KR20160147884A

KR20160147884A - 오토탁신에 결합하여 오토탁신의 생리 활성을 저해하는 압타머 및 그의 이용

Info

Publication number: KR20160147884A
Application number: KR1020167032546A
Authority: KR
Inventors: 히사오 이케다
Original assignee: 가부시키가이샤 리보믹
Priority date: 2014-04-24
Filing date: 2015-04-24
Publication date: 2016-12-23
Also published as: US20170044545A1; EP3135766B1; JP6586669B2; CA2946709A1; JPWO2015163458A1; AU2015250584A1; EP3135766A1; EP3135766A4; WO2015163458A1; CN106232817A

Abstract

본 발명은 오토탁신에 결합하는 압타머로서, 하기 식: GWAACAGGUUUUGCU(서열번호 42)(식 중, W는 A 또는 U이다)로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다)을 포함하고, 또한 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것인 압타머: (a) 상기 압타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서, (i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 불소 원자이고, (ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 히드록시기인 압타머; (b) 상기 (a)의 압타머에 있어서, (i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 불소 원자가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고, (ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록시기가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 압타머를 제공한다.

Description

오토탁신에 결합하여 오토탁신의 생리 활성을 저해하는 압타머 및 그의 이용{APTAMER FOR BONDING TO AUTOTAXIN AND INHIBITING BIOLOGICAL ACTIVITY OF AUTOTAXIN, AND USE FOR SAME}

본 발명은 오토탁신(autotaxin)에 대한 압타머(aptamer) 및 그의 이용 방법 등에 관한 것이다.

오토탁신은 멜라노마 세포의 운동성을 항진시키는 분자로서 동정된 분비 단백질이다. Enpp(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase) 패밀리 단백질에 속하며 Enpp2로서도 알려져 있다. 포스포디에스테라제 활성을 가지며 세포 밖의 뉴클레오티드 대사에 관계된다. 또한, Lyso Phospholipase D 활성(Lyso PLD 활성)을 가지며, 리소포스파티딜콜린(LPC)을 리소포스파티딘산(LPA)과 콜린으로 분해하는 효소이기도 하다. 산생(産生)된 LPA는 지질 메디에이터로서, 세포 운동 활성화, 세포 증식, 혈관 신생 등 여러 가지 생리 활성을 나타낸다. LPA는 암 세포의 증식, 전이 등에 관계하고 있다고 하여, 많은 연구가 이루어지고 있다. 또한 LPA의 산생 효소인 오토탁신도 암 환자의 혈중이나 복수 중에서 발현이나 활성이 상승하고 있다고 하는 보고가 다수 존재한다.

최근, 블레오마이신 유도에 의한 폐섬유증 모델에 있어서, LPA 수용체 LPA1의 녹아웃 마우스나 LPA1 저해제에 의한 섬유화 억제 효과가 보고되어, LPA와 폐섬유증의 관계가 시사되어 있고, LPA의 산생 효소인 오토탁신에 대해서도 폐섬유증과의 관계에 주목이 모아지고 있다.

그 중에서 항오토탁신 모노클로날 항체가 간질성 폐렴 및/또는 폐섬유증에 대한 예방 및/또는 치료 효과를 갖는 것이 보고되었다. 또한 오토탁신 저분자 저해제에 의해, 블레오마이신 유도에 의한 폐섬유증 모델에 있어서의 섬유증 억제 효과도 보고되었다. 어느 보고에서도, 특발성 폐섬유증 환자의 폐포 세정액 중에 오토탁신이 존재하여, 건강인과 비교하여 그 농도나 활성이 높은 것이 나타나 있다.

특발성 폐섬유증은 5년 생존율이 30％라고 하는 매우 예후가 나쁜 질환이다. 그 메커니즘은 불명한 점이 많지만, 일반적으로 폐포 등이 손상을 받음으로써, 조직 수복 기구가 과잉으로 작용하여, 폐간질부에 있어서, 섬유아 세포의 이상 증식이나 결합 조직 단백질의 과잉 생산이 일어난다고 되어 있다. 현재, 세계적인 표준 치료로서 스테로이드, 면역 억제제 등이 사용되고 있지만, 2008년, 세계에 앞서 일본에서 특발성 폐섬유증의 치료약으로서, 피레스파(일반명: 피르페니돈)가 승인되어, 그 유효성 등이 임상의 자리에서도 검토되어 있다. 그러나, 피레스파가 무엇을 표적으로 하고 있는지 등, 그 작용 메커니즘은 불명한 점이 많다.

압타머는 표적 분자(단백질, 당쇄, 호르몬 등)에 특이적으로 결합하는 핵산을 의미한다. 단일쇄의 RNA(또는 DNA)가 취하는 3차원 입체 구조에 의해, 표적 분자에 결합한다. 그 취득에는 SELEX법(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)으로 불리는 스크리닝법이 이용된다(특허문헌 1∼3). SELEX법으로 얻어지는 압타머는 80 뉴클레오티드 정도의 쇄장이며, 그 후 표적 분자의 생리 저해 활성을 지표로 단쇄화를 도모한다. 또한 생체 내에서의 안정성 향상을 목적으로 화학 수식을 더하여, 의약품으로서의 최적화를 도모한다.

압타머는 표적 분자와의 결합 특성이 높고, 동일한 기능을 갖는 항체와 비교하여도 그 친화성은 높은 경우가 많다. 또한 면역 배제를 받기 어려워, 항체 특유의 항체 의존성 세포 장해(ADCC)나 보체 의존성 세포 장해(CDC) 등의 부작용은 발생하기 어렵다고 되어 있다. 딜리버리의 관점에서는, 압타머는 항체의 1/10 정도의 분자 사이즈이기 때문에 조직 이행이 일어나기 쉬워, 원하는 부위까지 약물을 송달시키는 것이 보다 용이하다. 또한 동일한 분자 표적 의약의 저분자에 있어서는, 그 중에는 난용성의 것도 있어, 그 제제화에는 최적화가 필요한 경우도 있지만, 압타머는 수용성이 높기 때문에, 그 점에서도 유리하다. 또한 화학 합성에 의해 생산되기 때문에, 대량 생산하면 비용 절감을 도모할 수 있다. 그 외, 장기간 보존 안정성이나 열·용매 내성도 압타머의 우수한 특징이다. 한편으로, 일반적으로 압타머의 혈중 반감기는 항체보다 짧다. 그러나, 이 점도 독성을 고려한 경우는 메리트가 되는 경우가 있다.

2004년 12월에는 세계 최초의 RNA 압타머 의약인 Macugen이 가령 황반 변성증의 치료약으로서 미국에서 승인되어 있고, RNA 압타머의 치료약, 진단약, 시약에의 응용이 주목되어, 차세대 의약품으로서 기대되고 있다.

특허문헌 1: 국제 공개 제91/19813호 팜플렛 특허문헌 2: 국제 공개 제94/08050호 팜플렛 특허문헌 3: 국제 공개 제95/07364호 팜플렛

본 발명은 오토탁신에 대한 압타머 및 그의 이용 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해, 예의 검토한 결과, 오토탁신에 대한 양질의 압타머를 제작하는 것에 성공하였고, 따라서 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 발명들을 제공하는 것이다.

[1] 오토탁신에 결합하는 압타머로서, 하기 식:

GWAACAGGUUUUGCU (서열번호 42)

(식 중, W는 A 또는 U이다)

으로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다)을 포함하고, 또한 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것인 압타머:

(a) 상기 압타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,

(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 불소 원자이고,

(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 히드록시기인 압타머;

(b) 상기 (a)의 압타머에 있어서,

(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 불소 원자가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고,

(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록시기가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 압타머.

[2] W가 A인, [1]에 기재된 압타머.

[3] 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, [1] 또는 [2]에 기재된 압타머.

[4] [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 압타머에 있어서, 서열번호 10으로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중에 1개∼수 개의 뉴클레오티드가 치환, 삽입 또는 부가되고, 또한 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것인, 오토탁신에 결합하는 압타머:

(a) 상기 치환, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드에 있어서,

(b) 상기 (a)의 치환, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드에 있어서,

[5] 오토탁신에 결합하는 압타머로서,

하기 (A), (B) 또는 (C):

(A) 서열번호 4, 8, 14∼20, 24, 29, 30, 32, 40, 41, 44∼48 및 50∼53에서 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다);

(B) 서열번호 4, 8, 14∼20, 24, 29, 30, 40, 44, 45, 47, 48 및 50∼53에서 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다)에 있어서, 1개∼수 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열;

(C) 서열번호 4, 8, 14∼20, 24, 29, 30, 40, 44, 45, 47, 48 및 50∼53에서 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다)과 60％ 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열

중 어느 것의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또한 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것인 압타머:

(a) 상기 압타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,

(b) 상기 (a)의 압타머에 있어서,

[6] 오토탁신에 결합하는 압타머로서,

하기 (A'), (B') 또는 (C'):

(A') 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다);

(B') 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다)(GAAACAGGUUUUGCU(서열번호 10)로 표시되는 서열을 제외한다)에 있어서, 1개∼7개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열;

(C') 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다)과 70％ 이상의 동일성을 갖는(단, GAAACAGGUUUUGCU(서열번호 10)로 표시되는 서열은 동일하다) 뉴클레오티드 서열

(a) 상기 압타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,

(b) 상기 (a)의 압타머에 있어서,

[7] 염기 길이가 23 이상인, [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 압타머.

[8] 하나 이상의 뉴클레오티드가 수식 또는 개변되어 있는, [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 압타머.

[9] 역위(inverted) dT 또는 폴리에틸렌 글리콜로 수식되어 있는, [8]에 기재된 압타머.

[10] 역위 dT 또는 폴리에틸렌 글리콜이 압타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 결합하고 있는, [9]에 기재된 압타머.

[11] 압타머에 포함되는 인산기 중 하나 이상이 포스포로티오에이트화(phosphorothioated) 또는 포스포로디티오에이트화(phosphorodithioated)된 것인, [1]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 압타머.

[12] 오토탁신에 결합하는 압타머로서, 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 중,

GAAACAGGUUUUGCU(서열번호 10)로 표시되는 서열에 있어서의 인산기 중 하나 이상이 포스포로티오에이트화 또는 포스포로디티오에이트화된 것이며, 압타머의 5' 말단 또는 3' 말단이 각각 역위 dT 또는 폴리에틸렌 글리콜로 수식된 것이고, 또한 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것인 압타머:

(a) 상기 압타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,

(b) 상기 (a)의 압타머에 있어서,

[13] [1]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 압타머와 기능성 물질을 포함하는 복합체.

[14] 기능성 물질이 친화성 물질, 표지용 물질, 효소, 약물, 독소 또는 약물 송달 매체인, [13]에 기재된 복합체.

[15] [1]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 압타머, 또는 [13] 또는 [14]에 기재된 복합체를 포함하는 의약.

[16] [1]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 압타머, 또는 [13] 또는 [14]에 기재된 복합체를 포함하는 항섬유화제.

[17] [1]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 압타머, 또는 [13] 또는 [14]에 기재된 복합체를 포함하는, 오토탁신의 검출용 프로브.

[18] [1]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 압타머, 또는 [13] 또는 [14]에 기재된 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는, 오토탁신의 검출 방법.

[19] [1]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 압타머를 포함하여 이루어지는, 오토탁신의 저해제.

본 발명의 압타머 및 복합체는, 예컨대 섬유증이나 암 등의 오토탁신에 기인하는 여러 가지 질환에 대한 의약, 혹은 진단약, 시약으로서 유용할 수 있다. 본 발명의 압타머 및 복합체는 또한, 오토탁신의 정제 및 농축과 오토탁신의 검출 및 정량에 유용할 수 있다.

도 1은 서열번호 4 및 16으로 표시되는 압타머의, MFOLD 프로그램에 의해 예상되는 2차 구조를 나타내는 도면이다. 서열번호 10으로 표시되는 서열의 뉴클레오티드를 동그라미 문자로 나타낸다.
도 2는 서열번호 4로 표시되는 압타머가 오토탁신에 결합하는 모습을 나타내는 도면이다. 30N은 30 뉴클레오티드의 랜덤 서열을 포함한 RNA 풀이다. 캡처 분자로서, 압타머 또는 네거티브 컨트롤의 30N을 고정화하고, 애널라이트(analyte)로서 인간 오토탁신을 흐르게 하였다. 측정은 GE 헬스케어사 제조의 Biacore T100으로 행하였다.
도 3은 서열번호 16(23)으로 표시되는 압타머가 FGF2에 대하여 결합 활성을 갖고 있지 않은 것을 나타내는 도면이다.
도 4는 블레오마이신 유도형 폐섬유증 모델 마우스에 있어서의 폐 중 하이드록시프롤린 양에 미치는 오토탁신 압타머 투여의 효과를 나타내는 도면이다. 블레오마이신 투여의 다음날부터, 2종류의 용량의 오토탁신 압타머(서열번호 16(49))를 연일 투여한 군과, 비이클 투여군에서, 투여 종료 후에 적출한 좌측 폐 중의, 폐 중량당 하이드록시프롤린 양을 측정하여, 비교하였다. 컨트롤군은 무처치(블레오마이신 비투여)의 마우스를 나타낸다.
도 5는 블레오마이신 유도형 폐섬유증 모델 마우스에 있어서의 섬유화의 임상 소견에 미치는 오토탁신 압타머 투여의 효과를 나타내는 도면이다. 블레오마이신 투여의 다음날부터, 2종류의 용량의 오토탁신 압타머(서열번호 16(49))를 연일 투여한 군과, 비이클 투여군에서, 투여 종료 후에 폐를 적출하여 조직 세그먼트를 제작하여, 섬유화를 클리니컬 스코어로 평가하였다. 컨트롤군은 무처치(블레오마이신 비투여)의 마우스를 나타낸다.

본 발명은 오토탁신에 대하여 결합 활성을 갖는 압타머(이하, 본 발명의 압타머라고도 함)를 제공한다. 또한 본 발명의 압타머는, 오토탁신의 활성을 저해할 수 있다.

압타머란, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 압타머는, 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 압타머는, 오토탁신에 대하여 결합 활성을 가지고, 오토탁신의 활성을 저해할 수 있는 압타머이다. 또한 본 발명의 압타머는, RNA, DNA, 수식 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 압타머는 또한, 직쇄형 또는 환형의 형태일 수 있다.

오토탁신(EC.3.1.4.39)은 혈액 중에 존재하는 당단백질로, 리소포스파티딜콜린(LPC)을 리소포스파티딘산(LPA)과 콜린으로 분해하는 효소이다. 본 발명의 압타머는, 임의의 포유 동물에 유래하는 오토탁신에 대한 저해 활성을 가질 수 있다. 이러한 포유 동물로서는, 예컨대, 영장류(예, 인간, 원숭이), 설치류(예, 마우스, 랫트, 모르모트, 햄스터) 및 페트, 가축 및 사역 동물(예, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양, 돼지)을 들 수 있지만, 바람직하게는 인간이다.

인간 오토탁신은 α, β, γ, δ의 4개의 아이소타이프가 보고되어 있지만, 본 발명에 있어서 인간 오토탁신은 특히 β 타입을 의미한다. 인간 β-오토탁신의 아미노산 서열은 NCBI 액세션 번호 NP_001035181로 특정되는 아미노산 서열을 갖는 인간 오토탁신을 말하지만, 이들과 실질적으로 동등한 LPA 합성 활성을 갖는 부분 단백질 또는 일부의 아미노산이 치환, 결손, 부가 혹은 삽입된 이변 단백질도 이것에 포함된다.

본 발명의 압타머는, 생리적인 완충액 중에서 오토탁신에 결합한다. 완충액으로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, pH가 약 5.0∼10.0 정도인 것이 바람직하게 이용되고, 이러한 완충액으로서는, 예컨대 후술하는 용액 A(실시예 1 참조)를 들 수 있다. 본 발명의 압타머는, 이하 중 어느 하나의 시험에 의해 검출 가능한 정도의 강도로 오토탁신에 결합하는 것이다.

결합 강도의 측정에는 GE 헬스케어사 제조의 Biacore T100을 이용한다. 하나의 측정 방법으로서는, 우선 센서 칩에 압타머를 고정화한다. 고정화량은 약 1500 RU로 한다. 애널라이트용의 오토탁신 용액은 0.020 μM로 조제한 것을 20 μL 인젝트하여, 오토탁신의 압타머에의 결합을 검출한다. 30 뉴클레오티드로 이루어지는 랜덤의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA를 네거티브 컨트롤로 하고, 상기 컨트롤 RNA와 비교하여 오토탁신이 유의하게 강하게 압타머에 결합한 경우, 상기 압타머는 오토탁신에의 결합능을 갖는다고 판정할 수 있다.

