JP6586669B2 - オートタキシンに結合しオートタキシンの生理活性を阻害するアプタマー及びその利用 - Google Patents
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Description
最近、ブレオマイシン誘導による肺線維症モデルにおいて、LPA受容体LPA1のノックアウトマウスやLPA1阻害剤による線維化抑制効果が報告され、LPAと肺線維症との関わりが示唆されており、LPAの産生酵素であるオートタキシンについても肺線維症との関わりに注目が集まっている。
その中で抗オートタキシンモノクローナル抗体が間質性肺炎及び/又は肺線維症に対する予防及び/又は治療効果を有することが報告された。またオートタキシン低分子阻害剤により、ブレオマイシン誘導による肺線維症モデルにおける線維症抑制効果も報告された。いずれの報告でも、特発性肺線維症患者の肺胞洗浄液中にオートタキシンが存在し、健常人と比較してその濃度や活性が高いことが示されている。
特発性肺線維症は5年生存率が30%という極めて予後の悪い疾患である。そのメカニズムは不明な点が多いが、一般的に肺胞などが損傷を受けることで、組織修復機構が過剰に働き、肺間質部において、線維芽細胞の異常増殖や結合組織タンパク質の過剰生産が起こるとされている。現在、世界的な標準治療としてステロイド、免疫抑制剤などが使用されているが、2008年、世界に先駆けて日本において特発性肺線維症の治療薬として、ピレスパ(一般名:ピルフェニドン)が承認され、その有効性などが臨床の場でも検討されている。しかし、ピレスパが何を標的としているのかなど、その作用機序は不明な点が多い。
アプタマーは標的分子との結合特性が高く、同様な機能をもつ抗体と比較してもその親和性は高い場合が多い。さらに免疫排除を受けにくく、抗体特有の抗体依存性細胞障害(ADCC)や補体依存性細胞障害(CDC)などの副作用は起こりにくいとされる。デリバリーの観点では、アプタマーは抗体の1/10程度の分子サイズであるため組織移行が起こりやすく、目的の部位まで薬物を送達させることがより容易である。また同じ分子標的医薬の低分子においては、中には難溶性のものもあり、その製剤化には最適化が必要である場合もあるが、アプタマーは水溶性が高いため、その点でも有利である。さらに化学合成により生産されるので、大量生産すればコストダウンを図ることができる。その他、長期保存安定性や熱・溶媒耐性もアプタマーの優位な特徴である。一方で、一般にアプタマーの血中半減期は抗体よりも短い。しかし、この点も毒性を考慮した場合はメリットとなる場合がある。
2004年12月には世界初のRNAアプタマー医薬であるMacugenが加齢黄斑変性症の治療薬として米国で承認されており、RNAアプタマーの治療薬、診断薬、試薬への応用が注目され、次世代医薬品として期待されている。
[1]オートタキシンに結合するアプタマーであって、下式:
GWAACAGGUUUUGCU(配列番号42)
(式中、WはA又はUである)
で表わされるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい)を含み、かつ以下の(a)又は(b)のいずれかである、アプタマー:
(a)該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフッ素原子であり、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位がヒドロキシ基である、アプタマー;
(b)該(a)のアプタマーにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
[2]WがAである、[1]に記載のアプタマー。
[3]配列番号16で表わされるヌクレオチド配列を含む、[1]又は[2]に記載のアプタマー。
[4][1]〜[3]のいずれかに記載のアプタマーにおいて、配列番号10で表わされるヌクレオチド配列中で1〜数個のヌクレオチドが置換、挿入又は付加され、かつ以下の(a)又は(b)のいずれかである、オートタキシンに結合するアプタマー:
(a)該置換、挿入又は付加されたヌクレオチドにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフッ素原子であり、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位がヒドロキシ基である、アプタマー;
(b)該(a)の置換、挿入又は付加されたヌクレオチドにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
[5]オートタキシンに結合するアプタマーであって、
下記(A)、(B)又は(C):
(A)配列番号4、8、14〜20、24、29、30、32、40、41、44〜48及び50〜53から選択されるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい);
(B)配列番号4、8、14〜20、24、29、30、40、44、45、47、48及び50〜53から選択されるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい)において、1〜数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列;
(C)配列番号4、8、14〜20、24、29、30、40、44、45、47、48及び50〜53から選択されるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい)と60%以上の同一性を有するヌクレオチド配列;
のいずれかのヌクレオチド配列を含み、かつ
以下の(a)又は(b)のいずれかである、アプタマー:
(a)該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフッ素原子であり、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位がヒドロキシ基である、アプタマー;
(b)該(a)のアプタマーにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
[6]オートタキシンに結合するアプタマーであって、
下記(A’)、(B’)又は(C’):
(A’)配列番号16で表わされるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい);
(B’)配列番号16で表わされるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい)(GAAACAGGUUUUGCU(配列番号10)で表わされる配列を除く)において、1〜7個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列;
(C’)配列番号16で表わされるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい)と70%以上の同一性を有する(但し、GAAACAGGUUUUGCU(配列番号10)で表わされる配列は同一である)ヌクレオチド配列;
のいずれかのヌクレオチド配列を含み、かつ
以下の(a)又は(b)のいずれかである、アプタマー:
(a)該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフッ素原子であり、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位がヒドロキシ基である、アプタマー;
(b)該(a)のアプタマーにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
[7]塩基長が23以上である、[1]〜[6]のいずれかに記載のアプタマー。
[8]少なくとも一つのヌクレオチドが修飾もしくは改変されている、[1]〜[7]のいずれかに記載のアプタマー。
[9]inverted dT又はポリエチレングリコールで修飾されている、[8]に記載のアプタマー。
[10]inverted dT又はポリエチレングリコールが、アプタマーの5’末端もしくは3’末端に結合している、[9]に記載のアプタマー。
[11]アプタマーに含まれるリン酸基の少なくとも一つが、ホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化されたものである、[1]〜[10]のいずれかに記載のアプタマー。
[12]オートタキシンに結合するアプタマーであって、配列番号16で表わされるヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列中、
GAAACAGGUUUUGCU(配列番号10)で表わされる配列におけるリン酸基の少なくとも一つがホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化されたものであり、アプタマーの5’末端もしくは3’末端がそれぞれinverted dT又はポリエチレングリコールで修飾されたものであり、かつ以下の(a)又は(b)のいずれかである、アプタマー:
(a)該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフッ素原子であり、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位がヒドロキシ基である、アプタマー;
(b)該(a)のアプタマーにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
[13][1]〜[12]のいずれかに記載のアプタマーと機能性物質とを含む複合体。
[14]機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物、毒素又は薬物送達媒体である、[13]に記載の複合体。
[15][1]〜[12]のいずれかに記載のアプタマー、あるいは[13]又は[14]に記載の複合体を含む医薬。
[16][1]〜[12]のいずれかに記載のアプタマー、あるいは[13]又は[14]に記載の複合体を含む抗線維化剤。
