KR20210113173A - Cxcl8 결합 핵산 - Google Patents

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카이 호리히
악셀 바텔
베르너 푸쉬케
디르크 즈보랄스키
크리스티안 마쉬
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아프타리온 바이오테크 아게
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Abstract

본 발명은 인간 CXCL8에 결합할 수 있는 L-핵산 분자에 관한 것으로, 여기서 L-핵산 분자는 뉴클레오타이드의 중심 스트레치를 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드의 중심 스트레치는 5'-GG A AGU ACGUGGA AAGCCRA(XU)RAGUGUGUCCCG-3' [서열 번호 27](여기서, Xu는 U이거나 부재한다)의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

Description

CXCL8 결합 핵산
본 발명은 CXCL8에 결합할 수 있는 핵산 분자, 질환의 치료 및/또는 예방 방법에 사용하기 위한 핵산 분자, CXCL8 검출 방법에 사용하기 위한 핵산 분자, 검출 수단 또는 바이오센서 제조를 위한 핵산 분자, 핵산 분자를 포함하는 약제학적 조성물, 약제 제조를 위한 핵산 분자의 사용, 진단기, 진단 수단 또는 바이오센서의 제조를 위한 핵산 분자의 사용, CXCL8의 검출을 위한 핵산 분자의 사용, 핵산 분자를 포함하는 키트, 핵산 분자를 사용하는 CXCL8의 검출 방법, 핵산 분자를 포함하는 복합체, 핵산 분자를 사용하여 CXCL8에 의해 매개되는 활성 길항제의 스크리닝 방법 및 핵산 분자의 검출 방법에 관한 것이다.
인터루킨 8(약칭 IL-8)로도 알려져 있는, CXCL8(UniProtKB/Swiss-Prot P10145, IL8_HUMAN; 서열 번호 2), 호중구-활성화 단백질 1(약칭 NAP-1), 단핵구-유도된 호중구 화학주성 인자(약칭 MDNCF), 또는 과립구 화학주성 단백질 1(약칭 GCP-1)은 N-말단의 글루타메이트-류신-아르기닌(약칭 ELR) 모티프를 특징으로 하는 전염증 및 혈관신생 촉진 특성을 가진 CXC 케모카인의 서브패밀리에 속하는 작은 염기성 단백질이다. ELR-양성 케모카인 CXCL1(성장-조절 알파 단백질, Gro-알파, 흑색종 성장 자극 활성, MGSA 또는 NAP-3이라고도 함), CXCL2(Gro-베타 또는 대식세포 염증 단백질 2-알파, MIP2-알파라고도 함), CXCL3(Gro-감마 또는 MIP2-베타라고도 함), CXCL5(상피-유래 호중구-활성화 단백질 78, ENA-78 또는 소유도성 사이토카인 B5로도 알려짐), CXCL6(케모카인 알파 3, CKA-3, 과립구 화학주성 단백질 2, GCP-2 또는 소유도성 사이토카인 B6이라고도 함), CXCL7(혈소판 염기성 단백질, PBP, 백혈구-유래 성장 인자, LDGF, 대식세포-유래 성장 인자, MDGF 또는 소유도성 사이토카인 B7이라고도 함) 및 CXCL8은 수용체 CXCR2(IL8RB, IL8R 유형 2, CD182, CDwl28b 또는 GRO/MGSA 수용체라고도 함)의 작용제이다. CXCL6, CXCL7 및 CXCL8은 수용체 CXCR1(IL8RA, IL8R 유형 1, CD181 또는 CDwl28a로도 알려짐)의 작용제이다. CXCL8은 약 4 nM의 유사한 친화도로 수용체 CXCR1 및 CXCR2에 결합한다. CXCR1/2에 CXCL8이 결합하면 Gαi-의존적 신호전달 경로를 유발되고, 예를 들어 호중구 이동, 탈과립 및 산화 파열(oxidative burst)이 유도된다. 수용체 민감도는 인산화, 베타-아레스틴 모집 및 수용체 내재화에 의해 조절될 수 있다(문헌[Ha, Theranostics 2017]). CXCL7은 33개의 동일한 아미노산으로 CXCL8과 가장 높은 상동성을 가지고 있다. 비인간 영장류(붉은털 원숭이(macaca mulata), 사이노몰구스 원숭이)의 CXCL8은 인간 CXCL8과 95% 동일성(77개 아미노산 중 73개 동일)을 갖는다. 마우스와 래트에는 CXCL8의 오르소로그(ortholog)가 없다.
CXCL8은 예를 들어 병원체-관련 분자 패턴(약칭 PAMP) 분자(예를 들어, LPS), 전-염증 매개체(예를 들어, IL-1, IL-6 및 TNF-a), 저산소증, 활성 산소종 또는 환경 스트레스 요인(예를 들어, 담배 연기)에 반응하여 단핵구, 대식세포, 섬유아세포, 내피 및 상피 세포를 포함하는 다양한 세포 유형에서 분비된다(문헌[Ha, Theranostics 2017]). CXCL8은 호중구 및 단핵구에 대한 화학주성 및 활성화 사이토카인 역할을 하며, 숙주 방어에서 중요한 생리학적 역할을 한다.
CXCL8은 바이러스 감염(예를 들어, 호흡기 세포융합 바이러스, 단순 포진 바이러스, B형 및 C형 간염 바이러스, 인간 거대세포바이러스), 세균 감염(예를 들어, 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Stretptococcus pneumoniae) 및 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)) 및 곰팡이 감염(예를 들어, 칸디다 알비칸스(Clandida albicans) 및 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus))에서 설명된 CXCL8 수준이 상승된 감염성 질환의 진단, 질환 상태, 예후 및 치료 효능을 위한 바이오마커로 사용된다. 소아 호흡기 세포융합 바이러스(약칭 RSV) 감염에서, CXCL8 혈장 수준은 질환 중증도와 상관 관계가 있다. 따라서, CXCL8은 RSV 감염의 중증도를 평가하고 임상 관리를 가이드하는 바이오마커 역할을 할 수 있다. 다른 면역학적 바이오마커, 즉 림프구 수 및 CCL5 혈장 수준과 함께 확인하면 정확도가 향상된다(문헌[Brand, Pediatr Res 2013]). 감염성 질환에서의 바이오마커로서 CXCL8의 사용에 대한 추가 예는 신생아 패혈증(문헌[Zhou, PLoS One 2015]), 세균성 수막염(문헌[Yao, Int J Clin Exp Med 2015]), 폐렴(문헌[Morris, Thorax 2009]) 및 신경 매독(문헌[Wang, Sci Rep 2016])이 포함된다. CXCL8은 또한 만성 전립선염, 급성 신우신염, 낭포성 섬유증 및 다양한 자가면역 질환을 포함한 염증성 질환의 바이오마커로 사용될 수 있다(문헌[Shahzad, Int Arch Med 2010]). 암 환자에서의 CXCL8 수준은 종양 크기와 관련이 있으며, 나쁜 결과와도 관련이 있다(문헌[Sanmamed, Clin Cancer Res 2014]). 예를 들어, CXCL8은 유방암(문헌[Fang, Anticancer Res 2017]) 및 췌장암(문헌[Chen, World J Gastroenterol 2012]) 및 소아 육종(문헌[Highfill, Sci Transl Med 2014])에서 더 짧은 생존율과 관련이 있다. 흑색종에서, 기준선 CXCL8 수준이 상승하면 항-CTLA 4/화학요법 조합 치료에 대한 반응성이 없어지고, 환자가 더 악화된다(문헌[Jamal, J Immunother Cancer 2017]).
CXCL8 및 이의 수용체는 호흡기계의 염증성 질환(예를 들어, 만성 폐쇄성 폐질환, 급성 호흡곤란 증후군, 천식, 낭포성 섬유증, 폐섬유증), 피부의 염증성 질환(예를 들어, 호중구 피부병, 건선, 수포성 천포창), 자가면역 질환(예를 들어, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 류마티스 관절염), 염증성 신경 질환(예를 들어, 신경 스위트 질환, 알츠하이머 질환), 허혈성 질환(예를 들어, 뇌졸중, 심근 경색, 뇌 허혈 및 경색) 및 기타 염증성 질환(예를 들어, 죽상동맥경화증)을 포함한 여러 염증성 질환의 병인과 관련이 있다(문헌[Ha, Theranostics 2017; Russo, Expert Rev Clin Immunol 2014]). CXCL8을 억제하면 이러한 염증성 질환이 치료된다는 잠재 능력이 동물 질환 모델를 사용한 연구에 의해 확인되었다. 예를 들어, 토끼에 항-CXCL8 항체를 투여하면 LPS-유발 피부염, LPS-유발 흉막염, LPS/IL-1-유발 관절염, IC형 사구체신염, 급성 폐 손상 및 폐 재관류 손상이 개선되었다(문헌[Bao, Int Immunopharmacol 2010; Harada, J Leukoc Biol 1994]). CXCR1/2를 차단하면 래트 모델에서 허혈성 뇌 손상이 감소되었다(문헌[Garau, Cytokine 2005]).
CXCL8은 폐암, 결장암, 전립선암, 췌장암, 유방암, 난소암 및 흑색종을 포함한 인간 암의 발병, 진행 및 치료-내성과 관련이 있으며, 종양 성장 및 전이를 촉진한다(문헌[Brat, Neuro Oncol 2005; Ha, Theranostics 2017; Koch, Science 1992; Li, Angiogenesis 2005; Liu, Cytokine Growth Factor Rev 2016; Xu, Oncol Res 2000]). CXCL8에 의한 암 촉진 메커니즘에는 혈관신생 자극, 암 줄기 세포 자가-재생, 상피-간엽 전환, 및 면역억제 종양 미세환경 생성이 포함된다(문헌[Ginestier, J Clin Invest 2010; Visvader, Nat Rev Cancer 2008; David, Vaccines 2016]). CXCL8 억제에 의한 인간의 암 치료 가능성이 동물 질환 모델에 의해 확인되었다. 예를 들면 CXCL8를 녹다운시키면 화학요법-내성 난소 암 세포의 성장이 감소되었다(문헌[Merritt, J Natl Cancer Inst 2008]). CXCL8을 억제하면 난소 암 및 전립선 암 모델에서 도세탁셀에 의해 유도되는 항-혈관신생 반응이 증가하였다(문헌[Campbell, Pharmaceuticals 2013]). 포스파타제 및 텐신 동족체(PTEN)가 불충분한 종양에서 CXCL8가 과발현하면 암 세포 생존력이 향상되고 치료-내성 종양의 발병이 유발된다(문헌[Campbell, Pharmaceuticals 2013; Maxwell, Eur Urol 2013; Maxwell, Oncotarget 2014]). CXCL8 신호전달을 억제하면 PTEN-결핍뿐만 아니라 p53-돌연변이 암 세포가 DNA 손상제, 항-대사산물 또는 안드로겐 수용체-표적화 전략에 민감하게 된다(문헌[Campbell, Pharmaceuticals 2013]). CXCR2를 차단하면 횡문근육종 및 췌장관 선암종이 있는 마우스 모델에서 면역 체크포인트 억제제 항-PD-1의 효능이 향상된다(문헌[Highfill, Sci Transl Med 2014; Steele, Cancer Cell 2016]).
CXCL8 또는 각각의 수용체 CXCR1 및 CXCR2 중 하나 또는 둘 모두를 표적으로 하는 여러가지 화합물이 알려져 있고, 성공적으로 생체 내 모델에서 테스트하였다. 이들 중 일부는 임상 시험에서 추가로 테스트하였다. CXCR1 및/또는 CXCR2의 길항제, 즉 레파릭신(reparixin), 라다릭신(ladarixin), 다니릭신(danirixin), 나바릭신(navarixin), SX-682 및 AZD-5069는 췌도 이식, 장기 이식, 제1 형 당뇨병, COPD, 천식, 기관지확장증, 건선, 수포성 유천포창 및 암에 대한 임상 시험에서 테스트하였다. CXCR1/2 길항제 레파릭신은 전이성 삼중 음성 유방암 환자에서 추가로 임상적으로 테스트하였다. CXCR2 길항제 AZD-5069는 고형암에서 항-PD-L1 두르발루맙 또는 화학요법과 함께 테스트하였다.
수용체 CXCR1 및 CXCR2를 공유하지만, ELR-양성 케모카인은 구별되는 발현 패턴, 생체 내 분포(세포 외 기질 결합 특성) 및 수용체와의 상호작용 메커니즘을 갖는다(문헌[Feniger-Barish, Cytokine 1999; Sawant, Sci Rep 2016]). 다른 ELR-양성 케모카인 패밀리 구성원 각각의 생리적 기능은 아직 잘 알려지지 않았다. 따라서, 질환을 촉진하는 CXCL8를 선택적으로 억제하면 잠재적으로 질환 치료에 더 효과적이며, CXCR1/CXCR2 차단의 광범위한 봉쇄에 비해 부작용의 위험을 줄일 수 있다. 예를 들어, 암 줄기 세포 유지를 위해서는 CXCL8이 필요하지만 CXCL1은 필요하지 않다(문헌[Liotti F et al., Stem Cells 2017; 35: 135-146]). 감염에서, 케모카인은 중복 활성을 갖는다. 결과적으로, ELR-양성 케모카인의 광범위한 억제(예를 들어, CXCL8 및 CXCL1의 동시 억제)는 감염 위험 증가와 관련이 있을 수 있다(문헌[Yung SC 및 Murphy PM; Frontiers in Immunology, September 2012, vol. 3, Art. 276]). CXCRl/2 리간드는 결합 에피토프 역할을 할 수 있는 공통 N-말단 ELR 모티프를 공유한다(미국 특허 제9,783,605호에 기재됨). CXCR1/2 리간드 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7 및 CXCL8에서 이러한 구조적 특징을 공유하므로 ELR-양성 케모카인을 간섭하지 않으면서 CXCL8을 선택적으로 결합하고 억제할 수 있는 화합물을 식별하는 것이 어렵다.
CXCL8에 결합하지만 ELR-양성 케모카인 CXCL1(성장-조절 단백질 알파, GRO-알파라고도 함) 및 CXCL2(성장-조절 단백질 베타, GRO-베타라고도 함)에 결합하지 않는 항체가 발견되었다(문헌[Skov, J Immunol 2008]). CXCL8-특이적 단일클론 항체는 약동학적 프로파일, 생체분포 및 제거를 포함하여, 이 물질 등급의 약리학적 특성과 관련시킬 수 있는 임상 시험에서 효능을 나타내지 못했다. 예를 들어, 케모카인 생산 속도가 높아서 치료 항체가 빨리 포화될 수 있고, 일상적으로 사용되는 긴 투약 간격으로 인한 효능이 불충분하게 나타날 수 있다. 또한, 항체는 케모카인과 글리코사미노글리칸의 결합을 잠재적으로 방해하지 않아 케모카인 구배 파괴가 부족하고 백혈구 이동 및 혈관외유출을 불충분하게 억제할 수 있다. 핵산은 단백질의 글리코사미노글리칸-결합 부위에 우선적으로 결합한다(문헌[Oberthur, Nat Commun 2015]). 따라서, 핵산과 같은 다른 물질 종류가 CXCL8의 치료적 표적화에 더 좋을 수 있다.
핵산은 체액에 존재하는 효소(뉴클레아제)에 의한 분해에 민감하다. 이러한 생체 안정성의 결여는 인간의 치료를 위한 핵산-기반 약제의 제조뿐만 아니라 질환의 확인 및/또는 치료를 위한 핵산-기반 진단제의 제조를 방해한다. 화학적 변형은 핵산의 안정성을 증가시킬 수 있지만, 약제 사용을 위한 충분한 안정성을 제공하기에는 불충분할 수 있다. 예를 들어, 2'-플루오로 변형된 피리미딘을 갖는 핵산은 모든 DNA 핵산과 비슷한 혈장 반감기를 나타내며, 긴 반감기를 달성하려면 2'-0-메틸 변형이 필요했다(문헌[Kratschmer, Nucleic Acid Ther 2017]). 치료 용도로 승인된 최초의 앱타머인 마쿠겐(Macugen)은 2'-플루오로-피리미딘, 2'-0-메틸-퓨린 및 3'-캡의 조합으로 안정화된다. 또한, 화학적 변형은 약제 제조에 사용될 때 부작용 위험이 증가할 수 있다. 대조적으로, 비천연 L-구성의 핵산은 매우 생물 안정성이 매우 높고, 임상 시험에서 안전하고 내성이 좋고, 효과적인 것으로 나타났다(문헌[Ludwig, Leukemia 2017; Menne, Nephrol Dial Transplant 2016]).
CXCL8-결합 2'-플루오로 피리미딘 RNA-앱타머는 이전에 보고되었다(문헌[Sung, Biomaterials 2014]). 그러나, 기능 분석에서, 기재된 앱타머 중 하나인 앱타머 8A-35의 높은 결합 친화도는 IC50 > 125 nM으로 CXCL8-유도 호중구 이동을 억제하면서 기능이 개선되지 않았다. 반정량적 분석은 ELR-양성 케모카인 CXCL1(GRO-알파라고도 함) 및 CXCL2(GRO-베타라고도 함)에 전구체 앱타머가 결합하지 않거나, 낮게 결합함을 보여주었다.
본 발명의 근본적인 과제는 CXCL8과 특이적으로 상호작용하는, 바람직하게는 다른 ELR-양성 케모카인과 특이적으로 상호작용하지 않는, 보다 바람직하게는 수용체 CXCR1 및/또는 CXCR2에 결합하는 ELR-양성 케모카인과 특이적으로 상호작용하지 않는 핵산 분자, 바람직하게는 L-핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 근본적인 또 다른 과제는 CXCL8에 높은 친화도로 결합하여 CXCL8-자극 화학주성을, 바람직하게는 한 자리 나노몰 범위, 보다 바람직하게는 피코몰 범위의 억제 상수로 효과적으로 억제할 수 있는 핵산 분자, 바람직하게는 L-핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 근본적인 또 다른 과제는 바람직하게는 적어도 CXCL8을 길항하거나 억제하여 치료 효과를 낼 수 있는 정도까지 질환의 병인 기전에 CXCL8이 직접 또는 간접적으로 관여하는 것을 특징으로 하는, 인간 및/또는 비인간 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 핵산 분자, 바람직하게는 L-핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 근본적인 또 다른 과제는 질환의 병인 기전에 CXCL8이 직접 또는 간접적으로 관여하는 것을 특징으로 하는, 이러한 질환의 식별, 진단 및/또는 치료용 진단제의 제조를 위한 핵산 분자, 바람직하게는 L-핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 근본적인 상기 및 다른 과제는 첨부된 독립 청구항의 주제에 의해 해결된다. 바람직한 실시형태는 종속 청구항으로부터 취할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 근본적인 과제는 인간 CXCL8에 결합할 수 있는 L-핵산 분자에 의한 제1 양태로 해결되며, 여기서 L-핵산 분자는 뉴클레오타이드의 중심 스트레치(central stretch)를 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드의 중심 스트레치는 5'-GGAAGUACGUGGAAAGCCRA(Xu)RAGUGUGUCCCG-3'[서열 번호 27](여기서, Xu는 U이거나 부재함)의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 근본적인 과제는 질환의 치료 및/또는 예방 방법에 사용하기 위한, 제1 양태의 L-핵산 분자(이의 임의의 실시형태 포함)에 의한 제2 양태로 해결된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 근본적인 과제는 CXCL8 검출 방법에 사용하기 위한, 제1 양태의 L-핵산 분자(이의 임의의 실시형태 포함)에 의한 제3 양태로 해결된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 근본적인 과제는 검출 수단 또는 바이오센서의 제조를 위한, 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)의 L-핵산 분자에 의한 제4 양태로 해결된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 근본적인 과제는 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따른 L-핵산 분자 및 선택적으로 추가 구성 성분을 포함하는 약제학적 조성물에 의한 제5 양태로 해결되며, 여기서 추가 구성 성분은 약제학적으로 허용되는 부형제, 약제학적으로 허용되는 담체 및 약제학적 활성제를 포함하는 군으로부터 선택된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 근본적인 과제는 약제의 제조를 위한, 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따른 L-핵산 분자를 사용함으로써 제6 양태로 해결된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 근본적인 과제는 진단기, 진단 수단 또는 바이오센서의 제조를 위한, 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따른 L-핵산 분자를 사용함으로써 제7 양태로 해결된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 근본적인 과제는 CXCL8, 바람직하게는 인간 CXCL8의 검출을 위해 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따른 L-핵산 분자를 사용함으로써 제8 양태로 해결된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 근본적인 과제는 CXCL8의 검출을 위한 키트에 의해 제9 양태로 해결되며, 여기서 키트는 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따른 L-핵산 분자, 및 적어도 하나의 지침서 또는 반응 용기를 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 근본적인 과제는 샘플에서 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따라 정의된 바와 같은 L-핵산을 사용하는 CXCL8의 검출 방법에 의해 제10 양태로 해결되며, 여기서 이 방법은 하기 단계:
a) 알려지지 않은 농도의 CXCL8을 가진 샘플을 제공하는 단계;
b) 샘플 또는 이의 희석액을 제7 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에서 정의된 바와 같은 진단기, 진단 수단 또는 바이오센서와 접촉시키는 단계;
c) 제7 양태에서 정의된 바와 같은 진단기, 진단 수단 또는 바이오센서(이의 임의의 실시형태 포함)로 신호를 측정하는 단계;
d) 선택적으로, 신호를 기준과 비교하는 단계를 포함하며;
선택적으로, CXCL8 농도가 알려지지 않은 샘플에서의 CXCL8의 농도는 알려진 CXCL8 농도를 가진 적어도 하나의 샘플에서 얻은 신호와 비교하여 결정되며, 바람직하게는 알려진 CXCL8 농도를 가진 적어도 하나의 샘플은 단계 b) 내지 c)에 적용된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 근본적인 과제는 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따른 L-핵산 분자 및 CXCL8을 포함하는 복합체에 의해 제11 양태로 해결되며, 여기서 복합체는 바람직하게는 결정질 복합체이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 근본적인 과제는 하기 단계를 포함하는, CXCL8에 의해 매개되는 활성의 길항제의 스크리닝 방법에 의해 제12 양태로 해결된다:
- CXCL8에 의해 매개되는 활성의 후보 길항제를 제공하는 단계,
- 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따른 L-핵산 분자를 제공하는 단계,
- CXCL8에 의해 매개되는 활성의 길항제의 존재 하에 신호를 제공하는 테스트 시스템을 제공하는 단계, 및
- CXCL8에 의해 매개되는 활성의 후보 길항제가 CXCL8에 의해 매개되는 활성의 길항제인지를 결정하는 단계.
보다 구체적으로, 본 발명의 근본적인 과제는 샘플에서 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따른 L-핵산 분자의 검출 방법에 의해 제13 양태로 해결되며, 여기서 방법은
a) 포획 프로브를 제공하는 단계로서, 여기서 포획 프로브는 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따른 L-핵산 분자의 제1 부분 및 검출 프로브에 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 검출 프로브는 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따른 L-핵산 분자의 제2 부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이거나, 또는 대안적으로 포획 프로브는 제1 양태에 따른 L-핵산 분자(이의 임의의 실시형태 포함)의 제2 부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 검출 프로브는 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따른 L-핵산 분자의 제1 부분에 적어도 부분적으로 상보적인, 단계;
b) 포획 프로브 및 검출 프로브를 개별적으로 또는 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따른 L-핵산 분자를 함유하거나, 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따른 L-핵산 분자를 포함하는 것으로 추정되는 샘플에 결합하여 첨가하는 단계;
c) 포획 프로브 및 검출 프로브를 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따른 L-핵산 분자와 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 반응하도록 허용하는 단계;
d) 선택적으로 포획 프로브가 단계 a)에서 제공된 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따른 L-핵산 분자에 혼성화되는지의 여부를 검출하는 단계; 및
e) 제1 양태(이의 임의의 실시형태 포함)에 따른 L-핵산 분자, 및 포획 프로브 및 검출 프로브로 구성된, 단계 c)에서 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 하기 실시형태 1 내지 103에 의해 더욱 구체적으로 해결되며, 실시형태 1은 제1 양태에 대응하고, 실시형태 47은 제2 양태에 대응하고, 실시형태 49는 제3 양태에 대응하고, 실시형태 50은 제4 양태에 대응하고, 실시형태 51은 제5 양태에 대응하고, 실시형태 53은 제6 양태에 대응하고, 실시형태 56은 제7 양태에 대응하고, 실시형태 79는 제8 양태에 대응하고, 실시형태 96은 제9 양태에 대응하고, 실시형태 97은 제10 양태에 대응하고, 실시형태 98은 제11 양태에 대응하고, 실시형태 99는 제12 양태에 대응하고, 실시형태 100은 제13 양태에 대응한다:
실시형태 1: 인간 CXCL8에 결합할 수 있는 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 뉴클레오타이드의 중심 스트레치를 포함하고, 뉴클레오타이드의 중심 스트레치는 5'-GGAAGUACGUGGAAAGCCRA(Xu)RAGUGUGUCCCG-3'[서열 번호 27](여기서, Xu는 U이거나 부재함)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, L-핵산 분자.
실시형태 2: 실시형태 1의 L-핵산 분자로서, 뉴클레오타이드의 중심 스트레치는 하기 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, L-핵산 분자.
a) 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 3'[서열 번호 28],
b) 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAUGAGUGUGUCCCG 3'[서열 번호 29], 및
c) 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3'[서열 번호 30].
실시형태 3: 실시형태 2의 L-핵산 분자로서, 뉴클레오타이드의 중심 스트레치는 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3'[서열 번호 30] 또는 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 3'[서열 번호 28], 바람직하게는 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3'[서열 번호 30]의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, L-핵산 분자.
실시형태 4: 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 5'-> 3' 방향으로 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치, 뉴클레오타이드의 중심 스트레치 및 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치를 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 3 내지 6개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 3 내지 6개의 뉴클레오타이드를 포함하며, 바람직하게는 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5 내지 6개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5개 내지 6개의 뉴클레오타이드를 포함하며, 보다 바람직하게는 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5개의 뉴클레오타이드를 포함하는, L-핵산 분자.
실시형태 5: 실시형태 4의 L-핵산 분자로서, 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' Z1Z2Z3Z4Z5C 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GZ6Z7Z8Z9Z10 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며,
여기서
Z1은 G이거나 부재하며, Z2는 S이거나 부재하며, Z3은 K이거나 부재하며, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이거나 부재하며, Z9는 S이거나 부재하며, Z10은 C이거나 부재하며;
바람직하게는
a) Z1은 G이고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 C이며; 또는
b) Z1은 부재하고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 부재하며; 또는
c) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
d) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 부재하고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 부재하고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
e) Z1은 부재하고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 C이며; 또는
f) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 C이며; 또는
g) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 부재하고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 C이며; 또는
h) Z1은 G이고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 부재하며; 또는
i) Z1은 G이고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
j) Z1은 G이고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 부재하고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
k) Z1은 부재하고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
l) Z1은 부재하고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 부재하고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
m) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 부재하며; 또는
n) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 부재하고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 부재하며; 또는
o) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 부재하고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
p) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 부재하고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 부재하고, Z10은 부재한, L-핵산 분자.
