JPWO2013047844A1 - Ｎｇｆに対するアプタマー及びその用途 - Google Patents

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Abstract

本発明は、式（I）で表される潜在的２次構造を形成できる、ＮＧＦと結合するアプタマーを提供する。（式中、NはA、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つのヌクレオチドであり、N11〜N13、N21〜N23、N32〜N38およびN42〜N48は、それぞれ同一または異なって、A、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つもしくは２つのヌクレオチド、または結合であり、N14、N24、N31、N41、N39およびN49は、それぞれ同一または異なって、A、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つのヌクレオチドであって、N14とN24、N31とN41およびN39とN49は互いにワトソン−クリック塩基対を形成し、N11-N12-N13-N14とN21-N22-N23-N24の組合せでステム構造を形成できるヌクレオチド配列であり、N31-N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38-N39とN41-N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48-N49の組合せでステム構造を形成できるヌクレオチド配列である。）

Description

本発明は、ＮＧＦに対するアプタマー及びその用途に関する。
神経成長因子ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）は１９５１年に同定された最初のニューロトロフィンであり、末梢および中枢ニューロンの発達・生存に係わる重要な分泌タンパク質である。１１８個のアミノ酸からなり、分子量は１３ｋＤａで、分子内に３ヶ所のＳ−Ｓ結合を有する。
ＮＧＦの受容体には高親和性のチロシンキナーゼ型受容体ＴｒｋＡと低親和性の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに属するｐ７５が知られている。これらの受容体はホモ二量体もしくはヘテロ二量体として作用し神経系の発生と維持に深く係わっている。ＴｒｋＡは一回膜貫通型受容体で細胞内ドメインにチロシンキナーゼ構造を持つ。ＮＧＦが結合するとチロシンリン酸化が起こり、下流にシグナルが伝わり、その細胞の分化促進や生存維持に働く。
ＴｒｋＡのファミリー受容体としてＴｒｋＢとＴｒｋＣが知られている。ＴｒｋＢはＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５と結合し、ＴｒｋＣはＮＴ−３と結合する。ｐ７５はＴｒｋＡに比べてリガンド特異性が低く、ＮＧＦ以外にもＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５と結合する。ｐ７５は一回膜貫通型受容体であるが、細胞質側にチロシンキナーゼドメインはない。ＴｒｋＡ同様、神経細胞だけでなく非神経細胞にも発現している。この受容体は細胞の分化促進や生存維持に関与しているほか、アポトーシスの誘導や細胞遊走とも関係していることが知られている。結晶構造解析の結果から、ホモ二量体のＮＧＦはＴｒｋＡと２：２で結合するが、ｐ７５とは２：１で結合することが示唆された。ホモ二量体のＮＧＦがＴｒｋＡとｐ７５のヘテロ二量体に結合することもある。
ＮＧＦは神経系において重要な役割を担っていることはよく知られている。コリン作動性ニューロンの生存を維持する作用を有することが明らかにされており、アルツハイマー病と何らかの関連があると考えられている。また、老齢ラットの脳内にＮＧＦを投与すると、記憶障害の改善が認められることから、老人性痴呆の治療薬としても期待されている。
またＮＧＦは炎症と関連があり、炎症性疾患の患者や炎症性動物モデルでＮＧＦの発現上昇が観察されている。例えば、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、関節炎、間質性膀胱炎、喘息などがそれに当たる。関節リウマチの患者の滑液中のＮＧＦの濃度が上昇していることが報告されている。また、関節リウマチモデルラットのＮＧＦの発現の向上、関節炎モデルマウスで肥満細胞の増加とＮＧＦの発現の向上が報告されている。
ＮＧＦは痛みと深く関わる。ヒトにＮＧＦを皮下投与すると、筋肉痛のような深部痛が数日続き、注入部位の痛覚過敏が生じる。ＮＧＦノックアウトマウスとＴｒｋＡノックアウトマウスは無髄神経が欠損し痛みを感じなくなる。成熟ラットに１ｍｇ／ｋｇのＮＧＦを腹腔内投与すると、侵害性熱や機械刺激に対する痛覚過敏が生じる。ＮＧＦのトランスジェニックマウスは炎症症状を伴わない痛覚過敏を示す。また、先天性無痛無汗症（ＣＩＰＡ）の患者のＴｒｋＡ遺伝子に異常があること、ＮＧＦの遺伝子に異常があると痛覚が低下することが知られている。
以上より、ＮＧＦ阻害剤は侵害受容性疼痛、炎症性疼痛、神経因性疼痛、癌性疼痛、線維筋痛などの疼痛の治療薬として利用可能であることが理解できる。
ところで、近年、ＲＮＡアプタマーの治療薬、診断薬、試薬への応用が注目されており、いくつかのＲＮＡアプタマーが臨床段階あるいは実用化段階に入っている。２００４年１２月には世界初のＲＮＡアプタマー医薬であるＭａｃｕｇｅｎが加齢黄斑変性症の治療薬として米国で承認された。ＲＮＡアプタマーとはタンパク質などの標的物質に特異的に結合するＲＮＡのことで、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を用いて作製することができる（特許文献１〜３）。ＳＥＬＥＸとは、１０１４個程度の異なるヌクレオチド配列を持つＲＮＡのプールから、標的物質に特異的に結合するＲＮＡを選別してくる方法である。使用されるＲＮＡは４０残基程度のランダム配列をプライマー配列で挟み込んだ構造をしている。このＲＮＡプールを標的物質と会合させて、フィルターなどを用いて標的物質に結合したＲＮＡのみ回収する。回収したＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、これを次のラウンドの鋳型として用いる。この作業を１０回程度繰り返すことにより、標的物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを取得することができる場合がある。
アプタマー医薬は抗体医薬と同様に細胞外因子を標的にすることができるが、既に公表されている多くの学術論文等を参考にすると、いくつかの点で抗体医薬を上回る可能性がある。例えば、アプタマーは抗体よりも結合力と特異性が高い場合が多々ある。また、免疫排除を受けにくく、抗体特有の抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）などの副作用は起こらない。デリバリーの観点では、アプタマーは抗体の１／１０程度のサイズであるので、目的の部位まで薬物を送達させることはより容易である。アプタマーは化学合成により生産されるので、各種修飾を容易に入れることができ、大量生産によるコストダウンが可能である。一方で、一般にアプタマーの血中半減期は抗体よりも短い。しかし、この点も毒性を考慮した場合はメリットとなる場合がある。以上の点より、同じ分子を標的にした医薬品であっても、アプタマー医薬は抗体医薬に勝る可能性がある。
本発明者らは、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するアプタマーを製造し、これがＮＧＦによる神経突起伸長活性を阻害することを見出した（特許文献４）。一方、特許文献５には、自動化されたＳＥＬＥＸによって得られたＮＧＦに対するアプタマーが記載されており、また特許文献６には、特許文献４で得られたアプタマーの改変体および修飾体が記載されている。
国際公開ＷＯ９１／１９８１３号 国際公開ＷＯ９４／０８０５０号 国際公開ＷＯ９５／０７３６４号 国際公開ＷＯ２０１０／０３５７２５号 国際公開ＷＯ０２／０７７２６２号 国際公開ＷＯ０３／０７０９８４号
本発明は、ＮＧＦに対するアプタマー及びその利用方法などを提供することを目的とする。特に、医薬品用途に適したＮＧＦアプタマー、即ち、短鎖長でかつＮＧＦ活性（神経突起伸長活性、ＴＦ−１細胞増殖活性）阻害活性が高く、しかもＮＧＦに対する特異性の高いアプタマーを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、神経突起伸長阻害についてのＩＣ５０値が１ｎＭ以下の、従来公知のＮＧＦアプタマーに比べて顕著に高い神経突起伸長阻害活性を有する、より良質なＮＧＦアプタマーを作製することに成功し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の発明などを提供するものである。
［１］式（I）で表される潜在的２次構造を形成できる、ＮＧＦと結合するアプタマー。
（式中、NはA、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つのヌクレオチドであり、
N11〜N13、N21〜N23、N32〜N38およびN42〜N48は、それぞれ同一または異なって、A、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つもしくは２つのヌクレオチド、または結合であり、
N14、N24、N31、N41、N39およびN49は、それぞれ同一または異なって、A、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つのヌクレオチドであって、
N14とN24、N31とN41およびN39とN49は互いにワトソン−クリック塩基対を形成し、
N11-N12-N13-N14とN21-N22-N23-N24の組合せでステム構造を形成できるヌクレオチド配列であり、
N31-N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38-N39とN41-N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48-N49の組合せでステム構造を形成できるヌクレオチド配列である。）
［２］N11〜N13、N21〜N23、N32〜N38およびN42〜N48が、それぞれ同一または異なって、A、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つのヌクレオチドである、上記［１］記載のアプタマー。
［３］N14がU、N24がA、N31がG、N41がC、N39がG、N49がCである、上記［１］または［２］記載のアプタマー。
［４］N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38とN42-N43-N44-N45-N46-N47-N48で4個以上のワトソン−クリック塩基対を形成する、上記［１］〜［３］のいずれかに記載のアプタマー。
［５］以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである上記［１］記載のアプタマー：
（ａ）配列番号３、配列番号９〜１３、配列番号２２〜１１７および配列番号１５２〜１６８のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）からなる核酸；
（ｂ）上記（ａ）のヌクレオチド配列において、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＮＧＦと結合する核酸。
［６］塩基長が５０以下である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載のアプタマー。
［７］少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、上記［１］〜［６］のいずれかに記載のアプタマー。
［８］ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴまたはポリエチレングリコールで修飾されている、上記［７］記載のアプタマー。
［９］ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴまたはポリエチレングリコールが、アプタマーの５’末端または３’末端に結合している、上記［８］記載のアプタマー。
［１０］各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一または異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子およびメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置き換えられている、上記［７］〜［９］のいずれかに記載のアプタマー。
［１１］各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一または異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子およびメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置き換えられている、上記［７］〜［９］のいずれかに記載のアプタマー。
［１２］ＮＧＦの神経突起伸長活性および／または細胞増殖活性を阻害する、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載のアプタマー。
［１３］上記［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマーを含む、医薬組成物。
［１４］上記［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマーを含む、抗疼痛剤。
［１５］上記［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマーを含む、抗炎症剤。
［１６］上記［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマーを、それを必要とする対象に投与することを特徴とする、疼痛又は炎症を伴う疾患を治療又は予防する方法。
［１７］疼痛又は炎症を伴う疾患の治療又は予防のための、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマー。
本発明のアプタマーまたは核酸は、上記の構成をとることにより優れたＮＧＦ阻害活性、特に高い神経突起伸長阻害活性を示すので、疼痛や炎症性疾患などの疾患に対する医薬として有用であり得る。
配列番号３で表されるＮＧＦアプタマーの予測される２次構造の模式図である。左上側のステム−ループ構造がコンセンサス二次構造１に相当する。 配列番号１２で表されるＮＧＦアプタマーのヌクレオチド配列に代表されるコンセンサス二次構造１を示す模式図である。 配列番号８２（２）で表されるＮＧＦアプタマー（修飾体）がＮＧＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４に結合することを示すセンサーグラムである。縦軸のＲＵは、相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｕｎｉｔ）を示し、Ｒｅｓｐ．Ｄｉｆｆ．は、反応差（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）を示す。横軸は、時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓ））を示す。縦軸、横軸におけるこれらの表記は、以下の図４〜５でも同様である。 配列番号８２（２）で表されるＮＧＦアプタマー（修飾体）がＮＧＦとＮＧＦ受容体ＴｒｋＡとの結合を阻害することを示すセンサーグラムである。 配列番号８２（２）で表されるＮＧＦアプタマー（修飾体）がＮＧＦとＮＧＦ受容体ｐ７５との結合を阻害することを示すセンサーグラムである。
本発明は、式（I）で表される潜在的２次構造：
（式中、NはA、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つのヌクレオチドであり、
N11〜N13、N21〜N23、N32〜N38およびN42〜N48は、それぞれ同一または異なって、A、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つもしくは２つのヌクレオチド、または結合であり、
N14、N24、N31、N41、N39およびN49は、それぞれ同一または異なって、A、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つのヌクレオチドであって、
N14とN24、N31とN41およびN39とN49は互いにワトソン−クリック塩基対を形成し、
N11-N12-N13-N14とN21-N22-N23-N24の組合せでステム構造を形成できるヌクレオチド配列であり、
N31-N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38-N39とN41-N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48-N49の組合せでステム構造を形成できるヌクレオチド配列である。）
を形成できる、ＮＧＦと結合するアプタマー（以下、「本発明のアプタマー」と記載する）を提供する。上記ヌクレオチド配列は後述する修飾を受けていてもよい。
アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。アプタマーは、所定の標的分子に対して結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害し得る。本発明のアプタマーは、ＮＧＦに対して結合活性を有するアプタマーである。好ましい態様によれば、本発明のアプタマーはＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害することによって、ＮＧＦの活性を阻害し得る。
本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸又はそれらの混合物などの核酸であり得る。従って、以下において、本発明のアプタマーは「本発明の核酸」と読み替えて表される場合もあり得る。
一本鎖核酸は種々の２次構造をとることができる。「潜在的２次構造」とは、ある一本鎖核酸が、その１次構造からみて熱力学的にとり得る２次構造を意味するが、特に本発明のアプタマーにおける潜在的２次構造は、実施例５に記載のＭＦＯＬＤプログラムを用いて予測することができる２次構造である。従って、上記式（I）で表される２次構造をとり得る１次構造を有する限り、現に当該２次構造をとっていない核酸であっても、本発明のアプタマーに包含される。
よって好ましくは、本発明のアプタマーは、その１次構造からみて熱力学的に安定に上記式（I）で表される２次構造をとり得る核酸分子であり、この意味において、本発明のアプタマーは式（I）で表わされる潜在的２次構造を形成できるアプタマーである。
式（I）で表される潜在的２次構造は、いわゆる「ステム−ループ構造」であり、特にN11-N12-N13-N14とN21-N22-N23-N24との組合せにより形成され得るステム構造と、N31-N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38-N39とN41-N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48-N49との組合せにより形成され得るステム構造との間にループ構造（本明細書中、「インターナルループ１」と記載する）を有し、さらに、N39とN49との間にループ構造（本明細書中、「ループ２」と記載する）を有することを特徴とする。
「ステム構造」とは、核酸分子内の相補性を有する部分ヌクレオチド配列同士がワトソン−クリック塩基対（G-CもしくはA-U/T）を形成した構造をいうが、本明細書においては、N11-N12-N13-N14とN21-N22-N23-N24およびN31-N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38-N39とN41-N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48-N49は完全相補的である必要はなく、ミスマッチおよび／またはG-U/Tのwobblingを許容するものである。すなわち、ステム構造を形成する部分ヌクレオチド配列両末端のヌクレオチド同士がワトソン−クリック塩基対を形成していれば、必ずしもそれ以外のヌクレオチド同士の全てがワトソン−クリック塩基対を形成している必要はない。
式（I）中、ループ２部分に位置する「N」はA、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つのヌクレオチドであるが、好ましい一実施態様においては「N」はGであり得る。
式（I）中、N11〜N13、N21〜N23、N32〜N38およびN42〜N48は、それぞれ同一または異なって、A、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つもしくは２つのヌクレオチド、または結合を示す。Ni（iは11〜13、21-23、32〜38、42〜48から選ばれる整数）が「２つのヌクレオチド」である場合、当該２つのヌクレオチドは同一であっても異なっていてもよい。また、Niが「２つのヌクレオチド」もしくは「結合」である場合、好ましくはN11〜N13、N21〜N23、N32〜N38およびN42〜N48の各部分配列中に２個以下、より好ましくは１個以下の頻度で含まれる。従って、一方のステム構造を形成するN11〜N14およびN21〜N24は、好ましくは２〜６個、より好ましくは３〜５個のヌクレオチド長をそれぞれ有し、もう一方のステム構造を形成するN31〜N39およびN41〜N49は、好ましくは７〜１１個、より好ましくは８〜１０個のヌクレオチド長をそれぞれ有する。
なお上記「結合」とは、単結合を意味し、式（I）中の任意のNiが「結合」という場合は、当該ヌクレオチドに隣接するヌクレオチド同士がホスホジエステル結合によって連結していることを示す。
特に好ましくは、N11〜N13、N21〜N23、N32〜N38およびN42〜N48は、それぞれ同一または異なって、A、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つのヌクレオチドである。従って２次構造を形成する部分の両末端を含むステム構造のステム長は、好ましくは４ヌクレオチド以下であり、また２つのループに挟まれる内部ステム構造のステム長は、好ましくは９ヌクレオチドである。
また、式（I）中、N14、N24、N31、N41、N39およびN49は、それぞれ同一または異なって、A、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つのヌクレオチドであって、N14とN24、N31とN41およびN39とN49は互いにワトソン−クリック塩基対（G-CもしくはA-U/T）を形成する。従って、２次構造を形成する部分の両末端を含むステム構造は少なくともインターナルループ１部分側末端で塩基対を形成しており、２つのループに挟まれる内部ステム構造はその両端で塩基対形成している。より好ましくは、N14がU、N24がA、N31がG、N41がC、N39がG、N49がCである。
一方、前記のように定義したとおり、「ステム構造」におけるN11-N12-N13とN21-N22-N23、およびN32-N33-N34-N35-N36-N37-N38とN42-N43-N44-N45-N46-N47-N48については完全相補的である必要はない（全てワトソン−クリック塩基対を形成する必要はない）が、ステム構造を形成し得る（ステム内にループ（バブル）が形成されない）程度の相補性を有している必要がある。具体的には、各ステム構造内に３個の連続するミスマッチもしくはG-U/Tのwobblingが含まれる場合にはループが形成され得るため、各ステム構造は３個の連続するミスマッチもしくはG-U/Tのwobblingを含まないことが望ましい。また、N11-N12-N13とN21-N22-N23、およびN32-N33-N34-N35-N36-N37-N38とN42-N43-N44-N45-N46-N47-N48のそれぞれにおいて、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上がワトソン−クリック塩基対を形成するヌクレオチド同士であることが望ましい。
本発明はまた、以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかのヌクレオチド配列からなる核酸を提供する。
