WO2010143714A1 - キマーゼに対するアプタマー及びその使用 - Google Patents

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WO2010143714A1
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義一 中村
玲 金
聡子 山▲崎▼
寿子 池田
正宏 村口
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株式会社リボミック
大塚製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to aptamers for chymase and methods for using the aptamers.
  • Human chymase (EC 3.4.21.39) is a type of chymotrypsin-like serine protease that is stored in secretory granules of mast cells. Mast cells undergo degranulation when externally stimulated, and human chymase is released extracellularly along with various inflammatory mediators. The released human chymase specifically recognizes an aromatic amino acid such as phenylalanine or tyrosine contained in a substrate protein or peptide and cleaves the peptide bond adjacent to the amino acid.
  • a typical substrate for human chymase is angiotensin I (AngI). Human chymase cleaves AngI to produce angiotensin II (AngII), a vasoconstrictor.
  • Mammalian chymases are systematically classified into two subfamilies, ⁇ and ⁇ . Only one type of chymase expressed by primates including humans belongs to the ⁇ family. On the other hand, rodents express both ⁇ and ⁇ chymases. In the case of mice, a plurality of types of chymase are known. From the viewpoint of substrate specificity and tissue expression, mouse most cell protease-4 (mMCP-4) belonging to the ⁇ family is considered to be the closest to human chymase. In addition, hamster chemase-1 belonging to the ⁇ family also corresponds to hamsters.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • LTBP latent TGF- ⁇ binding protein
  • chymase is thought to be involved in the release of latent TGF- ⁇ from the extracellular matrix and the conversion reaction of latent TGF- ⁇ to active TGF- ⁇ .
  • Chymase is known to be associated with various diseases such as fibrosis, cardiovascular disease, inflammation, allergic disease, and organ adhesion.
  • Fibrosis is a disease in which abnormal metabolism of extracellular matrix occurs in the lungs, heart, liver, kidney, skin, etc., resulting in excessive deposition of connective tissue proteins.
  • connective tissue proteins such as collagen are excessively deposited in the lungs, and the alveoli are hardened and become difficult to breathe.
  • Lung fibrosis is caused by pneumoconiosis caused by exposure to large amounts of dust, drug-induced pneumonia caused by drug use such as anticancer drugs, allergic pneumonia, pulmonary tuberculosis, autoimmune diseases such as collagen disease, etc. I know that. On the other hand, there are many cases where the cause is unknown. The molecular pathogenesis of fibrosis has not been fully elucidated. In general, the growth and function of fibroblasts are well controlled under normal conditions, but when inflammation or trauma is severe or persistent, the tissue repair mechanism works excessively and fibroblasts Overgrowth and overproduction of connective tissue proteins occur. TGF- ⁇ is known as a factor causing such a phenomenon.
  • chymase inhibitors can be used as prophylactic or therapeutic agents for diseases associated with chymase such as fibrosis.
  • chymase inhibitors low molecular compounds such as TPC-806, SUN-13834, SUN-C8257, SUN-C8077, and JNJ-10311795 have been developed (Patent Document 1).
  • RNA aptamers are an RNA that specifically binds to a target substance such as a protein, and can be prepared using the SELEX method (Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment) (Patent Documents 2 to 4).
  • the SELEX method is a method for selecting RNA that specifically binds to a target substance from a pool of RNA having about 10 14 different nucleotide sequences.
  • the RNA used has a structure in which a random sequence of about 40 nucleotides is sandwiched between primer sequences. This RNA pool is associated with the target substance, and only the RNA bound to the target substance is recovered using a filter or the like. The recovered RNA is amplified by RT-PCR and used as a template for the next round. By repeating this operation about 10 times, an RNA aptamer that specifically binds to the target substance may be obtained.
  • Aptamer drugs can target extracellular proteins in the same way as antibody drugs, but there are some possibilities over antibody drugs in some respects by referring to many published academic papers. For example, aptamers often exhibit higher affinity and specificity for target molecules than antibodies. In addition, it is difficult to receive immune exclusion, and side effects such as antibody-specific antibody-dependent cytotoxicity (ADCC) and complement-dependent cytotoxicity (CDC) are unlikely to occur. From the viewpoint of delivery, aptamers are about 1/10 of the molecular size of antibodies, so that tissue migration is likely to occur, and it is easier to deliver a drug to a target site. Since aptamers are produced by chemical synthesis, site-selective chemical modification is possible, and cost reduction can be achieved by mass production.
  • ADCC antibody-specific antibody-dependent cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • aptamers In addition, long-term storage stability and heat / solvent resistance are also superior features of aptamers. On the other hand, the blood half-life of aptamers is generally shorter than that of antibodies. However, this point may be a merit when toxicity is considered. From the above points, even if the drug targets the same molecule, the aptamer drug may be superior to the antibody drug.
  • An object of the present invention is to provide an aptamer for chymase and a method for using the aptamer.
  • the present inventors have succeeded in producing a high-quality aptamer for chymase, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides the following inventions and the like: [1] An aptamer that binds to chymase and inhibits chymase activity. [2] X 1 GAUAGAN 1 N 2 UAAX 2 (SEQ ID NO: 21; wherein X 1 and X 2 are the same or different and are A or G; N 1 and N 2 are the same or different; , G, C, U or T). The aptamer according to [1]. [3] The aptamer according to [2], wherein N 1 N 2 is GA, GU, GC, UU, GT or CU. [4] The aptamer according to [2], wherein X 1 and X 2 are both A or G.
  • [5] The aptamer according to [3] or [4], wherein at least one of pyrimidine nucleotides is modified or altered.
  • [6] The aptamer according to [1], comprising the nucleotide sequence of any of the following (a), (b), or (c): (A) a nucleotide sequence selected from any of SEQ ID NOs: 4-34, 38-57, 59-65, and 69-72 (provided that uracil may be thymine); (B) in a nucleotide sequence selected from any of SEQ ID NOs: 4-34, 38-57, 59-65, and 69-72 (provided that uracil may be thymine), 1-5 nucleotides Substituted, deleted, inserted or added nucleotide sequence; or (c) a nucleotide sequence selected from any of SEQ ID NOs: 4-34, 38-57, 59-65 and 69-72 (provided that ura
  • the hydroxyl group at the 2 ′ position of ribose of each pyrimidine nucleotide contained in the aptamer is the same or different and is unsubstituted, or an atom or group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a fluorine atom and a methoxy group
  • the aptamer according to [1] which is substituted.
  • the hydroxyl group at the 2′-position of the ribose of each purine nucleotide contained in the aptamer is the same or different and is an unsubstituted atom or group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a fluorine atom and a methoxy group
  • the aptamer according to [1] which is substituted.
  • a complex comprising the aptamer according to any one of [1] to [10] and a functional substance.
  • the complex according to [11], wherein the functional substance is an affinity substance, a labeling substance, an enzyme, a drug delivery vehicle, or a drug.
  • a medicament comprising the aptamer according to any one of [1] to [10] or the complex according to [11] or [12].
  • a diagnostic agent comprising the aptamer according to any one of [1] to [10] or the complex according to [11] or [12].
  • a chymase detection probe comprising the aptamer according to any one of [1] to [10] or the complex according to [11] or [12].
  • a solid phase carrier for purifying chymase comprising the aptamer according to any one of [1] to [10] or the complex according to [11] or [12].
  • a method for detecting chymase comprising using the aptamer according to any one of [1] to [10] or the complex according to [11] or [12].
  • a method for purifying chymase comprising using the aptamer according to any one of [1] to [10] or the complex according to [11] or [12].
  • the aptamer and complex of the present invention can be useful as a medicament for various diseases caused by chymase such as fibrosis and cardiovascular diseases, or as a diagnostic agent or reagent.
  • the aptamers and complexes of the present invention may also be useful for the purification and concentration of chymase and the detection and quantification of chymase.
  • FIG. 3 is a diagram showing secondary structures predicted by the MFOLD program of aptamers represented by SEQ ID NOs: 22 to 27.
  • the consensus sequence represented by SEQ ID NO: 21 is indicated by a circle.
  • FIG. 3 is a diagram showing secondary structures predicted by the MFOLD program of aptamers represented by SEQ ID NOs: 28 to 34.
  • the consensus sequence represented by SEQ ID NO: 21 is indicated by a circle. It is a figure which shows a mode that the aptamer represented by sequence number 12 and 13 couple
  • FIG. 3 is a diagram showing secondary structures predicted by the MFOLD program of aptamers having the sequences represented by SEQ ID NOs: 38 to 40, 43, and 48. The consensus sequence represented by SEQ ID NO: 21 is indicated by a circle.
  • FIG. 3 is a diagram showing secondary structures predicted by the MFOLD program of aptamers represented by SEQ ID NOs: 49, 51, 55 to 57.
  • SEQ ID NO: 21 The consensus sequence represented by SEQ ID NO: 21 is indicated by a circle. It is a figure which shows a mode that the aptamer represented by sequence number 13, 55, 56 couple
  • 40N is an RNA pool containing a random sequence of 40 nucleotides. Chymase was immobilized on the chip surface, and aptamer or negative control 40N was run as an analyte. The measurement was performed with Biacore T100 manufactured by GE Healthcare.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of detecting the degradation of LTBP-1 by chymase and the inhibition of LTBP-1 degradation by the aptamers included in Table 9 by Western blotting. Lane numbers 1, 8, 9, 23, and 31 are markers, lane numbers 6, 21, and 29 are negative controls (no inhibitor), and lane numbers 7, 22, and 30 are controls with no chymase added.
  • the present invention provides an aptamer having binding activity to chymase.
  • the aptamer of the present invention can inhibit chymase activity.
  • Aptamer refers to a nucleic acid molecule having binding activity to a predetermined target molecule. Aptamers can inhibit the activity of a given target molecule by binding to the given target molecule.
  • the aptamer of the present invention is an aptamer that has a binding activity to chymase and can inhibit the activity of chymase.
  • the aptamer of the present invention may be RNA, DNA, modified nucleic acid, or a mixture thereof.
  • the aptamer of the present invention can also be in a linear or cyclic form.
  • Chymase is one of known serine proteases and is stored in the secretory granules of mast cells. Chymase is deeply involved in various biological reactions involving mast cells such as bioactive peptide production / degradation, extracellular matrix remodeling, cytokine networks, and immunity.
  • the aptamer of the present invention may have an inhibitory activity against chymase derived from any mammal. Such mammals include, for example, primates (eg, humans, monkeys), rodents (eg, mice, rats, guinea pigs, hamsters), and pets, livestock and working animals (eg, dogs, cats, horses). Cattle, goats, sheep, pigs), preferably humans.
  • human chymase The amino acid sequence of human chymase is represented by Accession Number AAB26828, but may be one having a mutation of one to several residues, its domain part, or peptide part. Further, the structure of human chymase may be not only a monomer but also a dimer or a multimer.
  • the aptamer of the present invention binds to chymase in a physiological buffer.
  • the buffer solution is not particularly limited, but a buffer solution having a pH of about 5.0 to 10.0 is preferably used. Examples of such a buffer solution include Solution A and Solution C described below (Examples). 1 and 2).
  • the aptamer of the present invention binds to chymase with an intensity that can be detected by any of the following tests.
  • Biacore T100 manufactured by GE Healthcare is used for measuring the bond strength.
  • an aptamer is immobilized on a sensor chip.
  • the immobilization amount is about 1000 RU.
  • chymase solution for the analyte 20 ⁇ L of the 0.2 ⁇ M prepared chymase solution is injected to detect the binding of chymase to the aptamer.
  • RNA containing a random nucleotide sequence consisting of 30 or 40 nucleotides is used as a negative control and chymase binds to the aptamer equivalently or significantly stronger than the control RNA, the aptamer is determined to have the ability to bind chymase. can do.
  • chymase is immobilized on a sensor chip. The immobilization amount is about 4000 RU.
  • RNA containing a random nucleotide sequence consisting of 30 or 40 nucleotides is used as a negative control and chymase binds to the aptamer equivalently or significantly stronger than the control RNA, the aptamer is determined to have the ability to bind chymase. To do.
  • the inhibitory activity against chymase means the ability to inhibit any activity possessed by chymase.
  • one of the functions of chymase is to inhibit the enzyme activity that cleaves by hydrolyzing the peptide chain.
  • Acceptable substrates for enzyme activity are not limited to proteins and physiologically active peptides (eg, AngI, lent TGF- ⁇ , etc.) present in the body, but color develops on peptides containing a partial amino acid sequence of those peptides. Peptides with added substances or fluorescent substances are also included. Color developing substances and fluorescent substances are known to those skilled in the art.
  • examples of phenomena that occur through the degradation reaction of proteins and physiologically active peptides include increased expression of collagen I / III, increased amount of hydroxyproline, increased expression of IgE, and the like. included.
  • the activity of inhibiting the migration activity of neutrophils, monocytes and eosinophils against chymase is also included in the inhibitory activity against chymase.
  • the inhibitory activity against chymase also includes histamine release promotion, increased mast cell count, increased vascular permeability, tissue fibrosis, inflammation, angiogenesis, and intimal thickening induced by chymase. .
  • the chymase substrate means a peptide or protein that is hydrolyzed and cleaved by chymase.
  • AngI lent TGF- ⁇
  • SCF stem cell factor
  • procollagen procollagenase
  • fibronectin promatrix metalloprotease-1
  • pro-MMP-1 pro-MMP -9
  • tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 TIMP-1
  • apolipoprotein AI apoA-I
  • apoE phospholipid transfer protein
  • IL-1 ⁇ precursor big-1 endogenET-1
  • Big-ET-2 connective tissue-activating peptide III
  • IL-18 precursor connective tissue-activating peptide III
  • s Peptides and proteins such as ubstance P, vasoactive intestinal peptide (VIP), kallidin, bradykinin, and C3a are known.
  • the substrate of chymase in the present specification is not limited to these, and artificially designed model peptides containing amino acid residues such as Phe and Tyr that are specifically recognized by chymase as a partial amino acid sequence thereof, A peptide in which a coloring substance or a fluorescent substance is added to such a peptide is also included.
  • Whether the aptamer inhibits the enzyme activity of chymase can be evaluated by the following test. Three methods are shown below as examples.
  • a chymase substrate for example, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA (4-methylcoumaryl-7 containing 4-amino acid peptide, “Ala-Ala-Pro-Phe”, which is a standard substrate of chymotrypsin-like protease, is used. -Amido group (Peptide Institute, Inc.) is used.
  • a 96-well plate F16 Black Maxisorp Fluoronunc, manufactured by Nunc
  • the reaction volume is 100 ⁇ L, and the reaction is performed in a buffer (solution C; see Example 2 described later).
  • nucleic acid prepared in solution C 50 ⁇ L is prepared. 10 ⁇ L of 1 mM substrate prepared in solution C is added thereto, and then the plate is set in a microplate reader SpectraMax190 (manufactured by Molecular Devices) and kept at 37 ° C. for 5 minutes. On the other hand, 40 ⁇ L of 0.05 ⁇ g chymase (recombinant, manufactured by SIGMA) diluted in solution C is prepared and kept at 37 ° C. for 5 minutes. A chymase solution is added to a mixture of nucleic acid and substrate to initiate the enzymatic reaction.
  • SpectraMax190 manufactured by Molecular Devices
  • the plate containing the reaction solution is set in a microplate reader SpectraMax 190 (manufactured by Molecular Devices), and changes in fluorescence intensity are measured over time (excitation wavelength: 380 nm, detection wavelength: 460 nm) at 37 ° C. for 5 minutes.
  • a linear approximation of the increase in fluorescence of AMC (7-amino-4-methylcoumarin) released from the substrate by chymase activity is obtained, and the value of the slope is taken as the initial velocity.
  • nucleic acid pool containing a random sequence of 30 or 40 nucleotides as a control (negative control) and when using chymostatin, a known chymotrypsin-like serine protease inhibitor (positive control), the same treatment and measurement are performed. I do.
  • the initial reaction rate when no nucleic acids and inhibitors are not included is defined as an enzyme activity of 100%, the inhibition rate of each test substance is calculated, and the concentration of inhibitor (IC 50 ) required to inhibit the enzyme activity by 50% is determined. Aptamers that exhibit a low IC 50 value compared to chymostatin, a known inhibitor, are determined to be aptamers with superior inhibitory activity.
  • an evaluation method using a natural substrate is shown.
  • a natural substrate of chymase for example, angiotensin I is used.
  • a method of fluorescence-inducing His-Leu which is a peptide fragment released by the degradation of angiotensin I, and quantitatively measuring the fluorescence intensity will be described.
  • the volume of the enzyme reaction solution in the assay is 50 ⁇ L, and the reaction is carried out in solution C.
  • 5 ⁇ L of 0.3 to 0.75 ng chymase (recombinant, manufactured by SIGMA, or native, Calbiochem) diluted in solution C is prepared.
  • the entire mixture is centrifuged at 14,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and 30 ⁇ L of the supernatant is used for the next fluorescence derivatization reaction.
  • 30 ⁇ L of the above supernatant was added to a 96-well plate (black, manufactured by Costar), and 15 ⁇ L of 2% o-phthalaldehyde (manufactured by SIGMA) dissolved in methanol and 170 ⁇ L of 0.3 M NaOH solution were added to each well. Mix and leave at room temperature for 10 minutes. Thereafter, 25 ⁇ L of 3M HCl solution is added to stop the reaction.
  • the plate is set in a microplate reader SpectraMax 190 (manufactured by Molecular Devices), and the fluorescence intensity is measured under conditions of an excitation wavelength of 355 nm and a fluorescence wavelength of 460 nm.
  • the measurement is performed in the same manner when SEQ ID NO: 58 is used (negative control) and when chymostatin, which is a known chymotrypsin-like serine protease inhibitor, is used (positive control). Under each condition, the fluorescence intensity at a reaction time of 0 minutes is blank.
  • the fluorescence intensity detected when the same amount of solution C is added instead of adding nucleic acid is defined as 100%, the inhibition rate of each test substance is calculated, and it is required to inhibit the enzyme activity by 50%.
  • the concentration of inhibitor (IC 50 ) is determined. Aptamers that exhibit a low IC 50 value compared to chymostatin, a known inhibitor, are determined to be aptamers with superior inhibitory activity.
  • LTBP-1 which is a chymase substrate
  • LTBP-1 which is a chymase substrate
  • Cryopreserved NHLF cells are rapidly thawed in a water bath at 37 ° C. and then suspended in a medium (10% FBS / F-12). After centrifugation (1200 rpm, 5 minutes), the supernatant is removed and the cells are resuspended in medium. A medium is added to the centrifuged cells to make a total volume of 10 mL, and the suspension is transferred to a cell culture dish and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
  • the morphology and proliferation state of the cells are observed with a microscope, and when confluent, the medium is replaced with a serum-free medium (0.2% BSA / F-12). Two days after the medium change, the culture supernatant is collected, dispensed, and stored frozen at ⁇ 30 ° C. 40 ⁇ L of NHLF culture supernatant thawed before use is dispensed into a tube, and 5 ⁇ L of a nucleic acid solution diluted with Solution C is added. As a positive control, chymostatin is diluted with Solution C and added in the same manner. As a negative control, only solution C is added.
  • chymase diluted to 100 ng / mL with solution E (solution C + 0.1% BSA, 0.05% sodium azide) is added.
  • solution E solution C + 0.1% BSA, 0.05% sodium azide
  • a tube without chymase is prepared. After stirring, the mixture is incubated at 37 ° C. for 1 hour and mixed with an equal amount of electrophoresis lysis buffer to complete the reaction.
  • LTBP-1 in the sample is detected by the following Western blotting. Samples mixed with Lysis buffer are boiled for 3 minutes, 10 ⁇ L of sample is applied to 5-20% acrylamide gel and electrophoresed.
  • the band of the chymase-free well was defined as a positive control (+), and the band of the negative control well was defined as a negative control ( ⁇ ). Existence is visually determined.
  • the aptamer of the present invention is not particularly limited as long as it can bind to any part of chymase and inhibit its activity.
  • the length of the aptamer of the present invention is not particularly limited and can generally be about 10 to about 200 nucleotides, but is, for example, about 100 nucleotides or less, preferably about 50 nucleotides or less, more preferably about 40 nucleotides or less. And most preferably may be about 30 nucleotides or less. If the total number of nucleotides is small, chemical synthesis and mass production are easier, and the merit in cost is also great. In addition, chemical modification is easy, the in vivo stability is high, and the toxicity is considered low.
  • Each nucleotide contained in the aptamer of the present invention is the same or different and contains a hydroxyl group at the 2 ′ position of ribose (eg, ribose of pyrimidine nucleotide, ribose of purine nucleotide) (ie, nucleotide that is unsubstituted).
  • ribose eg, ribose of pyrimidine nucleotide, ribose of purine nucleotide
  • the hydroxyl group can be a nucleotide substituted with any atom or group.
  • Examples of such an arbitrary atom or group include a hydrogen atom, a fluorine atom, or —O-alkyl group (eg, —O-Me group), —O-acyl group (eg, —O—COMe group), amino And nucleotides substituted with groups (eg, —NH 2 groups).
  • the aptamer of the present invention is represented by X 1 GUAGAAN 1 N 2 UAAX 2 (SEQ ID NO: 21; wherein X 1 and X 2 are the same or different and A or G, and N 1 and N 2 are the same or different.
  • Aptamers having this sequence strongly bind to chymase and inhibit chymase activity.
  • X 1 and X 2 are preferably both A or G.
  • N 1 and N 2 are preferably N 1 N 2 is GA, GU, GC, UU, GT or CU (however, uracil may be thymine).
  • the aptamer of the present invention also has at least one (eg, 1, 2, 3 or 4) nucleotides at the 2 ′ position of ribose, a hydroxyl group, or any atom or group described above, eg, a hydrogen atom, It may be a nucleotide containing at least two (eg, 2, 3 or 4) groups selected from the group consisting of a fluorine atom, a hydroxyl group and a methoxy group.
  • all pyrimidine nucleotides are the same or different nucleotides substituted at the 2 ′ position of ribose with a fluorine atom, or any atom or group described above, preferably hydrogen. It may be a nucleotide substituted with an atom or group selected from the group consisting of an atom, a hydroxyl group and a methoxy group.
  • all purine nucleotides are the same or different nucleotides substituted at the 2 ′ position of ribose with a hydroxyl group, or any atom or group described above, preferably hydrogen. It may be a nucleotide substituted with an atom or group selected from the group consisting of an atom, a methoxy group and a fluorine atom.
  • nucleotides are selected from the group consisting of a hydroxyl group or any of the above-described atoms or groups such as a hydrogen atom, a fluorine atom, a hydroxyl group and a methoxy group at the 2 ′ position of ribose. It can be a nucleotide containing the same group.
  • the mode of modification to the sugar group in the nucleotide will be described. Does not mean that DNA is excluded from the nucleotides constituting, and is appropriately read as a modification to DNA.
  • the nucleotide constituting the aptamer is DNA
  • the replacement of the hydroxyl group at the 2'-position of ribose with X is read as the replacement of one hydrogen atom at the 2'-position of deoxyribose with X.
  • the aptamer of the present invention is also (A) an aptamer comprising a nucleotide sequence selected from any of SEQ ID NOs: 4-34, 38-57, 59-65, and 69-72 (provided that uracil may be thymine); (B) one or several nucleotides substituted in a nucleotide sequence selected from any of SEQ ID NOs: 4-34, 38-57, 59-65 and 69-72 (provided that uracil may be thymine) An aptamer comprising a nucleotide sequence deleted, inserted or added; or (c) a nucleotide sequence selected from any of SEQ ID NOs: 4-34, 38-57, 59-65 and 69-72 (provided uracil is An aptamer comprising a nucleotide sequence having an identity of 70% or more (preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more); Or as an aptamer of
  • the aptamer (a) but also the aptamers (b) to (d) can bind to chymase and / or inhibit chymase activity (such as the enzymatic activity of chymase).
  • the aptamer of the present invention is also (A ′) SEQ ID NOs: 56 (1) to 56 (7), 56 (9), 56 (11), 56 (12), 56 (15) to 56 (52), 61 (1), 69 (1) , 69 (2) and an aptamer comprising a nucleotide sequence selected from any of 72 (1) to 72 (8) (wherein uracil may be thymine); (B ′) SEQ ID NOs: 56 (1) to 56 (7), 56 (9), 56 (11), 56 (12), 56 (15) to 56 (52), 61 (1), 69 (1) 69 (2) and 72 (1) -72 (8) (wherein uracil may be thymine) 1-5 nucleotides are substituted, deleted, An aptamer comprising an inserted or added nucleotide sequence; or (c ′) SEQ ID NOs: 56 (1) to 56 (7), 56 (9), 56 (11), 56 (12), 56 (15) to 56 ( 52), 61 (1), 69 (1), 69 (2) and a nucleot
  • aptamer of the present invention (E) One or more aptamers selected from the group consisting of the above (a), (b) and (c) and one aptamer selected from the group consisting of (a ′), (b ′) and (c ′) Concatenations consisting of two or more are also included.