[17][1]〜[12]のいずれかに記載のアプタマー、あるいは[13]又は[14]に記載の複合体を含むオートタキシンの検出用プローブ。
[18][1]〜[12]のいずれかに記載のアプタマー、あるいは[13]又は[14]に記載の複合体を用いることを特徴とする、オートタキシンの検出方法。
[19][1]〜[12]のいずれかに記載のアプタマーを含んでなる、オートタキシンの阻害剤。
結合強度の測定にはGEヘルスケア社製のBiacore T100を用いる。一つの測定方法としては、まずセンサーチップにアプタマーを固定化する。固定化量は約1500RUとする。アナライト用のオートタキシン溶液は0.020μMに調製したものを20μLインジェクトし、オートタキシンのアプタマーへの結合を検出する。30ヌクレオチドからなるランダムなヌクレオチド配列を含むRNAをネガティブコントロールとし、該コントロールRNAと比較してオートタキシンが有意に強くアプタマーに結合した場合、該アプタマーはオートタキシンへの結合能を有すると判定することができる。
別の測定方法としては、まずセンサーチップにオートタキシンを固定化する。固定化量は約2700RUとする。アナライト用のアプタマー溶液は0.30μMに調製したものを20μLインジェクトし、アプタマーのオートタキシンへの結合を検出する。30ヌクレオチドからなるランダムなヌクレオチド配列を含むRNAをネガティブコントロールとし、該コントロールRNAと比較してアプタマーが有意に強くオートタキシンに結合した場合、該アプタマーはオートタキシンへの結合能を有すると判定する。
GWAACAGGUUUUGCU(配列番号42)
(式中、WはA又はUである)
で表わされるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい)を含む(以下、本発明のアプタマー(I)ともいう)。
(a)(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフッ素原子であり、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位がヒドロキシ基である;
(b)(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基、アルコキシ基(例、メトキシ基)、アシルオキシ基(例、アセチルオキシ基)及びアミノ基(例、−NH2基)からなる群より選ばれる原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、フッ素原子又はアルコキシ基(例、メトキシ基)、アシルオキシ基(例、アセチルオキシ基)及びアミノ基(例、−NH2基)からなる群より選ばれる原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている;
のいずれかである。
本発明のアプタマーは、GWAACAGGUUUUGCU(配列番号42)(式中、WはA又はUである)で表わされる配列部分において上記構造をとることができる。この構造をとることで、オートタキシンに対する種々の活性(オートタキシンへの結合活性、オートタキシンの阻害活性等)を有すると考えられる。
したがって、好ましくは、本発明のアプタマー(I)は、式:GWAACAGGUYYYGCU(式中、WはA又はUであり、YはU又はCである)(配列番号49)で表わされるヌクレオチド配列を含み得る。式中、Wは、好ましくはAであり、YYYは、好ましくはUUU、UUC、UCU又はCUUである。また、配列番号42で表わされるヌクレオチド配列中、5’末端から6番目のAが置換される場合、U以外のヌクレオチドで置換されることが好ましく、より好ましくは5’末端から6番目のAは置換されない。
(a)(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフッ素原子であり、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位がヒドロキシ基である;
(b)(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基、アルコキシ基(例、メトキシ基)、アシルオキシ基(例、アセチルオキシ基)及びアミノ基(例、−NH2基)からなる群より選ばれる原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、フッ素原子又はアルコキシ基(例、メトキシ基)、アシルオキシ基(例、アセチルオキシ基)及びアミノ基(例、−NH2基)からなる群より選ばれる原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている;
のいずれかである。
(A)配列番号4、8、14〜20、24、29、30、32、40、41、44〜48及び50〜53から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマー(但し、ウラシルはチミンであってもよい);
(B)配列番号4、8、14〜20、24、29、30、40、44、45、47、48及び50〜53から選択されるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい)において、1〜数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマー;又は
(C)配列番号4、8、14〜20、24、29、30、40、44、45、47、48及び50〜53から選択されるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい)と60%以上(好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、さらに好ましくは80%以上、いっそう好ましくは85%以上、特に好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上)の同一性を有するヌクレオチド配列を含むアプタマー;
(但し、上記(B)または(C)のアプタマーは、オートタキシンに結合し、オートタキシンの活性(オートタキシンの酵素活性等)を阻害し得るものである。)
のいずれかのアプタマーである(以下、本発明のアプタマー(II)ともいう)。
(A’)配列番号16で表わされるヌクレオチド配列を含むアプタマー(但し、ウラシルはチミンであってもよい);
(B’)配列番号16で表わされるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい)(GAAACAGGUUUUGCU(配列番号10)で表わされる配列を除く)において、1〜7個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマー;又は
(C’)配列番号16で表わされるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい)と70%以上(好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、特に好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上)の同一性を有する(但し、GAAACAGGUUUUGCU(配列番号10)で表わされる配列は同一である)ヌクレオチド配列を含むアプタマー(但し、上記(B’)または(C’)のアプタマーは、オートタキシンに結合し、オートタキシンの活性(オートタキシンの酵素活性等)を阻害し得るものである。)
のいずれかである。
(D)1以上の上記(A)および/または1以上の上記(B)および/または1以上の上記(C)の複数の連結物、好ましくは、
(D’)1以上の上記(A’)および/または1以上の上記(B’)および/または1以上の上記(C’)の複数の連結物
であり得る。上記(D)、(D’)において連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖(例、1〜約20ヌクレオチド)、非ヌクレオチド鎖(例、−(CH2)n−リンカー、−(CH2CH2O)n−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、TEGリンカー、ペプチドを含むリンカー、−S−S−結合を含むリンカー、−CONH−結合を含むリンカー、−OPO3−結合を含むリンカー)が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、2以上であれば特に限定されないが、例えば2個、3個又は4個であり得る。
(a)(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフッ素原子であり、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位がヒドロキシ基である;
(b)(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている;
のいずれかである。
式(I’)中、Wは、好ましくはAであり、YYYは、好ましくはUUU、UUC、UCU又はCUUである。
また糖残基については、2’位及び4’位で架橋構造を形成したBNA:Bridged nucleic acid(LNA:Linked nucleic acid)とすることもできる。このような糖残基の改変も、自体公知の方法により行うことができる(例えば、Tetrahedron Lett., 38, 8735−8738 (1997); Tetrahedron, 59, 5123−5128 (2003)、Rahman S.M.A., Seki S., Obika S., Yoshikawa H., Miyashita K., Imanishi T., J. Am. Chem. Soc., 130, 4886−4896 (2008)など参照)。
