KR20080009072A - 그렐린 결합형 핵산 - Google Patents

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플로리안 야로슈
디르크 율베르그
크리스티안 매쉬
스테펜 헬름링
스벤 클루스만
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녹손 파르마 아게
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Abstract

본 발명은 핵산, 바람직하게는 그렐린에 결합하는 핵산이며, 여기에서 상기 핵산은 1차 스트레치 박스 A (a first stretch Box A) 및 2차 스트레치 박스 B (a second stretch Box B)를 포함하고, 여기에서 상기 1차 스트레치 박스 A는 약 25개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 2차 스트레치 박스 B는 약 6 내지 8개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 상기 1차 스트레치 박스 A의 뉴클레오티드의 3’말단 스트레치 (stretch)는 2차 스트레치 박스 B와 잡종화하는 것이고, 상기와 같은 잡종화로 1차 이중 가닥 구조를 형성하고, 이러한 1차 이중 가닥 구조는 벌지를 포함하는 것이다.

Description

그렐린 결합형 핵산 {GHRELIN BINDING NUCLEIC ACIDS}
본 발명은 그렐린에 결합하는 핵산, 약제 제조를 위한 용도, 및 진단제 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
그렐린 (Ghrelin)은 성장호르몬 분비촉진제 수용체 1a (growth hormone secretagogue receptor 1a; GHSR1a)의 천연 리간드로서 동정되었다. 상기 수용체는 뇌하수체 및 뇌의 시상하부 부위에 가장 많이 분포하나, 다른 조직에서는 낮은 농도로도 관찰된다. 1970년대 후반부터 분비촉진제로 명명된 합성 펩티드 및 기타 화합물들이 성장호르몬의 분비를 촉진함이 알려져 왔다. 그러나, 1999년 그렐린의 발견 전까지 성장호르몬의 분비를 담당하는 천연 리간드는 알려진 바가 없었다. 그렐린은 N말단의 3번째 아미노산 (세린)에 옥타노일산 측쇄를 가진 28개의 아미노산으로 구성된 고염기성의 펩티드 호르몬이다. 상기의 비통상적인 변형은 GHS수용체 및 그 활성간의 상호 작용에 필수적인 것이다. 정제된 랫트 (rat) 그렐린의 아미노산 서열은 GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR (서열 번호 2)로 결정되었다; 정제된 인간 그렐린의 아미노산 서열은 GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR (서열 번호 1)로 결정 되었다.
그렐린은 동화 단계에 해당되는 생리 기능을 매개하는 것으로 알려졌다. 그렐린은 뇌하수체에서 성장 호르몬 (GH)의 분비를 직접적으로 촉진하며, 따라서 말단비대증의 치료에 있어서 적절한 목표가 될 수도 있다. 설치류 실험에서는 그렐린이 시상하부 뉴런에 작용하여 성장 호르몬비의존적인 피딩 (feeding)을 또한 유도함이 밝혀졌다. 흥미롭게도, 그렐린의 1차 생산지는 위의 산분비선으로서 이는 그렐린이 위, 뇌하수체 및 시상하부 간의 호르몬 연계작용을 수행함을 나타낸다. 랫트에 그렐린의 주입시 에너지 섭취 및/또는 연료 소모상의 변화 결과로서 나타나는 체중 증가 현상은 상기의 역할을 입증하는 것이다. 게다가, 그렐린의 인체 전신 투여 실험은 시험객체의 공복감을 유발하여 과식을 유도한다. 상기와 같은 연구 결과, 그렐린은 급성 및 만성 영양부족 상태의 신호로 작용하여 식욕 및 체중 조절에 결정적인 역할을 하는 것으로 유추된다. 상기 가설에 대한 추가적 증거로서, 체중 감소에 영향을 미치는 과정의 효율에 대한 최소한의 원인으로 작용하는 위우회로 수술 (gastric bypass) 후, 그렐린 수치뿐만 아니라, 식욕도 또한 감소됨이 밝혀졌다. 프레더윌리 증후군 (PraderWilli syndrome) 환자의 임상 자료는 또한 상기 질환과 수반되는 이상 식욕 항진증 (hyperphagia) 및 비만이 막대한 과그렐린혈증 (hyperghrelinemia)의 결과임을 암시한다. 게다가, 그렐린은 고혈당을 유발시키고 인슐린 분비를 억제하는 것으로 나타나, 그렐린이 포도당 대사에도 관여함을 나타낸다. 이러한 에너지 대사에 관여하는 상기 기능들 외에도, 그렐린은 다른 일련의 과정들에도 관여함이 알려져 있다. 다수의 신경내분비 종양 (neuroendocrine tumors)에서 발현되며, 뇌하수체로부터의 성장 호르몬 분비 작용외에도 ACTH, PRL 및 코티졸 (cortisol)의 분비에도 관여하는 것으로 밝혀졌다. 건강한 사람에게 그렐린의 단회 주입은 심박출량 (cardiac output) 증가 및 혈압 강하 효과를 나타낸다. 따라서, 그렐린은 다양한 대사에서 각기 다른 작용을 나타내는 것으로 보여진다. 부가적인 배경 정보는 하기 문헌들에서 확인할 수 있는 있다: Kojima M et al., “그렐린은 위에서 분리되는 성장호르몬을 분비하는 아실화 펩티드이다 (Ghrelin is a growthhormonereleasing acylated peptide from stomach)” Nature, 402(6762), pp656660, 1999; Tschp M et al., “그렐린은 설치류에서 비만을 유도한다 (ghrelin induces adiposity in rodents)”, Nature, 407(6806), pp908913, 2000; Wren AM et al., “그렐린은 인체에서 식욕을 증진하며, 음식 섭취를 증대시킨다 (Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans)”, J. Clin. Endocrinol . Metab., 86(12), pp5992, 2001; Nakazato M et al., “섭취의 중심 조절에 있어서의 그렐린의 역할 (A role for ghrelin in the central regulation of feeding)”, Nature, 409(6817), pp 194198, 2001; Nagaya N et al., “건강한 지원자들의 인간 그렐린의 혈액동력학적 및 호르몬성 영향 (Hemodynamic and hormonal effects of human ghrelin in healthy volunteers)”, Am . J. Physiol . Regul . Integr . Comp . Physiol., 280(5), ppR14831487, 2001; Volante M et al., “췌장 랑게르한스섬 세포 및 관련 내분비선 암에 의한 그렐린 및 성장호르몬 촉진 수용체의 발현 (Expression of ghrelin and of the GH secretagogue receptor by pancreatic islet cells and related endocrine tumors)”, J. Clin . Endocrinol . Metab., 87(3), pp13001308, 2002; Jeffery PL et al., “성장호르몬 분비 펩티드인 그렐린의 발현 및 작용과 전립선 암세포주에서의 그 수용체 (Expression and action of the growth hormone releasing peptide ghrelin and its receptor in prostate cancer cell lines)”, J. Endocrinol., 172(3), ppR711, 2002; Egido EM, et al., “인슐린 및 췌장 소마스타틴 분비에 대한 그렐린의 저해효과 (Inhibitory effect of ghrelin on insulin and pancreatic somastatin secretion)”, Eur . J. Endocrinol., 146(2), pp241244, 2002; Broglio F et al., “위에서 생산되는 자연 성장호르몬 촉진제인 그렐린은 인체에서 고혈당증을 유도하고 인슐린 분비를 감소시킨다 (Ghrelin, a natural GH secreragogue produced by the stomach, induces hyperglycemia and reduces insulin secretion in humans)”, J. Clin . Endocrinol . Metab., 86(10), pp50835086, 2001.
본 발명의 근본적인 과제는 그렐린에 작용하는 특이적인 길항제를 제공하는 것이다. 본 발명의 과제상의 추가적인 양태는 성장호르몬 분비촉진제 수용체 1a (GHSR 1a)에 작용하는 특이적인 길항제를 제공하는 것이다. 또 다른 양태는 그렐린 및 성장호르몬 분비촉진제 수용체 1a (GHSR 1a) 각각에 관련되는 장애 및 질환의 치료를 위한 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 첫번째 일 양태로서, 본 발명의 근본적인 과제는 핵산, 바람직하게는 그렐린에 결합하는 핵산이며, 상기에서 핵산은 1차 스트레치 박스 A (a first stretch Box A) 및 2차 스트레치 박스 B (a second stretch Box B)를 포함하고,
여기에서 상기 1차 스트레치 박스 A는 약 25개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 2차 스트레치 박스 B는 약 6 내지 8개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고,
여기에서 상기 1차 스트레치 박스 A의 뉴클레오티드의 3’말단 스트레치(stretch)는 2차 스트레치 박스 B와 잡종화하는 것이고, 상기와 같은 잡종화로 1차 이중 가닥 구조를 형성하고, 이러한 1차 이중 가닥 구조는 벌지 (bulge)를 포함하는 것이다.
상기 이중 가닥 구조의 하나의 구현예는 1차 스트레치 박스 A의 5개의 3’말단 연속적인 뉴클레오티드 및 2차 스트레치 박스 B의 뉴클레오티드의 전체 또는 일부분, 바람직하게는 2차 스트레치 박스 B의 6 내지 8개의 연속적인 뉴클레오티드로 형성되는 것이다.
상기 벌지(bulge)의 하나의 구현예는 2차 스트레치 박스 B의 1 내지 3개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 1차 스트레치 박스 A의 5개의 3’말단의 연속적인 뉴클레오티드와 비염기쌍 2차 스트레치 박스 B의 1개의 뉴클레오티드로 형성되는 것이다.
상기 벌지의 하나의 구현예는 비염기쌍 푸린 (purine)으로 형성되고, 상기 푸린은 바람직하게는 구아노신 (guanosine)인 것이다.
상기 비염기쌍 푸린 (nonbase pairing purine)의 바람직한 구현예는 2차 스트레치 박스 B (the second stretch Box B)에 의해 제공되는 것이다.
상기 핵산의 하나의 구현예는 3차 스트레치 박스 C1 (a third stretch Box C1) 및 4차 스트레치 박스 C2 (a fourth stretch Box C2)를 추가적으로 포함하는 것이며, 여기에서 상기 3차 스트레치 박스 C1는 1개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 4차 스트레치 박스 C2는 1개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것이고, 여기에서 상기 3차 스트레치 박스 C1는 상기 2차 스트레치 박스 B의 3’말단 내지 5’말단에 부착된 것이고, 4차 스트레치 박스 C2는 1차 스트레치 박스 A의 5’말단 내지 3’말단에 부착된 것이다.
상기 3차 스트레치 박스 C1 및 4차 스트레치 박스 C2의 바람직한 구현예는 는 잡종화가 가능하며, 여기에서 상기 잡종화에 의해 2차 이중 가닥 구조를 형성하는 것이다.
상기 1차 이중 가닥 구조의 구현예는 1차 나선 구조를 형성하는 것이다.
상기 이중 가닥 구조의 바람직한 구현예는 2차 나선 구조를 형성하는 것이다.
보다 바람직한 구현예로서, 상기 2차 나선 구조는 1 내지 10개의 염기쌍, 바람직하게는 1 내지 3개의 염기쌍, 보다 바람직하게는 2 내지 3개의 염기쌍을 포함하는 나선형 또는 나선형 유사 구조를 갖는 것이다.
바람직한 구현예로서, 상기 1차 나선 구조는 상기 2차 나선 구조에 의해 신장되는 것이다.
바람직한 구현예로서, 상기 3차 스트레치 박스 C1 (the third stretch Box C1)는 약 1 내지 10개의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 내지 3개의 연속적인 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 2 내지 3개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
바람직한 구현예로서, 4차 스트레치 박스 C2 (the fourth stretch Box C2)는 약 1 내지 10개의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 내지 3개의 연속적인 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 2 내지 3개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
바람직한 구현예로서, 상기 핵산은 부가적으로 5차 스트레치 박스 D (a fifth stretch Box D)를 포함하는 것이고, 여기에서 상기 5차 스트레치 박스 D는 2개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
보다 바람직한 구현예로서, 상기 5차 스트레치 박스 D는 서열 5’CA를 포함하는 것이다.
보다 바람직한 구현예로서, 상기 5차 스트레치 박스 D (the fifth stretch Box D)는 임의 길이의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 것이고, 여기에서 상기 길이는 2, 3, 4, 5, 및 6개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이다.
바람직한 구현예로서, 상기 5차 스트레치 박스 D (the fifth stretch Box D)는 5’CA(X)n 3’의 서열을 포함하고, 여기에서 X는 임의의 뉴클레오티드, 바람직하게는 A, G, T, C, U 및 I를 포함하는 그룹으로부터 선택되어지고 상기 n은 0, 1, 2, 3 및 4로 구성된 그룹으로부터 선택된 정수인 것이다.
보다 바람직한 구현예로는, 상기 5차 스트레치 박스 D (the fifth stretch Box D)는 5’CA(X)n 3’(여기에서 n=4) 서열로 구성된 것이다.
바람직한 구현예로서, 상기 5차 스트레치 박스 D (the fifth stretch Box D)는 2차 스트레치 박스 B (the second stretch Box B)의 5’말단 내지 3’말단에 부착된 것이다.
바람직한 구현예로서, 상기 핵산은 부가적으로 6차 스트레치 박스 E (a sixth stretch Box E)를 포함하는 것이고, 여기에서 상기 6차 스트레치 박스 E는 한 개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
보다 바람직한 구현예로서, 상기 6차 스트레치 박스 E는 약 1 내지 10개의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 내지 4개의 연속적인 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 3개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
보다 더 바람직한 구현예로서, 상기 6차 스트레치 박스 E (the sixth stretch Box E)의 하나 이상의 뉴클레오티드는 U 및 G로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것이다.
특히 더 바람직한 구현예로서, 상기 U 또는 G 뉴클레오티드는 상기 1차 스트레치 박스 A (the first stretch Box A)의 5’말단에 직접 인접하여 위치하는 것이다.
바람직한 구현예로서, 상기 6차 스트레치 박스 E (the sixth stretch Box E)는 상기 1차 스트레치 박스 A (the first stretch Box A)의 3’말단 내지 5’말단에 부착되는 것이다.
바람직한 예로서, 상기 5차 스트레치 박스 D (the fifth stretch Box D)의 3’말단은 1차 스페이서 (spacer)에 의해 상기 6차 스트레치 박스 E (the sixth stretch Box E)의 5’말단 (end)에 부착되는 것이다.
바람직한 구현예로서, 상기 4차 스트레치 박스 C2 (the fourth stretch Box C2)의 3’말단은 2차 스페이서(a second spacer)에 의해 상기 3차 스트레치 박스 C1 (the third stretch Box C1)의 5’말단에 부착되는 것이다.