  • the aptamers (a ') to (d') and (e) described above can also bind to chymase and / or inhibit chymase activity (such as chymase enzymatic activity).
  • the number of nucleotides substituted, deleted, inserted or added is particularly as long as the aptamer can bind to chymase and / or inhibit chymase activity (such as chymase enzymatic activity). Without limitation, it may be, for example, about 30 or less, preferably about 20 or less, more preferably about 10 or less, even more preferably 5 or less, and most preferably 4, 3, 2, or 1. .
  • identity means an optimal alignment (preferably the algorithm) when two nucleotide sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art. Means the percentage of identical nucleotide residues relative to all overlapping nucleotide residues in which one may consider the introduction of gaps into one or both of the sequences for optimal alignment.
  • NCBI BLAST-2 National Center for Biotechnology Information Basic Alignment Search Tool
  • connection can be performed by a tandem bond.
  • a linker may be used for the connection.
  • a nucleotide chain eg, 1 to about 20 nucleotides
  • a non-nucleotide chain eg, — (CH 2 ) n-linker, — (CH 2 CH 2 O) n-linker, hexaethylene glycol linker, TEG linker ,
  • the number of the plurality of connected objects is not particularly limited as long as it is 2 or more, but may be 2, 3, or 4, for example.
  • the nucleotides in the above (a) to (d), (a ′) to (d ′) and (e) are the same or different and each has a hydroxyl group at the 2 ′ position of ribose (eg, ribose of pyrimidine nucleotide). Or a nucleotide in which the hydroxyl group is substituted at the 2 ′ position of ribose with any group (eg, hydrogen atom, fluorine atom or —O—Me group).
  • the aptamer of the present invention may be one in which the sugar residue (eg, ribose) of each nucleotide is modified in order to improve the binding property to chymase, stability, drug delivery property and the like.
  • the site modified in the sugar residue include those in which the oxygen atom at the 2′-position, 3′-position and / or 4′-position of the sugar residue is replaced with another atom.
  • modifications include fluorination, O-alkylation (eg, O-methylation, O-ethylation), O-allylation, S-alkylation (eg, S-methylation, S-ethylation). ), S-allylation, amination (eg, —NH 2 ).
  • the aptamer of the present invention may also be one in which a nucleobase (eg, purine or pyrimidine) is modified (eg, chemically substituted) in order to enhance the binding activity to chymase.
  • a nucleobase eg, purine or pyrimidine
  • modifications include 5-position pyrimidine modification, 6- and / or 8-position purine modification, modification with exocyclic amines, substitution with 4-thiouridine, and substitution with 5-bromo or 5-iodo-uracil.
  • the phosphate group contained in the aptamer of the present invention may be modified so as to be resistant to nuclease and hydrolysis.
  • the P (O) O group may be P (O) S (thioate), P (S) S (dithioate), P (O) NR 2 (amidate), P (O) CH 3 , P (O) BH. 3 , optionally substituted with P (O) R, R (O) OR ′, CO or CH 2 (form acetal) or 3′-amine (—NH—CH 2 —CH 2 —) R or R ′ in H is independently H, or substituted or unsubstituted alkyl (eg, methyl, ethyl).
  • the linking group include —O—, —N—, and —S—, which can be bonded to adjacent nucleotides through these linking groups. Modifications may also include 3 ′ and 5 ′ modifications such as capping.
  • Modifications are further made of polyethylene glycol, amino acids, peptides, inverted dT, nucleic acids, nucleosides, Myristoy, Lithocholic-oleyl, Docosanyl, Lauroyl, Stearoyl, Palmitoyl, Oleoyl, Linoleyl, other lipids, vitamins, steroids, cholesterol, steroids It can be performed by adding a fluorescent substance, an anticancer agent, a toxin, an enzyme, a radioactive substance, biotin or the like to the terminal. Such modification can be performed with reference to, for example, US Pat. Nos. 5,660,985 and 5,756,703.
  • the aptamer of the present invention can be synthesized by the disclosure in the present specification and a method known per se in the art.
  • One of the synthesis methods is a method using RNA polymerase.
  • a target RNA can be obtained by chemically synthesizing a DNA having a target sequence and an RNA polymerase promoter sequence, and using this as a template for transcription by a known method. It can also be synthesized using a DNA polymerase.
  • a DNA having a target sequence is chemically synthesized, and this is used as a template to amplify by a polymerase chain reaction (PCR) which is a known method. This is converted into a single strand by polyacrylamide electrophoresis or enzyme treatment, which are already known methods.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the efficiency of the extension reaction can be increased by using a polymerase having a mutation introduced at a specific position.
  • the aptamer thus obtained can be easily purified by a known method.
  • Aptamers can be synthesized in large quantities by chemical synthesis methods such as the amidite method or the phosphoamidite method. The synthesis method is well known and is described in Nucleic Acid (Vol. 2) [1] Synthesis and Analysis of Nucleic Acid (Editor: Yukio Sugiura, Hirokawa Publishing Company, etc.). In practice, a synthesizer such as OligoPilot 100 or OligoProcess manufactured by GE Healthcare Bioscience is used.
  • Aptamers can add functional substances after synthesis by introducing an active group such as an amino group during chemical synthesis such as the phosphoramidite method.
  • an active group such as an amino group during chemical synthesis such as the phosphoramidite method.
  • a polyethylene glycol chain having a carboxyl group introduced therein can be condensed by introducing an amino group at the end of the aptamer.
  • Aptamers bind to a target substance by various binding modes such as ionic bonds using the negative charge of phosphate groups, hydrophobic bonds and hydrogen bonds using ribose, hydrogen bonds using nucleobases and stacking interactions.
  • the ionic bond utilizing the negative charge of the phosphate group that exists in the number of constituent nucleotides is strong and binds to the positive charge of lysine or arginine present on the surface of the protein.
  • nucleobases that are not involved in direct binding to the target substance can be substituted.
  • the stem structure portion is already base-paired and faces the inside of the double helix structure, so that the nucleobase is difficult to bind directly to the target substance. Therefore, the activity of the aptamer is often not reduced even if the base pair is replaced with another base pair.
  • Aptamers are produced using the SELEX method and its improved methods (for example, Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510). can do.
  • the SELEX method by increasing the number of rounds or using a competing substance to tighten the selection conditions, aptamers having a stronger binding power to the target substance are concentrated and selected. Therefore, by adjusting the number of rounds of SELEX and / or changing the competition state, aptamers with different binding strengths, aptamers with different binding modes, binding strengths and binding modes are the same, but base sequences are different. Aptamers may be obtained.
  • the SELEX method includes an amplification process by PCR. By introducing a mutation by using manganese ions in the process, it becomes possible to perform SELEX with more diversity.
  • Aptamers obtained by SELEX are nucleic acids having high affinity for the target substance, but this does not mean that the physiological activity of the target substance is inhibited.
  • Chymase is a basic protein, and it is considered that nucleic acids are likely to bind non-specifically, but does not affect the activity of the target substance other than aptamers that bind strongly to specific sites.
  • RNA containing a random sequence used as a negative control bound weakly to chymase, but did not inhibit chymase enzyme activity.
  • SELEX for obtaining an aptamer having higher activity can be performed based on the active aptamer selected in this way.
  • a specific method is to prepare a template in which a part of an aptamer whose sequence is determined is a random sequence or a template in which a random sequence of about 10 to 30% is doped, and perform SELEX again.
  • the aptamer obtained by SELEX has a length of about 80 nucleotides, and it is difficult to make it as a medicine as it is. Therefore, it is necessary to repeat trial and error to shorten the length to about 50 nucleotides or less that can be easily chemically synthesized.
  • the aptamers obtained by SELEX vary in ease of subsequent minimization work depending on the primer design. If the primer is not designed well, even if active aptamers can be selected by SELEX, subsequent development becomes impossible. In the present invention, an aptamer having activity even at 23 nucleotides could be obtained.
  • Aptamers are easy to modify because they can be chemically synthesized. Aptamers use the MFOLD program to predict secondary structures, predict three-dimensional structures by X-ray analysis or NMR analysis, which nucleotides can be replaced or deleted, and where new nucleotides can be found. Can be estimated to some extent. The aptamer of the predicted new sequence can be easily chemically synthesized, and whether or not the aptamer retains the activity can be confirmed by an existing assay system.
  • the activity often changes even if a new sequence is added to both ends of the sequence. do not do.
  • the length of the new sequence is not particularly limited.
  • aptamers can be highly designed or modified.
  • the present invention also provides a predetermined sequence (eg, a sequence corresponding to a portion selected from a stem portion, an internal loop portion, a bulge portion, a hairpin loop portion, and a single-stranded portion: hereinafter, abbreviated as a fixed sequence if necessary) And a method for producing an aptamer that can be highly designed or modified.
  • the method for producing such aptamer is as follows:
  • (N) a represents a nucleotide chain consisting of a N
  • (N) b represents a nucleotide chain consisting of b N
  • N is the same or different, respectively, A, G
  • It is a nucleotide selected from the group consisting of C, U and T (preferably A, G, C and U).
  • a and b are the same or different and may be any number, for example, 1 to about 100, preferably 1 to about 50, more preferably 1 to about 30, even more preferably 1 to about There may be 20 or 1 to about 10.
  • Each of a single type of nucleic acid molecule or a plurality of types of nucleic acid molecules eg, a library of nucleic acid molecules having different numbers of a, b, etc.
  • primer sequences eg, a library of nucleic acid molecules having different numbers of a, b, etc.
  • primer sequences i
  • ii Producing an aptamer comprising a fixed sequence using the corresponding primer pair.
  • the present invention also provides a complex comprising the aptamer of the present invention and a functional substance bound thereto.
  • the bond between the aptamer and the functional substance in the complex of the present invention can be a covalent bond or a non-covalent bond.
  • the complex of the present invention may be a conjugate of the aptamer of the present invention and one or more (eg, 2 or 3) of the same or different functional substances.
  • the functional substance is not particularly limited as long as it newly adds some function to the aptamer of the present invention or can change (eg, improve) some characteristic that can be retained by the aptamer of the present invention.
  • Examples of the functional substance include proteins, peptides, amino acids, lipids, carbohydrates, monosaccharides, polynucleotides, and nucleotides.
  • Examples of functional substances include, for example, affinity substances (eg, biotin, streptavidin, polynucleotides having affinity for target complementary sequences, antibodies, glutathione sepharose, histidine), labeling substances (eg, fluorescent substances, Luminescent substances, radioisotopes), enzymes (eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase), drug delivery vehicles (eg, liposomes, microspheres, peptides, polyethylene glycols), drugs (eg, calicheamicin and duocarmycin) Used in missile therapy, nitrogen mustard analogues such as cyclophosphamide, melphalan, ifosfamide or trophosphamide, ethyleneimines such as thiotepa, nitrosoureas such as carmustine,
  • ⁇ унк ⁇ онент ⁇ may eventually be removed. Furthermore, it may be a peptide that can be recognized and cleaved by an enzyme such as thrombin, matrix metalloprotease (MMP), Factor X, or a polynucleotide that can be cleaved by a nuclease or a restriction enzyme.
  • an enzyme such as thrombin, matrix metalloprotease (MMP), Factor X, or a polynucleotide that can be cleaved by a nuclease or a restriction enzyme.
  • the aptamer and complex of the present invention can be used, for example, as a medicine or diagnostic agent, test agent, or reagent.
  • the aptamer and complex of the present invention may have an activity of inhibiting chymase function.
  • chymase is closely related to fibrosis and cardiovascular diseases. Therefore, the aptamer and complex of the present invention are useful as a medicament for treating or preventing a disease associated with fibrosis or a circulatory disease.
  • the aptamer and complex of the present invention can specifically bind to chymase. Therefore, the aptamer and complex of the present invention are useful as a chymase detection probe.
  • the probe is useful for in vivo imaging of chymase, blood concentration measurement, tissue staining, ELISA and the like.
  • the probe is useful as a diagnostic agent, a test agent, a reagent, and the like for diseases involving chymase (such as diseases involving fibrosis and cardiovascular diseases).
  • the aptamer and complex of the present invention can be used as a ligand for separation and purification of chymase.
  • the aptamer and complex of the present invention can also be used as a drug delivery agent.
  • Diseases involving organ or tissue fibrosis include pulmonary fibrosis, prostatic hypertrophy, myocardial fibrosis, myocardial fibrosis, musculoskeletal fibrosis, myelofibrosis, uterine fibroids, scleroderma, adhesion after surgery, Post-surgical scar, burn scar, hypertrophic scar, keloid, atopic dermatitis, peritoneal sclerosis, asthma, cirrhosis, chronic pancreatitis, gastric cancer, liver fibrosis, renal fibrosis, fibrovascular disease, diabetes Retinopathy caused by fibrotic microvasculitis, neurosis, nephropathy, glomerulonephritis, tubulointerstitial nephritis, hereditary renal disease, arteriosclerotic peripheral arteritis, and the like.
  • Cardiovascular diseases include vascular disorders, aortic aneurysms, renal failure, hypertension, arteriosclerosis, myocardial infarction, cardiac hypertrophy, heart failure, restenosis after vascular disorders due to percutaneous transluminal coronary angioplasty, diabetic and non- Examples include diabetic nephropathy and peripheral circulation disorder.
  • Chymase possesses enzymatic activity and cleaves physiologically active substances that serve as substrates.
  • substrate for example, AngI, latent TGF- ⁇ , SCF, procollagen, procollagenase, pro-MMP-9, IL-1 ⁇ precursor, etc. are known, and through the production / degradation reaction of these physiologically active peptides It exerts physiological effects such as remodeling of extracellular matrix, network with cytokines, immunity, and vasoconstriction.
  • chymase itself has an effect of activating mast cells and promoting histamine release, which is closely related to inflammation.
  • the aptamer and the complex of the present invention are not limited to the above-mentioned substrates, but may be drugs for diseases related to biological functions mediated by a chymase-acceptable substrate and diseases involving chymase itself or It can be used as a diagnostic agent, test agent, reagent.
  • the medicament of the present invention may be formulated with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier include excipients such as sucrose, starch, mannitol, sorbit, lactose, glucose, cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate, cellulose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, polypropylpyrrolidone , Gelatin, gum arabic, polyethylene glycol, sucrose, starch and other binders, starch, carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, sodium-glycol starch, sodium bicarbonate, calcium phosphate, calcium citrate and other disintegrants, magnesium stearate , Aerosil, Talc, Lubricant such as sodium lauryl sulfate, Citric acid, Menthol, Glycyllysine / Ammonium salt, Glycine, Orange powder and other fragrances, Sodium benzoate Preservatives such as sodium, sodium bisulfite, methylparaben, propylparab
  • Preparations suitable for oral administration include solutions in which an effective amount of a ligand is dissolved in a diluent such as water, physiological saline or orange juice, capsules or sachets containing an effective amount of the ligand as solids or granules.
  • a diluent such as water, physiological saline or orange juice
  • capsules or sachets containing an effective amount of the ligand as solids or granules.
  • a tablet a suspension in which an effective amount of an active ingredient is suspended in an appropriate dispersion medium, an emulsion obtained by dispersing and emulsifying a solution in which an effective amount of an active ingredient is dissolved in an appropriate dispersion medium, a water-soluble substance C10 and the like that promote absorption of.
  • the medicament of the present invention can be coated by a method known per se for the purpose of taste masking, enteric solubility or sustainability, if necessary.
  • a coating agent used for coating for example, hydroxypropylmethylcellulose, ethylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyoxyethylene glycol, Tween 80, Pluronic F68, cellulose acetate phthalate, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxymethylcellulose acetate succinate, Eudragit (Rohm, Germany, methacrylic acid / acrylic acid copolymer) and pigments (eg, Bengala, titanium dioxide) are used.
  • the medicine may be either an immediate release preparation or a sustained release preparation.
  • Suitable preparations for parenteral administration include aqueous and nonaqueous isotonic sterile injection solutions. Which may contain antioxidants, buffers, bactericides, isotonic agents and the like. Also, aqueous and non-aqueous sterile suspensions can be mentioned, which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like.
  • the preparation can be enclosed in a container in unit doses or multiple doses like ampoules and vials.
  • the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be lyophilized and stored in a state that may be dissolved or suspended in a suitable sterile solvent immediately before use.
  • Sustained release preparations can also be mentioned as suitable preparations.
  • suitable preparations include sustained-release forms from carriers or containers embedded in the body, such as artificial bones, biodegradable base materials, non-biodegradable sponges, and bags.
  • sustained-release preparations include devices such as drug pumps and osmotic pumps that are continuously or intermittently delivered from outside the body to the body or locally.
  • biodegradable base material include liposomes, cationic liposomes, poly (lactide-co-glycolic) acid (PLGA), atelocollagen, gelatin, hydroxyapatite, and polysaccharide schizophyllan.
  • inhalants suitable for transpulmonary administration in addition to injection solutions, suspensions and sustained-release preparations, inhalants suitable for transpulmonary administration, ointments suitable for transdermal administration, and the like are also possible.
  • the lyophilized active ingredient is refined and administered by inhalation using an appropriate inhalation device.
  • a surfactant, oil, seasoning, cyclodextrin or a derivative thereof used as necessary can be appropriately blended as necessary.
  • Inhalants can be manufactured according to conventional methods. That is, the aptamer or complex of the present invention can be produced by making it into powder or liquid form, blending it in an inhalation propellant and / or carrier, and filling it into an appropriate inhalation container.
  • a normal mechanical powder inhaler can be used, and in the case of a liquid, an inhaler such as a nebulizer can be used.
  • an inhaler such as a nebulizer
  • the inhalable propellant conventionally known ones can be widely used.
  • Freon-227, Freon-C318, Freon compounds such as 1,1,1,2-tetrafluoroethane, hydrocarbons such as propane, isobutane and n-butane, ethers such as diethyl ether, nitrogen gas, Examples thereof include compressed gas such as carbon dioxide gas.
  • surfactant examples include oleic acid, lecithin, diethylene glycol dioleate, tetrahydrofurfuryl oleate, ethyl oleate, isopropyl myristate, glyceryl trioleate, glyceryl monolaurate, glyceryl monooleate, glyceryl monostearate, Glyceryl monolysinoate, cetyl alcohol, stearyl alcohol, polyethylene glycol 400, cetylpyridinium chloride, sorbitan trioleate (trade name span 80), sorbitan monooleate (trade name span 80), sorbitan monolaurate (trade name span 20), Polyoxyethylene hydrogenated castor oil (trade name HCO-60), polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (trade name Tween 20), Polio Siethylene (20) sorbitan monooleate (trade name Tween 80), natural resources derived lecithin (trade name Epicron), oley
  • oil examples include corn oil, olive oil, cottonseed oil and sunflower oil.
  • an appropriate pharmaceutically acceptable base yellow petrolatum, white petrolatum, paraffin, plastibase, silicone, white ointment, beeswax, pig oil, vegetable oil, hydrophilic ointment, hydrophilic petrolatum, purified lanolin, hydrolyzed lanolin , Water-absorbing ointment, hydrophilic plastibase, macrogol ointment, etc.
  • the aptamer of the present invention which is an active ingredient, to prepare and use.
  • the dose of the medicament of the present invention varies depending on the type / activity of the active ingredient, the severity of the disease, the animal species to be administered, the drug acceptability of the administration target, body weight, age, etc.
  • the amount of active ingredient may be about 0.0001 to about 100 mg / kg, such as about 0.0001 to about 10 mg / kg, preferably about 0.005 to about 1 mg / kg.
  • the present invention also provides a solid phase carrier on which the aptamer and complex of the present invention are immobilized.
  • the solid phase carrier include a substrate, a resin, a plate (eg, multiwell plate), a filter, a cartridge, a column, and a porous material.
  • the substrate may be one used for DNA chips, protein chips, etc., for example, nickel-PTFE (polytetrafluoroethylene) substrate, glass substrate, apatite substrate, silicon substrate, alumina substrate, etc. And the like coated with a polymer or the like.
  • the resin examples include agarose particles, silica particles, copolymers of acrylamide and N, N′-methylenebisacrylamide, polystyrene-crosslinked divinylbenzene particles, particles obtained by crosslinking dextran with epichlorohydrin, cellulose fibers, and allyldextran.
  • examples include N, N'-methylenebisacrylamide cross-linked polymers, monodisperse synthetic polymers, monodisperse hydrophilic polymers, sepharose, and Toyopearl.
  • resins in which various functional groups are bonded to these resins. .
  • the solid phase carrier of the present invention can be useful for, for example, purification of chymase and detection and quantification of chymase.
  • the aptamer and complex of the present invention can be immobilized on a solid support by a method known per se.
  • an affinity substance for example, one described above
  • a predetermined functional group is introduced into the aptamer and complex of the present invention, and then immobilized on a solid phase carrier using the affinity substance or the predetermined functional group.
  • a method is mentioned.
  • the present invention also provides such a method.
  • the predetermined functional group may be a functional group that can be subjected to a coupling reaction, and examples thereof include an amino group, a thiol group, a hydroxyl group, and a carboxyl group.
  • the present invention also provides an aptamer having such a functional group introduced therein.
  • the present invention also provides a method for purifying and concentrating chymase.
  • the present invention can separate chymase from other family proteins.
  • the purification and concentration method of the present invention can include adsorbing chymase on the solid phase carrier of the present invention and eluting the adsorbed chymase with an eluent.
  • Adsorption of chymase to the solid phase carrier of the present invention can be carried out by a method known per se. For example, a sample containing chymase (eg, bacterial or cell culture or culture supernatant, blood) is introduced into the solid phase carrier of the present invention or its contents. The elution of chymase can be performed using an eluent such as a neutral solution.
  • the neutral eluate is not particularly limited, and may be, for example, a pH of about 6 to about 9, preferably about 6.5 to about 8.5, more preferably about 7 to about 8.
  • Neutral solutions also include, for example, urea, chelating agents (eg, EDTA), sodium salts (eg, NaCl), potassium salts (eg, KCl), magnesium salts (eg, MgCl 2 ), surfactants (eg, Tween 20). , Triton, NP40), and glycerin.
  • the purification and concentration method of the present invention may further comprise washing the solid support using a washing solution after the adsorption of chymase.
  • the cleaning liquid examples include urea, a chelating agent (eg, EDTA), a surfactant such as Tris, acid, alkali, Transfer RNA, DNA, Tween 20, and a salt containing a salt such as NaCl.
  • a chelating agent eg, EDTA
  • a surfactant such as Tris, acid, alkali, Transfer RNA, DNA, Tween 20, and a salt containing a salt such as NaCl.
  • the purification and concentration method of the present invention may further include heat-treating the solid phase carrier. By this process, the solid phase carrier can be regenerated and sterilized.
  • the present invention also provides a method for detecting and quantifying chymase.
  • the present invention can detect and quantify chymase separately from other family proteins.
  • the detection and quantification method of the present invention may include measuring chymase using the aptamer of the present invention (eg, by using the complex of the present invention and a solid phase carrier).
  • the chymase detection and quantification method can be performed by the same method as the immunological method except that the aptamer of the present invention is used instead of the antibody.
  • enzyme immunoassay eg, direct competitive ELISA, indirect competitive ELISA, sandwich ELISA
  • radioimmunoassay (RIA) radioimmunoassay
  • FIA fluorescent immunoassay Detection and quantification
  • FIA Western blot method
  • immunohistochemical staining method cell sorting method and the like.
  • PET molecular probe
  • Such a method may be useful, for example, for measuring the amount of chymase in a biological or biological sample, or for diagnosing a disease associated with chymase.
  • RNA aptamer specifically binding to chymase was prepared using the SELEX method. SELEX was performed with reference to the method of Ellington et al. (Ellington and Szostak, Nature 346, 818-822, 1990) and the method of Tuerk et al. (Tuerk and Gold, Science 249, 505-510, 1990). As a target substance, chymase (Human Skin, Calbiochem) immobilized on a carrier of NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) was used. The method of immobilizing chymase on the carrier was performed in accordance with the specifications of GE Healthcare.
  • the amount of immobilization was confirmed by examining the chymase solution before immobilization and the supernatant immediately after immobilization by SDS-PAGE. As a result of SDS-PAGE, no chymase band was detected in the supernatant, confirming that almost all of the chymase used was coupled. About 167 pmol chymase was immobilized on about 3 ⁇ L of resin.
  • RNA (40N) used in the first round was obtained by transcription of DNA obtained by chemical synthesis using DuraScript TM T7 Transcription Kit (manufactured by Epicentre).
  • the RNA obtained by this method is one in which the 2 ′ position of ribose of the pyrimidine nucleotide is fluorinated.
  • a DNA template a 70-nucleotide DNA having a primer sequence at both ends of a 40-nucleotide random sequence shown below was used. DNA templates and primers were prepared by chemical synthesis.
