KR102021626B1 - Ngf에 대한 압타머 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 화학식 (I)로 표시되는 잠재적 2차 구조를 형성할 수 있는, NGF와 결합하는 압타머를 제공한다.
Figure 112014038112419-pct00015

(상기 식에서, N은 A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드이고, N11∼N13, N21∼N23, N32∼N38 및 N42∼N48은, 각각 동일하거나 또는 상이하며, A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 1개 혹은 2개의 뉴클레오티드, 또는 결합이고, N14, N24, N31, N41, N39 및 N49는, 각각 동일하거나 또는 상이하며, A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드로서, N14와 N24, N31과 N41 및 N39와 N49는 상호 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하고, N11-N12-N13-N14와 N21-N22-N23-N24의 조합으로 스템 구조를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열이며, N31-N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38-N39와 N41-N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48-N49의 조합으로 스템 구조를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열이다.)

Description

NGF에 대한 압타머 및 그의 용도{NGF APTAMER AND APPLICATION THEREOF}
본 발명은 NGF에 대한 압타머 및 그의 용도에 관한 것이다.
신경 성장 인자 NGF(nerve growth factor)는 1951년에 동정된 최초의 뉴로트로핀으로서, 말초 및 중추 뉴런의 발달·생존에 관계된 중요한 분비 단백질이다. 118개의 아미노산으로 이루어지며, 분자량은 13 kDa이고, 분자 내에 3곳의 S-S 결합을 갖는다.
NGF의 수용체에는 고친화성의 티로신 키나아제형 수용체 TrkA와 저친화성의 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리에 속하는 p75가 알려져 있다. 이들 수용체는 호모이량체 또는 헤테로이량체로서 작용하며, 신경계의 발생과 유지에 깊게 관여하고 있다. TrkA는 1회 막 관통형 수용체로 세포내 도메인에 티로신 키나아제 구조를 갖는다. NGF가 결합하면 티로신인산화가 일어나고, 하류에 신호가 전달되어, 그 세포의 분화 촉진이나 생존 유지에 작용한다.
TrkA의 패밀리 수용체로서 TrkB와 TrkC가 알려져 있다. TrkB는 BDNF 및 NT-4/5와 결합하고, TrkC는 NT-3과 결합한다. p75는 TrkA에 비하여 리간드 특이성이 낮고, NGF 이외에도 BDNF, NT-3, NT-4/5와 결합한다. p75는 1회 막 관통형 수용체이지만, 세포질 측에 티로신 키나아제 도메인은 없다. TrkA와 마찬가지로 신경 세포뿐만 아니라 비신경 세포에도 발현하고 있다. 이 수용체는 세포의 분화 촉진이나 생존 유지에 관여하고 있는 것 외에 아포토시스의 유도나 세포 유주와도 관계되어 있다는 것이 알려져 있다. 결정 구조 해석의 결과로부터, 호모이량체의 NGF는 TrkA와 2:2로 결합하지만, p75와는 2:1로 결합하는 것이 시사되었다. 호모이량체의 NGF가 TrkA와 p75의 헤테로이량체에 결합하는 경우도 있다.
NGF는 신경계에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다는 것은 잘 알려져 있다. 콜린 작동성 뉴런의 생존을 유지하는 작용을 갖는 것이 분명하게 되어 있으며, 알츠하이머병과 어떠한 관련이 있다고 생각되고 있다. 또한, 노령 래트의 뇌 내에 NGF를 투여하면, 기억 장애의 개선이 인정되므로, 노인성 치매의 치료약으로서도 기대되고 있다.
또한 NGF는 염증과 관련이 있으며, 염증성 질환의 환자나 염증성 동물 모델에서 NGF의 발현 상승이 관찰되고 있다. 예컨대, 전신성 홍반성 루프스, 다발성 경화증, 건선, 관절염, 간질성 방광염, 천식 등이 그것에 해당된다. 관절 류머티즘 환자의 골액 중의 NGF의 농도가 상승하고 있음이 보고되어 있다. 또한, 관절 류머티즘 모델 래트의 NGF 발현의 향상, 관절염 모델 마우스에서 비만 세포의 증가와 NGF 발현의 향상이 보고되어 있다.
NGF는 통증과 깊게 관련된다. 인간에게 NGF를 피하 투여하면, 근육통과 같은 심부통(深部痛)이 여러 날 이어져, 주입 부위의 통각 과민이 일어난다. NGF 녹아웃 마우스와 TrkA 녹아웃 마우스는 무수 신경이 결손되어 통증을 느끼지 못하게 된다. 성숙 래트에게 1 ㎎/㎏의 NGF를 복강내 투여하면, 침해성 열이나 기계 자극에 대한 통각 과민이 일어난다. NGF의 트랜스제닉 마우스는 염증 증상을 동반하지 않는 통각 과민을 보인다. 또한, 선천성 무통 무한증(CIPA) 환자의 TrkA 유전자에 이상이 있거나, NGF의 유전자에 이상이 있으면 통각이 저하되는 것이 알려져 있다.
이상에서, NGF 저해제는 침해수용성 동통, 염증성 동통, 신경인성 동통, 암성 동통, 섬유 근통 등의 동통의 치료약으로서 이용할 수 있음을 이해할 수 있다.
그런데, 최근, RNA 압타머의 치료약, 진단약, 시약에의 응용이 주목되고 있으며, 몇 개의 RNA 압타머가 임상 단계 또는 실용화 단계에 들어가 있다. 2004년 12월에는 세계 최초의 RNA 압타머 의약인 마큐젠(Macugen)이 가령 황반 변성증의 치료약으로서 미국에서 승인되었다. RNA 압타머란 단백질 등의 표적 물질에 특이적으로 결합하는 RNA를 말하며, SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)를 이용하여 제작할 수 있다(특허문헌 1∼3). SELEX란, 1014개 정도의 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA의 풀에서, 표적 물질에 특이적으로 결합하는 RNA를 선별해 오는 방법이다. 사용되는 RNA는 40 잔기 정도의 랜덤 서열을 프라이머 서열 사이에 끼운 구조를 하고 있다. 이 RNA 풀을 표적 물질과 회합시켜, 필터 등을 이용하여 표적 물질에 결합한 RNA만 회수한다. 회수한 RNA는 RT-PCR로 증폭하여, 이것을 다음 라운드의 주형으로서 이용한다. 이 작업을 10회 정도 반복함으로써, 표적 물질과 특이적으로 결합하는 RNA 압타머를 취득할 수 있는 경우가 있다.
압타머 의약은 항체 의약과 마찬가지로 세포외 인자를 표적으로 할 수 있지만, 이미 공표되어 있는 많은 학술논문 등을 참고하면, 몇 가지 점에서 항체 의약을 상회할 가능성이 있다. 예컨대, 압타머는 항체보다도 결합력과 특이성이 높은 경우가 많이 있다. 또한, 면역 배제를 받기 어려워, 항체 특유의 항체 의존성 세포 장애(ADCC)나 보체 의존성 세포 장애(CDC) 등의 부작용은 발생하지 않는다. 송달(delivery)의 관점에서는, 압타머는 항체의 1/10 정도의 사이즈이기 때문에, 원하는 부위까지 약물을 송달시키는 것은 보다 용이하다. 압타머는 화학 합성에 의해 생산되기 때문에, 각종 수식을 용이하게 넣을 수 있어, 대량 생산에 의한 비용 절감이 가능하다. 한편, 일반적으로 압타머의 혈중 반감기는 항체보다도 짧다. 그러나, 이 점도 독성을 고려한 경우는 메리트가 되는 경우가 있다. 이상의 점에서, 동일한 분자를 표적으로 한 의약품이라도, 압타머 의약은 항체 의약보다 나을 가능성이 있다.
본 발명자들은, NGF에 결합하고, NGF와 NGF 수용체와의 결합을 저해하는 압타머를 제조하여, 이것이 NGF에 의한 신경 돌기 신장 활성을 저해하는 것을 발견하였다(특허문헌 4). 한편, 특허문헌 5에는 자동화된 SELEX에 의해 얻어진 NGF에 대한 압타머가 기재되어 있고, 또한, 특허문헌 6에는 특허문헌 4에서 얻어진 압타머의 개변체 및 수식체가 기재되어 있다.
특허문헌 1: 국제 공개 WO91/19813호 특허문헌 2: 국제 공개 WO94/08050호 특허문헌 3: 국제 공개 WO95/07364호 특허문헌 4: 국제 공개 WO2010/035725호 특허문헌 5: 국제 공개 WO02/077262호 특허문헌 6: 국제 공개 WO03/070984호
본 발명은, NGF에 대한 압타머 및 그 이용 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히, 의약품 용도에 알맞은 NGF 압타머, 즉, 단쇄 길이이면서 NGF 활성(신경 돌기 신장 활성, TF-1 세포 증식 활성) 저해 활성이 높고, 게다가 NGF에 대한 특이성이 높은 압타머를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 신경 돌기 신장 저해에 관한 IC50 값이 1 nM 이하인, 종래 공지된 NGF 압타머와 비교하여 현저히 높은 신경 돌기 신장 저해 활성을 갖는, 보다 양질의 NGF 압타머를 제작하는 데에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 발명 등을 제공하는 것이다.
[1] 화학식 (I)로 표시되는 잠재적 2차 구조를 형성할 수 있는, NGF와 결합하는 압타머.
Figure 112014038112419-pct00001
(상기 식에서, N은 A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드이고,
N11∼N13, N21∼N23, N32∼N38 및 N42∼N48은, 각각 동일하거나 또는 상이하며, A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 1개 혹은 2개의 뉴클레오티드, 또는 결합이고,
N14, N24, N31, N41, N39 및 N49는, 각각 동일하거나 또는 상이하며, A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드로서,
N14와 N24, N31과 N41 및 N39와 N49는 상호 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하고,
N11-N12-N13-N14와 N21-N22-N23-N24의 조합으로 스템 구조를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열이며,
N31-N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38-N39와 N41-N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48-N49의 조합으로 스템 구조를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열이다.)
[2] N11∼N13, N21∼N23, N32∼N38 및 N42∼N48이, 각각 동일하거나 또는 상이하며, A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드인 상기 [1]에 기재된 압타머.
[3] N14가 U, N24가 A, N31이 G, N41이 C, N39가 G, N49가 C인 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 압타머.
[4] N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38과 N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48로 4개 이상의 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하는 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 압타머.
[5] 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나인 상기 [1]에 기재된 압타머:
(a) 서열번호 3, 서열번호 9∼13, 서열번호 22∼117 및 서열번호 152∼168 중 어느 것에서 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋음)로 이루어지는 핵산;
(b) 상기 (a)의 뉴클레오티드 서열에 있어서, 하나 또는 여러 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 또한 NGF와 결합하는 핵산.
[6] 염기 길이가 50 이하인 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 압타머.
[7] 적어도 하나의 뉴클레오티드가 수식되어 있는 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 압타머.
[8] 인버티드(inverted) dT 또는 폴리에틸렌글리콜로 수식되어 있는 상기 [7]에 기재된 압타머.
[9] 인버티드 dT 또는 폴리에틸렌글리콜이, 압타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 결합되어 있는 상기 [8]에 기재된 압타머.
[10] 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'위의 히드록실기가, 동일하거나 또는 상이하며, 무치환이거나, 수소 원자, 불소 원자 및 메톡시기로 이루어진 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 상기 [7] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 압타머.
[11] 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2'위의 히드록실기가, 동일하거나 또는 상이하며, 무치환이거나, 수소 원자, 불소 원자 및 메톡시기로 이루어진 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 상기 [7] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 압타머.
[12] NGF의 신경 돌기 신장 활성 및/또는 세포 증식 활성을 저해하는 상기 [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 압타머.
[13] 상기 [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 압타머를 포함하는 의약 조성물.
[14] 상기 [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 압타머를 포함하는 항동통제.
[15] 상기 [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 압타머를 포함하는 항염증제.
[16] 상기 [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 압타머를, 그것을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 특징으로 하는, 동통 또는 염증을 동반하는 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
[17] 동통 또는 염증을 동반하는 질환의 치료 또는 예방을 위한 상기 [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 압타머.
본 발명의 압타머 또는 핵산은, 상기한 구성을 취함으로써 우수한 NGF 저해 활성, 특히 높은 신경 돌기 신장 저해 활성을 보이기 때문에, 동통이나 염증성 질환 등의 질환에 대한 의약으로서 유용할 수 있다.
도 1은 서열번호 3으로 표시되는 NGF 압타머의 예측되는 2차 구조의 모식도이다. 좌측 위쪽의 스템-루프 구조가 콘센서스 이차 구조 1에 상당한다.
도 2는 서열번호 12로 표시되는 NGF 압타머의 뉴클레오티드 서열로 대표되는 콘센서스 이차 구조 1을 도시하는 모식도이다.
도 3은 서열번호 82(2)로 표시되는 NGF 압타머(수식체)가 NGF, NT-3 및 NT-4에 결합하는 것을 나타내는 센서그램이다. 종축의 RU는 상대치(Relative Unit)를 나타내고, Resp.Diff.는 반응차(Response Differences)를 나타낸다. 횡축은 시간(초)(Time(s))을 나타낸다. 종축, 횡축에 있어서의 이들의 표기는 이하의 도 4 내지 도 5에서도 동일하다.
도 4는 서열번호 82(2)로 표시되는 NGF 압타머(수식체)가 NGF와 NGF 수용체 TrkA와의 결합을 저해하는 것을 나타내는 센서그램이다.
도 5는 서열번호 82(2)로 표시되는 NGF 압타머(수식체)가 NGF와 NGF 수용체 p75와의 결합을 저해하는 것을 나타내는 센서그램이다.
본 발명은 화학식 (I)로 표시되는 잠재적 2차 구조:
Figure 112014038112419-pct00002
(상기 식에서, N은 A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드이고,
N11∼N13, N21∼N23, N32∼N38 및 N42∼N48은, 각각 동일하거나 또는 상이하며, A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 1개 혹은 2개의 뉴클레오티드, 또는 결합이고,
N14, N24, N31, N41, N39 및 N49는, 각각 동일하거나 또는 상이하며, A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드로서,
N14와 N24, N31과 N41 및 N39와 N49는 상호 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하고,
N11-N12-N13-N14와 N21-N22-N23-N24의 조합으로 스템 구조를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열이며,
N31-N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38-N39와 N41-N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48-N49의 조합으로 스템 구조를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열이다.)를 형성할 수 있는, NGF와 결합하는 압타머(이하, 「본 발명의 압타머」라고 기재함)를 제공한다. 상기 뉴클레오티드 서열은 후술하는 수식을 받고 있어도 좋다.
압타머란, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 압타머는, 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 압타머는 NGF에 대하여 결합 활성을 갖는 압타머이다. 바람직한 양태에 따르면, 본 발명의 압타머는 NGF에 결합하여, NGF와 NGF 수용체와의 결합을 저해함으로써, NGF의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 압타머는, RNA, DNA, 수식 핵산 또는 이들의 혼합물 등의 핵산일 수 있다. 따라서, 이하에서, 본 발명의 압타머는 「본 발명의 핵산」이라고 바꿔 읽어 나타내는 경우도 있을 수 있다.
단일쇄 핵산은 다양한 2차 구조를 취할 수 있다. 「잠재적 2차 구조」란, 어떤 단일쇄 핵산이, 그 1차 구조로부터 보아 열역학적으로 취할 수 있는 2차 구조를 의미하는데, 특히 본 발명의 압타머에 있어서의 잠재적 2차 구조는, 실시예 5에 기재된 MFOLD 프로그램을 이용하여 예측할 수 있는 2차 구조이다. 따라서, 상기 화학식 (I)로 표시되는 2차 구조를 취할 수 있는 1차 구조를 갖는 한, 실제로 상기 2차 구조를 취하고 있지 않은 핵산이라도 본 발명의 압타머에 포함된다.
따라서 바람직하게는, 본 발명의 압타머는, 그 1차 구조로부터 보아 열역학적으로 안정적으로 상기 화학식 (I)로 표시되는 2차 구조를 취할 수 있는 핵산 분자이며, 이 의미에서, 본 발명의 압타머는 화학식 (I)로 표시되는 잠재적 2차 구조를 형성할 수 있는 압타머이다.
화학식 (I)로 표시되는 잠재적 2차 구조는, 소위「스템-루프 구조」이며, 특히 N11-N12-N13-N14와 N21-N22-N23-N24와의 조합에 의해 형성될 수 있는 스템 구조와, N31-N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38-N39와 N41-N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48-N49와의 조합에 의해 형성될 수 있는 스템 구조 사이에 루프 구조(본 명세서에서, 「인터널 루프 1」이라고 기재함)를 가지며, 또한, N39와 N49 사이에 루프 구조(본 명세서에서, 「루프 2」라고 기재함)를 갖는 것을 특징으로 한다.
「스템 구조」란, 핵산 분자 내의 상보성을 갖는 부분 뉴클레오티드 서열끼리 왓슨-크릭 염기쌍(G-C 혹은 A-U/T)을 형성한 구조를 말하는데, 본 명세서에서는, N11-N12-N13-N14와 N21-N22-N23-N24 및 N31-N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38-N39와 N41-N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48-N49는 완전 상보적일 필요는 없고, 미스 매치 및/또는 G-U/T의 wobbling를 허용하는 것이다. 즉, 스템 구조를 형성하는 부분 뉴클레오티드 서열 양 말단의 뉴클레오티드끼리 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하고 있으면, 반드시 그 이외의 뉴클레오티드끼리 전부가 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하고 있을 필요는 없다.
화학식 (I)에서, 루프 2 부분에 위치하는 「N」은 A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드인데, 바람직한 일 실시양태에서는 「N」은 G일 수 있다.
화학식 (I)에서, N11∼N13, N21∼N23, N32∼N38 및 N42∼N48은, 각각 동일하거나 또는 상이하며, A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 1개 혹은 2개의 뉴클레오티드, 또는 결합을 나타낸다. Ni(i는 11∼13, 21-23, 32∼38, 42∼48에서 선택되는 정수)가 「2개의 뉴클레오티드」인 경우, 이 2개의 뉴클레오티드는 동일하여도 좋고 상이하여도 좋다. 또한, Ni가 「2개의 뉴클레오티드」 혹은 「결합」인 경우, 바람직하게는 N11∼N13, N21∼N23, N32∼N38 및 N42∼N48의 각 부분 서열 중에 2개 이하, 보다 바람직하게는 1개 이하의 빈도로 포함된다. 따라서, 한쪽의 스템 구조를 형성하는 N11∼N14 및 N21∼N24는, 바람직하게는 2∼6개, 보다 바람직하게는 3∼5개의 뉴클레오티드 길이를 각각 가지며, 다른 한쪽의 스템 구조를 형성하는 N31∼N39 및 N41∼N49는, 바람직하게는 7∼11개, 보다 바람직하게는 8∼10개의 뉴클레오티드 길이를 각각 갖는다.
또한, 상기 「결합」이란, 단결합을 의미하고, 화학식 (I)에서의 임의의 Ni가 「결합」이라고 하는 경우는, 상기 뉴클레오티드에 인접하는 뉴클레오티드끼리가 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 있음을 나타낸다.
