología molecular convencionales. Lo mismo se puede lograr utilizando las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas VL y CL. Las secuencias de la región constante de la cadena pesada y ligera humanas son conocidas en la técnica. Véase, p. ej., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed., NIH Publ. Núm. 91-3242, 1991.

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Vectores

Para expresar los anticuerpos, o las porciones de anticuerpos descritas, se insertan los ADN que codifican las cadenas ligera y pesada completas, obtenidos como se ha descrito antes, en vectores de expresión de manera que los genes son conectados operativamente a secuencias de control transcripcional y traduccional. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos, YAC, episomas derivados de EBV, y similares. El gen del anticuerpo se liga en un vector de manera que las secuencias de control transcripcional y traduccional del vector sirven para su función pretendida de regulación de la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se seleccionan para que sean compatibles con la célula anfitriona de expresión utilizada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en vectores separados. En una realización preferida, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos convencionales (p. ej., ligación de sitios de restricción complementarios sobre el fragmento del gen del anticuerpo y el vector, o ligación de extremos romos si no se encuentran presentes sitios de restricción).

Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados diseñados de manera que cualquier secuencia VH o VL pueda ser fácilmente insertada y expresada, como se ha descrito antes. En tales vectores, normalmente se produce un empalme entre el sitio donador de empalme de la región J insertada y el sitio aceptor de empalme que precede a la región C humana, y también en las regiones de empalme que existen en los exones CH humanos. La poliadenilación y la terminación de la transcripción se producen en los sitios cromosómicos nativos aguas abajo de las regiones codificantes. El vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido señal que facilite la secreción de la cadena de anticuerpo a partir de una célula anfitriona. El gen de la cadena de anticuerpo puede ser clonado en el vector de manera que el péptido señal esté unido en marco al extremo amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (esto es, un péptido señal de una proteína distinta de una inmunoglobulina).

Además de los genes de las cadenas de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de las cadenas de anticuerpo en una célula anfitriona. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de las secuencias reguladoras puede depender de factores tales como la elección de la célula anfitriona que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células anfitrionas de mamífero incluyen elementos virales que dirigen elevados niveles de expresión de proteínas en células de mamífero, tales como promotores y/o intensificadores derivados de LTR retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/intensificador de CMV), Virus de Simios 40 (SV40) (tal como el promotor/intensificador de SV40), adenovirus, (p. ej., el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)), polioma y promotores de mamíferos fuertes tales como los promotores de inmunoglobulina y actina nativos. Para una descripción adicional de elementos reguladores virales, y de sus secuencias, véanse p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.168.062 de Stinski, la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.510.245 de Bell et al. y la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.968.615 by Schaffner
et al.

Además de los genes de las cadenas de anticuerpos y de las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células anfitrionas (p. ej., orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células anfitrionas en las cuales se ha introducido el vector (véanse p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula anfitriona en la cual se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células anfitrionas dhfr^{-} con selección/amplificación por metotrexato) y el gen neo (para la selección por G418).

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Células Anfitrionas de No Hibridoma y Métodos de Producción de Proteína Recombinantemente

Las moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos anti-IL-5 y los vectores que comprenden estos anticuerpos se pueden utilizar para la transformación de una célula anfitriona de mamífero adecuada. La transformación puede ser mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula anfitriona. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del polinucleótido o los polinucleótidos en liposomas, y microinyección directa del ADN en núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden ser introducidas en células de mamífero por medio de vectores virales. Los métodos de transformación de células son bien conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, y 4.959.455.

Las líneas celulares de mamífero disponibles como anfitriones para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas asequibles de la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de Hámster Chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p. ej., Hep G2), células A549, y otras numerosas líneas celulares. Las líneas celulares de particular preferencia se seleccionan determinando qué líneas celulares tienen niveles de expresión elevados. Otras líneas celulares que se pueden utilizar son líneas celulares de insecto, tales como células Sf9. Cuando se introducen vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpo en células anfitrionas de mamífero, se producen los anticuerpos cultivando las células anfitrionas durante un período de tiempo suficiente para permtir la expresión del anticuerpo en las células anfitrionas o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se desarrollan las células anfitrionas. Los anticuerpos pueden ser recuperados del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas convencionales.

Adicionalmente, se puede intensificar la producción de anticuerpos (u otros radicales de los mismos) a partir de las líneas celulares de producción utilizando numerosas técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de la glutamina sintetasa (el sistema GS) es un enfoque común para intensificar la expresión en ciertas condiciones. El sistema GS se comenta en su totalidad o en parte en relación con las Patentes Europeas Núms. 0 216 846, 0 256 055, y 0 323 997 y la Solicitud de Patente Europea EP-A-0338841.

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Animales Transgénicos

Los anticuerpos de la invención también pueden ser producidos transgénicamente por medio de la generación de un mamífero o una planta que sean transgénicos para las secuencias de la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina de interés y la producción del anticuerpo a partir de ellos de una forma recuperable. En relación con la producción de animales transgénicos en mamíferos, los anticuerpos pueden ser producidos en, y recuperados de, la leche de cabras, vacas, u otros mamíferos. Véanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172, y 5.741.957. En una realización, los animales transgénicos no humanos que comprenden loci de inmunoglobulinas humanas son inmunizados con IL-5 o una de sus porciones. Se pueden producir tales animales transgénicos utilizando los métodos descritos en las Patentes de los Estados Unidos 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598 y 6.130.364. Véanse también el documento WO 91/10741, publicado el 25 de Julio de 1991, el documento WO 94/02602, publicado el 3 de Febrero de 1994, el documento WO 96/34096 y el documento WO 96/33735, publicados ambos el 31 d Octubre de 1996, el documento WO 98/16654, publicado el 23 de Abril de 1998, el documento WO 98/24893, publicado el 11 de Junio de 1998, el documento WO 98/50433, publicado el 12 de Noviembre de 1998, el documento WO 99/45031, publicado el 10 de Septiembre de 1999, el documento WO 99/53049, publicado el 21 de Octubre de 1999, el documento WO 00 09560, publicado el 24 de Febrero de 2000 y el documento WO 00/037504, publicado el 29 de Junio de 2000. En otra realización, los animales transgénicos pueden comprender un "minilocus" de genes de inmunoglobulinas humanas. Los métodos descritos antes pueden ser modificados como se describe, entre otros, en la Patente de los Estados Unidos 5.994.619. En una realización preferida, los animales no humanos pueden ser ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. En otra realización, los animales transgénicos comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-IL-5. En una realización preferida, los animales transgénicos comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras específicas para IL-5. En otra realización, los animales transgénicos comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo modificado tal como un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos anti-IL-5 pueden ser elaborados en cualquier animal transgénico. En una realización preferida, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos.

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Cambio de Clase

Otro aspecto consiste en proporcionar un mecanismo por medio del cual se pueda cambiar la clase del anticuerpo anti-IL-5 por otra. En un aspecto de la invención, se aísla una molécula de ácido nucleico que codifica VL o VH utilizando métodos bien conocidos en la técnica de manera que no incluya ninguna secuencia de ácido nucleico que codifique CL o CH. Las moléculas de ácido nucleico que codifican VL o VH se conectan después operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica CL o CH de una clase diferente de molécula de inmunoglobulina. Esto se puede lograr utilizando un vector o molécula de ácido nucleico que comprende una cadena CL o CH, como se ha descrito antes. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-5 que era originalmente IgM puede ser cambiado a una IgG. Adicionalmente, se puede utilizar el cambio de clase para convertir una subclase de IgG en otra, p. ej., de IgG 1 a IgG2.

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Derivados de Anticuerpos

Se pueden utilizar las moléculas de ácido nucleico descritas antes para generar derivados de anticuerpos utilizando los mecanismos y métodos conocidos por un experto normal en la técnica.

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Anticuerpos Mutados

En otra realización, las moléculas de ácido nucleico, los vectores y las células anfitrionas se pueden utilizar para elaborar anticuerpos anti-IL-5 mutados. Los anticuerpos pueden ser mutados en los dominios variables de las cadenas pesada y/o ligera para alterar una propiedad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, se puede realizar una mutación en una o más de las regiones CDR para incrementar o disminuir la K_{d} del anticuerpo IL-5, para incrementar o disminuir la K_{off}, o para alterar la especificidad de unión del anticuerpo. Los mecanismos de mutagénesis dirigida al sitio son bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Sambrook et al. y Ausubel et al., supra. En una realización preferida, se realizan mutaciones en un resto aminoácido que se sabe que ha cambiado en comparación con la línea germinal en una región variable de un anticuerpo anti-IL-5. En una realización más preferida, se realizan una o más mutaciones en un resto aminoácido que se sabe que ha cambiado en comparación con la línea germinal en una región variable de uno de los anticuerpos anti-IL-5 de la invención. En otra realización, las moléculas de ácido nucleico se mutan en una o más regiones marco. Se puede realizar una mutación en una región marco o dominio constante para incrementar la vida media del anticuerpo anti-IL-5. Véase, p. ej., la Solicitud de los Estados Unidos US 2002/0 142 374 A1, presentada el 17 de Agosto de 1999. También se puede realizar una mutación en una región marco o dominio constante para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proporcionar un sitio para la unión covalente o no covalente a otra molécula, o para alterar propiedades tales como la fijación del complemento. Se pueden realizar mutaciones en cada una de las regiones marco, el dominio constante y las regiones variables en un único anticuerpo mutado. Alternativamente, se pueden realizar mutaciones en solo una de las regiones marco, las regiones variables o el dominio constante en un único anticuerpo mutado.

