ES2397803T3 - Ácidos nucleicos de unión a MCP-1 - Google Patents

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Abstract

Un ácido nucleico L capaz de unirse a MCP-1, en donde el ácido nucleico comprende en la dirección 5'->3' unaprimera extensión Caja B1A, una segunda extensión Caja B2 y una tercera extensión Caja B1B, en donde la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste enACGCA, CGCA y GCA, la segunda extensión Caja B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC,y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprendeUGCGU, UGCG y UGC.

Description

Ácidos nucleicos de unión a MCP-1
La presente invención se refiere a un ácido nucleico L que es capaz de unirse a MCP-1, a una composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico, al uso del ácido nucleico para la fabricación de un medicamento, al
5 uso del ácido nucleico para la fabricación de un medio de diagnóstico, a un complejo que comprende una quimiocina y el ácido nucleico, al uso del ácido nucleico para la detección de una quimiocina, a un método para el escrutinio de un agonista de quimiocina y/o un antagonista de quimiocina, a un kit para la detección de una quimiocina que comprende el ácido nucleico, y a un método para la detección del ácido nucleico en una muestra.
La MCP-1 humana (proteína quimiotáctica de monocitos 1; nombres alternativos, MCAF [factor quimiotáctico y activador de monocitos]; CCL2; SMC-CF [factor estimulante de la colonia de células de músculo liso]; HC-11; LDCF; GDCF; TSG-8; SCYA2; A2; código de acceso SwissProt, P13500) ha sido caracterizada por tres gruposindependientes (Matsushima 1988; Rollins 1989; Yoshimura 1989). Ésta consiste en 76 aminoácidos y pone de relieve un sitio de unión a heparina como todas las quimiocinas. Los dos puentes de disulfuro intramoleculares confieren a la molécula una estructura rígida, estable. Además, la MCP-1 porta un piroglutamato en su extremo
15 amino. En la Thr 71, se localiza un sitio potencial de glicosilación unido a O. Existen miembros adicionales de la familia MCP tanto en seres humanos (MCP-2, -3, -4) como en ratones (MCP-2, -3, -5). Las proteínas humanas son homólogas en aproximadamente un 70% a la MCP-1 humana.
La estructura de la MCP-1 ha sido dilucidada mediante RMN (Handel 1996) y rayos X (Lubkowski 1997). El monómero de MCP-1 tiene el típico pliegue de las quimiocinas en donde las cisteínas amino-terminales van seguidas de un bucle largo que produce tres láminas plegadas enf antiparalelas en un motivo de llave griega. La proteína finaliza en una hélice a que se superpone a las tres láminas f (código de acceso PDB 1DOK).
Si bien las estructuras tridimensionales de las formas de MCP-1 de diferentes especies de mamíferos generalmente se han mantenido, la secuencia de aminoácidos no se ha conservado particularmente bien en la evolución. Los resultados del alineamiento de secuencias demuestran una semejanza de secuencia global del 55% entre MCP-1
25 humana y murina (también llamada JE) dentro de los primeros 76 aminoácidos. Aparte de la secuencias de aminoácidos, la MCP-1 murina difiere de la MCP-1 humana en el tamaño molecular (125 aminoácidos) y en el grado de glicosilación. La MCP-1 murina contiene un dominio carboxiterminal de 49 aminoácidos que no está presente en la MCP-1 humana y que no es requerido para la bioactividad in vitro. La MCP-1 humana comparte los siguientes porcentajes de aminoácidos idénticos con la MCP-1 de:
•
Macaca mulatta (mono Rhesus) MCP-1 97%
•
Sus scrofa (cerdo) MCP-1 79%
•
Equus caballus (caballo) 78%
•
Canis familiaris (perro) MCP-1 76%
• Oryctolagus cuniculus (conejo) MCP-1 75% 35 • Bos Taurus (bovino) 72%
•
Homo sapiens MCP-3 71%
•
Homo sapiens Eotaxina 64%
•
Homo sapiens MCP-2 62%
•
Mus musculus (ratón) MCP-1 55%
•
Rattus norvegicus (rata) MCP-1 55%
Dado este alto grado de divergencia puede ser necesario generar antagonistas de la MCP-1 de roedores para la realización exitosa de estudios farmacológicos en modelos de roedores.
La MCP-1 es una potente atractora de monocitos/macrófagos, basófilos, células T activadas y células NK. Una amplia variedad de tipos celulares expresan MCP-1, tales como células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos,
45 queratinocitos, células sinoviales, células del mesangio, osteoblastos, células del músculo liso, además de una multitud de células tumorales (Baggiolini 1994). Su expresión está estimulada por varios tipos de agentes proinflamatorios tales como IL-1f, TNF-a, IFN-y, LPS (lipopolisacáridos) y GM-CSF.
Bastante inusual en la promiscua estructura de la quimiocina, la MCP-1 es muy específica en su uso como receptor, se une solo al receptor de quimiocina CCR2 con alta afinidad. Como todos los receptores de quimiocina, el CCR2 es un GPCR (Dawson 2003). El CCR2 parece expresarse en dos formas ligeramente diferentes debido a la división alternativa del ARNm que codifica la región carboxiterminal, CCR2a y CCR2b (Charo 1994). Estos receptores se expresan en monocitos, células precursoras mieloideas y células T activadas (Myers 1995; Qin 1996). La constante de disociación del MCP-1 al receptor transfectado en las células HEK-293 es de 260 pM, lo que está de acuerdo con los valores medidos en monocitos (Myers 1995; Van Riper 1993). La activación de CCR2b en células HEK-293 55 transfectadas con MCP-1 inhibe la adenilil ciclasa a una concentración de 90 pM, y moviliza el calcio intracelular a concentraciones ligeramente superiores, aparentemente de forma independiente a la hidrólisis de fosfatidil inositol. Los efectos en la adenilil ciclasa y en la liberación de calcio intracelular son fuertemente inhibidos por la toxina de la
tosferina, lo que implica la participación de las proteínas G heterotriméricas de tipo Gi en la transducción de señales (Myers 1995).
La MCP-1 está involucrada en el reclutamiento de monocitos en los tejidos inflamados. Allí, los macrófagos residentes liberan quimiocinas tales como MCP-1 y otras, y citocinas como TNF, IL-1f y otras, que activan a las células endoteliales para que expresen una batería de moléculas de adhesión. El endotelio “pegajoso” resultante hace que los monocitos de los vasos sanguíneos lleguen a su superficie. Aquí, los monocitos encuentran a la MCP-1 presente en la superficie endotelial, que se une al CCR2 de los monocitos y los activa. Esto finalmente conduce al frenado estricto, la propagación de monocitos por todo el endotelio y la transmigración al tejido circundante, donde los monocitos se diferencian en macrófagos y migran hacia el sitio de concentración máxima de MCP-1.
La MCP-1 es un miembro de la familia de las quimiocinas que es una familia de moléculas pequeñas (aproximadamente 8-14 kDa) principalmente básicas y relacionadas estructuralmente que se unen a heparina. Se forman predominantemente en tejidos inflamados y regulan el reclutamiento, la activación y la proliferación de células sanguíneas blancas (leucocitos) (Baggiolini 1994; Springer 1995; Schall 1994). Las quimiocinas inducen selectivamente la quimiotaxis de neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, macrófagos, mastocitos, células T y B. Además de su efecto quimiotáctico, pueden ejercer selectivamente otros efectos en células sensibles, como cambios en la forma, aumento transitorio en la concentración de iones de calcio intracelular libre, desgranulación, regulación por aumento de las integrinas, formación de lípidos bioactivos tales como leucotrienos, prostaglandinas, tromboxanos o estallido respiratorio (liberación de especies de oxígeno reactivo para la destrucción de los organismos patógenos o células tumorales). De este modo, al provocar la liberación de mediadores proinflamatorios adicionales, la quimiotaxis y extravasación de leucocitos hacia los sitios de infección o inflamación, las quimiocinas desencadenan la escalada de la respuesta inflamatoria.
En base a la disposición de los dos primeros, de cuatro, residuos conservados de cisteína, las quimiocinas se dividen en cuatro clases: CC o f-quimiocinas en las que las cisteínas están en tándem, CXC o a-quimiocinas, donde están separadas por un residuo de aminoácido adicional, XC o -quimiocinas con la linfotactina como único
y representante hasta la fecha, que poseen un único puente de disulfuro, y quimiocinas CX3C, que se caracterizan por tres residuos de aminoácidos entre las cisteínas, siendo la fractalquina unida a membrana el único miembro de la clase conocido hasta la fecha (Bazan 1997).
Las quimiocinas CXC actúan principalmente sobre neutrófilos, en particular las quimiocinas CXC que portan la secuencia de aminoácidos ELR en sus extremos amino. Los ejemplos de quimiocinas CXC que son activas sobre neutrófilos son IL-8, GROa, -f, y –y, NAP-2, ENA-78 y GCP-2. Las quimiocinas CC actúan sobre una mayor variedad de leucocitos, tales como monocitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos, además de los linfocitos T y B (Oppenheim 1991; Baggiolini 1994; Miller 1992; Jose 1994; Ponath 1996a). Ejemplos de éstas son I-309; MCP-1, -2, -3, -4, MIP-1a y –f, RANTES, y eotaxina.
Las quimiocinas actúan a través de receptores que pertenecen a una superfamilia de siete receptores acoplados a la proteína G que abarcan la transmembrana (GPCRs; Murphy 2000). En términos generales, las interacciones de quimiocina y receptor de quimiocina tienden a ser promiscuas en el sentido en que una quimiocina se puede unir a muchos receptores de quimiocina e, inversamente, un único receptor de quimiocina puede interactuar con varias quimiocinas. Algunos receptores conocidos para las quimiocinas CC incluyen CCR1, que se une a MIP-1a y RANTES (Neote 1993; Gao 1993); CCR2, que se une a quimiocinas que incluyen MCP-1, -2, -3, y -4 (Charo 1994; Myers 1995; Gong 1997; Garcia-Zepeda 1996); CCR3,que se une a quimiocinas que incluyen eotaxina, RANTES y MCP-3 (Ponath 1996b); CCR4, que se halló que indica la respuesta a MCP-1, MIP-1a, y RANTES (Power 1995); y CCR5, que se halló que indica la respuesta a MIP-1a y -f, y RANTES (Boring 1996; Raport 1996; Samson 1996).
Como se ha mencionado anteriormente, los cuatro miembros de la familia MCP y (1-4) se unen a CCR2, mientras que MCP-2, MCP-3, y MCP-4 también pueden interactuar con CCR1 y CCR3 (Gong 1997; Heath 1997; Uguccioni 1997) y, en el caso de MCP-2, con CCR5 (Ruffing 1998). Otra quimiocina CC que muestra alta homología con la familia MCP es la eotaxina, que originalmente se halló en el líquido de lavado broncoalveolar tomado de cobayas sensibilizadas estimuladas con alérgenos (Jose 1994). Se ha demostrado que la eotaxina también puede activar a CCR2 (Martinelli 2001).
El problema esencial de la presente invención es proporcionar un medio que interactúe específicamente con la MCP-1. Más específicamente, problema esencial de la presente invención es proporcionar un medio sobre la base de un ácido nucleico que interactúe específicamente con la MCP-1.
Otro problema esencial de la presente invención es proporcionar un medio para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades humanas o no humanas, en donde la enfermedad se caracteriza porque la MCP-1 unida tanto de forma directa como indirecta participa en el mecanismo patogenético de dicha enfermedad.
Otro problema esencial adicional de la presente invención es proporcionar un medio para la fabricación de un agente diagnóstico para el tratamiento de una enfermedad, en donde la enfermedad se caracteriza porque la MCP-1 unida tanto de forma directa como indirecta participa en el mecanismo patogenético de tal enfermedad.
Estos y otros problemas subyacentes de la presente invención se resuelven a través del contenido de las reivindicaciones independientes adjuntas. Las realizaciones preferidas se pueden adoptar a partir de las reivindicaciones dependientes. El ácido nucleico según la presente invención también se denomina en la presente memoria como ácido(s) nucleico(s) de tipo 2.
Más específicamente, el problema esencial de la presente invención se resuelve en un primer aspecto que también es la primera realización del primer aspecto, mediante un ácido nucleico L capaz de unirse a MCP-1, en donde el ácido nucleico comprende en la dirección 5’->3’ una primera extensión de Caja B1A, una segunda extensión de Caja B2 y una tercera extensión de Caja B1B, en donde la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en ACGCA, CGCA y GCA, la segunda extensión Caja B2 comprende una secuencia de ácido nucleico de CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAG-CCGYGGCUC, y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en UGCGU, UGCG y UGC.
En una segunda realización del primer aspecto que también es una realización de la primera realización del primer aspecto, la segunda extensión Caja B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC.
En una tercera realización del primer aspecto que también es una realización de la primera y de la segunda realizaciones del primer aspecto,
a) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de ACGCA,
y
la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGCGU; o
b) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de CGCA,
y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGCG; o
c) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GCA,
y
la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGC ó UGCG.
En una cuarta realización del primer aspecto que también es una realización de la primera, la segunda y la tercera realizaciones del primer aspecto, la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GCA.
En una quinta realización del primer aspecto que también es una realización de la primera, segunda, tercera y cuarta realizaciones del primer aspecto, y preferiblemente de la cuarta realización del primer aspecto de la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGCG.
En una sexta realización del primer aspecto que también es una realización de la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta realizaciones del primer aspecto, el ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 116, SEC ID Nº: 117 y SEC ID Nº: 278, o un ácido nucleico homólogo a las mismas, en donde la homología es de al menos un 85%.
En una séptima realización del primer aspecto, que también es una realización de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta y sexta realizaciones del primer aspecto, el ácido nucleico es capaz de unirse a una quimiocina, en donde la quimiocina se selecciona del grupo que consiste en eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
En una octava realización del primer aspecto, que también es una realización de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta y séptima realización del primer aspecto, el ácido nucleico es capaz de unirse a MCP-1 humana.
En una novena realización del primer aspecto, que también es una realización de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima y octava realizaciones del primer aspecto, el ácido nucleico comprende una modificación, en donde la modificación es preferiblemente un resto de elevado peso molecular y/o en donde la modificación preferiblemente permite modificar las características del ácido nucleico según cualquiera de las realizaciones primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima y octava del primer aspecto en términos de tiempo de residencia en el cuerpo humano o animal, preferiblemente en el cuerpo humano.
En una décima realización del primer aspecto que también es una realización de la novena realización del primer aspecto, la modificación se selecciona del grupo que comprende un residuo HES y un residuo PEG.
En una undécima realización del primer aspecto que también es una realización de la décima realización del primer aspecto, la modificación es un residuo PEG que consta de un PEG lineal o ramificado, en donde el peso molecular del residuo PEG preferiblemente está entre aproximadamente 20 y 120 kD, más preferiblemente entre
aproximadamente 30 y 80 kD y lo más preferiblemente aproximadamente 40 kD.
En una duodécima realización del primer aspecto, que también es una realización de la décima realización del primer aspecto, la modificación es un residuo de HES, en donde preferiblemente el peso molecular del residuo de HES va de aproximadamente 10 a 130 kD, más preferiblemente entre aproximadamente 30 y 130 kD y lo más preferiblemente aproximadamente 100 kD.
En una decimotercera realización del primer aspecto, que también es una realización de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima y duodécima realizaciones del primer aspecto, la primera extensión Caja B1A y la tercera extensión Caja B1B se hibridan opcionalmente una con la otra, con lo cual a través de dicha hibridación se forma una estructura de cadena doble.
En una decimocuarta realización del primer aspecto, que también es una realización de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto, el ácido nucleico es para uso en un método de tratar una enfermedad.
En una decimoquinta realización del primer aspecto que también es una realización de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico es para uso en un método de diagnosis.
El problema esencial de la presente invención se resuelve en un segundo aspecto que también es la primera realización del segundo aspecto, mediante una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto y opcionalmente un constituyente adicional, en donde el constituyente adicional se selecciona del grupo que comprende excipientes farmacéuticamente aceptables, vehículos farmacéuticamente aceptables y agentes farmacéuticamente activos.
El problema esencial de la presente invención se soluciona en un tercer aspecto que también es la primera realización del tercer aspecto, mediante el uso de un ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto para la fabricación de un medicamento.
El problema esencial de la presente invención se soluciona en un cuarto aspecto que también es la primera realización del cuarto aspecto, mediante el uso de un ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto para la fabricación de un medio de diagnóstico.
En una segunda realización del tercer aspecto, que también es una realización de la primera realización del tercer aspecto, el medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que comprende enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, encefalomielitis autoinmune, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple aguda y crónica, inflamación crónica, artritis reumatoide, enfermedades renales, restenosis, restenosis después de la angioplastia, reacciones alérgicas agudas y crónicas, reacciones inmunológicas y alérgicas primarias y secundarias, asma, conjuntivitis, bronquitis, cáncer, aterosclerosis, insuficiencia cardíaca cardiovascular arteriosclerótica o accidente cerebrovascular, psoriasis, artritis psoriática, inflamación del sistema nervioso, dermatitis atópica, colitis, endometriosis, uveítis, trastornos retinianos que incluyen degeneración macular, desprendimiento de retina, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, retinitis pigmentaria, vitreorretinopatía proliferativa y coriorretinopatía serosa central; fibrosis pulmonar idiopática, sarcoidosis, polimiositis, dermatomiositis, anulación de la inmunosupresión, reducción del riesgo de infección, sepsis, inflamación renal, glomerulonefritis, glomerulonefritis progresiva rápida, glomerulonefritis proliferativa, neuropatía diabética, nefropatía obstructiva, necrosis tubular aguda y glomeruloesclerosis difusa, lupus eritematoso sistémico, bronquitis crónica, enfermedad de Behçet, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), ateroesclerosis prematura después de la enfermedad de Kawasaki, infarto de miocardio, obesidad, enfermedad hepática crónica, enfermedad de Peyronie, lesión de médula espinal aguda, trasplante de pulmón o riñón, miocarditis, enfermedad de Alzheimer y neuropatía, carcinoma de mama, carcinoma gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, hamartoma, carcinoma colorrectal, adenoma colónico, pancreatitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y enfermedades intestinales inflamatorias tales como enfermedad de Crohn o la colitis ulcerativa.
El problema esencial de la presente invención se resuelve en un quinto aspecto que también es la primera realización del quinto aspecto, mediante un complejo que comprende una quimiocina y un ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, decimosegunda y decimotercera realizaciones del primer aspecto, en donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3, en donde el complejo preferiblemente es un complejo cristalino.
El problema esencial de la presente invención se resuelve en un sexto aspecto que también es la primera realización del sexto aspecto mediante el uso de un ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto para la detección in vitro de una quimiocina, en donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
El problema esencial de la presente invención se resuelve en un séptimo aspecto que también es la primera realización del séptimo aspecto, mediante un método para el escrutinio de un antagonista de quimiocina o un agonista de quimiocina que comprende las siguientes etapas:
-
proporcionar un candidato de antagonista de quimiocina y/o un candidato de agonista de quimiocina,
-
proporcionar un ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima o decimotercera realizaciones del primer aspecto,
-
proporcionar un sistema de ensayo que proporcione una señal en presencia de un agonista de quimiocina y/o de un antagonista de quimiocina, y
-
determinar si el antagonista de quimiocina candidato es un antagonista de quimiocina y/o si el agonista de quimiocina candidato es un agonista de quimiocina,
en donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
El problema esencial de la presente invención se resuelve en un octavo aspecto que también es la primera realización del octavo aspecto, mediante un método para el escrutinio de un agonista de quimiocina y/o un antagonista de quimiocina que comprende las siguientes etapas:
-
proporcionar una quimiocina inmovilizada en una fase, preferiblemente una fase sólida,
-
proporcionar un ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto,
preferiblemente un ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto, que es marcado,
-
añadiendo un agonista de quimiocina candidato y/o un antagonista de quimiocina candidato, y
-
determinando si el agonista de quimiocina candidato es un agonista de quimiocina y/o si el antagonista de quimiocina candidato es un antagonista de quimiocina,
en donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
El problema esencial de la presente invención se resuelve en un noveno aspecto que también es la primera realización del noveno aspecto, mediante un kit para la detección de una quimiocina que comprende un ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto, en donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
El problema esencial de la presente invención se resuelve en un décimo aspecto que también es la primera realización del décimo aspecto mediante un método para la detección del ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto en una muestra, en donde el método comprende las etapas de:
a) proporcionar una muestra que contiene el ácido nucleico según la presente invención;
b) proporcionar una sonda de captura, en donde la sonda de captura es complementaria al menos parcialmente a una primera parte del ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto, y una sonda de detección, en donde la sonda de detección es complementaria al menos parcialmente a una segunda parte del ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto, o, alternativamente, la sonda de captura es complementaria al menos parcialmente a una segunda parte del ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto y la sonda de detección es complementaria al menos parcialmente a una primera parte del ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto;
c) dejar que la sonda de captura y la sonda de detección reaccionen simultáneamente o secuencialmente en cualquier orden con el ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto, o con una parte del mismo;
d) opcionalmente detectar si la sonda de captura se ha hibridado o no con el ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima,
duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto proporcionado en la etapa a); y
e) detectar el complejo formado en la etapa c) que consiste en el ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto, y la sonda de captura y la sonda de detección.
En una segunda realización del décimo aspecto, que también es una realización de la primera realización del décimo aspecto, la sonda de detección comprende un medio de detección, y/o en donde la sonda de captura se puede inmovilizar sobre un soporte, preferiblemente un soporte sólido.
En una tercera realización del décimo aspecto, que también es una realización de la primera y segunda realizaciones del décimo aspecto, se elimina de la reacción toda sonda de detección que no forme parte del complejo de tal modo que en la etapa e) sólo se detecte una sonda de detección que forme parte del complejo.
En una cuarta realización del décimo aspecto que también es una realización de la primera, segunda y tercera realizaciones del décimo aspecto, la etapa e) comprende la etapa de comparar la señal generada por el medio de detección cuando la sonda de captura y la sonda de detección son hibridadas en presencia del ácido nucleico según cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima y decimotercera realizaciones del primer aspecto, o parte del mismo, y en ausencia de dicho ácido nucleico o parte del mismo.
En una quinta realización del décimo aspecto, que también es una realización de la primera, segunda, tercera y cuarta realizaciones del décimo aspecto, el ácido nucleico que se va a detectar es el ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico según las SEC ID Nº: 37, 116, 117 ó 278, y la sonda de captura o la sonda de detección comprenden una secuencia de ácido nucleico según la SEC ID Nº: 255 o la SEC ID Nº: 256.
También se describe un ácido nucleico de tipo 1A, en donde el ácido nucleico tipo 1A comprende en dirección 5’->3’ una primera extensión Caja B1A, una segunda extensión Caja B2, una tercera extensión Caja B3, una cuarta extensión Caja B4, una quinta extensión Caja B5, una sexta extensión Caja B6 y una séptima extensión Caja B1B, en donde
la primera extensión Caja B1A y la séptima extensión Caja B1B opcionalmente se hibridan entre sí, en donde en la hibridación se forma una estructura de cadena doble, la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de AGCRUG, la segunda extensión Caja B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CCCGGW, la tercera extensión Caja B3 comprende una secuencia de nucleótidos de GUR, la cuarta extensión Caja B4 comprende una secuencia de nucleótidos de RYA, la quinta extensión Caja B5 comprende una secuencia de nucleótidos de GGGGGRCGCGAYC la sexta extensión Caja B6 comprende una secuencia de nucleótidos de UGCAAUAAUG ó URYAWUUG, y la séptima extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de CRYGCU.
En una realización preferida la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de AGCGUG.
En una realización la segunda extensión Caja B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CCCGGU.
En una realización la tercera extensión Caja B3 comprende una secuencia de nucleótidos de GUG.
En una realización la cuarta extensión Caja B4 comprende una secuencia de nucleótidos de GUA.
En una realización la quinta extensión Caja B5 comprende una secuencia de nucleótidos de GGGGGGCGCGACC.
En una realización la sexta extensión Caja B6 comprende una secuencia de nucleótidos de UACAUUUG.
En una realización la séptima extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de CACGCU.
En una realización el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico según la SEC ID Nº: 21.
También se describe un ácido nucleico tipo 1B, en donde el ácido nucleico tipo 1B comprende en dirección 5’->3’ una primera extensión Caja B1A, una segunda extensión Caja B2, una tercera extensión Caja B3, una cuarta extensión Caja B4, una quinta extensión Caja B5, una sexta extensión Caja B6 y una séptima extensión Caja B1B, en donde la primera extensión Caja B1A y la séptima extensión Caja B1B opcionalmente se hibridan entre sí, en donde con la
hibridación se forma una estructura de cadena doble, la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de AGYRUG, la segunda extensión Caja B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CCAGCU ó CCAGY, la tercera extensión Caja B3 comprende una secuencia de nucleótidos de GUG, la cuarta extensión Caja B4 comprende una secuencia de nucleótidos de AUG, la quinta extensión Caja B5 comprende una secuencia de nucleótidos de GGGGGGCGCGACC, la sexta extensión Caja B6 comprende una secuencia de nucleótidos de CAUUUUA ó CAUUUA, y la séptima extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de CAYRCU.
En una realización la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de AGCGUG.
En una realización la segunda extensión Caja B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CCAGU.
En una realización la sexta extensión Caja B6 comprende una secuencia de nucleótidos de CAUUUUA.
En una realización la séptima extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de CACGCU.
En una realización el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID Nº: 28 y la SEC ID Nº: 27.
También se describe un ácido nucleico tipo 3, en donde el ácido nucleico tipo 3 comprende en dirección 5’->3’ una primera extensión Caja B1A, una segunda extensión Caja B2A, una tercera extensión Caja B3, una cuarta extensión Caja B2B, una quinta extensión Caja B4, una sexta extensión Caja B5A, una séptima extensión Caja B6, una octava extensión Caja B5B y una novena extensión Caja B1B,
en donde la primera extensión Caja B1A y la novena extensión Caja B1B opcionalmente se hibridan entre sí, en donde con la hibridación se forma una estructura de cadena doble, la segunda extensión Caja B2A y la cuarta Caja B2B opcionalmente se hibridan entre sí, en donde con la hibridación se forma una estructura de cadena doble, la sexta extensión Caja B5A y la octava Caja B5B opcionalmente se hibridan entre sí, en donde con la hibridación se forma una estructura de cadena doble, la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos que se selecciona del grupo que comprende GURCUGC, GKSYGC, KBBSC y BNGC, la segunda extensión Caja B2A comprende una secuencia de nucleótidos de GKMGU, la tercera extensión Caja B3 comprende una secuencia de nucleótidos de KRRAR, la cuarta extensión Caja B2B comprende una secuencia de nucleótidos de ACKMC, la quinta extensión Caja B4 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende CURYGA, CUWAUGA, CWRMGACW y UGCCAGUG, la sexta extensión Caja B5A comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende GGY y CWGC, la séptima extensión Caja B6 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende YAGA, CKAAU y CCUUUAU, la octava extensión Caja B5B comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende GCYR y GCWG, y la novena extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende GCAGCAC, GCRSMC, GSVVM y GCNV.
En una realización la tercera extensión Caja B3 comprende una secuencia de nucleótidos de GAGAA o UAAAA
En una realización la quinta extensión Caja B4 comprende una secuencia de nucleótidos de CAGCGACU o CAACGACU.
En una realización la quinta extensión Caja B4 comprende una secuencia de nucleótidos de CAGCGACU y la Caja B3 comprende una secuencia de nucleótidos de UAAAA.
En una realización la quinta extensión Caja B4 comprende una secuencia de nucleótidos de CAACGACU y la Caja B3 comprende una secuencia de nucleótidos de GAGAA.
En una realización la séptima extensión Caja B6 comprende una secuencia de nucleótidos de UAGA.
En una realización
a) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GURCUGC, y la novena extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCAGCAC; o
b) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GKSYGC, y la novena extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCRSMC; o
c) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de KBBSC, y la novena extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GSVVM; o
d) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de BNGC, y la novena extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCNV.
En una realización preferida
a) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GUGCUGC, y la novena extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCAGCAC; o
b) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GUGCGC, y la novena extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCGCAC; o
c) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de KKSSC, y la novena extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GSSMM; o
d) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de SNGC, y la novena extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCNS.
En una realización preferida adicional la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GGGC, y la novena extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCCC.
En una realización la segunda extensión Caja B2A comprende una secuencia de nucleótidos de GKMGU y la cuarta extensión Caja B2B comprende una secuencia de nucleótidos de ACKMC.
En una realización preferida la segunda extensión Caja B2A comprende una secuencia de nucleótidos de GUAGU y la cuarta extensión Caja B2B comprende una secuencia de nucleótidos de ACUAC.
En una realización
a) la sexta extensión Caja B5A comprende una secuencia de nucleótidos de GGY, y la octava extensión Caja B5B comprende una secuencia de nucleótidos de GCYR; o b) la sexta extensión Caja B5A comprende una secuencia de nucleótidos de CWGC, y la octava extensión Caja B5B comprende una secuencia de nucleótidos de GCWG.
En una realización preferida la sexta extensión Caja B5A comprende una secuencia de nucleótidos de GGC, y la octava extensión Caja B5B comprende una secuencia de nucleótidos de GCCG.
En una realización más preferida la sexta extensión Caja B5A se hibrida con los nucleótidos GCY de la octava extensión Caja B5B.
En una realización el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID Nº: 56.
En una realización el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que comprende las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con las SEC ID Nº: 57 a 61, SEC ID Nº: 67 a 71 y SEC ID Nº: 73.
También se describe un ácido nucleico de tipo 4, en donde el ácido nucleico de tipo 4 comprende en dirección 5’->3’ una primera extensión Caja B1A, una segunda extensión Caja B2, una tercera extensión Caja B1B, en donde la primera extensión Caja B1A y la tercera extensión Caja B1B opcionalmente se hibridan entre sí, en donde con la hibridación se forma una estructura de cadena doble, la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende AGCGUGDU, GCGCGAG, CSKSUU, GUGUU, y UGUU; la segunda extensión Caja B2 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende AGNDRDGBKGGURGYARGUAAAG, AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG y CAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGA, y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende GNCASGCU, CUCGCGUC, GRSMSG, GRCAC, y GGCA.
En una realización
a) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GUGUU, y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GRCAC;
b) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GCGCGAG, y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de CUCGCGUC; o
c) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de CSKSUU, y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GRSMSG, o
d) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de UGUU, y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GGCA, o
e) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de AGCGUGDU, y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GNCASGCU.
En una realización preferida la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de CSKSUU y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GRSMSG.
En una realización más preferida la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de CCGCUU y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GGGCGG.
En una realización la segunda extensión Caja B2 comprende una secuencia de nucleótidos de AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG.
En una realización el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID Nº: 80.
En una realización el ácido nucleico es capaz de unirse a MCP-1, con preferencia a la MCP-1 humana.
En una realización el ácido nucleico es capaz de unirse a una quimiocina, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
En una realización el ácido nucleico es capaz de unirse a una quimiocina, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende a eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana.
En una realización el ácido nucleico es capaz de unirse a MCP-1, donde MCP-1 con preferencia se selecciona del grupo que comprende MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina, MCP-1 porcina y MCP-1 humana.
En una realización el ácido nucleico es capaz de unirse a MCP-1 humana.
En una realización preferida la MCP-1 tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº: 1.
También se describe un ácido nucleico, que preferiblemente se une a MCP-1 murina, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEC ID Nº: 122, SEC ID Nº: 253 y SEC ID Nº: 254.
También se describe un ácido nucleico, que preferiblemente se une a MCP-1 murina, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID Nº: 127.
En una realización la MCP-1 murina comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº: 2.
En una realización del primer aspecto la modificación se acopla al ácido nucleico mediante un conector.
En una realización del primer aspecto la modificación se acopla al ácido nucleico en su nucleótido 5’-terminal y/o en su nucleótido 3’-terminal y/o a un nucleótido del ácido nucleico entre el nucleótido 5’-terminal y el nucleótido 3’terminal.
En una realización del primer aspecto los nucleótidos del ácido nucleico, o los nucleótidos que forman el ácido nucleico, son nucleótidos L.
En una realización del primer aspecto el residuo del ácido nucleico capaz de unirse a MCP-1 consiste en nucleótidos
L.
En una realización del segundo aspecto la composición farmacéutica comprende un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y un vehículo aceptable para uso farmacéutico.
En una realización del tercer aspecto el medicamento es para uso en medicina humana o para uso en medicina veterinaria.
En una realización del cuarto aspecto y de los medios diagnósticos, es para la diagnosis de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que comprende enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, encefalomielitis autoinmune, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple aguda y crónica, inflamación crónica, artritis reumatoide, enfermedades renales, restenosis, restenosis después de la angioplastia, reacciones alérgicas aguda y crónica, reacciones inmunológicas y alérgicas primarias y secundarias, asma, conjuntivitis, bronquitis, cáncer, aterosclerosis, insuficiencia cardíaca cardiovascular arteriosclerótica o accidente cerebrovascular, psoriasis, artritis psoriática, inflamación del sistema nervioso, dermatitis atópica, colitis, endometriosis, uveítis, trastornos retinianos que incluyen degeneración macular, desprendimiento de retina, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, retinitis pigmentaria, vitreorretinopatía proliferativa y coriorretinopatía serosa central; fibrosis pulmonar idiopática, sarcoidosis, polimiositis, dermatomiositis, anulación de la inmunosupresión, reducción del riesgo de infección, sepsis, inflamación renal, glomerulonefritis, glomerulonefritis progresiva rápida, glomerulonefritis proliferativa, neuropatía diabética, nefropatía obstructiva, necrosis tubular aguda y glomeruloesclerosis difusa, lupus eritematoso sistémico, bronquitis crónica, enfermedad de Behçet, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), ateroesclerosis prematura después de la enfermedad de Kawasaki, infarto de miocardio, obesidad, enfermedad hepática crónica, enfermedad de Peyronie, lesión de médula espinal aguda, trasplante de pulmón o riñón, miocarditis, enfermedad de Alzheimer y neuropatía, carcinoma de mama, carcinoma gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, hamartoma, carcinoma colorrectal, adenoma colónico, pancreatitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y enfermedades intestinales inflamatorias tales como enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa.
Sin pretender establecer una teoría, la adecuación de los ácidos nucleicos de la presente invención para los propósitos diagnósticos se basa principalmente en el aumento o la disminución del nivel de quimiocina, en donde dicha quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3, más específicamente MCP-1. Será reconocido por el experto en la técnica que la mayoría de las enfermedades antes mencionadas muestran tal aumento o disminución del nivel de quimiocina.
En una realización del quinto aspecto la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana.
En una realización del quinto aspecto la quimiocina es MCP-1, donde MCP-1 se selecciona preferiblemente del grupo que comprende MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina, MCP-1 porcina y MCP-1 humana. En una realización del sexto aspecto, la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana.
En una realización del sexto aspecto la quimiocina es MCP-1, donde MCP-1 se selecciona preferiblemente del grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina, MCP-1 porcina y MCP-1 humana.
En una realización del octavo aspecto la determinación se realiza de modo que se evalúa si el ácido nucleico es reemplazado por el agonista de quimiocina candidato o por un antagonista de quimiocina candidato.
En una realización del séptimo aspecto y del octavo aspecto la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana.
En una realización del séptimo aspecto y del octavo aspecto la quimiocina es MCP-1, donde MCP-1 se selecciona preferiblemente del grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina, MCP-1 porcina, más preferiblemente MCP-1 es MCP-1 humana.
En una realización del noveno aspecto la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana.
En una realización del noveno aspecto la quimiocina es MCP-1, donde la MCP-1 se selecciona preferiblemente del
grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP1 canina, MCP-1 porcina, más preferiblemente MCP-1 es MCP-1 humana.
También se describe un antagonista de quimiocina obtenible por el método de acuerdo con el séptimo aspecto o el octavo aspecto, en donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
En una realización la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana.
En una realización la quimiocina es MCP-1, donde la MCP-1 se selecciona preferiblemente del grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina, MCP-1 porcina, más preferiblemente MCP-1 es MCP-1 humana.
También se describe un agonista de quimiocina obtenible por el método de acuerdo con el séptimo aspecto o el octavo aspecto, en donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
En una realización la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana.
En una realización la quimiocina es MCP-1, en donde MCP-1 se selecciona preferiblemente del grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina, MCP-1 porcina, más preferiblemente MCP-1 es MCP-1 humana.
Será reconocido por los expertos en la técnica que un agonista de quimiocina y/o un antagonista de quimiocina preferiblemente es un agonista y un antagonista, respectivamente, que se dirige a la quimiocina respectiva como se especifica en la presente memoria. Por consiguiente, el agonista de quimiocina y el antagonista de quimiocina son, por ejemplo, un agonista de MCP-1 y un antagonista de MCP-1, respectivamente.
En una realización del décimo aspecto el ácido nucleico detectado es el ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEC ID Nº: 122, 253 ó 254 y la sonda de captura o la sonda de detección comprenden una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID Nº: 281 y la SEC ID Nº: 282.
Las características del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención descritas en la presente memoria se pueden realizar en cualquier aspecto de la presente invención donde se usa el ácido nucleico, tanto solo como en alguna combinación.
La MCP-1 humana, así como también la murina, son proteínas básicas que tienen la secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID Nº: 1 y 2, respectivamente.
El hallazgo de que se podían identificar ácidos nucleicos cortos de alta afinidad con la MCP-1, en lo que es sorprendente, ya que Eaton et al. (1997) observaron que la generación de aptámeros, es decir, ácidos D-nucleicos que se unen a una molécula diana, dirigida a una proteína básica es en general muy difícil porque esta clase de diana produce una relación señal-ruido alta aunque no específica. Esta relación señal-ruido alta proviene de la alta afinidad no específica mostrada por los ácidos nucleicos hacia dianas básicas tales como la MCP-1.
Como se describe con más detalle en las reivindicaciones y en el ejemplo 1, los presentes inventores pudieron identificar de forma sorprendente una variedad de diferentes moléculas de ácidos nucleicos de unión a MCP-1, en donde la mayoría de los ácidos nucleicos se podían caracterizar en términos de extensiones de nucleótidos que en la presente memoria también se denominan Cajas. Las diversas moléculas de ácidos nucleicos de unión a MCP-1 se pueden clasificar en base a dichas Cajas y algunos rasgos y elementos estructurales, respectivamente. Las diversas categorías definidas de este modo también se denominan en la presente memoria tipos, y más específicamente, tipo 1A, tipo 1B, tipo 2, tipo 3 y tipo 4.
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención también comprenderán ácidos nucleicos que son esencialmente homólogos a las secuencias particulares descritas en la presente memoria. El término sustancialmente homólogo se entenderá de modo tal que la homología es de al menos 75%, preferiblemente 85%, más preferiblemente 90% y lo más preferiblemente más de 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99%.
El porcentaje real de los nucleótidos homólogos presentes en el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención dependerá de la cantidad total de nucleótidos presentes en el ácido nucleico. El porcentaje de modificación se puede basar en la cantidad total de nucleótidos presentes en el ácido nucleico.