별도의 측정 방법으로서는, 먼저 센서 칩에 오토탁신을 고정화한다. 고정화량은 약 2700 RU로 한다. 애널라이트용의 압타머 용액은 0.30 μM로 조제한 것을 20 μL 인젝트하여, 압타머의 오토탁신에의 결합을 검출한다. 30 뉴클레오티드로 이루어지는 랜덤의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA를 네거티브 컨트롤로 하고, 상기 컨트롤 RNA와 비교하여 압타머가 유의하게 강하게 오토탁신에 결합한 경우, 상기 압타머는 오토탁신에의 결합능을 갖는다고 판정한다.

오토탁신에 대한 저해 활성이란, 오토탁신이 보유하는 임의의 활성에 대한 저해능을 의미한다. 오토탁신은 가수 분해에 의해 포스포디에스테르 결합을 절단하는 포스포디에스테라제 활성을 가지고 있는데, 그것을 저해한다고 하는 것이다. 효소 활성에 대한 기질로서 허용되는 것은 생체 내에 존재하는 포스포디에스테르 결합 함유 물질(예컨대 ATP 등)에 한정되지 않고, 그것이 포함되는 화합물에 발색 물질이나 형광 물질이 부가된 기질을 포함한다. 발색 물질이나 형광 물질은, 당업자에게 공지이다. 또한, 오토탁신은 리소포스포리파아제 D 활성을 가지고 있다. 이 활성은 리소인 지질의 포스포디에스테르의 글리세롤 골격과는 반대측의 결합을 절단하여, 주로 리소포스파티딘산(LPA)을 산생하는데, 이 산생을 억제하는 것도 오토탁신 활성을 저해하는 것에 포함된다.

오토탁신의 기질이란 오토탁신에 의해 가수 분해를 받아, 절단되는 포스포디에스테르 결합을 갖는 물질을 말한다. 생체 내에 존재하는 오토탁신의 기질은 리소포스파티딜콜린(LPC)과 스핑고실포스포릴콜린(SPC)이 알려져 있다. 본 명세서에 있어서의 오토탁신의 기질로서는 여러 가지 탄소쇄장과 불포화도를 갖는 LPC나 SPC, 이들에 발색 물질이나 형광 물질이 부가된 기질도 포함된다.

오토탁신의 효소 활성을 압타머가 저해하는지의 여부는, 예컨대 이하의 시험에 의해 평가할 수 있다. 오토탁신의 기질로서, 포스포디에스테르 결합 함유 합성 기질 p-니트로페닐 티미딘 5'-모노포스페이트(pNP-TMP)(SIGMA)를 이용한다. 가수 분해에 의해 포스포디에스테르 결합이 절단되어, p-니트로페놀이 유리한다. 이 p-니트로페놀은 노랗게 발색하여, 그것을 검출한다. 어세이에는 96 웰 플레이트(96-Well EIA/RIA Polystyrene Plates, Costar사)를 사용하며, 반응액량 200 μL에서 행한다. 핵산을 용액 A(후술하는 실시예 1을 참조) 100 μL 중에 준비하고, 거기에 동일하게 반응액 A 중에서 조정한 10 mM pNP-TMP, 20 μL를 첨가하여 잘 혼합한 후, 37℃에서 5분간 가온한다. 한쪽에서 6 ng의 오토탁신(Recombinant Human, R&D사 제조)을 용액 A로 희석한 것을 80 μL 준비하고, 37℃에서 5분간 가온한다. 가온 후 양자를 혼합하여 효소 반응을 개시시킨다. 반응 용액 중의 최종 오토탁신 농도는 0.3 nM, 최종 기질 농도는 1 mM이다. 반응액을 포함하는 플레이트를 37℃에서 24시간 가온 후, 마이크로 플레이트 리더 Spectra Max 190(몰레큘러디바이스사 제조)에 셋트하여 파장 405 ㎚에서 흡광도를 구한다. 핵산을 넣고 있지 않을 때의 흡광도를 100％(A0)로 하여, 각 피험 물질의 흡광도(A)로부터 효소 활성률을 다음 식으로부터 구한다.

효소 활성률 = (A/A0) × 100

효소 활성을 50％ 저해하는 데 요구되는 저해제의 농도(IC₅₀)를 구한다. IC₅₀값이 0.10 μM 이하인 압타머를 우수한 저해 활성을 갖는 압타머라고 판정한다.

본 발명의 압타머는, 오토탁신의 임의의 부분에 결합하는 압타머인 한 특별히 한정되지 않는다. 또한 본 발명의 압타머는, 오토탁신의 임의의 부분에 결합하여, 그 활성을 저해할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다.

본 발명의 압타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상, 약 200 뉴클레오티드 이하일 수 있지만, 예컨대 약 100 뉴클레오티드 이하이며, 바람직하게는 약 50 뉴클레오티드 이하이고, 보다 바람직하게는 약 40 뉴클레오티드 이하이며, 가장 바람직하게는 약 30 뉴클레오티드 이하일 수 있다. 총뉴클레오티드수가 적으면, 화학 합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 또한 비용면에서의 메리트도 크다. 또한, 화학 수식도 용이하고, 생체 내 안정성도 높으며, 독성도 낮다고 생각된다. 본 발명의 압타머 길이의 하한은, 서열번호 53으로 표시되는 공통 서열(GWAACAGGUYYYGCU; W는 A 또는 U, Y는 U 또는 C를 나타낸다. 단, 우라실은 티민이어도 좋다)을 포함하고, 상기 공통 서열이 원하는 2차 구조(후술하는 식 (I') 또는 (II)로 표시되는 2차 구조)를 취할 수 있는 한 특별히 제한은 없지만, 상기 압타머 길이는, 예컨대 15 뉴클레오티드 이상, 바람직하게는 20 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 23 뉴클레오티드 이상일 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명의 압타머의 길이는 23∼50 뉴클레오티드, 혹은 23∼40 뉴클레오티드이다.

바람직한 일실시양태에 있어서, 본 발명의 압타머는, 하기 식:

GWAACAGGUUUUGCU(서열번호 42)

(식 중, W는 A 또는 U이다)

로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다)을 포함한다(이하, 본 발명의 압타머 (I)라고도 함).

본 발명의 압타머 (I)에 포함되는 각 뉴클레오티드는, 이하의 (a) 또는 (b):

(a) (i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 불소 원자이고,

(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 히드록시기임;

(b) (i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 불소 원자가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 히드록시기, 알콕시기(예, 메톡시기), 아실옥시기(예, 아세틸옥시기) 및 아미노기(예, -NH₂기)로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기, 바람직하게는, 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고,

(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록시기가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 불소 원자 또는알콕시기(예, 메톡시기), 아실옥시기(예, 아세틸옥시기) 및 아미노기(예, -NH₂기)로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기, 바람직하게는, 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있음

중 어느 것이다.

식: GWAACAGGUUUUGCU(서열번호 42)에 있어서, W는 바람직하게는 A이다.

식: GWAACAGGUUUUGCU(서열번호 42)로 표시되는 서열은, 식 (I):

또는 식 (II):

로 표시되는 잠재적 2차 구조를 형성할 수 있다.

본 발명의 압타머는, GWAACAGGUUUUGCU(서열번호 42)(식 중, W는 A 또는 U이다)로 표시되는 서열 부분에 있어서 상기 구조를 취할 수 있다. 이 구조를 취함으로써, 오토탁신에 대한 여러 가지 활성(오토탁신에의 결합 활성, 오토탁신의 저해 활성 등)을 갖는다고 생각된다.

또한 상기 구조에 있어서, 5' 말단과 3' 말단 각각에 계속되는 서열간의 상호 작용에 의해, 바람직하게는 스템 구조가 형성될 수 있다. 본 발명의 압타머가 여러 가지 활성(오토탁신에의 결합 활성, 오토탁신의 저해 활성 등)을 갖기 위해서는, 상기 잠재적 2차 구조에 더하여, 그것에 계속되는 스템 구조를 갖는 것이 바람직하다. 스템 구조를 가짐으로써 압타머가 안정화하여, 강한 활성을 갖게 된다. 스템 구조는 상보적인 염기쌍(왓슨-클릭 염기쌍 외에, G=U 염기쌍도 포함함)에 의해 형성되지만, 염기쌍의 수(스템 길이)는 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, 스템 길이는 4 염기쌍 이상이다. 상한은 특별히 제한은 없지만, 예컨대 18 염기쌍 이하, 바람직하게는 11 염기쌍 이하이다. 또한 스템 구조에 있어서는, 전체로서 스템 구조를 구성하는 한에 있어서, 그 일부에 있어서 염기쌍을 형성하지 않아도 압타머 활성은 유지된다. 따라서, 스템 구조 부분은, 그 구조를 갖는 한에 있어서 뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입, 부가 등이 가능하다. 스템 구조의 구체적인 예는, 예컨대 도 1에 나타낸다.

식: GWAACAGGUUUUGCU(서열번호 42)(식 중, W는 A 또는 U이다)로 표시되는 서열의 5' 말단과 3' 말단 각각에 계속되는 서열간의 상호 작용에 의해, 스템 구조가 형성되는 바람직한 뉴클레오티드 서열의 예로서, 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 예로 들 수 있다. 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열이 취할 수 있는 잠재적 2차 구조를 도 1 우측에 나타낸다.

본 발명의 압타머 (I)는, 오토탁신에의 결합 활성 및 오토탁신 활성(오토탁신의 효소 활성 등)의 저해 활성을 유지하는 한, 서열번호 42로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 있어서, 1개∼수개(예컨대, 1개∼4개, 바람직하게는 1개∼3개, 보다 바람직하게는 1개∼2개, 특히 바람직하게는 1개)의 뉴클레오티드가 치환, 삽입 또는 부가되어도 좋다. 뉴클레오티드가 치환 또는 삽입되는 위치는 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 뉴클레오티드가 치환되는 경우, 서열번호 10으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단으로부터 10번째∼12번째의 UUU 중 적어도 1개의 U가, 다른 뉴클레오티드, 바람직하게는 A 이외의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 C로 치환되는 것이 바람직하다.

따라서, 바람직하게는, 본 발명의 압타머 (I)는, 식: GWAACAGGUYYYGCU(식 중, W는 A 또는 U이고, Y는 U 또는 C이다)(서열번호 49)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 식 중, W는, 바람직하게는 A이고, YYY는, 바람직하게는 UUU, UUC, UCU 또는 CUU이다. 또한, 서열번호 42로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중, 5' 말단으로부터 6번째의 A가 치환되는 경우, U 이외의 뉴클레오티드로 치환되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5' 말단으로부터 6번째의 A는 치환되지 않는다.

상기에 있어서, 치환, 삽입 또는 부가되는 뉴클레오티드는, 이하의 (a) 또는 (b):

중 어느 것이다.

혹은, 별도의 바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명의 압타머는, 하기 (A)∼(C):

(A) 서열번호 4, 8, 14∼20, 24, 29, 30, 32, 40, 41, 44∼48 및 50∼53에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머(단, 우라실은 티민이어도 좋다);

(B) 서열번호 4, 8, 14∼20, 24, 29, 30, 40, 44, 45, 47, 48 및 50∼53에서 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다)에 있어서, 1개∼수 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머; 또는

(C) 서열번호 4, 8, 14∼20, 24, 29, 30, 40, 44, 45, 47, 48 및 50∼53에서 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다)과 60％ 이상(바람직하게는 70％ 이상, 보다 바람직하게는 75％ 이상, 더욱 바람직하게는80％ 이상, 한층 더 바람직하게는 85％ 이상, 특히 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상)의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머

(단, 상기 (B) 또는 (C)의 압타머는, 오토탁신에 결합하여, 오토탁신의 활성(오토탁신의 효소 활성 등)을 저해할 수 있는 것이다.)

중 어느 것의 압타머이다(이하, 본 발명의 압타머 (II)라고도 함).

상기 (B) 및 (C)의 서열번호 4, 8, 14∼20, 24, 29, 30, 40, 44, 45, 47, 48및 50∼53으로 표시되는 각 뉴클레오티드 서열은, 식: GWAACAGGUUUUGCU(서열번호 42)(식 중, W는 A 또는 U이다)로 표시되는 서열을 공통 서열로서 포함한다.

상기 (B)에 있어서, 치환, 결실, 삽입 또는 부가되는 뉴클레오티드수는, 압타머가 오토탁신에 결합하여, 오토탁신의 활성(오토탁신의 효소 활성 등)을 저해할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 약 30개 이하, 바람직하게는 약 20개 이하, 보다 바람직하게는 약 10개 이하, 더욱 보다 바람직하게는 5개 이하, 가장 바람직하게는 4개, 3개, 2개 또는 1개일 수 있다. 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열 중에 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 부가를 갖는 경우, 상기 본 발명의 압타머 (I)과 동일한 이변을 포함하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 상기 공통 서열 중에 뉴클레오티드의 치환을 갖는 경우, 상기 (B)의 압타머는, 식: GWAACAGGUYYYGCU(식 중, W는 A 또는 U이고, Y는 U 또는 C이다)(서열번호 49)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 식 중, W는, 바람직하게는 A이고, YYY는, 바람직하게는 UUC, UCU 또는 CUU이다. 또한, 서열번호 10으로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중, 5' 말단으로부터 6번째의 A가 치환되는 경우, U 이외의 뉴클레오티드로 치환되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5' 말단으로부터 6번째의 A는 치환되지 않는다.

상기 (C)에 있어서, 「동일성」이란, 상기 기술분야에 있어서 공지의 수학적 알고리즘을 이용하여 2개의 뉴클레오티드 서열을 얼라인시킨 경우의, 최적의 얼라인먼트(바람직하게는, 상기 알고리즘은 최적의 얼라인먼트를 위해 서열의 한쪽 혹은 양쪽에의 갭의 도입을 고려할 수 있는 것이다)에 있어서의, 오버랩하는 전체 뉴클레오티드 잔기에 대한, 동일 뉴클레오티드 잔기의 비율(％)을 의미한다.

본 명세서에 있어서, 뉴클레오티드 서열에 있어서의 동일성은, 예컨대 상동성 계산 알고리즘 NCBI BLAST-2(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여, 이하의 조건(갭 오픈=5 페널티; 갭 익스텐션=2 페널티; x_드롭 오프=50; 기대치=10; 필터링=ON)에서 2개의 뉴클레오티드 서열을 얼라인함으로써, 계산할 수 있다.

상기 (C)의 압타머에 있어서, 서열번호 42로 표시되는 공통 서열 부분에 대한 동일성은, 80％ 이상, 바람직하게는 85％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상이고, 특히 바람직하게는, 상기 압타머는, 식: GWAACAGGUYYYGCU(식 중, W는 A 또는 U이고, Y는 U 또는 C이다)(서열번호 49)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 식 중, W는, 바람직하게는 A이고, YYY는, 바람직하게는 UUC, UCU 또는 CUU이다. 또한, 서열번호 10으로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중, 5' 말단으로부터 6번째의 A가 치환되는 경우, U 이외의 뉴클레오티드로 치환되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5' 말단으로부터 6번째의 A는 치환되지 않는다.

특히 바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명의 압타머 (II)는, 하기 (A'), (B') 또는 (C'):

(A') 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머(단, 우라실은 티민이어도 좋다);

(B') 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다)(GAAACAGGUUUUGCU(서열번호 10)로 표시되는 서열을 제외한다)에 있어서, 1개∼7개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머; 또는

(C') 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다)과 70％ 이상(바람직하게는 75％ 이상, 보다 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 85％ 이상, 특히 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상)의 동일성을 갖는(단, GAAACAGGUUUUGCU(서열번호 10)로 표시되는 서열은 동일하다) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머(단, 상기 (B') 또는 (C')의 압타머는, 오토탁신에 결합하여, 오토탁신의 활성(오토탁신의 효소 활성 등)을 저해할 수 있는 것이다.)

중 어느 것이다.

상기 (B')에 있어서, 치환, 결실, 삽입 또는 부가되는 뉴클레오티드수는, 바람직하게는 5개 이하, 보다 바람직하게는 4개, 더욱 바람직하게는 3개, 특히 바람직하게는 2개 또는 1개일 수 있다.

상기 (C')에 있어서, 「동일성」이란, 상기 (C)와 동의이다.