  • DNA template 5'-GCGGCCGCCTCTTCTATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAATTCCTACCCGT-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • Primer Fwd 5′-TAATACGACTCACTATAGGGACGGGTAGGAATTC-3 ′
  • Primer Rev 5′-GCGGCCGCTCTTTCTATG-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
  • N in the DNA template is 40 nucleotides in any combination (40N: each N is A, G, C or T), and the resulting aptamer unique sequence region Arise.
  • Primer Fwd contains the promoter sequence for T7 RNA polymerase. Variations of the RNA pool used in the first round was theoretically 10 14.
  • RNA pool was added to the carrier on which chymase was immobilized, and kept at room temperature for 30 minutes, and then the resin was washed with solution A to remove RNA that did not bind to chymase.
  • solution A is a mixed solution of 145 mM sodium chloride, 5.4 mM potassium chloride, 1.8 mM calcium chloride, 0.8 mM magnesium chloride, 20 mM Tris (pH 7.6).
  • solution B as an eluent, heat-treating at 95 ° C. for 10 minutes.
  • the solution B is a mixed solution of 7M Urea, 3 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 6.6).
  • the recovered RNA was amplified by RT-PCR, transcribed with DuraScribe TM T7 Transcription Kit, and used as a pool for the next round. The above was set as one round, and the same operation was repeated several times.
  • the PCR product was cloned into a pGEM-T Easy vector (Promega) and E. coli strain DH5 ⁇ (Toyobo) was transformed. After extracting the plasmid from the single colony, the base sequence of the clone was examined with a DNA sequencer (3130 ⁇ 1 Genetic Analyzer, manufactured by ABI).
  • SEQ ID NOs: 4-20 The sequences of some of these clones are shown in SEQ ID NOs: 4-20. Among them, there were 6 sequences represented by SEQ ID NO: 4. There were two sequences of SEQ ID NO: 5. The sequences represented by SEQ ID NOs: 6 to 20 were one sequence. SEQ ID NOs: 6 and 8 differ by only one base in the sequence. The sequences of SEQ ID NOs: 4, 13, and 14 contained a common sequence represented by SEQ ID NO: 21. The consensus sequence represented by SEQ ID NO: 21 was contained in 9 out of 44 clones. When the secondary structure of these sequences was predicted using the MFOLD program (M. Zuker, Nucleic Acids Res.
  • nucleotide sequence is shown below. Unless otherwise stated, the individual sequences listed below shall be expressed in the 5 ′ to 3 ′ direction, the purine bases (A and G) are 2′-OH forms, and the pyrimidine bases (U and C) Is a 2′-fluoro modified product. Further, N (N 1 , N 2 ) in the sequence represents any nucleotide of A, G, C, and U, and X (X 1 , X 2 ) both represents A or both G.
  • SEQ ID NOs: 22-27 There were 22 sequences represented by SEQ ID NO: 4 and 4 sequences represented by SEQ ID NO: 14 as having the same sequence after 8 rounds. This means that the consensus sequence represented by SEQ ID NO: 21 was enriched. In addition, there was one sequence represented by SEQ ID NO: 5. In addition, there were 3 sequences represented by SEQ ID NO: 22, and 2 sequences represented by SEQ ID NOs: 23 and 24. The sequences represented by SEQ ID NOs: 25 to 27 were one sequence. SEQ ID NOs: 22 and 11 differ by only one base in the sequence.
  • SEQ ID NOs: 26 and 4 differ by only one base in the sequence.
  • the common sequence represented by SEQ ID NO: 21 was contained in 35 out of 93 clones.
  • the sequences of SEQ ID NOs: 25 and 26 contained the common sequence represented by SEQ ID NO: 21.
  • FIG. 2 shows the secondary structure prediction of the aptamer having the sequences represented by SEQ ID NOs: 22 to 27.
  • the portion of the common sequence represented by SEQ ID NO: 21 is circled ( ⁇ ). As in FIG. 1, they all have a characteristic loop structure.
  • nucleotide sequence is shown below. Unless otherwise stated, the individual sequences listed below shall be expressed in the 5 ′ to 3 ′ direction, the purine bases (A and G) are 2′-OH, and the pyrimidine bases (U and C) Is a 2′-fluoro modified product.
  • chymase Human Skin, Calbiochem
  • a Heparin Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare
  • the chymase was immobilized on the support by adding the chymase solution to the support and maintaining at room temperature for 30 minutes.
  • the amount of solid phase was confirmed by examining the chymase solution before solid phase and the supernatant immediately after solid phase by SDS-PAGE.
  • SDS-PAGE no chymase band was detected from the supernatant, confirming that almost all of the chymase used was immobilized.
  • About 100 pmol chymase was immobilized on about 3 ⁇ L of resin.
  • the 11th round pool was cloned and the sequence of 79 clones was determined.
  • the partial sequences of these clones are shown in SEQ ID NOs: 28-34.
  • SEQ ID NOs: 28-34 As the same sequence as the sequence after 8 rounds, there are 9 sequences represented by SEQ ID NO: 4 and 1 sequence represented by SEQ ID NO: 19, and the same sequence as the sequence after 11 rounds There were two sequences represented by SEQ ID NO: 27. In addition, there were 4 sequences represented by SEQ ID NO: 28 and 2 sequences represented by SEQ ID NO: 29.
  • the sequence represented by SEQ ID NOs: 30 to 34 was one sequence. SEQ ID NOs: 30 and 31 differ by only one base in the sequence.
  • SEQ ID NO: 32 is a sequence in which SEQ ID NO: 31 is deleted by one base.
  • the consensus sequence represented by SEQ ID NO: 21 was contained in 14 clones out of 79 clones. Among the sequences newly appearing in the 11th round, the sequences of SEQ ID NOs: 30 to 32 and 34 contained the common sequence represented by SEQ ID NO: 21.
  • the predicted secondary structure of the aptamer having the sequence represented by SEQ ID NOs: 28 to 34 is shown in FIG.
  • the portion of the common sequence represented by SEQ ID NO: 21 is circled ( ⁇ ).
  • the portion of the common sequence represented by SEQ ID NO: 21 had a characteristic loop structure similar to FIG. 1 except for the clone represented by SEQ ID NO: 34.
  • nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 28 to 34 are shown below. Unless otherwise stated, the individual sequences listed below shall be expressed in the 5 ′ to 3 ′ direction, the purine bases (A and G) are 2′-OH forms, and the pyrimidine bases (U and C) Is a 2′-fluoro modified product.
  • the binding activity of the nucleic acids represented by SEQ ID NOs: 4 to 20 and 22 to 34 to chymase was evaluated by the surface plasmon resonance method.
  • Biacore T100 manufactured by GE Healthcare was used.
  • the sensor chip used was an SA chip on which streptavidin was immobilized. To this, about 1500 RU of 16-nucleotide Poly dT having biotin bound to the 5 'end was bound.
  • a nucleic acid to be a ligand was added with 16 nucleotides of Poly A at the 3 'end, and immobilized on the SA chip by annealing T and A.
  • SEQ ID NOs: 4, 13, 14, 25, 26 and 30 containing this common sequence had higher binding activity than 40N, while SEQ ID NOs: 31, 32 and 34 containing similar common sequences were equivalent to 40N. It was found that N 1 N 2 contained in the sequence of SEQ ID NO: 21 may be GA, GU, UU, or CU. It was found that X 1 and X 2 contained in the sequence of SEQ ID NO: 21 may both be A.
  • Table 1 Binding activity to chymase. “++” indicates that the antibody binds to chymase significantly more than 40N of the negative control, and “+” indicates that it binds to the same extent as 40N of the negative control.
  • 40N is a nucleic acid pool used in the first round including a random sequence of 40 nucleotides.
  • Example 2 Preparation of RNA aptamer that specifically binds chymase (2) SELEX similar to Example 1 was performed using a template having a random sequence of 30 nucleotides and a primer sequence different from that used in Example 1. As a target substance for SELEX, chymase (recombinant, manufactured by SIGMA) immobilized on a carrier of NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow (manufactured by GE Healthcare) was used. The template and primer sequences used are shown below. DNA templates and primers were prepared by chemical synthesis.
  • N in the DNA template is 30 nucleotides in any combination (30N: each N is A, G, C or T), and the resulting aptamer unique sequence region Arise.
  • Primer Fwd contains the promoter sequence for T7 RNA polymerase. Variations of the RNA pool used in the first round was theoretically 10 14.
  • RNA bound to chymase was recovered by adding solution D as an eluent and stirring at room temperature for 10 minutes.
  • the solution D is a solution prepared by adding 6M guanidine hydrochloride to the solution C and adjusting the pH to 7.6.
  • RNA sequencer 3130 ⁇ 1 Genetic Analyzer, manufactured by ABI.
  • SEQ ID NO: 21 The sequences of some of these clones are shown in SEQ ID NOs: 38-48. There were 6 sequences represented by SEQ ID NO: 38 and 2 sequences represented by SEQ ID NO: 39. There was one sequence of SEQ ID NOs: 40-48.
  • the predicted secondary structure of the aptamer having the sequences represented by SEQ ID NOs: 38 to 40, 43 and 48 is shown in FIG. In FIG. 5, the common sequence represented by SEQ ID NO: 21 is circled ( ⁇ ). Many of the common sequences represented by SEQ ID NO: 21 formed characteristic loop structures similar to those shown in FIG.
  • nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 38 to 48 are shown below. Unless otherwise stated, the individual sequences listed below shall be expressed in the 5 ′ to 3 ′ direction, the purine bases (A and G) are 2′-OH, and the pyrimidine bases (U and C) Is a 2′-fluoro modified product.
  • SEQ ID NO: 38 GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGGAAUAGAGUUAAGAUCUGGCUGGCGCAUAUGCCUAUUGCGUCUGUAGUGA
  • SEQ ID NO: 40 GGGAGCAGGAGAGGUCAGAGACGGAUAAGAGCUAAGAGUUCGUCAGAGGGGCUUAUGCGUUGUAGUGUGA
  • SEQ ID NO: 41 GGGAGCAGGAGAGGUCAGAUGGUGAGAUAGAGUAUUAACACCACAUAUGUAGCCCAUUGCGUUGCUAGUGUGA
  • the binding activity of the nucleic acids represented by SEQ ID NOs: 38 to 48 to chymase was evaluated by the surface plasmon resonance method.
  • the measurement was performed using the same method as that shown in Example 1.
  • Solution C was used as the running buffer.
  • Table 2 shows the measurement results. It was shown that the nucleic acids represented by SEQ ID NOs: 38 to 48 are aptamers that bind to chymase significantly more than 30N. It was found that X 1 and X 2 contained in SEQ ID NO: 21 which is a common sequence may be both A or G. It was found that N 1 N 2 contained in these common sequences may be GU, GC, GA, or UU.
  • Table 2 Binding activity to chymase. “++” represents a substance that binds to chymase significantly more than 30N of the negative control.
  • 30N refers to the nucleic acid pool used in the first round including a random sequence of 30 nucleotides.
  • Example 3 Measurement of Chymase Inhibitory Activity Using a Synthetic Substrate Whether the nucleic acids represented by SEQ ID NOs: 4 to 20, 22 to 34, and 38 to 48 inhibit chymase enzymatic activity was evaluated by the following method. .
  • a chymase substrate As a chymase substrate, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA (manufactured by Peptide Institute, Inc.) containing the 4-amino acid peptide Ala-Ala-Pro-Phe, which is a standard substrate for chymotrypsin-like protease, was selected.
  • Suc is a protecting group succinyl group
  • MCA is a 4-methylcoumaryl-7-amide group.
  • AMC (7-amino-4-methylcoumarin) is released.
  • the enzyme activity of chymase can be measured.
  • a 96-well plate F16 Black Maxisorp Fluoronunc, manufactured by Nunc
  • 50 ⁇ L of nucleic acid prepared by serial dilution in solution C to a concentration of 0.0027 to 2 ⁇ M was prepared.
  • 10 ⁇ L of 1 mM substrate prepared in solution C was added thereto, and then the plate was set in a microplate reader SpectraMax190 (manufactured by Molecular Devices) and kept at 37 ° C. for 5 minutes.
  • Table 3 Inhibitory activity against chymase (IC 50 ). “> 0.5” indicates that no inhibitory activity was observed in the concentration range up to 0.5 ⁇ M. The IC 50 value is an average value of 2 to 3 measurements.
  • Negative control 30N or 40N showed no inhibitory activity (IC 50 > 0.5 ⁇ M). Further, the IC 50 value of chymostatin, which is a positive control, was 0.1 ⁇ M to 0.2 ⁇ M. From the above results, many of the aptamers described in Table 3 showed inhibitory activity against chymase. In particular, it can be said that aptamers that showed an IC 50 value of 0.1 ⁇ M or less showed an excellent inhibitory effect. All aptamers including the consensus sequence represented by SEQ ID NO: 21 showed inhibitory activity. Further, from this result, it was shown that X 1 and X 2 contained in these common sequences may be either A or G, and N 1 N 2 may be any of GA, GU, GC, UU or CU.
  • Example 4 Shortening of aptamer
  • the aptamers represented by SEQ ID NOs: 4, 12, 13, and 14 were shortened.
  • the aptamers represented by SEQ ID NOs: 4, 13, and 14 include a common sequence represented by SEQ ID NO: 21.
  • SEQ ID NO: 12 is an aptamer that does not contain this common sequence.
  • the shortened sequences are shown in SEQ ID NOs: 49-57.
  • the predicted secondary structure of the aptamer represented by SEQ ID NOs: 49, 51, 55 to 57 is shown in FIG. In FIG. 6, the common sequence represented by SEQ ID NO: 21 is circled ( ⁇ ).
  • nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 49 to 57 are shown below. Unless otherwise stated, the individual sequences listed below shall be expressed in the 5 ′ to 3 ′ direction, the purine bases (A and G) are 2′-OH, and the pyrimidine bases (U and C) Is a 2′-fluoro modified product.
  • SEQ ID NO: 49 (Sequence obtained by shortening the clone represented by SEQ ID NO: 4 to a length of 29 nucleotides including a common sequence) GGUUCUACAGAUAGAGAUAAAAGUAGAACC SEQ ID NO: 50: (Sequence obtained by shortening the clone represented by SEQ ID NO: 4 to a length of 35 nucleotides including a common sequence) GGCAUUCUACAGAUAGAGAAUAAAGUAGAAAUUUAAC SEQ ID NO: 51: (Sequence obtained by shortening the clone represented by SEQ ID NO: 12 to a length of 45 nucleotides) CGUUACAAUAUAUGUAUAUACCAGGGUACAUAAACAUAGAGAAGAGCGGG SEQ ID NO: 52: (Sequence obtained by shortening the clone represented by SEQ ID NO: 12 to a length of 26 nucleotides) CCGUAUAUACCAGGGUAACUAAACG SEQ ID NO
  • nucleic acids of SEQ ID NOs: 49 to 57 were prepared by chemical synthesis. Whether these nucleic acids bind to chymase was evaluated by surface plasmon resonance.
  • Biacore T100 manufactured by GE Healthcare was used, and the measurement was performed by the following method. About 4000 RU chymase (recombinant, manufactured by SIGMA) was immobilized on the sensor chip surface of the CM5 chip using an amine coupling kit. At a flow rate of 20 ⁇ L / min, 20 ⁇ L of nucleic acid prepared as 0.3 ⁇ M as an analyte was injected. Solution C was used as the running buffer. Table 4 shows the measurement results. The evaluation method is the same as in Example 1.
  • nucleic acids other than SEQ ID NO: 52 are aptamers that bind to chymase significantly more than control 40N (Table 4).
  • FIG. 7 shows a sensorgram showing how the aptamers represented by SEQ ID NOs: 13, 55 and 56 bind to chymase.
  • the chymase inhibitory activity was measured in the same manner as in Example 3.
  • the respective IC 50 values are shown in Table 4. Strong inhibitory activity was observed for nucleic acids other than SEQ ID NO: 52 (Table 4). From the results of SEQ ID NOs: 51 and 52, the aptamer represented by SEQ ID NO: 12 that does not contain a common sequence maintains activity when shortened to 45 nucleotides, but is active when shortened to 26 nucleotides Was found to disappear. On the other hand, from the result of SEQ ID NO: 56, the aptamer represented by SEQ ID NO: 13 including the common sequence could be shortened to a shorter length of 23 nucleotides.
  • N 1 N 2 included in the common sequence is not limited to GU, and the sequence included in the stem structure of SEQ ID NO: 56 in FIG. 6 maintains the stem structure. It was shown that there is no particular limitation as far as possible. These aptamers are thought to be usable as chymase inhibitors.
  • Table 4 Binding activity and inhibitory activity (IC 50 ) for chymase. “++” indicates that binding to chymase is significantly more than 40N of the negative control, and “+” indicates binding that is comparable to 40N of the negative control.
  • 40N is the nucleic acid pool of the first round used in Example 1 containing a random sequence of 40 nucleotides. “> 1” indicates that no inhibitory activity was observed in the concentration range up to 1 ⁇ M.
  • the IC 50 value is an average value of 2 to 3 measurements.
  • the negative control 40N showed no inhibitory activity in the concentration range up to 1 ⁇ M (IC 50 > 1 ⁇ M). Further, the IC 50 value of chymostatin, which is a positive control, was 0.1 ⁇ M to 0.2 ⁇ M. From the above results, nucleic acids other than SEQ ID NO: 52 included in Table 4 showed inhibitory activity against chymase. In particular, it can be said that a nucleic acid having an IC 50 value of 0.1 ⁇ M or less exhibited an excellent inhibitory effect.
  • Example 5 Effect of Substitution and Deletion of Short Aptamer Base Mutation and deletion were introduced into the aptamer represented by SEQ ID NO: 56, and the influence on binding activity and inhibitory activity was examined. The sequences are shown in SEQ ID NOs 58-68.
  • nucleotide sequences of the aptamers shown by SEQ ID NOs: 58 to 68 are shown below. Unless otherwise stated, the individual sequences listed below shall be expressed in the 5 ′ to 3 ′ direction, and the brackets in the nucleotides indicate modifications at the 2 ′ position of the ribose (eg, U (F)) In this case, the 2′-position of ribose of uracil is modified with F), and F represents a fluorine atom.
  • SEQ ID NO: 58 (Sequence in which 13 nucleobases included in the common sequence of the clone represented by SEQ ID NO: 56 are randomly arranged) GGGU (F) U (F) GAAGAU (F) AU (F) U (F) AAAGAAC (F) C (F) C (F) SEQ ID NO: 59: (Sequence in which N 2 contained in the consensus sequence of the clone represented by SEQ ID NO: 56 is substituted) GGGU (F) U (F) AGAU (F) AGAGAU (F) AAAAAAC (F) C (F) C (F) SEQ ID NO: 60: (Sequence in which N 2 contained in the consensus sequence of the clone represented by SEQ ID NO: 56 is substituted) GGGU (F) U (F) AGAU (F) AGAGC (F) U (F) AAAAAAC (F) C (F) C (F) SEQ ID NO: 61: (Sequence in which N 1 contained
  • nucleic acids of SEQ ID NOs: 58 to 68 were prepared by chemical synthesis. Whether or not these nucleic acids bind to chymase was evaluated by the surface plasmon resonance method in the same manner as in Example 4. Measurement of inhibitory activity against chymase was carried out in the same manner as in Example 3. Table 5 shows the measurement results. As a result, it was found that among the nucleic acids included in Table 5, the nucleic acids of SEQ ID NOs: 59 to 65 retained strong binding strength and inhibitory activity.
  • SEQ ID NO: 58 both the binding activity and the inhibitory activity were reduced to the same level as 40N / 30N used in Examples 1 and 2. Therefore, the consensus sequence represented by SEQ ID NO: 21 is important for the binding and inhibitory activities to chymase. It was shown that. From this result, it was decided to use SEQ ID NO: 58 as a negative control of the shortened aptamer in the following examples (Examples 5 to 9). From the results of SEQ ID NOs: 59 to 61, it was shown that N 1 and N 2 contained in the common sequence may be any nucleotide, but preferably GU, GA, GC, UU.
  • the result of SEQ ID NO: 62 indicates that X 1 and X 2 may be any nucleotide, but are preferably A or G, more preferably both A or both G.
  • the base pair sequence of the stem structure included other than the common sequence eg, SEQ ID NO: 56 of FIG. 6
  • the base pair sequence of the stem structure included other than the common sequence may be any nucleotide as long as the stem structure is maintained, and the length is 3 It has been shown that more than base pairs are preferred.
  • the activity decreased when a mutation was introduced into the common sequence, so that the importance of the common sequence was shown again.
  • Binding activity and inhibitory activity (IC 50 ) for chymase In the binding activity, “++” represents a substance that binds to chymase significantly more than the negative control SEQ ID NO: 58, and “+” represents a substance having the same binding as the negative control SEQ ID NO: 58. In the inhibitory activity, “> 1” indicates that the inhibitory activity was not observed in the concentration range up to 1 ⁇ M.
  • the IC 50 value represents the average value of two measurements.
  • SEQ ID NO: 58 showed no inhibitory activity in the concentration range up to 1 ⁇ M (IC 50 > 1 ⁇ M). Further, the IC 50 value of chymostatin, which is a positive control, was 0.1 ⁇ M to 0.2 ⁇ M. From the above results, it can be seen that among the aptamers listed in Table 5, the aptamers represented by SEQ ID NOs: 59 to 65 have strong inhibitory activity against chymase (IC 50 ⁇ 0.1 ⁇ M).
  • Example 6 Modification of shortened aptamer 1
  • SEQ ID NO: 56 a modified end-modified, a modified version introduced with an O-methyl group or F modification at the 2′-position of the purine base ribose in the sequence, A modification in which phosphorothioate was introduced was prepared.
  • the sequences are shown in SEQ ID NOs: 56 (1) to 56 (14) and 56 (17) to 56 (19).
  • nucleotide sequence is shown below. Unless otherwise stated, the individual sequences listed below shall be expressed in the 5 ′ to 3 ′ direction, the brackets in the nucleotides indicate modifications at the 2 ′ position of the ribose, F is a fluorine atom, M is O -Represents a methyl group. Further, idT at each sequence end indicates modification by inverted-dT, and PEG indicates modification by 40 kDa branched polyethylene glycol. S in the sequence indicates that the phosphate group that binds nucleotides is phosphorothioated.
  • nucleic acids of SEQ ID NOs: 56 (1) to 56 (19) were prepared by chemical synthesis. Whether or not these nucleic acids bind to chymase was evaluated by the surface plasmon resonance method in the same manner as in Example 4. The results are shown in Table 6. As a result, nucleic acids other than SEQ ID NOs: 56 (8), 56 (10), 56 (13), and 56 (14) exhibited significantly more binding activity to chymase than the negative control SEQ ID NO: 58.
  • the inhibitory activity for chymase was measured by the same method as in Example 3. IC 50 values are shown in Table 6. Nucleic acids other than SEQ ID NOs: 56 (8), 56 (10), 56 (13), and 56 (14) were found to have inhibitory activity in these aptamers, although the inhibitory activity was strong or weak. When the IC 50 values were compared, the inhibitory activities of SEQ ID NOs: 56 (1) to 56 (7), 56 (11), and 56 (12) were maintained at substantially the same level as SEQ ID NO: 56.
  • the inhibitory activity of SEQ ID NO: 56 (9), 56 (15), 56 (16), 56 (17) is attenuated compared to SEQ ID NO: 56, and SEQ ID NO: 56 (8), 56 (10), 56 ( It was shown that the inhibitory activity of 13) and 56 (14) disappeared. Furthermore, it was shown that the inhibitory activity of sequence number 56 (18) and 56 (19) improves rather than sequence number 56. From the results of SEQ ID NOs: 56 (1) and 56 (17), it was found that the influence of activity due to terminal modification was small. From the results of SEQ ID NOs: 56 (2) and 56 (3), it was shown that there was no influence of activity due to the modification of the stem sequence.
  • the inhibitory activity can be retained even if modified as in 56 (4) to 56 (7), 56 (11), 56 (12), and SEQ ID NO: 56 (8). , 56 (9), 56 (10), 56 (13), 56 (14), the inhibitory activity was sometimes lowered (or disappeared) by the modification.
  • the aptamer represented by SEQ ID NO: 56 may be one having a modification introduced into at least one nucleotide in order to improve stability.
  • nucleotide modifications include 2′-amino modification in addition to 2′-O-methyl modification.
  • any one of the nucleotide modifications (U (F)) contained in the consensus sequence of the clone represented by SEQ ID NO: 56 (the 9th or 15th position) It was found that the inhibitory activity decreased when) was converted to a natural ribonucleotide (U).
  • the nuclease resistance of an aptamer is improved by including a modified form.
  • At least one of pyrimidine nucleotides (9th and 15th U of the clone represented by SEQ ID NO: 56) contained in the common sequence is a modified form.
