NL1031538C2

NL1031538C2 - Ghrelinebindende nucleïnezuren.

Info

Publication number: NL1031538C2
Application number: NL1031538A
Authority: NL
Inventors: Florian Jarosch; Dirk Eulberg; Christian Maasch; Steffen Helmling; Sven Klussmann
Original assignee: Noxxon Pharma Ag
Priority date: 2005-04-08
Filing date: 2006-04-07
Publication date: 2007-03-20
Also published as: TNSN07375A1; AP2007004189A0; NL1033520C2; US8101734B2; US20120115937A1; JP5308813B2; GB2439673A; PE20061358A1; CN101189337A; CA2605377A1; KR20080009072A; US20060258607A1; GB0719489D0; WO2006108599A2; CR9423A; NL1031538A1; GT200600137A; IL186085A0; MX2007012419A; AU2006233647A2

Description

5 GHRELINEBINDENDE NUCLEÏNEZUREN

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op .nucleïnezuren die binden aan ghreline, en op het gebruik hiervan voor de bereiding van een geneesmiddel, en op het 10 gebruik hiervan voor de bereiding van een diagnostisch middel.

Ghreline werd geïdentificeerd als de natuurlijke ligand van de groeihormoon-secretagoog-receptor la (GSHRla) . De receptor komt het meest voor in de hypofyse 15 en in hypothalamische gedeelten van de hersenen, maar kan in lage concentraties ook worden gedetecteerd in andere weefsels. Vanaf de late jaren 70 is aangetoond dat synthetische peptiden en andere verbindingen, secretagogen genaamd, de afgifte van groeihormoon stimuleren. De 20 natuurlijke ligand die verantwoordelijk is voor de afgifte van groeihormoon bleef echter onbekend totdat ghreline werd ontdekt in 1999. Ghreline is een zeer basisch peptidehormoon van 28 aminozuren, met een octanoylzijketen aan het derde aminozuur vanaf de N-terminus (serine 3) . 25 Deze ongebruikelijke modificatie is vereist voor wisselwerking met de GHS-receptor en voor activiteit. In biologische monsters komt echter een mengsel voor van octanoylghreline, dat een vorm van een bioactief ghreline is, en het ongemodificeerde of desoctanoylghreline. De 30 aminozuursequentie van gezuiverd rattenghreline werd bepaald en is GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO 2); de overeenkomstige humane sequentie wijkt hiervan slechts op twee posities af, draagt dezelfde n-octanoyl-zijketen op de aminozuurpositie serine 3, en heeft de sequentie 35 GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO 1)

Naast de natuurlijke n-oqtanoylrest mediëren ook onverzadigde of vertakte octanoylgroepen en langere !1 031538j 2 alifatische ketens, geïntroduceerd op positie 3 van ghreline, de receptorherkenning. Het receptorwisselwerkingsdomein bevindt zich aan de N-terminus van ghreline; deletiestudies hebben aangetoond 5 dat het minimale motief van de aminozuren 1-5 (ghreline(1-5) [GSSFL]) voldoende is voor stimulatie van GHSRla, maar peptidemodificatie met de n-octanoylrest bleek hiervoor van groot belang.

Er is aangetoond dat ghreline fysiologische functies 10 medieert die betrekking hebben op een anabole toestand.

Het stimuleert rechtstreeks de afgifte van groeihormoon (GH) door de hypofyse, en kan derhalve een geschikt doelwit zijn voor de behandeling van acromegalie.

Experimenten in knaagdieren hebben ook uitgewezen dat 15 ghreline eetgedrag induceert, op een GH-onafhankelijke wijze, door in te werken op hypothalamische neuronen. Er zij opgemerkt dat oxyntische klieren in de maag voornaamste plaats van ghrelineproductie vormen, wat suggereert dat ghreline dienst doet als een hormonale 20 koppeling tussen maag, hypofyse en hypothalamus. De waarneming dat ghrelinetoediening in ratten resulteerde in gewichtstoename als gevolg van veranderingen in energieopname en/of brandstofbenutting ondersteunt een dergelijke rol. Bovendien veroorzaakt systemische 25 ghrelinetoediening in mensen een gevoel van honger in de proefpersonen en induceert dit overmatig eten. Op basis van deze bevindingen wordt aangenomen dat ghreline een cruciale rol speelt in de regulering van eetlust een lichaamsgewicht, fungerend als zowel een acuut als een 30 chronisch signaal van een ondervoede toestand. Verdere steun voor deze hypothese wordt geleverd door waarnemingen dat zowel ghrelineniveaus als eetlust verlaagd zijn in individuen na een maagbypass, wat ten minste voor een deel bijdraagt aan de effectiviteit van deze procedure in het 35 teweegbrengen van gewichtsverlies. Klinische gegevens van patiënten met het syndroom van Prader-Willi suggereren ook dat de hyperfagie en het overgewicht die met deze ziekte 3 gepaard gaan het gevolg zijn van enorme hyperghrelinemie. Voorts is gebleken dat ghreline hyperglykemie en remming van insulineafgifte induceert, wat duidt op betrokkenheid bij het glucosemetabolisme. Naast deze functies in 5 energiemetabolisme, is ghreline ook geïmpliceerd in een aantal andere processen op het gebied van gastro-intestinale ziekten, zoals maagleging en regulatie van ingewandsbewegingen. Verder bleek ghreline ook tot expressie te worden gebracht in een aantal neuroendocriene 10 tumoren, en, naast GH-afgifte door de hypofyse, de afgifte van ACTH, PRL en cortisol te stimuleren. Enkelvoudige injecties van ghreline in gezonde individuen bleken de hartfunctie te verhogen en de bloeddruk te verlagen. Ghreline blijkt derhalve te zijn betrokken bij 15 verscheidene taken. Verdere achtergrondinformatie hierover kan worden gevonden in M. Kojima, H. Hosoda, Y. Date, M. Nakazato, H. Matsu, K. Kangawa, "Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach", Nature 402:656-60,1999; M. Tschöp, D.L. Smiley, M.L. Heiman, 20 "Ghrelin induces adiposity in rodents", Nature 407:908-13,2000; A.M. Wren et al., "Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans", Journal of Clinical Endocrinology Metabolism 86:5992-6,2001; M. Nakazato et al., "A role for ghrelin in the central regulation of 25 feeding", Nature 409: 194-8,2001; N. Nagaya, et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2001 May; 280(5):R1483-7; Hemodynamic and hormonal effects of human ghrelin in healthy volunteers; Volante M, et al., J Clin Endocrinol Metab. 2002 Mar; 87(3):1300-8. Expression of ghrelin and 30 of the GH secretagogue receptor by pancreatic islet cells and related endocrine tumors; Jeffery PL, et al., J Endocrinol. 2002 Mar; 172(3):R7-11 Expression and action of the growth hormone releasing peptide ghrelin and its receptor in prostate cancer cell lines; Egido EM, et al., 35 Eur J Endocrinol. 2002 Feb; 146(2):241-4 Inhibitory effect of ghrelin on insulin and pancreatic somatostatin secretion; Broglio F, et al., J Clin Endocrinol Metab.

4 2001 Oct; 86(10):5083-6, Ghrelin, a natural GH secretagogue produced by the stomach, induces hyperglycemia and reduces insulin secretion in humans;

Bednarek MA, et al., J Med Chem. 2000 Oct.; 43:4370-6, 5 Structure-function studies on the new growth hormonereleasing peptide, ghrelin: minimal sequence of ghrelin necessary for activity of growth hormone secretagogue receptor la.

Het probleem dat ten grondslag ligt aan de 10 onderhavige uitvinding is het verschaffen van een specifieke antagonist voor ghreline. Een ander aspect van het probleem dat ten grondslag ligt aan de onderhavige uitvinding is het verschaffen van een specifieke antagonist voor de groeihormoon-sectregagoog-receptor la 15 (GHSR-la) . Nog een ander aspect van het probleem dat ten grondslag ligt aan de onderhavige uitvinding is het verschaffen van een verbinding voor de behandeling van ziekten en aandoeningen waarbij respectievelijk ghreline en de GHSR-la-receptor betrokken zijn.

20 Weer een ander probleem dat ten grondslag ligt aan de !

onderhavige uitvinding is het verschaffen van wijzen voor de binding van bioactief ghreline en meer in het bijzonder het verschaffen van een werkwijze voor de behandeling van ziekten en aandoeningen die worden gemedieerd door J

25 bioactief ghreline, en van werkwijzen voor de specifieke 1 detectie van bioactief ghreline. i

Het probleem dat ten grondslag ligt aan de onderhavige uitvinding wordt in een eerste aspect opgelost door een nucleïnezuur, bij voorkeur bindend aan ghreline, 30 bevattende een eerste stuk, Box A, en een tweede stuk, Box B, waarbij het eerste stuk, Box A, ongeveer 25 opeenvolgende 35 nucleotiden bevat, het tweede stuk, Box B, ongeveer zes tot acht opeenvolgende nucleotiden bevat, 5 waarbij een stuk van een aantal nucleotiden aan het 3'-ige uiteinde van het eerste stuk, Box A, hybridiseert met het tweede stuk, Box B, waardoor bij hybridisatie een eerste 5 dubbelstrengsstructuur wordt gevormd, waarbij deze eerste dubbelstrengsstructuur een bobbel bevat.

In een uitvoeringsvorm van elk aspect van de onderhavige uitvinding is het ghreline een bioactief ghreline, en meer bij voorkeur octanoylghréline en meest 10 bij voorkeur n-octanoylghreline.

In een uitvoeringsvorm wordt de dubbelstrengsstructuur gevormd door de vijf 3’-terminale opeenvolgende nucleotiden van het eerste stuk, Box A, en een deel van of alle nucleotiden van het tweede stuk, Box 15 B, bij voorkeur de zes tot acht opeenvolgende nucleotiden van het tweede stuk, Box B.

In een uitvoeringsvorm wordt de bobbel gevormd door 1 tot 3 nucleotiden van het tweede stuk, Box B, bij voorkeur door 1 nucleotide van het tweede stuk, Box B, die niet 20 baseparen met de vijf 3'-terminale opeenvolgende nucleotiden van het eerste stuk, Box A.

In een uitvoeringsvorm wordt de bobbel gevormd door een niet-baseparende purine, waarbij de purine bij voorkeur een guanosine is.

25 In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt de niet- baseparende purine verschaft door het tweede stuk, Box B.

In een uitvoeringsvorm·bevat het nuclelnezuur voorts een derde stuk, Box Cl, en een vierde stuk, Box C2, waarbij het derde stuk, Box Cl, ten minste één nucleotide 30 bevat en het vierde stuk, Box C2, ten minste één nucleotide bevat, en waarbij het derde stuk, Box Cl, met zijn 3'-ige uiteinde is gehecht aan het 5'-ige uiteinde van het tweede stuk, 35 Box B, en het vierde stuk, Box C2, met zijn 5'-ige uiteinde is gehecht aan het 3'-ige uiteinde van het eerste stuk, Box A.

( > 6

In een voorkeursuitvoeringsvorm zijn het derde stuk,

Box Cl, en het vierde stuk, Box C2, in staat tot hybridisatie, waarbij na hybridisatie een tweede dubbelstrengsstructuur wordt gevormd.

5 In een uitvoeringsvorm vormt de eerste dubbelstrengsstructuur een eerste helicale structuur.

In een voorkeursuitvoeringsvorm vormt de tweede dubbelstrengsstructuur een tweede helicale structuur.

In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm is 10 de tweede helicale structuur een helix of een helixachtige structuur die 1 tot 10 baseparen bevat, bij voorkeur 1 tot 3 baseparen en meer bij voorkeur 2 tot 3 baseparen.

In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt de eerste helicale structuur verlengd door de tweede helicale 15 structuur.

In een voorkeursuitvoeringsvorm bevat het derde stuk,

Box Cl, ongeveer twee tot 10 opeenvolgende nucleotiden, bij voorkeur 1 tot 3 nucleotiden en meer bij voorkeur 2 of 3 opeenvolgende nucleotiden.

20 In een voorkeursuitvoeringsvorm bevat het vierde stuk, Box C2, ongeveer twee tot 10 opeenvolgende nucleotiden, bij voorkeur 1 tot 3 nucleotiden en meer bij voorkeur 2 of 3 opeenvolgende nucleotiden.

In een voorkeursuitvoeringsvorm bevat het 25 nucleïnezuur voorts een vijfde stuk, Box D, dat ten minste twee opeenvolgende nucleotiden bevat.

In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm bevat het vijfde stuk, Box D, de sequentie 5'-CA.

In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm 30 bevat het vijfde stuk, Box D, een aantal opeenvolgende nucleotiden, waarbij het aantal is gekozen uit de groep bestaande uit twee, drie, vier, vijf en zes opeenvolgende nucleotiden.

In een voorkeursuitvoeringsvorm bevat het vijfde 35 stuk, Box D, de sequentie ! S'CAU)^' r j 7 waarbij X elk nucleotide kan zijn, bij voorkeur gekozen uit de groep omvattende A, G, T, C, U en I, en waarbij n een heel getal is gekozen uit de groep 5 bestaande uit 0, 1, 2, 3 en 4.

In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm bestaat het vijfde stuk, Box D, uit de seguentie 5' CA (X) n3' 10 waarbij n = 4.

In een voorkeursuitvoeringsvorm is het vijfde stuk, Box D, met het 5'-ige uiteinde gehecht aan het 3'-ige uiteinde van het tweede stuk, Box B.

15 In een voorkeursuitvoeringsvorm bevat het nucleïnezuur voorts een zesde stuk, Box E, dat ten minste één nucleotide bevat.

In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm bevat het zesde stuk, Box E, ongeveer 1 tot 10 20 opeenvolgende nucleotiden, bij voorkeur 1 tot 4 opeenvolhende nucleotiden, en meer bij voorkeur 3 opeenvolgende nucleotiden.

In een andere neer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm is ten minste één van de nucleotiden van 25 het zesde stuk, Box E, gekozen uit de groep bestaande uit U en G.

In een bijzonder de voorkeur genietende uitvoeringsvorm bevindt het U- of G-nucleotide zich onmiddellijk naast het 5'-ige uiteinde van het eerste 30 stuk, Box A.

In een voorkeursuitvoeringsvorm is het zesde stuk, Box E, met het 3'-ige uiteinde gehecht aan het 5'-ige uiteinde van het eerste stuk, Box A.

In een voorkeursuitvoeringsvorm is het 3'-ige 35 uiteinde van het vijfde stuk, Box D, gehecht aan het 5'-ige uiteinde van het zesde stuk, Box E, door middel van een eerste spacer.

« t 8

In een voorkeursuitvoeringsvorm is het 3'-ige uiteinde van het vierde stuk, Box C2, gehecht aan het 5'-ige uiteinde van het derde stuk, Box Cl, door middel van een tweede spacer.

5 In een voorkeursuitvoeringsvorm zijn de eerste en de tweede spacer elk afzonderlijk en onafhankelijk van elkaar gekozen uit de groep bestaande uit hydrofiele spacers.

In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm is de hydrofiele spacer gekozen uit de groep bestaande uit 10 nucleïnezuurspacers en niet-nucleïnezuurspacers.

In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm is de eerste spacer een nucleïnezuurspacer die ongeveer 1 tot 20 opeenvolgende nucleotiden bevat, bij voorkeur 1 tot 5 opeenvolgende nucleotiden en meer bij voorkeur 2 15 opeenvolgende nucleotiden.

In een andere meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm is de tweede spacer een nucleïnezuurspacer die ongeveer 3 tot 20 opeenvolgende nucleotiden bevat, bij voorkeur 3 tot 5 opeenvolgende nucleotiden en meer bij 20 voorkeur 3 opeenvolgende nucleotiden. In een nog meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm bestaat de spacer uit ACA of CAA.

In een andere meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm is de spacer een niet-nucleïnezuur. In een 25 bijzonder de voorkeur genietende uitvoeringsvorm daarvan bevat de eerste spacer en/of de tweede spacer ten minste één ethyleenglycolgroep of een veelvoud van dergelijke ethyleenglycolgroepen.

In een uitvoeringsvorm heeft de spacer een 30 molecuulgewicht van ongeveer 172 tot 688 Da, bij voorkeur 344 Da.

In een uitvoeringsvorm is het nucleïnezuur een cyclisch nucleïnezuur.

In een uitvoeringsvorm heeft het nucleïnezuur de 35 structuur van 5’- [Box Cll -1 BoxB 1 -1 Box D 1 - Spacer -1 BoxE | -1 Box A-"

Box C2 1 ï 9 of de structuur van ! _ _____ _ 5 5’-1 BoxE [ -1 Box A - |Box C2| - Spacer - |Box Cl| -

1 Box B ~| - Box D

In een uitvoeringsvorm bevat het eerste stuk, Box A, de sequentie van ! 10 ! ' UAAXiX2CCGAAX3GUAX4CCAUUCCUX5C (SEQ ID NO: 3); waarbij 15 Xi = G of A; X2 = A of U; X3 = G of A; X4 = A of C of U; en X5 = G of A, I 20 bij voorkeur 5'ÜAAGACCGAAGGUACCCAUUCCUAC3' (SEQ ID NO: 4).

In een uitvoeringsvorm bevat het tweede stuk, Box B, de sequentie van 5'GUGAGG3'.

In een uitvoeringsvorm is de sequentie van het 25 nucleïnezuur gekozen uit de groep bestaande uit de sequenties volgens_ _SEQ ID NO:__interne referentie_ _5__MS-P2-E3_ _6__MS-P2-G2_ _7__MS-P2-D2 _ _8__MS-P2-A3_ _9__MS-P2-E1_ _10__MS-P2-B1_ _11__MS-P2-F1_ _12__MS-P2-C3_ _13__MS-P2-C2_ _14_ MS-P2-H2_ 1 * 10 _15__MS-P2-A4_ _16__MS-P2-B2_ _17__MS-P2-A2_ _18__MS-P3-H3_ _19__MS-P2-D1_ _20__SOT-C_ _21__F12_ _22__SOT-D (C12 )_ _23__SOT-D-OOO_ _24__ SOT-D-IOO_ _25__SOT-D-101_ _26__SQT-D-102_ _27__SQT-D-104_ _28__SQT-D-106_ _29__SQT-D-108_ _30__SQT-D-109_ 31 SOT-D-110

- ---------- I

_32__SOT-D-111_ _33__SOT-E of MS-P2-F1_ _34__S0T-E-02_ _35__SQT-E-09_ _36__SOT-E-11_ _37__SOT-E-12_ _38__SOT-E-14_ _39__SOT-E-19_ _40__SOT-E-21_ _41__SOT-E-25_ _42__SOT-E-33_ _43__SOT-E19-L_ _44__SOT-E19-L1_ _45__SOT-E19-L2_ _46__SOT-E19-L3_ _47__SOT-E19-L4_ _48__SOT-E19-L5_ _49__SOT-E19-L6_ _50__SOT-E19-L7_ 1 * 11 _51__SOT-E19-5 ' -PEG_ _52__SOT-D-109 (N0X-B11-2) _72__gebiotinyleerde NOX-B11

In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt de sequentie van het nucleüinezuur gekozen uit de groep bestaande uit | de sequenties van SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 5 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO:

40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID

NO: 47, SEQ ID NO: 51 en SEQ ID NO: 52.

In een uitvoeringsvorm is het nucleïnezuur in staat ghreline, bij voorkeur humaan ghreline, te binden.

10 In een voorkeursuitvoeringsvorm heeft het ghreline een aminozuursequentie volgens SEQ ID NO: 1.

In een uitvoeringsvorm bevat het nucleïnezuur een modificatie.

In een voorkeursuitvoeringsvorm is de modificatie 15 gekozen uit de groep bestaande uit HES-groepen en PEG-groepen.

In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm is de modificatie een PEG-groep bestaande uit een onvertakte of vertakte PEG, met bij voorkeur een molecuulgewicht van 20 ongeveer 20 tot 120 kD, meer bij voorkeur van ongeveer 30 tot 80 kD, en meest bij voorkeur van ongeveer 40 kD.

In een andere meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm is de modificatie een HES-groep, met bij voorkeur een molecuulgewicht van ongeveer 10 tot 130 kD, 25 meer bij voorkeur van ongeveer 30 tot 80 kD, en meest bij voorkeur van ongeveer 50 kD.

In een uitvoeringsvorm zijn de nucleotiden van het nucleïnezuur L-nucleotiden.

In een andere uitvoeringsvorm bestaat het 30 nucleïnezuur volledig uit L-nucleotiden.

Het probleem dat ten grondslag ligt aan de onderhavige uitvinding wordt in een tweede aspect opgelost door een farmaceutisch preparaat dat een nucleïnezuur bevat volgens het eerste aspect en eventueel een ander f t- 12 bestanddeel, waarbij het andere bestanddeel is gekozen uit de groep bestaande uit farmaceutisch aanvaardbare excipiënten en farmaceutisch actieve middelen.

Het probleem dat ten grondslag ligt aan de 5 onderhavige uitvinding wordt in een derde aspect opgelost door het gebruik van een nucleïnezuur volgens het eerste aspect voor de bereiding van een geneesmiddel.

Het probleem dat ten grondslag ligt aan de onderhavige uitvinding wordt in een vierde aspect opgelost 10 door het gebruik van een nucleïnezuur volgens het eerste aspect voor de bereiding van een diagnostisch middel.

In een uitvoeringsvorm van het derde aspect is het geneesmiddel voor de behandeling en/of preventie van een ziekte of aandoening gekozen uit de groep omvattende 15 zwaarlijvigheid, eetstoornissen, diabetes, glucosemetabolismestoornissen, tumor, bloeddrukstoornissen, cardiovasculaire ziekten, acromegalie en regulering van energiebalans, eetlust, lichaamsgewicht, en gastro-intestinale ziekten.

20 Het probleem dat ten grondslag ligt aan de onderhavige uitvinding wordt in een vijfde aspect opgelost door een complex dat ghreline en een nucleïnezuur volgens het eerste aspect bevat, waarbij het complex bij voorkeur een kristallijn complex is.

25 Het probleem dat ten grondslag ligt aan de onderhavige uitvinding wordt in een zesde aspect opgelost door het gebruik van een nucleïnezuur volgens het eerste aspect voor de detectie van ghreline.

