CN111542607A - 针对adamts5的适配体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供适配体,其是与具有血小板反应蛋白基序5的解联蛋白和金属蛋白酶(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs‑5,ADAMTS5)结合的适配体,且包含以下的式(1)或式(2)所表示的序列(其中,尿嘧啶可以是胸腺嘧啶):(1)GGGGCCUCC‑N1‑GGACYAAACC、(2)GGGGCCUCC‑N1‑GGACWYAAACC,式中,N1为3~24个长度的碱基,Y表示C或U,W表示A或U。
Description
技术领域
本发明涉及针对ADAMTS5的适配体及其利用方法等。
背景技术
已知ADAMTS5(具有血小板反应蛋白基序5的解联蛋白和金属蛋白酶(Adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5))是ADAMTS家族蛋白之一,在软骨细胞或滑膜细胞中表达,起到聚集蛋白聚糖降解酶的作用,是软骨病变中的主要致病蛋白。因此,ADAMTS5抑制剂可用作以变形性膝关节炎为代表的软骨病变的治疗剂(非专利文献1~4)。
近年来,RNA适配体在治疗药、诊断药、试剂中的应用受到关注,几种RNA适配体已进入临床阶段或实用阶段。2004年12月作为世界上第一个RNA适配体药物的Macugen在美国被批准作为老年性黄斑变性的治疗药。RNA适配体是指特异性地与蛋白等靶物质结合的RNA,可使用SELEX法(指数富集配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment))来制作(参照专利文献1~3)。SELEX法是指从1014个左右的具有不同的核苷酸序列的RNA库(RNApool)中选出特异性地与靶物质结合的RNA的方法。所使用的RNA形成了通过引物序列夹入40个残基左右的随机序列的结构。使该RNA库与靶物质缔合,使用滤器等仅回收与靶物质结合的RNA。回收的RNA通过RT-PCR扩增,将其用作下一轮的模板。通过重复进行10次左右该操作,有时可获取特异性地与靶物质结合的RNA适配体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开W091/19813号小册子;
专利文献2:国际公开W094/08050号小册子;
专利文献3:国际公开W095/07364号小册子;
非专利文献
非专利文献1:J Biol Chem.2002 Jun 21;277(25):22201-8;
非专利文献2:Nature.2005Mar31;434(7033):648-52;
非专利文献3:Nat Clin Pract Rheumatol.2008Aug;4(8):420-7;
非专利文献4:Osteoarthritis Cartilage.2015Aug;23(8):1254-66。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于:提供针对ADAMTS5的适配体及其利用方法等。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题,本发明人进行了深入研究,结果成功地制作了针对ADAMTS5的优质的适配体,因此完成了本发明。
即,本发明如下:
[1]适配体,其是与具有血小板反应蛋白基序5的解联蛋白和金属蛋白酶(Adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5,ADAMTS5)结合的适配体,且包含以下的式(1)或式(2)所表示的序列(其中,尿嘧啶可以是胸腺嘧啶):
(1)GGGGCCUCC-N1-GGACYAAACC
(2)GGGGCCUCC-N1-GGACWYAAACC
(式中,N1为3~24个长度的碱基,Y表示C或U,W表示A或U)。
[2][1]所述的适配体,该适配体具有以下的式(1)’或式(2)’所表示的潜在的二级结构:
[化学式1]
这里,式(1)’和式(2)’中的如下部分显示可具有凸起结构(突起结构)的茎-环结构且为N1部分,Y表示C或U,W表示A或U,
[化学式2]
[3][1]或[2]所述的适配体,该适配体抑制ADAMTS5的活性。
[4][1]~[3]中任一项所述的适配体,其中,碱基长度为80以下。
[5][1]~[4]中任一项所述的适配体,其中,W为U。
[6][1]~[4]中任一项所述的适配体,其中,Y为U。
[7][1]~[6]中任一项所述的适配体,其中,N1由式(3)表示:
(3)X1CAGCN2GCUX2
(式中,N2为3~15个的任意数目的核苷酸,X1和X2为A/U碱基的组合或G/C碱基的组合)。
[8][7]所述的适配体,其中,N2的核苷酸数为4。
[9][1]所述的适配体,该适配体包含以下的(a)、(b)或(c)中的任一条核苷酸序列:
(a)选自SEQ ID NO:1、3~6、10~14、16~45的任一条的核苷酸序列(其中,尿嘧啶可以是胸腺嘧啶);
(b)在选自SEQ ID NO:1、3~6、10~14、16~45的任一条的核苷酸序列(其中,尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中有1个~多个核苷酸被取代、缺失、插入或添加而得到的核苷酸序列;或者
(c)与选自SEQ ID NO:1、3~6、10~14、16~45的任一条的核苷酸序列(其中,尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)具有70%以上的同源性的核苷酸序列。
[10][9]所述的适配体,其中,适配体中所含的至少一个核苷酸被修饰或改变。
[11][1]~[10]中任一项所述的适配体,其中,适配体中所含的各嘧啶核苷酸的核糖2’位的羟基相同或不同、且未取代或被选自氢原子、氟原子和甲氧基的原子或基团取代。
[12][1]~[11]中任一项所述的适配体,其中,适配体中所含的各嘌呤核苷酸的核糖2’位的羟基相同或不同、且未取代或被选自氢原子、氟原子和甲氧基的原子或基团取代。
[13]复合物,该复合物包含[1]~[12]中任一项所述的适配体和功能性物质。
[14]药物,该药物包含[1]~[12]中任一项所述的适配体或[13]所述的复合物。
[15][14]所述的药物,该药物为因聚集蛋白聚糖过度地降解而产生的疾病的治疗药。
[16][15]所述的药物,其中,因聚集蛋白聚糖过度地降解而产生的疾病为关节炎或变形性膝关节炎。
[17]ADAMTS5的检测方法,其特征在于:使用[1]~[12]中任一项所述的适配体或[13]所述的复合物。
[18]因聚集蛋白聚糖过度地降解而产生的疾病的治疗方法,该治疗方法包括:向对象给予[1]~[12]中任一项所述的适配体、[13]所述的复合物或[14]所述的药物。
[19][1]~[12]中任一项所述的适配体、[13]所述的复合物或[14]所述的药物在因聚集蛋白聚糖过度地降解而产生的疾病的治疗中的应用。
[20][1]~[12]中任一项所述的适配体或[13]所述的复合物在因聚集蛋白聚糖过度地降解而产生的疾病的治疗用药物的制备中的应用。
发明效果
本发明的适配体或复合物可用作关节炎或变形性膝关节炎的治疗药。本发明的适配体或复合物还可用于ADAMTS5的纯化和浓缩、ADAMTS5的标记、以及ADAMTS5的检测和定量。
附图说明
[图1]是显示由MFOLD程序预测的、具有SEQ ID NO:1所表示的核苷酸序列的适配体的二级结构的图。
[图2]是显示具有SEQ ID NO:1所表示的核苷酸序列的适配体与ADAMTS5结合的传感图。
[图3]是显示由MFOLD程序预测的、具有SEQ ID NO:3或9所表示的核苷酸序列的适配体的二级结构的图。
[图4]是显示由MFOLD程序预测的、具有SEQ ID NO:10或12所表示的核苷酸序列的适配体的二级结构的图。
[图5-1]是显示由MFOLD程序预测的、具有SEQ ID NO:16或19所表示的核苷酸序列的适配体的二级结构的图。
[图5-2]是显示由MFOLD程序预测的、具有SEQ ID NO:20、21和25所表示的核苷酸序列的适配体的二级结构的图。
[图6]是显示由MFOLD程序预测的、具有SEQ ID NO:27或29所表示的核苷酸序列的适配体的二级结构的图。
[图7-1]是显示由MFOLD程序预测的、具有SEQ ID NO:30或35所表示的核苷酸序列的适配体的二级结构的图。
[图7-2]是显示由MFOLD程序预测的、具有SEQ ID NO:36或41所表示的核苷酸序列的适配体的二级结构的图。
[图7-3]是显示由MFOLD程序预测的、具有SEQ ID NO:42或45所表示的核苷酸序列的适配体的二级结构的图。
具体实施方式
本发明提供对ADAMTS5具有结合活性的适配体。本发明的适配体可抑制ADAMTS5的活性(聚集蛋白聚糖酶活性等)。
适配体是指对规定的靶分子具有结合活性的核酸分子。适配体通过与规定的靶分子结合,可抑制规定的靶分子的活性。本发明的适配体可以是RNA、DNA、修饰核酸或它们的混合物。另外,本发明的适配体可以是直链状或环状的形式。
本发明提供对ADAMTS5具有结合活性的适配体。在一个实施方案中,本发明的适配体通过与ADAMTS5结合,可抑制ADAMTS5的活性。
ADAMTS5是软骨细胞或滑膜细胞等所表达的蛋白,例如是具有UniprotKB中Q9UNA0所表示的氨基酸序列的蛋白。本发明中的ADAMTS5除了在动物体内形成以外,还可使用小鼠等哺乳细胞、昆虫细胞、大肠杆菌等培养细胞来制作,而且还可通过化学合成来制作。在通过培养细胞或化学合成来制作的情况下,可通过自身已知的方法容易地制作突变体。这里,ADAMTS5的“突变体”是从已知的ADAMTS5的氨基酸序列中通过1个~多个氨基酸被取代、缺失、添加等而得到的、或者是由已知的ADAMTS5的氨基酸序列的一部分氨基酸序列构成的、且具有ADAMTS5本来所具有的活性的至少一种以上活性的蛋白或肽。在氨基酸被取代、添加的情况下,该氨基酸可以是天然氨基酸,也可以是非天然氨基酸。本发明中的ADAMTS5包括它们的突变体。
ADAMTS5的前结构域被切割,作为活性型来分泌,之后通过自身消化,在C末端侧富有Cys的结构域中间被切割,还作为截断型而存在。本发明的适配体可与任一种ADAMTS5结合,也可抑制任一种ADAMTS5的活性。
在一个实施方案中,本发明提供适配体,该适配体与ADAMTS5结合,且包含以下的式(1)或式(2)所表示的序列(其中,尿嘧啶可以是胸腺嘧啶):
(1)GGGGCCUCC-N1-GGACYAAACC
(2)GGGGCCUCC-N1-GGACWYAAACC
(式中,N1为3~24个的任意数目的核苷酸,Y表示C或U,W表示A或U)。
对ADAMTS5的抑制活性是指对ADAMTS5所保有的任意活性的抑制能力。例如,已知ADAMTS5具有降解聚集蛋白聚糖的活性。因此,对ADAMTS5的抑制活性可以是抑制由ADAMTS5引起的聚集蛋白聚糖的降解的活性。
因此,在本发明的适配体与ADAMTS5结合而抑制了由ADAMTS5引起的聚集蛋白聚糖降解活性的情况下,认为对被视为因聚集蛋白聚糖过度地降解而产生的疾病的治疗有效。
本发明的适配体可对源自任意哺乳动物的ADAMTS5具有抑制活性。作为这样的哺乳动物,例如可列举:灵长类(例如,人、猴)、啮齿类(例如,小鼠、大鼠、豚鼠)、以及宠物、家畜和役用动物(役畜)(例如,狗、猫、马、牛、山羊、绵羊、猪)。
本发明的适配体可以是与ADAMTS5结合而不与具有同样的聚集蛋白聚糖降解能力的ADAMTS4结合的、对ADAMTS5具有特异性的适配体。
据报道,ADAMTS5较ADAMTS4具有1000倍左右的聚集蛋白聚糖降解活性(J.Biol.Chem.2007,282:18294-18306),另外还报道了ADAMTS5在关节炎的发病中较为重要(非专利文献2)。本发明的适配体用于因ADAMTS5导致聚集蛋白聚糖过度地降解而产生的疾病的治疗。
上述式(1)和式(2)中,N1表示任意数目的核苷酸。在本说明书中,“碱基”是指构成核酸的腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)的任一者。
关于N1的核苷酸数,只要包含式(1)和式(2)所表示的核苷酸序列的适配体与ADAMTS5结合即可,没有特别限定,可优选为3~24个、5~18个、6~15个、8~15个、11~15个、13~15个等。更优选为6~15个、8~15个、11~15个、13~15个,最优选为13~15个。
若N1的核苷酸数小于3,则如后所述无法由N1部分形成环结构,若N1的核苷酸数超过24,则N1部分的序列或结构会影响到适配体整体的功能,有时会失去对ADAMTS5的结合活性。
在优选实施方案中,上述式(1)和式(2)中,N1与ADAMTS5结合,具有形成茎-环结构所必需的碱基数和核苷酸序列。由N1所示的核苷酸序列形成的茎-环结构中的茎部分可采取凸起结构。
这里,上述式(1)和式(2)中,GGGGCCUCC部分的UCC与GGACYAAACC或GGACWYAAACC部分中的GGA形成碱基对并采取茎结构。对于本发明的适配体与ADAMTS5结合而言,如后所述,通过上述式(1)和式(2)中的N1和与其相邻的UCC和GGA采取茎-环结构较为重要。
因此,只要所得的适配体与ADAMTS5结合即可,由N1所示的核苷酸序列形成的茎-环结构可仅为环结构。即,环部分的最小碱基数为3、茎部分的最小碱基数为0(式(1)和式(2)中,GGGGCCUCC部分的UCC与GGACYAAACC或GGACWYAAACC部分中的GGA形成茎结构,N1仅形成环部分)。
关于环部分的长度,只要本发明的适配体与ADAMTS5结合即可,没有特别限定,例如可以是3~15个、3~11个、4~11个等,但优选为3~11个,更优选为3~8个,进一步优选为3~5个,最优选为3个或4个。
另外,只要本发明的适配体与ADAMTS5结合即可,环部分的核苷酸序列是可变的。
或者,本发明的适配体可以是与ADAMTS5结合的、包含下述(a)、(b)或(c)的任一条所表示的核苷酸序列的适配体:
(a)选自SEQ ID NO:1、3、4~6、10~44的任一条的核苷酸序列;
(b)在选自SEQ ID NO:1、3、4~6、10~44的任一条的核苷酸序列中,除外GGGGCCUCC-N1-GGACYAAACC或GGGGCCUCC-N1-GGACWYAAACC(式中,N1为3~24个的任意数目的核苷酸,Y表示C或U,W表示A或U)中的GGGGCCUCC和GGACYAAACC或GGACWYAAACC所表示的序列的1个或多个核苷酸被取代、缺失、插入或添加而得到的核苷酸序列;或者
(c)与选自SEQ ID NO:1、3、4~6、10~44的任一条的核苷酸序列具有70%以上(优选80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上)的同源性(其中,GGGGCCUCC-N1-GGACYAAACC或GGGGCCUCC-N1-GGACWYAAACC(式中,N1、Y和W同上)中的GGGGCCUCC和GGACYAAACC或GGACWYAAACC所表示的序列同源)的核苷酸序列。
在更优选的实施方案中,N1由式(3)表示:
(3)X1CAGCN2GCUX2
(式中,N2为3~15个的任意数目的核苷酸,X1和X2为A/U碱基的组合或G/C碱基的组合)。
这里,由式(3)中的X1CAGC与GCUX2形成茎结构(包括凸起结构),N2部分形成环结构。
N2的核苷酸数通常为3~15个,优选为3~11个,更优选为3~8个,进一步优选为3~5个,最优选为4个。
对N2所示的环部分的序列没有特别限定,只要式(3)整体上形成茎-环结构即可,可以是任意的碱基的组合。然而,在优选方案中,式(3)中的N2为GCUC、UUCG、GUAA、AUUC的任一者。
另外,X1和X2为A/U碱基的组合或G/C碱基的组合,优选X1为A而X2为U的组合或者X1为G而X2为C的组合。更优选X1为A而X2为U的组合。
上述(1)或(2)所表示的序列可形成以下的式(1)’或(2)’所表示的潜在的二级结构。认为本发明的适配体通过在上述(1)或(2)所表示的序列部分中采取上述结构而具有各种活性。需要说明的是,式(1)’或(2)’的结构分别对应于上述式(1)或(2)。
[化学式3]
另外,在上述结构中,通过5’末端和3’末端各自所连接的序列间的相互作用,可优选形成茎结构(包括凸起结构)。
为了使本发明的适配体具有各种活性,优选维持如上述潜在的二级结构所示的茎-环结构。虽然茎结构是通过互补性碱基对形成的,但对碱基对的数目没有特别限定。另外,在茎结构中,只要整体上构成茎结构即可,即使其中的一部分没有形成碱基对,也可维持适配体活性。
位于式(1)’或(2)’的上部的茎-环部分SL1相当于式(1)和式(2)中的N1部分。
这里,认为通过使N1成为上述式(3)所表示的序列,可更稳定地维持式(1)’或(2)’所表示的茎-环结构。即,通过式(3)中的ACAGC和GCUU,茎结构(包括凸起结构)形成式(1)’或(2)’中的SL1部分的茎结构,式(3)中的N2形成SL1部分的环结构。
另外,式(1)和式(2)中的GGGGCCUCC部分的UCC与GGACYAAACC或GGACWYAAACC部分中的GGA形成碱基对并形成茎结构,而且GGGGCCUCC部分中的最初的GG与GGACYAAACC或GGACWYAAACC部分中的最后的CC形成茎结构,由剩余序列形成内环。
需要说明的是,上述式(1)和式(2)中的不同仅在于W的有无。而且,由式(1)’或(2)’可知:碱基W周边构成内环。而且,如实施例中充分地所示的那样,W的有无不会造成结构上和活性上的较大的不同。因此,具有式(1)和式(2)所表示的序列的本发明的适配体是根据完全相同的技术思想而发明的适配体。
对本发明的适配体的长度没有特别限定,通常可以是约25~约200个核苷酸,例如为约25个核苷酸以上(例如,30个核苷酸以上、31个核苷酸以上、32个核苷酸以上、33个核苷酸以上),优选为25个核苷酸以上,更优选为30个核苷酸以上,进一步可优选为33个核苷酸以上。另外,例如可以是约100个核苷酸以下,通常为约80个核苷酸以下,优选为约70个核苷酸以下,更优选为约60个核苷酸以下,进一步优选为约50个核苷酸以下,进一步优选为约45个核苷酸以下(例如,44个核苷酸以下、43个核苷酸以上、42个核苷酸以下、41个核苷酸以下、40个核苷酸以下)。如果总核苷酸数少,则化学合成和大量生产更为容易,并且在成本方面的优点也大。另外,认为化学修饰也容易,生物体内的稳定性也高,毒性也低。
