KR20200079534A - Adamts5에 대한 앱타머, 및 adamts5에 대한 앱타머의 용도 - Google Patents

Adamts5에 대한 앱타머, 및 adamts5에 대한 앱타머의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ADAMTS5 (A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs-5)에 결합하는 앱타머를 제공한다. 앱타머는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 서열을 포함한다 (단 우라실은 티민일 수 있다):
화학식 1
GGGGCCUCC-N1-GGACYAAACC
화학식 2
GGGGCCUCC-N1-GGACWYAAACC
(화학식에서, N1은 3 내지 24개 길이의 염기를 나타내고, Y는 C 또는 U를 나타내며, W는 A 또는 U르 나타낸다).

Description

ADAMTS5에 대한 앱타머, 및 ADAMTS5에 대한 앱타머의 용도
본 발명은 ADAMTS5에 대한 앱타머, 이를 사용하는 방법 등에 관한 것이다.
ADAMTS5 (A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5)는 ADAMTS 패밀리 단백질 중 하나이며, 연골 세포 및 활막 세포에서 발현되며, 아그레칸 분해 효소로서 기능하고, 연골 병변에서 주요 원인 단백질인 것으로 알려져 있다. 따라서, ADAMTS5 억제제는 무릎 골관절염 (knee osteoarthritis)을 포함한 연골 병변의 치료제로서 유용할 수 있다 (비특허 문헌 1-4).
최근에, 치료제, 진단제 및 시약에의 RNA 앱타머의 적용이 주목을 받고 있으며, 일부 RNA 앱타머는 임상 시험 또는 실용화 단계에 있다. 2004년 12월에, 세계 최초의 RNA 앱타머 약물인 Macugen이 미국에서 연령-관련 황반 변성의 치료 약물로서 승인되었다. RNA 앱타머는 단백질 등과 같은 표적 물질에 특이적으로 결합하는 RNA이며, SELEX 방법 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)을 사용하여 생성될 수 있다 (특허 문헌 1-3 참조). SELEX 방법은 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 약 1014개 RNA의 풀로부터 표적 물질에 특이적으로 결합하는 RNA를 선택하는 방법이다. 사용되는 RNA는 약 40개 잔기의 랜덤 서열이 프라이머 서열 사이에 샌드위치된 구조를 갖는다. 이러한 RNA 풀은 표적 물질과 관련되며, 표적 물질에 결합된 RNA 만이 필터 등을 사용하여 수집된다. 회수된 RNA는 RT-PCR에 의해 증폭되어 다음 라운드의 주형으로서 사용된다. 이 작업을 약 10회 반복함으로써, 표적 물질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머가 때때로 수득된다.
[문헌 목록]
[특허 문헌]
특허 문헌 1: WO 91/19813
특허 문헌 2: WO 94/08050
특허 문헌 3: WO 95/07364
[비특허 문헌]
비특허 문헌 1: J Biol Chem. 2002 Jun 21; 277(25):22201-8
비특허 문헌 2: Nature. 2005 Mar 31; 434(7033):648-52
비특허 문헌 3: Nat Clin Pract Rheumatol. 2008 Aug; 4(8):420-7
비특허 문헌 4: Osteoarthritis Cartilage. 2015 Aug; 23(8):1254-66
본 발명은 ADAMTS5에 대한 앱타머 및 이를 사용하는 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기한 문제를 해결하려는 시도로 집중적인 연구를 수행하여 ADAMTS5에 대한 우수한 품질의 앱타머를 제조하는데 성공하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 다음과 같다.
[1] 하기 화학식 1 또는 2로 나타내어지는 서열을 포함하는 앱타머(aptamer):
[화학식 1]
GGGGCCUCC-N1-GGACYAAACC
[화학식 2]
GGGGCCUCC-N1-GGACWYAAACC
여기서, N1은 3 내지 24개 길이의 염기를 나타내고, Y는 C 또는 U이며, W는 A 또는 U이고 (우라실은 임의로 티민이다), 여기서 앱타머는 ADAMTS5 (A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs-5)에 결합한다.
[2] 앱타머가 하기 화학식 1' 또는 화학식 2'로 나타내어지는 잠재적 2차 구조를 갖는, [1]의 앱타머:
[화학식 1'] [화학식 2']
Figure pct00001
또는
Figure pct00002
여기서, 화학식 1' 및 화학식 2'에서
Figure pct00003
의 부분은 벌지 구조 (bulge structure)를 임의로 갖는 스템-루프 구조 (stem-loop structure)를 나타내고 N1 부분이며, Y는 C 또는 U이고, W는 A 또는 U이다.
[3] 앱타머가 ADAMTS5의 활성을 억제하는, [1] 또는 [2]의 앱타머.
[4] 앱타머가 80개 이하의 염기 길이를 갖는, [1] 내지 [3] 중의 어느 하나의 앱타머.
[5] W가 U인, [1] 내지 [4] 중의 어느 하나의 앱타머.
[6] Y가 U인, [1] 내지 [4] 중의 어느 하나의 앱타머.
[7] N1이 화학식 3인, [1] 내지 [6] 중의 어느 하나의 앱타머:
[화학식 3]
X1CAGCN2GCUX2
여기서, N2는 3 내지 15개의 임의의 수의 뉴클레오티드를 나타내고, X1 및 X2는 A/U 염기 또는 G/C 염기의 조합을 나타낸다.
[8] N2에 대한 뉴클레오티드의 수가 4인, [7]의 앱타머.
[9] 하기 (a), (b) 및 (c)의 뉴클레오티드 서열 중의 어느 것을 포함하는, [1]의 앱타머:
(a) 서열 번호 1, 3 - 6, 10 - 14, 16 - 45 중의 어느 것으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 (우라실은 임의로 티민이다);
(b) 1개 내지 수 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 서열 번호 1, 3 - 6, 10 - 14, 16 - 45 중의 어느 것으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 (우라실은 임의로 티민이다); 및
(c) 서열 번호 1, 3 - 6, 10 - 14, 16 - 45 중의 어느 것으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 (우라실은 임의로 티민이다)과 70% 이상의 동일성(identity)을 갖는 뉴클레오티드 서열.
[10] 앱타머에 함유된 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형 또는 변경되는, [9]의 앱타머.
[11] 앱타머에 함유된 각각의 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스 2'-위치의 하이드록실 그룹이 동일하거나 상이하고 치환되지 않거나 수소 원자, 불소 원자 및 메톡시 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 원자 또는 그룹에 의해 치환되는, [1] 내지 [10] 중의 어느 하나의 앱타머.
[12] 앱타머에 함유된 각각의 퓨린 뉴클레오티드의 리보스 2'-위치의 하이드록실 그룹이 동일하거나 상이하고 치환되지 않거나 수소 원자, 불소 원자 및 메톡시 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 원자 또는 그룹에 의해 치환되는, [1] 내지 [11] 중의 어느 하나의 앱타머.
[13] [1] 내지 [12] 중의 어느 하나의 앱타머 및 기능성 물질을 포함하는 복합체.
[14] [1] 내지 [12] 중의 어느 하나의 앱타머 또는 [13]의 복합체를 포함하는 약제.
[15] 약제가 아그레칸(Aggrecan)의 과도한 분해에 의해 유발된 질환에 대한 치료제인, [14]의 약제.
[16] 아그레칸의 과도한 분해에 의해 유발된 질환이 관절염 (arthritis) 또는 무릎 골관절염 (knee osteoarthritis)인, [15]의 약제.
[17] [1] 내지 [12] 중의 어느 하나의 앱타머 또는 [13]의 복합체를 사용함을 포함하여, ADAMTS5를 검출하는 방법.
[18] [1] 내지 [12] 중의 어느 하나의 앱타머 또는 [13]의 복합체, 또는 [14]의 약제를 표적에 투여함을 포함하여, 아그레칸의 과도한 분해에 의해 유발된 질환을 치료하는 방법.
[19] 아그레칸의 과도한 분해에 의해 유발된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, [1] 내지 [12] 중의 어느 하나의 앱타머, [13]의 복합체, 또는 [14]의 약제.
[20] 아그레칸의 과도한 분해에 의해 유발된 질환을 치료하기 위한 약제를 제조하는데 있어서의 [1] 내지 [12] 중의 어느 하나의 앱타머 또는 [13]의 복합체의 용도.
본 발명의 앱타머 또는 복합체는 관절염 (arthritis) 또는 무릎 골관절염 (knee osteoarthritis)에 대한 치료 약물로서 유용할 수 있다. 본 발명의 앱타머 또는 복합체는 또한 ADAMTS5의 정제와 농축, ADAMTS5의 표지, 및 ADAMTS5의 검출과 정량에 유용할 수 있다.
도 1은 MFOLD 프로그램으로부터 예상되는 바와 같은, 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 2차 구조를 보여준다.
도 2는 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머가 ADAMTS5에 결합함을 보여주는 센서그램이다.
도 3은 MFOLD 프로그램으로부터 예상되는 바와 같은, 서열 번호 3 내지 9에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 2차 구조를 보여준다.
도 4는 MFOLD 프로그램으로부터 예상되는 바와 같은, 서열 번호 10 내지 12에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 2차 구조를 보여준다.
도 5a는 MFOLD 프로그램으로부터 예상되는 바와 같은, 서열 번호 16 내지 19에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 2차 구조를 보여준다.
도 5b는 MFOLD 프로그램으로부터 예상되는 바와 같은, 서열 번호 20, 21 및 25에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 2차 구조를 보여준다.
도 6은 MFOLD 프로그램으로부터 예상되는 바와 같은, 서열 번호 27 내지 29에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 2차 구조를 보여준다.
도 7a는 MFOLD 프로그램으로부터 예상되는 바와 같은, 서열 번호 30 내지 35에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 2차 구조를 보여준다.
도 7b는 MFOLD 프로그램으로부터 예상되는 바와 같은, 서열 번호 36 내지 41에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 2차 구조를 보여준다.
도 7c는 MFOLD 프로그램으로부터 예상되는 바와 같은, 서열 번호 42 내지 45에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 2차 구조를 보여준다.
본 발명은 ADAMTS5에 대한 결합 활성을 갖는 앱타머를 제공한다. 본 발명의 앱타머는 ADAMTS5의 활성 (아그레카나제 활성 등)을 억제할 수 있다.
앱타머는 특정 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 지칭한다. 앱타머는 특정 표적 분자에 결합함으로써 특정 표적 분자의 활성을 억제할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한 직쇄상 또는 환상 형태일 수 있다.
본 발명은 ADAMTS5에 대한 결합 활성을 갖는 앱타머를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 ADAMTS5에 결합함으로써 ADAMTS5 활성을 억제할 수 있다.
ADAMTS5는 연골 세포, 활막 세포 등에 의해 발현되는 단백질이며, 예를 들면, UniprotKB에서 Q9UNA0으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. 본 발명에 있어서 ADAMTS5는 동물의 체내 뿐만 아니라 마우스 등의 포유동물 세포, 곤충 세포, 및 대장균과 같은 배양 세포를 사용하여 제조될 수 있고, 추가로 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 배양된 세포 또는 화학적 합성을 사용하여 제조되는 경우, 변이체가 자체 공지된 방법으로 쉽게 생성될 수 있다. 여기서 ADAMTS5의 "변이체"는 공지된 ADAMTS5의 아미노산 서열의 1개 내지 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가된 등의 단백질 또는 펩타이드, 또는 공지된 ADAMTS5의 아미노산 서열의 일부로 구성되고 ADAMTS5가 본질적으로 가지고 있는 활성 중 적어도 하나를 갖는 단백질 또는 펩타이드를 의미한다. 아미노산이 치환 또는 부가되는 경우, 아미노산은 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 본 발명에서 ADAMTS5는 이러한 변이체를 포함한다.
ADAMTS5는 프로도메인에서 절단되어 활성 형태로 분비된다. 그후, 이것은 C-말단 Cys-풍부 도메인의 중간에서 자기-소화에 의해 절단되며, 또한 절단 형태 (truncate form)로 존재한다. 본 발명의 앱타머는 임의의 ADAMTS5에 결합하고 임의의 ADAMTS5의 활성을 억제할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 나타내어지는 서열을 함유하는 ADAMTS5-결합 앱타머를 제공한다:
[화학식 1]
GGGGCCUCC-N1-GGACYAAACC
[화학식 2]
GGGGCCUCC-N1-GGACWYAAACC
여기서, N1은 3 내지 24개 중의 임의의 수의 뉴클레오티드이고, Y는 C 또는 U이고, W는 A 또는 U이다 (우라실은 임의로 티민이다).
ADAMTS5에 대한 억제 활성은 ADAMTS5가 갖는 임의의 활성에 대한 억제 능력을 의미한다. 예를 들면, ADAMTS5는 아그레칸을 분해하는 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, ADAMTS5에 대한 억제 활성은 ADAMTS5에 의한 아그레칸의 분해를 억제하는 활성일 수 있다.
따라서, 본 발명의 앱타머가 ADAMTS5에 결합하고 ADAMTS5의 아그레칸 분해 활성을 억제하는 경우, 앱타머는 아그레칸의 과도한 분해에 의해 유발되는 질환의 치료에 유용한 것으로 간주된다.
본 발명의 앱타머는 임의의 포유동물로부터 유래된 ADAMTS5에 대한 억제 활성을 나타낼 수 있다. 이러한 포유동물은 영장류 (예를 들어, 인간, 원숭이), 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트, 기니피그) 및 반려 동물, 가축 및 사역 동물 (예를 들어, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양, 돼지)를 포함한다.
본 발명의 앱타머는 ADAMTS5에 결합하지만 유사한 아그레칸 분해능을 갖는 ADAMTS4에는 결합하지 않는 ADAMTS5에 특이성을 갖는 앱타머일 수 있다.
ADAMTS5는 ADAMTS4보다 약 1000배 높은 아그레칸 분해 활성을 보이는 것으로 보고되었으며 (J. Biol. Chem. 2007, 282 : 18294-18306), 또한 ADAMTS5는 관절염의 발병에 중요하다고 보고되었다 (비특허 문헌 2). 본 발명의 앱타머는 ADAMTS5에 의한 아그레칸의 과도한 분해에 의해 유발되는 질환의 치료에 유용하다.
상기한 화학식 1 및 화학식 2에서, N1은 임의의 수의 뉴클레오티드를 나타낸다. 본 명세서에서, "염기"는 핵산을 구성하는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C), 우라실 (U) 및 티민 (T) 중 어느 하나를 의미한다.
N1에 대한 뉴클레오티드의 수는 화학식 1 및 화학식 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 앱타머가 ADAMTS5에 결합하는 한 특별히 제한되지 않는다. 이것은 바람직하게는 3 - 24개, 5 - 18개, 6 - 15개, 8 - 15개, 11 - 15개, 13 - 15개 등이다. 보다 바람직하게는, 이것은 6 - 15개, 8 - 15개, 11 - 15개, 13 - 15개, 및 가장 바람직하게는 13 - 15개이다.
N1에 대한 뉴클레오티드 수가 3개 미만인 경우, 후술하는 바와 같이 N1 부분에 루프 구조가 형성될 수 없다. N1에 대한 뉴클레오티드의 수가 24개를 초과하는 경우, N1 부분의 서열 및 구조가 전체 앱타머의 기능에 영향을 미칠 수 있고 ADAMTS5에 대한 결합 활성이 일부 경우에 상실될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기한 화학식 1 및 화학식 2에서, N1은 ADAMTS5에 결합함으로써 스템-루프 구조를 형성하는데 필요한 염기의 수 및 뉴클레오티드 서열을 갖는다. N1에 대한 뉴클레오티드 서열에 의해 형성된 스템-루프 구조의 스템 부분은 벌지 구조를 가질 수 있다.
상기한 화학식 1 및 화학식 2에서, GGGGCCUCC 부분의 UCC 및 GGACYAAACC 또는 GGACWYAAACC 부분의 GGA가 염기 쌍을 형성하며 스템 구조를 취한다. 하기 언급된 바와 같이, 본 발명의 앱타머가 ADAMTS5에 결합할 때, 상기한 화학식 1 및 화학식 2의 N1 및 N1에 인접한 UCC 및 GGA가 스템-루프 구조를 형성하는 것이 중요하다.
따라서, N1에 대한 뉴클레오티드 서열에 의해 형성된 스템-루프 구조는, 수득된 앱타머가 ADAMTS5에 결합하는 한, 루프 구조 단독일 수 있다. 즉, 루프 부분의 염기의 최소 수는 3이고, 스템 부분의 염기의 최소 수는 0이다 (화학식 1 및 화학식 2에서, GGGGCCUCC 부분의 UCC 및 GGACYAAACC 또는 GGACWYAAACC 부분의 GGA는 스템 구조를 형성하고 N1은 루프 부분만을 형성한다).
루프 부분의 길이는 본 발명의 앱타머가 ADAMTS5에 결합하는 한 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 3 - 15개, 3 - 11개, 4 - 11개 등일 수 있다. 이것은 바람직하게는 3 - 11개, 보다 바람직하게는 3 - 8개, 더욱 바람직하게는 3 - 5개, 가장 바람직하게는 3 또는 4개이다.
루프 부분의 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 앱타머가 ADAMTS5에 결합하는 한 가변적이다.
