MX2014008456A - Acidos nucleicos que enlazan especificamente a cgrp. - Google Patents

Acidos nucleicos que enlazan especificamente a cgrp.

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Christian Maasch
Sven Klussmann
Simone Schülzchen
Werner Purschke
Florian Jarosch
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Abstract

La presente se refiere a una molécula de ácido nucleico con la capacidad de enlazar a CGRP, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una extensión central de nucleótidos, en donde la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' HWn1n2YGGAn3An4UMn5n6Yn7n8n9n10n11 Kn12 Rn13ADn14 n14n15AGn16Un17Cn18n19Un20n21 3' [SEQ ID NO: 99], en donde H, W, Y, G, A, U, M, B, K, R, D, C son ribonucleótidos, y n1 es R o dG, n2 es U o dT,n3 es K o dG,n4 es C o dC,n5 es M o dC,n6 es B o dU,n7 es N o dG, n8 es Y o dT, n9 es N o dC, n10 es R o dG, n11 es V o dA,n12 es K o dT o dU,n13 es G o dG,n14 es A o dA,n15 es U o dT, n16 es R o dG, n17 es Y o dC, n18 es C o dC, n19 es B o dC, n20 es C o dC, n21 es C o dC, y dG, dT, dC, dA y dU son 2'- desoxirribonucleótidos.

Description

ÁCIDOS NUCLEICOS QUE ENLAZAN ESPECÍFICAMENTE A CGRP Campo de la Invención La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico con la capacidad de enlazar a un péptido relacionado con gen de calcitonina (abreviatura CGRP), al uso de la misma para la fabricación de un medicamento, un agente de diagnóstico y un agente de detección, respectivamente, a una composición que comprende la molécula de ácido nucleico, un complejo que comprende la molécula de ácido nucleico, un método para clasificar un antagonista de una actividad transmitida por CGRP utilizando la molécula de ácido nucleico, y un método para la detección de la molécula de ácido nucleico.
Antecedentes de la Invención Alfa-CGRP es un neuropéptido de 37 aminoácidos que es generado por la división alternativa de la transcripción del gen de calcitonina (Amara, Joñas et al. 1982). CGRP se expresa predominantemente en el sistema nervioso periférico y central (van Rossum, Hanisch et al. 1997). Aunque se han descrito diversas funciones para CGRP, sus acciones más conocidas in vivo son vasodilatación dural y transmisión de nocicepción (Edvinsson and Ho 2010). La estructura para CGRP humano se determinó en parte mediante 1H-RMN. El péptido comprende un circuito enlazado por disulfuro de terminal amino definido (residuos 2-7) en una alfa hélice bien definida (residuos 8 y 18). La parte C-terminal del péptido no tiene una estructura claramente definida (Breeze, Harvey et al. 1991).
Beta-CGRP es un péptido con alta homología para alfa-CGRP (CGRP alfa y beta humano sólo difiere en 3 de los 37 aminoácidos, es decir, el 95% de aminoácidos idénticos) que aún es transcrito por un gen separado. Ambos péptidos son expresados en distintas ubicaciones anatómicas pero muestran acciones biológicas similares (Edvinsson and Ho 2010). Otros péptidos que muestran la homología de secuencia para alfa-CGRP humano son amilina humana (15 de 37 = 41% de aminoácidos idénticos con alfa-CGRP humano), calcitonina (7 de 37 = 19% idénticos), adrenomedulina (7 de 37 = 19% idénticos) e intermedina (7 de 37 = 19% idénticos) (ver figura 8A).
El receptor celular para CGRP en un heterodímero del receptor tipo calcitonina del receptor acoplado por proteína G (abreviatura CLR) y una proteína de transmembrana pequeña, llamada proteína 1 de modificación de actividad de receptor (abreviatura RAMPI). Dos RAMPs, es decir RAMP2 y RAMP3, han sido clonados de modo que puedan formar heterod ¡meros con CLR y determinar la selectividad para otros miembros de la familia de péptidos de calcitonina. Por ejemplo, CLR y RAMP2 forman un receptor selectivo para adrenomedulina (McLatchie, Fraser et al. 1998). Los datos estructurales confirmaron que CLR y RAMP1, juntos forman una cavidad de enlace para CGRP y que los antagonistas de receptor CGRP clínicamente efectivos bloquean esta grieta de enlace (Raddant and Russo 2011). El enlace de CGRP a su receptor da como resultado niveles intracelulares de cAMP incrementados.
Aunque varias funciones han sido descritas para CGRP, sus acciones mejor conocidas in vivo son vasodilatación dural y transmisión de nocicepción (Edvinsson and Ho 2010). De hecho, CGRP se utiliza ampliamente como un marcador para fibras nerviosas nociceptivas.
En países occidentales, aproximadamente el 10% de la población adulta se ven afectados por migraña con mayor incidencia en mujeres. La migraña es una enfermedad debilitante caracterizada por dolores de cabeza intensos recurrentes asociados con náusea, vómito, o fotofobia o fonofobia. Aproximadamente en el 15% de los pacientes, el dolor de cabeza está precedido por síntomas neurológicos, normalmente visuales. Este tipo de migraña es definida como migraña con aura (Goadsby 2003).
Las opciones de tratamiento actuales incluyen analgésicos estándar (principalmente fármacos antiinflamatorios no esteroidales (abreviatura NSAIDs) tal como ácido acetilsalicílico, paracetamol, ibuprofeno e inhibidores de COX-2) y dos clases de analgésicos específicos de migraña: derivados alcaloides de ergot de vasoconstricción (por ejemplo dihidroergotamina) y triptanos, agonistas de receptor 5-HT1B/ID (por ejemplo Sumatriptan). Aunque estos fármacos son altamente eficientes para muchos pacientes, no todos los pacientes con migraña pueden ser tratados adecuadamente con fármacos actualmente disponibles, impulsando la necesidad de opciones terapéuticas novedosas (Monteith and Goadsby 2011).
Varias líneas de evidencia sugieren un papel central para CGRP en patología de la migraña. La vasodilatación de los vasos cerebrales se considera un mecanismo crucial para el desarrollo de dolor de cabeza en migraña. CGRP es conocido como un vasodilatador potente, y mostró que la estimulación del ganglio trigeminal da como resultado la liberación de CGRP de las terminales nerviosas trigeminales, y la subsecuente vasodilatación que es transmitida a través de los receptores CGRP que residen en el músculo liso vascular (Limmroth, Katsarava et al. 2001). Además, se elevaron los niveles de CGRP en plasma en pacientes durante ataques de migraña (Goadsby, Edvinsson et al. 1990; Gallai, Sarchielli et al. 1995; Juhasz, Zsombok et al. 2003), aunque otros estudios no tuvieron la capacidad de comprobar esto (Tvedskov, Lipka et al. 2005). En migraña pediátrica, se ha sugerido una fuente extracefálica de CGRP (Tfelt-Hansen and Ashina 2010). En forma notable, la infusión de CGRP induce dolor de cabeza tipo migraña en pacientes con migraña, pero no en individuos saludables, lo que sugiere una sensibilidad incrementada en personas con migraña CGRP (Lassen, Haderslev et al. 2002). Además existe evidencia de que CGRP está implicado en dolores de cabeza diferentes a la migraña, tal como cefalea en racimos, hemicrania paroxismal, dolor de cabeza cervicogénico y dolor de cabeza por diálisis (Frese, Schilgen et al. 2005; Alessandri, Massanti et al. 2006; Tfelt-Hansen and Le 2009; Summ, Andreou et al. 2010). Por ejemplo, los niveles de CGRP en plasma se elevan durante los ataques de cefalea en racimos que se normalizan después de tratamiento con analgésicos (Goadsby and Edvinsson 1994; Tfelt-Hansen and Le 2009).
Existe una evidencia creciente de que CGRP está implicado en otros mecanismos además de vasodilatación, lo que contribuye a la patof isiolog ía de migraña. La inflamación neurogénica es un tipo estéril de inflamación que resulta de la activación de nervios sensoriales y está caracterizada por vasodilatación, extra asación de proteína en plasma y liberación de transmisores proinflamatorios de mastocitos residentes. La liberación perivascular de CGRP de las terminales nerviosas trigeminales puede activar dichos eventos inflamatorios, estimulando los mastocitos que residen en la dura y las células gliales satelitales (Ottosson and Edvinsson 1997; Raddant and Russo 2011). Además, CGRP puede impactar directamente en la transmisión sináptica de nocicepción, que da como resultado sensibilidad incrementada a la entrada sensorial tal como se observa durante la foto y fonofobia asociada con migraña (Ho, Edvinsson et al. 2010).
La importancia de CGRP en migraña se ve acentuada por observaciones de que la administración de fármacos antimigraña, tal como dihidroergotamina o sumatriptan tienen la capacidad de reducir los niveles de CGRP (Limmrofh, Katsarava et al. 2001; Stepien, Jagustyn et al. 2003). El fragmento de péptido CGRP(8-37) antagoniza la función de CGRP bloqueando su receptor. CGRP(8-37) se utilizó con éxito en una variedad de modelos de migraña y dolor, pero su uso está limitado debido a una deficiente bioestabilidad. Se han desarrollado diversos antagonistas de receptor CGRP de molécula pequeña no peptídicos. Olcegepant (Bl BN4096BS), un antagonista de receptor CGRP formulado en forma intravenosa, fue efectivo para tratar ataques agudos de migraña (Olesen, Diener et al. 2004). A pesar de estos resultados prometedores, su desarrollo se detuvo probablemente debido a la carencia de disponibilidad oral. Un compuesto de Olcegepant de seguimiento oralmente disponible, BI-44370 TA, mostró recientemente una eficacia dependiente de la dosis en una prueba fase II para migraña aguda (Diener, Barbanti et al. 2011). Telcagepant (MK-0974) es un antagonista de receptor CGRP oralmente disponible desarrollado para el tratamiento potencial de migraña. Mostró eficacia en pruebas clínicas fase III para migraña aguda (Ho, Ferrari et al. 2008; Connor, Shapiro et al. 2009), aunque su desarrollo fue discontinuado recientemente, debido presuntamente a los signos de toxicidad en hígado por una prueba clínica de profilaxis (Raddant and Russo 2011). BMS-927711 se desarrolló actualmente para el tratamiento potencial en cápsulas orales de migraña en una prueba clínica fase II. Los anticuerpos monoclonales anti-CGRP inhibieron efectivamente la vasodilatación neurogénica (Tan, Brown et al. 1995; Zeller, Poulsen et al. 2008). Dos anticuerpos monoclonales que dirigen CGRP están siendo desarrollados actualmente. Ambos anticuerpos están actualmente en pruebas clínicas fase I para el tratamiento potencial de migraña. Sin embargo, debido a su inmunogenicidad potencial, estos y otros anticuerpos pueden no ser una opción viable para el tratamiento a largo plazo de migraña.
Esencialmente, los intentos para una intervención terapéutica a través de la disminución de los niveles/actividad de CGRP, han producido una cantidad de resultados que soportan el concepto del antagonismo de CGRP como un tratamiento potencial de migraña, pero no conduce a compuestos con suficiente potencia o suficiente perfil de seguridad.
Hemos descrito previamente Espiegélmeros que enlazan a CGRP de rata, y, con menor afinidad, CGRP de humano (Vater, Jarosch et al. 2003). En modelos animales, estos Espiegélmeros inhibieron efectivamente la vasodilatación inducida por CGRP (Edvinsson, Nilsson et al. 2007; Juhl, Edvinsson et al. 2007), evitó incrementos en el flujo de sangre arterial meningeal después de estimulación eléctrica (Denekas, Troltzsch et al. 2006), y eliminó la hipersensibilidad a calor nocivo relacionada con la deformación (Mogil, Miermeister et al. 2005).
La amilina o polipéptido amiloide de isleto (abreviatura IAPP) es una hormona de péptido de 37 aminoácidos que muestra el 41% de residuos de aminoácido idénticos a a-CGRP en humanos. La amilina se segrega junto con insulina de las células ß de isletos de Langerhans. Contribuye a controlar los niveles de azúcar en sangre, disminuyendo el vaciado gástrico, la inhibición de secreción digestiva y la reducción resultante en ingesta de alimentos. Además, origina un sentimiento de saciedad y sed, aparentemente a través de la interacción con el sistema nervioso central (Field, Chaudhri et al. 2010). De acuerdo con esto, la inyección de amilina da como resultado una ingesta de alimentos reducida en ratas (Lutz, Del Prete et al. 1994; Morley, Flood et al. 1994). Debido a este efecto anoréxico, la inhibición de amilina puede conducir a una ingesta incrementada de alimentos y obesidad (Lutz 2006). Como una reacción cruzada consecuente de los Espiegélmeros de enlace CGRP a amilina, es un obstáculo importante para el tratamiento potencial de migraña.
Breve Descripción de la Invención El problema que subyace la presente invención, es proporcionar un medio el cual enlaza específicamente a CGRP humano, preferentemente alfa-CGRP humano, sin interactuar con amilina, preferentemente amilina humana y que antagonice con una actividad transmitida por CGRP, preferentemente alfa-CGRP humano, en donde el medio es adecuado para la prevención y/o tratamiento de enfermedades y condiciones tales como migraña, dolor agudo y crónico o tolerancia a analgesia a base de morfina.
Estos y otros problemas que subyacen la presente invención se resuelven a través del asunto materia de las reivindicaciones independientes adjuntas. Las modalidades preferidas pueden tomarse de las reivindicaciones dependientes.
El problema que subyace la presente invención se soluciona en un primer aspecto, el cual también es la primera modalidad del primer aspecto, a través de una molécula de ácido nucleico con la capacidad de enlazar a CGRP, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una extensión central de nucleótidos, en donde la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5" HWn1n2YGGAn3An4UMn5n6Yn7n8n9n1on11Kn12Rn 3ADni4ni5ARn 6U n17Cn18n19Un2on2i 3' [SEQ ID NO: 99], en donde H, W, Y, G, A, U, M, B, K, R, D, C son ribonucleótidos, y ?·, es R o dG, n2 es U o dT, n3 es K o dG, n4 es C o dC, n5 es M o dC, n6 es B o dU, n7 es N o dG, n8 es Y o dT, n9 es N o dC, n10 es R o dG, nn es V o dA, n12 es K o dT o dU, n13 es G o dG, n14 es A o dA, n15 es U o dT, n16 es R o dG, n17 es Y o dC, n18 es C o dC, n19 es B o dC, n20 es C o dC, n2i es C o dC, y dG, dT, dC, dA y dU son 2'-desoxirribonucleótidos.
En una segunda modalidad del primer aspecto la cual también en una modalidad de la primera modalidad del primer aspecto, la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUn1n2YGGAn3An4UMn5n6Bn7n8n9n1on11Kn12An13ADn14n15AGn16U n17Cn18n19Un2on21 3' [SEO. ID NO: 100] en donde C, U, Y, G, A, M, B, Y, H, K, D, R y V son ribonucleótidos, y ni es G o dG, n2 es U o dT, n3 es G o dG, n4 es C o dC, n5 es M o dC, n6 es B o dU, n7 es D o dG, n8 es Y o dT, n9 es H o dC, n10 es R o dG, n1 n es V o dA, n 2 es K o dT o dU, n13 es G o dG, n14 es A o dA, n15 es U o dT, n16 es G o dG, n17 es Y o dC, n18 es C o dC, n19 es C o dC, n20 es C o dC, n21 es C o dC, y dG, dT, dC, dA y dU son 2'-desoxirribonucleótidos.
En una tercera modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera y segunda modalidad del primer aspecto, la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUn1n2CGGAn3An4UAn5n6Cn7n8n9n1on1 !Gn^An!sAAn^riTsAGn!eU n17Cn18n19Un20n21 3' [SEO. ID NO: 101] en donde C, U, Y, G, A, H y R son ribonucleótidos, y n, es G o dG, n2 es U o dT, n3 es G o dG, n4 es C o dC, n5 es C o dC, n6 es U o dU, n7 es R o dG, n8 es Y o dT, n9 es H o dC, n 0 es G o dG, n es R o dA, n12 es U o dT o dU, n13 es G o dG, n14 es A o dA, n15 es U o dT, n16 es G o dG, n17 es C o dC, n18 es C o dC, n19 es C o dC, n2o es C o dC, n2i es C o dC, y dG, dT, dC, dA y dU son 2'-desoxirribonucleótidos.
En una cuarta modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda y tercera modalidad del primer aspecto, la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUn1n2CGGAn3An4UAn5n6Cn7n8n9n1on11Gn12An13AAn14n15AGn16U n17Cn18n19Un2on21 3" [SEQ ID NO: 102] en donde C, U, G, A, son ribonucleótidos, y n, es G o dG, n2 es U o dT, n3 es G o dG, n4 es C o dC, n5 es C o dC, n6 es U o dU, n7 es G o dG, n8 es U o dT, n9 es C o dC, n10 es G o dG, ?·,·, es A o dA, n12 es U o dT o dU, n13 es G o dG, n14 es A o dA, n15 es U o dT, n16 es G o dG, n17 es C o dC, ni8 es C o dC, n19 es C o dC, n20 es C o dC, n2i es C o dC, y dG, dT, dC, dA y dU son 2'-desoxirribonucleótidos.
En una quinta modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera y cuarta modalidad del primer aspecto, la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo de (1) 5' CUdGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 103], (2) 5' C UGcTTCGGAGACU ACUCGUCGAGUAG AAAUAGGUCCCC UCC 3' [SEQ ID NO: 104], (3) 5' CUGUCGGAdGACU ACUCGUCGAGUAG AAAUAGGUCCCC UCC 3' [SEQ ID NO: 105], (4) 5' CUGUCGGAGAdCU ACUCGUCGAGUAG AAAUAGGUCCCC UCC 3' [SEQ ID NO: 106], (5) 5' CUGUCGGAGACUAdCUCGUCGAGUAG AAAUAGGUCCCC UCC 3' [SEQ ID NO: 107], (6) 5' CUGUCGGAGACUACUCdGUCGAGUAG AAAUAGGUCCCC UCC 3' [SEQ ID NO: 108], (7) 5· CUGUCGGAGACUACUCGdTCGAGUAG AAAUAGGUCCCC UCC 3' [SEQ ID NO: 109], (8) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUdCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 110], (9) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCdGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 111], (10) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGdAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 112], (11) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGdTAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 113], (12) 5" CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAdGAAAUAGGUCCCCUCC 3" [SEQ ID NO: 114] (13) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAdAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 115] (14) 5· CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAdTAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 116], (15) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGdGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 117], (16) 5* CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUdCCCCUCC 3 [SEQ ID NO: 118], (17) 5 CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdCCUCC 3 [SEQ ID NO: 119], (18) 5 CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCdCUCC 3 [SEQ ID NO: 120], (19) 5 CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUdCC3' [SEQ ID NO: 121], (20) 5 CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCdC. 3 [SEQ ID NO: 122], (21) 5 CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdCCUdCC 3' [SEQ ID NO: 123], (22) 5 CUGUCGGAGACUACdUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdCCUCC 3' [SEQ ID NO: 130], (23) 5 CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGdUAGAAAUAGGUCCdCCUCC 3' [SEQ ID NO: 131], (24) 5 CUGUCGGAGACUACdUCGUCGAGdUAGAAAUAGGUCCdCCUCC 3' [SEQ ID NO: 132], (25) 5' CUGUCGGAGACUACdUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdCCUdCC 3' [SEQ ID NO: 133], (26) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGdUAGAAAUAGGUCCdCCUdCC 3' [SEQ ID NO: 134], (27) 5' CUGUCGGAGACUACdJJCGUCGAGdU.AGAAAUAGGUCCdC.CUdC. C 3' [SEQ ID NO: 90], en donde C, U, G, A, son ribonucleótidos, y dG, dT, dC, dA y dU son 2'-desoxirribonucleótidos.
En una sexta modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta modalidad del primer aspecto, la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5* CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdCCUCC 3' [SEQ ID NO: 119] o 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdCCUdCC 3' [SEQ ID NO: 123) o 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGdU.AGAAAUAGGUCCdC.CUCC 3" [SEQ ID NO: 131].
En una séptima modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera y cuarta modalidad del primer aspecto, la extensión central de nucleótidos consiste de ribonucleótidos y 2'-desoxirribonucleótidos.
En una octava modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera y cuarta modalidad del primer aspecto, la extensión central de nucleótidos consiste en 2'-ribonucleótidos.
En una novena modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima y octava modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende una dirección 5'->3', una primera extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos y la segunda extensión terminal de nucleótidos, en donde la primera extensión terminal de nucleótidos comprende de cuatro a siete nucleótidos, y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende de cuatro a siete nucleótidos, preferentemente la primera extensión terminal de nucleótidos, comprende de cinco a siete nucleótidos, y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende de cinco a siete nucleótidos.
En una décima modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la novena modalidad del primer aspecto, la primera extensión terminal de nucleótidos comprende cinco nucleótidos, y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende cinco nucleótidos.
En una decimoprimera modalidad del primer aspecto, la cual también es una modalidad de la novena y décima modalidad del primer aspecto, la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' Z^Z2 ZSZ4\NZ5 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' ZeZyZg gZi oZi 1 Z-i 2 3', en donde S, W, V, B y K son ribonucleótidos, y ? es S o está ausente, Z2 es V o está ausente, Z3 es B o está ausente, Z4 es V o dG, Z5 es G o dG, Z6 es Y o dC, Z7 es W o dA, Z8 es B o dC, Z9 es S o dG, Z10 es S o dG o está ausente, Zn es B o está ausente, Z12 es K o está ausente, y dG, dC y dA son 2'-desoxirribonucleótidos.
En una decimosegunda modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la decimoprimera modalidad del primer aspecto, a) ?? es S, Z2 es V, Z3 es B, Z10 es S o dG, Z1 ( es B, Z12 es ; b) ?? está ausente, Z2 es V, Z3 es B, Z10 es S o dG, Z^ es B, Zi2 es K; c) Zi es S, Z2 es V, Z3 es B, Zi0 es S o dG, Z es B, Z12 está ausente; d) Z está ausente, Z2 es V, Z3 es B, Z10 es S o dG, Z es B, Z12 está ausente; e) ?? está ausente, Z2 está ausente, Z3 es B, Z10 es S o dG, Zn es B, Z12 está ausente; f) ?i está ausente, Z2 es V, Z3 es B, Z10 es S o dG, Z está ausente, Z12 está ausente; g) Z-i está ausente, Z2 está ausente, Z3 es B, Z 0 es S o dG, Z está ausente, Z12 está ausente; h) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z10 es S o dG, Z está ausente, Z12 está ausente; i) ?? está ausente, Z2 está ausente, Z3 es B, Z10 está ausente, Z está ausente, Z12 está ausente; o j) ZT está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, ? 0 está ausente, Zn está ausente, Zi2 está ausente.
En una 13° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la novena, decimoprimera y decimoseg unda modalidad del primer aspecto, la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGGUG 3'; o la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GGCCGUG 3* y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGGCU 3'; o la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GUCAUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGGC 3'; o la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCCAUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CAUGGC 3'; o la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGGC 3'; o la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGGG 3'.