因此,作为本发明的适配体的长度,通常可以是约25~约200个核苷酸,优选为25~80个核苷酸,更优选为25~60个核苷酸,进一步优选为25~50个核苷酸,最优选为30~45个核苷酸。
本发明的适配体还可以是选自下述的连接物:包含上述式(1)所表示的核苷酸序列的多个适配体(适配体(A))的连接物;包含在上述式(1)所表示的核苷酸序列中有1个或多个核苷酸被取代、缺失、插入或添加而得到的核苷酸序列的多个适配体(适配体(B))的连接物;以及1个或多个适配体(A)与1个或多个适配体(B)的连接物。这些连接物也可与ADAMTS5结合。
这里,连接可通过随机结合来进行。另外,在连接时可利用接头。作为接头,可列举核苷酸链(例如,1个~约20个核苷酸)、非核苷酸链(例如,-(CH2)n-接头、-(CH2CH2O)n-接头、六甘醇接头、TEG接头、包含肽的接头、包含-S-S-键的接头、包含-CONH-键的接头、包含-OPO3-键的接头)。上述多个的连接物中的多个如果是2以上,则没有特别限定,例如可以是2个、3个或4个。
本发明的适配体中所含的各核苷酸各自相同或不同,可以是在核糖(例如,嘧啶核苷酸的核糖、嘌呤核苷酸的核糖)的2’位包含羟基的核苷酸(即,天然核糖核苷酸),或者是在核糖的2’位羟基被任意的原子或基团取代(修饰)的核苷酸(本发明中,有时记为“修饰核苷酸”)。
作为这样的任意的原子或基团,例如可列举:被氢原子、氟原子或-O-烷基(例如,-O-Me基)、-O-酰基(例如,-O-CHO基)、氨基(例如,-NH2基)取代的核苷酸。本发明的适配体还可以是:至少1种(例如,1、2、3或4种)核苷酸在核糖的2’位包含羟基、或上述的任意的原子或基团、例如选自氢原子、氟原子、羟基和-O-Me基的至少2种(例如,2、3或4种)基团的修饰核苷酸。
另外,在本发明的适配体中,所有的嘧啶核苷酸均可以是核糖的2’位为氟原子的核苷酸;或者是该氟原子相同或不同、且未取代或者被上述的任意的原子或基团、优选选自氢原子、羟基和甲氧基的原子或基团取代的核苷酸。特别是,作为本发明的适配体的制造方法,在适用后述的使用了DuraScribeTMT7转录试剂盒(Epicentre公司制造)的制造方法的情况下,可得到所有的嘧啶核苷酸的核糖2’位均发生了氟化的适配体。氟原子被其他的上述原子或基团取代的本发明的适配体可按照后述的方法来制造。
另外,在本发明的适配体中,所有的嘌呤核苷酸均可以是核糖的2’位为羟基的核苷酸、或者该羟基相同或不同、未取代或者被上述的任意的原子或基团、优选选自氢原子、甲氧基和氟原子的原子或基团取代的核苷酸。羟基被其他的上述原子或基团取代的本发明的适配体可按照后述的方法进行制造。
另外,在本发明的适配体中,所有的嘧啶核苷酸均可以是核糖的2’位的氟原子被上述的任意的原子或基团、例如选自氢原子、羟基和-O-Me基的相同的原子或基团取代的核苷酸。
另外,在本发明的适配体中,所有的嘌呤核苷酸均可以是核糖的2’位的羟基被上述的任意的原子或基团、例如选自氢原子、氟原子和-O-Me基的相同的原子或基团取代的核苷酸。
在优选的实施方案中,本发明的适配体中所含的各嘧啶核苷酸均为在核糖的2’位包含氟原子的核苷酸,并且,各嘌呤核苷酸均为在核糖的2’位包含羟基的核苷酸。在另一个实施方案中,上述各嘧啶核苷酸的核糖的2’位的氟原子可各自独立地被选自氢原子、羟基和甲氧基的原子或基团取代,并且上述各嘌呤核苷酸的核糖的2’位的羟基可各自独立地被选自氢原子、甲氧基和氟原子的原子或基团取代。
尚需说明的是,在本说明书中,将构成适配体的核苷酸假定为RNA(即,将糖基假定为核糖),对核苷酸中的糖基的修饰方案进行说明,但这并不意味着从构成适配体的核苷酸中排除了DNA,可适当理解为对DNA的修饰。例如,在构成适配体的核苷酸为DNA的情况下,核糖的2’位的羟基取代成X可理解为脱氧核糖的2’位的氢原子取代成X。
在本发明的适配体中,通过将尿嘧啶取代成胸腺嘧啶,可提高对ADAMTS5的结合性、抑制ADAMTS5的聚集蛋白聚糖降解的活性、适配体的稳定性、药物递送性、在血液中的稳定性等。
另外,在本发明的适配体中,核苷酸中的磷酸二酯键的1个或多个、例如1~2个、1~3个、1~4个、1~5个核苷酸可用任意的取代基修饰或取代。例如,磷酸二酯键可被取代成硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、膦酸烷基酯键、氨基磷酸酯键等。这里,例如“核苷酸被取代成硫代磷酸酯键”是指位于相邻的核苷酸间的结合位点的磷酸基被硫化、即磷酸二酯键变更为硫代磷酸酯键。
另外,在本发明的适配体中,为了使适配体变得稳定、提高其活性,1个或多个、例如1~2个、1~3个、1~4个、1~5个核苷酸可被交联化核酸桥连核酸(BNA)或锁核酸(LNA)取代。这里,“交联化核酸”是指,通过分子内交联约束核酸的自由度,从而具有提高对互补序列的结合亲和性、并且获得核酸酶抗性的结构,例如可列举:2’,4’-BNA(LNA)、2’-O,4’-C-亚乙基桥连核酸(ENA)等,但并不限于这些。
本发明的适配体是与ADAMTS5结合的适配体,进一步优选为可抑制ADAMTS5的活性的适配体。本发明的适配体是否与ADAMTS5结合,例如可通过实施例1等的利用了表面等离子体共振法的试验进行评价,另外,本发明的适配体能否抑制ADAMTS5的活性,例如可通过实施例1等的利用了聚集蛋白聚糖的试验等进行评价。
为了提高对ADAMTS5的结合性、稳定性、药物递送性等,本发明的适配体可以是各核苷酸的糖残基(例如,核糖)被修饰的适配体。作为糖残基中被修饰的位点,例如可列举将糖残基的2’位、3’位和/或4’位的氧原子取代成其它原子而得到的位点等。作为修饰的种类,例如可列举:氟化、O-烷基化(例如,O-甲基化、O-乙基化)、O-烯丙基化、S-烷基化(例如,S-甲基化、S-乙基化)、S-烯丙基化、氨基化(例如,-NH2)。此外,作为例子还可列举:将4’位的氧取代成了硫的4’-SRNA、将2’位和4’位经由亚甲基交联而得到的LNA(锁核酸)、将3’位的羟基取代成了氨基的3’-N-磷酰胺核酸等。本发明的适配体有时会由其制备方法使嘧啶核苷酸的核糖2’位的氧原子具有一定的修饰来制备,在适用后述的使用了DuraScribeTMT7转录试剂盒(Epicentre)的制备方法的情况下,优选制备所有的嘧啶核苷酸的核糖2’位均发生了氟化的适配体。因此,通过随后对所得的适配体加入这样的糖残基的改变,可制造核苷酸序列相同但活性有所提高的各种变异的适配体。由以上可知:本发明的适配体优选可以是至少一个核苷酸的糖残基被修饰的适配体。这样的糖残基的改变可通过自身已知的方法进行(例如,参照Sproat等人,(1991),Nucl.Acid.Res.19,733-738;Cotton等人,(1991),Nucl.Acid.Res.19,2629-2635;Hobbs等人,(1973),Biochemistry12,5138-5145)。具体而言,以所有的嘧啶核苷酸的核糖2’位的羟基均被取代成了氟基的适配体为基础,可制备核糖2’位的羟基被选自氢原子、羟基和甲氧基的原子或基团取代的适配体。
另外,为了提高对ADAMTS5的结合性、稳定性、药物递送性等,本发明的适配体可以是核酸碱基(例如,嘌呤、嘧啶)被改变(例如,化学取代)的适配体。作为这样的改变,例如可列举:5位嘧啶改变、6和/或8位嘌呤改变、用环外胺的改变、用4-硫代尿苷的取代、用5-溴-尿嘧啶或5-碘-尿嘧啶的取代。另外,本发明的适配体中所含的磷酸基可被改变,使对核酸酶和水解呈抗性。例如,P(O)O基可被P(O)S(硫代酸酯)、P(S)S(二硫代酸酯)、P(O)NR2(酰胺化物)、P(O)R、R(O)OR’、CO或CH2(甲缩醛)或3’-胺(-NH-CH2-CH2-)取代[这里,各R或R’独立地为H、或者为取代或未取代的烷基(例如,甲基、乙基)]。
作为连接基,例示-O-、-N-或-S-,通过这些连接基可与相邻的核苷酸结合。
另外,改变可包含加帽这样的3’和5’的改变。
改变还可通过在末端添加聚乙二醇、氨基酸、肽、反向dT、核酸、核苷、肉豆蔻酰基、石胆酸-油烯基(Lithocolic-oleyl)、二十二烷基(docosanyl)、月桂酰基、硬脂酰基、棕榈酰基、油酰基、亚油酰基(Linoleoyl)、其他脂质、甾族化合物(类固醇)、胆固醇、咖啡因、维生素、色素、荧光物质、抗癌药、毒素、酶、放射性物质、生物素等来进行。关于这些改变,例如参照美国专利第5,660,985号、美国专利第5,756,703号。
特别是,在通过在末端添加PEG来进行改变的情况下,对PEG的分子量没有特别限定,但优选为1000~100000,更优选为30000~90000。PEG可以是直链状,也可以是分成两个以上的链的支链状(多臂PEG)。
作为这样的PEG,没有特别限定,本领域技术人员可适当选择市售或已知的PEG进行使用(例如,参照http://www.peg-drug.com/peg_product/branched.html),作为适用于本发明的适配体的PEG的优选例子,具体而言,可列举分子量为40000的两支链GS型PEG(SUNBRIGHTGL2-400GS日油制造)、分子量为40000的两支链TS型PEG(SUNBRIGHTGL2-400TS日油制造)、分子量为40000的4支链TS型PEG(SUNBRIGHTGL4-400TS日油制造)、分子量为80000的两支链TS型PEG(SUNBRIGHTGL2-800TS日油制造)、或分子量为80000的4支链TS型PEG(SUNBRIGHTGL4-800TS日油制造)等。这种情况下,本发明的适配体可在末端直接添加PEG,但更优选在其末端添加具有可与PEG结合的基团的接头等,并经由该接头将PEG添加至本发明的适配体中。
作为PEG与本发明的适配体的接头,没有特别限定,可根据结合位点或PEG的种类等适当选择碳链数或官能团等。作为这样的接头,例如可列举具有氨基的接头,具体而言,在5’末端添加的情况下,例示ssH接头(SAFC)或DMS(O)MT-氨基-修饰物(GLENRESEARCH),在3’末端添加的情况下,例示TFA氨基C-6lcaaCPG(ChemGenes)等。在选择了该接头的情况下,通过在PEG上例如添加N-羟基琥珀酰亚胺的活性基团后使其与接头侧的氨基反应,从而可经由接头结合本发明的适配体与PEG。
需要说明的是,作为PEG或接头,可优选使用市售品。另外,与PEG、接头和本发明的适配体的结合有关的反应条件等可由本领域技术人员适当设定。
本发明的适配体可通过本说明书中的公开和本技术领域中自身已知的方法进行化学合成。适配体通过利用了磷酸基的负电荷的离子键、利用了核糖的疏水键和氢键、利用了核酸碱基的氢键或堆积键(Stackingbond)等多种结合方式与靶物质结合。特别是,利用了仅存在构成核苷酸的数的磷酸基的负电荷的离子键较强,与存在于蛋白表面的赖氨酸或精氨酸的正电荷结合。因此,可取代与靶物质的直接结合无关的核酸碱基。特别是,茎结构的部分已形成碱基对,另外还朝向双螺旋结构的内侧,因此核酸碱基难以与靶物质直接结合。因此,即使将碱基对取代成其他的碱基对,适配体的活性也往往不会降低。即使在不形成环结构等碱基对的结构中,在核酸碱基不参与与靶分子的直接结合的情况下,就可进行碱基的取代。关于核糖的2’位的修饰,虽然核糖的2’位的官能团很少与靶分子直接进行相互作用,但往往是无关系的,可取代成其它的修饰分子。如此,适配体只要不取代或不删除参与与靶分子的直接结合的官能团,则往往会保持其活性。另外,整体的立体结构(三维结构)没有大幅变化也很重要。
适配体可通过利用SELEX法及其改良法(例如,Ellington等人,(1990),Nature,346,818-822;Tuerk等人,(1990),Science,249,505-510)来制作。在SELEX法中,通过增加轮数、或者使用竞争物质,对靶物质的结合力更强的适配体被浓缩、选出。因此,通过调节SELEX的轮数和/或改变竞争状态,有时可得到结合力不同的适配体、结合方式不同的适配体、结合力或结合方式相同但核苷酸序列不同的适配体。另外,SELEX法包括通过PCR进行的扩增过程,但在其过程中通过使用锰离子等引入突变,可进行更富多样性的SELEX。
通过SELEX得到的适配体是对靶物质显示出高亲和性的核酸,但这并不意味着其与靶物质的活性位点结合。因此,通过SELEX得到的适配体未必对靶物质的功能起作用。ADAMTS5为碱性蛋白,认为其容易与核酸非特异性地结合。认为不与活性位点结合的适配体不会对其靶物质的活性产生影响。
如此操作而选择的具有活性的适配体通过进行优化SELEX,可进一步实现高性能化。优化SELEX是指,制作某个序列已确定的适配体的一部分为随机序列的模板或掺杂了10~30%左右的随机序列的模板,再次进行SELEX。
通过SELEX得到的适配体具有80个核苷酸左右的长度,难以将其直接制成药物。于是,反复进行摸索试验,并优选缩短至可容易地进行化学合成的长度(例如,可进行化学合成的长度为约60个核苷酸以下,更优选约50核苷酸左右以下,进一步优选45个核苷酸以下)。
通过SELEX得到的适配体取决于其引物设计,之后的最小化操作的容易度发生变化。若没有顺利地设计引物,则即使通过SELEX选出了具有活性的适配体,之后的开发也是不可能的。鉴于所涉及的背景,还可采用与通常的SELEX法相比可得到具有短的碱基长度的适配体的Tailored-SELEX法(Vater等人.NucleicAcidsRes.31,2003,el30;Jarosch等人.NucleicAcidsRes.34,2006,e86)、或将Tailored-SELEX法进一步改良而得到的无引物(Primer-less)SELEX法等。
因适配体可进行化学合成,故容易改变。适配体通过使用MFOLD程序来预测二级结构、或者通过X射线分析或NMR分析来预测立体结构,可在一定程度上预测可取代或缺失哪个核苷酸,以及可在哪里插入新的核苷酸。所预测的新的序列的适配体可容易地进行化学合成,可通过现有的测定体系确认其适配体是否保持活性。
在通过反复进行如上所述的摸索试验特定出对于所得的适配体与靶物质的结合较为重要的部分的情况下,即使在其序列的两端添加新的序列,多数情况下活性也会保持不变。而且,对新的序列的长度没有特别限定。
而且,如已阐述的那样,关于修饰也与序列同样可高度地进行设计或改变。
如上所述,适配体可高度地进行设计或改变。本发明还提供适配体的制造方法,该制造方法可高度地设计或改变包含规定序列(例如,选自茎部分、内环部分、发夹环部分和单链部分的部分所对应的序列:以下,根据需要简称为固定序列)的适配体。
例如,这样的适配体的制造方法包括:使用由下述式表示的核苷酸序列构成的单种核酸分子或多种核酸分子(例如,数a、b等不同的核酸分子的文库)、以及引物用序列(i)、(ii)各自所对应的引物对来制造包含固定序列的适配体,
[化学式4]
[上述式中,(N)a显示由a个N构成的核苷酸链,(N)b显示由b个N构成的核苷酸链,N各自相同或不同为选自A、G、C、U和T(优选A、G、C和U)的核苷酸。a、b各自相同或不同可以是任意的数,例如可以是1~约100,优选为1~约50,更优选为1~约30,进一步优选为1~约20或1~约10]。
本发明还提供包含本发明的适配体和与其结合的功能性物质的复合物。本发明的复合物中的适配体与功能性物质之间的键可以是共价键或非共价键。本发明的复合物可以是本发明的适配体与1个以上(例如,2个或3个)的同种或异种的功能性物质结合而得到的复合物。功能性物质只要是对本发明的适配体新添加了某些功能的物质、或者可使本发明的适配体所能保持的某些特性发生变化(例如,提高)的物质即可,没有特别限定。作为功能性物质,例如可列举:蛋白、肽、氨基酸、脂质、糖质、单糖、多核苷酸、核苷酸。作为功能性物质,例如还可列举:亲和性物质(例如,生物素、链霉亲和素、对靶互补序列具有亲和性的多核苷酸、抗体、谷胱甘肽琼脂糖、组氨酸)、标记用物质(例如,荧光物质、发光物质、放射性同位素)、酶(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)、药物递送介质(例如,脂质体、微球体、肽、聚乙二醇类)、药物(例如,刺孢霉素或倍癌霉素等在导弹疗法(missile therapy)中使用的药物;环磷酰胺、美法仑(苯丙氨酸氮芥)、异环磷酰胺或曲磷胺等氮芥子气类似物;噻替哌等吖丙啶类;卡莫司汀等亚硝基脲;替莫唑胺或达卡巴嗪等烷基化剂;甲氨蝶呤或雷替曲塞等叶酸类似代谢拮抗剂;硫鸟嘌呤、克拉屈滨或氟达拉滨等嘌呤类似物;氟尿嘧啶、替加氟或吉西他滨等嘧啶类似物;长春碱、长春新碱或长春瑞滨等长春花生物碱及其类似物;依托泊苷、紫杉烷、多西他赛或紫杉醇等鬼臼毒素衍生物;多柔比星(阿霉素)、表柔比星、伊达比星和米托蒽醌等蒽环类和类似物;博来霉素和丝裂霉素等其他的细胞毒性抗生素;顺铂、卡铂和奥沙利铂等铂化合物;喷司他丁、米替福新、雌莫司汀、拓扑替康、伊立替康和比卡鲁胺)、毒素(例如,蓖麻毒素、liatoxin(リア毒素)和维罗(Vero)毒素)。这些功能性分子有时最终会被除去。而且,还可以是凝血酶或基质金属蛋白酶(MMP)、X因子等酶所能识别并切割的肽、核酸酶或限制酶所能切割的多核苷酸。
本发明的适配体或复合物例如可用作药物或诊断药、检测药、试剂。特别是,可用作关节炎、变形性膝关节炎这样的软骨疾病的治疗用或预防用的药物、或诊断药、检测药、试剂。
作为上述药物的对象疾病,可列举:因聚集蛋白聚糖过度地降解而产生的疾病、例如疼痛、慢性疼痛、神经源性疼痛、术后疼痛、类风湿性关节炎、变形性关节病(例如,变形性膝关节炎等)、运动外伤、关节炎(例如,弥漫性关节炎等)、强直性脊椎病、神经痛、神经障碍、痛觉、神经损伤、缺血、神经变性、软骨变性、脑卒中(脑中风)、失禁、炎症性疾病、过敏性肠综合征、牙周病、异常血管新生、肿瘤的浸润和转移、角膜溃疡、糖尿病的并发症等多种疾病和病状等。
本发明的药物可掺混药学上可接受的载体。作为药学上可接受的载体,例如可列举:蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙、碳酸钙等赋形剂;纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉等粘合剂;淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、钠-乙二醇-淀粉、碳酸氢钠、磷酸钙、枸橼酸钙等崩解剂;硬脂酸镁、气溶胶、滑石、十二烷基硫酸钠等润滑剂;枸橼酸、薄荷醇、甘草甜素(Glycyrrhicin)/铵盐、甘氨酸、橙粉等芳香剂;苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等(防腐剂);枸橼酸、枸橼酸钠、乙酸等稳定剂;甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝等悬浮剂;表面活性剂等分散剂;水、生理盐水、橙汁等稀释剂;可可脂、聚乙二醇、白煤油等基质蜡等,但并不限定于这些。