また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、あるいはオートタキシンに対する結合活性等を高める目的で、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、リン酸基たるP(O)O基が、P(O)S(チオエート)、P(S)S(ジチオエート)、P(O)NR2(アミデート)、P(O)R、R(O)OR’、CO又はCH2(ホルムアセタール)又は3’−アミン(−NH−CH2−CH2−)で置換されていてもよい〔ここで各々のR又はR’は独立して、Hであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル(例、メチル、エチル)である〕。なかでもリン酸基たるP(O)O基の少なくとも一つが、P(O)S(チオエート)又はP(S)S(ジチオエート)で置換されている、いわゆるホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化したものが好ましい。アプタマーに含まれるリン酸基の少なくとも一つがホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化されることによって、本発明のアプタマーの活性が向上する。ホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化されるリン酸基は特に制限されないが、例えば、本発明のアプタマー(I)又は(II)における共通配列(配列番号10、42又は49)中の任意のヌクレオチドであってよく、好ましくは、該共通配列の5’末端から3番目のAのリン酸基であり得る。
連結基としては、−O−、−N−又は−S−が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
改変はまた、キャッピングのような3’及び5’の改変を含んでもよい。
(1)配列番号16で表わされるヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列中、GAAACAGGUUUUGCU(配列番号10)で表わされる配列におけるリン酸基の少なくとも一つ(例えば、5’末端から3番目のAのリン酸基等)がホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化されたものであり、
(2)アプタマーの5’末端もしくは3’末端がそれぞれinverted dT又はポリエチレングリコールで修飾されたものであり、かつ以下の(a)又は(b):
(a)該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフッ素原子であり、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位がヒドロキシ基である、アプタマー;
(b)該(a)のアプタマーにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー;
のいずれかであるアプタマーを提供する。
上述のように、本発明のアプタマーの長さは、好ましくは23〜50ヌクレオチド、あるいは23〜40ヌクレオチドであるから、配列番号16で表わされるヌクレオチド配列(29ヌクレオチド)を含む上記アプタマーの長さは、好ましくは29〜50ヌクレオチド、あるいは29〜40ヌクレオチドである。配列番号16で表わされるヌクレオチド配列の5’末端及び3’末端のそれぞれに続くヌクレオチド配列は、少なくとも図1右に示される、配列番号16で表わされるヌクレオチド配列がとり得る二次構造を維持し得るものであれば、特に制限はないが、図1右のステム構造を延長することにより(ミスマッチやバルジの形成を許容する)、図1右のステム−ループ構造をさらに安定化し得るものであることが望ましい。
アプタマーはアミダイト法もしくはホスホアミダイト法などの化学合成法によって大量合成することができる。合成方法はよく知られている方法であり、Nucleic Acid(Vol.2)[1]Synthesis and Analysis of Nucleic Acid(Editor:Yukio Sugiura,Hirokawa Publishing Company)などに記載のとおりである。実際にはGEヘルスケアーバイオサイエンス社製のOligoPilot100やOligoProcessなどの合成機を使用する。精製はクロマトグラフィー等の自体公知の方法により行われる。
アプタマーはホスホアミダイト法などの化学合成時にアミノ基などの活性基を導入することで、合成後に機能性物質を付加することができる。例えば、アプタマーの末端にアミノ基を導入することで、カルボキシル基を導入したポリエチレングリコール鎖を縮合させることができる。
アプタマーは、リン酸基の負電荷を利用したイオン結合、リボースを利用した疎水結合及び水素結合、核酸塩基を利用した水素結合やスタッキング結合など多様な結合様式により標的物質と結合する。特に、構成ヌクレオチドの数だけ存在するリン酸基の負電荷を利用したイオン結合は強く、タンパク質の表面に存在するリジンやアルギニンの正電荷と結合する。このため、標的物質との直接的な結合に関わっていない核酸塩基は置換することができる。特に、ステム構造の部分は既に塩基対が作られており、また、二重らせん構造の内側を向いているので、核酸塩基は、標的物質と直接結合し難い。従って、塩基対を他の塩基対に置換してもアプタマーの活性は減少しない場合が多い。ループ構造など塩基対を作っていない構造においても、核酸塩基が標的分子との直接的な結合に関与していない場合に、塩基の置換が可能である。リボースの2’位の修飾に関しては、まれにリボースの2’位の官能基が標的分子と直接的に相互作用していることがあるが、多くの場合無関係であり、他の修飾分子に置換可能である。このようにアプタマーは、標的分子との直接的な結合に関与している官能基を置換又は削除しない限り、その活性を保持していることが多い。また、全体の立体構造が大きく変わらないことも重要である。
当該剤に含まれるアプタマーは、本明細書中に記載される本発明のアプタマーであれば特に限定されない。
オートタキシンに特異的に結合するRNAアプタマーはSELEX法を用いて作製した。SELEXはEllingtonらの方法(Ellington and Szostak,Nature 346,818−822,1990)及びTuerkらの方法(Tuerk and Gold,Science 249,505−510,1990)を参考にして行った。標的物質としてTALON Metal Affinity Resin(Clontech社製)の担体に固相化したHisタグ付きβオートタキシン(Recombinant Human、R&D社製、以下、オートタキシンと記す)を用いた。オートタキシンが固相化された担体は、担体中に存在するコバルトのヒスチジンへの要求性を利用し、両者を混ぜ、1時間程度室温で反応させることで得た。固相化量は、固相化前のオートタキシン溶液と固相化直後の上清をSDS−PAGEにより調べることで確認した。SDS−PAGEの結果、上清からはオートタキシンのバンドは検出されず、使用したオートタキシンのほぼ全てがカップリングされたことが確認された。約50pmolのオートタキシンが約5μLの樹脂に固相化されたことになる。
最初のラウンドで用いたランダム配列のRNA(30N)は、化学合成したDNAをDuraScribeTMT7 Transcription Kit(Epicentre社製)を用いて転写することで得た。この方法によって得られたRNAはピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフルオロ化されたものである。DNA鋳型として、以下に示す30ヌクレオチドのランダム配列の両端にプライマー配列を持った長さ73ヌクレオチドのDNAを用いた。DNA鋳型とプライマーは化学合成によって作製した。
プライマーFwd:5’−TAATACGACTCACTATAGGGACCGCACTCTAAACGCTCTG−3’(配列番号2)
プライマーRev:5’−CGGATACGTCTCACTTCGTC−3’(配列番号3)
SELEXを8ラウンド行った後に46クローンの配列を調べたところ、配列に収束が見られた。その中から、配列番号4で表わされるヌクレオチド配列からなるクローンが6つ得られた。MFOLDプログラム(M.Zuker,Nucleic Acids Res.31(13),3406−3415,2003)を用いて予測した、このアプタマーの二次構造を図1に示す。
配列番号4:GGGACCGCACUCUAAACGCUCUGAGGGAAACAGGUUUUGCUCCUCGGAGCGUGGACGAAGUGAGACGUAUCCG
測定結果を図2及び表1に示した。測定の結果、配列番号4の核酸はオートタキシンに結合することがわかった。また、ネガティブコントロールとして使用した、30ヌクレオチドのランダム配列を含む1ラウンド目に使用した核酸プール(30N)は、結合量が配列番号4の核酸の10%以下であり、結合しない(“−”とした)ことがわかった。ここで結合量とは、最大のレゾナンスユニット(RU)値を示す。
ランダム配列が40ヌクレオチドで、プライマー配列が実施例1で用いたものと異なる鋳型を用いて、実施例1と同様のSELEXをおこなった。SELEXの標的物質としてTALON Metal Affinity Resin(Clontech社製)の担体に固相化したHisタグ付きオートタキシン(Recombinant Human、R&D社製)を用いた。使用した鋳型とプライマーの配列を以下に示す。DNA鋳型とプライマーは化学合成により作製した。
プライマーFwd:5’−TAATACGACTCACTATAGGGTGGCAACAGGACATGGAAC−3’(配列番号6)
プライマーRev:5’−GTACGAAGACGCATCTCAC−3’(配列番号7)
DNA鋳型(配列番号5)中のNは、ヌクレオチド(A,G,C又はT)の任意の組み合わせである。またプライマーFwdはT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。
配列番号8:
GGGUGGCAACAGGACAUGGAACGCGCCCCAACUGCUUGAAACAGGUUUUGCUGAGCAGUGAUGUGAGAUGCGUCUUCGUAC
配列番号9:
GGGUGGCAACAGGACAUGGAACGCGCCCCAACUGCUUGAAAC[U]GGUUUUGCUGAGCAGUGAUGUGAGAUGCGUCUUCGUAC