실시형태 6: 실시형태 4 내지 5 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 여기서
a) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' CUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCAG 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 또는
b) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GCUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCAGC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 또는
c) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GCUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUGAGC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
d) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
e) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' UGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCA 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
f) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
g) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GCAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUGC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
h) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GGUC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GACC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
i) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' UGGC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GCCA 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
j) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
바람직하게는,
뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' CUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCAG 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GCUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCAGC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
보다 바람직하게는,
뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' CUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCAG 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나;
뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, L-핵산 분자.
실시형태 7: 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 40 내지 45개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 42 내지 45개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 42개의 뉴클레오타이드를 포함하는, L-핵산 분자.
실시형태 8: 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 리보뉴클레오타이드로 구성되는, L-핵산 분자.
실시형태 9: 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 서열 번호 14 내지 26 및 39 내지 44의 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, L-핵산 분자는 서열 번호 14 내지 26 및 39 내지 44의 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 L-핵산 분자에 대한 적어도 75%의 동일성을 갖는 L-핵산 분자를 포함하거나, L-핵산 분자는 서열 번호 14 내지 26 및 39 내지 44의 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 L-핵산 분자와 상동성인 L-핵산 분자를 포함하고, 여기서 상동성은 적어도 75%인, L-핵산 분자.
실시형태 10: 실시형태 9의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 20 및 서열 번호 41 내지 44의 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, L-핵산 분자는 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 20 및 서열 번호 41 내지 44의 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 L-핵산 분자에 대한 적어도 75%의 동일성을 갖는 L-핵산 분자를 포함하거나, L-핵산 분자는 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 20 및 서열 번호 41 내지 44의 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 L-핵산 분자와 상동성인 L-핵산 분자를 포함하고, 여기서 상동성은 적어도 75%인, L-핵산 분자.
실시형태 11: 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 CXCL8에 결합할 수 있고, 바람직하게는 CXCL8은 인간 CXCL8, 원숭이 CXCL8, 토끼 CXCL8, 돼지 CXCL8, 개 CXCL8, 양 CXCL8 또는 기니피그 CXCL8인, L-핵산 분자.
실시형태 12: 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 CXCL8, 바람직하게는 인간 CXCL8, 원숭이 CXCL8, 토끼 CXCL8, 돼지 CXCL8, 개 CXCL8, 양 CXCL8 또는 기니피그 CXCL8, 보다 바람직하게는 인간 CXCL8에 특이적으로 결합할 수 있는, L-핵산 분자.
실시형태 13: 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자가 CXCL8과 상이한 ELR-양성 CXC 케모카인에 결합하지 않거나 결합할 수 없으며, 여기서 CXCL8과 상이한 ELR-양성 CXC 케모카인은 바람직하게는 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6 및 CXCL7로 구성된 군으로부터 선택되는, L-핵산 분자.
실시형태 14: 실시형태 13의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자가 인간 CXCL8과 상이한 ELR-양성 인간 CXC 케모카인에 결합하지 않거나 결합할 수 없으며, 여기서 인간 CXCL8과 상이한 ELR-양성 인간 CXC 케모카인은 바람직하게는 인간 CXCL1, 인간 CXCL2, 인간 CXCL3, 인간 CXCL5, 인간 CXCL6 및 인간 CXCL7로 구성된 군으로부터 선택되는, L-핵산 분자.
실시형태 15: 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 KD로 표현되는 인간 CXCL8에 대한 결합 친화도가 10 nM 이하, 바람직하게는 1 nM 이하, 보다 바람직하게는 100 pM 이하, 가장 바람직하게는 30 pM 이하인, L-핵산 분자.
실시형태 16: 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 IC50으로 표현되는 인간 CXCL8에 대한 결합 친화도가 10 nM 이하, 바람직하게는 1 nM 이하, 보다 바람직하게는 100 pM 이하, 가장 바람직하게는 30 pM 이하인, L-핵산 분자.
실시형태 17: 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 KD로 표현되는 CXCL8과 상이한 ELR-양성 CXC 케모카인에 대한 결합 친화도가 100 nM 이상, 바람직하게는 500 nM 이상, 더 바람직하게는 1000 nM 이상인, L-핵산 분자.
실시형태 18: 실시형태 1 내지 17 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 IC50으로 표현되는 CXCL8과 상이한 ELR-양성 CXC 케모카인에 대한 결합 친화도가 100 nM 이상, 바람직하게는 500 nM 이상, 더 바람직하게는 1000 nM 이상인, L-핵산 분자.
실시형태 19: 실시형태 1 내지 18 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 KD로 표현되는 인간 CXCL8에 대한 결합 친화도가 10 nM 이하, 바람직하게는 1 nM 이하, 보다 바람직하게는 100 pM 이하, 가장 바람직하게는 30 pM 이하이며, 여기서 L-핵산 분자는 KD로 표현되는 CXCL8과 상이한 ELR-양성 CXC 케모카인에 대한 결합 친화도가 100 nM 이상, 바람직하게는 500 nM 이상, 보다 바람직하게는 1000 nM 이상이고/이거나,
상기 L-핵산 분자는 IC50으로 표현되는 인간 CXCL8에 대한 결합 친화도가 10 nM 이하, 바람직하게는 1 nM 이하, 보다 바람직하게는 100 pM 이하, 가장 바람직하게는 30 pM 이하이며, 여기서 L-핵산 분자는 IC50으로 표현되는 CXCL8과 상이한 ELR-양성 CXC 케모카인에 대한 결합 친화도가 100 nM 이상, 바람직하게는 500 nM 이상, 보다 바람직하게는 1000 nM 이상이다.
실시형태 20: 실시형태 15 내지 19 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 결합 친화도가 실온에서, 바람직하게는 25℃에서 결정되는, L-핵산 분자.
실시형태 21: 실시형태 15 내지 19 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 결합 친화도가 37℃에서 결정되는, L-핵산 분자.
실시형태 22: 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 CXCL8, 바람직하게는 인간 CXCL8, 원숭이 CXCL8, 토끼 CXCL8, 돼지 CXCL8, 개 CXCL8, 양 CXCL8 또는 기니피그 CXCL8, 보다 바람직하게는 인간 CXCL8에 의해 매개되는 활성의 길항제인, L-핵산 분자.
실시형태 23: 실시형태 22의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 인간 CXCL8과 상이한 ELR-양성 인간 CXC 케모카인의 길항제가 아니거나, CXCL8과 상이한 ELR-양성 CXC 케모카인에 의해 매개되는 활성을 길항할 수 없으며, 여기서 CXCL8과 상이한 ELR-양성 CXC 케모카인은 바람직하게는 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6 및 CXCL7로 구성된 군으로부터 선택되는, L-핵산 분자.
실시형태 24: 실시형태 23의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 인간 CXCL8과 상이한 ELR-양성 인간 CXC 케모카인의 길항제가 아니거나, 인간 CXCL8과 상이한 ELR-양성 인간 CXC 케모카인에 의해 매개되는 활성을 길항할 수 없으며, 여기서 인간 CXCL8과 상이한 ELR-양성 인간 CXC 케모카인은 바람직하게 인간 CXCL1, 인간 CXCL2, 인간 CXCL3, 인간 CXCL5, 인간 CXCL6 및 인간 CXCL7로 구성된 군으로부터 선택되는, L-핵산 분자.
실시형태 25: 실시형태 22 내지 24 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, IC50으로 표현되는 인간 CXCR1 및/또는 CXCR2에 의해 매개되는 활성에 대한 L-핵산 분자의 길항 활성이 10 nM 이하, 바람직하게는 1 nM 이하, 보다 바람직하게는 100 pM 이하, 가장 바람직하게는 30 pM 이하인, L-핵산 분자.
실시형태 26: 실시형태 22 내지 25 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 인간 CXCL8에 의해 매개되는 활성에 대한 L-핵산 분자의 길항 활성이 37℃에서 결정되는, L-핵산 분자.
실시형태 27: 실시형태 1 내지 26 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 변형기를 포함하는, L-핵산 분자.
실시형태 28: 실시형태 27의 L-핵산 분자로서, 상기 변형기는 L-핵산 분자의 5'-말단 뉴클레오타이드 및/또는 3'-말단 뉴클레오타이드 및/또는 L-핵산 분자의 5'-말단 뉴클레오타이드와 L-핵산 분자의 3'-말단 뉴클레오타이드 사이의 L-핵산 분자의 뉴클레오타이드에 결합되는, L-핵산 분자.
실시형태 29: 실시형태 27 또는 28의 L-핵산 분자로서, 상기 변형기는 링커를 통해 L-핵산 분자에 결합되는, L-핵산 분자.
실시형태 30: 실시형태 29의 L-핵산 분자로서, 상기 링커는 친수성 링커이고, 바람직하게는 친수성 링커는 하나 이상의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하고, 보다 바람직하게는 친수성 링커는 트리에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는, L-핵산 분자.
실시형태 31: 실시형태 29의 L-핵산 분자로서, 상기 링커는 생분해성 링커인, L-핵산 분자.
실시형태 32: 실시형태 27 내지 31 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 유기체로부터의 변형기를 포함하는 L-핵산 분자의 배출 속도는 변형기를 포함하지 않는 L-핵산의 배출 속도에 비해 감소되는, L-핵산 분자.
실시형태 33: 실시형태 27 내지 31 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 변형기를 포함하는 L-핵산 분자는 변형기를 포함하지 않는 L-핵산 분자 유기체에서의 체류 시간과 비교하여 유기체에서 증가된 체류 시간을 갖는, L-핵산 분자.
실시형태 34: 실시형태 32 또는 33의 L-핵산 분자로서, 상기 유기체가 인간 또는 동물 신체, 바람직하게는 인간 신체인, L-핵산 분자.
실시형태 35: 실시형태 27 및 34 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 변형기는 생분해성 변형 및 비-생분해성 변형을 포함하는 기로부터 선택되고, 바람직하게는 변형기는 폴리에틸렌 글리콜, 선형 폴리에틸렌 글리콜, 분지형 폴리에틸렌 글리콜, 하이드록시에틸 전분, 펩타이드, 단백질, 다당류, 스테롤, 폴리옥시프로필렌, 폴리옥시아미데이트 및 폴리(2-하이드록시에틸)-L-글루타민을 포함하는 군으로부터 선택되는, L-핵산 분자.
실시형태 36: 실시형태 35의 L-핵산 분자로서, 상기 변형기는 폴리에틸렌 글리콜, 바람직하게는 선형 폴리에틸렌 글리콜 또는 분지형 폴리에틸렌 글리콜이고, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 약 20,000 내지 약 120,000 Da, 보다 바람직하게는 약 30,000 내지 약 80,000 Da, 가장 바람직하게는 약 40,000 Da인, L-핵산 분자.
실시형태 37: 실시형태 36의 L-핵산 분자로서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 약 20,000 내지 약 120,000 Da, 바람직하게는 약 30,000 내지 약 80,000 Da, 보다 바람직하게는 약 40,000 Da인, L-핵산 분자.
실시형태 38: 실시형태 35의 L-핵산 분자로서, 상기 변형기는 하이드록시에틸 전분이고, 바람직하게는 하이드록시에틸 전분의 분자량은 약 50 내지 약 1000 kDa, 보다 바람직하게는 약 100 내지 약 700 kDa, 가장 바람직하게는 200 내지 500 kDa인, L-핵산 분자.
실시형태 39: 실시형태 27 내지 31 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 변형기는 L-핵산 분자의 고정화를 위한 것인, L-핵산 분자.
실시형태 40: 실시형태 39의 L-핵산 분자로서, 상기 고정화는 표면에 대한 L-핵산 분자의 공유 결합을 포함하고, 여기서 바람직하게 상기 표면은 반응 용기의 표면, 반응 용기 내 장치의 표면 또는 바이오센서의 표면인, L-핵산 분자.
실시형태 41: 실시형태 39의 L-핵산 분자로서, 상기 고정화는 표면에 대한 L-핵산 분자의 비공유 결합을 포함하고, 여기서 바람직하게 상기 표면은 반응 용기의 표면, 반응 용기 내 장치의 표면 또는 바이오센서의 표면인, L-핵산 분자.
실시형태 42: 실시형태 39 내지 41 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 변형기는 카르복실, 하이드록실, 포스파티딜, 술폰산 에스테르, 아민, 티올, 에폭사이드, 알킨, 변형된 사이클로알킨, 말레이미드, 아지드, 하이드라지드를 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 바람직하게는 변형된 사이클로알킨은 디벤조사이클로옥틸(DBCO), 비사이클로[6.1.0]논-4-인(BCN) 및 아자디벤조사이클로옥틴(ADIBO)을 포함하는 군으로부터 선택되는, L-핵산 분자.
실시형태 43: 실시형태 42의 L-핵산 분자로서, 상기 변형기는 변형된 사이클로알킨, 바람직하게는 디벤조사이클로옥틸(DBCO)인, L-핵산 분자.
실시형태 44: 실시형태 41의 L-핵산 분자로서, 상기 변형기는 비오틴, 브로모-데스옥시우리딘, 디곡시게닌 또는 올리고뉴클레오타이드이고, 바람직하게 변형기는 비오틴인, L-핵산 분자.
실시형태 45: 실시형태 27 내지 31 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 상기 변형기는 L-핵산 분자의 검출을 허용하고, 바람직하게 변형기는 표지인, L-핵산 분자.
실시형태 46: 실시형태 45의 L-핵산 분자로서, 상기 표지는 비오틴, 브로모-데스옥시우리딘, 디곡시게닌, 올리고뉴클레오타이드, 형광 표지, 전기화학발광 표지, 방사성 표지, 효소 표지, UV-표지, 콜로이드 금, 나노입자 및 킬레이터 분자 표지를 포함하는 군으로부터 선택되는, L-핵산 분자.
실시형태 47: 실시형태 1 내지 46 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 질환의 치료 및/또는 예방 방법에 사용하기 위한, L-핵산 분자.
실시형태 48: 실시형태 47의 사용을 위한 L-핵산 분자로서, 상기 질환은 CXCL8-매개 병원성 기전과 관련되고/되거나, 염증성 질환 및 암을 포함하는 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 염증성 질환은 호흡기계의 염증성 질환, 피부의 염증성 질환, 자가면역 질환, 염증성 신경 질환, 허혈성 질환, 죽상동맥경화증, 췌도 이식 거부, 장기 이식 거부, 장기 기능 지연, 척수 손상 또는 방광염인, L-핵산 분자.
실시형태 49: 실시형태 1 내지 47 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, CXCL8을 검출하기 위한 방법에 사용하기 위한, L-핵산 분자.
실시형태 50: 실시형태 1 내지 47 중 어느 하나의 L-핵산 분자로서, 검출 수단 또는 바이오센서의 제조를 위한, L-핵산 분자.
실시형태 51: 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자 및 선택적으로 추가의 구성성분을 포함하는 약제학적 조성물로서, 추가 구성성분은 약제학적으로 허용되는 부형제, 약제학적으로 허용되는 담체 및 약제학적 활성제를 포함하는 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
실시형태 52: 실시형태 51의 약제학적 조성물로서, 상기 약제학적 조성물은 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
실시형태 53: 약제의 제조를 위한, 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자의 용도.
실시형태 54: 실시형태 53의 용도로서, 상기 약제는 인간 의학에 사용하기 위한 것 또는 수의학에 사용하기 위한 것인, 용도.
실시형태 55: 실시형태 54의 용도에 있어서, 상기 약제는 CXCL8-매개 병원성 기전과 관련된 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 것이고/이거나, 염증성 질환 및 암을 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 바람직하게는 염증성 질환은 호흡기계의 염증성 질환, 피부의 염증성 질환, 자가면역 질환, 염증성 신경 질환, 허혈성 질환, 죽상동맥경화증, 췌도 이식 거부, 장기 이식 거부, 장기 기능 지연, 척수 손상 또는 방광염인, 용도.
실시형태 56: 진단기, 진단 수단 또는 바이오센서의 제조를 위한, 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자의 용도.
실시형태 57: 실시형태 56의 용도로서, 상기 진단기 또는 진단 수단이 반응 용기 상의 표면 또는 반응 용기 내의 장치 상의 표면을 갖는, 용도.
실시형태 58: 실시형태 56의 용도로서, 상기 바이오센서가 표면을 갖는, 용도.
실시형태 59: 실시형태 56 내지 58 중 어느 하나의 용도로서, 상기 진단기, 진단 수단 또는 바이오센서는 CXCL8, 바람직하게는 인간 CXCL8을 직접 또는 간접적으로 검출하는데 적합한, 용도.
실시형태 60: 실시형태 56 또는 57의 용도로서, 상기 CXCL8은 샌드위치 결합 분석 또는 경쟁 결합 분석으로 직접 결합에 의해 검출되는, 용도.
실시형태 61: 실시형태 60의 용도로서, 상기 직접 결합은 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자만을 사용하고, CXCL8과 상호작용하는 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자와 상이한 제2 분자를 사용하지 않거나 사용하는데 관여하지 않는 검출 방법을 포함하는, 용도.
실시형태 62: 실시형태 60의 용도로서, 상기 샌드위치 분석은 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자가 표면에 고정되고, 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자 및 CXCL8의 복합체가 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자에 의해 결합된 것(들)과 상이한 CXCL8의 에피토프(들)에 결합하는 검출 수단에 의해 검출되는, 샌드위치 혼성화 분석인, 용도.
실시형태 63: 실시형태 60의 용도로서, 상기 샌드위치 분석은 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자에 의해 결합된 것(들)과 상이한 CXCL8의 에피토프(들)에 결합하는 수단이 표면에 고정되고, 이러한 수단 및 CXCL8의 복합체가 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자에 의해 검출되는 샌드위치 혼성화 분석인, 용도.
실시형태 64: 실시형태 60의 용도로서, 상기 경쟁 결합 분석에서 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자는 표면에 고정되고, CXCL8에 대한 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자의 결합은 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자에 적어도 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 CXCL8과 경쟁하며, 바람직하게 상보성은 보다 바람직하게는 왓슨-크릭 염기 쌍을 기반으로 하는 염기 상보성인, 용도.
실시형태 65: 실시형태 60의 용도로서, 상기 경쟁 결합 분석에서 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자는 표면에 고정되지 않고, CXCL8에 대한 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자의 결합은 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 CXCL8와 경쟁하며, 바람직하게는 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 CXCL8은 표면에 고정되며, 바람직하게 상보성은 보다 바람직하게는 왓슨-크릭 염기 쌍을 기반으로 하는 염기 상보성인, 용도.
실시형태 66: 실시형태 62 내지 65 중 어느 하나의 용도로서, 표면에 대한 고정화를 위해 실시형태 39 내지 44 중 어느 하나의 L-핵산 분자가 사용되는, 용도.
실시형태 67: 실시형태 57 내지 66 중 어느 하나의 용도로서, 표면, 바람직하게는 바이오센서의 표면은 금, 은, 티타늄, 지르코늄, 바나듐, 크롬, 망간, 코발트, 텅스텐, 몰리브덴, 백금, 알루미늄, 철, 강철, 구리, 니켈, 실리콘, 게르마늄, 인화 인듐, 비화 갈륨, 및 이들의 산화물, 질화물 또는 합금 또는 혼합물, 인듐-주석 산화물, 유리질 탄소, 사파이어, 규산염 유리 및 붕산염 유리로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
실시형태 68: 실시형태 57 내지 67 중 어느 하나의 용도로서, 표면, 바람직하게는 바이오센서의 표면은 폴리라이신, 아미노실란, 에폭시실란, 니트로셀룰로스, 카르복시덱스트란, 탄소 나노막, 그래핀 산화물, 탄소 표면, 예컨대 카본 블랙, 탄소 섬유, 탄소 플레이트, 탄소 천, 활성탄, 유리질 탄소, 숯, 활성탄, 흑연 분말, 흑연 섬유, 탄소 나노튜브, 풀러렌, 카르복실기, 아지드기, 티올기, 하이드록시기, 에폭사이드, 말레이미드, 알킨, 변형된 알킨 또는 이들의 임의의 조합에 의해 변형되는, 용도.
실시형태 69: 실시형태 68의 용도로서, 실시형태 39 내지 44 중 어느 하나의 L-핵산 분자의 고정화를 위해, 표면은 1차 아민, 티올기, 아지드, 알킨, 알켄, 테트라진, 테트라졸, 또는 변형된 사이클로알킨으로 작용화되며, 여기서 바람직하게는 변형된 사이클로알킨은 디벤조사이클로옥틸(DBCO), 비사이클로[6.1.0]논-4-인(BCN) 또는 아자디벤조사이클로옥틴(ADIBO)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
실시형태 70: 실시형태 69의 용도로서, 실시형태 42 또는 43의 L-핵산 분자의 고정화를 위해 변형-촉진 아지드-알킨 고리화첨가가 사용되는, 용도.
실시형태 71: 실시형태 56 내지 70 중 어느 하나의 용도로서, 실시형태 44 내지 46 중 어느 하나의 L-핵산 분자가 검출에 사용되는, 용도.
실시형태 72: 실시형태 56 내지 71 중 어느 하나의 용도로서, 상기 바이오센서의 검출 시스템은 광학 판독, 질량 변화, 굴절률, 전하, 표면 응력 및 원자력 현미경에 기초하는, 용도.
실시형태 73: 실시형태 72의 용도로서, 광학 판독에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 형광, 흡수 또는 발광인, 용도.
실시형태 74: 실시형태 72의 용도로서, 질량 변화에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 수정 미세저울 또는 미세전자기계 시스템인, 용도.
실시형태 75: 실시형태 72의 용도로서, 굴절률에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 표면 플라즈몬 공명, 링 공명기 또는 타원계측법인, 용도.
실시형태 76: 실시형태 72의 용도로서, 전하에 기반한 바이오센서의 검출 시스템이 전기화학적 임피던스, 전압전류법, 전류측정법, 전위차 법, 전도도 또는 전계 효과 트랜지스터인, 용도.
실시형태 77: 실시형태 72의 용도로서, 표면 응력에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 캔틸레버 바이오센서인, 용도.
실시형태 78: 실시형태 56 내지 59 중 어느 하나의 용도로서, CXCL8은 균일한 분석 설정에 의해 검출되는, 용도.
실시형태 79: CXCL8, 바람직하게는 인간 CXCL8의 검출을 위한, 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자의 용도.
실시형태 80: 실시형태 79의 용도로서, CXCL8은 샌드위치 결합 분석 설정, 균일 분석 설정 또는 경쟁 분석 설정으로 검출되는, 용도.
실시형태 81: 실시형태 80의 용도로서, 상기 샌드위치 결합 분석 설정, 균일 분석 설정 또는 경쟁 분석 설정은 CXCL8을 직접 또는 간접적으로 검출하는 데 적합한, 용도.
실시형태 82: 실시형태 78 내지 81 중 어느 하나의 용도로서, 상기 L-핵산 분자는 진단기의 반응 용기의 장치 표면 상에, 진단기의 반응 용기 내의 장치 표면 상에, 또는 바이오센서의 표면 상에 공유적으로 고정되는, 용도.
실시형태 83: 실시형태 82의 용도로서, 고정화를 위해 실시형태 39 내지 44 중 어느 하나의 L-핵산 분자가 사용되는, 용도.
실시형태 84: 실시형태 82 또는 83의 용도로서, 표면, 바람직하게 바이오센서의 표면은 금, 은, 티타늄, 지르코늄, 바나듐, 크롬, 망간, 코발트, 텅스텐, 몰리브덴, 백금, 알루미늄, 철, 강철, 구리, 니켈, 실리콘, 게르마늄, 인화 인듐, 비화 갈륨, 및 이들의 산화물, 질화물 또는 합금 또는 혼합물, 인듐-주석 산화물, 유리질 탄소, 사파이어, 규산염 유리 및 붕산염 유리로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
실시형태 85: 실시형태 82 내지 84 중 어느 하나의 용도로서, 표면, 바람직하게 바이오센서의 표면은 폴리라이신, 아미노실란, 에폭시실란, 니트로셀룰로스, 카르복시덱스트란, 탄소 나노막, 그래핀 산화물, 탄소 표면, 예컨대 카본 블랙, 탄소 섬유, 탄소 플레이트, 탄소 천, 활성탄, 유리질 탄소, 숯, 활성탄, 흑연 분말, 흑연 섬유, 탄소 나노튜브, 풀러렌, 카르복실기, 아지드기, 티올기, 하이드록시기, 에폭사이드, 말레이미드, 알킨, 변형된 알킨 또는 이들의 임의의 조합에 의해 변형되는, 용도.
실시형태 86: 실시형태 85의 용도로서, 실시형태 38 내지 44 중 어느 하나의 L-핵산 분자의 고정화를 위해 표면은 활성화된 활성화된 1차 아민, 티올기, 아지드 또는 변형된 사이클로알킨에 의해 작용화되고, 여기서 바람직하게는 변형된 사이클로알킨은 디벤조사이클로옥틸(DBCO), 비사이클로[6.1.0]논-4-인(BCN) 또는 아자디벤조사이클로옥틴(ADIBO)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
실시형태 87: 실시형태 86의 용도로서, 실시형태 42 또는 43의 L-핵산 분자의 고정화를 위해 변형-촉진 아지드-알킨 고리화첨가가 사용되는, 용도.
실시형태 88: 실시형태 82 내지 87 중 어느 하나의 용도로서, 바이오센서의 검출 시스템은 광학 판독, 질량 변화, 굴절률, 전하, 표면 응력 및 원자력 현미경에 기초하는, 용도.
실시형태 89: 실시형태 88의 용도로서, 광학 판독에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 형광, 흡수 또는 발광인, 용도.
실시형태 90: 실시형태 85의 용도로서, 질량 변화에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 수정 미세저울 또는 미세전자기계 시스템인, 용도.
실시형태 91: 실시형태 88의 용도로서, 굴절률에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 표면 플라즈몬 공명, 링 공명기 또는 타원계측법인, 용도.
실시형태 92: 실시형태 88의 용도로서, 전하에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 전기화학적 임피던스, 전압전류법, 전류측정법, 전위차 법, 전도도 또는 전계 효과 트랜지스터인, 용도.
실시형태 93: 실시형태 88의 용도로서, 표면 응력에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 캔틸레버 바이오센서인, 용도.
실시형태 94: 실시형태 79 내지 81 중 어느 하나의 용도로서, 상기 L-핵산 분자는 L-핵산 분자의 검출을 허용하는 변형기를 포함하고, 바람직하게 변형기는 표지인, 용도.