본 발명의 압타머 (II)는 또한,

(D) 1 이상의 상기 (A) 및/또는 1 이상의 상기 (B) 및/또는 1 이상의 상기 (C)의 복수의 연결물, 바람직하게는,

(D') 1 이상의 상기 (A') 및/또는 1 이상의 상기 (B') 및/또는 1 이상의 상기 (C')의 복수의 연결물

일 수 있다. 상기 (D), (D')에 있어서 연결은 탠덤 결합으로 행해질 수 있다. 또한, 연결에 있어서, 링커를 이용하여도 좋다. 링커로서는, 뉴클레오티드쇄(예, 1∼약 20 뉴클레오티드), 비뉴클레오티드쇄(예, -(CH₂)n- 링커, -(CH₂CH₂O)n- 링커, 헥사에틸렌글리콜 링커, TEG 링커, 펩티드를 포함하는 링커, -S-S- 결합을 포함하는 링커, -CONH- 결합을 포함하는 링커, -OPO₃- 결합을 포함하는 링커)를 들 수 있다. 상기 복수의 연결물에 있어서의 복수란, 2 이상이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 2개, 3개 또는 4개일 수 있다.

상기 (A)∼(D), (A')∼(D')에 있어서의 각 뉴클레오티드는, 이하의 (a) 또는 (b):

(b) (i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 불소 원자가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고,

(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록시기가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있음

중 어느 것이다.

또한, 본 발명의 압타머 (II)는, 상기 (B) 또는 (C)에 있어서, 식: GWAACAGGUYYYGCU(식 중, W는 A 또는 U이고, Y는 U 또는 C이다)(서열번호 49)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열은, 식 (I'):

또는 식 (II):

로 표시되는 잠재적 2차 구조를 형성할 수 있다.

식 (I') 중, W는, 바람직하게는 A이고, YYY는, 바람직하게는 UUU, UUC, UCU 또는 CUU이다.

또한, 본 발명의 압타머 (II)는, 상기 (B) 또는 (C)에 있어서, 식: GWAACAGGUYYYGCU(식 중, W는 A 또는 U이고, Y는 U 또는 C이다)(서열번호 49)로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단과 3' 말단 각각에 계속되는 서열간의 상호 작용에 의해, 스템 구조를 형성할 수 있다. 스템 길이는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 4 염기쌍 이상이다. 스템 길이의 상한도 특별히 제한은 없지만, 예컨대 18 염기쌍 이하, 바람직하게는 11 염기쌍 이하이다. 또한 스템 구조에 있어서는, 전체로서 스템 구조를 구성하는 한에 있어서, 그 일부에 있어서 염기쌍을 형성하지 않아도 압타머 활성은 유지된다. 따라서, 스템 구조 부분은, 그 구조를 갖는 한에 있어서 뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입, 부가 등이 가능하다.

또한, 본 발명의 압타머 (II)는, 상기 (B') 또는 (C')에 있어서, 식: GAAACAGGUUUUGCU(서열번호 10)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열은, 식 (I"):

로 표시되는 잠재적 2차 구조를 형성할 수 있다.

또한, 본 발명의 압타머 (II)는, 상기 (B) 또는 (C)에 있어서, 식: GAAACAGGUUUUGCU(서열번호 10)로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단과 3' 말단각각에 계속되는 서열간의 상호 작용에 의해, 스템 구조를 형성할 수 있다. 스템 길이는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 4 염기쌍 이상이다. 스템 길이의 상한도 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 10 염기쌍 이하이다. 또한 스템 구조에 있어서는, 전체로서 스템 구조를 구성하는 한에 있어서, 그 일부에 있어서 염기쌍을 형성하지 않아도 압타머 활성은 유지된다. 따라서, 스템 구조 부분은, 그 구조를 갖는 한에 있어서 뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입, 부가 등이 가능하다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 압타머(본 발명의 압타머 (I) 및 (II)를 포괄한다)는, 적어도 1종(예, 1종, 2종, 3종 또는 4종)의 뉴클레오티드가, 리보스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대, 수소 원자, 불소 원자, 히드록실기 및 메톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2종(예, 2종, 3종 또는 4종)의 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 압타머에 있어서는 또한, 모든 피리미딘 뉴클레오티드가, 리보스의 2' 위치에 있어서, 불소 원자이거나, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 바람직하게는, 수소 원자, 히드록실기 및 메톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 동일한 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 압타머에 있어서는 또한, 모든 퓨린 뉴클레오티드가, 리보스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기이거나, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 바람직하게는, 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어지는 군에서 선택되는 동일한 원자 또는 기로 치환되는 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 압타머는 또한, 모든 뉴클레오티드가, 리보스의 2' 위치에 있어서, 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대, 수소 원자, 불소 원자, 히드록실기 및 메톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 동일한 원자 또는 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서는, 압타머를 구성하는 뉴클레오티드를 RNA로 가정하여(즉 당기를 리보스로 가정하여), 뉴클레오티드 중의 당기에의 수식의 양태를 설명하는데, 이것은, 압타머를 구성하는 뉴클레오티드로부터 DNA가 제외되는 것을 의미하는 것이 아니고, 적절하게 DNA에의 수식으로서 이역할 수 있다. 예컨대, 압타머를 구성하는 뉴클레오티드가 DNA인 경우, 리보스의 2' 위치의 히드록실기의 X로의 치환은, 디옥시리보스의 2' 위치의 한쪽의 수소 원자의 X로의 치환으로서 이역된다.

본 발명의 압타머는, 오토탁신에 대한 결합성, 안정성, 약물 송달성 등을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기(예, 리보스)가 수식된 것이어도 좋다. 당 잔기에 있어서 수식되는 부위로서는, 예컨대, 당 잔기의 2' 위치, 3'위 및/또는 4'위의 히드록실기를 다른 원자로 대체한 것 등을 들 수 있다. 수식의 종류로서는, 예컨대, 플루오로화, 알콕시화(예, 메톡시화, 에톡시화), O-알릴화, S-알킬화(예, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화(예, -NH₂)를 들 수 있다. 이러한 당 잔기의 개변은, 자체 공지의 방법에 따라 행할 수 있다(예컨대, Sproat et al., (1991) Nucle.Acid. Res.19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl.Acid. Res.19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145 참조).

또한 당 잔기에 대해서는, 2' 위치 및 4'위로 가교 구조를 형성한 BNA: Bridged nucleic acid(LNA: Linked nucleic acid)로 할 수도 있다. 이러한 당 잔기의 개변도, 자체 공지의 방법에 따라 행할 수 있다(예컨대, Tetrahedron Lett., 38, 8735-8738(1997); Tetrahedron, 59, 5123-5128(2003), Rahman S.M.A., Seki S., Obika S., Yoshikawa H., Miyashita K., Imanishi T., J. Am. Chem. Soc., 130, 4886-4896(2008) 등 참조).

본 발명의 압타머는 또한, 오토탁신에 대한 결합 활성 등을 높이기 위해, 핵산 염기(예, 퓨린, 피리미딘)가 개변(예, 화학적 치환)된 것이어도 좋다. 이러한 개변으로서는, 예컨대, 5위 피리미딘 개변, 6위 및/또는 8위 퓨린 개변, 환외 아민으로의 개변, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우라실로의 치환을 들 수 있다.

또한, 뉴클레아제 및 가수 분해에 대하여 내성이도록, 혹은 오토탁신에 대한 결합 활성 등을 높일 목적으로, 본 발명의 압타머에 포함되는 인산기가 개변되어 있어도 좋다. 예컨대, 인산기인 P(O)O기가, P(O)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)NR₂(아미데이트), P(O)R, R(O)OR', CO 또는 CH₂(포름아세탈) 또는 3'-아민(-NH-CH₂-CH₂-)으로 치환되어 있어도 좋다〔여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로, H이거나, 혹은 치환되어 있거나, 또는 치환되어 있지 않은 알킬(예, 메틸, 에틸)이다〕. 그 중에서도 인산기인 P(O)O기 중 적어도 하나가, P(O)S(티오에이트) 또는 P(S)S(디티오에이트)로 치환되어 있다, 소위 포스포로티오에이트화 또는 포스포로디티오에이트화한 것이 바람직하다. 압타머에 포함되는 인산기 중 하나 이상이 포스포로티오에이트화 또는 포스포로디티오에이트화됨으로써, 본 발명의 압타머의 활성이 향상한다. 포스포로티오에이트화 또는 포스포로디티오에이트화되는 인산기는 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 본 발명의 압타머 (I) 또는 (II)에 있어서의 공통 서열(서열번호 10, 42 또는 49) 중의 임의의 뉴클레오티드여도 좋고, 바람직하게는, 상기 공통 서열의 5' 말단으로부터 3번째의 A의 인산기일 수 있다.

연결기로서는, -O-, -N- 또는 -S-가 예시되고, 이들 연결기를 통하여 인접한 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.

개변은 또한, 캡핑과 같은 3' 및 5'의 개변을 포함하여도 좋다.

본 발명의 압타머는 또한, 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산, 펩티드, 역위 dT, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일, 리토콜릭-올레일, 도코사닐, 라우로일, 스테아로일, 팔미토일, 올레오일, 리놀레오일, 그 외 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광 물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 압타머의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 부가함으로써, 말단 수식을 행할 수 있다. 이러한 말단 수식에 대해서는, 예컨대, 미국 특허 제5,660,985호, 미국 특허 제5,756,703호를 참조하여 행할 수 있다.

특히 바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명은, 오토탁신에 결합하는 압타머로서,

(1) 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 중, GAAACAGGUUUUGCU(서열번호 10)로 표시되는 서열에 있어서의 인산기 중 적어도 하나(예컨대, 5' 말단으로부터 3번째의 A의 인산기 등)가 포스포로티오에이트화 또는 포스포로디티오에이트화된 것이고,

(2) 압타머의 5' 말단 혹은 3' 말단이 각각 역위 dT 또는 폴리에틸렌 글리콜로 수식된 것이며, 또한 이하의 (a) 또는 (b):

(a) 상기 압타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,

(b) 상기 (a)의 압타머에 있어서,

(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록시기가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 압타머

중 어느 것인 압타머를 제공한다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 압타머의 길이는, 바람직하게는 23∼50 뉴클레오티드, 혹은 23∼40 뉴클레오티드이기 때문에, 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열(29 뉴클레오티드)을 포함하는 상기 압타머의 길이는, 바람직하게는 29∼50 뉴클레오티드, 혹은 29∼40 뉴클레오티드이다. 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 및 3' 말단의 각각에 계속되는 뉴클레오티드 서열은, 적어도 도 1 우측에 나타내는, 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 취할 수 있는 2차 구조를 유지할 수 있는 것이면, 특별히 제한은 없지만, 도 1 우측의 스템 구조를 연장함으로써(미스매치나 벌지의 형성을 허용함), 도 1 우측의 스템-루프 구조를 더욱 안정화할 수 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 압타머는, 본 명세서 중의 개시 및 상기 기술분야에 있어서의 자체 공지의 방법에 따라 합성할 수 있다. 합성 방법의 하나는 RNA 폴리메라아제를 이용하는 방법이다. 목적의 서열과 RNA 폴리메라아제의 프로모터 서열을 갖는 DNA를 화학 합성하고, 이것을 템플레이트으로 하여 이미 공지의 방법에 따라 전사함으로써 원하는 RNA를 얻을 수 있다. 또한, DNA 폴리메라아제를 이용하는 것이라도 합성할 수 있다. 목적의 서열을 갖는 DNA를 화학 합성하고, 이것을 템플레이트로 하여, 이미 공지의 방법인 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭한다. 이것을 이미 공지의 방법인 폴리아크릴아미드 전기 영동법이나 효소 처리법에 따라 단일쇄로 한다. 수식이 들어간 압타머를 합성하는 경우는, 특정한 위치에 이변을 도입한 폴리메라아제를 이용함으로써 신장 반응의 효율을 올릴 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 압타머는 공지의 방법에 따라 용이하게 정제할 수 있다.

압타머는 아미다이트법 혹은 포스포아미다이트법 등의 화학 합성법에 따라 대량 합성할 수 있다. 합성 방법은 잘 알려져 있는 방법이며, Nucleic Acid(Vol.2) [1] Synthesis and Analysis of Nucleic Acid(Editor: Yukio Sugiura, Hirokawa Publishing Company) 등에 기재된 바와 같다. 실제로는 GE 헬스케어-바이오사이언스사 제조의 Oligo Pilot 100이나 Oligo Process 등의 합성기를 사용한다. 정제는 크로마토그래피 등의 자체 공지의 방법에 따라 행해진다.

압타머는 포스포아미다이트법 등의 화학 합성 시에 아미노기 등의 활성기를 도입함으로써, 합성 후에 기능성 물질을 부가할 수 있다. 예컨대, 압타머의 말단에 아미노기를 도입함으로써, 카르복실기를 도입한 폴리에틸렌 글리콜쇄를 축합시킬 수 있다.

압타머는, 인산기의 마이너스 전하를 이용한 이온 결합, 리보스를 이용한 소수 결합 및 수소 결합, 핵산 염기를 이용한 수소 결합이나 스태킹 결합 등 다양한 결합 양식에 따라 표적 물질과 결합한다. 특히, 구성 뉴클레오티드의 수만큼 존재하는 인산기의 마이너스 전하를 이용한 이온 결합은 강하여, 단백질의 표면에 존재하는 리신이나 아르기닌의 플러스 전하와 결합한다. 이 때문에, 표적 물질과의 직접적인 결합에 관계되지 않은 핵산 염기는 치환할 수 있다. 특히, 스템 구조의 부분은 이미 염기쌍이 만들어져 있고, 또한, 이중 나선 구조의 내측을 향하고 있기 때문에, 핵산 염기는, 표적 물질과 직접 결합하기 어렵다. 따라서, 염기쌍을 다른 염기쌍으로 치환하여도 압타머의 활성은 감소하지 않는 경우가 많다. 루프 구조 등 염기쌍을 만들고 있지 않은 구조에 있어서도, 핵산 염기가 표적 분자와의 직접적인 결합에 관여하지 않는 경우에, 염기의 치환이 가능하다. 리보스의 2' 위치의 수식에 관해서는, 드물게 리보스의 2' 위치의 관능기가 표적 분자와 직접적으로 상호 작용하고 있는 경우가 있지만, 많은 경우 무관계이며, 다른 수식 분자로 치환 가능하다. 이와 같이 압타머는, 표적 분자와의 직접적인 결합에 관여하고 있는 관능기를 치환 또는 삭제하지 않는 한, 그 활성을 유지하고 있는 경우가 많다. 또한, 전체의 입체 구조가 크게 변하지 않는 것도 중요하다.

압타머는, SELEX법 및 그 개량법(예컨대, Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510)을 이용함으로써 제작할 수 있다. SELEX법에서는 라운드수를 늘리거나, 경합 물질을 사용하거나 하여, 선별 조건을 엄격하게 함으로써, 표적 물질에 대하여 보다 결합력이 강한 압타머가 농축되어, 선별되어 온다. 따라서, SELEX의 라운드수를 조절하거나, 및/또는 경합 상태를 변화시키거나 함으로써, 결합력이 상이한 압타머, 결합 형태가 상이한 압타머, 결합력이나 결합 형태는 동일하지만 염기 서열이 상이한 압타머를 얻을 수 있는 경우가 있다. 또한, SELEX법에는 PCR에 의한 증폭 과정이 포함되지만, 그 과정에서 망간 이온을 사용하는 등에 의해 이변을 넣음으로써, 보다 다양성이 풍부한 SELEX를 행하는 것이 가능해진다.

SELEX에서 얻어지는 압타머는 표적 물질에 대하여 친화성이 높은 핵산이지만, 그것은 표적 물질의 생리 활성을 저해하는 것을 의미하지 않는다. 오토탁신은 염기성 단백질이며, 핵산이 비특이적으로 결합하기 쉽다고 생각되지만, 특정한 부위에 강하게 결합하는 압타머 이외에는 그 표적 물질의 활성에 영향을 끼치지 않는다. 실제로, 네거티브 컨트롤로서 이용한 랜덤 서열을 포함하는 RNA는 오토탁신과의 결합이나 저해는 보이지 않았다.

이와 같이 하여 선택된 활성이 있는 압타머에 기초하여, 보다 높은 활성을 갖는 압타머를 획득하기 위해 더욱 프라이머를 바꾸어 SELEX를 행할 수 있다. 구체적인 방법이란, 어떤 서열이 결정되어 있는 압타머의 일부를 랜덤 서열로 한 템플레이트이나 10％∼30％ 정도의 랜덤 서열을 도프한 템플레이트을 제작하여, 재차 SELEX를 행하는 것이다.