대안적으로, 본 발명의 앱타머는 하기 (a), (b) 또는 (c)를 함유하는 ADAMTS5-결합 앱타머일 수 있다:
(a) 서열 번호 1, 3, 4 - 6, 10 - 44 중의 어느 것으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열;
(b) GGGGCCUCC-N1-GGACYAAACC 또는 GGGGCCUCC-N1-GGACWYAAACC (여기서, N1은 3 내지 24개 중의 임의의 수의 뉴클레오티드이고, Y는 C 또는 U이고, W는 A 또는 U이다)에서 GGGGCCUCC 및 GGACYAAACC 또는 GGACWYAAACC로 표시되는 서열 이외의 1개 또는 수 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된, 서열 번호 1, 3, 4 - 6, 10 - 44 중의 어느 것으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열; 또는
(c) 서열 번호 1, 3, 4 - 6, 10 - 44로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 70% 이상 (바람직하게는, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 (여기서, GGGGCCUCC-N1-GGACYAAACC 또는 GGGGCCUCC-N1-GGACWYAAACC (여기서, N1, Y 및 W는 상기한 바와 동일한다)에서 GGGGCCUCC 및 GGACYAAACC 또는 GGACWYAAACC로 표시되는 서열은 동일하다).
보다 바람직한 실시양태에서, N1은 화학식 3으로 나타내어진다:
[화학식 3]
X1CAGCN2GCUX2
여기서, N2는 3 내지 15개 중의 임의의 수의 뉴클레오티드이고, X1 및 X2는 A/U 염기 또는 G/C 염기의 조합이다.
화학식 3에서, X1CAGC 및 GCUX2는 스템 구조 (벌지 구조 포함)를 형성하고 N2 부분은 루프 구조를 형성한다.
N2에 대한 뉴클레오티드의 수는 전형적으로 3 - 15개, 바람직하게는 3 - 11개, 보다 바람직하게는 3 - 8개, 더욱 바람직하게는 3 - 5개, 가장 바람직하게는 4개이다.
N2에 대한 루프 구조의 서열은 화학식 3이 전체로서 스템-루프 구조를 형성하는 한 특별히 제한되지 않으며, 염기의 임의의 조합일 수 있다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, 화학식 3에서 N2는 GCUC, UUCG, GUAA, 및 AUUC 중의 어느 것이다.
X1 및 X2는 A/U 염기 또는 G/C 염기의 조합이다. 이것은 바람직하게는 X1에 대한 A와 X2에 대한 U의 조합 또는 X1에 대한 G와 X2에 대한 C의 조합, 보다 바람직하게는, X1에 대한 A와 X2에 대한 U의 조합이다.
상기 (1) 또는 (2)로 나타내어지는 서열은 하기 화학식 1' 또는 2'로 나타내어지는 잠재적 2차 구조를 형성할 수 있다:
화학식 1' 화학식 2'
Figure pct00004
또는
Figure pct00005
본 발명의 앱타머는 상기 (1) 또는 (2)로 나타내어지는 서열의 부분에 상기 구조를 갖기 때문에 다양한 활성을 나타내는 것으로 간주된다. 화학식 1 '또는 2'의 구조는 각각 상기한 화학식 1 또는 2에 상응한다.
또한, 스템 구조 (벌지 구조 포함)는 바람직하게는 상기한 구조에서 5'-말단 및 3'-말단을 뒤따르는 서열 사이의 상호작용에 의해 형성될 수 있다.
본 발명의 앱타머가 다양한 활성을 나타내기 위해, 상기 잠재적 2차 구조로 나타낸 스템-루프 구조가 유지되는 것이 바람직하다. 스템 구조는 상보적 염기 쌍에 의해 형성될 수 있지만, 염기 쌍의 수는 특별히 제한되지 않는다. 스템 구조에서, 염기 쌍이 이의 일부에 형성되지 않더라도, 스템 구조가 전체로서 구성되는 한 앱타머의 활성은 유지된다.
화학식 1' 또는 2'의 상부에서 스템-루프 부분 SL1은 화학식 1 및 화학식 2에서 N1 부분에 상응한다.
N1이 상기 화학식 3으로 나타내어지는 서열을 취할 때, 화학식 1' 또는 2'로 나타내어지는 스템-루프 구조가 보다 안정적으로 유지되는 것으로 간주된다. 즉, 화학식 3에서 ACAGC 및 GCUU에 의해 형성된 스템 구조 (벌지 구조 포함)는 화학식 1' 또는 2'에서 SL1 부분의 스템 구조를 형성하고, 화학식 3에서 N2는 SL1 부분의 루프 구조를 형성한다.
화학식 1 및 화학식 2에서, GGGGCCUCC 부분의 UCC 및 GGACYAAACC 또는 GGACWYAAACC 부분의 GGA는 염기 쌍을 형성하며 스템 구조를 취한다. 게다가, GGGGCCUCC 부분의 처음 GG 및 GGACYAAACC 또는 GGACWYAAACC 부분의 마지막 CC는 스템 구조를 형성하고, 나머지 서열은 내부 루프를 형성한다.
상기 화학식 1과 화학식 2 사이의 유일한 차이는 W의 존재 또는 부재이다. 화학식 1' 또는 2'로부터 명백한 바와 같이, 내부 루프는 염기 W 주위에 구성된다. 실시예에 충분히 나타낸 바와 같이, W의 존재 또는 부재는 구조 또는 활성에 현저한 차이를 야기하지 않는다. 따라서, 화학식 1 및 화학식 2로 나타내어지는 서열을 갖는 본 발명의 모든 앱타머는 동일한 기술적 사상에 기초하여 발명되었다.
본 발명의 앱타머의 길이는 특별히 제한되지 않으며, 전형적으로 약 25 내지 약 200개의 뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들면, 이것은 약 25개 이상의 뉴클레오티드 (예를 들어, 30개 이상의 뉴클레오티드, 31개 이상의 뉴클레오티드, 32개 이상의 뉴클레오티드, 33개 이상의 뉴클레오티드), 바람직하게는 25개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 30개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 33개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 예를 들면, 이것은 약 100개 이하의 뉴클레오티드, 전형적으로 약 80개 이하의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 70개 이하의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 60개 이하의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 50개 이하의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 45개 이하의 뉴클레오티드 (예를 들어, 44개 이하의 뉴클레오티드, 43개 이하의 뉴클레오티드, 42개 이하의 뉴클레오티드, 41개 이하의 뉴클레오티드, 40개 이하의 뉴클레오티드)일 수 있다. 뉴클레오티드의 총 수가 보다 적은 경우, 화학적 합성 및 대량 생산이 쉬워질 것이며, 비용면에서 큰 이점이 있다. 또한, 화학적 변형이 용이하고 신체내 안정성이 높으며 독성이 낮은 것으로 간주된다.
따라서 본 발명의 앱타머의 길이는 전형적으로 약 25 - 약 200개 뉴클레오티드, 바람직하게는 25 - 80개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 25 - 60개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 25 - 50개 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 30 - 45개 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 앱타머는 상기 화학식 1로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 다수의 앱타머 (앱타머 (A))의 접합체, 1개 내지 수 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 상기 화학식 1로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 다수의 앱타머 (앱타머 (B))의 접합체, 및 1개 또는 다수의 앱타머 (A) 및 1개 또는 다수의 앱타머 (B)의 접합체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 접합체일 수 있다. 이들 접합체도 ADAMTS5에 결합할 수 있다.
여기서 접합은 탠덤 결합에 의해 달성될 수 있다. 접합에서, 링커가 이용될 수 있다. 링커로서, 뉴클레오티드 쇄 (예를 들어, 1 내지 약 20개의 뉴클레오티드) 및 비-뉴클레오티드 쇄 (예를 들어, -(CH2)n- 링커, -(CH2CH2O)n- 링커, 헥사에틸렌 글리콜 링커, TEG 링커, 펩티드-함유 링커, -SS- 결합-함유 링커, -CONH- 결합-함유 링커, -OPO3- 결합-함유 링커)가 언급될 수 있다. 상기 다수의 접합체에서 언급된 바와 같은 다수는 이것이 둘 이상인 한 특별히 제한되지 않으며, 다수는 예를 들면 2, 3 또는 4개일 수 있다.
본 발명의 앱타머에 함유된 각각의 뉴클레오티드는 동일하거나 상이할 수 있으며, 리보스 (예를 들어, 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스, 퓨린 뉴클레오티드의 리보스)의 2'-위치에 하이드록시 그룹을 함유하는 뉴클레오티드 (즉, 천연 리보뉴클레오티드) 또는 하이드록시 그룹이 리보스의 2'-위치에서 임의의 원자 또는 그룹으로 치환된 (변형된) 뉴클레오티드 (때로는 본 발명에서 "변형된 뉴클레오티드"로 나타냄)일 수 있다.
예를 들면, 수소 원자, 불소 원자 또는 -O-알킬 그룹 (예를 들어, -O-Me 그룹), -O-아실 그룹 (예를 들어, -O-CHO 그룹), 아미노 그룹 (예를 들어, -NH2 그룹)으로 예시되는 이러한 임의의 원자 또는 그룹으로 치환된 뉴클레오티드가 언급될 수 있다. 본 발명의 앱타머는 적어도 1종 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4종)의 뉴클레오티드가 리보스의 2'-위치에 하이드록실 그룹, 또는 상기한 임의의 원자 또는 그룹, 예를 들면, 불소 원자, 하이드록실 그룹 및 -O-Me 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2종 (예를 들어, 2, 3 또는 4종)의 원자 또는 그룹을 함유하는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 앱타머에서, 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 리보스의 2'-위치가 불소 원자인 뉴클레오티드일 수 있거나, 불소 원자는 동일하거나 상이하고 치환되지 않거나 상기한 임의의 원자 또는 그룹, 바람직하게는, 수소 원자, 하이드록실 그룹 및 메톡시 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 동일한 원자 또는 그룹으로 치환된다. 특히, 후술된 DuraScribeTM T7 전사 키트 (Epicentre에 의해 제조됨)를 사용한 제조방법이 본 발명의 앱타머의 제조방법으로서 적용되는 경우, 모든 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'-위치가 플루오르화된 앱타머가 수득된다. 불소 원자가 상기한 다른 원자 또는 그룹으로 치환된 본 발명의 앱타머는 후술된 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 앱타머에서, 모든 퓨린 뉴클레오티드는 리보스의 2'-위치가 하이드록시 그룹인 뉴클레오티드, 또는 하이드록시 그룹이 동일하거나 상이하고, 치환되지 않거나 상기한 임의의 원자 또는 그룹, 바람직하게는, 수소 원자, 메톡시 그룹 및 불소 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 원자 또는 그룹으로 치환된 뉴클레오티드일 수 있다. 하이드록시 그룹이 상기한 다른 원소 또는 그룹으로 치환된 본 발명의 앱타머는 후술된 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 앱타머에서, 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 리보스의 2'-위치의 불소 원자가 상기한 임의의 원자 또는 그룹, 예를 들면, 수소 원자, 하이드록시 그룹 및 -O-Me 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 동일한 원자 또는 그룹으로 치환된 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 앱타머에서, 모든 퓨린 뉴클레오티드는 리보스의 2'-위치의 하이드록시 그룹이 상기한 임의의 원자 또는 그룹, 예를 들면, 수소 원자, 불소 원자 및 -O-Me 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 동일한 원자 또는 그룹으로 치환된 뉴클레오티드일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 앱타머에 함유된 각각의 피리미딘 뉴클레오티드는 리보스의 2'-위치에 불소 원자를 함유하는 뉴클레오티드이며, 각 퓨린 뉴클레오티드는 리보스의 2'-위치에 하이드록시 그룹을 함유하는 뉴클레오티드이다. 또 다른 실시양태에서, 상기한 각 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'-위치의 불소 원자는 독립적으로 수소 원자, 하이드록시 그룹 및 메톡시 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 원자 또는 그룹으로 임의로 치환되고, 상기한 각 퓨린 뉴클레오티드의 리보스의 2'-위치의 하이드록시 그룹은 각각 독립적으로 수소 원자, 메톡시 그룹 및 불소 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 원자 또는 그룹으로 임의로 치환된다.
당해 설명에서, 뉴클레오티드에서 당 그룹이 어떻게 변형되는지를 기술하는데 있어서, 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드는 RNA인 것으로 가정한다 (즉, 당 그룹은 리보스인 것으로 가정한다). 그러나, 이것은 앱타머-구성 뉴클레오티드로부터 DNA가 제외됨을 의미하지 않으며, 변형은 경우에 따라 DNA의 변형으로서 판독해야 한다. 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드가 DNA인 경우, 예를 들면, 리보스의 2'-위치의 하이드록실 그룹의 X로의 치환은 데옥시리보스의 2'-위치의 수소 원자의 X로의 치환으로 판독해야 한다.
본 발명의 앱타머에서, ADAMTS5에 대한 결합 특성, ADAMTS5에 의한 아그레칸 분해에 대한 억제 활성, 앱타머 안정성, 약물 전달성, 혈중 안정성 등은 우라실을 티민으로 치환함으로써 향상될 수 있다.
본 발명의 앱타머에서, 뉴클레오티드에서 인산 디에스테르 결합의 1개 내지 수 개, 예를 들면, 1 - 2개, 1 - 3개, 1 - 4개, 1 - 5개 뉴클레오티드는 임의의 치환체(들)로 변형 또는 치환될 수 있다. 예를 들면, 인산 디에스테르 결합은 포스포로티오에이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합, 알킬포스포네이트 결합, 포스포르아미데이트 결합 등으로 치환될 수 있다. 여기서, 예를 들면, "뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된다"는 인접한 뉴클레오티드 간의 결합 부위에서의 포스페이트 그룹이 황화되고, 즉 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 그룹으로 전환됨을 의미한다.
본 발명의 앱타머에서, 1개 또는 수 개, 예를 들면, 1 - 2개, 1 - 3개, 1 - 4개, 1 - 5개 뉴클레오티드는 앱타머를 안정화시키고 이의 활성을 개선시키기 위해 가교화 핵산 (Bridged Nucleic Acid; BNA) 또는 잠금 핵산 (Locked Nucleic Acid; LNA)으로 치환될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "가교화 핵산"은 상보적 서열에 대한 결합 친화성이 분자내 가교결합에 의해 핵산의 자유도를 제한함으로써 향상되고 뉴클레아제 내성을 획득하는 구조를 갖는 것을 지칭한다. 이의 예는 2',4'-BNA (잠금 핵산 (LNA)), 2'-O,4'-C-에틸렌-가교화 핵산 (ENA) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 앱타머는 ADAMTS5에 결합하는 앱타머, 더욱 바람직하게는 ADAMTS5의 활성을 억제할 수 있는 앱타머이다. 본 발명의 앱타머가 ADAMTS5에 결합하는지의 여부는, 예를 들면, 실시예 1 등의 표면 플라스몬 공명법을 이용한 시험에 의해 평가될 수 있다. 또한, 본 발명의 앱타머가 ADAMTS5의 활성을 억제할 수 있는지의 여부는, 예를 들면, 실시예 1 등의 어그레칸을 이용한 시험에 의해 평가될 수 있다.
본 발명의 앱타머는 각 뉴클레오티드의 당 잔기 (예를 들어, 리보스)가 ADAMTS5 결합 활성, 안정성, 약물 전달성 등을 증가시키도록 변형된 것일 수 있다. 당 잔기에서의 변형의 예로서, 당 잔기의 2'-위치, 3'-위치 및/또는 4'-위치의 산소 원자의 다른 잔기로의 치환 등이 언급될 수 있다. 변형의 종류로서, 플루오르화, O-알킬화 (예를 들어, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화 (예를 들어, S-메틸화, S-에틸화), S-아릴화 및 아민화 (예를 들어, -NH2)가 언급될 수 있다. 또한, 이의 예는 4'-위치 산소가 황으로 대체된 4'-SRNA, 2'-위치 및 4'-위치가 메틸렌을 통해 가교결합된 LNA (잠금 핵산), 3'-위치 하이드록실 그룹이 아미노 그룹으로 대체된 3'-N-포스포르아미데이트 핵산 등을 포함한다. 본 발명의 앱타머는 때때로 이의 제조방법으로 인해 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'-위치에서 산소 원자의 소정의 변형으로 제조된다. 후술된 DuraScribeTM T7 전사 키트 (Epicentre에 의해 제조됨)를 사용한 제조 방법이 본 발명의 앱타머의 제조 방법으로 적용되는 경우, 바람직하게는 모든 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'-위치가 플루오르화된 앱타머가 제조된다. 따라서, 수득된 앱타머에 당 잔기의 이러한 변경을 적용함으로써, 염기 서열이 동일하더라도 활성이 향상된 앱타머의 다양한 변형을 생성할 수 있다. 상기로부터, 본 발명의 앱타머는 바람직하게는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 당 잔기가 변형된 앱타머일 수 있다. 당 잔기의 이러한 변형은 자체 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Sproat et al.,(1991), Nucl.Acid.Res.19,733-738; Cotton et al.,(1991), Nucl.Acid.Res.19,2629-2635; Hobbs et al.,(1973), Biochemistry 12,5138-5145]을 참조한다). 구체적으로, 리보스의 2'-위치의 하이드록실 그룹이 수소 원자, 하이드록실 그룹 및 메톡시 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 원자 또는 그룹으로 치환된 앱타머는 모든 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'-위치의 하이드록실 그룹이 플루오로 그룹으로 치환된 앱타머를 베이스로 사용함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 앱타머는 또한 ADAMTS5 결합 활성, 안정성, 약물 전달성 등을 증가시키기 위해 변형된 (예를 들어, 화학적 치환) 핵산 염기 (예를 들어, 퓨린 또는 피리미딘)를 가질 수 있다. 이러한 변형의 예로서, 5-위치에서의 피리미딘 변형, 6- 및/또는 8-위치(들)에서의 퓨린 변형, 환외 (extracyclic) 아민으로의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 및 5-브로모 또는 5-요오도-우라실로의 치환이 언급될 수 있다. 또한, 본 발명의 앱타머에 함유된 포스페이트 그룹은 뉴클레아제 및 가수분해에 대한 내성을 부여하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, P(O)O 그룹은 P(O)S (티오에이트), P(S)S (디티오에이트), P(O)NR2 (아미데이트), P(O)R, R(O)OR', CO 또는 CH2 (포름아세탈) 또는 3'-아민 (-NH-CH2-CH2-)으로 치환될 수 있다 [여기서 R 또는 R'의 각 단위는 독립적으로 H 또는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 (예를 들어, 메틸, 에틸)이다].