특히 바람직하게는, N11∼N13, N21∼N23, N32∼N38 및 N42∼N48은, 각각 동일하거나 또는 상이하며, A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드이다. 따라서 2차 구조를 형성하는 부분의 양 말단을 포함하는 스템 구조의 스템 길이는, 바람직하게는 4 뉴클레오티드 이하이고, 또한 2개의 루프 사이에 끼워지는 내부 스템 구조의 스템 길이는 바람직하게는 9 뉴클레오티드이다.
또한, 화학식 (I)에서, N14, N24, N31, N41, N39 및 N49는, 각각 동일하거나 또는 상이하며, A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드로서, N14와 N24, N31과 N41 및 N39와 N49는 서로 왓슨-크릭 염기쌍(G-C 혹은 A-U/T)을 형성한다. 따라서, 2차 구조를 형성하는 부분의 양 말단을 포함하는 스템 구조는 적어도 인터널 루프 1 부분측 말단에서 염기쌍을 형성하고 있고, 2개의 루프 사이에 끼워지는 내부 스템 구조는 그 양단에서 염기쌍 형성하고 있다. 보다 바람직하게는 N14가 U, N24가 A, N31이 G, N41이 C, N39이 G, N49가 C이다.
한편, 상기와 같이 정의한 대로, 「스템 구조」에 있어서의 N11-N12-N13과 N21-N22-N23 및 N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38과 N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48에 관해서는 완전 상보적일 필요는 없지만(전부 왓슨-크릭 염기쌍을 형성할 필요는 없음), 스템 구조를 형성할 수 있을(스템 내에 루프(버블)이 형성되지 않을)정도의 상보성을 갖고 있을 필요가 있다. 구체적으로는, 각 스템 구조 내에 3개의 연속되는 미스 매치 혹은 G-U/T의 wobbling이 포함되는 경우에는 루프가 형성될 수 있기 때문에, 각 스템 구조는 3개의 연속되는 미스 매치 혹은 G-U/T의 wobbling을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 또한, N11-N12-N13과 N21-N22-N23 및 N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38과 N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48의 각각에 있어서, 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상이 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하는 뉴클레오티드끼리인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산을 제공한다.
(a) 서열번호 3, 서열번호 9∼13, 서열번호 22∼117 및 서열번호 152∼168 중 어느 것에서 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋음).
(b) 상기 (a)의 뉴클레오티드 서열에 있어서, 하나 또는 여러 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열이면서, NGF와 결합하는 서열.
이들의 핵산은 상기 화학식 (I)로 표시되는 잠재적 2차 구조를 형성할 수 있다.
한편, 서열 상의 어느 우라실이나 티민으로나 치환할 수 있지만, 치환되는 우라실은, 본 발명의 압타머가 갖는 활성을 유지하도록, 바람직하게는 상기 잠재적 2차 구조에 있어서의 인터널 루프 1 부분 및 루프 2 부분 이외의 부분에 있어서의 우라실일 수 있다.
본원 명세서에서 「서열번호」로 특정되는 서열이란, 각 압타머 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 예컨대 「서열번호 1의 서열을 포함하는 핵산」이란, 서열번호 1의 서열을 포함하는 천연의 핵산, 수식 핵산 또는 그 양쪽으로 구성되는 핵산을 의미한다. 서열표에는 각 압타머의 서열번호의 염기 서열을 기재하고 있다.
상기 (b)에 있어서, 치환, 결실, 삽입 또는 부가되는 뉴클레오티드의 수는 예컨대 약 1∼10개, 바람직하게는 1∼6개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 가장 바람직하게는 1개 혹은 2개일 수 있다.
상기 (b)에 있어서, 치환, 결실, 삽입 또는 부가되는 뉴클레오티드의 위치는 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 압타머가 갖는 활성을 유지하도록, 바람직하게는 상기 잠재적 2차 구조에 있어서의 인터널 루프 1 부분 및 루프 2 부분 이외의 부분에 있어서의 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 압타머 또는 핵산의 뉴클레오티드 길이는 특별히 제한되지 않지만, 통상 34∼약 200 뉴클레오티드인데, 바람직하게는 34∼약 100 뉴클레오티드이고, 보다 바람직하게는 36∼60 뉴클레오티드이며, 더욱 바람직하게는 38∼44 뉴클레오티드이다. 또한, 본 발명의 압타머 또는 핵산의 염기 길이는, 바람직하게는 50 이하이며, 보다 바람직하게 44 이하이다. 상기 화학식 (I)로 표시되는 잠재적 2차 구조를 형성할 수 있는 범위에서 총 뉴클레오티드의 수를 적게 함으로써, 압타머의 화학 합성 및 대량 생산이 보다 용이하게 되고, 또한 비용면에서의 메리트도 크다. 또한, 이러한 압타머는 화학 수식이 용이하고, 생체내 안정성을 향상시키기 쉬우며, 독성이 낮다고 생각된다.
본 발명의 압타머는 또한, 상기 (a)의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산의 복수의 연결물, 상기 (b)의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산의 복수의 연결물, 및 상기 (a)의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산 및 상기 (b)의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산의 복수의 연결물로 이루어진 군에서 선택되는 연결물일 수 있다.
이들 연결물도, NGF에 결합하면서/하거나, NGF의 활성(NGF 수용체와의 결합 활성 등)을 저해할 수 있다.
여기서 연결은 탠덤 결합으로써 행할 수 있다. 또한, 연결할 때, 링커를 이용하여도 좋다. 링커로서는, 뉴클레오티드 쇄(예컨대, 1∼약 20 뉴클레오티드), 비뉴클레오티드 쇄(예컨대, -(CH2)n- 링커, -(CH2CH2O)n- 링커, 헥사에틸렌글리콜 링커, TEG 링커, 펩티드를 포함하는 링커, -S-S- 결합을 포함하는 링커, -CONH- 결합을 포함하는 링커, -OPO3- 결합을 포함하는 링커)를 들 수 있다. 상기 복수의 연결물에 있어서의 복수란, 2 이상이라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 2개, 3개 또는 4개일 수 있다.
본 발명의 압타머에 포함되는 각 뉴클레오티드는 각각 동일하거나 또는 상이하며, 리보스(예컨대, 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스, 퓨린 뉴클레오티드의 리보스)의 2'위에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드(즉, 미치환인 뉴클레오티드)이거나, 혹은 리보스의 2'위에 있어서, 히드록실기가 임의의 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 임의의 원자 또는 기로서는, 예컨대, 수소 원자, 불소 원자 또는 -O-알킬기(예컨대, -O-Me기), -O-아실기(예컨대, -O-CHO기), 아미노기(예컨대, -NH2기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드를 들 수 있다. 이하에 리보스의 2'위에 있어서, 히드록실기가 수소 원자, 불소 원자, -O-Me기로 치환된 경우를 각각 나타낸다.
Figure 112014038112419-pct00003

Figure 112014038112419-pct00004

Figure 112014038112419-pct00005

본 발명의 압타머는 또한, 적어도 1종(예컨대, 1, 2, 3 또는 4종)의 뉴클레오티드가, 리보스의 2'위에 있어서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대, 수소 원자, 불소 원자, 히드록실기 및 -O-Me기로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 2종(예컨대, 2, 3 또는 4종)의 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 압타머는 또한, 모든 피리미딘 뉴클레오티드가, 리보스의 2'위에 있어서, 동일하거나 또는 상이하며, 불소 원자로 치환되는 뉴클레오티드이거나, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 바람직하게는 수소 원자, 히드록실기 및 메톡시기로 이루어진 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다.
발명의 압타머는 또한, 모든 퓨린뉴클레오티드가, 리보스의 2'위에 있어서, 동일하거나 또는 상이하며, 히드록실기로 치환되는 뉴클레오티드이거나, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 바람직하게는 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어진 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되는 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 압타머는 또한, 모든 뉴클레오티드가, 리보스의 2'위에 있어서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대, 수소 원자, 불소 원자, 히드록실기 및 -O-Me기로 이루어진 군에서 선택되는 동일한 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다.
한편, 본 명세서에 있어서는, 압타머를 구성하는 뉴클레오티드를 RNA라 가정하여(즉 당기(糖基)를 리보스라고 가정하여), 뉴클레오티드 중의 당기에의 수식 양태를 설명하는데, 이것은, 압타머를 구성하는 뉴클레오티드로부터 DNA가 제외되는 것을 의미하는 것은 아니며, 적절하게 DNA에의 수식으로 바꿔 읽을 수 있다. 예컨대, 압타머를 구성하는 뉴클레오티드가 DNA인 경우, 리보스의 2'위의 히드록실기의 X로의 치환은, 데옥시리보스의 2'위의 한쪽의 수소 원자의 X로의 치환으로 바꿔 읽을 수 있다.
또한, 본 발명의 압타머에 있어서, 우라실을 티민으로 치환함으로써, NGF에 대한 결합성, NGF와 NGF 수용체와의 결합 저해 활성, NGF의 신경 돌기 신장 저해 활성, NGF의 세포 증식 저해 활성, 압타머의 안정성, 약물 송달성, 혈액 속에서의 안정성 등을 높일 수 있다.
본 발명의 압타머가 결합하는 NGF는 공지된 뉴로트로핀이며, 말초 및 중추 뉴런의 발달·생존에 관련한 중요한 분비 단백질이다. 본 발명에 있어서의 NGF는, 특히 β 타입의 NGF를 의미한다. 인간 β-NGF의 아미노산 서열은 Accession Number NP002497, P01138, AAI26151, AAI26149, CAB75625로 표시되는 것인데, 변이가 들어간 것이나, 그 기능 도메인, 펩티드 단편이라도 좋다. 또한, 모노머뿐만 아니라 다이머나 다량체라도 좋다. 또한 인간 이외의 포유동물, 예컨대, 영장류(예컨대, 원숭이), 설치류(예컨대, 마우스, 래트, 몰모트) 및 애완 동물, 가축 및 사역 동물(예컨대, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양, 돼지) 유래의 NGF도 포함된다.
본 발명의 압타머는, NGF에 결합하여, NGF와 NGF 수용체와의 결합을 저해함으로써, NGF의 활성을 저해한다. NGF와 NGF 수용체와의 결합을 저해할 수 있는 한, 본 발명의 압타머는 NGF의 어떠한 부분에 결합하여도 좋다.
본 명세서에서, 「NGF에 대한 저해 활성」이란 NGF가 보유하는 임의의 활성에 대한 저해능을 의미한다. 예컨대, NGF가 NGF 수용체에 결합하는 것을 저해하는 활성, NGF가 NGF 수용체에 결합함으로써 생기는, NGF 수용체의 하류의 신호 전달(Ras-MAP 키나아제 경로, PI3 키나아제 경로)의 저해, TRPV1, SP, BDNF 등의 발현 상승의 저해, 비만 세포 등으로부터 방출되는 HA, BK, PG, NGF, 기타 사이토카인 발현의 저해 활성, 또한 NGF에 의해 유도되는 신경 세포의 분화, 생존, 신경 돌기 신장, 혈관 투과성의 증대, T 세포나 B 세포의 면역 응답의 증강, 림프구의 분화, 비만 세포나 적백혈병 세포, 암 세포 등 각종 세포의 증식 등의 저해, NGF에 의해 유발되는 동통, 통각 과민의 경감 등을 들 수 있다.
본 발명의 압타머가 갖는 바람직한 「NGF에 대한 저해 활성」은, NGF가 NGF 수용체에 결합하는 것을 저해하는 활성이며, NGF에 의해 유도되는 신경 돌기 신장 활성을 저해하는 활성, NGF에 의해 유도되는 세포 증식 활성을 저해하는 활성 등이다.
본 발명의 압타머는, 생리적인 완충액(예컨대 용액 A: 실시예 1 참조) 속에서, NGF에 결합한다. 본 발명의 압타머는, 예컨대 이하의 시험에 의해 검출할 수 있을 정도의 강도로 NGF에 결합한다.
측정에는 BIAcore사 제조의 BIAcore2000을 이용한다. 센서 칩에 압타머를 고정화한다. 고정화량은 1000 RU로 한다. 0.3 M의 NaCl을 함유하는 생리적인 완충액(용액 A: 실시예 1 참조)에 의해 NGF 용액(0.5 μM)을 조제한다. 이 NGF 용액을 20 ㎕ 주입하여, NGF의 압타머에의 결합을 검출한다. 40 뉴클레오티드로 이루어지는 랜덤한 뉴클레오티드를 포함하는 RNA를 음성 대조군으로 하고, 상기 컨트롤 RNA와 비교하여 NGF가 유의적으로 강하게 압타머에 결합한 경우, 그 압타머는 NGF에의 결합능을 갖는다고 판정한다.
본 명세서에서, 「NGF 수용체」란, NGF가 결합하는 세포 표면 단백질을 의미한다. NGF 수용체로서는, TrkA와 p75가 알려져 있다. 본 발명에서 말하는 NGF 수용체란, 천연의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이라도 좋고, 그 변이체라도 좋다. 여기서 「그 변이체」란, 「NGF 수용체」의 아미노산이 여러 개 치환된 것이나 그 일부분의 아미노산 서열이며, NGF에 대하여 결합 활성을 가지면서, NGF와 NGF 수용체의 결합을 저해하는 단백질 또는 펩티드를 의미한다.
본 발명의 압타머는, NGF에 결합하여, NGF와 NGF 수용체와의 결합을 저해하는 압타머이다. NGF의 NGF 수용체에의 결합을 압타머가 저해하는지 여부는 예컨대 이하의 시험에 의해 평가할 수 있다.
측정에는 BIAcore사 제조의 BIAcore2000을 이용한다. CM5 센서 칩에 NGF 수용체와 Fc와의 융합 단백질(예컨대, TrkA-Fc(175-TK, R&D systems) 또는 p75-Fc(R&D systems))을 고정화한다. 고정화량은 500∼700 RU로 한다. 생리적인 완충액(용액 A: 실시예 1 참조) 속에서 NGF(0.1 μM)와 압타머(0.2 μM)를 혼합하여, 30분 걸쳐 샘플이 되는 혼합액을 조제한다. 이 혼합액을 BIAcore2000에 주입하여, NGF의 NGF 수용체에의 결합을 검출한다.
일 양태에 있어서, 본 발명의 압타머는, NGF와 TrkA와의 결합 및 NGF와 p75와의 결합 양쪽을 저해할 수 있다.
본 발명의 압타머는, NGF의 신경 돌기 신장 활성 및/또는 NGF의 세포 증식 활성을 저해하는 압타머이다. NGF의 신경 돌기 신장 활성을 본 발명의 압타머가 저해하는지 여부는 예컨대 실시예 3에 기재된 시험에 의해 평가할 수 있다. 또한, NGF의 세포 증식 활성을 본 발명의 압타머가 저해하는지 여부는 예컨대 실시예 8에 기재된 시험에 의해 평가할 수 있다.
본 발명의 압타머는, NGF의 신경 돌기 신장 활성을 50% 저해하는 농도(IC50 또는 50% 저해 농도)가 1 nM 이하인 것을 특징으로 한다. 종래 공지된 NGF 압타머는 NGF의 신경 돌기 신장 활성에 대한 IC50 값이 수 nM 정도이기 때문에, 본 발명의 압타머는, 신경 돌기 신장 저해 활성에 관해 보다 우수한 특성을 갖는다.
또한, 바람직한 실시양태에서는, 본 발명의 압타머는, NGF의 세포 증식 활성에 대한 IC50 값도 1 nM 이하이다.
한편, 본 발명의 압타머가, NGF 이외의 뉴로트로핀, 구체적으로는, 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀 3(NT-3) 및 뉴로트로핀 4/5(NT-4/5)의 세포 증식 활성을 저해하는 활성을 갖는지에 관해서는 압타머에 따라 상이하다. 여기서 BDNF, NT-3 및 NT-4/5의 용어는, 각각 인간을 포함하는 전체 포유류종의 BDNF, NT-3 및 NT-4/5를 의미한다.
다른 뉴로트로핀(BDNF, NT-3, NT-4/5)의 세포 증식 저해 활성의 정도는 실시예 16에 기재된 시험에 의해 평가할 수 있다. 실시예 16 및 표 2에 기재된 본 발명의 압타머의 세포 증식 저해 활성은, NGF에 대하여 IC50 값이 0.1 nM 이하인 데 대하여, BDNF에 대한 IC50 값은 1000 nM 이상으로, 본 발명의 압타머는 BDNF의 세포 증식 활성을 저해하지 않는다고 할 수 있지만, NT-3에 대해서는 0.97 nM에서 10 nM 이상이며; 또한 NT-4에 대해서는 3 nM 이하부터 30 nM 이상;과 같이, NT-3 및 NT-4의 세포 증식 활성에 관해서는 압타머에 따라 상이하다.
본 발명의 압타머는, NGF에 대한 결합성, NGF와 NGF 수용체와의 결합 저해 활성, NGF의 신경 돌기 신장 저해 활성, NGF의 세포 증식 저해 활성, 압타머의 안정성, 약물 송달성, 혈액 중에서의 안정성 등을 높이기 위해서, 각 뉴클레오티드의 당 잔기(예컨대, 리보스)가 수식된 것이라도 좋다. 당 잔기에 있어서 수식되는 부위로서는, 예컨대, 당 잔기의 2'위, 3'위 및/또는 4'위의 산소 원자를 다른 원자로 치환한 것 등을 들 수 있다. 수식의 종류로서는, 예컨대, 플루오로화, O-알킬화(예컨대, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화(예컨대, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화(예컨대, -NH2)를 들 수 있다. 그 외에도, 4'위의 산소를 황으로 치환한 4'-SRNA, 2'위와 4'위를 메틸렌을 통해 가교한 LNA(Locked Nucleic Acid), 3'위의 수산기를 아미노기로 치환한 3'-N-포스포로아미데이트 핵산 등을 예로서 들 수 있다. 이러한 당 잔기의 개변은, 자체 공지된 방법에 의해 행할 수 있다(예컨대, Sproat et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145 참조).
본 발명의 압타머는 또한, NGF에 대한 결합성, NGF와 NGF 수용체와의 결합 저해 활성, NGF의 신경 돌기 신장 저해 활성, NGF의 세포 증식 저해 활성, 압타머의 안정성, 약물 송달성, 혈액 속에서의 안정성 등을 높이기 위해서, 핵산 염기(예컨대, 퓨린, 피리미딘)가 개변(예컨대, 화학적 치환)된 것이어도 좋다. 이러한 개변으로서는, 예컨대, 5위 피리미딘 개변, 6 및/또는 8위 퓨린 개변(O-메틸 수식 등), 환외 아민에 의한 개변, 4-티오우리딘에 의한 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우라실에 의한 치환, 5-아미노산 타입의 수식, 5-트립토판 측쇄의 수식을 들 수 있다. 또한, 뉴클레아제 및 가수분해에 대하여 내성이 되도록, 본 발명의 압타머에 포함되는 인산기가 개변되어 있어도 좋다. 예컨대, 압타머의 포스페이트 부분이, P(O)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)NR2(아미데이트), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2(포름아세탈), P(O)BH3(보라노포스페이트) 또는 3'-아민(-NH-CH2-CH2-)으로 치환되어 있어도 좋다[여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H이거나 또는 치환되어 있거나 또는 치환되어 있지 않은 알킬(예컨대, 메틸, 에틸)임].
