BRPI0707842A2 - Ácidos nuclÉicos que se ligam À mcp-1 - Google Patents

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chemokine
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Werner Purschke
Florian Jarosch
Dirk Eulberg
Sven Klussmann
Klaus Buchner
Christian Maasch
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Noxxon Pharma Ag
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Abstract

ÁCIDOS NUCLÉICOS QUE SE LIGAM À MCP-1 .A presente invenção refere-se a um ácido nucléico, preferivelmenté que se liga à MCP-1, selecionado a partir do grupo que compreende os ácidos nucléicos do tipo 1 A, os ácidos nucléicos do tipo 1 B, os ácidos nucléicos do tipo 2, os ácidos nucléicos do tipo 3, os ácidos nucléicos do tipo 4 e os ácidos nucléicos tendo uma seqúência de ácidos nucléicos de acordo com quaisquer de SEQ. ID. N2: 87 a 115.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ÁCIDOSNUCLÉICOS QUE SE LIGAM À MCP-1".
A presente invenção refere-se aos ácidos nucléicos que se ligamà MCP-1, e ao seu uso para a fabricação de um medicamento e um agentediagnóstico, respectivamente.
A MCP-1 humana (proteína quimiotática de monócitos 1; nomesalternativos, MCAF [fator quimiotático e ativador de monócitos]; CCL2; SMC-CF [célula do músculo liso-fator estimulador de colônia]; HC-11; LDCF;GDCF; TSG-8; SCYA2; A2; código de acesso do SwissProt, P13500) foicaracterizada por três grupos independentemente (Matsushima 1988; Rollins1989; Yoshimura 1989). Ela consiste em 76 aminoácidos e caracteriza-sepor um local de ligação à heparina como todas as quimiocinas. As duasligações de dissulfeto intramoleculares conferem uma estrutura rígida,estável, à molécula. Além disso, a MCP-1 carrega um piroglutamato em suaextremidade de amino. Em Thr 71, está localizado um local de glicosilaçãoligado ao potencial O. Os membros adicionais da família de MCP existemtanto em seres humanos (MCP-2, -3, -4) quanto em camundongos (MCP-2,-3, -5). As proteínas humanas são aproximadamente 70% homólogas àMCP-1 humana.
A estrutura da MCP-1 foi resolvida por RMN (Handel 1996) eraio X (Lubkowski 1997). O monômero de MCP-1 tem a dobra de quimiocinatípica, em que as cisteínas amino terminais são seguidas por uma longaseqüência que resulta em três folhas antiparalelas dobradas β em um motivode estilo grego. A proteína termina em uma hélice a que sobrepõe as trêsfolhas β (código de acesso de dados de PDB IDOK).
Embora a estrutura tridimensional das formas de MCP-1 dediferentes espécies de mamíferos geralmente tenha sido mantida, aseqüência de aminoácidos não foi particularmente bem-conservada durantea evolução. Os resultados de alinhamento das seqüências demonstram 55%de similaridade global das seqüências entre a MCP-1 humana e de murino(também chamada JE) dentro dos primeiros 76 aminoácidos. Semconsiderar a seqüência de aminoácidos, a MCP-1 de murino difere daMCP-1 humana no tamanho molecular (125 aminoácidos) e no grau deglicosilação. A MCP-1 de murino contém um domínio carbóxi terminal de 49aminoácidos que não está presente na MCP-1 humana e não é requeridopara a bioatividade in vitro. A MCP-1 humana compartilha a seguinteporcentagem de aminoácidos idênticos com a MCP-1 de:
MCP-1 de Macaca mulatta (macaco Rhesus) 97%
MCP-1 de Sus scrofa (Porco) 79%
Equus caballus (Cavalo) 78%
MCP-1 de Canis familiarís (Cão) 76%
MCP-1 de Oryctolagus cuniculus (Coelho) 75%
Bos Taurus (Boi) 72%
MCP-3 de Homo sapiens 71%
Eotaxina de Homo sapiens 64%
MCP-2 de Homo sapiens 62%
MCP-1 de Mus musculus (Camundongo) 55%
MCP-1 de Rattus norvegicus (Rato) 55%
Dado este alto grau de divergência, pode ser necessário gerar antagonistas de MCP-1 de rodentes para o desempenho bem-sucedido dosestudos farmacológicos em modelos de rodentes.
A MCP-1 é um atraente potente de monócitos/macrófagos,basófilos, células T ativadas, e células NK. Uma ampla variedade de tipos decélulas, tais como as células endoteliais, as células epiteliais, os fibroblastos,os ceratinócitos, as células sinoviais, as células mesangiais, os osteoblastos,as células do músculo liso, bem como uma grande quantidade de células detumor, expressam a MCP-1 (Baggliolini 1994). A sua expressão é estimuladapor diversos tipos de agentes pró-inflamatórios, tais como a ΙL-1β, o TNF-a,o IFN-γ, o LPS (lipopolissacarídeo), e o GM-CSF.
Bastante incomum na rede desordenada de quimiocinas, aMCP-1 é altamente específica em seu uso de receptor, ligando-se somenteao receptor de quimiocina CCR2 com alta afinidade. Como todos osreceptores de quimiocinas, o CCR2 é um GPCR (Dawson 2003). O CCR2parece ser expresso em duas formas ligeiramente diferentes devido àemenda alternativa dos mRNA que codificam as regiões carbóxi terminais,CCR2a e CCR2b (Charo 1994). Estes receptores são expressos emmonócitos, células precursoras mielóides e células T ativadas (Myeres 1995;Qin 1996). A constante de dissociação da MCP-1 para o receptortransfectado nas células HEK-293 é 260 pM, que está em concordância comos valores medidos nos monócitos (Myers 1995; Van Riper 1993). A ativaçãodo CCR2b nas células HEK-293 com a MCP-1 inibe a adenilil ciclase emuma concentração de 90 pM, e mobiliza o cálcio intracelular emconcentrações ligeiramente mais elevadas, aparentemente independente dahidrólise de fosfátidil inositol. Os efeitos sobre a adenilil ciclase e a liberaçãode cálcio intracelular são fortemente inibidos pela toxina da coqueluche,implicando o envolvimento das proteínas G heterotriméricas do tipo Gi natransdução de sinal (Myers 1995).
A MCP-1 está envolvida no recrutamento de monócitos nostecidos inflamados. Lá, os macrófagos residentes liberam quimiocinas, taiscomo a MCP-1 e outras, e citocinas como o TNF, a IL-1 β e outros, queativam as células endoteliais para expressar uma bateria de moléculas deadesão. O endotélio "grudento" resultante faz com que os monócitos no vasosangüíneo rolem ao longo de sua superfície. Aqui, os monócitos encontrama MCP-1 apresentada sobre a superfície endotelial, que se liga ao CCR2sobre os monócitos e os ativa. Isto finalmente resulta na retenção firme, noespalhamento dos monócitos ao longo do endotélio, e na transmigração parao tecido circundante, onde os monócitos diferenciam-se em macrófagos emigram para o local de concentração máxima de MCP-1.
A MCP-1 é um membro da família de quimiocinas, que é umafamília de moléculas principalmente básicas e estruturalmente relacionadas,que se ligam à heparina, pequenas (cerca de 8-14 kDa). Elas são formadaspredominantemente nos tecidos inflamados e regulam o recrutamento, aativação, e a proliferação de células sangüíneas brancas (leucócitos)(Baggiolini 1994; Springer 1995; Schall 1994). As quimiocinas induzemseletivamente a quimiotaxia de neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos,macrófagos, mastócitos, células TeB. Além de seu efeito quimiotático, elaspodem exercer seletivamente outros efeitos em células responsivas, comoalterações no formato da célula, aumento transiente na concentração deíons cálcio intracelulares livres, desgranulação, supra-regulação dasintegrinas, formação de lipídios bioativos, tais como leucotrienos,prostaglandinas, tromboxanos, ou explosão respiratória (liberação deespécie reativa de oxigênio para a destruição de organismos patogênicos oucélulas de tumor). Assim, pela provocação da liberação de mediadores pró-inflamatórios adicionais, da quimiotaxia e do extravasamento de leucócitospara os locais de infecção ou inflamação, as quimiocinas desencadeiam aescalada da resposta inflamatória.
Com base no arranjo dos primeiros dois de quatro resíduos decisteína conservados, as quimiocinas são divididas em quatro classes: CCou β-quimiocinas, em que as cisteínas estão em série, CXC ou a-quimiocinas, onde elas são separadas por um resíduo de aminoácidoadicional, XC ou γ quimiocinas, com a Iinfotactina como o únicorepresentante até o momento, que possuem somente uma ponte dedissulfeto, e quimiocinas CX3C, que se caracterizam por três resíduos deaminoácidos entre as cisteínas, com a fractalquina ligada à membrana comoo único membro da classe conhecido até o momento (Bazan 1997).
As quimiocinas CXC atuam principalmente sobre os neutrófilos,em particular aquelas quimiocinas CXC que carregam a seqüência deaminoácidos ELR sobre a sua extremidade de amino. Os exemplos dequimiocinas CXC que são ativas sobre os neutrófilos são a IL-8, as GROoc, -β, e -γ, a NAP-2, a ENA-78 e a GCP-2. As quimiocinas CC atuam sobre umavariedade maior de leucócitos, tais como monócitos, macrófagos, eosinófilos,basófilos, bem como linfócitos TeB (Oppenheim 1991, Baggiolini 1994;Miller 1992; Jose 1994; Ponath 1996a). Os exemplos destas são I-309;MCP-1, -2, -3, -4, MIP-Ia e -β, RANTES, e eotaxina.
As quimiocinas atuam através de receptores que pertencem auma superfamília de sete receptores acoplados à proteína G de transposiçãode transmembrana (GPCRs; Murphy 2000). Falando de um modo geral, asinterações entre as quimiocinas e os receptores de quimiocinas tendem aser desordenadas pelo fato que uma quimiocina pode ligar muitos receptoresde quimiocinas e, inversamente, um único receptor de quimiocina podeinteragir com diversas quimiocinas. Alguns receptores conhecidos para asquimiocinas CC incluem o CCR1, que liga a MIP-Ia e a RANTES (Neote1993; Gao 1993); o CCR2, que liga as quimiocinas que incluem as MCP-1, -2, -3, e -4 (Charo 1994; Myers 1995; Gong 1997; Garcia-Zepeda 1996); oCCR3, que liga as quimiocinas que incluem a eotaxina, a RANTES, e aMCP-3 (Ponath 1996b); o CCR4, que foi verificado sinalizar em resposta àMCP-1, à ΜΙΡΊα, e à RANTES (Power 1995); e o CCR5, que mostrousinalizar em resposta às MIP-Ia e -β, e à RANTES (Boring 1996; Raport1996; Samson 1996).
Conforme acima mencionado, todos os quatro membros dafamília de MCP (1-4) se ligam ao CCR2, ao passo que a MCP-2, a MCP-3, ea MCP-4 podem também interagir com o CCR1 e o CCR3 (Gong 1997;Heath 1997; Uguccioni 1997) e, no caso da MCP-2, o CCR5 (Ruffing 1998).Uma outra quimiocina CC que mostra alta homologia com a família de MCPé a eotaxina, que foi originalmente isolada do fluido de lavagembroncoalveolar retirado de porquinhos-da-índia sensibilizados, provocadoscom alérgenos (Jose 1994). Foi mostrado que a eotaxina é também capazde ativar o CCR2 (Martinelli 2001).
O problema que é a base da presente invenção é proporcionarum meio que interaja especificamente com a MCP-1. Mais especificamente,o problema que fundamenta a presente invenção é proporcionar um meiobaseado em ácido nucléico que interaja especificamente com a MCP-1.
Um problema adicional fundamentando a presente invenção éproporcionar um meio para a fabricação de um medicamento para otratamento de uma doença humana ou não-humana, pelo que a doença écaracterizada pela MCP-1 estando direta ou indiretamente envolvida nomecanismo patogenético de tal doença.
Um problema ainda adicional que é a base da presente invençãoé proporcionar um meio para a fabricação de um agente diagnóstico para otratamento de uma doença, pelo que a doença é caracterizada pela MCP-1estando direta ou indiretamente envolvida no mecanismo patogenético de taldoença.
Estes e outros problemas que fundamentam a presenteinvenção são resolvidos pelo assunto das reivindicações independentes emanexo. As modalidades preferidas podem ser consideradas a partir dasreivindicações dependentes.
O problema que fundamenta a presente invenção é tambémresolvido, em um primeiro aspecto, por um ácido nucléico, preferivelmenteque se liga à MCP-1, selecionado a partir do grupo que compreende osácidos nucléicos do tipo 1A, os ácidos nucléicos do tipo 1B, os ácidosnucléicos do tipo 2, os ácidos nucléicos do tipo 3, os ácidos nucléicos do tipo4 e os ácidos nucléicos tendo uma seqüência de ácidos nucléicos de acordocom quaisquer de SEQ. ID. Ne: 87 a 115.
Em um primeiro subaspecto do primeiro aspecto, o ácidonucléico do tipo 1A compreende, na direção 5'-*3', uma primeira Caixa deextensão B1A, uma segunda Caixa de extensão B2, uma terceira Caixa deextensão B3, uma quarta Caixa de extensão B4, uma quinta Caixa deextensão B5, uma sexta Caixa de extensão B6 e uma sétima Caixa deextensão B1B, pelo que
a primeira Caixa de extensão B1A e a sétima Caixa de extensãoB1B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com ahibridizaçãò, forma-se uma estrutura de filamento duplo,
a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüênciade nucleotídeos de AGCRUG,
a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma seqüênciade nucleotídeos de CCCGGW,
a terceira Caixa de extensão B3 compreende uma seqüência denucleotídeos de GUR,
a quarta Caixa de extensão B4 compreende uma seqüência denucleotídeos de RYA,
a quinta Caixa de extensão B5 compreende uma seqüência denucleotídeos de GGGGGRCGCGAYCa sexta Caixa de extensão B6 compreende uma seqüência denucleotídeos de UGCAAUAAUG ou URYAWUUG, e
a sétima Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência denucleotídeos de CRYGCU.
Em uma modalidade preferida do primeiro subaspectoa primeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüênciade nucleotídeos de AGCGUG.
Em uma modalidade do primeiro subaspectoa segunda Caixa de extensão B2 compreende uma seqüênciade nucleotídeos de CCCGGU.
Em uma modalidade do primeiro subaspectoa terceira Caixa de extensão B3 compreende uma seqüência denucleotídeos de GUG.
Em uma modalidade do primeiro subaspectoa quarta Caixa de extensão B4 compreende uma seqüência denucleotídeos de GUA.
Em uma modalidade do primeiro subaspectoa quinta Caixa de extensão B5 compreende uma seqüência denucleotídeos de GGGGGGCGCGACC.
Em uma modalidade do primeiro subaspectoa sexta Caixa de extensão B6 compreende uma seqüência denucleotídeos de UACAUUUG.
Em uma modalidade do primeiro subaspectoa sétima Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência denucleotídeos de CACGCU.
Em uma modalidade do primeiro subaspecto, o ácido nucléicocompreende uma seqüência de ácidos nucléicos de acordo com SEQ. ID.NQ: 21.
Em um segundo subaspecto do primeiro aspecto, o ácidonucléico do tipo 1B compreende, na direção 5'->3', uma primeira Caixa deextensão B1A, uma segunda Caixa de extensão B2, uma terceira Caixa deextensão B3, uma quarta Caixa de extensão B4, uma quinta Caixa deextensão B5, uma sexta Caixa de extensão B6 e uma sétima Caixa deextensão B1B1 pelo que
a primeira Caixa de extensão B1A e a sétima Caixa de extensãoB1B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com ahibridização, forma-se uma estrutura de filamento duplo,
a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüênciade nucleotídeos de AGVRUG,
a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma seqüênciade nucleotídeos de CCAGCU ou CCAGY,
a terceira Caixa de extensão B3 compreende uma seqüência denucleotídeos de GUG,
a quarta Caixa de extensão B4 compreende uma seqüência denucleotídeos de AUG,
a quinta Caixa de extensão B5 compreende uma seqüência denucleotídeos de GGGGGGCGCGACC
a sexta Caixa de extensão B6 compreende uma seqüência denucleotídeos de CAUUUUA ou CAUUUA1 e
a sétima Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência denucleotídeos de CAYRCU.
Em uma modalidade do segundo subaspectoa primeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüênciade nucleotídeos de AGCGUG.
Em uma modalidade do segundo subaspectoa segunda Caixa de extensão B2 compreende uma seqüênciade nucleotídeos de CCAGU.
Em uma modalidade do segundo subaspectoa sexta Caixa de extensão B6 compreende uma seqüência denucleotídeos de CAUUUUA.
Em uma modalidade do segundo subaspectoa sétima Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência denucleotídeos de CACGCU.
Em uma modalidade do segundo subaspecto, o ácido nucléicocompreende uma seqüência de ácidos nucléicos de acordo com SEQ. ID.Ne: 28 e SEQ. ID. Ns: 27.
Em um terceiro subaspecto do primeiro aspecto, o ácidonucléico do tipo 2 compreende, na direção 5'->3', uma primeira Caixa deextensão B1A, uma segunda Caixa de extensão B2, e uma terceira Caixa deextensão B1B, pelo que
a primeira Caixa de extensão B1A e a terceira Caixa deextensão B1B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com ahibridização, forma-se uma estrutura de filamento duplo,
a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüênciade nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende ACGCA,CGCAeGCA,
a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma seqüênciade nucleotídeos de CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC, e
a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma seqüênciade nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende UGCGU,UGCG eUGC.
Emumamodalidadedoterceirosubaspecto
a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma seqüênciade nucleotídeos de CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC.
Em uma modalidade do terceiro subaspecto
a) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de ACGCA,
e
a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência denucleotídeos de UGCGU; ou
b) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de CGCA,
e
a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência denucleotídeos de UGCG; ou
c) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de GCA1e
a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência denucleotídeos dé UGC ou UGCG.
Em uma modalidade do terceiro subaspectoa primeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüênciade nucleotídeos de GCA.
Em uma modalidade preferida do terceiro subaspectoa terceira Caixa de extensão B1B compreende uma seqüênciade nucleotídeos de UGCG.
Em uma modalidade do terceiro subaspecto, o ácido nucléicocompreende uma seqüência de ácidos nuciéicos de acordo com SEQ. ID.Ne: 37., SEQ. ID. Ne: 116, SEQ. ID. NB: 117e SEQ. ID. Ns: 278.
Em um quarto subaspecto do primeiro aspecto, o ácido nucléicodo tipo 3 compreende, na direção 5'->3\ uma primeira Caixa de extensãoB1A, uma segunda Caixa de extensão B2A, uma terceira Caixa de extensãoB3, uma quarta Caixa de extensão B2B, uma quinta Caixa de extensão B4,uma sexta Caixa de extensão B5A, uma sétima Caixa de extensão B6, umaoitava Caixa de extensão B5B e uma nona Caixa de extensão B1B, pelo quea primeira Caixa de extensão B1A e a nona Caixa de extensãoB1B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com ahibridização, forma-se uma estrutura de filamento duplo,
a segunda Caixa de extensão B2A e a quarta Caixa B2Bopcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com a hibridização,forma-se uma estrutura de filamento duplo,
a sexta Caixa de extensão B5A e a oitava Caixa B5Bopcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com a hibridização,forma-se uma estrutura de filamento duplo,
a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüênciade nucleotídeos que é selecionada a partir do grupo que compreendeGURCUGC, GKSYGC, KBBSC e BNGC,
a segunda Caixa de extensão B2A compreende uma seqüênciade nucleotídeos de GKMGU,
a terceira Caixa de extensão B3 compreende uma seqüência denucleotídeos de KRRAR,
a quarta Caixa de extensão B2B compreende uma seqüência denucleotídeos de ACKMC,
a quinta Caixa de extensão B4 compreende uma seqüência denucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende CURYGA,CUWAUGA, CWRMGACW e UGCCAGUG,
a sexta Caixa de extensão B5A compreende uma seqüência denucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende GGY e CWGC,a sétima Caixa de extensão B6 compreende uma seqüência denucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende YAGA, CKAAUe CCUUUAU,
a oitava Caixa de extensão B5B compreende uma seqüência denucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende GCYR eGCWG, e
a nona Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência denucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende GCAGCAC,GGRSMC, GSVVM e GCNV.
Em uma modalidade do quarto subaspectoa terceira Caixa de extensão B3 compreende uma seqüência denucleotídeos de GAGAA ou UAAAA
Emumamodalidadedoquartosubaspectoa quinta Caixa de extensão B4 compreende uma seqüência denucleotídeos de CAGCGACU ou CAACGACU.
Em uma modalidade do quarto subaspectoa quinta Caixa de extensão B4 compreende uma seqüência denucleotídeos de CAGCGACU e a Caixa B3 compreende uma seqüência denucleotídeos de UAAAA.
Em uma modalidade do quarto subaspectoa quinta Caixa de extensão B4 compreende uma seqüência denucleotídeos de CAACGACU e a Caixa B3 compreende uma seqüência denucleotídeos de GAGAA.
Em uma modalidade do quarto subaspectoa sétima Caixa de extensão B6 compreende uma seqüência denucleotídeos dè UAGA.
Em uma modalidade do quarto subaspecto
a) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de GURCUGC,
e
a nona Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência de nucleotídeosde GCAGCAC; ou
b) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de GKSYGC1
e
a nona Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência de nucleotídeosde GCRSMC; ou
c) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de KBBSC,
e
a nona Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência de nucleotídeosde G SWM; ou
d) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de BNGC,
e
a nona Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência de nucleotídeosde GCNV.
Em uma modalidade preferida do quarto subaspecto
a) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de GUGCUGC,
e
a nona Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência de nucleotídeosde GCAGCAC; ou
b) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de GUGCGC,e
a nona Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência de nucleotídeosde GCGCAC; ou
c) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de KKSSC,
e
a nona Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência de nucleotídeosde GSSMM; ou
d) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de SNGC,
a nona Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência de nucleotídeosde GCNS.
Em uma modalidade preferida adicional do quarto subaspectoa primeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüência denucleotídeos de GGGC1e
a nona Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência de nucleotídeosde GCCC.
Em uma modalidade do quarto subaspecto, a segunda Caixa deextensão B2A compreende uma seqüência de nucleotídeos de GKMGU e aquarta Caixa de extensão B2B compreende uma seqüência de nucleotídeosde ACKMC.
Em uma modalidade preferida do quarto subaspecto, a segundaCaixa de extensão B2A compreende uma seqüência de nucleotídeos deGUAGU e a quarta Caixa de extensão B2B compreende uma seqüência denucleotídeos de ACUAC.
Em uma modalidade do quarto subaspectoa) a sexta Caixa de extensão B5A compreende umaseqüência de nucleotídeos de GGY,a oitava Caixa de extensão B5B compreende uma seqüência denucleotídeos de GCYR; ou
b) a sexta Caixa de extensão B5A compreende umaseqüência de nucleotídeos de CWGC1e
a oitava Caixa de extensão B5B compreende uma seqüência denucleotídeos de GCWG.
Em uma modalidade preferida do quarto subaspectoa sexta Caixa de extensão B5A compreende uma seqüência de nucleotídeosde GGC1e
a oitava Caixa de extensão B5B compreende uma seqüência denucleotídeos de GCCG.
Em uma modalidade mais preferida do quarto subaspecto, asexta Caixa de extensão B5A hibridiza com os nucleotídeos GCY da oitavaCaixa de extensão B5B.