연결 그룹은, 예를 들면, -O-, -N- 또는 -S-이고, 뉴클레오티드는 이러한 연결 그룹을 통해 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.
변형은 또한 3' 및 5'에서의 캡핑과 같은 변형을 포함할 수 있다.
변형은 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 펩티드, 역 dT, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일, 리토콜릭-올레일, 도코사닐, 라우로일, 스테아로일, 팔미토일, 올레오일, 리놀레오일, 다른 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 염료, 형광 물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 말단에 부가함으로써 추가로 수행될 수 있다. 이러한 변형에 대해서는, 예를 들면, 미국 특허 제5,660,985호 및 제5,756,703호를 참조한다.
특히, 변형이 PEG의 말단 부가에 의해 수행되는 경우, PEG의 분자량은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 1000 내지 100000, 보다 바람직하게는 30000 내지 90000이다. PEG는 선형이거나 2개 이상의 쇄로 분지될 수 있다 (멀티-아암 PEG).
이러한 PEG는 특별히 제한되지 않으며, 당업계의 통상의 숙련가들은 상업적으로 이용 가능하거나 공지된 PEG를 적절히 선택하여 사용할 수 있다 (예를 들어, http://www.peg-drug.com/peg_product/branched.html 참조). 본 발명의 앱타머에 적용되는 PEG의 구체적인 바람직한 예는 40000의 분자량을 갖는 2-분지된 GS 타입 PEG (NOF CORPORATION에 의해 제조된 SUNBRIGHT GL2-400GS2), 40000의 분자량을 갖는 2-분지된 TS 타입 PEG (NOF CORPORATION에 의해 제조된 SUNBRIGHT GL2-400TS), 40000의 분자량을 갖는 4-분지된 TS 타입 PEG (NOF CORPORATION에 의해 제조된 SUNBRIGHT GL4-400TS), 80000의 분자량을 갖는 2-분지된 TS 타입 PEG (NOF CORPORATION에 의해 제조된 SUNBRIGHT GL2-800TS), 80000의 분자량을 갖는 4-분지된 TS 타입 PEG (NOF CORPORATION에 의해 제조된 SUNBRIGHT GL4-800TS) 등을 포함한다. 이러한 경우에, 본 발명의 앱타머에서, PEG는 말단에 직접 부가될 수 있다. PEG 등에 결합할 수 있는 그룹을 갖는 링커가 이의 말단에 부가되고, PEG가 링커를 통해 본 발명의 앱타머에 부가되는 것이 보다 바람직하다.
PEG 및 본 발명의 앱타머를 위한 링커는 특별히 제한되지 않으며, 탄소 쇄 수, 관능 그룹 등은 결합 부위, PEG의 종류 등에 따라 적절히 선택될 수 있다. 이러한 링커의 예는 아미노 그룹을 갖는 링커를 포함한다. 구체적으로, 5'-말단에 부가될 때, ssH 링커 (SAFC) 또는 DMS(O)MT-AMINO-MODIFIER (GLEN RESEARCH)가 언급될 수 있고, 3'-말단에 부가될 때, TFA 아미노 C-6 lcaa CPG (ChemGenes) 등이 언급될 수 있다. 이러한 링커가 선택될 때, 예를 들면, N-하이드록시석신이미드의 활성 그룹이 PEG에 부가되고, 링커 측의 아미노 그룹과 반응하여, 본 발명의 앱타머가 링커를 통해 PEG에 결합될 수 있다.
PEG 및 링커로서, 시판 제품들이 바람직하게는 사용될 수 있다. PEG, 링커 및 본 발명의 앱타머의 결합에 관한 반응 조건 등은 당업계의 통상의 숙련가들에 의해 적절히 결정될 수 있다.
본 발명의 앱타머는 본원에 개시된 바와 같이 및 당업계에 자체 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 앱타머는 포스페이트 그룹의 음전하에 기초한 이온 결합, 리보스에 기초한 소수성 결합 및 수소 결합, 및 핵산 염기에 기초한 수소 결합 및 적층 상호작용과 같은 광범위한 결합 모드로 표적 물질에 결합한다. 특히, 구성 뉴클레오티드의 수와 동일한 수로 존재하는 포스페이트 그룹의 음전하에 기초한 이온 결합은 강하며, 단백질의 양전하의 표면에 존재하는 리신 및 아르기닌에 결합한다. 이러한 이유로, 표적 물질에 대한 직접 결합에 관여하지 않는 핵산 염기가 치환될 수 있다. 특히, 스템 구조의 영역은 이미 염기 쌍을 형성하였고 이중 나선 구조의 내부를 향하기 때문에, 핵산 염기는 표적 물질에 직접 결합할 것 같지 않다. 따라서, 염기 쌍이 다른 염기 쌍으로 치환되더라도, 앱타머의 활성은 종종 감소하지 않는다. 루프 구조와 같은 염기 쌍이 형성되지 않은 구조에서, 핵산 염기가 표적 분자에의 직접 결합에 관여하지 않는 한, 염기 치환이 가능하다. 리보스의 2'-위치의 변형과 관련하여, 리보스의 2'-위치의 관능 그룹은 드물게 표적 분자와 직접 상호작용하지만, 많은 경우에 관련이 없으며, 다른 변형된 분자로 치환될 수 있다. 따라서, 앱타머는, 표적 분자에의 직접 결합에 관여하는 관능 그룹이 치환되거나 결실되지 않는 한, 종종 이의 활성을 보유한다. 또한 전체 입체 구조가 실질적으로 변하지 않는 것이 중요하다.
앱타머는 DNA-SELEX 방법 및 이의 개선된 방법을 이용함으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, Ellington et al., (1990), Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990), Science, 249, 505-510). SELEX 방법에서는, 라운드 수를 증가시키거나 경쟁 물질을 사용함으로써, 표적 물질에 대한 더 강한 결합능을 나타내는 앱타머가 농축되고 선택된다. 따라서, SELEX의 라운드 수를 조정하고/하거나 경쟁 상태를 변화시킴으로써, 상이한 결합력을 갖는 앱타머, 상이한 결합 모드를 갖는 앱타머, 및 결합력 또는 결합 모드는 동일하지만 염기 서열은 상이한 앱타머가 일부 경우에 수득될 수 있다. SELEX 방법은 PCR에 의한 증폭 과정을 포함하며; 이 과정에서 망간 이온 등을 사용하여 돌연변이를 유발함으로써, 보다 높은 다양성으로 SELEX를 수행하는 것이 가능하다.
SELEX에 의해 수득된 앱타머는 표적 물질에 대해 높은 친화성을 나타내는 핵산이지만, 이것이 표적 물질의 활성 부위에 결합하는 것을 의미하지는 않는다. 따라서, SELEX에 의해 수득된 앱타머는 반드시 표적 물질의 기능에 작용하지는 않는다. ADAMTS5는 염기성 단백질이며, 핵산이 비특이적으로 결합하게 할 수 있는 것으로 간주진다. 활성 부위에 결합하지 않는 앱타머는 표적 물질의 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 간주된다.
이렇게 선택된 활성 앱타머를 사용하여, 최적화된 SELEX가 더 높은 활성을 갖는 앱타머를 수득하기 위해 수행될 수 있다. 최적화된 SELEX는 결정된 서열을 갖는 앱타머가 부분적으로 무작위화된 주형 또는 약 10 내지 30%의 랜덤 서열로 도핑된 주형을 제조한 후 다시 SELEX를 수행함을 의미한다.
SELEX에 의해 수득된 앱타머는 약 80개 뉴클레오티드의 길이를 가지며, 이것은 그대로 약제로서 제조하기 어렵다. 따라서, 시행착오를 반복하여 앱타머를 용이한 화학적 합성을 가능하게 하는 길이 (예를 들어, 화학적 합성은 약 60개 이하 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 50개 이하 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 45개 이하 뉴클레오티드에 대해 가능하다)로 짧게 하는 것이 바람직하다.
SELEX에 의해 수득된 앱타머에 대한 프라이머 설계에 따라, 후속 최소화 작업의 용이성이 변한다. 프라이머가 성공적으로 설계되지 않으면, SELEX에 의해 활성을 갖는 앱타머가 선택되더라도 후속 개발은 불가능할 것이다. 이러한 배경에서 볼 때, 전형적인 SELEX 방법에 비해 더 짧은 염기 길이를 갖는 앱타머를 제공할 수 있는 Tailored-SELEX 방법 (Vater et al., Nucleic Acids Res. 31, 2003, el30; Jarosch et al. Nucleic Acids Res. 34, 2006, e86), Tailored-SELEX 방법의 개선된 버전인 Primer-less SELEX 방법 등이 또한 사용될 수 있다.
앱타머는 화학적 합성을 허용하기 때문에 쉽게 변형된다. 앱타머의 경우, MFOLD 프로그램을 사용하여 2차 구조를 예측하거나 X-선 분석 또는 NMR 분석에 의해 입체 구조를 예측함으로써, 어떤 뉴클레오티드가 치환 또는 결실될 수 있는지를 및 어디에 새로운 뉴클레오티드가 삽입되는지를 어느 정도 예측하는 것이 가능하다. 새로운 서열을 갖는 예측된 앱타머는 용이하게 화학적으로 합성될 수 있으며, 기존 분석 시스템을 사용하여 앱타머가 활성을 보유하는지 여부를 결정할 수 있다.
수득된 앱타머와 표적 물질과의 결합에 중요한 영역이 상기한 바와 같은 반복된 시행착오에 의해 확인된 경우, 새로운 서열이 서열의 양 말단에 부가되더라도 다수의 경우에 활성은 변화가 없다. 새로운 서열의 길이는 특별히 제한되지 않는다.
이미 기술된 바와 같이, 변형은 서열과 같이 고도로 설계되거나 변경될 수 있다.
상기 명시된 바와 같이, 앱타머는 광범위한 설계 또는 변경을 허용한다. 본 발명은 또한 특정 서열 (예를 들어, 스템 영역, 내부 루프 영역, 헤어핀 루프 영역 및 단일-가닥 영역으로부터 선택된 부분에 상응하는 서열: 이하, 필요에 따라 고정된 서열로 약칭됨)을 포함하는 앱타머의 광범위한 설계 또는 변경을 가능하게 하는 앱타머의 제조 방법을 제공한다.
예를 들면, 이러한 앱타머의 제조 방법은 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 구성된 단일 종류의 핵산 분자:
Figure pct00006
[여기서, (N)a는 "a" 단위의 N으로 구성된 뉴클레오티드 쇄를 나타내고; (N)b는 "b" 단위의 N으로 구성된 뉴클레오티드 쇄를 나타내며; N의 단위 각각은, 동일하건 상이하건 간에, A, G, C, U 및 T (바람직하게는, A, G, C 및 U)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드이다. "a" 및 "b" 각각은, 동일하건 상이하건 간에, 임의의 수일 수 있으며, 예를 들면, 1 내지 약 100, 바람직하게는 1 내지 약 50, 보다 바람직하게는 1 내지 약 30, 여전히 보다 바람직하게는 1 내지 약 20 또는 1 내지 약 10일 수 있다], 또는 다수 종류의 핵산 분자 (예를 들어, a, b의 수 등이 상이한 핵산 분자의 라이브러리) 및 각각 프라이머용 서열 (i) 및 (ii)에 상응하는 프라이머 쌍을 사용함으로써 고정된 서열을 포함하는 앱타머의 제조를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 앱타머 및 이에 결합된 기능성 물질을 포함하는 복합체를 제공한다. 본 발명의 복합체에서 앱타머와 기능성 물질 간의 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 본 발명의 복합체는 본 발명의 앱타머 및 동일한 종류 또는 상이한 종류의 하나 이상 (예를 들어, 2 또는 3개)의 기능성 물질이 함께 결합된 것일 수 있다. 기능성 물질은, 본 발명의 앱타머에 특정 기능을 새롭게 부여하거나, 본 발명의 앱타머가 가질 수 있는 특정 특성을 변화 (예를 들어, 개선)시킬 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 기능성 물질의 예로서, 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 당, 단당류, 폴리뉴클레오티드, 및 뉴클레오티드가 언급될 수 있다. 기능성 물질의 예로서, 친화성 물질 (예를 들어, 비오틴, 스트렙트아비딘, 표적 상보적 서열에 대한 친화성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 항체, 글루타티온 세파로스, 히스티딘), 표지용 물질 (예를 들어, 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위원소), 효소 (예를 들어, 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제), 약물 전달 비히클 (예를 들어, 리포솜, 미소구체, 펩티드, 폴리에틸렌글리콜), 약물 (예를 들어, 칼리케아마이신 및 듀오카마이신과 같은 미사일 요법에 사용되는 것; 사이클로포스파미드, 멜팔란, 이포스파미드 또는 트로포스파미드와 같은 질소 머스타드 유사체; 티오테파와 같은 에틸렌이민; 카르무스틴과 같은 니트로소우레아; 테모졸로미드 또는 다카바진과 같은 알킬화제; 메토트렉세이트 또는 랄티트렉시드와 같은 엽산-유사 대사 길항제; 티오구아닌, 클라드리빈 또는 플루다라빈과 같은 퓨린 유사체; 플루오로우라실, 테가푸르 또는 젬시타빈과 같은 피리미딘 유사체; 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈과 같은 빈카 알칼로이드 및 이의 유사체; 에토포시드, 탁산, 도세탁셀 또는 파클리탁셀과 같은 포도필로톡신 유도체; 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신 및 미토크산트론과 같은 안트라사이클린 및 이의 유사체; 블레오마이신 및 미토마이신과 같은 다른 세포독성 항생제; 시스플라틴, 카보플라틴 및 옥살리플라틴과 같은 백금 화합물; 펜토스타틴, 밀테포신, 에스트라무스틴, 토포테칸, 이리노테칸 및 비칼루타미드), 및 독소 (예를 들어, 리신 독소, 리아톡신 및 베로 독소)가 언급될 수 있다. 이들 기능성 분자는 일부 경우에 최종적으로 제거된다. 또한, 분자는 트롬빈, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP) 및 인자 X와 같은 효소에 의해 인식되고 절단될 수 있는 펩티드일 수 있으며, 뉴클레아제 또는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 앱타머 및 복합체는, 예를 들면, 약제, 진단 시약, 시험 시약 또는 시약으로서 사용될 수 있다. 특히, 이들은 관절염 및 무릎 골관절염과 같은 연골 질환의 치료 또는 예방용 약제, 또는 진단제, 시험 시약 또는 시약으로서 유용하다.
상기 언급된 약제의 대상 질환은 아그레칸의 과도한 분해에 의해 야기되는 것으로 여겨지는 질환을 포함하며, 예를 들면, 통증 (pain), 만성 통증 (chronic pain), 신경병성 통증 (neuropathic pain), 수술후 통증 (postoperative pain), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 골관절염 (osteoarthritis)(예를 들어, 무릎 골관절염 등), 스포츠 외상 (sports trauma), 관절염 (arthritis) (예를 들어, 미란 관절염 (erosive arthritis) 등), 강직성 척추염 (askylosing spondylitis), 신경통 (neuralgia), 신경병증 (neuropathy), 통각 (pain sensation), 신경 손상 (nerve damage), 허혈 (ischemia), 신경변성 (neurodegeneration), 연골 변성 (cartilage degeneration), 뇌졸중 (cerebral apoplexy), 요실금 (incontinence), 염증성 질환 (inflammatory diseases), 과민성 장 증후군 (irritable bowel syndrome), 치주 질환 (periodontal disease), 비정상적인 혈관신생 (abnormal angiogenesis), 종양 침윤 (tumor infiltration) 및 전이 (metastasis), 각막 궤양 (corneal ulcer) 및 당뇨병의 합병증 (complications of diabetes)과 같은 다수의 질환, 질환 상태 등이 언급될 수 있다.
본 발명의 약제는 약제학적으로 허용되는 담체로 제형화된 것일 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예로서, 수크로스, 전분, 마니트, 소르비트, 락토오스, 글루코스, 셀룰로스, 활석, 인산칼슘 및 탄산칼슘과 같은 부형제; 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 폴리프로필피롤리돈, 젤라틴, 아라비아 검, 폴리에틸렌 글리콜, 수크로스 및 전분과 같은 결합제; 전분, 카복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필전분, 나트륨-글리콜-전분, 탄산수소나트륨, 인산칼슘 및 시트르산칼슘과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트, 에어로실, 활석 및 나트륨 라우릴 설페이트와 같은 윤활제; 시트르산, 멘톨, 글리시리진-암모늄염, 글리신 및 오렌지 파우더와 같은 향미제; 벤조산나트륨, 아황산수소나트륨, 메틸파라벤 및 프로필파라벤과 같은 방부제; 시트르산, 시트르산나트륨 및 아세트산과 같은 안정화제; 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 및 알루미늄 스테아레이트와 같은 현탁제; 계면활성제와 같은 분산제; 물, 생리 식염수 및 오렌지 주스와 같은 희석제; 카카오 버터, 폴리에틸렌 글리콜 및 등유와 같은 기재 왁스; 등이 언급될 수 있지만, 이들이 제한적인 것은 아니다.
경구 투여에 적합한 제제는 유효량의 리간드를 물, 생리 식염수 또는 오렌지 주스와 같은 희석제에 용해시켜 제조된 용액; 유효량의 리간드를 고체 또는 과립 형태로 포함하는 캡슐, 사쉐제 또는 정제; 유효량의 활성 성분을 적절한 분산제에 현탁시켜 제조된 현탁액; 유효량의 활성 성분의 용액을 적절한 분산제에 분산 및 유화시켜 제조된 에멀젼 등이다.