연결기로서는, -O-, -N- 또는 -S-가 예시되며, 이들 연결기를 통하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.
개변은 또한 캡핑과 같은 3' 및 5'의 개변을 포함하여도 좋다.
개변은 폴리에틸렌글리콜(이하, 「PEG」라고 기재하는 경우가 있음), 아미노산, 펩티드, 인버티드 dT, 미리스토일, 리토콜산-올레일, 도코산일, 라우로일, 스테아로일, 팔미토일, 올레오일, 리놀레오일, 기타 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광 물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 말단에 더 부가함으로써 행할 수 있다. 이러한 개변에 대해서는 예컨대 미국 특허 제5,660,985호, 미국 특허 제5,756,703호를 참조한다.
특히, 개변이 PEG의 말단 부가에 의해 행해지는 경우, PEG의 분자량은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1000∼100000, 보다 바람직하게는 30000∼90000이다. PEG는 직쇄상이어도 좋고, 2개 이상의 쇄로 분기된 것[멀티 아암(multi-arm) PEG]이어도 좋다.
이러한 PEG으로서는 특별히 한정되지 않고, 당업자라면 시판되거나 또는 공지된 PEG를 적절하게 선택하여 이용할 수 있지만(예컨대, http://www.peg-drug.com/peg_product/branched.html을 참조), 본 발명의 압타머에 적용하는 PEG의 적합예로서 구체적으로는, 분자량 40000의 2분기 GS형 PEG(SUNBRIGHT GL2-400GS2 니치유사 제조), 분자량 40000의 2분기 TS형 PEG(SUNBRIGHT GL2-400TS 니치유사 제조), 분자량 40000의 4분기 TS형 PEG(SUNBRIGHT GL4-400TS 니치유사 제조), 분자량 80000의 2분기 TS형 PEG(SUNBRIGHT GL2-800TS 니치유사 제조) 또는 분자량 80000의 4분기 TS형 PEG(SUNBRIGHT GL4-800TS 니치유사 제조) 등을 들 수 있다.
이 경우, 본 발명의 압타머는, PEG이 말단에 직접 부가되어 있어도 좋지만, 그 말단에 PEG와 결합 가능한 기를 갖는 링커 등이 부가되며, 그것을 통해 PEG를 본 발명의 압타머에 부가하는 것이 보다 바람직하다.
PEG와 본 발명의 압타머의 링커로서는 특별히 한정되지 않고, 탄소 쇄의 수나 작용기 등을 결합 부위나 PEG의 종류 등에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 이러한 링커로서는, 예컨대 아미노기를 갖는 링커를 들 수 있고, 구체적으로는, 5' 말단에 부가하는 경우는, ssH 링커(SAFC) 또는 DMS(O)MT-AMINO-MODIFIER(GLEN RESERCH)가, 3' 말단에 부가하는 경우는, TFA Amino C-6 lcaa CPG(ChemGenes) 등이 예시된다. 이 링커를 선택한 경우, PEG에는, 예컨대 N-히드록시숙신이미드의 활성기를 부가한 후에, 이것을 링커 측의 아미노기와 반응시킴으로써 본 발명의 압타머와 PEG를 링커를 통해 결합할 수 있다.
또한, PEG나 링커로서는, 시판되고 있는 것을 바람직하게 이용할 수 있다. 또한, PEG, 링커 및 본 발명의 압타머의 결합에 관한 반응 조건 등은 당업자라면 적절하게 설정할 수 있다.
본 발명의 압타머는, 본 명세서 중에서 개시되고 그 기술 분야에서의 자체 공지된 방법에 의해 화학 합성할 수 있다. 압타머는, 인산기의 마이너스 전하를 이용한 이온 결합, 리보스를 이용한 소수 결합 및 수소 결합, 핵산 염기를 이용한 수소 결합이나 스태킹 결합 등 다양한 결합 양식에 의해 표적 물질과 결합한다. 특히, 구성 뉴클레오티드의 수만큼 존재하는 인산기의 마이너스 전하를 이용한 이온 결합은 강하며, 단백질의 표면에 존재하는 리신이나 아르기닌의 플러스 전하와 결합한다. 이 때문에, 표적 물질과의 직접적인 결합에 관여하지 않는 핵산 염기는 치환할 수 있다. 특히, 스템 구조 부분은 이미 염기쌍이 만들어져 있고, 또한, 이중 나선 구조의 내측을 향하고 있기 때문에, 핵산 염기는 표적 물질과 직접 결합하기 어렵다. 따라서, 염기쌍을 다른 염기쌍으로 치환하여도 압타머의 활성은 감소하지 않는 경우가 많다. 루프 구조 등 염기쌍을 만들지 않는 구조에 있어서도, 핵산 염기가 표적 분자와의 직접적인 결합에 관여하지 않는 경우에, 염기의 치환이 가능하다. 리보스의 2'위의 수식에 관해서는, 드물게 리보스의 2'위의 작용기가 표적 분자와 직접적으로 상호 작용하고 있는 경우가 있지만, 대부분의 경우 관계가 없으며, 다른 수식 분자로 치환 가능하다. 이와 같이 압타머는, 표적 분자와의 직접적인 결합에 관여하고 있는 작용기를 치환 또는 삭제하지 않는 한, 그 활성을 유지하고 있는 경우가 많다. 또한, 전체의 입체 구조가 크게 변하지 않는 것도 중요하다.
압타머는, SELEX 및 그 개량법(예컨대, Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510)을 이용함으로써 제작할 수 있다. SELEX에서는 라운드수를 늘리거나, 경합 물질을 사용함으로써, 표적 물질에 대하여 보다 결합력이 강한 압타머가 농축되어, 선별된다. 따라서, SELEX의 라운드수를 조절하거나 및/또는 경합 상태를 변화시킴으로써, 결합력이 상이한 압타머, 결합 형태가 상이한 압타머, 결합력이나 결합 형태는 동일하지만 염기 서열이 상이한 압타머를 얻을 수 있는 경우가 있다. 또한, SELEX에는 PCR에 의한 증폭 과정이 포함되는데, 그 과정에서 망간 이온을 사용하는 등으로 변이를 넣음으로써 보다 다양성이 풍부한 SELEX를 행할 수 있게 된다.
SELEX에서 얻어지는 압타머는 표적 물질에 대하여 친화성이 높은 핵산이며, 그것은 표적 물질의 활성 부위에 결합하는 것을 의미하지 않는다. 따라서, SELEX에서 얻어지는 압타머는 반드시 표적 물질의 기능에 작용하는 것은 아니다. NGF는 염기성 단백질이며, 핵산이 비특이적으로 결합하기 쉽다고 생각된다. 활성 부위에 결합하지 않는 압타머는 그 표적 물질의 활성에 영향을 미치지 않는다.
이와 같이 하여 선택된 활성이 있는 압타머에 기초하여, 보다 높은 활성을 갖는 압타머를 획득하기 위해서 취득된 압타머의 서열을 기초로 한 SELEX를 행할 수 있다. 구체적인 방법은, 어떤 서열이 정해져 있는 압타머의 일부를 랜덤 서열로 한 템플레이트나 10%∼30% 정도의 랜덤 서열을 도핑한 템플레이트를 제작하여, 재차 SELEX를 행하는 것이다.
SELEX에 의해 얻어지는 압타머는 80 뉴클레오티드 정도의 길이가 있으며, 이것을 그대로 의약으로 하기는 어렵다. 그래서, 시행착오를 반복하여, 용이하게 화학 합성을 할 수 있는 60 뉴클레오티드 이하, 바람직하게는 50 뉴클레오티드 이하, 가장 바람직하게는 45 뉴클레오티드 이하의 길이까지 짧게 할 필요가 있다. SELEX에 의해 얻어지는 압타머는 그 프라이머 설계에 따라, 그 후의 최소화 작업의 용이성이 변한다. 프라이머를 잘 설계하지 않으면, SELEX에 의해 활성이 있는 압타머를 선별할 수 있었다고 해도, 그 후의 개발이 불가능하게 된다.
압타머는 화학 합성이 가능하기 때문에 개변이 용이하다. 압타머는 MFOLD 프로그램을 이용하여 이차 구조를 예측하거나, X선 해석이나 NMR 해석에 의해 입체 구조를 예측함으로써, 어떤 뉴클레오티드를 치환 또는 결손하는 것이 가능한지, 또한, 어디에 새로운 뉴클레오티드를 삽입할 수 있는지 어느 정도 예측할 수 있다. 예측된 새로운 서열의 압타머는 용이하게 화학 합성할 수 있으며, 그 압타머가 활성을 유지하고 있는지 어떤지 기존의 분석계에 의해 확인할 수 있다.
얻어진 압타머의 표적 물질과의 결합에 중요한 부분을, 상기와 같은 시행착오를 반복함으로써 특정할 수 있었던 경우, 그 서열의 양단에 새로운 서열을 부가하여도, 대부분의 경우 활성은 변화하지 않는다. 그리고, 이러한 새로운 서열의 길이는 특별히 한정되는 것은 아니다.
수식에 관해서도 서열과 마찬가지로 고도로 설계 또는 개변 가능하다.
이상과 같이, 압타머는 고도로 설계 또는 개변 가능하다. 본 발명은 또한, 소정의 서열(예컨대, 스템 부분, 인터널 루프 부분, 헤어핀 루프 부분 및 단일쇄 부분에서 선택되는 부분에 대응하는 서열: 이하, 필요에 따라 고정 서열로 생략함)을 포함하는 압타머를 고도로 설계 또는 개변 가능한 압타머의 제조 방법을 제공한다.
예컨대, 이러한 압타머의 제조 방법은 하기:
Figure 112014038112419-pct00006
[상기에 있어서, (N)a는 a개의 N으로 이루어지는 뉴클레오티드 쇄를 나타내고, (N)b는 b개의 N으로 이루어지는 뉴클레오티드 쇄를 나타내며, N은 각각 동일하거나 또는 상이하고, A, G, C, U 및 T(바람직하게는, A, G, C 및 U)로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드이다. a, b는 각각 동일하거나 또는 상이하고, 임의의 수일 수 있는데, 예컨대 1∼약 100개, 바람직하게는 1∼약 50개, 보다 바람직하게는 1∼약 30개, 보다 더 바람직하게는 1∼약 20개 또는 1∼약 10개일 수 있다.]으로 표시되는 뉴클레오티드로 이루어지는 단일 종의 핵산 분자 또는 복수 종의 핵산 분자(예컨대, a, b의 수 등이 상이한 핵산 분자의 라이브러리) 및 프라이머용 서열 (i), (ii)에 각각 대응하는 프라이머 쌍을 이용하여, 고정 서열을 포함하는 압타머를 제조하는 것을 포함한다.
본 발명의 압타머로서 바람직하게는, 서열번호 82로 표시되는 서열을 포함하고, 또한 염기 길이가 50 이하인 것을 특징으로 하는, NGF에 결합하는 압타머이다.
서열번호 82로 표시되는 서열은 본 발명의 압타머가 NGF에 결합하여, NGF의 활성, 특히 신경 돌기 신장 활성, 세포 증식 활성을 저해하는 등, 본 발명의 압타머로서 기능하는 데에 있어서 중요한 부분이지만, 이들 서열의 양단에 새로운 서열을 부가하여도 본 발명의 압타머로서의 기능이 손상되는 일은 없다. 또한, 이들 서열은, 상기한 당 잔기의 수식·핵산 염기나 인산기의 개변 등을 받고 있어도 좋다.
즉 본 발명의 압타머로서,
서열번호 82로 표시되는 서열을 포함하고, 또한 뉴클레오티드 길이가 50 이하인 것을 특징으로 하는 NGF에 결합하는 압타머로서,
(i) 적어도 1종의 뉴클레오티드가, 리보스의 2'위에 있어서, 히드록실기가, 수소 원자, 불소 원자, -O-알킬기, -O-아실기 또는 아미노기로 치환되어 있는 압타머;
(ii) PEG, 아미노산, 펩티드, 인버티드 dT, 미리스토일, 리토콜산-올레일, 도코산일, 라우로일, 스테아로일, 팔미토일, 올레오일, 리놀레오일, 기타 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광 물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질 또는 비오틴이 말단에 부가되어 있는 압타머;
(iii) (i) 및 (ii)의 요건을 만족하는 압타머;
등을 바람직한 구체예로서 들 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 압타머 및 그것에 결합한 기능성 물질을 포함하는 복합체를 제공한다. 본 발명의 복합체에 있어서의 압타머와 기능성 물질간의 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 본 발명의 복합체는, 본 발명의 압타머와 1 이상(예컨대, 2개 또는 3개)의 동종 또는 이종의 기능성 물질이 결합한 것일 수 있다. 기능성 물질은, 본 발명의 압타머에 어떠한 기능을 새롭게 부가하는 것, 또는 본 발명의 압타머가 유지할 수 있는 어떠한 특성을 변화(예컨대, 향상)시킬 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 기능성 물질로서는, 예컨대, 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 당질, 단당, 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오티드를 들 수 있다. 기능성 물질로서는 또한 예컨대, 친화성 물질(예컨대, 비오틴, 스트렙타비딘, 표적 상보 서열에 대하여 친화성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 항체, 글루타치온 세파로오스, 히스티딘), 표지용 물질(예컨대, 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위체), 효소(예컨대, 서양 고추냉이 페록시다아제, 알칼리포스파다아제), 약물 송달 매체(예컨대, 리포좀, 마이크로스피어, 펩티드, 폴리에틸렌글리콜류), 약물(예컨대, 칼리키아마이신이나 듀오칼마이신 등 미사일 요법(missile therapy)에 사용되고 있는 것, 시클로포스파미드, 멜파란, 이포스파미드 또는 트로포스파미드 등의 나이트로겐 머스타드 유사체, 티오테파 등의 에틸렌이민류, 카무스틴 등의 니트로소우레아, 테모졸로마이드 또는 다카바진 등의 알킬화제, 메토트렉세이트 또는 랄티트렉세드 등의 엽산 유사 대사 길항제, 티오구아닌, 클라드리빈 또는 플루다라빈 등의 퓨린 유사체, 플루오로우라실, 테가푸르 또는 젬시타빈 등의 피리미딘 유사체, 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈 등의 빈카 알칼로이드 및 그 유사체, 에토포시드, 탁산, 도세탁셀 또는 파클리탁셀 등의 포도필로톡신 유도체, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신 및 미톡산트론 등의 안트라사이클린류 및 유사체, 블레오마이신 및 미토마이신 등의 다른 세포 독성 항생 물질, 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥살리플라틴 등의 백금 화합물, 펜토스타틴, 밀테포신, 에스트라머스틴, 토포테칸, 이리노테칸 및 비칼루타미드), 독소(예컨대, 리신 독소, 리아 독소 및 베로 독소)를 들 수 있다. 이들 기능성 분자는 최종적으로 제거되는 경우가 있다. 더욱이, 트롬빈이나 매트릭스-메탈로프로테아제(MMP), FactorX 등의 효소가 인식하여 절단할 수 있는 펩티드, 뉴클레아제나 제한 효소가 절단할 수 있는 폴리뉴클레오티드여도 좋다.
본 발명의 압타머 및 복합체는, 예컨대, 의약 또는 진단약, 검사약, 시약, 음료수나 식품의 첨가제, 증강제, 완화제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 압타머 및 복합체는, NGF에 결합하여, NGF와 NGF 수용체와의 결합을 저해함으로써, NGF의 기능을 저해하는 활성을 가질 수 있다. 전술한 바와 같이, NGF는 동통이나 염증과 깊게 관련되어 있다. 따라서, 본 발명의 압타머 및 복합체는, 동통이나 염증을 동반하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약(항동통제, 항염증제 등)으로서 유용하다.
여기서 동통으로서는 침해수용성 동통(근육통, 배부통, 상지통, 편타 손상, 관절통, 변형성 관절증, 통풍, 만성 관절 류머티즘, 두통, 편두통, 긴장형 두통, 군발 두통, 이차성 두통, 구강 안면통, 치통, 발치후 작열통, 환치통, 내장통, 심장통, 복통, 중간통, 월경 곤란, 진통, 신장통, 요관통, 방광통 등), 염증성 동통, 신경인성 동통(당뇨병성 신경병증, 중독성 신경병증, 수술후통증, 환지통, 절단부 통증, 반사성 교감신경성 이영양증, 작열통, 대상포진후통, 삼차신경통, 중추성 동통), 암성 동통(내장기관에의 암 침윤에 의한 통증, 암 조직의 혈관 침윤에 의한 혈관 폐색으로 생기는 통증, 골 전이의 통증, 뇌내 전이에 따른 통증, 암 조직의 말초 신경 침윤에 의한 통증), 섬유 근통 등을 들 수 있다.
여기서 염증에 따른 질환으로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 전신성 홍반성 루프스, 다발성 경화증, 건선, 변형성 관절증, 만성 관절 류머티즘, 간질성 방광염, 천식 등을 들 수 있다.
상기 암으로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 식도암, 갑상선암, 방광암, 대장암, 위암, 췌장암, 흉부암, 간장암, 폐암, 비소세포폐암, 유방암, 뉴로블라스토마, 교아세포종, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 윌름스 종양, 전립선암 등을 들 수 있다.
NGF는 그 수용체 TrkA에 결합하면 TrkA의 티로신 인산화 및 TrkA 하류의 Ras-MAPK, PLC-γ, PI3K 등을 활성화시켜, 신경 세포의 생존이나 분화와 같은 생리적 작용을 발휘한다. 한편, p75 수용체를 통한 신호 경로에서는 세포사를 유도한다. 따라서, 본 발명의 압타머 및 복합체는, 이들 신호 전달 경로의 활성화에 관계된 질환의 의약 또는 진단약, 검사약, 시약으로서 사용될 수 있다. 이들 신호 전달 경로의 활성화에 관계된 질환으로는 상기 동통이나 염증성 질환, 암을 들 수 있다.
본 발명의 압타머 및 복합체가 의약, 진단약, 검사약, 시약 등으로서 이용되는 경우, 그것이 투여되는 대상은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 영장류(예컨대, 인간, 원숭이), 설치류(예컨대, 마우스, 래트, 몰모트) 및 애완 동물, 가축 및 사역 동물(예컨대, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양, 돼지)을 들 수 있다.
본 발명의 압타머 및 복합체는 NGF에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 압타머 및 복합체는, NGF 검출용 프로브로서 유용하다. 이 프로브는, NGF의 인비보 이미지화, 혈중 농도 측정, 조직 염색, ELISA 등에 유용하다. 또한, 이 프로브는, NGF가 관여하는 질환(동통이나 염증을 동반하는 질환 등)의 진단약, 검사약, 시약 등으로서 유용하다.