En una 14° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la novena, décima, decimoprimera y decimosegunda modalidad del primer aspecto, la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCZ4UZ5 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' ZeZyZaZgZio 3', o en donde C, G, A y U son ribonucleótidos, y Z4 es G o dG, Z5 es G o dG, Z6 es C o dC, Z7 es A o dA, Z8 es C o dC, Z9 es G o dG, Z10 es G o dG, dC, dG y dA son 2'-desoxirribonucleótidos.
En una 15° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la novena, décima, decimoprimera, decimosegunda y decimocuarta modalidad del primer aspecto, a) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGG 3'; o b) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCdGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGG 3'; o c) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUdG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGG 3'; o d) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5* dCACGG 3'; o e) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CdACGG 3'; o f) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CAdCGG 3'; o g) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACdGG 3'; o h) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGdG 3'; en donde preferentemente la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGG 3'.
En una 16° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la novena, décima, decimoprimera, decimosegunda y decimocuarta modalidad del primer aspecto, a) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGC 3'; o b) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GGGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACCC 3'; o c) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCCUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CAGGC 3'.
En una 17° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la novena, decimoprimera y decimosegunda modalidad del primer aspecto, la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACG 3*; o la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' UACG 3'; o la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCAG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUGC 3'.
En una 18° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16° y 17° modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88, o una molécula de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos el 85% con la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88, o una molécula de ácido nucleico que es homóloga a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88, en donde la homología es de al menos el 85%.
En una 19° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda 13°, 14°, 15°, 16° y 17° modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 124 y SEQ ID NO: 078 o una molécula de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos el 85% con la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 124 y SEQ ID NO: 078, o una molécula de ácido nucleico que es homologa a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 124 y SEQ ID NO: 078, en donde la homología es de al menos el 85%.
En una 20° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19° y 20° modalidad del primer aspecto, los nucleótidos de, o los nucleótidos que forman la molécula de ácido nucleico son L-nucleótidos.
En una 21° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18° y 19° modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido L-nucleico.
En una 22° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20° y 21° modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende al menos una porción de enlace que tiene la capacidad de enlazar CGRP, en donde dicha porción de enlace consiste en L-nucleótidos.
En una 23° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21° y 22° modalidad del primer aspecto, el ácido nucleico es un antagonista de una actividad transmitida por CGRP.
En una 24° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22° y 23° modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende un grupo de modificación, en donde el rango de excreción de la molécula de ácido nucleico que comprende el grupo de modificación de un organismo, se disminuye en comparación con un ácido nucleico que no comprende el grupo de modificación.
En una 25° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22° y 23° modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende un grupo de modificación, en donde la molécula de ácido nucleico que comprende el grupo de modificación tiene un tiempo de retención incrementado en un organismo en comparación con una molécula de ácido nucleico que no comprende el grupo de modificación.
En una 26° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la 24° y 25° modalidad del primer aspecto, el grupo de modificación se selecciona del grupo que comprende modificaciones biodegradable y no biodegradable, preferentemente el grupo de modificación se selecciona del grupo que comprende polietilenglicol, polietilenglicol lineal, polietilenglicol ramificado, almidón de hidroxietilo, un péptido, una proteína, un polisacárido, un esterol, un polioxipr pileno, polioxiamidato y poli(2-hidroxietil)-L-glutamina.
En una 27° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la vigesimosexta modalidad del primer aspecto, el grupo de modificación es un polietilenglicol, que consiste preferentemente en un polietilenglicol lineal o un polietilenglicol ramificado, en donde el peso molecular del polietilenglicol es preferentemente de aproximadamente 20,000 hasta aproximadamente 120,000 Da, más preferentemente de aproximadamente 30,000 hasta aproximadamente 80,000 Da y más preferentemente aproximadamente 40,000 Da.
En una 28° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la vigesimosexta modalidad del primer aspecto, el grupo de modificación es almidón de hidroxietilo, en donde preferentemente el peso molecular de almidón de hidroxietilo es de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 1000 kDa, más preferentemente de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 700 kDa y más preferentemente de aproximadamente 200 hasta aproximadamente 500 kDa.
En una 29° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la 24°, 25°, 26°, 27° y 28° modalidad del primer aspecto, el grupo de modificación se acopla a la molécula de ácido nucleico a través de un enlazador, mediante lo cual preferentemente el enlazador es un enlazador biodegradable.
En una 30° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la 24°, 25°, 26°, 27° y 28° modalidad del primer aspecto, el grupo de modificación se acopla al nucleótido 5'-terminal y/o el nucleótido 3'-terminal de la molécula de ácido nucleico y/o a un nucleótido de la molécula de ácido nucleico entre el nucleótido 5'-terminal de la molécula de ácido nucleico y el nucleótido 3'-terminal de la molécula de ácido nucleico.
En una 31° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la 24°, 25°, 26°, 27° 28°, 29° y 30° modalidad del primer aspecto, el organismo es el cuerpo de un animal o humano, preferentemente un cuerpo humano.
Un problema subyacente de la presente invención se resuelve en un segundo aspecto, el cual también es la primera modalidad del segundo aspecto, a través de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto, para utilizarse en un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.
En una segunda modalidad del segundo aspecto el cual también es una modalidad de la primera modalidad del segundo aspecto, la enfermedad se selecciona del grupo que comprende migraña, diferentes formas de dolor de cabeza, dolor agudo, dolor crónico, tolerancia a analgesia con base en morfina, osteoartritis, angiogénesis, enfermedades autoinmune, enfermedades inflamatorias y de crecimiento de tumor, mediante lo cual preferentemente el dolor agudo y el dolor crónico es de origen inflamatorio y/o neuropático.
El problema que subyace la presente invención se resuelve en un tercer aspecto, el cual también es la primera modalidad del tercer aspecto, a través de una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto, y opcionalmente un constituyente adicional, en donde el constituyente adicional se selecciona del grupo que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable, un transportador farmacéuticamente aceptable y un agente farmacéuticamente activo.
En una segunda modalidad del tercer aspecto el cual también es una modalidad de la primera modalidad del tercer aspecto, la composición farmacéutica comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto y un transportador farmacéuticamente aceptable.
El problema que subyace la presente invención se resuelve en un cuarto aspecto, el cual también es la primera modalidad del cuarto aspecto, a través del uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto para la fabricación de un medicamento.
En una segunda modalidad del cuarto aspecto el cual también es una modalidad de la primera modalidad del cuarto aspecto, el medicamento es para utilizarse en medicina humana o para utilizarse en medicina veterinaria.
En una tercera modalidad del cuarto aspecto el cual también es una modalidad de la primera y segunda modalidad del cuarto aspecto, el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de migraña, diferentes formas de dolor de cabeza, dolor agudo, dolor crónico, tolerancia a analgesia con base en morfina, osteoartritis, angiogénesis, enfermedades autoinmune, enfermedades inflamatorias y de crecimiento de tumor mediante lo cual preferentemente el dolor agudo y el dolor crónico es de origen inflamatorio y/o neuropático.
El problema que subyace la presente invención se resuelve en un quinto aspecto, el cual también es la primera modalidad del quinto aspecto a través del uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto, para la fabricación de un medio de diagnóstico.
El problema que subyace la presente invención se resuelve en un sexto aspecto, el cual también es la primera modalidad del sexto aspecto, a través de un complejo que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera , decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto y CGRP, en donde preferentemente el complejo es un complejo cristalino.
El problema que subyace la presente invención se resuelve en un séptimo aspecto, el cual también es la primera modalidad del séptimo aspecto a través del uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28*, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto para la detección de CGRP.
El problema que subyace la presente invención se resuelve en un octavo aspecto, el cual también es la primera modalidad del octavo aspecto a través de un método para clasificar un antagonista de una actividad transmitida por CGRP, en donde el método comprende los siguientes pasos: - proporcionar un antagonista candidato de la actividad transmitida por CGRP, - proporcionar una molécula de ácido nucleico de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto, - proporcionar un sistema de prueba que proporciona una señal en la presencia de un antagonista de la actividad transmitida por CGRP, y - determinar si el antagonista candidato de la actividad transmitida por CGRP es un antagonista de la actividad transmitida por CGRP.
El problema que subyace la presente invención se resuelve en un noveno aspecto, el cual también es la primera modalidad del noveno aspecto, a través de un equipo para la detección de CGRP, en donde el equipo comprende molécula de ácido nucleico de acuerdo con la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda , 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto y al menos un folleto de instrucción o un envase de reacción.
El problema que subyace la presente invención se resuelve en un décimo aspecto, el cual también es la primera modalidad del décimo aspecto, a través de un método para la detección de una molécula de ácido nucleico de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto en una muestra, en donde el método comprende los pasos de: a) proporcionar una sonda de captura, en donde la sonda de captura es al menos parcialmente complementaria a una primera parte de la molécula de ácido nucleico de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto, y una sonda de detección, en donde la sonda de detección es al menos parcialmente complementaria con una segunda parte de la molécula de ácido nucleico de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto, o alternativamente, la sonda de captura es al menos parcialmente complementaria a la segunda parte de la molécula de ácido nucleico de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto y la sonda de detección es al menos parcialmente complementaria a la primera parte de la molécula de ácido nucleico de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto; b) agregar una sonda de captura y la sonda de detección por separado o en forma combinada a una muestra que contiene la molécula de ácido nucleico o se presume contiene la molécula de ácido nucleico de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto; c) permitir que la sonda de captura y la sonda de detección reaccionen ya sea en forma simultánea o en cualquier orden en secuencias con la molécula de ácido nucleico de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto o una parte de la misma; d) detectar opcionalmente si la sonda de captura híbrida o no para la molécula de ácido nucleico de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto proporcionada en el paso a); y e) detectar un complejo formado en el paso c) que consiste en la molécula de ácido nucleico de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera , decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto y la sonda de captura y la sonda de detección.
En una segunda modalidad del décimo aspecto el cual también es una modalidad de la primera modalidad del décimo aspecto, la sonda de detección comprende un medio de detección y/o en donde la sonda de captura es inmovilizada a un soporte, preferentemente un soporte sólido.
En una tercera modalidad del décimo aspecto el cual también es una modalidad de la primera y segunda modalidad del décimo aspecto, cualquier sonda de detección que no es parte del complejo formado en el paso c) se elimina de la reacción de modo que en el paso e), únicamente se detecta una sonda de detección que es parte del complejo.
En una cuarta modalidad del décimo aspecto, el cual también es una modalidad de la primera, la segunda y la tercera modalidad del décimo aspecto, el paso e) comprende el paso de comparar la señal generada por el medio de detección, en donde la sonda de captura y la sonda de detección se hibridan en la presencia de una molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32 o una parte de las mismas, y en la ausencia de la molécula de ácido nucleico o parte de la misma.
En una 32° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30° y 31° modalidad del primer aspecto, y que también es una segunda modalidad del segundo aspecto que también es una modalidad de la primera modalidad del segundo aspecto, el CGRP es CGRP humano, CGRP de ratón, CGRP de rata o CGRP de macaca mulata, preferentemente CGRP es CGRP humano.
En una 33° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30°, 31° y 32° modalidad del primer aspecto, y que también es una tercera modalidad del segundo aspecto el cual también es una modalidad de la primera y segunda modalidad del segundo aspecto, el CGRP es a-CGRP o ß-CGRP, preferentemente a-CGRP de humano, a-CGRP de humano o a-CGRP de rata.
En una 34° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30°, 31°, 32° y 33° modalidad del primer aspecto, y que también es una cuarta modalidad del segundo aspecto que también es una modalidad de la primera, segunda y tercera modalidad del segundo aspecto, la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace con a-CGRP humana, expresada como KD de 10 nM o menos, preferentemente de 1 nM o menos, y más preferentemente de 100 pM o menos.
En una 35° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30°, 31°, 32°, 33° y 34° modalidad del primer aspecto, y que también es una quinta modalidad del segundo aspecto que también es una modalidad de la primera, segunda, tercera y cuarta modalidad del segundo aspecto, la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace con a-CGRP humana, expresada como IC50 de 10 nM o menos, preferentemente del nM o menos, y más preferentemente de 100 pM o menos.
En una 36° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30°, 31° , 32°, 33°, 34° y 35° modalidad del primer aspecto, y que también es una sexta modalidad del segundo aspecto que también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta modalidad del segundo aspecto, la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace con amilina humana, expresada como KD de 100 nM o más, preferentemente de 500 nM o más, y más preferentemente de 1000 nM o más.
En una 37° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30°, 31°, 32°, 33°, 34°, 35° y 36° modalidad del primer aspecto, y que también es una séptima modalidad del segundo aspecto que también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta y sexta modalidad del segundo aspecto, la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace con amilina humana, expresada como IC50 de 100 nM o más, preferentemente de 500 nM o más, y más preferentemente de 1000 nM o más.
En una 38° modalidad del primer aspecto el cual también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30°, 31° , 32°, 33°, 34°, 35°, 36° y 37° modalidad del primer aspecto, y que también es una octava modalidad del segundo aspecto que también es una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta y séptima modalidad del segundo aspecto, la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace con a-CGRP humana expresada como KD, de 10 nM o menos, preferentemente de 1 nM o menos, y más preferentemente de 100 pM o menos, en donde la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace con amilina humana, expresada como KD de 100 nM o más, preferentemente de 500 nM o más, y más preferentemente de 1000 nM o más, y/o la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace con a-CGRP humana expresada como IC50 de 10 nM o menos, preferentemente de 1 nM o menos, y más preferentemente de 100 pM o menos, en donde la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace con amilina humana expresada como IC50 de 100 nM o más, preferentemente de 500 nM o más, y más preferentemente de 1000 nM o más.
Sin pretender limitarse a teoría alguna, los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se enlaza específicamente y con alta afinidad a CGRP, para inhibir de esta forma el enlace de CGRP a su receptor CGRP sin reaccionar en forma cruzada a amilina. Por consiguiente la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención tiene el potencial de ser utilizada para el tratamiento de trastornos y enfermedades relacionadas con CGRP, tal como trastornos relacionados con dolor, incluyendo migraña y otras enfermedades. Además, los inventores de la presente invención han descubierto que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es adecuada para bloquear la interacción de CGRP con el receptor CGRP. Por lo tanto, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es un antagonista de CGRP y/o un antagonista del sistema de receptor CGRP-CGRP.
Un antagonista para CGRP es una molécula que enlaza a CGRP - tal como la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención - y antagoniza una actividad transmitida por CGRP para el receptor CGRP en un ensayo in vitro tal como se describe en el Ejemplo 5. Una actividad transmitida por CGRP de acuerdo con la presente invención es la inducción de la producción de cAMP en células de neuroblastoma humano tal como se describe en el Ejemplo 5.
Como para diversas enfermedades, condiciones y trastornos que pueden ser tratadas o evitadas por el uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención o una composición, preferentemente una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, se ha reconocido que dichas enfermedades, condiciones y trastornos son las que aquí se describen, incluyendo y en particular aquellas que se describen y establecen en la parte de introducción de la presente solicitud. Por lo tanto, los pasajes respectivos de la especificación y la parte introductoria de la especificación, forman una parte integral de la presente invención, que enseña la capacidad de adecuación de la molécula de ácido nucleico de la presente invención para la prevención y tratamiento, respectivamente, de las enfermedades, condiciones y trastornos.
Tal como se utiliza en la presente invención, el término CGRP se refiere a cualquier CGRP que incluye pero no se limita a CGRP de mamífero. Preferentemente, el CGRP de mamífero se selecciona del grupo que comprende CGRP de humano, CGRP de mono, CGRP de rata, CGRP de ratón, CGRP de cerdo, CGRP de oveja, CGRP de perro. Más preferentemente el CGRP es CGRP de humano. Tal como se define en la presente invención, el término CGRP se refiere a aCGRP y ß-CGRP. Preferentemente, a-CGRP se selecciona del grupo que comprende a-CGRP humano, a-CGRP de mono, a-CGRP de rata, a-CGRP de ratón, a-CGRP de cerdo, a-CGRP de oveja, a-CGRP de perro. Más preferentemente el a-CGRP es a-CGRP humano.
La alineación de secuencia (ver figura 8B) demuestra los siguientes porcentajes de aminoácidos idénticos de a-CGRP humano con un a-CGRP de: • Macaca mulatta (mono rhesus) 100% • Rattus norvegicus (rata) 89% • Mus musculus (ratón) 89% · Sus scrofa (cerdo) 86% • Ovis aries (oveja) 89% • Canis familiaris (perro) 92% Tal como se utiliza en la presente invención, el término receptor CGRP se refiere a cualquier proteína de superficie celular que transmite una señal CGRP a las células, mediante la inducción de un evento de transducción de señal. Los receptores CGRP incluyen pero no se limitan a receptores CGRP de mamífero. Preferentemente, el receptor CGRP de mamífero se selecciona del grupo que comprende receptor CGRP humano, receptor CGRP de mono, receptor CGRP de rata, receptor CGRP de ratón, receptor CGRP de cerdo, receptor CGRP de oveja, receptor CGRP de perro. Más preferentemente el receptor CGRP es el receptor CGRP humano.
Además, se prefiere una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención si el efecto fisiológico del eje de receptor CGRP - CGRP se relaciona con mayores niveles en plasma de CGRP.
Como una consecuencia de una alta homología de secuencia entre CGRP y amilina (ver alineación de figura 9), los Espielgémeros de enlace CGRP previamente identificados (ver Publicación de Patente WO2003/04372) mostraron reactividad cruzada con amilina (ejemplo 7, figura 10). Por lo tanto, la presente invención está basada en el hallazgo sorprendente de que es posible generar una molécula de ácido nucleico que enlaza con alta afinidad a CGRP humano, para inhibir y antagonizar de esta forma los efectos de CGRP, en particular los efectos de CGRP en su receptor, y que es altamente específico en términos de enlace a CGRP humano, mientras no se muestra reactividad cruzada con amilina humana.
Está dentro de la presente invención que el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención sea una molécula de ácido nucleico. Por lo tanto, los términos ácido nucleico y molécula de ácido nucleico se utilizan en la presente invención enforma de sinónimo si no se indica lo contrario. Además, dicho ácido(s) nucleico es/son referidos también en la presente invención como la molécula(s) de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el ácido(s) nucleico de acuerdo con la presente invención, el ácido(s) nucleico de la invención o la molécula(s) de ácido nucleico de la invención.
Las características del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención tal como aquí se describen, pueden materializarse en cualquier aspecto de la presente invención, en donde se utiliza el ácido nucleico, ya sea sólo o en cualquier combinación.
Tal como se señala con mayor detalle en la presente invención, los inventores de la presente invención no han identificado un número de diferentes moléculas de moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP que enlazan específicamente a CGRP, en donde las moléculas de ácido nucleico pueden estar caracterizadas en términos de extensión de nucleótidos las cuales son referidas en la presente invención tal como se describe (ver Ejemplo 1).
Las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP de la presente invención comprende tres diferentes extensiones de nucleótidos: una primera extensión terminal de nucleótidos, una extensión central de nucleótidos y una segunda extensión terminal de nucleótidos. En general, una molécula de ácido nucleico de enlace CGRP de la presente invención comprende en el extremo 5' y en el extremo 3' cada una de las extensiones terminales de nucleótidos, es decir, la primera extensión terminal de nucleótidos y la segunda extensión terminal de nucleótidos (también referida como extensión 5'-terminal de nucleótidos y extensión 3'-terminal de nucleótidos). La primera extensión terminal de nucleótidos y la segunda extensión terminal de nucleótidos, pueden, en principio debido a su complementariedad base, hibridar entre sí, mediante lo cual al momento de la hibridación se forma una estructura de hebra doble. Sin embargo, dicha hibridación no es materializada necesariamente en la molécula bajo condiciones fisiológicas y/o no fisiológicas. Las tres extensiones de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de enlace CGRP de la presente invención - la primera extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos y la segunda extensión terminal de nucleótidos - se ajustan entre sí en la dirección 5' ? 3': la primera extensión terminal de nucleótidos - la extensión central de nucleótidos - la segunda extensión terminal de nucleótidos. Alternativamente, la segunda extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos y la primera extensión terminal de nucleótidos se ajustan entre sí en una dirección 5' ? 3'.
La longitud de la extensión central de nucleótidos de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención es preferentemente 40.
La longitud de la primera extensión terminal de los nucleótidos de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención es de entre cuatro y siete nucleótidos, preferentemente entre cinco y siete nucleótidos, más preferentemente cinco nucleótidos.
La longitud de la segunda extensión terminal de nucleótidos de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención es de entre cuatro y siete nucleótidos, preferentemente entre cinco y siete nucleótidos, más preferentemente cinco nucleótidos.
Las diferencias en las secuencias de los cuadros y extensiones definidas entre las diferentes moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP de la presente invención influencian la afinidad de enlace con CGRP. Con base en los análisis de enlace de las diferentes moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP de la presente invención, la extensión central de los nucleótidos que forman los mismos son individual y más preferentemente en su totalidad, esenciales para el enlace de las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP a CGRP.
El término "extensión" y "extensión de nucleótido" se utilizan en la presente invención en una forma sinónima si no se indica lo contrario.
En una modalidad preferida, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es una molécula de ácido nucleico simple. En una modalidad adicional, la molécula de ácido nucleico simple está presente como una pluralidad de moléculas de ácido nucleico simples o como una pluralidad de especies de molécula de ácido nucleico simple.
Será reconocido por los expertos en la técnica, que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, consiste preferentemente en nucleótidos que se enlazan covalentemente entre sí, preferentemente a través de enlaces o ligaduras de fosfodiéster.
Está dentro de la presente invención que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención que comprenden dos o más extensiones o partes de los mismos, en principio puedan hibridar entre sí. Al momento de dicha hibridación se forma una estructura de hebra doble. Es reconocido por los expertos en la técnica, que dicha hibridación puede o no ocurrir, particularmente bajo condiciones in vitro y/o in vivo. Asimismo, en el caso de dicha hibridación, no es necesariamente el caso que ocurra la hibridación en toda la longitud de las dos extensiones, en donde al menos con base en las reglas del emparejamiento base, dicha hibridación y por lo tanto la formación de una estructura de hebra doble, puede ocurrir en principio. Tal como se utiliza preferentemente en la presente invención, una estructura de hebra doble es parte de la molécula de ácido nucleico o una estructura formada por dos o más hebras separadas o dos extensiones espacialmente separadas de una sola hebra de una molécula de ácido nucleico, mediante lo cual existen al menos uno, preferentemente dos o más pares bases los cuales son un emparejamiento base, preferentemente de acuerdo con las reglas de emparejamiento base de Watson-Crick. También será reconocido por los expertos en la técnica, que puedan existir otros emparejamientos base tales como emparejamiento base de Hoogsten o que formen dicha estructura de hebra doble. También se reconoce que la característica de que las dos extensiones hibriden, indica preferentemente que dicha hibridación se asume que sucede debido a la complementariedad base de las dos extensiones sin importar si dicha hibridación ocurre realmente in vivo y/o in vitro. En relación con la presente invención, dichas extensiones son la primera extensión terminal de nucleótidos y la segunda extensión de nucleótidos las cuales, en una modalidad, pueden hibridar tal como se describió anteriormente.