SELEX로 얻어지는 압타머는 80 뉴클레오티드 정도의 길이가 있어, 이것을 그대로 의약으로 하는 것은 어렵다. 그래서, 시행 착오를 반복하여, 용이하게 화학 합성을 할 수 있는 50 뉴클레오티드 정도 이하의 길이까지 짧게 할 필요가 있다. SELEX로 얻어지는 압타머는 그 프라이머 설계에 의존하여, 그 후의 최소화 작업의 용이함이 변한다. 프라이머를 잘 설계하지 않으면, SELEX에 의해 활성이 있는 압타머로 선별할 수 있었다고 해도, 그 후의 개발이 불가능해진다. 본 발명에서는 23 뉴클레오티드라도 저해 활성을 유지하고 있는 압타머를 얻을 수 있었다.

압타머는 화학 합성이 가능하기 때문에 개변이 용이하다. 압타머는 MFOLD 프로그램을 이용하여 2차 구조를 예측하거나, X선 해석이나 NMR 해석에 의해 입체 구조를 예측하거나 함으로써, 어떤 뉴클레오티드를 치환 또는 결손하는 것이 가능한지, 또한, 어디에 새로운 뉴클레오티드를 삽입 가능한지 등을, 어느 정도 예측할 수 있다. 예측된 새로운 서열의 압타머는 용이하게 화학 합성할 수 있고, 그 압타머가 활성을 유지하고 있는지의 여부는, 기존의 분석계에 의해 확인할 수 있다.

얻어진 압타머의 표적 물질과의 결합에 중요한 부분이, 상기와 같은 시행 착오를 반복함으로써 특정할 수 있었던 경우, 그 서열의 양단에 새로운 서열을 부가하여도, 대부분의 경우 활성은 변화하지 않는다. 새로운 서열의 길이는 특별히 한정되는 것이 아니다.

수식에 관해서도, 서열과 마찬가지로 당업자라면 자유롭게 설계 또는 개변 가능하다.

이상과 같이, 압타머는 고도로 설계 또는 개변 가능하다. 본 발명은 또한, 소정의 서열(예, 스템 부분, 인터널 루프 부분, 벌지 부분, 헤어핀 루프 부분 및 단일쇄 부분에서 선택되는 부분에 대응하는 서열: 이하, 필요에 따라 고정 서열로 생략한다)을 포함하는 압타머를 고도로 설계 또는 개변 가능한 압타머의 제조 방법을 제공한다.

예컨대, 이러한 압타머의 제조 방법은, 하기:

〔상기에 있어서, (N)a는 a개의 N으로 이루어지는 뉴클레오티드쇄를 나타내고, (N)b는 b개의 N으로 이루어지는 뉴클레오티드쇄를 나타내며, N은 각각, 동일 또는 상이하고, A, G, C, U 및 T(바람직하게는, A, G, C 및 U)로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드이다. a, b는 각각, 동일 또는 상이하고, 임의의 수일 수 있지만, 예컨대 1개∼약 100개, 바람직하게는 1개∼약 50개, 보다 바람직하게는 1개∼약 30개, 더욱 보다 바람직하게는 1개∼약 20개 또는 1개∼약 10개일 수 있다.〕으로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 단일종의 핵산 분자 또는 복수종의 핵산 분자(예, a, b의 수 등이 상이한 핵산 분자의 라이브러리) 및 프라이머용 서열 (i), (ii)에 각각 대응하는 프라이머쌍을 이용하여, 고정 서열을 포함하는 압타머를 제조하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 압타머 및 그것에 결합한 기능성 물질을 포함하는 복합체를 제공한다. 본 발명의 복합체에 있어서의 압타머와 기능성 물질 사이의 결합은 공유 결합, 또는 비공유 결합일 수 있다. 본 발명의 복합체는, 본 발명의 압타머와 1 이상(예, 2개 또는 3개)의 동종 또는 이종의 기능성 물질이 결합한 것일 수 있다. 기능성 물질로서는, 본 발명의 압타머에 어떠한 기능을 새롭게 부가하는 것, 혹은 본 발명의 압타머가 유지할 수 있는 어떠한 특성을 변화(예, 향상)시킬 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 기능성 물질로서는, 예컨대, 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 당질, 단당, 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오티드를 들 수 있다. 기능성 물질로서는 또한, 예컨대, 친화성 물질(예, 비오틴, 스트렙타아비딘, 표적 상보 서열에 대하여 친화성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 항체, 글루타치온세파로오스, 히스티딘), 표지용 물질(예, 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위체), 효소(예, 서양고추냉이 페록시다아제, 알칼리포스파타제), 약품 송달 매체(예, 리포솜, 마이크로스페어, 펩티드, 폴리에틸렌 글리콜류), 약품(예, 칼리키아미신이나 듀오카르마이신 등 미사일 요법에 사용되고 있는 것, 시클로포스파미드, 멜팔란, 이포스파미드 또는 트로포스파미드 등의 나이트로젠 머스터드 유사체, 티오테파 등의 에틸렌이민류, 카르무스틴 등의 니트로소 요소, 테모졸로미드 또는 다카르바진 등의 알킬화제, 메토트렉세이트 또는 랄티트렉세드 등의 엽산 유사 대사 길항제, 티오구아닌, 클라드리빈 또는 플루다라빈 등의 퓨린 유사체, 플루오로우라실, 테가푸르 또는 젬시타빈 등의 피리미딘 유사체, 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈 등의 빈카알카로이드 및 그 유사체, 에토포시드, 탁산, 도세탁셀 또는 파클리탁셀 등의 포도필로톡신 유도체, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신 및 미톡산트론 등의 안트라사이클린류 및 유사체, 블레오마이신 및 미토마이신 등의 다른 세포 독성 항생 물질, 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥살리플라틴 등의 백금 화합물, 펜토스타틴, 밀테포신, 에스트라무스틴, 토포테칸, 이리노테칸 및 비칼루타미드), 독소(예, 리신 독소, 리어 독소(liatoxin) 및 베로 독소)를 들 수 있다. 이들 기능성 분자는 최종적으로 제거되는 경우가 있다. 또한, 트롬빈이나 매트릭스메타로프로테아제(MMP), Factor X 등의 효소를 인식하여 절단할 수 있는 펩티드, 뉴클레아제나 제한 효소를 절단할 수 있는 폴리뉴클레오티드여도 좋다.

본 발명의 압타머 및 복합체는, 예컨대, 의약 또는 진단약, 검사약, 시약으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 압타머 및 복합체는, 오토탁신의 기능을 저해하는 활성을 가질 수 있다. 전술한 바와 같이, 오토탁신은 장기 또는 조직의 섬유화와 깊게 관계되어 있다. 따라서, 본 발명의 압타머 및 복합체는, 장기 또는 조직의 섬유화가 관여하는 질환, 특히 여러 가지 조직에 있어서의 섬유증을 수반하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약으로서 유용하다.

여기서 장기 또는 조직의 섬유화가 관여하는 질환으로서는, 폐섬유증, 전립선 비대, 심근 섬유화, 심근 섬유증, 근골격 섬유증, 골수 섬유증, 자궁 근종, 강피증, 외과 수술 후의 유착, 수술 후의 반흔, 열상성 반흔, 비후성 반흔, 켈로이드, 아토피성 피부염, 복막 경화증, 천식, 간경변, 만성 췌염, 스킬스 위암, 간섬유증, 신섬유증, 섬유성 혈관병, 당뇨병의 합병증인 섬유성 미소 혈관염에 의한 망막증, 신경증, 신증, 사구체신염, 요세관 사이질성 신염, 유전성 신질환, 동맥 경화 말초 동맥염 등을 들 수 있다.

오토탁신은 효소 활성을 가지고, 그 기질이 되는 생리 활성 물질을 절단한다. 주로 LPC로부터 LPA가 산생되지만, LPA는 세포 표면에 발현하고 있는 그 수용체와 결합하여, 세포내 G 단백질이나, 더욱 그 하류의 PLC, ERK나 Rho를 활성화시켜, 세포 증식이나 생존, 유주라고 하는 생리적 작용을 발휘한다. 따라서, 본 발명의 압타머 및 복합체는, 이들의 경로의 활성화에 관계한 질환의 의약 또는 진단약, 검사약, 시약으로서 사용될 수 잇다. 상기 질환으로서는, 상기한 장기 또는 조직의 섬유화가 관여하는 질환을 들 수 있다.

본 발명의 의약은, 의약상 허용되는 담체가 배합된 것일 수 있다. 의약상 허용되는 담체로서는, 예컨대, 자당, 전분, 만니톨, 소르비트, 젖당, 글루코오스, 셀룰로오스, 탈크, 인산칼슘, 탄산칼슘 등의 부형제, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리프로필피롤리돈, 젤라틴, 아라비아 고무, 폴리에틸렌 글리콜, 자당, 전분 등의 결합제, 전분, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 스타치, 나트륨-글리콜-스타치, 탄산수소나트륨, 인산칼슘, 시트르산칼슘 등의 붕괴제, 스테아린산마그네슘, 에어로질, 탈크, 라우릴황산나트륨 등의 활제, 시트르산, 멘톨, 글리시리진·암모늄염, 글리신, 오렌지 가루 등의 방향제, 안식향산 나트륨, 아황산수소나트륨, 메틸파라벤, 프로필파라벤 등의 보존제, 시트르산, 시트르산나트륨, 초산 등의 안정제, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 스테아린산알루미늄 등의 현탁제, 계면 활성제 등의 분산제, 물, 생리 식염수, 오렌지 주스 등의 희석제, 카카오지, 폴리에틸렌 글리콜, 백등유 등의 베이스 왁스 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것이 아니다.

본 발명의 의약의 투여 경로로서는 특별히 한정되는 것이 아니지만, 예컨대 경구 투여, 비경구 투여를 들 수 있다. 경구 투여에 적합한 제제는, 물, 생리 식염수, 오렌지 주스와 같은 희석액에 유효량의 리간드를 용해시킨 액제, 유효량의 리간드를 고체나 과립으로서 포함하고 있는 캡슐제, 사셰제 또는 정제, 적당한 분산매 중에 유효량의 유효 성분을 현탁시킨 현탁액제, 유효량의 유효 성분을 용해시킨 용액을 적당한 분산매 중에 분산시켜 유화시킨 유제 등이다.

또한, 본 발명의 의약은 필요에 따라, 맛의 마스킹, 장용성 혹은 지속성 등의 목적을 위하여, 자체 공지의 방법으로 코팅할 수 있다. 코팅에 이용되는 코팅제로서는, 예컨대, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌글리콜, 트윈 80, 플루로닉 F68, 셀룰로오스아세테이트프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트, 히드록시메틸셀룰로오스아세테이트석시네이트, 유드라짓(롬사 제조, 독일, 메타아크릴산·아크릴산 공중합체) 및 색소(예, 벵갈라, 이산화티탄 등) 등이 이용된다. 상기 의약은, 속방성 제제, 서방성 제제 중 어느 것이어도 좋다. 서방의 기재로서는, 예컨대, 리포솜, 아텔로콜라겐, 젤라틴, 히드록시 아파타이트, PLGA 등을 들 수 있다.

비경구적인 투여(예컨대, 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 국소 투여, 복강내 투여, 경비 투여, 경폐 투여 등)에 적합한 제제로서는, 수성 및 비수성의 등장인 무균의 주사액제가 있고, 이것에는 항산화제, 완충액, 제균제, 등장화제 등이 포함되어 있어도 좋다. 또한, 수성 및 비수성의 무균의 현탁액제를 들 수 있고, 이것에는 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 방부제 등이 포함되어 있어도 좋다. 상기 제제는, 앰플이나 바이알과 같이 단위 투여량 혹은 복수회 투여량씩 용기에 봉입할 수 있다. 또한, 유효 성분 및 의약상 허용되는 담체를 동결 건조하여, 사용 직전에 적당한 무균의 용매에 용해 또는 현탁하면 좋은 상태로 보존할 수도 있다. 또한, 서방 제제도 적합한 제제로서 예를 들 수 있다. 서방 제제로서는, 인공골이나 생체 분해성 혹은 비분해성 스폰지, 백, 약제 펌프, 침투압 펌프 등, 체내에 매립된 담체 혹은 용기로부터의 서방 형태, 혹은 체외로부터 계속적 혹은 단속적으로 체내 혹은 국소에 송달되는 디바이스 등을 들 수 있다. 생체 분해성의 기재로서는, 리포솜, 카치오닉 리포솜, Poly(lactic-co-glycolic) acid(PLGA), 아텔로콜라겐, 젤라틴, 히드록시 아파타이트, 다당 시조필란 등을 들 수 있다. 또한 주사액제나 서방 제제 이외에도, 흡입제, 연고제도 가능하다. 흡입제의 경우, 동결 건조 상태의 유효 성분을 미세화하여 적당한 흡입 디바이스를 이용하여 흡입 투여한다. 흡입제에는, 더욱 필요에 따라 종래부터 사용되고 있는 계면 활성제, 오일, 조미료, 시클로덱스트린 또는 그 유도체 등을 적절하게 배합할 수 있다.

여기서 계면 활성제로서는, 예컨대 올레인산, 레시틴, 디에틸렌글리콜디올레에이트, 테트라히드로푸르푸릴올레에이트, 에틸올레에이트, 이소프로필미리스테이트, 글리세릴트리올레에이트, 글리세릴모노라우레이트, 글리세릴모노올레에이트, 글리세릴모노스테아레이트, 글리세릴모노리시노에이트, 세틸알코올, 스테아릴알코올, 폴리에틸렌 글리콜 400, 세틸피리디늄클로라이드, 소르비탄트리올레에이트(상품명 Span 85), 소르비탄모노올레에이트(상품명 Span 80), 소르비탄모노라우레이트(상품명 Span 20), 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유(상품명 HCO-60), 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노라우레이트(상품명 트윈 20), 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노올레에이트(상품명 트윈 80), 천연 자원 유래의 레시틴(상품명 에피클론), 올레일폴리옥시에틸렌(2)에테르(상품명 브리지 92), 스테아릴폴리옥시에틸렌(2)에테르(상품명 브리지 72), 라우릴폴리옥시에틸렌(4)에테르(상품명 브리지 30), 올레일폴리옥시에틸렌(2)에테르(상품명 게나폴 0-020), 옥시에틸렌과 옥시프로필렌의 블록 공중합체(상품명 신페로닉) 등을 들 수 있다. 오일로서는, 예컨대 옥수수유, 올리브유, 면실유, 해바라기유 등을 들 수 있다. 또한, 연고제의 경우, 적당한 의약상 허용되는 기제(황색 바셀린, 백색 바셀린, 파라핀, 플라스티베이스, 실리콘, 백색 연고, 밀랍, 돼지유, 식물유, 친수 연고, 친수 바셀린, 정제 라놀린, 가수 라놀린, 흡수 연고, 친수 플라스티베이스, 마크로골 연고 등)를 이용하여, 유효 성분과 혼합하여 제제화하여 사용한다.

흡입제는 통상법에 따라 제조할 수 있다. 즉, 상기 본 발명의 압타머 및 복합체를 분말 또는 액형으로 하여, 흡입 분사제 및/또는 담체 중에 배합하고, 적당한 흡입 용기에 충전함으로써 제조할 수 있다. 또한 상기 본 발명의 압타머 및 복합체가 분말인 경우는 통상의 기계적 분말 흡입기를, 액형의 경우는 네뷸라이저 등의 흡입기를 각각 사용할 수도 있다. 여기서 분사제로서는 종래 공지의 것을 널리 사용할 수 있고, 프레온-11, 프레온-12, 프레온-21, 프레온-22, 프레온-113, 프레온-114, 프레온-123, 프레온-142c, 프레온-134a, 프레온-227, 프레온-C318, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 등의 프레온계 화합물, 프로판, 이소부탄, n-부탄 등의 탄화수소류, 디에틸에테르 등의 에테르류, 질소 가스, 탄산 가스 등의 압축 가스 등을 예시할 수 있다.