Het probleem dat ten grondslag ligt aan de 30 onderhavige uitvinding wordt in een zevende aspect opgelost door een werkwijze voor het screenen van een ghrelineantagonist of een ghrelineagonist, die de volgende stappen omvat: het verschaffen van een kandidaatghrelineantagonist 35 en/of een kandidaatghrelineagonist, het verschaffen van een nucleïnezuur volgens het eerste aspect, • Μ 13 het verschaffen van een testsysteem dat een signaal verschaft in aanwezigheid van een ghrelineantagonist en/of een ghrelineagonist, en het bepalen of de kandidaatghrelineantagonist een 5 ghrelineantagonist is en/of of de kandidaatghrelineagonist een ghrelineagonist is.

Het probleem dat ten grondslag ligt aan de onderhavige uitvinding wordt in een achtste aspect opgelost door een werkwijze voor het screenen van een 10 ghrelineagonist of een ghrelineantagonist, die de volgende stappen omvat: het verschaffen van ghreline geïmmobiliseerd aan een fase, bij voorkeur een vaste fase, het verschaffen van een nucleïnezuur volgens het 15 eerste aspect, bij voorkeur een nucleïnezuur volgens het eerste aspect dat gelabeld is, het toevoegen van een kandidaatghrelineagonist en/of een kandidaatghrelineantagonist, en het bepalen of de kandidaatghrelineagonist een 20 ghrelineagonist is en/of of de kandidaatghrelineantagonist een ghrelineantagonist is.

In een uitvoeringsvorm wordt het bepalen zodanig uitgevoerd dat wordt vastgesteld of het nucleïnezuur wordt 25 verdrongen door de kandidaatghrelineagonist of door een kandidaatghrelineantagonist.

Het probleem dat ten grondslag ligt aan de onderhavige uitvinding wordt in een negende aspect opgelost door een kit voor de detectie van ghreline, 30 bevattende een nucleïnezuur volgens het eerste aspect.

Het probleem dat ten grondslag ligt aan de onderhavige uitvinding wordt in een tiende aspect opgelost door een ghrelineantagonist die kan worden verkregen door middel van de werkwijze volgens het achtste aspect.

35 Het probleem dat ten grondslag ligt aan de onderhavige uitvinding wordt in een elfde aspect opgelost • * 14 door een ghrelineagonist die kan worden verkregen door middel van de werkwijze volgens het achtste aspect.

De onderhavige uitvinding is gebaseerd op de verrassende bevinding dat het mogelijk is nucleïnezuren te 5 genereren die specifiek en met hoge affiniteit binden aan ghreline. Meer specifiek konden de onderhavige uitvinders verrassenderwijs nucleïnezuren genereren die specifiek binden aan bioactief ghreline, en meer bij voorkeur octanoylghreline en meest bij voorkeur n-octanoylghreline.

10 Ghreline is een basisch peptide met de aminozuursequentie volgens SEQ ID NO: 1, en is bij voorkeur gemodificeerd met een vetzuurzijketen, die bij voorkeur een octanoylzijketen is en meer bij voorkeur een n-octanoylzijketen. De berekende pi van ghreline is 11,07 15 voor humaan ghreline en 10,56 voor rattenghreline. In een voorkeursuitvoeringsvorm is het ghreline waaraan de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding binden een ghreline dat is gemodificeerd met de vetzuurzijketen. In een alternatieve uitvoeringsvorm is het ghreline een 20 ghreline dat de vetzuurzijketen niet bevat. Zoals hier i gebruikt heeft de term ghreline betrekking op elk ! ghreline, waaronder, maar niet beperkt tot, zoogdierghrelines. Bij voorkeur is het zoogdierghreline gekozen uit de groep omvattende muizen-, ratten-, hamster-25 en humaan ghreline. Meest bij voorkeur is het ghreline humaan ghreline.

De bevinding dat nucleïnezuren die met hoge affiniteit binden aan ghreline konden worden geïdentificeerd is in zoverre verrassend daar Eaton et al.

30 (Eaton, B.E.; Gold, L.; Hicke, B.J.; Janjic, N.; Jucker, F.M.; Sebosta, D.P.; Tarasow, T.M.; Willis, M.C.; Zichi, D.A. ; Bioorganic & Medicinal Chemistry, Vol 5, No. 6/ pp 1087-1096, 1997) waarnamen dat de generatie van aptameren, i.e. D-nucleïnezuren die binden aan een doelwitmolecuul, 35 gericht op een basisch eiwit in het algemeen zeer moeilijk is omdat dit soort doelwit een hoge maar niet-specifieke signaal-ruis-verhouding produceert. Deze hoge signaal- » t 15 ruis-verhouding is het gevolg van de hoge niet-specifieke affiniteit die nucleïnezuren vertonen voor basische doelwitten zoals ghreline.

Een nog verrassender bevinding is dat ondanks de zeer 5 basische overall-pl van ghreline en ondanks dat het receptorbindende motief GSSFL [ghreline(1-5)] een nogal zuur domein is met een berekende pi van 5,5, de onderhavige uitvinders met gebruikmaking van het volledige ghreline een nucleïnezuur konden identificeren dat 10 specifiek het zure receptorbindingsdomein herkent maar niet het basische centrale en carboxy-terminale domein van het peptide. Dit is verrassend gezien de elektrostatische effecten van zowel de ladingen van doelwitmolecuul, i.e. ghreline, en de ladingen van het nucleïnezuur. De binding 15 van negatief geladen nucleïnezuren aan een basisch domein van een doelwitmolecuul zou veel voordeliger moeten zijn in vergelijking met de binding van een nucleïnezuur aan een zuur domein van een doelwitmolecuul. Er dient derhalve te worden opgemerkt dat de vakman geen redelijke 20 verwachting van succes heeft om een nucleïnezuurligand te selecteren die niet bindt aan het basisch gedeelte van ghreline maar aan het zure domein van het doelwitmolecuul.

Naast het bezitten van het amino-terminale receptorbindende motief GSSFL, wordt een biologisch actief 25 ghreline, hier ook aangeduid als bioactief ghreline, bij voorkeur ook gekenmerkt door acylering van aminozuur serine 3 met een n-octanoylgroep. De nucleïnezuurmoleculen volgens de onderhavige uitvinding, die bij voorkeur een ligand zijn van het hierin beschreven aminoterminale 30 motief GSSFL, maken het bij voorkeur mogelijk de biologisch actieve vorm van ghreline te onderscheiden van de bio-inactieve of niet-bioactieve vorm van ghreline. Dit is verrassend daar binding strikt afhankelijk is van de aanwezigheid van twee groepen, de octanoylgroep en het 35 peptide: binding van het nucleïnezuur aan octanoylghreline is specifiek in aanwezigheid van een 1000-voudige overmaat aan desoctanoylghreline, meer bij voorkeur in aanwezigheid • · 16 van een 100-voudige overmaat aan desoctanoylghreline, en meest bij voorkeur in aanwezigheid van een 10-voudige overmaat aan desoctanoylghreline.

Zoals gebruikt in hierin beschreven 5 voorkeursuitvoeringsvormen, is een bioactief ghreline een ghreline dat in een voorkeursuitvoeringsvorm vrijwel alle kenmerken van het natuurlijke ghreline vertoont. In het bijzonder is een bioactief ghreline zoals hier gebruikt in voorkeursuitvoeringsvormen een ghreline of 10 ghrelinederivaat die de afgifte van groeihormoon kan veroorzaken of opwekken, meer bij voorkeur via een wisselwerking met de GHS-receptor. In tegenstelling hiermee is een niet-bioactief ghreline in voorkeursuitvoeringsvormen een ghreline dat verschilt van 15 bioactief ghreline, meer bij voorkeur dat de afgifte van groeihormoon niet opwekt, meer bij voorkeur via een wisselwerking met de GHS-receptor.

In een voorkeursuitvoeringsvorm waren de onderhavige uitvinders verrassenderwijs in staat ghrelinebindende 20 nucleïnezuren te genereren, waarbij het ghreline een bioactief ghreline of biologisch actief ghreline is, die onderscheid maken tussen ghreline met de octanoylzijketen aan het derde aminozuur van de N-terminus ervan (serine 3) terwijl zij niet binden aan ghreline dat een dergelijke 25 octanoylzijketen mist.

De kenmerken van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding zoals hierin beschreven kunnen worden gerealiseerd in elk aspect van de onderhavige uitvinding waarin het nucleïnezuur wordt gebruikt, hetzij 30 alleen of in elke combinatie.

Zonder gebonden te willen zijn aan een theorie, nemen de onderhavige uitvinders aan dat de waargenomen specificiteit van de ghrelinebindende nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding enige structuurkenmerken 35 delen, die in het navolgende zullen worden bediscussieerd, waarbij wordt gerefereerd aan Fig. 20A. Er zij echter begrepen dat Fig. 20Δ een aantal van deze 17 structuurkenmerken bevat die niet noodzakelijkerwijs hoeven te zijn gerealiseerd in één of elk van de nucleinezuren volgens de onderhavige uitvinding.

Het basisstructuurkenmerk is een eerste stuk van 5 opeenvolgende nucleotiden dat hierin ook wordt aangeduid als Box A of als eerste stuk, Box A, en een tweede stuk van opeenvolgende nucleotiden dat hierin ook wordt aangeduid als Box B of als tweede stuk, Box B. Het eerste stuk, Box A, bevat ongeveer 25 opeenvolgende nucleotiden, 10 terwijl tweede stuk, Box B, ongeveer zes tot acht opeenvolgende nucleotiden bevat. Het 3'-terminale stuk van het eerste stuk, Box A, hybridiseert aan het tweede stuk, Box B, waardoor bij hybridisatie een eerste dubbelstrengsstructuur wordt gevormd, waarbij een 15 dergelijke eerste dubbelstrengsstructuur een bobbel bevat. De dubbelstrengsstructuur wordt gevormd door de vijf 3'-terminale opeenvolgende nucleotiden van het eerste stuk, Box A, en een aantal van de zes tot acht opeenvolgende nucleotiden van het tweede stuk, Box B. De bobbel wordt 20 gevormd door 1 tot 3 nucleotiden die niet baseparen met de vijf 3'-terminale opeenvolgende nucleotiden van het eerste stuk, Box A. De bobbel kan derhalve bestaan uit 1, 2 of 3 niet-baseparende nucleotiden, bij voorkeur verschaft door het tweede stuk, Box B. Gegeven deze bobbelgrootte kan het 25 tweede stuk, Box B, zes tot acht opeenvolgende nucleotiden bevatten. Meer bij voorkeur wordt de bobbel gevormd door een niet-baseparend derde nucleotide in het tweede stuk, Box B, gezien vanaf het 5'-ige uiteinde van het tweede stuk, Box B, waarbij het tweede stuk, Box B bij voorkeur 30 zes opeenvolgende nucleotiden bevat.

In een voorkeursuitvoeringsvorm is het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding een enkel nucleïnezuurmolecuul. In een verdere uitvoeringsvorm is het enkele nucleïnezuurmolecuul aanwezig als een veelheid 35 van het enkele nucleïnezuurmolecuul. Bij voorkeur worden de termen nucleïnezuur en nucleïnezuurmolecuul hier uitwisselbaar gebruikt, tenzij anders aangegeven.

• » 18

De vakman zal onderkennen dat het nucleïnezuurmolecuul volgens de uitvinding bij voorkeur bestaat uit nucleotiden die covalent aan elkaar zijn gekoppeld, bij voorkeur door middel van 5 fosfodiesterkoppelingen.

Een verder belangrijk kenmerk is een tweede dubbelstrengsstructuur. Een dergelijke tweede dubbelstrengsstructuur wordt gevormd door een derde stuk ; van opeenvolgende nucleotiden dat ook wordt aangeduid als 10 Box Cl, of als derde stuk, Box Cl, en een vierde stuk van opeenvolgende nucleotiden dat ook wordt aangeduid als Box C2, of als vierde stuk, Box C2. Het derde stuk, Box Cl, is met zijn 3'-ige uiteinde gehecht aan het 5'-ige uiteinde van het tweede stuk, Box B, en het vierde stuk, Box C2, is 15 met zijn 5'-ige uiteinde gehecht aan het 3'-ige uiteinde van het eerste stuk, Box A. Deze tweede dubbelstrengsstructuur vormt typischerwijs een helicale structuur die hier ook wordt aangeduid als de tweede helicale structuur. Een dergelijke tweede helicale 20 structuur is bij voorkeur een verlenging van de helicale structuur die typischerwijs wordt gevormd door de eerste dubbelstrengsstructuur. De lengte van deze eerste dubbelstrengsstructuur die bij voorkeur een helicale structuur is, hier ook aangeduid als eerste helicale 25 structuur, wordt gedefinieerd door de lengte van het eerste stuk, Box A, en het tweede stuk, Box B, meer specifiek door het stuk van deze twee Boxen dat aan elkaar hybridiseert. De door de tweede dubbelstrengsstructuur aan deze eerste helicale structuur verschafte verlenging is, 30 volgens het huidige inzicht van de uitvinders, meer van stabiliserende aard, hoewel de onderhavige uitvinders niet door deze theorie gebonden wensen te zijn. De tweede helicale structuur bestaat uit één tot tien baseparen, bij voorkeur één tot drie baseparen, en meer bij voorkeur twee 35 tot drie baseparen. De vakman zal onderkennen dat slechts één tot drie baseparen niet noodzakelijkerwijs voldoet om een helix te vormen. Deze structuur wordt hier derhalve

» I

19 dan ook aangeduid als een helixachtige structuur, waarbij een dergelijke helixachtige structuur bij voorkeur een structuur is die, wanneer hij zou zijn verlengd met één of meer baseparen, zou resulteren in een helicale structuur.

5 Een verder belangrijk kenmerk is een vijfde stuk van opeenvolgende nucleotiden dat hierin ook wordt aangeduid als Box D, of als vijfde stuk, Box D. Dit aanvullende stuk voorziet in een verbetering van de overallbinding van het nucleïnezuur. Hoewel het vijfde stuk ten minste slechts 10 twee nucleotiden bevat, kan het gunstige effect op de binding van ghreline verder worden verbeterd door de lengte van het vijfde stuk te vergroten tot bij voorkeur 6 opeenvolgende nucleotiden. Ook is gebleken dat het vijfde stuk met name effectief is wanneer het aan het 5'-ige 15 uiteinde ervan een CA-dinucleotide bevat en wanneer het vijfde stuk de sequentie heeft van 5 1 CA (X) n3 ' 20 waarbij X elk nucleotide kan zijn, bij voorkeur gekozen uit de groep omvattende A, G, T, C, U en I.

Een verder kenmerk van de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding is het zesde stuk van opeenvolgende nucleotiden, dat hier ook wordt aangeduid als Box E, of 25 als zesde stuk, Box E. Bij voorkeur bestaat het zesde stuk uit ten minste één nucleotide.

De verschillende stukken zijn aan elkaar gehecht zoals kan worden afgeleid uit Fig. 20A. Zoals daarin aangegeven, bevatten het derde stuk, Box Cl, en het vierde 30 stuk, Box C2, elk één of twee nucleotiden, meer bij voorkeur twee nucleotiden, en bevat het vijfde stuk, Box D, ten minste twee nucleotiden, bij voorkeur vier nucleotiden en meest bij voorkeur zes nucleotiden.

In de uitvoeringsvorm waarin de lengte van het derde 35 stuk, Box Cl, en vierde stuk, Box C2, 0 is kunnen eerste stuk, Box A, en tweede stuk, Box B, eventueel aan elkaar zijn gekoppeld via een koppelgroep of spacer, waarbij een 20 dergelijke spacer elk van de hierin beschreven spacers kan zijn. Zoals hier gebruikt worden de termen "spacer" en "koppelgroep" inwisselbaar gebruikt, tenzij anders aangegeven.

5 Met betrekking tot de onderhavige uitvinding heeft het de voorkeur dat het eerste stuk en het tweede stuk aan elkaar zijn gekoppeld, bij voorkeur via een covalente koppeling. In een voorkeursuitvoeringsvorm, is de covalente koppeling een fosfodiesterkoppeling. In een nog 10 verder de voorkeur genietende uitvoeringsvorm is de 3'-terminus van het eerste stuk gekoppeld aan de 5'-ige terminus van het tweede stuk.

In een andere uitvoeringsvorm bevat het zesde stuk,

Box E, 1 tot 10 opeenvolgende nucleotiden, bij voorkeur 1 15 tot 4 opeenvolgende nucleotiden, en meest bij voorkeur 3 j opeenvolgende nucleotiden.

Zoals blijkt uit deze verschillende schikkingen, is het mogelijk dat het vijfde stuk en het zesde stuk aan elkaar zijn gekoppeld of niet, dat het derde en vierde 20 stuk aan elkaar zijn gekoppeld of niet en dat het eerste en tweede stuk aan elkaar zijn gekoppeld of niet. Er zal worden onderkend dat de koppeling bij voorkeur geschiedt via een covalente binding. Meer bij voorkeur geschiedt de koppeling via een hydrofiele spacer die ten minste één, 25 bij voorkeur een veelheid van ethyleenglycolgroepen bevat. Verscheidene koppelgroepen en spacers zijn de vakman bekend en kunnen worden gekozen met behulp van de volgende criteria zoals beschreven door bijv. Plis en Micura (Nucleic Acid Research (2000), 28(9):1959-1863). De 30 koppelgroepen dienen niet te interfereren met de baseparen zelf. Koppelgroeptypen die aromatische koolstofringen bevatten stapelen op het terminale basepaar en zijn derhalve niet geschikt (J. Am. Chem. Soc. (1999), 121:9905-9906; J. Am. Chem. Soc. (1998), 120:11004-11005).

35 Op ethyleenglycol gebaseerde of van ethyleenglycol afgeleide koppelgroepen voldoen echter aan de vereisten daar zij het voordeel bezitten van goede 21 wateroplosbaarheid en hoge conformationele flexibiliteit (J. Am. Chem. Soc. (1993), 115:8483-8484; Nucleic Acid

Research (1993), 21:5600-5603; Biochemistry (1993), 32:1751-1758; Nucleic Acid Research (1990), 18:6353-6359; 5 J. Am. Chem. Soc. (1997) 119:11591-11597). Bij voorkeur bevat de spacer één of meer ethyleenglycolgroepen, of bestaat hij uit één of meer ethyleenglycolgroepen, waarbij de zuurstof is vervangen of gesubstitueerd door een CH2, een fosfaat of zwavel.

10 Op basis van deze koppelingsmogelijkheden kunnen de volgende structuren worden gerealiseerd 5’- [Box Clj - I Box B I -1 BoxD 1 - Spacer -1 BoxE ] -1 Box A —--

Box C2 15 of 5’-1 BoxE 1 - 1 Box A 1 - |Box C2| - Spacer - |Box Cl| - I BoxB [ -

iBox D I

20

Tot slot valt het ook binnen de strekking van de onderhavige uitvinding dat een volledig gesloten, i.e. cyclische structuur voor de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding wordt gerealiseerd, zoals 25 weergegeven in Fig. 20D.

Tot de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding behoren ook nucleïnezuren die vrijwel homoloog zijn aan de hierin beschreven specifieke sequenties. De term nagenoeg homoloog drukt uit dat de homologie ten 30 minste 75% is, bij voorkeur 85%, meer bij voorkeur 90%, en meest bij voorkeur meer dan 95%, 96%, 97%, 98% of 99%.

De term nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding omvat ook die nucleïnezuren die de hierin beschreven nucleïnezuursequenties of gedeelten daarvan 35 bevatten, bij voorkeur in die zin dat de nucleïnezuren of gedeelten zijn betrokken bij de binding aan ghreline, en meer bij voorkeur bioactief ghreline onderscheiden van 22 niet-bioactief ghreline, i.e. in het bijzonder octanoylghreline van desoctanoylghreline. Een dergelijk nucleïnezuur kan van de hierin beschreven nucleïnezuren zijn afgeleid, bijv. door middel van inkorting. Inkorting 5 kan betrekking hebben op elk van beide of beide uiteinden van de hierin beschreven nucleïnezuren. Inkorting kan ook betrekking hebben op de inwendige sequentie van nucleotiden, i.e. kan betrekking hebben op de nucleotide(n) tussen respectievelijk het 5'- en 3'- 10 terminale nucleotide. Bovendien kan inkorting ook de deletie omvatten van één of meer nucleotiden uit de hierin beschreven nucleïnezuren. Inkorting kan ook betrekking hebben op meer dan één stuk van de nucleïnezuren van de uitvinding, waarbij het stuk één of meer nucleotiden lang 15 kan zijn.

De nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding kunnen D-nucleïnezuren of L-nucleïnezuren zijn. Bij voorkeur zijn de nucleïnezuren volgens de uitvinding L-nucleïnezuren. Daarnaast is het mogelijk dat één of meer 20 gedeelten van het nucleïnezuur bestaan uit D-nucleïnezuren of dat ten minste één of meer geddelten van de nucleïnezuren L-nucleïnezuren zijn. De term "gedeelte" van de nucleïnezuren heeft de betekenis van ten minste één nucleotide. Dergelijke nucleïnezuren worden hier in het 25 algemeen aangeduid als respectievelijk D- en L- nucleïnezuren. In een in het bijzonder de voorkeur genietende uitvoeringsvorm bestaan de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding derhalve uit L- nucleotiden en bevatten ten minste één D-nucleotide. Een 30 dergelijk D-nucleotide is bij voorkeur gehecht aan een ander gedeelte dan aan de stukken die de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding definiëren, bij voorkeur die delen daarvan, waarbij een wisselwerking met andere gedeelten van het nucleïnezuur betrokken is. Bij voorkeur 35 is een dergelijke D-nucleotide gehecht aan een terminus van willekeurig welk van de stukken en van willekeurig welk van de nucleïnezuren volgens de onderhavige 23 uitvinding. In een verdere voorkeursuitvoeringsvorm kunnen dergelijke D-nucleotiden dienstdoen als spacer of als koppelgroep, bij voorkeur voor aanhechting van modificaties zoals PEG en HES aan de nucleïnezuren volgens 5 de onderhavige uitvinding.

Binnen de strekking van de onderhavige uitvinding valt ook dat de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding deel uitmaken van een langer nucleïnezuur waarbij dit langere nucleïnezuur verscheidene delen bevat 10 waarbij ten minste één gedeelte een nucleïnezuur is volgens de onderhavige uitvinding of een gedeelte daarvan. De andere gedeelten van deze langere nucleïnezuren kunnen D-nucleïnezuren of L-nucleïnezuren zijn. Elke mogelijke combinatie zou kunnen worden gebruikt met betrekking tot 15 de onderhavige uitvinding. Deze andere gedeelte(n) van het langere nucleïnezuur kunnen een werking hebben die verschilt van binding, bij voorkeur van binding aan ghreline. Één mogelijke functie is het mogelijk maken van wisselwerking met andere moleculen, waarbij dergelijke 20 andere moleculen bij voorkeur verschillen van ghreline, zoals bijv. voor immobilisatie, verknoping, detectie of amplificatie.

j Zoals hier gebruikt zijn L-nucleïnezuren nucleïnezuren die bestaan uit L-nucleotiden, bij voorkeur 25 nucleïnezuren die volledig bestaan uit L-nucleotiden.