En una modalidad preferida, el término ajuste, tal como se utiliza en la presente invención, significa el orden o secuencia de características o elementos estructurales o funcionales aquí descritos en relación con el ácido(s) nucleico de la invención aquí descrita.
Los expertos en la técnica reconocerán que el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención tiene la capacidad de enlazar a CGRP. Sin pretender limitarse a teoría alguna, los inventores de la presente invención asumen que el enlace de CGRP resulta de una combinación de tres rasgos o elementos estructurales dimensionales de la molécula de ácido nucleico de la presente invención, que se originan mediante la orientación y patrones de multiplicación de la secuencia primaria de nucleótidos que forma dichos rasgos o elementos, mediante lo cual preferentemente dichos rasgos y elementos son la primera extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos y la segunda extensión terminal de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP. Es evidente que el rasgo o elemento individual pueda ser formado a través de varias diferentes secuencias individuales cuyo grado de variación puede depender de la estructura tridimensional que dicho elemento o rasgo tiene que formar para transmitir el enlace de la molécula de ácido nucleico de la presente invención a CGRP. La característica de enlace general del ácido nucleico reivindicado resulta del juego interno de los diversos elementos y rasgos, respectivamente, lo cual finalmente da como resultado la interacción del ácido nucleico reivindicado con su objetivo, es decir CGRP. Nuevamente sin pretender limitarse a la teoría, dicha extensión central de nucleótidos que es característica de los ácidos nucleicos de enlace CGRP, es importante para transmitir el enlace de las moléculas de los ácidos nucleicos reivindicadas con CGRP. Por consiguiente, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención son adecuados para la interacción con CGRP. Asimismo, los expertos en la técnica reconocerán que el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es un antagonista para CGRP. Debido a esto el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es adecuado para el tratamiento y prevención, respectivamente, de cualquier enfermedad o condición que está asociada con u originada por CGRP. Dichas enfermedades y condiciones pueden tomarse de la técnica anterior, lo cual establece que CGRP está implicada o asociada con las enfermedades y condiciones, respectivamente, y que se incorporan en la presente invención como referencia proporcionando ia explicación científica para el uso terapéutico de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención.
La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención también debe comprender una molécula de ácido nucleico la cual es esencialmente homologa a las secuencias de nucleótidos particulares aquí descritas. El término "sustancialmente homologa" debe entenderse que es una homología de al menos 75%, preferentemente al menos 85%, más preferentemente al menos 90% y lo más preferentemente más que al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99%.
El porcentaje real de los nucleótidos homólogos presentes en la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención dependerá del número total de nucleótidos presentes en el ácido nucleico. El porcentaje de modificación se puede calcular con base en el número total de nucleótidos presentes en la molécula de ácido nucleico.
La homología entre las dos moléculas de ácido nucleico puede ser determinada como lo saben los expertos en la técnica. Más específicamente, se puede utilizar un algoritmo de comparación de secuencia para calcular el porcentaje de homología de secuencia para la secuencia(s) de prueba relativa a la secuencia de referencia, con base en los parámetros de programa diseñados. La secuencia de prueba es preferentemente la secuencia o molécula de ácido nucleico que será homologa o se probará si es homologa, y si es así, hasta qué grado, a una molécula de ácido nucleico diferente, mediante lo cual dicha molécula de ácido nucleico diferente también es referida como la secuencia de referencia. En una modalidad, la secuencia de referencia es una molécula de ácido nucleico tal como aquí se describe, preferentemente una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de acuerdo con una de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 124 y SEQ ID NO: 078. La alineación óptima de secuencias para comparación se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante al algoritmo de una homología local de Smith & Waterman (Smith & Waterman, 1981) mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch (Needleman & Wunsch, 1970) mediante la búsqueda de método de similitud de Pearson & Lipman (Pearson & Lipman, 1988), medíante implementaciones computarizadas de los algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Sicence Dr., Madison, Wis), o mediante inspección visual.
Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia, es el algoritmo utilizado en la herramienta de búsqueda de alineación local básica (en lo sucesivo "BLAST"), ver por ejemplo la Publicación de Altschul et al (Altschul et al. 1990 and Altschul et al, 1997). El software para llevar a cabo análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional de Información de Biotecnología) (en lo sucesivo "NCBI"). Los parámetros por omisión utilizados para determinar la identidad de secuencia utilizando el software disponible en NCBI, por ejemplo, BLASTN (para secuencias de nucleótidos) y BLASTP (para secuencias de aminoácido) se describen en la Pulicación de McGinnis et al (McGinnis et al, 2004).
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención también deben comprender ácidos nucleicos que tienen un cierto grado de identidad en forma relativa a los ácidos nucleicos aquí descritos y definidos por su secuencia de nucleótido. Más preferentemente, la presente invención también comprende las moléculas de ácido nucleico que tienen una identidad de al menos 75%, preferentemente 85%, más preferentemente 90% y más preferentemente más del 95%, 96%, 97%, 98% o 99% en forma relativa a los ácidos nucleicos aquí descritos y definidos por su secuencia de nucleótidos o una parte de la misma.
El término ácido nucleico de la presente invención o ácido nucleico de acuerdo con la presente invención también deben comprender los ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos aquí descritas o parte de las mismas, preferentemente hasta el grado en que los ácidos nucleicos o las partes estén implicadas o tienen la capacidad de enlazar a CGRP. Dicho ácido nucleico, es en una modalidad, una de las moléculas de ácido nucleico aquí descritas, o un derivado y/o un metabolito del mismo, mediante lo cual dicho derivado y/o metabolito es preferentemente un ácido nucleico truncado en comparación con las moléculas de ácido nucleico aquí descritas. El truncado puede estar relacionado ya sea con cualquiera de o ambos de los extremos de los ácidos nucleicos tal como aquí se describen. Asimismo, el truncado puede estar relacionado con la secuencia interna de los nucleótidos del ácido nucleico, es decir, puede estar relacionado con el nucleótido(s) entre los nucleótidos 5' y 3', respectivamente. Además, el truncado debe comprender la eliminación de tan poco como un solo nucleótido de la secuencia de los ácidos nucleicos aquí descritos. El truncado también puede estar relacionado con más de una extensión de los ácidos nucleicos inventivos, por lo cual la extensión puede ser tan pequeña como de un nucleótido de largo. El enlace del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede ser determinado por un experto en la técnica utilizando experimentos de rutina o utilizando o adoptando un método tal como aquí se describe, preferentemente tal como aquí se describe en la parte de ejemplos.
La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede ser ya sea una molécula de ácido D-nucleico o una molécula de ácido L-nucleico. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es una molécula de ácido L-nucleico. Más preferentemente, la molécula de ácido nucleico de la presente invención es un Espiegélmero.
También está dentro de la presente invención que, una modalidad, cada una y cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aquí descritas en su totalidad en términos de su secuencia(s) de ácido nucleico, se limiten a la secuencia(s) de nucleótidos indicada en particular. En otras palabras, los términos "que comprende" o "comprende(n)" deben interpretarse en dicha modalidad dentro del significado de que contiene o consiste en.
También está dentro de la presente invención que, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención sea parte de un ácido nucleico más largo, por lo cual este ácido nucleico más largo comprende varias partes, por lo que al menos una de dichas partes es un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. La otra parte(s) de estos ácidos nucleicos más largos puede ser ya sea uno o varios ácidos D-nucleico o uno o más ácidos L-nucleico. Cualquier combinación puede ser utilizada en relación con la presente invención. Esta otra parte(s) del ácido nucleico más largo ya sea solo o tomados juntos, ya sea en su totalidad o en una combinación particular, puede exhibir una función que es diferente del enlace, preferentemente del enlace a CGRP. Una posible función es permitir la interacción con otras moléculas, mediante lo cual dichas otras moléculas son preferentemente diferentes a CGRP, tal como, por ejemplo, para inmovilización, reticulación, detección o amplificación. En una modalidad adicional de la presente invención, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención comprenden, como porciones individuales o combinadas, varios de los ácidos nucleicos de la presente invención. Dicho ácido nucleico que comprende varios de los ácidos nucleicos de la presente invención también están comprendidos por el término ácido nucleico más largo.
Un ácido L-nucleico tal como se utiliza en la presente invención, es un ácido nucleico o una molécula de ácido nucleico que consiste en L-nucleótidos, que consiste preferentemente totalmente de L-nucleótidos.
Un ácido D-nucleico tal como se utiliza en la presente invención, es ácido nucleico o molécula de ácido nucleico que consiste en D-nucleótidos, que consiste preferentemente completamente de D-nucleótidos.
Los términos ácido nucleico y molécula de ácido nucleico tal como se utilizan en la presente invención en una forma intercambiable si no se indica explícitamente lo contrario.
Asimismo, si no se indica lo contrario, cualquier secuencia de nucleótido se establece en la presente invención en la dirección 5'?·3'.
Tal como se utiliza preferentemente en la presente invención, cualquier posición de un nucleótido se determina o refiere en forma relativa al extremo 5' de una secuencia, una extensión o una subextensión que contiene dicho nucleótido. Por consiguiente, un segundo nucleótido es el segundo nucleótido abarcado desde el extremo 5' de la secuencia, extensión y subextensión, respectivamente. Asimismo, de acuerdo con esto, un penúltimo nucleótido es el segundo nucleótido que abarca del extremo 3' de una secuencia, extensión y subextensión, respectivamente.
Sin importar si la molécula de ácido nucleico de la presente invención consiste en D-nucleótidos, L-nucleótidos o una combinación de ambos, con la combinación siendo, por ejemplo, una combinación aleatoria o una secuencia definida de extensiones que consisten en al menos un L-nucleótido y al menos un ácido D-nucleico, el ácido nucleico puede consistir en desoxirribonucleótido(s), ribonucleótido(s) o combinaciones de los mismos.
Está también dentro de la presente invención, que la molécula de ácido nucleico consista tanto en ribonucleótidos como en 2'desoxirribonucleótidos. Los 2'desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos se muestran en las figuras 11A-B y 12. Con el objeto de distinguir entre ribonucleótidos y 2'desoxirribonucleótidos en la secuencia de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, se utiliza en la presente invención el siguiente código de referencia.
La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención consiste en 2'desoxirribonucleótidos, en donde dG es 2'desoxi-guanosina-5'-monofosfato, dC es 2'desoxi-citidina-5'-monofosfato, dA es 2'desoxi-adenosina-5'-monofosfato, dU es 2'desoxi-uridina 5 'monofosfato.
La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención consiste en ribonucleótidos, en donde G es guanosina-5'-monofosfato, C es citidina 5'-monofosfato, A es adenosina-5'-monofosfato, U es uridina-5 'monofosfato.
El diseño de la molécula de ácido nucleico de la presente invención como una molécula de ácido L-nucleico es conveniente por varias razones. Las moléculas de ácido L-nucleico son enantiómeros de ácidos nucleicos que ocurren naturalmente. Sin embargo, las moléculas de ácido D-nucleico no son muy estables en soluciones acuosas y particularmente en sistemas biológicos o muestras biológicas debido a la amplia presencia de nucleasas. Las nucleasas de origen natural, particularmente nucleasas de células animales no tienen la capacidad de degradar ácidos L-nucleicos. Debido a esto, la vida media biológica de una molécula de ácido L-nucleico se incrementa significativamente en dicho sistema, incluyendo el cuerpo animal y humano. Debido a la carencia de capacidad de degradación de las moléculas de ácido L-nucleico, no se generan productos de degradación de nucleasa y por lo tanto no se observan efectos secundarios que surjan de los mismos en dicho sistema, incluyendo el cuerpo animal y de humano. Este aspecto distingue moléculas de ácido L-nucleico de los otros compuestos que son utilizados en terapia de enfermedades y/o trastornos que implican la presencia de CGRP, o que son transmitidas por CGRP. Una molécula de ácido L-nucleico que enlaza específicamente a una molécula objetivo a través de un mecanismo de diferente emparejamiento base de Watson Crick, o un aptámero que consiste parcial o completamente en L-nucleótidos, particularmente con las partes del aptámero que están implicadas en el enlace del aptámero de la molécula objetivo, también se llama un espielgémero. Los aptámeros y espiegélmeros, tal como lo conocen los expertos en la técnica, se describen, entre otras partes, en la Publicación de "The Aptamer Handbook" (Manual de Aptámeros) (eds. lussmann, 2006).
También está dentro de la presente invención que la molécula de ácido nucleico de la presente invención, sin importar si está presente como un ácido D-nucleico, ácido L-nucleico o ácido D, L-nucleico o si es un ADN o ARN, puede estar presente como una molécula de ácido nucleico de hebra simple o hebra doble. Normalmente, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico de hebra simple que exhibe una estructura secundaria definida debido a su secuencia primaria y también puede formar una estructura terciaria. Sin embargo, la molécula de ácido nucleico, también puede ser de hebra doble dentro del significado de que dos hebras que son complementarias o parcialmente complementarias entre sí, son hibridadas entre sí.
La molécula de ácido nucleico de la presente invención puede ser modificada. Dicha modificación puede estar relacionada con un solo nucleótido de la molécula de ácido nucleico y es bien conocida en la técnica. Los ejemplos de dichas modificaciones se describen, entre otras publicaciones, en Venkatesan et al. (Venkatesan et al., 2003) y Kusser (Kusser, 2000). Dichas modificaciones pueden ser un átomo H, un átomo F o un grupo 0-CH3 o un grupo NH2-en la posición 2' de uno, varios o todos los nucleótidos individuales de los cuales consiste la molécula de ácido nucleico. Asimismo, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender al menos un nucleótido LNA. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención consiste en nucleótidos LNA.
En una modalidad, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede ser una molécula de ácido nucleico de partes múltiples. Una molécula de ácido nucleico de partes múltiples tal como aquí se utiliza, es una molécula de ácido nucleico que consiste en al menos en dos hebras de ácido nucleico separadas. Estas al menos dos hebras de ácido nucleico forman una unidad funcional, por lo que la unidad funcional es un ligando para una molécula objetivo, y preferentemente un antagonista para la molécula objetivo, en el caso particular de CGRP. Las al menos dos hebras de ácido nucleico pueden derivarse de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención ya sea mediante descomposición de una molécula de ácido nucleico de la presente invención para generar al menos dos hebras, o mediante sintetización de una molécula de ácido nucleico que corresponde a una primera parte de la molécula de ácido nucleico de longitud total de la presente invención, y otra molécula de ácido nucleico que corresponde a otra parte de la molécula de ácido nucleico de longitud total de la presente invención. Dependiendo del número de partes que forman las moléculas de ácido nucleico de longitud total, el número de partes correspondientes que tienen la secuencia de nucleótido requeridas será sintetizada. Se reconoce que tanto el método de descomposición como el método de síntesis pueden aplicarse para generar una molécula de ácido nucleico de partes múltiples en donde existen más de dos hebras tal como se ejemplificó anteriormente. En otras palabras, las al menos dos hebras de ácido nucleico separadas normalmente son diferentes a dos hebras que son complementarias y que hibridan entre sí aunque puede haber un cierto grado de complementariedad entre las al menos dos hebras de ácido nucleico separadas, y por lo que dicha complementariedad puede dar como resultado la hibridación de las hebras separadas.
Finalmente, también está dentro de la presente invención que se materialice una estructura completamente cerrada, es decir una estructura circular para la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, es decir, que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención esté cerrada en una modalidad, preferentemente a través de una ligadura covalente, por lo que más preferentemente, dicha ligadura covalente se elabora entre el extremo 5' y el extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico de la presente invención, tal como aquí se describe o cualquier derivado de la misma.
Una posibilidad para determinar las constantes de enlace de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, es el uso de los métodos tal como se describen en los ejemplos 3 y 4, lo cual confirma el descubrimiento anterior de que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención exhiben un rango de valor KD favorable. Una medida adecuada con el objeto de expresar la intensidad del enlace entre la molécula de ácido nucleico individual y el objetivo el cual está en el caso particular de CGRP, es el valor llamado KD el cual, así como el método para su determinación, es conocido por un experto en la técnica.
Preferentemente, el valor KD mostrado por los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención es menor a 1 µ?. Un valor KD de aproximadamente 1 µ? se dice que es característico de un enlace no específico de un ácido nucleico a un objetivo. Tal como lo reconocerán los expertos en la técnica, el valor KD de un grupo de compuestos tal como los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención está dentro de cierto rango. El KD antes mencionado de aproximadamente 1 µ?, es un límite superior preferido para el valor KD. El límite inferior para el KD de los ácidos nucleicos de enlace objetivo pueden ser tan pequeño como de aproximadamente 10 picomolar o puede ser mayor. Esta dentro de la presente invención que los valores KD de los ácidos nucleicos individuales que enlazan a CGRP, estén preferentemente dentro de este rango. Los rangos preferidos pueden ser definidos eligiendo cualquier primer número dentro de este rango, y cualquier segundo número dentro de este rango. Los valores KD superiores preferidos son 250 nM y 100 nM, los valores KD inferiores preferidos son 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM y 10 pM. El valor KD superior más preferido es 10 nM, el valor KD inferior más preferido es 100 pM.
Preferentemente CGRP es alfa-CGRP humano, en donde lam olécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace a alfa-CGRP humano, expresado como KD, de 10 nM o menor, preferentemente de 1nM o menor, y más particularmente de 100 pM o menor.
Tal como se muestra en el ejemplo 7 para la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, no se puede detectar enlace a amilina humana mediante medida de resonancia de plasmón de superficie. Preferentemente la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención tiene una afinidad de enlace a amilina humana, expresada como KD, de 100 nM o más, preferentemente de 500 nM o más y más preferentemente de 1000 nM o más.
Además de las propiedades de enlace de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención inhiben la función de la molécula objetivo respectiva que está en el caso particular de CGRP. La inhibición de la función de CGRP - por ejemplo, el estímulo de los receptores respectivos tal como se describió previamente - se logra enlazando las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención a CGRP y formando un complejo de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y CGRP. Dicho complejo de una molécula de ácido nucleico y CGRP puede no estimular los receptores que normalmente son estimulados por CGRP, es decir, CGRP el cual no está presente en un complejo con una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Por consiguiente, la inhibición de la función receptora mediante moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es independiente del receptor respectivo que puede ser estimulado por CGRP pero que resulta de la prevención del estímulo de receptor mediante CGRP a través de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.
Una posibilidad para determinar la constante de inhibición de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es el uso de los métodos tal como se describe en el ejemplo 5, el cual confirma el descubrimiento anterior de que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención exhibe una constante de inhibición favorable que permite el uso de los ácidos nucleicos en un esquema de tratamiento terapéutico. Una medida adecuada con el objeto de expresar la intensidad del efecto inhibidor de la molécula de ácido nucleico individual en la interacción del objetivo, el cual en este caso particular CGRP y el receptor respectivo, que es la llamada concentración de inhibición máxima media (abreviatura IC50) la cual, así como el método para su determinación, es conocida por un experto en la técnica.
En una modalidad preferida CGRP, es alfa-CGRP humano, en donde la molécula de ácido nucleico tiene afinidad de enlace con alfa-CGRP humano, expresado como IC50, de 10 nM o menos, preferentemente de 1 nM o menos, y más preferentemente de 100 pM o menos.
Tal como se muestra en el Ejemplo 7 para la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, se midió una IC50 > 1000 nM para amilina humana y IC5o > 100 nM para amilina de rata. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, tiene una afinidad de enlace para amilina humana, expresada como IC50, de 100 nM o más, preferentemente de 500 nM o más, y más preferentemente de 1000 nM o más.
Preferentemente, la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace con alfa-CGRP humana, expresada como KD, de 10 nM o menos, preferentemente de 1 nM o menos, y más preferentemente de 100 pM o menos, en donde la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace con amilina humana, expresada como una KD, de 100 nM o más, preferentemente de 500 nM o más, y más preferentemente de 1000 nM o más, y/o la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace de alfa-CGRP humana, expresada como IC5o, de 10 nM o menos, preferentemente de 1 nM o menos, y más preferentemente de 100 pM o menos, en donde la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace a amilina humana, expresada como IC50, de 100 nM o más, preferentemente de 500 nM o más y más preferentemente de 1000 nM o más.
Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención pueden tener cualquier longitud siempre que tengan la capacidad de enlazar a la molécula objetivo. Se reconocerá en la técnica que existen longitudes preferidas de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Normalmente, la longitud es de entre 15 y 120 nucleótidos. Los expertos en la técnica reconocerán que cualquier entero entre 15 y 120 es una longitud posible para los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Los rangos más preferidos para la longitud de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención son longitudes de aproximadamente 20 a 100 nucleótidos, de aproximadamente 20 a 80 nucleótidos, de aproximadamente 20 a 60 nucleótidos, de aproximadamente 20 a 52 nucleótidos y de aproximadamente 48 a 54 nucleótidos.
Está dentro de la presente invención, que la molécula de ácido nucleico de la presente invención comprenda una porción, preferentemente es una porción de alto peso molecular y/o que preferentemente permite la modificación de las características de la molécula de ácido nucleico en términos, entre otros, del tiempo de residencia en el cuerpo del animal, preferentemente el cuerpo humano. Una modalidad particularmente preferida de dicha modificación es PEGilación y HESilación de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Tal como se utiliza en la presente invención, PEG permanece para poli(etilenglicol) y HES para almidón de hidroxietilo. La PEGilación tal como se utiliza preferentemente en la presente invención, es la modificación de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, por lo que dicha modificación consiste en una porción PEG que se adhiere a una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. La HESilación tal como se utiliza preferentemente en la presente invención es la modificación de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, por lo que dicha modificación consiste en una porción HES que se adhiere a una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Estas modificaciones, así como el proceso para modificar la molécula de ácido nucleico utilizando dichas modificaciones, se describe en la solicitud de Patente Europea EP 1 306 382, cuya descripción está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.
En el caso de que PEG sea dicha porción de alto peso molecular, el peso molecular es preferentemente de aproximadamente 20,000 hasta aproximadamente 120,000 Da, más preferentemente de aproximadamente 30,000 hasta aproximadamente 80,000 Da y lo más preferentemente de aproximadamente 40,000 Da. En el caso de que HES sea dicha porción de alto peso molecular, el peso molecular es preferentemente de aproximadamente 50 kDa hasta aproximadamente 1000 kDa, más preferentemente de aproximadamente 100 kDa hasta aproximadamente 700 kDa y lo más preferentemente desde 200 kDa a 500 kDa. HES exhibe una sustitución molar de 0.1 a 1.5, más preferentemente de 1 a 1.5 y exhibe un grado de sustitución expresado como la proporción C2/C6 de aproximadamente 0.1 a 15, preferentemente de aproximadamente 3 a 10. El proceso de la modificación HES, se describe por ejemplo, en la Solicitud de Patente Alemana DE 1 2004 006 249.8, cuya descripción está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia .
En principio, la modificación puede elaborarse en la molécula de ácido nucleico de la presente invención en cualquier posición de la misma. Preferentemente, dicha modificación se elabora ya sea en el nucleótido 5'-terminal, el nucleótido 3'-terminal y/o cualquier nucleótido entre el nucleótido 5' y el nucleótido 3' de la molécula de ácido nucleico.