配列番号10:
GAAACAGGUUUUGCU
ランダム配列が30ヌクレオチドで、プライマー配列が実施例1で用いたものと異なる鋳型を用いて、実施例1と同様のSELEXをおこなった。SELEXの標的物質としてTALON Metal Affinity Resin(Clontech社製)の担体に固相化したHisタグ付きオートタキシン(Recombinant Human、R&D社製)を用いた。使用した鋳型とプライマーの配列を以下に示す。DNA鋳型とプライマーは化学合成により作製した。また、転写用のヌクレオチドは、リボヌクレオチド(A及びG及びC)とデオキシリボヌクレオチド(T)を使用した。
プライマーFwd:5’−TAATACGACTCACTATAGGGTTAGGACCACTACTACGCTG−3’(配列番号12)
プライマーRev:5’−AAGCTTCGTAAGTCGCAGTC−3’(配列番号13)
DNA鋳型(配列番号11)中のNは、ヌクレオチド(A,G,C又はT)の任意の組み合わせである。またプライマーFwdはT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。
配列番号4、8、9の核酸がオートタキシンの活性を阻害するかどうかを、下記の方法により評価した。オートタキシンの基質として、ホスホジエステル結合含有合成基質p−nitrophenyl thymidine 5’−monophosphate(pNP−TMP)(SIGMA)を選択した(以下、NPP2阻害アッセイと称する)。加水分解によりホスホジエステル結合が切断され、p−ニトロフェノールが遊離する。このp−ニトロフェノールは黄色く発色し、それを検出する。アッセイには96ウェルプレート(96−Well EIA/RIA Polystyrene Plates、 Costar社)を使用し、反応液量200μLで行った。なお、反応液として溶液Aを用いた。核酸を溶液A100μL中に用意し、そこに同じく反応液A中で10mMに調整したpNP−TMP20μLを添加してよく混合したあと、37℃で5分間加温した。一方で6ngのオートタキシンを溶液Aで希釈したものを80μL用意し、37℃で5分間加温した。加温後両者を混合し、酵素反応を開始させた。反応溶液中の最終オートタキシン濃度は0.3nM、最終基質濃度は1mMである。反応液を含むプレートを37℃で24時間加温後、マイクロプレートリーダーSpectraMax190(モレキュラーデバイス社製)にセットし、波長405nmで吸光度を求めた。核酸をいれていないときの吸光度(A0)を100%とし、各被験物質の吸光度(A)から阻害率を次式により求めた。
また、IC50値は2〜3回測定の平均値±標準偏差を示す。“>1.0”は、1.0μMまでの濃度範囲で阻害活性が見られなかったことを示す(以下のNPP2阻害アッセイについても同様)。
配列番号4、8のアプタマーの短鎖化を行った。改変体の配列を配列番号14〜24に示す。得られたアプタマーのうち、配列番号16で表わされるアプタマーの二次構造予測を図1右に示す。
配列番号14:(配列番号4で表わされるアプタマーを、共通配列を含む46ヌクレオチドの長さに短鎖化し、5’末端にGGGを、3’末端にCCCを付加した配列)
GGGCUAAACGCUCUGAGGGAAACAGGUUUUGCUCCUCGGAGCGUGGACGCCC
配列番号15:(配列番号4で表わされるアプタマーを、共通配列を含む37ヌクレオチドの長さに短鎖化し、5’末端のAをCに,3’末端のUをGに置換した配列)
[C]CGCUCUGAGGGAAACAGGUUUUGCUCCUCGGAGCG[G]
配列番号16:(配列番号4で表わされるアプタマーを、共通配列を含む29ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列)
UCUGAGGGAAACAGGUUUUGCUCCUCGGA
配列番号17:(配列番号4で表わされるアプタマーを、共通配列を含む25ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列)
UGAGGGAAACAGGUUUUGCUCCUCG
配列番号18:(配列番号4で表わされるアプタマーを、共通配列を含む27ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列)
CUGAGGGAAACAGGUUUUGCUCCUCGG
配列番号19:(配列番号4で表わされるアプタマーを、共通配列を含む25ヌクレオチドの長さに短鎖化し、ヌクレオチドを1つ置換した配列)
[C]GAGGGAAACAGGUUUUGCUCCUCG
配列番号20:(配列番号4で表わされるアプタマーを、共通配列を含む23ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列)
GAGGGAAACAGGUUUUGCUCCUC
配列番号21:(配列番号4で表わされるアプタマーを、共通配列を含む21ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列)
AGGGAAACAGGUUUUGCUCCU
配列番号22:(配列番号4で表わされるアプタマーを、共通配列を含む19ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列)
GGGAAACAGGUUUUGCUCC
配列番号23:(配列番号4で表わされるアプタマーを、共通配列を含む17ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列)
GGAAACAGGUUUUGCUC
配列番号24:(配列番号8で表わされるアプタマーを、共通配列を含む29ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列)
ACUGCUUGAAACAGGUUUUGCUGAGCAGU
DNA鋳型配列:5’−GGGCGTCCACGCTCCGAGGAGCAAAACCTGTTTCCCTCAGAGCGTTTAGCCCTATAGTGAGTCGTATTA−3’(配列番号25)
配列番号15〜24の核酸は全て化学合成により作製した。これらの核酸がオートタキシンと結合するかどうかを、実施例2と同様な表面プラズモン共鳴法により評価した。測定結果を表2に示す。表2では、結合量が配列番号4のアプタマーの10%以下であるものを結合しない(−)とし、それ以上のものは結合する(+)とした。ここで結合量とは、最大のレゾナンスユニット(RU)値を示す。
以上より、配列番号10で表わされる配列はオートタキシンを阻害するのに重要な配列であることがわかった。また、配列番号20のアプタマーの結果から、23ヌクレオチドまで短鎖化しても高い阻害活性を有していることがわかった。
配列番号16で表わされる配列をもとに、ヌクレオチドの置換、欠失を導入し、アプタマーのオートタキシン阻害活性に対する影響を調べた。作製した変異アプタマーの配列を配列番号26〜37に示す。下線は共通配列(配列番号10)部分を示し、[ ]は置換されたヌクレオチドを示し、“−”は欠失を示す。また個々の配列は、5’から3’の方向で表し、各ヌクレオチドは、プリン(A及びG)が2’−OH(天然RNA型)であり、ピリミジン(U及びC)が2’−フルオロ修飾体であることを意味している。
UCUGAGGG[U]AACAGGUU[A]UGCUCCUCGGA
配列番号27:(配列番号10で表わされる共通配列の5’末端から3番目のAをUに、10番目のUをAに置換した配列)
UCUGAGGGA[U]ACAGGU[A]UUGCUCCUCGGA
配列番号28:(配列番号10で表わされる共通配列の5’末端側から4番目のAをUに、9番目のUをAに置換した配列)
UCUGAGGGAA[U]CAGG[A]UUUGCUCCUCGGA
配列番号29:(配列番号16で表わされる配列の5’末端側から3番目のUをCに置換した配列)
UC[C]GAGGGAAACAGGUUUUGCUCCUCGGA
配列番号30:(配列番号16で表わされる配列の3’末端側から3番目のGをAに置換した配列)
UCUGAGGGAAACAGGUUUUGCUCCUC[A]GA
配列番号31:(配列番号10で表わされる共通配列の5’末端側から9番目のUをCに置換した配列)
UCUGAGGGAAACAGG[C]UUUGCUCCUCGGA
配列番号32:(配列番号10で表わされる共通配列の5’末端から12番目のUをCに置換した配列)
UCUGAGGGAAACAGGUUU[C]GCUCCUCGGA
配列番号33:(配列番号10で表わされる共通配列の5’末端から2番目のAをGに置換した配列)
UCUGAGGG[G]AACAGGUUUUGCUCCUCGGA
配列番号34:(配列番号10で表わされる共通配列の5’末端側から3番目のAをGに置換した配列)
UCUGAGGGA[G]ACAGGUUUUGCUCCUCGGA
配列番号35:(配列番号10で表わされる共通配列の5’末端側から4番目のAをGに置換した配列)
UCUGAGGGAA[G]CAGGUUUUGCUCCUCGGA
配列番号36:(配列番号10で表わされる共通配列の5’末端から10番目〜12番目のUUUのうち1塩基を欠損させた配列)
UCUGAGGGAAACAGGUUU−GCUCCUCGGA
配列番号37:(配列番号10で表わされる共通配列の5’末端側から2〜4番目のAAAのうち1塩基を欠損させた配列)
UCUGAGGGAA−CAGGUUUUGCUCCUCGGA
また、これらの核酸がオートタキシン阻害活性を示すかどうかを、実施例4と同様にNPP2阻害アッセイで測定した。そのIC50値を表3に示す。その結果、配列番号29、30、32のアプタマーはIC50値が100nM以下の高い阻害活性を示した。
配列番号16で表わされる配列のうち、配列番号10で表わされる共通配列を9%のランダム配列にドープしたRNAプールを用いてSELEXをおこなった。SELEXは実施例1とほぼ同様におこなった。そのDNA鋳型と5’末端側のプライマー配列を以下に示す。また、プライマーRevは配列番号3の核酸を使用した。DNA鋳型とプライマーは化学合成により作製した。