La homología se puede determinar de modos conocidos por los expertos en la técnica. Más específicamente, un algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa designados. La secuencia de ensayo es preferiblemente la secuencia o molécula de ácido nucleico que es homóloga o se debe ensayar si es homóloga, y si es así, en qué grado, con respecto a otra molécula de ácido nucleico, en donde dicha otra molécula de ácido nucleico también se define como secuencia de referencia. En una realización, la secuencia de referencia es una molécula de ácido nucleico descrita en la presente memoria, más preferiblemente una molécula de ácido
nucleico que tiene una secuencia de acuerdo con alguna de las SEC ID Nº: 10 a 129, 132 a 256 y 278 - 282. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación se puede realizar, por ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman (Smith & Waterman, 1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch (Needleman & Wunsch, 1970), mediante el método de búsqueda de semejanza de Pearson & Lipman (Pearson & Lipman, 1988), mediante implementaciones computerizadas de dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o a través de inspección visual.
Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es el algoritmo usado en la herramienta de búsqueda de alineamiento local básico (de aquí en adelante "BLAST"), véase, por ej., Altschul et al (Altschul et al. 1990 y Altschul et al, 1997). El software para realizar los análisis BLAST está disponible al público a través del Centro Nacional de Información de Biotecnología (de aquí en adelante "NCBI").Los parámetros por defecto que se usan para determinar la identidad de secuencia mediante el programa de computación disponible en NCBI, por ej., BLASTN (para secuencias de nucleótidos) y BLASTP (para secuencias de aminoácidos) se describen en McGinnis et al (McGinnis et al, 2004).
El término ácido nucleico inventivo o ácido nucleico de acuerdo con la presente invención también comprenderá a los ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente memoria o parte de las mismas, preferiblemente en la medida en que los ácidos nucleicos o dichas partes participen en la unión a MCP-1. El termino ácido nucleico inventivo usado preferiblemente en la presente memoria, en una realización también comprenderá un ácido nucleico adecuado para unirse a cualquier molécula seleccionada del grupo que comprende a MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina. Será reconocido por los expertos en la técnica que los ácidos nucleicos individuales de acuerdo con la presente invención se unirán a una o varias de estas moléculas. Dicho ácido nucleico es, en una realización, una de las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria o un derivado y/o un metabolito del mismo, en donde dicho derivado y/o metabolito preferiblemente son un ácido nucleico truncado en comparación con las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria. El truncamiento puede estar referido a uno o a ambos extremos de los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria. También, el truncamiento se puede referir a la secuencia interior de los nucleótidos del ácido nucleico, es decir, se puede referir a el(los) nucleótido(s) entre el nucleótido 5’ y el 3’ del extremo terminal respectivamente. Además, el truncamiento comprenderá la supresión de tan solo un único nucleótido de la secuencia de los ácidos nucleicos descrita en la presente memoria. El truncamiento también puede estar referido a más de una extensión de el(los) ácido(s) nucleico(s) de la invención, donde la extensión puede ser de tan solo un nucleótido de largo. La unión del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, con preferencia a una molécula seleccionada del grupo que comprende MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina, puede ser determinada por los expertos en la técnica mediante experimentos de rutina, o mediante el uso o la adopción de un método como el descrito en la presente memoria, preferiblemente como el descrito en la presente memoria en la parte de los ejemplos. Está incluido en una realización de la presente invención, a menos que se indique explícitamente lo contrario, que siempre que se mencione en la presente memoria la unión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención a o con MCP-1, esto también se aplica a la unión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención a o con cualquier molécula seleccionada del grupo que comprende MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina.
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden ser tanto ácidos nucleicos D o ácidos nucleicos
L. Preferiblemente, los ácidos nucleicos de la invención son ácidos nucleicos L. Además, es posible que una o varias partes del ácido nucleico estén presentes como ácidos nucleicos D o al menos una o varias partes de los nucleicos sean ácidos nucleicos L. El término “parte” de los ácidos nucleicos significará hasta solo un nucleótido. Tales ácidos nucleicos generalmente se mencionan en la presente memoria como ácidos nucleicos D y L, respectivamente. En consecuencia, en una realización particularmente preferida, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención consisten en nucleótidos L y comprenden al menos un nucleótido D. Dicho nucleótido D preferiblemente se une a una parte diferente de las extensiones que definen a los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, preferiblemente a las partes de los mismos en las que está involucrada una interacción con otras partes del ácido nucleico. Preferiblemente, dicho nucleótido D está unido a un extremo terminal de cualquiera de las extensiones y de cualquier ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, respectivamente. En una realización preferida adicional, dichos nucleótidos D pueden actuar como un espaciador o un conector, preferiblemente al unir modificaciones tales como PEG y HES a los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención.
También se engloba dentro de la presente invención que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención son parte de un ácido nucleico más largo en donde dicho ácido nucleico más largo comprende varias partes, en donde al menos una de dichas partes es un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, o una parte del mismo. La(s) otra(s) parte(s) de dichos ácidos nucleicos más largos pueden ser uno o varios ácidos nucleicos D o uno o varios ácidos nucleicos L. Se puede usar cualquier combinación en relación a la presente invención. Estas otras partes del ácido nucleico más largo tanto solas como consideradas en conjunto, tanto al completo como en una combinación particular, pueden exhibir una función que es diferente de la unión, preferiblemente de la unión a MCP
1. Una posible función es permitir la interacción con otras moléculas, en donde dichas otras moléculas preferiblemente son diferentes a la MCP-1, tal como, por ejemplo, para inmovilización, reticulado, detección o amplificación. En una realización adicional de la presente invención los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención comprenden, como restos individuales o combinados, varios de los ácidos nucleicos de la presente invención. Dicho
ácido nucleico que comprende varios de los ácidos nucleicos de la presente invención también está abarcado por la expresión “ácido nucleico más largo”.
Los ácidos nucleicos L usados en la presente memoria son ácidos nucleicos que consisten en nucleótidos L, que preferiblemente consisten por completo en nucleótidos L.
Los ácidos nucleicos D usados en la presente memoria son ácidos nucleicos que consisten en nucleótidos D, que preferiblemente consisten por completo en nucleótidos D.
Los términos ácido nucleico y molécula de ácido nucleico se usan en la presente memoria en forma indistinta si no se indica explícitamente lo contrario.
Asimismo, si no se indica lo contrario, cualquier secuencia de nucleótidos se expone en la presente memoria en dirección 5’ -3’.
Con independencia de si el ácido nucleico de la invención consiste en nucleótidos D, nucleótidos L o una combinación de ambos, siendo una combinación por ej., una combinación al azar o una secuencia definida de extensiones que consisten en por lo menos un nucleótido L y por lo menos un ácido nucleico D, el ácido nucleico puede consistir en desoxirribonucleótido(s), ribonucleótido(s) o combinaciones de los mismos.
El diseño de ácidos nucleicos inventivos como el ácido nucleico L es ventajoso por diversas razones. Los ácidos nucleicos L son enantiómeros de los ácidos nucleicos naturales. Los ácidos nucleicos D, sin embargo, no son muy estables en disoluciones acuosas y en particular en sistemas biológicos o muestras biológicas debido a la extendida presencia de nucleasas. Las nucleasas naturales, en particular las nucleasas de células animales, no son capaces de degradar ácidos nucleicos L. Debido a esto, la vida media biológica del ácido nucleico L aumenta significativamente en dicho sistema, que incluye al cuerpo animal y humano. Debido a la falta de degradabilidad del ácido nucleico L, no se generan productos de degradación de nucleasas y por tanto no se observan efectos secundarios provenientes de los mismos. Este aspecto delimita al ácido nucleico L entre objetivamente todos los otros compuestos que se usan en la terapia de enfermedades y/o trastornos que involucran la presencia de MCP-1. Los ácidos nucleicos L que se unen específicamente a una molécula diana a través de un mecanismo diferente del emparejamiento de bases Watson Crick, o aptámeros que consisten de forma parcial o completa en nucleótidos L, en particular con las partes del aptámero que están involucradas en la unión del aptámero a la molécula diana, también se llaman en spiegelmeros.
También está incluido en la presente invención que los ácidos nucleicos de la invención, también denominados en la presente memoria ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, sin tener en cuenta si están presentes como ácidos nucleicos D, ácidos nucleicos L o ácidos nucleicos D,L o si son ADN o ARN, pueden estar presentes como ácidos nucleicos de cadena simple o cadena doble. Típicamente, los ácidos nucleicos de la invención son ácidos nucleicos de cadena simple que exhiben estructuras secundarias definidas debidas a la secuencia primaria y de este modo pueden formar estructuras terciarias. Los ácidos nucleicos de la invención, sin embargo, también pueden ser de cadena doble en el sentido en que dos cadenas que son complementarias o parcialmente complementarias entre sí se hibridan entre sí. Esto confiere estabilidad al ácido nucleico que, en particular, será ventajoso si el ácido nucleico está presente en forma D más que en forma L.
Los ácidos nucleicos de la invención se pueden modificar. Tales modificaciones se pueden referir al nucleótido único del ácido nucleico y son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de tal modificación son los que se describen, entre otros, en Venkatesan (2003); Kusser (2000); Aurup (1994); Cummins (1995); Eaton (1995); Green (1995); Kawasaki (1993); Lesnik (1993); y Miller (1993). Dicha modificación puede ser un átomo de H, un átomo de F o grupo O-CH3 o grupo NH2 en la posición 2’ del nucleótido individual que forma parte del ácido nucleico. Asimismo, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender al menos un nucleótido LNA. En una realización el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención consiste en nucleótidos LNA.
En una realización, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden ser un ácido nucleico multiparte. Un ácido nucleico multiparte tal como se usa en la presente memoria, es un ácido nucleico que consiste en al menos dos cadenas de ácido nucleico. Dichas al menos dos cadenas de ácido nucleico forman una unidad funcional donde la unidad funcional es un ligando de una molécula diana. Las al menos dos cadenas de ácido nucleico pueden derivar de cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención tanto por ruptura del ácido nucleico para generar dos cadenas o por síntesis de un ácido nucleico correspondiente a una primera parte de la invención, es decir, un ácido nucleico total y otro ácido nucleico correspondiente a la segunda parte del ácido nucleico total. Se reconoce que se puede aplicar tanto la ruptura como la síntesis para generar un ácido nucleico multiparte donde hay más de dos cadenas como se ejemplificó anteriormente. En otras palabras, las al menos dos cadenas de ácido nucleico son típicamente diferentes de las dos cadenas que son complementarias y que se hibridan entre sí, si bien puede existir un cierto grado de complementariedad entre las diversas partes de ácido nucleico.
Finalmente también está incluido en la presente invención que se realice una estructura completamente cerrada, es decir una estructura circular, para los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, es decir, que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención están cerrados, preferiblemente mediante una unión
covalente, en donde más preferiblemente dicha unión covalente se realiza entre el extremo 5’ y el extremo 3’ de las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente memoria.
Los presentes inventores han descubierto que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención exhiben un rango de valores de KD muy favorable.
Una posibilidad para determinar la constante de unión es el uso del llamado dispositivo biacore, que también es conocido por los expertos en la técnica. La afinidad, tal como se usa en la presente memoria, también se midió mediante el uso del “ensayo de unión” descrito en los ejemplos. Una medida apropiada para expresar la identidad de la unión entre el ácido nucleico según la diana que en el presente caso es MCP-1, es el llamado valor de KD que tanto como tal como el método para su determinación son conocidos por los expertos en la técnica.
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención se caracterizan por un determinado valor de KD. Preferiblemente, el valor de KD mostrado por los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención es inferior a 1 μM. Se dice que un valor de KD de aproximadamente 1 μM es característico de una unión no específica de un ácido nucleico a una diana. Como reconocerán los expertos en la técnica, el valor de KD de un grupo de compuestos tal como los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención está dentro de un rango determinado. La KD mencionada anteriormente de aproximadamente de 1 μM es un límite superior preferido para el valor de KD. El límite inferior preferido para el KD de los ácidos nucleicos que se unen a diana puede ser aproximadamente 10 picomolar o superior. Está incluido en la presente invención que los valores de KD de los ácidos nucleicos individuales que se unen a MCP-1 preferiblemente están dentro de este rango. Los rangos preferidos se pueden definir por la elección de un primer número dentro de este rango y cualquier segundo número dentro de este rango. Los valores superiores preferidos son 250 nM y 100 nM, los valores inferiores preferidos son 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM y 10 pM.
Las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden tener cualquier longitud con la condición de que todavía sean capaces de unirse a la molécula diana. En la técnica se reconocerá que existen longitudes preferidas de los ácidos nucleicos de acuerdo con las presentes invenciones. Típicamente, la longitud está entre 15 y 120 nucleótidos. Los expertos en la técnica reconocerán que cualquier número entero entre 15 y 120 es una longitud posible para los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Los rangos más preferidos para la longitud de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención son longitudes de aproximadamente 20 a 100 nucleótidos, aproximadamente 20 a 80 nucleótidos, aproximadamente 20 a 60 nucleótidos, aproximadamente 20 a 50 nucleótidos y aproximadamente 30 a 50 nucleótidos.
Está incluido en la presente invención que los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria comprenden un residuo que preferiblemente es un residuo de alto peso molecular y/o que preferiblemente permite modificar las características del ácido nucleico en términos de, entre otros, tiempo de residencia en el cuerpo del animal, preferiblemente el cuerpo humano. Una realización particularmente preferida de tal modificación es la PEGilación y la HESilación de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Tal como se usan en la presente memoria PEG quiere decir poli(etilenglicol) y HES hidroxietilalmidón. La PEGilación tal como se usa preferiblemente en la presente memoria es la modificación de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención donde tal modificación consiste en un residuo PEG que está unido a un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. La HESilación tal como se usa preferiblemente en la presente memoria es la modificación de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención donde tal modificación consiste en un residuo HES que está unido a un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Estas modificaciones, además de los procesos para modificar un ácido nucleico mediante tales modificaciones, se describen en la Solicitud de Patente Europea EP 1 306 382.
Preferiblemente, el peso molecular de una modificación que consiste en, o que comprende, un residuo de alto peso molecular es aproximadamente de 2.000 a 200.000 Da, preferiblemente de 20,000 a 120.000 Da, particular en el caso de que dicho residuo de peso molecular alto sea PEG, y preferiblemente es aproximadamente de 3.000 a
180.000 Da, más preferiblemente de 5.000 a 130.000 Da, en particular en el caso de que dicho residuo de peso molecular alto sea HES. El proceso de modificación con HES, por ej., se describe en la solicitud de patente alemana DE 1 2004 006 249.8.
Está incluido en la presente invención que tanto el PEG como el HES se pueden usar en forma lineal o ramificada, tal como se describe adicionalmente en las solicitudes de patente WO2005074993 y PCT/EP02/11950. Tal modificación se puede realizar, en principio, en las moléculas de ácido nucleico de la presente invención en cualquier posición de las mismas. Preferiblemente, dicha modificación se realiza tanto en el nucleótido del extremo 5’-terminal como en el nucleótido del extremo 3’-terminal y/o cualquier nucleótido entre el nucleótido 5’ y el nucleótido 3’ de la molécula de ácido nucleico.
La modificación y preferiblemente el residuo PEG y/o HES se pueden unir a la molécula de ácido nucleico de la presente invención tanto de forma directa como a través de un conector. También está incluido en la presente invención que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención comprende una o más modificaciones, preferiblemente uno o más residuos PEG y/o HES. En una realización la molécula de conector individual une más de un residuo PEG o residuo HES a una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El conector usado en relación con la presente invención puede ser en sí mismo lineal o ramificado. Esta
clase de conectores son conocidos por los expertos en la técnica y se describen en las solicitudes de patente WO2005074993 y PCT/EP02/11950.
Sin pretender establecer ninguna teoría, parece que al modificar los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención con un residuo de alto peso molecular tal como un polímero y más particularmente los polímeros descriptos en la presente memoria, que preferiblemente son aceptables para uso fisiológico, se modifica la cinética de excreción. Más particularmente, parece que debido al aumento del peso molecular de tales ácidos nucleicos de la invención modificados y debido a que los ácidos nucleicos no se someten al metabolismo en particular cuando están en forma L, disminuye la excreción de un cuerpo de animal, preferiblemente de un cuerpo de mamífero y más preferiblemente de un cuerpo humano. Ya que la excreción típicamente se produce por medio de los riñones, los presentes inventores suponen que la velocidad de filtración glomerular del ácido nucleico modificado de este modo está significativamente reducida en comparación con los ácidos nucleicos que no tienen esta clase de modificación de alto peso molecular que produce un aumento en el tiempo de residencia en el cuerpo. En relación con lo mismo, es particularmente digno de mención que, a pesar de tal modificación de alto peso molecular, la especificidad del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención no se ve afectada de una forma perjudicial. En la medida de lo posible, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención tienen características sorprendentes –que normalmente no se pueden esperar en los compuestos activos para uso farmacéutico– de tal modo que no es necesario que una formulación farmacéutica proporcione una liberación sostenida para proporcionar una liberación sostenida. Más bien, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención en su forma modificada que comprende un residuo de alto peso molecular, se pueden usar como tales como una formulación de liberación sostenida. En la medida de lo posible, la(s) modificación(es) de las moléculas de ácidos nucleicos descritas en la presente memoria y las moléculas de ácidos nucleicos modificadas de este modo, y cualquier composición que comprenda las mismas, pueden proporcionar una farmacocinética y una biodistribución de la misma distintas, preferiblemente controladas. Esto también incluye el tiempo de residencia en circulación y la distribución a los tejidos. Tales modificaciones se describen adicionalmente en la Solicitud de Patente PCT/EP02/11950.
Sin embargo, también está incluido en la presente invención que los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria no comprenden cualquier modificación y en particular ninguna modificación de alto peso molecular tal como la PEGilación o la HESilación. Tal realización es particularmente preferida cuando el ácido nucleico muestra una distribución preferencial a un órgano o tejido diana cualquiera del cuerpo. Los agentes de ácido nucleico con dicho perfil distributivo permitirían el establecimiento de las concentraciones locales efectivas en el tejido diana a la vez que se mantiene una baja concentración sistémica. Esto permitiría el uso de dosis bajas, lo que no solo es beneficioso desde un punto de vista económico sino que también reduce la exposición innecesaria de otros tejidos al agente de ácido nucleico, reduciendo de este modo el riesgo potencial de efectos secundarios.
Los ácidos nucleicos de la invención, que también se denominan en la presente memoria ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, y/o los antagonistas de acuerdo con la presente invención se pueden usar para la generación o fabricación de un medicamento. Dicho medicamento o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención contiene al menos uno de los ácidos nucleicos de la invención, opcionalmente junto con otros compuestos farmacéuticamente activos, donde el ácido nucleico de la invención preferiblemente actúa él mismo como compuesto farmacéuticamente activo. Tales medicamentos comprenden en realizaciones preferidas al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal vehículo puede ser, por ej., agua, disolución salina, PBS, disolución de glucosa, preferiblemente una disolución equilibrada con sal de glucosa al 5%, almidón, azúcar, gelatina
o cualquier otra sustancia vehículo aceptable. Tales vehículos son generalmente conocidos por los expertos en la técnica. El experto en la técnica reconocerá que cualquiera de las realizaciones, usos y aspectos del medicamento de la presente invención, o relacionados con el mismo, también son aplicables a la composición farmacéutica de la presente invención y viceversa.
La indicación, enfermedades y trastornos para el tratamiento y/o prevención para los cuales los ácidos nucleicos, las composiciones farmacéuticas y medicamentos de acuerdo con la presente invención, o preparados de acuerdo con ella, provienen de la participación, tanto directa como indirecta, de la MCP-1 en el mecanismo patogenético respectivo. Sin embargo, estas indicaciones, enfermedades y trastornos también se pueden tratar y prevenir en el mecanismo patogenético en el cual MCP-2, MCP-3, MCP-4 y/o eotaxina están involucradas de forma directa o indirecta. Es obvio para los expertos en la técnica que en particular los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención se pueden usar en la medida de lo posible, es decir, para las enfermedades en las que participan en el sentido más amplio MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina, que interactúan y se unen, respectivamente, a MCP-2, MCP3, MCP-4 y eotaxina, respectivamente.
Más específicamente, tales usos surgen, entre otros, del patrón de expresión de MCP-1 que sugiere que cumple funciones importantes en las enfermedades humanas que se caracterizan por la infiltración de células mononucleares. Tal infiltración de células está presente en muchas enfermedades inflamatorias y autoinmunes. En modelos animales, se ha demostrado que la MCP-1 se expresa en el cerebro después de una isquemia focal (Kim 1995; Wang 1995) y durante la encefalomielitis autoinmune experimental (Hulkower 1993; Ransohoff 1993; Banisor 2005). La MCP-1 puede ser una quimiocina importante que se dirige a las células mononucleares en el proceso de la enfermedad ilustrado por estos modelos animales, tal como accidente cerebrovascular y esclerosis múltiple.
Un gran conjunto de evidencias argumenta a favor de un papel único del eje MCP-1/CCR2 en la quimiotaxis de
monocitos y, por tanto, en la inflamación crónica: (i) los ratones deficientes en MCP-1 o CCR2 muestran una respuesta quimiotáctica de macrófagos extremadamente reducida mientras que por otra parte parecen normales (Kuziel 1997; Kurihara 1997; Boring 1997; Lu 1998). (ii), a pesar de la redundancia funcional con otras quimiocinas in vitro, la pérdida de función efectora de la MCP-1 sola es suficiente para alterar la circulación monocítica en varios modelos inflamatorios (Lloyd 1997; Furuichi 2003; Egashira 2002; Galasso 2000; Ogata 1997; Kennedy 1998; Gonzalo 1998; Kitamoto 2003). (iii), los niveles de MCP-1 se elevan en muchas enfermedades inflamatorias. De hecho, se considera que la MCP-1 desempeña un papel en muchas enfermedades con y sin componente inflamatorio obvio tal como la artritis reumatoide (Koch 1992; Hosaka 1994; Akahoshi 1993; Harigai 1993; Rollins 1996), la enfermedad renal (Wada 1996; Viedt 2002), la restenosis después de angioplastia (Economou 2001), la alergia y el asma (Alam 1996; Holgate 1997; Gonzalo 1998), el cáncer (Salcedo 2000; Gordillo 2004), la aterosclerosis (Nelken 1991; Yla-Herttuala 1991; Schwartz 1993; Takeya 1993; Boring 1998), la psoriasis (Vestergaard 2004), la inflamación del sistema nervioso (Huang 2001), la dermatitis atópica (Kaburagi 2001), la colitis (Okuno 2002), la endometriosis (Jolicoeur 2001), la uveítis (Tuaillon 2002), los trastornos retinianos (Nakazawa 2007), la fibrosis pulmonar idiopática y la sarcoidosis (Iyonaga 1994) y la polimiositis/dermatomiositis (De Bleecker 2002).
La intervención terapéutica con agentes anti-MCP-1 – o antagonistas de CCR2 – debería afectar al exceso de circulación de monocitos inflamatorios pero puede disminuir la circulación basal de fagocitos, evitando de este modo la inmunosupresión general y el riesgo aumentado de infecciones (Dawson 2003).
Además, en base al creciente conocimiento de los mecanismos moleculares del proceso inflamatorio y la interacción de los mediadores de la inflamación secretados localmente, se han identificado nuevas dianas para la terapia de las enfermedades renales (Holdsworth 2000; Segerer 2000). Una de estas dianas, para la cual existen datos rigurosos de estudios de expresión e intervención con antagonistas específicos en modelos animales apropiados, es la MCP
1. Esta proteína tiene un papel ampliamente no redundante en el reclutamiento de células inmunes a los sitios de inflamación renal. Se considera que la infiltración de células inmunes al riñón es un mecanismo principal de daño estructural renal y de deterioro de la función renal en el desarrollo de diversas formas de enfermedad renal.
Todos los tipos de células renales pueden expresar quimiocinas que incluyen a la MCP-1 tras estimulación in vitro (Segerer 2000); existe una larga lista de estímulos que desencadenan la expresión de MCP-1 in vitro que incluye a las citocinas, radicales oxígeno, complejos inmunes y mediadores lipídicos.
En riñones sanos de ratas y ratones, la MCP-1 no está expresada, pero se regula por aumento fácilmente durante el curso de inflamación renal aguda y crónica en modelos de roedores que incluyen la glomerulonefritis de complejos inmunes, la glomerulonefritis progresiva rápida, la glomerulonefritis proliferativa, la neuropatía diabética, la neuropatía obstructiva o la necrosis tubular aguda (Segerer 2000; Anders 2003). Los datos de expresión para MCP1 en roedores se correlacionan bien con la respectiva expresión observada en biopsias renales humanas (Rovin 1994; Cockwell 1998; Wada 1999). Además, la expresión renal en riñones humanos se asocia a la actividad de la enfermedad y disminuye cuando una terapia apropiada induce la remisión de la enfermedad (Amann 2003).
La infiltración de células mononucleares glomerulares se asocia al desarrollo de una glomeruloesclerosis difusa en pacientes con nefropatía diabética. La MCP-1 cumple un papel importante en el reclutamiento y la acumulación de monocitos y linfocitos dentro del glomérulo (Banba 2000; Morii 2003).
La MCP-1 producida localmente parece estar particularmente involucrada en el inicio y la progresión del daño tubulointersticial, documentado en experimentos con ratones transgénicos con nefritis inducida por suero nefrotóxico (NSN). Se detectó MCP-1 principalmente en las células endoteliales vasculares, en las células epiteliales tubulares y en las células infiltradas mononucleares en lesiones intersticiales. La activación mediada por MCP-1 de las células epiteliales tubulares es compatible con la idea de que la MCP-1 contribuye a la inflamación tubulointersticial, un marcador de enfermedad renal progresiva (Wada 2001; Viedt 2002).
Debido a la homología entre la MCP-1 por un lado y las MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina por otro, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, al menos los que interactúan o se unen a MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina, respectivamente, se pueden usar típicamente para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de cualquier enfermedad en la que MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina, respectivamente, están involucradas de forma directa o indirecta. “Involucrado”, tal como se usa preferiblemente en la presente memoria, significa que si se impide a la molécula respectiva que está involucrada en la enfermedad ejercer una, varias o todas sus funciones en relación con el mecanismo patogenético subyacente a la enfermedad, la enfermedad se curará o disminuirá el grado de la misma
o se evitará el inicio de la misma; se aliviarán y mejorarán al menos los síntomas o algún indicador de dicha enfermedad, respectivamente, de modo que los síntomas e indicador, respectivamente, son idénticos o próximos a los que se observan en un sujeto que no padece la enfermedad o no está en riesgo de desarrollar tal enfermedad.
Naturalmente, debido a que los ácidos nucleicos de unión a MCP-1 de acuerdo con la presente invención interactúan con, o se unen a, MCP-1 humana o murina, un experto generalmente entenderá que los ácidos nucleicos de unión a MCP-1 de acuerdo con la presente invención se pueden usar con facilidad para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de cualquier enfermedad de seres humanos y animales descrita en la presente memoria.
Estos miembros de la familia de proteínas quimiotácticas de monocitos (MCP), es decir, MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina comparten por tanto un alto grado de semejanza de secuencia con la MCP-1. Si bien no exclusivamente, la eotaxina, MCP-2, -3, y -4 interactúan por medio de CCR3, el receptor de quimiocina característico de los eosinófilos humanos (Heath 1997). El receptor CCR3 se regula por aumento en condiciones neoplásicas, tales como el linfoma de células T cutáneo (Kleinhans 2003), el glioblastoma (Kouno 2004) o el carcinoma de células renales (Johrer 2005).
Más específicamente, los niveles aumentados de eotaxina se asocian directamente con el diagnóstico de asma y función pulmonar comprometida (Nakamura 1999). Se ha observado una expresión elevada de eotaxina en los sitios de inflamación alérgica tanto de asmáticos atópicos como no atópicos (Ying 1997; Ying 1999). También, los ARNm que codifican para MCP-2 y -4 se expresan de forma constitutiva en una variedad de tejidos; sin embargo, se desconocen sus funciones fisiológicas en estos contextos. Los niveles plasmáticos de MCP-2 están elevados en la sepsis junto con la MCP-1 (Bossink 1995); la expresión de MCP-3 se produce en asmáticos (Humbert 1997). Finalmente, la MCP-4 se puede hallar en la superficie luminal de los vasos ateroscleróticos (Berkhout 1997).
Por consiguiente, la enfermedad y/o trastornos y/o condiciones de enfermedad para el tratamiento y/o prevención de las cuales se puede usar el medicamento de acuerdo con la presente invención incluyen, aunque sin limitación a enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, encefalomielitis autoinmune, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple aguda y crónica, inflamación crónica, artritis reumatoide, enfermedades renales, restenosis, restenosis después de la angioplastia, reacciones alérgicas aguda y crónica, reacciones inmunológicas y alérgicas primarias y secundarias, asma, conjuntivitis, bronquitis, cáncer, aterosclerosis, insuficiencia cardíaca cardiovascular arteriosclerótica o accidente cerebrovascular, psoriasis, artritis psoriática, inflamación del sistema nervioso, dermatitis atópica, colitis, endometriosis, uveítis, trastornos retinianos que incluyen degeneración macular, desprendimiento de retina, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, retinitis pigmentaria, vitreorretinopatía proliferativa y coriorretinopatía serosa central; fibrosis pulmonar idiopática, sarcoidosis, polimiositis, dermatomiositis, anulación de la inmunosupresión, reducción del riesgo de infección, sepsis, inflamación renal, glomerulonefritis, glomerulonefritis progresiva rápida, glomerulonefritis proliferativa, neuropatía diabética, nefropatía obstructiva, necrosis tubular aguda y glomeruloesclerosis difusa, lupus eritematoso sistémico, bronquitis crónica, enfermedad de Behçet, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), ateroesclerosis prematura después de la enfermedad de Kawasaki, infarto de miocardio, obesidad, enfermedad hepática crónica, enfermedad de Peyronie, lesión de médula espinal aguda, trasplante de pulmón o riñón, miocarditis, enfermedad de Alzheimer y neuropatía, carcinoma de mama, carcinoma gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, hamartoma, carcinoma colorrectal, adenoma colónico, pancreatitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y enfermedades intestinales inflamatorias tales como enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa.
En una realización adicional, el medicamento comprende un agente adicional farmacéuticamente activo. Tales compuestos adicionales farmacéuticamente activos son, entre otros, aunque sin limitación, los conocidos para controlar la presión arterial y la diabetes, tales como inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) y bloqueantes del receptor de angiotensina. El compuesto adicional farmacéuticamente activo puede ser, en una realización adicional, también uno de los compuestos que reducen la infiltración de células inmunes en los sitios de inflamación crónica o que suprimen generalmente la respuesta inmune exuberante que está presente en los estados inflamatorios crónicas y que conducen al daño de tejidos. Tales compuestos pueden ser, aunque sin limitación, esteroides o supresores inmunológicos y preferiblemente se seleccionan del grupo que comprende corticoides como prednisona, metilprednisolona, hidrocortisona, dexametasona e inmunosupresores generales tales como ciclofosfamida, ciclosporina, clorambucilo, azatioprina, tacrolimus o micofenilato de mofetilo. Adicionalmente, son útiles en realizaciones adicionales bloqueantes más específicos de la coestimulación de células T, por ej., bloqueantes de CD154 o CD40 o CD28 o CD86 o CD80; o agentes de reducción de células T- y/o B como un agente anti-CD20. Finalmente, el agente adicional farmacéuticamente activo puede ser un modulador de la actividad de cualquier otra quimiocina que puede ser un agonista o antagonista de quimiocina o un agonista o un antagonista del receptor de quimiocina. De forma alternativa, o adicional, dicho agente adicional farmacéuticamente activo es un ácido nucleico adicional de acuerdo con la presente invención. Alternativamente, el medicamento comprende al menos un ácido nucleico más que se une a una molécula diana diferente de MCP-1 o que exhibe una función que es diferente a uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención.
Está incluido en la presente invención que el medicamento se usa de forma alternativa o adicional, en principio, para la prevención de cualquiera de las enfermedades descritas en relación con el uso del medicamento para el tratamiento de dichas enfermedades. Por lo tanto, los marcadores respectivos, es decir, para las enfermedades respectivas, son conocidos por los expertos en la técnica. Preferiblemente, el marcador respectivo es la MCP-1. De forma alternativa o adicional, el marcador respectivo se selecciona del grupo que comprende MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina. Un grupo adicional de marcadores se selecciona del grupo que comprende anticuerpos autorreactivos en el plasma, tal como, por ejemplo, anticuerpos anti-ADNds o factor reumatoide.
En una realización del medicamento de la presente invención, dicho medicamento es para uso en combinación con otros tratamientos para cualquiera de las enfermedades descritas en la presente memoria, en particular aquellas en las que se usa el medicamento de la presente invención.
"Terapia de combinación" (o "co-terapia") incluye la administración de un medicamento de la invención y al menos un segundo agente como parte de un régimen de tratamiento específico para proporcionar el efecto beneficioso a partir de la co-acción de dichos agentes terapéuticos, es decir, el medicamento de la presente invención y dicho segundo agente. El efecto beneficioso de la combinación incluye, aunque sin limitación, la co-acción farmacocinética
o farmacodinámica resultante de la combinación de agentes terapéuticos. La administración de estos agentes terapéuticos en combinación se realiza típicamente durante un período de tiempo determinado (habitualmente minutos, horas, días o semanas dependiendo de la combinación seleccionada).
"Terapia de combinación" puede, aunque generalmente no lo pretende, abarcar la administración de dos o más de estos agentes terapéuticos como parte de regímenes de monoterapias separadas, que en forma intencional y arbitraria producen las combinaciones de la presente invención. "Terapia de combinación” pretende abarcar la administración de dichos agentes terapéuticos de forma sucesiva, o sea, donde cada agente terapéutico se administra a un tiempo diferente, así como también la administración de dichos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos, de una forma sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea se puede lograr, por ejemplo, mediante la administración a un sujeto de una cápsula única que tiene una proporción fija de cada agente terapéutico o en cápsulas múltiples, únicas para cada uno de los agentes terapéuticos.
La administración de forma sucesiva o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico se puede efectuar por cualquier vía apropiada, lo que incluye, aunque sin limitación, vías tópicas, vías orales, vías intravenosas, vías intramusculares y absorción directa a través de las membranas mucosas de los tejidos. Los agentes terapéuticos se pueden administrar por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, se puede administrar un primer agente terapéutico de la combinación seleccionada mediante inyección mientras que los otros agentes terapéuticos de la administración se pueden administrar por vía tópica.
Alternativamente, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos se pueden administrar por vía tópica o todos los agentes terapéuticos se pueden administrar mediante inyección. La secuencia en que se administran los agentes terapéuticos no es rigurosamente crítica a menos que se indique lo contrario. "Terapia de combinación" también puede abarcar la administración de los agentes terapéuticos como se describió anteriormente en otra combinación con otros componentes biológicamente activos. Cuando la terapia de combinación además comprende un tratamiento sin fármacos, el tratamiento sin fármacos se puede realizar en cualquier momento adecuado siempre que se obtenga un efecto beneficioso a partir de la co-acción de la combinación de los agentes terapéuticos y el tratamiento sin fármacos. Por ejemplo, en casos apropiados, el efecto beneficioso se obtiene todavía cuando el tratamiento sin fármacos se elimina temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, quizás durante días o incluso durante semanas.
Como se describió en términos generales anteriormente, el medicamento de acuerdo con la presente invención se puede administrar, en principio, de cualquier forma conocida para los expertos en la técnica. Una vía preferida de administración es la administración sistémica, más preferiblemente por vía parenteral, preferiblemente mediante inyección. Alternativamente, el medicamento se puede administrar en forma local. Otras vías de administración comprenden la vía intramuscular, intraperitoneal, y subcutánea, por boca, intranasal, intratraqueal o pulmonar con preferencia dada para la vía de administración que sea menos invasiva, siempre que garantice la eficiencia.
La administración parenteral generalmente se usa para las inyecciones e infusiones subcutáneas, intramusculares o intravenosas. Adicionalmente, un método para la administración parenteral emplea la implantación de sistemas de liberación lenta o liberación sostenida, que asegura que se mantenga un nivel constante de dosis, éstos son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Además, los medicamentos preferidos de la presente invención se pueden administrar de forma intranasal mediante uso tópico de vehículos intranasales adecuados, inhalantes, o por vías transdérmicas, mediante las formas de parches cutáneos transdérmicos bien conocidas por los expertos en la técnica. Para administrarse en forma de un sistema de aplicación transdérmica, la administración de la dosis será, naturalmente, continua más que intermitente a lo largo del régimen de dosis. Otras preparaciones tópicas preferidas incluyen cremas, ungüentos, lociones, sprays en aerosol y geles, donde la concentración del elemento activo típicamente variará entre 0,01% y 15%, p/p o p/v.
El medicamento de la presente invención generalmente comprenderá una cantidad efectiva de el(los) componente(s) activo(s) de la terapia, que incluyen, pero sin limitación, moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención, disueltos o dispersos en un medio farmacéuticamente aceptable. Los medios o vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Los componentes activos suplementarios también se pueden incorporar en el medicamento de la presente invención.
En un aspecto adicional la presente invención se refiere a una composición farmacéutica. Tal composición farmacéutica comprende al menos uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención y preferiblemente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo puede ser cualquier vehículo o cualquier aglutinante usado y/o conocido en la técnica. Más particularmente dicho aglutinante o vehículo es cualquier vehículo
o aglutinante descrito en relación con la fabricación del medicamento descrito en la presente memoria. En una realización adicional, la composición farmacéutica comprende un agente farmacéuticamente activo adicional.
La preparación de un medicamento y una composición farmacéutica será conocida por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Típicamente, tales composiciones se pueden preparar como inyectables, tanto como disoluciones o suspensiones líquidas; formas sólidas adecuadas para formar disoluciones, o suspensiones, líquidas previas a la inyección; como comprimidos u otras formas sólidas para la administración oral; como cápsulas de liberación con el tiempo; o en cualquier otra forma usada habitualmente, que incluye gotas oculares, cremas, lociones, ungüentos, inhalantes y similares. El uso de formulaciones estériles, tales como lavados basados en disoluciones salinas, por cirujanos, médicos o trabajadores de la salud para tratar un área particular en el campo de operación también puede ser particularmente útil. Las composiciones también se pueden administrar por medio de microdispositivos, micropartículas o esponja.
En la formulación, se administrará un medicamento en una forma compatible con la formulación de la dosis y en tal proporción es farmacológicamente efectivo. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosis, tales como el tipo de disoluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármaco y similares.
En este contexto, la cantidad de componente activo y el volumen de la composición administrada dependen del individuo o del sujeto tratado. Las cantidades específicas del compuesto activo requeridas para la administración dependen del criterio del profesional y son particulares para cada individuo.
Generalmente se utiliza un volumen mínimo del medicamento requerido para dispersar los compuestos activos. Los regímenes adecuados para la administración son también variables, pero se tipificarían por la administración inicial del compuesto y la monitorización de los resultados, y después aplicando dosis controladas a intervalos adicionales.
Por ejemplo, para la administración oral en forma de un comprimido o una cápsula (por ej., una cápsula de gelatina), el componente del fármaco activo, es decir, una molécula de ácido nucleico de la presente invención y/o cualquier otro agente farmacéuticamente activo, también denominado en la presente memoria agente(s) terapéutico(s) o compuestos(s) activo(s), se puede combinar con un vehículo oral inerte, no tóxico, farmacéuticamente aceptable tal como etanol, glicerol, agua y similares. Además, cuando se desee o sea necesario también se pueden incorporar aglutinantes, lubricantes, agentes desintegrantes y agentes colorantes adecuados a la mezcla. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, silicato de magnesio aluminio, pasta de almidón, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona, azúcares naturales tales como glucosa o beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como acacia, tragacanto o alginato de sodio, polietilenglicol, ceras y similares. Los lubricantes usados en estas formas de dosificación incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, sílice, talco, ácido esteárico, su sal de magnesio o calcio y/o polietilenglicol y similares. Los desintegrantes incluyen, sin limitación, almidón, metil celulosa, agar, bentonita, almidones de goma xantano, agar, ácido algínico o su sal de sodio, o mezclas efervescentes y similares. Los diluyentes incluyen, por ej., lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina.