계면 활성제로서는, 예컨대 올레인산, 레시틴, 디에틸렌글리콜디올레에이트, 테트라히드로푸르푸릴올레에이트, 에틸올레에이트, 이소프로필미리스테이트, 글리세릴트리올레에이트, 글리세릴모노라우레이트, 글리세릴모노올레에이트, 글리세릴모노스테아레이트, 글리세릴모노리시노에이트, 세틸알코올, 스테아릴알코올, 폴리에틸렌 글리콜 400, 세틸피리디늄클로라이드, 소르비탄트리올레에이트(상품명 span 85), 소르비탄모노올레에이트(상품명 span 80), 소르비탄모노라우레이트(상품명 span 20), 폴리옥시에틸렌경화피마자유(상품명 HCO-60), 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노라우레이트(상품명 트윈 20), 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노올레에이트(상품명 트윈 80), 천연 자원 유래의 레시틴(상품명 에피클론), 올레일폴리옥시에틸렌(2)에테르(상품명 브리지 92), 스테아릴폴리옥시에틸렌(2)에테르(상품명 브리지 72), 라우릴폴리옥시에틸렌(4)에테르(상품명 브리지 30), 올레일폴리옥시에틸렌(2)에테르(상품명 게나폴 0-020), 옥시에틸렌과 옥시프로필렌의 블록 공중합체(상품명신페로닉) 등을 들 수 있다. 오일로서는, 예컨대 옥수수유, 올리브유, 면실유, 해바라기유 등을 들 수 있다. 또한, 연고제의 경우, 적당한 의약상 허용되는 기제(황색 바셀린, 백색 바셀린, 파라핀, 플라스티베이스, 실리콘, 백색 연고, 밀랍, 돼지유, 식물유, 친수 연고, 친수 바셀린, 정제 라놀린, 가수 라놀린, 흡수 연고, 친수 플라스티베이스, 마크로골 연고 등)를 이용하여, 유효 성분인 본 발명의 압타머와 혼합하여 제제화하여 사용한다.

본 발명의 의약의 투여량은, 유효 성분의 종류·활성, 병의 중독도, 투여 대상이 되는 동물종, 투여 대상의 약물 수용성, 체중, 연령 등에 따라 상이하지만, 통상, 성인 1일당 유효 성분량으로서 약 0.0001 ㎎/㎏∼약 100 ㎎/㎏, 예컨대 약 0.0001 ㎎/㎏∼약 10 ㎎/㎏, 바람직하게는 약 0.005 ㎎/㎏∼약 1 ㎎/㎏일 수 있다.

본 발명의 압타머 및 복합체는, 오토탁신에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 압타머 및 복합체는, 오토탁신 검출용 프로브로서 유용하다. 상기 프로브는, 오토탁신의 인 비보 이메징, 혈중 농도 측정, 조직 염색, ELISA 등에 유용하다. 또한, 상기 프로브는, 오토탁신이 관여하는 질환(섬유증이나 악성 종양을 수반하는 질환 등)의 진단약, 검사약, 시약 등으로서 유용하다.

또한, 그 오토탁신에의 특이적 결합에 기초하여, 본 발명의 압타머 및 복합체는 오토탁신의 분리 정제용 리간드로서 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 압타머 및 복합체는, 생체 내의 오토탁신이 국재하는 부위에의 약물 송달제로서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 압타머 및 복합체가 고정화된 고상 담체를 제공한다. 고상 담체로서는, 예컨대, 기판, 수지, 플레이트(예, 멀티 웰 플레이트), 필터, 카트리지, 컬럼, 다공질재를 들 수 있다. 기판은, DNA 칩이나 프로틴 칩 등에 사용되고 있는 것 등일 수 있고, 예컨대, 니켈-PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌) 기판이나 유리 기판, 아파타이트 기판, 실리콘 기판, 알루미나 기판 등으로, 이들 기판에 폴리머 등의 코팅을 실시한 것을 들 수 있다. 수지로서는, 예컨대, 아가로스 입자, 실리카 입자, 아크릴아미드와 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체, 폴리스티렌 가교 디비닐벤젠 입자, 덱스트란을 에피클로로히드린으로 가교한 입자, 셀룰로오스 파이버, 알릴덱스트란과 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드의 가교 폴리머, 단분산계 합성 폴리머, 단분산계 친수성 폴리머, 세파로오스, 토요펄 등을 들 수 있고, 또한, 이들 수지에 각종 관능기를 결합시킨 수지도 포함된다. 본 발명의 고상 담체는, 예컨대, 오토탁신의 정제 및 오토탁신의 검출, 정량에 유용할 수 있다.

본 발명의 압타머 및 복합체는, 자체 공지의 방법에 따라 고상 담체에 고정할 수 있다. 예컨대, 친화성 물질(예, 전술한 것)이나 소정의 관능기를 본 발명의 압타머 및 복합체에 도입하고, 계속해서 상기 친화성 물질이나 소정의 관능기를 이용하여 고상 담체에 고정화하는 방법을 들 수 있다. 본 발명은 또한, 이러한 방법을 제공한다. 소정의 관능기는, 커플링 반응에 제공하는 것이 가능한 관능기일 수 있고, 예컨대, 아미노기, 티올기, 히드록실기, 카르복실기를 들 수 있다. 본 발명은 또한, 이러한 관능기가 도입된 압타머를 제공한다.

본 발명은 또한, 오토탁신의 정제 및 농축 방법을 제공한다. 특히 본 발명은 오토탁신을 다른 패밀리 단백질로부터 분리하는 것이 가능하다. 본 발명의 정제 및 농축 방법은, 본 발명의 고상 담체에 오토탁신을 흡착시키고, 흡착한 오토탁신을 용출액에 의해 용출시키는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 고상 담체에의 오토탁신의 흡착은 자체 공지의 방법에 따라 행할 수 있다. 예컨대, 오토탁신을 함유하는 시료(예, 세균 또는 세포의 배양물 또는 배양 상청, 혈액)를, 본 발명의 고상 담체 또는 그 함유물에 도입한다. 오토탁신의 용출은, 중성 용액 등의 용출액을 이용하여 행할 수 있다. 중성 용출액은 특별히 한정되는 것이 아니지만, 예컨대 pH 약 6∼약 9, 바람직하게는 약 6.5∼약 8.5, 보다 바람직하게는 약 7∼약 8일 수 있다. 중성 용액은 또한, 예컨대, 요소, 킬레이트제(예, EDTA), 나트륨염(예, NaCl), 칼륨염(예, KCl), 마그네슘염(예, MgCl₂), 계면 활성제(예, Tween 20, Triton, NP 40), 글리세린을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 정제 및 농축 방법은 또한, 오토탁신의 흡착 후, 세정액을 이용하여 고상 담체를 세정하는 것을 포함할 수 있다. 세정액으로서는, 예컨대, 요소, 킬레이트제(예, EDTA), Tris, 산, 알칼리, 운반 RNA, DNA, Tween 20 등의 표면 활성제, NaCl 등의 염을 포함하는 것 등을 들 수 있다. 본 발명의 정제 및 농축 방법은 또한, 고상 담체를 가열 처리하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 공정에 의해, 고상 담체의 재생, 멸균이 가능하다.

본 발명은 또한, 오토탁신의 검출 및 정량 방법을 제공한다. 특히 본 발명은 오토탁신과 다른 패밀리 단백질과 구별하여 검출 및 정량할 수 있다. 본 발명의 검출 및 정량 방법은, 본 발명의 압타머를 이용하여(예, 본 발명의 복합체 및 고상 담체의 사용에 의해) 오토탁신을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 오토탁신의 검출 및 정량 방법은, 항체 대신에 본 발명의 압타머를 이용하는 것 이외에는, 면역학적 방법과 동일한 방법에 따라 행해질 수 있다. 따라서, 항체 대신에 본 발명의 압타머를 프로브로서 이용함으로써, 효소 면역 측정법(EIA)(예, 직접 경합 ELISA, 간접 경합 ELISA, 샌드위치 ELISA), 방사 면역 측정법(RIA), 형광 면역 측정법(FIA), 웨스턴 블로트법, 면역 조직 화학적 염색법, 셀 소팅법 등의 방법과 같은 방법에 따라, 검출 및 정량을 행할 수 있다. 또한, PET 등의 분자 프로브로서도, 사용할 수 있다. 이러한 방법은, 예컨대, 생체 또는 생물학적 샘플에 있어서의 오토탁신량의 측정, 오토탁신이 관련된 질환의 진단에 유용할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 압타머를 포함하는, 오토탁신의 저해제를 제공한다. 본 발명의 압타머는 오토탁신에 결합하여 그 기능을 저해할 수 있기 때문에, 상기 압타머를 포함하는 제를 이용함으로써, 오토탁신의 기능을 저해하는 것이 가능해진다.

상기 제에 포함되는 압타머는, 본 명세서 중에 기재되는 본 발명의 압타머이면 특별히 한정되지 않는다.

본 명세서 중에서 든 특허 및 특허 출원 명세서를 포함하는 모든 간행물에 기재된 내용은, 본 명세서에서의 인용에 의해, 그 전부가 명시된 것과 같은 정도로 본 명세서에 삽입되는 것이다.

이하에 실시예를 들어, 본 발명을 더욱 자세하게 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예 등에 조금도 제약되는 것이 아니다.

실시예

실시예 1: 오토탁신에 특이적으로 결합하는 RNA 압타머의 제작 1

오토탁신에 특이적으로 결합하는 RNA 압타머는 SELEX법을 이용하여 제작하였다. SELEX는 Ellington 등의 방법(Ellington and Szostak, Nature 346, 818-822, 1990) 및 Tuerk 등의 방법(Tuerk and Gold, Science 249, 505-510, 1990)을 참고로 하여 행하였다. 표적 물질로서 TALON Metal Affinity Resin(Clontech사 제조)의 담체에 고상화한 His 태그를 갖는 β 오토탁신(Recombinant Human, R&D사 제조, 이하, 오토탁신이라고 기재함)을 이용하였다. 오토탁신이 고상화된 담체는, 담체 중에 존재하는 코발트의 히스티딘에의 요구성을 이용하여, 양자를 섞어, 1시간 정도 실온에서 반응시킴으로써 얻었다. 고상화량은, 고상화 전의 오토탁신 용액과 고상화 직후의 상청을 SDS-PAGE에 의해 조사함으로써 확인하였다. SDS-PAGE의 결과, 상청으로부터는 오토탁신의 밴드는 검출되지 않고, 사용한 오토탁신의 거의 전부가 커플링된 것이 확인되었다. 약 50 pmol의 오토탁신이 약 5 μL의 수지에 고상화된 것이 된다.

최초의 라운드로 이용한 랜덤 서열의 RNA(30N)는, 화학 합성한 DNA를 Dura Scribe^TM T7 Transcription Kit(Epicentre사 제조)를 이용하여 전사함으로써 얻었다. 이 방법에 따라 얻어진 RNA는 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 플루오로화된 것이다. DNA 주형으로서, 이하에 표시되는 30 뉴클레오티드의 랜덤 서열의 양단에 프라이머 서열을 갖는 길이 73 뉴클레오티드의 DNA를 이용하였다. DNA 주형과 프라이머는 화학 합성에 의해 제작하였다.

DNA 주형(서열번호 1) 중의 N은, 뉴클레오티드(A, G, C 또는 T)의 임의의 조합이다. 또한 프라이머 Fwd는 T7 RNA 폴리메라아제의 프로모터 서열을 포함하고 있다.

오토탁신이 고상화된 담체에 RNA 풀을 더하여, 30분 실온에서 유지한 후, 오토탁신에 결합하지 않는 RNA를 제거하기 위해, 용액 A로 수지를 세정하였다. 여기서 용액 A는 145 mM 염화나트륨, 5.4 mM 염화칼륨, 1.8 mM 염화칼슘, 0.8 mM 염화마그네슘, 20 mM 트리스(pH 7.6), 0.05％ Tween 20의 혼합 용액이다. 오토탁신에 결합한 RNA는, 용출액으로서 용액 B를 더하여 95℃에서 10분간 열 처리를 행하고, 그 상청으로부터 회수하였다. 여기서 용액 B는 6 M 구아니딘 염산염과 용액 A의 혼합액이다. 회수된 RNA는 RT-PCR로 증폭하여, Dura Scribe^TM T7 Transcription Kit로 전사하여 다음 라운드의 풀로서 이용하였다. 이상을 1 라운드로 하고, 동일한 작업을 복수회 반복해서 행하였다. 3 라운드 이후는 용출액으로서 용액 C를 사용하였다. 여기서 용액 C는 250 mM 이미다졸과 용액 A의 혼합 용액이다. SELEX 종료 후, PCR 산물을 pGEM-T Easy 벡터(Promega사 제조)에 클로닝하여, 대장균주 DH5α(Toyobo사 제조)를 트랜스포메이션하였다. 싱글 콜로니로부터 플라스미드를 추출 후, DNA 시퀀서(3130xl Genetic Analyzer, ABI사 제조)로 클론의 염기 서열을 조사하였다.

SELEX를 8 라운드 행한 후에 46 클론의 서열을 조사한 바, 서열에 수속이 보였다. 그 중에서, 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 클론이 6개 얻어졌다. MFOLD 프로그램(M.Zuker, Nucleic Acids Res.31(13), 3406-3415, 2003)을 이용하고 예측하였다, 이 압타머의 2차 구조를 도 1에 나타낸다.

이하에 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 특별히 언급이 없다면, 실시예 중에서 드는 개개의 서열은, 5'로부터 3'의 방향으로 나타내며, 각 뉴클레오티드는, 퓨린(A 및 G)이 2'-OH(천연 RNA형)이고, 피리미딘(U 및 C)이 2'-플루오로 수식체인 것을 의미하고 있다.

서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산(이하, 「서열번호 X로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산(압타머)」을 「서열번호 X의 핵산(압타머)」이라고 약기하는 경우가 있음)의 오토탁신에 대한 결합 활성을 표면 플라즈몬 공명법에 따라 평가하였다. 측정에는 GE 헬스케어사 제조의 Biacore T100을 이용하였다. 센서 칩에는 스트렙타아비딘이 고정화되어 있는 SA 칩을 이용하였다. 이것에, 5' 말단에 비오틴이 결합하고 있는 16 뉴클레오티드의 Poly dT를 1500 RU 정도 결합시켰다. 리간드가 되는 핵산은, 3' 말단에 16 뉴클레오티드의 Poly A를 부가하여, T와 A의 어닐링에 의해 SA 칩에 고정화하였다. 유속 20 μL/min으로 핵산을 20 μL 인젝트하여, 약 1500 RU의 핵산을 고정화하였다. 애널라이트용의 오토탁신은 0.02 μM으로 조제하여, 20 μL 인젝트하였다. 러닝 버퍼에는 용액 A를 이용하였다.

측정 결과를 도 2 및 표 1에 나타내었다. 측정의 결과, 서열번호 4의 핵산은 오토탁신에 결합하는 것을 알았다. 또한, 네거티브 컨트롤으로서 사용하였다, 30 뉴클레오티드의 랜덤 서열을 포함하는 1 라운드째에 사용한 핵산 풀(30N)은, 결합량이 서열번호 4의 핵산의 10％ 이하이며, 결합하지 않는("-"로 함) 것을 알았다. 여기서 결합량이란, 최대의 레조넌스 유닛(RU)값을 나타낸다.

실시예 2: 오토탁신에 특이적으로 결합하는 RNA 압타머의 제작 2

랜덤 서열이 40 뉴클레오티드이며, 프라이머 서열이 실시예 1에서 이용한 것과 상이한 주형을 이용하여, 실시예 1과 동일한 SELEX를 행하였다. SELEX의 표적 물질로서 TALON Metal Affinity Resin(Clontech사 제조)의 담체에 고상화한 His 태그를 갖는 오토탁신(Recombinant Human, R&D사 제조)을 이용하였다. 사용한 주형과 프라이머의 서열을 이하에 나타낸다. DNA 주형과 프라이머는 화학 합성에 의해 제작하였다.

DNA 주형(서열번호 5) 중의 N은, 뉴클레오티드(A, G, C 또는 T)의 임의의 조합이다. 또한 프라이머 Fwd는 T7 RNA 폴리메라아제의 프로모터 서열을 포함하고 있다.

SELEX를 8 라운드 행한 후에 48 클론의 서열을 조사한 바, 서열에 수속이 보였다. 그 중에서, 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중에 포함되는, 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열을 포함하는 클론(그 서열을 서열번호 8에 나타냄)이 5개 얻어졌다. 또한, 상기 공통 서열에 있어서 1 염기 차이의 서열을 포함하는, 서열번호 9의 핵산이 1 클론 얻어졌다.