En una realización, no hay más de diez cambios de aminoácidos en cualquiera de las regiones VH o VL del anticuerpo anti-IL-5 mutado en comparación con el anticuerpo anti-IL-5 antes de la mutación. En una realización más preferida, no existen más de cinco cambios de aminoácidos en cualquiera de las regiones VH o VL del anticuerpo anti-IL-5 mutado, más preferiblemente no más de tres cambios de aminoácidos. En otra realización, no hay más de quince cambios de aminoácidos en los dominios constantes, más preferiblemente, no más de diez cambios de aminoácidos, incluso más preferiblemente, no más de cinco cambios de aminoácidos.

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Anticuerpos de Fusión E Inmunoadhesinas

En otra realización, se puede elaborar un anticuerpo de fusión o inmunoadhesina que comprende todo o una porción de un anticuerpo anti-IL-5 conectado a otro polipéptido. En una realización preferida, solamente se conectan al polipéptido las regiones variables del anticuerpo anti-IL-5. En otra realización preferida, se conecta el dominio VH del anticuerpo anti-IL-5 a un primer polipéptido, mientras el dominio VL del anticuerpo anti-IL-5 se conecta a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de una manera en la que los dominios VH y VL pueden interaccionar entre sí para formar un sitio de unión al anticuerpo. En otra realización preferida, se separa el dominio VH del dominio VL por medio de un conector de manera que los dominios VH y VL puedan interaccionar entre sí (véase más abajo en Anticuerpos de Cadena Sencilla). El anticuerpo VH-conector-VL se conecta después al polipéptido de interés. El anticuerpo de fusión es útil para dirigir un polipéptido a una célula o tejido que expresa IL-5. El polipéptido puede ser un agente terapéutico, tal como una toxina, un factor de crecimiento u otra proteína reguladora, o puede ser un agente de diagnóstico, tal como una enzima que pueda ser fácilmente visualizada, tal como peroxidasa de rábano picante. Además, se pueden crear anticuerpos de fusión en los que dos (o más) anticuerpos de cadena sencilla se conectan entre sí. Esto resulta útil si se quiere crear un anticuerpo divalente o polivalente sobre una única cadena polipeptídica, o si se quiere crear un anticuerpo biespecífico. En una realización, el anticuerpo de fusión o inmunoadhesina se prepara utilizando las regiones variables del anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra realización, el anticuerpo de fusión o inmunoadhesina se prepara utilizando una o más de las regiones CDR de un anticuerpo anti-IL-5, por ejemplo de 20.13.3.

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Anticuerpos de Cadena Sencilla

Para crear un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), se conectan operativamente los fragmentos de ADN que codifican VH y VL a otro fragmento que codifica un conector flexible, p. ej., que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly_{4} -Ser)_{3}, de manera que se pueden expresar las secuencias VH y VL como una proteína de cadena sencilla contigua, con las regiones VL y VH unidas por el conector flexible (véanse p. ej., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554). El anticuerpo de cadena sencilla puede ser monovalente, si solamente se utiliza una única VH y VL, bivalente, si se utilizan dos VH y VL, o polivalente, si se utilizan más de dos VH y VL.

En una realización, el anticuerpo de cadena sencilla se prepara utilizando una o más regiones variables del anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra realización, el anticuerpo de cadena sencilla se prepara utilizando una o más regiones CDR de dicho anticuerpo anti-IL-5.

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Kappabodies, Minibodies, Diabodies y Janusinas

En otra realización, se pueden preparar otros anticuerpos modificados utilizando moléculas de ácido nucleico que codifican anti-IL-5. Por ejemplo, se pueden preparar "Kappa bodies" (III et al., Protein Eng 10: 949-57 (1997)), "Minibodies" (Martin et al., EMBOJ 13: 5303-9 (1994)), "Diabodies" (Holliger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)), o "Janusinas" (Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-3659 (1991) y Traunecker et al. "Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int J Cancer Supl 7:51-52 (1992)) utilizando técnicas de la biología molecular convencionales siguiendo las enseñanzas de la memoria. En una realización, los anticuerpos modificados se preparan utilizando una o más de las regiones variables del anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra realización, se prepara el anticuerpo modificado utilizando una o más de las regiones CDR de dicho anticuerpo anti-IL-5.

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Anticuerpos Quiméricos

En otro aspecto, se pueden generar anticuerpos biespecíficos. En una realización, se puede generar un anticuerpo quimérico que se una específicamente a IL-5 a través de un dominio de unión y a una segunda molécula a través de un segundo dominio de unión. El anticuerpo quimérico puede ser producido por medio de técnicas de biología molecular recombinante, o puede ser conjugado físicamente. Además, se puede generar un anticuerpo de cadena sencilla que contenga más de una VH y VL que se una específicamente a IL-5 y a otra molécula. Tales anticuerpos biespecíficos pueden ser generados utilizando técnicas que son bien conocidas por ejemplo, Fanger et al. Immunol Methods 4: 72-81 (1994) y Wright y Harris, supra y con respecto a (iii) véase p. ej., Traunecker et al. Int. J. Cancer (Supl.) 7: 51-52 (1992). En una realización preferida, el anticuerpo quimérico se une a IL-5 y a otra molécula implicada en la promoción de la proliferación de eosinófilos y basófilos. En realizaciones preferidas, la otra molécula es eotaxina, IL-3, o GM-CSF.

En una realización, los anticuerpos quiméricos se preparan utilizando una o más de las regiones variables del anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra realización, el anticuerpo quimérico se prepara utilizando una o más de las regiones CDR de dicho anticuerpo anti-IL-5.

Anticuerpos Derivatizados y Marcados

Se puede derivatizar un anticuerpo o una porción de anticuerpo o conectar a otra molécula (p. ej., otro péptido o proteína). En general, los anticuerpos o sus porciones se derivatizan de manera que la unión a IL-5 no resulte afectada adversamente por la derivatización o el marcaje. Por consiguiente, los anticuerpos y las porciones de anticuerpos pueden incluir las formas tanto intactas como modificadas de los anticuerpos anti-IL-5 humanos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, se puede conectar funcionalmente un anticuerpo o porción de anticuerpo (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares distintas, tales como otro anticuerpo (p. ej., un anticuerpo biespecífico o un fragmento bivalente "diabody"), un agente de detección, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que pueda mediar la asociación del anticuerpo o la porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región núcleo de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).

Un tipo de anticuerpo derivatizado es producido mediante entrecruzamiento de dos o más anticuerpos \beta (del mismo tipo o de tipos diferentes, p. ej., para crear anticuerpos biespecíficos). Los entrecruzadores adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos claramente reactivos separados por un espaciador apropiado (p. ej., éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimidico) u homobifuncional (p. ej., suberato de disuccinimidilo). Tales conectores son asequibles de Pierce Chemical Company, Rockford, III.

Otro tipo de anticuerpo derivatizado es un anticuerpo marcado. Los agentes de detección útiles con los que se puede derivatizar un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención incluyen compuestos fluorescentes, incluyendo fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamino-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina, sustancias fosforescentes de lantánidos y similares. Un anticuerpo también se puede marcar con enzimas que sean útiles para la detección, tales como la peroxidasa de rábano picante, la \beta-galactosidasa, la luciferasa, la fosfatasa alcalina, la glucosa oxidasa y similares. Cuando un anticuerpo se marca con una enzima detectable, se detecta añadiendo reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reacción que puede ser discernido. Por ejemplo, cuando está presente el agente peroxidasa de rábano picante, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción coloreado, que es detectable. También se puede marcar un anticuerpo con biotina, y detectarlo mediante medida indirecta de la unión a avidina o estreptavidina. También se puede marcar un anticuerpo con epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por una secuencia informadora (p. ej., secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas epitópicas). En algunas realizaciones, las marcas se anclan por medio de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el potencial impedimento estérico.

También se puede marcar un anticuerpo anti-IL-5 con un aminoácido marcado radiactivamente. La radiomarca se puede utilizar para fines tanto diagnósticos como terapéuticos. El anticuerpo anti-IL-5 radiomarcado se puede utilizar como diagnóstico, por ejemplo, para determinar los niveles de IL-5 en un sujeto. Adicionalmente, el anticuerpo anti-IL-5 radiomarcado se puede utilizar terapéuticamente para tratar, por ejemplo, enfermedades alérgicas caracterizadas por una infiltración eosinofílica pronunciada, tales como, sin limitación, asma, exacerbaciones del asma, episodios de empeoramiento de asma, neumonía crónica, rinitis alérgica, rinitis alérgica perenne, aspergilosis broncopulmonar alérgica, hipereosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por Onchocerca, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica, enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones helmínticas, enfermedad de Hodgkins, pólipos nasales, síndrome de Loeffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis nodosa, sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica, esofagitis eosinofílica alérgica, conjuntivitis alérgica. Los ejemplos de las marcas para los polipéptidos incluyen, pero no están limitados a, los siguientes radioisótopos o radionúclidos - H^{3}, C^{14}, N^{15}, S^{35}, Y^{90}, Tc^{99}, In^{111}, I^{125}, I^{131}.

