ES2327830T3 - Anticuerpos monoclonales humanos anti-interleuquina-5 y metodos y composiciones que los contienen. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno que se une específicamente a IL-5, donde dicho anticuerpo o fragmento comprende: (i) una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2, con o sin el péptido señal; (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 6; (c) la secuencia de aminoácidos desde el resto 50-127 del SEQ ID NO: 2; y (d) las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID NOS: 8, 10, y 12, respectivamente; y (ii) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 4, con o sin el péptido señal; (b) la secuencia de aminoácidos desde el resto 23-130 del SEQ ID NO: 4; (c) la secuencia de aminoácidos desde el resto 46-119 del SEQ ID NO: 4; y (d) las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID NOS: 14, 16, y 18, respectivamente.
Description
Anticuerpos monoclonales humanos
anti-interleuquina-5 y métodos y
composiciones que los contienen.
La presente invención se refiere a anticuerpos
monoclonales humanos y sus porciones de unión al antígeno que se
unen específicamente a interleuquina-5
(IL-5) y a los métodos y composiciones que
comprenden tales anticuerpos monoclonales o sus porciones de unión
al antígeno.
Los eosinófilos juegan un importante papel en la
patogénesis del asma. Tanto la gravedad del asma como el grado de
hipersensibilidad de las vías respiratorias se corresponden con el
número de eosinófilos en sangre y esputos. Los estudios de biopsias
bronquiales muestran que los eosinófilos son un componente
prominente de la inflamación de las vías respiratorias asmáticas y
que los contenidos de los gránulos de eosinófilos están presentes
en concentraciones crecientes en el fluido de revestimiento de las
vías respiratorias de los asmáticos. Estos contenidos de los
gránulos consisten en numerosas proteínas que tienen efectos tóxicos
directos sobre las células de las vías respiratorias por medio de
múltiples mecanismos tales como desprendimiento de células
epiteliales, ciliostasis, generación de radicales oxígeno y lesión
de las fibras nerviosas de las vías respiratorias. Los eosinófilos
también producen mediadores que pueden aumentar la liberación de
histamina en los mastocitos. Este espectro de actividades
contribuye directamente a la inflamación crónica de las vías
respiratorias bronquiales que se manifiesta por hinchazón de las
paredes de las vías respiratorias y generación de mucus en las vías
respiratorias. Facilitando la penetración de agentes transmitidos
por el aire a través del epitelio de las vías respiratorias
dañadas, esta inflamación puede causar directamente un aumento de la
sensibilidad neuronal y de la contracción de la musculatura lisa
(Greenfeder et al. Respiratory Research
2:71-79, 2001).
La interleuquina 5 (IL-5) es el
principal mediador de los eosinófilos y un factor crítico en la
lesión inflamatoria de las vías respiratorias en el asma. Es
producida principalmente por el subgrupo Th2 de las células T y, en
un grado menor, por otros tipos de células incluyendo los
eosinófilos. La IL-5 tiene una importancia crítica
para la maduración de los eosinófilos en la médula ósea y una
importancia menor para la respuesta quimiotáctica de los
eosinófilos. La IL-5 también estimula la activación
de los eosinófilos, prolonga la supervivencia, facilita la
desgranulación en respuesta a estímulos específicos (tales como IgA
o IgG), y es generalmente un mediador
pro-inflamatorio. Se han medido aumentos de niveles
de IL-5 en el asma clínica y en modelos de
sensibilización con antígenos bronquiales humanos (Greenfeder et
al. Respiratory Research 2:71-79, 2001).
El asma es tratada en la actualidad muy
eficazmente mediante un régimen de esteroides inhalados u orales que
suprime la expresión de numerosos mediadores clave en el asma,
incluyendo la IL-5, dando como resultado una
disminución de la inflamación pulmonar. Existen, sin embargo,
impedimentos percibidos a largo plazo de la terapia con esteroides.
Por estas razones, la terapia
anti-IL-5 directa, es una diana
atractiva en el control del asma.
De este modo, sería deseable obtener anticuerpos
de alta afinidad, concretamente anticuerpos
anti-IL-5 humanos, que pudieran ser
utilizados para tratar las patologías mediadas por
IL-5 en seres humanos.
La presente descripción proporciona anticuerpos
o sus porciones de unión al antígeno, que se unen específicamente a
IL-5 y que se definen en las reivindicaciones
adjuntas. En ciertas realizaciones, los anticuerpos o porciones de
unión al antígeno son aislados y puede ser policlonales o
monoclonales. Los anticuerpos de la invención se unen
específicamente a IL-5 humana. En realizaciones
particularmente preferidas, los anticuerpos son anticuerpos
monoclonales humanos.
Se describen las secuencias de aminoácidos de la
cadena pesada de los anticuerpos o sus fragmentos de unión al
antígeno que comprenden una secuencia de aminoácidos derivada de las
secuencias de aminoácidos de la línea germinal de un gen
V3-23 humano, un gen D1-20 humano y
un gen JH4B humano. La cadena pesada CDR2 de los anticuerpos o sus
fragmentos de unión al antígeno pueden comprender una sustitución de
aminoácido en comparación con la secuencia de aminoácidos de la
línea germinal y la cadena pesada CDR3 contiene dos sustituciones de
aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la
línea germinal.
Se describen las secuencias de aminoácidos de la
cadena ligera de los anticuerpos o sus fragmentos de unión al
antígeno que comprenden una secuencia de aminoácidos derivada de las
secuencias de aminoácidos de la línea germinal de un gen VK08/018
humano y un gen JK4 humano. La cadena ligera CDR1, CDR2, FR3, CDR3 y
FR4 pueden comprender cada una sustitución de aminoácido en
comparación con la secuencia de aminoácidos de la línea
germinal.
En un primer aspecto, la presente descripción
proporciona un anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno que
se une específicamente a IL-5, donde dicho
anticuerpo o fragmento comprende: i) una secuencia de aminoácidos
de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: (a) la
secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2, con o sin el
péptido señal; (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID
NO: 6; (c) la secuencia de aminoácidos desde el resto
50-127 del SEQ ID NO: 2; y (d) las secuencias de
aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID NOS: 8, 10, y
12, respectivamente; y (ii) la secuencia de aminoácidos de la
cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: (a) la
secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 4, con o sin el
péptido señal; (b) la secuencia de aminoácidos desde el resto
23-130 del SEQ ID NO: 4; (c) la secuencia de
aminoácidos desde el resto 46-119 del SEQ ID NO: 4;
y (d) las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en
los SEQ ID NOS: 14, 16, y 18, respectivamente. De este modo en
algunas realizaciones del primer aspecto, el anticuerpo comprende
la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada mostrada en el SEQ
ID NO: 2. En otras realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena
pesada que comprende la CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID
NOS: 8, 10, y 12, respectivamente. En otra realización, la cadena
pesada del anticuerpo comprende una porción contigua de la
secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2 desde CDR1 a CDR3.
En una realización adicional, la cadena pesada del anticuerpo
comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la
cadena pesada mostrada en el SEQ ID NO: 6. Cualquiera de los
anticuerpos descritos antes comprende adicionalmente la secuencia
de aminoácidos de la cadena ligera mostrada en el SEQ ID NO: 4, o
la región variable (restos aminoácido 23-130 del SEQ
ID NO: 4), las CDR1 a CDR3 mostradas en la Tabla 3 (restos
aminoácido 46-119 del SEQ ID NO: 4) o CDR1 (SEQ ID
NO: 14), CDR2 (SEQ ID NO: 16) y CDR3 (SEQ ID NO: 18) de la
secuencia de aminoácidos de la cadena ligera.
Los anticuerpos o sus porciones pueden ser una
molécula de inmunoglobulina G (IgG), una IgM, una IgE, una IgA o
una IgD. En una realización preferida, el anticuerpo humano es una
IgG y es un subtipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En una realización más
preferida, el anticuerpo humano es un subtipo IgG4. En una
realización aún más preferida, el anticuerpo humano es 20.13.3. En
otra realización, el anticuerpo o su porción de unión al antígeno
deriva de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')_{2}, un
fragmento F_{v}, un anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo
quimérico. En otra realización, el anticuerpo o su porción de unión
al antígeno forma una proteína de fusión.
En otro aspecto, la descripción proporciona
moléculas de polinucleótido que comprenden secuencias que codifican
moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada o ligera o sus
porciones, concretamente secuencias de nucleótidos que codifican
regiones variables de la cadena pesada y ligera, secuencias de
aminoácidos de la cadena pesada y ligera contiguas de CDR1 a CDR3 y
CDR individuales. Las moléculas de polinucleótido de la invención se
definen en las reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con otro objeto, la descripción
proporciona un anticuerpo anti-IL-5
humano o una de sus porciones de unión al antígeno que está marcada
o derivatizada. En una realización, el anticuerpo o su porción están
marcados con una marca radiactiva, una marca enzimática, una
toxina, un agente magnético o un producto conjugado con un fármaco.
En otra realización, el anticuerpo o su porción están derivatizados
para mejorar una o más de sus características, tales como la vida
media, la biodisponibilidad o la actividad. En una realización
preferida, el anticuerpo o su porción son derivatizados con
polietilenglicol, al menos un grupo metilo o etilo o al menos un
radical hidrocarbonado. En otra realización preferida, el anticuerpo
o su porción marcados o derivatizados se utilizan en métodos
diagnósticos o terapéuticos.
De acuerdo con otro objeto, la descripción
proporciona un anticuerpo anti-IL-5
o su porción de unión al antígeno que se caracteriza por uno o más
de los siguientes: inhibe o disminuye la inflamación mediada por
IL-5, la maduración, la activación, la
desgranulación o la infiltración de los eosinófilos en un tejido
in vivo o in Vitro, inhibe la
hiper-sensibilidad inducida por IL-5
de la musculatura lisa, y disminuye los niveles de
IL-5 en pulmones, vías respiratorias o sangre. En
una realización preferida, el anticuerpo humano inhibe o disminuye
la infiltración de eosinófilos en un tejido in vivo. En una
realización preferida, el tejido es el pulmón o el tejido que
reviste las vías respiratorias.
De acuerdo con otro aspecto, la descripción
proporciona composiciones farmacéuticas y kits que comprenden el
anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno y un portador
farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, la
composición farmacéutica o kit comprende otro componente, tal como
un reactivo de formación de imágenes o un agente terapéutico. En
las realizaciones preferidas, la composición farmacéutica o kit se
utiliza en métodos diagnósticos o terapéuticos.
Asimismo se describen en la presente memoria,
métodos diagnósticos, p. ej. un método para diagnosticar la
presencia o localización de un tejido que expresa
IL-5. En un caso preferido, en el método se utiliza
un anticuerpo marcado o una de sus porciones. El método se puede
utilizar in vivo o in vitro. En otro caso, se
proporciona en método diagnóstico que comprende determinar si un
anticuerpo anti-IL-5 humano inhibe o
disminuye la infiltración eosinofílica en un tejido, p. ej. el
pulmón.
En un aspecto adicional, la descripción
proporciona el uso de un anticuerpo
anti-IL-5 o una de sus porciones de
unión al antígeno en la fabricación de un medicamento como se define
en las reivindicaciones adjuntas. En una realización, el método
terapéutico comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz
del anticuerpo a un sujeto que lo necesite. En una realización
preferida, el sujeto padece asma, exacerbaciones del asma,
episodios que empeoran el asma, neumonía crónica, rinitis alérgica,
rinitis alérgica perenne, aspergilosis broncopulmonar alérgica,
hipereosinofilia, síndrome de Churo-Strauss,
dermatitis atópica, dermatitis por Onchocerca, angioedema
episódico, síndrome de mialgia eosinofílica, enfermedad celíaca,
gastroenteritis eosinofílica, infecciones helmínticas, enfermedad
de Hodgkins, pólipos nasales, síndrome de Loeffler, urticaria,
bronquitis hipereosinofílica, arteritis nodosa, sinusitis,
sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica, esofagitis eosinofílica
alérgica, conjuntivitis alérgica. En una realización más preferida,
el método inhibe o disminuye la infiltración eosinofílica en el
pulmón. El anticuerpo o su porción pueden ser administrados de tres
veces al día a una vez cada seis meses, y pueden ser administrados
por ruta intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral o
tópica. En otra realización, el método se realiza junto con cirugía
u otra inmunoterapia. En otra realización más, el anticuerpo está
marcado con una marca radiactiva, un producto conjugado con fármaco,
una inmunotoxina o una toxina, o es una proteína de fusión que
comprende un péptido tóxico.
En otro aspecto, la presente descripción
proporciona métodos para producir un anticuerpo de la memoria o una
de sus porciones de unión al antígeno, incluyendo la producción por
una célula inmortalizada, métodos sintéticos, expresión
recombinante o presentación en fagos.
Otro objeto es proporcionar ácidos nucleicos
como los definidos por las reivindicaciones adjuntas que codifican
la cadena pesada y/o ligera, sus porciones de unión al antígeno o
sus derivados de un anticuerpo
anti-IL-5. En una realización
preferida, la molécula de ácido nucleico deriva de una célula o una
línea celular que expresa un anticuerpo
anti-IL-5. En una realización más
preferida, el ácido nucleico deriva de un hibridoma. En una
realización aún más preferida, el hibridoma es 20.13.3. En otra
realización, la descripción proporciona vectores y células
anfitrionas que comprenden una o varias de las moléculas de ácido
nucleico descritas. En una realización adicional, la descripción
proporciona un método de producción recombinante de la cadena pesada
y/o ligera, sus porciones de unión al antígeno o sus derivados.
Asimismo se describe en la presente memoria un
método para tratar a un sujeto que lo necesite con una cantidad
eficaz de una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena
pesada y/o ligera, sus porciones de unión al antígeno o sus
derivados de un anticuerpo
anti-IL-5. En una realización
preferida, el método se utiliza para tratar, sin limitación, asma,
exacerbaciones del asma, episodios de empeoramiento del asma,
neumonía crónica, rinitis alérgica, rinitis alérgica perenne,
aspergilosis broncopulmonar alérgica, hipereosinofilia, síndrome de
Churo-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por
Onchocerca, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica,
enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones
helmínticas, enfermedad de Hodgkins, pólipos nasales, síndrome de
Loeffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis nodosa,
sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica, esofagitis
eosinofílica alérgica, conjuntivitis alérgica.
A menos que se defina de otro modo en la
presente memoria, los términos científicos y técnicos utilizados
con respecto a la presente invención tendrán los significados que
comprenden comúnmente los expertos en la técnica. Adicionalmente, a
menos que sea requerido de otro modo por el contexto, los términos
en singular incluirán las pluralidades y los términos en plural
incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas
con respecto a, y las técnicas de, cultivo de células y tejidos,
biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química
e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas en la
presente memoria son aquellas bien conocidas y utilizadas
comúnmente en la técnica. Los métodos y técnicas se realizan
generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos
en la técnica y descritos en diversas referencias generales y más
específicas que se citan y comentan a lo largo de la presente
memoria a menos que se indique de otro modo. Véanse, p. ej.,
Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
(1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular
Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow and Lane
Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor. Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Las reacciones enzimáticas
y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con la
especificación del fabricante, cumplidas comúnmente en la técnica o
como se describe en la presente memoria. Las nomenclaturas
utilizadas con respecto a, y los procedimientos y las técnicas de
laboratorio, de la química analítica, la química orgánica
sintética, y la química Médica y farmacéutica descritas en la
presente memoria son aquellas bien conocidas y utilizadas comúnmente
en la técnica. Las técnicas convencionales se utilizan para las
síntesis químicas, los análisis químicos, la preparación
farmacéutica, la formulación, y la liberación, y el tratamiento de
los pacientes.
Se deberá entender que los siguientes términos,
a menos que se indique de otro modo, tienen los siguientes
significados:
El término "polipéptido" abarca las
proteínas nativas o artificiales, los fragmentos de proteínas, y los
análogos polipeptídicos de una secuencia de proteína. Un
polipéptido puede ser monomérico o polimérico. Los polipéptidos
preferidos de acuerdo con la invención comprenden las moléculas de
inmunoglobulina de cadena pesada humana y las moléculas de
inmunoglobulina de cadena ligera kappa humana, así como las
moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden
las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de
inmunoglobulina de cadena ligera, tales como las moléculas de
inmunoglobulina de cadena ligera \kappa, así como sus fragmentos
y análogos.
El término "proteína aislada" o
"polipéptido aislado" es una proteína o polipéptido que en
virtud de su origen o fuente de derivación (1) no está asociado con
componentes asociados naturalmente que lo acompañan en su estado
nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3)
es expresado por una célula de una especie diferente, o (4) no se
encuentra en la naturaleza. De este modo, un polipéptido que es
sintetizado químicamente o sintetizado en un sistema celular
diferente de la célula a partir de la cual se origina naturalmente
estará "aislado" de sus componentes asociados naturalmente. Una
proteína también se puede volver sustancialmente libre de
componentes asociados naturalmente por aislamiento, utilizando
mecanismos de purificación de proteínas bien conocidos en la
técnica.