바람직한 구현예로서, 상기 1차 및 2차 스페이서는 친수성 스페이서들을 포함하는 그룹으로부터 각각 별개로 및 독립적으로 선택되는 것이다.
보다 바람직한 구현예로서, 상기 친수성 스페이서는 핵산 스페이서 및 비핵산 스페이서를 포함하고 있는 그룹으로부터 선택되는 것이다.
보다 바람직한 구현예로서, 상기 1차 스페이서는 약 1 내지 20개의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 2개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 스페이서인 것이다.
호환가능한 보다 바람직한 구현예로서, 상기 2차 스페이서는 약 3 내지 20개의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 3 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 3개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 스페이서인 것이다.
추가적으로 호환 가능한 보다 바람직한 구현예로서, 상기 스페이서는 비핵산인 것이다. 이의 특히 바람직한 구현예로서, 상기 1차 스페이서 및/또는 2차 스페이서는 하나 이상의 에틸렌 글리콜 부위 또는 이러한 에틸렌 글리콜 부위가 다수인 것을 포함하는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 상기 스페이서는 약 172 내지 688 달톤 (Da), 바람직하게는 344 달톤 (Da)의 분자량을 갖는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 상기 핵산은 고리형 핵산인 것이다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 상기 핵산은
5’ Box Box Box Spacer Box Box Box
또는
5’ Box Box Box Spacer Box Box Box
의 구조를 갖는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 상기 1차 스트레치 박스 A (the first stretch Box A)는 UAAX1X2CCGAAX3GUAX4CCAUUCCUX5C(서열 번호 3)의 서열이고; 상기에서, X1=G 또는 A; X2=A 또는 U; X3=G 또는 A; X4=A 또는 C 또는 U; 및 X5=G 또는 A, 바람직하게는 5’UAAGACCGAAGGUACCCAAUCCUAC 3’ (서열 번호 4)인 것이다.
본 발명의 구현예로서, 상기 2차 스트레치 박스 B (the second stretch Box B)는 5’GUGAGG 3’의 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 구현예로서, 상기 핵산 서열은 하기 표 1에 기재된 서열을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것이다.
Figure 112007072179816-PCT00001
바람직한 구현예로서, 상기 핵산 서열은 서열번호 38 (SEQ ID No. 38), 서열번호 39 (SEQ ID No. 39), 서열번호 32 (SEQ ID No. 32), 서열번호 29 (SEQ ID No. 29), 서열번호 41 (SEQ ID No. 41) 및 서열번호 40 (SEQ ID No. 40)에 따른 서열을 포함하고 있는 그룹으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 구현예로서, 상기 핵산은 그렐린, 바람직하게는 인간 그렐린 (human ghrelin)을 결합 가능한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 상기 그렐린은 서열번호 1 (SEQ ID No. 1)에 따른 아미노산 서열을 갖는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 상기 핵산은 변형체 (a modification)를 포함하는 것이다.
바람직한 구현예로서, 상기 변형체는 HES 부위 및 PEG 부위를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것이다.
보다 바람직한 구현예로서, 상기 변형체는 직쇄 또는 가지상 PEG로 구성되는 PEG 부위인 것이고, 여기에서 상기 PEG 부위의 분자량은 바람직하게는 약 20 내지 120 kD, 보다 바람직하게는 약 30 내지 80 kD, 가장 바람직하게는 약 40 kD인 것이다.
호환적인 보다 바람직한 구현예로서, 상기 변형체는 HES 부위인 것이고, 여기에서 상기 HES 부위의 분자량은 바람직하게는 약 10 내지 130 kD, 보다 바람직하게는 약 30 내지 80 kD, 및 가장 바람직하게는 약 50 kD인 것이다.
본 발명의 구현예로서, 상기 핵산은 L뉴클레오티드로 구성된 것이다.
본 발명의 두번째 양태에 있어서, 본 발명의 해결해야 하는 문제점은 본 발명의 첫번째 양태에 따른 핵산 및 임의적인 추가 구성 성분을 포함하는 약학조성물에 의하여 해결되는 것이고, 여기에서 상기 추가 구성 성분은 약학적으로 허용 가능한 부형제 및 약학적으로 활성을 갖는 활성제를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 세번째 양태에 있어서, 본 발명의 해결해야 하는 문제점은 약제(medicament) 제조를 위한 본 발명의 상기 첫번째 양태에 따른 핵산의 용도에 의해 해결된다.
본 발명의 네번째 양태에 있어서, 본 발명의 해결해야 하는 문제점은 진단용 도구를 제조하기 위한 본 발명의 상기 첫번째 양태에 따른 핵산의 용도에 의해 해결된다.
본 발명의 세번째 양태의 구현예로서, 상기 약제는 비만, 섭식장애, 당뇨, 포도당 대사증, 종양, 혈압 질환, 심혈관계 질환, 말단비대증, 및 에너지 균형, 식욕 및 체중의 조절 관련 질환으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 것이다.
본 발명의 다섯번째 양태에 있어서, 본 발명의 해결해야 하는 문제점은 본 발명의 첫번째 양태에 따른 그렐린 및 핵산을 포함하는 복합체에 의해 해결되며, 여기에서 상기 복합체는 바람직하게는 결정성 복합체인 것이다.
본 발명의 여섯번째 양태에 있어서, 본 발명의 해결해야 하는 문제점은 그렐린 검출을 위한 본 발명의 첫번째 양태에 따른 핵산의 용도에 의해 해결된다.
본 발명의 일곱번째 양태에 있어서, 본 발명의 해결해야 하는 문제점은 하기의 단계들을 포함하는 그렐린 길항제 (antagonist) 또는 그렐린 효현제 (agonist)를 스크리닝하는 방법에 의해 해결된다:
후보 그렐린 길항제 및/또는 후보 그렐린 효현제를 제공하는 단계,
상기 첫번째 양태에 따른 핵산을 제공하는 단계,
상기 그렐린 길항제 및/또는 그렐린 효현제 존재하에 신호를 제공하는 시험용 시스템을 제공하는 단계, 및
상기 후보 그렐린 길항제가 그렐린 길항제인지 여부 및/ 또는 상기 후보 그렐린 효현제가 그렐린 효현제인지 여부를 결정하는 단계.
본 발명의 여덟번째 양태에 있어서, 본 발명의 해결해야 하는 문제점은 하기의 단계들을 포함하는 그렐린 효현제 (agonist) 및/또는 그렐린 길항제(antagonist)를 스크리닝 방법에 의해 해결된다:
- 어떠한 상(phase), 바람직하게는 고체상에 동화된 그렐린을 제공하는 단계,
- 본 발명의 첫번째 양태에 따른 핵산, 바람직하게는 표지된 첫번째 양태에 따른 핵산을 제공하는 단계,
- 후보 그렐린 효현제 및/ 또는 후보 그렐린 길항제를 첨가하는 단계 및
- 상기 후보 그렐린 효현제가 그렐린 효현제인지 여부 및/ 또는 상기 후보 그렐린 길항제가 그렐린 길항제인지 여부를 결정하는 단계.
본 발명의 하나의 구현예로서, 상기 결정단계는 상기 핵산이 상기 후보 그렐린 효현제 또는 후보 그렐린 길항제로 대체되는지 여부를 평가하는 것으로 수행되는 것이다.
본 발명의 아홉번째 양태에 있어서, 본 발명의 해결해야 하는 문제점은 본 발명의 첫번째 양태에 따른 핵산을 포함하는, 그렐린을 탐지하기 위한 키트(kit)에 의해 해결된다.
본 발명의 열번째 양태에 있어서, 본 발명의 해결해야 하는 문제점은 본 발명의 여덟번째 양태에 따른 방법에 의해 수득가능한 그렐린 길항제에 의해 해결된다.
본 발명의 열한번째 양태에 있어서, 본 발명의 해결해야 하는 문제점은 본 발명의 여덟번째 양태에 따른 방법에 의해 수득가능한 그렐린 효현제에 의해 해결된다.
본 발명은 그렐린에 고친화도 (high affinity)를 갖고 특이적으로 결합하는 핵산의 발생이 가능하다는 놀라운 발견에 기초를 두고 있다.
그렐린은 서열번호 1에 따른 아미노산 서열, 바람직하게는 지방산 측쇄로 변형된 형태의 기본적인 펩티드이다. 그렐린의 등전점 (pI) 측정치는 각각 인간 그렐린이 11,07이고, 랫트 (rat) 그렐린은 10,56이다. 본 발명의 바람직한 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산에 결합하는 그렐린은 지방산 측쇄를 갖는 변형된 그렐린이다. 본 발명의 호환적인 구현예로서, 상기 그렐린은 지방산 측쇄를 갖지 않는 그렐린이다. 본원에서 사용되는 용어 ‘그렐린’은 제한하고자 함은 아니나, 포유동물의 그렐린을 포함하는 모든 그렐린을 의미한다. 바람직하게는, 상기 포유동물의 그렐린은 마우스, 랫트, 토끼, 햄스터 및 인간 그렐린을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것이다. 가장 바람직하게는 인간 그렐린이다.
그렐린에 고친화성으로 결합하는 핵산이 동정가능하다는 발견은 이튼 (Eaton) 등의 문헌 (Eaton, B.E.; Gold, L.; Hicke, B.J.; Janjic, N.; Jucker, F.M.; Sebosta, D.P.; Tarasow, T.M.; Willis, M.C.; Zichi, D.A.; Bioorganic & Medicinal Chemistry, Vol 5, No.6; pp 1087 1096, 1997)에 기재된 내용, 즉, 목표 분자에 결합하고, 기본 단백질로 유도된 헥산인 압타머 (aptamer)의 발생이 이러한 종류의 목표 (target)가 높은 그러나 비특이적인 신호-대-잡음 비(signal-to-noise)를 발생하므로 일반적으로 매우 어렵다는 사실내용을 기초로 하는 한은 놀라운 사실이다. 이 비특이적 신호-대-잡음은 그렐린와 같은 기본 목표의 핵산의 높은 비특이성의 결과로서 나타난다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 본 발명자들은 놀랍게도 옥타노일산 측쇄가 없는 그렐린과는 결합하지 않는 반면에, N말단 (세린 3)의 세번째 아미노산에 옥타노일산 측쇄를 갖는 그렐린을 구분하는 그렐린 결합성 핵산을 발생시킬 수 있음을 확인한 것이다.
본원에서 개시하는 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산의 구성은 핵산 단독 또는 어떠한 조합으로 사용되는 본 발명의 어떠한 양태도 구현 가능할 것이다.
어떠한 이론에 의해서 제한되지 않고, 본 발명자들은 본 발명에 따른 그렐린 결합 핵산의 발견된 특이성은 하기와 같이 검토되어지는 몇몇의 구조적인 특징을 나타냄을 가정하고 여기에서 도 20A를 참고로 제시한다. 그러나, 상기 도 20A는 본 발명에 따른 어떠한 핵산 및 그 각각에서 필수적으로 실현되지 않아도 되는 몇가지 상기한 구조적인 특징도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
기본적인 본 발명의 구조적 구성은 본원에서 박스 A (Box A)로 지칭되는 인접 뉴클레오티드의 1차 스트레치 박스 A (first stretch Box A) 및 본원에서 박스 B (Box B)로 지칭되는 인접 뉴클레오티드의 2차 스트레치 박스 B (second stretch Box B) 또는 본원의 2차 스트레치 박스 B (second stretch Box B)이다. 상기 1차 스트레치 박스 A (first stretch Box A)는 약 25개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 반면에 두번째 스트레치 박스 B (second stretch Box B)는 약 6 내지 8개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다. 상기 1차 스트레치 박스 A의 3’말단 스트레치는 상기 2차 스트레치 박스 B와 잡종화하고, 이러한 잡종화로 1차 이중가닥 구조가 형성되고, 여기에서 이러한 1차 이중 가닥 구조는 벌지 (bulge)를 포함한다.
상기 이중 가닥 구조는 1차 스트레치 박스 A (first stretch Box A)의 5개의 3’말단 연속적인 뉴클레오티드 및 2차 스트레치 박스 B (second stretch Box B)의 6 내지 8개의 연속적인 뉴클레오티드에 의해 형성된다. 상기 벌지 (bulge)는 1차 스트레치 박스 A (first stretch Box A)의 5개의 3’말단 연속적인 뉴클레오티드과 염기쌍을 갖지 않는 적어도 1개 내지 많아야 3개의 뉴클레오티드에 의해서 형성된다. 따라서, 상기 벌지(bulge)는 1, 2 또는 3개의 비염기쌍 (non-base-paring) 뉴클레오티드, 바람직하게는 2차 스트레치 박스 B (second stretch Box B)에 의해 제공되는 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 이러한 벌지 크기 측면에서, 상기 2차 스트레치 박스 B (second stretch Box B)는 6 내지 8개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 벌지는 상기 2차 스트레치 박스 B (second stretch Box B), 바람직하게는, 6개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 상기 2차 스트레치 박스 B (second stretch Box B)의 5’ 말단으로부터 보여지는 2차 스트레치 박스 B (second stretch Box B) 내에 있는 비염기쌍 세번째 뉴클레오티드에 의해 만들어진다.
본 발명의 보다 중요한 구성은 2차 이중가닥 구조이다. 이와 같은 2차 이중 가닥 구조는 "박스C1 (Box C1)" 또는 "3차 스트레치 박스 C1 (third stretch Box C1)"으로 지칭되는 연속된 뉴클레오티드들의 3차 스트레치(stretch)에 의해 또는 "박스 C2" 또는 “4차 스트레치 박스 C2 (fourth stretch Box C2)” 으로 지칭되는 연속된 뉴클레오티드들의 4차 스트레치 (fourth stretch)에 의해 형성된다. 상기 3차 스트레치 박스 C1는 그 3’말단이 상기 2차 스트레치 박스 B의 5’말단에 부착되어 있으며, 상기 4차 스트레치 박스 C2는 그 5’말단이 1차 스트레치 박스 A의 3’말단에 부착되어 있다. 이와 같은 이차 이중가닥 구조는 전형적으로 본원에서는 “이차 나선형 구조 (the second helical structure)”라 불리우는 나선형 구조이다. 이와 같은 2차 나선형 구조는 바람직하게는 일차 이중 가닥 구조로부터 전형적으로 구성된 나선형 구조의 신장 (extension)이다. 바람직하게는 본원에서 “1차 나선형 구조(first helical structure)”라고 지칭되는 나선형 구조인 상기 일차 이중가닥 구조의 길이는 1차 스트레치 박스 A (first stretch Box A) 및 2차 스트레치 박스 B (second stretch Box B)의 길이, 더욱 명확하게는, 상기 서로 잡종화된 상기 두 개의 박스들의 스트레치에 의하여 결정된다. 본 발명자들이 현재의 이해수준에 따라, 2차 이중 가닥 구조에 의한 상기 일차 나선 구조에 제공된 신장은 안정된 종류에 더 가까우나, 본 발명가들은 이 이론에 제한하고자 함은 아니다. 상기 이차 나선형 구조는 하나 내지 열 개의 염기 쌍(base pair), 바람직하게는 하나 내지 세 개의 염기 쌍, 더욱 바람직하게는 두 개 내지 세 개의 염기 쌍으로 구성된다. 하나 내지 세 개의 염기 쌍으로는 나선 (helix)을 구성하기에는 적합하지 않음은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 이와 같은 구조는 본원에서는 “나선-유사 구조 (helixlike structure)”로 지칭되며, 이와 같은 구조는 바람직하게는 하나 내지 여러 개의 염기 서열로 신장되는 경우에 결과적으로 나선형 구조를 이룰 수 있는 구조를 의미한다.