이하에, 상기 각각의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 밑줄은 공통 서열(서열번호 10) 부분을 나타내고, [U]는 상기 공통 서열과 상이한 뉴클레오티드를 나타낸다. 또한 개개의 서열은, 5'로부터 3'의 방향으로 나타내며, 각 뉴클레오티드는, 퓨린(A 및 G)이 2'-OH(천연 RNA형)이고, 피리미딘(U 및 C)이 2'-플루오로 수식체인 것을 의미하고 있다.

서열번호 8 및 9의 핵산이 오토탁신와 결합하는지의 여부를, 표면 플라즈몬 공명법에 따라 평가하였다. 측정에는, GE 헬스케어사 제조의 Biacore T100을 이용하여, 이하에 나타내는 방법으로 측정을 행하였다. CM4 칩의 센서 칩 표면에, 아민 커플링 키트를 사용하여, 약 2700 RU의 오토탁신을 고정화하였다. 유속 20 μL/min에서, 애널라이트로서 0.3 μM로 조정한 핵산을 20 μL 인젝트하였다. 러닝 버퍼에는 용액 A를 이용하였다. 결과를 표 1에 나타내었다. 표 1에서는, 결합량이 서열번호 4의 압타머의 10％ 이하인 것을 결합하지 않는(-) 것으로 하고, 그 이상의 것은 결합하는(+) 것으로 하였다(여기서 결합량이란, 최대의 레조넌스 유닛(RU)값을 의미한다). 측정의 결과, 서열번호 8의 핵산은 오토탁신에 결합하는 것을 알았다. 또한, 네거티브 컨트롤으로서 사용한, 40 뉴클레오티드의 랜덤 서열을 포함하는 1 라운드째에 사용한 핵산 풀(40N)은, 결합하지 않는 것을 알았다. 또한, 1 염기 차이의 서열번호 9의 핵산은 결합하지 않는 것을 알았다.

실시예 3: 오토탁신에 특이적으로 결합하는 RNA 압타머의 제작 3

랜덤 서열이 30 뉴클레오티드이며, 프라이머 서열이 실시예 1에서 이용한 것과 상이한 주형을 이용하여, 실시예 1과 동일한 SELEX를 행하였다. SELEX의 표적 물질로서 TALON Metal Affinity Resin(Clontech사 제조)의 담체에 고상화한 His 태그를 갖는 오토탁신(Recombinant Human, R&D사 제조)을 이용하였다. 사용한 주형과 프라이머의 서열을 이하에 나타낸다. DNA 주형과 프라이머는 화학 합성에 의해 제작하였다. 또한, 전사용의 뉴클레오티드는, 리보튜클레오티드(A 및 G 및 C)와 디옥시리보 뉴클레오티드(T)를 사용하였다.

DNA 주형(서열번호 11) 중의 N은, 뉴클레오티드(A, G, C 또는 T)의 임의의 조합이다. 또한 프라이머 Fwd는 T7 RNA 폴리메라아제의 프로모터 서열을 포함하고 있다.

SELEX를 8 라운드 행한 후에 52 클론의 서열을 조사한 바, 서열에 수속이 보였지만, 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열을 갖는 서열은 포함되어 있지 않았다.

실시예 4: 오토탁신 저해 활성의 측정 1

서열번호 4, 8, 9의 핵산이 오토탁신의 활성을 저해하는지의 여부를, 하기의 방법에 따라 평가하였다. 오토탁신의 기질로서, 포스포디에스테르 결합 함유 합성 기질 p-니트로페닐 티미딘 5'-모노포스페이트(pNP-TMP)(SIGMA)를 선택하였다(이하, NPP2 저해 어세이라고 칭함). 가수 분해에 의해 포스포디에스테르 결합이 절단되어, p-니트로페놀이 유리한다. 이 p-니트로페놀은 노랗게 발색하여, 그것을 검출한다. 분석에는 96 웰 플레이트(96-Well EIA/RIA Polystyrene Plates, Costar사)를 사용하며, 반응액량 200 μL로 행하였다. 또한, 반응액으로서 용액 A를 이용하였다. 핵산을 용액 A 100 μL 중에 준비하고, 거기에 동일하게 반응액 A 중에서 10 mM로 조정한 pNP-TMP 20 μL를 첨가하여 잘 혼합한 후, 37℃에서 5분간 가온하였다. 한쪽에서 6 ng의 오토탁신을 용액 A로 희석한 것을 80 μL 준비하고, 37℃에서 5분간 가온하였다. 가온 후 양자를 혼합하여, 효소 반응을 개시시켰다. 반응 용액 중의 최종 오토탁신 농도는 0.3 nM, 최종 기질 농도는 1 mM이다. 반응액을 포함하는 플레이트를 37℃에서 24시간 가온 후, 마이크로 플레이트 리더 Spectra Max 190(몰레큘러디바이스사 제조)에 셋트하여, 파장 405 ㎚에서 흡광도를 구하였다. 핵산을 넣고 있지 않을 때의 흡광도(A0)를 100％로 하고, 각 피험 물질의 흡광도(A)로부터 저해율을 다음 식에 따라 구하였다.

효소 활성률 = (A/A0) × 100

효소 활성을 50％ 저해하는 데 요하는 저해제의 농도(IC₅₀)를 구하였다. 컨트롤로서, 30N 또는 40N의 핵산 풀을 이용한 경우(네거티브 컨트롤) 및 기지의 오토탁신 저해제 S32836(SIGMA사)(포지티브 컨트롤)을 이용한 경우도 동일하게 처리하여, 측정을 행하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.

표 중, "-"는 결합량이 서열번호 4의 압타머의 10％ 이하인 것, "+"는 그 이상의 것을 나타낸다. 여기서 결합량이란, 최대의 레조넌스 유닛(RU)값을 의미한다(이하의 Biacore 결합 시험에 대해서도 동일함).

또한, IC₅₀값은 2회∼3회 측정의 평균값±표준 편차를 나타낸다. "＞1.0"은, 1.0 μM까지의 농도 범위에서 저해 활성이 보이지 않은 것을 나타낸다(이하의 NPP2 저해 어세이에 대해서도 동일함).

측정의 결과, 서열번호 4 및 8의 압타머는, 오토탁신의 포스포디에스테라제 활성에 대하여 저해 활성을 갖고 있는 것이 나타났다. 한편, 서열번호 9의 압타머에 대해서는, Biacore로의 결합 활성, 저해 활성의 양쪽 모두 보이지 않았기 때문에, 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단으로부터 6번째의 A는 U로는 치환 가능하지 않은 것이 나타났다. 또한, 네거티브 컨트롤인 30N 혹은 40N은 저해 활성을 나타내지 않았다(IC₅₀＞1.0 μM). 적극적 컨트롤인 S32836의 IC₅₀값은 0.015 μM의 값을 나타내었다.

실시예 5: 압타머의 단쇄화

서열번호 4, 8의 압타머의 단쇄화를 행하였다. 개변체의 서열을 서열번호 14∼24에 나타낸다. 얻어진 압타머 중, 서열번호 16으로 표시되는 압타머의 2차 구조 예측을 도 1의 우측에 나타낸다.

이하에 각각의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 밑줄은 공통 서열(서열번호 10) 부분을 나타내고, [ ]는 치환된 뉴클레오티드를 나타낸다. 또한 개개의 서열은, 5'로부터 3'의 방향으로 나타내며, 각 뉴클레오티드는, 퓨린(A 및 G)이 2'-OH(천연 RNA형)이고, 피리미딘(U 및 C)이 2'-플루오로 수식체인 것을 의미하고 있다.

서열번호 14: (서열번호 4로 표시되는 압타머를, 공통 서열을 포함하는 46 뉴클레오티드의 길이로 단쇄화하여, 5' 말단에 GGG를, 3' 말단에 CCC를 부가한 서열)

서열번호 15: (서열번호 4로 표시되는 압타머를, 공통 서열을 포함하는 37 뉴클레오티드의 길이로 단쇄화하여, 5' 말단의 A를 C로, 3' 말단의 U를 G로 치환한 서열)

서열번호 16: (서열번호 4로 표시되는 압타머를, 공통 서열을 포함하는 29 뉴클레오티드의 길이로 단쇄화한 서열)

서열번호 17: (서열번호 4로 표시되는 압타머를, 공통 서열을 포함하는 25 뉴클레오티드의 길이로 단쇄화한 서열)

서열번호 18: (서열번호 4로 표시되는 압타머를, 공통 서열을 포함하는 27 뉴클레오티드의 길이로 단쇄화한 서열)

서열번호 19: (서열번호 4로 표시되는 압타머를, 공통 서열을 포함하는 25뉴클레오티드의 길이로 단쇄화하여, 뉴클레오티드를 하나 치환한 서열)

서열번호 20: (서열번호 4로 표시되는 압타머를, 공통 서열을 포함하는 23 뉴클레오티드의 길이로 단쇄화한 서열)

서열번호 21: (서열번호 4로 표시되는 압타머를, 공통 서열을 포함하는 21 뉴클레오티드의 길이로 단쇄화한 서열)

서열번호 22: (서열번호 4로 표시되는 압타머를, 공통 서열을 포함하는 19 뉴클레오티드의 길이로 단쇄화한 서열)

서열번호 23: (서열번호 4로 표시되는 압타머를, 공통 서열을 포함하는 17 뉴클레오티드의 길이로 단쇄화한 서열)

서열번호 24: (서열번호 8로 표시되는 압타머를, 공통 서열을 포함하는 29 뉴클레오티드의 길이로 단쇄화한 서열)

서열번호 14는 이하에 표시되는 화학 합성한 DNA 서열을 주형으로 하며, Dura Scribe^TM T7 Transcription Kit를 이용하여 전사함으로써 얻었다.

서열번호 15∼24의 핵산은 전부 화학 합성에 의해 제작하였다. 이들의 핵산이 오토탁신와 결합하는지의 여부를, 실시예 2와 동일한 표면 플라즈몬 공명법에 따라 평가하였다. 측정 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2에서는, 결합량이 서열번호 4의 압타머의 10％ 이하인 것을 결합하지 않는 (-)로 하고, 그 이상의 것은 결합하는 (+)로 하였다. 여기서 결합량이란, 최대의 레조넌스 유닛(RU)값을 나타낸다.

또한, 오토탁신 저해 활성을, 실시예 4와 동일하게 NPP2 저해 어세이로 측정하였다. 그 IC₅₀값을 표 2에 나타낸다.

NPP2 저해 어세이의 결과, 서열번호 14∼20 및 24로 표시되는 압타머는, IC₅₀값이 100 nM 이하인 강한 저해 활성을 갖고 있는 것을 알았다. 이들 압타머는 전부 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열을 포함하고 있다. 서열번호 14∼20의 압타머의 2차 구조는, 상기 공통 서열 부분이 식 (I"):

로 표시되고, 그 5' 말단 및 3' 말단의 각각에 계속되는 서열이 여러 가지 길이의 스템을 형성한다, 스템-루프 구조이다. 또한, 서열번호 24의 압타머는, 공통 서열의 일부가 스템 구조로 되어 있지만, 식 (II):

로 표시되는 공통 서열 부분과, 그 5' 말단 및 3' 말단의 각각에 계속되는 서열에 의해 형성되는 스템 구조로 이루어져 있고, 서열번호 14∼20의 압타머의 2차 구조에 가까운 구조로 되어있다.

이상보다, 서열번호 10으로 표시되는 서열은 오토탁신을 저해하는 데 중요한 서열인 것을 알았다. 또한, 서열번호 20의 압타머의 결과로부터, 23 뉴클레오티드까지 단쇄화하더라도 높은 저해 활성을 갖고 있는 것을 알았다.

실시예 6: 단쇄화한 압타머의 염기 치환, 결실의 효과

서열번호 16으로 표시되는 서열을 기초로, 뉴클레오티드의 치환, 결실을 도입하여, 압타머의 오토탁신 저해 활성에 대한 영향을 조사하였다. 제작한 이변 압타머의 서열을 서열번호 26∼37에 나타낸다. 밑줄은 공통 서열(서열번호 10) 부분을 나타내고, [ ]는 치환된 뉴클레오티드를 나타내며, "-"는 결실을 나타낸다. 또한 개개의 서열은, 5'로부터 3'의 방향으로 나타내고, 각 뉴클레오티드는, 퓨린(A 및 G)이 2'-OH(천연 RNA형)이며, 피리미딘(U 및 C)이 2'-플루오로 수식체인 것을 의미하고 있다.

서열번호 26: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단으로부터 2번째의 A를 U로, 11번째의 U를 A로 치환한 서열)

서열번호 27: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단으로부터 3번째의 A를 U로, 10번째의 U를 A로 치환한 서열)

서열번호 28: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단측으로부터 4번째의 A를 U로, 9번째의 U를 A로 치환한 서열)

서열번호 29: (서열번호 16으로 표시되는 서열의 5' 말단측으로부터 3번째의 U를 C로 치환한 서열)

서열번호 30: (서열번호 16으로 표시되는 서열의 3' 말단측으로부터 3번째의 G를 A로 치환한 서열)

서열번호 31: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단측으로부터 9번째의 U를 C로 치환한 서열)

서열번호 32: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단으로부터 12번째의 U를 C로 치환한 서열)

서열번호 33: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단으로부터 2번째의 A를 G로 치환한 서열)

서열번호 34: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단측으로부터 3번째의 A를 G로 치환한 서열)

서열번호 35: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단측으로부터 4번째의 A를 G로 치환한 서열)

서열번호 36: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단으로부터 10번째∼12번째의 UUU 중 1 염기를 결손시킨 서열)

서열번호 37: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단측으로부터 2∼4번째의 AAA 중 1 염기를 결손시킨 서열)

서열번호 26∼37의 핵산은 전부 화학 합성에 의해 제작하였다. 이들 핵산이 오토탁신과 결합하는지의 여부를, 실시예 2와 동일한 표면 플라즈몬 공명법에 따라 평가하였다. 측정 결과를 표 3에 나타내었다. 그 결과, 서열번호 26, 29∼34로 표시되는 압타머는 오토탁신에 결합하는 것을 알았다.

또한, 이들 핵산이 오토탁신 저해 활성을 나타내는지의 여부를, 실시예 4와 마찬가지로 NPP2 저해 어세이로 측정하였다. 그 IC₅₀값을 표 3에 나타낸다. 그 결과, 서열번호 29, 30, 32의 압타머는 IC₅₀값이 100 nM 이하인 높은 저해 활성을 나타내었다.

표 3에 포함되는 서열 중 서열번호 26∼28의 결과로부터, 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단으로부터 2번째의 A 및 11번째의 U에 동시에 이변을 도입하면, 저해 활성이 감소하고, 상기 공통 서열의 5' 말단으로부터 3번째의 A 및 10번째의 U, 또는 5' 말단으로부터 4번째의 A 및 9번째의 U에 동시에 이변을 도입하면, 저해 활성이 보다 현저하게 감소하는 것을 알았다. 서열번호 29와 30이 표 3 중에서 높은 저해 활성을 나타내었지만, MFOLD 프로그램으로부터 예측되는 그 2차 구조는, 서열번호 16과 동일한 것을 알았다. 이들은, 공통 서열 부분 이외의 스템 부분에 이변이 들어간 것으로, 스템 부분은 몇 가지인가 이변이 들어가도 구조를 유지할 수 있으면, 활성에 영향을 끼치지 않는 것이 시사되었다. 한편으로, 서열번호 32의 결과로부터, 공통 서열에 포함되는 5' 말단으로부터 12번째의 U는 약간 저해 활성이 떨어지지만, C로 치환이 가능한 것을 알았다. 그러나, 서열번호 33∼34의 결과로부터, 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단으로부터 2번째의 A는 G로 변환할 수 없고, 5' 말단으로부터 3번째의 A를 G로 치환하면, 저해 활성이 감소하는 것을 알았다. 또한, 서열번호 35의 결과로부터, 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단측으로부터 4번째의 A를 G에 치환하면, 결합 활성, 저해 활성이 함께 현저하게 감소하는 것을 알 수 있어, 결합과 저해 활성에 중요한 부분인 것이 시사되었다. 또한 서열번호 36과 37의 결과로부터, 공통 서열의 염기가 하나라도 결손하면, 결합·저해 활성이 함께 현저하게 감소하는 것도 알았다.

실시예 7: 보다 높은 활성의 오토탁신 압타머의 제작 1

서열번호 16으로 표시되는 서열 중, 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열을 9％의 랜덤 서열에 도프한 RNA 풀을 이용하여 SELEX를 행하였다. SELEX는 실시예 1과 거의 동일하게 행하였다. 그 DNA 주형과 5' 말단측의 프라이머 서열을 이하에 나타낸다. 또한, 프라이머 Rev는 서열번호 3의 핵산을 사용하였다. DNA 주형과 프라이머는 화학 합성에 의해 제작하였다.

