JP5537812B2 - Ｍｃｐ−１に結合する核酸 - Google Patents

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Description

本発明は、ＭＣＰ−１に結合する核酸、ならびにそれぞれ医薬品および診断剤の製造のためのそれらの使用に関する。
ヒトＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質−１；代替名ＭＣＡＦ［単球走化性・活性化因子］；ＣＣＬ２；ＳＭＣ−ＣＦ［平滑筋細胞コロニー刺激因子］；ＨＣ−１１；ＬＤＣＦ；ＧＤＣＦ；ＴＳＧ−８；ＳＣＹＡ２；Ａ２；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託コードＰ１３５００）は、独立に３群を特徴とした（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。それは７６アミノ酸よりなり、そして全部のケモカインのようなヘパリン結合部位を特徴とする。２個の分子内ジスルフィド結合が該分子に安定な固い構造を賦与する。さらに、ＭＣＰ−１はそのアミノ末端にピログルタミン酸を保有する。Ｔｈｒ ７１に潜在的Ｏ−結合グリコシル化部位が位置する。付加的なＭＣＰファミリーメンバーはヒト（ＭＣＰ−２、−３、−４）およびマウス（ＭＣＰ−２、−３、−５）双方に存在する。該ヒトタンパク質はヒトＭＣＰ−１におよそ７０％相同である。
ＭＣＰ−１の構造はＮＭＲ（非特許文献４）およびＸ線（非特許文献５）により解明された。ＭＣＰ−１単量体は、アミノ末端システインの後にギリシャキーモチーフ中の３個の反平行β−プリーツシートに至る１個の長いループが続く典型的なケモカイン折り畳みを有する。該タンパク質は３個のβシートの上に重なるαヘリックス中で終端する（ＰＤＢデータ受託コード１ＤＯＫ）。
異なる哺乳動物種からのＭＣＰ−１形態の三次元構造は一般に維持されているとは言え、アミノ酸配列は進化の間にとりわけ良好に保存されてはいない。配列アライメントの結果は、最初の７６アミノ酸内にヒトおよびマウスＭＣＰ−１（ＪＥともまた呼ばれる）間で５５％の全体的配列類似性を示す。アミノ酸配列は別にして、マウスＭＣＰ−１は分子の大きさ（１２５アミノ酸）およびグリコシル化の程度がヒトＭＣＰ−１と異なる。マウスＭＣＰ−１はヒトＭＣＰ−１中に存在せずかつｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性に必要とされない４９アミノ酸のカルボキシ末端ドメインを含有する。ヒトＭＣＰ−１は、以下からのＭＣＰ−１と、以下の割合の同一のアミノ酸を共有する：
Figure 0005537812
この高程度の相違を考えれば、げっ歯類モデルでの薬理学的研究の成功裏の成績のため
に、げっ歯類ＭＣＰ−１のアンタゴニストを生成することが必要でありうる。
ＭＣＰ−１は、単球／マクロファージ、好塩基球、活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞の強力な誘引物質である。内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、滑膜細胞、メサンギウム細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞のような多様な細胞型、ならびに多数の腫瘍細胞がＭＣＰ−１を発現する（非特許文献６）。その発現は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＰＳ（リポ多糖）およびＧＭ−ＣＳＦのようないくつかの型の炎症前剤により刺激される。
乱雑なケモカインネットワークにおいてはむしろ異常に、ＭＣＰ−１はその受容体の使用において高度に特異的であり、ケモカイン受容体ＣＣＲ２にのみ高親和性で結合する。全部のケモカイン受容体のようにＣＣＲ２はＧＰＣＲである（非特許文献７）。ＣＣＲ２は、カルボキシ末端領域をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシングにより２種のわずかに異なる形態すなわちＣＣＲ２ａおよびＣＣＲ２ｂで発現されるようである（非特許文献８）。これらの受容体は、単球、骨髄系前駆細胞および活性化Ｔ細胞で発現される（非特許文献９；非特許文献１０）。ＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトした受容体に対するＭＣＰ−１の解離定数は２６０ｐＭであり、これは単球で測定される値と一致している（非特許文献９；非特許文献１１）。トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞上のＣＣＲ２ｂのＭＣＰ−１での活性化は、９０ｐＭの濃度でアデニリルシクラーゼを阻害し、そしてわずかにより高い濃度で（見るところホスファチジルイノシトール加水分解に依存せず）細胞内カルシウムを動員する。アデニリルシクラーゼおよび細胞内カルシウム放出に対する影響は破傷風毒素により強く阻害され、シグナル伝達におけるＧｉ型ヘテロ三量体Ｇタンパク質の関与を意味している（非特許文献９）。
ＭＣＰ−１は炎症を起こした組織への単球の動員に関与する。そこで、常在性マクロファージは、ＭＣＰ−１および他者のようなケモカイン、ならびにＴＮＦ、ＩＬ−１βおよび他者のようなサイトカインを放出し、それらは一連の接着分子を発現するように内皮細胞を活性化する。生じる「粘着性」内皮は血管中の単球をその表面に沿ってローリングさせる。ここで、単球は内皮表面上に提示されるＭＣＰ−１に遭遇し、ＭＣＰ−１は単球上のＣＣＲ２に結合しかつそれらを活性化する。これは最終的に確実な停止、内皮に沿った単球の拡散および周囲組織への遊出に至り、周囲組織で単球はマクロファージに分化しかつ最大ＭＣＰ−１濃度の部位に移動する。
ＭＣＰ−１は、小型（約８〜１４ｋＤａ）ヘパリンに結合する、大部分は塩基性かつ構造上関係した分子の１ファミリーであるケモカインファミリーの１メンバーである。それらは炎症を起こした組織で主に形成され、そして白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））の動員、活性化および増殖を調節する（非特許文献６；非特許文献１２；非特許文献１３）。ケモカインは、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、肥満細胞、ＴおよびＢ細胞の走化性を選択的に誘導する。それらの走化効果に加え、それらは、細胞形状の変化、遊離細胞内カルシウムイオンの濃度の一過性増大、脱顆粒、インテグリンの上方制御、ロイコトリエン、プロスタグランジン、トロンボキサンのような生物活性脂質の形成、または呼吸性バースト（病原性生物体若しくは腫瘍細胞の破壊のための反応性酸素種の放出）のような応答性細胞での他の効果を選択的に発揮し得る。従って、さらなる炎症前メディエーターの放出、感染若しくは炎症の部位への白血球の走化性および血管外遊走を惹起することにより、ケモカインは炎症反応の増大を誘発する。
４個の保存されたシステイン残基の最初の２種の配置に基づき、ケモカインは４分類、すなわち、システインが縦列であるＣＣ若しくはβ−ケモカイン、それらが１個の付加的なアミノ酸残基により分離されているＣＸＣ若しくはα−ケモカイン、ただ１個のジスル
フィド架橋を有する、今日まで唯一の代表（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｎｔ）としてリンホタクチンを含むＸＣ若しくはγケモカイン、および今日まで知られている唯一の分類メンバーとして膜結合型フラクタルカインを含む、システイン間の３アミノ酸残基を特徴とするＣＸ３Ｃケモカインに分割される（Ｂａｚａｎ １９９７）。
ＣＸＣケモカイン、とりわけそれらのアミノ末端にアミノ酸配列ＥＬＲを保有するＣＸＣケモカインは主に好中球に作用する。好中球上で活性であるＣＸＣケモカインの例は、ＩＬ−８、ＧＲＯα、−βおよび−γ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８およびＧＣＰ−２である。ＣＣケモカインは、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球のようなより多様な白血球、ならびにＴおよびＢリンパ球に作用する（非特許文献１４；非特許文献６；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。これらの例は、Ｉ−３０９；ＭＣＰ−１、−２、−３、−４、ＭＩＰ−１αおよび−β、ＲＡＮＴＥＳならびにエオタキシンである。
ケモカインは、７個の膜を貫通するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ；非特許文献１８）のスーパーファミリーに属する受容体を通じて作用する。一般的に言って、ケモカインおよびケモカイン受容体の相互作用は、１種のケモカインが多くのケモカイン受容体に結合し得、かつ、逆に、単一のケモカイン受容体が数種のケモカインと相互作用し得るために、乱雑である傾向がある。ＣＣケモカインの数種の既知の受容体は、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳを結合するＣＣＲ１（非特許文献１９；非特許文献２０）；ＭＣＰ−１、−２、−３および−４を包含するケモカインを結合するＣＣＲ２（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献２１；非特許文献２２）；エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−３を包含するケモカインを結合するＣＣＲ３（非特許文献２３）；ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳに応答してシグナルを発することが見出されたＣＣＲ４（非特許文献２４）；ならびにＭＩＰ−１αおよび−β、ならびにＲＡＮＴＥＳに応答してシグナルを発することが示されたＣＣＲ５（非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７）を包含する。
上で挙げられたとおり、ＭＣＰファミリーの全４メンバー（１−４）はＣＣＲ２に結合する一方、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３およびＭＣＰ−４は、ＣＣＲ１およびＣＣＲ３（非特許文献２１；非特許文献２８；非特許文献２９）、ならびにＭＣＰ−２の場合はＣＣＲ５（非特許文献３０）ともまた相互作用し得る。ＭＣＰファミリーとの高い相同性を示す別のＣＣケモカインはエオタキシンであり、それは元はアレルゲンで攻撃した感作されたモルモットから採取した気管支肺胞洗浄液から単離された（非特許文献１６）。エオタキシンはまたＣＣＲ２も活性化し得ることが示されている（非特許文献３１）。
本発明の根底にある問題は、ＭＣＰ−１と特異的に相互作用する手段を提供することである。より具体的には、本発明の根底にある問題は、ＭＣＰ−１と特異的に相互作用する、核酸に基づく手段を提供することである。
本発明の根底にあるさらなる一問題は、ヒト若しくはヒト以外の疾患の処置のための医薬品の製造のための手段を提供することであり、該疾患は、こうした疾患の発病機序に直接若しくは間接的にのいずれかで関与しているＭＣＰ−１を特徴とする。
本発明の根底にあるなおさらなる一問題は、疾患の処置のための診断剤の製造のための手段を提供することであり、該疾患は、こうした疾患の発病機序に直接若しくは間接的にのいずれかで関与しているＭＣＰ−１を特徴とする。
Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ １９８８ Ｒｏｌｌｉｎｓ １９８９ Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ １９８９ Ｈａｎｄｅｌ １９９６ Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ １９９７ Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ １９９４ Ｄａｗｓｏｎ ２００３ Ｃｈａｒｏ １９９４ Ｍｙｅｒｓ １９９５ Ｑｉｎ １９９６ Ｖａｎ Ｒｉｐｅｒ １９９３ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ １９９５ Ｓｃｈａｌｌ １９９４ Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ １９９１ Ｍｉｌｌｅｒ １９９２ Ｊｏｓｅ １９９４ Ｐｏｎａｔｈ １９９６ａ Ｍｕｒｐｈｙ ２０００ Ｎｅｏｔｅ １９９３ Ｇａｏ １９９３ Ｇｏｎｇ １９９７ Ｇａｒｃｉａ−Ｚｅｐｅｄａ １９９６ Ｐｏｎａｔｈ １９９６ｂ Ｐｏｗｅｒ １９９５ Ｂｏｒｉｎｇ １９９６ Ｒａｐｏｒｔ １９９６ Ｓａｍｓｏｎ １９９６ Ｈｅａｔｈ １９９７ Ｕｇｕｃｃｉｏｎｉ １９９７ Ｒｕｆｆｉｎｇ １９９８ Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ ２００１
［発明の要約］
本発明の根底にあるこれらおよび他の問題は、付属される独立請求項の主題により解決される。好ましい態様を従属請求項から採用しうる。
本発明の根底にある問題は、１Ａ型核酸、１Ｂ型核酸、２型核酸、３型核酸、４型核酸、および配列番号８７ないし１１５のいずれかの核酸配列を有する核酸を含んでなる群から選択される、好ましくはＭＣＰ−１に結合する核酸により、第一のアスペクトにおいてもまた解決される。
該第一のアスペクトの第一の下位アスペクト（ｓｕｂａｓｐｅｃｔ）において、１Ａ型核酸は、５’→３’の方向に、第一の伸長ボックスＢ１Ａ、第二の伸長ボックスＢ２、第三の伸長ボックスＢ３、第四の伸長ボックスＢ４、第五の伸長ボックスＢ５、第六の伸長ボックスＢ６および第七の伸長ボックスＢ１Ｂを含んでなり、
第一の伸長ボックスＢ１Ａおよび第七の伸長ボックスＢ１Ｂは場合によっては相互とハイブリダイズし、それによりハイブリダイゼーションに際して二本鎖構造が形成され、
第一の伸長ボックスＢ１ＡはＡＧＣＲＵＧのヌクレオチド配列を含んでなり、
第二の伸長ボックスＢ２はＣＣＣＧＧＷのヌクレオチド配列を含んでなり、
第三の伸長ボックスＢ３はＧＵＲのヌクレオチド配列を含んでなり、
第四の伸長ボックスＢ４はＲＹＡのヌクレオチド配列を含んでなり、
第五の伸長ボックスＢ５はＧＧＧＧＧＲＣＧＣＧＡＹＣのヌクレオチド配列を含んでなり
、
第六の伸長ボックスＢ６はＵＧＣＡＡＵＡＡＵＧ若しくはＵＲＹＡＷＵＵＧのヌクレオチド配列を含んでなり、および
第七の伸長ボックスＢ１ＢはＣＲＹＧＣＵのヌクレオチド配列を含んでなる。
第一の下位アスペクトの好ましい一態様において、
第一の伸長ボックスＢ１ＡはＡＧＣＧＵＧのヌクレオチド配列を含んでなる。
第一の下位アスペクトの一態様において、
第二の伸長ボックスＢ２はＣＣＣＧＧＵのヌクレオチド配列を含んでなる。
第一の下位アスペクトの一態様において、
第三の伸長ボックスＢ３はＧＵＧのヌクレオチド配列を含んでなる。
第一の下位アスペクトの一態様において、
第四の伸長ボックスＢ４はＧＵＡのヌクレオチド配列を含んでなる。
第一の下位アスペクトの一態様において、
第五の伸長ボックスＢ５はＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＡＣＣのヌクレオチド配列を含んでなる。
第一の下位アスペクトの一態様において、
第六の伸長ボックスＢ６はＵＡＣＡＵＵＵＧのヌクレオチド配列を含んでなる。
第一の下位アスペクトの一態様において、
第七の伸長ボックスＢ１ＢはＣＡＣＧＣＵのヌクレオチド配列を含んでなる。
第一の下位アスペクトの一態様において、該核酸は配列番号２１の核酸配列を含んでなる。
第一のアスペクトの第二の下位アスペクトにおいて、１Ｂ型核酸は、５’→３’の方向に、第一の伸長ボックスＢ１Ａ、第二の伸長ボックスＢ２、第三の伸長ボックスＢ３、第四の伸長ボックスＢ４、第五の伸長ボックスＢ５、第六の伸長ボックスＢ６および第七の伸長ボックスＢ１Ｂを含んでなり、
第一の伸長ボックスＢ１Ａおよび第七の伸長ボックスＢ１Ｂは場合によっては相互とハイブリダイズし、それによりハイブリダイゼーションに際して二本鎖構造が形成され、
第一の伸長ボックスＢ１ＡはＡＧＹＲＵＧのヌクレオチド配列を含んでなり、
第二の伸長ボックスＢ２はＣＣＡＧＣＵ若しくはＣＣＡＧＹのヌクレオチド配列を含んでなり、
第三の伸長ボックスＢ３はＧＵＧのヌクレオチド配列を含んでなり、
第四の伸長ボックスＢ４はＡＵＧのヌクレオチド配列を含んでなり、
第五の伸長ボックスＢ５はＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＡＣＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
第六の伸長ボックスＢ６はＣＡＵＵＵＵＡ若しくはＣＡＵＵＵＡのヌクレオチド配列を含んでなり、および
第七の伸長ボックスＢ１ＢはＣＡＹＲＣＵのヌクレオチド配列を含んでなる。
該第二の下位アスペクトの一態様において、
第一の伸長ボックスＢ１ＡはＡＧＣＧＵＧのヌクレオチド配列を含んでなる。
第二の下位アスペクトの一態様において、
第二の伸長ボックスＢ２はＣＣＡＧＵのヌクレオチド配列を含んでなる。
第二の下位アスペクトの一態様において、
第六の伸長ボックスＢ６はＣＡＵＵＵＵＡのヌクレオチド配列を含んでなる。
第二の下位アスペクトの一態様において、
第七の伸長ボックスＢ１ＢはＣＡＣＧＣＵのヌクレオチド配列を含んでなる。
第二の下位アスペクトの一態様において、該核酸は、配列番号２８および配列番号２７の核酸配列を含んでなる。
第一のアスペクトの第三の下位アスペクトにおいて、２型核酸は、５’→３’の方向に、第一の伸長ボックスＢ１Ａ、第二の伸長ボックスＢ２および第三の伸長ボックスＢ１Ｂを含んでなり、
第一の伸長ボックスＢ１Ａおよび第三の伸長ボックスＢ１Ｂは場合によっては相互とハイブリダイズし、それによりハイブリダイゼーションに際して二本鎖構造が形成され、
第一の伸長ボックスＢ１Ａは、ＡＣＧＣＡ、ＣＧＣＡおよびＧＣＡを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、
第二の伸長ボックスＢ２はＣＳＵＣＣＣＵＣＡＣＣＧＧＵＧＣＡＡＧＵＧＡＡＧＣＣＧＹＧＧＣＵＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
第三の伸長ボックスＢ１Ｂは、ＵＧＣＧＵ、ＵＧＣＧおよびＵＧＣを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる。
該第三の下位アスペクトの一態様において、
第二の伸長ボックスＢ２はＣＧＵＣＣＣＵＣＡＣＣＧＧＵＧＣＡＡＧＵＧＡＡＧＣＣＧＵＧＧＣＵＣのヌクレオチド配列を含んでなる。
第三の下位アスペクトの一態様において、
ａ）第一の伸長ボックスＢ１ＡはＡＣＧＣＡのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第三の伸長ボックスＢ１ＢはＵＧＣＧＵのヌクレオチド配列を含んでなるか；または
ｂ）第一の伸長ボックスＢ１ＡはＣＧＣＡのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第三の伸長ボックスＢ１ＢはＵＧＣＧのヌクレオチド配列を含んでなるか；または
ｃ）第一の伸長ボックスＢ１ＡはＧＣＡのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第三の伸長ボックスＢ１ＢはＵＧＣ若しくはＵＧＣＧのヌクレオチド配列を含んでなる。
第三の下位アスペクトの一態様において、
第一の伸長ボックスＢ１ＡはＧＣＡのヌクレオチド配列を含んでなる。
第三の下位アスペクトの好ましい一態様において、
第三の伸長ボックスＢ１ＢはＵＧＣＧのヌクレオチド配列を含んでなる。
第三の下位アスペクトの一態様において、該核酸は、配列番号３７、配列番号１１６、配列番号１１７および配列番号２７８の核酸配列を含んでなる。
第一のアスペクトの第四の下位アスペクトにおいて、３型核酸は、５’→３’の方向で、第一の伸長ボックスＢ１Ａ、第二の伸長ボックスＢ２Ａ、第三の伸長ボックスＢ３、第四の伸長ボックスＢ２Ｂ、第五の伸長ボックスＢ４、第六の伸長ボックスＢ５Ａ、第七の伸長ボックスＢ６、第八の伸長ボックスＢ５Ｂおよび第九の伸長ボックスＢ１Ｂを含んでなり、
第一の伸長ボックスＢ１Ａおよび第九の伸長ボックスＢ１Ｂは場合によっては相互とハイブリダイズし、それによりハイブリダイゼーションに際して二本鎖構造が形成され、
第二の伸長ボックスＢ２Ａおよび第四のボックスＢ２Ｂは場合によっては相互とハイブリダイズし、それによりハイブリダイゼーションに際して二本鎖構造が形成され、
第六の伸長ボックスＢ５Ａおよび第八のボックスＢ５Ｂは場合によっては相互とハイブリダイズして、それによりハイブリダイゼーションに際して二本鎖構造が形成され、
第一の伸長ボックスＢ１Ａは、ＧＵＲＣＵＧＣ、ＧＫＳＹＧＣ、ＫＢＢＳＣおよびＢＮＧＣを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、
第二の伸長ボックスＢ２ＡはＧＫＭＧＵのヌクレオチド配列を含んでなり、
第三の伸長ボックスＢ３はＫＲＲＡＲのヌクレオチド配列を含んでなり、
第四の伸長ボックスＢ２ＢはＡＣＫＭＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
第五の伸長ボックスＢ４は、ＣＵＲＹＧＡ、ＣＵＷＡＵＧＡ、ＣＷＲＭＧＡＣＷおよびＵＧＣＣＡＧＵＧを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、
第六の伸長ボックスＢ５Ａは、ＧＧＹおよびＣＷＧＣを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、
第七の伸長ボックスＢ６は、ＹＡＧＡ、ＣＫＡＡＵおよびＣＣＵＵＵＡＵを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、
第八の伸長ボックスＢ５Ｂは、ＧＣＹＲおよびＧＣＷＧを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、ならびに
第九の伸長ボックスＢ１Ｂは、ＧＣＡＧＣＡＣ、ＧＣＲＳＭＣ、ＧＳＶＶＭおよびＧＣＮＶを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる。
該第四の下位アスペクトの一態様において、
第三の伸長ボックスＢ３は、ＧＡＧＡＡ若しくはＵＡＡＡＡのヌクレオチド配列を含んでなる。
第四の下位アスペクトの一態様において、
第五の伸長ボックスＢ４は、ＣＡＧＣＧＡＣＵ若しくはＣＡＡＣＧＡＣＵのヌクレオチド配列を含んでなる。
第四の下位アスペクトの一態様において、
第五の伸長ボックスＢ４はＣＡＧＣＧＡＣＵのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ、ボックスＢ３はＵＡＡＡＡのヌクレオチド配列を含んでなる。
第四の下位アスペクトの一態様において、
第五の伸長ボックスＢ４はＣＡＡＣＧＡＣＵのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ、ボックスＢ３はＧＡＧＡＡのヌクレオチド配列を含んでなる。
第四の下位アスペクトの一態様において、
第七の伸長ボックスＢ６はＵＡＧＡのヌクレオチド配列を含んでなる。
第四の下位アスペクトの一態様において、
ａ）第一の伸長ボックスＢ１ＡはＧＵＲＣＵＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢはＧＣＡＧＣＡＣのヌクレオチド配列を含んでなるか；若しくは
ｂ）第一の伸長ボックスＢ１ＡはＧＫＳＹＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢはＧＣＲＳＭＣのヌクレオチド配列を含んでなるか；若しくはｃ）第一の伸長ボックスＢ１ＡはＫＢＢＳＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢはＧＳＶＶＭのヌクレオチド配列を含んでなるか；若しくは
ｄ）第一の伸長ボックスＢ１ＡはＢＮＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢはＧＣＮＶのヌクレオチド配列を含んでなる。
第四の下位アスペクトの好ましい一態様において、
ａ）第一の伸長ボックスＢ１ＡはＧＵＧＣＵＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢはＧＣＡＧＣＡＣのヌクレオチド配列を含んでなるか；若しくは
ｂ）第一の伸長ボックスＢ１ＡはＧＵＧＣＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢはＧＣＧＣＡＣのヌクレオチド配列を含んでなるか；若しくはｃ）第一の伸長ボックスＢ１ＡはＫＫＳＳＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢはＧＳＳＭＭのヌクレオチド配列を含んでなるか；若しくは
ｄ）第一の伸長ボックスＢ１ＡはＳＮＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢはＧＣＮＳのヌクレオチド配列を含んでなる。
第四の下位アスペクトのさらなる好ましい一態様において、
第一の伸長ボックスＢ１ＡはＧＧＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢはＧＣＣＣのヌクレオチド配列を含んでなる。
第四の下位アスペクトの一態様において、該第二の伸長ボックスＢ２ＡはＧＫＭＧＵのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ、第四の伸長ボックスＢ２ＢはＡＣＫＭＣのヌクレオチド配列を含んでなる。
第四の下位アスペクトの好ましい一態様において、該第二の伸長ボックスＢ２ＡはＧＵＡＧＵのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ、第四の伸長ボックスＢ２ＢはＡＣＵＡＣのヌクレオチド配列を含んでなる。
第四の下位アスペクトの一態様において、
ａ）第六の伸長ボックスＢ５ＡはＧＧＹのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第八の伸長ボックスＢ５ＢはＧＣＹＲのヌクレオチド配列を含んでなるか；若しくは
ｂ）第六の伸長ボックスＢ５ＡはＣＷＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第八の伸長ボックスＢ５ＢはＧＣＷＧのヌクレオチド配列を含んでなる。
第四の下位アスペクトの好ましい一態様において、
第六の伸長ボックスＢ５ＡはＧＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第八の伸長ボックスＢ５ＢはＧＣＣＧのヌクレオチド配列を含んでなる。
第四の下位アスペクトのより好ましい一態様において、第六の伸長ボックスＢ５Ａは、第八の伸長ボックスＢ５ＢのヌクレオチドＧＣＹとハイブリダイズする。
第四の下位アスペクトの一態様において、該核酸は配列番号５６に記載の核酸配列を含んでなる。
第四の下位アスペクトの一態様において、該核酸は、配列番号５７ないし６１、配列番号６７ないし７１および配列番号７３の核酸配列を含んでなる群から選択される核酸配列を含んでなる。
第一のアスペクトの第五の下位アスペクトにおいて、４型核酸は、５’→３’の方向で、第一の伸長ボックスＢ１Ａ、第二の伸長ボックスＢ２、第三の伸長ボックスＢ１Ｂを含んでなり、
第一の伸長ボックスＢ１Ａおよび第三の伸長ボックスＢ１Ｂは場合によっては相互とハイブリダイズし、それによりハイブリダイゼーションに際して二本鎖構造が形成され、
第一の伸長ボックスＢ１Ａは、ＡＧＣＧＵＧＤＵ、ＧＣＧＣＧＡＧ、ＣＳＫＳＵＵ、ＧＵＧＵＵおよびＵＧＵＵを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、
第二の伸長ボックスＢ２は、ＡＧＮＤＲＤＧＢＫＧＧＵＲＧＹＡＲＧＵＡＡＡＧ、ＡＧＧＵＧＧＧＵＧＧＵＡＧＵＡＡＧＵＡＡＡＧおよびＣＡＧＧＵＧＧＧＵＧＧＵＡＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、ならびに
第三の伸長ボックスＢ１Ｂは、ＧＮＣＡＳＧＣＵ、ＣＵＣＧＣＧＵＣ、ＧＲＳＭＳＧ、ＧＲＣＡＣおよびＧＧＣＡを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる。
該第五の下位アスペクトの一態様において、
ａ）第一の伸長ボックスＢ１ＡはＧＵＧＵＵのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第三の伸長ボックスＢ１ＢはＧＲＣＡＣのヌクレオチド配列を含んでなり；
ｂ）第一の伸長ボックスＢ１ＡはＧＣＧＣＧＡＧのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第三の伸長ボックスＢ１ＢはＣＵＣＧＣＧＵＣのヌクレオチド配列を含んでなるか；若しくは
ｃ）第一の伸長ボックスＢ１ＡはＣＳＫＳＵＵのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第三の伸長ボックスＢ１ＢはＧＲＳＭＳＧのヌクレオチド配列を含んでなるか、若しくはｄ）第一の伸長ボックスＢ１ＡはＵＧＵＵのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第三の伸長ボックスＢ１ＢはＧＧＣＡのヌクレオチド配列を含んでなるか、若しくは
ｅ）第一の伸長ボックスＢ１ＡはＡＧＣＧＵＧＤＵのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第三の伸長ボックスＢ１ＢはＧＮＣＡＳＧＣＵのヌクレオチド配列を含んでなる。
第五の下位アスペクトの好ましい一態様において、第一の伸長ボックスＢ１ＡはＣＳＫＳＵＵのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ、第三の伸長ボックスＢ１ＢはＧＲＳＭＳＧのヌクレオチド配列を含んでなる。
第五の下位アスペクトのより好ましい一態様において、第一の伸長ボックスＢ１ＡはＣＣＧＣＵＵのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ、第三の伸長ボックスＢ１ＢはＧＧＧＣＧＧのヌクレオチド配列を含んでなる。
第五の下位アスペクトの一態様において、
第二の伸長ボックスＢ２は、ＡＧＧＵＧＧＧＵＧＧＵＡＧＵＡＡＧＵＡＡＡＧのヌクレオチド配列を含んでなる。
第五の下位アスペクトの一態様において、該核酸は配列番号８０の核酸配列を含んでなる。
第一ないし第五の下位アスペクトの一態様において、核酸はＭＣＰ−１、好ましくはヒトＭＣＰ−１を結合することが可能である。
第一ないし第五の下位アスペクトの一態様において、核酸はケモカインを結合することが可能であり、該ケモカインはエオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される。
第一ないし第五の下位アスペクトの一態様において、核酸はケモカインを結合することが可能であり、該ケモカインはヒトエオタキシン、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２およびヒトＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される。
第一ないし第五の下位アスペクトの一態様において、核酸はＭＣＰ−１を結合することが可能であり、ＭＣＰ−１は好ましくはサルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１、ブタＭＣＰ−１およびヒトＭＣＰ−１を含んでなる群から選択される。
第一ないし第五の下位アスペクトの一態様において、核酸はヒトＭＣＰ−１を結合することが可能である。
第一ないし第五の下位アスペクトの好ましい一態様において、ＭＣＰ−１は配列番号１のアミノ酸配列を有する。
本発明の根底にある問題は、好ましくはマウスＭＣＰ−１に結合する核酸により第二のアスペクトにおいて解決され、該核酸は、配列番号１２２、配列番号２５３および配列番号２５４の核酸配列を含んでなる。
本発明の根底にある問題は、好ましくはマウスＭＣＰ−１に結合する核酸により第三のアスペクトにおいて解決され、該核酸は配列番号１２７の核酸配列を含んでなる。
第二および第三のアスペクトの一態様において、マウスＭＣＰ−１は配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる。
第一ないし第三のアスペクトの一態様において、該核酸は修飾を含んでなり、該修飾は好ましくは高分子部分であり、かつ／または、該修飾は、好ましくは、動物若しくはヒト身体、好ましくはヒト身体中の滞留時間に関して第一、第二および第三のアスペクトのいずれかの核酸の特徴を改変することを可能にする。
第一ないし第三のアスペクトの好ましい一態様において、修飾はＨＥＳ部分およびＰＥＧ部分を含んでなる群から選択される。
第一ないし第三のアスペクトのより好ましい一態様において、修飾は直鎖若しくは分枝状ＰＥＧよりなるＰＥＧ部分であり、該ＰＥＧ部分の分子量は好ましくは約２０から１２０ｋＤまで、より好ましくは約３０から８０ｋＤまで、および最も好ましくは約４０ｋＤである。
第一ないし第三のアスペクトの代替のより好ましい一態様において、修飾はＨＥＳ部分であり、好ましくは該ＨＥＳ部分の分子量は約１０から１３０ｋＤまで、より好ましくは約３０から１３０ｋＤまで、および最も好ましくは約１００ｋＤである。
第一ないし第三のアスペクトの一態様において、修飾はリンカーを介して核酸に結合される。
第一ないし第三のアスペクトの一態様において、修飾は、その５’末端ヌクレオチドおよび／若しくはその３’末端ヌクレオチドの核酸に、ならびに／または５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドの間の核酸のヌクレオチドに結合される。
第一ないし第三のアスペクトの一態様において、核酸のヌクレオチド若しくはそれを形成するヌクレオチドはＬ−ヌクレオチドである。
第一ないし第三のアスペクトの一態様において、核酸はＬ−核酸である。
第一ないし第三のアスペクトの一態様において、ＭＣＰ−１を結合することが可能な核酸の部分はＬ−ヌクレオチドよりなる。
本発明の根底にある問題は、第一、第二および第三のアスペクトの核酸、ならびに場合によっては１種のさらなる構成要素を含んでなる製薬学的組成物により、第四のアスペクトにおいて解決され、該さらなる構成要素は、製薬学的に許容できる賦形剤、製薬学的に許容できる担体および製薬学的有効成分を含んでなる群から選択される。
該第四のアスペクトの一態様において、製薬学的組成物は、第一ないし第三のアスペクトのいずれかの核酸、および製薬学的に許容できる担体を含んでなる。
本発明の根底にある問題は、医薬品の製造のための第一、第二および第三のアスペクトの核酸の使用により、第五のアスペクトにおいて解決される。
該第五のアスペクトの一態様において、医薬品は、ヒト医学での使用のため若しくは獣医学での使用のためである。
本発明の根底にある問題は、診断手段の製造のための第一、第二および第三のアスペクトの核酸の使用により、第六のアスペクトにおいて解決される。