본 발명의 약제는 필요에 따라 맛 차폐, 장용성, 서방성 등의 목적으로 자체 공지된 방법으로 코팅될 수 있다. 코팅에 사용되는 코팅제의 예로서, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 폴리옥시에틸렌 글리콜, Tween 80, Pluronic F68, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트, 하이드록시메틸셀룰로스 아세테이트 석시네이트, Eudragit (독일의 Rohm에 의해 제조됨, 메타크릴산/아크릴산 공중합체), 염료 (예를 들어, 적색 산화철, 이산화티탄 등) 등이 사용된다. 약제는 속방성 제제 또는 서방성 제제일 수 있다. 서방성 제제의 기재의 예는 리포솜, 아텔로콜라겐, 젤라틴, 하이드록시아파타이트, PLGA 등을 포함한다.
비경구 투여 (예를 들어, 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 국소 투여, 복강내 투여, 비강내 투여, 폐 투여 등)에 적합한 제제로서, 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사액이 이용 가능하며, 이것은 항산화제, 완충 용액, 정균제, 등장화제 등을 포함할 수 있다. 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 방부제 등을 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 또한 언급될 수 있다. 제제는 단위 투여 용적으로 또는 수 개의 분할 용량으로 앰풀 또는 바이알과 같은 용기에 포함될 수 있다. 활성 성분 및 약제학적으로 허용되는 담체는 또한 동결 건조되고, 사용 직전에 적절한 멸균 비히클에 용해되거나 현탁될 수 있는 상태로 저장될 수 있다. 액체 주사제 외에도, 흡입제 및 연고가 또한 허용 가능하다. 흡입제의 경우에, 동결-건조된 상태의 활성 성분이 미세화되고 적절한 흡입 장치를 사용하여 흡입에 의해 투여된다. 흡입제는 필요에 따라 통상적으로 사용되는 계면활성제, 오일, 조미료, 사이클로덱스트린 또는 이의 유도체 등으로 적절히 제형화될 수 있다.
여기서, 계면활성제의 예로서, 올레산, 레시틴, 디에틸렌 글리콜 디올레에이트, 테트라하이드로플루푸릴 올레에이트, 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 글리세릴 트리올레에이트, 글리세릴 모노라우레이트, 글리세릴 모노올레에이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 모노리시노에이트, 세틸 알콜, 스테아릴 알콜, 폴리에틸렌글리콜 400, 세틸피리디늄 클로라이드, 소르비탄 트리올레에이트 (상표명, Span 85), 소르비탄 모노올레에이트 (상표명, Span 80), 소르비탄 모노라우레이트 (상표명, Span 20), 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 (상표명, HCO-60), 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트 (상표명, Tween 20), 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트 (상품명, Tween 80), 천연 자원 기원의 레시틴 (상품명, Epiclon), 올레일폴리옥시에틸렌 (2) 에테르 (상품명, Brij 92), 스테아릴 폴리옥시에틸렌 (2) 에테르 (상품명, Brij 72), 라우릴 폴리옥시에틸렌 (4) 에테르 (상품명, Brij 30), 올레일폴리옥시에틸렌 (2) 에테르 (상품명, Genapol 0-020), 옥시에틸렌과 옥시프로필렌의 블록 공중합체 (상표명, Synperonic) 등이 언급될 수 있다. Span, Tween, Epiclon, Brij, Genapol 및 Synperonic이 상표이다.
오일의 예로서, 옥수수유, 올리브유, 면실유, 해바라기유 등이 언급될 수 있다. 연고의 경우, 적절한 약제학적으로 허용되는 기재 (황색 바셀린, 백색 바셀린, 파라핀, 플라스티베이스, 실리콘, 백색 연고, 밀랍, 라드, 식물유, 친수성 연고, 친수성 바셀린, 정제 라놀린, 함수 라놀린, 수분-흡수 연고, 친수성 플라스티베이스, 마크로골 연고 등)를 활성 성분과 혼합하여 제제로서 사용한다.
흡입제는 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 구체적으로, 흡입제는 상기한 본 발명의 앱타머 또는 복합체를 분말화 또는 액화시키고, 이를 흡입 추진제 및/또는 담체에 블렌딩하고 이를 적절한 흡입 용기에 충전시킴으로써 제조될 수 있다. 상기한 본 발명의 앱타머 또는 복합체가 분말인 경우, 통상의 기계적 분말 흡입기가 사용될 수 있으며; 액체의 경우, 분무기와 같은 흡입기가 사용될 수 있다. 여기서, 추진제로서, 통상적으로 공지된 것이 광범위하게 사용될 수 있다; 클로로플루오로카본-11, 클로로플루오로카본-12, 클로로플루오로카본-21, 클로로플루오로카본-22, 클로로플루오로카본-113, 클로로플루오로카본-114, 클로로플루오로카본-123, 클로로플루오로카본-142c, 클로로플루오로카본-134a, 클로로플루오로카본-227, 클로로플루오로카본-C318 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄과 같은 클로로플루오로카본계 화합물, 프로판, 이소부탄, 및 n-부탄과 같은 탄화수소, 디에틸 에테르와 같은 에테르, 질소 가스 및 이산화탄소 가스와 같은 압축 가스 등이 언급될 수 있다.
본 발명의 약제가 연골 질환의 예방 또는 치료용 약제로서 사용되는 경우, 본 발명의 약제는 관절 염증 부위에 직접 투여되거나 상기 언급된 다른 방법에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 앱타머는 단일 가닥 핵산이기 때문에, 상보적 서열을 함유하는 뉴클레오티드의 투여에 의한 해독이 가능하고, 투여 후 동력학적으로 제어하기 어려운 중화 항체보다 안전성이 높은 의학품을 제조할 가능성이 높다. 이것은 신체내 항체의 긴 체류 시간에 의해 유발되는, 약물 치료 등에서 항체에서 발생할 수 있는 감염의 문제를 고려할 때 매우 유리한 측면이다. 특히, 본 발명의 약제가 관절염의 예방 또는 치료용 약제로서 사용되는 경우, 질환의 중증도 및 부작용의 위험을 고려하여, 생체내 동역학의 용이한 제어를 가능하게 하는 앱타머를 사용함으로써 보다 높은 안전성을 갖는 약제가 수득될 수 있음이 명백하다.
본 발명의 약제의 투여량은 활성 성분의 종류 및 활성, 질환의 심각성, 투여 대상인 동물 종, 투여 대상의 약물 내약성, 체중, 연령 등에 따라 변하며, 성인의 일일 활성 성분의 양을 기준으로 한 통상의 투여량은 약 0.0001 내지 약 100 mg/kg, 예를 들면, 약 0.0001 내지 약 10 mg/kg, 바람직하게는 약 0.005 내지 약 1 mg/kg일 수 있다.
본 발명의 앱타머 또는 복합체는 또한 약물 전달 비히클, 생체내 이미징용 프로브, ADAMTS5의 혈중 농도 측정용 프로브, 조직학적 염색용 프로브, ELISA용 프로브, 및 ADAMTS5의 분리 및 정제용 리간드로서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 앱타머 및 복합체가 고정화된 고체상 담체를 제공한다. 고체상 담체의 예로서, 기판, 수지, 플레이트 (예를 들어, 멀티웰 플레이트), 필터, 카트리지, 칼럼 및 다공성 물질이 언급될 수 있다. 기판은 DNA 칩, 단백질 칩 등에 사용되는 것일 수 있으며; 예를 들면, 니켈-PTFE (폴리테트라플루오로에틸렌) 기판, 유리 기판, 아파타이트 기판, 실리콘 기판, 알루미나 기판 등, 및 이들 기판을 중합체 등으로 코팅하여 제조된 기판이 언급될 수 있다. 수지의 예로서, 아가로스 입자, 실리카 입자, 아크릴아미드와 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체, 폴리스티렌-가교결합된 디비닐벤젠 입자, 에피클로로하이드린과 가교결합된 덱스트란의 입자, 셀룰로스 섬유, 아릴덱스트란과 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드의 가교결합된 중합체, 단분산된 합성 중합체, 단분산된 친수성 중합체, 세파로스, 토요펄 (Toyopearl) 등이 언급될 수 있으며, 또한 이들 수지에 다양한 관능 그룹을 결합시켜 제조된 수지가 포함되었다. 본 발명의 고체상 담체는, 예를 들면, ADAMTS5를 정제, 검출 및 정량하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 앱타머 및 복합체는 자체 공지된 방법에 의해 고체상 담체 상에 고정화될 수 있다. 예를 들면, 친화성 물질 (예를 들어, 상기한 것들) 또는 소정의 관능 그룹을 본 발명의 앱타머 또는 복합체에 도입한 다음 친화성 물질 또는 소정의 관능 그룹을 통해 앱타머 및 복합체를 고체상 담체 상에 고정화시키는 방법이 언급될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 앱타머 또는 복합체를 고체상 담체 상에 고정화하는 방법 및 이에 의해 수득된 고체상 담체를 제공한다. 소정의 관능 그룹은 커플링 반응에 적용될 수 있는 관능 그룹일 수 있고; 예를 들면, 아미노 그룹, 티올 그룹, 하이드록시 그룹, 및 카복실 그룹이 언급될 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 관능 그룹이 도입된 앱타머를 제공한다.
본 발명은 또한 ADAMTS5를 정제 및 농축시키는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 정제 방법은 ADAMTS5를 다른 ADAMTS 패밀리 단백질로부터 분리할 수 있게 한다. 본 발명의 정제 및 농축 방법은 ADAMTS5를 본 발명의 고체상 담체에 흡착시키는 단계 및 흡착된 ADAMTS5를 용출제로 용출시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 고체상 담체에 대한 ADAMTS5의 흡착은 자체 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, ADAMTS5-함유 샘플 (예를 들어, 세균 또는 세포 배양물 또는 배양 상청액, 혈액)이 본 발명의 고체상 담체 또는 이를 함유하는 조성물에 도입된다. ADAMTS5는 중성 용액과 같은 용출제를 사용하여 용출될 수 있다. 중성 용출제에는 제한이 없으며, 이것은, 예를 들면, 약 6 내지 약 9, 바람직하게는 약 6.5 내지 약 8.5, 보다 바람직하게는 약 7 내지 약 8의 pH를 가질 수 있다. 중성 용액은 또한, 예를 들면, 칼륨 염 (예를 들어, KCl), 마그네슘 염 (예를 들어, MgCl2), 계면활성제 (예를 들어, Tween 20, Triton, NP40) 및 글리세린을 함유할 수 있다.
본 발명의 정제 및 농축 방법은 ADAMTS5 흡착 후 세정 용액을 사용하여 고체상 담체를 세정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 세정 용액의 예는 우레아, 킬레이트제 (예를 들어, EDTA), 트리스, 산, 알칼리, 전이 RNA, DNA, Tween 20과 같은 계면활성제, NaCl과 같은 염 등을 함유하는 것을 포함한다. 본 발명의 정제 및 농축 방법은 고체상 담체를 가열하는 단계를 여전히 추가로 포함할 수 있다. 이 단계는 고체상 담체의 재생 및 멸균을 가능하게 한다.
본 발명의 앱타머 또는 복합체는 검출 프로브, 특히 ADAMTS5의 검출용 프로브로서 사용될 수 있다. 앱타머의 표지화 방법은 특별히 제한되지 않으며; 자체 공지된 방법이 적용될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들면, 방사성 동위원소로 표지, 형광 염료 또는 형광 단백질로 표지하는 등을 포함한다.
본 발명은 또한 ADAMTS5를 검출 및 정량하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 다른 ADAMTS 패밀리 단백질의 단백질과는 별도로 ADAMTS5를 검출 및 정량할 수 있게 한다. 본 발명의 검출 및 정량 방법은 본 발명의 앱타머를 사용함으로써 (예를 들어, 본 발명의 복합체 및 고체상 담체의 사용에 의해) ADAMTS5를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. ADAMTS5를 검출 및 정량하는 방법은 항체 대신에 본 발명의 앱타머가 사용되는 것을 제외하고는 면역학적 방법과 동일한 방식으로 수행될 수 있다. 따라서, 항체 대신에 본 발명의 앱타머를 사용함으로써, 효소 면역검정 (EIA) (예를 들어, 직접 경쟁 ELISA, 간접 경쟁 ELISA, 샌드위치 ELISA), 방사면역검정 (RIA), 형광 면역검정 (FIA), 웨스턴 블롯법 (예를 들어, 웨스턴 블롯법에서 이차 항체 대신 사용), 면역조직화학적 염색법, 및 세포 선별법과 같은 방법과 동일한 방식으로, 검출 및 정량이 수행될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들면, 살아있는 유기체 또는 생물학적 샘플에서 ADAMTS5 함량을 측정하는데 및 ADAMTS5와 관련된 질환을 진단하는데 유용할 수 있다.
특허 및 특허 출원 명세서를 포함하여 본원에 언급된 모든 공보의 개시내용은 이들 모두가 명백하게 제공되는 정도로 본 발명에서 본원에 참고로 포함된다.
다음은 본 발명을 실시하기 위한 특정 실시양태의 예를 보여준다. 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하려는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: ADAMTS5에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머의 제조 (1)
ADAMTS5에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머는 SELEX 방법을 사용하여 제조하였다. SELEX는 Ellington 등의 방법 (Ellington and Szostak, Nature 346, 818-822, 1990) 및 Tuerk 등의 방법 (Tuerk and Gold, Science 249, 505-510, 1990)을 참조하여 수행하였다. 표적 물질로서, NHS-활성화된 세파로스 4 Fast Flow (GE healthcare에 의해 제조됨)의 담체 상에 고정화된 ADAMTS5 (R&D systems에 의해 제조됨)를 사용하였다. 담체 상의 ADAMTS5의 고정화 방법은 GE healthcare의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 고정화의 양은 고정화 전의 ADAMTS5 용액 및 고정화 직후의 상청액을 SDS-PAGE에 의해 조사함으로써 확인하였다. SDS-PAGE의 결과로서, 상청액으로부터 ADAMTS5 밴드가 검출되지 않았으며, 이것은 사용된 거의 모든 ADAMTS5가 커플링되었음을 확인시켜 주었다. 약 73.2 pmol의 ADAMTS5가 약 3 μL의 수지 상에 고정되었다.
최초 라운드에서 사용된 RNA (40N)는 DuraScribeTM T7 전사 키트 (Epicentre에 의해 제조됨)를 사용하여 화학적으로 합성된 DNA를 전사시킴으로써 수득하였다. 이러한 방법으로 수득된 RNA에서, 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'-위치는 플루오르화되었다. 40-뉴클레오티드 랜덤 서열의 각 말단에 프라이머 서열을 갖는, 아래에 나타낸 80 뉴클레오티드 길이 DNA를 DNA 주형으로서 사용하였다. DNA 주형 및 프라이머는 화학적 합성에 의해 제조하였다.
DNA 주형: 5'-
GTACGCTAGGCGTTAGTCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATCGTACGACGGTCGTACCC-3' (서열 번호 46)
프라이머 Fwd: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACGACCGTCGTACGAT-3' (서열 번호 47)
프라이머 Rev: 5'-GTACGCTAGGCGTTAGTCTC-3' (서열 번호 48)
DNA 주형 (서열 번호 46)의 연속 N은 40개 뉴클레오티드의 임의의 조합이며 (40N: 각각의 N은 A, C, G 또는 T이다), 수득된 앱타머에 특유한 서열 영역을 형성한다. 프라이머 Fwd는 T7 RNA 폴리머라제의 프로모터 서열을 포함한다. 최초 라운드에서 사용된 RNA 풀의 변동은 이론적으로 1013이었다.
RNA 풀을 ADAMTS5가 고정화된 담체에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 유지시켰다. 수지를 용액 A로 세정하여 ADAMTS5에 결합되지 않은 RNA를 제거하였다. 여기서, 용액 A는 145mM 염화나트륨, 5.4mM 염화칼륨, 1.8mM 염화칼슘, 0.8mM 염화마그네슘, 20mM 트리스 (pH 7.6), 0.05% Tween 20의 혼합 용액이다. ADAMTS5에 결합된 RNA는 용액 B를 용출제로서 첨가하고, 혼합물을 95℃에서 3분 동안 열처리하고, 이의 상청액으로부터 회수함으로써 수득하였다. 여기서, 용액 B는 7M 우레아, 5 mM EDTA, 20 mM 트리스 (pH 7.6)의 혼합 용액이다. 회수된 RNA를 역전사 PCR에 의해 증폭시키고, 증폭된 DNA를 DuraScribeTM T7 전사 키트를 사용하여 전사하여 다음 라운드를 위한 RNA 풀을 제조하였다. 상기를 1 라운드로 하여, 유사한 작업을 다수회 반복하였다. SELEX의 완료 후, 뉴클레오티드 서열을 차세대 서열분석기를 사용하여 분석하였다. 차세대 서열분석기로서, Ion PGMTM 시스템 (Temp에 의해 제조됨)을 사용하였으며 Thermo의 매뉴얼에 따라 분석을 수행하였다.