Un anticuerpo anti-IL-5 también puede ser derivatizado con un grupo químico tal como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo, o un grupo carbohidratado. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, p. ej., para incrementar la vida media en suero o para incrementar la unión al tejido.

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Caracterización de Anticuerpos Anti-IL-5 Clase y Subclase de Anticuerpos Anti-IL-5

La clase y la subclase de los anticuerpos anti-IL-5 se pueden determinar mediante cualquier método conocido en la técnica. En general, la clase y la subclase de un anticuerpo se pueden determinar utilizando anticuerpos que son específicos para una clase y subclase concreta de anticuerpo. Tales anticuerpos se encuentran disponibles en el mercado. La clase y subclase pueden ser determinadas mediante ELISA, Transferencia Western así como otras técnicas. Alternativamente, la clase y la subclase se pueden determinar secuenciando todo o una porción de los dominios constantes de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos conocidas de diversas clases y subclases de inmunoglobulinas, y determinando la clase y la subclase de los anticuerpos.

En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede ser una molécula de IgG, una IgM, una IgE, una IgA o una IgD. En una realización preferida, el anticuerpo es una IgG y es del subtipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En una realización más preferida, los anticuerpos anti-IL-5 son de la subclase IgG2. En otra realización preferida, los anticuerpos anti-IL-5 son de la misma clase y subclase que el anticuerpo monoclonal 20.13.3.

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Afinidad de Unión de Anti-IL-5 a IL-5

Los anticuerpos anti-IL-5 se unen a IL-5 con una elevada afinidad. Los anticuerpos se unen a IL-5 sustancialmente con la misma K_{d} que el anticuerpo monoclonal 20.13.3.

La afinidad de unión y la velocidad de disociación de un anticuerpo anti-IL-5 a IL-5 se pueden determinar mediante cualquier método conocido en la técnica. En una realización, se puede medir la afinidad de unión mediante tecnología de ELISA competitivo, RIA, BIAcore o KinExA. La velocidad de disociación también se puede medir mediante tecnología BIAcore o KinExA. En una realización, la afinidad de unión y la velocidad de disociación se miden mediante resonancia de plasmón superficial utilizando. p. ej., BIAcore.

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Identificación de Epítopos de IL-5 Reconocidos por el Anticuerpo Anti-IL-5

La descripción también proporciona un anticuerpo anti-IL-5 que se une al mismo antígeno o epítopo que un anticuerpo anti-IL-5 humano. Adicionalmente, la descripción proporciona un anticuerpo anti-IL-5 que compite de manera cruzada con un anticuerpo anti-IL-5 humano. En una realización preferida, el anticuerpo anti-IL-5 es el anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra realización preferida, el anti-IL-5 humano comprende una o más CDR del anticuerpo monoclonal 20.13.3. En una realización preferida, el anticuerpo anti-IL-5 es otro anticuerpo humano.

Se puede determinar si un anticuerpo anti-IL-5 se une al mismo antígeno utilizando una variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede determinar si un anticuerpo anti-IL-5 de ensayo se une al mismo antígeno utilizando un anticuerpo anti-IL-5 para capturar un antígeno que se sabe que se une al anticuerpo anti-IL-5, tal como IL-5, eluyendo el antígeno del anticuerpo, y determinando después si el anticuerpo de ensayo se unirá al antígeno eluido. Se puede determinar si un anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-IL-5 uniendo el anticuerpo anti-IL-5 a IL-5 en condiciones saturantes, y midiendo después la capacidad del anticuerpo de ensayo para unirse a IL-5. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a la IL-5 a la vez que el anticuerpo anti-IL-5, en ese caso el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente que el anticuerpo anti-IL-5. Sin embargo, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse a la IL-5 a la vez, en ese caso el anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que el anticuerpo anti-IL-5 humano. Este experimento se puede realizar utilizando ELISA, RIA o resonancia de plasmón superficial. En una realización preferida, el experimento se realiza utilizando la resonancia de plasmón superficial. En una realización más preferida, se utiliza BIAcore. También se puede determinar si un anticuerpo anti-IL-5 compite de manera cruzada con un anticuerpo anti-IL-5. En una realización preferida, se puede determinar si un anticuerpo anti-IL-5 compite de manera cruzada con otro utilizando el mismo método que se utiliza para medir si el anticuerpo anti-IL-5 es capaz de unirse al mismo epítopo que otro anticuerpo
anti-IL-5.

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Uso de la Cadena Ligera y Pesada

La descripción también proporciona un anticuerpo anti-IL-5 que comprende secuencias variables de la cadena ligera codificadas por un gen V\kappa humano y un gen J\kappa humano. En el anticuerpo monoclonal 20.13.3, las cadenas ligeras \kappa utilizan un gen 08/018 V\kappa humano unido a un gen J\kappa4 humano.

En realizaciones preferidas, la región variable de la cadena ligera de los anticuerpos anti-IL-5 de la invención contiene las mismas sustituciones de aminoácidos, con respecto a la secuencia de aminoácidos del gen 08/018 de la línea germinal, que el anticuerpo monoclonal 20.13.3. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-IL-5 puede contener una o más sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de 08/018 de la línea germinal que están presentes en el anticuerpo monoclonal 20.13.3. De esta manera, se pueden mezclar y emparejar rasgos diferentes de los anticuerpos que se unen para alterar, p. ej., la afinidad del anticuerpo por la IL-5 o su velocidad de disociación del antígeno.

En otra realización, la región variable de la cadena ligera contiene sustituciones de aminoácidos en las mismas posiciones que el anticuerpo monoclonal 20.13.3, pero utiliza diferentes aminoácidos en esas posiciones. Preferiblemente la sustitución es conservativa con respecto al aminoácido presente en esa posición en 20.13.3. Por ejemplo, si se encuentra presente glutamato en 20.13.3 en una posición concreta y el glutamato representa una sustitución en comparación con la línea germinal, de acuerdo con la presente invención, se puede sustituir conservativamente el aspartato en esa posición. De un modo similar, si la sustitución del aminoácido es serina, se puede remplazar la serina por treonina.

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En otra realización preferida la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de VL del Mab 20.13.3. En otra realización muy preferida, la cadena ligera comprende las secuencias de aminoácidos que son las mismas que las regiones CDR de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal 20.13.3 (como se muestra en la Tabla 3 y en los SEQ ID NOS: 14, 16, y 18, respectivamente).

En otra realización; el anticuerpo o una de sus porciones comprenden una cadena ligera lambda.

Asimismo se proporciona un anticuerpo anti-IL-5 o una de sus porciones que comprende una cadena pesada humana o una secuencia derivada de una cadena pesada humana. En una realización, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada deriva de la familia del gen V_{H} DP-47 humano. En una realización más preferida, la cadena pesada comprende no más de ocho cambios de aminoácidos con respecto a V_{H} DP-47 de la línea germinal, más preferiblemente no más de seis cambios de aminoácidos, e incluso más preferiblemente no más de tres cambios de aminoácidos.

En una realización preferida, la VH del anticuerpo anti-IL-5 contiene las mismas sustituciones de aminoácidos, con respecto a la secuencia de aminoácidos de la línea germinal, tal como Mab 20.13.3. En otra realización, las sustituciones de aminoácidos se realizan en la misma posición que las encontradas en la VH del Mab 20.13.3, pero se realizan sustituciones conservativas en lugar de utilizar el mismo aminoácido.

En una realización preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de la VH del Mab 20.13.3. En otra realización muy preferida, la cadena pesada comprende secuencias de aminoácidos que son las mismas que las regiones CDR de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 20.13.3 mostrado en la Tabla 2. También se describen en la presente memoria cadenas pesadas que comprenden una secuencia de aminoácido de al menos una región CDR de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra realización preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre los SEQ ID NOS: 2, 6, 8, 10, y 12. En otra realización preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre los SEQ ID NOS: 8, 10, y 12.

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Inhibición de la Actividad Receptora de IL-5 por el Anticuerpo Anti-IL-5 Inhibición de la Unión de IL-5 al Receptor de IL

En otra realización, la descripción proporciona un anticuerpo anti-IL-5 que inhibe la unión de IL-5 al receptor de IL-5. En una realización preferida, el receptor de IL-5 es humano. En otra realización preferida, el anticuerpo anti-IL-5 es un anticuerpo humano. En otra realización, el anticuerpo o una de sus porciones inhiben la unión entre IL-5 y el receptor de IL-5 con una CI_{50} de no más de 50 nM. En una realización preferida, la CI_{50} no es mayor de 10 nM. En una realización más preferida, la CI_{50} no es mayor de 2,0 nM, 0,5 nM, 0,25 nM, 0,1 nM, o 0,05 nM. La CI_{50} se puede medir mediante cualquier método conocido en la técnica. Típicamente, la CI_{50} se puede medir mediante ELISA, RIA, o Antagonismo Funcional. En una realización preferida, la CI_{50} se mide mediante Antagonismo Funcional.