El medicamento de la invención también se puede administrar en formas de dosificación orales tales como comprimidos o cápsulas de liberación con el tiempo y liberación sostenida, pastillas, polvos, gránulos, elixires, tinturas, suspensiones, jarabes y emulsiones. Los supositorios se preparan de forma ventajosa a partir de emulsiones o suspensiones grasas.
La composición farmacéutica o medicamento se puede esterilizar y/o contener adyuvantes, tales como agentes conservantes, estabilizantes, humectantes o emulsionantes, promotores de disolución, sales para regular la presión osmótica y/o tampones. Además, estos pueden contener otras sustancias terapéuticamente valiosas. Las composiciones se preparan de acuerdo con los métodos convencionales de mezcla, granulación o recubrimiento, y típicamente contienen aproximadamente de 0,1% a 75%, preferiblemente aproximadamente de 1% a 50%, del componente activo.
Las composiciones líquidas, en particular las inyectables, por ejemplo, se pueden preparar por disolución, dispersión, etc. El compuesto activo se disuelve o se mezcla con un disolvente farmacéuticamente puro tal como, por ejemplo, agua, disolución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares, para formar de este modo la disolución o suspensión inyectable. Adicionalmente, se pueden formular formas sólidas adecuadas para la disolución en líquido antes de la inyección.
Para las composiciones sólidas, los excipientes incluyen, en grado para uso farmacéutico, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. El compuesto activo definido anteriormente, también se puede formular como supositorios, usando como vehículo, por ejemplo, polialquilen glicoles, por ejemplo, propilen glicol. En algunas realizaciones, los supositorios se preparan de forma ventajosa a partir de emulsiones o suspensiones grasas.
Los medicamentos y las moléculas de ácido nucleico, respectivamente, de la presente invención también se pueden administrar en la forma de sistemas de liberación de liposomas, tales como pequeñas vesículas unilaminares,
grandes vesículas unilaminares y vesículas multilaminares. Los liposomas se pueden formar a partir de una variedad de fosfolípidos, que contienen colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas. En algunas realizaciones, una película de componentes lipídicos se hidrata con una disolución acuosa del fármaco para formar una capa lipídica que encapsula al fármaco, el cual es bien conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria se pueden proporcionar como un complejo con un compuesto lipofílico o no inmunogénico, un compuesto de alto peso molecular construido mediante métodos conocidos en la técnica. Adicionalmente, los liposomas pueden portar dichas moléculas de ácido nucleico en su superficie para identificar y transportar agentes citotóxicos internamente para mediar en la destrucción celular. Un ejemplo de complejos asociados a ácidos nucleicos se proporciona en la Patente de EE.UU. Nº 6.011.020.
Los medicamentos y las moléculas de ácido nucleico, respectivamente, de la presente invención también se pueden acoplar con polímeros solubles como vehículos de fármaco dirigidos. Tales polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropil-metacrilamida-fenol, polihidroxietilaspanamidofenol o polietilenóxidopolillisina sustituida con residuos de palmitoílo. Además, los medicamentos y moléculas de ácido nucleico, respectivamente, de la presente invención se pueden acoplar a una clase de polímeros biodegradables útiles para obtener la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, poliepsilon caprolactona, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianocrilatos y copolímeros en bloque entrecruzados o anfipáticos de hidrogeles.
Si se desea, la composición farmacéutica y el medicamento, respectivamente, que se van a administrar también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulgentes, agentes tamponantes del pH y otras sustancias tales como, por ejemplo, acetato de sodio y oleato de trietanolamina.
El régimen de dosificación que usa las moléculas de ácido nucleico y los medicamentos, respectivamente, de la presente invención se selecciona de acuerdo con una variedad de factores que incluyen el tipo, la especie, la edad, el peso, el sexo y la condición médica del paciente; la gravedad de la condición tratada; la vía de administración; la función renal y hepática del paciente; y el aptámero particular, o su sal, empleado. Un médico o veterinario experto puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva de fármaco requerida para evitar, contrarrestar o detener el avance de la condición.
Los niveles plasmáticos efectivos del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención preferiblemente varían entre 500 fM y 500 μM en el tratamiento de cualquiera de las enfermedades descritas en la presente memoria.
Las moléculas de ácido nucleico y los medicamentos, respectivamente, de la presente invención preferiblemente se pueden administrar en una dosis única, cada dos o tres días, semanalmente, cada dos semanas, en una única dosis mensual o cada tres meses.
Está incluido en la presente invención que el medicamento descrito en la presente memoria constituye la composición farmacéutica descrita en la presente memoria.
En un aspecto adicional la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de un sujeto que necesita dicho tratamiento, donde el método comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente activa de al menos uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. En una realización, el sujeto padece una enfermedad o está en riesgo de desarrollar dicha enfermedad, donde la enfermedad es alguna de las descritas en la presente memoria, en particular alguna de las enfermedades en relación con el uso de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención para la fabricación de un medicamento.
Debe entenderse que se puede usar tanto el ácido nucleico como los antagonistas de acuerdo con la presente invención no sólo como un medicamento o para la fabricación de un medicamento, sino también con propósitos cosméticos, en particular con respecto a la participación de la MCP-1 en las lesiones cutáneas regionales inflamadas. En consecuencia, una afección o enfermedad adicional para cuyo tratamiento o prevención se puede usar el ácido nucleico, el medicamento y/o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, son las lesiones cutáneas regionales inflamadas.
Tal como se usa preferiblemente en la presente memoria, un agente diagnóstico o medio diagnóstico es adecuado para detectar, tanto de forma directa como indirecta, la MCP-1, preferiblemente la MCP-1 descrita en la presente memoria y más preferiblemente la MCP-1 descrita en la presente memoria en relación con los diversos trastornos y enfermedades descritos en la presente memoria. Sin embargo, en la medida en que las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención también se unen a cualquiera, algunas o todas las MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina, dichas moléculas de ácido nucleico también se pueden usar para el diagnóstico de enfermedades y trastornos, respectivamente, el mecanismo patogenético está directa o indirectamente unido o asociado a la sobreexpresión o sobreactividad con MCP-2, MCP-3, MCP-4 y/o eotaxina. El diagnóstico es adecuado para la detección y/o el seguimiento de cualquiera de los trastornos y enfermedades, respectivamente, descritos en la presente memoria. Tal detección es posible a través de la unión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención a la MCP-1. Tal unión se puede detectar de forma directa o indirecta. Los métodos y medios respectivos son conocidos por los expertos en la técnica. Entre otros, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención
pueden comprender una marca que permite la detección de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, preferiblemente el ácido nucleico unido a MCP-1. Dicha marca se selecciona preferiblemente del grupo que comprende marcas radioactivas, enzimáticas y fluorescentes. En principio, todos los ensayos conocidos desarrollados para anticuerpos se pueden adoptar para los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, siempre que el anticuerpo que se une a la diana se sustituya por un ácido nucleico que se una a la diana. En los ensayos de anticuerpos que usan anticuerpos que se unen a diana no marcada, la detección se realiza preferiblemente mediante un anticuerpo secundario que está modificado con marcas radiactivas, enzimáticas y fluorescentes, y se unen al anticuerpo que se une a la diana en su fragmento Fc. En el caso de un ácido nucleico, preferiblemente un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico es modificado con dicha marca, donde preferiblemente dicha marca se selecciona del grupo que comprende biotina, Cy-3 y Cy-5, y dicha marca es detectada por un anticuerpo dirigido contra dicha marca, por ej., un anticuerpo anti-biotina, un anticuerpo anti-Cy3 o un anticuerpo anti-Cy5 ó – en el caso de que la marca sea biotina – la marca se detecta con estreptavidina o avidina que se unen de forma natural a la biotina. Tal anticuerpo, estreptavidina o avidina a su vez se modifican preferiblemente con una marca respectiva, por ej., una marca radioactiva, enzimática o fluorescente (como un anticuerpo secundario).
En una realización adicional las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención se detectan o analizan mediante un segundo medio de detección, donde dicho segundo medio de detección es una baliza molecular. La metodología de la baliza molecular es conocida por los expertos en la técnica. Brevemente, las sondas de ácidos nucleicos que también se mencionan como balizas moleculares son un complemento inverso de la muestra de ácidos nucleicos que se va a detectar y se hibridan por ello a una parte de la muestra de ácido nucleico que se va a detectar. Después de la unión a la muestra de ácido nucleico, los grupos fluorofóros de la baliza molecular se separan, lo que produce un cambio de la señal de fluorescencia, preferiblemente un cambio de intensidad. Este cambio se correlaciona con la cantidad de ácidos nucleicos presentes en la muestra.
Será reconocido que la detección de la MCP-1 mediante los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención permitirá en particular la detección de la MCP-1 definida en la presente memoria.
En relación con la detección de la MCP-1, un método preferido comprende los siguientes pasos:
(a)
proporcionar una muestra que se ensayará para determinar la presencia de la MCP-1,
(b)
proporcionar un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención,
(c)
hacer reaccionar la muestra con el ácido nucleico, preferiblemente en un recipiente de reacción
en donde el paso (a) se puede realizar antes del paso (b), o el paso (b) se puede realizar antes del paso (a).
En una realización preferida se proporciona un paso adicional d), que consiste en la detección de la reacción de la muestra con el ácido nucleico. Preferiblemente, el ácido nucleico del paso b) se inmoviliza en una superficie. La superficie puede ser la superficie de un recipiente de reacción tal como un tubo de reacción, un pocillo de una placa,
o la superficie de un dispositivo contenido en tal recipiente de reacción, tal como, por ejemplo, una microesfera. La inmovilización del ácido nucleico en la superficie se puede realizar mediante cualquiera de los medios conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, aunque sin limitación, uniones no covalentes o covalentes. Preferiblemente, la unión se establece por medio de un enlace químico covalente entre la superficie y el ácido nucleico. Sin embargo, también está incluido en la presente invención que el ácido nucleico se inmovilice en forma indirecta a una superficie, donde tal inmovilización indirecta involucra el uso de un componente adicional o un par de compañeros de interacción. Dicho componente adicional preferiblemente es un compuesto que interactúa específicamente con el ácido nucleico inmovilizado, el cual también se denomina compañero de interacción, y de este modo media en la unión del ácido nucleico a la superficie. El compañero de interacción preferiblemente se selecciona del grupo que comprende ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y anticuerpos. Preferiblemente, el compañero de interacción es un anticuerpo, más preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Alternativamente, el compañero de interacción es un ácido nucleico, preferiblemente un ácido nucleico funcional. Más preferiblemente, dicho ácido nucleico funcional se selecciona del grupo que comprende aptámeros, spiegelmeros y ácidos nucleicos que son, al menos parcialmente, complementarios al ácido nucleico. En una realización alternativa adicional, la unión del ácido nucleico a la superficie está mediada por un compañero de interacción multiparte. Dicho compañero de interacción multi-parte preferiblemente es un par de compañeros de interacción que consisten en un primer miembro y un segundo miembro, donde el primer miembro está compuesto por o unido al ácido nucleico y el segundo miembro está comprendido por la superficie. El compañero de interacción multi-parte preferiblemente se selecciona del grupo de pares de compañeros de interacción que comprende biotina y avidina, biotina y estreptavidina, y biotina y neutravidina. Preferiblemente, el primer miembro del par de compañero de interacción es biotina.
Un resultado preferido de dicho método es la formación de un complejo inmovilizado de MCP-1 y ácido nucleico, donde más preferiblemente se detecta dicho complejo. Está incluido en una realización que a partir del complejo se detecte la MCP-1.
Un medio de detección respectivo que cumple con este requisito es, por ejemplo, cualquier medio de detección que sea específico para dicha(s) parte(s) de la MCP-1. Un medio de detección particularmente preferido es un medio de detección que se selecciona del grupo que comprende ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y anticuerpos, cuya
generación es conocida por los expertos en la técnica.
El método para la detección de la MCP-1 también comprende que la muestra sea eliminada del recipiente de reacción que se ha usado preferiblemente para realizar el paso c).
El método comprende en una realización adicional también el paso de inmovilización del compañero de interacción de la MCP-1 sobre una superficie, preferiblemente una superficie como la definida anteriormente, donde el compañero de interacción es el definido en la presente memoria y preferiblemente como se indicó anteriormente en relación con el método respectivo, y más preferiblemente comprende ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y anticuerpos en sus diversas realizaciones. En esta realización, un medio de detección particularmente preferido es un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, donde dicho ácido nucleico preferiblemente puede estar marcado o no marcado. En el caso en que el ácido nucleico esté marcado, puede detectarse de forma directa o indirecta. Tal detección también puede incluir el uso de un segundo medio de detección que, preferiblemente, también se selecciona del grupo que comprende ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y realizaciones de las diversas realizaciones descritas en la presente memoria. Dichos medios de detección son preferiblemente específicos para el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. En una realización más preferida el segundo medio de detección es una baliza molecular. Tanto el ácido nucleico como el segundo medio de detección,
o ambos, pueden comprender en una realización preferida una marca de detección. La marca de detección se selecciona preferiblemente del grupo que comprende biotina, una marca de bromo-desoxiridina, una marca de digoxigenina, una marca de fluorescencia, una marca UV, una radiomarca y una molécula quelante. Alternativamente, el segundo medio de detección interactúa con la marca de detección que preferiblemente está contenida, comprendida o unida al ácido nucleico. Las combinaciones particularmente preferidas son las siguientes:
la marca de detección es biotina y el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra biotina, o en donde la marca de detección es biotina y el segundo medio de detección es una avidina o una molécula que porta avidina, o en donde la marca de detección es biotina y el segundo medio de detección es una estreptavidina o una molécula que porta estreptavidina, o donde la marca de detección es biotina y el segundo medio de detección es una neutravidina o una molécula que porta neutravidina, o en donde la marca de detección es una bromo-desoxiuridina y el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra bromo-desoxiuridina, o en donde la marca de detección es una digoxigenina y el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra digoxigenina, o en donde la marca de detección es un quelante y el segundo medio de detección es un radionucleido, en donde se prefiere que dicha marca de detección esté unida al ácido nucleico. Se debe reconocer que esta clase de combinación también es aplicable a la realización en la que el ácido nucleico está unido a la superficie. En tal realización se prefiere que la marca de detección esté unida al compañero de interacción.
Finalmente, también está incluido en la presente invención que el segundo medio de detección se detecte mediante un tercer medio de detección, preferiblemente el tercer medio de detección es una enzima, más preferiblemente que presenta una reacción enzimática después de la detección del segundo medio de detección, o el tercer medio de detección es un medio para detectar radiación, más preferiblemente radiación emitida por un radionucleido. Preferiblemente, el tercer medio de detección está detectando y/o interactuando específicamente con el segundo medio de detección.
También en la realización con un compañero de interacción de la MCP-1 que está inmovilizada en una superficie y el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, se agrega preferiblemente el complejo formado entre el compañero de interacción y la MCP-1, la muestra se puede retirar de la reacción, más preferiblemente del recipiente de reacción donde se realizan el paso c) y/o d).
En una realización el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención comprende un residuo de fluorescencia y en donde la fluorescencia del residuo de fluorescencia es diferente después de la formación del complejo entre el ácido nucleico y MCP-1 y la MCP-1 libre.
En una realización adicional el ácido nucleico es un derivado del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, en donde el derivado del ácido nucleico comprende al menos un derivado fluorescente de adenosina que reemplaza una adenosina. En una realización preferida, el derivado fluorescente de adenosina es etenoadenosina.
En una realización adicional el complejo que consiste en el derivado del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y la MCP-1 se detecta mediante fluorescencia.
En una realización del método, en el paso (c) o en el paso (d) se crea una señal y la señal se correlaciona preferiblemente con la concentración de MCP-1 de la muestra.
En un aspecto preferido, los ensayos se pueden realizar en placas de 96 pocillos, en donde los componentes se inmovilizan en los recipientes de reacción descritos anteriormente y los pocillos actúan como recipientes de reacción.
Será reconocido por los expertos en la técnica que lo dicho anteriormente también se aplica a MCP-2, MCP-3, MCP4 y/o eotaxina, al menos en la medida que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención también se unan a, o con, MCP-2, MCP-3, MCP-4 y/o eotaxina.
El ácido nucleico de la invención se puede usar adicionalmente como material de partida para el diseño del fármaco. Básicamente hay dos métodos posibles. Un método es la identificación de bibliotecas de compuestos siempre que dichas bibliotecas de compuestos preferiblemente sean bibliotecas de compuestos de bajo peso molecular. En una realización, la identificación es una identificación de alto rendimiento. Preferiblemente, una identificación de alto rendimiento es la evaluación eficiente y rápida mediante prueba y error de los compuestos en un ensayo basado en la diana. En el mejor caso, los análisis se llevan a cabo mediante una medición colorimétrica. Las bibliotecas usadas en relación con los mismos son conocidas en la técnica.
Alternativamente, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se puede usar para el diseño racional de fármacos. Preferiblemente, el diseño racional de fármacos es el diseño de una estructura guía de fármacos. Se parte de la estructura tridimensional de la diana que generalmente está identificada por métodos tales como cristalografía de rayos X o espectroscopía de resonancia magnética nuclear, se usan programas de computación para buscar a través de las bases de datos que contienen las estructuras de muchos compuestos químicos diferentes. La selección se hace mediante un ordenador, los compuestos identificados se pueden ensayar posteriormente en el laboratorio.
El diseño racional de fármacos puede iniciarse a partir del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención e involucra una estructura, con preferencia una estructura tridimensional, que es similar a la estructura de los ácidos nucleicos de la invención o idéntica a las partes que median la unión de la estructura de los ácidos nucleicos de la invención. En cualquier caso, dicha estructura todavía muestra la misma o similar unión característica de los ácidos nucleicos de la invención. En un paso adicional, o como un paso alternativo en el diseño racional de fármacos, preferiblemente la estructura tridimensional de estas partes de los ácidos nucleicos que se unen al neurotransmisor es imitada por grupos químicos que son diferentes de los nucleótidos y ácidos nucleicos. Por este mimetismo se puede diseñar un compuesto diferente de los ácidos nucleicos. Dicho compuesto preferiblemente es una molécula pequeña o un péptido.
En el caso de escrutinio de bibliotecas de compuestos, tal como por medio de ensayos competitivos que son conocidos por los expertos en la técnica, se pueden hallar análogos de MCP-1, agonistas de MCP-1 o antagonistas de MCP-1 apropiados. Tales ensayos competitivos se pueden ejecutar de la siguiente manera. El ácido nucleico de la invención, preferiblemente un spiegelmero que es un ácido nucleico L que se une a la diana, se acopla a una fase sólida. Para identificar los análogos de MCP-1 marcados se puede agregar MCP-1 al ensayo. Un análogo potencial debería competir con las moléculas de MCP-1 que se unen al spiegelmero, lo que debería venir acompañado de una disminución de la señal obtenida por la marca respectiva. La identificación de agonistas o antagonistas puede involucrar el uso de un ensayo de cultivo de células, conocido por los expertos en la técnica.
El kit de acuerdo con la presente invención puede comprender al menos uno o varios de los ácidos nucleicos de la invención. Adicionalmente, el kit puede comprender al menos uno o varios controles positivos o negativos. Un control positivo, por ejemplo, puede ser MCP-1, en particular uno contra el cual se selecciona el ácido nucleico de la invención o al cual se une, preferiblemente, en una forma líquida. Un control negativo puede ser, por ej., un péptido que se define en términos de propiedades biofísicas similares a la MCP-1, pero que no es reconocido por los ácidos nucleicos de la invención. Además, dicho kit puede comprender uno o varios tampones. Los diversos componentes pueden estar contenidos en el kit en forma seca o liofilizada o disuelta en líquido. El kit puede comprender uno o varios recipientes que a su vez pueden contener uno o varios componentes del kit. En una realización adicional, el kit comprende unas instrucciones o folleto instructivo que proporcionan la información al usuario sobre cómo se usa el kit y sus diversos componentes.
La determinación farmacéutica y bioanalítica del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es esencial para la evaluación de su perfil farmacocinético y biodinámico en diversos humores, tejidos y órganos del cuerpo humano y no humano. Para tal propósito, se puede usar cualquiera de los medios de detección descritos en la presente memoria o conocidos por los expertos en la técnica. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. En el ensayo de detección se usa una sonda de captura y una sonda de detección. La sonda de captura es complementaria con la primera parte y la sonda de detección con la segunda parte del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Tanto la sonda de captura como la de detección pueden estar formadas por nucleótidos de ADN, nucleótidos de ADN modificados, nucleótidos de ARN modificados, nucleótidos de ARN, nucleótidos LNA y/o nucleótidos de PNA.
En consecuencia, la sonda de captura comprende una extensión de secuencia complementaria con el extremo 5’ del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y la sonda de detección comprende una extensión de
secuencia complementaria con el extremo 3’ del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. En este caso, la sonda de captura está inmovilizada sobre una superficie o matriz por medio de su extremo 5’, en donde la sonda de captura puede estar inmovilizada directamente a su extremo 5’ o por medio de un conector entre su extremo 5’ y la superficie o matriz. Sin embargo, en principio el conector se puede unir a cada nucleótido de la sonda de captura. El conector puede estar formado por conectores hidrofílicos conocidos por los expertos en la técnica o por nucleótidos de D-ADN, nucleótidos de D-ADN modificados, nucleótidos de D-ARN, nucleótidos de D-ARN modificados, nucleótidos de D-LNA, nucleótidos de PNA, nucleótidos de L-ARN, nucleótidos de L-ANA, nucleótidos de L-ARN modificados, nucleótidos de L-ADN modificados y/o nucleótidos de L-LNA.
Alternativamente, la sonda de captura comprende una extensión de secuencia complementaria con el extremo 3’ del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y la sonda de detección comprende una extensión de secuencia complementaria con el extremo 5’ del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. En este caso, la sonda de captura está inmovilizada sobre una superficie o matriz por medio de su extremo 3’, en donde la sonda de captura puede estar inmovilizada directamente a su extremo 3’ o por medio de un conector entre su extremo 3’ y la superficie o matriz. Sin embargo, en principio el conector se puede unir a cualquier nucleótido de la extensión de secuencia complementaria con el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El conector puede estar formado por conectores hidrofílicos conocidos por los expertos en el arte o por nucleótidos de D-ADN, nucleótidos de D-ADN modificados, nucleótidos de D-ARN, nucleótidos de D-ARN modificados, nucleótidos de D-LNA, nucleótidos de PNA, nucleótidos de L-ARN, nucleótidos de L-ADN, nucleótidos de L-ARN modificados, nucleótidos de L-ADN modificados y/o nucleótidos de L-LNA.
El número de nucleótidos de las sondas de captura y de detección que se pueden hibridar con el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es variable y puede depender de la cantidad de nucleótidos de la sonda de captura y/o de detección y/o del propio ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El número total de nucleótidos de la sonda de captura y de detección que se pueden hibridar con el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención deberá ser el número máximo de nucleótidos que están comprendidos por el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El número mínimo de nucleótidos (de 2 a 10 nucleótidos) de la sonda de detección y de captura deberá permitir la hibridación en el extremo 5’ o 3’, respectivamente, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Para obtener una alta especificidad y selectividad entre el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y otros ácidos nucleicos que aparecen en las muestras analizadas, el número total de nucleótidos de las sondas de captura y de detección deberá ser el número máximo de nucleótidos que están comprendidos por el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.
Además, la sonda de detección preferiblemente porta una molécula marcadora o marca que se puede detectar como se ha descrito previamente en la presente memoria. La marca o molécula marcadora en principio puede unirse a cualquier nucleótido de la sonda de detección. Preferiblemente, la marca o molécula marcadora se ubica en el extremo 5’ o en el extremo 3’ de la sonda de detección, en donde se puede insertar un conector entre los nucleótidos de la sonda de detección que son complementarios con el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y la marca. El conector puede estar formado por conectores hidrofílicos conocidos en la técnica o por nucleótidos de D-ADN, nucleótidos de D-ADN modificados, nucleótidos de D-ARN, nucleótidos de D-ARN modificados, nucleótidos de D-LNA, nucleótidos de PNA, nucleótidos de L-ARN, nucleótidos de L-ADN, nucleótidos de L-ARN modificados, nucleótidos de L-ADN modificados y/o nucleótidos de L-LNA.
La detección del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo de la siguiente manera: El ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se hibrida por uno de sus extremos a la sonda de captura y por el otro extremo a la sonda de detección. Después se elimina la sonda de detección no unida, por ej., mediante uno o varios pasos de lavado. La cantidad de sonda de detección unida, que preferiblemente porta una marca o molécula marcadora, se puede medir posteriormente.
Tal como se usa preferiblemente en la presente memoria, el término tratamiento comprende en una realización preferida adicional o alternativamente la prevención y/o el seguimiento.
Tal como se usa preferiblemente en la presente memoria, los términos de enfermedad y trastorno se usarán de forma indistinta, si no se indica lo contrario.
Tal como se usa en la presente memoria, el término comprende preferiblemente no pretende limitar el contenido seguido o descrito por tal término. Sin embargo, en una realización alternativa el termino comprende se entenderá en el sentido de contener y por tanto como una limitación al contenido seguido o descrito por tal término.
Las diversas SEC ID Nº, la naturaleza química de las moléculas del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y las moléculas MCP-1 diana tal como se usan en la presente memoria, la secuencia real y el número de referencia interno de las mismas, se sintetizas en la siguiente tabla.
SEC. ID.
ARN/Péptido Secuencia Referencia interna
1
L-proteína QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT MCP-1 humana, huMCP-1, CCL2
2
L-proteína QPDAVNAPLTCCYSFTSKMIPMSRLESYKRITSSRCPKEAVVFVTKLKREVCADPKKEWVQTYIKNLDRNQMRSEPTTLFKTASALRSSAPLNVKLTRKSEANASTTFSTTTSSTSVGVTSVTVN MCP-1 de ratón,mCCL2, mMCP-1, MCP1 murina (Musmusculus)
3
L-proteína QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQIQTPKP MCP-1 de mono(Macaca mulatta)
4
L-proteína QPDAINSPVTCCYTLTSKKISMQRLMSYRRVTSSKCPKEAVIFKTIAGKEICAEPKQKWVQDSISHLDKKNQTPKP MCP-1 de cerdo (Sus scrofa)
5
L-proteína QPDAIISPVTCCYTLTNKKISIQRLASYKRVTSSKCPKEAVIFKTVLNKEICADPKQKWVQDSMAHLDKKSQTQTA MCP-1 de perro (Canis familiaris)
6
L-proteína QPDAVNSPVTCCYTFTNKTISVKRLMSYRRINSTKCPKEAVIFMTKLAKGICADPKQKWVQDAIANLDKKMQTPKTLTSYSTTQEHTTNLSSTRTPSTTTSL MCP-1 de conejo (Oryctolagus cuniculus)
7
L-proteína QPVGINTSTTCCYRFINKKIPKQRLESYRRTTSSHCPREAVIFKTKLDKEICADPTQKWVQDFMKHLDKKTQTPKL MCP-3 humana, CCL7, huMCP-3
8
L-proteína GPASVPTTCCFNLANRKIPLQRLESYRRITSGKCPQKAVIFKTKLAKDICADPKKKWVQDSMKILDQKSPTPKP eotaxina humana/CCL11
9
L-proteína QPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKRGKEVCADPKERWVRDSMKHLDQIFQNLKP MCP-2 humana, CCL8, huMCP-2
10
L-ARN AGCGUGCCCGGAGUGGCAGGGGGACGCGACCUGCAAUAAUGCACGCU 169-B1trc
11
L-ARN AGCGUGCCCGGAGUGGCAGGGGGACGCGACCUGCAAUUGCACGCU 169-F3trc
12
L-ARN AGCGUGCCCGGAGUGGCAGGGGGACGCGACCUGUAAUAAUGCACGCU 169-C1trc
13
L-ARN AGCGUGCCCGGUGUGGCAGGGGGACGCGACCUGCAAUAAUGCGCGCU 169-A3trc
14
L-ARN AGCGUGCCCGGAGUAGCAGGGGGGCGCGACCUGCAAUAAUGCACGCU 169-B2trc
15
L-ARN AGCGUGCCCGGUGUGGUAGGGGGGCGCGAUCUACAAUUGCACGCU 176-B12trc
16
L-ARN AGCGUGCCCGGUGUGACAGGGGGGCGCGACCUGCAUUUGCACGCU 176-D9trc
17
L-ARN AGCGUGCCCGGUGUGGCAGGGGGGCGCGACCUGUAUUUGCACGCU 176-B10trc
18
L-ARN AGCGUGCCCGGAGUGGCAGGGGGGCGCGACCUGCAAUAAUGCACGCU 169-F2trc
19
L-ARN AGCGUGCCCGGUGUGGCAGGGGGGCGCGACCUGCAAUUGCACGCU 176-B9trc
SEC. ID.
ARN/Péptido Secuencia Referencia interna
20
L-ARN AGCAUGCCCGGUGUGGCAGGGGGGCGCGACCUGCAUUUGCAUGCU 176-H9trc
21
L-ARN AGCGUGCCCGGUGUGGUAGGGGGGCGCGACCUACAUUUGCACGCU 176-E10trc
22
L-ARN AGUGUGCCAGCUGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACACACU 176-G9trc
23
L-ARN AGUGUGCCAGCGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACACACU 176-F9trc
24
L-ARN AGUGUGCGAGCGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACAUACU 176-C11trc
25
L-ARN AGUGUGCCAGCGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACAUACU 176-E11trc
26
L-ARN AGUAUGCCAGCGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUACAUACU 176-D10trc
27
L-ARN AGUGUGCCAGUGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACACACU 176-H10trc
28
L-ARN AGCGUGCCAGUGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACACGCU 176-C9trc
29
L-ARN ACGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGCGGCUCUGCGU 180-B1-001
30
L-ARN ACGCACCUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCGC 180-A4-002
31
L-ARN ACGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCGU 180-D1-002
32
L-ARN GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCGU 180-D1-011
33
L-ARN ACGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGC 180-D1-012
34
L-ARN GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGC 180-D1-018
35
L-ARN CGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCGU 180-D1-034
36
L-ARN CGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCG 180-D1-035
37
L-ARN GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCG 180-D1-036 = NOX-E36
38
L-ARN GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUAAUGACAGCCGAAUGCUGGCAGCAC 178-A8
39
L-ARN GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUAAUGACAGCCUAAUGCUGGCAGCAC 178-F7
40
L-ARN GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUUAUGACAGCCGAAUGCUGGCAGCAC 178-G7
41
L-ARN GUGCUGCGUAGUGAAAAACUACUGCCAGUGGGUCAGAGCUAGCAGCAC 178-C6
42
L-ARN GUGCUGCGGAGUUAAAAACUCCCUAAGACAGGCCAGAGCCGGCAGCAC 178-E7
43
L-ARN GUGCUGCGGAGUUGAAAACUCCCUAAGACAGGCCAGAGCCGGCAGCAC 178-G6
44
L-ARN GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUAUGACAGCCUAAUGCUGGCAGCAC 178-A7
45
L-ARN GUGCUGCGGAGUUAAAAACUCCCUAAGACAGGCUAGAGCCGGCAGCAC 178-C7
SEC. ID.
ARN/Péptido Secuencia Referencia interna
46
L-ARN GUGCUGCGGCGUGAAAAACGCCCUGCGACUGCCCUUUAUGCAGGCAGCAC 178-E5
47
L-ARN GUGCUGCGUAGUGAAAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC 181-F1
48
L-ARN GUGCUGCGUAGUGAAAGACUACCUGUGACAGCCGAAUGCUGGCAGCAC 181-B2
49
L-ARN GUACUGCGUAGUUAAAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC 181-C2
50
L-ARN GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC 178-A6
51
L-ARN GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACAGGCUAGAGCCGGCAGCAC 178-D6
52
L-ARN GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC 178-D5
53
L-ARN GUGCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC 181-A2
54
L-ARN GGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGAGCCGGCAGCC 178-D5-020
55
L-ARN GGCGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGAGCCGGCGCC 178-D5-027
56
L-ARN GUGCGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGAGCCGGCGCAC 178-D5-030
57
L-ARN GUGCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGCAC 181-A2-002
58
L-ARN GUGCCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGGCAC 181-A2-004
59
L-ARN GUGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCCAC 181-A2-005
60
L-ARN GUCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGAC 181-A2-006
61
L-ARN UGCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGCA 181-A2-007
62
L-ARN GCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGC 181-A2-008
63
L-ARN GCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGC 181-A2-011
64
L-ARN GGUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCACC 181-A2-012
65
L-ARN UGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGC-CA 181-A2-015
66
L-ARN GCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGC 181-A2-016
67
L-ARN GUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAC 181-A2-017
68
L-ARN GG-GCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCCC 181-A2-018
69
L-ARN GAGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCUC 181-A2-019
70
L-ARN CGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCCG 181-A2-020
71
L-ARN CCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGG 181-A2-021
SEC. ID.
ARN/Péptido Secuencia Referencia interna
72
L-ARN CAGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCUG 181-A2-022
73
L-ARN CUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAG 181-A2-023
74
L-ARN AGCGUGUUAGUGAAGUGGGUGGCAGGUAAAGGACACGCU 184-B8trc
75
L-ARN AGCGUGGUAGCGGUGUGGGUGGUAGGUAAAGGCCACGCU 184-C6trc
76
L-ARN AGCGUGAUAGAAGAGCGGGUGGUAGGUAAAGGUCAGGCU 184-H5trc
77
L-ARN AGCGUGUUAGGUAGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACACGCU 184-A7trc
78
L-ARN AGCGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACACGCU 187-A5trc
79
L-ARN AGCGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCACGCU 187-H5trc
80
L-ARN CCGCUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGGCGG 174-D4-004
81
L-ARN GCGCGAGCAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGACUCGCGUC 166-A4-002
82
L-ARN CGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACACG 187-A5trc-001
83
L-ARN GUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACAC 187-A5trc-002
84
L-ARN CGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCACG 187-H5trc-002
85
L-ARN GUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCAC 187-H5trc-003
86
L-ARN UGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCA 187-H5trc-004
87
L-ARN GGACGAGAGUGACAAAUGAUAUAACCUCCUGACUAACGCUGCGGGCGACAGG 177-B3
88
L-ARN GGACCUAUCGCUAAGACAACGCGCAGUCUACGGGACAUUCUCCGCGGACAGG 177-C1
89
L-ARN GGACAAUUGUUACCCCCGAGAGAGACAAAUGAGACAACCUCCUGAAGACAGG 177-C2
90
L-ARN GGACGAAAGUGAGAAAUGAUACAACCUCCUGUUGCUGCGAAUCCGGACAGG 177-E3
91
L-ARN GGACGUAAAAGACGCUACCCGAAAGAAUGUCAGGAGGGUAGACCGACAGG 177-D1
92
L-ARN GGACUAGAAACUACAAUAGCGGCCAGUUGCACCGCGUUAUCAACGACAGG 177-E1
93
L-ARN GGACUAGUCAGCCAGUGUGUAUAUCGGACGCGGGUUUAUUUACUGACAGG 177-A1
94
L-ARN GGACUGUCCGGAGUGUGAAACUCCCCGAGACCGCCAGAAGCGGGGACAGG 177-G3
95
L-ARN GGACUUCUAUCCAGGUGGGUGGUAGUAUGUAAAGAGAUAGAAGUGACAGG 177-C3
96
L-ARN GGACGAGAGCGAACAAUGAUAUAACCUCCUGACGGAAAGAGAUCGACAGG 177-A2
97
L-ARN CCUGUGCUACACGCAGUAAGAAGUGAACGUUCAGUAUGUGUGCACAGG 170-E4trc
SEC. ID.
ARN/Péptido Secuencia Referencia interna
98
L-ARN CGUGAGCCAGGCACCGAGGGCGUUAACUGGCUGAUUGGACACGACACG 166-D2trc
99
L-ARN CGUGAACAUGCAAGCUAAGCGGGGCUGUUGGUUGCUUGGCCCGCCACG 174-A2trc
100
L-ARN CGUGCAGAGAGAGACCAACCACGUAAAAUCAACCUAAUGGGCCGCACG 174-E2trc
101
L-ARN CGUGCAGAGAGAGACCAACCACGUAAAAUCAACCUAAUGGGCCGCACG 183-G3trc
102
L-ARN CGUGAACAUUCAAGCUAAGCGGGGCUGUUGGUUGCUUGGCCCGCCACG 183-B2trc
103
L-ARN CGUGCCGAGGCGGCGACCAGCGUUACUUAGAGAGGCUUUGGCACCACG 166-B2trc
104
L-ARN CGUGAUAACAGCCGUCGGUCAAGAAAACAAAGUUCGGGCGGCGCACG 166-G3trc
105
L-ARN CGUGGGUGGCGCACCGAGGGCGAAAAGCCACCAGUAAAGAUAGACCG 166-D1trc
106
L-ARN CGUGUGAUCUCCUUUGGGGUGAUUAGCUUAGAGACUUCCCACACG 183-H2trc
107
L-ARN GCACCUUCGCCUAAUACACGUGCCGGCUAGCUAAUACUCGUCCGC 167-A7trc
108
L-ARN GCACGACUUGGGCGACCAGUGAUACUUAGAGAGCAAGUCGUCGGC 167-C7trc
109
L-ARN GCGCGCGCUCAGUAAGAAAUUGAAAGUUCAGAAUGUCGUCGCGC 167-B5trc
110
L-ARN AGUGUGUGGCAGGCUAAGGAGAUAUUCCGAGACCACGCU 184-D7trc
111
L-ARN AGUGUGUGGCAGACUAUGGAUAGACUCCGAGACCACGCU 184-D6trc
112
L-ARN AGCGUGAGGCGACCAGCGGAUUACUUAGAGAGUCACGCU 184-E5trc
113
L-ARN AGCGUGAAGGGGACCAGCGUUACUUACAGAGUUCACGCU 184-G6trc
114
L-ARN AGCGUGUGAUGUAUGUAGCACCGUAUCAGAGGACACGCU 184-B7trc
115
L-ARN AGCGUGAGGCGACCCGUGUUUCGUAGAGAGUCACGCU 184-B6trc
116
L-ARN 5’PEG-GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCG NOX-E36-5’PEG
117
L-ARN GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCG-3’PEG NOX-E36-3’PEG
118
L-ARN GAGAUGGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCAUUC 188-A3-001
119
L-ARN GAUGGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCAUUC 188-A3-004
120
L-ARN GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCAUUC 188-A3-005
121
L-ARN GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCAUU 188-A3-006
122
L-ARN GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCA 188-A3-007=mNOX-E36
123
L-ARN GCUGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCACCAGC 189-G7-001
SEC. ID.