适合口服给药的制剂为:在水、生理盐水、橙汁这样的稀释液中溶解有有效量的配体而得到的溶液制剂;以固体或颗粒的形式包含有效量的配体的胶囊剂、香囊剂(sachet)或片剂;在适当的分散介质中悬浮有有效量的有效成分而得到的悬浮液制剂;将溶解有有效量的有效成分的溶液分散在适当的分散介质中使其乳化而得到的乳剂等。
另外,本发明的药物根据需要为了掩盖味道、肠溶性或持续性等目的,可通过自身已知的方法进行包衣。作为包衣中使用的包衣剂,例如可使用:羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚氧化亚乙基二醇、吐温80、Pluronic F68、乙酸纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟甲基纤维素乙酸琥珀酸酯、Eudragit(ROHM公司制造、德国、甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物)和色素(例如,铁丹、二氧化钛等)等。该药物可以是速释制剂、缓释制剂的任一种。作为缓释制剂的基材,例如可列举:脂质体、缺端胶原(atelocollagen)、明胶、羟基磷灰石、PLGA等。
作为适合胃肠外给药(例如,静脉内给药、皮下给药、肌肉内给药、局部给药、腹腔内给药、经鼻给药、经肺给药等)的制剂,有水性和非水性的等渗无菌注射液制剂,其中可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、等渗剂等。另外,可列举水性和非水性的无菌悬浮液制剂,其中可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定化剂、防腐剂等。该制剂可像安瓿或小瓶那样以每单位给药量或每多次给药量封入在容器内。另外,还可将有效成分和药学上可接受的载体冷冻干燥,并以可在临使用前溶解或悬浮于适当的无菌溶剂的状态保存。而且,除注射液制剂以外,还可制成吸入剂、软膏剂。在吸入剂的情况下,将冷冻干燥状态的有效成分微细化,并使用适当的吸入装置进行吸入给药。在吸入剂中根据需要可进一步适当掺混以往使用的表面活性剂、油、调味剂、环糊精或其衍生物等。
这里,作为表面活性剂,例如可列举:油酸、卵磷脂、二甘醇二油酸酯、油酸四氢糠酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、三油酸甘油酯、单月桂酸甘油酯、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、单蓖麻油酸甘油酯、十六烷醇、硬脂醇、聚乙二醇400、氯化十六烷基吡啶鎓、脱水山梨糖醇三油酸酯(商品名Span(span)85)、脱水山梨糖醇单油酸酯(商品名Span(span)80)、脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Span(span)20)、聚氧乙烯氢化蓖麻油(商品名HCO-60)(商品名)、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(商品名Tween(Tween)20)、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(商品名Tween(Tween)80)、源自天然资源的卵磷脂(商品名Epiclon(Epiclon))、油烯基聚氧乙烯(2)醚(商品名Brij(Brij)92)、硬脂基聚氧乙烯(2)醚(商品名Brij(Brij)72)、月桂基聚氧乙烯(4)醚(商品名Brij(Brij)30)、油烯基聚氧乙烯(2)醚(商品名Genapol(Genapol)0-020)、氧化乙烯与氧化丙烯的嵌段共聚物(商品名Synperonic(Synpectics))等。Span、Tween、Epiclon、Brij、Genapol和Synperonic均为商标。
作为油,例如可列举:玉米油、橄榄油、棉籽油、葵花油等。另外,在软膏剂的情况下,使用适当的药学上可接受的基质(黄色凡士林、白色凡士林、石蜡、Plastibase(液体石蜡和聚乙烯的复合软膏基质)、有机硅、白色软膏、蜂蜡、猪油、植物油、亲水软膏、亲水凡士林、纯化羊毛脂、加水羊毛脂、吸水软膏、亲水Plastibase、聚乙二醇软膏等),与有效成分混合并制成制剂,进行使用。
吸入剂可按照常规方法来制造。即,可通过将上述本发明的适配体或复合物制成粉末或液态,掺混在吸入喷射剂和/或载体中,填充在适当的吸入容器中来制造。另外,在上述本发明的适配体或复合物为粉末的情况下可使用普通的机械粉末吸入器,在其为液态的情况下可使用雾化器等吸入器。这里,作为喷射剂,可广泛使用以往已知的喷射剂,可例示:氯氟烃-11、氯氟烃-12、氯氟烃-21、氯氟烃-22、氯氟烃-113、氯氟烃-114、氯氟烃-123、氯氟烃-142c、氯氟烃-134a、氯氟烃-227、氯氟烃-C318、1,1,1,2-四氟乙烷等氯氟烃系化合物;丙烷、异丁烷、正丁烷等烃类;二乙醚等醚类;氮气、二氧化碳气体等压缩气体等。
在将本发明的药物用作软骨疾病的预防和治疗用药物的情况下,本发明的药物不仅可对关节的炎症部位直接给药,还可通过上述的其他方法进行给药。
因本发明的适配体为单链核酸,故还可通过给予包含互补序列的核苷酸来解毒,成为与给药后难以控制动力学的中和抗体相比安全性高的药品的可能性高。即使鉴于可在抗体药物治疗等中发生的、因抗体在体内长时间滞留而引起的感染症的问题,这也可谓是非常有利的。特别是,在将本发明的药物用作关节炎的预防或治疗用药物的情况下,若考虑到疾病的严重性和副作用的风险,则显然是利用容易控制体内动力学的适配体可得到具有更高安全性的药物。
本发明的药物的给药量根据有效成分的种类/活性、疾病的严重度、作为给药对象的动物种、给药对象的药物耐受性、体重、年龄等而不同,作为成人每天的有效成分量,通常可以是约0.0001~约100mg/kg,例如为约0.0001~约10mg/kg,优选为约0.005~约1mg/kg。
另外,本发明的适配体或复合物还可用作药物递送剂、体内成像用探针、ADAMTS5的血中浓度测定用探针、组织染色用探针、ELISA用探针、ADAMTS5的分离纯化用配体。
本发明还提供固定有本发明的适配体或复合物的固相载体。作为固相载体,例如可列举:基板、树脂、板(例如,多孔板)、过滤器、药筒、柱、多孔材料。基板可以是DNA芯片或蛋白芯片等中使用的基板等,例如可列举:镍-PTFE(聚四氟乙烯)基板或玻璃基板、磷灰石基板、有机硅基板、氧化铝基板等、以及对这些基板实施聚合物等的包覆而得到的基板。作为树脂,例如可列举:琼脂糖颗粒、二氧化硅颗粒、丙烯酰胺与N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的共聚物、聚苯乙烯交联二乙烯基苯颗粒、将葡聚糖用环氧氯丙烷交联而得到的颗粒、纤维素纤维、烯丙基葡聚糖与N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联聚合物、单分散系合成聚合物、单分散系亲水性聚合物、琼脂糖、TOYOPEARL等,另外,还包括在这些树脂上结合有各种官能团而得到的树脂。本发明的固相载体例如可用于ADAMTS5的纯化和ADAMTS5的检测、定量。
本发明的适配体或复合物可通过自身已知的方法固定在固相载体上。例如可列举下述方法:将亲和性物质(例如,上述的物质)或规定的官能团导入本发明的适配体或复合物中,然后利用该亲和性物质或规定的官能团固定在固相载体上。本发明还提供将本发明的适配体或复合物固定在固相载体上的方法、以及如此操作而得到的固相载体。规定的官能团可以是可供于偶联反应的官能团,例如可列举:氨基、巯基、羟基、羧基。本发明还提供导入了这样的官能团的适配体。
本发明还提供ADAMTS5的纯化和浓缩方法。特别是,本发明的纯化方法可由其他的ADAMTS家族蛋白分离ADAMTS5。本发明的纯化和浓缩方法可包括:使ADAMTS5吸附于本发明的固相载体,利用洗脱液洗脱所吸附的ADAMTS5。在本发明的固相载体上吸附ADAMTS5可利用自身已知的方法进行。例如,将含有ADAMTS5的样品(例如,细菌或细胞的培养物或培养上清、血液)导入本发明的固相载体或其含有物中。ADAMTS5的洗脱可使用中性溶液等洗脱液来进行。对中性洗脱液没有特别限定,例如pH可以是约6~约9,优选为约6.5~约8.5,更优选为约7~约8。另外,中性溶液例如可包含钾盐(例如,KCl)、镁盐(例如,MgCl2)、表面活性剂(例如,Tween(吐温)20、Triton、NP40)、甘油。
本发明的纯化和浓缩方法可进一步包括:在吸附ADAMTS5之后,使用洗涤液对该固相载体进行洗涤。作为洗涤液,例如可列举:包含尿素、螯合剂(例如,EDTA)、Tris、酸、碱、转运RNA、DNA、Tween(吐温)20等表面活性剂、NaCl等盐的洗涤液等。本发明的纯化和浓缩方法可进一步包括:对该固相载体进行加热处理。通过所涉及的步骤,可进行该固相载体的再生、灭菌。
本发明的适配体或复合物可用作检测用探针、特别是ADAMTS5的检测用探针。作为适配体的标记方法,没有特别限定,可采用自身已知的方法。作为这样的方法,例如可列举:使用放射性同位素进行标记、使用荧光色素或荧光蛋白进行标记等。
本发明还提供ADAMTS5的检测和定量方法。特别是,本发明可将ADAMTS5与其他的ADAMTS家族蛋白区别开来进行检测和定量。本发明的检测和定量方法可包括:利用本发明的适配体(例如,通过使用本发明的复合物和固相载体)测定ADAMTS5。ADAMTS5的检测和定量方法除了使用本发明的适配体代替抗体以外,可利用与免疫学方法同样的方法来进行。因此,通过使用本发明的适配体代替抗体,可通过与酶免疫测定法(EIA)(例如,直接竞争ELISA、间接竞争ELISA、夹层ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)、蛋白质印迹法(例如,用以替代蛋白质印迹法中的二次抗体)、免疫组织化学染色法、细胞分选法等方法同样的方法进行检测和定量。这样的方法例如可用于生物体或生物学样品中的ADAMTS5量的测定、ADAMTS5相关疾病的诊断。
本说明书中列举的包括专利和专利申请说明书在内的所有出版物所记载的内容均通过在本说明书中的引用,而与其全部明示同等程度地纳入本说明书中。
以下是用于实施本发明的特定的实施方式的例子。实施例仅以说明为目的而提供,并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1:特异性地与ADAMTS5结合的RNA适配体的制作(1)
特异性地与ADAMTS5结合的RNA适配体采用SELEX法进行制作。SELEX参考Ellington等人的方法(Ellington and Szostak,Nature 346,818-822,1990)和Tuerk等人的方法(Tuerk and Gold,Science 249,505-510,1990)来进行。作为靶物质,使用在NHS-activated Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare公司制造)的载体上固相化的ADAMTS5(R&Dsystems公司制造)。ADAMTS5在载体上固相化的方法按照GE Healthcare公司的工艺说明书(仕様書)进行。固相化量通过利用SDS-PAGE研究固相化前的ADAMTS5溶液与刚刚固相化后的上清来确认。SDS-PAGE的结果,从上清中没有检测到ADAMTS5的谱带,确认到所使用的ADAMTS5几乎全部偶联。约73.2pmol的ADAMTS5在约3μL的树脂上固相化。
最初一轮中使用的RNA(40N)是使用DuraScribeTMT7转录试剂盒(Epicentre公司制造)转录通过化学合成得到的DNA而得到的。通过该方法得到的RNA其嘧啶核苷酸的核糖的2’位被氟化。作为DNA模板,使用以下所示的在40个核苷酸的随机序列的两端具有引物序列的长度为80个核苷酸的DNA。DNA模板和引物通过化学合成来制作。
DNA模板:5’-GTACGCTAGGCGTTAGTCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATCGTACGACGGTCGTACCC-3’(SEQ ID NO:46)
正向引物:5’-TAATACGACTCACTATAGGGTACGACCGTCGTACGAT-3’(SEQ ID NO:47)
反向引物:5’-GTACGCTAGGCGTTAGTCTC-3’(SEQ ID NO:48)
DNA模板(SEQ ID NO:46)中的N的连续是任意组合的40个核苷酸(40N:各N分别为A、C、G或T),生成所得适配体独特的序列区。正向引物包含T7RNA聚合酶的启动子序列。最初一轮中使用的RNA库的变异在理论上为1013。
在固相化有ADAMTS5的载体中加入RNA库,在室温下保持30分钟,之后用溶液A洗涤树脂,以去除未与ADAMTS5结合的RNA。这里,溶液A是145mM氯化钠、5.4mM氯化钾、1.8mM氯化钙、0.8mM氯化镁、20mM Tris(pH7.6)、0.05%Tween20的混合溶液。加入溶液B作为洗脱液,在95℃下进行3分钟的热处理,由其上清回收与ADAMTS5结合的RNA。这里,溶液B是7M脲、5mMEDTA、20mM Tris(pH7.6)的混合溶液。回收的RNA通过逆转录PCR扩增,通过DuraScribeTMT7转录试剂盒转录,用作下一轮的库。将以上作为1轮,重复多次进行同样的操作。SELEX结束后,使用下一代测序仪进行核苷酸序列分析。下一代测序仪使用Ion PGMTM系统(Thermo公司制造),分析是按照Thermo公司的工艺说明书进行。
实施7轮SELEX后,通过下一代测序仪特定78889种克隆序列,确认收敛至10068种序列。这些克隆中的一部分的序列见SEQ ID NO:1~2。SEQ ID NO:1所表示的序列存在6,711个序列。SEQ ID NO:2所表示的序列存在1,305个序列。SEQ ID NO:1的序列中包含通用序列1。SEQ ID NO:1和2仅序列中的一个碱基不同,在SEQ ID NO:2中通用序列中的4个连续G碱基之一缺失。通用序列1在10,068种序列中存在138种。在利用MFOLD程序(M.Zukker,NucleicAcidsRes.31(13),3406-3415,2003)预测这些序列的二级结构时,形成了通用序列的部分极其相似的环结构。具有SEQ ID NO:1所表示的核苷酸序列的适配体的二级结构见图1。
以下显示各核苷酸序列。只要没有特别提及,则以下列举的各序列以5’到3’的方向表示,嘌呤碱基(A和G)为2’-OH体,嘧啶碱基(U和C)为2’-氟修饰体。另外,序列中的N1显示3~24个的任意长度的核苷酸,Y显示C或U。
SEQ ID NO:1
GGGUACGACCGUCGUACGAUUGGGGCCUCCACAGCUGCUCAGCUUGGACUAAACCAAUAAGAGACUAACGCCUAGCGUAC
SEQ ID NO:2
GGGUACGACCGUCGUACGAUUGGGCCUCCACAGCUGCUCAGCUUGGACUAAACCAAUAAGAGACUAACGCCUAGCGUAC
通用序列1:
GGGGCCUCC-N1-GGACYAAAC
通过表面等离子体共振法评价具有SEQ ID NO:1和2所示的核苷酸序列的适配体对ADAMTS5的结合活性。测定中使用GE Healthcare公司制造的Biacore T100。传感器芯片使用固定有链霉亲和素的SA芯片。在该芯片上结合800RU左右的在5’末端结合有生物素的16个核苷酸的Poly dT。成为配体的核酸在其3’末端添加16个核苷酸的Poly A,通过T和A的退火,固定在SA芯片上。以流速10μL/分钟注射核酸30秒,固定约300RU的核酸。分析物用的ADAMTS5调制成0.1μM,以流速30μL/分钟注射60秒。运行缓冲液使用溶液C。这里,溶液C是300mM氯化钠、5.4mM氯化钾、1.8mM氯化钙、0.8mM氯化镁、20mM Tris(pH7.6)、0.05%Tween20的混合溶液。
由测定结果可知:具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的适配体与ADAMTS5结合(表1)。用作阴性对照的包含40个核苷酸的随机序列的、在第1轮中使用的核酸库(40N)没有确认到与ADAMTS5结合。具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的适配体没有确认到与ADAMTS5结合,与40N为同等程度。SEQ ID NO:2具有通用序列中的连续的4个G碱基缺失了1个碱基的序列,结合活性的测定结果显示出:通用序列中的连续的4个G碱基对适配体的活性较为重要。显示具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的适配体与ADAMTS5结合的情况的传感图见图2。需要说明的是,表1中,“++”表示ADAMTS5结合量(RU值)与适配体在SA芯片上的固定化量(RU值)的比例为40%以上,“+”表示上述比例为10%以上且小于40%,“-”表示上述比例小于10%。
[表1]
对ADAMTS5的结合活性
SEQ ID NO | 长度 | 在Biacore中的结合活性 |
1 | 80 | ++ |
2 | 79 | - |