본 발명의 보다 중요한 구성은 본원에서 “박스 D (Box D)” 또는 “5차 스트레치 박스 D (fifth stretch Box D)”로 지칭되는 연속적인 뉴클레오티드의 5차 스트레치 (fifth stretch)이다. 이 추가적인 스트레치는 상기 핵산의 전체적인 결합에 있어서 향상 (improvement)을 제공하고자 함이다. 상기 5차 스트레치가 두 개 이상의 뉴클레오티드를 함유하고 있음에도, 그렐린 (ghrelin)의 결합에 있어서 유익한 효과는 상기 5차 스트레치의 길이, 바람직하게는 6개의 연속적인 뉴클레오티드까지 신장시킴으로서 더욱 향상될 수 있다. 또한, 상기 5차 스트레치는 만일 바람직하게는 CA 디뉴클레오타이드 (dinucleotide)의 5’말단 및 5’CA(X)n 3’ (여기서 X는 A, G, T, C, U 또는 I로부터 선택된 임의의 뉴클레오타이드를 의미함)의 염기서열을 갖는 5차 스트레치에 포함된다면 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따른 상기 핵산의 추가적인 구성은 본원에서 “박스 E (Box E)” 또는 “6차 스트레치 박스 E (sixth stretch Box E)”로 지칭되는 연속된 뉴클레오티드의 6차 스트레치 (sixth stretch)이다. 바람직하게는, 상기 6차 스트레치는 하나 이상의 뉴클레오티드로 구성된다.
상기 다양한 스트레치들은 도 20A에서 보는 바와 같이 서로에게 부착되어 있다. 도에 도시된 바와 같이, 바람직하게는, 상기 3차 스트레치 박스 C1 및 4차 스트레치 박스 C2는 각각 하나 내지 두 개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 2개의 뉴클레오티드를 포함하고, 5차 스트레치 박스 D는 2개 이상의 뉴크레오티드, 바람직하게는 4개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 6개의 뉴클레오티드를 함유한다.
상기 3차 스트레치 박스 C1 및 4차 스트레치 박스 C2의 길이가 0인 구현예에서는, 1차 스트레치 박스 A와 2차 스트레치 박스 B는 선택적으로 링커 (linker) 또는 스페이서 (spacer)를 통하여 연결되어 있으며, 여기에서 이와 같은 스페이서는 본원에 개시되는 임의의 스페이서일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 “스페이서(spacer)” 및 “링커(linker)”는 별달리 적시하지 않는 한은 호환가능하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 6차 스트레치 박스 E는 1 내지 10 개의 연속적인 뉴클레오티드를, 바람직하게는 1 내지 4개의 뉴클레오티드를, 더욱 바람직하게는 3 내지 4개의 연속적인 뉴클레오티드를 함유하고 있다.
이러한 다양한 구성으로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 5차 스트레치 및 상기 6차 스트레치는 서로에게 연결되거나 연결되지 않을 수도 있는 점, 상기 3차 및 4차 스트레치가 서로에게 연결되거나 연결되지 않을 수도 있는 점, 및 1차 및 2차 스트레치가 서로에게 연결되거나 연결되지 않을 수도 있는 점은 가능할 것이다. 상기 결합은 바람직하게는 공유 결합 (covalent bond)을 통하여 연결됨도 인정될 수 있을 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기 연결은 최소 하나 이상, 바람직하게는 다수의 에틸렌 글리콜 부위 (ethylene glycol moieties)를 포함하는 친수성 스페이서 (hydrophilic spacer)를 통해 형성되는 것이다. 다양한 링커들 및 스페이서들은, 당업계에 공지되어 있으며 이미 개시된 문헌, 예를 들어 필리스(Pilis) 및 미쿠라(Micura)의 문헌 (Nucleic Acid Research 28(9), pp18591863, 2000)에 개시된 기준들을 이용하여 선택될 수 있다. 상기 링커들은 그들간의 염기쌍 결합 자체에 영향을 주면 안 된다. 방향족 카르보사이클 (aromatic carbocycle)을 포함하고 있는 링커 종류들은 말단 염기쌍에 축적하므로 적합하지 않다 (J. Am. Chem. Soc. 121, pp99059906, 1999; J. Am. Chem. Soc. 120, pp1100411005, 1998). 그러나, 에틸린 글리콜 기초 (eythylene glycol based) 또는 에틸렌 글리콜 유래 (ethylene glycol derived)의 링커인 경우는 높은 수용성 및 높은 공간형태상의 유연성 등의 장점과 같은 이와 같은 조건을 만족시킨다 (J. Am. Chem. Soc. 115, pp84838484, 1993; Nucleic Acids Research 21, pp56005603, 1993; Biochemistry 32, pp17511758, 1993; Nucleic Acid Research 18, pp63536359, 1990; J. Am. Chem. Soc. 119, pp1159111597, 1997). 바람직하게는, 상기 스페이서는 산소원자가 CH2, 인산 또는 황원자로 대체 또는 치환되는 하나 내지 여러 개의 에틸린 글리콜 부위를 포함하거나 이로 구성된다.
이와 같은 연결 선택사항에 따라, 다음과 같은 구조를 구현가능하다.
5’ Box C1 Box B Box D Spacer Box E Box A Box C2
또는
5’ Box E Box A Box C2 Spacer Box C1 Box B Box D
결과적으로, 본 발명에서는 완전히 닫힌 구조, 즉 본 발명에 따른 핵산들의 원형 구조가 도 20 D에서 도시한 바와 같이 실체화될 수도 있음도 본 발명의 범위 내이다.
본 발명에 따른 핵산들은 또한 본원에 개시된 특정 서열과 필수적으로 상동성 (homologous)을 갖고 있는 핵산들을 모두 포함할 수 있을 것이다. 본원에서 정의되는 용어 “실질적으로 상동성 (substantially homologous)”은 75% 이상, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 것으로 해석되어야 한다.
본원에서 정의되는 용어 “본 발명 핵산 (inventive nucleic acid) 또는 본 발명에 따른 핵산 (nucleic acid according to the present invention)”은 본원에 개시된 핵산 또는 이들의 부분을 포함하는 핵산들을 또한 포함하는 것이며, 바람직하게는 상기 핵산 또는 상기 핵산의 부분들은 그렐린과의 결합과 관련되는 정도인 것이다.
본 발명에 따른 핵산은 D핵산 또는 L핵산일 수 있다. 바람직하게는, 상기 본 발명 핵산은 L핵산이다. 추가적으로, 상기 핵산의 하나 내지 여러 부분은 D핵산형으로 존재 가능하며, 또는 상기 핵산의 1개 이상 내지 여러 부분은 L핵산형이다. 상기 핵산의 “부분 (part)"라는 용어는 적어도 1개 이상의 뉴클레오티드를 의미하는 것일 것이다. 이러한 핵산들은 일반적으로, 각각 “D 및 L핵산”으로 정의되어 있다. 따라서, 특히 바람직한 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산들은 L뉴클레오티드로 구성되고 최소 하나 이상의 D-뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 D뉴클레오티드는 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산, 바람직하게는 이들의 일부분을 한정하는 스트레치와는 별개의 다른 부분에 부착되는 것이며, 이 일부분들은 핵산의 다른 부분과의 상호작용이 연관된 접촉의 부분을 의미한다. 바람직하게는, 이러한 D뉴클레오티드는 각각 본 발명의 임의의 핵산 및 임의의 스트레치의 말단에 부착되는 것이다. 보다 바람직한 구현예로서, 상기의 D뉴클레오티드는 스페이서 또는 링커로 작용될 수 있으며, 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산에 PEG 또는 HES와 같은 변형체를 부착할 수도 있다.
또한, 본 발명에 따른 핵산은 비교적 긴 핵산 (longer nucleic acid)의 일부분이며, 여기에서 상기 비교적 긴 핵산은 최소한 본 발명의 한 부분이 본 발명에 따른 핵산 또는 그 일부분인 여러 부분을 포함함도 본 발명의 범위 내이다. 이러한 비교적 긴 핵산의 다른 일부분은 D핵산 또는 L핵산 중 어느 것일 수 있다. 본 발명에서는 이들의 임의 조합이 사용될 수 있을 것이다. 이러한 비교적 긴 핵산의 다른 일부분은 결합 (binding), 바람직하게는 그렐린과의 결합과는 다른 기능을 나타낼 수 있다. 하나의 가능한 기능은 다른 분자와의 상호작용 (interaction), 예를 들어, 고정화 (immobilization), 교차결합 (crosslinking), 탐지 (detection) 또는 증폭 (amplification)등의 작용을 허용하는 것이고, 여기에서 상기 다른 분자들은 바람직하게는 그렐린와 상이한 것이다.
본원에서 사용되는 L핵산들은 L뉴클레오티드, 바람직하게는 오로지 L뉴클레오티드로만 구성된 핵산들이다.
본원에서 사용되는 D핵산들은 D뉴클레오티드, 바람직하게는 오로지 D뉴클레오티드로만 구성된 핵산들이다.
본 발명의 본 발명 핵산이 D뉴클레오티드, L뉴클레오티드 또는 상기 두 형태 뉴클레오티드의 조합, 예를 들어 하나 이상의 L뉴클레오티드 및 하나 이상의 D뉴클레오티드로 구성되는 무작위 조합 (random combination) 또는 하나 이상의 L뉴클레오티드 및 하나 이상의 D뉴클레오티드로 구성되는 스트레치의 한정된 서열을 포함하는가 여부에 상관없이, 본 발명의 핵산은 데스옥시리보뉴클레오티드 (desoxyribonucleotide(s)), 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide(s)) 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다.
L핵산과 같은 본 발명의 본 발명 핵산을 고안하는 것은 여러 이유로 장점을 갖는다. L핵산은 자연 발생적 핵산들의 거울상 이성질체이다. 그러나 D핵산은 수용액상, 및 특히 핵산 분해 효소 (nucleases)의 광범위한 분포에 기인하는 생체 조직 (biological systems) 또는 생체 표본 (biological samples)에서 매우 불안정하다. 자연 발생적 핵산 분해효소, 특히 동물 세포 유래 핵산 분해 효소는 L핵산에 대한 분해 능력이 없다. 이와 같은 이유로 L핵산의 생물학적 반감기 (biological halflife)는 동물체 및 인체를 포함한 상기 조직에서 두드러지게 증가한다. L핵산의 분해능 결핍으로 인해, 핵산 분해 효소의 분해산물이 발생되지 않으며, 상기 결과로 어떠한 부작용도 일어나지 않음을 관찰할 수 있다. 이러한 측면은 그렐린 존재와 관련한 질환 및/또는 장애의 치료를 위해 사용되고 있는 사실상 모든 기타 화합물의 L핵산으로 한정되지 않는 것이다. 특이적으로 왓슨와 크릭의 염기 결합과는 다른 메커니즘을 통한 목표 분자와 결합을 하는 L-핵산 또는 L-뉴클레오티드로 일부 또는 온전히 구성되는 압타머 (aptamer), 특히, 상기 목표물질과 압타머 (aptamer)의 결합과 관련되는 압타머의 일부분을 갖는 압타머를 또한 스피에겔머 (spiegelmer)이라고 지칭한다.
또한, 본 발명의 핵산은 그 핵산이 D핵산, L핵산 또는 D, L핵산으로 존재하는가 여부 또는 DNA 또는 RNA인가 여부와 상관없이 단일 가닥 (single strand) 또는 이중 가닥 (double strand) 핵산으로 존재할 수도 있는 것도 본 발명의 범주 내이다. 전형적으로, 본 발명의 핵산은 일차원 구조에 기인한 한정된 이차원 구조 (defined secondary structure)를 나타내는 단일 가닥 핵산으로서, 삼차 구조 (tertiary structure)를 또한 형성할 수도 있다. 그러나 본 발명의 핵산은 서로 상보적인 또는 서로 일부가 상보적인 이중 가닥이 서로 잡종화된다는 의미에서 이중 가닥도 또한 포함될 수도 있다. 이러한 특성은 특히 핵산이 L형이 아닌 자연 발생의 D형으로 존재한다면 유리할 것으로 생각되므로 핵산에 안정성을 부여한다.
본 발명의 핵산은 변형가능 하다. 이러한 변형은 상기 핵산의 단일 뉴클레오티드와 관련될 수 있으며, 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 변형의 예는 그 중에서도, 다음의 문헌들, 즉, Venkatesan N. et al. Curr. Med. Chem. Oct; 10(19), pp.197391, 2003; Kusser, W. J. Biotechnol ., 74, pp.2738, 2000; Aurup, H. et al. Nucleic . Acids . Res ., 22, pp.204, 1994; Cummins, L.L. et al, Nucleic Acids Res, 23, pp.201924, 1995; Eaton, B.E. et al. Chem Biol, 2, pp.6338, 1995; Green, L.S. et al., Chem Biol., 2, pp.68395, 1995; Kawasaki, A.M. et al., J Med Chem, 36, pp.83141, 1993; Lesnik. E. A. et al., Biochemistry, 32, pp.78328, 1993; Miller, L.E. et al., J Physiol, 469, pp.21343, 1993에 개시되어 있다.