  • natural purine bases included in the common sequence of the clone represented by SEQ ID NO: 56 are preferably natural ribonucleotides since the inhibitory activity decreases when the modification is introduced.
  • SEQ ID NOs: 56 (18) and 56 (19) it was found that the introduction of phosphorothioate at least one place as a phosphate group modification in addition to the sugar residue modification improved the inhibitory activity. .
  • Binding activity and inhibitory activity (IC 50 ) for chymase In the binding activity, “++” indicates that it binds to chymase significantly more than the negative control SEQ ID NO: 58, and “+” indicates that it binds to the same extent as the negative control SEQ ID NO: 58. “Nd.” Represents unmeasured. “> 1” indicates that no inhibitory activity was observed in the concentration range up to 1 ⁇ M.
  • the IC 50 value represents the average value of two measurements.
  • the negative control SEQ ID NO: 58 did not show inhibitory activity in the concentration range up to 1 ⁇ M (IC 50 > 1 ⁇ M). Further, the IC 50 value of chymostatin, which is a positive control, was 0.1 ⁇ M to 0.2 ⁇ M.
  • Example 7 Modification of shortened aptamer 2 Based on the result of Example 6, the aptamer represented by SEQ ID NO: 56 was further modified. Variants were examined in which a 2′-O-methyl group was introduced, various terminal modifications, phosphorothioates were introduced, ribonucleotides were replaced with DNA, and combinations thereof were prepared. The sequences are represented by SEQ ID NOs: 56 (20) to 56 (47), 61 (1), 69, 69 (1), 69 (2), 70 to 74, 74 (1), 75 to 77, 77 (1), 77. (2), 78-82.
  • nucleotide sequence is shown below. Unless otherwise stated, the individual sequences listed below shall be expressed in the 5 'to 3' direction, with capital letters indicating RNA and small letters indicating DNA.
  • the parentheses in the nucleotides indicate modifications at the 2 'position of the ribose, F represents a fluorine atom, and M represents an O-methyl group.
  • idT at each sequence end indicates modification by inverted-dT
  • PEG indicates modification by 40 kDa branched polyethylene glycol
  • Cho indicates modification by cholesterol
  • B indicates modification by biotin.
  • Peptide 1 indicates that Phe-Cys is bound to the C-terminal side
  • Peptide 2 indicates that Cys-Phe is bound to the N-terminal side, and each is bound to the 5 'end of the nucleic acid via a disulfide bond.
  • S in the sequence indicates that the phosphate group that binds nucleotides is phosphorothioated.
  • SEQ ID NO: 56 (20): G (M) G (M) G (M) G (M) U (F) U (F) AG (M) A (M) U (F) A (M) GAGU (F) U (F) A (M) A (M) AA (M) A (M) C (F) C (F) SEQ ID NO: 56 (21): G (M) G (M) G (M) U (F) U (F) AG (M) A (M) U (F) A (M) GAG (M) U (F) U (F) A ( M) A (M) A (M) A (M) A (M) C (F) C (F) SEQ ID NO: 56 (22): G (M) G (M) G (M) U (F) U (F) sAG (M) A (M) U (F) A (M) GAG (M) U (F) U (F) A (M) A (M) A (M) A (M) A (M) A (M) C
  • nucleic acids of SEQ ID NOs: 56 (20) to 56 (52), 61 (1), 69, 69 (1), 69 (2), 70 to 72, 72 (1) to 72 (8) are all prepared by chemical synthesis. did. Whether or not these nucleic acids bind to chymase was evaluated by the surface plasmon resonance method in the same manner as in Example 4. The results are shown in Table 7. As a result, all the nucleic acids (partially excluding unmeasured nucleic acids) bound to chymase significantly more than the negative control. Measurement of inhibitory activity against chymase was carried out in the same manner as in Example 3. IC 50 values are shown in Table 7. As a result, all of the nucleic acids included in Table 7 were found to have strong inhibitory activity.
  • terminal modification such as PEG may be either the 5 ′ end or the 3 ′ end.
  • terminal modifications in addition to idT and PEG shown in Example 6, peptides, amino acids, biotin, etc. It was found that the above compound may be used.
  • terminal modifications such as idT and PEG are linked via a polynucleotide chain.
  • an alkyl type spacer may be used. Moreover, it turned out that inhibitory activity improves by making some F bodies into a DNA body.
  • Table 7 Binding activity and inhibitory activity (IC 50 ) for chymase.
  • IC 50 inhibitory activity
  • “++” indicates that it binds to chymase significantly more than the negative control SEQ ID NO: 58.
  • Nd Represents unmeasured.
  • the IC 50 value represents the average value of two measurements.
  • the negative control SEQ ID NO: 58 did not show inhibitory activity in the concentration range up to 1 ⁇ M (IC 50 > 1 ⁇ M). Further, the IC 50 value of chymostatin, which is a positive control, was 0.1 ⁇ M to 0.2 ⁇ M.
  • aptamers effective as chymase inhibitors are aptamers that particularly satisfy one or more of the following conditions.
  • a common sequence represented by SEQ ID NO: 21 (X 1 GAUAGAN 1 N 2 UAAX 2 ) is included.
  • the pyrimidine nucleotides contained in the common sequence may be natural nucleotides, but preferably some of the pyrimidine nucleotides are modified nucleotides or DNA.
  • N 1 N 2 may be any nucleotide, but is preferably GU, GA, GC, UU, CU or GT.
  • X 1 and X 2 may be any nucleotide, but are preferably the same or different and are A or G, more preferably both A or both G.
  • the stem structure base pair sequence (eg, SEQ ID NO: 56 in FIG. 6) may be any nucleotide as long as the stem structure is maintained, but preferably has a length of 3 base pairs or more.
  • SEQ ID NO: 56 may be any nucleotide as long as the stem structure is maintained, but preferably has a length of 3 base pairs or more.
  • each nucleotide is partially modified or partially replaced with DNA. ing.
  • a terminal modification is introduced.
  • a part of the phosphate group between nucleotides is phosphorothioated.
  • Example 8 Measurement of Chymase Inhibitory Activity Using Angiotensin I as a Substrate
  • the enzyme activity of chymase was determined by the following method using angiotensin I which is a natural substrate of chymase. It was measured. Angiotensin I is converted to angiotensin II by chymase, and the peptide fragment His-Leu is released. Since the peptide His-Leu is fluorescently derivatized with o-phthalaldehyde, the fluorescence intensity can be quantitatively measured.
  • the amount of the enzyme reaction solution in the assay was 50 ⁇ L, and the reaction was performed in the buffer solution of Solution C.
  • chymase recombinant, (manufactured by SIGMA) or native (manufactured by Calbiochem)
  • solution C 5 ⁇ L of 0.3 to 0.75 ng of chymase (recombinant, (manufactured by SIGMA) or native (manufactured by Calbiochem)) diluted in solution C was prepared.
  • recombinant is chymase expressed using yeast
  • native is chymase purified from human skin mast cells.
  • Nucleic acids were serially diluted in solution C at a concentration of 0.0027 to 2 ⁇ M, and 25 ⁇ L each was prepared. 5 ⁇ L of chymase solution and 25 ⁇ L of nucleic acid solution were mixed and incubated at 37 ° C. for 5 minutes.
  • angiotensin I (manufactured by Peptide Laboratories) prepared in solution C was prepared and kept at 37 ° C. for 5 minutes.
  • An angiotensin I solution was added to the mixed solution consisting of chymase and nucleic acid to initiate the enzyme reaction.
  • the final chymase concentration in the reaction solution is 0.2-0.5 nM and the final substrate concentration is 50 ⁇ M.
  • 25 ⁇ L of an ice-cooled 30% trichloroacetic acid solution was added to stop the reaction.
  • the whole mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and 30 ⁇ L of the supernatant was used for the next fluorescence induction reaction.
  • 30 ⁇ L of the above supernatant was added to a 96-well plate (black, manufactured by Costar), and 15 ⁇ L of 2% o-phthalaldehyde (manufactured by SIGMA) dissolved in methanol and 170 ⁇ L of 0.3 M NaOH solution were added to each well. Mix and leave at room temperature for 10 minutes. Thereafter, 25 ⁇ L of 3M HCl solution was added to stop the reaction.
  • the plate was set in a microplate reader SpectraMax190 (manufactured by Molecular Devices), and the fluorescence intensity was measured under the conditions of an excitation wavelength of 355 nm and a fluorescence wavelength of 460 nm.
  • Inhibition rate (%) [1- ⁇ (fluorescent intensity of test substance ⁇ fluorescent intensity of blank of test substance) / (fluorescent intensity when test substance is not included ⁇ fluorescent intensity of blank when test substance is not included) ⁇ ] ⁇ 100
  • Table 8 Inhibitory activity against chymase (IC 50 ) when angiotensin I was used as a substrate. IC 50 indicates the value of a single measurement.
  • SEQ ID NO: 58 used as a negative control showed no inhibitory activity (IC 50 > 1 ⁇ M).
  • the IC 50 values of chymostatin as a positive control were 0.35 to 0.5 ⁇ M (Native) and 0.45 to 0.6 ⁇ M (Recombinant).
  • the activity of PEG-conjugated aptamers is relatively low compared to aptamers that are not PEG-conjugated. This is a phenomenon that is commonly seen because it occurs because PEG (molecular weight about 40,000) is larger than aptamer (molecular weight about 10,000). Since pharmacokinetics in vivo is greatly improved by binding PEG, it can be expected to show an effect in vivo even if the drug efficacy is somewhat reduced in vitro.
  • nucleic acids included in Table 8 have strong inhibitory activity against chymase even when angiotensin I, which is a natural substrate, is used. Therefore, as a prophylactic and / or therapeutic agent for various diseases involving angiotensin. Be expected.
  • Example 9 Measurement of LTBP-1 Degradation Inhibitory Activity Using Normal Human Lung Fibroblast (NHLF) Chymase is one of the important factors causing fibrosis to activate TGF- ⁇ . Deeply related. In the process of TGF- ⁇ activation, chymase decomposes LTBP-1 to release latent TGF- ⁇ existing as a latent form in the extracellular matrix, and further, the latent TGF- ⁇ is activated TGF- ⁇ . It has been suggested that it is also involved in the reaction to convert to. Whether or not the nucleic acid according to the present invention has an inhibitory activity against LTBP-1 degradation by chymase was evaluated by the method described below.
  • NHLF Normal Human Lung Fibroblast
  • Cryopreserved NHLF cells (Cambrex Bio Science) were rapidly thawed in a water bath at 37 ° C. and suspended in a medium (10% FBS / F-12). After centrifugation (1200 rpm, 5 minutes), the supernatant was removed and the cells were resuspended in medium. The total volume of the medium was 10 mL, transferred to a cell culture petri dish, and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 . The morphology and growth state of the cells were observed with a microscope, and the cells were replaced with serum-free medium (0.2% BSA / F-12) when they reached a confluent state.
  • the final chymase concentration in the reaction solution was 10 ng / mL (0.33 nM) and the final nucleic acid concentration was 5 ⁇ M.
  • a tube to which chymase was not added was prepared. After pipetting, the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour, and mixed with an equal amount of electrophoresis lysis buffer to complete the reaction.
  • LTBP-1 in the sample was detected by the following Western blotting. The sample mixed with the lysis buffer was boiled for 3 minutes, 10 ⁇ L of the sample was applied to a 5-20% acrylamide gel and electrophoresed.
  • the mixture was transferred to a nitrocellulose filter, and the filter was blocked with 5% skim milk, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.05% sodium azide.
  • the filter was reacted overnight at room temperature with anti-LTBP-1 monoclonal antibody diluted to 2 ⁇ g / mL with 2% BSA, PBS, 0.05% sodium azide.
  • the filter was washed three times and incubated with a secondary antibody solution (HRP-labeled anti-mouse IgG antibody diluted 10000-fold in 0.1% BSA / PBS) at room temperature for 2 hours.
  • the filter was washed 5 times and detected with a chemiluminescent substrate.
  • the presence or absence of inhibitory activity of each test substance was determined by the density and position (molecular weight) of the LTBP-1 band.
  • the analysis was performed in three parts.
  • the band of the well without chymase was defined as a positive control (+), the band of the negative control well was negative ( ⁇ ), and the presence or absence of inhibitory activity was visually determined from the band of each test substance well.
  • the analysis result by Western blotting is shown in FIG. 8, and the determination result of the inhibitory activity is shown in Table 9.
  • Table 9 Presence or absence of inhibitory activity against LTBP-1 degradation. “+” Indicates that a band having the same density as the LTBP-1 band in the control was detected, and “ ⁇ ” indicates that the LTBP-1 band was not clearly detected as in the negative control.
  • SEQ ID NO: 58 showed no inhibitory activity ( ⁇ ).
  • chymostatin which is a positive control, showed inhibitory activity (+).
  • All aptamers other than SEQ ID NO: 58 included in Table 9 showed inhibitory activity against LTBP-1 degradation. From the above results, it was found that the aptamer according to the present invention inhibits LTBP-1 degradation by chymase. Therefore, it has been shown that it can be used for the prevention and / or treatment of various diseases involving the activation of TGF- ⁇ such as fibrosis.
  • the aptamer and complex of the present invention can be useful as a medicine for a disease such as a circulatory system disease or fibrosis, a diagnostic agent, or a reagent.
  • the aptamers and complexes of the present invention may also be useful for the purification and concentration of chymase and the detection and quantification of chymase.

Abstract

　キマーゼに結合しキマーゼの活性を阻害するアプタマー；Ｘ１ＧＡＵＡＧＡＮ１Ｎ２ＵＡＡＸ２（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、Ａ又はＧであり、Ｎ１及びＮ２は、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴである）で表されるヌクレオチド配列を含むアプタマー；当該アプタマーおよび機能性物質（例えば、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体、又は薬物など）を含む複合体；当該アプタマーあるいは複合体を含む医薬または試薬；当該アプタマーあるいは複合体を用いることを特徴とするキマーゼの検出方法および精製方法などを提供する。

Description

キマーゼに対するアプタマー及びその使用
　本発明は、キマーゼに対するアプタマー及びその利用方法などに関するものである。
　ヒトキマーゼ（ＥＣ．３．４．２１．３９）はキモトリプシン様セリンプロテアーゼの一種で、肥満細胞の分泌顆粒中に貯蔵されている。肥満細胞が外的刺激を受けると脱顆粒を起こし、ヒトキマーゼは様々な炎症メディエーターと共に細胞外に放出される。放出されたヒトキマーゼは、基質である蛋白質やペプチドに含まれるフェニルアラニンやチロシンといった芳香族アミノ酸を特異的に認識し、そのアミノ酸に隣接するペプチド結合を切断する。ヒトキマーゼの代表的な基質として、アンジオテンシンＩ（ＡｎｇＩ）が挙げられる。ヒトキマーゼはＡｎｇＩを切断し、血管収縮因子であるアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）を産生する。
　哺乳類のキマーゼは系統学的にαとβの２つのサブファミリーに分類される。ヒトを含む霊長類の発現するキマーゼは一種類のみでαファミリーに属している。一方で、げっ歯類はαとβ両方のキマーゼを発現する。マウスの場合、複数の種類のキマーゼが知られているが、基質特異性や組織における発現様式から、βファミリーに属するｍｏｕｓｅ　ｍａｓｔ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｔｅａｓｅ－４（ｍＭＣＰ－４）が最もヒトキマーゼに近いと考えられる。また、ハムスターでもβファミリーに属するｈａｍｓｔｅｒ　ｃｈｙｍａｓｅ－１がそれに対応する。一方で、ヒトキマーゼと同じαファミリーに属するｍＭＣＰ－５やｈａｍｓｔｅｒ　ｃｈｙｍａｓｅ－２はエラスターゼ様活性を持ち、基質特異性が異なる。
　キマーゼはトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）の活性化に深く関係している。ＴＧＦ－βは上皮細胞や内皮細胞周辺の細胞外マトリックス中に潜在型（ｌａｔｅｎｔ－ＴＧＦ－β）として存在し、ｌａｒｇｅ　ｌａｔｅｎｔ　ＴＧＦ－β　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＴＢＰ）を介して細胞外マトリックスに保持されている。必要に応じて細胞外マトリックスから放出され、活性化されたＴＧＦ－βは細胞の増殖分化、組織障害後の修復や再生に関与するとされ、生体にとって極めて重要なサイトカインである。また、そのシグナルの破綻は、様々な疾患の発症及び進展に繋がることも知られている。この過程において、キマーゼはｌａｔｅｎｔ　ＴＧＦ－βの細胞外マトリックスからの遊離、及びｌａｔｅｎｔ　ＴＧＦ－βから活性型ＴＧＦ－βへの変換反応へ関与すると考えられている。
　キマーゼは線維症、循環器疾患、炎症、アレルギー疾患、臓器癒着など様々な疾患と関係していることが知られている。線維症とは肺や心臓、肝臓、腎臓、皮膚などで細胞外基質の代謝異常が起こり、結合組織タンパク質が過剰に沈着する病気である。例えば肺線維症では肺にコラーゲンなどの結合組織タンパク質が過剰に沈着し、肺胞が硬く縮んでしまい呼吸困難に陥る。肺の線維化は、大量のほこりに曝露することで起こる塵肺、抗がん剤などの薬物使用によって起こる薬剤性肺炎、アレルギー性肺炎、肺結核、膠原病のような自己免疫疾患などが原因で起こることがわかっている。一方で原因不明のケースも少なくない。
　線維症の分子レベルでの発症機序は未だ十分に解明されていない。一般に正常な状態においては線維芽細胞の増殖やその機能は十分に制御されているが、炎症や外傷が重篤あるいは持続的であった場合には、組織修復機構が過剰に働き、線維芽細胞の異常増殖や結合組織タンパク質の過剰生産が起こる。このような現象を引き起こす因子としてＴＧＦ－βが知られている。その関与を示唆するものとして、線維症動物モデルに抗ＴＧＦ－β中和抗体を投与すると、コラーゲン発現が減少し、線維化が有意に抑制されることが報告されている。また、特発性肺線維症患者においては、ＴＧＦ－βやキマーゼ陽性肥満細胞の増加がみられる。
　一方で、キマーゼが線維症に関係していることがモデル動物を用いた実験により示されている。ハムスターのブレオマイシン誘発性肺線維症モデルでは、キマーゼ活性の亢進、コラーゲンＩＩＩ　ｍＲＮＡの発現増加、組織の線維化といった現象が、キマーゼ阻害剤により有意に減少する。マウスのブレオマイシン誘発性肺線維症モデルにおいても同様で、キマーゼ阻害剤投与により、キマーゼ活性の抑制、ヒドロキシプロリン量の減少といった効果が得られている。
　以上より、キマーゼ阻害剤は線維症などのキマーゼと関係する疾患の予防薬又は治療薬として利用可能である。キマーゼ阻害剤としては低分子化合物であるＴＰＣ－８０６やＳＵＮ－１３８３４、ＳＵＮ－Ｃ８２５７、ＳＵＮ－Ｃ８０７７、ＪＮＪ－１０３１１７９５などが開発されている（特許文献１）。
　ところで、近年、ＲＮＡアプタマーの治療薬、診断薬、試薬への応用が注目されており、いくつかのＲＮＡアプタマーが臨床段階あるいは実用化段階に入っている。２００４年１２月には世界初のＲＮＡアプタマー医薬であるＭａｃｕｇｅｎが加齢黄斑変性症の治療薬として米国で承認された。ＲＮＡアプタマーとはタンパク質などの標的物質に特異的に結合するＲＮＡのことで、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を用いて作製することができる（特許文献２～４）。ＳＥＬＥＸ法とは、１０１４個程度の異なるヌクレオチド配列を持つＲＮＡのプールから、標的物質に特異的に結合するＲＮＡを選別する方法である。使用されるＲＮＡは４０ヌクレオチド程度のランダム配列をプライマー配列で挟み込んだ構造をしている。このＲＮＡプールを標的物質と会合させて、フィルターなどを用いて標的物質に結合したＲＮＡのみ回収する。回収したＲＮＡはＲＴ－ＰＣＲで増幅し、これを次のラウンドの鋳型として用いる。この作業を１０回程度繰り返すことにより、標的物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを取得することができる場合がある。
　アプタマー医薬は抗体医薬と同様に細胞外タンパク質を標的にすることができるが、既に公表されている多くの学術論文等を参考にすると、いくつかの点で抗体医薬を上回る可能性がある。例えば、アプタマーは抗体よりも標的分子に対して高い親和性や特異性を示す場合が多々ある。また、免疫排除を受けにくく、抗体特有の抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）などの副作用は起こりにくいとされる。デリバリーの観点では、アプタマーは抗体の１／１０程度の分子サイズであるため組織移行が起こりやすく、目的の部位まで薬物を送達させることがより容易である。アプタマーは化学合成により生産されるので、部位選択的な化学修飾が可能であり、大量生産すればコストダウンを図ることができる。その他、長期保存安定性や熱・溶媒耐性もアプタマーの優位な特徴である。一方で、一般にアプタマーの血中半減期は抗体よりも短い。しかし、この点も毒性を考慮した場合はメリットとなる場合がある。以上の点より、同じ分子を標的にした医薬品であっても、アプタマー医薬は抗体医薬に勝る可能性がある。