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Inhibición de la proliferación celular mediada por IL-5 por medio de anticuerpo anti-IL-5 (in vitro)

En otra realización preferida, la descripción proporciona un anti-cuerpo anti-IL-5 que inhibe la proliferación mediada por IL-5 de una línea celular sensible a IL-5. En una realización preferida, la línea celular es humana. En una realización incluso más preferida, la línea celular es una línea celular eosinofílica humana o una línea celular de eritroleucemia humana, por ejemplo, TF-1.

En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En una realización más preferida, el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 20.13.3 o uno de sus fragmentos funcionales.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-IL-5 o una de sus porciones funcionales inhiben la proliferación de una línea celular sensible a IL-5 con un valor de CI_{50} de no más de 10 nM. En realizaciones preferidas, la CI_{50} no es mayor de 1 nM. En otras realizaciones preferidas, la CI_{50} no es mayor de 250 pM. En realizaciones preferidas adicionales, la CI_{50} no es mayor de 100 pM. En realizaciones aún más preferidas, la CI_{50} no es mayor de 50 pM.

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Inhibición de la Acumulación de Eosinófilos In Vivo

En otra realización, un anticuerpo anti-IL-5 inhibe la acumulación de eosinófilos in vivo. En una realización preferida, el anticuerpo inhibe la acumulación de eosinófilos mediante la comparación con la acumulación de eosinófilos en un animal no tratado. En una realización más preferida, el anticuerpo inhibe la acumulación de eosinófilos en un 50%. En una realización aún más preferida, el anticuerpo inhibe la acumulación de eosinófilos en un 75%.

En ciertas realizaciones, la terapia con anticuerpo anti-IL-5 se lleva a cabo junto con la terapia con uno o más agentes terapéuticos adicionales. En una realización preferida, el agente adicional promueve adicionalmente la inhibición de la producción, la maduración, la migración a la sangre, la activación, la acumulación, o la infiltración de eosinófilos en tejidos en un mamífero. En ciertas realizaciones, la terapia adicional comprende la administración de uno o más de los agentes seleccionados del grupo que consiste en corticosteroides, agonistas \beta_{2}, inhibidores de 5-LO, antagonistas del receptor de LTD4, y anti-histaminas. Los ejemplos de los corticosteroides para semejante terapia incluyen, pero no están limitados a beta-metasona, prednisolona e hidrocortisona. Los uno o más agentes terapéuticos adicionales se pueden administrar por separado o simultáneamente con un anticuerpo anti-IL-5 de la invención. En una realización preferida, la co-administración de un agente y un anticuerpo anti-IL-5 inhibe la acumulación de eosinófilos al menos en 50%, más preferiblemente 7%, más preferiblemente 90% después de un período de 22-24 días.

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Composiciones Farmacéuticas y Kits

La descripción también hace referencia a composiciones farmacéuticas para el tratamiento de trastornos, concretamente trastornos alérgicos, caracterizados por la producción, maduración, migración a la sangre, activación o infiltración de eosinófilos en tejidos mediadas por IL-5, en un mamífero. En una realización, dicha composición farmacéutica es para el tratamiento de enfermedades eosinofílicas tales como, sin limitación, asma, exacerbaciones del asma, episodios de empeoramiento del asma, neumonía crónica, rinitis alérgica, rinitis alérgica perenne, aspergilosis broncopulmonar crónica, hipereosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por Onchocerca, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica, enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones por helmintos, enfermedad de Hodgkins, pólipos nasales, síndrome de Loeffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis nodosa, sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica, esofagitis eosinofílica alérgica y conjuntivitis alérgica.

Los anticuerpos anti-IL-5 pueden ser incorporados a las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Según se utiliza en la presente memoria, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como sus combinaciones. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, alcoholes polihidroxilados tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Las sustancias farmacéuticamente aceptables tales como humectantes o cantidades minoritarias de sustancias coadyuvantes tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que intensifican la vida media o la eficacia del anticuerpo o porción de anticuerpo.

Las composiciones pueden estar en cualquier variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semi-sólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (p. ej., soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica pretendidos. Las composiciones preferidas típicas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las utilizadas para la inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. El modo de administración preferido es el parenteral (p. ej., intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una realización preferida, el anticuerpo se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea.

Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede ser formulada en forma de una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para la elevada concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación del anticuerpo anti-IL-5 en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados antes, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión alcalino y los otros ingredientes requeridos entre los enumerados antes. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado a vacío y la liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución del mismo esterilizada por filtración previamente. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensoactivos. La adsorción prolongada de las composiciones inyectables se puede alcanzar aproximadamente incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales monoestearato y gelatina.

Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno se pueden administrar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la ruta/modo de administración preferida es subcutánea, intramuscular, intravenosa o en infusión. Como apreciará un experto en la técnica, la ruta y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados.

En ciertas realizaciones, el compuesto activo se puede preparar con un portador que proteja el compuesto de la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de liberación microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biocompatibles, biodegradables, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y poli(ácido láctico). Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la técnica. Véase, p. ej., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-IL-5 o los fragmentos de unión al antígeno pueden ser administrados oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también pueden incluirse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, formarse en comprimidos, o incorporarse directamente a la dieta del sujeto. Para la administración terapéutica oral, los compuestos pueden tener incorporados excipientes y pueden ser utilizados en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invención mediante una administración distinta de la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o administrar el compuesto simultáneamente con, un material que evite su inactivación.

También se pueden incorporar a las composiciones compuestos activos suplementarios. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-IL-5 es formulado simultáneamente y/o administrado simultáneamente con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Estos agentes incluyen,, sin limitación, anticuerpos que se unen a otras dianas (p. ej., anticuerpos que se unen a uno o más factores de crecimiento o citoquinas o sus receptores de la superficie celular), agentes que reducen la producción o actividad de IL-5, tales como proteínas de unión a IL-5, oligonucleótidos antisentido contra IL-5 o receptor de IL-5, análogos peptídicos que bloquean la activación del receptor de IL-5, receptor de IL-5 soluble, glucocorticoides y ciclosporina, y agentes que inhiben la producción, maduración, supervivencia, activación, o migración desde la médula ósea de eosinófilos, tales como los corticosteroides. Semejantes terapias combinadas pueden requerir dosis inferiores del anticuerpo anti-IL-5 y/o los agentes administrados simultáneamente, evitando de este modo posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" hace referencia a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o porción de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo, y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para lograr una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es aquella en la que cualquiera de los efectos tóxicos o perjudiciales del anticuerpo o la porción de anticuerpo son sobrepasados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" hace referencia a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, puesto que se utiliza una dosis profiláctica en los sujetos antes de o en una fase anterior de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta óptima deseada (p. ej., una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o se puede reducir o incrementar proporcionalmente la dosis indicada por las exigencias de la situación terapéutica. Resulta especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en formas de dosificación unitarias para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria utilizada en la presente memoria hace referencia a unidades físicamente discretas adaptadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se van a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado asociado con el portador farmacéutico requerido. Las especificaciones para las formas unitarias de dosificación de la invención están dictadas por y son directamente dependientes de (a) las características únicas del anticuerpo y el efecto terapéutico o profiláctico concreto a alcanzar, y (b) las limitaciones inherentes de la técnica de composición de semejante anticuerpo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.

Un intervalo ilustrativo, no limitante para una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es de 0,1-100 mg/kg, más preferiblemente 0,1-50 mg/kg, más preferiblemente 0,1-20 mg/kg, e incluso más preferiblemente 1-10 mg/kg (p. ej., 0,3, 1, o 3 mg/kg). Se debe observar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la condición a aliviar. Se debe entender adicionalmente que para un sujeto concreto, los regímenes de dosificación específicos se deben ajustar a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y los intervalos de dosificación mostrados en la presente memoria son meramente ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance o la práctica de la composición reivindicada.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona kits que comprenden anticuerpos anti-IL-5 o fragmentos de unión al antígeno y las composiciones farmacéuticas que comprenden estos anticuerpos. Un kit puede incluir, además del anticuerpo o la composición farmacéutica, agentes de diagnóstico o terapéuticos. Un kit también puede incluir instrucciones para su uso en un método diagnóstico o terapéutico. En una realización preferida, el kit incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y un agente de diagnóstico que puede ser utilizado en un método descrito más abajo. En otra realización preferida, el kit incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y uno o más agentes terapéuticos que pueden ser utilizados en un método descrito más abajo.