（ａ）配列番号３、配列番号９〜１３、配列番号２２〜１１７および配列番号１５２〜１６８のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）。
（ｂ）上記（ａ）のヌクレオチド配列において、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列であり、かつＮＧＦと結合する配列。
これらの核酸は、上記式（I)で表される潜在的２次構造を形成することができる。
なお、配列上のいずれのウラシルもチミンへ置き換えることができるが、置き換えられるウラシルは、本発明のアプタマーが有する活性を保つべく、好ましくは、前記潜在的２次構造におけるインターナルループ１部分およびループ２部分以外の部分におけるウラシルであり得る。
本願明細書において「配列番号」で特定される配列とは、各アプタマー又は核酸のヌクレオチド配列を意味し、例えば「配列番号１の配列を含む核酸」とは、配列番号１の配列を含む天然の核酸、修飾核酸またはその両方で構成される核酸を意味する。配列表には、各アプタマーの配列番号の塩基配列を記載している。
上記（ｂ）において、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチド数は、例えば約１〜１０個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、最も好ましくは１個もしくは２個であり得る。
上記（ｂ）において、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチドの位置は特に限定されないが、本発明のアプタマーが有する活性を保つべく、好ましくは前記潜在的２次構造におけるインターナルループ１部分およびループ２部分以外の部分におけるヌクレオチドであり得る。
本発明のアプタマーまたは核酸のヌクレオチド長は特に制限されないが、通常、３４〜約２００ヌクレオチドであるが、好ましくは３４〜約１００ヌクレオチドであり、より好ましくは３６〜６０ヌクレオチドであり、さらに好ましくは３８〜４４ヌクレオチドである。また、本発明のアプタマーまたは核酸の塩基長は、好ましくは５０以下であり、より好ましく４４以下である。上記式（I）で表される潜在的２次構造を形成できる範囲で総ヌクレオチド数を少なくすることにより、アプタマーの化学合成及び大量生産がより容易となり、かつコスト面でのメリットも大きい。また、このようなアプタマーは化学修飾が容易であり、生体内安定性を向上させやすく、毒性が低いと考えられる。
本発明のアプタマーはまた、上記（ａ）のヌクレオチド配列からなる核酸の複数の連結物、上記（ｂ）のヌクレオチド配列からなる核酸の複数の連結物、並びに上記（ａ）のヌクレオチド配列からなる核酸及び上記（ｂ）のヌクレオチド配列からなる核酸の複数の連結物からなる群より選ばれる連結物であり得る。
これらの連結物も、ＮＧＦに結合し且つ／又はＮＧＦの活性（ＮＧＦ受容体との結合活性等）を阻害し得る。
ここで連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ２）ｎ−リンカー、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ３−結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば２個、３個又は４個であり得る。
本発明のアプタマーに含まれる各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース、プリンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチド（即ち、未置換であるヌクレオチド）であるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の原子又は基で置き換えられているヌクレオチドであり得る。このような任意の原子又は基としては、例えば、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−アルキル基（例、−Ｏ−Ｍｅ基）、−Ｏ−アシル基（例、−Ｏ−ＣＨＯ基）、アミノ基（例、−ＮＨ２基）で置き換えられているヌクレオチドが挙げられる。以下にリボースの２’位において、ヒドロキシル基が水素原子、フッ素原子、−Ｏ−Ｍｅ基で置き換えられた場合をそれぞれ示す。
本発明のアプタマーはまた、少なくとも１種（例、１、２、３又は４種）のヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる少なくとも２種（例、２、３又は４種）の基を含むヌクレオチドであり得る。
本発明のアプタマーはまた、全てのピリミジンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一または異なって、フッ素原子で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換されているヌクレオチドであり得る。
本発明のアプタマーはまた、全てのプリンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一または異なって、ヒドロキシル基で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子または基で置換されるヌクレオチドであり得る。
本発明のアプタマーはまた、全てのヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる同一の基を含むヌクレオチドであり得る。
尚、本明細書においては、アプタマーを構成するヌクレオチドをＲＮＡと仮定して（すなわち糖基をリボースと仮定して）、ヌクレオチド中の糖基への修飾の態様を説明するが、これは、アプタマーを構成するヌクレオチドからＤＮＡが除外されることを意味するものではなく、適宜ＤＮＡへの修飾として読み替えられる。例えば、アプタマーを構成するヌクレオチドがＤＮＡである場合、リボースの２’位のヒドロキシル基のＸへの置き換えは、デオキシリボースの２’位の一方の水素原子のＸへの置き換えとして読み替えられる。
なお本発明のアプタマーにおいて、ウラシルをチミンに置換することによって、ＮＧＦに対する結合性、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合阻害活性、ＮＧＦの神経突起伸長阻害活性、ＮＧＦの細胞増殖阻害活性、アプタマーの安定性、薬物送達性、血液中での安定性等を高めることが可能である。
本発明のアプタマーが結合するＮＧＦは公知のニューロトロフィンであり、末梢および中枢ニューロンの発達・生存に係わる重要な分泌タンパク質である。本発明におけるＮＧＦは、特にβタイプのＮＧＦを意味する。ヒトβ−ＮＧＦのアミノ酸配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＰ００２４９７、Ｐ０１１３８、ＡＡＩ２６１５１、ＡＡＩ２６１４９、ＣＡＢ７５６２５で表されるものであるが、変異の入ったものや、その機能ドメイン、ペプチド断片であってもよい。また、モノマーだけでなくダイマーや多量体であってもよい。さらにヒト以外の哺乳動物、例えば、霊長類（例、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）由来のＮＧＦも含まれる。
本発明のアプタマーは、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害することによって、ＮＧＦの活性を阻害する。ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害し得る限り、本発明のアプタマーはＮＧＦのいかなる部分に結合してもよい。
本明細書中、「ＮＧＦに対する阻害活性」とはＮＧＦが保有する任意の活性に対する阻害能を意味する。例えば、ＮＧＦがＮＧＦ受容体に結合することを阻害する活性、ＮＧＦがＮＧＦ受容体に結合することによって生じる、ＮＧＦ受容体の下流のシグナル伝達（Ｒａｓ−ＭＡＰキナーゼ経路、ＰＩ３キナーゼ経路）の阻害、ＴＲＰＶ１、ＳＰ、ＢＤＮＦなどの発現上昇の阻害、肥満細胞などから放出されるＨＡ、ＢＫ、ＰＧ、ＮＧＦ、その他サイトカインの発現の阻害活性、さらに、ＮＧＦにより誘導される神経細胞の分化、生存、神経突起伸長、血管透過性の増大、Ｔ細胞やＢ細胞の免疫応答の増強、リンパ球の分化、肥満細胞や赤白血病細胞、癌細胞など各種細胞の増殖などの阻害、ＮＧＦにより誘発される疼痛、痛覚過敏の軽減などが挙げられる。
本発明のアプタマーが有する好ましい「ＮＧＦに対する阻害活性」は、ＮＧＦがＮＧＦ受容体に結合することを阻害する活性であり、ＮＧＦにより誘導される神経突起伸長活性を阻害する活性、ＮＧＦにより誘導される細胞増殖活性を阻害する活性などである。
本発明のアプタマーは、生理的な緩衝液（例えば溶液Ａ：実施例１参照）中で、ＮＧＦへ結合する。本発明のアプタマーは、例えば以下の試験により検出可能な程度の強度で、ＮＧＦへ結合する。
測定にはＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いる。センサーチップにアプタマーを固定化する。固定化量は１０００ＲＵとする。０．３ＭのＮａＣｌを含有する生理的な緩衝液（溶液Ａ：実施例１参照）によりＮＧＦ溶液（０．５μＭ）を調製する。このＮＧＦ溶液を２０μＬ注入し、ＮＧＦのアプタマーへの結合を検出する。４０ヌクレオチドからなるランダムなヌクレオチドを含むＲＮＡをネガティブコントロールとし、該コントロールＲＮＡと比較してＮＧＦが有意に強くアプタマーに結合した場合、該アプタマーはＮＧＦへの結合能を有すると判定する。
本明細書中、「ＮＧＦ受容体」とはＮＧＦが結合する細胞表面タンパク質を意味する。ＮＧＦ受容体としては、ＴｒｋＡとｐ７５が知られている。本発明でいうＮＧＦ受容体とは、天然のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいし、その変異体であってもよい。ここで「その変異体」とは、「ＮＧＦ受容体」のアミノ酸が数個置換されたものやその一部分のアミノ酸配列であって、ＮＧＦに対して結合活性を有し、かつＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するタンパク質またはペプチドを意味する。
本発明のアプタマーは、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するアプタマーである。ＮＧＦのＮＧＦ受容体への結合をアプタマーが阻害するか否かは、例えば以下の試験により評価することができる。
測定にはＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いる。ＣＭ５センサーチップにＮＧＦ受容体とＦｃとの融合タンパク質（例えば、ＴｒｋＡ−Ｆｃ（１７５−ＴＫ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）又はｐ７５−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ））を固定化する。固定化量は５００〜７００ＲＵとする。生理的な緩衝液（溶液Ａ：実施例１参照）中でＮＧＦ（０．１μＭ）とアプタマー（０．２μＭ）を混合し、３０分かけてサンプルとなる混合液を調製する。この混合液をＢＩＡｃｏｒｅ２０００に注入し、ＮＧＦのＮＧＦ受容体への結合を検出する。
一態様において、本発明のアプタマーは、ＮＧＦとＴｒｋＡとの結合およびＮＧＦとｐ７５との結合を両方阻害し得る。
本発明のアプタマーは、ＮＧＦの神経突起伸長活性および／またはＮＧＦの細胞増殖活性を阻害するアプタマーである。ＮＧＦの神経突起伸長活性を本発明のアプタマーが阻害するか否かは、例えば、実施例３に記載の試験により評価することができる。また、ＮＧＦの細胞増殖活性を本発明のアプタマーが阻害するか否かは、例えば、実施例８に記載の試験により評価することができる。
本発明のアプタマーは、ＮＧＦの神経突起伸長活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０または５０％阻害濃度）が１ｎＭ以下であることを特徴とする。従来公知のＮＧＦアプタマーはＮＧＦの神経突起伸長活性に対するＩＣ５０値が数ｎＭ程度であるので、本発明のアプタマーは、神経突起伸長阻害活性に関しより優れた特性を有する。
また、好ましい実施態様においては、本発明のアプタマーは、ＮＧＦの細胞増殖活性に対するＩＣ５０値も１ｎＭ以下である。
一方、本発明のアプタマーが、ＮＧＦ以外のニューロトロフィン、具体的には、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）およびニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）の細胞増殖活性を阻害する活性を有するかについては、アプタマーによって異なっている。ここでＢＤＮＦ、ＮＴ−３及びＮＴ−４／５の用語は、それぞれヒトを含む、全哺乳類種のＢＤＮＦ、ＮＴ−３及びＮＴ−４／５を意味する。
他のニューロトロフィン（ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５）の細胞増殖阻害活性の程度は、実施例１６に記載の試験により評価することができる。実施例１６および表２に記載の本発明のアプタマーの細胞増殖阻害活性は、ＮＧＦに対してＩＣ５０値が０．１ｎＭ以下であるのに対して、ＢＤＮＦに対するＩＣ５０値は１０００ｎＭ以上であり、本発明のアプタマーはＢＤＮＦの細胞増殖活性を阻害しないといえるが、ＮＴ−３に対しては０．９７ｎＭから１０ｎＭ以上であり；またＮＴ−４に対しては３ｎＭ以下から３０ｎＭ以上である；というように、ＮＴ−３およびＮＴ−４の細胞増殖活性については、アプタマーによって異なっている。
本発明のアプタマーは、ＮＧＦに対する結合性、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合阻害活性、ＮＧＦの神経突起伸長阻害活性、ＮＧＦの細胞増殖阻害活性、アプタマーの安定性、薬物送達性、血液中での安定性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、Ｏ−アルキル化（例、Ｏ−メチル化、Ｏ−エチル化）、Ｏ−アリル化、Ｓ−アルキル化（例、Ｓ−メチル化、Ｓ−エチル化）、Ｓ−アリル化、アミノ化（例、−ＮＨ２）が挙げられる。他にも、４’位の酸素を硫黄に置き換えた４’−ＳＲＮＡ、２’位と４’位とをメチレンを介して架橋したＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、３’位の水酸基をアミノ基に置き換えた３’−Ｎ−ホスホロアミデート核酸などを例として挙げることができる。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，７３３−７３８；Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，２６２９−２６３５；Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２，５１３８−５１４５参照）。
本発明のアプタマーはまた、ＮＧＦに対する結合性、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合阻害活性、ＮＧＦの神経突起伸長阻害活性、ＮＧＦの細胞増殖阻害活性、アプタマーの安定性、薬物送達性、血液中での安定性等を高めるため、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）が改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、６および／または８位プリン改変（Ｏ−メチル修飾など）、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルでの置換、５−アミノ酸タイプの修飾、５−トリプトファン側鎖の修飾が挙げられる。また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、アプタマーのホスフェート部分が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（ホルムアセタール）、Ｐ（Ｏ）ＢＨ３（ボラノホスフェート）又は３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）で置き換えられていてもよい〔ここで各々のＲ又はＲ’は独立して、Ｈであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。
連結基としては、−Ｏ−、−Ｎ−又は−Ｓ−が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
改変はまた、キャッピングのような３’及び５’の改変を含んでもよい。
改変はさらに、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」と記載する場合がある）、アミノ酸、ペプチド、ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ、Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｉｃ−ｏｌｅｙｌ、Ｄｏｃｏｓａｎｙｌ、Ｌａｕｒｏｙｌ、Ｓｔｅａｒｏｙｌ、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、Ｏｌｅｏｙｌ、Ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチンなどを末端に付加することにより行われ得る。このような改変については、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号、同第５，７５６，７０３号を参照のこと。
特に、改変がＰＥＧの末端付加によって行われる場合、ＰＥＧの分子量は特に限定されないが、好ましくは１０００〜１０００００、より好ましくは３００００〜９００００である。ＰＥＧは、直鎖状であってもよいし、二つ以上の鎖に分岐したもの（マルチアームＰＥＧ）であってもよい。
このようなＰＥＧとしては特に限定されず、当業者であれば市販あるいは公知のＰＥＧを適宜選択して用いることができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｇ−ｄｒｕｇ．ｃｏｍ／ｐｅｇ＿ｐｒｏｄｕｃｔ／ｂｒａｎｃｈｅｄ．ｈｔｍｌを参照のこと）が、本発明のアプタマーに適用するＰＥＧの好適例として具体的には、分子量４００００の２分岐ＧＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２−４００ＧＳ２ 日油社製）、分子量４００００の２分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２−４００ＴＳ 日油社製）、分子量４００００の４分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ４−４００ＴＳ 日油社製）、分子量８００００の２分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２−８００ＴＳ 日油社製）、または分子量８００００の４分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ４−８００ＴＳ 日油社製）などが挙げられる。
この場合、本発明のアプタマーは、ＰＥＧが末端に直接付加されていてもよいが、その末端にＰＥＧと結合可能な基を有するリンカーなどが付加され、それを介してＰＥＧを本発明のアプタマーに付加することがより好ましい。
ＰＥＧと本発明のアプタマーのリンカーとしては特に限定されず、炭素鎖数や官能基などを結合部位やＰＥＧの種類などに応じて適宜選択することができる。このようなリンカーとしては、例えばアミノ基を有するリンカーが挙げられ、具体的には、５’末端に付加する場合は、ｓｓＨ Ｌｉｎｋｅｒ（ＳＡＦＣ）またはＤＭＳ（Ｏ）ＭＴ−ＡＭＩＮＯ−ＭＯＤＩＦＩＥＲ（ＧＬＥＮ ＲＥＳＥＡＲＣＨ）が、３’末端に付加する場合は、ＴＦＡ Ａｍｉｎｏ Ｃ−６ ｌｃａａ ＣＰＧ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）などが例示される。このリンカーを選択した場合、ＰＥＧには、例えばＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅの活性基を付加した上で、これをリンカー側のアミノ基と反応させることで、本発明のアプタマーとＰＥＧとをリンカーを介して結合することができる。
なおＰＥＧやリンカーとしては、市販のものを好ましく用いることができる。またＰＥＧ、リンカーおよび本発明のアプタマーの結合に関する反応条件などは、当業者であれば適宜設定することが可能である。
本発明のアプタマーは、本明細書中の開示及び当該技術分野における自体公知の方法により化学合成することができる。アプタマーは、リン酸基の負電荷を利用したイオン結合、リボースを利用した疎水結合および水素結合、核酸塩基を利用した水素結合やスタッキング結合など多様な結合様式により標的物質と結合する。特に、構成ヌクレオチドの数だけ存在するリン酸基の負電荷を利用したイオン結合は強く、タンパク質の表面に存在するリジンやアルギニンの正電荷と結合する。このため、標的物質との直接的な結合に関わっていない核酸塩基は置換することができる。特に、ステム構造の部分は既に塩基対が作られており、また、二重らせん構造の内側を向いているので、核酸塩基は、標的物質と直接結合し難い。従って、塩基対を他の塩基対に置換してもアプタマーの活性は減少しない場合が多い。ループ構造など塩基対を作っていない構造においても、核酸塩基が標的分子との直接的な結合に関与していない場合に、塩基の置換が可能である。リボースの２’位の修飾に関しては、まれにリボースの２’位の官能基が標的分子と直接的に相互作用していることがあるが、多くの場合無関係であり、他の修飾分子に置換可能である。このようにアプタマーは、標的分子との直接的な結合に関与している官能基を置換または削除しない限り、その活性を保持していることが多い。また、全体の立体構造が大きく変わらないことも重要である。
アプタマーは、ＳＥＬＥＸ及びその改良法（例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６，８１８−８２２；Ｔｕｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５−５１０）を利用することで作製することができる。ＳＥＬＥＸではラウンド数を増やしたり、競合物質を使用したりすることで、標的物質に対してより結合力の強いアプタマーが濃縮され、選別されてくる。よって、ＳＥＬＥＸのラウンド数を調節したり、及び／又は競合状態を変化させたりすることで、結合力が異なるアプタマー、結合形態が異なるアプタマー、結合力や結合形態は同じであるが塩基配列が異なるアプタマーを得ることができる場合がある。また、ＳＥＬＥＸにはＰＣＲによる増幅過程が含まれるが、その過程でマンガンイオンを使用するなどして変異を入れることで、より多様性に富んだＳＥＬＥＸを行うことが可能となる。
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは標的物質に対して親和性が高い核酸であり、そのことは標的物質の活性部位に結合することを意味しない。従って、ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは必ずしも標的物質の機能に作用するとは限らない。ＮＧＦは塩基性タンパク質であり、核酸が非特異的に結合しやすいと考えられる。活性部位に結合しないアプタマーはその標的物質の活性に影響を及ぼさない。
このようにして選ばれた活性のあるアプタマーに基づき、より高い活性を有するアプタマーを獲得するために取得されたアプタマーの配列を基にしたＳＥＬＥＸを行うことが出来る。具体的な方法とは、ある配列が決まっているアプタマーの一部をランダム配列にしたテンプレートや１０〜３０％程度のランダム配列をドープしたテンプレートを作製して、再度ＳＥＬＥＸを行うものである。
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは８０ヌクレオチド程度の長さがあり、これをそのまま医薬にすることは難しい。そこで、試行錯誤を繰り返し、容易に化学合成ができる約６０ヌクレオチド以下、より好ましくは約５０ヌクレオチド以下、最も好ましくは４５ヌクレオチド以下の長さまで短くする必要がある。ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーはそのプライマー設計に依存して、その後の最小化作業のしやすさが変わる。うまくプライマーを設計しないと、ＳＥＬＥＸによって活性のあるアプタマーが選別できたとしても、その後の開発が不可能となる。