Zoals hier gebruikt zijn D-nucleïnezuren nucleïnezuren die bestaan uit D-nucleotiden, bij voorkeur nucleïnezuren die volledig bestaan uit D-nucleotiden.

Ongeacht of de nucleïnezuren volgens de uitvinding 30 bestaan uit D-nucleotiden, L-nucleotiden of een combinatie van beide, waarbij de combinatie bijv. een random combinatie of een gedefinieerde sequentie van stukken bestaande uit ten minste één L-nucleotide en ten minste één D-nucleotide kan zijn, kan het nucleïnezuur bestaan 35 uit desoxyribonucleotide(n) , ribonucleotide(n) of combinaties daarvan.

^ , » 24

Ontwerp van de nucleïnezuren volgens de uitvinding als L-nucleotiden is voordelig vanwege meerdere redenen. L-nucleïnezuren zijn enantioneren van natuurlijke nucleïnezuren. D-nucleïnezuren zijn echter niet erg 5 stabiel in waterige oplossingen en in het bijzonder in biologische systemen of biologische monsters als gevolg van de wijd verspreide aanwezigheid van nucleasen. Natuurlijke nucleasen, in het bijzonder nucleasen uit dierlijke cellen, zijn niet in staat L-nucleïnezuren af te 10 breken. Hierdoor is de biologische halfwaardetijd van het L-nucleïnezuur aanzienlijk hoger in een dergelijk systeem, waaronder het dierlijke en menselijke lichaam. Als gevolg van de gebrekkige afbreekbaarheid van L-nucleïnezuur worden geen afbraakproducten gegenereerd en worden 15 derhalve geen neveneffecten die daaruit voortkomen waargenomen. Dit aspect onderscheidt het L-nucleïnezuur van feitelijk alle andere verbindingen die worden gebruikt bij de therapie van ziekten en/of aandoeningen waarbij de aanwezigheid van ghreline betrokken is. L-nucleïnezuren 20 die specifiek binden aan een doelwitmolecuul via een mechanisme dat verschilt van Watson-Crick-baseparing, of aptameren die gedeeltelijk of geheel uit L-nucleotiden bestaan, in het bijzonder met die gedeelten van het aptameer die betrokken zijn bij de binding van het 25 aptameer aan het doelwitmolecuul, worden ook wel spiegelmeren genoemd.

Binnen de strekking van de onderhavige uitvinding valt ook dat de nucleïnezuren volgens de uitvinding, ongeacht of zij aanwezig zijn als D-nucleïnezuren, L-30 nucleïnezuren of D,L-nucleïnezuren en ongeacht op zij DNA

of RNA zijn, aanwezig kunnen zijn als enkelstrengs of dubbelstrengs nucleïnezuren. Typischerwijs zijn de nucleïnezuren volgens de uitvinding enkelstrengs nucleïnezuren die bepaalde secundaire structuren vertonen 35 als gevolg van de primaire structuur en derhalve ook tertiaire structuren kunnen vormen. De nucleïnezuren volgens de uitvinding kunnen echter ook dubbelstrengs zijn 25 in die zin dat twee strengen die geheel of gedeeltelijk complementair zijn aan elkaar aan elkaar zijn gehybridiseerd. Dit geeft stabiliteit aan het nucleïnezuur wat met name voordelig zal zijn indien het nucleïnezuur 5 aanwezig is in de natuurlijke D-vorm in plaats van de L-vorm.

De nucleïnezuren van de uitvinding kunnen gemodificeerd zijn. Dergelijke modificaties kunnen betrekking hebben op de afzonderlijke nucleotiden van het 10 nucleïnezuur en zijn welbekend in het vakgebied. Voorbeelden van dergelijke modificaties worden beschreven in onder andere Venkatesan, N. et al. (2003) Curr Med Chem. Oct; 10 (19):1973-91; Kusser, W. (2000) J Biotechnol, 74:27-38; Aurup, H. et al. (1994) Nucleic Acids Res, 15 22:20-4; Cummins, L.L. et al, (1995) Nucleic Acids Res, 23:2019-24; Eaton, B.E. et al. (1995) Chem Biol, 2:633-8; Green, L.S. et al., (1995) Chem Biol, 2:683-95; Kawasaki, A.M. et al., (1993) J Med Chem, 36:831-41; Lesnik, E.A. et al., (1993) Biochemistry, 32:7832-8; Miller, L.E. et al., 20 (1993) J Physiol, 469:213-43. Dergelijke modificaties kunnen een H-atoom, een F-atoom of CH3-0-groep of NH2-groep zijn op de 2’-positie van de afzonderlijke nucleotiden waaruit het nucleïnezuur bestaat. Het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding kan ook ten minste één LNA-25 molecuul bevatten. In een uitvoeringsvorm bestaat het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding uit LNA-nucleotiden.

In een uitvoeringsvorm kunnen de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding een meerdelig 30 nucleïnezuur zijn. Zoals hier gebruikt is een meerdelig nucleïnezuur een nucleïnezuur dat bestaat uit ten minste twee nucleïnezuurstrengen. Deze ten minste twee nucleïnezuurstrengen vormen een functionele eenheid waarbij de functionele eenheid een ligand is voor een 35 doelwitmolecuul. De ten minste twee nucleïnezuurstrengen kunnen zijn afgeleid van de nucleïnezuren van de uitvinding, door middel van klieving van het nucleïnezuur 26 om zo twee strengen te genereren, of door één nucleïnezuur te synthetiseren dat een eerste gedeelte van het overallnucleïnezuur van de uitvinding vormt en een ander nucleïnezuur dat het tweede gedeelte van het 5 overallnucleïnezuur vormt. Er zij begrepen dat zowel klieving als synthese kan worden toegepast om een meerdelig nucleïnezuur te genereren waarin er meer dan twee strengen zijn zoals hierboven beschreven. Met andere woorden de ten minste twee nucleïnezuurstrengen zijn j 10 typischerwijs verschillend van twee strengen die complementair zijn en die aan elkaar hybridiseren, hoewel er een zekere mate van complementariteit tussen de verscheidene gedeelten kan bestaan.

De onderhavige uitvinders hebben ontdekt dat de 15 nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding zeer gunstige Kd-waarden vertonen. Meer in het bijzonder vertonen oligonucleotiden die - naast de volledige Box A en Box B - Box Cl en C2 met elk minimaal twee nucleotiden,

Box D met minimaal zes nucleotiden en Box E met minimaal 20 drie nucleotiden bevatten (bijvoorbeeld SOT-E) een zesmaal betere bindingsaffiniteit voor ghreline (Fig. 18) dan SOT-C.

Een mogelijkheid voor het bepalen van de bindingsconstante is het gebruik van het zogenoemde 25 Biacore-apparaat, dat de vakman bekend is. Affiniteit zoals hier gebruikt werd ook gemeten met behulp van een "evenwichtsassay" zoals beschreven in de voorbeelden. Een geschikte maat voor het uitdrukken van de intensiteit van de binding tussen het nucleïnezuur en het doelwit dat in 30 het onderhavige geval ghreline is, is de zogenoemde Kd-waarde, die de vakman bekend is, evenals de werkwijze voor de bepaling ervan.

De nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding worden gekenmerkt door een bepaalde Kd-waarde. Bij 35 voorkeur ligt de door de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding vertoonde Kd-waarde onder de 1 μΜ.

Een Kd-waarde van ongeveer 1 μΜ wordt beschouwd als 27 karakteristiek voor een niet-specifieke binding van een nucleïnezuur aan een doelwit. Zoals de vakman zal j onderkennen vallen de Kd-waarden van een groep verbindingen zoals de nucleinezuren volgens de onderhavige 5 uitvinding binnen een bepaald bereik. De hierboven genoemde Kd van ongeveer 1 μΜ is een voorkeursbovengrens voor de Kd-waarde. De voorkeursondergrens voor de Kd van doelwitbindende nucleinezuren kan ongeveer 10 picomolair of hoger zijn. Binnen de strekking van de onderhavige 10 uitvinding valt dat de Kd-waarden van afzonderlijke nucleinezuren die binden aan ghreline bij voorkeur binnen dit bereik liggen. Voorkeursbereiken kunnen worden gedefinieerd door een eerste en een tweede getal binnen dit bereik te kiezen. Voorkeursbovengrenzen zijn 0,25 μΜ, 15 0,1 μΜ en 0,01 μΜ, voorkeursondergrenzen zijn 100 nM, 10 nM, 1 nM en 0,05 nM.

De nucleinezuren volgens de onderhavige uitvinding kunnen elke lengte hebben op voorwaarde dat zij nog in staat zijn te binden aan het doelwitmolecuul, en bioactief 20 ghreline kunnen onderscheiden van niet-bioactief ghreline, i.e. bij voorkeur octanoylghreline van desoctanoylghreline. De vakman zal onderkennen dat er voorkeurslengtes zijn voor de nucleinezuren volgens de onderhavige uitvindingen. Typischerwijs ligt de lengte 25 tussen 15 en 120 nucleotiden. De vakman zal onderkennen dat elk geheel getal tussen 15 en 120 een mogelijke lengte is voor de nucleinezuren volgens de onderhavige uitvinding. Meer de voorkeur genietende bereiken voor de lengte van de nucleinezuren volgens de onderhavige 30 uitvinding zijn lengtes van ongeveer 20 tot 100 nucleotiden, ongeveer 20 tot 80 nucleotiden, ongeveer 20 tot 60 nucleotiden, ongeveer 20 tot 50 nucleotiden en ongeveer 30 tot 50 nucleotiden.

Binnen de strekking van de onderhavige uitvinding 35 valt dat de hierin beschreven nucleinezuren een groep bevatten die bij voorkeur een groep is met een hoog molecuulgewicht en/of die het bij voorkeur mogelijk maakt « k 28 de eigenschappen van het nucleinezuur te veranderen in termen van onder andere verblijftijd in het dierlijke lichaam, bij voorkeur het menselijke lichaam. Een in het bijzonder de voorkeur genietende uitvoeringsvorm van een 5 de modificatie is PEGylering en HESylering van de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding. Zoals hier gebruikt staat PEG voor poly(ethyleenglycol) en HES voor hydroxyethylzetmeel. Zoals hier bij voorkeur gebruikt is PEGylering de modificatie van een nucleinezuur volgens 10 de onderhavige uitvinding waarbij de modificatie bestaat uit een PEG-groep die is gehecht aan een nucleinezuur volgens de onderhavige uitvinding. Zoals hier bij voorkeur gebruikt is HESylering de modificatie van een nucleinezuur volgens de onderhavige uitvinding waarbij de modificatie 15 bestaat uit een HES-groep die is gehecht aan een nucleinezuur volgens de onderhavige uitvinding. Deze modificaties en de werkwijze voor het modificeren van een nucleinezuur met behulp van dergelijke modificaties, is beschreven in Europese octrooiaanvrage EP 1 306 382, 20 waarvan de beschrijving hier bij referentie in zijn geheel is opgenomen.

Bij voorkeur is het molecuulgewicht van een modificatie die een groep met een hoog molecuulgewicht bevat of hieruit bestaat ongeveer 2000 tot 200000 Da, bij 25 voorkeur 40000 tot 120000 Da, in het bijzonder in het geval waarin PEG deze groep met een hoog molecuulgewicht is, en bij voorkeur ongeveer 3000 tot 100000 Da, meer bij voorkeur 5000 tot 60000 Da, in het bijzonder in het geval waarin HES deze groep met een hoog molecuulgewicht is. De 30 werkwijze van HES-modificatie wordt bijv. beschreven in Duitse octrooiaanvrage DE 1 2004 006 249.8, waarvan de beschrijving hier bij referentie in zijn geheel is opgenomen.

Zonder gebonden te willen zijn door een theorie, 35 lijkt het erop dat, door modificatie van de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding met een groep met een hoog molecuulgewicht zoals polymeren, en meer in het • t 29 bijzonder de hierin beschreven polymeren, die bij voorkeur fysiologisch aanvaardbaar zijn, de excretiekinetiek wordt veranderd. Meer in het bijzonder lijkt het erop dat als gevolg van het verhoogde molecuulgewicht van de 5 gemodificeerde nucleïnezuren volgens de uitvinding en als gevolg van het feit dat de nucleïnezuren niet worden gemetaboliseerd wanneer zij de L-vorm hebben, excretie uit een dierlijk lichaam, bij voorkeur uit een zoogdierlichaam en meer bij voorkeur uit een menselijk lichaam, wordt 10 vertraagd. Aangezien excretie gewoonlijk plaatsvindt via de nieren, nemen de onderhavige uitvinders aan dat de glomerulaire filtratiesnelheid van het aldus gemodificeerde nucleïnezuur aanzienlijk verlaagd is in vergelijking tot nucleïnezuren zonder dit soort 15 modificatie met een hoog molecuulgewicht, wat resulteert in een verhoging van de verblijftijd in het lichaam. In verband daarmee is het in het bijzonder opmerkelijk dat ondanks een dergelijk modificatie met een hoog molecuulgewicht de specificiteit van het nucleïnezuur 20 volgens de onderhavige uitvinding niet op nadelige wijze wordt beïnvloed. De nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding hebben derhalve verrassende eigenschappen die normalerwijs niet kunnen worden verwacht van farmaceutisch actieve verbindingen - zodat een farmaceutische 25 formulering die voorziet in duurzame afgifte niet noodzakelijkerwijs nodig is voor om te voorzien in een duurzame afgifte. In plaats daarvan kunnen de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding in hun 1 gemodificeerde vorm die een groep met een hoog 30 molecuulgewicht bevat, als zodanig reeds worden gebruikt als een formulering voor duurzame afgifte.

Binnen de strekking van de onderhavige uitvinding valt echter ook dat de hierin beschreven nucleïnezuren geen enkele modificatie bevatten en in het bijzonder geen 35 modificatie met een hoog molecuulgewicht zoals PEGylering of HESylering. Een dergelijke uitvoeringsvorm heeft in het bijzonder de voorkeur wanneer een snelle ruiming van de 30 nucleïnezuren uit het lichaam na toediening is gewenst. Een dergelijke snelle ruiming zou wenselijk kunnen zijn in geval van in-vivo-beeldvorming of tijdelijke eetlustonderdrukking met behulp van de nucleïnezuren of 5 van geneesmiddelen die deze bevatten, volgens de onderhavige uitvinding.

De nucleïnezuren volgens de uitvinding en/of de antagonisten volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden gebruikt voorde generatie of vervaardiging van een 10 geneesmiddel. Een dergelijk geneesmiddel bevat ten minste één van de nucleïnezuren volgens de uitvinding, eventueel tezamen met andere farmaceutisch actieve verbindingen, waarbij het nucleïnezuur volgens de uitvinding bij voorkeur zelf werkzaam is als een farmaceutisch actieve 15 verbinding. Dergelijke geneesmiddelen bevatten in voorkeursuitvoeringsvormen ten minste een farmaceutisch aanvaardbare drager. Een dergelijke drager kan bijv. water, buffer, PBS, glucoseoplossing, bij voorkeur een zoutgebalanceerde 5% glucoseoplossing, zetmeel, suiker, 20 gelatine of andere aanvaardbare drager. Dergelijke dragers zijn de vakman bekend.

In een verdere uitvoeringsvorm bevat het geneesmiddel nog een ander farmaceutisch actief middel. Dergelijke verdere farmaceutisch actieve verbindingen kunnen die zijn 25 waarvan bekend is dat zij eetlust verminderen worden bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit PYY3-45, CCK, Leptine, en Insuline. Anderzijds of daarnaast kan een dergelijk ander farmaceutisch actief middel een ander nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding zijn. 30 Anderzijds kan het geneesmiddel nog ten minste één nucleïnezuur bevatten dat bindt aan een doelwitmolecuul anders dan ghreline of dat een werking vertoont die verschilt van die van de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding. In een uitvoeringsvorm bindt een 35 dergelijk nucleïnezuur aan een ghreline die de octanoylzuurgroep mist.

31

Ziekten en/of stoornissen en/of ziektetoestanden waarvoor ter behandeling en/of preventie ervan een dergelijk geneesmiddel kan worden gebruikt zijn onder meer zwaarlijvigheid, de regulering van de energiebalans, 5 eetlust en lichaamsgewicht, eetstoornissen, gastro- intestinale ziekten, diabetes, glucosemetabolisme, tumor, bloeddruk, cardiovasculaire ziekten, acromegalie en andere vormen van GH-onbalans. Zoals de vakman zal onderkennen kunnen de nucleïnezuren volgens de uitvinding worden 10 gebruikt bij elke ziekte waarbij een antagonist voor ghreline kan worden toegediend aan een patiënt die behoefte heeft aan een dergelijke antagonist en waarbij een dergelijke antagonist geschikt is om de oorzaak van de ziekte of de stoornis te elimineren of ten minste de 15 effecten van de ziekte of de stoornis te verminderen. Dergelijke effecten zijn onder meer zwaarlijvigheid, de regulering van de energiebalans, eetlust en lichaamsgewicht, eetstoornissen, gastro-intestinale ziekten, diabetes, glucosemetabolisme, tumorbehandeling, 20 bloeddruk, cardiovasculaire ziekten, acromegalie en andere vormen van GH-onbalans. De toepasbaarheid van de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding met betrekking tot deze en andere ziekten of stoornissen is onder andere het gevolg van de betrokkenheid van ghreline 25 zoals beschreven in het inleidende gedeelte van de onderhavige octrooiaanvrage. In het kader van de onderhavige uitvinding wordt regulering van de energiebalans beschouwd als een ziekte. Meer in het bijzonder het gebruik is voor de behandeling van elke 30 ziekte waarbij de regulering van de energiebalans wordt beïnvloed door ghreline, hetzij direct of indirect, en waarbij reductie van de biobeschikbaarheid van ghreline gewenst wordt. Hetzelfde is van toepassing op suikermetabolisme, bloeddruk en eetlust en 35 lichaamsgewicht. Verdere ziekten die kunnen worden behandeld met behulp van de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding, mogelijk door systemische of .( i 32 lokale toediening, zijn die welke kunnen worden gekozen uit de groep omvattende hypofysetumoren, acromegalie, centraal syndroom van Cushing, adrenaal syndroom van Cushing, paraneoplastisch syndroom van Gushing, ectopisch 5 syndroom van Cushing, adrenale tumor, stress, hypercortisolisme, hartinsufficiëntie, hartinfarct, beroerte, adrenocorticale insufficiëntie, hypotonie, aortische stenose, pulmonair hypotonie, constrictieve pericarditis, infectieziekten, infectieuze toxische 10 hypotonie, hypovolemie, en hyponatriëmie.

Zoals hier gebruikt omvat de term gastro-intestinale ziekte die kan worden behandeld met behulp van de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding maagziekten en -stoornissen, ingewandsziekten en 15 -stoornissen, colonstoornissen en -ziekten en modulatie van gastrische en colonbewegelijkheid. In een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de term ingewandsstoornissen en ingewandsziekten ingewandsontstekingsziekten. Meer de voorkeur genietende 20 ingewandsontstekingsziekten zijn ulceratieve colitis en de ziekte van Crohn. De geschiktheid van de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding voor de behandeling van dit soort ziekten komt voort uit de betrokkenheid van ghreline bij dergelijke ziekten zoals beschreven in 25 Karmiris K et al. (Karmiris K, Koutroubakis IE, Xidakis C, Polychronaki M, Voudouri T, Kouroumalis EA. Circulating levels of leptin, adiponectin, resistin, and ghrelin in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 2006 Feb;12(2):100-5), Tebbe JJ et al. (Tebbe JJ, Mronga S, 30 Tebbe CG, Ortmann E, Arnold R, Schafer MK. Ghrelin-induced stimulation of colonic propulsion is dependent on hypothalamic neuropeptide Yl- and corticotrophin-releasing factor 1 receptor activation. J. Neuroendocrinol. 2005

Sep;17(9):570-6) en Fukuda H. et al. (Fukuda H, Mizuta Y, 35 Isomoto H, Takeshima F, Ohnita K, Ohba K, Omagari K, Taniyama K, Kohno S. Ghrelin enhances gastric motility through direct stimulation of intrinsic neural pathways ! Λ 33 and capsaicin-sensitive afferent neurons in rats. Scand J Gastroenterol. 2004 Dec;39(12):1209-14).

Het artikel van Kobelt et al. (Kobelt P, Helmling S, Stengel A, Wlotzka B, Andresen V, Klapp BF, Wiedenmann B, 5 Klussmann S, Monnikes H. Anti-ghrelin SPIEGELMER NOX-Bll inhibits neurostimulatory and orexigenic effects of peripheral ghrelin in rats. Gut. 2005 Jun 30, Epub ahead of print) rapporteert een dosisafhankelijke vermindering van korte-termijn-voedselinname geïnduceerd door 10 periferaal ghreline na toediening van anti-ghreline-Spiegelmeer NOX-Bll. Meer specifiek, in de positieve controlegroep verhoogde behandeling met PBS en 3 nmol ghreline (vehikel/ghreline-groep) de voedselinname binnen het eerste half uur na intraperitoneale injectie (4,94 + 15 0,63 g/kg-BW) significant in vergelijking tot de vehikel/vehikel-groep (1,13 ± 0,59 g/kg-BW, p<0,0002) (Fig. 2A van Kobelt et al., supra). Voorbehandeling met 30 nmol Spiegelmeer NOX-Bll (= SOT-C = Blltrc) blokkeerde het stimulerende effect van ghreline op voedselinname (0,58 ± 20 0,58 g/kg-BW, p<0,0001) (Fig. 2A van Kobelt et al., supra). Daarentegen had toediening van een controle-Spiegelmeer bestaande uit een randomsequentie geen remmend effect maar liet dit de ghrelinegeïnduceerde stimulatie van voedselinname intact (4,77 ± 0,66 g/kg-BW; p<0,864) 25 (Fig. 2A van Kobelt et al., supra).