7 라운드의 SELEX 후, 차세대 서열분석기에 의해 78889 종류의 클론 서열이 결정되었으며, 이들은 10068 종류의 서열로 수렴되는 것으로 확인되었다. 이들 클론의 일부 서열은 서열 번호 1 내지 2에 나타내어진다. 서열 번호 1로 나타낸 6,711개의 서열이 존재하였다. 서열 번호 2로 나타낸 1,305개의 서열이 존재하였다. 서열 번호 1에 나타낸 서열은 컨센서스 서열 1을 함유하였다. 서열 번호 1 및 2는 서열에서 하나의 염기에서만 상이하며, 컨센서스 서열에서 4개의 연속 G 염기 중 하나는 서열 번호 2에서 결실되었다. 10,068 종류의 서열 중 컨센서스 서열 1을 갖는 138 종류의 서열이 있었다. 이러한 서열의 2차 구조는 MFOLD 프로그램 (M. Zuker, Nucleic Acids Res. 31(13), 3406-3415, 2003)에 의해 예측하였다. 그 결과, 컨센서스 서열 부분은 유사한 루프 구조를 가졌다. 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 2차 구조는 도 1에 제시되어 있다.
각각의 뉴클레오티드 서열이 아래에 나타내어져 있다. 특별히 지시되지 않는 한, 아래에 나타낸 서열은 5'에서 3' 방향이고, 퓨린 염기 (A 및 G)는 2'-OH 화합물이고 피리미딘 염기 (U 및 C)는 2'-플루오로 개질된 화합물이다. 서열에서 N1은 3 - 24개의 임의의 길이를 갖는 뉴클레오티드를 나타내고, Y는 C 또는 U이다.
서열 번호 1:
GGGUACGACCGUCGUACGAUUGGGGCCUCCACAGCUGCUCAGCUUGGACUAAACCAAUAAGAGACUAACGCCUAGCGUAC
서열 번호 2:
GGGUACGACCGUCGUACGAUUGGGCCUCCACAGCUGCUCAGCUUGGACUAAACCAAUAAGAGACUAACGCCUAGCGUAC
컨센서스 서열 1
GGGGCCUCC-N1-GGACYAAAC
서열 번호 1 및 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 ADAMTS5에 대한 결합 활성은 표면 플라스몬 공명법에 의해 평가하였다. GE Healthcare에 의해 제조된 Biacore T100을 측정에 사용하였다. 스트렙트아비딘이 고정화된 SA 칩을 센서 칩으로서 사용하였다. 5'-말단에 비오틴을 갖는 약 800 RU의 16-뉴클레오티드 Poly dT를 칩 상에 결합시켰다. 리간드 핵산은 이의 3'-말단에 16-뉴클레오티드 폴리 A를 가졌으며, T 및 A의 어닐링에 의해 SA 칩 상에 고정화시켰다. 핵산을 10 μL/분의 유속으로 30초 동안 주입하여 약 300 RU의 핵산을 고정화시켰다. 분석물을 위한 ADAMTS5를 0.1 μM로 제조하고, 30 μL/분의 유속으로 60초 동안 주입하였다. 러닝 버퍼로서, 용액 C를 사용하였다. 용액 C는 300mM 염화나트륨, 5.4mM 염화칼륨, 1.8mM 염화칼슘, 0.8mM 염화마그네슘, 20mM 트리스 (pH 7.6) 및 0.05% Tween20의 혼합 용액이다.
측정 결과로서, 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머가 ADAMTS5에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (표 1). 최초 라운드에 대한 음성 대조군으로서 사용되고 40-뉴클레오티드 랜덤 서열을 함유하는 핵산 풀 (40N)은 ADAMTS5에 결합하지 않았다. 서열 번호 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머는 ADAMTS5에 결합하지 않았으며, 40N과 동일한 수준이었다. 서열 번호 2는 컨센서스 서열에서 연속 4개의 G 염기로부터 하나의 염기 결실이 있는 서열을 가지며, 결합 활성의 측정 결과로부터 컨센서스 서열의 연속 4개의 G 염기가 앱타머의 활성에 중요한 것으로 나타났다. 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 ADAMTS5에 대한 결합을 보여주는 센서그램이 도 2에 제시되어 있다. 표 1에서, "++"는 SA 칩 상에 고정화된 앱타머의 양 (RU 값)에 대한 ADAMTS5 결합 양 (RU 값)의 비율이 40% 이상인 것을 나타내고, "+"는 비율이 10% 이상 40% 미만인 것을 나타내고, "-"는 비율이 10% 미만인 것을 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00007
서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머가 ADAMTS5의 효소 활성을 억제하는지 여부는 하기 방법에 의해 평가하였다. ADAMTS5의 기질로서, 아그레칸의 G1-IGD-G2 도메인 (R&D systems에 의해 제조됨)을 사용하였다. ADAMTS5는 G1-IGD-G2 도메인에서 392번째 글루탐산과 393번째 알라닌 사이를 특이적으로 절단하여 2개의 단편을 생성한다. 이들 단편은 절단되지 않은 G1-IGD-G2보다 더 빠른 전기영동 이동성을 갖는다. 따라서, ADAMTS5의 효소 활성은 SDS-PAGE 전기영동에 의해 G1-IGD-G2의 밴드 강도를 정량함으로써 측정할 수 있다. 반응 혼합물 용적을 10 μL로 하여 용액 A 완충액에서 분석을 수행하였다. 먼저, 핵산과 ADAMTS5의 혼합물 (10 μL)을 제조하고 25℃에서 15분 동안 항온처리하였다. 용액 A로 희석된 기질 용액 (5 μL)에 핵산과 ADAMTS5의 혼합물 (5 μL)을 첨가하여 효소 반응을 개시하였다. 반응 용액 중의 ADAMTS5의 최종 농도는 5 nM이고, 최종 기질 농도는 50 μg/mL이었다. 반응 용액을 37℃에서 2시간 동안 항온처리하고, 용액 D 2 μL를 첨가하고, 혼합물을 95℃에서 2분 동안 가열하여 ADAMTS5의 효소 반응을 정지시켰다. 용액 D는 0.25M 트리스 (pH 6.8), 10% SDS, 50% 글리세롤, 0.25% 브로모 페놀블루 및 20% 2-머캅토에탄올을 함유한다. 열처리된 반응 용액을 7.5% SDS-PAGE로 전기영동하고 SYPRO Orange (Sigma-Aldrich에 의해 제조됨)로 염색하였다. 염색은 Sigma-Aldrich의 매뉴얼에 따라 수행하였으며 GE Healthcare에 의해 제조된 STORM840을 사용하여 검출하였다. 분석 곡선을 위해, 비절단 기질 1000 ng, 400 ng, 160 ng, 64 ng, 25.6 ng, 10.24 ng 및 4.1 ng를 전기영동하고, 염색 및 검출을 동일한 방식으로 수행하였다. 각각의 반응 용액에서 비절단 기질의 양을 밴드 강도 및 표준 곡선으로부터 정량하였다. 이러한 반응 조건 하에서 ADAMTS5의 기질 절단 효율은 80 내지 100%였다. 시험 물질의 억제율은 하기 식을 사용하여 계산하였다.
억제율 (%)=(Sapt-SE)/(S0-SE)x100
여기서, Sapt는 시험 물질을 첨가한 비절단 기질의 양이고, SE는 ADAMTS5를 첨가한 비절단 기질의 잔여량이고, S0는 ADAMTS5를 첨가하지 않은 비절단 기질의 잔여량이다.
효소 활성의 50%를 억제하는데 필요한 억제제의 농도 (IC50)를 결정하였다. 이의 결과는 표 2에 나타나 있다. IC50은 4회 측정의 평균이다.
[표 2]
Figure pct00008
음성 대조군 40N은 30 nM의 최종 핵산 농도의 조건 하에서 억제 활성을 나타내지 않았다 (억제율 5.6±4.7%). 양성 대조군, ADAMTS5 저분자량 억제제 (CAS929634-33-3) (Merck에 의해 제조됨)의 IC50 값은 90.5 μM이었다.
상기 결과로부터, 이것은 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머가 ADAMTS5에 대해 우수한 억제 효과를 나타냄을 시사한다.
실시예 2: 앱타머의 가닥-단축 - 1
서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머를 가닥-단축시켰다. 가닥-단축 후 서열이 서열 번호 3 - 9에 나타내어져 있다. 서열 번호 3 - 9에 나타낸 앱타머의 예측된 2차 구조는 도 3에 제시되어 있다. 도 3에서, 컨센서스 서열은 원으로 싸여져 있다 (○). 부분적으로 결실된 컨센서스 서열을 갖는 서열의 경우, 결실된 위치는 화살표 (흑색 삼각형)로 표시된다.
하기 서열 번호 3 - 9에 나타낸 앱타머의 뉴클레오티드 서열이 아래에 나타내어져 있다. 특별히 지시되지 않는 한, 아래 나타낸 각각의 서열은 5'에서 3' 방향이고, 퓨린 염기 (A 및 G)는 2'-OH 화합물이고, 피리미딘 염기 (U 및 C)는 2'-플루오로 개질된 화합물이다.
서열 번호 3:
(서열 번호 1에 나타낸 서열을 컨센서스 서열을 포함한 44개 뉴클레오티드의 길이로 단축시킴으로써 수득된 서열)
GGAUUGGGGCCUCCACAGCUGCUCAGCUUGGACUAAACCAAUCC
서열 번호 4:
(서열 번호 1에 나타낸 서열을 컨센서스 서열을 포함한 44개 뉴클레오티드의 길이로 단축시키고 추가로 3번째 및 42번째로 구성된 AU 염기 쌍을 CG 염기 쌍으로 치환시켜 수득된 서열)
GGCUUGGGGCCUCCACAGCUGCUCAGCUUGGACUAAACCAAGCC
서열 번호 5:
(서열 번호 4에 나타낸 서열을 컨센서스 서열을 포함한 42개 뉴클레오티드의 길이로 단축시킴으로써 수득된 서열)
GGCUUGGGGCCUCCACAGCGCUCGCUUGGACUAAACCAAGCC
서열 번호 6:
(서열 번호 4에 나타낸 서열을 컨센서스 서열을 포함한 43개 뉴클레오티드의 길이로 단축시킴으로써 수득된 서열)
GGCUUGGGGCCUCCACAGCUGUCAGCUUGGACUAAACCAAGCC
서열 번호 7:
(서열 번호 4에 나타낸 서열에서 컨센서스 서열의 3개의 연속 A 염기 중 하나를 결실시킴으로써 수득된 43개 뉴클레오티드로 구성된 서열)
GGCUUGGGGCCUCCACAGCUGCUCAGCUUGGACUAACCAAGCC
서열 번호 8:
(서열 번호 4에 나타낸 서열에서 컨센서스 서열의 CG 염기 쌍 (13번째 및 31번째 염기)을 결실시킴으로써 수득된 42개 뉴클레오티드로 구성된 서열)
GGCUUGGGGCCUCACAGCUGCUCAGCUUGACUAAACCAAGCC
서열 번호 9:
(서열 번호 3, 5, 6에 나타낸 서열의 조합을 컨센서스 서열을 포함한 41개 뉴클레오티드의 길이로 단축시킴으로써 수득된 서열)
GGAUUGGGGCCUCCACAGCGUCGCUUGGACUAAACCAAUCC
이들 앱타머가 ADAMTS5의 효소 활성을 억제하는지의 여부는 실시예 1과 유사한 방법으로 시험하였다. 핵산의 최종 농도는 시험에서 30 nM로 고정시켰다. 이의 결과가 표 3에 나타내어져 있다.
[표 3]
Figure pct00009
서열 번호 3 및 4에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 결과로부터, 3번째 및 42번째로 구성된 AU 염기 쌍이 CG 염기 쌍으로도 기능하는 것으로 밝혀졌다. 서열 번호 5, 6, 9에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 결과로부터, 활성은 컨센서스 서열에서 N1 (스템-루프 구조)의 스템 영역을 9개 염기로 가닥-단축시키고 루프 영역을 3개의 염기로 가닥-단축시켜도 영향을 받지 않지만 이들은 조합하여 활성에 현저한 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 상기 결과로부터, 컨센서스 서열에서 N1은 적어도 13개 염기로 가닥-단축될 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 3: 앱타머의 변형 - 1
서열 번호 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머 (피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'-위치는 플루오르화된다)의 뉴클레아제 내성을 향상시키기 위해, 2'-O-메틸 그룹이 삽입된 변이체를 제조하였다. 변형된 서열은 서열 번호 3(1) - 3(16)에 나타내어져 있다.
서열 번호 3(1) - 3(16)에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 뉴클레오티드 서열이 변형과 함께 아래 나타내어져 있다. 특별히 지시되지 않는 한, 아래에 나타낸 서열은 5'에서 3' 방향이며, 대문자는 RNA를 나타낸다. 뉴클레오티드 안의 괄호는 리보스의 2'-위치의 변형을 나타내고, F는 불소 원자이고, M은 O-메틸 그룹이다.
서열 번호 3(1):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 3에 나타낸 서열의 컨센서스 서열 이외의 서열의 6위치에 도입함으로써 수득된 서열)
G(M)G(M)A(M)U(F)U(F)GGGGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)AGC(F)U(F)GC(F)U(F)C(F)AGC(F)U(F)U(F)GGAC(F)U(F)AAAC(F)C(F)AAU(M)C(M)C(M)
서열 번호 3(2):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 3에 나타낸 서열의 컨센서스 서열을 함유하는 서열의 6위치에 도입함으로써 수득된 서열)
GGAU(M)U(M)G(M)GGGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)AGC(F)U(F)GC(F)U(F)C(F)AGC(F)U(F)U(F)GGAC(F)U(F)AAAC(F)C(M)A(M)A(M)U(F)C(F)C(F)
서열 번호 3(3):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 3에 나타낸 서열의 컨센서스 서열 이외의 서열의 6위치에 도입함으로써 수득된 서열)
GGAU(F)U(F)GGGGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)AG(M)C(M)U(M)GC(F)U(F)C(F)A(M)G(M)C(M)U(F)U(F)GGAC(F)U(F)AAAC(F)C(F)AAU(F)C(F)C(F)
서열 번호 3(4):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 3에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
GGAU(F)U(F)GGGGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)AGC(F)U(F)GC(F)U(F)C(F)AGC(F)U(F)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)AC(F)C(F)AAU(F)C(F)C(F)
서열 번호 3(5):
(서열 번호 3(1) - 3(4)에 나타낸 서열의 모든 2'-O-메틸 변형의 조합을 도입함으로써 수득된 서열)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)GGGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)AG(M)C(M)U(M)GC(F)U(F)C(F)A(M)G(M)C(M)U(F)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)AC(F)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
서열 번호 3(6):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 3(5)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 2 위치에 적용함으로써 수득된 서열)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)AG(M)C(M)U(M)GC(F)U(F)C(F)A(M)G(M)C(M)U(F)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
서열 번호 3(7):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 3(5)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열 이외의 서열의 하나의 위치에 적용함으로써 수득된 서열)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)GGGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(M)AG(M)C(M)U(M)GC(F)U(F)C(F)A(M)G(M)C(M)U(F)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)AC(F)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
서열 번호 3(8):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 3(5)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열 이외의 서열의 6 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
서열 번호 3(9):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 3(8)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 적용함으로써 수득된 서열)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)G(M)GC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
서열 번호 3(10):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 3(8)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 적용함으로써 수득된 서열)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GG(M)C(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M))U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
서열 번호 3(11):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 3(8)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열 이외의 서열의 하나의 위치에 적용함으로써 수득된 서열)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)A(M)C(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
서열 번호 3(12):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 3(8)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 적용함으로써 수득된 서열)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
서열 번호 3(13):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 3(8)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 적용함으로써 수득된 서열)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)GG(M)AC(F)U(F)AA(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
서열 번호 3(14):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 3(8)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 적용함으로써 수득된 서열)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)GGA(M)C(F)U(F)AA(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
서열 번호 3(15):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 3(8)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 적용함으로써 수득된 서열)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)GGAC(F)U(F)A(M)A(M)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
서열 번호 3(16):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 3(8)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 적용함으로써 수득된 서열)
G(M)G(M)A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)GGAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)C(M)C(M)
서열 번호 3(1) - 3(16)에 나타낸 핵산은 모두 화학적 합성에 의해 제조하였다. 이들 핵산이 ADAMTS5의 효소 활성을 억제하는지의 여부는 실시예 1에서와 유사한 방법에 의해 결정하였다. 평가에서 핵산의 최종 농도는 10 nM 및 30 nM이었다. 결과는 표 4에 나타내어져 있다. 표에서 "n.d."는 결정되지 않음을 의미한다.
[표 4]
Figure pct00010
각각의 앱타머는 비록 강도는 다양하지만 억제 활성을 보이는 것으로 밝혀졌다. 서열 번호 3(1) - 3(4)에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 억제 활성은 일반적으로 서열 번호 3에서와 동일한 수준으로 유지되었으며, 서열 번호 3(1) - 3(4)의 모든 변형을 조합하여 함유하는 서열 번호 3(5)에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 억제 활성은 서열 번호 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 억제 활성보다 더 개선되는 것으로 나타났다. 또한, 서열 번호 3(5)에 변형을 추가로 도입함으로써 수득된, 서열 번호 3(6) 및 3(8)에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머는 더욱 개선된 억제 활성을 나타내지만, 서열 번호 3(7)에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머는 보다 낮은 억제 활성을 보이는 것으로 나타났다. 서열 번호 3(8)에 변형을 추가로 도입함으로써 수득된, 서열 번호 3(11), 3(12), 또는 3(16)에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 억제 활성은 유지되지만, 서열 번호 3(9), 3(10), 3(13), 3(14), 3(15)에서는 억제 활성이 감소한 것으로 나타났다.
상기 결과로부터, 안정성을 개선시키기 위해 변형이 뉴클레오티드의 다양한 부위 (적어도 28개)에 도입된, 서열 번호 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머가 또한 기능하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 컨센서스 서열에서 5'-측 2개 염기 (G, G) 및 3'-측 4개 염기 (A, A, C, C)는 2'-O-메틸 등의 변형이 도입될 때에도 기능할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 뉴클레오티드의 변형으로서는, 예를 들면, 2'-O-메틸 변형 이외에 2'-아미노 변형 등이 언급될 수 있다.