5’−CGGATACGTCTCACTTCGTCCACGCTCCGAGGagcaaaacctgtttcCCTCAGAGCGTTTAGAGTGCGGTCCC−3’(配列番号38)
a:a(91%), g(3%), c(3%), t(3%)
g:g(91%), a(3%), c(3%), t(3%)
c:c(91%), a(3%), g(3%), t(3%)
t:t(91%), a(3%), c(3%), g(3%)
プライマーFwd:5’−TAATACGACTCACTATAGGGACCGCACTCTAAACGC−3’(配列番号39)
UCUGAGGG[U]AACAGGUUUUGCUCCUCGGA
配列番号41:(配列番号10で表わされる共通配列の5‘末端から10番目のUがCに置換された配列)
UCUGAGGGAAACAGGU[C]UUGCUCCUCGGA
配列番号40と41のアプタマーは、いずれも共通配列(上記式(I))とステム構造から成る構造であった。特に配列番号41は配列番号16と同じ構造をとっていた。
さらに、配列番号16で表わされる配列のうち、配列番号10で表わされる共通配列以外の配列部分を9%のランダム配列にドープしたRNAプールを用いてSELEXをおこなった。SELEXは実施例1とほぼ同様におこなった。その鋳型配列を以下に示す。またプライマーは配列番号39の核酸と配列番号3の核酸とを使用した。DNA鋳型とプライマーは化学合成により作製した。
DNA鋳型
5’−CGGATACGTCTCACTTCGTCCACGCtccgaggAGCAAAACCTGTTTCcctcagaGCGTTTAGAGTGCGGTCCC−3’ (配列番号43)
a:a(91%), g(3%), c(3%), t(3%)
g:g(91%), a(3%), c(3%), t(3%)
c:c(91%), a(3%), g(3%), t(3%)
t:t(91%), a(3%), c(3%), g(3%)
UCUG[G]GGGAAACAGGUUUUGCUCC[C]CGGA
配列番号45:(配列番号10で表わされる共通配列以外の1カ所が置換された配列)
UCUGAGGGAAACAGGUUUUGCUCCUCG[A]A
配列番号46:(配列番号10で表わされる共通配列の5’末端から11番目のUがCに置換された配列)
UCUGAGGGAAACAGGUU[C]UGCUCCUCGGA
配列番号47:(配列番号10で表わされる共通配列以外の2カ所が置換された配列)
UC[C]GAGGGAAACAGGUUUUGCUCCUCG[C]A
配列番号48:(配列番号10で表わされる共通配列以外の2カ所が置換された配列)
UCUGAG[U]GAAACAGGUUUUGCU[G]CUCGGA
また、共通配列以外の部分では、共通配列(上記式(I’))とステム構造とから成る二次構造をとり得る限り、ステム部分に数個の変異が導入されても活性に影響が出ないことが示された。更に、配列番号45と47(MFOLDによる二次構造予測では末端の2ヌクレオチドはステム構造をとらない)の結果から、ステム構造の長さは7である必要はなく、より短いものでもよいことがわかった。これは配列番号17のアプタマーに活性があることと一致する。
さらに、配列番号16で表わされる配列のうち、配列番号10で表わされる共通配列以外の配列部分を45%のランダム配列にドープしたRNAプールを用いてSELEXをおこなった。SELEXは実施例1とほぼ同様におこなった。そのDNA鋳型として配列番号43を使用した。またプライマーは配列番号39と配列番号3を使用した。
a:a(55%), g(15%), c(15%), t(15%)
g:g(55%), a(15%), c(15%), t(15%)
c:c(55%), a(15%), g(15%), t(15%)
t:t(55%), a(15%), c(15%), g(15%)
U[A][G][A]GA[U]GGAAACAGGUUUUGCUC[A]UC[U][C]A
配列番号51:(配列番号10で表わされる共通配列以外の5カ所が置換された配列)
U[U]UGA[A]GGAAACAGGUUUUGCUC[U]UCG[A][G]
配列番号52:(配列番号10で表わされる共通配列以外の4カ所が置換された配列)
U[U][C]GAGGGAAACAGGUUUUGCUCCUC[A][A]A
配列番号53:(配列番号10で表わされる共通配列以外の7カ所が置換された配列)
U[G][G]GA[A]GGAAACAGGUUUUGCUC[U]UC[A][C][C]
配列番号16で表わされるアプタマーの末端を修飾した改変体や、配列中のプリンヌクレオチドのリボースの2’位に修飾を導入した改変体、デオキシリボヌクレオチドに置換した改変体を作製した。それらの配列を配列番号16(1)〜16(68)に示す。核酸は全て化学合成により作製した。
U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)GAAAC(F)AGGU(F)U(F)U(F)U(F)GC(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)
配列番号16(2):(配列番号16で表わされるアプタマーに修飾を導入した配列)
U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AA(M)C(F)A(M)GGU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)
配列番号16(3):(配列番号16(1)で表わされるアプタマーの両末端にidT修飾を導入した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)GAAAC(F)AGGU(F)U(F)U(F)U(F)GC(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(4):(配列番号16(2)で表わされるアプタマーの両末端にidT修飾を導入した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AA(M)C(F)A(M)GGU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(5):(配列番号16(4)で表わされるアプタマーの配列のうち1か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AA(M)C(F)A(M)gGU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(6):(配列番号16(4)で表わされるアプタマーの配列のうち2か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(7):(配列番号16(4)で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AsA(M)C(F)A(M)GGU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(8):(配列番号16(4)で表わされるアプタマーの配列の5’末端に40kDaポリエチレングリコールを導入した配列)
40PP−Y−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AA(M)C(F)A(M)GGU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(9):(配列番号16(4)で表わされるアプタマーの配列の5’末端に80kDaポリエチレングリコールを導入した配列)
80PP−Y−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AA(M)C(F)A(M)GGU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(10):(配列番号16(4)で表わされるアプタマーの配列のうち3か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−tctG(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AA(M)C(F)A(M)GGU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(11):(配列番号16(4)で表わされるアプタマーの配列のうち2か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AA(M)C(F)A(M)GGU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)tcG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(12):(配列番号16(4)で表わされるアプタマーの配列のうち2か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AA(M)C(F)A(M)GGU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)ccU(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(13):(配列番号16(4)で表わされるアプタマーの配列のうち1か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AA(M)C(F)A(M)GGU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)tC(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(14):(配列番号16(4)で表わされるアプタマーの配列のうち1か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)GGU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(15):(配列番号16(4)で表わされるアプタマーの配列のうち1か