이러한 변형은 핵산을 구성하는 개별적인 뉴클레오티드의 2’위치에서의 수소 원자, 불소 원자 혹은 OCH3 또는 NH2이 될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 핵산은 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 LNA 뉴클레오티드로 구성되어 있다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 다중 분할된 핵산 (multipartite nucleic acid)일 수 있다. 본원에서 사용되는“다중 분할된 핵산(multipartite nucleic acid)”은 두 개 이상의 핵산 가닥으로 구성된 핵산이다. 상기 두 개 이상의 핵산 가닥은 목표 분자에 대한 리간드 (ligand)로 작용하는 기능 부위 (functional unit)를 형성한다. 이 두 개 이상의 핵산 가닥은 본 발명의 임의의 핵산으로부터 핵산을 두 개의 가닥으로 분할시키는 방법 또는 본 발명 핵산의 첫번째 부분에 상응하는 한 개의 핵산 합성, 즉 전체 핵산 (overall nucleic acid) 및 전체 핵산의 두 번째 부분에 상응하는 다른 한 개의 핵산을 합성하는 합성 방법으로 유래될 수 있다. 상기 분할 (cleavage) 및 합성 (synthesis) 방법 모두는 상기에서 예시한 바로 2개 이상의 가닥을 갖는 다중 분할된 핵산을 제조함에도 적용될 수 있음도 알아야 한다. 환원하면, 2개 이상의 핵산 가닥은 비록 다양한 핵산의 일부분 사이에 어느 정도의 상보적 구역이 존재한다 할지라도 서로 상보성 및 잡종화를 갖는 이중 가닥과는 전형적으로 구별된다는 것이다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 핵산이 매우 좋은 분해도 (Kd value) 범위를 갖는 다는 것을 발견했다. 더 상세하게, 완전한 박스 A 또는 박스 B가 아닌, 각각 최소한 2개의 뉴클레오티드를 갖는 박스 C1 또는 박스 C2, 최소한 6개의 뉴클레오티드를 갖는 박스 C 및 최소한 3개의 뉴클레오티드를 갖는 박스 E (예를 들어 SOTE)를 함유하는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)는 SOTC 보다 그렐린에 대하여 여섯 배수의 결합 친화력 (binding affinity)을 보였다 (도 18).
결합 상수 (binding constant)의 측정은 당업계에 잘 알려진 바와 같은 소위, 비아코아 장치 (biacore device)로 불리는 장치의 사용으로 가능하다. 또한, 본원에서 사용되는 친화도 (affinity)는 하기 실시예에 기재된 “평형 측정법 (equilibrium assay)”의 사용으로 측정될 수 있다. 본 발명의 경우에 있어서 그렐린인 목표 분자에 따른 핵산간의 결합 강도 (intensity of the binding)를 표시하기 적합한 측정치는 당업계에 잘 알려진 측정 방법과 같은 소위 “Kd 치 (Kd value)”이다.
본 발명에 따른 핵산은 특정한 Kd 치에 의해 특징화될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산의 Kd 치는 1 μM 이하이다. 약 1 μM 정도의 Kd 치는 목표 분자에 대한 핵산의 비특이적 결합 (nonspecific binding)으로 특정된다고 간주된다. 당업자에게 인지된 것인 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산과 같은 화합물군의 Kd 치가 일정 범위 내에 존재함은 인지될 것이다. 상기한 약 1 μM 정도의 Kd 치는 Kd 치의 바람직한 상한치에 해당한다. 바람직한 목표 물질 결합 핵산의 Kd 치 하한선은 약 10 pM (picomolar) 또는 그 이상일 수 있다. 본 발명에서 그렐린과 결합하는 개별적인 핵산의 Kd 치는 바람직하게 이 범위 내에 속함도 본 발명의 범주 내이다. 바람직하게는 이 범주 내의 임의의 첫 번째 숫자로 및 이 범주 내의 임의의 두번째 숫자를 선택함으로서 바람직한 범위가 정의될 수 있다. 바람직한 상위 값은 0.25 μM, 0.1 μM 또는 0.01 μM이며, 바람직한 하위 값은 100 nM, 10 nM, 1 nM 또는 0.05 nM이다.
본원에서 개시된 본 발명의 핵산은 일부분, 바람직하게는 높은 분자랑 부위 및/ 또는 핵산의 특성, 동물 신체, 바람직하게는 인체 내에서 그들 중에 체류 시간을 통하여 핵산의 특성을 변형시키는 부위를 포함함도 본 발명의 범주 내이다. 상기 변형의 특정 바람직한 구현예는 본 발명에 따른 PEG화 반응 (PEGylation) 및 HES화 반응 (HESylation)이다. 본원에서 사용되는 PEG는 폴리(에틸렌 글라이콜) (poly(ethylene glycol))의 약어이고 HES는 히드록시에틸 전분 (hydroxyethyl starch)의 약자로 사용된다. 본원에서 바람직하게 사용되는 PEG화 반응은 본 발명에 따른 핵산에 부착되어 있는 PEG부위로 구성되는 변형과 같은 핵산의 변형이다. 본원에서 바람직하게 사용되는 HES화 반응은 본 발명에 따른 핵산에 부착되어 있는 HES부위로 구성되는 변형과 같은 핵산의 변형이다. 상기 변형뿐만 아니라는 상기 변형법을 이용하여 핵산을 변형하는 제조방법은 유럽특허출원 EP 1 306 382호에 개시되어 있으며, 이 문헌의 개시내용은 본원에서 참고로서 그 전체를 인용하는 것이다.
바람직하게는, 높은 분자량 부위를 함유하거나 구성하고 있는 상기 변형체의 분자량은 구체적으로 매우 높은 분자량 부위인 PEG의 경우에는, 약 2,000 내지 200,000 Da이며, 바람직하게는 40,000 내지 120,000 Da이며, 구체적으로 매우 높은 분자량 부위인 HES의 경우에는 바람직하게는 약 3,000 내지 100,000 Da, 보다 더 바람직하게는 5,000 내지 60,000 Da이다, HES 변형의 제조방법은 독일특허출원 제 DE 1 2004 006 249.8호에 개시되어 있으며, 이 문헌의 개시내용은 본원에서 참고로서 그 전체를 인용하는 것이다.
어떠한 이론에 국한되지 않은 범위 내에서, 배출 역학 (excretion kinetic)은 본 발명에 따른 핵산을 중합체 (polymer)와 같은 고분자량 부위, 더욱 상세하게는, 본원에 명시된 생체내에 수용이 가능한 폴리머로 핵산을 변형시킴에 따라 변화가능할 것이다. 더욱 상세하게는, 상기의 변형된 본 발명 핵산의 증가된 분자량 또는 핵산, 특히 L형인 경우에 대사공정의 대상이 되지 않는 핵산으로 기인하는 경우에 생체내 바람직하게는 포유류의 생체, 더욱 바람직하게는 인체 내에서의 배출이 감소한다. 상기 배출은 신장을 통해 전형적으로 일어나므로, 본원 발명자들은 상기 변형된 핵산의 사구체의 여과속도가 이와 같은 높은 분자량의 변형을 거치지 않아 결과적으로 생체 내의 체류시간이 증가되는 이러한 고분자량의 변형체를 갖지 않은 핵산과 비교시에 현저하게 감소된다. 이와 연관지어, 본 발명에 따른 핵산의 특성이 상기와 같은 높은 분자량 변형에도 불구하고 불리한 영향을 받지 않음은 매우 두드러진 사실이다. 지금까지, 본 발명에 따른 핵산은 정상인 경우는 약학 활성 성분으로부터 기대할 수 없는 예를 들어 지체된 방출을 제공하기 위해 지체된 방출속도를 제공하는 약학적 제형이 필수적이지는 않다는 것과 같은 놀라운 특성을 갖는다. 오히려 높은 분자량 부위를 함유하고 있는 변형된 본 발명에 따른 핵산은 서방형 (sustained release formulation)으로서 즉시 사용가능하다.
그러나, 본원에서 개시된 핵산은 임의의 변형 및 특히 예를 들어, PEG화 반응 또는 HES화 반응과 같은 비 고 분자량성 변형체를 포함하고 있지 않음도 본 발명의 범주 내이다. 이러한 구현예는, 투여 후 체내로부터 핵산의 신속한 신장 청소율 (fast clearance)이 요구됨이 바람직하다. 상기의 신속한 신장 청소율은 본 발명에 따른 생체내 이미징 (in vivo imaging) 또는 핵산 또는 이를 포함한 약제를 이용한 일시적 식욕 억제 (temporary appetite suppression)의 경우에 요구될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산으로 본원에서 지칭되는, 본 발명의 핵산 및/또는 본 발명에 따른 길항제들은 약제의 생성 또는 제조에 이용될 수 있다. 상기 약제는 적어도 하나 이상의 본 발명 핵산을 포함하는데, 임의적으로 추가의 약학적 활성 화합물을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 본 발명 핵산은 바람직하게는 핵산 그 자체가 약학적 활성 화합물로서 작용하는 것이다. 바람직한 구현예로서, 상기 약제는 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 물, 완충액, PBS, 글루코스 수용액, 바람직하게는 5% 포도당 염 조절 수용액, 전분, 당, 젤라틴 또는 기타 임의의 허용되는 담체 물질 등을 들 수 있다. 상기 담체들은 일반적으로 당업계에 널리 알려져 있다.
본 발명의 추가의 구현예로서, 상기 약제는 추가의 약학 활성 성분을 포함하는 것이다. 이러한 상기의 추가의 약학 활성 성분은 식욕을 저해한다고 알려져 있으며, 바람직하게는, PYY345, CCK, 레틴 (leptin) 및 인슐린 (insulin)을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것이다. 선택적으로 또는 부가적으로, 이러한 상기 추가의 약학 활성 성분은 본 발명에 따른 추가적인 핵산이다. 호환적으로, 상기 약제는 그렐린이 아닌 목표 분자와 결합하거나 또는 본 발명에 따른 어느 하나의 핵산과 다른 기능을 나타내는 하나 이상의 핵산을 함유하는 것이다. 본 발명의 구현예로서, 이러한 핵산은 옥타노일산 부위가 없는 그렐린과 결합하는 것이다.
이러한 상기 약제가 사용될 수 있는 치료 및/ 또는 예방을 위한 질환 및/ 또는 질환으로는 이에 제한되지는 않으나, 비만증, 에너지 균형 조절, 식욕 및 체중, 섭식 장애, 당뇨, 포도당 대사, 종양, 혈압, 심혈관계 질환, 말단 비대증 및 기타 성장 호르몬의 불균형을 들 수 있다. 당업자에 의해 인지될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 핵산은 그렐린에 대한 길항제를 필요로 하는 환자에게 상기 길항제가 투여되고, 상기 길항제가 이러한 상기 질환 및/ 또는 장애의 원인을 제거하는데 적합하거나 적어도 상기 질환 및/ 또는 장애를 경감시킬 수 있는 모든 질환에 실질적으로 사용될 수 있다. 상기 효과는 이에 제한되지는 않으나, 비만증, 에너지 균형 조절, 식욕 및 체중, 섭식 장애, 당뇨, 포도당 대사, 종양 치료, 혈압, 심혈관계 질환, 말단 비대증 및 기타 성장 호르몬의 불균형을 들 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 ‘에너지 균형의 조절 (regulation of energy balance)’은 질환으로서 간주된다. 보다 상세하게는, 상기 용도는 그렐린에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 받으며, 그렐린의 생체이용율 (bio-availibility)의 감소가 요구되는 에너지 균형의 조절과 관련된 모든 질환의 치료를 위함이다. 상기와 동일하게 당 대사, 혈압, 식욕 및 체중에도 적용할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산을 이용하여 전신적(systemic) 또는 국소적(local) 적용수단으로 적용가능하고 치료가능한 추가적인 질환은 뇌하수체 종양 (pituitary tumors), 말단 비대증 (acromegaly), 중추 쿠싱 증후군 (central Cushing’s syndrome), 부신 쿠싱 증후군 (adrenal Cushing’s syndrome), 부종양 쿠싱 증후군 (paraneoplastic Cushing’s syndrome), 부신피질 쿠싱 증후군 (ectopic Cushing’s syndrome), 부신 종양 (adrenal tumor), 스트레스 (stress), 고코티솔증 (hypercortisolism), 심장 기능 부전 (cardiac insufficiency), 심근경색 (cardiac infarction), 뇌졸중 (stroke), 부신피질 부전증 (adrenocortical insufficiency), 저혈압 (hypotonia), 대동맥판 협착증 (aortic stenosis), 폐 긴장항진 (pulmonal hypertonia), 수축성 심낭염 (contsrictive pericarditis), 감염성 질환 (infectious diseases), 감염성 독성 저혈압 (infectious toxic hypotonia), 저혈량증 (hypovolemia) 및 저나트륨증 (hypronatriemia)을 포함하는 군으로부터 선택가능하다.
상기 약제는 원칙적으로 상기 질병의 치료를 위한 약제의 사용과 관련된 어떠한 질병의 예방을 위해 선택적으로 또는 추가적으로 사용될 수 있음도 본 발명의 범주 내이다. 이를 위한 개개의 마커 (marker)는 예를 들어 콜레스테롤과 같은 심혈관계 위험 인자, 낮은 운동 활동(low aerobic activity) 또는 체중 관리에 필수적인 일반 요소군를 구성하고 있는 군으로부터 선택된 그룹으로 선택되는 것이다.
본 발명에 따른 약제는 원칙적으로는 당업자에 잘 알려진 어떠한 형태로든 투여할 수 있다. 바람직한 투여방법은 전신 투여이며, 보다 바람직하게는 주사투여 방법이다. 선택적으로, 상기 약제는 국소 투여가 가능하다. 다른 투여 방법으로는 근육 투여, 복강 투여, 피하 투여, 경구 투여 또는 비강 투여, 바람직하게는 효능을 유지하면서도 최소한의 공격성을 가진 투여 방법들이다.
본 발명의 추가적인 양태는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산, 및 바람직하게는 약학적으로 허용된 결합제 (binder)를 함유한다. 상기 결합제는 당업계에 공지 및/ 또는 사용되는 어떠한 결합제가 될 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 결합제는 본원에 개시된 약제의 제조와 연관하여 설시한 바와 같은 임의의 결합제이다. 본 발명의 추가적인 구현예로서, 상기 약학 조성물은 추가의 약학 활성 성분을 포함하는 것이다.
본원에 개시된 약제는 본원에 개시된 상기 약학 조성물을 구성함은 본 발명의 범위 내이다.
본 발명의 추가적인 양태는 약학적 유효량의 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산을 투여함을 포함하는 상기 치료를 필요로 하는 객체의 치료를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 구현예로서, 상기 객체는 본원에 개시된 임의의 질병, 특히, 본 발명에 따른 임의의 핵산을 약제 제조에 사용하기 위한 용도와 관련하여 개시한 임의의 질환으로 고통받거나, 이러한 질환으로 전개될 가능성이 큰 것이다.
