MX2008010489A - Acidos nucleicos que se enlazan con mcp-1 - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a unácido nucleico, que se enlaza preferencialmente con MCP-I, seleccionado a partir del grupo que comprendeácidos nucleicos tipo IA,ácidos nucleicos tipo IB,ácidos nucleicos tipo 2,ácidos nucleicos tipo 3,ácidos nucleicos tipo 4, yácidos nucleicos que tienen una secuencia deácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las SEQ. ID. NOs:87 a 115.

Description

ÁCIDOS NUCLEICOS QUE SE ENLAZAN CON CP-I La presente invención se refiere a ácidos nucleicos que se enlazan a MCP-1, y al uso de los mismos para la fabricación de un medicamento y un agente de diagnóstico, respectivamente. La MCP-1 humana (proteína quimiotáctica de monocitos 1; nombres alternativos, MCAF [factor quimiotáctico y activador de monocitos]; CCL2; SMC-CF [factor estimulante de la colonia de células del músculo liso]; HC-11; LDCF; GDCF; TSG-8; SCYA2; A2; código de acceso SwissProt, P13500) fue caracterizado por tres grupos independientes (Matsushima 1988; Rollins 1989; Yoshimura 1989). Esta consiste en 76 aminoácidos y pone de relieve un sitio de enlace a heparina como todas las quimiocinas. Los dos puentes disulfuro intramoleculares confieren una estructura rígida, estable, a la molécula. Además, la MCP-1 porta un piroglutamato en su extremo amino. En la Thr 71, se localiza un sitio potencial de glicosilación unido a O. Los miembros de la familia MCP adicionales existen tanto en seres humanos (MCP-2, -3, -4) como en ratones (MCP-2, -3, -5). Las proteínas humanas son aproximadamente 70% homologas a la MCP-1 humana. La estructura de la MCP-1 ha sido dilucidada mediante RMN (Handel 1996) y rayos X (Lubkowski 1997). El monómero de MCP-1 tiene el pliegue de la quimiocina típico en el que las cisteínas amino- terminales están seguidas por un largo bucle que produce tres láminas plegadas en ß antiparalelas en un motivo en guarda griega.

La proteína finaliza en una hélice a que se superpone a las tres láminas ß (código de datos de acceso PDB 1DOK). Si bien la estructura tridimensional de la MCP-1 de diferentes especies de mamíferos generalmente se ha mantenido, la secuencia de aminoácidos no se ha conservado particularmente bien durante la evolución. Los resultados del alineamiento de secuencias demuestra una similitud de secuencia total del 55% entre la MCP-1 humana y murina (también llamada JE) dentro de los primeros 76 aminoácidos. Aparte de las secuencias de aminoácidos, la MCP-1 murina difiere de la MCP-1 humana en tamaño molecular (125 aminoácidos) y el grado de glicosilación. La MCP-1 murina contiene un dominio carboxiterminal de 49 aminoácidos que no está presente en la MCP-1 humana y no se requiere para la bioactividad in vitro. La MCP-1 humana comparte el siguiente porcentaje de aminoácidos idénticos con la MCP-1 de: • Macaca mulatta (mono Rhesus) MCP-1 97% Sus scrofa (cerdo) MCP-1 79% • Equus caballus (caballo) 78% • Canis familiaris (perro) MCP-1 76% • Oryctolagus cuniculus (conejo) MCP-1 75% • Bos Taurus (bovino) 72% Homo sapiens MCP-3 71% • Homo sapiens Eotaxina 64% • Homo sapiens MCP-2 62% • Mus musculus (ratón) MCP-1 55% • Rattus norvegicus (rata) MCP-1 55% Dado este alto grado de divergencia puede ser necesario generar antagonistas de la MCP-1 de roedores para la modalidad de estudios farmacológicos en modelos de roedores. La MCP-1 es una potente sustancia que atrae monocitos/macrófagos, basófilos, células T activadas y células NK. Una amplia variedad de tipos celulares, tales como células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos, queratinocitos, células sinoviales, células del mesangio, osteoblastos, células del músculo liso, además de una multitud de células tumorales expresan MCP-1 (Baggiolini 1994). Su expresión está estimulada por varios tipos de agentes proinflamatorios tales como I L- , TNF-a, IFN-?, LPS (lipopolisacárido), y GM-CSF. Más que inusual en la caótica estructura de la quimiocina, la MCP-1 es muy específica en su uso como receptor, se enlaza solo al receptor de quimiocina CCR2 con alta afinidad. Como todos los receptores de quimiocina, el CCR2 es un GPCR (Dawson 2003). El CCR2 parece expresarse en dos formas ligeramente diferentes debido al empalme alternativo del ARNm que codifica la región carboxiterminal, CCR2a y CCR2b (Charo 1994). Estos receptores se expresan en los monocitos, las células precursoras mieloideas y las células T activadas (Myers 1995; Qin 1996). La constante de disociación de la MCP-1 al receptor transfectado en las células HEK- 293 es de 260 pM que está de acuerdo con los valores medidos en los monocitos (Myers 1995; Van Riper 1993). La activación de CCR2b en las células HEK-293 transfectadas con MCP-1 inhibe la adenilciclasa a una concentración de 90 pM, y moviliza el calcio intracelular a concentraciones ligeramente superiores, aparentemente independiente de la hidrólisis de fosfatidil inositol. Los efectos en la adenilii ciclasa y la liberación de calcio intracelular son fuertemente inhibidas por la toxina de la tos ferina, lo que implica la participación de las proteínas G heterotriméricas de tipo G¡ en la transducción de señales ( yers 1995). La MCP-1 está involucrada en el reclutamiento de monocitos en los tejidos inflamados. Allí, los macrófagos residentes liberan quimiocinas tales como la MCP-1 y otras, y citocinas como TNF, IL-1ß y otras, que activan a las células endoteliales para que expresen una batería de moléculas de adhesión. El endotelio "pegajoso" resultante produce que los monocitos de los vasos sanguíneos lleguen a su superficie. Aquí, los monocitos encuentran a la MCP-1 presente en la superficie endotelial, que se enlaza al CCR2 en los monocitos y los activa. Esto finalmente produce el freno estricto, propagación de monocitos a lo largo del endotelio y transmigración en el tejido circundante, donde los monocitos se diferencian en macrófagos y migran hacia el sitio de concentración de MCP-1 máxima. La MCP-1 es un miembro de la familia de quimiocinas que es una familia de moléculas pequeñas (ca. 8-14 kDa) principalmente básicas y estructuralmente relacionadas que se enlazan a heparina. Éstas se forman predominantemente en tejidos inflamados y regulan el reclutamiento, la activación y la proliferación de los glóbulos objetivos (leucocitos) (Baggiolini 1994; Springer 1995; Schall 1994). Las quimiocinas inducen selectivamente la quimiotaxis de los neutrófilos, los eosinófilos, los basófilos, los monocitos, los macrófagos, los mastocitos, y las células T y B. Además de su efecto quimiotáctico, estos pueden ejercer selectivamente otros efectos en células sensibles como cambios en la forma, aumento transitorio en la concentración de iones de calcio intracelular libre, desgranulación, regulación por aumento de las integrinas, formación de lípidos bioactivos tales como leucotrienos, prostaglandinas, tromboxanos o estallido respiratorio (liberación de especies de oxígeno reactivo para la destrucción de los organismos patógenos o células tumorales). De este modo, al provocar la liberación de otros mediadores proinflamatorios, la qumiotaxis y la extravasación de leucocitos hacia los sitios de infección o inflamación, las quimiocinas desencadenan la escalada de la respuesta inflamatoria. Sobre la base de la disposición de los primeros dos de cuatro residuos conservados de cisteína, las quimiocinas se dividen en cuatro clases: CC o ß-quimiocinas en las que las cisteínas están en tándem, CXC o a-quimiocinas, donde están separadas por un residuo de aminoácido adicional, XC o ? quimiocinas con la linfotactina como único representante hasta la fecha, que posee solo un puente disulfuro, y CX3C-quimiocinas que se caracterizan por tres residuos de aminoácidos entre las cisteínas, con la fractalquina unida a la membrana como único miembro de la clase hasta la fecha (Bazan 1997). Las quimiocinas CXC actúan principalmente sobre los neutrófilos, en particular las quimiocinas CXC que portan la secuencia de aminoácidos ELR en sus extremos amino terminales. Los ejemplos de quimiocinas CXC que son activas en los neutrófilos son IL-8, GROa, -ß, y -?, NAP-2, ENA-78 y GCP-2. Las quimiocinas CC actúan sobre una mayor variedad de leucocitos, tales como monocitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos, además de los linfocitos T y B (Oppenheim 1991; Baggiolini 1994; Miller 1992; José 1994; Ponath 1996a). Los ejemplos de éstos son I-309; MCP-1, -2, -3, -4, MIP-1a y -ß, RANTES, y eotaxina. Las quimiocinas actúan a través de receptores que pertenecen a una superfamilia de siete receptores acoplados a la proteína G que abarcan la transmembrana (GPCRs; Murphy 2000). En términos generales, las interacciones de la quimiocina y el receptor de quimiocina tienden a ser caóticas en el sentido de que una quimiocina se puede unir a muchos receptores de quimiocina e inversamente un único receptor de quimiocina puede interactuar con varias quimiocinas. Algunos receptores conocidos para las quimiocinas CC incluyen al CCR1, que se enlaza a MIP-1a y RANTES (Neote 1993; Gao 1993); el CCR2, que se enlaza a quimiocinas que incluyen a MCP-1, -2, -3, y -4 (Charo 1994; Myers 1995; Gong 1997; Garcia-Zepeda 1996); el CCR3, que se enlaza a quimiocinas que incluyen la eotaxina, RANTES, y MCP-3 (Ponath 1996b); el CCR4, que se halló que indica la respuesta a MCP-1, MIP- 1a, y RANTES (Power 1995); y el CCR5, que se halló que indica la respuesta a MIP-1a y -ß, y RANTES (Boring 1996; Raport 1996; Samson 1996). Como se mencionó anteriormente, los cuatro miembros de la familia MCP y (1-4) se enlazan al CCR2, mientras que MCP-2, MCP-3, y MCP-4 también pueden interactuar con CCR1 y CCR3 (Gong 1997; Heath 1997; Uguccioni 1997) y, en el caso de MCP-2, con CCR5 (Ruffing 1998). Otra quimiocina CC que muestra alta homología con la familia MCP es la eotaxina, que originalmente se halló en el líquido de lavado broncoalveolar tomado de cobayos sensibilizados estimulados con alérgenos (José 1994). Se ha demostrado que la eotaxina también puede activar al CCR2 (Martinelli 2001). El problema esencial de la presente invención es proporcionar un medio que interactúe específicamente con la MCP-1. Más específicamente, el problema esencial de la presente invención es proporcionar un medio sobre la base de un ácido nucleico que interactúe específicamente con la MCP-1. Otro problema esencial de la presente invención es proporcionar un medio para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades humanas o no humanas, donde la enfermedad se caracteriza porque la MCP-1 unida tanto en forma directa como indirecta participa en el mecanismo patogenético de tal enfermedad. Aún otro problema esencial de la presente invención es proporcionar un medio para la fabricación de un agente de diagnóstico para el tratamiento de una enfermedad, donde la enfermedad se caracteriza porque la MCP-1 unida tanto en forma directa como indirecta participa en el mecanismo patogenético de tal enfermedad. Éstos y otros problemas subyacentes de la presente invención se resuelven por el contenido de las reivindicaciones independientes adjuntas. Las modalidades preferidas se pueden adoptar a partir de las reivindicaciones dependientes. El problema esencial de la presente invención se resuelve adicionalmente en un primer aspecto por un ácido nucleico, de preferencia que se enlaza a la MCP-1, seleccionado del grupo que comprende a los ácidos nucleicos tipo 1A, los ácidos nucleicos tipo 1B, los ácidos nucleicos tipo 2, los ácidos nucleicos tipo 3, los ácidos nucleicos tipo 4 y los ácidos nucleicos que tienen una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con alguna de las SEQ.ID.No.87 a 115. En un primer subaspecto, el primer aspecto del ácido nucleico tipo 1A comprende en dirección 5'-->3' una primera extensión Cuadro B1A, una segunda extensión Cuadro B2, una tercera extensión Cuadro B3, una cuarta extensión Cuadro B4, una quinta extensión Cuadro B5, una sexta extensión Cuadro B6 y una séptima extensión Cuadro B1 B, donde la primera extensión Cuadro B1A y la séptima extensión Cuadro B1B opcionalmente se hibridan entre sí, donde después de la hibridación se forma una estructura de doble cadena, la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de AGCRUG, la segunda extensión Cuadro B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CCCGGW, la tercera extensión Cuadro B3 comprende una secuencia de nucleótidos de GUR, la cuarta extensión Cuadro B4 comprende una secuencia de nucleótidos de RYA, la quinta extensión Cuadro B5 comprende una secuencia de nucleótidos de GGGGGRCGCGAYC la sexta extensión Cuadro B6 comprende una secuencia de nucleótidos de UGCAAUAAUG o URYAWUUG, y la séptima extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de CRYGCU. En una modalidad preferida del primer subaspecto la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de AGCGUG. En una modalidad del primer subaspecto la segunda extensión Cuadro B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CCCGGU. En una modalidad del primer subaspecto la tercera extensión Cuadro B3 comprende una secuencia de nucleótidos de GUG. En una modalidad del primer subaspecto Iü la cuarta extensión Cuadro B4 comprende una secuencia de nucleótidos de GUA. En una modalidad del primer subaspecto la quinta extensión Cuadro B5 comprende una secuencia de nucleótidos de GGGGGGCGCGACC. En una modalidad del primer subaspecto la sexta extensión Cuadro B6 comprende una secuencia de nucleótidos de UACAUUUG. En una modalidad del primer subaspecto la séptima extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de CACGCU. En una modalidad del primer subaspecto el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ.ID.No 21. En un segundo subaspecto del primer aspecto, el ácido nucleico tipo 1B comprende en dirección 5'-->3' una primera extensión Cuadro B1A, una segunda extensión Cuadro B2, una tercera extensión Cuadro B3, una cuarta extensión Cuadro B4, una quinta extensión Cuadro B5, una sexta extensión Cuadro B6 y una séptima extensión Cuadro B1B, donde la primera extensión Cuadro B1A y la séptima extensión Cuadro B1B opcionalmente se hibridan entre sí, donde después de la hibridación se forma una estructura de doble cadena, la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de AGYRUG, la segunda extensión Cuadro B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CCAGCU o CCAGY, la tercera extensión Cuadro B3 comprende una secuencia de nucleótidos de GUG, la cuarta extensión Cuadro B4 comprende una secuencia de nucleótidos de AUG, la quinta extensión Cuadro B5 comprende una secuencia de nucleótidos de GGGGGGCGCGACC, la sexta extensión Cuadro B6 comprende una secuencia de nucleótidos de CAUUUUA o CAUUUA, y la séptima extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de CAYRCU. En una modalidad del segundo subaspecto la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de AGCGUG. En una modalidad del segundo subaspecto la segunda extensión Cuadro B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CCAGU. En una modalidad del segundo subaspecto la sexta extensión Cuadro B6 comprende una secuencia de nucleótidos de CAUUUUA. En una modalidad del segundo subaspecto la séptima extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de CACGCU. En una modalidad del segundo subaspecto el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ.ID.No 28 y SEQ.ID.No 27. En un tercer subaspecto del primer aspecto, el ácido nucleico tipo 2 comprende en dirección 5'-->3' una primera extensión Cuadro BIA, una segunda extensión Cuadro B2, y una tercera extensión Cuadro B1B, o en dirección 5'-->3' una tercera extensión Cuadro BIB, una segunda extensión Cuadro B2, y una primera extensión Cuadro B1 A, donde la primera extensión Cuadro B1A y la tercera extensión Cuadro B1B opcionalmente se hibridan entre sí, donde después de la hibridación se forma una estructura de doble cadena, la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende ACGCA, CGCA y GCA, la segunda extensión Cuadro B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende UGCGU, UGCG y UGC. En una modalidad del tercer subaspecto la segunda extensión Cuadro B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC. En una modalidad del tercer subaspecto a) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de ACGCA, la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGCGU; o b) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de CGCA, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGCG; o c) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GCA, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGC o UGCG. En una modalidad del tercer subaspecto la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GCA. En una modalidad preferida del tercer subaspecto la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGCG. En una modalidad del tercer subaspecto el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ.ID.No 37, SEQ.ID.No 116, SEQ.ID.No 117 y SEQ.ID.No 278. En un cuarto subaspecto del primer aspecto el ácido nucleico tipo 3 comprende en dirección 5'-->3' una primera extensión Cuadro B1A, una segunda extensión Cuadro B2A, una tercera extensión Cuadro B3, una cuarta extensión Cuadro B2B, una quinta extensión Cuadro B4, una sexta extensión Cuadro B5A, una séptima extensión Cuadro B6, una octava extensión Cuadro B5B y una novena extensión Cuadro B1B, en donde la primera extensión Cuadro B1A y la novena extensión Cuadro B1B opcionalmente se hibridan entre sí, donde después de la hibridación se forma una estructura de doble cadena, la segunda extensión Cuadro B2A y la cuarta Cuadro B2B opcionalmente se hibridan entre sí, donde después de la hibridación se forma una estructura de doble cadena, la sexta extensión Cuadro B5A y la octava Cuadro B5B opcionalmente se hibridan entre sí, donde después de la hibridación se forma una estructura de doble cadena, la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos que se selecciona del grupo que comprende GURCUGC, GKSYGC, KBBSC y BNGC, la segunda extensión Cuadro B2A comprende una secuencia de nucleótidos de GKMGU, la tercera extensión Cuadro B3 comprende una secuencia de nucleótidos de KRRAR, la cuarta extensión Cuadro B2B comprende una secuencia de nucleótidos de ACKMC, la quinta extensión Cuadro B4 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende CURYGA, CUWAUGA, CWRMGACW y UGCCAGUG, la sexta extensión Cuadro B5A comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que comprende GGY y CWGC, la séptima extensión Cuadro B6 comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que comprende YAGA, CKAAU y CCUUUAU, la octava extensión Cuadro B5B comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que comprende GCYR y GCWG, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que comprende GCAGCAC, GCRSMC, GSVVM y GCNV. En una modalidad del cuarto subaspecto la tercera extensión Cuadro B3 comprende una secuencia de nucleotidos de GAGAA o UAAAA En una modalidad del cuarto subaspecto la quinta extensión Cuadro B4 comprende una secuencia de nucleotidos de CAGCGACU o CAACGACU. En una modalidad del cuarto subaspecto la quinta extensión Cuadro B4 comprende una secuencia de nucleotidos de CAGCGACU y la Cuadro B3 comprende una secuencia de nucleotidos de UAAAA. En una modalidad del cuarto subaspecto la quinta extensión Cuadro B4 comprende una secuencia de nucleotidos de CAACGACU y la Cuadro B3 comprende una secuencia de nucleótidos de GAGAA.

En una modalidad del cuarto subaspecto la séptima extensión Cuadro B6 comprende una secuencia de nucleótidos de UAGA. En una modalidad del cuarto subaspecto a) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GURCUGC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCAGCAC; o b) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GKSYGC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCRSMC; o c) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de KBBSC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GSVVM; o d) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de BNGC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCNV. En una modalidad preferida del cuarto subaspecto a) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GUGCUGC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCAGCAC; o b) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GUGCGC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCGCAC; o c) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de KKSSC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GSSMM; o d) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de SNGC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCNS. En una modalidad preferida del cuarto subaspecto la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GGGC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCCC. En una modalidad del cuarto subaspecto la segunda extensión Cuadro B2A comprende una secuencia de nucleótidos de GKMGU y la cuarta extensión Cuadro B2B comprende una secuencia de nucleótidos de ACKMC. En una modalidad preferida del cuarto subaspecto la segunda extensión Cuadro B2A comprende una secuencia de nucleótidos de GUAGU y la cuarta extensión Cuadro B2B comprende una secuencia de nucleótidos de ACUAC. En una modalidad del cuarto subaspecto a) la sexta extensión Cuadro B5A comprende una secuencia de nucleótidos de GGY, y la octava extensión Cuadro B5B comprende una secuencia de nucleótidos de GCYR; o b) la sexta extensión Cuadro B5A comprende una secuencia de nucleótidos de CWGC, y la octava extensión Cuadro B5B comprende una secuencia de nucleótidos de GCWG. En una modalidad preferida del cuarto subaspecto la sexta extensión Cuadro B5A comprende una secuencia de nucleótidos de GGC, y la octava extensión Cuadro B5B comprende una secuencia de nucleótidos de GCCG. En una modalidad más preferida del cuarto subaspecto la sexta extensión Cuadro B5A se híbrida con los nucleótidos GCY de la octava extensión Cuadro B5B. En una modalidad del cuarto subaspecto el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ.ID.No 56. En una modalidad del cuarto subaspecto el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que comprende las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con las SEQ.ID.No 57 a 61, SEQ.ID.No 67 a 71 y SEQ.ID.No 73. En un quinto subaspecto del primer aspecto el ácido nucleico de tipo 4 comprende en dirección 5'->3' una primera extensión Cuadro B1A, una segunda extensión Cuadro B2, una tercera extensión Cuadro B1B, donde la primera extensión Cuadro B1A y la tercera extensión Cuadro B1B opcionalmente se hibridan entre sí, donde después de la hibridación se forma una estructura de doble cadena, la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende AGCGUGDU, GCGCGAG, CSKSUU, GUGUU, y UGUU; la segunda extensión Cuadro B2 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende AGNDRDGBKGGURGYARGUAAAG, AGGUGGGUGGUAGU AAGUAAAG y CAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGA, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende GNCASGCU, CUCGCGUC, GRSMSG, GRCAC, y GGCA. En una modalidad del quinto subaspecto a) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GUGUU, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GRCAC; b) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GCGCGAG, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de CUCGCGUC; o c) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de CSKSUU, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GRSMSG, o d) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de UGUU, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GGCA, o e) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de AGCGUGDU, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GNCASGCU. En una modalidad preferida del quinto subaspecto la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de CSKSUU y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GRSMSG. En una modalidad más preferida del quinto subaspecto la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de CCGCUU y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GGGCGG. En una modalidad del quinto subaspecto la segunda extensión Cuadro B2 comprende una secuencia de nucleótidos de AGGUGGGUGGUAGU AAGUAAAG. En una modalidad del quinto subaspecto el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ.ID.No 80. En una modalidad del primer al quinto subaspecto el ácido nucleico es capaz de unirse a MCP-1, de preferencia a la MCP-1 humana. En una modalidad del primer al quinto subaspecto el ácido nucleico es capaz de unirse a quimiocina, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y 1? MCP-3. En una modalidad del primer al quinto subaspecto el ácido nucleico es capaz de unirse a quimiocina, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende la eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y CP-3 humana. En una modalidad del primer al quinto subaspecto el ácido nucleico es capaz de unirse a MCP-1, donde MCP-1 de preferencia se selecciona del grupo que comprende MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina, MCP-1 porcina y MCP-1 humana. En una modalidad del primer al quinto subaspecto el ácido nucleico es capaz de unirse a MCP-1 humana. En una modalidad preferida del primer al quinto subaspecto la MCP-1 tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID No. 1. El problema esencial de la presente invención se resuelve en un segundo aspecto mediante un ácido nucleico, que de preferencia se enlaza a MCP-1 murino, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ. ID. o. 122, SEQ. ID. o.253 y SEQ. ID. No.254. El problema esencial de la presente invención se resuelve en un tercer aspecto mediante un ácido nucleico, que de preferencia se enlaza a MCP-1 murino, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ. ID. No. 127. En una modalidad del segundo y tercer aspectos la MCP-1 murina comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID No. 2. En una modalidad del primer al tercer aspecto el ácido nucleico comprende una modificación, donde la modificación de preferencia es una fracción de alto peso molecular y/o donde la modificación de preferencia permite modificar las características del ácido nucleico de acuerdo con el primer, segundo y tercer aspecto en términos de tiempo de residencia en el cuerpo del animal o humano, de preferencia el cuerpo humano. En una modalidad preferida del primer al tercer aspecto la modificación se selecciona entre el grupo que comprende una fracción HES y una fracción PEG. En una modalidad preferida del primer al tercer aspecto la modificación es una fracción de PEG que consiste en un PEG lineal o ramificado, donde el peso molecular de la reacción PEG es de preferencia de aproximadamente 20 a 120 kD, con más preferencia de aproximadamente 30 a 80 kD y con máxima preferencia de aproximadamente 40 kD. En una modalidad alternativa más preferida del primer al tercer aspecto la modificación es una fracción HES, donde de preferencia el peso molecular de la fracción HES es de aproximadamente 10 a 130 kD, con más preferencia de aproximadamente 30 a 130 kD y con máxima preferencia de aproximadamente 100 kD. En una modalidad del primer al tercer aspecto la modificación se acopla al ácido nucleico por medio de un conector.

En una modalidad del primer al tercer aspecto la modificación se acopla al ácido nucleico en su nucleótido 5'-terminal y/o su nucleótido 3'-terminal y/o a un nucleótido del ácido nucleico entre el nucleótido 5'-terminal y el nucleótido 3'-terminal. En una modalidad del primer al tercer aspecto los nucleótidos del o de los nucleótidos que forman el ácido nucleico son nucleótidos L. En una modalidad del primer al tercer aspecto el ácido nucleico es un ácido nucleico L. En una modalidad del primer al tercer aspecto la fracción del ácido nucleico capaz de unirse a la MCP-1 consiste en los nucleótidos L. El problema esencial de la presente invención se resuelve en un cuarto aspecto mediante una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico de acuerdo con el primer, segundo y tercer aspecto y opcionalmente un constituyente adicional, donde el constituyente adicional se selecciona entre el grupo que comprende excipientes aceptables para uso farmacéutico, vehículos aceptables para uso farmacéutico y agentes activos para uso farmacéutico. En una modalidad del cuarto aspecto la composición farmacéutica comprende un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera del primer al tercer aspecto y un vehículo aceptable para uso farmacéutico. El problema esencial de la presente invención se resuelve en un quinto aspecto mediante el uso del ácido nucleico de acuerdo con el primer, segundo y tercer aspecto para la fabricación de un medicamento. En una modalidad del quinto aspecto el medicamento es para uso en la medicina humana o para uso en medicina veterinaria. El problema esencial de la presente invención se resuelve en un sexto aspecto mediante el uso de un ácido nucleico de acuerdo con el primer, segundo y tercer aspecto para la fabricación de un medio de diagnóstico. En una modalidad del quinto aspecto y en una modalidad del sexto aspecto del medicamento y medios de diagnóstico, respectivamente, es para el tratamiento y/o prevención y diagnóstico, respectivamente, de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que comprende enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, encefalomielitis autoinmune, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple aguda y crónica, inflamación crónica, artritis reumatoide, enfermedades renales, restenosis, restenosis después de la angioplastia, reacciones alérgicas aguda y crónica, reacciones inmunológicas y alérgicas primarias y secundarias, asma, conjuntivitis, bronquitis, cáncer, aterosclerosis, insuficiencia cardiaca cardiovascular arteriosclerótica o accidente cerebrovascular, psoriasis, artritis psoriática, inflamación del sistema nervioso, dermatitis atópica, colitis, endometriosis, uveítis, trastornos retiñíanos que incluyen degeneración macular, desprendimiento de retina, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, retinitis pigmentaria, vitreorretinopatía proliferativa y coriorretinopatía serosa central; fibrosis pulmonar ¡diopática, sarcoidosis, polimiositis, dermatomiositis, anulación de la inmunosupresión, reducción del riesgo de infección, sepsis, inflamación renal, glomerulonefritis, glomerulonefritis progresiva rápida, glomerulonefritis proliferativa, nefropatía diabética, nefropatía obstructiva, necrosis tubular aguda y glomeruloesclerosis difusa, lupus eritematoso sistémico, bronquitis crónica, enfermedad de Beh et, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), ateroesclerosis prematura después de la enfermedad de Kawasaki, infarto del miocardio, obesidad, enfermedad hepática crónica, enfermedad de Peyronie, lesión de médula espinal aguda, trasplante de pulmón o riñon, miocarditis, enfermedad de Alzheimer y neuropatía, carcinoma de mama, carcinoma gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, hamartoma, carcinoma colorrectal, adenoma colónico, pancreatitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y enfermedades intestinales inflamatorias tales como enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa. Sin pretender vincularlo a alguna teoría, la adecuación de los ácidos nucleicos de la presente invención para los propósitos diagnósticos se basa principalmente en el nivel de quimiocina aumentado o disminuido, donde tal quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3, más específicamente MCP-1. Será reconocido por el experto en el arte que la mayoría de las enfermedades antes mencionadas muestran tal nivel de quimiocina aumentado o disminuido.

El problema esencial de la presente invención se resuelve en un séptimo aspecto por un complejo que comprende una quimiocina y un ácido nucleico de acuerdo con el primer, segundo y tercer aspecto, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3, donde de preferencia el complejo es un complejo cristalino. En una modalidad del séptimo aspecto la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana. En una modalidad del séptimo aspecto la quimiocina es MCP-1, donde MCP-1 de preferencia se selecciona del grupo que comprende MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina, MCP-1 porcina y MCP-1 humana. Más preferiblemente la MCP-1 es MCP-1 humana. El problema esencial de la presente invención se resuelve en un octavo aspecto por el uso de un ácido nucleico de acuerdo con el primer, segundo y tercer aspecto para la detección de una quimiocina, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3. En una modalidad del octavo aspecto la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana. En una modalidad del octavo aspecto la quimiocina es MCP-1, donde MCP-1 de preferencia se selecciona del grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina, MCP-1 porcina y MCP-1 humana, más preferiblemente la MCP-1 es una MCP-1 humana . El problema esencial de la presente invención se resuelve en un noveno aspecto mediante un método para la detección de un antagonista de la quimiocina o agonista de quimiocina que comprende los siguientes pasos: proporcionar un antagonista de la quimiocina candidato y/o agonista de la quimiocina candidato, proporcionar un ácido nucleico de acuerdo con el primer, segundo y tercer aspecto, proporcionar un sistema de ensayo que proporciona una señal en presencia de un antagonista de quimiocina y/o un agonista de quimiocina, y determinar si el antagonista de la quimiocina candidato es un antagonista de la quimiocina y/o si el agonista de la quimiocina candidato es un agonista de la quimiocina, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3. En una modalidad del noveno aspecto la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana. En una modalidad del noveno aspecto la quimiocina es MCP-1, donde MCP-1 de preferencia se selecciona del grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina, MCP-1 porcina, con más preferencia MCP-1 es MCP-1 humana. El problema esencial de la presente invención se resuelve en un décimo aspecto mediante un método para la detección de un agonista de quimiocina y/o un antagonista de quimiocina que comprende los siguientes pasos: proporcionar una quimiocina inmovilizada en una fase, de preferencia una fase sólida, proporcionar un ácido nucleico de acuerdo con el primer, segundo o tercer aspecto, de preferencia un ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto que está marcado, agregar un agonista de quimiocina candidato y/o un antagonista de quimiocina candidato y determinar si el agonista de quimiocina candidato es un agonista de quimiocina y/o si el antagonista de quimiocina candidato es un antagonista de quimiocina, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3. En una modalidad del décimo aspecto la determinación se realiza de modo que se evalúa si el ácido nucleico se reemplaza por el agonista de quimiocina candidato o por un antagonista de quimiocina candidato. En una modalidad del décimo aspecto la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana. En una modalidad del décimo aspecto la quimiocina es MCP-1, donde MCP-1 de preferencia se selecciona del grupo que comprende CP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina, MCP-1 porcina, con más preferencia MCP-1 es MCP-1 humana. El problema esencial de la presente invención se resuelve en un undécimo aspecto por un kit de detección de una quimiocina, que comprende un ácido nucleico de acuerdo con el primer, segundo o tercer aspecto, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3. En una modalidad del undécimo aspecto la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana. En una modalidad del undécimo aspecto la quimiocina es MCP-1, donde la MCP-1 de preferencia se selecciona del grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina, MCP-1 porcina, con más preferencia MCP-1 es MCP-1 humana. El problema esencial de la presente invención se resuelve en un duodécimo aspecto por un antagonista de quimiocina obtenible por el método de acuerdo con el décimo aspecto o el noveno aspecto, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3. En una modalidad del duodécimo aspecto la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana.

En una modalidad del duodécimo aspecto la quimiocina es MCP-1, donde la MCP-1 de preferencia se selecciona del grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina, MCP-1 porcina, con más preferencia MCP-1 es MCP-1 humana. El problema esencial de la presente invención se resuelve en el decimotercer aspecto por un agonista de quimiocina obtenible por el método de acuerdo con el décimo aspecto o el noveno aspecto, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3. En una modalidad del decimotercer aspecto la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana. En una modalidad del decimotercer aspecto la quimiocina es MCP-1, donde MCP-1 de preferencia se selecciona del grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina, MCP-1 porcina, con más preferencia MCP-1 es MCP-1 humana. Será reconocido por los expertos en el arte que un agonista de quimiocina y/o un antagonista de quimiocina de preferencia es un agonista y antagonista, respectivamente, que se dirige a la quimiocina respectiva como se especifica en la presente descripción. Por consiguiente, el agonista de quimiocina y antagonista de quimiocina es, por ejemplo, un agonista de MCP-1 y antagonista de MCP-1 respectivamente.