실시형태 95: 실시형태 94의 용도로서, 상기 표지는 비오틴, 브로모-데스옥시우리딘, 디곡시게닌, 올리고뉴클레오타이드, 형광 표지, 전기화학발광 표지, 방사성 표지, 효소 표지, UV-표지, 콜로이드 금, 나노입자 및 킬레이터 분자 표지를 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
실시형태 96: CXCL8의 검출을 위한 키트로서, 여기서 키트는 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자 및 적어도 지침서 또는 반응 용기를 포함하는, 용도.
실시형태 97: 샘플 내 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 L-핵산을 사용하여 CXCL8을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
a) 알려지지 않은 농도의 CXCL8을 가진 샘플을 제공하는 단계;
b) 샘플 또는 이의 희석액을 실시형태 56 내지 78 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 진단기, 진단 수단 또는 바이오센서와 접촉시키는 단계;
c) 실시형태 56 내지 78 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 같은 진단, 진단 수단 또는 바이오센서로 신호를 측정하는 단계;
d) 선택적으로, 신호를 기준과 비교하는 단계;
e) 선택적으로, CXCL8 농도가 알려지지 않은 샘플에서 CXCL8의 농도는 알려진 CXCL8 농도를 가진 적어도 하나의 샘플에서 얻은 신호와 비교하여 결정되며, 바람직하게는 알려진 CXCL8 농도를 가진 적어도 하나의 샘플은 단계 b) 내지 c)에 적용되는, 방법.
실시형태 98: 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 L-핵산 분자 및 CXCL8을 포함하는 복합체로서, 바람직하게는 복합체는 결정질 복합체인, 복합체.
실시형태 99: CXCL8에 의해 매개되는 활성의 길항제의 스크리닝 방법으로서, 하기 단계들:
- CXCL8에 의해 매개된 활성의 후보 길항제를 제공하는 단계,
- 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 L-핵산 분자를 제공하는 단계,
- CXCL8에 의해 매개되는 활성의 길항제의 존재 하에 신호를 제공하는 테스트 시스템을 제공하는 단계, 및
- CXCL8에 의해 매개되는 활성의 후보 길항제가 CXCL8에 의해 매개되는 활성의 길항제인지 여부를 결정하는 단계
를 포함하는, 방법.
실시형태 100: 샘플에서 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 정의된 L-핵산을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계들:
a) 포획 프로브를 제공하는 단계로서, 여기서 포획 프로브는 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자의 제1 부분 및 검출 프로브에 적어도 부분적으로 상보적이며, 상기 검출 프로브는 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 정의된 L-핵산 분자의 제2 부분에 적어도 부분적으로 상보적이거나, 대안적으로, 포획 프로브는 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 정의된 L-핵산 분자의 제2 부분에 적어도 부분적으로 상보적이며, 검출 프로브는 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 정의된 L-핵산 분자의 제1 부분에 적어도 부분적으로 상보적인, 단계;
b) 포획 프로브 및 검출 프로브를 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자를 함유하거나 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자를 함유하는 것으로 추정되는 샘플에 개별적으로 또는 조합하여 첨가하는 단계;
c) 포획 프로브 및 검출 프로브가 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자 또는 이의 일부와 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 반응하도록 하는 단계;
d) 포획 프로브가 단계 a)에서 제공된 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자에 혼성화되는지 여부를 선택적으로 검출하는 단계; 및
e) 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자 및 포획 프로브 및 검출 프로브로 구성된, 단계 c)에서 형성된 복합체를 검출하는 단계
를 포함하는, 방법.
실시형태 101: 실시형태 100의 방법으로서, 상기 검출 프로브는 검출 수단을 포함하고/하거나, 포획 프로브는 지지체, 바람직하게는 고체 지지체에 고정되는, 방법.
실시형태 102: 실시형태 100 또는 101의 방법으로서, 단계 c)에서 형성된 복합체의 일부가 아닌 임의의 검출 프로브가 반응으로부터 제거되어, 단계 e)에서 복합체의 일부인 검출 프로브만 검출되는, 방법.
실시형태 103: 실시형태 100 내지 102 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 e)는 포획 프로브와 검출 프로브가 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자 또는 이의 일부의 존재 하에 및 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 상기 L-핵산 분자의 부재 하에 혼성화될 때 검출 수단에 의해 생성된 신호를 비교하는 단계를 포함하는, 방법.
어떠한 이론에도 얽매이고 싶지는 않지만, 본 발명자들은 본 발명에 따른 생체안정성 L-핵산 분자가 인간 CXCL8에 특이적이고 높은 친화도로 결합하여, CXCL8의 그의 수용체와의 결합을 효과적으로 억제한다는 것을 놀랍게도 발견했다. 놀랍게도, 본 발명자들은 CXCL8에 특이적으로 결합하고 억제하지만, 각각-관련 케모카인 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6 및 CXCL7이 ELR 모티프와 같이 CXCL8과 구조적 특징을 공유함에도 불구하고 이들 단백질에 결합 및 억제하지 않는 핵산 분자를 확인했다. CXCL8 결합 핵산의 피코몰 범위로 표시된 친화도와 높은 선택도는 예측할 수 없었다.
특히, 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따른 핵산 분자가 CXCL8과 그의 수용체의 상호작용을 차단하는데 적합하고, 피코몰 범위의 억제 상수로 CXCL8-유도된 화학주성을 억제한다는 것을 발견했다. 지금까지, 본 발명에 따른 핵산 분자는 또한 CXCL8의 효과, 특히 그의 수용체 CXCR1 및/또는 CXCR2에 대한 CXCL8의 효과의 길항제로 볼 수 있다. 본원에서 바람직하게 사용되는 바와 같이, CXCL8에 대한 길항제는 CXCL8에 결합하는 분자, 예컨대, 본 발명에 따른 핵산 분자이며, 바람직하게는 실시예에 기재된 바와 같은 시험관 내 분석 또는 생체 내 모델에서 CXCL8의 기능을 억제한다.
본 발명 내에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 핵산이다. 지금까지 용어 핵산 및 핵산 분자는 반대로 표시되지 않는 한 동의어 방식으로 본원에서 사용된다. 더욱이, 이러한 핵산(들)은 바람직하게는 (본) 발명에 따른 핵산 분자(들), 본 발명에 따른 핵산(들), 본 발명의 핵산(들), 또는 본 발명의 핵산 분자(들)로도 지칭된다.
본원에 기재된 본 발명에 따른 핵산의 특징은 핵산이 단독으로 또는 임의의 조합으로 사용되는 이의 임의의 실시형태를 포함하여 본 발명의 임의의 양태에서 실현될 수 있다. 본 발명의 양태의 임의의 실시형태는 본 발명의 각각 및 임의의 다른 양태의 실시형태라는 것을 인지해야 한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 제1 양태의 임의의 실시형태는 또한 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12 및 제13 양태의 각각 및 어느 하나의 실시형태이다.
본 발명에 따른 핵산 분자 및 이를 포함하는 조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물을 이용하여 치료 또는 예방할 수 있는 각종 질환, 병태 및 장애에 대해서는, 이러한 질환, 병태 및 장애가 바람직하게는 본원에 기재된 것, 특히 본 출원의 도입 부분에 기술되고 제시된 것들을 포함한다는 것을 인지하여야 한다. 지금까지, 명세서의 각각의 구절 및 명세서의 도입 부분은 상기 질환, 병태 및 장애의 예방 및 치료에 대한 본 발명의 핵산 분자의 적합성을 각각 교시하는 본 개시내용의 필수적인 부분을 형성한다. 부가적으로, CXCL8-CXCR1 수용체 및 CXCL8-CXCR2 수용체 축의 생리적 효과가 CXCL8의 높은 혈장 수준과 관련이 있는 경우 본 발명에 따른 핵산 분자가 바람직하다.
본원에서 바람직하게 사용되는 용어 CXCL8은 포유동물 CXCL8을 포함하지만, 이로 한정되지 않는 임의의 CXCL8을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물 CXCL8은 인간, 원숭이, 토끼, 돼지, 개, 양, 제브라피시 및 기니피그 CXCL8을 포함하는 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는 CXCL8은 바람직하게는 서열 번호 2에 따른 아미노산 서열을 갖는, 인간 CXCL8이다.
청구범위 및 실시예 1에 보다 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 인간 CXCL8에 결합할 수 있는 다수의 상이한 핵산 분자를 식별할 수 있었다.
본 명세서에 보다 상세하게 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 인간 CXCL8에 결합할 수 있는 다수의 상이한 CXCL8 핵산 분자를 식별하였으며, 이에 의해 핵산 분자는 본원에서 또한 개시된 바와 같이 지칭되는 뉴클레오타이드의 스트레치 측면에서 특징화될 수 있다(실시예 1 참조).
CXCL8에 결합하는 본 발명의 CXCL8 결합 핵산 분자의 각각의 상이한 유형은 3개의 상이한 뉴클레오타이드 스트레치: 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치, 뉴클레오타이드의 중심 스트레치 및 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치를 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 CXCL8 결합 핵산 분자는 그의 5'-말단 및 3'-말단 각각에 뉴클레오타이드의 말단 스트레치, 즉 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치, 및/또는 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치(각각 뉴클레오타이드의 5'-말단 스트레치 및 뉴클레오타이드의 3'-말단 스트레치라고도 함)를 포함한다. 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치 및 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 원칙적으로 그들의 염기 상보성으로 인해 서로 혼성화할 수 있으며, 이로써 혼성화 시 이중가닥 구조가 형성된다. 그러나, 그러한 혼성화는 생리적 및/또는 비-생리적 조건 하에서 분자에서 반드시 실현되는 것은 아니다. CXCL8 결합 핵산 분자의 세 가지 뉴클레오타이드 스트레치, 즉 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치, 뉴클레오타이드의 중심 스트레치 및 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5'→3'-방향으로 서로 배열된다: 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치 - 뉴클레오타이드의 중심 스트레치 - 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치. 대안적으로, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치, 뉴클레오타이드의 중심 스트레치 및 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5'→3'-방향으로 서로 배열된다.
본 발명에 따른 핵산의 뉴클레오타이드의 중심 스트레치의 길이는 바람직하게는 32 또는 33개 뉴클레오타이드이다.
본 발명에 따른 핵산의 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치의 길이는 3 내지 6개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 5 내지 6개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 5개의 뉴클레오타이드이다.
본 발명에 따른 핵산의 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치의 길이는 3 내지 6개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 5 내지 6개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 5개의 뉴클레오타이드이다.
용어 '스트레치' 및 '뉴클레오타이드의 스트레치'는 반대로 나타내지 않으면 동의어 방식으로 본원에서 사용된다.
상이한 CXCL8 결합 핵산 분자 사이에 정의된 스트레치의 서열의 차이는 CXCL8에 대한 결합 친화도에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 상이한 CXCL8 결합 핵산 분자의 결합 분석에 기초하여, 중심 스트레치 및 이를 형성하는 뉴클레오타이드는 CXCL8 결합 핵산 분자를 CXCL8에 결합하기 위해 개별적으로, 그리고 더욱 바람직하게는 그 전체가 필수적이다.
바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 핵산 분자는 단일 핵산 분자이다. 추가 실시형태에서, 단일 핵산 분자는 다수의 단일 핵산 분자로서 또는 다수의 단일 핵산 분자 종으로서 존재한다.
당업자라면 본 발명에 따른 핵산 분자가 바람직하게는 포스포디에스테르 연결 또는 결합을 통해 서로 공유적으로 연결된 뉴클레오타이드로 바람직하게 구성됨을 인지할 것이다.
본 발명의 범위내에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 원칙적으로 서로 혼성화할 수 있는 둘 이상의 스트레치 또는 이의 일부(들)를 포함한다. 이러한 혼성화시, 이중가닥 구조가 형성된다. 이러한 혼성화는 특히 시험관 내 및/또는 생체 내 조건 하에서 발생할 수 있거나 발생하지 않을 수 있음을 당업자는 인지할 것이다. 또한, 혼성화의 경우, 그러한 혼성화는 적어도 염기 쌍에 대한 규칙에 기초하여 이러한 혼성화 및 따라서, 이중가닥 구조의 형성이 원칙적으로 발생할 수 있는 두 스트레치의 전체 길이에 걸쳐 반드시 발생하는 것은 아니다. 본원에서 바람직하게 사용되는 바와 같이, 이중가닥 구조는 핵산 분자의 일부 또는 핵산 분자의 단일 가닥의 2개 이상의 분리된 가닥 또는 공간적으로 분리된 2개의 스트레치에 의해 형성된 구조로, 바람직하게는 왓슨-크릭 염기 쌍 규칙에 따른 염기 쌍인, 적어도 하나, 바람직하게는 2개 이상의 염기 쌍이 존재한다. 이는 또한, 후그스틴(Hoogsten) 염기 쌍과 같은 다른 염기 쌍이 이러한 이중가닥 구조 내에 존재할 수 있거나 형성될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 또한, 2개의 스트레치가 혼성화하는 특징은 바람직하게는 그러한 혼성화가 실제로 생체 내 및/또는 시험관 내에서 발생하는지 여부에 관계없이 두 스트레치의 염기 상보성으로 인해 그러한 혼성화가 발생하는 것으로 가정됨을 나타내는 것으로 인식된다. 본 발명과 관련하여 이러한 스트레치는 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치 및 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치이며, 실시형태에서 상기 정의된 바와 같이 혼성화할 수 있다.
바람직한 실시형태에서 본원에 사용된 용어 배열은 본원에 개시된 핵산 분자(들)와 관련하여 본원에 기재된 구조적 또는 기능적 특징 또는 요소의 순서 또는 서열을 의미한다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 또한 본 명세서에 개시된 특정 서열에 본질적으로 상동성인 핵산을 포함해야 한다. 실질적으로 상동성이라는 용어는 상동성이 적어도 75%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상인 것으로 이해되어야 한다. 본 발명에 따른 핵산 분자에 존재하는 상동성 뉴클레오타이드의 실제 백분율은 핵산 분자에 존재하는 총 뉴클레오타이드의 수에 따라 달라질 것이다. 변형 백분율은 핵산 분자에 존재하는 총 뉴클레오타이드 수를 기반으로 할 수 있다.
2개의 핵산 분자 사이의 상동성은 당업자에게 알려진 바와 같이 확인할 수 있다. 보다 구체적으로, 지정된 프로그램 매개변수에 기초하여 참조 서열에 대한 테스트 서열(들)에 관한 서열 상동성 백분율을 계산하기 위해 서열 비교 알고리즘을 사용할 수 있다. 테스트 서열은 상동성이거나 상동성인지의 여부를 테스트할 서열 또는 핵산 분자인 것이 바람직하고, 어느 정도까지 상이한 핵산 분자라면, 이러한 상이한 핵산 분자도 참조 서열이라고 한다. 일 실시형태에서, 참조 서열은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 바람직하게는 서열 번호 14 내지 26 및 39 내지 44, 바람직하게는 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 25, 및 서열 번호 26, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 20 및 서열 번호 41 내지 44 중 어느 하나에 따른 서열을 갖는 핵산 분자이다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어, Smith & Waterman의 로컬 상동 알고리즘에 의해(Smith & Waterman, 1981), Needleman & Wunsch의 상동 정렬 알고리즘에 의해(Needleman & Wunsch, 1970), Pearson & Lipman의 유사성 방법 검색에 의해(Pearson & Lipman, 1988), 이러한 알고리즘들의 전산화 구현에 의해(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) 또는 육안 검사에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 백분율을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 한 예는 기본 로컬 정렬 검색 도구(이하 "BLAST")에서 사용되는 알고리즘이며, 예를 들어 Altschul et al의 문헌[Altschul et al. 1990 및 Altschul et al., 1997]을 참고한다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information(이하 "NCBI")을 통해 공개적으로 입수할 수 있다. NCBI에서 입수할 수 있는 소프트웨어, 예를 들어 BLASTN(뉴클레오타이드 서열용) 및 BLASTP(아미노산 서열용)를 사용하여 서열 동일성을 결정하는 데 사용되는 기본 매개변수는 McGinnis et al의 문헌[McGinnis et al., 2004]에 설명되어 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 또한 본원에 개시 및 기재되고 이들의 뉴클레오타이드 서열에 의해 정의된 핵산에 대해 어느 정도의 동일성을 갖는 핵산 분자를 포함해야 한다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 또한 본원에 개시 및 기재되고 이의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부에 의해 정의된 핵산 분자에 대해 적어도 75%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 핵산 분자를 포함한다.
본 발명에 따른 용어인, 본 발명의 핵산 또는 핵산 분자는 바람직하게는 핵산 분자 또는 상기 부분이 인간 CXCL8에 대한 결합에 관여하는 정도로, 또한 본원에 개시 또는 기재된 핵산 서열 또는 그의 일부를 포함하는 핵산 분자를 포함해야 한다. 일 실시형태에서, 이러한 핵산은 본원에 기재되거나 개시된 핵산 분자 중 하나 또는 이의 유도체 및/또는 대사산물이며, 따라서, 이러한 유도체 및/또는 대사산물은 바람직하게는 본원에 기재 또는 개시된 핵산 분자에 비해 절단된 핵산 분자이다. 절단은 본원에 개시 또는 기재된 핵산 분자의 말단 중 하나 또는 둘 모두와 관련될 수 있다. 또한, 절단은 핵산 분자의 뉴클레오타이드의 내부 서열과 관련될 수 있으며, 즉, 각각 5' 및 3' 말단 뉴클레오타이드 사이의 뉴클레오타이드(들)와 관련될 수 있다. 더욱이, 절단은 본원에 개시된 핵산의 서열에서 적어도 단일 뉴클레오타이드만큼의 결실을 포함해야 한다. 절단은 또한 본원에 기재 또는 개시된 핵산(들)의 하나 이상의 스트레치와 관련될 수 있으며, 이에 의해 스트레치는 1개의 뉴클레오타이드 길이만큼 작을 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 분자의 결합은 일상적인 실험을 사용하거나, 본원에 기재된, 바람직하게는 본원의 실시예 부분에 기재된 바와 같은 방법을 사용하거나 채택함으로써 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 D-핵산 분자 또는 L-핵산 분자일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산 분자는 L-핵산 분자이다.
또한, 일 실시형태에서, 핵산 서열(들)의 관점에서 전체적으로 본원에 기재된 핵산 분자 각각 및 임의의 것은 특정 표시된 뉴클레오타이드 서열(들)로 제한된다는 것도 본 발명에 포함된다. 다시 말해서, 용어 "포함하는" 또는 "포함한다"는 그러한 실시형태에서 포함하거나 구성하는 의미로 해석되어야 한다.
또한, 본 발명에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 더 긴 핵산 분자의 일부이고, 이로 인해 이 더 긴 핵산은 여러 부분을 포함하고, 이에 의해 적어도 하나의 그러한 부분이 본 발명에 따른 핵산이거나, 또는 그 일부이다. 이러한 더 긴 핵산 분자의 다른 부분(들)은 하나 또는 여러개의 D-핵산 분자(들) 또는 하나 또는 여러개의 L-핵산 분자(들)일 수 있다. 본 발명과 관련하여 임의의 조합이 사용될 수 있다. 더 긴 핵산 분자의 이들 다른 부분(들)은 단독으로 또는 전체적으로 또는 특정 조합으로 함께 취해져서 결합과, 바람직하게는 CXCL8에 대한 결합과 상이한 기능을 나타낼 수 있다. 하나의 가능한 기능은 다른 분자와의 상호작용을 허용하는 것이며, 이에 의해 그러한 다른 분자는 바람직하게는 예를 들어 고정화, 가교 결합, 검출 또는 증폭과 같이 CXCL8과 상이하다. 본 발명의 추가 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 개별 또는 결합된 모이어티로서, 본 발명의 여러 핵산 분자를 포함한다. 본 발명의 여러 핵산을 포함하는 이러한 핵산 분자는 또한 용어 더 긴 핵산에 포함된다.
본원에 사용된 L-핵산은 L-뉴클레오타이드로 구성된, 바람직하게는 L-뉴클레오타이드로 완전히 구성된 핵산 또는 핵산 분자이다.
본원에 사용된 D-핵산은 D-뉴클레오타이드로 구성된, 바람직하게는 D-뉴클레오타이드로 완전히 구성된 핵산 또는 핵산 분자이다.
용어 핵산 및 핵산 분자는 반대로 명시적으로 나타내지 않으면 상호교환 가능한 방식으로 본원에서 사용된다.
또한, 반대로 지시되지 않으면, 임의의 뉴클레오타이드 서열은 본원에 5'→3' 방향으로 제시된다.
본원에서 바람직하게 사용되는 바와 같이, 뉴클레오타이드의 임의의 위치는 이러한 뉴클레오타이드를 함유하는 서열의 5' 말단, 스트레치 또는 서브스트레치에 대해 결정되거나 언급된다. 따라서, 제2 뉴클레오타이드는 각각 서열의 5' 말단, 스트레치 및 서브스트레치로부터 계산된 제2 뉴클레오타이드이다. 또한, 그것에 따라, 끝에서 2번째의 뉴클레오타이드는 각각 서열의 3' 말단, 스트레치 및 서브스트레치로부터 계산된 제2 뉴클레오타이드이다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 리보뉴클레오타이드로 구성되며, 여기서
G는 구아노신-5'-모노포스페이트이고,
C는 시티딘 5'-모노포스페이트이고,
A는 아데노신-5'-모노포스페이트이고,
U는 우리딘-5'모노포스페이트이다.
리보뉴클레오타이드 서열 모티프의 정의를 위해, 분명하게 규정되지 않은 뉴클레오타이드에 대한 IUPAC 약어가 사용된다:
S 강한 G 또는 C;
W 약한 A 또는 U(T);
R 퓨린 G 또는 A;
Y 피리미딘 C 또는 U(T);
K 케토 G 또는 U(T);
M 이미노 A 또는 C;
B A 아님 C 또는 U(T) 또는 G;
D C 아님 A 또는 G 또는 U(T);
H G 아님 A 또는 C 또는 U(T);
V U 아님 A 또는 C 또는 G;
N 모두 A 또는 G 또는 C 또는 U(T)
본 발명의 핵산 분자를 L-핵산 분자로 설계하는 것은 여러 가지 이유로 유리하다. L-핵산 분자는 자연 발생 핵산 분자의 거울상 이성질체이다. 그러나 D-핵산 분자는 뉴클레아제의 광범위한 존재로 인해 수용액, 및 특히 생물학적 시스템 또는 생물학적 샘플에서 매우 안정적이지 않다. 자연적으로 발생하는 뉴클레아제, 특히 동물 세포로부터의 뉴클레아제는 L-핵산을 분해할 수 없다. 이로 인해 L-핵산 분자의 생물학적 반감기가 동물과 인체를 포함한 그러한 시스템에서 현저하게 증가한다. L-핵산 분자의 분해성이 부족하기 때문에 뉴클레아제 분해 산물이 생성되지 않으므로 동물과 인체를 포함하는 이러한 시스템에서 그로 인한 부작용이 관찰되지 않는다. 이 양태는 L-핵산 분자를 CXCL8의 존재와 관련된 질환 및/또는 장애의 치료에 사용되는 사실상 다른 모든 화합물과 구별한다. 왓슨 크릭 염기 쌍과는 상이한 메커니즘을 통해 표적 분자에 특이적으로 결합하는 L-핵산 분자, 또는 L-뉴클레오타이드로 부분적으로 또는 완전히 구성되는 앱타머, 특히 표적 분자에 대한 앱타머의 결합에 관여하는 앱타머의 이러한 일부는 스피겔머라고 도한다. 그와 같은 앱타머 및 스피겔머(spiegelmer)는 당업자에게 공지되어 있으며, 특히, 문헌 ['The Aptamer Handbook' (eds. Klussmann, 2006)]에 기재되어 있다.
또한, 본 발명에서, 본 발명의 핵산 분자는 D-핵산 분자, L-핵산 분자 또는 D, L-핵산 분자로 존재하는지 여부에 관계없이 단일 가닥 또는 이중가닥 핵산 분자로 존재할 수 있다. 전형적으로, 핵산 분자는 이의 1차 서열로 인해 정의된 2차 구조를 나타내는 단일 가닥 핵산 분자이며, 따라서, 3차 구조를 형성할 수도 있다. 그러나, 핵산 분자는 또한 서로 상보적이거나 부분적으로 상보적인 두 가닥이 서로 혼성화된다는 의미에서 이중가닥일 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 변형될 수 있다. 이러한 변형은 핵산 분자의 단일 뉴클레오타이드와 관련될 수 있으며, 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 변형의 예는 특히 Venkatesan et al.의 문헌[Venkatesan et al., 2003] 및 Kusser의 문헌[Kusser, 2000]에 기재되어 있다. 이러한 변형은 핵산 분자를 구성하는 모든 개별 뉴클레오타이드 여러개 중 하나의 2' 위치에 있는 NH2-기 또는 O-CH3 기, F 원자, 또는 H 원자일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 핵산 분자는 적어도 하나의 LNA 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서 본 발명에 따른 핵산 분자는 LNA 뉴클레오타이드로 구성된다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 다중부분 핵산 분자일 수 있다. 본원에 사용된 다중부분 핵산 분자는 적어도 2개의 개별 핵산 가닥으로 구성된 핵산 분자이다. 이들 적어도 2개의 핵산 가닥은 기능 단위를 형성하고, 이에 의해 기능 단위는 표적 분자에 대한 리간드, 바람직하게는 CXCL8의 경우 표적 분자에 대한 길항제이다. 적어도 2개의 핵산 가닥은 본 발명의 핵산 분자를 절단하여 적어도 2개의 가닥을 생성하거나, 또는 본 발명의 전장 핵산 분자 및 본 발명의 전장 핵산 분자의 다른 부분에 상응하는 또 다른 핵산 분자의 제1 부분에 상응하는 하나의 핵산 분자를 합성함으로써 본 발명의 임의의 핵산 분자로부터 유래될 수 있다. 전장 핵산 분자를 형성하는 부분의 수에 따라, 필요한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 해당 수의 부분이 합성될 것이다. 상기 예시된 바와 같이 2개 초과의 가닥이 있는 다중부분 핵산 분자를 생성하기 위해 절단 접근법 및 합성 접근법 모두가 적용될 수 있음을 인지해야 한다. 즉, 적어도 2개의 개별 핵산 가닥은 전형적으로 상보적이고 서로 혼성화되는 2개의 가닥과 상이하지만, 상기 적어도 2개의 개별 핵산 가닥 사이에 어느 정도의 상보성이 존재할 수 있고, 이에 의해 이러한 상보성은 상기 분리된 가닥의 혼성화를 초래할 수 있다.