利用下述方法评价具有SEQ ID NO:1所表示的核苷酸序列的适配体是否抑制ADAMTS5的酶活性。选择聚集蛋白聚糖的G1-IGD-G2结构域(R&D systems公司制造)作为ADAMTS5的底物。ADAMTS5特异性地在G1-IGD-G2结构域中的第392位的谷氨酸与第393位的丙氨酸之间切割,生成两个片段。这些片段在电泳中的移动度较未切割的G1-IGD-G2快,因此实施SDS-PAGE电泳,并定量G1-IGD-G2的谱带强度,从而可测定ADAMTS5的酶活性。将反应液量设为10μL,在溶液A的缓冲液中实施测定。首先,调制用溶液A稀释的核酸与ADAMTS5的10μL混合液,在25℃下保温15分钟。在用溶液A稀释的5μL底物液中加入核酸与ADAMTS5的5μL混合液,引发酶反应。反应溶液中的最终ADAMTS5浓度为5nM,最终底物浓度为50μg/mL。将反应溶液在37℃下保温2小时后,添加2μL的溶液D,在95℃下加热2分钟,使ADAMTS5的酶反应停止。这里,溶液D是0.25M Tris(pH6.8)、10%SDS、50%甘油、0.25%溴酚蓝、20%2-巯基乙醇。已加热处理的反应溶液通过7.5%的SDS-PAGE进行电泳,通过宝石橙(Sigma-Aldrich公司制造)进行染色。染色按照Sigma-Aldrich公司的工艺说明书进行,使用GE Healthcare公司制造的STORM840进行检测。作为标准曲线,使1000ng、400ng、160ng、64ng、25.6ng、10.24ng、4.1ng未切割的底物进行电泳,同样地进行染色和检测。由谱带强度和标准曲线定量各反应溶液中的未切割的底物量。该反应条件下的ADAMTS5的底物切割效率为80~100%。受试物质的抑制率利用下式算出。
抑制率(%)=(Sapt-SE)/(S0-SE)×100
这里,Sapt是添加受试物质时的未切割底物量,SE是添加ADAMTS5时的残留未切割底物量,S0是未添加ADAMTS5的条件下的未切割底物量。
求出抑制50%酶活性所需的抑制剂的浓度(IC50)。其结果见表2。需要说明的是,IC50显示4次测定的平均值。
[表2]
对ADAMTS5的抑制活性(IC50)
SEQ ID NO | IC<sub>50</sub>[nM] |
1 | 16.8±2.8 |
作为阴性对照的40N在最终核酸浓度30nM条件下没有显示出抑制活性(抑制率5.6±4.7%)。另外,作为阳性对照的ADAMTS5低分子抑制剂(CAS929634-33-3)(Merck公司制造)的IC50值为90.5μM。
由以上结果可知:具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的适配体对ADAMTS5显示出优异的抑制效果。
实施例2:适配体的短链化1
进行具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的适配体的短链化。进行了短链化的序列见SEQ ID NO:3~9。SEQ ID NO:3~9所表示的适配体的二级结构预测见图3。图3中,通用序列用圆(〇)圈起来。另外,关于缺失了一部分通用序列的序列,其位置用箭头(黑三角形)标记。
以下显示具有SEQ ID NO:3~9所示的核苷酸序列的适配体的核苷酸序列。只要没有特别提及,则以下列举的各序列以5’到3’的方向表示,嘌呤碱基(A和G)为2’-OH体,嘧啶碱基(U和C)为2’-氟修饰体。
SEQ ID NO:3
(将SEQ ID NO:1所表示的序列短链化至包含通用序列的44个核苷酸的长度而得到的序列)
GGAUUGGGGCCUCCACAGCUGCUCAGCUUGGACUAAACCAAUCC
SEQ ID NO:4
(将SEQ ID NO:1所表示的序列短链化至包含通用序列的44个核苷酸的长度、并进一步将由第3位和第42位构成的AU碱基对取代成CG碱基对而得到的序列)
GGCUUGGGGCCUCCACAGCUGCUCAGCUUGGACUAAACCAAGCC
SEQ ID NO:5
(将SEQ ID NO:4所表示的序列短链化至包含通用序列的42个核苷酸的长度而得到的序列)
GGCUUGGGGCCUCCACAGCGCUCGCUUGGACUAAACCAAGCC
SEQ ID NO:6
(将SEQ ID NO:4所表示的序列短链化至包含通用序列的43个核苷酸的长度而得到的序列)
GGCUUGGGGCCUCCACAGCUGUCAGCUUGGACUAAACCAAGCC
SEQ ID NO:7
(由缺失了SEQ ID NO:4所表示的序列的通用序列中的连续的3个A碱基之一的43个核苷酸构成的序列)
GGCUUGGGGCCUCCACAGCUGCUCAGCUUGGACUAACCAAGCC
SEQ ID NO:8
(由缺失了SEQ ID NO:4所表示的序列的通用序列中的CG碱基对(第13位和第31位的碱基)的42个核苷酸构成的序列)
GGCUUGGGGCCUCACAGCUGCUCAGCUUGACUAAACCAAGCC
SEQ ID NO:9
(组合SEQ ID NO:3、5、6所表示的序列、且短链化至包含通用序列的41个核苷酸的长度而得到的序列)
GGAUUGGGGCCUCCACAGCGUCGCUUGGACUAAACCAAUCC
利用与实施例1同样的方法研究了这些适配体是否抑制ADAMTS5的酶活性。其中,将核酸的最终浓度固定在30nM进行评价。其结果见表3。
[表3]
对ADAMTS5的抑制活性
SEQ ID NO | 长度 | 抑制活性% |
3 | 44 | 36.4 |
4 | 44 | 23 |
5 | 42 | 27 |
6 | 43 | 33.7 |
7 | 43 | -2.3 |
8 | 42 | -8.6 |
9 | 41 | 5.9 |
由具有SEQ ID NO:3和4所示的核苷酸序列的适配体的结果判明:由第3位和第42位构成的AU碱基对即使是CG碱基对也会起作用。另外,由具有SEQ ID NO:5、6、9所示的核苷酸序列的适配体的结果判明:即使通用序列中的N1(显示茎-环结构)的茎区短链化至9个碱基、环区短链化至3个碱基,也不会影响到活性,若将它们组合,则会显著影响到活性。由以上的结果显示出:通用序列中的N1至少可缩短至13个碱基。
实施例3:适配体的改变1
为了提高具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的适配体(嘧啶核苷酸的核糖的2’位被氟化)的核酸酶抗性,制作了导入有2’-O-甲基的改变体。另外,施行了改变的序列见SEQ ID NO:3(1)~3(16)。
以下将具有SEQ ID NO:3(1)~3(16)所示的核苷酸序列的各适配体的核苷酸序列与修饰一同显示。只要没有特别提及,则以下列举的各序列以5’到3’的方向表示,大写文字显示RNA。核苷酸中的括弧显示核糖的2’位的修饰,F显示氟原子,M显示O-甲基。
SEQ ID NO:3(1)
(在SEQ ID NO:3所示的序列的除通用序列以外的序列中的六处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
G(M)G(M)A(M)U(F)U(F)GGGGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)AGC(F)U(F)GC(F)U(F)C(F)AGC(F)U(F)U(F)GGAC(F)U(F)AAAC(F)C(F)AAU(M)C(M)C(M)
SEQ ID NO:3(2)
(在包含SEQ ID NO:3所示的序列的通用序列的序列中的六处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
GGAU(M)U(M)G(M)GGGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)AGC(F)U(F)GC(F)U(F)C(F)AGC(F)U(F)U(F)GGAC(F)U(F)AAAC(F)C(M)A(M)A(M)U(F)C(F)C(F)
SEQ ID NO:3(3)
(在包含SEQ ID NO:3所示的序列的除通用序列以外的序列中的六处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
GGAU(F)U(F)GGGGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)AG(M)C(M)U(M)GC(F)U(F)C(F)A(M)G(M)C(M)U(F)U(F)GGAC(F)U(F)AAAC(F)C(F)AAU(F)C(F)C(F)
SEQ ID NO:3(4)
(在SEQ ID NO:3所示的序列的通用序列中的一处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
GGAU(F)U(F)GGGGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)AGC(F)U(F)GC(F)U(F)C(F)AGC(F)U(F)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)AC(F)C(F)AAU(F)C(F)C(F)
SEQ ID NO:3(5)
(SEQ ID NO:3(1)~3(4)所表示的序列的导入2’-O-甲基修饰的全部组合而得到的序列)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)GGGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)AG(M)C(M)U(M)GC(F)U(F)C(F)A(M)G(M)C(M)U(F)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)AC(F)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
SEQ ID NO:3(6)
(对SEQ ID NO:3(5)所表示的序列的通用序列的两处施行2’-O-甲基修饰而得到的序列)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)AG(M)C(M)U(M)GC(F)U(F)C(F)A(M)G(M)C(M)U(F)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
SEQ ID NO:3(7)
(对SEQ ID NO:3(5)所表示的序列的除通用序列以外的序列的一处施行2’-O-甲基修饰而得到的序列)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)GGGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(M)AG(M)C(M)U(M)GC(F)U(F)C(F)A(M)G(M)C(M)U(F)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)AC(F)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
SEQ ID NO:3(8)
(对SEQ ID NO:3(5)所表示的序列的除通用序列以外的序列的六处施行2’-O-甲基修饰而得到的序列)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
SEQ ID NO:3(9)
(对SEQ ID NO:3(8)所表示的序列的通用序列的一处施行2’-O-甲基修饰而得到的序列)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)G(M)GC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
SEQ ID NO:3(10)
(对SEQ ID NO:3(8)所表示的序列的通用序列的一处施行2’-O-甲基修饰而得到的序列)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GG(M)C(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M))U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
SEQ ID NO:3(11)
(对SEQ ID NO:3(8)所表示的序列的除通用序列以外的序列的一处施行2’-O-甲基修饰而得到的序列)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)A(M)C(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
SEQ ID NO:3(12)
(对SEQ ID NO:3(8)所表示的序列的通用序列的一处施行2’-O-甲基修饰而得到的序列)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
SEQ ID NO:3(13)
(对SEQ ID NO:3(8)所表示的序列的通用序列的一处施行2’-O-甲基修饰而得到的序列)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)GG(M)AC(F)U(F)AA(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
SEQ ID NO:3(14)
(对SEQ ID NO:3(8)所表示的序列的通用序列的一处施行2’-O-甲基修饰而得到的序列)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)GGA(M)C(F)U(F)AA(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
SEQ ID NO:3(15)
(对SEQ ID NO:3(8)所表示的序列的通用序列的一处施行2’-O-甲基修饰而得到的序列)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)GGAC(F)U(F)A(M)A(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
SEQ ID NO:3(16)
(对SEQ ID NO:3(8)所表示的序列的通用序列的一处施行2’-O-甲基修饰而得到的序列)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
SEQ ID NO:3(1)~3(16)的核酸均通过化学合成来制作。按照与实施例1同样的方法评价这些核酸是否抑制ADAMTS5的酶活性。在核酸的最终浓度为10nM和30nM下进行评价。其结果见表4。表中,“n.d.”表示未测定。
[表4]
对ADAMTS5的抑制活性
判明:虽然各适配体在抑制活性上有强有弱,但均显示出抑制活性。显示出:具有SEQ ID NO:3(1)~3(4)所示的核苷酸序列的适配体的抑制活性保持在与SEQ ID NO:3大致同等的程度,与具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的适配体的抑制活性相比,具有组合了SEQ ID NO:3(1)~3(4)的全部修饰而得到的SEQ ID NO:3(5)所示的核苷酸序列的适配体的抑制活性有所提高。还显示出:具有在SEQ ID NO:3(5)中进一步导入修饰而得到的SEQID NO:3(6)和3(8)所示的核苷酸序列的适配体中,抑制活性进一步提高,但在具有SEQ IDNO:3(7)所示的核苷酸序列的适配体中抑制活性降低。显示出:具有在SEQ ID NO:3(8)中进一步导入修饰而得到的SEQ ID NO:3(11)、3(12)、3(16)所示的核苷酸序列的适配体中虽然保持了抑制活性,但在SEQ ID NO:3(9)、3(10)、3(13)、3(14)、3(15)中抑制活性降低。
由以上结果判明:具有SEQ ID NO:3所表示的核苷酸序列的适配体即使是在各处(至少28处)的核苷酸中导入了修饰以提高稳定性的适配体,也可起作用。还判明:通用序列中的5’侧2个碱基(G、G)和3’侧4个碱基(A、A、C、C)即使是导入了2’-O-甲基等修饰的碱基也可起作用。作为核苷酸的修饰,除2’-O-甲基修饰以外,例如还可列举2’-氨基修饰等。
实施例4:适配体的短链化2
对具有SEQ ID NO:3(16)所示的核苷酸序列的适配体进一步进行短链化。进行了短链化和修饰的序列见SEQ ID NO:10~12。具有SEQ ID NO:10~12所示的核苷酸序列的适配体的二级结构预测见图4。图4中,通用序列用圆(〇)圈起来。
以下显示具有SEQ ID NO:10~12所示的核苷酸序列的各适配体的核苷酸序列。如果没有特别提及,则以下列举的各序列以5’到3’的方向表示,大写字母表示RNA。核苷酸中的括弧显示核糖的2’位的修饰,F显示氟原子,M显示O-甲基。
SEQ ID NO:10
(组合SEQ ID NO:3(12)和SEQ ID NO:3(16)所表示的序列的2’-O-甲基修饰、并短链化至包含通用序列的40个核苷酸的长度而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11
(将SEQ ID NO:10所表示的序列短链化至包含通用序列的38个核苷酸的长度而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:12
(将SEQ ID NO:10所表示的序列短链化至包含通用序列的36个核苷酸的长度而得到的序列)
U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)
SEQ ID NO:10~12的核酸均通过化学合成来制作。按照与实施例1同样的方法研究了具有这些序列所示的核苷酸序列的适配体是否抑制ADAMTS5的酶活性。在核酸的最终浓度为10nM下进行评价。其结果见表5。SEQ ID NO:10~12的短链化物均维持着抑制活性。
[表5]
对ADAMTS5的抑制活性
由以上的结果可知:具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的适配体即使是包含通用序列的36个核苷酸的长度也起作用。
实施例5:适配体的改变2
为了提高实施例4中制作的具有SEQ ID NO:10、11所示的核苷酸序列的适配体的核酸酶抗性,制作了末端修饰的改变体、导入了2’-O-甲基的改变体、导入了DNA的改变体、此外还有导入了硫代磷酸酯的改变体。施行了改变的序列见SEQ ID NO:10(1)~10(8)(SEQID NO:10系统)、11(1)~11(35)(SEQ ID NO:11系统)。另外,为了将序列优化,制作取代了一部分序列的改变体。施行了序列取代的序列见SEQ ID NO:13~14。另外,作为阴性对照,制作随机取代了一部分通用序列的修饰体。其序列见SEQ ID NO:15。