第五のアスペクトの一態様において、および第六のアスペクトの一態様において、医薬品および診断手段それぞれは、炎症性疾患、自己免疫疾患、自己免疫性脳脊髄炎、卒中、急性および慢性多発性硬化症、慢性炎症、関節リウマチ、腎疾患、再狭窄、血管形成術後の再狭窄、急性および慢性アレルギー反応、一次的および二次的免疫学的若しくはアレルギー反応、喘息、結膜炎、気管支炎、癌、アテローム硬化症、アテローム硬化性心血管系心不全若しくは卒中、乾癬、乾癬性関節炎、神経系の炎症、アトピー性皮膚炎、大腸炎、子宮内膜症、ブドウ膜炎、黄斑変性を包含する網膜障害、網膜剥離、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜色素変性、増殖性硝子体網膜症、および中心性漿液性網脈絡膜症；特発性肺線維症、サルコイドーシス、多発性筋炎、皮膚筋炎、免疫抑制の回避、感染症のリスクを低下させること、敗血症、腎の炎症、糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、閉塞性腎症、急性尿細管壊死、およびびまん性糸球体硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性気管支炎、ベーチェット病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、川崎病後の早発性アテローム硬化症、心筋梗塞、肥満、慢性肝疾患、ペイロニー病、急性脊髄損傷、肺若しくは腎移植、心筋炎、アルツハイマー病およびニューロパシー、乳癌、胃癌、膀胱癌、卵巣癌、過誤腫、結腸直腸癌、結腸腺腫、膵炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ならびにクローン病若しくは潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患を含んでなる群から選択される疾患若しくは障害のそれぞれ処置および／若しくは予防ならびに診断のためである。
論理により束縛されることを望むものではなく、診断目的上の本発明の核酸の適合性は、増大若しくは低下されたケモカインレベルに主に基づき、こうしたケモカインは、エオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択され、より具体的にはＭＣＰ−１である。前述の疾患の大部分はこうした増大若しくは低下されたケモカインレベルを示すことが当業者により認められるであろう。
本発明の根底にある問題は、ケモカインならびに第一、第二および第三のアスペクトの核酸を含んでなる複合体により、第七のアスペクトにおいて解決され、該ケモカインは、エオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択され、好ましくは該複合体は結晶性複合体である。
該第七のアスペクトの一態様において、ケモカインは、ヒトエオタキシン、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２およびヒトＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される。
第七のアスペクトの一態様において、ケモカインはＭＣＰ−１であり、ＭＣＰ−１は、好ましくはヒトＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１およびブタＭＣＰ−１を含んでなる群から選択され、より好ましくはＭＣＰ−１はヒトＭＣＰ−１である。
本発明の根底にある問題は、ケモカインの検出のための第一、第二および第三の核酸の使用により、第八のアスペクトにおいて解決され、該ケモカインはエオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される。
該第八のアスペクトの一態様において、ケモカインは、ヒトエオタキシン、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２およびヒトＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される。
第八のアスペクトの一態様において、ケモカインはＭＣＰ−１であり、ＭＣＰ−１は、好ましくはヒトＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１およびブタＭＣＰ−１を含んでなる群から選択され、より好ましくはＭＣＰ−１はヒトＭＣＰ−１である。
本発明の根底にある問題は、以下の段階：
・候補ケモカインアンタゴニストおよび／若しくは候補ケモカインアゴニストを提供する段階、
・第一、第二若しくは第三のアスペクトの核酸を提供する段階、
・ケモカインアンタゴニストおよび／若しくはケモカインアゴニストの存在下でシグナルを提供する試験系を提供する段階、ならびに
・候補ケモカインアンタゴニストがケモカインアンタゴニストであるかどうか、および／若しくは候補ケモカインアゴニストがケモカインアゴニストであるかどうかを決定する段階
を含んでなり、
該ケモカインはエオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、
ケモカインアンタゴニスト若しくはケモカインアゴニストのスクリーニング方法により、
第九のアスペクトにおいて解決される。
該第九のアスペクトの一態様において、ケモカインは、ヒトエオタキシン、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２およびヒトＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される。
第九のアスペクトの一態様において、ケモカインはＭＣＰ−１であり、ＭＣＰ−１は、好ましくはヒトＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１およびブタＭＣＰ−１を含んでなる群から選択され、より好ましくはＭＣＰ−１はヒトＭＣＰ−１である。
本発明の根底にある問題は、以下の段階：
・相、好ましくは固相に固定されたケモカインを提供する段階、
・標識されている、第一、第二若しくは第三のアスペクトの核酸、好ましくは第一のアスペクトの核酸を提供する段階、
・候補ケモカインアゴニストおよび／若しくは候補ケモカインアンタゴニストを添加する段階、ならびに
・候補ケモカインアゴニストがケモカインアゴニストであるかどうか、および／若しくは候補ケモカインアンタゴニストがケモカインアンタゴニストであるかどうかを決定する段階
を含んでなり、
該ケモカインはエオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、
ケモカインアゴニストおよび／若しくはケモカインアンタゴニストのスクリーニング方法により、第十のアスペクトにおいて解決される。
該第十のアスペクトの一態様において、該核酸が候補ケモカインアゴニスト若しくは候補ケモカインアンタゴニストにより置換されるかどうかが評価されるような該決定することが実施される。
第十のアスペクトの一態様において、ケモカインは、ヒトエオタキシン、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２およびヒトＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される。
第十のアスペクトの一態様において、ケモカインはＭＣＰ−１であり、ＭＣＰ−１は、好ましくはヒトＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１およびブタＭＣＰ−１を含んでなる群から選択され、より好ましくはＭＣＰ−１はヒトＭＣＰ−１である。
本発明の根底にある問題は、第一、第二および第三のアスペクトの核酸を含んでなる、ケモカインの検出のためのキットにより、第十一のアスペクトにおいて解決され、該ケモカインはエオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される。
該第十一のアスペクトの一態様において、ケモカインは、ヒトエオタキシン、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２およびヒトＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される。
第十一のアスペクトの一態様において、ケモカインはＭＣＰ−１であり、ＭＣＰ−１は、好ましくはヒトＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１およびブタＭＣＰ−１を含んでなる群から選択され、より好ましくはＭＣＰ−１はヒトＭＣＰ−１である。
本発明の根底にある問題は、第十のアスペクト若しくは第九のアスペクトの方法により得ることが可能なケモカインアンタゴニストにより、第十二のアスペクトにおいて解決され、該ケモカインは、エオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される。
第十二のアスペクトの一態様において、ケモカインは、ヒトエオタキシン、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２およびヒトＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される。
第十二のアスペクトの一態様において、ケモカインはＭＣＰ−１であり、ＭＣＰ−１は好ましくはヒトＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１およびブタＭＣＰ−１を含んでなる群から選択され、より好ましくはＭＣＰ−１はヒトＭＣＰ−１である。
本発明の根底にある問題は、第十のアスペクト若しくは第九のアスペクトの方法により得ることが可能なケモカインアゴニストにより、第十三のアスペクトにおいて解決され、該ケモカインは、エオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される。
第十三のアスペクトの一態様において、ケモカインは、ヒトエオタキシン、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２およびヒトＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される。
第十三のアスペクトの一態様において、ケモカインはＭＣＰ−１であり、ＭＣＰ−１は、好ましくはヒトＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１およびブタＭＣＰ−１を含んでなる群から選択され、より好ましくはＭＣＰ−１はヒトＭＣＰ−１である。
ケモカインアゴニストおよび／若しくはケモカインアンタゴニストが、好ましくは、本明細書に明記されるところのそれぞれのケモカインを扱うそれぞれアゴニストおよびアンタゴニストであることが、当業者により認められるであろう。従って、ケモカインアゴニストおよびケモカインアンタゴニストは、例えばそれぞれＭＣＰ−１アゴニストおよびＭＣＰ−１アンタゴニストである。
本発明の根底にある問題は、サンプル中の第一、第二および第三のアスペクトのいずれかの核酸の検出方法により、第十四のアスペクトにおいて解決され、該方法は：
ａ）本発明の核酸を含有するサンプルを提供する段階；
ｂ）捕捉プローブ（該捕捉プローブは第一、第二および第三のアスペクトのいずれかの核酸の第一の部分に少なくとも部分的に相補的であり）、ならびに検出プローブ（該検出プローブは第一、第二および第三のアスペクトのいずれかの核酸の第二の部分に少なくとも部分的に相補的であるか、若しくは、あるいは、該捕捉プローブは第一、第二および第三のアスペクトのいずれかの核酸の第二の部分に少なくとも部分的に相補的であり、かつ、該検出プローブは第一、第二および第三のアスペクトのいずれかの核酸の第一の部分に少なくとも部分的に相補的である）を提供する段階；
ｃ）捕捉プローブおよび検出プローブを、同時に若しくはいずれかの順序で連続してのいずれかで、第一、第二および第三のアスペクトのいずれかの核酸若しくはその部分と反応させる段階；
ｄ）場合によっては、捕捉プローブが、段階ａ）で提供される第一、第二および第三のアスペクトのいずれかの核酸に従った核酸にハイブリダイズするかどうかを検出する段階；ならびに
ｅ）第一、第二および第三のアスペクトのいずれかの核酸、ならびに捕捉プローブおよび検出プローブよりなる段階ｃ）で形成される複合体を検出する段階
を含んでなる。
該第十四のアスペクトの一態様において、検出プローブは検出手段を含んでなり、かつ／若しくは捕捉プローブは支持体、好ましくは固体支持体に固定され得る。
第十四のアスペクトの一態様において、複合体の一部でないいかなる検出プローブも、段階ｅ）で複合体の一部である検出プローブのみが検出されるように反応から除去される。
第十四のアスペクトの一態様において、段階ｅ）は、第一、第二若しくは第三のアスペクトのいずれかの核酸またはその部分の存在下および前記核酸若しくはその部分の非存在下で捕捉プローブおよび検出プローブがハイブリダイズされる場合に検出手段により生成されるシグナルを比較する段階を含んでなる。
第十四のアスペクトの一態様において、検出されるべき核酸は、配列番号３７、１１６、１１７若しくは２７８の核酸配列を有する核酸であり、かつ、捕捉プローブ若しくは検出プローブは、配列番号２５５若しくは配列番号２５６の核酸配列を含んでなる。
第十四のアスペクトの一態様において、検出されるべき核酸は、配列番号１２２、２５３若しくは２５４の核酸配列を有する核酸であり、かつ、捕捉プローブ若しくは検出プローブは、配列番号２８１および配列番号２８２の核酸配列を含んでなる。
［発明の詳細な記述］
本発明の根底にある問題は、それに付属される独立請求項の主題によってもまた解決される。好ましい態様は付属される従属請求項から採用しうる。
本明細書に記述されるところの本発明の核酸の特徴は、単独で若しくはいずれかの組合せのいずれかで核酸を使用する本発明のいかなるアスペクトでも実現し得る。
ヒトならびにマウスのＭＣＰ−１は、それぞれ配列番号１および２のアミノ酸配列を有する基本的タンパク質である。
ＭＣＰ−１に対する短い高親和性結合核酸を同定し得たという知見は、基本的タンパク質に向けられるアプタマーすなわち標的分子へのＤ−核酸結合の生成が、高いがしかし非特異的Ｓ／Ｎ比をこの種の標的が生じるために一般に非常に困難であることをＥａｔｏｎら（１９９７）が観察した限りにおいては驚くべきである。この高Ｓ／Ｎ比は、ＭＣＰ−１のような基礎的標的に対し核酸により示される高い非特異的親和性から生じる。
特許請求の範囲および実施例１により詳細に概説されるとおり、本発明者は、多数の異なるＭＣＰ−１結合核酸分子をより驚くべきことに同定し得、それにより該核酸の大部分を本明細書でボックスともまた称されるヌクレオチドの伸長に関して特徴付け得た。多様なＭＣＰ−１結合核酸分子は、それぞれ前記ボックスならびにいくつかの構造的特徴および要素に基づき分類し得る。かように定義された多様な範疇は、本明細書で型ならびにより具体的には１Ａ型、１Ｂ型、２型、３型および４型ともまた称される。
本発明の核酸は、本明細書に開示される特定の配列に本質的に相同である核酸もまた含んでなる。相同性が最低７５％、好ましくは８５％，より好ましくは９０％および最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％以上であるような、実質的に相同という用語が理解されるべきである。
本発明の核酸に存在する相同なヌクレオチドの実際の比率は、該核酸に存在するヌクレ
オチドの総数に依存することができる。改変パーセントは該核酸に存在するヌクレオチドの総数に依存し得る。
相同性は当業者に既知のとおり決定し得る。より具体的には、配列比較アルゴリズムが、その場合、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列に関する試験配列（１種若しくは複数）について配列同一性パーセントを計算する。試験配列は、好ましくは、それが別の核酸分子に相同であるかどうか、およびもしそうであればどの程度かを試験すべきと言われる若しくは試験すべきである配列若しくは核酸分子であり、それによりこうした別の核酸分子は参照配列ともまた称される。一態様において、参照配列は本明細書に記述されるところの核酸分子、より好ましくは、配列番号１０ないし１２９、１３２ないし２５６および２７８〜２８２のいずれかの配列を有する核酸分子である。比較のための配列の至適のアライメントは、例えばＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１）ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、１９７０）ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎの相同性検索法（ＰｅａｓｏｎとＬｉｐｍａｎ、１９８８）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、ウィスコンシン州マディソンのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、若しくは目視検査により、実施し得る。
配列同一性パーセントを決定するのに適するアルゴリズムの一例は、基本的局所アライメント検索ツール（下で「ＢＬＡＳＴ」）で使用されるアルゴリズムである。例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら １９９０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（下で「ＮＣＢＩ」）から公的に入手可能である。ＮＣＢＩから入手可能なソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列のため）およびＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列のため）を使用する配列同一性の決定において使用されるデフォルトのパラメータが、ＭｃＧｉｎｎｉｓら（ＭｃＧｉｎｎｉｓら、２００４）に記述されている。
発明の核酸、若しくは本発明の核酸という用語は、本明細書に開示される核酸配列若しくはそれらの部分を、好ましくは該核酸若しくは前記部分がＭＣＰ−１への結合に関与する程度まで含んでなる核酸もまた含んでなる。本明細書で好ましく使用されるところの発明の核酸という用語は、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４およびエオタキシンを含んでなる群から選択されるいずれかの分子に結合するのに適する核酸も、一態様においてまた含んでなる。本発明の個々の核酸はこうした分子の１若しくは数種に結合することができることが、当業者により認められるであろう。こうした核酸は、一態様において、本明細書に記述される核酸分子の１種、またはその誘導体および／若しくは代謝物であり、こうした誘導体および／若しくは代謝物は，好ましくは、本明細書に記述される核酸分子に比較して切断された核酸である。切断は、本明細書に開示されるところの核酸の端のいずれか若しくは双方に関しうる。また、切断は、核酸のヌクレオチドの内部配列に関しうる。すなわち、それはそれぞれ５’および３’末端ヌクレオチドの間のヌクレオチド（１個若しくは複数）に関しうる。さらに、切断は、本明細書に開示される核酸の配列からのわずか単一ヌクレオチドの欠失を含んでなる。切断は、発明の核酸（１種若しくは複数）の１個以上の伸長にもまた関することができ、該伸長は約１ヌクレオチド長であり得る。好ましくはＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４およびエオタキシンを含んでなる群から選択される分子への本発明の核酸の結合は、慣例の実験を使用して、または本明細書に開示されるところの、好ましくは実施例の部で本明細書に記述されるところの方法を使用若しくは採用することにより、当業者により決定され得る。それとは反対に明示的に示されない限り、それが本発明の核酸の若しくはＭＣＰ−１との結合と本明細書で称される場合はいつも、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４およびエオタキシンを含んでなる群から選択されるいずれかの分子への若しくはそれらとの本発明の核酸の結合にもこれがまた当てはまることは、本発明の一態様内にある。
本発明の核酸はＤ−核酸若しくはＬ−核酸いずれでもありうる。好ましくは、発明の核酸はＬ−核酸である。加えて、核酸の一部若しくはいくつかの部分がＤ−核酸として存在するか、または核酸の少なくとも一部分若しくはいくつかの部分がＬ−核酸であることが可能である。核酸の「部分」という用語は約１ヌクレオチドを意味している。こうした核酸は一般に本明細書でそれぞれＤ−およびＬ−核酸と称される。従って、とりわけ好ましい一態様において、本発明の核酸はＬ−ヌクレオチドよりなりかつ最低１個のＤ−ヌクレオチドを含んでなる。こうしたＤ−ヌクレオチドは、好ましくは、本発明の核酸を規定する伸長と異なる部分、好ましくは、該核酸の他の部分との相互作用が関わるその部分に結合される。好ましくは、こうしたＤ−ヌクレオチドは、それぞれ伸長のいずれかおよび本発明のいずれかの核酸の一末端に結合される。さらなる好ましい一態様において、こうしたＤ−ヌクレオチドは、好ましくは本発明の核酸にＰＥＧおよびＨＥＳのような修飾を結合するスペーサー若しくはリンカーとして作用しうる。
それらの核酸配列（１種若しくは複数）に関してそっくりそのまま本明細書に記述される核酸分子のそれぞれおよびいずれも特定のヌクレオチド配列（１種若しくは複数）に制限されることもまた、本発明の一態様内にある。言い換えれば「含んでなること」若しくは「含んでなる」という用語は、こうした態様において含有すること若しくはよりなることという意味に解釈されるべきである。
本発明の核酸がより長い核酸の部分であり、このより長い核酸はいくつかの部分を含んでなり、最低１個のこうした部分が本発明の核酸若しくはその一部分であることもまた、本発明内にある。これらのより長い核酸の他の部分（１個若しくは複数）は１若しくは数個のＤ−核酸または１若しくは数個のＬ−核酸のいずれでもあり得る。いかなる組合せも本発明とともに使用しうる。単独の若しくは一緒にされるのいずれのより長い核酸のこれらの他の部分（１個若しくは複数）も、そっくりそのまま若しくは特定の組合せでのいずれかで、結合、好ましくはＭＣＰ−１への結合と異なる機能を表し得る。１つの可能な機能は他の分子との相互作用を可能にすることであり、それによりこうした他の分子は、好ましくは例えば固定、架橋、検出若しくは増幅についてのようにＭＣＰ−１と異なる。本発明のさらなる一態様において、本発明の核酸は、個別の若しくは組合せられた部分として、本発明の核酸の数種を含んでなる。本発明の核酸の数種を含んでなるこうした核酸もまたより長い核酸という用語により包括される。
本明細書で使用されるところのＬ−核酸は、Ｌ−ヌクレオチドよりなる、好ましくは完全にＬ−ヌクレオチドよりなる核酸である。
本明細書で使用されるところのＤ−核酸は、Ｄ−ヌクレオチドよりなる、好ましくは完全にＤ−ヌクレオチドよりなる核酸である。
核酸および核酸分子という用語は、それとは反対に明示的に示されない場合は互換性の様式で本明細書で使用される。
また、それとは反対に示されない場合、いかなるヌクレオチド配列も本明細書で５’→３’の方向で示される。
発明の核酸がＤ−ヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド若しくは双方の組合せ（該組合せは
例えば無作為の組合せであるか、若しくは最低１個のＬ−ヌクレオチドおよび最低１種のＤ−核酸よりなる伸長の定義された配列である）よりなるかどうかに関係なく、該核酸は、デスオキシリボヌクレオチド（１個若しくは複数）、リボヌクレオチド（１個若しくは複数）またはそれらの組合せよりなることができる。
発明の核酸をＬ−核酸として設計することはいくつかの理由から有利である。Ｌ−核酸は天然に存在する核酸の鏡像異性体である。Ｄ−核酸は、しかしながら、ヌクレアーゼの広範囲の存在により、水性溶液、およびとりわけ生物学的系若しくは生物学的サンプル中で非常に安定ではない。天然に存在するヌクレアーゼ、とりわけ動物細胞からのヌクレアーゼはＬ−核酸を分解することが可能でない。これのため、Ｌ−核酸の生物学的半減期は、動物およびヒトの身体を包含するこうした系で有意に延長される。Ｌ−核酸の欠如する分解性により、ヌクレアーゼ分解生成物は生成されず、そして従ってそれから生じる副作用は観察されない。このアスペクトは、ＭＣＰ−１の存在が関わる疾患および／若しくは障害の治療で使用される事実上全部の他の化合物のＬ−核酸の範囲を定める。ワトソン・クリック塩基対形成と異なる機構により標的分子に特異的に結合するＬ−核酸、またはＬ−ヌクレオチドより部分的に若しくは完全になるアプタマー（とりわけアプタマーのそれらの部分は標的分子へのアプタマーの結合に関与する）はシュピーゲルマーともまた呼ばれる。
本明細書で本発明の核酸ともまた称される発明の核酸は、それらがＤ−核酸、Ｌ−核酸若しくはＤ，Ｌ−核酸として存在するかどうか、またはそれらがＤＮＡであるか若しくはＲＮＡであるかどうかに関係なく、一本鎖若しくは二本鎖核酸として存在しうることもまた本発明内にある。典型的には、発明の核酸は、一次配列により規定された二次構造を表しかつ従って三次構造もまた形成しうる一本鎖核酸である。発明の核酸は、しかしながら、相互に対し相補的若しくは部分的に相補的である２本の鎖が相互にハイブリダイズされるという意味で二本鎖でもまたありうる。これは、核酸がＬ体よりむしろ天然に存在するＤ体で存在する場合ににとりわけ有利であることができる安定性を核酸に賦与する。
発明の核酸は修飾しうる。こうした修飾は核酸の単一ヌクレオチドに関することができ、そして当該技術分野で公知である。こうした修飾の例は、とりわけ、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ（２００３）；Ｋｕｓｓｅｒ（２０００）；Ａｕｒｕｐ（１９９４）；Ｃｕｍｍｉｎｓ（１９９５）；Ｅａｔｏｎ（１９９５）；Ｇｒｅｅｎ（１９９５）；Ｋａｗａｓａｋｉ（１９９３）；Ｌｅｓｎｉｋ（１９９３）；およびＭｉｌｌｅｒ（１９９３）に記述されている。こうした修飾は、それらより核酸がなる個々のヌクレオチドの２’位のＨ原子、Ｆ原子またはＯ−ＣＨ３基若しくはＮＨ２基であり得る。また、本発明の核酸は最低１個のＬＮＡヌクレオチドを含み得る。一態様において、本発明の核酸はＬＮＡヌクレオチドよりなる。
一態様において、本発明の核酸は多分割の核酸でありうる。本明細書で使用されるところの多分割の核酸は、最低２種の核酸鎖よりなる核酸である。これらの最低２種の核酸鎖は一機能単位を形成し、該機能単位は標的分子に対するリガンドである。該最低２種の核酸鎖は、２本の鎖を生成するように核酸を切断すること、若しくは発明のすなわち全体的核酸の第一の部分に対応する一核酸および該全体的核酸の第二の部分に対応する別の核酸を合成することのいずれかにより、発明の核酸のいずれかに由来しうる。切断および合成の双方を、上で例示されたところの２種以上の鎖が存在する多分割の核酸を生成するために応用しうることが認められるべきである。言い換えれば、該最低２種の核酸鎖は、典型的には、相補的でありかつ相互にハイブリダイズする２本の鎖と異なるとは言え、多様な核酸部分の間のある程度の相補性が存在しうる。
最後に、本発明の核酸の完全に閉鎖したすなわち環状構造が実現されること、すなわち
、本発明の核酸は好ましくは共有結合により閉鎖され、それによりより好ましくはこうした共有結合は本明細書に開示されるところの核酸配列の５’端と３’端の間で作成されることもまた、本発明内にある。
本発明者は、本発明の核酸が非常に好都合なＫＤ値範囲を表すことを発見した。
結合定数を決定することの可能性は、当業者にもまた既知であるいわゆるｂｉａｃｏｒｅ装置の使用である。本明細書で使用されるところの親和性を、実施例に記述されるところの「プルダウンアッセイ」の使用によってもまた測定した。本場合にＭＣＰ−１である標的による核酸の間の結合の強度を表すための適切な一尺度は、それ自体同様にその測定方法が当業者に既知であるいわゆるＫＤ値である。
本発明の核酸はある種のＫＤ値を特徴とする。好ましくは、本発明の核酸により示されるＫＤ値は１μＭより下である。約１μＭのＫＤ値は、標的への核酸の非特異的結合に特徴的であると言われる。当業者により認められるであろうとおり、本発明の核酸のような化合物の群のＫＤ値はある範囲内にある。約１μＭという上述されたＫＤは該ＫＤ値の好ましい上限である。標的結合核酸のＫＤの好ましい下限は約１０ピコモル濃度若しくはそれ以上であり得る。ＭＣＰ−１への個々の核酸の結合のＫＤ値が好ましくはこの範囲内にあることが本発明内にある。好ましい範囲は、この範囲内のいずれかの第一の数およびこの範囲内のいずれかの第二の数を選ぶことにより定義し得る。好ましい上値は２５０ｎＭおよび１００ｎＭであり、好ましい下値は５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭおよび１０ｐＭである。
本発明の核酸分子はいかなる長さも有しうるが、但しそれらは標的分子になお結合することが可能である。本発明の核酸の好ましい長さが存在することが当該技術分野で認められるであろう。典型的には，該長さは１５と１２０ヌクレオチドの間である。１５と１２０の間のいずれの整数も本発明の核酸に可能な長さであることが当業者により認められるであろう。本発明の核酸の長さのより好ましい範囲は、約２０ないし１００ヌクレオチド、約２０ないし８０ヌクレオチド、約２０ないし６０ヌクレオチド、約２０ないし５０ヌクレオチド、および約３０ないし５０ヌクレオチドの長さである。
本明細書に開示される核酸は、好ましくは高分子量部分でありかつ／若しくは好ましくはとりわけ動物の身体、好ましくはヒト身体内での滞留時間に関して核酸の特徴を改変することを可能にする部分を含んでなることが、本発明内にある。こうした修飾のとりわけ好ましい一態様は本発明の核酸のＰＥＧ化およびＨＥＳ化である。本明細書で使用されるところのＰＥＧはポリ（エチレングリコール）を、およびＨＥＳはヒドロキシエチルデンプンを示す。好ましく本明細書で使用されるところのＰＥＧ化は、こうした修飾が本発明の核酸に結合されるＰＥＧ部分よりなる、本発明の核酸の修飾である。好ましく本明細書で使用されるところのＨＥＳ化は、こうした修飾が本発明の核酸に結合されるＨＥＳ部分よりなる、本発明の核酸の修飾である。これらの修飾、ならびにこうした修飾を使用する核酸の修飾方法は、欧州特許出願第ＥＰ １ ３０６ ３８２号明細書（その開示はこれによって引用することによりそっくりそのまま組み込まれる）に記述されている。
好ましくは、高分子量部分よりなる若しくはそれを含んでなる修飾の分子量は、とりわけこうした高分子量であるＰＥＧの場合は約２，０００から２００，０００Ｄａまで、好ましくは２０，０００ないし１２０，０００Ｄａであり、また、とりわけこうした高分子量部分であるＨＥＳの場合は好ましくは約３，０００から１８０，０００Ｄａまで、より好ましくは５，０００から１３０，０００Ｄａまでである。ＨＥＳ修飾の方法は、例えば独国特許出願第ＤＥ １ ２００４ ００６ ２４９．８号明細書（その開示はこれによって引用することによりそっくりそのまま組み込まれる）に記述されている。
ＰＥＧおよびＨＥＳのいずれも、特許出願第ＷＯ２００５０７４９９３号および第ＰＣＴ／ＥＰ０２／１１９５０号明細書にさらに記述されるところから直鎖若しくは分枝状いずれとしても使用しうることが本発明内にある。こうした修飾は、原則として、本発明の核酸分子にそのいずれの位置でも行い得る。好ましくは、こうした修飾は、該核酸分子の５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、および／若しくは５’ヌクレオチドと３’ヌクレオチドの間のいずれかのヌクレオチドのいずれでもなされる。
該修飾、ならびに好ましくはＰＥＧおよび／若しくはＨＥＳ部分は、本発明の核酸分子に直接若しくはリンカーを通じてのいずれでも結合し得る。本発明の核酸分子が１個若しくはそれ以上の修飾、好ましくは１個若しくはそれ以上のＰＥＧおよび／若しくはＨＥＳ部分を含んでなることもまた本発明内にある。一態様において、個々のリンカー分子は、１個以上のＰＥＧ部分若しくはＨＥＳ部分を本発明の核酸分子に結合する。本発明とともに使用されるリンカーは、それ自身直鎖若しくは分枝状いずれでもあり得る。この種類のリンカーは当業者に既知であり、そして特許出願第ＷＯ２００５０７４９９３号および第ＰＣＴ／ＥＰ０２／１１９５０号明細書にさらに記述されている。
いずれかの論理により束縛されることを願わず、好ましくは生理学的に許容できるポリマーおよびより具体的には本明細書に開示されるポリマーのような高分子量部分で本発明の核酸を修飾することにより、排泄のキネティックが変化されるようである。より具体的には、こうした修飾された発明の核酸の増大された分子量により、およびとりわけＬ形態の場合の代謝にさらされない核酸により、動物の身体、好ましくは哺乳動物の身体およびより好ましくはヒト身体からの排泄が低下されるようである。排泄は典型的に腎を介して起こるため、本発明者は、かように修飾された核酸の糸球体濾過速度が、身体中の滞留時間の増大をもたらすこの種類の高分子量修飾を有しない核酸に比較して有意に低下されると推定する。それと関係して、こうした高分子量修飾にもかかわらず、本発明の核酸の特異性が有害な様式で影響を及ぼされないことにとりわけ注目すべきである。その限りにおいて、本発明の核酸は、徐放を提供する製薬学的製剤が徐放を提供するために必ずしも必要とされないような、製薬学的有効成分から通常期待され得ない驚くべき特徴を有する。むしろ、高分子量部分を含んでなるそれらの修飾された形態の本発明の核酸は、であるから、徐放製剤として既に使用され得る。その限りにおいて、本明細書に開示される核酸分子の修飾（１個若しくは複数）およびかように修飾された核酸分子ならびにそれらを含んでなるいずれの組成物も、独特な、好ましく制御された薬物動態およびそれらの生物分布を提供しうる。これは循環中の滞留時間および組織への分布もまた包含する。こうした修飾は特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ０２／１１９５０号明細書にさらに記述される。
しかしながら、本明細書に開示される核酸がいかなる修飾および具体的にはＰＥＧ化若しくはＨＥＳ化のような高分子量修飾を含まないこともまた本発明内にある。こうした態様は、核酸が身体中のいずれかの標的器官若しくは組織への優先的分布を示す場合にとりわけ好ましい。こうした分布プロファイルを伴う核酸剤は、全身濃度を低く保ちつつ標的組織中の有効局所濃度の確立を可能にするとみられる。これは、経済的観点から有益であるのみならず、しかしまた核酸剤への他の組織の不必要な曝露も低下させて、かように副作用の潜在的危険を低下させる、低用量の使用を可能にするとみられる。
本発明の核酸ともまた本明細書で称される発明の核酸、および／若しくは本発明のアンタゴニストは、医薬品の生成若しくは製造に使用しうる。本発明のこうした医薬品若しくは製薬学的組成物は、場合によってはさらなる製薬学的有効成分と一緒に発明の核酸の最低１種を含有し、それにより発明の核酸は好ましくは製薬学的有効成分それ自身として作用する。こうした医薬品は、好ましい態様において最低１種の製薬学的に許容できる担体を含んでなる。こうした担体は、例えば、水、緩衝液、ＰＢＳ、ブドウ糖溶液、好ましく