또한, 그 NGF에의 특이적 결합에 기초하여, 본 발명의 압타머 및 복합체는 NGF의 분리 정제용 리간드로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 압타머 및 복합체는, 연애 등의 정신적 상태를 조사하기 위한 검사약이나 정신 상태를 조정하기 위한 의약, 조정제, 증강제, 완화제로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 압타머 및 복합체는 약물 송달제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 의약은, 의약상 허용되는 담체가 배합된 것일 수 있다. 의약상 허용되는 담체로서는, 예컨대, 자당, 전분, 만니톨, 소르비트, 젖당, 글루코오스, 셀룰로오스, 탈크, 인산칼슘, 탄산칼슘 등의 부형제, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리프로필피롤리돈, 젤라틴, 아라비아 고무, 폴리에틸렌글리콜, 자당, 전분 등의 결합제, 전분, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 나트륨-글리콜-스타치, 탄산수소나트륨, 인산칼슘, 시트르산칼슘 등의 붕괴제, 스테아린산마그네슘, 에어로실, 탈크, 라우릴황산나트륨 등의 윤활제, 시트르산, 멘톨, 글리시리진·암모늄염, 글리신, 오렌지 가루 등의 방향제, 안식향산나트륨, 아황산수소나트륨, 메틸파라벤, 프로필파라벤 등의 보존제, 시트르산, 시트르산나트륨, 아세트산 등의 안정제, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 스테아린산알루미늄 등의 현탁제, 계면활성제 등의 분산제, 물, 생리식염수, 오렌지 쥬스 등의 희석제, 카카오지, 폴리에틸렌글리콜, 백등유 등의 베이스 왁스 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여에 적합한 제제는, 물, 생리식염수, 오렌지 쥬스와 같은 희석액에 유효량의 리간드를 용해시킨 액제, 유효량의 리간드를 고체나 과립으로서 포함하고 있는 캡슐제, 사셰(sachet)제 또는 정제, 적당한 분산매 중에 유효량의 유효 성분을 현탁시킨 현탁액제, 유효량의 유효 성분을 용해시킨 용액을 적당한 분산매 중에 분산시켜 유화시킨 유제 등이다.
또한, 본 발명의 의약은 필요에 따라, 맛의 마스킹, 장용성 또는 지속성 등의 목적을 위하여, 자체 공지된 방법으로 코팅할 수 있다. 코팅에 이용되는 코팅제로서는, 예컨대, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌글리콜, 트윈 80, 플루로닉 F68, 셀룰로오스아세테이트프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트, 히드록시메틸셀룰로오스아세테이트숙시네이트, 유드라짓(롬사 제조, 독일, 메타아크릴산·아크릴산 공중합체) 및 색소(예컨대, 벵갈라, 이산화티탄 등)등이 이용된다. 이 의약은 속방성 제제, 서방성 제제 중 어느 것이라도 좋다. 서방의 기재로서는, 예컨대, 리포좀, 아텔로콜라겐, 젤라틴, 히드록시아파타이트, PLGA 등을 들 수 있다.
비경구적인 투여(예컨대, 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 국소 투여, 복강내 투여, 경비 투여, 경폐 투여 등)에 적합한 제제로서는, 수성 및 비수성의 등장의 무균 주사액제가 있으며, 이들에는 항산화제, 완충액, 제균제, 등장화제 등이 포함되어 있어도 좋다. 또한, 수성 및 비수성의 무균 현탁액제를 들 수 있으며, 이것에는 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 방부제 등이 포함되어 있어도 좋다. 상기 제제는, 앰플이나 바이알과 같이 단위 투여량 또는 복수회 투여량씩 용기에 봉입할 수 있다. 또한, 유효 성분 및 의약상 허용되는 담체를 동결 건조하여, 사용 직전에 적당한 무균의 용매에 용해 또는 현탁하면 되는 상태로 보존할 수도 있다. 또한, 서방 제제도 적합한 제제로서 들 수 있다. 서방 제제로서는, 인공 뼈나 생체 분해성 또는 비분해성 스폰지, 백(bag), 약제 펌프, 침투압 펌프 등, 체내에 매립된 담체 또는 용기로부터의 서방 형태, 또는 체외로부터 계속적 또는 단속적으로 체내 또는 국소에 송달되는 디바이스 등을 들 수 있다. 생체 분해성 기재로서는, 리포좀, 양이온성 리포좀, 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 아텔로콜라겐, 젤라틴, 히드록시아파타이트, 다당 시조피란 등을 들 수 있다. 더욱이 주사액제나 서방 제제 이외에도, 흡입제, 연고제도 가능하다. 흡입제의 경우, 동결건조 상태의 유효 성분을 미세화하여 적당한 흡입 디바이스를 이용하여 흡입 투여한다. 흡입제에는, 필요에 따라 종래부터 사용되고 있는 계면활성제, 오일, 조미료, 시클로덱스트린 또는 그 유도체 등을 적절하게 더 배합할 수 있다.
여기서 계면활성제로서는, 예컨대 올레인산, 레시틴, 디에틸렌글리콜 디올레에이트, 테트라히드로푸르푸릴 올레에이트, 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 글리세릴 트리올레에이트, 글리세릴 모노라우레이트, 글리세릴 모노올레에이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 모노리시노에이트, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올, 폴리에틸렌글리콜 400, 세틸피리디늄 클로라이드, 소르비탄 트리올레에이트(상품명 스판 85), 소르비탄 모노올레에이트(상품명 스판 80), 소르비탄 모노라우레이트(상품명 스판 20), 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유(상품명 HCO-60), 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트(상품명 트윈 20), 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트(상품명 트윈 80), 천연 자원 유래의 레시틴(상품명 에피클론), 올레일 폴리옥시에틸렌 (2) 에테르(상품명 브리지 92), 스테아릴 폴리옥시에틸렌 (2) 에테르(상품명 브리지 72), 라우릴 폴리옥시에틸렌 (4) 에테르(상품명 브리지 30), 올레일 폴리옥시에틸렌 (2) 에테르(상품명 게나폴 0-020), 옥시에틸렌과 옥시프로필렌과의 블록 공중합체(상품명 신페로닉)등을 들 수 있다. 오일로서는, 예컨대 옥수수유, 올리브유, 면실유, 해바라기유 등을 들 수 있다. 또한, 연고제의 경우, 적당한 의약상 허용되는 기제(황색 바셀린, 백색 바셀린, 파라핀, 플라스티베이스, 실리콘, 백색 연고, 밀랍, 돈유, 식물유, 친수 연고, 친수 바셀린, 정제 라놀린, 가수 라놀린, 흡수 연고, 친수 플라스티베이스, 매크로골 연고 등)를 이용하고, 유효 성분과 혼합하여 제제화하여 사용한다.
흡입제는 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 즉, 상기 본 발명의 압타머 및 복합체를 분말 또는 액상으로 하여, 흡입 분사제 및/또는 담체 중에 배합하여, 적당한 흡입 용기에 충전함으로써 제조할 수 있다. 또한, 상기 본 발명의 압타머 및 복합체가 분말인 경우는 통상의 기계적 분말 흡입기를, 액상인 경우는 네뷸라이저 등의 흡입기를 각각 사용할 수도 있다. 여기서 분사제로서는 종래 공지된 것을 널리 사용할 수 있으며, 프론-11, 프론-12, 프론-21, 프론-22, 프론-113, 프론-114, 프론-123, 프론-142c, 프론-134a, 프론-227, 프론-C318, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 등의 프론계 화합물, 프로판, 이소부탄, n-부탄 등의 탄화수소류, 디에틸에테르 등의 에테르류, 질소 가스, 탄산 가스 등의 압축 가스 등을 예시할 수 있다.
본 발명 의약의 투여량은, 유효 성분의 종류·활성, 병의 위중도, 투여 대상이 되는 동물종, 투여 대상의 약물 수용성, 체중, 연령 등에 따라 다르지만, 통상, 성인 1일당 유효 성분량으로서 약 0.0001∼약 100 ㎎/㎏, 예컨대 약 0.0001∼약 10 ㎎/㎏, 바람직하게는 약 0.005∼약 1 ㎎/㎏일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 압타머 및 복합체가 고정화된 고상 담체를 제공한다. 고상 담체로서는, 예컨대, 기판, 수지, 플레이트(예컨대, 멀티웰 플레이트), 필터, 카트리지, 칼럼, 다공질재를 들 수 있다. 기판은, DNA 칩이나 프로테인 칩 등에 사용되고 있는 것 등일 수 있으며, 예컨대, 니켈-PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌) 기판이나 유리 기판, 아파타이트 기판, 실리콘 기판, 알루미나 기판 등으로, 이들 기판에 폴리머 등을 코팅한 것을 들 수 있다. 수지로서는, 예컨대, 아가로스 입자, 실리카 입자, 아크릴아미드와 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체, 폴리스티렌 가교 디비닐벤젠 입자, 덱스트란을 에피클로로히드린으로 가교한 입자, 셀룰로오스 파이버, 알릴덱스트란과 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드의 가교 폴리머, 단분산계 합성 폴리머, 단분산계 친수성 폴리머, 세파로스, 토요펄(Toyopearl) 등을 들 수 있으며, 또한, 이들 수지에 각종 작용기를 결합시킨 수지도 포함된다. 본 발명의 고상 담체는, 예컨대, NGF의 정제 및 NGF의 검출, 정량에 유용할 수 있다.
본 발명의 압타머 및 복합체는, 자체 공지된 방법에 의해 고상 담체에 고정할 수 있다. 예컨대, 친화성 물질(예컨대, 전술한 것)이나 소정의 작용기를 본 발명의 압타머 및 복합체에 도입하고, 이어서 상기 친화성 물질이나 소정의 작용기를 이용하여 고상 담체에 고정화하는 방법을 들 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 방법을 제공한다. 소정의 작용기는, 커플링 반응에 제공할 수 있는 작용기일 수 있으며, 예컨대, 아미노기, 티올기, 히드록실기, 카르복실기를 들 수 있다. 본 발명은 또한, 이러한 작용기가 도입된 압타머를 제공한다.
본 발명은 또한 NGF의 정제 및 농축 방법을 제공한다. 특히 본 발명은 NGF를 다른 패밀리 단백질로부터 분리하는 것이 가능하다. 본 발명의 정제 및 농축 방법은, 본 발명의 고상 담체에 NGF를 흡착시키고, 흡착한 NGF를 용출액에 의해 용출시키는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 고상 담체에의 NGF의 흡착은 자체 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 예컨대, NGF를 함유하는 시료(예컨대, 세균 또는 세포의 배양물 또는 배양 상청, 혈액)를, 본 발명의 고상 담체 또는 그 함유물에 도입한다. NGF의 용출은, 중성 용액 등의 용출액을 이용하여 행할 수 있다. 중성 용출액은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 pH 약 6∼약 9, 바람직하게는 pH 약 6.5∼약 8.5, 보다 바람직하게는 pH 약 7∼약 8일 수 있다. 중성 용액은 또한, 예컨대, 요소, 킬레이트제(예컨대, EDTA), 칼륨염(예컨대, KCl), 마그네슘염(예컨대, MgCl2), 계면활성제(예컨대, 트윈 20, Triton, NP40), 글리세린을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 정제 및 농축 방법은 또한, NGF의 흡착 후, 세정액을 이용하여 고상 담체를 세정하는 것을 포함할 수 있다. 세정액으로서는, 예컨대, 요소, 킬레이트제(예컨대, EDTA), Tris, 산, 알칼리, Transfer RNA, DNA, 트윈 20 등의 표면활성제, NaCl 등의 염을 포함하는 것 등을 들 수 있다. 본 발명의 정제 및 농축 방법은 또한, 고상 담체를 가열 처리하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 공정에 의해 고상 담체의 재생, 멸균이 가능하다.
본 발명은 또한 NGF의 검출 및 정량 방법을 제공한다. 특히 본 발명은 NGF를 다른 패밀리 단백질과 구별하여 검출 및 정량할 수 있다. 본 발명의 검출 및 정량 방법은, 본 발명의 압타머를 이용하여(예컨대, 본 발명의 복합체 및 고상 담체의 사용에 의해) NGF를 측정하는 것을 포함할 수 있다. NGF의 검출 및 정량 방법은, 항체 대신에 본 발명의 압타머를 이용하는 것 이외에는, 면역학적 방법과 동일한 방법에 의해 행할 수 있다. 따라서, 항체 대신에 본 발명의 압타머를 프로브로서 이용함으로써, 효소 면역 측정법(EIA)(예컨대, 직접 경합 ELISA, 간접 경합 ELISA, 샌드위치 ELISA), 방사 면역 측정법(RIA), 형광 면역 측정법(FIA), 웨스턴 블롯법, 면역 조직화학적 염색법, 셀 소팅법 등의 방법과 동일한 방법에 의해 검출 및 정량을 행할 수 있다. 또한, PET 등의 분자 프로브로서도 사용할 수 있다. 이러한 방법은, 예컨대, 생체 또는 생물학적 샘플에 있어서의 NGF량의 측정, NGF가 관련되는 질환의 진단에 유용할 수 있다.
본 명세서 중에서 예로 든 특허 및 특허출원 명세서를 포함하는 모든 간행물에 기재된 내용은, 본 명세서에서의 인용에 의해, 그 전체가 명시된 것과 같은 정도로 본 명세서에 삽입되는 것이다.
이하에, 실시예를 들어, 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예 등에 하등 제약되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: NGF 압타머의 제작 1
NGF에 특이적으로 결합하는 RNA 압타머는 SELEX법을 이용하여 제작하였다. SELEX는 Ellington 등의 방법(Ellington and Szostak, Nature 346, 818-822, 1990)및 Tuerk 등의 방법(Tuerk and Gold, Science 249, 505-510, 1990)을 참고하여 행하였다. 표적 물질로서 인간 NGF(R&D Systems사 제조)를 이용하였다.
맨 처음 라운드에서 이용한 RNA(40N)는, 화학 합성에 의해 얻어진 DNA를 DuraScribeTMT7 Transcription Kit(Epicentre사 제조)를 이용하여 전사하여 얻었다. 키트에 포함되는 NTP 중, 2'-OHATP은 2'-데옥시아데노신-5'-삼인산(2'-H ATP 또는 dATP, GE Healthcare사 제조)으로 대체하고, 그 밖의 기질은 키트에 있는 것을 사용하였다. 이 방법에 의해 얻어진 RNA는 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'위가 플루오로화된 것으로, 퓨린 뉴클레오티드인 G는 RNA 타입, A는 DNA 타입이다. DNA 주형으로서 이하에 나타내는 40 뉴클레오티드의 랜덤 서열의 양단에 프라이머 서열을 지닌 길이 83 뉴클레오티드의 DNA를 이용하였다. DNA 주형과 프라이머는 화학 합성에 의해 제작하였다.
DNA 주형 1:
5'-gaggatccatgtatgcgcacata-40 n-cttctggtcgaagttctccc-3'(서열번호 118)
프라이머 Fwd1:
5'-cggaattctaatacgactcactatagggagaacttcgaccagaag-3'(서열번호 119)
프라이머 Rev1:
5'-gaggatccatgtatgcgcacata-3'(서열번호 120)
상기 서열에 있어서, n은 a, g, c 또는 t 중 어느 하나를 나타낸다. 프라이머 Fwd1은 T7 RNA 폴리머라제의 프로모터 서열을 포함하고 있다. 맨 처음 라운드에서 이용한 RNA 풀의 베리에이션(variation)은 이론상 1014였다.
SELEX를 10 라운드 행한 후, PCR 산물을 pGEM-T Easy 벡터(Promega사 제조)에 클로닝하여, 대장균주 DH5α(Toyobo사 제조)에 트랜스포메이션하였다. 싱글 콜로니로부터 플라스미드를 추출 후, DNA 시퀀서(ABI PRISM3100, ABI사 제조)로 염기 서열을 결정하였다. 48 클론을 조사한 바, 45 서열을 결정할 수 있었다. 그 중 2 서열씩 같은 것이 7 종류, 나머지 31 서열은 싱글 서열이었다. SELEX를 3 라운드 더 추가하여 재차 서열을 조사한 바, 한층 더한 수속이 보였다.
10과 13 라운드에서 수속이 보인 서열 및 몇 개의 싱글 서열의 NGF에 대한 결합 활성을 표면 플라즈몬 공명법에 의해 평가하였다.
측정 장치는 BIAcore사 제조의 BIAcore2000을 사용하고, 센서 칩으로서 아미노기와 반응하는 CM5를 이용하였다. 인간 NGF는 고정화 용액(10 mM 아세트산나트륨, pH 6)에 용해하여 25∼40 ㎍/㎖로 하였다. 단백질 측의 아미노기와 칩 측의 카르복실기의 반응에는 에틸-3-카르보디이미드 히드로클로라이드와 N-히드록시숙신이미드를 이용하였다. 반응 후, 에탄올아민-HCl에 의한 블로킹을 행하였다. NGF의 고정화량은 3000∼4000 RU로 하였다. 아날라이트용의 압타머는 0.15 μM∼0.5 μM로 조제하였다. 런닝 버퍼에는 용액 A를 이용하였다. 여기서 용액 A란 145 mM 염화나트륨, 5.4 mM 염화칼륨, 1.8 mM 염화칼슘, 0.8 mM 염화마그네슘, 20 mM 트리스(pH 7.6), 0.05% 트윈 20의 혼합 용액이다. 재생 용액으로서 1 M NaCl과 50 mM NaOH의 혼합 용액을 이용하였다. NGF는 FC2에 고정화하고, FC1의 결과를 뺌으로써 최종적인 센서그램으로 하였다.
34 서열의 결합 활성을 측정한 바, 모든 RNA가 컨트롤의 40N보다도 유의적으로 NGF에 결합하는 것을 알 수 있었다. 여기서 40N이란 40 뉴클레오티드의 랜덤 서열을 포함하는, 1 라운드째에 사용한 RNA 풀을 말한다. 이상으로부터, 이들 RNA는 NGF에 결합하는 압타머임이 드러났다.
실시예 2: NGF와 NGF 수용체의 결합을 저해하는 압타머
실시예 1에서 얻어진 압타머가 NGF와 NGF 수용체(TrkA와 p75)의 결합을 저해하는지 여부를 표면 플라즈몬 공명법을 이용하여 조사하였다.
BIAcore사의 프로토콜에 따라, CM5 센서 칩에 Protein A(21181, PIERCE)를 고정화하였다. 거기에, IgG의 Fc 부분이 융합된 인간 TrkA-Fc(175-TK, R&D systems) 혹은 인간 P75(367-NR, R&D systems)를 약 700∼1200 RU 고정화하였다. 아날라이트로서 NGF(0.1 μM)와 압타머(0.3 μM)를 혼합하여 30분 유지한 것을 인젝션하였다. 만일 압타머가 NGF와 TrkA 혹은 p75의 결합을 저해하는 경우는 센서그램의 신호는 상승하지 않지만, 만일 저해하지 않는 경우는 3자 복합체를 형성하여 신호가 상승할 것이 예상된다. 또한, NGF가 압타머보다도 수용체에 강하게 결합하는 경우는, 압타머가 빠지고, NGF가 수용체와 결합하는 경우도 있다. 저해 실험을 시작하기 전에 TrkA 혹은 p75에 NGF가 결합하는 것을 확인하였다.
34 서열의 저해 활성을 측정한 바, 모든 압타머가 NGF와 TrkA 혹은 p75의 결합을 저해하는 것을 알 수 있었다. 특히 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 7로 표시되는 압타머는 강한 저해 활성을 보였다. 이상으로부터, 이들 RNA는 NGF와 NGF 수용체의 결합을 저해하는 압타머임이 드러났다.