Het remmende effect van N0X-B11 (= SOT-C = Blltrc)op voedselinname bleek strikt dosisafhankelijk te zijn. Een dosis van 1 nmol Spiegelmeer NOX-Bll (= SOT-C = Blltrc) had geen effect op de stimulatie van voedselinname door 30 ghreline (Fig. 2A van Kobelt et al., supra). Een tussenliggend effect werd waargenomen voor een dosis van 10 nmol NOX-Bll (= SOT-C = Blltrc): bij dit dosisniveau was het stimulerende effect van 3 nmol ghreline tijdens de eerste 30 minuten gematigd (3,51 ± 0,66 g/kg-BW vs. 4,94 ± 35 0,63 g/kg-BW p<0,159 met alleen ghreline) (Fig. 2A van

Kobelt et al., supra).

t · 34

Het artikel van Shearman et al. (Shearman LP, Wang SP, Helmling S, Stribling DS, Mazur P, Ge L, Wang L,

Klussmann S, Macintyre DE, Howard AD, Strack AM. Ghrelin

Neutralisation by a Ribonucleic Acid-SPM Ameliorates 5 Obesity in Diet-Induced Obese Mice. Endocrinology. 2006 Mar;147(3):1517-26. Epub 2005 Dec 8) rapporteert een vermindering in lichaamsgewicht en verlaging van de voedselinname na toediening van anti-ghreline-Spiegelmeer NOX-Bll-2 (SOT-D-109) in dieet-gelnduceerde zwaarlijvige 10 (diet-induced obese, DIO) muizen. Meer specifiek wekte infusie met NOX-Bll-2 (SOT-D-109) gewichtsverlies op in vergelijking tot controles (zie Fig. 4A van Shearman et al., supra). Aanzienlijk verlies van lichaamsgewichts werd waargenomen met in fusie met NOX-Bll-2 (SOT-D-109) op 15 dagen 1 tot en met 10 en op dag 12 in vergelijking met muizen die met vehikel werden behandeld; op dagen 1 tot en met 13 in vergelijking met de met controle-Spiegelmeer (controle-SPM) geïnfuseerde groep (P<0,05 vs. vehikel of controle-SPM) . Op dag 13 was het lichaamsgewicht van met 20 NOX-Bll-2 geïnfuseerde muizen toegenomen met gemiddeld 0,32 g erbij gekregen, terwijl dat van muizen die controle-Spiegelmeer ontvingen met gemiddeld 1,85 g was toegenomen en dat van muizen die vehikel ontvingen met gemiddeld 0,91 g was toegenomen. Infusie met NOX-Bll-2 25 (SOT-D-109) verlaagde ook de voedselinname significant (zie Fig. 4B van Shearman et al., supra). Significante effecten op cumulatieve voedselinname werden waargenomen op dagen 1-8 in vergelijking met de vehikelgroep en op dag 1-13 in vergelijking met de controle-Spiegelmeergroep 30 (39, 33 g vs. 42,61 g op dag 13; p<0,05) (Fig. 4C van

Shearman et al., supra). Daarnaast werd de voedingsefficiëntie (gewichtstoename per ingenomen kcal), die aangeeft hoe efficiënt de voedselenergie werd gebruikt voor verhoging van het lichaamsgewicht, berekend op basis 35 van de gegevens van dagen 1-5 en 6-13 (zie Fig. 4D van Shearman et al., supra). De voedingsefficiëntie werd door infusie met NOX-Bll-2 (SOT-D-109) gereduceerd op dagen 1-5 « 35 en dit effect werd niet waargenomen op basis van de gegevens van dagen 6-13, wat suggereert dat de transiënte verlaging in gewichtstoename niet slechts het gevolg was van vermindering van voedselinname. Daarnaast veranderde 5 behandeling met N0X-B11-2 (SOT-D-109) de lichaamssamenstelling van DIO-muizen (Fig. 4E van Shearman et al., supra) . Terwijl er geen verandering was in het gehalte aan magere massa, was het vetmassa-gehalte van muizen die een infusie kregen met N0X-B11-2 (SOT-D-109) 10 verlaagd, zelfs na correctie voor totaal lichaamsgewicht (Fig. 4F van Shearman et al., supra). Wit- vetweefseldepotgewichten werden niet veranderd door infusie met NOX-B11-2 (SOT-D-109), en infusie met controle-Spiegelmeer veranderde de lichaamssamenstelling 15 of het gewicht aan wit vetweefsel niet.

In chronische infusiestudies met N0X-B11-2 (SOT-D- 109) waarbij zowel DIO ghrelinedeficiënte als wildtypemuizen werden gebruikt, werd een significant verliés aan lichaamsgewicht waargenomen bij infusie met 20 N0X-B11-2 (SOT-D-109) in wildtype muizen op dagen 1 tot en met 6 ((zie Fig. 5A van Shearman et al., supra).

Daarentegen veranderde (zie Fig. 4A van Shearman et al., supra) het lichaamsgewicht van GhrT1'- muizen niet (zie Fig. 5B van Shearman et al., supra). Daarnaast verlaagde 25 infusie met NOX-B11-2 (SOT-D-109) de dagelijkse voedselinname op dag 1 in wildtype muizen (zie Fig. 5C van Shearman et al., supra). Infusie met NOX-B11-2 (SOT-D-109) veranderde de voedselinname van GhrT1'- muizen niet (zie Fig. 5D van Shearman et al., supra).

30 Binnen de strekking van de onderhavige uitvinding valt dat het geneesmiddel, in principe, anderzijds of ook kan worden gebruikt voor de preventie van de ziekten die zijn beschreven met betrekking tot het gebruik van het geneesmiddel voor de behandeling van die ziekten. 35 Respectievelijke merkers daarvoor worden gekozen uit de groep omvattende cardiovasculaire risicofactoren, zoals 36 bijvoorbeeld cholesterol en lage aërobe activiteit en algemene factoren die gewichtsbeheersing nodig maken.

Het geneesmiddel volgens de onderhavige uitvinding kan, in principe, worden toegediend op elke wijze die in 5 het vakgebied bekend is. Een voorkeursroute van toediening is systemische toediening, meer bij voorkeur door middel van injectie. Anderzijds kan het geneesmiddel lokaal worden toegediend. Andere toedieningsroutes omvatten intramusculaire, intraperitoneale, en subcutane, orale, of 10 intranasale toediening, waarbij de voorkeur uitgaat naar de toedieningsroute die het minst invasief is, maar nog wel effectief.

In een verder aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een farmaceutisch preparaat. Een dergelijk 15 farmaceutisch preparaat bevat ten minste één van de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding en bij voorkeur een farmaceutisch aanvaardbaar bindmiddel. Een dergelijk bindmiddel kan elk bindmiddel zijn dat in het vakgebied wordt gebruikt/bekend is. Meer in het bijzonder 20 is een dergelijke bindmiddel elk bindmiddel dat wordt bediscussieerd in verband met de vervaardiging van het hierin beschreven geneesmiddel. In een verdere uitvoeringsvorm bevat het farmaceutische preparaat nog een farmaceutisch actief middel.

25 Binnen de strekking van de onderhavige uitvinding valt dat het geneesmiddel zoals hierin beschreven het hierin beschreven farmaceutische preparaat vormt.

In een verder aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een werkwijze voor de behandeling van een 30 individu dat behoefte heeft aan een dergelijke behandeling, omvattende de toediening van een farmaceutisch actieve hoeveelheid van ten minste één van de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding. In een uitvoeringsvorm lijdt het individu aan een ziekte of loopt 35 het risico om een ziekte te krijgen, waarbij de ziekte één van de hierin beschreven ziekten is, in het bijzonder één van de ziekten die wordt beschreven in verband met het 37 gebruik van nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding voor de vervaardiging van een geneesmiddel.

Er zij begrepen dat zowel het nucleïnezuur als de antagonisten volgens de onderhavige uitvinding niet alleen 5 kunnen worden gebruikt als een geneesmiddel of voor de vervaardiging van een geneesmiddel, maar ook voor cosmetische doeleinden, in het bijzonder met betrekking tot de betrokkenheid van ghreline bij zwaarlijvigheid. Voor hetzelfde doeleinde en/of om de zelfde redenen kunen 10 zowel het nucleïnezuur als de antagonisten volgens de onderhavige uitvinding worden gebruikt als een voedseladditief, een middel voor gewichtsbeheersing, een middel voor eetlustbeheersing en/of als een diagnostisch middel. Een preparaat dat zowel het nucleïnezuur als de 15 antagonisten volgens de onderhavige uitvinding bevat kan worden gebruikt voor willekeurig welk van de bovengenoemde doeleinden.

Zoals bij voorkeur hierin gebruikt is een diagnostisch middel geschikt voor het detecteren, direct | 20 of indirect, van ghreline, bij voorkeur ghreline zoals hierin beschreven en meer bij voorkeur ghreline zoals hierin beschreven in verband met de verschillende hierin beschreven stoornissen en ziekten. Het diagnostische middel is geschikt voor de detectie en/of observatie van 25 de hierin beschreven stoornissen en ziekten. Een dergelijke detectie is mogelijk via de binding van de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding aan ghreline. Een dergelijke binding kan direct of indirect worden gedetecteerd. De betreffende werkwijzen en middelen 30 zijn de vakman bekend. Onder andere, kunnen de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding een label bevatten dat detectie van de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding mogelijk maakt, bij voorkeur het aan ghreline gebonden nucleïnezuur. Een dergelijk label 35 wordt bij voorkeur gekozen uit de groep omvattende radioactieve, enzymatische en fluorescente labels. In principe kunnen alle bekende voor antilichamen ontwikkelde

• I

38 assays worden toegepast op de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding, waarbij het doelwitbindende antilichaam wordt gesubstitueerd door een doelwitbindend nucleïnezuur. In antilichaamassays waarbij ongelabelde 5 doelwitbindende antilichamen worden gebruikt wordt de j j detectie bij voorkeur uitgevoerd door middel van een j secundair antilichaam dat is gemodificeerd met radioactieve, enzymatische en fluorescente labels en dat bindt aan het Fc-fragment van het doelwitbindende 10 antilichaam. In het geval van een nucleïnezuur, bij voorkeur een nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding, wordt het nucleïnezuur gemodificeerd met een dergelijk label, waarbij een dergelijk label bij voorkeur wordt gekozen uit de groep omvattende biotine, Cy-3 en Cy-15 5, en wordt een dergelijk label gedetecteerd door middel van een antilichaam gericht op een dergelijk label, bijv. een antibiotine-antilichaam, een anti-Cy3-antilichaam of een anti-Cy5-antilichaam, of - het geval dat het label biotine is - wordt het label gedetecteerd door middel van 20 streptavidine of avidine die van nature binden aan biotine. Een dergelijk antilichaam, streptavidine of avidine wordt dan weer bij voorkeur gemodificeerd met een label, bijv. een radioactief, enzymatisch of fluorescent label (zoals een secundair antilichaam).

25 In een verdere uitvoeringsvorm worden de nucleïnezuurmoleculen volgens de uitvinding gedetecteerd of geanalyseerd door middel van een tweede detectiemiddel, waarbij dit detectiemiddel een moleculair baken is. De methodologie van moleculaire bakens is de vakman bekend.

30 Kort gezegd zijn nucleïnezuurprobes die ook wel worden aangeduid als moleculaire bakens omgekeerde complementen van het te detecteren nucleïnezuurmonster en hybridiseren als gevolg hiervan aan een gedeelte van het te detecteren nucleïnezuurmonster. Bij binding aan het 35 nucleïnezuurmonster raken de fluorofore groepen van het moleculaire baken van elkaar gescheiden, wat resulteert in een verandering van het fluorescentiesignaal, bij voorkeur .* « 39 een verandering in intensiteit. Deze verandering komt overeen met de aanwezige hoeveelheid nucleïnezuurmonster.

De assays voor discriminatie van bioactief en niet-bioactief ghreline volgens de onderhavige uitvinding 5 kunnen worden uitgevoerd met behulp van standaardtechnieken die de vakman bekend zijn. Er zij begrepen dat dergelijke assays ook kunnen worden gebruikt voor de detectie van ghreline en bij voorkeur bioactief ghreline zoals in het navolgende zal worden beschreven.

10 Er zij begrepen dat de detectie van ghreline met behulp van de nucleïnezuren volgens de onderhavige uitvinding in het bijzonder de detectie van bioactief ghreline zoals hierin gedefinieerd mogelijk maakt. Daarnaast kan het bioactieve ghreline apart worden 15 gedetecteerd en dus worden onderscheiden van het desoctanoylghreline door middel van, onder andere, de volgende werkwijze, waarbij andere werkwijzen de vakman duidelijk zullen zijn.

Met betrekking tot de detectie van het bioactieve 20 ghreline omvat een voorkeurswerkwijze de volgende stappen: (a) het verschaffen van een monster dat dient te worden getest op aanwezigheid van bioactief ghreline, (b) het verschaffen van een nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding, 25 (c) het laten reageren van het monster met het nucleïnezuur, bij voorkeur in een reactievat, waarbij stap (a) voorafgaand aan stap (b) kan worden uitgevoerd, of stap (b) voorafgaand aan stap (a) kan worden uitgevoerd.

30 In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt een verdere stap (d) verschaft, die bestaat uit de detectie van de reactie van het monster met het nucleïnezuur. Bij voorkeur wordt het nucleïnezuur van stap (b) geïmmobiliseerd op een oppervlak. Het oppervlak kan het oppervlak zijn van een 35 reactievat zoals een reageerbuis, een putje in een plaat, of het oppervlak van een inrichting die zich in een dergelijk reactievat bevindt, zoals bijvoorbeeld een 40 kraal. De immobilisatie van het nucleïnezuur op het oppervlak kan worden uitgevoerd op elke wijze die de vakman bekend is, waaronder, maar niet beperkt tot, niet-covalente of covalente koppelingen. Bij voorkeur wordt de 5 koppeling bewerkstelligd via een covalente chemische binding tussen het oppervlak en het nucleïnezuur. Het valt echter ook binnen de strekking van de onderhavige uitvinding dat het nucleïnezuur indirect wordt geïmmobiliseerd op een oppervlak, waarbij een dergelijke 10 indirecte immobilisatie het gebruik omvat van nog een ander bestanddeel of een paar van wisselwerkingpartners.

Een dergelijk ander bestanddeel is bij voorkeur een verbinding die op specifieke wijze wisselwerking heeft met het te immobiliseren nucleïnezuur, die ook wel wordt 15 aangeduid als wisselwerkingpartner, en aldus de hechting van het nucleïnezuur aan het oppervlak medieert. De wisselwerkingspartner wordt bij voorkeur gekozen uit de groep omvattende nucleïnezuren, polypeptiden, eiwitten, en antilichamen. Bij voorkeur is de wisselwerkingspartner een 20 antilichaam, meer bij voorkeur een monoklonaal antilichaam. In een alternatief is de wisselwerkingspartner een nucleïnezuur, bij voorkeur een functioneel nucleïnezuur. Meer bij voorkeur wordt een dergelijk functioneel nucleïnezuur gekozen uit de groep 25 omvattende aptameren, spiegelmeren,, en nucleïnezuren die ten minste gedeeltelijk complementair zijn aan het nucleïnezuur. In een verdere alternatieve uitvoeringsvorm, wordt de binding van het nucleïnezuur aan het oppervlak gemedieerd door een meerdelige wisselwerkingspartner. Een 30 dergelijke meerdelige wisselwerkingspartner is bij voorkeur een paar van wisselwerkingspartners of een wisselwerkingspartner die bestaat uit een eerste lid en een tweede lid, waarbij het eerste lid is omvat door of gehecht aan het nucleïnezuur en het tweede lid is omvat 35 door of gehecht aan het oppervlak. De meerdelige wisselwerkingspartner wordt bij voorkeur gekozen uit de groep van paren wisselwerkingspartners omvattende biotine 41 en avidine, biotine en streptavidine, en biotine en neutravidine. Bij voorkeur is het eerste lid van het paar van wisselwerkingspartners biotine.

Een voorkeursresultaat van een dergelijke werkwijze 5 is de vorming van een geïmmobiliseerd complex van bioactief ghreline en het nucleïnezuur, waarbij meer bij voorkeur het complex wordt gedetecteerd. Het valt binnen de strekking van een uitvoeringsvorm dat van het complex het bioactieve ghreline wordt gedetecteerd. Meer bij 10 voorkeur wordt het bioactieve ghreline gedetecteerd door middel van een detectiemiddel dat specifiek is voor bioactief ghreline. In een bijzonder de voorkeur j genietende uitvoeringsvorm wordt het bioactieve ghreline gedetecteerd door middel van een detectiemiddel dat zowel 15 bioactief ghreline als niet-bioactief ghreline detecteert.

Detectiemiddelen die voldoen aan deze vereiste zijn, bijvoorbeeld detectiemiddelen die specifiek zijn voor dat/die gedeelte(n) van ghreline dat/die identiek is/zijn in het bioactieve ghreline en het desoctanoylghreline. Bij 20 voorkeur binden dergelijke detectiemiddelen derhalve aan het C-terminale uiteinde van ghreline, of binden ten j minste niet aan het domein dat wordt gevormd door de N-terminus en de n-octanoyl-zijketen. Een zeer de voorkeur genietend detectiemiddel is een detectiemiddel dat is 25 gekozen uit de groep omvattende nucleïnezuren, polypeptiden, eiwitten en antilichamen, waarvan de bereidingswijze aan de vakman bekend is.

De werkwijze voor de detectie van ghreline omvat ook dat het monster uit het reactievat wordt verwijderd dat 30 bij voorkeur is gebruikt om stap (c) uit te voeren.

De werkwijze omvat in een verdere uitvoeringsvorm ook de stap van het immobiliseren van een wisselwerkingspartner van bioactief en/of desoctanoylghreline op een oppervlak, bij voorkeur een 35 oppervlak zoals hierboven beschreven, waarbij de wisselwerkingspartner is gedefinieerd zoals hierin beschreven en bij voorkeur zoals hierboven beschreven met ( 1 42 betrekking tot de respectievelijke werkwijze, en omvat bij voorkeur nucleïnezuren, polypeptiden en eiwitten en antilichamen in hun verscheidene uitvoeringsvormen. In deze uitvoeringsvorm is een bijzonder de voorkeur 5 genietend detectiemiddel een nucle'inezuur volgens de onderhavige uitvinding, waarbij een dergelijk nucleïnezuur bij voorkeur gelabeld of niet-gelabeld kan zijn. Indien een dergelijk nucleïnezuur gelabeld is kan het rechtstreeks of onrechtstreeks worden gedetecteerd. Een de 10 detectie kan ook het gebruik omvatten van een tweede detectiemiddel dat, bij voorkeur, ook gekozen uit de groep omvattende nucleïnezuren, polypeptiden, eiwitten en antilichamen in de verschillende hierin beschreven uitvoeringsvormen. Dergelijke detectiemiddelen zijn bij 15 voorkeur specifiek voor het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding. In een meer de voorkeur genietende uitvoeringsvorm is het tweede detectiemiddel een moleculair baken. Het nucleïnezuur of het tweede detectiemiddel of beide kunnen in een 20 voorkeursuitvoeringsvorm een detectielabel bevatten. Het detectielabel is bij voorkeur gekozen uit de groep omvattende biotine, een broomdesoxyuridine-label, een digoxigeninelabel, een fluorescentielabel, een UV-label, een radioactief label, en een chelatormolecuul. In een 25 alternatief heeft het tweede detectiemiddel wisselwerking met het detectielabel dat bij voorkeur wordt bevat door, omvat door, of is gehecht aan het nucleïnezuur. Bijzonder de voorkeur genietende combinaties zijn die waarin: het detectielabel biotine is en het tweede 30 detectiemiddel een op biotine gericht antilichaam is, of waarin het detectielabel biotine is en het tweede detectiemiddel een avidine of een avidinedragend molecuul is, of waarin 35 het detectielabel biotine is en. het tweede detectiemiddel een streptavidine of een streptavidinedragend molecuul is, of waarin . 43 i » het detectielabel biotine is en het tweede detectiemiddel een neutravidine of een neutravidinedragend molecuul is, of waarin het detectielabel een broomdesoxyuridine is en het 5 tweede detectiemiddel een op broomdesoxyuridine gericht antilichaam is, of waarin het detectielabel een broomdesoxyuridine is en het tweede detectiemiddel een op broomdesoxyuridine gericht antilichaam is, of waarin 10 het detectielabel een digoxigenine is en het tweede detectiemiddel een op digoxigenine gericht antilichaam is, of waarin het detectielabel een chelator is en het tweede detectiemiddel een radionuclide is, 15 waarbij het de voorkeur heeft dat het detectielabel gehecht is aan het nucleïnezuur. Er zij begrepen dat dit soort combinatie ook toepasbaar is op de uitvoeringsvorm waarin het nucleïnezuur gehecht is aan het oppervlak. In een dergelijke uitvoeringsvorm heeft het de voorkeur dat 20 het detectielabel gehecht is aan de wisselwerkingspartner.

Tot slot valt het ook innen de strekking van de onderhavige uitvinding dat het tweede detectiemiddel wordt gedetecteerd met behulp van een derde detectiemiddel, bij voorkeur is het derde detectiemiddel een enzym, bij 25 voorkeur een enzym dat een enzymatische reactie vertoont bij detectie van het tweede detectiemiddel, of is het derde detectiemiddel een middel voor het detecteren van straling, meer bij voorkeur straling die wordt uitgezonden door een radionuclide. Bij voorkeur detecteert het derde 30 detectiemiddel specifiek het tweede detectiemiddel, en/of heeft het derde detectiemiddel specifiek wisselwerking met het tweede detectiemiddel.

Ook in de uitvoeringsvorm waarbij een wisselwerkingspartner van bioactief en/of 35 desoctanoylghreline is geïmmobiliseerd op een oppervlak en waarbij het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding bij voorkeur wordt toegevoegd aan het complex dat wordt 4 > 44 gevormd tussen de wisselwerkingspartner en het ghreline, kan het monster worden verwijderd uit het reactiemengsel, meer bij voorkeur uit het reactievat waarin stap (c) en/of (d) wordt uitgevoerd.

5 In een uitvoeringsvorm bevat het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding een fluorescente groep, waarbij de fluorescentie van de fluorescente groep verschilt bij complexvorming tussen het nucleïnezuur en bioactief ghreline en vrij bioactief ghreline.

10 In een verdere uitvoeringsvorm is het nucleïnezuur een derivaat van het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding, waarbij de derivaat van het nucleïnezuur ten minste één fluorescente derivaat van adenosine bevat die adenosine vervangt. In een voorkeursuitvoeringsvorm is de 15 fluorescente derivaat van adenosine ethenoadenosine.

In een verdere uitvoeringsvorm wordt het complex dat bestaat uit de derivaat van het nucleïnezuur vólgens de onderhavige uitvinding en de bioactieve ghreline gedetecteerd met behulp van fluorescentie.