El problema esencial de la presente invención se resuelve en un decimocuarto aspecto mediante un método para la detección del ácido nucleico de acuerdo con cualquiera del primer, segundo y tercer aspecto de una muestra, donde el método comprende los pasos de: a) proporcionar una muestra que contiene el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención; b) proporcionar una sonda de captura, donde la sonda de captura es por lo menos parcialmente complementaria con una primera parte del ácido nucleico de acuerdo con cualquiera del primer, segundo y tercer aspecto y una sonda de detección, donde la sonda de detección es por lo menos parcialmente complementaria con una segunda parte del ácido nucleico de acuerdo con cualquiera del primer, segundo y tercer aspecto o, alternativamente, la sonda de captura es por lo menos parcialmente complementaria con una segunda parte del ácido nucleico de acuerdo con cualquiera del primer, segundo y tercer aspecto y la sonda de detección es por lo menos parcialmente complementaria con una primera parte del ácido nucleico de acuerdo con cualquiera del primer, segundo y tercer aspecto; c) permitir que la sonda de captura y la sonda de detección reaccionen ya sea simultáneamente o en cualquier orden sucesivo con el ácido nucleico de acuerdo con cualquiera del primer, segundo y tercer aspecto o parte de los mismos; d) opcionalmente detectar si la sonda de captura se híbrida o no con el ácido nucleico de acuerdo con cualquiera del primer, segundo y tercer aspecto provisto en el paso a); y e) detectar el complejo formado en el paso c) que consiste en el ácido nucleico de acuerdo con cualquiera del primer, segundo y tercer aspecto, y la sonda de captura y la sonda de detección. En una modalidad del decimocuarto aspecto la sonda de detección comprende un medio de detección y/o mediante el cual la sonda de captura se puede inmovilizar a un soporte, de preferencia un soporte sólido. En una modalidad del decimocuarto aspecto cualquier sonda de detección que no sea parte del complejo se elimina de la reacción para que en el paso e) solo se detecte una sonda de detección que sea parte del complejo. En una modalidad del decimocuarto aspecto el paso e) comprende el paso de comparar la señal generada por el medio de detección cuando la sonda de captura y la sonda de detección se hibridan en presencia del ácido nucleico de acuerdo con cualquiera del primer, segundo y tercer aspecto o parte de los mismos y en ausencia de dicho ácido nucleico o parte del mismo. En una modalidad del decimocuarto aspecto el ácido nucleico detectado es el ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ. ID. NOs. 37, 116, 117 o 278, y la sonda de captura o sonda de detección comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ .ID. NO. 255 o SEQ. ID. NO. 256.

En una modalidad del decimocuarto aspecto el ácido nucleico detectado es el ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ. ID. NOs. 122, 253 o 254 y la sonda de captura o sonda de detección comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ. ID. NO. 281 y SEQ. ID. NO. 282. El problema esencial de la presente invención también se resuelve por el contenido de las reivindicaciones independientes adjuntas a la misma. La modalidad preferida se puede adoptar a partir de las reivindicaciones dependientes adjuntas. Las características del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención descritas en la presente descripción se pueden realizar en cualquier aspecto de la presente invención donde se usa el ácido nucleico, tanto solo como en alguna combinación. Las MCP-1 humana así también como la murina son proteínas básicas que tienen la secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEQ. ID. Nos. 1 y 2, respectivamente. El hallazgo de que se pudieron identificar ácidos nucleicos cortos de alta afinidad con MCP-1, es lo que es sorprendente, ya que Eaton y colaboradores (1997) observaron que la generación de aptámeros, es decir, ácidos D-nucleicos que se enlazan a una molécula objetivo, dirigida a una proteína básica es en general muy difícil porque esta clase de objetivo produce una relación señal-ruido alta pero no específica. Esta relación señal-ruido alta proviene de la alta afinidad no específica mostrada por los ácidos nucleicos para los objetivos básicos tales como MCP-1. Como se describe con más detalle en las reivindicaciones y el Ejemplo 1 , los presentes inventores podrían identificar en forma más sorprendente una variedad de moléculas de ácidos nucleicos de enlace al MCP-1 diferentes, donde la mayoría de los ácidos nucleicos se podrían caracterizar en términos de extensiones de nucleótidos que en la presente descripción también se mencionan como Cuadros o Cuadros. Las diversas moléculas de ácidos nucleicos de enlace a MCP-1 se pueden clasificar sobre la base de dichos Cuadros y algunos rasgos y elementos estructurales, respectivamente. Las diversas categorías definidas de este modo también se mencionan en la presente descripción como tipos y más específicamente como tipo 1A, tipo 1B, tipo 2, tipo 3 y tipo 4. Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención también comprenderán ácidos nucleicos que son esencialmente homólogos con las secuencias particulares descritas en la presente descripción. El término sustancialmente homólogo se entenderá de modo tal que la homología sea de por lo menos 75%, de preferencia 85%, con más preferencia 90% y con máxima preferencia más de 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99%. El porcentaje de homología real de los nucleótidos homólogos presentes en el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención dependerá de la cantidad total de nucleótidos presentes en el ácido nucleico. El porcentaje de modificación se puede basar sobre la cantidad total de nucleótidos presentes en el ácido nucleico.

La homología se puede determinar como es conocido por los expertos en el arte. Más específicamente, un algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, sobre la base de los parámetros del programa designado. La secuencia de ensayo, de preferencia es la secuencia o molécula de ácido nucleico que se probará si es homologa y si lo es, en qué grado, a otra molécula de ácido nucleico, en la que esta otra molécula de ácido nucleico también se conoce como secuencia de referencia. En una modalidad, la secuencia de referencia es una molécula de ácido nucleico descrita en la presente descripción, con más preferencia una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de acuerdo con alguna de las SEQ. ID. NOs. 10 a 129, 132 a 256 y 278 a 282. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman (Smith & Waterman, 1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch (Needleman & Wunsch, 1970) mediante la búsqueda del método de semejanza de Pearson & Lipman (Pearson & Lipman, 1988), mediante implementaciones computadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual. Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es el algoritmo usado en la herramienta de búsqueda de alineamiento local básico (de aquí en adelante "BLAST"), ver, por ejemplo, Altschul y colaboradores (Altschul y colaboradores, 1990 y Altschul y colaboradores, 1997). El programa de computación para realizar los análisis BLAST está disponible al público a través del Centro Nacional de Información de Biotecnología (de aquí en adelante "NCBI").Los parámetros por omisión que se usan para determinar la identidad de secuencia mediante el programa de computación disponible en NCBI, por ejemplo, BLASTN (para secuencias de nucleótidos) y BLASTP (para secuencias de aminoácidos) se describen en McGinnis y colaboradores (McGinnis y colaboradores, 2004). El término ácido nucleico inventivo o ácido nucleico de acuerdo con la presente invención también comprenderá a los ácidos nucleicos que comprenden a las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente descripción o parte de las mismas, de preferencia en la medida que los ácidos nucleicos o dichas partes participen en el enlace con la MCP-1. El termino ácido nucleico de la invención usado de preferencia en la presente descripción, en una modalidad también comprenderá a un ácido nucleico adecuado para enlazarse a cualquier molécula seleccionada del grupo que comprende a MCP-2, MCP-3, MCP-4, y eotaxína. Será reconocido por los expertos en el arte que los ácidos nucleicos individuales de acuerdo con la presente invención se enlazarán a una o varias de estas moléculas. Tal ácido nucleico, en una modalidad, es una de las, moléculas de ácidos nucleicos descritas en la presente descripción o un derivado y/o un metabolito del mismo, donde tal derivado y/o metabolito de preferencia son un ácido nucleico truncado en comparación con las moléculas de ácidos nucleicos descritas en la presente descripción. El truncamiento se puede referir a alguno o a ambos extremos de los ácidos nucleicos descritos en la presente descripción. También, el truncamiento se puede referir a la secuencia interior de los nucleótidos del ácido nucleico, es decir, se puede referir a los nucleótido(s) entre el nucleótido 5' y el 3' del extremo terminal respectivamente. Además, el truncamiento comprenderá la supresión de tan solo un nucleótido único de la secuencia de los ácidos nucleicos descrita en la presente descripción. El truncamiento también se puede referir a más de una extensión de los ácido(s) nucleico(s) de la invención, donde la extensión puede ser de tan solo un nucleótido de largo. El enlace de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, de preferencia a un molécula seleccionada del grupo que comprende MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina, puede ser determinada por los expertos en el arte mediante experimentos de rutina o por el uso o adopción de un método como se describe en la presente descripción, de preferencia como se describe en la presente descripción en la parte de los ejemplos. Está incluido en una modalidad de la presente invención, a menos que se indique explícitamente lo contrario, que siempre que se mencione en la presente descripción el enlace de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención a o con MCP-1, esto también se aplica a el enlace de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención a o con cualquier molécula seleccionada del grupo que comprende MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina. Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden ser tanto D-ácidos nucleicos como L-ácidos nucleicos. De preferencia, los ácidos nucleicos de la invención son ácidos nucleicos L. Además es posible que una o varias partes del ácido nucleico están presentes como D-ácidos nucleicos o al menos una o varias partes de los ácidos nucleicos son L-ácidos nucleicos. El término "parte" de los ácidos nucleicos significará tan solo como un nucleótido. Tales ácidos nucleicos generalmente se mencionan en la presente descripción como D- y L-ácidos nucleicos, respectivamente. En consecuencia, en una modalidad particularmente preferida, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención consisten en L-nucleótidos y comprenden por lo menos un D-nucleótido. Tal D-nucleótido de preferencia se enlaza a una parte diferente de las extensiones que definen a los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, de preferencia a las partes de los mismos, donde está involucrada una interacción con otras partes del ácido nucleico. De preferencia, tal D-nucleótido está unido a un extremo terminal de cualquiera de las extensiones y de cualquier ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, respectivamente. En una modalidad preferida adicional, tales D-nucleótidos pueden actuar como un espaciador o un conector, de preferencia al unir modificaciones tales como PEG y HES a los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. También está incluido en una modalidad de la presente invención que cada una y cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos descritas en la presente descripción en su totalidad en términos de sus secuencia(s) de ácidos nucleicos están limitadas a las secuencia(s) de nucleótidos particulares. En otra palabras, los términos "que comprende" o "comprende" se interpretarán en esta modalidad en el sentido de contener o consistir en. También está incluido en la presente invención que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención son parte de un ácido nucleico más largo donde este ácido nucleico más largo comprende varias partes donde por lo menos una de estas partes es un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, o una parte del mismo. Las otras parte(s) de estos ácidos nucleicos más largos pueden ser uno o varios D-ácido(s) nucleico(s) o uno o varios L-ácido(s) nucleico(s). Se puede usar cualquier combinación en relación con la presente invención. Estas otras parte(s) del ácido nucleico más largo tanto solas como tomadas juntas, tanto en su totalidad como en una combinación particular, pueden exhibir una función que es diferente del enlace, de preferencia del enlace a MCP-1. Una función posible es permitir la interacción con otras moléculas, donde estas otras moléculas de preferencia son diferentes de MCP-1, tales como, por ejemplo, para inmovilización, reticulación, detección o amplificación. En una modalidad adicional de la presente invención los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención comprenden, como fracciones individuales o combinadas, varios de los ácidos nucleicos de la presente invención. Tal ácido nucleico que comprende a varios de los ácidos nucleicos de la presente invención también está comprendido por el término ácido nucleico más largo. Los L-ácidos nucleicos usados en la presente descripción son ácidos nucleicos que consisten en L-nucleótidos, de preferencia que consisten por completo en L-nucleótidos. Los D-ácidos nucleicos usados en la presente descripción son ácidos nucleicos que consisten en D-nucleótidos, de preferencia que consisten por completo en D-nucleótidos. Los términos ácido nucleico y molécula de ácido nucleico se usan en la presente descripción en forma indistinta si no se indica explícitamente lo contrario. Asimismo, si no se indica lo contrario, cualquier secuencia de nucleótidos se expone en la presente descripción en dirección 5' ? 3'. Con independencia de si el ácido nucleico de la invención consiste en D-nucleótidos, L-nucleótidos o una combinación de ambos, con una combinación que puede ser por ejemplo, una combinación al azar o una secuencia definida de extensiones que consisten en por lo menos un L-nucleótido y por lo menos un D-ácido nucleico, el ácido nucleico puede consistir en desoxirribonucleótido(s), ribonucleótido(s) o combinaciones de los mismos.

El diseño de ácidos nucleicos de la invención como L-ácido nucleico es ventajoso por diversas razones. Los L-ácidos nucleicos son enantiómeros de los ácidos nucleicos naturales. Los D-ácidos nucleicos, sin embargo, no son muy estables en soluciones acuosas y en particular en los sistemas biológicos o muestras biológicas debido a la extendida presencia de nucleasas. Las nucleasas naturales, en particular las nucleasas de las células animales no son capaces de degradar los L-ácidos nucleicos. Debido a esto la vida media biológica del L-ácido nucleico está significativamente aumentada en tal sistema, que incluye al cuerpo animal y humano. Debido a la falta de degradabilidad del L-ácido nucleico se generan productos de degradación no nucleasa y de este modo se observan efectos secundarios provenientes de ellos. Este aspecto delimita el L-ácido nucleico de objetivamente todos los otros compuestos que se usan en la terapia de las enfermedades y/o trastornos que involucran la presencia de MCP-1. Los L-ácidos nucleicos que se enlazan específicamente a una molécula objetivo a través de un mecanismo diferente del apareamiento de bases Watson Crick, o aptámeros que consisten en forma parcial o completa en L-nucleótidos, en particular con las partes del aptámero que están involucradas en el enlace del aptámero a la molécula objetivo, también se llaman spiegelmeros. También está incluido en la presente invención que los ácidos nucleicos de la invención, también se mencionan en la presente descripción como ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, sin tener en cuenta si están presentes como D-ácidos nucleicos, L-ácidos nucleicos o D, L-ácidos nucleicos o si estos son ADN o ARN pueden estar presentes como ácidos nucleicos de cadena simple o cadena doble. Típicamente, los ácidos nucleicos de la invención son ácidos nucleicos de cadena simple que exhiben estructuras secundarias definidas debidas a la secuencia primaria y pueden de este modo formar estructuras terciarias. Los ácidos nucleicos de la invención, sin embargo, también pueden ser de doble cadena en el sentido de que dos cadenas que son complementarias o parcialmente complementarias entre sí se hibridan entre sí. Esto confiere estabilidad al ácido nucleico que, en particular, será ventajoso si el ácido nucleico está presente en forma D más que en la forma L. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden modificar. Tales modificaciones se pueden referir al nucleótido único del ácido nucleico y son bien conocidos en el arte. Los ejemplos de tal modificación son los que se describen, entre otros en, Venkatesan (2003); Kusser (2000); Aurup (1994); Cummins (1995); Eaton (1995); Green (1995); Kawasaki (1993); Lesnik (1993); y Miller (1993). Tal modificación puede ser un átomo de H, un átomo de F o grupo O-CH3 o grupo NH2 en la posición 2' del nucleótido individual que forma parte del ácido nucleico. Asimismo, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender por lo menos un nucleótido LNA. En una modalidad el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención consiste en nucleótidos LNA. En una modalidad, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden ser un ácido nucleico multipartita. Un ácido nucleico multipartita, usado en la presente descripción, es un ácido nucleico que consiste en por lo menos dos cadenas de ácido nucleico. Estas por lo menos dos cadenas de ácido nucleico forman una unidad funcional donde la unidad funcional es un ligando de una molécula objetivo. Las por lo menos dos cadenas de ácido nucleico pueden derivar de cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención tanto por ruptura del ácido nucleico para generar dos cadenas o por síntesis de un ácido nucleico correspondiente a una primera parte de la invención, es decir, ácido nucleico total y otro ácido nucleico correspondiente a la segunda parte del ácido nucleico total. Se reconoce que se puede aplicar tanto la ruptura como la síntesis para generar un ácido nucleico multipartita donde hay más de dos cadenas como se ejemplificó anteriormente. En otras palabras, las por lo menos dos cadenas de ácido nucleico son típicamente diferentes de las dos cadenas que son complementarias y que se hibridan entre sí, si bien puede existir un cierto grado de complementariedad entre las diversas partes de ácido nucleico. Finalmente también está incluido en la presente invención que una estructura completamente cerrada, es decir, se realiza una estructura circular para los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, es decir, que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención están cerrados, de preferencia mediante un enlace covalente, donde con más preferencia tal enlace covalente se realiza entre el extremo 5' y el extremo 3' de las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente descripción .

Los presentes inventores han descubierto que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención exhiben un intervalo de variación del valor de KD muy favorable. Una posibilidad para determinar la constante de enlace es el uso del llamado dispositivo biacore, que también es conocido por los expertos en el arte. La afinidad, como se usa en la presente descripción, también se midió mediante el uso del "ensayo de unión" descrito en los ejemplos. Una medida apropiada para expresar la identidad del enlace entre el ácido nucleico de acuerdo con el objetivo, que en el presente caso es MCP-1, es el llamado valor de KD que como tal, así como también el método para su determinación, son conocidos por los expertos en el arte. Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención se caracterizan por un determinado valor de KD. De preferencia, el valor de KD mostrado por los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención es inferior a 1 µ?. Se dice que un valor de KD de aproximadamente 1 µ? es característico de un enlace no específico de un ácido nucleico a un objetivo. Como será reconocido por los expertos en el arte, el valor de KD de un grupo de compuestos tal como los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención está dentro de un intervalo de variación determinado. El valor de KD mencionado anteriormente de aproximadamente 1 µ? es un límite superior preferido para el valor de KD. El límite inferior preferido para el KD de los ácidos nucleicos que se enlazan al objetivo pueden ser aproximadamente 10 picomolar o superior. Está incluido en la presente invención que los valores de KD de los ácidos nucleicos individuales que se enlazan a MCP-1 de preferencia están dentro de este intervalo de variación. Los intervalos de variación preferidos se pueden definir eligiendo cualquier primer número dentro de este intervalo de variación y algún segundo número dentro de este intervalo de variación. Los valores superiores preferidos son 250 nM y 100 nM, los valores preferidos inferiores son 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM y 10 pM. Las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden tener cualquier longitud con la condición de que sean todavía capaces de enlazarse a la molécula objetivo. Será reconocido en el arte que estas son las longitudes preferidas de los ácidos nucleicos de acuerdo con las presentes invenciones. Típicamente, la longitud está entre 15 y 120 nucleótidos. Será reconocido por los expertos en el arte que cualquier número entero entre 15 y 120 es un longitud posible para los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Los intervalos de variación más preferidos para la longitud de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención son longitudes de aproximadamente 20 a 100 nucleótidos, aproximadamente 20 a 80 nucleótidos, aproximadamente 20 a 60 nucleótidos, aproximadamente 20 a 50 nucleótidos y aproximadamente 30 a 50 nucleótidos. Está incluido en la presente invención que los ácidos nucleicos descritos en la presente descripción comprenden una fracción que de preferencia es una fracción de alto peso molecular y/o que de preferencia permite modificar las características del ácido nucleico en términos de, entre otros, el tiempo de residencia en el cuerpo del animal, de preferencia el cuerpo humano. Una modalidad particularmente preferida de tal modificación es PEGilación y HESilación de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Como se usa en la presente descripción PEG quiere decir poli (etilenglicol) y HES para hidroxietilalmidón. La PEGilación de preferencia usada en la presente descripción es la modificación de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención donde tal modificación consiste en una fracción PEG que está unida a un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. La HESilación de preferencia usada en la presente descripción es la modificación de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención donde tal modificación consiste en una fracción HES que está unida a un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Estas modificaciones además de los procesos para modificar un ácido nucleico mediante tales modificaciones, se describen en la Solicitud de Patente Europea EP 1 306 382, cuya descripción está incorporada en su totalidad en la presente descripción como referencia. De preferencia, el peso molecular de una modificación que consiste en o comprende una fracción de alto peso molecular es aproximadamente de 2.000 a 200.000 Da, de preferencia de 20,000 a 120.000 Da, en particular en el caso de PEG es una fracción de tal peso molecular alto, y de preferencia es aproximadamente de 3.000 a 180.000 Da, con más preferencia de 5.000 a 130.000 Da, en particular en el caso de HES es una fracción de tal peso molecular alto. El proceso de modificación con HES, por ejemplo, se describe en la Solicitud de Patente Alemana DE 1 2004 006 249.8, cuya descripción está incorporada en su totalidad en la presente descripción como referencia. Está incluido en la presente invención que tanto el PEG como el HES se pueden usar como forma lineal o ramificada como se describe en las solicitudes de patente WO2005074993 y PCT/EP02/11950. Tal modificación se puede realizar, en principio, en las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención en cualquier posición del mismo. De preferencia tal modificación se realiza tanto en el nucleótido del extremo 5' -terminal y el nucleótido del extremo 3'-terminal y/o cualquier nucleótido entre el nucleótido 5' y el nucleótido 3' de la moléculas de ácidos nucleicos. La modificación y de preferencia la fracción PEG y/o HES se puede unir a la moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención tanto en forma directa como a través de un conector. También está incluido en la presente invención que la molécula de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención comprende una o más modificaciones, de preferencia uno o más fracciones PEG y/o HES. En una modalidad la molécula del conector individual se enlaza a más de una fracción PEG o fracción HES a una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El conector usado en conexión con la presente invención puede ser en sí mismo lineal o ramificado. Esta clase de conectores son conocidos por los expertos en el arte y se describen en las solicitudes de patente WO2005074993 y PCT/EP02/11950. Sin aferrarse a ninguna teoría, parece que al modificar los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención con una fracción de alto peso molecular tal como un polímero y más particularmente los polímeros descritos en la presente descripción, que de preferencia son aceptables para uso fisiológico, se modifica la cinética de excreción. Más particularmente, parece que debido al peso molecular aumentado de tales ácidos nucleicos de la invención modificados y debido a que los ácidos nucleicos no se someten al metabolismo en particular cuando están en forma L, disminuye la excreción de un cuerpo de animal, de preferencia de un cuerpo de mamífero y con más preferencia de un cuerpo humano. Ya que la excreción típicamente se produce por medio de los ríñones, los presentes inventores suponen que la velocidad de filtración glomerular del ácido nucleico modificado de este modo está significativamente reducida en comparación con los ácidos nucleicos que no tienen esta clase de modificación de alto peso molecular que produce un aumento en el tiempo de residencia en el cuerpo. En relación con el mismo es particularmente digno de mención que, a pesar de tal modificación de alto peso molecular la especificidad del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención no se afecta en una forma perjudicial. En la medida de lo posible, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención tienen características sorprendentes - que normalmente no se pueden esperar de los compuestos activos para uso farmacéutico - para que una formulación farmacéutica proporcione una liberación sostenida no se requiere necesariamente proporcionar una liberación sostenida. Más bien, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención en su forma modificada que comprende una fracción de alto peso molecular, se puede usar como tal como una formulación de liberación sostenida. En la medida de lo posible, la o las modificaciones de las moléculas de ácidos nucleicos descritas en la presente descripción y las moléculas de ácidos nucleicos modificadas de este modo y cualquier composición que comprenda ei mismo puede proporcionar una farmacocinética y biodistribución distinta, de preferencia controlada. Esto también incluye el tiempo de residencia en circulación y la distribución a los tejidos. Tales modificaciones se describen adicionalmente en la Solicitud de Patente PCT/EP02/11950. Sin embargo, también está incluido en la presente invención que los ácidos nucleicos descritos en la presente descripción no comprenden modificaciones y en particular ninguna modificación de peso molecular alto tal como PEGilación o HESilación. Tal modalidad es particularmente preferida cuando el ácido nucleico muestra la distribución preferencial a cualquier órgano o tejido objetivo del cuerpo. Los agentes del ácido nucleico con tal perfil distributivo permitirían el establecimiento de las concentraciones locales efectivas del tejido objetivo mientras se mantiene una baja concentración sistémica. Esto permitiría el uso de dosis bajas que no solo es benéfico desde un punto de vista económico, sino también reduce la exposición innecesaria de otros tejidos al agente del ácido nucleico, de este modo se reduce el riesgo potencial de efectos secundarios. Los ácidos nucleicos de la invención, que también se mencionan en la presente descripción como ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, y/o los antagonistas de acuerdo con la presente invención se pueden usar para la generación o fabricación de un medicamento. Tal medicamento o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención contiene por lo menos uno de los ácidos nucleicos de la invención, opcionalmente junto con otros compuestos activos para uso farmacéutico, donde el ácido nucleico de la invención de preferencia actúa él mismo como compuesto activo para uso farmacéutico. Tales medicamentos comprenden en las modalidades preferidas por lo menos, un vehículo aceptable para uso farmacéutico. Tal vehículo puede ser, por ejemplo, agua, regulador, PBS, solución de glucosa, de preferencia una solución equilibrada con sal de glucosa al 5%, almidón, azúcar, gelatina o cualquier otra sustancia vehículo aceptable. Tales vehículos generalmente son conocidos por los expertos en el arte. Será reconocido por los expertos en el arte cualquiera de las modalidades, usos y aspectos o relacionados al medicamento de la presente invención es también aplicable a la composición farmacéutica de la presente invención y viceversa. La indicación, las enfermedades y los trastornos para el tratamiento y/o prevención, para los cuales los ácidos nucleicos, las composiciones farmacéuticas y medicamentos de acuerdo con o preparados de acuerdo con la presente invención, provienen de la participación, tanto directa como indirecta, de la MCP-1 en el mecanismo patogenético respectivo. Sin embargo, estas indicaciones, enfermedades y trastornos también se pueden tratar y prevenir en el mecanismo patogenético en el cual participan MCP-2, MCP-3, MCP-4 y/o la eotaxina en forma directa o indirecta. Es obvio para los expertos en el arte que en particular estos ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención se pueden usar en la medida de lo posible, es decir, para las enfermedades que involucran en el sentido más amplio a la MCP-2, MCP-3, MCP-4 y la eotaxina, las cuales interactúan y se enlazan, respectivamente a o con MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina, respectivamente. Más específicamente, tales usos surgen, entre otros, del patrón de expresión de MCP-1 que sugiere que cumple funciones importantes en las enfermedades humanas que se caracterizan por la infiltración de células mononucleares. Tal infiltración de células está presente en muchas enfermedades inflamatorias y autoinmunes. En modelos animales, se ha demostrado que la MCP-1 se expresa en el cerebro después de la isquemia focal (Kim 1995; Wang 1995) y durante la encefalomielitis autoinmune experimental (Hulkower 1993; Ransohoff 1993; Banisor 2005). La MCP-1 puede ser una quimiocina importante que se dirige a las células mononucleares en el proceso de la enfermedad ilustrado por estos modelos animales, tales como el accidente cerebrovascular y la esclerosis múltiple. Un gran conjunto de evidencias argumenta a favor de un papel único del eje MCP-1/CCR2 en la quimiotaxis de monocitos y de este modo la inflamación crónica: (i) Los ratones deficientes en MCP-1 o CCR2 muestran una respuesta quimiotáctica de macrófagos extremadamente reducida mientras que por otra parte parecen normales (Kuziel 1997; Kurihara 1997; Boring 1997; Lu 1998). (ii) A pesar de la redundancia funcional con otras quimiocinas in vitro, la pérdida de función efectora de MCP-1 sola es suficiente para alterar la circulación monocítica en varios modelos inflamatorios (Lloyd 1997; Furuichi 2003; Egashira 2002; Galasso 2000; Ogata 1997; Kennedy 1998; Gonzalo 1998; Kitamoto 2003). (iü) Los niveles de MCP-1 se elevan en muchas enfermedades inflamatorias. En efecto, se considera que la MCP-1 cumple una función en muchas enfermedades con y sin un componente inflamatorio obvio tal como la artritis reumatoide (Koch 1992; Hosaka 1994; Akahoshi 1993; Harigai 1993; Rollins 1996), enfermedad renal (Wada 1996; Viedt 2002), restenosis después de la angioplastia (Economou 2001), alergia y asma (Alam 1996; Holgate 1997; Gonzalo 1998), cáncer (Salcedo 2000; Gordillo 2004), aterosclerosis (Nelken 1991; Yla- Herttuala 1991; Schwartz 1993; Takeya 1993; Boring 1998), psoriasis (Vestergaard 2004), inflamación del sistema nervioso (Huang 2001), dermatitis atópica (Kaburagi 2001), colitis (Okuno 2002), endometriosis (Jolicoeur 2001), uveítis (Tuaillon 2002), trastornos retiñíanos (Nakazawa 2007), fibrosis pulmonar idiopática y sarcoidosis (lyonaga 1994) y polimiositis/dermatomiositis (De Bleecker 2002). La intervención terapéutica con agentes anti-MCP- -o antagonistas de CCR2- debería afectar el exceso de circulación de monocitos inflamatorios pero puede disminuir la circulación basal de fagocitos, de este modo evita la inmunosupresión general y el riesgo aumentado de infecciones (Dawson 2003). Además, sobre la base del creciente conocimiento de los mecanismos moleculares del proceso inflamatorio y la interacción de los mediadores de la inflamación secretados localmente, se han identificado nuevos objetivos para la terapia de las enfermedades renales (Holdsworth 2000; Segerer 2000). Uno de estos objetivos, para los cuales existen datos rigurosos de estudios de expresión e intervención con antagonistas específicos en modelos animales apropiados, es la MCP-1. Esta proteína tiene un papel ampliamente no superfluo en el reclutamiento de células inmunes para los sitios de inflamación renal. Se considera que la infiltración de células inmunes al riñón es un mecanismo principal de daño estructural renal y deterioro de la función renal en el desarrollo de diversas formas de enfermedad renal. Todos los tipos de células renales pueden expresar quimiocinas que incluyen a la MCP-1 después de la estimulación in vitro (Segerer 2000); existe una larga lista de estímulos que desencadenan la expresión de MCP-1 in vitro que incluye a las citocinas, radicales oxígeno, complejos inmunes y mediadores de lípidos. En ríñones sanos de ratas y ratones, no se expresa la MCP-1, pero se regula ascendentemente fácilmente durante el curso de la inflamación renal aguda y crónica en los modelos de roedores que incluyen la glomerulonefritis de complejos inmunes, glomerulonefritis progresiva rápida, glomerulonefritis proliferativa, nefropatía diabética, nefropatía obstructiva o necrosis tubular aguda (Segerer 2000; Anders 2003). Los datos de expresión para MCP-1 en roedores se correlacionan bien con la expresión respectiva hallada en biopsias renales humanas (Rovin 1994; Cockwell 1998; Wada 1999). Además, la expresión renal en ríñones humanos se asocia con la actividad de la enfermedad y disminuye cuando la terapia apropiada indujo la remisión de la enfermedad (Amann 2003). La infiltración de células mononucleares glomerulares se asocia con el desarrollo de una glomeruloesclerosis difusa en pacientes con nefropatía diabética. La MCP-1 cumple un papel importante en el reclutamiento y acumulación de monocitos y linfocitos dentro del glomérulo (Banba 2000; Morii 2003). La MCP-1 producida en forma local parece estar particularmente involucrado en la iniciación y progresión del daño túbulo-intersticial, documentado en experimentos mediante ratones transgénicos con nefritis inducida por suero nefrotóxico (NSN). La MCP-1 fue detectada principalmente en las células endoteliales vasculares, las células epiteliales tubulares y las células infiltradas mononucleares en las lesiones intersticiales. La activación mediada por MCP-1 de las células epiteliales tubulares es compatible con la idea de que la MCP-1 contribuye a la inflamación túbulo-intersticial, un marcador de enfermedad renal progresiva (Wada 2001; Viedt 2002). Debido a la homología entre la MCP-1 por un lado y las MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina por el otro lado, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, por lo menos algunos de estos que interactúan o se enlazan a MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina, respectivamente, típicamente se pueden usar para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de cualquier enfermedad en la que MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina, respectivamente, están involucradas en forma directa o indirecta. Involucrado como se usa de preferencia en la presente descripción, significa que si se impide a la molécula respectiva que está involucrada en la enfermedad, ejercer una, varias o todas sus funciones en relación con el mecanismo patogenético subyacente a la enfermedad, la enfermedad se curará disminuirá el grado de la misma o se evitará el comienzo de la misma; por lo menos los síntomas o algún indicador de tal enfermedad será aliviado y mejorado, respectivamente, de modo que los síntomas e indicador, respectivamente, son idénticos o próximos a los que se observan en un sujeto que no sufre de la enfermedad o no está en riesgo de desarrollar tal enfermedad. Naturalmente, debido a que los ácidos nucleicos de enlace a MCP-1 de acuerdo con la presente invención interactúan con o se enlazan a MCP-1 humana o murina, un experto generalmente entenderá que los ácidos nucleicos de enlace a MCP-1 de acuerdo con la presente invención se pueden usar con facilidad para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de cualquier enfermedad de seres humanos y animales descrita en la presente descripción. Estos miembros de la familia de proteínas quimiotácticas de monocitos (MCP), es decir, MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina de este modo comparten un alto grado de semejanza de secuencia con la MCP-1. Si bien no exclusivamente, las eotaxina, MCP-2, -3, y -4 interactúan por medio de CCR3, el receptor de quimiocina característico de los eosinófilos humanos (Heath 1997). El receptor CCR3 se regula por aumento en condiciones neoplásicas, tales como linfoma de células T cutáneo (Kleinhans 2003), glioblastoma (Kouno 2004), o carcinoma de células renales (Johrer 2005). Más específicamente, los niveles aumentados de eotaxina se asocian directamente con el diagnóstico de asma y función pulmonar comprometida (Nakamura 1999). Se ha observado la expresión elevada de eotaxina en los sitios de inflamación alérgica tanto de asmáticos atópicos como de no atópicos (Ying 1997; Ying 1999). También, los ARNm que codifican a MCP-2 y -4 se expresan en forma constitutiva en una variedad de tejidos; sus funciones fisiológicas en estos contextos, sin embargo, son desconocidos. Los niveles plasmáticos de MCP-2 está elevados en la sepsis junto con la MCP-1 (Bossink 1995); la expresión de MCP-3 se produce en asmáticos (Humbert 1997). Finalmente, la MCP-4 se puede hallar en al superficie luminal de los vasos ateroscleróticos (Berkhout 1997). Por consiguiente, la enfermedad y/o trastornos y/o condiciones enfermas para el tratamiento y/o prevención de la cual se puede usar el medicamento de acuerdo con la presente invención incluyen, pero sin limitación a enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, encefalomielitis autoinmune, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple aguda y crónica, inflamación crónica, artritis reumatoide, enfermedades renales, restenosis, restenosis después de la angioplastia, reacciones alérgicas aguda y crónica, reacciones inmunológicas y alérgicas primarias y secundarias, asma, conjuntivitis, bronquitis, cáncer, aterosclerosis, insuficiencia cardíaca cardiovascular arteriosclerótica o accidente cerebrovascular, psoriasis, artritis psoriática, inflamación del sistema nervioso, dermatitis atópica, colitis, endometriosis, uveítis, trastornos retiñíanos que incluyen degeneración macular, desprendimiento de retina, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, retinitis pigmentaria, vitreorretinopatía proliferativa y coriorretinopatía serosa central; fibrosis pulmonar idiopática, sarcoidosis, polimiositis, dermatomiositis, anulación de la inmunosupresión, reducción del riesgo de infección, sepsis, inflamación renal, glomerulonefritis, glomerulonefritis progresiva rápida, glomerulonef itis proliferativa, nefropatía diabética, nefropatía obstructiva, necrosis, tubular aguda y glomeruloesclerosis difusa, lupus eritematoso sistémico, bronquitis crónica, enfermedad de Behget, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), ateroesclerosis prematura después de la enfermedad de Kawasaki, Infarto de miocardio, obesidad, enfermedad hepática crónica, enfermedad de Peyronie, lesión de médula espinal aguda, trasplante de pulmón o riñon, miocarditis, enfermedad de Alzheimer y neuropatía, carcinoma de mama, carcinoma gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, hamartoma, carcinoma colorrectal, adenoma colónico, pancreatitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y enfermedades intestinales inflamatorias tales como enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa. En una modalidad adicional, el medicamento comprende un agente activo para uso farmacéutico adicional. Tales compuestos activos para uso farmacéutico adicionales son, entre otros pero sin limitación a los mismos, los conocidos para controlar la presión arterial y diabetes tales como inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) y bloqueadores del receptor de angiotensina. El compuesto activo para uso farmacéutico adicional puede ser, en una modalidad adicional, también uno de los compuestos que reducen la infiltración de células inmunes en los sitios de inflamación crónica o generalmente suprimen la respuesta inmune exuberante que está presente en los estados inflamatorios crónicos y que conducen al daño tisular. Tales compuestos pueden ser, pero sin limitación, esteroides o supresores inmunológicos y de preferencia se seleccionan del grupo que comprende a corticoides como prednisona, metilprednisolona, hidrocortisona, dexametasona e inmunosupresores generales tales como ciclofosfamida, ciclosporina, clorambucilo, azatioprina, tacrolimus o micofenilato de mofetilo. Adicionalmente, los bloqueadores más específicos de la coestimulación de las células T, por ejemplo, bloqueadores de CD154 o CD40 o CD28 o CD86 o CD80; o agentes de reducción de células T- y/o B como un agente anti-CD20 son útiles en modalidades adicionales. Finalmente, el agente activo para uso farmacéutico puede ser un modulador de la actividad de cualquier otra quimiocina que puede ser un agonista o antagonista de quimiocina o un agonista o un antagonista del receptor de quimiocina. En forma alternativa o adicional, tal agente activo para uso farmacéutico es un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención adicional. Alternativamente, el medicamento comprende por lo menos un ácido nucleico más que se enlaza a una molécula objetivo diferente de MCP-1 o exhibe una función que es diferente de uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Está incluido en la presente invención que el medicamento se usa en forma alternativa o adicional, en principio, para la prevención de cualquiera de las enfermedades descritas en relación con el uso del medicamento para el tratamiento de dichas enfermedades. Los marcadores respectivos, en consecuencia, es decir, para las enfermedades respectivas son conocidos 'por los expertos en el arte. De preferencia, el marcador respectivo es la MCP-1. En forma alternativa o adicional, el marcador respectivo se selecciona del grupo que comprende MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina. Un grupo adicional de marcadores se selecciona del grupo que comprende a anticuerpos autorreactivos en el plasma, tal como, por ejemplo, anticuerpos anti-ADNsd o factor reumatoide. En una modalidad del medicamento de la presente invención, tal medicamento es para usar en combinación con otros tratamientos para cualquiera de las enfermedades descritas en la presente descripción, en particular aquellas en las que se usa el medicamento de la presente invención. "Terapia de combinación" (o "co-terapia") incluye la administración de un medicamento de la invención y por lo menos un segundo agente como parte de un régimen de tratamiento específico para proporcionar el efecto benéfico a partir de la co-acción de estos agentes terapéuticos, es decir, el medicamento de la presente invención y dicho segundo agente. El efecto benéfico de la combinación incluye, pero sin limitación a la co-acción farmacocinética o farmacodinámica resultante de la combinación de agentes terapéuticos. La administración de estos agentes terapéuticos en combinación se realiza típicamente durante un período de tiempo determinado (usualmente minutos, horas, días o semanas dependiendo de la combinación seleccionada). "Terapia de combinación" puede, pero generalmente no pretende abarcar a la administración de dos o más de estos agentes terapéuticos como parte de regímenes de monoterapias separadas que en forma incidental y arbitraria produce las combinaciones de la presente invención. "Terapia de combinación" pretende abarcar la administración de estos agentes terapéuticos en forma sucesiva, o sea, donde cada agente terapéutico se administra en un tiempo diferente, así también como la administración de estos agentes terapéuticos, o por lo menos dos de los agentes terapéuticos, en una forma sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea se puede lograr, por ejemplo, por la administración a un sujeto de una cápsula única que tiene una proporción fija de cada agente terapéutico o en múltiples cápsulas únicas, para cada uno de los agentes terapéuticos. La administración en forma sucesiva o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico se puede efectuar por cualquier vía apropiada que incluye, pero sin limitación a vías tópicas, vías orales, vías intravenosas, vías intramusculares y absorción directa a través de las membranas mucosas de los tejidos. Los agentes terapéuticos se pueden administrar por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, se puede administrar un primer agente terapéutico de la combinación seleccionada por inyección mientras que los otros agentes terapéuticos de la administración se pueden administrar por vía tópica. Alternativamente, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos se pueden administrar por vía tópica o todos los agentes terapéuticos se pueden administrar por inyección. La secuencia en que se administran los agentes terapéuticos no es rigurosamente crítica a menos que se indique lo contrario. "Terapia de combinación" también puede abarcar la administración de los agentes terapéuticos como se describió anteriormente en otra combinación con otros componentes biológicamente activos. Cuando la terapia de combinación además comprende un tratamiento sin fármacos, el tratamiento sin fármacos se puede realizar en cualquier momento adecuado siempre que se obtenga un efecto benéfico a partir de la co-acción de la combinación de los agentes terapéuticos y el tratamiento sin fármacos. Por ejemplo, en casos apropiados, el efecto beneficioso se obtiene cuando el tratamiento sin fármacos se elimina temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, quizás por días o incluso por semanas. Como se describió en términos generales anteriormente, el medicamento de acuerdo con la presente invención se puede administrar, en principio, en cualquier forma conocida para los expertos en el arte. Una vía preferida de administración es la administración sistémica, con más preferencia por vía parenteral, de preferencia por inyección. Alternativamente, el medicamento se puede administrar en forma local. Otras vías de administración comprenden la vía intramuscular, intraperitoneal, y subcutánea, por boca, intranasal, intratraqueal o pulmonar de preferencia dada para la vía de administración que es la menos invasiva, mientras que garantiza eficiencia. La administración parenteral generalmente se usa para las inyecciones e infusiones subcutáneas, intramusculares o intravenosas. Adicionalmente, un método para la administración parenteral emplea la implantación de sistemas de liberación lenta o liberación sostenida, que asegura que se mantenga un nivel constante de dosis, estos son bien conocidos por los expertos en el arte. Además, los medicamentos preferidos de la presente invención se pueden administrar en forma intranasal por uso tópico vehículos intranasales adecuados, inhalantes, o por vías transdérmicas, mediante las formas de parches cutáneos transdérmicos bien conocidos por los expertos en el arte. Para administrarse en forma de un sistema de aplicación transdérmica, la administración de la dosis será, naturalmente, continua más que intermitente a lo largo del régimen de dosis. Otras preparaciones tópicas preferidas incluye cremas, ungüentos, lociones, aspersiones en aerosol y gels, donde la concentración del elemento activo típicamente variará de 0,01% a 15%, peso/peso o peso/volumen. El medicamento de la presente invención generalmente comprenderá una cantidad efectiva del o los componentes activos de la terapia, que incluyen pero sin limitación, a moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención, disueltas o dispersas en un medio aceptable para uso farmacéutico. Los medios o vehículos aceptables para uso farmacéutico incluyen algunos y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónico y retardadores de la absorción y similares. El uso de tales medios y agentes para las sustancias activas para uso farmacéutico es bien conocido en el arte. Los componentes activos suplementarios también se pueden incorporar en el medicamento de la presente invención.