米国特許公報６５００８３５号 国際公開ＷＯ９１／１９８１３号パンフレット 国際公開ＷＯ９４／０８０５０号パンフレット 国際公開ＷＯ９５／０７３６４号パンフレット
　本発明は、キマーゼに対するアプタマー及びその利用方法などを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、キマーゼに対する良質なアプタマーを作製することに成功し、もって本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、以下の発明などを提供するものである：
［１］キマーゼに結合しキマーゼの活性を阻害するアプタマー。
［２］Ｘ１ＧＡＵＡＧＡＮ１Ｎ２ＵＡＡＸ２（配列番号２１；式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、Ａ又はＧであり、Ｎ１及びＮ２は、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴである）で表されるヌクレオチド配列を含む、［１］記載のアプタマー。
［３］Ｎ１Ｎ２がＧＡ、ＧＵ、ＧＣ、ＵＵ、ＧＴ又はＣＵである、［２］記載のアプタマー。
［４］Ｘ１及びＸ２が共にＡ、もしくは共にＧである、［２］記載のアプタマー。
［５］ピリミジンヌクレオチドの少なくとも一つが修飾または改変されている、［３］または［４］記載のアプタマー。
［６］以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、［１］記載のアプタマー：
（ａ）配列番号４～３４、３８～５７、５９～６５および６９～７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ）配列番号４～３４、３８～５７、５９～６５および６９～７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１～５個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列；又は
（ｃ）配列番号４～３４、３８～５７、５９～６５および６９～７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
［７］アプタマーに含まれる少なくとも１つのヌクレオチドが修飾または改変されている、［６］記載のアプタマー。
［８］以下の（ａ’）、（ｂ’）又は（ｃ’）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、［１］記載のアプタマー：
（ａ’）配列番号５６（１）～５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）～５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）、及び７２（１）～７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ’）配列番号５６（１）～５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）～５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）、及び７２（１）～７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１～５個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列；又は
（ｃ’）配列番号５６（１）～５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）～５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）、及び７２（１）～７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
［９］アプタマーに含まれる各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、［１］記載のアプタマー。
［１０］アプタマーに含まれる各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、［１］記載のアプタマー。
［１１］［１］～［１０］のいずれか一に記載のアプタマー及び機能性物質を含む複合体。
［１２］機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物である、［１１］記載の複合体。
［１３］［１］～［１０］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１１］又は［１２］記載の複合体を含む医薬。
［１４］循環器系疾患または線維症の予防もしくは治療用である、［１３］記載の医薬。
［１５］［１］～［１０］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１１］又は［１２］記載の複合体を含む診断薬。
［１６］［１］～［１０］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１１］又は［１２］記載の複合体を含むキマーゼ検出用プローブ。
［１７］［１］～［１０］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１１］又は［１２］記載の複合体を含む、キマーゼ精製用固相担体。
［１８］［１］～［１０］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１１］又は［１２］記載の複合体を用いることを特徴とする、キマーゼの検出方法。
［１９］［１］～［１０］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１１］又は［１２］記載の複合体を用いることを特徴とする、キマーゼの精製方法。
　本発明のアプタマー及び複合体は、例えば線維症や循環器系疾患などのキマーゼに起因する種々の疾患に対する医薬、あるいは診断薬、試薬として有用であり得る。本発明のアプタマー及び複合体はまた、キマーゼの精製及び濃縮、並びにキマーゼの検出及び定量に有用であり得る。
配列番号４、５、１２～１４、１８で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。配列番号２１で表される共通配列を丸で示す。 配列番号２２～２７で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。配列番号２１で表される共通配列を丸で示す。 配列番号２８～３４で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。配列番号２１で表される共通配列を丸で示す。 配列番号１２及び１３で表されるアプタマーがキマーゼに結合する様子を示す図である。４０Ｎは４０ヌクレオチドのランダム配列を含んだＲＮＡプールである。キャプチャー分子として、アプタマー又はネガティブコントロールの４０Ｎを固定化し、アナライトとしてヒトキマーゼを流した。測定はＧＥヘルスケア社製のＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００で行った。 配列番号３８～４０、４３、４８で表される配列のアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。配列番号２１で表される共通配列を丸で示す。 配列番号４９、５１、５５～５７で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。配列番号２１で表される共通配列を丸で示す。 配列番号１３、５５、５６で表されるアプタマーがキマーゼに結合する様子を示す図である。４０Ｎは４０ヌクレオチドのランダム配列を含んだＲＮＡプールである。チップ表面にキマーゼを固定化し、アナライトとしてアプタマー又はネガティブコントロールの４０Ｎを流した。測定はＧＥヘルスケア社製のＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００で行った。 キマーゼによるＬＴＢＰ－１分解と表９に含まれるアプタマーによるＬＴＢＰ－１分解阻害の様子をウェスタンブロッティングで検出した結果を示す図である。レーン番号１、８、９、２３、３１はマーカー、レーン番号６、２１、２９はネガティブコントロール（阻害剤なし）、レーン番号７、２２、３０はキマーゼ不添加によるコントロールを示す。
　本発明は、キマーゼに対して結合活性を有するアプタマーを提供する。本発明のアプタマーは、キマーゼの活性を阻害し得る。
　アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。アプタマーは、所定の標的分子に対して結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害し得る。本発明のアプタマーは、キマーゼに対して結合活性を有し、キマーゼの活性を阻害し得るアプタマーである。また本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸又はそれらの混合物であり得る。本発明のアプタマーはまた、直鎖状又は環状の形態であり得る。
　キマーゼは公知のセリンプロテアーゼの一つであり、肥満細胞の分泌顆粒内に貯蔵されている。キマーゼは、例えば生理活性ペプチドの産生・分解、細胞外マトリックスのリモデリング、サイトカインとのネットワーク、免疫等の肥満細胞が関与する様々な生体反応に深く関与している。本発明のアプタマーは、任意の哺乳動物に由来するキマーゼに対する阻害活性を有し得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）が挙げられるが、好ましくはヒトである。ヒトキマーゼのアミノ酸配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　ＡＡＢ２６８２８で表されるものであるが、１～数残基の変異が入ったものや、そのドメイン部分、ペプチド部分であってもよい。また、ヒトキマーゼの構造はモノマーだけでなくダイマーや多量体であってもよい。
　本発明のアプタマーは、生理的な緩衝液中でキマーゼへ結合する。緩衝液としては特に限定されるものではないが、ｐＨが約５．０～１０．０程度のものが好ましく用いられ、このような緩衝液としては、例えば後述する溶液Ａや溶液Ｃ（実施例１及び２参照）が挙げられる。本発明のアプタマーは、以下のいずれかの試験により検出可能な程度の強度で、キマーゼへ結合するものである。
　結合強度の測定にはＧＥヘルスケア社製のＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００を用いる。一つの測定方法としては、まずセンサーチップにアプタマーを固定化する。固定化量は約１０００ＲＵとする。アナライト用のキマーゼ溶液は０．２μＭに調製したものを２０μＬインジェクトし、キマーゼのアプタマーへの結合を検出する。３０もしくは４０ヌクレオチドからなるランダムなヌクレオチド配列を含むＲＮＡをネガティブコントロールとし、該コントロールＲＮＡと比較してキマーゼが同等もしくは有意に強くアプタマーに結合した場合、該アプタマーはキマーゼへの結合能を有すると判定することができる。
　別の測定方法としては、まずセンサーチップにキマーゼを固定化する。固定化量は約４０００ＲＵとする。アナライト用のアプタマー溶液は０．０１μｇ／μＬに調製したものを２０μＬインジェクトし、アプタマーのキマーゼへの結合を検出する。３０もしくは４０ヌクレオチドからなるランダムなヌクレオチド配列を含むＲＮＡをネガティブコントロールとし、該コントロールＲＮＡと比較してキマーゼが同等もしくは有意に強くアプタマーに結合した場合、該アプタマーはキマーゼへの結合能を有すると判定する。
　キマーゼに対する阻害活性とは、キマーゼが保有する任意の活性に対する阻害能を意味する。例えば、キマーゼの機能の一つに、ペプチド鎖を加水分解することにより切断する酵素活性があるが、それを阻害するということである。酵素活性に対する基質として許容されるのは、生体内に存在する蛋白質や生理活性ペプチド（例えばＡｎｇＩ、ｌａｔｅｎｔ　ＴＧＦ－βなど）に限らず、それらのペプチドの一部のアミノ酸配列が含まれるペプチドに発色物質や蛍光物質が付加したペプチドも含まれる。発色物質や蛍光物質は、当業者に公知である。また、蛋白質や生理活性ペプチドの分解反応を介して起こる現象として、コラーゲンＩ／ＩＩＩの発現増加、ヒドロキシプロリン量の増加、ＩｇＥ発現増加などが挙げられるが、これらに対する抑制効果もキマーゼに対する阻害活性に含まれる。その他、キマーゼに対する好中球、単球、好酸球の遊走活性を阻害する活性も、キマーゼに対する阻害活性に含まれる。さらに、キマーゼにより誘導されるヒスタミン遊離促進、肥満細胞数の増加、血管透過性の増大、組織の線維化、炎症、血管新生、血管内膜肥厚などに対する抑制効果も、キマーゼに対する阻害活性に含まれる。
　キマーゼの基質とは、キマーゼにより加水分解を受け切断されるペプチドや蛋白質などを意味する。生体内に存在するキマーゼの基質としては、ＡｎｇＩ、ｌａｔｅｎｔ　ＴＧＦ－β、ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）、プロコラーゲン、プロコラゲナーゼ、フィブロネクチン、プロマトリックスメタロプロテアーゼ－１（ｐｒｏ－ＭＭＰ－１）、ｐｒｏ－ＭＭＰ－９、ｔｉｓｓｕｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１（ＴＩＭＰ－１）、アポリポプロテインＡ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）、ａｐｏＥ、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ＩＬ－１β前駆体、ｂｉｇ－ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１（ｂｉｇ－ＥＴ－１）、ｂｉｇ－ＥＴ－２、ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　ｔｉｓｓｕｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ＩＩＩ、ＩＬ－１８前駆体、ｓｕｂｓｔａｎｃｅ　Ｐ、ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ（ＶＩＰ）、ｋａｌｌｉｄｉｎ、ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ、Ｃ３ａなどのペプチドや蛋白質が知られている。本明細書におけるキマーゼの基質としては、これらに限らず、それらの一部のアミノ酸配列としてキマーゼが特異的に認識するＰｈｅやＴｙｒなどのアミノ酸残基を含む人工的に設計されたモデルペプチドや、このようなペプチドに発色物質や蛍光物質が付加されたペプチドも含まれる。
　キマーゼの酵素活性をアプタマーが阻害するか否かは、以下の試験により評価することができる。例として三つの方法を以下に示す。
　一つめに、合成基質を用いる評価方法を示す。キマーゼの基質としては、例えばキモトリプシン様プロテアーゼの標準基質である４アミノ酸ペプチド、「Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ」を含んでなる、Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ＭＣＡ（４－メチルクマリル－７－アミド基）（ペプチド研究所社製）を用いる。
　アッセイには、９６ウェルプレート（Ｆ１６　Ｂｌａｃｋ　Ｍａｘｉｓｏｒｐ　Ｆｌｕｏｒｏｎｕｎｃ、Ｎｕｎｃ社製）を用い、反応液量を１００μＬとし、緩衝液（溶液Ｃ；後述する実施例２参照）中で反応を行う。まず、核酸は溶液Ｃ中に調製したものを、５０μＬ用意する。そこに、溶液Ｃ中に調製した１ｍＭの基質を１０μＬ添加した後、プレートをマイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、３７℃で５分間保温する。一方で、０．０５μｇのキマーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＳＩＧＭＡ社製）を溶液Ｃ中に希釈したものを４０μＬ用意し、３７℃で５分間保温する。核酸及び基質からなる混合液に、キマーゼ溶液を加えて、酵素反応を開始させる。反応液を含むプレートを、マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、３７℃で５分間、蛍光強度の変化を経時的に測定（励起波長　３８０ｎｍ、検出波長　４６０ｎｍ）する。キマーゼ活性により、基質から放出されるＡＭＣ（７－アミノ－４－メチルクマリン）の蛍光増加の線形近似を求め、その傾きの値を初速度とする。コントロールとして、３０もしくは４０ヌクレオチドのランダム配列を含む核酸プールを用いた場合（ネガティブコントロール）、及び既知のキモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤であるキモスタチンを用いた場合（ポジティブコントロール）において、同様に処理し測定を行う。核酸、阻害剤を含まない場合の反応初速度を酵素活性１００％とし、各被験物質の阻害率を算出し、酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求める。ＩＣ５０が既知の阻害剤であるキモスタチンに比べて低い値を示すアプタマーを、優れた阻害活性を持つアプタマーであると判定する。
　二つめに、天然の基質を用いる評価方法を示す。キマーゼの天然の基質としては、例えばアンジオテンシンＩを用いる。ここでは、アンジオテンシンＩの分解により遊離するペプチド断片であるＨｉｓ－Ｌｅｕを蛍光誘導化し、その蛍光強度を定量的に測定する方法を説明する。
　アッセイにおける酵素反応の溶液量は５０μＬとし、溶液Ｃ中で反応を行う。まず、０．３～０．７５ｎｇのキマーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＳＩＧＭＡ社製、もしくはｎａｔｉｖｅ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を溶液Ｃ中に希釈したものを５μＬ用意する。核酸は溶液Ｃ中に調製したものを、２５μＬ用意する。キマーゼ溶液５μＬと核酸溶液２５μＬを混和し、３７℃で５分間保温する。一方で、溶液Ｃ中に調製した１２５μＭアンジオテンシンＩ（ペプチド研究所社製）を２０μＬ用意し、３７℃で５分間保温する。キマーゼ及び核酸からなる混合液に、アンジオテンシンＩ溶液を加えて、酵素反応を開始させる。３７℃で９０分間反応させた後、氷冷した３０％トリクロロ酢酸溶液を２５μＬ添加し、反応を停止させる。混合液全体を４℃、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、その上清３０μＬを次の蛍光誘導化反応に用いる。
　上記の上清３０μＬを９６ウェルプレート（ブラック、Ｃｏｓｔａｒ社製）に加え、各ウェルに対し、メタノールに溶解した２％　ｏ－フタルアルデヒド（ＳＩＧＭＡ社製）溶液１５μＬと、０．３Ｍ　ＮａＯＨ溶液１７０μＬを混和し、室温に１０分間放置する。その後、３Ｍ　ＨＣｌ溶液を２５μＬ添加し、反応を停止させる。プレートをマイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍの条件で蛍光強度を測定する。
　なお、コントロールとして、配列番号５８を用いた場合（ネガティブコントロール）、及び既知のキモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤であるキモスタチンを用いた場合（ポジティブコントロール）で同様に処理し測定を行う。各条件において、反応時間０分における蛍光強度をブランクとする。キマーゼ酵素反応において、核酸を添加するかわりに溶液Ｃを同量添加した場合に検出される蛍光強度を１００％とし、各被験物質の阻害率を算出し、酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求める。ＩＣ５０が既知の阻害剤であるキモスタチンに比べて低い値を示すアプタマーを、優れた阻害活性を持つアプタマーであると判定する。
　三つめに、細胞培養上清中に含まれる天然の基質を用いる評価方法を示す。ここではキマーゼの基質であるＬＴＢＰ－１の分解をウェスタンブロッティングにより検出する。凍結保存されたＮＨＬＦ細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ　Ｂｉｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を３７℃のｗａｔｅｒ　ｂａｔｈにて急速融解後、培地（１０％　ＦＢＳ／Ｆ－１２）に懸濁する。遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）後、上清を除去し、細胞を培地に再懸濁する。遠心分離された細胞に培地を加え全量を１０ｍＬとして、懸濁液を細胞培養用シャーレに移して３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養する。顕微鏡にて細胞の形態及び増殖状態を観察し、コンフルエントの状態になったところで無血清培地（０．２％　ＢＳＡ／Ｆ－１２）に交換する。培地交換から２日後に培養上清を採取し、分注して－３０℃で凍結保存する。
　用時解凍したＮＨＬＦ培養上清４０μＬをチューブに分注し、溶液Ｃで希釈した核酸溶液を５μＬ添加する。ポジティブコントロールはキモスタチンを溶液Ｃで希釈し、同様に添加する。ネガティブコントロールは溶液Ｃのみ添加する。次に、溶液Ｅ（溶液Ｃ＋０．１％　ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウム）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したキマーゼを５μＬ添加する。コントロールとして、キマーゼを添加しないチューブを作製する。攪拌後３７℃で1時間インキュベーションし、等量の電気泳動用Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒと混合して反応を終了する。次に示すウェスタンブロッティングにより、サンプル中のＬＴＢＰ－１を検出する。
　Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒと混合したサンプルを３分間煮沸し、５～２０％アクリルアミドゲルに１０μＬのサンプルをアプライして電気泳動する。泳動終了後、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした後、フィルターを５％スキムミルク、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０５％アジ化ナトリウムでブロッキングする。フィルターを２％ ＢＳＡ、ＰＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウムで２μｇ／ｍＬに希釈した抗ＬＴＢＰ－１モノクローナル抗体と室温で一晩反応させる。フィルターを３回洗浄し、２次抗体溶液（ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を０．１％　ＢＳＡ／ＰＢＳに１００００倍希釈）と室温で２時間インキュベーションする。フィルターを５回洗浄し、化学発光基質で検出を行う。
　ＬＴＢＰ－１のバンドの濃さおよび位置（分子量）から、キマーゼ不添加のウェルのバンドを陽性対照（＋）、ネガティブコントロールのウェルのバンドを陰性対照（－）とし、各被験物質の阻害活性の有無を目視で判定する。
　本発明のアプタマーは、キマーゼの任意の部分に結合し、その活性を阻害し得るものである限り特に限定されない。
　本発明のアプタマーの長さは特に限定されず、通常、約１０～約２００ヌクレオチドであり得るが、例えば約１００ヌクレオチド以下であり、好ましくは約５０ヌクレオチド以下であり、より好ましくは約４０ヌクレオチド以下であり、最も好ましくは約３０ヌクレオチド以下であり得る。総ヌクレオチド数が少なければ、化学合成及び大量生産がより容易であり、かつコスト面でのメリットも大きい。また、化学修飾も容易であり、生体内安定性も高く、毒性も低いと考えられる。
　本発明のアプタマーに含まれる各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース、プリンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチド（即ち、未置換であるヌクレオチド）であるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の原子又は基で置換されているヌクレオチドであり得る。このような任意の原子又は基としては、例えば、水素原子、フッ素原子又は－Ｏ－アルキル基（例、－Ｏ－Ｍｅ基）、－Ｏ－アシル基（例、－Ｏ－ＣＯＭｅ基）、アミノ基（例、－ＮＨ２基）で置換されているヌクレオチドが挙げられる。
　本発明のアプタマーは、Ｘ１ＧＡＵＡＧＡＮ１Ｎ２ＵＡＡＸ２（配列番号２１；式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、Ａ又はＧであり、Ｎ１及びＮ２は、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴである。但し、ウラシルはチミンであってもよい）で表される配列を有するアプタマーである。この配列を有するアプタマーは強くキマーゼに結合し、キマーゼの活性を阻害する。
　上記式中、Ｘ１及びＸ２として好ましくは、共にＡ、もしくは共にＧである。またＮ１及びＮ２として好ましくは、Ｎ１Ｎ２がＧＡ、ＧＵ、ＧＣ、ＵＵ、ＧＴ又はＣＵである（但し、ウラシルはチミンであってもよい）。
　本発明のアプタマーはまた、少なくとも１種（例、１、２、３又は４種）のヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる少なくとも２種（例、２、３又は４種）の基を含むヌクレオチドであり得る。
　本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのピリミジンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一又は異なって、フッ素原子で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されているヌクレオチドであり得る。
　本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのプリンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一又は異なって、ヒドロキシル基で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されるヌクレオチドであり得る。
　本発明のアプタマーはまた、全てのヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる同一の基を含むヌクレオチドであり得る。
　尚、本明細書においては、アプタマーを構成するヌクレオチドをＲＮＡと仮定して（すなわち糖基をリボースと仮定して）、ヌクレオチド中の糖基への修飾の態様を説明するが、これは、アプタマーを構成するヌクレオチドからＤＮＡが除外されることを意味するものではなく、適宜ＤＮＡへの修飾として読み替えられる。例えば、アプタマーを構成するヌクレオチドがＤＮＡである場合、リボースの２’位のヒドロキシル基のＸへの置換は、デオキシリボースの２’位の一方の水素原子のＸへの置換として読み替えられる。
　本発明のアプタマーはまた、
（ａ）配列番号４～３４、３８～５７、５９～６５および６９～７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含むアプタマー；
（ｂ）配列番号４～３４、３８～５７、５９～６５および６９～７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマー；又は
（ｃ）配列番号４～３４、３８～５７、５９～６５および６９～７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列を含むアプタマー；
であり得；或いは、本発明のアプタマーとしては、
（ｄ）上記（ａ）の複数の連結物、上記（ｂ）の複数の連結物、上記（ｃ）の複数の連結物、上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の複数の連結物からなる群より選ばれる連結物も含まれる。
　上記（ａ）のアプタマーだけでなく（ｂ）～（ｄ）のアプタマーも、キマーゼに結合し且つ／又はキマーゼの活性（キマーゼの酵素活性等）を阻害し得る。
　本発明のアプタマーはまた、
（ａ’）配列番号５６（１）～５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）～５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）および７２（１）～７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含むアプタマー；
（ｂ’）配列番号５６（１）～５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）～５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）および７２（１）～７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１～５個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマー；又は
（ｃ’）配列番号５６（１）～５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）～５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）および７２（１）～７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むアプタマー；
であり得；或いは、本発明のアプタマーとしては、
（ｄ’）上記（ａ’）の複数の連結物、上記（ｂ’）の複数の連結物、上記（ｃ’）の複数の連結物、上記（ａ’）、（ｂ’）及び（ｃ’）の複数の連結物からなる群より選ばれる連結物も含まれる。さらに、本発明のアプタマーとしては、
（ｅ）上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群より選ばれるアプタマーの一つ以上と（ａ’）、（ｂ’）及び（ｃ’）からなる群より選ばれるアプタマーの一つ以上とからなる連結物も含まれる。
　上記（ａ’）～（ｄ’）および（ｅ）のアプタマーも、キマーゼに結合し且つ／又はキマーゼの活性（キマーゼの酵素活性等）を阻害し得る。
　上記（ｂ）および（ｂ’）において、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチド数は、アプタマーがキマーゼに結合し且つ／又はキマーゼの活性（キマーゼの酵素活性等）を阻害し得る限り特に限定されないが、例えば約３０個以下、好ましくは約２０個以下、より好ましくは約１０個以下、さらにより好ましくは５個以下、最も好ましくは４個、３個、２個又は１個であり得る。
　上記（ｃ）および（ｃ’）において、「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのヌクレオチド配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全ヌクレオチド残基に対する、同一ヌクレオチド残基の割合（％）を意味する。
　本明細書において、ヌクレオチド配列における同一性は、例えば相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ－２（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（ギャップオープン＝５ペナルティ；ギャップエクステンション＝２ペナルティ；ｘ＿ドロップオフ＝５０；期待値＝１０；フィルタリング＝ＯＮ）にて２つのヌクレオチド配列をアラインすることにより、計算することができる。
　上記（ｄ）、（ｄ’）および（ｅ）において連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１～約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、－（ＣＨ２）ｎ－リンカー、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、－Ｓ－Ｓ－結合を含むリンカー、－ＣＯＮＨ－結合を含むリンカー、－ＯＰＯ３－結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば２個、３個又は４個であり得る。上記（ａ）～（ｄ）、（ａ’）～（ｄ’）および（ｅ）における各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の基（例、水素原子、フッ素原子又は－Ｏ－Ｍｅ基）で置換されているヌクレオチドであり得る。
　本発明のアプタマーは、キマーゼに対する結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、Ｏ－アルキル化（例、Ｏ－メチル化、Ｏ－エチル化）、Ｏ－アリル化、Ｓ－アルキル化（例、Ｓ－メチル化、Ｓ－エチル化）、Ｓ－アリル化、アミノ化（例、－ＮＨ２）が挙げられる。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Ｓｐｒｏａｔ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅ．Ａｃｉｄ．　Ｒｅｓ．１９，７３３－７３８；Ｃｏｔｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９１）　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，２６２９－２６３５；Ｈｏｂｂｓ　ｅｔ　ａｌ．，（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１２，５１３８－５１４５参照）。
　本発明のアプタマーはまた、キマーゼに対する結合活性等を高めるため、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）が改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、６及び／又は８位プリン改変、環外アミンでの改変、４－チオウリジンでの置換、５－ブロモ又は５－ヨード－ウラシルでの置換が挙げられる。
　また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）ＣＨ３、Ｐ（Ｏ）ＢＨ３、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｒ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（ホルムアセタール）又は３’－アミン（－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－）で置換されていてもよい〔ここで各々のＲ又はＲ’は独立して、Ｈであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。
　連結基としては、－Ｏ－、－Ｎ－又は－Ｓ－が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
　改変はまた、キャッピングのような３’及び５’の改変を含んでもよい。
　改変はさらに、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｄＴ、核酸、ヌクレオシド、Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｉｃ－ｏｌｅｙｌ、Ｄｏｃｏｓａｎｙｌ、Ｌａｕｒｏｙｌ、Ｓｔｅａｒｏｙｌ、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、Ｏｌｅｏｙｌ、Ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチンなどを末端に付加することにより行われ得る。このような改変については、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号、同第５，７５６，７０３号を参照して行うことができる。
　本発明のアプタマーは、本明細書中の開示及び当該技術分野における自体公知の方法により合成することができる。合成方法の一つはＲＮＡポリメラーゼを用いる方法である。目的の配列とＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を持つＤＮＡを化学合成し、これをテンプレートにして既に公知の方法により転写することで目的のＲＮＡを得ることができる。また、ＤＮＡポリメラーゼを用いることでも合成することができる。目的の配列を有したＤＮＡを化学合成し、これをテンプレートにして、既に公知の方法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。これを既に公知の方法であるポリアクリルアミド電気泳動法や酵素処理法により一本鎖とする。修飾の入ったアプタマーを合成する場合は、特定の位置に変異を導入したポリメラーゼを用いることで伸長反応の効率を上げることができる。このようにして得られたアプタマーは公知の方法により容易に精製することができる。