は５％ブドウ糖塩類平衡溶液、デンプン、糖、ゼラチン若しくはいずれかの他の許容できる担体物質でありうる。こうした担体は一般に当業者に既知である。本発明の医薬品の若しくはそれに関するいかなる態様、使用およびアスペクトも本発明の製薬学的組成物にもまた応用可能であり、かつ、逆もまた真であることが、当業者により認められるであろう。
その処置および／若しくは予防のために、本発明の若しくはそれにより製造される核酸、製薬学的組成物および医薬品が、それぞれの発病機序におけるＭＣＰ−１の直接若しくは間接いずれかの関与から生じる適応症、疾患および障害。しかしながらまた、その発病機序においてＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４および／若しくはエオタキシンが直接若しくは間接的にのいずれかで関与する適応症、疾患および障害を処置および予防し得る。とりわけ、本発明の核酸を、その限りにおいて、すなわちそれぞれＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４およびエオタキシンに若しくはそれらとそれぞれ相互作用および結合する、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４およびエオタキシンがより広範な意味で関わる疾患に使用し得ることが、当業者に明らかであろう。
より具体的には、こうした使用は、とりわけ、それが単核細胞浸潤を特徴とするヒト疾患で重要な役割を演じていることを示唆するＭＣＰ−１の発現パターンから生じる。こうした細胞浸潤は多くの炎症性および自己免疫疾患に存在する。動物モデルにおいて、ＭＣＰ−１は、局所虚血後の脳（Ｋｉｍ １９９５；Ｗａｎｇ １９９５）および実験的自己免疫性脳脊髄炎の間（Ｈｕｌｋｏｗｅｒ １９９３；Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ １９９３；Ｂａｎｉｓｏｒ ２００５）で発現されることが示されている。ＭＣＰ−１は、卒中および多発性硬化症のようなこれらの動物モデルにより具体的に説明される疾患過程で単核細胞を標的とする重要なケモカインでありうる。
証拠の大部分は、単球走化性および従って慢性炎症におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２系の独特の役割を支持して議論している。すなわち（ｉ）ＭＣＰ−１若しくはＣＣＲ２欠損マウスは、それ以外は正常に見える一方で顕著に低下されたマクロファージ走化性応答を示す（Ｋｕｚｉｅｌ １９９７；Ｋｕｒｉｈａｒａ １９９７；Ｂｏｒｉｎｇ １９９７；Ｌｕ １９９８）。（ｉｉ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの他のケモカインでの機能的余剰にもかかわらず、ＭＣＰ−１エフェクター機能単独の喪失は、数種の炎症モデルで単球輸送を減じるのに十分である（Ｌｌｏｙｄ １９９７；Ｆｕｒｕｉｃｈｉ ２００３；Ｅｇａｓｈｉｒａ ２００２；Ｇａｌａｓｓｏ ２０００；Ｏｇａｔａ １９９７；Ｋｅｎｎｅｄｙ １９９８；Ｇｏｎｚａｌｏ １９９８；Ｋｉｔａｍｏｔｏ ２００３）。（ｉｉｉ）、ＭＣＰ−１レベルは多くの炎症性疾患で上昇される。事実、ＭＣＰ−１は、関節リウマチ（Ｋｏｃｈ １９９２；Ｈｏｓａｋａ １９９４；Ａｋａｈｏｓｈｉ １９９３；Ｈａｒｉｇａｉ １９９３；Ｒｏｌｌｉｎｓ １９９６）、腎疾患（Ｗａｄａ １９９６；Ｖｉｅｄｔ ２００２）、血管形成術後の再狭窄（Ｅｃｏｎｏｍｏｕ ２００１）、アレルギーおよび喘息（Ａｌａｍ １９９６；Ｈｏｌｇａｔｅ １９９７；Ｇｏｎｚａｌｏ １９９８）、癌（Ｓａｌｃｅｄｏ ２０００；Ｇｏｒｄｉｌｌｏ ２００４）、アテローム硬化症（Ｎｅｌｋｅｎ １９９１；Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ １９９１；Ｓｃｈｗａｒｔｚ １９９３；Ｔａｋｅｙａ １９９３；Ｂｏｒｉｎｇ １９９８）、乾癬（Ｖｅｓｔｅｒｇａａｒｄ ２００４）、神経系の炎症（Ｈｕａｎｇ ２００１）、アトピー性皮膚炎（Ｋａｂｕｒａｇｉ ２００１）、大腸炎（Ｏｋｕｎｏ ２００２）、子宮内膜症（Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ ２００１）、ブドウ膜炎（Ｔｕａｉｌｌｏｎ ２００２）、網膜障害（Ｎａｋａｚａｗａ ２００７）、特発性肺線維症およびサルコイドーシス（Ｉｙｏｎａｇａ １９９４）ならびに多発性筋炎／皮膚筋炎（Ｄｅ Ｂｌｅｅｃｋｅｒ ２００２）のような、明らかな炎症成分を伴うおよび伴わない多くの疾患である役割を演じていると考えられている。
抗ＭＣＰ−１剤若しくはＣＣＲ２アンタゴニストでの治療的介入は、過剰の炎症性単球輸送に影響を及ぼすとみられるが、しかし、食細胞の基礎的輸送を節約して、それにより全身免疫抑制および感染の増大された危険を回避しうる（Ｄａｗｓｏｎ ２００３）。
加えて、炎症過程の分子機序および局所で分泌される炎症メディエーターの相互作用に関する増大する知識に基づき、腎疾患の治療のための新たな標的が同定された（Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈ ２０００；Ｓｅｇｅｒｅｒ ２０００）。 適切な動物モデルで特異的アンタゴニストを用いる発現および介入研究に関する確実なデータが存在する標的の１つが、ＭＣＰ−１である。このタンパク質は、腎の炎症の部位への免疫細胞動員に対し、広範に非重複性の役割を有する。腎への免疫細胞の浸潤は、多様な形態の腎疾患の発症における構造的腎損傷および腎機能の低下の主要な機序であると考えられている。
全部の型の腎細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激に際して、ＭＣＰ−１を包含するケモカインを発現し得（Ｓｅｇｅｒｅｒ ２０００）、サイトカイン、酸素ラジカル、免疫複合体および脂質メディエーターを包含する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＣＰ−１発現を誘発する刺激の長い一覧が存在する。
ラットおよびマウスの健康な腎ではＭＣＰ−１は発現されないが、しかし、免疫複合体型糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、閉塞性腎症若しくは急性腎尿細管壊死を包含する腎の炎症の急性および慢性のげっ歯類モデルの経過の間に、容易に上方制御される（Ｓｅｇｅｒｅｒ ２０００；Ａｎｄｅｒｓ ２００３）。げっ歯類でのＭＣＰ−１の発現データはヒト腎生検で見出されるそれぞれの発現と良好に相関する（Ｒｏｖｉｎ １９９４；Ｃｏｃｋｗｅｌｌ １９９８；Ｗａｄａ １９９９）。さらに、ヒト腎における腎発現は、疾患の活動性と関連しており、そして適切な治療が疾患の寛解を誘導した場合に低下する（Ａｍａｎｎ ２００３）。
糸球体単核細胞浸潤は、糖尿病性腎症を伴う患者におけるびまん性糸球体硬化症の発症と関連している。ＭＣＰ−１は、糸球体内の単球およびリンパ球の動員および蓄積で重要な役割を演じている（Ｂａｎｂａ ２０００；Ｍｏｒｉｉ ２００３）。
局所で産生されるＭＣＰ−１は、腎毒性血清誘発性腎炎（ＮＳＮ）を伴うトランスジェニックマウスを使用する実験で示されたとおり、尿細管間質損傷の開始および進行にとりわけ関与しているようである。ＭＣＰ−１は、主として、間質病変中の血管内皮細胞、尿細管上皮細胞および浸潤した単核細胞中で検出された。尿細管上皮細胞のＭＣＰ−１媒介性の活性化は、ＭＣＰ−１が尿細管間質炎症（進行性腎疾患の特質）に寄与するという概念と矛盾しない（Ｗａｄａ ２００１；Ｖｉｅｄｔ ２００２）。
一方でＭＣＰ−１、ならびに他方でＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４およびエオタキシンの間の相同性により、本発明の核酸、それらのうち少なくともそれぞれＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４およびエオタキシンと相互作用若しくはそれらに結合するものは、典型的に、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４およびエオタキシンがそれぞれ直接若しくは間接的にのいずれかで関与しているいかなる疾患の処置、予防および／若しくは診断に使用し得る。好ましく本明細書で使用されるところの関与するは、疾患に関与するそれぞれの分子が該疾患の根底にある発病機序に関してその機能の１、数種若しくは全部を発揮することを予防される場合に、該疾患が治癒される、若しくはその程度が低下される、若しくはその大発生が予防されるであろうことを意味しており、それぞれ該症状および指標が、疾患に罹っていないか若しくはこうした疾患を発症する危険にさらされていない被験体でみられるもの（１種若しくは複数）と同一若しくはそれらにより近くなるような、こうした疾患の少なくとも症状若しくはいずれかの指標がそれぞれ解消および改善されることができる。
もちろん、本発明のＭＣＰ−１結合核酸はヒト若しくはマウスＭＣＰ−１と相互作用するか若しくはそれに結合するため、当業者は、本発明のＭＣＰ−１に結合する核酸を、ヒトおよび動物の本明細書に記述されるところのいずれかの疾患の処置、予防および／若しくは診断に容易に使用し得ることを一般に理解するであろう。
単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）ファミリーのこれらのメンバーすなわちＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４およびエオタキシンは、従って、ＭＣＰ−１と高程度の配列類似性を共有する。独占的でないとは言え、エオタキシン、ＭＣＰ−２、−３および−４は、ヒト好酸球上の特徴的ケモカイン受容体ＣＣＲ３を介して相互作用する（Ｈｅａｔｈ １９９７）。ＣＣＲ３受容体は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（Ｋｌｅｉｎｈａｎｓ ２００３）、神経膠芽腫（Ｋｏｕｎｏ ２００４）若しくは腎細胞癌（Ｊｏｈｒｅｒ ２００５）のような腫瘍状態で上方制御される。
より具体的には、上昇されたレベルのエオタキシンは喘息診断および損なわれた肺機能と直接関連する（Ｎａｋａｍｕｒａ １９９９）。アレルギー性炎症の部位のエオタキシンの上昇された発現は、アトピー性および非アトピー性双方の喘息患者で観察されている（Ｙｉｎｇ １９９７；Ｙｉｎｇ １９９９）。また、ＭＣＰ−２および−４をコードするｍＲＮＡは多様な組織中で構成的に発現されるが、これらの情況でのそれらの生理学的機能はしかしながら未知である。血漿ＭＣＰ−２濃度は敗血症においてＭＣＰ−１と一緒に上昇され（Ｂｏｓｓｉｎｋ １９９５）、ＭＣＰ−３発現は喘息患者で起こる（Ｈｕｍｂｅｒｔ １９９７）。最後に、ＭＣＰ−４はアテローム硬化症の血管の管腔表面で見出され得る（Ｂｅｒｋｈｏｕｔ １９９７）。
従って、その処置および／若しくは予防に本発明の医薬品を使用しうる疾患および／若しくは障害および／若しくは疾患に罹った状態は、限定されるものでないが、炎症性疾患、自己免疫疾患、自己免疫性脳脊髄炎、卒中、急性および慢性多発性硬化症、慢性炎症、関節リウマチ、腎疾患、再狭窄、血管形成術後の再狭窄、急性および慢性アレルギー反応、一次的および二次的免疫学的若しくはアレルギー反応、喘息、結膜炎、気管支炎、癌、アテローム硬化症、アテローム硬化性心血管系心不全若しくは卒中、乾癬、乾癬性関節炎、神経系の炎症、アトピー性皮膚炎、大腸炎、子宮内膜症、ブドウ膜炎、黄斑変性、網膜剥離、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜色素変性、増殖性硝子体網膜症、および中心性漿液性網脈絡膜症を包含する網膜障害；特発性肺線維症、サルコイドーシス、多発性筋炎、皮膚筋炎、免疫抑制の回避、感染症のリスクを低下させること、敗血症、腎の炎症、糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、閉塞性腎症、急性尿細管壊死、およびびまん性糸球体硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性気管支炎、ベーチェット病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、川崎病後の早発性アテローム硬化症、心筋梗塞、肥満、慢性肝疾患、ペイロニー病、急性脊髄損傷、肺若しくは腎移植、心筋炎、アルツハイマー病、およびニューロパシー、乳癌、胃癌、膀胱癌、卵巣癌、過誤腫、結腸直腸癌、結腸腺腫、膵炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）ならびにクローン病若しくは潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患を挙げることができる。
さらなる一態様において、医薬品はさらなる製薬学的有効成分を含んでなる。こうしたさらなる製薬学的有効成分は、とりわけ、限定されるものでないが、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤およびアンジオテンシン受容体阻害薬のような血圧および糖尿病を制御することが既知のものを挙げることができる。さらなる製薬学的有効成分は、さらなる一態様において、慢性炎症の部位への炎症細胞の浸潤を低下させるか若しくは慢性炎症の状況で存在しかつ組織損傷に至る過剰増殖性免疫応答を全般に抑制する化合物の１種でもまたあり得る。こうした化合物は、限定されるものでないがステロイド若しくは免疫抑制薬を挙げることができ、そして、好ましくは、プレドニゾン、メチルプレドニゾン、
ヒドロコルチゾン、デキサメサゾンのようなコルチコステロイド、およびシクロホスファミド、シクロスポリン、クロラムブシル、アザチオプリン、タクロリムス若しくはミコフェノール酸モフェチルのような全身性免疫抑制薬を含んでなる群から選択される。加えて、Ｔ細胞共刺激のより特異的な阻害剤、例えばＣＤ１５４若しくはＣＤ４０若しくはＣＤ２８若しくはＣＤ８６若しくはＣＤ８０の阻害剤、または抗ＣＤ２０剤のようなＴおよび／若しくはＢ細胞枯渇剤が、さらなる態様において有用である。最後に、さらなる製薬学的有効成分は、ケモカインアゴニスト若しくはアンタゴニスト、またはケモカイン受容体アゴニスト若しくはアンタゴニストであり得るいずれかの他のケモカインの活性の調節物質でありうる。あるいは、若しくは加えて、こうしたさらなる製薬学的有効成分は本発明のさらなる核酸である。あるいは、該医薬品は、ＭＣＰ−１と異なる標的分子に結合するか若しくは本発明の核酸の１種と異なる機能を表す最低１種のさらなる核酸を含んでなる。
該医薬品が、あるいは、若しくは加えて、原則として前記疾患の処置のための医薬品の使用に関して開示される疾患のいずれかの予防に使用されることが、本発明内にある。それぞれのマーカーは、従って、すなわち、それぞれの疾患について当業者に既知である。好ましくはそれぞれのマーカーはＭＣＰ−１である。あるいは、および／若しくは加えて、それぞれのマーカーはＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４およびエオタキシンを含んでなる群から選択される。マーカーのなおさらなる一群は、例えば抗ｄｓＤＮＡ抗体若しくはリウマチ因子のような血漿中の自己反応性抗体を含んでなる群から選択される。
本発明の医薬品の一態様において、こうした医薬品は、本明細書に開示される疾患、とりわけ本発明の医薬品を使用すべきであるもののいずれかのための他の処置とともにの使用のためである。
「併用療法」（若しくは「共療法」）は、本発明のの医薬品、およびこれらの治療薬の共作用から有益な効果を提供することを意図している特定の処置レジメンの一部としての最低１種の第二の剤、すなわち本発明の医薬品および前記第二の剤の投与を包含する。該組合せの有益な効果は、限定されるものでないが、治療薬の組合せから生じる薬物動態若しくは薬力学的共作用を挙げることができる。典型的に組合せでのこれらの治療薬の投与は、規定された時間（通常は選択される組合せに依存して分、時間、日若しくは週）にわたり実施する。
「併用療法」は、本発明の組合せを偶発的にかつ自由裁量によりもたらす別個の単剤療法レジメンの一部としてこれらの治療薬の２種若しくはそれ以上の投与を包含することを意図しうるが、しかし一般にそうではない。「併用療法」は、これらの治療薬の連続的様式（すなわち各治療薬を異なる時間で投与する）での投与、ならびにこれらの治療薬若しくは該治療薬の最低２種の実質的に同時の様式での投与を包含することを意図している。実質的に同時の投与は、例えば、各治療薬の固定された比を有する単一カプセル剤、若しくは該治療薬のそれぞれについて複数の単一カプセル剤で被験体に投与することにより達成し得る。
各治療薬の連続的若しくは実質的に同時の投与は、限定されるものでないが、局所経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織を通る直接吸収を挙げることができるいずれかの適切な経路により遂げることができる。治療薬は同一経路若しくは異なる経路により投与し得る。例えば、選択される組合せの第一の治療薬を注入により投与することができる一方、組合せの他の治療薬を局所投与し得る。
あるいは、例えば、全部の治療薬を局所で投与しうるか、若しくは全部の治療薬を注入により投与しうる。治療薬を投与する順序は別の方法で示されない限り厳密に決定的に重
要でない。「併用療法」はまた、上述されたところの治療薬の他の生物学的有効成分とのさらなる組合せでの投与も包含し得る。併用療法が薬物以外の処置をさらに含んでなる場合、該薬物以外の処置は、該治療薬および薬物以外の処置の組合せの共作用からの有益な効果が達成される限りは、いかなる適する時点でも実施しうる。例えば、適切な場合には、有益な効果は、薬物以外の処置がおそらく数日若しくはなお数週間だけ治療薬の投与から一時的に除去される場合になお達成される。
上の一般的用語で概説されたとおり、本発明の医薬品は、原則として当業者に既知のいかなる形態でも投与し得る。好ましい一投与経路は全身投与、より好ましくは非経口投与により、好ましくは注入による。あるいは、該医薬品は局所投与しうる。他の投与経路は、筋肉内、腹腔内および皮下、経口、鼻内、気管内若しくは肺を含んでなり、有効性を確保しつつ最も少なく侵襲性である投与経路が好ましい。
非経口投与は、一般に、皮下、筋肉内若しくは静脈内注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）および注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）に使用する。加えて、非経口投与のための１アプローチは、当業者に公知である、一定水準の投薬量が維持されることを保証する徐放（ｓｌｏｗ−ｒｅｌｅａｓｅ）すなわち徐放（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅｄ）系の埋植を使用する。
さらに、本発明の好ましい医薬品は、適する鼻内ベヒクル、吸入剤の局所使用を介して鼻内の形態で、若しくは、当業者に公知の経皮皮膚貼付剤の形態を使用する経皮経路を介して投与し得る。経皮送達系の形態で投与されるためには、投薬量の投与はもちろん、投薬レジメンを通じて間欠的であるよりはむしろ連続的であることができる。他の好ましい局所製剤は、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、エアゾルスプレー剤およびゲル剤を包含し、ここで有効成分の濃度は典型的には０．０１％から１５％（ｗ／ｗ若しくはｗ／ｖ）までの範囲にわたることができる。
本発明の医薬品は、一般に、限定されるものでないが、製薬学的に許容できる媒体に溶解若しくは分散された本発明の核酸分子を挙げることができる治療の有効成分（１種若しくは複数）の有効量を含むことができる。製薬学的に許容できる媒体若しくは担体は、いずれかのおよび全部の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを包含する。製薬学的有効成分のためのこうした媒体および剤の使用は当該技術分野で公知である。補助的有効成分もまた本発明の医薬品に組み込み得る。
さらなる一アスペクトにおいて、本発明は製薬学的組成物に関する。こうした製薬学的組成物は、本発明の核酸の最低１種および好ましくは製薬学的に許容できるベヒクルを含んでなる。こうしたベヒクルは、当該技術分野で使用されるかつ／若しくは既知のいかなるベヒクル若しくはいかなる結合剤でもあり得る。より具体的には、こうした結合剤若しくはベヒクルは、本明細書に開示される医薬品の製造に関して論考されたところのいずれかの結合剤若しくはベヒクルである。さらなる一態様において、製薬学的組成物はさらなる製薬学的有効成分を含んでなる。
医薬品および製薬学的組成物の製造法は、本開示に照らして当業者に既知であろう。典型的には、こうした組成物は、液体溶液若しくは懸濁液いずれかとしての注射剤として；注入の前の液体中の溶液若しくは懸濁液に適する固体形態物；経口投与のための錠剤若しくは他の固形物として；持続放出カプセル剤として；または点眼薬、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、吸入剤などを包含する現在使用されるいずれかの他の形態で製造しうる。手術野の特定領域を処置するために外科医、内科医若しくは医療従事者による生理的食塩水に基づく洗浄液のような無菌製剤の使用もまたとりわけ有用でありうる。組成物は微小装置、微小粒子若しくはスポンジを介してもまた送達しうる。
処方に際して、医薬品は投薬処方と適合性の様式で、および薬理学的に有効であるような量で投与することができる。製剤は、上述された注入可能な溶液の型のような多様な投薬形態物で容易に投与されるが、しかし、薬物放出カプセルなどもまた使用し得る。
本情況において、投与されるべき有効成分の量および組成物の容量は処置される個体若しくは被験体に依存する。投与に必要とされる有効成分の特定の量は実務者の判断に基づき、そして各個体に特有である。
有効成分を分散させるのに必要とされる医薬品の最少量を典型的に利用する。適する投与レジメンは変動可能でもまたあるが、しかし、最初に該化合物を投与すること、および結果をモニターすること、ならびにその後さらなる制御された用量をさらなる間隔で与えることにより、類型化されるとみられる。
例えば、錠剤若しくはカプセル剤（例えばゼラチンカプセル剤）の形態での経口投与のため、有効成分すなわち本発明の核酸分子および／若しくはいずれかのさらなる製薬学的有効成分（本明細書で治療薬（１種若しくは複数）または有効成分（１種若しくは複数）ともまた称される）を、エタノール、グリセロール、水などのような経口の非毒性の製薬学的に許容できる不活性担体と組み合わせ得る。さらに、所望の若しくは必要な場合は、適する結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤もまた混合物に組み込み得る。適する結合剤は、デンプン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／若しくはポリビニルピロリドン、ブドウ糖若しくはβ−乳糖のような天然の糖、トウモロコシ甘味料、アカシアゴム、トラガカントガム若しくはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成のガム、ポリエチレングリコール、蝋などを包含する。これらの投薬形態物で使用される滑沢剤は、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム若しくはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコールなどを包含する。崩壊剤は、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムデンプン、寒天、アルギン酸若しくはそのナトリウム塩、または発泡混合物などを制限なしに包含する。希釈剤は、例えば乳糖、デキストロース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／若しくはグリシンを包含する。
本発明の医薬品はまた、徐放（ｔｉｍｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）および徐放（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）の錠剤若しくはカプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁剤、シロップ剤および乳剤のような経口投薬形態物でも投与し得る。坐剤は脂肪乳剤若しくは懸濁剤から有利に製造する。
製薬学的組成物若しくは医薬品は滅菌することができ、かつ／または保存剤、安定剤、湿潤剤若しくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩および／若しくは緩衝剤のような補助物質を含有しうる。加えてそれらは他の治療上貴重な物質もまた含有しうる。該組成物は、慣習的混合、造粒若しくはコーティング法に従って製造され、そして典型的には約０．１％ないし７５％、好ましくは約１％ないし５０％の有効成分を含有する。
液体、とりわけ注入可能な組成物は、例えば、溶解すること、分散することなどにより製造し得る。有効成分は、例えば水、生理的食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどのような製薬学的に純粋な溶媒に溶解若しくはそれらと混合して、それにより注入可能な溶液若しくは懸濁液を形成する。加えて、注入前に液体に溶解するのに適する固体の形態物を処方し得る。
固体組成物については、賦形剤は製薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、ブドウ糖、ショ糖、炭酸マグネシウムなどを包含する。上で定義された有効成分は、担体として例えばポリアルキレングリコール、例えばプロピレングリコールを使用して、坐剤としてもまた処方しうる。いくつかの態様において、坐剤は有利には脂肪乳剤若しくは懸濁剤から製造する。
本発明のそれぞれ医薬品および核酸分子は、小型単層小胞、大型単層小胞および多層小胞のようなリポソーム送達系の形態でもまた投与し得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン若しくはホスファチジルコリンを含有する多様なリン脂質から形成し得る。いくつかの態様において、脂質成分の薄膜を薬物の水性溶液で水和させて、薬物を被包化する脂質層（当業者に公知であるもの）を形成する。例えば、本明細書に記述される核酸分子を、当該技術分野で既知の方法を使用して構築される親油性化合物若しくは非免疫原性の高分子量化合物との複合体として提供し得る。加えて、リポソームは細胞殺傷を標的としかつそれを内的に媒介するための細胞傷害剤を保有するために、それらの表面上にこうした核酸分子を有しうる。核酸と会合した複合体の一例が米国特許第６，０１１，０２０号明細書に提供されている。
本発明のそれぞれ医薬品および核酸分子は、標的を定めることができる薬物担体としての可溶性ポリマーともまた結合しうる。こうしたポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール、若しくはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを包含し得る。さらに、本発明のそれぞれ医薬品および核酸分子は、薬物の放出制御を達成することにおいて有用な一分類の生物分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋若しくは両親媒性ブロックコポリマーに結合しうる。
所望の場合は、投与されるべきそれぞれ製薬学的組成物および医薬品は、少量の、湿潤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ならびに例えば酢酸ナトリウムおよびオレイン酸トリエタノールアミンのような他の物質のような非毒性の補助物質もまた含有しうる。
本発明のそれぞれ核酸分子および医薬品を利用する投薬レジメンは、患者の種類、種、齢、重量、性および医学的状態；処置されるべき状態の重症度；投与経路；患者の腎および肝機能；ならびに使用される特定のアプトマー若しくはその塩を包含する多様な因子に従って選択する。通常熟練した医師若しくは獣医師は、該状態の進行を予防する、打ち消す若しくは停止するのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定かつ処方し得る。
本発明の核酸の有効血漿濃度は、好ましくは、本明細書に開示される疾患のいずれかの処置において５００ｆＭから５００μＭまでの範囲にわたる。
本発明のそれぞれ核酸分子および医薬品は、好ましくは単一の連日用量、２若しくは３日毎、週１回、２週毎、単一の月１回の用量、または３か月毎で投与しうる。
本明細書に記述されるところの医薬品が本明細書に開示される製薬学的組成物を構成することは本発明内にある。
さらなる一アスペクトにおいて、本発明はこうした処置を必要とする被験体の処置方法に関し、該方法は、本発明の核酸の最低１種の製薬学的有効量の投与を含んでなる。一態様において、被験体は疾患に罹っているか、若しくはこうした疾患を発症する危険にさら
されており、該疾患は本明細書に開示されるもののいずれか、とりわけ、医薬品の製造のための本発明の核酸のいずれかの使用とともに開示される疾患のいずれかである。
本発明の核酸ならびにアンタゴニストが医薬品として若しくは医薬品の製造のためのみならず、しかしまた化粧の目的上、とりわけ炎症を起こした局所皮膚病変におけるＭＣＰ−１の関与に関しても使用し得ることが理解されるべきである。従って、その処置若しくは予防のために本発明の核酸、医薬品および／若しくは製薬学的組成物を使用し得るさらなる状態若しくは疾患は、炎症を起こした局所皮膚病変である。
本明細書で好ましく使用されるところの診断薬若しくは診断剤若しくは診断手段は、ＭＣＰ−１、好ましくは本明細書に記述されるところのＭＣＰ−１、およびより好ましくは本明細書に記述される多様な障害および疾患に関して本明細書に記述されるところのＭＣＰ−１を直接若しくは間接的にのいずれかで検出するのに適する。しかしながら、本発明の核酸分子がＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４およびエオタキシンのいずれか、数種若しくは全部にもまた結合している程度まで、こうした核酸分子はそれぞれ疾患および障害の診断にもまた使用し得、該発病機序は、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４および／若しくはエオタキシンを伴う過剰発現若しくは活性亢進と直接若しくは間接的にのいずれかで結び付けられるか若しくは関連付けられる。該診断薬は、本明細書に記述されるそれぞれ障害および疾患のいずれかの検出および／若しくは経過観察に適する。こうした検出は、ＭＣＰ−１への本発明の核酸の結合により可能である。こうした結合は、直接若しくは間接的にのいずれでも検出し得る。それぞれの方法および手段は当業者に既知である。とりわけ、本発明の核酸は、本発明の核酸、好ましくはＭＣＰ−１に結合する核酸の検出を可能にする標識を含みうる。こうした標識は、好ましくは放射活性、酵素および蛍光標識を含んでなる群から選択される。原則として、抗体のため開発された全部の既知のアッセイを本発明の核酸に採用し得る一方、標的に結合する抗体が標的に結合する核酸に置換される。未標識の標的に結合する抗体を使用する抗体アッセイにおいて、検出は、好ましくは、放射活性、酵素および蛍光標識で修飾されかつ標的に結合する抗体にそのＦｃフラグメントで結合する二次抗体によりなされる。核酸、好ましくは本発明の核酸の場合、該核酸はこうした標識で修飾され、好ましくはこうした標識は、ビオチン、Ｃｙ−３およびＣｙ−５を含んでなる群から選択され、また、こうした標識は、こうした標識に向けられた抗体、例えば抗ビオチン抗体、抗Ｃｙ３抗体若しくは抗Ｃｙ５抗体により検出されるか、または、標識がビオチンである場合、標識はビオチンに天然に結合するストレプトアビジン若しくはアビジンにより検出される。こうした抗体、ストレプトアビジン若しくはアビジンは、順に、好ましくはそれぞれの標識、例えば放射活性、酵素若しくは蛍光標識で（二次抗体のように）修飾される。
さらなる一態様において、本発明の核酸分子は第二の検出手段により検出若しくは分析され、前記検出手段は分子ビーコンである。分子ビーコンの方法論は当業者に既知である。簡潔には、分子ビーコンともまた称される核酸プローブは、検出されるべき核酸サンプルに対する逆相補配列であり、そして、これのため、検出されるべき核酸サンプルの一部にハイブリダイズする。核酸サンプルへの結合に際して、分子ビーコンのフルオロフォア基が分離され、それが蛍光シグナルの変化、好ましくは強度の変化をもたらす。この変化は存在する核酸サンプルの量と相関する。
本発明の核酸を使用するＭＣＰ−１の検出は、とりわけ、本明細書で定義されるところのＭＣＰ−１の検出を可能にすることができることが認められるであろう。
ＭＣＰ−１の検出に関して、好ましい一方法は以下の段階を含んでなる：
（ａ）ＭＣＰ−１の存在について試験されるべきであるサンプルを提供する段階、
（ｂ）本発明の核酸を提供する段階、
（ｃ）好ましくは反応容器中でサンプルを核酸と反応させる段階
これに際して、段階（ａ）は段階（ｂ）の前に実施し得るか、若しくは段階（ｂ）は段階（ａ）の前に実施し得る。
好ましい一態様において、サンプルの核酸との反応の検出に存するさらなる一段階ｄ）が提供される。好ましくは、段階ｂ）の核酸は表面に固定される。該表面は反応チューブのような反応容器の表面、プレートの壁、若しくは例えばビーズのようなこうした反応容器に含有される装置の表面でありうる。核酸の表面への固定は、限定されるものでないが非共有若しくは共有結合を挙げることができる当業者に既知のいずれの手段によっても行い得る。好ましくは、該結合は表面と核酸の間の共有化学結合を介して確立される。しかしながら、核酸が間接的に表面に固定され、こうした間接的固定がさらなる成分若しくは一対の相互作用パートナーの使用を伴うこともまた本発明内にある。こうしたさらなる成分は、好ましくは、相互作用パートナーともまた称される固定されるべき核酸と特異的に相互作用しかつ従って表面への核酸の結合を媒介する化合物である。相互作用パートナーは、好ましくは核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含んでなる群から選択される。好ましくは、相互作用パートナーは抗体、より好ましくはモノクローナル抗体である。あるいは、相互作用パートナーは核酸、好ましくは機能的核酸である。より好ましくは、こうした機能的核酸は、アプトマー、シュピーゲルマー、および該核酸に少なくとも部分的に相補的である核酸を含んでなる群から選択される。さらなる代替の一態様において、表面への核酸の結合は多分割の相互作用パートナーにより媒介される。こうした多分割の相互作用パートナーは、好ましくは一対の相互作用パートナー、若しくは第一のメンバーおよび第二のメンバーよりなる相互作用パートナーであり、第一のメンバーは該核酸により含まれるか若しくはそれに結合され、そして第二のメンバーは表面に結合されるか若しくはそれにより含まれる。多分割の相互作用パートナーは、好ましくは、ビオチンおよびアビジン、ビオチンおよびストレプトアビジン、ならびにビオチンおよびニュートラビジンを含んでなる相互作用パートナーの対の群から選択される。好ましくは、相互作用パートナーの対の第一のメンバーはビオチンである。