마지막으로, 본 발명 내에서, 본 발명에 따른 핵산 분자에 대한 완전 폐쇄, 즉 원형 구조가 실현되는 것, 즉 본 발명에 따른 핵산 분자가 일 실시형태에서 바람직하게는 공유 연결을 통해 폐쇄되어, 보다 바람직하게는 이러한 공유 연결이 본원에 개시된 본 발명의 핵산 분자 또는 이의 임의의 유도체의 핵산 서열의 5' 말단과 3' 말단 사이에 이루어진다.
본 발명에 따른 핵산 분자의 결합 상수를 결정할 수 있는 가능한 방법은 본 발명에 따른 핵산 분자가 유리한 KD 값 범위를 나타내는 상기 발견을 확인하는 실시예 3 및 4에 기재된 방법을 사용하는 것이다. 개별 핵산 분자와 본원의 경우 CXCL8인 표적 사이의 결합 강도를 표현하기 위한 적당한 척도는 소위 KD 값이며, 그 측정 방법도 당업자에게 알려져 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산이 나타내는 KD 값은 1 μM 미만이다. 약 1 μM의 KD 값은 표적에 대한 핵산의 비특이적 결합에 대해 특징적이라고 한다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산 분자와 같은 화합물 그룹의 KD 값은 특정 범위 내에 있다. 약 1 μM의 상기 언급된 KD는 KD 값에 대한 바람직한 상한이다. 표적 결합 핵산의 KD에 대한 하한은 약 10 피코몰 정도이거나 더 높을 수 있다. 본 발명 내에서, CXCL8에 결합하는 개별 핵산의 KD 값은 바람직하게는 이 범위 내에 있다. 이 범위 내의 임의의 제1 숫자와 이 범위 내의 임의의 제2 숫자를 선택하여 선호 범위를 정의할 수 있다. 바람직한 상위 KD 값은 250 nM, 100 nM 및 20 nM이고, 바람직한 하위 KD 값은 10 nM 이하, 1 nM 이하, 100 pM 이하 및 30 pM 이하이다. 보다 바람직한 상위 KD 값은 20 nM이고, 보다 바람직한 하위 KD 값은 30 pM 이하이다.
본 발명에 따른 핵산 분자의 결합 특성에 더하여, 본 발명에 따른 핵산 분자는 본 경우 CXCL8인 각각의 표적 분자의 기능을 억제한다. CXCL8의 기능 억제, 예를 들어, 상기 기재된 각각의 수용체의 자극의 억제는 본 발명에 따른 핵산 분자가 CXCL8에 결합하고 본 발명에 따른 핵산 분자 및 CXCL8의 복합체를 형성함으로써 달성된다. 핵산 분자와 CXCL8의 이러한 복합체는 일반적으로 CXCL8에 의해 자극되는 수용체, 즉 본 발명의 핵산 분자와의 복합체에 존재 하지 않는 CXCL8을 자극할 수 없다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산 분자에 의한 수용체 기능의 억제는 CXCL8에 의해 자극될 수 있는 각각의 수용체와는 독립적이지만, 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 CXCL8에 의한 수용체 자극을 막음으로써 발생한다.
본 발명에 따른 핵산 분자의 억제 상수를 결정할 수 있는 가능한 방법은 본 발명에 따른 핵산 분자가 치료적 처리 계획에서 상기 핵산의 사용을 허용하는 양호한 억제 상수를 나타낸다는 상기 발견을 확인하는 실시예 5에 기재된 방법을 사용하는 것이다. 본원의 경우 CXCL8인 표적과 각각의 수용체의 상호작용에 대한 개별 핵산 분자의 억제 효과의 강도를 표현하기 위한 적당한 척도는 소위 절반의 최대 억제 농도(약칭 IC50)이며, 그 결정 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산 분자가 나타내는 IC50 값은 1 μM 미만이다. 약 1 μM의 IC50 값은 핵산 분자에 의한 표적 기능의 비특이적 억제에 대해 특징적이라고 한다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산 분자와 같은 화합물 그룹의 IC50 값은 특정 범위 내에 있다. 약 1 μM의 상기 언급된 IC50은 IC50 값에 대한 바람직한 상한이다. 표적 결합 핵산 분자의 IC50에 대한 하한은 약 10 피코몰 정도이거나 더 높을 수 있다. 본 발명 내에서, CXCL8에 결합하는 개별 핵산의 IC50 값이 바람직하게는 이 범위 내에 있다. 이 범위 내의 임의의 제1 숫자와 이 범위 내의 임의의 제2 숫자를 선택하여 바람직한 범위를 정의할 수 있다. 바람직한 상위 IC50 값은 250 nM 및 100 nM 및 20 nM이고, 바람직한 하위 IC50 값은 10 nM 이하, 1 nM 이하, 500 pM 이하 및 260 pM 이하이다. 더 바람직한 상위 IC50 값은 20 nM이고, 더 바람직한 하위 IC50 값은 260 pM 이하이다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 표적 분자에 여전히 결합할 수 있는 한 임의의 길이를 가질 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 분자의 바람직한 길이가 있음이 당 업계에 인지될 것이다. 전형적으로, 길이는 15개 내지 120개의 뉴클레오타이드이다. 당업자는 15 내지 120의 임의의 정수가 본 발명에 따른 핵산 분자에 대해 가능한 길이임을 인지할 것이다. 본 발명에 따른 핵산 분자의 길이에 대한 보다 바람직한 범위는 약 20 내지 100개의 뉴클레오타이드, 약 20 내지 80개의 뉴클레오타이드, 약 20 내지 60개의 뉴클레오타이드, 약 38 내지 45개의 뉴클레오타이드 및 약 40 내지 45개의 뉴클레오타이드의 길이이다.
본 발명 내에서, 본 발명의 핵산 분자는 바람직하게는 고 분자량 모이어티이고/이거나, 바람직하게는 다른 것들 중에서도 동물 신체, 바람직하게는 인체에서의 체류 시간의 측면에서 핵산 분자의 특성을 변형시키는 모이어티를 포함한다. 이러한 변형의 특히 바람직한 실시형태는 본 발명에 따른 핵산 분자의 PEG화(PEGylation) 및 HES화(HESylation)이다. 본 명세서에서 사용되는 PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)을 나타내고, HES는 하이드록시에틸 전분을 나타낸다. 본원에서 바람직하게 사용되는 PEG화는 본 발명에 따른 핵산 분자의 변형으로서, 이러한 변형은 본 발명에 따른 핵산 분자에 부착된 PEG 모이어티로 구성된다. 본원에서 바람직하게 사용되는 HES화는 본 발명에 따른 핵산 분자의 변형으로서, 이러한 변형은 본 발명에 따른 핵산 분자에 부착된 HES 모이어티로 구성된다. 이러한 변형뿐만 아니라 이러한 변형을 사용하여 핵산 분자를 변형하는 방법은 특허출원 EP 1 306 382 호 및 W02018099600A1 호에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
이러한 고 분자량 모이어티인 PEG의 경우, 분자량은 바람직하게는 약 20,000 내지 약 120,000 Da, 보다 바람직하게는 약 30,000 내지 약 80,000 Da, 가장 바람직하게는 약 40,000 Da이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, PEG는 국제공개 W003076490 호에 기재된 바와 같은 PEG이다. HES가 이러한 고 분자량 모이어티인 경우, 분자량은 바람직하게는 약 50 kDa 내지 약 1000 kDa, 보다 바람직하게는 약 100 kDa 내지 약 700 kDa, 가장 바람직하게는 200 kDa 내지 500 kDa이다. HES는 0.1 내지 1.5, 보다 바람직하게는 1 내지 1.5의 몰 치환을 나타내고, 약 0.1 내지 15, 바람직하게는 약 3 내지 10의 C2/C6 비율로 표현된 치환 등급을 나타낸다. HES 변형 방법은 예를 들어, 독일특허 DE 1 2004 006 249.8 호에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
원칙적으로, 변형은 본 발명의 핵산 분자의 임의의 위치에서 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 이러한 변형은 5'-말단 뉴클레오타이드, 3'-말단 뉴클레오타이드 및/또는 핵산 분자의 5' 뉴클레오타이드와 3' 뉴클레오타이드 사이의 임의의 뉴클레오타이드에 대해 이루어진다.
변형 및 바람직하게는 PEG 및/또는 HES 모이어티는 직접 또는 간접적으로, 바람직하게는 링커를 통해 간접적으로 본 발명의 핵산 분자에 부착될 수 있다. 본 발명 내에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 하나 이상의 변형, 바람직하게는 하나 이상의 PEG 및/또는 HES 모이어티를 포함한다. 일 실시형태에서 개별 링커 분자는 하나 초과의 PEG 모이어티 또는 HES 모이어티를 본 발명에 따른 핵산 분자에 부착한다. 본 발명과 관련하여 사용되는 링커는 그 자체가 선형이거나 분지형일 수 있다. 이러한 종류의 링커는 당업자에게 공지되어 있으며, 국제공개 W02005/074993 호 및 W02003/035665 호에 추가로 기재되어 있다.
바람직한 실시형태에서, 링커는 생분해성 링커이다. 생분해성 링커는 특히 본 발명에 따른 핵산 분자로부터의 변형 방출로 인한 동물 신체, 바람직하게는 인체에서의 체류 시간 측면에서 본 발명에 따른 핵산 분자의 특성을 변형시킬 수 있게 한다. 생분해성 링커를 사용하면 본 발명에 따른 핵산 분자의 체류 시간을 더 잘 제어할 수 있다. 이러한 생분해성 링커의 바람직한 실시형태는 국제공개 W02006/052790 호, W02008/034122 호, W02004/092191 호 및 W02005/099768 호에 기재되어 있는 생분해성 링커이지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명 내에서, 변형 또는 변형기는 생분해성 변형이며, 이에 의해 생분해성 변형은 직접 또는 간접적으로, 바람직하게는 링커를 통해 본 발명의 핵산 분자에 부착될 수 있다. 생분해성 변형은 특히 본 발명에 따른 핵산 분자로부터 변형의 방출 또는 분해로 인한 동물 신체, 바람직하게는 인체에서의 체류 시간의 측면에서 본 발명에 따른 핵산 분자의 특성을 변형시킬 수 있다. 생분해성 변형을 사용하면 본 발명에 따른 핵산 분자의 체류 시간을 더 잘 제어할 수 있다. 이러한 생분해성 변형의 바람직한 실시형태는 국제공개 WO2002/065963 호, WO2003/070823 호, WO2004/113394 호 및 WO2000/41647 호, 바람직하게는 WO2000/41647 호, 페이지 18, 4행 내지 24행에 기재된 바와 같이 생분해성이지만, 이들로 한정되지 않는다.
추가의 바람직한 실시형태에서, 링커는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00001
각각의 링커는 예를 들어 국제공개 WO 2015/062743 호에 개시되어있다. 상기 구조로부터 명백한 바와 같이, 링커는 본 발명에 따른 핵산 분자에 대한 뉴클레오타이드의 포스페이트 모이어티의 OH 기에 2개의 개별 PEG 모이어티를 연결한다.
상기 기재된 바와 같은 변형 이외에, 본 발명에 따른 핵산 분자의 특성을 변형하기 위해 다른 변형을 사용할 수 있으며, 이에 따라 상기 다른 변형들은 단백질, 콜레스테롤과 같은 지질 및 아밀라아제, 덱스트란 등과 같은 당 사슬의 군으로부터 선택될 수 있다.
이론에 얽매이지 않고, 본 발명에 따른 핵산 분자를 고 분자량 모이어티, 예컨대 중합체 및 더욱 특히 본원에 개시된 중합체 중 하나 또는 여러 개로 변형함으로써 바람직하게는 생리학적으로 허용되는, 본 발명의 변형된 핵산 분자가 투여되는 동물 또는 인체로부터의 이와 같이 변형된 본 발명의 핵산 분자의 배설 운동이 변화된다. 보다 구체적으로, 본 발명의 변형된 핵산 분자의 증가된 분자량 때문에, 그리고 특히 L 형태, 즉 L-핵산 분자인 경우 본 발명의 핵산 분자가 대사되지 않기 때문에 동물의 몸에서 바람직하게는 포유류 신체로부터, 보다 바람직하게는 인간 신체로부터 배설이 감소된다. 배설이 전형적으로 신장을 통해 발생하기 때문에, 본 발명자들은 이렇게 변형된 핵산 분자의 사구체 여과율이 이러한 종류의 고 분자량 변형을 갖지 않는 핵산 분자에 비해 현저히 감소하여 동물 신체에서 변형된 핵산 분자의 체류시간 증가를 초래한다고 가정한다. 이와 관련하여, 이러한 고 분자량 변형에도 불구하고 본 발명에 따른 핵산 분자의 특이성은 해로운 방식으로 영향을 받지 않는다는 것이 특히 주목할 만하다. 지금까지 본 발명에 따른 핵산 분자는 무엇보다도 서방성을 제공하는 약제학적 제형이 본 발명에 따른 핵산 분자의 서방성을 제공하기 위해 반드시 필요하지는 않다는, 일반적으로 약제학적 활성 화합물로부터 예상할 수 없는 놀라운 특징을 갖는다. 오히려, 고 분자량 모이어티를 포함하는 변형된 형태의 본 발명에 따른 핵산 분자는 이미 서방형 제형으로부터 방출된 것처럼 그의 변형으로 인해 작용하기 때문에 서방형 제형으로 이미 사용될 수 있다. 지금까지, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 핵산 분자의 변형(들) 및 따라서, 본 발명에 따른 변형된 핵산 분자 및 이를 포함하는 임의의 조성물은 별개의, 바람직하게는 제어된 약동학 및 그의 생체분포를 제공할 수 있다. 여기에는 동물과 인체의 순환에서의 체류 시간과 그러한 동물과 인간의 조직으로의 분포도 포함된다. 이러한 변형은 국제공개 W0 2003/035665 호에 추가로 기재되어 있다.
그러나, 본 발명 내에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 어떠한 변형도 포함하지 않고 특히 PEG 또는 HES와 같은 고 분자량 변형을 포함하지 않는다. 이러한 실시형태는 본 발명에 따른 핵산 분자가 체내의 임의의 표적 기관 또는 조직에 우선적으로 분포하는 경우, 또는 투여 후 본 발명에 따른 핵산 분자의 체내로부터 빠른 제거가 요구되는 경우 특히 바람직하다. 신체의 임의의 표적 기관 또는 조직에 대한 우선적인 분포 프로파일을 갖는 본원에 개시된 본 발명에 따른 핵산 분자는 핵산 분자의 전신 농도를 낮게 유지하면서 표적 조직에서 효과적인 국소 농도를 확립시킨다. 이것은 경제적 관점에서 유익할뿐만 아니라 다른 조직의 핵산 분자에 대한 불필요한 노출을 감소시켜 부작용의 잠재적 위험을 줄이는 저용량의 사용을 가능하게 한다. 특히, 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 이를 포함하는 약제를 사용하는 생체 내 영상화 또는 특정 치료 투여 요건의 경우, 투여 후 신체로부터 본 발명에 따른 핵산 분자의 빠른 제거가 바람직할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 핵산 분자로도 본원에 지칭되는 본 발명의 핵산 및/또는 본 발명에 따른 길항제는 약제의 생성 또는 제조를 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 이러한 약제 또는 약제학적 조성물은 임의로 추가의 약제학적 활성 화합물과 함께 본 발명의 핵산 중 적어도 하나를 함유하고, 이에 의해 본 발명의 핵산은 바람직하게는 약제학적 활성 화합물 자체로서 작용한다. 이러한 약제는 바람직한 실시형태에서 적어도 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 이러한 담체는 예를 들어 물, 완충액, PBS, 글루코스 용액, 바람직하게는 5% 글루코스 염 밸런스 용액, 전분, 당, 젤라틴 또는 기타 허용되는 담체 물질일 수 있다. 이러한 담체는 일반적으로 당업자에게 알려져있다. 본 발명의 약제의 임의의 실시형태, 용도 및 양태가 본원에 개시되거나 기재된 임의의 질환의 치료 및/또는 예방 및/또는 진단에 사용하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물 및 본 발명에 따른 핵산 분자에도 적용될 수 있음을 당업자는 인지할 것이며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
본 발명에 따라, 또는 본 발명에 따라 제조된 핵산, 약제학적 조성물 및 약제가 각각의 병인 메커니즘에서 CXCL8의 직접적 또는 간접적 관여로부터 초래되는 치료 및/또는 예방을 위한 적응증, 질환 및 장애.
인터루킨 8(IL-8), 호중구-활성화 단백질 1(NAP-1), 단핵구-유래 호중구 화학주성 인자(MDNCF) 또는 과립구 화학주성 단백질 1(GCP-1)로도 알려져 있는 CXCL8(UniProtKB/Swiss-Prot P10145, IL8_HUMAN; 서열 번호 2)은 N-말단의 글루타메이트-류신-아르기닌(ELR) 모티프를 특징으로 하는 전염증 및 혈관신생 특성을 가진 CXC 케모카인의 서브패밀리에 속하는 작은 염기성 단백질이다. ELR-양성 케모카인 CXCL1(성장-조절 알파 단백질, Gro-alpha, 흑색종 성장 자극 활성, MGSA 또는 NAP-3이라고도 함), CXCL2(Gro-베타 또는 대식세포 염증 단백질 2-알파, MIP2-알파라고도 함), CXCL3(Gro-감마 또는 MIP2-베타라고도 함), CXCL5(상피-유래 호중구-활성화 단백질 78, ENA-78 또는 소-유도성 사이토카인 B5라고도 함), CXCL6(케모카인 알파 3, CKA-3, 과립구 화학주성 단백질 2, GCP-2 또는 소-유도성 사이토카인 B6이라고도 함), CXCL7(혈소판 염기성 단백질, PBP, 백혈구-유래 성장 인자, LDGF, 대식세포-유래 성장 인자, MDGF 또는 소-유도성 사이토카인 B7이라고도 함) 및 CXCL8은 수용체 CXCR2(IL8RB, IL8R 제2형, CD182, CDwl28b 또는 GRO/MGSA 수용체라고도 함)의 작용제이다. CXCL6, CXCL7 및 CXCL8은 수용체 CXCR1(IL8RA, IL8R 1 형, CD181 또는 CDwl28a라고도 함)의 작용제이다. CXCL8은 약 4 nM의 유사한 친화도로 수용체 CXCR1 및 CXCR2에 결합한다. CXCR1/2에 결합하는 CXCL8은 Gαi-의존성 신호전달 경로를 촉발하고, 예를 들어 호중구 이동, 탈과립 및 산화 버스트를 유도한다. 수용체 민감도는 인산화, 베타-아레스틴 모집 및 수용체 내재화에 의해 조절될 수 있다(문헌[Ha, Theranostics 2017]). CXCL7은 33개의 동일한 아미노산으로 CXCL8에 대해 가장 높은 상동성을 가지고 있다. 비인간 영장류(붉은털 원숭이(macaca mulata), 사이노몰구스 원숭이)로부터의 CXCL8은 인간 CXCL8과 95% 동일성(77개 아미노산 중 73개 동일)을 공유한다. 마우스와 래트에는 CXCL8의 오르소로그가 없다.
물론, 본 발명에 따른 CXCL8 결합 핵산 분자는 인간 CXCL8과 상호작용하거나 결합하기 때문에, 당업자는 일반적으로 본 발명에 따른 CXCL8 결합 핵산 분자가 본원에 기재된 인간 및 동물의 임의의 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 용이하게 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 이와 관련하여, 본 발명에 따른 핵산 분자는 이러한 질환, 장애 및 병태의 기저에 있는 작용 방식에 관계없이 본원에 기재된 임의의 질환, 장애 또는 병태의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있음을 인지해야 한다.
하기에서, 그리고 어떤 이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 다양한 질환, 장애 및 병태와 관련하여 본 발명에 따른 핵산 분자의 사용에 대한 합리성이 제공되고, 따라서, 본 발명에 따른 핵산 분자의 청구된 치료적, 예방적 및 진단적 적용가능성이 타당하다. 불필요한 임의의 반복을 피하기 위해, CXCL8-CXCL8 수용체 축과 관련하여 설명된 바와 같은 CXCL8-CXCL8 수용체 축의 관련으로 인해, 상기 축은 청구된 치료, 예방 및 진단 효과가 달성되도록 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 처리될 수 있음을 인지해야 한다. 또한, 환자의 질환, 장애 및 병태의 특이성 및 이와 관련하여 기재된 치료 요법의 임의의 세부사항은 본 출원의 바람직한 실시형태에 따를 수 있음을 인지해야 한다.
CXCL8 및 그의 수용체는 여러 염증성 질환의 병태생리학에 연루되거나 관련되며, 이러한 염증성 질환의 치료를 위한 CXCL8 억제 가능성은 동물 질환 모델에 의해 뒷받침된다. 본 발명에 따른 약제가 사용될 수 있는 치료 및/또는 예방을 위한 염증성 질환 및/또는 장애 및/또는 질환 병태는 하기를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다:
호흡기계의 염증성 질환
a. 만성 폐쇄성 폐 장애
b. 급성 호흡기 장애 증후군
c. 천식 및 알레르기성 염증
d. 기관지염, 세기관지염, 폐쇄성 세기관지염, 기관지 확장증
e. 폐 섬유증을 포함한 간질성 폐 질환
f. 낭포성 섬유증
g. 폐 이식
h. 물리적 손상에 인한 폐 손상, 예를 들어, 담배 연기, 캘럽 후 재팽창(reexpansion after callaps), 과다산소증
i. 세균, 바이러스 또는 곰팡이 감염(폐렴)으로 인한 폐 손상
피부의 염증성 질환
a. 호중구 피부병
b. 건선
c. 수포성 류천포창
d. 표피용해 수포
e. 화농성 열 선염
f. 신경피부염
g. 엑세마
자가면역 질환
a. 염증성 장 질환
b. 궤양성 대장염
c. 다발성 경화증
d. 류마티스 관절염
e. 제1형 당뇨병
f. 강직성 척추염
신경계 질환
a. 신경단병
b. 알츠하이머 병
허혈 재관류 손상
a. 뇌졸중
b. 심근 경색증
c. 뇌 허혈 및 경색
기타 염증성 질환
a. 죽상동맥경화증
b. 췌도 이식 거부
c. 장기 이식 거부 및/또는 기능 지연
d. 척수 손상
e. 방광염
(문헌[Russo, Expert Rev Clin Immunol 2014] 및 문헌[Ha, Theranostics 2017] 검토).
CXCL8은 인간 암에서 과발현되며, 실험 암 모델은 암 치료를 위한 CXCL8 억제 가능성의 잠재력을 뒷받침한다. 따라서, 본 발명에 따른 약제가 사용될 수 있는 치료 및/또는 예방을 위한 질환 및/또는 장애 및/또는 질환 상태는 하기를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다:
a. 폐암
b. 대장암
c. 대장직장암
d. 호르몬 불응성 전립선 암을 포함한 전립선암
e. 췌장암
f. 간암
g. 유방암
h. 난소암
i. 갑상선암
j. 흑색종
k. 교모세포종
l. 골육종
m. 식도암
n. 혈액암(백혈병 및 림프종)
o. PTEN 불충분한 종양
p. P53-돌연변이 종양
q. Kras-돌연변이 종양
r. 화학요법제, 항혈관신생제, 티로신 키나제 억제제 및 면역 체크포인트 억제제를 사용한 치료에 내성이 있는 암을 포함한 치료 내성 암.
추가 실시형태에서, 약제는 암 및/또는 종양의 치료를 위한 추가의 약제학적 활성제를 포함한다. 이러한 추가의 약제학적 활성 화합물은 무엇보다도 알킬화제, 항대사산물, 항혈관신생제, 유사분열 억제제, 토포이소머라제 억제제, 세포 신호전달 억제제, 호르몬, 항체, 면역 접합체 및 융합 단백질과 같은 항종양-활성 물질로 공지된 것들이다.
암 및/또는 종양의 치료를 위한 다른 약제학적 활성 화합물은 면역치료제이다. 이러한 추가의 약제학적 활성 화합물은 무엇보다도 체크포인트 억제제, 암 백신, 면역-자극제, 세포, 암 요법제이다.
다른 약제학적 활성 화합물은 무엇보다도 블레오마이신으로 알려진 것들, 티미딜레이트신타제(thymidylatsynthase) 억제제, 예컨대 랄티트렉세드(Raltitrexed) 및 페메트렉세드(Pemetrexed), 효소, 예컨대 L-아스파라기나제, 밀테포신(Miltefosin) 및 아나그렐리드(ANAgrelid), 프로테아좀 억제제, 예컨대 보르테조밉(Bortezomib)이다.
본 발명자들에 따른 핵산을 각각 함유하는 약제 및 약제학적 조성물을 이러한 방식으로 치료에 사용할 수 있는 것은 본 발명에 속한다.
추가 실시형태에서, 약제는 염증성 질환의 치료를 위한 추가의 약제학적 활성제를 포함한다. 이러한 추가의 약제학적 활성 화합물은 무엇보다도 비스테로이드성 항염증제, 코르티코스테로이드, 칼시뉴린 억제제, 사이클로스포린 A, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 타크롤리무스, 라파마이신, 클로람부실, 레플루노마이드, 마이코페놀레이트 모페틸, 브레퀴나르(brequinar), 미조리빈(mizoribin), 탈리도마이드, 데옥시스퍼구알린, 댑손(dapson), 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine), 설파살라진, 항히스타민, 또는 항종양 괴사 인자 항체 아달리무맙과 같은 항염증 생물제, B 세포-고갈 항-CD20 항체 리툭시맙, 항-IL6R 항체 토실리주맙, 항-IgE 항체 오말리주맙 및 정맥 내 면역글로불린과 같은, 면역계를 억제하는 것으로 알려진 것들이며, 이들로 한정되지는 않는다.
마지막으로, 추가의 약제학적 활성제는 케모카인 작용제 또는 길항제 또는 케모카인 수용체 작용제 또는 길항제일 수 있는 임의의 다른 케모카인의 활성의 조절제일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 이러한 추가의 약제학적 활성제는 본 발명에 따른 추가의 핵산 분자이다. 대안적으로, 약제는 CXCL8과 상이한 표적 분자에 결합하거나 본 발명에 따른 핵산 중 하나와 상이한 기능을 나타내는 적어도 하나 이상의 핵산을 포함한다.
원칙적으로 상기 질환의 치료를 위한 약제의 사용과 관련하여 개시된 임의의 질환의 예방을 위해 약제가 대안적으로 또는 추가적으로 사용되는 것은 본 발명에 속한다. 따라서, 각각의 질환에 대한 각각의 마커는 당업자에게 알려져 있다. 바람직하게는, 각각의 마커는 CXCL8이다.