Métodos de Uso Diagnóstico

Los anticuerpos anti-IL-5 o sus fragmentos de unión al antígeno se pueden utilizar para detectar IL-5 en una muestra biológica. Los anticuerpos anti-IL-5 se pueden utilizar en un inmunoanálisis convencional, incluyendo, sin limitación, ELISA, RIA, FACS, inmunohistoquímica de tejidos, transferencia Western o inmunoprecipitación. Los anticuerpos anti-IL-5, se pueden utilizar para detectar IL-5 de seres humanos. En otra realización, los anticuerpos anti-IL-5 se pueden utilizar para detectar IL-5 de primates del Viejo Mundo tales como monos cynomolgus y rhesus, chimpancés y simios. Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de la invención se pueden utilizar en un método para detectar IL-5 en una muestra biológica que comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo anti-IL-5 de la invención sus fragmentos de unión al antígeno y detectar el anticuerpo unido a IL-5, para detectar la IL-5 en la muestra biológica. En una realización, el anticuerpo anti-IL-5 se marca directamente con una marca detectable. En otra realización, el anticuerpo anti-IL-5 (el primer anticuerpo) no está marcado y un segundo anticuerpo u otra molécula que se puede unir al anticuerpo anti-IL-5 está marcado. Como es bien sabido por un experto en la técnica, se elige un segundo anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a la especie y clase específica del primer anticuerpo. Por ejemplo, si el anticuerpo anti-IL-5 es una IgG humana, el anticuerpo secundario puede ser uno anti-IgG humana. Otras moléculas que se pueden unir a anticuerpos incluyen, sin limitación, Proteína A y Proteína G, ambas las cuales son asequibles comercialmente, p. ej., de Pierce Chemical Co.

Las marcas adecuadas para el anticuerpo o el secundario han sido descritas supra, e incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos con grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína; rodamina, diclorotriazinilamin-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen I^{125}, I^{131}, S^{35} o H^{3}.

En una realización alternativa, se puede analizar la IL-5 en una muestra biológica por medio de un análisis competitivo utilizando patrones de IL-5 marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-IL-5 no marcado. En este análisis, la muestra biológica, los patrones de IL-5 marcados y el anticuerpo anti-IL-5 se combinan y se determina la cantidad de patrón de IL-5 marcado unido al anticuerpo no marcado. La cantidad de IL-5 en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de patrón de IL-5 marcado unido al anticuerpo anti-IL-5.

Se pueden utilizar los inmunoanálisis descritos antes para numerosos fines. En una realización, se pueden utilizar anticuerpos anti-IL-5 o fragmentos para detectar IL-5 en una muestra, concretamente una muestra biológica.

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Métodos de Uso Terapéutico

Asimismo se describe en la presente memoria un método para inhibir la actividad de IL-5 administrando un anticuerpo anti-IL-5 como se reivindica o uno de sus fragmentos de unión al antígeno a un paciente que lo necesite. Se puede utilizar terapéuticamente cualquiera de los tipos descritos en la presente memoria. En una realización preferida, el anticuerpo anti-IL-5 es un anticuerpo humano. En otra realización preferida, la IL-5 es humana y el paciente es un paciente humano. Alternativamente, el anticuerpo o fragmento puede ser administrado a un mamífero no humano que exprese una IL-5 con la cual reacciona de forma cruzada el anticuerpo (esto es, un primate, mono cynomolgus o rhesus) con fines veterinarios o como un modelo animal de enfermedad humana. Tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de esta invención.

Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "un trastorno en el que la actividad de IL-5 es perjudicial" incluya enfermedades y otros trastornos en los cuales la presencia de IL-5 en un sujeto que padece el trastorno se ha demostrado que es o se sospecha que es responsable de la patofisiología del trastorno o un factor que contribuye al empeoramiento del trastorno. Por consiguiente, la presente invención proporciona, de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas, el uso de un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno en la fabricación de un medicamento para prevenir o inhibir una condición o trastorno caracterizados por la actividad no deseada de IL-5. Por consiguiente, un trastorno en el que la actividad de IL-5 es perjudicial es un trastorno en el que se espera que la inhibición de la actividad de IL-5 alivie los síntomas y/o el progreso del trastorno. Tales trastornos mediados por IL-5 incluyen, pero no están limitados a, trastornos alérgicos, concretamente trastornos alérgicos de la piel y los tejidos pulmonares e inflamación pulmonar. Tales trastornos pueden ser evidenciados, por ejemplo, por un incremento del número de eosinófilos y/o basófilos en la médula ósea, la sangre u otros tejidos, o en el fluido del lavado broncoalveolar (BAL). En particular, tales trastornos pueden estar caracterizados por eosinofilia pulmonar o cutánea, hipersensibilidad bronquial, acumulación de eosinófilos en el tejido pulmonar, regiones perivasculares y/o peribronquiales, lesión del epitelio de las vías respiratorias, edema intersticial de las vías respiratorias, aumento de la secreción de mucus en los bronquios o broncoconstricción. Alternativamente, la actividad patológica de IL-5 puede ser evidenciada por el incremento de una o más de eosinopoyesis en la médula ósea, incremento de supervivencia de eosinófilos, incremento de adherencia de eosinófilos a las células endoteliales e incremento de actividad citotóxica de los eosinófilos.

En una realización preferida, se puede administrar un anticuerpo anti-IL-5 o uno de sus fragmentos de unión al antígeno a un paciente que padece inflamación, incluyendo enfermedades alérgicas caracterizadas por infiltración eosinofílica pronunciada, tales como rinitis nasal, pólipos nasales, asma, síndromes eosinofílicos idiopáticos, y dermatitis atópica. En una realización incluso más preferida, el anticuerpo anti-IL-5 se administra a un paciente que tiene inflamación pulmonar crónica. En una realización muy preferida, el método hace que la inflamación se vuelva menos grave o desaparezca.

En otra realización preferida, se puede administrar un anticuerpo anti-IL-5 a un paciente que tenga niveles incrementados de eosinófilos en la médula ósea, la sangre u otros tejidos corporales. Se sabe en la técnica que el incremento de la presencia de eosinófilos se asocia con enfermedades tales como, sin limitación, asma, exacerbaciones del asma, episodios de empeoramiento del ama, neumonía crónica, rinitis alérgica, rinitis alérgica perenne, aspergilosis broncopulmonar alérgica, hipereosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por Onchocerca, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica, enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones por helmintos, enfermedad de Hodgkins, pólipos nasales, síndrome de Loeffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis nodosa, sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica, esofagitis eosinofílica alérgica, conjuntivitis alérgica. En una realización preferida, el anticuerpo anti-IL-5 de la invención o uno de sus fragmentos de unión al antígeno es administrado a un paciente con asma. En una realización aún más preferida, el método evita o reduce la gravedad de la enfermedad.

El anticuerpo o fragmento puede ser administrado de aproximadamente tres veces al día a aproximadamente una vez cada seis meses, y preferiblemente puede ser administrado por una ruta oral, mucosal, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, intratumoral o tópica. El anticuerpo también puede ser administrado continuamente por medio de una minibomba. Generalmente el anticuerpo se administrará durante todo el tiempo que esté presente el estado de enfermedad, siempre que el anticuerpo haga que la condición se detenga o mejore. Generalmente el anticuerpo se administrará como parte de una composición farmacéutica como se ha descrito supra. El anticuerpo también se puede administrar profilácticamente con el fin de evitar que se produzca la inflamación alérgica y/o la infiltración eosinofílica. Esto puede resultar especialmente útil en pacientes que han demostrado tener un alto riesgo de desarrollar una afección mediada por IL-5 o mediada por eosinófilos.

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Terapia Génica

Las moléculas de ácido nucleico pueden ser administradas a un paciente que lo necesite a través de la terapia génica. La terapia puede ser in vivo o ex vivo. En un caso preferido, se administran a un paciente las moléculas de ácido nucleico que codifican tanto una cadena pesada como una cadena ligera. En un caso más preferido, las moléculas de ácido nucleico se administran de manera que están integradas establemente en el cromosoma de las células B debido a que estas células están especializadas para producir anticuerpos. En un caso preferido, las células B precursoras son transfectadas o infectadas ex vivo y re-transplantadas a un paciente que lo necesite. En otro caso, las células B precursoras u otras células son infectadas in vivo utilizando un virus que se sabe que infecta el tipo de célula de interés. Los vectores típicos utilizados para la terapia génica incluyen liposomas, plásmidos, o vectores virales, tales como retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociados. Tras la infección in vivo o ex vivo, se pueden controlar los niveles de expresión de anticuerpo tomando una muestra del paciente tratado y utilizando cualquier inmunoanálisis conocido en la técnica y comentado en la presente memoria.

En un caso preferido, el método de terapia génica comprende las etapas de administrar una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o su porción de unión al antígeno del anticuerpo humano y expresar la molécula de ácido nucleico. En otro caso, el método de terapia génica comprende las etapas de administrar una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena ligera o su porción de unión al antígeno del anticuerpo humano y expresar la molécula de ácido nucleico. En un caso más preferido, el método de terapia génica comprende las etapas de administrar una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o su porción de unión al antígeno del anticuerpo humano y una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena ligera o su porción de unión al antígeno del anticuerpo humano y expresar las moléculas de ácido nucleico. El método de terapia génica también puede comprender la etapa de administrar otro agente que tenga efectos terapéuticos similares a los del anticuerpo o su fragmento funcional tales como los enumerados, supra.