본 발명에 따른 길항제 뿐만 아니라 핵산은 약제 또는 약제 제조뿐만 아니라, 미용적 목적, 상세하게는 그렐린의 비만증과 관련한 미용상의 목적으로 사용가능함도 본 발명의 범주 내이다. 동일한 목적으로, 본 발명에 따른 길항제뿐만 아니라 상기 핵산도 체중 조절용 및/ 또는 식욕 조절용으로서의 수단인 식품첨가제로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 본 발명에 따른 길항제뿐만 아니라 상기 핵산을 포함하는 조성물은 상기에 언급한 어떠한 목적을 위하여 사용될 수 있다.
상기 본 발명 핵산은 나아가 신약 설계를 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다. 기본적으로 두 가지 가능한 접근 방법이 있다. 그 하나는 화합물 라이브러리 스크리닝법 (screening of compound libraries)으로서, 저분자량 화합물 라이브러리가 바람직하다. 본 발명의 구현에로서 상기 스크리닝법은 고 처리량 스크리닝법(high throughput screening)이다. 바람직하게 고 처리량 스크리닝법은 목표 기초 어세이법으로서 화합물의 신속하며, 효율적인 시행-및-착오 평가법(trial-and-error evaluation)이다. 가장 바람직하게는 상기 분석법은 변색 분석법 (colormatic measurement)에 의해 수행되는 것이다. 이와 관련하여 사용된 라이브러리는 당업계에 잘 알려져 있다.
선택적으로, 본 발명에 따른 상기 핵산은 이론적 신약 설계법 (rational design of drugs)에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이론적 신약 설계법은 약학적 선두 구조의 설계이다. X선 결정학 (Xray crystallography) 또는 핵자기공명분광법 (nuclear magnetic resonance spectroscopy)의 전형적인 방법으로 동정되는 목표물질의 삼차원 구조로부터 시작하여, 컴퓨터 프로그램들이 다수의 상이한 화학구조를 담고 있는 데이터베이스를 통한 검색에 이용된다. 컴퓨터를 통해 선별이 이뤄지며, 동정된 화합물들은 실험실에서 연속적으로 시험될 수가 있다.
상기 이론적 신약 설계법은 본 발명에 따른 임의의 핵산으로부터 시작될 수 있으며, 화학구조, 바람직하게는 본 발명 핵산 구조와 유사하거나 또는 본 발명 핵산 구조의 결합 매개 부위와 동일한 삼차원 구조로 전개된다. 어떠한 경우라도, 그러한 구조는 본 발명 핵산과 동일 내지 유사한 결합 특성을 나타낸다. 상기 이론적 신약 설계법상의 추가적 단계 또는 대체 단계의 일환으로서, 신경전달물질에 결합하는 핵산의 일부 결합부위의 바람직한 삼차원 구조는 뉴클레오티드 및 핵산들과는 상이한 화학물질군에 의하여 모방 설계된다. 이러한 모방 설계법에 의해, 상기 핵산과 상이한 화합물이 설계될 수 있다. 상기 화합물들은 바람직하게는 저분자 물질 또는 펩티드이다.
화합물 라이브러리 스크리닝법의 경우에, 당업자에게 공지된 경쟁적 어세이법을 사용하여, 적당한 그렐린 유사체, 그렐린 효현제 (agonist) 또는 그렐린 길항제 등의 화합물들이 발견될 수 있다. 상기 경쟁적 어세이법은 하기와 같이 수행될 수 있다. 본 발명의 본 발명 핵산, 바람직하게는 L핵산에 결합하는 목표물질인 스피에겔머는 고체상에 결합된다. 그렐린 유사체를 동정하기 위하여 표지된 그렐린을 어세이법에 추가가능하다. 잠재적 효능을 갖는 유사체는 스피에겔머와 결합하는 그렐린 분자와 경쟁하여 각각 표지에 의해 획득되는 신호상의 감소를 수반할 것이다. 효현제 또는 길항제에 대한 스크리닝은 당업계에 공지된 세포 배양 어세이법의 사용과 관련될 수 있다.
본 발명에 따른 키트 (kit)는 적어도 하나 이상의 본 발명 핵산을 포함할 수 있다. 추가적으로, 상기 키트는 적어도 하나 이상의 양성 또는 음성 대조군을 포함할 수 있다. 양성 대조군으로는 예를 들어, 그렐린, 특히, 본 발명 핵산이 액상 형태에서 선택되거나 결합되는 것일 수 있다. 음성대조군으로는 예를 들어, 그렐린과 유사한 생물리학적 특성을 갖으나, 본 발명 핵산에 의해 인식되지는 않는 펩티드일 수 있다. 게다가, 상기 키트는 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 건조, 동결건조 또는 액체에 용해된 형태로 다양한 성분들이 키트에 포함될 수 있다. 상기 키트는 상기 하나 이상의 성분이 번갈아 포함될 수 있는 하나 이상의 컨테이너(container)를 포함할 수도 있다. 보다 구체적인 구현예로서, 상기 키트는 키트를 사용하는 방법에 관한 사용자 정보를 제공하는 지시내용 또는 지시내용 용지 및 이의 다양한 요소를 포함하는 것이다.
본 발명은 더 나아가 특성, 구현예 또는 장점을 나타내는 하기의 도면, 실시예 및 서열 목록들에 의하여 상세하게 설명된다.
도 1은 인체의 그렐린와 결합하는 RNA 리간드 서열의 정열을 나타낸 도이고;
도 2는 알려진 서열 SOTC (B11 trc) 대 절단된 업타머의 그렐린 결합에 대한 경쟁적 어세이를 나타낸 도이며;
도 3은 WO 2004/013274 A2에 공개된 RNA 리간드의 선택되어진 서열의 정렬을 나타낸 도이고;
도 4는 “RNA 폴드 (RNA fold)” 프로그램 (Hofacker et al., 1994, Monatsh. Chem 125: 167188)을 이용하여 계산된 이차 구조, 즉 그렐린과 결합하는 RNA 스피겔머 복제 SOTC의 계산된 이차 구조를 나타낸 도이며;
도 5는 “RNA 폴드 (RNA fold)” 프로그램 (Hofacker et al., 1994, Monatsh. Chem 125: 167188)을 이용하여 계산된 이차 구조, 즉 그렐린 결합하는 RNA 스피겔머 복제 SOTD000의 계산된 이차 구조를 나타낸 도이고;
도 6은 “RNA 폴드 (RNA fold)” 프로그램 (Hofacker et al., 1994, Monatsh. Chem 125: 167188)을 이용하여 계산된 이차 구조, 즉 그렐린 결합하는 RNA 스피겔머 복제 SOTD의 계산된 이차 구조를 나타낸 도이며;
도 7은 “RNA 폴드 (RNA fold)” 프로그램 (Hofacker et al., 1994, Monatsh. Chem 125: 167188)을 이용하여 계산된 이차 구조, 즉 그렐린 결합하는 RNA 스피겔머 복제 F12의 계산된 이차 구조를 나타낸 도이고;
도 8은 절단 (truncation) 또는 이론적 설계 실험 (rational design experiments) 의 결과인 SOTD000 유도체의 정렬을 나타낸 도이며;
도 9는 실온에서 스피에겔머 SOTC, SOTD000 및 그의 변이체들에 의한 그렐린유도된 칼슘 방출의 저해의 원포인트 측정법 (onepoint measurement); 세포들은 실온에서 전배양된 5 nM 그렐린으로 처리 후 다양한 농도의 스피에겔머 SOTC, SOTD000 및 D000의 및 이들의 변이체들과 함께 처리함으로서 자극되고; 그 결과는 스피에겔머가 처리가 되지 않은 신호로 표준화된 형광신호의 퍼센트를 나타낸 도이고;
도 10은 D그렐린 결합 RNA 스피에겔머 클론 SOTD109의 추정적 이차 구조를 나타낸 도이며;
도 11은 실온에서 스피에겔머 D109 및 5’PEG화된 D109에 의한 그렐린유도된 칼슘 방출의 저해를 위한 농도 의존적 커브를 나타낸 도이고; 세포들은 실온에서 5 nM 그렐린으로 처리 후 다양한 농도의 스피에겔머 D109 및 5'PEG화된 D109와 함께 처리함으로서 자극되고; 결과는 스피에겔머가 처리가 되지 않은 신호로 표준화된 형광신호의 퍼센트를 나타내며; 스피에겔머 D109 및 그의 변형체가 동일한 IC50 값으로 그렐린유도된 칼슘 방출을 저해함을 나타나며;
도 12는 “RNA 폴드 (RNA fold)” 프로그램 (Hofacker et al., 1994, Monatsh. Chem 125: 167188)을 이용하여 계산된 이차 구조, 즉 그렐린 결합하는 RNA 스피겔머 복제 SOTE의 계산된 이차 구조를 나타낸 도이며;
도 13은 세포 배양 실험에 의해 시험된 스피에겔머 SOTE 절단된 변형체의 결합력 분석을 나타낸 도이고;
도 14는 그렐린 결합 RNA 스피에겔머 SOTE19의 추정적 이차 구조를 나타낸 도이고;
도 15는 D그렐린 결합 RNA 스피에겔머 SOTE21의 추정적 이차 구조를 나타낸 도이며;
도 16은 D그렐린 결합 RNA 스피에겔머 SOTE33의 추정적 이차 구조를 나타낸 도이고;
도 17은 D그렐린 결합 RNA 스피에겔머 SOTE25의 추정적 이차 구조를 나타낸 도이며;
도 18은 D그렐린 결합 RNA 클론 SOTC 또는 SOTE의 Kd 치를 나타내는 비아코어 2000 센스올감 (Biacore 2000 sensoragrams)을 나타낸 도이고;
도 19는 37℃에서 스피에겔머 SOTE, SOTC195'아미노기, SOTE195'PEG 또는 SOT-D109에 의한 그렐린유도된 칼슘 방출의 저해를 위한 농도 의존적 커브를 나타낸 도이며; 세포들은 실온에서 2 nM 인체 그렐린으로 처리 후 다양한 농도의 스피에겔머 SOTE, SOTC195'아미노기, SOTE195'PEG 또는 SOT D109와 함께 처리되어 자극되고; 결과는 스피에겔머가 처리가 되지 않은 신호로 표준화된 형광신호의 퍼센트를 나타내며; 스피에겔머 E19 및 그의 변형체들은 약 4nM의 IC50 값으로 그렐린유도된 칼슘 방출을 저해하는 것으로 나타나며;
도 20A는 그렐린 결합 스피에겔머의 특성이 되는 서열 박스의 정의를 나타내는 도이고;
도 20B는 Fig. 20A의 한 변형을 나타낸 도이며;
도 20C는 Fig. 20A의 한 변형을 나타낸 도이고;
도 20D는 Fig. 20A의 한 변형을 나타낸 도이며;
도 21은 SOTD109, SOTE, SOTE19, SOTE21, SOTE33 또는 SOTE25의 서열을 나타내고;도 22는 항그렐린 (antighrelin) 스피에겔머 SOTE195'PEG에 의한 외인성 그렐린 투여 후의 성장호르몬 방출의 저해를 나타낸 도이다.
하기의 예들은 단지 본 발명의 설명의 목적을 설명하고자 하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 제한하고자 함이 아니다.
실시예 1. 염기서열들에 결합하는 그렐린
독일특허출원 DE 제 10349441.3호에 기재된 것으로부터 유래한 과학기술을 사용하여 실험관 내에서 인간 그렐린쪽으로 유도되는 RNA 선택법을 수행하였다. 농축된 dsDNA 분자들은 복제되었고 배열되었다. 그 서열분석 결과는 도 1에 나타내었다.
모든 서열들은 공지된 그렐린결합 서열 SOTC (B11trc; 특허출원 제 WO2004/013274 A2호 참조)의 그렐린결합 모티프 A를 포함하고 있다. 23개의 클론들 중에서 오직 4개만이모티브 A가 그 염기서열의 3’말단에 위치하였다. 19개의 서열 내에서 모티프 A가 그 클론들의 5’말단에 위치하였다. 부가적으로 모티프 D라 불 리는 모티프는 모티프 A의 3’말단에 위치하였다.
서열들의 결합 특성
다른 위치에서 변이를 나타내는 15개의 클론들 (도 1 참조)을 실시예 2에서 기재된 “경쟁 어세이법”을 이용하여 37℃에서 서열 실험을 하기 위해 선택되었다. 참고문헌에 기재된 바와 같이, 방사능 표지된 압타머 SOTC (B11trc)가 사용되었다. 몇 가지 후보물질들은 한 층 낮은 KD 또는 “경쟁 어세이법”에서는 분화될 수 없는 고등의 활동적인 구조의 양을 나타내는 SOTC (B11trc)보다 D그렐린에 더 강하게 결합하였다. 클론 MSP2G2, MSP2D2, MSP2A2, MSP2H3은 대조군 클론 SOTC (B11trc), 클론 MSP2E1, MSP2B1, MSP2F1, MSP2C3, C2, MSP2A4 보다 훨씬 더 우수한 결합력을 보였으며 MSP2B2는 더 좋은 결합력을 가지고 있는 것 같았다. SOTC (B11trc)와 비교한 유사한 결합결과는 클론 MSP2E3, MSP2A3, MSP2H2 및 MSP2D1에서도 측정될 수 있을 것이다. (도 2; 평가는 도 1 참조). 그러므로 상기의 가장 바람직한 클론들은 평행 어세이법에서 압타머로서 그 활성을 시험하였고 37℃ 세포 배양 어세이법에서는 스피에겔머로서 그 활성을 시험하였다 (프로토콜은 실시예 2 참조). 그 결과는 도 1에 요약하여 나타내었다. 클론 MSP2D2, MSP2F1, MSP2C2, MSP2A4 및 MSP2B2는 37℃에서 수행한 평행 어세이법에서 2234 nM의 KD 값 (약 60% 활성 분자)을 나타냈으며 및 37℃에서 수행한 세포 배양실험법에서 3.08.0 nM의 IC50값을 나타내었다. 비교하면, SOTC (B11trc)의 IC50값은 37℃에서 20 nM로 검출되 었고, SOTC (B11trc)의 KD값은 37℃ (제 WO2004/013274 A2에서는 상온에서의 SOTC의 IC50값이 약 5 nM으로 기재되어 있다)에서 100 nM으로 측정되었다. 그 결과는 스피에겔머 MSP2F1, MSP2C2 및 MSP2D의 생물학적 활성이 37℃에서 SOTC (B11trc)보다 대략 5배까지 더 우수할 수 있는 것으로 나타났다. 연속적인 절단 실험을 하기 위해서, 클론 MSP2F1 (IC50: 4.0 nM)가 선택되었다 (2차원 구조 예측, 도 2 참조).