こうした方法の好ましい一結果は、ＭＣＰ−１および核酸の固定された複合体の形成であり、より好ましくは前記複合体が検出される。該複合体からＭＣＰ−１が検出されることが一態様内にある。
本要件に適合するそれぞれの検出手段は、例えばＭＣＰ−１のその／それらの部分（１個若しくは複数）に特異的であるいずれかの検出手段である。とりわけ好ましい一検出手段は、核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含んでなる群から選択される検出手段であり、その生成は当業者に既知である。
ＭＣＰ−１の検出方法は、段階ｃ）を実施するのに好ましく使用される反応容器からサンプルが取り出されることもまた含んでなる。
該方法は、さらなる一態様において、ＭＣＰ−１の相互作用パートナーを表面、好ましくは上で定義されたところの表面に固定する段階もまた含んでなり、該相互作用パートナーは、本明細書のとおり、かつ、好ましくはそれぞれの方法に関して上のとおり定義され、ならびにより好ましくはそれらの多様な態様において核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含んでなる。本態様において、とりわけ好ましい一検出手段は本発明の核酸であり、こうした核酸は好ましくは標識若しくは未標識でありうる。こうした核酸が標識される場合、それは直接若しくは間接的に検出され得る。こうした検出は、好ましくは、核酸、ポリペプチド、タンパク質、および本明細書に記述される多様な態様における態様を含んでなる群から選択もまたされる第二の検出手段の使用もまた伴いうる。こうした検出手段は好ましくは本発明の核酸に特異的である。より好ましい一態様において、第二の検出手段は分子ビーコンである。核酸若しくは第二の検出手段のいずれかまたは双方は、好ましい一態様において検出標識を含みうる。検出標識は、好ましくはビオチン、ブロモデスオキシウリジン標識、ジゴキシゲニン標識、蛍光標識、ＵＶ標識、放射標識およびキレート剤分子を含んでなる群から選択される。あるいは、第二の検出手段は、好ましくは該核酸により含有されるか、それにより含まれるか、若しくはそれに結合される検出標識と相互作用する。とりわけ好ましい組合せは後に続くとおりである：
検出標識がビオチンであり、そして第二の検出手段がビオチンに向けられた抗体であるか、または
検出標識がビオチンであり、そして第二の検出手段がアビジン若しくはアビジンを保有する分子であるか、または
検出標識がビオチンであり、そして第二の検出手段がストレプトアビジン若しくはストレプトアビジンを保有する分子であるか、または
検出標識がビオチンであり、そして第二の検出手段がニュートラビジン若しくはニュートラビジンを保有する分子であるか、または
検出標識がブロモデスオキシウリジンであり、そして第二の検出手段がブロモデスオキシウリジンに向けられた抗体であるか、または
検出標識がジゴキシゲニンであり、そして第二の検出手段がジゴキシゲニンに向けられた抗体であるか、または
検出標識がキレート剤であり、そして第二の検出手段が放射核種であり、前記検出標識が核酸に結合されていることが好ましい。この種の組合せは、核酸が表面に結合されている態様にもまた応用可能であることが認められるべきである。こうした態様において、検出標識が相互作用パートナーに結合されていることが好ましい。
最後に、第二の検出手段が第三の検出手段を使用して検出されることもまた本発明内にあり、好ましくは、第三の検出手段は、より好ましくは第二の検出手段の検出に際して酵素反応を示す酵素であるか、若しくは、第三の検出手段は放射線、より好ましくは放射核種により放射される放射線を検出するための手段である。好ましくは、第三の検出手段は、第二の検出手段を特異的に検出かつ／若しくはそれと相互作用している。
また、ＭＣＰ−１の相互作用パートナーが表面上に固定されかつ本発明の核酸が好ましくは相互作用パートナーとＭＣＰ−１の間で形成される複合体に添加される態様において、サンプルを、反応、より好ましくは段階ｃ）および／若しくはｄ）を実施する反応容器から取り出し得る。
一態様において、本発明の核酸は蛍光部分を含んでなり、そして該蛍光部分の蛍光は、複合体形成に際して、核酸およびＭＣＰ−１と遊離ＭＣＰ−１の間で異なる。
さらなる一態様において、該核酸は本発明の核酸の誘導体であり、該核酸の該誘導体はアデノシンを置き換えるアデノシンの最低１個の蛍光誘導体を含んでなる。好ましい一態様において、アデノシンの蛍光誘導体はエテノアデノシンである。
さらなる一態様において、本発明の核酸の誘導体およびＭＣＰ−１よりなる複合体は、蛍光を使用して検出される。
該方法の一態様において、シグナルは段階（ｃ）若しくは段階（ｄ）で創製され、そして、好ましくは、該シグナルはサンプル中のＭＣＰ−１の濃度と相関する。
好ましい一アスペクトにおいて、アッセイは９６ウェルプレートで実施することができ、ここで成分は上述されたとおり反応容器に固定され、そしてウェルが反応容器として作用する。
上で言われたことは、少なくとも、本発明の核酸がＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４および／若しくはエオタキシンに若しくはそれらともまた結合している程度まで、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４および／若しくはエオタキシンにもまた当てはまることが、当業者により認められるであろう。
発明の核酸はドラッグデザインのための出発原料としてさらに使用しうる。基本的に２つの可能なアプローチが存在する。１アプローチは化合物ライブラリーのスクリーニングである一方、こうした化合物ライブラリーは好ましくは低分子量化合物ライブラリーである。一態様において、スクリーニングはハイスループットスクリーニングである。好ましくは、ハイスループットスクリーニングは、標的に基づくアッセイにおける化合物の迅速で効率的な試行錯誤評価である。最良の場合、分析は比色測定により実施される。それとともに使用されるところのライブラリーは当業者に既知である。
あるいは、本発明の核酸は薬物の合理的設計に使用しうる。好ましくは、合理的ドラッグデザインは製薬学的リード構造の設計である。Ｘ線結晶学若しくは核磁気共鳴分光法のような方法により典型的に同定される標的の三次元構造から出発して、コンピュータプログラムを使用して多くの異なる化合物の構造を含有するデータベース全体を検索する。該選択はコンピュータによりなされ、同定された化合物をその後実験室で試験し得る。
薬物の合理的設計は本発明の核酸のいずれからも開始することができ、そして発明の核酸の構造に類似、若しくは発明の核酸の構造の結合を媒介する部分に同一である構造、好ましくは三次元構造を必要とする。いかなる場合も、こうした構造は発明の核酸と同一若しくは類似の結合の特徴をなお示す。薬物の合理的設計のさらなる一段階において若しくは代替の一段階としてのいずれかで、神経伝達物質に結合する核酸のそれらの部分の好ましくは三次元の構造が、ヌクレオチドおよび核酸と異なる化学基により模倣される。この模倣により、核酸と異なる化合物を設計し得る。こうした化合物は好ましくは小分子若しくはペプチドである。
当業者に既知である競合アッセイを使用することによるような化合物ライブラリーのスクリーニングの場合、適切なＭＣＰ−１アナログ、ＭＣＰ−１アゴニスト若しくはＭＣＰ−１アンタゴニストを見出しうる。こうした競合アッセイは後に続くとおり設定しうる。標的に結合するＬ−核酸である発明の核酸、好ましくはシュピーゲルマーを固相に結合する。ＭＣＰ−１アナログを同定するため、標識ＭＣＰ−１をアッセイに添加しうる。潜在的アナログが、それぞれの標識により得られるシグナルの減少と一緒に進むとみられるシュピーゲルマーへのＭＣＰ−１分子の結合と競合するとみられる。アゴニスト若しくはアンタゴニストのスクリーニングは、当業者に既知のところの細胞培養物アッセイの使用を必要としうる。
本発明のキットは、発明の核酸の最低１若しくは数種を含みうる。加えて、該キットは最低１若しくは数種の陽性若しくは陰性対照を含みうる。陽性対照は、例えばＭＣＰ−１、とりわけそれに対して発明の核酸が選択されるか若しくはそれが好ましくは液体の形態で結合するものでありうる。陰性対照は、例えば、ＭＣＰ−１に類似の生物物理特性に関して定義されるがしかし発明の核酸により認識されないペプチドでありうる。さらに、前記キットは１若しくは数種の緩衝剤を含みうる。多様な成分を乾燥若しくは凍結乾燥した形態でまたは溶液に溶解してキットに含有しうる。該キットは、順に該キットの１若しくは数種の成分を含有しうる１若しくは数個の容器を含みうる。さらなる一態様において、該キットは該キットおよびその多様な成分をどのように使用するかに関する情報を使用者に提供する説明書若しくは説明書リーフレットを含んでなる。
本発明の核酸の製薬学的および生物分析的測定は、基本的に、ヒトおよびヒト以外の身体の数種の体液、組織および器官におけるその薬物動態および生物動力学的（ｂｉｏｄｙｎａｍｉｃ）プロファイルの評価のためである。こうした目的上、本明細書に開示される若しくは当業者に既知の検出方法のいずれかを使用しうる。本発明のさらなる一アスペクトにおいて、本発明の核酸の検出のためのサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイが提供される。該検出アッセイ内で捕捉プローブおよび検出プローブを使用する。捕捉プローブは本発明の核酸の第一の部分に、および検出プローブは第二の部分に相補的である。双方すなわち捕捉および検出プローブは、ＤＮＡヌクレオチド、修飾ＤＮＡヌクレオチド、修飾ＲＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチドおよび／若しくはＰＮＡヌクレオチドにより形成し得る。
これゆえに、捕捉プローブは本発明の核酸の５’端に相補的な配列伸長を含んでなり、また、検出プローブは本発明の核酸の３’端に相補的な配列伸長を含んでなる。この場合、捕捉プローブはその５’端を介して表面若しくはマトリックスに固定され、それにより、捕捉プローブはその５’端で直接、またはその５’端と表面若しくはマトリックスの間のリンカーを介して固定し得る。しかしながら、原則としてリンカーは捕捉プローブの各ヌクレオチドに連結し得る。リンカーは、当業者の親水性リンカー、またはＤ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾Ｄ−ＤＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＬＮＡヌクレオチド、ＰＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾Ｌ−ＤＮＡヌクレオチドおよび／若しくはＬ−ＬＮＡヌクレオチドにより形成し得る。
あるいは、捕捉プローブは本発明の核酸の３’端に相補的な配列伸長を含んでなり、また、検出プローブは本発明の核酸の５’端に相補的な配列伸長を含んでなる。この場合、捕捉プローブがその３’端を介して表面若しくはマトリックスに固定され、それにより、捕捉プローブはその３’端で直接、またはその３’端と表面若しくはマトリックスの間のリンカーを介して固定し得る。しかしながら、原則としてリンカーは本発明の核酸に相補的である配列伸長の各ヌクレオチドに連結し得る。リンカーは、当業者の親水性リンカー、またはＤ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾Ｄ−ＤＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＬＮＡヌクレオチド、ＰＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾Ｌ−ＤＮＡヌクレオチドおよび／若しくはＬ−ＬＮＡヌクレオチドにより形成し得る。
本発明の核酸にハイブリダイズしうる捕捉および検出プローブのヌクレオチドの数は変動可能であり、そして捕捉および／若しくは検出プローブならびに／または本発明の核酸それ自身のヌクレオチドの数から依存し得る。本発明の核酸にハイブリダイズしうる捕捉および検出プローブのヌクレオチドの総数は、本発明の核酸により含まれるヌクレオチドの最大数であるべきである。検出および捕捉プローブのヌクレオチドの最少数（２ないし１０ヌクレオチド）が、本発明の核酸のそれぞれ５’端若しくは３’端へのハイブリダイゼーションを可能にするはずである。本発明の核酸と、分析されるサンプル中に存在する他の核酸の間の高い特異性および選択性を実現するために、捕捉および検出プローブのヌクレオチドの総数は、本発明の核酸により含まれるヌクレオチド若しくはその最大数であるべきである。
さらに、検出プローブは、好ましくは本明細書に前述されたところの検出され得るマーカー分子若しくは標識を保有する。該標識若しくはマーカー分子は、原則として検出プローブの各ヌクレオチドに連結し得る。好ましくは、標識若しくはマーカーは検出プローブの５’端若しくは３’端に配置され、それにより本発明の核酸に相補的である検出プローブ内のヌクレオチドとラベルの間にリンカーを挿入し得る。リンカーは、当業者の親水性リンカー、またはＤ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾Ｄ−ＤＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＬＮＡヌクレオチド、ＰＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、修飾Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、修飾Ｌ−ＤＮＡヌクレオチドおよび／若しくはＬ−ＬＮＡヌクレオチドにより形成し得る。
本発明の核酸の検出は後に続くとおり実施し得る。すなわち、本発明の核酸は、捕捉プローブにその端の一方で、および検出プローブに他端でハイブリダイズする。その後、未結合の検出プローブを例えば１若しくは数回の洗浄段階により除去する。好ましくは標識若しくはマーカー分子を保有する結合した検出プローブの量をその後測定し得る。
好ましく本明細書で使用されるところの処置という用語は、好ましい一態様において、加えて若しくはあるいは予防および／若しくは経過観察を含んでなる。
好ましく本明細書で使用されるところの疾患および障害という用語は、それとは反対に示されない場合は互換性の意味で使用する。
本明細書で使用されるところの含んでなるという用語は、好ましくはこうした用語により続かれる若しくは記述される主題を制限することを意図していない。しかしながら、代替の一態様において、含んでなるという用語は含有することという意味で、そして従ってこうした用語により続かれる若しくは記述される主題を制限するとして理解されるべきである。
本明細書で使用されるところの多様な配列番号、本発明の核酸分子の化学的性質、および標的分子ＭＣＰ−１、それらの実際の配列ならびに内的参照番号を以下の表に要約する。
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［実施例］
ヒトＭＣＰ−１を結合する核酸
ビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１を標的として使用して、ヒトＭＣＰ−１に結合する数種の核酸を生成し得、それらのヌクレオチド配列を図１から７に描く。該核酸は、ビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１を用いる競合若しくは直接プルダウンアッセイを使用してアプタマーすなわちＤ−核酸レベル（実施例４）で、またはＢｉａｃｏｒｅ ２０００装置を使用する表面プラズモン共鳴測定（実施例７）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物Ｃａ＋＋放出アッセイ（実施例５）若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ走化性アッセイ（実施例６）によりシュピーゲルマーレベル、すなわちＭＣＰ−１の天然の配置をもつＬ−核酸（Ｌ−ＭＣＰ）で特徴付けした。
かように生成した核酸は多様な配列モチーフを表し、４種の主な型を図１および２（１Ａ／１Ｂ型）、図３（２型）、図４および５（３型）ならびに図６（４型）に定義する。相互とおよび本明細書に記述される多様な配列モチーフと関係し得ない、付加的なＭＣＰ−１に結合する核酸を図７に列挙する。ヌクレオチド配列モチーフの定義のため、紛らわしいヌクレオチドのＩＵＰＡＣ略語を使用する。すなわち、
Ｓ 強 Ｇ若しくはＣ；
Ｗ 弱 Ａ若しくはＵ；
Ｒ プリン Ｇ若しくはＡ；
Ｙ ピリミジン Ｃ若しくはＵ；
Ｋ ケト Ｇ若しくはＵ；
Ｍ イミノ Ａ若しくはＣ；
Ｂ Ａでない Ｃ若しくはＵ若しくはＧ；
Ｄ Ｃでない Ａ若しくはＧ若しくはＵ；
Ｈ Ｇでない Ａ若しくはＣ若しくはＵ；
Ｖ Ｕでない Ａ若しくはＣ若しくはＧ；
Ｎ 全 Ａ若しくはＧ若しくはＣ若しくはＵ。
それとは反対に示されない場合、いかなる核酸配列若しくはそれぞれ伸長およびボックスの配列も５’→３’の方向で示す。
１Ａ型のＭＣＰ−１に結合する核酸（図１）
図１に描かれるとおり、１Ａ型のＭＣＰ−１に結合する核酸の全配列は、数個の配列伸長若しくはボックスを含んでなり、これにより、
Figure 0005537812
は相互とハイブリダイズし得る５’および３’末端伸長である。しかしながら、こうしたハイブリダイゼーションは生理学的条件下で実際に存在するところの分子で必ずしも示されない。
Figure 0005537812
により隣接される。
該核酸を、それらの結合挙動に関してそれらを等級付けするために、ビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１を用いる直接および競合プルダウンアッセイを使用して、アプタマーレベルで特徴付けした（実施例４）。選択した配列をシュピーゲルマーとして合成し（実施例３）、そして、天然の配置のＭＣＰ−１（Ｌ−ＭＣＰ）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物Ｃａ＋＋放出アッセイにて試験した（実施例５）。
定義されるボックスの配列は、ＭＣＰ−１に対する結合親和性に影響する１Ａ型のＭＣＰ−１に結合する核酸間で異なりうる。１Ａ型のＭＣＰ−１に結合する核酸として要約される多様なＭＣＰ−１に結合する核酸の結合分析に基づき、
Figure 0005537812
ならびに下述されるところのそれらのヌクレオチド配列は、個々にかつより好ましくはそっくりそのまま、ＭＣＰ−１への結合に不可欠である。
Figure 0005537812
図１に描かれるとおり、１７６−Ｅ１０ｔｒｃと称される核酸分子は、ＭＣＰ−１に対する最良の結合親和性を有し（アプタマーとしてプルアッセイで５ｎＭのＫＤを伴い、ならびにシュピーゲルマーとしてｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物Ｃａ＋＋放出アッセイで４〜５ｎＭのＩＣ５０を伴う）、そして従って、最適配列、ならびに
Figure 0005537812
の最適の組合せを構成しうる。
１Ｂ型のＭＣＰ−１に結合する核酸（図２）
図２に描かれるとおり、１Ｂ型の全配列は数個の配列伸長若しくはボックスを含んでなり、これにより
Figure 0005537812
は相互とハイブリダイズし得る５’および３’末端伸長であり、ならびに
Figure 0005537812
により隣接される。しかしながら、こうしたハイブリダイゼーションは、生理学的条件下で実際に存在するところの分子で必ずしも示されない。
該核酸を、それらの結合挙動に関してそれらを等級付けするために、ビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１を用いる直接および競合プルダウンアッセイを使用して、アプタマーレベルで特徴付けした（実施例４）。選択した配列をシュピーゲルマーとして合成し（実施例３）、そして、天然の配置のＭＣＰ−１（Ｌ−ＭＣＰ）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物Ｃａ＋＋放出アッセイにて試験した（実施例５）。
定義されるボックスの配列は、ＭＣＰ−１に対する結合親和性に影響する１Ｂ型のＭＣＰ−１に結合する核酸間で異なりうる。１Ｂ型のＭＣＰ−１に結合する核酸として要約される多様なＭＣＰ−１に結合する核酸の結合分析に基づき、
Figure 0005537812
ならびに下述されるところのそれらのヌクレオチド配列は、個々にかつより好ましくはそっくりそのまま、ＭＣＰ−１への結合に不可欠である。
Figure 0005537812
図２に描かれるとおり、１７６−Ｃ９ｔｒｃと称される核酸は、ＭＣＰ−１に対する最良の結合親和性を有し（アプタマーとしてプルダウンアッセイで５ｎＭのＫＤを伴い、ならびにシュピーゲルマーとしてｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物Ｃａ＋＋放出アッセイで４〜５ｎＭのＩＣ５０を伴う）、そして従って、最適配列、ならびに
Figure 0005537812
の最適の組合せを構成しうる。
２型のＭＣＰ−１に結合する核酸（図３）
図３に描かれるとおり、２型の全配列は数個の配列伸長若しくはボックスを含んでなり、これにより
Figure 0005537812
は相互とハイブリダイズし得る５’および３’末端伸長であり、ならびにボックスＢ２は中央配列要素である。しかしながら、こうしたハイブリダイゼーションは、生理学的条件下で実際に存在するところの分子で必ずしも示されない。
該核酸を、それらの結合挙動に関してそれらを等級付けするために、ビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１を用いる直接および競合プルダウンアッセイを使用して、アプタマーレベルで特徴付けした（実施例４）。選択した配列をシュピーゲルマーとして合成し（実施例３）、そして、天然の配置のＭＣＰ−１（Ｌ−ＭＣＰ）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物Ｃａ＋＋放出（実施例５）若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ走化性アッセイ（実施例６）にて試験した。
定義されるボックスの配列は、ＭＣＰ−１に対する結合親和性に影響する３型のＭＣＰ−１に結合する核酸間で異なりうる。２型のＭＣＰ−１に結合する核酸として要約される多様なＭＣＰ−１に結合する核酸の結合分析に基づき、
Figure 0005537812
ならびに下述されるところのそれらのヌクレオチド配列は、個々にかつより好ましくはそっくりそのまま、ＭＣＰ−１への結合に不可欠である。
Figure 0005537812
図３に描かれるとおり、１８０−Ｄ１−００２と称される核酸、ならびに１８０−Ｄ１−０１１、１８０−Ｄ１−０１２、１８０−Ｄ１−０３５および１８０−Ｄ１−０３６（＝ＮＯＸ−Ｅ３６）のような１８０−Ｄ１−００２の誘導体は、アプタマーとしてプルダウン若しくは競合プルダウンアッセイで＜１ｎＭのＫＤを伴いＭＣＰ−１に対する最良の結合親和性を有し、そして従って、最適配列、ならびに
Figure 0005537812
の最適の組合せを構成しうる。
核酸分子Ｄ−ＮＯＸ−Ｅ３６（Ｄ−１８０−Ｄ１−０３６；配列番号１５９）について、室温（ＲＴ）で８９０±６５ｐＭおよび３７℃で１４６±１３ｐＭの解離定数（ＫＤ）が測定された（実施例４；図９）。それぞれのシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６（１８０−Ｄ１−０３６；配列番号３７）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃａ＋＋放出アッセイで３〜４ｎＭ（実施例５；図１２）およびｉｎ ｖｉｔｒｏ走化性アッセイで約０．５ｎＭ（実施例６；図１５）の阻害濃度（ＩＣ５０）を表した。ＮＯＸ−Ｅ３６のＰＥＧ化誘導体、ＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧおよびＮＯＸ−Ｅ３６−５’ＰＥＧについては、Ｃａ＋＋放出アッセイで約３ｎＭ（実施例５；図２５および図２７Ａ）ならびに走化性アッセイで＜１ｎＭ（実施例６；図２６および図２７Ｂ）のＩＣ５０が測定された。
３型のＭＣＰ−１に結合する核酸（図４および５）
図４および５に描かれるとおり、３型の全配列は数個の配列伸長若しくはボックスを含んでなり、これにより３対のボックスが３型のＭＣＰ−１に結合する核酸について特徴付けられている。
Figure 0005537812
ならびにボックスＢ２ＡおよびＢ２ＢならびにボックスＢ５ＡおよびＢ５Ｂの双方は、相互とハイブリダイズする能力を有する。しかしながら、こうしたハイブリダイゼーションは、生理学的条件下で実際に存在するところの分子で必ずしも示されない。これらの潜在的にハイブリダイズされる配列要素間に、ハイブリダイズしないヌクレオチドが配置され、
Figure 0005537812
と定義される。
該核酸を、それらの結合挙動に関してそれらを等級付けするために、ビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１を用いる直接および競合プルダウンアッセイを使用して、アプタマーレベルで特徴付けした（実施例４）。選択した配列をシュピーゲルマーとして合成し（実施例３）、そして天然の配置のＭＣＰ−１（Ｌ−ＭＣＰ）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ走化性アッセイ（実施例６）にて、若しくはＢｉａｃｏｒｅ測定（実施例７）を介して試験した。
定義されるボックスの配列は、ＭＣＰ−１に対する結合親和性に影響する３型のＭＣＰ−１に結合する核酸間で異なりうる。３型のＭＣＰ−１に結合する核酸として要約される多様なＭＣＰ−１に結合する核酸の結合分析に基づき、
Figure 0005537812
ならびに下述されるところのそれらのヌクレオチド配列は、個々にかつより好ましくはそっくりそのまま、ＭＣＰ−１への結合に不可欠である。
Figure 0005537812
図４および５に描かれるとおり、１７８−Ｄ５と称される核酸およびその誘導体１７８−Ｄ５−０３０、ならびにその誘導体１８１−Ａ２−００２、１８２−Ａ２−００４、１８１−Ａ２−００５、１８１−Ａ２−００６、１８１−Ａ２−００７、１８１−Ａ２−０１７、１８１−Ａ２−０１８、１８１−Ａ２−０１９、１８１−Ａ２−０２０、１８１−Ａ２−０２１および１８１−Ａ２−０２３を含む１８１−Ａ２はＭＣＰ−１に対する最良の結合親和性を有する。１７８−Ｄ５および１７８−Ｄ５−０３０は、アプタマーとして直接若しくは競合プルダウンアッセイ（実施例４）にておよそ５００ｐＭのＫＤを伴い評価された。同一の実験の設定で、１８１−Ａ２はおよそ１００ｐＭのＫＤを伴い測定された。Ｂｉａｃｏｒｅ分析（実施例７）により、１８１−Ａ２およびその誘導体のＭＣＰ−１に対するＫＤは２００〜３００ｐＭであることが決定された。培養細胞を用いるＣａ＋＋放出および走化性アッセイ（それぞれ実施例５および６）において、１７８−Ｄ５および１８１−Ａ２双方についておよそ５００ｐＭのＩＣ５０が測定された。従って、１７８−Ｄ５ならびに１８１−Ａ２およびそれらの誘導体は、最適配列、ならびに
Figure 0005537812
の最適の組合せを構成しうる。
４型のＭＣＰ−１に結合する核酸（図６）
図６に描かれるとおり、４型の全配列は数個の配列、伸長若しくはボックスを含んでなり、これにより
Figure 0005537812
は相互とハイブリダイズし得る５’および３’末端伸長であり、また、ボックスＢ２は中央配列要素である。
該核酸を、それらの結合挙動に関してそれらを等級付けするために、ビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１を用いる直接プルダウンアッセイを使用してアプタマーレベルで特徴付けした（実施例４）。選択した配列をシュピーゲルマーとして合成し（実施例３）、そして天然の配置のＭＣＰ−１（Ｌ−ＭＣＰ）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物Ｃａ＋＋放出（実施例５）および／若しくは走化性アッセイ（実施例６）で試験した。
定義されたボックスの配列は、４型のＭＣＰ−１に結合する核酸間で異なることがあり、それはＭＣＰ−１への結合親和性に影響する。４型のＭＣＰ−１に結合する核酸として要約される多様なＭＣＰ−１に結合する核酸の結合分析に基づき、
Figure 0005537812
ならびに下述されるところのそれらのヌクレオチド配列は、個別に個々にかつより好ましくはそっくりそのまま、ＭＣＰ−１への結合に不可欠である。
Figure 0005537812
図６に描かれるとおり、１７４−Ｄ４−００４および１６６−Ａ４−００２と称される核酸はＭＣＰ−１に対する最良の結合親和性を有し（シュピーゲルマーとしてｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物Ｃａ＋＋放出アッセイで２〜５ｎＭのＩＣ５０を伴う）、そして、従って、最適配列、ならびに
Figure 0005537812
の最適の組合せを構成しうる。
加えて、ＭＣＰ−１に結合する核酸の１〜４型について示されたところのヌクレオチド配列要素の組合せにより記述され得ない、２９種の他のＭＣＰ−１に結合する核酸が同定された。これらの配列を図７に列挙する。
図１から７に示される配列のいずれも、その切断型を包含するがしかしその伸長型もまた包含する本発明の核酸であることが理解されるべきであるが、但し、しかしながらそれぞれかように切断および伸長された核酸分子は標的に結合することがなお可能である。
マウスＭＣＰ−１を結合する核酸
標的としてビオチニル化マウスＤ−ＭＣＰ−１を使用して、それに結合する数種の核酸分子を生成し得た。これらの核酸分子の配列分析の結果を図８から採用し得る。
該核酸を、それらの結合挙動に関してそれらを等級付けするために、ビオチニル化マウスＤ−ＭＣＰ−１を使用するプルダウンアッセイを使用してアプタマーレベルで特徴付けした（実施例４）。選択した配列をシュピーゲルマーとして合成し（実施例３）、そして天然の配置のＭＣＰ−１（Ｌ−ＭＣＰ）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物Ｃａ＋＋放出（実施例５）および走化性アッセイ（実施例６）で試験した。
図８に描かれるとおり、Ｄ−１８８−Ａ３−００１およびＤ−１８９−Ｇ７−００１ならびにそれらの誘導体は、プルダウンアッセイにてナノモル濃度以下のＫＤでＤ−ＭＣＰ−１を結合する（図８）。
Ｄ−ｍＮＯＸ−Ｅ３６（＝Ｄ−１８８−Ａ３−００７；配列番号２４４）について、３７℃で０．１〜０．２ｎＭの解離定数（ＫＤ）が測定された（実施例４；図１０）。それぞれのシュピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６（１８８−Ａ３−００７；配列番号１２２）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃａ＋＋放出アッセイ（実施例５；図１３）でおよそ１２ｎＭ、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ走化性アッセイ（実施例６；図１６）でおよそ７ｎＭの阻害濃度（ＩＣ５０）を表した。ｍＮＯＸ−Ｅ３６のＰＥＧ化誘導体ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ（配列番号２５４）について、Ｃａ＋＋放出アッセイでおよそ８ｎＭ（実施例５、図２９）および走化性アッセイでおよそ３ｎＭ（実施例６；図３１）のＩＣ５０が測定された。
図１から７に示される配列のいずれも、その切断型を包含するがしかしその伸長型もまた包含する本発明の核酸であることが理解されるべきであるが、但し、しかしながらそれぞれかように切断および伸長された核酸分子は標的に結合することがなお可能である。
アプタマーおよびシュピーゲルマーの合成および誘導体化
小スケール合成
アプタマーおよびシュピーゲルマーは、２’ＴＢＤＭＳ ＲＮＡホスホルアミダイト化学（Ｍ．Ｊ．Ｄａｍｈａ、Ｋ．Ｋ．Ｏｇｉｌｖｉｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２０ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｏｇｓ、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、ｐ．８１−１
１４、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９９３）を使用して、ＡＢＩ ３９４合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティ）を用いる固相合成により製造した。ＤおよびＬ−配置のｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、ｒＣ（Ａｃ）−、ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−およびｒＵ−ホスホルアミダイトはＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントンから購入した。アプタマーおよびシュピーゲルマーはゲル電気泳動により精製した。
大スケール合成および修飾
シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６は、２’ＴＢＤＭＳ ＲＮＡホスホルアミダイト化学（Ｍ．Ｊ．Ｄａｍｈａ、Ｋ．Ｋ．Ｏｇｉｌｖｉｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２０ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｏｇｓ、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、ｐ．８１−１１４、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９９３）を使用して、ＡｅｋｔａＰｉｌｏｔ１００合成機（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、フライブルク）を用いる固相合成により製造した。Ｌ−ｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、Ｌ−ｒＣ（Ａｃ）−、Ｌ−ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−およびＬ−ｒＵ−ホスホルアミダイトはＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントンから購入した。５’−アミノ修飾物質はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（米国マサチューセッツ州フラミンガム）から購入した。未修飾シュピーゲルマーの合成はＬ−リボＧ修飾ＣＰＧ孔径１０００Å（Ｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、英国グラスゴー）上で開始し；３’−ＮＨ２修飾シュピーゲルマーには３’−Ａｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒ−ＣＰＧ、１０００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）を使用した。カップリング（周期あたり１５分）のため、アセトニトリル中０．３Ｍベンジルチオテトラゾール（ＣＭＳ−Ｃｈｅｉｃａｌｓ、英国アビンドン）および３．５等量のアセトニトリル中のそれぞれの０．１Ｍホスホルアミダイト溶液を使用した。酸化−キャッピング周期を使用した。オリゴヌクレオチド合成のためのさらなる標準的溶媒および試薬はＢｉｏｓｏｌｖｅ（オランダ・ファルケンスワルト）から購入した。シュピーゲルマーはＤＭＴ−ＯＮで合成し；脱保護後に、Ｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ媒体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用する調製的ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｗｉｎｃｏｔｔ Ｆ．ら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３：２６７７）を介してそれを精製した。５’ＤＭＴ基を８０％酢酸で除去した（ＲＴで３０分）。その後、水性２Ｍ ＮａＯＡｃ溶液を添加し、そして５Ｋ再生セルロースメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用する接線流濾過によりシュピーゲルマーを脱塩した。