Una proteína o polipéptido es "sustancialmente
puro", "sustancialmente homogéneo" o "sustancialmente
purificado" cuando al menos aproximadamente un 60 a 75% de la
muestra exhibe una única especie de polipéptido. El polipéptido o
proteína puede ser monomérico o multimérico. Un polipéptido o
proteína sustancialmente puro comprenderá típicamente
aproximadamente un 50%, 60, 70%, 80% o 90% P/P de una muestra de
proteína, más usualmente aproximadamente 95%, y preferiblemente
será pura en más del 99%. La pureza u homogeneidad de la proteína
puede ser indicada por numerosos métodos bien conocidos en la
técnica, tales como la electroforesis en gel de poliacrilamida de
una muestra de proteína, seguido de la visualización de una única
banda de polipéptido tras la tinción del gen con un colorante bien
conocido en la técnica. Para ciertos fines, se puede proporcionar
una resolución superior utilizando HPLC u otros métodos bien
conocidos en la técnica para la purificación.
El término "fragmento polipeptídico" según
se utiliza en la presente memoria hace referencia a un polipéptido
que tiene una deleción amino terminal y/o carboxi terminal, pero
donde el resto de la secuencia de aminoácidos es idéntica a las
correspondientes posiciones de la secuencia de origen natural. Los
fragmentos tienen típicamente al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de
longitud, preferiblemente al menos 14 aminoácidos de longitud, más
preferiblemente al menos al menos 20 aminoácidos de longitud,
normalmente al menos 50 aminoácidos de longitud, e incluso más
preferiblemente al menos 70 aminoácidos de longitud.
El término "análogo polipeptídico" según se
utiliza en la presente memoria hace referencia a un polipéptido que
está comprendido por un segmento de al menos 25 aminoácidos que
tiene una identidad sustancial con una porción de una secuencia de
aminoácidos y que se une específicamente a IL-5 en
condiciones de unión adecuadas. Típicamente, los análogos
polipeptídicos comprenden una sustitución de aminoácidos
conservativa (o una inserción o deleción) con respecto a la
secuencia de origen natural. Los análogos tienen típicamente al
menos 20 aminoácidos de longitud, preferiblemente al menos 50
aminoácidos de longitud o más, y a menudo pueden ser tan largos como
un polipéptido de origen natural completo.
Comúnmente se utilizan análogos no peptídicos en
la industria farmacéutica como fármacos con propiedades análogas a
las de péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se
denominan "miméticos de péptidos" o "peptidomiméticos".
Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS
p.392 (1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987),
que se incorporan a la presente memoria como referencia. Tales
compuestos se desarrollan a menudo con la ayuda de modelos
moleculares computarizados. Los miméticos de péptidos que son
estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles
pueden ser utilizados para producir un efecto terapéutico o
profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son
estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (esto es, un
polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o una actividad
farmacológica deseada), tal como un anticuerpo humano, pero tienen
uno o más enlaces peptídicos opcionalmente sustituidos por un enlace
seleccionado del grupo que consiste en: -CH_{2}NH-, -CH_{2}S-,
-CH_{2}-CH_{2}-, -CH=CH-(cis y trans),
-COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2-}-, y -CH_{2}SO-,
mediante métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución
sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso por
un D-aminoácido del mismo tipo (p. ej.,
D-lisina en lugar de L-lisina)
también se puede utilizar para generar péptidos más estables.
Además, se pueden generar péptidos restringidos que comprenden una
secuencia consenso o una variación de la secuencia consenso
sustancialmente idéntica mediante métodos conocidos en la técnica
(Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992); por ejemplo,
añadiendo restos cisteína internos capaces de formar puentes
disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.
Una "inmunoglobulina" es una molécula
tetramérica. En una inmunoglobulina de origen natural, cada
tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas
polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera"
(aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente
50-70 kDa). La porción amino terminal de cada cadena
incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más
aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del
antígeno. La porción carboxi terminal de cada cadena define una
región constante responsable principalmente de la función efectora.
Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras
\kappa y \lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como \mu,
\Delta, \gamma, \alpha, o \varepsilon, y definen el isotipo
del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, y IgE, respectivamente. En
las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes
se unen por medio de una región "J" de aproximadamente 12 o más
aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región
"D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase
generalmente, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed.,
2ª ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada
par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo
de manera que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de
unión.
Las cadenas de inmunoglobulina muestran la misma
estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas
unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas
regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de
las dos cadenas de cada par se alinean por medio de las regiones
marco, permitiendo la unión a un epítopo específico. Desde el
extremo N al extremo C, las cadenas tanto ligera como pesada
comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La
asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las
definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological
Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y
1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature
342:878-883 (1989).
\newpage
Un "anticuerpo" hace referencia a una
inmunoglobulina intacta, o a una porción de unión al antígeno de la
misma que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica.
Las porciones de unión al antígeno pueden ser producidas mediante
técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o
química de anticuerpos intactos. Las porciones de unión al antígeno
incluyen, inter alia, los fragmentos Fab, Fab',
F(ab')_{2}, Fv, dAb, y de la región determinante de la
complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv),
anticuerpos quiméricos, fragmentos bivalentes de anticuerpos
"diabodies" y polipéptidos que contienen al menos una porción
de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión
específica del antígeno al polipéptido. Un fragmento Fab es un
fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH
I; un fragmento F(ab')_{2} es un fragmento bivalente que
comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la
región bisagra; un fragmento Fd consiste en los dominios VH y CH1;
un fragmento Fv consiste en los dominios VL y VH de un brazo
sencillo de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward et al.,
Nature 341:544-546, 1989) consiste en un dominio
VH. Un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) es un anticuerpo en el
que las regiones VL y VH están emparejadas para formar moléculas
monovalentes por medio de un conector sintético que permite
elaborarlas en forma de una cadena de proteína sencilla (Bird et
al., Science 242:423-426, 1988 y Huston et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883,
1988). Los fragmentos bivalentes de anticuerpos "diabodies"
son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los cuales los dominios
VH y VL son expresados sobre una única cadena polipeptídica, pero
utilizando un conector que es demasiado corto para permitir el
emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, forzando
de ese modo a los dominios a emparejarse con dominios
complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a
antígenos (véase p. ej., Holliger, P., et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, y Poljak, R. J.,
et al., Structure 2:1121-1123, 1994). Se
pueden incorporar una o más CDR a una molécula covalentemente o no
covalentemente para hacer de ella una inmunoadhesina. Una
inmunoadhesina puede incorporar las CDR como parte de una cadena
polipeptídica mayor, puede unir covalentemente las CDR a otra
cadena polipeptídica, o puede incorporar las CDR no covalentemente.
Las CDR permiten que la inmunoadhesina se una específicamente a un
antígeno particular de interés.
Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de
unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden
ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una
inmunoglobulina de origen natural tiene dos sitios de unión
idénticos, un anticuerpo de cadena sencilla o fragmento Fab tiene un
sitio de unión, mientras un anticuerpo "biespecífico" o
"bifuncional" tiene dos sitios de unión diferentes. Los
anticuerpos biespecíficos pueden ser producidos mediante una
variedad de métodos incluyendo la fusión de hibridomas o la
conexión de fragmentos Fab'. Véase, p. ej., Songsivilai &
Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990),
Kostelny et al. J. Immunol.
148:1547-1553(1992).
Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo
que (1) no está asociado con componentes asociados naturalmente,
incluyendo otros anticuerpos asociados naturalmente, que lo
acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de
la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie
diferente, o (4) no se encuentra en la naturaleza. Los ejemplos de
los anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo
anti-IL-5 que ha sido purificado
por afinidad utilizando IL-5, un anticuerpo
anti-IL-5 que ha sido sintetizado
por un hibridoma u otra línea celular in vitro, y un
anticuerpo anti-IL-5 humano derivado
de un ratón transgénico.
El término "anticuerpo humano" incluye
todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y
constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas humanas.
Estos anticuerpos pueden ser preparados de diversas formas, como se
describe más abajo.
Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que
está derivado de una especie no humana, en la cual ciertos
aminoácidos de los dominios marco y constantes de las cadenas
pesada y ligera han sido mutados con el fin de evitar o anular una
respuesta inmunitaria en seres humanos. Alternativamente, se puede
producir un anticuerpo humanizado fusionando los dominios
constantes de un anticuerpo humano a los dominios variables de una
especie no humana. Los ejemplos de cómo elaborar anticuerpos
humanizados se pueden encontrar en las Patentes de los Estados
Unidos Núms. 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293.
El término "anticuerpo quimérico" hace
referencia a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un
anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos
distintos.
El término "K_{off}" hace referencia a la
constante de la velocidad de disociación para la disociación de un
anticuerpo a partir del complejo anticuerpo/antígeno.
El término "K_{d}" hace referencia a la
constante de disociación de una interacción
anticuerpo-antígeno concreta.
El término "epítopo" incluye cualquier
determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una
inmunoglobulina o un receptor de células T. Los determinantes
epitópicos consisten normalmente en agrupamientos de moléculas de
superficie químicamente activos tales como cadenas laterales de
aminoácidos o azúcares y tienen normalmente características
estructurales tridimensionales específicas, así como características
de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une
específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es
\leq1 \muM, preferiblemente \leq100 nM y muy preferiblemente
\leq10 nM.
Los fragmentos o análogos de anticuerpo o
moléculas de inmunoglobulina pueden ser preparados fácilmente por
aquellos expertos en la técnica siguiendo las enseñanzas de esta
memoria. Los extremos amino y carboxi preferidos de los fragmentos
o análogos se encuentran cerca de los límites de los Dominios
funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden ser
identificados mediante comparación de los datos de la secuencia de
nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias
públicas o privadas. Preferiblemente, los métodos de comparación
computarizados se utilizan para identificar motivos de la secuencia
o dominios de conformación de proteínas pronosticados que existen
en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Los métodos
para identificar las secuencias de proteínas
que se pliegan en una estructura tridimensional conocida son conocidos. Bowie et al. Science 253:164 (1991).
que se pliegan en una estructura tridimensional conocida son conocidos. Bowie et al. Science 253:164 (1991).
Las sustituciones de aminoácidos preferidas son
aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2)
reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad
de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran las
afinidades de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades
fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden
incluir diversas muteínas de una secuencia distinta de la secuencia
peptídica de origen natural. Por ejemplo, las sustituciones de un
único o de múltiples aminoácidos (preferiblemente sustituciones de
aminoácidos conservativas) se pueden realizar en la secuencia de
origen natural (preferiblemente en la porción del polipéptido fuera
de los dominios que forman los contactos intermoleculares. Una
sustitución de aminoácidos conservativa no debe cambiar
sustancialmente las características estructurales de la secuencia
de origen (p. ej., una sustitución de un aminoácido no debe tender a
romper una hélice que exista en la secuencia de origen, o
interrumpir otros tipos de estructura secundaria que caractericen la
secuencia de origen). Los ejemplos de las estructuras secundarias y
terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen
en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.
H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein
Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva
York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354:105
(1991).
Según se utiliza en la presente memoria, los
veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso
convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2ª Edición, E.S. Golub
and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass.
(1991)).
Los estereoisómeros (p. ej.,
D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos
convencionales, los aminoácidos no naturales tales como los
aminoácidos \alpha,\alpha-disustituidos, los
N-alquil-aminoácidos, el ácido
láctico, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser
componentes adecuados para los polipéptidos de la presente
invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen:
4-hidroxiprolina,
\gamma-carboxiglutamato,
\varepsilon-N,N,N-trimetillisina,
\varepsilon-N-acetil-lisina,
O-fosfoserina, N-acetilserina,
N-formilmetionina,
3-metilhistidina, 5-hidroxilisina,
s-N-metilarginina, y otros
aminoácidos e iminoácidos similares (p. ej.,
4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos
utilizada en la presente memoria, la dirección a mano izquierda es
la dirección amino terminal y la dirección a mano derecha es la
dirección carboxi terminal, de acuerdo con el uso normalizado y la
convención.
El término "polinucleótido" referido en la
presente memoria representa una forma polimérica de nucleótidos de
al menos 10 bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o
desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de
nucleótido. El término incluye formas monocatenarias y bicatenarias
de ADN.
El término "polinucleótido aislado" según
se utiliza en la presente memoria debe representar un polinucleótido
de origen genómico, de ADNc, o sintético o alguna de sus
combinaciones, en virtud de cuyo origen el "polinucleótido
aislado" (1) no está asociado con todo o una porción de un
polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" se
encuentra en la naturaleza, (2) está conectado operablemente a un
polinucleótido al que no está conectado en la naturaleza, o (3) no
se encuentra en la naturaleza como parte de una secuencia más
grande.
El término "oligonucleótido" referido en la
presente memoria incluye los nucleótidos de origen natural, y
modificados conectados por medio de enlaces oligonucleotídicos
naturales, y no naturales. Los oligonucleótidos son un subgrupo de
polinucleótidos que comprenden generalmente una longitud de 200
bases o menos. Preferiblemente los oligonucleótidos tienen de 10 a
60 bases de longitud y muy preferiblemente 12, 13, 14, 15, 16, 17,
18, 19, o 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son
normalmente monocatenarios, p. ej. para sondas; aunque los
oligonucleótidos pueden ser bicatenarios, p. ej. para su uso en la
construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos pueden ser
oligonucleótidos efectores o antisentido.
El término "nucleótidos de origen natural"
referido en la presente memoria incluye desoxirribonucleótidos y
ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" referido
en la presente memoria incluye nucleótidos con grupos azúcar
modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces
oligonucleotídicos" referido en la presente memoria incluye
enlaces oligonucleotídicos tales como fosforotioato,
fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato,
fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y similares.
Véanse p. ej., LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081
(1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein
et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al.
Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991), Zon et
al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, págs.
87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press.
Oxford Inglaterra (1991)); Stec et al. Patente de los
Estados Unidos Núm. 5.151.510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews
90:543 (1990). Un oligonucleótido puede incluir una marca para su
detección, si se desea.
A menos que se especifique de otro modo, el
extremo izquierdo de las secuencias de polinucleótidos
monocatenarias es el extremo 5'; la dirección izquierda de las
secuencias de polinucleótidos bicatenarias es referida como
dirección 5'. La dirección de la adición 5' a 3' de los transcritos
de ARN nacientes es referida como la dirección de transcripción;
las regiones de la secuencia sobre la hebra de ADN que tienen la
misma secuencia que el ARN y que son 5' con respecto al extremo 5'
del transcrito de ARN son referidas como "secuencias aguas
arriba"; las regiones de la secuencia sobre la hebra de ADN que
tienen la misma secuencia que el ARN y que son 3' con respecto al
extremo 3' del transcrito de ARN son referidas como "secuencias
aguas abajo".
Las secuencias "conectadas operablemente"
incluyen tanto las secuencias de control de la expresión que son
contiguas al gen de interés como las secuencias de control de la
expresión que actúan en trans o a una distancia con respecto
al gen de interés. El término "secuencia de control de la
expresión" según se utiliza en la presente memoria hace
referencia a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para
efectuar la expresión y el procesamiento de las secuencias
codificantes a las cuales están conectadas. Las secuencias de
control de la expresión incluyen las secuencias de inicio de la
transcripción, terminación, promotoras e intensificadoras
apropiadas; las señales de procesamiento de ARN eficaces tales como
las señales de empalme y poliadenilación; las secuencias que
estabilizan el ARNm citoplásmico; las secuencias que intensifican la
eficacia de traducción (esto es, la secuencia consenso de Kozak);
las secuencias que intensifican la estabilidad de las proteínas; y
cuando se desee, las secuencias que intensifican la secreción de
proteínas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere
dependiendo del organismo anfitrión; en procariotas, tales
secuencias de control incluyen generalmente el promotor, el sitio
de unión al ribosoma, y la secuencia de terminación de la
transcripción; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de
control incluyen promotores y la secuencia de terminación de la
transcripción. Se pretende que el término "secuencias de
control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya
presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y
también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es
ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias compañeras de
fusión.
Se pretende que el término "vector", según
se utiliza en la presente memoria, haga referencia a una molécula
de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual
ha sido conectado. Un tipo de vector es un "plásmido", que
hace referencia a un bucle de ADN bicatenario circular en el cual se
pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es
un vector viral, en el que los segmentos de ADN adicionales pueden
ser ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de
replicar autónomamente en una célula anfitriona en la cual son
introducidos (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de
replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Otros
vectores (p. ej., vectores de mamífero no episómicos) pueden ser
integrados en el genoma de una célula anfitriona tras la
introducción en la célula anfitriona, y de ese modo replican junto
con el genoma del anfitrión. Por otra parte, ciertos vectores son
capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están
conectados operablemente. Tales vectores son referidos en la
presente memoria como "vectores de expresión recombinante" (o
simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores
de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están
a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria,
"plásmido" y "vector" se pueden utilizar indistintamente
ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada.
Sin embargo, se pretende que la descripción incluya esas otras
formas de vectores de expresión, tales como los vectores virales
(p. ej., retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus
adeno-asociados), que sirven para funciones
equivalentes.
El término "célula anfitriona recombinante"
(o simplemente "célula anfitriona"), según se utiliza en la
presente memoria, pretende hacer referencia a una célula en la cual
se ha introducido un vector de expresión recombinante. Se debe
entender que tales términos pretenden hacer referencia no solamente
al sujeto concreto si no a la progenie de semejante célula.