실시예 3: 압타머의 신경 돌기 신장 저해 활성
PC12 세포의 서브클론인 Neuroscreen-1 세포를 이용하여, 실시예 1에서 얻은 압타머의 신경 돌기 신장 저해 활성을 평가하였다.
콜라겐 타입 IV로 코트한 96 웰 평저 플레이트에 1 웰당 2500개의 세포를 2.5% 말 혈청과 1.25% 태아 소 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배지로 1일 배양하였다. 거기에 실온 혹은 37℃에서 30분간부터 1시간 무혈청의 RPMI-1640배지 속에서 미리 반응시킨 인간 NGF(최종 농도 0.38 nM 혹은 1.14 nM)와 압타머(최종 농도 500∼0.01 nM)의 혼합 용액을 첨가하였다. 2일 후에 Cellomics Neurite Outgrowth Kit(Thermo Scientific사 제조)를 사용하여 세포질과 핵을 염색하고, Cellomics ArrayScan VTI(Thermo Scientific사 제조)에 의해 1 세포당의 신경 돌기 길이를 측정하였다. NGF만의 첨가일 때에 얻어진 1 세포당의 신경 돌기 길이를 저해 활성 0%, NGF 무첨가로 2일간 배양하여 얻어진 1 세포당의 신경 돌기 길이를 저해 활성 100%로 하여, NGF와 압타머를 혼합 첨가한 경우에 얻어진 1 세포당의 신경 돌기 길이로부터, 압타머의 저해 활성을 구하였다.
실시예 1에서 얻어진 34 종류의 압타머의 저해 활성을 조사한 바, 서열번호 1∼8로 표시되는 압타머가 10 nM 첨가함으로써 신경 돌기 신장을 강하게 저해하는 것을 알 수 있었다. 다른 압타머는 10 nM로 현저한 저해를 보이지 않았다.
이하에 각각의 서열번호에 대응하는 실제로 얻어진 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 대문자는 RNA, 소문자는 DNA, 뉴클레오티드에 있어서의 괄호는 그 2'위의 수식을 나타내고, F는 불소 원자를 나타낸다(이하 동일).
서열번호 1:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GaC(F)GaC(F)C(F)aaC(F)U(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)U(F)U(F)aU(F)GGaU(F)U(F)U(F)aC(F)GU(F)GaaC(F)C(F)C(F)GU(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 2:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)C(F)C(F)aaaC(F)GGGaC(F)U(F)U(F)U(F)aU(F)aC(F)C(F)U(F)C(F)U(F)GaGU(F)C(F)GC(F)C(F)U(F)aC(F)GC(F)U(F)C(F)C(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 3:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 4:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)aC(F)GU(F)U(F)aGU(F)aC(F)GU(F)U(F)U(F)GC(F)aU(F)aU(F)GU(F)aC(F)aaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)aU(F)aC(F)GaU(F)aC(F)GU(F)aGaU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 5:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)aGaaGaGGaC(F)U(F)aGU(F)U(F)GC(F)U(F)aaU(F)GC(F)C(F)C(F)U(F)GGU(F)U(F)C(F)GU(F)C(F)GC(F)U(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 6:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)GC(F)aaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 7:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGaC(F)GC(F)aC(F)C(F)U(F)C(F)U(F)U(F)aU(F)C(F)aC(F)aC(F)aU(F)GC(F)GU(F)C(F)aGC(F)C(F)U(F)U(F)GU(F)GaU(F)aC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 8:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGaU(F)C(F)C(F)aC(F)U(F)GGU(F)aC(F)U(F)aC(F)GU(F)GaC(F)C(F)C(F)C(F)GC(F)aU(F)aGGC(F)aaU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
실시예 4: 압타머의 단쇄화
서열번호 3 및 6으로 표시되는 압타머의 단쇄화를 행하였다. MFOLD 프로그램(Zuker, Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415, 2003)을 이용하여 RNA의 2차 구조를 예측하고, 그 구조를 참고로 하면서 단쇄화하였다. 단쇄화체는, 원하는 서열의 DNA를 화학 합성에 의해 제작하고, DuraScribe T7 Transcription Kit(Epicentre사 제조)를 이용하여 전사함으로써 얻어졌다. 전사 산물은 DNase 처리 후, 페놀·클로로포름 처리에 의해 단백질을 제거하고, 에탄올 침전에 의해 회수하였다. 회수된 RNA의 순도는 폴리아크릴아미드 전기 영동법으로, 양은 흡광도 측정법으로 확인하였다. 실제로 제작한 단쇄화체의 서열은 다음과 같다.
서열번호 9: 서열번호 3으로 표시되는 압타머의 개변체로 73 뉴클레오티드 길이의 RNA
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)
서열번호 10: 서열번호 3으로 표시되는 압타머의 개변체로 68 뉴클레오티드 길이의 RNA
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)G
서열번호 11: 서열번호 3으로 표시되는 압타머의 개변체로 46 뉴클레오티드 길이의 RNA
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
서열번호 12: 서열번호 3으로 표시되는 압타머의 개변체로 40 뉴클레오티드 길이의 RNA
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GG C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 13: 서열번호 3으로 표시되는 압타머의 개변체로 42 뉴클레오티드 길이의 RNA
GGGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
서열번호 121: 서열번호 11로 표시되는 압타머의 개변체로 스템 2로부터 1 염기쌍을 제거한 RNA
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
서열번호 122: 서열번호 11로 표시되는 압타머의 개변체로 스템 2로부터 1 염기쌍을 제거한 RNA
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)G GC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
서열번호 123: 서열번호 11로 표시되는 압타머의 개변체로 스템 2로부터 1 염기쌍을 제거한 RNA
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
서열번호 124: 서열번호 11로 표시되는 압타머의 개변체로 스템 2로부터 1 염기쌍을 제거한 RNA
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GGU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
서열번호 125: 서열번호 11로 표시되는 압타머의 개변체로 스템 2로부터 1 염기쌍을 제거한 RNA
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)U(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
서열번호 126: 서열번호 11로 표시되는 압타머의 개변체로 스템 2로부터 1 염기쌍을 제거한 RNA
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)GU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
서열번호 127: 서열번호 13으로 표시되는 압타머의 개변체로, 스템 2로부터 1 염기쌍을 제거한 RNA
GGGGU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGU(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
서열번호 128: 서열번호 13으로 표시되는 압타머의 개변체로, 스템 2로부터 1 염기쌍을 제거한 RNA
GGGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
서열번호 129: 서열번호 13으로 표시되는 압타머의 개변체로, 스템 1로부터 1 염기쌍을 제거한 RNA
GGGGC(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)C(F)C(F)C(F)C(F)
서열번호 130: 서열번호 11로 표시되는 압타머의 개변체로, 루프 2로부터 U를 하나 제거한 RNA
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
서열번호 131: 서열번호 11로 표시되는 압타머의 개변체로, 루프 2로부터 C를 2개 제거한 RNA
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
서열번호 132: 서열번호 11로 표시되는 압타머의 개변체로, 루프 2로부터 G를 하나 제거한 RNA
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
서열번호 133: 서열번호 13으로 표시되는 압타머의 개변체로, 루프 2로부터 U를 하나 제거한 RNA
GGGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GC(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
서열번호 134: 서열번호 11로 표시되는 압타머의 개변체로, 인터널 루프 1로부터 U를 하나 제거한 RNA
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)aU(F)GU(F)GC(F)
서열번호 135: 서열번호 13으로 표시되는 압타머의 개변체로, 인터널 루프 1로부터 C를 하나 제거한 RNA
GGGGU(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
서열번호 136: 서열번호 13으로 표시되는 압타머의 개변체로, 인터널 루프 1로부터 U를 하나 제거한 RNA
GGGGU(F)C(F)C(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
서열번호 137: 서열번호 13으로 표시되는 압타머의 개변체로, 인터널 루프 1로부터 C와 U를 하나씩 제거한 RNA
GGGGU(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
서열번호 138: 서열번호 13으로 표시되는 압타머의 개변체로, 인터널 루프 1로부터 C와 G를 하나씩 제거한 RNA
GGGGU(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)U(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
서열번호 139: 서열번호 13으로 표시되는 압타머의 개변체로, 인터널 루프 1로부터 U를 2개 제거한 RNA
GGGGU(F)C(F)C(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
서열번호 140: 서열번호 13으로 표시되는 압타머의 개변체로, 인터널 루프 1로부터 U와 G를 하나씩 제거한 RNA
GGGGU(F)C(F)C(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)U(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
서열번호 141: 서열번호 13으로 표시되는 압타머의 개변체로, 인터널 루프 1로부터 U를 2개 제거한 RNA
GGGGU(F)C(F)C(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
서열번호 14: 서열번호 6으로 표시되는 압타머의 개변체로 78 뉴클레오티드 길이의 압타머
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)GC(F)aaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGa
서열번호 15: 서열번호 6으로 표시되는 압타머의 개변체로 73 뉴클레오티드 길이의 압타머
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)GC(F)aaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)
서열번호 16: 서열번호 6으로 표시되는 압타머의 개변체로 63 뉴클레오티드 길이의 압타머
C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)GC(F)aaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)
서열번호 17: 서열번호 6으로 표시되는 압타머의 개변체로 58 뉴클레오티드 길이의 압타머
aGaaGU(F)GC(F)aaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)
서열번호 18: 서열번호 6으로 표시되는 압타머의 개변체로 48 뉴클레오티드 길이의 압타머
U(F)GC(F)aaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)G
서열번호 19: 서열번호 6으로 표시되는 압타머의 개변체로 46 뉴클레오티드 길이의 압타머
GC(F)aaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
서열번호 20: 서열번호 6으로 표시되는 압타머의 개변체로 50 뉴클레오티드 길이의 압타머
GU(F)GC(F)aaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)
서열번호 21: 서열번호 6으로 표시되는 압타머의 개변체로 48 뉴클레오티드 길이의 압타머
GGGaaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)C(F)C(F)C(F)
이들 압타머의 NGF에 대한 결합 활성을 실시예 1과 마찬가지로 표면 플라즈몬 공명법을 이용하여 평가하였다. 그 결과, 서열번호 9∼21로 표시되는 RNA는 컨트롤의 40N보다도 유의적으로 NGF에 결합하는 것을 알 수 있었다. 한편, 서열번호 121∼141로 표시되는 RNA는, 서열번호 11 또는 13으로 표시되는 압타머와 비교하여 결합량이 크게 저하하였다.
실시예 2와 마찬가지로 표면 플라즈몬 공명법에 의해 NGF와 그 수용체(TrkA 및 p75)의 결합 저해를 평가한 바, 서열번호 9∼16로 표시되는 압타머가 높은 저해 활성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
실시예 3과 동일한 방법으로 신경 돌기 신장 저해 활성을 조사한 바, 서열번호 9∼21로 표시되는 압타머는 10 nM의 농도로 높은 저해 활성을 보이는 것을 알 수 있었다. 한편, 서열번호 127, 128, 131, 133, 135, 141로 표시되는 압타머는 10 nM로 현저한 저해 활성을 보이지 않았다.
실시예 5: 서열번호 3으로 표시되는 압타머 및 그 단쇄화체의 이차 구조 예측
서열번호 3, 9∼13 및 서열번호 121∼141로 표시되는 RNA의 이차 구조를 MFOLD 프로그램을 이용하여 예측하였다. 활성을 갖고 있는 압타머는 전부 서열번호 12로 표시되는 압타머의 이차 구조를 포함하고 있었다(도 1). 이 이차 구조는 5' 말단에서부터, 스템 1, 인터널 루프 1, 스템 2, 루프 2의 4개의 구조로 특징 지워졌다(도 2). 스템 1은 4 염기쌍, 인터널 루프 1은 3 뉴클레오티드와 4 뉴클레오티드, 스템 2는 9 염기쌍, 루프 2는 7 뉴클레오티드로 구성되어 있다.
서열번호 121∼128로 표시되는 RNA는 스템 2로부터 1 염기쌍을 제거한 것인데, 그 모든 활성이 크게 저하하였다. 따라서, 스템 2는 9 염기쌍 필요하다는 것이 시사되었다.
서열번호 12 및 13으로 표시되는 압타머는 서열번호 11로 표시되는 압타머의 개변체이며, 스템 1을 G-C 페어로 치환한 것이다. 서열번호 12 및 13으로 표시되는 압타머는 서열번호 11과 동등한 신경 돌기 신장 저해 활성을 보였다. 따라서, 스템 1은 스템 구조인 한 어떠한 베이스 페어라도 활성에 크게 영향을 주지 않음이 시사되었다. 한편, 서열번호 129로 표시되는 RNA는 서열번호 13으로 표시되는 압타머의 스템 1로부터 U-a 염기쌍을 제거한 것인데, 활성이 크게 저하하였다. 따라서, 스템 1의 4번째의 염기쌍은 U-a일 필요가 있음을 알 수 있었다.
서열번호 130∼133으로 표시되는 RNA는 루프 2로부터 1 뉴클레오티드 제거한 RNA인데, 그 모든 활성이 크게 저하하였다. 따라서, 루프 2는 7 뉴클레오티드로 구성될 필요가 있음이 시사되었다.
서열번호 134∼141로 표시되는 RNA는 인터널 루프 1의 뉴클레오티드를 하나 또는 2개 제거한 RNA인데, 그 모든 활성이 크게 저하하였다. 따라서, 인터널 루프 1은 전체적으로 7 뉴클레오티드로 구성될 필요가 있음이 시사되었다.
이하, 도 2에서 규정되는 구조를 콘센서스 이차 구조 1이라고 부른다.
실시예 6: NGF 압타머의 제작 2
실시예 1과 다른 프라이머를 이용하여 SELEX를 행하여, 콘센서스 이차 구조 1을 갖는 압타머를 취득할 수 있는지 여부를 검토하였다. 이하에 사용한 DNA 주형과 프라이머 서열을 나타낸다.
DNA 주형 2:
5'-ccagttgttggtgacaatgcnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnngcagctccacaggcttccc(서열번호 142)
프라이머 Fwd2:
5'-taatacgactcactatagggaagcctgtggagctgc(서열번호 143)
프라이머 Rev2:
5'-gcattgtcaccaacaactgg(서열번호 144)
상기 서열에 있어서, n은 a, g, c 또는 t 중 어느 하나를 나타낸다. 프라이머 Fwd2는 T7 RNA 폴리메라아제의 프로모터 서열을 포함하고 있다. 맨 처음 라운드에서 이용한 RNA 풀의 베리에이션은 이론상 1014였다.
SELEX는 실시예 1과 동일하게 행하였다. SELEX를 10 라운드 행한 후, 48 클론을 조사한 바, 46 서열을 결정할 수 있었다. 그 중, 5 클론 같은 것이 1 서열, 3 클론 같은 것이 4 서열, 2 클론 같은 것이 3 서열, 계 8 서열이 수속되었다. 나머지 23 서열은 싱글 서열이었다.
수속이 보인 8 서열을 선택하여, NGF에 대한 결합 활성을 표면 플라즈몬 공명법에 의해 평가하였다. 측정 방법은 실시예 1과 동일하였다. 그 결과, 모든 서열이 NGF에 근소하게 밖에 결합하지 않았다.
싱글 서열도 포함시켜 모든 서열의 이차 구조를 MFOLD 프로그램을 이용하여 예측한 바, 콘센서스 이차 구조 1을 포함하는 서열은 존재하지 않았다.
실시예 7: NGF 압타머의 제작 3
서열번호 12로 표시되는 서열에 15%의 랜덤 서열을 도핑하고, 그 양단에 실시예 1과 동일한 프라이머 서열을 부가한 RNA 풀을 이용하여 SELEX를 행하였다. SELEX는 실시예 1과 거의 동일하게 행하였다. 그 주형의 서열을 이하에 나타낸다.
주형 3:
5'-gaggatccatgtatgcgcacata-acagccacggagacggaaactacgcagcaggatgtgccaa-cttctggtcgaagttctccc-3'(서열번호 145)
그 중, 밑줄로 나타낸 염기 서열은 다음과 같다.
a: a(85%), g(5%), c(5%), t(5%)
g: a(5%), g(85%), c(5%), t(5%)
c: a(5%), g(5%), c(85%), t(5%)
t: a(5%), g(5%), c(5%), t(85%)
4 라운드 종료 후에 48 클론의 서열을 확인한 바, 약 반은 서열번호 12를 포함한 서열이고, 나머지는 여러 곳에 변이가 들어간 서열이었다. 서열번호 12와 동일한 서열을 제거하기 위해서, 서열번호 12의 안티센스 올리고를 RNA 풀에 가하고, 3 라운드 SELEX를 더 추가하였다. 안티센스 올리고의 서열은 다음과 같다.
5'-agacggaaactacgcagcagga-3'-(서열번호 146)
안티센스 올리고는 RNA 풀에 대하여 10배량 가하였다. 얻어진 RNA의 서열을 확인한 바, 약 반은 서열번호 12로 표시되는 서열에 여러 곳 변이가 들어간 서열이고, 나머지는 서열번호 12로 표시되는 서열과 전혀 다른 서열이었다.
4 및 7 라운드부터 서열번호 22∼37로 표시되는 계 16 서열을 선택하여, NGF에 대한 결합 활성 및 NGF와 NGF 수용체의 결합 저해 활성을 조사하였다. 측정은 실시예 1 및 2에 나타낸 것과 같이 표면 플라즈몬 공명법을 이용하였다. 측정 결과, 모든 서열이 컨트롤의 40N보다도 유의적으로 NGF에 결합하여, NGF와 NGF 수용체의 결합을 저해하는 것을 알 수 있었다. 또한, 신경 돌기 신장 저해 활성을 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과, 모든 서열이 10 nM의 농도로 높은 저해 활성을 보였다. 이하에 각각의 서열번호에 대응하는 실제로 얻어진 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 22:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 23:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 24:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GaaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 25:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GC(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 26:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 27:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GC(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 28:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)aU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 29:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)C(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GaaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 30:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GaaGGU(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)aC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 31:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GC(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)C(F)U(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 32:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 33:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)C(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)aaU(F)C(F)U(F)U(F)GGU(F)GGC(F)GU(F)GU(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 34:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)C(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 35:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 36:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGGU(F)aC(F)GU(F)U(F)aGU(F)aC(F)GU(F)U(F)U(F)GC(F)aU(F)aU(F)GU(F)aC(F)aaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)aU(F)aC(F)GaU(F)aC(F)GU(F)aGGU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 37:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)aC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 22∼37로 표시되는 압타머의 이차 구조를 MFOLD 프로그램을 이용하여 예측하였다. 그 결과, 서열번호 30, 33, 36으로 표시되는 압타머 이외의 압타머는 전부 콘센서스 이차 구조 1을 포함하고 있음을 알 수 있었다. 이들의 인터널 루프 1의 서열은 전부 5' 측이 CCU이고 3' 측이 UGUU였다(도 2). 또한, 루프 2는 5'-UUUCCXU-3'으로 표시되는 콘센서스 서열을 포함하고 있었다. 여기서 X는 A, G, C, U 중 어느 것이다. 스템 1의 최후의 염기쌍은 전부 U-a였다. 스템 2의 1, 5, 6, 8, 9번째의 염기쌍은 각각 G-C, C-G, G-C, a-U, G-C였다. 2∼4 및 7번째는 몇 개의 다른 염기쌍이 존재하였다.