アプタマーは化学合成が可能であるので改変が容易である。アプタマーはＭＦＯＬＤプログラムを用いて二次構造を予測したり、Ｘ線解析やＮＭＲ解析によって立体構造を予測したりすることで、どのヌクレオチドを置換または欠損することが可能か、また、どこに新たなヌクレオチドを挿入可能かある程度予測することができる。予測された新しい配列のアプタマーは容易に化学合成することができ、そのアプタマーが活性を保持しているかどうか既存のアッセイ系により確認することができる。
得られたアプタマーの標的物質との結合に重要な部分が、上記のような試行錯誤を繰り返すことにより特定できた場合、その配列の両端に新しい配列を付加しても、多くの場合活性は変化しない。そしてこのような新しい配列の長さは特に限定されるものではない。
修飾に関しても配列と同様に高度に設計又は改変可能である。
以上のように、アプタマーは高度に設計又は改変可能である。本発明はまた、所定の配列（例、ステム部分、インターナルループ部分、ヘアピンループ部分及び一本鎖部分から選ばれる部分に対応する配列：以下、必要に応じて固定配列と省略する）を含むアプタマーを高度に設計又は改変可能であるアプタマーの製造方法を提供する。
例えば、このようなアプタマーの製造方法は、下記：
〔上記において、（Ｎ）ａはａ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、（Ｎ）ｂは、ｂ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、Ｎはそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴ（好ましくは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる群より選ばれるヌクレオチドである。ａ、ｂはそれぞれ、同一又は異なって、任意の数であり得るが、例えば１〜約１００個、好ましくは１〜約５０個、より好ましくは１〜約３０個、さらにより好ましくは１〜約２０個又は１〜約１０個であり得る。〕で表されるヌクレオチドからなる単一種の核酸分子又は複数種の核酸分子（例、ａ、ｂの数等が異なる核酸分子のライブラリ）、及びプライマー用配列（ｉ）、（ｉｉ）にそれぞれ対応するプライマー対を用いて、固定配列を含むアプタマーを製造することを含む。
本発明のアプタマーとして好ましくは、配列番号８２で表される配列を含み、かつヌクレオチド長が５０以下であることを特徴とする、ＮＧＦに結合するアプタマーである。
配列番号８２で表される配列は本発明のアプタマーがＮＧＦに結合し、ＮＧＦの活性、特に神経突起伸長活性、細胞増殖活性を阻害するなど、本発明のアプタマーとして機能する上で重要な部分であるが、これらの配列の両端に新しい配列を付加しても本発明のアプタマーとしての機能が損なわれることはない。またこれらの配列は、前記した糖残基の修飾・核酸塩基やリン酸基の改変などを受けていてもよい。
すなわち本発明のアプタマーとして、
配列番号８２で表される配列を含み、かつヌクレオチド長が５０以下であることを特徴とする、ＮＧＦに結合するアプタマーであって、
（ｉ）少なくとも１種のヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アシル基またはアミノ基で置き換えられている、アプタマー；
（ｉｉ）ＰＥＧ、アミノ酸、ペプチド、ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ、Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｉｃ−ｏｌｅｙｌ、Ｄｏｃｏｓａｎｙｌ、Ｌａｕｒｏｙｌ、Ｓｔｅａｒｏｙｌ、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、Ｏｌｅｏｙｌ、Ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質またはビオチンが末端に付加されている、アプタマー；
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の要件を満足するアプタマー；
などを、好ましい具体例として挙げることができる。
本発明はまた、本発明のアプタマー及びそれに結合した機能性物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体におけるアプタマーと機能性物質との間の結合は共有結合、又は非共有結合であり得る。本発明の複合体は、本発明のアプタマーと１以上（例、２又は３個）の同種又は異種の機能性物質とが結合したものであり得る。機能性物質は、本発明のアプタマーに何らかの機能を新たに付加するもの、あるいは本発明のアプタマーが保持し得る何らかの特性を変化（例、向上）させ得るものである限り特に限定されない。機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドが挙げられる。機能性物質としてはまた、例えば、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジン）、標識用物質（例、蛍光物質、発光物質、放射性同位体）、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、薬物送達媒体（例、リポソーム、ミクロスフェア、ペプチド、ポリエチレングリコール類）、薬物（例、カリケアマイシンやデュオカルマイシンなどミサイル療法に使用されているもの、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミドまたはトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体、チオテパなどのエチレンイミン類、カルムスチンなどのニトロソ尿素、テモゾロミドまたはダカルバジンなどのアルキル化剤、メトトレキセートまたはラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤、チオグアニン、クラドリビンまたはフルダラビンなどのプリン類似体、フルオロウラシル、テガフールまたはゲムシタビンなどのピリミジン類似体、ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体、エトポシド、タキサン、ドセタキセルまたはパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体、ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質、シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物、ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミド）、毒素（例、リシン毒素、リア毒素及びベロ毒素）が挙げられる。これらの機能性分子は最終的に取り除かれる場合がある。更に、トロンビンやマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＦａｃｔｏｒＸなどの酵素が認識して切断することができるペプチド、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。
本発明のアプタマー及び複合体は、例えば、医薬又は診断薬、検査薬、試薬、飲料水や食品の添加剤、増強剤、緩和剤として使用され得る。
本発明のアプタマー及び複合体は、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害することによって、ＮＧＦの機能を阻害する活性を有し得る。上述のように、ＮＧＦは疼痛や炎症と深く関わっている。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、疼痛や炎症を伴う疾患を治療又は予防するための医薬（抗疼痛剤、抗炎症剤等）として有用である。
ここで疼痛としては侵害受容性疼痛（筋肉痛、背部痛、上肢痛、鞭打ち損傷、関節痛、変形性関節症、痛風、慢性関節リウマチ、頭痛、片頭痛、緊張型頭痛、群発頭痛、二次性頭痛、口腔顔面痛、歯痛、抜歯後カウザルギー、幻歯痛、内臓痛、心臓痛、腹痛、中間痛、月経困難、陣痛、腎臓痛、尿管痛、膀胱痛など）、炎症性疼痛、神経因性疼痛（糖尿病性ニューロパチー、中毒性ニューロパチー、術後痛、幻肢痛、断端部痛、反射性交感神経性ジストロフィー、カウザルギー、帯状疱疹後痛、三叉神経痛、中枢性疼痛）、癌性疼痛（内臓器官への癌浸潤による痛み、癌組織の血管浸潤による血管閉塞で生じる痛み、骨転移の痛み、脳内転移に伴う痛み、癌組織の末梢神経浸潤による痛み）、線維筋痛などが挙げられる。
ここで炎症に伴う疾患としては、特に限定されるものではないが、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、変形性関節症、慢性関節リウマチ、間質性膀胱炎、喘息などが挙げられる。
上記癌としては、特に限定されるものではないが、食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、ニューロブラストーマ、グリオブラストーマ、子宮癌、子宮頚癌、卵巣癌、ウィルムス腫瘍、前立腺癌などが挙げられる。
ＮＧＦはその受容体ＴｒｋＡに結合するとＴｒｋＡのチロシンリン酸化およびＴｒｋＡ下流のＲａｓ−ＭＡＰＫ、ＰＬＣ−γ、ＰＩ３Ｋなどを活性化させ、神経細胞の生存や分化といった生理的作用を発揮する。一方、ｐ７５受容体を介するシグナル経路では細胞死を誘導する。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、これらのシグナル伝達経路の活性化に関係した疾患の医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。これらのシグナル伝達経路の活性化に関係した疾患としては、上記疼痛や炎症性疾患、癌が挙げられる。
本発明のアプタマー及び複合体が医薬、診断薬、検査薬、試薬などとして用いられる場合、それが投与される対象としては特に限定されないが、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）が挙げられる。
本発明のアプタマー及び複合体は、ＮＧＦに特異的に結合し得る。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、ＮＧＦ検出用プローブとして有用である。該プローブは、ＮＧＦのインビボイメージング、血中濃度測定、組織染色、ＥＬＩＳＡ等に有用である。また、該プローブは、ＮＧＦが関与する疾患（疼痛や炎症を伴う疾患等）の診断薬、検査薬、試薬等として有用である。
また、そのＮＧＦへの特異的結合に基づき、本発明のアプタマー及び複合体はＮＧＦの分離精製用リガンドとして使用され得る。
また、本発明のアプタマー及び複合体は、恋愛などの精神的状態を調べるための検査薬や精神状態を調整するための医薬、調整剤、増強剤、緩和剤として使用され得る。
また、本発明のアプタマー及び複合体は、薬物送達剤として使用され得る。
本発明の医薬は、医薬上許容される担体が配合されたものであり得る。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
また、本発明の医薬は必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性などの目的のため、自体公知の方法でコーティングすることができる。コーティングに用いられるコーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ，メタアクリル酸・アクリル酸共重合体）および色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。当該医薬は、速放性製剤、徐放性製剤のいずれであってもよい。徐放の基材としては、例えば、リポソーム、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、ＰＬＧＡなどが挙げられる。
非経口的な投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、腹腔内投与、経鼻投与、経肺投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌の溶媒に溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。また、徐放製剤も好適な製剤として挙げることができる。徐放製剤としては、人工骨や生体分解性もしくは非分解性スポンジ、バッグ、薬剤ポンプ、浸透圧ポンプなど、体内に埋め込まれた担体もしくは容器からの徐放形態、あるいは体外から継続的もしくは断続的に体内もしくは局所に送達されるデバイス等が挙げられる。生体分解性の基材としては、リポソーム、カチオニックリポソーム、Ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ）ａｃｉｄ（ＰＬＧＡ）、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、多糖シゾフィランなどが挙げられる。更に注射液剤や徐放製剤以外にも、吸入剤、軟膏剤も可能である。吸入剤の場合、凍結乾燥状態の有効成分を微細化し適当な吸入デバイスを用いて吸入投与する。吸入剤には、更に必要に応じて従来使用されている界面活性剤、油、調味料、シクロデキストリンまたはその誘導体等を適宜配合することができる。
ここで界面活性剤としては、例えばオレイン酸、レシチン、ジエチレングリコールジオレエート、テトラヒドロフルフリルオレエート、エチルオレエート、イソプロピルミリステート、グリセリルトリオレエート、グリセリルモノラウレート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノリシノエート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール４００、セチルピリジニウムクロリド、ソルビタントリオレエート（商品名スパン８５）、ソルビタンモノオレエート（商品名スパン８０）、ソルビタンモノラウレート（商品名スパン２０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（商品名ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名ツイーン２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（商品名ツイーン８０）、天然資源由来のレシチン（商品名エピクロン）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ９２）、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ７２）、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル（商品名ブリジ３０）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ゲナポル０−０２０）、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体（商品名シンペロニック）等が挙げられる。油としては、例えばトウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油等が挙げられる。また、軟膏剤の場合、適当な医薬上許容される基剤（黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコーン、白色軟膏、ミツロウ、豚油、植物油、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、加水ラノリン、吸水軟膏、親水プラスチベース、マクロゴール軟膏等）を用い、有効成分と混合し製剤化し使用する。
吸入剤は常法に従って製造することができる。すなわち、上記本発明のアプタマー及び複合体を粉末または液状にして、吸入噴射剤および／または担体中に配合し、適当な吸入容器に充填することにより製造することができる。また上記本発明のアプタマー及び複合体が粉末の場合は通常の機械的粉末吸入器を、液状の場合はネブライザー等の吸入器をそれぞれ使用することもできる。ここで噴射剤としては従来公知のものを広く使用でき、フロン−１１、フロン−１２、フロン−２１、フロン−２２、フロン−１１３、フロン−１１４、フロン−１２３、フロン−１４２ｃ、フロン−１３４ａ、フロン−２２７、フロン−Ｃ３１８、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等のフロン系化合物、プロパン、イソブタン、ｎ−ブタン等の炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、窒素ガス、炭酸ガス等の圧縮ガス等を例示できる。
本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５〜約１ｍｇ／ｋｇであり得る。
本発明はまた、本発明のアプタマー及び複合体が固定化された固相担体を提供する。固相担体としては、例えば、基板、樹脂、プレート（例、マルチウェルプレート）、フィルター、カートリッジ、カラム、多孔質材が挙げられる。基板は、ＤＮＡチップやプロテインチップなどに使われているものなどであり得、例えば、ニッケル−ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）基板やガラス基板、アパタイト基板、シリコーン基板、アルミナ基板などで、これらの基板にポリマーなどのコーティングを施したものが挙げられる。樹脂としては、例えば、アガロース粒子、シリカ粒子、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの共重合体、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼン粒子、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した粒子、セルロースファイバー、アリルデキストランとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマー、単分散系合成ポリマー、単分散系親水性ポリマー、セファロース、トヨパールなどが挙げられ、また、これらの樹脂に各種官能基を結合させた樹脂も含まれる。本発明の固相担体は、例えば、ＮＧＦの精製、及びＮＧＦの検出、定量に有用であり得る。
本発明のアプタマー及び複合体は、自体公知の方法により固相担体に固定できる。例えば、親和性物質（例、上述したもの）や所定の官能基を本発明のアプタマー及び複合体に導入し、次いで当該親和性物質や所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法が挙げられる。本発明はまた、このような方法を提供する。所定の官能基は、カップリング反応に供することが可能な官能基であり得、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基が挙げられる。本発明はまた、このような官能基が導入されたアプタマーを提供する。
本発明はまた、ＮＧＦの精製及び濃縮方法を提供する。特に本発明はＮＧＦを他のファミリータンパク質から分離することが可能である。本発明の精製及び濃縮方法は、本発明の固相担体にＮＧＦを吸着させ、吸着したＮＧＦを溶出液により溶出させることを含み得る。本発明の固相担体へのＮＧＦの吸着は自体公知の方法により行うことができる。例えば、ＮＧＦを含有する試料（例、細菌又は細胞の培養物又は培養上清、血液）を、本発明の固相担体又はその含有物に導入する。ＮＧＦの溶出は、中性溶液等の溶出液を用いて行うことができる。中性溶出液は特に限定されるものではないが、例えばｐＨ約６〜約９、好ましくはｐＨ約６．５〜約８．５、より好ましくはｐＨ約７〜約８であり得る。中性溶液はまた、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、カリウム塩（例、ＫＣｌ）、マグネシウム塩（例、ＭｇＣｌ２）、界面活性剤（例、ツイーン２０、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ４０）、グリセリンを含むものであり得る。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、ＮＧＦの吸着後、洗浄液を用いて固相担体を洗浄することを含み得る。洗浄液としては、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、Ｔｒｉｓ、酸、アルカリ、Ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ、ＤＮＡ、ツイーン２０などの表面活性剤、ＮａＣｌなどの塩を含むものなどが挙げられる。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、固相担体を加熱処理することを含み得る。かかる工程により、固相担体の再生、滅菌が可能である。
本発明はまた、ＮＧＦの検出及び定量方法を提供する。特に本発明はＮＧＦを他のファミリータンパク質と区別して検出及び定量することができる。本発明の検出及び定量方法は、本発明のアプタマーを利用して（例、本発明の複合体及び固相担体の使用により）ＮＧＦを測定することを含み得る。ＮＧＦの検出及び定量方法は、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により行われ得る。従って、抗体の代わりに本発明のアプタマーをプローブとして用いることにより、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法等の方法と同様の方法により、検出及び定量を行うことができる。また、ＰＥＴ等の分子プローブとしても、使用することができる。このような方法は、例えば、生体又は生物学的サンプルにおけるＮＧＦ量の測定、ＮＧＦが関連する疾患の診断に有用であり得る。
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
実施例１：ＮＧＦアプタマーの作製１
ＮＧＦに特異的に結合するＲＮＡアプタマーはＳＥＬＥＸ法を用いて作製した。ＳＥＬＥＸはＥｌｌｉｎｇｔｏｎらの方法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ ３４６，８１８−８２２，１９９０）及びＴｕｅｒｋらの方法（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，５０５−５１０，１９９０）を参考にして行った。標的物質としてヒトＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。
最初のラウンドで用いたＲＮＡ（４０Ｎ）は、化学合成によって得られたＤＮＡをＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて転写して得た。キットに含まれるＮＴＰのうち、２’−ＯＨ ＡＴＰは２’−デオキシアデノシン ５’−三リン酸（２’−Ｈ ＡＴＰまたはｄＡＴＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に入れ替えて、ほかの基質はキットにあるものを使用した。この方法によって得られたＲＮＡはピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフルオロ化されたもので、プリンヌクレオチドであるＧはＲＮＡタイプ、ＡはＤＮＡタイプである。ＤＮＡ鋳型として以下に示す４０ヌクレオチドのランダム配列の両端にプライマー配列を持った長さ８３ヌクレオチドのＤＮＡを用いた。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成によって作製した。
ＤＮＡ鋳型１：
５’−ｇａｇｇａｔｃｃａｔｇｔａｔｇｃｇｃａｃａｔａ−４０ｎ−ｃｔｔｃｔｇｇｔｃｇａａｇｔｔｃｔｃｃｃ−３’（配列番号１１８）
プライマーＦｗｄ１：
５’−ｃｇｇａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａａｃｔｔｃｇａｃｃａｇａａｇ−３’（配列番号１１９）
プライマーＲｅｖ１：
５’−ｇａｇｇａｔｃｃａｔｇｔａｔｇｃｇｃａｃａｔａ−３’（配列番号１２０）
上記配列において、ｎはａ，ｇ，ｃ又はｔのいずれか一つを示す。プライマーＦｗｄ１はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたＲＮＡプールのバリエーションは理論上１０１４であった。
ＳＥＬＥＸを１０ラウンド行った後、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングし、大腸菌株ＤＨ５α（Ｔｏｙｏｂｏ社製）にトランスフォーメーションした。シングルコロニーからプラスミドを抽出後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１００、ＡＢＩ社製）で塩基配列を決定した。４８クローンを調べたところ、４５配列を決定することができた。そのうち２配列ずつ同じものが７種類、残り３１配列はシングル配列であった。ＳＥＬＥＸをさらに３ラウンド追加して再度配列を調べたところ、更なる収束が見られた。