도 1에서 나타난 임의의 서열들은 본원 발명에 따른 핵산 뿐만 아니라, 목표물질에 여전히 결합능을 갖고 있는 이들의 절단된 형태도 포함하고 있는 것으로 간주되어야 할 것이다.
실시예 2. 서열들의 결합특성
2.1 평형 결합 어세이법 ( equilibrium binding assay )을 이용한 방사선표지 압타머들의 서열
본원에 개시되어 있으며, 도 1에 보다 상세하게 기록된 대부분의 클론들은 “평행 결합 어세이법” 이용하여 D그렐린에 대한 그들의 결합반응에 대해서 방사선표지 압타머 (D-RNA)를 이용하여 그 서열을 평가하였다.
인간 D그렐린에 대한 상기 분자들의 결합반응 서열을 평가하는 것은 수행되었다. 이 목적을 위해, 본원에 개시된 표준 프로토콜을 사용하여 동정된 압타머들 을 도 1에 도시한 바와 같이 절단된 압타머 (프라이머 결합 부위가 없는)들로 합성하였다.
하기한 압타머 염기서열들은 하기의 방법을 사용하여 5’말단에 γ32PATP로 표지되었다.
구성요소 [최종]
올리고뉴클레오티드 5μM
T4지향(forward) 반응완충액(Invitrogen) 1x
T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(Invitrogen) 10U/10μl반응부피
[γ32P]ATP 1μl/10μl반응분량
이 반응은 37℃에서 1시간동안 배양되었다. 하기에서 방사선표지 압타머들을 젤상에서 정제하였다.
2 내지 5 pM의 방사선 표지 RNA들을 Ca＋＋ 및 Mg＋＋ 이 없는 선택완충액 (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM KCl을 포함하고 인체 혈액에서 생리학적 조건하에서 제조, pH 7.4로 37℃에서 조정)에서 95℃에서 3분 동안 변성하였고, 37℃에서 Ca＋＋ 및 Mg＋＋의 최종농도가 1 mM가 되도록 첨가한 후 0.4 내지 3000 nM 농도범위의 비오틴 결합 인간 D그렐린과 함께 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 연속하여, 일정량의 뉴트르아비딘 (NeutrAvidin) 아가로즈를 매트렉스 (matrix)로서 첨가되었고 RNA: 펩티드 복합체를 37℃에서 30분 이상 진탕하였다. 결합된 펩티드를 갖는 매트릭스 및 튜브를 침강시켰고 상등액을 제거하였으며, 매트릭스를 100 μl 선택 완충액으로 세척하였고 결합성 및 비결합성RNA간의 차이는 베크맨 쿨터 (Beckman Coulter)를 사용하여 방사성 활성 (radioactivity)을 측정함으로서 결정하였다. 계산치로부터, 대조군 (0 nM D그렐린)을 기준 (background)으로서 공제하였다. 이 평형 상수는 소프트웨어 프로그램 “GraFIT" (버젼 4.0.10., Erithacus Software Ltd., Surrey, UK)을 사용하여 계산하였다.
2.2 경쟁 어세이법 (competition assay)을 이용한 압타머들의 서열
이미 공지된 그렐린결합 서열 SOTC (B11trc; 제 WO2004/013274 A2호 참조)에 대한 클론들과 비교하기 위해, SOTC를 본원에 개시된 표준 프로토콜 (실시예 4)을 사용하여 압타머 (DRNA)로서 합성하였다. 이 압타머 염기서열은 본원에 개시된 표준 실험방법을 사용하여 γP32ATP으로 5’말단에 표지하였다.
방사선표지 SOTC 및 동정된 클론들 (DRNA)은 평형 어세이법에 개시된 바와 같은 방법으로 제조하였다. 이 경쟁 어세이법은 20 nM 펩티드 농도 (그렐린)에서 수 행하였다. 이후 균등량의 방사선 표지 SOTC 및 2개의 다른 농도 (40 nM 및 200 nM)의 압타머를 시험하였다 (결과는 도 2에 도시). 이 경쟁 어세이법은 평행 어세이법과 유사하게 수행하였다.
2.3 그렐린결합 스피에겔머들에 의한 그렐린유도 칼슘 분비 저해
인간 그렐린 수용체 (GHSR1a; 입수처: Euroscreen, Gosselies, Belgium)를 발현하는 안정된 형질전환 CHO 세포를 투명한 바닥의 검정색 96웰 플레이트 (Greiner)에 57x 104 세포수/웰의 농도로 분주하였고, 100 units/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 400 μg/ml 제네티신 (geneticin) 및 2.5 μg/ml 훈기존 (fungizone)을 함유한 UltraCHO 배지 (Cambrex) 내에서 37℃ 및 5% CO2의 조건하에서 하룻밤동안 배양하였다.
스피에겔머들을 0.2 ml의 낮은 양상 (low profile) 96웰 플레이트에서 15분 내지 60분 동안, 상온 또는 37℃에서 5 mM 프로베네시드 (probenecid) 및 20 mM HEPES (CHOU+)를 함유한 UltraCHO 배지 내의 인간 그렐린과 함께 배양하였다.
칼슘 지시약 (Dye fluo4)를 첨가하기 전에, 세포들을 200 μl CHOU+로 1회 세척하였다. 그 다음에 50 μl의 지시약 염색용액 [10 μM fluo4 (Molecular probe사), CHOU+내 0.08% 플루로닉 127 (Molecular probe사)]를 첨가하였고, 세포들을 37℃에서 60분 동안 배양하였다. 그 후 세포들을 180 μl CHOU+로 3회 세척하였다. 마지막으로 90 μl CHOU+를 웰마다 첨가하였다. 그 뒤, 그 0.2 ml 낮은 양상 96튜브 플레이트를 37℃에서 미리 가열된 기기 (Fluostar Optimal multidetection plate reader; BMG)에서 배양하였다.
형광신호의 측정은 주입펌프들이 장착된 플루오스타 다검출 플레이트 리더기 (Fluostar multidetection plate reader; BMG)에서 485 nm 여기 파장 및 520 nm 방출 파장에서 수행하였다.
여러 시료를 동시에 측정하기 위하여, 96플레이트의 수직 일렬 (perpendicular one row)로 이루어진 웰들을 동시에 기록하였다. 기저선 결정을 위하여 4초의 시간 간격으로 초기에 3회 측정하였다. 그 후 기록을 중단하였고, 플레이트를 기기 밖으로 이동시켰다. 다채널피펫 (multichannel pipette)을 이용하여, 10 ㎕의 자극 용액 (stimulation solution)을 상기 웰들에 첨가한 후, 이 플레이트를 다시 기기 안으로 이동시킨 다음 측정을 계속하였다. 4초의 시간 간격으로 총 20회 기록이 수행되었다.
각각의 웰에 대하여, 최대 형광치 및 기저선 수치 간의 차이를 측정하였고 그렐린 농도 또는 스피에겔머에 의한 칼슘 방출 억제 실험에서 스피에겔머 농도를 고려하여 도식화하였다.
2.4 표면 플라즈몬 공명 ( SPR ; Surface Plasmon Resonance ) 측정
D그렐린에 결합하는 압타머 특성을 개시되는 바와 같이 기기 (BlAcore 2000 instrument; BIAcore AB, Uppsals Sweden)를 사용한 SPR 실시간 동력학 분석기기 (SPR real time kinetic analysis)로 측정하였다.C말단에 바이오틴이 결합된 펩타이드의 100 RU (Flowcell 2) 및 300 RU (Flowcell 3)는 스트렙타비딘 (streptavidin)이 결합된 감지 칩 (BIAcore AB, Freiburg, Germany)상에서 고정시켰고, 0.1 μM 내지 1 μM의 농도범위의 시료들을 360초의 상호결합시간 (association time) 및 360(초)의 분해 시간 (dissociation)을 한정한 Kinject command를 사용하여 주입하였다. 플로우셀 (Flowcell) 1을 완충액 및 텍스트란 매트릭스 대조군으로 사용한 반면, 플로우셀 4 비특이적 D펩티드는 그 압타머의 비특이적인 결합을 결정하기 위해 고정화시켰다. 반응은 37℃에서 수행되었다. 소프트웨어 (BIAevaluation 3.0 software)로 데이터 분석을 하기 위해, 수식 (Langmuir 1:1 stochiometric fitting algorithm)을 사용하였다.
실시예 3. 그렐린 -결합 스피에겔머 모티프 ( motif )의 정의
3.1 SOTD000 의 절단
3.1.1 미리 선택된 스피에겔머 SOTD000의 말단 절단
도 3에서 나타난 그렐린결합 스피에겔머를 국제특허출원 제 WO2004/013274 A2호에 이미 제시된 바대로 수득하였다. 2차원 구조 예측으로 (최소 자유 에너지 배열 구조 [Hofacker et al., 1994, Monatsh. Chem 125:167188]), 5'- 및 3‘- 말단 사이에서 정준분자 내 염기쌍 (canonical intramolecular base pair)을 얻을 가능성은 모든 스피에겔머들에 적합함은 자명해졌다 (도 4 내지 7; 도 3의 밑줄친 염기들). 스피에겔머상의 이러한 구조적 요소들의 존재는 활성적 삼차원 구조의 올바른 접기 (folding)를 위해서 중요할 수 있으나, 경제적인 스피에겔머 합성을 위해서는 상기 분자들은 가능한 짧아야 할 것이다. 스피에겔머 SOTD000 (프라이머 결합 부위가 없는 SOT-R04-DR14-F7의 절단 버전)을 가장 긴 말단 나선을 형성할 가능성있는 가장 짧게 선별된 스피에겔머이므로 말단절단용의 기본으로 선택하였다.
10개 대신 8개 (SOTD108), 7개 (SOTD100) 및 6개 (SOTD104) 염기쌍들의 나선형 길이를 갖는 SOTD000의 절단된 변형체들을 (도 8) 합성하였고 실시예 2에서 기재된 세포 배양실험법으로 시험하였다 (도 9). SOTD10 4 (39mer)는 유의적으로 결합 활성을 소실한 반면에 SOTD100 (41mer) 및 108 (43mer)는 완전한 그레린길항적 양상 (ghrelin-antagonistic performance)을 유지하였다. G4가 제거된 SOTD104로부터 추가적인 절단물인, 변형체 SOTD106는 실질적으로는 불활성이었다. 놀랍게도, 선택된 모든 그렐린 스피에겔머들의 나선상에 존재하는 비조화된 G (nonmatched G)는 쉽게 제거되지 않을 수도 있다는 점이다. 그러나, 이는 그렐린 결합에 필수적인 것으로 나타났다.
3.1.2. SOTD100 및 108의 내부 삭제 변이체들 (internal deletion mutants)
도 3의 선택된 그렐린 결합자 (binders)들의 배열을 고려시에, 고도 변이 부위는 5‘ 말단에서 말단 나선에 일직선으로 근접한 모든 배열된 분자들에 존재하는 것처럼 보인다. 그렐린 결합자들의 추가적인 절단을 위해 이 뚜렷한 변이성을 이용하기 위하여, 가장 짧고 충분히 활성화된 SOTD의 변이체인 SOTD100 및 108를 추가적인 절단을 위한 기초로 사용하였다. 내부 SOTD100 변이체들인 경우에, 각각의 염기들이 쉽게 삭제된 반면, SOTD108 변이체들인 경우에는 각각의 염기들을 합성과정 동안 유연성이 있는 친수성 스페이서로 치환되었다. SOTD108의 파생물들인 SOTD109, 110 및 111 뿐만 아니라 SOTD100 및 그의 파생물들인 SOTD101 및 102를 실시예 2에 개시된 세포 배양물에서 시험하였다.
도 9에 제시된 바와 같이, 3개의 내부 뉴클레오티드가 아닌 2개의 내부 뉴클레오티드의 삭제는 활성 손실 없이 가능하였다 (SOTD101;102). 대조적으로, 스페이서 (SOTD109, 110, 111)로 치환되었을 때에 3개의 뉴클레오티드를 제거 할 수 있고, 상기 스페이서의 최적 위치는 SOTD109에서 실현되었다 (도 10).
40 kDa 부위을 갖는 5' 말단의 SOTD109 변형은 그렐린결합 활성에 대한 손실 없이 가능했다 (도 11 참조).
3.2 SOTE의 절단
하기에서는 선두 서열로 선택된 그렐린결합 서열 MSP2F1 (도 1 및 도 12)을 SOTE로 지칭함.
2차 구조 예측으로부터 (최소 자유 에너지 배열구조 [Hofacker et al., 1994, Monatsh. Chem 125:167188]), C30 및 G50 사이의 정준분자 내 염기쌍을 얻을 가능성은 스피에겔머 SOT-E에 대해서 자명해졌다 (도 12; 도 1에 밑줄 친 염기들). 스피에겔머 SOTE을 절단한 결과로 귀착하는 하기와 같은 실험방법을 개시한다. 모든 스피에겔머 SOTE의 절단된 변형체들의 활성을 세포배양실험으로 시험하였다 (실시예 2 참조).
3.2.1 스피에겔머 SOTE의 말단 절단
3' 말단의 6개의 뉴클레오티드는 그 분자의 다른 부분에 결합되지 않는 것처럼 보인다. 대조적으로, 5' 말단의 뉴클레오티드는 부분적으로 쌍을 이룰 수도 있다. 놀랍게도, 3' 말단은 결합의 감소 없이는 절단될 수 없었던 반면, 스피에겔머 SOTE014 (5’말단의 6개의 뉴클레오티드 절단)는 충분한 그렐린길항 활성을 유지하였다 (도 13).
3.2.2 스피에겔머 SOTE 의 내부 삭제 변이체들
도 1의 선택된 그렐린 결합자인 MSP2E3, MSP2G2, MSP2D2, MSP2A3, MSP2E1, MSP2B1, MSP2C3, MSP2C2, MSP2H2, MSP2A4 및 SOTE (집단 1) 배열을 고려하였을 때, 박스 D내에서의 변이 지역은 말단 및 나선 (SOTE에 있는 G36C43)에 일직선으로 근 접해 있는 모든 배열된 분자들에 존재하는 것처럼 보인다. 스피에겔머 SOTE의 2차 구조 예측은 4개의 뉴클레오티드 (A38U41; 도 12)의 루프 (loop)로 나타난다. 그렐린 결합자의 추가적인 절단을 목적으로 이 뚜렷한 변이성을 이용하기 위하여, 첫번째로 스피에겔머 SOTE의 각각의 염기들을 합성과정동안 유연성이 있는 친수성 스페이서로 치환하였다. 8개의 뉴클레오티드 (G36C43; SOTE008)가 아니라 6개의 뉴클레오티드 (U37A42;SOTE011)의 삭제는 활성손실 없이 가능하였다. 5' 말단 (G1-A6)에서의 절단결과물 및 유연성이 있는 친수성 스페이서에 의한 6개의 뉴클레오티드의 치환과의 조합은 56뉴클레오티드 스피에겔머 SOTE (도 12 참조)와 같은 세포배양 실험에서 동일한 IC50값을 나타내는 44뉴클레오티드 스피에겔머 SOTE019를 이끌었다 (도 14).