20 In een uitvoeringsvorm van de werkwijze wordt een signaal gevormd in stap (c) of stap (d), en is het signaal bij voorkeur gerelateerd aan de concentratie aan bioactief ghreline in het monster.

In een voorkeursaspect kunnen de assays worden 25 uitgevoerd in 96-putsplaten, waarbij bestanddelen worden geïmmobiliseerd in de reactievaten zoals hierboven beschreven en waarbij de putjes dienstdoen als reactievaten.

De hierboven beschreven reeks reactiestappen en de 30 verschillende in verband daarmee beschreven uitvoeringsvormen zijn, in principe, geschikt voor het detecteren van zowel bioactief ghreline, i.e.

octanoylghreline en meer bij voorkeur n-octanoylghreline, alsook desoctanoylghreline. Dit is mogelijk onder de 35 voorwaarde dat voor de detectie van bioactief ghreline, ten minste één van de wisselwerkingspartners en het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding geschikt is 45 om specifiek het bioactieve ghreline te detecteren. In principe is het voldoende dat het nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding, dat specifiek is voor bioactief ghreline, wordt gebruikt. De uitlezing van dit soort 5 werkwijze die de hoeveelheid ghreline in een monster aangeeft, kan als zodanig worden gebruikt als het resultaat van een analyse op bioactief ghreline. Het resultaat kan echter ook worden gebruikt in een werkwijze voor het bepalen van het overallgehalte aan ghreline, bij 10 voorkeur zowel bioactief ghreline als desoctanoylghreline. Hiertoe wordt bij voorkeur eenzelfde werkwijze gebruikt als hierboven beschreven, waarbij detectiemiddelen of wisselwerkingspartners worden gebruikt die specifiek zijn voor desoctanoylghreline of geschikt zijn om zowel 15 bioactief als desoctanoylghreline te detecteren, i.e. het overallghrelinegehalte of de hoeveelheid daarvan. Indien de wisselwerkingspartner of het detectiemiddel geschikt is voor het detecteren van elk type ghreline, ongeacht of het bioactief ghreline of desoctanoylghreline is, kan de 20 overallhoeveelheid ghreline in het monster worden berekend aan de hand van het meetresultaat van een dergelijke werkwijze, waardoor het mogelijk is het percentage bioactief ghreline in het monster te bepalen door het quotiënt te berekenen van de voor bioactief ghreline 25 verkregen waarde en de het overallgehalte aan ghreline. In een verdere uitvoeringsvorm wordt de werkwijze gebruikt voor het specifiek detecteren van desoctanoylghreline. Dit I desoctanoylghreline kan bijvoorbeeld worden gedetecteerd door middel van detectiemiddelen of wisselwerkingpartners 30 die specifiek zijn voor desoctanoylghreline, bijvoorbeeld door te zijn gericht op de C-terminus of de N-terminus van ghreline zonder n-octanoylgroep. De aldus bepaalde hoeveelheid ghreline, i.e. de hoeveelheid desoctanoylghreline kan vervolgens worden opgeteld bij de 35 hoeveelheid bioactief ghreline om het overallgehalte aan ghreline in het monster te berekenen.

* · 46

Het nucleïnezuur volgens de uitvinding kan voorts worden gebruikt als uitgangsmateriaal voor geneesmiddelontwerp. Globaal zijn er twee mogelijke benaderingen. Één benadering is de screening van 5 bibliotheken van verbindingen, bij voorkeur bibliotheken van verbindingen met een laag molecuulgewicht. In een uitvoeringsvorm is de screening een hoge-doorzet-screening. Bij voorkeur is hoge-doorzet-screening de snelle, efficiënte trial-and-error-evaluatie van 10 verbindingen in een doelwitgebaseerd assay. In het beste geval wordt de analyse uitgevoerd door middel van een colorimetrische meting. Bibliotheken die hierbij kunnen worden gebruikt zijn de vakman bekend.

Anderzijds kan het nucleïnezuur volgens de 15 onderhavige uitvinding worden gebruikt voor het rationeel ontwerpen van geneesmiddelen. Bij voorkeur is rationeel geneesmiddelontwerp het ontwerp van een farmaceutische leidraadstructuur. Uitgaand van de 3-dimensionale structuur van het doelwit, die meestal wordt verkregen met 20 behulp van werkwijzen zoals Röntgenkristallografie of kernmagnetische-resonantiespectroscopie, worden computerprogramma's gebruikt om databanken te doorzoeken die structuren bevatten van veel verschillende chemische verbindingen. De selectie wordt uitgevoerd met een 25 computer, de geïdentificeerde verbindingen kunnen vervolgens in het laboratorium worden getest.

Bij het rationele ontwerp van geneesmiddelen kan worden uitgegaan van een nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding, en het ontwerp heeft betrekking op 30 een structuur, bij voorkeur een driedimensionale structuur, die vergelijkbaar is met de structuur van de nucleïnezuren van de uitvinding, of identiek aan de bindingmediërende gedeelten van de structuur van de nucleïnezuren van de uitvinding. Zo'n structuur heeft 35 dezelfde of vergelijkbare bindingskarakteristieken als de nucleïnezuren van de uitvinding. In een verdere stap of als een alternatieve stap in het rationele ontwerp van 47.

geneesmiddelen wordt de, bij voorkeur driedimensionale, structuur van die gedeelten van de nucleïnezuren die binden aan de neurotransmitter nagebootst door chemische groepen die verschillen van nucleotiden en nucleïnezuren.

5 Door deze nabootsing kan een verbinding worden ontworpen die verschilt van de nucleïnezuren. Een dergelijke verbinding is bij voorkeur een klein molecuul of een peptide.

In het geval van screening van bibliotheken van 10 verbindingen, bijvoorbeeld met behulp van competitieve assays welke de vakman bekend zijn, kunnen geschikte ghreline-analogen, ghreline-agonisten of ghreline-antagonisten worden gevonden. Dergelijke competitieve assays kunnen als volgt worden opgezet. Het nucleïnezuur 15 van de uitvinding, bij voorkeur een spiegelmeer dat een doelwitbindend L-nucleïnezuur is, wordt gekoppeld aan een vaste fase. Om ghreline-analogen te identificeren kan gelabeld ghreline worden toegevoegd aan het assay. Een potentiële analoog zou met de ghrelinemoleculen wedijveren 20 om binding aan het spiegelmeer, wat gepaard zou gaan met een verlaging van het signaal dat door het betreffende label wordt veroorzaakt. Screening op agonisten of antagonisten kan worden uitgevoerd met behulp van een celkweekassay, zoals bekend bij de vakman.

25 De kit van de onderhavige uitvinding kan ten minste één of meer van de nucleïnezuren van de uitvinding bevatten. Daarbij kan de kit ten minste één of meer positieve of negatieve controles bevatten. Een positieve controle kan bijvoorbeeld ghreline zijn, in het bijzonder 30 degene waarop het nucleïnezuur van de uitvinding is geselecteerd of waaraan het bindt, bij voorkeur in vloeibare vorm. Een negatieve controle kan bijv. een peptide zijn dat qua biofysische eigenschappen lijkt op ghreline, maar dat niet wordt herkend door de 35 nucleïnezuren van de uitvinding. Voorts kan de kit één of meer buffers bevatten. De verschillende ingrediënten kunnen in gedroogde of gelyofiliseerde vorm of opgelost in ( » 48 een vloeistof in de kit zitten. De kit kan één of meer houders bevatten die elk één of meer ingrediënten van de kit kunnen bevatten. In een verdere uitvoeringsvorm bevat de kit een instructie of instructiebrochure die de 5 gebruiker informatie verschaft met betrekking tot het gebruik van de kit en de verschillende ingrediënten ervan.

Zoals hierin bij voorkeur gebruikt omvat de term behandeling in een voorkeursuitvoeringsvorm ook of als alternatief preventie en/of langdurige observatie.

10 Zoals hierin bij voorkeur gebruikt zullen de termen ziekte en aandoening op uitwisselbare wijze worden gebruikt, tenzij anders aangegeven.

Zoals hierin gebruikt worden de termen omvatten of bevatten bij voorkeur niet bedoeld als inperking van het 15 onderwerp dat door deze termen wordt beschreven. In een andere uitvoeringsvorm dienen de termen omvatten of bevatten echter te worden opgevat in de betekenis van bestaan uit en derhalve als inperking van het onderwerp dat door deze term wordt beschreven.

20 De verschillende SEQ ID NO's, de chemische aard van de nucleïnezuurmoleculen volgens de onderhavige uitvinding en de ghreline-doelwitmoleculen zoals hierin gebruikt, de precieze sequentie daarvan en het interne referentienummer zijn samengevat in de navolgende tabel.

25 i ___49_ι_

SEQ ID. RNA/Peptide Sequentie__InteJ

1 __L-peptide GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR_ huroa; 2 __L-peptide GS S FLS PEHQKAQQRKE S KKPPAKLQPR__ratt< 3 L-RNA ÜAAX1X2CCGAAX3GUAX4CCAUUCCÖX5C waar]

Xi = X2 = X3 = X4 = ____x5 -

„ UAAGACCGAAGGUACCCAAUCCUAC

4 L-RNA voor! ____SEQ : 5 __L-RNA GGGUAAGCGUAAGACCGAAAGUAACCAAUCCUACCGUAUAUACGGUGAGGCAGCAC_MS~P' 6 __L-RNA ggguaagcguaagaccgaagguaaccaauccuaccguaucuacagugaggcagcac_ MS~P' 7 __L-RNA ggguaagcguaagaccgaagguaaccaauccuaccguaucuacggugaggcagcac_MS~P' 8 __L-RNA ggguaagcguaagaccgaagguaaccaauccuaucguaucuauggugaggcagcac_MS~P'

9 __L-RNA ggguaugcauaagaccgaaggoaaccaauccüaccguaucuacggugaggcagcac_ MS~P

10 __L-RNA ggguaugcguaagaccgaagguaaccaauccuaccguaucuacggugaggcagcac_ MS~P

11 __L-RNA gggugagcguaagaccgaaggöaaccaauccuaccguaucuacggugaggcagcac_ MS~P

12 __L-RNA ggguguauguaagaccgaagguraccaauccuaccauaucuacggugaggcagcac _ MS~P

13 L-RNA Igggugugcguaagaccgaagguaaccaauccuaccauaucuacggugaggcagcac_MS~P

__50 _ 14 __L-RNR GGGUGUGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUAUCAUAUCUACGGUGAGGCAGCAC_

,GGGUGUGCGUAAGACCGAAGGUACCCAAUCCUACCUACUAACUGGUGAGGCAGCAC

15 __L-RNA__ 16 __L-RNA GGGUGACGUAAGACCGAAGGUACCCAAUCCUACCUtJUCCUGAGGUGAGGCAGCAC_ 17 __L-RNA GGGUGCUGUGAGGCAAAAAAGUAAGUCCGAAGGUAACCAAUCCUACAGCAC_ 18 __L-RNA GGGUGCUGUGAGGCAAUGCGUAAGUCCGAAGGUAUCCAAUCCUGCAGCAC_ 19 __L-RNA GGGUGUUGUGAGGCAAUAAGUAAGUCCGAAGGUAACCAAUCCUGCAGCAC_ 20 , L-RNA CGUGUGAGGCAAUAAAACUUAAGUCCGAAGGUAACCAAUCCUACACG_ 21 __L-RNA C G UG U G AGG U AG U AAAAAAAAAAAAAC GU AAAU C C G AAGG U AAC C AAU CCUACACG_ 22 L-RNA CGUGCGGUGAGGCAAAAACGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCCACG_ 23 L-RNA CGUGCGGUGAGGCAGACGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCCACG_ 24 __L-RNA C GG U G AGGC AG AC G U AAG AC C G AAGG UAACCAU U C C U AC C G_ 25 __L-RNA CGGUGAGGCAGAUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCG_ 26 __L-RNA CGGUGAGGCAAUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCG_ 27 __L-RNA GGUGAGGCAGACGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACC _ 28 __L-RNA GGUAGGCAGACGÜAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACC_ 29 __L-RNA CCGGUGAGGCAGACGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCGG_ 30 __L-RNA CCGGUGAGGCAGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCGG_ 31 __L-RNA CCGGUGAGGCAGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCGG_ 32 L-RNA CCGGUGAGGCCGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCGG_ 33 L-RNA GGGUGAGCGOAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC_ 34 L-RNA GGGUGAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACC---S---GGUGAGGCAGCAC_ ___51_ 35 __L-RNA CGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC_ ! 36 __L-RNA GGGUGAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG--S---CGGUGAGGCAGCAC_ ! 37 __L-RNA GGGUGAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGC_j 38 __L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC__! 39 __L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG—S---CGGUGAGGCAGCAC_ !

40 __L-RNA CGGUGAGGCAGCAC---S-GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG_ I

41 __L-RNA CGGUGAGGCAGC---S-GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG_ ! 42 __L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG—S---CGGUGAGGCAGC__i 43 __L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC_ : 44 __L-RNA__GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGAAACGGUGAGGCAGCAC_ : 45 __L-RNA__GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGAUACGGUGAGGCAGCAC_ : 46 __L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGACACGGUGAGGCAGCAC_ , 47 __L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGCAACGGUGAGGCAGCAC__: 48 __L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCDACCGAUCUCGGUGAGGCAGCAC_' : 49 __L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUUUCGGUGAGGCAGCAC_ : 50 __L-RNA__GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCGGUGAGGCAGCAC_ ; 51 __L-RNA__5 ' -PEG-GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG—S---CGGUGAGGCAGCAC_ ; 52 __L-RNA__5 ' -PEG-CCGGUGAGGCAGÖAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCGG_

53 D-peptide GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR

54 __D-RNA GGGUAAGCGUAAGACCGAAAGUAACCAAUCCUACCGUAUAUACGGUGAGGCAGCAC_ i ___52 _ 55 __D-RNA GGGUAAGCGÜAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACAGUGAGGCAGCAC_ 56 __D-RNA GGGOAAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC_ 57 __D-RNA GGGUAAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUAUCGUAUCUAÜGGUGAGGCAGCAC_ 58 __D-RNA GGGUAUGCAUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC_ 59 __D-RNA GGGUAUGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCÜACGGUGAGGCAGCAC_ 60 __D-RNA GGGUGAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC_ 61 __D-RNA GGGUGUAUGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCAUAUCUACGGUGAGGCAGCAC_ 62 __D-RNA GGGUGUGCGUAAGACCGAAGGÜAACCAAUCCUACCAUAUCUACGGUGAGGCAGCAC_ 63 __D-RNA GGGUGUGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUAUCAUAUCUACGGUGAGGCAGCAC_ 64 __D-RNA GGGUGUGCGUAAGACCGAAGGUACCCAAUCCUACCUACUAACUGGUGAGGCAGCAC_ 65 __D-RNA GGGUGACGUAAGACCGAAGGUACCCAAUCCUACCUUUCCUGAGGUGAGGCAGCAC_ 66 __D-RNA GGG ÜGCCJG DGAGGCAAAAAAG DAAG U CCGAAGG CJAACCAAUCC UACAGCAC_ 67 D-RNA GGGUGCUGUGAGGCAAÜGCGUAAGUCCGAAGGUAUCCAAUCCUGCAGCAC_ 68 __D-RNA CGUGUGAGGCAAUAAAACUOAAGUCCGAAGGUAACCAAUCCUACACG_ 69 D-RNA CCGGUGAGGCAGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCGG_ 70 __D-RNA GGGUGAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC_ 71 __L-RNA 5 ' - PEG-UAAGGAAACUCGGUCUGAUGCGGUAGCGCUGUGCAGAGCU_ 72 __L-RNA 5 ' -biotine-CGUGUGAGGCAAUAAAACÜÜAAGüCCGAAGGUAACCAAUCCUACACG_ * » 53

De onderhavige uitvinding wordt verder geïllustreerd aan de hand van de figuren, voorbeelden en de sequentielijst waaruit verdere kenmerken, uitvoeringsvormen en voordelen naar voren komen.

5 Fig. 1 toont een gelijkschikking van sequenties van RNA-liganden die binden aan humaan ghreline;

Fig. 2 toont een competitieassay van binding aan ghreline met ingekorte aptameren versus de bekende sequentie SOT-C (Blltrc); 10 Fig. 3 toont een gelijkschikking van gekozen sequenties van RNA-liganden, die werden gepubliceerd in octrooiaanvrage WO 2004/013274 A2;

Fig. 4 toont de berekende secundaire structuur van ghrelinebindende RNA-spiegelmeerkloon SOT-C, de secundaire 15 structuur werd berekend met het programma "RNAfold" (Hofacker et al., 1994, Monatsh. Chem 125:167-188);

Fig. 5 toont de berekende secundaire structuur van ghrelinebindende RNA-spiegelmeerkloon SOT-D-OOO, de secundaire structuur werd berekend met het programma 20 "RNAfold" (Hofacker et al., 1994, Monatsh. Chem 125:167-188) ;

Fig. 6 toont de berekende secundaire structuur van ghrelinebindende RNA-spiegelmeerkloon SOT-D, de secundaire structuur werd berekend met het programma "RNAfold" 25 (Hofacker et al., 1994, Monatsh. Chem 125:167-188);

Fig. 7 toont de berekende secundaire structuur van ghrelinebindende RNA-spiegelmeerkloon F-12, de secundaire structuur werd berekend met het programma "RNAfold" (Hofacker et al., 1994, Monatsh. Chem 125:167-188); 30 Fig. 8 toont een gelijkschikking van SOT-D-000- derivaten die het resultaat zijn van inkortingsO- en rationeel-ontwerpexperimenten;

Fig. 9 toont een eenpuntsmeting voor de remming van ghrelinegeïnduceerde Ca++-afgifte door de Spiegelmeren SOT-35 C, SOT-D-OOO en varianten daarvan bij kamertemperatuur; cellen werden gestimuleerd met 5 nM ghreline dat bij kamertemperatuur was gepre-incubeerd met verschillende 54 hoeveelheden Spiegelmeer SOT-C, SOT-D-OOO, of een variant van D-000. De resultaten tonen het percentage fluorescentiesignaal genormaliseerd ten opzichte van het zonder Spiegelmeer verkregen signaal; 5 Fig. 10 toont een vermoedelijke secundaire structuur van ghrelinebindende RNA-spiegelmeerkloon SOT-D-109;

Fig. 11 toont een dosis-respons-curve voor de remming van ghreline-geïnduceerde Ca++-afgifte door Spiegelmeren D-109 en 5'-gePEGyleerd D-109 bij kamertemperatuur; cellen 10 werden gestimuleerd met 5 nM ghreline dat bij kamertemperatuur was gepre-incubeerd met verschillende hoeveelheden Spiegelmeer D-109 en 5'-gePEGyleerd D-109; de resultaten tonen het percentage fluorescentiesignaal genormaliseerd ten opzichte van het zonder Spiegelmeer 15 verkregen signaal; Spiegelmeer D-109 en de gemodificeerde versies ervan bleken ghreline-geïnduceerde Ca++-afgifte te remmen met eenzelfde IC50;

Fig. 12 toont de berekende secundaire structuur van ghrelinebindende RNA-spiegelmeerkloon SOT-E, de secundaire 20 structuur werd berekend met het programma "RNAfold" (Hofacker et al·., 1994, Monatsh. Chem 125:167-188);

Fig. 13 toont bindingsanalyse van ingekorte varianten van SOT-E-Spiegelmeren getest door middel van celkweekexperimenten; 25 Fig. 14 toont een vermoedelijke secundaire structuur van ghrelinebindende RNA-spiegelmeerkloon SOT- E-19;

Fig. 15 toont een vermoedelijke secundaire structuur van ghrelinebindende RNA-spiegelmeerkloon SOT-E-21;

Fig. 16 toont een vermoedelijke secundaire structuur 30 van ghrelinebindende RNA-spiegelmeerkloon SOT-E-33;

Fig. 17 toont een vermoedelijke secundaire structuur van ghrelinebindende RNA-spiegelmeerkloon SOT-E-25;

Fig. 18 toont de Biacore-2000-sensorgrammen die de KD-waarden aangeven van de D-ghrelinebindende RNA-klonen SOT-35 C en SOT-E;

Fig. 19 toont een dosis-respons-curve voor de remming van ghreline-geïnduceerde Ca++-afgifte door Spiegelmeren i ______ ________ j 55 SOT-E, SOT-E-19-5'-Amino, SOT-E-19-5'-PEG of SOT-D-109 bij 37°C; cellen werden gestimuleerd met 2 nM ghreline dat bij 37 °C was gepre-incubeerd met verschillende hoeveelheden Spiegelmeer SOT-E, SOT-E-19-5'-Amino, SOT-E-19-5'-PEG of 5 SOT-D-109; de resultaten tonen het percentage fluorescentiesignaal genormaliseerd ten opzichte van het zonder Spiegelmeer verkregen signaal; Spiegelmeer SOT-E-19 en de gemodificeerde versies ervan bleken ghreline- geinduceerde Ca++-afgifte te remmen met eenICso van ongeveer 10 4 nM;

Fig. 20A toont de definitie van de sequentieboxen die karakteristiek zijn voor ghrelinebindende Spiegelmeren;

Fig. 20B toont een variant van Fig. 20A;

Fig. 20C toont een variant van Fig. 20A; 15 Fig. 20D toont een variant van Fig. 20A;

Fig. 21 toont de sequenties van SOT-D-109, SOT-E, SOT-E-19, SOT-E-21, SOT-E-33 en SOT-E-25;

Fig. 22 toont de remming van groeihormoonafgifte na toediening van exogeen ghreline, door anti-ghreline-20 Spiegelmeer SOT-E19-5'-PEG;

Fig. 23 toont een overzicht van verschillende derivaten van SOT-E-19 die extra nucleotiden bevatten in plaats van de interne koppelgroep, en de waargenomen IC50-waarde in nM; 25 Fig. 24 toont het resultaat van een cellulair competitieassay met octanoylghreline, desocatnoylghreline, en Spiegelmeer SOT-E-19, met combinaties en concentraties van de componenten aangegeven onder de staven;

Fig. 25 toont een standaardcurve van absorptie versus 30 concentratie aan humaan ghreline (geoctanoyleerd) , gemeten met een detectieassay van het EIA-type, waarbij het ghrelinebindende Spiegelmeer N0X-B11 werd gebruikt om (geoctanoyleerd) humaan ghreline te immobiliseren, om zo de kwantificering van (geoctanoyleerd) humaan ghreline 35 mogelijk te maken;

Fig. 26A-D toont verschillende stappen van een werkwijze voor de kwantificering van octanoylghreline met • , 56 behulp van een ghrelinebindend nucleïnezuur volgens de onderhavige uitvinding.