El término "hibrida selectivamente"
referido en la presente memoria significa que se une detectablemente
y específicamente. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y sus
fragmentos de acuerdo con la invención hibridan selectivamente con
hebras de ácido nucleico en condiciones de hibridación y lavado que
minimizan cantidades apreciables de unión detectable a ácidos
nucleicos no específicos. Se pueden utilizar condiciones de "alta
restricción" o "muy restrictivas"
para lograr condiciones de
hibridación selectivas como es sabido en la técnica y se comenta en
la presente memoria. Un ejemplo de condiciones de "alta
restricción" o "muy restrictivas" es un método de
incubación de un polinucleótido con otro polinucleótido, donde un
polinucleótido puede ser fijado a una superficie sólida tal como
una membrana, en un tampón de hibridación de 6X SSPE o SSC,
formamida al 50%, 5X reactivo de Denhardt, SDS al 0,5%, 100
\mug/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado
a una temperatura de hibridación de 42ºC durante
12-16 horas, seguido de lavado dos veces a 55ºC
utilizando un tampón de lavado de 1X SSC, SDS al 0,5%. Véase
también Sambrook et al., supra, págs.
9.50-9.55.
Dos secuencias de aminoácidos son homólogas si
existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por
ejemplo, una homología del 85% significa que el 85% de los
aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias son alineadas
para un emparejamiento máximo. Los espacios (que en cualquiera de
las dos secuencias están emparejados) se dejan en el emparejamiento
máximo; se prefieren longitudes de los espacios de 5 o menos, siendo
más preferidas de 2 o menos. Alternativamente y preferiblemente,
dos secuencias de proteínas (o secuencias de polipéptidos derivadas
de ellas de al menos 30 aminoácidos de longitud) son homólogas,
según se utiliza este término en la presente memoria, si tienen una
puntuación de alineamiento de más de 5 (en unidades de desviación
típica) utilizando el programa ALIGN con la matriz de datos de
mutaciones y una penalización del espacio de 6 o mayor. Véase
Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, págs.
101-110 (Volumen 5, National Biomedical Research
Foundation (1972)) y el Suplemento 2 de este volumen, págs.
1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son
más preferiblemente homólogas si sus aminoácidos son idénticos en un
50% o más cuando se alinean óptimamente utilizando el programa
ALIGN.
El término "corresponde a" se utiliza en la
presente memoria para significar que una secuencia de
polinucleótidos es idéntica a toda o una porción de una secuencia
de polinucleótidos de referencia, o que una secuencia de
polipéptidos es idéntica a una secuencia de polipéptidos de
referencia. Por el contrario, el término "complementario a" se
utiliza la presente memoria para significar que la secuencia
complementaria es idéntica a toda o una porción de una secuencia de
polinucleótidos de referencia. Como ilustración, la secuencia de
nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia
"TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia
"GTATA".
Los siguientes términos se utilizan para
describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de
polinucleótidos o aminoácidos: "secuencia de referencia",
"ventana de comparación", "identidad de secuencia",
"porcentaje de identidad de la secuencia", e "identidad
sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia
definida utilizada como base para una comparación de secuencias; una
secuencia de referencia puede ser un subgrupo de una secuencia más
grande, por ejemplo, en forma de un segmento de un ADNc o una
secuencia génica completos dados en una lista de secuencias o puede
comprender un ADNc o una secuencia génica completos. Generalmente,
una secuencia de referencia tiene al menos 18 nucleótidos o 6
aminoácidos de longitud, frecuentemente al menos 24 nucleótidos u 8
aminoácidos de longitud, y a menudo al menos 48 nucleótidos o 16
aminoácidos de longitud. Puesto que dos secuencias de
polinucleótidos o aminoácidos pueden comprender cada una (1) una
secuencia (esto es, una porción de la secuencia de polinucleótidos
o aminoácidos completa) que es similar entre las dos moléculas, y
(2) puede comprender adicionalmente una secuencia que es divergente
entre las dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos, las
comparaciones de secuencias entre dos (o más) moléculas se realizan
típicamente comparando secuencias de las dos moléculas a lo largo de
una "ventana de comparación" para identificar y comparar
regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de
comparación", según se utiliza en la presente memoria, hace
referencia a un segmento conceptual de al menos 18 posiciones de
nucleótidos contiguos o 6 aminoácidos donde una secuencia de
polinucleótidos o una secuencia de aminoácidos se puede comparar con
respecto a una secuencia de referencia de al menos 18 nucleótidos
contiguos o secuencias de 6 aminoácidos y donde la porción de la
secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede
comprender adiciones, deleciones, sustituciones, y similares (esto
es, espacios) de 20 por ciento o menos en comparación con la
secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones)
para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento
óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación se
puede realizar mediante el algoritmo de homología local de Smith y
Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de
alineamiento de homología de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol.
48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de
Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988),
mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos
(paquetes de soporte lógico GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el
Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer
Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks, o MacVector), o
mediante inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (esto es,
dando como resultado
el mayor porcentaje de homología a lo largo de la ventana de comparación) generado mediante los diversos métodos.
el mayor porcentaje de homología a lo largo de la ventana de comparación) generado mediante los diversos métodos.
El término "identidad de secuencia"
significa que dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos son
idénticas (esto es, nucleótido por nucleótido o resto por resto) a
lo largo de la ventana de comparación. El término "porcentaje de
identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias
óptimamente alineadas a lo largo de la ventana de comparación,
determinando el número de posiciones en las cuales aparece la base
de ácido nucleico (p. ej., A, T, C, G, U, o I) o resto idéntico en
ambas secuencias para dar el número de posiciones emparejadas,
dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total
de posiciones de la ventana de comparación (esto es, el tamaño de
la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para dar el
porcentaje de identidad de la secuencia. El término "identidad
sustancial" según se utiliza en la presente memoria indica una
característica de una secuencia de polinucleótidos o aminoácidos,
donde el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que
tiene una identidad de secuencia de al menos 85 por ciento,
preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 90 a 95 por
ciento, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos
98 por ciento, más normalmente una identidad de secuencia de al
menos 99 por ciento en comparación con una secuencia de referencia
a lo largo de una ventana de comparación de al menos 18 posiciones
de nucleótidos (6 aminoácidos), frecuentemente a lo largo de una
ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótidos
(8-16 aminoácidos), donde el porcentaje de
identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de
referencia con la secuencia que puede incluir deleciones o
adiciones que suman un 20 por ciento o menos de la secuencia de
referencia a lo largo de la ventana de comparación. La secuencia de
referencia puede ser un subgrupo de una secuencia mayor.
Aplicado a polipéptidos, el término "identidad
sustancial" significa que dos secuencias peptídicas, cuando
están óptimamente alineadas, por ejemplo mediante los programas GAP
o BESTFIT utilizando pesos de espacios por defecto, comparten al
menos una identidad de secuencia de 80 por ciento, preferiblemente
una identidad de secuencia de al menos 90 por ciento, más
preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 95 por
ciento, incluso más preferiblemente una identidad de secuencia de al
menos 98 por ciento y muy preferiblemente una identidad de
secuencia de al menos 99 por ciento. Preferiblemente, las posiciones
de los restos que no son idénticos difieren por sustituciones de
aminoácidos conservativas. Las sustituciones de aminoácidos
conservativas hacen referencia a la intercambiabilidad de restos
que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de
aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas son glicina,
alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que
tienen cadenas laterales con hidroxilo alifáticas son serina y
treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que
contienen amida son asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos
que tienen cadenas laterales aromáticas son fenilalanina, tirosina,
y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales
alcalinas son lisina, arginina, e histidina; y un grupo de
aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre son
cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservativa de
aminoácidos preferidos son:
valina-leucina-isoleucina,
fenilalanina-tirosina,
lisina-arginina, alanina-valina,
glutamato-aspartato, y
asparagina-glutamina.
Según se utiliza en la presente memoria, los
términos "marca" o "marcado" hacen referencia a la
incorporación de otra molécula al anticuerpo. En una realización.
La marca es un marcador detectable, p. ej., la incorporación de un
aminoácido radiomarcado o el anclaje a un polipéptido de radicales
biotinilados que pueden ser detectados por medio de avidina marcada
(p. ej., estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o una
actividad enzimática que puede ser detectada mediante métodos
ópticos o colorimétricos). En otra realización, la marca o marcador
puede ser terapéutica, p. ej., un producto conjugado con un fármaco
o una toxina. Se conocen en la técnica y se pueden utilizar
diversos métodos de marcaje de polipéptidos y glicoproteínas. Los
ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, pero no están
limitados a, los siguientes:
- \quad
- radioisótopos o radionúclidos (p. ej., H^{3}, C^{14}, N^{15}, S^{35}, Y^{90}, Tc^{99}, In^{111}, I^{125}, I^{131}), marcas fluorescentes (p. ej., FITC, rodamina, sustancias fosforescentes de lantánidos), marcas enzimáticas (p. ej., peroxidasa de rábano picante, \beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilados, epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un informador secundario (p. ej., secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas epitópicas), agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio, toxinas tales como toxina de pertusis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi-antracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y sus análogos u homólogos. En algunas realizaciones, las marcas son ancladas por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el potencial impedimento estérico.
El término "agente" se utiliza en la
presente memoria para indicar un compuesto químico, una mezcla de
compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto
hecho de materiales biológicos.
El término "agente farmacéutico o fármaco"
según se utiliza en la presente memoria hace referencia a un
compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto
terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un
paciente. Otros términos químicos de la presente memoria se utilizan
de acuerdo con el uso convencional de la técnica, como se ilustra
por medio del Diccionario McGraw-Hill de Términos
Químicos (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San
Francisco (1985))).
El término paciente incluye seres humanos y
sujetos veterinarios.
En toda esta memoria y en las reivindicaciones,
se entenderá que la palabra "comprenden", o variaciones tales
como "comprende" o "que comprende" implican la inclusión
de un número entero o un grupo de números enteros establecido pero
no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números
enteros.
Los anticuerpos humanos evitan ciertos problemas
asociados con los anticuerpos que poseen las regiones variables y/o
constantes de ratón o rata. La presencia de tales proteínas
derivadas de ratón o rata puede conducir al rápido aclaramiento de
los anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta
inmunitaria contra el anticuerpo por el paciente. Se espera que los
anticuerpos anti-IL-5 totalmente
humanos minimicen las respuestas inmunogénicas y alérgicas
intrínsecas a Mabs de ratón o derivados de ratón y de este modo
incrementen la eficacia y seguridad de los anticuerpos
administrados. Se puede esperar que el uso de anticuerpos totalmente
humanos proporcione una ventaja sustancial en el tratamiento de
enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como la
inflamación y el cáncer, que pueden requerir administraciones
repetidas de anticuerpos.
En una realización, los anticuerpos humanos son
producidos inmunizando un animal no humano que comprende alguno o
todos los loci de la inmunoglobulina humana con un antígeno
IL-5 o uno de sus fragmentos inmunogénicos. En una
realización preferida, el animal no humano es un XenoMouse®.
El XenoMouse® es una cepa de ratón diseñada
genéticamente que comprende fragmentos grandes de los loci de la
inmunoglobulina humana y tiene una producción deficiente de
anticuerpos de ratón. Véanse, p. ej., Green et al. Nature
Genetics 7:13-21 (1994) y Patentes de los Estados
Unidos 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181,
6.091.001, 6.114.598 y 6.130.364. Véanse también los documentos WO
91/10741, publicado el 25 de Julio de 1991, WO 94/02602, publicado
el 3 de Febrero de 1994, WO 96/34096 y WO 96/33735, publicados
ambos el 31 de Octubre de 1996, WO 98/16654, publicado el 23 de
Abril de 1998, WO 98/24893, publicado el 11 de Junio de 1998, WO
98/50433, publicado el 12 de Noviembre de 1998, WO 99/45031,
publicado el 10 de Septiembre de 1999, WO 99/53049, publicado el 21
de Octubre de 1999, WO 00 09560, publicado el 24 de Febrero de 2000
y WO 00/037504, publicado el 29 de Junio de 2000.
Las cepas XenoMouse® fueron diseñadas con
cromosomas artificiales de levadura (YAC) que contenían fragmentos
de configuración de la línea germinal de 245 kb y 190 kb del locus
de la cadena pesada humana y el locus de la cadena ligera kappa,
respectivamente, que contenían secuencias de la región variable y
constante del núcleo. Id. XenoMouse® produce un repertorio
humano de tipo adulto de anticuerpos totalmente humanos, y genera
anticuerpos monoclonales humanos específicos de antígenos (Mab). Un
XenoMouse® de segunda generación contiene aproximadamente 80% del
repertorio de anticuerpos humanos por medio de la introducción de
fragmentos YAC de configuración de la línea germinal, con un tamaño
de megabases de los loci de la cadena pesada humana y los loci de
la cadena ligera kappa. Véanse Méndez et al. Nature Genetics
15:146-156 (1997), Green y Jakobovits J. Exp. Med.
188:483-495 (1998), y Patente de los Estados Unidos
Núm. US 7.064.244, presentada el 3 de Diciembre de 1996.
En otra realización, los animales no humanos que
comprenden loci del gen de la inmunoglobulina humana son animales
que tienen un "minilocus" de inmunoglobulinas humanas. En el
enfoque del minilocus, se imita un locus de Ig exógeno por medio de
la inclusión de genes individuales del locus de la Ig. De este modo,
se forman uno o más genes V_{H}, uno o más genes D_{H}, uno o
más genes J_{H}, una región constante mu, y una segunda región
constante (preferiblemente una región constante gamma) en un
constructo para la inserción en el animal. Este enfoque se
describe, entre otras en las Patentes de los Estados Unidos Núms.
5.545.807, 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016,
5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367,
5.789.215, y 5.643.763.
Una ventaja del enfoque del minilocus es la
rapidez con la que se pueden generar los constructos que incluyen
las porciones del locus de la Ig e introducir en los animales. Sin
embargo, una desventaja potencial del enfoque del minilocus es que
puede no haber suficiente diversidad de inmunoglobulina para
soportar el desarrollo de células B completas, de manera que puede
haber una producción de anticuerpo inferior.
\vskip1.000000\baselineskip
También están incluidas las moléculas de ácido
nucleico que codifican anticuerpos
anti-IL-5 humanos como se definen
en las reivindicaciones adjuntas. En una realización, la molécula de
ácido nucleico codifica una cadena pesada y/o ligera de una
inmunoglobulina anti-IL-5 humana
intacta. En una realización preferida, una única molécula de ácido
nucleico codifica una cadena pesada de una inmunoglobulina
anti-IL-5 humana y otra molécula de
ácido nucleico codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina
anti-IL-5 humana. En una realización
más preferida, la inmunoglobulina codificada es una IgG humana. La
cadena ligera codificada puede ser una cadena \lambda o una
cadena \kappa. En una realización aún más preferida, la cadena
ligera codificada es una cadena \kappa.
En las realizaciones preferidas, la molécula de
ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada
(VH) deriva de un gen de VH
DP-47/3-11 humano. En diversas
realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica la VH
contiene no más de diez, no más de seis o no más de tres cambios de
aminoácido del gen DP-47/3-11 de la
línea germinal. En una realización preferida, la molécula de ácido
nucleico que codifica la VH contiene al menos un cambio de
aminoácido en comparación con la secuencia de la línea germinal que
es idéntica al cambio de aminoácido de la secuencia de la línea
germinal de la cadena pesada del anticuerpo 20.13.3. En una
realización incluso más preferida, la VH contiene al menos tres
cambios de aminoácidos en comparación con las secuencias de la
línea germinal que son idénticas al menos a tres cambios de
aminoácidos de la secuencia de la línea germinal de la VH del
anticuerpo 20.13.3.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido
nucleico comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos
derivada de un gen del segmento de diversidad D1-20
humano. En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico
comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos derivada de un
JH4B humano.
En la Tabla 1 se enumeras las secuencias de
ácido nucleico, y las correspondientes secuencias de aminoácidos
que codifican, del anticuerpo 20.13.3 o sus porciones.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
En las realizaciones preferidas, la molécula de
ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
la secuencia de aminoácidos de la VH del anticuerpo 20.13.3 al menos
de la CDR1 a la CDR3 como se muestra en la Tabla 2. También se
describe en la presente memoria una molécula de ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de
aminoácidos de una o más de las CDR de la cadena pesada del
anticuerpo 20.13.3. En otra realización, la molécula de ácido
nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la
secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo
monoclonal 20.13.3 mostrado en el SEQ ID NO: 2. En otra
realización, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica la cadena pesada del anticuerpo monoclonal
20.13.3 mostrado en el SEQ ID NO: 1. Asimismo se describe en la
presente memoria una molécula de ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una o más de las CDR de la
cadena pesada del anticuerpo monoclonal 20.13.3 mostrado en la Tabla
2 o mostrado en los SEQ ID NOS: 8, 10 y 12, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En otras realizaciones de la invención, las
moléculas de ácido nucleico descritas antes pueden hibridar en
condiciones muy restrictivas, tales como las descritas antes, con
una cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas antes,
con tal que estas estén incluidas en las reivindicaciones
adjuntas.
En otras realizaciones, la molécula de ácido
nucleico que codifica la región variable de la cadena ligera del
anticuerpo comprende una secuencia de nucleótidos derivada de un gen
08/018 V_{\kappa} humano. Dicha molécula de ácido nucleico puede
contener hasta diez, hasta 6 o hasta 3 cambios de aminoácidos a
partir del gen 08/018 V_{\kappa} de la línea germinal. En las
realizaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico contiene al
menos tres cambios de aminoácidos en comparación con la secuencia
V_{\kappa} de la línea germinal que son idénticos a los cambios
con respecto a la línea germinal encontrados en el anticuerpo
monoclonal 20.13.3. En realizaciones adicionales, cualquiera de las
moléculas de ácido nucleico anteriores comprende adicionalmente una
secuencia de nucleótidos derivada de un gen del segmento de unión a
J_{\kappa}4 humano.