以下显示SEQ ID NO:10(1)~10(8)、11(1)~11(35)、13~15所示的各核苷酸序列。如果没有特别提及,则以下列举的各序列以5’到3’的方向表示,大写字母显示RNA,小写字母显示DNA。核苷酸中的括弧显示核糖的2’位的修饰,F显示氟原子,M显示O-甲基。另外,序列末端的idT显示利用反向-dT进行的修饰,PEG显示利用40kDa的支链型聚乙二醇进行的修饰。序列中的s显示连接核苷酸彼此的磷酸基被硫代磷酸酯化。
SEQ ID NO:10(1)
(在SEQ ID NO:10所表示的序列的通用序列的一处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(M)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:10(2)
(在SEQ ID NO:10所表示的序列的通用序列的一处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(M)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:10(3)
(在SEQ ID NO:10所表示的序列的通用序列的一处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(M)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:10(4)
(在SEQ ID NO:10所表示的序列的通用序列的一处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(M)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:10(5)
(在SEQ ID NO:10所表示的序列的通用序列的一处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(M)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:10(6)
(在SEQ ID NO:10所表示的序列的除通用序列以外的序列的一处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:10(7)
(在SEQ ID NO:10所表示的序列的通用序列的一处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(M)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:10(8)
(在SEQ ID NO:10所表示的序列的通用序列的一处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(M)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(1)
(在SEQ ID NO:11所表示的序列的除通用序列以外的序列的一处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(2)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的通用序列的一处导入DNA而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)gGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(3)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的通用序列的一处导入DNA而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GgC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(4)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的通用序列的一处导入DNA而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGcC(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(5)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的通用序列的一处导入DNA而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)cU(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(6)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的通用序列的一处导入DNA而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)tC(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(7)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的通用序列的一处导入DNA而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)cC(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(8)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的通用序列的一处导入DNA而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)cAC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(9)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的除通用序列以外的序列的一处导入DNA而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AcA(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(10)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的通用序列的一处导入DNA而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)gAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(11)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的通用序列的一处导入DNA而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GaC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(12)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的通用序列的一处导入DNA而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAcU(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(13)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的通用序列的一处导入DNA而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)tAA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(14)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的通用序列的一处导入DNA而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)aA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(15)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的除通用序列以外的序列的一处导入DNA而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)aC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(16)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)sGGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(17)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GsGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(18)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGsC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(19)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)sC(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(20)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)sU(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(21)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)sC(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(22)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)sC(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(23)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)sAC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(24)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AsC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(25)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)sA(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(26)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)sGAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(27)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GsAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(28)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAsC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(29)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)sU(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(30)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)sAA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(31)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的一处导入硫代磷酸酯修饰而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AsA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:13
(将SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的两末端的各2个核苷酸取代成其他序列而得到的序列)
G(M)C(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)G(M)C(M)
SEQ ID NO:14
(将SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的环区的4个核苷酸取代成其他序列而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)C(M)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
SEQ ID NO:11(32)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的4处导入硫代磷酸酯修饰、并在3’末端添加idT而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)sC(F)sU(F)sC(F)C(F)AC(F)sA(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)-idT
SEQ ID NO:11(33)
(在SEQ ID NO:11(1)所表示的序列的5’末端添加40kDa的聚乙二醇、并在3’末端添加idT而得到的序列)
PEG-A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)-idT
SEQ ID NO:11(34)
(在SEQ ID NO:11(19)所表示的序列的3’末端添加idT而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)sC(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)-idT
SEQ ID NO:11(35)
(在SEQ ID NO:11(19)所表示的序列的5’末端添加40kDa的聚乙二醇、并在3’末端添加idT而得到的序列)
PEG-A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)sC(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)-idT
SEQ ID NO:15
(将SEQ ID NO:11(34)所表示的序列的通用序列随机地按顺序排列而得到的序列)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)C(F)sA(M)C(F)GGAG(M)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)C(F)U(F)C(F)GA(M)U(F)C(F)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)-idT
具有SEQ ID NO:10(1)~10(8)和11(1)~11(35)、SEQ ID NO:13~15所表示的序列的适配体均通过化学合成来制作。对于具有SEQ ID NO:10(1)~10(8)和11(1)~11(33)、SEQ ID NO:13和14的序列所表示的序列的适配体,按照与实施例1同样的方法(评价方法1)研究了这些适配体是否抑制ADAMTS5的酶活性。在核酸的最终浓度为10nM下进行评价。其结果见表6的评价方法1。
另一方面,通过下述方法(评价方法2)对具有SEQ ID NO:11(34)~11(35)和SEQID NO:15的序列所表示的序列的适配体进行评价。ADAMTS5的底物(聚集蛋白聚糖G1-IGD-G2)的切割反应除下述这一点以外与实施例1同样地进行。不同点在于:在ADAMTS5和底物的最终浓度分别为0.2nM和400nM(48μg/mL)下实施;以及酶反应时间设为30分钟。反应后,添加过剩量的ADAMTS5低分子抑制剂以停止反应。被切割的底物的定量通过使用了2种抗聚集蛋白聚糖抗体的夹层ELISA法实施。抗聚集蛋白聚糖抗体使用了R&Dsystems公司制造的MAB6489和生物素化的MAB1220。MAB6489是特异性地识别通过ADAMTS5切割的聚集蛋白聚糖的切割面的抗体,通过使用该抗体可定量所切割的底物的量。检测是通过使用了辣根过氧化物酶标记化链霉亲和素的标准ELISA检测法实施。该反应条件下的ADAMTS5的底物切割效率为7%左右。受试物质的抑制率利用下式算出。
抑制率(%)=(PE-Papt)/(PE-P0)×100