실시예 4: 앱타머의 가닥-단축 - 2
서열 번호 3(16)에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머를 추가로 가닥-단축시켰다. 단축 및 변형 후의 서열이 서열 번호 10 - 12에 나타내어진다. 서열 번호 10 - 12에 나타낸 앱타머의 예측된 2차 구조는 도 4에 제시되어 있다. 도 4에서, 컨센서스 서열은 원으로 싸여져 있다 (○).
아래 서열 번호 10 - 12에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 각각의 뉴클레오티드 서열이 아래에 제시되어 있다. 특별히 지시되지 않는 한, 아래에 나타낸 각 서열은 5'에서 3' 방향이며, 대문자는 RNA를 나타낸다. 뉴클레오티드 안의 괄호는 리보스의 2'-위치의 변형을 나타내고, F는 불소 원자이고, M은 O-메틸 그룹이다.
서열 번호 10:
(서열 번호 3(12) 및 서열 번호 3(16)에 나타낸 서열의 2'-O-메틸 변형을 조합함으로써 컨센서스 서열을 포함한 40개 뉴클레오티드의 길이로 단축시킴으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11:
(서열 번호 10에 나타낸 서열을 컨센서스 서열을 포함한 38개 뉴클레오티드의 길이로 단축시킴으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 12:
(서열 번호 10에 나타낸 서열을 컨센서스 서열을 포함한 36개 뉴클레오티드의 길이로 단축시킴으로써 수득된 서열)
U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)
서열 번호 10 - 12의 핵산은 모두 화학적 합성에 의해 제조하였다. 이들 핵산에 의해 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머가 ADAMTS5의 효소 활성을 억제하는지의 여부는 실시예 1에서와 유사한 방법에 의해 결정하였다. 평가에서 핵산의 최종 농도는 10 nM이었다. 결과는 표 5에 나타내어져 있다. 서열 번호 10 - 12의 가닥-단축된 화합물 모두는 억제 활성을 유지하였다.
[표 5]
Figure pct00011
상기 결과로부터, 서열 번호 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머는 컨센서스 서열을 포함한 36개 뉴클레오티드의 길이로도 기능하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 5: 앱타머의 변형 - 2
실시예 4에서 제조된 서열 번호 10, 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 뉴클레아제 내성을 향상시키기 위해, 말단 변형을 갖는 변이체, 2'-O-메틸 그룹이 도입된 변이체, DNA가 도입된 변이체, 및 포스포로티오에이트가 도입된 변이체를 제조하였다. 변형된 서열은 서열 번호 10(1) - 10(8) (서열 번호 10 계통), 11(1) - 11(35) (서열 번호 11 계통)에 나타내어진다. 서열을 최적화하기 위해, 서열의 일부가 치환된 변이체를 제조하였다. 서열 치환을 받은 서열은 서열 번호 13 내지 14에 나타내어진다. 음성 대조군으로서, 컨센서스 서열의 일부의 무작위 치환을 갖는 것을 제조하였다. 서열은 서열 번호 15에 나타내어진다.
다음은 서열 번호 10(1) - 10(8), 11(1) - 11(35), 13 - 15에 나타낸 각각의 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 특별히 지시되지 않는 한, 아래에 나타낸 서열은 5'에서 3' 방향이며, 대문자는 RNA를 나타내고, 소문자는 DNA를 나타낸다. 뉴클레오티드 안의 괄호는 리보스의 2'-위치의 변형을 나타내고, F는 불소 원자이고, M은 O-메틸 그룹이다. 또한, 서열 말단에서의 idT는 역-dT에 의한 변형을 나타내고, PEG는 40 kDa 분지형 폴리에틸렌 글리콜에 의한 변형을 나타낸다. 서열에서, s는 뉴클레오티드를 연결하는 인산 그룹이 포스포로티오에이트화됨을 나타낸다.
서열 번호 10(1):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 10에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(M)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 10(2):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 10에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(M)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 10(3):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 10에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(M)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 10(4):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 10에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(M)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 10(5):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 10에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(M)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 10(6):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 10에 나타낸 서열의 컨센서스 서열 이외의 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 10(7):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 10에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(M)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 10(8):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 10에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)G(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(F)G(M)GAC(F)U(M)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(1):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 11에 나타낸 서열의 컨센서스 서열 이외의 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(2):
(DNA를 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)gGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(3):
(DNA를 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GgC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(4):
(DNA를 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGcC(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(5):
(DNA를 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)cU(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(6):
(DNA를 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)tC(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(7):
(DNA를 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)cC(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(8):
(DNA를 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)cAC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(9):
(DNA를 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열 이외의 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AcA(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(10):
(DNA를 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)gAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(11):
(DNA를 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GaC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(12):
(DNA를 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAcU(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(13):
(DNA를 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)tAA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(14):
(DNA를 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)aA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(15):
(DNA를 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열 이외의 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)aC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(16):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)sGGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(17):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GsGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(18):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGsC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(19):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)sC(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(20):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)sU(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(21):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)sC(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(22):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)sC(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(23):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)sAC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(24):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AsC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(25):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)sA(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(26):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)sGAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(27):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GsAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(28):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAsC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(29):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)sU(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(30):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)sAA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(31):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AsA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 13:
(서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 양 말단의 2개의 뉴클레오티드를 다른 서열로 치환함으로써 수득된 서열)
G(M)C(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)G(M)C(M)
서열 번호 14:
(서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 루프 영역의 4개의 뉴클레오티드를 다른 서열로 치환함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)C(M)G(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)
서열 번호 11(32):
(포스포로티오에이트 변형을 서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 4 위치에 도입하고 idT를 3'-말단에 부가함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)sC(F)sU(F)sC(F)C(F)AC(F)sA(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)-idT
서열 번호 11(33):
(서열 번호 11(1)에 나타낸 서열의 5'-말단에 40 kDa 폴리에틸렌 글리콜 및 3'-말단에 idT를 부가함으로써 수득된 서열)
PEG-A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)-idT
서열 번호 11(34):
(서열 번호 11(19)에 나타낸 서열의 3'-말단에 idT를 부가함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)sC(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)-idT
서열 번호 11(35):
(서열 번호 11(19)에 나타낸 서열의 5'-말단에 40 kDa 폴리에틸렌 글리콜 및 3'-말단에 idT를 부가함으로써 수득된 서열)
PEG-A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)GGC(F)sC(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)-idT
서열 번호 15:
(서열 번호 11(34)에 나타낸 서열의 컨센서스 서열을 무작위로 재정렬함으로써 수득된 서열)
A(M)U(M)U(M)G(M)G(M)C(F)sA(M)C(F)GGAG(M)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)C(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)C(F)U(F)C(F)GA(M)U(F)C(F)AC(M)C(M)A(M)A(M)U(M)-idT
서열 번호 10(1) - 10(8) 및 11(1) - 11(35), 서열 번호 13 - 15에 나타낸 서열을 갖는 앱타머는 모두 화학적 합성에 의해 제조하였다. 이들 앱타머가 ADAMTS5의 효소 활성을 억제하는지의 여부는 서열 번호 10(1) - 10(8) 및 11(1) - 11(33), 서열 번호 13 및 14의 서열로 나타낸 서열을 갖는 앱타머에 대해 실시예 1 (평가 방법 1)에서와 유사한 방법에 의해 결정하였다. 평가에서 핵산의 최종 농도는 10 nM이었다. 결과는 표 6의 평가 방법 1에 나타내어져 있다.
다른 한편으로, 서열 번호 11(34) - 11(35) 및 서열 번호 15의 서열로 나타낸 서열을 갖는 앱타머는 다음 방법 (평가 방법 2)에 의해 평가하였다. ADAMTS5에 의한 기질 (아그레칸 G1-IGD-G2)의 절단 반응은 하기 점을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방식으로 수행하였다. 차이는 ADAMTS5 및 기질의 최종 농도가 각각 0.2 nM 및 400 nM (48 μg/mL)이고, 효소 반응 시간이 30분이라는 것이다. 반응 후, 과량의 ADAMTS5 소분자 억제제를 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 절단된 기질을 2종의 항-아그레칸 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 방법에 의해 정량하였다. 항-아그레칸 항체로서, R&D Systems에 의해 제조된 MAB6489 및 비오틴화 MAB1220을 사용하였다. MAB6489는 ADAMTS5에 의해 절단된 아그레칸의 절단 표면을 특이적으로 인식하는 항체이다. 이를 이용하여, 절단된 기질의 양을 정량할 수 있다. 서양 고추냉이 퍼옥시다제-표지된 스트렙트아비딘을 사용한 표준 ELISA 검출 방법에 의해 검출을 수행하였다. 이러한 반응 조건 하에서 ADAMTS5의 기질 절단 효율은 약 7%였다. 시험 물질의 억제율은 하기 식을 사용하여 계산하였다.
억제율 (%) = (PE-Papt)/(PE-P0)x100
여기서, PE는 ADAMTS5를 첨가한 절단된 기질의 양이고, Papt는 시험 물질을 첨가한 절단된 기질의 양이고, P0는 ADAMTS5를 첨가하지 않은 절단된 기질의 잔여량이다.
서열 번호 11(34) - 11(35) 및 서열 번호 15에 나타낸 서열을 갖는 앱타머의 억제 활성의 측정 결과는 표 6, 평가 방법 2에 나타내어져 있다. 표에서, "평가 방법 1"은 10 nM 앱타머 농도 조건 하에서 억제 활성을 보인다. "평가 방법 2"는 2 nM 앱타머 농도 조건 하에서 억제 활성을 보인다. "n.d."는 결정되지 않음을 의미한다.
[표 6]
Figure pct00012
Figure pct00013
2'-O-메틸화 변형이 도입된 변이체 중에서, 서열 번호 10(1), 10(6) (서열 번호 10 계통) 및 서열 번호 11(1) (서열 번호 11 계통)에 나타낸 서열을 갖는 앱타머는 비록 강도는 다양하지만 억제 활성을 유지하였다. 다른 한편으로, 서열 번호 10(2) - 10(5) 및 10(7), 10(8)에 나타낸 서열을 갖는 앱타머는 현저하게 감소된 억제 활성을 나타내었다. 상기 결과로부터, 컨센서스 서열의 5'-말단에서 5번째 C 및 3'-말단에서 10번째 G에 도입된 2'-O-메틸화 변형을 갖는 앱타머가 또한 가능하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 2'-O-메틸화 변형은 컨센서스 서열의 내부 루프 대부분에서 앱타머 억제 활성을 상당히 감소시켰으며, 이것은 이 영역이 앱타머 활성에 중요할 수 있음을 시사한다.
DNA (서열 번호 11 계통)가 도입된 변이체 중에서, 서열 번호 11(2), 11(4), 11(8), 11(9), 11(10), 11(12), 11(14), 11(15)에 나타낸 서열을 갖는 앱타머는 비록 강도는 다양하지만 억제 활성을 유지하였다. 상기 결과로부터, 컨센서스 서열의 5'-말단에서 3번째 G, 5번째 C, 및 9번째 C 및 3'-말단에서 9번째 G, 7번째 C, 및 5번째 A에 대해 DNA를 갖는 앱타머가 또한 기능하는 것으로 밝혀졌다. 뉴클레오티드의 변형으로서, 예를 들면, 2'-O-메틸 변형 및 DNA 이외에 2'-아미노 변형 등이 언급될 수 있다. 인산 그룹에 포스포로티오에이트 변형이 도입된 서열 번호 11(16) - 11(32) 중에서, 서열 번호 11(30)에 나타낸 서열을 갖는 앱타머 이외의 모든 서열은 비록 강도는 다양하지만 억제 활성을 유지하였다. 그중에서도, 서열 번호 11(19) - 11(21), 11(25)에 나타낸 서열을 갖는 앱타머가 개선된 억제 활성을 보였다. 서열 번호 13에 나타낸 서열을 갖는 앱타머의 결과로부터, 말단 상의 2개의 염기 쌍, AU 쌍 및 UA 쌍의 각각 GC 쌍 및 CG 쌍으로의 치환이 억제 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 서열 번호 14에 나타낸 서열을 갖는 앱타머의 결과로부터, 18번째 내지 21번째 염기로 구성된 루프 서열의 GUCC 내지 UUCG로의 치환이 억제 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다.
서열 번호 11(33) - (35)에 나타낸 서열을 갖는 앱타머의 결과로부터, 5'-말단에 PEG를 첨가하고 3'-말단에 idT를 첨가하는 것이 억제 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 말단 변형으로서, 예를 들면, PEG 및 idT 이외에 펩티드, 아미노산, 당, 글리코사미노글리칸, 비오틴 등이 언급될 수 있다. 상기로부터, 화학식 1 또는 화학식 1'를 함유하는 본 발명의 앱타머가 다양한 방식으로 변형될 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 6: ADAMTS5에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머의 제조 - (2)
실시예 1에서와는 상이한 프라이머 서열을 갖는 랜덤 서열을 주형으로 사용하여, SELEX를 실시예 1에서와 동일한 방식으로 수행하였다. SELEX의 표적 물질로서, 담체로서의 NHS-활성화 세파로스 4 Fast Flow (GE Healthcare에 의해 제조됨)에 고정화된 ADAMTS5 (R&D systems에 의해 제조됨)를 사용하였다. 사용된 주형 및 프라이머의 서열은 아래에 나타내어져 있다. 돌연변이는 서열 번호 3의 서열에 기초하여 주형 DNA에 도입된다.
DNA 주형: 5'-TGCTCGATCTGGACT(G)(G)(A)(T)(T)(G)(G)(T)(T)(T)(A)(G)(T)(C)(C)(A)(A)(G)(C)(T)(G)(A)(G)(C)(A)(G)(C)(T)(G)(T)(G)(G)(A)(G)(G)(C)(C)(C)(C)(A)(A)(T)(C)(C)AGTTACGCATGTCCC-3' (서열 번호 49)
프라이머 Fwd: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGACATGCGTAACT-3' (서열 번호 50)
프라이머 Rev: 5'-TGCTCGATCTGGACT-3' (서열 번호 51)
DNA 주형 (서열 번호 49) 안의 괄호는 변형의 도입을 나타내며, 주형은 괄호 안에 나타낸 뉴클레오티드 76% 및 다른 3가지 종류의 뉴클레오티드 각각 8%를 함유하도록 설계하였다. 프라이머 Fwd는 T7 RNA 폴리머라제의 프로모터 서열을 포함한다. 최초 라운드에서 사용된 RNA 풀의 변동은 이론적으로 1013이었다.
RNA 풀을 ADAMTS5가 고정화된 담체에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 유지시켰다. 수지를 용액 A로 세정하여 ADAMTS5에 결합되지 않은 RNA를 제거하였다. 여기서, 용액 A는 145mM 염화나트륨, 5.4mM 염화칼륨, 1.8mM 염화칼슘, 0.8mM 염화마그네슘, 20mM 트리스 (pH 7.6) 및 0.05% Tween 20의 혼합 용액이다. ADAMTS5에 결합된 RNA는 용액 B를 용출제로서 첨가하고, 혼합물을 95℃에서 3분 동안 열 처리하고, 이의 상청액으로부터 수집함으로써 수득하였다. 여기서, 용액 B는 7M 우레아, 5mM EDTA 및 20mM 트리스 (pH 7.6)의 혼합 용액이다. 회수된 RNA를 역전사 PCR에 의해 증폭시키고, DuraScribeTM T7 전사 키트를 사용하여 전사시키고, 다음 라운드를 위한 풀로서 사용하였다. 상기를 1 라운드로 하여, 유사한 작업을 다수 회 반복하였다. SELEX의 완료 후, PCR 산물을 pGEM-T Easy 벡터 (Promega에 의해 제조됨)에 클로닝하고, 대장균 균주 DH5α (Toyobo에 의해 제조됨)를 형질전환시켰다. 단일 콜로니로부터 플라스미드를 추출한 후, 클론의 염기 서열을 모세관 DNA 서열분석기 (3130xl 유전자 분석기, ABI에 의해 제조됨)에 의해 검사하였다. 염기 서열의 대규모 분석은 또한 차세대 서열분석기를 사용하여 수행하였다. 차세대 서열분석기로서, Ion PGMTM 시스템 (Temp에 의해 제조됨)을 사용하였으며 Thermo 매뉴얼에 따라 분석을 수행하였다.
7 라운드의 SELEX 후, 48개 클론의 서열을 모세관 DNA 서열분석기에 의해 결정하여 26개 클론의 서열이 아래 나타낸 컨센서스 서열 1 또는 2를 함유함을 밝혀내었다. 이들 클론의 서열 중 일부는 서열 번호 16-20에 나타내어진다.
또한, 47623 종류의 클론 서열을 차세대 서열분석기에 의해 결정하였으며, 이들이 12728 종류의 서열에 수렴하는 것으로 확인되었다. 이들 클론의 일부 서열은 서열 번호 21-25에 나타내어진다. 서열 번호 21에 나타낸 1,045개의 서열이 존재하였다. 서열 번호 22에 나타낸 595개 서열이 존재하였다. 서열 번호 23에 나타낸 557개의 서열이 존재하였다. 서열 번호 24에 나타낸 442개의 서열이 존재하였다. 서열 번호 25에 나타낸 288개의 서열이 존재하였다. 이들 서열의 2차 구조는 MFOLD 프로그램에 의해 예측하였다 (M. Zuker, Nucleic Acids Res. 31(13), 3406-3415, 2003). 그 결과, 컨센서스 서열 부분은 유사한 루프 구조를 가졌다. 이들 서열의 2차 구조는 도 5a 및 도 5b에 제시되어 있다. 도 5a 및 도 5b에서, 컨센서스 서열은 원으로 싸여져 있다 (○). 또한, 서열 번호 3과는 상이한 서열은 화살표 (흑색 삼각형)로 표시된다.