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AA(M)C(F)A(M)GGU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)cU(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(16):(配列番号16(4)で表わされるアプタマーの配列のうち1か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AA(M)C(F)A(M)GGU(F)U(F)U(F)tG(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(17):(配列番号16(4)で表わされるアプタマーの配列のうち1か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AA(M)C(F)A(M)GGU(F)U(F)tU(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(18):(配列番号16(4)で表わされるアプタマーの配列のうち1か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AA(M)C(F)A(M)GGU(F)tU(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(19):(配列番号16(4)で表わされるアプタマーの配列のうち1か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AA(M)C(F)A(M)GGtU(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(20):(配列番号16(4)で表わされるアプタマーの配列のうち1か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)G(F)A(M)AA(M)cA(M)GGU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(21):(配列番号16(6)で表わされるアプタマーの配列のうち1か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(22):(配列番号16(21)で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(23):(配列番号16(22)で表わされるアプタマーの配列の5’末端idTの代わりに40kDaのポリエチレングリコールを導入したもの。)
40P−Y−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(24):(配列番号16(21)で表わされるアプタマーの配列の5’末端idTの代わりに40kDaのポリエチレングリコールを導入したもの。)
40P−Y−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(25):(配列番号16(6)で表わされるアプタマーの配列のうち4か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−tctG(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(26):(配列番号16(6)で表わされるアプタマーの配列のうち2か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(27):(配列番号16(6)で表わされるアプタマーの配列のうち2か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)tC(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(28):(配列番号16(6)で表わされるアプタマーの配列のうち2か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)cU(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(29):(配列番号16(6)で表わされるアプタマーの配列のうち2か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)cC(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(30):(配列番号16(21)で表わされるクローンの配列の5’末端idTの代わりにssHリンカーを導入した配列)
Y−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(31):(配列番号16(22)で表わされるアプタマーの配列の5’末端idTの代わりにssHリンカーを導入した配列)
Y−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(32):(配列番号16(21)で表わされるアプタマーの配列のうち6か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−tctG(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)ccU(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(33)(配列番号16(21)で表わされるアプタマーの配列のうち3か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)ccU(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(34)配列番号16(32)で表わされるアプタマーの配列の5’末端idTの代わりに40kDaのポリエチレングリコールを導入したもの)
40P−Y−tctG(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)ccU(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(35)(配列番号16(33)で表わされるアプタマーの配列の5’末端idTの代わりに40kDaのポリエチレングリコールを導入したもの)
40P−Y−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)ccU(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(36):(配列番号16(32)で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入した配列)
idT−tctG(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)ccU(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(37):(配列番号16(33)で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)ccU(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(38):(配列番号16(21)で表わされるアプタマーの配列のうち2か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(39):(配列番号16(38)で表わされるアプタマーの配列の5’末端idTの代わりに40kDaのポリエチレングリコールを導入したもの)
40P−Y−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(40):(配列番号16(21)で表わされるアプタマーの配列のうち1か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−tC(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(41):(配列番号16(21)で表わされるアプタマーの配列のうち1か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)cU(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(42):(配列番号16(21)で表わされるアプタマーの配列のうち1か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−U(F)C(F)tG(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(43)(配列番号16(21)で表わされるアプタマーの配列の5’末端idTの代わりに80kDaのポリエチレングリコールを導入したもの)
80P−Y−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(44)(配列番号16(43)で表わされるアプタマーにホスホロチオエートを導入した配列)
80P−Y−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(45)(配列番号16(21)で表わされるアプタマーの配列の5’末端idTの代わりに80kDaのポリエチレングリコールを導入したもの)
80PPP−Y−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(46)(配列番号16(45)で表わされるアプタマーにホスホロチオエートを導入した配列)