실시예 8: 압타머의 세포 증식 저해 활성(TF-1 분석)
TF-1 세포를 이용한 증식 저해 평가계에 의해 서열번호 22∼37로 표시되는 압타머의 저해 활성을 평가하였다.
인간 적백혈병 세포주인 TF-1 세포(ATCC Number: CRL-2003)에 레트로바이러스 벡터를 이용하여 2개의 NGF 수용체(인간 TrkA 및 인간 p75) 유전자를 도입하여, 2개의 수용체를 동시에 안정적으로 고발현하는 세포를 제작하였다. 이 세포를 20%의 태아 소 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배지에 현탁하여, 백색의 96웰 평저 플레이트에 1 웰당 1000개(50 ㎕)의 세포를 파종하였다. 거기에 실온에서 30분간 무혈청의 RPMI-1640 배지 속에서 미리 반응시킨 인간 NGF(최종 농도 0.076 nM)와 압타머(최종 농도 30∼0.01 nM)의 혼합 용액 50 ㎕를 첨가하고, 3일 후에 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega사 제조)의 CellTiter-Glo 시약을 각 웰에 100 ㎕ 첨가한 후, 마이크로플레이트 리더에 의해 화학 발광을 측정하여, NGF 자극에 의한 TF-1 세포의 증식을 평가하였다. NGF만의 첨가로 세포를 3일간 배양하여 얻어진 1 웰당의 발광량을 저해 활성 0%, NGF 무첨가로 3일간 배양하여 얻어진 1 웰당의 발광량을 저해 활성 100%로 하여, NGF와 압타머를 혼합 첨가한 경우에 얻어진 1 웰당의 발광량으로부터, 압타머의 저해 활성을 구하였다. 그 결과, 이들 모든 압타머가 10 nM의 농도로 높은 저해 활성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
WO2010/035725A1에 기재된 서열번호 62와 68로 표시되는 압타머의 저해 활성을 비교를 위해 조사하였다. 그 결과, 각각의 IC50은 6.1 및 7.5 nM이었다.
실시예 9: 압타머의 단쇄화 2
높은 저해 활성을 보인 서열번호 23, 25, 26, 27, 28, 29, 31, 32, 34 및 35로 표시되는 압타머의 단쇄화를, 콘센서스 이차 구조 1을 참고하여 행하였다. NGF에 대한 결합 활성을 실시예 1과 마찬가지로 표면 플라즈몬 공명법을 이용하여 측정한 바, 모든 단쇄화체가 NGF에 강하게 결합하였다. 또한, 신경 돌기 신장 저해 활성과 TF-1 세포 증식 저해 활성을 실시예 3 및 8과 동일한 방법으로 측정한 바, 10 nM의 농도로 강한 저해 활성을 보였다. 이하에 이들의 실제로 얻어진 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 38:(서열번호 26의 단쇄화체)
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 39:(서열번호 27의 단쇄화체)
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GC(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 40:(서열번호 28의 단쇄화체)
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)aU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 41:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GaaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 42:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GC(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)C(F)U(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 43:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 44:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)C(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 45:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 46:(서열번호 25의 단쇄화체)
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GC(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 47:(서열번호 26의 단쇄화체)
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
이들 압타머의 이차 구조를 MFOLD 프로그램을 이용하여 예측한 바, 그 전부가 콘센서스 이차 구조 1로 나타내는 구조였다.
실시예 10: NGF 압타머의 제작 4
서열번호 12로 표시되는 서열에 21%의 랜덤 서열을 도핑하고, 그 양단에 실시예 1과 동일한 프라이머 서열을 부가한 RNA 풀을 이용하여 SELEX를 행하였다. SELEX는 실시예 1과 동일하게 행하였다. 그 주형의 서열을 이하에 나타낸다.
주형 3:
5'-gaggatccatgtatgcgcacata-acagccacggagacggaaactacgcagcaggatgtgccaa-cttctggtcgaagttctccc-3'(서열번호 145)
그 중, 밑줄로 나타낸 염기 서열은 다음과 같다.
a: a(79%), g(7%), c(7%), t(7%)
g: a(7%), g(79%), c(7%), t(7%)
c: a(7%), g(7%), c(79%), t(7%)
t:a(7%), g(7%), c(7%), t(79%)
4 라운드 종료 후에 48 클론의 서열을 확인한 바 수속은 보이지 않았다. 그래서 3 라운드를 더 추가하였다. 5, 6, 7 라운드 각각 48 클론의 서열을 확인한 바, 라운드가 진행됨에 따라 서열에 수속이 보였다. 7 라운드째에는 대부분의 서열이 수속되어 있었다.
5, 6, 7 라운드로부터, 계 14 서열을 선택하여, 표면 플라즈몬 공명법으로 NGF에 대한 결합 활성을 조사하였다. 측정 방법은 실시예 1에 나타낸 것과 같다. 측정 결과, 모든 서열이 컨트롤의 40N보다도 유의적으로 NGF에 결합하였다. 이하에 이들의 실제로 얻어진 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 48:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GGU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 49:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)U(F)GC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 50:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGC(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GaC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 51:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aC(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)aC(F)GGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GGU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 52:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)aU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)U(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 53:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)U(F)GC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GC(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 54:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GaU(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 55:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 56:
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서열번호 57:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)aGGC(F)aC(F)GU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)aU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GU(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 58:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GaC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 59:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)U(F)GC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 60:
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서열번호 61:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)aGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
이들 압타머의 이차 구조를 MFOLD 프로그램을 이용하여 예측한 바, 그 전부에 콘센서스 이차 구조 1로 나타내는 구조가 보였다. 이들의 인터널 루프 1의 서열은 전부 5' 측이 CCU이고 3' 측이 UGUU였다. 또한, 루프 2는 5'-UUUCCXU-3'으로 표시되는 콘센서스 서열을 포함하고 있었다. 여기서 X는 G 또는 U 중 어느 것이다. 스템 2는 1, 3, 8, 9번째의 염기쌍이 각각 G-C, U-G, a-U, G-C였다. 2 및 4∼7번째는 몇 개의 다른 염기쌍이 존재하였다.
이들 압타머에 대하여 실시예 4와 동일하게 단쇄화를 행하였다. 그 결과, 모든 압타머에서 결합 활성을 유지한 채로 콘센서스 이차 구조 1과 같은 구조까지 단쇄화할 수 있었다.
실시예 3 및 8과 마찬가지로, 신경 돌기 신장 저해 활성과 TF-1 세포 증식 저해 활성을 평가하였다. 그 결과, 이들 압타머는 전부 10 nM의 농도로 높은 저해 활성을 보였다. 이하에 이들의 실제로 얻어진 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 62:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GGU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 63:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 64:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 65:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)aC(F)GGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GGU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 66:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)aU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)U(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 67:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GC(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 68:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaU(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 69:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 70:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GU(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)aU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 71:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)aU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GU(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 72:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 73:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 74:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)aGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GGU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 75:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
실시예 11: NGF 압타머의 제작 5
콘센서스 이차 구조 1의 스템 2를 랜덤 서열로 한 다음과 같은 주형을 이용하여, 실시예 1과 동일한 SELEX를 행하였다.
주형 4:
5'-gaggatccatgtatgcgcacataacagnnnnnnngacggaaacnnnnnnncaggatgtgccaacttctggtcgaagttctccc-3'(서열번호 147)
7 라운드 종료 후에 48 클론의 서열을 확인한 바, 서열의 수속이 보이지 않았다. 그래서, 3 라운드를 더 추가하였다. 10 라운드 종료 후 48 클론의 서열을 확인한 바, 약 반수의 서열에 수속이 보이고, 나머지 반수는 싱글 서열이었다. 그 중, 17 서열을 선택하여, 표면 플라즈몬 공명법으로 NGF에 대한 결합 활성을 조사하였다. 측정 방법은 실시예 1에 나타낸 것과 같다. 측정 결과, 모든 서열이 컨트롤인 40N보다도 유의적으로 NGF에 결합하는 것을 알 수 있었다.
상기한 압타머에 대하여 실시예 4와 동일하게 단쇄화를 행하였다. 그 결과, 모든 압타머에서 결합 활성을 유지한 채로 콘센서스 이차 구조 1과 동일한 구조까지 단쇄화할 수 있었다. 이하에 이들의 실제로 얻어진 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 76:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaU(F)U(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aaU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 77:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaC(F)U(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aGU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 78:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GGC(F)C(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GGU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 79:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GGU(F)U(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aaC(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 80:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GGC(F)U(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aGU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 81:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GGU(F)GaU(F)aaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)aU(F)C(F)aC(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 82:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GGaU(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 83:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)aC(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GU(F)aC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 84:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)C(F)GC(F)U(F)aaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)U(F)GC(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 85:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaGU(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)aU(F)aC(F)U(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 86:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 87:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)C(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GGGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 88:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)C(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GaaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 89:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)GGaaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)C(F)C(F)aC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 90:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aU(F)GC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 91:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)C(F)U(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aGGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 92:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaC(F)C(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GGU(F)C(F)U(F)GU(F)aC(F)C(F)C(F)
이들 압타머의 신경 돌기 신장 저해 활성은, NGF만 첨가할 때에 얻어진 1 세포당 신경 돌기 길이를 저해 활성 0%, NGF 무첨가로 2일간 배양하여 얻어진 1 세포당 신경 돌기 길이를 저해 활성 100%로 하여, NGF와 압타머를 혼합 첨가한 경우에 얻어진 1 세포당 신경 돌기 길이로부터 산출하였다. 50% 저해 농도(IC50)는, 50% 저해 활성을 사이에 둔 상하 2점의 농도로부터 구하였다. 실험 결과를 표 1에 나타낸다. 표 1에서 IC50 값을 「<X」라고 기재한 것은, 기재한 농도 X가 측정 최저 농도였던 경우에 있어서 저해 활성이 50% 이상이었음을 나타낸다. 실험한 모든 압타머가 강한 저해 활성을 보였다. 그 일부의 IC50 값을 표 1에 나타낸다.
TF-1 세포 증식 저해 활성에 관해서는, NGF만의 첨가로 세포를 3일간 배양하여 얻어진 1 웰당의 발광량을 저해 활성 0%, NGF 무첨가로 3일간 배양하여 얻어진 1 웰당의 발광량을 저해 활성 100%로 하여, NGF와 압타머를 혼합 첨가한 경우에 얻어진 1 웰당의 발광량으로부터, 압타머의 저해 활성을 산출하였다. 50% 저해 농도(IC50)는, 50% 저해 활성을 사이에 둔 상하 2점의 농도로부터 구하였다. 결과를 표 1에 나타낸다. IC50 값을 「<X」라고 기재한 것은, 기재한 농도 X가 측정 최저 농도였던 경우에 있어서 저해 활성이 50% 이상이었음을 나타낸다. 실험 결과, 서열번호 81, 84, 86, 89 이외의 압타머는 IC50 값이 1 nM 이하임을 알 수 있었다.
이들 압타머의 인터널 루프 1의 서열은 전부 5' 측이 CCU이고 3' 측이 UGUU였다. 또한, 루프 2는 5' UUUCCXU3'으로 표시되는 콘센서스 서열을 포함하고 있었다. 여기서 X는 G 또는 U 중 어느 것이다. 스템 1의 최후의 염기쌍은 전부 U-a였다. 스템 2는 1, 8, 9번째의 염기쌍이 각각 G-C, a-U, G-C였다. 2∼7번째는 몇 개의 다른 염기쌍이 존재하였다.
실시예 12: NGF 압타머의 제작 6
NGF는 저해하지만 NT-3 및 NT-4은 저해하지 않는 압타머를 제작하기 위해서 새로운 SELEX를 행하였다. 최초의 풀로서, 실시예 9와 10의 맨 처음에 이용한 RNA 풀을 1:1로 혼합한 것을 사용하였다. 셀렉션 전의 RNA 풀에 NT-3(R&D systems사 제조, 294 pmol), NT-4(R&D systems사 제조, 179 pmol) 및 BDNF(R&D systems사 제조, 148 pmol)를 혼합하여, 이것을 NGF(380 pmol)가 고정화된 비드에 가하였다.
4 라운드 종료 후에 48 클론의 서열을 확인한 바, 서열의 수속이 보이지 않았다. 싱글 서열 중에 서열번호 27, 28, 34, 64, 72와 동일한 서열의 것이 있었다. 신규의 14 서열을 선택하고, MFOLD 프로그램을 이용하여 이차 구조를 예측한 바, 전부 콘센서스 이차 구조 1을 포함하고 있었다. 그래서, 이들 압타머를 콘센서스 이차 구조 1과 마찬가지로 40 mer까지 단쇄화하였다. 이들 단쇄화체의 NGF와 NT-3에 대한 결합 활성을 표면 플라즈몬 공명법으로 측정하였다. 측정 방법은 실시예 1에 나타낸 것과 같이, BIAcore사 제조의 BIAcore2000을 사용하고, 센서 칩으로서 아미노기와 반응하는 CM5를 이용하였다. 단백질의 고정화는 실시예 1과 마찬가지로 에틸-3-카르보디이미드 히드로클로라이드와 N-히드록시숙신이미드를 이용하여 행하였다. 인간 NGF 혹은 NT-3은 고정화 용액(10 mM 아세트산나트륨, pH 6)에 용해하여 25∼40 ㎍/㎖로서 사용하였다. 단백질 고정화 후, 에탄올아민-HCl에 의한 블로킹을 행하였다. NGF와 NT-3의 고정화량은 각각 3,000∼4,000 RU와 3,000∼5,000 RU로 하였다. 아날라이트용의 압타머는 0.15 μM∼0.5 μM로 조제하였다. 런닝 버퍼와 재생 용액은 실시예 1과 동일하였다. NT-3은 FC2에, NGF는 FC3에 고정화하여, 각각 FC1의 결과를 뺌으로써 최종적인 센서그램으로 하였다. 그 결과, 7 서열이 NGF에 강하게 결합하는 것을 알 수 있었다. 한편, NT-3에 대해서는 어느 것이나 거의 결합하지 않았다.
실시예 3과 마찬가지로 신경 돌기 신장 저해 활성을 측정한 바, 서열번호 93∼98로 표시되는 압타머가 10 nM에서 강한 저해 활성을 보였다. 이하에 각 서열번호에 대응하는 실제로 얻어진 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 93:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)C(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 94:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GGaGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 95:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)aU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 96:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aU(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 97:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)aC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 98:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)aC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
이들 압타머의 인터널 루프 1의 서열은 전부 5' 측이 CCU이고 3' 측이 UGUU였다. 또한, 루프 2는 5' UUUCCXU3'으로 표시되는 콘센서스 서열을 포함하고 있었다. 여기서 X는 G 또는 a 중 어느 것이다. 스템 1의 최후의 염기쌍은 전부 U-a였다. 스템 2는 2, 5, 8, 9번째의 염기쌍이 각각 C-G, C-G, a-U, G-C였다. 그 밖에는 몇 개의 다른 염기쌍이 존재하였다.
SELEX를 7 라운드까지 추가하여 48 클론의 서열을 확인한 바, 대부분의 서열은 1 종류의 서열에 수속되었다. 나머지 중에서 싱글 13 서열을 선택하여, 상기와 동일하게 표면 플라즈몬 공명법으로 NGF 및 NT-3에 대한 결합 활성을 조사하였다. 측정 결과, 7 서열이 NGF에 강하게 결합하는 것을 알 수 있었다. 한편, NT-3에 대해서는 어느 것이나 거의 결합하지 않았다.
이들 압타머의 이차 구조를 MFOLD 프로그램을 이용하여 예측한 바, 어느 것이나 콘센서스 이차 구조 1을 포함하고 있지 않았다. 실시예 3과 동일하게 신경 돌기 신장 저해 활성을 측정한 바, 서열번호 99 및 100으로 표시되는 압타머가 10 nM에서 강한 저해 활성을 보였다. 한편, 실시예 8과 동일하게 TF-1 세포 증식 저해 활성을 측정한 바, 모두 저해 활성을 보이지 않았다. 이하에 각 서열번호에 대응하는 실제로 얻어진 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 99:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)C(F)C(F)aaaC(F)GGGaC(F)U(F)U(F)U(F)aU(F)aC(F)C(F)U(F)C(F)U(F)GaGU(F)C(F)GC(F)C(F)U(F)U(F)U(F)GC(F)U(F)C(F)C(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
서열번호 100:
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGaC(F)C(F)aaaC(F)GGaC(F)U(F)U(F)U(F)aU(F)aC(F)C(F)U(F)C(F)U(F)GaGU(F)C(F)GC(F)C(F)U(F)aU(F)GC(F)U(F)C(F)C(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
실시예 13: NGF 압타머의 제작 7
NGF는 저해하지만 NT-3 및 NT-4는 저해하지 않는 압타머를 제작하기 위해서 새로운 SELEX를 실시예 12와 동일하게 행하였다. 맨 처음에 이용한 RNA 풀의 주형과 프라이머는 다음과 같다.
주형 5:
5'-gaggatccatgtatgcgcacatnnnnggatacgagnnnnnnnctcttatccnnnatgtgccaacttctggtcgaagttctccc-3'(서열번호 148)
그 중, 밑줄로 나타낸 염기 서열은 다음과 같다.
a: a(70%), g(10%), c(10%), t(10%)
g: a(10%), g(70%), c(10%), t(10%)
c: a(10%), g(10%), c(70%), t(10%)
t: a(10%), g(10%), c(10%), t(70%)
프라이머 Fwd3:
5'-taatacgactcactatagggagaacttcgaccagaagttggcaca(서열번호 149)
프라이머 Rev3:
5'-gaggatccatgtatgcgcaca(서열번호 150)
주형 서열은 서열번호 82로 표시되는 서열을 기초로 하고 있으며, 콘센서스 이차 구조 1의 스템 2에 30%의 랜덤 서열을 도핑하고, 인터널 루프 1과 루프 2 부분을 완전한 랜덤 서열(n)로 하였다.
4 라운드 종료 후에 48 클론의 서열을 확인한 바, 21 클론은 서열번호 22로 표시되는 서열과 일치하고 있었다. 나머지 서열 중 2 클론은 동일한 서열이고, 그 밖에는 싱글 서열이었다. 그 중 13 서열을 선택하여, 이차 구조를 MFOLD 프로그램으로 예측한 바, 콘센서스 이차 구조 1의 구조를 갖고 있었다. 그래서, 이들의 압타머를 콘센서스 이차 구조 1과 동일하게 되도록 40 mer까지 단쇄화하였다. 단쇄화한 압타머의 결합 활성을 실시예 12와 마찬가지로 표면 플라즈몬 공명법으로 확인하였다. NT-4는 NT-3과 동일하게 측정하였다. 그 결과, 단쇄화체가 NGF와 강하게 결합하는 것을 알 수 있었다. 한편, NT-3 및 NT-4와의 결합은 약하였다.