서열 번호 16-25에 나타낸 각각의 뉴클레오티드 서열이 아래에 제시되어 있다. 특별히 지시되지 않는 한, 아래에 나타낸 서열은 5'에서 3' 방향이며, 퓨린 염기 (A 및 G)는 2'-OH 화합물이고 피리미딘 염기 (U 및 C)는 2'-플루오로 개질된 화합물이다. 서열에서 N1은 임의의 길이를 갖는 6 - 15개 뉴클레오티드를 나타내고, W는 A 또는 U이고, Y는 C 또는 U이다.
서열 번호 16:
GGGACAUGCGUAACUUGAUAGGGGCCUCCGCAGCUGAUCAGCUCGGACUCAAACCAUCAAGUCCAGAUCGAGCA
서열 번호 17:
GGGACAUGCGUAACUGUAUAGGGGCCUCCACAGCUGAAAAGCUUGGACUCAAACCAUACAGUCCAGAUCGAGCA
서열 번호 18:
GGGACAUGCGUAACUGCAUCGGGGCCUCCGCAGCUGUUAAGCUCGGACUCAAACCAUGCAGUCCAGAUCGAGCA
서열 번호 19:
GGGACAUGCGUAACUUGAUAGGGGCCUCCACAGCUGAUAAGCUUGGACUCAAACCAUCAAGUCCAGAUCGAGCA
서열 번호 20:
GGGACAUGCGUAACUGUAUAGGGGCCUCCGCAGCUAUUCAGCUCGGACAUAAACCAUACAGUCCAGAUCGAGCA
서열 번호 21:
GGGACAUGCGUAACUAUAUAGGGGCCUCCACAGCUGUAAAGCUUGGACUUAAACCAUAUAGAGUCCAGAUCGAGCA
서열 번호 22:
GGGACAUGCGUAACUGCAUAGGGGCCUCCACAGCUAUUCAGCUUGGACACAAACCAUGCAGUCCAGAUCGAGCA
서열 번호 23:
GGGACAUGCGUAACUGUAUAGGGGCCUCCACAGCUGAAAAGCUUGGACUCAAACCAUACAGUCCAGAUCGAGCA
서열 번호 24:
GGGACAUGCGUAACUUGAUAGGGGCCUCCACAGCCGGUAGGCUUGGACUCAAACCAUCAAGUCCAGAUCGAGCA
서열 번호 25:
GGGACAUGCGUAACUGCAUAGGGGCCUCCACAGCUAUUCAGCUUGGACACAAACCAUGCAGUCCAGAUCGAGCA
컨센서스 서열 1:
GGGGCCUCC-N1-GGACYAAAC
컨센서스 서열 2:
GGGGCCUCC-N1-GGACWYAAAC
서열 번호 16 - 25에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 ADAMTS5에 대한 결합 활성 및 효소 억제 활성을 측정하였다. 결합 활성은 표면 플라스몬 공명법에 의해 평가하였다. 측정을 위해, 실시예 1에서와 유사한 방법을 사용하였다. 효소 억제 활성은 실시예 1에서와 유사한 방법으로 측정하였다. 측정 결과는 표 7에 나타내어져 있다. 표에서, "++" 및 "+"는 음성 대조군 핵산보다 더 유의하게 ADAMTS5에 결합하는 것을 보여준다. 음성 대조군 핵산은 SELEX 방법의 최초 라운드에서 사용된 핵산 풀을 지칭한다. "++"는 SA 칩에 고정화된 앱타머의 양 (RU 값)에 대한 ADAMTS5 결합 양 (RU 값)의 비율이 40% 이상인 것을 나타내고, "+"는 비율이 40% 미만인 것을 나타낸다. 억제 활성의 수치는 표에 나타낸 각각의 앱타머 농도에서 효소 억제 활성을 나타낸다. "n.d."는 결정되지 않음을 의미한다.
[표 7]
Figure pct00014
서열 번호 16 - 25에 나타낸 서열을 갖는 앱타머는 음성 대조군 핵산보다 더 유의하게 ADAMTS5에 결합하는 것으로 나타났다. 또한, 모든 핵산은 비록 강도는 다양하지만 억제 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
또한, 서열 번호 16 - 25에 나타낸 서열을 갖는 앱타머의 2차 구조의 예측, 결합 활성 및 억제 활성의 결과로부터, 컨센서스 서열에 인접한 말단 스템 서열이 벌지 구조를 함유하더라도 기능하는 것으로 밝혀졌다. 벌지 구조는 스템 구조 내에 염기 쌍을 형성하지 않는 돌출 뉴클레오티드 서열을 갖는 구조를 지칭한다. 벌지 구조는 서열 번호 16 - 25에 나타낸 서열을 갖는 앱타머의 스템 구조에 함유되었다.
실시예 7: 앱타머의 가닥-단축 - (3)
서열 번호 21 및 25에 나타낸 서열을 갖는 앱타머의 가닥-단축 및 염기 치환을 수행하였다. 앱타머의 서열은 서열 번호 26-29에 나타내어진다.
서열 번호 27, 28 및 29에 대해, 서열 번호 11(1)의 변형 도입의 결과에 기초하여, 2'-O-메틸 변형을 도입한 다음 가닥을 단축시켰다. 서열 번호 27 - 29에 나타낸 서열을 갖는 앱타머의 예측된 2차 구조가 도 6에 제시되어 있다. 도 6에서, 컨센서스 서열은 원으로 싸여져 있다 (○). 아래 서열 번호 26 - 29에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열이 아래에 제시되어 있다. 특별히 지시되지 않는 한, 아래에 나타낸 각 서열은 5'에서 3' 방향이며, 대문자는 RNA를 나타낸다. 뉴클레오티드 안의 괄호는 리보스의 2'-위치의 변형을 나타내고, F는 불소 원자이고, M은 O-메틸 그룹이다. "idT"는 역 dT이다.
서열 번호 26:
(서열 번호 21에 나타낸 서열을 컨센서스 서열을 포함한 46개 뉴클레오티드의 길이로 단축시킴으로써 수득된 서열)
GGGU(F)AU(F)AGGGGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)AGC(F)GU(F)AAGC(F)U(F)U(F)GGAC(F)U(F)U(F)AAAC(F)C(F)AU(F)AC(F)C(F)C(F)
서열 번호 27:
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 21에 나타낸 서열에 도입하여 서열 번호 11(1)의 2'-위치의 변형을 반영하고, 컨센서스 서열을 함유한 40개 뉴클레오티드의 길이로 단축시킴으로써 수득된 서열)
U(M)A(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)U(M)A(M)
서열 번호 28:
(서열 번호 27에 나타낸 서열의 양 말단 상의 두 개의 뉴클레오티드를 다른 서열로 치환함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
서열 번호 29:
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 25에 나타낸 서열에 도입하여 서열 번호 11(1)의 2'-위치의 변형을 반영하고, 컨센서스 서열을 함유한 40개 뉴클레오티드의 길이로 단축시키고, idT를 3'-말단에 부가함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)A(M)U(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)AC(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
서열 번호 26에 나타낸 서열을 갖는 앱타머는 T7RNA 폴리머라제에 의한 전사에 의해 제조하고, 서열 번호 27 - 29에 나타낸 서열을 갖는 앱타머는 화학적 합성에 의해 제조하였다. 이들 앱타머가 ADAMTS5의 효소 활성을 억제하는지 여부는 실시예 1에서와 유사한 방법으로 평가하였다. 측정 결과는 표 8에 나타내어져 있다. 표에서, "n.d."는 결정되지 않음을 의미한다.
[표 8]
Figure pct00015
서열 번호 26 - 29에 나타낸 서열을 갖는 앱타머는 모두 억제 활성을 유지하였다. 상기 결과로부터, 서열 번호 21 및 25에 나타낸 앱타머는 컨센서스 서열을 포함한 40개 뉴클레오티드의 길이로 기능하는 것으로 밝혀졌다. 서열 번호 27 및 28에 나타낸 서열을 갖는 앱타머의 결과로부터, 말단 상의 두 개의 염기 쌍, UA 쌍 및 AU 쌍의 각각 CG 쌍 및 GC 쌍으로의 치환이 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다.
실시예 8: 앱타머의 변형 - 3
서열 번호 28, 29에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머의 뉴클레아제 내성을 향상시키기 위해, 말단 변형을 갖는 변이체, 플루오로 그룹이 도입된 변이체, 및 2'-O-메틸 그룹이 도입된 변이체를 제조하였다. 변형된 서열은 서열 번호 28(1) - 28(18) (서열 번호 28 계통), 29(1) - 29(3) (서열 번호 29 계통)에 나타내어진다.
서열 번호 28(1) - 28(18), 29(1) - 29(3)에 나타낸 뉴클레오티드 서열이 아래에 제시된다. 특별히 지시되지 않는 한, 아래에 나타낸 각각의 서열은 5'에서 3'방향이며, 대문자는 RNA를 나타낸다. 뉴클레오티드 안의 괄호는 리보스의 2'- 위치의 변형을 나타내고, F는 불소 원자이고, M은 O-메틸 그룹이다. 서열 말단에서 idT는 역-dT에 의한 변형을 나타내고, PEG는 40 kDa 분지형 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형을 나타낸다.
서열 번호 28(1):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 28에 나타낸 서열의 컨센서스 서열 이외의 서열의 3 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(M)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
서열 번호 28(2):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 28에 나타낸 서열의 컨센서스 서열 이외의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
서열 번호 28(3):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 28에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(M)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
서열 번호 28(4):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 28에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(M)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
서열 번호 28(5):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 28에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 4 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(M)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
서열 번호 28(6):
(2'-플루오로 변형을 서열 번호 28에 나타낸 서열의 컨센서스 서열 이외의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)A(F)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
서열 번호 28(7):
(2'-플루오로 변형을 서열 번호 28에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)G(F)GC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
서열 번호 28(8):
(2'-플루오로 변형을 서열 번호 28에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GG(F)C(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
서열 번호 28(9):
(2'-플루오로 변형을 서열 번호 28에 나타낸 서열의 컨센서스 서열 이외의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)A(F)C(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
서열 번호 28(10):
(2'-플루오로 변형을 서열 번호 28에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)G(F)AC(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
서열 번호 28(11):
(2'-플루오로 변형을 서열 번호 28에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GA(F)C(F)U(F)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
서열 번호 28(12):
(2'-플루오로 변형을 서열 번호 28에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)AAG(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(F)U(F)A(F)A(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)
서열 번호 28(13):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 28에 나타낸 서열의 5 위치에 도입하고 idT를 3'-말단에 부가함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(M)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(M)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
서열 번호 28(14):
(2'-플루오로 변형을 서열 번호 28(13)에 나타낸 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)G(F)GC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(M)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)G(F)AC(F)U(M)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
서열 번호 28(15):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 28에 나타낸 서열의 4 위치에 도입하고 idT를 3'-말단에 부가함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(M)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(M)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
서열 번호 28(16):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 28에 나타낸 서열의 4 위치에 도입하고 idT를 3'-말단에 부가함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(M)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
서열 번호 28(17):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 28에 나타낸 서열의 3 위치에 도입하고 idT를 3'-말단에 부가함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(F)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(M)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
서열 번호 28(18):
(PEG를 서열 번호 28(15)에 나타낸 서열의 5'-말단에 부가함으로써 수득된 서열)
PEG-C(M)G(M)U(M)AG(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)G(M)U(M)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)U(M)U(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
서열 번호 29(1):
(2'-O-메틸 변형을 서열 번호 29에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)GGC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)A(M)U(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)GAC(F)A(M)C(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
서열 번호 29(2):
(2'-플루오로 변형을 서열 번호 29에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 하나의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)G(F)GC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)A(M)U(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)G(F)AC(F)A(M)C(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
서열 번호 29(3):
(2'-플루오로 변형을 서열 번호 29에 나타낸 서열의 컨센서스 서열의 두 개의 위치에 도입함으로써 수득된 서열)
C(M)G(M)U(M)A(M)G(M)G(M)G(F)GC(F)C(F)U(F)C(F)C(F)AC(F)A(M)G(M)C(M)A(M)U(M)U(M)C(M)G(M)C(M)U(M)U(M)G(M)G(F)AC(F)AC(F)AA(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)G(M)-idT
서열 번호 28(1) - 28(18) (서열 번호 28 계통) 및 서열 번호 29(1) - 29(3) (서열 번호 29 계통)에 나타낸 서열을 갖는 앱타머는 모두 화학적 방법에 의해 제조하였다. 이들 앱타머가 ADAMTS5의 효소 활성을 억제하는지 여부는 실시예 1 및 실시예 5에서와 유사한 방법으로 평가하였다. 측정 결과는 표 9에 나타내어져 있다. 표에서, "n.d."는 결정되지 않음을 의미한다. 표에서, "평가 방법 1"은 전기영동을 검출 방법으로 사용하는 효소 억제 활성 평가 방법이고, 10 nM 핵산의 최종 농도에서 억제 활성을 보인다. "평가 방법 2"는 ELISA 방법을 검출 방법으로 사용하는 효소 억제 활성 평가 방법이고, 2 nM 핵산의 최종 농도에서 억제 활성 및 IC50 값을 보여준다. "n.d."는 결정되지 않음을 의미한다.
[표 9]
Figure pct00016
서열 번호 28(2) 및 28(6)에 나타낸 서열을 갖는 앱타머의 결과로부터, 5'-말단으로부터 4번째 염기의 A (스템 1에서 벌지 구조를 형성함)는 RNA 뿐만 아니라 2'-플루오로 변형 및 2'-O-메틸 변형에 기능하는 것으로 밝혀졌다. 서열 번호 28(3) 및 29(1)에 나타낸 서열을 갖는 앱타머의 결과로부터, 컨센서스 서열의 3'-말단에서 7번째 W (A 또는 U)가 RNA, 2'-플루오로 변형 및 2'-O-메틸 변형에 대해서도 기능하는 것으로 밝혀졌다. 서열 번호 28(7), 28(8), 28(10), 28(12), 29(2))에 나타낸 서열을 갖는 앱타머의 결과로부터, 컨센서스 서열의 5'-말단에서 3번째 염기 및 4번째 염기의 G, 및 3'-말단에서 10번째 염기 G 및 5번째 염기 A가 RNA 뿐만 아니라 2'-플루오로 변형에 대해서도 기능하는 것으로 밝혀졌다. 다른 한편으로, 서열 번호 28(4) 및 28(11)에 나타낸 서열을 갖는 앱타머의 결과로부터, 컨센서스 서열의 3'-말단에서 6번째 Y에 2'-O-메틸화 변형의 도입은 앱타머의 억제 활성을 현저하게 약화시키고, 3'-말단에서 9번째 A의 2'-플루오르화 변형은 앱타머의 활성을 낮추는 것으로 밝혀졌다.
서열 번호 28(13) - (18) (서열 번호 28 계통), 29 및 29(1) - 29(3) (서열 번호 29 계통)에 나타낸 서열을 갖는 앱타머의 결과로부터, 5'-말단에 PEG를 첨가하고 3'-말단에 idT를 첨가하는 것이 억제 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 말단 변형으로서, PEG 및 idT 이외에 펩티드, 아미노산, 당, 글리코사미노글리칸, 비오틴 등이 언급될 수 있다.
실시예 9: ADAMTS5에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머의 제조 - (3)
ADAMTS5에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머는 Vater 등의 SELEX 방법 (Vater et al. Nucleic Acid Research, 31, e130, 2003)의 개선된 방법으로 제조하였다. SELEX에 대한 표적 물질로서, NHS-활성화된 세파로스 4 Fast Flow (GE healthcare에 의해 제조됨)의 담체 상에 고정화된 ADAMTS5 (R&D systems에 의해 제조됨)를 사용하였다. 최초 라운드에 사용된 RNA는 실시예 1에서와 유사한 방법으로 화학적으로 합성된 DNA를 전사함으로써 수득하였다. 이 방법에 의해 수득된 RNA는 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스의 2'-위치가 플루오르화된 것이다. 사용된 주형 및 프라이머의 서열은 아래에 나타내어져 있다. DNA 주형 및 프라이머는 화학적 합성에 의해 제조하였다. 주형 DNA는 서열 번호 11의 서열의 컨센서스 서열 이외의 스템-루프 영역의 서열에 돌연변이가 도입된 설계를 갖는다.
DNA 주형: 5'-ATATCTTTTGCTTATTCTCGAGAATTGGTTTAGTCCANNNNNNNNNNGTGGAGGCCCCAATACCCTATAGTGAGTCGTATTA-3' (서열 번호 52)
프라이머 Fwd: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGT-3' (서열 번호 53)
프라이머 Rev: 5'-ATATCTTTTGCTTATTCTCGAG-3' (서열 번호 54)
DNA 주형 (서열 번호 46)의 연속 N은 10개 뉴클레오티드의 임의의 조합이다 (각각의 N은 A, C, G 또는 T이다). 프라이머 Fwd는 T7 RNA 폴리머라제의 프로모터 서열을 포함한다. 최초 라운드에서 사용된 RNA 풀의 변동은 이론적으로 1013이었다.