3.2.3 SOTE019 내의 서열 단편들의 재배열
서열들 MSP2A2, MSP2H3 및 MSP2D1 (도 1)로 표시되는 서열 가족 (sequence family) Ⅱ는 서열 가족 Ⅰ (SOT-E 포함)과 유사성을 갖는다. 이 서열상동성은 도 1의 박스 A (UAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUAC)로 강조되었다. 서열 가족 Ⅱ 박스 A는 약간 3' 말단에 위치한 반면에 서열 가족 Ⅰ 박스 A는 5’말단에 인접한다. 시험관 내 선택법 (in vitro selection) 및 스피에겔머 SOTE의 2차 구조 예측 결과로, SOTE019의 변이체를 박스 A가 5' 말단에 위치하도록 설계하였다. 이러한 목적으로, SOTE019 본래의 5’말단 및 3' 말단은 친수성 스페이서와 연결되었고 그 루프는 제 거되어 새로운 5’및 3' 말단이 생겼다 (변이체 SOTE021; 도 15 및 도 21). 놀랍게도, F21경우는 활성을 잃지 않았다. SOTE019, SOTE021 (SOT-E-33, 도 16 및 도 21) 및 SOTE25 (도 17 및 도 21)을 기초로 한 추가적인 절단은 그렐린길항 활성을 감소시키지 않고는 불가능하였다 (도 13 참조).
3.3 SOTC , SOTD -109 및 SOTE 의 비교
SOTC와 비교하여 스피에겔머 SOTE를 SPR (Surface Plasmon Resonance; 실시예 2 참조)방법으로 측정하였고 6배 더 우수한 KD 값을 나타냄을 확인하였다 (도 18). D109 (도 19 참조)와 비교하여 스피에겔머 SOTE로 세포배양 실험한 경우 (실시예 2)에서 동일하게 개선된 결합 (5배 더 우수)을 확인할 수 있었다. 동물체내에서의 체류 시간을 개선하기 위하여, 스피에겔머 SOTE10의 5’ 말단을 40kDaPEG 부위 (SOTE195'-PEG)로 변형시켰다. 스피에겔머 SOTE195'PEG는 세포배양 실험에서의 SOTE와 비교시에 유사한 결과를 나타냈고 (도 19 참조) 추가적으로 생체 내(in vivo) 활성이 증명되었다 (실시예 5; 도 21 참조).
3.4 그렐린 결합 스피에겔머 모티프의 정의
그렐린에 결합하는 모든 분자, 특히 본원에서 개시되는 옥타노일 산 측쇄를 갖는 그렐린은 그렐린 결합에 필수적인 25개의 뉴클레오티드 ("박스 A") 모티프가 존재하다는 것이 주요한 특성이다. "박스 A” 내의 25개의 뉴클레오티드 중 몇몇은 다른 염기들로 상호 교체되는 것 같다 (도 20A).
그렐린 결합 스피에겔머 내의 “박스 A"의 기능성을 위한 절대적으로 필요한 것은, 비접합 (non-pairing) 중앙에 위치한 구아노신(박스 B)을 갖는 나선형 구조를 형성하는 서열 5’ GUGAGG의 상보적인 가닥을 갖는 ”박스 A“의 3’말단의 5개 뉴클레오티드 (5’ CCUAC)의 잡종화 (hybridisation)이다. 박스 B내의 중앙의 구아노신의 삭제는 유의적인 결합 손실을 유발한다 ("박스 A로 정의된 나선”, 비접합 G; 도 20A). "박스 A” 에 근접한 3’말단, 즉 “박스 A로 정의된 나선”은 1개, 바람직하게 2개 이상의 비-한정된 (non-defined) 염기쌍으로 최소한 신장되어야 한다 (도 20A에서 "박스 C1” 및 “박스 C2”).
“박스 B"의 3’ 말단에서, 추가의 뉴클레오티드들이 결합에 필수적이다. 적어도 2개 이상의 뉴클레오티드 (바람직하게는 5' CA)가 결합에 필수적이다. 결합의 유의적인 개선은 이 위치 ("박스 D", 도 20A)에서 추가적으로 2개 이상, 최적으로 4개 뉴클레오티드를 부가하여 2, 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오티드를 포함하는 박스 D를 수득할 수 있다.
“박스 A"의 5’ 말단에서, 추가적인 뉴클레오티드들이 결합에 필수적이다. 적어도 한개 이상의 뉴클레오티드 (특히 U 또는 G)가 결합에 필수적이다. 결합의 유의적인 개선은 이 위치 ("박스 E", 도 20A)에서 2개 이상의 뉴클레오티드를 부가 하여 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오티드를 포함하는 박스 E를 수득할 수 있다.
만약 박스 D 및 E가 유연한 친수성 스페이서를 통해 연결된다면, 상기 스페이서는 또한 다양한 위치로 삽입될 수 있다 (도 8 참조; SOTD109, SOTD110 및 SOTD111).
놀랍게도, 이 한정된 서열성분들은 “박스 C1” 및 “박스 C2”가 박스 D 및 E 대신에 유연한 친수성 스페이스와 연결되었을 때 기능성을 갖는다.
변형체 1:
5’ Box C1 Box B Box D Spacer Box E Box A Box C2
변형체 2:
5’ Box E Box A Box C2 Spacer Box C1 Box B Box D
실시예 4. 압타머와 스피에겔머의 화학적 합성
화학적 고체상 합성
소량 합성법
압타머들을 문헌에 개시된 방법 (2’TBDMS RNA phosphoramidite 화학법; M.J. Damha, K.K. Ogilvie, Methods in Molecular Biology, Vol.20 Protocols for oligonucleotides and analogs, ed. S. Agrwal, p. 81114, Humana Press Inc. 1993)을 이용하여 합성기 (ABI 394 synthesizer; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 고체상에서 합성하여 생산하였다. DrA(NBZ), DrC(Ac), DrG(Nibu), DrU 및 헥산에틸린 글리콜 포스포라미다이츠 (hexaethylene glycol phosphoramidites)는 회사 (ChemGenes, Wilmington, MA.)로부터 구입하였다. 이 압타머들은 겔 전기영동기 (electrophorese)로 정제하였다.
비변형된 스피에겔머 (PEG화 반응이 없는)들은 문헌에 개시된 방법 (2'TBDMS RNA phosphoramidite chemistry; M.J. Damha, K.K. Ogilvie, Methods in Molecular Biology, Vol.20 Protocols for oligonucleotides and analogs, ed. S. Agrwal, p. 81114, Humana Press Inc.1993)을 이용하여 합성기(ABI 394 synthesizer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 고체상에서 합성하여 생산하였다. LrA (NBZ), LrC (Ac), LrG (Nibu), LrU 및 헥산에틸렌 글리콜 포스포라미다이츠는 회사 (ChemGenes, Wilmington, MA.)로부터 구입하였다. 압타머들은 겔 전기영동기로 정제하였다.
대량 합성법 및 변형법
변형된 스피에겔머 SOTE19를 문헌에 개시된 방법 (2'TBDMS RNA phosphoramidite synthesizer, M.J. Damha, K.K. Ogilvie, Methods in Molecular Biology, Vol. 20 Protocols for oligonucleotides and analogs, ed. S. Agrwal, pp81114, Humana Press Inc., 1993)을 이용하여 합성기 (AktaPilot100 synthesizer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 고체상에서 합성하여 생산하였다. LrA(NBZ), LrC(Ac), LrG(Nibu), LrU 및 헥산에틸렌 글리콜 포스포라미다이츠는 회사 (ChemGenes, Wilmington, MA.)로부터 구입하였다. 그 합성은 LriboC 변형 CPG (구멍 사이즈 1000; Link Technology, Glasgow, UK)상에서 시작하였다. 결합을 위해 (15분/사이클), 아세토니트릴에 용해된 0.3M 벤질티오테트라졸 (CMSChemical, Abingdon, UK) 및 아세토니트릴에 용해된 각각 0.1M 포스포라미다이츠 용액 3.5 당량을 사용하였다. 상기 스피에겔머의 5‘말단의 아미노기는 아미노헥실 포스포라미다이츠 (aminohexyl phosphoramidite; ChemGenes사)를 결합시켜 부착하였다. 산화캠핑 (Oxidation-capping) 사이클을 사용하였다. 추가로 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 표준 용매 및 시약들을 회사 (Biosolve사; Valkenswaard, NL)로부터 구입하였다. 상기 스피에겔머는 합성된 DMTOM이고; 탈보호후에, 스피에겔머는 배지 (source 15RPC medium; Amersham사)를 이용하여 장치 (preparative RPHPLC; Wincott F et al 1995 Nucleic Acids Res. 23:2677)를 통해 정제하였다. 5'DMT기는 80% 아세트산으로 제거하였다 (실온에서 30분간). 연속하여, 수용성 2M NaOAc 용액을 첨가하였고 상기 스피에겔머는 5K의 재생 셀룰로오스 막을 이용하여 접선교류 여과법으로 (tangential-flow filtration) 탈염하였다 (Miliproe, Bedford, MA).
PEG 화 반응
생체 내 (in vivo)에서 신장 청소율을 감소시키기 위하여, 스피에겔머 SOTE19 를 5' 말단에서 40 kDa 폴리에틸린 글리콜 (PEG)부위에 공유결합으로 결합시켰다. 이러한 증가된 분자량을 갖는 스피에겔머를 사용하여, 혈장에서 유의적으로 연장된 체류시간을 얻었고 따라서 보다 효율성을 수득할 수 있었다.
PEG화 반응을 위해 (유럽 특허출원 EP 제 1306382호 참조), 정제된 5‘-아미노 변형된 스피에겔머를 7 g 구연산 물용액, 3.54g 붕산, 2.26ml 인산 및 343ml의 1 M 수산화나트륨을 혼합하고, 여기에 물을 넣어 최종부피가 1 리터가 되도록 하는 제조공정으로 제조한 용액 (2.5 ml 물, 5 ml DMF 및 5 ml 완충액 A; pH=8.4가 되도록 1 M의 염산으로 적정)에 용해시켰다.
이 스피에겔머 용액의 pH는 1 M 수산화나트륨으로 8.4로 적정하였다. 이 후, 40 kDa PEGNHS 에스테르 (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL)를 최대 수율이 75 내지 85%가 될 때까지 0.6 당량의 4개 부분에 37℃에서 30분마다 첨가하였다. 반응혼합물의 pH는 PEGNHS 에스테르의 첨가동안에 1 M 수산화나트륨으로 8 내지 8.5로 유지하였다.
그 반응혼합물을4 ml 요소용액 (8 M), 4 ml 완충액 A 및 4 ml 완충액 B (수욕상 0.1 M 트리에틸암모니움 아세테이트)와 혼합하였고, 15분 동안 95℃에서 가열하였다. PEG화 스피에겔머는 아세토니트릴 용매경사법 (완충액 B; 완충액 C; 아세토니트릴상 0.1 M 트리에틸암모니움)을 이용하여 배지 (source 15RPC medium)로 RPHPLC 기기로 정제하였다. 과잉의 PEG를 5% 완충액 C에서 용출시키고, PEG화 스피에겔머는 1015% 완충액으로 용출시켰다. 95% 이상의 순도를 갖는 (HPLC로 확인) 생성물 분획들을 모으고 40 ml의 3 M NaOAC와 혼합시켰다. 이 PEG화 스피에겔머는 접선-교류여과법 (5K 재생 셀룰로오스 막, Milipore, Bedford, MA)으로 탈염하였다.
실시예 5. 항- 그렐린 - 스피에겔머 SOTE195'PEG 에 의한 외인성 그렐린 투여후의 성장 호르몬의 억제
외인성 그렐린의 투여는 랫트에서 성장 호르몬의 방출을 촉진시키는 것으로 알려졌다. 그렐린결합 스피에겔머의 전 투여는 그렐린유도된 성장호르몬의 방출을 억제한다.
스프라그 도올리 (Sprague Dawley)랫트들을 7일 동안 새로운 환경에 적응시켰다. 실험 준비는 각각 5마리의 동물로 구성되는 5개의 그룹으로 이루어졌다: 하나의 양성대조군 그룹 및 서로 다른 투여량의 스피에겔머 SOTE195'PEG의 4개의 시료투여군. 모든 동물들을 실험기간 동안 시약 (Ketamine/Xylazine)으로 마취하였고, 꼬리 정맥에 두 번의 정맥내 주사를 하였다. 첫 번째 주사는 두 번째 주사 30분전에 주입하였고, PBS (양성 대조군) 또는 도 22상의 스피에겔머 SOTE195'PEG의 여러 농도의 시료투여군으로 구성되었다.두 번째 투여는 모든 동물들에 3 nmol의 그렐린을 투여하였고 실험을 위해 시간 0로 표시하였다. 두 번째 투여에 앞서, 첫 번째 혈액시료는 안화의 두 (orbital sinus)로부터 채취하였다. 그렐린을 투여한 후 4, 15, 30 및 45분에 추가 시료들을 채취하였다. 얻어진 혈장 시료들을 제조지침서에 따라 상업적 효소 면역어세이법 (Growth hormone, Rat, Biotrak Assay Kit, RPN 2561, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg)으로 성장호르몬 농도를 분석하였다.
도 22에 도시된 바와 같이, 성장호르몬의 방출은 그렐린 투여에 의해 강력하게 자극되었지만 SOTE195'PEG의 앞선 전투여에 의해 억제되었다. 최대 억제는 75nmol SOTE195'PEG/ kg(체중)까지 도달하였다. 150 nmol SOTE195'PEG/kg (체중)까지 추가적인 증가된 투여 농도에서 성장호르몬 방출을 더 이상 억제하지 않았다. 그 결과는 항-그렐린-스피에겔머인 SOTE195'PEG의 생체 내 활성을 증명하는 것이다.