La modificación y preferentemente la porción PEG y/o HES puede adherirse a la molécula de ácido nucleico de la presente invención, ya sea directa o indirectamente, preferentemente directamente a través de un enlazador. También está dentro de la presente invención que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención comprenda una o más modificaciones, preferentemente una o más porciones PEG y/o HES. En una modalidad, la molécula de enlazador individual se adhiere más que una porción PEG o porción HES a una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El enlazador utilizado en relación con la presente invención por sí mismo puede ser ya sea lineal o ramificado.
Este tipo de enlazador son conocidos por los expertos en la técnica y se describen en forma adicional en las solicitudes de Patente Internacional WO2005/074993 y WO2003/035665.
En una modalidad preferida, el enlazador es un enlazador biodegradable. El enlazador biodegradable permite modificar las características de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en términos, entre otros, del tiempo de residencia en el cuerpo del animal, preferentemente un cuerpo humano, debido a la liberación de la modificación de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El uso del enlazador biodegradable puede permitir un mejor control del tiempo de residencia de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Una modalidad preferida de dicho enlazador biodegradable en el enlazador biodegradable tal como se describe en, pero sin limitarse a las Solicitudes de Patente Internacional WO2006/052790, WO2008/034122, WO2004/092191 y WO2005/099768.
Está dentro de la presente invención que la modificación o grupo de modificación sea una modificación biodegradable, por lo que la modificación biodegradable pueda adherirse a la molécula de ácido nucleico de la presente invención ya sea directa o indirectamente, preferentemente a través de un enlazador. La modificación biodegradable permite modificar las características de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en términos de, entre otros, tiempo de residencia en el cuerpo del animal, preferentemente en un cuerpo humano, debido a la liberación o degradación de la modificación de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El uso de una modificación biodegradable puede permitir un mejor control del tiempo de residencia de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Una modalidad preferida de dicha modificación biodegradable, se describe en, pero no se limita a las solicitudes de patente internacional WO2002/065963, WO2003/070823, WO2004/113394 y WO2000/41647, preferentemente en WO2000/41647, página 18, líneas 4 a 24.
Además de las modificaciones descritas anteriormente, se pueden utilizar otras modificaciones para modificar las características de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, por lo que dichas modificaciones pueden ser seleccionadas del grupo de proteínas, lípidos, tales como colesterol y cadenas de azúcar tales como amilasa, dextrano, etc.
Sin pretender limitarse a teoría alguna, para modificar la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención con una porción de alto peso molecular, tal como un polímero y más particularmente uno o varios de los polímeros aquí descritos, los cuales son preferentemente fisiológicamente aceptables, se cambia la cinética de excreción de la molécula de ácido nucleico de la presente invención procedente del cuerpo del animal o humano al cual se administra la molécula de ácido nucleico modificada de la presente invención. Más particularmente debido al peso molecular incrementado de la molécula de ácido nucleico modificada de la presente invención, y debido a que la molécula de ácido nucleico de la presente invención no se somete a metabolismo particularmente cuando está en la forma L, es decir, siendo una molécula de ácido L-nucleico, se disminuye la excreción del cuerpo de un animal, preferentemente del cuerpo de un mamífero y más particularmente del cuerpo de un humano. Ya que la excreción normalmente ocurre a través de los ríñones, los inventores de la presente invención asumen que el rango de filtración glomerular de la molécula de ácido nucleico modificada de esta forma, se reduce significativamente en comparación con una molécula de ácido nucleico que no tiene este tipo de modificación de alto peso molecular que da como resultado un incremento en el tiempo de residencia de la molécula de ácido nucleico modificada en el cuerpo del animal. En relación con esto, es particularmente notable que, a pesar de dicha modificación de alto peso molecular, la especificidad de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención no se ve afectada en una forma perjudicial. De hecho, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención tiene, entre otras, características sorprendentes - que normalmente no pueden esperarse de un compuesto farmacéuticamente activo - de modo que no se requiere necesariamente una formulación farmacéutica que proporcione una liberación sostenida para proporcionar la liberación sostenida de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Más bien, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención está en su forma modificada que comprende una porción de alto peso molecular, puede ya ser utilizada como una formulación de liberación sostenida conforme actúa, debido a su modificación, si se liberó de la formulación de liberación sostenida. Por lo tanto, la modificación(s) de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención tal como aquí se describe, y por lo tanto la molécula de ácido nucleico modificada de acuerdo con la presente invención y cualquier composición que comprende las mismas puede proporcionar una farmacocinética distinta preferentemente controlada o una biodistribución de la misma. Esto también incluye un tiempo reducido en la circulación del cuerpo del animal y humano, y la distribución a los tejidos en dicho animal y humanos. Dichas modificaciones se describen en forma adicional en la patente WO2003/035665.
Sin embargo, también está dentro de la presente invención que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención no comprenda cualquier modificación, y particularmente ninguna modificación de alto peso molecular, tal como PEG o HES. Dicha modalidad es particularmente preferida cuando la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención muestra una distribución preferencial para cualquier órgano o tejido objetivo en el cuerpo, o cuando se desea el despeje rápido de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención del cuerpo después de la administración. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención tal como aquí se describe, con un perfil de distribución preferencial para cualquier órgano o tejido objetivo en el cuerpo, puede permitir el establecimiento de concentraciones locales efectivas en el tejido objetivo, manteniendo al mismo tiempo baja la concentración sistémica de la molécula de ácido nucleico. Esto puede permitir el uso de bajas dosis que no únicamente son benéficas desde un punto de vista económico, sino también reducen la exposición innecesaria de los tejidos a la molécula de ácido nucleico, reduciendo de esta forma el riesgo potencial de efectos secundarios. El rápido despeje de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención del cuerpo después de la administración puede ser deseado, entre otros casos, en el caso de generación de imágenes in vivo o requerimientos de dosificación terapéuticos específicos utilizando la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención o los medicamentos que comprenden la misma.
La molécula de ácido nucleicos de acuerdo con la presente invención, y/o el antagonista de acuerdo con la presente invención, pueden ser utilizados para la generación o fabricación de un medicamento. Dicho medicamento o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención contiene al menos uno de los ácidos nucleicos de la invención, opcionalmente junto con los compuestos farmacéuticamente activos, por lo que el ácido nucleico de la invención actúa preferentemente por sí mismo como un compuesto farmacéuticamente activo. Dichos medicamentos comprenden, en modalidades preferidas, al menos un transportador farmacéuticamente aceptable. Dicho transportador puede ser por ejemplo, agua, amortiguador, PBS, solución de glucosa, preferentemente una solución equilibrada de sal de glucosa al 5%, almidón, azúcar, gelatina o cualquier otra sustancia transportadora aceptable. Dichos transportadores generalmente son conocidos por los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica reconocerán que cualquiera modalidades, usos y aspectos de, o que se relacionan con el medicamento de la presente invención, también aplican a la composición farmacéutica de la presente invención y vice versa.
Las indicaciones, enfermedades y trastornos para el tratamiento y/o prevención de dichos ácidos nucleicos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de acuerdo con, o que se preparan de acuerdo con la presente invención resultan de la implicación, ya sea directa o indirecta de CGRP en el mecanismo patógeno respectivo.
Con base en la implicación de CGRP en trayectorias relevantes para o implicadas en migraña y otras manifestaciones de dolor de cabeza, es evidente que la molécula de ácido nucleico de la presente invención, composiciones farmacéuticas de la presente invención que contienen una o varias de las mismas y un medicamento de la presente invención que contiene una o varias de las mismas, son útiles en el tratamiento y/o prevención de dicha enfermedad, trastornos y condiciones de enfermedad.
El uso de la molécula de ácido nucleico de la presente invención, una composición farmacéutica de la presente invención que contiene una o varias de las mismas y un medicamento de la presente invención que contiene uno o varias de los mismos, no se restringe a las intervenciones terapéuticas potenciales en migraña y otras manifestaciones de dolor de cabeza, tal como se indicó anteriormente. Más allá de que son aplicables a enfermedades y/o trastornos y/o condiciones de enfermedad para las cuales se ha descrito la implicación patofisiológica de CGRP. Por consiguiente, dichas enfermedades y/o trastornos y/o condiciones de enfermedad, incluyen pero no se limitan a migraña, diferentes formas de dolor de cabeza, dolor agudo, dolor crónico, tolerancia a analgesia con base en morfina, osteoartritis, angiogénesis, crecimiento de tumor, enfermedades autoinmune y/o enfermedades inflamatorias, mediante lo cual preferentemente el dolor agudo y el dolor crónico es de origen inflamatorio y/o neuropático.
Por supuesto, debido a que la molécula de ácido nucleico de enlace CGRP de acuerdo con la presente invención interactúa con o enlaza a CGRP, un experto en la técnica comprenderá generalmente que la molécula de ácido nucleico de enlace CGRP de acuerdo con la presente invención puede ser fácilmente utilizada para el tratamiento prevención y/o diagnóstico de cualquier enfermedad tal como aquí se describe de humanos y animales. En relación con esto, se reconocerá como una modalidad, que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede ser utilizada para el tratamiento y prevención de cualquier enfermedad, trastorno o condición aquí descrita, sin importar el modo de acción que subyace la enfermedad, trastorno y condición.
Con el objeto de evitar cualquier repetición innecesaria, deberá ser reconocido que debido a la implicación del eje de receptor CGRP- CGRP tal como se describe con relación a esto, dicho eje puede ser dirigido por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, de modo que se logre el efecto terapéutico, preventivo y de diagnóstico reivindicado. Adicionalmente deberá reconocerse que las particularidades de las enfermedades, trastornos y condiciones de los pacientes y cualquier detalle del régimen de tratamiento descrito con relación a esto, puede someterse a las modalidades preferidas de la presente solicitud.
Dolor agudo y crónico. CGRP es expresado altamente por fibras nerviosas nociceptivas. Existe evidencia acumulada de que CGRP está implicado en el desarrollo y perpetuación de dolor agudo y crónico. Las inflamaciones pueden ser un activador potente para sensaciones de dolor agudas y crónicas. En pancreatitis crónica, el dolor es el síntoma más desafiante. Se promueve por la expresión incrementada de NGF en el páncreas que a su vez induce la activación de CGRP en el ganglio de la raíz dorsal (Winston, He et al. 2005; Wíck, Hoge et al. 2006; Liu, Shenoy et al. 2011). La administración intratecal de CGRP(8-37) puede antagonizar este mecanismo y reducir la hiperalgesia (Liu, Shenoy et al. 2011). En modelos animales de artritis, CGRP(8-37) intratecal y Olcegepant inhibieron significativamente la actividad neuronal e incrementaron el valor de umbral de los reflejos de retiro de la pata trasera (McDougall 2006; Adwanikar, Ji et al. 2007). Los ratones con deficiencia de CGRP fallaron en demostrar hiperalgesia después de la inducción experimental de inflamación de articulación (Zhang y McDougall 2006). Además, se ha descubierto que CGRP en altos niveles en el fluido sinovial de articulaciones temporomandibulares artríticas en asociación con dolor espontáneo (Kopp 2001). En un modelo de inflamación de tejido profundo, CGRP(8-37) intravenoso bloqueo la extravasación de plasma y eliminó la alodinia mecánica tanto de cabeza como de extremidad trasera (Ambalavanar, Moritani et al. 2006).
Se observa una expresión elevada de CGRP en modelos de dolor neuropático (Zheng, Wang et al. 2008; Nitzan-Luques, Devor et al. 2011). CGRP(8-37) es efectivo para eliminar la alodinia mecánica y térmica provocada por hemisección espinal o transección de nervio espinal (Bennett, Chastain et al. 2000; Lee y Kim 2007). Similarmente, CGRP(8-37) y Olecgepant atenuaron efectivamente la hiperalgesia térmica después de ligadura de nervio ciático parcial (Ma y Quirion 2006). En modelos de dolor neuropático por diabetes, CGRP (8-37) intravenoso atenúo significativamente la actividad hiperalgésica en ratones con diabetes inducida por STZ (Gabra y Sirois 2004). CGRP puede estar implicada en forma adicional en neuralgia post-herpética que se considera una consecuencia del daño a los nervios originado por herpes zoster (Hou, Barr et al. 2011).
El dolor de espalda baja es conocido por originarse en las articulaciones sacroiliacas. Los estudios histológicos de tejido humano mostraron que CGRP está presente en la capa superficial de cartílagos sacral e iliaco (Szadek, Hoogland et al. 2010). De acuerdo con esto, se incrementó la expresión de CGRP en ratas en los ganglios de raíz dorsal durante dolor de espalda baja inducido por adyuvante (Lee, Kim et al. 2009).
La evidencia para una implicación de CGRP en dolor por cáncer, es proporcionada por estudios que muestran que la inervación de tumor incrementada con fibras positivas CGRP y la liberación de CGRP, está asociada con hiperalgesia (Wacnik, Baker et al. 2005; Schweizerhof , . Stosser et al. 2009). La inyección intra-tumor de CGRP (8-37) bloquea parcialmente la hiperalgesia asociada con tumor (Wacnik, Baker et al. 2005).
El dolor es un síntoma característico de síndrome intestinal irritable. En un modelo no inflamatorio de hipersensibilidad colónica crónica, el bloqueo del receptor CGRP redujo la hipersensibilidad colónica. Esto sugiere el antagonismo de CGRP como un tratamiento potencial para dolor abdominal y síndrome intestinal irritable (Bourdu, Dapoigny et al. 2005).
En casos de intervenciones terapéuticas en migraña, otras formas de dolor de cabeza, dolor agudo y crónico, la molécula de ácido nucleico, la composición farmacéutica y el medicamento de la presente invención o preparados de acuerdo con la presente invención, se pueden utilizar en terapias de combinación con analgésicos establecidos tales como NSAIDs, derivados de alcaloides (por ejemplo dihidroergotamina) y triptanos, antagonistas de receptor 5-HT1B/-I D (por ejemplo Sumatriptan) .
Tolerancia a analgesia con base de morfina. La exposición prolongada a fármacos con base de morfina conduce a una disminución gradual de eficacia analgésica, que limita su uso clínico. CGRP se sugiere como implicada en transmitir esta tolerancia a analgésicos con base de morfina. En ratas, el tratamiento de morfina intratecal crónico conduce a tolerancia a sus efectos antinociceptivos e induce una activación de CGRP en el asta dorsal espinal. A su vez, CGRP liberado de estas terminales nerviosas contribuye al desarrollo de tolerancia de analgesia inducida por morfina. En modelos animales, el tratamiento intratecal con Olcegepant o CGRP(8-37) bloquea estos efectos de corriente descendente, conduciendo de esta forma al mantenimiento de las propiedades analgésicas de la morfina utilizada en forma crónica. Por consiguiente, los antagonistas CGRP pueden ser utilizados potencialmente como adjuntos en terapias a base de opiáceos (Powell, Ma et al. 2000; Wang, Ma et al. 2009).
Osteoartritis. Las articulaciones de la cadera de pacientes con osteoartritis dolorosa (abreviatura OA) tuvo una densidad mayor al triple de los nervios positivos CGRP en comparación con controles e histología de tejido sinoviales de artritis reumatoide y pacientes OA mostraron una densidad significativamente mayor de fibras nerviosas positivas a CGRP en OA (Saxler, Loer et al. 2007; Dirmeier, Capellino et al. 2008). De acuerdo con esto, el porcentaje de fibras positivas CGRP que inervan la articulación se incrementó significativamente en un modelo animal de OA (Ferreira-Gomes, Adaes et al. 2010). El efecto analgésico de un antagonista del miembro 1 de la subfamilia V del canal de catión potencial de receptor temporal estuvo asociado con niveles espinales reducidos de CGRP en un modelo (Puttfarcken, Han et al. 2010). Además de este papel en nocicepción, CGRP también estuvo implicada directamente en metabolismo de hueso. La señalización de CGRP mantiene la masa ósea estimulando la proliferación y diferenciación de osteoblastos y mediante la supresión de osteoclastogénesis inducida por RANKL y reabsorción de huesos (Han, Zhang et al. 2010; Wang, Shi et al. 2010).
Angiogénesis y crecimiento de tumor. En ratones con deficiencia de CGRP, el crecimiento de tumor y la angiogénesis asociada con tumor de células de carcinoma de pulmón transplantada se reducen significativamente. En ratones wt, CGRP(8-37) o la desnervación suprimieron el crecimiento de célula de carcinoma. Estos resultados indican que CGRP facilita la angiogénesis asociada con tumor y el crecimiento de tumor. Esta es una indicación de que la molécula de corriente descendente relevante para el incremento dependiente de CGRP de la angiogénesis es VEGF (Toda, Suzuki et al. 2008). En humanos, la expresión CGRP elevada ha sido identificada tanto en plasma como en tumores de cánceres específicos; incluyendo carcinomas de pulmón de célula pequeña, cáncer de próstata, cáncer de seno y cáncer de tiroides. En cáncer de próstata, CGRP de suero se correlacionó con enfermedad de grado/etapa alta. La expresión del mARN RAMP1 ha sido detectada en feocromocitomas benignos y malignos, adenoma de Conn y cánceres pancreáticos (Hay, Walker et al. 2011).
Angiogénesis inducida por isquemia. La isquemia induce angiogénesis como un mecanismo de compensación. Se incrementaron los niveles de CGRP en tejido isquémico de extremidad trasera de rata y la sobreexpresión adenoviral de CGRP dio como resultado una densidad capilar incrementada en extremidades traseras isquémicas (Zheng, Li et al. 2010). Los ratones con deficiencia de CGRP mostraron una recuperación de flujo de sangre dañada y densidad capilar disminuida después de isquemia de extremidad trasera experimental. La infusión subcutánea de CGRP(8-37) mediante bomba miniosmótica retardó la angiogénesis (Mishima, Ito et al. 2011).
Inflamación. Existe evidencia de que CGRP impacta directamente los procesos inflamatorios. CGRP se activa en modelos animales de artritis (Nohr, Schafer et al. 1999; Chen, Willcockson et al. 2008). En un modelo de esclerosis múltiple, se demostró que CGRP promueve respuestas de célula T patogénicas (Mikami, Watanabe et al. 2012). Los niveles de CGRP incrementados también se observaron en modelos animales de diabetes tipo 2 (Gram, Hansen et al. 2005; Tanaka, Shimaya et al. 2011). En un modelo de ratón de psoriasis, la desnervación o inhibición de CGRP mediante CGRP(8-37) dio como resultado reducciones significativas en los números de célula CD4+ y acantosis (Ostrowski , Belkadi et al. 2011). Un desempeño para CGRP en inflamación de piel se sugiere en forma adicional a través de estudios que muestran que CGRP inhibe la producción de quimiocina mediante células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (Huang, Stohl et al. 2011) y que moduló la producción de citocinas mediante células T de pacientes con dermatitis atópica (Antunez, Torres et al. 2009).
Ansiedad. La infusión de CGRP evoca respuestas tipo ansiedad en ratas, lo que sugiere que el antagonismo de CGRP puede ser una estrategia clínicamente útil para reducción de ansiedad (Sink, Walker et al. 2011).
Enfermedades neurodegenerativas. Un estudio reciente mostró que una mutación del receptor de andrógenos es crucial para la patogénesis de atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA), está asociada con la expresión CGRP incrementada y que la supresión de la expresión de CGRP reduce síntomas clínicos (Minamiyama , Katsuno et al. 2012).
Un desempeño patogénico de CGRP ha sido sugerido en otras varias enfermedades incluyendo fibrosis quística (Xie, Fisher et al. 2011), mastocitosis (Maintz, Wardelmann et al. 201 1), síndrome de ovario poliquístico (PCOS) (Zhang, Gong et al. 2012), enfermedad de reflujo sin erosión (Xu, Li et al. 2012).
En una modalidad adicional, el medicamento comprende un agente farmacéuticamente activo adicional. Dichos compuestos farmacéuticamente activos adicionales, son entre otros, pero no se limitan a compuestos para el tratamiento y/o prevención de migraña, dolor agudo y crónico, en donde los compuestos se seleccionan del grupo que comprende triptanos, NSAIDs, opioides, bloqueadores de los canales de calcio con entrada de voltaje tipo N (Ziconotida), fármacos antidepresivos y antiepilépticos. Quedará entendido para los expertos en la técnica, que debido a las diversas indicaciones que pueden dirigirse de acuerdo con la presente invención a través de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, y el agente(s) farmacéuticamente activo adicional puede ser cualquiera, el cual en principio sea adecuado para el tratamiento y/o prevención de dichas enfermedades. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, particularmente si está presente o se utiliza como un medicamento, preferentemente, es o será combinada con triptanos, NSAIDs, opioides, bloqueadores de canales de calcio con entrada de voltaje tipo N (Ziconotide) , fármacos antidepresivos y antiepilépticos.
Está dentro de la presente invención que el medicamento sea utilizado en forma alternativa o adicional, en principio, para la prevención de cualquiera de las enfermedades descritas en relación con el uso del medicamento para el tratamiento de las enfermedades. Por consiguiente los marcadores respectivos, por ejemplo, para enfermedades respectivas, son conocidos por los expertos en la técnica. Preferentemente, el marcador respectivo es CGRP.
En una modalidad del medicamento de la presente invención, dicho medicamento es para utilizarse en combinación con otros tratamientos para cualquiera de las enfermedades aquí descritas, particularmente aquellas para las cuales será utilizado el medicamento de la presente invención.
La "terapia de combinación" (o "co-terapia") incluye la administración de un medicamento de la presente invención y al menos un segundo agente como parte de un régimen de tratamiento específico proyectado para proporcionar el efecto benéfico de la coacción de estos agentes terapéuticos, es decir, el medicamento de la presente invención y el segundo agente. El efecto benéfico de la combinación incluye, pero no se limita a coacción farmacocinética o farmacodinámica que resulte de la combinación de agentes terapéuticos. La administración de estos agentes terapéuticos en combinación normalmente se lleva a cabo durante un período de tiempo definido (normalmente minutos, días o semanas dependiendo de la combinación seleccionada).
La "terapia de combinación" puede, aunque generalmente no, está proyectada para comprender la administración de dos o más de estos agentes terapéuticos como parte de regímenes de monoterapia separados que dan como resultado incidental o arbitrariamente las combinaciones de la presente invención. La "terapia de combinación" pretende abarcar la administración de estos agentes terapéuticos en una forma secuencial, esto es, en donde el agente terapéutico se administra en un diferente momento, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos en una forma sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea puede lograrse por ejemplo administrando a un sujeto una sola cápsula que tiene una proporción fija de cada agente terapéutico o en múltiples cápsulas individuales para cada uno de los agentes terapéuticos.
La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico puede efectuarse a través de cualquier ruta adecuada que incluye pero no se limita a rutas tópicas, rutas orales, rutas intravenosas, rutas intramusculares, de absorción directa a través de tejido de membrana mucosa. Los agentes terapéuticos se pueden administrar a través de la misma ruta o mediante diferentes rutas. Por ejemplo, el primer agente terapéutico de la combinación seleccionada puede administrarse mediante inyección, en tanto que los otros agentes terapéuticos de la combinación se pueden administrar en forma tópica.
Alternativamente, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos se pueden administrar en forma tópica o todos los agentes terapéuticos se pueden administrar mediante inyección.