VOORBEELD 1: Ghreline-bindende sequenties 5 Tenzij expliciet anders aangegeven is het ghreline dat in deze voorbeelden werd gebruik ghreline in de geoctanoyleerde vorm.

Met behulp van een technologie die was afgeleid van die welke wordt beschreven in DE 10349441.3 werd een op 10 gebiotinyleerd humaan D-ghreline gerichte in-vitro-RNA-selectie uitgevoerd. Een verrijkte populatie van dsDNA-moleculen werd gekloneerd en gesequentieerd. Het resultaat van de sequentieanalyse is weergegeven in Fig. 1.

Alle sequenties bevatten het ghrelinebindende motief 15 A (25 nucleotiden) van de bekende ghrelinebindende sequentie SOT-C (Blltrc; zie octrooiaanvrage WO 2004/013274 A2) . Slechts in vier van deze 23 klonen is motief A meer gelegen aan het 3'-ige uiteinde van de sequentie. In 19 sequenties is motief A gelegen aan het 20 5'-ige uiteinde van de klonen. Het aanvullende motief dat motief D wordt genoemd is gelegen aan het 3'-ige uiteinde van motief A.

Bindinqskarakteristieken van de sequenties

De 15 klonen (Fig. 1) die variaties op verschillende 25 posities vertonen werden uitgekozen voor vergelij kingsexperimenten bij 37°C met behulp van het in Voorbeeld 2 beschreven "competitieassay". Als referentie werd het radioactief gelabelde aptameer SOT-C (Blltrc) gebruikt. Verscheidene kandidaten bonden sterker aan D- 30 ghreline dan SOT-C (Blltrc), hetzij door een lagere KD of een hogere hoeveelheid actieve conformatie, waartussen niet kan worden gedifferentieerd met het "competitieassay". De klonen MS-P2-G2, MS-P2-D2, MS-P2-A2, MS-P2-H3 leken een betere binding te hebben dan de 35 controlekloon SOT-C (Blltrc), de klonen MS-P2-E1, MS-P2-Bl, MS-P2-F1, MS-P2-C3, MS-P2-C2, MS-P2-A4 en MS-P2-B2 vertoonden veel betere binding. Vergelijkbare 57 bindingsresultaten in vergelijking met SOT-C (Blltrc) konden worden vastgesteld voor de klonen MS-P2-E3, MS-P2-A3, MS-P2-H2 en MS-P2-D1 (Fig. 2: zie voor de evaluatie

Fig. 1) . Derhalve werden de beste klonen getest op hun 5 activiteit als aptameren in het evenwichtsassay en als Spiegelmeren in een celkweekassay bij 37°C (protocollen zie Voorbeeld 2). De resultaten zijn opgesomd in Fig. 1. De klonen MS-P2-D2, MS-P2-F1, MS-P2-C2, MS-P2-C2, MS-P2-A4 en MS-P2-B2 werden gemeten bij 37°C in het evenwichtsassay 10 met een Kd van 22-34 nM (ongeveer 60% actieve moleculen) en IC5o-waarden van 3,0-8,0 nM konden worden waargenomen in celkweekexperimenten bij 37 °C. SOT-C (Blltrc) gaf, ter vergelijking, een IC50 van 20 nM bij 37°C, en een KD van 100 nM (47% actieve moleculen) bij 37°C (zoals beschreven 15 in octrooiaanvrage W02004/013274 A2 is de IC50 van SOT-C bij kamertemperatuur ongeveer 5 nM) . De resultaten geven aan dat de biologische activiteit van de Spiegelmeren MS-P2-F1, MS-P2-C2 en MS-P2-D2 bij 37°C zelfs ongeveer vijf maal zo goed zou kunnen zijn als die van SOT-C (Blltrc) . 20 Voor verdere inkortingsexperimenten werd kloon MS-P2-F1 (IC50 van 4,0 nM) uitgekozen (zie Fig. 12 voor een voorspelling van de secundaire structuur).

Er zij begrepen dat de in Fig. 1 weergegeven sequenties nucleïnezuren zijn volgens de onderhavige 25 uitvinding, evenals de ingekorte versies daarvan die nog steeds in staat zijn aan het doelwit te binden.

VOORBEELD 2: Bindinqskarakteriserinq van de sequenties 30 2.1 Vergelijking van radioactief gelabelde aptameren met behulp van het "evenwichtsbindingsassay"

De meeste van de hierin beschreven klonen en meer in het bijzonder de in Figuur 1 opgenoemde klonen werden als radioactief gelabelde aptameren (D-RNA) vergeleken met 35 betrekking tot hun bindingsgedrag met gebiotinyleerd humaan D-ghreline, met behulp van het "evenwichtsbindingsassay".

58

Een vergelijking van het bindingsgedrag van de moleculen ten opzichte van humaan D-ghreline werd uitgevoerd. Voor dit doel werden de aangegeven aptameren met behulp van standaardwerkwijzen gesynthetiseerd als 5 ingekorte aptameren (zonder primerbindingsplaatsen) zoals weergegeven in Figuur 1.

Vervolgens werden de aptameersequenties aan het 5'-ige uiteinde radioactief gelabeld met γ-32Ρ-ΑΤΡ met behulp van het volgende protocol.

10

Component Eindconcentratie

Oligonucleotide 5 μΜ T4 Forward Reaction Buffer (Invitrogen) lx T4 Polynucleotide Kinase (Invitrogen) 10 U/10 plreactievoiume [ Y“ P]-ATP 1 μ1/10 μΐ react ievolume

Het reactiemengsel werd 1 h geïncubeerd bij 37 °C. Vervolgens werden de radioactief gelabelde aptameren op gel gezuiverd. 2-5 pmol van de radioactief gelabelde RNA's 15 werd 3 min bij 95°C gedenatureerd in selectiebuffer (volgens de fysiologische omstandigheden in humaan bloed: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM KC1, pH op 7,4 gebracht bij 37°C) zonder Ca++ en Mg++, gevouwen door toevoeging van deze ionen tot een concentratie van 1 mM bij 37°C, en 1 uur bij 20 37°C geïncubeerd met gebiotinyleerd humaan D-ghreline in concentraties van 0,4 tot 3000 nM. Vervolgens werd een constante hoeveelheid NeutrAvidin-agarose toegevoegd als matrix en werd het RNArpeptide-complex nog 30 min geschud bij 37°C. De matrix met gebonden peptide liet men 25 vervolgens sedimenteren, het supernatant werd verwijderd, de matrix werd gewassen met 100 μΐ selectiebuf fer en het verschil tussen geboden en ongebonden RNA werd bepaald door middel van meting van de radioactiviteit met behulp van een Beekman Coulter. Van de berekende getallen werd de 30 controle (0 nM gebiotinyleerd humaan D-ghreline) afgetrokken als achtergrond. De evenwichtsconstanten 59 werden berekend met behulp van het programma "GraFIT" (Versie 4.0.10, Erithacus Software Ltd., Surrey, UK).

2.2. Vergelijking van aptameren met behulp van competitieassay 5 Om de klonen te vergelijken met de reeds bekende

Ghrelinebindende sequentie SOT-C (Blltrc; zie

octrooiaanvrage W02004/013274 A2) werd SOT-C

gesynthetiseerd als aptameer (D-RNA) volgens standaardwerkwijzen zoals hierin beschreven (Voorbeeld 4). 10 De aptameersequentie werd aan het 51-ige uiteinde radioactief gelabeld met γ-32Ρ-ΑΤΡ volgens standaardwerkwijzen zoals hierin beschreven.

Radioactief gelabeld SOT-C en de geïdentificeerde klonen (D-RNA) werden bereid zoals beschreven voor het 15 evenwichtsassay. Het assay werd uitgevoerd bij een peptideconcentratie (gebiotinyleerd humaan D-ghreline) van 20 nM. Vervolgens werden equimolaire hoeveelheden van radioactief gelabeld SOT-C en twee verschillende concentraties (40 nM en 200 nM) van de aptameren getest 20 (De resultaten zijn weergegeven in Fig. 2). Het assay werd uitgevoerd zoals het evenwichtsassay.

2.3 Remming van qhreline-geïnduceerde calciumafgifte door ghrelinebindende Spiegelmeren

Functionele karakterisering van ghrelinebindende 25 Spiegelmeren is uitgevoerd in een cellulair assaysysteem waarin de wisselwerking van humaan (L-)ghreline en de humane groeihormoonsecretagoogreceptor (GHS-R) werd gevolgd. De intracellulaire calciumafgifte die het gevolg is van receptor-ligand-wisselwerking wordt zichtbaar 30 gemaakt met behulp van een fluorescente calciumindicator.

Stabiel getransfecteerde CHO-cellen die de humane ghrelinereceptor (GHS-Rla) tot expressie brengen (verkregen van Euroscreen, Gosselies, België) worden met 5-7xl04 cellen per putje geïnoculeerd in een zwarte 96-35 putsplaat met doorzichtige bodem (Greiner) en overnacht gekweekt bij 37 °C en 5% C02 in UltraCHO-medium (Cambrex) 60 met 100 eenheden/ml penicilline, 100 ug/ml streptomycine, 400 pg/ml geneticine en 2,5 pg/ml fungizone.

Voorafgaand aan belading met de calciumindicatorkleurstof fluo-4 worden de cellen eenmaal 5 gewassen met 200 μΐ CHO-U+. Vervolgens wordt 50 μΐ van de indicatorkleurstofoplossing (10 μΜ fluo-4 (Molecular Probes), 0,08% pluronic 127 (Molecular Probes) in CH0-U+) toegevoegd en worden de cellenöO min geïncubeerd bij 37°C. Daarna worden de cellen driemaal gewassen met 180 μΐ CHO-10 U+. Tot slot wordt 90 μΐ CH0-U+ toegevoegd per putje.

Variabele hoeveelheden Spiegelmeer worden tezamen met humaan (L-)ghreline (gekocht van Bachem) in UltraCHO-medium met 5 mM probenecid en 20 mM HEPES (CHO-U+) 15 tot 60 min bij kamertemperatuur of bij 37°C geïncubeerd in een 15 0,2 ml laag-profiel-96-putsplaat. Als controle worden monsters met alleen peptide (maximale calciumafgifte) en monsters zonder peptide (minimale calciumafgifte) geanalyseerd. In deze stimulatieoplossingen hebben het peptide en het Spiegelmeer (indien toegevoegd) een 10 maal 20 zo hoge concentratie als in het assay.

Voor de detectie van calciumafgifte wordt de stimulatieoplossing toegevoegd aan de cellen (10 μΐ/putje), en wordt de verandering an het fluorescentiesignaal gevolgd. Meting van 25 fluorescentiesignalen wordt uitgevoerd met een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 520 nm in een Fluostar Optima multidetectieplaatlezer (BMG), voorzien van injectiepompen.

Voor parallelle meting van verscheidene monsters 30 worden putjes van één (overdwarse) rij van een 96-putsplaat tezamen gemeten. Eerst worden drie metingen met een interval van 4 sec uitgevoerd voor bepaling van de basislijn. Vervolgens wordt de meting onderbroken en wordt de plaat uit het instrument verwijderd. Met behulp van een 35 meerkanaalspipet wordt 10 μΐ stimulatieoplossing toegevoegd aan de putjes, waarna de plaat weer in het instrument wordt geplaatst en de meting wordt hervat. In 61 totaal worden 20 metingen met tijdsintervallen van 4 seconden uitgevoerd.

Voor elk putje wordt het verschil tussen de maximale fluorescentie en de achtergrondwaarde bepaald en uitgezet 5 tegen de concentratie aan humaan (L-)ghreline (geoctanoyleerd) of, in de experimenten met betrekking tot de remming van calciumafgifte door Spiegelmeren, tegen de concentratie aan Spiegelmeer, waardoor het mogelijk wordt de halfmaximale remmingsconstante (IC50) te bepalen.

10 2.4 Oppervlakteplasmonresonantie- (SPR) meting

Aptameerbinding aan gebiotinyleerd humaan D-ghreline werd gekarakteriseerd door middel van SPR-real-time-kinetiekanalyse met behulp van een BIAcore 2000 instrument. (BIAcore AB, Uppsala, Zweden) zoals

15 beschreven. 100 RU en (Doorstroomcel 2) en 300 RU

(Doorstroomcel 3) aan C-terminaal gebiotintyleerd peptide werd geïmmobiliseerd op een met Streptavidine bedekte sensorchip (Biacore AB, Freiburg, Duitsland) em monsters met een concentratie van 0,1 μΜ tot 1 μΜ werden 20 geïnjecteerd met behulp van het Kinject-commando waarmee een associatietijd van 360 s en een dissociatietijd van 360 s werd gedefinieerd. Doorstroomcel 1 werd gebruikt als buffer-en-dextranmatrix-controle (Biacore SA-Chip- oppervlak) terwijl op Doorstroomcel 4 onspecifiek D-25 peptide werd geïmmobiliseerd om onspecifieke binding van het aptameer te bepalen. Reacties werden uitgevoerd bij 37°C. Voor data-analyse met de BIAevaluation 3.0 software (BIAcore AB, Uppsala, Zweden) gebruikten we het Langmuir 1:1 stoichiometrisch fittingsalgoritme.

30 VOORBEELD 3: Definitie van ghrelinebindende

Spiegelmeermotieven

3.1 Inkorting van SOT-D-OOO

3.1.2. Terminale inkorting van eerder geselecteerde 35 Spiegelmeer SOT-D-OOO

De ghrelinebindende Spiegelmeren die zijn weergegeven in Fig. 3 zijn eerder verkregen, zoals reeds beschreven in • a 62 octrooiaanvrage W02004/013274 A2. Uit voorspellingen van de secundaire structuur (conformaties met minimale vrije energie [Hofacker et al., 1994, Monatsh. Chem 125:167-188]) blijkt dat de mogelijkheid voor canonieke 5 intramoleculaire baseparing tussen de 5'-ige en 3'-ige terminus bestaat voor alle Spiegelmeren (Fig. 4-7; onderstreepte basen in Fig. 3) . De aanwezigheid van dergelijke structuurelementen in een Spiegelmeer is mogelijk cruciaal voor correcte vouwing van de actieve 10 driedimensionale structuur, maar voor economische

Spiegelmeersynthese dienen de moleculen zo kort mogelijk j te zijn. Spiegelmeer SOT-D-OOO (een ingekorte versie van j SOT-R04-DR14-F7 zonder primerbindingsplaatsen) werd gekozen als basis voor terminale inkorting daar het de 15 kortste geselecteerde Spiegelmeer is met de mogelijkheid de langste terminale helix te vormen.

Ingekorte varianten van SOT-D-OOO met helixlengtes van acht (SOT-D-108), zeven (SOT-D-100), en zes (SOT-D-104) baseparen, in plaats van tien (Fig. 8), werden 20 gesynthetiseerd en getest in celkweek zoals beschreven in

Voorbeeld 2 (Fig. 9) . SOT-D-104 (39-meer) verloor duidelijk bindingsactiviteit, terwijl SOT-D-100 (41-meer) en -108 (43-meer) de volledige ghreline-antagonistische werking behielden. Variant SOT-D-106, een verdere 25 inkorting van SOT-D-104 waaruit G4 was verwijderd, was vrijwel inacief. Verrassenderwijs kan deze niet-gepaarde G - die aanwezig is in de helix van alle geselecteerde ghrelineSpiegelmeren - niet zomaar worden verwijderd. Hij lijkt zelfs essentieel te zijn voor de ghrelinebinding.

30 3.1.2. Interne deletiemutanten van SOT-D-100 en -108

Bij beschouwing van de gelijkschikking van geselecteerde ghrelinebinders in Fig. 3, lijkt er in alle gelijkgeschikte moleculen direct grenzend aan de terminale helix aan het 5'-ige uiteinde een zeer variabel gebied 35 voor te komen. Om deze klaarblijkelijke variabiliteit te benutten voor verdere inkorting van ghrelinebinders werden de kortste volledig actieve SOT-D-varianten SOT-D-100 en 63 -108 'gebruikt als basis voor verdere inkortigen. In het geval van interne SOT-D-108-varanten werden de betreffende basen eenvoudigweg weggelaten, terwijl zij in de SOT-D-108-varianten werden gesubstitueerd door een flexibele 5 hydrofiele spacer tijdens de synthese. SOT-D-100 en de derivaten SOT-D-101 en -102 daarvan, en de SOT-D-108-derivaten SOT-D_109, -110 en -111, werden vervolgens in celkweek getest zoals beschreven in Voorbeeld 2 (Fig. 9). Zoals weergegeven in Fig. 8, was deletie van twee, maar 10 niet van drie, interne nucleotiden mogelijk zonder activiteitsverlies (SOT-D-101; -102). Daarentegen konden bij substitutie door een spacer (SOT-D-109, -110, -111) drie nucleotiden worden weggelaten. Een optimale plaatsing van de spacer is gerealiseerd in SOT-D-109 (Fig. 10).

15 Modificaties van SOT-D-109 aan het 5'-ige uiteinde met een groep van 4 0 kDa was mogelijk zonder verlies van de ghrelinebindende activiteit (Fig. 11).

3.2. Inkorting van SQT-E

In het navolgende wordt de ghrelinebindende sequentie 20 MS-P2-F1 (Fig. 1 en Fig. 12) die werd gekozen als leidraadsequentie aangeduid als SOT-E.

Uit voorspellingen van de secundaire structuur (conformaties met minimale vrije energie [Hofacker et al., 1994, Monatsh. Chem 125:167-188]) blijkt dat de 25 mogelijkheid voor canonieke intramoleculaire baseparing tussen C30 en G50 bestaat voor Spiegelmeer SOT-E (Fig.

12). In de navolgende worden experimenten beschreven die resulteren in inkorting van Spiegelmeer SOT-E. Alle ingekorte versies van Spiegelmeer SOT-E werden getest met 30 betrekking tot hun activiteit in celkweek (zie Voorbeeld 2) .

3.2.1. Terminale inkorting van Spiegelmeer SOT-E

De zes nucleotiden aan het 3'-ige uiteinde lijken niet te zijn gehybridiseerd aan andere gedeelten van het 35 molecuul. Daarentegen zijn de nucleotiden aan het 5'-ige uiteinde mogelijk gedeeltelijk gepaard. Verrassenderwijs kan het 3'-ige uiteinde niet worden ingekort zonder 64 vermindering van de binding (Spiegelmeer SOT-E-012), terwijl Spiegelmeer SOT-E-014 (inkorting van zes nucleotiden aan het 5'-ige uiteinde) de volledige ghreline-antaginistische activiteit behield (Fig. 13).

5 3.2.2. Interne deletiemutanten van Spiegelmeer SOT-E

Bij . beschouwing van de gelijkschikking van geselecteerde ghrelinebinders MS-P2-E3, MS-P2-G2, MS-P2- D2, MS-P2-A3, MS-P2E1, MS-P2-B1, MS-P2-C3, MS-P2-C2, MS- P2-H2, MS-P2-A4 en SOT-E (sequentiefamilie I) in Fig. 1 10 lijkt er in alle gelijkgeschikte moleculen aan het einde en direct grenzend aan de helix (G36-C43 in SOT-E) een variabel gebied voor te komen. De voorspelling van de secundaire structuur van Spiegelmeer SOT-E toont een lus van vier nucleotiden (A38-U41; Fig. 12) . Om deze 15 klaarblijkelijke variabiliteit te benutten voor verdere inkorting van ghrelinebinders werden eerst de betreffende basen van Spiegelmeer SOT-E vervangen door een flexibele hydrofobe spacer tijdens synthese. Deletie van zes (U37-A42; SOT-E-011) nucleotiden, maar niet van acht (G36-C43; 20 SOT-E-008) nucleotiden was mogelijk zonder verlies aan activiteit. De combinatie van de resultaten van inkorting aan het 5'-ige uitiende (G1-A6) en de substitutie van zes nucleotiden (U37-A42) door flexibele hydrofiele spacer leidt tot het 44 nucleotiden bevattende Spiegelmeer SOT-E-25 019 (Fig. 14) dat in celkweek een identieke IC50 vertoont als het 56 nucleotiden bevattende Spiegelmeer SOT-E (Fig.

12) .

3.2.2. Herschikking van sequentieseqmenten in SOT-E- 019 30 De sequentiefamilie II vertegenwoordigd door de sequenties MS-P2-A2, MS-P2-H3 en MS-P2-D1 (Fig. 1) vertonen overeenkomsten met sequentiefamilie I (waaronder SOT-E). Deze sequentiehomologie is aangegeven als box A (UAAGACCGAAGGÜAACCAAUCCUAC) in Fig. 1. In sequentiefamilie 35 2 bevindt box A zich meer aan het 3’-ige uiteinde terwijl in sequentiefamilie I box A zich dicht bij het 5'~ige uiteinde bevindt. Op basis van dit resultaat van de in- 65 vitro-selectie en de voorspelling van de secundaire structuur van Spiegelmeer SOT-E werd een variant van SOT-E-019 ontworpen waarin box A zich bevindt aan het 5'-ige uiteinde. Hiertoe werden de oorspronkelijke 5'-ige en 3'-5 ige uiteinden van SOT-E-019 met een flexibele spacer aan elkaar gekoppeld en werd de lus verwijderd wat resulteerde in nieuwe 5'-ige en 3'-ige uiteinden (variant SOT-E-021; Fig. 15 en 21) . Verrassenderwijs kon voor SOT-E-021 geen activiteitsverlies worden waargenomen. Verdere inkortingen 10 op basis van SOT-E-019 en SOT-E-021 (SOT--E-33 (Fig. 16 en 21) en SOT-E-25 (Fig. 17 en 21) waren niet mogelijk zonder de ghreline-antagonistische werking te verminderen (Fig.

13) .

3.3. Vergelijking van SOT-C, SQT-D-109 en SOT-E

15 Spiegelmeer SOT-E werd gemeten door middel van oppervlakteplasmonresonantie (Voorbeeld 2) in vergelijking met SOT-C en een zesmaal zo lage KD kon worden bepaald (Fig. 18) . Dezelfde verbeterde binding (vijfmaal zo goed) kon worden gedetecteerd in celkweekexperimenten (Voorbeeld 20 2) met Spiegelmeer SOT-E in vergelijking met D-109 (Fig.