80PPP−Y−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(47):(配列番号16(21)で表わされるアプタマーの配列のうち3か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−tC(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(48):(配列番号16(47)で表わされるアプタマーの配列の5’末端idTの代わりに80kDaのポリエチレングリコールを導入したもの)
80P−Y−tC(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(49):(配列番号16(48)で表わされるアプタマーにホスホロチオエートを導入した配列)
80P−Y−tC(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(50):(配列番号16(38)で表わされるアプタマーの配列の5’末端idTの代わりに80kDaのポリエチレングリコールを導入したもの)
80P−Y−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(51):(配列番号16(50)で表わされるアプタマーにホスホロチオエートを導入した配列)
80P−Y−U(F)C(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(52):(配列番号16(40)で表わされるアプタマーの配列の5’末端idTの代わりに80kDaのポリエチレングリコールを導入したもの)
80P−Y−tC(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(53):(配列番号16(52)で表わされるアプタマーにホスホロチオエートを導入した配列)
80P−Y−tC(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)C(F)C(F)U(F)C(F)G(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(54):(配列番号16(36)で表わされるアプタマーの配列の5’末端idTの代わりに80kDaのポリエチレングリコールを導入したもの)
80P−Y−tctG(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)ccU(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(55):(配列番号16(47)で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入し、さらに2か所にメトキシ修飾を導入した配列)
idT−tC(M)U(M)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(56):(配列番号16(47)で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入し、さらに2か所にメトキシ修飾を導入した配列)
idT−tC(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)cC(M)U(M)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(57):(配列番号16(47)で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入し、さら1か所にメトキシ修飾を導入した配列)
idT−tC(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(M)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(58):(配列番号16(47)で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入し、さらに1か所にメトキシ修飾を導入した配列)
idT−tC(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(M)U(F)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(59):(配列番号16(47)で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入し、さらに1か所にメトキシ修飾を導入した配列)
idT−tC(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(M)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(60):(配列番号16(47)で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入し、さらに1か所にメトキシ修飾を導入した配列)
idT−tC(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(M)G(M)C(F)U(F)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(61):(配列番号16(47)で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入し、さらに1か所にメトキシ修飾を導入した配列)
idT−tC(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(M)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(62):(配列番号16(47)で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入し、さらに1か所にメトキシ修飾を導入した配列)
idT−tC(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(M)U(F)G(M)C(F)U(F)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(63):(配列番号16(49)で表わされるアプタマーの配列の5’末端のポリエチレングリコールを80kDaから40kDaに変更した配列)
40P−Y−tC(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(64):(配列番号16(49)で表わされるアプタマーの配列の5’末端のポリエチレングリコールの種類を変更した配列)
80PPP−Y−tC(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(65):(配列番号16(49)で表わされるアプタマーの配列の5カ所にメトキシ修飾を導入した配列)
80P−Y−tC(M)U(M)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(M)cC(M)U(M)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(66):(配列番号16(65)で表わされるアプタマーの配列の5’末端のポリエチレングリコールを80kDaから40kDaに変更した配列)
40P−Y−tC(M)U(M)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(M)cC(M)U(M)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(67):(配列番号16(49)で表わされるアプタマーの配列の6カ所にメトキシ修飾を導入した配列)
80P−Y−tC(M)U(M)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(M)U(M)cC(M)U(M)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(68):(配列番号16(47)で表わされるアプタマーの配列にホスホロジチオエートを導入し、さらに1か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列)
idT−tC(F)U(F)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)assA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(F)cC(F)U(F)cG(M)G(M)A(M)−idT
配列番号16(1)〜16(68)で表わされるアプタマーは、配列番号10で表わされる共通配列の部分及びステム部分の修飾を変えたものであるが、どれもオートタキシンに対して阻害活性を示した。これはリボースの2’位の修飾が各種変更可能であることを示している。
また、ホスホロチオエート及びホスホロジチオエート修飾を施すことで活性が向上することがわかった。
配列番号16(23)で表わされるアプタマーがFGF2(ぺプロテック社)に対して結合活性を有しているかどうか表面プラズモン共鳴法で確認した。オートタキシンをフローセル2に、FGF2をフローセル3に固定化し(約1100RU)、アプタマーをインジェクションした。他は実施例2と同様に行った。測定の結果、配列番号16(23)で表わされるアプタマーはFGF2には結合しないことがわかった(図3)。これは、本発明のアプタマーがオートタキシンに特異的に結合することを示している。
実施例10で作製した配列番号16(49)で表わされるアプタマーを、ブレオマイシン誘導型肺線維症モデルマウスに腹腔内投与し、その効果を検証した。