１０と１３ラウンドで収束が見られた配列および幾つかのシングル配列のＮＧＦに対する結合活性を表面プラズモン共鳴法により評価した。
測定装置はＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００を使用し、センサーチップとしてアミノ基と反応するＣＭ５を用いた。ヒトＮＧＦは固定化溶液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６）に溶解し２５〜４０μｇ／ｍｌとした。タンパク質側のアミノ基とチップ側のカルボキシル基の反応にはＥｔｈｙｌ−３−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅとＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅを用いた。反応後、ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−ＨＣｌによるブロッキングを行った。ＮＧＦの固定化量は３０００〜４０００ＲＵとした。アナライト用のアプタマーは０．１５μＭ〜０．５μＭに調製した。ランニングバッファーには溶液Ａを用いた。ここで溶液Ａとは１４５ｍＭ塩化ナトリウム、５．４ｍＭ塩化カリウム、１．８ｍＭ塩化カルシウム、０．８ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．６）、０．０５％ ツイーン２０の混合溶液である。再生用液として１Ｍ ＮａＣｌと５０ｍＭ ＮａＯＨの混合溶液を用いた。ＮＧＦはＦＣ２に固定化し、ＦＣ１の結果を引くことで最終的なセンサーグラムとした。
３４配列の結合活性を測定したところ、全てのＲＮＡがコントロールの４０Ｎよりも有意にＮＧＦに結合することがわかった。ここで４０Ｎとは４０ヌクレオチドのランダム配列を含む、１ラウンド目に使用したＲＮＡプールのことである。以上より、これらのＲＮＡはＮＧＦに結合するアプタマーであることが示された。
実施例２：ＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合を阻害するアプタマー
実施例１で得られたアプタマーがＮＧＦとＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡとｐ７５）の結合を阻害するかどうか、表面プラズモン共鳴法を用いて調べた。
ＢＩＡｃｏｒｅ社のプロトコールに従って、ＣＭ５センサーチップにＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（２１１８１，ＰＩＥＲＣＥ）を固定化した。そこに、ＩｇＧのＦｃ部分が融合したヒトＴｒｋＡ−Ｆｃ（１７５−ＴＫ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）あるいはヒトＰ７５（３６７−ＮＲ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を約７００〜１２００ＲＵ固定化した。アナライトとしてＮＧＦ（０．１μＭ）とアプタマー（０．３μＭ）を混合して３０分保持したものをインジェクションした。もしアプタマーがＮＧＦとＴｒｋＡあるいはｐ７５の結合を阻害する場合はセンサーグラムのシグナルは上がらないが、もし阻害しない場合は三者複合体を形成しシグナルが上がることが予想される。また、ＮＧＦがアプタマーよりも受容体に強く結合する場合は、アプタマーがはずれて、ＮＧＦが受容体と結合する場合もある。阻害実験を開始する前にＴｒｋＡあるいはｐ７５にＮＧＦが結合することを確認した。
３４配列の阻害活性を測定したところ、全てのアプタマーがＮＧＦとＴｒｋＡあるいはｐ７５の結合を阻害することがわかった。特に配列番号１、２、３、４、５、７で表わされるアプタマーは強い阻害活性を示した。以上より、これらのＲＮＡはＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合を阻害するアプタマーであることが示された。
実施例３：アプタマーの神経突起伸長阻害活性
ＰＣ１２細胞のサブクローンであるＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ−１細胞を用いて、実施例１で得たアプタマーの神経突起伸長阻害活性を評価した。
コラーゲンタイプＩＶでコートした９６ウェル平底プレートに１ウェルあたり２５００個の細胞を２．５％ウマ血清と１．２５％胎児ウシ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で１日培養した。そこに室温もしくは３７℃にて３０分間から１時間無血清のＲＰＭＩ−１６４０培地中で予め反応させたヒトＮＧＦ（最終濃度０．３８ｎＭあるいは１．１４ｎＭ）とアプタマー（最終濃度５００〜０．０１ｎＭ）の混合溶液を添加した。２日後にＣｅｌｌｏｍｉｃｓ Ｎｅｕｒｉｔｅ Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用して細胞質と核を染色し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によって１細胞あたりの神経突起長を測定した。ＮＧＦのみの添加の際に得られた１細胞あたりの神経突起長を阻害活性０％、ＮＧＦ無添加で２日間培養して得られた１細胞あたりの神経突起長を阻害活性１００％として、ＮＧＦとアプタマーを混合添加した場合に得られた１細胞あたりの神経突起長から、アプタマーの阻害活性を求めた。
実施例１で得られた３４種類のアプタマーの阻害活性を調べたところ、配列番号１〜８で表されるアプタマーが１０ｎＭ添加することで神経突起伸長を強く阻害することがわかった。他のアプタマーは１０ｎＭで顕著な阻害を示さなかった。
以下にそれぞれの配列番号に対応する実際に得られたヌクレオチド配列を示す。大文字はＲＮＡ、小文字はＤＮＡ、ヌクレオチドにおける括弧はその２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子を示す（以下同様）。
配列番号１：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GaC(F)GaC(F)C(F)aaC(F)U(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)U(F)U(F)aU(F)GGaU(F)U(F)U(F)aC(F)GU(F)GaaC(F)C(F)C(F)GU(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号２：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)C(F)C(F)aaaC(F)GGGaC(F)U(F)U(F)U(F)aU(F)aC(F)C(F)U(F)C(F)U(F)GaGU(F)C(F)GC(F)C(F)U(F)aC(F)GC(F)U(F)C(F)C(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号３：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号４：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)aC(F)GU(F)U(F)aGU(F)aC(F)GU(F)U(F)U(F)GC(F)aU(F)aU(F)GU(F)aC(F)aaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)aU(F)aC(F)GaU(F)aC(F)GU(F)aGaU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号５：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)aGaaGaGGaC(F)U(F)aGU(F)U(F)GC(F)U(F)aaU(F)GC(F)C(F)C(F)U(F)GGU(F)U(F)C(F)GU(F)C(F)GC(F)U(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号６：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)GC(F)aaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号７：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGaC(F)GC(F)aC(F)C(F)U(F)C(F)U(F)U(F)aU(F)C(F)aC(F)aC(F)aU(F)GC(F)GU(F)C(F)aGC(F)C(F)U(F)U(F)GU(F)GaU(F)aC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号８：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGaU(F)C(F)C(F)aC(F)U(F)GGU(F)aC(F)U(F)aC(F)GU(F)GaC(F)C(F)C(F)C(F)GC(F)aU(F)aGGC(F)aaU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
実施例４：アプタマーの短鎖化
配列番号３および６で表わされるアプタマーの短鎖化を行った。ＭＦＯＬＤプログラム（Ｚｕｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１，３４０６−３４１５，２００３）を用いてＲＮＡの２次構造を予測し、その構造を参考にしながら短鎖化した。短鎖化体は、目的の配列のＤＮＡを化学合成により作製し、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて転写することで得られた。転写産物はＤＮａｓｅ処理の後、フェノール・クロロホルム処理によりタンパク質を除去し、エタノール沈殿により回収した。回収されたＲＮＡの純度はポリアクリルアミド電気泳動法で、量は吸光度測定法で確認した。実際に作製した短鎖化体の配列は以下の通りである。
配列番号９：配列番号３で表わされるアプタマーの改変体で７３ヌクレオチドの長さのＲＮＡ
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)
配列番号１０：配列番号３で表わされるアプタマーの改変体で６８ヌクレオチドの長さのＲＮＡ
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)G
配列番号１１：配列番号３で表わされるアプタマーの改変体で４６ヌクレオチドの長さのＲＮＡ
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
配列番号１２：配列番号３で表わされるアプタマーの改変体で４０ヌクレオチドの長さのＲＮＡ
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号１３：配列番号３で表わされるアプタマーの改変体で４２ヌクレオチドの長さのＲＮＡ
GGGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
配列番号１２１：配列番号１１で表わされるアプタマーの改変体でステム２から１塩基対を取り除いたＲＮＡ
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
配列番号１２２：配列番号１１で表わされるアプタマーの改変体でステム２から１塩基対を取り除いたＲＮＡ
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
配列番号１２３：配列番号１１で表わされるアプタマーの改変体でステム２から１塩基対を取り除いたＲＮＡ
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
配列番号１２４：配列番号１１で表わされるアプタマーの改変体でステム２から１塩基対を取り除いたＲＮＡ
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GGU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
配列番号１２５：配列番号１１で表わされるアプタマーの改変体でステム２から１塩基対を取り除いたＲＮＡ
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)U(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
配列番号１２６：配列番号１１で表わされるアプタマーの改変体でステム２から１塩基対を取り除いたＲＮＡ
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)GU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
配列番号１２７：配列番号１３で表わされるアプタマーの改変体で、ステム２から１塩基対を取り除いたＲＮＡ
GGGGU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGU(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
配列番号１２８：配列番号１３で表わされるアプタマーの改変体で、ステム２から１塩基対を取り除いたＲＮＡ
GGGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
配列番号１２９：配列番号１３で表わされるアプタマーの改変体で、ステム１から１塩基対を取り除いたＲＮＡ
GGGGC(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)C(F)C(F)C(F)C(F)
配列番号１３０：配列番号１１で表わされるアプタマーの改変体で、ループ２からＵを一つ取り除いたＲＮＡ
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
配列番号１３１：配列番号１１で表わされるアプタマーの改変体で、ループ２からＣを二つ取り除いたＲＮＡ
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
配列番号１３２：配列番号１１で表わされるアプタマーの改変体で、ループ２からＧを一つ取り除いたＲＮＡ
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
配列番号１３３：配列番号１３で表わされるアプタマーの改変体で、ループ２からＵを一つ取り除いたＲＮＡ
GGGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GC(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
配列番号１３４：配列番号１１で表わされるアプタマーの改変体で、インターナルループ１からＵを一つ取り除いたＲＮＡ
GGGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)aU(F)GU(F)GC(F)
配列番号１３５：配列番号１３で表わされるアプタマーの改変体で、インターナルループ１からＣを一つ取り除いたＲＮＡ
GGGGU(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
配列番号１３６：配列番号１３で表わされるアプタマーの改変体で、インターナルループ１からＵを一つ取り除いたＲＮＡ
GGGGU(F)C(F)C(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
配列番号１３７：配列番号１３で表わされるアプタマーの改変体で、インターナルループ１からＣとＵを一つずつ取り除いたＲＮＡ
GGGGU(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
配列番号１３８：配列番号１３で表わされるアプタマーの改変体で、インターナルループ１からＣとＧを一つずつ取り除いたＲＮＡ
GGGGU(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)U(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
配列番号１３９：配列番号１３で表わされるアプタマーの改変体で、インターナルループ１からＵを２つ取り除いたＲＮＡ
GGGGU(F)C(F)C(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
配列番号１４０：配列番号１３で表わされるアプタマーの改変体で、インターナルループ１からＵとＧを一つずつ取り除いたＲＮＡ
GGGGU(F)C(F)C(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)U(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
配列番号１４１：配列番号１３で表わされるアプタマーの改変体で、インターナルループ１からＵを２つ取り除いたＲＮＡ
GGGGU(F)C(F)C(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)aC(F)C(F)C(F)C(F)
配列番号１４：配列番号６で表わされるアプタマーの改変体で７８ヌクレオチドの長さのアプタマー
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)GC(F)aaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGa
配列番号１５：配列番号６で表わされるアプタマーの改変体で７３ヌクレオチドの長さのアプタマー
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)GC(F)aaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)
配列番号１６：配列番号６で表わされるアプタマーの改変体で６３ヌクレオチドの長さのアプタマー
C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)GC(F)aaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)
配列番号１７：配列番号６で表わされるアプタマーの改変体で５８ヌクレオチドの長さのアプタマー
aGaaGU(F)GC(F)aaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)
配列番号１８：配列番号６で表わされるアプタマーの改変体で４８ヌクレオチドの長さのアプタマー
U(F)GC(F)aaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)G
配列番号１９：配列番号６で表わされるアプタマーの改変体で４６ヌクレオチドの長さのアプタマー
GC(F)aaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)
配列番号２０：配列番号６で表わされるアプタマーの改変体で５０ヌクレオチドの長さのアプタマー
GU(F)GC(F)aaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)
配列番号２１：配列番号６で表わされるアプタマーの改変体で４８ヌクレオチドの長さのアプタマー
GGGaaU(F)aC(F)U(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)aU(F)aU(F)GU(F)GC(F)aaaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)C(F)aC(F)GaC(F)U(F)aU(F)GU(F)C(F)C(F)C(F)
これらのアプタマーのＮＧＦに対する結合活性を実施例１と同様に表面プラズモン共鳴法を用いて評価した。その結果、配列番号９〜２１で表わされるＲＮＡはコントロールの４０Ｎよりも有意にＮＧＦに結合することがわかった。一方、配列番号１２１〜１４１で表わされるＲＮＡは、配列番号１１または１３で表わされるアプタマーと比べて結合量が大きく低下した。
実施例２と同様に表面プラズモン共鳴法によりＮＧＦとその受容体（ＴｒｋＡおよびｐ７５）の結合阻害を評価したところ、配列番号９〜１６で表わされるアプタマーが高い阻害活性を有していることがわかった。
実施例３と同様な方法で神経突起伸長阻害活性を調べたところ、配列番号９〜２１で表わされるアプタマーは１０ｎＭの濃度で高い阻害活性を示すことがわかった。一方、配列番号１２７、１２８、１３１、１３３、１３５、１４１で表わされるアプタマーは１０ｎＭで顕著な阻害活性を示さなかった。
実施例５：配列番号３で表わされるアプタマーおよびその短鎖化体の二次構造予測
配列番号３、９〜１３および配列番号１２１〜１４１で表わされるＲＮＡの二次構造をＭＦＯＬＤプログラムを用いて予測した。活性を有しているアプタマーは全て配列番号１２で表わされるアプタマーの二次構造を含んでいた（図１）。この二次構造は５’末端から、ステム１、インターナルループ１、ステム２、ループ２の４つの構造で特徴付けられた（図２）。ステム１は４塩基対、インターナルループ１は３ヌクレオチドと４ヌクレオチド、ステム２は９塩基対、ループ２は７ヌクレオチドから構成されている。
配列番号１２１〜１２８で表わされるＲＮＡはステム２から１塩基対を除いたものであるが、その全ての活性が大きく低下した。よって、ステム２は９塩基対必要であることが示唆された。
配列番号１２および１３で表わされるアプタマーは配列番号１１で表わされるアプタマーの改変体であり、ステム１をＧ−Ｃペアーに置き換えたものである。配列番号１２および１３で表わされるアプタマーは配列番号１１と同等の神経突起伸長阻害活性を示した。よって、ステム１はステム構造である限りどのようなベースペアーであっても活性に大きく影響しないことが示唆された。一方、配列番号１２９で表わされるＲＮＡは配列番号１３で表わされるアプタマーのステム１からＵ−ａ塩基対を除いたものであるが、活性が大きく低下した。よって、ステム１の４番目の塩基対はＵ−ａである必要があることがわかった。
配列番号１３０〜１３３で表わされるＲＮＡはループ２から１ヌクレオチド取り除いたＲＮＡであるが、その全ての活性が大きく低下した。従って、ループ２は７ヌクレオチドで構成される必要があることが示唆された。
配列番号１３４〜１４１で表わされるＲＮＡはインターナルループ１のヌクレオチドを１つまたは２つ取り除いたＲＮＡであるが、その全ての活性が大きく低下した。従って、インターナルループ１は全部で７ヌクレオチドで構成される必要があることが示唆された。
以下、図２で規定される構造をコンセンサス二次構造１と呼ぶ。
実施例６：ＮＧＦアプタマーの作製２
実施例１と異なるプライマーを用いてＳＥＬＥＸを行い、コンセンサス二次構造１を有するアプタマーが取得できるかどうか検討した。以下に使用したＤＮＡ鋳型とプライマー配列を示す。
ＤＮＡ鋳型２：
５’−ｃｃａｇｔｔｇｔｔｇｇｔｇａｃａａｔｇｃｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｇｃａｇｃｔｃｃａｃａｇｇｃｔｔｃｃｃ（配列番号１４２）
プライマーＦｗｄ２：
５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａａｇｃｃｔｇｔｇｇａｇｃｔｇｃ（配列番号１４３）
プライマーＲｅｖ２：
５’−ｇｃａｔｔｇｔｃａｃｃａａｃａａｃｔｇｇ（配列番号１４４）
上記配列において、ｎはａ，ｇ，ｃ又はｔのいずれか一つを示す。プライマーＦｗｄ２はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたＲＮＡプールのバリエーションは理論上１０１４であった。
ＳＥＬＥＸは実施例１と同様に行った。ＳＥＬＥＸを１０ラウンド行った後、４８クローンを調べたところ、４６配列を決定することができた。そのうち、５クローン同じものが１配列、３クローン同じものが４配列、２クローン同じものが３配列、計８配列が収束した。残り２３配列はシングル配列であった。
収束が見られた８配列を選び、ＮＧＦに対する結合活性を表面プラズモン共鳴法により評価した。測定方法は実施例１と同様であった。その結果、全ての配列がＮＧＦに僅かしか結合しなかった。
シングル配列も含めて全ての配列の二次構造をＭＦＯＬＤプログラムを用いて予測したところ、コンセンサス二次構造１を含む配列は存在しなかった。
実施例７：ＮＧＦアプタマーの作製３