ARN/Péptido Secuencia Referencia interna
124
L-ARN CUGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCACCAG 189-G7-002
125
L-ARN UGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCACCA 189-G7-003
126
L-ARN GCCGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCACCGGC 189-G7-007
127
L-ARN GCCGGCUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCGCCGGC 189-G7-008
128
L-ARN GCGCGUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCCGCGC 189-G7-010
129
L-ARN GGGCCUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCGGCCC 189-G7-012
130
D-proteína Biotina-QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQD-SMDHLDKQTQTPKT D-MCP-1 biotiniladahumana
131
D-proteína CYSFTSKMIPMSRLESYKRITSSRCPKEAVVFVTKLKREVCADPKKEWVQTYIKNLDRNQMRSEP-Biotina MCP-1 biotinilada de ratón
132
D-ARN AGCGUGCCCGGAGUGGCAGGGGGACGCGACCUGCAAUAAUGCACGCU 169-B1trc
133
D-ARN AGCGUGCCCGGAGUGGCAGGGGGACGCGACCUGCAAUUGCACGCU 169-F3trc
134
D-ARN AGCGUGCCCGGAGUGGCAGGGGGACGCGACCUGUAAUAAUGCACGCU 169-C1trc
135
D-ARN AGCGUGCCCGGUGUGGCAGGGGGACGCGACCUGCAAUAAUGCGCGCU 169-A3trc
136
D-ARN AGCGUGCCCGGAGUAGCAGGGGGGCGCGACCUGCAAUAAUGCACGCU 169-B2trc
137
D-ARN AGCGUGCCCGGUGUGGUAGGGGGGCGCGAUCUACAAUUGCACGCU 176-B12trc
138
D-ARN AGCGUGCCCGGUGUGACAGGGGGGCGCGACCUGCAUUUGCACGCU 176-D9trc
139
D-ARN AGCGUGCCCGGUGUGGCAGGGGGGCGCGACCUGUAUUUGCACGCU 176-B10trc
140
D-ARN AGCGUGCCCGGAGUGGCAGGGGGGCGCGACCUGCAAUAAUGCACGCU 169-F2trc
141
D-ARN AGCGUGCCCGGUGUGGCAGGGGGGCGCGACCUGCAAUUGCACGCU 176-B9trc
142
D-ARN AGCAUGCCCGGUGUGGCAGGGGGGCGCGACCUGCAUUUGCAUGCU 176-H9trc
143
D-ARN AGCGUGCCCGGUGUGGUAGGGGGGCGCGACCUACAUUUGCACGCU 176-E10trc
144
D-ARN AGUGUGCCAGCUGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACACACU 176-G9trc
145
D-ARN AGUGUGCCAGCGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACACACU 176-F9trc
146
D-ARN AGUGUGCGAGCGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACAUACU 176-C11trc
147
D-ARN AGUGUGCCAGCGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACAUACU 176-E11trc
148
D-ARN AGUAUGCCAGCGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUACAUACU 176-D10trc
SEC. ID.
ARN/Péptido Secuencia Referencia interna
149
D-ARN AGUGUGCCAGUGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACACACU 176-H10trc
150
D-ARN AGCGUGCCAGUGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACACGCU 176-C9trc
151
D-ARN ACGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGCGGCUCUGCGU 180-B1-001
152
D-ARN ACGCACCUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCGC 180-A4-002
153
D-ARN ACGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCGU 180-D1-002
154
D-ARN GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCGU 180-D1-011
155
D-ARN ACGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGC 180-D1-012
156
D-ARN GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGC 180-D1-018
157
D-ARN CGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCGU 180-D1-034
158
D-ARN CGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCG 180-D1-035
159
D-ARN GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCG (D-)180-D1-036, (D-)-NOX-E36
160
D-ARN GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUAAUGACAGCCGAAUGCUGGCAGCAC 178-A8
161
D-ARN GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUAAUGACAGCCUAAUGCUGGCAGCAC 178-F7
162
D-ARN GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUUAUGACAGCCGAAUGCUGGCAGCAC 178-G7
163
D-ARN GUGCUGCGUAGUGAAAAACUACUGCCAGUGGGUCAGAGCUAGCAGCAC 178-C6
164
D-ARN GUGCUGCGGAGUUAAAAACUCCCUAAGACAGGCCAGAGCCGGCAGCAC 178-E7
165
D-ARN GUGCUGCGGAGUUGAAAACUCCCUAAGACAGGCCAGAGCCGGCAGCAC 178-G6
166
D-ARN GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUAUGACAGCCUAAUGCUGGCAGCAC 178-A7
167
D-ARN GUGCUGCGGAGUUAAAAACUCCCUAAGACAGGCUAGAGCCGGCAGCAC 178-C7
168
D-ARN GUGCUGCGGCGUGAAAAACGCCCUGCGACUGCCCUUUAUGCAGGCAGCAC 178-E5
169
D-ARN GUGCUGCGUAGUGAAAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC 181-F1
170
D-ARN GUGCUGCGUAGUGAAAGACUACCUGUGACAGCCGAAUGCUGGCAGCAC 181-B2
171
D-ARN GUACUGCGUAGUUAAAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC 181-C2
172
D-ARN GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC 178-A6
173
D-ARN GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACAGGCUAGAGCCGGCAGCAC 178-D6
174
D-ARN GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC 178-D5
SEC. ID.
ARN/Péptido Secuencia Referencia interna
175
D-ARN GUGCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC 181-A2
176
D-ARN GGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGAGCCGGCAGCC 178-D5-020
177
D-ARN GGCGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGAGCCGGCGCC 178-D5-027
178
D-ARN GUGCGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGAGCCGGCGCAC 178-D5-030
179
D-ARN GUGCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGCAC 181-A2-002
180
D-ARN GUGCCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGGCAC 181-A2-004
181
D-ARN GUGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCCAC 181-A2-005
182
D-ARN GUCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGAC 181-A2-006
183
D-ARN UGCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGCA 181-A2-007
184
D-ARN GCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGC 181-A2-008
185
D-ARN GCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGC 181-A2-011
186
D-ARN GGUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCACC 181-A2-012
187
D-ARN UGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGC—CA 181-A2-015
188
D-ARN GCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGC 181-A2-016
189
D-ARN GUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAC 181-A2-017
190
D-ARN GG—GCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCCC 181-A2-018
191
D-ARN GAGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCUC 181-A2-019
192
D-ARN CGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCCG 181-A2-020
193
D-ARN CCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGG 181-A2-021
194
D-ARN CAGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCUG 181-A2-022
195
D-ARN CUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAG 181-A2-023
196
D-ARN AGCGUGUUAGUGAAGUGGGUGGCAGGUAAAGGACACGCU 184-B8trc
197
D-ARN AGCGUGGUAGCGGUGUGGGUGGUAGGUAAAGGCCACGCU 184-C6trc
198
D-ARN AGCGUGAUAGAAGAGCGGGUGGUAGGUAAAGGUCAGGCU 184-H5trc
199
D-ARN AGCGUGUUAGGUAGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACACGCU 184-A7trc
200
D-ARN AGCGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACACGCU 187-A5trc
SEC. ID.
ARN/Péptido Secuencia Referencia interna
201
D-ARN AGCGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCACGCU 187-H5trc
202
D-ARN CCGCUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGGCGG 174-D4-004
203
D-ARN GCGCGAGCAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGACUCGCGUC 166-A4-002
204
D-ARN CGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACACG 187-A5trc-001
205
D-ARN GUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACAC 187-A5trc-002
206
D-ARN CGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCACG 187-H5trc-002
207
D-ARN GUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCAC 187-H5trc-003
208
D-ARN UGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCA 187-H5trc-004
209
D-ARN GGACGAGAGUGACAAAUGAUAUAACCUCCUGACUAACGCUGCGGGCGACAGG 177-B3
210
D-ARN GGACCUAUCGCUAAGACAACGCGCAGUCUACGGGACAUUCUCCGCGGACAGG 177-C1
211
D-ARN GGACAAUUGUUACCCCCGAGAGAGACAAAUGAGACAACCUCCUGAAGACAGG 177-C2
212
D-ARN GGACGAAAGUGAGAAAUGAUACAACCUCCUGUUGCUGCGAAUCCGGACAGG 177-E3
213
D-ARN GGACGUAAAAGACGCUACCCGAAAGAAUGUCAGGAGGGUAGACCGACAGG 177-D1
214
D-ARN GGACUAGAAACUACAAUAGCGGCCAGUUGCACCGCGUUAUCAACGACAGG 177-E1
215
D-ARN GGACUAGUCAGCCAGUGUGUAUAUCGGACGCGGGUUUAUUUACUGACAGG 177-A1
216
D-ARN GGACUGUCCGGAGUGUGAAACUCCCCGAGACCGCCAGAAGCGGGGACAGG 177-G3
217
D-ARN GGACUUCUAUCCAGGUGGGUGGUAGUAUGUAAAGAGAUAGAAGUGACAGG 177-C3
218
D-ARN GGACGAGAGCGAACAAUGAUAUAACCUCCUGACGGAAAGAGAUCGACAGG 177-A2
219
D-ARN CCUGUGCUACACGCAGUAAGAAGUGAACGUUCAGUAUGUGUGCACAGG 170-E4trc
220
D-ARN CGUGAGCCAGGCACCGAGGGCGUUAACUGGCUGAUUGGACACGACACG 166-D2trc
221
D-ARN CGUGAACAUGCAAGCUAAGCGGGGCUGUUGGUUGCUUGGCCCGCCACG 174-A2trc
222
D-ARN CGUGCAGAGAGAGACCAACCACGUAAAAUCAACCUAAUGGGCCGCACG 174-E2trc
223
D-ARN CGUGCAGAGAGAGACCAACCACGUAAAAUCAACCUAAUGGGCCGCACG 183-G3trc
224
D-ARN CGUGAACAUUCAAGCUAAGCGGGGCUGUUGGUUGCUUGGCCCGCCACG 183-B2trc
225
D-ARN CGUGCCGAGGCGGCGACCAGCGUUACUUAGAGAGGCUUUGGCACCACG 166-B2trc
226
D-ARN CGUGAUAACAGCCGUCGGUCAAGAAAACAAAGUUCGGGCGGCGCACG 166-G3trc
SEC. ID.
ARN/Péptido Secuencia Referencia interna
227
D-ARN CGUGGGUGGCGCACCGAGGGCGAAAAGCCACCAGUAAAGAUAGACCG 166-D1trc
228
D-ARN CGUGUGAUCUCCUUUGGGGUGAUUAGCUUAGAGACUUCCCACACG 183-H2trc
229
D-ARN GCACCUUCGCCUAAUACACGUGCCGGCUAGCUAAUACUCGUCCGC 167-A7trc
230
D-ARN GCACGACUUGGGCGACCAGUGAUACUUAGAGAGCAAGUCGUCGGC 167-C7trc
231
D-ARN GCGCGCGCUCAGUAAGAAAUUGAAAGUUCAGAAUGUCGUCGCGC 167-B5trc
232
D-ARN AGUGUGUGGCAGGCUAAGGAGAUAUUCCGAGACCACGCU 184-D7trc
233
D-ARN AGUGUGUGGCAGACUAUGGAUAGACUCCGAGACCACGCU 184-D6trc
234
D-ARN AGCGUGAGGCGACCAGCGGAUUACUUAGAGAGUCACGCU 184-E5trc
235
D-ARN AGCGUGAAGGGGACCAGCGUUACUUACAGAGUUCACGCU 184-G6trc
236
D-ARN AGCGUGUGAUGUAUGUAGCACCGUAUCAGAGGACACGCU 184-B7trc
237
D-ARN AGCGUGAGGCGACCCGUGUUUCGUAGAGAGUCACGCU 184-B6trc
238
D-ARN 5’PEG-GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCG NOX-E36-5’PEG
239
D-ARN GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCG-3’PEG NOX-E36-3’PEG
240
D-ARN GAGAUGGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCAUUC 188-A3-001
241
D-ARN GAUGGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCAUUC 188-A3-004
242
D-ARN GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCAUUC 188-A3-005
243
D-ARN GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCAUU 188-A3-006
244
D-ARN GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCA (D-)188-A3-007 = (D-) mNOX-E36
245
D-ARN GCUGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCACCAGC 189-G7-001
246
D-ARN CUGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCACCAG 189-G7-002
247
D-ARN UGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCACCA 189-G7-003
248
D-ARN GCCGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCACCGGC 189-G7-007
249
D-ARN GCCGGCUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCGCCGGC 189-G7-008
250
D-ARN GCGCGUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCCGCGC 189-G7-010
251
D-ARN GGGCCUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCGGCCC 189-G7-012
252
L-proteína QPDAVNAPLTCCYSFTGKMIPMSRLENYKRITSSRCPKEAVVFVTKLKREICADPNKEWVQKYIRKLDQ rat MCP-1
SEC. ID.
ARN/Péptido Secuencia Referencia interna
NQVRSET
253
L-ARN 5’PEG-GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCA mNOX-E36-5’PEG
254
L-ARN GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCA-3’PEG mNOX-E36-3’PEG
255
L-DNA 5'-GAGGGACGTGC-(Espaciador 18)2 -NH4+ -3' Sonda de captura NOX-E36
256
L-DNA 5'- Biotina-(Espaciador 18)2 -CGCAGAGCC Sonda de detección NOX-E36
257
L-Proteína KSMQVPFSRCCFSFAEQEIPLRAILCYRNTSSICSNEGLIFKLKRGKEACALDTVGWVQRHRKMLRHCPSKRK CCL1/I-309
258
L-Proteína SLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPGVIFLTKRSRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA CCL3/MIP-1a
259
L-Proteína APMGSDPPTACCFSYTARKLPRNFVVDYYETSSLCSQPAVVFQTKRSKQVCADPSESWVQEYVYDLELN CCL4/MIP-1f
260
L-Proteína SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS CCL5/RANTES
261
L-Proteína FNPQGLAQPDALNVPSTCCFTFSSKKISLQRLKSYVITTSRCPQKAVIFRTKLGKEICADPKEKWVQNYMKHLGRKAHTLKT CCL13/MCP-4
262
L-Proteína TKTESSSRGPYHPSECCFTYTTYKIPRQRIMDYYETNSQCSKPGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKEN CCL14/HCC-1
263
L-Proteína ASVATELRCQCLQTLQGIHPKNIQSVNVKSPGPHCAQTEVIATLKNGRKACLNPASPIVKKIIEKMLNSDKSN C CL1_GROa
264
L-Proteína APLATELRCQCLQTLQGIHLKNIQSVKVKSPGPHCAQTEVIATLKNGQKACLNPASPMVKKIIEKMLKNGKSN C CL _GROf
265
L-Proteína ASVVTELRCQCLQTLQGIHLKNIQSVNVRSPGPHCAQTEVIATLKNGKKACLNPASPMVQKIIEKILNKGSTN C CL _GROy
266
L-Proteína EAEEDGDLQCLCVKTTSQVRPRHITSLEVIKAGPHCPTAQLIATLKNGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES CXCL4/PF4
267
L-Proteína GPAAAVLRELRCVCLQTTQGVHPKMISNLQVFAIGPQCSKVEVVASLKNGKEICLDPEAPFLKKVIQKILDGGNKEN CXCL5/ENA-78
268
L-Proteína GPVSAVLTELRCTCLRVTLRVNPKTIGKLQVFPAGPQCSKVEVVASLKNGKQVCLDPEAPFLKKVIQKILDSGNKKN CXCL6/GCP-2
269
L-Proteína SSTKGQTKRNLAKGKEESLDSDLYAELRCMCIKTTSGIHPKNIQSLEVIGKGTHCNQVEVIATLKDGRKICLDPDAPRIKKIVQKKLAGDESAD CXCL7/NAP-2
270
L-Proteína EGAVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEK CXCL8/IL-8
SEC. ID.
ARN/Péptido Secuencia Referencia interna
FLKRAENS
271
L-Proteína TPVVRKGRCSCISTNQGTIHLQSLKDLKQFAPSPSCEKIEIIATLKNGVQTCLNPDSADVKELIKKWEKQVSQKKKQKNGKKHQKKKVLKVRKSQRSRQKKTT CXCL9/MIG
272
L-Proteína VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSP CXCL10/IP-10
273
L-Proteína FPMFKRGRCLCIGPGVKAVKVADIEKASIMYPSNNCDKIEVIITLKENKGQRCLNPKSKQARLIIKKVERKNF CXCL11/I-TAC
274
L-Proteína KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEILEKALNKRFKM C CL1 a_SnF-1a
275
L-Proteína KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEILEKALNKRFKM C CL1 f_SnF-1f
276
L-Proteína QHHGVTKCNITCSKMTSKIPVALLIHYQQNQASCGKRAIILETRQHRLFCADPKEQWVKDAMQHLDRQAAALTRNG CX3 CL1/ Fractalquina
277
L-Proteína VGSEVSDKRTCVSLTTQRLPVSRIKTYTITEGSLRAVIFITKRGLKVCADPQATWVRDVVRSMDRKSNTRNNMIQTKPTGTQQSTNTAVTLTG XCL1/Linfotactina
278
L-ARN 5’-Biotina-GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCG NOX-E36 biotinilada
279
L-ARN 5’-UAAGGAAACUCGGUCUGAUGCGGU AGCGCUGUGCAGAGCU POC
280
L-ARN 5’-PEG-UAAGGAAACUCGGUCUGAUGCGGU AGCGCUGUGCAGAGCU-3’ POC-PEG
281
L-DNA 5'-CCAATGTCGCC-(Espaciador 18)2 -NH4+ -3' Sonda de captura mNOX-E36
282
L-DNA 5'- Biotina-(Espaciador 18)2 -CGCAGAGCC Sonda de detección mNOX-E36
283
L-proteína QPDAINSPVTCCYTFTGKKISSQRLGSYKRVTSSKCPKEAVIFKTILAKEICADPEQKWVQDAVKQLDKKAQTPKP MCP-1 de caballo (Equus caballus)
284
L-proteína QPDAINSQVACCYTFNSKKISMQRLMNYRRVTSSKCPKEAVIFKTILGKELCADPKQKWVQDSINILNKKNQTPKP MCP-1 bovina (Bos Taurus)
285
L-proteína QPDAVNAPLTCCYSFTGKMIPMSRLENYKRITSSRCPKEAVVFVTKLKREICADPNKEWVQKYIRKLDQNQVRSETTVFYKIASTLRTSAPLNVNLTHKSEANASTLFSTTTSSTSVEVTSMTEN MCP-1 de rata (Rattus norvegicus)
La presente invención está ilustrada adicionalmente por las figuras, ejemplos y el listado de secuencias del cual se pueden tomar rasgos, realizaciones y ventajas, en donde
Figura 1: muestra un alineamiento de secuencias de ligandos de ARN relacionados unidos a MCP-1 humana que indica el motivo de secuencia (“Tipo 1A”) que es en una realización preferida en su totalidad esencial para la unión a la MCP-1 humana;
Figura 2: muestra un alineamiento de secuencias de ligandos de ARN relacionados unidos a MCP-1 humana que indica el motivo de secuencia (“Tipo 1B”) que es en una realización preferida en su totalidad esencial para la unión a MCP-1 humana y derivados de ligandos de ARN 180-D1-002;
Figura 3: muestra un alineamiento de secuencias de ligandos de ARN relacionados unidos a MCP-1 humana que indica el motivo de secuencia (“Tipo 2”) que es en una realización preferida en su totalidad esencial para la unión a la MCP-1 humana;
Figura 4: muestra un alineamiento de secuencias de ligandos de ARN relacionados unidos a MCP-1 humana que indica el motivo de secuencia (“Tipo 3”) que es en una realización preferida en su totalidad esencial para la unión a la MCP-1 humana;
Figura 5: muestra derivados de ligandos de ARN 178-D5 y 181-A2 (ligandos de ARN de la MCP-1 humana del motivo de secuencia “Tipo 3”);
Figura 6: muestra un alineamiento de secuencias de ligandos de ARN relacionados unidos a MCP-1 humana que indica el motivo de secuencia (“Tipo 4”) que es en una realización preferida en su totalidad esencial para la unión a la MCP-1 humana (otras secuencias);
Figura 7: muestra una tabla de secuencias de varios ligandos diferentes de ARN que se unen a la MCP-1 humana que no puede ser relacionada con los motivos de secuencia de unión a MCP-1“Tipo 1A”, “Tipo 1B”; “Tipo 2”, “Tipo 3”
o “Tipo 4”;
Figura 8: muestra alineamientos de derivados de ligandos de ARN 188-A3-001 y de 189-G7-001 que se unen a la MCP-1 murina;
Figura 9: muestra el resultado de los análisis de unión del aptámero D-NOX-E36 a D-MCP-1 biotinilada humana a temperatura ambiente y 37°C, representado como la unión del aptámero sobre la concentración de la D-MCP-1 biotinilada humana;
Figura 10: muestra el resultado de los análisis de unión del aptámero D-mNOX-E36 a la D-MCP-1 biotinilada murina a 37°C, representado como la unión del aptámero sobre la concentración de la D-MCP-1 biotinilada murina;
Figura 11: muestra la liberación de Ca++ inducida por MCP-1 en células THP-1, mientras que se obtuvo una curva de dosis respuesta para la MCP-1 humana, lo que indica una concentración efectiva media (EC50) de aproximadamente 3 nM, representada como la diferencia en fluorescencia con el blanco sobre la concentración de MCP-1 humana;
Figura 12: muestra la eficacia del Spiegelmero NOX-E36 en un ensayo de liberación de calcio; las células se estimularon con 3 nM de MCP-1 humana preincubada a 37°C con diversas cantidades de Spiegelmero NOX-E36, representado como porcentaje de control sobre la concentración de NOX-E36;
Figura 13: muestra la eficacia del Spiegelmero mNOX-E36 en un ensayo de liberación de calcio; las células se estimularon con 5 nM de MCP-1 murina preincubada a 37°C con diversas cantidades de Spiegelmero mNOX-E36, representado como porcentaje de control sobre la concentración de mNOX-E36;
Figura 14: muestra la quimiotaxis inducida por la MCP-1 humana de las células THP-1 mientras que después de 3 horas de migración de las células THP-1 hacia diversas concentraciones de MCP-1 se obtuvo una curva de dosis respuesta para la MCP-1, representada como factor X de aumento en comparación con el control sobre la concentración de la MCP-1 humana;
Figura 15: muestra la eficacia del Spiegelmero NOX-E36 en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia 0,5 nM de MCP-1 humana preincubada a 37°C con diversas proporciones de Spiegelmero NOX-E36, representado como porcentaje de control sobre la concentración de Spiegelmero NOX-E36;
Figura 16: muestra la eficacia del Spiegelmero mNOX-E36 en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia 0.5 nM MCP-1 murina preincubada a 37°C con diversas proporciones de Spiegelmero NOX-E36, representado como porcentaje de control sobre la concentración de Spiegelmero mNOX-E36;
Figura 17: muestra el sensograma de Biacore 2000 que indica el valor de KD del Spiegelmero NOX-E-36 que se une a la MCP-1 humana que estaba inmovilizada en un chip sensor PioneerF1 por el procedimiento de acoplamiento de amina, representado como respuesta (UR) con el tiempo;
Figura 18: muestra el sensograma de Biacore 2000 que indica el valor de KD del Spiegelmero NOX-E-36 a las proteínas de la familia MCP humana (huMCP-1, huMCP-2, huMCP-3) y eotaxina humana, que estaban inmovilizadas por el procedimiento de acoplamiento de amina en un PioneerF1 y un chip sensor CM4, respectivamente, representado como respuesta (UR) con el tiempo;
Figura 19: muestra el sensograma de Biacore 2000 que indica la unión de del Spiegelmero NOX-E36 a la MCP-1 de especies diferentes (MCP-1 canina, MCP-1 de mono, MCP-1 humana, MCP-1 porcina, MCP-1 de conejo, MCP-1 de ratón, MCP-1 de rata) mientras que diferentes formas de MCP-1 se inmovilizaron por el procedimiento de acoplamiento de aminas PioneerF1 y chips sensores CM4, respectivamente, representado como respuesta (UR) con el tiempo;
Figura 20: muestra el sensograma de Biacore 2000 que indica el valor de KD del Spiegelmero 181-A2-018 que se une a la MCP-1 humana que estaba inmovilizada en un chip sensor CM4 por el procedimiento de acoplamiento de aminas, representado como respuesta (UR) con el tiempo;
Figura 21: muestra el sensograma de Biacore 2000 que indica la unión del Spiegelmero 181-A2-018 a las proteínas de la familia de MCP (huMCP-1, huMCP-2, huMCP-3) y eotaxina humana que estaban inmovilizadas por el procedimiento de acoplamiento de aminas a PioneerF1 y un chip sensor CM4, respectivamente, representado como respuesta (UR) con el tiempo;
Figura 22: muestra el sensograma de Biacore 2000 que indica la unión del Spiegelmero 181-A2-018 a la MCP-1 de especies diferentes (MCP-1 canina, MCP-1 de mono, MCP-1 humana, MCP-1 porcina, MCP-1 de conejo, MCP-1 de ratón, MCP-1 de rata) mientras que diferentes formas de MCP-1 se inmovilizaron por el procedimiento de acoplamiento de aminas PioneerF1 y chips sensores CM4, respectivamente, representado como respuesta (UR) con el tiempo;
Figura 23: muestra un alineamiento Clustal W de la MCP-1 de diferentes especies de mamíferos además de la MCP2, MCP-3, y eotaxina humana (solo posiciones 1-76);
Figura 24A: muestra una tabla que sintetiza la especificidad de unión de NOX-E36 y 181-A2-018 con respecto a la MCP-1 de diferentes especies de mamíferos además de la MCP-2, MCP-3, y eotaxina humana;
Figura 24B: muestra una tabla que sintetiza la selectividad de NOX-E36 determinada por análisis Biacore donde NOX-E36 biotinilado estaba inmovilizado en la superficie del chip sensor y se analizó la unión de un panel de diversas quimiocinas CC y CXC a la NOX-E36;
Figura 24C: muestra el análisis de cinética de NOX-E36 que interactúa con las quimiocinas determinadas por el análisis Biacore donde las quimiocinas estaban inmovilizadas de forma covalente sobre la superficie de un chip sensor CM5 y se inyectaron diversas concentraciones de NOX-E36 y se analizó el comportamiento de unión NOX-E36s mediante el programa de computación BiaEvaluation;
Figura 24D: muestra la curva dosis respuesta de la quimiotaxis de la estimulación de las células THP-1 con MIP-1a con una concentración efectiva media de aproximadamente 0,2 nM;
Figura 24E: muestra la inhibición de la quimiotaxis inducida de MIP-1a por NO -E36. NOX-E36 no tuvo influencia sobre la quimiotaxis inducida por MIP1a de las células THP-1;
Figura 25: muestra la eficacia del Spiegelmero NOX-E36-3’-PEG en un ensayo de liberación de calcio; las células se estimularon con 3 nM de MCP-1 humana preincubada a 37°C con diversas cantidades de Spiegelmero NOX-E36-3’-PEG, representado como porcentaje de control sobre la concentración de Spiegelmero NOX-E36-3’-PEG;
Figura 26: muestra la eficacia del Spiegelmero NOX-E36-3’-PEG en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia 0,5 nM de MCP-1 humana preincubada a 37°C con diversas cantidades de Spiegelmero NOX-E36-3’-PEG, representado como porcentaje de control sobre la concentración de NOX-E36-3’-PEG;
Figura 27A: muestra la eficacia del Spiegelmero NOX-E36-5’-PEG en un ensayo de liberación de calcio; las células se estimularon con 3 nM de MCP-1 humana preincubada a 37°C con diversas cantidades de Spiegelmero NOX-E36-5’-PEG, representado como porcentaje de control sobre la concentración de Spiegelmero NOX-E36-5’-PEG;
Figura 27B: muestra la eficacia del Spiegelmero NOX-E36-5’-PEG en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia 0,5 nM de MCP-1 humana preincubada a 37°C con diversas cantidades de Spiegelmero NOX-E36-5’-PEG, representado como porcentaje de control sobre la concentración de Spiegelmero NOX-E36-5’-PEG;
Figura 28: muestra la liberación de Ca++ inducida por la MCP-1 murina en células THP-1, mientras que se obtuvo una curva de dosis respuesta para la MCP-1 murina, que indica una concentración efectiva media (EC50) de aproximadamente 5 nM, representado como diferencia de fluorescencia del blanco sobre la concentración de MCP-1 murina;
Figura 29: muestra la eficacia de la anti-MCP-1 murina para el Spiegelmero mNOX-E36-3’-PEG en un ensayo de liberación de calcio; las células se estimularon con 3 nM de MCP-1 murina preincubada a 37°C con diversas cantidades de Spiegelmero mNOX-E36-3’-PEG, representado como porcentaje de control sobre la concentración de Spiegelmero mNOX-E36-3’-PEG;
Figura 30: muestra la quimiotaxis inducida por la MCP-1 murina de las células THP-1 mientras que después de 3 horas de la migración de las células THP-1 hacia diversas concentraciones de mMCP-1 se obtuvo una curva de dosis respuesta para mMCP-1, representado como X veces de aumento en comparación con el control sobre la concentración de MCP-1 murina;
Figura 31: muestra la eficacia de la anti-MCP-1 murina del Spiegelmero mNOX-E36-3’-PEG en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia 0,5 nM de MCP-1 murina preincubada a 37°C con diversas cantidades de Spiegelmero mNOX-E36-3’-PEG, representado como porcentaje de control sobre la concentración de Spiegelmero mNOX-E36-3’-PEG anti-murina;
Figura 32: muestra el sensograma de Biacore 2000 que indica el valor de KD del aptámero D-mNOX-E36 de unión a la D-MCP-1 murina que estaba inmovilizada sobre el chip sensor PioneerF1 por el procedimiento de acoplamiento de aminas, representado como respuesta (UR) con el tiempo;
Figura 33: muestra el sensograma de Biacore 2000 que indica la unión del aptámero D-mNOX-E36 a la D-MCP-1 humana y D-MCP-1 murina mientras que las dos formas diferentes de la D-MCP-1 estaban inmovilizadas por el procedimiento de acoplamiento de aminas PioneerF1 y chips sensores CM4, respectivamente, representado como respuesta (UR) con el tiempo;
Figura 34: muestra las secciones renales de ratones de 24 semanas MRLlpr/lpr, teñidos con ácido peryódico de Schiff (PAS), anticuerpos para Mac-2 (macrófagos) y CD3 (células T) como se indica; las imágenes son representativas para 7-12 ratones en cada grupo (aumento original PAS: x 100, insertos PAS: x 400, Mac2: x 400, CD3: x 100;
Figura 35: muestra una tabla que ilustra los parámetros de función renal y los hallazgos clínicos de los diferentes grupos de ratones MRLlpr/lpr de 24 semanas;
Figura 36: muestra la cuantificación de cambios histológicos por morfometría realizada en secciones teñidas con plata de ratones de todos los grupos; A, índice de volumen intersticial; B, índice de dilatación tubular, y C, índice de daño celular tubular, se calcularon como porcentaje de campo eléctrico de alto voltaje y se expresan como media ± SEM;
Figura 37: muestra la supervivencia de los ratones MRLlpr/lpr de los diversos grupos de tratamiento calculada mediante análisis de Kaplan-Meier;
Figura 38: muestra la expresión de ARNm renal para las quimiocinas CC CCL2 y CCL5 determinada mediante RT-PCR de tiempo real con ARN renal total combinado de 5 ratones de cada grupo, donde los niveles de ARN son expresados por la respectiva expresión de ARNr 18S;
Figura 39: muestra la reducción de patología pulmonar por el tratamiento con mNOX-E36-3'PEG; el tejido de pulmón se preparó a partir de todos los grupos de 24 semanas y se clasificó de forma semicuantitativa; el tratamiento con mNOX-E36 y mNOX-E36-3'PEG redujo la inflamación peribronquiolar en ratones MRLlpr/lpr; las imágenes son representativas de 7-11 ratones de cada grupo; aumento original x 100;
Figura 40: muestra las manifestaciones de lupus cutáneo de ratones MRLlpr/lpr de 24 semanas que aparecen generalmente en el área facial o del cuello (ratón izquierdo) que fueron menos comunes en ratones tratados con Spiegelmero anti-mCCL2 (ratón derecho);
Figura 41: muestra los hallazgos séricos e histológicos de los ratones MRLlpr/lpr de 24 semanas;
Figura 42: muestra la farmacocinética de los Spiegelmeros anti-mCCL2 pegilados y no pegilados en plasma durante el estudio, indicado como concentración plasmática del Spiegelmero mNOX-E36 en función del tiempo;
Figura 43: muestra la citometría de flujo para CCR2 en médula ósea y sangre periférica de ratones MRLlpr/lpr de 24 semanas tratados con vehículo o con mNOX-E36-3'PEG; los datos se muestran como la media del porcentaje de las células CCR2 positivas ± SEM, tanto en medula ósea como en sangre periférica en 5 ratones de cada grupo;
Figura 44: muestra los niveles de CCL2 sérico en PoC-PEG- (barras blancas) y ratones 1K db/db tratados con mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-P) (barras negras) determinados por ELISA a diferentes tiempos, como se indica; los datos son medias ± SEM; *, p < 0,05 mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-P) frente a PoC-PEG;
Figura 45: muestra el número de células Mac-2 y Ki-67 positivas infiltradas en los glomérulos y el intersticio de los ratones db/db no tratados o tratados con POC-PEG o más que mNOX-E36-3'PEG;
Figura 46: muestra la glomeruloesclerosis diabética en ratones db/db de 6 meses; las secciones renales de los
ratones de los diferentes grupos se tiñeron con ácido peryódico de Schiff y se clasificaron 15 glomérulos de cada sección renal por el grado de glomeruloesclerosis; las imágenes muestran glomérulos representativos clasificados con los puntajes respectivos indicados, aumento original 400 x; el gráfico ilustra el porcentaje medio de cada puntaje ± SEM de todos los ratones de cada grupo (n = 7 – 10); *, p < 0,05 para ratones 1K db/db tratados con mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-P) frente a PoC-PEG (PoC-P);
Figura 47: muestra la velocidad de filtración glomerular (GFR) de ratones 1K db/db de 6 meses tratados con mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-P) y PoC-PEG(PoC-P); la GFR se determinó por la cinética de depuración de FITC-inulina de los grupos de ratones 1K db/db tratados con PoC-PEG y mNOX-E36-3'PEG al final del estudio;
Figura 48: muestra la atrofia tubular y el volumen intersticial de ratones db/db de 6 meses; las imágenes de secciones renales teñidas con plata ilustran los riñones representativos de los grupos respectivos (aumento original 100x); los valores representan las medias ± SEM del índice del análisis morfométrico de 7 -10 ratones de cada grupo; *, p < 0,05 ratones 2K db/db frente a BKS natural; #, p < 0,05 ratones db/db 1K frente a 2K; †, p < 0,05 ratones 1K db/db tratados con mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-PEG) frente a PoC-PEG;
Figura 49: muestra la expresión de ARNm renal de CCL2 de los ratones db/db determinada por RT-PCR en tiempo real usando el ARN renal total combinado de 6 - 10 ratones de cada grupo; los niveles de ARNm para cada grupo de ratones son expresados por la respectiva expresión de ARNr 18 S; y
Figura 50: muestra la expresión de CCL2 espacial en riñones de ratones db/db determinados por inmunotinción; las imágenes ilustran secciones representativas de riñones de ratones de 6 meses de los grupos respectivos indicados (aumento original, 200 x).
Ejemplo 1: Ácidos nucleicos que se unen a MCP-1 humana
Usando D-MCP-1 biotinilada humana como diana, se podrían generar varios ácidos nucleicos que se unen a la MCP1, cuyas secuencias de nucleótidos se representan en las Figuras 1 a 7. Los ácidos nucleicos se caracterizaron en el aptámero, es decir, el nivel de ácido nucleico D mediante ensayos competitivos o de unión directa a D-MCP-1 biotinilada humana (Ejemplo 4) o a nivel del Spiegelmero, es decir, el ácido nucleico L con la configuración natural de la MCP-1 (L-MCP) a través de una medida de resonancia de plasmón superficial mediante un instrumento Biacore 2000 (Ejemplo 7), un ensayo in vitro de liberación de Ca++ del cultivo celular (Ejemplo 5) o un ensayo de quimiotaxis in vitro (Ejemplo 6).
Las moléculas de ácido nucleico generadas de este modo exhiben diferentes motivos de secuencias, los cuatro tipos principales se definen en las Figuras 1 y 2 (Tipo 1A / 1B), la Figura 3 (Tipo 2), las Figuras 4 y 5 (Tipo 3) y la Figura 6 (Tipo 4). Los ácidos nucleicos adicionales de unión a MCP-1 que no se pueden relacionar entre sí ni con los motivos de secuencias diferentes descritos en la presente memoria, se enumeran en la Figura 7. Para la definición de los motivos de secuencia de nucleótidos, se usan las abreviaturas IUPAC para los nucleótidos ambiguos:
S fuerte G o C; W débil A o U; R purina G o A; Y pirimidina C o U; K ceto G o U; M imino A o C; B no A C o U o G; D no C A o G o U; H no G A o C o U; V no U A o C o G; N total A o G o C o U
Si no se indica lo contrario, cualquier secuencia de ácido nucleico o secuencia de extensiones y cajas, respectivamente, se indica en la dirección 5’ -3’.
Ácidos nucleicos de unión a MCP-1 de Tipo 1A (Figura 1)
Como se ilustra en la Figura 1, todas las secuencias de ácidos nucleicos de Tipo 1A que se unen a MCP-1 comprenden varias extensiones o cajas de secuencia donde las cajas B1A
y B1B
son las extensiones terminales 5’y 3’ que se pueden hibridar entre sí. Sin embargo, dicha hibridación no se da necesariamente en la molécula como se presenta realmente en condiciones fisiológicas. Las cajas B2, B3, B4, B5 y la caja B6 están flanqueadas por la
caja B1A y la caja B1B.
Los ácidos nucleicos se caracterizaron a nivel aptámero, es decir, a nivel de ácido nucleico D mediante ensayos de unión directos y competitivos con D-MCP-1 biotinilada humana, para clasificarlos con respecto a su comportamiento de unión (Ejemplo 4). Las secuencias seleccionadas se sintetizaron como Spiegelmero (Ejemplo 3) y se ensayaron usando la configuración natural de la MCP-1 (L-MCP) en un ensayo de liberación de Ca++ in vitro del cultivo celular (Ejemplo 5).
Las secuencias de las cajas definidas pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos de Tipo 1A que se unen a MCP-1 lo que influye en la afinidad de unión a MCP-1. En base al análisis de la unión de los diferentes ácidos
nucleicos que se unen a MCP-1 denominados ácidos nucleicos de Tipo 1A de unión a MCP-1, las cajas B1A, B2,
B3, B4, B5, B6 y B1B, y sus secuencias de nucleótidos tal como se describen a continuación, son individualmente y,
más preferiblemente, en su totalidad esenciales para la unión a la MCP-1:
• las cajas B1A
son las extensiones de los extremos terminales 5’ y 3’ que se pueden hibridar entre sí; en donde B1A es AGCRUG, preferiblemente AGCGUG; y donde B1B es CRYGCU, preferiblemente CACGCU;
•
la caja B2, que es CCCGGW, preferiblemente CCCGGU;
•
la caja B3, que es GUR, preferiblemente GUG;
•
la caja B4, que es RYA, preferiblemente GUA;
•
la caja B5, que es GGGGGRCGCGAYC, preferiblemente GGGGGGCGCGACC;
•
la caja B6, que es UGCAAUAAUG o URYAWUUG, preferiblemente UACAUUUG.
Como se ilustra en la Figura 1, la molécula de ácido nucleico designada como 176-E10trc tiene la mejor afinidad con la MCP-1 (como aptámero en el ensayo de unión con una KD de 5 nM, además de como Spiegelmero con una IC50 de 4 - 5 nM en el ensayo de liberación de Ca++ in vitro del cultivo celular), y en consecuencia puede constituir la
secuencia óptima y la combinación óptima de los elementos de secuencia B1A, B2, B3, B4, B5, B6 y B1B.