주형

2 라운드와 5 라운드 종료 후에 각각 48 클론의 합계 98 클론의 서열을 조사한 바, 대부분의 서열이 서열번호 4로 나타나는 서열이었다. 그 중에서, 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열 중인 뉴클레오티드가 치환된 것이 2개 확인되었다. 이들에 대해서 상기 공통 서열 부분을 포함하는 길이 29 뉴클레오티드로 단쇄화한 것의(서열번호 40 및 41) 서열을 이하에 나타낸다. 밑줄은 공통 서열(서열번호 10) 부분을 나타내고, [ ]는 치환된 뉴클레오티드를 나타낸다. 또한 개개의 서열은, 5'로부터 3'의 방향으로 나타내고, 각 뉴클레오티드는, 퓨린(A 및 G)이 2'-OH(천연 RNA형)이며, 피리미딘(U 및 C)이 2'-플루오로 수식체인 것을 의미하고 있다.

서열번호 40: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단으로부터 2번째의 A가 U로 치환된 서열)

서열번호 41: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5`말단으로부터 10번째의 U가 C로 치환된 서열)

서열번호 40과 41의 핵산은 전부 화학 합성에 의해 제작하였다. 이들 핵산이 오토탁신 저해 활성을 나타내는지의 여부를, 실시예 4와 마찬가지로 NPP2 저해 어세이로 측정하였다. 그 IC₅₀값을 표 4에 나타낸다. 그 결과, 모두 오토탁신에 대하여 IC₅₀값이 100 nM 이하인 높은 저해 활성을 나타내었다. 서열번호 40의 결과로부터, 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단으로부터 2번째의 A는 U로 할 수도 있는 것이 나타났다. 따라서, 오토탁신에 결합하여, 그 활성을 저해할 수 있는 압타머의 공통 서열로서, GWAACAGGUUUUGCU(W는 A 또는 U를 나타낸다)(서열번호 42)가 추출되었다. 또한, 서열번호 41의 결과로부터, 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단으로부터 10번째의 U는 C로 치환 가능한 것이 나타났다.

서열번호 40과 41의 압타머는, 모두 공통 서열(상기 식 (I))과 스템 구조로 이루어지는 구조였다. 특히 서열번호 41은 서열번호 16과 동일한 구조를 취하고 있었다.

실시예 8: 보다 높은 활성의 오토탁신 압타머의 제작 2

또한, 서열번호 16으로 표시되는 서열 중, 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열 이외의 서열 부분을 9％의 랜덤 서열에 도프한 RNA 풀을 이용하여 SELEX를 행하였다. SELEX는 실시예 1과 거의 동일하게 행하였다. 그 주형 서열을 이하에 나타낸다. 또한 프라이머는 서열번호 39의 핵산과 서열번호 3의 핵산을 사용하였다. DNA 주형과 프라이머는 화학 합성에 의해 제작하였다.

DNA 주형

5 라운드 종료 후에, 1, 3, 5 라운드로부터 각각 48 클론, 합계 144 클론에 대해서 서열을 조사하였다. 대부분의 서열이 서열번호 4로 표시되는 서열이지만, 그 중에 서열번호 16으로 표시되는 서열 부분의 염기가 치환된 서열이 있었다. 이들에 대해서 공통 서열(서열번호 10) 부분을 포함하는 길이 29 뉴클레오티드에 단쇄화한 것(서열번호 44∼48)의 서열을 이하에 나타낸다. 밑줄은 공통 서열(서열번호 10) 부분을 나타내고, [ ]는 치환된 뉴클레오티드를 나타낸다. 또한 개개의 서열은, 5'로부터 3'의 방향으로 나타내고, 각 뉴클레오티드는, 퓨린(A 및 G)이 2'-OH(천연 RNA형)이며, 피리미딘(U 및 C)이 2'-플루오로 수식체인 것을 의미하고 있다.

서열번호 44: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열 이외의 2개소가 치환된 서열)

서열번호 45: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열 이외의 1개소가 치환된 서열)

서열번호 46: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단으로부터 11번째의 U가 C로 치환된 서열)

서열번호 47: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열 이외의 2개소가 치환된 서열)

서열번호 48: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열 이외의 2개소가 치환된 서열)

서열번호 44∼48의 핵산은 전부 화학 합성에 의해 제작하였다. 이들 핵산이 오토탁신 저해 활성을 나타내는지의 여부를, 실시예 4와 동일한 방법으로 측정하였다. 그 IC₅₀값을 표 4에 나타낸다. 그 결과, 이들 압타머는 IC₅₀값이 100 nM 이하의 높은 저해 활성을 나타내는 것을 알았다. 서열번호 46의 결과로부터, 공통 서열(서열번호 10 또는 42)의 5' 말단으로부터 11번째의 U는 C로 치환할 수 있는 것이 나타났다. 전술한 서열번호 32 및 41의 결과와 합치면, 공통 서열의 5' 말단으로부터 10번째∼12번째의 UUU 중, 적어도 하나의 U는 C로 치환 가능한 것이 시사되었다. 따라서, 오토탁신에 결합하여, 그 활성을 저해할 수 있는 압타머의 공통 서열로서, GWAACAGGUYYYGCU(W는 A 또는 U, Y는 U 또는 C을 나타낸다)(서열번호 49)가 추출되었다.

또한, 공통 서열 이외의 부분에서는, 공통 서열(상기 식 (I'))과 스템 구조와로 이루어지는 2차 구조를 취할 수 있는 한, 스템 부분에 수 개의 이변이 도입되어도 활성에 영향을 끼치지 않는 것이 나타났다. 또한, 서열번호 45와 47(MFOLD에 의한 2차 구조 예측에서는 말단의 2뉴클레오티드는 스템 구조를 취하지 않는다)의 결과로부터, 스템 구조의 길이는 7일 필요는 없고, 보다 짧은 것이어도 좋은 것을 알았다. 이것은 서열번호 17의 압타머에 활성이 있는 것과 일치한다.

실시예 9: 보다 높은 활성의 오토탁신 압타머의 제작 3

또한, 서열번호 16으로 표시되는 서열 중, 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열 이외의 서열 부분을 45％의 랜덤 서열에 도프한 RNA 풀을 이용하여 SELEX를 행하였다. SELEX는 실시예 1과 거의 동일하게 행하였다. 그 DNA 주형으로서 서열번호 43을 사용하였다. 또한 프라이머는 서열번호 39와 서열번호 3을 사용하였다.

SELEX를 6 라운드 행한 후에 48 클론의 서열을 조사한 바, 수속은 보이지 않았지만, 도프를 넣은 부분이 여러 가지 염기로 치환된 서열이 얻어졌다. 이들에 대해서 공통 서열을 포함하는 길이 29 또는 30 뉴클레오티드로 단쇄화한 것(서열번호 50∼53)의 서열을 이하에 나타낸다. 밑줄은 공통 서열(서열번호 10) 부분을 나타내고, [ ]는 치환된 뉴클레오티드를 나타낸다. 또한 개개의 서열은, 5'로부터 3'의 방향으로 나타내고, 각 뉴클레오티드는, 퓨린(A 및 G)이 2'-OH(천연 RNA형)이며, 피리미딘(U 및 C)이 2'-플루오로 수식체인 것을 의미하고 있다.

서열번호 50: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열 이외의 7개소가 치환된 길이가 30 뉴클레오티드인 서열)

서열번호 51: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열 이외의 5개소가 치환된 서열)

서열번호 52: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열 이외의 4개소가 치환된 서열)

서열번호 53: (서열번호 10으로 표시되는 공통 서열 이외의 7개소가 치환된 서열)

서열번호 50∼53의 핵산은 전부 화학 합성에 의해 제작하였다. 이들 핵산이 오토탁신 저해 활성을 나타내는지의 여부를, 실시예 4와 동일한 방법으로 측정하였다. 그 IC₅₀값을 표 4에 나타낸다. 그 결과, 모두 오토탁신에 대하는 저해 활성을 나타내었다. 서열번호 50∼53의 결과로부터, 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열 이외의 부분은 4개소, 5개소, 또는 7개소의 염기 치환이 가능한 것이 시사되었다.

이상, 실시예 6∼9의 결과로부터, 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 5' 말단으로부터 2번째의 A는 U로 치환할 수 있고, 상기 공통 서열의 5' 말단으로부터 10번째∼12번째의 UUU 중, 적어도 하나의 U는 C로 치환할 수 있는 것을 알았다. 즉, 오토탁신에 결합하여, 그 활성을 저해할 수 있는 압타머의 공통 서열로서, GWAACAGGUYYYGCU(W는 A 또는 U, Y는 U 또는 C을 나타낸다)(서열번호 49)가 추출되었다. 또한, 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열 이외의 부분은 1개∼7개의 치환이 가능한 것이 나타났다.

실시예 10: 단쇄화한 압타머의 수식

서열번호 16으로 표시되는 압타머의 말단을 수식한 개변체나, 서열 중의 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치에 수식을 도입한 개변체, 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 개변체를 제작하였다. 이들의 서열을 서열번호 16(1)∼16(68)에 나타낸다. 핵산은 전부 화학 합성에 의해 제작하였다.

이하에 각각의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각 서열 중, 각 뉴클레오티드의 우측의 괄호는 그 2' 위치에 있어서의 수식을 나타내고, F는 불소 원자를, M은 메톡시기를 각각 나타낸다. 또한, 각 뉴클레오티드의 우측의 소문자의 s는, 그 뉴클레오티드의 인산기의 포스포로티오에이트화, ss는 포스포로디티오에이트화를 각각 나타낸다. 그 외의 소문자는 디옥시리보 뉴클레오티드를 나타낸다. 또한, 말단 수식에 있어서, idT는 역위-dT를, Y는 ssH 링커를, 40P는 SUNBRIGHT GL2-400GS2를, 80P는 SUNBRIGHT GL2-800GS2를, 40PP는 SUNBRIGHT GL2-400TS를, 80PP는 SUNBRIGHT GL2-800TS, 80PPP는 SUNBRIGHT GL4-800GS2의 폴리에틸렌 글리콜을, 각각 나타낸다. 밑줄은 공통 서열(서열번호 10) 부분을 나타낸다.

서열번호 16(1): (서열번호 16으로 표시되는 압타머에 메톡시 수식을 도입한 서열)

서열번호 16(2): (서열번호 16으로 표시되는 압타머에 수식을 도입한 서열)

서열번호 16(3): (서열번호 16(1)로 표시되는 압타머의 양말단에 idT 수식을 도입한 서열)

서열번호 16(4): (서열번호 16(2)로 표시되는 압타머의 양말단에 idT 수식을 도입한 서열)

서열번호 16(5): (서열번호 16(4)로 표시되는 압타머의 서열 중 1개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(6): (서열번호 16(4)로 표시되는 압타머의 서열 중 2개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(7): (서열번호 16(4)로 표시되는 압타머의 서열에 포스포로티오에이트를 도입한 서열)

서열번호 16(8): (서열번호 16(4)로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단에 40 kDa 폴리에틸렌 글리콜을 도입한 서열)

서열번호 16(9): (서열번호 16(4)로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단에 80 kDa 폴리에틸렌 글리콜을 도입한 서열)

서열번호 16(10): (서열번호 16(4)로 표시되는 압타머의 서열 중 3개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(11): (서열번호 16(4)로 표시되는 압타머의 서열 중 2개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(12): (서열번호 16(4)로 표시되는 압타머의 서열 중 2개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(13): (서열번호 16(4)로 표시되는 압타머의 서열 중 1개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(14): (서열번호 16(4)로 표시되는 압타머의 서열 중 1개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(15): (서열번호 16(4)로 표시되는 압타머의 서열 중 1개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(16): (서열번호 16(4)로 표시되는 압타머의 서열 중 1개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(17): (서열번호 16(4)로 표시되는 압타머의 서열 중 1개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(18): (서열번호 16(4)로 표시되는 압타머의 서열 중 1개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(19): (서열번호 16(4)로 표시되는 압타머의 서열 중 1개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(20): (서열번호 16(4)로 표시되는 압타머의 서열 중 1개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(21): (서열번호 16(6)으로 표시되는 압타머의 서열 중 1개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(22): (서열번호 16(21)로 표시되는 압타머의 서열에 포스포로티오에이트를 도입한 서열)

서열번호 16(23): (서열번호 16(22)로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단 idT 대신에 40 kDa의 폴리에틸렌 글리콜을 도입한 것.)

서열번호 16(24): (서열번호 16(21)로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단 idT 대신에 40 kDa의 폴리에틸렌 글리콜을 도입한 것.)

서열번호 16(25): (서열번호 16(6)으로 표시되는 압타머의 서열 중 4개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(26): (서열번호 16(6)으로 표시되는 압타머의 서열 중 2개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(27): (서열번호 16(6)으로 표시되는 압타머의 서열 중 2개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(28): (서열번호 16(6)으로 표시되는 압타머의 서열 중 2개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(29): (서열번호 16(6)으로 표시되는 압타머의 서열 중 2개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(30): (서열번호 16(21)로 표시되는 클론의 서열의 5' 말단 idT 대신에 ssH 링커를 도입한 서열)

서열번호 16(31): (서열번호 16(22)로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단 idT 대신에 ssH 링커를 도입한 서열)

서열번호 16(32): (서열번호 16(21)로 표시되는 압타머의 서열 중 6개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(33): (서열번호 16(21)로 표시되는 압타머의 서열 중 3개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(34): (서열번호 16(32)로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단 idT 대신에 40 kDa의 폴리에틸렌 글리콜을 도입한 것)

서열번호 16(35): (서열번호 16(33)으로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단 idT 대신에 40 kDa의 폴리에틸렌 글리콜을 도입한 것)

서열번호 16(36): (서열번호 16(32)로 표시되는 압타머의 서열에 포스포로티오에이트를 도입한 서열)

서열번호 16(37): (서열번호 16(33)으로 표시되는 압타머의 서열에 포스포로티오에이트를 도입한 서열)

서열번호 16(38): (서열번호 16(21)로 표시되는 압타머의 서열 중 2개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(39): (서열번호 16(38)로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단 idT 대신에 40 kDa의 폴리에틸렌 글리콜을 도입한 것)

서열번호 16(40): (서열번호 16(21)로 표시되는 압타머의 서열 중 1개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(41): (서열번호 16(21)로 표시되는 압타머의 서열 중 1개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(42): (서열번호 16(21)로 표시되는 압타머의 서열 중 1개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(43): (서열번호 16(21)로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단 idT 대신에 80 kDa의 폴리에틸렌 글리콜을 도입한 것)

서열번호 16(44): (서열번호 16(43)으로 표시되는 압타머에 포스포로티오에이트를 도입한 서열)

서열번호 16(45): (서열번호 16(21)로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단 idT 대신에 80 kDa의 폴리에틸렌 글리콜을 도입한 것)

서열번호 16(46): (서열번호 16(45)로 표시되는 압타머에 포스포로티오에이트를 도입한 서열)

서열번호 16(47): (서열번호 16(21)로 표시되는 압타머의 서열 중 3개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(48): (서열번호 16(47)로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단 idT 대신에 80 kDa의 폴리에틸렌 글리콜을 도입한 것)

서열번호 16(49): (서열번호 16(48)로 표시되는 압타머에 포스포로티오에이트를 도입한 서열)

서열번호 16(50): (서열번호 16(38)로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단 idT 대신에 80 kDa의 폴리에틸렌 글리콜을 도입한 것)

서열번호 16(51): (서열번호 16(50)으로 표시되는 압타머에 포스포로티오에이트를 도입한 서열)

서열번호 16(52): (서열번호 16(40)으로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단 idT 대신에 80 kDa의 폴리에틸렌 글리콜을 도입한 것)

서열번호 16(53): (서열번호 16(52)로 표시되는 압타머에 포스포로티오에이트를 도입한 서열)

서열번호 16(54): (서열번호 16(36)으로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단 idT 대신에 80 kDa의 폴리에틸렌 글리콜을 도입한 것)

서열번호 16(55): (서열번호 16(47)로 표시되는 압타머의 서열에 포스포로티오에이트를 도입하고, 더욱 2개소에 메톡시 수식을 도입한 서열)

서열번호 16(56): (서열번호 16(47)로 표시되는 압타머의 서열에 포스포로티오에이트를 도입하고, 더욱 2개소에 메톡시 수식을 도입한 서열)