19). Om de verblijftijd in het dierlijke lichaam te verbeteren, werd Spiegelmeer SOT-E-109 aan het 5'-ige uiteinde gemodificeerd met een PEG-groep van 40 kDa (SOT-E19-5'-PEG). Spiegelmeer SOT-E19-5'-PEG toonde 25 vergelijkbare resultaten in vergelijking tot SOT-E in celkweekexperimenten (Fig. 19) en vertoonde daarnaast in-vivo-activiteit (Voorbeeld 5; Fig. 22).

3.4. _Def inintie_van_ghrelinebindende

Spieqelmeermotieven 30 Alle moleculen die ghreline binden, in het bijzonder ghreline met een octanoylzijketen zoals hierin gedefinieerd, worden primair gekarakteriseerd door de aanwezigheid van een motief van 25 nucleotiden ("Box A") dat essentieel is voor ghrelinebinding. Sommige van de 25 35 nucleotiden in "Box A" lijken uitwisselbaar te zijn met andere basen (Fig. 20A).

I k 66

Een essentiële noodzaak voor de functionaliteit van "Box A" in een ghrelinebindend Spiegelmeer is de hybridisatie van de 5 3'-terminale nucleotiden van "Box A" (5'-CCUAG) met een complementaire streng met de sequentie 5 5'-GUGAGG, waardoor een helicale structuur wordt gevormd met een niet-parende centraal geplaatste guanosine (Box B). Deletie van deze centrale guanosine in Box B leidt tot significant bindingsverlies ("door Box A gedefinieerde helix", Niet-parende G; Fig. 20A). 3'-ig grenzend aan "Box 10 A" dient de "door Box A gedefinieerde helix" minimaal te zijn verlengd door één, bij voorkeur twee of meer, aanvullende niet gedefinieerde baseparen ("Box Cl" en "Box C2", Fig. 20A).

Aan het 3'-ige uiteinde van "Box B" zijn verdere 15 nucleotiden essentieel voor binding. Aanzienlijke verbetering van binding kan worden bewerkstelligd door nog twee, optimaal vier nucleotiden toe te voegen op deze positie ("Box D", Fig. 20A), resulterend in een Box D met twee, drie, vier, vijf of zes nucleotiden.

20 Aan het 5'-ige uiteinde van "Box A" zijn verdere nucleotiden essentieel voor binding. Ten minste één verder nucleotide (met name U of G) is noodzakelijk voor binding. Aanzienlijke verbetering van binding kan worden bewerkstelligd door nog twee nucleotiden toe te voegen op 25 deze positie ("Box E", Fig. 20A), resulterend in een Box E met één, twee, drie of vier nucleotiden.

Indien de boxen D en E worden gekoppeld via een flexibele hydrofiel spacer kan deze spacer ook op verschillende posities worden geinserteerd (zie Fig. 8; 30 SOT-D-109, SOT-D-110 en SOT-D-111).

Verrassenderwijs zijn de gedefinieerde sequentie-elementen functioneel wanneer "Box Cl" en "Box C2" in plaats van Box D en E aan elkaar zijn gekoppeld met een hydrofiele spacer.

35

Variant 1: 5’- Box Cl -1 BoxB ] - Box D - Spacer -1 Box E -_Box A_-

Box C2 67

Variant 2: 5’- BoxE I -1 Box A | - (Box C2| - Spacer - [Box Cl| -1 Box B ] -

Box D I

5

De in de beschrijving, de conclusies en/of de figuren beschreven kenmerken van de onderhavige uitvinding kunnen zowel afzonderlijk als in elke willekeurige combinatie materiaal vormen voor het realiseren van de uitvinding in 10 verschillende vormen daarvan.

VOORBEELD 4: Chemische synthese van aptameren en

Spiegelmeren

Chemische vaste-fase-synthese 15 Kleinschalige synthese

De aptameren werden geproduceerd door middel van vaste-fase-synthese met een ABI 394 synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) met behulp van 2'TBDMS -RNA - fosforamidietchemie (M.J. Damha, K.K. Ogilvie, 20 Methods in Molecular Biologie, Vol. 20 Protocols for oligonucleotides and analogs, red. S. Agrawal, pp. 81-114, Humana Press Inc., 1993). D-rA(N-Bz)-, D-rC(Ac)-, D-rG(N-ibu)-, D-rU- en hexaethyleenglycolfosforamidieten werden gekocht van ChemGenes, Wilmington, MA. De aptameren werden 25 gezuiverd door middel van gelelektroforese.

De ongemodificeerde Spiegelmeren (zonder PEGylering) werden geproduceerd door middel van vaste-fase-synthese met een ABI 394 synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) met behulp van 2'TBDMS - RNA 30 fosforamidietchemie (M.J. Damha, K.K. Ogilvie, Methods in Molecular Biologie, Vol. 20 Protocols for oligonucleotides and analogs, red. S. Agrawal, pp. 81-114, Humana Press Inc., 1993). L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, L-rU-en hexaethyleenglycolfosforamidieten werden gekocht van 35 ChemGenes, Wilmington, MA. De aptameren werden gezuiverd door middel van gelelektroforese.

Grootschalige synthese plus modificatie 68

Het gemodificeerde Spiegelmeer SOT-E-19 werd geproduceerd door middel van vaste-fase-synthese met een AktaPilotlOO synthesizer (Amersham Biosciences; General Electric Healthcare, Freiburg) met behulp van 2'TBDMS -5 RNA - fosforamidietchemie (M.J. Damha, K.K. Ogilvie, Methods in Molecular Biologie, Vol. 20 Protocols for oligonucleotides and analogs, red. S. Agrawal, pp. 81-114, Humana Press Inc., 1993). L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, L-rU- en hexaethyleenglycolfosforamidieten werden 10 gekocht van ChemGenes, Wilmington, MA. De synthese werd gestart op met L-riboC gemodificeerd CPG met een poriegrootte van 1000 A (Link Technology, Glasgow, UK) . Voor koppeling (15 min per cyclus) werd 0,3 Μ benzothiotetrazool (CMS-Chemical, Abingdon, UK) in 15 acetonitril, en 3,5 equivalenten van de betreffende 0,1 M fosforamidietoplossing in acetonitril gebruikt. De aminogroep aan het 5'-ige uiteinde van het Spiegelmeer werd aangehecht door koppeling van aminohexylfosforamidiet (ChemGenes). Een oxidatie-capping-cyclus werd gebruikt. 20 Verdere standaardoplosmiddelen en reagentia voor oligonucleotidesynthese werden gekocht van Biosolve (Valkenswaard, NL) . Het Spiegelmeer werd DMT-ON gesynthetiseerd; na ontscherming werd het opgezuiverd door middel van preparatieve RP-HPLC (Wincott F. et al., 1995, 25 Nucleic Acids Res. 23:2677) met behulp van Sourcel5RPC-medium (Amersham). De 5'DMT-groep werd verwijderd met 80% azijnzuur (30 min bij kamertemperatuur). Vervolgens werd waterige 2 M NaOAc-oplossing toegevoegd en werd het Spiegelmeer ontzout door middel van tangentiële-30 doorstroom-filtratie met behulp van een 5 K geregenereerde cellulosemembraan (Millipore, Bedford, MA).

PEGylering

Ter vertraging van renale ruiming in vivo werd Spiegelmeer SOT-E-19 aan het 5'-ige uiteinde covalent 35 gekoppeld aan een polyethyleenglycolgroep (PEG) van 40 kDa. Met een Spiegelmeer met een op dergelijke wijze verhoogde molecuulmassa kan een aanzienlijk langer 69 verblijf in plasma en derhalve langere werking worden bewerkstelligd.

Voor PEGylering (zie Europese octrooiaanvrage EP 1 306 382) werd het gezuiverde 5' -amino-gemodificeerde 5 Spiegelmeer opgelost in een mengsel van H20 (2,5 ml), DMF (5 ml), en buffer A (5 ml; bereid door citroenzuur·H20 [7 g] , boorzuur [3,54 g] , fosforzuur [2,26 ml] en 1 M NaOH [343 ml] te mengen en water toe te voegen tot een eindvolume van 1 1; de pH werd op 8,4 gebracht met 1 M 10 HC1).

De pH van de Spiegelmeeroplossing werd op 8,4 gebracht met 1 M NaOH. Vervolgens werd PEG-NHS-ester van 40 kDa (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) toegevoegd bij 37°C elke 30 min in vier porties van 0,6 equivalenten 15 totdat een maximale opbrengst van 75 tot 85% was bereikt. De pH van het reactiemengsel werd op 8-8,5 gehouden met 1 M NaOH tijdens toevoeging van de PEG-NHS-ester.

Het reactiemengsel werd gemengd met 4 ml

ureumoplossing (8 M), 4 ml buffer A, en 4 ml buffer B (0,1 20 M triethylammoniumacetaat in H20) en 15 min bij 95°C

verwarmd. Het gePEGyleerde Spiegelmeer werd vervolgens gezuiverd door middel van RP-HPLC met Source 15 RPC-medium (Amersham), met gebruikmaking van een acetonitrilgradiënt (buffer B; buffer C: 0,1 M triethylammoniumacetaat in 25 acetonitril). Overmaat PEG elueerde bij 5% buffer C, gePEGyleerd Spiegelmeer bij 10-15% buffer C.

Productfracties met een zuiverheid van >95% (bepaald door middel van HPLC) werden gecombineerd en gemengd met 40 ml 3 M NaOAC. Het gePEGyleerde Spiegelmeer werd ontzout door 30 middel van tangentiële-doorstroom-filtratie (5 K

geregenereerde cellulosemembraan, Millipore, Bedford, MA).

VOORBEELD 5; Remming van de qroeihormoonafgifte na toediening van exogeen ghreline, door anti-qhreline-35 Spiegelmeer SOT-E19-51-PEG

Het is bekend dat de toediening van exogeen ghreline de afgifte van groeihormoon (GH) induceert in ratten.

70

Voorafgaande toediening van ghrelinebindende Spiegelmeren onderdrukt de ghreline-geïnduceerde afgifte van GH.

Sprague-Dawley-ratten kregen 7 dagen de gelegenheid aan hun nieuwe omgeving te wennen. De experimentele opzet 5 bestond uit vijf groepen met elk vijf dieren: één positieve controlegroep en vier verschillende doses aan Spiegelmeer SOT-E19-5'-PEG. Alle dieren werden voor de duur van het experiment verdoofd met Ketamine/Xylazine en ontvingen twee intraveneuze injecties in de staartader. De 10 eerste injectie werd 30 minuten voor de tweede injectie toegediend en bestond uit PBS (positieve controlegroep) of de in Fig. 22 aangegeven doses Spiegelmeer SOT-E19-5'-PEG. De tweede toediening bestond uit 3 nmol rattenghreline voor alle dieren en definieerde het tijdstip 0 van het 15 experiment. Voorafgaand aan de tweede toediening werd een eerste bloedmonster afgenomen uit de orbitale sinus. Voorts werden monsters genomen na 5, 15, 30 en 45 minuten na toediening van rattenghreline. De resulterende plasmamonsters werden op groeihormoonconcentraties 20 geanalyseerd met behulp van een commercieel enzymatisch immunoassaysysteem volgens de instructies van de fabrikant (Groeihormoon, Rat, Biotrak Assay Kit, RPN2561, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg).

Zoals zichtbaar is in Fig. 22 wordt de afgifte van GH 25 krachtig gestimuleerd door de injectie van rattenghreline, maar kan zij worden geremd door de voorafgaande toediening van SOT-E19-5'-PEG. Maximale remming wordt bereikt bij 75 nmol SOT-E19-5'-PEG/kg lichaamsgewicht. Verdere verhoging van de toegediende dosis tot 150 nmol SOT-E19-5'-PEG/kg 30 lichaamsgewicht onderdrukt de GH-afgifte niet verder. Het resultaat toont de in-vivo-activiteit van het anti-ghreline-Spiegelmeer SOT-E19-5'-PEG.

VOORBEELD 6: Derivaten van SOT-E-19 zonder een 35 interne koppelgroep

Zoals beschreven in Voorbeeld 3 bestaat anti-ghreline-Spiegelmeer SOT-E-19 uit L-nucleotiden en een 71 interne koppelgroep die in het oorspronkelijke SOT-E-molecuul was ingebouwd ter vervanging van 6 nucleotiden. 4 van die 6 nucleotiden vormen een lus in Spiegelmeer SOT-E, de overige 2 nucleotiden (van de zes nucleotiden) kunnen 5 met elkaar hybridiseren (SOT-E, zie Fig. 23, eerste rij, gehybridiseerde nucleotiden zijn onderstreept).

Teneinde zo kort mogelijke derivaten van SOT-E-19 te realiseren zonder interne koppelgroep, werd de koppelgroep gesusbstitueerd door verschillende bouwstenen van 3 10 nucleotiden. Alle derivaten werden gesynthetiseerd als Spiegelmeren (protocol zie Voorbeeld 4) en geanalyseerd in celkweekexperimenten (protocol zie Voorbeeld 2) . Substitutie van de interne koppelgroep van SOT-E-19 zonder verlies aan bindings- en remmingswerkzaamheid (IC50) bleek 15 succesvol met de volgende bouwstenen: ACA (SOT-E-19-L3) en CAA (SOT-E-19-L4). De verschillende derivaten van SOT-E-19 zijn weergegeven in Fig. 23.

VOORBEELD 7: Onderscheiding van octanoylghreline en 20 desoctanoylghreline door qhrelinebindende Spiegelmeren

De karakteristieken van de binding van Spiegelmeer S0T-E19 aan ghreline werden verder geanalyseerd in een competitieassay, gebaseerd op de in Voorbeeld 2 beschreven werkwijze. In deze assays werd het Spiegelmeer geincubeerd 25 met verschillende combinaties van ghrelinepeptiden (octanoyl- en desoctanoylghreline) in de stimuleringsoplossingen voorafgaand aan stimulatie van de cellen.

Het schema van peptidecombinaties en de resultaten 30 van het expressieplasmide met compleet octanoylghreline (humaan ghreline = hu ghreline) zijn samengevat in Fig. 24 (staven genummerd van links naar rechts): zonder octanoylghreline (humaan ghreline = hu ghreline) of met desoctanoylghreline in een eindconcentratie van 300 nM 35 wordt geen stimulering van de cellen gedetecteerd (staven 1 en 2), terwijl octanoylghreline (humaan ghreline = hu ghreline) in een concentratie van 13 nM reeds voldoende is 72 voor het mediëren van calciumafgifte (staaf 3); verdere toevoeging van 300 nM desoctanoylghreline (staaf 4) interfereert niet met de celstimulering, wat aangeeft dat het biologisch inactieve desoctanoylghreline geen 5 receptorantagonist is. De door 3 nM octanoylghreline (humaan ghreline = hu ghreline) gemedieerde calciumafgifte kan worden geremd door een 10-voudige overmaat aan S0T-E19 (staaf 5) , en zelfs de aanwezigheid van desoctanoylghreline in een 100-voudige overmaat (300 nM) 10 ten opzichte van octanoylghreline (humaan ghreline = hu ghreline) geeft geen competitie met de remming (staaf 6) . Daarentegen wordt bij een assayconcentratie van 300 nM octanoylghreline en 30 nM Spiegelmeer een verhoogde calciumafgifte waargenomen (staaf 7), wat erop duidt dat 15 onder assayomstandigheden een stimuleringsverhoging kan worden bewerkstelligd met octanoylghreline (humaan ghreline = hu ghreline). Dit experiment toont aan dat SOT-E19 specifiek onderscheidt maakt tussen ghreline in de octanoylvorm en de desoctanoylvorm.

20 De bindingskarakteristieken van Spiegelmeer NOX-B11 aan ghreline (bindend aan octanoylghreline maar niet of zwak aan desoctanoylghreline) zijn vergelijkbaar met SOT-E-19 (hetzelfde experiment werd eerder uitgevoerd zoals beschreven in W02005/049828).

25 Omdat beide moleculen een hoge structuurovereenkomst hebben (zie Voorbeeld 3) die hoofdzakelijk is gebaseerd op Box A, ondersteunen de resultaten de aanname dat moteif A eseentieel is voor de hoge specificiteit van de nucleïnezuurmoleculen volgens de onderhavige uitvinding 30 voor de geoctanoyleerde vorm van ghreline, speciaal met betrekking tot de vijf aminozuren aan de N-terminus inclusief de octanoylgroep.

VOORBEELD 8: Kwantificering van octanoylghreline met 35 behulp van qhrelinebindende Spiegelmeer NOX-B11

De ghrelinebindende Spiegelmeer N0X-B11 kan worden gebruikt in een assayformat vergelijkbaar met dat van een 73 enzymiminuuriassay (EIA) voor niet-radioactieve kwantificering van geoctanoyleerd humaan en rattenghreline.

Principe 5 In dit assay worden standaarden, controles en onbekend behandeld plasma geïncubeerd in 96-putsmicrotiterplaten die zijn bedekt met ghrelinebindende Spiegelmeer, bijv. Spiegelmeer N0X-B11, die octanoylghreline herkennen aan de N-terminus. Na incubatie 10 en wassen worden de putjes behandeld met een anti-ghreline-antilichaam (eerste antilichaam) of een nucleïnezuur dat aan ghreline bindt aan de C-terminus van ghreline. Dit antilichaam of nucleïnezuur kan al dan niet gelabeld zijn, waarbij een nucleïnezuur bij voorkeur 15 gelabeld zu zijn. Indien het (eerste) antilichaam niet gelabeld is wordt, na incubatie, verwijdering van het (eerste) anti-ghreline-antilichaam en verscheidene wasstappen, een tweede antilichaam (gericht op het Fc-fragment van het eerste antilichaam en gelabeld) 20 toegevoegd. Het label van het tweede antilichaam kan het enzym mierikswortelperoxidase (HRP) zijn. Na incubatie met het tweede antilichaam en verwijdering van de ongebonden fractie worden de putjes geïncubeerd met het HRP-substraat tetramethylbenzidine (TMB). Vervolgens wordt een zure 25 stopoplossing toegevoegd en wordt de mate van enzymatische omzetting bepaald door middel van absorptiemeting bij 450 nm. De gemeten absorptie is recht evenredig met de in het monster aanwezige concentratie octanoylghreline. Een set ghreline-standaarden wordt gebruikt om een standaardcurve 30 van absorptie tegen ghrelineconcentratie te plotten, op basis waarvan de ghrelineconcentratie in de onbekende monsters kan worden berekend.

Protocol

Ten eerste werd een met streptavidine bedekte 96-35 putsplaat (Reacti-Bind Streptavidin Coated High Bind Capacity Black 96-well Plates, Perbio Science, Bonn, Duitsland) driemaal gewassen met PBS-Dulbecco (met Mg2+ en 9 « 74

Ca2+, Biochrom AG, Berlijn, Duitsland) met 0,1% Tween. Elk putje werd 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met 100 μΐ 50 μΜ gebiotinyleerde Spiegelmeer NOX-B11 (opgelost in PBS; SEQ ID NO:72). Na immobilisatie van gebiotinyleerde 5 Spiegelmeer NOX-B11 werd ongebonden Spiegelmeer verwijderd door middel van één wasstap (100 μΐ PBS) . Dit is schematisch weergegeven in Fig. 26A.

Na verwijdering van de wasbuffer werden de stockoplossingen met een gedefinieerde concentratie aan 10 octanoylghreline toegevoegd, waarna 1 uur werd geïncubeerd bij kamertemperatuur. Het supernatant werd verwijderd en de putjes werden eenmaal gewassen (100 μΐ PBS). Dit is schematisch weergegeven in Fig. 26B.

Het anti-ghreline-antilichaam (afkomstig van Phoenix 15 Peptides, Belmont, CA, USA; le ab) werd 1 uur geïncubeerd in blokkeringsoplossing (Phoenix Peptides, Belmont, CA, USA), waarna ongebonden antilichamen werden verwijderd door middel van vijf wasstappen (elk 100 μΐ PBS) . Dit is schematisch weergegeven in Fig. 26C.

20 Om het gebonden anti-ghreline-antilichaam te detecteren werd een tweede antilichaam (Phoenix Peptides, Belmont, CA, USA; 2e ab-HRP) gebruikt dat specifiek het Fc-fragment van het anti-ghreline-antilichaam (le ab) herkent en dat gemodificeerd is met 25 mierikswortelperoxidase. De ongebonden fractie van het tweede antilichaam (2e ab-HRP) werd verwijderd door middel van vijf wasstappen (elk 100 μΐ PBS) . Dit is schematisch weergegeven in Fig. 26D.

Voor kwantificering werd 100 μΐ TMB-substraat 30 (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK) toegevoegd waarna de plaat werd afgesloten en 30 min in het donker werd geïncubeerd. Vervolgens werd 50 ml stopoplossing toegevoegd. De mate van enzymatische omzetting van het substraat werd bepaald door middel van absorptiemeting bij 35 450 nm en het verschil in absorptie-eenheden werd gemeten.

75

Zoals weergegeven in Fig. 25 werd een set ghrelinestandaarden gebruikt om een standaardcurve te plotten van absorptie versus ghrelineconcentratie.

Resultaten 5 De experimentele gegevens tonen aan dat Spiegelmeer N0X-B11 in principe kan worden gebruikt om octanoylghreline te immobiliseren op een concentratieafhankelijke wijze, en derhalve de potentie heeft om te worden gebruikt in een detectieassay van het 10 EIA-type.

De in de beschrijving, de conclusies en/of de figuren beschreven kenmerken van de onderhavige uitvinding kunnen zowel afzonderlijk als in elke willekeurige combinatie materiaal vormen voor het realiseren van de uitvinding in 15 verschillende vormen daarvan.

1 0 3 1 538ü

Claims

1. L-nucleïnezuur, bij voorkeur bindend aan ghreline, met de structuur 10 5'- 1 Box E I - I Box A ~~| - Box C2| - Spacer - |Box Cl| - | Box B 1 - | Box D omvattende een eerste stuk, Box A, een tweede stuk, Box B, een derde stuk, Box Cl, een vierde stuk, Box C2, een 15 vijfde stuk, Box D, een zesde stuk, Box E, en een tweede spacer, "Spacer", waarbij het eerste stuk, Box A, ongeveer 25 opeenvolgende nucleotiden bevat, 20 het tweede stuk, Box B, ongeveer zes tot acht opeenvolgende nucleotiden bevat, een stuk van een aantal nucleotiden aan het 3'-ige uiteinde van het eerste stuk, Box A, hybridiseert met het tweede stuk, Box B, waardoor bij hybridisatie een eerste 25 dubbelstrengsstructuur wordt gevormd, waarbij deze eerste dubbelstrengsstructuur een bobbel bevat, het derde stuk, Box Cl, ten minste één nucleotide bevat en het vierde stuk, Box C2, ten minste één nucleotide 30 bevat, het derde stuk, Box Cl, met zijn 3'-ige uiteinde is gehecht aan het 5'-ige uiteinde van het tweede stuk, Box B, en het vierde stuk, Box C2, met zijn 5'-ige uiteinde is gehecht aan het 3'-ige uiteinde van het eerste stuk, Box 35 A, het vijfde stuk, Box D, ten minste twee opeenvolgende nucleotiden bevat, 1031538 het vijfde stuk, Box D, met zijn 5'-ige uiteinde is gehecht aan het 3'-ige uiteinde van het tweede stuk, Box B, het zesde stuk, Box E, ten minste één nucleotide 5 bevat, het zesde stuk, Box E, met zijn 3'-ige uiteinde is gehecht aan het 5'-ige uiteinde van het eerste stuk, Box A, en het 3'-ige uiteinde van het vierde stuk, Box C2, 10 is gehecht aan het 5'-ige uiteinde van het derde stuk, Box Cl, door de tweede spacer.