Ácidos nucleicos de unión a MCP-1 de Tipo 1B (Figura 2)
Como se ilustra en la Figura 2, todas las secuencias de ácidos nucleicos de Tipo 1B que se unen a MCP-1 comprenden varias extensiones o cajas de secuencias donde las cajas B1A y B1B
son las extensiones terminales 5’
y 3’ que se pueden hibridar entre sí, y las cajas B2, B3, B4, B5 y la caja B6 están flanqueadas por la caja B1A y la
caja B1B. Sin embargo, dicha hibridación no se da necesariamente en la molécula como se presenta realmente en
condiciones fisiológicas.
Los ácidos nucleicos se caracterizaron a nivel aptámero, usando ensayos de unión directos y competitivos con D-MCP-1 biotinilada humana, para clasificarlos con respecto a su comportamiento de unión (Ejemplo 4). Las secuencias seleccionadas se sintetizaron como el Spiegelmero (Ejemplo 3) y se evaluaron usando la configuración natural de la MCP-1 (L-MCP) en un ensayo de liberación de Ca++ in vitro del cultivo celular (Ejemplo 5).
Las secuencias de las cajas definidas pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos de Tipo 1B que se unen a MCP-1, lo que influye en la afinidad de unión a la MCP-1. En base a los análisis de unión de los diferentes ácidos nucleicos que se unen a MCP-1 designados como ácidos nucleicos de Tipo 1B que se unen a MCP-1, las cajas B1A, B2, B3, B4, B5, B6 y B1B, y sus secuencias de nucleótidos descritas a continuación, son individualmente y,
más preferiblemente, en su totalidad esenciales para la unión a la MCP-1:
• las cajas B1A
que se pueden hibridar entre sí; donde B1A es AGCGUG; y donde B1B es CAYRCU, preferiblemente CACGCU;
AGYRUG, preferiblemente
•
la caja B2, que es CCAGCU o CCAGY, preferiblemente CCAGU;
•
la caja B3, que es GUG;
•
la caja B4, que es AUG;
•
la caja B6, que es CAUUUUA o CAUUUA, con preferencia CAUUUUA;
Como se ilustra en la Figura 2, el ácido nucleico designado como 176-C9trc tiene la mejor afinidad con la MCP-1 (como aptámero en el ensayo de unión con una KD de 5 nM, además de como Spiegelmero con una IC50 de 4 - 5 nM en el ensayo de liberación de Ca++ in vitro del cultivo celular) y en consecuencia puede constituir la secuencia óptima
y la combinación óptima de los elementos de secuencia B1A, B2, B3, B4, B5, B6 y B1B.
Ácidos nucleicos de unión a MCP-1 de Tipo 2 (Figura 3)
Como se ilustra en la Figura 3, todas las secuencias de Tipo 2 comprenden varias extensiones o cajas de
secuencias donde las cajas B1A y B1B son las extensiones terminales 5’- y 3’ que se pueden hibridar entre sí y la
caja B2 es el elemento de secuencia central. Sin embargo, dicha hibridación no se da necesariamente en la molécula como se presenta realmente en condiciones fisiológicas.
Los ácidos nucleicos se caracterizaron a nivel aptámero, usando ensayos de unión directos y competitivos con D-MCP-1 biotinilada humana, para clasificarlos con respecto a su comportamiento de unión (Ejemplo 4). Las secuencias seleccionadas se sintetizaron como el Spiegelmero (Ejemplo 3) y se ensayaron usando la configuración natural de la MCP-1 (L-MCP) en un ensayo de liberación de Ca++ in vitro del cultivo celular (Ejemplo 5) en ensayos de quimiotaxis in vitro (Ejemplo 6).
Las secuencias de las cajas definidas pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos de Tipo 2 que se unen a MCP-1, lo que influye en la afinidad de unión a la MCP-1. En base al análisis de la unión de diferentes ácidos
nucleicos que se unen a MCP-1 designados como ácidos nucleicos de Tipo 2 que se unen a MCP-1, las cajas B1A, B2, y B1B, y sus secuencias de nucleótidos descritas a continuación, son individualmente y, más preferiblemente, en su totalidad esenciales para la unión a la MCP-1:
• la caja B2, CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC, preferiblemente CGUCCCUCACC-GGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC
Como se ilustra en la Figura 3, el ácido nucleico designado como 180-D1-002 además de los derivados de tipo 180D1-002 tales como 180-D1-011, 180-D1-012, 180-D1-035, y 180-D1-036 (= NOX-E36) tienen la mejor afinidad de unión con la MCP-1 como aptámero en el ensayo de unión con una KD < 1 nM y, en consecuencia, pueden constituir
la secuencia óptima y la combinación óptima de elementos de secuencia B1A, B2, y B1B.
Para la moléculas de ácido nucleico D-NOX-E36 (D-180-D1-036; SEC ID Nº: 159), se determinó una constante de disociación (KD) de 890 ± 65 pM a temperatura ambiente (TA) y de 146 ± 13 pM a 37°C (Ejemplo 4; Figura 9). El Spiegelmero NOX-E36 respectivo (180-D1-036; SEC ID Nº: 37) exhibió una concentración inhibidora (IC50) de 3 - 4 nM en un ensayo de liberación de Ca++ in vitro (Ejemplo 5; Figura 12) y de aproximadamente 0,5 nM en un ensayo de quimiotaxis in vitro (Ejemplo 6; Figura 15). Para los derivados PEGilados de NOX-E36, NOX-E36-3’PEG y NOX-E36-5’PEG, se determinaron las IC50 de aproximadamente 3 nM en el ensayo de liberación de Ca++ (Ejemplo 5, Figura 25 y Figura 27A) y < 1 nM en el ensayo de quimiotaxis (Ejemplo 6; Figura 26 y Figura 27B).
Ácidos nucleicos de unión a MCP-1 de Tipo 3 (Figuras 4+5)
Como se ilustra en las Figuras 4 y 5, todas las secuencias de Tipo 3 comprenden varias extensiones o cajas de secuencias donde tres pares de cajas son características para los ácidos nucleicos de Tipo 3 de unión a MCP-1. Ambas cajas B1A y B1B, así como las cajas B2A y B2B y las cajas B5A y B5B tienen la capacidad para hibridarse
entre sí. Sin embargo, dicha hibridación no se da necesariamente en la molécula como se presenta realmente en condiciones fisiológicas. Entre estos elementos de secuencia potencialmente hibridados, se localizan nucleótidos no
Los ácidos nucleicos se caracterizaron a nivel de aptámero, usando ensayos de unión directa y competitiva con D-MCP-1 biotinilada humana, para clasificarlos con respecto a su comportamiento de unión (Ejemplo 4). Las secuencias seleccionadas se sintetizaron como el Spiegelmero (Ejemplo 3) y se evaluaron usando la configuración natural de la MCP-1 (L-MCP) en ensayos de quimiotaxis in vitro (Ejemplo 6) o por medio de medidas de Biacore (Ejemplo 7).
Las secuencias de las cajas definidas pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos de Tipo 3 que se unen a MCP-1, lo que influye en la afinidad de unión a la MCP-1. En base al análisis de la unión de diferentes ácidos nucleicos que se unen a MCP-1 designados como ácidos nucleicos de Tipo 3 que se unen a MCP-1, las cajas
individualmente y, más preferiblemente, en su totalidad esenciales para la unión a la MCP-1:
•
las cajas B2A y B2B, extensiones que se pueden hibridar entre sí, donde B2A es GKMGU y B2B es ACKMC; preferiblemente B2A es GUAGU y B2B es ACUAC;
•
la caja B3, que es KRRAR, preferiblemente UAAAA o GAGAA;
•
la caja B4, que es CURYGA o CUWAUGA o CWRMGACW o UGCCAGUG, preferiblemente CAGCGACU o CAACGACU;
•
B5A y B5B, extensiones que se pueden hibridar entre sí; donde B5A es GGY y B5B es GCYR mientras que GCY se puede hibridar con los nucleótidos de B5A; o B5A es CWGC y B5B es GCWG; preferiblemente B5A es GGC y B5B es GCCG;
Tal como se ilustra en las Figuras 4 y 5, el ácido nucleico designado como 178-D5 y su derivado 178-D5-030, así como 181-A2 con sus derivados 181-A2-002, 181-A2-004, 181-A2-005, 181-A2-006, 181-A2-007, 181-A2-017, 181A2-018, 181-A2-019, 181-A2-020, 181-A2-021, y 181-A2-023 presentan la mejor afinidad con MCP-1. 178-D5 y 178D5-030 se evaluaron como aptámeros en ensayos de unión directa o competitiva (Ejemplo 4) con una KD de aproximadamente 500 pM. En el mismo experimento, se determinó que 181-A2 tenía una KD de aproximadamente
100 pM. En el análisis Biacore (Ejemplo 7), se deteminó que la KD de 181-A2 y sus derivados hacia MCP-1 era de 200 - 300 pM. En los ensayos de liberación de Ca++ y de quimiotaxis con células cultivadas (Ejemplos 5 y 6, respectivamente), para ambos, 178-D5 y 181-A2, se midió una IC50 de aproximadamente 500 pM. En consecuencia, 178-D5 además 181-A2 y sus derivados pueden constituir la secuencia óptima y la combinación óptima de
Ácidos nucleicos de unión a MCP-1 de Tipo 3 (Figura 6)
Tal como se ilustra en la Figura 6, todas las secuencias de Tipo 4 comprenden varias extensiones o cajas de
secuencia, en donde las cajas B1A y B1B son las extensiones terminales 5’ y 3’ que se pueden hibridar entre sí y la
caja B2 es el elemento de secuencia central.
Los ácidos nucleicos fueron caracterizados a nivel de aptámero usando ensayos de unión directa y competitiva con D-MCP-1 biotinilada humana, para clasificarlos con respecto a su comportamiento de unión (Ejemplo 4). Las secuencias seleccionadas se sintetizaron como el Spiegelmero (Ejemplo 3) y se evaluaron usando la configuración natural de la MCP-1 (L-MCP) en ensayos de liberación de Ca++ in vitro del cultivo celular (Ejemplo 5) y/o en ensayos de quimiotaxis (Ejemplo 6).
Las secuencias de las cajas definidas pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos de Tipo 4 que se unen a MCP-1, lo que influye en la afinidad de unión a MCP-1. En base al análisis de la unión de diferentes ácidos nucleicos
que se unen a MCP-1 designados como ácidos nucleicos de Tipo 4 que se unen a MCP-1, las cajas B1A, B2, y
B1B, y sus secuencias de nucleótidos descritas a continuación, son individualmente y, más preferiblemente, en su
totalidad esenciales para la unión a la MCP-1:
• la caja B2, que es AGNDRDGBKGGURGYARGUAAAG o AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG o CAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGA, preferiblemente AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG
Tal como se ilustra en la Figura 6, el ácido nucleico designado como 174-D4-004 y 166-A4-002 tiene la mejor afinidad con la MCP-1(como Spiegelmero con una IC50 de 2 - 5 nM en un ensayo de liberación de Ca++ in vitro) y puede, en consecuencia, constituir la secuencia óptima y la combinación óptima de los elementos de secuencia
B1A, B2, y B1B.
Adicionalmente, se identificaron otros 29 ácidos nucleicos de unión a MCP-1 que no se pueden describir por una combinación de elementos de secuencia de nucleótidos como la demostrada para los ácidos nucleicos de Tipos 1 4 que se unen a MCP-1. Estas secuencias se enumeran en la Figura 7.
Se considera que cualquiera de las secuencias mostradas en las Figuras 1 a 7 son ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, que incluyen las formas truncadas de los mismos pero que también incluyen las formas extendidas del mismos, con la condición, sin embargo, de que las moléculas de ácidos nucleicos trucadas y extendidas de este modo, respectivamente, sean todavía capaces de unirse a la diana.
Ejemplo 2: Ácidos nucleicos que se unen a MCP-1 murina
Mediante el uso de la D-MCP-1 biotinilada murina como diana, se podrían generar varias moléculas de ácido nucleico que se unen a la misma. El resultado de un análisis de secuencia de estas moléculas de ácido nucleico se puede tomar de la Figura 8.
Los ácidos nucleicos fueron caracterizados a nivel de aptámero usando ensayos de unión directa y competitiva con D-MCP-1 biotinilada murina, para clasificarlos con respecto a su comportamiento de unión (Ejemplo 4). Las secuencias seleccionadas se sintetizaron como el Spiegelmero (Ejemplo 3) y se evaluaron usando la configuración natural de la MCP-1 (L-MCP) en un ensayo de liberación de Ca++ in vitro del cultivo celular (Ejemplo 5) y un ensayos de quimiotaxis in vitro (Ejemplo 6).
Tal como se ilustra en la Figura 8, D-188-A3-001 y D-189-G7-001 y sus derivados se unen a D-MCP-1 con una KD sub-nanomolar en el ensayo de unión (Figura 8).
Para D-mNOX-E36 (= D-188-A3-007; SEC ID Nº: 244), se determinó una constante de disociación (KD) de 0,1 - 0,2 nM a 37°C (Ejemplo 4; Figura 10). El Spiegelmero mNOX-E36 (188-A3-007; SEC ID Nº: 122) respectivo exhibió una concentración inhibidora (IC50) de aproximadamente 12 nM en un ensayo de liberación de Ca++ in vitro (Ejemplo 5; Figura 13) y de aproximadamente 7 nM en un ensayo de quimiotaxis in vitro (Ejemplo 6; Figura 16). Para el derivado PEGilado de mNOX-E36, mNOX-E36-3’PEG (SEC ID Nº: 254), se determinaron las IC50 de aproximadamente 8 nM
en un ensayo de liberación de Ca++ (Ejemplo 5, Figura 29) y de aproximadamente 3 nM en el ensayo de quimiotaxis (Ejemplo 6; Figura 31).
Debe entenderse que cualquiera de las secuencias mostradas en las Figuras 1 a 7 son ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, que incluyen las formas truncadas de los mismos pero que también incluyen las formas extendidas de los mismos, con la condición, sin embargo, de que las moléculas de ácido nucleico truncadas y extendidas de este modo, respectivamente, sean todavía capaces de unirse a la diana.
Ejemplo 3: Síntesis y derivatización de aptámeros y Spiegelmeros
Síntesis a pequeña escala
Los aptámeros y los Spiegelmeros se produjeron mediante una síntesis en fase sólida con un sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) usando reacciones químicas con ARN 2’TBDMS fosforamidita (M.J. Damha, K.K. Ogilvie, Methods in Molecular Biology, Vol. 20 Protocols for oligonucleotides and analogs, ed. S. Agrawal, p. 81-114, Humana Press Inc. 1993). Las fosforamiditas rA(N-Bz)-, rC(Ac)-, rG(N-ibu)- y UR en configuración D y L se adquirieron en ChemGenes, Wilmington, MA. Los aptámeros y los Spiegelmeros se purificaron mediante electroforesis en gel.
Síntesis a gran escala más modificación
El Spiegelmero NOX-E36 se produjo mediante síntesis en fase sólida con un sintetizador ÄktaPilot100 (Amersham Biosciences; General Electric Healthcare, Friburgo) usando reacciones químicas con ARN 2’TBDMS fosforamidita
(M.J. Damha, K.K. Ogilvie, Methods in Molecular Biology, Vol. 20 Protocols for oligonucleotides and analogs, ed. S. Agrawal, p. 81-114, Humana Press Inc. 1993). Las fosforamiditas rA(N-Bz)-, rC(Ac)-, rG(N-ibu)- y UR en configuración D y L se adquirieron en ChemGenes, Wilmington, MA. El modificador de 5’-amino se adquirió en American International Chemicals Inc. (Framingham, MA, EE.UU.). La síntesis del Spiegelmero no modificado comenzó sobre CPG modificado con riboG-L de tamaño de poro de 1000 Å (Link Technology, Glasgow, R.U.); para el Spiegelmero modificado en 3’-NH2, se usó el aminomodificador 3’-CPG, 1000 Å (ChemGenes, Wilmington, MA). Para el acoplamiento (15 minutos por ciclo), se usó benciltiotetrazol 0,3 M (CMS-Chemicals, Abingdon, R.U.) en acetonitrilo y 3,5 equivalentes de la disolucion de fosforamidita respectiva 0,1 M en acetonitrilo. Se usó un ciclo de oxidación-terminación de cadena. Los disolventes y reactivos estándares adicionales para la síntesis de oligonucleótidos se adquirieron en Biosolve (Valkenswaard, Holanda). El Spiegelmero se sintetizó en DMT-ON; después de desprotección, se purificó por medio de RP-HPLC preparativa (Wincott F. et al. (1995) Nucleic Acids Res
23: 2677) usando un medio Source15RPC (Amersham). El grupo 5’DMT se eliminó con ácido acético al 80% (30 minutos a temperatura ambiente). Posteriormente, se agregó una disolución de NaOAc 2 M y el Spiegelmero se desalinizó por filtración con flujo tangencial mediante una membrana de celulosa regenerada 5 K (Millipore, Bedford, MA).
PEGilación de NOX-E36
Para prolongar el tiempo de residencia del plasma del Spiegelmero in vivo, el Spiegelmero NOX-E36 se acopló de forma covalente a un residuo de polietilen glicol de 40 kDa (PEG) en el extremo 3’ o 5’.
PEGilación en 3’ de NOX-E36
Para la PEGilación (para detalles técnicos del método para PEGilación ver la Solicitud de Patente Europea EP 1 306 382), se disolvió el Spiegelmero modificado en 3’-amino purificado en una mezcla de H2O (2,5 mL), DMF (5 mL), y tampón A (5 mL; preparado mezclando ácido cítrico · H2O [7 g], ácido bórico [3,54 g], ácido fosfórico [2,26 mL] y NaOH 1 M [343 mL] y añadiendo H2O hasta un volumen final de 1 L; el pH = 8,4 se ajustó con HCl 1 M).
El pH de la disolución del Spiegelmero se llevó a 8,4 con NaOH 1 M. Luego, se añadió éster de PEG-NHS 40 kDa (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) a 37°C cada 30 minutos en cuatro porciones de 0,6 equivalentes hasta que alcanzó un rendimiento máximo de 75 a 85%. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo a 8 - 8,5 con NaOH 1 M durante la adición del éster de PEG-NHS.
La mezcla de reacción se combinó con 4 mL de disolución de urea (8 M), 4 mL de tampón A y 4 mL de tampón B (acetato de trietilamonio 0,1 M en H2O) y se calentó a 95°C durante 15 minutos. El Spiegelmero PEGilado luego se purificó mediante RP-HPLC con un medio Source 15RPC (Amersham), con un gradiente de acetonitrilo (tampón B; tampón C: acetato de trieetilamonio 0,1 M en acetonitrilo). El exceso de PEG eluido con un tampón C de 5%, Spiegelmero PEGilado en un tampón C de 10 - 15%. Las fracciones del producto con una pureza de >95% (medido por HPLC) se combinaron y mezclaron con 40 mL de NaOAC 3 M. El Spiegelmero PEGilado fue desalinizado por filtración con flujo tangencial (membrana de celulosa regenerada 5 K, Millipore, Bedford MA).
PEGilación en 5’ de NOX-E36
Para la PEGilación (para detalles técnicos del método de PEGilación ver la Solicitud de Patente Europea EP 1 306 382), se disolvió el Spiegelmero modificado en 5’-amino purificado en una mezcla de H2O (2,5 mL), DMF (5 mL) y
tampón A (5 mL; preparado mezclando ácido cítrico · H2O [7 g], ácido bórico [3,54 g], ácido fosfórico [2,26 mL] y NaOH 1 M [343 mL] y añadiendo H2O hasta un volumen final de 1 L; el pH = 8,4 se ajustó con HCl 1 M).
El pH de la disolución del Spiegelmero se llevó a 8,4 con NaOH 1 M. Luego, se añadió éster de PEG-NHS 40 kDa (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) a 37°C cada 30 minutos en seis porciones de 0,25 equivalentes hasta que se alcanzó un rendimiento máximo de 75 a 85%. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo a 8 - 8,5 con NaOH 1 M durante la adición del éster de PEG-NHS.
La mezcla de reacción se combinó con 4 mL de disolución de urea (8 M), 4 mL de tampón A y 4 mL de tampón B (acetato de trietilamonio 0,1 M en H2O) y se calentó a 95°C durante 15 minutos. El Spiegelmero PEGilado luego se purificó mediante RP-HPLC con un medio Source 15RPC (Amersham), usando un gradiente de acetonitrilo (tampón B; tampón C: acetato de trietilamonio 0,1 M en acetonitrilo). El exceso de PEG eluído con un tampón C de 5%, Spiegelmero PEGilado en un tampón C de 10 - 15%. Las fracciones del producto con una pureza de >95% (medido por HPLC) se combinaron y mezclaron con 40 mL de NaOAC 3 M. El Spiegelmero PEGilado se desalinizó por filtración con flujo tangencial (membrana de celulosa regenerada 5 K, Millipore, Bedford MA).
Ejemplo 4: Determinación de las constantes de unión (ensayo de unión)
Ensayo de unión directa
Se midió la afinidad de los aptámeros con el D-MCP-1 en un formato de ensayo de unión a 20 o 37°C, respectivamente. Los aptámeros fueron marcados con 5’-fosfato mediante T4 polinucleótido quinasa (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) usando ATP marcado con [y-32P] (Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemania). La radiactividad específica de los aptámeros marcados fue de 200.000 - 800.000 cpm/pmol. Los aptámeros se incubaron después de la des- y re-naturalización hasta una concentración de 20 pM a 37°C en un tampón de selección (Tris 20 mM-HCl pH 7,4; NaCl 137 mM; KCl 5 mM; MgCl2 1 mM; CaCl2 1 mM; Tween-20 al 0,1% [p/vol]) junto con cantidades variadas de D-MCP-1 biotinilada durante 4 - 12 horas para alcanzar el equilibrio a concentraciones bajas. El tampón de selección se suplementó con 10 μg/mL de albúmina de suero humano (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania), y 10 μg/mL de ARN de levaduras (Ambion, Austin, EE.UU.) para evitar la adsorción de los compañeros de unión en superficies de plástico o la matriz de inmovilización. El rango de concentración de D-MCP-1 biotinilada se ajustó entre 8 pM y 100 nM; el volumen de reacción total fue 1 mL. Los complejos de péptido y péptido-aptámero se inmovilizaron en 1,5 μL de partículas de estreptavidina Streptavidin Ultralink Plus (Pierce Biotechnology, Rockford, EE.UU.) que habían sido pre-equilibradas con tampón de selección y se re-suspendieron en un volumen total de 6 μL. Las partículas se mantuvieron en suspensión durante 30 minutos a la temperatura respectiva en un mezclador térmico. La radiactividad inmovilizada se cuantificó en un contador de centelleo después de retirar el sobrenadante y de un lavado apropiado. El porcentaje de unión se representó frente a la concentración de D-MCP-1 biotinilada y se obtuvieron las constantes mediante algoritmos de software (GRAFIT; Erithacus Software; Surrey R.U.) suponiendo una estequiometría de 1:1.
Ensayo de unión competitiva
Con el objetivo de comparar diferentes aptámeros de unión a D-MCP-1, se realizó un ensayo de clasificación competitiva. Para este propósito, el aptámero disponible más afín se marcó con radiactividad (ver anteriormente) y actuó como referencia. Después de la des- y la re-naturalización se incubó a 37°C con D-MCP-1 biotinilada en 1 mL de tampón de selección en condiciones que producen alrededor de 5 - 10 % de unión al péptido después de la inmovilización y lavado en agarosa NeutrAvidin o estreptavidina Ultralink Plus (ambas de Pierce) sin competición. Se añadió a reacciones de unión paralelas un exceso de aptámero de D-ARN des- y re-naturalizado no marcado a diferentes concentraciones (por ej., 2, 10, y 50 nM) con el aptámero de referencia marcado. Los aptámeros ensayados compitieron con el aptámero de referencia para unirse a la diana, disminuyendo de este modo la señal de unión dependiendo de las características de unión. El aptámero hallado como más activo en este ensayo puede servir a continuación como nueva referencia para el análisis comparativo de otras variantes de aptámero.
Ejemplo 5: Determinación de la concentración inhibidora en un ensayo de liberación de Ca++
Se cultivaron células THP-1 (DSMZ, Braunschweig) durante una noche con una densidad celular de 0,3 x 106/mL a 37°C y 5% de CO2 en medio RPMI 1640 con GlutaMAX (Invitrogen) que contenía además un 10% de suero de carnero fetal, 50 unidades_mL de penicilina, 50 Ig_mL de estreptomicina y f-mercaptoetanol 50 μM.
Los Spiegelmeros se incubaron junto con MCP-1 recombinante humana (Bachem) en disolución salina equilibrada de Hanks (HBSS), que contiene 1 mg/mL de albúmina de suero bovino, probenecid 5 mM y HEPES 20 mM (HBSS+) durante de 15 a 60 minutos a 37°C en una placa de 96 pocillos de perfil bajo de 0,2 mL ("disolución de estimulación").
Para la carga con el colorante indicador de calcio, las células se centrifugaron a 300 x g durante 5 min, se resuspendieron en 4 mL de disolución de colorante indicador (10 μM de fluo-4 [Molecular Probes], 0,08% de pluronic 127 [Molecular Probes] en HBSS+) y se incubó durante 60 minutos a 37°C. Después de ello, se añadieron 11 mL de HBSS+ y se centrifugaron las células como antes, se lavaron una vez con 15 mL de HBSS+ y luego se
resuspendieron en HBSS+ para dar una densidad celular de 1,1 x 106/mL. Se agregaron 90 μL de esta suspensión de células a cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos.
La medición de las señales de fluorescencia se realizó con una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm en una placa lectora de detección múltiple Fluostar Optima (BMG). Para una medición paralela de varias muestras, se registraron juntos los pocillos de cada fila (perpendicular) de la placa de 96 pocillos. Se realizaron las tres primeras lecturas con un tiempo de demora de 4 segundos para la determinación de la línea de base. Luego el registro se interrumpió y la placa se retiró del instrumento. Mediante una pipeta multicanal, se agregaron 10 μL de la disolución de estimulación a los pocillos, luego la placa se colocó otra vez en el instrumento y la medición continuó. En total, se realizaron 20 registros con intervalos de tiempo de 4 segundos.
Para cada pocillo se determinó la diferencia entre la fluorescencia máxima y el valor de la línea base, y se representó frente a la concentración de MCP-1 o, en los experimentos de inhibición de la liberación de calcio por Spiegelmeros, frente a la concentración de Spiegelmero.
Determinación de la concentración efectiva media máxima (EC50) correspondiente a MCP-1 humana
Después de estimular células THP-1 con diversas concentraciones de hMCP-1 y de representar gráficamente la diferencia entre las señales máximas y basales, se obtuvo una curva de dosis respuesta para la MCP-1 humana, la cual indica una concentración efectiva media (EC50) de aproximadamente 2 - 4 nM (Figura 11). Esta concentración se usó para los experimentos adicionales de inhibición de la liberación de Ca++ por los Spiegelmeros.
Determinación de la concentración efectiva media máxima (EC50) correspondiente a MCP-1 murina
Después de estimular células THP-1 con diversas concentraciones de hMCP-1 y de representar gráficamente la diferencia entre las señales máximas y basales, se obtuvo una curva de dosis respuesta para la MCP-1 murina, la cual indica una concentración efectiva media (EC50) de aproximadamente 5 nM (Figura 28). Esta concentración se usó para los experimentos adicionales de inhibición de la liberación de Ca++ por los Spiegelmeros.
Ejemplo 6: Determinación de la concentración inhibidora en un ensayo de quimiotaxis
Células THP-1 cultivadas como se ha descrito anteriormente fueron centrifugadas, lavadas una vez con HBH (HBSS, que contiene 1 mg/mL de albúmina de suero bobino y HEPES 20 mM) y resuspendidas a razón de 3 x 106 células/mL. Se añadieron 100 μL de esta suspensión a insertos Transwell con poros de 5 μm (Corning, nº 3421). En los compartimientos inferiores la MCP-1 se preincubó junto con los Spiegelmeros en diversas concentraciones en 600 μL de HBH a 37°C durante 20 a 30 minutos antes de la adición de las células. Las células se dejaron migrar a 37°C durante 3 horas. Después se retiraron los insertos y se añadieron 60 μL de resazurina 440 μM (Sigma) en disolución tamponada con fosfato a los compartimientos inferiores. Después de incubar a 37°C durante 2,5 horas, se midió la fluorescencia en una longitud de onda de excitación de 544 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm en un lector de placa de detección múltiple Fluostar Optima (BMG).
Determinación de la concentración efectiva media máxima (EC50) correspondiente a MCP-1 humana
Después de 3 horas de migración de las células THP-1 a diversas concentraciones de MCP-1 humana, se obtuvo una curva de dosis respuesta para la MCP-1 humana, que indica una concentración efectiva máxima de aproximadamente 1 nM, y una activación reducida a concentraciones superiores (Figura 14). Para experimentos adicionales de inhibición de la quimiotaxis por los Spiegelmeros se usó una concentración de MCP-1 de 0,5 nM.
Determinación de la concentración efectiva media máxima (EC50) correspondiente a la MCP-1 murina
Después de 3 horas de migración de las células THP-1 a diversas concentraciones de MCP-1 murina, se obtuvo una curva de dosis respuesta para la MCP-1 murina, que indica una concentración efectiva máxima de aproximadamente 1 - 3 nM y una activación reducida a concentraciones superiores (Figura 30). Para experimentos adicionales de inhibición de la quimiotaxis por los Spiegelmeros, se usó una concentración de MCP-1 murina de 0,5 nM.
Ejemplo 7: Análisis de unión por medición de la resonancia de plasmón superficial
7.1 Evaluación de especificidad de NOX-E36, 181-A2-018 y mNOX-E36
Se usó un instrumento Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) para analizar la unión de los ácidos nucleicos a la MCP-1 humana y proteínas relacionadas. Cuando se logró el acoplamiento por medio de los grupos amino, las proteínas se dializaron contra agua durante 1 - 2 h (ésteres de celulosa mixtos Millipore VSWP; tamaño de poro, 0,025 μM) para eliminar las aminas interferentes. Los chips sensores PioneerF1 o CM4 (Biacore AB) se activaron antes del acoplamiento de proteínas por una inyección de 35 μL de una dilución 1:1 de NHS 0,4 M y EDC 0,1 M con un caudal de 5 μL/minuto. Luego se inyectó quimiocina en concentraciones de 0,1 - 1,5 μg/mL con un caudal de 2 μL/minuto hasta que la respuesta del instrumento estuvo en el rango de 1000 - 2000 UR (unidades relativas). Los ésteres de NHS no reaccionados se desactivaron con una inyección de 35 μL de una disolución de clorhidrato de etanolamina (pH 8,5) con un caudal de 5 μL/minuto. El chip sensor se activó dos veces con tampón de unión y se equilibró a razón de 10 μL/minuto durante 1 - 2 horas hasta que el valor basal fue estable. Para todas las proteínas,
se evaluaron los parámetros cinéticos y las constantes de disociación mediante una serie de inyecciones de Spiegelmeros a concentraciones de 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, y 0 nM en tampón de selección (Tris-HCl, 20 mM; NaCl, 137 mM; KCl, 5 mM; CaCl2, 1 mM; MgCl2, 1 mM; Tween20, 0,1% [p/v]; pH 7,4). En todos los experimentos se realizó el análisis a 37°C mediante el comando Kinject que define un tiempo de asociación de 180 y un tiempo de disociación de 360 segundos a un caudal de 10 μL/minuto. Los análisis de datos y el cálculo de las constantes de disociación (KD) se realizaron con el software BIAevaluation 3.0 (BIACORE AB, Uppsala, Suecia) usando el algoritmo de ajuste estequiométrico de Langmuir 1:1.
7.1.1 NOX-E36 y 181-A2-018 (ácidos nucleicos específicos para MCP-1 humana)
Solo se representan los sensogramas correspondientes a MCP-1 humana (Figuras 17 y 20, respectivamente); para las otras proteínas, solo se muestra el sensograma obtenido con 125 nM de concentración de Spiegelmero para mayor claridad (Figuras 18/19 y 21/22).
Análisis de la interacción NOX-E36·hMCP-1: se inmovilizó MCP-1 recombinante humana en un chip sensor PioneerF1 siguiendo las recomendaciones del fabricante (procedimiento de acoplamiento de aminas) hasta establecer una respuesta del instrumento de 1381 UR (unidades relativas). La constante de disociación determinada (KD) para la unión de NOX-E36 a la MCP-1 humana fue de aproximadamente 890 pM (Figura 17).
Análisis de la interacción 181-A2-018·hMCP-1: MCP-1 recombinante humana se inmovilizó en un chip sensor CM4 siguiendo las recomendaciones del fabricante (procedimiento de acoplamiento de aminas) hasta establecer una respuesta del instrumento de 3111 UR (unidades relativas). La constante de disociación determinada (KD) para la unión de 181-A2-018 a la MCP-1 humana fue de aproximadamente 370 pM (Figura 20).
Para determinar la especificidad de NOX-E36 y 181-A2-018, se inmovilizaron diversas proteínas de la familia de la MCP-1 humana además de la eotaxina humana en un chip sensor PioneerF1 y CM4 (hMCP-1, 1754 UR; hMCP-2, 1558 UR; hMCP-3, 1290 UR; eotaxina, 1523 UR). El análisis cinético demostró que NOX-E36 se une a eotaxina y hMCP-2 con constantes de disociación (KD) de 5 - 10 nM; la hMCP-3 no fue reconocida (Figuras 18 y 24A). 181-A2018, por contra, se une a eotaxina, hMCP-2 y hMCP-3, pero con una afinidad ligeramente menor (10 - 20 nM; Figuras 21 y 24A).
La reactividad cruzada interespecie de NOX-E36 y 181-A2-018 se evaluó mediante acoplamiento de amino inmovilizado en MCP-1 de ser humano (1460 UR), mono (1218 UR), cerdo (1428 UR), perro (1224 UR), conejo (1244 UR), rata (1267 UR) y ratón (1361 UR) en un chip sensor PioneerF1 y CM4. El análisis cinético demostró que NOX-E36 se une a MCP-1 humana, de mono, porcina y canina con constantes de disociación comparables (KD) de 0,89 - 1,2 nM mientras que las MCP-1 de ratón, rata y conejo no fueron reconocidas (Figuras 19 y 24A). 181-A2-018 se une a MCP-1 humana y de mono con constantes de disociación comparables (KD) de 0,5-0,6 nM, mientras que las MCP-1 porcina, de conejo y canina se unen con mucha menor afinidad. Las MCP-1 de rata y ratón no fueron reconocidas por NOX-A2-018 (Figuras 22 y 24A).
Las secuencias, así como el grado de homología en porcentaje de aminoácidos idénticos entre la proteína de MCP-1 de diferentes especies y proteínas humnas estrechamente relacionada se representan en la Figura 23; los valores de KD calculados para NOX-E36 y 181-A2-018 se exhiben en forma de tabla en la Figura 24A.
7.1.2 mNOX-E36 (ácido nucleico específico para MCP-1 murina)
Para analizar el comportamiento de unión de mNOX-E36, se inmovilizaron 3759 UR de D-MCP-1 biotinilada murina sintética (celda de flujo 3) y 3326 UR de D-MCP-1 biotinilada humana (celda de flujo 4) en un chip sensor conjugado de estreptavidina (Biacore AB, Friburgo, Alemania), respectivamente. Las disoluciones del aptámero mNOX-E36 (D-ARN) de 500, 250, 125, 62,5, 31,25, y 0 nM se inyectaron mediante un comando Kinject definido con un tiempo de asociación de 180 segundos y un tiempo de disociación de 360 segundos. La celda de flujo 1 se usó como tampón y el control de matriz de dextrano (superficie Biacore SA-Chip) mientras que en la celda de flujo 2 se inmovilizó un péptido D específico para determinar la unión inespecífica del aptámero. La Figura 32 muestra un sensograma de la cinética de D-NOX-E36 para la unión a la D-MCP-1 murina con una constante de disociación calculada (KD) de 200 300 pM. mNOX-E36 no se une a D-MCP-1 humana (Figura 33); para mayor claridad solo se muestra el sensograma obtenido con 125 nM de Spiegelmero.
7.2 Evaluación de selectividad de NOX-E36
La selectividad de NOX-E36 se evaluó mediante análisis de resonancia de plasmón superficial al inmovilizar NOX-E36 5´-biotinilado en estreptavidina (SA-Chip). Se inmovilizaron 352 UR de NOX-E36 en la celda de flujo (FC) 1 y una cantidad igual de Spiegelmero control no funcional biotinilado en el extremo 5´-terminal (POC) en la FC 2 mediante la unión de estreptavidina/biotina. Se usó la FC3 como control de superficie para determinar la unión inespecífica a la superficie del sensor de dextrano-SA.
Se inyectaron 100 nM de un panel de quimiocinas humanas de los cuatro subgrupos (CC, CXC, CX3C y XC) durante 360 s y los complejos se dejaron disociar durante 360 s con un caudal de 10 μL/minuto y 37°C. Se representaron gráficamente las unidades de respuesta después de la asociación (Respuesta 1; grado de interacción) y después de
la disociación (Respuesta 2, afinidad de interacción). Después de cada inyección, la superficie del chip se regeneró con 240 s de cloruro de sodio 1 M, con 0,1% de Tween; los Spiegelmeros inmovilizados se dejaron posteriormente replegar durante 2 minutos en condiciones fisiológicas (tampón de corrida). La inyección de cada quimiocina se repitió 3 veces. CXCL1, CXCL2, CXCL6 y CXCL9 mostraron unión inespecífica a ácidos ribonucleicos y la superficie de dextrano del chip. La unión de alta afinidad especifica a NOX-E36 inmovilzado solo pudo ser detectada para CCL2/MCP-1, CCL8/MCP-2, CCL11/eotaxina, CCL _MIP1a, y C CL7_NAP-2 (Figura 24B). El hallazgo de que la MCP-2 y la eotaxina se unen con NOX-E36 no es sorprendente, ya que la relativamente alta homología entre estas quimiocinas y la MCP-1, de 62 y 70 %; para los positivos inesperados de CCL3/MIP-1a y CXCL7/NAP-2 se han realizado pruebas de inhibición funcional in vitro o se están estableciendo actualmente, respectivamente.
Finalmente, se determinaron los parámetros cinéticos de la interacción entre NOX-E36 y CCL2/MCP-1, CCL8/MCP2, CCL11/eotaxina, CCL _MIP1a, C CL7_NAP-2, CCL7/MCP-3 y CCL13/MCP-4 en el sistema "invertido”. Aquí, se inmovilizaron las quimiocinas y se inyectó NOX-E36 (para el protocolo detallado, ver 7.1). Los datos cinéticos se resumen en la Figura 24C.
7.3 Evaluación de la funcionalidad anti-MIP-1a in vitro
Las mediciones en Biacore han mostrado reactividad cruzada de NOX-E36 con MIP-1e. Mediante el empleo de un ensayo funcional in vitro basado en cultivo de célula se debería examinar si la unión simple Biacore de NOX-E36 a MIP-1e también se traduce a funcionalidad, por ej., antagonismo.
Para obtener esto, se realizaron experimentos de quimiotaxis con células THP-1 que se pueden estimular con MIP-1
a. Las células THP -1 cultivadas como se describió anteriormente se centrifugaron, se lavaron una vez con HBH (HBSS, (HBSS, que contiene 1 mg/mL de albúmina de suero bobino y HEPES 20 mM) y se resuspendieron a razón de 3 x 106 células/mL. Se añadieron 100 μL de esta suspensión a insertos Transwell con poros de 5 μm (Corning, nº 3421). En los compartimientos inferiores la MIP-1e se preincubó junto con los Spiegelmeros a diversas concentraciones en 600 μL de HBH a 37°C durante 20 a 30 minutos antes de la adición de las células. Las células se dejaron migrar a 37°C durante 3 horas. Después se retiraron los insertos y se agregaron 60 μL de resazurina 440 μM (Sigma) en solución tamponada con fosfato a los compartimientos inferiores. Después de incubar a 37°C durante 2,5 horas, se midió la fluorescencia en una longitud de onda de excitación de 544 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm en un lector de placa de detección múltiple Fluostar Optima (BMG).