　アプタマーはアミダイト法もしくはホスホアミダイト法などの化学合成法によって大量合成することができる。合成方法はよく知られている方法であり、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（Ｖｏｌ．２）［１］Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（Ｅｄｉｔｏｒ：Ｙｕｋｉｏ　Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｈｉｒｏｋａｗａ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ）などに記載のとおりである。実際にはＧＥヘルスケアーバイオサイエンス社製のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ１００やＯｌｉｇｏＰｒｏｃｅｓｓなどの合成機を使用する。精製はクロマトグラフィー等の自体公知の方法により行われる。
　アプタマーはホスホアミダイト法などの化学合成時にアミノ基などの活性基を導入することで、合成後に機能性物質を付加することができる。例えば、アプタマーの末端にアミノ基を導入することで、カルボキシル基を導入したポリエチレングリコール鎖を縮合させることができる。
　アプタマーは、リン酸基の負電荷を利用したイオン結合、リボースを利用した疎水結合及び水素結合、核酸塩基を利用した水素結合やスタッキング相互作用など多様な結合様式により標的物質と結合する。特に、構成ヌクレオチドの数だけ存在するリン酸基の負電荷を利用したイオン結合は強く、タンパク質の表面に存在するリジンやアルギニンの正電荷と結合する。このため、標的物質との直接的な結合に関わっていない核酸塩基は置換することができる。特に、ステム構造の部分は既に塩基対が作られており、また、二重らせん構造の内側を向いているので、核酸塩基は、標的物質と直接結合し難い。従って、塩基対を他の塩基対に置換してもアプタマーの活性は減少しない場合が多い。ループ構造など塩基対を作っていない構造においても、核酸塩基が標的分子との直接的な結合に関与していない場合に、塩基の置換が可能である。リボースの２’位の修飾に関しては、まれにリボースの２’位の官能基が標的分子と直接的に相互作用していることがあるが、多くの場合無関係であり、他の修飾分子に置換可能である。このようにアプタマーは、標的分子との直接的な結合に関与している官能基を置換又は削除しない限り、その活性を保持していることが多い。また、全体の立体構造が大きく変わらないことも重要である。
　アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法及びその改良法（例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９０）　Ｎａｔｕｒｅ，　３４６，　８１８－８２２；　Ｔｕｅｒｋ　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９０）　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４９，　５０５－５１０）を利用することで作製することができる。ＳＥＬＥＸ法ではラウンド数を増やしたり、競合物質を使用したりして、選別条件を厳しくすることで、標的物質に対してより結合力の強いアプタマーが濃縮され、選別されてくる。よって、ＳＥＬＥＸのラウンド数を調節したり、及び／又は競合状態を変化させたりすることで、結合力が異なるアプタマー、結合形態が異なるアプタマー、結合力や結合形態は同じであるが塩基配列が異なるアプタマーを得ることができる場合がある。また、ＳＥＬＥＸ法にはＰＣＲによる増幅過程が含まれるが、その過程でマンガンイオンを使用するなどして変異を入れることで、より多様性に富んだＳＥＬＥＸを行うことが可能となる。
　ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは標的物質に対して親和性が高い核酸であるが、そのことは標的物質の生理活性を阻害することを意味しない。キマーゼは塩基性タンパク質であり、核酸が非特異的に結合しやすいと考えられるが、特定の部位に強く結合するアプタマー以外はその標的物質の活性に影響を及ぼさない。実際、ネガティブコントロールとして用いたランダム配列を含むＲＮＡはキマーゼに弱く結合するものの、キマーゼの酵素活性を阻害しなかった。
　このようにして選ばれた活性のあるアプタマーに基づき、より高い活性を有するアプタマーを獲得するためのＳＥＬＥＸを行うことが出来る。具体的な方法とは、ある配列が決まっているアプタマーの一部をランダム配列にしたテンプレートや１０～３０％程度のランダム配列をドープしたテンプレートを作製して、再度ＳＥＬＥＸを行うものである。
　ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは８０ヌクレオチド程度の長さがあり、これをそのまま医薬にすることは難しい。そこで、試行錯誤を繰り返し、容易に化学合成ができる５０ヌクレオチド程度以下の長さまで短くする必要がある。ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーはそのプライマー設計に依存して、その後の最小化作業のしやすさが変わる。うまくプライマーを設計しないと、ＳＥＬＥＸによって活性のあるアプタマーが選別できたとしても、その後の開発が不可能となる。本発明では２３ヌクレオチドでも活性を保持しているアプタマーを得ることができた。
　アプタマーは化学合成が可能であるので改変が容易である。アプタマーはＭＦＯＬＤプログラムを用いて二次構造を予測したり、Ｘ線解析やＮＭＲ解析によって立体構造を予測したりすることで、どのヌクレオチドを置換又は欠損することが可能か、また、どこに新たなヌクレオチドを挿入可能かなどを、ある程度予測することができる。予測された新しい配列のアプタマーは容易に化学合成することができ、そのアプタマーが活性を保持しているかどうかは、既存のアッセイ系により確認することができる。
　得られたアプタマーの標的物質との結合に重要な部分が、上記のような試行錯誤を繰り返すことにより特定できた場合、その配列の両端に新しい配列を付加しても、多くの場合活性は変化しない。新しい配列の長さは特に限定されるものではない。
　修飾に関しても、配列と同様に当業者であれば自由に設計又は改変可能である。
　以上のように、アプタマーは高度に設計又は改変可能である。本発明はまた、所定の配列（例、ステム部分、インターナルループ部分、バルジ部分、ヘアピンループ部分及び一本鎖部分から選ばれる部分に対応する配列：以下、必要に応じて固定配列と省略する）を含むアプタマーを高度に設計又は改変可能であるアプタマーの製造方法を提供する。
　例えば、このようなアプタマーの製造方法は、下記：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
〔上記において、（Ｎ）ａはａ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、（Ｎ）ｂは、ｂ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、Ｎはそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴ（好ましくは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる群より選ばれるヌクレオチドである。ａ、ｂはそれぞれ、同一又は異なって、任意の数であり得るが、例えば１～約１００個、好ましくは１～約５０個、より好ましくは１～約３０個、さらにより好ましくは１～約２０個又は１～約１０個であり得る。〕で表されるヌクレオチド配列からなる単一種の核酸分子又は複数種の核酸分子（例、ａ、ｂの数等が異なる核酸分子のライブラリ）、及びプライマー用配列（ｉ）、（ｉｉ）にそれぞれ対応するプライマー対を用いて、固定配列を含むアプタマーを製造することを含む。
　本発明はまた、本発明のアプタマー及びそれに結合した機能性物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体におけるアプタマーと機能性物質との間の結合は共有結合、又は非共有結合であり得る。本発明の複合体は、本発明のアプタマーと１以上（例、２又は３個）の同種又は異種の機能性物質とが結合したものであり得る。機能性物質としては、本発明のアプタマーに何らかの機能を新たに付加するもの、あるいは本発明のアプタマーが保持し得る何らかの特性を変化（例、向上）させ得るものである限り特に限定されない。機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドが挙げられる。機能性物質としてはまた、例えば、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジン）、標識用物質（例、蛍光物質、発光物質、放射性同位体）、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、薬物送達媒体（例、リポソーム、ミクロスフェア、ペプチド、ポリエチレングリコール類）、薬物（例、カリケアマイシンやデュオカルマイシンなどミサイル療法に使用されているもの、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミド又はトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体、チオテパなどのエチレンイミン類、カルムスチンなどのニトロソ尿素、テモゾロミド又はダカルバジンなどのアルキル化剤、メトトレキセート又はラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤、チオグアニン、クラドリビン又はフルダラビンなどのプリン類似体、フルオロウラシル、テガフール又はゲムシタビンなどのピリミジン類似体、ビンブラスチン、ビンクリスチン又はビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体、エトポシド、タキサン、ドセタキセル又はパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体、ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質、シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物、ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミド）、毒素（例、リシン毒素、リア毒素及びベロ毒素）が挙げられる。これらの機能性分子は最終的に取り除かれる場合がある。更に、トロンビンやマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＦａｃｔｏｒＸなどの酵素が認識して切断することができるペプチド、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。
　本発明のアプタマー及び複合体は、例えば、医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。
　本発明のアプタマー及び複合体は、キマーゼの機能を阻害する活性を有し得る。上述のように、キマーゼは線維症や循環器系疾患と深く関わっている。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、線維症や循環器系疾患を伴う疾患を治療又は予防するための医薬として有用である。
　本発明のアプタマー及び複合体は、キマーゼに特異的に結合し得る。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、キマーゼ検出用プローブとして有用である。該プローブは、キマーゼのインビボイメージング、血中濃度測定、組織染色、ＥＬＩＳＡ等に有用である。また、該プローブは、キマーゼが関与する疾患（線維症や循環器系疾患を伴う疾患等）の診断薬、検査薬、試薬等として有用である。
　また、そのキマーゼへの特異的結合に基づき、本発明のアプタマー及び複合体はキマーゼの分離精製用リガンドとして使用され得る。
　また、本発明のアプタマー及び複合体は、薬物送達剤として使用され得る。
　臓器又は組織の線維化が関与する疾患としては、肺線維症、前立腺肥大、心筋線維化、心筋線維症、筋骨格線維症、骨髄線維症、子宮筋腫、強皮症、外科手術後の癒着、手術後の瘢痕、熱傷性瘢痕、肥厚性瘢痕、ケロイド、アトピー性皮膚炎、腹膜硬化症、喘息、肝硬変、慢性膵炎、スキルス胃癌、肝線維症、腎線維症、線維性血管病、糖尿病の合併症である線維性微小血管炎による網膜症、神経症、腎症、糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎、遺伝性腎疾患、動脈硬化末梢動脈炎などが挙げられる。
　循環器系疾患としては、血管障害、大動脈瘤、腎不全、高血圧症、動脈硬化、心筋梗塞、心肥大、心不全、経皮経管冠動脈形成術などによる血管障害後の再狭窄、糖尿病性及び非糖尿病性の腎障害、末梢循環障害などが挙げられる。
　キマーゼは酵素活性を保有し、基質となる生理活性物質を切断する。その基質としては、例えばＡｎｇＩ、ｌａｔｅｎｔ　ＴＧＦ－β、ＳＣＦ、プロコラーゲン、プロコラゲナーゼ、ｐｒｏ－ＭＭＰ－９、ＩＬ－１β前駆体などが知られており、これら生理活性ペプチドの産生・分解反応を介して、細胞外マトリックスのリモデリング、サイトカインとのネットワーク、免疫、血管収縮といった生理作用を発揮する。一方、キマーゼそのものが肥満細胞を活性化したり、ヒスタミン遊離を促進したりする作用があり、炎症と関連深い。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、上記に挙げた基質に限定されるものではないが、キマーゼに許容される基質が媒介する生体機能に関係した疾患及びキマーゼそのものが関与する疾患の医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。
　本発明の医薬は、医薬上許容される担体が配合されたものであり得る。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム－グリコール－スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
　本発明の医薬の投与経路としては特に限定されるものではないが、例えば経口投与、非経口投与が挙げられる。
　経口投与に好適な製剤としては、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、水溶性物質の吸収を促進させるＣ１０等が挙げられる。
　また、本発明の医薬は必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性などの目的のため、自体公知の方法でコーティングすることができる。コーティングに用いられるコーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ，メタアクリル酸・アクリル酸共重合体）及び色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。当該医薬は、速放性製剤、徐放性製剤のいずれであってもよい。
　非経口的な投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、腹腔内投与、経鼻投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌の溶媒に溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
　また、徐放製剤も好適な製剤として挙げることができる。徐放製剤の剤形としては、人工骨や生体分解性基材もしくは生体非分解性スポンジ、バッグなど、体内に埋め込まれた担体もしくは容器からの徐放形態が挙げられる。あるいは薬剤ポンプ、浸透圧ポンプなど、体外から継続的もしくは断続的に体内もしくは局所に送達されるデバイス等も徐放製剤に含む。生体分解性の基材としては、リポソーム、カチオニックリポソーム、Ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ－ｃｏ－ｇｌｙｃｏｌｉｃ）ａｃｉｄ（ＰＬＧＡ）、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、多糖シゾフィランなどが挙げられる。
　更に注射液剤、懸濁液剤や徐放製剤以外にも、経肺投与に適した吸入剤、経皮投与に適した軟膏剤なども可能である。
　吸入剤の場合、凍結乾燥状態の有効成分を微細化し適当な吸入デバイスを用いて吸入投与する。吸入剤には、更に必要に応じて使用されている界面活性剤、油、調味料、シクロデキストリン又はその誘導体等を適宜配合することができる。吸入剤は常法に従って製造することができる。すなわち、本発明のアプタマー又は複合体を粉末状又は液状にして、吸入噴射剤及び／又は担体中に配合し、適当な吸入容器に充填することにより製造することができる。また上記本発明のアプタマー又は複合体が、粉末状の場合は通常の機械的粉末吸入器を、液状の場合はネブライザー等の吸入器をそれぞれ使用することもできる。ここで吸入噴射剤としては従来公知のものを広く使用でき、フロン－１１、フロン－１２、フロン－２１、フロン－２２、フロン－１１３、フロン－１１４、フロン－１２３、フロン－１４２ｃ、フロン－１３４ａ、フロン－２２７、フロン－Ｃ３１８、１，１，１，２－テトラフルオロエタン等のフロン系化合物、プロパン、イソブタン、ｎ－ブタン等の炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、窒素ガス、炭酸ガス等の圧縮ガス等を例示できる。
　界面活性剤としては、例えばオレイン酸、レシチン、ジエチレングリコールジオレエート、テトラヒドロフルフリルオレエート、エチルオレエート、イソプロピルミリステート、グリセリルトリオレエート、グリセリルモノラウレート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノリシノエート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール４００、セチルピリジニウムクロリド、ソルビタントリオレエート（商品名スパン８５）、ソルビタンモノオレエート（商品名スパン８０）、ソルビタンモノラウエート（商品名スパン２０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（商品名ＨＣＯ－６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名ツイーン２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（商品名ツイーン８０）、天然資源由来のレシチン（商品名エピクロン）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ９２）、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ７２）、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル（商品名ブリジ３０）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ゲナポル０－０２０）、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体（商品名シンペロニック）等が挙げられる。油としては、例えばトウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油等が挙げられる。また、軟膏剤の場合、適当な医薬上許容される基剤（黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコーン、白色軟膏、ミツロウ、豚油、植物油、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、加水ラノリン、吸水軟膏、親水プラスチベース、マクロゴール軟膏等）を用い、有効成分である本発明のアプタマーと混合し製剤化し使用する。
　本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０００１～約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５～約１ｍｇ／ｋｇであり得る。
　本発明はまた、本発明のアプタマー及び複合体が固定化された固相担体を提供する。固相担体としては、例えば、基板、樹脂、プレート（例、マルチウェルプレート）、フィルター、カートリッジ、カラム、多孔質材が挙げられる。基板は、ＤＮＡチップやプロテインチップなどに使われているものなどであり得、例えば、ニッケル－ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）基板やガラス基板、アパタイト基板、シリコン基板、アルミナ基板などで、これらの基板にポリマーなどのコーティングを施したものが挙げられる。樹脂としては、例えば、アガロース粒子、シリカ粒子、アクリルアミドとＮ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミドの共重合体、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼン粒子、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した粒子、セルロースファイバー、アリルデキストランとＮ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマー、単分散系合成ポリマー、単分散系親水性ポリマー、セファロース、トヨパールなどが挙げられ、また、これらの樹脂に各種官能基を結合させた樹脂も含まれる。本発明の固相担体は、例えば、キマーゼの精製、及びキマーゼの検出、定量に有用であり得る。
　本発明のアプタマー及び複合体は、自体公知の方法により固相担体に固定できる。例えば、親和性物質（例、上述したもの）や所定の官能基を本発明のアプタマー及び複合体に導入し、次いで当該親和性物質や所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法が挙げられる。本発明はまた、このような方法を提供する。所定の官能基は、カップリング反応に供することが可能な官能基であり得、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基が挙げられる。本発明はまた、このような官能基が導入されたアプタマーを提供する。
　本発明はまた、キマーゼの精製及び濃縮方法を提供する。特に本発明はキマーゼを他のファミリータンパク質から分離することが可能である。本発明の精製及び濃縮方法は、本発明の固相担体にキマーゼを吸着させ、吸着したキマーゼを溶出液により溶出させることを含み得る。本発明の固相担体へのキマーゼの吸着は自体公知の方法により行うことができる。例えば、キマーゼを含有する試料（例、細菌又は細胞の培養物又は培養上清、血液）を、本発明の固相担体又はその含有物に導入する。キマーゼの溶出は、中性溶液等の溶出液を用いて行うことができる。中性溶出液は特に限定されるものではないが、例えばｐＨ約６～約９、好ましくは約６．５～約８．５、より好ましくは約７～約８であり得る。中性溶液はまた、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、ナトリウム塩（例、ＮａＣｌ）、カリウム塩（例、ＫＣｌ）、マグネシウム塩（例、ＭｇＣｌ２）、界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ４０）、グリセリンを含むものであり得る。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、キマーゼの吸着後、洗浄液を用いて固相担体を洗浄することを含み得る。洗浄液としては、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、Ｔｒｉｓ、酸、アルカリ、Ｔｒａｎｆｅｒ　ＲＮＡ、ＤＮＡ、Ｔｗｅｅｎ　２０などの表面活性剤、ＮａＣｌなどの塩を含むものなどが挙げられる。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、固相担体を加熱処理することを含み得る。かかる工程により、固相担体の再生、滅菌が可能である。
　本発明はまた、キマーゼの検出及び定量方法を提供する。特に本発明はキマーゼを他のファミリータンパク質と区別して検出及び定量することができる。本発明の検出及び定量方法は、本発明のアプタマーを利用して（例、本発明の複合体及び固相担体の使用により）キマーゼを測定することを含み得る。キマーゼの検出及び定量方法は、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により行われ得る。従って、抗体の代わりに本発明のアプタマーをプローブとして用いることにより、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法等の方法と同様の方法により、検出及び定量を行うことができる。また、ＰＥＴ等の分子プローブとしても、使用することができる。このような方法は、例えば、生体又は生物学的サンプルにおけるキマーゼ量の測定、キマーゼが関連する疾患の診断に有用であり得る。
　本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
実施例１：キマーゼに特異的に結合するＲＮＡアプタマーの作製（１）
　キマーゼに特異的に結合するＲＮＡアプタマーはＳＥＬＥＸ法を用いて作製した。ＳＥＬＥＸはＥｌｌｉｎｇｔｏｎらの方法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ　ａｎｄ　Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ　３４６，８１８－８２２，１９９０）及びＴｕｅｒｋらの方法（Ｔｕｅｒｋ　ａｎｄ　Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９，５０５－５１０，１９９０）を参考にして行った。標的物質としてＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）の担体に固相化したキマーゼ（Ｈｕｍａｎ　Ｓｋｉｎ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を用いた。担体へのキマーゼの固相化方法はＧＥヘルスケア社の仕様書に沿って行った。固相化量は、固相化前のキマーゼ溶液と固相化直後の上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより調べることで確認した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果、上清からはキマーゼのバンドは検出されず、使用したキマーゼのほぼ全てがカップリングされたことが確認された。約１６７ｐｍｏｌのキマーゼが約３μＬの樹脂に固相化されたことになる。
　最初のラウンドで用いたＲＮＡ（４０Ｎ）は、化学合成によって得られたＤＮＡをＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて転写して得た。この方法によって得られたＲＮＡはピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフルオロ化されたものである。ＤＮＡ鋳型としては、以下に示す４０ヌクレオチドのランダム配列の両端にプライマー配列を持った長さ７０ヌクレオチドのＤＮＡを用いた。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成によって作製した。
ＤＮＡ鋳型：５’－ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＴＣＴＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＣＧＴ－３’（配列番号１）
プライマーＦｗｄ：５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＧＧＴＡＧＧＡＡＴＴＣ－３’（配列番号２）
プライマーＲｅｖ：５’－ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＴＣＴＡＴＧ－３’（配列番号３）
　ＤＮＡ鋳型（配列番号１）中のＮの連続は任意の組み合わせの４０個のヌクレオチド（４０Ｎ：それぞれのＮは、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴである）であり、得られるアプタマー独特の配列領域を生じる。プライマーＦｗｄはＴ７　ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたＲＮＡプールのバリエーションは理論上１０１４であった。
　キマーゼが固相化された担体にＲＮＡプールを加え、３０分室温で保持した後、キマーゼに結合しないＲＮＡを取り除くために、溶液Ａで樹脂を洗浄した。ここで溶液Ａは１４５ｍＭ　塩化ナトリウム、５．４ｍＭ　塩化カリウム、１．８ｍＭ　塩化カルシウム、０．８ｍＭ　塩化マグネシウム、２０ｍＭ　トリス（ｐＨ７．６）の混合溶液である。キマーゼに結合したＲＮＡは、溶出液として溶液Ｂを加えて９５℃で１０分間熱処理を行い、その上清から回収した。ここで溶液Ｂは７Ｍ　Ｕｒｅａ、３ｍＭ　ＥＤＴＡ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．６）の混合液である。回収されたＲＮＡはＲＴ－ＰＣＲで増幅し、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔで転写して次のラウンドのプールとして用いた。以上を１ラウンドとし、同様の作業を複数回繰り返し行った。ＳＥＬＥＸ終了後、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングし、大腸菌株ＤＨ５α（Ｔｏｙｏｂｏ社製）をトランスフォーメーションした。シングルコロニーからプラスミドを抽出後、ＤＮＡシーケンサー（３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ社製）でクローンの塩基配列を調べた。
　ＳＥＬＥＸを８ラウンド行った後に４４クローンの配列を調べたところ、配列に収束が見られた。それらクローンの一部の配列を配列番号４～２０に示す。そのうち、配列番号４で表される配列は６配列存在した。配列番号５は２配列存在した。配列番号６～２０で表される配列は１配列であった。配列番号６と８は配列中の一塩基のみが異なる。配列番号４、１３、及び１４の配列には配列番号２１で表される共通配列が含まれていた。配列番号２１で表される共通配列は４４クローン中９クローンに含まれていた。これらの配列の二次構造をＭＦＯＬＤプログラム（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６－３４１５，２００３）を用いて予測したところ、共通配列の部分がよく似たループ構造となった。配列番号４、５、１２～１４、１８で表される配列のアプタマーの二次構造予測を図１に示す。配列番号２１で表される共通配列を丸（○）で囲った。
　以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’－ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’－フルオロ修飾体である。また、配列中のＮ（Ｎ１、Ｎ２）はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕのうちの任意のヌクレオチドを示し、Ｘ（Ｘ１、Ｘ２）は共にＡ、もしくは共にＧを示す。
配列番号４：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＧＵＣＣＡＵＵＣＵＡＣＡＧＡＵＡＧＡＧＡＵＡＡＡＧＵＡＧＡＡＵＵＵＡＡＣＡＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号５：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＡＣＵＵＧＵＣＵＵＵＧＡＧＧＣＡＡＧＡＡＡＵＵＧＵＡＵＵＣＣＧＡＡＧＡＡＧＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号６：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＵＡＣＧＧＵＣＵＧＵＧＵＧＡＡＡＵＵＧＡＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＵＡＧＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号７：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＡＣＣＵＵＵＣＣＡＡＵＵＧＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＵＧＡＣＡＵＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号８：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＵＡＣＧＧＵＣＵＧＵＧＵＧＡＡＡＵＵＧＡＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＵＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号９：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＧＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＧＣＵＵＧＣＵＡＡＡＡＵＧＡＵＵＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１０：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＧＣＣＧＣＣＵＡＡＡＡＡＡＣＧＡＣＧＡＵＡＵＵＡＣＡＧＡＡＡＣＧＵＣＡＡＡＵＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１１：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＧＡＣＡＣＧＡＡＡＵＧＵＧＵＧＡＵＵＡＡＵＵＣＣＧＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＵＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１２：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＧＣＣＧＵＣＡＡＣＧＵＵＡＣＡＵＡＡＵＧＵＡＵＡＵＡＣＣＡＧＧＧＵＡＡＣＵＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１３：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＧＣＡＡＣＣＡＵＣＣＣＧＵＡＡＣＵＡＵＧＧＵＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＡＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１４：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＵＣＧＵＵＣＣＵＧＡＣＡＧＣＡＵＵＵＧＡＧＡＵＡＧＡＵＵＵＡＡＡＣＡＡＡＣＧＣＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１５：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＡＧＡＡＡＡＵＡＡＡＵＵＣＣＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＵＵＵＵＵＧＣＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１６：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＡＵＧＡＣＵＧＡＡＡＡＡＣＧＵＣＡＧＵＡＡＡＡＵＣＣＧＡＡＡＡＵＣＡＵＡＵＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１７：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＧＵＵＣＧＣＡＧＡＡＡＣＧＡＡＣＵＵＵＵＡＡＡＡＡＡＵＧＵＡＣＧＵＧＧＧＡＧＣＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１８：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＧＡＡＣＧＡＣＡＡＡＵＵＡＵＡＧＡＡＣＵＵＣＧＵＵＵＧＡＣＡＵＵＣＣＡＣＡＣＣＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１９：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＡＣＵＧＣＡＡＵＵＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＵＵＣＣＧＡＡＡＡＡＣＡＣＡＣＡＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号２０：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＡＡＡＡＵＣＡＧＣＵＧＡＵＵＵＧＵＡＡＵＵＵＵＵＵＵＡＣＡＣＡＧＧＣＡＡＡＡＣＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号２１：
Ｘ１ＧＡＵＡＧＡＮ１Ｎ２ＵＡＡＸ２