RNA 풀을 ADAMTS5가 고정화된 담체에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 유지시켰다. 수지를 용액 A로 세정하여 ADAMTS5에 결합되지 않은 RNA를 제거하였다. 여기서, 용액 A는 145mM 염화나트륨, 5.4mM 염화칼륨, 1.8mM 염화칼슘, 0.8mM 염화마그네슘, 20mM 트리스 (pH 7.6), 0.05% Tween 20의 혼합 용액이다. ADAMTS5에 결합된 RNA는 용액 B를 용출제로서 첨가하고, 혼합물을 95℃에서 3분 동안 열처리하고, 이의 상청액으로부터 회수함으로써 수득하였다. 여기서, 용액 B는 7M 우레아, 5 mM EDTA, 및 20 mM 트리스 (pH 7.6)의 혼합 용액이다. 회수된 RNA에서, 프라이머 서열을 T7 RNA 리가네 2 (New England Biolabs에 의해 제조됨)를 사용하여 양 말단에 연결하고 RNA를 역전사 PCR에 의해 증폭시켰다. 제한 효소 부위 XhoI는 Rev 프라이머의 3'-말단에 설계하였으며, Rev 프라이머 서열은 PCR 증폭 산물을 XhoI (New England Biolabs에 의해 제조됨)로 소화함으로써 제거될 수 있다. 제한 효소로 소화된 PCR 증폭 산물을 주형으로서 사용하여, 이를 DuraScribeTM T7 전사 키트를 사용하여 전사시키고 다음 라운드를 위한 풀로서 사용하였다. 상기를 1 라운드로 하여, 유사한 작업을 다수회 반복하였다. SELEX의 완료 후, 뉴클레오티드 서열의 대규모 분석을 또한 차세대 서열분석기를 사용하여 수행하였다. 차세대 서열분석기로서, Ion PGMTM 시스템 (Temp에 의해 제조됨)을 사용하였으며 Thermo의 매뉴얼에 따라 분석을 수행하였다.
3 라운드의 SELEX 후, 차세대 서열분석기에 의해 7956 종류의 클론 서열이 결정되었으며, 이들은 7676 종류의 서열로 수렴되는 것으로 확인되었다. 이들 클론의 일부 서열은 서열 번호 30 - 45에 나타내어진다. 서열 번호 30으로 나타낸 4개의 서열이 존재하였다. 서열 번호 31 - 45로 나타낸 3개의 서열이 존재하였다.
이들 서열의 2차 구조는 MFOLD 프로그램에 의해 예측하였다 (M. Zuker, Nucleic Acids Res. 31(13), 3406-3415, 2003). 그 결과, 컨센서스 서열 부분은 유사한 루프 구조를 가졌다. 이들 서열의 2차 구조는 도 7a, 도 7b, 및 도 7c에 제시되어 있다. 도 7a, 도 7b, 및 도 7c에서, 컨센서스 서열은 원으로 싸여져 있다 (○). 또한, 서열 번호 11과는 상이한 서열은 화살표 (흑색 삼각형)로 표시된다.
서열 번호 30 - 45에 나타낸 각각의 뉴클레오티드 서열은 아래에 제시되어 있다. 특별히 지시되지 않는 한, 아래에 나타낸 서열은 5'에서 3' 방향이며, 퓨린 염기 (A 및 G)는 2'-OH 화합물이고 피리미딘 염기 (U 및 C)는 2'-플루오로 개질된 화합물이다.
서열 번호 30:
GGGUAUUGGGGCCUCCACAAUAGAUAAAUGGACUAAACCAACUCGA
서열 번호 31:
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGUUGAAGCUUGGACUAAACCAAUCUCGA
서열 번호 32:
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGAAAAAUCUUGGACUAAACCAAUCUCGA
서열 번호 33:
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGCCGAGGCUUGGACUAAACCAAUCUCGA
서열 번호 34:
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGAAAAAACUUGGACUAAACCAACUCGA
서열 번호 35:
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGUAAGCACUUGGACUAAACCAGCUCGA
서열 번호 36:
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGUUUAAACUUGGACUAAACCAACUCGA
서열 번호 37:
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGUAAAUUCUUGGACUAAACCAACUCGA
서열 번호 38:
GGGUAUUGGGGCCUCCACGCUAGAAGGCUGGACUAAACCAACUCGA
서열 번호 39:
GGGUAUUGGGGCCUCCACGUAACUAAACUGGACUAAACCAACUCGA
서열 번호 40:
GGGUAUUGGGGCCUCCACGCAAUGGUGCUGGACUAAACCAACUCGA
서열 번호 41:
GGGUAUUGGGGCCUCCACAUGGAUACAUUGGACUAAACCAACUCGA
서열 번호 42:
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGAUAAUUCUUGGACUAAACCAACUCGA
서열 번호 43:
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGAAAAUUCUUGGACUAAACCAACUCGA
서열 번호 44:
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGAACUUUCUUGGACUAAACCAACUCGA
서열 번호 45:
GGGUAUUGGGGCCUCCACAGAAAAGUCUUGGACUAAACCAACUCGA
서열 번호 30 - 45에 나타낸 핵산의 ADAMTS5에 대한 결합 활성을 측정하였다. 결합 활성은 표면 플라스몬 공명법에 의해 평가하였다. 측정 결과는 표 10에 나타내어져 있다. 표에서, "++"는 SA 칩 상에 고정화된 앱타머의 양 (RU 값)에 대한 ADAMTS5 결합 양 (RU 값)의 비율이 40% 이상인 것을 나타내고, "+"는 비율이 10% 이상 40% 미만인 것을 나타내고, "-"는 비율이 10% 미만인 것을 나타낸다.
[표 10]
Figure pct00017
측정 결과로부터, 모든 시험된 서열이 ADAMTS5에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 서열 번호 30 - 45의 결과로부터, SELEX 방법에 의해 돌연변이가 도입된 서열 번호 11의 16번째 G에서 23번째 C까지의 서열은 2 또는 3개의 연속 염기 쌍을 형성하는 경향이 있지만, 뉴클레오티드 서열은 무작위로 가변적인 것으로 밝혀졌다.
실시예 10: 활막 세포에서 ADAMTS5 앱타머의 아그레칸 절단 억제 활성의 평가
활막 세포에서 서열 번호 11(34), 28(13), 28(15), 28(18)에 나타낸 앱타머의 아그레칸 절단 억제 활성을 측정하였다. 측정은 다음의 방법에 의해 수행하였다. 인간 무릎 골관절염 환자로부터 유도된 활막 세포 (HFLS-OA 세포) (Cell Applications에 의해 제조됨)를 웰당 2x104개 세포로 접종하고, 16 - 24시간 동안 배양하였다. 배양 방법은 Cell Applications의 매뉴얼을 따랐다. 배양 후, 배지를 제거하고, 세포를 기본 배지 (Cell Applications에 의해 제조됨)로 세정하고, 기본 배지로 희석된 500 ng의 아그레칸 G1-IGD-G2 (R&D systems에 의해 제조됨)를 기질로서 첨가하였다. 앱타머를 기질과 동시에 샘플에 첨가하여 앱타머에 의한 억제를 평가하였다. 세포를 계속 배양하고 3일 후에 배양 상청액을 수집하였다. 첨가된 기질은 HFLS-OA 세포로부터 분비된 ADAMTS5와 같은 기질-절단 효소에 의해 배양 동안 절단된다. 배양 상청액에 함유된 절단된 기질 단편의 양은 실시예 5에 기술된 ELISA 방법에 의해 정량하였다. 이 평가 시스템에서 기질 절단 효율은 1 - 8%였다. 서열 번호 15에 나타낸 핵산을 음성 대조군으로 사용하였다. 측정 결과는 표 11에 나타내어져 있다.
[표 11]
Figure pct00018
측정 결과로서, 모든 앱타머는 음성 대조군과 비교하여 현저한 억제 활성을 나타내었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 앱타머는 활막 세포에서 기질 절단에 대해 우수한 억제 효과를 나타낸다고 말할 수 있다.
[산업상 이용 가능성]
본 발명의 앱타머 또는 복합체는 무릎 골관절염 등과 같은 연골 질환의 약제 또는 진단제 또는 시약으로서 유용할 수 있다. 본 발명의 앱타머 또는 복합체는 또한 ADAMTS5의 정제 및 농축, ADAMTS5의 표지 및 ADAMTS5의 검출 및 정량에 유용할 수 있다.
본 출원은 일본에서 출원된 특허 출원 제2017-216280호 (출원일: 2017년 11월 9일)을 기초로 하며, 이의 내용은 본원에 전부 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Ribomic Inc. Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. <120> Aptamer against ADAMTS5 and use thereof <130> 092818 <150> JP2017-216280 <151> 2017-11-09 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 1 ggguacgacc gucguacgau uggggccucc acagcugcuc agcuuggacu aaaccaauaa 60 gagacuaacg ccuagcguac 80 <210> 2 <211> 79 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence not binding to ADAMTS5 <400> 2 ggguacgacc gucguacgau ugggccucca cagcugcuca gcuuggacua aaccaauaag 60 agacuaacgc cuagcguac 79 <210> 3 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 3 ggauuggggc cuccacagcu gcucagcuug gacuaaacca aucc 44 <210> 4 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 4 ggcuuggggc cuccacagcu gcucagcuug gacuaaacca agcc 44 <210> 5 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 5 ggcuuggggc cuccacagcg cucgcuugga cuaaaccaag cc 42 <210> 6 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 6 ggcuuggggc cuccacagcu gucagcuugg acuaaaccaa gcc 43 <210> 7 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence not binding to ADAMTS5 <400> 7 ggcuuggggc cuccacagcu gcucagcuug gacuaaccaa gcc 43 <210> 8 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence not binding to ADAMTS5 <400> 8 ggcuuggggc cucacagcug cucagcuuga cuaaaccaag cc 42 <210> 9 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence not binding to ADAMTS5 <400> 9 ggauuggggc cuccacagcg ucgcuuggac uaaaccaauc c 41 <210> 10 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 10 auuggggccu ccacagcugc ucagcuugga cuaaaccaau 40 <210> 11 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 11 auuggggccu ccacagcgcu cgcuuggacu aaaccaau 38 <210> 12 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 12 uuggggccuc cacagcgcuc gcuuggacua aaccaa 36 <210> 13 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 13 gcuggggccu ccacagcgcu cgcuuggacu aaaccagc 38 <210> 14 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 14 auuggggccu ccacagcuuc ggcuuggacu aaaccaau 38 <210> 15 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 15 auuggcacgg agacagcgcu cgcuucucga ucaccaau 38 <210> 16 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 16 gggacaugcg uaacuugaua ggggccuccg cagcugauca gcucggacuc aaaccaucaa 60 guccagaucg agca 74 <210> 17 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 17 gggacaugcg uaacuguaua ggggccucca cagcugaaaa gcuuggacuc aaaccauaca 60 guccagaucg agca 74 <210> 18 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 18 gggacaugcg uaacugcauc ggggccuccg cagcuguuaa gcucggacuc aaaccaugca 60 guccagaucg agca 74 <210> 19 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 19 gggacaugcg uaacuugaua ggggccucca cagcugauaa gcuuggacuc aaaccaucaa 60 guccagaucg agca 74 <210> 20 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 20 gggacaugcg uaacuguaua ggggccuccg cagcuauuca gcucggacau aaaccauaca 60 guccagaucg agca 74 <210> 21 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 21 gggacaugcg uaacuauaua ggggccucca cagcuguaaa gcuuggacuu aaaccauaua 60 gaguccagau cgagca 76 <210> 22 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 22 gggacaugcg uaacugcaua ggggccucca cagcuauuca gcuuggacac aaaccaugca 60 guccagaucg agca 74 <210> 23 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 23 gggacaugcg uaacuguaua ggggccucca cagcugaaaa gcuuggacuc aaaccauaca 60 guccagaucg agca 74 <210> 24 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 24 gggacaugcg uaacuugaua ggggccucca cagccgguag gcuuggacuc aaaccaucaa 60 guccagaucg agca 74 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gacuaaacca aucucga 47 <210> 32 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 32 ggguauuggg gccuccacag aaaaaucuug gacuaaacca aucucga 47 <210> 33 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 33 ggguauuggg gccuccacag ccgaggcuug gacuaaacca aucucga 47 <210> 34 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 34 ggguauuggg gccuccacag aaaaaacuug gacuaaacca acucga 46 <210> 35 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 35 ggguauuggg gccuccacag uaagcacuug gacuaaacca gcucga 46 <210> 36 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 36 ggguauuggg gccuccacag uuuaaacuug gacuaaacca acucga 46 <210> 37 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 37 ggguauuggg gccuccacag uaaauucuug gacuaaacca acucga 46 <210> 38 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 38 ggguauuggg gccuccacgc uagaaggcug gacuaaacca acucga 46 <210> 39 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 39 ggguauuggg gccuccacgu aacuaaacug gacuaaacca acucga 46 <210> 40 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 40 ggguauuggg gccuccacgc aauggugcug gacuaaacca acucga 46 <210> 41 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 41 ggguauuggg gccuccacau ggauacauug gacuaaacca acucga 46 <210> 42 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 42 ggguauuggg gccuccacag auaauucuug gacuaaacca acucga 46 <210> 43 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 43 ggguauuggg gccuccacag aaaauucuug gacuaaacca acucga 46 <210> 44 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 44 ggguauuggg gccuccacag aacuuucuug gacuaaacca acucga 46 <210> 45 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> aptamer against ADAMTS5 <400> 45 ggguauuggg gccuccacag aaaagucuug gacuaaacca acucga 46 <210> 46 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA template <220> <221> misc_feature <222> (21)..(60) <223> n is a, c, g, or t <400> 46 gtacgctagg cgttagtctc nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 atcgtacgac ggtcgtaccc 80 <210> 47 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Fwd <400> 47 taatacgact cactataggg tacgaccgtc gtacgat 37 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Rev <400> 48 gtacgctagg cgttagtctc 20 <210> 49 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA template <400> 49 tgctcgatct ggactggatt ggtttagtcc aagctgagca gctgtggagg ccccaatcca 60 gttacgcatg tccc 74 <210> 50 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Fwd <400> 50 taatacgact cactataggg acatgcgtaa ct 32 <210> 51 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Rev <400> 51 tgctcgatct ggact 15 <210> 52 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA template <220> <221> misc_feature <222> (38)..(47) <223> n is a, c, g, or t <400> 52 atatcttttg cttattctcg agaattggtt tagtccannn nnnnnnngtg gaggccccaa 60 taccctatag tgagtcgtat ta 82 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Fwd <400> 53 taatacgact cactataggg t 21 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer Rev <400> 54 atatcttttg cttattctcg ag 22

Claims (17)

  1. ADAMTS5 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5)에 결합하는, 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 나타내어지는 서열을 포함하는 앱타머(aptamer):
    화학식 1
    GGGGCCUCC-N1-GGACYAAACC
    화학식 2
    GGGGCCUCC-N1-GGACWYAAACC
    여기서, N1은 3 내지 24개 길이의 염기를 나타내고, Y는 C 또는 U이고, W는 A 또는 U이다 (우라실은 임의로 티민이다).
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 1' 또는 화학식 2'로 나타내어지는 잠재적 2차 구조를 갖는 앱타머:
    화학식 1' 화학식 2'
    Figure pct00019
    또는
    Figure pct00020

    여기서, 화학식 1' 및 화학식 2'에서
    Figure pct00021
    의 부분은 벌지 구조 (bulge structure)를 임의로 갖는 스템-루프 구조(stem-loop structure)를 나타내고 N1 부분이며, Y는 C 또는 U이고, W는 A 또는 U이다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, ADAMTS5의 활성을 억제하는 앱타머.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 80개 이하의 염기 길이를 갖는 앱타머.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, W가 U인 앱타머.
  6. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, Y가 U인 앱타머.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, N1이 화학식 3인 앱타머:
    화학식 3
    X1CAGCN2GCUX2
    여기서, N2는 3 내지 15개의 임의의 수의 뉴클레오티드를 나타내고, X1 및 X2는 A/U 염기 또는 G/C 염기의 조합을 나타낸다.
  8. 제7항에 있어서, N2에 대한 뉴클레오티드의 수가 4인 앱타머.
  9. 제1항에 있어서, 하기 (a), (b) 및 (c)의 뉴클레오티드 서열 중의 어느 것을 포함하는 앱타머:
    (a) 서열 번호 1, 3 - 6, 10 - 14, 16 - 45 중의 어느 것으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 (우라실은 임의로 티민이다);
    (b) 1개 내지 수 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 서열 번호 1, 3 - 6, 10 - 14, 16 - 45 중의 어느 것으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 (우라실은 임의로 티민이다); 및
    (c) 서열 번호 1, 3 - 6, 10 - 14, 16 - 45 중의 어느 것으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 (우라실은 임의로 티민이다)과 70% 이상의 동일성(identity)을 갖는 뉴클레오티드 서열.
  10. 제9항에 있어서, 앱타머에 함유된 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형 또는 변경되는 앱타머.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 앱타머에 함유된 각각의 피리미딘 뉴클레오티드의 리보스 2'-위치의 하이드록실 그룹이 동일하거나 상이하고 치환되지 않거나 수소 원자, 불소 원자 및 메톡시 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 원자 또는 그룹에 의해 치환되는 앱타머.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 앱타머에 함유된 각각의 퓨린 뉴클레오티드의 리보스 2'-위치의 하이드록실 그룹이 동일하거나 상이하고 치환되지 않거나 수소 원자, 불소 원자 및 메톡시 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 원자 또는 그룹에 의해 치환되는 앱타머.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 앱타머 및 기능성 물질을 포함하는 복합체.
  14. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 앱타머 또는 제13항에 따르는 복합체를 포함하는 약제.
  15. 제14항에 있어서, 아그레칸(Aggrecan)의 과도한 분해에 의해 유발된 질환에 대한 치료제인 약제.
  16. 제15항에 있어서, 아그레칸의 과도한 분해에 의해 유발된 질환이 관절염 (arthritis) 또는 무릎 골관절염 (knee osteoarthritis)인 약제.
  17. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 앱타머 또는 제13항에 따르는 복합체를 사용함을 포함하여, ADAMTS5를 검출하는 방법.
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