Em uma modalidade do quarto subaspecto, o ácido nucléicocompreende uma seqüência de ácidos nucléicos de acordo com SEQ. ID.NB: 56.
Em uma modalidade do quarto subaspecto, o ácido nucléicocompreende uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada a partir dogrupo que compreende as seqüências de ácidos nucléicos de acordo comSEQ. ID. Ns: 57 a 61, SEQ. ID. NQ: 67 a 71 e SEQ. ID. Ns: 73.
Em um quinto subaspecto do primeiro aspecto, o ácido nucléicodo tipo 4 compreende, na direção 5'->3', uma primeira Caixa de extensão
BIA, uma segunda Caixa de extensão B2, uma terceira Caixa de extensão
BIB, pelo que
a primeira Caixa de extensão B1A e a terceira Caixa deextensão B1B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com ahibridização, forma-se uma estrutura de filamento duplo,
a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüênciade nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreendeAGCGUGDU, GCGCGAG, CSKSUU, GUGUU, e UGUU;
a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma seqüênciade nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreendeAGNDRDGBKGGURGYARGUAAAG, AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG eCAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGA, e
a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma seqüênciade nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreendeGNCASGCU, CUCGCGUC, GRSMSG1 GRCAC, e GGCA.Em uma modalidade do quinto subaspecto
a) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de GUGUU,
e
a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência denucleotídeos de GRCAC;
b) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de GCGCGAG,
e
a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência denucleotídeos de CUCGCGUC; ou
c) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de CSKSUU,
e
a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência denucleotídeos de G RSMSG, ou
d) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de UGUU,
e
a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma seqüênciade nucleotídeos de GGCA, ou
e) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de AGCGUGDU,a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência denucleotídeos de GNCASGCU.
Em uma modalidade preferida do quinto subaspecto, a primeiraCaixa de extensão B1A compreende uma seqüência de nucleotídeos deCSKSUU e a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma seqüênciade nucleotídeos de GRSMSG.
Em uma modalidade mais preferida do quinto subaspecto, aprimeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüência denucleotídeos de CCGCUU e a terceira Caixa de extensão B1B compreendeuma seqüência de nucleotídeos de GGGCGG.
Em uma modalidade do quinto subaspectoa segunda Caixa de extensão B2 compreende uma seqüênciade nucleotídeos de AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG.
Em uma modalidade do quinto subaspecto, o ácido nucléicocompreende uma seqüência de ácidos nucléicos de acordo com SEQ. ID.Ns: 80.
Em uma modalidade do primeiro até o quinto subaspecto, oácido nucléico é capaz de ligar a MCP-1, preferivelmente a MCP-1 humana.
Em uma modalidade do primeiro até o quinto subaspecto, oácido nucléico é capaz de ligar uma quimiocina, pelo que a quimiocina éselecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
Em uma modalidade do primeiro até o quinto subaspecto, oácido nucléico é capaz de ligar uma quimiocina, pelo que a quimiocina éselecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, a MCP-1humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
Em uma modalidade do primeiro até o quinto subaspecto, oácido nucléico é capaz de ligar a MCP-1, pelo que a MCP-1 épreferivelmente selecionada a partir do grupo que compreende a MCP-1 demacaco, a MCP-1 de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1canina, a MCP-1 de porco e a MCP-1 humana.
Em uma modalidade do primeiro até o quinto subaspecto, oácido nucléico é capaz de ligar a MCP-1 humana.
Em uma modalidade preferida do primeiro até o quintosubaspecto, a MCP-1 tem uma seqüência de aminoácidos de acordo com aSEQ ID Ne: 1.
O problema que fundamenta a presente invenção é resolvido emum segundo aspecto por um ácido nucléico, preferivelmente que se liga àMCP-1 de murino, pelo que o ácido nucléico compreende uma seqüência deácidos nucléicos de acordo com SEQ. ID. N9: 122, SEQ. ID. Ns: 253 e SEQ.ID. N9: 254.
O problema que é a base da presente invenção é resolvido emum terceiro aspecto por um ácido nucléico, preferivelmente que se liga àMCP-1 de murino, pelo que o ácido nucléico compreende uma seqüência deácidos nucléicos de acordo com SEQ. ID. N9:127.
Em uma modalidade do segundo e do terceiro aspecto, a MCP-1de murino compreende uma seqüência de aminoácidos de acordo com aSEQ ID Ns: 2.
Em uma modalidade do primeiro até o terceiro aspecto, o ácidonucléico compreende uma modificação, pelo que a modificação épreferivelmente uma porção de alto peso molecular e/ou pelo que amodificação preferivelmente permite modificar as características do ácidonucléico de acordo com qualquer do primeiro, do segundo e do terceiroaspecto em termos de tempo de residência no corpo do animal ou humano,preferivelmente no corpo humano.
Em uma modalidade preferida do primeiro até o terceiro aspecto,a modificação é selecionada a partir do grupo compreendendo uma porçãode HES e uma porção de PEG.
Em uma modalidade mais preferida do primeiro até o terceiroaspecto, a modificação é uma porção de PEG consistindo em um PEG retoou ramificado, pelo que o peso molecular da porção de PEG épreferivelmente de cerca de 20 a 120 kD, mais preferivelmente de cerca de30 a 80 kD e mais preferivelmente ainda cerca de 40 kD.
Em uma modalidade mais preferida alternativa do primeiro até oterceiro aspecto, a modificação é uma porção de HES1 pelo quepreferivelmente o peso molecular da porção de HES é de cerca de 10 a 130kD, mais preferivelmente de cerca de 30 a 130 kD e mais preferivelmenteainda cerca de 100 kD.
Em uma modalidade do primeiro até o terceiro aspecto, amodificação é acoplada ao ácido nucléico via um ligante.
Em uma modalidade do primeiro até o terceiro aspecto, amodificação é acoplada ao ácido nucléico em seu nucleotídeo 5'-terminale/ou seu nucleotídeo 3'-terminal e/ou a um nucleotídeo do ácido nucléicoentre o nucleotídeo 5'-terminal e o nucleotídeo 3'-terminal.
Em uma modalidade do primeiro até o terceiro aspecto, osnucleotídeos do, ou os nucleotídeos que formam o, ácido nucléico são l-nucíeotídeos.
Em uma modalidade do primeiro até o terceiro aspecto, o ácidonucléico é um l-ácido nucléico.
Em uma modalidade do primeiro até o terceiro aspecto, a porçãodo ácido nucléico capaz de ligar a MCP-1 consiste em l-nucleotídeos.
O problema que fundamenta a presente invenção é resolvido emum quarto aspecto por uma composição farmacêutica compreendendo umácido nucléico de acordo com o primeiro, o segundo e o terceiro aspecto e1 opcionalmente um constituinte adicional, pelo que o constituinte adicional éselecionado a partir do grupo que compreende excipientesfarmaceuticamente aceitáveis, veículos farmaceuticamente aceitáveis eagentes farmaceuticamente ativos.
Em uma modalidade do quarto aspecto, a composiçãofarmacêutica compreende um ácido nucléico de acordo com quaisquer doprimeiro até o terceiro aspecto e um veículo farmaceuticamente aceitável.
O problema que é a base da presente invenção é resolvido emum quinto aspecto pelo uso de um ácido nucléico de acordo com o primeiro,o segundo e o terceiro aspecto, para a fabricação de um medicamento.
Em uma modalidade do quinto aspecto, o medicamento é parauso na medicina humana ou para uso na medicina veterinária.O problema que fundamenta a presente invenção é resolvido emum sexto aspecto pelo uso de um ácido nucléico de acordo com o primeiro,o segundo e o terceiro aspecto, para a fabricação de um meio diagnóstico.
Em uma modalidade do quinto aspecto e em uma modalidade dósexto aspecto, o medicamento e o meio diagnóstico, respectivamente, sãopara o tratamento e/ou a prevenção e a diagnose, respectivamente, de umadoença ou distúrbio selecionado a partir do grupo que compreende doençasinflamatórias, doenças auto-imunes, encefalomielite auto-imune, acidentevascular cerebral, esclerose múltipla aguda e crônica, inflamação crônica,artrite reumatóidè, doenças renais, reestenose, réestenose após angioplastia,reações alérgicas agudas e crônicas, reações imunológicas ou alérgicasprimárias e secundárias, asma, conjuntivite, bronquite, câncer, aterosclerose,insuficiência cardíaca cardiovascular arteriosclerótica ou acidente vascularcerebral, psoríase, artrite psoriática, inflamação do sistema nervoso,dermatite atópica, colite, endometriose, uveíte, distúrbios da retina, incluindoa degeneração macular, o descolamento da retina, a retinopatia diabética, aretinopatia de prematuridade, a retinite pigmentosa, a vitreorretinopatiaproliferativa, e a coriorretinopatia serosa central; fibrose pulmonar idiopática,sarcoidose, polimiosite, dermatomiosite, anulação da imunossupressão,reduzindo o risco de infecção, sepse, inflamação renal, glomerulonefrite,glomerulonefrite progressiva rápida, glomerulonefrite proliferativa, nefropatiadiabética, nefropatia obstrutiva, necrose tubular aguda, e glomeruloesclerosedifusa, lúpus eritematoso sistêmico, bronquite crônica, doença de Behcet,esclerose lateral amiotrófica (ALS), aterosclerose prematura após doença deKawasaki, infarto do miocárdio, obesidade, doença crônica do fígado,doença de Peyronie, lesão do cordão espinhal aguda, transplante de pulmãoou rim, miocardite, mal de Alzheimer e neuropatia, carcinoma de mama,carcinoma gástrico, câncer de bexiga, câncer ovariano, hamartoma,carcinoma colorretal, adenoma colônico, pancreatite, doença pulmonarobstrutiva crônica (COPD) e doenças inflamatórias dos intestinos, tais comoa doença de Crohn ou a colite ulcerativa.
Sem desejar ligar-se a qualquer teoria, a adequabilidade dosácidos nucléicos da presente invenção para propósitos diagnósticos éprincipalmente baseada em um nível aumentado ou diminuído de quimiocina,pelo que tal quimiocina é selecionada a partir do grupo compreendendo aeotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3, mais especificamente a MCP-1.
Será reconhecido pela pessoa versada na técnica que a maioria dasdoenças antes mencionadas mostra tal nível aumentado ou diminuído dequimiocina.
O problema que é a base da presente invenção é resolvido emum sétimo aspecto por um complexo compreendendo uma quimiocina e umácido nucléico de acordo com o primeiro, o segundo e o terceiro aspectos,pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende aeotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3, pelo que, de preferência, ocomplexo é um complexo cristalino.
Em uma modalidade do sétimo aspecto, a quimiocina éselecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, a MCP-1humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
Em uma modalidade do sétimo aspecto, a quimiocina é a MCP-1,pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada a partir do grupo quecompreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, a MCP-1 de cavalo, aMCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e a MCP-1 de porco,mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
O problema que fundamenta a presente invenção é resolvido emum oitavo aspecto pelo uso de um ácido nucléico de acordo com o primeiro,o segundo e o terceiro aspectos, para a detecção de uma quimiocina, peloque a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende aeotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
Em uma modalidade do oitavo aspecto, a quimiocina éselecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, a MCP-1humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
Em uma modalidade do oitavo aspecto, a quimiocina é a MCP-1,pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada a partir do grupo quecompreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, a MCP-1 de cavalo, aMCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e a MCP-1 de porco,mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
O problema que é a base da presente invenção é resolvido emum nono aspecto por um método para a triagem de um antagonista dequimiocina ou um agonista de quimiocina, compreendendo as seguintesetapas:
- proporcionar um antagonista de candidato à quimiocina e/ouum agonista de candidato à quimiocina,
- proporcionar um ácido nucléico de acordo com o primeiro, osegundo ou o terceiro aspecto,
- proporcionar um sistema de teste que proporcione um sinal napresença de um antagonista de quimiocina e/ou um agonista de quimiocina,e
- determinar se o antagonista de candidato à quimiocina é umantagonista de quimiocina e/ou se o agonista de candidato à quimiocina éum agonista de quimiocina,
pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende aeotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
Em uma modalidade do nono aspecto, a quimiocina éselecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, a MCP-1humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
Em uma modalidade do nono aspecto, a quimiocina é a MCP-1,pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada a partir do grupo quecompreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, a MCP-1 de cavalo, aMCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e a MCP-1 de porco,mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
O problema que fundamenta a presente invenção é resolvido emum décimo aspecto, por um método para a triagem de um agonista dequimiocina e/ou um antagonista de quimiocina, compreendendo as seguintesetapas:
- proporcionar uma quimiocina imobilizada a uma fase,preferivelmente uma fase sólida,- proporcionar um ácido nucléico de acordo com o primeiro, osegundo ou o terceiro aspecto, preferivelmente um ácido nucléico de acordocom o primeiro aspecto, o qual está rotulado,
- adicionar um agonista de candidato à quimiocina e/ou umantagonista de candidato à quimiocina, e
- determinar se o agonista de candidato à quimiocina é umagonista de quimiocina e/ou se o antagonista de candidato à quimiocina éum antagonista de quimiocina,
pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende aeotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
Em uma modalidade do décimo aspecto, a determinação érealizada de modo tai que seja avaliado se o ácido nucléico é substituídopelo agonista de candidato à quimiocina ou por um antagonista de candidatoà quimiocina.
Em uma modalidade do décimo aspecto, a quimiocina éselecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, a MCP-1humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
Em uma modalidade do décimo aspecto, a quimiocina é a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada a partir do grupo quecompreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, a MCP-1 de cavalo, aMCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e a MCP-1 de porco,mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
O problema que fundamenta a presente invenção é resolvido emum décimo primeiro aspecto por um kit para a detecção de uma quimiocina,compreendendo um ácido nucléico de acordo com o primeiro, o segundo e oterceiro aspectos, pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo quecompreende a eotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
Em uma modalidade do décimo primeiro aspecto, a quimiocina éselecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, a MCP-1humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
Em uma modalidade do décimo primeiro aspecto, a quimiocina éa MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada a partir do grupoque compreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, a MCP-1 decavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e a MQP-1 deporco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
O problema que fundamenta a presente invenção é resolvido emum décimo segundo aspecto por um antagonista de quimiocina, obtenívelpelo método de acordo com o décimo aspecto ou o nono aspecto, pelo que aquimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina, aMCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
Em uma modalidade do décimo segundo aspecto, a quimiocinaé selecionada á partir do grupo que compreende a eotaxina humana, aMCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
Em uma modalidade do décimo segundo aspecto, a quimiocinaé a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada a partir dogrupo que compreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, a MCP-1 decavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e a MCP-1 deporco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
O problema que fundamenta a presente invenção é resolvido emum décimo terceiro aspecto por um agonista de quimiocina, obtenível pelométodo de acordo com o décimo aspecto ou o nono aspecto, pelo que aquimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina, aMCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
Em uma modalidade do décimo terceiro aspecto, a quimiocina éselecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, a MCP-1humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
Em uma modalidade do décimo terceiro aspecto, a quimiocina éa MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada a partir do grupoque compreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, a MCP-1 decavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e a MCP-ideporco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
Será reconhecido pela pessoa versada na técnica que umagonista de quimiocina e/ou um antagonista de quimiocina é preferivelmenteum agonista e antagonista, respectivamente, abrangendo a respectivaquimiocina conforme especificada neste documento. Desse modo, oagonista de quimiocina e o antagonista de quimiocina são, por exemplo, umagonista de MCP-1 e antagonista de MCP-1, respectivamente.
O problema que se baseia a presente invenção é resolvido emum décimo quarto aspecto por um método para a detecção do ácido nucléicode acordo com qualquer do primeiro, segundo e terceiro aspecto, em umaamostra, pelo que o método compreende as etapas de:
a) proporcionar uma amostra contendo o ácido nucléico deacordo com a presente invenção;
b) proporcionar uma sonda de captura, pelo que a sonda decaptura é pelo menos parcialmente complementar a uma primeira parte doácido nucléico de acordo com qualquer do primeiro, segundo e terceiroaspecto, e uma sonda de detecção, pelo que a sonda de detecção é pelomenos parcialmente complementar a uma segunda parte do ácido nucléicode acordo com qualquer do primeiro, segundo e terceiro aspecto, ou,alternativamente, a sonda de captura é pelo menos parcialmentecomplementar a uma segunda parte do ácido nucléico de acordo comqualquer do primeiro, segundo e terceiro aspecto e a sonda de detecção épelo menos parcialmente complementar à primeira parte do ácido nucléicode acordo com qualquer do primeiro, segundo e terceiro aspecto;
c) deixar que a sonda de captura e a sonda de detecção reajamsimultaneamente ou em qualquer ordem seqüencialmente com o ácidonucléico de acordo com qualquer do primeiro, segundo e terceiro aspecto ouparte dele;
d) opcionalmente detectar se a sonda de captura é hibridizadaou não com o ácido nucléico de acordo com o ácido nucléico de acordo comqualquer do primeiro, segundo e terceiro aspecto proporcionado na etapa a);e
e) detectar o complexo formado na etapa c) consistindo no ácidonucléico de acordo com qualquer do primeiro, segundo e terceiro aspecto, ena sonda de captura e na sonda de detecção.
Em uma modalidade do décimo quarto aspecto, a sonda dedetecção compreende um meio de detecção, e/ou pelo que a sonda decaptura pode ser imobilizada a um suporte, preferivelmente um suportesólido.
Em uma modalidade do décimo quarto aspecto, qualquer sondade detecção que não seja parte do complexo é removida da reação, demodo que na etapa e) somente uma sonda de detecção que seja parte docomplexo seja detectada.
Em uma modalidade do décimo quarto aspecto, a etapa e)compreende a etapa de comparar o sinal gerado pelo meio de detecçãoquando a sonda de captura e a sonda de detecção forem hibridizadas napresença do ácido nucléico de acordo com qualquer do primeiro, segundo outerceiro aspecto ou parte dele, e na ausência do dito ácido nucléico ou partedele.
Em uma modalidade do décimo quarto aspecto, o ácido nucléicoa ser detectado é o ácido nucléico tendo uma seqüência de ácidos nucléicosde acordo com as SEQ. ID. Nss: 37, 116, 117 ou 278, e a sonda de capturaou a sonda de detecção compreende uma seqüência de ácidos nucléicos deacordo com a SEQ. ID. N9: 255 ou a SEQ. ID. NQ: 256.
Em uma modalidade do décimo quarto aspecto, o ácido nucléicoa ser detectado é o ácido nucléico tendo uma seqüência de ácidos nucléicosde acordo com as SEQ. ID. Nss: 122, 253 ou 254, e a sonda de captura ou asonda de detecção compreende uma seqüência de ácidos nucléicos deacordo com a SEQ. ID. Ns: 281 e a SEQ. ID. NQ: 282.
O problema que fundamenta a presente invenção é tambémresolvido pelo assunto das reivindicações independentes anexadas. Amodalidade preferida pode ser considerada a partir das reivindicaçõesdependentes em anexo.
As características do ácido nucléico de acordo com a presenteinvenção, conforme descritas neste documento, podem ser entendidas emqualquer aspecto da presente invenção onde o ácido nucléico for usado,sozinho ou em qualquer combinação.
As MCP-1 humanas, bem como de murinos, são proteínasbásicas tendo a seqüência de aminoácidos de acordo com as SEQ. ID. Nes:1 e 2, respectivamente.
A descoberta que poderiam ser identificados ácidos nucléicoscurtos que sè ligam com alta afinidade à MCP-1 é, a tal ponto,surpreendente, visto que Eaton et al. (1997) observaram que a geração deaptâmeros, isto é, Ácidos nucléicos D que se ligam a uma molécula-alvo,dirigidos para uma proteína básica, é, em geral, muito difícil porque este tipode alvo produz uma razão de sinal para ruído alta, porém não-específica.Esta razão alta de sinal para ruído resulta da alta afinidade não-específicamostrada pelos ácidos nucléicos pelos alvos básicos, tais como a MCP-1.
Conforme resumido em mais detalhe nas reivindicações e noexemplo 1, os presentes inventores puderam mais surpreendentementeidentificar diversas moléculas de ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1,diferentes, pelo que a maioria dos ácidos nucléicos pôde ser caracterizadaem termos de extensões de nucleotídeos, que são também referidas nestedocumento como Caixas. As diversas moléculas de ácidos nucléicos que seligam à MCP-1 podem ser categorizadas com base nas ditas Caixas e emalgumas características e elementos estruturais, respectivamente. Asdiversas categorias assim definidas são também referidas neste documentocomo tipos, e mais especificamente como tipo 1A, tipo 1B, tipo 2, tipo 3 etipo 4.
Os ácidos nucléicos de acordo com a presente invençãotambém compreenderão ácidos nucléicos que são essencialmentehomólogos às seqüências particulares descritas neste documento. O termosubstancialmente homólogos será entendido de modo tal que a homologiaseja pelo menos 75%, preferivelmente 85%, mais preferivelmente 90% emais preferivelmente ainda mais do que 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99%.
A porcentagem real de nucleotídeos homólogos presentes noácido nucléico de acordo com a presente invenção dependerá do númerototal de nucleotídeos presentes no ácido nucléico. A porcentagem demodificação pode ser baseada no número total de nucleotídeos presentes noácido nucléico.A homologia pode ser determinada conforme sabido para apessoa versada na técnica. Mais especificamente, um algoritmo decomparação de seqüências então calcula a porcentagem de identidade deseqüência para a(s) seqüência(s) de teste em relação à seqüência dereferência, com base nos parâmetros designados do programa. A seqüênciade teste é preferivelmente a seqüência ou a molécula de ácido nucléico queé dita para ser ou para ser testada, se ela for homóloga, e se for assim, atéque proporção, a uma outra molécula de ácido nucléico, pelo que tal outramolécula de ácido nucléico é também referida como a seqüência dereferência. Em lima modalidade, a seqüência de referência é uma moléculade ácido nucléico conforme descrita neste documento, mais preferivelmenteuma molécula de ácido nucléico tendo uma seqüência de acordo comqualquer de SEQ. ID. Nes: 10 a 129, 132 a 256 e 278 - 282. O alinhamentoopcional das seqüências para comparação pode ser conduzido, por exemplo,pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (Smith e Waterman,1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman eWunsch (Needleman e Wunsch, 1970), pelo método de busca porsimilaridade de Pearson e Lipman (Pearson e Lipman, 1988), porimplementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT,FASTA, e TFASTA no Pacote de Softwares da Wisconsin Genetics,Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis), ou por inspeçãovisual.
Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar aporcentagem de identidade de seqüência é o algoritmo usado na ferramentabásica de busca de alinhamento local (doravante, "BLAST"), vide, porexemplo, Altschul et al. (Altschul et al. 1990 e Altschul et al., 1997). Osoftware para efetuar as análises por BLAST está publicamente disponívelatravés do National Center for Biotechnology Information (doravante, "NCBI").Os parâmetros preestabelecidos usados na determinação da identidade deseqüência, usando o software disponível do NCBI, por exemplo, BLASTN(para as seqüências de nucleotídeos) e BLASTP (para as seqüências deaminoácidos), são descritos em McGinnis et al. (McGinnis et al., 2004).O termo ácido nucléico inventivo ou ácido nucléico de acordocom a presente invenção também compreenderá aqueles ácidos nucléicoscompreendendo as seqüências de ácidos nucléicos descritas nestedocumento ou parte delas, preferivelmente na medida em que os ácidosnucléicos ou as ditas partes estejam envolvidas na ligação à MCP-1. Otermo ácido nucléico inventivo, conforme preferivelmente usado nestedocumento, também compreenderá em uma modalidade um ácido nucléicoque seja adequado para ligar-se a qualquer molécula selecionada a partir dogrupo compreendendo MCP-2, MCP-3, MCP-4, e eotaxina. Seráreconhecido pelos versados na técnica que os ácidos nucléicos individuaisde acordo com a presente invenção ligar-se-ão a uma ou a diversas de taismoléculas. Tal ácido nucléico é, em uma modalidade, uma das moléculas deácido nucléico descritas neste documento, ou um derivado e/ou ummetabólito dela, pelo que tal derivado e/ou metabólito são preferivelmenteum ácido nucléico truncado, comparados às moléculas de ácidos nucléicosdescritas neste documento. O truncamento pode estar relacionado aqualquer uma ou a ambas as extremidades dos ácidos nucléicos, conformedescrito neste documento. Também, o truncamento pode estar relacionado àseqüência interna de nucleotídeos do ácido nucléico, isto é, ele pode estarrelacionado ao(s) nucleotídeo(s) entre o nucleotídeo 5' e 3' terminal,respectivamente. Além disso, o truncamento compreenderá a remoção detão pouco quanto um único nucleotídeo da seqüência dos ácidos nucléicosdescritos neste documento. O truncamento pode também estar relacionadoa mais do que uma extensão do(s) ácido(s) nucléico(s) inventivo(s), pelo quea extensão pode ser tão pequena quanto um nucleotídeo de comprimento. Aligação do ácido nucléico de acordo com a presente invenção,preferivelmente a uma molécula selecionada a partir do grupocompreendendo a MCP-1, a MCP-2, a MCP-3, a MCP-4 e a eotaxina, podeser determinada pelos versados na técnica, usando experimentos de rotinaou por utilização ou adoção de um método como descrito neste documento,preferivelmente conforme descrito neste documento na parte de exemplos.
Está dentro de uma modalidade da presente invenção, a não ser queexplicitamente indicado ao contrário, que sempre que for referido nestedocumento à ligação dos ácidos nucléicos de acordo com a presenteinvenção à, ou com a, MCP-1, isto se aplica também à ligação dos ácidosnucléicos de acordo com a presente invenção a, ou com, qualquer moléculaselecionada a partir do grupo que compreende a MCP-1, a MCP-2, a MCP-3,a MCP-4 e a eotaxina.
Os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção podemser Ácidos nucléicos D ou L-ácidos nucléicos. De preferência, os ácidosnucléicos inventivos são L-ácidos nucléicos. Além disso, é possível que umaou diversas partes do ácido nucléico estejam presentes como Ácidosnucléicos D ou pelo menos uma ou diversas partes dos ácidos nucléicossejam L-ácidos nucléicos. O termo "parte" dos ácidos nucléicos significarátão pouco quanto um nucleotídeo. Tais ácidos nucléicos são geralmentereferidos neste documento como D- e L-ácidos nucléicos, respectivamente.Portanto, em uma modalidade particularmente preferida, os ácidos nucléicosde acordo com a presente invenção consistem em L-nucleotídeos ecompreendem pelo menos um D-nucleotídeo. Tal D-nucleotídeo estápreferivelmente ligado a uma parte diferente das extensões que definem osácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, preferivelmenteaquelas partes dele onde esteja envolvida uma interação com as outraspartes do ácido nucléico. De preferência, tal D-nucleotídeo está ligado emuma extremidade de quaisquer das extensões e de qualquer ácido nucléicode acordo com a presente invenção, respectivamente. Em uma modalidadeadicional preferida, tais D-nucleotídeos podem atuar como um espaçador ouum ligante, preferivelmente unindo as modificações, tais como PEG e HES,aos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção.
Está também dentro de uma modalidade da presente invençãoque cada uma e quaisquer das moléculas de ácidos nucléicos, descritasneste documento em sua totalidade em termos de sua(s) seqüência(s) deácidos nucléicos, estejam limitadas à(s) seqüência(s) de nucleotídeosparticular(es). Em outras palavras, os termos "compreendendo" ou"compreende(m)" serão interpretados em tal modalidade no significado deconter ou consistir em.
Está também dentro da presente invenção que os ácidosnucléicos de acordo com a presente invenção são parte de um ácidonucléico mais longo, pelo que este ácido nucléico mais longo compreendediversas partes, pelo que pelo menos tal parte é um ácido nucléico deacordo com a presente invenção, ou uma parte dele. A(s) outra(s) parte(s)destes ácidos nucléicos mais longos pode(m) ser um ou diversos Ácidosnucléicos D ou um ou diversos L-ácidos nucléicos. Qualquer combinaçãopode ser usada em conexão com a presente invenção. Esta(s) outra(s)parte(s) do ácido nucléico mais longo, sozinhas ou consideradasconjuntamente, em sua totalidade ou em uma combinação particular,pode(m) exibir uma função que seja diferente de ligação, preferivelmente deligação à MCP-1. Uma função possível é permitir a interação com outrasmoléculas, pelo que tais outras moléculas preferivelmente são diferentes daMCP-1, tal como, por exemplo, para a imobilização, a reticulação, adetecção ou a amplificação. Em uma modalidade adicional da presenteinvenção, os ácidos nucléicos de acordo com a invenção compreendem,como porções individuais ou combinadas, diversos dos ácidos nucléicos dapresente invenção. Tal ácido nucléico compreendendo diversos dos ácidosnucléicos da presente invenção também está incluído pelo termo ácidonucléico mais longo.
Os L-ácidos nucléicos como usados neste documento são ácidosnucléicos consistindo em L-nucleotídeos, de preferência consistindocompletamente em L-nucleotídeos.
Os Ácidos nucléicos D como usados neste documento sãoácidos nucléicos consistindo em D-nucleotídeos, de preferência consistindocompletamente em D-nucleotídeos.
Os termos ácido nucléico e molécula de ácido nucléico sãousados neste documento em um modo intercambiável, se não explicitamenteindicado ao contrário.
Também, se não indicado ao contrário, qualquer seqüência denucleotídeos é apresentada neste documento na direção 5' 3'.Independente de se o ácido nucléico inventivo consiste em D-nucleotídeos, l-nucleotídeos ou uma combinação de ambos, com acombinação sendo, por exemplo, uma combinação aleatória ou umaseqüência definida de extensões consistindo em pelo menos um l-nucleotídeo e pelo menos um Ácido nucléico D, o ácido nucléico podeconsistir em desoxirribonucleotídeo(s), ribonucleotídeo(s) ou combinaçõesdeles.
Projetar os ácidos nucléicos inventivos como l-ácido nucléico évantajoso por diversas razões. Os l-ácidos nucléicos são enantiômeros deácidos nucléicos de ocorrência natural. Os Ácidos nucléicos D, entretanto,não são muito estáveis em soluções aquosas e, particularmente, emsistemas biológicos ou amostras biológicas, devido à ampia presença denucleases. As nucleases de ocorrência natural, particularmente as nucleasesde células animais, não são capazes de degradar os l-ácidos nucléicos. Porcausa disto, a meia-vida biológica do l-ácido nucléico é significativamenteaumentada em tal sistema, incluindo o corpo animal e humano. Devido àausência de capacidade de degradar do l-ácido nucléico, nenhum produtode degradação da nuclease é gerado e, assim, nenhum efeito colateral quesurja dele observado. Este aspecto delimita o l-ácido nucléico efetivamentede todos os outros compostos que são usados na terapia de doenças e/oudistúrbios que envolvam a presença de MCP-1. Os l-ácidos nucléicos queespecificamente se ligam a uma molécula-alvo através de um mecanismodiferente do emparelhamento de bases de Watson Crick, ou os aptâmerosque consistem parcial ou completamente em l-nucleotídeos, particularmentecom aquelas partes do aptâmero estando envolvidas na ligação do aptâmeroà molécula-alvo, são também chamados "spiegelmeros".
Está também dentro da presente invenção que os ácidosnucléicos inventivos, também referidos neste documento como ácidosnucléicos de acordo com a invenção, independente se eles estão presentescomo Ácidos nucléicos D, l-ácidos nucléicos ou D, l-ácidos nucléicos, ou seeles são o DNA ou o RNA, podem estar presentes como ácidos nucléicos defita simples ou de filamento duplo. Tipicamente, os ácidos nucléicosinventivos são ácidos nucléicos de fita simples, os quais exibem estruturassecundárias definidas, devidas à seqüência primária e podem, assim,também formar estruturas terciárias. Os ácidos nucléicos inventivos,entretanto, podem também ser de filamento duplo no significado que doisfilamentos, que são complementares ou parcialmente complementares umaa outra, são hibridizadas uma com a outra. Isto confere estabilidade ao ácidonucléico, o que, em particular, será vantajoso se o ácido nucléico estiverpresente na forma D de ocorrência natural, em vez da forma L.
Os ácidos nucléicos inventivos podem ser modificados. Taismodificações podem estar relacionadas ao nucleotídeo individual do ácidonucléico e são bastante conhecidas na técnica. Os exemplos para talmodificação são descritos, entre outros, em Venkatesan (2003); Kusser(2000); Aurup (1994); Cummins (1995); Eaton (1995); Green (1995);Kawasaki (1993); Lesnik (1993); e Miller (1993). Tal modificação pode serum átomo de H, um átomo de F ou o grupo 0-CH3 ou o grupo NH2 naposição 2' do nucleotídeo individual do qual consiste o ácido nucléico.Também, o ácido nucléico de acordo com a presente invenção podecompreender pelo menos um nucleotídeo de LNA. Em uma modalidade, oácido nucléico de acordo com a presente invenção consiste nosnucleotídeos de LNA.
Em uma modalidade, os ácidos nucléicos de acordo com apresente invenção podem ser um ácido nucléico de múltiplas partes. Umácido nucléico de múltiplas partes, conforme usado neste documento, é umácido nucléico que consiste em pelo menos dois filamentos de ácidonucléico. Estas pelo menos dois filamentos de ácido nucléico formam umaunidade funcional, pelo que a unidade funcional é um Iigante para umamolécula-alvo. As pelo menos dois filamentos de ácido nucléico podem serderivadas de quaisquer dos ácidos nucléicos inventivos, por clivagem doácido nucléico para gerar dois filamentos ou por síntese de um ácidonucléico correspondendo a uma primeira parte do ácido nucléico inventivo,isto é, global, e de um outro ácido nucléico correspondendo à segunda partedo ácido nucléico global. É para ser reconhecido que tanto a clivagemquanto a síntese podem ser aplicadas para gerar um ácido nucléico demúltiplas partes onde houver mais do que dois filamentos, comoexemplificado acima. Em outras palavras, as pelo menos dois filamentos deácido nucléico são tipicamente diferentes de dois filamentos que sãocomplementares e hibridizam uma com a outra, embora possa existir certograu de complementaridade entre as diversas partes do ácido nucléico.
Finalmente, está também dentro da presente invenção que sejaobtida uma estrutura inteiramente fechada, isto é, circular, para os ácidosnucléicos de acordo com a presente invenção, isto é, que os ácidosnucléicos de acordo com a presente invenção sejam fechados,preferivelmente através de uma ligação covalente, pelo que maispreferivelmente tal ligação covalente é feita entre a extremidade Si e aextremidade 3' das seqüências de ácidos nucléicos, como descritas nestedocumento.
Os presentes inventores descobriram que os ácidos nucléicos deacordo com a presente invenção exibem uma faixa de valores de Kd muitofavorável.
Uma possibilidade de determinar a constante de ligação é o usodo assim chamado dispositivo biacore, que é também conhecido paraalguém versado na técnica. A afinidade, como usada neste documento, foitambém medida pelo uso do "ensaio de co-imunoprecipitação", comodescrito nos exemplos. Uma medida apropriada para expressar aintensidade da ligação entre o ácido nucléico de acordo com a presenteinvenção ao alvo, o qual é, no presente caso, a MCP-1, e o assim chamadovalor de KD, o qual, como do mesmo modo também o método para a suadeterminação, é conhecido para alguém versado na técnica.
Os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção sãocaracterizados por certo valor de KD. De preferência, o valor de K0 mostradopelos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção está abaixo de 1μΜ. Um valor de Kd de cerca de 1 μΜ é dito ser caracterizado por umaligação não-específica de um ácido nucléico a um alvo. Conforme seráreconhecido por alguém na técnica, o valor de Kd de um grupo decompostos, tal como os ácidos nucléicos de acordo com a presenteinvenção, está dentro de certa faixa. O K0 acima mencionado de cerca de 1μΜ é um limite superior preferido para o valor de KD. O limite inferiorpreferido para o K0 dos ácidos nucléicos que se ligam ao alvo pode sercerca de 10 picomolares ou maior. Está dentro da presente invenção que osvalores de K0 dos ácidos nucléicos individuais que se ligam à MCP-1 estãopreferivelmente dentro desta faixa. As faixas preferidas podem ser definidasescolhendo-se qualquer primeiro numero dentro desta faixa e qualquersegundo número dentro desta faixa. Os valores superiores preferidos são250 nM e 100 nM, os valores inferiores preferidos são 50 nM, 10 nM, 1 nM,100pMe 10 pM.
As moléculas de ácidos nucléicos de acordo com a presenteinvenção podem ter qualquer comprimento, desde que elas ainda sejamcapazes de ligar-se à molécula-alvo. Será reconhecido na técnica queexistem comprimentos preferidos dos ácidos nucléicos de acordo com apresente invenção. Tipicamente, o comprimento é entre 15 e 120nucleotídeos. Será reconhecido pelos versados na técnica que qualquernúmero inteiro entre 15 e 120 é um comprimento possível para os ácidosnucléicos de acordo com a presente invenção. As faixas mais preferidaspara o comprimento dos ácidos nucléicos de acordo com a presenteinvenção são os comprimentos de cerca de 20 a 100 nucleotídeos, cerca de20 a 80 nucleotídeos, cerca de 20 a 60 nucleotídeos, cerca de 20 a 50nucleotídeos e cerca de 30 a 50 nucleotídeos.
Está dentro da presente invenção que os ácidos nucléicosdescritos neste documento compreendem uma porção que preferivelmente éuma porção de alto peso molecular e/ou que preferivelmente permitemodificar as características do ácido nucléico em termos de, entre outros,tempo de residência no corpo do animal, preferivelmente no corpo humano.Uma modalidade particularmente preferida de tal modificação é aPEGuilação e a HESilação dos ácidos nucléicos de acordo com a presenteinvenção. Conforme usado aqui, PEG significa poli(etileno glicol) e HEShidroxietil amido. A PEGuilação, como preferivelmente usada nestedocumento, é a modificação de um ácido nucléico de acordo com a presenteinvenção, pelo que tal modificação consiste em uma porção de PEG que éunida a um ácido nucléico de acordo com a presente invenção. A HESilação,como preferivelmente usada neste documento, é a modificação de um ácidonucléico de acordo com a presente invenção, pelo que tal modificaçãoconsiste em uma porção de HES que é unida a um ácido nucléico de acordocom a presente invenção. Estas modificações, bem como o processo demodificar um ácido nucléico usando tal modificação, são descritas no pedidode patente europeu EP 1 306 382, cuja descrição é incorporada com opresente em sua totalidade, por referência.
De preferência, o peso molecular de uma modificaçãoconsistindo em, ou compreendendo, uma porção de alto peso moiecuiar écerca de 2.000 a 200.000 Da, preferivelmente 20.000 a 120.000 Da,particularmente no caso do PEG sendo tal porção de alto peso molecular, eé preferivelmente cerca de 3.000 a 180.000 Da, mais preferivelmente de5.000 a 130.000 Da, particularmente no caso do HES sendo tal porção dealto peso molecular. O processo de modificação com HES é, por exemplo,descrito no pedido de patente alemão DE 1 2004 006 249.8, cuja descrição é,com o presente, incorporada em sua totalidade, por referência.
Está dentro da presente invenção que um ou outro de PEG eHES possa ser usado como uma forma linear ou ramificada, comoadicionalmente descrito nos pedidos de patentes W02005074993 ePCT/EP02/11950. Tal modificação pode, em princípio, ser feita nasmoléculas de ácidos nucléicos da presente invenção em qualquer posiçãodelas. De preferência, tal modificação é feita no nucleotídeo 5' terminal, nonucleotídeo 3' terminal e/ou em qualquer nucleotídeo entre o nucleotídeo em5' e o nucleotídeo em 3' da molécula de ácido nucléico.
A modificação, e preferivelmente a porção de PEG e/ou de HES1pode ser unida à molécula de ácido nucléico da presente invençãodiretamente ou através de um ligante. Está também dentro da presenteinvenção que a molécula de ácido nucléico de acordo com a presenteinvenção compreende uma ou mais modificações, preferivelmente uma oumais porções de PEG e/ou de HES. Em uma modalidade, a moléculaIigiadora individual une mais do que uma porção de PEG ou porção de HESa uma molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Oligante usado èm conexão com a presente invenção pode, ele próprio, serlinear ou ramificado. Este tipo de Iigantes é conhecido para aquelesversados na técnica e é adicionalmente descrito nos pedidos de patentesWO2005074993 e PCT/EP02/11950.
Sem desejar ligar-se a qualquer teoria, parece que pelamodificação dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção comuma porção de alto peso molecular, tal como um polímero, e maisparticularmente os polímeros descritos neste documento, os quais são, depreferência, fisiologicamente aceitáveis, a cinética de excreção é aiteraaa.Mais particularmente, parece que devido ao peso molecular aumentado detais ácidos nucléicos inventivos modificados e devido aos ácidos nucléicosnão estarem sujeitos ao metabolismo, particularmente quando na forma L, aexcreção de um corpo de animal, preferivelmente de um corpo de mamífero,e mais preferivelmente de um corpo humano, é aumentada. Gomo aexcreção ocorre tipicamente via os rins, os presentes inventores assumemque a taxa de filtração glomerular do ácido nucléico assim modificado ésignificativamente reduzida, comparado aos ácidos nucléicos não tendo estetipo de modificação de alto peso molecular, o que resulta em um aumento notempo de residência no corpo. Em conexão com isto, é particularmentenotável que, apesar de tal modificação de alto peso molecular, aespecificidade do ácido nucléico de acordo com a presente invenção não éafetada em um modo prejudicial. Até tal ponto, os ácidos nucléicos deacordo com a presente invenção têm características surpreendentes - o quenormalmente não pode ser esperado dos compostos farmaceuticamenteativos - de modo que uma formulação farmacêutica que proporcione umaliberação continuada não é necessariamente requerida para proporcionaruma liberação continuada. De preferência, os ácidos nucléicos de acordocom a presente invenção, em sua forma modificada compreendendo umaporção de alto peso molecular, podem, como tais, já ser usados como umaformulação de liberação continuada. Até tal ponto, a(s) modificação(ões) dasmoléculas de ácidos nucléicos como descritas aqui e as moléculas de ácidosnucléicos assim modificadas e qualquer composição compreendendo asmesmas podem proporcionar uma farmacocinética e uma biodistribuiçãosingular, preferivelmente controlada, delas. Isto também inclui o tempo deresidência em circulação e a distribuição para os tecidos. Tais modificaçõessão adicionalmente descritas no pedido de patente PCT/EP02/11950.
Entretanto, está também dentro da presente invenção que osácidos nucléicos descritos neste documento não compreendem nenhumamodificação e particularmente nenhuma modificação de alto peso molecular,tal como a PEGuilação ou a HESilação. Tal modalidade é particularmentepreferida quando o ácido nuciéico mostrar distribuição preferenciai paraqualquer órgão Ou tecido-alvo no corpo. Os agentes de ácidos nucléicos comtal perfil distributivo permitiriam o estabelecimento de concentrações locaisefetivas no tecido-alvo, ao mesmo tempo mantendo a concentraçãosistêmica baixa. Isto permitiria o uso de baixas doses, o que não somente ébenéfico a partir de um ponto de vista econômico, como também reduz aexposição desnecessária dos outros tecidos ao agente de ácido nuciéico,assim reduzindo o risco potencial de efeitos colaterais.
Os ácidos nucléicos inventivos, os quais são também referidosneste documento como os ácidos nucléicos de acordo com a presenteinvenção, e/ou os antagonistas de acordo com a presente invenção podemser usados para a geração ou a fabricação de um medicamento. Talmedicamento ou uma composição farmacêutica de acordo com a presenteinvenção contém pelo menos um dos ácidos nucléicos inventivos,opcionalmente junto com mais compostos farmaceuticamente ativos, peloque o ácido nuciéico inventivo preferivelmente atua como o compostofarmaceuticamente ativo propriamente dito. Tais medicamentoscompreendem, nas modalidades preferidas, pelo menos um veículofarmaceuticamente aceitável. Tal veículo pode ser, por exemplo, a água, otampão, a PBS1 a solução de glicose, preferivelmente uma soluçãobalanceada de sal de glicose a 5%, o amido, o açúcar, a gelatina ouqualquer outra substância veículo aceitável. Tais veículos são geralmenteconhecidos para alguém versado na técnica. Será reconhecido pela pessoaversada na técnica que quaisquer modalidades, uso e aspectos, ourelacionados aò, medicamento da presente invenção são também aplicáveisà composição farmacêutica da presente invenção e vice-versa.
A indicação, as doenças e os distúrbios para o tratamento e/ou aprevenção, dos quais os ácidos nucléicos, as composições farmacêuticas eos medicamentos de acordo com, ou preparados de acordo com, a presenteinvenção, resultam a partir do envolvimento, direto ou indireto, da MCP-1 nomecanismo patogenético respectivo. Entretanto, também aquelas indicações,doenças e distúrbios podem ser tratados e prevenidos no mecanismopatogenético do quai a MCP-2, a MCP-3, a MCP-4 e/ou a eotaxina estãodireta ou indiretamente envolvidas. E óbvio para aqueles versados natécnica que podem ser usados, até tal ponto, particularmente aqueles ácidosnucléicos de acordo com a presente invenção, isto é, para as doenças queenvolvam, no sentido mais amplo, a MCP-2, a MCP-3, a MCP-4 e a eotaxina,que interagem e se ligam, respectivamente, à ou com a MCP-2, a MCP-3, aMCP-4 e a eotaxina, respectivamente.
Mais especificamente, tais usos originam-se, entre outros, dopadrão de expressão da MCP-1, o que sugere que ela desempenha funçõesnas doenças humanas que são caracterizadas por infiltração de célulasmononucleares. Tal infiltração de células está presente em muitas doençasinflamatórias e auto-imunes. Em modelos de animais, a MCP-1 mostrou serexpressa no cérebro após isquemia focai (Kim 1995; Wang 1995) e durantea encefalomielite auto-imune experimental (Hulkower 1993; Ransohoff 1993;Banisor 2005). A MCP-1 pode ser uma quimiocina importante que direcionaas células mononucleares no processo da doença ilustrado por estesmodelos de animais, tal como o acidente vascular cerebral e a esclerosemúltipla.