En un aspecto adicional la presente invención se refiere a una composición farmacéutica. Tal composición farmacéutica comprende por lo menos uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención y de preferencia un vehículo aceptable para uso farmacéutico. Tal vehículo puede ser cualquier vehículo o cualquier aglutinante usado y/o conocido en el arte. Más particularmente tal aglutinante o vehículo es cualquier vehículo o aglutinante descrito en relación con la fabricación del medicamento descrito en la presente descripción. En una modalidad adicional, la composición farmacéutica comprende un agente activo para uso farmacéutico adicional. La preparación de un medicamento y una composición farmacéutica será conocida por los expertos en el arte a la luz de la presente descripción. Típicamente, tales composiciones se pueden preparar como inyectables, tanto como soluciones o suspensiones líquidas; formas sólidas adecuadas para la formar soluciones, o suspensiones, líquidas previas a la inyección; como comprimidos u otras formas sólidas para la administración oral; como cápsulas de liberación con el tiempo; o en cualquier otra forma usada habitualmente, que incluye gotas oculares, cremas, lociones, ungüentos, inhaladores y similares. También puede ser particularmente útil el uso de formulaciones estériles, tales como lavados basados en sales, por los cirujanos, los médicos o los trabajadores de la salud para tratar un área particular en el campo de operación. Las composiciones también se pueden administrar por medio de microdispositivos, micropartículas o esponja. Después de la formulación, se administrará un medicamento en una forma compatible con la formulación de la dosis y en tal proporción es efectivo para uso farmacológico. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de las formas de dosis, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármaco y similares. En este contexto, la cantidad de componente activo y volumen de la composición administrada depende del individuo o el sujeto tratado. Las cantidades específicas del compuesto activo requerido para la administración dependen del criterio del profesional y son particulares para cada individuo. Generalmente se utiliza un volumen mínimo del medicamento requerido para dispersar los compuestos activos. Los regímenes adecuados para la administración son también variables, pero se deben tipificar por la administración inicial del compuesto y el control de los resultados y luego se aplican las dosis controladas en intervalos adicionales. Por ejemplo, para la administración oral en forma de un comprimido o una cápsula (por ejemplo, una cápsula de gelatina), el componente del fármaco activo, es decir, una moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención y/o cualquier otro agente activo para uso farmacéutico, también mencionado en la presente descripción como agente(s) terapéutico(s) o compuesto(s) activo(s) se puede combinar con un vehículo inerte, no tóxico, aceptable para uso farmacéutico oral tal como etanol, glicerol, agua y similares. Además, cuando se desee o sea necesario también se pueden incorporar aglutinantes, lubricantes, agentes desintegrantes y agentes colorantes adecuados en la mezcla. Los aglutinantes adecuados incluyen a almidón, silicato de magnesio aluminio, pasta de almidón, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona, azúcares naturales tales como glucosa o beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como acacia, tragacanto o alginato de sodio, polietilenglicol, ceras y similares. Los lubricantes usados en estas formas de dosificación incluyen al oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, sílice, talco, ácido esteárico, su sal de magnesio o calcio y/o polietilenglicol y similares. Los desintegrantes incluyen, sin limitación, almidón, metil celulosa, agar, bentonita, almidones de goma xantano, agar, ácido algínico o su sal de sodio, o mezclas efervescentes y similares. Los diluyentes incluyen, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina. El medicamento de la invención también se puede administrar en formas de dosificación orales tales como comprimidos o cápsulas de liberación con el tiempo y liberación sostenida, pastillas, polvos, gránulos, elixires, tinturas, suspensiones, jarabes y emulsiones. Los supositorios se preparan en forma ventajosa a partir de emulsiones o suspensiones grasas.

La composición farmacéutica o medicamento se puede esterilizar y/o contener adyuvantes, tales como agentes conservantes, estabilizadores, humectantes o emulsionantes, promotores de solución, sales para regular la presión osmótica y/o reguladores. Además, éstos pueden contener otras sustancias terapéuticamente valiosas. Las composiciones se preparan de acuerdo con los métodos convencionales de mezcla, granulación o recubrimiento, y típicamente contienen aproximadamente 0,1% a 75%, de preferencia aproximadamente 1% a 50%, del componente activo. Las composiciones líquidas, en particular las inyectables, por ejemplo, se pueden preparar por disolución, dispersión, etc. El compuesto activo se disuelve o mezcla con un solvente puro para uso farmacéutico tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol, y similares, para formar de este modo la solución o suspensión inyectable. Adicionalmente, se pueden formular formas sólidas adecuadas para la disolución en líquido antes de la inyección. Para las composiciones sólidas, los excipientes incluyen en un grado para uso farmacéutico manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. El compuesto activo definido anteriormente, también se puede formular como supositorios, mediante por ejemplo, polialquilen-glicoles, por ejemplo, propilen- glicol, como el vehículo. En algunas modalidades, los supositorios se preparan en forma ventajosa a partir de emulsiones o suspensiones grasas. Los medicamentos y las moléculas de ácidos nucleicos, respectivamente, de la presente invención, también se pueden administrar en la forma de sistemas de liberación de liposomas, tales como pequeñas vesículas unilaminares, grandes vesículas unilaminares y vesículas multitaminares. Los liposomas se pueden formar a partir de una variedad de fosfolípidos, que contienen colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas. En algunas modalidades una película de componentes de lípidos se hidrata con una solución acuosa del fármaco para formar una capa de lípido que encapsula al fármaco, el cual es bien conocido por los expertos en el arte. Por ejemplo, las moléculas de ácidos nucleicos descritas en la presente descripción se pueden proporcionar como un complejo con un compuesto lipofílico o no inmunogénico, compuesto de alto peso molecular construido mediante métodos conocidos en el arte. Adicionalmente, los liposomas pueden portar tales moléculas de ácidos nucleicos en su superficie para identificar y transportar agentes citotóxicos en forma interna para mediar la destrucción de celular. Un ejemplo de complejos asociados con ácidos nucleicos se proporciona en la Patente Estadounidense No.6.011.020. Los medicamentos y moléculas de ácidos nucleicos, respectivamente, de la presente invención también se pueden acoplar con polímeros solubles como vehículos del fármaco identificables. Tales polímeros pueden incluir polivinil-pirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropil-metacrilamida-fenol, polihidroxietil-aspanamidofenol o polietilen-óxido-polil-lisina sustituida con residuos de palmitoílo. Además, los medicamentos y moléculas de ácidos nucleicos, respectivamente, de la presente invención se pueden acoplar a una clase de polímeros biodegradables útiles para obtener la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, poli-épsilon-capro-lactona, ácido polihidroxi butírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianocrilatos y copolímeros en bloque reticulados o antipáticos de hidrogels. Si se desea, la composición farmacéutica y medicamento, respectivamente, administrados también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores del pH y otras sustancias tales como por ejemplo, acetato de sodio y oleato de trietanolamina. El régimen de dosificación que usa las moléculas del ácido nucleico y medicamentos, respectivamente, de la presente invención se selecciona de acuerdo con una variedad de factores que incluye tipo, especies, edad, peso, sexo y condición médica del paciente; la gravedad de la condición tratada; la vía de administración; la función renal y hepática del paciente; y el aptámero particular o su sal empleados. Un médico o veterinario experto fácilmente puede determinar y prescribir la cantidad efectiva del fármaco requerida para evitar, contrarrestar o detener el avance de la condición.

Los niveles plasmáticos efectivos del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención de preferencia varían de 500 fM a 500 µ en el tratamiento de cualquiera de las enfermedades descritas en la presente descripción. Las moléculas de ácidos nucleicos y los medicamentos, respectivamente, de la presente invención de preferencia se pueden administrar en una dosis única, cada dos o tres días, semanalmente, cada dos semanas, en una única dosis mensual o cada tres meses. Se incluye en la presente invención que el medicamento descrito en la presente descripción constituye la composición farmacéutica descrita en la presente descripción. En un aspecto adicional la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de un sujeto que necesita tal tratamiento, donde el método comprende la administración de una cantidad activa para uso farmacéutico de por lo menos uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. En una modalidad, el sujeto sufre de una enfermedad o está en riesgo de desarrollar tal enfermedad, donde la enfermedad es alguna de estas descritas en la presente descripción, en particular alguna de estas enfermedades en relación con el uso de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención para la fabricación de un medicamento. Se considera que se pueden usar el ácido nucleico además de los antagonistas de acuerdo con la presente invención no solo como un medicamento o para la fabricación de un medicamento, sino también con propósitos cosméticos, en particular con respecto a la participación de la MCP-1 en las lesiones cutáneas regionales inflamadas. En consecuencia, una afección o enfermedad adicional para cuyo tratamiento o prevención se puede usar el ácido nucleico, el medicamento y/o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, es en las lesiones cutáneas regionales inflamadas. De preferencia en la presente descripción se usa un agente de diagnóstico o medio de diagnóstico adecuado para detectar, tanto en forma directa como indirecta a la MCP-1, de preferencia la MCP-1 descrita en la presente descripción y con más preferencia MCP-1 descrita en la presente descripción en relación con los diversos trastornos y enfermedades descritas en la presente descripción. Sin embargo, en la medida que las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención también se enlazan a cualquiera, alguna o todas las MCP-2, MCP-3, MCP-4 y eotaxina, tales moléculas de ácidos nucleicos también se pueden usar para el diagnóstico de enfermedades y trastornos, respectivamente, el mecanismo patogenético está directa o indirectamente relacionado o asociado con la sobreexpresión o sobreactividad con MCP-2, MCP-3, MCP-4 y/o eotaxina. El diagnóstico es adecuado para la detección y/o seguimiento de cualquiera de los trastornos y enfermedades, respectivamente, descritos en la presente descripción. Tal detección es posible a través del enlace de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención a la MCP-1. Tal unión se puede detectar en forma directa o indirecta. Los métodos y medios respectivos son conocidos por los expertos en el arte. Entre otros, los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden comprender una marca que permite la detección de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, de preferencia el ácido nucleico unido a MCP-1. Tal marca de preferencia se selecciona del grupo que comprende marcas radioactiva, enzimática y fluorescente. En principio, todos los ensayos conocidos desarrollados para anticuerpos se pueden adoptar para los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención mientras que el anticuerpo que se enlaza al objetivo se sustituye con un ácido nucleico que se enlaza al objetivo. En los ensayos de anticuerpos mediante anticuerpos que se enlazan al objetivo no marcado, la detección de preferencia se realiza por un anticuerpo secundario que está modificado con marcas radiactiva, enzimática y fluorescente y se enlazan al anticuerpo que se enlaza al objetivo en su fragmento Fe. En el caso de un ácido nucleico, de preferencia un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico se modifica con tal marca, donde de preferencia tal marca se selecciona del grupo que comprende a biotina, Cy-3 y Cy-5, y tal marca se detecta por un anticuerpo dirigido contra tal marca, por ejemplo, un anticuerpo anti- biotina, un anticuerpo anti-Cy3 o un anticuerpo anti-Cy5 o - en el caso que la marca sea biotina - la marca se detecta con estreptavidina o avidina que se enlaza naturalmente a biotina. Tal anticuerpo, estreptavidina o avidina a su vez de preferencia está modificado con una marca respectiva, por ejemplo, una marca radioactiva, enzimática o fluorescente (como un anticuerpo secundario) . En una modalidad adicional las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención se detectan o analizan por un segundo medio de detección, donde dicho segundo medio de detección es una baliza molecular. La metodología de la baliza molecular es conocida por los expertos en el arte. Brevemente, las sondas de ácidos nucleicos que también se mencionan como balizas moleculares, son un complemento inverso de la muestra de ácidos nucleicos que se va a detectar y se hibridan a causa de esto a una parte de la muestra de ácido nucleico que se va a detectar. Después del enlace a la muestra de ácido nucleico los grupos fluoróforos de la baliza molecular se separan, lo que produce un cambio de la señal de fluorescencia, de preferencia un cambio de intensidad. Este cambio se correlaciona con la cantidad de ácidos nucleicos presente en la muestra. Será reconocido que la detección de la MCP-1 mediante los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención permitirá en particular la detección de la MCP-1 definida en la presente descripción. En relación con la detección de la MCP-1, un método preferido comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una muestra que se examinará para determinar la presencia de la MCP-1, (b) proporcionar un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, (c) hacer reaccionar la muestra con el ácido nucleico, de preferencia en un recipiente de reacción donde el paso (a) se puede realizar antes del paso (b), o el paso (b) se puede realizar antes del paso (a). En una modalidad preferida se proporciona un paso adicional (d), que consiste en la detección de la reacción de la muestra con el ácido nucleico. De preferencia, el ácido nucleico del paso (b) se inmoviliza en una superficie. La superficie puede ser la superficie de un recipiente de reacción tal como un tubo de reacción, un pocilio de una placa, o la superficie de un dispositivo contenido en tal recipiente de reacción tal como, por ejemplo, una cuenta. La inmovilización del ácido nucleico en la superficie se puede realizar por cualquiera de los medios conocidos por los expertos en el arte que incluyen, pero sin limitación, a uniones no covalentes o covalentes. De preferencia, el enlace se establece por medio de un enlace químico covalente entre la superficie y el ácido nucleico. Sin embargo, también está incluido en la presente invención que el ácido nucleico se inmovilice en forma indirecta a una superficie, donde tal inmovilización indirecta involucra el uso de un componente adicional o un par de compañeros de interacción. Tal componente adicional de preferencia es un compuesto que interactúa específicamente con el ácido nucleico inmovilizado, el cual también se menciona como compañero de interacción y de este modo media el enlace del ácido nucleico a la superficie. El compañero de interacción de preferencia se selecciona del grupo que comprende ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y anticuerpos. De preferencia, el compañero de interacción es un anticuerpo, con más preferencia un anticuerpo monoclonal. Alternativamente, el compañero de interacción es un ácido nucleico, de preferencia un ácido nucleico funcional. Gon más preferencia tal ácido nucleico funcional se selecciona del grupo que comprende a aptámeros, spiegelmeros y ácidos nucleicos que son por lo menos parcialmente complementarios con el ácido nucleico. En una modalidad alternativa adicional, el enlace del ácido nucleico a la superficie está mediada por un compañero de interacción multiparte. Tal compañero de interacción multiparte de preferencia es un par de compañeros de interacción que consisten en un primer miembro y un segundo miembro, donde el primer miembro está compuesto por o unido al ácido nucleico y el segundo miembro está comprendido por la superficie. El compañero de interacción multiparte de preferencia se selecciona del grupo de pares de compañeros de interacción que comprenden biotina y avidina, biotina y estreptavidina, y biotina y neutravidina. De preferencia, el primer miembro del par de compañero de interacción es biotina. Un resultado preferido de tal método es la formación de un complejo inmovilizado de CP-1 y el ácido nucleico, donde con más preferencia se detecta dicho complejo. Está incluido en una modalidad que a partir del complejo se detecte la MCP-1. Un medio de detección respectivo que cumple con este requisito es, por ejemplo, cualquier medio de detección que es específico para esta/estas parte(s) de la MCP-1. Un medio de detección particularmente preferido es un medio de detección que se selecciona del grupo que comprende a ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y anticuerpos, cuya generación es conocida por los expertos en el arte. El método para la detección de la MCP-1 también comprende que la muestra sea eliminada del recipiente de reacción que de preferencia se ha usado para realizar el paso (c). El método comprende en una modalidad adicional también el paso de inmovilización del compañero de interacción de la MCP-1 sobre una superficie, de preferencia un superficie como la definida anteriormente, donde el compañero de interacción es el definido en la presente descripción y de preferencia como se indicó anteriormente en relación con el método respectivo y con más preferencia comprende ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y anticuerpos en sus diversas modalidades. En esta modalidad, un medio de detección particularmente preferido es un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, donde tal ácido nucleico de preferencia puede estar marcado o no marcado. En el caso de que el ácido nucleico esté marcado, puede detectarse en forma directa o indirecta. Tal detección también puede incluir el uso de un segundo medio de detección que, de preferencia, también se selecciona del grupo que comprende ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y modalidades de las diversas modalidades descritas en la presente descripción. Tales medios de detección son de preferencia específicos para el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. En una modalidad más preferida el segundo medio de detección es una baliza molecular. Tanto el ácido nucleico o el segundo medio de detección o ambos pueden comprender en una modalidad preferida una marca de detección. La marca de detección de preferencia se selecciona del grupo que comprende biotina, una marca de bromo-desoxiuridina, una marca de digoxigenina, una marca de fluorescencia, una marca UV, una radiomarca y una molécula quelante. Alternativamente, el segundo medio de detección interactúa con la marca de detección que de preferencia está contenida, comprendida o unida al ácido nucleico. Las combinaciones particularmente preferidas son las siguientes: la marca de detección es biotina y el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra biotina, o donde la marca de detección es biotina y el segundo medio de detección es una avidina o una molécula que porta avidina, o donde la marca de detección es biotina y el segundo medio de detección es una estreptavidina o una molécula que porta estreptavidina, o donde la marca de detección es biotina y el segundo medio de detección es una neutravidina o una molécula que porta neutravidina, o donde la marca de detección es una bromo-desoxiuridina y el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra bromo- desoxiuridina, o donde la marca de detección es una digoxigenina y el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra digoxigenina, o donde la marca de detección es un quelante y el segundo medio de detección es un radionucleido, donde se prefiere que dicha marca de detección este unida al ácido nucleico. Se debe reconocer que esta clase de combinación también es aplicable a la modalidad en la que el ácido nucleico está unido a la superficie. En tal modalidad se prefiere que la marca de detección esté unida al compañero de interacción. Finalmente, también está incluido en la presente invención que el segundo medio de detección se detecta mediante un tercer medio de detección, de preferencia el tercer medio de detección es una enzima, con más preferencia que muestra una reacción enzimática después de la detección del segundo medio de detección, o el tercer medio de detección es un medio para detectar radiación, con más preferencia radiación emitida por un radionucleido. De preferencia, el tercer medio de detección es detectar y/o interactuar específicamente con el segundo medio de detección. También en la modalidad con un compañero de interacción de la MCP-1 que esta inmovilizada en una superficie y el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención de preferencia se agrega el complejo formado entre el compañero de interacción y la MCP-1, la muestra se puede retirar de la reacción, con más preferencia del recipiente de reacción donde se realizan el paso (c) y/o (d). En una modalidad el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención comprende una fracción de fluorescencia y donde la fluorescencia de la fracción de fluorescencia es diferente después de la formación del complejo entre el ácido nucleico y MCP-1 y MCP-1 libre. En una modalidad adicional el ácido nucleico es un derivado del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, donde el derivado del ácido nucleico comprende por lo menos un derivado fluorescente de adenosina que reemplaza adenosina. En una modalidad preferida el derivado fluorescente de adenosina es etenoadenosina. En una modalidad adicional el complejo consiste en el derivado del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y la MCP-1 se detecta mediante fluorescencia. En una modalidad del método, una señal se crea en el paso (c) o paso (d) y de preferencia la señal se correlaciona con la concentración de la MCP-1 de la muestra. En un aspecto preferido, los ensayos se pueden realizar en placas de 96 pocilios, donde los componentes se inmovilizan en los recipientes de reacción descritos anteriormente y los pocilios actúan como recipientes de reacción. Será reconocido por los expertos en el arte que lo dicho anteriormente también se aplica a la MCP-2, MCP-3, MCP-4 y/o eotaxina, por lo menos en la medida que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención también se unan a o con MCP-2, MCP-3, MCP-4 y/o eotaxina.