En realizaciones preferidas, la molécula de
ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena
ligera del anticuerpo monoclonal 20.133, al menos desde CDR1 a CDR3
como se muestra en la Tabla 3. Asimismo se describe en la presente
memoria una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia
de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una o
más de las CDR de la cadena ligera del anticuerpo 20.13.3. En otra
realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia
de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena
ligera del anticuerpo monoclonal 20.13.3 (SEQ ID NO: 4). En otra
realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia
de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 3. También se describe en
la presente memoria una molécula de ácido nucleico que comprende
una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de
aminoácidos de una o más de las CDR mostradas en los SEQ ID NOS:
14, 16, y 18.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, la molécula de ácido
nucleico que codifica una VL puede hibridar en condiciones muy
restrictivas, tales como las descritas antes, con una secuencia de
ácido nucleico que codifica una VL descrita inmediatamente antes,
con tal que el ácido nucleico esté incluido en las reivindicaciones
adjuntas.
Se puede obtener una molécula de ácido nucleico
que codifica la cadena pesada completa o la ligera completa de un
anticuerpo anti-IL-5 o sus regiones
variables a partir de cualquier fuente que produzca un anticuerpo
anti-IL-5. En una realización de la
invención, se pueden obtener moléculas de ácido nucleico a partir de
un hibridoma que expresa un anticuerpo
anti-IL-5. Los métodos de
aislamiento del ARNm que codifica un anticuerpo son bien conocidos
en la técnica. Véase, p. ej., Sambrook et al. Se puede
utilizar el ARNm para producir ADNc para su uso en la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) o la clonación de ADNc de genes del
anticuerpo. En una realización preferida, la molécula de ácido
nucleico deriva de un hibridoma que tiene como uno de sus
compañeros de fusión una célula de un animal transgénico que expresa
genes de inmunoglobulina humana. En una realización aún más
preferida, la célula del animal compañero de fusión deriva de un
animal Xenomouse®. En otra realización, el hibridoma deriva de un
animal transgénico no ratón, no humano como se ha descrito
antes.
En una realización preferida, se puede construir
la cadena pesada de un anticuerpo
anti-IL-5 fusionando una molécula
de ácido nucleico que codifica el dominio variable de una cadena
pesada con un dominio constante de una cadena pesada. De un modo
similar, se puede construir la cadena ligera de un anticuerpo
anti-IL-5 fusionando una molécula
de ácido nucleico que codifica el dominio variable de una cadena
ligera con un dominio constante de una cadena ligera. En una
realización más preferida, el ácido nucleico que codifica la región
variable de la cadena pesada codifica la secuencia de aminoácido
del SEQ ID NO: 6, y la molécula de ácido nucleico que codifica la
región variable de las cadenas ligeras codifica la secuencia de
aminoácidos desde el resto 23-130 del SEQ ID NO: 4.
La secuencia de aminoácidos desde el resto 139-465
del SEQ ID NO: 2 representa la secuencia de aminoácidos de la
región constante de la cadena pesada de 20.13.3, y la secuencia de
aminoácidos desde el resto 131-236 del SEQ ID NO: 4
representa la secuencia de aminoácidos de la región constante de la
cadena ligera de 20.13.3. La secuencia de ácido nucleico desde el
nucleótido 415-709, 1102-1137,
1256-1585, y 1683-2002 del SEQ ID
NO: 1 representa la secuencia de ácido nucleico que codifica la
región constante de la cadena pesada de 20.13.3, y la secuencia de
ácido nucleico desde el 391-708 del SEQ ID NO: 3
representa la secuencia de ácido nucleico que codifica la región
constante de la cadena ligera de 20.13.3. En una realización
preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio
constante de la cadena pesada codifica la secuencia de aminoácidos
desde el resto 139-465 del SEQ ID NO: 2, y la
molécula de ácido nucleico que codifica el dominio constante de la
cadena ligera codifica la secuencia de aminoácidos desde el resto
131-236 del SEQ ID NO: 4. En una realización aún
más preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio
constante de la cadena pesada tiene la secuencia de ácido nucleico
desde el nucleótido 415-709,
1102-1137, 1256-1585, y
1683-2002 del SEQ ID NO: 1, y la molécula de ácido
nucleico que codifica el dominio constante de la cadena ligera
tiene la secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido
nucleico desde el 391-708 del SEQ ID
NO: 3.
NO: 3.
En otra realización, se puede aislar la propia
célula productora de anticuerpo
anti-IL-5 de un animal no humano.
El animal transgénico puede ser un ratón, tal como un ratón
Xenomouse®, u otro animal transgénico no humano. En otra
realización, la célula productora de anticuerpo
anti-IL-5 deriva de un animal no
transgénico.
En otra realización, se pueden utilizar las
moléculas de ácido nucleico para elaborar vectores utilizando
métodos conocidos por los expertos normales en la técnica. Véanse,
p. ej., Sambrook et al. y Ausubel et al. En una
realización, los vectores pueden ser vectores plasmídicos o
cosmídicos. En otra realización, los vectores pueden ser vectores
virales. Los vectores virales incluyen, sin limitación, adenovirus,
retrovirus, virus adeno-asociados y otros
picornavirus, virus de la hepatitis y baculovirus. Los vectores
también pueden ser bacteriófagos incluyendo, sin limitación,
M13.
Las moléculas de ácido nucleico se pueden
utilizar para expresar recombinantemente grandes cantidades de
anticuerpos anti-IL-5, como se
describe más abajo. Las moléculas de ácido nucleico también se
pueden utilizar para producir anticuerpos quiméricos, anticuerpos
de cadena sencilla, inmunoadhesinas, fragmentos bivalentes de
anticuerpos, anticuerpos mutados y derivados de anticuerpos, como
se describe adicionalmente más abajo.
En una realización, las moléculas de ácido
nucleico que codifican la región variable de las cadenas pesada
(VH) y ligera (VL) se convierten en genes de anticuerpos completos.
En una realización, tales moléculas de ácido nucleico se insertan
en vectores de expresión que ya comprenden secuencias que codifican
las regiones constantes de la cadena pesada o de la cadena ligera,
respectivamente, de manera que el segmento VH o VL está conectado
operativamente al segmento o los segmentos CH o CL, respectivamente,
dentro del vector. En otra realización, las moléculas de ácido
nucleico que codifican las cadenas VH y/o VL se convierten en genes
de anticuerpos completos conectando la molécula de ácido nucleico
que codifica una cadena VH con una molécula de ácido nucleico que
codifica una cadena CH utilizando técnicas de la biología molecular
convencionales. Lo mismo se puede lograr utilizando las moléculas
de ácido nucleico que codifican las cadenas VL y CL. Las secuencias
de la región constante de la cadena pesada y ligera humanas son
conocidas en la técnica. Véase, p. ej., Kabat et al.,
Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed., NIH Publ.
Núm. 91-3242, 1991.
\vskip1.000000\baselineskip
Para expresar los anticuerpos, o las porciones
de anticuerpos descritas, se insertan los ADN que codifican las
cadenas ligera y pesada completas, obtenidos como se ha descrito
antes, en vectores de expresión de manera que los genes son
conectados operativamente a secuencias de control transcripcional y
traduccional. Los vectores de expresión incluyen plásmidos,
retrovirus, cósmidos, YAC, episomas derivados de EBV, y similares.
El gen del anticuerpo se liga en un vector de manera que las
secuencias de control transcripcional y traduccional del vector
sirven para su función pretendida de regulación de la transcripción
y la traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y
las secuencias de control de la expresión se seleccionan para que
sean compatibles con la célula anfitriona de expresión utilizada.
El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena
pesada del anticuerpo se pueden insertar en vectores separados. En
una realización preferida, ambos genes se insertan en el mismo
vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el
vector de expresión mediante métodos convencionales (p. ej.,
ligación de sitios de restricción complementarios sobre el
fragmento del gen del anticuerpo y el vector, o ligación de extremos
romos si no se encuentran presentes sitios de restricción).
Un vector conveniente es uno que codifica una
secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana funcionalmente completa,
con sitios de restricción apropiados diseñados de manera que
cualquier secuencia VH o VL pueda ser fácilmente insertada y
expresada, como se ha descrito antes. En tales vectores, normalmente
se produce un empalme entre el sitio donador de empalme de la
región J insertada y el sitio aceptor de empalme que precede a la
región C humana, y también en las regiones de empalme que existen
en los exones CH humanos. La poliadenilación y la terminación de la
transcripción se producen en los sitios cromosómicos nativos aguas
abajo de las regiones codificantes. El vector de expresión
recombinante también puede codificar un péptido señal que facilite
la secreción de la cadena de anticuerpo a partir de una célula
anfitriona. El gen de la cadena de anticuerpo puede ser clonado en
el vector de manera que el péptido señal esté unido en marco al
extremo amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido señal
puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal
heterólogo (esto es, un péptido señal de una proteína distinta de
una inmunoglobulina).
Además de los genes de las cadenas de
anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la invención
portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los
genes de las cadenas de anticuerpo en una célula anfitriona. Los
expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de
expresión, incluyendo la selección de las secuencias reguladoras
puede depender de factores tales como la elección de la célula
anfitriona que se va a transformar, el nivel de expresión de la
proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para
la expresión en células anfitrionas de mamífero incluyen elementos
virales que dirigen elevados niveles de expresión de proteínas en
células de mamífero, tales como promotores y/o intensificadores
derivados de LTR retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tales como el
promotor/intensificador de CMV), Virus de Simios 40 (SV40) (tal
como el promotor/intensificador de SV40), adenovirus, (p. ej., el
promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)), polioma y
promotores de mamíferos fuertes tales como los promotores de
inmunoglobulina y actina nativos. Para una descripción adicional de
elementos reguladores virales, y de sus secuencias, véanse p. ej.,
la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.168.062 de Stinski, la
Patente de los Estados Unidos Núm. 4.510.245 de Bell et al.
y la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.968.615 by
Schaffner
et al.
et al.
Además de los genes de las cadenas de
anticuerpos y de las secuencias reguladoras, los vectores de
expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias
adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del
vector en células anfitrionas (p. ej., orígenes de replicación) y
genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable
facilita la selección de las células anfitrionas en las cuales se ha
introducido el vector (véanse p. ej., las Patentes de los Estados
Unidos Núms. 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel et
al.). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable
confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o
metotrexato, en una célula anfitriona en la cual se ha introducido
el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen
el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células
anfitrionas dhfr^{-} con selección/amplificación por metotrexato)
y el gen neo (para la selección por G418).
\vskip1.000000\baselineskip
Las moléculas de ácido nucleico que codifican
los anticuerpos anti-IL-5 y los
vectores que comprenden estos anticuerpos se pueden utilizar para
la transformación de una célula anfitriona de mamífero adecuada. La
transformación puede ser mediante cualquier método conocido para
introducir polinucleótidos en una célula anfitriona. Los métodos
para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de
mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección
mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio,
transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos,
electroporación, encapsulación del polinucleótido o los
polinucleótidos en liposomas, y microinyección directa del ADN en
núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden ser
introducidas en células de mamífero por medio de vectores virales.
Los métodos de transformación de células son bien conocidos en la
técnica. Véanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Núms.
4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, y 4.959.455.
Las líneas celulares de mamífero disponibles
como anfitriones para la expresión son bien conocidas en la técnica
e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas asequibles de la
Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC). Estas incluyen, entre
otras, células de ovario de Hámster Chino (CHO), NSO, células SP2,
células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de
riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p.
ej., Hep G2), células A549, y otras numerosas líneas celulares. Las
líneas celulares de particular preferencia se seleccionan
determinando qué líneas celulares tienen niveles de expresión
elevados. Otras líneas celulares que se pueden utilizar son líneas
celulares de insecto, tales como células Sf9. Cuando se introducen
vectores de expresión recombinante que codifican genes de
anticuerpo en células anfitrionas de mamífero, se producen los
anticuerpos cultivando las células anfitrionas durante un período de
tiempo suficiente para permtir la expresión del anticuerpo en las
células anfitrionas o, más preferiblemente, la secreción del
anticuerpo en el medio de cultivo en el que se desarrollan las
células anfitrionas. Los anticuerpos pueden ser recuperados del
medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas
convencionales.
Adicionalmente, se puede intensificar la
producción de anticuerpos (u otros radicales de los mismos) a partir
de las líneas celulares de producción utilizando numerosas técnicas
conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de la
glutamina sintetasa (el sistema GS) es un enfoque común para
intensificar la expresión en ciertas condiciones. El sistema GS se
comenta en su totalidad o en parte en relación con las Patentes
Europeas Núms. 0 216 846, 0 256 055, y 0 323 997 y la Solicitud de
Patente Europea EP-A-0338841.
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Los anticuerpos de la invención también pueden
ser producidos transgénicamente por medio de la generación de un
mamífero o una planta que sean transgénicos para las secuencias de
la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina de interés y la
producción del anticuerpo a partir de ellos de una forma
recuperable. En relación con la producción de animales transgénicos
en mamíferos, los anticuerpos pueden ser producidos en, y
recuperados de, la leche de cabras, vacas, u otros mamíferos.
Véanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.827.690,
5.756.687, 5.750.172, y 5.741.957. En una realización, los animales
transgénicos no humanos que comprenden loci de inmunoglobulinas
humanas son inmunizados con IL-5 o una de sus
porciones. Se pueden producir tales animales transgénicos utilizando
los métodos descritos en las Patentes de los Estados Unidos
5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001,
6.114.598 y 6.130.364. Véanse también el documento WO 91/10741,
publicado el 25 de Julio de 1991, el documento WO 94/02602,
publicado el 3 de Febrero de 1994, el documento WO 96/34096 y el
documento WO 96/33735, publicados ambos el 31 d Octubre de 1996, el
documento WO 98/16654, publicado el 23 de Abril de 1998, el
documento WO 98/24893, publicado el 11 de Junio de 1998, el
documento WO 98/50433, publicado el 12 de Noviembre de 1998, el
documento WO 99/45031, publicado el 10 de Septiembre de 1999, el
documento WO 99/53049, publicado el 21 de Octubre de 1999, el
documento WO 00 09560, publicado el 24 de Febrero de 2000 y el
documento WO 00/037504, publicado el 29 de Junio de 2000. En otra
realización, los animales transgénicos pueden comprender un
"minilocus" de genes de inmunoglobulinas humanas. Los métodos
descritos antes pueden ser modificados como se describe, entre
otros, en la Patente de los Estados Unidos 5.994.619. En una
realización preferida, los animales no humanos pueden ser ratas,
ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. En otra
realización, los animales transgénicos comprenden moléculas de
ácido nucleico que codifican anticuerpos
anti-IL-5. En una realización
preferida, los animales transgénicos comprenden moléculas de ácido
nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras específicas para
IL-5. En otra realización, los animales transgénicos
comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo
modificado tal como un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo
quimérico o un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos
anti-IL-5 pueden ser elaborados en
cualquier animal transgénico. En una realización preferida, los
animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras,
ganado vacuno o caballos.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto consiste en proporcionar un
mecanismo por medio del cual se pueda cambiar la clase del
anticuerpo anti-IL-5 por otra. En
un aspecto de la invención, se aísla una molécula de ácido nucleico
que codifica VL o VH utilizando métodos bien conocidos en la
técnica de manera que no incluya ninguna secuencia de ácido nucleico
que codifique CL o CH. Las moléculas de ácido nucleico que
codifican VL o VH se conectan después operativamente a una
secuencia de ácido nucleico que codifica CL o CH de una clase
diferente de molécula de inmunoglobulina. Esto se puede lograr
utilizando un vector o molécula de ácido nucleico que comprende una
cadena CL o CH, como se ha descrito antes. Por ejemplo, un
anticuerpo anti-IL-5 que era
originalmente IgM puede ser cambiado a una IgG. Adicionalmente, se
puede utilizar el cambio de clase para convertir una subclase de IgG
en otra, p. ej., de IgG 1 a IgG2.
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Se pueden utilizar las moléculas de ácido
nucleico descritas antes para generar derivados de anticuerpos
utilizando los mecanismos y métodos conocidos por un experto normal
en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, las moléculas de ácido
nucleico, los vectores y las células anfitrionas se pueden utilizar
para elaborar anticuerpos anti-IL-5
mutados. Los anticuerpos pueden ser mutados en los dominios
variables de las cadenas pesada y/o ligera para alterar una
propiedad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, se puede realizar
una mutación en una o más de las regiones CDR para incrementar o
disminuir la K_{d} del anticuerpo IL-5, para
incrementar o disminuir la K_{off}, o para alterar la
especificidad de unión del anticuerpo. Los mecanismos de
mutagénesis dirigida al sitio son bien conocidos en la técnica.
Véase, p. ej., Sambrook et al. y Ausubel et al.,
supra. En una realización preferida, se realizan mutaciones
en un resto aminoácido que se sabe que ha cambiado en comparación
con la línea germinal en una región variable de un anticuerpo
anti-IL-5. En una realización más
preferida, se realizan una o más mutaciones en un resto aminoácido
que se sabe que ha cambiado en comparación con la línea germinal en
una región variable de uno de los anticuerpos
anti-IL-5 de la invención. En otra
realización, las moléculas de ácido nucleico se mutan en una o más
regiones marco. Se puede realizar una mutación en una región marco
o dominio constante para incrementar la vida media del anticuerpo
anti-IL-5. Véase, p. ej., la
Solicitud de los Estados Unidos US 2002/0 142 374 A1, presentada el
17 de Agosto de 1999. También se puede realizar una mutación en una
región marco o dominio constante para alterar la inmunogenicidad
del anticuerpo, para proporcionar un sitio para la unión covalente o
no covalente a otra molécula, o para alterar propiedades tales como
la fijación del complemento. Se pueden realizar mutaciones en cada
una de las regiones marco, el dominio constante y las regiones
variables en un único anticuerpo mutado. Alternativamente, se
pueden realizar mutaciones en solo una de las regiones marco, las
regiones variables o el dominio constante en un único anticuerpo
mutado.