Después de 3 horas de migración de las células THP-1 a diversas concentraciones de MIP-1e humana, se obtuvo una curva de dosis respuesta para MIP-1e humana, que indica una concentración efectiva máxima media de aproximadamente 1 nM y una activación reducida a concentraciones superiores (Figura 24D). Para los experimentos adicionales de inhibición de la quimiotaxis por Spiegelmeros se usó una concentración de MIP-1e de 0,5 nM.
Se realizaron experimentos para la determinación de la inhibición de la quimiotaxis por NOX-E36 con un estímulo de 0,5 nM de MIP-1a. Se pudo demostrar claramente que NO -E36 no inhibe la quimiotaxis inducida por MIP-1a hasta la mayor concentración ensayada de 1 μM de MIP-1a. Como control positivo, se realiió en paralelo el experimento respectivo con MCP-1 como estímulo (Figura 24E).
Ejemplo 8: Terapia de la enfermedad de tipo lupus en ratones MRLlpr/lpr con Spiegelmero anti-mMCP-1
El bloqueo de los mediadores proinflamatorios se ha convertido en un método exitoso para el tratamiento de la inflamación crónica (Steinman 2004). Además del TNF y las interleucinas, las quimiocinas CC son candidatos importantes para el antagonismo específico, ya que las quimiocinas CC median en el reclutamiento de leucocitos del espacio intravascular a los sitios de inflamación (Baggiolini 1998, Luster 2005). Existe una evidencia muy sólida de que la MCP-1 (= CCL2), y su respectivo receptor de quimiocina CCR2, cumple un papel crucial en la lesión del tejido autoinmune tal como las manifestaciones clínicas del lupus eritematoso sistémico (Gerard & Rollins 2001). Por ejemplo, los ratones MRLlpr/lpr deficientes en el gen Ccl2 o Ccr2 están protegidos de la autoinmunidad semejante al lupus (Perez de Lema 2005, Tesch 1999). De este modo, el eje CCL2/CCR2 puede representar un objetivo terapéutico prometedor, por ej., para la nefritis lúpica. En efecto, la terapia génica retardada o la transferencia de células transfectadas, ambas resultantes de la producción in situ de una MCP-1 truncada en NH2, redujeron considerablemente la lesión tisular autoinmune en ratones MRLlpr/lpr. Sin embargo, tales métodos experimentales no se pueden usar en seres humanos debido a la producción incontenible de antagonistas y a la formación de tumores (Hasegawa 2003, Shimizu 2004). En consecuencia, todavía es necesario desarrollar nuevos antagonistas CCL2 con perfiles farmacocinéticos favorables in vivo. En este ejemplo se demuestra que el bloqueo de CCL2 murino con el Spiegelmero anti-mCCL2 mNOX-E36 o mNOX-E36-3'PEG sería adecuado para el tratamiento de la nefritis lúpica y de otras manifestaciones de la enfermedad de lupus eritematoso sistémico. El comienzo tardío de la terapia con Spiegelmero mCCL2 mejora efectivamente la nefritis lúpica, peribronquitis autoinmune y enfermedad cutánea semejante a lupus en ratones MRLlpr/lpr, independientemente de cualquier problema previo asociado con el bloqueo de CCL2/CCR2 terapéutico.
Animales y protocolo experimental
Se obtuvieron ratones hembra MRLlpr/lpr de diez semanas de edad en Harlan Winkelmann (Borchen, Alemania) y se mantuvieron en condiciones normales de alojamiento con un ciclo de 12 horas de luz y oscuridad. El agua y el
pienso estándar (Ssniff, Soest, Alemania) estuvieron disponibles ad libitum. A la edad de 14 semanas, grupos de 12 ratones recibieron inyecciones subcutáneas de Spiegelmeros en 5% de glucosa (volumen de inyección, 4 mL/kg) tres veces por semana de la siguiente manera: mNOX-E36, 1,5 μmol/kg; mNOX-E36-3'PEG, 0,9 μmol/kg; Spiegelmero de control no funcional PoC (5’-UAAGGAAACUCGGUCUGAUGCGGU AGCGCUGUGCAGAGCU-3’), 1,9 μmol/kg; PoC-PEG, 0,9 μmol/kg; vehículo (5% de glucosa). Se determinaron los niveles plasmáticos de mNOX-E36 y mNOX-E36-3'PEG en muestras de sangre tomadas semanalmente del seno retroorbital 3 o 24 horas después de la inyección, respectivamente. Los niveles de Spiegelmero en las muestras de plasma se determinaron a través de una modificación del método de hibridación sándwich descrito en el Ejemplo 8. Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical al final a las 24 semanas de edad.
Evaluación del lupus sistémico
Las lesiones cutáneas se registraron por un puntaje semicuantitativo (Schwarting 2005). Se calculó la proporción del peso del bazo y la masa de los ganglios linfáticos del mesenterio respecto al peso corporal total como marcador del síndrome linfoproliferativo asociado con el lupus. Se recogieron muestras de sangre y orina de cada animal al final del período de estudio por sangrado del plexo venoso retro-orbital bajo anestesia general con éter inhalador. Se recogieron muestras de sangre y orina de cada animal al final del período de estudio y se determinó la relación albúmina/cretinita urinaria y los títulos séricos del isotipo IgG del autoanticuerpo ADNsd como se ha descrito previamente (Pawar 2006). Se determinó la velocidad de filtración glomerular (GFR) a las 24 semanas a través de la cinética de depuración de FITC-inulina plasmática (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) 5, 10, 15, 20, 35, 60, y 90 minutos después de una única inyección en bolo (Qi 2004). Se determinó la fluorescencia con excitación de 485 nm y se leyó a una emisión de 535 nm. La GFR se calculó sobre la base del modelo de dos compartimientos mediante un software de ordenador de ajuste de curva con regresión no lineal (GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Se determinaron los niveles de citocinas en suero mediante kits comerciales de ELISA para las IL-6, IL12p40 (OptEiA, BD Pharmingen), e IFN-a (PBL Biomedical Labs, USA). Se fijaron los riñones y pulmones de todos los ratones en 10% de formalina tamponada, se procesaron y se incluyeron en parafina. Se prepararon secciones de 5 Im para las tinciones con plata yácido peryódico de Schiff, siguiendo los protocolos de rutina (Anders 2002) . Se clasificó la gravedad de las lesiones renales mediante los índices de actividad y cronicidad descritos para la nefritis lúpica humana (Austin 1984), y se realizó la morfometría de la lesión intersticial renal como se ha descrito previamente (Anders 2002). La gravedad de la inflamación peribronquial se clasificó de forma semicuantitativa entre 0 y 4. Para la inmunotinción, las secciones de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina se desparafinaron y se rehidrataron. Se bloqueó la peroxidasa endógena con un 3% de peróxido de hidrógeno y se realizó la recuperación del antígeno en disolución de recuperación del antígeno (Vector, Burlingame, CA) en una estufa autoclave. La biotina se bloqueó con el kit de bloqueo de avidina/biotina (Vector). Los portaobjetos se incubaron con los anticuerpos primarios durante una hora, seguido por los anticuerpos secundarios biotinilados (IgG anti-rata, Vector) y el reactivo ABC (Vector). Los portaobjetos se lavaron en disolución salina tamponada con fosfato entre los pasos de incubación. Se usó 3’3’diaminobencidina (DAB, Sigma, Taufkirchen, Alemania) con refuerzo metálico como sistema de detección, lo que originó un producto de color negro. Se usó verde de metilo como tintura de contraste, los portaobjetos se rehidrataron y montaron en Histomount (Zymed Laboratories, San Francisco, CA). Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-Mac2 de rata (macrófagos, Cederlane, Ontario, Canadá, 1:50), CD3 anti-ratón (1:100, clon 500A2, BD), IgG1 anti-ratón (1:100, M32015, Caltag Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.), IgG2a antiratón (1:100, M32215, Caltag), C3 anti-ratón (1:200, GAM/C3c/FITC, Nordic Immunological Laboratories, Tilburg, Holanda). Los controles negativos incluyeron la incubación con un anticuerpo del isotipo respectivo. Para el análisis cuantitativo, se contaron las células glomerulares de 15 glomérulos corticales por sección. Se clasificaron los depósitos de Ig y C3c glomerulares de 0-3 en 15 secciones de glomérulos corticales.
Preparación de ARN y RT-PCR cuantitativa en tiempo real (TaqMan)
El tejido renal de cada ratón se separó congelado en nitrógeno líquido y se conservó a -80°C. Para cada animal se realizó la preparación del ARN renal total y la transcripción inversa tal como se ha descrito (Anders 2002). Los cebadores y las sondas fueron de PE Biosystems, Weiterstadt, Alemania. Los cebadores usados (300 nM) se emplearon para la detección de Ccl2, Ccl5 y ARNr 18S, el reactivo del ensayo TaqMan predesarrollado provenía de PE Biosystems.
Citometría de flujo
Al final del estudio se obtuvieron muestras de sangre entera y de medula ósea de los ratones de todos los grupos. Se realizó la citometría de flujo mediante una máquina FACScalibur y el anticuerpo previamente caracterizado MC21 anti-mCCR2 (Mack 2001). Para la detección se usó un anticuerpo IgG anti-rata biotinilado (BD Biosciences). Se usó una IgG2b de rata (BD Biosciences) como control de isotipo.
Análisis estadístico
Los datos se expresaron como media ± error estándar de la media (SEM). Se realizó la comparación entre los grupos mediante un ANOVA univariado. Se usó la corrección de Posthoc Bonferroni para las comparaciones múltiples. Se consideró que un valor de p < 0,05 indica significación estadística.
Ensayo de hibridación tipo sándwich
Se cuantificó la cantidad de Spiegelmero en las muestras mediante un ensayo de hibridación tipo sándwich basado en un ensayo descrito por Drolet et al. 2000 (Pharm Res 17:1503). Las muestras de sangre se recogieron en paralelo para seguir la depuración plasmática de NOX-E36. Los tejidos seleccionados se prepararon para determinar las concentraciones de Spiegelmero.
Preparación de la placa de hibridación
El Spiegelmero mNOX-E36 se cuantificó por medio un ensayo de hibridación tipo sándwich no validado. Brevemente, la sonda de captura de mNOX-E36 (SEC ID Nº: 281) se inmovilizó sobre placas blancas de 96 pocillos ADN-BIND (Corning Costar, Wiesbaden, Alemania) a 0,75 mM en fosfato de sodio 0,5 M, EDTA 1 mM, pH 8,5 durante la noche a 4°C. Los pocillos se lavaron dos veces y se bloquearon con 0,5% p/v de BSA en fosfato de sodio 0,25 M, EDTA 1 mM, pH 8,5 durante 3 h a 37°C, se lavó otra vez y se conservó a 4°C hasta uso. Antes de la hibridación, las pocillos se pre-calentaron a 37°C y se lavaron dos veces con tampón de lavado pre-calentado (3xSSC, 0,5% [p/v] sarcosinato de dodecil sodio, pH 7,0; por adelantado se prepara una disolución patrón 20x [NaCl 3 M, citrato de Na3 0,3 M) sin lauroilsarcosina sodio y diluido de la forma correspondiente).
Preparación de muestra
Todas las muestras se ensayaron por duplicado. Las muestras plasmáticas se descongelaron en hielo, se agitaron en vórtice y se centrifugaron brevemente en una centrífuga de mesa refrigerada. Los homogenatos de tejido se descongelaron a TA y se centrifugaron 5 minutos a velocidad máxima y temperatura ambiente. Se retiraron 5 !L de cada muestra para el ensayo y después se devolvió al refrigerador para la conservación. Las muestras se diluyeron con tampón de hibridización (sonda de detección 8 nM mNOX-E36 [SEC ID Nº: 282] en tampón de lavado) a temperatura ambiente según el siguiente esquema:
1:30 muestra 5 !L + 145 !L de tampón de hibridización
1:300 20 !L 1:30 + 180 !L de tampón de hibridización 1:3000 20 !L 1:300 + 180 !L de tampón de hibridización 1:30000 20 !L 1:3000 + 180 !L de tampón de hibridización
Se ensayaron todas las diluciones de las muestras. El mNOX-E36 estándar se diluyó en forma seriada en una curva de calibración de 8 puntos, que abarcan el rango de 0-4 nM. Se prepararon y ensayaron las muestras no QC. El patrón de calibración fue idéntico a las muestras en estudio.
Hibridación y detección
Las muestras se calentaron durante 10 min a 95°C y se enfriaron hasta 37°C. Los complejos de Spiegelmero/sonda de detección se maduraron con sondas de captura inmovilizadas durante 30 minutos a 37°C. Los Spiegelmeros no unidos se retiraron por lavado dos veces con tampón de lavado y 1x TBST (Tris-Cl 20 mM, NaCl 137 mM, Tween 20 0,1%, pH 7,5), respectivamente. Los complejos hibridados se detectaron mediante estreptavidina-fosfatasa alcalina diluida a 1:5000 en TBST 1x durante 1 h a temperatura ambiente. Para eliminar el conjugado no unido, los pocillos se lavaron otra vez con TBST 1x y Tris-Cl 20 mM, MgCl2 1 mM, pH 9,8 (cada uno dos veces). Los pocillos se llenaron finalmente con 100 mL de sustrato CSDP (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania) y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente. Se midió la quimioluminiscencia en un lector de microplacas FLUOstar Optima (BMG Labtechnologies, Offenburg, Alemania).
Análisis de datos
Se usaron las siguientes diluciones de muestra de ensayo para el análisis cuantitativo de datos:
Plasma EDTA de rata 1:2000
Los datos obtenidos del grupo de vehículo (al que no se administró Spiegelmero) se restaron como señal de ruido de fondo.
El ensayo de hibridación descrito en la presente memoria también actúa de modo similar para los Spiegelmeros NOX-36, NOX-E36-5’-PEG y NOX-E36-3’-PEG, en donde se ha usado la respectiva sonda de captura NOX-E36 (SEC ID Nº: 255) y la respectiva sonda de detección NOX-E36 (SEC ID Nº: 256) (datos no mostrados).
Resultados
mNOX-E36-3'PEG mejora la supervivencia y la enfermedad renal de ratones MRLlpr/lpr
Los ratones MRLlpr/lpr se desarrollan y posteriormente mueren de glomerulonefritis compleja inmune proliferativa con semejanzas llamativas con la nefritis lúpica proliferativa difusa de los seres humanos. En este diseño de estudio terapéutico, los ratones MRLlpr/lpr tratados con Spiegelmero anti-mCCL2 pgilado y no pegilado, ("PoC")-Spiegelmero control regulado o no pegilado o vehículo tenían entre 14 y 24 semanas de edad. En este punto de tiempo, el vehículo, los ratones MRLlpr/lpr tratados con PoC o PoC-PEG mostraron glomerulonefritis proliferativa difusa por
infiltración de macrófagos glomerular y un infiltrado de células inflamatorias mixtas periglomerulares e intersticiales que consiste en macrófagos glomerulares e intersticiales positivos a Mac2 y linfocitos intersticiales positivos a CD3 (Figuras 34 y 35). mNOX-E36-3'PEG mejoró el índice de actividad y cronicidad de la nefritis lúpica además de los marcadores de inflamación renal previamente mencionados (Figura 35). La molécula de mNOX-E36 no pegilada fue menos efectiva en el índice de cronicidad y los recuentos de macrófagos intersticiales y células T (Figura 35). La enfermedad renal crónica avanzada se ilustró adicionalmente por atrofia tubular y áreas confluyentes de fibrosis intersticiales en ratones tratados con vehículo, PoC y PoC-PEG (Figura 34). Mediante la aplicación de morfometría para cuantificar estos cambios, se halló que mNOX-E36 pegilado y no pegilado redujo el volumen intersticial, el daño celular tubular y dilatación tubular, siendo todos marcadores de la gravedad y pronóstico de la enfermedad renal crónica (Figura 36). El mNOX-E36-3'PEG mejoró en un 50% la mortalidad, pero no el mNOX-E36 no pegilado (Figura 37). De este modo, el mNOX-E36-3'PEG puede reducir el número de macrófagos renales e infiltrados de células T y mejorar la nefritis lúpica y supervivencia (renal) de los ratones MRLlpr/lpr. Para estudiar si el tratamiento con mNOX-E36 y mNOX-E36-3'PEG afecta a la inflamación intrarrenal en ratones MRLlpr/lpr, se llevó a cabo la RT-PCR en tiempo real para evaluar los niveles de expresión de las quimiocinas proinflamatorias CCL2 y CCL5, que previamente habían demostrado estar reguladas por un aumento progresivo en los riñones de ratones MRLlpr/lpr durante el avance de la enfermedad renal (Perez de Lema 2001). El tratamiento con mNOX-E36 y mNOX-E36-3'PEG desde la semana 14 a 24 de edad redujo la expresión renal del ARNm de CCL2 y CCL5 en comparación con los controles tratados con vehículo (Figura 38).
Los Spiegelmeros anti-CCL2 reducen la lesión tisular extrarrenal autoinmune de los ratones MRLlpr/lpr
La piel y los pulmones también se ven habitualmente afectados por lesiones tisulares autoinmunes en ratones MRLlpr/lpr. La enfermedad pulmonar autoinmune en los ratones tratados con vehículo se caracterizó por infiltrados moderados de células inflamatorias peribronquiolares y perivasculares, y se observaron lesiones cutáneas en el 60% de los ratones (Figura 39, 40 y 35). Tanto mNOX-E36 como mNOX-E36-3'PEG redujeron la inflamación peribronquial y la enfermedad cutánea en comparación con los ratones MRLlpr/lpr tratados con vehículo, PoC, y PoC-PEG, respectivamente (Figuras 39, 40 y 35). En consecuencia, los efectos de los Spiegelmeros específicos de CCL2 no están limitados a nefritis lúpica sino que se extienden a otras manifestaciones de lesión tisular autoinmune de los ratones MRLlpr/lpr.
mNOX-E36 y síndrome linfoproliferativo, autoanticuerpos ADNds y niveles en suero de citocinas de ratones MRLlpr/lpr
Los ratones MRLlpr/lpr hembra desarrollan un síndrome linfoproliferativo caracterizado por esplenomegalia masiva y masas de ganglios linfáticos cervicales, axilares, inguinales y mesentéricos. Tanto mNOX-E36 como mNOX-E36-3'PEG no presentaron efecto sobre el peso de los bazos y ganglios linfaticos de los ratones MRLlpr/lpr (Figura 41). La autoinmunidad en los ratones MRLlpr/lpr se caracteriza por la producción de autoanticuerpos contra múltiples antígenos nucleares que incluyen ADNds. Los autoanticuerpos IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b de ADNds se presentaron en altos niveles en suero de ratones MRLlpr/lpr de 24 semanas de edad. Tanto mNOX-E36 como mNOX-E36-3'PEG no presentaron efecto sobre ninguno de estos autoanticuerpos de ADN (Figura 41). La enfermedad semejante a lupus en ratones MRLlpr/lpr tratados con vehículo se caracterizó por elevados niveles en suero de IFN-a, IL-12p40, y IL-6. Tanto mNOX-E36 como mNOX-E36-3'PEG no presentaron efecto sobre estos mediadores inflamatorios (Figura 41). De este modo, ambas variantes de mNOX-E36 no afectan a la linfoproliferación, la producción de IgG anti-ADNds y los niveles en suero de citocinas en ratones MRLlpr/lpr.
Niveles plasmáticos de mNOX-E36 y mNOX-E36-3'PEG de los ratones MRLlpr/lpr
Los niveles plasmáticos de mNOX-E36 y mNOX-E36-3'PEG se determinaron en intervalos semanales para controlar la exposición al fármaco durante la enfermedad renal progresiva en ratones MRLlpr/lpr. Los niveles plasmáticos medios de mNOX-E36 3 h después de la inyección y de mNOX-E36-3'PEG 24 h después de la inyección fueron de aproximadamente 300 nM y 1 μM a lo largo del estudio, respectivamente (Figura 42). De este modo, la pegilación aumentó los niveles plasmáticos de mNOX-E36 y la enfermedad renal progresiva de los ratones MRLlpr/lpr no modularon la farmacocinética de ambos Spiegelmeros.
mNOX-E36-3'PEG bloquea la emigración de monocitos de la médula ósea
Se demostró que la emigración de monocitos de la médula ósea durante la infección bacteriana involucra al receptor de quimiocina CCR2 (Serbina 2006), pero el papel de CCL2 en el contexto de la autoinmunidad todavía es hipotético. En consecuencia, se examinó la población de monocitos positivos a CCR2 en sangre periférica y médulas óseas de ratones de grupos de ratones MRLlpr/lpr de 24 semanas de edad tratados con mNOX-E36-3'PEG- y vehículo. El tratamiento con mNOX-E36-3'PEG aumentó el porcentaje de células positivas a CCR2 en la médula ósea de 13% a 26%, mientras que redujo esta población en la sangre periférica de 26% a 11% (Figura 43). Estos datos avalan un papel de CCL2 en la evasión de las células CCR2 positivas de la medula ósea durante la enfermedades autoinmunes en ratones MRLlpr/lpr.
Resumen
Aplicando la tecnología del Spiegelmero, se creó un nuevo antagonista específico de mCCL2 que potencialmente bloquea mCCL2 in vitro e in vivo. De hecho, el comienzo tardío del tratamiento con el Spiegelmero CCL2 aumentó
considerablemente la lesión tisular semejante a lupus avanzada en los ratones MRLlpr/lpr. Estos datos avalan un papel central del CCL2 en el daño tisular inflamatorio crónico e identifican a los Spiegelmeros CCL2 como una nueva terapia para la lesión tisular autoinmune.
Ejemplo 9: Terapia de la nefropatía diabética en ratones nefrectomizados unilateralmente con Spiegelmero anti-mMCP-1
La nefropatía diabética aún es la causa principal de la enfermedad renal en estadio final debido a que dirigir el tratamiento a los mecanismos patológicos dependientes de angiotensina no siempre impide el avance de la enfermedad (Zimmet 2001; Ritz 1999; United States Renal Data System 2004; Svensson 2003). En consecuencia, se requieren otras estrategias de tratamiento para agregar al armamento terapéutico para la nefropatía diabética. Los datos de estudios experimentales recientes relacionan el avance de la nefropatía diabética a la inflamación intrarrenal (Galkina 2006; Mora 2005; Meyer 2003; Tuttle 2005). Por ejemplo, el micofenolato de mofetilo, el metotrexato o la irradiación reducen la excreción de albúmina urinaria y la glomeruloesclerosis en ratas con nefropatía diabética inducida por estreptozotocina (Yozai 2005; Utimura 2003). Todavía hoy los mecanismos moleculares y celulares de la inflamación intrarrenal en la nefropatía diabética continúan estando mal caracterizados. Los pacientes con nefropatía diabética han aumentado los niveles séricos de marcadores de fase aguda de la inflamación pero esto no representa la inflamación intrarrenal (Dalla Vestra 2005; Navarro 2003). Los pacientes con nefropatía diabética excretan altos niveles de proteína 1 quimiotáctica de monocitos-quimiocina CC (MCP-1/CCL2) en la orina que puede ser más específica para la inflamación intrarrenal (Morii 2003; Tashiro 2002; Takebayashi 2006). De hecho, la MCP-1/CCL2 se expresa en las células mesangiales humanas expuestas a altas concentraciones de glucosa o productos finales de la glicación avanzada (Ihm 1998; Yamagishi 2002). La CCL2 participa en el proceso complejo de múltiples pasos del reclutamiento de leucocitos de los compartimentos intravascular a extravascular, es decir, glomérulos e intersticio renal (Baggiolini 1998). De hecho, los infiltrados de macrófagos son un hallazgo común en la glomeruloesclerosis diabética y la lesión tubulointersticial humana y experimental (Bohle 1991; Furuta 1993; Chow 2007). Los ratones diabéticos deficientes en Ccl2 tipo 1 o tipo 2 tienen recuentos de macrófagos glomerulares inferiores, lo que se asocia a una menor lesión glomerular (Chow 2004; Chow 2006). En estos estudios también se ha demostrado el papel funcional del CCL2 en la patología glomerular de la nefropatía diabética de tipo 1 y tipo 2. En consecuencia, el CCL2 puede representar una diana terapéutica potencial para la nefropatía diabética, y se deben validar antagonistas de CCL2 adecuados con perfiles farmacocinéticos favorables en este contexto de enfermedad. En este ejemplo nosotros informamos los efectos del Spiegelmero mNOX-E36-3'PEG anti-CCL2 PEGilado en ratones db/db diabéticos de tipo 2 con nefropatía diabética avanzada. Hemos demostrado que el Spiegelmero anti-CCL2 sería adecuado para el tratamiento de la nefropatía diabética.
Animales y protocolo experimental
Se obtuvieron ratones db/db C57BLKS de C57BLKS tipo salvaje machos de 5 semanas de edad de Taconic (Ry, Dinamarca) y se alojaron en jaulas con filtro en el extremo superior con un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad y acceso ilimitado a comida y agua durante el estudio. Las jaulas, lechos, material de anidamiento, alimento y agua se esterilizaron con autoclave antes de usar. A la edad de 6 semanas se realizó una uninefrectomía (ratones "1K") o cirugía falsa (ratones "2K") mediante una incisión de 1 cm en el flanco como se ha descrito previamente en ratones db/db de tipo salvaje (Bower 1980). En los ratones de los grupos de la cirugía falsa el riñón se dejó in situ. Después de 10 semanas, a la edad de 4 meses, los ratones db/db 1K se dividieron en dos grupos que recibieron tres veces por semana inyecciones subcutáneas con mNOX-E36-3'PEG o PoC-PEG en 5% de glucosa (dosis, 0,9 μmol/kg; volumen de inyección, 1 mL/kg). El tratamiento continuó durante 8 semanas (hasta la edad de 6 meses) cuando los animales se sacrificaron y se obtuvieron los tejidos para la evaluación histopatológica. Todos los procedimientos experimentales han sido aprobados por las autoridades gubernamentales locales.
Evaluación de la nefropatía diabética
Todos los estudios inmunohistológicos se realizaron con las secciones incluidas en parafina descritas (Anders 2002). Se usaron los siguientes anticuerpos como anticuerpos primarios: anti-Mac2 de rata (macrófagos glomerulares, Cederlane, Ontario, Canadá, 1:50), anti-Ki-67 (proliferación celular, Dianova, Hamburg, Alemania, 1:25). Para la evaluación histopatológica, se fijaron partes de los riñones de cada ratón en formalina al 10% en disolución salina tamponada con fosfato y se incluyeron en parafina. Se colorearon secciones de 3 !m con reactivo de ácido peryódico de Schiff o plata siguiendo las instrucciones del proveedor (Bio-Optica, Milano, Italia). Las lesiones escleróticas glomerulares se evaluaron mediante un puntaje semicuantitativo con un observador ciego de la siguiente manera: 0 = no lesión, 1 = < 25% esclerótico, 2 = 25-49% esclerótico, 3 = 50-74% esclerótico, 4 = 75-100% esclerótico, respectivamente. Se analizaron 15 glomérulos por sección. Se determinaron los índices de volumen intersticial y la dilatación tubular por superposición de una cuadrícula de 100 puntos en 10 campos corticales no superpuestos, como se ha descrito previamente (Anders 2002). Los recuentos de células intersticiales fueron realizados en 15 campos de alta potencia (hpf, 400 x) por un observador ciego. La preparación de ARN y la RT-PCR de tiempo real cuantitativa (TaqMan) se hicieron a partir de los glomérulos desparafinados. Después de la incubación en tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, SDS 2% y 20 μg/mL de proteinasa K) durante 16 h a 60°C, se realizó la extracción del ARN sobre la base de fenol-cloroformo. El ARN glomerular se disolvió en 10 μL de agua libre de ARNasa. Se realizó la transcripción inversa y la RT-PCR de tiempo real del ARN total del órgano y
glomerular descrita (Anders 2002, Cohen 2002). Los controles que consistían en ddH2O fueron negativos para los genes diana y constitutivos. El cebador (300 nM) y las sondas de oligonucleótidos (100 nM) para mCcl2, Gapdh, y ARNr 18 S fueron reactivos de ensayo TaqMan predesarrollado de PE. Los cebadores y sondas eran de ABI Biosystems, Weiterstadt, Alemania. La velocidad de filtración glomerular (GFR) se determinó a través de la cinética de depuración de FITC-inulina (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) 5, 10, 15, 20, 35, 60, y 90 minutos después de una inyección en bolo única (Qi 2004). La fluorescencia se determinó a 485 nm de excitación y se leyó a una emisión de 535 nm. La GFR se calculó en base a un modelo de dos compartimentos usando un software de ajuste de curva con regresión no lineal (GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Todos los datos se presentan como media ± SEM. Se realizó la comparación de los grupos mediante ANOVA y se usó la corrección de Bonferroni post-hoc para comparaciones múltiples. Se consideró que un valor de p < 0,05 indica significación estadística.
Resultados
mNOX-E36-3’PEG reduce los recuentos de macrófagos glomerulares y la glomeruloesclerosis global en ratones db/db nefrectomizados unilateralmente
Cuando la falta de CCL2 funcional se asocia al reclutamiento reducido de macrófagos glomerulares en ratones db/db (Chow 2007) y el mNOX-E36-3’PEG puede bloquear el reclutamiento de macrófagos mediado por CCL2 in vitro e in vivo, mNOX-E36-3’PEG debe alterar el reclutamiento de macrófagos renales en ratones db/db con nefropatía diabética tipo 2 avanzada. Para probar esta hipótesis, nosotros realizamos inyecciones subcutáneas con mNOX-E36-3’PEG o PoC-PEG a la edad de 4 meses en los ratones db/db ("1K") nefrectomizados unilateralmente. El tratamiento continuó durante 8 semanas, cuando se recogieron tejidos para la evaluación de la nefropatía diabética. Durante este periodo, el tratamiento con mNOX-E36-3’PEG no afectó significativamente los recuentos de leucocitos
o plaquetas, los niveles de glucemia o peso corporal fueron considerablemente elevados en todos los grupos de ratones db/db en comparación con los ratones BLKS no diabéticos (datos no mostrados). De modo interesante, mNOX-E36-3’PEG aumentó los niveles séricos de CCL2 en ratones db/db, lo que indica que el antagonista de CCL2 retiene CCL2 en la circulación (Figura 44). De acuerdo con nuestra hipótesis, el mNOX-E36-3’PEG redujo de forma significativa el número de macrófagos glomerulares en un 40% en comparación con los ratones db/db tratados con PoC-PEG o vehículo, asociado a cantidades menores de células proliferantes positivas a Ki-67 dentro del glomérulo en los ratones db/db tratados con mNOX-E36-3’PEG (Figura 45). Estos hallazgos se asociaron a un aumento significativo de la glomeruloesclerosis diabética total en ratones db/db 1K (Figura 46). De hecho, el tratamiento mNOX-E36-3’PEG redujo la glomeruloesclerosis diabética en ratones db/db 1K en la medida de la glomeruloesclerosis presente en ratones db/db ("2K") no nefrectomizados emparejados por edad (Figura 46). Estos hallazgos demuestran que el bloqueo retardado del reclutamiento de macrófagos glomerulares dependiente de CCL2 con mNOX-E36-3’PEG impide la glomeruloesclerosis diabética total en ratones db/db diabéticos tipo 2.
mNOX-E36-3’PEG mejora la GFR en ratones db/db 1K
Los efectos beneficiosos del tratamiento con mNOX-E36-3’PEG en la glomeruloesclerosis diabética en ratones db/db 1K se deberían asociar a una mejor GFR. Nosotros analizamos la cinética de la depuración de FITC-inulina como un marcador de la GFR en ratones db/db (Qi 2004). En comparación con una GFR normal de aproximadamente 250 mL/minuto en ratones db/db (Qi 2004), nosotros hallamos una GFR reducida de 112 ± 23 mL/minuto en ratones db/db 1K de 6 meses inyectados con PoC-PEG (Figura 47). El tratamiento con mNOX-E36-3’PEG mejoró significativamente la GFR a 231 ± 30 mL/minuto en ratones db/db 1K (p < 0,001), lo que sugiere que el bloqueo del reclutamiento de macrófagos glomerulares dependiente de CCL2 también puede mejorar la función renal en ratones diabéticos tipo 2.
mNOX-E36-3’PEG reduce los recuentos de macrófagos intersticiales y la lesion tubulointersticial en ratones db/db 1K
La nefropatía diabética avanzada en los seres humanos se asocia a cantidades significativas de macrófagos intersticiales y a lesión tubulointersticial (Bohle 1991). En los ratones db/db 2K, los infiltrados de macrófagos intersticiales y la lesión tubulointersticial significativa no aparece antes de los 8 meses (Chow 2007). La uninefrectomía temprana acelera el desarrollo de la patología tubulointersticial en ratones db/db (Ninichuk 2005), de este modo nosotros cuantificamos los macrófagos intersticiales, la dilatación tubular y el volumen intersticial como marcadores del daño tubulointersticial en ratones de todos los grupos de 6 meses de edad. En este punto de tiempo los ratones db/db 1K demostraron cantidades aumentadas de macrófagos intersticiales y elevaciones significativas de la dilatación tubular y del volumen intersticial en comparación con ratones db/db 2K (Figura 45, Figura 48). El tratamiento con mNOX-E36-3’PEG redujo las cantidades de macrófagos intersticiales en un 53%, además de la dilatación tubular y del volumen intersticial en ratones db/db 1K (Figura 45, Figura 48). De este modo, el bloqueo del reclutamiento de macrófagos renales dependiente de CCL2 también impide la lesión tubulointersticial en ratones db/db diabéticas tipo 2.
mNOX-E36-3’PEG reduce la expresión renal de Ccl2 in ratones db/db 1K
Los infiltrados de macrófagos amplifican las respuestas inflamatorias de la lesión tisular, por ej., la expresión local de CCL2. Nosotros, en consecuencia, propusimos la hipótesis de que la disminución de los macrófagos renales relacionada con mNOX-E36-3’PEG se debe asociar a una menor expresión de CCL2 renal. Usamos RT-PCR de tiempo real para cuantificar la expresión de ARNm de CCL2 en ratones db/db. mNOX-E36-3’PEG redujo los niveles de ARNm de CCL2 en riñones de ratones db/db 1K de 6 meses en comparación con ratones tratados con PoC-PEG apareados por edad (Figura 49). Para evaluar adicionalmente la expresión espacial de CCL2 realizamos la inmunotinción para la proteína de CCL2 en secciones renales. En ratones db/db 1K la expresión de CCL2 aumentó considerablemente en los glomérulos, túbulos y células intersticiales en comparación con los ratones db/db 2K o tipo salvaje 2K (Figura 50). mNOX-E36-3’PEG redujo considerablemente la tinción de CCL2 en todos los compartimentos en comparación con los ratones db/db 1K tratados con vehículo o PoC-PEG. Estos datos indican que el bloqueo del reclutamiento de macrófagos renales dependiente de CCL2 con mNOX-E36-3’PEG reduce la expresión local de CCL2 en ratones db/db 1K.
Resumen
El concepto de que la inflamación contribuye al avance de la nefropatía diabética ha sido aceptado de forma creciente (Tuttle 2005), y lleva a considerar a la MCP-1/CCL2 como una diana potencial para tratar esta enfermedad. En este ejemplo, hemos demostrado que el tratamiento de ratones diabéticos nefrectomizados unilateralmente con mNOX-E36-3’PEG redujo las cantidades de macrófagos glomerulares (e intersticiales) de 6 meses, asociados a menos células glomerulares proliferantes. Además, la expresión renal/glomerular del ARNm de CCL2 se redujo considerablemente con el tratamiento con mNOX-E36-3’PEG. Además, las cantidades inferiores de macrófagos glomerulares y células glomerulares proliferativas del grupo de terapia estuvieron asociados a la protección de la glomeruloesclerosis total y con un aumento significativo de la velocidad de filtración glomerular. Los efectos beneficiosos de mNOX-E36-3’PEG sobre la patología glomerular y la función renal en ratones diabéticos son compatibles con los estudios que han usado otros antagonistas de CCL2 en otros modelos de lesión glomerular (Lloyd 1997, Hasegawa 2003, Tang 1996, Wenzel 1997, Fujinaka 1997, Schneider 1999). El comienzo tardío del bloqueo de CCL2 también redujo de forma considerable las cantidades de macrófagos intersticiales que están asociados a menos patología tubulointersticial en ratones db/db 1K.
En conjunto, estos datos validan al CCL2 como una diana terapéutica prometedora para la nefropatía diabética y sugieren que el comienzo del bloqueo de CCL2 con un Spiegelmero – aún en un estado avanzado de la enfermedad
– todavía puede ser protector.
Referencias
Los datos bibliográficos completos de los documentos mencionados en la presente memoria son los siguientes.
Akahoshi T, Wada C, Endo H, Hirota K, Hosaka S, Takagishi K, Kondo H, Kashiwazaki S, Matsushima K (1993). Expression of monocyte chemotactic and activating factor in rheumatoid arthritis. Regulation of its production in synovial cells by interleukin-1 and tumor necrosis factor. Arthritis Rheum. 36: 762.
Alam R, York J, Moyars M, Stafford S, Grant JA, Lee J, Forsythe P, Sim T, Ida N (1996). Increased MCP-1, RANTES, y MIP-1a in bronchoalveolar lavage fluid of allergic asthmatic patients. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153: 1398.
Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990), Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3): 403-10.
Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ (1997). Gapped BLAST y PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Acids nucleics Res. Sep 1; 25 (17): 3389-402.
Amann B, Tinzmann R, Angelkort B (2003). ACE inhibitors improve diabetic nephropathy through suppression of renal MCP-1. Diabetes Care 26: 2421.
Anders HJ, Vielhauer V, Frink M, Linde Y, Cohen CD, Blattner SM, Kretzler M, Strutz F, Mack M, Grone HJ, Onuffer J, Horuk R, Nelson PJ, Schlöndorff D (2002). A chemokines receptor CCR-1 antagonist reduces renal fibrosis after unilateral ureter ligation. J. Clin. Invest. 109: 251.
Anders HJ, Vielhauer V, Schlöndorff D (2003). Chemokines and chemokine. quimiocina receptors are involved in the resolution o progression of renal disease. Kidney Int. 63: 401.
Aurup H et al. (1994). Acid nucleics Res 22: 20.
Austin HA 3rd, Muenz LR, Joyce KM, Antonovych TT, Balow JE (1984). Diffuse proliferative lupus nephritis: identification of specific pathologic features affecting renal outcome. Kidney Int. 25: 689.
Baggiolini M, Dewald B, Moser B (1994). Interleukin-8 y related chemotactic cytokines – CXC y CC chemokines. Adv. Immunol. 55: 97
Baggiolini M (1998). Chemokines y leukocyte traffic. Nature 392: 565.
Banba N, Nakamura T, Matsumura M, Kuroda H, Hattori Y, Kasai K (2000). Possible relationship of monocyte chemoattractant proteína-1 with diabetic nephropathy. Kidney Int. 58: 684.
Banisor I, Leist TP, Kalman B (2005). Involvement of f-chemokines in the development of inflammatory demyelination. J. Neuroinflammation 2: 7.