El ácido nucleico de la invención se puede usar adicionalmente como material de partida para el diseño del fármaco. Básicamente hay dos métodos posibles. Un método es la selección de bibliotecas de compuestos siempre que tales bibliotecas de compuestos de preferencia sean bibliotecas de compuestos de bajo peso molecular. En una modalidad, la selección es una selección de alto rendimiento. De preferencia, una selección de alto rendimiento es la evaluación eficiente y rápida por ensayo y error de los compuestos en una prueba basada en el objetivo. En el mejor caso los análisis se llevan a cabo por una medición colorimétrica. Las bibliotecas usadas en relación con los mismos son conocidas en el arte. Alternativamente, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se puede usar para el diseño racional de fármacos. De preferencia, el diseño racional de fármacos es el diseño de una estructura guía de fármacos. Se parte de la estructura tridimensional del objetivo que generalmente está identificada por métodos tales como cristalografía de rayos X o espectroscopia de resonancia magnética nuclear, se usan programas de computación para buscar a través de las bases de datos que contienen las estructuras de muchos compuestos químicos diferentes. La selección se hace por una computadora, los compuestos identificados posteriormente se ensayan en el laboratorio. El diseño racional de fármacos puede iniciarse a partir del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención e involucra una estructura, de preferencia una estructura tridimensional, que es similar a la estructura de los ácidos nucleicos de la invención o idénticos a las partes que median el enlace de la estructura de los ácidos nucleicos de la invención. En cualquier caso, tal estructura todavía muestra la misma o similar unión característica de los ácidos nucleicos de la invención. En un paso adicional o como un paso alternativo en el diseño racional de fármacos, de preferencia la estructura tridimensional de estas partes de los ácidos nucleicos que se enlazan al neurotransmisor son imitadas por grupos químicos que son diferentes de los nucleótidos y ácidos nucleicos. Por este mimetismo se puede diseñar un compuesto diferente de los ácidos nucleicos. Tales compuestos de preferencia es una pequeña molécula o un péptido. En el caso de la selección de bibliotecas de compuestos, tal como por medio de ensayos competitivos que son conocidos en las artes, se pueden hallar análogos de MCP-1 , agonistas de CP-1 o antagonistas de MCP-1 apropiados. Tales ensayos competitivos se pueden ejecutar de la siguiente manera. El ácido nucleico de la invención, de preferencia un spiegelmero que es un ácido nucleico L que se enlaza al objetivo, se acopla a una fase sólida. Para identificar los análogos de MCP-1 marcados se puede agregar MCP- 1 al ensayo. Un análogo potencial debería competir con las moléculas de MCP-1 que se enlazan al spiegelmero que se debería acompañar con una disminución de la señal obtenida por la marca respectiva. La selección de agonistas o antagonistas puede involucrar el uso de un ensayo de cultivo de células conocido por los expertos en el arte. El kit de acuerdo con la presente invención puede comprender por lo menos uno o varios de los ácidos nucleicos de la invención. Adicionalmente, el kit puede comprender por lo menos uno o varios controles positivos o negativos. Un control positivo, por ejemplo, puede ser MCP-1, en particular uno contra el cual se selecciona el ácido nucleico de la invención o al cual se enlaza, de preferencia, en una forma líquida. Un control negativo puede ser, por ejemplo, un péptido que se define en términos de propiedades biofísicas similares a la MCP-1, pero que no es reconocido por los ácidos nucleicos de la invención. Además, dicho kit puede comprender uno o varios reguladores. Los diversos componentes pueden estar contenidos en el kit en forma seca o liofilizada o disuelta en líquido. El kit puede comprender uno o varios recipientes que a su. vez pueden contener uno o varios componentes del kit. En una modalidad adicional, el kit comprende instrucciones o un folleto instructivo que proporciona la información al usuario sobre cómo se usa el kit y sus diversos componentes. La determinación farmacéutica y bioanalítica del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es en forma elemental para la evaluación de su perfil farmacocinético y biodinámico en diversos humores, tejidos y órganos del cuerpo humano y no humano. Para tal propósito, se pueden usar cualquiera de los medios de detección descritos en la presente descripción o conocidos por los expertos en el arte. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un ensayo de hibridación sándwich para la detección del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. En el ensayo de detección se usan una sonda de captura y una sonda de detección. La sonda de captura es complementaria con la primera parte y la sonda de detección con la segunda parte del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Tanto la sonda de captura como la de detección, se pueden formar por nucleótidos de ADN, nucleótidos de ADN modificados, nucleótidos de ARN modificados, nucleótidos de ARN, nucleótidos LNA y/o nucleótidos de PNA. En consecuencia, la sonda de captura comprende una extensión de secuencia complementaria con el extremo 5' del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y la sonda de detección comprende una extensión de secuencia complementaria con el extremo 3' del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. En este caso la sonda de captura está inmovilizada una superficie o matriz por medio de su extremo 5' donde la sonda de captura puede estar inmovilizada directamente a su extremo 5' o por medio de un conector entre su extremo 5' y la superficie o matriz. Sin embargo, en principio el conector se puede unir a cada nucleótido de la sonda de captura. El conector puede estar formado por conectores hidrof ílicos conocidos por los expertos en el arte o por nucleótidos de D-ADN, nucleótidos de D-ADN modificados, nucleótidos de D- ARN, nucleótidos de D-ARN modificados, nucleótidos de D-LNA, nucleótidos de PNA, nucleótidos de L-ARN, nucleótidos de L-ADN, nucleótidos de L-ARN modificados, nucleótidos de L-ADN modificados y/o nucleótidos de L-LNA. Alternativamente, la sonda de captura comprende una extensión de secuencia complementaria con el extremo 3' del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y la sonda de detección comprende una extensión de secuencia complementaria con el extremo 5' del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. En este caso la sonda de captura está inmovilizada una superficie o matriz por medio de su extremo 3' donde la sonda de captura puede estar inmovilizada directamente a su extremo 3' o por medio de un conector entre su extremo 3' y la superficie o matriz. Sin embargo, en principio el conector se puede unir a cada nucleótido de la extensión de secuencia complementaria con el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El conector puede estar formado por conectores hidrof (lieos conocidos por los expertos en el arte o por nucleótidos de D-ADN, nucleótidos de D-ADN modificados, nucleótidos de D-ARN, nucleótidos de D-ARN modificados, nucleótidos de D-LNA, nucleótidos de PNA, nucleótidos de L-ARN, nucleótidos de L-ADN, nucleótidos de L-ARN modificados, nucleótidos de L-ADN modificados y/o nucleótidos de L-LNA. El número de nucleótidos de la sonda de captura y de detección que puede hibridar al ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es variable y puede depender de la cantidad de nucleótidos de la sonda de captura y/o de detección y/o el ácido nucleico mismo de acuerdo con la presente invención. El número total de nucleótidos de la sonda de captura y de detección que puede hibridar al ácido nucleico de acuerdo con la presente invención deberá ser el número máximo de nucleótidos que están comprendidos por el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El número mínimo de nucleótidos (2 a 10 nucleótidos) de la sonda de detección y de captura deberá permitir la hibridación en el extremo 5' o 3', respectivamente, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Para obtener alta especificidad y selectividad entre el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y otros ácidos nucleicos que aparecen en las muestras analizadas, el número total de nucleótidos de la sonda de captura y de detección deberá ser el número máximo de nucleótidos que están comprendidos por el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Además la sonda de detección de preferencia porta una molécula marcadora o marca que se puede detectar como se describió previamente en la presente descripción. La marca o molécula marcadora en principio puede unirse a cada nucleótído de la sonda de detección. De preferencia, la marca o molécula marcadora se ubica en el extremo 5' o extremo 3' de la sonda de detección, donde se puede insertar un conector entre los nucleótidos de la sonda de detección que son complementarios con el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y la marca. El conector se puede formar por conectores hidrof ílicos conocidos en el arte o por nucleótidos de D-ADN, nucleótidos de D-ADN modificados, nucleótidos de D-ARN, nucleótidos de D-ARN modificados, nucleótidos de D-LNA, nucleótidos de PNA, nucleótidos de L-ARN, nucleótidos de L-ADN, nucleótidos de L-ARN modificados, nucleótidos de L-ADN modificados y/o nucleótidos de L-LNA. La detección del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo de la siguiente manera: El ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se híbrida con un o de sus extremos a la sonda de captura y con el otro extremo a la sonda de detección. Después de eliminar la sonda de detección no unida, por ejemplo, por uno o varios pasos de lavado. La cantidad de sonda de detección unida, de preferencia que porta una marca o molécula marcadora, se puede medir posteriormente. Como se usa de preferencia en la presente descripción, en una modalidad preferida el término tratamiento comprende la prevención y/o seguimiento en forma adicional o alternativa. Como se usa de preferencia en la presente descripción, los términos de enfermedad y trastorno se usarán en forma indistinta, si no se indica lo contrario. Como se usa en la presente descripción, el término comprende de preferencia no pretende limitar el contenido seguido o descrito por tal término. Sin embargo, en una modalidad alternativa el termino comprende se entenderá en el sentido de contener y de este modo como una limitación al contenido seguido o descrito por tal término. Las diversas SEQ.ID. Nos., la estructura química de las moléculas del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y las moléculas objetivo MCP- usadas en la presente descripción, la secuencia real de la misma y el número de referencia interno se sintetiza en la siguiente tabla.

OI O OI O OI en en o en o en Ti o en o tn en en o en o en en O en o en en en OI C7I en O en o en en o en o en en o a? o n en en o en o en en o en o La presente invención está ilustrada adicionalmente por las figuras, ejemplos y el listado de secuencias de las cuales se pueden tomar rasgos, modalidades y ventajas, donde la Figura 1 muestra un alineamiento de secuencias de ligandos de ARN relacionados enlazados a MCP-1 humana que indica el motivo de secuencia ("Tipo 1A") que es en una modalidad preferida en su totalidad esencial para el enlace a la MCP-1 humana; la Figura 2 muestra un alineamiento de secuencias de ligandos de ARN relacionados enlazados a MCP-1 humana que indica el motivo de secuencia ("Tipo 1B") que es en una modalidad preferida en su totalidad esencial para el enlace con MCP-1 humana y derivados de ligandos de ARN 180-D1-002; la Figura 3 muestra un alineamiento de secuencias de ligandos de ARN relacionados enlazados a MCP-1 humana que indica el motivo de secuencia ("Tipo 2") que es en una modalidad preferida en su totalidad esencial para el enlace a la MCP-1 humana; la Figura 4 muestra un alineamiento de secuencias de ligandos de ARN relacionados enlazados a MCP-1 humana que indica el motivo de secuencia ("Tipo 3") que es en una modalidad preferida en su totalidad esencial para el enlace a la MCP-1 humana; la Figura 5 muestra derivados de ligandos de ARN 178-D5 y 181-A2 (ligandos de ARN de la MCP-1 humana del motivo de secuencia "Tipo 3"); la Figura 6 muestra un alineamiento de secuencias de ligandos de ARN relacionados enlazados a MCP-1 humana que indica el motivo de secuencia ("Tipo 4") que es en una modalidad preferida en su totalidad esencial para el enlace a la MCP-1 humana (otras secuencias); la Figura 7 muestra una tabla de secuencias de varios ligandos diferentes de ARN que se enlazan a la MCP-1 humana que no puede ser relacionada con los motivos de secuencia de enlace a MCP-1"Tipo 1A", "Tipo 1B"; "Tipo 2", "Tipo 3" o "Tipo 4"; la Figura 8 muestra alineamientos de derivados de ligandos de ARN 188-A3-001 y de 189-G7-001 que se enlazan a la MCP-1 o murina; la Figura 9 muestra el resultado de los análisis de enlace del aptámero D-NOX-E36 a D-MCP-1 biotinilada humana a temperatura ambiente y 37°C, representado como el enlace del aptámero sobre la concentración de la D-MCP-1 biotinilada humana; la Figura 10 muestra el resultado de los análisis de enlace del aptámero D-mNOX-E36 a la D-MCP-1 biotinilada murina a 37°C, representado como el enlace del aptámero sobre la concentración de la D-MCP-1 biotinilada murina; la Figura 11 muestra la liberación de Ca++ inducida por MCP-1 en células THP-1, mientras que se obtuvo una curva de dosis respuesta para la MCP-1 humana, los que indica una concentración efectiva media (EC50) de aproximadamente 3 nM, representado como la diferencia en fluorescencia con el objetivo sobre la concentración de MCP-1 humana; la Figura 12 muestra la eficacia del Spiegelmero NOX-E36 en un ensayo de liberación de calcio; las células se estimularon con 3 nM de MCP-1 humana preincubada a 37°C con diversas cantidades de Spiegelmero NOX-E36, representado como porcentaje de control sobre la concentración de NOX-E36; la Figura 13 muestra la eficacia del Spiegelmero mNOX-E36 en un ensayo de liberación de calcio; las células se estimularon con 5 nM de MCP-1 murina preincubada a 37°C con diversas cantidades de Spiegelmero mNOX-E36, representado como porcentaje de control sobre la concentración de mNOX-E36; la Figura 14 muestra la quimiotaxis inducida por la MCP-1 humana de las células THP-1 mientras que después de 3 horas de migración de las células THP-1 hacia diversas concentraciones de MCP-1 se obtuvo una curva de dosis respuesta para la MCP-1, representado como factor X de aumento en comparación con el control sobre la concentración de la MCP-1 humana; la Figura 15 muestra la eficacia del Spiegelmero NOX-E36 en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia 0,5 nM de MCP-1 humana preincubada a 37°C con diversas proporciones de Spiegelmero NOX-E36, representado como porcentaje de control sobre la concentración de Spiegelmero NOX-E36; la Figura 16 muestra la eficacia del Spiegelmero mNOX-E36 en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia 0.5 nM MCP-1 murina preincubada a 37°C con diversas proporciones de Spiegelmero NOX-E36, representado como porcentaje de control sobre la concentración de Spiegelmero mNOX-E36; la Figura 17 muestra el sensograma de Biacore 2000 que indica el valor de KD del Spiegelmero NOX-E-36 que se une a la MCP-1 humana que estaba inmovilizada en un chip sensor PioneerFI por el procedimiento de acoplamiento de amina, representado como respuesta (UR) sobre tiempo; la Figura 18 muestra el sensograma de Biacore 2000 que indica el valor de KD del Spiegelmero NOX-E-36 a las proteínas de la familia MCP humana (huMCP-1, huMCP-2, huMCP-3) y eotaxina humana, que estaban inmovilizadas por el procedimiento de acoplamiento de amina en un PioneerFI y un chip sensor CM4, respectivamente, representado como respuesta (UR) sobre tiempo; la Figura 19 muestra el sensograma de Biacore 2000 que indica el enlace de del Spiegelmero NOX-E36 a la MCP-1 de especies diferentes (MCP-1 canina, MCP-1 de mono, MCP-1 humana, MCP-1 porcina, MCP-1 de conejo, MCP-1 de ratón, MCP-1 de rata) mientras que diferentes formas de MCP-1 se inmovilizaron por el procedimiento de acoplamiento de aminas PioneerFI y chips sensores CM4, respectivamente, representado como respuesta (UR) sobre tiempo; la Figura 20 muestra el sensograma de Biacore 2000 que indica el valor de KD del Spiegelmero 181-A2-018 que se une a la MCP-1 humana que estaba inmovilizada en un chip sensor CM4 por el procedimiento de acoplamiento de aminas, representado como respuesta (UR) sobre tiempo; la Figura 21 muestra el sensograma de Biacore 2000 que indica el enlace del Spiegelmero 181-A2-018 a las proteínas de la familia de MCP (huMCP-1, huMCP-2, huMCP-3) y eotaxina humana que estaban inmovilizadas por el procedimiento de acoplamiento de aminas a PioneerFI y un chip sensor CM4, respectivamente, representado como respuesta (UR) sobre tiempo; la Figura 22 muestra el sensograma de Biacore 2000 que indica el enlace del Spiegelmero 181-A2-018 a la MCP-1 de especies diferentes (MCP-1 canina, MCP-1 de mono, MCP-1 humana, MCP-1 porcina, MCP-1 de conejo, MCP-1 de ratón, MCP-1 de rata) mientras que diferentes formas de MCP-1 se inmovilizaron por el procedimiento de acoplamiento de aminas PioneerFI y chips sensores CM4, respectivamente, representado como respuesta (UR) sobre tiempo; la Figura 23 muestra un alineamiento Clustal W de la MCP-1 de diferentes especies de mamíferos además de la MCP-2, MCP-3, y eotaxina humana (Solo posiciones 1-76); la Figura 24A muestra una tabla que sintetiza la especificidad de enlace de NOX-E36 y 181-A2-018 con respecto a la MCP-1 de diferentes especies de mamíferos además de la MCP-2, MCP-3, y eotaxina humana; la Figura 24B muestra una tabla que sintetiza la selectividad de NOX-E36 determinada por análisis Biacore donde NOX-E36 biotinilado estaba inmovilizado en la superficie del chip sensor y se analizó el enlace de un panel de diversas quimiocinas CC y CXC a la NOX-E36; la Figura 24C muestra el análisis de cinética de NOX-E36 que interactúa con las quimiocinas determinadas por el análisis Biacore donde las quimiocinas estaban inmovilizadas en forma covalentes en la superficie de un chip sensor CM5 y se inyectaron diversas concentraciones de NOX-E36 y se analizó el comportamiento del enlace NOX-E36s mediante el programa de computación BiaEvaluation; la Figura 24D muestra la curva dosis respuesta de la quimiotaxis de la estimulación de las células THP-1 con MIP-1c¡ con una concentración efectiva media de aproximadamente 0,2 nM; la Figura 24E muestra la inhibición de la quimiotaxis inducida de MIP-1a por NOX-E36. NOX-E36 no tuvo influencia sobre la quimiotaxis inducida por MIP-1 aMIP1 de las células THP-1; la Figura 25 muestra la eficacia del Spiegelmero NOX-E36-3'-PEG en un ensayo de liberación de calcio; las células se estimularon con 3 nM de MCP-1 humana preincubada a 37°C con diversas cantidades de Spiegelmero NOX-E36-3'-PEG, representado como porcentaje de control sobre la concentración de Spiegelmero NOX- E36-3'-PEG; la Figura 26 muestra la eficacia del Spiegelmero NOX-E36-3'- PEG en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia 0,5 nM de MCP-1 humana preincubada a 37°C con diversas cantidades de Spiegelmero NOX-E36-3'-PEG, representado como porcentaje de control sobre la concentración de NOX-E36-3'-PEG; la Figura 27A muestra la eficacia del Spiegelmero NOX-E36-5'- PEG en un ensayo de liberación de calcio; las células se estimularon con 3 nM de MCP-1 humana preincubada a 37°C con diversas cantidades de Spiegelmero NOX-E36-5'-PEG, representado como porcentaje de control sobre la concentración de Spiegelmero NOX-E36-5'-PEG; la Figura 27B muestra la eficacia del Spiegelmero NOX-E36-5'-PEG en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia 0,5 nM de MCP-1 humana preincubada a 37°C con diversas cantidades de Spiegelmero NOX-E36-5'-PEG, representado como porcentaje de control sobre la concentración de Spiegelmero NOX-E36-5'-PEG; la Figura 28 muestra la liberación de Ca++ inducida por la MCP-1 murina en las células THP-1, mientras que se obtuvo una curva de dosis respuesta para la MCP-1 murina, que indica una concentración efectiva media (EC50) de aproximadamente 5 nM, representado como diferencia de fluorescencia del objetivo sobre la concentración de MCP-1 murina; la Figura 29 muestra la eficacia de la anti-MCP-1 murina para el Spiegelmero mNOX-E36-3'-PEG en un ensayo de liberación de calcio; las células se estimularon con 3 nM de MCP-1 murina preincubada a 37°C con diversas cantidades de Spiegelmero mNOX- E36-3'-PEG, representado como porcentaje de control sobre la concentración de Spiegelmero mNOX-E36-3'-PEG; la Figura 30 muestra la quimiotaxis inducida por la MCP-1 murina de las células THP-1 mientras que después de 3 horas de la migración de las células THP-1 hacia diversas concentraciones de mMCP-1 se obtuvo una curva de dosis respuesta para mMCP-1, representado como X veces de aumento en comparación con el control sobre la concentración de MCP-1 murina; la Figura 31 muestra la eficacia de la anti-MCP-1 murina del Spiegelmero mNOX-E36-3'-PEG en un ensayo de quimiotaxis; las células se dejaron migrar hacia 0,5 nM de MCP-1 murina preincubada a 37°C con diversas cantidades de Spiegelmero mNOX-E36-3'-PEG, representado como porcentaje de control sobre la concentración de Spiegelmero mNOX-E36-3'-PEG anti-murina; la Figura 32 muestra el sensograma de Biacore 2000 que indica el valor de KD del aptámero D-mNOX-E36 de enlace a la D-MCP-1 murina que estaba inmovilizada en el chip sensor PioneerFI por el procedimiento de acoplamiento de aminas, representado como respuesta (UR) sobre tiempo; la Figura 33 muestra el sensograma de Biacore 2000 que indica el enlace del aptámero D-mNOX-E36 a la D-MCP-1 humana y D-MCP- 1 murina mientras que las dos formas diferentes de la D-MCP-1 estaban inmovilizadas por el procedimiento de acoplamiento de aminas PioneerFI y chips sensores CM4, respectivamente, representado como respuesta (UR) sobre tiempo; la Figura 34 muestra las secciones renales de ratones de 24 semanas MRLlpr"pr, coloreados con ácido peryódico de Schiff (PAS), anticuerpos para Mac-2 (macrófagos) y CD3 (células T) indicados; las imágenes son representativas para 7-12 ratones en cada grupo (aumento original PAS: x 100, insertos PAS: x 400, Mac2: x 400, CD3: x 100; la Figura 35 muestra una tabla que ilustra los parámetros de función renal y hallazgos clínicos de los diferentes grupos de ratones MRLlpr"p' de 24 semanas; la Figura 36 muestra la cuantificación de cambios histológicos por morfometría realizada en secciones teñidas con plata de ratones de todos los grupos; A, índice de volumen intersticial; B, índice de dilatación tubular, y C, índice de daño celular tubular se calcularon como porcentaje de campo eléctrico alto y se expresan como media ± SEM; la Figura 37 muestra la supervivencia de los ratones MRLlpr lpr de los diversos grupos de tratamiento calculado como análisis de Kaplan-Meier; la Figura 38 muestra la expresión de ARNm renal para las quimiocinas CC CCL2 y CCL5 determinado por RT-PCR de tiempo real mediante ARN renal total combinado de 5 ratones de cada grupo donde los niveles de ARN se expresan por la expresión de ARNr 18S respectiva; la Figura 39 muestra la reducción de patología pulmonar por el tratamiento con mNOX-E36-3'PEG; el tejido de pulmón se preparó a partir de todos los grupos de 24 semanas y se clasificaron en forma semicuantitativa; el tratamiento con mNOX-E36 y mNOX-E36-3'PEG redujo la inflamación peribronquiolar en ratones MRLlpr lpr; las imágenes son representativas de 7-11 ratones de cada grupo; aumento original x 100; la Figura 40 muestra las manifestaciones de lupus cutáneo de los ratones MRLlpr/lpr de 24 semanas que aparecen generalmente en el área facial o del cuello (ratón izquierdo) que fueron menos comunes en ratones tratados con Spiegelmero anti-mCCL2 (ratón derecho) ; la Figura 41 muestra los hallazgos séricos e histológicos de los ratones MRLlpr/,pr de 24 semanas; la Figura 42 muestra la farmacocinética de los Spiegelmero anti-mCCL2 pegilados y no pegilados en plasma durante el estudio, indicado como concentración plasmática del Spiegelmero mNOX-E36 en función del tiempo; la Figura 43 muestra la citometría de flujo para CCR2 en médula ósea y sangre periférica de ratones MRLlpr/lpr de 24 semanas tratados con vehículo o mNOX-E36-3'PEG; los datos se muestran como la media del porcentaje de las células CCR2 positivas ± SEM tanto en medula ósea como en sangre periférica en 5 ratones de cada grupo; la Figura 44 muestra los niveles de CCL2 sérico en PoC-PEG- (barras blancas) y ratones 1K db/db tratados con mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-P) (barras negras) determinado por ELISA en diferentes puntos de tiempo como se indica; los datos son medias ± SEM; *, p < 0.05 mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-P) vs. PoC-PEG; la Figura 45 muestra el número de células Mac-2 y Ki-67 positivas infiltradas en los glomérulos y el intersticio de los ratones db/db no tratados o tratados con POC-PEG o más que mNOX-E36-3'PEG; la Figura 46 muestra la glomeruloesclerosis diabética en ratones db/db de 6 meses; las secciones renales de los ratones de los diferentes grupos se colorearon con ácido peryódico de Schiff y 15 glomérulos de cada sección renal se clasificaron por el grado de glomeruloesclerosis; las imágenes muestran glomérulos representativos clasificados con los puntajes respectivos indicados, aumento original 400 x; el gráfico ilustra el porcentaje medio de cada puntaje ± SEM de todos los ratones de cada grupo (n = 7 - 10); *, p < 0,05 para ratones 1K db/db tratados con mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-P) vs. PoC-PEG (PoC-P); la Figura 47 muestra la velocidad de filtración glomerular (GFR) de ratones 1K db/db de 6 meses tratados con mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-P) y PoC-PEG (PoC-P); la GFR se determinó por la cinética de depuración de FITC-inulina de los grupos de ratones 1K db/db tratados con PoC-PEG y mNOX-E36-3'PEG al final del estudio; la Figura 48 muestra la atrofia tubular y el volumen intersticial de ratones db/db de 6 meses; las imágenes de secciones renales teñidas con plata ilustran los ríñones representativos de los grupos respectivos (aumento original 100x); los valores representan las medias ± SEM del índice del análisis morfométrico de 7 - 10 ratones de cada grupo; *, p < 0,05 ratones 2K db/db vs. BKS tipo salvaje; , p < 0,05 ratones db/db 1K vs, 2K; †, p < 0,05 ratones 1K db/db tratados con mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-PEG) vs. PoC-PEG; la Figura 49 muestra la expresión de ARNm renal de CCL2 de los ratones db/db determinado por RT-PCR en tiempo real del ARN renal total combinado de 6 - 10 ratones de cada grupo; los niveles de ARNm para cada grupo de ratones se expresan por la expresión de ARNr 18 S respectiva; y la Figura 50 muestra la expresión de CCL2 espacial en ríñones de ratones db/db determinados por inmunotinción; las imágenes ilustran secciones representativas de ríñones de ratones de 6 meses de los grupos respectivos indicados (aumento original, 200 x).

Ejemplo 1: Ácidos nucleicos que se enlazan a la MCP-1 humana Mediante D-MCP-1 biotinilada humana como objetivo, varios ácidos nucleicos que se enlazan a la MCP-1 podrían generar las secuencias de nucleótidos que se representan en las Figuras 1 a 7. Los ácidos nucleicos se caracterizaron en el aptámero, es decir, el nivel de D-ácido nucleico mediante ensayos competitivos o de enlace directos con D-MCP-1 biotinilada humana (Ejemplo 4) o en el nivel del Spiegelmero, es decir, el L-ácido nucleico con la configuración natural de la MCP-1 (L-MCP) por la medición de la resonancia del plasmón superficial mediante un instrumento Biacore 2000 (Ejemplo 7), un ensayo in vitro de liberación de Ca++ del cultivo celular (Ejemplo 5), o un ensayo de quimiotaxis in vitro (Ejemplo 6). Las moléculas de ácidos nucleicos generadas de este modo exhiben diferentes motivos de secuencias, los cuatro tipos I 19 principales se definen en las Figuras 1 y 2 (Tipo 1A / 1B), Fig. 3 (Tipo 2), Figuras 4 y 5 (Tipo 3), y Fig. 6 (Tipo 4). Los ácidos nucleicos de enlace a la MCP-1 adicionales que no se pueden relacionar entre sí y con los motivos de secuencias diferentes descritos en la presente memoria, se enumeran en la Figura 7. Para la definición de los motivos de la secuencia de nucleótidos, se usan las abreviaturas IUPAC para los nucleótidos ambiguos: s fuerte G o C; w débil A o U; R purina G o A; Y pirimidina C o U; K ceto G o U; M imino A o C; B no A C o U o G; D no C A o G o U; H no G A o C o U; V no U A o C o G; N total A o G o C o U Si no se indica lo contrario, cualquier secuencia de ácido nucleico o secuencias de extensiones y cuadros, respectivamente, se indica en la dirección 5' ? 3'. Ácidos nucleicos Tipo 1A de enlace a MCP-1 (Fig. 1) Como se ilustra en la Figura 1 todas las secuencias de ácidos nucleicos de Tipo 1A que se enlazan a MCP-1 comprenden varias extensiones de secuencias o cuadros donde los cuadros |B1 A] y )B1 B son las extensiones terminales 5'- y 3' que se pueden hibridar entre sí. Sin embargo, tal hibridación no se da necesariamente en la molécula como se presenta realmente en condiciones fisiológicas. Los cuadros B2, B3, B4, B5 y el Cuadro B6 están flanqueados por el Cuadro |B A| y Cuadro |B1 B Los ácidos nucleicos se caracterizaron en el nivel aptámero, es decir, el nivel de D-ácido nucleico mediante ensayos de unión directos y competitivos con D-MCP-1 biotinilada humana para clasificarlos con respecto a su comportamiento de enlace (Ejemplo 4). Las secuencias seleccionadas se sintetizaron como Spiegelmero (Ejemplo 3) y se ensayaron mediante la configuración natural de la MCP-1 (L-MCP) en un ensayo de liberación de Ca++ in vitro del cultivo celular (Ejemplo 5). Las secuencias de los cuadros definidos pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos de Tipo 1A que se enlazan a MCP-1 que influencian la afinidad de enlace a la MCP-1. Sobre la base del análisis del enlace de diferentes ácidos nucleicos que se enlazan a MCP-1 sintetizados como ácidos nucleicos Tipo 1A de enlace a MCP-1, los cuadros [B 1 Aj, B2, B3, B4, |B5,| B6 y |B1 B| y sus secuencias de nucleótidos descritas a continuación son individualmente y con más preferencia en su totalidad esenciales para el enlace a la MCP- 1 : los cuadros B1A B1B son las extensiones de los extremos terminales 5' y 3' que se pueden hibridar entre sí; donde IBI Al es lAGCRUGl, con preferencia |AGCGUGl; y donde es !CRYGCUl, con preferencia jCACGCU • Cuadro B2, que es CCCGGW, con preferencia CCCGGU; • Cuadro B3, que es GUR, con preferencia GUG; • Cuadro B4, que es RYA, con preferencia GUA; • Cuadro ;B5j, que es G G G G GRC GCGÁYC, con preferencia GGGGGGCGCGACC ; • Cuadro B6, que es UGCAAUAAUG o URYAWUUG, con preferencia UACAUUUG; Como se ilustra en la Figura 1, la moléculas de ácidos nucleicos mencionada como 176-E10trc tiene la mejor afinidad con la MCP-1 (como aptámero en el ensayo de unión con una KD de 5 nM además de como Spiegelmero con una IC50 de 4 - 5 nM en el ensayo de liberación de Ca++ in vitro del cultivo celular) y en consecuencia puede constituir la óptima secuencia y la combinación óptima de los elementos de secuencia [B 1 A|, B2, 83, B4, B5, B6 y |B 1 B Acidos nucleicos Tipo 1B de enlace a MCP-1 (Fig. 2) Como se ilustra en la Figura 2 todas las secuencias de ácidos nucleicos de Tipo 1B que se enlazan a MCP-1 comprenden varias extensiones de secuencias o cuadros donde los cuadros ]B1 A| y |B1 B son las extensiones terminales 5'- y 3' que se pueden hibridar entre sí y los cuadros B2, B3, B4, ¡B5j y el Cuadro B6 están flanqueados por el Cuadro |B1 A| y Cuadro |B 1 B|. Sin embargo, tal hibridación no se da necesariamente en la molécula como se presenta realmente en condiciones fisiológicas.

Los ácidos nucleicos se caracterizaron en el nivel aptámero, mediante ensayos de unión directos y competitivos con D-MCP-1 biotinilada humana para clasificarlos con respecto a su comportamiento de enlace (Ejemplo 4). Las secuencias seleccionadas se sintetizaron como el Spiegelmero (Ejemplo 3) y se ensayaron mediante la configuración natural de la MCP-1 (L-MCP) en un ensayo de liberación de Ca++ in vitro del cultivo celular (Ejemplo 5). Las secuencias de los cuadros definidos pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos de Tipo 1B que se enlazan a MCP-1 que influencian la afinidad de enlace a la MCP-1. Sobre la base del análisis del enlace de diferentes ácidos nucleicos que se enlazan a MCP-1 sintetizados como ácidos nucleicos Tipo 1B que se enlazan a MCP-1, los cuadros |B 1 A|, B2, B3, B4, ,B5, B6 y ¡B B| y sus secuencias de nucleótidos descritas a continuación son individualmente y con más preferencia en su totalidad esenciales para el enlace a la MCP-1: Cuadros |B 1 Aj y |B1 B| que se pueden hibridar entre sí; donde |B1 A| es |AGYRUG|, con preferencia |AGCGUG|; y donde es CAYRCUl, con preferencia jCACGCU Cuadro B2., que es CCAGCU o CCAGY, con preferencia CCAGU; Cuadro 83, que es GUG; Cuadro B4, que es AUG; Cuadro :B5j, que es ÍGGGGGGCGCG • Cuadro B6, que es CAUUUUA o CAUUUA, con preferencia CAUUUUA; Como se ilustra en la Figura 2, el ácido nucleico mencionado como 176-C9trc tiene la mejor afinidad con la MCP-1 (como aptámero en el ensayo de unión con una K0 de 5 nM además de como Spiegelmero con una IC50 de 4 - 5 nM en el ensayo de liberación de Ca*+ in vitro del cultivo celular) y en consecuencia puede constituir la óptima secuencia y la combinación óptima de los elementos de secuencia |B 1 A|, B2, B3, B4, ¡B5J B6 y |B1 B Acidos nucleicos Tipo 2 de enlace a MCP-1 (Fig. 3) Como se ilustra en la Figura 3 todas las secuencias de Tipo 2 comprenden varias extensiones de secuencias o cuadros donde los cuadros |B1 A| y [B1 B| son las extensiones terminales 5'- y 3' que se pueden hibridar entre sí y el cuadro B_2 es el elemento de secuencia central. Sin embargo, tal hibridación no se da necesariamente en la molécula como se presenta realmente en condiciones fisiológicas. Los ácidos nucleicos se caracterizaron en el nivel aptámero, mediante ensayos de unión directos y competitivos con D-MCP-1 biotinilada humana para clasificarlos con respecto a su comportamiento de enlace (Ejemplo 4). Las secuencias seleccionadas se sintetizaron como el Spiegelmero (Ejemplo 3) y se ensayaron mediante la configuración natural de la MCP-1 (L-MCP) en un ensayo de liberación de Ca++ in vitro del cultivo celular (Ejemplo 5) en ensayos de quimiotaxis in vitro (Ejemplo 6).