配列番号１２で表わされる配列に１５％のランダム配列をドープし、その両端に実施例１と同様なプライマー配列を付加したＲＮＡプールを用いてＳＥＬＥＸを行った。ＳＥＬＥＸは実施例１とほぼ同様に行った。その鋳型の配列を以下に示す。
鋳型３：
５’−ｇａｇｇａｔｃｃａｔｇｔａｔｇｃｇｃａｃａｔａ−ａｃａｇｃｃａｃｇｇａｇａｃｇｇａａａｃｔａｃｇｃａｇｃａｇｇａｔｇｔｇｃｃａａ−ｃｔｔｃｔｇｇｔｃｇａａｇｔｔｃｔｃｃｃ−３’（配列番号１４５）
そのうち、下線で示した塩基配列は以下の通りである。
ａ：ａ（８５％），ｇ（５％），ｃ（５％），ｔ（５％）
ｇ：ａ（５％），ｇ（８５％），ｃ（５％），ｔ（５％）
ｃ：ａ（５％），ｇ（５％），ｃ（８５％），ｔ（５％）
ｔ：ａ（５％），ｇ（５％），ｃ（５％），ｔ（８５％）
４ラウンド終了後に４８クローンの配列を確認したところ、約半分は配列番号１２を含んだ配列で、残りは数箇所に変異が入った配列であった。配列番号１２と同じ配列を除去するため、配列番号１２のアンチセンスオリゴをＲＮＡプールに加えて、さらに３ラウンドＳＥＬＥＸを追加した。アンチセンスオリゴの配列は以下の通りである。
５’−ａｇａｃｇｇａａａｃｔａｃｇｃａｇｃａｇｇａ−３’−（配列番号１４６）
アンチセンスオリゴはＲＮＡプールに対して１０倍量加えた。得られたＲＮＡの配列を確認したところ、約半分は配列番号１２で表わされる配列に数箇所変異が入った配列で、残りは配列番号１２で表わされる配列と全く異なる配列であった。
４および７ラウンドから配列番号２２〜３７で表わされる計１６配列を選び、ＮＧＦに対する結合活性およびＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合阻害活性を調べた。測定は実施例１および２に示した通りで表面プラズモン共鳴法を用いた。測定の結果、すべての配列がコントロールの４０Ｎよりも有意にＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合を阻害することがわかった。また、神経突起伸長阻害活性を実施例３と同様な方法で測定した。その結果、全ての配列が１０ｎＭの濃度で高い阻害活性を示した。以下にそれぞれの配列番号に対応する実際に得られたヌクレオチド配列を示す。
配列番号２２：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号２３：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号２４：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GaaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号２５：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GC(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号２６：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号２７：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GC(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号２８：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)aU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号２９：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)C(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GaaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号３０：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GaaGGU(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)aC(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号３１：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GC(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)C(F)U(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号３２：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号３３：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)C(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)aaU(F)C(F)U(F)U(F)GGU(F)GGC(F)GU(F)GU(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号３４：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)C(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号３５：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号３６：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGGU(F)aC(F)GU(F)U(F)aGU(F)aC(F)GU(F)U(F)U(F)GC(F)aU(F)aU(F)GU(F)aC(F)aaC(F)C(F)U(F)U(F)GC(F)aU(F)aC(F)GaU(F)aC(F)GU(F)aGGU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号３７：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)aC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号２２〜３７で表わされるアプタマーの二次構造をＭＦＯＬＤプログラムを用いて予測した。その結果、配列番号３０、３３、３６で表わされるアプタマー以外のアプタマーは全てコンセンサス二次構造１を含んでいることがわかった。それらのインターナルループ１の配列は全て５’側がＣＣＵで３’側がＵＧＵＵであった（図２）。また、ループ２は５’−ＵＵＵＣＣＸＵ−３’で表わされるコンセンサス配列を含んでいた。ここでＸはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕのいずれかである。ステム１の最後の塩基対は全てＵ−ａであった。ステム２の１、５、６、８、９番目の塩基対はそれぞれＧ−Ｃ、Ｃ−Ｇ、Ｇ−Ｃ、ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃであった。２〜４および７番目はいくつかの異なる塩基対が存在した。
実施例８：アプタマーの細胞増殖阻害活性（ＴＦ−１アッセイ）
ＴＦ−１細胞を用いた増殖阻害評価系により配列番号２２〜３７で表わされるアプタマーの阻害活性を評価した。
ヒト赤白血病細胞株であるＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ−２００３）にレトロウイルスベクターを用いて二つのＮＧＦ受容体（ヒトＴｒｋＡおよびヒトｐ７５）遺伝子を導入し、二つの受容体を同時に安定的に高発現する細胞を作製した。この細胞を２０％の胎児ウシ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、白色の９６ウェル平底プレートに１ウェルあたり１０００個（５０μＬ）の細胞を播種した。そこに室温にて３０分間無血清のＲＰＭＩ−１６４０培地中で予め反応させたヒトＮＧＦ（最終濃度０．０７６ｎＭ）とアプタマー（最終濃度３０〜０．０１ｎＭ）の混合溶液５０μＬを添加し、３日後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに１００μＬ添加後、マイクロプレートリーダーにより化学発光を測定し、ＮＧＦ刺激によるＴＦ−１細胞の増殖を評価した。ＮＧＦのみの添加で細胞を３日間培養して得られた１ウェルあたりの発光量を阻害活性０％、ＮＧＦ無添加で３日間培養して得られた１ウェルあたりの発光量を阻害活性１００％として、ＮＧＦとアプタマーを混合添加した場合に得られた１ウェルあたりの発光量から、アプタマーの阻害活性を求めた。その結果、これら全てのアプタマーが１０ｎＭの濃度で高い阻害活性を有していることがわかった。
ＷＯ２０１０／０３５７２５Ａ１に記載された配列番号６２と６８で表わされるアプタマーの阻害活性を比較のために調べた。その結果、それぞれのＩＣ５０は６．１および７．５ｎＭであった。
実施例９：アプタマーの短鎖化２
高い阻害活性を示した配列番号２３、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３２、３４および３５で表わされるアプタマーの短鎖化を、コンセンサス二次構造１を参考にしておこなった。ＮＧＦに対する結合活性を実施例１と同様に表面プラズモン共鳴法を用いて測定したところ、全ての短鎖化体がＮＧＦに強く結合した。また、神経突起伸長阻害活性とＴＦ−１細胞増殖阻害活性を実施例３および８と同様な方法で測定したところ、１０ｎＭの濃度で強い阻害活性を示した。以下にそれらの実際に得られたヌクレオチド配列を示す。
配列番号３８：（配列番号２６の短鎖化体）
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号３９：（配列番号２７の短鎖化体）
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GC(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号４０：（配列番号２８の短鎖化体）
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)aU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号４１：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GaaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号４２：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GC(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)C(F)U(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号４３：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号４４：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)C(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号４５：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号４６：（配列番号２３の短鎖化体）
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GC(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号４７：（配列番号２５の短鎖化体）
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
これらのアプタマーの二次構造をＭＦＯＬＤプログラムを用いて予測したところ、その全てがコンセンサス二次構造１で示される構造であった。
実施例１０：ＮＧＦアプタマーの作製４
配列番号１２で表わされる配列に２１％のランダム配列をドープし、その両端に実施例１と同様なプライマー配列を付加したＲＮＡプールを用いてＳＥＬＥＸを行った。ＳＥＬＥＸは実施例１と同様に行った。その鋳型の配列を以下に示す。
鋳型３：
５’−ｇａｇｇａｔｃｃａｔｇｔａｔｇｃｇｃａｃａｔａ−ａｃａｇｃｃａｃｇｇａｇａｃｇｇａａａｃｔａｃｇｃａｇｃａｇｇａｔｇｔｇｃｃａａ−ｃｔｔｃｔｇｇｔｃｇａａｇｔｔｃｔｃｃｃ−３’（配列番号１４５）
そのうち、下線で示した塩基配列は以下のとおりである。
ａ：ａ（７９％），ｇ（７％），ｃ（７％），ｔ（７％）
ｇ：ａ（７％），ｇ（７９％），ｃ（７％），ｔ（７％）
ｃ：ａ（７％），ｇ（７％），ｃ（７９％），ｔ（７％）
ｔ：ａ（７％），ｇ（７％），ｃ（７％），ｔ（７９％）
４ラウンド終了後に４８クローンの配列を確認したところ収束は見られなかった。そこでさらに３ラウンドを追加した。５、６、７ラウンドそれぞれ４８クローンの配列を確認したところ、ラウンドが進むにつれて配列に収束が見られた。７ラウンド目ではほとんどの配列が収束していた。
５、６、７ラウンドから、計１４配列を選び、表面プラズモン共鳴法でＮＧＦに対する結合活性を調べた。測定方法は実施例１に示した通りである。測定の結果、すべての配列がコントロールの４０Ｎよりも有意にＮＧＦに結合した。以下にそれらの実際に得られたヌクレオチド配列を示す。
配列番号４８：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GGU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号４９：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)U(F)GC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号５０：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGC(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GaC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号５１：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aC(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)aC(F)GGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GGU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号５２：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)aU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)U(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号５３：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)U(F)GC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GC(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号５４：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GaU(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号５５：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号５６：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GU(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)aU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号５７：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)aGGC(F)aC(F)GU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)aU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GU(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号５８：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GaC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号５９：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)U(F)GC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号６０：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)GGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)aGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GGU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号６１：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)U(F)aGC(F)aC(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
これらのアプタマーの二次構造をＭＦＯＬＤプログラムを用いて予測したところ、その全てにコンセンサス二次構造１で示される構造が見られた。それらのインターナルループ１の配列は全て５’側がＣＣＵで３’側がＵＧＵＵであった。また、ループ２は５’−ＵＵＵＣＣＸＵ−３’で表わされるコンセンサス配列を含んでいた。ここでＸはＧまたはＵのいずれかである。ステム２は１、３、８、９番目の塩基対がそれぞれＧ−Ｃ、Ｕ−Ｇ、ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃであった。２および４〜７番目はいくつかの異なる塩基対が存在した。
これらのアプタマーに対して実施例４と同様に短鎖化を行った。その結果、すべてのアプタマーで結合活性を保持したままコンセンサス二次構造１と同様な構造まで短鎖化することができた。
実施例３および８と同様に、神経突起伸長阻害活性とＴＦ−1細胞増殖阻害活性を評価した。その結果、これらのアプタマーは全て１０ｎＭの濃度で高い阻害活性を示した。以下にそれらの実際に得られたヌクレオチド配列を示す。
配列番号６２：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GGU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号６３：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号６４：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号６５：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)aC(F)GGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GGU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号６６：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)aU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)U(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号６７：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GC(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号６８：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaU(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号６９：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号７０：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GU(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)aU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号７１：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)aU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GU(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号７２：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号７３：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号７４：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)aGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GGU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号７５：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
実施例１１：ＮＧＦアプタマーの作製５
コンセンサス二次構造１のステム２をランダム配列にした以下のような鋳型を用いて、実施例１と同様なＳＥＬＥＸを行った。
鋳型４：
５’−ｇａｇｇａｔｃｃａｔｇｔａｔｇｃｇｃａｃａｔａａｃａｇｎｎｎｎｎｎｎｇａｃｇｇａａａｃｎｎｎｎｎｎｎｃａｇｇａｔｇｔｇｃｃａａｃｔｔｃｔｇｇｔｃｇａａｇｔｔｃｔｃｃｃ−３’（配列番号１４７）
７ラウンド終了後に４８クローンの配列を確認したところ、配列の収束が見られなかった。そこで、さらに３ラウンドを追加した。１０ラウンド終了後４８クローンの配列を確認したところ、約半数の配列に収束がみられ、残り半数はシングル配列であった。その内、１７配列を選び、表面プラズモン共鳴法でＮＧＦに対する結合活性を調べた。測定方法は実施例１に示した通りである。測定の結果、すべての配列がコントロールである４０Ｎよりも有意にＮＧＦに結合することがわかった。
上記のアプタマーに対して実施例４と同様に短鎖化を行った。その結果、すべてのアプタマーで結合活性を保持したままコンセンサス二次構造１と同様な構造まで短鎖化することができた。以下にそれらの実際に得られたヌクレオチド配列を示す。