Bazan JF, Bacon KB, Hardiman G, Wang W, Soo K, Rossi D, Greaves DR, Zlotnik A, Schall TJ (1997). A new class of membrane-bound chemokine with a CX3C motif. Nature 385: 640.
Bohle A, Wehrmann M, Bogenschutz O, Batz C, Muller CA, Muller GA (1991). The pathogenesis of chronic renal failure in diabetic nephropathy. Investigation of 488 cases of diabetic glomeruloesclerosis. Pathol. Res. Pract. 187:
251.
Boring L, Gosling J, Chensue SW, Kunkel SL, Farese RV Jr, Broxmeyer HE, Charo IF (1997). Impaired monocyte migration y reduced type 1 (Th1) cytokine responses in C-C chemokine receptor 2 knockout mice. J. Clin. Invest.
100: 2552.
Boring L, Gosling J, Cleary M, Charo IF (1998). Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokine in the initiation of atherosclerosis. Nature 394: 894.
Boring L, Gosling J, Monteclaro FS, Lusis AJ, Tsou CL, Charo IF (1996). Molecular cloning y functional expression of murine JE (monocyte chemoattractant proteína 1) y murine macrophage inflammatory protein 1alpha receptors: evidence for two closely linked C-C chemokine receptors on chromosome 9. J. Biol. Chem. 271: 7551.
Bossink AW, Paemen L, Jansen PM, Hack CE, Thijs LG, Van Damme J (1995). Plasma levels of the chemokine monocyte chemotactic proteins-1 y -2 are elevated in human sepsis. Blood 86: 3841.
Bower G, Brown DM, Steffes MW, Vernier RL, Mauer SM (1980). Studies of the glomerular mesangium y the juxtaglomerular apparatus in the genetically diabetic mouse. Lab. Invest. 43: 333.
Charo IF, Myers SJ, Herman A, Franci C, Connolly AJ, Coughlin SR (1994). Molecular cloning y functional expression of two monocyte chemoattractant protein 1 receptors reveals alternative splicing of the carboxil-terminal tails. Proc. Natl Acad. Sci. USA 91: 2752.
Chow FY, Nikolic-Paterson DJ, Ma FY, Ozols E, Rollins BJ, Tesch GH (2007). Monocyte chemoattractant protein-1induced tissue inflammation is critical for the development of renal injury but not type 2 diabetes in obese db/db mice. Diabetologica 50: 471.
Chow FY, Nikolic-Paterson DJ, Ozols E, Atkins RC, Rollin BJ, Tesch GH (2006). Monocyte chemoattractant protein-1 promotes the development of diabetic renal injury in streptozotocin-treated mice. Kidney Int. 69: 73.
Chow F, Ozols E, Nikolic-Paterson DJ, Atkins RC, Tesch GH (2004). Macrophages in mouse type 2diabetic nephropathy: Correlation with diabetic state y progressive renal injury. Kidney Int. 65: 116.
Cockwell P, Howie AJ, Adu D, Savage CO (1998). In situ analysis of C-C chemokine mRNA in human glomerulonephritis. Kidney Int. 54: 827.
Cohen CD, Gröne HJ, Gröne EF, Nelson PJ, Schlöndorff D, Kretzler M (2002). Laser microdissection and gene expression analysis on formaldehyde-fixed archival tissue. Kidney Int. 61: 125.
Cummins LL et al. (1995). Acids nucleics Res 23: 2019.
Dalla Vestra M, Mussap M, Gallina P, Bruseghin M, Cernigoi AM, Saller A, Plebani M, Fioretto P (2005). Acute-phase markers of inflammation y glomerular structure in patients with type 2 diabetes. J. Am. Soc. Nephrol. 16 Suppl 1: S78.
Dawson J, Miltz W, Mir AK, Wiessner C (2003). Targeting monocyte chemoattractant protein-1 signalling in disease. Expert Opin. Ther. Targets 7: 35.
De Bleecker JL, De Paepe B, Vanwalleghem IE, Schroder JM (2002). Differential expression of chemokines in inflammatory myopathies. Neurology 58: 1779.
Drolet DW, Nelson J, Tucker CE, Zack PM, Nixon K, Bolin R, Judkins MB, Farmer JA, Wolf JL, Gill SC, Bendele RA (2000). Pharmacokinetics and safety of an anti-vascular endothelial growth factor aptamer (NX1838) following injection into the vitreous humor of rhesus monkeys. Pharm. Res. 17: 1503.
Eaton BE et al. (1995). Chem Biol 2: 633.
Eaton BE, Gold L, Hicke BJ, Janjic N, Jucker FM, Sebosta DP, Tarasow TM, Willis MC, Zichi DA (1997). Bioorg Med Chem 5: 1087.
Economou E, Tousoulis D, Katinioti A, Stefanadis C, Trikas A, Pitsavos C, Tentolouris C, Toutouza MG, Toutouzas P (2001). Chemokines in patients with ischaemic heart disease and the effect of coronary angioplasty. Int. J. Cardiol.
80: 55.
Egashira K, Zhao Q, Kataoka C, Ohtani K, Usui M, Charo IF, Nishida K, Inoue S, Katoh M, Ichiki T, Takeshita A (2002). Importance of monocyte chemoattractant protein-1 pathway in neointimal hyperplasia after periarterial injury in mice y monkeys. Circ. Res. 90: 1167.
Fujinaka H, Yamamoto T, Takeya M, Feng L, Kawasaki K, Yaoita E, Kondo D, Wilson CB, Uchiyama M, Kihara I (1997). Suppression of anti-glomerular basement membrane nephritis by administration of anti-monocyte chemoattractant protein-1 antibody in WKY rats. J. Am. Soc. Nephrol. 8: 1174.
Furuichi K, Wada T, Iwata Y, Kitagawa K, Kobayashi K-I, Hashimoto H, Ishiwata Y, Tomosugi N, Mukaida N, Matsushima K, Egashira K, Yokoyama H (2003). Gene therapy expressing amino-terminal truncated monocyte chemoattractant protein-1 prevents renal ischemia-reperfusion injury. J. Am. Soc. Nephrol. 14: 1066.
Furuta T, Saito T, Ootaka T, Soma J, Obara K, Abe K, Yoshinaga K (1993). The role of macrophages in diabetic glomeruloesclerosis. Am. J. Kidney Dis. 21: 480.
Galasso JM, Liu Y, Szaflarski J, Warren JS, Silverstein FS (2000). Monocyte chemoattractant proteín-1 is a mediator of acute excitotoxic injury in neonatal rat brain. Neuroscience 101: 737.
Gao JL, Kuhns DB, Tiffany HL, McDermott D, Li X, Francke U, Murphy PM (1993). Structure and functional expression of the human macrophage inflammatory protein 1 alpha/RANTES receptor. J. Exp. Med. 177: 1421.
Garcia-Zepeda EA, Combadiere C, Rothenberg ME, Sarafi MN, Lavigne F, Hamid Q, Murphy PM, Luster AD (1996). Human monocyte chemoattractant protein (MCP)-4 is a novel CC chemokine with activities on monocytes, eosinophils, and basophils induced in allergic y nonallergic inflammation that signals through the CC chemokine receptors (CCR)-2 y -3. J. Immunol. 157: 5613.
Gerard C, Rollins, BJ. Chemokine and disease. Nat. Immunol. 6: 1182.
Gong X, Gong W, Kuhns DB, Ben-Baruch A, Howard OM, Wang JM (1997). Monocyte chemotactic protein-2 (MCP2) uses CCR1 y CCR2B as its functional receptors. J. Biol. Chem. 272: 11682.
Gonzalo JA, Lloyd CM, Wen D, Albar JP, Wells TNC, Proudfoot A, Martinez-A C, Dorf M, Bjerke T, Coile AJ, Gutierrez-Ramos JC (1998). The coordinated action of CC chemokines in the lung orchestrates allergic inflammation y airway hyperresponsiveness. J. Exp. Med. 188: 157.
Gordillo GM, Onat D, Stockinger M, Roy S, Atalay M, Beck FM, Sen CK (2004). A key angiogenic role of moncyte chemoattractant protein-1 in hemangioendothelioma proliferation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287: C866.
Green LS et al. (1995). Chem Biol 2: 683.
Handel TM, Domaille PJ (1996). Heteronuclear (1H, 13C, 15N) NMR assignments and solution structure of the monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) dimer. Biochemistry 35: 6569.
Harigai M, Hara M, Yoshimura T, Leonard EJ, Inoue K, Kashiwazaki S (1993). Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in inflammatory joint diseases and its involvement in the cytokine network of rheumatoid synovium. Clin. Immunol. Immunopathol. 69: 83.
Hasegawa H, Kohno M, Sasaki M, Inoue A, Ito MR, Terada M, Hieshima K, Maruyama H, Miyazaki J, Yoshie O, Nose M, Fujita S (2003). Antagonist of monocyte chemoattractant protein 1 ameliorates the initiation y progression of lupus nephritis and renal vasculitis in MRL/lpr mice. Arthritis Rheum. 48: 2555.
Heath H, Qin S et al. (1997). Quimiocina receptor usage by human eosinophils. The importance of CCR3 demonstrated using an antagonistic monoclonal antibody. J Clin Invest 99: 178.
Holdsworth SR, Kitching AR, Tipping PG (2000). Chemokines as therapeutic targets in renal disease. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 9: 505.
Holgate ST, Bodey KS, Janezic A, Frew AJ, Kaplan AP, Teran LM (1997). Release of RANTES, MIP-1a, y MCP-1 into asthmatic airways following endobronchial allergen challenge. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156: 1377.
Hosaka S et al. (1994). Clin Exp Immunol 97: 451.
Huang DR, Wang J, Kivisakk P, Rollins BJ, Ransohoff RM (2001). Absence of monocyte chemoattractant protein 1 in mice leads to decreased local macrophage recruitment and antigen-specific T helper cell type 1 immune response in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Exp. Med. 193: 713.
Hulkower K, Brosnan CF, Aquino DA, Cammer W, Kulshrestha S, Guida MP, Rapoport DA, Berman JW (1993). Expression of CSF-1, c-fms, y MCP-1 in the central nervous system of rats with experimental allergic encephalomyelitis. J. Immunol. 150: 2525.
Humbert M, Ying S, Corrigan C, Menz G, Barkans J, Pfister R, Meng Q, Van Damme J, Opdenakker G, Durham SR, Kay AB (1997). Bronchial mucosal expression of the genes encoding chemokines RANTES y MCP-3 in symptomatic atopic y nonatopic asthmatics: relationship to the eosinophil-active cytokines interleukin (IL)-5, granulocyte macrophage-colony-stimulating factor, y IL-3. Am J Respir Cell Mol Biol 16: 1.
Ihm CG, Park JK, Hong SP, Lee TW, Cho BS, Kim MJ, Cha DR, Ha H (1998). A high glucose concentration stimulates the expression of monocyte chemotactic peptide 1 in human mesangial cells. Nephron 79: 33.
Iyonaga K, Takeya M, Saita N, Sakamoto O, Yoshimura T, Ando M, Takahashi K (1994). Monocyte chemoattractant protein-1 in idiopathic pulmonary fibrosis and other interstitial lung diseases. Hum. Pathol. 25: 455.
Johrer K, Zelle-Rieser C, Perathoner A, Moser P, Hager M, Ramoner R, Gander H, Holtl L, Bartsch G, Greil R, Thurnher M (2005). Up-regulation of functional chemokine receptor CCR3 in human renal cell carcinoma. Clin Cancer Res 11: 2459.
Jolicoeur C, Lemay A, Akoum A (2001). Comparative effect of danazol and a GnRH agonist on monocyte chemotactic protein-1 expression by endometriotic cells. Am. J. Reprod. Immunol. 45: 86.
Jose PJ, Griffiths-Johnson DA, Collins PD, Walsh DT, Moqbel R, Totty NF, Truong O, Hsuan JJ, Williams TJ. Eotaxina: a potent eosinophil chemoattractant cytokine detected in a guinea pig model of allergic airways inflammation. J. Exp. Med. 179: 881.
Kaburagi Y, Shimada Y, Nagaoka T, Hasegawa M, Takehara K, Sato S (2001). Enhanced production of CCchemokines (RANTES, MCP-1, MIP-1a, MIP-1f, y eotaxina) in patients with atopic dermatitis. Arch. Dermatol. Res.
293: 350.
Kawasaki AM et al. (1993). J Med Chem 36: 831.
Kennedy KJ, Strieter RM, Kunkel SL, Lukacs NW, Karpus WJ (1998). Acute and relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis are regulated by differential expression of the CC chemokines macrophage inflammatory protein1e y monocyte chemotactic protein-1. J. Neuroimmunol. 91: 98.
Kim JS, Gautam SC, Chopp M, Zaloga C, Jones ML, Ward PA, Welch KM (1995). Expression of monocyte chemoattractant protein-1 and macrophage inflammatory protein-1 after focal cerebral ischemia in the rat. J. Neuroimmunol. 56: 127.
Kitamoto S, Egashira K (2003). Anti-monocyte chemoattractant protein-1 gene therapy for cardiovascular diseases. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 1: 393.
Kleinhans M, Tun-Kyi A, Gilliet M, Kadin ME, Dummer R, Burg G, y Nestle FO (2003). Functional expression of the eotaxin receptor CCR3 in CD30+ cutaneous T-cell lymphoma. Blood 101: 1487.
Koch AE, Kunkel SL, Harlow LA, Johnson B, Evanoff HL, Haines GK, Burdick MD, Pope RM, Strieter RM (1992). Enhanced production of monocyte chemoattractant protein-1 in rheumatoid arthritis. J. Clin. Invest. 90: 772.
Kouno J, Nagai H, Nagahata T, Onda M, Yamaguchi H, Adachi K, Takahashi H, Teramoto A, y Emi M (2004). Upregulation of CC chemokine, CCL3L1, and receptors, CCR3, CCR5 in human glioblastoma that promotes cell growth. J Neurooncol 70: 301.
Kurihara T, Warr G, Loy J, Bravo R (1997). Defects in macrophage recruitment and host defense in mice lacking the CCR2 chemokine receptor. J. Exp. Med. 186: 1757.
Kusser W (2000). J Biotechnol 74: 27-38.
Kuziel WA, Morgan SJ, Dawson TC, Griffin S, Smithies O, Ley K, Maeda N (1997). Severe reduction in leukocyte adhesion y monocyte extravasation in mice deficient in CC chemokine receptor 2. Proc. Natl Acad. Sci. U S A 94: 12053.
Lesnik EA et al. (1993). Biochemistry 32: 7832.
Lloyd CM, Minto AW, Dorf ME, Proudfoot A, Wells TNC, Salant DJ, Gutierrez-Ramos JC (1997). RANTES y monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) play an important role in the inflammatory phase of crescentic nephritis, but only MCP-1 is involved in crescent formation and interstitial fibrosis. J. Exp. Med. 185: 1371.
Lu BB, Rutledge BJ, Gu L, Fiorillo J, Lukacs NW, Kunkel SL, North R, Gerard C, Rollins BJ (1998). Abnormalities in monocyte recruitment and cytokine expression in monocyte chemoattractant protein-1 deficient mice. J. Exp. Med.
187: 601.
Lubkowski J, Bujacz G, Boque L, Domaille PJ, Handel TM, Wlodawer A (1997). The structure of MCP-1 in two crystal forms provides a rare example of variable quaternary interactions. Nat Struct Biol 4: 64.
Mack M, Cihak J, Simonis C, Luckow B, Proudfoot AE, Plachy J, Bruhl H, Frink M, Anders HJ, Vielhauer V, Pfirstinger J, Stangassinger M, Schlöndorff D (2001). Expression and characterization of the chemokine receptors CCR2 y CCR5 in mice. J. Immunol. 166: 4697.
Martinelli R, Sabroe I, LaRosa G, Williams TJ, Pease JE. The CC chemokine eotaxin (CCL11) is a partial agonist of CC chemokine receptor 2b. J Biol Chem 276: 42957.
Matsushima K, Morishita K, Yoshimura T, Lavu S, Kobayashi Y, Lew W, Appella E, Kung HF, Leonard EJ, Oppenheim JJ (1989). Molecular cloning of a human monocyte-derived neutrophil chemotactic factor (MDNCF) and the induction of MDNCF mRNA by interleukin 1 and tumor necrosis factor. J. Exp. Med. 167: 1883.
McGinnis S, Madden TL (2004). BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Ácidos nucleicos Res. 32(Web Server issue): W20-5.
Meyer TW (2003). Immunosuppression for diabetic glomerular disease? Kidney Int. 63: 377.
Miller MD, Krangel MS (1992). Biology and biochemistry of the chemokines: a family of chemotactic and inflammatory cytokines. Crit. Rev. Immunol. 12: 17.
Miller LE et al. (1993). J Physiol 469: 213.
Mora C, Navarro JF (2005). The role of inflammation as a pathogenic factor in the development of renal disease in diabetes. Curr. Diab. Rep. 5: 399.
Morii T, Fujita H, Narita T, Shimotomai T, Fujishima H, Yoshioka N, Imai H, Kakei M, Ito S (2003). Association of monocyte chemoattractant protein-1 with renal tubular damage in diabetic nephropathy. J. Diabetes Complications
17:1.
Murphy PM, Baggiolini M, Charo IF, Hebert CA, Horuk R, Matsushima K, Miller LH, Oppenheim JJ, Power CA (2000). International union of pharmacology. XXII. Nomenclature for chemokine receptors. Pharmacol. Rev. 52: 145.
Nakamura H, Weiss ST, Israel E, Luster AD, Drazen JM, Lilly CM (1999). Eotaxin and impaired lung function in asthma. Am J Respir Crit Care Med 160: 1952.
Nakazawa T, Hisatomi T, Nakazawa C, Noda K, Maruyama K, She H, Matsubara A, Miyahara S, Nakao S, Yin Y, Benowitz L, Hafezi-Moghadam A, Miller JW (2007). Monocyte chemoattractant protein 1 mediated retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proc Natl. Acad. Sci. USA 104: 2425.
Navarro JF, Mora C, Maca M, Garca J (2003). Inflammatory parameters are independently associated with urinary albumin in type 2 diabetes mellitus. Am. J. Kidney Dis. 42: 53.
Myers SJ, Wong LM, Charo IF (1995). Signal transduction and ligand specificity of the human monocyte chemoattractant protein-1 receptor in transfected embryonic kidney cells. J. Biol. Chem. 270: 5786.
Needleman & Wunsch (1970), A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteínas. J Mol Biol. 48 (3): 443-53.
Nelken NA, Coughlin SR, Gordon D, Wilcox JN (1991). Monocyte chemoattractant protein-1 in human atheromatous plaques. J. Clin. Invest. 88: 1121.
Neote K, DiGregorio D, Mak JY, Horuk R, Schall TJ (1993). Molecular cloning, functional expression, and signaling characteristics of a C-C chemokine receptor. Cell 72: 415.
Ninichuk V, Gross O, Reichel C, Khandoga A, Pawar RD, Ciubar R, Segerer S, Belemezova E, Radomska E, Luckow B, de Lema GP, Murphy PM, Gao JL, Henger A, Kretzler M, Horuk R, Weber M, Krombach F, Schlondorff D, Anders HJ (2005). Delayed chemokine receptor 1 blockade prolongs survival in collagen 4A3-deficient mice with Alport disease. J. Am. Soc. Nephrol. 16: 977.
Ogata H, Takeya M, Yoshimura T, Takagi K, Takahashi K (1997). The role of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in the pathogenesis of collagen-induced arthritis in rats. J. Pathol. 182: 106.
Okuno T, Andoh A, Bamba S, Araki Y, Fujiyama Y, Fujiyama M, Bamba T (2002). Interleukin-1f and tumor necrosis factor-a induce chemokine and matrix metalloproteínaase gene expression in human colonic subepithelial myofibroblasts. Scand. J. Gastroenterol. 37: 317.
Oppenheim JJ, Zachariae CO, Mukaida N, Matsushima K (1991). Properties of the novel proinflammatory supergene "intercrine" cytokine family. Annu. Rev. Immunol. 9: 617.
Pawar RD, Patole PS, Zecher D, Segerer S, Kretzler M, Schlöndorff D, Anders HJ (2006). Toll-like receptor-7 modulates immune complex glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol. 17: 141.
Pearson & Lipman (1988), Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444.
Perez de Lema G, Maier H, Franz TJ, Escribese M, Chilla mS, Segerer S, Camarasa N, Schmid H, Banas B, Kalaydjiev S, Busch DH, Pfeffer K, Mampaso F, Schlöndorff D, Luckow B (2005). Chemokine receptor CCR2 deficiency reduces renal disease and prolongs survival in MRL/lpr lupus-prone mice. J. Am. Soc. Nephrol. 16: 3592.
Perez de Lema G, Maier H, Nieto E, Vielhauer V, Luckow B, Mampaso F, Schlöndorff D. Chemokine expression precedes inflammatory cell infiltration and chemokine receptor and cytokine expression during the initiation of murine lupus nephritis. J. Am. Soc. Nephrol. 12: 1369.
Ponath PD, Qin S, Ringler DJ, Clark-Lewis I, Wang J, Kassam N, Smith H, Shi X, Gonzalo JA, Newman W, Gutierrez-Ramos JC, Mackay CR (1996a). Cloning of the human eosinophil chemoattractant, eotaxin. Expression, receptor binding, and functional properties suggest a mechanism for the selective recruitment of eosinophils. J. Clin. Invest. 97: 604.
Ponath PD, Qin S, Post TW, Wang J, Wu L, Gerard NP, Newman W, Gerard C, Mackay CR (1996b). Molecular cloning and characterization of a eotaxin human receptor expressed selectively on eosinophils. J. Exp. Med. 183: 2437.
Power CA, Meyer A, Nemeth K, Bacon KB, Hoogewerf AJ, Proudfoot AE, Wells TN (1995). Molecular cloning and functional expression of a novel CC chemokine receptor cDNA from a human basophilic cell line. J. Biol. Chem. 270: 19495.
Qi Z, Whitt I, Mehta A, Jin J, Zhao M, Harris RC, Fogo AB, Breyer MD (2004). Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286: F590.
Qin S, LaRosa G, Campbell JJ, Smith-Heath H, Kassam N, Shi X, Zeng L, Buthcher EC, Mackay CR (1996). Expression of monocyte chemoattractant protein-1 y interleukin-8 receptors on subsets of T cells: correlation with transendothelial chemotactic potential. Eur. J. Immunol. 26: 640.
Ransohoff RM et al. (1993). FASEB J 7: 592.
Raport CJ, Gosling J, Schweickart VL, Gray PW, Charo IF (1996). Molecular cloning and functional characterization of a novel human CC chemokine receptor (CCR5) for RANTES, MIP-1f, and MIP-1a. J. Biol. Chem. 271: 17161.
Ritz E, Rychlik I, Locatelli F, Halimi S (1999). End-stage renal failure in type 2 diabetes: A medical catastrophe of worldwide dimensions. Am. J. Kidney Dis. 34: 795-808.
Rollins BJ, Stier P, Ernst T, Wong GG (1989). The human homolog of the JE gene encodes a monocyte secretory protein. Mol. Cell Biol. 9: 4687.
Rollins BJ (1996). Monocyte chemoattractant protein 1: a potential regulator of monocyte recruitment in inflammatory disease. Mol. Med. Today 2: 198.
Rovin BH, Rumancik M, Tan L, Dickerson J (1994). Glomerular expression of monocyte chemoattractant protein-1 in experimental y human glomerulonephritis. Lab. Invest. 71: 536.
Ruffing N, Sullivan N, et al. (1998). CCR5 has an expanded ligand-binding repertoire and is the primary receptor used by MCP-2 on activated T cells. Cell Immunol 189: 160.
Salcedo R, Ponce ML, Young HA, Wasserman K, Ward JM, Keinman HK, Oppenheim JJ, Murphy WJ (2000). Human endothelial cells express CCR2 and respond to MCP-1: direct role of MCP-1 in angiogenesis and tumor progression. Blood 96: 34.
Samson M, Labbe O, Mollereau C, Vassart G, Parmentier M (1996). Molecular cloning and functional expression of a new human CC-chemokine receptor gene. Biochemistry 35: 3362.
Schneider A, Panzer U, Zahner G, Wenzel U, Wolf G, Thaiss F, Helmchen U, Stahl RA (1999). Monocyte chemoattractant protein-1 mediates collagen deposition in experimental glomerulonephritis by transforming growth factor-beta. Kidney Int. 56: 135.
Schwarting A, Paul K, Tschirner S, Menke J, Hansen T, Brenner W, Kelly VR, Relle M, Galle PR (2005). Interferonbeta: a therapeutic for autoimmune lupus in MRL-Faslpr mice. J. Am. Soc. Nephrol. 16: 3264.
Schwartz CJ, Valente AJ, Sprague EA (1993). A modern view of atherogenesis. Am. J. Cardiol. 71: 9B.
Segerer S, Nelson PJ, Schlöndorff D (2000). Chemokines, chemokine receptors, y renal disease: from basic science to pathophysiologic and therapeutic studies. J. Am. Soc. Nephrol. 11: 152.
Shimizu S, Nakashima H, Masutani K, Inoue Y, Miyake K, Akahoshi M, Tanaka Y, Egashira K, Hirakata H, Otsuka T, Harada M (2004). Anti-monocyte chemoattractant protein-1 gene therapy attenuates nephritis in MRL/lpr mice. Rheumatology (Oxford) 43: 1121.
Smith & Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2: 482.
Springer TA (1995). Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Annu. Rev.Physiol. 57: 827.
Steinman L (2004). Immune therapy for autoimmune diseases. Science 305: 212.
Svensson M, Sundkvist G, Arnqvist HJ, Bjork E, Blohme G, Bolinder J, Henricsson M, Nystrom L, Torffvit O, Waernbaum I, Ostman J, Eriksson JW (2003). Signs of nephropathy may occur early in young adults with diabetes despite modern diabetes management: Results from the nationwide population-based Diabetes Incidence Study in Sweden (DISS). Diabetes Care 26: 2903.
Takebayashi K, Matsumoto S, Aso Y, Inukai T (2006). Association between circulating monocyte chemoattractant protein-1 and urinary albumin excretion in nonobese Tipo 2 diabetic patients. J. Diabetes Complications 20: 98.
Takeya M, Yoshimura T, Leonard EJ, Takahashi K (1993). Detection of monocyte chemoattractant protein-1 in human atherosclerotic lesions by an anti-monocyte chemoattractant protein-1 monoclonal antibody. Hum. Pathol. 24:
534.
Tang WW, Qi M, Warren JS (1996). Monocyte chemoattractant protein 1 mediates glomerular macrophage infiltration
in anti-GBM Ab GN. Kidney Int. 50: 665.
Tashiro K, Koyanagi I, Saitoh A, Shimizu A, Shike T, Ishiguro C, Koizumi M, Funabiki K, Horikoshi S, Shirato I, Tomino Y (2002). Urinary levels of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and interleukin-8 (IL-8), y renal injuries in patients with type 2 diabetic nephropathy. J. Clin. Lab. Anal.16: 1.
Tesch GH, Maifert S, Schwarting A, Rollins BJ, Kelley VR (1999). Monocyte chemoattractant protein 1-dependent leukocytic infiltrates are responsible for autoimmune disease in MRL-Fas(lpr) mice. J. Exp. Med. 190: 1813.
Tuaillon N, Shen de F, Berger RB, Lu B, Rollins BJ, Chan CC (2002). MCP-1 expression in endotoxin-induced uveitis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43: 1493.
Tuttle KR (2005). Linking metabolism y immunology: diabetic nephropathy is an inflammatory disease. J. Am. Soc. Nephrol. 16: 1537.
Uguccioni M, Mackay CR et al. (1997). High expression of the chemokine receptor CCR3 in human blood basophils. Role in activation by eotaxin, MCP-4, y other chemokines. J Clin Invest 100: 1137.
United States Renal Data System (2004). Annual data report: Incidence and prevalence 2004. Am. J. Kidney Dis. 45: S77.
Utimura R, Fujihara CK, Mattar AL, Malheiros DM, Noronha IL, Zatz R (2003). Mycophenolate mofetil prevents the development of glomerular injury in experimental diabetes. Kidney Int. 63: 209.
Van Riper G, Siciliano S, Fischer PA, Meurer R, Springer MS, Rosen H (1993). Characterization and species distribution of high affinity GTP-coupled receptors for human rantes y monocyte chemoattractant protein 1. J. Exp. Med. 177: 851.
Venkatesan N et al. (2003). Curr Med Chem 10: 1973.
Vestergaard C, Just H, Baumgartner Nielsen J, Thestrup-Pedersen K, Deleuran M (2004). Expression of CCR2 on monocytes y macrophages in chronically inflamed skin in atopic dermatitis and psoriasis. Acta Derm. Venereol. 84:
353.
Viedt C, Orth SR (2002). Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in the kidney: does it more than simply attract monocytes? Nephrol. Dial. Transplant. 17: 2043.
Wada T, Furuichi K, Segada-Takaeda C, Ahimizu M, Sakai N, Takeda SI, Takasawa K, Kida H, Kobayashi KI, Mukaida N, Ohmoto Y, Matsushima K, Yokoyama H (1999). MIP-1a y MCP-1 contribute to crescents y interstitial lesions in human crescentic glomerulonephritis. Kidney Int. 56: 995.
Wada T, Yokoyama H, Matsushima K, Kobayashi KI (2001). Chemokines in renal diseases. Int. Immunopharmacol.
1: 637.
Wada T, Yokoyama H, Furuichi K, Kobayashi KI, Harada K, Naruto M, Su SB, Akiyama M, Mukaida N, Matsushima K (1996). Intervention of crescentic glomerulonephritis by antibodies to monocyte chemotactic and activating factor (MCAF/MCP-1). FASEB J. 10: 1418.
Wang X, Yue TL, Barone FC, Feuerstein GZ (1995). Monocyte chemoattractant protein-1 messenger ARN expression in rat ischemic cortex. Stroke 26: 661.
Wenzel U, Schneider A, Valente AJ, Abboud HE, Thaiss F, Helmchen UM, Stahl RA (1997). Monocyte chemoattractant protein-1 mediates monocyte/macrophage influx in anti-thymocyte antibody-induced glomerulonephritis. Kidney Int. 51: 770.
Yamagishi S, Inagaki Y, Okamoto T, Amano S, Koga K, Takeuchi M, Makita Z (2002). Advanced glycation end product-induced apoptosis y overexpression of vascular endothelial growth factor and monocyte chemoattractant protein-1 in human-cultured mesangial cells. J. Biol. Chem. 277: 20309.
Ying S, Robinson DS, Meng Q, Rottman J, Kennedy R, Ringler DJ, Mackay CR, Daugherty BL, Springer MS, Durham SR, Williams TJ, Kay AB (1997). Enhanced expression of eotaxin y CCR3 mRNA y proteína in atopic asthma. Association with airway hyperresponsiveness y predominant co-localization of eotaxin mRNA to bronchial epithelial and endothelial cells. Eur J Immunol 27: 3507.
Ying S, Meng Q, Zeibecoglou K, Robinson DS, Macfarlane A, Humbert M, Kay AB (1999). Eosinophil chemotactic chemokines (eotaxin, eotaxin-2, RANTES, monocyte chemoattractant protein-3 (MCP-3), y MCP-4), y C-C chemokine receptor 3 expression in bronchial biopsies from atopic and nonatopic (Intrinsic) asthmatics. J Immunol
163: 6321.
Yla-Herttuala S, Lipton BA, Rosenfeld ME, Sarkioja T, Yoshimura T, Leonard EJ, Witztum JL, Steinberg D (1991). Expression of monocyte chemoattractant protein 1 in macrophage-rich areas of human and rabbit atherosclerotic lesions. Proc. Natl Acad. Sci. U S A 88: 5252.
Yoshimura T, Robinson EA, Tanaka S, Appella E, Leonard EJ (1989). Purification and amino acid analysis of two 5 human monocyte chemoattractants produced by phytohemagglutinin-stimulated human blood mononuclear leukocytes. J. Immunol. 142: 1956.
Yozai K, Shikata K, Sasaki M, Tone A, Ohga S, Usui H, Okada S, Wada J, Nagase R, Ogawa D, Shikata Y, Makino H (2005). Methotrexate prevents renal injury in experimental diabetic rats via anti-inflammatory actions. J. Am. Soc. Nephrol. 16: 3326.