또한, 이들 단쇄화체에 대하여 실시예 3과 동일하게 신경 돌기 신장 저해 활성을 측정한 바, 서열번호 101 및 102로 표시되는 압타머의 IC50 값이 1 nM 이하의 강한 저해 활성을 보였다(표 1). 한편, 실시예 8과 마찬가지로 TF-1 세포 증식 저해 활성을 측정한 바, 동일한 2 압타머의 IC50 값은 1 nM 이상이었다. 이하에 각 서열번호에 대응하는 실제로 얻어진 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 101:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaC(F)GU(F)aU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GU(F)aU(F)GU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 102:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaGC(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)aU(F)GC(F)U(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
실시예 14: 고속 시퀀서를 이용한 서열 해석
콘센서스 이차 구조 1을 갖는 압타머로, NGF는 저해하지만 다른 뉴로트로핀은 저해하지 않는 압타머를 얻기 위해서, 고속 시퀀서 GS FLX(Roche사 제조)를 이용하여 시퀀스 해석을 행하였다. 실시예 1에서는 생어 시퀀스에 의해 48 클론의 서열 해석을 행하였지만, 고속 시퀀서를 이용하면 수만 서열의 해석이 가능하게 된다. 측정 및 데이터 해석은 Operon사에서 실시하고, 샘플 조제는 Operon사의 프로토콜에 따라 행하였다. 측정 대상의 DNA는 실시예 8에서 행해진 SELEX에서 얻어진 7, 9, 10 라운드, 실시예 12에서 행해진 SELEX에서 얻어진 4 및 5 라운드, 실시예 13에서 행해진 SELEX에서 얻어진 3 및 4 라운드 종료 후의 DNA 풀을 등몰씩 혼합한 풀로 하였다.
얻어진 시퀀스 서열의 총수는 69249였다. 이 중, FLX 프라이머 서열이 완전 일치 또는 1 염기 치환되어 있는 서열이면서, N40 부분의 서열 길이가 40인 서열은 40077 서열이었다. 이들 서열의 이차 구조를 RNAfold 프로그램을 이용하여 예측하였다. 콘센서스 이차 구조 1과 동일한 구조를 포함하는 서열은 22453 서열 존재하였다. 실시예 10, 12, 13에서 생어 시퀀스에 의해 얻어진 서열과 비교한 바, 99%가 신규 서열이었다. 신규 서열 중, 수속되어 있었던 서열은 1615 종류이며, 싱글 서열은 4168 서열이었다. 이들 중에서 고빈도로 출현한 신규 52 서열을 선택하여, 콘센서스 이차 구조 1의 형태가 되도록 40 mer까지 단쇄화하였다. 또한, 실시예 13에서 생어 시퀀스에 의해 얻어진 싱글 서열을 10 서열 다시 선발하여, 마찬가지로 40 mer까지 단쇄화하였다.
단쇄화한 서열은 표면 플라즈몬 공명법으로 NGF, NT-3, NT-4와의 결합을 측정하였다. 측정은 실시예 13과 동일하게 행하였다. 그 결과, 모든 서열이 NGF와 결합하였지만, 특히 이하에 나타내는 15 서열이 강하게 결합하였다. 한편, NT-3 및 NT-4는 거의 결합하지 않았다.
그래서, 이들 15 서열의 신경 돌기 신장 저해 활성을 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과, 모든 압타머의 IC50 값이 1 nM 이하임을 알 수 있었다(표 1). 또한, TF-1 세포 증식 저해 활성을 실시예 8과 동일한 방법으로 측정한 바, 서열번호 111, 112, 114∼117로 표시되는 압타머는 IC50 값이 1 nM 이하였다(표 1).
이하에 각 서열번호에 대응하는 실제로 얻어진 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 한편, 서열번호 111은 실시예 13에서 생어 시퀀스에 의해 얻어진 서열이다.
서열번호 103:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 104:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaU(F)GU(F)C(F)aaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)GaU(F)GU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 105:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GC(F)U(F)aaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)aGU(F)GaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 106:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)aGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 107:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GaaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 108:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 109:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 110:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)C(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 111:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)C(F)U(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aGaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 112:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)C(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GGaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 113:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GU(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)aU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 114:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaC(F)aaaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)U(F)GU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 115:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)C(F)U(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aGaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 116:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)C(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GaaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
서열번호 117:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GaaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)C(F)aaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
이들 압타머의 인터널 루프 1의 서열은 전부 5' 측이 CCU이고 3' 측이 UGUU였다. 또한, 루프 2는 5'UUUCCXU3'으로 표시되는 콘센서스 서열을 포함하고 있었다. 여기서 X는 G 또는 U 중 어느 것이다. 스템 1의 최후의 염기쌍은 전부 U-a였다. 스템 2는 8 및 9번째의 염기쌍이 각각 a-U, G-C였다. 1∼7번째는 몇 개의 다른 염기쌍이 존재하였다.
실시예 15: 단쇄화한 압타머의 수식
압타머의 혈액 속에서의 안정성을 높이기 위해서, 리보스의 2'위의 수식을 바꾼 개변체를 제작하였다.
이하에 각각의 수식체의 서열을 나타낸다. 뉴클레오티드에 있어서의 괄호는, 그 2'위의 수식을 나타내고, F는 불소 원자, M은 O-메틸기, L은 Locked Nucleic Acid(LNA)를 나타낸다. 대문자는 RNA, 소문자는 DNA, idT는 인버티드 dT를 나타낸다. 링커는 5' 말단의 경우는 ssH Linker(SAFC) 또는 DMS(O)MT-AMINO-MODIFIFIER C6(GLENRESEARCH)을, 3' 말단의 경우는 TFA Amino C-6 lcaa CPG(ChemGenes)을 이용하였다. PEG40GS2는 분자량 40000의 2분기 GS형(SUNBRIGHT GL2-400GS2 니치유사 제조), PEG40TS2는 분자량 40000의 2분기 TS형(SUNBRIGHT GL2-400TS 니치유사 제조), PEG40TS4는 분자량 40000의 4분기 TS형(SUNBRIGHT GL4-400TS 니치유사 제조), PEG80TS2는 분자량 80000의 2분기 TS형(SUNBRIGHT GL2-800TS 니치유사 제조), PEG80TS4는 분자량 80000의 4분기 TS형(SUNBRIGHT GL4-800TS 니치유사 제조)이다.
서열번호 38(1):
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)U(F)C(F)G(M)C(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
서열번호 151:
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)GC(F)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
서열번호 152:
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
서열번호 153:
PEG40GS2-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
서열번호 154:
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-PEG40GS2
서열번호 155:
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)G(M)C(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)aC(F)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
서열번호 62(1):
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)G(M)G(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
서열번호 66(1):
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)aU(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)U(F)U(F)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
서열번호 68(1):
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GaU(F)G(M)C(F)G(M)U(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)G(M)U(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
서열번호 71(1):
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)aU(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)G(M)U(F)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
서열번호 74(1):
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)aG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
서열번호 76(1):
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GaU(F)U(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aaU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
서열번호 77(1):
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GaC(F)U(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aG(M)U(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
서열번호 78(1):
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)C(F)C(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)G(M)G(M)U(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
서열번호 78(2):
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)C(F)C(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)G(M)G(M)U(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
서열번호 78(3):
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)C(M)C(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)G(M)G(M)U(F)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
서열번호 78(4):
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서열번호 165:
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서열번호 89(5):
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서열번호 111(1):
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서열번호 82(2)로 표시되는 RNA의 NGF, NT-3, NT-4에 대한 결합 활성을 실시예 13과 마찬가지로 표면 플라즈몬 공명법으로 측정하였다. 그 결과, 어느 쪽의 단백질에 대하여나 결합 활성을 갖고 있음을 알 수 있었다(도 3). 또한, 서열번호 82(2)로 표시되는 압타머가 NGF와 그 수용체인 TrkA 또는 p75의 결합을 저해하는지 여부를, 실시예 2와 마찬가지로 표면 플라즈몬 공명법을 이용하여 조사하였다. 그 결과, NGF와 양 수용체의 결합을 함께 강하게 저해하는 것을 알 수 있었다(도 4와 5).
상기한 모든 수식체에 대하여 신경 돌기 신장 저해 활성을 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과, 서열번호 62(1) 이외의 모든 수식체의 IC50 값이 1 nM 이하였다(표 1). 특히 서열번호 162로 표시되는 압타머의 IC50 값은 0.033 nM이었다. 또한, TF-1 세포 증식 저해 활성을 실시예 8과 동일한 방법으로 측정한 바, 대부분의 압타머의 IC50 값은 1 nM 이하였다(표 1). 특히 서열번호 162로 표시되는 압타머의 IC50 값은 0.014 nM이었다. 서열번호 62(1)로 표시되는 압타머의 IC50 값은 0.49 nM이었다.
이상으로부터, 본 압타머는 리보스의 2'위의 수식을 바꾸어도 저해 활성을 유지할 수 있는 것이 드러났다.
[표 1-1]
Figure 112014038112419-pct00007

[표 1-2]
Figure 112014038112419-pct00008
[표 1-3]
Figure 112014038112419-pct00009

실시예 16: TF-1 세포 증식 저해 평가계에 의한 다른 뉴로트로핀과의 교차성의 확인
TF-1 세포를 이용하여 NGF 압타머가 BDNF, NT-3, NT-4를 저해하는지 여부를 조사하였다. 인간 적백혈병 세포주인 TF-1 세포(ATCC Number: CRL-2003)에 레트로바이러스 벡터를 이용하여 각 신경 영양 인자에 대한 인간 수용체 유전자(TrkB, TrkC, p75)를 도입하여, 이들의 수용체를 안정적으로 고발현하는 세포를 제작하였다. 한편, BDNF에의 저해 활성 평가에는 TrkB 및 p75를 도입한 TF-1 세포, NT-3에 대한 평가에는 TrkC 및 p75를 도입한 TF-1 세포, 그리고 NT-4에 대한 평가에는 TrkB만을 도입한 TF-1 세포를 사용하였다. 이들 세포를 20%의 태아 소 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배지에 현탁하여, 백색의 96 웰 평저 플레이트에 1 웰당 1000개(50 ㎕)의 세포를 파종하였다. 거기에 실온에서 30분간 무혈청의 RPMI-1640 배지 속에서 미리 반응시킨 인간 BDNF(최종 농도 0.074 nM) 혹은 NT-3(최종 농도 0.074 nM) 혹은 NT-4(최종 농도 0.071 nM)와 압타머(최종 농도 1 μM∼0.01 nM)의 혼합 용액 50 ㎕를 첨가하고, 3일 후에 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega사 제조)의 CellTiter-Glo 시약을 각 웰에 100 ㎕ 첨가 후, 마이크로플레이트 리더에 의해 화학 발광을 측정하였다. BDNF, NT-3 혹은 NT-4만의 첨가로 세포를 3일간 배양하여 얻어진 1 웰당의 발광량을 저해 활성 0%, BDNF 혹은 NT-3 혹은 NT-4 무첨가로 3일간 배양하여 얻어진 1 웰당의 발광량을 저해 활성 100%로 하여, BDNF, NT-3 혹은 NT-4와 압타머를 혼합 첨가한 경우에 얻어진 1 웰당의 발광량으로부터, 압타머의 저해 활성을 산출하였다. 저해 활성이 0 이하인 경우는 0%로 하였다. 50% 저해 농도(IC50)는, 50% 저해 활성을 사이에 둔 상하 2점의 농도로부터 구하였다. 실험 결과를 표 2에 나타낸다. IC50 값을 「>X」라고 기재한 것은, 기재한 농도 X가 측정 최고 농도였던 경우에 저해 활성이 50% 이하였음을 나타낸다. N.D.는 미측정의 의미이다.
실험한 모든 압타머가 강한 저해 활성을 보였다. 그 일부의 IC50 값을 표 2에 나타낸다. 표 2에 기재된 본 발명의 압타머의 저해 활성은, NGF에 대하여 IC50 값이 0.1 nM 이하인 데 대하여, BDNF에 대한 IC50 값은 1000 nM 이상이었다. NT-3에 대해서는 0.97 nM부터 10 nM 이상으로 압타머에 따라 상이하였다. 또한, NT-4에 대해서는 3 nM 이하부터 30 nM 이상으로, 이쪽도 압타머에 따라 상이하였다.
[표 2]
Figure 112014038112419-pct00010

실시예 17: NGF 압타머에 의한 진통 작용
NGF 유발성 동통에 대한 NGF 압타머의 진통 작용을 검토하기 위해서, 래트 뒷다리로의 NGF 피하 투여에 의해 야기되는 열성 통각 과민 모델을 사용하였다. 실험에는 Jcl: SD계 래트(6주령)를 사용하였다. 열성 통각 과민의 지표로서, 발바닥 열자극 측정 장치(Ugo Basile사 제조)로부터의 발바닥으로의 적외선 조사에 대한 도피 행동의 반응 잠시(潛時)를 이용하였다. 시험 전날에 평가계에 대한 순화를 행하였다. 시험 당일의 투여 전에 도피 행동 반응 잠시를 측정하여, 10초 이상 20초 미만인 개체를 사용하였다. 비히클(Vehicle)(20 mM Tris-HCl(pH 7.6), 145 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 0.1% BSA)에 인간 β-NGF(R&D systems, 종농도 50 ㎍/㎖) 및 피험 물질을 혼합하여, 실온 30분간의 인큐베이트 후, 왼쪽 뒷다리 발바닥에 10 ㎕ 피하 투여하고, 5시간 후에 도피 행동 반응 잠시를 측정하였다. 서열번호 153으로 표시되는 압타머를, 종농도 50 ㎎/㎖(NGF에 대한 몰비: 1000배)로 투여하였다. 컨트롤로서, 비히클 또는 비히클과 NGF와의 혼합액을 동일하게 투여하였다. 결과를 표 3에 나타낸다(Mean±SEM, n=9).
투여 5시간 후에, 비히클군에 비하여 NGF군에서 도피 행동 반응 잠시가 유의적으로 작았다(p<0.01). 또한, 투여 5시간 후에, 압타머 투여군의 도피 행동 반응 잠시가 NGF만의 투여군에 비하여 컸다(p<0.01). 이상의 결과로부터, 본 압타머는 NGF에 기인하는 동통약으로서 사용 가능하다는 것을 알 수 있었다.
[표 3]
Figure 112019013949213-pct00021
실시예 18: NGF 압타머에 의한 수술후통증 모델에 있어서의 진통 작용
NGF 압타머 요법의 약효를 검토하기 위해, 열성 통각 과민이 야기되는 수술후통증 모델을 사용하였다. 실험에는 Crl:CD(SD)계 래트(5주령)를 사용하였다. 카테터의 선단을 대퇴정맥 내에 유치하고, 다른 한쪽의 선단을 래트 배부(背部)에서 체외로 노출시켰다. 1주일 후에 Quick connect 인퓨전 시스템(Strategic applications incorporated사 제조)을 래트에 장착하고, 또 1주일 후에 열성 통각 과민을 평가하였다. 열성 통각 과민의 지표로서, 발바닥 열자극 측정 장치(Ugo Basile사 제조)로부터의 발바닥으로의 적외선 조사에 대한 도피 행동의 반응 잠시를 이용하였다. 시험 시작 3일 전에 평가계에 대한 순화를 행하였다. 시험 시작일에 도피 행동 반응 잠시를 측정하여, 10초 이상 20초 미만인 개체를 사용하였다. 생리식염수에 용해한 NGF 압타머를 시린지 펌프(테루모사 제조)를 이용하여 지속적으로 정맥 내에 투여하였다. NGF 압타머로서는, 서열번호 82(56)로 표시되는 압타머(21.2 ㎎/240 ㎖/㎏/96 hr로 투여) 및 서열번호 82(55)로 표시되는 압타머(10.08 ㎎/240 ㎖/㎏/96 hr로 투여)를 이용하였다. 컨트롤로서, 비히클을 동일하게 투여하였다. 투여 시작 1시간 후에 오른쪽 뒷다리 발바닥의 피부 및 근막을 절개한 후, 굴근(屈筋)을 수직으로 이분하고, 피부를 봉합하였다. 절개 수술 후, 1, 2, 3, 4일 후에 도피 행동 반응 잠시를 측정하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
비히클군에 있어서, 투여·절개술 1, 2, 3, 4일 후의 도피 행동 반응 잠시가 투여·절개 시술 전에 비하여 유의적으로 작았다(p<0.01). 투여·절개술 1, 2, 3, 4일 후에 있어서, 어느 압타머 투여군의 도피 행동 반응 잠시도 비히클군에 비하여 유의적으로 컸다(p<0.01). 실험 결과를 표 4 및 표 5에 나타낸다(Mean±SEM, n=8-9). 이것으로부터 항NGF 압타머는 수술후통증 모델에 대한 진통 작용을 갖는 것이 드러났다.
[표 4]
Figure 112014038112419-pct00012

[표 5]
Figure 112014038112419-pct00013
본 발명의 압타머는, 동통이나 염증성 질환 등의 질환에 대한 의약, 혹은 진단약, 시약으로서 유용할 수 있다. 본 발명의 압타머 및 복합체는 또한 NGF의 정제와 농축 및 NGF의 검출과 정량에 유용할 수 있다.