　８ラウンドまで行った上記ＳＥＬＥＸを同様の条件で継続し、１１ラウンド目に９３クローンの配列を調べた。それらクローンの一部の配列を配列番号２２～２７に示す。８ラウンド後の配列と同配列であったものとして、配列番号４で表される配列が２２配列、配列番号１４で表される配列が４配列存在した。これは配列番号２１で表される共通配列が濃縮されたことを意味する。また、配列番号５で表される配列が１配列存在した。その他に、配列番号２２で表される配列が３配列、配列番号２３及び２４で表される配列は２配列存在した。配列番号２５～２７で表される配列は１配列であった。配列番号２２と１１は配列中の一塩基のみが異なる。配列番号２６と４は配列中の一塩基のみが異なる。配列番号２１で表される共通配列は９３クローン中３５クローンに含まれていた。１１ラウンドで新しく出現した配列中では、配列番号２５、及び２６の配列に配列番号２１で表される共通配列が含まれていた。配列番号２２～２７で表される配列のアプタマーの二次構造予測を図２に示す。配列番号２１で表される共通配列の部分を丸（○）で囲った。それらは図１同様、全て特徴的なループ構造となった。
　以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’－ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’－フルオロ修飾体である。
配列番号２２：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＧＡＣＡＣＡＡＡＡＵＧＵＧＵＧＡＵＵＡＡＵＵＣＣＧＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＵＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号２３：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＡＵＡＵＧＵＡＣＵＣＣＧＵＣＣＵＧＡＣＡＡＡＡＵＧＵＣＡＡＵＧＡＣＡＡＡＣＧＵＵＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号２４：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＵＵＣＡＵＡＧＵＡＧＡＡＵＧＵＵＧＧＵＵＵＣＵＡＣＡＡＡＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号２５：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＡＧＣＵＧＡＣＵＣＣＡＡＵＧＣＡＣＡＣＧＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＣＧＵＵＧＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号２６：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＧＵＣＧＡＵＵＣＵＡＣＡＧＡＵＡＧＡＧＡＵＡＡＡＧＵＡＧＡＡＵＵＵＡＡＣＡＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号２７：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＧＵＣＡＵＣＧＧＵＵＧＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＵＡＣＡＡＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
　上記８ラウンドのＳＥＬＥＸの後、標的物質としてＨｅｐａｒｉｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）の担体に固相化したキマーゼ（Ｈｕｍａｎ　Ｓｋｉｎ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を用いて、さらにＳＥＬＥＸを継続した。キマーゼ溶液を担体に加え、室温で３０分保持することで、キマーゼを担体に固相化した。固相化量は、固相化前のキマーゼ溶液と固相化直後の上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより調べることで確認した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果、上清からはキマーゼのバンドは検出されず、使用したキマーゼのほぼ全てが固相化されたことが確認された。約１００ｐｍｏｌのキマーゼが約３μＬの樹脂に固相化されたことになる。
　１１ラウンド目のプールをクローニングし、７９クローンの配列を決定した。それらクローンの一部の配列を配列番号２８～３４に示す。上記８ラウンド後の配列と同配列であったものとして、配列番号４で表される配列が９配列、配列番号１９で表される配列が１配列存在し、上記１１ラウンド後の配列と同配列であったものとして、配列番号２７で表される配列が２配列存在した。その他に、配列番号２８で表される配列が４配列、配列番号２９で表される配列が２配列存在した。配列番号３０～３４で表される配列は１配列であった。配列番号３０と３１は配列中の一塩基のみが異なる。配列番号３２は配列番号３１が一塩基欠失した配列である。配列番号２１で表される共通配列は７９クローン中１４クローンに含まれていた。１１ラウンドで新しく出現した配列中では、配列番号３０～３２、及び３４の配列に配列番号２１で表される共通配列が含まれていた。配列番号２８～３４で表される配列のアプタマーの二次構造予測を図３に示す。配列番号２１で表される共通配列の部分を丸（○）で囲った。配列番号２１で表される共通配列の部分は、配列番号３４で表されるクローン以外、全て図１同様の特徴的なループ構造となった。
　以下に配列番号２８～３４で表されるそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’－ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’－フルオロ修飾体である。
配列番号２８：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＡＡＵＵＵＣＵＵＵＣＵＡＵＵＣＵＣＡＣＣＵＧＡＧＵＡＵＡＵＣＡＧＧＣＡＣＡＧＵＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号２９：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＡＣＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧＵＧＡＣＡＵＵＵＵＡＧＡＡＡＣＡＣＣＧＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号３０：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＧＵＣＣＣＵＣＵＵＧＵＣＵＡＵＵＵＵＧＣＡＧＡＵＡＧＡＣＵＵＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号３１：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＧＵＣＣＣＵＣＡＵＧＵＣＵＡＵＵＵＵＧＣＡＧＡＵＡＧＡＣＵＵＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号３２：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＧＵＣＣＵＣＡＵＧＵＣＵＡＵＵＵＵＧＣＡＧＡＵＡＧＡＣＵＵＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号３３：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＵＧＵＣＵＵＵＵＣＣＣＡＣＧＣＡＡＣＡＡＡＵＵＡＣＡＧＡＧＣＵＵＵＧＣＡＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号３４：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＵＧＣＣＧＣＡＡＣＣＣＡＡＵＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡＵＡＧＡＧＡＵＡＡＡＵＣＧＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
　配列番号４～２０と２２～３４で表される核酸のキマーゼに対する結合活性を表面プラズモン共鳴法により評価した。測定にはＧＥヘルスケア社製のＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００を用いた。センサーチップにはストレプトアビジンが固定化されているＳＡチップを用いた。これに、５’末端にビオチンが結合している１６ヌクレオチドのＰｏｌｙ　ｄＴを１５００ＲＵ程度結合させた。リガンドとなる核酸は、３’末端に１６ヌクレオチドのＰｏｌｙ　Ａを付加し、ＴとＡのアニーリングによりＳＡチップに固定化した。流速２０μＬ／ｍｉｎで核酸を２０μＬインジェクトし、約１０００ＲＵの核酸を固定化した。アナライト用のキマーゼは０．２μＭに調製し、２０μＬインジェクトした。ランニングバッファーには溶液Ａを用いた。
　測定の結果、測定した全ての配列がキマーゼと結合することがわかった（表１）。しかし、ネガティブコントロールとして用いた４０ヌクレオチドのランダム配列を含む１ラウンド目に使用した核酸プール（４０Ｎ）もキマーゼと弱い結合活性を示すことがわかった。そこで、表１では４０Ｎよりも結合活性が高いアプタマーを＋＋、４０Ｎと同等のものを＋で示した。また、配列番号１２及び１３で表されるアプタマーがキマーゼと結合する様子を示すセンサーグラムを図４に示す。
　配列番号２１で表される共通配列の有無にかかわらず、４０Ｎよりも結合活性が高いものと、４０Ｎと同等なものが存在した。この共通配列を含む配列番号４、１３、１４、２５、２６、３０は４０Ｎよりも結合活性が高かったが、同様の共通配列を含む配列番号３１、３２、３４は４０Ｎと同等であった。配列番号２１の配列中に含まれるＮ１Ｎ２はＧＡ、ＧＵ、ＵＵ、ＣＵでよいことがわかった。配列番号２１の配列中に含まれるＸ１とＸ２は共にＡでよいことがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
表１：キマーゼに対する結合活性。“＋＋”はネガティブコントロールの４０Ｎよりも有意にキマーゼに結合するもの、“＋”はネガティブコントロールの４０Ｎと同程度の結合のものを表す。ここで４０Ｎとは４０ヌクレオチドのランダム配列を含む、１ラウンド目に使用した核酸プールのことである。
実施例２：キマーゼに特異的に結合するＲＮＡアプタマーの作製（２）
　ランダム配列が３０ヌクレオチドでプライマー配列が実施例１で用いたものと異なる鋳型を用いて、実施例１と同様のＳＥＬＥＸを行った。ＳＥＬＥＸの標的物質としてＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）の担体に固相化したキマーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。使用した鋳型とプライマーの配列を以下に示す。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成により作製した。
ＤＮＡ鋳型：５’－ＴＣＡＣＡＣＴＡＧＣＡＣＧＣＡＴＡＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＡＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣ－３’（配列番号３５）
プライマーＦｗｄ：５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧ－３’（配列番号３６）
プライマーＲｅｖ：５’－ＴＣＡＣＡＣＴＡＧＣＡＣＧＣＡＴＡＧＧ－３’（配列番号３７）
　ＤＮＡ鋳型（配列番号３５）中のＮの連続は任意の組み合わせの３０個のヌクレオチド（３０Ｎ：それぞれのＮは、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴである）であり、得られるアプタマー独特の配列領域を生じる。プライマーＦｗｄはＴ７　ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたＲＮＡプールのバリエーションは理論上１０１４であった。
　キマーゼが固相化された担体にＲＮＡプールを加え、３０分室温で保持した後、キマーゼに結合しないＲＮＡを取り除くために、溶液Ｃで樹脂を洗浄した。ここで溶液Ｃは１４５ｍＭ　塩化ナトリウム、５．４ｍＭ　塩化カリウム、１．８ｍＭ　塩化カルシウム、０．８ｍＭ　塩化マグネシウム、２０ｍＭ　トリス（ｐＨ７．６）、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０の混合溶液である。キマーゼに結合したＲＮＡは、溶出液として溶液Ｄを加えて室温で１０分間攪拌することで回収した。ここで溶液Ｄとは、溶液Ｃに６Ｍグアニジン塩酸塩を加え、ｐＨ７．６に調製したものである。溶出操作は３回行った。回収されたＲＮＡはＲＴ－ＰＣＲで増幅し、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔで転写して次のラウンドのプールとして用いた。以上を１ラウンドとし、同様の作業を複数回繰り返し行った。ＳＥＬＥＸ終了後、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングし、大腸菌株ＤＨ５α（Ｔｏｙｏｂｏ社製）をトランスフォーメーションした。シングルコロニーからプラスミドを抽出後、ＤＮＡシーケンサー（３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ社製）でクローンの塩基配列を調べた。
　ＳＥＬＥＸ８ラウンド終了後に配列を調べたところ、まだ配列に収束は見られなかった。そこで、競合剤として２ｍｇ／ｍＬのへパリンを加えて１１ラウンドまで進めた。４０クローンの配列を決定したところ、収束が見られ、４０クローンすべての配列に配列番号２１で表される共通配列が含まれていた。これらのクローンの一部の配列を配列番号３８～４８に示す。配列番号３８で表される配列は６配列存在し、配列番号３９で表される配列は２配列存在した。配列番号４０～４８は１配列存在した。
　配列番号３８～４０、４３、４８で表される配列のアプタマーの二次構造予測を図５に示す。図５中、配列番号２１で表される共通配列は丸（○）で囲んだ。配列番号２１で表される共通配列の多くは図１で示したものと同様の特徴的なループ構造を形成した。
　以下に配列番号３８～４８で表されるそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’－ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’－フルオロ修飾体である。
配列番号３８：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＧＡＵＣＵＧＧＣＵＧＧＣＧＣＡＵＵＡＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号３９：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＧＵＵＡＣＧＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＧＧＵＡＡＣＧＧＵＡＣＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４０：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＡＣＧＧＡＵＡＧＡＧＣＵＡＡＧＡＧＵＵＣＧＵＣＡＧＡＧＧＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４１：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＧＵＧＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＣＡＣＣＡＣＡＡＵＡＧＵＡＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４２：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＣＧＵＧＡＵＣＧＵＧＣＡＡＧＧＣＧＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４３：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＵＧＣＣＡＡＧＡＵＡＧＡＵＵＵＡＡＡＵＧＧＣＧＵＵＵＧＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４４：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＵＵＡＧＡＣＣＡＡＡＧＣＡＵＡＧＧＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４５：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＧＡＣＣＡＣＣＧＡＵＧＧＧＣＡＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＵＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４６：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＧＧＡＣＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＧＵＣＣＧＵＵＡＣＧＵＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４７：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＧＵＧＡＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵＣＧＣＵＧＡＡＵＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４８：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＵＧＡＡＧＡＵＡＧＡＧＡＵＡＡＡＵＣＡＣＡＵＡＣＡＧＵＣＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
　配列番号３８～４８で表される核酸のキマーゼに対する結合活性を表面プラズモン共鳴法により評価した。配列番号３８～４８の評価においては、測定は実施例１で示した方法と同様の方法を用いて測定した。ランニングバッファーには溶液Ｃを用いた。測定の結果を表２に示す。
　配列番号３８～４８で表される核酸は３０Ｎよりも有意にキマーゼに結合するアプタマーであることが示された。共通配列である配列番号２１に含まれるＸ１及びＸ２は共にＡもしくは、共にＧでよいことがわかった。これら共通配列に含まれるＮ１Ｎ２はＧＵ、ＧＣ、ＧＡ、ＵＵでよいことがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
表２：キマーゼに対する結合活性。“＋＋”はネガティブコントロールの３０Ｎよりも有意にキマーゼに結合するものを表す。ここで３０Ｎとは３０ヌクレオチドのランダム配列を含む、１ラウンド目に使用した核酸プールのことである。
実施例３：合成基質を用いたキマーゼ阻害活性の測定
　配列番号４～２０、２２～３４、３８～４８で表される核酸がキマーゼの酵素活性を阻害するかどうかを、下記の方法により評価した。キマーゼの基質としてキモトリプシン様プロテアーゼの標準基質である４アミノ酸ペプチドＡｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅを含むＳｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ＭＣＡ（ペプチド研究所社製）を選択した。ここでＳｕｃは保護基であるスクシニル基、ＭＣＡは４－メチルクマリル－７－アミド基であり、フェニルアラニンのＣ末端側が切断されるとＡＭＣ（７－アミノ－４－メチルクマリン）が遊離する。このＡＭＣの蛍光を検出することで、キマーゼの酵素活性を測定することができる。アッセイには、９６ウェルプレート（Ｆ１６　Ｂｌａｃｋ　Ｍａｘｉｓｏｒｐ　Ｆｌｕｏｒｏｎｕｎｃ、Ｎｕｎｃ社製）を用い、反応液量を１００μＬとし、溶液Ｃの緩衝液中で実施した。まず、核酸は溶液Ｃ中に０．００２７～２μＭの濃度に段階希釈したものを、５０μＬずつ用意した。そこに、溶液Ｃ中に調製した１ｍＭの基質を１０μＬ添加した後、プレートをマイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、３７℃で５分間保温した。一方で、０．０５μｇ（もしくは０．００５μｇ）のキマーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＳＩＧＭＡ社製）を溶液Ｃ中に希釈したものを４０μＬ用意し、３７℃で５分間保温した。核酸及び基質からなる混合液に、キマーゼ溶液を加えて、酵素反応を開始させた。反応溶液中の最終キマーゼ濃度は１６．７ｎＭ（もしくは１．６７ｎＭ）、最終基質濃度は１００μＭである。反応液を含むプレートを、マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、３７℃で５分間（もしくは３０分間）、蛍光強度の変化を経時的に測定した（励起波長　３８０ｎｍ、検出波長　４６０ｎｍ）。キマーゼ活性により、基質から放出されるＡＭＣの蛍光増加の線形近似を求め、その傾きの値を初速度（Ｖｍａｘ）とした。コントロールとして、３０Ｎもしくは４０Ｎ（３０個もしくは４０個の連続したヌクレオチド；Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴである）の核酸プールを用いた場合（ネガティブコントロール）、及び既知のキモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤であるキモスタチンを用いた場合（ポジティブコントロール）において、同様に処理し測定を行った。核酸、阻害剤を含まない場合の反応初速度（Ｖ０）を酵素活性１００％とし、各被験物質の阻害率を次式を用いて算出した。
阻害率（％）＝（１－Ｖｍａｘ／Ｖ０）×１００
酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求めた。その結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
表３：キマーゼに対する阻害活性（ＩＣ５０）。“＞０．５”は０．５μＭまで濃度範囲で阻害活性が見られなかったことを示す。ＩＣ５０値は２～３回測定の平均値を示す。
　ネガティブコントロールである３０Ｎもしくは４０Ｎは阻害活性を示さなかった（ＩＣ５０＞０．５μＭ）。また、ポジティブコントロールであるキモスタチンのＩＣ５０値は０．１μＭ～０．２μＭの値を示した。
　以上の結果より、表３に記載されたアプタマーの多くはキマーゼに対する阻害活性を示した。特に０．１μＭ以下のＩＣ５０値を示したアプタマーは優れた阻害効果を示したと言える。配列番号２１で表される共通配列を含むアプタマーは全て阻害活性示した。またこの結果から、これら共通配列に含まれるＸ１、Ｘ２は共にＡもしくは、共にＧでよく、Ｎ１Ｎ２はＧＡ、ＧＵ、ＧＣ、ＵＵ又はＣＵのどれでもよいことが示された。
実施例４：アプタマーの短鎖化
　配列番号４、１２、１３、１４で表されるアプタマーの短鎖化を行った。配列番号４、１３、１４で表されるアプタマーは配列番号２１で表される共通配列を含む。配列番号１２はこの共通配列を含まないアプタマーである。短鎖化した配列を配列番号４９～５７に示す。配列番号４９、５１、５５～５７で表されるアプタマーの二次構造予測を図６に示す。図６中、配列番号２１で表される共通配列を丸（○）で囲った。
　以下に配列番号４９～５７で表されるそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’－ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’－フルオロ修飾体である。
配列番号４９：
（配列番号４で表されるクローンを共通配列を含む２９ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＵＵＣＵＡＣＡＧＡＵＡＧＡＧＡＵＡＡＡＧＵＡＧＡＡＣＣ
配列番号５０：
（配列番号４で表されるクローンを共通配列を含む３５ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＧＡＵＡＧＡＧＡＵＡＡＡＧＵＡＧＡＡＵＵＵＡＡＣ
配列番号５１：
（配列番号１２で表されるクローンを４５ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＣＧＵＵＡＣＡＵＡＡＵＧＵＡＵＡＵＡＣＣＡＧＧＧＵＡＡＣＵＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧ
配列番号５２：
（配列番号１２で表されるクローンを２６ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＣＣＧＵＡＵＡＵＡＣＣＡＧＧＧＵＡＡＣＵＡＡＡＣＧＧ
配列番号５３：
（配列番号１３で表されるクローンを共通配列を含む４２ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＧＵＡＡＣＵＡＵＧＧＵＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＡＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＣＣ
配列番号５４：
（配列番号１３で表されるクローンを共通配列を含む３６ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＵＡＡＣＵＡＵＧＧＵＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＡＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡ
配列番号５５：
（配列番号１３で表されるクローンを共通配列を含む２９ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＣＵＡＵＧＧＵＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＡＣＣＡＵＡＧ
配列番号５６：
（配列番号１３で表されるクローンを共通配列を含む２３ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＧＵＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＡＣＣＣ
配列番号５７：
（配列番号１４で表されるクローンを共通配列を含む２７ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＣＡＵＵＵＧＡＧＡＵＡＧＡＵＵＵＡＡＡＣＡＡＡＣＧＣ
　配列番号４９～５７の核酸は全て化学合成により作製した。
　これらの核酸がキマーゼと結合するかどうかを、表面プラズモン共鳴法により評価した。測定には、ＧＥヘルスケア社製のＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００を用い、以下に示す方法で測定を行った。ＣＭ５チップのセンサーチップ表面に、アミンカップリングキットを使用し、約４０００ＲＵのキマーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＳＩＧＭＡ社製）を固定化した。流速２０μＬ／ｍｉｎで、アナライトとして０．３μＭに調製した核酸を２０μＬインジェクトした。ランニングバッファーには溶液Ｃを用いた。測定の結果を表４に示す。評価方法は実施例１と同様である。
　その結果、配列番号５２以外の核酸がコントロールの４０Ｎよりも有意にキマーゼに結合するアプタマーであることが示された（表４）。配列番号１３、５５、５６で表されるアプタマーがキマーゼと結合する様子を示すセンサーグラムを図７に示す。
　また、キマーゼ阻害活性の測定は、実施例３と同様の方法で行った。それぞれのＩＣ５０値を表４に示す。
　配列番号５２以外の核酸に強い阻害活性が認められた（表４）。配列番号５１と５２の結果より、共通配列を含まない配列番号１２で表されるアプタマーは４５ヌクレオチドに短鎖化したものでは活性を維持しているが、２６ヌクレオチドに短鎖化したものでは活性が消失することがわかった。
　一方で、配列番号５６の結果より、共通配列を含む配列番号１３で表されるアプタマーはより短い２３ヌクレオチドの長さまで短鎖化できた。これは、配列番号２１で表される共通配列がキマーゼに対する結合及び阻害活性に重要であることを示している。
　また、配列番号４９と５７も阻害活性を示したことより、共通配列に含まれるＮ１Ｎ２はＧＵに限らないこと、図６の配列番号５６のステム構造に含まれる配列はステム構造を維持する限り特に限定されないことが示された。
　これらのアプタマーはキマーゼ阻害剤として使用可能であると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
表４：キマーゼに対する結合活性と阻害活性（ＩＣ５０）。“＋＋”はネガティブコントロールの４０Ｎよりも有意にキマーゼに結合するもの、“＋”はネガティブコントロールの４０Ｎと同程度の結合のものを表す。ここで４０Ｎとは４０ヌクレオチドのランダム配列を含む、実施例１で使用した１ラウンド目の核酸プールである。“＞１”は１μＭまでの濃度範囲で阻害活性が見られなかったことを示す。ＩＣ５０値は２～３回測定の平均値を示す。
　ネガティブコントロールである４０Ｎは１μＭまでの濃度範囲で阻害活性を示さなかった（ＩＣ５０＞１μＭ）。また、ポジティブコントロールであるキモスタチンのＩＣ５０値は０．１μＭ～０．２μＭの値を示した。
　以上の結果より、表４に含まれる配列番号５２以外の核酸はキマーゼに対する阻害活性を示した。特に０．１μＭ以下のＩＣ５０値を示した核酸は優れた阻害効果を示したと言える。
実施例５：短鎖化したアプタマーの塩基の置換、欠損の効果
　配列番号５６で表されるアプタマーに変異、欠損を導入し、結合活性及び阻害活性に対する影響を調べた。配列を配列番号５８～６８に示す。
　以下に配列番号５８～６８で示される各アプタマーのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、ヌクレオチドにおける括弧はそのリボースの２’位の修飾を示し（例えば、Ｕ（Ｆ）と表記する場合、ウラシルのリボースの２’位がＦで修飾されることを示す）、Ｆはフッ素原子を示す。
配列番号５８：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれる１３個の核酸塩基をランダムに配置した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＡＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＧＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５９：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれるＮ２を置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号６０：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれるＮ２を置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号６１：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれるＮ１を置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号６２：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれるＸ１及びＸ２を置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＧＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号６３：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列以外に含まれる塩基配列を置換した配列）
ＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＧＵ（Ｆ）ＡＧＣ（Ｆ）
配列番号６４：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列以外に含まれる塩基配列を置換した配列）
ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＧＵ（Ｆ）ＧＡＣ（Ｆ）
配列番号６５：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列以外に含まれる塩基配列を一部置換させ、一部欠損させた配列）
ＧＧＣ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号６６：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれるプリン塩基をピリミジン塩基に置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＣＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号６７：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれるプリン塩基をピリミジン塩基に置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＣＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号６８：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれるプリン塩基をピリミジン塩基に置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＵＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
　配列番号５８～６８の核酸は全て化学合成により作製した。これらの核酸がキマーゼと結合するかどうかについて、実施例４と同様にして、表面プラズモン共鳴法により評価した。キマーゼに対する阻害活性の測定は、実施例３と同様に行った。測定結果を表５に示す。
　その結果、表５に含まれる核酸のうち配列番号５９～６５の核酸が強い結合力と阻害活性を保持していることがわかった。
　配列番号５８は、結合活性、阻害活性共に、実施例１や２で用いた４０Ｎ／３０Ｎと同程度まで低下したことから、配列番号２１で表される共通配列がキマーゼに対する結合及び阻害活性に重要であることが示された。またこの結果より、これ以降の実施例（実施例５～９）においては、短鎖化したアプタマーのネガティブコントロールとして配列番号５８を用いることにした。
　配列番号５９～６１の結果より、共通配列に含まれるＮ１及びＮ２は任意のヌクレオチドであってよいが、好ましくはＧＵ、ＧＡ、ＧＣ、ＵＵであることが示された。配列番号６２の結果より、Ｘ１及びＸ２は任意のヌクレオチドであってよいが、好ましくはＡまたはＧであり、より好ましくは共にＡもしくは共にＧであることが示された。
　配列番号６３～６５の結果より、共通配列以外に含まれるステム構造の塩基対配列は（例：図６の配列番号５６）、ステム構造を保つ限り任意のヌクレオチドであってよく、長さは３塩基対以上が好ましいことが示された。
　配列番号６６～６８の結果より、共通配列に変異を導入すると活性が低下することから、共通配列の重要性が改めて示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
表５：キマーゼに対する結合活性と阻害活性（ＩＣ５０）。結合活性において、“＋＋”はネガティブコントロールである配列番号５８よりも有意にキマーゼに結合するもの、“＋”はネガティブコントロールである配列番号５８と同程度の結合のものを表す。阻害活性において、“＞１”は１μＭまでの濃度範囲で阻害活性が見られなかったことを示す。ＩＣ５０値は２回測定の平均値を示す。
　配列番号５８は１μＭまでの濃度範囲で阻害活性を示さなかった（ＩＣ５０＞１μＭ）。また、ポジティブコントロールであるキモスタチンのＩＣ５０値は０．１μＭ～０．２μＭの値を示した。以上の結果より、表５に記載のあるアプタマーのうち、配列番号５９～６５で表されるアプタマーはキマーゼに対する強い阻害活性（ＩＣ５０＜０．１μＭ）を有していることがわかる。
実施例６：短鎖化したアプタマーの改変１
　配列番号５６で表されるアプタマーのヌクレアーゼ耐性を高めるために、末端修飾した改変体、配列中のプリン塩基のリボースの２’位にＯ－メチル基あるいはＦ修飾を導入した改変体、その他に、ホスホロチオエートを導入した改変体を作製した。配列を配列番号５６（１）～５６（１４）、５６（１７）～５６（１９）に示す。また、配列番号５６で表されるアプタマーの共通配列に含まれるピリミジンヌクレオチドの修飾（２’－Ｆ；リボース２位のＦ修飾）を天然型（２’－ＯＨ）に置換した改変体を作製し、修飾の必要性について評価した。それらの配列を配列番号５６（１５）、５６（１６）に示す。
　以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、ヌクレオチドにおける括弧はそのリボースの２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子、ＭはＯ－メチル基を示す。また、各配列末端におけるｉｄＴはｉｎｖｅｒｔｅｄ－ｄＴによる修飾を示し、ＰＥＧは４０ｋＤａの分岐型ポリエチレングリコールによる修飾を示す。配列中におけるｓはヌクレオチド同士を結合するリン酸基がホスホロチオエート化されたことを示す。