这里,PE是添加ADAMTS5时的切割底物量,Papt是添加受试物质时的切割底物量,P0是未添加ADAMTS5条件下的切割底物量。
具有SEQ ID NO:11(34)~11(35)和SEQ ID NO:15所表示的序列的适配体的抑制活性的测定结果见表6的评价方法2。表中,“评价方法1”中显示10nM的适配体浓度条件下的抑制活性。“评价法2”中显示2nM的适配体浓度条件下的抑制活性。“n.d.”表示未测定。
[表6]
对ADAMTS5的抑制活性
在导入了2’-O-甲基化修饰的改变体中,具有SEQ ID NO:10(1)、10(6)(SEQ IDNO:10系统)和SEQ ID NO:11(1)(SEQ ID NO:11系统)所表示的序列的适配体保持了抑制活性,但有强有弱。另一方面,具有SEQ ID NO:10(2)~10(5)和10(7)、10(8)所表示的序列的适配体的抑制活性显著下降。由以上结果判明:从通用序列的5’末端起第5位的C以及从3’末端起第10位的G即使是导入了2’-O-甲基化修饰的碱基也起作用。另外,在通用序列中的内环的大部分中,因2’-O-甲基化修饰导致适配体的抑制活性显著降低,由此暗示了该区对适配体的活性较为重要的可能性。
另外,在导入了DNA的改变体(SEQ ID NO:11系统)中,具有SEQ ID NO:11(2)、11(4)、11(8)、11(9)、11(10)、11(12)、11(14)、11(15)所表示的序列的适配体虽然活性有强有弱,但保持了抑制活性。由以上结果判明:从通用序列的5’末端起第3位的G、第5位的C、第9位的C以及从3’末端起第9位的G、第7位的C、第5位的A即使是DNA也起作用。作为核苷酸的修饰,除2’-O-甲基修饰、DNA以外,例如还可列举2’-氨基修饰等。另外,在磷酸基中导入了硫代磷酸酯修饰的SEQ ID NO:11(16)~11(32)中,在除具有SEQ ID NO:11(30)所表示的序列的适配体以外的所有序列中,虽然活性有强有弱,但维持了抑制活性。其中,具有SEQ IDNO:11(19)~11(21)、11(25)所表示的序列的适配体的抑制活性提高。由具有SEQ ID NO:13所表示的序列的适配体的结果判明:即使末端的两个碱基对、AU对和UA对分别取代成了GC对和CG对,也不会影响到抑制活性。另外,由具有SEQ ID NO:14所表示的序列的适配体的结果判明:即使将由第18位~第21位的碱基构成的环序列由GCUC取代成UUCG,也不会影响到抑制活性。
由具有SEQ ID NO:11(33)~(35)所表示的序列的适配体的结果判明:即使在5’末端添加PEG、在3’末端添加idT,也不会影响到抑制活性。作为末端修饰,除PEG、idT以外,还可列举肽、氨基酸、糖、糖胺聚糖或生物素等。由以上可知:包含式(1)或式(1)’的本发明的适配体可进行各种修饰。
实施例6:特异性地与ADAMTS5结合的RNA适配体的制作(2)
使用随机序列和引物序列与实施例1中使用的序列不同的模板,进行与实施例1同样的SELEX。作为SELEX的靶物质,使用了在NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow(GEHealthcare公司制造)的载体上固相化的ADAMTS5(R&Dsystems公司制造)。使用的模板和引物的序列如下所示。DNA模板和引物通过化学合成来制作。在模板DNA中根据SEQ ID NO:3的序列导入了突变。
DNA模板:5’-TGCTCGATCTGGACT(G)(G)(A)(T)(T)(G)(G)(T)(T)(T)(A)(G)(T)(C)(C)(A)(A)(G)(C)(T)(G)(A)(G)(C)(A)(G)(C)(T)(G)(T)(G)(G)(A)(G)(G)(C)(C)(C)(C)(A)(A)(T)(C)(C)AGTTACGCATGTCCC-3’(SEQ ID NO:49)
正向引物:5’-TAATACGACTCACTATAGGGACATGCGTAACT-3’(SEQ ID NO:50)
反向引物:5’-TGCTCGATCTGGACT-3’(SEQ ID NO:51)
DNA模板(SEQ ID NO:49)中的括弧表示突变导入,设计成包含76%的括弧内所示的核苷酸和各8%的其他3种核苷酸。正向引物包含T7RNA聚合酶的启动子序列。最初一轮中使用的RNA库的变异在理论上为1013。
在固相化有ADAMTS5的载体中加入RNA库,在室温下保持30分钟后,用溶液A洗涤树脂,以去除未与ADAMTS5结合的RNA。这里,溶液A是145mM氯化钠、5.4mM氯化钾、1.8mM氯化钙、0.8mM氯化镁、20mM Tris(pH7.6)、0.05%Tween20的混合溶液。加入溶液B作为洗脱液,在95℃下进行3分钟的热处理,由其上清回收与ADAMTS5结合的RNA。这里,溶液B是7M脲、5mMEDTA、20mM Tris(pH7.6)的混合溶液。回收的RNA通过逆转录PCR扩增,通过DuraScribeTMT7转录试剂盒转录,用作下一轮的库。将以上作为1轮,重复多次进行同样的操作。SELEX结束后,将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体(Promega公司制造)中,转化大肠杆菌株DH5α(Toyobo公司制造)。由单一集落提取质粒后,使用毛细管DNA测序仪(3130xl基因分析仪、ABI公司制造)研究克隆的核苷酸序列。另外,还使用下一代测序仪进行了核苷酸序列的大规模分析。下一代测序仪使用IonPGMTM系统(Thermo公司制造),分析按照Thermo公司的工艺说明书进行。
实施7轮SELEX后,通过毛细管DNA测序仪确定48个克隆的序列时,在26个克隆的序列中包含以下所示的通用序列1或2。这些克隆的一部分序列见SEQ ID NO:16~20。
另外,通过下一代测序仪特定47623种克隆序列,确认收敛至12728种序列。这些克隆的一部分序列见SEQ ID NO:21~25。SEQ ID NO:21所表示的序列存在1,045个序列。SEQID NO:22所表示的序列存在595个序列。SEQ ID NO:23所表示的序列存在557个序列。SEQID NO:24所表示的序列存在442个序列。SEQ ID NO:25所表示的序列存在288个序列。利用MFOLD程序(M.Zukker,NucleicAcidsRes.31(13),3406-3415,2003)预测这些序列的二级结构时,形成了通用序列的部分极其相似的环结构。这些序列的二级结构见图5-1、图5-2。图5-1、图5-2中,通用序列用圆(〇)圈起来。另外,序列不同于SEQ ID NO:3的位置用箭头(黑三角形)显示。
以下显示SEQ ID NO:16~25所表示的各核苷酸序列。如果没有特别提及,则以下列举的各序列以5’到3’的方向表示,嘌呤碱基(A和G)为2’-OH体,嘧啶碱基(U和C)为2’-氟修饰体。另外,序列中的N1显示6~15个的任意的核苷酸,W显示A或U,Y显示C或U。
SEQ ID NO:16
GGGACAUGCGUAACUUGAUAGGGGCCUCCGCAGCUGAUCAGCUCGGACUCAAACCAUCAAGUCCAGAUCGAGCA
SEQ ID NO:17
GGGACAUGCGUAACUGUAUAGGGGCCUCCACAGCUGAAAAGCUUGGACUCAAACCAUACAGUCCAGAUCGAGCA
SEQ ID NO:18
GGGACAUGCGUAACUGCAUCGGGGCCUCCGCAGCUGUUAAGCUCGGACUCAAACCAUGCAGUCCAGAUCGAGCA
SEQ ID NO:19
GGGACAUGCGUAACUUGAUAGGGGCCUCCACAGCUGAUAAGCUUGGACUCAAACCAUCAAGUCCAGAUCGAGCA
SEQ ID NO:20
GGGACAUGCGUAACUGUAUAGGGGCCUCCGCAGCUAUUCAGCUCGGACAUAAACCAUACAGUCCAGAUCGAGCA
SEQ ID NO:21
GGGACAUGCGUAACUAUAUAGGGGCCUCCACAGCUGUAAAGCUUGGACUUAAACCAUAUAGAGUCCAGAUCGAGCA
SEQ ID NO:22
GGGACAUGCGUAACUGCAUAGGGGCCUCCACAGCUAUUCAGCUUGGACACAAACCAUGCAGUCCAGAUCGAGCA
SEQ ID NO:23
GGGACAUGCGUAACUGUAUAGGGGCCUCCACAGCUGAAAAGCUUGGACUCAAACCAUACAGUCCAGAUCGAGCA
SEQ ID NO:24
GGGACAUGCGUAACUUGAUAGGGGCCUCCACAGCCGGUAGGCUUGGACUCAAACCAUCAAGUCCAGAUCGAGCA
SEQ ID NO:25
GGGACAUGCGUAACUGCAUAGGGGCCUCCACAGCUAUUCAGCUUGGACACAAACCAUGCAGUCCAGAUCGAGCA
通用序列1:
GGGGCCUCC-N1-GGACYAAAC
通用序列2:
GGGGCCUCC-N1-GGACWYAAAC
测定了具有SEQ ID NO:16~25所表示的序列的适配体对ADAMTS5的结合活性和酶抑制活性。结合活性通过表面等离子体共振法进行评价。测定是利用与实施例1所示的方法同样的方法进行。酶抑制活性利用与实施例1所示的方法同样的方法进行测定。测定结果见表7。需要说明的是,表中“++”和“+”表示与阴性对照的核酸相比显著地与ADAMTS5结合的核酸。这里,阴性对照的核酸是指在SELEX法的第1轮中使用的核酸库。“++”表示ADAMTS5结合量(RU值)与适配体在SA芯片上的固定化量(RU值)的比例为40%以上,“+”表示上述比例小于40%。抑制活性的数值表示在表中所示的各适配体浓度下的酶抑制活性。“n.d.”表示未测定。
[表7]
对ADAMTS5的结合活性和抑制活性
显示出:与阴性对照的核酸相比,具有SEQ ID NO:16~25所表示的序列的适配体均显著地与ADAMTS5结合。还判明:虽然活性有强有弱,但所有核酸均显示出抑制活性。
另外,由具有SEQ ID NO:16~25所表示的序列的适配体的二级结构预测和结合活性、以及抑制活性的结果判明:与通用序列相邻的末端的茎序列即使包含凸起结构也可起作用。凸起结构是指在茎结构内未形成碱基对具有突出的核苷酸序列的结构。在具有SEQID NO:16~25所表示的序列的适配体的茎结构内包含凸起结构。
实施例7:适配体的短链化(3)
进行了具有SEQ ID NO:21和25所表示的序列的适配体的短链化和碱基取代。该适配体的序列见SEQ ID NO:26~29。
关于SEQ ID NO:27、28和29,根据SEQ ID NO:11(1)的修饰导入结果,在导入了2’-O-甲基修饰之后实施短链化。具有SEQ ID NO:27~29所表示的序列的适配体的二级结构预测见图6。图6中,通用序列用圆(〇)圈起来。以下显示SEQ ID NO:26~29所表示的各核苷酸序列。如果没有特别提及,则以下列举的各序列以5’到3’的方向表示,大写文字显示RNA。核苷酸中的括弧显示核糖的2’位的修饰,F显示氟原子,M显示O-甲基。“idT”显示反向dT。
SEQ ID NO:26
(将SEQ ID NO:21所表示的序列短链化至包含通用序列的46个核苷酸的长度而得到的序列)
GGGU(F)AU(F)AGGGGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)AGC(F)GU(F)AAGC(F)U(F)U(F)GGAC(F)U(F)U(F)AAAC(F)C(F)AU(F)AC(F)C(F)C(F)
SEQ ID NO:27
(在SEQ ID NO:21所表示的序列中导入2’-O-甲基修饰使反映SEQ ID NO:11(1)的2’位的修饰、并短链化至包含通用序列的40个核苷酸的长度而得到的序列)
U(M)A(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)U(M)A(M)
SEQ ID NO:28
(将SEQ ID NO:27所表示的序列的两末端各2个核苷酸取代成其他序列而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
SEQ ID NO:29
(在SEQ ID NO:25所表示的序列中导入2’-O-甲基修饰使反映SEQ ID NO:11(1)的2’位的修饰、并短链化至包含通用序列的40个核苷酸长度、且在3’末端添加idT而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)A(M)U(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)AC(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
具有SEQ ID NO:26所表示的序列的适配体通过T7RNA聚合酶转录来调制,具有SEQID NO:27~29所表示的序列的适配体通过化学合成来调制。采用与实施例1同样的方法评价了这些适配体是否抑制ADAMTS5的酶活性。测定结果见表8。需要说明的是,表中“n.d.”表示未测定。
[表8]
对ADAMTS5的抑制活性
具有SEQ ID NO:26~29所表示的序列的适配体均维持了抑制活性。由以上结果判明:SEQ ID NO:21和25所表示的适配体以包含通用序列的40个核苷酸的长度起作用。由具有SEQ ID NO:27和28所表示的序列的适配体的结果判明:末端的两个碱基对UA对和AU对即使分别取代成CG对和GC对,也不会影响到活性。
实施例8:适配体的改变3
为了提高具有SEQ ID NO:28、29所表示的序列的适配体的核酸酶抗性,制作了末端修饰的改变体、导入了2’-氟基、2’-O-甲基的改变体。施行了改变的序列见SEQ ID NO:28(1)~28(18)(SEQ ID NO:28系统)、29(1)~29(3)(SEQ ID NO:29系统)。
以下显示SEQ ID NO:28(1)~28(18)、29(1)~29(3)所表示的各核苷酸序列。如果没有特别提及,则以下列举的各序列以5’到3’的方向表示,大写文字显示RNA。核苷酸中的括弧显示核糖的2’位的修饰,F显示氟原子,M显示O-甲基。另外,序列末端中的idT显示通过反向-dT进行的修饰,PEG显示通过40kDa的支链型聚乙二醇进行的修饰。
SEQ ID NO:28(1)
(在SEQ ID NO:28所表示的序列的除通用序列以外的三处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(M)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
SEQ ID NO:28(2)
(在SEQ ID NO:28所表示的序列的除通用序列以外的一处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
SEQ ID NO:28(3)
(在SEQ ID NO:28所表示的序列的通用序列的一处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(M)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
SEQ ID NO:28(4)
(在SEQ ID NO:28所表示的序列的通用序列的一处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(M)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
SEQ ID NO:28(5)
(在SEQ ID NO:28所表示的序列的通用序列的四处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(M)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
SEQ ID NO:28(6)
(在SEQ ID NO:28所表示的序列的除通用序列以外的一处导入2’-氟修饰而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)A(F)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
SEQ ID NO:28(7)
(在SEQ ID NO:28所表示的序列的通用序列的一处导入2’-氟修饰而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)G(F)GC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
SEQ ID NO:28(8)
(在SEQ ID NO:28所表示的序列的通用序列的一处导入2’-氟修饰而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GG(F)C(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
SEQ ID NO:28(9)
(在SEQ ID NO:28所表示的序列的除通用序列以外的一处导入2’-氟修饰而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)A(F)C(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
SEQ ID NO:28(10)
(在SEQ ID NO:28所表示的序列的通用序列的一处导入2’-氟修饰而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)G(F)AC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
SEQ ID NO:28(11)
(在SEQ ID NO:28所表示的序列的通用序列的一处导入2’-氟修饰而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GA(F)C(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