配列番号７６：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaU(F)U(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aaU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号７７：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaC(F)U(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aGU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号７８：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GGC(F)C(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GGU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号７９：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GGU(F)U(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aaC(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号８０：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GGC(F)U(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aGU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号８１：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GGU(F)GaU(F)aaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)aU(F)C(F)aC(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号８２：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GGaU(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号８３：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)aC(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GU(F)aC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号８４：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)C(F)GC(F)U(F)aaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)U(F)GC(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号８５：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaGU(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)aU(F)aC(F)U(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号８６：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号８７：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)C(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GGGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号８８：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)C(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GaaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号８９：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)GGaaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)C(F)C(F)aC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号９０：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aU(F)GC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号９１：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)C(F)U(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aGGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号９２：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaC(F)C(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GGU(F)C(F)U(F)GU(F)aC(F)C(F)C(F)
これらのアプタマーの神経突起伸長阻害活性は、ＮＧＦのみ添加の際に得られた１細胞あたりの神経突起長を阻害活性０％、ＮＧＦ無添加で２日間培養して得られた１細胞あたりの神経突起長を阻害活性１００％として、ＮＧＦとアプタマーを混合添加した場合に得られた１細胞あたりの神経突起長から算出した。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、５０％阻害活性を挟む上下二点の濃度より求めた。実験の結果を表１に示す。表１においてＩＣ５０値を「＜Ｘ」と記載したものは、記載した濃度Ｘが測定最低濃度であった場合において阻害活性が５０％以上であったことを示す。実験したすべてのアプタマーが強い阻害活性を示した。その一部のＩＣ５０値を表１に示す。
ＴＦ−１細胞増殖阻害活性については、ＮＧＦのみの添加で細胞を３日間培養して得られた１ウェルあたりの発光量を阻害活性０％、ＮＧＦ無添加で３日間培養して得られた１ウェルあたりの発光量を阻害活性１００％として、ＮＧＦとアプタマーを混合添加した場合に得られた１ウェルあたりの発光量から、アプタマーの阻害活性を算出した。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、５０％阻害活性を挟む上下二点の濃度より求めた。結果を表１に示す。ＩＣ５０値を「＜Ｘ」と記載したものは、記載した濃度Ｘが測定最低濃度であった場合において阻害活性が５０％以上であったことを示す。実験の結果、配列番号８１、８４、８６、８９以外のアプタマーはＩＣ５０値が１ｎＭ以下であることがわかった。
これらのアプタマーのインターナルループ１の配列は全て５’側がＣＣＵで３’側がＵＧＵＵであった。また、ループ２は５’ＵＵＵＣＣＸＵ３’で表わされるコンセンサス配列を含んでいた。ここでＸはＧまたはＵのいずれかである。ステム１の最後の塩基対は全てＵ−ａであった。ステム２は１、８、９番目の塩基対がそれぞれＧ−Ｃ、ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃであった。２〜７番目はいくつかの異なる塩基対が存在した。
実施例１２：ＮＧＦアプタマーの作製６
ＮＧＦは阻害するがＮＴ−３およびＮＴ−４は阻害しないアプタマーを作製するために新たなＳＥＬＥＸを行った。最初のプールとして、実施例９と１０の最初に用いたＲＮＡプールを１：１で混合したものを使用した。セレクション前のＲＮＡプールにＮＴ−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、２９４ｐｍｏｌ）、ＮＴ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、１７９ｐｍｏｌ）およびＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、１４８ｐｍｏｌ）を混合し、これをＮＧＦ（３８０ｐｍｏｌ）が固定化されたビーズに加えた。
４ラウンド終了後に４８クローンの配列を確認したところ、配列の収束が見られなかった。シングル配列の中に配列番号２７、２８、３４、６４、７２と同じ配列のものがあった。新規な１４配列を選び、ＭＦＯＬＤプログラムを用いて二次構造を予測したところ、全てコンセンサス二次構造１を含んでいた。そこで、これらのアプタマーをコンセンサス二次構造１と同様に４０ｍｅｒまで短鎖化した。これらの短鎖化体のＮＧＦとＮＴ−３に対する結合活性を表面プラズモン共鳴法で測定した。測定方法は実施例１に示したように、ＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００を使用し、センサーチップとしてアミノ基と反応するＣＭ５を用いた。タンパク質の固定化は実施例１と同様にＥｔｈｙｌ−３−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅとＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅを用いて行った。ヒトＮＧＦあるいはＮＴ−３は固定化溶液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６）に溶解し２５〜４０μｇ／ｍｌとして使用した。タンパク質固定化後、ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−ＨＣｌによるブロッキングを行った。ＮＧＦとＮＴ−３の固定化量はそれぞれ３，０００〜４，０００ＲＵと３，０００〜５，０００ＲＵとした。アナライト用のアプタマーは０．１５μＭ〜０．５μＭに調製した。ランニングバッファーと再生用液は実施例１と同様であった。ＮＴ−３はＦＣ２に、ＮＧＦはＦＣ３に固定化し、それぞれＦＣ１の結果を引くことで最終的なセンサーグラムとした。その結果、７配列がＮＧＦに強く結合することがわかった。一方、ＮＴ−３に対してはどれもほとんど結合しなかった。
実施例３と同様に神経突起伸長阻害活性を測定したところ、配列番号９３〜９８で表わされるアプタマーが１０ｎＭで強い阻害活性を示した。以下に各配列番号に対応する実際に得られたヌクレオチド配列を示す。
配列番号９３：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)C(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GC(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号９４：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GGaGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号９５：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)aU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号９６：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aU(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号９７：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)aC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号９８：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)aC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)aC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
これらのアプタマーのインターナルループ１の配列は全て５’側がＣＣＵで３’側がＵＧＵＵであった。また、ループ２は５’ＵＵＵＣＣＸＵ３’で表わされるコンセンサス配列を含んでいた。ここでＸはＧまたはａのいずれかである。ステム１の最後の塩基対は全てＵ−ａであった。ステム２は２、５、８、９番目の塩基対がそれぞれＣ−Ｇ、Ｃ−Ｇ、ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃであった。他はいくつかの異なる塩基対が存在した。
ＳＥＬＥＸを７ラウンドまで追加し４８クローンの配列を確認したところ、大半の配列は一種類の配列に収束した。残りの中からシングル１３配列を選び、上記と同様に表面プラズモン共鳴法でＮＧＦおよびＮＴ−３に対する結合活性を調べた。測定の結果、７配列がＮＧＦに強く結合することがわかった。一方、ＮＴ−３に対してはどれもほとんど結合しなかった。
これらのアプタマーの二次構造をＭＦＯＬＤプログラムを用いて予測したところ、どれもコンセンサス二次構造１を含んでいなかった。実施例３と同様に神経突起伸長阻害活性を測定したところ、配列番号９９および１００で表わされるアプタマーが１０ｎＭで強い阻害活性を示した。一方、実施例８と同様にＴＦ−1細胞増殖阻害活性を測定したところ、どれも阻害活性を示さなかった。以下に各配列番号に対応する実際に得られたヌクレオチド配列を示す。
配列番号９９：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGU(F)C(F)C(F)aaaC(F)GGGaC(F)U(F)U(F)U(F)aU(F)aC(F)C(F)U(F)C(F)U(F)GaGU(F)C(F)GC(F)C(F)U(F)U(F)U(F)GC(F)U(F)C(F)C(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
配列番号１００：
GGGaGaaC(F)U(F)U(F)C(F)GaC(F)C(F)aGaaGaC(F)C(F)aaaC(F)GGaC(F)U(F)U(F)U(F)aU(F)aC(F)C(F)U(F)C(F)U(F)GaGU(F)C(F)GC(F)C(F)U(F)aU(F)GC(F)U(F)C(F)C(F)U(F)aU(F)GU(F)GC(F)GC(F)aU(F)aC(F)aU(F)GGaU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)
実施例１３：ＮＧＦアプタマーの作製７
ＮＧＦは阻害するがＮＴ−３およびＮＴ−４は阻害しないアプタマーを作製するために新たなＳＥＬＥＸを実施例１２と同様に行った。最初に用いたＲＮＡプールの鋳型とプライマーは以下の通りである。
鋳型５：
５’−ｇａｇｇａｔｃｃａｔｇｔａｔｇｃｇｃａｃａｔｎｎｎｎｇｇａｔａｃｇａｇｎｎｎｎｎｎｎｃｔｃｔｔａｔｃｃｎｎｎａｔｇｔｇｃｃａａｃｔｔｃｔｇｇｔｃｇａａｇｔｔｃｔｃｃｃ−３’（配列番号１４８）
そのうち、下線で示した塩基配列は以下の通りである。
ａ：ａ（７０％），ｇ（１０％），ｃ（１０％），ｔ（１０％）
ｇ：ａ（１０％），ｇ（７０％），ｃ（１０％），ｔ（１０％）
ｃ：ａ（１０％），ｇ（１０％），ｃ（７０％），ｔ（１０％）
ｔ：ａ（１０％），ｇ（１０％），ｃ（１０％），ｔ（７０％）
プライマーＦｗｄ３：
５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａａｃｔｔｃｇａｃｃａｇａａｇｔｔｇｇｃａｃａ（配列番号１４９）
プライマーＲｅｖ３：
５’−ｇａｇｇａｔｃｃａｔｇｔａｔｇｃｇｃａｃａ（配列番号１５０）
鋳型配列は配列番号８２で表わされる配列を基にしており、コンセンサス二次構造１のステム２に３０％のランダム配列をドープし、インターナルループ１とループ２部分を完全なランダム配列（ｎ）にした。
４ラウンド終了後に４８クローンの配列を確認したところ、２１クローンは配列番号２２で表わされる配列と一致していた。残りの配列のうち２クローンは同一の配列で、他はシングル配列であった。そのうちの１３配列を選び、二次構造をＭＦＯＬＤプログラムで予測したところ、コンセンサス二次構造１の構造を有していた。そこで、それらのアプタマーをコンセンサス二次構造１と同様になるように４０ｍｅｒまで短鎖化した。短鎖化したアプタマーの結合活性を実施例１２と同様に表面プラズモン共鳴法で確認した。ＮＴ−４はＮＴ−３と同様に測定した。その結果、短鎖化体がＮＧＦと強く結合することがわかった。一方、ＮＴ−３およびＮＴ−４との結合は弱かった。
また、これらの短鎖化体に対して実施例３と同様に神経突起伸長阻害活性を測定したところ、配列番号１０１、および１０２で表わされるアプタマーのＩＣ５０値が１ｎＭ以下の強い阻害活性を示した（表１）。一方、実施例８と同様にＴＦ−1細胞増殖阻害活性を測定したところ、同じ２アプタマーのＩＣ５０値は１ｎＭ以上であった。以下に各配列番号に対応する実際に得られたヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０１：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaC(F)GU(F)aU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GU(F)aU(F)GU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号１０２：
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaGC(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)aU(F)GC(F)U(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
実施例１４：高速シーケンサーを用いた配列解析
コンセンサス二次構造１を有するアプタマーで、ＮＧＦは阻害するが他のニューロトロフィンは阻害しないアプタマーを得るために、高速シーケンサーＧＳ ＦＬＸ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてシーケンス解析を行った。実施例１ではサンガーシーケンスにより４８クローンの配列解析を行ったが、高速シーケンサーを用いると数万配列の解析が可能となる。測定およびデータ解析はＯｐｅｒｏｎ社で実施し、サンプル調製はＯｐｅｒｏｎ社のプロトコールに従って行った。測定対象のＤＮＡは実施例８で行われたＳＥＬＥＸで得られた７、９、１０ラウンド、実施例１２で行われたＳＥＬＥＸで得られた４および５ラウンド、実施例１３で行われたＳＥＬＥＸで得られた３および４ラウンド終了後のＤＮＡプールを等モルずつ混合したプールとした。
得られたシーケンス配列の総数は６９２４９であった。そのうち、ＦＬＸプライマー配列が完全一致または１塩基置換している配列で、且つ、Ｎ４０の部分の配列長が４０である配列は４００７７配列であった。これらの配列の二次構造をＲＮＡｆｏｌｄプログラムを用いて予測した。コンセンサス二次構造１と同じ構造を含む配列は２２４５３配列存在した。実施例１０、１２、１３でサンガーシーケンスにより得られた配列と比較したところ、９９％が新規配列であった。新規の配列のうち、収束していた配列は１６１５種類であり、シングル配列は４１６８配列であった。これらの中から高頻度で出現した新規５２配列を選び、コンセンサス二次構造１の形になるように４０ｍｅｒまで短鎖化した。また、実施例１３でサンガーシークエンスにより得られたシングル配列を１０配列拾い直し、同様に４０ｍｅｒまで短鎖化した。
短鎖化した配列は表面プラズモン共鳴法でＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４との結合を測定した。測定は実施例１３と同様に行った。その結果、すべての配列がＮＧＦと結合したが、特に以下に示す１５配列が強く結合した。一方、ＮＴ−３およびＮＴ−４とはほとんど結合しなかった。
そこで、それら１５配列の神経突起伸長阻害活性を実施例３と同様な方法で測定した。その結果、すべてのアプタマーのＩＣ５０値が１ｎＭ以下であることがわかった（表１）。また、ＴＦ−１細胞増殖阻害活性を実施例８と同様な方法で測定したところ、配列番号１１１、１１２、１１４〜１１７で表わされるアプタマーはＩＣ５０値が１ｎＭ以下であった（表１）。
以下に各配列番号に対応する実際に得られたヌクレオチド配列を示す。なお、配列番号１１１は実施例１３でサンガーシーケンスにより得られた配列である。
配列番号１０３:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号１０４:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaU(F)GU(F)C(F)aaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)GaU(F)GU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号１０５:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GC(F)U(F)aaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)aGU(F)GaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号１０６:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)aGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号１０７:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GaaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)U(F)C(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号１０８:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号１０９:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)U(F)U(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号１１０:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)C(F)GC(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)GU(F)GGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号１１１:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)C(F)U(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aGaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号１１２:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)C(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GGaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号１１３:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)GU(F)GU(F)aGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)GC(F)aU(F)GGU(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号１１４:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GaC(F)aaaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)U(F)GU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号１１５:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)C(F)U(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)aGaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号１１６:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)C(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GaaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