En una realización, no hay más de diez cambios
de aminoácidos en cualquiera de las regiones VH o VL del anticuerpo
anti-IL-5 mutado en comparación con
el anticuerpo anti-IL-5 antes de la
mutación. En una realización más preferida, no existen más de cinco
cambios de aminoácidos en cualquiera de las regiones VH o VL del
anticuerpo anti-IL-5 mutado, más
preferiblemente no más de tres cambios de aminoácidos. En otra
realización, no hay más de quince cambios de aminoácidos en los
dominios constantes, más preferiblemente, no más de diez cambios de
aminoácidos, incluso más preferiblemente, no más de cinco cambios
de aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, se puede elaborar un
anticuerpo de fusión o inmunoadhesina que comprende todo o una
porción de un anticuerpo anti-IL-5
conectado a otro polipéptido. En una realización preferida,
solamente se conectan al polipéptido las regiones variables del
anticuerpo anti-IL-5. En otra
realización preferida, se conecta el dominio VH del anticuerpo
anti-IL-5 a un primer polipéptido,
mientras el dominio VL del anticuerpo
anti-IL-5 se conecta a un segundo
polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de una manera en
la que los dominios VH y VL pueden interaccionar entre sí para
formar un sitio de unión al anticuerpo. En otra realización
preferida, se separa el dominio VH del dominio VL por medio de un
conector de manera que los dominios VH y VL puedan interaccionar
entre sí (véase más abajo en Anticuerpos de Cadena Sencilla). El
anticuerpo VH-conector-VL se
conecta después al polipéptido de interés. El anticuerpo de fusión
es útil para dirigir un polipéptido a una célula o tejido que
expresa IL-5. El polipéptido puede ser un agente
terapéutico, tal como una toxina, un factor de crecimiento u otra
proteína reguladora, o puede ser un agente de diagnóstico, tal como
una enzima que pueda ser fácilmente visualizada, tal como
peroxidasa de rábano picante. Además, se pueden crear anticuerpos
de fusión en los que dos (o más) anticuerpos de cadena sencilla se
conectan entre sí. Esto resulta útil si se quiere crear un
anticuerpo divalente o polivalente sobre una única cadena
polipeptídica, o si se quiere crear un anticuerpo biespecífico. En
una realización, el anticuerpo de fusión o inmunoadhesina se prepara
utilizando las regiones variables del anticuerpo monoclonal
20.13.3. En otra realización, el anticuerpo de fusión o
inmunoadhesina se prepara utilizando una o más de las regiones CDR
de un anticuerpo anti-IL-5, por
ejemplo de 20.13.3.
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Para crear un anticuerpo de cadena sencilla
(scFv), se conectan operativamente los fragmentos de ADN que
codifican VH y VL a otro fragmento que codifica un conector
flexible, p. ej., que codifica la secuencia de aminoácidos
(Gly_{4} -Ser)_{3}, de manera que se pueden expresar las
secuencias VH y VL como una proteína de cadena sencilla contigua,
con las regiones VL y VH unidas por el conector flexible (véanse p.
ej., Bird et al. (1988) Science 242:423-426;
Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:5879-5883; McCafferty et al., Nature
(1990) 348:552-554). El anticuerpo de cadena
sencilla puede ser monovalente, si solamente se utiliza una única
VH y VL, bivalente, si se utilizan dos VH y VL, o polivalente, si se
utilizan más de dos VH y VL.
En una realización, el anticuerpo de cadena
sencilla se prepara utilizando una o más regiones variables del
anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra realización, el anticuerpo de
cadena sencilla se prepara utilizando una o más regiones CDR de
dicho anticuerpo anti-IL-5.
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En otra realización, se pueden preparar otros
anticuerpos modificados utilizando moléculas de ácido nucleico que
codifican anti-IL-5. Por ejemplo, se
pueden preparar "Kappa bodies" (III et al., Protein Eng
10: 949-57 (1997)), "Minibodies" (Martin et
al., EMBOJ 13: 5303-9 (1994)), "Diabodies"
(Holliger et al., PNAS USA 90: 6444-6448
(1993)), o "Janusinas" (Traunecker et al., EMBO J 10:
3655-3659 (1991) y Traunecker et al.
"Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int J
Cancer Supl 7:51-52 (1992)) utilizando técnicas de
la biología molecular convencionales siguiendo las enseñanzas de la
memoria. En una realización, los anticuerpos modificados se
preparan utilizando una o más de las regiones variables del
anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra realización, se prepara el
anticuerpo modificado utilizando una o más de las regiones CDR de
dicho anticuerpo anti-IL-5.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, se pueden generar anticuerpos
biespecíficos. En una realización, se puede generar un anticuerpo
quimérico que se una específicamente a IL-5 a través
de un dominio de unión y a una segunda molécula a través de un
segundo dominio de unión. El anticuerpo quimérico puede ser
producido por medio de técnicas de biología molecular recombinante,
o puede ser conjugado físicamente. Además, se puede generar un
anticuerpo de cadena sencilla que contenga más de una VH y VL que
se una específicamente a IL-5 y a otra molécula.
Tales anticuerpos biespecíficos pueden ser generados utilizando
técnicas que son bien conocidas por ejemplo, Fanger et al.
Immunol Methods 4: 72-81 (1994) y Wright y Harris,
supra y con respecto a (iii) véase p. ej., Traunecker et
al. Int. J. Cancer (Supl.) 7: 51-52 (1992). En
una realización preferida, el anticuerpo quimérico se une a
IL-5 y a otra molécula implicada en la promoción de
la proliferación de eosinófilos y basófilos. En realizaciones
preferidas, la otra molécula es eotaxina, IL-3, o
GM-CSF.
En una realización, los anticuerpos quiméricos
se preparan utilizando una o más de las regiones variables del
anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra realización, el anticuerpo
quimérico se prepara utilizando una o más de las regiones CDR de
dicho anticuerpo anti-IL-5.
Se puede derivatizar un anticuerpo o una porción
de anticuerpo o conectar a otra molécula (p. ej., otro péptido o
proteína). En general, los anticuerpos o sus porciones se
derivatizan de manera que la unión a IL-5 no resulte
afectada adversamente por la derivatización o el marcaje. Por
consiguiente, los anticuerpos y las porciones de anticuerpos pueden
incluir las formas tanto intactas como modificadas de los
anticuerpos anti-IL-5 humanos
descritos en la presente memoria. Por ejemplo, se puede conectar
funcionalmente un anticuerpo o porción de anticuerpo (mediante
acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de
otro modo) a una o más entidades moleculares distintas, tales como
otro anticuerpo (p. ej., un anticuerpo biespecífico o un fragmento
bivalente "diabody"), un agente de detección, un agente
citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que
pueda mediar la asociación del anticuerpo o la porción de anticuerpo
con otra molécula (tal como una región núcleo de estreptavidina o
una etiqueta de polihistidina).
Un tipo de anticuerpo derivatizado es producido
mediante entrecruzamiento de dos o más anticuerpos \beta (del
mismo tipo o de tipos diferentes, p. ej., para crear anticuerpos
biespecíficos). Los entrecruzadores adecuados incluyen aquellos que
son heterobifuncionales, que tienen dos grupos claramente reactivos
separados por un espaciador apropiado (p. ej., éster
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimidico)
u homobifuncional (p. ej., suberato de disuccinimidilo). Tales
conectores son asequibles de Pierce Chemical Company, Rockford,
III.
Otro tipo de anticuerpo derivatizado es un
anticuerpo marcado. Los agentes de detección útiles con los que se
puede derivatizar un anticuerpo o porción de anticuerpo de la
invención incluyen compuestos fluorescentes, incluyendo
fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de
5-dimetilamino-1-naftalenosulfonilo,
ficoeritrina, sustancias fosforescentes de lantánidos y similares.
Un anticuerpo también se puede marcar con enzimas que sean útiles
para la detección, tales como la peroxidasa de rábano picante, la
\beta-galactosidasa, la luciferasa, la fosfatasa
alcalina, la glucosa oxidasa y similares. Cuando un anticuerpo se
marca con una enzima detectable, se detecta añadiendo reactivos
adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de
reacción que puede ser discernido. Por ejemplo, cuando está presente
el agente peroxidasa de rábano picante, la adición de peróxido de
hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción
coloreado, que es detectable. También se puede marcar un anticuerpo
con biotina, y detectarlo mediante medida indirecta de la unión a
avidina o estreptavidina. También se puede marcar un anticuerpo con
epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por una
secuencia informadora (p. ej., secuencias de pares de cremallera de
leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de
unión a metales, etiquetas epitópicas). En algunas realizaciones,
las marcas se anclan por medio de brazos espaciadores de diversas
longitudes para reducir el potencial impedimento estérico.
También se puede marcar un anticuerpo
anti-IL-5 con un aminoácido marcado
radiactivamente. La radiomarca se puede utilizar para fines tanto
diagnósticos como terapéuticos. El anticuerpo
anti-IL-5 radiomarcado se puede
utilizar como diagnóstico, por ejemplo, para determinar los niveles
de IL-5 en un sujeto. Adicionalmente, el anticuerpo
anti-IL-5 radiomarcado se puede
utilizar terapéuticamente para tratar, por ejemplo, enfermedades
alérgicas caracterizadas por una infiltración eosinofílica
pronunciada, tales como, sin limitación, asma, exacerbaciones del
asma, episodios de empeoramiento de asma, neumonía crónica, rinitis
alérgica, rinitis alérgica perenne, aspergilosis broncopulmonar
alérgica, hipereosinofilia, síndrome de
Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por
Onchocerca, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica,
enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones
helmínticas, enfermedad de Hodgkins, pólipos nasales, síndrome de
Loeffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis
nodosa, sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica,
esofagitis eosinofílica alérgica, conjuntivitis alérgica. Los
ejemplos de las marcas para los polipéptidos incluyen, pero no
están limitados a, los siguientes radioisótopos o radionúclidos -
H^{3}, C^{14}, N^{15}, S^{35}, Y^{90}, Tc^{99},
In^{111}, I^{125}, I^{131}.
Un anticuerpo
anti-IL-5 también puede ser
derivatizado con un grupo químico tal como polietilenglicol (PEG),
un grupo metilo o etilo, o un grupo carbohidratado. Estos grupos
pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del
anticuerpo, p. ej., para incrementar la vida media en suero o para
incrementar la unión al tejido.
\vskip1.000000\baselineskip
La clase y la subclase de los anticuerpos
anti-IL-5 se pueden determinar
mediante cualquier método conocido en la técnica. En general, la
clase y la subclase de un anticuerpo se pueden determinar utilizando
anticuerpos que son específicos para una clase y subclase concreta
de anticuerpo. Tales anticuerpos se encuentran disponibles en el
mercado. La clase y subclase pueden ser determinadas mediante ELISA,
Transferencia Western así como otras técnicas. Alternativamente, la
clase y la subclase se pueden determinar secuenciando todo o una
porción de los dominios constantes de las cadenas pesada y/o ligera
de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoácidos con
las secuencias de aminoácidos conocidas de diversas clases y
subclases de inmunoglobulinas, y determinando la clase y la
subclase de los anticuerpos.
En una realización, el anticuerpo es un
anticuerpo policlonal. En otra realización, el anticuerpo es un
anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede ser una molécula de IgG,
una IgM, una IgE, una IgA o una IgD. En una realización preferida,
el anticuerpo es una IgG y es del subtipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
En una realización más preferida, los anticuerpos
anti-IL-5 son de la subclase IgG2.
En otra realización preferida, los anticuerpos
anti-IL-5 son de la misma clase y
subclase que el anticuerpo monoclonal 20.13.3.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos
anti-IL-5 se unen a
IL-5 con una elevada afinidad. Los anticuerpos se
unen a IL-5 sustancialmente con la misma K_{d}
que el anticuerpo monoclonal 20.13.3.
La afinidad de unión y la velocidad de
disociación de un anticuerpo
anti-IL-5 a IL-5 se
pueden determinar mediante cualquier método conocido en la técnica.
En una realización, se puede medir la afinidad de unión mediante
tecnología de ELISA competitivo, RIA, BIAcore o KinExA. La velocidad
de disociación también se puede medir mediante tecnología BIAcore o
KinExA. En una realización, la afinidad de unión y la velocidad de
disociación se miden mediante resonancia de plasmón superficial
utilizando. p. ej., BIAcore.
\vskip1.000000\baselineskip
La descripción también proporciona un anticuerpo
anti-IL-5 que se une al mismo
antígeno o epítopo que un anticuerpo
anti-IL-5 humano. Adicionalmente, la
descripción proporciona un anticuerpo
anti-IL-5 que compite de manera
cruzada con un anticuerpo anti-IL-5
humano. En una realización preferida, el anticuerpo
anti-IL-5 es el anticuerpo
monoclonal 20.13.3. En otra realización preferida, el
anti-IL-5 humano comprende una o más
CDR del anticuerpo monoclonal 20.13.3. En una realización
preferida, el anticuerpo anti-IL-5
es otro anticuerpo humano.
Se puede determinar si un anticuerpo
anti-IL-5 se une al mismo antígeno
utilizando una variedad de métodos conocidos en la técnica. Por
ejemplo, se puede determinar si un anticuerpo
anti-IL-5 de ensayo se une al mismo
antígeno utilizando un anticuerpo
anti-IL-5 para capturar un antígeno
que se sabe que se une al anticuerpo
anti-IL-5, tal como
IL-5, eluyendo el antígeno del anticuerpo, y
determinando después si el anticuerpo de ensayo se unirá al
antígeno eluido. Se puede determinar si un anticuerpo se une al
mismo epítopo que un anticuerpo
anti-IL-5 uniendo el anticuerpo
anti-IL-5 a IL-5 en
condiciones saturantes, y midiendo después la capacidad del
anticuerpo de ensayo para unirse a IL-5. Si el
anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a la IL-5 a
la vez que el anticuerpo anti-IL-5,
en ese caso el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente
que el anticuerpo anti-IL-5. Sin
embargo, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse a la
IL-5 a la vez, en ese caso el anticuerpo de ensayo
se une al mismo epítopo que el anticuerpo
anti-IL-5 humano. Este experimento
se puede realizar utilizando ELISA, RIA o resonancia de plasmón
superficial. En una realización preferida, el experimento se
realiza utilizando la resonancia de plasmón superficial. En una
realización más preferida, se utiliza BIAcore. También se puede
determinar si un anticuerpo
anti-IL-5 compite de manera cruzada
con un anticuerpo anti-IL-5. En una
realización preferida, se puede determinar si un anticuerpo
anti-IL-5 compite de manera cruzada
con otro utilizando el mismo método que se utiliza para medir si el
anticuerpo anti-IL-5 es capaz de
unirse al mismo epítopo que otro anticuerpo
anti-IL-5.
anti-IL-5.
\vskip1.000000\baselineskip
La descripción también proporciona un anticuerpo
anti-IL-5 que comprende secuencias
variables de la cadena ligera codificadas por un gen V\kappa
humano y un gen J\kappa humano. En el anticuerpo monoclonal
20.13.3, las cadenas ligeras \kappa utilizan un gen 08/018
V\kappa humano unido a un gen J\kappa4 humano.
En realizaciones preferidas, la región variable
de la cadena ligera de los anticuerpos
anti-IL-5 de la invención contiene
las mismas sustituciones de aminoácidos, con respecto a la secuencia
de aminoácidos del gen 08/018 de la línea germinal, que el
anticuerpo monoclonal 20.13.3. Por ejemplo, en algunas
realizaciones, la región variable de la cadena ligera del
anticuerpo anti-IL-5 puede contener
una o más sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia
de 08/018 de la línea germinal que están presentes en el anticuerpo
monoclonal 20.13.3. De esta manera, se pueden mezclar y emparejar
rasgos diferentes de los anticuerpos que se unen para alterar, p.
ej., la afinidad del anticuerpo por la IL-5 o su
velocidad de disociación del antígeno.
En otra realización, la región variable de la
cadena ligera contiene sustituciones de aminoácidos en las mismas
posiciones que el anticuerpo monoclonal 20.13.3, pero utiliza
diferentes aminoácidos en esas posiciones. Preferiblemente la
sustitución es conservativa con respecto al aminoácido presente en
esa posición en 20.13.3. Por ejemplo, si se encuentra presente
glutamato en 20.13.3 en una posición concreta y el glutamato
representa una sustitución en comparación con la línea germinal, de
acuerdo con la presente invención, se puede sustituir
conservativamente el aspartato en esa posición. De un modo similar,
si la sustitución del aminoácido es serina, se puede remplazar la
serina por treonina.
\newpage
En otra realización preferida la cadena ligera
comprende una secuencia de aminoácidos que es la misma que la
secuencia de aminoácidos de VL del Mab 20.13.3. En otra realización
muy preferida, la cadena ligera comprende las secuencias de
aminoácidos que son las mismas que las regiones CDR de la cadena
ligera del anticuerpo monoclonal 20.13.3 (como se muestra en la
Tabla 3 y en los SEQ ID NOS: 14, 16, y 18, respectivamente).