ＮＯＸ−Ｅ３６のＰＥＧ化
シュピーゲルマーのｉｎ ｖｉｖｏでの血漿滞留時間を延長するため、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６を３’端若しくは５’端で４０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に共有結合した。
ＮＯＸ−Ｅ３６の３’−ＰＥＧ化
ＰＥＧ化（ＰＥＧ化方法の技術的詳細は欧州特許出願第ＥＰ １ ３０６ ３８２号明細書を参照されたい）のため、精製した３’アミノ修飾シュピーゲルマーをＨ２Ｏ（２．５ｍｌ）、ＤＭＦ（５ｍｌ）および緩衝液Ａ（５ｍｌ；クエン酸・Ｈ２Ｏ［７ｇ］、ホウ酸［３．５４ｇ］、リン酸［２．２６ｍｌ］および１Ｍ ＮａＯＨ［３４３ｍｌ］を混合すること、ならびに１ｌの最終容量までＨ２Ｏを添加することにより調製した；ｐＨ＝８．４を１Ｍ ＨＣｌで調節した）の混合物に溶解した。
シュピーゲルマー溶液のｐＨを１Ｍ ＮａＯＨで８．４にもたらした。その後、４０ｋＤａのＰＥＧ−ＮＨＳエステル（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、アラバマ州
ハンツビル）を、７５ないし８５％の最大収率に達するまで、０．６等量の４部分で３７℃で３０分毎に添加した。反応混合物のｐＨは、ＰＥＧ−ＮＨＳエステルの添加の間、１Ｍ ＮａＯＨで８〜８．５に保った。
反応混合物を４ｍｌ尿素溶液（８Ｍ）、４ｍｌ緩衝液Ａおよび４ｍｌ緩衝液Ｂ（Ｈ２Ｏ中０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）と混和し、そして９５℃に１５分間加熱した。ＰＥＧ化したシュピーゲルマーをその後、アセトニトリル勾配（緩衝液Ｂ；緩衝液Ｃ：アセトニトリル中０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）を使用して、Ｓｏｕｒｃｅ １５ＲＰＣ媒体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。過剰のＰＥＧは５％緩衝液Ｃ、ＰＥＧ化されたシュピーゲルマーは１０〜１５％緩衝液Ｃで溶離した。＞９５％（ＨＰＬＣにより評価されるところの）の純度を伴う生成物画分を合わせ、そして４０ｍｌの３Ｍ ＮａＯＡＣと混合した。ＰＥＧ化シュピーゲルマーを接線流濾過（５Ｋ再生セルロースメンブレン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）により脱塩した。
ＮＯＸ−Ｅ３６の５’−ＰＥＧ化
ＰＥＧ化（ＰＥＧ化方法の技術的詳細は欧州特許出願第ＥＰ １ ３０６ ３８２号明細書を参照されたい）のため、精製した５’アミノ修飾シュピーゲルマーをＨ２Ｏ（２．５ｍｌ）、ＤＭＦ（５ｍｌ）および緩衝液Ａ（５ｍｌ；クエン酸・Ｈ２Ｏ［７ｇ］、ホウ酸［３．５４ｇ］、リン酸［２．２６ｍｌ］および１Ｍ ＮａＯＨ［３４３ｍｌ］を混合すること、ならびに１ｌの最終容量まで水を添加することにより調製した；ｐＨ＝８．４を１Ｍ ＨＣｌで調節した）の混合物に溶解した。
シュピーゲルマー溶液のｐＨを１Ｍ ＮａＯＨで８．４にもたらした。その後、４０ｋＤａのＰＥＧ−ＮＨＳエステル（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、アラバマ州ハンツビル）を、７５ないし８５％の最大収率に達するまで、０．２５等量の６部分で３７℃で３０分毎に添加した。反応混合物のｐＨは、ＰＥＧ−ＮＨＳエステルの添加の間、１Ｍ ＮａＯＨで８〜８．５に保った。
反応混合物を、４ｍｌ尿素溶液（８Ｍ）、および４ｍｌ緩衝液Ｂ（Ｈ２Ｏ中０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）と混和し、そして９５℃に１５分間加熱した。ＰＥＧ化したシュピーゲルマーをその後、アセトニトリル勾配（緩衝液Ｂ；緩衝液Ｃ：アセトニトリル中０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）を使用して、Ｓｏｕｒｃｅ １５ＲＰＣ媒体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。過剰のＰＥＧは５％緩衝液Ｃ、ＰＥＧ化されたシュピーゲルマーは１０〜１５％緩衝液Ｃで溶離した。＞９５％（ＨＰＬＣにより評価されるところの）の純度を伴う生成物画分を合わせ、そして４０ｍｌの３Ｍ ＮａＯＡＣと混合した。ＰＥＧ化シュピーゲルマーを接線流濾過（５Ｋ再生セルロースメンブレン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）により脱塩した。
結合定数の測定（プルダウンアッセイ）
直接プルダウンアッセイ
Ｄ−ＭＣＰ−１に対するアプタマーの親和性をそれぞれ２０若しくは３７℃でのプルダウンアッセイ形式で測定した。アプタマーは、［γ−３２Ｐ］標識ＡＴＰ（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａｎａｌｙｔｉｃ、独国ブラウンシュヴァイク）を使用してＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、独国カールスルーエ）により５’−リン酸標識した。標識アプタマーの比放射活性は２００，０００〜８００，０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌであった。アプタマーを、低濃度で平衡に達せさせるため、変性および再生後に、変動する量のビオチニル化Ｄ−ＭＣＰ−１と一緒に選択緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４
；１３７ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＫＣｌ；１ｍＭ ＭｇＣｌ２；１ｍＭ ＣａＣｌ２；０．１％［ｗ／ｖｏｌ］Ｔｗｅｅｎ−２０）中２０ｐＭ濃度で３７℃で４〜１２時間インキュベートした。選択緩衝液は、使用されるプラスチック器具若しくは固定マトリックスの表面での結合パートナーの吸着を予防するため、１０μｇ／ｍｌヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、独国シュタインハイム）および１０μｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、米国オースティン）を補充した。ビオチニル化Ｄ−ＭＣＰ−１の濃度範囲は８ｐＭから１００ｎＭまでに設定し；総反応容量は１ｍｌであった。ペプチドおよびペプチド−アプタマー複合体を、選択緩衝液で前平衡させかつ６μｌの総容量に再懸濁した１．５μｌのストレプトアビジンＵｌｔｒａｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ粒子（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国ロックフォード）に固定した。粒子をサーモミキサー中それぞれの温度で３０分間懸濁に保った。固定された放射活性を、上清を分離することおよび適切な洗浄後にシンチレーションカウンターで定量した。結合の割合をビオチニル化Ｄ−ＭＣＰ−１の濃度に対してプロットし、そして１：１の化学量論を推定してソフトウェアアルゴリズム（ＧＲＡＦＩＴ；Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ；英国サリー）を使用することにより、解離定数を得た。
競合プルダウンアッセイ
多様なＤ−ＭＣＰ−１結合アプタマーを比較するため、競合等級付けアッセイを実施した。この目的上、利用可能な最も擬似のアプタマーを放射活性標識し（上を参照されたい）、そして参照としてはたらいた。変性および再生後に、競合なしでニュートラビジンアガロース若しくはストレプトアビジンＵｌｔｒａｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ（双方ともＰｉｅｒｃｅから）上での固定および洗浄後にペプチドへの５〜１０％結合をもたらした条件で、１ｍｌ選択緩衝液中３７℃でビオチニル化Ｄ−ＭＣＰ−１とともにそれをインキュベートした。結合反応に対応させるため、過剰の変性および再生した未標識Ｄ−ＲＮＡアプタマーバリアントを、標識参照アプタマーとともに異なる濃度（例えば２、１０および５０ｎＭ）まで添加した。試験されるべきアプタマーは標的結合について参照アプタマーと競合し、かようにそれらの結合の特徴の依存において結合シグナルを低下させた。本アッセイで最も活性と見出されたアプタマーは、その後、さらなるアプタマーバリアントの競合分析のための新たな参照としてはたらき得た。
Ｃａ＋＋放出アッセイにおける阻害濃度の決定
ＴＨＰ−１細胞（ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク）を、１０％ウシ胎児血清に加え５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５０μＭ β−メルカプトエタノールを含有したＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃かつ５％ＣＯ２で、０．３×１０６／ｍｌの細胞密度で一夜培養した。
シュピーゲルマーは、０．２ｍｌ薄型（ｌｏｗ ｐｒｏｆｉｌｅ）９６チューブプレート中で、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、５ｍＭプロベネシドおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（ＨＢＳＳ＋）中３７℃で１５ないし６０分間、組換えヒトＭＣＰ−１（Ｂａｃｈｅｍ）と一緒にインキュベートした（「刺激溶液」）。
カルシウム指示薬色素を負荷するため、細胞を３００×ｇで５分間遠心分離し、４ｍｌ指示薬色素溶液（ＨＢＳＳ＋中１０μＭ ｆｌｕｏ−４［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ］、０．０８％プルロニック１２７［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ］）に再懸濁し、そして３７℃で６０分間インキュベートした。その後、１１ｍｌのＨＢＳＳ＋を添加し、そして細胞を上のとおり遠心分離し、１５ｍｌのＨＢＳＳ＋で１回洗浄し、そしてその後１．１×１０６／ｍｌの細胞密度を生じるようにＨＢＳＳ＋に再懸濁した。この細
胞懸濁液９０μｌを黒色９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。
蛍光シグナルの測定は、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ多検出プレートリーダー（ＢＭＧ）にて４８５ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長で行った。数サンプルの同時測定のため、９６ウェルプレートの１（垂直）行のウェルを一緒に記録した。４秒の遅れを伴う最初の３個の読取りをベースラインの測定のため行った。その後記録を中断し、そしてプレートを装置から動かした。多チャンネルピペットを使用して、１０μｌの刺激溶液をウェルに添加し、その後プレートを再度装置に動かしかつ測定を継続した。合計で４秒の時間間隔を伴う２０記録を実施した。
各ウェルについて、最大蛍光とベースライン値の間の差違を決定し、そしてＭＣＰ−１濃度に対し、若しくは、シュピーゲルマーによるカルシウム放出の阻害に関する実験ではシュピーゲルマーの濃度に対しプロットした。
ヒトＭＣＰ−１の半最大有効濃度（ＥＣ５０）の決定
多様なｈＭＣＰ−１濃度でのＴＨＰ−１細胞の刺激、ならびに最大およびベースラインシグナルの間の差違をプロットすることの後に、約２〜４ｎＭの半有効濃度（ＥＣ５０）を示すヒトＭＣＰ−１の用量応答曲線を得た（図１１）。この濃度を、シュピーゲルマーによるＣａ＋＋放出の阻害に関するさらなる実験に使用した。
マウスＭＣＰ−１の半最大有効濃度（ＥＣ５０）の決定
多様なｍＭＣＰ−１濃度でのＴＨＰ−１細胞の刺激、ならびに最大およびベースラインシグナルの間の差違をプロットすることの後に、約５ｎＭの半有効濃度（ＥＣ５０）を示すマウスＭＣＰ−１の用量応答曲線を得た（図２８）。この濃度を、シュピーゲルマーによるＣａ＋＋放出の阻害に関するさらなる実験に使用した。
走化性アッセイにおける阻害濃度の測定
上述されたとおり増殖させたＴＨＰ−１細胞を遠心分離し、ＨＢＨ（１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有するＨＢＳＳ）で１回洗浄しかつ３×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。この懸濁液１００μｌを、５μｍ孔をもつＴｒａｎｓｗｅｌｌインサ―ト（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３４２１）に添加した。下区画中で、ＭＣＰ−１を６００μｌのＨＢＨ中の多様な濃度のシュピーゲルマーと一緒に、細胞の添加前に３７℃で２０ないし３０分間前インキュベートした。細胞を３７℃で３時間移動させた。その後インサートを取り出し、そしてリン酸緩衝生理的食塩水中４４０μＭレサズリン（Ｓｉｇｍａ）６０μｌを下区画に添加した。３７℃で２．５時間のインキュベーション後に、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ多検出プレートリーダー（ＢＭＧ）にて５４４ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で蛍光を測定した。
ヒトＭＣＰ−１の半最大有効濃度（ＥＣ５０）の測定
多様なヒトＭＣＰ−１濃度へのＴＨＰ−１細胞の３時間の移動後に、約１ｎＭの最大有効濃度およびより高濃度での低下された活性化を示すヒトＭＣＰ−１の用量応答曲線を得た（図１４）。シュピーゲルマーによる走化性の阻害に関するさらなる実験に、０．５ｎＭのＭＣＰ−１濃度を使用した。
マウスＭＣＰ−１の半最大有効濃度（ＥＣ５０）の測定
多様なマウスＭＣＰ−１濃度へのＴＨＰ−１細胞の３時間の移動後に、約１〜３ｎＭの最大有効濃度およびより高濃度での低下された活性化を示すマウスＭＣＰ−１の用量応答曲線を得た（図３０）。シュピーゲルマーによる走化性の阻害に関するさらなる実験に、０．５ｎＭのマウスＭＣＰ−１濃度を使用した。
表面プラズモン共鳴測定による結合分析
７．１ ＮＯＸ−Ｅ３６、１８１−Ａ２−０１８およびｍＮＯＸ−Ｅ３６の特異性評価
Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、スウェーデン・ウプサラ）を使用して、ヒトＭＣＰ−１および関係するタンパク質への核酸の結合を分析した。アミン基を介してカップリングを達成するべきであった場合に、該タンパク質を水に対し１〜２時間透析して（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＶＳＷＰ混合セルロースエステル；孔径０．０２５μＭ）妨害するアミンを除去した。ＰｉｏｎｅｅｒＦ１若しくはＣＭ４センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を、０．４Ｍ ＮＨＳおよび０．１Ｍ ＥＤＣの１：１希釈の５μｌ／分の流速での３５μｌ注入により、タンパク質カップリング前に活性化した。ケモカインをその後、装置応答が１０００〜２０００ＲＵ（相対単位）の範囲になるまで、２μｌ／分の流速で０．１〜１．５μｇ／ｍｌの濃度で注入した。未反応ＮＨＳエステルは３５μｌの塩酸エタノールアミン溶液（ｐＨ８．５）の５μｌ／分の流速での注入により非活性化した。センサーチップを結合緩衝液で２回プライミングし、そしてベースラインが安定に見えるまで１〜２時間、１０μｌ／分で平衡化した。全部のタンパク質について、速度論的パラメータおよび解離定数を、選択緩衝液（トリス−ＨＣｌ、２０ｍＭ；ＮａＣｌ、１３７ｍＭ；ＫＣｌ、５ｍＭ；ＣａＣｌ２、１ｍＭ；ＭｇＣｌ２、１ｍＭ；Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％［ｗ／ｖ］；ｐＨ７．４）中１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５および０ｎＭの濃度の一連のシュピーゲルマーの注入により評価した。全実験において、分析は、１０μｌ／分の流速で１８０の会合時間および３６０秒の解離時間を定義するＫｉｎｊｅｃｔコマンドを使用して３７℃で実施した。データ解析および解離定数（ＫＤ）の計算は、ラングミュアーの１：１化学量論的当てはめアルゴリズムを使用してＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウェア（ＢＩＡＣＯＲＥ ＡＢ、スウェーデン・ウプサラ）を用いて行った。
７．１．１ ＮＯＸ−Ｅ３６および１８１−Ａ２−０１８（ヒトＭＣＰ−１特異的核酸）
ヒトＭＣＰ−１についてのみ全部のセンサー図を描き（それぞれ図１７および２０）；他のタンパク質については、明瞭さのため、１２５ｎＭのシュピーゲルマー濃度で得られたセンサー図のみ示す（図１８／１９および２１／２２）。
ＮＯＸ−Ｅ３６・ｈＭＣＰ−１の相互作用の分析：組換えヒトＭＣＰ−１を、１３８１ＲＵ（相対単位）の装置応答が確立されるまで、製造元の推奨（アミンカップリング処置）に従って、ＰｉｏｎｅｅｒＦ１センサーチップに固定した。ヒトＭＣＰ−１へのＮＯＸ−Ｅ３６結合の測定された解離定数（ＫＤ）は約８９０ｐＭであった（図１７）。
１８１−Ａ２−０１８・ｈＭＣＰ−１の相互作用の分析：組換えヒトＭＣＰ−１を、３１１１ＲＵ（相対単位）の装置応答が確立されるまで、製造元の推奨（アミンカップリング処置）に従って、ＣＭ４センサーチップに固定した。ヒトＭＣＰ−１への１８１−Ａ２−０１８結合の測定された解離定数（ＫＤ）は約３７０ｐＭであった（図２０）。
ＮＯＸ−Ｅ３６および１８１−Ａ２−０１８の特異性を決定するため、多様なヒトＭＣＰ−１ファミリータンパク質、ならびにヒトエオタキシンを、ＰｉｏｎｅｅｒＦ１およびＣＭ４センサーチップに固定した（ｈＭＣＰ−１、１７５４ＲＵ；ｈＭＣＰ−２、１５５８ＲＵ；ｈＭＣＰ−３、１２９０ＲＵ；エオタキシン、１５２３ＲＵ）。速度論的分析は、ＮＯＸ−Ｅ３６が５〜１０ｎＭの解離定数（ＫＤ）でエオタキシンおよびｈＭＣＰ−２に結合することを示し；ｈＭＣＰ−３は認識されなかった（図１８および２４Ａ）。１８１−Ａ２−０１８は、対照的に、エオタキシン、ｈＭＣＰ−２およびｈＭＣＰ−３を、しかしわずかにより低い親和性で結合する（１０〜２０ｎＭ；図２１および２４Ａ）。
ＮＯＸ−Ｅ３６および１８１−Ａ２−０１８の種間交差反応性を、ＰｉｏｎｅｅｒＦ１およびＣＭ４センサーチップ上のヒト（１４６０ＲＵ）、サル（１２１８ＲＵ）、ブタ（１４２８ＲＵ）、イヌ（１２２４ＲＵ）、ウサギ（１２４４ＲＵ）、ラット（１２６７ＲＵ）およびマウス（１３６１ＲＵ）からのアミノカップリング固定したＭＣＰ−１を使用して評価した。速度論的分析は、ＮＯＸ−Ｅ３６が、０．８９〜１．２ｎＭの比較可能な解離定数（ＫＤ）でヒト、サル、ブタおよびイヌＭＣＰ−１に結合する一方、マウス、ラットおよびウサギからのＭＣＰ−１は認識されなかったことを示した（図１９および２４Ａ）。１８１−Ａ２−０１８は、０．５〜０．６ｎＭの比較可能な解離定数（ＫＤ）でヒトおよびサルＭＣＰ−１に結合する一方、ブタ、ウサギおよびイヌＭＣＰ−１ははるかにより低い親和性で結合される。ラットおよびマウスＭＣＰ−１はＮＯＸ−Ａ２−０１８により認識されなかった（図２２および２４Ａ）。
多様な種からのＭＣＰ−１タンパク質および緊密に関係するヒトタンパク質の配列、ならびにそれらの間の同一アミノ酸パーセントでの相同性の程度を図２３に描き；ＮＯＸ−Ｅ３６および１８１−Ａ２−０１８の計算されたＫＤ値を表形式で図２４Ａに表示する。
７．１．２ ｍＮＯＸ−Ｅ３６（マウスＭＣＰ−１特異的核酸）
ｍＮＯＸ−Ｅ３６の結合挙動を解析するため、３７５９ＲＵの合成ビオチニル化マウスＤ−ＭＣＰ−１（フロ―セル３）および３３２６ＲＵのビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１（フローセル４）を、それぞれストレプトアビジン結合したセンサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、独国フライブルク）に固定した。５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５および０ｎＭのｍＮＯＸ−Ｅ３６アプタマー（Ｄ−ＲＮＡ）溶液を、１８０秒の会合時間および３６０秒の解離時間を規定するＫｉｎｊｅｃｔコマンドを使用して注入した。フローセル１は緩衝液およびデキストランマトリックス対照（Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＡチップ表面）として使用した一方、フローセル２では、アプタマーの非特異的結合を測定するため非特異的Ｄ−ペプチドを固定した。図３２は、２００〜３００ｐＭの計算された解離定数（ＫＤ）を伴うマウスＤ−ＭＣＰ−１への結合のＤ−ＮＯＣ−Ｅ３６のキネティックのセンサー図を示す。ｍＮＯＸ−Ｅ３６はヒトＤ−ＭＣＰ−１を結合せず（図３３）；明瞭さのため、１２５ｎＭのシュピーゲルマーで得られたセンサー図のみを示す。
７．２ ＮＯＸ−Ｅ３６の選択性評価
ＮＯＸ−Ｅ３６の選択性を、ストレプトアビジン（ＳＡチップ）に５’ビオチニル化ＮＯＸ−Ｅ３６を固定することにより表面プラズモン共鳴分析により評価した。フローセル（ＦＣ）１上の３５２ＲＵのＮＯＸ−Ｅ３６、およびＦＣ２上の等量の５’末端ビオチニル化した非機能的対照シュピーゲルマー（ＰＯＣ）を、ストレプトアビジン／ビオチン結合により固定した。ＦＣ３を、デキストラン−ＳＡセンサー表面への非特異的結合を測定するための表面対照として使用した。
全４サブグループ（ＣＣ、ＣＸＣ、ＣＸ３ＣおよびＸＣ）からの１００ｎＭのヒトケモカインの一団を３６０秒間注入し、そして複合体を１０μｌ／分の流速および３７℃で３６０秒間解離させた。会合後（応答１；相互作用の程度）および解離後（応答２：相互作用の親和性）の応答単位をプロットした。各注入後に、チップ表面を２４０秒の０．１％ Ｔｗｅｅｎを含む１Ｍ塩化ナトリウムで再生し；固定したシュピーゲルマーをその後、生理学的条件（泳動緩衝液）で２分間再フォールディングさせた。各ケモカインの注入を３回反復した。ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ６およびＣＸＣＬ９は、リボ核酸およびチップデキストラン表面への非特異的結合を示した。固定したＮＯＸ−Ｅ３６への特異的高親和性結合は、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ３／ＭＩＰ１αおよびＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２についてのみ検出し得た（図２４Ｂ）。ＭＣＰ−２およびエオタキシンがＮＯＸ−Ｅ３６により結合されるという知見は、６２および７０％のこれらのケモカインとＭＣＰ−１の間の比較的高い相同性により驚くべきでなく、期待されなかった陽性、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αおよびＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２について、機能阻害のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験はそれぞれ実施されたか若しくは現在確立されつつある。
最後に、ＮＯＸ−Ｅ３６およびＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ３／ＭＩＰ１α、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３およびＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４の間の相互作用の速度論的パラメータを「反転」系で測定した。ここで、ケモカインを固定し、そして遊離ＮＯＸ−Ｅ３６を注入した（詳細なプロトコルについては７．１を参照されたい）。速度論的データを図２４Ｃに要約する。
７．３ ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗ＭＩＰ−１α機能性の評価
Ｂｉａｃｏｒｅ測定はＭＩＰ−１αとのＮＯＸ−Ｅ３６の交差反応性を示した。機能的な細胞培養物に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用することにより、ＭＩＰ−１αへのＮＯＸ−Ｅ３６の単なるＢｉａｃｏｒｅ結合もまた機能性、例えば拮抗作用に変わるかどうかを確認すべきである。
これを達成するため、ＭＩＰ−１αにより刺激され得るＴＨＰ−１細胞を用いる走化性実験を実施した。上述されたとおり増殖させたＴＨＰ−１細胞を遠心分離し、ＨＢＨ（１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有するＨＢＳＳ）で１回洗浄し、そして３×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。この懸濁液１００μｌを、５μｍ孔をもつＴｒａｎｓｗｅｌｌインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３４２１）に添加した。下区画中で、ＭＩＰ−１αを６００μｌのＨＢＨ中の多様な濃度のシュピーゲルマーと一緒に、細胞の添加前に３７℃で２０ないし３０分間前インキュベートした。細胞を３７℃で３時間移動させた。その後、インサートを取り出し、そしてリン酸緩衝生理的食塩水中４４０μＭレサズリン（Ｓｉｇｍａ）６０μｌを下区画に添加した。３７℃で２．５時間のインキュベーション後に、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ多検出プレートリーダー（ＢＭＧ）で５４４ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長にて蛍光を測定した。
多様なヒトＭＩＰ−１α濃度へのＴＨＰ−１細胞の３時間の移動後に、約１ｎＭの半最大有効濃度およびより高濃度での低下された活性化を示すヒトＭＩＰ−１αの用量応答曲線を得た（図２４Ｄ）。シュピーゲルマーによる走化性の阻害に関するさらなる実験に、０．５ｎＭのＭＩＰ−１α濃度を使用した。
ＮＯＸ−Ｅ３６による走化性阻害の測定のための実験を、０．５ｎＭのＭＩＰ−１αの刺激を用いて実施した。ＮＯＸ−Ｅ３６が、１μＭ ＭＩＰ−１αの最高の試験した濃度まで、ＭＩＰ−１α誘発性の走化性を阻害しないことを明瞭に示し得た。陽性対照として、刺激としてのＭＣＰ−１伴うそれぞれの実験を同時に実施した（図２４Ｅ）。
抗ｍＭＣＰ−１シュピーゲルマーでのＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける狼瘡様疾患の治療
炎症前メディエーターを阻害することは慢性炎症の処置のための成功裏の一アプローチとなっている（Ｓｔｅｉｎｍａｎ ２００４）。ＴＮＦおよびインターロイキンに加え、Ｃ−ケモカインは炎症の部位への血管内空隙からの白血球動員を媒介するため、ＣＣ−ケモカインは特定の拮抗作用の重要な候補である（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ １９９８、Ｌｕｓｔｅｒ ２００５）。ＭＣＰ−１（＝ＣＣＬ２）およびそのそれぞれのケモカイン受容体ＣＣＲ２が全身性エリテマトーデスの臨床症状発現のような自己免疫性組織傷害で決定的な役割を演じているという非常に強力な証拠が存在する（ＧｅｒａｒｄとＲｏｌｌｉｎｓ ２００１）。例えば、Ｃｃｌ２若しくはＣｃｒ２いずれかの遺伝子について欠損のＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスは狼瘡様自己免疫から保護される（Ｐｅｒｅｚ ｄｅ Ｌｅｍａ ２００５、Ｔｅｓｃｈ １９９９）。これゆえに、ＣＣＬ２／ＣＣＲ２系は例えばループス腎炎の有望な治療標的を表しうる。事実、遅延された遺伝子治療若しくはトランス
フェクトした細胞の移入（双方ともＮＨ２切断型ＭＣＰ−１のｉｎ ｓｉｔｕ産生をもたらす）は、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける自己免疫性組織傷害を顕著に低下させた。しかしながら、こうした実験的アプローチは、抑制不可能なアンタゴニスト産生および腫瘍形成のためヒトで使用し得ない（Ｈａｓｅｇａｗａ ２００３、Ｓｈｉｍｉｚｕ ２００４）。従って、ｉｎ ｖｉｖｏで好都合な薬物動態プロファイルをもつ新規ＣＣＬ２アンタゴニストを開発することが必要なままである。本実施例において、抗ｍＣＣＬ２シュピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６若しくはｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧでのマウスＣＣＬ２の阻害が、全身性エリテマトーデスのループス腎炎および他の疾患症状発現の処置に適しているとみられることが示される。ｍＣＣＬ２シュピーゲルマー治療の後期の開始は、治療的ＣＣＬ２／ＣＣＲ２阻害と関連するいかなる以前の問題にも依存せず、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおけるループス腎炎、自己免疫性気管支周囲炎および狼瘡様皮膚疾患を効果的に改善する。
動物および実験プロトコル
１０週齢雌性ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスはＨａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ（独国ボルヒェン）から得、そして１２時間の明および暗周期での通常の収容条件で飼育した。水および標準的飼料（Ｓｓｎｉｆｆ、独国ゾースト）は任意に利用可能であった。１４週齢時に、１２マウスの群が、後に続くところの５％ブドウ糖中のシュピーゲルマーの皮下注入（注入容量４ｍｌ／ｋｇ）を週あたり３回受領した：ｍＮＯＸ−Ｅ３６、１．５μｍｏｌ／ｋｇ；ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ、０．９μｍｏｌ／ｋｇ；非機能的対照シュピーゲルマーＰｏＣ（５’−ＵＡＡＧＧＡＡＡＣＵＣＧＧＵＣＵＧＡＵＧＣＧＧＵＡＧＣＧＣＵＧＵＧＣＡＧＡＧＣＵ−３’）、１．９μｍｏｌ／ｋｇ；ＰｏＣ−ＰＥＧ、０．９μｍｏｌ／ｋｇ；ベヒクル（５％ブドウ糖）。ｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧの血漿濃度を、それぞれ注入３若しくは２４時間後に後眼窩洞から週１回採取する血液サンプルから測定した。血漿サンプル中のシュピーゲルマー濃度は実施例８に記述されるところのサンドイッチハイブリダイゼーション法の変法により測定した。マウスは２４週齢の終了時に頚部脱臼により殺した。
全身性狼瘡の評価
皮膚病変を半定量的スコア（Ｓｃｈｗａｒｔｉｎｇ ２００５）により記録した。全体重に対する脾および巨大な腸間膜リンパ節の重量比を、狼瘡関連リンパ球増殖症候群のマーカーとして計算した。血液および尿サンプルを各動物から試験期間の終了時に吸入エーテルを用いる全身麻酔下に後眼窩静脈叢からの出血により収集した。血液および尿サンプルを試験の終了時に各動物から収集し、そして尿アルブミン／クレアチニン比および血清ｄｓＤＮＡ自己抗体ＩｇＧアイソタイプ力価を前述された（Ｐａｗａｒ ２００６）とおり測定した。糸球体濾過速度（ＧＦＲ）を、単一ボーラス注入５、１０、１５、２０、３５、６０および９０分後の血漿ＦＩＴＣ−イヌリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、独国シュタインハイム）のクリアランスキネティクス（Ｑｉ ２００４）により、２４週に測定した。蛍光を４８５ｎｍの励起および５３５ｎｍの発光での読取りで測定した。ＧＦＲは、非直線回帰曲線当てはめソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用する２コンパートメントモデルに基づき計算した。血清サイトカイン濃度は、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０（ＯｐｔＥｉＡ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＩＦＮ−α（ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｓ、米国）のための商業的ＥＬＩＳＡを使用して測定した。全マウスから、腎および肺を１０％緩衝ホルマリン中で固定し、加工しかつパラフィンに包埋した。銀および過ヨウ素酸シッフ染色のための５μｍ切片を慣例のプロトコル（Ａｎｄｅｒｓ ２００２）に従って調製した。腎病変の重症度を、ヒトループス腎炎について記述されたところの活動性および慢性性についての指標（Ａｕｓｔｉｎ １９８４）を使用して等級付けし、また、腎間質傷害の形態計測を前述された（Ａｎｄｅｒｓ ２００２）とおり実施した。気管支周囲の炎症の重症度は０〜４から半定量的に等級付けした。免疫染色のため、ホルマリン固定しかつパラフィン包埋した組織の切片を脱蝋しかつ再水和した。内因性ペルオキシダーゼを３％過酸化水素により阻害し、そして抗原の回収をオートクレーブオーブン中で抗原回収溶液（Ｖｅｃｔｏｒ、カリフォルニア州バーリンゲーム）中で実施した。アビジン／ビオチンブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ）を使用してビオチンをブロッキングした。スライドを一次抗体と１時間、次いでビオチニル化二次抗体（抗ラットＩｇＧ、Ｖｅｃｔｏｒ）およびＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ）とインキュベートした。スライドはインキュベーション段階の間にリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄した。金属増強を伴う３’３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、Ｓｉｇｍａ、独国タウフキルヒェン）を検出系として使用して、黒色生成物をもたらした。メチルグリーンを対染色として使用し、スライドを脱水しかつＨｉｓｔｏｍｏｕｎｔ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州サンフランシスコ）にマウントした。以下の一次抗体を使用した：ラット抗Ｍａｃ２（マクロファージ、Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ、カナダ・オンタリオ州、５０倍）、抗マウスＣＤ３（１００倍、クローン５００Ａ２、ＢＤ）、抗マウスＩｇＧ１（１００倍、Ｍ３２０１５、Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）、抗マウスＩｇＧ２ａ（１００倍、Ｍ３２２１５、Ｃａｌｔａｇ）、抗マウスＣ３（２００倍、ＧＡＭ／Ｃ３ｃ／ＦＩＴＣ、Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オランダ・ティルブルク）。陰性対照はそれぞれのアイソタイプ抗体とのインキュベーションを包含した。定量分析のため、糸球体細胞を切片あたり１５個の皮質糸球体中で計数した。糸球体ＩｇおよびＣ３ｃ沈着物を１５個の皮質糸球体切片で０〜３から評価した。