2. Nucleïnezuur volgens conclusie 1, waarbij de dubbelstrengsstructuur wordt gevormd door de vijf 3'-15 terminale opeenvolgende nucleotiden van het eerste stuk, Box A, en een deel van of alle nucleotiden van het tweede stuk, Box B, bij voorkeur de zes tot acht opeenvolgende nucleotiden van het tweede stuk, Box B.

3. Nucleïnezuur volgens conclusie 1 of 2, waarbij de bobbel wordt gevormd door 1 tot 3 nucleotiden van het tweede stuk, Box B, bij voorkeur door 1 nucleotide van het tweede stuk, Box B, die niet baseparen met met de vijf 3'-terminale opeenvolgende nucleotiden van het eerste stuk, 25 Box A.

4. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 3, waarbij de bobbel wordt gevormd door een niet-baseparend purine, waarbij het purine bij voorkeur een 30 guanosine is.

5. UAAX1X2CCGAAX3GUAX4CCAAUCCUX5C; waarbij

5. CA (X)n3' waarbij n = 4.

5. Nucleïnezuur volgens conclusie 4, waarbij het niet-baseparende purine wordt verschaft door het tweede stuk, Box B. 35

5 -CONCLUSIES-

6. Nucleïnezuur volgens conclusie 6, waarbij het derde stuk, Box Cl, en het vierde stuk, Box C2, in staat zijn tot hybridisatie, waarbij na hybridisatie een tweede dubbelstrengsstructuur wordt gevormd.

7. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 5 6, waarbij de eerste dubbelstrengsstructuur een eerste helicale structuur vormt.

8. Nucleïnezuur volgens conclusie 6, waarbij de tweede dubbelstrengsstructuur een tweede helicale 10 structuur vormt.

9. Nucleïnezuur volgens conclusie 8, waarbij de tweede helicale structuur een helix of een helixachtige structuur is die 1 tot 10 baseparen bevat, bij voorkeur 1 15 tot 3 baseparen en meer bij voorkeur 2 tot 3 baseparen.

10. Nucleïnezuur volgens conclusie 8 of 9, waarbij de eerste helicale structuur wordt verlengd door de tweede helicale structuur. 20

11. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 10, waarbij het derde stuk, Box Cl, ongeveer 1 tot 10 opeenvolgende nucleotiden bevat, bij voorkeur 1 tot 3 opeenvolgende nucleotiden en meer bij voorkeur 2 of 3 25 opeenvolgende nucleotiden.

12. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 11, waarbij het vierde stuk, Box C2, ongeveer 1 tot 10 opeenvolgende nucleotiden bevat, bij voorkeur 1 tot 3 30 opeenvolgende nucleotiden en meer bij voorkeur 2 of 3 opeenvolgende nucleotiden.

13. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 12, waarbij het vijfde stuk, Box D, de sequentie 5' -CA 35 bevat.

14. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 13, waarbij het vijfde stuk. Box D, een aantal opeenvolgende nucleotiden bevat, waarbij het aantal is gekozen uit de groep bestaande uit twee, drie, vier, vijf 5 en zes opeenvolgende nucleotiden.

15. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 14, waarbij het vijfde stuk, Box D, een sequentie bevat van 10 5'CA(X)n3' waarbij X elk nucleotide kan zijn, bij voorkeur gekozen uit de groep omvattende A, G, T, C, U en I, 15 en waarbij n een heel getal is gekozen uit de groep bestaande uit 0, 1, 2, 3 en 4.

16. Nucleïnezuur volgens conclusie 17, waarbij het vijfde stuk, Box D, bestaat uit de sequentie 20

17. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 16, waarbij het zesde stuk, Box E, ongeveer 1 tot 10 opeenvolgende nucleotiden bevat, bij voorkeur 1 tot 4 opeenvolgende nucleotiden, en meer bij voorkeur 3 opeenvolgende nucleotiden. 30

18. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 17, waarbij ten minste één van de nucleotiden van het zesde stuk, Box E, is gekozen uit de groep bestaande uit U en G. 35

19. Nucleïnezuur volgens conclusie 18, waarbij het U- of G-nucleotide zich onmiddellijk naast het 5'-ige uiteinde van het eerste stuk, Box A, bevindt.

20 Xi = G of A; X2 = A of U; X3 = G of A; X4 = A of C of U; en X5 = G of A, 25 bij voorkeur 5'UAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUAC3' .

20. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 19, waarbij het 3'-ige uiteinde van het vijfde stuk, Box D, is gehecht aan het 5'-ige uiteinde van het zesde stuk, Box E, door een eerste spacer.

21. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 20, waarbij de eerste en de tweede spacer elk afzonderlijk en onafhankelijk van elkaar zijn gekozen uit de groep omvattende hydrofiele spacers.

22. Nucleïnezuur volgens conclusie 21, waarbij de hydrofiele spacer is gekozen uit de groep omvattende nucleïnezuurspacers en niet-nucleïnezuurspacers.

23. Nucleïnezuur volgens conclusie 22, waarbij de 20 eerste spacer een nucleïnezuurspacer is die ongeveer 1 tot 20 opeenvolgende nucleotiden bevat, bij voorkeur 1 tot 5 opeenvolgende nucleotiden en meer bij voorkeur 2 opeenvolgende nucleotiden.

24. Nucleïnezuur volgens conclusie 22, waarbij de tweede spacer een nucleïnezuurspacer is die ongeveer 3 tot 20 opeenvolgende nucleotiden bevat, bij voorkeur 3 tot 5 opeenvolgende nucleotiden en meer bij voorkeur 3 opeenvolgende nucleotiden. 30

25. Nucleïnezuur volgens conclusie 24, waarbij de tweede spacer bestaat uit ACA of CAA.

26. Nucleïnezuur volgens conclusie 22, waarbij de 35 spacer een niet-nucleïnezuur is.

27. Nucleïnezuur volgens conclusie 26, waarbij de eerste spacer en/of de tweede spacer ten minste één ethyleenglycolgroep of een veelvoud van dergelijke ethyleenglycolgroepen bevat. 5

28. Nucleïnezuur volgens conclusie 27, waarbij de spacer een molecuulgewicht heeft van ongeveer 172 tot 688 Da, bij voorkeur 344 Da.

29. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 28, waarbij het nucleïnezuur een cyclisch nucleïnezuur is.

30. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 29, waarbij het eerste stuk, Box A, de sequentie bevat van 15

31. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 29, waarbij het eerste stuk, Box A, de sequentie bevat van 30 5'ÖAAX1X2CCGAAX3GUAX4CCAUUCCUX5C (SEQ ID NO: 3) ; waarbij

32. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 5 31, in het bijzonder conclusie 30 of 31, waarbij het tweede stuk, Box B, de sequentie 5'GUGAGG3' bevat.

33. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 28, 30 en 31, waarbij de sequentie van het nucleïnezuur de 10 sequentie volgens SEQ ID NO: 39 of SEQ ID NO: 51 bevat.

34. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 28, 30 en 31, waarbij de sequentie van het nucleïnezuur de sequentie volgens SEQ ID NO: 42 bevat. 15

35 Xi = G of A; X2 = A of U; X3 = G of A; X4 = A of C of Ü; en X5 = G of A.

36. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 35, waarbij het nucleïnezuur in staat is ghreline, bij voorkeur humaan ghreline, te binden. 5

37. Nucleïnezuur volgens conclusie 36, waarbij het ghreline een aminozuursequentie heeft volgens SEQ ID NO: 1.

38. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 37, waarbij het nucleïnezuur een modificatie bevat.

38 SOT-E-14_

39. Nucleïnezuur volgens conclusie 38, waarbij de modificatie is gekozen uit de groep bestaande uit HES- 15 groepen en PEG-groepen.

39. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 28, 30 en 31, waarbij de sequentie van het nucleïnezuur is gekozen uit de groep omvattende de sequenties volgens_ _SEQ ID NO:__interne referentie_ _43__SOT-E19-L_ _44__SOT-E19-L1_ _45__SOT-E19-L2_ _46__SOT-E19-L3_ _ 47__SOT-E19-L4_ _ 48__SOT-E19-L5_ _49__SOT-E19-L6_ j _50_ SOT-E19-L7_ _ 5__MS-P2-E3_ __6__MS-P2-G2_ _7__MS-P2-D2_ _8__MS-P2-A3_ _9___MS-P2-E1_ _10__MS-P2-B1_ _11__MS-P2-F1_ _12_ MS-P2-C3_ _13_____MS-P2-C2_ _14___MS-P2-H2_ _15__MS-P2-A4_ _16__MS-P2-B2_ _33__SOT-E of M5-P2-F1_ _34__S0T-E-02_ _35__SOT-E-09_ _36__SOT-E-11_ _37__SOT-E-12_

40. Nucleïnezuur volgens conclusie 39, waarbij de modificatie een PEG-groep is bestaande uit een onvertakte of vertakte PEG, waarbij het molecuulgewicht van de PEG- 20 groep ongeveer 20 tot 120 kD, meer bij voorkeur van ongeveer 30 tot 80 kD, en meest bij voorkeur van ongeveer 40 kD is.

41. Nucleïnezuur volgens conclusie 39, waarbij de 25 modificatie een HES-groep is, met bij voorkeur een molecuulgewicht van ongeveer 10 tot 130 kD, meer bij voorkeur van ongeveer 30 tot 80 kD, en meest bij voorkeur van ongeveer 50 kD.

42. Nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 41, waarbij het nucleïnezuur volledig uit L-nucleotiden bestaat.

43. Farmaceutisch preparaat dat een nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 42 en eventueel een ander bestanddeel bevat, waarbij het andere bestanddeel is gekozen uit de groep bestaande uit farmaceutisch aanvaardbare excipiënten en farmaceutisch actieve 10 middelen.

44. Gebruik van een nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 42 voor de bereiding van een geneesmiddel. 15

45. Gebruik van een nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 42 voor de bereiding van een diagnostisch middel.

46. Gebruik volgens conclusie 44, waarbij het geneesmiddel bestemd is voor de behandeling en/of preventie van een ziekte of aandoening gekozen uit de groep omvattende zwaarlijvigheid, eetstoornissen, diabetes, glucosemetabolismestoornissen, tumor, bloeddruk- 25 stoornissen, cardiovasculaire ziekten, acromegalie en regulering van energiebalans, eetlust, lichaamsgewicht.

47. Gebruik volgens conclusie 44, waarbij het geneesmiddel bestemd is voor de behandeling en/of 30 preventie van een ziekte of aandoening gekozen uit de groep omvattende gastro-intestinale ziekten.

48. Complex dat ghreline en een nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 42 bevat, waarbij het complex 35 bij voorkeur een kristallijn complex is.

49. Gebruik van een nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 42 voor de detectie van ghreline.

50. Werkwijze voor het screenen van een 5 ghrelineantagonist of een ghrelineagonist, die de volgende stappen omvat: het verschaffen van een kandidaatghrelineantagonist en/of een kandidaatghrelineagonist, het verschaffen van een nucleïnezuur volgens één van 10 de conclusies 1 tot 42, het verschaffen van een testsysteem dat een signaal verschaft in aanwezigheid van een ghrelineantagonist en/of een ghrelineagonist, en het bepalen of de kandidaatghrelineantagonist een 15 ghrelineantagonist is en/of of de kandidaat- ghrelineagonist een ghrelineagonist is.

51. Werkwijze voor het screenen van een ghrelineagonist of een ghrelineantagonist, die de volgende 20 stappen omvat: het verschaffen van ghreline geïmmobiliseerd aan een fase, bij voorkeur een vaste fase, het verschaffen van een nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 42, bij voorkeur een nucleïnezuur 25 volgens één van de conclusies 1 tot 42 dat gelabeld is, het toevoegen van een kandidaatghrelineagonist en/of een kandidaatghrelineantagonist, en het bepalen of de kandidaatghrelineagonist een 30 ghrelineagonist is en/of of de kandidaatghreline antagonist een ghrelineantagonist is.

52. Werkwijze volgens conclusie 51, met het kenmerk dat het bepalen zodanig wordt uitgevoerd dat wordt 35 vastgesteld of het nucleïnezuur wordt verdrongen door de kandidaatghrelineagonist of door een kandidaatghrelineantagonist .

53. Kit voor de detectie van ghreline, bevattende een nucleïnezuur volgens één van de conclusies 1 tot 42.

54. Ghrelineantagonist die kan worden verkregen door middel van de werkwijze volgens conclusie 51 of 52.

55. Ghrelineagonist die kan worden verkregen door i middel van de werkwijze volgens conclusie 51 of 52. 10 -o-o-o- 1031538 88 SEQUENCE LISTING <110> NOXXON Pharma AG <120> Ghrelin binding nucleic acids <130> N 10046 PCT <150> EP 05007795.7 <151> 2004-04-08 <160> 72 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> ghrelin <400> 1 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Arg Val Gin Gin Arg Lys 15 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg 20 25 10315383 89 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> MISC_FEATURE <223> ghrelin <400> 2 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys 15 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg 20 25 <210> 3 <211> 25 <212> RNA <213 > Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 3 uaarwccgaa rguahccauu ccurc 25 <210> 4 <211> 25 <212> RNA 90 <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 4 uaagaccgaa gguacccaau ccuac 25 <210> 5 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 5 ggguaagcgu aagaccgaaa guaaccaauc cuaccguaua uacggugagg cagcac 56 <210> 6 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 6 ggguaagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacagugagg cagcac 56 <210> 7 91 <211> 56 <212> RNA <213 > Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400 > 7 ggguaagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac 56 <210> 8 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <22 0 > <221> misc_feature <223> synthetic <400> 8 ggguaagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaucguauc uauggugagg cagcac 56 <210> 9 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> 92 <221> raisc_feature <223 > synthetic <400> 9 ggguaugcau aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac 56 <210> 10 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 10 ggguaugcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac 56 <210> 11 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 11 gggugagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac 56 <210> 12 <211> 56 i i j 93 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc__f eature <223> synthetic <400> 12 ggguguaugu aagaccgaag guaaccaauc cuaccauauc uacggugagg cagcac 56 <210> 13 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <4 O O > 13 gggugugcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccauauc uacggugagg cagcac 56 <210> 14 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <22 0> <221> misc_feature <223> synthetic 94 <400> 14 gggugugcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaucauauc uacggugagg cagcac 56 <210> 15 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 15 gggugvigcgii aagaccgaag guacccaauc cuaccuacna acuggugagg cagcac 56 <210> 16 <211> 55 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 16 gggugacgua agaccgaagg uacccaaucc uaccuuuccu gaggugaggc agcac 55 <210> 17 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial <220> 95 <221> misc_feature <223> synthetic <400> 17 gggugcugug aggcaaaaaa guaaguccga agguaaccaa uccuacagca c 51 <210> 18 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 18 gggugcugug aggcaaugcg uaaguccgaa gguauccaau ccugcagcac 50 <210> 19 <211> 50 <212> RNA <213 > Artificial <220> <221> misc_feature <22 3 > synthet ic <400> 19 ggguguugug aggcaauaag uaaguccgaa gguaaccaau ccugcagcac 50 <210? 20 <211> 47 96 <212 > RNA <213 > Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 20 cgugugaggc aauaaaacuu aaguccgaag guaaccaauc cuacacg 47 <210> 21 <211> 56 <212> RNA <213 > Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <4 00> 21 cgugugaggu aguaaaaaaa aaaaaacgua aauccgaagg uaaccaaucc uacacg 56 <210> 22 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <22 3 > synthetic 97 <400> 22 cgugcgguga ggcaaaaacg uaagaccgaa gguaaccauu ccuacccacg 50 <210> 23 <211> 48 <212> RNA <213 > Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 23 cgugcgguga ggcagacgua agaccgaagg uaaccauucc uacccacg 48 <210> 24 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 24 cggugaggc:a gacguaagac cgaagguaac cauuccuacc g 41 <210> 25 <211> 39 <212> RNA <213 > Artificial 98 <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 25 cggugaggca gauaagaccg aagguaacca uuccuaccg 39 <210> 26 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 26 cggugaggca auaagaccga agguaaccau uccuaccg 38 <210> 27 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 27 ggugaggcag acguaagacc gaagguaacc auuccuacc 39 <210> 28 99 <211> 38 <212> RNA <213 > Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 28 gguaggcaga cguaagaccg aagguaacca uuccuacc 38 <210> 29 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 29 ccggugaggc agacguaaga ccgaagguaa ccauuccuac cgg 43 <210> 30 <211> 40 <212> RNA <213 > Artificial <220> <221> misc_feature 100 <223> synthetic <400> 30 ccggugaggc aguaagaccg aagguaacca uuccuaccgg 40 j i <210> 31 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223 > synthetic <400> 31 ccggugaggc aguaagaccg aagguaacca uuccuaccgg 40 <210> 32 <211> 40 <212> RNA <213 > Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 32 ccggugaggc cguaagaccg aagguaacca uuccuaccgg 40 <210> 33 <211> 56 <212> RNA 101 <213 > Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 33 gggugagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac 56 <210> 34 <211> 49 <212> RNA <213 > Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is S <400> 34 gggugagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccnggug aggcagcac 49 <210> 35 <211> 49 <212 > RNA <213> Artificial <220> 102 <221> misc_feature <223> synthetic <400> 35 cguaagaccg aagguaacca auccuaccgu aucuacggug aggcagcac 49 <210> 36 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n is S <400> 36 gggugagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccgncgg ugaggcagca c 51 <210> 37 <211> 54 <212> RNA <213 > Artificial <220> ; <221> misc_feature 103 <223> synthetic <400> 37 gggugagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cage 54 <210> 38 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 38 gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg uaucuacggu gaggeageae 50 <210> 39 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> N is S 104 <400> 39 gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg ncggugaggc agcac 45 <210> 40 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is S <400> 40 cggugaggca gcacngcgua agaccgaagg uaaccaaucc uaccg 45 <210> 41 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222 > (13)..(13) 105 <223> n is S <400> 41 cggugaggca gcngcguaag accgaaggua accaauccua ccg 43 <210> 42 <211> 43 <212> RNA <213 > Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222 > (31)..(31) <223> n is S <400> 42 gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg ncggugaggc age 43 <210> 43 <211> 50 <212> RNA <213 > Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic 106 <400> 43 gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg uaucuacggu gaggcagcac 50 <210> 44 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 44 gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg aaacggugag gcagcac 47 <210> 45 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 45 gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg auacggugag gcagcac <210> 46 <211> 47 <212> RNA <213 > Artificial <220> 107 <221> misc_feature <223> synthetic <400> 46 gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg acacggugag gcagcac 47 <210> 47 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> raisc_feature <223> synthetic <400> 47 gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg caacggugag gcagcac 47 <210> 48 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 48 48 gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg aucucgguga ggcagcac <210> 49 108 <211> 47 <212 > RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 49 gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg uuucggugag gcagcac 47 <210> 50 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial i <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 50 gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg uaucggugag gcagcac 47 <210> 51 <211> 45 <212> RNA <213 > Artificial <220> <221> misc_feature i 109 <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> PEG moiety attached to 5' end <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is S <400> 51 gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg ncggugaggc agcac 45 <210> 52 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> PEG moiety attached to 5' end <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> PEG moiety attached to 5' end <400> 52 ccggugaggc aguaagaccg aagguaacca uuccuaccgg 40 <210> 53 110 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223 > biotinylated human D-ghrelin <400> 53 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Arg Val Gin Gin Arg Lys 15 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg 20 25 <210> 54 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 54 ggguaagcgu aagaccgaaa guaaccaauc cuaccguaua uacggugagg cagcac 56 <210> 55 <211> 56 <212> RNA Ill <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 55 ggguaagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacagugagg cagcac 56 <210> 56 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 56 ggguaagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac 56 <210> 57 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 57 ggguaagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaucguauc uauggugagg cagcac 56 <210> 58 112 <211> 56 <212> RNA <213 > Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 58 ggguaugcau aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac 56 <210> 59 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 59 ggguaugcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac 56 . <210> 60 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> 113 <221> misc_feature <223> synthetic <400> 60 gggugagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac 56 <210> 61 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 61 ggguguaugu aagaccgaag guaaccaauc cuaccauauc uacggugagg cagcac 56 <210> 62 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 62 gggugugcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccauauc uacggugagg cagcac 56 <210> 63 <211> 56 <212> RNA 114 <213 > Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 63 gggugugcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaucauauc uacggugagg cagcac 56 <210> 64 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <4 00 > 64 gggugugcgu aagaccgaag guacccaauc cuaccuacua acuggugagg cagcac 56 <210 > 65 <211> 55 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic 115 <400> 65 gggugacgua agaccgaagg uacccaaucc uaccuuuccu gaggugaggc agcac 55 <210> 66 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223 > synthetic <400> 66 999u9cugug aggcaaaaaa guaaguccga agguaaccaa uccuacagca c 51 <210> 67 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 67 999ugcugug aggcaaugcg uaaguccgaa gguauccaau ccugcagcac 50 <210> 68 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial <220> 116 <221> misc_feature <223> synthetic <4O0> 68 cgugugaggc aauaaaacuu aaguccgaag guaaccaauc cuacacg 47 <210> 69 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 69 ccggugaggc aguaagaccg aagguaacca uuccuaccgg 40 <210> 70 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 70 gggugagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac 56 <210> 71 117 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 71 ÜAAGGAAACU CGGUCUGAUG CGGUAGCGCU GUGCAGAGCU 40 <210> 72 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> synthetic <400> 72 CGUGUGAGGC AAUAAAACUU AAGUCCGAAG GUAACCAAUC CUACACG 46 1 o 3 1 5 38 D