En otra realización; el anticuerpo o una de sus
porciones comprenden una cadena ligera lambda.
Asimismo se proporciona un anticuerpo
anti-IL-5 o una de sus porciones que
comprende una cadena pesada humana o una secuencia derivada de una
cadena pesada humana. En una realización, la secuencia de
aminoácidos de la cadena pesada deriva de la familia del gen
V_{H} DP-47 humano. En una realización más
preferida, la cadena pesada comprende no más de ocho cambios de
aminoácidos con respecto a V_{H} DP-47 de la línea
germinal, más preferiblemente no más de seis cambios de
aminoácidos, e incluso más preferiblemente no más de tres cambios
de aminoácidos.
En una realización preferida, la VH del
anticuerpo anti-IL-5 contiene las
mismas sustituciones de aminoácidos, con respecto a la secuencia de
aminoácidos de la línea germinal, tal como Mab 20.13.3. En otra
realización, las sustituciones de aminoácidos se realizan en la
misma posición que las encontradas en la VH del Mab 20.13.3, pero
se realizan sustituciones conservativas en lugar de utilizar el
mismo aminoácido.
En una realización preferida, la cadena pesada
comprende una secuencia de aminoácidos que es la misma que la
secuencia de aminoácidos de la VH del Mab 20.13.3. En otra
realización muy preferida, la cadena pesada comprende secuencias de
aminoácidos que son las mismas que las regiones CDR de la cadena
pesada del anticuerpo monoclonal 20.13.3 mostrado en la Tabla 2.
También se describen en la presente memoria cadenas pesadas que
comprenden una secuencia de aminoácido de al menos una región CDR de
la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 20.13.3. En otra
realización preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre los SEQ ID NOS: 2, 6, 8, 10, y 12.
En otra realización preferida, la cadena pesada comprende una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre los SEQ ID NOS: 8, 10,
y 12.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, la descripción proporciona
un anticuerpo anti-IL-5 que inhibe
la unión de IL-5 al receptor de
IL-5. En una realización preferida, el receptor de
IL-5 es humano. En otra realización preferida, el
anticuerpo anti-IL-5 es un
anticuerpo humano. En otra realización, el anticuerpo o una de sus
porciones inhiben la unión entre IL-5 y el receptor
de IL-5 con una CI_{50} de no más de 50 nM. En una
realización preferida, la CI_{50} no es mayor de 10 nM. En una
realización más preferida, la CI_{50} no es mayor de 2,0 nM, 0,5
nM, 0,25 nM, 0,1 nM, o 0,05 nM. La CI_{50} se puede medir
mediante cualquier método conocido en la técnica. Típicamente, la
CI_{50} se puede medir mediante ELISA, RIA, o Antagonismo
Funcional. En una realización preferida, la CI_{50} se mide
mediante Antagonismo Funcional.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización preferida, la descripción
proporciona un anti-cuerpo
anti-IL-5 que inhibe la
proliferación mediada por IL-5 de una línea celular
sensible a IL-5. En una realización preferida, la
línea celular es humana. En una realización incluso más preferida,
la línea celular es una línea celular eosinofílica humana o una
línea celular de eritroleucemia humana, por ejemplo,
TF-1.
En una realización preferida, el anticuerpo es
un anticuerpo humano. En una realización más preferida, el
anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 20.13.3 o uno de sus
fragmentos funcionales.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo
anti-IL-5 o una de sus porciones
funcionales inhiben la proliferación de una línea celular sensible
a IL-5 con un valor de CI_{50} de no más de 10 nM.
En realizaciones preferidas, la CI_{50} no es mayor de 1 nM. En
otras realizaciones preferidas, la CI_{50} no es mayor de 250 pM.
En realizaciones preferidas adicionales, la CI_{50} no es mayor
de 100 pM. En realizaciones aún más preferidas, la CI_{50} no es
mayor de 50 pM.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, un anticuerpo
anti-IL-5 inhibe la acumulación de
eosinófilos in vivo. En una realización preferida, el
anticuerpo inhibe la acumulación de eosinófilos mediante la
comparación con la acumulación de eosinófilos en un animal no
tratado. En una realización más preferida, el anticuerpo inhibe la
acumulación de eosinófilos en un 50%. En una realización aún más
preferida, el anticuerpo inhibe la acumulación de eosinófilos en un
75%.
En ciertas realizaciones, la terapia con
anticuerpo anti-IL-5 se lleva a cabo
junto con la terapia con uno o más agentes terapéuticos
adicionales. En una realización preferida, el agente adicional
promueve adicionalmente la inhibición de la producción, la
maduración, la migración a la sangre, la activación, la acumulación,
o la infiltración de eosinófilos en tejidos en un mamífero. En
ciertas realizaciones, la terapia adicional comprende la
administración de uno o más de los agentes seleccionados del grupo
que consiste en corticosteroides, agonistas \beta_{2},
inhibidores de 5-LO, antagonistas del receptor de
LTD4, y anti-histaminas. Los ejemplos de los
corticosteroides para semejante terapia incluyen, pero no están
limitados a beta-metasona, prednisolona e
hidrocortisona. Los uno o más agentes terapéuticos adicionales se
pueden administrar por separado o simultáneamente con un anticuerpo
anti-IL-5 de la invención. En una
realización preferida, la co-administración de un
agente y un anticuerpo anti-IL-5
inhibe la acumulación de eosinófilos al menos en 50%, más
preferiblemente 7%, más preferiblemente 90% después de un período
de 22-24 días.
\vskip1.000000\baselineskip
La descripción también hace referencia a
composiciones farmacéuticas para el tratamiento de trastornos,
concretamente trastornos alérgicos, caracterizados por la
producción, maduración, migración a la sangre, activación o
infiltración de eosinófilos en tejidos mediadas por
IL-5, en un mamífero. En una realización, dicha
composición farmacéutica es para el tratamiento de enfermedades
eosinofílicas tales como, sin limitación, asma, exacerbaciones del
asma, episodios de empeoramiento del asma, neumonía crónica, rinitis
alérgica, rinitis alérgica perenne, aspergilosis broncopulmonar
crónica, hipereosinofilia, síndrome de
Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por
Onchocerca, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica,
enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones por
helmintos, enfermedad de Hodgkins, pólipos nasales, síndrome de
Loeffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis
nodosa, sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica,
esofagitis eosinofílica alérgica y conjuntivitis alérgica.
Los anticuerpos
anti-IL-5 pueden ser incorporados a
las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a
un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un
anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de la invención y un
portador farmacéuticamente aceptable. Según se utiliza en la
presente memoria, "portador farmacéuticamente aceptable"
incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión,
recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes
isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que sean
fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de los portadores
farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución
salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol,
etanol y similares, así como sus combinaciones. En muchos casos,
será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares,
alcoholes polihidroxilados tales como manitol, sorbitol, o cloruro
de sodio en la composición. Las sustancias farmacéuticamente
aceptables tales como humectantes o cantidades minoritarias de
sustancias coadyuvantes tales como agentes humectantes o
emulsionantes, conservantes o tampones, que intensifican la vida
media o la eficacia del anticuerpo o porción de anticuerpo.
Las composiciones pueden estar en cualquier
variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de
dosificación líquidas, semi-sólidas y sólidas,
tales como soluciones líquidas (p. ej., soluciones inyectables e
infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras,
polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del
modo de administración y de la aplicación terapéutica pretendidos.
Las composiciones preferidas típicas están en forma de soluciones
inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las
utilizadas para la inmunización pasiva de seres humanos con otros
anticuerpos. El modo de administración preferido es el parenteral
(p. ej., intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular).
En una realización preferida, el anticuerpo se administra mediante
infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, el
anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o
subcutánea.
Las composiciones terapéuticas típicamente deben
ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y
almacenamiento. La composición puede ser formulada en forma de una
solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura
ordenada adecuada para la elevada concentración de fármaco. Las
soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la
incorporación del anticuerpo
anti-IL-5 en la cantidad requerida
en un disolvente apropiado con uno o una combinación de
ingredientes enumerados antes, según se requiera, seguido de
esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se
preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que
contiene un medio de dispersión alcalino y los otros ingredientes
requeridos entre los enumerados antes. En el caso de los polvos
estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles,
los métodos de preparación preferidos son el secado a vacío y la
liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más
cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución del
mismo esterilizada por filtración previamente. La fluidez apropiada
de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de
un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del
tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y
mediante el uso de tensoactivos. La adsorción prolongada de las
composiciones inyectables se puede alcanzar aproximadamente
incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por
ejemplo, sales monoestearato y gelatina.
Los anticuerpos o fragmentos de unión al
antígeno se pueden administrar mediante una variedad de métodos
conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones
terapéuticas, la ruta/modo de administración preferida es
subcutánea, intramuscular, intravenosa o en infusión. Como
apreciará un experto en la técnica, la ruta y/o el modo de
administración variarán dependiendo de los resultados deseados.
En ciertas realizaciones, el compuesto activo se
puede preparar con un portador que proteja el compuesto de la
liberación rápida, tal como una formulación de liberación
controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas
de liberación microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros
biocompatibles, biodegradables, tales como acetato de etilenvinilo,
polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y
poli(ácido láctico). Muchos métodos para la preparación de tales
formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los
expertos en la técnica. Véase, p. ej., Sustained and Controlled
Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker,
Inc., Nueva York, 1978.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo
anti-IL-5 o los fragmentos de unión
al antígeno pueden ser administrados oralmente, por ejemplo, con un
diluyente inerte o un portador comestible asimilable. El compuesto
(y otros ingredientes, si se desea) también pueden incluirse en una
cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, formarse en
comprimidos, o incorporarse directamente a la dieta del sujeto. Para
la administración terapéutica oral, los compuestos pueden tener
incorporados excipientes y pueden ser utilizados en forma de
comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas,
elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para
administrar un compuesto de la invención mediante una administración
distinta de la parenteral, puede ser necesario recubrir el
compuesto con, o administrar el compuesto simultáneamente con, un
material que evite su inactivación.
También se pueden incorporar a las composiciones
compuestos activos suplementarios. En ciertas realizaciones, el
anticuerpo anti-IL-5 es formulado
simultáneamente y/o administrado simultáneamente con uno o más
agentes terapéuticos adicionales. Estos agentes incluyen,, sin
limitación, anticuerpos que se unen a otras dianas (p. ej.,
anticuerpos que se unen a uno o más factores de crecimiento o
citoquinas o sus receptores de la superficie celular), agentes que
reducen la producción o actividad de IL-5, tales
como proteínas de unión a IL-5, oligonucleótidos
antisentido contra IL-5 o receptor de
IL-5, análogos peptídicos que bloquean la activación
del receptor de IL-5, receptor de
IL-5 soluble, glucocorticoides y ciclosporina, y
agentes que inhiben la producción, maduración, supervivencia,
activación, o migración desde la médula ósea de eosinófilos, tales
como los corticosteroides. Semejantes terapias combinadas pueden
requerir dosis inferiores del anticuerpo
anti-IL-5 y/o los agentes
administrados simultáneamente, evitando de este modo posibles
toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas
monoterapias.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir
una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad
profilácticamente eficaz" de un anticuerpo o porción de
anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente
eficaz" hace referencia a una cantidad eficaz, a las dosis y
durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado
terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del
anticuerpo o porción de anticuerpo puede variar de acuerdo con
factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo, y el
peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción de
anticuerpo para lograr una respuesta deseada en el individuo. Una
cantidad terapéuticamente eficaz también es aquella en la que
cualquiera de los efectos tóxicos o perjudiciales del anticuerpo o
la porción de anticuerpo son sobrepasados por los efectos
terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente
eficaz" hace referencia a una cantidad eficaz, a dosificaciones
y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado
profiláctico deseado. Típicamente, puesto que se utiliza una dosis
profiláctica en los sujetos antes de o en una fase anterior de la
enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la
cantidad terapéuticamente eficaz.
Los regímenes de dosificación se pueden ajustar
para proporcionar la respuesta óptima deseada (p. ej., una
respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede
administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis
divididas a lo largo del tiempo o se puede reducir o incrementar
proporcionalmente la dosis indicada por las exigencias de la
situación terapéutica. Resulta especialmente ventajoso formular
composiciones parenterales en formas de dosificación unitarias para
facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La
forma de dosificación unitaria utilizada en la presente memoria hace
referencia a unidades físicamente discretas adaptadas como
dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se van a
tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de
compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico
deseado asociado con el portador farmacéutico requerido. Las
especificaciones para las formas unitarias de dosificación de la
invención están dictadas por y son directamente dependientes de (a)
las características únicas del anticuerpo y el efecto terapéutico o
profiláctico concreto a alcanzar, y (b) las limitaciones inherentes
de la técnica de composición de semejante anticuerpo para el
tratamiento de la sensibilidad en los individuos.
Un intervalo ilustrativo, no limitante para una
cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de un
anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es de
0,1-100 mg/kg, más preferiblemente
0,1-50 mg/kg, más preferiblemente
0,1-20 mg/kg, e incluso más preferiblemente
1-10 mg/kg (p. ej., 0,3, 1, o 3 mg/kg). Se debe
observar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y
la gravedad de la condición a aliviar. Se debe entender
adicionalmente que para un sujeto concreto, los regímenes de
dosificación específicos se deben ajustar a lo largo del tiempo de
acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la
persona que administra o supervisa la administración de las
composiciones, y los intervalos de dosificación mostrados en la
presente memoria son meramente ilustrativos y no se pretende que
limiten el alcance o la práctica de la composición
reivindicada.
Otro aspecto de la presente descripción
proporciona kits que comprenden anticuerpos
anti-IL-5 o fragmentos de unión al
antígeno y las composiciones farmacéuticas que comprenden estos
anticuerpos. Un kit puede incluir, además del anticuerpo o la
composición farmacéutica, agentes de diagnóstico o terapéuticos. Un
kit también puede incluir instrucciones para su uso en un método
diagnóstico o terapéutico. En una realización preferida, el kit
incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y un
agente de diagnóstico que puede ser utilizado en un método descrito
más abajo. En otra realización preferida, el kit incluye el
anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y uno o más
agentes terapéuticos que pueden ser utilizados en un método
descrito más abajo.
Los anticuerpos
anti-IL-5 o sus fragmentos de unión
al antígeno se pueden utilizar para detectar IL-5 en
una muestra biológica. Los anticuerpos
anti-IL-5 se pueden utilizar en un
inmunoanálisis convencional, incluyendo, sin limitación, ELISA,
RIA, FACS, inmunohistoquímica de tejidos, transferencia Western o
inmunoprecipitación. Los anticuerpos
anti-IL-5, se pueden utilizar para
detectar IL-5 de seres humanos. En otra realización,
los anticuerpos anti-IL-5 se pueden
utilizar para detectar IL-5 de primates del Viejo
Mundo tales como monos cynomolgus y rhesus, chimpancés y simios.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de la
invención se pueden utilizar en un método para detectar
IL-5 en una muestra biológica que comprende poner en
contacto una muestra biológica con un anticuerpo
anti-IL-5 de la invención sus
fragmentos de unión al antígeno y detectar el anticuerpo unido a
IL-5, para detectar la IL-5 en la
muestra biológica. En una realización, el anticuerpo
anti-IL-5 se marca directamente con
una marca detectable. En otra realización, el anticuerpo
anti-IL-5 (el primer anticuerpo) no
está marcado y un segundo anticuerpo u otra molécula que se puede
unir al anticuerpo anti-IL-5 está
marcado. Como es bien sabido por un experto en la técnica, se elige
un segundo anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a la
especie y clase específica del primer anticuerpo. Por ejemplo, si el
anticuerpo anti-IL-5 es una IgG
humana, el anticuerpo secundario puede ser uno
anti-IgG humana. Otras moléculas que se pueden unir
a anticuerpos incluyen, sin limitación, Proteína A y Proteína G,
ambas las cuales son asequibles comercialmente, p. ej., de Pierce
Chemical Co.
Las marcas adecuadas para el anticuerpo o el
secundario han sido descritas supra, e incluyen diversas
enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales
luminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas
adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina,
\beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los
ejemplos de complejos con grupos prostéticos adecuados incluyen
estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de
materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona,
fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína; rodamina,
diclorotriazinilamin-fluoresceína, cloruro de
dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluye
luminol; y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen
I^{125}, I^{131}, S^{35} o H^{3}.
En una realización alternativa, se puede
analizar la IL-5 en una muestra biológica por medio
de un análisis competitivo utilizando patrones de
IL-5 marcados con una sustancia detectable y un
anticuerpo anti-IL-5 no marcado. En
este análisis, la muestra biológica, los patrones de
IL-5 marcados y el anticuerpo
anti-IL-5 se combinan y se
determina la cantidad de patrón de IL-5 marcado
unido al anticuerpo no marcado. La cantidad de IL-5
en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad
de patrón de IL-5 marcado unido al anticuerpo
anti-IL-5.