ＲＮＡ調製およびリアルタイム定量的（ＴａｑＭａｎ）ＲＴ−ＰＣＲ
各マウスからの腎組織を液体窒素中で急速凍結しかつ−８０℃で保存した。各動物について、全腎ＲＮＡ調製および逆転写は記述された（Ａｎｄｅｒｓ ２００２）とおり実施した。プライマーおよびプローブはＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、独国ヴァイターシュタットからであった。Ｃｃ１２、Ｃｃｌ５および１８Ｓ ｒＲＮＡの検出に使用される使用したプライマー（３００ｎＭ）、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの予め開発されたＴａｑＭａｎアッセイ試薬。
フローサイトメトリー
全血および骨髄サンプルを試験終了時に全群のマウスから得た。フローサイトメトリーはＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ器械および以前に特徴付けされたＭＣ２１抗ｍＣＣＲ２抗体（Ｍａｃｋ ２００１）を使用して実施した。ビオチニル化抗ラットＩｇＧ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を検出に使用した。ラットＩｇＧ２ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をアイソタイプ対照として使用した。
統計学的解析
データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。群間の比較は一変量ＡＮＯＶＡを使用して実施した。事後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を多重比較に使用した。ｐ＜０．０５という値を統計学的有意性を示すために考慮した。
サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ
サンプル中のシュピーゲルマーの量を、Ｄｒｏｌｅｔら ２０００（Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １７：１５０３）により記述されたところのアッセイに基づくサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにより定量した。血液サンプルを、ＮＯＸ−Ｅ３６の血漿クリアランスを追跡するために同時に収集した。選択した組織を、シュピーゲルマー濃度を測定するため調製した。
ハイブリダイゼーションプレート調製
シュピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６を、検証されていないサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを使用して定量した。簡潔には、ｍＮＯＸ−Ｅ３６捕捉プローブ（配列番号２８１）を、０．５Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５中０．７５ｍＭで白色ＤＮＡ−ＢＩＮＤ ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、独国ヴィースバーデン）に４℃で一夜固定した。ウェルを２回洗浄し、そして０．２５Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５中０．５％ｗ／ｖ ＢＳＡで３７℃で３時間ブロッキングし、再度洗浄しかつ使用まで４℃で保存した。ハイブリダイゼーション前にウェルを３７℃に前加温し、そして前加温した洗浄緩衝液（３×ＳＳＣ、０．５％［ｗ／ｖ］ドデシルサルコシンナトリウム、ｐＨ７．０；事前にラウロイルサルコシンナトリウムを含まずに２０×ストック［３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ Ｎａ３クエン酸］を調製し、そして相応して希釈する）で２回洗浄した。
サンプル調製
全サンプルは２検体でアッセイした。血漿サンプルを氷上で融解し、ボルテックス攪拌しかつ冷却した卓上遠心機で短時間回転した。組織ホモジェネートをＲＴで融解し、そして最大速度かつＲＴで５分遠心分離した。５μｌのみの各サンプルをアッセイのため取り出し、そしてその後保存のため冷凍庫に戻した。サンプルは、以下のスキームに従い、ＲＴでハイブリダイゼーション緩衝液（洗浄緩衝液中８ｎＭ ｍＮＯＸ−Ｅ３６検出プローブ［配列番号２８２］）で希釈した：
３０倍 ５μｌサンプル＋１４５μｌハイブリダイゼーション緩衝液
３００倍 ２０μｌの３０倍＋１８０μｌハイブリダイゼーション緩衝液
３０００倍 ２０μｌの３００倍＋１８０μｌハイブリダイゼーション緩衝液
３００００倍 ２０μｌの３０００倍＋１８０μｌハイブリダイゼーション緩衝液
全サンプル希釈をアッセイした。ｍＮＯＸ−Ｅ３６標準は０〜４ｎＭ範囲にわたる８点較正曲線に連続希釈した。ＱＣサンプルは調製およびアッセイしなかった。較正標準は試験内（ｉｎ−ｓｔｕｄｙ）サンプルのものに同一であった。
ハイブリダイゼーションおよび検出
サンプルを９５℃で１０分間加熱しそして３７℃に冷却した。シュピーゲルマー／検出プローブ複合体を、固定した捕捉プローブに３７℃で３０分間アニーリングした。未結合のシュピーゲルマーは、洗浄緩衝液および１×ＴＢＳＴ（２０ｍＭトリス−Ｃｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．５）でそれぞれ２回洗浄することにより除去した。ハイブリダイズした複合体を、１×ＴＢＳＴ中５０００倍希釈したストレプトアビジンアルカリホスファターゼにより室温で１時間検出した。未結合の複合物を除去するため、ウェルを再度１×ＴＢＳＴおよび２０ｍＭトリス−Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８（各２回）で洗浄した。ウェルを最後に１００ｍｌのＣＳＤＰ基質（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、独国ダルムシュタット）で満たし、そして室温で４５分間インキュベートした。化学発光をＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、独国オッフェンブルク）で測定した。
データ解析
以下のアッセイしたサンプル希釈を定量的データ解析に使用した：
ラットＥＤＴＡ血漿 ２０００倍
ベヒクル群（シュピーゲルマーを投与しなかった）から得たデータをバックグラウンドシグナルとして差し引いた。
本明細書に記述されるところのサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイは、シュピーゲルマーＮＯＸ−３６、ＮＯＸ−Ｅ３６−５’−ＰＥＧおよびＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧにもまた類似の様式で作用し、それによりそれぞれのＮＯＸ−Ｅ３６捕捉プローブ（配列番号２５５）およびそれぞれのＮＯＸ−Ｅ３６検出プローブ（配列番号２５６）を使用しなければならない（データは示されない）。
結果
ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧはＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの生存および腎疾患を改善する
雌性ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、ヒトでのびまん性増殖性ループス腎炎に対する著しい類似性を伴う増殖性免疫複合体型糸球体腎炎を発症しかつその後それで死亡する。本治療試験デザインでは、処置されるＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスを、ＰＥＧ化および未ＰＥＧ化抗ｍＣＣＬ２シュピーゲルマー、ＰＥＧ化および未ＰＥＧ化対照（「ＰｏＣ」）シュピーゲルマー若しくはベヒクルで１４から２４週齢まで処置した。この時点で、ベヒクル、ＰｏＣ若しくはＰｏＣ−ＰＥＧ処置したＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、糸球体マクロファージ浸潤、ならびに糸球体および間質Ｍａｃ２陽性マクロファージならびに間質ＣＤ３陽性リンパ球よりなる混合型糸球体周囲および間質炎症細胞浸潤を特徴とするびまん性増殖性糸球体腎炎を示した（図３４および３５）。ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、ループス腎炎の活動性および慢性性指標、ならびに腎の炎症の前述のマーカーを改善した（図３５）。未ＰＥＧ化分子ｍＮＯＸ−Ｅ３６は慢性性指標ならびに間質マクロファージおよびＴ細胞数に対しより少なく効果的であった（図３５）。進行した慢性腎疾患が、ベヒクル、ＰｏＣおよびＰｏＣ−ＰＥＧ処置マウスでの尿細管萎縮および間質線維症の集密領域によりさらに具体的に説明された（図３４）。これらの変化を定量化するための形態計測を応用して、ＰＥＧ化および未ＰＥＧ化ｍＮＯＸ−Ｅ３６が、間質容量、尿細管細胞損傷および尿細管拡張（全部慢性腎疾患の重症度および予後のマーカーである）を低下させたことが見出された（図３６）。ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは５０％死亡率を改善したがしかし未ＰＥＧ化ｍＮＯＸ−Ｅ３６はしなかった（図３７）。従って、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの腎マクロファージおよびＴ細胞浸潤の数を低下させかつループス腎炎および（腎）生存を改善し得る。ｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧでの処置がＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスでの腎内炎症に影響を及ぼすかどうか研究するため、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施して、腎疾患の進行の間にＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの腎において漸進性に上方制御されることが以前に示された（Ｐｅｒｅｚ ｄｅ Ｌｅｍａ ２００１）炎症前ケモカインＣＣＬ２およびＣＣＬ５の発現レベルを評価した。１４から２４週齢までのｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧでの処置は、ベヒクル処置した対照に比較してＣＣＬ２およびＣＣＬ５ ｍＲＮＡの腎発現を低下させた（図３８）。
抗ＣＣＬ２シュピーゲルマーはＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける腎外自己免疫性組織傷害を低下させる
皮膚および肺もまたＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける自己免疫性組織傷害から一般に影響を受ける。ベヒクル処置したマウスにおいて、自己免疫性肺疾患は、中程度の細気管支周囲および血管周囲炎症細胞浸潤を特徴とし、また、皮膚病変がマウスの６０％で観察された（図３９、４０および３５）。ｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ双方は、それぞれベヒクル、ＰｏＣおよびＰｏＣ−ＰＥＧ処置したＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスに比較して気管支周囲の炎症および皮膚疾患を低下させた（図３９、４０および３５）。これゆえに、ＣＣＬ２特異的シュピーゲルマーの効果はループス腎炎に制限されず、しかしＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける自己免疫性組織傷害の他の症状発現に及ぶ。
ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおけるｍＮＯＸ−Ｅ３６およびリンパ球増殖症候群、ｄｓＤＮＡ自己抗体ならびに血清サイトカイン濃度
雌性ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、大規模な脾腫大ならびに巨大な頚部、液窩、鼠径部および腸間膜リンパ節を特徴とするリンパ球増殖症候群を発症する。ｍＮＯＸ−Ｅ３６
およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ双方は、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの脾およびリンパ節の重量に対し影響を有しなかった（図４１）。ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスでの自己免疫は、ｄｓＤＮＡを包含する複数の核抗原に対する自己抗体の産生を特徴とする。２４週齢ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスでは、血清ｄｓＤＮＡ ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ自己抗体が高レベルで存在した。ｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ双方はこれらのＤＮＡ自己抗体のいずれに対しても影響を有しなかった（図４１）。ベヒクル処置したＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスでの狼瘡様疾患は、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−６の上昇された血清濃度を特徴とした。ｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ双方はこれらの炎症メディエーターのいずれに対しても影響を有しなかった（図４１）。従って、双方のｍＮＯＸ−Ｅ３６バリアントは、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおけるリンパ球増殖、抗ｄｓＤＮＡ ＩｇＧ産生および血清サイトカイン濃度に影響を及ぼさない。
ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスでのｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧの血漿濃度
ｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ血漿濃度を、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの進行性腎疾患の間の薬物曝露をモニターするために、週間隔で測定した。注入３時間後のｍＮＯＸ−Ｅ３６および注入２４時間後のｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧの血漿濃度中央値は試験を通じてそれぞれおよそ３００ｎＭおよび１μＭであった（図４２）。従って、ＰＥＧ化はｍＮＯＸ−Ｅ３６の血漿濃度を増大させ、そして、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの進行性腎疾患は双方のシュピーゲルマーの薬物動態を調節しなかった。
ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは骨髄からの単球の移動を阻害する
細菌感染の間の骨髄からの単球移動は、ケモカイン受容体ＣＣＲを関与させることが示された（Ｓｅｒｂｉｎａ ２００６）が、しかし、自己免疫の情況でのＣＣＬ２の役割は仮説のままである。従って、２４週齢ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスのｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧおよびベヒクル処置群のマウスでの末梢血および骨髄のＣＣＲ２陽性単球集団を検査した。ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧでの処置は骨髄中のＣＣＲ２陽性細胞の割合を１３％から２６％に増加させた一方、それは末梢血中のこの集団を２６％から１１％に減少させた（図４３）。これらのデータは、ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの自己免疫疾患の間の骨髄からのＣＣＲ２陽性細胞の忌避のためのＣＣＬ２の役割を裏付ける。
要約
シュピーゲルマー技術を応用して、ｍＣＣＬ２をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで強力に阻害する新規かつ特異的ｍＣＣＬ２アンタゴニストを創製した。事実、ＣＣＬ２シュピーゲルマーでの処置の晩期の開始はＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける進行した狼瘡様自己免疫性組織傷害を顕著に改善した。これらのデータは、慢性炎症性組織損傷におけるＣＣＬ２の中心的役割を裏付け、かつ、ＣＣＬ２シュピーゲルマーを自己免疫性組織傷害の新規治療薬と同定する。
抗ｍＭＣＰ−１シュピーゲルマーを用いる一側腎摘出糖尿病マウスにおける糖尿病性腎症の治療
糖尿病性腎症は、アンジオテンシン依存性の発症機序を標的とすることが疾患の進行を常に予防するわけでないため、末期腎疾患の第一位の原因のままである（Ｚｉｍｍｅｔ ２００１；Ｒｉｔｚ １９９９；Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｒｅｎａｌ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ ２００４；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ ２００３）。これゆえに、他の処置戦略が、糖尿病性腎症の治療的装備に追加するために必要とされる。
最近の実験的研究からのデータは糖尿病性腎症の腎内炎症への進行に関する（Ｇａｌｋ
ｉｎａ ２００６；Ｍｏｒａ ２００５；Ｍｅｙｅｒ ２００３；Ｔｕｔｔｌｅ ２００５）。例えば、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート若しくは照射は、ストレプトゾトシン誘発性糖尿病性腎症を伴うラットで尿アルブミン排泄および糸球体硬化を低下させる（Ｙｏｚａｉ ２００５；Ｕｔｉｍｕｒａ ２００３）。それでもなお、糖尿病性腎症における腎内炎症の分子および細胞機序は乏しく特徴付けられているままである。糖尿病性腎症を伴う患者は、炎症の急性期マーカーの上昇された血清濃度を有するが、しかしこれは腎内炎症を表さないことがある（Ｄａｌｌａ Ｖｅｓｔｒａ ２００５；Ｎａｖａｒｒｏ ２００３）。糖尿病性腎症を伴う患者は、腎内炎症により特異的でありうる、高レベルのＣＣ−ケモカイン、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２）を尿中に排泄する（Ｍｏｒｉｉ ２００３；Ｔａｓｈｉｒｏ ２００２；Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ ２００６）。事実、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２は、高ブドウ糖濃度若しくは進行した糖化最終生成物のいずれかに曝露されたヒトメサンギウム細胞により発現される（Ｉｈｍ １９９８；Ｙａｍａｇｉｓｈｉ ２００２）。ＣＣＬ２は血管内から血管外区画すなわち糸球体および腎間質への白血球動員の複雑な多段階過程に関与している（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ １９９８）。事実、マクロファージ浸潤は、ヒトならびに実験的糖尿病性糸球体硬化および尿細管間質傷害における一般的所見である（Ｂｏｈｌｅ １９９１；Ｆｕｒｕｔａ １９９３；Ｃｈｏｗ ２００７）。Ｃｃｌ２欠損の１型若しくは２型糖尿病マウスは、より少ない糸球体傷害を伴うより低い糸球体マクロファージ数を有する（Ｃｈｏｗ ２００４；Ｃｈｏｗ ２００６）。これらの研究で、１型および２型糖尿病性腎症の糸球体の病理学のＣＣＬ２の機能的役割もまた示された。これゆえに、ＣＣＬ２は糖尿病性腎症の潜在的治療標的を表すとみられ、そして好都合な薬物動態プロファイルをもつ適するＣＣＬ２アンタゴニストがこの疾患の情況で検証されるべきである。本実施例において、われわれは進行した糖尿病性腎症を伴う２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＰＥＧ化抗ＣＣＬ２シュピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧの効果を報告する。われわれは、抗ＣＣＬ２シュピーゲルマーが糖尿病性腎症の処置に適しているとみられることを示した。
動物および実験プロトコル
雄性の５週齢Ｃ５７ＢＬＫＳ ｄｂ／ｄｂ若しくはＣ５７ＢＬＫＳ野生型マウスはＴａｃｏｎｉｃ（デンマーク・リュー）から得、そして、試験の期間、１２時間の暗／明周期ならびに食餌および水への制限されない到達を伴いフィルタートップケージに収容した。ケージ、敷きわら、巣（ｎｅｓｔｌｅｔ）、食餌および水は使用前にオートクレーブ処理により滅菌した。６週齢で、一腎摘出（「１Ｋ」マウス）若しくは擬似手術（「２Ｋ」マウス）を、ｄｂ／ｄｂおよび野生型マウスで、前述された（Ｂｏｗｅｒ １９８０）とおり、１ｃｍの脇腹切開により実施した。擬似手術群のマウスでは腎はｉｎ ｓｉｔｕに残した。１０週後すなわち４月齢時に、１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスを、５％ブドウ糖中ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ若しくはＰｏＣ−ＰＥＧ（用量０．９μｍｏｌ／ｋｇ；注入容量１ｍｌ／ｋｇ）いずれかの皮下注入を週あたり３回受領した２群に分割した。処置を８週間（６月齢まで）継続し、その時に動物を殺し、そして組織病理学的評価のため組織を得た。全実験手順は地域の政府当局により承認されていた。
糖尿病性腎症の評価
全部の免疫組織学的研究は記述された（Ａｎｄｅｒｓ ２００２）とおりパラフィン包埋切片で実施した。以下の抗体を一次抗体として使用した：ラット抗Ｍａｃ２（糸球体マクロファージ、Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ、カナダ・オンタリオ州、５０倍）、抗Ｋｉ−６７（細胞増殖、Ｄｉａｎｏｖａ、独国ハンブルク、２５倍）。組織病理学的評価のため、各マウスから腎の一部をリン酸緩衝生理的食塩水中１０％ホルマリン中で固定しかつパラフィンに包埋した。３μｍ切片を、供給元（Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｃａ、イタリア・ミラノ）の説明書に従って過ヨウ素酸シッフ試薬若しくは銀で染色した。糸球体硬化性病変は、後に続くところの盲検化した観察者による半定量的スコアを使用して評価した。すなわち、それぞれ０＝病変なし、１＝＜２５％硬化性、２＝２５〜４９％硬化性、３＝５０〜７４％硬化性、４＝７５〜１００％硬化性。１５個の糸球体を切片あたり分析した。間質容量および尿細管拡張の指標は、前述された（Ａｎｄｅｒｓ ２００２）ところの１０個の重ならない皮質野に１００点の格子を重ね合わせることにより決定した。間質細胞数は、盲検化した観察者により１５個の高倍率野（ｈｐｆ、４００倍）で測定された。ＲＮＡ調製およびリアルタイム定量的（ＴａｑＭａｎ）ＲＴ−ＰＣＲは脱パラフィンした糸球体から行った。溶解緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ ＳＤＳおよび２０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）中６０℃で１６時間のインキュベーション後に、フェノール−クロロホルムに基づくＲＮＡ抽出を実施した。糸球体ＲＮＡを１０μｌのＲＮアーゼを含まない水に溶解した。全臓器および糸球体ＲＮＡからの逆転写およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、記述された（Ａｎｄｅｒｓ ２００２、Ｃｏｈｅｎ ２００２）とおり実施した。ｄｄＨ２Ｏよりなる対照は標的およびハウスキーパー遺伝子について陰性であった。ｍＣｃｌ２、Ｇａｐｄｈおよび１８Ｓ ｒＲＮＡのオリゴヌクレオチドプライマー（３００ｎＭ）およびプローブ（１００ｎＭ）は、ＰＥからの予め開発されたＴａｑＭａｎアッセイ試薬であった。プライマーおよびプローブはＡＢＩ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、独国ヴァイターシュタットからであった。糸球体濾過速度（ＧＦＲ）は、単一ボーラス注入の５、１０、１５、２０、３５、６０および９０分後の血漿ＦＩＴＣ−イヌリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、独国シュタインハイム）のクリアランスキネティクスにより測定した（Ｑｉ ２００４）。蛍光は４８５ｎｍの励起および５３５ｎｍの発光での読取りで測定した。ＧＦＲは、非直線回帰曲線当てはめソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用する２コンパートメントモデルに基づき計算した。全データは平均±ＳＥＭとして提示する。群の比較はＡＮＯＶＡを使用して実施し、そして事後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を多重比較に使用した。ｐ＜０．０５という値を統計学的有意性を示すために考慮した。
結果
ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、一側腎摘出ｄｂ／ｄｂマウスで糸球体マクロファージ数および全体的糸球体硬化を低下させる。
機能的ＣＣＬ２の欠如がｄｂ／ｄｂマウスでの減少した糸球体マクロファージ動員と関連し（Ｃｈｏｗ ２００７）、また、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧがｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＣＣＬ２媒介性のマクロファージ動員を阻害することが可能である場合、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは進行した２型糖尿病性腎症を伴うｄｂ／ｄｂマウスでの腎マクロファージ動員を損なうはずである。この仮説を試験するため、われわれは、一側腎摘出（「１Ｋ」）ｄｂ／ｄｂマウスで４月齢時点でｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ若しくはＰｏＣ−ＰＥＧでの皮下注入を開始した。処置は８週間継続し、その時に組織を糖尿病性腎症の評価のため収集した。その期間の間、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ処置は、白血球若しくは血小板数、血糖値若しくは体重（非糖尿病性ＢＬＫＳマウスに比較してｄｂ／ｄｂマウスの全群で双方とも顕著に増加した）に有意に影響を及ぼさなかった（データは示されない）。興味深いことに、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスでＣＣＬ２の血清濃度を増大させ、ＣＣＬ２アンタゴニストが循環中でＣＣＬ２を保持することを示した（図４４）。われわれの仮説と一致して、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ処置したｄｂ／ｄｂマウスで糸球体内のＫｉ−６７陽性増殖細胞のより低い数を伴い、ＰｏＣ−ＰＥＧ若しくはベヒクル処置したｄｂ／ｄｂマウスと比較して、糸球体マクロファージ数を４０％有意に低下させた（図４５）。これらの知見は、１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスでの全体的糖尿病性糸球体硬化の有意の改善を伴った（図４６）。事実、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ処置は、１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスでの糖尿病性糸球体硬化を、齢をマッチさせた非腎摘出（「２Ｋ」）ｄｂ／ｄｂマウスに存在する糸球体硬化の程度まで低下させた（図４６）。これらの知見は、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧでのＣＣＬ２依存性糸球体マクロファージ動員の遅延された阻害が、２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスで全体的な糖尿病性糸球体硬化を予防することを示す。
ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスでＧＦＲを改善する
１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスでの糖尿病性糸球体硬化に対するｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ処置の有益な効果は、より良好なＧＦＲを伴うはずである。われわれは、ｄｂ／ｄｂマウスでＧＦＲのマーカーとしてＦＩＴＣ−イヌリンのクリアランスキネティクスを分析した（Ｑｉ ２００４）。ｄｂ／ｄｂマウスでの約２５０ｍｌ／分の通常のＧＦＲ（Ｑｉ ２００４）に比較して、われわれは、ＰｏＣ−ＰＥＧを注入した６月齢１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスで１１２±２３ｍｌ／分であったの低下されたＧＦＲを見出した（図４７）。ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ処置は、ＧＦＲを１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスで２３１±３０ｍｌ／分まで有意に改善し（ｐ＜０．００１）、ＣＣＬ２依存性の糸球体マクロファージ動員を阻害することが２型糖尿病マウスで腎機能もまた改善し得ることを示唆した。
ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスで間質マクロファージ数および尿細管間質傷害を低下させる
ヒトでの進行した糖尿病性腎症は有意の数の間質マクロファージおよび尿細管間質傷害を伴う（Ｂｏｈｌｅ １９９１）。２Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスでは、間質マクロファージ浸潤および有意の尿細管間質傷害は８月齢前に起こらない（Ｃｈｏｗ ２００７）。早期一腎摘出はｄｂ／ｄｂマウスで尿細管間質の病状の発症を加速し（Ｎｉｎｉｃｈｕｋ ２００５）、従って、われわれは、間質マクロファージ、尿細管拡張および間質容量を６月齢の全群のマウスで尿細管間質損傷のマーカーとして定量化した。この時点で、１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスは、２Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスと比較して、増大した数の間質マクロファージ、ならびに尿細管拡張および間質容量の有意の上昇を示した（図４５、図４８）。ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ処置は、１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、間質マクロファージの数を５３％、ならびに尿細管拡張および間質容量を低下させた（図４５、図４８）。従って、ＣＣＬ２依存性の腎マクロファージ動員を阻害することは、２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにおける尿細管間質傷害もまた予防する。
ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスでのＣｃｌ２の腎発現を低下させる
マクロファージ浸潤は組織傷害における炎症反応、例えば局所ＣＣＬ２発現を増幅する。われわれは従って、腎マクロファージのｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ関連の減少が、より少ない腎ＣＣＬ２発現と関連するであろうと仮説を立てた。われわれはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用してｄｂ／ｄｂマウスでのＣＣＬ２のｍＲＮＡ発現を定量した。ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、齢をマッチさせたＰｏＣ−ＰＥＧ処置マウスと比較して、６月齢１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスの腎でのＣＣＬ２のｍＲＮＡレベルを低下させた（図４９）。ＣＣＬ２の空間的発現をさらに評価するため、われわれは腎切片でのＣＣＬ２タンパク質の免疫染色を実施した。１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、ＣＣＬ２の発現は、２Ｋ ｄｂ／ｄｂ若しくは２Ｋ野生型マウスと比較して、糸球体、尿細管および間質細胞中で顕著に高められた（図５０）。ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧは、ベヒクル若しくはＰｏＣ−ＰＥＧ処置した１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスに比較して、全部のこれらの区画でのＣＣＬ２の染色を顕著に低下させた。これらのデータは、ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧでＣＣＬ２依存性の腎マクロファージ動員を阻害することが、１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスでのＣＣＬ２の局所発現を低下させることを示す。