서열번호 16(57): (서열번호 16(47)로 표시되는 압타머의 서열에 포스포로티오에이트를 도입하고, 더욱 1개소에 메톡시 수식을 도입한 서열)

서열번호 16(58): (서열번호 16(47)로 표시되는 압타머의 서열에 포스포로티오에이트를 도입하고, 더욱 1개소에 메톡시 수식을 도입한 서열)

서열번호 16(59): (서열번호 16(47)로 표시되는 압타머의 서열에 포스포로티오에이트를 도입하고, 더욱 1개소에 메톡시 수식을 도입한 서열)

서열번호 16(60): (서열번호 16(47)로 표시되는 압타머의 서열에 포스포로티오에이트를 도입하고, 더욱 1개소에 메톡시 수식을 도입한 서열)

서열번호 16(61): (서열번호 16(47)로 표시되는 압타머의 서열에 포스포로티오에이트를 도입하고, 더욱 1개소에 메톡시 수식을 도입한 서열)

서열번호 16(62): (서열번호 16(47)로 표시되는 압타머의 서열에 포스포로티오에이트를 도입하고, 더욱 1개소에 메톡시 수식을 도입한 서열)

서열번호 16(63): (서열번호 16(49)로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단의 폴리에틸렌 글리콜을 80 kDa에서 40 kDa로 변경한 서열)

서열번호 16(64): (서열번호 16(49)로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단의 폴리에틸렌 글리콜의 종류를 변경한 서열)

서열번호 16(65): (서열번호 16(49)로 표시되는 압타머의 서열의 5개소에 메톡시 수식을 도입한 서열)

서열번호 16(66): (서열번호 16(65)로 표시되는 압타머의 서열의 5' 말단의 폴리에틸렌 글리콜을 80 kDa에서 40 kDa로 변경한 서열)

서열번호 16(67): (서열번호 16(49)로 표시되는 압타머의 서열의 6개소에 메톡시 수식을 도입한 서열)

서열번호 16(68): (서열번호 16(47)로 표시되는 압타머의 서열에 포스포로디티오에이트를 도입하고, 더욱 1개소를 디옥시리보 뉴클레오티드로 치환한 서열)

서열번호 16(1)∼16(68)의 핵산은 전부 화학 합성에 의해 제작하였다. 이들 핵산이 오토탁신 저해 활성을 나타내는지의 여부를, 실시예 4와 동일한 NPP2 저해 어세이로 측정하였다. 그 IC₅₀값을 표 5에 나타낸다. 서열번호 16(1)∼16(68)로 표시되는 압타머는, NPP2 저해 어세이에 있어서 IC₅₀값이 100 nM 이하인 높은 저해 활성을 나타내었다.

서열번호 16(1)∼16(68)로 표시되는 압타머는, 서열번호 10으로 표시되는 공통 서열의 부분 및 스템 부분의 수식을 바꾼 것인데, 모두 오토탁신에 대하여 저해 활성을 나타내었다. 이것은 리보스의 2' 위치의 수식이 각종 변경 가능한 것을 나타내고 있다.

또한, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트 수식을 실시함으로써 활성이 향상하는 것을 알았다.

실시예 11: 오토탁신 압타머의 특이성의 확인

서열번호 16(23)으로 표시되는 압타머가 FGF2(페프로테크사)에 대하여 결합 활성을 가지고 있는지의 여부를 표면 플라즈몬 공명법으로 확인하였다. 오토탁신을 플로우셀 2에, FGF2를 플로우셀 3에 고정화하여(약 1100 RU), 압타머를 인젝션하였다. 그 외는 실시예 2와 동일하게 행하였다. 측정의 결과, 서열번호 16(23)으로 표시되는 압타머는 FGF2에는 결합하지 않는 것을 알았다(도 3). 이것은, 본 발명의 압타머가 오토탁신에 특이적으로 결합하는 것을 나타내고 있다.

실시예 12: 오토탁신 압타머의 폐섬유증에의 효과

실시예 10에서 제작한 서열번호 16(49)로 표시되는 압타머를, 블레오마이신 유도형 폐섬유증 모델 마우스에게 복강내 투여하여, 그 효과를 검증하였다.

ICR계 SPF 마우스(10주 연령, 수컷, 니혼찰즈리버)에 대하여, PBS로 770 μg/mL로 조정한 블레오마이신 50 μL를, 마취 하, 기관내 투여하였다. 블레오마이신을 투여한 다음날부터 매일 1회, 1 mM 염화마그네슘이 든 PBS에 녹인 오토탁신 압타머 용액, 또는 1 mM 염화마그네슘이 든 PBS만(비히클군)을, 1회의 투여량 100 μL로 복강내 투여하였다. 압타머 투여량은 1 ㎎/㎏/일 및 3 ㎎/㎏/일의 2용량으로 하였다. 또한, 무처치의 컨트롤군도 동일한 시험 기간 사육하였다. 블레오마이신 투여 개시로부터 21일째에 시험을 종료하고, 폐를 적출하여, 좌측 폐를 히드록시프롤린 측정용으로 동결 보존하였다. 또한 우측 폐는 10％ 포르말린 용액으로 고정하여, 조직 세그먼트를 제작하여 메이슨·트리크롬 염색을 행하였다. 히드록시프롤린의 측정은 바이오비전사의 Hydroxyproline Colorimetric Assay 키트를 이용하여 측정하였다. 또한 섬유화의 클리니컬 스코어로서 평가하는 방법은 이하와 같이 행하였다. 즉, 전체 관찰면의 영역에 있어서 콜라게 섬유의 증생이 없는 것을 0, 약 25％까지 보이는 것을 1, 약 25％∼50％까지 보이는 것을 2, 약 50％∼75％까지 보이는 것을 3, 75％ 이상인 경우를 4로 하였다. 또한, 통계학적 유의차의 평가는 컨트롤군과 비히클군의 검정은 T 검정, 비히클군과 약제 투여군의 검정으로 등분산의 것은 Dunnett 검정, 부등 분산의 것은 Steel 검정으로 행하였다.

도 4, 5에 결과를 나타내었다. 모든 결과는 마우스 6마리∼7마리의 평균값±S.E로 나타내었다. 또한, 도면 중의 **는 p＜0.01을 나타낸다. 도 4에 좌측폐 중량당의 히드록시프롤린 양을 나타내었다. 압타머 투여군 3 ㎎/㎏에서, 비히클군에 대하여 억제가 보여졌다. 또한, 도 5의 섬유화 스코어에서는, 압타머 투여군 3 ㎎/㎏에서 비히클군에 대하여 유의하게(p＜0.01) 억제가 보여졌다.

이상으로부터, 서열번호 16(49)로 표시되는 압타머는 폐섬유증 치료약으로서 사용 가능한 것이 시사되었다.

본 발명의 압타머 및 복합체는, 섬유증 등의 질환에 대한 의약, 혹은 진단약, 시약으로서 유용할 수 있다. 본 발명의 압타머 및 복합체는 또한, 오토탁신의 정제 및 농축과 오토탁신의 검출 및 정량에 유용할 수 있다.

본 출원은 일본에서 출원된 특허 출원 제2014-090755호(출원일: 평성26년 4월 24일)를 기초로 하고 있으며, 그 내용은 전부 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.

SEQUENCE LISTING <110> RIBOMIC INC. <120> Aptamer that binds to autotaxin and inhibits its physiological activity and use thereof <130> 092336 <150> JP 2014-090755 <151> 2014-04-24 <160> 53 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA template <220> <221> misc_feature <222> (21)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 cggatacgtc tcacttcgtc nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn cagagcgttt 60 agagtgcggt ccc 73 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 taatacgact cactataggg accgcactct aaacgctctg 40 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 cggatacgtc tcacttcgtc 20 <210> 4 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 4 gggaccgcac ucuaaacgcu cugagggaaa cagguuuugc uccucggagc guggacgaag 60 ugagacguau ccg 73 <210> 5 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA template <220> <221> misc_feature <222> (20)..(59) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 gtacgaagac gcatctcacn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng 60 ttccatgtcc tgttgccacc c 81 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 taatacgact cactataggg tggcaacagg acatggaac 39 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gtacgaagac gcatctcac 19 <210> 8 <211> 81 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 8 ggguggcaac aggacaugga acgcgcccca acugcuugaa acagguuuug cugagcagug 60 augugagaug cgucuucgua c 81 <210> 9 <211> 81 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 9 ggguggcaac aggacaugga acgcgcccca acugcuugaa acugguuuug cugagcagug 60 augugagaug cgucuucgua c 81 <210> 10 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 10 gaaacagguu uugcu 15 <210> 11 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA template <220> <221> misc_feature <222> (21)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 11 aagcttcgta agtcgcagtc nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn cagcgtagta 60 gtggtcctaa ccc 73 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 taatacgact cactataggg ttaggaccac tactacgctg 40 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 aagcttcgta agtcgcagtc 20 <210> 14 <211> 52 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 14 gggcuaaacg cucugaggga aacagguuuu gcuccucgga gcguggacgc cc 52 <210> 15 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 15 ccgcucugag ggaaacaggu uuugcuccuc ggagcgg 37 <210> 16 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 16 ucugagggaa acagguuuug cuccucgga 29 <210> 17 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 17 ugagggaaac agguuuugcu ccucg 25 <210> 18 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 18 cugagggaaa cagguuuugc uccucgg 27 <210> 19 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 19 cgagggaaac agguuuugcu ccucg 25 <210> 20 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 20 gagggaaaca gguuuugcuc cuc 23 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 21 agggaaacag guuuugcucc u 21 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 22 gggaaacagg uuuugcucc 19 <210> 23 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 23 ggaaacaggu uuugcuc 17 <210> 24 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 24 acugcuugaa acagguuuug cugagcagu 29 <210> 25 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA template <400> 25 gggcgtccac gctccgagga gcaaaacctg tttccctcag agcgtttagc cctatagtga 60 gtcgtatta 69 <210> 26 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 26 ucugagggua acagguuaug cuccucgga 29 <210> 27 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 27 ucugagggau acagguauug cuccucgga 29 <210> 28 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 28 ucugagggaa ucaggauuug cuccucgga 29 <210> 29 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 29 uccgagggaa acagguuuug cuccucgga 29 <210> 30 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 30 ucugagggaa acagguuuug cuccucaga 29 <210> 31 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 31 ucugagggaa acaggcuuug cuccucgga 29 <210> 32 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 32 ucugagggaa acagguuucg cuccucgga 29 <210> 33 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 33 ucugagggga acagguuuug cuccucgga 29 <210> 34 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 34 ucugagggag acagguuuug cuccucgga 29 <210> 35 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 35 ucugagggaa gcagguuuug cuccucgga 29 <210> 36 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 36 ucugagggaa acagguuugc uccucgga 28 <210> 37 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 37 ucugagggaa cagguuuugc uccucgga 28 <210> 38 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA template <400> 38 cggatacgtc tcacttcgtc cacgctccga ggagcaaaac ctgtttccct cagagcgttt 60 agagtgcggt ccc 73 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 taatacgact cactataggg accgcactct aaacgc 36 <210> 40 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 40 ucugagggua acagguuuug cuccucgga 29 <210> 41 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 41 ucugagggaa acaggucuug cuccucgga 29 <210> 42 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 42 gwaacagguu uugcu 15 <210> 43 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA template <400> 43 cggatacgtc tcacttcgtc cacgctccga ggagcaaaac ctgtttccct cagagcgttt 60 agagtgcggt ccc 73 <210> 44 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 44 ucugggggaa acagguuuug cuccccgga 29 <210> 45 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 45 ucugagggaa acagguuuug cuccucgaa 29 <210> 46 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 46 ucugagggaa acagguucug cuccucgga 29 <210> 47 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 47 uccgagggaa acagguuuug cuccucgca 29 <210> 48 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 48 ucugaggaaa cagguuuugc ugcucgga 28 <210> 49 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 49 gwaacagguy yygcu 15 <210> 50 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 50 uagagaugga aacagguuuu gcucaucuca 30 <210> 51 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 51 uuugaaggaa acagguuuug cucuucgag 29 <210> 52 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 52 uucgagggaa acagguuuug cuccucaaa 29 <210> 53 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 53 ugggaaggaa acagguuuug cucuucacc 29

Claims

오토탁신(autotaxin)에 결합하는 압타머(aptamer)로서, 하기 식:
GWAACAGGUUUUGCU (서열번호 42)
(식 중, W는 A 또는 U이다)
으로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다)을 포함하고, 또한 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것인 압타머:
(a) 상기 압타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 불소 원자이고,
(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 히드록시기인 압타머;
(b) 상기 (a)의 압타머에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 불소 원자가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고,
(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록시기가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 압타머.
제1항에 있어서, W가 A인 압타머.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 10으로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중에 1개∼수 개의 뉴클레오티드가 치환, 삽입 또는 부가되고, 또한 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것인, 오토탁신에 결합하는 압타머:
(a) 상기 치환, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 불소 원자이고,
(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 히드록시기인 압타머;
(b) 상기 (a)의 치환, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 불소 원자가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고,
(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록시기가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 압타머.
오토탁신에 결합하는 압타머로서,
하기 (A), (B) 또는 (C):
(A) 서열번호 4, 8, 14∼20, 24, 29, 30, 32, 40, 41, 44∼48 및 50∼53에서 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다);
(B) 서열번호 4, 8, 14∼20, 24, 29, 30, 40, 44, 45, 47, 48 및 50∼53에서 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다)에 있어서, 1개∼수 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열;
(C) 서열번호 4, 8, 14∼20, 24, 29, 30, 40, 44, 45, 47, 48 및 50∼53에서 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다)과 60％ 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열
중 어느 것의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또한 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것인 압타머:
(a) 상기 압타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 불소 원자이고,
(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 히드록시기인 압타머;
(b) 상기 (a)의 압타머에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 불소 원자가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고,
(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록시기가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 압타머.
오토탁신에 결합하는 압타머로서,
하기 (A'), (B') 또는 (C'):
(A') 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다);
(B') 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다)(GAAACAGGUUUUGCU(서열번호 10)로 표시되는 서열을 제외한다)에 있어서, 1개∼7개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열;
(C') 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이어도 좋다)과 70％ 이상의 동일성을 갖는(단, GAAACAGGUUUUGCU(서열번호 10)로 표시되는 서열은 동일하다) 뉴클레오티드 서열
중 어느 것의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또한 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것인 압타머:
(a) 상기 압타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 불소 원자이고,
(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 히드록시기인 압타머;
(b) 상기 (a)의 압타머에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 불소 원자가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고,
(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록시기가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 압타머.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 염기 길이가 23 이상인 압타머.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드가 수식 또는 개변되어 있는 압타머.
제8항에 있어서, 역위(inverted) dT 또는 폴리에틸렌 글리콜로 수식되어 있는 압타머.
제9항에 있어서, 역위 dT 또는 폴리에틸렌 글리콜이 압타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 결합하고 있는 압타머.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머에 포함되는 인산기 중 하나 이상이 포스포로티오에이트화(phosphorothioated) 또는 포스포로디티오에이트화(phosphorodithioated)된 것인 압타머.
오토탁신에 결합하는 압타머로서, 서열번호 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 중, GAAACAGGUUUUGCU(서열번호 10)로 표시되는 서열에 있어서의 인산기 중 하나 이상이 포스포로티오에이트화 또는 포스포로디티오에이트화된 것이며, 압타머의 5' 말단 또는 3' 말단이 각각 역위 dT 또는 폴리에틸렌 글리콜로 수식된 것이고, 또한 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것인 압타머:
(a) 상기 압타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 불소 원자이고,
(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 히드록시기인 압타머;
(b) 상기 (a)의 압타머에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 불소 원자가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고,
(ii) 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록시기가 각각 독립적으로, 무치환이거나, 수소 원자, 메톡시기 및 불소 원자로 이루어지는 군에서 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 압타머.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 압타머와 기능성 물질을 포함하는 복합체.
제13항에 있어서, 기능성 물질이 친화성 물질, 표지용 물질, 효소, 약물, 독소 또는 약물 송달 매체인 복합체.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 압타머, 또는 제13항 또는 제14항에 기재된 복합체를 포함하는 의약.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 압타머, 또는 제13항 또는 제14항에 기재된 복합체를 포함하는 항섬유화제.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 압타머, 또는 제13항 또는 제14항에 기재된 복합체를 포함하는 오토탁신의 검출용 프로브.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 압타머, 또는 제13항 또는 제14항에 기재된 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는, 오토탁신의 검출 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 압타머를 포함하여 이루어지는, 오토탁신의 저해제.