配列番号５６（１）：
（配列番号５６で表されるクローンの両末端にｉｄＴ修飾を導入した配列）
ｉｄＴ－ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（２）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列以外の配列のうち三か所に修飾を導入した配列）
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（３）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列以外の配列のうち二か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（４）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（５）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち二か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（６）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（７）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（８）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）ＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（９）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡ（Ｍ）ＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１０）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１１）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１２）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１３）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧ（Ｆ）ＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１４）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１５）：
（配列番号５６で表されるクローンの９番目のヌクレオチドＵ（Ｆ）をＵに置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１６）：
（配列番号５６で表されるクローンの１５番目のヌクレオチドＵ（Ｆ）をＵに置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）ＵＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１７）：
（配列番号５６で表されるクローンの末端にＰＥＧとｉｄＴ修飾を導入した配列）
ＰＥＧ－ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ)－ｉｄＴ
配列番号５６（１８）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所のリン酸基をホスホロチオエート化した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｓＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１９）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所のリン酸基をホスホロチオエート化した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
　配列番号５６（１）～５６（１９）の核酸は全て化学合成により作製した。これらの核酸がキマーゼと結合するかどうかを、実施例４と同様にして、表面プラズモン共鳴法により評価した。結果を表６に示す。
　その結果、配列番号５６（８）、５６（１０）、５６（１３）、５６（１４）以外の核酸は、ネガティブコントロールである配列番号５８よりも有意にキマーゼに対する結合活性を示した。
　キマーゼに対する阻害活性の測定は、実施例３と同様の方法で行った。ＩＣ５０値を表６に示した。配列番号５６（８）、５６（１０）、５６（１３）、５６（１４）以外の核酸は、阻害活性の強弱はあるものの、これらのアプタマーに阻害活性があることがわかった。ＩＣ５０値を比較すると、配列番号５６（１）～５６（７）、５６（１１）、５６（１２）の阻害活性は配列番号５６とほぼ同程度に保持されていた。一方で配列番号５６（９）、５６（１５）、５６（１６）、５６（１７）の阻害活性は配列番号５６と比べて減弱し、配列番号５６（８）、５６（１０）、５６（１３）、５６（１４）の阻害活性は消失することが示された。さらに、配列番号５６（１８）、５６（１９）の阻害活性は配列番号５６よりも向上することが示された。
　配列番号５６（１）、５６（１７）の結果より、末端修飾による活性の影響は少ないことがわかった。配列番号５６（２）、５６（３）の結果より、ステム配列の修飾による活性の影響はないことが示された。共通配列に含まれるヌクレオチドに関しては、５６（４）～５６（７）、５６（１１）、５６（１２）のように修飾しても阻害活性を保持できた場合と、配列番号５６（８）、５６（９）、５６（１０）、５６（１３）、５６（１４）のように、修飾により阻害活性が低下（あるいは消失）した場合があった。
　以上より、配列番号５６で表されるアプタマーは安定性を向上させるため、少なくとも一つのヌクレオチドに修飾を導入したものであってもよいことがわかった。ヌクレオチドの修飾としては、２’－Ｏ－メチル修飾以外にも、例えば２’－アミノ修飾などが挙げられる。
　一方で配列番号５６（１５）、５６（１６）の結果より、配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれるヌクレオチド修飾体（Ｕ（Ｆ））のうちいずれか（９番目もしくは１５番目）を天然型のリボヌクレオチド（Ｕ）にすると阻害活性が低下することがわかった。一般に、修飾体が含まれることでアプタマーのヌクレアーゼ耐性は向上する。したがって、共通配列に含まれるピリミジンヌクレオチド（配列番号５６で表されるクローンの９番目と１５番目のＵ）の少なくともどちらか一方は修飾体であることが好ましい。
　また、配列番号５６（８）、５６（９）、５６（１０）、５６（１３）、５６（１４）の結果より、配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれる天然のプリン塩基のうち、６番目のＡ、１１番目のＧ、１２番目のＡは修飾を導入すると阻害活性が低下するため、少なくともひとつは天然のリボヌクレオチドであることが好ましい。
　その他に、配列番号５６（１８）、５６（１９）の結果より、糖残基の修飾以外にリン酸基の修飾として、少なくとも一か所にホスホロチオエートを導入すると阻害活性が向上することが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
表６：キマーゼに対する結合活性と阻害活性（ＩＣ５０）。結合活性において、“＋＋”はネガティブコントロールの配列番号５８よりも有意にキマーゼに結合するものを示し、“＋”はネガティブコントロールの配列番号５８と同程度に結合するものを示す。“ｎ．ｄ．”は未測定を表す。“＞１”は１μＭまでの濃度範囲で阻害活性が見られなかったことを示す。ＩＣ５０値は２回測定の平均値を示す。
　ネガティブコントロールである配列番号５８は１μＭまでの濃度範囲で阻害活性を示さなかった（ＩＣ５０＞１μＭ）。また、ポジティブコントロールであるキモスタチンのＩＣ５０値は０．１μＭ～０．２μＭの値を示した。
　以上の結果より、表６に含まれる核酸のうち、特に０．１μＭ以下のＩＣ５０値を示したものは、キマーゼに対する強い阻害活性を有し、キマーゼ阻害剤として使用可能であることが示された。
実施例７：短鎖化したアプタマーの改変２
　実施例６の結果を踏まえて、配列番号５６で表されるアプタマーのさらなる改変を行った。２’－Ｏ－メチル基の導入、様々な末端修飾、ホスホロチオエートの導入、リボヌクレオチドのＤＮＡへの置換等について検討した改変体、またそれらの組み合わせによる改変体を作製した。配列を配列番号５６（２０）～５６（４７）、６１（１）、６９、６９（１）、６９（２）、７０～７４、７４（１）、７５～７７、７７（１）、７７（２）、７８～８２に示す。
　以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、大文字はＲＮＡを示し、小文字はＤＮＡを示す。ヌクレオチドにおける括弧はそのリボースの２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子、ＭはＯ－メチル基を示す。また、各配列末端におけるｉｄＴはｉｎｖｅｒｔｅｄ－ｄＴによる修飾を示し、ＰＥＧは４０ｋＤａの分岐型ポリエチレングリコールによる修飾を示し、Ｃｈｏはコレステロールによる修飾を示し、Ｂはビオチンによる修飾を示す。Ｐｅｐｔｉｄｅ１はＰｈｅ－ＣｙｓがＣ末端側で、Ｐｅｐｔｉｄｅ２はＣｙｓ－ＰｈｅがＮ末端側で、それぞれジスルフィド結合を介して核酸の５’末端に結合していることを示す。配列中におけるｓはヌクレオチド同士を結合するリン酸基がホスホロチオエート化されたことを示す。
配列番号５６（２０）：
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（２１）：
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（２２）：
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｓＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（２３）：
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（２４）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（２５）：
ｉｄＴ－ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（２６）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（２７）：
ＰＥＧ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（２８）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（２９）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｓＡｓＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（３０）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（３１）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（３２）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（３３）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧＡ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（３４）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（３５）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（３６）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧｓＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（３７）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧｓＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（３８）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｓＡｓＧＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（３９）：
ＰＥＧ－ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（４０）：
ｉｄＴ－ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（４１）：
ｉｄＴ－ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（４２）：
Ｃｈｏ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（４３）：
Ｐｅｐｔｉｄｅ１－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（４４）：
Ｐｅｐｔｉｄｅ２－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（４５）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ＰＥＧ
配列番号５６（４６）：
Ｂ－ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（４７）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ－Ｂ
配列番号５６（４８）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ－ｉｄＴ
配列番号５６（４９）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ａＧ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（５０）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）ａＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（５１）：
Ｂ－ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）ａＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号５６（５２）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｇａＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号６１（１）：
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号６９：
ＰＥＧ－Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号６９（１）：
ｉｄＴ－Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号６９（２）：
ｉｄＴ－Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号７０：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号７１：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）－ｉｄＴ
配列番号７２：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ－ｉｄＴ
配列番号７２（１）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）ａＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ－ｉｄＴ
配列番号７２（２）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡｓＧ（Ｍ）ａＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ－ｉｄＴ
配列番号７２（３）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡｇｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ－ｉｄＴ
配列番号７２（４）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）ａＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ－ｉｄＴ
配列番号７２（５）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ａＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ－ｉｄＴ
配列番号７２（６）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ａＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ－ｉｄＴ
配列番号７２（７）：
ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）ａＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ－ＰＥＧ
配列番号７２（８）：
Ｂ－ｉｄＴ－Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）ａＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ－ｉｄＴ
　配列番号５６（２０）～５６（５２）、６１（１）、６９、６９（１）、６９（２）、７０～７２、７２（１）～７２（８）の核酸は全て化学合成により作製した。これらの核酸がキマーゼと結合するかどうかについて、実施例４と同様にして、表面プラズモン共鳴法により評価した。結果を表７に示す。
　その結果、すべての核酸（一部、未測定である核酸は除く）はネガティブコントロールよりも有意にキマーゼに結合した。
　キマーゼに対する阻害活性の測定は、実施例３と同様に行った。ＩＣ５０値を表７に示す。その結果、表７に含まれる核酸のすべてに強い阻害活性が認められた。
　配列番号５６（２７）および５６（４５）の結果より、例えばＰＥＧのような末端修飾は５’末端、３’末端のいずれであってもよいことが示された。
　また配列番号５６（４３）、５６（４４）、５６（４６）、および５６（４７）の結果より、末端修飾としては、実施例６で示したｉｄＴやＰＥＧ以外にペプチド、アミノ酸、あるいはビオチンなどの化合物であってもよいことがわかった。
　さらに配列番号５６（２６）と６９（２）、５６（２７）と６９、そして５６（２８）と６９（１）の結果より、ｉｄＴやＰＥＧのような末端修飾はポリヌクレオチド鎖を介して結合させても阻害活性に影響がないことがわかった。このようなスペーサーとしては、任意のポリヌクレオチド鎖以外に、例えばアルキル型スペーサーを用いてもよい。
　また一部のＦ体をＤＮＡ体にすることで阻害活性が向上することが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
表７：キマーゼに対する結合活性と阻害活性（ＩＣ５０）。結合活性において、“＋＋”はネガティブコントロールの配列番号５８よりも有意にキマーゼに結合するものを示す。“ｎ．ｄ．”は未測定を表す。ＩＣ５０値は２回測定の平均値を示す。
　ネガティブコントロールである配列番号５８は１μＭまでの濃度範囲で阻害活性を示さなかった（ＩＣ５０＞１μＭ）。また、ポジティブコントロールであるキモスタチンのＩＣ５０値は０．１μＭ～０．２μＭの値を示した。
　以上の結果より、表７に含まれるすべての核酸はキマーゼに対する強い阻害活性を有し、キマーゼ阻害剤として使用可能であることが示された。
　以上、実施例１から７の結果をまとめると、キマーゼ阻害剤として有効なアプタマーは、特に以下の条件の一つ以上を満足するようなアプタマーであるといえる。
（１）配列番号２１で表される共通配列（Ｘ１ＧＡＵＡＧＡＮ１Ｎ２ＵＡＡＸ２）を含む。
（２）共通配列に含まれるピリミジンヌクレオチドは、天然型ヌクレオチドであってよいが、好ましくは一部のピリミジンヌクレオチドが修飾ヌクレオチドまたはＤＮＡである。
（３）Ｎ１Ｎ２は任意のヌクレオチドであってよいが、好ましくはＧＵ、ＧＡ、ＧＣ、ＵＵ、ＣＵ又はＧＴである。
（４）Ｘ１及びＸ２は任意のヌクレオチドであってよいが、好ましくは同一または異なって、ＡまたはＧであり、より好ましくは共にＡ、もしくは共にＧである。
（５）ステム構造の塩基対配列（例：図６の配列番号５６）は、ステム構造を保つ限り任意のヌクレオチドであってよいが、好ましくは長さが３塩基対以上である。
（６）一部のヌクレオチド（配列番号５６において、６番目のＡ、１１番目のＧ、１２番目のＡ）を除き、各ヌクレオチドは部分的に修飾されているか、または部分的にＤＮＡに置換されている。
（７）末端修飾が導入されている。
（８）ヌクレオチド間のリン酸基の一部が、ホスホロチオエート化されている。
実施例８：アンジオテンシンＩを基質として用いたキマーゼ阻害活性の測定
　本発明の核酸の阻害活性についてさらに評価するため、キマーゼの天然基質であるアンジオテンシンＩを用いて、下記の方法によりキマーゼの酵素活性を測定した。アンジオテンシンＩはキマーゼによりアンジオテンシンＩＩに変換され、その際にペプチド断片であるＨｉｓ－Ｌｅｕが遊離する。このペプチドＨｉｓ－Ｌｅｕはｏ－フタルアルデヒドにより蛍光誘導体化されるため、その蛍光強度を定量的に測定することが可能である。
　アッセイにおける酵素反応の溶液量は５０μＬとし、溶液Ｃの緩衝液中で実施した。まず、０．３～０．７５ｎｇのキマーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、（ＳＩＧＭＡ社製）もしくはｎａｔｉｖｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製））を溶液Ｃ中に希釈したものを５μＬ用意した。ここでｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔとは酵母を用いて発現させたキマーゼであり、ｎａｔｉｖｅとはヒト皮膚肥満細胞から精製したキマーゼである。核酸は溶液Ｃ中に０．００２７～２μＭの濃度で段階希釈したものを、２５μＬずつ用意した。キマーゼ溶液５μＬと核酸溶液２５μＬを混和し、３７℃で５分間保温した。一方で、溶液Ｃ中に調製した１２５ｍＭアンジオテンシンＩ（ペプチド研究所社製）を２０μＬ用意し、３７℃で５分間保温した。キマーゼ及び核酸からなる混合液に、アンジオテンシンＩ溶液を加えて、酵素反応を開始させた。反応溶液中の最終キマーゼ濃度は０．２～０．５ｎＭ、最終基質濃度は５０μＭである。３７℃で９０分間反応させた後、氷冷した３０％トリクロロ酢酸溶液を２５μＬ添加し、反応を停止させた。混合液全体を４℃、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、その上清３０μＬを次の蛍光誘導化反応に用いた。
　上記の上清３０μＬを９６ウェルプレート（ブラック、Ｃｏｓｔａｒ社製）に加え、各ウェルに対し、メタノールに溶解した２％　ｏ－フタルアルデヒド（ＳＩＧＭＡ社製）溶液１５μＬと、０．３Ｍ　ＮａＯＨ溶液１７０μＬを混和し、室温に１０分間放置した。その後、３Ｍ　ＨＣｌ溶液を２５μＬ添加し、反応を停止させた。プレートをマイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍの条件で蛍光強度を測定した。
　なお、コントロールとして、配列番号５８を用いた場合（ネガティブコントロール）、及び既知のキモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤であるキモスタチンを用いた場合（ポジティブコントロール）で同様に処理し測定を行った。各条件において、反応時間０分における蛍光強度をブランクとした。キマーゼ酵素反応において、核酸を添加するかわりに溶液Ｃを同量添加した場合に検出される蛍光強度を１００％とし、各被験物質の阻害率を次式を用いて算出した。
阻害率（％）＝［１－｛（被験物質の蛍光強度－被験物質のブランクの蛍光強度）／（被験物質を含まない場合の蛍光強度－被験物質を含まない場合のブランクの蛍光強度）｝］×１００
　酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求めた。その結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
表８：アンジオテンシンＩを基質として用いた場合のキマーゼに対する阻害活性（ＩＣ５０）。ＩＣ５０は一回測定の値を示す。
　ネガティブコントロールとして用いた配列番号５８は阻害活性を示さなかった（ＩＣ５０＞１μＭ）。また、ポジティブコントロールであるキモスタチンのＩＣ５０値は０．３５～０．５μＭ（Ｎａｔｉｖｅ）、０．４５～０．６μＭ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）の値を示した。ＰＥＧ結合アプタマーの活性はＰＥＧが結合していないアプタマーと比べて相対的に低い。これはＰＥＧ（分子量約４０，０００）がアプタマー（分子量約１０，０００）よりも大きいために起こることで、一般的によく見られる現象である。ＰＥＧを結合することでｉｎ　ｖｉｖｏでの薬物体内動態が大きく改善されるので、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで薬効が多少低下してもｉｎ　ｖｉｖｏで効果を示すことが期待できる。
　以上の結果より、表８に含まれるすべての核酸は、天然の基質であるアンジオテンシンＩを用いた場合でもキマーゼに対する強い阻害活性を有するため、アンジオテンシンが関与する各種疾患の予防および／または治療薬として期待される。
実施例９：正常ヒト肺線維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｕｎｇ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＮＨＬＦ）を用いたＬＴＢＰ－1分解阻害活性の測定
　キマーゼは線維症を引き起こす重要な因子の一つであるＴＧＦ－βの活性化に深く関係している。ＴＧＦ－β活性化の過程において、キマーゼはＬＴＢＰ－１を分解することにより、細胞外マトリックス中に潜在型として存在するｌａｔｅｎｔ　ＴＧＦ－βを遊離させ、さらに、ｌａｔｅｎｔ　ＴＧＦ－βを活性型ＴＧＦ－βへ変換させる反応にも関与することが示唆されている。本発明に係わる核酸が、キマーゼによるＬＴＢＰ－１分解に対する阻害活性を有するかどうかを下記に示す方法で評価した。
　凍結保存されたＮＨＬＦ細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ　Ｂｉｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を３７℃のｗａｔｅｒ ｂａｔｈにて急速融解後、培地（１０％ＦＢＳ／Ｆ－１２）に懸濁した。遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）後、上清を除去し，細胞を培地に再懸濁した。培地で全量を１０ｍＬとして、細胞培養用シャーレに移して３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。顕微鏡にて細胞の形態及び増殖状態を観察し、コンフルエントの状態になったところで無血清培地（０．２％ＢＳＡ／Ｆ－１２）に交換した。培地交換から２日後に培養上清を採取し、分注して－３０℃で凍結保存した。
　用時解凍したＮＨＬＦ培養上清４０μＬをチューブに分注し、溶液Ｃで５０μＭに希釈した核酸溶液を５μＬずつ添加した。ポジティブコントロールとしてはキモスタチンを溶液Ｃで希釈したものを用い、同様に添加した。ネガティブコントロールとしては溶液Ｃのみを用い、同様に添加した。次に、溶液Ｅ（溶液Ｃ＋０．１％ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウム）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したキマーゼを５μＬ添加した。反応溶液中の最終キマーゼ濃度は１０ｎｇ／ｍＬ（０．３３ｎＭ）、最終核酸濃度は５μＭであった。コントロールとして、キマーゼを添加しないチューブを作製した。ピペッティングの後３７℃で1時間インキュベーションし、等量の電気泳動用Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒと混合して反応を終了した。次に示すウェスタンブロッティングにより、サンプル中のＬＴＢＰ－１を検出した。
　Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒと混合したサンプルを３分間煮沸し、５～２０％アクリルアミドゲルに１０μＬのサンプルをアプライして電気泳動した。泳動終了後、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした後、フィルターを５％スキムミルク、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０５％アジ化ナトリウムでブロッキングした。フィルターを２％ＢＳＡ、ＰＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウムで２μｇ／ｍＬに希釈した抗ＬＴＢＰ－１モノクローナル抗体と室温で一晩反応させた。フィルターを３回洗浄し、２次抗体溶液（ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに１００００倍希釈）と室温で２時間インキュベーションした。フィルターを５回洗浄し、化学発光基質で検出を行った。
　各被験物質の阻害活性の有無はＬＴＢＰ－１のバンドの濃さおよび位置（分子量）で判定した。分析は３回に分けておこなった。キマーゼ不添加のウェルのバンドを陽性対照（＋）、ネガティブコントロールのウェルのバンドを陰性（－）とし、各被験物質のウェルのバンドから阻害活性の有無を目視で判定した。ウェスタンブロッティングによる分析結果を図８に、阻害活性の判定結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
表９：ＬＴＢＰ－１分解に対する阻害活性の有無。“＋”はコントロールにおけるＬＴＢＰ－１のバンドと同程度の濃さのバンドが検出されたもの、“－”はネガティブコントロールのようにＬＴＢＰ－１のバンドが明確に検出されなかったものを表す。
　配列番号５８は阻害活性を示さなかった（－）。また、ポジティブコントロールであるキモスタチンは阻害活性を示した（＋）。表９に含まれる配列番号５８以外のアプタマーすべてに、ＬＴＢＰ－１分解に対する阻害活性が認められた。
　以上の結果より、本発明に係わるアプタマーはキマーゼによるＬＴＢＰ－１分解を阻害することが分かった。従って、例えば線維症のようにＴＧＦ－βの活性化が関与する各種疾患の予防および／または治療に使用可能であることが示された。
　本発明のアプタマー及び複合体は、循環器系疾患や線維症などの疾患に対する医薬、あるいは診断薬、試薬として有用であり得る。本発明のアプタマー及び複合体はまた、キマーゼの精製及び濃縮、並びにキマーゼの検出及び定量に有用であり得る。
　本出願は、日本国で出願された特願２００９－１４０５８５を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (19)

  1. 　キマーゼに結合しキマーゼの活性を阻害するアプタマー。
  2. 　Ｘ１ＧＡＵＡＧＡＮ１Ｎ２ＵＡＡＸ２（配列番号２１；式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、Ａ又はＧであり、Ｎ１及びＮ２は、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴである）で表されるヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のアプタマー。
  3. 　Ｎ１Ｎ２がＧＡ、ＧＵ、ＧＣ、ＵＵ、ＧＴ又はＣＵである、請求項２記載のアプタマー。
  4. 　Ｘ１及びＸ２が共にＡ、もしくは共にＧである、請求項２記載のアプタマー。
  5. 　ピリミジンヌクレオチドの少なくとも一つが修飾または改変されている、請求項３または４記載のアプタマー。
  6. 　以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のアプタマー：
    （ａ）配列番号４～３４、３８～５７、５９～６５および６９～７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
    （ｂ）配列番号４～３４、３８～５７、５９～６５および６９～７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１～５個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列；又は
    （ｃ）配列番号４～３４、３８～５７、５９～６５および６９～７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
  7. 　アプタマーに含まれる少なくとも１つのヌクレオチドが修飾または改変されている、請求項６記載のアプタマー。
  8. 　以下の（ａ’）、（ｂ’）又は（ｃ’）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のアプタマー：
    （ａ’）配列番号５６（１）～５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）～５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）、及び７２（１）～７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
    （ｂ’）配列番号５６（１）～５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）～５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）、及び７２（１）～７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１～５個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列；又は
    （ｃ’）配列番号５６（１）～５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）～５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）、及び７２（１）～７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
  9. 　アプタマーに含まれる各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、請求項１記載のアプタマー。
  10. 　アプタマーに含まれる各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、請求項１記載のアプタマー。
  11. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載のアプタマー及び機能性物質を含む複合体。
  12. 　機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物である、請求項１１記載の複合体。
  13. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１１又は１２記載の複合体を含む医薬。
  14. 　循環器系疾患または線維症の予防もしくは治療用である、請求項１３記載の医薬。
  15. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１１又は１２記載の複合体を含む診断薬。
  16. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１１又は１２記載の複合体を含むキマーゼ検出用プローブ。
  17. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１１又は１２記載の複合体を含む、キマーゼ精製用固相担体。
  18. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１１又は１２記載の複合体を用いることを特徴とする、キマーゼの検出方法。
  19. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１１又は１２記載の複合体を用いることを特徴とする、キマーゼの精製方法。
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