Las secuencias de los cuadros definidos pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos de Tipo 2 que se enlazan a MCP-1 que influencian la afinidad de enlace a la MCP-1. Sobre la base del análisis del enlace de diferentes ácidos nucleicos que se enlazan a MCP-1 sintetizados como ácidos nucleicos Tipo 2 que se enlazan a MCP-1, los cuadros |B 1 A|, B2, y |B1 B| y sus secuencias de nucleótidos descritas a continuación son individualmente y con más preferencia en su totalidad esenciales para el enlace a la MCP-1: cuadros |B1 A| y |B 1 B|, extensiones terminales 5'- y 3' que pueden hibridar entre sí; donde |B1 A] es |ACGCA| y |B1 B| es |UGCGU l o B1 A| es |CGCA| y |B 1 Bj es |UGCG|, o |B1 A| es |GCA| y |B1 B| es |UGCG UGC|; con preferencia |B1 A| es |GCA| y [B1 B| es |UGCG • Cuadro B2, CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC. con preferencia CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC Como se ilustra en la Figura 3, el ácido nucleico mencionado como 180-D1-002 además de los derivados de 180-D1-002 como 180-D1-011, 180-D1-012, 180-D1-035, y 180-D1-036 (= NOX-E36) tienen la mejor afinidad con la MCP-1 como aptámero en el ensayo de unión con una KD < 1 nM y en consecuencia puede constituir la óptima secuencia y la combinación óptima de los elementos de secuencia |B 1 A|, B2, y |B1B Para una molécula de ácidos nucleico D-NOX-E36 (D-180-D1- 036; SEQ.ID No. 159), se determinó una constante de disociación (KD) de 890 ± 65 pM a temperatura ambiente (TA) y de 146 ± 13 pM a 37°C (Ejemplo 4; Fig. 9). El Spiegelmero NOX-E36 respectivo (180-D1-036; SEQ.ID No. 37) exhibió una concentración inhibitoria (IC50) de 3 - 4 nM en un ensayo de liberación de Ca+* in vitro (Ejemplo 5; Fig. 12) y de aproximadamente 0,5 nM en un ensayo de quimiotaxis in vitro (Ejemplo 6; Fig. 15). Para los derivados PEGilados de NOX-E36, NOX-E36-3'PEG y NOX-E36-5'PEG, se determinaron las IC50 de aproximadamente 3 nM en el ensayo de liberación de Ca++ (Ejemplo 5, Fig. 25 y Fig.27A) y < 1 nM en el ensayo de quimiotaxis (Ejemplo 6; Fig. 26 y Fig. 27B). Ácidos nucleicos Tipo 3 de enlace a MCP-1 (Figuras 4+5) Como se ilustra en las Fig. 4 y 5, todas las secuencias de Tipo 3 comprenden varias extensiones de secuencias o cuadros donde tres pares de cuadros son características para los ácidos nucleicos Tipo 3 de enlace a MCP-1. Ambos cuadros |B1A| y |B1 B| además de los cuadros B2A y B2B además de los cuadros B5A y B5B portan la capacidad para hibridar entre sí. Sin embargo, tal hibridación no se da necesariamente en la molécula como se presenta realmente en condiciones fisiológicas. Entre estos elementos de secuencia potencialmente hibridados, se localizan los nucleótidos no hibridantes, definidos como Cuadro B3, Cuadro B4 y Cuadro |B6j. Los ácidos nucleicos se caracterizaron en el nivel aptámero, mediante ensayos de unión directos y competitivos con D-MCP- biotinilada humana para clasificarlos con respecto a su comportamiento de enlace (Ejemplo 4). Las secuencias seleccionadas se sintetizaron como el Spiegelmero (Ejemplo 3) y se ensayaron mediante la configuración natural de la MCP-1 (L-MCP) en ensayos quimiotaxis in vitro (Ejemplo 6) o por medio de mediciones en Biacore (Ejemplo 7). Las secuencias de los cuadros definidos pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos de Tipo 3 que se enlazan a MCP-1 que influencian la afinidad de enlace a la MCP-1. Sobre la base del análisis del enlace de diferentes ácidos nucleicos que se enlazan a MCP-1 sintetizados como ácidos nucleicos Tipo 3 que se enlazan a MCP-1, los cuadros [B A|, B2A. B3, B2B. B4, B5A, §6!, B5B, |B B| y sus secuencias de nucleótidos descritas a continuación son individualmente y con más preferencia en su totalidad esenciales para el enlace a la MCP-1: Cuadros B1A y B1BJ, extensiones de los extremos terminales 5'- y 3' que se pueden hibridar entre sí; donde |B1 A es GURCUGCl y |B1 B| es |GCAGCAC|; con preferencia es GUGCUGC B1B es GCAGCAC B1 A| es IGKSYGCI y |B 1 B| es |GCRSMC|; con preferencia |B1 A es IGUGCGCI y |B1B| es |GCGCAC B1A es KBBSC B1B es IGSVVMI; con preferencia |B A es KKSSC pV B1 B es GSSMM |BNGC| y |B1B| es |GCNV|; con preferencia |B1 A| es iSNGCj y B1 B| es |GCNS|; con máxima preferencia |B1 A| es |GGGC| y |B1 B es iGCCCl; • Cuadros B2A y B2B, extensiones que se pueden hibridar entre sí, donde B2A es GKMGU y B2B es ACKMC; con preferencia B2A es GUAGU y B2B es ACUAC; • Cuadro B3, que es KRRAR, con preferencia UAAAA o GAGAA\ Cuadro B4, que es CURYGA o CUWAUGA o CWRMGACW o UGCCAGUG, con preferencia CAGCGACU o CAACGACU; • B5A y B5B, extensiones que se pueden hibridar entre sí; donde B5A es GGY y B5B es GCYR mientras que GCY se puede hibridar con los nucleótidos de B5A; o B5A es CWGC y B5B es GCWG; con preferencia B5A es GGC y B5B es GCCG; Cuadro B6j, que es: jYAGAj o iCKAAÜj o ICCÜUÜAÜ], con preferencia jUAGÁl Como se ilustra en las Figuras 4 y 5, el ácido nucleico mencionado como 178-D5 y sus derivados 178-D5-030 además de 181-A2 con sus derivados 181-A2-002, 181-A2-004, 181-A2-005, 181-A2-006, 181-A2-007, 181-A2-017, 181-A2-018, 181-A2-019, 181- A2-020, 181-A2-021, y 181-A2-023 presentan la mejor afinidad con MCP-1. 178-D5 y 178-D5-030 se evaluaron como aptámeros en ensayos de unión directos o competitivos (Ejemplo 4) con una KD de aproximadamente 500 pM. En el mismo experimento, se determinó 181-A2 con una KD de aproximadamente 100 pM. En el ensayo de Biacore (Ejemplo 7), se determinó que la KD de 181-A2 y sus derivados hacia MCP-1 era de 200 - 300 pM. En los ensayos de liberación de Ca++ y quimiotaxis con células cultivadas (Ejemplo 5 y 6, respectivamente), para ambos 178-D5 y 181-A2, se midió una IC50 de aproximadamente 500 pM. En consecuencia, 178-D5 además 181-A2 y sus derivados pueden constituir la secuencia óptima y la combinación óptima de elementos de secuencia [BIAj, B2A, B3, B2B, B4, B5A, B6i, B5B y ]B 1 B Ácidos nucleicos Tipo 3 de enlace a MCP-1 (Fig. 6) Como se ilustra en la Figura 6, todas las secuencias de Tipo 4 comprenden varias extensiones de secuencias o cuadros donde los cuadros |B1 A| y |B 1 B| son las extensiones terminales 5'- y 3' que se pueden hibridar entre sí y el cuadro B2 es el elemento de secuencia central. Los ácidos nucleicos se caracterizaron en el nivel aptámero, mediante ensayos de unión directos y competitivos con D-MCP-1 biotinilada humana para clasificarlos con respecto a su comportamiento de enlace (Ejemplo 4). Las secuencias seleccionadas se sintetizaron como el Spiegelmero (Ejemplo 3) y se ensayaron mediante la configuración natural de la MCP-1 (?-MCP) en ensayos de liberación de Ca++ in vitro del cultivo celular (Ejemplo 5) en ensayos de quimiotaxis (Ejemplo 6). Las secuencias de los cuadros definidos pueden ser diferentes entre los ácidos nucleicos de Tipo 4 que se enlazan a MCP-1 que influencian la afinidad de enlace a la MCP-1. Sobre la base del análisis del enlace de diferentes ácidos nucleicos que se enlazan a MCP-1 sintetizados como ácidos nucleicos Tipo 4 que se enlazan a MCP-1, los cuadros |B1 A|, B2, y ]B1 B[ y sus secuencias de nucleótidos descritas a continuación son individualmente y con más preferencia en su totalidad esenciales para el enlace a la MCP-1: cuadros ¡B 1 A| y [B1 B|, extensiones terminales 5'- y 3' que AGCGUGDU y B1 B es CUCGCGUC ; o B1 A es ICSKSUUl y |B1B| es |GRSMSG|; o jB 1 A] es |GUGUU| y |B 1 B| es [GRCAC |B 1 Aj es [UGUUl y ¡B 1 B| es |GGCA|; con preferencia |B1 A| es [CSKSUUl y B 1 B| es |GRSMSG|; con máxima preferencia B 1 A es |CCGCUU[ y es GGGCGG ; y • Cuadro B2, que es AGNDRDGBKGGURGYARGUAAAG o AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG o C AGGUGGGUGGU AGAAUGUAAAGA, con preferencia AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG Como se ilustra en la Figura 6, el ácido nucleico mencionado como 174-D4-004 y 166-A4-002 tiene la mejor afinidad con la MCP- 1(como Spiegelmero con una IC50 de 2 - 5 nM en un ensayo de liberación de Ca++ in vitro) y puede en consecuencia constituir la óptima secuencia y la combinación óptima de los elementos de secuencia ¡B 1 Aj, B2, y |B1B Adícionalmente, se identificaron otros 29 ácidos nucleicos de enlace con MCP-1 que no se puede describir por una combinación de elementos de secuencia de nucleótidos como ha sido demostrado para los ácidos nucleicos Tipos 1 - 4 que se enlazan con MCP-1.

Estas secuencias se enumeran en la Figura 7. Se considera que cualquiera de las secuencias mostradas en las Figuras 1 a 7 son ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, que incluyen a las formas truncadas de los mismos pero que también incluyen a las formas extendidas del mismos con la condición, sin embargo, de que las moléculas de ácidos nucleicos trucadas y extendidas de este modo, respectivamente, son todavía capaces de unirse al objetivo. Ejemplo 2: Ácidos nucleicos que se enlazan a la MCP-1 murina Mediante el uso de la D-MCP-1 biotinilada murina como objetivo, se podrían generar varias moléculas del ácidos nucleicos que se enlazan a la misma. El resultado de un análisis de secuencia de estas moléculas de ácidos nucleicos se puede tomar de la Figura 8. Los ácidos nucleicos se caracterizaron en el nivel aptámero, mediante ensayos de unión directos y competitivos con D-MCP-1 biotinilada murina para clasificarlos con respecto a su comportamiento de enlace (Ejemplo 4). Las secuencias seleccionadas se sintetizaron como el Spiegelmero (Ejemplo 3) y se ensayaron mediante la configuración natural de la MCP-1 (L-MCP) en un ensayo de liberación de Ca++ in vitro del cultivo celular (Ejemplo 5) en ensayos de quimiotaxis in vitro (Ejemplo 6). Como se ilustra en la Figura 8, D-188-A3-001 y D-189-G7-001 y sus derivados se enlazan a D-MCP-1 con una D subnanomolar en el ensayo de unión (Fig. 8).

Para D-mNOX-E36 (= D-188-A3-007; SEQ.ID No. 244), se determino una constante de disociación (KD) de 0,1 - 0,2 nM a 37°C (Ejemplo 4; Fig. 10). El Spiegelmero mNOX-E36 (188-A3-007; SEQ.ID No. 122) respectivo exhibió una concentración inhibitoria (IC50) de aproximadamente 12 nM en un ensayo de liberación de Ca+ + in vitro (Ejemplo 5; Fig. 13) y de aprox. 7 nM en un ensayo de quimiotaxis in vitro (Ejemplo 6; Fig. 16). Para el derivado PEGilado de mNOX-E36, mNOX-E36-3'PEG (SEQ.ID No. 254), se determinaron las IC50 de aproximadamente 8 nM en un ensayo de liberación de Ca++ (Ejemplo 5, Fig. 29) y aproximadamente 3 nM en el ensayo de quimiotaxis (Ejemplo 6; Fig. 31). Se considera que cualquiera de las secuencias mostradas en las Figuras 1 a 7 son ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, que incluyen a las formas truncadas de los mismos pero que también incluyen a las formas extendidas del mismos con la condición, sin embargo, de que las moléculas de ácidos nucleicos trucadas y extendidas de este modo, respectivamente, son todavía capaces de enlazarse al objetivo. Ejemplo 3: Síntesis y derivación de aptámeros Spiegelmeros Síntesis en pequeña escala Los aptámeros y Spiegelmeros se produjeron por una síntesis en fase sólida con un sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) mediante reacciones químicas con ARN 2'TBDMS fosforamidita (M.J. Damha, K. . Ogilvie, Methods in Molecular Biology, Vol. 20 Protocols for oligonucleotides and analogs, ed. S. Agrawal, p. 81-114, Humana Press Inc. 1993). Las fosforamiditas rA(N-Bz)-, rC(Ac)-, rG(N-ibu)-, y UR en configuración D- y L se adquirieron en ChemGenes, Wilmington, MA. Los aptámeros y Spiegelmeros se purificaron por electroforesis en gel. Síntesis más modificación en gran escala El Spiegelmero NOX-E36 se produjo por síntesis en fase sólida con un sintetizador ÁktaPilotlOO (Amersham Biosciences; General Electric Healthcare, Freiburg) mediante reacciones químicas con ARN 2'TBDMS fosforamidita (M.J. Damha, K.K. Ogilvie, Methods in Molecular Biology, Vol. 20 Protocols for oligonucleotides and analogs, ed. S. Agrawal, p. 81-114, Humana Press Inc. 1993). Las fosforamiditas rA(N-Bz)-, rC(Ac)-, rG(N-ibu)-, y UR en configuración D- y L se adquirieron en ChemGenes, Wilmington, MA. El modificador de 5'-amino se adquirió en American International Chemicals Inc. (Framingham, MA, USA). La síntesis del Spiegelmero no modificado comenzó sobre CPG modificado con L-de tamaño de poro de 1000 Á (Link Technology, Glasgow, UK); para el Spiegelmero modificado en 3'-NH2, se usó el aminomodificador 3'-CPG, 1000 Á (ChemGenes, Wilmington, MA). Para el acoplamiento (15 min por ciclo), se usaron 0,3 M de benciltiotetrazol (CMS-Chemicals, Abingdon, UK) en acetonitrilo y 3,5 equivalentes de la solución de fosforamidita 0,1 M respectiva en acetonitrilo. Se usó un ciclo de oxidación-terminación de cadena. Los solventes y reactivos estándares adicionales para la síntesis de oligonucleótidos se adquirieron en Biosolve (Valkenswaard, NL). El Spiegelmero se sintetizó en DMT-ON; después de la desprotección, se purificó por medio de RP-HPLC preparativa (Wincott F. et al. (1995) Ácidos nucleicos Res 23:2677) usando un medio Source15RPC (Amersham). El grupo 5'DMT se eliminó con 80% de ácido acético (30 min a TA). Posteriormente, se agregó una solución de NaOAc 2 M y el Spiegelmero se desalinizó por filtración con flujo tangencial mediante una membrana de celulosa regenerada 5 K (Millipore, Bedford, MA). PEGilación de NOX-E36 Para prolongar el tiempo de residencia del plasma del Spiegelmero in vivo, el Spiegelmero NOX-E36 se acopló en forma covalente a una fracción de polietilen-glicol de 40 kDa (PEG) en el extremo 3' o 5'. PEGilación en 3' de NOX-E36 Para la PEGilación (para detalles técnicos del método para PEGilación ver la Solicitud de Patente Europea EP 1 306 382), se disolvió el Spiegelmero modificado en 3'-amino purificado en una mezcla de H20 (2.5 mi), D F (5 mi), y regulador A (5 mi; preparado por la mezcla de ácido cítrico · H20 [7 g], ácido bórico [3,54 g], ácido fosfórico [2,26 mi], y NaOH 1 M [343 mi] y agregado de H20 a un volumen final de 1 I; el pH = 8,4 se ajustó con HCI 1 M). El pH de la solución del Spiegelmero se llevó a 8,4 con NaOH 1 M. Luego, se agregó éster de PEG-NHS 40 kDa (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) a 37°C cada 30 min en cuatro porciones de 0,6 equivalentes hasta que alcanzó un máximo rendimiento de 75 a 85%. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo a 8 - 8,5 con NaOH 1 M durante la adición del éster de PEG-NHS. La mezcla de reacción se combinó con 4 mi de solución de urea (8 M), 4 mi de regulador A, y 4 mi de regulador B (acetato de trietilamonio 0,1 M en H20) y se calentó a 95°C durante 15 min. El Spiegeimero PEGilado luego se purificó por RP-HPLC con un medio Source 15RPC (Amersham), mediante un gradiente de acetonitrilo (regulador B; regulador C: acetato de trietilamonio 0,1 M en acetonitrilo). El exceso de PEG eluido con un regulador C de 5%, Spiegeimero PEGilado en un regulador C de 10 - 15%. Las fracciones del producto con una pureza de >95% (medido por HPLC) se combinaron y mezclaron con 40 mi de NaOAC 3 M. El Spiegeimero PEGilado desalinizó por filtración con flujo tangencial (membrana de celulosa regenerada 5 K, Millipore, Bedford MA). PEGilación en 5' de NOX-E36 Para la PEGilación (para detalles técnicos del método para PEGilación ver la Solicitud de Patente Europea EP 1 306 382), se disolvió el Spiegeimero modificado en 5'-amino purificado en una mezcla de H20 (2,5 mi), DMF (5 mi), y regulador A (5 mi; preparado por la mezcla de ácido cítrico · H20 [7 g], ácido bórico [3,54 g], ácido fosfórico [2,26 mi], y NaOH 1 M [343 mi] y agregado de H20 a un volumen final de 1 I; pH = 8.4 se ajustó con HCI 1 M). El pH de la solución del Spiegeimero se llevó a 8,4 con NaOH 1 M. Luego, se agregó éster de PEG-NHS 40 kDa (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) a 37°C cada 30 min en seis porciones de 0,25 equivalentes hasta que alcanzó un máximo rendimiento de 75 a 85%. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo a 8 - 8,5 con NaOH 1 M durante la adición del éster de PEG-NHS. La mezcla de reacción se combinó con 4 mi de solución de urea (8 M), 4 mi de regulador A, y 4 mi de regulador B (acetato de trietilamonio 0,1 M en H20) y se calentó a 95°C durante 15 min. El Spiegelmero PEGilado luego se purificó por RP-HPLC con un medio Source 15RPC (Amersham), mediante un gradiente de acetonitrilo (regulador B; regulador C: acetato de trietilamonio 0,1 M en acetonitrilo). El exceso de PEG eluido con un regulador C de 5%, Spiegelmero PEGilado en un regulador C de 10 - 15%. Las fracciones del producto con una pureza de >95% (medido por HPLC) se combinaron y mezclaron con 40 mi de NaOAC 3 M. El Spiegelmero PEGilado desalinizó por filtración con flujo tangencial (membrana de celulosa regenerada 5 K, Millipore, Bedford MA). Ejemplo 4: Determinación de las constantes de enlace (ensayo de unión) Ensayo de unión directa Se midió la afinidad de los aptámeros con el D-MCP-1 en un formato de ensayo de unión a 20 o 37°C, respectivamente. Los aptámeros eran 5'-fosfato marcado por T4 polinucleótido quinasa (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) mediante ATP marcado con [?-32?] (Hartmann Analytic, Braunschweíg, Alemania). La radiactividad específica de los aptámeros marcados fue 200.000 - 800.000 cpm/pmol. Los aptámeros se incubaron después de la de- y renaturalización a una concentración de 20 pM a 37°C en un regulador de selección (Tris 20 mM-HCI pH 7,4; NaCI 137 m ; KCI 5 mM; MgCI2 1 mM; CaCI2 1 mM; Tween-20 0,1% [p/vol] ) junto con cantidades variadas de D-MCP-1 biotinilada durante 4 - 12 horas para alcanzar el equilibrio a concentraciones bajas. El regulador de selección se suplemento con 10 pg/ml de albúmina sérica humana (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania), y 10 µg/ml de ARN de levaduras (Ambion, Austin, USA) para evitar la adsorción de los compañeros de enlace con superficies de plástico o la matriz de inmovilización. El rango de concentración de D-MCP-1 biotinilada se ajustó de 8 pM a 100 nM; el volumen de reacción total fue 1 mi. Los complejos de péptido y péptido-aptámero se inmovilizaron en 1,5 µ? de partículas de estreptavidina Streptavidin Ultralink Plus (Pierce Biotechnology, Rockford, USA) que había sido pre-equilibrado con regulador de selección y se resuspendieron en un volumen total de 6 µ?. Las partículas se mantuvieron en suspensión durante 30 min a la temperatura respectiva en un mezclador térmico. La radiactividad inmovilizada se cuantificó en un contador de centelleo después del retirar del sobrenadante y el lavado apropiado. El porcentaje de enlace se gráfico contra la concentración de D-MCP-1 biotinilada y se obtuvieron las constantes por medio de algoritmos de programa de computación (GRAFIT; Erithacus Software; Surrey R.U.) suponiendo un estequiometría 1:1. Ensayo de unión competitivo Para comparar diferentes aptámeros de enlace a D-MCP-1, se realizó un ensayo de clasificación competitiva. Para este propósito el aptámero disponible más afín se marcó con radiactividad (ver anteriormente) y actuó como referencia. Después de la des- y renaturalización se incubó a 37°C con D-MCP-1 biotinilada en 1 mi de regulador de selección en condiciones que producen alrededor de 5 - 10 % de enlace al péptido después de la inmovilización y lavado en agarosa NeutrAvidin o estreptavidina Ultralink Plus (ambas de Pierce) sin competición. Se agregó un exceso de aptámero de D-ARN des- y renaturalizado no marcado a diferentes concentraciones (por ejemplo, 2, 10, y 50 nM) con el aptámero de referencia marcado a reacciones de enlace paralelas. Los aptámeros ensayados compitieron con el aptámero de referencia para unirse al objetivo, de este modo disminuye la señal de enlace dependiendo de sus características de enlace. El aptámero hallado como más activo en este ensayo luego puede servir como nueva referencia para el análisis comparativo de otras variantes de aptámero. Ejemplo 5: Determinación de la concentración inhibitoria en un ensayo de liberación de Ca+ + Las células THP-1 (DSMZ, Braunschweig) se cultivaron toda la noche con una densidad celular de 0,3 x 106/ml a 37°C y 5% de C02 en medio RPMI 1640 con GlutaMAX (Invitrogen) que contenía además 10% de suero de carnero fetal, 50 unidades/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina y 50 µ? de ß-mercaptoetanol. Los Spiegelmeros se incubaron junto con MCP-1 recombinante humana (Bachem) en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), que contiene 1 mg/ml de albúmina sérica bovina, 5 mM de probenecid y 20 mM de HEPES (HBSS + ) durante 15 a 60 min a 37°C en una placa de 96 pocilios de perfil bajo de 0,2 mi ("solución de estimulación"). Para la carga con el colorante indicador de calcio, las células se centrifugaron a 300 x g durante 5 min, se resuspendieron en 4 mi de solución del colorante indicador (10 µ? de fluo-4 [Molecular Probes], 0,08% de pluronic 127 [Molecular Probes] en HBSS + ) y se incubó durante 60 min a 37°C. De aquí en adelante, se agregaron 11 mi de HBSS+ y las células se centrifugaron como antes, se lavaron una vez con 15 mi de HBSS+ y luego se resuspendieron en HBSS + para dar una densidad celular de 1,1 x 106/ml. Se agregaron 90 µ? de esta suspensión de células a cada pocilio de una placa negra de 96 pocilios. La medición de las señales de fluorescencia se realizó con una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm en una placa lectora de detección múltiple Fluostar Optima (BMG). Para una medición paralela de varias muestras, se registraron juntos los pocilios de fila (perpendicular) de la placa de 96 pocilios. Se realizaron las tres primeras lecturas con un tiempo de demora de 4 segundos para la determinación de la línea de base. Luego el registro se interrumpió y la placa se retiró del instrumento. Mediante una pipeta multicanal, se agregaron 10 µ? de la solución de estimulación a los pocilios, luego la placa se colocó otra vez en el instrumento y la medición continuó. En total, se realizaron 20 registros con intervalos de tiempo de 4 segundos.