Con el fin de comprender mejor esta invención, se exponen los siguientes ejemplos.

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Ejemplo 1 Generación de Hibridomas que Producen Anticuerpo Anti-IL-5

Se prepararon anticuerpos de la invención, se seleccionaron, y se analizaron como sigue: Inmunización y generación de hibridoma

Se inmunizaron un total de 288 XenoMice® IgG2 o IgG4 divididos en grupos de 15 a 20 ratones de 8 a 15 semanas de edad de acuerdo con el programa mostrado en la siguiente Tabla 4.

TABLA 4 Programas de Inmunización

4

Para las inmunizaciones en la base de la cola (bot), se emulsionó IL-5 humana en coadyuvante completo de Freund (CFA) para la primera inmunización y en coadyuvante incompleto de Freund (IFA) para posteriores inmunizaciones a las dosis y tiempos indicados antes. (Para la información de la secuencia de IL-5, véase la publicación de la Patente Europea número EP0267779.) Para la inmunización en la almohadilla de la pata (FP), el antígeno se emulsionó en coadyuvante Ribi. Algunos animales (grupo 7) recibieron antígeno tanto bot como intraperitonealmente (ip) en CFA o Ribi. El grupo 8 recibió antígeno en forma de producto conjugado en el que la IL-5 humana estaba conjugada químicamente con un anticuerpo anti-CD3 de ratón.

Se fusionaron células de bazo y/o nódulo linfático de ratones inmunizados o bien con la línea celular de mieloma no secretora P3-X63-Ag8.653 (ATCC, Rockville, MD) o bien con la línea celular de mieloma NSO-bcl2 (B. Diamond, Albert Einstein College of Medicine, NY), como se ha descrito previamente (Galfre y Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46, 1981). Los cultivos se examinaron regularmente en cuanto al crecimiento de las células híbridas, y los sobrenadantes de aquellos pocillos que contenían hibridomas se recogieron para un primer escrutinio mediante ELISA en busca de la presencia de IgG/kappa humana específica de IL-5.

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Análisis de Unión a IL-5

Las placas de ELISA se recubrieron con 50 \mul/pocillo de antígeno IL-5 a 2 \mug/ml en Tampón de Recubrimiento (tampón carbonato 0,1 M, pH 9,6 y 8,4 g/l de NaHCO_{3} (PM 84)) y se incubaron a 4ºC durante la noche o a 37ºC durante 2 horas. Las placas se lavaron con tampón de lavado (Tween 20 al 0,05% en PBS) tres veces, se bloquearon con 200 \mul/pocillo de tampón de bloqueo (BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,01%, Timerosal al 0,01% en 1x PBS) durante 1 hora a la temperatura ambiente, y se lavaron tres veces más con tampón de lavado. Se añadieron 50 \mul/pocillo de muestra (o controles) a los pocillos y se incubaron a la temperatura ambiente durante 2 horas. Después de tres lavados con tampón de lavado, se añadieron 100 \mul/pocillo de anticuerpo anti-huIgGfc-HRP de cabra (Caltag, núm. cat. H10507) (y GT anti-hkappa-HRP en un escrutinio secundario) a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a la temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se añadieron 100 \mul de solución desarrollo (10 ml de tampón sustrato, 7,14 g/l de ácido cítrico y 16,96 g/l de fosfato de sodio dibásico), 10 mg de o-fenilendiamina (Sigma, núm. cat. P-7288), y 10 \mul de H_{2}O_{2} al 30%) a cada pocillo. Después de aproximadamente 10 minutos, se añadió una solución de parada (H_{2}SO_{4} 2 M) a cada pocillo y las placas se analizaron utilizando un lector de placas ELISA a una longitud de onda de 492 nm. Los cultivos positivos se transfirieron a placas de 48 pocillos y con posterioridad se transfirieron a placas de 24 pocillos después de alcanzar la confluencia.

Se obtuvieron un total de 116 hibridomas productores de anticuerpos reactivos con IL-5, de los cuales 7 fueron IgG2 y 109 fueron IgG4. Se piensa que la prevalencia desproporcionada de anticuerpos IgG4 está relacionada con un efecto de la IL-5 sobre el cambio de clase. De los 116 hibridomas que producen anticuerpos específicos para IL-5, se seleccionó un hibridoma IgG4/kappa designado 20.13 para la caracterización adicional basándose en su fuerte actividad de neutralización comparable con la de un anticuerpo de control IgG de ratón (39D10 de Schering-Plough).

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Ejemplo 2 Análisis de Proliferación para determinar anticuerpos biológicamente funcionales

Se utilizaron las ascitis y los sobrenadantes de los hibridomas purificados por afinidad para un análisis funcional cuantitativo de la neutralización de la proliferación de células TF1 inducida por IL-S (DNAX). En resumen, se diluyó IL-5 humana recombinante en medio de cultivo RPMI-1640 con FBS al 1% hasta una concentración final de 1,0 ng/ml, y el anticuerpo de control, 39D10 (Schering-Plough) se diluyó hasta una concentración final de 1,0 \mug/ml con medio con IL-5. Se añadió la solución de IL-5 o la solución de IL-5 más 39D10 a los pocillos de las placas de 96 pocillos. Los pocillos de control contuvieron solamente medio o solamente IL-5.

Se lavaron las células TFP1 dos veces con medio RPMI-1640 y se resuspendieron a una concentración final de 2,5 x 10^{5} células TF1 por ml en medio de cultivo FBS. Se añadieron 100 \mul de la suspensión celular a cada pocillo y se incubaron durante 48-56 horas a 37ºC y CO_{2} al 5%. Después de 48 horas, se añadieron 20 \mul de Azul Alamar a cada pocillo y se incubaron durante la noche. Las placas se analizaron utilizando un lector de placa FluoroCount® a una longitud de onda de excitación de 530 nm, longitud de onda de emisión de 590 nm, y PMT de 600 voltios.

Los resultados de los estudios utilizando el anticuerpo 20.13.3, purificado a partir de las ascitis o sobrenadantes, muestran que 20.13.3 bloqueaba eficazmente la proliferación celular inducida por IL-5.

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Ejemplo 3 Determinación de la CI_{50} de Neutralización

Se sometió a ensayo el Mab 20.13.3 en un análisis de anti-proliferación de TF-1 contra IL-5 tanto humana como murina (Egan et al. Drug Res. 49:779-790 (1999)). En resumen, se añadieron 50 \mul de medio de análisis (RPMI 1640 con un suplemento de glutamina al 1%, solución pen/strep al 1%, mercaptoetanol al 0,1%, fungizona al 0,05% y suero bovino fetal al 1%) a los pocillos de una placa de cultivo de 96 pocillos. Se añadieron concentraciones variables de Mab 20.13.3 a los pocillos y se incubaron a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadieron veinte microlitros (20 \mul) de IL-5 humana o murina (12 ng/ml) a cada pocillo (excepto controles negativos). Se prepararon células TF-1 a una concentración de 5x10^{5} células por ml, y se añadieron alícuotas de 30 \mul de la suspensión celular a todos los pocillos. Las placas se incubaron durante 44-48 horas a 37ºC y CO_{2} al 5%. Después se añadieron 25 \mul de una solución de 5 mg/ml de MTT a cada pocillo y se incubaron durante otras 6 horas. Se añadieron 100 \mul de una solución de SDS al 10% a cada pocillo y las placas se incubaron durante la noche. Las placas se analizaron en un espectrofotómetro UV MAX®. Los resultados indican que en el análisis, el Mab 20.13.3 muestra valores de CI_{50} de 250 pM y 380 pM frente a IL-5 humana y murina, respectivamente.

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Ejemplo 4 Análisis Funcional In Vivo

Se evaluó un anticuerpo anti-IL-5 anticuerpo de la invención en un modelo de ratón de inflamación pulmonar inducida por antígeno (Kung et al 1994). En resumen, se administraron dosis a ratones sensibilizados con ovoalbúmina (OVA) de solución salina, Mab 20.13.3 a 5, 1, 0,5, o 0,1 mg/kg s.c., o un mAb anti-IL-5 murino de control positivo, TRFK-5 (Schering Plough Research Institute; Mita et al., J. Immunol. Methods 125:233 (1987)) a 1 mg/kg i.p 2 horas antes de la sensibilización con OVA en aerosol. Se recogió el fluido de lavado broncoalveolar (BAL) 24 horas después de la sensibilización y se determinó la celularidad. TRFK-5 produjo un incremento significativo de todos los parámetros. Mab 20.13.3 inhibió significativamente las células totales y los eosinófilos en el BAL a 5, 1 y 0,5 mg/kg.