본 발명의 약제의 일 실시형태에서, 이러한 약제는 본원에 개시된 임의의 질환, 특히 본 발명의 약제가 사용되는 질환에 대한 다른 치료와 조합하여 사용하기 위한 것이다.
"병용 요법"(또는 "공동 요법")은 이들 치료제, 즉 본 발명의 약제 및 제2 제제의 공동 작용으로부터 유익한 효과를 제공하도록 의도된 특정 치료 요법의 일부로서 본 발명의 약제 및 적어도 제2 제제의 투여를 포함한다. 조합의 유익한 효과는 치료제의 조합으로 인한 약동학적 또는 약력학적 공동 작용을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 이들 치료제를 조합하여 투여하는 것은 전형적으로 정의된 기간(선택된 조합에 따라 일반적으로 분, 시간, 일 또는 주)에 걸쳐 수행된다.
"병용 요법"은 부수적으로 그리고 임의로 본 발명의 조합을 초래하는 별개의 단일요법의 일부로서 이들 치료제 중 2개 이상의 투여를 포함하도록 의도될 수 있지만, 일반적으로 의도되지는 않는다. "병용 요법"은 순차적인 방식으로 이들 치료제의 투여를 포괄하는 것으로 의도되며, 즉, 각각의 치료제는 상이한 시간에 투여 될뿐만 아니라 실질적으로 동시 방식으로 이들 치료제 또는 적어도 2개의 치료제의 투여를 포함한다. 실질적으로 동시 투여는, 예를 들어 각각의 치료제의 고정된 비율을 갖는 단일 캡슐을 대상체에게 투여하거나 각각의 치료제에 대해 다중 단일 캡슐로 투여함으로써 달성될 수 있다. 각 치료제의 순차적 또는 실질적으로 동시 투여는 국소 경로, 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 임의의 적당한 경로에 의해 수행될 수 있다. 치료제는 동일한 경로 또는 다른 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 선택된 조합의 제1 치료제는 주사에 의해 투여될 수 있는 반면, 조합의 다른 치료제는 국소 투여될 수 있다.
대안적으로, 예를 들어, 모든 치료제는 국소 투여될 수 있거나 모든 치료제는 주사로 투여될 수 있다. 치료제가 투여되는 순서는 달리 언급하지 않는 한 좁게 중요하지 않다. "병용 요법"은 또한 다른 생물학적 활성 성분과의 추가 조합으로 상기 기재된 바와 같은 치료제의 투여를 포함할 수 있다. 병용 요법이 비-약물 치료를 추가로 포함하는 경우, 비-약물 치료는 치료제와 비-약물 치료의 조합의 공동 작용으로부터 유익한 효과가 달성되는 한 임의의 적합한 시간에 수행될 수 있다. 예를 들어, 적절한 경우에 비-약물 치료가 아마도 몇 일 또는 심지어 몇 주까지 치료제의 투여로부터 일시적으로 제거될 때 유익한 효과가 여전히 달성된다.
상기 일반적인 용어로 개괄된 바와 같이, 본 발명에 따른 약제는 원칙적으로 당업자에게 공지된 임의의 형태로 투여될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 전신 투여, 보다 바람직하게는 비경구 투여, 바람직하게는 주사이다. 대안적으로, 약제는 국소로 투여될 수 있다. 다른 투여 경로에는 근육 내, 복강 내 및 피하, 구강 당, 비강 내, 기관 내 또는 폐가 포함되며, 효율성을 보장하면서 최소 침습적인 투여 경로가 선호된다.
비경구 투여는 일반적으로 피하, 근육 내 또는 정맥 내 주사 및 주입에 사용된다. 추가로, 비경구 투여를 위한 한 가지 접근법은 당 업계의 숙련자에게 잘 알려진 일정한 수준의 투여량이 유지되는 것을 보장하는 서방형 또는 지속-방출형 시스템의 이식을 사용한다.
더욱이, 본 발명의 바람직한 약제는 적합한 비강 내 비히클, 흡입제의 국소 사용을 통해 비강 내 형태로 또는 경피 경로를 통해 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려진 경피 피부 패치의 형태를 사용하여 투여될 수 있다. 경피 전달 시스템의 형태로 투여되기 위해, 투여량 투여는 물론 투여 요법 전체에 걸쳐 간헐적이기 보다는 연속적일 것이다. 다른 바람직한 국소 제제는 크림, 연고, 로션, 에어로졸 스프레이 및 겔을 포함하며, 여기서 활성 성분의 농도는 전형적으로 0.01% 내지 15%, w/w 또는 w/v 범위일 것이다.
본 발명의 약제는 일반적으로 약제학적으로 허용되는 매질에 용해되거나 분산된 본 발명의 핵산 분자를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 치료의 활성 성분(들)의 유효량을 포함할 것이다. 약제학적으로 허용되는 매질 또는 담체는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당 업계에 잘 알려져있다. 보충 활성 성분도 본 발명의 약제에 포함될 수 있다.
추가 양태에서 본 발명은 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 핵산 중 적어도 하나 및 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함한다. 이러한 비히클은 임의의 비히클 또는 본 기술 분야에서 사용되고/되거나 공지된 임의의 결합제일 수 있다. 보다 구체적으로, 그러한 결합제 또는 비히클은 본원에 개시된 약제의 제조와 관련하여 논의된 바와 같은 임의의 결합제 또는 비히클이다. 추가 실시형태에서, 약제학적 조성물은 추가의 약제학적 활성제를 포함한다.
약제 및 약제학적 조성물의 제조는 본 개시내용에 비추어 당업자에게 공지 될 것이다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주사용, 주사 전 액체내 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태; 경구 투여용 정제 또는 기타 고체로; 시간 제한 방출 캡슐로; 또는 점안액, 크림, 로션, 고약, 흡입제 등을 포함하여 현재 사용되는 다른 형태로 제조될 수 있다. 외과의, 의사 또는 의료 종사자가 수술 현장에서 특정 부위를 치료하기 위해 식염수-기반 세척과 같은 멸균 제형을 사용하는 것도 특히 유용할 수 있다. 조성물은 또한 마이크로장치, 마이크로입자 또는 스폰지를 통해 전달될 수 있다.
제형화시, 약제 또는 약제학적 조성물은 투여 제형에 적합한 방식으로, 그리고 약리학적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 상기 기재된 주사가능한 용액의 유형과 같은 다양한 투여 형태로 쉽게 투여되지만, 약물 방출 캡슐 등도 사용될 수 있다.
이러한 맥락에서, 투여될 활성 성분의 양 및 조성물의 부피는 치료될 개체 또는 대상체에 따라 달라진다. 투여에 필요한 활성 화합물의 특정 양은 의사의 판단에 따라 다르며, 각 개인에 따라 다르다.
활성 화합물을 분산시키는 데 필요한 최소 부피의 약제 또는 약제학적 조성물이 전형적으로 사용된다. 투여에 적합한 섭생은 또한 가변적이지만, 처음에 화합물을 투여하고 결과를 모니터링한 다음 추가 간격으로 추가로 조절된 용량을 제공함으로써 대표된다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐(예를 들어, 젤라틴 캡슐) 형태의 경구 투여를 위해, 활성 약물 성분, 즉 본 발명의 핵산 분자 및/또는 본원에서 치료제(들) 또는 활성 화합물(들)로도 지칭되는 임의의 추가 약제학적 활성제는 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성, 약제학적으로 허용되는 비활성 담체와 조합될 수 있다. 더욱이, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 착색제가 또한 혼합물에 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈, 천연 당, 예컨대 글루코스 또는 베타-락토스, 옥수수 감미료, 천연 및 합성 검, 예컨대 아카시아, 트라가칸트 또는 알긴산 나트륨, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 포함한다. 이러한 투여 형태에 사용되는 윤활제는 올레산 나트륨, 스테아르산 나트륨, 스테아르산 마그네슘, 벤조산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 실리카, 활석, 스테아르산, 그의 마그네슘 또는 칼슘 염 및/또는 폴리에틸렌글리콜 등을 포함한다. 붕해제는 제한없이 전분, 메틸 셀룰로오스, 한천, 벤토나이트, 잔탄 검 전분, 한천, 알긴산 또는 이의 나트륨 염, 또는 발포성 혼합물 등을 포함한다. 희석제는 예를 들어 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스 및/또는 글리신을 포함한다.
본 발명의 약제 또는 약제학적 조성물은 또한 시간 제한 방출 및 지속 방출 정제 또는 캡슐, 환제, 분말, 과립, 엘릭시르, 팅크, 현탁액, 시럽 및 에멀젼과 같은 경구 투여 형태로 투여될 수 있다. 좌제는 유리하게는 지방 에멀젼 또는 현탁액으로부터 제조된다.
약제학적 조성물 또는 약제는 멸균되고/되거나 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 이들은 치료적으로 유용한 다른 물질도 포함할 수 있다. 조성물은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제조되며, 전형적으로 약 0.1% 내지 75%, 바람직하게는 약 1% 내지 50%의 활성 성분을 함유한다.
액체, 특히 주사 가능한 조성물은 예를 들어 용해, 분산 등에 의해 제조될 수 있다. 활성 화합물은 예를 들어, 물, 식염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 약제학적으로 순수한 용매에 용해되거나 이와 혼합되어, 주사 가능한 용액 또는 현탁액을 형성한다. 추가로, 주사 전에 액체에 용해하기에 적합한 고체 형태가 제형화될 수 있다.
고체 조성물의 경우, 부형제는 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산 마그네슘 등을 포함한다. 상기 정의된 활성 화합물은 또한 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜을 담체로 사용하여 좌약으로 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 좌약은 유리하게는 지방 에멀젼 또는 현탁액으로부터 제조된다.
본 발명의 약제, 약제학적 조성물 및 핵산 분자는 각각 작은 단층 소포, 큰 단층 소포 및 다층 소포와 같은 리포좀 전달 시스템의 형태로 투여될 수도 있다. 리포좀은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린을 포함하는 다양한 인지질로부터 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 지질 성분의 필름은 약물의 수용액으로 수화되어 약물을 캡슐화하는 지질 층을 형성하는데, 이는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 핵산 분자는 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 구축된 친유성 화합물 또는 비-면역원성 고분자량 화합물과의 복합체로서 제공될 수 있다. 또한 리포좀은 세포 사멸을 매개하기 위해 세포독성제를 내부적으로 표적화하고 운반하기 위해 그의 표면에 이러한 핵산 분자를 보유할 수 있다. 핵산-관련 복합체의 예는 미국 특허 제 6,011,020 호에 제공된다.
본 발명의 약제, 약제학적 조성물 및 핵산 분자는 각각 표적 가능한 약물 담체로서 가용성 중합체와 결합될 수 있다. 이러한 중합체는 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리하이드록시프로필-메타크릴아미드-페놀, 폴리하이드록시에틸아스판아미드페놀, 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥시드폴리라이신을 포함할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 약제 및 핵산 분자는 각각 약물의 제어 방출을 달성하는데 유용한 생분해성 중합체의 부류, 예를 들어 폴리락트산, 폴리엡실론 카프로락톤, 폴리하이드록시 부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디하이드로피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 하이드로겔의 가교 또는 양친매성 블록 공중합체에 결합될 수 있다.
원하는 경우, 투여될 약제학적 조성물 및 약제는 각각 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 및 예를 들어 아세트산 나트륨 및 트리에탄올아민 올레에이트과 같은 기타 물질과 같은 무독성 보조 물질을 소량 함유할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자, 약제 또는 약제학적 조성물을 각각 이용하는 투약 요법은 환자의 유형, 종, 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태를 포함하는 다양한 인자; 치료할 병태의 중증도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 사용되는 특정 앱타머 또는 이의 염에 따라 선택된다. 일반적으로 숙련된 의사 또는 수의사는 병태의 진행을 예방, 대응 또는 저지하는 데 필요한 약물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산의 효과적인 혈장 수준은 바람직하게는 본원에 개시된 임의의 질환의 치료에서 500 fM 내지 500 μM 범위이다.
본 발명의 핵산 분자, 약제 및 약제학적 조성물 각각은 바람직하게는 1일 1회, 2일 또는 3일마다, 매주, 2주마다, 매월 단일 용량으로 또는 3개월마다 투여될 수 있다.
본 발명 내에서, 본원에 기재된 약제가 본원에 기재된 약제학적 조성물을 구성한다.
추가 양태에서, 본 발명은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법에 관한 것으로, 이 방법은 본 발명에 따른 약제학적 활성량의 적어도 하나의 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 대상체는 질환을 앓고 있거나 이러한 질환을 발병할 위험이 있으며, 이에 따라 질환은 본원에 개시된 임의의 것, 특히 약제 제조를 위해 본 발명에 따른 임의의 핵산을 사용하는 것과 관련하여 개시된 임의의 질환이다.
본 발명에 따른 핵산 및 길항제는 약제 또는 약제의 제조뿐만 아니라 미용 목적, 특히 염증 부위 피부 병변에서 CXCL8의 침범과 관련하여 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산, 약제 및/또는 약제학적 조성물이 사용될 수 있는 치료 또는 예방을 위한 추가 병태 또는 질환은 염증 부위 피부 병변이다.
물론, 본 발명에 따른 CXCL8 결합 핵산 분자는 인간 CXCL8과 상호작용하거나 결합하기 때문에 통상의 기술자는 본 발명에 따른 CXCL8 결합 핵산 분자가 CXCL8 검출 및 진단제 또는 바이오센서 제조를 위해 쉽게 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 바람직하게 사용되는 바와 같이, 진단 또는 진단제 또는 진단 수단 또는 바이오센서는 CXCL8, 바람직하게는 본원에 기재된 CXCL8, 보다 바람직하게는 본원에 기재된 다양한 장애 및 질환과 관련하여 본원에 기재된 CXCL8을 직접 또는 간접적으로 검출하는데 적합하다. 진단 또는 바이오센서는 각각 본원에 기재된 임의의 장애 및 질환의 검출 및/또는 후속 조치에 적합하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 검출은 본 발명에 따른 핵산과 CXCL8의 결합을 통해 가능하다. 이러한 결합은 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있으며, 이에 따라 핵산 분자는 변형기를 포함하거나 변형기를 포함하지 않을 수 있다. 하나의 바람직한 실시형태에서 변형기는 핵산의 고정화를 허용한다. 다른 바람직한 실시형태에서 변형기는 표지이다. 각각의 방법 및 수단은 당업자에게 공지되어있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 핵산은 비공유 또는 공유 결합을 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 진단기의 반응 용기의 표면, 진단기의 반응 용기 내에 포함된 장치의 표면 또는 바이오센서의 표면에 고정화된다.
바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 핵산은 표면에 대한 공유 결합에 의해 고정된다. 따라서, 본 발명 내에서 본 발명의 핵산 분자는 핵산 분자가 표면에 고정될 수 있도록 하는 변형기를 포함한다. 공유 결합을 위한 이러한 변형기에는 (활성화된) 카르복실, 하이드록실, 포스파티딜, 술폰산 에스테르, 아민, 티올, 에폭사이드, 알킨, 변형된 사이클로알킨(예를 들어, 디벤조사이클로옥틸, DBCO; 비사이클로[6.1.0]논-4-인, BCN; 또는 아자디벤조사이클로옥틴, ADIBO), 말레이미드, 아지드, 하이드라지드가 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다.
이러한 공유 결합은 예를 들어 1차 아민과 반응하는 활성화된 카르복실기(예를 들어, EDC/NHS 활성화), 티올기와 반응하는 말레이미드, 구리-촉매된 아지드 알킨 고리화첨가(클릭 화학), 무-구리 아지드 변형 알킨 고리화첨가, 알켄 아지드[3+2] 고리화첨가, 알켄 테트라진 역-수요 딜스-알더(Diels-Alder) 및 알켄 테트라졸 광클릭 반응, 또는 금 표면에 티올화 프로브의 직접 커플링을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 무-구리 클릭 화학에 의해 형성될 수 있다. 그러한 방법은 실시형태 내에서 특정 기하학적 구조에 제한되지 않고 반응성 그룹이 표면 또는 핵산에 위치할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 핵산은 변형-촉진 아지드-알킨 고리화첨가(클릭 화학)에 의해 바이오센서의 아지드기능화된 표면에 커플링된다. 이를 위해 표면은 아지드로 기능화되고, 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 5' 또는 3' 말단에서, 변형된 알킨, 예를 들어 디벤조사이클로옥틸, DBCO; 비사이클로[6.1.0]논-4-인(BCN) 및 아자디벤조사이클로옥틴(ADIBO)으로 기능화된다. 대안적으로, 역 기하학이 사용될 수 있는데, 즉 변형된 알킨 기능화된 바이오센서 표면 및 아지드-변형 핵산을 사용한다.
다른 실시형태에서 본 발명에 따른 핵산은 비공유 결합에 의해 고정된다. 따라서, 본 발명 내에서 본 발명의 핵산 분자는 핵산 분자가 표면에 고정되도록 하는 변형기를 포함하여 결합이 역전될 수 있다. 비공유 결합을 위한 이러한 변형기에는 비오틴(아비딘, 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘에 결합), 브로모-데스옥시우리딘(항-브로모-데스옥시루리딘 항체에 결합), 디곡시게닌(항-디곡시게닌 항체에 결합), 및 올리고뉴클레오타이드(상보적 올리고뉴클레오타이드에 결합)가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 올리고뉴클레오타이드의 차단되지 않은 3' 말단은 중합효소에 대한 프라이머 또는 리가아제 반응에서 다른 핵산에 대한 수용체 역할을 할 수 있다. 실시형태내에서, 그러한 방법은 특정 기하학적 구조에 제한되지 않고 반응성기가 표면 또는 핵산에 위치할 수 있다.
본 발명 내에서 본 발명의 핵산 분자는 고정화되지 않고 용액에 사용되며, 바람직하게는 본원에서 표지라고 하는, 핵산 분자의 검출을 허용하는 변형기를 포함한다. 이러한 표지에는 비오틴(아비딘, 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘에 결합), 브로모-데스옥시우리딘(항-브로모-데스옥시루리딘 항체에 결합), 디곡시게닌(항-디곡시게닌 항체에 결합), 올리고뉴클레오타이드(상보적 올리고뉴클레오타이드에 결합), 형광 표지(예를 들어, 플루오레세인, Cy-3, Cy-5), 전기화학발광 표지, 방사성 표지, 효소 표지, UV-표지, 콜로이드 금, 나노입자 및 킬레이터 분자 표지가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
추가 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 비-뉴클레오사이드, 바람직하게는 단일 단위 또는 반복 에틸렌 글리콜, 예를 들어 트리에틸렌 글리콜(TEG), 헥사에틸렌 글리콜(HEG) 또는 심지어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 친수성 링커를 함유하며, 핵산 및 변형기를 연결할 수 있다.
CXCL8의 검출과 관련하여 바람직한 방법은 CXCL8의 직접 결합, 샌드위치 결합 분석, 경쟁 결합 분석 또는 측면 흐름 설정이다.
일 실시형태에서, CXCL8은 고정화된 핵산의 CXCL8에 대한 직접 결합에 의해 검출된다. 본 발명에 따른 직접 결합은 CXCL8과 상호작용하는 제2 분자가 아닌 본 발명에 따른 핵산만을 사용하는 방법이다.
샌드위치 결합 분석의 한 포맷은 고정화를 위한 변형기를 포함하는 본 발명에 따른 CXCL8 및 핵산 분자의 고정화된 복합체의 형성이며, 이에 의해 복합체는 진단기의 반응 용기의 표면, 진단기의 반응 용기 내에 포함된 장치의 표면, 또는 바이오센서의 표면에 고정화되어, 바람직하게는 상기 복합체가 검출된다. 일 실시형태에서, CXCL8이 복합체로부터 검출된다. 이 요건을 따르는 각각의 검출 수단은 예를 들어, 본 발명의 핵산 분자에 의해 검출되지 않고 CXCL8의 그/그 부분(들)(에피토프)에 특이적이고 핵산, 폴리펩타이드, 단백질 및 항체를 포함하는 군으로부터 선택되는 임의의 검출 수단이며, 그 세대는 당업자에게 알려져있다. 이러한 샌드위치 결합 분석의 방법론은 당업자에게 알려져있다.
샌드위치 결합 분석의 실시형태 내에서, 상기 기재된 검출 수단이 진단기의 반응 용기의 표면에, 진단기의 반응 용기 내에 포함된 장치의 표면에, 또는 바이오센서의 표면에 고정되는 역 기하학이 사용되어, 샘플에 제공된 CXCL8과 복합체를 형성할 수 있고 복합체는 본 발명의 핵산 분자에 의해 검출된다. 이 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 표지를 포함하거나 표지되지 않는다. 비-표지 핵산 분자의 검출은 바람직하게는 본원에 기재된 다양한 실시형태에서 핵산, 폴리펩타이드, 단백질 및 실시형태를 포함하는 군으로부터 또한 선택되는 제2 검출 수단의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 검출 수단은 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산에 특이적이다.
마지막으로, 본 발명 내에서, 제2 검출 수단이 제3 검출 수단을 사용하여 검출되고, 바람직하게는 제3 검출 수단이 효소에 연결되고, 보다 바람직하게는 제2 검출 수단의 검출시 효소 반응을 나타내거나, 또는 제3 검출 수단은 방사선, 보다 바람직하게는 방사성핵종에 의해 방출되는 방사선을 검출하기 위한 수단이다. 바람직하게는, 제3 검출 수단은 제2 검출 수단을 구체적으로 검출 및/또는 상호작용한다.
추가 실시형태에서, CXCL8에 대한 본 발명에 따른 핵산 분자의 결합은 경쟁 분석으로 검출된다. 본원에서, 본 발명에 따른 핵산 분자의 일부에 상보적인 고정된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 본 발명의 핵산과 CXCL8 사이의 복합체 형성과 경쟁하며, 이에 따라 이러한 실시형태에서 핵산 분자는 표면에 고정되지 않는다. 대안적으로, 고정된 CXCL8은 본 발명의 핵산과 CXCL8 사이의 복합체 형성과 경쟁하며, 이에 따라 이러한 실시형태에서 핵산 분자는 표면에 고정되지 않는다. 추가 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 표면에 고정되고 CXCL8의 본 발명에 따른 고정된 핵산 분자에 대한 결합은 본 발명에 따른 핵산 분자의 일부에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프로브와 경쟁한다. 이러한 분석의 방법론은 당업자에게 알려져있다.
CXCL8의 검출과 관련하여 더욱 바람직한 실시형태는 바이오센서를 제조하기 위한 본 발명에 따른 핵산 분자의 사용이다. 정의에 의하면, 바이오센서는 본 발명에 따른 핵산과 같은 생물학적 성분과 물리화학적 검출기를 결합한, CXCL8과 같은 분석물의 검출에 사용되는 분석 장치이다. 하나의 신호를 다른 신호로 변환하는 변환기 또는 검출기 요소는 CXCL8과 생물학적 요소의 상호작용으로 인해 초래되는 광학, 압전, 전기화학, 전기화학발광 등 물리화학적 방식으로 작동한다. 바이오센서는 바이오센서 표면에 공유적으로 고정된 적어도 하나의 생물학적 요소를 포함할 수 있다. 바이오센서 표면에 공유적으로 고정된 적어도 하나의 생물학적 요소는 고정화를 위한 변형기, 본 발명의 핵산에 의해 결합되지 않은 CXCL8의 에피토프(들)에 대한 특이적 결합을 갖는 수단, 본 발명의 핵산 또는 CXCL8에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 본 발명에 따른 핵산이다. 본 발명의 핵산이 바이오센서의 표면에 고정되지 않은 경우, 본 발명의 핵산은 표지인 변형기를 포함하거나, 변형기를 포함하지 않는다.
바이오센서 표면 또는 진단의 표면은 금, 은, 티타늄, 지르코늄, 바나듐, 크롬, 망간, 코발트, 텅스텐, 몰리브덴, 백금, 알루미늄, 철, 강철, 구리, 니켈, 실리콘, 게르마늄, 인듐 인화물, 갈륨 비소 및 상기 언급된 물질의 산화물, 질화물 또는 합금 또는 혼합물, 인듐-주석 산화물, 유리질 탄소, 사파이어 및 규산염 또는 붕산염 유리로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
이들 표면은 폴리라이신, 아미노실란, 에폭시실란, 니트로셀룰로오스, 카르복시덱스트란, 탄소 나노막, 산화 그래핀, 아미노 그래핀, 탄소 표면, 예컨대 카본 블랙, 탄소 섬유, 탄소 플레이트, 탄소 천, 활성탄, 유리질 탄소, 숯, 활성탄, 흑연 분말, 흑연 섬유, 탄소 나노튜브, 풀러렌, 카르복실기, 아지드기, 티올기, 하이드록시기, 에폭사이드, 말레이미드, 알킨, 변형된 알킨 또는 이들의 조합에 의해 추가로 변형될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 고정화를 위한 변형기를 구성하는 본 발명에 따른 핵산 분자는 CXCL8의 직접 검출 또는 샌드위치 분석 형식 또는 경쟁 분석 형식에서 CXCL8의 검출을 위해 바이오센서 표면에 고정된다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 검출은 본 발명의 핵산에 의해 검출되지 않은 CXCL8의 에피토프(들)(상기 기재됨)에 특이적인 것을 의미하고, 본 발명의 핵산 또는 CXCL8에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프로브는 바이오센서 표면에 고정되고, 본 발명에 따른 표지된 또는 비-표지된 핵산(상기 기재됨)은 샌드위치 분석 형식 또는 경쟁 분석 형식으로 검출에 사용된다.
진단 수단 및 바이오센서의 검출 시스템은 예를 들어 광학 판독(형광, 흡수 및 발광), 질량 변화(예를 들어, 수정 마이크로밸런스, 미세전자기계 시스템), 굴절률(표면 플라즈몬 공명, 링 공명기, 타원계측법), 전하(전기화학적 임피던스, 전압전류법, 전류측정법, 전위차 법 또는 전도도, 전계 효과 트랜지스터), 표면 응력(캔틸레버 바이오센서) 및 원자력 현미경을 기반으로 할 수 있다.
추가 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 샌드위치 또는 경쟁적 측면 흐름 분석에 사용된다. 이러한 측면 흐름 분석의 방법론은 당업자에게 알려져있다.