Para cada pocilio se determinó la diferencia entre fluorescencia máxima y el valor de la línea de base y se gráfico contra la concentración de MCP-1 o en los experimentos de inhibición de la liberación de calcio por Spiegelmeros, contra la concentración de Spiegelmero. Determinación de la media de la concentración efectiva máxima (EC5o) para MCP-1 humana Después de estimular las células THP-1 con diversas concentraciones de hMCP-1 y graficar la diferencia entre las señales máximas y básales, se obtuvo una curva de dosis respuesta para la MCP-1 humana, lo que indica una concentración efectiva media (EC50) de aproximadamente 2 - 4 nM (Fig. 11). Esta concentración se usó para los experimentos adicionales de inhibición de la liberación de Ca++ por los Spiegelmeros. Determinación de la media de la concentración efectiva máxima (EC50) para MCP-1 murina Después de estimular las células THP-1 con diversas concentraciones de hMCP-1 y graficar la diferencia entre las señales máximas y básales, se obtuvo una curva de dosis respuesta para la MCP-1 murina, lo que indica una concentración efectiva media (EC50) de aproximadamente 5 nM (Fig. 28). Esta concentración se usó para los experimentos adicionales de inhibición de la liberación de Ca++ por los Spiegelmeros. Ejemplo 6: Determinación de concentración inhibitoria en el ensayo de quimiotaxis Las células THP-1 cultivadas como se describió anteriormente, se centrifugaron, lavaron una vez con HBH (HBSS, que contiene 1 mg/ml de albúmina sérica bovina y 20 mM de HEPES) y se resuspendieron a razón de 3 x 106 células/ml. Se agregaron 100 µ? de esta suspensión a insertos TransweII con poros de 5 µ?? (Corning, #3421). En los compartimientos inferiores la MCP-1se preincubó junto con los Spiegelmeros en diversas concentraciones en 600 µ? de HBH a 37°C durante 20 a 30 min antes de la adición de las células. Las células se dejaron migrar a 37°C durante 3 horas. Después se retiraron los insertos y se agregaron 60 µ? de resazurina 440 µ? (Sigma) en solución regulada con fosfato a los compartimientos inferiores. Después de incubar a 37°C durante 2,5 horas, se midió la fluorescencia en una longitud de onda de excitación de 544 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm en un lector de placa de detección múltiple Fluostar Optima (BMG). Determinación de la media de la concentración efectiva máxima (EC50) para MCP-1 humana Después de 3 horas de la migración de las células THP-1 a diversas concentraciones de MCP-1 humana, se obtuvo una curva de dosis respuesta para la MCP-1 humana, que indica una concentración efectiva máxima de aproximadamente 1 nM y activación reducida a concentraciones superiores (Fig. 14). Para experimentos adicionales de inhibición de la quimiotaxis por los Spiegelmeros, se usó una concentración de MCP-1 de 0,5 nM. Determinación de la media de la concentración efectiva máxima (EC5o) para la CP-1 murina Después de 3 horas de la migración de las células THP-1 a diversas concentraciones de MCP-1 murina, se obtuvo una curva de dosis respuesta para la MCP-1 murina, que indica una concentración efectiva máxima de aproximadamente 1 - 3 nM y activación reducida a concentraciones superiores (Fig. 30). Para experimentos adicionales de inhibición de la quimiotaxis por los Spiegelmeros, se usó una concentración de MCP-1 murina de 0,5 nM. Ejemplo 7: Análisis del enlace por medición de la resonancia del plasmón superficial 7.1 Evaluación de especificidad de NOX-E36, 181-A2-018 y mNOX-E36 Se usó el instrumento Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) para analizar el enlace de los ácidos nucleicos a la MCP-1 humana y proteínas relacionadas. Cuando se logró el acoplamiento por medio de los grupos amina, las proteínas se dializaron contra agua durante 1 - 2 h (ésteres de celulosa mixtos Millipore VSWP; tamaño de poro, 0,025 µ?) para eliminar las aminas interferentes. Los chips sensores PioneerFI o CM4 (Biacore AB) se activaron antes del acoplamiento de proteínas por una inyección de 35 µ? de una dilución 1:1 de NHS 0,4 M y EDC 0,1 M con un caudal de flujo de 5 µ?/min. Luego se inyectó quimiocina en concentraciones de 0,1 - 1 ,5 µg/ml con un caudal de flujo de 2 µ?/min hasta que la respuesta del instrumento estuvo en el rango de 1000 - 2000 UR (unidades relativas). Los ésteres de NHS no reaccionados se desactivaron con una inyección de 35 µ? de una solución de clorhidrato de etanolamina (pH 8,5) con un caudal de flujo de 5 µ?/min. El chip sensor se activó dos veces con regulador de enlace y se equilibró a razón de 10 µ?/min durante 1 - 2 horas hasta el valor basal fue estable. Para todas las proteínas, se evaluaron los parámetros cinéticos y las constantes de disociación por una serie de inyecciones de Spiegelmeros a concentraciones de 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, y 0 nM en regulador de selección (Tris-HCI, 20 mM; NaCI, 137 mM; KCI, 5 mM; CaCI2, 1 mM; MgCI2, 1 mM; Tween20, 0,1% [p/v]; pH 7.4). En todos los experimentos, se realizó el análisis a 37°C mediante el comando Kinject que define un tiempo de asociación de 180 y un tiempo de disociación de 360 segundos a un caudal de flujo de 10 µ?/min. Los análisis de datos y el cálculo de las constantes de disociación (KD) se realizaron con el programa de computación BIAevaluation 3.0 (Bl ACORE AB, Uppsala, Suecia) usando el algoritmo de ajuste estequiométrico de Langmuir 1:1. 7.1.1 NOX-E36 y 181-A2-018 (ácidos nucleicos específicos para MCP-1 humana) Solo se representan los sensogramas para MCP-1 humana (Figuras 17 y 20, respectivamente); para las otras proteínas, solo se muestra el sensograma obtenido con 125 nM de concentración de Spiegelmero para mayor claridad (Fig. 18/19 y 21/22). El análisis de la interacción NOX-E36*hMCP-1 : se inmovilizó MCP-1 recombinante humana en un chip sensor PioneerFI siguiendo las recomendaciones del fabricante (procedimiento de acoplamiento de aminas) hasta establecer una respuesta del instrumento de 1381 UR (unidades relativas). La constante de disociación determinada ( KQ) para el enlace de NOX-E36 a la MCP-1 humana fue de aproximadamente 890 pM (Fig. 17). El análisis de la interacción 181 -A2-018*hMCP-1 : MCP-1 recombinante humana se inmovilizó en un chip sensor CM4 siguiendo las recomendaciones del fabricante (procedimiento de acoplamiento de aminas) hasta establecer una respuesta del instrumento de 3111 UR (unidades relativas). La constante de disociación determinada (KD) para el enlace de 181-A2-018 a la MCP-1 humana fue de aproximadamente 370 pM (Fig. 20). Para determinar la especificidad de NOX-E36 y 181-A2-018, se inmovilizaron diversas proteínas de la familia de la MCP-1 humana además de la eotaxina humana en un chip sensor PioneerFI y CM4 (hMCP-1 , 1754 UR; hMCP-2, 1558 UR; hMCP-3, 1290 UR; eotaxina, 1523 UR). El análisis cinético demostró que NOX-E36 se une a la eotaxina y hMCP-2 con constantes de disociación (KD) de 5 - 10 nM; hMCP-3 no fue reconocido (Figuras 18 y 24A). 181-A2-018, en contraste, se une a la eotaxina, hMCP-2 y hMCP-3, pero con una afinidad ligeramente menor (10 - 20 nM; Figuras 21 y 24A). La reactividad cruzada interespecie de NOX-E36 y 181-A2-018 se evaluó mediante acoplamiento de amino inmovilizado en MCP-1 de ser humano (1460 UR), de mono (1218 UR), cerdo (1428 UR), perro (1224 UR), conejo (1244 UR), rata (1267 UR), y ratón (1361 UR) en un chip sensor PioneerFI y CM4. El análisis cinético demostró que NOX-E36 se une a MCP-1 humana, de mono, porcina y canina con constantes de disociación comparables (KD) de 0,89 - 1.2 nM mientras que la MCP-1 de ratón, rata y conejo no fueron reconocidos (Figuras 19 y 24A). 181-A2-018 se une a MCP-1 humana y de mono con constantes de disociación comparables (K0) de 0,5-0,6 nM, mientras que las MCP-1 porcina, de conejo y canina se enlazan con mucho menor afinidad. La MCP-1 de rata y ratón no fueron reconocidas por NOX-A2-018 (Figuras 22 y 24A). Las secuencias además del grado de homología en porcentaje de aminoácidos idénticos entre la proteína de MCP-1 de diferentes especies y estrechamente relacionada con las proteínas humanas se representan en la Figura 23; los valores de KD calculados para NOX-E36 y 181-A2-018 se exhiben en forma de tabla de la Figura 24A. 7.1.2 mNOX-E36 (ácido nucleico específico para MCP-1 murina) Para analizar el comportamiento de enlace de mNOX-E36, se inmovilizaron 3759 UR de D-MCP-1 biotinilada murina sintética (celda de flujo 3) y 3326 UR de D-MCP-1 biotinilada humana (celda de flujo 4) en un chip sensor conjugado de estreptavidina (Biacore AB, Freiburg, Alemania), respectivamente. Las soluciones del aptámero mNOX-E36 (D-ARN) de 500, 250, 125, 62,5, 31,25, y 0 nM se inyectaron mediante un comando Kinject definido con un tiempo de asociación de 180 seg y un tiempo de disociación de 360 seg. El flujo de la celda 1 se usó como regulador y el control de matriz de dextrano (superficie Biacore SA-Chip) mientras que el flujo de la celda 2, se inmovilizó un D-péptido específico para determinar el enlace inespecífica del aptámero. La Figura 32 muestra un sensograma de la cinética de D-NOX-E36 para el enlace a la D-MCP-1 murina con una constante de disociación calculada (KD) de 200 -300 pM. mNOX-E36 no se une a D-MCP-1 humana (Fig. 33); para mayor claridad, solo se muestra el sensograma obtenido con 125 nM de Spiegelmero. 7.2 Evaluación de selectividad de NOX-E36 < La selectividad de NOX-E36 se evaluó por análisis de resonancia del plasmón superficial al inmovilizar NOX-E36 5 'biotinilado en estreptavidina (SA-Chip). Se inmovilizaron 352 UR de NOX-E36 en celda de flujo (FC) 1 y una cantidad igual de Spiegelmero control no funcional biotinilado en el extremo 5'-terminal (POC) en FC 2 por el enlace de estreptavidina/biotina. Se usó FC3 como control de superficie para determinar el enlace inespecífica a la superficie del sensor de dextrano-SA. Se inyectaron 100 nM de un panel de quimiocinas humanas de los cuatro subgrupos (CC, CXC, CX3C, y XC) por 360s y los complejos se dejaron disociar por 360s con un caudal de flujo de ??µ?/min y 37°C. Se grafícaron las unidades de respuesta después de la asociación (Resp.1; grado de interacción) y después de la disociación (Resp.2, afinidad de interacción). Después de cada inyección la superficie del chip se regeneró con 240s de cloruro de sodio 1 M con 0,1% de Tween; los Spiegelmeros inmovilizados se dejaron posteriormente replegar durante 2 minutos en condiciones fisiológicas (regulador de corrida). La inyección de cada quimiocina se repitió 3 veces. CXCL1, CXCL2, CXCL6 y CXCL9 mostraron unión inespecífica a ácidos ribonucleicos y la superficie de dextrano del chip. El enlace de alta afinidad especifica a NOX-E36 inmovilizado solo pudo ser detectada para CCL2/MCP-1 , CCL8/MCP-2, CCL11/eotaxina, CCL3/MIP1 a, y CXCL7/N AP-2 (Fig. 24B). El hallazgo de que MCP-2 y eotaxina se enlazan con NOX-E36 no es sorprendente debido a la relativamente alta homología entres estas quimiocinas y MCP-1 de 62 y 70 %, para los positivos inesperados de CCL3/MIP-1a y CXCL7/NAP-2, se han realizado pruebas de inhibición funcional in vitro o se están estableciendo en la actualidad, respectivamente. Finalmente, se determinaron los parámetros cinéticos de la interacción entre NOX-E36 y CCL2/MCP-1, CCL8/MCP-2, CCL11/eotaxina, CCL3/MIP1 a, CXCL7/NAP-2, CCL7/MCP-3 y CCL13/MCP-4 en el sistema "invertido". Aquí, se inmovilizaron las quimiocinas y se inyectó NOX-E36 (para el protocolo detallado, ver 7.1). Los datos cinéticos se sintetizan en la Figura 24C. 7.3 Evaluación de la funcionalidad de anti-MIP-1 a in vitro Las mediciones en Biacore han mostrado reactividad cruzada de NOX-E36 con MIP-1oc. Mediante el empleo de un ensayo funcional in vitro basado en cultivo de célula se deberá examinar si el enlace simple Biacore de NOX-E36 a MIP-1oc también se traduce a funcionalidad, por ejemplo, antagonismo. Para obtener esto, se realizaron experimentos de quimiotaxis con células THP-1 que se pueden estimular con MIP-1 a. Las células THP-1 cultivadas como se describió anteriormente se centrifugaron, se lavaron una vez con HBH (HBSS, (HBSS, que contiene 1 mg/ml de albúmina sérica bovina y 20 mM de HEPES) y se resuspendieron a razón de 3 x 106 células/ml. Se agregaron 100 µ? de esta suspensión a insertos Transwell con poros de 5 µ?t? (Corning, #3421). En los compartimientos inferiores la MIP-1a se preincubó junto con los Spiegelmeros en diversas concentraciones en 600 µ? de HBH a 37°C durante 20 a 30 min antes de la adición de las células. Las células se dejaron migrar a 37°C durante 3 horas. Después se retiraron los insertos y se agregaron 60 µ? de resazurina 440 µ? (Sigma) en solución regulada con fosfato a los compartimientos inferiores. Después de incubar a 37°C durante 2,5 horas, se midió la fluorescencia en una longitud de onda de excitación de 544 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm en un lector de placa de detección múltiple Fluostar Optima (BMG). Después de 3 horas de migración de las células THP-1 a diversas concentraciones de MIP-1a humana, se obtuvo una curva de dosis respuesta para MIP-1a humana, que indica la mitad de la concentración efectiva máxima de aproximadamente 1 nM y activación reducida a concentraciones superiores (Fig. 24D). Para los experimentos adicionales de inhibición de la quimiotaxis por Spiegelmeros se usó una concentración de MIP-1oc de 0,5 nM. Se realizaron experimentos para la determinación de la inhibición de la quimiotaxis por NOX-E36 con un estímulo de 0,5 nM de ???-1a. Se pudo demostrar claramente que NOX-E36 no inhibe la quimiotaxis inducida por MIP-1a hasta la mayor concentración ensayada de 1 µ? de MIP-1a. Como control positivo, el experimento respectivo con MCP-1 como estímulo se realizó en paralelo (Fig. 24E). Ejemplo 8: Terapia de la enfermedad semejante a lupus en ratones MRLlpr/lpr con Spiegelmero anti-mMCP-1 El bloqueo de los mediadores proinflamatorios se ha convertido en un exitoso método para el tratamiento de la inflamación crónica (Steinman 2004). Además del TNF y las interleucinas, las quimiocinas CC son importantes candidatos para el antagonismo específico ya que las quimiocinas CC median el reclutamiento de leucocitos del espacio intravascular a los sitios de inflamación (Baggiolini 1998, Luster 2005). Existe una evidencia muy sólida de que la MCP-1 (= CCL2) y su respectivo receptor de quimiocina CCR2 cumple un papel crucial en la lesión del tejido autoinmune tal como las manifestaciones clínicas del lupus eritematoso sistémico (Gerard & Rollins 2001). Por ejemplo, los ratones MRLlpr lpr deficientes en el gen Ccl2 o Ccr2 están protegidos de la autoinmunidad semejante al lupus (Pérez de Lema 2005, Tesch 1999). De este modo, el eje CCL2/CCR2 puede representar un objetivo terapéutico promisorio, por ejemplo, para nefritis lúpica. En efecto, la terapia génica retardada o la transferencia de células transfectadas, ambas resultantes de la producción in situ de una MCP-1 truncada en NH2, redujeron considerablemente la lesión tisular autoinmune en ratones MRLlpr/lpr. Sin embargo, tales métodos experimentales no se pueden usar en seres humanos debido a la producción de antagonistas incontenible y la formación de tumores (Hasegawa 2003, Shimizu 2004). En consecuencia, todavía es necesario desarrollar nuevos antagonistas CCL2 con perfiles farmacocinéticos favorables in vivo. En este ejemplo se ha demostrado que el bloqueo de CCL2 murino con el Spiegelmero anti-mCCL2 mNOX-E36 o mNOX-E36-3'PEG sería adecuado para el tratamiento de la nefritis lúpica y "otras manifestaciones de la enfermedad de lupus eritematoso sistémico. El comienzo tardío de la terapia con Spiegelmero mCCL2 efectivamente mejora la nefritis lúpica, peribronquitis autoinmune y enfermedad cutánea semejante a lupus en los ratones MRLlpr/lpr, independientemente de cualquier problema previo asociado con el bloqueo de CCL2/CCR2 terapéutico. Animales y protocolo experimental Se obtuvieron ratones hembra MRLlpr lpr de 10 semanas en Harían Winkelmann (Borchen, Alemania) y se mantuvieron en condiciones de albergue normal con un ciclo de 12 horas de luz y oscuridad. El agua y la dieta chow estándar (Ssniff, Soest, Alemania) estuvieron disponibles ad libitum. A las 14 semanas, grupos de 12 ratones recibieron inyecciones subcutáneas de Spiegelmeros en 5% de glucosa (volumen de inyección, 4 ml/kg) tres veces por semana de la siguiente manera: mNOX-E36, 1,5 µG???/kg; mNOX-E36-3'PEG, 0,9 µ????/kg; Spiegelmero control no funcional PoC (5'- UAAGGAAACUCGGUCUGAUGCGGU AGCGCUGUGCAGAGCU-3') , 1,9 pmol/kg; PoC-PEG, 0,9 µ????/kg; vehículo (5% de glucosa). Se determinaron los niveles plasmáticos de mNOX-E36 y mNOX-E36-3'PEG en las muestras de sangre tomadas en forma semanal del seno retroorbital 3 o 24 horas después de la inyección, respectivamente. Los niveles de Spiegelmero en las muestras de plasma se determinaron por una modificación del método de hibridación sándwich descrito en el Ejemplo 8. Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical al final de las 24 semanas. Evaluación del lupus sistémico Las lesiones cutáneas se registraron por un puntaje semicuantitativo (Schwarting 2005). La proporción del peso del bazo y la masa de los ganglios linfáticos del mesenterio al peso corporal total se calcularon como marcadores del síndrome linfoproliferativo asociado con el lupus. Se recogieron muestras de sangre y orina de cada animal al final del período de estudio por sangrado del plexo venoso retro-orbital bajo anestesia general con éter inhalador. Se recogieron muestras de sangre y orina de cada animal al final del período de estudio y se determinaron la relación albúmina/cretinita urinaria y títulos séricos del isotipo IgG del autoanticuerpo ADNsd como se describió previamente (Pawar 2006). La velocidad de filtración glomerular (GFR) se determinó a las 24 semanas por la cinética de depuración de FITC-inulina plasmática (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) 5, 10, 15, 20, 35, 60, y 90 minutos después de una única inyección en bolo (Qi 2004). La fluorescencia se determinó con excitación de 485 nm y se leyó a una emisión de 535 nm. La GFR se calculó sobre la base del modelo de dos compartimientos mediante un programa de computación de ajuste de curva con regresión no lineal (GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Los niveles de citocinas sérica se determinaron mediante kits comerciales de ELISA para las IL-6, IL-12p40 (OptEiA, BD Pharmingen), e IFN-a (PBL Biomedical Labs, USA). Se fijaron los ríñones y pulmones de todos los ratones en 10% de formalina regulada, se procesaron e incluyeron en parafina. Se prepararon secciones de 5 pm para las tinciones con plata y ácido peryódico de Schiff siguiendo los protocolos de rutina (Anders 2002). Se clasificó la gravedad de las lesiones renales mediante los índices de actividad y cronicidad descritos para la nefritis lúpica humana (Austin 1984), y se realizó la morfometría de la lesión intersticial renal como se describió previamente (Anders 2002). La gravedad de la inflamación peribronquial se clasificó en forma semicuantitativa de 0-4. Para la inmunotinción, las secciones de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina se desparafinaron y rehidrataron. La peroxidasa endógena se bloqueó con 3% de peróxido de hidrógeno y se realizó la recuperación del antígeno en solución de recuperación del antígeno (Vector, Burlingame, CA) en una estufa autoclave. La biotina se bloqueó con el kit de bloqueo de avidina/biotina (Vector). Los portaobjetos se incubaron con los anticuerpos primarios durante una hora, seguido por los anticuerpos secundarios biotinilados (IgG anti-rata, Vector), y el reactivo ABC (Vector). Los portaobjetos se lavaron en solución salina regulada con fosfato entre los pasos de incubación. Se usó 3'3'diaminobencidina (DAB, Sigma, Taufkirchen, Alemania) con refuerzo metálico como sistema de detección, lo que originó un producto de color negro. Se usó verde de metilo como tintura de contraste, los portaobjetos se rehidrataron y montaron en Histomount (Zymed Laboratories, San Francisco, CA). Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-Mac2 de rata (macrófagos, Cederlane, Ontario, Canadá, 1:50), CD3 anti-ratón (1:100, clon 500A2, BD), IgG, anti-ratón (1:100, M32015, Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA), lgG2a anti-ratón (1:100, M32215, Caltag), C3 anti-ratón (1:200, G AM/C3c/FITC, Nordic Immunological Laboratories, Tilburg, Holanda). Los controles negativos incluyeron la incubación con un anticuerpo del isotipo respectivo. Para el análisis cuantitativo, se contaron células glomerulares en 15 glomérulos corticales por sección. Se clasificaron los depósitos de Ig y C3c glomerulares de 0-3 en 15 secciones de glomérulos corticales.

Preparación de ARN y RT-PCR de tiempo real cuantitativa (TaqMan) El tejido renal de cada ratón se separó congelado en nitrógeno líquido y se conservó a -80°C. De cada animal, se realizaron la preparación del ARN renal total y la trascripción reversa descrita (Anders 2002). Los cebadores y las sondas fueron de PE Biosystems, Weiterstadt, Alemania. Los cebadores usados (300 n ) se emplearon para la detección de Ccl2, Ccl5 y ARNr 18S, el reactivo del ensayo TaqMan predesarrollado provenía de PE Biosystems. Citóme tría de flujo Se obtuvieron muestras de sangre entera y medula ósea de los ratones de todos los grupos al final del estudio. Se realizó la citometría de flujo mediante una máquina FACScalibur y el anticuerpo previamente caracterizado MC21 anti-mCCR2 (Mack 2001). Se usó un anticuerpo IgG anti-rata biotinilado (BD Biosciences) para la detección. Se usó una lgG2b de rata (BD Biosciences) como control de isotipo. Análisis estadístico Los datos se expresaron como media ± error estándar de la media (SEM). Se realizó la comparación entre los grupos mediante un ANOVA univariado. Se usó la corrección de Posthoc Bonferroni para las comparaciones múltiples. Se consideró que un valor de p < 0,05 indica significación estadística. Ensayo de hibridación sándwich Se cuantificó la cantidad de Spiegelmero en las muestra por un ensayo de hibridación sándwich sobre la base de un ensayo descrito por Drolet et al. 2000 (Pharm Res 17:1503). Las muestras de sangre se recogieron en paralelo para seguir la depuración plasmática de NOX-E36. Los tejidos seleccionados se prepararon para determinar las concentraciones de Spiegelmero. Preparación de la placa de hibridación El Spiegelmero mNOX-E36 se cuantificó por medio un ensayo de hibridación sándwich no validado. En breves palabras, la sonda de captura de mNOX-E36 (SEQ.ID.: 281) se inmovilizó en las placas blancas de 96 pocilios ADN-BIND (Corning Costar, Wiesbaden, Alemania) a 0,75 mM en fosfato de sodio 0,5 M, EDTA 1 mM, pH 8,5 toda la noche a 4°C. Los pocilios se lavaron dos veces y bloquearon con 0,5% p/v de BSA en fosfato de sodio 0,25 M, EDTA 1 mM, pH 8,5 durante 3 h a 37°C, se lavó otra vez y se conservó a 4°C hasta el uso. Antes de la hibridación, las pocilios se pre-calentaron a 37°C y se lavaron dos veces con regulador de lavado pre-calentado (3xSSC, 0,5% [p/v] sarcosinato de dodecil sodio, pH 7,0; por adelantado se prepara una solución patrón 20x [NaCI 3 M, citrato de Na3 0,3 M) sin lauroilsarcosina sodio y diluido en forma correspondiente). Preparación de la muestra Todas las muestras se ensayaron en duplicados. Las muestras plasmáticas se descongelaron en hielo, se agitaron en vórtex y se centrifugaron brevemente en una centrífuga de mesa refrigerada. Los homogenados de tejido se descongelaron a TA y se centrifugaron 5 min a velocidad máxima y TA. Se retiraron 5 µ? de cada muestra para el ensayo y después volvió al refrigerador para la conservación. Las muestras se diluyeron con regulador de hibridación (sonda de detección 8 nM mNOX-E36 [SEQ.ID:282] en regulador de lavado) a TA de acuerdo con el siguiente esquema: 1:30 muestra 5 µ? + 145 µ? de regulador de hibridación 1:300 20 µ? 1:30 + 180 µ? de regulador de hibridación 1:3000 20 µ? 1:300 + 180 µ? de regulador de hibridación 1:30000 20 µ? 1:3000+ 180 µ.? de regulador de hibridación Se ensayaron todas las diluciones de las muestras. El mNOX-E36 estándar se diluyó en forma seriada en una curva de calibración de 8 puntos que abarca el rango de 0-4 nM. Se prepararon y ensayaron las muestras No QC. El estándar de calibración fue idéntico a las muestras en estudio. Hibridación y detección Las muestras se calentaron durante 10 min a 95°C y se enfrió a 37°C. Los complejos de Spiegelmero/sonda de detección se aparearon a sonda de captura inmovilizadas durante 30 min a 37°C. Los spiegelmero no enlazados se retiraron por lavado dos veces con regulador de lavado y 1x TBST (Tris-CI 20 mM, NaCI 137 mM, Tween 20 0,1%, pH 7.5), respectivamente. Los complejos hibridados se detectaron por estreptavidina-fosfatasa alcalina diluida en 1:5000 en TBST 1x durante 1h a temperatura ambiente. Para eliminar el conjugado no unido, los pocilios se lavaron otra vez con TBST 1x y Tris-CI 20 mM, MgCI2 1 mM, pH 9,8 (cada uno dos veces). Los pocilios se llenaron finalmente con 100 mi de sustrato CSDP (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania) y se incubaron durante 45 min a temperatura ambiente. Se midió la quimioluminiscencia en un lector de microplaca FLUOstar Optima (BMG Labtechnologies, Offenburg, Alemania).

Análisis de datos Se usaron las siguientes diluciones de muestra de ensayo para el análisis de datos cuantitativos: Plasma EDTA de rata 1:2000 Los datos obtenidos del grupo vehículo (no se administró Spiegelmero) se sustrajo como señal umbral. El ensayo de hibridación descrito en la presente memoria también actúa en modo similar para el Spiegelmero NOX-36, NOX-E36-5'-PEG y NOX-E36-3'-PEG donde se ha usado la sonda de captura respectiva NOX-E36 (SEQ.ID:255) y la sonda de detección NOX-E36 respectiva (SEQ.ID:256) (datos no mostrados). Resultados El mNOX-E36-3'PEG mejora la supervivencia y enfermedad renal de los ratones MRLlpr/lpr Los ratones MRLlpr lpr se desarrollan y posteriormente mueren de glomerulonefritis compleja inmune proliferativa con llamativa semejanzas con la nefritis lúpica proliferativa difusa de los seres humanos. En este diseño de estudio terapéutico, los ratones MRLlpr lpr tratados con Spiegelmero anti-mCCL2 pegilado y no pegilado, ("PoC")-Spiegelmero control regulado o no pegilado o vehículo eran de 14 a 24 de semanas. En este punto de tiempo, el vehículo, los ratones MRLlpr lpr tratados con PoC o PoC-PEG mostraron glomerulonefritis proliferativa difusa por infiltración de macrófagos glomerular y un infiltrado de células inflamatorias mixtas periglomerulares e intersticiales que consiste en macrófagos glomerulares e intersticiales positivos a Mac2 y linfocitos intersticiales positivos a CD3 (Figuras 34 y 35). mNOX-E36-3'PEG mejoró el índice de actividad y cronicidad de la nefritis lúpica además de los marcadores de inflamación renal previamente mencionados (Fig. 35). La molécula de mNOX-E36 no pegilada fue menos efectiva en el índice de cronicidad y los recuentos de macrófagos intersticiales y células T (Fig. 35). La enfermedad renal crónica avanzada se ilustró adicionalmente por atrofia tubular y áreas confluentes de fibrosis intersticiales en ratones tratados con vehículo, PoC, y PoC-PEG (Fig. 34). Por la aplicación de morfometría para cuantificar estos cambios, se halló que mNOX-E36 pegilado y no pegilado redujo el volumen intersticial, el daño celular tubular y dilatación tubular, todos son marcadores de la gravedad y pronóstico de la enfermedad renal crónica (Fig.36). El mNOX-E36-3'PEG pero no el mNOX-E36 no pegilado mejoró el 50% de la mortalidad (Fig. 37). De este modo, el mNOX-E36-3'PEG puede reducir el número de macrófagos renales e infiltrados de células T y mejorar la nefritis lúpica y supervivencia (renal) de los ratones M RLiPr/ipr para estudiar s¡ e| tratamiento con mNOX-E36 y mNOX- E36-3'PEG afecta la inflamación intrarrenal en ratones MRLlpr lpr, se llevó a cabo la RT-PCR en tiempo real para evaluar los niveles de expresión de las quimiocinas proinflamatorias CCL2 y CCL5 que había demostrado previamente estar reguladas por aumento en forma progresiva en los ríñones de los ratones MRLlpr lpr durante el avance de la enfermedad renal (Pérez de Lema 2001). El tratamiento con mNOX-E36 y mNOX-E36-3'PEG desde la semana 14 a 24 redujo la expresión renal del ARNm de CCL2 y CCL5 en comparación con los controles tratados con vehículos (Fig. 38). Los Spiegelmeros anti-CCL2 reducen la lesión tisular extrarrenal autoinmune de los ratones MRLiprñpr La piel y los pulmones también están afectadas comúnmente de lesiones titulares autoinmunes en los ratones MRLlpr"pr. La enfermedad pulmonar autoinmune en los ratones tratados con vehículo se caracterizó por infiltrados moderados de células inflamatorias peribronquiolares y perivasculares y se observaron lesiones cutáneas en 60% de los ratones (Figuras 39, 40 y 35). Tanto mNOX-E36 como mNOX-E36-3'PEG redujeron la inflamación peribronquial y la enfermedad cutánea en comparación con los ratones MRLlpr lpr tratados con vehículo, PoC, y PoC-PEG, respectivamente (Figuras 39, 40 y 35). En consecuencia, los efectos de los Spiegelmeros específicos de CCL2 no están limitados a nefritis lúpica sino que se extienden a otras manifestaciones de lesión tisular autoinmune de los ratones MRL,p"'pr. mNOX-E36 y el síndrome linfoproliferativo, autoanticuerpos ADNsd y niveles de citocinas séricas de los ratones MRLlpr/lpr Los ratones RLlpr lpr hembra desarrollan un síndrome linfoproliferativo caracterizado por esplenomegalia masiva y masas de ganglios linfáticos cervicales, axilares, inguinales y mesentéricos. Tanto mNOX-E36 como mNOX-E36-3'PEG no presentaron efecto sobre el peso de los bazos y ganglios linfáticos de los ratones M R 1_ipr/iPr ^Fjg 41 ) La a u 10 ¡ n m u n i d ad en los ratones MRLlpr/lpr se caracteriza por la producción de autoanticuerpos contra múltiples antígenos nucleares que incluyen a ADNsd. En suero de ratones M R(_ipr/ipr de 24 semanas el autoanticuerpos IgG, IgG,, lgG2a, lgG2 de ADNsd se presentaron en altos niveles. Tanto mNOX-E36 como mNOX-E36-3'PEG no presentaron efecto sobre ninguno de estos autoanticuerpos de ADN (Fig. 41). La enfermedad semejante a lupus en ratones MRLlpr/lpr tratados con vehículo se caracterizó por elevados niveles séricos de IFN-a, IL-12p40, y IL-6. Tanto mNOX-E36 como mNOX-E36-3'PEG no presentaron efecto sobre estos mediadores inflamatorios (Fig. 41). De este modo, amas variantes de mNOX-E36 no afectan a la linfoproliferación, producción de IgG anti-ADNsd y niveles de citocinas séricas en ratones MRLlpr lpr. Niveles plasmáticos de mNOX-E36 y mNOX-E36-3'PEG de los ratones MRLlpr/lpr Los niveles de mNOX-E36 y mNOX-E36-3'PEG se determinaron en intervalos semanales para controlar la exposición al fármaco durante la enfermedad renal progresiva en los ratones MRLlpr l r. Los niveles plasmáticos medios de mNOX-E36 3 h después de la inyección y de mNOX-E36-3'PEG 24 h después de la inyección fueron de aproximadamente 300 nM y 1 µ? a lo largo del estudio, respectivamente (Fig. 42). De este modo, la pegilación aumentó los niveles plasmáticos de mNOX-E36 y la enfermedad renal progresiva de los ratones MRLlpr"pr no modularon la farmacocinética de ambos Spiegelmeros. mNOX-E36-3'PEG bloquea la emigración de monocitos de la médula ósea Se demostró que la emigración de monocitos de la médula ósea durante la infección bacteriana involucra al receptor de quimiocina receptor CCR2 (Serbina 2006), pero el papel de CCL2 en el contexto de la autoinmunidad todavía es hipotético. En consecuencia, se examinó la población de monocitos positivos a CCR2 en sangre periférica y médulas óseas de ratones de grupos de ratones MRLlpr/lpr de 24 semanas tratados con mNOX-E36-3'PEG- y vehículo. El tratamiento con mNOX-E36-3'PEG aumentó el porcentaje de células positivas a CCR2 en la médula ósea de 13% a 26% mientras que redujo esta población en al sangre periférica de 26% a 11% (Fig. 43). Estos datos avalan un papel de CCL2 para la evasión de las células CCR2 positivas de la medula ósea durante la enfermedades autoinmune de los ratones MRLlpr/lpr. Síntesis Aplicando la tecnología del Spiegelmero, se creó un nuevo y específico antagonista de mCCL2 que potencialmente bloquea a mCCL2 in vitro e in vivo. En efecto, el comienzo tardío del tratamiento con el Spiegelmero CCL2 aumentó considerablemente la lesión tisular semejante a lupus avanzada en los ratones MRl_'pr lpr. Estos datos avalan un papel central para el CCL2 en el daño tisular inflamatorio crónico e identifica a los Spiegelmeros CCL2 como una nueva terapéutica para la lesión tisular autoinmune. Ejemplo 9: Terapia de la nefropatía diabética en ratones nefrectomizados unilateralmente con Spiegelmero anti-mMCP-1 La nefropatía diabética aún es la causa principal de la enfermedad renal en estadio final debido a que dirigirse el tratamiento a los mecanismos patológicos dependientes de angiotensina no siempre impide el avance de la enfermedad (Zimmet 2001; Ritz 1999; United States Renal Data System 2004; Svensson 2003). En consecuencia, se requieren otras estrategias de tratamiento para agregar al armamento terapéutico para la nefropatía diabética. Los datos de estudios experimentales recientes relacionan el avance de la nefropatía diabética a la inflamación intrarrenal (Galkina 2006; Mora 2005; Meyer 2003; Tuttle 2005). Por ejemplo, el micofenolato de mofetilo, metotrexato o la irradiación reducen la excreción de albúmina urinaria y la glomeruloesclerosis en ratas con nefropatía diabética inducida por estreptozotocina (Yozai 2005; Utimura 2003). Todavía hoy, los mecanismos moleculares y celulares de la inflamación intrarrenal en la nefropatía diabética continúan mal caracterizados. Los pacientes con nefropatía diabética han aumentado los niveles séricos de marcadores de fase aguda de la inflamación pero esto no representa la inflamación intrarrenal (Dalla Vestra 2005; Navarro 2003). Los pacientes con nefropatía diabética excretan altos niveles de proteína 1 quimiotáctica de monocitos- quimiocina CC (MCP-1/CCL2) en al orina que puede ser más específica para la inflamación intrarrenal (Morii 2003; Tashiro 2002; Takebayashi 2006). En efecto, la MCP-1/CCL2 se expresa en las células mesangiales humanas expuestas a altas concentraciones de glucosa o productos finales de la glicación avanzada 1998; Yamagishi 2002). La CCL2 participa en el proceso complejo de múltiples pasos del reclutamiento de leucocitos de los compartimientos intravascular a extravascular, es decir glomérulos e intersticio renal (Baggiolini 1998). En efecto, los infiltrados de macrófagos son un hallazgo común en la glomeruloesclerosis diabética y la lesión tubulointersticial humana y experimental (Bohle 1991; Furuta 1993; Chow 2007). Los ratones diabéticos deficientes en Ccl2 tipo 1 o tipo 2 tienen recuentos de macrófagos glomerulares inferiores, lo que se asocia con menor lesión glomerular (Chow 2004; Chow 2006). En estos estudios también de ha demostrado el papel funcional de CCL2 en la patología glomerular de la nefropatía diabética de tipo 1 y tipo 2. En consecuencia, CCL2 puede representar un potencial objetivo terapéutico para la nefropatía diabética y antagonistas de CCL2 adecuados con perfiles farmacocinéticos favorables que debe ser validado en este contexto de enfermedad. En este ejemplo nosotros informamos los efectos de Spiegelmero mNOX-E36-3'PEG anti-CCL2 PEGilado en ratones db/db diabéticos de tipo 2 con nefropatía diabética avanzada. Nosotros demostramos que el Spiegelmero anti-CCL2 debería ser adecuado para el tratamiento de la nefropatía diabética. Animales y protocolo experimental Se obtuvieron ratones db/db C57BL S de C57BLKS tipo salvaje machos de 5 semanas de Taconic (Ry, Dinamarca) y se albergaron en jaulas con filtro en el extremo superior con un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad y acceso ilimitado a comida y agua durante el estudio. Las jaulas, camas, material de anidamiento, alimento y agua se esterilizaron con autoclave antes de usar. A la edad de 6 semanas se realizó una uninef rectomía (ratones "1K") o cirugía falsa (ratones "2K") mediante una incisión de 1 cm en el flanco como se describió previamente en ratones db/db y tipo salvaje (Bower 1980). En los ratones de los grupos de la cirugía falsa el riñon se dejó in situ. Después de 10 semanas, a la edad de 4 meses, los ratones db/db 1K se dividieron en dos grupos que recibieron tres veces por semana inyecciones subcutáneas con mNOX-E36-3'PEG o PoC-PEG en 5% de glucosa (dosis, 0,9 µ?t???/kg; volumen de inyección, 1 ml/kg). El tratamiento continuó durante 8 semanas (hasta la edad de 6 meses) cuando los animales se sacrificaron y se obtuvieron los tejidos para la evaluación histopatológica. Todos los procedimientos experimentales han sido aprobados por las autoridades gubernamentales locales. Evaluación de la nefropatía diabética Todos los estudios inmunohistológicos se realizaron en las secciones incluidas en parafina descritas (Anders 2002). Los siguientes anticuerpos se usaron como anticuerpos primarios: anti- Mac2 de rata (macrófagos glomerulares, Cederlane, Ontario, Canadá, 1:50), anti-Ki-67 (proliferación celular, Dianova, Hamburg, Alemania, 1:25). Para la evaluación histopatológica, se fijaron partes de de los ríñones de cada ratón en 10% de formalina en solución salina regulada con fosfato y se incluyeron en parafina. Se colorearon secciones de 3 µ?? con reactivo de ácido peryódico de Schiff o plata siguiendo las instrucciones del proveedor (Bio-Optica, Milano, Italia). Las lesiones escleróticas glomerulares se evaluaron mediante un puntaje semicuantitativo con un observador ciego de la siguiente manera: 0 = no lesión, 1 = < 25% esclerótico, 2 = 25-49% esclerótico, 3 = 50-74% esclerótico, 4 = 75-100% esclerótico, respectivamente. Se analizaron 15 glomérulos por sección. Los índices de volumen intersticial y dilatación tubular se determinaron por superposición de una cuadrícula de 100 puntos en 10 campos corticales no superpuestos como se describió previamente (Anders 2002). Los recuentos de células intersticiales fueron determinados en 15 campos de alta potencia (hpf, 400 x) por un observador ciego. La preparación de ARN y la RT-PCR de tiempo real cuantitativa (TaqMan) se hicieron a partir de los glomérulos desparafinados. Después de la incubación en regulador de lisado (Tris-HCI 10 mM, EDTA 0,1 mM, SDS 2% y 20 pg/ml de proteinasa K) durante 16 h a 60°C, se realizó la extracción del ARN sobre la base de fenol- cloroformo. El ARN glomerular se disolvió en 10 µ? de agua libre de ARNasa. Se realizó la transcripción reversa y la RT-PCR de tiempo real del ARN total del órgano y glomerular descrita (Anders 2002, Cohén 2002). Los controles que consistían en ddH20 fueron negativos para los genes objetivo y constitutivos. El cebador (300 nM) y las sondas de oligonucleótidos (100 nM) para mCcl2, Gapdh, y ARNr 18 S fueron reactivos del ensayo TaqMan predesarrollados de PE. Los cebadores y sondas eran de ABI Biosystems, Weiterstadt, Alemania. La velocidad de filtración glomerular (GFR) se determinó por la cinética de depuración de FITC-inulina (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) 5, 10, 15, 20, 35, 60, y 90 minutos después de una inyección en bolo única (Qi 2004). La fluorescencia se determinó con 485 nm de excitación y se leyó a una emisión de 535 nm. La GFR se calculó sobre la base de un modelo de dos compartimientos un programa de computación de ajuste de curva con regresión no lineal (GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Todos los datos se presentan como media ± SEM. Se realizó la comparación de los grupos mediante ANOVA y se usó la corrección de Bonferroni post-hoc para conversiones múltiples. Se consideró que un valor de p < 0,05 indica significación estadística. Resultados mNOX-E36-3'PEG reduce los recuentos de macrofagos glomerulares y la glomeruloesclerosis global en ratones db/db nefrectomizados unilateralmente Cuando la falta de CCL2 funcional se asocia con reclutamiento de macrofagos glomerulares reducido en los ratones db/db (Chow 2007) y el mNOX-E36-3'PEG puede bloquear el reclutamiento de macrófagos mediado por CCL2 in vitro e in vivo, mNOX-E36-3'PEG debe alterar el reclutamiento de macrófagos renales en ratones db/db con nefropatía diabética tipo 2 avanzada. Para probar esta hipótesis, nosotros realizamos inyecciones subcutáneas con mNOX- E36-3'PEG o PoC-PEG a la edad de 4 meses en los ratones db/db ("1K") nef rectomizados unilateralmente. El tratamiento continuó durante 8 semanas cuando se recogieron tejidos para la evaluación de la nefropatía diabética. Durante este período, el tratamiento con mNOX-E36-3'PEG no afectó significativamente los recuentos de leucocitos o plaquetas, los niveles de glucemia o peso corporal fueron considerablemente elevados en todos los grupos de ratones db/db en comparación con los ratones BLKS no diabéticos (datos no mostrados). De modo interesante, mNOX-E36-3'PEG aumentó los niveles séricos de CCL2 en ratones db/db, lo que indica que el antagonista de CCL2 retiene CCL2 en la circulación (Fig. 44). Compatible con nuestra hipótesis el mNOX-E36-3'PEG redujo en forma significativa el número de macrófagos glomerulares en un 40% en comparación con los ratones db/db tratados con PoC-PEG o vehículo, asociado con cantidades menores de células proliferantes positivas a Ki-67 dentro del glomérulo en los ratones db/db tratados con mNOX-E36-3'PEG (Fig. 45). Estos hallazgos se asociaron con un aumento significativo de la giomeruloescierosis diabética total en ratones db/db 1K (Fig. 46). En efecto, el tratamiento mNOX-E36- 3'PEG redujo la giomeruloescierosis diabética en ratones db/db 1K en la medida de la giomeruloescierosis presente en ratones db/db ("2K") no nefrectomizados apareados por edad (Fig. 46). Estos hallazgos muestran que el bloqueo demorado del reclutamiento de macrófagos glomerulares dependiente de CCL2 con mNOX-E36- 3'PEG impide la giomeruloescierosis diabética total en ratones db/db diabéticos tipo 2. mNOX-E36-3'PEG mejora la GFR en ratones db/db 1K Los efectos beneficiosos del tratamiento con mNOX-E36-3'PEG en la glomeruloesclerosis diabética en ratones db/db 1K se deberían asociar con una GFR mejor. Nosotros analizamos la cinética de la depuración de FITC-inulina como un marcador de la GFR en ratones db/db (Qi 2004). En comparación con una GFR normal de aproximadamente 250 ml/min en ratones db/db (Qi 2004), nosotros hallamos una GFR reducida de 112 ± 23 ml/min en ratones db/db 1K de 6 meses inyectados con PoC-PEG (Fig. 47). El tratamiento con mNOX-E36-3'PEG mejoró significativamente la GFR a 231 ± 30 ml/min en ratones db/db 1K (p < 0,001) los que sugiere que el bloqueo del reclutamiento de macrófagos glomerulares dependiente de CCL2 también puede mejorar la función renal en ratones diabéticos tipo 2. mNOX-E36-3'PEG reduce los recuentos de macrófagos intersticiales y la lesión tubulointersticial en ratones db/db 1 K La nefropatía diabética avanzada en los seres humanos se asocia con cantidades significativas de macrófagos intersticiales y lesión tubulointersticial (Bohle 1991). En los ratones db/db 2K los infiltrados de macrófagos intersticiales y la lesión tubulointersticial significativa no aparece antes de los 8 meses (Chow 2007). La uninefrectomía temprana acelera el desarrollo de la patología tubulointersticial en ratones db/db (Ninichuk 2005), de este modo nosotros cuantificamos macrófagos intersticial, dilatación tubular y volumen intersticial como marcadores del daño tubulointersticial en ratones de todos los grupos de 6 meses de edad. En este punto de tiempo los ratones db/db 1K demostraron cantidades aumentadas de macrófagos intersticiales y elevaciones significativas de dilatación tubular y volumen intersticial en comparación con ratones db/db 2K (Fig. 45, Fig. 48). El tratamiento con mNOX-E36-3'PEG redujo las cantidades de macrófagos intersticiales en 53% además de la dilatación tubular y volumen intersticial en ratones db/db 1K (Fig. 45, Fig. 48). De este modo, el bloqueo del reclutamiento de macrófagos renales dependiente de CCL2 también impide la lesión tubulointersticial en ratones db/db diabéticas tipo 2. mNOX-E36-3'PEG reduce la expresión renal de Ccl2 in ratones db/db 1K Los infiltrados de macrófagos amplifican las respuestas inflamatorias de la lesión tisular, por ejemplo, expresión local de CCL2. Nosotros en consecuencia hipotetizamos que la disminución de los macrófagos renales relacionada con mNOX-E36-3'PEG se debe asociar con menos expresión de CCL2 renal. Nosotros usamos RT-PCR de tiempo real para cuantificar la expresión de ARNm de CCL2 en ratones db/db. mNOX-E36-3'PEG redujo los niveles de ARNm de CCL2 en ríñones de ratones db/db 1K de 6 meses en comparación con ratones tratados con PoC-PEG apareados por edad (Fig.49). Para evaluar adicionalmente la expresión espacial de CCL2 nosotros realizamos la inmunotinción para la proteína de CCL2 en secciones renales. En ratones db/db 1K la expresión de CCL2 aumentó considerablemente en los glomérulos, túbulos, y células intersticiales en comparación con los ratones db/db 2K o tipo salvaje 2 (Fig. 50). mNOX-E36-3'PEG redujo considerablemente la tinción de CCL2 en todos los compartimientos en comparación con los ratones db/db 1K tratados con vehículo o PoC-PEG. Estos datos indican que el bloqueo del reclutamiento de macrófagos renales dependiente de CCL2 con mNOX-E36-3'PEG reduce la expresión local de CCL2 en ratones db/db 1K. Síntesis El concepto de que la inflamación contribuye al avance de la nefropatía diabética ha sido aceptado en forma creciente (Tuttle 2005), y lleva a considerar a la MCP-1/CCL2 como un objetivo potencial para tratar esta enfermedad. En este ejemplo, nosotros hemos mostrado que el tratamiento de los ratones diabéticos nefrectomizados unilateralmente con mNOX-E36-3'PEG redujo las cantidades de macrófagos glomerulares (e intersticiales) de 6 meses, asociados con menos células glomerulares proliferantes. Además, la expresión renal/glomerular del ARNm de CCL2 se redujo considerablemente con el tratamiento con mNOX-E36-3'PEG. Además, las cantidades inferiores de macrófagos glomerulares y células glomerulares proliferantes del grupo de terapia estuvieron asociados con la protección de la glomeruloesclerosis total y con un significativo aumento de la velocidad de filtración glomerular. Los efectos beneficiosos de mNOX-E36-3'PEG sobre la patología glomerular y la función renal en ratones diabéticos son compatibles con estos estudios que han usado otros antagonistas de CCL2 en otros modelos de lesión glomerular (Lloyd 1997, Hasegawa 2003, Tang 1996, Wenzel 1997, Fujinaka 1997, Schneider 1999). El comienzo tardío del bloqueo de CCL2 también redujo en forma considerable las cantidades de macrófagos intersticiales que están asociados con menos patología tubulointersticial en ratones db/db 1 K. En conjunto, estos datos validan a CCL2 como un objetivo terapéutico promisorio para la nefropatía diabética y sugiere que el comienzo del bloqueo de CCL2 con un Spiegelmero - aun en estado avanzado de la enfermedad - puede ser todavía protector.