Se evaluó la duración de la actividad de los anticuerpos anti-IL-5 de la invención en el modelo descrito antes. A los ratones sensibilizados con ovoalbúmina (OVA) se les administraron dosis de solución salina o Mab 20.13.3 a 5 y 1 mg/kg s.c. 2 horas, 2 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes de la sensibilización con OVA en aerosol. El fluido del lavado broncoalveolar se recogió 24 horas después de la sensibilización y se determinó la celularidad. Se tomaron muestras de sangre en el momento de recolección del BAL para el análisis farmacocinético. Las dosis de 5 y 1 mg/kg de Mab 20.13.3 inhibieron significativamente las células totales y los eosinófilos en el BAL cuando se administraron 2 horas y 13 días antes de la sensibilización con OVA. El Mab 20.13.3 inhibió significativamente las células totales y los eosinófilos en el BAL cuando se administró 4 semanas antes de la sensibilización solamente a la dosis de 5 mg/kg. No se observó más inhibición cuando se administraron las dosis del Mab 20.13.3 6 semanas - 12 semanas antes de la sensibilización.

Los autores de la presente invención evaluaron Mab 20.13.3 en un modelo de mono cynomolgus de inflamación pulmonar inducida por antígeno (Mauser et al 1995). En resumen, primero se trataron simuladamente nueve monos naturalmente sensibles a Ascaris suum con vehículo (solución salina subcutánea) y 18 horas más tarde se sensibilizaron con Ascaris suum (antígeno) en aerosol. Veinticuatro horas después de la sensibilización con Ascaris, se recogió una muestra de fluido BAL y se obtuvo una muestra de sangre periférica. Se determinaron el contenido celular del BAL y las muestras de sangre.

Tres semanas más tarde, se administraron a los nueve monos dosis de Mab 20.13.3 a 0,3 mg/kg s.c. Dieciocho horas más tarde, se sensibilizaron los monos con Ascaris suum en aerosol y se recogió una muestra de BAL 24 horas más tarde. Se tomaron muestras de sangre antes y en los momentos seleccionados después de la administración de Ascaris suum. La sensibilización con Ascaris suum se repitió 4 y 8 semanas después de la dosificación inicial con Mab 20.13.3 y se analizó el contenido celular en el fluido de BAL antes y 24 horas después de cada sensibilización con Ascaris. El Mab 20.13.3 redujo significativamente la acumulación de eosinófilos en el BAL inducida por el antígeno 4 semanas después de la administración de las dosis con una tendencia a niveles reducidos (reducción del 55%) 8 semanas después de la administración de las dosis. El Mab 20.13.3 redujo significativamente el número de eosinófilos en la sangre periférica 42 h, 2 s, 4 s, 8 s y 12 s después de la administración de las dosis con niveles que regresaban hasta casi los niveles previos a la administración de las dosis en 14 s.

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Ejemplo 5 Análisis Estructural de Anticuerpos Monoclonales Anti-IL-5 Completamente Humanos

Para analizar la estructura de los anticuerpos producidos de acuerdo con la invención, los autores de la presente invención clonaron y secuenciaron los ácidos nucleicos que codificaban los fragmentos de la cadena pesada y ligera de los hibridomas que producían los anticuerpos monoclonales anti-IL-5. Los autores de la invención analizaron todas las secuencias mediante alineamientos con respecto al "directorio de secuencias V BASE" (Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) utilizando programas de soporte lógico MacVector y Geneworks.

Para clonar el ADNc que codifica el anticuerpo monoclonal 20.13.3, los autores de la presente invención aislaron ARN de aproximadamente 1 X 10^{6} células de hibridoma mediante el método RNAzol (Tel-Test, INC.). Los autores de la presente invención realizaron una transcripción inversa del ARNm utilizando oligo-dT(18) y el kit Advantage® RT/PCR (Clonetech). Los autores de la presente invención utilizaron los siguientes cebadores para amplificar el ADNc.

6

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Los productos de la PCR del ADNc de la cadena ligera de 20.13.3 se sometieron a electroforesis en geles de agarosa/TAE al 1% y se separó por corte la banda de \sim760 pb y se purificó con cuentas de Sephaglas (Amersham) y se subclonó en el vector PCR TOP02.1 (Invitrongen). Se secuenciaron los insertos de ADNc con el kit de secuenciación de cebadores coloreados (Applied Biosystems) con los cebadores vk018-Eco y ckp2-Apa. Se realizó el análisis de la secuencia utilizando el soporte lógico SeqEd y GeneWorks. Los fragmentos EcoRI/ApaI aislados de los plásmidos identificados se clonaron en el vector de expresión pManuKappa.

Los productos de la PCR de la cadena pesada de 20.13.3 se digirieron con EcoRI/NheI, se sometieron a electroforesis en geles de agarosa/TAE al 1% y la banda de \sim435 pb se separó por corte y se purificó con Sephaglas (Amersham) y se subclonó en pManuGamma4. Los clones se secuenciaron con el kit de secuenciación de cebadores coloreados (Applied Biosystems) con los cebadores v3023-Eco y Jh4-Nhe.

Para cada clon, los autores de la presente invención verificaron la secuencia de ambas hebras al menos en tres reacciones.

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Análisis de Utilización del Gen

La Tabla 5 muestra la utilización del gen por el hibridoma de 20.13.3 de acuerdo con la invención.

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TABLA 5 Utilización del Gen de la Cadena Pesada y Ligera

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Análisis de Mutaciones

Como se apreciará, el análisis de utilización del gen proporciona solamente una visión de conjunto limitada de la estructura del anticuerpo. A medida que las células B en los animales XenoMouse® generan estocásticamente transcritos de la cadena pesada V-D-J o de la cadena ligera kappa V-J, existen numerosos procedimientos secundarios que se producen, incluyendo, sin limitación, hipermutación somática, adiciones, y prolongaciones de CDR3. Véase, por ejemplo, Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997) y la Publicación de Patente Internacional WO98/24893, publicada el 11 de Octubre de 1998. Por consiguiente, para examinar adicionalmente la estructura del anticuerpo, los autores de la presente invención generaron secuencias de aminoácidos pronosticadas de los anticuerpos a partir de los ADNc obtenidos de los clones.

El dominio variable de la cadena pesada del Mab 20.13.3 contiene tres sustituciones de aminoácidos en comparación con la línea germinal - una en la CDR2 y dos en la CDR3. El dominio variable de la cadena ligera del Mab 20.13.3 contiene cinco mutaciones con respecto a la línea germinal, una en cada una de CDR1, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.

Se apreciará que muchas de las sustituciones o inserciones de aminoácidos identificadas antes existen en íntima proximidad a o en una CDR. Tales sustituciones parecerían portar cierto efecto sobre la unión del anticuerpo a la molécula de IL-5. Adicionalmente, tales sustituciones podrían tener un efecto significativo sobre la afinidad de los anticuerpos.

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Ejemplo 6 Determinación de las Constantes de Afinidad (K_{d}) del Anticuerpo Monoclonal Anti-IL-5 Completamente Humano Mediante Análisis de Exclusión Cinética

Se determinó la constante de disociación en equilibrio (Kd) para el anticuerpo monoclonal humano 20.13.3 utilizando el aparato KinExA 3000® (Sapidyne Instruments Inc.). El KinExA utiliza el principio del método de Análisis de Exclusión Cinética basado en la medida de la concentración de anticuerpo que no forma complejo en una mezcla de anticuerpo, antígeno y complejo antígeno-anticuerpo. La concentración de anticuerpo libre se mide exponiendo la mezcla a un antígeno inmovilizado en fase sólida durante un período de tiempo muy breve. En la práctica, esto se logra haciendo fluir la mezcla de antígeno-anticuerpo en fase de solución por delante de las partículas recubiertas con antígeno atrapadas en una célula de flujo. Los datos, generados por el aparato se analizan utilizando el soporte lógico ad hoc. Las constantes de equilibrio se calculan utilizando una teoría matemática basada en las siguientes suposiciones:

1. 1.

La unión sigue la ecuación de unión reversible para el equilibrio:

K_{on}[Ab][Ag] = K_{off}[Ab \ Ag];

2. 2.

El anticuerpo y el antígeno se unen 1:1, y el anticuerpo total es igual al complejo antígeno-anticuerpo más el anticuerpo libre;

\quad

y

3. 3.

La señal del aparato está linealmente relacionada con la concentración de anticuerpo libre.

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Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con el Manual de KinExA 3000®. Todas las rondas se realizaron por duplicado. La siguiente tabla muestra las condiciones de análisis para las rondas de K_{d} patrón a concentraciones de Ab de 0,1 nM y 0,01 nM, respectivamente:

8

En cada análisis, se prepararon diluciones seriadas al doble del antígeno y se mezclaron con el anticuerpo a concentración constante. La mezcla se incubó durante 2 horas a la temperatura ambiente para equilibrar.