본 명세서, 청구항 및/ 또는 도면에 기재된 본 발명의 특징들은 이들의 다양한 형태로 본 발명을 실현하기 위한 물질로써 단독 및 이들의 어떠한 조합으로도 사용될 수 있다.
본 발명은 그렐린에 결합하는 핵산, 약제 제조를 위한 용도, 및 진단제 제조를 위한 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 본 발명의 핵산은 그렐린에 특이적으로 결합하여 생체 활성형 그렐린의 활성을 효과적으로 억제하므로, 그렐린의 생물학적 이용가능성 (bioavailability)의 감소 (reduction)가 요구되는 에너지 균형의 조절과 관련된 질환 및/또는 장애를 치료하기 위한 약제 또는 약제 제조뿐만 아니라, 미용적 목적, 상세하게는 그렐린의 비만증과 관련한 미용상의 목적, 체중 조절용 및/ 또는 식욕 조절용의 식품첨가제로 사용가능하며, 생체 활성형 그렐린을 특이적으로 탐지하는 방법, 그렐린 효현제 (agonist) 및/또는 그렐린 길항제(antagonist)를 스크리닝 방법 등에 유용하게 활용될 수 있다.
<110> NOXXON Pharma AG <120> Ghrelin binding nucleic acids <130> N 10046 PCT <150> PCT/EP2006/003276 <151> 2006-10-04 <160> 72 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 3 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> misc_feature synthetic <400> 3 uaarwccgaa rguahccauu ccurc 25 <210> 4 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> misc_feature synthetic <400> 4 uaagaccgaa gguacccaau ccuac 25 <210> 5 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> misc_feature synthetic <400> 5 ggguaagcgu aagaccgaaa guaaccaauc cuaccguaua uacggugagg cagcac 56 <210> 6 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Claims (58)

  1. 핵산, 바람직하게는 그렐린에 결합하는 핵산이며, 여기에서 상기 핵산은 1차 스트레치 박스 A (a first stretch Box A) 및 2차 스트레치 박스 B (a second stretch Box B)를 포함하고, 여기에서 상기 1차 스트레치 박스 A는 약 25개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 2차 스트레치 박스 B는 약 6 내지 8개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 상기 1차 스트레치 박스 A의 뉴클레오티드의 3’말단 스트레치 (stretch)는 2차 스트레치 박스 B와 잡종화하는 것이고, 상기와 같은 잡종화로 1차 이중 가닥 구조를 형성하고, 이러한 1차 이중 가닥 구조는 벌지(bulge)를 포함하는 핵산.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 이중 가닥 구조는 1차 스트레치 박스 A (a first stretch Box A)의 5개의 3’ 말단 연속적인 뉴클레오티드 및 2차 스트레치 박스 B (a second stretch Box B)의 뉴클레오티드의 전체 또는 일부분, 바람직하게는 2차 스트레치 박스 B의 6 내지 8개의 연속적인 뉴클레오티드로 형성되는 핵산.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 벌지 (bulge)는 2차 스트레치 박스 B의 1 내지 3개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 1차 스트레치 박스 A의 5개의 3’말단의 연속적인 뉴클레오티드와 비염기쌍 2차 스트레치 박스 B의 1개의 뉴클레오티드로 형성되는 핵산.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벌지 (bulge)는 비염기쌍 푸린 (purine)으로 형성되고, 상기 푸린은 바람직하게는 구아노신 (guanosine)인 핵산.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 벌지 (bulge)는 비염기쌍 푸린은 2차 스트레치 박스 B (the second stretch Box B)에 의해 제공되는 핵산.
  6. 제 1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 3차 스트레치 박스 C1 (a third stretch Box C1) 및 4차 스트레치 박스 C2 (a fourth stretch Box C2)를 추가적으로 포함하는 것이며, 여기에서 상기 3차 스트레치 박스 C1는 1개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 4차 스트레치 박스 C2는 1개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것이고, 여기에서 상기 3차 스트레치 박스 C1는 상기 2차 스트레치 박스 B의 3’말단 내지 5’말단에 부착된 것이고, 4차 스트레치 박스 C2는 1차 스트레치 박스 A의 5’말단 내지 3’말단에 부착된 핵산.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 3차 스트레치 박스 C1 및 4차 스트레치 박스 C2는 잡종화가 가능하며, 여기에서 상기 잡종화에 의해 2차 이중 가닥 구조를 형성하는 핵산.
  8. 제 1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 1차 이중 가닥 구조는 1차 나선 구조를 형성하는 핵산.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 이중 가닥 구조는 2차 나선 구조를 형성하는 핵산.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 2차 나선 구조는 1 내지 10개의 염기쌍, 바람직하게는 1 내지 3개의 염 기쌍, 보다 바람직하게는 2 내지 3개의 염기쌍을 포함하는 나선형 또는 나선형 유사 구조를 갖는 핵산.
  11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서,
    상기 1차 나선 구조는 상기 2차 나선 구조에 의해 신장되는 핵산.
  12. 제 6항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 3차 스트레치 박스 C1 (the third stretch Box C1)는 약 1 내지 10개의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 내지 3개의 연속적인 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 2 내지 3개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
  13. 제 6항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 4차 스트레치 박스 C2 (the fourth stretch Box C2)는 약 1 내지 10개의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 내지 3개의 연속적인 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 2 내지 3개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
  14. 제 6항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 부가적으로 5차 스트레치 박스 D (a fifth stretch Box D)를 포함하는 것이고, 여기에서 상기 5차 스트레치 박스 D는 2개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 5차 스트레치 박스 D는 서열 5'CA를 포함하는 핵산.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서,
    상기 5차 스트레치 박스 D (the fifth stretch Box D)는 임의 길이의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 것이고, 여기에서 상기 길이는 2, 3, 4, 5, 및 6개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 핵산.
  17. 제 13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 5차 스트레치 박스 D (the fifth stretch Box D)는 5' CA(X)n 3’의 서열을 포함하고, 여기에서 X는 임의의 뉴클레오티드, 바람직하게는 A, G, T, C, U 및 I를 포함하는 그룹으로부터 선택되어지고 상기 n은 0, 1, 2, 3 및 4로 구성된 그룹으로부터 선택된 정수인 핵산.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 5차 스트레치 박스 D (the fifth stretch Box D)는 5’CA(X)n 3’(여기에서 n=4) 서열로 구성된 것인 핵산.
  19. 제 14항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 5차 스트레치 박스 D (the fifth stretch Box D)는 2차 스트레치 박스 B (the second stretch Box B)의 5’말단 내지 3’말단에 부착된 것인 핵산.
  20. 제 14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 부가적으로 6차 스트레치 박스 E (a sixth stretch Box E)를 포함하는 것이고, 여기에서 상기 6차 스트레치 박스 E는 한 개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 6차 스트레치 박스 E는 약 1 내지 10개의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 내지 4개의 연속적인 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 3개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
  22. 제 20항 또는 제21항에 있어서,
    상기 6차 스트레치 박스 E (the sixth stretch Box E)의 하나 이상의 뉴클레오티드는 U 및 G로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것인 핵산.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 U 또는 G 뉴클레오티드는 상기 1차 스트레치 박스 A (the first stretch Box A)의 5’말단에 직접 인접하여 위치하는 핵산.
  24. 제 20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 6차 스트레치 박스 E (the sixth stretch Box E)는 상기 1차 스트레치 박스 A (the first stretch Box A)의 3’말단 내지 5’말단에 부착되는 것인 핵산.
  25. 제 20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 5차 스트레치 박스 D (the fifth stretch Box D)의 3’말단은 1차 스페이서(spacer)에 의해 상기 6차 스트레치 박스 E (the sixth stretch Box E)의 5’말단에 부착되는 것인 핵산.
  26. 제 20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 4차 스트레치 박스 C2 (the fourth stretch Box C2)의 3’말단은 2차 스페이서 (a second spacer)에 의해 상기 3차 스트레치 박스 C1 (the third stretch Box C1)의 5’말단에 부착되는 것인 핵산.
  27. 제 25항 또는 제 26항에 있어서,
    상기 1차 및 2차 스페이서는 친수성 스페이서들을 포함하는 그룹으로부터 각각 별개로 및 독립적으로 선택되는 것인 핵산.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 친수성 스페이서는 핵산 스페이서 및 비핵산 스페이서를 포함하고 있는 그룹으로부터 선택되는 것인 핵산.
  29. 제 28항에 있어서,
    상기 1차 스페이서는 약 1 내지 20개의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 2개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 스페이서인 것인 핵산.
  30. 제 28항에 있어서,
    상기 2차 스페이서는 약 3 내지 20개의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 3 내지 5의 연속적인 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 3개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 스페이서인 것인 핵산.
  31. 제 28항에 있어서,
    상기 스페이서는 비핵산인 것인 핵산.
  32. 제 31항에 있어서,
    상기 1차 스페이서 및/ 또는 2차 스페이서는 하나 이상의 에틸렌 글리콜 부 위 또는 이러한 에틸렌 글리콜 부위가 다수인 것을 포함하는 것인 핵산.
  33. 제 32항에 있어서,
    상기 스페이서는 약 172 내지 688 달톤 (Da), 바람직하게는 344 달톤 (Da)의 분자량을 갖는 것인 핵산.
  34. 제 1항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 고리형 핵산인 것인 핵산.
  35. 제 1항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 5’ Box Box Box Spacer Box Box Box 또는 5’ Box Box Box Spacer Box Box Box의 구조를 갖는 핵산.
  36. 제 1항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 1차 스트레치 박스 A (the first stretch Box A)는 UAAX1X2CCGAAX3GUAX4CCAUUCCUX5C (서열 번호 3)의 서열이고; 상기에서, X1=G 또는 A; X2=A 또는 U; X3=G 또는 A; X4=A 또는 C 또는 U; 및 X5=G 또는 A, 바람직하게는 5’-UAAGACCGAAGGUACCCAAUCCUAC-3’ (서열 번호 4)인 핵산.
  37. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서,
    특히 제 36항에 있어서, 상기 2차 스트레치 박스 B (the second stretch Box B)는 5'-GUGAGG-3’의 서열을 포함하는 핵산.
  38. 제 1항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 서열은 하기 표에 기재된 서열을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 핵산:
    Figure 112007072179816-PCT00002
  39. 제 38항에 있어서,
    상기 핵산 서열은 서열번호 38 (SEQ ID No. 38), 서열번호 39 (SEQ ID No. 39), 서열번호 32 (SEQ ID No. 32), 서열번호 29 (SEQ ID No. 29), 서열번호 41 (SEQ ID No. 41) 및 서열번호 40 (SEQ ID No. 40)에 따른 서열을 포함하고 있는 그 룹으로부터 선택되는 것인 핵산.
  40. 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 그렐린, 바람직하게는 인간 그렐린 (human ghrelin)을 결합 가능한 것인 핵산.
  41. 제 40항에 있어서,
    상기 그렐린은 서열번호 1 (SEQ ID No. 1)에 따른 아미노산 서열을 갖는 것인 핵산.
  42. 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 변형체 (a modification)를 포함하는 것인 핵산.
  43. 제 42항에 있어서,
    상기 변형체는 HES 부위 및 PEG 부위를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 핵산.
  44. 제 43항에 있어서,
    상기 변형체는 직쇄 또는 가지상 PEG로 구성되는 PEG 부위인 것이고, 여기에서 상기 PEG 부위의 분자량은 바람직하게는 약 20 내지 120 kD, 보다 바람직하게는 약 30 내지 80 kD, 가장 바람직하게는 약 40 kD인 것인 핵산.
  45. 제 43항에 있어서,
    상기 변형체는 HES 부위인 것이고, 여기에서 상기 HES 부위의 분자량은 바람직하게는 약 10 내지 130 kD, 보다 바람직하게는 약 30 내지 80 kD, 및 가장 바람직하게는 약 50 kD인 것인 핵산.
  46. 제 1항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 L뉴클레오티드로 구성된 것인 핵산.
  47. 제 1항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 및 임의적인 추가 구성성분을 포함하는 약학조성물, 여기에서 상기 추가 구성 성분은 약학적으로 허용 가 능한 부형제 및 약학적으로 활성을 갖는 활성제를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
  48. 약제 (medicament) 제조를 위한 제 1항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 기재된 핵산의 용도.
  49. 진단용 수단 (diagnostic means) 제조를 위한 제 1항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 기재된 핵산의 용도.
  50. 제 48항에 있어서,
    상기 약제는 비만, 섭식장애, 당뇨, 포도당 대사증, 종양, 혈압 질환, 심혈관계 질환, 말단비대증, 및 에너지 균형, 식욕 및 체중의 조절 관련 질환으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 질환 또는 장애의 치료 및/ 또는 예방을 위한 것인 용도.
  51. 그렐린 및 제 1항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 포함하는 복합체.
  52. 그렐린 검출을 위한 제 1항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 기재된 핵산의 용도.
  53. 후보 그렐린 길항제 및/ 또는 후보 그렐린 효현제를 제공하는 단계; 제 1항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 제공하는 단계; 상기 그렐린 길항제 및/또는 그렐린 효현제 존재하에 신호를 제공하는 시험용 시스템을 제공하는 단계; 및 상기 후보 그렐린 길항제가 그렐린 길항제인지 여부 및/ 또는 상기 후보 그렐린 효현제가 그렐린 효현제인지 여부를 결정하는 단계들을 포함하는 그렐린 길항제(antagonist) 또는 그렐린 효현제 (agonist)를 스크리닝하는 방법.
  54. 어느 한 상 (phase), 바람직하게는 고체상에 동화된 그렐린을 제공하는 단계; 제 1항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 기재된 핵산, 바람직하게는 표지된 제 1항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 제공하는 단계; 후보 그렐린 효현제 및/또는 후보 그렐린 길항제를 첨가하는 단계 및 상기 후보 그렐린 효현제가 그렐린 효현제인지 여부 및/또는 상기 후보 그렐린 길항제가 그렐린 길항제인지 여 부를 결정하는 단계들을 포함하는 그렐린 효현제 (agonist) 및/ 또는 그렐린 길항제(antagonist)를 스크리닝 방법.
  55. 제 54항에 있어서,
    상기 결정단계는 상기 핵산이 상기 후보 그렐린 효현제 또는 후보 그렐린 길항제로 대체되는지 여부를 평가하는 것으로 수행되는 것임을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 1항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 포함하는, 그렐린을 탐지하기 위한 키트 (kit).
  57. 제 54항 또는 제55항에 기재된 방법에 의해 수득가능한 그렐린 길항제.
  58. 제 54항 또는 제55항에 기재된 방법에 의해 수득가능한 그렐린 효현제.
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