要約
ヒト糖尿病性腎症の進行に炎症が寄与するという概念はますます受け入れられるようになり（Ｔｕｔｔｌｅ ２００５）、この疾患を処置するための潜在的標的としてＭＣＰ−
１／ＣＣＬ２に焦点を合わせた。本実施例にて、われわれは、一側腎摘出糖尿病マウスのｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧでの処置が、より少ない増殖糸球体細胞を伴い、６月齢で糸球体（および間質）マクロファージの数を低下させたことを示した。加えて、ＣＣＬ２
ｍＲＮＡの腎／糸球体発現がｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ処置で顕著に低下された。さらに、治療群におけるより少数の糸球体マクロファージおよび糸球体増殖細胞は、全体的な糸球体硬化からの保護および糸球体濾過速度の有意の改善を伴った。糖尿病マウスでの糸球体の病状および腎機能に対するｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧの有益な効果は、糸球体傷害の他のモデルで他のＣＣＬ２アンタゴニストを使用した研究（Ｌｌｏｙｄ １９９７、Ｈａｓｅｇａｗａ ２００３、Ｔａｎｇ １９９６、Ｗｅｎｚｅｌ １９９７、Ｆｕｊｉｎａｋａ １９９７、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ １９９９）と矛盾しない。意外にも、ＣＣＬ２阻害の遅延された開始は、１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスでより少ない尿細管間質の病状を伴い、間質マクロファージ数もまた低下させた。
一緒に、これらのデータは、ＣＣＬ２を糖尿病性腎症の有望な治療標的として検証し、そして、シュピーゲルマーでのＣＣＬ２阻害を開始することが、疾患の進行した状態ででさえなお保護的でありうることを示唆する。
参考文献
本明細書で列挙される文書の完全な書誌データ（それらの開示は引用することにより組み込まれる）は、それとは反対に示されない場合は、後に続くとおりである。
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本明細書、特許請求の範囲および／若しくは図面に開示される本発明の特徴は、個別におよびそれらのいずれかの組合せの双方で、本発明をその多様な形態で実現するための材料であり得る。なお、本発明の主たる特徴または態様は以下のとおりである。
態様１：１Ａ型核酸、１Ｂ型核酸、２型核酸、３型核酸、４型核酸、および配列番号８７ないし１１５のいずれかの核酸配列を有する核酸を含んでなる群から選択される、好ましくはＭＣＰ−１に結合する核酸。
態様２：１Ａ型核酸が、５’→３’の方向に、第一の伸長ボックスＢ１Ａ、第二の伸長ボックスＢ２、第三の伸長ボックスＢ３、第四の伸長ボックスＢ４、第五の伸長ボックスＢ５、第六の伸長ボックスＢ６および第七の伸長ボックスＢ１Ｂを含んでなり、
第一の伸長ボックスＢ１Ａおよび第七の伸長ボックスＢ１Ｂは場合によっては相互とハイブリダイズし、それによりハイブリダイゼーションに際して二本鎖構造が形成され、
第一の伸長ボックスＢ１ＡはＡＧＣＲＵＧのヌクレオチド配列を含んでなり、
第二の伸長ボックスＢ２はＣＣＣＧＧＷのヌクレオチド配列を含んでなり、
第三の伸長ボックスＢ３はＧＵＲのヌクレオチド配列を含んでなり、
第四の伸長ボックスＢ４はＲＹＡのヌクレオチド配列を含んでなり、
第五の伸長ボックスＢ５はＧＧＧＧＧＲＣＧＣＧＡＹＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
第六の伸長ボックスＢ６はＵＧＣＡＡＵＡＡＵＧ若しくはＵＲＹＡＷＵＵＧのヌクレオチド配列を含んでなり、および
第七の伸長ボックスＢ１ＢはＣＲＹＧＣＵのヌクレオチド配列を含んでなる、
態様１に記載の核酸。
態様３：第一の伸長ボックスＢ１ＡがＡＧＣＧＵＧのヌクレオチド配列を含んでなる、態様２に記載の核酸。
態様４：第二の伸長ボックスＢ２がＣＣＣＧＧＵのヌクレオチド配列を含んでなる、態様２若しくは３に記載の核酸。
態様５：第三の伸長ボックスＢ３がＧＵＧのヌクレオチド配列を含んでなる、
態様２ないし４のいずれかに記載の核酸。
態様６：第四の伸長ボックスＢ４がＧＵＡのヌクレオチド配列を含んでなる、
態様２ないし５のいずれかに記載の核酸。
態様７：第五の伸長ボックスＢ５がＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＡＣＣのヌクレオチド配列を含んでなる、態様２ないし６のいずれかに記載の核酸。
態様８：第六の伸長ボックスＢ６がＵＡＣＡＵＵＵＧのヌクレオチド配列を含んでなる、態様２ないし７のいずれかに記載の核酸。
態様９：第七の伸長ボックスＢ１ＢがＣＡＣＧＣＵのヌクレオチド配列を含んでなる、態様２ないし８のいずれかに記載の核酸。
態様１０：核酸が配列番号２１の核酸配列を含んでなる、態様２ないし９のいずれかに記載の核酸。
態様１１：１Ｂ型核酸が、５’→３’の方向に、第一の伸長ボックスＢ１Ａ、第二の伸長ボックスＢ２、第三の伸長ボックスＢ３、第四の伸長ボックスＢ４、第五の伸長ボックスＢ５、第六の伸長ボックスＢ６および第七の伸長ボックスＢ１Ｂを含んでなり、
第一の伸長ボックスＢ１Ａおよび第七の伸長ボックスＢ１Ｂは場合によっては相互とハイブリダイズし、それによりハイブリダイゼーションに際して二本鎖構造が形成され、
第一の伸長ボックスＢ１ＡはＡＧＹＲＵＧのヌクレオチド配列を含んでなり、
第二の伸長ボックスＢ２はＣＣＡＧＣＵ若しくはＣＣＡＧＹのヌクレオチド配列を含んでなり、
第三の伸長ボックスＢ３はＧＵＧのヌクレオチド配列を含んでなり、
第四の伸長ボックスＢ４はＡＵＧのヌクレオチド配列を含んでなり、
第五の伸長ボックスＢ５はＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＡＣＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
第六の伸長ボックスＢ６はＣＡＵＵＵＵＡ若しくはＣＡＵＵＵＡのヌクレオチド配列を含んでなり、および
第七の伸長ボックスＢ１ＢはＣＡＹＲＣＵのヌクレオチド配列を含んでなる、
態様１に記載の核酸。
態様１２：第一の伸長ボックスＢ１ＡがＡＧＣＧＵＧのヌクレオチド配列を含んでなる、態様１１に記載の核酸。
態様１３：第二の伸長ボックスＢ２がＣＣＡＧＵのヌクレオチド配列を含んでなる、態様１１若しくは１２に記載の核酸。
態様１４：第六の伸長ボックスＢ６がＣＡＵＵＵＵＡのヌクレオチド配列を含んでなる、態様１１ないし１３のいずれかに記載の核酸。
態様１５：第七の伸長ボックスＢ１ＢがＣＡＣＧＣＵのヌクレオチド配列を含んでなる、態様１１ないし１４のいずれかに記載の核酸。
態様１６：核酸が、配列番号２８および配列番号２７の核酸配列を含んでなる、態様１１ないし１５のいずれかに記載の核酸。
態様１７：２型核酸が、５’→３’の方向に、第一の伸長ボックスＢ１Ａ、第二の伸長ボックスＢ２および第三の伸長ボックスＢ１Ｂを含んでなり、
第一の伸長ボックスＢ１Ａおよび第三の伸長ボックスＢ１Ｂは場合によっては相互とハイブリダイズし、それによりハイブリダイゼーションに際して二本鎖構造が形成され、
第一の伸長ボックスＢ１Ａは、ＡＣＧＣＡ、ＣＧＣＡおよびＧＣＡを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、
第二の伸長ボックスＢ２はＣＳＵＣＣＣＵＣＡＣＣＧＧＵＧＣＡＡＧＵＧＡＡＧＣＣＧＹＧＧＣＵＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
第三の伸長ボックスＢ１Ｂは、ＵＧＣＧＵ、ＵＧＣＧおよびＵＧＣを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、
態様１に記載の核酸。
態様１８：第二の伸長ボックスＢ２がＣＧＵＣＣＣＵＣＡＣＣＧＧＵＧＣＡＡＧＵＧＡＡＧＣＣＧＵＧＧＣＵＣのヌクレオチド配列を含んでなる、態様１７に記載の核酸。
態様１９：ａ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＡＣＧＣＡのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第三の伸長ボックスＢ１ＢがＵＧＣＧＵのヌクレオチド配列を含んでなるか；または
ｂ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＣＧＣＡのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第三の伸長ボックスＢ１ＢがＵＧＣＧのヌクレオチド配列を含んでなるか；または
ｃ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＧＣＡのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第三の伸長ボックスＢ１ＢがＵＧＣ若しくはＵＧＣＧのヌクレオチド配列を含んでなる、態様１７若しくは１８のいずれかに記載の核酸。
態様２０：第一の伸長ボックスＢ１ＡがＧＣＡのヌクレオチド配列を含んでなる、態様１７ないし１９のいずれかに記載の核酸。
態様２１：第三の伸長ボックスＢ１ＢがＵＧＣＧのヌクレオチド配列を含んでなる、態様１７ないし２０のいずれか、および好ましくは請求項２０に記載の核酸。
態様２２：核酸が、配列番号３７、配列番号１１６、配列番号１１７および配列番号２７８の核酸配列を含んでなる、態様１７ないし２１のいずれかに記載の核酸。
態様２２：３型核酸が、５’→３’の方向で、第一の伸長ボックスＢ１Ａ、第二の伸長ボックスＢ２Ａ、第三の伸長ボックスＢ３、第四の伸長ボックスＢ２Ｂ、第五の伸長ボックスＢ４、第六の伸長ボックスＢ５Ａ、第七の伸長ボックスＢ６、第八の伸長ボックスＢ５Ｂおよび第九の伸長ボックスＢ１Ｂを含んでなり、
第一の伸長ボックスＢ１Ａおよび第九の伸長ボックスＢ１Ｂは場合によっては相互とハイブリダイズし、それによりハイブリダイゼーションに際して二本鎖構造が形成され、
第二の伸長ボックスＢ２Ａおよび第四のボックスＢ２Ｂは場合によっては相互とハイブリダイズし、それによりハイブリダイゼーションに際して二本鎖構造が形成され、
第六の伸長ボックスＢ５Ａおよび第八のボックスＢ５Ｂは場合によっては相互とハイブリダイズし、それによりハイブリダイゼーションに際して二本鎖構造が形成され、
第一の伸長ボックスＢ１Ａは、ＧＵＲＣＵＧＣ、ＧＫＳＹＧＣ、ＫＢＢＳＣおよびＢＮＧＣを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、
第二の伸長ボックスＢ２ＡはＧＫＭＧＵのヌクレオチド配列を含んでなり、
第三の伸長ボックスＢ３はＫＲＲＡＲのヌクレオチド配列を含んでなり、
第四の伸長ボックスＢ２ＢはＡＣＫＭＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
第五の伸長ボックスＢ４は、ＣＵＲＹＧＡ、ＣＵＷＡＵＧＡ、ＣＷＲＭＧＡＣＷおよびＵＧＣＣＡＧＵＧを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、
第六の伸長ボックスＢ５Ａは、ＧＧＹおよびＣＷＧＣを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、
第七の伸長ボックスＢ６は、ＹＡＧＡ、ＣＫＡＡＵおよびＣＣＵＵＵＡＵを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、
第八の伸長ボックスＢ５Ｂは、ＧＣＹＲおよびＧＣＷＧを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、ならびに
第九の伸長ボックスＢ１Ｂは、ＧＣＡＧＣＡＣ、ＧＣＲＳＭＣ、ＧＳＶＶＭおよびＧＣＮＶを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、
態様１に記載の核酸。
態様２４：第三の伸長ボックスＢ３がＧＡＧＡＡ若しくはＵＡＡＡＡのヌクレオチド配列を含んでなる、態様２３に記載の核酸。
態様２５：第五の伸長ボックスＢ４がＣＡＧＣＧＡＣＵ若しくはＣＡＡＣＧＡＣＵのヌクレオチド配列を含んでなる、態様２３若しくは２４に記載の核酸。
態様２６：第五の伸長ボックスＢ４がＣＡＧＣＧＡＣＵのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ、ボックスＢ３がＵＡＡＡＡのヌクレオチド配列を含んでなる、
態様２３ないし２５のいずれかに記載の核酸。
態様２７：第五の伸長ボックスＢ４がＣＡＡＣＧＡＣＵのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ、第三の伸長ボックスＢ３がＧＡＧＡＡのヌクレオチド配列を含んでなる、態様２３ないし２５のいずれかに記載の核酸。
態様２８：第七の伸長ボックスＢ６がＵＡＧＡのヌクレオチド配列を含んでなる、態様２３ないし２７のいずれかに記載の核酸。
態様２９：ａ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＧＵＲＣＵＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢがＧＣＡＧＣＡＣのヌクレオチド配列を含んでなるか；若しくは
ｂ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＧＫＳＹＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢがＧＣＲＳＭＣのヌクレオチド配列を含んでなるか；若しくは
ｃ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＫＢＢＳＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢがＧＳＶＶＭのヌクレオチド配列を含んでなるか；若しくは
ｄ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＢＮＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、
かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢがＧＣＮＶのヌクレオチド配列を含んでなる
態様２３ないし２８のいずれかに記載の核酸。
態様３０：ａ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＧＵＧＣＵＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢがＧＣＡＧＣＡＣのヌクレオチド配列を含んでなるか；若しくは
ｂ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＧＵＧＣＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢがＧＣＧＣＡＣのヌクレオチド配列を含んでなるか；若しくは
ｃ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＫＫＳＳＣのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢがＧＳＳＭＭのヌクレオチド配列を含んでなるか；若しくは
ｄ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＳＮＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢがＧＣＮＳのヌクレオチド配列を含んでなる、
態様２９に記載の核酸。
態様３１：第一の伸長ボックスＢ１ＡがＧＧＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第九の伸長ボックスＢ１ＢがＧＣＣＣのヌクレオチド配列を含んでなる、
態様３０に記載の核酸。
態様３２：第二の伸長ボックスＢ２ＡがＧＫＭＧＵのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ、第四の伸長ボックスＢ２ＢがＡＣＫＭＣのヌクレオチド配列を含んでなる、態様２３ないし３１のいずれかに記載の核酸。
態様３３：第二の伸長ボックスＢ２ＡがＧＵＡＧＵのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ、第四の伸長ボックスＢ２ＢがＡＣＵＡＣのヌクレオチド配列を含んでなる、態様３２に記載の核酸。
態様３４：ａ）第六の伸長ボックスＢ５ＡがＧＧＹのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第八の伸長ボックスＢ５ＢがＧＣＹＲのヌクレオチド配列を含んでなるか；若しくは
ｂ）第六の伸長ボックスＢ５ＡがＣＷＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第八の伸長ボックスＢ５ＢがＧＣＷＧのヌクレオチド配列を含んでなる、
態様２３ないし３３のいずれかに記載の核酸。
態様３５：第六の伸長ボックスＢ５ＡがＧＧＣのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第八の伸長ボックスＢ５ＢがＧＣＣＧのヌクレオチド配列を含んでなる、
態様３４に記載の核酸。
態様３６：第六の伸長ボックスＢ５Ａが、第八の伸長ボックスＢ５ＢのヌクレオチドＧＣＹとハイブリダイズする、態様２３ないし３５、好ましくは３４ないし３５のいずれかに記載の核酸。
態様３７：核酸が配列番号５６に記載の核酸配列を含んでなる、態様２３ないし２６および２８ないし３６のいずれかに記載の核酸。
態様３８：核酸が、配列番号５７ないし６１、配列番号６７ないし７１および配列番号７３の核酸配列を含んでなる群から選択される核酸配列を含んでなる、態様２３ないし２５および２７ないし３６のいずれかに記載の核酸。
態様３９：４型核酸が、５’→３’の方向で、第一の伸長ボックスＢ１Ａ、第二の伸長ボックスＢ２、第三の伸長ボックスＢ１Ｂを含んでなり、
第一の伸長ボックスＢ１Ａおよび第三の伸長ボックスＢ１Ｂは場合によっては相互とハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションに際して二本鎖構造が形成され、
第一の伸長ボックスＢ１Ａは、ＡＧＣＧＵＧＤＵ、ＧＣＧＣＧＡＧ、ＣＳＫＳＵＵ、ＧＵＧＵＵおよびＵＧＵＵを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、
第二の伸長ボックスＢ２は、ＡＧＮＤＲＤＧＢＫＧＧＵＲＧＹＡＲＧＵＡＡＡＧ、ＡＧＧＵＧＧＧＵＧＧＵＡＧＵＡＡＧＵＡＡＡＧおよびＣＡＧＧＵＧＧＧＵＧＧＵＡＧＡＡＵＧＵＡＡＡＧＡを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、ならびに
第三の伸長ボックスＢ１Ｂは、ＧＮＣＡＳＧＣＵ、ＣＵＣＧＣＧＵＣ、ＧＲＳＭＳＧ、ＧＲＣＡＣおよびＧＧＣＡを含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、態様１に記載の核酸。
態様４０：ａ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＧＵＧＵＵのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第三の伸長ボックスＢ１ＢがＧＲＣＡＣのヌクレオチド配列を含んでなり；
ｂ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＧＣＧＣＧＡＧのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第三の伸長ボックスＢ１ＢがＣＵＣＧＣＧＵＣのヌクレオチド配列を含んでなるか；若しくは
ｃ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＣＳＫＳＵＵのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第三の伸長ボックスＢ１ＢがＧＲＳＭＳＧのヌクレオチド配列を含んでなるか、若しくは
ｄ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＵＧＵＵのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第三の伸長ボックスＢ１ＢがＧＧＣＡのヌクレオチド配列を含んでなるか、若しくは
ｅ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＡＧＣＧＵＧＤＵのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
第三の伸長ボックスＢ１ＢがＧＮＣＡＳＧＣＵのヌクレオチド配列を含んでなる、
態様３９に記載の核酸。
態様４１：第一の伸長ボックスＢ１ＡがＣＳＫＳＵＵのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ、第三の伸長ボックスＢ１ＢがＧＲＳＭＳＧのヌクレオチド配列を含んでなる、態様４０に記載の核酸。
態様４２：第一の伸長ボックスＢ１ＡがＣＣＧＣＵＵのヌクレオチド配列を含んでなり、かつ、第三の伸長ボックスＢ１ＢがＧＧＧＣＧＧのヌクレオチド配列を含んでなる、態様４１に記載の核酸。
態様４３：第二の伸長ボックスＢ２がＡＧＧＵＧＧＧＵＧＧＵＡＧＵＡＡＧＵＡＡＡＧのヌクレオチド配列を含んでなる、態様３９ないし４２のいずれかに記載の核酸。
態様４４：核酸が配列番号８０の核酸配列を含んでなる、態様３９ないし４３のいずれかに記載の核酸。
態様４５：核酸がケモカインを結合することが可能であり、該ケモカインがエオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、態様１ないし４４のいずれかに記載の核酸。
態様４６：核酸がケモカインを結合することが可能であり、該ケモカインがヒトエオタキシン、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２およびヒトＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、態様１ないし４５のいずれかに記載の核酸。
態様４７：核酸がＭＣＰ−１を結合することが可能であり、ＭＣＰ−１が好ましくはサルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１、ブタＭＣＰ−１およびヒトＭＣＰ−１を含んでなる群から選択される、態様１ないし４６のいずれかに記載の核酸。
態様４８：核酸がヒトＭＣＰ−１を結合することが可能である、態様１ないし４７のいずれかに記載の核酸。
態様４９：ＭＣＰ−１が配列番号１のアミノ酸配列を有する、態様１ないし４８のいずれか、好ましくは態様４８に記載の核酸。
態様５０：核酸が配列番号１２２、配列番号２５３および配列番号２５４の核酸配列を含んでなる、好ましくはマウスＭＣＰ−１に結合する核酸。
態様５１：核酸が配列番号１２７の核酸配列を含んでなる、好ましくはマウスＭＣＰ−１に結合する核酸。
態様５２：マウスＭＣＰ−１が配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる、態様５０若しくは５１に記載の核酸。
態様５３：核酸が修飾を含んでなり、該修飾が好ましくは高分子部分であり、かつ／または該修飾が、好ましくは、動物若しくはヒト身体、好ましくはヒト身体中の滞留時間に関して態様１ないし５２のいずれかに記載の核酸の特徴を改変することを可能にする、態様１ないし５２のいずれかに記載の核酸。
態様５４：修飾がＨＥＳ部分およびＰＥＧ部分を含んでなる群から選択される、態様５３に記載の核酸。
態様５５：修飾が直鎖若しくは分枝状ＰＥＧよりなるＰＥＧ部分であり、該ＰＥＧ部分の分子量が好ましくは約２０から１２０ｋＤまで、より好ましくは約３０から８０ｋＤまで、および最も好ましくは約４０ｋＤである、態様５４に記載の核酸。
態様５６：修飾がＨＥＳ部分であり、好ましくは該ＨＥＳ部分の分子量が約１０から１３０ｋＤまで、より好ましくは約３０から１３０ｋＤまで、および最も好ましくは約１００ｋＤである、態様５４に記載の核酸。
態様５７：修飾がリンカーを介して核酸に結合される、態様５３ないし５６のいずれかに記載の核酸。
態様５８：修飾が、その５’末端ヌクレオチドおよび／若しくはその３’末端ヌクレオチドの核酸に、ならびに／または５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドの間の核酸のヌクレオチドに結合される、態様５３ないし５７のいずれかに記載の核酸。
態様５９：核酸のヌクレオチド若しくはそれを形成するヌクレオチドがＬ−ヌクレオチドである、態様１ないし５８のいずれかに記載の核酸。
態様６０：核酸がＬ−核酸である、態様１ないし５９のいずれかに記載の核酸。
態様６１：ＭＣＰ−１を結合することが可能な核酸の部分がＬ−ヌクレオチドよりなる、態様１ないし５９のいずれかに記載の核酸。
態様６２：態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸、および場合によっては１種のさらなる構成要素を含んでなり、該さらなる構成要素は、製薬学的に許容できる賦形剤、製薬学的に許容できる担体および製薬学的有効成分を含んでなる群から選択される、製薬学的組成物。
態様６３：製薬学的組成物が、態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸および製薬学的に許容できる担体を含んでなる、態様６２に記載の製薬学的組成物。
態様６４：医薬品の製造のための、態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸の使用。
態様６５：医薬品が、ヒト医学での使用のため、若しくは獣医学での使用のためである、態様６４に記載の使用。
態様６６：診断手段の製造のための、態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸の使用。
態様６７：医薬品が、炎症性疾患、自己免疫疾患、自己免疫性脳脊髄炎、卒中、急性および慢性多発性硬化症、慢性炎症、関節リウマチ、腎疾患、再狭窄、血管形成術後の再狭窄、急性および慢性アレルギー反応、一次的および二次的免疫学的若しくはアレルギー反応、喘息、結膜炎、気管支炎、癌、アテローム硬化症、アテローム硬化性心血管系心不全若しくは卒中、乾癬、乾癬性関節炎、神経系の炎症、アトピー性皮膚炎、大腸炎、子宮内膜症、ブドウ膜炎、黄斑変性を包含する網膜障害、網膜剥離、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜色素変性、増殖性硝子体網膜症、および中心性漿液性網脈絡膜症；特発性肺線維症、サルコイドーシス、多発性筋炎、皮膚筋炎、免疫抑制の回避、感染症のリスクを低下させること、敗血症、腎の炎症、糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、閉塞性腎症、急性尿細管壊死、およびびまん性糸球体硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性気管支炎、ベーチェット病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、川崎病後の早発性アテローム硬化症、心筋梗塞、肥満、慢性肝疾患、ペイロニー病、急性脊髄損傷、肺若しくは腎移植、心筋炎、アルツハイマー病およびニューロパシー、乳癌、胃癌、膀胱癌、卵巣癌、過誤腫、結腸直腸癌、結腸腺腫、膵炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ならびにクローン病若しくは潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患を含んでなる群から選択される疾患若しくは障害の処置および／若しくは予防のためである、態様６４若しくは６５に記載の使用。
態様６８：ケモカイン、および態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸を含んでなる複合体であって、該ケモカインが、エオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択され、好ましくは該複合体が結晶性複合体である、上記複合体。
態様６９：ケモカインが、ヒトエオタキシン、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２およびヒトＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、態様６８に記載の複合体。
態様７０：ケモカインがＭＣＰ−１であり、ＭＣＰ−１が、好ましくはヒトＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１およびブタＭＣＰ−１を含んでなる群から選択され、より好ましくはＭＣＰ−１はヒトＭＣＰ−１である、態様６８若しくは６９に記載の複合体。
態様７１：ケモカインの検出のための態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸の使用であって、該ケモカインがエオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、上記使用。
態様７２：ケモカインが、ヒトエオタキシン、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２およびヒトＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、態様７１に記載の使用。
態様７３：ケモカインがＭＣＰ−１であり、ＭＣＰ−１が好ましくはヒトＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１およびブタＭＣＰ−１を含んでなる群から選択され、より好ましくはＭＣＰ−１はヒトＭＣＰ−１である、態様７１若しくは７２に記載の使用。
態様７４：以下の段階：
・候補ケモカインアンタゴニストおよび／若しくは候補ケモカインアゴニストを提供する段階、
・態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸を提供する段階、
・ケモカインアンタゴニストおよび／若しくはケモカインアゴニストの存在下でシグナルを提供する試験系を提供する段階、ならびに
・候補ケモカインアンタゴニストがケモカインアンタゴニストであるかどうか、および／若しくは候補ケモカインアゴニストがケモカインアゴニストであるかどうかを決定する段階を含んでなり、
該ケモカインはエオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、
ケモカインアンタゴニスト若しくはケモカインアゴニストのスクリーニング方法。
態様７５：ケモカインが、ヒトエオタキシン、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２およびヒトＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、態様７４に記載の方法。
態様７６：ケモカインがＭＣＰ−１であり、ＭＣＰ−１が好ましくはヒトＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１およびブタＭＣＰ−１を含んでなる群から選択され、より好ましくはＭＣＰ−１はヒトＭＣＰ−１である、態様７４若しくは７５に記載の方法。
態様７７：以下の段階：
・相、好ましくは固相に固定されたケモカインを提供する段階、
・標識されている、態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸、好ましくは態様１ないし５２のいずれかに記載の核酸を提供する段階、
・候補ケモカインアゴニストおよび／若しくは候補ケモカインアンタゴニストを添加する段階、ならびに
・候補ケモカインアゴニストがケモカインアゴニストであるかどうか、および／若しくは候補ケモカインアンタゴニストがケモカインアンタゴニストであるかどうかを決定する段階
を含んでなり、
該ケモカインはエオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、
ケモカインアゴニストおよび／若しくはケモカインアンタゴニストのスクリーニング方法。
態様７８：核酸が候補ケモカインアゴニスト若しくは候補ケモカインアンタゴニストにより置換されるかどうかが評価されるような該決定することが実施される、態様７７に記載の方法。
態様７９：ケモカインが、ヒトエオタキシン、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２およびヒトＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、態様７７若しくは７８に記載の方法。
態様８０：ケモカインがＭＣＰ−１であり、ＭＣＰ−１が好ましくはヒトＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１およびブタＭＣＰ−１を含んでなる群から選択され、より好ましくはＭＣＰ−１はヒトＭＣＰ−１である、態様７７ないし７９のいずれかに記載の方法。
態様８１：態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸を含んでなる、ケモカインの検出のためのキットであって、該ケモカインはエオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、上記キット。
態様８２：ケモカインが、ヒトエオタキシン、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２およびヒトＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、態様８１に記載のキット。
態様８３：ケモカインがＭＣＰ−１であり、ＭＣＰ−１が好ましくはヒトＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１およびブタＭＣＰ−１を含んでなる群から選択され、より好ましくはＭＣＰ−１はヒトＭＣＰ−１である、態様８１若しくは８２に記載のキット。
態様８４：ケモカインが、エオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、態様７４ないし８０のいずれかに記載の方法により得ることが可能なケモカインアンタゴニスト。