SEQ ID NO:28(12)
(在SEQ ID NO:28所表示的序列的通用序列的一处导入2’-氟修饰而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)A(F)A(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
SEQ ID NO:28(13)
(在SEQ ID NO:28所表示的序列的五处导入2’-O-甲基修饰、并在3’末端添加了idT而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(M)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(M)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:28(14)
(在SEQ ID NO:28(13)所表示的序列的通用序列的一处导入2’-氟修饰而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)G(F)GC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(M)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)G(F)AC(F)U(M)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:28(15)
(在SEQ ID NO:28所表示的序列的四处导入2’-O-甲基修饰、并在3’末端添加idT而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(M)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(M)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:28(16)
(在SEQ ID NO:28所表示的序列的四处导入2’-O-甲基修饰、并在3’末端添加idT而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(M)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:28(17)
(在SEQ ID NO:28所表示的序列的三处导入2’-O-甲基修饰、并在3’末端添加idT而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(M)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:28(18)
(在SEQ ID NO:28(15)所表示的序列的5’末端添加PEG而得到的序列)
PEG-C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(M)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(M)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:29(1)
(在SEQ ID NO:29所表示的序列的通用序列的一处导入2’-O-甲基修饰而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)A(M)U(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)A(M)C(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:29(2)
(在SEQ ID NO:29所表示的序列的通用序列的一处导入2’-氟修饰而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)G(F)GC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)A(M)U(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)G(F)AC(F)A(M)C(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:29(3)
(在SEQ ID NO:29所表示的序列的通用序列的两处导入2’-氟修饰而得到的序列)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)G(F)GC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)A(M)U(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)G(F)AC(F)AC(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
具有SEQ ID NO:28(1)~28(18)(SEQ ID NO:28系统)和SEQ ID NO:29(1)~29(3)(SEQ ID NO:29系统)所表示的序列的适配体均通过化学合成来调制。利用与实施例1和实施例5同样的方法评价了这些适配体是否抑制ADAMTS5的酶活性。测定结果见表9。表中“评价方法1”是检测方法为电泳法的酶抑制活性评价方法,显示在10nM的核酸最终浓度下的抑制活性。“评价方法2”是检测方法为ELISA法的酶抑制活性评价方法,显示在2nM的核酸最终浓度下的抑制活性以及IC50值。“n.d.”显示未测定。
[表9]
对ADAMTS5的抑制活性
由具有SEQ ID NO:28(2)和28(6)所表示的序列的适配体的结果判明:从5’末端起第4个碱基的A(由茎1形成凸起结构)除了是RNA以外即使是2’-氟修饰或2’-O-甲基修饰也会起作用。另外,由具有SEQ ID NO:28(3)和29(1)所表示的序列的适配体的结果判明:从通用序列的3’末端侧起第7位的W(A或U)除了是RNA、2’-氟修饰以外即使是2’-O-甲基修饰也会起作用。另外,由具有SEQ ID NO:28(7)、28(8)、28(10)、28(12)、29(2))所表示的序列的适配体的结果判明:从通用序列的5’末端起第3个碱基和第4个碱基的G、从3’末端起第10个碱基的G、第5个碱基的A除了是RNA以外即使是2’-氟修饰也会起作用。另一方面,由具有SEQID NO:28(4)、28(11)所表示的序列的适配体的结果判明:从通用序列的3’末端起第6位的Y通过导入2’-O-甲基化修饰,适配体的抑制活性显著减弱,另外,从3’末端起第9位的A因2’-氟化修饰而导致适配体的活性降低。
由具有SEQ ID NO:28(13)~(18)(SEQ ID NO:28系统)、29和29(1)~29(3)(SEQID NO:29系统)所表示的序列的适配体的结果判明:即使在5’末端添加PEG、在3’末端添加idT,也不会影响到抑制活性。作为末端修饰,除PEG、idT以外,还可列举肽、氨基酸、糖、糖胺聚糖或生物素等。
实施例9:特异性地与ADAMTS5结合的RNA适配体的制作(3)
采用Vater等人的SELEX法(Vater等人.Nucleic Acid Research,31、e130、2003)的改良法制作了特异性地与ADAMTS5结合的RNA适配体。作为SELEX的靶物质,使用在NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare公司制造)的载体上固相化的ADAMTS5(R&D systems公司制造)。最初一轮中使用的RNA是利用与实施例1同样的方法转录通过化学合成得到的DNA而得到的。通过该方法得到的RNA的嘧啶核苷酸的核糖的2’位被氟化。使用的模板和引物的序列如下所示。DNA模板和引物通过化学合成来制作。模板DNA具有在SEQID NO:11的序列的除通用序列以外的茎-环区的序列中导入了突变的设计。
DNA模板:5’-ATATCTTTTGCTTATTCTCGAGAATTGGTTTAGTCCANNNNNNNNNNGTGGAGGCCCCAATACCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’(SEQ ID NO:52)
正向引物:5’-TAATACGACTCACTATAGGGT-3’(SEQ ID NO:53)
反向引物:5’-ATATCTTTTGCTTATTCTCGAG-3’(SEQ ID NO:54)
DNA模板(SEQ ID NO)中的N的连续是任意组合的10个核苷酸(各N为A、C、G或T)。正向引物包含T7RNA聚合酶的启动子序列。最初一轮中使用的RNA库的变异在理论上为1013。
在固相化有ADAMTS5的载体中加入RNA库,在室温下保持30分钟后,用溶液A洗涤树脂,以去除未与ADAMTS5结合的RNA。这里,溶液A是145mM氯化钠、5.4mM氯化钾、1.8mM氯化钙、0.8mM氯化镁、20mM Tris(pH7.6)、0.05%Tween20的混合溶液。加入溶液B作为洗脱液,在95℃下进行3分钟的热处理,由其上清收集与ADAMTS5结合的RNA。这里,溶液B是7M脲、5mMEDTA、20mM Tris(pH7.6)的混合溶液。回收的RNA在使用T7 RNA连接酶2(New EnglandBiolabs公司制造)在两末端连接引物序列后通过逆转录PCR扩增。在反向引物的3’末端侧设计限制酶位点XhoI,通过用XhoI(New England Biolabs公司制造)消化PCR扩增产物,可去除反向引物序列。将用限制酶消化的PCR扩增产物通过DuraScribeTMT7转录试剂盒转录到模板上,用作下一轮的库。将以上设为1轮,反复多次进行同样的操作。SELEX结束后,使用下一代测序仪进行核苷酸序列的大规模分析。下一代测序仪使用IonPGMTM系统(Thermo公司制造),按照Thermo公司的工艺说明书进行分析。
实施3轮SELEX后,通过下一代测序仪特定7956种克隆序列,确认收敛至7676种序列。这些克隆的一部分序列见SEQ ID NO:30~45。SEQ ID NO:30所表示的序列存在4个序列。SEQ ID NO:31~45所表示的序列各存在3个序列。
利用MFOLD程序(M.Zukker,NucleicAcidsRes.31(13),3406-3415,2003)预测这些序列的二级结构时,形成了通用序列的部分极其相似的环结构。这些序列的二级结构见图7-1、图7-2、图7-3。在图7-1、图7-2、图7-3中,通用序列用圆(〇)圈起来。另外,序列不同于SEQ ID NO:11的位置用箭头(黑三角形)显示。
以下显示SEQ ID NO:30~45所表示的各核苷酸序列。如果没有特别提及,则以下列举的各序列以5’到3’的方向表示,嘌呤碱基(A和G)为2’-OH体,嘧啶碱基(U和C)为2’-氟修饰体。
SEQ ID NO:30
GGGUAUUGGGGCCUCCACAAUAGAUAAAUGGACUAAACCAACUCGA
SEQ ID NO:31
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGUUGAAGCUUGGACUAAACCAAUCUCGA
SEQ ID NO:32
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGAAAAAUCUUGGACUAAACCAAUCUCGA
SEQ ID NO:33
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGCCGAGGCUUGGACUAAACCAAUCUCGA
SEQ ID NO:34
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGAAAAAACUUGGACUAAACCAACUCGA
SEQ ID NO:35
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGUAAGCACUUGGACUAAACCAGCUCGA
SEQ ID NO:36
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGUUUAAACUUGGACUAAACCAACUCGA
SEQ ID NO:37
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGUAAAUUCUUGGACUAAACCAACUCGA
SEQ ID NO:38
GGGUAUUGGGGCCUCCACGCUAGAAGGCUGGACUAAACCAACUCGA
SEQ ID NO:39
GGGUAUUGGGGCCUCCACGUAACUAAACUGGACUAAACCAACUCGA
SEQ ID NO:40
GGGUAUUGGGGCCUCCACGCAAUGGUGCUGGACUAAACCAACUCGA
SEQ ID NO:41
GGGUAUUGGGGCCUCCACAUGGAUACAUUGGACUAAACCAACUCGA
SEQ ID NO:42
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGAUAAUUCUUGGACUAAACCAACUCGA
SEQ ID NO:43
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGAAAAUUCUUGGACUAAACCAACUCGA
SEQ ID NO:44
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGAACUUUCUUGGACUAAACCAACUCGA
SEQ ID NO:45
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGAAAAGUCUUGGACUAAACCAACUCGA
测定了SEQ ID NO:30~45所表示的核酸对ADAMTS5的结合活性。结合活性通过表面等离子体共振法进行评价。测定是采用与实施例1中所示的方法同样的方法进行测定的。测定结果见表10。表中,“++”表示ADAMTS5结合量(RU值)与适配体在SA芯片上的固定化量(RU值)的比例为40%以上,“+”表示该比例为10%以上且小于40%,“-”表示该比例小于10%。
[表10]
对ADAMTS5的结合活性
SEQ ID NO | 结合活性 |
30 | ++ |
31 | ++ |
32 | ++ |
33 | ++ |
34 | ++ |
35 | ++ |
36 | ++ |
37 | ++ |
38 | ++ |
39 | ++ |
40 | ++ |
41 | ++ |
42 | ++ |
43 | ++ |
44 | ++ |
45 | ++ |
由测定结果判明:已测定的所有序列均与ADAMTS5结合。由SEQ ID NO:30~45的结果显示出:通过SELEX法导入了突变的SEQ ID NO:11的第16位的G~第23位的C的序列存在着形成2~3个连续的碱基对的倾向,但核苷酸序列随机可变。
实施例10:滑膜细胞中的ADAMTS5适配体的聚集蛋白聚糖切割抑制活性评价
对于SEQ ID NO:11(34)、28(13)、28(15)、28(18)所表示的适配体,测定了在滑膜细胞中的聚集蛋白聚糖的切割抑制活性。测定通过下述方法实施。以2×104细胞/孔接种源自人变形性膝关节炎患者的滑膜细胞(HFLS-0A细胞)(Cell Applications公司制造),培养16~24小时。培养方法依照Cell Applications公司的工艺说明书。培养后,除去培养基,用Basal培养基(Cell Applications公司制造)洗涤细胞,添加用Basal培养基稀释的500ng聚集蛋白聚糖G1-IGD-G2(R&D systems公司制造)作为底物。对于实施适配体的抑制评价的样品,将适配体与底物同时添加。直接培养细胞,3天后回收培养上清。所添加的底物在培养期间通过以由HFLS-0A细胞分泌的ADAMTS5为代表的底物切割酶切割。培养上清中所含的切割底物片段量通过实施例5中记载的ELISA法来定量。该评价系统中的底物切割效率为1~8%。作为阴性对照,使用SEQ ID NO:15所表示的核酸。测定结果见表11。
[表11]
测定的结果,与阴性对照相比,所有适配体均显示出显著的抑制活性。由以上结果可知:本发明的适配体对滑膜细胞中的底物切割显示出优异的抑制效果。
产业实用性
本发明的适配体或复合物可用作针对变形性膝关节炎等软骨疾病的药物、或诊断药、试剂。另外,本发明的适配体或复合物可用于ADAMTS5的纯化和浓缩、ADAMTS5的标记、以及ADAMTS5的检测和定量。
本申请以在日本申请的特愿2017-216280(申请日:2017年11月9日)为基础,其内容全部包含在本说明书中。
<110> 力博美科股份有限公司
大正制药股份有限公司
<120> 针对ADAMTS5的适配体及其应用
<130> 092818
<150> JP2017-216280
<151> 2017-11-09
<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 80
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 1
ggguacgacc gucguacgau uggggccucc acagcugcuc agcuuggacu aaaccaauaa 60
gagacuaacg ccuagcguac 80
<210> 2
<211> 79
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 不与ADAMTS5结合的核苷酸序列
<400> 2
ggguacgacc gucguacgau ugggccucca cagcugcuca gcuuggacua aaccaauaag 60
agacuaacgc cuagcguac 79
<210> 3
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 3