10 Zimmet P, Alberti KG, Shaw J (2001). Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature 414: 782.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> NOXXON Pharma AG
<120> Acidos nucleicos de unión a MCP-1
<130> N 10056 PCT-EP/A 5 <150> EP 06 002 935.2
<151>
<150> EP 06 024 202.1
<151>
<160> 285 10 <170> PatentIn versión 3.1
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47
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<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 15
agcgugcccg gugugguagg ggggcgcgau cuacaauugc acgcu
45
<210> 16 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 16
agcgugcccg gugugacagg ggggcgcgac cugcauuugc acgcu
45
<210> 17 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 17
agcgugcccg guguggcagg ggggcgcgac cuguauuugc acgcu
45
<210> 18 <211> 47 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(47) <223> sintético
<400> 18
agcgugcccg gaguggcagg ggggcgcgac cugcaauaau gcacgcu
47
<210> 19 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220>
<221> L-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético <400> 19
agcgugcccg guguggcagg ggggcgcgac cugcaauugc acgcu
45
<210> 20 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 20
agcaugcccg guguggcagg ggggcgcgac cugcauuugc augcu
45
<210> 21 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 21
agcgugcccg gugugguagg ggggcgcgac cuacauuugc acgcu
45
<210> 22 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 22
agugugccag cugugauggg ggggcgcgac ccauuuuaca cacu
44
<210> 23 <211> 43 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(43)
<223> sintético
<400> 23
agugugccag cgugaugggg gggcgcgacc cauuuuacac acu
43
<210> 24 <211> 43 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(43) <223> sintético
<400> 24
agugugcgag cgugaugggg gggcgcgacc cauuuuacau acu
43
<210> 25 <211> 43 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(43) <223> sintético
<400> 25
agugugccag cgugaugggg gggcgcgacc cauuuuacau acu
43
<210> 26 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 26
aguaugccag cgugaugggg gggcgcgacc cauuuacaua cu
42
<210> 27 <211> 43 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(43) <223> sintético
<400> 27
agugugccag ugugaugggg gggcgcgacc cauuuuacac acu
43
<210> 28 <211> 43 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(43) <223> sintético
<400> 28
agcgugccag ugugaugggg gggcgcgacc cauuuuacac gcu
43
<210> 29 <211> 43 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(43) <223> sintético
<400> 29
acgcacgucc cucaccggug caagugaagc cgcggcucug cgu
43
<210> 30 <211> 43 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(43) <223> sintético
<400> 30
acgcaccucc cucaccggug caagugaagc cguggcucug cgc
43
<210> 31 <211> 43 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(43) <223> sintético
<400> 31
acgcacgucc cucaccggug caagugaagc cguggcucug cgu
43
<210> 32 <211> 41 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(41) <223> sintético
<400> 32
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg u
41
<210> 33 <211> 41 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(41) <223> sintético
<400> 33
acgcacgucc cucaccggug caagugaagc cguggcucug c
41
<210> 34 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 34
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugc
39
<210> 35 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 35
cgcacguccc ucaccggugc aagugaagcc guggcucugc gu
42
<210> 36 <211> 41 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(41) <223> sintético
<400> 36
cgcacguccc ucaccggugc aagugaagcc guggcucugc g
41
<210> 37 <211> 40 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(40) <223> sintético
<400> 37
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg
40
<210> 38 <211> 49 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(49) <223> sintético
<400> 38
gugcugcgua guggaagacu accuaaugac agccgaaugc uggcagcac
49
<210> 39 <211> 49 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(49) <223> sintético
<400> 39
gugcugcgua guggaagacu accuaaugac agccuaaugc uggcagcac
49
<210> 40 <211> 49
<212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(49) <223> sintético
<400> 40
gugcugcgua guggaagacu accuuaugac agccgaaugc uggcagcac
49
<210> 41 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 41
gugcugcgua gugaaaaacu acugccagug ggucagagcu agcagcac
48
<210> 42 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 42
gugcugcgga guuaaaaacu cccuaagaca ggccagagcc ggcagcac
48
<210> 43 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 43
gugcugcgga guugaaaacu cccuaagaca ggccagagcc ggcagcac
48
<210> 44 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 44
gugcugcgua guggaagacu accuaugaca gccuaaugcu ggcagcac
48
<210> 45 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 45
gugcugcgga guuaaaaacu cccuaagaca ggcuagagcc ggcagcac
48
<210> 46 <211> 50 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<400> 46
gugcugcggc gugaaaaacg cccugcgacu gcccuuuaug caggcagcac
50
<210> 47 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 47
gugcugcgua gugaaaaacu accaacgacu ggcuagagcc ggcagcac
48
<210> 48 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 48
gugcugcgua gugaaagacu accugugaca gccgaaugcu ggcagcac
48
<210> 49 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 49
guacugcgua guuaaaaacu accaacgacu ggcuagagcc ggcagcac
48
<210> 50 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 50
gugcugcgua guuaaaaacu accaacgacu ggcuagagcc ggcagcac
48
<210> 51 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 51
gugcugcgua guuaaaaacu accagcgaca ggcuagagcc ggcagcac
48
<210> 52 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN
<222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 52
gugcugcgua guuaaaaacu accagcgacu ggcuagagcc ggcagcac
48
<210> 53 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 53
gugcugcgua gugagaaacu accaacgacu ggcuagagcc ggcagcac
48
<210> 54 <211> 46 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(46) <223> sintético
<400> 54
ggcugcguag uuaaaaacua ccagcgacug gcuagagccg gcagcc
46
<210> 55 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 55
ggcgcguagu uaaaaacuac cagcgacugg cuagagccgg cgcc
44
<210> 56 <211> 46 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(46) <223> sintético
<400> 56
gugcgcguag uuaaaaacua ccagcgacug gcuagagccg gcgcac
46
<210> 57 <211> 46 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(46) <223> sintético <400> 57
gugcgcguag ugagaaacua ccaacgacug gcuagagccg gcgcac
46
<210> 58 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 58
gugccguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg gcac
44
<210> 59 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 59
guggcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg ccac
44
<210> 60 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 60
gucgcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cgac
44
<210> 61 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 61
ugcgcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cgca
44
<210> 62 <211> 44 <212> ARN <213> secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 62
gcugcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cagc
44
<210> 63 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 63
gcugcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cagc
44
<210> 64 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 64
ggugcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cacc
44
<210> 65 <211> 42
<212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 65
uggcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc ca
42
<210> 66 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 66
gcgcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc gc
42
<210> 67 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 67
gugcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc ac
42
<210> 68 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 68
gggcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc cc
42
<210> 69 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 69
gagcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc uc
42
<210> 70 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 70
cggcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc cg
42
<210> 71 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 71
ccgcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc gg
42
<210> 72 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético1
<400> 72
cagcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc ug
42
<210> 73 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 73
cugcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc ag
42
<210> 74 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 74
agcguguuag ugaagugggu ggcagguaaa ggacacgcu
39
<210> 75 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 75
agcgugguag cggugugggu gguagguaaa ggccacgcu
39
<210> 76 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 76
agcgugauag aagagcgggu gguagguaaa ggucaggcu
39
<210> 77 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN
<222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 77
agcguguuag guaggguggu aguaaguaaa ggacacgcu
39
<210> 78 <211> 38 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(38) <223> sintético
<400> 78
agcguguuag guggguggua guaaguaaag gacacgcu
38
<210> 79 <211> 38 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(38) <223> sintético
<400> 79
agcguguuag guggguggua guaaguaaag ggcacgcu
38
<210> 80 <211> 34 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(34) <223> sintético
<400> 80
ccgcuuaggu gggugguagu aaguaaaggg gcgg
34
<210> 81 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 81
gcgcgagcag guggguggua gaauguaaag acucgcguc
39
<210> 82 <211> 34 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(34) <223> sintético
<400> 82
cguguuaggu gggugguagu aaguaaagga cacg
34
<210> 83 <211> 32 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(32) <223> sintético
<400> 83
guguuaggug ggugguagua aguaaaggac ac
32
<210> 84 <211> 34 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(34) <223> sintético
<400> 84
cguguuaggu gggugguagu aaguaaaggg cacg
34
<210> 85 <211> 32 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(32) <223> sintético
<400> 85
guguuaggug ggugguagua aguaaagggc ac
32
<210> 86 <211> 30 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(30) <223> sintético
<400> 86
uguuaggugg gugguaguaa guaaagggca
30
<210> 87 <211> 52 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(52) <223> sintético
<400> 87
ggacgagagu gacaaaugau auaaccuccu gacuaacgcu gcgggcgaca gg
52
<210> 88 <211> 52 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(52) <223> sintético
<400> 88
ggaccuaucg cuaagacaac gcgcagucua cgggacauuc uccgcggaca gg
52
<210> 89 <211> 52 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(52) <223> sintético
<400> 89
ggacaauugu uacccccgag agagacaaau gagacaaccu ccugaagaca gg
52
<210> 90 <211> 51 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(51) <223> sintético
<400> 90
ggacgaaagu gagaaaugau acaaccuccu guugcugcga auccggacag g
51
<210> 91 <211> 50 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<400> 91
ggacguaaaa gacgcuaccc gaaagaaugu caggagggua gaccgacagg
50
<210> 92 <211> 50 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<400> 92
ggacuagaaa cuacaauagc ggccaguugc accgcguuau caacgacagg
50
<210> 93 <211> 50 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<400> 93
ggacuaguca gccagugugu auaucggacg cggguuuauu uacugacagg
50
<210> 94 <211> 50
<212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<400> 94
ggacuguccg gagugugaaa cuccccgaga ccgccagaag cggggacagg
50
<210> 95 <211> 50 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<400> 95
ggacuucuau ccaggugggu gguaguaugu aaagagauag aagugacagg
50
<210> 96 <211> 50 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<400> 96
ggacgagagc gaacaaugau auaaccuccu gacggaaaga gaucgacagg
50
<210> 97 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 97
ccugugcuac acgcaguaag aagugaacgu ucaguaugug ugcacagg
48
<210> 98 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 98
cgugagccag gcaccgaggg cguuaacugg cugauuggac acgacacg
48
<210> 99 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 99
cgugaacaug caagcuaagc ggggcuguug guugcuuggc ccgccacg
48
<210> 100 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> -ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 100
cgugcagaga gagaccaacc acguaaaauc aaccuaaugg gccgcacg
48
<210> 101 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 101
cgugcagaga gagaccaacc acguaaaauc aaccuaaugg gccgcacg
48
<210> 102 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 102
cgugaacauu caagcuaagc ggggcuguug guugcuuggc ccgccacg
48
<210> 103 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 103
cgugccgagg cggcgaccag cguuacuuag agaggcuuug gcaccacg
48
<210> 104 <211> 47 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(47) <223> sintético
<400> 104
cgugauaaca gccgucgguc aagaaaacaa aguucgggcg gcgcacg
47
<210> 105 <211> 47 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(47) <223> sintético
<400> 105
cguggguggc gcaccgaggg cgaaaagcca ccaguaaaga uagaccg
47
<210> 106 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN
<222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 106
cgugugaucu ccuuuggggu gauuagcuua gagacuuccc acacg
45
<210> 107 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 107
gcaccuucgc cuaauacacg ugccggcuag cuaauacucg uccgc
45
<210> 108 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 108
gcacgacuug ggcgaccagu gauacuuaga gagcaagucg ucggc
45
<210> 109 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 109
gcgcgcgcuc aguaagaaau ugaaaguuca gaaugucguc gcgc
44
<210> 110 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 110
aguguguggc aggcuaagga gauauuccga gaccacgcu
39
<210> 111 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 111
aguguguggc agacuaugga uagacuccga gaccacgcu
39
<210> 112 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 112
agcgugaggc gaccagcgga uuacuuagag agucacgcu
39
<210> 113 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 113
agcgugaagg ggaccagcgu uacuuacaga guucacgcu
39
<210> 114 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 114
agcgugugau guauguagca ccguaucaga ggacacgcu
39
<210> 115 <211> 37 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(37) <223> sintético
<400> 115
agcgugaggc gacccguguu ucguagagag ucacgcu
37
<210> 116 <211> 40 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> NOX-E36-5'PEG
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(40) <223> sintético
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(1) <223> PEGilación en 5'
<400> 116
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg
40
<210> 117 <211> 40 <212> ARN <213> secuencia artificial
<220> <223> NOX-E36-3'PEG
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(40) <223> sintético
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(40) <223> PEGilación en 3'
<400> 117
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg
40
<210> 118 <211> 58 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(58) <223> sintético
<400> 118
gagauggcga cauugguugg gcaugaggcg aggcccuuug augaauccgc ggccauuc
58
<210> 119 <211> 56 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(56) <223> sintético
<400> 119
gauggcgaca uugguugggc augaggcgag gcccuuugau gaauccgcgg ccauuc
56
<210> 120 <211> 53 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(53) <223> sintético
<400> 120
ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca uuc
53
<210> 121 <211> 52 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(52) <223> sintético
<400> 121
ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca uu
52
<210> 122 <211> 50 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<400> 122
ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca
50
<210> 123 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 123
gcugguuacc gagggggcgu cguuggaguu ugguugguug ucaccagc
48
<210> 124 <211> 46 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(46) <223> sintético
<400> 124
cugguuaccg agggggcguc guuggaguuu gguugguugu caccag
46
<210> 125 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 125
ugguuaccga gggggcgucg uuggaguuug guugguuguc acca
44
<210> 126 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN
<222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 126
gccgguuacc gagggggcgu cguuggaguu ugguugguug ucaccggc
48
<210> 127 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 127
gccggcuacc gagggggcgu cguuggaguu ugguugguug ucgccggc
48
<210> 128 <211> 46 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(46) <223> sintético
<400> 128
gcgcguaccg agggggcguc guuggaguuu gguugguugu ccgcgc
46
<210> 129 <211> 46 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(46) <223> sintético
<400> 129
gggccuaccg agggggcguc guuggaguuu gguugguugu cggccc
46
<210> 130 <211> 76 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> D MCP-1 biotinilada humana
<220> <221> D-Proteína <222> (1)..(76) <223> sintético
<220>
<221> Biotinilación
<222> (1)..(1)
<223> sintético
<400> 130
<210> 131
<211> 76
<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> D MCP-1 de ratón biotinilada
<220>
<221> D-Proteína 15 <222> (1)..(76)
<223> sintético
<220>
<221> Biotinilación
<222> (1)..(1) 20 <223> sintético
<220>
<221> Biotinilación
<222> (76)..(76)
<223> sintético
25 <400> 131
<210> 132 <211> 47 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(47) <223> sintético
<400> 132
agcgugcccg gaguggcagg gggacgcgac cugcaauaau gcacgcu
47
<210> 133 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 133
agcgugcccg gaguggcagg gggacgcgac cugcaauugc acgcu
45
<210> 134 <211> 47 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<400> 134
agcgugcccg gaguggcagg gggacgcgac cuguaauaau gcacgcu
47
<210> 135 <211> 47 <212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(47) <223> sintético
<400> 135
agcgugcccg guguggcagg gggacgcgac cugcaauaau gcgcgcu
47
<210> 136 <211> 47 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(47) <223> sintético
<400> 136
agcgugcccg gaguagcagg ggggcgcgac cugcaauaau gcacgcu
47
<210> 137 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 137
agcgugcccg gugugguagg ggggcgcgau cuacaauugc acgcu
45
<210> 138 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 138
agcgugcccg gugugacagg ggggcgcgac cugcauuugc acgcu
45
<210> 139 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 139
agcgugcccg guguggcagg ggggcgcgac cuguauuugc acgcu
45
<210> 140 <211> 47 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(47) <223> sintético
<400> 140
agcgugcccg gaguggcagg ggggcgcgac cugcaauaau gcacgcu
47
<210> 141 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 141
agcgugcccg guguggcagg ggggcgcgac cugcaauugc acgcu
45
<210> 142 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 142
agcaugcccg guguggcagg ggggcgcgac cugcauuugc augcu
45
<210> 143 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 143
agcgugcccg gugugguagg ggggcgcgac cuacauuugc acgcu
45
<210> 144 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 144
agugugccag cugugauggg ggggcgcgac ccauuuuaca cacu
44
<210> 145 <211> 43 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(43) <223> sintético
<400> 145
agugugccag cgugaugggg gggcgcgacc cauuuuacac acu
43
<210> 146 <211> 43 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(43) <223> sintético
<400> 146
agugugcgag cgugaugggg gggcgcgacc cauuuuacau acu
43
<210> 147 <211> 43 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN
<222> (1)..(43) <223> sintético
<400> 147
agugugccag cgugaugggg gggcgcgacc cauuuuacau acu
43
<210> 148 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 148
aguaugccag cgugaugggg gggcgcgacc cauuuacaua cu
42
<210> 149 <211> 43 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(43) <223> sintético
<400> 149
agugugccag ugugaugggg gggcgcgacc cauuuuacac acu
43
<210> 150 <211> 43 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(43) <223> sintético
<400> 150
agcgugccag ugugaugggg gggcgcgacc cauuuuacac gcu
43
<210> 151 <211> 43 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(43) <223> sintético
<400> 151
acgcacgucc cucaccggug caagugaagc cgcggcucug cgu
43
<210> 152 <211> 43 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(43) <223> sintético
<400> 152
acgcaccucc cucaccggug caagugaagc cguggcucug cgc
43
<210> 153 <211> 43 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(43) <223> sintético
<400> 153
acgcacgucc cucaccggug caagugaagc cguggcucug cgu
43
<210> 154 <211> 41 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(41) <223> sintético
<400> 154
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg u
41
<210> 155 <211> 41 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(41) <223> sintético
<400> 155
acgcacgucc cucaccggug caagugaagc cguggcucug c
41
<210> 156 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 156
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugc
39
<210> 157 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 157
cgcacguccc ucaccggugc aagugaagcc guggcucugc gu
42
<210> 158 <211> 41 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(41) <223> sintético
<400> 158
cgcacguccc ucaccggugc aagugaagcc guggcucugc g
41
<210> 159 <211> 40 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(40) <223> sintético
<400> 159
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg
40
<210> 160 <211> 49 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(49) <223> sintético
<400> 160
gugcugcgua guggaagacu accuaaugac agccgaaugc uggcagcac
49
<210> 161 <211> 49 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(49) <223> sintético
<400> 161
gugcugcgua guggaagacu accuaaugac agccuaaugc uggcagcac
49
<210> 162 <211> 49 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(49) <223> sintético
<400> 162
gugcugcgua guggaagacu accuuaugac agccgaaugc uggcagcac
49
<210> 163 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 163
gugcugcgua gugaaaaacu acugccagug ggucagagcu agcagcac
48
<210> 164 <211> 48
<212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 164
gugcugcgga guuaaaaacu cccuaagaca ggccagagcc ggcagcac
48
<210> 165 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 165
gugcugcgga guugaaaacu cccuaagaca ggccagagcc ggcagcac
48
<210> 166 <211> 48 <212> ARN <213> secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 166
gugcugcgua guggaagacu accuaugaca gccuaaugcu ggcagcac
48
<210> 167 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 167
gugcugcgga guuaaaaacu cccuaagaca ggcuagagcc ggcagcac
48
<210> 168 <211> 50 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<400> 168
gugcugcggc gugaaaaacg cccugcgacu gcccuuuaug caggcagcac
50
<210> 169 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 169
gugcugcgua gugaaaaacu accaacgacu ggcuagagcc ggcagcac
48
<210> 170 <211> 48 <212> ARN <213> secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 170
gugcugcgua gugaaagacu accugugaca gccgaaugcu ggcagcac
48
<210> 171 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 171
guacugcgua guuaaaaacu accaacgacu ggcuagagcc ggcagcac
48
<210> 172 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 172
gugcugcgua guuaaaaacu accaacgacu ggcuagagcc ggcagcac
48
<210> 173 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 173
gugcugcgua guuaaaaacu accagcgaca ggcuagagcc ggcagcac
48
<210> 174 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 174
gugcugcgua guuaaaaacu accagcgacu ggcuagagcc ggcagcac
48
<210> 175 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 175
gugcugcgua gugagaaacu accaacgacu ggcuagagcc ggcagcac
48
<210> 176 <211> 46 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN
<222> (1)..(46) <223> sintético
<400> 176
ggcugcguag uuaaaaacua ccagcgacug gcuagagccg gcagcc
46
<210> 177 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 177
ggcgcguagu uaaaaacuac cagcgacugg cuagagccgg cgcc
44
<210> 178 <211> 46 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(46) <223> sintético
<400> 178
gugcgcguag uuaaaaacua ccagcgacug gcuagagccg gcgcac
46
<210> 179 <211> 46 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(46) <223> sintético
<400> 179
gugcgcguag ugagaaacua ccaacgacug gcuagagccg gcgcac
46
<210> 180 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 180
gugccguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg gcac
44
<210> 181 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 181
guggcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg ccac
44
<210> 182 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 182
gucgcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cgac
44
<210> 183 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 183
ugcgcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cgca
44
<210> 184 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 184
gcugcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cagc
44
<210> 185 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 185
gcugcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cagc
44
<210> 186 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 186
ggugcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cacc
44
<210> 187 <211> 40 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(40) <223> sintético
<400> 187
uggcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc
40
<210> 188 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 188
gcgcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc gc
42
<210> 189 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 189
gugcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc ac
42
<210> 190 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 190
gggcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc cc
42
<210> 191 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 191
gagcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc uc
42
<210> 192 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 192
cggcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc cg
42
<210> 193 <211> 42
<212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 193
ccgcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc gg
42
<210> 194 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 194
cagcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc ug
42
<210> 195 <211> 42 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(42) <223> sintético
<400> 195
cugcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc ag
42
<210> 196 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 196
agcguguuag ugaagugggu ggcagguaaa ggacacgcu
39
<210> 197 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 197
agcgugguag cggugugggu gguagguaaa ggccacgcu
39
<210> 198 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 198
agcgugauag aagagcgggu gguagguaaa ggucaggcu
39
<210> 199 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 199
agcguguuag guaggguggu aguaaguaaa ggacacgcu
39
<210> 200 <211> 38 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(38) <223> sintético
<400> 200
agcguguuag guggguggua guaaguaaag gacacgcu
38
<210> 201 <211> 38 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(38) <223> sintético
<400> 201
agcguguuag guggguggua guaaguaaag ggcacgcu
38
<210> 202 <211> 34 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(34) <223> sintético
<400> 202
ccgcuuaggu gggugguagu aaguaaaggg gcgg
34
<210> 203 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 203
gcgcgagcag guggguggua gaauguaaag acucgcguc
39
<210> 204 <211> 34 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(34) <223> sintético
<400> 204
cguguuaggu gggugguagu aaguaaagga cacg
34
<210> 205 <211> 32 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN
<222> (1)..(32) <223> sintético
<400> 205
guguuaggug ggugguagua aguaaaggac ac
32
<210> 206 <211> 34 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(34) <223> sintético
<400> 206
cguguuaggu gggugguagu aaguaaaggg cacg
34
<210> 207 <211> 32 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(32) <223> sintético
<400> 207
guguuaggug ggugguagua aguaaagggc ac
32
<210> 208 <211> 30 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(30) <223> sintético
<400> 208
uguuaggugg gugguaguaa guaaagggca
30
<210> 209 <211> 52 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(52) <223> sintético
<400> 209
ggacgagagu gacaaaugau auaaccuccu gacuaacgcu gcgggcgaca gg
52
<210> 210 <211> 52 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(52) <223> sintético
<400> 210
ggaccuaucg cuaagacaac gcgcagucua cgggacauuc uccgcggaca gg
52
<210> 211 <211> 52 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(52) <223> sintético
<400> 211
ggacaauugu uacccccgag agagacaaau gagacaaccu ccugaagaca gg
52
<210> 212 <211> 51 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(51) <223> sintético
<400> 212
ggacgaaagu gagaaaugau acaaccuccu guugcugcga auccggacag g
51
<210> 213 <211> 50 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<400> 213
ggacguaaaa gacgcuaccc gaaagaaugu caggagggua gaccgacagg
50
<210> 214 <211> 50 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<400> 214
ggacuagaaa cuacaauagc ggccaguugc accgcguuau caacgacagg
50
<210> 215 <211> 50 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<400> 215
ggacuaguca gccagugugu auaucggacg cggguuuauu uacugacagg
50
<210> 216 <211> 50 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<400> 216
ggacuguccg gagugugaaa cuccccgaga ccgccagaag cggggacagg
50
<210> 217 <211> 50 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<400> 217
ggacuucuau ccaggugggu gguaguaugu aaagagauag aagugacagg
50
<210> 218 <211> 50 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<400> 218
ggacgagagc gaacaaugau auaaccuccu gacggaaaga gaucgacagg
50
<210> 219 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 219
ccugugcuac acgcaguaag aagugaacgu ucaguaugug ugcacagg
48
<210> 220 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 220
cgugagccag gcaccgaggg cguuaacugg cugauuggac acgacacg
48
<210> 221 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 221
cgugaacaug caagcuaagc ggggcuguug guugcuuggc ccgccacg
48
<210> 222 <211> 48
<212> ARN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Producto de unión a MCP-1
<220>
<221> D-ARN
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 222
cgugcagaga gagaccaacc acguaaaauc aaccuaaugg gccgcacg
48
<210> 223 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 223
cgugcagaga gagaccaacc acguaaaauc aaccuaaugg gccgcacg
48
<210> 224 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 224
cgugaacauu caagcuaagc ggggcuguug guugcuuggc ccgccacg
48
<210> 225 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 225
cgugccgagg cggcgaccag cguuacuuag agaggcuuug gcaccacg
48
<210> 226 <211> 47 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(47) <223> sintético
<400> 226
cgugauaaca gccgucgguc aagaaaacaa aguucgggcg gcgcacg
47
<210> 227 <211> 47 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(47) <223> sintético
<400> 227
cguggguggc gcaccgaggg cgaaaagcca ccaguaaaga uagaccg
47
<210> 228 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 228
cgugugaucu ccuuuggggu gauuagcuua gagacuuccc acacg
45
<210> 229 <211> 45 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 229
gcaccuucgc cuaauacacg ugccggcuag cuaauacucg uccgc
45
<210> 230 <211> 45
<212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(45) <223> sintético
<400> 230
gcacgacuug ggcgaccagu gauacuuaga gagcaagucg ucggc
45
<210> 231 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 231
gcgcgcgcuc aguaagaaau ugaaaguuca gaaugucguc gcgc
44
<210> 232 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 232
aguguguggc aggcuaagga gauauuccga gaccacgcu
39
<210> 233 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 233
aguguguggc agacuaugga uagacuccga gaccacgcu
39
<210> 234 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 234
agcgugaggc gaccagcgga uuacuuagag agucacgcu
39
<210> 235 <211> 39 <212> ARN <213> secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 235
agcgugaagg ggaccagcgu uacuuacaga guucacgcu
39
<210> 236 <211> 39 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(39) <223> sintético
<400> 236
agcgugugau guauguagca ccguaucaga ggacacgcu
39
<210> 237 <211> 37 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(37) <223> sintético
<400> 237
agcgugaggc gacccguguu ucguagagag ucacgcu
37
<210> 238 <211> 40 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(40) <223> sintético
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(40) <223> PEGilación en 5´
<400> 238
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg
40
<210> 239 <211> 40 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(40) <223> sintético
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(40) <223> PEGilación en 3'
<400> 239
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg
40
<210> 240 <211> 58 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(58) <223> sintético
<400> 240
gagauggcga cauugguugg gcaugaggcg aggcccuuug augaauccgc ggccauuc
58
<210> 241 <211> 56 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(56) <223> sintético
<400> 241
gauggcgaca uugguugggc augaggcgag gcccuuugau gaauccgcgg ccauuc
56
<210> 242 <211> 53 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(53) <223> sintético
<400> 242
ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca uuc
53
<210> 243 <211> 52 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(52) <223> sintético
<400> 243
ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca uu
52
<210> 244 <211> 50 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<400> 244
ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca
50
<210> 245 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 245
gcugguuacc gagggggcgu cguuggaguu ugguugguug ucaccagc
48
<210> 246 <211> 46
<212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(46) <223> sintético
<400> 246
cugguuaccg agggggcguc guuggaguuu gguugguugu caccag
46
<210> 247 <211> 44 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(44) <223> sintético
<400> 247
ugguuaccga gggggcgucg uuggaguuug guugguuguc acca
44
<210> 248 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 248
gccgguuacc gagggggcgu cguuggaguu ugguugguug ucaccggc
48
<210> 249 <211> 48 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(48) <223> sintético
<400> 249
gccggcuacc gagggggcgu cguuggaguu ugguugguug ucgccggc
48
<210> 250 <211> 46 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
5
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(46) <223> sintético
<400> 250
gcgcguaccg agggggcguc guuggaguuu gguugguugu ccgcgc
46
10
<210> 251 <211> 46 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
15
<220> <221> D-ARN <222> (1)..(46) <223> sintético
<400> 251
20
gggccuaccg agggggcguc guuggaguuu gguugguugu cggccc 46
<210> 252 <211> 76 <212> PRT <213> Rattus rattus
25
<400> 252
<210> 253
<211> 50
<212> ARN 30 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Producto de unión a MCP-1
<220>
<221> L-ARN 35 <222> (1)..(50)
<223> sintético
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(50) <223> PEGilación en 5'
<400> 253
ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca
50
<210> 254 <211> 50 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Producto de unión a MCP-1
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(50) <223> sintético
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(50) <223> PEGilación en 3'
<400> 254
ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca
50
<210> 255 <211> 11 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sonda de captura de NOX-E36
<220> <221> L-ADN <222> (1)..(11) <223> sintético
<220> <221> L-ADN <222> (1)..(11) <223> -(espaciador 18)2-nh4+ aen el extremo 3'
<400> 255
gagggacgtg c
11
<210> 256 <211> 9 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sonda de detección de NOX-E36
<220> <221> L-ADN <222> (1)..(9) <223> sintético
<220> <221> L-ADN <222> (1)..(9)
<223> 5'- Biotina-(espaciador 18)
<400> 256
cgcagagcc
9
5
<210> 257 <211> 73 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> CCL1/I-309
10
<220> <221> L-Proteína <222> (1)..(73) <223> sintético
<400> 257
<210> 258
<211> 69
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> CCL3/MIP-1?
<220>
<221> L-Proteína
<222> (1)..(69) 25 <223> sintético
<400> 258
<210> 259
<211> 69
<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> CCL4/MIP-1beta
<220>
<221> L-Proteína 10 <222> (1)..(69)
<223> sintético
<400> 259
<210> 260 15 <211> 68
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CCL5/RANTES
20 <220>
<221> L-Proteína
<222> (1)..(68)
<223> sintético
<400> 260
<210> 261
<211> 82 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CCL13/MCP-4
<220> 10 <221> L-Proteína
<222> (1)..(82)
<223> sintético
<400> 261
15 <210> 262
<211> 74
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> CCL14/HCC-1
<220>
<221> L-Proteína
<222> (1)..(74)
<223> sintético
<400> 262
<210> 263
<211> 73
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> CXCL1/GROalfa
<220>
<221> L-Proteína
<222> (1)..(73) 15 <223> sintético
<400> 263
<210> 264
<211> 73 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CXCL2/GRObeta
<220>
<221> L-Proteína
<222> (1)..(73)
<223> sintético
<400> 264
<210> 265
<211> 73
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> CXCL3/GROgamma
<220>
<221> L-Proteína
<222> (1)..(73) 15 <223> sintético
<400> 265
<210> 266
<211> 70 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CXCL4/PF4
<220>
<221> L-Proteína
<222> (1)..(70)
<223> sintético
<400> 266
<210> 267
<211> 77
<212> PRT 10 <213> secuencia artificial
<220>
<223> CXCL5/ENA-78
<220>
<221> L-Proteína 15 <222> (1)..(77)
<223> sintético
<400> 267
<210> 268 20 <211> 77
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CXCL6/GCP-2
<220>
<221> L-Proteína
<222> (1)..(77)
<223> sintético
<400> 268
<210> 269
<211> 94 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CXCL7/NAP-2
<220> 15 <221> L-Proteína
<222> (1)..(94)
<223> sintético
<400> 269
20 <210> 270
<211> 79
<212> PRT
<213> secuencia artificial
<220>
<223> CXCL8/IL-8
<220>
<221> L-Proteína
<222> (1)..(79)
<223> sintético
<400> 270
<210> 271
<211> 103
<212> PRT
<213> secuencia artificial
15 <220>
<223> CXCL9/MIG
<220>
<221> L-Proteína
<222> (1)..(103) 20 <223> sintético
<400> 271
<210> 272
<211> 77
<212> PRT 5 <213> secuencia artificial
<220>
<223> CXCL10/IP-10
<220>
<221> L-Proteína 10 <222> (1)..(77)
<223> sintético
<400> 272
<210> 273 15 <211> 73
<212> PRT
<213> secuencia artificial
<220>
<223> CXCL11/I-TAC
<220>
<221> L-Proteína
<222> (1)..(73)
<223> sintético
<400> 273
<210> 274
<211> 72 10 <212> PRT
<213> secuencia artificial
<220>
<223> CXCL12alfa/SDF-1alfa
<220> 15 <221> L-Proteína
<222> (1)..(72)
<223> sintético
<400> 274
20 <210> 275
<211> 72
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CXCL12beta/SDF-1beta
<220>
<221> L-Proteína
<222> (1)..(72)
<223> sintético
<400> 275
10 <210> 276
<211> 76
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> CX3CL1/Fractalquina
<220>
<221> L-Proteína
<222> (1)..(76)
<223> sintético
20 <400> 276 <210> 277
<211> 93
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
5 <220>
<223> XCL1/Linfotactina
<220>
<221> L-Proteína
<222> (1)..(93) 10 <223> artificial
<400> 277
15
<210> 278 <211> 40 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> NOX-E36 biotinilada
20
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(40) <223> sintético
25
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(40) <223> 5' BIotina
<400> 278
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg
40
30
<210> 279 <211> 40 <212> ARN <213> Secuencia artificial
35
<220> <223> POC
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(40) <223> sintético
<400> 279
uaaggaaacu cggucugaug cgguagcgcu gugcagagcu
40
<210> 280 <211> 40 <212> ARN <213> Secuencia artificial
<220> <223> POC-PEG
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(40) <223> sintético
<220> <221> L-ARN <222> (1)..(40) <223> PEGilación en 5'
<400> 280
uaaggaaacu cggucugaug cgguagcgcu gugcagagcu
40
<210> 281 <211> 11 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sonda de captura de mNOX-E36
<220> <221> L-ADN <222> (1)..(11) <223> sintético
<220> <221> L-ADN <222> (1)..(11) <223> 3'-(espaciador 18)2-NH4+
<400> 281
ccaatgtcgc c
11
<210> 282 <211> 9 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sonda de detección mNOX-E36
<220> <221> L-ADN <222> (1)..(9) <223> sintético
<220> <221> L-ADN <222> (1)..(9)
<223> 5'- biotina-(espacidor 18)2
<400> 282 cgcagagcc 9
<210> 283 5 <211> 76
<212> PRT
<213> Equus caballus
<400> 283
10 <210> 284
<211> 76
<212> PRT
<213> Bos Taurus
<400> 284
<210> 285
<211> 125
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
20 <400> 285

Claims (29)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un ácido nucleico L capaz de unirse a MCP-1, en donde el ácido nucleico comprende en la dirección 5’->3’ una primera extensión Caja B1A, una segunda extensión Caja B2 y una tercera extensión Caja B1B, en donde
    la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en ACGCA, CGCA y GCA,
    la segunda extensión Caja B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CSUCCCUCACCGGUGC-AAGUGAAGCCGYGGCUC, y
    la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende UGCGU, UGCG y UGC.
  2. 2.
    El ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde
    la segunda extensión Caja B2 comprende una secuencia de CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCC-GUGGCUC.
  3. 3.
    El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde a) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de ACGCA, y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGCGU; o b) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de CGCA, y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGCG; o c) la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GCA, y la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGC o UGCG.
  4. 4.
    El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la primera extensión Caja B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GCA.
  5. 5.
    El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y preferiblemente según la reivindicación 4, en donde
    la tercera extensión Caja B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGCG.
  6. 6.
    El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico según las SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 116, SEC ID Nº: 117 y SEC ID Nº: 278, o un ácido nucleico homólogo a los mismos, en donde la homología es de al menos un 85%.
  7. 7.
    El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el ácido nucleico es capaz de unirse a una quimiocina, en donde la quimicina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
  8. 8.
    El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el ácido nucleico es capaz de unirse a MCP-1 humana.
  9. 9.
    El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el ácido nucleico comprende una modificación, en donde la modificación preferiblemente es un resto de elevado peso molecular y/o en donde la modificación preferiblemente permite modificar las características del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en términos de tiempo de residencia en el organismo animal o humano, preferiblemente organismo humano.
  10. 10.
    El ácido nucleico según la reivindicación 9, en donde la modificación se selecciona del grupo que consiste en un resto de HES y un resto de PEG.
  11. 11.
    El ácido nucleico según la reivindicación 10, en donde la modificación es un resto de PEG que consiste en un PEG lineal o ramificado, en donde el peso molecular del resto de PEG preferiblemente está entre aproximadamente 20 y 120 kD, más preferiblemente entre aproximadamente 30 y 80 kD y lo más preferiblemente de aproximadamente 40 kD.
  12. 12.
    El ácido nucleico según la reivindicación 10, en donde la modificación es un resto de HES, en donde preferiblemente el peso molecular del resto de HES está entre aproximadamente 10 y 130 kD, más preferiblemente entre aproximadamente 30 y 130 kD y lo más preferiblemente de aproximadamente 100 kD.
  13. 13.
    El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la primera extensión Caja B1A y la tercera extensión Caja B1B se hibridan opcionalmente entre sí, en donde con la hibridación se forma una estructura de cadena doble.
  14. 14.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para uso en un método de tratamiento de una enfermedad.
  15. 15.
    La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para uso en un método de diagnosis.
  16. 16.
    Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y opcionalmente un constituyente adicional, en donde el constituyente adicional se selecciona del grupo que consiste en excipientes farmacéuticamente aceptables, vehículos farmacéuticamente aceptables y agentes farmacéuticamente activos.
  17. 17.
    El uso de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la fabricación de un medicamento.
  18. 18.
    El uso de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la fabricación de un medio de diagnóstico.
  19. 19.
    El uso según la reivindicación 17, en donde el medicamento es para el tratamiento y/o la prevención de una enferemedad o trastorno seleccionado del grupo que comprende enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, encefalomielitis autoinmune, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple aguda y crónica, inflamación crónica, artritis reumatoide, enfermedades renales, restenosis, restenosis después de angioplastia, reacciones alérgicas agudas y crónicas, reacciones inmunológicas y alérgicas primarias y secundarias, asma, conjuntivitis, bronquitis, cáncer, aterosclerosis, insuficiencia cardíaca cardiovascular arteriosclerótica o accidente cerebrovascular, psoriasis, artritis psoriática, inflamación del sistema nervioso, dermatitis atópica, colitis, endometriosis, uveítis, trastornos retinianos que incluyen degeneración macular, desprendimiento de retina, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, retinitis pigmentaria, vitreorretinopatía proliferativa y coriorretinopatía serosa central; fibrosis pulmonar idiopática, sarcoidosis, polimiositis, dermatomiositis, anulación de la inmunosupresión, reducción del riesgo de infección, sepsis, inflamación renal, glomerulonefritis, glomerulonefritis progresiva rápida, glomerulonefritis proliferativa, nefropatía diabética, nefropatía obstructiva, necrosis tubular aguda y glomeruloesclerosis difusa, lupus eritematoso sistémico, bronquitis crónica, enfermedad de Behget, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), ateroesclerosis prematura después de la enfermedad de Kawasaki, infarto de miocardio, obesidad, enfermedad hepática crónica, enfermedad de Peyronie, lesión de médula espinal aguda, trasplante de pulmón o riñón, miocarditis, enfermedad de Alzheimer y neuropatía, carcinoma de mama, carcinoma gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, hamartoma, carcinoma colorrectal, adenoma colónico, pancreatitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y enfermedades intestinales inflamatorias tales como la enfermedad de Crohn
    o la colitis ulcerativa.
  20. 20.
    Un complejo que comprende una quimiocina y un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3, en donde preferiblemente el complejo es un complejo cristalino.
  21. 21.
    El uso de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la detección in vitro de una quimiocina, en donde la quimiocina se selecciona del grupo que consiste en eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
  22. 22.
    Un método para el escrutinio de un antagonista de quimiocina o de un agonista de quimiocina que comprende los pasos siguientes:
    -
    proporcionar un antagonista de quimiocina candidato y/o un agonista de quimiocina candidato,
    -
    proporcionar un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13,
    -
    proporcionar un sistema de ensayo que provea una señal en presencia de un antagonista de quimiocina y/o de un agonista de quimiocina, y
    -
    determinar si el antagonista de quimiocina candidato es un antagonista de quimiocina y/o si el agonista de quimiocina candidato es un agonista de quimiocina,
    en donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
  23. 23. Un método para el escrutinio de un agonista de quimiocina y/o de un antagonista de quimiocina que comprende las siguientes etapas:
    -
    proporcionar una quimiocina inmovilizada a una fase, preferiblemente una fase sólida,
    -
    proporcionar un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, preferiblemente un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que está marcado,
    -
    añadir un agonista de quimiocina candidato y/o un antagonista de quimiocina candidato, y
    -
    determinar si el agonista de quimiocina candidato es agonista de quimiocina y/o si el antagonista de quimiocina candidato es antagonista de quimiocina,
    en donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
  24. 24.
    Un kit para la detección de una quimiocina que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
  25. 25.
    Un método para la detección del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en una muestra, en donde el método comprende las etapas de:
    a) proporcionar una muestra que contiene el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13;
    b) proporcionar una sonda de captura, donde la sonda de captura es al menos parcialmente complementaria a una primera parte del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y una sonda de detección, donde la sonda de detección es al menos parcialmente complementaria a una segunda parte del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o, alternativamente, la sonda de captura es al menos parcialmente complementaria a una segunda parte del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y la sonda de detección es al menos parcialmente complementaria a la primera parte del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13;
    c) dejar que la sonda de captura y la sonda de detección reaccionen bien simultáneamente o bien secuencialmente en cualquier orden con el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o con una parte del mismo;
    d) opcionalmente detectar si la sonda de captura se hibrida o no con el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 proporcionado en la etapa a); y
    e) detectar el complejo formado en la etapa c) que consiste en el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y la sonda de captura y la sonda de detección.
  26. 26.
    El método según la reivindicación 25, en donde la sonda de detección comprende un medio de detección, y/o en donde la sonda de captura puede inmovilizarse sobre un soporte, preferiblemente sobre un soporte sólido.
  27. 27.
    El método según la reivindicación 25 ó 26, en donde cualquier sonda de detección que no forme parte del complejo es eliminada de la reacción de tal modo que en la etapa e) solo se detecte una sonda de detección que forme parte del complejo.
  28. 28.
    El método según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en donde la etapa e) comprende la etapa de comparar la señal generada por el medio de detección cuando se hibridan la sonda de captura y la sonda de detección en presencia del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o de una parte del mismo, y en ausencia de dicho ácido nucleico o parte del mismo.
  29. 29.
    El método según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, en el que el ácido nucleico que va a ser detectado es el ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico según las SEC ID Nº: 37, 116, 117 ó 278, y la sonda de captura o la sonda de detección comprenden una secuencia de ácido nucleico según la SEC ID Nº: 255 ó la SEC ID Nº: 256.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE510014T1 (de) 2006-02-14 2011-06-15 Noxxon Pharma Ag Mcp-i-bindende nukleinsäuren
US8367629B2 (en) * 2006-02-14 2013-02-05 Noxxon Pharma Ag MCP-1 binding nucleic acids and use thereof
GB0718167D0 (en) 2007-09-18 2007-10-31 Cancer Rec Tech Ltd Cancer marker and therapeutic target
US20100311816A1 (en) * 2007-11-30 2010-12-09 Noxxon Pharma Ag MCP-1 binding nucleic acids and use thereof
EP2304031A2 (en) * 2008-06-11 2011-04-06 Bionucleon S.r.l. Inhibition of hrp-3 using modified oligonucleotides
WO2010070394A1 (en) * 2008-12-17 2010-06-24 Universite Pierre Et Marie Curie-Paris Vi Modulators of the cx3cr1 receptor and therapeutic uses thereof
WO2012025251A1 (en) * 2010-08-27 2012-03-01 Noxxon Pharma Ag Nucleic acids for treatment of chronic complications of diabetes
US8465413B2 (en) 2010-11-25 2013-06-18 Coloplast A/S Method of treating Peyronie's disease
EP4219516A3 (en) 2012-07-13 2024-01-10 Wave Life Sciences Ltd. Chiral control
WO2015062743A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Noxxon Pharma Ag Means and methods for the treatment of nephropathy
WO2021178923A1 (en) 2020-03-06 2021-09-10 Drinksavvy, Inc. Devices and methods for detecting a target analyte of interest
WO2023154452A1 (en) 2022-02-11 2023-08-17 Waypoint Bio, Inc. Cellular staining probes for analyte detection

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6011020A (en) 1990-06-11 2000-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US6670321B1 (en) * 1998-12-30 2003-12-30 The Children's Medical Center Corporation Prevention and treatment for retinal ischemia and edema
JP4713082B2 (ja) * 2001-10-26 2011-06-29 ノクゾン ファルマ アーゲー 修飾ｌ−核酸
EP1306382A1 (de) 2001-10-26 2003-05-02 Noxxon Pharma AG Modifizierte L-Nukleinsäure
US7750140B2 (en) * 2002-08-01 2010-07-06 Noxxon Pharma Ag Ghrelin binding nucleic acids
EP1386972A1 (en) 2002-08-01 2004-02-04 Noxxon Pharma AG Method and apparatus for designing a nucleic acid having a desired property
US20090281296A1 (en) 2004-02-09 2009-11-12 Supramol Parenteral Colloid Gmbh Process for the production of conjugates from polysaccharides and polynucelotides
WO2005084412A2 (en) * 2004-03-05 2005-09-15 Archemix Corp. Controlled modulation of the pharmacokinetics and biodistribution of aptamer therapeutics
WO2005108431A1 (en) * 2004-05-04 2005-11-17 University Of Kentucky Research Foundation Methods and compositions for the treatment of ocular neovascularization
ATE510014T1 (de) 2006-02-14 2011-06-15 Noxxon Pharma Ag Mcp-i-bindende nukleinsäuren
US8367629B2 (en) * 2006-02-14 2013-02-05 Noxxon Pharma Ag MCP-1 binding nucleic acids and use thereof
BRPI0815094B8 (pt) * 2007-08-06 2023-04-18 Noxxon Pharma Ag Uso de uma molécula de ácido l-nucleico ligada a sdf-1
US20100311816A1 (en) 2007-11-30 2010-12-09 Noxxon Pharma Ag MCP-1 binding nucleic acids and use thereof

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