Um grande corpo de evidência argumenta em favor de umafunção única do eixo MCP-1/CCR2 na quimiotaxia de monócitos e, assim, nainflamação crônica: (i) os camundongos deficientes de MCP-1 ou CCR2mostram resposta quimiotática de macrófagos marcadamente reduzida,enquanto de outro modo pareceriam normais (Kuziel 1997; Kurihara 1997;Boring 1997; Lu 1998). (ii), apesar da redundância funcional com outrasquimiocinas in vitro, a perda da função efetora da MCP-1 sozinha ésuficiente para prejudicar o tráfego em diversos modelos inflamatórios (Lloyd1997; Furuichi 2003; Egashira 2002; Galasso 2000; Ogata 1997; Kennedy1998; Gonzalo 1998; Kitamoto 2003). (iii), os níveis de MCP-1 são elevadosem muitas doenças inflamatórias. Na realidade, a MCP-1 é acreditadadesempenhar uma função em muitas doenças com e sem um componenteinflamatório óbvio, tais como a artrite reumatóide (Koch 1992; Hosaka 1994;Akahoshi 1993; Harigai 1993; Rollins 1996), a doença renal (Wada 1996;Viedt 2002), a reestenose após angiopiastia (Economou 2001), a alergia e aasma (Alam 1996; Holgate 1997; Gonzalo 1998), o câncer (Salcedo 2000;Gordillo 2004), a aterosclerose (Nelken 1991; Yla-Herttuala 1991; Schwartz1993; Takeya 1993; Boring 1998), a psoríase (Vestergaard 2004), ainflamação do sistema nervoso (Huang 2001), a dermatite atópica (Kaburagi2001), a colite (Okuno 2002), a endometriose (Jolicoeur 2001), a uveíte(Tuaillon 2002), os distúrbios da retina (Nakazawa 2007), a fibrose pulmonaridiopática e a sarcoidose (lyonaga 1994) e a polimiosite/dermatomiosite (DeBleecker 2002).
A intervenção terapêutica com os agentes anti-MCP-1 - ou osantagonistas de CCR2 - afetaria o tráfego em excesso de monócitosinflamatórios, porém pode escassear o tráfego basal de fagócitos, dessemodo evitando a imunossupressão geral e o risco aumentado de infecções(Dawson 2003).
Adicionalmente, com base no conhecimento crescente sobre osmecanismos moleculares do processo inflamatório e da interação demediadores da inflamação localmente secretados, identificaram-se novosalvos para a terapia das doenças renais (Holdsworth 2000; Segerer 2000).Um destes alvos, para os quais existem dados sólidos sobre a expressão eos estudos de intervenção com antagonistas específicos em modelos deanimais apropriados, é a MCP-1. Esta proteína tem uma função amplamentenão redundante para o recrutamento de células imunes para locais dainflamação renal. A infiltração de células imunes no rim é acreditada ser ummecanismo principal de dano renal estrutural e declínio da função renal nodesenvolvimento de diversas formas de doença dos rins.
Todos os tipos de células renais podem expressar asquimiocinas, incluindo a MCP-1, com o estímulo in vitro (Segerer 2000); háuma longa lista de estímulos que desencadeiam a expressão da MCP-1 invitro, incluindo as citocinas, os radicais de oxigênio, os complexos imunes, eos mediadores de lipídios.
Nos rins saudáveis de ratos e camundongos, a MCP-1 não éexpressa, porém é prontamente supra-regulada durante o curso de modelosde roaenies agudos e crônicos de inflamação renal, incluindo aglomerulonefrite complexa imune, a glomerulonefrite progressiva rápida, aglomerulonefrite proliferativa, a nefropatia diabética, a nefropatia obstrutiva,ou a necrose tubular aguda (Segerer 2000; Anders 2003). Os dados deexpressão para a MCP-1 de fato correlacionam-se bem com a expressãorespectiva verificada nas biopsias renais humanas (Rovin 1994; Cockwell1998, Wada 1999). Além disso, a expressão renal em rins humanos estáassociada com a atividade da doença e declina quando a terapia apropriadainduziu a remissão da doença (Amann 2003).
A infiltração de células mononucleares glomerulares estáassociada com o desenvolvimento de uma glomeruloesclerose difusa empacientes com nefropatia diabética. A MCP-1 desempenha uma funçãoimportante no recrutamento e no acúmulo de monócitos e linfócitos dentrodo glomérulo (Banba 2000; Morii 2003).
A MCP-1 produzida localmente parece estar particularmenteenvolvida na iniciação e na progressão do dano tubulointersticial, conformedocumentado em experimentos usando camundongos transgênicos comnefrite induzida por soro nefrotóxico (NSN). A MCP-1 foi principalmentedetectada em células endoteliais vasculares, células epiteliais tubulares ecélulas mononucleares infiltradas nas lesões intersticiais. A ativaçãomediada pela MCP-1 das células epiteliais tubulares está consistente com anoção que a MCP-1 contribui para a inflamação tubulointersticial, umacaracterística distintiva da doença renal progressiva (Wada 2001; Viedt2002).
Devido à homologia entre a MCP-1, por um lado, e a MCP-2, aMCP-3, a MCP-4 e a eotaxina, por outro lado, os ácidos nucléicos de acordocom a presente invenção, pelo menos aqueles deles que interagem com, ouse ligam à, a MCP-2, a MCP-3, a MCP-4 e eotaxina, respectivamente,podem tipicamente ser usados para o tratamento, a prevenção e/ou adiagnose de qualquer doença onde a MCP-2, a MCP-3, a MCP-4 e aeotaxina, respectivamente, estejam, direta ou indiretamente, envolvidas.Envolvida, conforme preferivelmente usado neste documento, significa quese a molécula respectiva que está envolvida na doença for impedida deexercer uma, diversas ou todas as suas funções em conexão com omecanismo patogenético que fundamenta a doença, a doença será curadaou o seu grau diminuído ou o seu surto impedido; pelo menos os sintomasou qualquer indicador de tal doença serão aliviados e melhorados,respectivamente, de modo tal que os sintomas e o indicador,respectivamente, sejam idênticos ou próximos ao(s) observado(s) em umpaciente que não sofre da doença ou não corre o risco de desenvolver taldoença.
Obviamente, porque os ácidos nucléicos de acordo com apresente invenção que se ligam à MCP-1 interagem com a, ou se ligam à,MCP-1 humana ou de murino, uma pessoa versada geralmente entenderáque os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção que se ligam àMCP-1 podem facilmente ser usados para o tratamento, a prevenção e/ou adiagnose de qualquer doença conforme descrita neste documento de sereshumanos e animais.
Estes membros da família de proteína quimiotática de monócltos(MCP), isto é, a MCP-2, a MCP-3, a MCP-4 e a eotaxina, desse modo,compartilham um alto grau de similaridade de seqüência com a MCP-1.Embora não exclusivamente, a eotaxina, as MCP-2, -3, e -4 interagem via oCCR3, o receptor de quimiocina característico sobre os eosinófilos humanos(Heath 1997). O receptor CCR3 é supra-regulado em condições neoplásticas,tais como o Iinfoma de células T cutâneo (Kleinhans 2003), o glioblastoma(Kouno 2004), ou o carcinoma de células renais (Johrer 2005).
Mais especificamente, os níveis aumentados de eotaxina estãodiretamente associados com o diagnóstico de asma e a função do pulmãocomprometida (Nakamura 1999). A expressão elevada da eotaxina em locaisde inflamação alérgica foi observada em asmáticos tanto atópicos quantonão atópicos (Ying 1997; Ying 1999). Também, os mRNAs que codificampara as MCP-2 e -4 são constitutivamente expressos em uma variedade detecidos; as suas funções fisiológicas nestes contextos, entretanto, sãodesconhecidas. Os níveis de MCP-2 no plasma são elevados na sepsejuniamente com a MCP-1 (Bossink 1995); a expressão da MCP-3 ocorre emasmáticos (Humbert 1997). Finalmente, a MCP-4 pode ser encontrada nasuperfície Iuminal de vasos ateroscleróticos (Berkhout 1997).
Desse modo, a doença e/ou os distúrbios e/ou as condições dedoença para o tratamento e/ou a prevenção dos quais pode ser usado omedicamento de acordo com a presente invenção incluem, porém não estãolimitados às, doenças inflamatórias, doenças auto-imunes, encefalomieliteauto-imune, acidente vascular cerebral, esclerose múltipla aguda e crônica,inflamação crônica, artrite reumatóide, doenças renais, reestenose,reestenose após angioplastia, reações alérgicas agudas e crônicas, reaçõesimunológicas ou alérgicas primárias e secundárias, asma, conjuntivite,bronquite, câncer, aterosclerose, insuficiência cardíaca cardiovasculararteriosclerótica ou acidente vascular cerebral, psoríase, artrite psoriática,inflamação do sistema nervoso, dermatite atópica, colite, endometriose,uveíte, distúrbios da retina, incluindo a degeneração macular, odescolamento da retina, a retinopatia diabética, a retinopatia deprematuridade, a retinite pigmentosa, a vitreorretinopatia proliferativa, e acoriorretinopatia serosa central; fibrose pulmonar idiopática, sarcoidose,polimiosite, dermatomiosite, anulação da imunossupressão, reduzindo orisco de infecção, sepse, inflamação renal, glomerulonefrite, glomerulonefriteprogressiva rápida, glomerulonefrite proliferativa, nefropatia diabética,nefropatia obstrutiva, necrose tubular aguda, e glomeruloesclerose difusa,lúpus eritematoso sistêmico, bronquite crônica, doença de Behcetl escleroselateral amiotrófica (ALS), aterosclerose prematura após doença de Kawasaki1infarto do miocárdio, obesidade, doença crônica do fígado, doença dePeyronie, lesão do cordão espinhal aguda, transplante de pulmão ou rim,miocardite, mal de Alzheimer, e neuropatia, carcinoma de mama, carcinomagástrico, câncer de bexiga, câncer ovariano, hamartoma, carcinomacolorretal, adenoma colônico, pancreatite, doença pulmonar obstrutivacrônica (COPD) e doenças inflamatórias dos intestinos, tais como a doençade Crohn ou a cólite ulcerativa.
Em uma modalidade adicional, o medicamento compreende umagente farmaceuticamente ativo adicionai. Tais compostosfarmaceuticamente ativos adicionais são, entre outros, porém não limitadosa eles, aqueles sabidos controlar a pressão sangüínea e o diabete, taiscomo os inibidores da enzima conversora de angiotensina (ACE) e osbloqueadores do receptor de angiotensina. O composto farmaceuticamenteativo adicional pode serr em uma modalidade adicional, também umdaqueles compostos que reduzem a infiltração de células imunes em locaisde inflamação crônica ou geralmente suprimem a resposta imune excessivaque está presente em indicações inflamatórias crônicas e que resulta nodano do tecido. Tais compostos podem ser, porém não estão limitados aos,esteróides e supressores imunes e são preferivelmente selecionados a partirdo grupo que compreende os corticosteróides, como a prednisona, ametilprednisolona, a hidrocortisona, a dexametasona, e osimunossupressores gerais, tais como a ciclofosfamida, a ciclosporina, oclorambucil, a azatioprina, o tacrolimus ou o micofenolato mofetil.
Adicionalmente, os bloqueadores mais específicos da co-estimulação dascélulas T, por exemplo, os bloqueadores de CD154 ou CD40 ou CD28 ouCD86 ou CD80; ou os agentes de redução das células T e/ou B, como umagente anti-CD20, são úteis em modalidades adicionais. Finalmente, oagente farmaceuticamente ativo adicional pode ser um modulador daatividade de qualquer outra quimiocina, o qual pode ser um agonista ouantagonista de quimiocina ou um agonista ou antagonista de receptor dequimiocina. Alternativa, ou adicionalmente, tal agente farmaceuticamenteativo adicional é um ácido nucléico adicional de acordo com a presenteinvenção. Alternativamente, o medicamento compreende pelo menos umácido nucléico que se liga a uma molécula-alvo diferente da MCP-1 ou exibeuma função que seja diferente daquela dos ácidos nucléicos de acordo coma presente invenção.
Está dentro da presente invenção que o medicamento éalternativa ou adicionalmente usado, em princípio, para a prevenção dequaisquer das doenças descritas em conexão com o uso do medicamentopara o tratamento das ditas doenças. Os marcadores respectivos, portanto,isto é, para as doenças respectivas, são conhecidos para aqueles versadosna técnica. De preferência, o marcador respectivo é a MCP-1. Alternativae/ou adicionalmente, o marcador respectivo é selecionado a partir do grupoque compreende a MCP-2, a MCP-3, a MCP-4 e a eotaxina. Ainda um grupoadicional de marcadores é selecionado a partir do grupo que compreende osanticorpos aüto-rêativõs nõ plasma, tais como, por exemplo, os anticorposanti-dsDNA ou o fator reumatóide.
Em uma modalidade do medicamento da presente invenção, talmedicamento é para uso em combinação com outros tratamentos paraquaisquer das doenças descritas neste documento, particularmente aquelaspara as quais o medicamento da presente invenção é para ser usado.
A "terapia de combinação" (ou "co-terapia") inclui aadministração de um medicamento da invenção e pelo menos um segundoagente, como parte de um regime de tratamento específico pretendido paraproporcionar o efeito benéfico a partir da ação em conjunto destes agentesterapêuticos, isto é, o medicamento da presente invenção e o dito segundoagente. O efeito benéfico da combinação inclui, porém não está limitado àação farmacocinética ou farmacodinâmica em conjunto que resulta dacombinação dos agentes terapêuticos. A administração destes agentesterapêuticos em combinação tipicamente é efetuada durante um período detempo definido (normalmente minutos, horas, dias ou semanas, dependendoda combinação selecionada).
A "terapia de combinação" pode ser, porém geralmente não é,pretendida incluir a administração de dois ou mais destes agentesterapêuticos como parte de regimes separados de monoterapia queincidental e arbitrariamente resultam nas combinações da presente invenção.
A "terapia de combinação" é pretendida incluir a administração destesagentes terapêuticos em um modo seqüencial, ou seja, onde cada agenteterapêutico é administrado em um tempo diferente, bem como aadministração destes agentes terapêuticos, ou pelo menos dois dos agentesterapêuticos, em um modo substancialmente simultâneo. A administraçãosubstancialmente simultânea pode ser efetuada, por exemplo, através deadministração a um paciente de uma cápsula individual tendo uma razão fixade cada agente terapêutico, ou em cápsulas individuais, múltiplas, para cadaum dos agentes terapêuticos.
A administração seqüencial ou substancialmente simultânea decada agente terapêutico pode ser efetuada por qualquer rota apropriada,incluindo, porém não limitada às rotas tópicas, rotas orais, rotas intravenosas,rotas intramusculares, e absorção direta através de tecidos da membranamucosa. Os agentes terapêuticos podem ser administrados por rotas iguaisou por rotas diferentes. Por exemplo, um primeiro agente terapêutico dacombinação selecionada pode ser administrado por injeção, enquanto osoutros agentes terapêuticos da combinação podem ser administradostopicamente.
Alternativamente, por exemplo, todos os agentes terapêuticospodem ser administrados topicamente ou todos os agentes terapêuticospodem ser administrados por injeção. A seqüência na qual sãoadministrados os agentes terapêuticos não é estreitamente crítica, a não serque de outro modo observado. A "terapia de combinação" também podeincluir a administração dos agentes terapêuticos conforme descritos acimaem combinação adicional com outros ingredientes biologicamente ativos.
Onde a terapia de combinação adicionalmente compreender um tratamentoque não seja por fármaco, o tratamento que não é por fármaco pode serconduzido em qualquer tempo adequado, desde que seja atingido um efeitobenéfico a partir da ação em conjunto da combinação dos agentesterapêuticos e o tratamento que não é por fármaco. Por exemplo, nos casosapropriados, o efeito benéfico ainda é atingido quando o tratamento que nãoé por fármaco for removido de modo temporário da administração dosagentes terapêuticos, talvez por dias ou mesmo por semanas.
Conforme resumido em termos gerais acima, ò medicamento deacordo com a presente invenção pode ser administrado, em princípio, emqualquer forma conhecida para aqueles versados na técnica. Uma rotapreferida de administração é a administração sistêmica, maispreferivelmente a administração parenteral, preferivelmente por injeção. Demodo alternativo, o medicamento pode ser administrado iocaimente. Asoutras rotas de administração compreendem a intramuscular, aintraperitoneal, e a subcutânea, a peroral, a intranasal, a intratraqueal ou apulmonar, com preferência dada à rota de administração que seja menosinvasiva, ao mesmo tempo assegurando a eficiência.
A administração parenteral é geralmente usada para as injeçõese as infusões subcutâneas, intramusculares ou intravenosas. Adicionalmente,uma abordagem para a administração parenteral emprega a implantação deum sistema de liberação lenta ou de liberação continuada, o qual asseguraque um nível constante de dosagem seja mantido, que é bastante conhecidopara o versado na técnica.
Além disso, os medicamentos preferidos da presente invençãopodem ser administrados na forma intranasal, via uso tópico de veículos,inalantes intranasais adequados, ou via rotas transdérmicas, usando aquelasformas de emplastros transdérmicos de pele bastante conhecidos paraaqueles versados na técnica. Para ser administrada na forma de um sistemade distribuição transdérmica, a administração da dosagem, obviamente, serácontínua, em vez de intermitente, por todo o regime de dosagem. As outraspreparações tópicas preferidas incluem os cremes, os ungüentos, as loções,os sprays de aerossóis e os géis, onde a concentração de ingrediente ativotipicamente variaria de 0,01% a 15%, p/p ou p/v.O medicamento da presente invenção geralmente compreenderáuma quantidade efetiva do(s) componente(s) ativo(s) da terapia, porém nãolimitado(s) a uma molécula de ácido nucléico da presente invenção,dissolvida ou dispersa em um meio farmaceuticamente aceitável. Os meiosou os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem quaisquer e todos ossolventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos eantifúngicos, agentes isotônicos e retardadores da absorção e similares. Ouso de tais meios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas ébastante conhecido na técnica. Podem também ser incorporadosingredientes ativos suplementares no medicamento da presente invenção.
Em um aspecto adicional, a presente invenção está relacionadaa uma composição farmacêutica. Tai composição farmacêutica compreendepelo menos um dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção epreferivelmente um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal veículo podeser qualquer veículo ou qualquer aglutinante usado e/ou conhecido natécnica. Mais particularmente, tal aglutinante ou veículo é qualqueraglutinante ou veículo conforme discutido em conexão com a fabricação domedicamento descrito neste documento. Em uma modalidade adicional, acomposição farmacêutica compreende um agente farmaceuticamente ativoadicional.
A preparação de um medicamento e de uma composiçãofarmacêutica será conhecida para aqueles versados na técnica levando emconsideração a presente descrição. Tipicamente, tais composições podemser preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas;formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, líquido antesda injeção; como comprimidos ou outros sólidos para a administração oral;como cápsulas de liberação com o tempo; ou em qualquer outra formaatualmente usada, incluindo os colírios, os cremes, as loções, as pomadas,os inalantes e similares. O uso de formulações estéreis, tais como as loçõesà base de solução salina, por cirurgiões, médicos ou profissionais da saúde,para tratar uma área particular no campo de operação, pode também serparticularmente útil. As composições podem também ser distribuídas viamicrodispositivo, micropartícula ou esponja.
Com a formulação, um medicamento será administrado em ummodo compatível com a formulação de dosagem, e em tal quantidadeconforme for farmaceuticamente efetiva. As formulações são facilmenteadministradas em uma variedade de formas de dosagens, tais como o tipode soluções injetáveis descritas acima, porém as cápsulas de liberação defármacos e similares podem também ser empregadas.
Neste contexto, a quantidade de ingrediente ativo e o volume dacomposição a ser administrada dependem do indivíduo ou do paciente a sertratado. As quantidades específicas de composto ativo requerido para aadministração dependem do julgamento do profissional e são peculiarespara cada indivíduo.
Tipicamente se utiliza um volume mínimo de um medicamentorequerido para dispersar os compostos ativos. Os regimes adequados para aadministração são também variáveis, porém seriam tipificados administrandoinicialmente o composto e monitorando os resultados e então dando dosescontroladas adicionais em intervalos adicionais.
Por exemplo, para a administração oral na forma de umcomprimido ou cápsula (por exemplo, uma cápsula gelatinosa), ocomponente de fármaco ativo, isto é, uma molécula de ácido nucléico dapresente invenção e/ou qualquer agente farmaceuticamente ativo adicional,também referido neste documento como agente(s) terapêutico(s) oucomposto(s) ativo(s), pode ser combinado com um veículo inerte,farmaceuticamente aceitável, não tóxico, oral, tal como o etanol, o glicerol, aágua e similar. Além disso, quando desejado ou necessário, os aglutinantes,os lubrificantes, os agentes desintegrantes, e os agentes corantesadequados podem também ser incorporados na mistura. Os aglutinantesadequados incluem o amido, o silicato de magnésio alumínio, a pasta deamido, a gelatina, a metilcelulose, a carboximetilcelulose sódica e/ou apolivinilpirrolidona, os açúcares naturais, tais como a glicose ou a beta-lactose, os adoçantes de milho, as gomas naturais e sintéticas, tais como aacácia, o tragacanto ou o alginato de sódio, o polietileno glicol, as ceras, esimilares. Os lubrificantes usados nestas formas de dosagens incluem ooleato de sódio, ô estearato de sódio, o estearato de magnésio, o benzoatode sódio, o acetato de sódio, o cloreto de sódio, a sílica, o talco, o ácidoesteárico, o sèu sal de magnésio ou cálcio e/ou o polietileno glicol, esimilares. Os desintegrantes incluem, sem limitação, o amido, a metilcelulose, o ágar, a bentonita, os amidos de goma xantana, o ágar, o ácidoalgínico ou o seu sal sódico, ou as misturas efervescentes, e similares. Osdiluentes incluem, por exemplo, a lactose, a dextrose, a sacarose, o manitol,o sorbitol, a celulose e/ou a glicina.
O medicamento da invenção pode também ser administrado emtais formas de dosagens orais como comprimidos ou cápsulas de liberaçãocom o tempo e de liberação continuada, pílulas, pós, grânulos, elixires,tinturas, suspensões, xaropes e emulsões. Os supositórios sãovantajosamente preparados a partir de emulsões ou suspensões graxas.
A composição farmacêutica ou o medicamento pode seresterilizado e/ou conter adjuvantes, tais como agentes conservantes,estabilizantes, umidificantes ou emulsificantes, promotores de solução, saispara regular a pressão osmótica e/ou tampões. Além disso, eles podemtambém conter outras substâncias terapeuticamente valiosas. Ascomposições são preparadas de acordo com métodos convencionais demistura, granulação, ou revestimento, e tipicamente contêm cerca de 0,1% a75%, preferivelmente cerca de 1 % a 50%, do ingrediente ativo.
As composições líquidas, particularmente injetáveis, podem, porexemplo, ser preparadas por dissolução, dispersão, etc. O composto ativo édissolvido em, ou misturado com, um solvente farmaceuticamente puro, talcomo, por exemplo, a água, a solução salina, a dextrose aquosa, o glicerol,o etanol, e similares, para, desse modo, formar a solução ou a suspensãoinjetável. Adicionalmente, podem ser formuladas formas sólidas adequadaspara dissolução em líquido antes da injeção.
Para as composições sólidas, os excipientes incluem os grausfarmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarinasódica, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio, esimilares. O composto ativo definido acima pode ser também formuladocomo supositórios, usando, por exemplo, os polialquileno glicóis, porexemplo, o propileno glicol, como o veículo. Em algumas modalidades, ossupositórios são vantajosamente preparados a partir de emulsões oususpensões graxas.