配列番号１１７:
GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)GaaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)C(F)aaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)
これらのアプタマーのインターナルループ１の配列は全て５’側がＣＣＵで３’側がＵＧＵＵであった。また、ループ２は５’ＵＵＵＣＣＸＵ３’で表わされるコンセンサス配列を含んでいた。ここでＸはＧまたはＵのいずれかである。ステム１の最後の塩基対は全てＵ−ａであった。ステム２は８および９番目の塩基対がそれぞれａ−Ｕ、Ｇ−Ｃであった。１〜７番目はいくつかの異なる塩基対が存在した。
実施例１５：短鎖化したアプタマーの修飾
アプタマーの血液中での安定性を高めるために、リボースの２’位の修飾を変えた改変体を作製した。
以下にそれぞれの修飾体の配列を示す。ヌクレオチドにおける括弧は、その２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子、ＭはＯ−メチル基、ＬはＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）を示す。大文字はＲＮＡ、小文字はＤＮＡ、ｉｄＴはｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴを示す。リンカーは５’末端の場合はｓｓＨ Ｌｉｎｋｅｒ（ＳＡＦＣ）またはＤＭＳ（Ｏ）ＭＴ−ＡＭＩＮＯ−ＭＯＤＩＦＩＦＩＥＲ Ｃ６（ＧＬＥＮＲＥＳＥＡＲＣＨ）を、３’末端の場合はＴＦＡ Ａｍｉｎｏ Ｃ−６ ｌｃａａ ＣＰＧ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用いた。ＰＥＧ４０ＧＳ２は分子量４００００の２分岐ＧＳ型（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２−４００ＧＳ２ 日油社製）、ＰＥＧ４０ＴＳ２は分子量４００００の２分岐ＴＳ型（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２−４００ＴＳ 日油社製）、ＰＥＧ４０ＴＳ４は分子量４００００の４分岐ＴＳ型（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ４−４００ＴＳ 日油社製）、ＰＥＧ８０ＴＳ２は分子量８００００の２分岐ＴＳ型（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２−８００ＴＳ 日油社製）、ＰＥＧ８０ＴＳ４は分子量８００００の４分岐ＴＳ型（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ４−８００ＴＳ 日油社製）である。
配列番号３８（１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)U(F)C(F)G(M)C(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号１５１：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)GC(F)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号１５２：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号１５３：
ＰＥＧ４０ＧＳ２-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号１５４：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-ＰＥＧ４０ＧＳ２
配列番号１５５：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)G(M)C(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)aC(F)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号６２（１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)G(M)G(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号６６（１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)aU(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)U(F)U(F)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号６８（１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GaU(F)G(M)C(F)G(M)U(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)G(M)C(F)G(M)U(F)G(M)U(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号７１（１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)aU(F)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)G(M)U(F)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号７４（１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)G(M)C(F)aG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)U(F)G(M)G(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号７６（１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GaU(F)U(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aaU(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号７７（１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GaC(F)U(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aG(M)U(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号７８（１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)C(F)C(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)G(M)G(M)U(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号７８（２）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)C(F)C(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)G(M)G(M)U(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号７８（３）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)C(M)C(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)G(M)G(M)U(F)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号７８（４）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)C(M)C(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)G(M)G(M)U(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号７９（１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)U(F)U(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aaC(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８０（１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)C(F)U(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aG(M)U(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（２）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（３）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（４）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（５）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(M)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（６）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（７）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(M)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（８）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(M)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（９）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(M)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（１０）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(M)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（１１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(M)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（１２）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(M)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（１３）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(M)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（１４）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(M)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（１５）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(M)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（１６）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(M)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（１７）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(M)C(F)-idT
配列番号８２（１８）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(M)-idT
配列番号８２（１９）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(M)C(M)G(M)U(F)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（２０）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(F)aU(M)C(F)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（２１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(F)G(M)U(M)aU(M)C(F)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（２２）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(F)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（２３）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(F)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（２４）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(F)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（２５）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（２６）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(M)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（２７）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)cC(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号１５６：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)tU(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号１５７：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)tU(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（３０）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)cC(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（３１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)cU(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号１５８：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)tGU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号１５９：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)taC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号１６０：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)tU(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号１６１：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)tGU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号１６２：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)tU(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)tGU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（３７）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)uGG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（３８）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)uU(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（３９）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)uC(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（４０）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)uC(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（４１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)uaC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（４２）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)A(M)G(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（４３）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aA(M)G(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（４４）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)A(M)aG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（４５）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)A(M)U(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（４６）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)A(M)U(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（４７）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)A(M)C(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（４８）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)A(M)U(M)aaG(M)A(M)G(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)A(M)U(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)A(M)C(M)C(M)C(M)-idT
配列番号１６３：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)tU(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)tGU(M)uaC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号１６４：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)uGG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)tU(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)tGU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号１６５：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)tU(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)tGU(M)uA(M)C(M)C(M)C(M)-idT
配列番号１６６：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)A(M)U(M)aaG(M)A(M)G(M)tU(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)A(M)U(M)C(M)C(M)tGU(M)uA(M)C(M)C(M)C(M)-idT
配列番号１６７：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)A(M)U(M)aaG(M)A(M)G(M)tU(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)A(M)U(M)C(M)C(M)tGU(M)U(F)A(M)C(M)C(M)C(M)-idT
配列番号１６８：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)uGG(M)A(M)U(M)aaG(M)A(M)G(M)tU(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)A(M)U(M)C(M)C(M)tGU(M)uA(M)C(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（５５）：
PEG80TS4-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（５６）：
PEG40GS2-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GG(M)aU(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(F)G(M)U(F)C(F)U(F)C(F)G(M)U(F)aU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)aC(F)C(F)C(F)-idT
配列番号８２（５７）：
G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)sGG(M)A(M)U(M)aaG(M)A(M)G(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)A(M)U(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)A(M)C(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（５８）：