La secuencia en la cual se administran los agentes terapéuticos no es muy importante, al menos que se indique lo contrario. El término "terapia de combinación" también puede abarcar la administración de los agentes terapéuticos tal como se describió anteriormente en combinación adicional con otros ingredientes biológicamente activos. Cuando la terapia de combinación comprende además un tratamiento sin fármacos, el tratamiento sin fármaco puede llevarse a cabo en cualquier momento adecuado siempre que se logre un efecto benéfico de la coacción de la combinación de los agentes terapéuticos y el tratamiento sin fármaco. Por ejemplo, en casos adecuados, el efecto benéfico aún se logrará cuando el tratamiento sin fármacos se elimina temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, posiblemente por días o incluso semanas.
Tal como señala en términos generales anteriormente con el medicamento con la presente invención, puede administrarse en principio, en cualquier forma conocida por los expertos en la técnica. Una ruta de administración preferida es la administración sistémica, más preferentemente mediante administración parenteral, preferentemente mediante inyección. Alternativamente el medicamento se puede administrar en forma local. Otra ruta de administración comprenden intramuscular, intraperitoneal, y subcutánea, per orum, intranasal, intratecal o pulmonar dando preferencia a la ruta de administración que sea la menos invasiva, y al mismo tiempo asegure la eficacia.
La administración parenteral generalmente se utiliza para inyecciones, infusiones, subcutáneas, intramusculares o intravenosas. Además, un método para administración parenteral emplea el implante de sistemas de liberación sostenida o liberación lenta, que asegura que se mantenga un nivel constante de dosificación, las cuales son conocidas por los expertos en la técnica.
Además, los medicamentos preferidos de la presente invención se pueden administrar en forma intranasal mediante el uso tópico de vehículos intranasales adecuados, inhalantes o mediante rutas transdérmicas utilizando las formas de parches cutáneos tra nsdérmicos bien conocidos para los expertos en la técnica. Se administrarán en la forma de un sistema de suministro transdérmico, en donde por supuesto, la dosificación será continua en lugar de intermitente a lo largo del régimen de dosificación. Otras preparaciones tópicas preferidas incluyen cremas, ungüentos, lociones, rocíos en aerosol y geles.
Los sujetos que responderán favorablemente a un método de la presente invención, incluyen sujetos médicos y veterinarios en general, incluyendo seres humanos y pacientes humanos. Entre otros sujetos, para los cuales son útiles el método y medios de la presente invención, son gatos, perros, animales grandes, aves, tales como pollos y similares.
El medicamento de la presente invención generalmente comprenderá una cantidad efectiva del componente(s) activo de la terapia, incluyendo sin limitase a una molécula de ácido nucleico de la presente invención, disuelta o dispersa en un medio farmacéuticamente aceptable. El medio o transportadores farmacéuticamente aceptable incluyen cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos, agente antifúngicos, agentes isotónicos o de retraso de absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas es bien conocido en la técnica. También se puede incorporar ingredientes activos suplementarios en el medicamento de la presente invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica. Dicha composición farmacéutica comprende al menos uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención y preferentemente un enlazador farmacéuticamente aceptable. Dicho enlazador puede ser cualquier enlazador utilizado y/o conocido en la técnica. Mas particularmente, dicho enlazador es cualquier enlazador tal como se describe en relación con la fabricación del medicamento aquí descrito, sin embargo, no se limita al mismo. En una modalidad adicional, la composición farmacéutica de la presente invención comprende un agente farmacéuticamente activo adicional.
La preparación de un medicamento y una composición farmacéutica será bien conocido por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Normalmente, dichas composiciones pueden prepararse como inyectables, ya sea como con soluciones o suspensiones, líquidas; una forma sólida adecuada para estar en la solución, o en la suspención, en la forma de líquido previo a la inyección; cómo una atableta u otro sólido adecuado para administración oral; como cápsulas de liberación con el tiempo; o en cualquier otra forma normalmente utilizada, incluyendo gotas para los ojos, cremas, lociones, bálsamos, inhalantes, y similares. El uso de formulaciones estériles tal como lavados a base de solución salina, por parte de cirujanos, médicos o cuidadores de la salud para tratar un área particular en el campo de operación, también puede ser particularmente útil. La composición también se puede suministrar mediante un microd ispositivo, micropartícula o esponja.
Al momento de la formulación, se administrará un medicamento en una forma compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad en la que sea farmacológicamente efectivo. Las formulaciones pueden ser administradas fácilmente en una variedad de forma de dosificación, tal como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, aunque también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármaco y similares.
El medicamento de la presente invención también se puede administrar en formas de dosificación oral como tabletas de liberación programada o sostenida o cápsulas, pildoras, polvos, granulos, elíxires, tinciones, suspensiones, jarabes y emulsiones. Los supositorios se preparan en forma conveniente a partir de emulsiones o suspensiones grasas.
La composición farmacéutica o medicamento de la presente invención puede esterilizarse y/o contener un adyuvante, tal como agentes de conservación, estabilización, humectación o emulsificación, promotores de solución, sales para regular la presión osmóstica y/o amortiguadores. Además, también pueden contener otras sustancias terapéuticamente valiosas. Las composiciones se preparan de acuerdo con mezclado convencional, granulación o métodos de recubrimiento, y normalmente contienen de aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 75%, preferentemente de aproximadamente 1% hasta aproximadamente 50%, del ingrediente activo.
Un líquido, particularmente, la composición inyectable puede set prepara por ejemplo mediante disolución, dispersión, etc. El compuesto activo se disuelve o se mezcla con un solvente farmacéuticamente puro tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares, para formar de esta manera la solución o suspensión inyectable. Además, se pueden formular formas sólidas adecuadas para disolverse en un líquido antes de la inyección.
El medicamento y molécula de ácido nucleico, respectivamente, de la presente invención también se puede administrar en la forma de un sistema de suministro de liposoma, tal como vesículas unilamelares pequeñas, vesículas unilamelares grandes y vesículas multilamelares. Se pueden formar liposomas de una variedad de fosfolípidos, que contienen colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas. En algunas modalidades, se hidrata una película de componentes de lípido con una solución acuosa de fármacos para formar una capa de lípido que encapsule el fármaco, lo que es bien conocido para los expertos en la técnica. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede proporcionarse como un complejo con un compuesto lipofílico o no inmunogénico, un compuesto de alto peso molecular construido utilizando métodos conocidos en la técnica. Además, los liposomas pueden contener moléculas de ácido nucleico en su superficie para dirigir y llevar agentes citotóxicos internamente para transmitir la exterminación celular. Un ejemplo de complejos asociados por ácido nucleico se proporciona en la Patente Norteamericana No. 6,011,020.
El medicamento y la moléculas de ácido nucleico, respectivamente, de la presente invención también pueden acoplarse con polímeros solubles como transportadores de fármacos dirigibles. Dichos polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de piran, polihidroxipropil-metacrilamida-fenol, polihidroxietilaspanamidefenol, o polietileneoxidepolilisina sustituidos con residuos de palmitoilo.
Además, los medicamentos y moléculas, respectivamente, de la presente invención se pueden acoplar a una clase de polímeros biodegradables útiles para lograr la liberación controlada de un fármaco por ejemplo ácido poliláctico, caprolactona de poliépsilon, ácido polihidroxi butírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de hidrogeles de bloque anfipático o reticulados.
Si se desea, la composición farmacéutica y medicamento, respectivamente que será administrada también contiene cantidades menores de las sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes de amortiguación de pH y otras sustancias tales como por ejemplo, acetato de sodio, y oleato de trietanolamina.
El régimen de dosificación que utiliza las moléculas de ácido nucleico y medicamentos, respectivamente, de la presente invención se selecciona de acuerdo con una variedad de factores que incluyen tipo, especie, edad, peso, sexo y condición médica del paciente; la severidad de la condición que será tratada, la ruta de administración; la función renal y hepática del paciente; y el aptámero particular o sal del mismo empleada. Un médico o veterinario experto en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva del fármaco requerida para prevenir, o contrarrestar el progreso de la condición .
Los niveles efectivos en plasma de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, fluctúan preferentemente de 500 fM a 200 µ?, preferentemente 1 nM a 20 µ?, más preferentemente de 5 nM a 20 µ?, lo más preferentemente de 50 nM a 20 µ? en el tratamiento de cualquiera de las enfermedades aquí descritas.
La molécula de ácido nucleico y medicamentos, respectivamente, de la presente invención pueden ser administrados preferentemente en una dosis diaria simple, cada segundo o tercer día, en forma semanal, cada segunda semana o una dosis mensual simple o cada tercer mes.
Esta dentro de presente invención que un medicamento tal como aquí se describe, constituya la composición farmacéutica aquí descrita, y preferentemente una composición farmacéutica de la presente invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para tratamiento de un sujeto quien necesita de dicho tratamiento en donde el método comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente activa de al menos uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. En una modalidad, el sujeto padece de una enfermedad o está en riesgo de desarrollar dicha enfermedad, por lo que la enfermedad es cualquiera de las aquí descritas, particularmente cualquiera de las enfermedades descritas en relación con el fluido con cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención para la fabricación de un medicamento.
Tal como se utiliza preferentemente en la presente invención, un diagnóstico, o agente de diagnóstico, o medio de diagnóstico es adecuado para detectar, ya sea directa o indirectamente CGRP, preferentemente CGRP tal como aquí se describe y más preferentemente CGRP tal como aquí se describe en relación con los diversos trastornos y enfermedades aquí descritos. El diagnóstico es adecuado para la detección y/o seguimientos de cualquiera de los trastornos de enfermedades, respectivamente, aquí descritos. Dicha detección es posible a través del enlace de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención a CGRP. Dicho enlace puede ser detectado ya sea directa o indirectamente. Los métodos respectivos y medios son conocidos para los expertos en la técnica. Entre otros, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden comprender una etiqueta que permite la detección de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, preferentemente el ácido nucleico enlazado al CGRP. Dicha etiqueta se selecciona preferentemente del grupo que comprende etiquetas radioactivas, enzimáticas y fluorescentes. En principio, todos los ensayos desarrollados para los anticuerpos pueden ser adoptados para los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, mientras que el anticuerpo de enlace de objetivo se substituye por un ácido nucleico de enlace de objetivo. En ensayos de anticuerpo que utilizan anticuerpos de enlace de objetivo no etiquetados, la detección se lleva a cabo preferentemente a través de un anticuerpo secundario que es modificado con etiquetas radioactivas, enzimáticas y fluorescentes, y enlazan al anticuerpo de enlace de objetivo en su fragmento-Fc. En el caso de un ácido nucleico, preferentemente un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico es modificado con una etiqueta, mediante lo cual la etiqueta se selecciona preferentemente del grupo que comprende biotina, Cy-3 y Cy-5, y dicha etiqueta es detectada por un anticuerpo dirigido contra dicha etiqueta, por ejemplo un anticuerpo anti-biotina, un anticuerpo anti-Cy3 o un anticuerpo anti-Cy5, o - en el caso que la etiqueta sea biotina - la etiqueta se detecta mediante estreptavidina o avidina que enlazan naturalmente a biotina. Dicho anticuerpo, estreptavidina o avidina, son modificados preferentemente con una etiqueta respectiva, por ejemplo, una etiqueta radioactiva, enzimática o fluorescente (tipo un anticuerpo secundario) lo cual proporciona una señal que permite la detección.
En una modalidad adicional, las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, se detectan o analizan a través de un segundo medio de detección, en donde el medio de detección es un faro molecular. La metodología de faro molecular es conocida para los expertos en la técnica y es revisada en la publicación de Mairal y asociados (Mairal y asociados, 2008).
Se reconocerá que la detección de CGRP utilizando los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, permitirán particularmente la detección de CGRP tal como aquí se define.
En conexión con la detección de CGRP un método preferido comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una muestra que será probada para la presencia de CGRP, (b) proporcionar un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, (c) hacer reaccionar la muestra con el ácido nucleico, preferentemente en un envase de reacción. mediante lo cual el paso (a) puede llevarse a cabo antes del paso (b), o el paso (b) se puede llevar a cabo antes del paso (a).
En una modalidad preferida se proporciona un paso d) adicional, el cual consiste en la detección de la reacción de la muestra con el ácido nucleico. Preferentemente, el ácido nucleico del paso b) es inmovilizado para una superficie. La superficie puede ser la superficie de un envase de reacción tal como un tubo de reacción, así como una placa, o la superficie de un dispositivo contenido en dicho envase de reacción tal como, por ejemplo, un gránulo. La inmovilización del ácido nucleico a la superficie puede elaborarse a través de cualquier medio conocido por los expertos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, ligaduras no covalentes o covalentes. Preferentemente, la ligadura se establece a través de un enlace químico covalente entre la superficie y el ácido nucleico. Sin embargo, también está dentro de la presente invención que el ácido nucleico sea inmovilizado indirectamente a una superficie, por lo que dicha inmovilización indirecta implica el uso de un componente adicional o un par de partes de interacción. Dicho componente adicional es preferentemente un compuesto el cual interactúa específicamente con el ácido nucleico que será inmovilizado el cual también es referido como una parte de interacción, y de esta forma transmite la adhesión del ácido nucleico a la superficie. La parte de interacción es seleccionada preferentemente del grupo que comprende ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y anticuerpos. Preferentemente la parte de interacción es un anticuerpo, más preferentemente, un anticuerpo monoclonal. Alternativamente, la parte de interacción es un ácido nucleico, preferentemente un ácido nucleico funcional. Más preferentemente, dicho ácido nucleico funcional se selecciona del grupo que comprende de aptámeros, Espiegélmeros, y ácidos nucleicos los cuales son al menos parcialmente complementarios para el ácido nucleico. En una modalidad alternativa adicional, el enlace del ácido nucleico a la superficie es transmitido por una parte de interacción de partes múltiples. Dicha parte de interacción de múltiples partes es preferentemente un par de partes de interacción o una parte de interacción que consiste en un primer miembro y en un segundo miembro, por lo que el primer miembro está comprendido por, o adherido al ácido nucleico y el segundo miembro está adherido a, o contiene la superficie. La parte de interacción de partes múltiples se selecciona preferentemente del grupo de pares de partes de interacción que comprenden biotina y avidina, biotina y estreptavidina , y biotina y neutravidina. Preferentemente, el primer miembro del par de partes de interacción es biotina.
Un resultado preferido de dicho método es la formación de un complejo inmobiliario de CGRP y el ácido nucleico, mediante lo cual se detecta más preferentemente el complejo. Está dentro de una modalidad que se detecte el complejo a partir del CGRP.
Un medio de detección respectivo que está en cumplimiento con este requerimiento es, por ejemplo, cualquier medio de detección que se especificó para dicha/aquella parte(s) de CGRP. Un medio de detección particularmente preferido es un medio de detección el cual es seleccionado del grupo que comprende ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y anticuerpos, cuya generación es conocida para los expertos en la técnica.
El método para la detección de CGRP también comprende que la muestra sea eliminada del envase de reacción, el cual ha sido utilizado preferentemente para llevar a cabo el paso c).
El método comprende en una modalidad adicional, también el paso de inmovilizar una parte de interacción de CGRP en una superficie, preferentemente una superficie tal como se definió anteriormente, en donde la parte de interacción es definida como aquí se indica, y preferentemente como se indicó anteriormente en relación con el método respectivo y más preferentemente comprende ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y anticuerpos en sus diversas modalidades. En esta modalidad, un medio de detección particularmente preferido es un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, en donde el ácido nucleico puede ser etiquetado o no etiquetado preferentemente. En el caso en el que el ácido nucleico sea etiquetado, puede ser detectado directa o indirectamente. Dicha detección también involucra el uso de un segundo medio de detección el cual también es seleccionado preferentemente del grupo que comprende ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y modalidades en las diversas modalidades aquí descritas. Dichos medios de detección son preferentemente específicos, para el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. En una modalidad más preferida, el segundo medio de detección es un faro molecular. Ya sea el ácido nucleico o el segundo medio de detección, o ambos, pueden comprender en una modalidad preferida una etiqueta de detección. La etiqueta de detección se selecciona preferentemente del grupo que comprende biotina, una etiqueta de bromo-desoxiuridina, una etiqueta de digoxigenina, una etiqueta de fluorescencia, una etiqueta UV, una radio-etiqueta, y una molécula de quelador. Alternativamente, el segundo medio de detección interactúa con la etiqueta de detección la cual está preferentemente contenida por, comprendida por o adherida al ácido nucleico. Las combinaciones particularmente preferidas se indican a continuación: la etiqueta de detección es biotina y el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra biotina, o en donde la etiqueta de detección es biotina y el segundo medio de detección es una avidina o una molécula que lleva avidina, o en donde, la etiqueta de detección es biotina y el segundo medio de detección es una molécula que lleva estrepta vidina o estretavidina, o en donde, la etiqueta de detección es biotina y el segundo medio de detección es una neutravidina o una molécula que lleva neutravidina , o en donde la etiqueta de detección es un bromo-desoxiuridina y el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra bromo-desoxiuridina, o en donde, la etiqueta de detección es una digoxigenina y el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra digoxigenina, o en donde, la etiqueta de detección es un quelador, y el segundo medio de detección es un radio-núclido, por lo que se prefiere que la etiqueta de detección se adhiera al ácido nucleico. Será reconocido que este tipo de combinación también aplica a la modalidad en donde el ácido nucleico se adhiere a la superficie. En dicha modalidad, se prefiere que la etiqueta de detección se adhiera a la parte de interacción.
Finalmente, también está dentro de la presente invención que el segundo medio de detección sea detectado utilizando un tercer medio de detección, preferentemente el tercer medio de detección es una enzima, que muestra más preferentemente una reacción enzimática al momento de la detección del segundo medio de detección, o el tercer medio de detección es un medio para detectar radiación, más preferentemente la radiación emitida por un radio-núclido. Preferentemente, el tercer medio de detección se detecta específicamente y/o interactúa con el segundo medio de detección.
También en la modalidad, con una parte de interacción de CGRP siendo inmovilizada en una superficie y en donde el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, se agrega preferentemente al complejo formado entre la parte de interacción y el CGRP, la muestra puede ser eliminada de la reacción, más preferentemente del envase de la reacción como en donde se lleva a cabo el paso c) y/o d).
En una modalidad, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención comprende una parte de fluorescencia y la fluorescencia de parte de la fluorescencia es diferente en la formación del complejo entre el ácido nucleico y CGRP y CGRP libre.
En una modalidad adicional el ácido nucleico es un derivado del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, en donde el derivado del ácido nucleico comprende al menos un derivado fluorescente de adenosina que reemplaza a la adenosina. En una modalidad preferida el derivado fluorescente de adenosina es etenoadenosina.
En una modalidad adicional el complejo consiste en el derivado del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y el CGRP se detecta utilizando fluorescencia.
En una modalidad del método se crea una señal del paso (c) o el paso (d) y preferentemente la señal está correlacionada con la concentración de CGRP en la muestra.
En un aspecto preferido, los ensayos pueden llevarse a cabo en placas de 96 depósitos, en donde los componentes son inmovilizados en los envases de reacción tal como se describe anteriormente, y los depósitos actúan como envases de reacción.
El ácido nucleico de la invención puede ser utilizado además como material de partida para el diseño de fármaco. Básicamente existen dos métodos posibles. Un método es la clasificación de bibliotecas del compuesto en donde las bibliotecas del compuesto son preferentemente bibliotecas del compuesto de bajo peso molecular. En una modalidad, la clasificación es una clasificación de alto rendimiento. Preferentemente, la clasificación de alto rendimiento es la evaluación rápida, eficiente, de prueba y error de los compuestos en un ensayo a base de objetivos. En el mejor caso el análisis se lleva a cabo a través de una medida colorimétrica. Las bibliotecas tal como se utilizan en relación con esto, son conocidas por los expertos en la técnica.
En el caso de clasificación de bibliotecas de compuestos, tal como mediante el uso de un ensayo competitivo que son conocidos por los expertos en la técnica, se pueden encontrar análogos CGRP, agonistas CGRP, o antagonistas CGRP adecuados. Dichos ensayos competitivos pueden establecerse como se indica a continuación. El ácido nucleico de la invención, preferentemente, un Espiegélmero que es un ácido L-nucleico de enlace objetivo, se acopla a una fase sólida. Con el objeto de identificar análogos CGRP se puede agregarse CGRP etiquetado al ensayo. Un análogo potencial puede competir con las moléculas CGRP que enlazan al Espiegélmero lo cual puede acompañar una disminución en la señal obtenida por la etiqueta respectiva. La clasificación de agonistas y antagonistas puede implicar el uso de un ensayo de cultivo celular tal como lo conocen los expertos en la técnica.
El equipo de acuerdo con la presente invención puede comprender al menos uno o varios de los ácidos nucleicos de la invención. Además, el equipo puede comprender al menos uno o varios controles positivos o negativos. Un control positivo puede ser, por ejemplo, CGRP, particularmente uno contra el cual se selecciona el ácido nucleico de la invención o al cual enlaza, preferentemente, en forma líquida. Un control negativo puede ser, por ejemplo, un péptido que es definido en términos de propiedades biofísicas similares a CGRP, pero que no es reconocido por los ácidos nucleicos de la invención. Además, el equipo puede comprender uno o varios amortiguadores. Los diferentes ingredientes pueden estar contenidos en el equipo en forma seca o liofilizada, o disueltos en un líquido. El equipo puede comprender uno o más contenedores que a su vez pueden contener uno o varios ingredientes del equipo. En una modalidad adicional, el equipo comprende una instrucción o folleto de instrucción que proporciona al usuario información respecto al uso del equipo y sus diversos ingredientes.
La determinación farmacéutica y bioanalítica del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, es elemental para la evaluación de su perfil farmacocinético y biodinámico en varios humores, tejidos y órganos del cuerpo humano y no humano. Para dicho propósito, cualquiera métodos de detección aquí descritos o conocidos por los expertos en la técnica pueden ser utilizados. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un ensayo de hibridación de intercalado para la detección del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Dentro del ensayo de detección, se utiliza una sonda de captura y una sonda de detección. La sonda de captura es complementaria para la primera parte, y la sonda de detección para la segunda parte del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. La sonda de captura se inmobiliza a una superficie o matriz. La sonda de detección lleva preferentemente una molécula o etiqueta marcadora que puede ser detectada tal como se describió previamente en la presente invención.
La detección del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo como se indica a continuación : El ácido nucleico de acuerdo con la presente invención híbrida con uno de sus extremos para la sonda de captura y con el otro extremo para la sonda de detección. Posteriormente se elimina la sonda de detección no enlazada mediante, por ejemplo, uno o varios pasos de lavado. La cantidad de sonda de detección enlazada que lleva preferentemente una etiqueta o molécula marcadora, se puede medir subsecuentemente como, por ejemplo, se señala con detalle en la publicación de Patente WO/2008/052774 , la cual está incorporada a la presente invención como referencia.
Tal como se utilizó previamente en la presente invención, el término "tratamiento" comprende en una modalidad preferida la prevención y/o seguimiento adicional o alternativo.
Tal como se utiliza previamente en la presente invención, los términos "enfermedad y trastorno" deben utilizarse en una forma intercambiable, sino indican lo contrario.
Tal como se usa en la presente invención, el término "comprende", preferentemente no está proyectado para limitar el asunto materia seguido o descrito en dicho término.