Os medicamentos e as moléculas de ácidos nucléicos,respectivamente, da presente invenção podem também ser administrados naforma de sistemas de distribuição de lipossomos, tais como as pequenasvesículas unilamelares, as grandes vesículas unilamelares e as vesículasmultilamelares. Os lipossomos podem ser formados a partir de umavariedade de fosfolipídios, contendo colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas. Em algumas modalidades, um filme de componentes iipídicos éhidratado com uma solução aquosa do fármaco para formar a camadalipfdica que encapsula o fármaco, o que é bem conhecido para o versado natécnica. Por exemplo, as moléculas de ácidos nucléicos descritas nestedocumento podem ser proporcionadas como um complexo com umcomposto Iipofílico ou composto de alto peso molecular, não imunogênico,construído usando métodos conhecidos na técnica. Adicionalmente, oslipossomos podem conter tais moléculas de ácidos nucléicos sobre a suasuperfície, para alvejar e carregar agentes citotóxicos internamente paramediar a morte celular. Um exemplo de complexos associados com ácidosnucléicos é proporcionado na Patente U.S. N2 6.011.020.
Os medicamentos e as moléculas de ácidos nucléicos,respectivamente, da presente invenção podem também ser acoplados compolímeros solúveis como veículos de fármacos alvejáveis. Tais polímerospodem incluir a polivinilpirrolidona, o copolímero de pirano, o poliidroxipropil-metacrilamida-fenol, o poliidroxietilaspanamidafenol, ou apolietilenooxidopolilisina substituída com resíduos de palmitoíla. Além disso,os medicamentos e as moléculas de ácidos nucléicos, respectivamente, dapresente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímerosbiodegradáveis, úteis em obter a liberação controlada de um fármaco, porexemplo, o poli(ácido láctico), a poliépsilon capro lactona, o poliidróxi ácidobutírico, os poliortoésteres, os poliacetais, os polidiidropiranos, ospolicianoacrilatos e os copolímeros em blocos reticulados ou antipáticos dehidrogéis.
Se desejado, a composição farmacêutica e o medicamento,respectivamente, a serem administrados podem também conter pequenasquantidades de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentesumidificantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH, e outrassubstâncias, tais como, por exemplo, o acetato de sódio, e o oleato detrietanolamina.
O regime de dosagem que utiliza as moléculas de ácidosnucléicos e os medicamentos, respectivamente, da presente invenção éselecionado de acordo com uma variedade de fatores, incluindo o tipo, aespécie, a idade, o peso, o sexo e a condição médica do paciente; agravidade da condição a ser tratada; a rota de administração, a função renale hepática do paciente; e o aptâmero particular ou o seu sal empregado. Ummédico ou veterinário comumente versado pode prontamente determinar eprescrever a quantidade efetiva do fármaco requerido para prevenir, deter ouparar o progresso da condição.
Os níveis efetivos no plasma do ácido nucléico de acordo com apresente invenção preferivelmente variam de 500 fM a 500 μΜ notratamento de quaisquer das doenças descritas neste documento.
As moléculas de ácidos nucléicos e os medicamentos,respectivamente, da presente invenção podem preferivelmente seradministrados em uma única dose diária, de dois em dois ou de três em trêsdias, semanalmente, de duas em duas semanas, em uma dose únicamensal ou de três em três meses.
Está dentro da presente invenção que o medicamento, conformedescrito neste documento, constitui a composição farmacêutica descritaneste documento.
Em um aspecto adicional, a presente invenção está relacionadaa um método para o tratamento de um paciente que esteja necessitado detal tratamento, pelo que o método compreende a administração de umaquantidade farmaceuticamente ativa de pelo menos um dos ácidos nucléicosde acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o paciente sofrede uma doença ou corre o risco de desenvolver tal doença, pelo que adoença é quaisquer daquelas descritas neste documento, particularmentequaisquer daquelas doenças descritas em conexão com o uso de quaisquerdos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção para a fabricaçãode um medicamento.
É para ser entendido que o ácido nucléico e também osantagonistas de acordo com a presente invenção podem ser usados nãosomente como úm medicamento ou para a fabricação de um medicamento,porém também para propósitos cosméticos, particularmente em relação aoenvolvimento da MCP-I em lesões da pele regionais inflamadas. Portanto,uma condição ou doença adicional para o tratamento ou a prevenção daqual podem ser usados o ácido nucléico, o medicamento e/ou a composiçãofarmacêutica de acordo com a presente invenção é as lesões da peleregionais inflamadas.
Conforme preferivelmente usado neste documento, um agentediagnóstico ou meio diagnóstico é adequado para detectar, direta ouindiretamente, a MCP-1, preferivelmente a MCP-1 conforme descrita nestedocumento, e mais preferivelmente a MCP-1 conforme descrita nestedocumento em conexão com os diversos distúrbios e doenças descritosneste documento. Entretanto, até o ponto em que as moléculas de ácidosnucléicos de acordo com a presente invenção estão também se ligando aquaisquer, algumas ou todas de MCP-2, MCP-3, MCP-4 e eotaxina, taismoléculas de ácidos nucléicos podem também ser usadas para a diagnósede doenças e distúrbios, respectivamente, cujo mecanismo patogenéticoestá direta ou indiretamente ligado ou associado com a superexpressão ou asuperatividade com a MCP-2, a MCP-3, a MCP-4 e/ou a eotaxina. Odiagnóstico é adequado para a detecção e/ou o acompanhamento dequaisquer dos distúrbios e doenças, respectivamente, descritos nestedocumento. Tal detecção é possível através da ligação dos ácidos nucléicosde acordo com a presente invenção à MCP-1. Tal ligação pode ser direta ouindiretamente detectada. Os métodos e os meios respectivos sãoconhecidos para aqueles versados na técnica. Entre outros, os ácidosnucléicos de acordo com a presente invenção podem compreender umrótulo que permite a detecção dos ácidos nucléicos de acordo com apresente invenção, preferivelmente do ácido nucléico ligado à MCP-1. Talrótulo é preferivelmente selecionado a partir do grupo que compreenderótulos radioativos, enzimáticos e fluorescentes. Em princípio, todos osensaios conhecidos desenvolvidos para anticorpos podem ser adotados paraos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, considerando que oanticorpo de ligação ao alvo é substituído por um ácido nucléico de ligaçãoao alvo. Nos ensaios de anticorpos usando anticorpos de ligação a alvos nãorotulados, a detecção é preferivelmente feita por um anticorpo secundário, oqual é modificado com rótulos radioativos, enzimáticos e fluorescentes e seliga ao anticorpo de ligação ao alvo em seu fragmento Fe. No caso de umácido nucléico, preferivelmente um ácido nucléico de acordo com a presenteinvenção, o ácido nucléico é modificado com tal rótulo, pelo quepreferivelmente tal rótulo é selecionado a partir do grupo que compreendebiotina, Cy-3 e Cy-5, e tal rótulo é detectado por um anticorpo dirigido contratal rótulo, por exemplo, um anticorpo antibiotina, um anticorpo anti-Cy3 ouum anticorpo anti-Cy5, ou - no caso que o rótulo é a biotina - o rótulo édetectado por estreptavidina ou avidina, que naturalmente se ligam à biotina.
Tal anticorpo, estreptavidina ou avidina, por sua vez, é preferivelmentemodificada com um rótulo respectiva, por exemplo, um rótulo radioativo,enzimático ou fluorescente (como um anticorpo secundário).
Em uma modalidade adicional, as moléculas de ácidos nucléicosde acordo com a invenção são detectadas ou analisadas por um segundomeio de detecção, onde o dito meio de detecção é um rótulo molecular. Ametodologia de rótulo molecular é conhecida para as pessoas versadas natécnica. Em resumo, as sondas de ácidos nucléicos, que são tambémreferidas como rótulos moleculares, são um complemento invertido para aamostra de ácidos nucléicos a ser detectada e hibridizam por causa distocom uma parte da amostra de ácido nucléico a ser detectada. Com a ligaçãoà amostra de ácido nucléico, os grupos fluorfóricos do rótulo molecular sãoseparados, o que resulta em uma alteração do sinal de fluorescência,preferivelmente uma alteração na intensidade. Esta alteração correlaciona-se com a quantidade de amostra de ácidos nucléicos presente.
Será reconhecido que a detecção da MCP-1 usando os ácidosnucléicos de acordo com á presente invenção particularmente permitirá adetecção da MCP-1 como definida neste documento.
Em conexão com a detecção da MCP-1, um método preferidocompreende as seguintes etapas:
proporcionar uma amostra que é para ser testada quanto àpresença de MCP-1,
b) proporcionar um ácido nuciéico de acordo com a presenteinvenção,
c) reagir a amostra com o ácido nucléico, preferivelmente em umvaso de reação pelo que a etapa (a) pode ser efetuada antes da etapa (b),ou a etapa (b) pode ser efetuada antes da etapa (a).
Em uma modalidade preferida, proporciona-se uma etapa d)adicional, a qual consiste na detecção da reação da amostra com o ácidonucléico. De preferência, o ácido nucléico da etapa b) é imobilizado a umasuperfície. A superfície pode ser a superfície de um vaso de reação, talcomo um tubo de reação, uma cavidade de uma placa, ou a superfície deum dispositivo contido em tal vaso de reação, tal como, por exemplo, umaconta. A imobilização do ácido nucléico à superfície pode ser feita porqualquer meio conhecido para aqueles versados na técnica, incluindo,porém não limitado às ligações não-covalentes ou covalentes. Depreferência, a ligação é estabelecida via uma ligação química covalenteentre a superfície e o ácido nucléico. Entretanto, está também dentro dapresente invenção que o ácido nucléico seja indiretamente imobilizado auma superfície, pelo que tal imobilização indireta envolve o uso de umcomponente adicional ou um par de pares de interação. Tal componenteadicional é preferivelmente um composto que especificamente interage como ácido nucléico a ser imobilizado, o qual é também referido como par deinteração, e assim media a ligação do ácido nucléico à superfície. O par deinteração é preférivelmente selecionado a partir do grupo que compreendeácidos nucléicos, polipeptídeos, proteínas e anticorpos. De preferência, o parde interação é um anticorpo, mais preferivelmente um anticorpo monoclonal.
Alternativamente, o par de interação é um ácido nucléico, preferivelmenteum ácido nucléico funcional. Mais preferivelmente, tal ácido nucléicofuncional é selecionado a partir do grupo que compreende aptâmeros,"spiegelmeros", e ácidos nucléicos que sejam pelo menos parcialmentecomplementares ao ácido nucléico. Em uma modalidade alternativa adicional,a ligação do ácido nucléico à superfície é mediada por um par de interaçãode múltiplas partes. Tal par de interação de múltiplas partes épreferivelmente um par de pares de interação ou um par de interaçãoconsistindo em um primeiro membro e um segundo membro, pelo que oprimeiro membro é compreendido pelo, ou está unido ao, ácido nucléico e osegundo membro está unido à, ou compreendido pela, superfície. O par deinteração de múltiplas partes é preferivelmente selecionado a partir do grupode pares de pares de interação compreendendo a biotina e a avidina, abiotina e a estreptavidina, e a biotina e a neutravidina. De preferência, oprimeiro membro do par de pares de interação é a biotina.
Um resultado preferido de tal método é a formação de umcomplexo imobilizado de MCP-1 e o ácido nucléico, pelo que maispreferivelmente o dito complexo é detectado. Está dentro de umamodalidade que a MCP-1 é detectada a partir do complexo.
Um meio de detecção respectivo, o qual está de acordo comesta exigência, é, por exemplo, qualquer meio de detecção que sejaespecífico para aquela(s) parte(s) da MCP-1. Um meio de detecçãoparticularmente preferido é um meio de detecção que é selecionado a partirdo grupo que compreende ácidos nucléicos, polipeptídeos, proteínas eanticorpos, cuja geração é conhecida para aqueles versados na técnica.
O método para a detecção da MCP-1 também compreende quea amostra é removida do vaso de reação, o qual tenha preferivelmente sidousado para efetuar a etapa c).O método compreende, em uma modalidade adicional, tambéma etapa de imobilizar um par de interação da MCP-1 sobre uma superfície,preferivelmente uma superfície como definida acima, pelo que o par deinteração é como definido neste documento, e preferivelmente como acimadescrito em conexão com o método respectivo, e mais preferivelmentecompreende os ácidos nucléicos, os polipeptídeos, as proteínas e osanticorpos em suas diversas modalidades. Nesta modalidade, um meio dedetecção particularmente preferido é um ácido nucléico de acordo com apresente invenção, pelo que tal ácido nucléico pode preferivelmente estarrotulado ou não-rotulado. Caso tal ácido nucléico esteja rotulado, ele podedireta ou indiretamente ser detectado. Tal detecção pode também envolver ouso de um segundo meio de detecção, o qual é, preferivelmente, tambémselecionado a partir do grupo que compreende os ácidos nucléicos, ospolipeptídeos, as proteínas e as modalidades nas diversas modalidadesdescritas neste documento. Tais meios de detecção são preferivelmenteespecíficos para o ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Emuma modalidade mais preferida, o segundo meio de detecção é um rótulomolecular. O ácido nucléico, ou o segundo meio de detecção, ou ambospodem compreender, em uma modalidade preferida, um rótulo de detecção.
O rótulo de detecção é preferivelmente selecionada a partir do grupo quecompreende a biotina, um rótulo de bromo-dessoxiuridina, um rótulo dedigoxigenina, um rótulo de fluorescência, um rótulo de UV, um radiorrótulo, euma molécula quelante. Alternativamente, o segundo meio de detecçãointerage com o rótulo de detecção, a qual está preferivelmente contida pelo,é compreendida pelo, ou está unida ao, ácido nucléico. As combinaçõesparticularmente preferidas são como se segue:
o rótulo de detecção é a biotina e o segundo meio de detecção éum anticorpo dirigido contra a biotina, ou onde
o rótulo de detecção é a biotina e o segundo meio de detecção éuma avidina ou uma molécula que carrega a avidina, ou onde
o rótulo de detecção é a biotina e o segundo meio de detecção éuma estreptavidina ou uma molécula que carrega a estreptavidina, ou ondeo rótulo de detecção é a biotina e o segundo meio de detecção éuma neutravidina ou uma molécula que carrega a neutravidina, ou
onde o rótulo de detecção é uma bromo-dessoxiuridina e osegundo meio de detecção é um anticorpo dirigido contra a bromo-dessoxiuridina, ou onde
o rótulo de detecção é uma digoxigenina e o segundo meio dedetecção é um anticorpo dirigido contra a digoxigenina, ou onde
o rótulo de detecção é um quelante e o segundo meio dedetecção é um radionuclídeo, pelo que é preferido que o dito rótulo dedetecção seja unido ao ácido nucléico. É para ser reconhecido que este tipode combinação é também aplicável à modalidade onde o ácido nucléico estáunido à superfície. Em tal modalidade, é preferido que o rótulo de detecçãoseja unido ao par de interação.
Finalmente, está também dentro da presente invenção que osegundo meio de interação é detectado usando um terceiro meio dedetecção, preferivelmente o terceiro meio de detecção é uma enzima, maispreferivelmente mostrando uma reação enzimática na detecção do segundomeio de detecção, ou o terceiro meio de detecção é um meio para adetecção de radiação, mais preferivelmente radiação emitida por umradionuclídeo. De preferência, o terceiro meio de detecção estáespecificamente detectando e/ou interagindo com o segundo meio dedetecção.
Também na modalidade com um par de interação da MCP-1sendo imobilizado sobre uma superfície e o ácido nucléico de acordo com apresente invenção sendo preferivelmente adicionado ao complexo formadoentre o par de interação e a MCP-1, a amostra pode ser removida da reação,mais preferivelmente do vaso de reação onde a etapa c) e/ou a d) sãoefetuadas.
Em uma modalidade, o ácido nucléico de acordo com a presenteinvenção compreende uma porção de fluorescência e, pela qual, afluorescência da porção de fluorescência é diferente da formação decomplexo entre o ácido nucléico e a MCP-1 e a MCP-1 livre.Em uma modalidade adicional, o ácido nucléico é um derivadodo ácido nucléico de acordo com a presente invenção, pelo que o derivadodo ácido nucléico compreende pelo menos um derivado fluorescente deadenosina substituindo a adenosina. Em uma modalidade preferida, oderivado fluorescente de adenosina é a etenoadenosina.
Em uma modalidade adicional, o complexo consistindo noderivado do ácido nucléico de acordo com a presente invenção e a MCP-1 édetectado usando fluorescência.
Em uma modalidade do método, cria-se um sinal na etapa (c) ouna etapa (d) e preferivelmente o sinal está correlacionado com aconcentração de MCP-1 na amostra.
Em um aspecto preferido, os ensaios podem ser efetuados emplacas de 96 cavidades, onde os componentes são imobilizados nos vasosde reação, conforme descrito acima, e as cavidades atuando como vasos dereação.
Será reconhecido pelos versados na técnica que o que tinhasido dito acima também se aplica à MCP-2, à MCP-3, à MCP-4 e/ou àeotaxina, pelo menos até o ponto em que os ácidos nucléicos de acordo coma presente invenção estão também se ligando à, ou com a, MCP-2-, MCP-3,MCP-4 e/ou eotaxina.
O ácido nucléico inventivo pode adicionalmente ser usado comomaterial de partida para o projeto de fármacos. Basicamente, existem duasabordagens possíveis. Uma abordagem é a triagem das bibliotecas decompostos, considerando que tais bibliotecas de compostos sãopreferivelmente bibliotecas de compostos de baixos pesos moleculares. Emuma modalidade, a triagem é uma triagem de altos rendimentos. Depreferência, a triagem de altos rendimentos é a avaliação rápida, eficiente,de tentativas e erros, dos compostos em um ensaio baseado em alvo. Nomelhor caso, as análises são conduzidas por uma medição colorimétrica. Asbibliotecas como usadas em conexão com isto são conhecidas para alguémversado na técnica.
Alternativamente, o ácido nucléico de acordo com a presenteinvenção pode ser usado para o projeto racional de fármacos. Depreferência, o projeto racional de fármacos é o projeto de uma estruturafarmacêutica de exemplo. Começando a partir da estrutura tridimensional doalvo, a qual é tipicamente identificada por métodos tais como a cristalografiade raios X ou a espectroscopia de ressonância magnética nuclear, usam-seprogramas de computador para buscar banco de dados contendo estruturasde muitos compostos químicos diferentes. A seleção é feita por umcomputador, os compostos identificados podem subseqüentemente sertestados no laboratório.
O projeto racional de fármacos pode iniciar a partir de quaisquerdos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção e envolve umaestrutura, preferivelmente uma estrutura tridimensional, a qual é similar àestrutura dos ácidos nucléicos inventivos ou idêntica às partes mediadorasde ligação da estrutura dos ácidos nucléicos inventivos. Em qualquer caso,tal estrutura ainda mostra uma característica de ligação igual ou similar aosácidos nucléicos inventivos. Em uma etapa adicional ou como uma etapaalternativa no projeto racional de fármacos, a estrutura preferivelmentetridimensional destas partes dos ácidos nucléicos que se ligam aoneurotransmissor é imitada por grupos químicos que são diferentes dosnucleotídeos e dos ácidos nucléicos. Por este mimetismo, um compostodiferente dos ácidos nucléicos pode ser projetado. Tal composto épreferivelmente uma pequena molécula ou um peptídeo.
No caso da triagem das bibliotecas de compostos, tal como porutilização de um ensaio competitivo, o qual é conhecido para alguémversado na técnica, podem ser encontrados análogos de MCP-1, agonistasde MCP-1 ou antagonistas de MCP-1 apropriados. Tais ensaios competitivospodem ser configurados como se segue. O ácido nucléico inventivo,preferivelmente um "spiegelmero", o qual é um L-ácido nucléico que se liga aum alvo, é acoplado a uma fase sólida. Para identificar os análogos de MCP-1, a MCP-1 rotulada pode ser adicionada ao ensaio. Um análogo potencialcompetiria com as moléculas de MCP-1 que se ligam ao "spiegelmero", oque acompanharia uma diminuição no sinal obtido pelo rótulo respectivo.A triagem por agonistas ou antagonistas pode envolver o uso de um ensaiode cultura de células, como conhecido para aqueles versados na técnica.
O kit de acordo com a presente invenção pode compreenderpelo menos um ou diversos dos ácidos nucléicos inventivos. Adicionalmente,o kit pode compreender pelo menos um ou diversos controles positivos ounegativos. Um controle positivo pode, por exemplo, ser a MCP-1,particularmente aquela contra a qual o ácido nucléico inventivo éselecionado ou à qual ele se liga, preferivelmente, na forma líquida. Umcontrole negativo pode, por exemplo, ser um peptídeo, o qual é definido emtermos de propriedades biofísicas similares á MCP-1, porém que não éreconhecido pelos ácidos nucléicos inventivos. Além disso, o dito kit podecompreender um ou diversos tampões. Os diversos ingredientes podemestar contidos no kit na forma secada ou Iiofilizada ou dissolvidos em umlíquido. O kit pode compreender um ou diversos recipientes, os quais, porsua vez, contêm um ou diversos ingredientes do kit. Em uma modalidadeadicional, o kit compreende uma instrução ou folheto de instrução quefornece ao usuário informação sobre como usar o kit e os seus diversosingredientes.
A determinação farmacêutica e bioanalítica do ácido nucléico deacordo com a presente invenção é basicamente para a avaliação de seuperfil farmacocinético e biodinâmico em diversas singularidades, tecidos eórgãos do corpo humano e não humano. Para tal propósito, podem serusados quaisquer dos métodos de detecção descritos neste documento econhecidos para uma pessoa versada na técnica. Em um aspecto adicionalda presente invenção, proporciona-se um ensaio de hibridização emsanduíche para a detecção do ácido nucléico de acordo com a presenteinvenção. Dentro do ensaio de detecção, usam-se uma sonda de captura euma sonda de detecção. A sonda de captura é complementar à primeiraparte e a sonda de detecção à segunda parte do ácido nucléico de acordocom a presente invenção. Ambas, a sonda de captura e de detecção, podemser formadas por nucleotídeos de DNA, nucleotídeos de DNA modificados,nucleotídeos de RNA modificados, nucleotídeos de RNA, nucleotídeos deLNA e/ou nucleotídeos de PNA.
Portanto, a sonda de captura compreende uma extensão deseqüência complementar à extremidade de 5' do ácido nucléico de acordocom a presenté invenção e a sonda de detecção compreende uma extensãode seqüência complementar à extremidade de 3' do ácido nucléico deacordo com a presente invenção. Neste caso, a sonda de captura éimobilizada a uma superfície ou matriz, via sua extremidade de 5', pelo que asonda de captura pode ser imobilizada diretamente na sua extremidade de 5'ou via um Iigante entre a sua extremidade de 5' e a superfície ou matriz.
Entretanto, em princípio, o Iigante pode ser ligado a cada nucleotídeo dasonda de captura. O Iigante pode ser formado por Iigantes hidrofílicos deversado na técnica ou por nucleotídeos de D-DNA, nucleotídeos de D-DNAmodificados, nucleotídeos de D-RNA, nucleotídeos de D-RNA modificados,nucleotídeos de D-LNA, nucleotídeos de PNA, nucleotídeos de l-RNA,nucleotídeos de l-DNA, nucleotídeos de l-RNA modificados, nucleotídeos del-DNA modificados e/ou nucleotídeos de l-LNA.