G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GsG(M)A(M)U(M)aaG(M)A(M)G(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)A(M)U(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)A(M)C(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（５９）：
G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)A(M)U(M)saaG(M)A(M)G(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)A(M)U(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)A(M)C(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（６０）：
G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)A(M)U(M)asaG(M)A(M)G(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)A(M)U(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)A(M)C(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（６１）：
G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)A(M)U(M)aasG(M)A(M)G(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)A(M)U(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)A(M)C(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（６２）：
G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)A(M)U(M)aaG(M)A(M)G(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)A(M)U(M)C(M)C(M)U(F)sGU(M)U(F)A(M)C(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（６３）：
G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)A(M)U(M)aaG(M)A(M)G(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)A(M)U(M)C(M)C(M)U(F)GsU(M)U(F)A(M)C(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（６４）：
PEG40TS2-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GG(M)aU(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)aU(M)C(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８７（１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GC(F)U(F)C(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GGGC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８７（２）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GC(F)U(F)C(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)GGGC(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８７（３）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GC(F)U(F)C(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)G(M)G(M)G(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８７（４）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GC(M)U(M)C(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)G(M)G(M)G(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８７（５）：
G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GC(M)U(M)C(M)aaG(M)A(M)G(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)G(M)G(M)G(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)A(M)C(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８８（１）：
idT-GGGU(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)C(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GaaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８８（２）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)U(F)C(F)aaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)GaaC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８８（３）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GU(F)U(F)C(F)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)GaaC(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８８（４）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GU(M)U(M)C(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)G(M)aaC(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８９（１）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(F)U(F)GU(F)GGaaGaGU(F)U(F)U(F)C(F)C(F)GU(F)C(F)U(F)C(F)GU(F)C(F)C(F)aC(F)U(F)GU(F)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８９（２）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(M)U(F)GU(F)GGaaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)C(F)C(F)aC(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８９（３）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(M)U(F)GU(F)G(M)G(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)C(F)C(F)aC(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８９（４）：
idT-G(M)G(M)G(M)U(F)C(F)C(M)U(F)GU(M)G(M)G(M)aaG(M)aG(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)C(M)C(M)aC(M)U(F)GU(M)U(F)aC(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８９（５）：
G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GU(M)G(M)G(M)aaG(M)A(M)G(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)C(M)C(M)A(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)A(M)C(M)C(M)C(M)-idT
配列番号１１１（１）：
G(M)G(M)G(M)U(M)C(F)C(M)U(F)GU(M)C(M)U(M)aaG(M)A(M)G(M)U(F)U(F)U(F)C(F)C(M)G(M)U(M)C(F)U(F)C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)A(M)C(M)U(F)GU(M)U(F)A(M)C(M)C(M)C(M)-idT
配列番号８２（２）で表わされるＲＮＡのＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４に対する結合活性を実施例１３と同様に表面プラズモン共鳴法で測定した。その結果、いずれのタンパク質に対しても結合活性を有していることがわかった（図３）。また、配列番号８２（２）で表わされるアプタマーがＮＧＦとその受容体であるＴｒｋＡまたはｐ７５の結合を阻害するかどうか、実施例２と同様に表面プラズモン共鳴法を用いて調べた。その結果、ＮＧＦと両受容体の結合をともに強く阻害することがわかった（図４と５）。
上記の全ての修飾体に対して神経突起伸長阻害活性を実施例３と同様な方法で測定した。その結果、配列番号６２（１）以外の全ての修飾体のＩＣ５０値が１ｎＭ以下であった（表１）。特に配列番号１６２で表わされるアプタマーのＩＣ５０値は０．０３３ｎＭであった。また、ＴＦ−１細胞増殖阻害活性を実施例８と同様な方法で測定したところ、ほとんどのアプタマーのＩＣ５０値は１ｎＭ以下であった（表１）。特に配列番号１６２で表わされるアプタマーのＩＣ５０値は０．０１４ｎＭであった。配列番号６２（１）で表わされるアプタマーのＩＣ５０値は０．４９ｎＭであった。
以上より、本アプタマーはリボースの２’位の修飾を変えても阻害活性を保持できることが示された。
実施例１６：ＴＦ−１細胞増殖阻害評価系による他のニューロトロフィンとの交差性の確認
ＴＦ−１細胞を用いてＮＧＦアプタマーがＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４を阻害するかどうか調べた。ヒト赤白血病細胞株であるＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ−２００３）にレトロウイルスベクターを用いて各神経栄養因子に対するヒト受容体遺伝子（ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、ｐ７５）を導入し、それらの受容体を安定的に高発現する細胞を作製した。尚、ＢＤＮＦへの阻害活性評価にはＴｒｋＢおよびｐ７５を導入したＴＦ−１細胞、ＮＴ−３に対する評価にはＴｒｋＣおよびｐ７５を導入したＴＦ−１細胞、そしてＮＴ−４に対する評価にはＴｒｋＢのみを導入したＴＦ−１細胞を使用した。これらの細胞を２０％の胎児ウシ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、白色の９６ウェル平底プレートに１ウェルあたり１０００個（５０μＬ）の細胞を播種した。そこに室温にて３０分間無血清のＲＰＭＩ−１６４０培地中で予め反応させたヒトＢＤＮＦ（最終濃度０．０７４ｎＭ）あるいはＮＴ−３（最終濃度０．０７４ｎＭ）あるいはＮＴ−４（最終濃度０．０７１ｎＭ）とアプタマー（最終濃度１μＭ〜０．０１ｎＭ）の混合溶液５０μＬを添加し、３日後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに１００μＬ添加後、マイクロプレートリーダーにより化学発光を測定した。ＢＤＮＦ、ＮＴ−３あるいはＮＴ−４のみの添加で細胞を３日間培養して得られた１ウェルあたりの発光量を阻害活性０％、ＢＤＮＦあるいはＮＴ−３あるいはＮＴ−４無添加で３日間培養して得られた１ウェルあたりの発光量を阻害活性１００％として、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３あるいはＮＴ−４とアプタマーを混合添加した場合に得られた１ウェルあたりの発光量から、アプタマーの阻害活性を算出した。阻害活性が０以下の場合は０％とした。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、５０％阻害活性を挟む上下二点の濃度より求めた。実験結果を表２に示す。ＩＣ５０値を「＞Ｘ」と記載したものは、記載した濃度Ｘが測定最高濃度であった場合に阻害活性が５０％以下であったことを示す。Ｎ．Ｄ．は未測定の意味である。
実験したすべてのアプタマーが強い阻害活性を示した。その一部のＩＣ５０値を表２に示す。表２に記載の本発明のアプタマーの阻害活性は、ＮＧＦに対してＩＣ５０値が０．１ｎＭ以下であるのに対して、ＢＤＮＦに対するＩＣ５０値は１０００ｎＭ以上であった。ＮＴ−３に対しては０．９７ｎＭから１０ｎＭ以上とアプタマーによって異なった。また、ＮＴ−４に対しては３ｎＭ以下から３０ｎＭ以上と、こちらもアプタマーによって異なっていた。
実施例１７：ＮＧＦアプタマーによる鎮痛作用
ＮＧＦ誘発性疼痛に対するＮＧＦアプタマーの鎮痛作用を検討する為、ラット後肢へのＮＧＦ皮下投与により引き起こされる熱性痛覚過敏モデルを使用した。実験にはＪｃｌ：ＳＤ系ラット（６週齢）を使用した。熱性痛覚過敏の指標として、足底熱刺激測定装置（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ社製）からの肢底への赤外線照射に対する逃避行動の反応潜時を用いた。試験前日に評価系への馴化を行った。試験当日の投与前に逃避行動反応潜時を測定し、１０秒以上２０秒未満の個体を使用した。Ｖｅｈｉｃｌｅ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ ＢＳＡ）にヒトβ−ＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、終濃度５０μｇ／ｍｌ）および被験物質を混合し、室温３０分間のインキュベート後、左後肢底に１０μｌ皮下投与し、５時間後に逃避行動反応潜時を測定した。配列番号１５３で表わされるアプタマーを、終濃度５０ｍｇ／ｍｌ（ＮＧＦに対するモル比：１０００倍）で投与した。コントロールとして、ＶｅｈｉｃｌｅまたはＶｅｈｉｃｌｅとＮＧＦとの混合液を同様に投与した。結果を表３に示す（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝９）。
投与５時間後で、Ｖｅｈｉｃｌｅ群に比べてＮＧＦ群で逃避行動反応潜時が有意に小さかった（ｐ＜０．０１）。また、投与５時間後で、アプタマー投与群の逃避行動反応潜時がＮＧＦのみの投与群に比べて大きかった（ｐ＜０．０１）。以上の結果より、本アプタマーはＮＧＦに起因する疼痛薬として使用可能であることがわかった。
実施例１８：ＮＧＦアプタマーによる術後痛モデルにおける鎮痛作用
ＮＧＦアプタマー療法の薬効検討の為、熱性痛覚過敏が引き起こされる術後痛モデルを使用した。実験にはＣｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系ラット（５週齢）を使用した。カテーテルの先端を大腿静脈内に留置し、もう一方の先端をラット背部から体外へ露出した。１週間後にＱｕｉｃｋ ｃｏｎｎｅｃｔインフュージョンシステム（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社製）をラットに装着し、更に１週間後に熱性痛覚過敏を評価した。熱性痛覚過敏の指標として、足底熱刺激測定装置（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ社製）からの肢底への赤外線照射に対する逃避行動の反応潜時を用いた。試験開始３日前に評価系への馴化を行った。試験開始日に逃避行動反応潜時を測定し、１０秒以上２０秒未満の個体を使用した。生理食塩水に溶解したＮＧＦアプタマーをシリンジポンプ（テルモ社製）を用いて持続的に静脈内投与した。ＮＧＦアプタマーとしては、配列番号８２（５６）で表わされるアプタマー（２１．２ｍｇ／２４０ｍｌ／ｋｇ／９６ｈｒで投与）および配列番号８２（５５）で表わされるアプタマー（１０．０８ｍｇ／２４０ｍｌ／ｋｇ／９６ｈｒで投与）を用いた。コントロールとして、Ｖｅｈｉｃｌｅを同様に投与した。投与開始１時間後に右後肢底の皮膚および筋膜を切開後、屈筋を垂直に二分し、皮膚を縫合した。切開手術後、１、２、３、４日後に逃避行動反応潜時を測定した。結果を表４に示す。
Ｖｅｈｉｃｌｅ群において、投与・切開術１、２、３、４日後の逃避行動反応潜時が投与・切開術前に比べて有意に小さかった（ｐ＜０．０１）。投与・切開術１、２、３、４日後において、いずれのアプタマー投与群の逃避行動反応潜時も、Ｖｅｈｉｃｌｅ群に比べて有意に大きかった（ｐ＜０．０１）。実験の結果を表４および表５に示す（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝８−９）。このことから抗ＮＧＦアプタマーは術後痛モデルに対する鎮痛作用を有することが示された。
本発明のアプタマーは、疼痛や炎症性疾患などの疾患に対する医薬、あるいは診断薬、試薬として有用であり得る。本発明のアプタマー及び複合体はまた、ＮＧＦの精製及び濃縮、並びにＮＧＦの検出及び定量に有用であり得る。
本出願は、日本で出願された特願2011-213585（出願日：2011年9月28日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (17)

  1. 式（I）で表される潜在的２次構造を形成できる、ＮＧＦと結合するアプタマー。
    （式中、NはA、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つのヌクレオチドであり、
    N11〜N13、N21〜N23、N32〜N38およびN42〜N48は、それぞれ同一または異なって、A、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つもしくは２つのヌクレオチド、または結合であり、
    N14、N24、N31、N41、N39およびN49は、それぞれ同一または異なって、A、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つのヌクレオチドであって、
    N14とN24、N31とN41およびN39とN49は互いにワトソン−クリック塩基対を形成し、
    N11-N12-N13-N14とN21-N22-N23-N24の組合せでステム構造を形成できるヌクレオチド配列であり、
    N31-N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38-N39とN41-N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48-N49の組合せでステム構造を形成できるヌクレオチド配列である。）
  2. N11〜N13、N21〜N23、N32〜N38およびN42〜N48が、それぞれ同一または異なって、A、G、C、UおよびTからなる群より選ばれる１つのヌクレオチドである請求項１記載のアプタマー。
  3. N14がU、N24がA、N31がG、N41がC、N39がG、N49がCである請求項１または２記載のアプタマー。
  4. N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38とN42-N43-N44-N45-N46-N47-N48で4個以上のワトソン−クリック塩基対を形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアプタマー。
  5. 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである請求項１記載のアプタマー：
    （ａ）配列番号３、配列番号９〜１３、配列番号２２〜１１７および配列番号１５２〜１６８のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）からなる核酸；
    （ｂ）上記（ａ）のヌクレオチド配列において、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＮＧＦと結合する核酸。
  6. 塩基長が50以下である請求項１〜５のいずれか１項に記載のアプタマー。
  7. 少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアプタマー。
  8. ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴまたはポリエチレングリコールで修飾されている請求項７記載のアプタマー。
  9. ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴまたはポリエチレングリコールが、アプタマーの５’末端または３’末端に結合している、請求項８記載のアプタマー。
  10. 各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一または異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子およびメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置き換えられている、請求項７〜９のいずれか１項に記載のアプタマー。
  11. 各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一または異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子およびメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置き換えられている、請求項７〜９のいずれか１項に記載のアプタマー。
  12. ＮＧＦの神経突起伸長活性および／または細胞増殖活性を阻害する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアプタマー。
  13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアプタマーを含む、医薬組成物。
  14. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアプタマーを含む、抗疼痛剤。
  15. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアプタマーを含む、抗炎症剤。
  16. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアプタマーを、それを必要とする対象に投与することを特徴とする、疼痛又は炎症を伴う疾患を治療又は予防する方法。
  17. 疼痛又は炎症を伴う疾患の治療又は予防のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアプタマー。
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