Referencias Los datos bibliográficos completos de los documentos mencionados en la presente memoria, cuya descripción está incorporada como referencia, si no se indica lo contrario, son los siguientes. Akahoshi T, Wada C, Endo H, Hirota K, Hosaka S, Takagishi K, Kondo H, Kashiwazaki S, Matsushima K (1993). Expression of monocyte chemotactic and activating factor in rheumatoid arthritis. Regulation of ¡ts production in synovial cells by interleukin-1 and tumor necrosis factor. Arthritis Rheum.36:762 Alam R, York J, Moyars M, Stafford S, Grant JA, Lee J, Forsythe P, Sim T, Ida N (1996). Increased MCP-1, RANTES, and MIP-1a in bronchoalveolar lavage fluid of allergic asthmatic patients. Am. J. Respir. Crit. Care Med.153:1398 Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990), Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215(3):403-10. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, iller W, Lipman DJ (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein datábase search programs. Acids nucieics Res. Sep 1 ;25(17):3389-402. Amann B, Tinzmann R, Angelkort B (2003). ACE inhibitors improve diabetic nephropathy through suppression of renal MCP-1. Diabetes Care 26:2421 Anders HJ, Vielhauer V, Frink M, Linde Y, Cohén CD, Blattner SM, Kretzler M, Strutz F, Mack M, Grone HJ, Onuffer J, Horuk R, Nelson PJ, Schlóndorff D (2002). A chemokines receptor CCR-1 antagonist reduces renal fibrosis after unilateral uréter ligation. J. Clin. Invest. 109:251 Anders HJ, Vielhauer V, Schlóndorff D (2003). Chemokines and chemokine. quimiocina receptors are involved in the resolution o progression of renal disease. Kidney Int.63:401 Aurup H et al. (1994). Acid nucieics Res 22:20 Austin HA 3rd, Muenz LR, Joyce KM, Antonovych TT, Balow JE (1984). Diffuse proliferative lupus nephritis: Identification of specific pathologic features affecting renal outcome. Kidney Int. 25:689 Baggiolini M, Dewald B, Moser B (1994). lnterleukin-8 and related chemotactic cytokines - CXC and CC chemokines. . Adv. Immunol.55:97 Baggiolini M (1998). Chemokines and leukocyte traffic. Nature 392:565 Banba , Nakamura T, Matsumura M, Kuroda H, Hattori Y, Kasai K (2000). Possible relationship of monocyte chemoattractant protein-1 with diabetic nephropathy. Kidney Int. 58:684 Banisor I, Leist TP, Kalman B (2005). Involvement of ß-chemokines in the development of inflammatory demyelination. J. Neuroinflammation 2:7 Bazan JF, Bacon KB, Hardiman G, Wang W, Soo K, Rossi D, Greaves DR, Zlotnik A, Schall TJ (1997). A new class of membrane-bound chemokine with a CX3C motif. Nature 385:640 Berkhout TA (1997). J Biol Chem 272:16404 Bohle A, Wehrmann M, Bogenschutz O, Batz C, Muller CA, Muller GA (199.1). The pathogenesis of chronic renal failure in diabetic nephropathy. Investigation of 488 cases of diabetic glomeruloesclerosis. Pathol. Res. Pract. 187:251 Boring L, Gosling J, Chensue SW, Kunkel SL, Farese RV Jr, Broxmeyer HE, Charo IF (1997). Impaired monocyte migration and reduced type 1 (Th1) cytokine responses in C-C chemokine receptor 2 knockout mice. J. Clin. Invest. 100:2552 Boring L, Gosling J, Cleary M, Charo IF (1998). Decreased lesión formation in CCR2-/- mice reveáis a role for chemokine in the initiation of atherosclerosis. Nature 394:894 Boring L, Gosling J, Monteclaro FS, Lusis AJ, Tsou CL, Charo IF (1996). Molecular cloning and functional expression of murine JE (monocyte chemoattractant protein 1) and murine macrophage inflammatory protein lalpha receptors: evidence for two closely linked C-C chemokine receptors on chromosome 9. J. Biol. Chem. 271 :7551 Bossink AW, Paemen L, Jansen PM, Hack CE, Thijs LG, Van Damme J (1995). Plasma levéis of the chemokine monocyte chemotactic proteins-1 and -2 are elevated in human sepsis. Blood 86:3841 Bower G, Brown DM, Steffes MW, Vernier RL, Mauer SM (1980). Studies of the glomerular mesangium and the juxtaglomerular apparatus in the genetically diabetic mouse. Lab. Invest.43:333 Charo IF, Myers SJ, Hermán A, Franci C, Connolly AJ, Coughlin SR (1994). Molecular cloning and functional expression of two monocyte chemoattractant protein 1 receptors reveáis alternative splicing of the carboxil-terminal tails. Proc. Nati Acad. Sci. USA 91:2752 Chow FY, Nikolic-Paterson DJ, Ma FY, Ozols E, Rollins BJ, Tesch GH (2007). Monocyte chemoattractant protein-1 -induced tissue inflammation is critical for the development of renal injury but not type 2 diabetes in obese db/db mice. Diabetologica 50:471 Chow FY, Nikolic-Paterson DJ, Ozols E, Atkins RC, Rollin BJ, Tesch GH (2006). Monocyte chemoattractant protein-1 promotes the development of diabetic renal injury in streptozotocin-treated mice. Kidney Int.69:73 Chow F, Ozols E, Nikolic-Paterson DJ, Atkins RC, Tesch GH (2004). Macrophages in mouse type 2diabetic nephropathy: Correlation with diabetic state and progressive renal injury. Kidney Int. 65:116 Cockwell P, Howie AJ, Adu D, Savage CO (1998). In situ analysis of C-C chemokine mRNA in human glomerulonephritis. Kidney Int. 54:827 Cohén CD, Gróne HJ, Gróne EF, Nelson PJ, Schlondorff D, Kretzler M (2002). Láser microdissection and gene expression analysis on formaldehyde-fixed archival tissue. Kidney Int. 61:125 Cummins LL et al. (1995). Acids nucleics Res 23:2019 Dalla Vestra M, Mussap M, Gallina P, Bruseghin M, Cernigoi AM, Saller A, Plebani M, Fioretto P (2005). Acute-phase markers of inflammation and glomerular structure in patients with type 2 diabetes. J. Am. Soc. Nephrol. 16 Suppl 1:S78 Dawson J, Miltz W, Mir AK, Wiessner C (2003). Targeting monocyte chemoattractant protein-1 signalling in disease. Expert Opin. Ther. Targets 7:35 De Bleecker JL, De Paepe B, Vanwalleghem IE, Schroder JM (2002). Differential expression of chemokines in inflammatory myopathies. Neurology 58:1779 Drolet DW, Nelson J, Tucker CE, Zack PM, Nixon K, Bolin R, Judkins MB, Farmer JA, Wolf JL, Gilí SC, Bendele RA (2000). Pharmacokinetics and safety of an anti-vascular endothelial growth factor aptamer (NX1838) following injection into the vitreous humor of rhesus monkeys. Pharm. Res. 17:1503 Eaton BE et al. (1995). Chem Biol 2:633 Eaton BE, Gold L, Hicke BJ, Janjic N, Jucker FM, Sebosta DP, Tarasow TM, Willis MC, Zichi DA (1997). Bioorg Med Chem 5:1087 Economou E, Tousoulis D, Katinioti A, Stefanadis C, Trikas A, Pitsavos C, Tentolouris C, Toutouza MG, Toutouzas P (2001). Chemokines in patients with ischaemic heart disease and the effect of coronary angioplasty. Int. J. Cardiol.80:55 Egashira K, Zhao Q, Kataoka C, Ohtani K, Usui M, Charo IF, Nishida K, Inoue S, Katoh M, lchiki T, Takeshita A (2002). Importance of monocyte chemoattractant protein-1 pathway in neointimal hyperplasia after periarterial injury in mice and monkeys. Circ. Res.90:1167 Fujinaka H, Yamamoto T, Takeya M, Feng L, Kawasaki K, Yaoita E, Kondo D, Wilson CB, Uchiyama M, Kihara I (1997). Suppression of anti-glomerular basement membrane nephritis by administration of anti-monocyte chemoattractant protein-1 antibody in WKY rats. J. Am. Soc. Nephrol.8:1174 Furuichi K, Wada T, Iwata Y, Kitagawa K, Kobayashi K-l, Hashimoto H, Ishiwata Y, Tomosugi N, Mukaida N, Matsushima K, Egashira K, Yokoyama H (2003). Gene therapy expressing amino-terminal truncated monocyte chemoattractant protein-1 prevents renal ischemia-reperfusion injury. J. Am. Soc. Nephrol. 14:1066 Furuta T, Saito T, Ootaka T, Soma J, Obara K, Abe K, Yoshinaga K (1993). The role of macrophages in diabetic glomeruloesclerosis. Am. J. Kidney Dis.21:480 Galasso JM, Liu Y, Szaflarski J, Warren JS, Silverstein FS (2000). Monocyte chemoattractant proteín-1 ¡s a mediator of acute excitotoxic injury in neonatal rat brain. Neuroscience 101:737 Galkina E, Ley K (2006). Leukocyte recruitment and vascular injury in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Nephrol. 17:368-377 Gao JL, Kuhns DB, Tiffany HL, McDermott D, Li X, Francke U, Murphy PM (1993). Structure and functional expression of the human macrophage inflammatory protein 1 alpha/RANTES receptor. J. Exp. Meó. 177:1421 Garcia-Zepeda EA, Combadiere C, Ftothenberg ME, Sarafi N, Lavigne F, Hamid Q, Murphy PM, Luster AD (1996). Human monocyte chemoattractant protein (MCP)-4 is a novel CC chemokine with activities on monocytes, eosinophils, and basophils induced in allergic and nonallergic inflammation that signáis through the CC chemokine receptors (CCR)-2 and -3. J. Immunol. 157:5613 Gerard C, Rollins, BJ. Chemokine and disease. Nat. Immunol. 6:1182 Gong X, Gong W, Kuhns DB, Ben-Baruch A, Howard OM, Wang JM (1997). Monocyte chemotactic protein-2 (MCP-2) uses CCR1 and CCR2B as its functional receptors. J. Biol. Chem.272:11682 Gonzalo JA, Lloyd CM, Wen D, Albar JP, Wells TNC, Proudfoot A, Martinez-A C, Dorf M, Bjerke T, Coile AJ, Gutierrez-Ramos JC (1998). The coordinated action of CC chemokines in the lung orchestrates allergic inflammation and airway hyperresponsiveness. J. Exp. Meó. 188:157 Gordillo GM, Onat D, Stockinger M, Roy S, Atalay M, Beck FM, Sen CK (2004). A key angiogenic role of moncyte chemoattractant protein-1 in hemangioendothelioma proliferation. Am. J. Physiol. Cell Physiol.287:C866 Green LS et al. (1995). Chem Biol 2:683 Handel TM, Domaille PJ (1996). Heteronuclear (1H, 13C, 15N) NMR assignments and solution structure of the monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) dimer. Biochemistry 35:6569 Harigai M, Hará M, Yoshimura T, Leonard EJ, Inoue K, Kashiwazaki S (1993). Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in inflammatory joint diseases and its involvement in the cytokine network of rheumatoid synovium. Clin. Immunol. Immunopathol. 69:83 Hasegawa H, Kohno M, Sasaki M, Inoue A, Ito MR, Terada M, Hieshima K, Maruyama H, Miyazaki J, Yoshie O, Nose M, Fujita S (2003). Antagonist of monocyte chemoattractant protein 1 ameliorates the initiation and progression of lupus nephritis and renal vasculitis in MRL/lpr mice. Arthritis Rheum.48:2555 Heath H, Qin S et al. (1997). Quimiocina receptor usage by human eosinophils. The importance of CCR3 demonstrated using an antagonistic monoclonal antibody. J Clin Invest 99:178 Holdsworth SR, Kitching AR, Tipping PG (2000). Chemokines as therapeutic targets in renal disease. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens.9:505 Holgate ST, Bodey KS, Janezic A, Frew AJ, Kaplan AP, Teran LM (1997). Reléase of RANTES, MIP-1a, and MCP-1 into asthmatic airways following endobronchial allergen challenge. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156:1377 Hosaka S et al. (1994). Clin Exp Immunol 97:451 Huang DR, Wang J, Kivisakk P, Rollins BJ, Ransohoff RM (2001). Absence of monocyte chemoattractant protein 1 in mice leads to decreased local macrophage recruitment and antigen-specific T helper cell type 1 immune response in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Exp. Med. 193:713 Hulkower K, Brosnan CF, Aquino DA, Cammer W, Kulshrestha S, Guida MP, Rapoport DA, Berman JW (1993). Expression of CSF-1, c-fms, and MCP-1 in the central nervous system of rats with experimental allergic encephalomyelitis. J. Immunol. 150:2525 Humbert M, Ying S, Corrigan C, Menz G, Barkans J, Pfister R, Meng Q, Van Damme J, Opdenakker G, Durham SR, Kay AB (1997). Bronchial mucosal expression of the genes encoding chemokines RANTES and MCP-3 in symptomatic atopic and nonatopic asthmatics: relationship to the eosinophil-active cytokines interleukin ( I L) -5 , granulocyte macrophage-colony-stimulating factor, and IL-3. Am J Respir Cell Mol Biol 16:1 Ihm CG, Park JK, Hong SP, Lee TW, Cho BS, Kim MJ, Cha DR, Ha H (1998). A high glucose concentration stimulates the expression of monocyte chemotactic peptide 1 in human mesangial cells. Nephron 79:33 lyonaga K, Takeya M, Saita N, Sakamoto O, Yoshimura T, Ando M, Takahashi K (1994). Monocyte chemoattractant protein-1 in idiopathic pulmonary fibrosis and other interstitial lung diseases. Hum. Pathol. 25:455 Johrer K, Zelle-Rieser C, Perathoner A, Moser P, Hager M, Ramoner R, Gander H, Holtl L, Bartsch G, Greil R, Thurnher M (2005). Up-regulation of functional chemokine receptor CCR3 in human renal cell carcinoma. Clin Cáncer Res 11 :2459 Jolicoeur C, Lemay A, Akoum A (2001). Comparative effect of danazol and a GnRH agonist on monocyte chemotactic protein-1 expression by endometriotic cells. Am. J. Reprod. Immunol.45:86 José PJ, Griffiths-Johnson DA, Collins PD, Walsh DT, Moqbel R, Totty NF, Truong O, Hsuan JJ, Williams TJ. Eotaxina: a potent eosinophil chemoattractant cytokine detected in a guinea pig model of allergic airways inflammation. J. Exp. Med. 179:881 Kaburagi Y, Shimada Y, Nagaoka T, Hasegawa M, Takehara K, Sato S (2001). Enhanced production of CC-chemokines (RANTES, MCP-1, ???-1a, ???-1ß, and eotaxina) in patients with atopic dermatitis. Arch. Dermatol. Res.293:350 Kawasaki AM et al. (1993). J Med Chem 36:831 Kennedy KJ, Strieter RM, Kunkel SL, Lukacs NW, Karpus WJ (1998). Acute and relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis are regulated by differential expression of the CC chemokines macrophage inflammatory protein-1 and monocyte chemotactic protein-1. J. Neuroimmunol.91:98 Kim JS, Gautam SC, Chopp M, Zaloga C, Jones ML, Ward PA, Welch KM (1995). Expression of monocyte chemoattractant protein-1 and macrophage inflammatory prote¡n-1 after focal cerebral ischemia in the rat. J. Neuroimmunol. 56:127 Kitamoto S, Egashira K (2003). Anti-monocyte chemoattractant protein-1 gene therapy for cardiovascular diseases. Expert fíev. Cardiovasc. Ther. 1:393 Kleinhans M, Tun-Kyi A, Gilliet M, Kadin ME, Dummer R, Burg G, and Nestle FO (2003). Functional expression of the eotaxin receptor CCR3 in CD30+ cutaneous T-cell lymphoma. Blood 101:1487 Koch AE, Kunkel SL, Harlow LA, Johnson B, Evanoff HL, Haines GK, Burdick MD, Pope RM, Strieter RM (1992). Enhanced production of monocyte chemoattractant protein-1 in rheumatoid arthritis. J. Clin. Invest.90:772 Kouno J, Nagai H, Nagahata T, Onda M, Yamaguchi H, Adachi K, Takahashi H, Teramoto A, and Emi M (2004). Up-regulation of CC chemokine, CCL3L1, and receptors, CCR3, CCR5 in human glioblastoma that promotes cell growth. J Neurooncol 70:301 Kurihara T, Warr G, Loy J, Bravo R (1997). Defects in macrophage recruitment and host defense in mice lacking the CCR2 chemokine receptor. J. Exp. Med.186:1757 Kusser W (2000). J Biotechnol 74:27-38 Kuziel WA, Morgan SJ, Dawson TC, Griffin S, Smithies O, Ley K, Maeda N (1997). Severe reduction in leukocyte adhesión and monocyte extravasation in mice deficient in CC chemokine receptor 2. Proc. Nati Acad. Sci. U SA 94:12053 Lesnik EA et al. (1993). Biochemistry 32:7832 Lloyd CM, Minto AW, Dorf ME, Proudfoot A, Wells TNC, Salant DJ, Gutierrez-Ramos JC (1997). R ANTES and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) play an ¡mportant role in the inflammatory phase of crescentic nephritis, but only MCP-1 is involved ¡n crescent formation and interstitial fibrosis. J. Exp. Med. 185:1371 Lu BB, Rutledge BJ, Gu L, Fiorillo J, Lukacs NW, Kunkel SL, North R, Gerard C, Rollins BJ (1998). Abnormalities in monocyte recruitment and cytokine expression in monocyte chemoattractant protein-1 deficient mice. J. Exp. Med. 187:601 Lubkowski J, Bujacz G, Boque L, Domaille PJ, Handel TM, Wlodawer A (1997). The structure of MCP-1 in two crystal forms provides a rare example of variable quaternary interactions. Nat Struct Biol 4:64 Mack M, Cihak J, Simonis C, Luckow B, Proudfoot AE, Plachy J, Bruhl H, Frink M, Anders HJ, Vielhauer V, Pfirstinger J, Stangassinger M, Schlóndorff D (2001). Expression and characterization of the chemokine receptors CCR2 and CCR5 in mice. J. Immunol. 166:4697 Martinelli R, Sabroe I, LaRosa G, Williams TJ, Pease JE. The CC chemokine eotaxin (CCL11) is a partial agonist of CC chemokine receptor 2b. J Biol Chem 276:42957 Matsushima K, Morishita K, Yoshimura T, Lavu S, Kobayashi Y, Lew W, Appella E, Kung HF, Leonard EJ, Oppenheim JJ (1989).

Molecular cloning of a human monocyte-derived neutrophil chemotactic factor (MDNCF) and the induction of MDNCF mRNA by interleukin 1 and tumor necrosis factor. J. Exp. Med. 167:1883 McGinnis S, Madden TL (2004). BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Ácidos nucleicos Res. 32(Web Server issue) :W20-5. Meyer TW (2003). Immunosuppression for diabetic glomerular disease? Kidney Int. 63:377 Miller MD, Krangel MS (1992). Biology and biochemistry of the chemokines: a family of chemotactic and inflammatory cytokines. Crit. Rev. Immunol. 12:17 Miller LE et al. (1993). J Physiol 469:213 Mora C, Navarro JF (2005). The role of inflammation as a pathogenic factor in the development of renal disease in diabetes. Curr. Diab. Rep. 5:399 Morii T, Fujita H, Narita T, Shimotomai T, Fujishima H, Yoshioka N, Imai H, Kakei M, Ito S (2003). Association of monocyte chemoattractant protein-1 with renal tubular damage in diabetic nephropathy. J. Diabetes Complications 17:11 Murphy PM, Baggiolini M, Charo IF, Hebert CA, Horuk R, Matsushima K, Miller LH, Oppenheim JJ, Power CA (2000). International unión of pharmacology . XXII. Nomenclature for chemokine receptors. Pharmacol. Rev. 52:145 Nakamura H, Weiss ST, Israel E, Luster AD, Drazen JM, Lilly CM (1999). Eotaxin and impaired lung function in asthma. Am J i 83 Respir Crit Care Med 160:1952 Nakazawa T, Hisatomi T, Nakazawa C, Noda K, Maruyama K, She H, Matsubara A, Miyahara S, Nakao S, Yin Y, Benowitz L, Hafezi-Moghadam A, Miller JW (2007). Monocyte chemoattractant protein 1 mediated retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proc Nati. Acad. Sci. U SA 104:2425 Navarro JF, Mora C, Maca M, Garca J (2003). Inflammatory parameters are independently associated with urinary albumin in type 2 diabetes mellitus. Am. J. Kidney Dis.42:53 Myers SJ, Wong LM, Charo IF (1995). Signal transduction and ligand specificity of the human monocyte chemoattractant protein-1 receptor in transfected embryonic kidney cells. J. Biol. Chem. 270:5786 Needleman & Wunsch (1970), A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol.48(3):443-53. Nelken NA, Coughlin SR, Gordon D, Wilcox JN (1991). Monocyte chemoattractant protein-1 in human atheromatous plaques. J. Clin. Invest. 88:1121 Neote K, DiGregorio D, Mak JY, Horuk R, Schall TJ (1993). Molecular cloning, functional expression, and signaling characteristics of a C-C chemokine receptor. Ce// 72:415 Ninichuk V, Gross O, Reichel C, Khandoga A, Pawar RD, Ciubar R, Segerer S, Belemezova E, Radomska E, Luckow B, de Lema GP, Murphy PM, Gao JL, Henger A, Kretzler M, Horuk R, Weber M, Krombach F, Schlondorff D, Anders HJ (2005). Delayed chemokine receptor 1 blockade prolongs survival in collagen 4A3-deficient mice with Alport disease. J. Am. Soc. Nephrol. 16:977 Ogata H, Takeya M, Yoshimura T, Takagi K, Takahashi K (1997). The role of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in the pathogenesis of collagen-induced arthritis in rats. J. Pathol. 182:106 Okuno T, Andoh A, Bamba S, Araki Y, Fujiyama Y, Fujiyama M, Bamba T (2002). lnterleukin-1 ß and tumor necrosis factor-a induce chemokine and matrix metalloproteinase gene expression in human colonic subepithelial myofibroblasts. Scand. J. Gastroenterol.37:317 Oppenheim JJ, Zachariae CO, Mukaida N, Matsushima K (1991). Properties of the novel proinflammatory supergene "intercrine" cytokine family. Annu. Rev. Immunol. 9:617 Pawar RD, Patole PS, Zecher D, Segerer S, Kretzler M, Schlondorff D, Anders HJ (2006). Toll-like receptor-7 modulates immune complex glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol. 17:141 Pearson & Lipman (1988), Improved too.ls for biological sequence comparison. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 Pérez de Lema G, Maier H, Franz TJ, Escríbese M, Chilla mS, Segerer S, Camarasa N, Schmid H, Bañas B, Kalaydjiev S, Busch DH, Pfeffer K, Mampaso F, Schlondorff D, Luckow B (2005). Chemokine receptor CCR2 deficiency reduces renal disease and prolongs survival in MRL/lpr lupus-prone mice. J. Am. Soc. Nephrol. 16:3592 Pérez de Lema G, Maier H, Nieto E, Vielhauer V, Luckow B, Mampaso F, Schlóndorff D. Chemokine expression precedes inflammatory cell infiltration and chemokine receptor and cytokine expression during the initiation of murine lupus nephritis. J. Am. Soc. Nephrol. 12:1369 Ponath PD, Qin S, Ringler DJ, Clark-Lewis I, Wang J, Kassam N, Smith H, Shi X, Gonzalo JA, Newman W, Gutierrez-Ramos JC, Mackay CR (1996a). Cloning of the human eosinophil chemoattractant, eotaxin. Expression, receptor binding, and functional properties suggest a mechanism for the selective recruitment of eosinophils. J. Clin. Invest.97:604 Ponath PD, Qin S, Post TW, Wang J, Wu L, Gerard NP, Newman W, Gerard C, Mackay CR (1996b). Molecular cloning and characterization of a eotaxin human receptor expressed selectively on eosinophils. J. Exp. Med. 183:2437 Power CA, Meyer A, Nemeth K, Bacon KB, Hoogewerf AJ, Proudfoot AE, Wells TN (1995). Molecular cloning and functional expression of a novel CC chemokine receptor cDNA from a human basophilic cell line. J. Biol. Chem.270:19495 Qi Z, Whitt I, Mehta A, Jin J, Zhao M, Harris RC, Fogo AB, Breyer MD (2004). Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Am. J. Physiol. Renal Physiol.286:F590 Qin S, LaRosa G, Campbell JJ, Smith-Heath H, Kassam N, Shi X, Zeng L, Buthcher EC, Mackay CR (1996). Expression of monocyte chemoattractant protein-1 and interleukin-8 receptors on subsets of T cells: correlation with transendothelial chemotactic potential. Eur. J. Immunol. 26:640 Ransohoff RM et al. (1993). FASEB J 7:592 Raport CJ, Gosling J, Schweickart VL, Gray PW, Charo IF (1996). Molecular cloning and functional characterization of a novel human CC chemokine receptor (CCR5) for RANTES, ???-1ß, and MIP-1a. J. Biol. Chem.271:17161 Ritz E, Rychlik I, Locatelli F, Halimi S (1999). End-stage renal failure in type 2 diabetes: A medical catastrophe of worldwide dimensions. Am. J. Kidney Dis.34:795-808 Rollins BJ, Stier P, Ernst T, Wong GG (1989). The human homolog of the JE gene encodes a monocyte secretory protein. Mol. Cell Biol.9:4687 Rollins BJ (1996). Monocyte chemoattractant protein 1: a potential regulator of monocyte recruitment in inflammatory disease. Mol. Med. Today 2:198 Rovin BH, Rumancik M, Tan L, Dickerson J (1994). Glomerular expression of monocyte chemoattractant protein-1 in experimental and human glomerulonephritis. Lab. Invest.71:536 Ruffing N, Sullivan N, et al. (1998). CCR5 has an expanded ligand-binding repertoire and is the primary receptor used by MCP-2 on activated T cells. Cell Immunol 189:160 Salcedo R, Ponce ML, Young HA, Wasserman K, Ward JM, Keinman H , Oppenheim JJ, Murphy WJ (2000). Human endothelial cells express CCR2 and respond to MCP-1: direct role of MCP-1 in angiogenesis and tumor progression. Blood 96:34 Samson M, Labbe O, Mollereau C, Vassart G, Parmentier M (1996). Molecular cloning and functional expression of a new human CC-chemokine receptor gene. Biochemistry 35:3362 Schall TJ, Bacon KB (1994). Chemokines, leukocyte trafficking, and inflammation. Curr. Opin. Immunol.6:865 Schneider A, Panzer U, Zahner G, Wenzel U, Wolf G, Thaiss F, Helmchen U, Stahl RA (1999). Monocyte chemoattractant protein-1 mediates collagen deposition in experimental glomerulonephritis by transforming growth factor-beta. Kidney Int.56:135 Schwarting A, Paul , Tschirner S, Menke J, Hansen T, Brenner W, Kelly VR, Relie M, Galle PR (2005). Interferon-beta: a therapeutic for autoimmune lupus in MRL-Faslpr mice. J. Am. Soc. Nephrol. 16:3264 Schwartz CJ, Valente AJ, Sprague EA (1993). A modern view of atherogenesis. Am. J. Cardiol.71:9B Segerer S, Nelson PJ, Schlóndorff D (2000). Chemokines, chemokine receptors, and renal disease: from basic science to pathophysiologic and therapeutic studies. J. Am. Soc. Nephrol. 11:152 Shimizu S, Nakashima H, Masutani K, Inoue Y, Miyake K, Akahoshi M, Tanaka Y, Egashira K, Hirakata H, Otsuka T, Harada M (2004). Anti-monocyte chemoattractant protein-1 gene therapy attenuates nephritis in MRL/lpr mice. Rheumatology (Oxford) 43:1121 Smith & Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2: 482 Springer TA (1995). Traffic signáis on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Annu. Rev.Physiol. 57:827 Steinman L (2004). Immune therapy for autoimmune diseases. Science 305:212 Svensson M, Sundkvist G, Arnqvist HJ, Bjork E, Blohme G, Bolinder J, Henricsson M, Nystrom L, Torffvit O, Waernbaum I, Ostman J, Eriksson JW (2003). Signs of nephropathy may occur early in young adults with diabetes despite modern diabetes management: Results from t e nationwide population-based Diabetes Incidence Study in Sweden (DISS). Diabetes Care 26:2903 Takebayashi K, Matsumoto S, Aso Y, Inukai T (2006). Association between circulating monocyte chemoattractant protein-1 and urinary albumin excretion in nonobese Tipo 2 diabetic patients. J. Diabetes Complications 20:98 Takeya M, Yoshimura T, Leónard EJ, Takahashi K (1993). Detection of monocyte chemoattractant protein-1 in human atherosclerotic lesions by an anti-monocyte chemoattractant protein- 1 monoclonal antibody. Hum. Pathol. 24:534 Tang WW, Qi M, Warren JS (1996). Monocyte chemoattractant protein 1 mediates glomerular macrophage infiltration in anti-GBM Ab GN. Kidney Int. 50:665 Tashiro K, Koyanagi I, Saitoh A, Shimizu A, Shike T, Ishiguro C, Koizumi M, Funabiki K, Horikoshi S, Shirato I, Tomino Y (2002).