Alternativamente, a sonda de captura compreende umaextensão de seqüência complementar à extremidade de 3' do ácido nucléicode acordo com a presente invenção e a sonda de detecção compreendeuma extensão de seqüência complementar à extremidade de 5' do ácido1 nucléico de acordo com a presente invenção. Neste caso, a sonda decaptura é imobilizada a uma superfície ou matriz, via sua extremidade de 3',pelo que a sonda de captura pode ser imobilizada diretamente na suaextremidade de 3' ou via um Iigante entre a sua extremidade de 3' e asuperfície ou matriz. Entretanto, em princípio, o Iigante pode ser ligado acada nucleotídeo da extensão de seqüência que é complementar ao ácidonucléico de acordo com a presente invenção. O Iigante pode ser formado porIigantes hidrofílicos de versado na técnica ou por nucleotídeos de D-DNA,nucleotídeos de D-DNA modificados, nucleotídeos de D-RNA, nucleotídeosde D-RNA modificados, nucleotídeos de D-LNA, nucleotídeos de PNA,nucleotídeos de l-RNA, nucleotídeos de l-DNA, nucleotídeos de l-RNAmodificados, nucleotídeos de l-DNA modificados e/ou nucleotídeos de l-LNA.O número de nucleotídeos da sonda de captura e de detecçãoque podem hibridizar com o ácido nucléico de acordo com a presenteinvenção é variável e pode ser dependente do número de nucleotídeos dasonda de captura e/ou da de detecção e/ou do ácido nucléico de acordo coma presente invenção propriamente dito. O número total de nucleotídeos dasonda de captura e da de detecção que podem hibridizar com o ácidonucléico de acordo com a presente invenção deve ser o número máximo denucleotídeos que é compreendido pelo ácido nucléico de acordo com apresente invenção. O número mínimo de nucleotídeos (2 a 10 nucleotídeos)da sonda de detecção e de captura deve permitir a hibridização com aextremidade de 5' ou a extremidade de 3', respectivamente, do ácidonucléico de acordo com a presente invenção. Para obter especificidade eseletividade altas entre o ácido nucléico de acordo com a presente invençãoe os outros ácidos nucléicos que ocorrem nas amostras que são analisadas,o número total de nucleotídeos da sonda de captura e de detecção deve sero número máximo de nucleotídeos que é compreendido pelo ácido nucléicode acordo com a presente invenção.
Além disso, a sonda de detecção preferivelmente carrega umamolécula de marcador ou rótulo que pode ser detectado conformeanteriormente descrito neste documento. O rótulo ou a molécula demarcador pode, em princípio, ser ligada a cada nucleotídeo da sonda dedetecção. De preferência, o rótulo ou o marcador está localizado naextremidade de 5' ou na extremidade de 3" da sonda de detecção, pelo quepode ser inserido um Iigante entre os nucleotídeos dentro da sonda dedetecção que são complementares ao ácido nucléico de acordo com apresente invenção, e o rótulo. O Iigante pode ser formado por Iiganteshidrofílicos de versados na técnica ou por nucleotídeos de D-DNA,nucleotídeos de D-DNA modificados, nucleotídeos de D-RNA, nucleotídeosde D-RNA modificados, nucleotídeos de D-LNA, nucleotídeos de PNA,nucleotídeos de l-RNA, nucleotídeos de l-DNA, nucleotídeos de l-RNAmodificados, nucleotídeos de l-DNA modificados e/ou nucleotídeos de l-LNA.
A detecção do ácido nucléico de acordo com a presenteinvenção pode ser realizada como se segue: O ácido nucléico de acordocom a presente invenção hibridiza, com uma de suas extremidades, com asonda de captura e, com a outra extremidade, com a sonda de detecção.Depois, a sonda de detecção não-ligada é removida, por exemplo, atravésde uma ou diversas etapas de lavagem. A quantidade de sonda de detecçãoligada que preferivelmente carrega um rótulo ou molécula de marcador podeser medida subseqüentemente.
Conforme preferivelmente usado neste documento, o termotratamento compreende, em uma modalidade preferida, adicional oualternativamente, a prevenção e/ou o acompanhamento.
Conforme preferivelmente usados aqui, os termos doença edistúrbio serão usados em um modo intercambiável, se não indicado aocontrário.
Conforme usado aqui, o termo compreender é preferivelmentenão pretendido para limitar o assunto seguido ou descrito por tal termo.Entretanto, em uma modalidade alternativa, o termo compreender seráentendido no significado de conter e, desse modo, como limitando o assuntoseguido ou descrito por tal termo.
As diversas SEQ.ID. Nos, a natureza química das moléculas deácidos nucléicos de acordo com a presente invenção e das moléculas-alvoMCP-1 como usadas neste documento, a sua seqüência real e o número dereferência interna são resumidos na tabela a seguir.
<table>table see original document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table>Seq.-ID VPeptídeo Seqüência teferência Interna AGCCGGCAGCAC 50 L-RNA GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAACGACUGGCUA GAGCCGGCAGCAC 178-A651 L-RNA GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACAGGCUA GAGCCGGCAGCAC 178-D652 L-RNA GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUA GAGCCGGCAGCAC 178-D553 L-RNA GUGCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUA GAGCCGGCAGCAC 181-A254 L-RNA GGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAG AGCCGGCAGCC 178-D5-02055 L-RNA GGCGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGA GCCGGCGCC 178-D5-02756 L-RNA GUGCGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAG AGCCGGCGCAC 178-D5-03057 L-RNA GUGCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAG AGCCGGCGCAC 181-A2-00258 L-RNA GUGCCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGA GCCGGGCAC 181-A2-00459 L-RNA GUGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGA GCCGGCCAC 181-A2-00560 L-RNA GUCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGA GCCGGCGAC 181-A2-00661 L-RNA UGCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGA GCCGGCGCA 181-A2-00762 L-RNA GCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGA GCCGGCAGC 181-A2-00863 L-RNA GCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGA GCCGGCAGC 181-A2-01164 L-RNA GGUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGA GCCGGCACC 181-A2-012<table>table see original document page 69</column></row><table>Seq.-ID VPeptideo Seqüência Referência Interna81 L-RNA GCGCGAGCAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGACUCG CGUC 166-A4-00282 L-RNA CGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACACG 187-A5trc-00183 L-RNA GUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACAC 187-A5trc-00284 L-RNA CGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCACG 187-H5trc-00285 L-RNA GUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCAC 187-H5trc-00386 L-RNA UGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCA 187-H5trc-00487 L-RNA GGACGAGAGUGACAAAUGAUAUAACCUCCUGACUAA CGCUGCGGGCGACAGG 177-B388 L-RNA GGACCUAUCGCUAAGACAACGCGCAGUCUACGGGA CAUUCUCCGCGGACAGG 177-C189 L-RNA GGACAAUUGUUACCCCCGAGAGAGACAAAUGAGACA ACCUCCUGAAGACAGG 177-C290 L-RNA GGACGAAAGUGAGAAAUGAUACAACCUCCUGUUGCU GCGAAUCCGGACAGG 177-E391 L-RNA GGACGUAAAAGACGCUACCCGAAAGAAUGUCAGGAG GGUAGACCGACAGG 177-D192 L-RNA GGACUAGAAACUACAAUAGCGGCCAGUUGCACCGC GUUAUCAACGACAGG 177-E193 L-RNA GGACUAGUCAGCCAGUGUGUAUAUCGGACGCGGGU UUAUUUACUGACAGG 177-A194 L-RNA GGACUGUCCGGAGUGUGAAACUCCCCGAGACCGCC AGAAGCGGGGACAGG 177-G395 L-RNA GGACUUCUAUCCAGGUGGGUGGUAGUAUGUAAAGA GAUÂGAAGUGACAGG 177-C396 L-RNA GGACGAGAGCGAACAAUGAUAUAACCUCCUGACGGA AAGAGAUCGACAGG 177-A297 L-RNA CCUGUGCUACACGCAGUAAGAAGUGAACGUUCAGU AUGUGUGCACAGG 170-E4trc98 L-RNA CGUGAGCCAGGCACCGAGGGCGUUAACUGGCUGAU UGGACACGACACG 166-D2trcSeq.-ID VPeptideo Seqüência Referência Interna99 L-RNA CGUGAACAUGCAAGCUAAGCGGGGCUGUUGGUUGC UUGGCCCGCCACG 174-A2trc100 L-RNA CGUGCAGAGAGAGACCAACCACGUAAAAUCAACCUA AUGGGCCGCACG 174-E2trc101 L-RNA CGUGCAGAGAGAGACCAACCACGUAAAAUCAACCUA AUGGGCCGCACG 183-G3trc102 L-RNA CGUGAACAUUCAAGCUAAGCGGGGCUGUUGGUUGC UUGGCCCGCCACG 183-B2trc103 L-RNA CGUGCCGAGGCGGCGACCAGCGUUACUUAGAGAGG CUUUGGCACCACG 166-B2trc104 L-RNA CGUGAUAACAGCCGUCGGUCMGAAAACAAAGUUCG GGCGGCGCACG 166-G3trc105 L-RNA CGUGGGUGGCGCACCGAGGGCGAAAAGCCACCAGU AAAGAUAGACCG 166-D1trc106 L-RNA CGUGUGAUCUCCUUUGGGGUGAUUAGCUUAGAGAC UUCCCACACG 183-H2trc107 L-RNA GCACCUUCGCCUAAUACACGUGCCGGCUAGCUAAU ACUCGUCCGC 167-A7trc108 L-RNA GCACGACUUGGGCGACCAGUGAUACUUAGAGAGCA AGUCGUCGGC 167-C7trc109 L-RNA GCGCGCGCUCAGUAAGAAAUUGAAAGUUCAGAAUG UCGUCGCGC 167-B5trc110 L-RNA AGUGUGUGGCAGGCUAAGGAGAUAUUCCGAGACCA CGCU 184-D7trc111 L-RNA AGUGUGUGGCAGACUAUGGAUAGACUCCGAGACCA CGCU 184-D6trc112 L-RNA AGCGUGAGGCGACCAGCGGAUUACUUAGAGAGUCA CGCU 184-E5trc113 L-RNA AGCGUGAAGGGGACCAGCGUUACUUACAGAGUUCA CGCU 184-G6trc114 L-RNA AGCGUGUGAUGUAUGUAGCACCGUAUCAGAGGACA 184-B7trc<table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table>Seq.-ID VPeptideo Seqüência Referência Interna159 D-RNA GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCU CUGCG 180-D1-036, (D- )NOX-E36160 D-RNA GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUAAUGACAGCCG AAUGCUGGCAGCAC -A8161 D-RNA GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUAAUGACAGCCU AAUGCUGGCAGCAC -F7162 D-RNA GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUUAUGACAGCCG AAUGCUGGCAGCAC -G7163 D-RNA GUGCUGCGUAGUGAAAAACUACUGCCAGUGGGUCA GAGCUAGCAGCAC -C6164 D-RNA GUGCUGCGGAGUUAAAAACUCCCUAAGACAGGCCA GAGCCGGCAGCAC -E7165 D-RNA GUGCUGCGGAGUUGAAAACUCCCUAAGACAGGCCA GAGCCGGCAGCAC -G6166 D-RNA GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUAUGACAGCCUA AUGCUGGCAGCAC -A7167 D-RNA GUGCUGCGGAGUUAAAAACUCCCUAAGACAGGCUA GAGCCGGCAGCAC -C7168 D-RNA GUGCUGCGGCGUGAAAAACGCCCUGCGACUGCCCU UUAUGCAGGCAGCAC -E5169 D-RNA GUGCUGCGUAGUGAAAAACUACCAACGACUGGCUA GAGCCGGCAGCAC -F1170 D-RNA GUGCUGCGUAGUGAAAGACUACCUGUGACAGCCGA AUGCUGGCAGCAC -B2171 D-RNA GUACUGCGUAGUUAAAAACUACCAACGACUGGCUAG AGCCGGCAGCAC -C2172 D-RNA GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAACGACUGGCUA GAGCCGGCAGCAC -A6173 D-RNA GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACAGGCUA GAGCCGGCAGCAC -D6174 D-RNA GUGCUGCGUAGUUAAAAACÜACCAGCGACUGGCUA 178-D5Seq.-ID VPeptídeo Seqüência Referência Interna GAGCCGGCAGCAC 175 D-RNA GUGCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUA GAGCCGGCAGCAC 181-A2176 D-RNA GGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAG AGCCGGCAGCC 178-D5-020177 D-RNA GGCGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGA GCCGGCGCC 178-D5-027178 D-RNA GUGCGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAG AGCCGGCGCAC 178-D5-030179 D-RNA GUGCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAG AGCCGGCGCAC 181-A2-002180 D-RNA GUGCCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGA GCCGGGCAC 181-A2-004181 D-RNA GUGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGA GCCGGCCAC 181-A2-005182 D-RNA GUCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGA GCCGGCGAC 181-A2-006183 D-RNA UGCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGA GCCGGCGCA 181-A2-007184 D-RNA GCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGA GCCGGCAGC 181-A2-008185 D-RNA GCÜGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGA GCCGGCAGC 181-A2-011186 D-RNA GGUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGA GCCGGCACC 181-A2-012187 D-RNA UGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAG CCGGCCA 181-A2-015188 D-RNA GCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAG CCGGCGC 181-A2-016189 D-RNA GUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAG CCGGCAC 181-A2-017Seq.-ID VPeptídeo Seqüência Referência Interna190 D-RNA GGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAG CCGGCCC 181-A2-018191 D-RNA GAGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAG CCGGCUC 181-A2-019192 D-RNA CGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAG CCGGCCG 181-A2-020193 D-RNA CCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAG CCGGCGG -A2-021194 D-RNA CAGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAG CCGGCUG -A2-022195 D-RNA CUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAG CCGGCAG -A2-023196 D-RNA AGCGUGUUAGUGAAGUGGGUGGCAGGUAAAGGACA CGCU -B8trc197 D-RNA AGCGUGGUAGCGGUGUGGGUGGUAGGUAAAGGCC ACGCU -C6trc198 D-RNA AGCGUGAUAGAAGAGCGGGUGGUAGGUAAAGGUCA GGCU -H5trc199 D-RNA AGCGUGUUAGGUAGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACA CGCU -A7trc200 D-RNA AGCGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACAC GCU -A5trc201 D-RNA AGCGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCAC GCU -H5trc202 D-RNA CCGCUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGGCGG -D4-004203 D-RNA GCGCGAGCAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGACUCG CGUC -A4-002204 D-RNA CGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACACG -A5trc-001205 D-RNA GUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACAC -A5trc-002206 D-RNA CGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCACG -H5trc-002207 D-RNA GUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCAC -H5trc-003Seq.-ID k/Peptídeo Seqüência Referência Interna208 D-RNA UGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCA -H5trc-004209 D-RNA GGACGAGAGUGAÇAAAUGAUAUAACCUCCUGACUAA CGCUGCGGGCGACAGG -B3210 D-RNA GGACCUAUCGCUAAGACAACGCGCAGUCUACGGGA CAUUCUCCGCGGACAGG -C1211 D-RNA GGACAAUUGUUACCCCCGAGAGAGACAAAUGAGACA ACCUCCUGAAGACAGG -C2212 D-RNA GGACGAAAGUGAGAAAUGAUACAACCUCCUGUUGCU GCGAAUCCGGACAGG -E3213 D-RNA GGACGUAAAAGACGCUACCCGAAAGAAUGUCAGGAG GGUAGACCGACAGG 177-D1214 D-RNA GGACUAGAAACUACAAUAGCGGCCAGU UGCACCGC GUUAUCAACGACAGG 177-E1215 D-RNA GGACUAGUCAGCCAGUGUGUAUAUCGGACGCGGGU UUAUUUACUGACAGG 177-A1216 D-RNA GGACUGUCCGGAGUGUGAAACUCCCCGAGACCGCC AGAAGCGGGGACAGG 177-G3217 D-RNA GGACUUCUAUCCAGGUGGGUGGUAGUAUGUAAAGA GAUAGAAGUGACAGG 177-C3218 D-RNA GGACGAGAGCGAACAAUGAUAUAACCUCCUGACGGA AAGAGAUCGACAGG 177-A2219 D-RNA CCÜGUGCUACACGCAGUAAGAAGUGAACGUUCAGU AUGUGUGCACAGG 170-E4trc220 D-RNA CGUGAGCCAGGCACCGAGGGCGUUAACUGGCUGAU UGGACACGACACG 166-D2trc221 D-RNA CGUGAACAUGCAAGCUAAGCGGGGCUGUUGGUUGC U U GGCCCGCCACG 174-A2trc222 D-RNA CGUGCAGAGAGAGACCAACCACGUAAAAUCAACCUA AUGGGCCGCACG 174-E2trc223 D-RNA CGUGCAGAGAGAGACCAACCACGUAAAAUCAACCUA AUGGGCCGCACG 183-G3trc<table>table see original document page 79</column></row><table>Seq.-ID VPeptídeo Seqüência Referência Interna239 D-RNA GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCU CUGCG-3'PEG <-E36-3'PEG240 D-RNA GAGAUGGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCC CUUUGAUGAAUCCGCGGCCAUUC -A3-001241 D-RNA GAUGGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCU UUGAUGAAUCCGCGGCCAUUC -A3-004242 D-RNA GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUU GAUGAAUCCGCGGCCAUUC -A3-005243 D-RNA GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUU GAUGAAUCCGCGGCCAUU -A3-006244 D-RNA GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUU GAUGAAUCCGCGGCCA 188-A3-007 = (D-) mNOX-E36245 D-RNA GCUGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGU UGGUUGUCACCAGC -G7-001246 D-RNA CUGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUU GGUUGUCACCAG -G7-002247 D-RNA UGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUG GUUGUCACCA -G7-003248 D-RNA GCCGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGU UGGUUGUCACCGGC -G7-007249 D-RNA GCCGGCUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGU UGGUUGUCGCCGGC -G7-008250 D-RNA GCGCGUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUU GGUUGUCCGCGC -G7-010251 D-RNA GGGCCUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUU GGUUGUCGGCCC -G7-012252 L-Proteína QPDAVNAPLTCCYSFTGKMIPMSRLENYKRITSSRCPKE AWFVTKLKREICADPNKEWVQKYIRKLDQNQVRSET 3-1 de rato253 L-RNA 5'PEG- GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUU GAUGAAUCCGCGG(XA mNOX-E36- 5'PEGSeq.-ID VPeptideo Seqüência Referência Interna254 L-RNA GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUU GAUGAAUCCGCGGCCA-3'PEG mNOX-E36- 3'PEG255 L-DNA 5'-GAGGGACGTGC-(Espaçador18)2-NH4+ -3' NOX-E36 Sonda de captura256 L-DNA 5'- Biotina-(Espaçador18)2-CGCAGAGCC NOX-E36 Sonda de detecção (-íon)257 L-Proteina KSMQVPFSRCCFSFAEQEIPLRAILCYRNTSSICSNEGLI FKLKRGKEACALDTVGWVQRHRKMLRHCPSKRK CCL1/1-309258 L-Proteina SLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPGVI FLTKRSRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA CCL3/MIP-1a259 L-Proteina APMGSDPPTACCFSYTARKLPRNFWDYYETSSLCSQP AWFQTKRSKQVCADPSESWVQEYVYDLELN CCL4/MIP-13260 L-Proteina SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAV VFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS CCL5/RANTES261 L-Proteina FNPQGLAQPDALNVPSTCCFTFSSKKISLQRLKSYVITTS RCPQKAVIFRTKLGKEICADPKEKWVQNYMKHLGRKAH TLKT CCL13/MCP-4262 L-Proteina TKTESSSRGPYHPSECCFTYTTYKIPRQRIMDYYETNSQ CSKPGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKEN CCL14/HCC-1263 L-Proteina ASVATELRCQCLQTLQGIHPKNIQSVNVKSPGPHCAQTE VIATLKNGRKACLNPASPIVKKIIEKMLNSDKSN CXCL1/GROa264 L-Proteina APLATELRCQCLQTLQGIHLKNIQSVKVKSPGPHCAQTE VIATLKNGQKACLNPASPMVKKIIEKMLKNGKSN CXCL2/GROp265 L-Proteina ASWTELRCQCLQTLQGIHLKNIQSVNVRSPGPHCAQTE VIATLKNGKKACLNPASPMVQKIIEKILNKGSTN CXCL3/GROY266 L-Proteína EAEEDGDLQCLCVKTTSQVRPRHITSLEVIKAGPHCPTA QLIATLKNGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES CXCL4/PF4267 L-Proteina GPAAA VLRELRCVCLQTTQGVHPKMISNLQVFAIGPQCS KVEWASLKNGKEICLDPEAPFLKKVIQKILDGGNKEN :L5/ENA-78268 L-Proteína GPVSAVLTELRCTCLRVTLRVNPKTIGKLQVFPAGPQCS KVEWASLKNGKQVCLDPEAPFLKKVIQKILDSGNKKN DL6/GCP-2<table>table see original document page 82</column></row><table>Seq.-ID VPeptideo Seqüência Referência Interna283 L- proteína QPDAINSPVTCCYTFTGKKISSQRLGSYKRVTSSKCPKE AVIFKTILAKEICADPEQKWVQDAVKQLDKKAQTPKP de cavalo (Equus caballus)284 L- proteína QPDAINSQVACCYTFNSKKISMQRLMNYRRVTSSKCPK EAVIFKTILGKELCADPKQKWVQDSINYLNKKNQTPKP bovina (Bos Taurus)285 L- proteína QPDAVNAPLTCCYSFTGKMIPMSRLENYKRITSS RCPKE AWFVTKLKREICADPNKEWVQKYIRKLDQNQVRSETTV FYKIASTLRTSAPLNVNLTHKSEANASTLFSTTTSSTSVE VTS MTEN =M de rato (Rattus norvegicus)
A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelas figuras,pelos exemplos e pela listagem de seqüências a partir dos quais podem serconsideradas características, modalidades e vantagens adicionais, onde
A Figura 1 mostra um alinhamento de seqüências de Iigantesde RNA relacionados que se ligam à MCP-1 humana, indicando o motivo deseqüência ("Tipo 1A") que é, em uma modalidade preferida, em suatotalidade, essencial para a ligação à MCP-1 humana;
A Figura 2 mostra um alinhamento de seqüências de Iigantesde RNA relacionados que se ligam à MCP-1 humana, indicando o motivo deseqüência ("Tipo 1B") que é, em uma modalidade preferida, em suatotalidade, essencial para a ligação à MCP-1 humana, e os derivados deligantes de RNA 180-D1-002;
A Figura 3 mostra um alinhamento de seqüências de ligantesde RNA relacionados que se ligam à MCP-1 humana, indicando o motivo deseqüência ("Tipo 2") que é, em uma modalidade preferida, em sua totalidade,essencial para a ligação à MCP-1 humana;
A Figura 4 mostra um alinhamento de seqüências de ligantesde RNA relacionados que se ligam à MCP-1 humana, indicando o motivo deseqüência ("Tipo 3") que é, em uma modalidade preferida, em sua totalidade,essencial para a ligação à MCP-1 humana;
A Figura 5 mostra os derivados de ligantes de RNA 178-D5 e181-A2 (ligantes de RNA da MCP-1 humana de motivo de seqüência "Tipo3");A Figura 6 mostra um alinhamento de seqüências de Iigantesde RNA relacionados que se ligam à MCP-1 humana, indicando o motivo deseqüência ("Tipo 4") que é, em uma modalidade preferida, em sua totalidade,essencial para à ligação à MCP-1 humana (outras seqüências);
A Figura 7 mostra uma tabela de seqüências de diversosligantes de RNA diferentes que se ligam à MCP-1 humana que não podemestar relacionados aos motivos de seqüências de ligação à MCP-1 "Tipo 1A","Tipo 1B", "Tipo 2", "Tipo 3" ou "Tipo 4";
A Figura 8 mostra os alinhamentos dos derivados do Iigantede RNA 188-A3-001 e do 189-G7-001 que se ligam à MCP-1 de murino;
A Figura 9 mostra o resultado de uma análise da ligação doaptâmero D-NOX-E36 à d-MCP-1 humana biotinilada, na temperaturaambiente e a 37°C, representada como a ligação do aptâmero pelaconcentração de d-MCP-1 humana biotinilada;
A Figura 10 mostra o resultado de uma análise da ligação doaptâmero d-mNOX-E36 à d-MCP-1 de murino biotinilada, a 37°C,representada como a ligação do aptâmero pela concentração de d-MCP-1 demurino biotinilada;
A Figura 11 mostra a liberação de Ca"1"1" induzida pela MCP-1em células THP-1, enquanto que a curva de resposta à dose para a MCP-1humana era obtida, indicando uma concentração semi-efetiva (EC50) deaproximadamente 3 nM, representada como a diferença na fluorescênciapara o branco pela concentração de MCP-1 humana;