추가 실시형태에서, CXCL8에 대한 본 발명에 따른 핵산 분자의 결합은 본 발명에 따른 핵산 분자의 일부에 상보적인 핵산 프로브에 의한 균일 분석에서 검출되며, 이에 따라 이러한 실시형태에서 핵산 분자는 표면에 고정되지 않는다. 본원에서 혼성화는 핵산에 연결된 2개의 형광 단의 형광 신호의 변화를 초래하고, 바람직하게는 강도 및 혼성화의 변화는 본 발명의 핵산과 CXCL8 사이의 복합체 형성과 경쟁한다. 2개의 형광 단은 둘 다 핵산 프로브(분자 비콘)에 연결되거나, 하나는 프로브에 연결되고 하나는 본 발명의 핵산에 연결된다. 추가 실시형태에서, 1개 또는 2개의 형광 단이 본 발명의 핵산에 연결되고 CXCL8과의 복합체 형성은 형광 신호의 변화, 바람직하게는 강도의 변화를 초래한다. 이러한 분석의 방법론은 당업자에게 알려져있다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 약물 설계를 위한 출발 물질로 추가로 사용될 수 있다. 기본적으로 두 가지 가능한 접근법이 있다. 한 가지 접근법은 화합물 라이브러리의 스크리닝이지만, 그러한 화합물 라이브러리는 바람직하게는 저 분자량 화합물 라이브러리이다. 일 실시형태에서, 스크리닝은 고 처리량 스크리닝이다. 바람직하게는 고 처리량 스크리닝은 표적 기반 분석에서 화합물의 빠르고 효율적인 시행착오 평가이다. 최상의 경우, 분석은 비색 측정으로 수행된다. 이와 관련하여 사용되는 라이브러리는 당업자에게 알려져있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 핵산 분자는 약물의 합리적 설계를 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는 합리적인 약물 설계는 약제학적 리드 구조의 설계이다. 전형적으로 X-선 결정학 또는 핵 자기 공명 분광법과 같은 방법으로 식별되는 표적의 3차원 구조에서 시작하여, 컴퓨터 프로그램을 사용하여 다양한 화학 화합물의 구조를 포함하는 데이터베이스를 검색한다. 선택은 컴퓨터에 의해 이루어지며, 확인된 화합물은 이후 실험실에서 테스트될 수 있다.
약물의 합리적 설계는 본 발명에 따른 임의의 핵산 분자로부터 시작될 수 있으며, 본 발명의 핵산의 구조와 유사하거나 본 발명의 핵산 구조의 일부를 매개하는 결합과 동일한 구조, 바람직하게는 3차원 구조를 포함할 수 있다. 어떠한 경우에도 이러한 구조는 여전히 본 발명의 핵산과 동일하거나 유사한 결합 특성을 나타낸다. 추가 단계에서 또는 약물의 합리적 설계의 대안 단계로서 신경전달물질에 결합하는 핵산 부분의 바람직하게는 3차원 구조가 뉴클레오타이드 및 핵산과 다른 화학 그룹에 의해 모방된다. 이러한 모방에 의해 본 발명에 따른 핵산과 다른 화합물이 설계될 수 있다. 이러한 화합물은 바람직하게는 소분자 또는 펩타이드이다.
당업자에게 공지된 경쟁 분석을 사용하는 것과 같이 화합물 라이브러리의 스크리닝의 경우, 적절한 CXCL8 유사체, CXCL8 작용제 또는 CXCL8 길항제가 발견될 수 있다. 이러한 경쟁 분석은 하기와 같이 설정할 수 있다. 본 발명의 핵산, 바람직하게는 표적 결합 L-핵산인 스피겔머는 고체상에 커플링된다. CXCL8 유사체를 확인하기 위해 표지된 CXCL8이 분석에 추가될 수 있다. 잠재적인 유사체는 스피겔머에 결합하는 CXCL8 분자와 경쟁할 것이며, 이는 각 표지에 의해 획득된 신호의 감소와 함께 진행된다. 작용제 또는 길항제에 대한 스크리닝은 당업자에게 알려진 세포 배양 분석의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 적어도 하나 또는 여러개의 본 발명의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 추가로, 키트는 적어도 하나 또는 여러개의 양성 또는 음성 대조군을 포함할 수 있다. 양성 대조군은 예를 들어 CXCL8일 수 있으며, 특히 본 발명의 핵산이 선택되거나 결합하는 것, 바람직하게는 액체 형태일 수 있다. 음성 대조군은 예를 들어 CXCL8과 유사한 생물 물리적 특성의 관점에서 정의되지만 본 발명의 핵산에 의해 인식되지 않는 펩타이드일 수 있다. 또한, 상기 키트는 하나 또는 여러 완충액을 포함할 수 있다. 다양한 성분은 키트에 건조 또는 동결건조된 형태로 포함되거나 액체에 용해될 수 있다. 키트는 키트의 하나 또는 여러 성분을 차례로 포함할 수 있는 하나 또는 여러 용기를 포함할 수 있다. 추가 실시형태에서, 키트는 키트 사용 방법 및 다양한 성분에 대한 정보를 사용자에게 제공하는 지침서 또는 지침 전단지를 포함한다.
본 발명에 따른 핵산 분자의 약제학적 및 생물학적 분석적 결정은 인간 및 비인간 신체의 여러 체액, 조직 및 기관에서 약동학적 및 생체역학적 프로파일을 평가하기 위한 기본이다. 이러한 목적을 위해, 본원에 개시되거나 당업자에게 공지된 임의의 검출 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 추가 양태에서, 본 발명에 따른 핵산 검출을 위한 샌드위치 혼성화 분석이 제공된다. 탐지 분석 내에서 포획 프로브와 검출 프로브가 사용된다. 포획 프로브는 본 발명에 따른 핵산의 제1 부분에 대해 상보적이고 검출 프로브는 제2 부분에 대해 상보적이다. 포획 및 검출 프로브는 모두 DNA 뉴클레오타이드, 변형된 DNA 뉴클레오타이드, 변형된 RNA 뉴클레오타이드, RNA 뉴클레오타이드, LNA 뉴클레오타이드 및/또는 PNA 뉴클레오타이드에 의해 형성될 수 있다.
따라서, 포획 프로브는 본 발명에 따른 핵산 분자의 5'-말단에 상보적인 서열 스트레치를 포함하고, 검출 프로브는 본 발명에 따른 핵산 분자의 3'-말단에 상보적인 서열 스트레치를 포함한다. 이 경우, 포획 프로브는 그의 5'-말단을 통해 표면 또는 매트릭스에 고정되며, 이에 따라 포획 프로브는 그의 5'-말단에서 직접 또는 그의 5'-말단과 표면 또는 매트릭스 사이의 링커를 통해 고정될 수 있다. 그러나, 원칙적으로 링커는 포획 프로브의 각 뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 링커는 당업자의 친수성 링커에 의해 또는 D-DNA 뉴클레오타이드, 변형된 D-DNA 뉴클레오타이드, D-RNA 뉴클레오타이드, 변형된 D-RNA 뉴클레오타이드, D-LNA 뉴클레오타이드, PNA 뉴클레오타이드, L-RNA 뉴클레오타이드, L-DNA 뉴클레오타이드, 변형된 L-RNA 뉴클레오타이드, 변형된 L-DNA 뉴클레오타이드, 및/또는 L-LNA 뉴클레오타이드에 의해 형성될 수 있다.
대안적으로, 포획 프로브는 본 발명에 따른 핵산 분자의 3'-말단에 상보적인 서열 스트레치를 포함하고, 검출 프로브는 본 발명에 따른 핵산 분자의 5'-말단에 상보적인 서열 스트레치를 포함한다. 이 경우 포획 프로브는 그의 3'-말단을 통해 표면 또는 매트릭스에 고정되며, 이에 따라 포획 프로브는 그의 3'-말단에서 직접 또는 그의 3'-말단과 표면 또는 매트릭스 사이의 링커를 통해 고정될 수 있다. 그러나, 원칙적으로 링커는 본 발명에 따른 핵산에 상보적인 서열 스트레치의 각 뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 링커는 당업자의 친수성 링커에 의해 또는 D-DNA 뉴클레오타이드, 변형된 D-DNA 뉴클레오타이드, D-RNA 뉴클레오타이드, 변형된 D-RNA 뉴클레오타이드, D-LNA 뉴클레오타이드, PNA 뉴클레오타이드, L-RNA 뉴클레오타이드, L-DNA 뉴클레오타이드, 변형된 L-RNA 뉴클레오타이드, 변형된 L-DNA 뉴클레오타이드, 및/또는 L-LNA 뉴클레오타이드에 의해 형성될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자에 혼성화할 수 있는 포획 및 검출 프로브의 뉴클레오타이드의 수는 가변적이며, 포획 및/또는 검출 프로브의 뉴클레오타이드 수 및/또는 본 발명에 따른 핵산 자체에 의존할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산에 혼성화할 수 있는 포획 및 검출 프로브의 총 뉴클레오타이드 수는 본 발명에 따른 핵산에 포함되는 뉴클레오타이드의 최대 수여야 한다. 검출 및 포획 프로브의 최소 뉴클레오타이드 수(2개 내지 10개 뉴클레오타이드)는 본 발명에 따른 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단 각각에 혼성화를 허용해야 한다. 본 발명에 따른 핵산과 분석된 샘플에서 발생하는 다른 핵산 사이의 높은 특이성과 선택성을 실현하려면, 포획 및 검출 프로브의 총 뉴클레오타이드 수는 본 발명에 따른 핵산 분자로 구성되는 뉴클레오타이드 수이거나 최대여야 한다.
더욱이, 검출 프로브는 바람직하게는 본원에서 이전에 기재된 바와 같이 검출될 수 있는 마커 분자 또는 표지를 운반한다. 표지 또는 마커 분자는 원칙적으로 검출 프로브의 각 뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 바람직하게는, 표지 또는 마커는 검출 프로브의 5'-말단 또는 3'-말단에 위치하여, 본 발명에 따른 핵산 분자에 상보적인 검출 프로브 내의 뉴클레오타이드와 표지 사이에 위치하여 링커가 삽입될 수 있다. 링커는 당업자의 친수성 링커에 의해 또는 D-DNA 뉴클레오타이드, 변형된 D-DNA 뉴클레오타이드, D-RNA 뉴클레오타이드, 변형된 D-RNA 뉴클레오타이드, D-LNA 뉴클레오타이드, PNA 뉴클레오타이드, L-RNA 뉴클레오타이드, L-DNA 뉴클레오타이드, 변형된 L-RNA 뉴클레오타이드, 변형된 L-DNA 뉴클레오타이드, 및/또는 L-LNA 뉴클레오타이드에 의해 형성될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산의 검출은 하기와 같이 수행될 수 있다:
본 발명에 따른 핵산 분자는 그의 말단 중 하나와 포획 프로브에 대해 그리고 다른 말단과 검출 프로브에 혼성화한다. 그 후에 결합되지 않은 검출 프로브는 예를 들어 하나 또는 여러 세척 단계에 의해 제거된다. 바람직하게는 표지 또는 마커 분자를 운반하는 결합된 검출 프로브의 양은 예를 들어 본원에 인용되어 포함된 국제공개 WO 2008/052774 호에 보다 상세하게 설명된 바와 같이 후속적으로 측정될 수 있다.
본원에서 바람직하게 사용되는, 용어 치료는 바람직한 실시형태에서 추가로 또는 대안적으로 예방 및/또는 후속 조치를 포함한다.
본원에서 바람직하게 사용되는 바와 같이, 용어 질환 및 장애는 반대로 표시되지 않는 경우 상호교환 가능한 방식으로 사용되어야 한다.
본원에 사용된 용어 포함하는은 바람직하게는 이러한 용어가 뒤따르거나 기재된 주제를 제한하려는 의도가 아니다. 그러나, 대안적인 실시형태에서, 용어 포함하는은 포함하는 의미로 이해되어야 하고, 따라서, 그러한 용어가 뒤따르거나 기재된 주제를 제한하는 것으로 이해되어야 한다.
다양한 서열 번호, 본 발명에 따른 핵산 분자 및 본원에서 사용된 표적 분자 CXCL8의 화학적 성질, 이의 실제 서열 및 내부 참조 번호는 하기 표에 요약되어 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
명세서, 청구범위, 서열 목록 및/또는 도면에 개시된 본 발명의 특징은 개별적으로 그리고 이들의 임의의 조합으로 본 발명을 다양한 형태로 실현하기 위한 재료일 수 있다.
본 발명은 추가 특징, 실시형태 및 이점이 취해질 수 있는 도면, 실시예 및 서열 목록에 의해 추가로 설명되며, 여기서
도 1은 경쟁 풀다운 결합 분석에 의해 결정된 KD 값을 포함하여 인간 CXCL8에 결합할 수 있는 핵산 분자의 서열 정렬을 보여주며;
도 2는 경쟁 풀다운 결합 분석 및/또는 표면 플라즈몬 공명 측정에 의해 결정된 바와 같이 인간 CXCL8에 대한 KD 값 및 상대적 결합 활성을 포함하는 핵산 분자 315-F8-001의 절단된 유도체를 나타내며;
도 3은 D-CXCL8에 대한 D-핵산 분자 315-F8-001 및 315-F8-002의 경쟁 풀다운 결합 분석에 의한 동역학 평가를 보여주며;
도 4는 표면 플라즈몬 공명 측정에 의해 결정된 바와 같이 (a) 25℃ 및 (b) 37℃에서 핵산 분자 315-F8-002의 CXCL8과의 결합을 보여주고, 결합 상수 ka 및 해리 상수 kd가 제공되며;
도 5는 표면 플라즈몬 공명 측정에 의해 결정된 바와 같이 (a) 25℃ 및 (b) 37℃에서 핵산 분자 315-F8-002-PEG의 CXCL8과의 결합을 보여주고, 결합 상수 ka 및 해리 상수 kd가 제공되며;
도 6은 표면 플라즈몬 공명 측정을 사용하는 경쟁 결합 분석에 의해 결정된 CXCL8에 대한 315-F8-002 결합의 선택성을 보여주며;
도 7은 핵산 분자 315-F8-002-PEG에 의한 CXCR2-발현 세포의 CXCL8-유도된 화학주성 억제를 보여주며;
도 8은 핵산 분자 315-F8-002에 의한 CXCL8의 정량화(도 8a) 및 핵산 분자 315-F8-002에 의한 CCL5 정량화(도 8b)를 보여주는 막대 다이어그램이며;
도 9는 상이한 농도에서 가용성 CXCL8 및 CXCL1에 대한 L-앱타머 315-F8-002(도 9a) 및 앱타머 8A-35(도 9b)의 결합을 보여주는 막대 다이어그램이다.
실시예 1 : 인간 CXCL8에 결합할 수 있는 핵산
몇몇 CXCL8-결합 핵산 및 이의 유도체가 확인되었으며, 이 뉴클레오타이드 서열은 도 1 내지 도 2에 도시되어 있다. CXCL8 결합 핵산은 D-앱타머(D-핵산) 및 L-앱타머(L-핵산)으로 시험되었으며, 이에 의해 D-핵산과 L-핵산은 실시예 2에 기재된 바와 같이 합성되었다.
CXCL8-결합 핵산은
a) 실시예 3에 나타낸 바와 같이 비오티닐화된 D-CXCL8(서열 번호 1)에 대한 풀다운 결합 분석에 의해 D-앱타머로서; 및
b) 표면 플라즈몬 공명(SPR) 측정(실시예 4) 및 인간 CXCR2 수용체를 발현하는 세포를 사용한 시험관 내 분석에 의해 L-앱타머로서, 특징화되며, 두 방법 모두에 대해 L-CXCL8(서열 번호 2)을 사용하였다(실시예 5).
이렇게 생성된 핵산은 약간 다른 서열을 나타내며, 따라서, 서열은 서열 패밀리로 요약되거나 그룹화될 수 있다.
뉴클레오타이드 서열 모티프의 정의를 위해, 분명하게 규정되지 않은 뉴클레오타이드에 대한 IUPAC 약어가 사용된다:
S 강한 G 또는 C;
W 약한 A 또는 U(T);
R 퓨린 G 또는 A;
Y 피리미딘 C 또는 U(T);
K 케토 G 또는 U(T);
M 이미노 A 또는 C;
B A 아님 C 또는 U(T) 또는 G;
D C 아님 A 또는 G 또는 U(T);
H G 아님 A 또는 C 또는 U(T);
V U 아님 A 또는 C 또는 G;
N 모두 A 또는 G 또는 C 또는 U(T)
반대로 표시되지 않는 경우, 임의의 핵산 서열 또는 스트레치 서열은 각각 5'→3' 방향으로 표시된다.
도 1 내지 2에 도시된 바와 같이, CXCL8 결합 핵산은 잠재적인 CXCL8 결합 모티프를 정의하는 하나의 중심 스트레치 뉴클레오타이드를 포함하며, 이에 의해 도 1은 서열 패밀리의 상이한 서열을 나타내고, 도 2는 CXCL8 핵산 315-F8-002-PEG를 포함하는 CXCL8 핵산 315-F8-001의 절단된 유도체를 나타낸다.
일반적으로, CXCL8 결합 핵산 분자는 뉴클레오타이드의 5'-말단 및 3'-말단 스트레치를 포함한다: 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치 및 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치. 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치와 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 서로 혼성화될 수 있으며, 이에 의해 혼성화 시 이중가닥 구조가 형성된다. 그러나, 이러한 혼성화는 생체 내 및 시험관 내 분자에서 반드시 제공되는 것은 아니다.
CXCL8 결합 핵산 분자의 세 가지 뉴클레오타이드 스트레치, 즉 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치, 뉴클레오타이드의 중심 스트레치 및 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5'→3'-방향으로 서로 배열된다: 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치 - 뉴클레오타이드의 중심 스트레치 - 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치. 그러나, 대안적으로, 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치, 뉴클레오타이드의 중심 스트레치 및 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5'→3'-방향으로 서로 배열된다: 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치 - 뉴클레오타이드의 중심 스트레치 - 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치.
정의된 스트레치의 서열은 CXCL8에 대한 결합 친화도에 영향을 미치는 CXCL8 결합 핵산 분자간에 상이할 수 있다. 상이한 CXCL8 결합 핵산 분자의 결합 분석에 기초하여, 하기에 기재된 바와 같은 뉴클레오타이드의 중심 스트레치 및 이들의 뉴클레오타이드 서열은 개별적으로 그리고 더욱 바람직하게는 CXCL8에 대한 결합에 전체적으로 필수적이다.
CXCL8 결합 핵산은 리보뉴클레오타이드로 구성된다(도 1 내지 2에 도시된 바와 같음).
도 1에 나타낸 바와 같이, CXCL8 결합 핵산 315-H9-001, 315-F11-001 및 315-F8-001의 뉴클레오타이드의 중심 스트레치의 서열은 약간 상이하다:
5'　GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG　3' (315-H9-001),
5'　GGAAGUACGUGGAAAGCCGAUGAGUGUGUCCCG　3' (315-F11-001),
5'　GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG　3' (315-F8-001).
본 발명에 따른 CXCL8 결합 핵산의 뉴클레오타이드의 중심 스트레치는 32 내지 33 nt를 포함하고 컨센서스 서열로 요약될 수 있다:
5'　GGAAGUACGUGGAAAGCCRA(XU)RAGUGUGUCCCG　3'
(여기서, Xu는 U이거나 부재함).
CXCL8에 대한 가장 높은 결합 친화도 또는 CXCL8에 대한 가장 낮은 해리 상수 Kd를 갖는 CXCL8 결합 핵산을 의미하는, CXCL8에 대한 가장 높은 결합 친화도를 갖는 CXCL8 결합 핵산은 5'　GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG　3' (315-F8-001) 및 5'　GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG　3' (315-H9-001)의 서열을 갖는 뉴클레오타이드의 중심 스트레치를 포함하며, 이에 의해 5'　GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG　3' (315-F8-001)의 서열을 갖는 뉴클레오타이드의 중심 스트레치는 CXCL8에 대한 CXCL8 핵산의 가장 높은 결합 친화도로 이어진다.
도 1 및 2에 도시된 바와 같이, CXCL8 결합 핵산의 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치 및 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 6개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드, 4개의 뉴클레오타이드 또는 3개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 이에 따라 스트레치는 서로 임의로 혼성화되며, 이에 따라 혼성화 시 이중가닥 구조가 형성된다. 이 이중가닥 구조는 6, 5, 4 또는 3개의 염기 쌍으로 구성될 수 있다. 그러나, 그러한 혼성화가 반드시 분자 내에 주어진 것은 아니다.
도 1에 도시된 바와 같이, CXCL8 결합 핵산 315-H9-001, 315-F11-001 및 315-F8-001의 뉴클레오타이드의 제1 스트레치 및 제2 스트레치는 각각 6개의 뉴클레오타이드를 포함한다:
a) CXCL8 결합 핵산 315-H9-001 및 315-F8-001 - 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5'　GCUGAC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5'　GUCAGC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
b) CXCL8 결합 핵산 315-F11-001 - 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5'　GCUGAC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5'　GUGAGC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
도 2에 도시된 바와 같이, CXCL8 결합 핵산의 뉴클레오타이드의 제1 및 제2 스트레치는 각각 5개, 4개 또는 3개의 뉴클레오타이드를 포함한다:
a) CXCL8 결합 핵산 315-F8-002 - 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치 5'　CUGAC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5'　GUCAG　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
b) CXCL8 결합 핵산 315-F8-005 - 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5'　GUGAC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5'　GUCAC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
c) CXCL8 결합 핵산 315-F8-003 - 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5'　UGAC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5'　GUCA　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
d) CXCL8 결합 핵산 315-F8-006 - 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5'　GGAC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5'　GUCC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
e) CXCL8 결합 핵산 315-F8-007 - 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5'　GCAC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5'　GUGC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
f) CXCL8 결합 핵산 315-F8-008 - 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5'　GGUC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5'　GACC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
g) CXCL8 결합 핵산 315-F8-009 - 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5'　UGGC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5'　GCCA　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
h) CXCL8 결합 핵산 315-F8-004 - 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5'　GAC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5'　GUC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
시험된 모든 CXCL8 결합 핵산 분자의 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치 및 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치 및 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치에 대한 다음 일반식으로 요약될 수 있다:
뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치에 대한 일반식은 5'　Z1Z2Z3Z4Z5C　3'이며, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치에 대한 일반식은 5'　GZ6Z7Z8Z9Z10　3'이며, 여기서 Z1은 G이거나 부재하며, Z2는 S이거나 부재하며, Z3은 K이거나 부재하며, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이거나 부재하며, Z9는 S이거나 부재하며, Z10은 C이거나 부재하며;
제1 바람직한 실시형태에서
q) Z1은 G이고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 C이며; 또는
r) Z1은 부재하고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 부재하며; 또는
s) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
t) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 부재하고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 부재하고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
u) Z1은 부재하고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 C이며; 또는
v) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 C이며; 또는
w) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 부재하고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 C이며; 또는
x) Z1은 G이고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 부재하며; 또는
y) Z1은 G이고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
z) Z1은 G이고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 부재하고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
aa) Z1은 부재하고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
bb) Z1은 부재하고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 부재하고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
cc) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 부재하며; 또는
dd) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 부재하고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 부재하며; 또는
ee) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 부재하고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
ff) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 부재하고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 부재하고, Z10은 부재한다.
CXCL8에 대한 가장 높은 결합 친화도 또는 CXCL8에 대한 가장 낮은 해리 상수 Kd를 갖는 CXCL8 결합 핵산을 의미하는, CXCL8에 대한 가장 높은 결합 친화도를 갖는 CXCL8 결합 핵산은 하기 뉴클레오타이드의 제1 및 제2 말단 스트레치를 포함한다:
a) CXCL8 결합 핵산 315-H9-001 및 315-F8-001 - 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5'　GCUGAC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5'　GUCAGC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
b) CXCL8 결합 핵산 315-F8-002 - 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5'　CUGAC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5'　GUCAG 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
c) CXCL8 결합 핵산 315-F8-005 - 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5'　GUGAC　3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5'　GUCAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
CXCL8-결합 핵산 315-F8-001, 315-H9-001 및 315-F11-001(6개 뉴클레오타이드가 있는 말단 스트레치 포함)의 Kd 값은 경쟁 풀다운 결합 분석에서 결정된 1.5~12.5 nM 범위에서 측정되었다(도 1~도 3). 직접 풀다운 분석 형식에서, CXCL8-결합 핵산 315-F8-001은 0.8 nM의 Kd 값을 나타냈다. Kd 값을 결정하는 보다 민감한 방법인 표면 플라즈몬 공명 측정을 사용하여, CXCL8 결합 핵산 315-F8-001에 대한 Kd는 25℃에서 0.22 nM, 37℃에서 0.68 nM이었다(도 2).
놀랍게도, 제1 말단 스트레치에서 6개 내지 5개의 뉴클레오타이드의 절단 및 제2 말단 스트레치에서 6개 내지 5개의 뉴클레오타이드의 절단은 CXCL8에 대한 결합 친화도에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것이 확인되었다. 경쟁 풀다운 분석(1.1 nM의 Kd; 도 2 및 도 3) 및 표면 플라즈몬 공명 측정(25℃에서 0.22 nM의 Kd 및 37℃에서 0.75 nM; 도 2 및 도 4)으로 측정된 CXCL8 결합 핵산 315-F8-002의 결합 친화도는 CXCL8-결합 핵산 315-F8-001에 대해 결정된 결합 친화도의 범위에 있다(상기 315-F8-001에 대한 Kd 값 참조).
CXCL8-결합 핵산 315-F8-002의 말단 스트레치를 추가로 절단 및/또는 돌연변이시키려는 시도로 CXCL8에 대한 낮은(315-F8-003, 315-F8-004, 315-F8-006, 315-F8-007, 315-F8-008, 및 315-F8-009) 또는 유사한(315-F8-005) 결합 친화도를 갖는 CXCL8-결합 핵산 315-F8-003, 315-F8-004, 315-F8-005, 315-F8-006, 315-F8-007, 315-F8-008 및 315-F8-009를 수득하였다(도 2).
CXCL8-결합 핵산 315-F8-002의 5'-40 kDa-PEG화된 변이체의 경우, CXCL8-결합 핵산 315-F8-002-PEG(AON-S08이라고도 함)의 Kd 25℃에서 0.2nM 및 37℃에서 0.8nM은 표면 플라즈몬 공명 측정으로 확인되었다(도 2 및 도 5).
CXCL8은 여러 ELR-양성 인간 CXC 케모카인 중 하나이다. CXCL8 외에, ELR-양성 인간 CXC 케모카인 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7은 CXCL8 수용체 CXCR2에 결합하고, 여기서 ELR-양성 인간 CXC 케모카인 CXCL6 및 CXCL7은 또한 CXCL8 수용체 CXCR1에 결합한다. CXCL8 결합 핵산 315-F8-002의 결합 특성의 특이성과 선택성을 보여주기 위해, CXCL8 결합 핵산 315-F8-002의 ELR-양성 인간 CXC 케모카인 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7에 대한 결합 친화도는 경쟁 결합 분석(실시예 4)으로 SPR에 의해 테스트하였다. CXCL8 결합 핵산 315-F8-002는 임의의 다른 ELR-양성 인간 CXC 케모카인 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7에 대한 결합을 나타내지 않았다(도 6).