Los materiales utilizados en los análisis anteriores fueron: Mab 20.13.3; IL_5 humana recombinante (rhIL-5) (asequible de Sigma (Núm. Cat. I5273), R&D Systems (Núm. Cat. 205-IL-005), Amersham (Núm. Cat. ARM19005), y Calbiochem (Núm. Cat. 407641)); partículas PMMA, 8 micras (Sapidyne, Núm. Cat. 440198); Neutravidina (Pierce, Cat No. 31000); EZ-link TFP PEO-Biotin (Pierce, Núm. Cat. 21219); rhIL-5 Biotinilada (razón Biotina/proteína: 19/1); y anti-HuIg de cabra conjugada con Cy5 (H+L) (Jackson Immunoresearch Laboratories Núm. Cat. 109-175-003). Las partículas de PMMA se recubrieron con rhIL-5 biotinilada de acuerdo con el "protocolo para recubrir partículas de PMMA con ligandos biotinilados que tienen brazos conectores cortos o no existentes" de Sapidyne. Para la biotinilación de rhIL-5 se utilizó EZ-link TFP PEO-biotina de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Boletín Pierce 0874). La razón de Biotina/proteína se estimó utilizando el análisis HABA (Boletín Pierce 0212).

El análisis de la Curva Dual (Concentraciones de Anticuerpo 0,1 y 0,01 nM) en el "modo convencional" (véase el Manual KinExA 3000® para una explicación de los métodos del análisis de datos de la Curva Dual) generó una buena curva de mejor ajuste para la Kd con un mínimo claro. El valor de la Kd calculado para el Mab 20.13.3 para este método de análisis fue 1,5 x 10^{-11} M. La Kd para el Mab 20.13.3 calculada mediante el método de la Curva Dual (Antígeno Desconocido) fue 1,95 x 10^{-11} M, que estaba comprensiblemente próxima a la Kd obtenida mediante el método de la Curva Dual (Convencional). El peso molecular del anticuerpo utilizado para el cálculo fue 150 Kda.

El análisis cinético indica que los anticuerpos preparados de acuerdo con la invención poseen afinidades elevadas por la IL-5 humana.

En toda esta memoria y en las reivindicaciones, se entenderá que la palabra "comprenden", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros establecido pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros.

<110> Schering Corporation and Abgenix, Inc.

\hskip1cm Greenfeder, Scott

\hskip1cm Corvalan, Jose

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<120> ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS PARA INTERLEUQUINA-5 Y MÉTODOS Y COMPOSICIONES QUE LOS COMPRENDEN

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<130> LI01564WI

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<160> 22

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 2002

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> región_V

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<222> (1)..(414)

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<223>

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<220>

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<221> región_CH1 C

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<222> (415)..(709)

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<223>

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<220>

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<221> Bisagra

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<222> (1102)..(1137)

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<223>

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<220>

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<221> región_CH2 C

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<222> (1256)..(1585)

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<223>

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> región_CH3 C

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1683)..(2002)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 465

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Región Variable

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20).. (138)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Región CH1

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (139)..(236)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Región Bisagra

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (237)..(248)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Región CH2

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (249)..(358)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Región CH3

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (359)..(465)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\hskip1cm10

\hskip1cm11

\hskip1cm12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 708

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm13

\hskip1cm14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 236

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Péptido Señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip1cm15

\hskip1cm16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 414

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip1cm26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip1cm33

Claims (21)

1. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno que se une específicamente a IL-5, donde dicho anticuerpo o fragmento comprende:

(i)

una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2, con o sin el péptido señal;

(b)

la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 6;

(c)

la secuencia de aminoácidos desde el resto 50-127 del SEQ ID NO: 2; y

(d)

las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID NOS: 8, 10, y 12, respectivamente; y

(ii)

una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 4, con o sin el péptido señal;

(b)

la secuencia de aminoácidos desde el resto 23-130 del SEQ ID NO: 4;

(c)

la secuencia de aminoácidos desde el resto 46-119 del SEQ ID NO: 4; y

(d)

las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID NOS: 14, 16, y 18, respectivamente.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Una molécula de ácido nucleico que comprende:

(i)

una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2, con o sin el péptido señal;

(b)

la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 6;

(c)

la secuencia de aminoácidos desde el resto 50-127 del SEQ ID NO: 2; y

(d)

las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID NOS: 8, 10, y 12, respectivamente; y

(ii)

una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 4, con o sin el péptido señal;

(b)

la secuencia de aminoácidos desde el resto 23-130 del SEQ ID NO: 4;

(c)

la secuencia de aminoácidos desde el resto 46-119 del SEQ ID NO: 4; y

(d)

las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID NOS: 14, 16, y 18, respectivamente.

\vskip1.000000\baselineskip

3. Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, comprendiendo dicho ácido nucleico:

(i)

una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 1-709, 1102-1137, 1256-1585, y 1683-2002 del SEQ ID NO: 1;

(b)

la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 58-709, 1102-1137, 1256-1585, y 1683-2002 del SEQ ID NO: 1;

(c)

la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 58-709 del SEQ ID NO: 1;

(d)

la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 148 al 381 del SEQ ID NO: 1; y

(e)

la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 1 al 2002 del SEQ ID NO: 1; y (ii) una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 3;

(b)

la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 67-708 mostrada en el SEQ ID NO: 3;

(c)

la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 67-390 mostrada en el SEQ ID NO; 3; y

(d)

la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 67-357 mostrada en el SEQ ID NO: 3.

4. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 2-3, conectada operablemente a una secuencia de control de la expresión.

5. Una célula anfitriona transformada con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la Reivindicación 4.

6. Un método para producir una inmunoglobulina o uno de sus fragmentos de unión al antígeno que se une específicamente a IL-5, que comprende la etapa de cultivar una célula anfitriona de acuerdo con la Reivindicación 5.

7. Una célula anfitriona transformada con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la Reivindicación 2 o la Reivindicación 3.

8. Un método para producir un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno que se une específicamente a IL-5, que comprende la etapa de cultivar una célula anfitriona de acuerdo con la Reivindicación 7.

9. Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la Reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

10. La composición de acuerdo con la Reivindicación 9, que comprende adicionalmente un componente seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un agente diagnóstico; y

(b)

un agente terapéutico.

\vskip1.000000\baselineskip

11. Un kit que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la Reivindicación 1.

12. El uso del anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la Reivindicación 1 o una composición de acuerdo con la Reivindicación 9 o 10 en la fabricación de un medicamento para prevenir o inhibir una condición o trastorno caracterizado por una actividad de IL-5 no deseada.

13. El uso de acuerdo con la Reivindicación 12, donde la condición o trastorno se selecciona del grupo que consiste en: asma, exacerbaciones del asma, episodios de empeoramiento del asma, neumonía crónica, rinitis alérgica, rinitis alérgica perenne, aspergilosis broncopulmonar alérgica, hipereosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por Onchocerca, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica, enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones por helmintos, enfermedad de Hodgkins, pólipos nasales, síndrome de Loeffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis nodosa, sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica, esofagitis eosinofílica alérgica, conjuntivitis alérgica.

14. El uso de acuerdo con la Reivindicación 12 o 13, donde el método disminuye o inhibe la infiltración de eosinófilos en el tejido afectado.

15. El uso del anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con la Reivindicación 1 o una composición de acuerdo con la Reivindicación 9 o 10 en la fabricación de un medicamento para prevenir o inhibir una respuesta alérgica mediada por IL-5 en un sujeto.

16. El uso del anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con la Reivindicación 1 o una composición de acuerdo con la Reivindicación 9 o 10, en la fabricación de un medicamento para prevenir o inhibir un evento mediado por IL-5 seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

proliferación, maduración, supervivencia, activación, migración a la corriente sanguínea, adherencia al endotelio, infiltración en tejidos de eosinófilos;

(b)

edema pulmonar;

(c)

broncoconstricción;

(d)

hipersensibilidad de las vías respiratorias;

(e)

eosinofilia o neutrofilia pulmonar;

(f)

eosinofilia cutánea; y

(g)

lesión epitelial de las vías respiratorias.

\vskip1.000000\baselineskip

17. El uso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 14-16, donde el anticuerpo anti-IL-5 se administra junto con la administración de otro agente terapéutico.

18. Un método in vitro para prevenir o inhibir la unión de IL-5 a un receptor de IL-5, comprendiendo el método la etapa de administrar al entorno en el se encuentran las células que expresan un receptor de IL-5 un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con la Reivindicación 1 o una composición de acuerdo con la Reivindicación 9 o 10.

19. Un método in vitro para prevenir o inhibir la fosforilación de tirosina mediada por el receptor de IL-5 que comprende la etapa de administrar al entorno en el que se encuentran las células que expresan la IL-5 un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con la Reivindicación 1 o una composición de acuerdo con la Reivindicación 9 o 10.

20. El uso de un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con la Reivindicación 1 o una composición de acuerdo con la Reivindicación 9 o 10 en la fabricación de una composición para prevenir o inhibir la unión de IL-5 a un receptor de IL-5.

21. El uso de un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con la Reivindicación 1 o una composición de acuerdo con la Reivindicación 9 o 10 en la fabricación de una composición para prevenir o inhibir la fosforilación de tirosina mediada por el receptor de IL-5.