ggauuggggc cuccacagcu gcucagcuug gacuaaacca aucc 44
<210> 4
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 4
ggcuuggggc cuccacagcu gcucagcuug gacuaaacca agcc 44
<210> 5
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 5
ggcuuggggc cuccacagcg cucgcuugga cuaaaccaag cc 42
<210> 6
<211> 43
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 6
ggcuuggggc cuccacagcu gucagcuugg acuaaaccaa gcc 43
<210> 7
<211> 43
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 不与ADAMTS5结合的核苷酸序列
<400> 7
ggcuuggggc cuccacagcu gcucagcuug gacuaaccaa gcc 43
<210> 8
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 不与ADAMTS5结合的核苷酸序列
<400> 8
ggcuuggggc cucacagcug cucagcuuga cuaaaccaag cc 42
<210> 9
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 不与ADAMTS5结合的核苷酸序列
<400> 9
ggauuggggc cuccacagcg ucgcuuggac uaaaccaauc c 41
<210> 10
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 10
auuggggccu ccacagcugc ucagcuugga cuaaaccaau 40
<210> 11
<211> 38
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 11
auuggggccu ccacagcgcu cgcuuggacu aaaccaau 38
<210> 12
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 12
uuggggccuc cacagcgcuc gcuuggacua aaccaa 36
<210> 13
<211> 38
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 13
gcuggggccu ccacagcgcu cgcuuggacu aaaccagc 38
<210> 14
<211> 38
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 14
auuggggccu ccacagcuuc ggcuuggacu aaaccaau 38
<210> 15
<211> 38
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 15
auuggcacgg agacagcgcu cgcuucucga ucaccaau 38
<210> 16
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 16
gggacaugcg uaacuugaua ggggccuccg cagcugauca gcucggacuc aaaccaucaa 60
guccagaucg agca 74
<210> 17
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 17
gggacaugcg uaacuguaua ggggccucca cagcugaaaa gcuuggacuc aaaccauaca 60
guccagaucg agca 74
<210> 18
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 18
gggacaugcg uaacugcauc ggggccuccg cagcuguuaa gcucggacuc aaaccaugca 60
guccagaucg agca 74
<210> 19
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 19
gggacaugcg uaacuugaua ggggccucca cagcugauaa gcuuggacuc aaaccaucaa 60
guccagaucg agca 74
<210> 20
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 20
gggacaugcg uaacuguaua ggggccuccg cagcuauuca gcucggacau aaaccauaca 60
guccagaucg agca 74
<210> 21
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 21
gggacaugcg uaacuauaua ggggccucca cagcuguaaa gcuuggacuu aaaccauaua 60
gaguccagau cgagca 76
<210> 22
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 22
gggacaugcg uaacugcaua ggggccucca cagcuauuca gcuuggacac aaaccaugca 60
guccagaucg agca 74
<210> 23
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 23
gggacaugcg uaacuguaua ggggccucca cagcugaaaa gcuuggacuc aaaccauaca 60
guccagaucg agca 74
<210> 24
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 24
gggacaugcg uaacuugaua ggggccucca cagccgguag gcuuggacuc aaaccaucaa 60
guccagaucg agca 74
<210> 25
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 25
gggacaugcg uaacugcaua ggggccucca cagcuauuca gcuuggacac aaaccaugca 60
guccagaucg agca 74
<210> 26
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 26
ggguauaggg gccuccacag cguaagcuug gacuuaaacc auaccc 46
<210> 27
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 27
uauaggggcc uccacagcgu aagcuuggac uuaaaccaua 40
<210> 28
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 28
cguaggggcc uccacagcgu aagcuuggac uuaaaccacg 40
<210> 29
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 29
cguaggggcc uccacagcau ucgcuuggac acaaaccacg 40
<210> 30
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 30
ggguauuggg gccuccacaa uagauaaaug gacuaaacca acucga 46
<210> 31
<211> 47
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 31
ggguauuggg gccuccacag uugaagcuug gacuaaacca aucucga 47
<210> 32
<211> 47
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 32
ggguauuggg gccuccacag aaaaaucuug gacuaaacca aucucga 47
<210> 33
<211> 47
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 33
ggguauuggg gccuccacag ccgaggcuug gacuaaacca aucucga 47
<210> 34
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 34
ggguauuggg gccuccacag aaaaaacuug gacuaaacca acucga 46
<210> 35
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 35
ggguauuggg gccuccacag uaagcacuug gacuaaacca gcucga 46
<210> 36
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 36
ggguauuggg gccuccacag uuuaaacuug gacuaaacca acucga 46
<210> 37
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 37
ggguauuggg gccuccacag uaaauucuug gacuaaacca acucga 46
<210> 38
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 38
ggguauuggg gccuccacgc uagaaggcug gacuaaacca acucga 46
<210> 39
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 39
ggguauuggg gccuccacgu aacuaaacug gacuaaacca acucga 46
<210> 40
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 40
ggguauuggg gccuccacgc aauggugcug gacuaaacca acucga 46
<210> 41
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 41
ggguauuggg gccuccacau ggauacauug gacuaaacca acucga 46
<210> 42
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 42
ggguauuggg gccuccacag auaauucuug gacuaaacca acucga 46
<210> 43
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 43
ggguauuggg gccuccacag aaaauucuug gacuaaacca acucga 46
<210> 44
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 44
ggguauuggg gccuccacag aacuuucuug gacuaaacca acucga 46
<210> 45
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对ADAMTS5的适配体
<400> 45
ggguauuggg gccuccacag aaaagucuug gacuaaacca acucga 46
<210> 46
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA模板
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(60)
<223> n为 a, c, g, 或t
<400> 46
gtacgctagg cgttagtctc nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
atcgtacgac ggtcgtaccc 80
<210> 47
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 47
taatacgact cactataggg tacgaccgtc gtacgat 37
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 48
gtacgctagg cgttagtctc 20
<210> 49
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA模板
<400> 49
tgctcgatct ggactggatt ggtttagtcc aagctgagca gctgtggagg ccccaatcca 60
gttacgcatg tccc 74
<210> 50
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 50
taatacgact cactataggg acatgcgtaa ct 32
<210> 51
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 51
tgctcgatct ggact 15
<210> 52
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA模板
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(47)
<223> n为 a, c, g, 或t
<400> 52
atatcttttg cttattctcg agaattggtt tagtccannn nnnnnnngtg gaggccccaa 60
taccctatag tgagtcgtat ta 82
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 53
taatacgact cactataggg t 21
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 54
atatcttttg cttattctcg ag 22
Claims (17)
1.适配体,其是与具有血小板反应蛋白基序5的解联蛋白和金属蛋白酶(Adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5,ADAMTS5)结合的适配体,且包含以下的式(1)或式(2)所表示的序列,其中,尿嘧啶可以是胸腺嘧啶,
(1) GGGGCCUCC-N1-GGACYAAACC
(2) GGGGCCUCC-N1-GGACWYAAACC
式中,N1为3~24个长度的碱基,Y表示C或U,W表示A或U。
3.权利要求1或2所述的适配体,该适配体抑制ADAMTS5的活性。
4.权利要求1~3中任一项所述的适配体,其中,碱基长度为80以下。
5.权利要求1~4中任一项所述的适配体,其中,W为U。
6.权利要求1~4中任一项所述的适配体,其中,Y为U。
7.权利要求1~6中任一项所述的适配体,其中,N1由式(3)表示:
(3) X1CAGCN2GCUX2
式中,N2为3~15个的任意数目的核苷酸,X1和X2为A/U碱基的组合或G/C碱基的组合。
8.权利要求7所述的适配体,其中,N2的核苷酸数为4。
9.权利要求1所述的适配体,该适配体包含以下的(a)、(b)或(c)中的任一条核苷酸序列:
(a) 选自SEQ ID NO: 1、3~6、10~14、16~45的任一条的核苷酸序列,其中,尿嘧啶可以是胸腺嘧啶;
(b) 在选自SEQ ID NO: 1、3~6、10~14、16~45的任一条的核苷酸序列中有1个~多个核苷酸被取代、缺失、插入或添加而得到的核苷酸序列,其中,尿嘧啶可以是胸腺嘧啶;或者
(c) 与选自SEQ ID NO: 1、3~6、10~14、16~45的任一条的核苷酸序列具有70%以上的同源性的核苷酸序列,其中,尿嘧啶可以是胸腺嘧啶。
10.权利要求9所述的适配体,其中,适配体中所含的至少一个核苷酸被修饰或改变。
11.权利要求1~10中任一项所述的适配体,其中,适配体中所含的各嘧啶核苷酸的核糖2’位的羟基相同或不同、且未取代或被选自氢原子、氟原子和甲氧基的原子或基团取代。
12.权利要求1~11中任一项所述的适配体,其中,适配体中所含的各嘌呤核苷酸的核糖2’位的羟基相同或不同、且未取代或被选自氢原子、氟原子和甲氧基的原子或基团取代。
13.复合物,该复合物包含权利要求1~12中任一项所述的适配体和功能性物质。
14.药物,该药物包含权利要求1~12中任一项所述的适配体或权利要求13所述的复合物。
15.权利要求14所述的药物,该药物为因聚集蛋白聚糖过度地降解而产生的疾病的治疗药。
16.权利要求15所述的药物,其中,因聚集蛋白聚糖过度地降解而产生的疾病为关节炎或变形性膝关节炎。
17.ADAMTS5的检测方法,其特征在于:使用权利要求1~12中任一项所述的适配体或权利要求13所述的复合物。
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