CXCL8 결합 핵산 315-F8-002-PEG는 0.26 nM의 평균 억제 상수 IC50으로 CXCR2-발현 BA/F3 세포의 CXCL8-유도된 화학주성을 억제하였다(도 7, 실시예 5).
고정된 CXCL8 결합 핵산 315-F8-002를 갖는 바이오센서를 사용하여 CXCL8을 검출하고 정량화하였다. 검출 한계(평균 기준 값 + 기준 값의 3x 표준 편차)는 < 98 pM CXCL8이었고, 정량화 하한(평균 기준 값 + 기준 값의 1Ox 표준 편차)도 < 98 pM CXCL8이었다(도 8a, 실시예 6). 고정된 CXCL8 결합 핵산 315-F8-002의 특이성을 나타내기 위해, 다른 케모카인(CCL5)을 분석물로 사용했다. CCL5의 결합은 최대 12.5 nM의 농도에서 측정되지 않았다(도 8b, 실시예 6).
실시예 2 : D-앱타머 및 L-앱타머의 합성
소규모 고체상 합성
D-앱타머(D-핵산) 및 L-앱타머(L-핵산)는 2'TBDMS RNA 포스포라미다이트 화학(Damha and Ogilvie, 1993)을 사용하여 ABI 394 합성기(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 고체상 합성에 의해 생성되었다. L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, L-rU-, D-rA(N-Bz)-, D-rC(Ac)-, D-rG(N-ibu)-, D-rU-포스포라미다이트는 ChemGenes, Wilmington, MA에서 구입했다. D- 및 L-앱타머는 겔 전기영동으로 정제하였다.
대규모 고체상 합성
L-앱타머는 2'TBDMS RNA 및 DNA 포스포라미다이트 화학(Damha and Ogilvie, 1993)을 사용하여 AktaPilotlOO 합성기(Amersham Biosciences; General Electric Healthcare, Freiburg)로 고체상 합성에 의해 생성되었다. L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, 및 L-rU-는 ChemGenes, Wilmington, MA에서 구입했다. 5'-아미노-변형제는 American International Chemicals Inc.(Framingham, MA, USA)에서 구입했다. 변형되지 않은 또는 5'-아미노 변형된 L-앱타머의 합성은 L-riboA, L-riboC, L-riboG, 또는 L-riboU, 변형된 CPG 기공 크기 1000 A(Link Technology, Glasgow, UK)에서 시작되었다. RNA 포스포라미다이트(사이클 당 15분)의 커플링을 위해, 아세토니트릴 중 0.3M 벤질티오테트라졸(CMS-Chemicals, Abingdon, UK) 및 아세토니트릴 중 각 0.2M 포스포라미다이트 용액 2 당량을 사용하였다. 산화-캡핑 사이클을 사용하였다. 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 추가 표준 용매 및 시약은 Biosolve(Valkenswaard, NL)에서 구입했다. L-앱타머는 DMT-ON으로 합성되었으며; 탈보호 후, Sourcel5RPC 배지(Amersham)를 사용하여 분취용 RP-HPLC(문헌[Wincott et al., 1995])를 통해 정제하였다. 5'DMT 그룹은 80% 아세트산(실온에서 30분)으로 제거되었다. 5'아미노변형된 L-앱타머의 경우, 5'MMT-그룹은 80% 아세트산으로 제거되었다(실온에서 90분). 이어서, 수성 2M NaOAc 용액을 첨가하고, 5K 재생 셀룰로오스 멤브레인(Millipore, Bedford, MA)을 사용하여 접선-흐름 여과에 의해 L-앱타머를 탈염시켰다.
L-앱타머의 PEG화
L-앱타머의 생체 내 혈장 체류 시간을 연장하기 위해, L-앱타머를 5'-말단에서 40 kDa 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티에 공유결합시켰다. PEG화(PEG화 방법에 대한 기술적 세부사항은 유럽 특허출원공개 EP 1 306 382 호 참조)의 경우, 정제된 5'아미노 변형된 L-앱타머를 H20(2.5 ml), DMF(5 ml) 및 완충액 A(5 ml; 구연산·H20[7 g], 붕산[3.54 g], 인산[2.26 ml] 및 1M NaOH[343 ml]를 혼합하고 물을 최종 부피 1 l가 될 때까지 첨가하여 제조함; pH = 8.4는 1M HCl로 조정됨)의 혼합물에 용해하였다.
L-앱타머 용액의 pH는 1 M NaOH를 사용하여 8.4가 되었다. 그 다음, 40 kDa PEG-NHS 에스테르(Jenkem Technology, Allen, TX, USA)를 37℃에서 매 30분마다 0.25 당량의 6부분으로 75%~85%의 최대 수율에 도달할 때까지 첨가했다. 반응 혼합물의 pH는 PEG-NHS 에스테르를 첨가하는 동안 1 M NaOH로 8~8.5로 유지되었다.
반응 혼합물을 요소 용액 4 ml(8M) 및 완충액 B(H20 중 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트) 4 ml와 혼합하고 15분 동안 95℃로 가열하였다. 이어서, PEG화된 L-앱타머를 아세토니트릴 구배(완충액 B; 완충액 C: 아세토니트릴 중 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트)를 사용하여 Source 15RPC 배지(Amersham)와 함께 RP-HPLC로 정제하였다. 과량의 PEG는 5% 완충액 C에서 용리되고, PEG화된 L-앱타머는 10%~15% 완충액 C에서 용리된다. 순도 > 95%(HPLC에 의해 평가됨)를 갖는 생성물 분획을 합하고, 40 ml 3 M NaOAc와 혼합하였다. PEG화된 L-앱타머는 접선-흐름 여과(5K 재생 셀룰로스 멤브레인, Millipore, Bedford MA)에 의해 탈염되었다.
실시예 3 : 풀다운 결합 분석
D-앱타머의 결합 상수 결정을 위한 직접 풀다운 분석
D-CXCL8(C-bio)(서열 번호 1)에 대한 D-앱타머의 친화도를 결정하기 위해 직접 풀다운 분석을 사용한다. 이를 위해 D-앱타머는 [γ-32P]-ATP(Hartmann Analytic, Braunschweig, Germany)를 사용하여 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)에 의해 방사성 표지된다. 표지된 D-앱타머의 특정 방사능은 110,000~300,000 cpm/pmol이었다. 표지된 D-앱타머는 선택 완충액(20 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5　mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.1% Tween 20, 100　μg/ml 필수 지방산이 제거된 소 혈청 알부민, 200 μg/ml 효모 RNA)에서 37℃에서 1.5~2시간 동안 0.0192 내지 300 nM 범위에 있는 다양한 양의 D-CXCL8(C-bio)과 함께 0.2nM 농도로 배양한다. D-CXCL8(C-bio)/D-앱타머 복합체는 선택 버퍼에서 사전 평형화된 NAag+ 비드(Pierce Biotechnology, Rockford, USA의 Neutravidin agarose plus)에 고정되었다. 상층액을 분리하고 적당한 세척 후, 섬광 계수기(LS6500; Beckman Coulter, Fullerton, USA)에서 비드-결합 방사능을 측정한다. 고정되고 표지된 D-앱타머(입력의 %)의 양은 D-CXCL8(C-bio)의 농도에 대해 플롯되고, 해리 상수 Kd는 소프트웨어 알고리즘(GRAFIT; Erithacus Software; Surrey UK)을 사용하여 1:1 화학량론을 가정하여 얻는다.
CXCL8 결합 앱타머에 대해 315-H9-001 및 315-F8-001 Kd 값 1.7 nM 및 0.8 nM을 각각 직접 풀다운 분석에 의해 결정하였다.
D-앱타머의 결합 상수의 순위 및 결정을 위한 경쟁 풀다운 분석
경쟁 풀다운 분석을 사용하여 다른 D-CXCL8(C-bio) 결합 D-앱타머의 친화도를 비교한다. 이를 위해, 참조 D-앱타머는 방사선 표지되고(상기 기재됨) NAag+에 고정된 후 비-포화 결합 신호를 초래하는 조건에서 선택 완충액에서 D-CXCL8(C-bio)과 함께 37℃에서 배양되고, 세척(예를 들어, 3 nM D-CXCL8(C-bio), 0.15 nM 표지된 D-앱타머)하였다. D-CXCL8(C-bio)에 대한 결합에 대해 표지된 D-앱타머와 경쟁하는 과량의 비-표지 D-앱타머를 추가하면 고정화 및 세척 후 비드 결합된 방사능의 양이 감소한다. 신호 감소 정도는 비-표지 D-앱타머의 양과 친화도에 따라 다르다. 경쟁 풀다운 분석은 실험 순위 지정 및 선택된 D-앱타머의 해리 상수(Kd)를 결정하는 데 사용된다. 해리 상수 Kd는 비-표지 경쟁 D-앱타머의 농도에 대해 D-CXCL8(C-bio)에 결합된 표지된 D-앱타머의 분획(%)을 플롯팅하여 결정된다. 데이터 분석은 GRAFIT로 수행되었다.
풀다운 결합 분석의 결과는 실시예 1에 명시되고, 도 1, 도 2 및 도 3에 도시되어 있으며, 여기서 표지된 D-앱타머로서 CXCL8 핵산 315-F8-001이 사용되었다.
실시예 4 : 표면 플라즈몬 공명(SPR) 결합 분석
표면 플라즈몬 공명 측정은 25℃ 또는 37℃의 일정한 온도로 설정된 Biacore 2000 기기(GE Healthcare)에서 수행되었다. 단백질은 아민 커플링에 의해 CM4 센서 칩(GE Healthcare)에 고정되었다. 센서 칩 표면은 0.4 M EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드; GE) 및 0.1 M NHS(N-하이드록시숙신이미드; GE)의 1:1 혼합물을 주입하여 활성화되었다. 공유적으로 고정된 펩타이드 또는 단백질에 대해 관찰된 최대 반응은 약 500 RU였다. 플로우 셀은 1 M 에탄올아민 염산염(GE, BR-1000-50)으로 차단되었다. 비공유 결합된 펩타이드 또는 단백질도 이 절차에 의해 제거된다. 처리되지 않은 덱스트란 표면이 있는 플로우 셀과 에탄올아민-차단 표면이 있는 플로우 셀을 대조군으로 사용하였다. 측정하기 전에 센서 칩을 탈기 된 생리학적 실행 버퍼(20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 및 1 mM CaCl2)로 2회 프라이밍하고, 최소 3회 주입 및 재생(5 M NaCl)주기를 거쳤다.
L-앱타머의 결합 친화도는 일련의 농도 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8, 3.9, 1.95, 0.98, 0.49, 0.24, 0.12, 0.06　nM 주입 및 결합 이벤트의 관련 및 해리 단계 기록에 의해 측정하였다. 생성된 결합 곡선은 해리 상수(Kd=kd/ka)를 계산하는 데 사용되는 결합 운동 속도 상수(결합 상수 ka; 해리 상수 kd)를 결정하기 위해 Langmuir 1:1 화학량론적 결합 모델에 맞춰졌다. 데이터 분석은 BIAevaluation 3.1.1 소프트웨어(BIACORE AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 일정한 굴절률(RI) 값과 1×10e7(RU·M-1s-1)의 초기 질량 수송 계수 kt를 사용하여 수행되었다.
L-앱타머 결합의 선택도는 경쟁 결합 분석에 의해 평가하였다. 이를 위해 인간 케모카인 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7 및 CXCL8(RnD Systems, PeproTech 또는 ProSpecTech에서 구입)은 CXCL8 결합 핵산 315-F8-002(0.25 nM)의 L-앱타머와 함께 40 nM에서 개별적으로 주입되어, 고정된 CXCL8에 대한 L-앱타머의 결합과 경쟁한다. 대조군으로서, 센서 칩 덱스트란 매트릭스 또는/및 고정된 CXCL8에 대한 결합을 모니터링하기 위해 L-앱타머의 부재 하에 케모카인을 주입하였다. 고정된 CXCL8에 대한 315-F8-002의 결합은 주입 종료 후 240초에 미리 정의된 보고 지점에서 기록하였다. 선택된 케모카인을 고정시키고, CXCL8-결합 핵산 315-F8-002의 L-앱타머의 결합 친화도를 상기 기재된 바와 같이 결정하였다.
SPR 결합 분석 결과는 실시예 1에 명시하고, 도 2, 4, 5 및 6에 도시되어 있다.
실시예 5 : 시험관 내 약리학-화학주성 분석
인간 CXCR2를 코딩하는 플라스미드를 사용하여 BA/F3 마우스 pro-B 세포주를 안정적으로 형질감염시켰다. 화학주성 분석을 위해, 재조합 CXCL8(0.5 nM)을 37℃에서 20분~30분 동안 5 μm 기공(Costar Coming, NY)이 있는 96-웰 Corning Transwell 플레이트의 하부 구획에서, HBH 완충액(Hanks 균형 염 용액(HBSS) + 1 mg/ml BSA + 20mM HEPES)에서 표시된 농도로 CXCL8 결합 핵산 315-F8-002-PEG의 L-앱타머와 함께 사전 배양하였다. HBH 완충액의 CXCR2+ 세포를 상부 구획에 추가하고, 37℃에서 3시간 동안 이동할 수 있었다. 상부 구획을 제거한 후, PBS 중의 50 μM 레자주린(Sigma-Aldrich)을 하부 구획에 첨가하고, 37℃에서 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 형광은 590 nm(여기 파장 544 nm)에서 측정되었다. 배경 보정 및 정규화된 형광 값은 L-앱타머 농도에 대해 플롯되었다. 억제 상수 IC50 값(최대 절반 억제에 필요한 L-앱타머 농도)은 Prism 5 소프트웨어(GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용하여 비선형 회귀(4 매개변수 적합)로 결정하였다.
화학주성 분석의 결과는 실시예 1에 명시되고, 도 7에 도시되어 있다.
실시예 6 : CXCL8 바이오센서
아지드-말단 카보 나노막으로 코팅된 SPR-센서 칩을 제조하고, CXCL8-결합 L-앱타머 315-F8-002-DBCO(315-F8-002-아미노의 DBCO-변형된 변이체)를 상업용 Biacore 시스템의 플로우 셀(약 1,000 RU까지)에 2 M NaCl의 20 μM 용액 외부로 고정시켰다. 참고로, 비기능성 L-앱타머(DBCO-변형된 역 315-F8-002-아미노)는 다른 플로우 셀에 유사한 양으로 고정되었다. 표면은 DBCO-변형된 선형 메톡시-말단 폴리에틸렌 글리콜(MW: 5 kDa)을 고정함으로써 부동태화되었다. 0.1%(w/v) Tween20을 첨가하여 표준 샘플 완충액(Copan의 Universal Transport Medium)에 스파이킹된 일련의 농도 분석물 CXCL8을 주입하면 용량-의존적으로 신호가 증가하는 것으로 나타났다. 측정 온도는 25℃, 유량은 30 μL/분이었고, 실행 완충액은 측정 완충액이었다(20　mM Tris pH　7.4, 150　mM NaCl, 5　mM KCl, 1　mM MgCl2, 1　mM CaCl2, 0.1% (w/v) Tween20). 분석물을 10분 동안 결합시킨 다음, 2.5분의 측정 완충액에서 해리 시간을 두었다. 해리 단계가 끝날 때의 신호는 기준 플로우 셀에서 신호를 빼서 참조되었다.
CXCL8 바이오센서의 결과는 실시예 1에 명시되고, 도 8에 도시되어 있다.
실시예 7 : 가용성 케모카인에 대한 결합 비교를 위한 SPR 결합 분석
앱타머의 억제 활성은 용액에서 그의 표적에 결합하는 능력에 따라 달라진다. 여기서, 경쟁 SPR 결합 분석은 가용성 CXCL8 및 CXCL1에 대한 본 발명에 따른 CXCL8-결합 핵산 315 F8 002 및 이전에 공개된 앱타머 8A-35(Sung, Biomaterials 2014)의 L 앱타머의 결합을 결정하기 위해 사용되었다. 이를 위해, 아민 커플링에 의해 CXCL8이 Cl 센서 칩(GE Healthcare) 상에 고정된 상태로 실시예 4에 기재된 바와 같이 SPR 측정을 수행하였다. 고정된 CXCL8에 대한 315 F8 002(3 nM) 또는 8A-35(1,6 nM)의 결합은 약 20개의 반응 단위의 결합 반응을 초래했다. 8A-35 결합 분석에서 센서 칩은 1 M CaCl2 용액을 사용하여 재생시켰다. 용액에서 두 앱타머의 표적에 대한 결합을 평가하기 위해, 가용성 CXCL8을 고정된 CXCL8에 대한 앱타머 결합과 경쟁하기 위한 등몰 농도(1:1 비율) 또는 5배 과량(1:5 비율)으로 동시에 주입하였다. 가용성 CXCL1의 결합은 대조군으로 사용하였다. 모든 측정은 37℃에서 수행하였다. 고정된 CXCL8에 대한 결합 반응은 주사 후 240초에 기록되었다.
고정된 CXCL8에 대한 315-F8-002의 결합은 등몰 농도의 가용성 CXCL8에 의해 완전히 차단되었다(> 90%)(도 9a). 대조적으로, 8A 35의 결합은 등몰(약 30%) 및 5배 과량 농도(약 45%)에서 가용성 CXCL8에 의해 부분적으로만 차단되었다(도 9b). 이것은 315-F8-002가 8A-35에 비해 가용성 CXCL8에 대해 더 높은 결합 친화도를 가짐을 보여준다. 가용성 CXCL8에 대한 결합 친화도 감소(비교 표면 고정 CXCL8)는 CXCL8-유도 호중구 이동 분석에서 관찰된 8A-358의 불량한 억제 활성을 설명할 수 있다(Sung, Biomaterials 2014).
315-F8-002는 다른 ELR-양성 케모카인에 대한 교차 반응이 없는 것으로 나타났기 때문에 가용성 CXCL1을 대조군으로 사용했다(도 6). 일치하게, 315-F8-002의 결합은 가용성 CXCL1에 의해 차단되지 않았다(도 9a). 놀랍게도, 8A-358의 결합은 가용성 CXCL8과 유사한 효능으로 가용성 CXCL1에 의해 차단되었다(등몰에서 약 25% 및 5배 과량 농도에서 약 35%)(도 9b). 이것은 8A-35가 315-F8-002와는 대조적으로 용액에서 CXCL8에 선택적으로 결합하지 않고 전향적으로 억제하지 않음을 보여준다.
참고문헌
본 명세서에 인용된 문헌의 완전한 서지 데이터는, 그 개시내용이 참조로 포함되며, 반대로 나타내지 않으면 하기와 같다.
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본 출원으로 이어지는 프로젝트는 증여 협정 번호 634415에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램으로부터 자금을 받았다.
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<400> 16 gcugacggaa guacguggaa agccgaaagu gugucccggu cagc 44 <210> 17 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 cugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ag 42 <210> 18 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 ugacggaagu acguggaaag ccgaaagugu gucccgguca 40 <210> 19 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 gacggaagua cguggaaagc cgaaagugug ucccgguc 38 <210> 20 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 gugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ac 42 <210> 21 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 ggacggaagu acguggaaag ccgaaagugu gucccggucc 40 <210> 22 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 gcacggaagu acguggaaag ccgaaagugu gucccggugc 40 <210> 23 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 ggucggaagu acguggaaag ccgaaagugu gucccggacc 40 <210> 24 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 uggcggaagu acguggaaag ccgaaagugu gucccggcca 40 <210> 25 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <223> PEG linked through aminohexyl linker to 5' end <400> 25 cugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ag 42 <210> 26 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <223> aminohexyl linker attached to 5' end <400> 26 cugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ag 42 <210> 27 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> U is U or absent <400> 27 ggaaguacgu ggaaagccra uraguguguc ccg 33 <210> 28 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 ggaaguacgu ggaaagccaa ugaguguguc ccg 33 <210> 29 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 ggaaguacgu ggaaagccga ugaguguguc ccg 33 <210> 30 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 ggaaguacgu ggaaagccga aagugugucc cg 32 <210> 31 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 gacuggcccu gugugaaagc cgaaaggugc augaaggcag uc 42 <210> 32 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(73) <223> CXCL1 <400> 32 Ala Ser Val Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln 1 5 10 15 Gly Ile His Pro Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Lys Ser Pro Gly 20 25 30 Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Arg 35 40 45 Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Ile Val Lys Lys Ile Ile Glu 50 55 60 Lys Met Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn 65 70 <210> 33 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(73) <223> CXCL2 <400> 33 Ala Pro Leu Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln 1 5 10 15 Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Lys Val Lys Ser Pro Gly 20 25 30 Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Gln 35 40 45 Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Lys Lys Ile Ile Glu 50 55 60 Lys Met Leu Lys Asn Gly Lys Ser Asn 65 70 <210> 34 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(73) <223> CXCL3 <400> 34 Ala Ser Val Val Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln 1 5 10 15 Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Arg Ser Pro Gly 20 25 30 Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Lys 35 40 45 Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Gln Lys Ile Ile Glu 50 55 60 Lys Ile Leu Asn Lys Gly Ser Thr Asn 65 70 <210> 35 <211> 78 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(78) <223> CXCL5 <400> 35 Ala Gly Pro Ala Ala Ala Val Leu Arg Glu Leu Arg Cys Val Cys Leu 1 5 10 15 Gln Thr Thr Gln Gly Val His Pro Lys Met Ile Ser Asn Leu Gln Val 20 25 30 Phe Ala Ile Gly Pro Gln Cys Ser Lys Val Glu Val Val Ala Ser Leu 35 40 45 Lys Asn Gly Lys Glu Ile Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Phe Leu Lys 50 55 60 Lys Val Ile Gln Lys Ile Leu Asp Gly Gly Asn Lys Glu Asn 65 70 75 <210> 36 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(77) <223> CXCL6 <400> 36 Gly Pro Val Ser Ala Val Leu Thr Glu Leu Arg Cys Thr Cys Leu Arg 1 5 10 15 Val Thr Leu Arg Val Asn Pro Lys Thr Ile Gly Lys Leu Gln Val Phe 20 25 30 Pro Ala Gly Pro Gln Cys Ser Lys Val Glu Val Val Ala Ser Leu Lys 35 40 45 Asn Gly Lys Gln Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Phe Leu Lys Lys 50 55 60 Val Ile Gln Lys Ile Leu Asp Ser Gly Asn Lys Lys Asn 65 70 75 <210> 37 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(94) <223> CXCL7 <400> 37 Ser Ser Thr Lys Gly Gln Thr Lys Arg Asn Leu Ala Lys Gly Lys Glu 1 5 10 15 Glu Ser Leu Asp Ser Asp Leu Tyr Ala Glu Leu Arg Cys Met Cys Ile 20 25 30 Lys Thr Thr Ser Gly Ile His Pro Lys Asn Ile Gln Ser Leu Glu Val 35 40 45 Ile Gly Lys Gly Thr His Cys Asn Gln Val Glu Val Ile Ala Thr Leu 50 55 60 Lys Asp Gly Arg Lys Ile Cys Leu Asp Pro Asp Ala Pro Arg Ile Lys 65 70 75 80 Lys Ile Val Gln Lys Lys Leu Ala Gly Asp Glu Ser Ala Asp 85 90 <210> 38 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(68) <223> CCL5 <400> 38 Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala 1 5 10 15 Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly 20 25 30 Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser 50 55 60 Leu Glu Met Ser 65 <210> 39 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> PEG attached through aminohexyl linker <400> 39 cugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ag 42 <210> 40 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> Aminohexyl linker attached <400> 40 cugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ag 42 <210> 41 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> PEG attached through aminohexal linker <400> 41 gugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ac 42 <210> 42 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Aminohexal linker attached <400> 42 gugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ac 42 <210> 43 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> PEG attached through aminohexyl linker <400> 43 gugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ac 42 <210> 44 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> Aminohexyl linker <400> 44 gugacggaag uacguggaaa gccgaaagug ugucccgguc ac 42 <210> 45 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <223> All C are 2' fluoro-C <220> <221> misc_feature <223> All U are 2' fluoro-U <400> 45 gggggcuuau cauuccauuu aguguuauga uaacc 35

Claims (103)

  1. 인간 CXCL8에 결합할 수 있는 L-핵산 분자로서, 상기 L-핵산 분자는 뉴클레오타이드의 중심 스트레치(central stretch)를 포함하고, 뉴클레오타이드의 중심 스트레치는 5'-GGAAGUACGUGGAAAGCCRA(Xu)RAGUGUGUCCCG-3'[서열 번호 27](여기서, Xu는 U이거나 부재함)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, L-핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 뉴클레오타이드의 중심 스트레치는 하기 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, L-핵산 분자:
    d) 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 3'[서열 번호 28],
    e) 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAUGAGUGUGUCCCG 3'[서열 번호 29], 및
    f) 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3'[서열 번호 30].