Las diversas SEQ.ID. Nos., la naturaleza química de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y las moléculas objetivo C5a tal como aquí se utilizan, la secuencia real de las mismas y el número de referencia interno se resumen en las siguientes tablas. > OI O en en Tabla 1 Oí 01 OI en en en en en en en o en en en o en en oí oí Oí en oí n oí oí en CJ1 en en La presente invención se ilustra en forma adicional a través de las figuras, ejemplos y el listado de secuencias de los cuales se pueden tomar características, modalidades y ventajas adicionales, en donde Las figuras 1A a 1B, muestran una alineación de secuencia de moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP de la presente invención y la actividad relativa a alfa-CGRP humano en un ensayo de enlace de competición; La figura 2, muestra derivados de la molécula de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001, con diferentes primeras y segundas extensiones terminales; Las figuras 3A a D, muestran derivados de la molécula de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001, que incluye el valor KD y la actividad de enlace relativa a alfa-CGRP humano tal como se determina mediante medición de resonancia de plasmón de superficie.
La figura 4, es un diagrama que muestra la evaluación cinética mediante medidas Biacore de los Espiegélmeros de enlace CGRP 226-F2-001 y 226-F2-001 -D41 a alfa-CGRP humano inmovilizado, en donde los datos para 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 7.8, 3.9, 1.95 y 0 nM de los Espiegélmeros 226-F2-001 y 226-F2-001 -D41 , se indican como unidades de respuesta; La figura 5, es un diagrama que muestra la evaluación cinética mediante medida Biacore de Espiegélmeros de enlace CGRP, 226-F2-001 y 226-F2-001 -D44 a alfa-CGRP humano inmovilizado, en donde los datos para 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 7.8, 3.9, 1.95 y 0 nM de los Espiegélmeros 226-F2-001 y 226-F2-001 -D44 se indican como unidades de respuesta; La figura 6, es un diagrama que muestra la evaluación cinética mediante medida Biacore de Espiegélmeros de enlace CGRP, 226-F2-001-D41 y 226-F2-001 -D41 /44 a alfa-CGRP humano inmovilizado, en donde los datos para 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 7.8, 3.9, 1.95 y 0 nM de los Espiegélmeros 226-F2-001 -D41 y 226- F2-001 -D41 /44 se indican como unidades de respuesta; La figura 7a, es un diagrama que muestra la inhibición de la producción cAMP inducido por alfa-CGRP humano mediante los Espiegélmeros de enlace CGRP 212-G1-001 (rombos negros) y 226-F2-001 (círculos negros), en donde a) las cantidades generadas de cAMP por depósito fueron normalizadas al valor más grande de cada conjunto de datos y se ilustran como porcentaje de actividad contra la concentración de Espiegélmero, b) las concentraciones de Espiegélmero en donde la producción de cAMP es inhibida en un 50% (IC50), se calcularon utilizando regresión no lineal (ajuste de cuatro parámetros) con el software Prism5, c) los valores IC5o para 212-G1-001 y 226-F2-001 determinados fueron de 8.7 nM y 3.5 nM, respectivamente; La figura 7B, es un diagrama que muestra la inhibición de la producción cAMP inducida por CGRP humano mediante los Espiegélmeros de enlace CGRP 226-F2-001 -5'40kDa-PEG (círculos negros) y NOX-L41 (también referidos como 226-F2-001-D41 -5'40kDa-PEG, cuadros negros), en donde a) las cantidades generadas de cAMP por depósito fueron normalizadas al valor más grande de cada conjunto de datos y se ilustran como el porcentaje de actividad contra la concentración de Espiegélmero, b) las concentraciones de Espiegélmero en donde la producción de cAMP se inhibe en un 50% (IC5o), se calcularon utilizando regresión no lineal (ajuste de cuatro parámetros) con el software Prism5, c) los valores IC50 para 226-F2-001 -5'40kDa-PEG y NOX-L41 determinados fueron 3.8 nM y 0.39 nM, respectivamente; La figura 8A, muestra una alineación de secuencia de aminoácido de alfa-CGRP humano, beta-CGRP humano, amilina humana, calcitonina humana, adrenomedulina humana e intermedina humana; La figura 8B, muestra una alineación de secuencia de aminoácido de alfa-CGRP de humano, macaca mulatta, rata, ratón, sus scrofa, oveja y perro; La figura 9, muestra una alineación de secuencia de aminoácido de CGRP de humano y rata y amilina de humano y rata; los valores IC50 determinados mediante ensayo in vitro con el receptor CGRP humano y las constantes de disociación KD determinadas mediante la medida Biacore cinética para Espiegélmeros de enlace CGRP NOX-L41 (también referido como 226-F2-001-D41-5'40kDa-PEG) y 226-F2-00 -D41 ; La figura 10, es un diagrama que muestra la inhibición de la producción de cAMP inducida por amilina humana mediante el Espiegélmero de enlace CGRP NOX-L41 (también referido como 226-F2-001 -D41 -5'40kDa-PEG , cuadros negros) y un Espiegélmero de control de enlace de amilina (triángulos negros) en donde las cantidades generadas de cAMP por depósito se normalizan para el valor más grande de cada conjunto de datos y se ilustran como el porcentaje de actividad contra concentración de Espiegélmero; La figura 11A a B, muestra los 2'desoxirribonucleótidos de los que consisten las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención; La figura 12, muestra los ribonucleótidos de los que consisten las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención; La figura 13, es un diagrama que muestra la evaluación cinética mediante medida Biacore de Espiegélmeros de enlace CGRP, 226-F2-001-D41 , 226-F2-001 -D41 -dU20 y 226-F2-001-D41-dU28 a CGRP humano inmovilizado, en donde los datos para 500-250-125-62.5-31.3-15.6-7.8(2x)-3.9-1.95-0.98-0.48-0 nM de los Espiegélmeros 226-F2-001 -D41 , 226-F2-001-D41-dU20 y 226-F2-001 -D41 -dU28 se indican como unidades de respuesta .
Ejemplo 1: Moléculas de ácido nucleico con la capacidad de enlazar específicamente CGRP Se identificaron diversas moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP y derivados de las mismas: cuyas secuencias de nucleótido se ilustran en las figuras 1 a 3. La afinidad de enlace de las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP a alfa-CGRP humano y su función antagónica con respecto a la interacción de alfa-CGRP humano y el receptor CGRP, se caracterizaron como: a) aptámeros, es decir, como moléculas de ácido D-nucleico utilizando un ensayo de despliegue de competición comparativo (Ejemplo 3) b) Espiegélmeros, es decir, ácido L-nucleico mediante medida de resonancia de plasmón de superficie (Ejemplo 4) o mediante un ensayo ¡n vitro con células que expresan el receptor CGRP humano (Ejemplo 5).
Los Espiegélmeros y aptámeros se sintetizaron tal como se describe en el Ejemplo 2.
Las moléculas de ácido nucleico generadas de esta forma exhiben secuencias ligeramente diferentes, en donde las secuencias se pueden resumir o agrupar como una familia de secuencias.
Para la definición de los motivos de secuencia de ribonucleótido, se utilizan las abreviaturas IUPAC para nucleótidos ambiguos: s fuerte G o C; w débil A o U; R purina G o A; Y pirimidina C o U; K ceto G o U; M imino A o C; B no A C o U o G; D no C A o G o U; H no G A o C o U; V no U A o C o G; N todos A o G o C o U Para diferenciación entre los 2'-desoxirribonucleótidos y los ribonucleótidos se utilizan las siguientes abreviaturas: Para 2'-desoxirribonucleótidos: dG, dC, dT, dA y dU (ver figura 11 A y 11 B).
Para ribonucleótidos: G, C, T, U (ver figura 12).
Si no se indica lo contrario, cualquier secuencia de ácido nucleico o secuencia de extensiones, respectivamente, se indica en la dirección 5'? 3'.
Tal como se ilustra en las figuras 1 a 3, las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP comprenden una extensión central de nucleótidos que definen un motivo de enlace CGRP potencial, en donde la figura 1 (figura 1A y 1B) muestra las diferentes secuencias de la familia de secuencias y las figuras 2 a 3, muestran derivados de la molécula de ácido nucleico 226-F2-001.
En general, las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP comprenden en las extensiones terminales de nucleótidos del extremo 5' y el extremo 3': la primera extensión terminal de nucleótidos y la segunda extensión terminal de nucleótidos. La primera extensión terminal de nucleótidos y la segunda extensión terminal de nucleótidos pueden hibridar entre si, en donde al momento de la hibridación se forma una estructura de hebra doble. Sin embargo, dicha hibridación no se proporciona necesariamente en la molécula ¡n vivo y/o ¡n vitro.
Las tres extensiones de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP - la primera extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos y la segunda extensión terminal de nucleótidos - se ajustan entre si en la dirección 5' — > 3': la primera extensión terminal de nucleótidos -la extensión central de nucleótidos - la segunda extensión terminal de nucleótidos. Sin embargo, alternativamente, la primera extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos y la segunda extensión terminal de nucleótidos se ajustan entre si en la dirección 5' ? 3': la segunda extensión terminal de nucleótidos - la extensión central de nucleótidos - la primera extensión terminal de nucleótidos.
Las secuencias de las extensiones definidas pueden ser diferentes entre las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP que influencian la afinidad de enlace a CGRP, preferentemente alfa-CGRP humano. Con base en el análisis de las diferentes moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP, la extensión central de nucleótidos y sus secuencias de nucleótido tal como se describe a continuación, son individualmente, y más preferentemente en su totalidad, esenciales para el enlace a CGRP, preferentemente alfa-CGRP humano.
Las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP de acuerdo con la presente invención tal como se muestran en la figura 1A y 1B, consisten en ribonucleótidos. La molécula de ácido nucleico de enlace CGRP, 212-G1-001 tiene una afinidad de enlace con KD de 5.12 nM para alfa-CGRP humano (determinado mediante medida de resonancia de plasmón, ver Ejemplo 4). Las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001, 212-F1-001, 224-B2-001, 224-E1-001, 226-A2-002, 226-A3-001, 226-G2-002, 226-G1-002, 226-C2-002, 226-E1-002, 226-F1-001, 226-C3-001, 231-A1-001, 231-G2-001, 231-C1-001, 231-C2-001, 231-D1-001, 231-F1-001, 231-E1-001, 231-B3-001, 231-A2-001, 231-E2-001 y 231-H2-001, se probaron en un ensayo de despliegue de competición comparativo versus el ácido nucleico de enlace CGRP, 212-G1-001, con respecto a su capacidad de enlazar a alfa-CGRP humano (ver Ejemplo 3, figuras 1 A y 1 B).
Las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001, 226-A3-001, 226-C3-001, 231-A1-001, 231-C1-001, 231- C2-001, 231-F1-001, 231-E1-001, 231-A2-001 y 231-E2-001 mostraron mejor afinidad de enlace que 212-G1-001. Las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP, 212-F1-001, 224-B2-001, 224-E1-001 y 226-F1-001 mostraron una afinidad de enlace similar a 212-G1-001. Las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP 226-A2-002, 226-G2-002, 226-C2-002, 226-E1-002, 231-G2-001, 231-D1-001, 231-B3-001 y 231-H2-001 mostraron afinidad de enlace más débil que 212-G1-001 (figuras 1A y 1B).
Las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP, 212-G1- 001, 226-F2-001, 212-F1-001, 224-B2-001, 224-E1-001, 226-A2- 002, 226-A3-001, 226-G2-002, 226-C2-002, 226-E1-002, 226-F1-001, 226-C3-001, 231-A1-001, 231-G2-001, 231-C1-001, 231-C2-001, 231-D1-001, 231-F1-001, 231-E1-001, 231-B3-001, 231-A2-001, 231-E2-001 y 231-H2-001, consisten en ribonucleótidos, y comparten la secuencia 5' HWRUYGGAKACUMMBYNYNRVKKRGADAUARRUYCCBUCC 3' [SEQ ID NO: 95].
Las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001, 212-F1-001, 224-B2-001, 224-E1-001, 226-A3-001, 226-F1-001, 226-C3-001, 231-A1-001, 231-C1-001, 231-C2-001, 231-F1-001, 231-E1-001, 231-A2-001 y 231-E2-001 mostraron una afinidad de enlace similar o mejor a alfa-CGRP humano y que 212-G1-001, y comparten la secuencia 5' CUGUYGGAGACUMMUBDYHRVKKAGADAUAGGUYCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 96].
Las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001, 226-A3-001, 226-C3-001, 231-A1-001, 231-C1-001, 231-C2-001, 231-F1-001, 231-E1-001, 231-A2-001 y 231-E2-001 mostraron la mejor afinidad de enlace a alfa-CGRP humano y comparten la secuencia 5' CUGUCGGAGACUACUCRYHGRGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 97], en donde la secuencia 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 98] es la modalidad preferida de la misma.
Los inventores descubrieron sorprendentemente que la afinidad de enlace de la molécula de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001 a alfa-CGRP humano, se mejoró reemplazando los ribonucleótidos por 2'-desoxirribonucleótidos dentro de la secuencia de la extensión central de nucleótidos, y la primera y la segunda extensión terminal de nucleótidos. En particular, reemplazando hasta dos ribonucleótidos por 2'-desoxirribonucleótidos en la molécula de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001, se obtuvo como resultado una afinidad de enlace mejorada a alfa-CGRP humano tal como se determina mediante medida de resonancia de plasmón (por protocolo, ver Ejemplo 4. Con más detalle, los inventores encontraron sorprendentemente que: a) reemplazar un ribonucleótido por un 2'-desoxiribonucleótido en la posición 3, 4, 9, 11, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 25, 28, 29, 32, 34, 36, 37, 39 y 40 en la extensión central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001, dio como resultado una afinidad de enlace mejorada a CGRP humano en comparación con la afinidad de enlace de la molécula de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001 (ver figuras 3A, 3B, 3C y 3D; Espiegélmeros 226-F2-001 -D08, 226-F2-001 -D09, 226-F2-001-D14, 226-F2-001-D16, 226-F2-001 -D19, 226-F2-001 -D22, 226-F2-001-D23, 226-F2-001-D24, 226-F2-001 -D25, 226-F2-001-D26, 226-F2-001-D28, 226-F2-001 -D30, 226-F2-001 -D33, 226-F2-001-D34, 226-F2-001-D37, 226-F2-001 -D39, 226-F2-001-D41, 226-F2-001-D42, 226-F2-001 -D44, 226-F2-001 -D45, 226-F2-001-dU-20 y 226-F2-001 -dU-28); b) reemplazar un ribonucleótido por un 2'-desoxiribon ucleótido en la posición 3 o 5 o en la primera extensión terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001, se obtuvo como resultado una afinidad de enlace mejorada con CGRP humano en comparación con la afinidad de enlace de la molécula de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001 (ver figura 3A; Espiegélmeros 226-F2-001 -D03 y 226-F2-011 -D05); c) reemplazar un ribonucleótido por un 2'-desoxiribonucleótido en una posición en la segunda extensión terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001, dio como resultado afinidad de enlace mejorada a CGRP humano en comparación con la afinidad de enlace de la molécula de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001 (ver figuras 3 A y 3C; Espiegélmeros 226-F2-001-D46, 226-F2-001-D47, 226-F2-001 -D48, 226-F2-001-D49, 226- F2-001-D50); d) reemplazar dos ribon ucleótidos por dos 2'-desoxirribonucleótidos en la posición 36 y 39 o en la posición 36 y 15 o en la posición 36 y 23 en la extensión central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001, se obtuvo como resultado una afinidad de enlace incrementada CGRP humano en comparación con la afinidad de enlace de la molécula de ácido nucleico de enlace CGRP 226-F2-001 (ver figuras 3A, 3C y 3D; Espiegélmeros 226-F2-001-D41/44, 226-F2-001-D41-dU-20 y 226-F2-001 -D41 -dU28); e) reemplazar tres ribon ucleótidos por tres 2'-desoxirribonucleótidos en la posición 36, 39 y 15 o en la posición 36, 39 y 23 en la extensión central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001, se obtuvo como resultado una afinidad de enlace mejorada a CGRP humano en comparación con la afinidad de enlace de la molécula de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001 (ver figura 3D; Espiegélmeros 226-F2-001 -D41 /D44-dU20, 226-F2-001-D41/D44-dU28).
Con base en los datos mostrados, ya que el reemplazo de ribonucleótidos por 2'-desoxirribonucleótidos en diversas posiciones de la extensión central de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP conduce a un enlace incrementado a alfa-CGRP humano, la extensión central de todas las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP probadas puede ser resumida en la siguiente fórmula genérica 5' HWn1n2YGGAn3An4UMn5n6Yn7n8n9n1on1 Kn12Rn13ADn14n15AGn16U n17Cn18n19Un2on2i 3' [SEQ ID NO: 99], en donde H, W, Y, G, A, U, M, B, K, R, D, C son ribonucleótidos, y n, es R o dG, n2 es U o dT, n3 es K o dG, n4 es C o dC, n5 es M o dC, n6 es B o dU, n7 es N o dG, n8 es Y o dT, n9 es N o dC, n10 es R o dG, nn es V o dA, n12 es K o dT o dU, ??3 es G o dG, n14 es A o dA, n15 es U o dT, n16 es R o dG, n 7 es Y o dC, n18 es C o dC, n 9 es B o dC, n2o es C o dC, n2i es C o dC, y dG, dT, dC, dA y dU son 2'-desoxirribonucleótidos.
La fórmula genérica 5' CUn2n2YGGAn3An4UMn5n5Bn7n8n9n1on11Kn12An13ADn14n15AGn16U n17Cn18n19Un2on2i 3' [SEQ ID NO: 100] resume las secuencias de las extensiones centrales de las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001, y derivados de los mismos, 212-F1-001, 224-B2-001, 224-E1-001, 226-A3-001, 226-F1-001, 226-C3-001, 231-A1-001, 231-C1-001, 231-C2-001, 231-F1-001, 231-E1-001, 231-A2-00 y 231-E2-001 que mostraron una afinidad de enlace similar o mejor a alfa-CGRP humano que 212-G1-001, en donde C, U, Y, G, A, M, B, Y, H, K, D, R y V son ribonucleótidos, y n, es G o dG, n2 es U o dT, n3 es G o dG, n4 es C o dC, n5 es M o dC, n6 es B o dU, n7 es D o dG, n8 es Y o dT, n9 es H o dC, n10 es R o dG, n1( es V o dA, n12 es K o dT o dU, n13 es G o dG, n14 es A o dA, n 5 es U o dT, n16 es G o dG, n17 es Y o dC, n18 es C o dC, n19 es C o dC, n2o es C o dC, n2i es C o dC, y dG, dT, dC, dA y dU son 2'-desoxirribonucleótidos.
La fórmula genérica 5' CUn1n2CGGAn3An4UAn5n6Cn7n8n9n1on11Gn12An 3AAn14n15AGn16U ni7Cn18n19Un2on2i 3' [SEQ ID NO: 101] resume las secuencias de las extensiones centrales de las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP con la mejor afinidad de enlace para CGRP ( Espiegélmero 226-F2-001 y derivados del mismo, y los Espiegélmeros 226-A3-001, 226-C3-001, 231-A1-001, 231-C1-001, 231-C2-001, 231-F1-001, 231-E1-001, 231-A2-001 y 231-E2-001) en donde C, U, Y, G, A, H y R son ribonucleótidos, y ?t es G o dG, n2 es U o dT, n3 es G o dG, n4 es C o dC, n5 es C o dC, n6 es U o dU, n7 es R o dG, n8 es Y o dT, n9 es H o dC, n10 es G o dG, n-n es R o dA, n12 es U o dT o dU, n 3 es G o dG, n14 es A o dA, n 5 es U o dT, n16 es G o dG, n17 es C o dC, n18 es C o dC, n19 es C o dC, n20 es C o dC, n21 es C o dC, y dG, dT, dC, dA y dU son 2'-desoxirribonucleótidos.
Las extensiones centrales de nucleótidos de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001, y sus derivados que muestran, debido al reemplazo de ribonucleótidos por 2'-desoxirribonucleótidos en diversas posiciones de la extensión central de nucleótidos, un enlace mejorado a CGRP en comparación con 226-F2-001, se pueden resumir en la siguiente fórmula genérica: 5' CUn1n2CGGAn3An4UAn5n6Cn7n8n9n on 1Gni2An13Aan14n 5AGn16U n17Cn18n19Un2on2i 3' [SEQ ID NO: 102] en donde C, U, G, A, son ribonucleótidos, y n, es G o dG, n2 es U o dT, n3 es G o dG, n4 es C o dC, n5 es C o dC, n6 es U o dU, n7 es G o dG, n8 es U o dT, n9 es C o dC, n10 es G o dG, n„ es A o dA, n12 es U o dT o dU, n13 es G o dG, n14 es A o dA, n15 es U o dT, n16 es G o dG, n 7 es C o dC, n18 es C o dC, ?1? es C o dC, n2o es C o dC, n2i es C o dC, y dG, dT, dC, dA y dU son 2'-desoxirribonucleótidos, en donde en una modalidad preferida, la extensión central de nucleótidos comprende la secuencia: (1) 5* CUdGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 103], (2) 5' CUGdTCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3 [SEQ ID NO: 104], (3) 5 CUGUCGGAdGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3 [SEQ ID NO: 105], (4) 5 CUGUCGGAGAdCUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3 [SEQ ID NO: 106], (5) 5 CUGUCGGAGACUAdCUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3 [SEQ ID NO: 107], (6) 5 CUGUCGGAGACUACUCdGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3 [SEQ ID NO: 108], (7) 5 CUGUCGGAGACUACUCGdTCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3 [SEQ ID NO: 109], (8) 5 CUGUCGGAGACUACUCGUdCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3 [SEQ ID NO: 110], (9) 5 CUGUCGGAGACUACUCGUCdGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3 [SEQ ID NO: 111], (10) 5 CUGUCGGAGACUACUCGUCGdAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3 [SEQ ID NO: 112], (11) 5' CUGUCGGAGAC UAC UCGUCGAGdTAGAAAUAGGUCCCC UCC 3' [SEQ ID NO: 113], (12) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAdGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 114] (13) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAdAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 115] (14) 5' CUGUCGGAGAC UAC UCGUCGAGUAGAAAdTAGGUCCCC UCC 3' [SEQ ID NO: 116], (15) 5* CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGdGUCCCCUCC 3* [SEQ ID NO: 117], (16) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUdCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 118], (17) 5' CUGUCGGAGAC UAC UCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdCC UCC 3' [SEQ ID NO: 119], (18) 5" CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCdCUCC 3' [SEQ ID NO: 120], (19) 5' C UG U C GG AG ACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCC CC UdCC3' [SEQ ID NO: 121], (20) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCdC 3" [SEQ ID NO: 122], (21) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdCCUdCC 3' [SEQ ID NO: 123], (22) 5' CUGUCGGAGACUACdU.CGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdC.CUCC 3' [SEQ ID NO: 130], (23) 5" CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGdU.AGAAAUAGGUCCdC.CUCC 3* [SEQ ID NO: 131], (24) 5" CUGUCGGAGACUACdlJCGUCGAGdU.AGAAAUAGGUCCdC.CUCC 3' [SEQ ID NO: 132], (25) 5' CUGUCGGAGACUACdUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdCCUdCC 3' [SEQ ID NO: 133], (26) 5' CUGUCGGAGACUAC UCGUCGAGdUAGAAAUAGGUCCdCCUdCC 3' [SEQ ID NO: 134], (27) 5' CUGUCGGAGACUACdJJCGUCGAGdU.AGAAAUAGGUCCdC.CUdC. C 3' [SEQ ID NO: 90], en donde en una modalidad más preferida, la extensión central de nucleótidos comprende la secuencia: 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdCCUCC 3' (ver Espiegélmero 226-F2-001 -D41 , [SEQ ID NO: 119]), o 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdCCUdCC 3' (ver Espiegélmero 226-F2-001 -D41 /44, [SEQ ID NO: 123]), o 5* CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGdU.AGAAAUAGGUCCdC.CUCC 3' (ver Espiegélmero 226-F2-001 -D41 -dU28, [SEQ ID NO: 131].