본 출원은 일본에서 출원된 일본 특허출원 제2011-213585호(출원일: 2011년 9월 28일)을 기초로 하고 있으며, 그 내용은 본 명세서에 전부 포함되는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> RIBOMIC Inc. <120> Aptamers to NGF and use thereof <130> 091940 <150> JP2011-213585 <151> 2011-09-28 <160> 168 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 1 gggagaacuu cgaccagaag uugacgacca acucgucucu uauggauuua cgugaacccg 60 uaugugcgca uacauggauc cuc 83 <210> 2 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 2 gggagaacuu cgaccagaag uccaaacggg acuuuauacc ucugagucgc cuacgcuccu 60 augugcgcau acauggaucc uc 82 <210> 3 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 3 gggagaacuu cgaccagaag uuggcacauc cugcugcgua guuuccgucu ccguggcugu 60 uaugugcgca uacauggauc cuc 83 <210> 4 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 4 gggagaacuu cgaccagaag uacguuagua cguuugcaua uguacaaccu ugcauacgau 60 acguagauua ugugcgcaua cauggauccu c 91 <210> 5 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 5 gggagaacuu cgaccagaag uuagaagagg acuaguugcu aaugcccugg uucgucgcua 60 uaugugcgca uacauggauc cuc 83 <210> 6 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 6 gggagaacuu cgaccagaag ugcaauacuu ucgcggcaua ugugcaaacc uugccacgac 60 uaugugcgca uacauggauc cuc 83 <210> 7 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 7 gggagaacuu cgaccagaag acgcaccucu uaucacacau gcgucagccu ugugauacua 60 ugugcgcaua cauggauccu c 81 <210> 8 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 8 gggagaacuu cgaccagaag auccacuggu acuacgugac cccgcauagg caauccugcu 60 uaugugcgca uacauggauc cuc 83 <210> 9 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 9 gggagaacuu cgaccagaag uuggcacauc cugcugcgua guuuccgucu ccguggcugu 60 uaugugcgca uac 73 <210> 10 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 10 gggagaacuu cgaccagaag uuggcacauc cugcugcgua guuuccgucu ccguggcugu 60 uaugugcg 68 <210> 11 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 11 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Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 18 ugcaauacuu ucgcggcaua ugugcaaacc uugccacgac uaugugcg 48 <210> 19 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 19 gcaauacuuu cgcggcauau gugcaaaccu ugccacgacu augugc 46 <210> 20 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 20 gugcaauacu uucgcggcau augugcaaac cuugccacga cuaugugcgc 50 <210> 21 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 21 gggaauacuu ucgcggcaua ugugcaaacc uugccacgac uauguccc 48 <210> 22 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 22 gggagaacuu cgaccagaag uuggcacauc cugcugcgua guuuccgucu ucguggcugu 60 uaugugcgca uacauggauc cuc 83 <210> 23 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 23 gggagaacuu cgaccagaag uggcacaucc ugcugcguag uuuccgucug cguggcuguu 60 augugcgcau acauggaucc uc 82 <210> 24 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 24 gggagaacuu cgaccagaag uuggcacauc cugcugcgaa guuuccgucu ccguggcugu 60 uaugugcgca uacauggauc cuc 83 <210> 25 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 25 gggagaacuu cgaccagaag uuggcacauc cugcugcgca guuuccgucu acguggcugu 60 uaugugcgca uacauggauc cuc 83 <210> 26 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 26 gggagaacuu cgaccagaag uggcacaucc ugcugcguag uuuccgucuu cgcggcuguu 60 augugcgcau acauggaucc uc 82 <210> 27 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 27 gggagaacuu cgaccagaag uuggcacauc cugcugcgca guuuccgucu gcguggcugu 60 uaugugcgca uacauggauc cuc 83 <210> 28 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 28 gggagaacuu cgaccagaag uuggcacauc cugcugcgua guuuccaucu gcguggcugu 60 uaugugcgca uacauggauc cuc 83 <210> 29 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 29 gggagaacuu cgaccagaag uucacauccu gcugcgaagu uuccuucuuc guggcuguua 60 ugugcgcaua cauggauccu c 81 <210> 30 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial <220> 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<211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 76 ggguccugau uaagaguuuc cgucucguaa ucuguuaccc 40 <210> 77 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 77 ggguccugac uaagaguuuc cgucucguag ucuguuaccc 40 <210> 78 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 78 ggguccuggc caagaguuuc cgucucgugg ucuguuaccc 40 <210> 79 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 79 ggguccuggu uaagaguuuc cgucucguaa ccuguuaccc 40 <210> 80 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 80 ggguccuggc uaagaguuuc cgucucguag ucuguuaccc 40 <210> 81 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 81 ggguccuggu gauaaguuuc cgucuuauca ccuguuaccc 40 <210> 82 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 82 ggguccugga uaagaguuuc cgucucguau ccuguuaccc 40 <210> 83 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 83 ggguccugua caagaguuuc cgucucgugu acuguuaccc 40 <210> 84 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 84 ggguccuguc gcuaaguuuc cgucuuugcg gcuguuaccc 40 <210> 85 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 85 ggguccugag uaagaguuuc cgucucauac ucuguuaccc 40 <210> 86 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 86 ggguccugcu gcguaguuuc cuucugcgug guuguuaccc 40 <210> 87 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 87 ggguccugcu caagaguuuc cgucucgugg gcuguuaccc 40 <210> 88 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 88 ggguccuguu caagaguuuc cgucucguga acuguuaccc 40 <210> 89 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 89 ggguccugug gaagaguuuc cgucucgucc acuguuaccc 40 <210> 90 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 90 ggguccugcg uaagaguuuc cgucucguau gcuguuaccc 40 <210> 91 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 91 ggguccugcc uaagaguuuc cgucucguag gcuguuaccc 40 <210> 92 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 92 ggguccugac caagaguuuc cgucucgugg ucuguaccc 39 <210> 93 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 93 ggguccugcc gcguaguuuc cgucuucgcg guuguuaccc 40 <210> 94 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 94 ggguccugcu gcguaguuuc cgucugcgga gcuguuaccc 40 <210> 95 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 95 ggguccugcu gcguaguuuc caucuucgug gcuguuaccc 40 <210> 96 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 96 ggguccugcu gcguaguuuc cgucuaugug gcuguuaccc 40 <210> 97 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 97 ggguccugcu acguaguuuc cgucugcgug gcuguuaccc 40 <210> 98 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 98 ggguccugcu acguaguuuc cgucuacgug gcuguuaccc 40 <210> 99 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 99 gggagaacuu cgaccagaag uccaaacggg acuuuauacc ucugagucgc cuuugcuccu 60 augugcgcau acauggaucc uc 82 <210> 100 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 100 gggagaacuu cgaccagaag accaaacgga cuuuauaccu cugagucgcc uaugcuccua 60 ugugcgcaua cauggauccu c 81 <210> 101 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 101 ggguccugac guauaguuuc cgucuguaug ucuguuaccc 40 <210> 102 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 102 ggguccugag caagaguuuc cgucucaugc ucuguuaccc 40 <210> 103 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 103 ggguccugcu gcguaguuuc cgucugcgug guuguuaccc 40 <210> 104 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 104 ggguccugau gucaaguuuc cgucuugaug ucuguuaccc 40 <210> 105 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 105 ggguccuguu gcuaaguuuc cgucuuagug acuguuaccc 40 <210> 106 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 106 ggguccugcu gcguaguuuc cgucugcgua gcuguuaccc 40 <210> 107 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 107 ggguccugcu gcgaaguuuc cgucuucgug gcuguuaccc 40 <210> 108 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 108 ggguccuguu gcguaguuuc cgucugcgug acuguuaccc 40 <210> 109 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 109 ggguccugcu gcguaguuuc cuucugcgug gcuguuaccc 40 <210> 110 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 110 ggguccugcc gcguaguuuc cgucugcgug gcuguuaccc 40 <210> 111 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 111 ggguccuguc uaagaguuuc cgucucguag acuguuaccc 40 <210> 112 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 112 ggguccuguu caagaguuuc cgucucgugg acuguuaccc 40 <210> 113 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 113 ggguccugcu guguaguuuc cgucugcaug guuguuaccc 40 <210> 114 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 114 ggguccugac aaagaguuuc cgucucguug ucuguuaccc 40 <210> 115 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 115 ggguccuguc uaagaguuuc cgucucguag acuguuaccc 40 <210> 116 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 116 ggguccuguu caagaguuuc cgucucguga acuguuaccc 40 <210> 117 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 117 ggguccuguu gaagaguuuc cgucucguca acuguuaccc 40 <210> 118 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA template <220> <221> misc_feature <222> (24)..(63) <223> n is a, c, g, or t <400> 118 gaggatccat gtatgcgcac atannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnncttctgg tcgaagttct ccc 83 <210> 119 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 119 cggaattcta atacgactca ctatagggag aacttcgacc agaag 45 <210> 120 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 120 gaggatccat gtatgcgcac ata 23 <210> 121 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 121 gggcacaucc ugcgcguagu uuccgucucc gugcuguuau gugc 44 <210> 122 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 122 gggcacaucc ugcugcgagu uuccgucucg uggcuguuau gugc 44 <210> 123 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 123 gggcacaucc ugugcguagu uuccgucucc gugcuguuau gugc 44 <210> 124 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 124 gggcacaucc ugcugguagu uuccgucucc uggcuguuau gugc 44 <210> 125 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 125 gggcacaucc ugcugcuagu uuccgucucg uggcuguuau gugc 44 <210> 126 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 126 gggcacaucc ugcugcgugu uuccgucccg uggcuguuau gugc 44 <210> 127 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 127 gggguccucu gcguaguuuc cgucuccgug guguuacccc 40 <210> 128 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 128 gggguccugc ugcguauuuc cguuccgugg cuguuacccc 40 <210> 129 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 129 ggggccugcu gcguaguuuc cgucuccgug gcuguucccc 40 <210> 130 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 130 gggcacaucc ugcugcguag uuccgucucc guggcuguua ugugc 45 <210> 131 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 131 gggcacaucc ugcugcguag uuugucuccg uggcuguuau gugc 44 <210> 132 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 132 gggcacaucc ugcugcguag uuuccucucc guggcuguua ugugc 45 <210> 133 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 133 gggguccugc ugcguaguuu ccgcuccgug gcuguuaccc c 41 <210> 134 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 134 gggcacaucc ugcugcguag uuuccgucuc cguggcugua ugugc 45 <210> 135 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 135 ggggucugcu gcguaguuuc cgucuccgug gcuguuaccc c 41 <210> 136 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 136 gggguccgcu gcguaguuuc cgucuccgug gcuguuaccc c 41 <210> 137 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 137 ggggucugcu gcguaguuuc cgucuccgug gcuguacccc 40 <210> 138 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 138 ggggucugcu gcguaguuuc cgucuccgug gcuuuacccc 40 <210> 139 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 139 gggguccgcu gcguaguuuc cgucuccgug gcguuacccc 40 <210> 140 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 140 gggguccgcu gcguaguuuc cgucuccgug gcuuuacccc 40 <210> 141 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 141 gggguccgcu gcguaguuuc cgucuccgug gcuguacccc 40 <210> 142 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA template <220> <221> misc_feature <222> (21)..(60) <223> n is a, c, g, or t <400> 142 ccagttgttg gtgacaatgc nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 gcagctccac aggcttccc 79 <210> 143 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 143 taatacgact cactataggg aagcctgtgg agctgc 36 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 144 gcattgtcac caacaactgg 20 <210> 145 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA template <400> 145 gaggatccat gtatgcgcac ataacagcca cggagacgga aactacgcag caggatgtgc 60 caacttctgg tcgaagttct ccc 83 <210> 146 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA <400> 146 agacggaaac tacgcagcag ga 22 <210> 147 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA template <220> <221> misc_feature <222> (28)..(34) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 147 gaggatccat gtatgcgcac ataacagnnn nnnngacgga aacnnnnnnn caggatgtgc 60 caacttctgg tcgaagttct ccc 83 <210> 148 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA template <220> <221> misc_feature <222> (23)..(26) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (36)..(42) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (52)..(54) <223> n is a, c, g, or t <400> 148 gaggatccat gtatgcgcac atnnnnggat acgagnnnnn nnctcttatc cnnnatgtgc 60 caacttctgg tcgaagttct ccc 83 <210> 149 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 149 taatacgact cactataggg agaacttcga ccagaagttg gcaca 45 <210> 150 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 150 gaggatccat gtatgcgcac a 21 <210> 151 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 151 ggguccugcu gcguaguuuc cgucugcgug gcuguuaccc 40 <210> 152 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 152 ggguccugcu gcguaguuuc cgucugcgug gcuguuaccc 40 <210> 153 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 153 ggguccugcu gcguaguuuc cgucugcgug gcuguuaccc 40 <210> 154 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 154 ggguccugcu gcguaguuuc cgucugcgug gcuguuaccc 40 <210> 155 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 155 ggguccugcu gcgcaguuuc cgucuacgug gcuguuaccc 40 <210> 156 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 156 ggguccugga uaagagtuuc cgucucguau ccuguuaccc 40 <210> 157 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 157 ggguccugga uaagagutuc cgucucguau ccuguuaccc 40 <210> 158 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 158 ggguccugga uaagaguuuc cgucucguau cctguuaccc 40 <210> 159 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 159 ggguccugga uaagaguuuc cgucucguau ccugutaccc 40 <210> 160 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 160 ggguccugga uaagagtuuc cgucucguau ccuguuaccc 40 <210> 161 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 161 ggguccugga uaagaguuuc cgucucguau cctguuaccc 40 <210> 162 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 162 ggguccugga uaagagtuuc cgucucguau cctguuaccc 40 <210> 163 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 163 ggguccugga uaagagtuuc cgucucguau cctguuaccc 40 <210> 164 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 164 ggguccugga uaagagtuuc cgucucguau cctguuaccc 40 <210> 165 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 165 ggguccugga uaagagtuuc cgucucguau cctguuaccc 40 <210> 166 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 166 ggguccugga uaagagtuuc cgucucguau cctguuaccc 40 <210> 167 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 167 ggguccugga uaagagtuuc cgucucguau cctguuaccc 40 <210> 168 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer to NGF <400> 168 ggguccugga uaagagtuuc cgucucguau cctguuaccc 40

Claims (18)

  1. 화학식 (I)로 표시되는 잠재적 2차 구조를 형성할 수 있는, NGF와 결합하는 압타머로서,
    Figure 112019013949213-pct00022

    (상기 식에서, N은 A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드이고,
    N11∼N13, N21∼N23, N32∼N38 및 N42∼N48은, 각각 동일하거나 또는 상이하며, A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 1개 혹은 2개의 뉴클레오티드, 또는 결합이고,
    N14, N24, N31, N41, N39 및 N49는, 각각 동일하거나 또는 상이하며, A, G, C, U 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드로서,
    N14와 N24, N31과 N41 및 N39와 N49는 상호 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하고,
    N11-N12-N13-N14와 N21-N22-N23-N24의 조합으로 스템 구조를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열이며,
    N31-N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38-N39와 N41-N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48-N49의 조합으로 스템 구조를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열이다.)
    (a) 서열번호 38, 서열번호 66, 서열번호 68, 서열번호 71, 서열번호 74, 서열번호 76∼85, 서열번호 87∼89, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 104∼112, 서열번호 114∼117 및 서열번호 151∼155로 이루어진 군에서 선택되는 서열번호로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋음), 또는
    (b) 상기 (a)의 뉴클레오티드 서열에 있어서, 하나 또는 여러 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열
    을 포함하고, NGF의 신경 돌기 신장 활성에 대한 50% 저해 농도가 1 nM 이하인 압타머.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 염기 길이가 50 이하인 압타머.
  7. 제1항 또는 제6항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오티드가 수식되어 있는 압타머.
  8. 제7항에 있어서, 인버티드(inverted) dT 또는 폴리에틸렌글리콜로 수식되어 있는 압타머.
  9. 제8항에 있어서, 인버티드 dT 또는 폴리에틸렌글리콜이, 압타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 결합되어 있는 압타머.
  10. 제7항에 있어서, 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'위의 히드록실기가, 동일하거나 또는 상이하며, 무치환이거나, 수소 원자, 불소 원자 및 메톡시기로 이루어진 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 압타머.
  11. 제7항에 있어서, 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2'위의 히드록실기가, 동일하거나 또는 상이하며, 무치환이거나, 수소 원자, 불소 원자 및 메톡시기로 이루어진 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 압타머.
  12. 제1항 또는 제6항에 있어서, NGF의 세포 증식 활성을 추가로 저해하는 압타머.
  13. 제1항 또는 제6항에 기재된 압타머를 포함하는 염증 또는 동통 치료용 의약 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제1항 또는 제6항에 있어서, 서열번호 82로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머.
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Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9394537B2 (en) 2010-12-22 2016-07-19 President And Fellows Of Harvard College Continuous directed evolution
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) * 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9068179B1 (en) 2013-12-12 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting presenilin point mutations
JP6586669B2 (ja) * 2014-04-24 2019-10-09 株式会社リボミック オートタキシンに結合しオートタキシンの生理活性を阻害するアプタマー及びその利用
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
CA2956808A1 (en) * 2014-07-31 2016-02-04 Academia Sinica Antagonistic ctla-4 aptamers and applications thereof in enhancing immune activity
WO2016077052A2 (en) 2014-10-22 2016-05-19 President And Fellows Of Harvard College Evolution of proteases
WO2016168631A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 President And Fellows Of Harvard College Vector-based mutagenesis system
US10392674B2 (en) 2015-07-22 2019-08-27 President And Fellows Of Harvard College Evolution of site-specific recombinases
US11524983B2 (en) 2015-07-23 2022-12-13 President And Fellows Of Harvard College Evolution of Bt toxins
WO2017019895A1 (en) 2015-07-30 2017-02-02 President And Fellows Of Harvard College Evolution of talens
CN108513575A (zh) 2015-10-23 2018-09-07 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器及其用途
WO2017127761A1 (en) 2016-01-20 2017-07-27 Vitrisa Therapeutics, Inc. Compositions and methods for inhibiting factor d
WO2018027078A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
WO2018136827A1 (en) * 2017-01-20 2018-07-26 Vitrisa Therapeutics, Inc. Stem-loop compositions and methods for inhibiting factor d
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
JP2020510439A (ja) 2017-03-10 2020-04-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シトシンからグアニンへの塩基編集因子
SG11201908658TA (en) 2017-03-23 2019-10-30 Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11447809B2 (en) 2017-07-06 2022-09-20 President And Fellows Of Harvard College Evolution of tRNA synthetases
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11624130B2 (en) 2017-09-18 2023-04-11 President And Fellows Of Harvard College Continuous evolution for stabilized proteins
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
WO2019241649A1 (en) 2018-06-14 2019-12-19 President And Fellows Of Harvard College Evolution of cytidine deaminases
DE112020001342T5 (de) 2019-03-19 2022-01-13 President and Fellows of Harvard College Verfahren und Zusammensetzungen zum Editing von Nukleotidsequenzen
CN112175945A (zh) * 2019-07-02 2021-01-05 苏州贝信生物技术有限公司 Ngf小干扰核酸分子及其应用
EP4146804A1 (en) 2020-05-08 2023-03-15 The Broad Institute Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2259800T3 (es) * 1990-06-11 2006-10-16 Gilead Sciences, Inc. Procedimientos de uso de ligandos de acido nucleico.
US5660985A (en) 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
DE69333961T2 (de) 1992-09-29 2006-08-24 Gilead Sciences, Inc., Foster City Nukleinsäureliganden und ihre herstellungsmethoden
AU692469B2 (en) 1993-09-08 1998-06-11 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligands and improved methods for producing the same
US20030054360A1 (en) * 1999-01-19 2003-03-20 Larry Gold Method and apparatus for the automated generation of nucleic acid ligands
JP2005517456A (ja) 2002-02-15 2005-06-16 ソマロジック・インコーポレーテッド 核酸リガンドによる標的結合を検出する方法および試薬
US7569364B2 (en) * 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
AU2006310882A1 (en) * 2005-11-07 2007-05-10 Copenhagen University Neurotrophin-derived peptide sequences
MX2009005148A (es) * 2006-11-14 2009-08-24 Ribomic Inc Aptamero contra midcina, y uso del mismo.
JP5223086B2 (ja) * 2007-03-26 2013-06-26 国立大学法人東京農工大学 血管内皮増殖因子結合性アプタマー
AU2009297626B2 (en) * 2008-09-24 2016-01-14 Fujimoto Pharmaceutical Corporation Aptamer for NGF and use thereof
AR077049A1 (es) 2009-06-11 2011-07-27 Otsuka Pharma Co Ltd Aptamero contra quimasa y su uso
JP5673992B2 (ja) * 2009-10-30 2015-02-18 国立大学法人東京農工大学 血管内皮細胞増殖因子結合性アプタマー
PL2551346T3 (pl) 2010-03-24 2016-07-29 Ribomic Inc Aptamer dla NGF i jego zastosowanie

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