態様８５：ケモカインが、ヒトエオタキシン、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２およびヒトＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、態様８４に記載のケモカインアンタゴニスト。
態様８６：ケモカインがＭＣＰ−１であり、ＭＣＰ−１が好ましくはヒトＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１およびブタＭＣＰ−１を含んでなる群から選択され、より好ましくはＭＣＰ−１はヒトＭＣＰ−１である、態様８４若しくは８５に記載のケモカインアンタゴニスト。
態様８７：ケモカインが、エオタキシン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、態様７４ないし８０のいずれかに記載の方法により得ることが可能なケモカインアゴニスト。
態様８８：ケモカインが、ヒトエオタキシン、ヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２およびヒトＭＣＰ−３を含んでなる群から選択される、態様８７に記載のケモカインアゴニスト。
態様８９：ケモカインがＭＣＰ−１であり、ＭＣＰ−１が好ましくはヒトＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ウマＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、ウシＭＣＰ−１、イヌＭＣＰ−１およびブタＭＣＰ−１を含んでなる群から選択され、より好ましくはＭＣＰ−１はヒトＭＣＰ−１である、態様８７若しくは８８に記載のケモカインアゴニスト。
態様９０：サンプル中の態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸の検出方法であって、該検出方法が：
ｆ）本発明の核酸を含有するサンプルを提供する段階；
ｇ）捕捉プローブ（該捕捉プローブは態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸の第一の部分に少なくとも部分的に相補的であり）、および検出プローブ（該検出プローブは態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸の第二の部分に少なくとも部分的に相補的であるか、若しくは、あるいは、該捕捉プローブは態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸の第二の部分に少なくとも部分的に相補的であり、かつ、該検出プローブは態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸の第一の部分に少なくとも部分的に相補的である）を提供する段階；
ｈ）捕捉プローブおよび検出プローブを、同時に若しくはいずれかの順序で連続してのいずれかで、態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸若しくはその部分と反応させる段階；
ｉ）場合によっては、捕捉プローブが、段階ａ）で提供される態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸に従った核酸にハイブリダイズするかどうかを検出する段階；ならびに
ｊ）態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸、ならびに捕捉プローブおよび検出プローブよりなる段階ｃ）で形成される複合体を検出する段階
を含んでなる、上記方法。
態様９１：検出プローブが検出手段を含んでなり、かつ／若しくは捕捉プローブが支持体、好ましくは固体支持体に固定され得る、態様９０に記載の方法。
態様９２：複合体の一部でないいかなる検出プローブも、段階ｅ）で複合体の一部である検出プローブのみが検出されるように反応から除去される、態様９０若しくは９１に記載の方法。
態様９３：段階ｅ）が、態様１ないし６１のいずれかに記載の核酸若しくはその部分の存在下および前記核酸若しくはその部分の非存在下で捕捉プローブおよび検出プローブがハイブリダイズされる場合に検出手段により生成されるシグナルを比較する段階を含んでなる、態様９０ないし９２のいずれかに記載の方法。
態様９４：検出されるべき核酸が、配列番号３７、１１６、１１７若しくは２７８の核酸配列を有する核酸であり、かつ、捕捉プローブ若しくは検出プローブが、配列番号２５５若しくは配列番号２５６の核酸配列を含んでなる、態様９０ないし９３のいずれかに記載の方法。
態様９５：検出されるべき核酸が、配列番号１２２、２５３若しくは２５４の核酸配列を有する核酸であり、かつ、捕捉プローブ若しくは検出プローブが、配列番号２８１および配列番号２８２の核酸配列を含んでなる、態様９０ないし９３のいずれかに記載の方法。
本発明は、図面、実施例および配列表によりさらに具体的に説明され、それらからさらなる特徴、態様および利点を捉えることができ、ここで
好ましい一態様においてヒトＭＣＰ−１への結合にそっくりそのまま不可欠である配列モチーフ（「１Ａ型」）を示すヒトＭＣＰ−１に結合する関係するＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す。 好ましい一態様においてヒトＭＣＰ−１への結合にそっくりそのまま不可欠である配列モチーフ（「１Ｂ型」）を示すヒトＭＣＰ−１に結合する関係するＲＮＡリガンド、およびＲＮＡリガンド１８０−Ｄ１−００２の誘導体の配列のアライメントを示す。 好ましい一態様においてヒトＭＣＰ−１への結合にそっくりそのまま不可欠である配列モチーフ（「２型」）を示すヒトＭＣＰ−１に結合する関係するＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す。 好ましい一態様においてヒトＭＣＰ−１への結合にそっくりそのまま不可欠である配列モチーフ（「３型」）を示すヒトＭＣＰ−１に結合する関係するＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す。 ＲＮＡリガンド１７８−Ｄ５および１８１−Ａ２（配列モチーフ「３型」のヒトＭＣＰ−１ ＲＮＡリガンド）の誘導体を示す。 好ましい一態様においてヒトＭＣＰ−１（他配列）への結合にそっくりそのまま不可欠である配列モチーフ（「４型」）を示すヒトＭＣＰ−１に結合する関係するＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す。 ＭＣＰ−１結合配列モチーフ「１Ａ型」、「１Ｂ型」、「２型」、「３型」若しくは「４型」に関係し得ないヒトＭＣＰ−１に結合する数種の異なるＲＮＡリガンドの配列の表を示す。 マウスＭＣＰ−１に結合するＲＮＡリガンド１８８−Ａ３−００１および１８９−Ｇ７−００１の誘導体のアライメントを示す。 ビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１の濃度にわたるアプタマーの結合として表される、室温および３７℃でのビオチニル化ヒトＤ−ＭＣＰ−１へのアプタマーＤ−ＮＯＸ−Ｅ３６の結合分析の結果を示す。 ビオチニル化マウスＤ−ＭＣＰ−１の濃度にわたるアプタマーの結合として表される、３７℃でのビオチニル化マウスＤ−ＭＣＰ−１へのアプタマーＤ−ｍＮＯＸ−Ｅ３６の結合分析の結果を示す。 ヒトＭＣＰ−１の濃度にわたるブランクに対する蛍光の差違として表される、ＴＨＰ−１細胞でのＭＣＰ−１誘発性のＣａ＋＋放出を示す一方で、およそ３ｎＭの半有効濃度（ＥＣ５０）を示すヒトＭＣＰ−１の用量応答曲線が得られた。 カルシウム放出アッセイでのシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６の有効性を示し；細胞を多様な量のシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６と３７℃で前インキュベートした３ｎＭヒトＭＣＰ−１で刺激し、ＮＯＸ−Ｅ３６の濃度にわたる対照の割合として表した。 カルシウム放出アッセイのシュピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６の有効性を示し；細胞を多様な量のシュピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６と３７℃で前インキュベートした５ｎＭマウスＭＣＰ−１で刺激し、ｍＮＯＸ−Ｅ３６の濃度にわたる対照の割合として表した。 ヒトＭＣＰ−１の濃度にわたる対照に比較したＸ倍増大として表される、ＴＨＰ−１細胞のヒトＭＣＰ−１誘発性の走化性を示す一方で、多様なＭＣＰ−１濃度へのＴＨＰ−１細胞の３時間の移動後にＭＣＰ−１の用量応答曲線が得られた。 走化性アッセイにおけるシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６の有効性を示し；細胞を多様な量のシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６と３７℃で前インキュベートした０．５ｎＭヒトＭＣＰ−１に移動させ、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６の濃度にわたる対照の割合として表した。 走化性アッセイにおけるシュピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６の有効性を示し；細胞を多様な量のシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６と３７℃で前インキュベートした０．５ｎＭマウスＭＣＰ−１に移動させ、シュピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６の濃度にわたる対照の割合として表した。 時間にわたる応答（ＲＵ）として表した、アミンカップリング処置によりＰｉｏｎｅｅｒＦ１センサーチップに固定したヒトＭＣＰ−１へのシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６の結合のＫＤ値を示すＢｉａｃｏｒｅ ２０００センサー図を示す。 時間にわたる応答（ＲＵ）として表した、アミンカップリング処置によりそれぞれＰｉｏｎｅｅｒＦ１およびＣＭ４センサーチップに固定したヒトＭＣＰファミリータンパク質（ｈｕＭＣＰ−１、ｈｕＭＣＰ−２、ｈｕＭＣＰ−３）およびヒトエオタキシンへのシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６の結合を示すＢｉａｃｏｒｅ ２０００センサー図を示す。 時間にわたる応答（ＲＵ）として表した、異なる形態のＭＣＰ−１をアミンカップリング処置によりＰｉｏｎｅｅｒＦ１およびＣＭ４センサーチップに固定した一方で、多様な種からのＭＣＰ−１（イヌＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−１、ブタＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、マウスＭＣＰ−１、ラットＭＣＰ−１）へのシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６の結合を示すＢｉａｃｏｒｅ ２０００センサー図を示す。 時間にわたる応答（ＲＵ）として表した、アミンカップリング処置によりＣＭ４センサーチップに固定したヒトＭＣＰ−１へのシュピーゲルマー１８１−Ａ２−０１８の結合のＫＤ値を示すＢｉａｃｏｒｅ ２０００センサー図を示す。 時間にわたる応答（ＲＵ）として表した、アミンカップリング処置によりそれぞれＰｉｏｎｅｅｒＦ１およびＣＭ４センサーチップに固定したヒトＭＣＰファミリータンパク質（ｈｕＭＣＰ−１、ｈｕＭＣＰ−２、ｈｕＭＣＰ−３）およびヒトエオタキシンへのシュピーゲルマー１８１−Ａ２−０１８の結合を示すＢｉａｃｏｒｅ ２０００センサー図を示す。 時間にわたる応答（ＲＵ）として表した、異なる形態のＭＣＰ−１をアミンカップリング処置によりそれぞれＰｉｏｎｅｅｒＦ１およびＣＭ４センサーチップに固定した一方で、多様な種からのＭＣＰ−１（イヌＭＣＰ−１、サルＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−１、ブタＭＣＰ−１、ウサギＭＣＰ−１、マウスＭＣＰ−１、ラットＭＣＰ−１）へのシュピーゲルマー１８１−Ａ２−０１８の結合を示すＢｉａｃｏｒｅ ２０００センサー図を示す。 多様な哺乳動物種からのＭＣＰ−１ならびにヒトＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３およびエオタキシンのＣｌｕｓｔａｌ Ｗアライメント（位置１〜７６のみ）を示す。 多様な哺乳動物種からのＭＣＰ−１ならびにヒトＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３およびエオタキシンに関するＮＯＸ−Ｅ３６および１８１−Ａ２−０１８の結合特異性を要約する表を示す。 Ｂｉａｃｏｒｅ分析により測定されたところのＮＯＸ−Ｅ３６の選択性を要約する表を示し、それにより、ビオチニル化ＮＯＸ−Ｅ３６をセンサーチップ表面に固定し、かつ、ＮＯＸ−Ｅ３６への多様なＣＣおよびＣＸＣケモカインの一団の結合を分析した。 Ｂｉａｃｏｒｅ分析により測定されたところのケモカインと相互作用するＮＯＸ−Ｅ３６の動態解析を示し、それにより、ケモカインをＣＭ５センサーチップ表面に共有固定し、そして多様な濃度のＮＯＸ−Ｅ３６を注入しかつＮＯＸ−Ｅ３６の結合挙動をＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して解析した。 約０．２ｎＭの半有効濃度をもつＭＩＰ−１αでのＴＨＰ−１細胞刺激の走化性の用量応答曲線を示す。 ＮＯＸ−Ｅ３６によるＭＩＰ−１α誘発性の走化性の阻害を示す。ＮＯＸ−Ｅ３６はＴＨＰ−１細胞のＭＩＰ１ａ誘発性の走化性に対する影響を有しなかった。 カルシウム放出アッセイでのシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの有効性を示し；細胞を、多様な量のシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧと３７℃で前インキュベートした３ｎＭヒトＭＣＰ−１で刺激し、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの濃度にわたる対照の割合として表した。 走化性アッセイでのシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの有効性を示し；細胞を、多様な量のシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧと３７℃で前インキュベートした０．５ｎＭヒトＭＣＰ−１に移動させ、ＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの濃度にわたる対照の割合として表した。 カルシウム放出アッセイでのシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−５’−ＰＥＧの有効性を示し；細胞を、多様な量のシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−５’−ＰＥＧと３７℃で前インキュベートした３ｎＭヒトＭＣＰ−１で刺激し、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−５’−ＰＥＧの濃度にわたる対照の割合として表した。 走化性アッセイでのシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−５’−ＰＥＧの有効性を示し；細胞を、多様な量のシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−５’−ＰＥＧと３７℃で前インキュベートした０．５ｎＭヒトＭＣＰ−１に移動させ、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６−５’−ＰＥＧの濃度にわたる対照の割合として表した。 マウスＭＣＰ−１の濃度にわたるブランクに対する蛍光の差違として表される、ＴＨＰ−１細胞でのマウスＭＣＰ−１誘発性のＣａ＋＋放出を示す一方で、およそ５ｎＭの半有効濃度（ＥＣ５０）を示すマウスＭＣＰ−１の用量応答曲線が得られた。 カルシウム放出アッセイにおける抗マウスＭＣＰ−１シュピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの有効性を示し；細胞を、多様な量のシュピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧと３７℃で前インキュベートした３ｎＭマウスＭＣＰ−１で刺激し、シュピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの濃度にわたる対照の割合として表した。 マウスＭＣＰ−１の濃度にわたる対照と比較したＸ倍増大として表される、ＴＨＰ−１細胞のマウスＭＣＰ−１誘発性の走化性を示す一方で、多様なｍＭＣＰ−１濃度へのＴＨＰ−１細胞の３時間の移動後にｍＭＣＰ−１の用量応答曲線が得られた。 走化性アッセイにおける抗マウスＭＣＰ−１シュピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの有効性を示し；細胞を、多様な量のシュピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧと３７℃で前インキュベートした０．５ｎＭマウスＭＣＰ−１に移動させ、抗マウスシュピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’−ＰＥＧの濃度にわたる対照の割合として表した。 時間にわたる応答（ＲＵ）として表した、アミンカップリング処置によりＰｉｏｎｅｅｒＦ１センサーチップに固定したマウスＤ−ＭＣＰ−１へのアプタマーＤ−ｍＮＯＸ−Ｅ３６の結合のＫＤ値を示すＢｉａｃｏｒｅ ２０００センサー図を示す。 時間にわたる応答（ＲＵ）として表した、２種の異なる形態のＤ−ＭＣＰ−１をアミンカップリング処置によりそれぞれＰｉｏｎｅｅｒＦ１およびＣＭ４センサーチップに固定した一方で、ヒトＤ−ＭＣＰ−１およびマウスＤ−ＭＣＰ−１へのアプタマーＤ−ｍＮＯＸ−Ｅ３６の結合を示すＢｉａｃｏｒｅ ２０００センサー図を示す。 示されるとおり過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）、Ｍａｃ−２（マクロファージ）およびＣＤ３（Ｔ細胞）に対する抗体で染色した、２４週齢ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの腎切片を示し；画像は各群の７〜１２マウスを代表する（元の拡大 ＰＡＳ：×１００、ＰＡＳ挿入図：×４００、Ｍａｃ２：×４００、ＣＤ３：×１００。 多様な群の２４週齢ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスでの腎機能パラメータおよび組織学的所見を具体的に説明する表を示す。 全群からのマウスの銀染色切片で実施した形態計測による組織学的変化の定量化を示し；Ａ、間質容量指標；Ｂ、尿細管拡張指標、およびＣ、尿細管細胞損傷指標は高倍率野の割合として計算し、そして平均±ＳＥＭとして表す。 Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析により計算されるところの多様な処置群のＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの生存を示す。 各群の５マウスからプールした全腎ＲＮＡを使用するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより決定されるところのＣＣケモカインＣＣＬ２およびＣＣＬ５の腎ｍＲＮＡ発現を示し、それによりマウスの各群のＲＮＡレベルはそれぞれの１８Ｓ ｒＲＮＡ発現により表す。 ｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧでの処置による肺の病状の低減を示し；肺組織は２４週齢の全群から調製しかつ半定量的に評価し；ｍＮＯＸ−Ｅ３６およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧでの処置はＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスで細気管支周囲の炎症を低下させ；画像は各群の７〜１１マウスを代表し；元の倍率×１００。 抗ｍＣＣＬ２シュピーゲルマー処置したマウス（右のマウス）でより少なく一般的であった、顔若しくは頚部領域で典型的に発生する、２４週齢ＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスの皮膚ループスの症状発現（左のマウス）を示す。 ２４週齢のＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスでの血清および組織学的所見を示す。 時間の関数としてのシュピーゲルマーｍＮＯＸ−Ｅ３６の血漿濃度として示される、試験の間の血漿中のＰＥＧ化および未ＰＥＧ化抗ｍＣＣＬ２シュピーゲルマーの薬物動態を示す。 ２４週齢のベヒクル若しくはｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ処置したＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスでの骨髄および末梢血でのＣＣＲ２についてのフローサイトメトリーを示し；データは各群５マウスの骨髄若しくは末梢血いずれか中のＣＣＲ２陽性細胞の平均割合±ＳＥＭとして示す。 示されるところの多様な時間点でＥＬＩＳＡにより測定されるところのＰｏＣ−ＰＥＧ（白棒）およびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−Ｐ）処置（黒棒）した１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスの血清ＣＣＬ２濃度を示し；＊、ＰｏＣ−ＰＥＧに対しｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−Ｐ）に対しｐ＜０．０５。 未処置またはＰＯＣ−ＰＥＧ若しくはむしろｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ処置したｄｂ／ｄｂマウスの糸球体および間質のＭａｃ−２およびＫｉ−６７陽性細胞の浸潤した数を示す。 ６月齢ｄｂ／ｄｂマウスでの糖尿病性糸球体硬化を示し；多様な群のマウスからの腎切片を過ヨウ素酸シッフで染色し、そして各腎切片からの１５個の糸球体を糸球体硬化の程度について評価し；画像は示されるところのそれぞれのスコアに等級付けされた代表的糸球体を示し、元の倍率４００×；グラフは各群の全マウス（ｎ＝７〜１０）からの各スコアの平均割合±ＳＥＭを具体的に説明し；＊、ＰｏＣ−ＰＥＧ（ＰｏＣ−Ｐ）処置した１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスに対しｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−Ｐ）についてｐ＜０．０５。 ６月齢のｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−Ｐ）およびＰｏＣ−ＰＥＧ（ＰｏＣ−Ｐ）処置した１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスでの糸球体濾過速度（ＧＦＲ）を示し；ＧＦＲは、試験の終了時に、ＰｏＣ−ＰＥＧおよびｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ処置した１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスの群でのＦＩＴＣ−イヌリンのクリアランスキネティクスにより決定した。 ６月齢ｄｂ／ｄｂマウスの尿細管萎縮および間質容量を示し；銀染色した腎切片の画像はそれぞれの群からの代表的腎を具体的に説明し（元の倍率１００×）；値は各群の７〜１０マウスからのそれぞれの形態計測分析指標の平均±ＳＥＭを表し；＊、ＢＫＳ野生型マウスに対し２Ｋ ｄｂ／ｄｂでｐ＜０．０５、＃、２Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスに対し１Ｋでｐ＜０．０５、†、ＰｏＣ−ＰＥＧ処置した１Ｋ ｄｂ／ｄｂマウスに対しｍＮＯＸ−Ｅ３６−３’ＰＥＧ（ｍＮＯＸ−Ｅ３６−ＰＥＧ）でｐ＜０．０５。 各群の６〜１０マウスからプールした全腎ＲＮＡを使用するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定されたところのｄｂ／ｄｂマウスにおける腎ＣＣＬ２ ｍＲＮＡ発現を示し；マウスの各群のｍＲＮＡレベルはそれぞれの１８Ｓ ｒＲＮＡ発現によりで表し、ならびに 免疫染色により測定されるところのｄｂ／ｄｂマウスの腎での空間的ＣＣＬ２発現を示し；画像は、示されるところのそれぞれの群の６月齢マウスからの腎の代表的切片を具体的に説明する（元の倍率、２００×）。

Claims (23)

  1. ＭＣＰ−１に結合するＬ−核酸であって、
    該核酸が、５’→３’の方向に、第一の伸長ボックスＢ１Ａ、第二の伸長ボックスＢ２および第三の伸長ボックスＢ１Ｂからなり、
    第一の伸長ボックスＢ１Ａは、ＡＣＧＣＡ、ＣＧＣＡおよびＧＣＡよりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
    第二の伸長ボックスＢ２はＣＳＵＣＣＣＵＣＡＣＣＧＧＵＧＣＡＡＧＵＧＡＡＧＣＣＧＹＧＧＣＵＣのヌクレオチド配列を含み、かつ、
    第三の伸長ボックスＢ１Ｂは、ＵＧＣＧＵ、ＵＧＣＧおよびＵＧＣよりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＬ−核酸。
  2. 第二の伸長ボックスＢ２がＣＧＵＣＣＣＵＣＡＣＣＧＧＵＧＣＡＡＧＵＧＡＡＧＣＣＧＵＧＧＣＵＣのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のＬ−核酸。
  3. ａ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＡＣＧＣＡのヌクレオチド配列を含み、
    かつ
    第三の伸長ボックスＢ１ＢがＵＧＣＧＵのヌクレオチド配列を含むか；または
    ｂ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＣＧＣＡのヌクレオチド配列を含み、
    かつ
    第三の伸長ボックスＢ１ＢがＵＧＣＧのヌクレオチド配列を含むか；または
    ｃ）第一の伸長ボックスＢ１ＡがＧＣＡのヌクレオチド配列を含み、
    かつ
    第三の伸長ボックスＢ１ＢがＵＧＣ若しくはＵＧＣＧのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のＬ−核酸。
  4. 第一の伸長ボックスがＧＣＡのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＬ−核酸。
  5. 第三の伸長ボックスがＵＧＣのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のＬ−核酸。
  6. 配列番号３７に示される核酸配列または該核酸配列に少なくとも９０％相同な核酸配列を含む、ことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のＬ−核酸。
  7. ケモカインを結合することが可能であり、かつ、該ケモカインがエオタキシン、ＭＣＰ−１およびＭＣＰ−２よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のＬ−核酸。
  8. ヒトＭＣＰ−１を結合することが可能であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−核酸。
  9. ＨＥＳ部分およびＰＥＧ部分よりなる群から選択される部分による修飾を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載のＬ−核酸。
  10. 修飾が直鎖若しくは分枝状ＰＥＧよりなる群から選択されるＰＥＧ部分によるものであり、かつ、該ＰＥＧ部分の分子量が２０から１２０ｋＤまでである、請求項９に記載のＬ−核酸。
  11. 配列番号１１６に示されるヌクレオチド配列および配列番号１１７に示されるヌクレオチド配列よりなる群から選択される配列を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のＬ−核酸。
  12. 修飾がＨＥＳ部分によるものであり、かつ、該ＨＥＳ部分の分子量が１０から１３０ｋＤまでであることを特徴とする、請求項９に記載のＬ−核酸。
  13. 第一の伸長ボックスおよび第三の伸長ボックスが任意に、相互にハイブリダイズすることにより、二本鎖構造が形成されていることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載のＬ−核酸。
  14. 請求項１〜１３のいずれかに記載のＬ−核酸、および１種のさらなる構成要素を含み、かつ、該さらなる構成要素が、製薬学的に許容できる賦形剤、製薬学的に許容できる担体および製薬学的有効成分よりなる群から選択されることを特徴とする、製薬学的組成物。
  15. 医薬品の製造のための、請求項１〜１３のいずれかに記載のＬ−核酸の使用。
  16. 医薬品が、炎症性疾患、自己免疫疾患、自己免疫性脳脊髄炎、卒中、急性および慢性多発性硬化症、慢性炎症、関節リウマチ、腎疾患、再狭窄、血管形成術後の再狭窄、急性および慢性アレルギー反応、一次的および二次的免疫学的若しくはアレルギー反応、喘息、結膜炎、気管支炎、癌、アテローム硬化症、アテローム硬化性心血管系心不全若しくは卒中、乾癬、乾癬性関節炎、神経系の炎症、アトピー性皮膚炎、大腸炎、子宮内膜症、ブドウ膜炎、黄斑変性を包含する網膜障害、網膜剥離、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜色素変性、増殖性硝子体網膜症、および中心性漿液性網脈絡膜症；特発性肺線維症、サルコイドーシス、多発性筋炎、皮膚筋炎、免疫抑制の回避、感染症のリスクを低下させること、敗血症、腎の炎症、糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、閉塞性腎症、急性尿細管壊死、およびびまん性糸球体硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性気管支炎、ベーチェット病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、川崎病後の早発性アテローム硬化症、心筋梗塞、肥満、慢性肝疾患、ペイロニー病、急性脊髄損傷、肺若しくは腎移植、心筋炎、アルツハイマー病およびニューロパシー、乳癌、胃癌、膀胱癌、卵巣癌、過誤腫、結腸直腸癌、結腸腺腫、膵炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ならびにクローン病若しくは潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患よりなる群から選択される疾患若しくは障害の処置および／若しくは予防のためのものであることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
  17. ケモカイン、および請求項１〜１３のいずれかに記載のＬ−核酸を含む複合体であって、該ケモカインが、エオタキシン、ＭＣＰ−１およびＭＣＰ−２よりなる群から選択されることを特徴する、複合体。
  18. ケモカインの検出のための試験キットであって、請求項１〜１３のいずれかに記載のＬ−核酸を含み、該ケモカインがエオタキシン、ＭＣＰ−１およびＭＣＰ−２よりなる群から選択されることを特徴とする、キット。
  19. 候補ケモカインアンタゴニストおよび／若しくは候補ケモカインアゴニストを提供する段階、
    請求項１〜１３のいずれかに記載のＬ−核酸を提供する段階、
    ケモカインアンタゴニストおよび／若しくはケモカインアゴニストの存在下でシグナルを提供する試験系を提供する段階、ならびに
    候補ケモカインアンタゴニストがケモカインアンタゴニストであるかどうか、および／若しくは候補ケモカインアゴニストがケモカインアゴニストであるかどうかを決定する段階
    を含んでなり、
    該ケモカインがエオタキシン、ＭＣＰ−１およびＭＣＰ−２よりなる群から選択される、
    ことを特徴とするケモカインアンタゴニスト若しくはケモカインアゴニストのスクリーニング方法。
  20. 固相に固定されたケモカインを提供する段階であって、該ケモカインが予め採取されたものである、段階、
    標識されている、請求項１〜１３のいずれかに記載のＬ−核酸を提供する段階、
    候補ケモカインアゴニストおよび／若しくは候補ケモカインアンタゴニストを添加する段階、ならびに
    候補ケモカインアゴニストがケモカインアゴニストであるかどうか、および／若しくは候補ケモカインアンタゴニストがケモカインアンタゴニストであるかどうかを決定する段階
    を含んでなり、
    該固相に固定されたケモカインがエオタキシン、ＭＣＰ−１およびＭＣＰ−２よりなる群から選択される、
    ことを特徴とするケモカインアゴニストおよび／若しくはケモカインアンタゴニストのスクリーニング方法。
  21. 請求項１〜１３のいずれかに記載のＬ−核酸を含んでなる、ケモカインの検出のためのキットであって、該ケモカインがエオタキシン、ＭＣＰ−１およびＭＣＰ−２よりなる群から選択されることを特徴とする、キット。
  22. 予め調製されたサンプル中の請求項１〜１３のいずれかに記載のＬ−核酸の検出方法であって、
    ａ）請求項１〜１３のいずれかに記載のＬ−核酸またはその部分を、捕捉プローブおよび検出プローブと、同時に若しくはいずれかの順序で連続してのいずれかで反応させる段階であって、該捕捉プローブが請求項１〜１３のいずれかに記載のＬ−核酸の第一の部分に少なくとも部分的に相補的であり、かつ、該検出プローブが請求項１〜１３のいずれかに記載のＬ−核酸の第二の部分に少なくとも部分的に相補的であるか、あるいはまた、該捕捉プローブが請求項１〜１３のいずれかに記載のＬ−核酸の第二の部分に少なくとも部分的に相補的であり、かつ、該検出プローブが請求項１〜１３のいずれかに記載のＬ−核酸の第一の部分に少なくとも部分的に相補的である、段階、ならびに
    ｂ）請求項１〜１３のいずれかに記載のＬ−核酸、ならびに捕捉プローブおよび検出プローブよりなる段階ａ）で形成される複合体を検出する段階
    を含むことを特徴とする、方法。
  23. 検出プローブが検出手段を含み、かつ／または捕捉プローブが固体支持体に固定され得ることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
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