Se pueden utilizar los inmunoanálisis descritos
antes para numerosos fines. En una realización, se pueden utilizar
anticuerpos anti-IL-5 o fragmentos
para detectar IL-5 en una muestra, concretamente una
muestra biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
Asimismo se describe en la presente memoria un
método para inhibir la actividad de IL-5
administrando un anticuerpo
anti-IL-5 como se reivindica o uno
de sus fragmentos de unión al antígeno a un paciente que lo
necesite. Se puede utilizar terapéuticamente cualquiera de los
tipos descritos en la presente memoria. En una realización
preferida, el anticuerpo anti-IL-5
es un anticuerpo humano. En otra realización preferida, la
IL-5 es humana y el paciente es un paciente humano.
Alternativamente, el anticuerpo o fragmento puede ser administrado a
un mamífero no humano que exprese una IL-5 con la
cual reacciona de forma cruzada el anticuerpo (esto es, un primate,
mono cynomolgus o rhesus) con fines veterinarios o como un modelo
animal de enfermedad humana. Tales modelos animales pueden ser
útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de
esta invención.
Según se utiliza en la presente memoria, se
pretende que el término "un trastorno en el que la actividad de
IL-5 es perjudicial" incluya enfermedades y otros
trastornos en los cuales la presencia de IL-5 en un
sujeto que padece el trastorno se ha demostrado que es o se
sospecha que es responsable de la patofisiología del trastorno o un
factor que contribuye al empeoramiento del trastorno. Por
consiguiente, la presente invención proporciona, de acuerdo con las
reivindicaciones adjuntas, el uso de un anticuerpo o uno de sus
fragmentos de unión al antígeno en la fabricación de un medicamento
para prevenir o inhibir una condición o trastorno caracterizados
por la actividad no deseada de IL-5. Por
consiguiente, un trastorno en el que la actividad de
IL-5 es perjudicial es un trastorno en el que se
espera que la inhibición de la actividad de IL-5
alivie los síntomas y/o el progreso del trastorno. Tales trastornos
mediados por IL-5 incluyen, pero no están limitados
a, trastornos alérgicos, concretamente trastornos alérgicos de la
piel y los tejidos pulmonares e inflamación pulmonar. Tales
trastornos pueden ser evidenciados, por ejemplo, por un incremento
del número de eosinófilos y/o basófilos en la médula ósea, la
sangre u otros tejidos, o en el fluido del lavado broncoalveolar
(BAL). En particular, tales trastornos pueden estar caracterizados
por eosinofilia pulmonar o cutánea, hipersensibilidad bronquial,
acumulación de eosinófilos en el tejido pulmonar, regiones
perivasculares y/o peribronquiales, lesión del epitelio de las vías
respiratorias, edema intersticial de las vías respiratorias, aumento
de la secreción de mucus en los bronquios o broncoconstricción.
Alternativamente, la actividad patológica de IL-5
puede ser evidenciada por el incremento de una o más de
eosinopoyesis en la médula ósea, incremento de supervivencia de
eosinófilos, incremento de adherencia de eosinófilos a las células
endoteliales e incremento de actividad citotóxica de los
eosinófilos.
En una realización preferida, se puede
administrar un anticuerpo anti-IL-5
o uno de sus fragmentos de unión al antígeno a un paciente que
padece inflamación, incluyendo enfermedades alérgicas caracterizadas
por infiltración eosinofílica pronunciada, tales como rinitis
nasal, pólipos nasales, asma, síndromes eosinofílicos idiopáticos,
y dermatitis atópica. En una realización incluso más preferida, el
anticuerpo anti-IL-5 se administra a
un paciente que tiene inflamación pulmonar crónica. En una
realización muy preferida, el método hace que la inflamación se
vuelva menos grave o desaparezca.
En otra realización preferida, se puede
administrar un anticuerpo anti-IL-5
a un paciente que tenga niveles incrementados de eosinófilos en la
médula ósea, la sangre u otros tejidos corporales. Se sabe en la
técnica que el incremento de la presencia de eosinófilos se asocia
con enfermedades tales como, sin limitación, asma, exacerbaciones
del asma, episodios de empeoramiento del ama, neumonía crónica,
rinitis alérgica, rinitis alérgica perenne, aspergilosis
broncopulmonar alérgica, hipereosinofilia, síndrome de
Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por
Onchocerca, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica,
enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones por
helmintos, enfermedad de Hodgkins, pólipos nasales, síndrome de
Loeffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis
nodosa, sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica,
esofagitis eosinofílica alérgica, conjuntivitis alérgica. En una
realización preferida, el anticuerpo
anti-IL-5 de la invención o uno de
sus fragmentos de unión al antígeno es administrado a un paciente
con asma. En una realización aún más preferida, el método evita o
reduce la gravedad de la enfermedad.
El anticuerpo o fragmento puede ser administrado
de aproximadamente tres veces al día a aproximadamente una vez cada
seis meses, y preferiblemente puede ser administrado por una ruta
oral, mucosal, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa,
subcutánea, intramuscular, parenteral, intratumoral o tópica. El
anticuerpo también puede ser administrado continuamente por medio
de una minibomba. Generalmente el anticuerpo se administrará
durante todo el tiempo que esté presente el estado de enfermedad,
siempre que el anticuerpo haga que la condición se detenga o
mejore. Generalmente el anticuerpo se administrará como parte de una
composición farmacéutica como se ha descrito supra. El
anticuerpo también se puede administrar profilácticamente con el fin
de evitar que se produzca la inflamación alérgica y/o la
infiltración eosinofílica. Esto puede resultar especialmente útil
en pacientes que han demostrado tener un alto riesgo de desarrollar
una afección mediada por IL-5 o mediada por
eosinófilos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las moléculas de ácido nucleico pueden ser
administradas a un paciente que lo necesite a través de la terapia
génica. La terapia puede ser in vivo o ex vivo. En un
caso preferido, se administran a un paciente las moléculas de ácido
nucleico que codifican tanto una cadena pesada como una cadena
ligera. En un caso más preferido, las moléculas de ácido nucleico
se administran de manera que están integradas establemente en el
cromosoma de las células B debido a que estas células están
especializadas para producir anticuerpos. En un caso preferido, las
células B precursoras son transfectadas o infectadas ex vivo
y re-transplantadas a un paciente que lo necesite.
En otro caso, las células B precursoras u otras células son
infectadas in vivo utilizando un virus que se sabe que
infecta el tipo de célula de interés. Los vectores típicos
utilizados para la terapia génica incluyen liposomas, plásmidos, o
vectores virales, tales como retrovirus, adenovirus y virus
adeno-asociados. Tras la infección in vivo o
ex vivo, se pueden controlar los niveles de expresión de
anticuerpo tomando una muestra del paciente tratado y utilizando
cualquier inmunoanálisis conocido en la técnica y comentado en la
presente memoria.
En un caso preferido, el método de terapia
génica comprende las etapas de administrar una cantidad eficaz de
una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada
o su porción de unión al antígeno del anticuerpo humano y expresar
la molécula de ácido nucleico. En otro caso, el método de terapia
génica comprende las etapas de administrar una cantidad eficaz de
una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena
ligera o su porción de unión al antígeno del anticuerpo humano y
expresar la molécula de ácido nucleico. En un caso más preferido,
el método de terapia génica comprende las etapas de administrar una
cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica la cadena pesada o su porción de unión al antígeno del
anticuerpo humano y una cantidad eficaz de una molécula de ácido
nucleico aislada que codifica la cadena ligera o su porción de
unión al antígeno del anticuerpo humano y expresar las moléculas de
ácido nucleico. El método de terapia génica también puede
comprender la etapa de administrar otro agente que tenga efectos
terapéuticos similares a los del anticuerpo o su fragmento funcional
tales como los enumerados, supra.
Con el fin de comprender mejor esta invención,
se exponen los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon anticuerpos de la invención, se
seleccionaron, y se analizaron como sigue: Inmunización y
generación de hibridoma
Se inmunizaron un total de 288 XenoMice® IgG2 o
IgG4 divididos en grupos de 15 a 20 ratones de 8 a 15 semanas de
edad de acuerdo con el programa mostrado en la siguiente Tabla
4.
Para las inmunizaciones en la base de la cola
(bot), se emulsionó IL-5 humana en coadyuvante
completo de Freund (CFA) para la primera inmunización y en
coadyuvante incompleto de Freund (IFA) para posteriores
inmunizaciones a las dosis y tiempos indicados antes. (Para la
información de la secuencia de IL-5, véase la
publicación de la Patente Europea número EP0267779.) Para la
inmunización en la almohadilla de la pata (FP), el antígeno se
emulsionó en coadyuvante Ribi. Algunos animales (grupo 7) recibieron
antígeno tanto bot como intraperitonealmente (ip) en CFA o Ribi. El
grupo 8 recibió antígeno en forma de producto conjugado en el que la
IL-5 humana estaba conjugada químicamente con un
anticuerpo anti-CD3 de ratón.
Se fusionaron células de bazo y/o nódulo
linfático de ratones inmunizados o bien con la línea celular de
mieloma no secretora P3-X63-Ag8.653
(ATCC, Rockville, MD) o bien con la línea celular de mieloma
NSO-bcl2 (B. Diamond, Albert Einstein College of
Medicine, NY), como se ha descrito previamente (Galfre y Milstein,
Methods Enzymol. 73:3-46, 1981). Los cultivos se
examinaron regularmente en cuanto al crecimiento de las células
híbridas, y los sobrenadantes de aquellos pocillos que contenían
hibridomas se recogieron para un primer escrutinio mediante ELISA
en busca de la presencia de IgG/kappa humana específica de
IL-5.
\vskip1.000000\baselineskip
Las placas de ELISA se recubrieron con 50
\mul/pocillo de antígeno IL-5 a 2 \mug/ml en
Tampón de Recubrimiento (tampón carbonato 0,1 M, pH 9,6 y 8,4 g/l
de NaHCO_{3} (PM 84)) y se incubaron a 4ºC durante la noche o a
37ºC durante 2 horas. Las placas se lavaron con tampón de lavado
(Tween 20 al 0,05% en PBS) tres veces, se bloquearon con 200
\mul/pocillo de tampón de bloqueo (BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,01%,
Timerosal al 0,01% en 1x PBS) durante 1 hora a la temperatura
ambiente, y se lavaron tres veces más con tampón de lavado. Se
añadieron 50 \mul/pocillo de muestra (o controles) a los pocillos
y se incubaron a la temperatura ambiente durante 2 horas. Después
de tres lavados con tampón de lavado, se añadieron 100
\mul/pocillo de anticuerpo
anti-huIgGfc-HRP de cabra (Caltag,
núm. cat. H10507) (y GT
anti-hkappa-HRP en un escrutinio
secundario) a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a la
temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se añadieron 100
\mul de solución desarrollo (10 ml de tampón sustrato, 7,14 g/l de
ácido cítrico y 16,96 g/l de fosfato de sodio dibásico), 10 mg de
o-fenilendiamina (Sigma, núm. cat.
P-7288), y 10 \mul de H_{2}O_{2} al 30%) a
cada pocillo. Después de aproximadamente 10 minutos, se añadió una
solución de parada (H_{2}SO_{4} 2 M) a cada pocillo y las
placas se analizaron utilizando un lector de placas ELISA a una
longitud de onda de 492 nm. Los cultivos positivos se transfirieron
a placas de 48 pocillos y con posterioridad se transfirieron a
placas de 24 pocillos después de alcanzar la confluencia.
Se obtuvieron un total de 116 hibridomas
productores de anticuerpos reactivos con IL-5, de
los cuales 7 fueron IgG2 y 109 fueron IgG4. Se piensa que la
prevalencia desproporcionada de anticuerpos IgG4 está relacionada
con un efecto de la IL-5 sobre el cambio de clase.
De los 116 hibridomas que producen anticuerpos específicos para
IL-5, se seleccionó un hibridoma IgG4/kappa
designado 20.13 para la caracterización adicional basándose en su
fuerte actividad de neutralización comparable con la de un
anticuerpo de control IgG de ratón (39D10 de
Schering-Plough).
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron las ascitis y los sobrenadantes de
los hibridomas purificados por afinidad para un análisis funcional
cuantitativo de la neutralización de la proliferación de células TF1
inducida por IL-S (DNAX). En resumen, se diluyó
IL-5 humana recombinante en medio de cultivo
RPMI-1640 con FBS al 1% hasta una concentración
final de 1,0 ng/ml, y el anticuerpo de control, 39D10
(Schering-Plough) se diluyó hasta una concentración
final de 1,0 \mug/ml con medio con IL-5. Se añadió
la solución de IL-5 o la solución de
IL-5 más 39D10 a los pocillos de las placas de 96
pocillos. Los pocillos de control contuvieron solamente medio o
solamente IL-5.
Se lavaron las células TFP1 dos veces con medio
RPMI-1640 y se resuspendieron a una concentración
final de 2,5 x 10^{5} células TF1 por ml en medio de cultivo FBS.
Se añadieron 100 \mul de la suspensión celular a cada pocillo y
se incubaron durante 48-56 horas a 37ºC y CO_{2}
al 5%. Después de 48 horas, se añadieron 20 \mul de Azul Alamar a
cada pocillo y se incubaron durante la noche. Las placas se
analizaron utilizando un lector de placa FluoroCount® a una
longitud de onda de excitación de 530 nm, longitud de onda de
emisión de 590 nm, y PMT de 600 voltios.
Los resultados de los estudios utilizando el
anticuerpo 20.13.3, purificado a partir de las ascitis o
sobrenadantes, muestran que 20.13.3 bloqueaba eficazmente la
proliferación celular inducida por IL-5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió a ensayo el Mab 20.13.3 en un
análisis de anti-proliferación de
TF-1 contra IL-5 tanto humana como
murina (Egan et al. Drug Res. 49:779-790
(1999)). En resumen, se añadieron 50 \mul de medio de análisis
(RPMI 1640 con un suplemento de glutamina al 1%, solución pen/strep
al 1%, mercaptoetanol al 0,1%, fungizona al 0,05% y suero bovino
fetal al 1%) a los pocillos de una placa de cultivo de 96 pocillos.
Se añadieron concentraciones variables de Mab 20.13.3 a los
pocillos y se incubaron a la temperatura ambiente durante 30
minutos. Se añadieron veinte microlitros (20 \mul) de
IL-5 humana o murina (12 ng/ml) a cada pocillo
(excepto controles negativos). Se prepararon células
TF-1 a una concentración de 5x10^{5} células por
ml, y se añadieron alícuotas de 30 \mul de la suspensión celular
a todos los pocillos. Las placas se incubaron durante
44-48 horas a 37ºC y CO_{2} al 5%. Después se
añadieron 25 \mul de una solución de 5 mg/ml de MTT a cada pocillo
y se incubaron durante otras 6 horas. Se añadieron 100 \mul de
una solución de SDS al 10% a cada pocillo y las placas se incubaron
durante la noche. Las placas se analizaron en un espectrofotómetro
UV MAX®. Los resultados indican que en el análisis, el Mab 20.13.3
muestra valores de CI_{50} de 250 pM y 380 pM frente a
IL-5 humana y murina, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó un anticuerpo
anti-IL-5 anticuerpo de la invención
en un modelo de ratón de inflamación pulmonar inducida por antígeno
(Kung et al 1994). En resumen, se administraron dosis a
ratones sensibilizados con ovoalbúmina (OVA) de solución salina,
Mab 20.13.3 a 5, 1, 0,5, o 0,1 mg/kg s.c., o un mAb
anti-IL-5 murino de control
positivo, TRFK-5 (Schering Plough Research
Institute; Mita et al., J. Immunol. Methods 125:233 (1987)) a
1 mg/kg i.p 2 horas antes de la sensibilización con OVA en aerosol.
Se recogió el fluido de lavado broncoalveolar (BAL) 24 horas
después de la sensibilización y se determinó la celularidad.
TRFK-5 produjo un incremento significativo de todos
los parámetros. Mab 20.13.3 inhibió significativamente las células
totales y los eosinófilos en el BAL a 5, 1 y 0,5 mg/kg.
Se evaluó la duración de la actividad de los
anticuerpos anti-IL-5 de la
invención en el modelo descrito antes. A los ratones sensibilizados
con ovoalbúmina (OVA) se les administraron dosis de solución salina
o Mab 20.13.3 a 5 y 1 mg/kg s.c. 2 horas, 2 semanas, 4 semanas, 6
semanas, 8 semanas o 12 semanas antes de la sensibilización con OVA
en aerosol. El fluido del lavado broncoalveolar se recogió 24 horas
después de la sensibilización y se determinó la celularidad. Se
tomaron muestras de sangre en el momento de recolección del BAL
para el análisis farmacocinético. Las dosis de 5 y 1 mg/kg de Mab
20.13.3 inhibieron significativamente las células totales y los
eosinófilos en el BAL cuando se administraron 2 horas y 13 días
antes de la sensibilización con OVA. El Mab 20.13.3 inhibió
significativamente las células totales y los eosinófilos en el BAL
cuando se administró 4 semanas antes de la sensibilización solamente
a la dosis de 5 mg/kg. No se observó más inhibición cuando se
administraron las dosis del Mab 20.13.3 6 semanas - 12 semanas antes
de la sensibilización.
Los autores de la presente invención evaluaron
Mab 20.13.3 en un modelo de mono cynomolgus de inflamación pulmonar
inducida por antígeno (Mauser et al 1995). En resumen,
primero se trataron simuladamente nueve monos naturalmente
sensibles a Ascaris suum con vehículo (solución salina
subcutánea) y 18 horas más tarde se sensibilizaron con Ascaris
suum (antígeno) en aerosol. Veinticuatro horas después de la
sensibilización con Ascaris, se recogió una muestra de
fluido BAL y se obtuvo una muestra de sangre periférica. Se
determinaron el contenido celular del BAL y las muestras de
sangre.