La primera y la segunda extensiones terminales de las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP de la presente invención comprenden cuatro, cinco, seis o siete nucleótidos (figura 1 a figura 3), en donde las extensiones se hibridan opcionalmente entre sí, en donde el momento de la hibridación se forma una estructura de hebra doble. Esta estructura de hebra doble puede consistir de uno a siete pares base. Sin embargo, dicha hibridación no es proporcionada necesariamente en la molécula in vivo y ¡n vitro.
Analizando la primera extensión terminal de nucleótidos y la segunda extensión terminal de nucleótidos de todas las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP probadas, la fórmula genérica para la primera extensión terminal de nucleótidos es ?1?2?33?4???5 3', y la fórmula genérica para la segunda extensión terminal de nucleótidos es 5' ?ß???ß??? 1 oZ 11 Z 12 3', en donde Z, es S o está ausente, Z2 es V o está ausente, Z3 es B o está ausente, Z4 es V o dG, Z5 es G o dG, Z6 es Y o dC, Z7 es W o dA, Z8 es B o dC, Z9 es S o dG, Z10 es S o dG o está ausente, Z,, es B o está ausente, Z12 es K o está ausente, y en donde S, W, V, B, Y y K son ribonucleótidos, y dG, dC y dA son 2'-desoxirribonucleótidos, en donde en una modalidad preferida, a) ZT es S, Z2 es V, Z3 es B, Z 0 es S o dG, Zn es B, Z 2 es K, b) ? está ausente, Z2 es V, Z3 es B, Z10 es S o dG, Zn es B, Zi2 es K, c) ?t es S, Z2 es V, Z3 es B, Z10 es S o dG, Z es B, Z12 está ausente, d) ? está ausente, Z2 es V, Z3 es B, Z10 es S o dG, Zn es B, Z12 está ausente, e) ?? está ausente, Z2 está ausente, Z3 es B, Z 0 es S o dG, Zn es B, Z12 está ausente, f) ZT está ausente, Z2 es V, Z3 es B, Z10 es S o dG, Zn está ausente, Zi2 está ausente g) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 es B, Zi0 es S o dG, Z está ausente, Z12 está ausente. h) ?! está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z10 es S o dG, Z está ausente, Z12 está ausente, i) ?? está ausente, Z2 está ausente, Z3 es B, Z10 está ausente, Zn está ausente, Z12 está ausente j) ?? está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z 0 está ausente, Z está ausente, Zi2 está ausente.
Las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP que comprenden la primera y segunda extensión terminal que consiste en ribonucleótidos, comprenden la siguiente combinación de primera y segunda extensiones terminales: a) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACCGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGGUG 3'; o b) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GGCCGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGGCU 3'; o c) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GUCAUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGGC 3*; o d) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCCAUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CAUGGC 3'; o e) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCCGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGGC 3'; o f) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCCGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGGG 3'; o g) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGC 3*; o h) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GGGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACCC 3'; o i) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCCUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CAGGC 3'; o j) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5* CACG 3'; o k) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' UACG 3'; o I) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCAG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUGC 3'.
Las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP que comprenden una primera y segunda extensión terminal que consiste en ribonucleótidos y 2'-desoxinucleótidos, comprende la siguiente combinación de primeras y segundas extensiones terminales: la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCZ4UZ5 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' ZeZyZsZgZ^ 3', o en donde C, G, A y U son ribonucleótidos, y Z4 es G o dG, Z5 es G o dG, Z6 es C o dC, Z7 es A o dA, Z8 es C o dC, Z9 es G o dG, Z10 es G o dG, dC, dG y dA son 2'-desoxirribonucleótidos, en donde en una modalidad preferida, a) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGG 3'; o b) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCdGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGG 3'; o c) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUdG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGG 3'; o d) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' dCACGG 3'; o e) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CdACGG 3'; o f) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CAdCGG 3'; o g) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACdGG 3'; o h) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3', y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGdG 3'.
La afinidad de enlace de los Espiegélmeros de enlace CGRP, 212-G1-001, 226-F2-001, 226-F2-001 -D41 , 226-F2-001-D44, 226-F2-001-D41/D44 y 226-F2-001 -D41 -dU28 a alfa-CGRP humano, expresados como KD, se determinó mediante medición de resonancia de plasmón (Ejemplo 4, figura 4, 5, 6 y 13): 212-G1-001 : KD de 5.12 nM, 226-F2-001: KD de 2.62 nM, 226-F2-001-D41 : KD de 0.55 nM, 226-F2-001-D44: KD de 0.52 nM, 226-F2-001-D41/D44: KD de 0.2 nM, 226-F2-001-D41-dU28: KD de 0.07 nM 226-F2-001-D41-dU28: KD de 0.21 nM.
Las moléculas de enlace de CGRP, 212-G1-001 y 226-F2-001 comparten la extensión central de nucleotidos idéntica (ver figura 1A). Tal como se muestra mediante medida de afinidad (ver anteriormente) una primera y segunda extensión terminal con cinco nucleotidos (ver 226-F2-001) en lugar de cuatro nucleotidos (ver 212-G1-001) conduce a una mejoría significativa de la afinidad de enlace a CCRP humano.
Además, tal como se muestra anteriormente y en las figuras 4, 5, y 6, el reemplazo de uno (ver 226-F2-001 -D41 y 226-F2-001-D44) o dos ribonucleótido(s) (ver 226-F2-001-D41/D44) por 2 -desoxiribonucleótido(s) en la molécula de enlace CGRP, 226-F2-001 conduce a una mejoría significativa de la afinidad de enlace a alfa-CCRP humano.
En general, se modificaron los Espiegélmeros con una porción PEG para su uso in vivo. Las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001 y 226-F2-001 -D4 , se sintetizaron como Espiegélmeros que comprenden un grupo amino en su extremo 5'. Para los Espiegélmeros modificados por amino, se acopló una porción PEG 40kDa que conduce a los Espiegélmeros de enlace CGRP, 226-F2-001 -5*-40kDa-PEG y 226-F2-001-D41-40kDa-PEG (también referidos como NOX-L41). La síntesis y PEGilación de Espiegélmero se describe en el Ejemplo 2. La modificación PEG de las moléculas de ácido nucleico de enlace CGRP, 226-F2-001 y 226-F2-001 -D41 , no tuvo influencia en el enlace y función de los Espiegélmeros (ver más adelante).
Las moléculas de enlace CGRP, 212-G1-001 , 226-F2-001, 226-F2-001-5'-40kDa-PEG y 226-F2-001 -D41 -5'40kDa-PEG (también referidas como NOX-L41) tienen la capacidad de antagonizar la función de CGRP humano a su receptor in vitro, con la siguiente IC5o (Ejemplo 5, figuras 7 A y 7B): 212-G1-001 : IC50 de 8.7 nM, 226-F2-001 : IC50 de 3.5 nM, 226-F2-001-5'40kDaPEG: IC50 de 3.8 nM, 226-F2-001-D41-5'40kDa-PEG: IC50 de 0.39 nM.
De acuerdo con las medidas de afinidad (ver anteriormente), una primera y segunda extensión terminal con cinco nucleótidos (ver 226-F2-001) en lugar de cuatro nucleótidos (ver 212-G1-001) conduce a una inhibición significa más fuerte de la función de alfa-CCRP humano (figura 7A).
Además, tal como se muestra anteriormente y en la figura 7B, el reemplazo de un ribonucleótido por 2-desoxiribonucleótido (226-F2-001 -5'-40kDa-PEG y NOX-L41, también referido como 226-F2-001 -D41 -5'40kDa-PEG) conduce a una inhibición significativamente más fuerte de la función de alfa-CCRP humano (ver figura 7B).
Ejemplo 2: Síntesis y Derivación de Aptámeros y Espiegélmeros Síntesis a pequeña escala Se produjeron aptámeros (ácidos nucleicos D-ARN o ácidos de D-ARN modificados por D-ARN) y Espiegélmeros (ácidos nucleicos L-ARN o ácidos nucleicos L-ARN modificados por L-ARN) mediante síntesis de fase sólida con un sintetizador A B I 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) utilizando química de fosforoamidita de ARN y ADN 2'TBDMS con grupos de protección amina exocíclicos estándar (Damha and Ogilvie, 1993). Para la parte de ARN del oligonucleótido, se utilizaron fosforoamiditas rA(N-Bz)-, rC(N-Ac)-, rG(N-ibu)- y rU- en la configuración D- y L-, mientras que para la parte de ADN se aplicaron dA(N-Bz)-, dC(N-Ac)-, dG(N-ibu)-, dT y dU en la configuración D y L. Todas las fosforoamiditas se compraron en ChemGenes, Wilmington, MA. Después de la síntesis y desprotección, los aptámeros y Espiegélmeros son purificados mediante electroforesis de gel.
Síntesis a gran escala más modificación Se produjeron Espiegélmeros mediante síntesis de fase sólida con un sintetizador ÁktaPilotlOO (GE Healthcare, Freiburg) utilizando química de fosforoamidita de ARN y ADN 2'TBDMS con grupos de protección amina exocíclicos estándar (Damha and Ogilvie, 1993). Se compraron fosforoamiditas L-rA(N-Bz)-, L-rC(N-Ac)-, L-rG(N-ibu)-, L-rU-, L-dA(N-Bz)-, L-dC(N-Ac)-, L-dG(N-ibu)- y L-dT- en ChemGenes, Wilmington, MA. El modificador 5'-amino se compró en American International Chemicals Inc. (Framingham, MA, USA). La síntesis del Espiegélmero no modificado o modificado por 5'-Amino se inició en tamaño de poro CPG modificado por L-riboG, L-riboC, L-riboA o L-riboU de 1000 Á (Link Technology, Glasgow, RU). Para el acoplamiento (15 minutos por ciclo), se utilizó 0.3 M benciltiotetrazol (CMS-Chemicals, Abingdon, RU) en acetonitrilo, y 3.5 equivalentes de la solución de 0.1 M fosforamidita respectiva en acetonitrilo. Se utilizó un ciclo de nivelación-oxidación. Los solventes y reactivos estándares adicionales para la síntesis de oligon ucleótido se compraron en Biosolve (Valkenswaard, NL). Se sintetizó el Espiegélmero DMT-ON; después de la desprotección, se purificó mediante RP-HPLC de preparación (Wincott et al., 1995) utilizando el medio Sourcel5RPC (Amersham). El grupo 5'DMT se eliminó con ácido acético al 80% (30 minutos a temperatura ambiente). Subsecuentemente, se agregó una solución acuosa de 2 M NaOAc y el Espiegélmero se decantó mediante filtración de flujo tangencial utilizando una membrana de celulosa regenerada 5 K (Millipore, Bedford, MA).
PEGilación de Espiegélmeros Con el objeto de prolongar in vivo el tiempo de residencia en plasma de Espiegélmero, los Espiegélmeros fueron acoplados en forma covalente a una poción de polietilenglicol (PEG) 40 kDa en el extremo 5'.
Para PEGilación (para detalles técnicos del método para PEGilación consultar la Solicitud de Patente Europea EP 1 306 382), se disolvió el Espiegélmero modificado por 5'-amino purificado en una mezcla de H20 (2.5 mi), DMF (5 mi), y de amortiguador A (5 mi; preparado mezclando ácido cítrico · H20 [7 g], ácido bórico [3.54 g], ácido fosfórico [2.26 mi], y 1 M NaOH [343 mi] y agregando agua a un volumen final de 1 I; el pH = 8.4 se ajustó con HCI 1 M).
El pH de la solución del Espiegélmero se llevó a 8.4 con 1 M NaOH. Posteriormente, se agregó éster de PEG-NHS de 40 kDa (Jenkem Technology, Alien, TX, E.U.A.) a una temperatura de 37°C cada 30 minutos en seis porciones de 0.25 equivalentes hasta que se alcanzó un rendimiento máximo del 75 al 85%. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo en 8 a 8.5 con NaOH 1 M durante la adición del éster PEG-NHS.
La mezcla de reacción se combinó con 4 mi de solución de urea (8 M), y 4 mi de amortiguador B (0.1 M de acetato de trietilamonio en H20) y se calentó a una temperatura de 95°C durante 15 minutos. Posteriormente se purificó el Espiegélmero PEGilado mediante RP-HPLC con un medio Source 15RPC (Amersham), utilizando un gradiente de acetonitrilo (amortiguador B; amortiguador C: acetato de trietilamonio 0.1 M en acetonitrilo). PEG en exceso eluido en el amortiguador C AL 5%, Espiegélmero PEGilado en amortiguador C al 10 a 15%. Las fracciones del producto con una pureza de >95% (tal como se evalúa mediante HPLC) se combinaron y mezclaron con 40 mi de NaOAc 3 M. El Espiegélmero PEGilado se decantó mediante filtración de flujo tangencial (membrana de celulosa regenerada 5 K, Millipore, Bedford MA).
Ejemplo 3: Clasificación de Aptámeros de enlace D-alfa-CGRP mediante Ensayo de Enlace de Despliegue Competitivo Se utilizó un ensayo de enlace de despliegue para la calificación comparativa de un conjunto de diferentes aptámeros de prueba. Para este propósito, los aptámeros no etiquetados compitieron con un aptámero de referencia etiquetado para enlazar a D-CGRP biotinilado, para disminuir de esta forma la señal de enlace de acuerdo con la afinidad de los aptámeros de prueba a D-CGRP. El apt mero de referencia fue etiquetado en forma radioactiva en el extremo 5' mediante la quinasa de polinucleótido T4 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), utilizando ATP etiquetado con [?-32?] (Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemania) a una radioactividad específica de 400000 - 800000 cpm/pmol. Las reacciones de enlace se llevaron a cabo a una temperatura de 37°C con 150 pM del aptámero de referencia etiquetado en forma radioactiva junto con una cantidad constante de 10 a 20 nM de D-CGRP biotinilado en 360 µ? de amortiguador de selección (20 mM Tris-HCI pH 7.4; 150 mM NaCI; 5 mM KCI; 1 mM MgCI2; 1 mM CaCI2; 0.1% [p/vol] Tween-20; 10 g ml HSA; 10 pg/ml ARN de levadura) durante 2 a 4 horas. Estas condiciones dieron como resultado de aproximadamente 5 a 10% de enlace del aptámero de referencia a D-CGRP biotinilado después de la inmovilización y se lavó en agarosa de NeutrAvidin o Streptavidin Ultralink Plus (ambos de Pierce Biotechnology , Rockford, EUA). Para competición, se agregaron aptámeros de prueba no etiquetados en 5 nM, 50 nM y 500 nM junto con la cantidad constante del aptámero de referencia etiquetado para las reacciones de enlace. Al término del enlace, inmovilización, lavado adecuado y determinación de radioactividad inmovilizada con el contador de centelleo, se encontró que el aptámero más activo en la prueba, sirvió posteriormente como una nueva referencia para análisis comparativo de las variantes de aptámero adicionales. Los resultados se muestran en las figuras 1A a B.
Ejemplo 4: Medida Biacore de Espiegélmeros que enlazan a CGRP y péptidos relacionados Preparación de ensayo Se inmovilizaron CGRP humano y péptidos relacionados mediante procedimiento de acoplamiento de amina en una carbodiimida carboximetilada en un chip de sensor recubierto con dextrano ca rboximetilado (abreviatura CM) utilizando una mezcla 1:1 de 0.4 M EDC (1 -etil-3-(3-dimetilaminopropilo) en H20; GE, BR-1000-50) y 0.1 NHS (N-hidroxisuccinimida en H20; GE, BR-1000-50). La célula de flujo de referencia en el mismo chip de sensor fue bloqueada con biotina.
Evaluación cinética general Se disolvieron los Espiegélmeros de enlace CGRP en agua para una concentración de reserva de 100 µ? (cuantificación mediante medida de absorción en 260 nm), se calentó a una temperatura de 95°C durante 30 segundos en un baño de agua o mezclador térmico y se enfriaron en forma instantánea sobre hielo para asegurar que la solución se disolviera en forma homogénea.
Se evaluaron los parámetros cinéticos y las constantes de disociación a través de una serie de inyecciones de Espiegélmero en concentraciones de 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 7.8, 3.9, 1.95 y 0 nM en concentraciones de 500-250-125-62.5-31.3-15.6-7.8(2x)-3.9-1.95-0.98-0.48-0 nM diluidos en amortiguador de corrida. En todos los experimentos, el análisis se llevó a cabo a una temperatura de 37°C utilizando el comando de Kinject que define un tiempo de asociación de 240 a 360 y un tiempo de disociación de 240 a 360 segundos en un flujo de 30 µ?/min. El ensayo fue referenciado en forma doble, mientras que FCI sirvió como un control de superficie (bloqueado) (contribución de volumen de cada concentración de Espiegélmero) y una serie de inyecciones de amortiguador sin material para análisis determinó la contribución en volumen del propio amortiguador. Se llevó a cabo el análisis de datos y el cálculo de la constante de disociación KD con un software BIAevaluation 3.1.1 (Bl ACORE AB, Uppsala, Suecia) utilizando un algoritmo de ajuste estequiométrico 1:1 Langmuir.
Se llevó a cabo el análisis de datos y el cálculo de la constante de disociación KD con el software BIAevaluation (BIACORE AB, Uppsala, Suecia) utilizando un algoritmo de ajuste estequiométrico 1:1 Langmuir, con una Rl constante y una evaluación de transferencia de masa con un coeficiente de transporte de masa kt de 1 x 107 [RU/M*s]. Los resultados se muestran en las figuras 3A a D, 4 a 6, 9 y 13).
Ejemplo 5: Inhibición de producción de cAMP inducida por alfa-CGRP en células de neuroblastoma humano La eficacia biológica de los Espiegélmeros de enlace CGRP se analiza a continuación.
Se sembraron células de neuroblastoma humano SK-N-MC (ACC203, DSMZ, Braunschweig) en 5x10e4 células/depósito en una placa de 96 depósitos de fondo plano (Greiner) y se cultivaron durante 48 horas a una temperatura de 37°C y condiciones de 5% C02 en 100 µ I en DMEM (1000mg/L glucosa, Invitrogen) suplementado con 10% de suero de becerro fetal desactivado por calor (FCS), 4 mM de L-alanil-L-glutamina (GLUTAMAX), 50 unidades/ml de Penicilina y 50 pg/ml de Estreptomicina.
Se prepararon soluciones de estimulación (1nM de L-alfaCGRP de humano o rata (Bachem) + concentraciones en incremento de Espiegélmero) como triplicados en HBSS (Gibco) suplementado con 1mg/ml de BSA y 20mM de HEPES utilizando placas de 96 depósitos con fondo de v de bajo perfil de 0.2 mi y se incubaron a una temperatura de 37°C durante 60 minutos en total. Se incluyeron como triplicados valores en blanco (sin L-alfaCGRP, sin Espiegélmero) y valores de control (1nM L-alfaCGRP, sin Espiegélmero). 20 minutos antes del estímulo, se agregó 1mM de inhibidor de fosfodiesterasa 3-lsobutil-1 -metilxantina (IBMX, Sigma; 50mM de reserva en DMSO diluido en HBSS/BSA/HEPES) a las células y las soluciones de estímulo.
Para el estímulo, se eliminó el medio de cultivo celular de las células y se sustituyó por 100µ? de solución de estímulo incubada previamente. Las células se estimularon durante 30 minutos a una temperatura de 37°C, condiciones 5% C02.
Después de la eliminación de las soluciones de estímulo, las células se Usaron mediante la adición de 50pl/depósito de amortiguador de ensayo/lisis (equipo Tropix cAMP-ScreenTM System, Applied Biosystems) durante 30minutos a una temperatura de 37°C.
La cantidad de cAMP producido por depósito se midió subsecuentemente utilizando el equipo Tropix cAMP-Screen™ ELISA System (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En síntesis, se preparó una curva estándar en amortiguador de ensayo/lisis fluctuando de 6nmol a 0.6pmol cAMP/depósito. Los lisados celulares diluidos en amortiguador de ensayo/lisis y las curvas estándar se agregaron a microplacas cubiertas previamente con IgG anticonejo de cabra. Se agregaron conjugado de fosfatasa alcalina cAMP y anticuerpo anti-cAMP a las muestras y se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Subsecuentemente las placas se lavaron y se agregó substrato quimioluminiscente. Después de 30 minutos, se midió la quimioluminiscencia en una unidad de lector de placa óptima FLUOstar (BMG Labtech). El sistema ELISA cAMP-Screen™ es un formato de inmunoensayo competitivo. Por lo tanto, la intensidad de señal de luz es inversamente proporcional al nivel de cAMP en la muestra o preparación estándar. Este sistema de ensayo se utilizó para probar Espiegélmeros dentro del alcance de los Ejemplos 1 y 7 aquí descritos. El resultado se ilustra en las figuras 7 y 8. Las cantidades de cAMP producido se proporciona como porcentaje del control. La concentración del Espiegélmero requerida para el 50% de inhibición de la producción cAMP relativa al control, define la constante de inhibición IC50. Los resultados se muestran en las figuras 7A y 7B.
Ejemplo 6: Inhibición de producción cAMP inducida por amilina Se analizó como se indica a continuación la reactividad cruzada de los Espiegélmeros de enlace CGRP a amilina humana o de rata.
Se sembraron células de cáncer de mama humano CF-7 (ACC115, DSMZ, Braunschweig) en 5x10e4 células/depósito en una placa de 96 depósitos de fondo redondo (Greiner) y se cultivaron durante 24 horas a una temperatura de 37°C y en condiciones 5% C02 en 100µ I en DMEM (1000mg/L glucosa, Invitrogen) suplementado con 10% de suero de becerro fetal desactivado por calor (FCS), 4 mM de L-alanil-L-glutamina (GLUTAMAX ), 50 unidades/ml de Penicilina y 50 g/ml de Estreptomicina.
Las soluciones de estímulo (3nM de L-amilina de humano o rata (Bachem) más las concentraciones en incremento de Espiegélmero) se prepararon por triplicado en HBSS (Gibco) suplementado con 1mg/ml de BSA y 20mM de HEPES utilizando placas de 96 depósitos con fondo v de bajo perfil de 0.2 mi y se incubaron a una temperatura de 37°C durante 60 minutos en total. Se indujeron por triplicado valores en blanco (sin L-amilina, sin Espiegélmero) y valores de control (1nM L-amilina, sin Espiegélmero). 20 minutos antes del estímulo se agregaron 3-lsobutil-1 -metilxantina de inhibidor de fosfodiesterasa (IBMX, Sigma; 50mM reserva en DMSO diluido en HBSS/BSA/H EPES) a las células y la solución de estímulo.