ICR系SPFマウス(10週齢、雄、日本チャールズリバー)に対し、PBSで770μg/mLに調整したブレオマイシン50μLを、麻酔下、気管内投与した。ブレオマイシンを投与した翌日から毎日1回、1mM塩化マグネシウム入りPBSに溶かしたオートタキシンアプタマー溶液、又は1mM塩化マグネシウム入りPBSのみ(ビークル群)を、1回の投与量100μLで腹腔内投与した。アプタマー投与量は1及び3mg/kg/日の2用量とした。また、無処置のコントロール群も同じ試験期間飼育した。ブレオマイシン投与開始から21日目に試験を終了し、肺を摘出、左肺をヒドロキシプロリン測定用に凍結保存した。さらに右肺は10%ホルマリン溶液で固定し、組織切片を作製してマッソン・トリクローム染色を行った。ヒドロキシプロリンの測定はバイオビジョン社のHydroxyproline Colorimetric Assay キットを用いて測定した。また線維化のクリニカルスコアとして評価する方法は以下のように行った。すなわち、全観察面の領域においてコラーゲン線維の増生がないものを0、約25%まで見られるものを1、約25%〜50%まで見られるものを2、約50%〜75%まで見られるものを3、75%以上の場合を4とした。なお、統計学的有意差の評価はコントロール群とビークル群との検定はT検定、ビークル群と薬剤投与群の検定で等分散のものはDunnett検定、不等分散のものはSteel検定で行った。
以上より、配列番号16(49)で表わされるアプタマーは肺線維症治療薬として使用可能であることが示唆された。
本出願は、日本で出願された特願2014−090755(出願日:平成26年4月24日)を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
Claims (18)
- オートタキシンに結合する、塩基長が21以上のアプタマーであって、下式:
GWAACAGGUUUUGCU(配列番号42)
(式中、WはA又はUである)
で表わされるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい)を含み、かつ以下の(a)又は(b)のいずれかである、アプタマー:
(a)該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフッ素原子であり、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位がヒドロキシ基である、アプタマー;
(b)該(a)のアプタマーにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。 - WがAである、請求項1に記載のアプタマー。
- 配列番号16で表わされるヌクレオチド配列を含む、請求項1又は2に記載のアプタマー。
- オートタキシンに結合する、塩基長が21以上のアプタマーであって、下式:
GWAACAGGUYYYGCU(配列番号49)
(式中、WはA又はUであり、YはU又はCである)
で表わされるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい)を含み、かつ以下の(a)又は(b)のいずれかである、オートタキシンに結合するアプタマー:
(a)該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフッ素原子であり、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位がヒドロキシ基である、アプタマー;
(b)該(a)のアプタマーにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。 - オートタキシンに結合する、塩基長が21以上のアプタマーであって、
下記(A)、(B)又は(C):
(A)配列番号4、8、14〜20、24、29、30、32、40、41、44〜48及び50〜53から選択されるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい);
(B)配列番号4、8、14〜20、24、29、30、40、44、45、47、48及び50〜53から選択されるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい)(GWAACAGGUUUUGCU(配列番号42)(式中、WはA又はUである)で表わされる配列を除く)において、1〜5個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列;
(C)配列番号4、8、14〜20、24、29、30、40、44、45、47、48及び50〜53から選択されるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい)と70%以上の同一性を有する(但し、GWAACAGGUUUUGCU(配列番号42)(式中、WはA又はUである)で表わされる配列は同一である)ヌクレオチド配列;
のいずれかのヌクレオチド配列を含み、かつ
以下の(a)又は(b)のいずれかである、アプタマー:
(a)該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフッ素原子であり、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位がヒドロキシ基である、アプタマー;
(b)該(a)のアプタマーにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。 - オートタキシンに結合する、塩基長が21以上のアプタマーであって、
下記(A’)、(B’)又は(C’):
(A’)配列番号16で表わされるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい);
(B’)配列番号16で表わされるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい)(GAAACAGGUUUUGCU(配列番号10)で表わされる配列を除く)において、1〜7個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列;
(C’)配列番号16で表わされるヌクレオチド配列(但し、ウラシルはチミンであってもよい)と70%以上の同一性を有する(但し、GAAACAGGUUUUGCU(配列番号10)で表わされる配列は同一である)ヌクレオチド配列;
のいずれかのヌクレオチド配列を含み、かつ
以下の(a)又は(b)のいずれかである、アプタマー:
(a)該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフッ素原子であり、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位がヒドロキシ基である、アプタマー;
(b)該(a)のアプタマーにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。 - 少なくとも一つのヌクレオチドが修飾もしくは改変されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載のアプタマー。
- inverted dT又はポリエチレングリコールで修飾されている、請求項7に記載のアプタマー。
- inverted dT又はポリエチレングリコールが、アプタマーの5’末端もしくは3’末端に結合している、請求項8に記載のアプタマー。
- アプタマーに含まれるリン酸基の少なくとも一つが、ホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化されたものである、請求項1〜9のいずれか1項に記載のアプタマー。
- オートタキシンに結合するアプタマーであって、配列番号16で表わされるヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列中、GAAACAGGUUUUGCU(配列番号10)で表わされる配列におけるリン酸基の少なくとも一つがホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化されたものであり、アプタマーの5’末端もしくは3’末端がそれぞれinverted dT又はポリエチレングリコールで修飾されたものであり、かつ以下の(a)又は(b)のいずれかである、アプタマー:
(a)該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフッ素原子であり、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位がヒドロキシ基である、アプタマー;
(b)該(a)のアプタマーにおいて、
(i)各ピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
(ii)各プリンヌクレオチドのリボースの2’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。 - 請求項1〜11のいずれか1項に記載のアプタマーと機能性物質とを含む複合体。
- 機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物、毒素又は薬物送達媒体である、請求項12に記載の複合体。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の塩基長が23以上のアプタマー、あるいは請求項12又は13に記載の複合体を含む医薬。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の塩基長が23以上のアプタマー、あるいは請求項12又は13に記載の複合体を含む抗線維化剤。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のアプタマー、あるいは請求項12又は13に記載の複合体を含むオートタキシンの検出用プローブ。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のアプタマー、あるいは請求項12又は13に記載の複合体を用いることを特徴とする、オートタキシンの検出方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の塩基長が23以上のアプタマーを含んでなる、オートタキシンの阻害剤。
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