  3. 제2항에 있어서,
    상기 뉴클레오타이드의 중심 스트레치는 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3'[서열 번호 30] 또는 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCAAUGAGUGUGUCCCG 3'[서열 번호 28], 바람직하게는 5' GGAAGUACGUGGAAAGCCGAAAGUGUGUCCCG 3'[서열 번호 30]의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, L-핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 5'->3' 방향으로 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치, 뉴클레오타이드의 중심 스트레치 및 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치를 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 3개 내지 6개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 3개 내지 6개의 뉴클레오타이드를 포함하며, 바람직하게는 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5개 내지 6개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5개 내지 6개의 뉴클레오타이드를 포함하며, 보다 바람직하게는 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5개의 뉴클레오타이드를 포함하는, L-핵산 분자.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' Z1Z2Z3Z4Z5C 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GZ6Z7Z8Z9Z10 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며,
    여기서
    Z1은 G이거나 부재하며, Z2는 S이거나 부재하며, Z3은 K이거나 부재하며, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이거나 부재하며, Z9는 S이거나 부재하며, Z10은 C이거나 부재하며;
    바람직하게는
    gg) Z1은 G이고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 C이며; 또는
    hh) Z1은 부재하고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 부재하며; 또는
    ii) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
    jj) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 부재하고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 부재하고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
    kk) Z1은 부재하고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 C이며; 또는
    ll) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 C이며; 또는
    mm) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 부재하고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 C이며; 또는
    nn) Z1은 G이고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 부재하며; 또는
    oo) Z1은 G이고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
    pp) Z1은 G이고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 부재하고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
    qq) Z1은 부재하고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
    rr) Z1은 부재하고, Z2는 S이고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 부재하고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
    ss) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 부재하며; 또는
    tt) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 부재하고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 S이고, Z10은 부재하며; 또는
    uu) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 K이고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 부재하고, Z9는 부재하고, Z10은 부재하며; 또는
    vv) Z1은 부재하고, Z2는 부재하고, Z3은 부재하고, Z4는 S이고, Z5는 D이고, Z6은 H이고, Z7은 S이고, Z8은 M이고, Z9는 부재하고, Z10은 부재한, L-핵산 분자.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    여기서
    a) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' CUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCAG 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
    b) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GCUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCAGC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 또는
    c) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GCUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUGAGC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
    d) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
    e) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' UGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCA 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
    f) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
    g) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GCAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUGC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
    h) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GGUC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GACC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
    i) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' UGGC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GCCA 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
    j) 뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
    바람직하게는,
    뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' CUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCAG 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GCUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCAGC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는
    뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
    보다 바람직하게는,
    뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' CUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCAG 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 또는
    뉴클레오타이드의 제1 말단 스트레치는 5' GUGAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 제2 말단 스트레치는 5' GUCAC 3'의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, L-핵산 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 40개 내지 45개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 42개 내지 45개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 42개의 뉴클레오타이드를 포함하는, L-핵산 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 리보뉴클레오타이드로 구성되는, L-핵산 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 서열 번호 14 내지 26 및 39 내지 44의 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, L-핵산 분자는 서열 번호 14 내지 26 및 39 내지 44의 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 L-핵산 분자에 대한 적어도 75%의 동일성을 갖는 L-핵산 분자를 포함하거나, L-핵산 분자는 서열 번호 14 내지 26 및 39 내지 44의 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 L-핵산 분자와 상동성인 L-핵산 분자를 포함하고, 여기서 상동성은 적어도 75%인, L-핵산 분자.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 20 및 서열 번호 41 내지 44의 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, L-핵산 분자는 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 20 및 서열 번호 41 내지 44의 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 L-핵산 분자에 대한 적어도 75%의 동일성을 갖는 L-핵산 분자를 포함하거나, L-핵산 분자는 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 20 및 서열 번호 41 내지 44의 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 L-핵산 분자와 상동성인 L-핵산 분자를 포함하고, 여기서 상동성은 적어도 75%인, L-핵산 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 CXCL8에 결합할 수 있고, 바람직하게는 CXCL8은 인간 CXCL8, 원숭이 CXCL8, 토끼 CXCL8, 돼지 CXCL8, 개 CXCL8, 양 CXCL8 또는 기니피그 CXCL8인, L-핵산 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 CXCL8, 바람직하게는 인간 CXCL8, 원숭이 CXCL8, 토끼 CXCL8, 돼지 CXCL8, 개 CXCL8, 양 CXCL8 또는 기니피그 CXCL8, 보다 바람직하게는 인간 CXCL8에 특이적으로 결합할 수 있는, L-핵산 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 CXCL8과 상이한 ELR-양성 CXC 케모카인에 결합하지 않거나 결합할 수 없으며, 여기서 CXCL8과 상이한 ELR-양성 CXC 케모카인은 바람직하게는 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6 및 CXCL7로 구성된 군으로부터 선택되는, L-핵산 분자.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 인간 CXCL8과 상이한 ELR-양성 인간 CXC 케모카인에 결합하지 않거나 결합할 수 없으며, 여기서 인간 CXCL8과 상이한 ELR-양성 인간 CXC 케모카인은 바람직하게는 인간 CXCL1, 인간 CXCL2, 인간 CXCL3, 인간 CXCL5, 인간 CXCL6 및 인간 CXCL7로 구성된 군으로부터 선택되는, L-핵산 분자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 KD로 표현되는 인간 CXCL8에 대한 결합 친화도가 10 nM 이하, 바람직하게는 1 nM 이하, 보다 바람직하게는 100 pM 이하, 가장 바람직하게는 30 pM 이하인, L-핵산 분자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 IC50으로 표현되는 인간 CXCL8에 대한 결합 친화도가 10 nM 이하, 바람직하게는 1 nM 이하, 보다 바람직하게는 100 pM 이하, 가장 바람직하게는 30 pM 이하인, L-핵산 분자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 KD로 표현되는 CXCL8과 상이한 ELR-양성 CXC 케모카인에 대한 결합 친화도가 100 nM 이상, 바람직하게는 500 nM 이상, 더 바람직하게는 1,000 nM 이상인, L-핵산 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 IC50으로 표현되는 CXCL8과 상이한 ELR-양성 CXC 케모카인에 대한 결합 친화도가 100 nM 이상, 바람직하게는 500 nM 이상, 더 바람직하게는 1,000 nM 이상인, L-핵산 분자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 KD로 표현되는 인간 CXCL8에 대한 결합 친화도가 10 nM 이하, 바람직하게는 1 nM 이하, 보다 바람직하게는 100 pM 이하, 가장 바람직하게는 30 pM 이하이며, 여기서 L-핵산 분자는 KD로 표현되는 CXCL8과 상이한 ELR-양성 CXC 케모카인에 대한 결합 친화도가 100 nM 이상, 바람직하게는 500 nM 이상, 보다 바람직하게는 1,000 nM 이상이고/이거나,
    상기 L-핵산 분자는 IC50으로 표현되는 인간 CXCL8에 대한 결합 친화도가 10 nM 이하, 바람직하게는 1 nM 이하, 보다 바람직하게는 100 pM 이하, 가장 바람직하게는 30 pM 이하이며, 여기서 L-핵산 분자는 IC50으로 표현되는 CXCL8과 상이한 ELR-양성 CXC 케모카인에 대한 결합 친화도가 100 nM 이상, 바람직하게는 500 nM 이상, 보다 바람직하게는 1,000 nM 이상인, L-핵산 분자.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 친화도는 실온에서, 바람직하게는 25℃에서 결정되는, L-핵산 분자.
  21. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 친화도는 37℃에서 결정되는, L-핵산 분자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 CXCL8, 바람직하게는 인간 CXCL8, 원숭이 CXCL8, 토끼 CXCL8, 돼지 CXCL8, 개 CXCL8, 양 CXCL8 또는 기니피그 CXCL8, 보다 바람직하게는 인간 CXCL8에 의해 매개되는 활성의 길항제인, L-핵산 분자.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 인간 CXCL8과 상이한 ELR-양성 인간 CXC 케모카인의 길항제가 아니거나, CXCL8과 상이한 ELR-양성 CXC 케모카인에 의해 매개되는 활성을 길항할 수 없으며, 여기서 CXCL8과 상이한 ELR-양성 CXC 케모카인은 바람직하게는 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6 및 CXCL7로 구성된 군으로부터 선택되는, L-핵산 분자.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 인간 CXCL8과 상이한 ELR-양성 인간 CXC 케모카인의 길항제가 아니거나, 인간 CXCL8과 상이한 ELR-양성 인간 CXC 케모카인에 의해 매개되는 활성을 길항할 수 없으며, 여기서 인간 CXCL8과 상이한 ELR-양성 인간 CXC 케모카인은 바람직하게 인간 CXCL1, 인간 CXCL2, 인간 CXCL3, 인간 CXCL5, 인간 CXCL6 및 인간 CXCL7로 구성된 군으로부터 선택되는, L-핵산 분자.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    IC50으로 표현되는 인간 CXCR1 및/또는 CXCR2에 의해 매개되는 활성에 대한 L-핵산 분자의 길항 활성이 10 nM 이하, 바람직하게는 1 nM 이하, 보다 바람직하게는 100 pM 이하, 가장 바람직하게는 30 pM 이하인, L-핵산 분자.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 CXCL8에 의해 매개되는 활성에 대한 L-핵산 분자의 길항 활성은 37℃에서 결정되는, L-핵산 분자.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 변형기를 포함하는, L-핵산 분자.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 변형기는 L-핵산 분자의 5'-말단 뉴클레오타이드 및/또는 3'-말단 뉴클레오타이드 및/또는 L-핵산 분자의 5'-말단 뉴클레오타이드와 L-핵산 분자의 3'-말단 뉴클레오타이드 사이의 L-핵산 분자의 뉴클레오타이드에 결합되는, L-핵산 분자.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    상기 변형기는 링커를 통해 L-핵산 분자에 결합되는, L-핵산 분자.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 링커는 친수성 링커이고, 바람직하게 상기 친수성 링커는 하나 이상의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하고, 보다 바람직하게 상기 친수성 링커는 트리에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는, L-핵산 분자.
  31. 제29항에 있어서, 상기 링커는 생분해성 링커인, L-핵산 분자.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    유기체로부터의 변형기를 포함하는 L-핵산 분자의 배출 속도는 변형기를 포함하지 않는 L-핵산의 배출 속도에 비해 감소되는, L-핵산 분자.
  33. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형기를 포함하는 L-핵산 분자는 변형기를 포함하지 않는 L-핵산 분자 유기체에서의 체류 시간과 비교하여 유기체에서 증가된 체류 시간을 갖는, L-핵산 분자.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    상기 유기체는 인간 또는 동물 신체, 바람직하게는 인간 신체인, L-핵산 분자.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형기는 생분해성 변형 및 비-생분해성 변형을 포함하는 기로부터 선택되고, 바람직하게 변형기는 폴리에틸렌 글리콜, 선형 폴리에틸렌 글리콜, 분지형 폴리에틸렌 글리콜, 하이드록시에틸 전분, 펩타이드, 단백질, 다당류, 스테롤, 폴리옥시프로필렌, 폴리옥시아미데이트 및 폴리(2-하이드록시에틸)-L-글루타민을 포함하는 군으로부터 선택되는, L-핵산 분자.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 변형기는 폴리에틸렌 글리콜, 바람직하게는 선형 폴리에틸렌 글리콜 또는 분지형 폴리에틸렌 글리콜이고, 바람직하게 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 약 20,000 Da 내지 약 120,000 Da, 보다 바람직하게는 약 30,000 Da 내지 약 80,000 Da, 가장 바람직하게는 약 40,000 Da인, L-핵산 분자.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 약 20,000 Da 내지 약 120,000 Da, 바람직하게는 약 30,000 Da 내지 약 80,000 Da, 보다 바람직하게는 약 40,000 Da인, L-핵산 분자.
  38. 제35항에 있어서,
    상기 변형기는 하이드록시에틸 전분이고, 바람직하게 상기 하이드록시에틸 전분의 분자량은 약 50 kDa 내지 약 1,000 kDa, 보다 바람직하게는 약 100 kDa 내지 약 700 kDa, 가장 바람직하게는 200 kDa 내지 500 kDa인, L-핵산 분자.
  39. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형기는 L-핵산 분자의 고정화를 위한 것인, L-핵산 분자.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 고정화는 표면에 대한 L-핵산 분자의 공유 결합을 포함하고, 여기서 바람직하게 상기 표면은 반응 용기의 표면, 반응 용기 내 장치의 표면 또는 바이오센서의 표면인, L-핵산 분자.
  41. 제39항에 있어서,
    상기 고정화는 표면에 대한 L-핵산 분자의 비공유 결합을 포함하고, 여기서 바람직하게 상기 표면은 반응 용기의 표면, 반응 용기 내 장치의 표면 또는 바이오센서의 표면인, L-핵산 분자.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형기는 카르복실, 하이드록실, 포스파티딜, 술폰산 에스테르, 아민, 티올, 에폭사이드, 알킨, 변형된 사이클로알킨, 말레이미드, 아지드, 하이드라지드를 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 바람직하게 상기 변형된 사이클로알킨은 디벤조사이클로옥틸(DBCO), 비사이클로[6.1.0]논-4-인(BCN) 및 아자디벤조사이클로옥틴(ADIBO)을 포함하는 군으로부터 선택되는, L-핵산 분자.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 변형기는 변형된 사이클로알킨, 바람직하게는 디벤조사이클로옥틸(DBCO)인, L-핵산 분자.
  44. 제41항에 있어서,
    상기 변형기는 비오틴, 브로모-데스옥시우리딘, 디곡시게닌 또는 올리고뉴클레오타이드이고, 바람직하게 상기 변형기는 비오틴인, L-핵산 분자.
  45. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형기는 L-핵산 분자의 검출을 허용하고, 바람직하게 상기 변형기는 표지인, L-핵산 분자.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 표지는 비오틴, 브로모-데스옥시우리딘, 디곡시게닌, 올리고뉴클레오타이드, 형광 표지, 전기화학발광 표지, 방사성 표지, 효소 표지, UV-표지, 콜로이드 금, 나노입자 및 킬레이터 분자 표지를 포함하는 군으로부터 선택되는, L-핵산 분자.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    질환의 치료 및/또는 예방 방법에 사용하기 위한, L-핵산 분자.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 질환은 CXCL8-매개 병원성 기전과 관련되고/되거나, 염증성 질환 및 암을 포함하는 군으로부터 선택되며, 바람직하게 염증성 질환은 호흡기계의 염증성 질환, 피부의 염증성 질환, 자가면역 질환, 염증성 신경 질환, 허혈성 질환, 죽상동맥경화증, 췌도 이식 거부, 장기 이식 거부, 장기 기능 지연, 척수 손상 또는 방광염인, L-핵산 분자.
  49. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    CXCL8을 검출하기 위한 방법에 사용하기 위한, L-핵산 분자.
  50. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    검출 수단 또는 바이오센서의 제조를 위한, L-핵산 분자.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자 및 선택적으로 추가의 구성성분을 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 추가 구성성분은 약제학적으로 허용되는 부형제, 약제학적으로 허용되는 담체 및 약제학적 활성제를 포함하는 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  53. 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자의 용도.
  54. 제53항에 있어서,
    상기 약제는 인간 의학에 사용하기 위한 것 또는 수의학에 사용하기 위한 것인, 용도.
  55. 제54항에 있어서,
    상기 약제는 CXCL8-매개 병원성 기전과 관련된 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 것이고/이거나, 염증성 질환 및 암을 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 바람직하게 염증성 질환은 호흡기계의 염증성 질환, 피부의 염증성 질환, 자가면역 질환, 염증성 신경 질환, 허혈성 질환, 죽상동맥경화증, 췌도 이식 거부, 장기 이식 거부, 장기 기능 지연, 척수 손상 또는 방광염인, 용도.
  56. 진단기, 진단 수단 또는 바이오센서의 제조를 위한, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자의 용도.
  57. 제56항에 있어서,
    상기 진단기 또는 진단 수단이 반응 용기 상의 표면 또는 반응 용기 내의 장치 상의 표면을 갖는, 용도.
  58. 제56항에 있어서,
    상기 바이오센서는 표면을 갖는, 용도.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 진단기, 진단 수단 또는 바이오센서는 CXCL8, 바람직하게는 인간 CXCL8을 직접 또는 간접적으로 검출하는데 적합한, 용도.
  60. 제56항 또는 제57항에 있어서,
    CXCL8은 샌드위치 결합 분석 또는 경쟁 결합 분석으로 직접 결합에 의해 검출되는, 용도.
  61. 제60항에 있어서,
    직접 결합은 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자만을 사용하고, CXCL8과 상호작용하는 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자와 상이한 제2 분자를 사용하지 않거나 사용하는데 관여하지 않는 검출 방법을 포함하는, 용도.
  62. 제60항에 있어서,
    상기 샌드위치 분석은 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자가 표면에 고정되고, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자 및 CXCL8의 복합체가 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자에 의해 결합된 것(들)과 상이한 CXCL8의 에피토프(들)에 결합하는 검출 수단에 의해 검출되는, 샌드위치 혼성화 분석인, 용도.
  63. 제60항에 있어서,
    상기 샌드위치 분석은 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자에 의해 결합된 것(들)과 상이한 CXCL8의 에피토프(들)에 결합하는 수단이 표면에 고정되고, 상기 수단 및 CXCL8의 복합체가 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자에 의해 검출되는 샌드위치 혼성화 분석인, 용도.
  64. 제60항에 있어서,
    상기 경쟁 결합 분석에서 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자는 표면에 고정되고, CXCL8에 대한 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자의 결합은 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 CXCL8과 경쟁하며, 바람직하게 상보성은 보다 바람직하게는 왓슨-크릭 염기 쌍을 기반으로 하는 염기 상보성인, 용도.
  65. 제60항에 있어서,
    상기 경쟁 결합 분석에서 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자는 표면에 고정되지 않고, CXCL8에 대한 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자의 결합은 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 CXCL8과 경쟁하여, 바람직하게 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 CXCL8은 표면에 고정되며, 바람직하게 상보성은 보다 바람직하게는 왓슨-크릭 염기 쌍을 기반으로 하는 염기 상보성인, 용도.
  66. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    표면에 대한 고정화를 위해 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자가 사용되는, 용도.
  67. 제57항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    표면, 바람직하게 바이오센서의 표면은 금, 은, 티타늄, 지르코늄, 바나듐, 크롬, 망간, 코발트, 텅스텐, 몰리브덴, 백금, 알루미늄, 철, 강철, 구리, 니켈, 실리콘, 게르마늄, 인화 인듐, 비화 갈륨, 및 이들의 산화물, 질화물 또는 합금 또는 혼합물, 인듐-주석 산화물, 유리질 탄소, 사파이어, 규산염 유리 및 붕산염 유리로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
  68. 제57항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    표면, 바람직하게 바이오센서의 표면은 폴리라이신, 아미노실란, 에폭시실란, 니트로셀룰로스, 카르복시덱스트란, 탄소 나노막, 그래핀 산화물, 탄소 표면, 예컨대 카본 블랙, 탄소 섬유, 탄소 플레이트, 탄소 천, 활성탄, 유리질 탄소, 숯, 활성탄, 흑연 분말, 흑연 섬유, 탄소 나노튜브, 풀러렌, 카르복실기, 아지드기, 티올기, 하이드록시기, 에폭사이드, 말레이미드, 알킨, 변형된 알킨 또는 이들의 임의의 조합에 의해 변형되는, 용도.
  69. 제68항에 있어서,
    제39항 내지 제44항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자의 고정화를 위해, 표면은 1차 아민, 티올기, 아지드, 알킨, 알켄, 테트라진, 테트라졸, 또는 변형된 사이클로알킨으로 작용화되며, 여기서 바람직하게 변형된 사이클로알킨은 디벤조사이클로옥틸(DBCO), 비사이클로[6.1.0]논-4-인(BCN) 또는 아자디벤조사이클로옥틴(ADIBO)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
  70. 제69항에 있어서,
    제42항 또는 제43항의 L-핵산 분자의 고정화를 위해 변형-촉진 아지드-알킨 고리화첨가가 사용되는, 용도.
  71. 제56항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    제44항 내지 제46항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자가 검출에 사용되는, 용도.
  72. 제56항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이오센서의 검출 시스템은 광학 판독, 질량 변화, 굴절률, 전하, 표면 응력 및 원자력 현미경에 기초하는, 용도.
  73. 제72항에 있어서,
    광학 판독에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 형광, 흡수 또는 발광인, 용도.
  74. 제72항에 있어서,
    질량 변화에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 수정 미세저울 시스템 또는 미세전자기계 시스템인, 용도.
  75. 제72항에 있어서,
    굴절률에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 표면 플라즈몬 공명, 링 공명기 또는 타원계측법인, 용도.
  76. 제72항에 있어서,
    전하에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 전기화학적 임피던스, 전압전류법, 전류측정법, 전위차 법, 전도도 또는 전계 효과 트랜지스터인, 용도.
  77. 제72항에 있어서,
    표면 응력에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 캔틸레버 바이오센서인, 용도.
  78. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    CXCL8은 균일한 분석 설정에 의해 검출되는, 용도.
  79. CXCL8, 바람직하게는 인간 CXCL8의 검출을 위한, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자의 용도.
  80. 제79항에 있어서,
    CXCL8은 샌드위치 결합 분석 설정, 균일 분석 설정 또는 경쟁 분석 설정으로 검출되는, 용도.
  81. 제80항에 있어서,
    상기 샌드위치 결합 분석 설정, 균일 분석 설정 또는 경쟁 분석 설정은 CXCL8을 직접 또는 간접적으로 검출하는 데 적합한, 용도.
  82. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 진단기의 반응 용기의 표면 상에, 진단기의 반응 용기 내의 장치 표면 상에, 또는 바이오센서의 표면 상에 공유적으로 고정되는, 용도.
  83. 제82항에 있어서,
    고정화를 위해 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자가 사용되는, 용도.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서,
    표면, 바람직하게 바이오센서의 표면은 금, 은, 티타늄, 지르코늄, 바나듐, 크롬, 망간, 코발트, 텅스텐, 몰리브덴, 백금, 알루미늄, 철, 강철, 구리, 니켈, 실리콘, 게르마늄, 인화 인듐, 비화 갈륨, 및 이들의 산화물, 질화물 또는 합금 또는 혼합물, 인듐-주석 산화물, 유리질 탄소, 사파이어, 규산염 유리 및 붕산염 유리로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    표면, 바람직하게 바이오센서의 표면은 폴리라이신, 아미노실란, 에폭시실란, 니트로셀룰로스, 카르복시덱스트란, 탄소 나노막, 그래핀 산화물, 탄소 표면, 예컨대 카본 블랙, 탄소 섬유, 탄소 플레이트, 탄소 천, 활성탄, 유리질 탄소, 숯, 활성탄, 흑연 분말, 흑연 섬유, 탄소 나노튜브, 풀러렌, 카르복실기, 아지드기, 티올기, 하이드록시기, 에폭사이드, 말레이미드, 알킨, 변형된 알킨 또는 이들의 임의의 조합에 의해 변형되는, 용도.
  86. 제85항에 있어서,
    제38항 내지 제44항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자의 고정화를 위해 표면은 활성화된 활성화된 1차 아민, 티올기, 아지드 또는 변형된 사이클로알킨에 의해 작용화되고, 여기서 바람직하게 변형된 사이클로알킨은 디벤조사이클로옥틸(DBCO), 비사이클로[6.1.0]논-4-인(BCN) 또는 아자디벤조사이클로옥틴(ADIBO)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
  87. 제86항에 있어서,
    제42항 또는 제43항의 L-핵산 분자의 고정화를 위해 변형-촉진 아지드-알킨 고리화첨가가 사용되는, 용도.
  88. 제82항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이오센서의 검출 시스템은 광학 판독, 질량 변화, 굴절률, 전하, 표면 응력 및 원자력 현미경에 기초하는, 용도.
  89. 제88항에 있어서,
    광학 판독에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 형광, 흡수 또는 발광인, 용도.
  90. 제85항에 있어서,
    질량 변화에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 수정 미세저울 시스템 또는 미세전자기계 시스템인, 용도.
  91. 제88항에 있어서,
    굴절률에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 표면 플라즈몬 공명, 링 공명기 또는 타원계측법인, 용도.
  92. 제88항에 있어서,
    전하에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 전기화학적 임피던스, 전압전류법, 전류측정법, 전위차 법, 전도도 또는 전계 효과 트랜지스터인, 용도.
  93. 제88항에 있어서,
    표면 응력에 기반한 바이오센서의 검출 시스템은 캔틸레버 바이오센서인, 용도.
  94. 제79항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 L-핵산 분자의 검출을 허용하는 변형기를 포함하고, 바람직하게 변형기는 표지인, 용도.
  95. 제94항에 있어서,
    상기 표지는 비오틴, 브로모-데스옥시우리딘, 디곡시게닌, 올리고뉴클레오타이드, 형광 표지, 전기화학발광 표지, 방사성 표지, 효소 표지, UV-표지, 콜로이드 금, 나노입자 및 킬레이터 분자 표지를 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
  96. CXCL8의 검출을 위한 키트로서, 상기 키트는 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자 및 적어도 지침 전단지 또는 반응 용기를 포함하는, 키트.
  97. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 L-핵산을 사용하여 CXCL8을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
    f) 알려지지 않은 농도의 CXCL8을 가진 샘플을 제공하는 단계;
    g) 샘플 또는 이의 희석액을 제56항 내지 제78항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 진단기, 진단 수단 또는 바이오센서와 접촉시키는 단계;
    h) 제56항 내지 제78항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 같은 진단기, 진단 수단 또는 바이오센서로 신호를 측정하는 단계;
    i) 선택적으로, 신호를 기준과 비교하는 단계;
    j) 선택적으로, CXCL8 농도가 알려지지 않은 샘플에서 CXCL8의 농도는 알려진 CXCL8 농도를 가진 적어도 하나의 샘플에서 얻은 신호와 비교하여 결정되며, 바람직하게 알려진 CXCL8 농도를 가진 적어도 하나의 샘플은 단계 b) 내지 c)에 적용되는, 방법.
  98. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 L-핵산 분자 및 CXCL8을 포함하는 복합체로서, 바람직하게 상기 복합체는 결정질 복합체인, 복합체.
  99. CXCL8에 의해 매개되는 활성을 갖는 길항제의 스크리닝 방법으로서,
    - CXCL8에 의해 매개된 활성을 갖는 후보 길항제를 제공하는 단계,
    - 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자를 제공하는 단계,
    - CXCL8에 의해 매개되는 활성을 갖는 길항제의 존재 하에 신호를 제공하는 테스트 시스템을 제공하는 단계, 및
    - CXCL8에 의해 매개되는 활성을 갖는 후보 길항제가 CXCL8에 의해 매개되는 활성을 갖는 길항제인지 여부를 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  100. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 L-핵산을 샘플에서 검출하는 방법으로서, 상기 방법은:
    f) 포획 프로브를 제공하는 단계로서, 여기서 상기 포획 프로브는 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자의 제1 부분 및 검출 프로브에 적어도 부분적으로 상보적이며, 상기 검출 프로브는 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 L-핵산 분자의 제2 부분에 적어도 부분적으로 상보적이거나, 대안적으로, 포획 프로브는 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 L-핵산 분자의 제2 부분에 적어도 부분적으로 상보적이며, 검출 프로브는 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 L-핵산 분자의 제1 부분에 적어도 부분적으로 상보적인, 단계;
    g) 포획 프로브 및 검출 프로브를 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자를 함유하거나 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자를 함유하는 것으로 추정되는 샘플에 개별적으로 또는 조합하여 첨가하는 단계;
    h) 포획 프로브 및 검출 프로브가 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자 또는 이의 일부와 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 반응하도록 하는 단계;
    i) 포획 프로브가 단계 a)에서 제공된 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자에 혼성화되는지 여부를 선택적으로 검출하는 단계; 및
    j) 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자 및 포획 프로브 및 검출 프로브로 구성된, 단계 c)에서 형성된 복합체를 검출하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  101. 제100항에 있어서,
    상기 검출 프로브는 검출 수단을 포함하고/하거나, 포획 프로브는 지지체, 바람직하게는 고체 지지체에 고정되는, 방법.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서,
    단계 c)에서 형성된 복합체의 일부가 아닌 임의의 검출 프로브가 반응으로부터 제거되어, 단계 e)에서 복합체의 일부인 검출 프로브만 검출되는, 방법.
  103. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 e)는 포획 프로브와 검출 프로브가 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 L-핵산 분자 또는 이의 일부의 존재 하에 및 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 상기 L-핵산 분자의 부재 하에 혼성화될 때 검출 수단에 의해 생성된 신호를 비교하는 단계를 포함하는, 방법.
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