Urinary levéis of monocyte chemoattractant protein-1 ( CP- ) and interleukin-8 (IL-8), and renal injuries in patients with type 2 diabetic nephropathy. J. Clin. Lab. Anal.16:1 Tesch GH, Maifert S, Schwarting A, Rollins BJ, Kelley VR (1999). Monocyte chemoattractant protein 1-dependent leukocytic infiltrates are responsible for autoimmune disease in MRL-Fas(lpr) mice. J. Exp. Meó. 190:1813 Tuaillon N, Shen de F, Berger RB, Lu B, Rollins BJ, Chan CC (2002). MCP-1 expression in endotoxin-induced uveitis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43:1493 Tuttle KR (2005). Linking metabolism and immunology: diabetic nephropathy is an inflammatory disease. J. Am. Soc. Nephrol. 16:1537 Uguccioni M, Mackay CR et al. (1997). High expression of the chemokine receptor CCR3 in human blood basophils. Role in activation by eotaxin, MCP-4, and other chemokines. J Clin Invest 100:1137 United States Renal Data System (2004). Annual data report: Incidence and prevalence 2004. Am. J. Kidney Dis. 45:S77 Utimura R, Fujihara CK, Mattar AL, Malheiros DM, Noronha IL, Zatz R (2003). Mycophenolate mofetil prevents the development of glomerular injury in experimental diabetes. Kidney Int. 63:209 Van Riper G, Siciliano S, Fischer PA, Meurer R, Springer MS, Rosen H (1993). Characterization and species distribution of high affinity GTP-coupled receptors for human rantes and monocyte chemoattractant protein 1. J. Exp. Med. 177:851 Venkatesan N et al. (2003). Curr Med Chem 10:1973 Vestergaard C, Just H, Baumgartner Nielsen J, Thestrup- Pedersen K, Deleuran M (2004). Expression of CCR2 on monocytes and macrophages in chronically inflamed skin in atopic dermatitis and psoriasis. Acta Derm. Venereol. 84:353 Viedt C, Orth SR (2002). Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in the kidney: does it more than simply attract monocytes? Nephrol. Dial. Transplant. 17:2043 Wada T, Furuichi K, Segada-Takaeda C, Ahimizu M, Sakai N, Takeda SI, Takasawa K, Kida H, Kobayashi Kl, Mukaida N, Ohmoto Y, Matsushima K, Yokoyama H (1999). MIP-1c¡ and MCP-1 contribute to crescents and interstitial lesions in human crescentic glomerulonephritis. Kidney Int. 56:995 Wada T, Yokoyama H, Matsushima K, Kobayashi Kl (2001).

Chemokines in renal diseases. Int. Immunopharmacol. 1:637 Wada T, Yokoyama H, Furuichi K, Kobayashi Kl, Harada K, Naruto M, Su SB, Akiyama M, Mukaida N, Matsushima K (1996).

Intervention of crescentic glomerulonephritis by antibodies to monocyte chemotactic and activating factor (MCAF/MCP-1 ). FASEB J. 10:1418 Wang X, Yue TL, Barone FC, Feuerstein GZ (1995). Monocyte chemoattractant protein-1 messenger ARN expression in rat ischemic cortex. Stroke 26:661 Wenzel U, Schneider A, Valente AJ, Abboud HE, Thaiss F, Helmc en U , Stahl RA (1997). Monocyte chemoattractant protein-1 mediates monocyte/macrophage influx in anti-thymocyte antibody-induced glomerulonephritis. Kidney Int. 51:770 Yamagishi S, Inagaki Y, Okamoto T, Amano S, Koga K, Takeuchi M, Makita Z (2002). Advanced glycation end product-induced apoptosis and overexpression of vascular endothelial growth factor and monocyte chemoattractant protein-1 in human-cultured mesangial cells. J. Biol. Chem. 277:20309 Ying S, Robinson DS, Meng Q, Rottman J, Kennedy R, Ringler DJ, Mackay CR, Daugherty BL, Springer MS, Durham SR, Williams TJ, Kay AB (1997). Enhanced expression of eotaxin and CCR3 mRNA and protein in atopic asthma. Association with airway hyperresponsiveness and predominant co-localization of eotaxin mRNA to bronchial epithelial and endothelial cells. Eur J Immunol 27:3507 Ying S, Meng Q, Zeibecoglou K, Robinson DS, Macfarlane A, Humbert M, Kay AB (1999). Eosinophil chemotactic chemokines (eotaxin, eotaxin-2, RANTES, monocyte chemoattractant protein-3 (MCP-3), and MCP-4), and C-C chemokine receptor 3 expression in bronchial biopsies from atopic and nonatopic (Intrinsic) asthmatics. J Immunol 163:6321 lla-Herttuala S, Lipton BA, Rosenfeld ME, Sarkioja T, Yoshimura T, Leonard EJ, Witztum JL, Steinberg D (1991). Expression of monocyte chemoattractant protein 1 in macrophage- rich áreas of human and rabbit atherosclerotic lesions. Proc. Nati Acad. Sci. U S A 88:5252 Yoshimura T, Robinson EA, Tanaka S, Appella E, Leonard EJ (1989). Purification and amino acid analysis oí two human monocyte chemoattractants produced by phytohemagglutinin-stimulated human blood mononuclear leukocytes. J. Immunol.142:1956 Yozai K, Shikata K, Sasaki M, Tone A, Ohga S, Usui H, Okada S, Wada J, Nagase R, Ogawa D, Shikata Y, Makino H (2005). Methotrexate prevents renal injury in experimental diabetic rats via anti-inflammatory actions. J. Am. Soc. Nephrol. 16:3326 Zimmet P, Alberti KG, Shaw J (2001). Global and societal irriplications of the diabetes epidemic. Nature 414:782 Las características de la presente invención descritas en la memoria descritiva, las reivindicaciones y/o las ilustraciones pueden tanto en forma separada como en cualquier combinación de las mismas ser material para realizar la invención en sus diversas formas.

Claims (95)

1. REIVINDICACIONES 1. Un ácido nucleico, que con preferencia se une a MCP-1, seleccionado del grupo que comprende ácidos nucleicos tipo 1A, ácidos nucleicos tipo 1B, ácidos nucleicos tipo 2, ácidos nucleicos tipo 3, ácidos nucleicos tipo 4 y ácidos nucleicos que tienen una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con alguna de las SEQ.ID.Nos. 87 a 115.
2. 2. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el ácido nucleico tipo 1A comprende en dirección 5'->3' una primera extensión Cuadro B1A, una segunda extensión Cuadro B2, una tercera extensión Cuadro B3, una cuarta extensión Cuadro B4, una quinta extensión Cuadro B5, una sexta extensión Cuadro B6 y una séptima extensión Cuadro B1B, por lo cual la primera extensión Cuadro B1A y la séptima extensión Cuadro B1B opcionalmente se hibridan entre sí, por la cual después de la hibridación se forma una estructura de doble cadena, la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de AGCRUG, la segunda extensión Cuadro B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CCCGGW, la tercera extensión Cuadro B3 comprende una secuencia de nucleótidos de GUR, la cuarta extensión Cuadro B4 comprende una secuencia de nucleótidos de RYA, la quinta extensión Cuadro B5 comprende una secuencia de nucleótidos de GGGGGRCGCGAYC, la sexta extensión Cuadro B6 comprende una secuencia de nucleótidos de UGCAAUAAUG o URYAWUUG, y la séptima extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de CRYGCU.
3. 3. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, donde la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de AGCGUG.
4. 4. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicaciones 2 o 3, donde la segunda extensión Cuadro B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CCCGGU.
5. 5. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde la tercera extensión Cuadro B3 comprende una secuencia de nucleótidos de GUG.
6. 6. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, donde la cuarta extensión Cuadro B4 comprende una secuencia de nucleótidos de GUA.
7. 7. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, donde la quinta extensión Cuadro B5 comprende una secuencia de nucleótidos de GGGGGGCGCGACC.
8. 8. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, donde la sexta extensión Cuadro B6 comprende una secuencia de nucleótidos de UACAUUUG.
9. 9. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, donde la séptima extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de CACGCU.
10. 10. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ.ID. No 21.
11. 11. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, donde el ácido nucleico tipo 1B comprende en dirección 5'->3' una primera extensión Cuadro B1A, una segunda extensión Cuadro B2, una tercera extensión Cuadro B3, una cuarta extensión Cuadro B4, una quinta extensión Cuadro B5, una sexta extensión Cuadro B6 y una séptima extensión Cuadro B1B, donde la primera extensión Cuadro B1A y la séptima extensión Cuadro B1B opcionalmente se hibridan entre sí, por lo cual después de la hibridación se forma una estructura de doble cadena, la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de AGYRUG, la segunda extensión Cuadro B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CCAGCU o CCAGY, la tercera extensión Cuadro B3 comprende una secuencia de nucleótidos de GUG, la cuarta extensión Cuadro B4 comprende una secuencia de nucleótidos de AUG, la quinta extensión Cuadro B5 comprende una secuencia de nucleótidos de GGGGGGCGCGACC la sexta extensión Cuadro B6 comprende una secuencia de nucleótidos de CAUUUUA o CAUUUA, y la séptima extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de CAYRCU.
12. 12. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11, donde la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de AGCGUG.
13. 13. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicaciones 11 o 12, donde la segunda extensión Cuadro B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CCAGU.
14. 14. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11a 13, donde la sexta extensión Cuadro B6 comprende una secuencia de nucleótidos de CAUUUUA.
15. 15. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, donde la séptima extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de CACGCU.
16. 16. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ.ID.No 28 y SEQ.ID.No 27.
17. 17. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, donde el ácido nucleico tipo 2 comprende en dirección 5'->3' una primera extensión Cuadro B1A, una segunda extensión Cuadro B2, y una tercera extensión Cuadro B1B, donde la primera extensión Cuadro B1A y la tercera extensión Cuadro B1B opcionalmente se hibridan entre sí, por lo cual después de la hibridación se forma una estructura de doble cadena, la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende ACGCA, CGCA y GCA, la segunda extensión Cuadro B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende UGCGU, UGCG y UGC.
18. 18. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 17, donde la segunda extensión Cuadro B2 comprende una secuencia de nucleótidos de CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC.
19. 19. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 18, donde a) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de ACGCA, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGCGU; o b) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de CGCA, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGCG; o c) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GCA, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGC o UGCG.
20. 20. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, donde la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GCA.
21. 21. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 y con preferencia la reivindicación 20, donde la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de UGCG.
22. 22. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ.ID.No 37, SEQ.ID.No 116, SEQ.ID.No 117 y SEQ.ID.No 278.
23. 23. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, donde el ácido nucleico tipo 3 comprende en dirección 5'->3' una primera extensión Cuadro B1A, una segunda extensión Cuadro B2A, una tercera extensión Cuadro B3, una cuarta extensión Cuadro B2B, una quinta extensión Cuadro B4, una sexta extensión Cuadro B5A, una séptima extensión Cuadro B6, una octava extensión Cuadro B5B y una novena extensión Cuadro B1B, donde la primera extensión Cuadro B1A y la novena extensión Cuadro B1B opcionalmente se hibridan entre sí, por lo cual después de la hibridación se forma una estructura de doble cadena, la segunda extensión Cuadro B2A y la cuarta Cuadro B2B opcionalmente se hibridan entre sí, por lo cual después de la hibridación se forma una estructura de doble cadena, la sexta extensión Cuadro B5A y la octava Cuadro B5B opcionalmente se hibridan entre sí, por lo cual después de la hibridación se forma una estructura de doble cadena, la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucieótidos que se selecciona del grupo que comprende GURCUGC, GKSYGC, KBBSC y BNGC, la segunda extensión Cuadro B2A comprende una secuencia de nucieótidos de GKMGU, la tercera extensión Cuadro B3 comprende una secuencia de nucleotidos de KRRAR, la cuarta extensión Cuadro B2B comprende una secuencia de nucleotidos de ACKMC, la quinta extensión Cuadro B4 comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que comprende CURYGA, CUWAUGA, CWRMGACW y UGCCAGUG, la sexta extensión Cuadro B5A comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que comprende GGY y CWGC, la séptima extensión Cuadro B6 comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que comprende YAGA, CKAAU y CCUUUAU, la octava extensión Cuadro B5B comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que comprende GCYR y GCWG, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que comprende GCAGCAC, GCRSMC, GSVVM y GCNV.
24. 24. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 23, donde la tercera extensión Cuadro B3 comprende una secuencia de nucleotidos de GAGAA o UAAAA
25. 25. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicaciones 23 o 24, donde la quinta extensión Cuadro B4 comprende una secuencia de nucleotidos de CAGCGACU o CAACGACU.
26. 26. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, donde la quinta extensión Cuadro B4 comprende una secuencia de nucleótidos de CAGCGACU y Cuadro B3 comprende una secuencia de nucleótidos de UAAAA.
27. 27. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, donde la quinta extensión Cuadro B4 comprende una secuencia de nucleótidos de CAACGACU y la tercera extensión Cuadro B3 comprende una secuencia de nucleótidos de GAGAA.
28. 28. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, donde la séptima extensión Cuadro B6 comprende una secuencia de nucleótidos de UAGA.
29. 29. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28, donde a) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GURCUGC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCAGCAC; o b) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GKSYGC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCRSMC; o c) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de KBBSC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GSVVM; o d) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de BNGC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCNV.
30. 30. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 29, donde a) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GUGCUGC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCAGCAC; o b) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GUGCGC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCGCAC; o c) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de KKSSC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GSSMM; o d) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de SNGC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCNS.
31. 31. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 30, donde la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GGGC, y la novena extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GCCC.
32. 32. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 31, donde la segunda extensión Cuadro B2A comprende una secuencia de nucleótidos de GKMGU y la cuarta extensión Cuadro B2B comprende una secuencia de nucleótidos de ACKMC.
33. 33. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 32, donde la segunda extensión Cuadro B2A comprende una secuencia de nucleótidos de GUAGU y la cuarta extensión Cuadro B2B comprende una secuencia de nucleótidos de ACUAC.
34. 34. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 33, donde a) la sexta extensión Cuadro B5A comprende una secuencia de nucleótidos de GGY, y la octava extensión Cuadro B5B comprende una secuencia de nucleótidos de GCYR; o b) la sexta extensión Cuadro B5A comprende una secuencia de nucleótidos de CWGC, y la octava extensión Cuadro B5B comprende una secuencia de nucleótidos de GCWG.
35. 35. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 34, donde la sexta extensión Cuadro B5A comprende una secuencia de nucleótidos de GGC, y la octava extensión Cuadro B5B comprende una secuencia de nucleótidos de GCCG.
36. 36. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 35, con preferencia 34 a 35, donde la sexta extensión Cuadro B5A híbrida con los nucleótidos GCY de la octava extensión Cuadro B5B.
37. 37. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26 y 28 a 36, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ.ID.No 56.
38. 38. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 y 27 a 36, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que comprende las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con las SEQ.ID.No 57 a 61, SEQ.ID.No 67 a 71 y SEQ.ID.No 73.
39. 39. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, donde el ácido nucleico tipo 4 comprende en dirección 5'->3' una primera extensión Cuadro B1A, una segunda extensión Cuadro B2, una tercera extensión Cuadro B1B donde la primera extensión Cuadro B1A y la tercera extensión Cuadro B1B opcionalmente se hibridan entre sí, por lo cual después de la hibridación se forma una estructura de doble cadena, la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende AGCGUGDU, GCGCGAG, CSKSUU, GUGUU y UGUU; la segunda extensión Cuadro B2 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende AGNDRDGBKGGURGYARGUAAAG, AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG y CAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGA, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende GNCASGCU, CUCGCGUC, GRSMSG, GRCAC y GGCA.
40. 40. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 39, donde a) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GUGUU, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GRCAC; b) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de GCGCGAG, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de CUCGCGUC; o c) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de CSKSUU, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GRSMSG, o d) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de UGUU, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GGCA, o e) la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de AGCGUGDU, y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GNCASGCU.
41. 41. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 40, donde la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de CSKSUU y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GRSMSG.
42. 42. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 41, donde la primera extensión Cuadro B1A comprende una secuencia de nucleótidos de CCGCUU y la tercera extensión Cuadro B1B comprende una secuencia de nucleótidos de GGGCGG.
43. 43. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 42, donde la segunda extensión Cuadro B2 comprende una secuencia de nucleótidos de AGGUGGGUGGUAGU AAGU AAAG.
44. 44. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 43, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ.ID.No 80.
45. 45. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 44, donde el ácido nucleico es capaz de unirse a una quimiocina, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
46. 46. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 45, donde el ácido nucleico es capaz de unirse a una quimiocina, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana.
47. 47. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, donde el ácido nucleico es capaz de unirse a MCP-1, donde MCP-1 se selecciona con preferencia del grupo que comprende MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina, MCP-1 porcina y MCP-1 humana.
48. 48. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 47, donde el ácido nucleico es capaz de unirse MCP-1 humana.
49. 49. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 48, con preferencia 48, donde la MCP-1 tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID No. 1.
50. 50. Un ácido nucleico, que con preferencia se une a MCP-1 murina, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ.ID.No. 122, SEQ.ID.No. 253 y SEQ.ID.No.254.
51. 51. Un ácido nucleico, que con preferencia se une a MCP-1 murina, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ.ID.No. 127.
52. 52. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 50 o 51, donde la MCP-1 murina comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID No.2.
53. 53. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 52, donde el ácido nucleico comprende una modificación, donde la modificación es con preferencia una fracción de alto peso molecular y/o donde la modificación con preferencia permite modificar las características del ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 52 en términos del tiempo de residencia en el cuerpo animal o humano, con preferencia el cuerpo humano.
54. 54. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 53, donde la modificación se selecciona del grupo que comprende una fracción HES y una fracción PEG.
55. 55. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 54, donde la modificación es una fracción PEG que consiste en un PEG lineal o ramificado, donde el peso molecular de la fracción PEG es con preferencia de aproximadamente 20 a 120 kD, con más preferencia de aproximadamente 30 a 80 kD y con máxima preferencia aproximadamente 40 kD.
56. 56. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 54, donde la modificación es una fracción HES, donde con preferencia el peso molecular de la fracción HES es de aproximadamente 10 a 130 kD, con más preferencia de aproximadamente 30 a 130 kD y con máxima preferencia aproximadamente 100 kD.
57. 57. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 53 a 56, donde la modificación se acopla con el ácido nucleico por medio de un conector.
58. 58. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 53 a 57, donde la modificación se acopla con el ácido nucleico en su nucleótido 5'-terminal y/o su nucleótido 3'- terminal y/o a un nucleótido del ácido nucleico entre el nucleótido 5'- terminal y el nucleótido 3'-terminal.
59. 59. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 58, donde los nucleótidos de o los nucleótidos que forman el ácido nucleico son nucleótidos L.
60. 60. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 59, donde el ácido nucleico es un ácido nucleico L.
61. 61. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 59, donde la fracción del ácido nucleico capaz de unirse a MCP-1 consiste en nucleótidos L.
62. 62. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61 y opcionalmente un constituyente adicional, donde el constituyente adicional se selecciona del grupo que comprende a los excipientes aceptables para uso farmacéutico, vehículos aceptables para uso farmacéutico y agentes activos para uso farmacéutico.
63. 63. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 62, donde la composición farmacéutica comprende un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61 y un vehículo aceptable para uso farmacéutico.
64. 64. Uso de un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61 para la fabricación de un medicamento.
65. 65. Uso de acuerdo con la reivindicación 64, donde el medicamento es para el uso en medicina humana o para uso en medicina veterinaria.
66. 66. Uso de un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61 para la fabricación de un medio diagnóstico.
67. 67. Uso de acuerdo con la reivindicación 64 o 65, donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que comprende enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, encefalomielitis autoinmune, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple aguda y crónica, inflamación crónica, artritis reumatoide, enfermedades renales, restenosis, restenosis después de angioplastia, reacciones alérgicas agudas y crónicas, reacciones inmunológicas y alérgicas primarias y secundarias, asma, conjuntivitis, bronquitis, cáncer, aterosclerosis, insuficiencia cardíaca cardiovascular arteriosclerótica o accidente cerebrovascular, psoriasis, artritis psoriática, inflamación del sistema nervioso, dermatitis atópica, colitis, endometriosis, uveítis, trastornos retiñíanos que incluyen degeneración macular, desprendimiento de retina, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, retinitis pigmentaria, vitreorretinopatía proliferativa y coriorretinopatía serosa central; fibrosis pulmonar idiopática, sarcoidosis, polimiositis, dermatomiositis, anulación de la inmunosupresión, reducción del riesgo de infección, sepsis, inflamación renal, glomerulonefritis, glomerulonefritis progresiva rápida, glomerulonefritis proliferativa, nefropatía diabética, nefropatía obstructiva, necrosis tubular aguda y glomeruloesclerosis difusa, lupus eritematoso sistémico, bronquitis crónica, enfermedad de Behget, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), ateroesclerosis prematura después de la enfermedad de Kawasaki, infarto de miocardio, obesidad, enfermedad hepática crónica, enfermedad de Peyronie, lesión de médula espinal aguda, trasplante de pulmón o riñon, miocarditis, enfermedad de Alzheimer y neuropatía, carcinoma de mama, carcinoma gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, hamartoma, carcinoma colorrectal, adenoma colónico, pancreatitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y enfermedades intestinales inflamatorias tales como enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa.
68. 68. Un complejo que comprende una quimiocina y un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3, donde con preferencia el complejo es un complejo cristalino.
69. 69. El complejo de acuerdo con la reivindicación 68, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana.
70. 70. El complejo de acuerdo con la reivindicación 68 o 69, donde la quimiocina es MCP-1, donde MCP-1 con preferencia se selecciona del grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina y MCP-1 porcina, con más preferencia MCP-1 es MCP-1 humana.
71. 71. Uso de un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61 para la detección de una quimiocina, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
72. 72. Uso de acuerdo con la reivindicación 71, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana.
73. 73. Uso de acuerdo con la reivindicación 71 o 72, donde la quimiocina es MCP-1, donde MCP-1 con preferencia se selecciona del grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina y MCP-1 porcina, con más preferencia MCP-1 es MCP-1 humana.
74. 74. Un método para la detección de un antagonista de quimiocina o un agonista de quimiocina que comprende los pasos siguientes: proporcionar un antagonista de quimiocina candidato y/o un agonista de quimiocina candidato, proporcionar un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61, proporcionar un sistema de ensayo que provee una señal en presencia de un antagonista de quimiocina y/o un agonista de quimiocina y determinar si el antagonista de quimiocina candidato es un antagonista de quimiocina y/o si el agonista de quimiocina candidato es un agonista de quimiocina, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1 , MCP-2 y MCP-3.
75. 75. El método de acuerdo con la reivindicación 74, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana.
76. 76. El método de acuerdo con la reivindicación 74 o 75, donde la quimiocina es MCP-1, donde MCP-1 con preferencia se selecciona del grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina y MCP-1 porcina, con más preferencia MCP-1 es MCP-1 humana y con más preferencia MCP-1 es MCP-1 humana.
77. 77. Un método para la detección de un antagonista de quimiocina o un agonista de quimiocina que comprende los pasos siguientes: proporcionar una quimiocina inmovilizada a una fase, con preferencia una fase sólida, proporcionar un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61, con preferencia un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 52 que está marcado, agregar un agonista de quimiocina candidato y/o un antagonista de quimiocina candidato, y determinar si el agonista de quimiocina candidato es agonista de quimiocina y/o si el antagonista de quimiocina candidato es antagonista de quimiocina, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
78. 78. El método de acuerdo con la reivindicación 77, caracterizado porque la determinación se realiza para evaluar si el ácido nucleico está reemplazado por el agonista de quimiocina candidato o por un antagonista de quimiocina candidato.
79. 79. El método de acuerdo con la reivindicación 77 o 78, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana.
80. 80. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 77 a 79, donde la quimiocina es MCP-1, donde MCP-1 con preferencia se selecciona del grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina y MCP-1 porcina, con más preferencia MCP-1 es MCP-1 humana y con más preferencia MCP-1 es MCP-1 humana.
81. 81. Ün kit para la detección de una quimiocina que comprende un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
82. 82. El kit de acuerdo con la reivindicación 81, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana.
83. 83. El kit de acuerdo con la reivindicación 81 u 82, donde la quimiocina es MCP-1, donde MCP-1 con preferencia se selecciona del grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina y MCP-1 porcina, con más preferencia MCP-1 es MCP-1 humana y con más preferencia MCP-1 es MCP-1 humana.
84. 84. Un antagonista de quimiocina obtenible por el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 74 a 80, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
85. 85. El antagonista de quimiocina de acuerdo con la reivindicación 84, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana.
86. 86. El antagonista de quimocina de acuerdo con la reivindicación 84 u 85, donde la quimiocina es MCP-1, donde MCP-1 con preferencia se selecciona del grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP- 1 bovina, MCP-1 canina y MCP-1 porcina, con más preferencia MCP- 1 es MCP-1 humana y con más preferencia MCP-1 es MCP-1 humana.
87. 87. Un agonista de quimiocina obtenible por el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 74 a 80, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina, MCP-1, MCP-2 y MCP-3.
88. 88. El agonista de quimiocina de acuerdo con la reivindicación 87, donde la quimiocina se selecciona del grupo que comprende eotaxina humana, MCP-1 humana, MCP-2 humana y MCP-3 humana.
89. 89. El agonista de quimiocina de acuerdo con la reivindicación 87 u 88, donde la quimiocina es MCP-1, donde MCP-1 con preferencia se selecciona del grupo que comprende MCP-1 humana, MCP-1 de mono, MCP-1 de caballo, MCP-1 de conejo, MCP-1 bovina, MCP-1 canina y MCP-1 porcina, con más preferencia MCP-1 es MCP-1 humana y con más preferencia MCP-1 es MCP-1 humana.
90. 90. Un método para la detección del ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61 en una muestra, donde el método comprende los pasos de: f) proporcionar una muestra que contiene el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención; g) proporcionar una sonda de captura, donde la sonda de captura es por lo menos parcialmente complementaria con una primera parte del ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61, y una sonda de detección, donde la sonda de detección es por lo menos parcialmente complementaria con una segunda parte del ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61 o, alternativamente, la sonda de captura es por lo menos parcialmente complementaria con una segunda parte del ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61 y la sonda de detección es por lo menos parcialmente complementaria con la primera parte del ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61 ; h) dejar que la sonda de captura y la sonda de detección reaccionen o bien en forma simultánea o bien en cualquier orden sucesivo con el ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61 o parte del mismo; i) opcionalmente detectar si la sonda de captura se híbrida o no al ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61 provisto en el paso a); y j) detectar el complejo formado en el paso c) que consiste en el ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61, y la sonda de captura y la sonda de detección.
91. 91. El método de acuerdo con la reivindicación 90, donde la sonda de detección comprende un medio de detección y/o donde la sonda de captura se puede inmovilizar a un soporte, con preferencia un soporte sólido.
92. 92. El método de acuerdo con la reivindicación 90 o 91, donde cualquier sonda de detección que no es parte del complejo se elimina de la reacción de modo que en el paso e) sólo se detecta una sonda de detección que es parte del complejo.
93. 93. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 90 a 92, donde el paso e) comprende el paso de comparar la señal generada por el medio de detección cuando la sonda de captura y la sonda de detección se hibridan en presencia del ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61 o parte del mismo y en ausencia de dicho ácido nucleico o parte del mismo.
94. 94. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 90 a 93, donde el ácido nucleico detectado es el ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ. ID. NOs. 37, 116, 117 o 278, y sonda de captura o sonda de detección comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEC .ID. NO. 255 o SEQ. ID. NO.256.
95. 95. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 90 a 93, donde el ácido nucleico detectado es el ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ. ID. NOs. 122, 253 o 254 y sonda de captura o sonda de detección comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ. ID. NO.281 y SEQ. ID. NO.282.