Tres semanas más tarde, se administraron a los
nueve monos dosis de Mab 20.13.3 a 0,3 mg/kg s.c. Dieciocho horas
más tarde, se sensibilizaron los monos con Ascaris suum en
aerosol y se recogió una muestra de BAL 24 horas más tarde. Se
tomaron muestras de sangre antes y en los momentos seleccionados
después de la administración de Ascaris suum. La
sensibilización con Ascaris suum se repitió 4 y 8 semanas
después de la dosificación inicial con Mab 20.13.3 y se analizó el
contenido celular en el fluido de BAL antes y 24 horas después de
cada sensibilización con Ascaris. El Mab 20.13.3 redujo
significativamente la acumulación de eosinófilos en el BAL inducida
por el antígeno 4 semanas después de la administración de las dosis
con una tendencia a niveles reducidos (reducción del 55%) 8 semanas
después de la administración de las dosis. El Mab 20.13.3 redujo
significativamente el número de eosinófilos en la sangre periférica
42 h, 2 s, 4 s, 8 s y 12 s después de la administración de las
dosis con niveles que regresaban hasta casi los niveles previos a la
administración de las dosis en 14 s.
\vskip1.000000\baselineskip
Para analizar la estructura de los anticuerpos
producidos de acuerdo con la invención, los autores de la presente
invención clonaron y secuenciaron los ácidos nucleicos que
codificaban los fragmentos de la cadena pesada y ligera de los
hibridomas que producían los anticuerpos monoclonales
anti-IL-5. Los autores de la
invención analizaron todas las secuencias mediante alineamientos
con respecto al "directorio de secuencias V BASE" (Tomlinson
et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)
utilizando programas de soporte lógico MacVector y Geneworks.
Para clonar el ADNc que codifica el anticuerpo
monoclonal 20.13.3, los autores de la presente invención aislaron
ARN de aproximadamente 1 X 10^{6} células de hibridoma mediante el
método RNAzol (Tel-Test, INC.). Los autores de la
presente invención realizaron una transcripción inversa del ARNm
utilizando oligo-dT(18) y el kit Advantage®
RT/PCR (Clonetech). Los autores de la presente invención utilizaron
los siguientes cebadores para amplificar el ADNc.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de la PCR del ADNc de la cadena
ligera de 20.13.3 se sometieron a electroforesis en geles de
agarosa/TAE al 1% y se separó por corte la banda de \sim760 pb y
se purificó con cuentas de Sephaglas (Amersham) y se subclonó en el
vector PCR TOP02.1 (Invitrongen). Se secuenciaron los insertos de
ADNc con el kit de secuenciación de cebadores coloreados (Applied
Biosystems) con los cebadores vk018-Eco y
ckp2-Apa. Se realizó el análisis de la secuencia
utilizando el soporte lógico SeqEd y GeneWorks. Los fragmentos
EcoRI/ApaI aislados de los plásmidos identificados se clonaron en
el vector de expresión pManuKappa.
Los productos de la PCR de la cadena pesada de
20.13.3 se digirieron con EcoRI/NheI, se sometieron a electroforesis
en geles de agarosa/TAE al 1% y la banda de \sim435 pb se separó
por corte y se purificó con Sephaglas (Amersham) y se subclonó en
pManuGamma4. Los clones se secuenciaron con el kit de secuenciación
de cebadores coloreados (Applied Biosystems) con los cebadores
v3023-Eco y Jh4-Nhe.
Para cada clon, los autores de la presente
invención verificaron la secuencia de ambas hebras al menos en tres
reacciones.
\newpage
La Tabla 5 muestra la utilización del gen por el
hibridoma de 20.13.3 de acuerdo con la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se apreciará, el análisis de utilización
del gen proporciona solamente una visión de conjunto limitada de la
estructura del anticuerpo. A medida que las células B en los
animales XenoMouse® generan estocásticamente transcritos de la
cadena pesada V-D-J o de la cadena
ligera kappa V-J, existen numerosos procedimientos
secundarios que se producen, incluyendo, sin limitación,
hipermutación somática, adiciones, y prolongaciones de CDR3. Véase,
por ejemplo, Mendez et al., Nature Genetics
15:146-156 (1997) y la Publicación de Patente
Internacional WO98/24893, publicada el 11 de Octubre de 1998. Por
consiguiente, para examinar adicionalmente la estructura del
anticuerpo, los autores de la presente invención generaron
secuencias de aminoácidos pronosticadas de los anticuerpos a partir
de los ADNc obtenidos de los clones.
El dominio variable de la cadena pesada del Mab
20.13.3 contiene tres sustituciones de aminoácidos en comparación
con la línea germinal - una en la CDR2 y dos en la CDR3. El dominio
variable de la cadena ligera del Mab 20.13.3 contiene cinco
mutaciones con respecto a la línea germinal, una en cada una de
CDR1, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.
Se apreciará que muchas de las sustituciones o
inserciones de aminoácidos identificadas antes existen en íntima
proximidad a o en una CDR. Tales sustituciones parecerían portar
cierto efecto sobre la unión del anticuerpo a la molécula de
IL-5. Adicionalmente, tales sustituciones podrían
tener un efecto significativo sobre la afinidad de los
anticuerpos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la constante de disociación en
equilibrio (Kd) para el anticuerpo monoclonal humano 20.13.3
utilizando el aparato KinExA 3000® (Sapidyne Instruments Inc.). El
KinExA utiliza el principio del método de Análisis de Exclusión
Cinética basado en la medida de la concentración de anticuerpo que
no forma complejo en una mezcla de anticuerpo, antígeno y complejo
antígeno-anticuerpo. La concentración de anticuerpo
libre se mide exponiendo la mezcla a un antígeno inmovilizado en
fase sólida durante un período de tiempo muy breve. En la práctica,
esto se logra haciendo fluir la mezcla de
antígeno-anticuerpo en fase de solución por delante
de las partículas recubiertas con antígeno atrapadas en una célula
de flujo. Los datos, generados por el aparato se analizan
utilizando el soporte lógico ad hoc. Las constantes de
equilibrio se calculan utilizando una teoría matemática basada en
las siguientes suposiciones:
- 1. 1.
- La unión sigue la ecuación de unión reversible para el equilibrio:
K_{on}[Ab][Ag]
= K_{off}[Ab \
Ag];
- 2. 2.
- El anticuerpo y el antígeno se unen 1:1, y el anticuerpo total es igual al complejo antígeno-anticuerpo más el anticuerpo libre;
- \quad
- y
- 3. 3.
- La señal del aparato está linealmente relacionada con la concentración de anticuerpo libre.
\newpage
Todos los procedimientos experimentales se
realizaron de acuerdo con el Manual de KinExA 3000®. Todas las
rondas se realizaron por duplicado. La siguiente tabla muestra las
condiciones de análisis para las rondas de K_{d} patrón a
concentraciones de Ab de 0,1 nM y 0,01 nM, respectivamente:
En cada análisis, se prepararon diluciones
seriadas al doble del antígeno y se mezclaron con el anticuerpo a
concentración constante. La mezcla se incubó durante 2 horas a la
temperatura ambiente para equilibrar.
Los materiales utilizados en los análisis
anteriores fueron: Mab 20.13.3; IL_5 humana recombinante
(rhIL-5) (asequible de Sigma (Núm. Cat. I5273),
R&D Systems (Núm. Cat.
205-IL-005), Amersham (Núm. Cat.
ARM19005), y Calbiochem (Núm. Cat. 407641)); partículas PMMA, 8
micras (Sapidyne, Núm. Cat. 440198); Neutravidina (Pierce, Cat No.
31000); EZ-link TFP PEO-Biotin
(Pierce, Núm. Cat. 21219); rhIL-5 Biotinilada (razón
Biotina/proteína: 19/1); y anti-HuIg de cabra
conjugada con Cy5 (H+L) (Jackson Immunoresearch Laboratories Núm.
Cat. 109-175-003). Las partículas
de PMMA se recubrieron con rhIL-5 biotinilada de
acuerdo con el "protocolo para recubrir partículas de PMMA con
ligandos biotinilados que tienen brazos conectores cortos o no
existentes" de Sapidyne. Para la biotinilación de
rhIL-5 se utilizó EZ-link TFP
PEO-biotina de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante (Boletín Pierce 0874). La razón de Biotina/proteína se
estimó utilizando el análisis HABA (Boletín Pierce 0212).
El análisis de la Curva Dual (Concentraciones de
Anticuerpo 0,1 y 0,01 nM) en el "modo convencional" (véase el
Manual KinExA 3000® para una explicación de los métodos del análisis
de datos de la Curva Dual) generó una buena curva de mejor ajuste
para la Kd con un mínimo claro. El valor de la Kd calculado para el
Mab 20.13.3 para este método de análisis fue 1,5 x 10^{-11} M. La
Kd para el Mab 20.13.3 calculada mediante el método de la Curva
Dual (Antígeno Desconocido) fue 1,95 x 10^{-11} M, que estaba
comprensiblemente próxima a la Kd obtenida mediante el método de la
Curva Dual (Convencional). El peso molecular del anticuerpo
utilizado para el cálculo fue 150 Kda.
El análisis cinético indica que los anticuerpos
preparados de acuerdo con la invención poseen afinidades elevadas
por la IL-5 humana.
En toda esta memoria y en las reivindicaciones,
se entenderá que la palabra "comprenden", o variaciones tales
como "comprende" o "que comprende" implican la inclusión
de un número entero o grupo de números enteros establecido pero no
la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números
enteros.
<110> Schering Corporation and Abgenix,
Inc.
\hskip1cm Greenfeder, Scott
\hskip1cm Corvalan, Jose
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS
PARA INTERLEUQUINA-5 Y MÉTODOS Y COMPOSICIONES QUE
LOS COMPRENDEN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> LI01564WI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2002
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_V
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(414)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_CH1 C
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (415)..(709)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Bisagra
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1102)..(1137)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_CH2 C
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1256)..(1585)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_CH3 C
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1683)..(2002)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 465
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Región Variable
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20).. (138)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Región CH1
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (139)..(236)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Región Bisagra
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (237)..(248)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Región CH2
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (249)..(358)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Región CH3
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (359)..(465)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm10
\hskip1cm11
\hskip1cm12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 708
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm13
\hskip1cm14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 236
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Péptido Señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm15
\hskip1cm16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 414
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm100
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm33
Claims (21)
1. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de
unión al antígeno que se une específicamente a IL-5,
donde dicho anticuerpo o fragmento comprende:
- (i)
- una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2, con o sin el péptido señal;
- (b)
- la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 6;
- (c)
- la secuencia de aminoácidos desde el resto 50-127 del SEQ ID NO: 2; y
- (d)
- las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID NOS: 8, 10, y 12, respectivamente; y
- (ii)
- una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 4, con o sin el péptido señal;
- (b)
- la secuencia de aminoácidos desde el resto 23-130 del SEQ ID NO: 4;
- (c)
- la secuencia de aminoácidos desde el resto 46-119 del SEQ ID NO: 4; y
- (d)
- las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID NOS: 14, 16, y 18, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Una molécula de ácido nucleico que
comprende:
- (i)
- una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2, con o sin el péptido señal;
- (b)
- la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 6;
- (c)
- la secuencia de aminoácidos desde el resto 50-127 del SEQ ID NO: 2; y
- (d)
- las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID NOS: 8, 10, y 12, respectivamente; y
- (ii)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 4, con o sin el péptido señal;
- (b)
- la secuencia de aminoácidos desde el resto 23-130 del SEQ ID NO: 4;
- (c)
- la secuencia de aminoácidos desde el resto 46-119 del SEQ ID NO: 4; y
- (d)
- las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en los SEQ ID NOS: 14, 16, y 18, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Una molécula de ácido nucleico que codifica
un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno,
comprendiendo dicho ácido nucleico:
- (i)
- una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 1-709, 1102-1137, 1256-1585, y 1683-2002 del SEQ ID NO: 1;
- (b)
- la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 58-709, 1102-1137, 1256-1585, y 1683-2002 del SEQ ID NO: 1;
- (c)
- la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 58-709 del SEQ ID NO: 1;
- (d)
- la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 148 al 381 del SEQ ID NO: 1; y
- (e)
- la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 1 al 2002 del SEQ ID NO: 1; y (ii) una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 3;
- (b)
- la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 67-708 mostrada en el SEQ ID NO: 3;
- (c)
- la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 67-390 mostrada en el SEQ ID NO; 3; y
- (d)
- la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 67-357 mostrada en el SEQ ID NO: 3.
4. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con
una cualquiera de las Reivindicaciones 2-3,
conectada operablemente a una secuencia de control de la
expresión.
5. Una célula anfitriona transformada con una
molécula de ácido nucleico de acuerdo con la Reivindicación 4.
6. Un método para producir una inmunoglobulina o
uno de sus fragmentos de unión al antígeno que se une
específicamente a IL-5, que comprende la etapa de
cultivar una célula anfitriona de acuerdo con la Reivindicación
5.
7. Una célula anfitriona transformada con una
molécula de ácido nucleico de acuerdo con la Reivindicación 2 o la
Reivindicación 3.
8. Un método para producir un anticuerpo o uno
de sus fragmentos de unión al antígeno que se une específicamente a
IL-5, que comprende la etapa de cultivar una célula
anfitriona de acuerdo con la Reivindicación 7.
9. Una composición que comprende el anticuerpo o
fragmento del mismo de acuerdo con la Reivindicación 1 y un
portador farmacéuticamente aceptable.
10. La composición de acuerdo con la
Reivindicación 9, que comprende adicionalmente un componente
seleccionado del grupo que consiste en:
- (a)
- un agente diagnóstico; y
- (b)
- un agente terapéutico.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Un kit que comprende el anticuerpo o
fragmento del mismo de acuerdo con la Reivindicación 1.
12. El uso del anticuerpo o fragmento del mismo
de acuerdo con la Reivindicación 1 o una composición de acuerdo con
la Reivindicación 9 o 10 en la fabricación de un medicamento para
prevenir o inhibir una condición o trastorno caracterizado
por una actividad de IL-5 no deseada.
13. El uso de acuerdo con la Reivindicación 12,
donde la condición o trastorno se selecciona del grupo que consiste
en: asma, exacerbaciones del asma, episodios de empeoramiento del
asma, neumonía crónica, rinitis alérgica, rinitis alérgica perenne,
aspergilosis broncopulmonar alérgica, hipereosinofilia, síndrome de
Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por
Onchocerca, angioedema episódico, síndrome de mialgia eosinofílica,
enfermedad celíaca, gastroenteritis eosinofílica, infecciones por
helmintos, enfermedad de Hodgkins, pólipos nasales, síndrome de
Loeffler, urticaria, bronquitis hipereosinofílica, arteritis nodosa,
sinusitis, sinusitis crónica, esofagitis eosinofílica, esofagitis
eosinofílica alérgica, conjuntivitis alérgica.
14. El uso de acuerdo con la Reivindicación 12 o
13, donde el método disminuye o inhibe la infiltración de
eosinófilos en el tejido afectado.
15. El uso del anticuerpo o un fragmento del
mismo de acuerdo con la Reivindicación 1 o una composición de
acuerdo con la Reivindicación 9 o 10 en la fabricación de un
medicamento para prevenir o inhibir una respuesta alérgica mediada
por IL-5 en un sujeto.
16. El uso del anticuerpo o un fragmento del
mismo de acuerdo con la Reivindicación 1 o una composición de
acuerdo con la Reivindicación 9 o 10, en la fabricación de un
medicamento para prevenir o inhibir un evento mediado por
IL-5 seleccionado del grupo que consiste en:
- (a)
- proliferación, maduración, supervivencia, activación, migración a la corriente sanguínea, adherencia al endotelio, infiltración en tejidos de eosinófilos;
- (b)
- edema pulmonar;
- (c)
- broncoconstricción;
- (d)
- hipersensibilidad de las vías respiratorias;
- (e)
- eosinofilia o neutrofilia pulmonar;
- (f)
- eosinofilia cutánea; y
- (g)
- lesión epitelial de las vías respiratorias.
\vskip1.000000\baselineskip
17. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
Reivindicaciones 14-16, donde el anticuerpo
anti-IL-5 se administra junto con
la administración de otro agente terapéutico.
18. Un método in vitro para prevenir o
inhibir la unión de IL-5 a un receptor de
IL-5, comprendiendo el método la etapa de
administrar al entorno en el se encuentran las células que expresan
un receptor de IL-5 un anticuerpo o uno de sus
fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con la Reivindicación 1 o
una composición de acuerdo con la Reivindicación 9 o 10.
19. Un método in vitro para prevenir o
inhibir la fosforilación de tirosina mediada por el receptor de
IL-5 que comprende la etapa de administrar al
entorno en el que se encuentran las células que expresan la
IL-5 un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión
al antígeno de acuerdo con la Reivindicación 1 o una composición de
acuerdo con la Reivindicación 9 o 10.
20. El uso de un anticuerpo o uno de sus
fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con la Reivindicación 1
o una composición de acuerdo con la Reivindicación 9 o 10 en la
fabricación de una composición para prevenir o inhibir la unión de
IL-5 a un receptor de IL-5.
21. El uso de un anticuerpo o uno de sus
fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con la Reivindicación 1
o una composición de acuerdo con la Reivindicación 9 o 10 en la
fabricación de una composición para prevenir o inhibir la
fosforilación de tirosina mediada por el receptor de
IL-5.
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