Para el estímulo, se eliminó el medio de cultivo celular de las células y se sustituyó por 100 I de solución de estímulo incubada previamente. Las células se estimularon durante 30 minutos a una temperatura de 37°C, condiciones 5% C02. Después de la eliminación de las soluciones de estímulo, las células se Usaron mediante la adición de d?µ?/depósÍto de amortiguador de lisis (equipo Tropix cAM P-ScreenTM System, Applied Biosystems) durante 30 minutos a una temperatura de 37°C.
La cantidad de cAMP producida por depósito se midió subsecuentemente utilizando el equipo Tropix cAMP-Screen™ ELISA System (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, tal como se describe brevemente anteriormente.
Este sistema de ensayo se utilizó para probar Espiegélmeros dentro del alcance del Ejemplo 7 aquí descrito. El resultado se ilustra en la figura 10. Las cantidades de cAMP producido se proporcionan como porcentaje del control. La concentración de Espiegélmero requerida para el 50% de inhibición de la producción cAMP relativa al control, define la constante de inhibición IC50.
Ejemplo 7: Discriminación de Espiegélmero de enlace CGRP NOX-L41 entre CGRP y amilina La figura 9, muestra la alineación de los péptidos amidados en forma C-terminal, alfa-CGRP de humano, alfa-CGRP de rata, amilina de humano y amilina de rata. Los cuatro péptidos tienen un puente de disulfuro Cys2-Cys7 conservado.
El Espiegélmero NOX-L41 (también referido como 226-F2- 001 -D41 -5'40kDa-PEG) y su forma no pegilada, 226-F2-001-D41, diferencian entre estos péptidos relacionados en forma cercana y enlazan en forma selectiva a alfa-CGRP de humano y rata. NOX-L41 inhibe la producción cAMP inducida por alfa-CGRP humano con una IC50 de 0.39 nM (figura 9). En contraste, la activación celular mediante amilina humana no fue inhibida por NOX-L41 en concentraciones de hasta 1 µ? (figura 10). Un Espiegélmero de enlace de amilina (secuencia: 5'-40kDa-PEG- GGACUGAUGGCGCGGUCCU AUUACGCCGAUAGGGUGAGGGGA, [SEQ ID NO: 135]), inhibe la producción cAMP inducida por amilina humana (figura 10). De acuerdo con esto, no se detectó enlace de 226-F2-001 -D41 a amilina humana mediante la medida Biacore cinética (figura 9). La afinidad (KD) de 226-F2-001 -D41 a CGRP humano fue de 0.55 nM (figura 9). Por lo tanto, NOX-L41 diferencia entre alfa- CGRP humano y amilina humana con un factor de más de mil. La discriminación entre alfa-CGRP de rata y amilina humana es menos pronunciada con una IC50 de 3.6 nM y 283 nM, respectivamente, que corresponde al factor de discriminación mayor a 75 (figura 9).
A partir de la relación de las concentraciones de inhibición y las afinidades, se puede deducir cuales residuos de aminoácido pueden estar implicados en el enlace de Espiegélmero.
Se inhibió la amilina de rata mediante NOX-L41 con una IC50 medible, mientras que no fue detectable la inhibición de amilina humana (figura 9 y 10). Existen únicamente residuos de aminoácido que son diferentes en amilina de rata y humano, es decir los residuos de aminoácido 18 y 29. El cambio respectivo de amilina humana es de R18H y P29S. Por lo tanto, ya sea R18 o P29, o ambos son parte del epítope de enlace mínimo. En el caso de P29 también es posible que la flexión inducida por prolina en los esqueletos de péptidos sea necesario para un reconocimiento adecuado de los residuos conservados por los vecinos. A partir de la literatura se sabe que son aptámeros de ácido nucleico, preferentemente argininas objetivo. Además, los epítopes de las moléculas objetivos enlazados por aptámeros normalmente comprenden más de un aminoácido con múltiples contactos débiles que contribuyen a la afinidad general. Por consiguiente, esto también es el caso en donde R18 juega un papel central en el enlace de Espiegélmeros con residuos adyacentes que contribuyen al evento del enlace que explica el enlace más débil a amilina de rata en comparación con CGRPs. Referencias Los datos bibliográficos completos de los documentos aquí mencionados cuya descripción está incorporada a la presente invención como referencia, si no se indica lo contrario, son como se indican a continuación.
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Las características de la presente invención descritas en la especificación, las reivindicaciones y/o los dibujos pueden ser tanto por separado como en cualquier combinación, material para llevar a cabo la presente invención en sus diversas formas.

Claims (54)

REIVINDICACIONES
1. Un ácido nucleico con la capacidad de enlazar a CGRP, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una extensión central de nucleótidos, en donde la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleotido de 5" HWn! n2YGGAn3An4UMn5n6Yn7n8n9n1on1 t Kn 2Rn13ADn1 n15ARn16U n17Cn18n19Un2on2i 3' [SEQ ID NO: 99], en donde H, W, Y, G, A, U, M, B, K, R, D, C son ribonucleótidos, y n1 es R o dG, n2 es U o dT, n3 es K o dG, n4 es C o dC, n5 es M o dC, n6 es B o dU, n7 es N o dG, n8 es Y o dT, n9 es N o dC, n10 es R o dG, n-n es V o dA, n 2 es K o dT o dU, n13 es G o dG, n 4 es A o dA, n15 es U o dT, n16 es R o dG, n17 es Y o dC, n1s es C o dC, n19 es B o dC, n2o es C o dC, n2i es C o dC, y dG, dT, dC, dA y dU son 2'-desoxirribonucleótidos.
2. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleotido de 5' CUn1n2YGGAn3An4UMn5nsBn7n8n9n1o 1Kn12An13ADn14n 5AGn16U n17Cn18n19Un20n21 3' [SEQ ID NO: 100] en donde C, U, Y, G, A, M , B, Y, H, K, D, R y V son ribonucleótidos, y nn es G o dG, n2 es U o dT, n3 es G o dG, n4 es C o dC, n5 es o dC, n6 es B o dU, n7 es D o dG, n8 es Y o dT, n9 es H o dC, n10 es R o dG, nn es V o dA, n 2 es K o dT o dU, n13 es G o dG, n14 es A o dA, n15 es U o dT, n16 es G o dG, n17 es Y o dC, n18 es C o dC, n19 es C o dC, n2o es C o dC, n21 es C o dC, y dG, dT, dC, dA y dU son 2'-desoxirribonucleótidos.
3. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUn1n2CGGAn3An4UAnsn6Cn7n8n9n1on 1Gn12Ani3AAni4n15AGn16U n17Cn18n19Un2on2i 3' [SEO. ID NO: 101] en donde C, U, Y, G, A, H y R son ribonucleótidos, y ri! es G o dG, n2 es U o dT, n3 es G o dG, n4 es C o dC, n5 es C o dC, n6 es U o dU, n7 es R o dG, n8 es Y o dT, n9 es H o dC, n 0 es G o dG, nn es R o dA, n12 es U o dT o dU, n13 es G o dG, n14 es A o dA, n15 es U o dT, n16 es G o dG, n17 es C o dC, n18 es C o dC, n19 es C o dC, n2o es C o dC, n21 es C o dC, y dG, dT, dC, dA y dU son 2'-desoxirribonucleótidos.
4. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, en donde la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUn1n2CGGAn3An4UAn5n6Cn7n8n9n10n1 ^n^An^AAn^n^AGn^U n17Cn18n19Un2on2i 3' [SEQ ID NO: 102] en donde C, U, G, A, son ribonucleótidos, y n es G o dG, n2 es U o dT, n3 es G o dG, n4 es C o dC, n5 es C o dC, n6 es U o dU, n7 es G o dG, n8 es U o dT, n9 es C o dC, n10 es G o dG, n^ es A o dA, n12 es U o dT o dU, n13 es G o dG, ni4 es A o dA, ni5 es U o dT, n 6 es G o dG, n17 es C o dC, n18 es C o dC, n19 es C o dC, n2o es C o dC, n2i es C o dC, y dG, dT, dC, dA y dU son 2'-desoxirribonucleótidos.
5. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, en donde la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo de (1) 5' CUdGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 103], (2) 51 CUGdTCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 104], (3) 5' CUGUCGGAdGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 105], (4) 5' CUGUCGGAGAdCUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 106], (5) 5' CUGUCGGAGACUAdCUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 107], (6) 5' CUGUCGGAGACUACUCdGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 108], (7) 5' CUGUCGGAGACUACUCGdTCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 109], (8) 51 CUGUCGGAGACUACUCGUdCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 110], (9) 51 CUGUCGGAGACUACUCGUCdGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 111], (10) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGdAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 112], (11) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGdTAGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 113], (12) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAdGAAAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 114] (13) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAdAUAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 115] (14) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAdTAGGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 116], (15) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGdGUCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 117], (16) 5* CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUdCCCCUCC 3' [SEQ ID NO: 118], (17) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdCCUCC 3' [SEQ ID NO: 119], (18) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCdCUCC 3' [SEQ ID NO: 120], (19) 51 CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUdCC3' [SEQ ID NO: 121], (20) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCdC 3' [SEQ ID NO: 122], (21) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdCCUdCC 3* [SEQ ID NO: 123], (22) 5' CUGUCGGAGACUACdy.CGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdC.CUCC 3' [SEQ ID NO: 130], (23) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGdU.AGAAAUAGGUCCdC.CU CC 3" [SEQ ID NO: 131], (24) 5' CUGUCGGAGACUACdJJCGUCGAGdU.AGAAAUAGGUCCdC.CUCC 3" [SEQ ID NO: 132], (25) 5' CUGUCGGAGACUACdUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdCCUdCC 3' [SEQ ID NO: 133], (26) 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGdUAGAAAUAGGUCCdCCUdCC 3' [SEQ ID NO: 134], (27) 5' CUGUCGGAGACUACdJJCGUCGAGdU.AGAAAUAGGUCCdC.CUdC. C 3" [SEQ ID NO: 90], en donde C, U, G, A, son ribonucleótidos, y dG, dT, dC, dA y dU son 2'-desoxirribonucleótidos.
6. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, en donde la extensión central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdCCUCC 3' [SEQ ID NO: 119] o 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCdCCUdCC 3' [SEQ ID NO: 123) o 5' CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGdU.AGAAAUAGGUCCdC.CUCC 3* [SEQ ID NO: 131].
7. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, en donde la extensión central de nucleótidos consiste en ribonucleótidos y 2'-desoxirribonucleótidos.
8. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, en donde la extensión central de nucleótidos consiste en 2'-ribonucleótidos.
9. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8, en donde la molécula de ácido nucleico comprende en la dirección 5'->3', una primera extensión terminal de nucleótidos, la extensión central de nucleótidos y una segunda extensión terminal de nucleótidos, en donde la primera extensión terminal de nucleótidos comprende uno cuatro a siete nucleótidos, y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende cuatro a siete nucleótidos, preferentemente la primera extensión terminal de nucleótidos comprende cinco a siete nucleótidos, y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende cinco a siete nucleótidos.
10. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la primera extensión terminal de nucleótidos comprende cinco nucleótidos, y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende cinco nucleótidos.
11. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 9 a la 10, en donde la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' Z Z2Z3SZ4WZ5 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' T§ 1Zt, o, -\ 1Z^^ ^2 3', en donde S, W, V, B y K son ribonucleótidos, y Z, es S o está ausente, Z2 es V o está ausente, Z3 es B o está ausente, Z4 es V o dG, Z5 es G o dG, Z6 es Y o dC, Z7 es W o dA, Z8 es B o dC, Z9 es S o dG, Z10 es S o dG o está ausente, Zn es B o está ausente, Z12 es K o está ausente, y dG, dC y dA son 2'-desoxirribonucleótidos.
12. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11, en donde a) ZT es S, Z2 es V, Z3 es B, Z10 es S o dG, ?,, es B, Z12 es K; b) ZT está ausente, Z2 es V, Z3 es B, Z10 es S o dG, Z1( es B, Zi2 es K; c) ?t es S, Z2 es V, Z3 es B, Z10 es S o dG, Zn es B, Z12 está ausente; d) ? está ausente, Z2 es V, Z3 es B, Z10 es S o dG, Zn es B, Z 2 está ausente; e) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 es B, Z10 es S o dG, Zn es B, Z12 está ausente; f) Z está ausente, Z2 es V, Z3 es B, Z10 es S o dG, Z está ausente, Z12 está ausente; g) ZT está ausente, Z2 está ausente, Z3 es B, Z 0 es S o dG, Z está ausente, Z12 está ausente; h) ?? está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z 0 es S o dG, Z está ausente, Z12 está ausente; i) Z- está ausente, Z2 está ausente, Z3 es B, Z10 está ausente, Zn está ausente, Z12 está ausente; o j) Z^ está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z 0 está ausente, Zn está ausente, Z 2 está ausente.
13. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9, 11 y 12, en donde la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGGUG 3'; o la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GGCCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGGCU 3'; o la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GUCAUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGGC 3'; o la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCCAUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CAUGGC 3'; o la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGGC 3'; o la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGGG 3'.
14. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 9 a la 12, en donde la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCZ UZ 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' ZeZ/ZsZgZ ) 3', o en donde C, G, A y U son ribonucleótidos, y Z4 es G o dG, Z5 es G o dG, Z6 es C o dC, Z7 es A o dA, Z8 es C o dC, ZQ es G o dG, Z10 es G o dG, dC, dG y dA son 2'-desoxirribonucleótidos.
15. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 9 a la 12 y 14, en donde a) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGG 3'; o b) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCdGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGG 3'; o c) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUdG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGG 3'; o d) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' dCACGG 3'; o e) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CdACGG 3'; o f) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CAdCGG 3'; o g) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5* CACdGG 3'; o h) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGdG 3'; en donde preferentemente la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGG 3'.
16. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 9 a la 12 y 14, en donde a) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACGC 3"; o b) la primera extensión terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GGGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CACCC 3'; o c) la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCCUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CAGGC 3'.
17. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9, 11 y 12, en donde la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5* CACG 3'; o la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CGUG 3' y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' UACG 3'; o la primera extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' GCAG 3' y la segunda extensión terminal de nucleotidos comprende una secuencia de nucleótido de 5' CUGC 3'.
18. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4 y 8 a 17, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88, o una molécula de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos el 85% con la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88, o una molécula de ácido nucleico que es homologa a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88, en donde la homología es de al menos el 85%.
19. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7 y 9 a 17, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 124 y SEQ ID NO: 078 o una molécula de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos el 85% con la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 124 y SEQ ID NO: 078, o una molécula de ácido nucleico que es homologa a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 124 y SEQ ID NO: 078, en donde la homología es de al menos el 85%.
20. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 19, en donde los nucleótidos de, o los nucleótidos que forman la molécula de ácido nucleico son L-nucleótidos.
21. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 19, en donde la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido L-nucleico.
22. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 21, en donde la molécula de ácido nucleico comprende al menos una porción de enlace que tiene la capacidad de enlazar CGRP, en donde la porción de enlace consiste en L-nucleótidos.
23. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 22, en donde el ácido nucleico es un antagonista de una actividad transmitida por CGRP.
24. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 23, en donde la molécula de ácido nucleico comprende un grupo de modificación, en donde el rango de excreción de la molécula de ácido nucleico que comprende el grupo de modificación de un organismo, disminuye en comparación con un ácido nucleico que no comprende el grupo de modificación.
25. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 23, en donde la molécula de ácido nucleico que comprende el grupo de modificación tiene un tiempo de retención incrementado en un organismo en comparación con una molécula de ácido nucleico que no comprende el grupo de modificación.
26. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 y 25, en donde el grupo de modificación se selecciona del grupo que comprende modificaciones biodegradables y no biodegradables, preferentemente el grupo de modificación se selecciona del grupo que comprende polietilenglicol, polietilenglicol lineal, polietilenglicol ramificado, almidón de hidroxietilo, un péptido, una proteína, un polisacárido, un esterol, polioxipropileno, polioxiamidato y poli (2-hidroxietil)-L-glutamina.
27. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 26, en donde el grupo de modificación es un polietilenglicol, que consiste preferentemente en un polietilenglicol lineal o un polietilenglicol ramificado, en donde el peso molecular del polietilenglicol es preferentemente de aproximadamente 20,000 hasta aproximadamente 120,000 Da, más preferentemente de aproximadamente 30,000 hasta aproximadamente 80,000 Da y más preferentemente de aproximadamente 40,000 Da.
28. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 26, en donde el grupo de modificación es almidón de hidroxietilo, en donde preferentemente el peso molecular del almidón de hidroxietilo es de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 1000 kDa, más preferentemente de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 700 kDa y más preferentemente de aproximadamente 200 hasta aproximadamente 500 kDa.
29. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 24 a la 28, en donde el grupo de modificación se acopla a la molécula de ácido nucleico a través de un enlazador, en donde preferentemente el enlazador es un enlazador biodegradable.
30. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 24 a la 28, en donde el grupo de modificación se acopla al nucleótido 5'-terminal y/o el nucleótido 3'-terminal de la molécula de ácido nucleico y/o a un nucleótido de la molécula de ácido nucleico entre el nucleótido 5'-terminal de la molécula de ácido nucleico y el nucleótido 3'-terminal de la molécula de ácido nucleico.
31. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 24 a la 30, en donde el organismo es un cuerpo de animal o humano, preferentemente un cuerpo humano.
32. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 31, para utilizarse en un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.
33. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 32, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que comprende migraña, diferentes formas de dolor de cabeza, dolor agudo, dolor crónico, tolerancia a analgesia con base en morfina, osteoartritis, angiogénesis, enfermedades autoinmune, enfermedades inflamatorias y de crecimiento de tumor, mediante lo cual preferentemente el dolor agudo y el dolor crónico es de origen inflamatorio y/o neuropático.
34. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32, y opcionalmente un constituyente adicional, en donde el constituyente adicional se selecciona del grupo que comprende un excipiente, un transportador farmacéuticamente aceptable y un agente farmacéuticamente aceptable.
35. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 34, en donde la composición farmacéutica comprende una molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32 y un transportador farmacéuticamente aceptable.
36. El uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32, para la fabricación de un medicamento.
37. El uso de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el medicamento es para utilizarse en medicina humana o para utilizarse en medicina veterinaria.
38. El uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32, para la fabricación de un medio de diagnóstico.
39. El uso de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de migraña, diferentes formas de dolor de cabeza, dolor agudo, dolor crónico, tolerancia a analgesia con base en morfina, osteoartritis, angiogénesis, enfermedades autoinmune, enfermedades inflamatorias y de crecimiento de tumor, mediante lo cual preferentemente el dolor agudo y el dolor crónico es de origen inflamatorio y/o neuropático.
40. Un complejo que comprende una molécula ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32 y CGRP, en donde preferentemente el complejo es un complejo cristalino.
41. El uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32, para la detección de CGRP.
42. Un método para clasificar un antagonista o una actividad transmitida por CGRP, en donde el método comprende los siguientes pasos: - proporcionar un antagonista candidato de la actividad transmitida por CGRP, - proporcionar una molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32, - proporcionar un sistema de prueba que proporciona una señal en la presencia de un antagonista de la actividad transmitida por CGRP, y - determinar si el antagonista candidato de la actividad transmitida por CGRP es un antagonista de la actividad transmitida por CGRP.
43. Un equipo para la detección de CGRP que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32, y al menos un folleto de instrucciones o un envase de reacción.
44. Un método para la detección de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32 en una muestra, en donde el método comprende los pasos de: a) proporcionar una sonda de captura, en donde la sonda de captura es al menos parcialmente complementaria a una primera parte de la molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32, y una sonda de detección, en donde la sonda de detección es al menos parcialmente complementaria a una segunda parte de la molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32, o alternativamente, la sonda de captura es al menos parcialmente complementaria a una segunda parte de la molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32, y la sonda de detección es al menos parcialmente complementaria a la primera parte de la molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32; b) agregar la sonda de captura y la sonda de detección por separado o combinada con una muestra que contiene la molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32 o se presume que contiene la molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32; c) permitir que la sonda de captura y la sonda de detección reaccionen ya sea en forma simultánea o en cualquier orden en secuencias con la molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32 o una parte de la misma; d) detectar opcionalmente si la sonda de captura es hibridada o no para una molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32 proporcionadas en el paso a); y e) detectar un complejo formado en el paso c) que consiste de la molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32, y la sonda de captura y la sonda de detección.
45. El método de acuerdo con la reivindicación 44, en donde la sonda de detección comprende un medio de detección y/o en donde la sonda de captura se inmoviliza a un soporte, preferentemente un soporte sólido.
46. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 44 o 45, en donde la sonda de detección, la cual no es parte del complejo formado en el paso c), se elimina de la reacción de modo que en el paso c) únicamente se detecta una sonda de detección que es parte del complejo.
47. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 44 a la 46, en donde el paso e) comprende el paso de compartir la señal generada por el medio de detección, en donde la sonda de captura y la sonda de detección son hibridadas en la presencia de la molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32 o una parte de las mismas, y en la ausencia de la molécula de ácido nucleico o parte de la misma.
48. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32, en donde CGRP es CGRP humano, CGRP de ratón, CGRP de rata o CGRP de maca mulatta, preferentemente CGRP es CGRP de humano.
49. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32 y la 48, en donde el CGRP es a-CGRP o ß-CGRP, preferentemente a-CGRP humano, a-CGRP humano o a-CGRP de rata.
50. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32 y de la 48 a la 49, en donde la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace a a-CGRP humano expresada como KD de 10 nM o menos, preferentemente de 1 nM o menos, y más preferentemente de 100 pM o menos.
51. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32 y de la 48 a la 50, en donde la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace a a-CGRP humano, expresada como IC50 de 10 nM o menos, preferentemente de 1 nM o menos, y más preferentemente de 100 pM o menos.
52. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32 y de la 48 a la 51, en donde la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace a amilina humana, expresada como KD de 100 nM o más, preferentemente de 500 nM o más, y más preferentemente de 1000 nM o más.
53. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32 y de la 48 a la 52, en donde la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace a amilina humana, expresada como IC50 de 100 nM o más, preferentemente de 500 nM o más, y más preferentemente de 1000 nM o más.
54. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32 y de la 48 a la 53, en donde la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace con a-CGRP humano, expresada como KD de 10 nM o menos, preferentemente de 1 nM o menos, y más preferentemente de 100 pM o menos, en donde la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace a amilina humana, expresada como KD de 100 nM o más, preferentemente de 500 nM o más, y más preferentemente de 1000 nM o más, y/o la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace con a-CGRP humano, expresado como IC50, de 10 nM o menos, preferentemente de 1 nM o menos, y más preferentemente de 100 pM o menos, en donde la molécula de ácido nucleico tiene una afinidad de enlace con amilina humana, expresada como IC50, de 100 nM o más, preferentemente de 500 nM o más, y más preferentemente de 1000 nM o más.
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