A Figura 12 mostra a eficácia do "spiegelmero" NOX-E36 emum ensaio de liberação de cálcio; as células foram estimuladas com 3 nM deMCP-1 humana, pré-incubada a 37°C com diversas quantidades do"spiegelmero" NOX-E36, representada como a porcentagem do controle pelaconcentração de NOX-E36;
A Figura 13 mostra a eficácia do "spiegelmero" mNOX-E36 emum ensaio de liberação de cálcio; as células foram estimuladas com 5 nM deMCP-1 de murino, pré-incubada a 37°C com diversas quantidades do"spiegelmero" mNOX-E36, representada como a porcentagem do controlepela concentração de mNOX-E36;
A Figura 14 mostra a quimiotaxia induzida pela MCP-1humana das células THP-1, enquanto que, após 3 horas de migração dascélulas THP-1 para diversas concentrações de MCP-1, obteve-se uma curvade resposta à dose para a MCP-1, representada como o aumento de Xvezes comparado ao controle pela concentração de MCP-1 humana;
A Figura 15 mostra a eficácia do "spiegelmero" NOX-E36 emum ensaio de quimiotaxia; as células foram deixadas migrar para 0,5 nM deMCP-1 humana, pré-incubada a 37°C com diversas quantidades do"spiegelmero" NOX-E36, representada como a porcentagem do controle pelaconcentração do "spiegelmero" NOX-E36;
A Figura 16 mostra a eficácia do "spiegelmero" mNOX-E36 emum ensaio de quimiotaxia; as células foram deixadas migrar para 0,5 nM deMCP-1 de murino, pré-incubada a 37°C com diversas quantidades do"spiegelmero" NOX-E36, representada como a porcentagem do controle pelaconcentração do "spiegelmero" mNOX-E36;
A Figura 17 mostra o sensorgrama Biacore 2000 indicando ovalor de Kd do "spiegelmero" NOX-E36 que se liga à MCP-1 humana, a qualfoi imobilizada sobre um chip de sensor PioneerFI por procedimento deacoplamento de amina, representada como a resposta (RU) pelo tempo;
A Figura 18 mostra o sensorgrama Biacore 2000 indicando aligação do "spiegelmero" NOX-E36 às proteínas da família de MCP humana(huMCP-1, huMCP-2, huMCP-3) e à eotaxina humana, que foramimobilizadas por procedimento de acoplamento de amina sobre um chip desensor PioneerFI e um CM4, respectivamente, representada como aresposta (RU) pelo tempo;
A Figura 19 mostra o sensorgrama Biacore 2000 indicando aligação do "spiegelmero" NOX-E36 à MCP-1 de diferentes espécies (MCP-1canina, MCP-1 de macaco, MCP-1 humana, MCP-1 de porco, MCP-1 decoelho, MCP-1 de camundongo, MCP-1 de rato), considerando que asdiferentes formas da MCP-1 foram imobilizadas por procedimento deacoplamento de amina sobre os chips de sensor PioneerFI e CM4,respectivamente, representada como a resposta (RU) pelo tempo;
A Figura 20 mostra o sensorgrama Biacore 2000 indicando ovalor de K0 do "spiegelmero" 181-A2-018 que se liga à MCP-1 humana, aqual foi imobilizada sobre um chip de sensor CM4 por procedimento deacoplamento de amina, representada como a resposta (RU) pelo tempo;
A Figura 21 mostra o sensorgrama Biacore 2000 indicando aligação do "spiegelmero" 181-A2-018 às proteínas da família de MCPhumana (huMCP-1, huMCP-2, huMCP-3) e à eotaxina humana, que foramimobilizadas por procedimento de acoplamento de amina sobre um chip desensor PioneerFI e um CM4, respectivamente, representada como aresposta (RU) pelo tempo;
A Figura 22 mostra o sensorgrama Biacore 2000 indicando aligação do "spiegelmero" 181-A2-018 à MCP-1 de diferentes espécies (MCP-1 canina, MCP-1 de macaco, MCP-1 humana, MCP-1 de porco, MCP-1 decoelho, MCP-1 de camundongo, MCP-1 de rato), considerando que asdiferentes formas da MCP-1 foram imobilizadas por procedimento deacoplamento de amina sobre os chips de sensor PioneerFI e CM4,respectivamente, representada como a resposta (RU) pelo tempo;
A Figura 23 mostra um alinhamento Clustal W da MCP-1 apartir de diferentes espécies de mamíferos, bem como da MCP-2 humana,da MCP-3, e da eotaxina (Posições 1-76 somente);
A Figura 24A mostra uma tabela resumindo a especificidade deligação de NOX-E36e 181-A2-018 com relação à MCP-1 de diferentesespécies de mamíferos, bem como MCP-2 humana, MCP-3, e eotaxina;
A Figura 24B mostra uma tabela resumindo a seletividade deNOX-E36, como determinada por análise de Biacore, pelo que o NOX-E36biotinilado foi imobilizado sobre uma superfície do chip de sensor e a ligaçãode um painel de diversas quimiocinas CC e CXC ao NOX-E36 foi analisada;
A Figura 24C mostra a análise cinética de NOX-E36 interagindocom as quimiocinas, como determinada por análise de Biacore, pelo que asquimiocinas foram imobilizadas covalentemente sobre uma superfície dochip de sensor CM5 e diversas concentrações do NOX-E36 foram injetadase o comportamento de ligação do NOX-E36 foi analisado usando o softwareBiaEvaIuation;
A Figura 24D mostra a curva de resposta à dose da quimiotaxiado estímulo das células THP-1 com a MIP-Ia com uma concentração semi-efetiva de cerca de 0,2 nM;
A Figura 24E mostra a Inibição da quimiotaxia induzida pelaMIP-Ia pelo NOX-E36. O NOX-E36 não teve nenhuma influência sobre aquimiotaxia induzida pela MIP1 a das células THP-1;
A Figura 25 mostra a eficácia do "spiegelmero" NOX-E36-31-PEG em um ensaio de liberação de cálcio; as células foram estimuladas com3 nM de MCP-1 humana, pré-incubada a 37°C com diversas quantidades de"spiegelmero" NOX-E36-3'-PEG, representada como a porcentagem docontrole pela concentração do "spiegelmero" NOX-E36-3'-PEG;
A Figura 26 mostra a eficácia do "spiegelmero" NOX-E36-31-PEG em um ensaio de quimiotaxia; as células foram deixadas migrar para0,5 nM de MCP-1 humana, pré-incubada a 37°C com diversas quantidadesdo "spiegelmero" N0X-E36-3'-PEG, representada como a porcentagem docontrole pela concentração de NOX-E36-3'-PEG;
A Figura 27A mostra a eficácia do "spiegelmero" NOX-E36-5'-PEG em um ensaio de liberação de cálcio; as células foram estimuladas com3 nM de MCP-1 humana, pré-incubada a 37°C com diversas quantidades de"spiegelmero" NOX-E36-5'-PEG, representada como a porcentagem docontrole pela concentração do "spiegelmero" NOX-E36-5'-PEG;
A Figura 27B mostra a eficácia do "spiegelmero" NOX-E36-5'-PEG em um ensaio de quimiotaxia; as células foram deixadas migrar para0,5 nM de MCP-1 humana, pré-incubada a 37°C com diversas quantidadesdo "spiegelmero" NOX-E36-5'-PEG, representada como a porcentagem docontrole pela concentração do "spiegelmero" NOX-E36-5'-PEG;
A Figura 28 mostra a liberação de Ca+* induzida pela MCP-1de murino em células THP-1, enquanto que uma curva de resposta à dosepara a MCP-1 de murino era obtida, indicando uma concentração semi-efetiva (EC50) de aproximadamente 5 nM, representada como a diferença nafluorescência para o branco pela concentração de MCP-1 de murino;
A Figura 29 mostra a eficácia do "spiegelmero" anti-MCP-1 demurino mNOX-E36-3'-PEG em um ensaio de liberação de cálcio; as célulasforam estimuladas com 3 nM de MCP-1 de murino, pré-incubada a 37°C comdiversas quantidades do "spiegelmero" mNOX-E36-3'-PEG, representadacomo a porcentagem do controle pela concentração do "spiegelmero"mNOX-E36-3'-PEG;
A Figura 30 mostra a quimiotaxia induzida pela MCP-1 demurino das células THP-1, enquanto que, após 3 horas de migração dascélulas THP-1 para diversas concentrações de mMCP-1, obteve-se umacurva de resposta à dose para a mMCP-1, representada como o aumento deX vezes comparado ao controle pela concentração de MCP-1 de murino;
A Figura 31 mostra a eficácia do "spiegelmero" anti-MCP-1 demurino mNOX-E36-3'-PEG em um ensaio de quimiotaxia; as células foramdeixadas migrar para 0,5 nM de MCP-1 de murino, pré-incubada a 37°C comdiversas quantidades do "spiegelmero" mNOX-E36-3'-PEG, representadacomo a porcentagem do controle pela concentração do "spiegelmero"antimurino mNOX-E36-3'-PEG;
A Figura 32 mostra o sensorgrama Biacore 2000 indicando ovalor de K0 do aptâmero d-mNOX-E36 que se liga à d-MCP-1 de murino, aqual foi imobilizada sobre um chip de sensor PioneerFI por procedimento deacoplamento de amina, representada como a resposta (RU) pelo tempo;
A Figura 33 mostra o sensorgrama Biacore 2000 indicando aligação do aptâmero d-mNOX-E36 à d-MCP-1 humana e à d-MCP-1 demurino, considerando que as duas formas diferentes de d-MCP-1 foramimobilizadas por procedimento de acoplamento de amina sobre os chips desensor PioneerFI e CM4, respectivamente, representada como a resposta(RU) pelo tempo;
A Figura 34 mostra as seções renais de camundongosMRLlpr/lpr de 24 semanas de idade, coloridas com ácido periódico Schiff(PAS), anticorpos para Mac-2 (macrófagos) e CD3 (células T), conformeindicado; as imagens são representativas para 7-12 camundongos em cadagrupo (ampliação do original PAS: χ 100, insertos de PAS: χ 400, Mac2: χ400, CD3: χ 100);
A Figura 35 mostra uma tabela ilustrando os parâmetros defunção renal e as verificações histológicas nos diferentes grupos decamundongos MRLlpr/lpr de 24 semanas de idade;
A Figura 36 mostra a quantificação das alterações histológicaspor morfometria efetuada sobre seções coloridas com prata decamundongos de todos os grupos; A, o índice de volume intersticial; Β, oíndice de dilatação tubular, e C, o índice de dano de célula tubular foramcalculados comó a porcentagem de campo de alta energia e são expressoscomo a média ± SEM;
A Figura 37 mostra a sobrevivência dos camundongosMRLlpr7lpr dós diversos grupos de tratamento como calculada por análise deKaplan-Meier;
A Figura 38 mostra a expressão de mRNA renal para asquimiocinas CC CCL2 e CCL5, como determinada por RT-PCR em temporeal, usando RNA renal total reunido de 5 camundongos de cada grupo, como que os níveis de RNA para cada grupo de camundongos são expressospor expressão de rRNA de 18S respectiva;
A Figura 39 mostra a redução da patologia do pulmão portratamento com mNOX-E36-3'PEG; o tecido do pulmão foi preparado a partirde todos os grupos em 24 semanas de idade e classificado de modosemiquantitativo; o tratamento com mNOX-E36 e mNOX-E36-3'PEG reduziua inflamação peribronquiolar nos camundongos MRLlpr/lpr; as imagens sãorepresentativas para 7-11 camundongos em cada grupo; ampliação dooriginal χ 100;
A Figura 40 mostra as manifestações de lúpus cutâneo doscamundongos MRLlpr/lpr em 24 semanas de idade, as quais tipicamenteocorreram na área facial ou do pescoço (camundongo da esquerda), asquais foram menos comuns nos camundongos tratados com "spiegelmero"anti-mCCL2 (camundongo da direita);
A Figura 41 mostra as verificações no soro e histológicas emcamundongos MRLlpr7lpr em 24 semanas de idade;
A Figura 42 mostra a farmacocinética dos "spiegelmeros" anti-mCCL2 peguilados e não-peguilados no plasma, durante o estudo, indicadacomo a concentração do "spiegelmero" mNOX-E36 no plasma como umafunção do tempo;
A Figura 43 mostra a citometria de fluxo para o CCR2 namedula óssea e no sangue periférico em camundongos MRLlpr/lpr de 24semanas de idade, tratados com veículo ou com mNOX-E36-3'PEG; osdados são mostrados como a porcentagem média de células positivas paraCCR2 ± SEM, na medula óssea ou no sangue periférico, em 5 camundongosde cada grupo;
A Figura 44 mostra os níveis de CCL2 no soro emcamundongos 1K db/db tratados com PoC-PEG (barras brancas) e commNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-P) (barras pretas), como determinados porELISA em diferentes pontos de tempo, conforme indicados; os dados são amédia ± SEM; *, ρ < 0,05 mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-P) vs. PoC-PEG;
A Figura 45 mostra o número infiltrado de células positivas paraMac-2 e Ki-67 nos glomérulos e no interstício de camundongos db/db nãotratados ou tratados com POC-PEG ou preferivelmente mNOX-E36-3'PEG;
A Figura 46 mostra, a glomeruloesclerose diabética emcamundongos db/db de 6 meses; as seções renais dos camundongos dosdiferentes grupos foram coloridas com ácido periódico Schiff e 15 glomérulosde cada secção renal foram classificados quanto à proporção deglomeruloesclerose; as imagens mostram os glomérulos representativos,graduados para as classificações respectivas, conforme indicadas,ampliação do original 400 χ; o gráfico ilustra a porcentagem média de cadaclassificação ± SEM a partir de todos os camundongos em cada grupo (n = 7- 10); *, ρ < 0,05 para os camundongos 1K db/db tratados com mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-P) vs. PoC-PEG (PoC-P);
A Figura 47 mostra a taxa de filtração glomerular (GFR) noscamundongos 1K db/db de 6 meses de idade, tratados com mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-P) e com PoC-PEG (PoC-P); a GFR foi determinada porcinética de depuração de FITC-inulina nos grupos de camundongos 1Kdb/db tratados com PoC-PEG e mNOX-E36-3'PEG no final do estudo;
A Figura 48 mostra a atrofia tubular e o volume intersticial decamundongos db/db de 6 meses de idade; as imagens das seções renaiscoloridas com prata ilustram os rins representativos a partir dos respectivosgrupos (ampliação do original 100x); os valores representam a média ± SEMdo respectivo índice de análise morfométrica a partir de 7 -10 camundongosem cada grupo; *, ρ < 0,05 para os camundongos 2K db/db vs. BKS do tiposelvagem; #, ρ < 0,05 para os camundongos db/db 1K vs. 2K;1, ρ < 0,05 paraos camundongos 1K db/db tratados com mNOX-E36-3'PEG (mNOX-E36-PEG) vs. PoC-PEG;
A Figura 49 mostra a expressão do mRNA renal para CCL2de camundongos db/db, como determinada por RT-PCR em tempo realusando o RNA renal total reunido de 6 - 10 camundongos de cada grupo; osníveis de mRNA para cada grupo de camundongos são expressos porexpressão de rRNA de 18 S respectiva; e
A Figura 50 mostra a expressão de CCL2 em rins decamundongos db/db, como determinada por imunocoloração; as imagensilustram as seções representativas dos rins de camundongos de 6 meses deidade dos grupos respectivos, como indicados (ampliação do original, 200 x).
Exemplo 1 - Ácidos nucléicos que ligam a MCP-1 humana
Usando a d-MCP-1 humana biotinilada como um alvo, diversosácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 humana puderam ser gerados, cujasseqüências de nucleotídeos são representadas nas Figuras 1 até 7. Osácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmero, isto é, Ácidonucléico D usando ensaios de co-imunoprecipitação competitiva ou diretacom a d-MCP-1 humana biotinilada (Exemplo 4), ou no nível de"spiegelmero", isto é, l-ácido nucléico com a configuração natural da MCP-1(l-McP) por medição da ressonância plasmônica de superfície usando uminstrumento Biacore 2000 (Exemplo 7), um ensaio de liberação de Ca^emcultura de células in vitro (Exemplo 5), ou um ensaio de quimiotaxia in vitro(Exemplo 6).As moléculas de ácidos nucléicos assim geradas exibemdiferentes motivos de seqüências, quatro tipos principais são definidos nasFiguras 1 e 2 (Tipo 1A / 1B), na Figura 3 (Tipo 2), nas Figuras 4 e 5 (Tipo 3),e na Figura 6 (Tipo 4). Os ácidos nucléicos adicionais que se ligam à MÇP-1,os quais não podem estar relacionados um ao outro e aos motivos deseqüências diferentes descritos neste documento, são listados na Figura 7.Para a definição dos motivos de seqüências de nucleotídeos, usam-se asabreviações da IUPAC para os nucleotídeos ambíguos:
S forte G ou C;
W fraco A ou U;
R purina G ou A;
Y pirimidina C ou U; K ceto G ou U;
M imino A ou C;
B não A C ou U ou G;
D não C A ou G ou U;
H não G A ou C ou U;
V não U A ou C ou G;
N tudo A ou G ou C ou U
Se não indicado ao contrário, qualquer seqüência deaminoácidos ou seqüência de extensões e caixas, respectivamente, éindicada na direação 5' 3'.
Ácidos nucléicos que se iigam à MCP-1 do Tipo 1A (Figura 1)
Conforme representado na Figura 1, todas as seqüências deácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 1A compreendem diversasextensões ou caixas de seqüências, pelo que as caixas |B1A| e |B1B são asextensões 5' e 3' terminais que podem hibridizar uma com a outra.Entretanto, tal hibridização não é necessariamente dada na moléculaconforme realmente presente sob condições fisiológicas. As caixas B2, B3,B4, |B5| e a caixa B6 são flanqueadas pela caixa |B1A| e pela caixa |B1B
Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmerousando ensaios de co-imunoprecipitação direta e competitiva com a d-MCP-1humana biotinilada, para graduá-los com relação ao seu comportamento deligação (Exemplo 4). As seqüências selecionadas foram sintetizadas como"spiegelmero" (Exemplo 3) e foram testadas usando a configuração naturalda MCP-1 (L-McP) em um ensaio de liberação de Ca+* em cultura de célulasin vitro (Exemplo 5).
As seqüências das caixas definidas podem ser diferentes entreos ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 1A, o que influencia aafinidade de ligação à MCP-1. Com base na análise da ligação dosdiferentes ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1, resumidos como ácidosnucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 1A, as caixas [B1A|, B2. B3, B4,B5, B6 e B1B e as suas seqüências de nucleotídeos, como descritas no que
se segue, são individualmente, e mais preferivelmente, em sua totalidade,essenciais para a ligação à MCP-1:
as caixas
B1A e B1B são as extensões 5' e 3' terminais quepodem hibridizar uma com a outra; onde |B1A| é |AGCRUG|, preferivelmente
AGCGUG; e onde B1B é CRYGCU, preferivelmente |CACGCU
» caixa B2, a qual é CCCGGW. preferivelmente CCCGGU:►caixa B3, a qual é GUR, preferivelmente GUG\•caixa B4, a qual é RYA1 preferivelmente GUA;
caixa [B5j, a qual é IGGGGGRCGCGAYCj, preferivelmente
IGGGGGGCGCGACCl;
•caixa B6, a qual é UGCAAUAAUG ou URYAWUUG,
preferivelmente UACAUUUG;
Conforme representado na Figura 1, a molécula de ácidonucléico referida como 176-E10trc tem a melhor afinidade de ligação à MCP-1 (como aptâmero no ensaio de co-imunoprecipitação com uma Kd de 5 nMe também como "spiegelmero" com uma IC50 de 4 - 5 nM no ensaio deliberação de Ca+"4" em cultura de células in vitro) e, portanto, pode constituir aseqüência otimizada e a combinação otimizada de elementos da seqüênciaB1A, B2, B3, B4, B5,|B6elB1B
Ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 1B (Figura 2)
Conforme representado na Figura 2, todas as seqüências doTipo 1B compreendem diversas extensões ou caixas de seqüências, peloque as caixas [B1A| e [B1B| são as extensões 5' e 3' terminais que podemhibridizar uma com a outra, e as caixas B2, B3, B4, !$5 e a caixa B6 sãoflanqueadas pela caixa |B1 A| e pela caixa |B1B|. Entretanto, tal hibridizaçãonão é necessariamente dada na molécula conforme realmente presente sobcondições fisiológicas.
Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmerousando os ensaios de co-imunoprecipitação direta e competitiva com a d-MCP-1 humana biotinilada, para graduá-los com relação ao seucomportamento de ligação (Exemplo 4). As seqüências selecionadas foramsintetizadas como "spiegelmero" (Exemplo 3) e foram testadas usando aconfiguração natural da MCP-1 (l-McP) em um ensaio de liberação de Ca++em cultura de células in vitro (Exemplo 5).
As seqüências das caixas definidas podem ser diferentes entreos ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 1B, o que influencia aafinidade de ligação à MCP-1. Com base na análise da ligação dosdiferentes ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1, resumidos como ácidosnucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 1B, as caixas ]B1 Aj, B2. B3, B4,Β5,ι B6 e B1B e as suas seqüências de nucleotídeos, como descritas no quese segue, são individualmente, e mais preferivelmente, em sua totalidade,essenciais para a ligação à MCP-1:
• as caixas B1A e B1B que podem hibridizar uma com a outra;onde B1A é AGYRUG, preferivelmente AGCGUG; e onde B1B é CAYRCUpreferivelmente CACGCU;
•caixa B2, a qual é CCAGCU ou CCAGY. preferivelmenteCCAGU:
•caixa B3, a qual é GUG;
• caixa B4, a qual é AUG;
•caixa |B5j, a qual é |GGGGGGÇGCGACO;
•caixa B6, a qual é CAUUUUA ou CAUUUA, preferivelmenteCAUUUUA;
Conforme representado na Figura 2, o ácido nucléico referidocomo 176-C9trc tem a melhor afinidade de ligação à MCP-1 (como aptâmerono ensaio de co-imunoprecipitação com uma Kd de 5 nM e também como"spiegelmero" com uma IC50 de 4 - 5 nM no ensaio de liberação de Ca++ emcultura de células in vitro) e, portanto, pode constituir a seqüência otimizada
e a combinação otimizada de elementos da seqüência |B1A|, B2, B3, B4, B5,B6e B1B
Ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 2 (Figura 3)
Conforme representado na Figura 3, todas as seqüências doTipo 2 compreendem diversas extensões ou caixas de seqüências, pelo queas caixas |B1A| e |B1B| são as extensões 5' e 3' terminais que podem
hibridizar uma com a outra, e a caixa B2 é o elemento de seqüência central.Entretanto, tal hibridização não é necessariamente dada na moléculaconforme realmente presente sob condições fisiológicas.
Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmerousando os ensaios de co-imunoprecipitação direta e competitiva com a d-MCP-1 humana biotinilada, para graduá-los com relação ao seucomportamento de ligação (Exemplo 4). As seqüências selecionadas foramsintetizadas como "spiegelmero" (Exemplo 3) e foram testadas usando aconfiguração natural da MCP-1 (l-McP) nos ensaios de liberação de Ca++ emcultura de células in vitro (Exemplo 5) ou de quimiotaxía in vitro (Exemplo 6).
As seqüências das caixas definidas podem ser diferentes entreos ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 3, o que influencia aafinidade de ligação à MCP-1. Com base na análise da ligação dosdiferentes ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1, resumidos como ácidos
nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 2, as caixas |B1A|, B2. e |B1B| e assuas seqüências de nucleotídeos, como descritas no que se segue, sãoindividualmente, e mais preferivelmente, em sua totalidade, essenciais paraa ligação à MCP-1:
caixas [B1A| e |B1B|, extensões 5' e 3' terminais que podemhibridizar uma com a outra; onde |B1A| é |ACGCA| e |B1 Bpreferivelmente|CGCAl| e |B1B| é| IUGCG|,ou |B1A| e |GCA| e |B1B| e |UGCG| ou |UGC|• caixa B2, CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC.preferivelmente CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC
Conforme representado na Figura 3, o ácido nucléico referidocomo 180-D1-002, bem como os derivados de 180-D1-002, como o 180-D1-011, o 180-D1-012, o 180-D1-035, e o 180-D1-036 (= NOX-E36), têm amelhor afinidade de ligação à MCP-1 como aptâmero no ensaio de co-imunoprecipitação direta ou competitiva, com uma K0 de < 1 nM e, portanto,pode constituir a seqüência otimizada e a combinação otimizada doselementos da seqüência [B1A|, B2, e [B1B.
Para a molécula de ácido nucléico D-NOX-E36 (D-180-D1-036;SEQ.ID Ns: 159), uma constante de dissociação (K0) de 890 ± 65 pM, natemperatura ambiente (TA), e de 146 ± 13 pM, a 37°C, foi determinada(Exemplo 4; Figura 9). O "spiegelmero" respectivo NOX-E36 (180-D1-036;SEQ.ID N9: 37) exibiu uma concentração inibitória (IC5o) de 3 - 4 nM em umensaio de liberação de Ca++ in vitro (Exemplo 5; Figura 12) e de cerca de 0,5nM em um ensaio de quimiotaxia in vitro (Exemplo 6; Figura 15). Para osderivados PEGuiIados de NOX-E36, NOX-E36-3'PEG e NOX-E36-5'PEG, asIC50S de cerca de 3 nM foram determinadas no ensaio de liberação de Ca++(Exemplo 5, Figura 25 e Figura 27A) e < 1 nM no ensaio de quimiotaxia(Exemplo 6; Figura 26 e Figura 27B).
Ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 3 (Figuras 4+5)
Conforme representado nas Figuras 4 e 5, todas as seqüênciasdo Tipo 3 compreendem diversas extensões ou caixas de seqüências, peloque três pares de caixas são característicos para os ácidos nucléicos quese ligam à MCP-1 do Tipo 3. Ambas as caixas |B1A| e |B1B|, bem como ascaixas B2A e B2B. bem como as caixas B5A e B5B contêm a capacidade dehibridizar uma com a outra. Entretanto, tal hibridização não énecessariamente dada na molécula conforme realmente presente sobcondições fisiológicas. Os nucleotídos de não-hibridização estão localizadosentre estes elementos de seqüência potencialmente hibridizados, definidoscomo caixa B3, caixa B4 e caixa |B6j.
Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmerousando os ensaios de co-imunoprecipitação direta e competitiva com a d-MCP-1 humana biotinilada, para graduá-los com relação ao seucomportamento de ligação (Exemplo 4). As seqüências selecionadas foramsintetizadas como "spiegelmero" (Exemplo 3) e foram testadas usando aconfiguração natural da MCP-1 (l-McP) nos ensaios de quimiotaxia in vitro(Exemplo 6) ou via medições por Biacore (Exemplo 7).
As seqüências das caixas definidas podem ser diferentes entreos ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 3, o que influencia aafinidade de ligação à MCP-1. Com base na análise da ligação dosdiferentes ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1, resumidos como ácidosnucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 3, as caixas |B1A|, B2A, B3, B2B.B4, B5A, IB6I, B5B, |B1B| e as suas seqüências de nucleotídeos, comodescritas no que se segue, são individualmente, e mais preferivelmente, emsua totalidade, essenciais para a ligação à MCP-1:
caixas |B1A| e |B1B|, extensões 5' e 3' terminais que podemhibridizar uma com a outra; onde [B1A| é [GURCUGCl e [B1B| é |GCAGCAC|;
preferivelmente [B1 Aj é |GUGCUGC| e |B1B| é |GCAGCAC|;ou
B1A é GKSYGC e B1B é GCRSMC; preferivelmente B1A é GUGCGC
e
oué
B1B é GCGCAC;
B1A é KBBSC e B1B é GSVVM; preferivelmente |B1 A| é |KKSSC| e |B1 B
GSSMM
ou
B1A é BNGC e B1B é GCNV; preferivelmente B1A é ISNGCl e |B1B
GCNSI; mais preferivelmente |B1A| é lGGGC| e |B1B| é lGCCC|;
• caixas B2A e B2B. extensões que podem hibridizar uma com aoutra; onde B2A é GKMGU e B2B é ACKMC; preferivelmente B2A é GUAGUe B2B é ACUAC;
• caixa B3, a qual é KRRAR, preferivelmente UAAAA ouGAGAA11
• caixa B4, a qual é CURYGA ou CUWAUGA ou CWRMGACWou UGCCAGUG, preferivelmente CAGCGACU ou CAACGACU;
• B5A e B5B, extensões que podem hibridizar uma com a outra;onde B5A é GGY e B5B é GCYR, considerando que GCY pode hibridizarcom os nucleotídeos de B5A; ou B5A é CWGC e B5B é GCWG;preferivelmente B5A é GGC e B5B é GCCG;
•caixa §§, a qual é: IYAG^ ou iCKAAÜj ou fCCUÜUAp,preferivelmente lUAG/iJ.
Conforme representado nas Figuras 4 e 5, o ácido nucléicoreferido como 178-D5 e o seu derivado 178-D5-030, e também 181-A2 comos seus derivados 181-A2-002, 181-A2-004, 181-A2-005, 181-A2-006, 181-A2-007, 181-A2-017, 181-A2-018, 181-A2-019, 181-A2-020, 181-A2-021, e181-A2-023 têm a melhor afinidade de ligação à MCP-1. 178-D5 e 178-D5-030 foram avaliados como aptâmeros nos ensaios de co-imunoprecipitaçãodireta ou competitiva (Exemplo 4) com uma Kd de aproximadamente 500 pM.
Na mesma configuração experimental, 181-A2 foi determinado com uma Kdde aproximadamente 100 pM. Através de análise por Biacore (Exemplo 7), aKd de 181-A2 e de seus derivados para a MCP-1 foi determinada ser 200 -300 pM. Nos ensaios de liberação de Ca++ e de quimiotaxia com as culturasde células (Exemplos 5 e 6, respectivamente), para ambos 178-D5 e 181-A2,mediu-se uma IC50 de aproximadamente 500 pM. Portanto, 178-D5 etambém 181-A2 e os seus derivados podem constituir a seqüência otimizadae a combinação otimizada de elementos da seqüência |B1A|, B2A, B3, B2B.B4, B5A, B6i, B5B e |B1B
Ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 4 (Figura 6)
Conforme representado na Figura 6, todas as seqüências doTipo 4 compreendem diversas seqüências, extensões ou caixas, pelo que ascaixas [B1A| e |B1 B| são as extensões 5' e 3' terminais que podem hibridizaruma com a outra, e a caixa B2 é o elemento de seqüência central.
Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmerousando os ensaios de co-imunoprecipitação direta com a d-MCP-1 humanabiotinilada, para graduá-los com relação ao seu comportamento de ligação(Exemplo 4). As seqüências selecionadas foram sintetizadas como"spiegelmero" (Exemplo 3) e foram testadas usando a configuração naturalda MCP-1 (l-McP) em um ensaio de liberação de Ca"*"1" em cultura de célulasin vitro (Exemplo 5) e/ou ensaio de quimiotaxia (Exemplo 6).As seqüências das caixas definidas podem diferir entre osácidos nucléicos que se ligam à MGP-1 do Tipo 4, o que influencia aafinidade de ligação à MCP-1. Com base na análise da ligação dosdiferentes ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1, resumidos como ácidosnucléicos que se ligam à MCP-1 do Tipo 4, as caixas |B1A|, B2, e jB1B| e assuas seqüências de nucleotídeos, como descritas no que se segue, sãoindividualmente, e mais preferivelmente, em sua totalidade, essenciais paraa ligação à MCP-1:
• caixas [B1A| e [B1Bl, extensões 5' e 3' terminais que podemhibridizar uma com a outra; onde [B1 A| é lAGCGUGDÜ] e |B1 Bj éiGNCASGCUl; ou [bTÃI é lGCGCGAGl e IH é |CUCGCGU(j; ou ΙΒΪ^ é
CSKSUU e B1B é GRSMSG; ou B1A é GUGUU e B1B é GRCAC ; ou B1A
UGUU e |B1B| é [GGCAJ; preferivelmente [B1AJ é |CSKSUUl e |B1B| é
ouou
preferivelmente
GRSMSGl; mais preferido B1A é |CCGCUUl e |B1B| é |GGGCGG|; e
caixa B2, a qual é AGNDRDGBKGGURGYARGUAAAGAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGCAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGA.AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG
Conforme representado na Figura 6., o ácido nucléico referidocomo 174-D4-004 e 166-A4-002 tem a melhor afinidade de ligação à MCP-1(como "spiegelmero" com uma IC50 de 2 - 5 nM no ensaio de liberação deCa"1"1" em cultura de células in vitro) e pode, portanto, constituir a seqüência
otimizada e a combinação otimizada dos elementos da seqüência |B1A|, B2.e [bTb.
Adicionalmente, 29 outros ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1 foram identificados, os quais não podem ser descritos por umacombinação de elementos da seqüência de nucleotídeos, como foi mostradopara os Tipos 1 - 4 dos ácidos nucléicos que se ligam à MCP-1. Estasseqüências são listadas na Figura 7.
É para ser entendido que quaisquer das seqüências mostradasnas Figuras 1 até 7 são ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção,incluindo aquelas formas truncadas deles, porém também incluindo aquelasformas estendidas deles, sob a condição, entretanto, que as moléculas deácidos nucléicos assim truncadas e estendidas, respectivamente, aindasejam capazes de ligar-se ao alvo.
Exemplo 2: Ácidos nucléicos que ligam a MCP-1 de murino
Utilizando a d-MCP-1 de murino biotinilada como um alvo,puderam ser geradas diversas moléculas de ácidos nucléicos que se ligam aela. O resultado de uma análise da seqüência destas moléculas de ácidosnucléicos pode ser inferido a partir da Figura 8.
Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmerousando o ensaio de co-imunoprecipitação utilizando a d-MCP-1 de murinobiotinilada, para graduá-los com relação ao seu comportamento de ligação(Exemplo 4). As seqüências selecionadas foram sintetizadas como"spiegelmero" (Exemplo 3) e foram testadas usando a configuração naturalda MCP-1 (l-McP) em um ensaio de liberação de Ca"1"1" em cultura de célulasin vitro (Exemplo 5) e de quimiotaxia (Exemplo 6).
Conforme representado na Figura 8, o D-188-A3-001 e o D-189-G7-001 e os seus derivados ligam a d-MCP-1 com K0 subnanomolar noensaio de co-imunoprecipitação (Figura 8).
Para o d-mNOX-E36 (= d-188-A3-007; SEQ.ID N9: 244), umaconstante de dissociação (K0) de 0,1 - 0,2 nM, a 37°C, foi determinada(Exemplo 4; Figura 10). O "spiegelmero" respectivo mNOX-E36 (188-A3-007; SEQ.ID Ne: 122) exibiu uma concentração inibitória (IC50) deaproximadamente 12· nM em um ensaio de liberação de Ca"1"1" in vitro(Exemplo 5; Figura 13) e de aproximadamente 7 nM em um ensaio dequimiotaxia in vitro (Exemplo 6; Figura 16). Para o derivado PEGuiIado demNOX-E36, mNOX-E36-3'PEG (SEQ.ID N9: 254), as IC501S deaproximadamente 8 nM foram determinadas no ensaio de liberação de Ca+*(Exemplo 5, Figura 29) e aproximadamente 3 nM no ensaio de quimiotaxia(Exemplo 6; Figura 31).
É para ser entendido que quaisquer das seqüências mostradasnas Figuras 1 até 7 são ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção,incluindo aquelas formas truncadas deles, porém também incluindo aquelasformas estendidas deles, sob a condição, entretanto, que as moléculas deácidos nucléicos assim truncadas e estendidas, respectivamente, aindasejam capazes de ligar-se ao alvo.
Exemplo 3: Síntese e derivação de Aptâmeros e "spiegelmeros"Síntese em pequena escala
Os Aptâmeros e os "spiegelmeros" foram produzidos por sínteseem fase sólida com um sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City,CA, EUA), usando a química de 2'TBDMS RNA fosforamídita (M.J. Damha,K.K. Ogilvie, Methods in Molecular Biology, Vol. 20 Protocols foroligonucleotides and analogs, ed. S. Agrawal, páginas 81-114, HumanaPress Inc. 1993). As rA(N-Bz)-, rC(Ac)-, rG(N-ibu)-, e rU- fosforamiditas naconfiguração DeL foram adquiridas da ChemGenes, Wilmington, MA. OsAptâmeros e os "spiegelmeros" foram purificados por eletroforese em gel.
Síntese em grande escala mais modificação
O "spiegelmero" NOX-E36 foi produzido por síntese em fasesólida com um sintetizador AktaPiIotIOO (Amersham Biosciences; GeneralElectric Healthcare, Freiburg), usando a química de 2'TBDMS RNAfosforamídita (M.J. Damha, K.K. Ogilvie, Methods in Molecular Biology, Vol.20 Protocols for oligonucleotides and analogs, ed. S. Agrawal, páginas 81-114, Humana Press Inc. 1993). As L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, e L-rU-fosforamiditas foram adquiridas da ChemGenes, Wilmington, MA. O 5'-amino-modificador foi adquirido da American International Chemicals Inc.(Framingham, MA, EUA). A síntese do "spiegelmero" não modificado foiiniciada sobre o tamanho de poro de CPG modificado com L-riboG 1000 Á(Link Technology, Glasgow, UK); para o "spiegelmero" modificado com 3'-NH2, usou-se 3'-Aminomodificador-CPG, 1000 Á (ChemGenes, Wilmington,MA). Para o acoplamento (15 min. por ciclo), usou-se 0,3 M debenziltiotetrazol (CMS-Chemicals, Abingdon, UK) em acetonitrila, e 3,5equivalentes da solução a 0,1 M de fosforamídita respectiva em acetonitrila.Usou-se um ciclo de oxidação-capeamento. Os solventes e os reagentespadrões adicionais para a síntese de oligonucleotídeos foram adquiridos daBiosolve (Valkenswaard, NL). O "spiegelmero" foi sintetizado DMT-ON; apósa desproteção, ele foi purificado via RP-HPLC preparativa (Wincott F. et ai.(1995) Nucleic Acids Res 23:2677), usando o meio Sourcel 5RPC(Amersham). O grupo 5'DMT foi removido com ácido acético a 80% (30 min.na TA). Subseqüentemente, a solução aquosa a 2 M de NaOAc foiadicionada e o "spiegelmero" foi dessalinizado por filtração de fluxotangencial usando uma membrana de celulose regenerada de 5 K (Millipore,Bedford, MA).
PEGuilação de NOX-E36
Para prolongar o tempo de residência no plasma do"spiegelmero" in vivo, o "spiegelmero" NOX-E36 foi acopladocovalentemente a uma porção de polietileno glicol (PEG) de 40 kDa naextremidade de 3' ou na extremidade de 5'.3'-PEGuilacão de NOX-E36
Para a PEGuilação (quanto a detalhes técnicos do método paraa PEGuilação, vide o pedido de patente europeu EP 1 306 382), o"spiegelmero" modificado com 3'-amino purificado foi dissolvido em umamistura de H2O (2,5 ml), DMF (5 ml), e tampão A (5 ml: preparado pormistura de ácido cítrico · H2O [7 g], ácido bórico [3,54 g], ácido fosfórico[2,26 ml], e NaOH a 1 M [343 ml] e adição de H20 até um volume final de 1I; o pH = 8,4 foi ajustado com HCI a 1 M).
O pH da solução de "spiegelmero" foi levado para 8,4 comNaOH a 1 M. Então, o éster de PEG-NHS de 40 kDa (Nektar Therapeutics,Huntsville, AL) foi adicionado, a 37°C, a cada 30 min., em quatro porções de0,6 equivalente, até um rendimento máximo de 75 a 85% ser atingido. O pHda mistura de reação foi mantido a 8 - 8,5 com NaOH a 1 M durante a adiçãodo éster de PEG-NHS.
A mistura de reação foi combinada com 4 ml de solução de uréia(8 M), 4 ml de tampão A, e 4 ml de tampão B (acetato de trietilamônio a 0,1M em H2O) e aquecida para 95SC por 15 min.. O "spiegelmero" PEGuiIadofoi então purificado por RP-HPLC com o meio Source 15RPC (Amersham),usando um gradiente de acetonitrila (tampão B; tampão C: acetato detrietilamônio a 0,1 M em acetonitrila). O PEG em excesso eluiu em 5% detampão C, o "spiegelmero" PEGuiIado em 10 -15% de tampão C. As fraçõesde produto com uma pureza de >95% (como avaliada por HPLC) foramcombinadas e misturadas com 40 ml de NaOAc a 3 Μ. O "spiegelmero"PEGuiIado foi dessalinizado por filtração de fluxo tangencial (membrana decelulose regenerada de 5 K, Millipore, Bedford, MA).5'-PEGuilacão de NOX-E36
Para a PEGuilação (quanto a detalhes técnicos do método paraa PEGuilação, vide o pedido de patente europeu EP 1 306 382), o"spiegelmero" modificado com 5'-amino purificado foi dissolvido em umamistura de H2O (2,5 ml), DMF (5 ml), e tampão A (5 ml: preparado pormistura de ácido cítrico · H2O [7 g], ácido bórico [3,54 g], ácido fosfórico[2,26 ml], e NaOH a 1 M [343 ml] e adição de água até um volume final de 1I; o pH = 8,4 foi ajustado com HCI a 1 M).
O pH da solução de "spiegelmero" foi levado para 8,4 comNaOH a 1 M. Então, o éster de PEG-NHS de 40 kDa (Nektar Therapeutics,Huntsville, AL) foi adicionado, a 37°C, a cada 30 min., em seis porções de0,25 equivalente, até um rendimento máximo de 75 a 85% ser atingido. O pHda mistura de reação foi mantido a 8 - 8,5 com NaOH a 1 M durante a adiçãodo éster de PEG-NHS.
A mistura de reação foi combinada com 4 ml de solução de uréia(8 M), e 4 ml de tampão B (acetato de trietilamônio a 0,1 M em H2O) eaquecida para 959C por 15 min.. O "spiegelmero" PEGuiIado foi entãopurificado por RP-HPLC com o meio Source 15RPC (Amersham), usandoum gradiente de acetonitrila (tampão B; tampão C: acetato de trietilamônio a0,1 M em acetonitrila). O PEG em excesso eluiu em 5% de tampão C, o"spiegelmero" PEGuiIado em 10 - 15% de tampão C. As frações de produtocom uma pureza de >95% (como avaliada por HPLC) foram combinadas emisturadas com 40 ml de NaOAc a 3 Μ. O "spiegelmero" PEGuiIado foidessalinizado por filtração de fluxo tangencial (membrana de celuloseregenerada de 5 K1 Millipore, Bedford, MA).Exemplo 4: Determinação das Constantes de Ligação (Ensaio de Co-Imunoprecipitação)
Ensaio de co-imunoprecipitação direta
A afinidade dos aptâmeros pela d-MCP-1 foi medida em umformato de ensaio de co-imunoprecipitação, a 20 ou 37°C, respectivamente.Os aptâmeros foram rotulados com 5'-fosfato pela T4 polinucleotídeo cinase(Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha), usando o ATP rotulado com [γ-32Ρ](Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemanha). A radioatividade específicados aptâmeros rotulados era 200.000 - 800.000 cpm/pmol. Os aptâmerosforam incubados após a des- e a renaturação em concentração de 20 pM, a37°C, em tampão de seleção (Tris-HCI a 20 mM pH 7,4; NaCl a 137 mM; KCIa 5 mM; MgCl2 a 1 mM; CaCl2 a 1 mM; 0,1% [p/vol] de Tween-20),juntamente com quantidades variadas de d-MCP-1 biotinilada, por 4-12horas, para atingir o equilíbrio em baixas concentrações. O tampão deseleção foi suplementado com 10 μg/ml de soro albumina humana (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha), e 10 μg/ml de RNA de levedura (Ambion,Austin, EUA), para impedir a adsorção de pares de ligação com assuperfícies dos artigos plásticos usados ou da matriz de imobilização. A faixade concentrações da d-MCP-1 biotinilada foi ajustada de 8 pM até 100 nM; ovolume total de reação era 1 ml. O peptídeo e os complexos de peptídeo-aptâmero foram imobilizados sobre 1,5 μΙ de partículas de EstreptatvidinaUltralink Plus (Pierce Biotechnology, Rockford, EUA) que tinham sido pré-equilibradas com tampão de seleção e ressuspensas novamente em umvolume total de 6 μΙ. As partículas foram mantidas em suspensão por 30min., na temperatura respectiva, em um termomisturador. A radioatividadeimobilizada foi quantificada em um contador de cintilação após remoção dosobrenadante e lavagem apropriada. A porcentagem de ligação foirepresentada graficamente contra a concentração de d-MCP-1 biotinilada eas constantes de dissociação foram obtidas usando os algoritmos desoftwares (GRAFIT; Software Erithacus; Surrey U.K.) assumindo umaestequiometria de 1:1.Ensaio de co-imunoprecipitação competitiva
Para comparar os diferentes aptâmeros que se ligam à d-MCP-1,efetuou-se um ensaio de classificação competitiva. Para este propósito, oaptâmero mais afim foi rotulado radioativamente (vide acima) e serviu comoreferência. Após a des- e a renaturação, ele foi incubado a 37°C com d-MCP-1 biotinilada, em 1 ml de tampão de seleção, em condições que resultaramem aproximadamente 5 - 10% de ligação ao peptídeo, após imobilização elavagem sobre agarose de NeutrAvidina ou Estreptavidina Ultralink Plus(ambas da Pierce), sem competição. Um excesso das variantes deaptâmeros de D-RNA não rotulados, des- e renaturados, foi adicionado adiferentes concentrações (por exemplo, 2, 10, e 50 nM), com o aptâmero dereferência rotulado, para correr paralelamente às reações de ligação. Osaptâmeros a serem testados competiram com o aptâmero de referência pelaligação ao alvo, assim diminuindo o sinal de ligação em dependência desuas características de ligação. O aptâmero que foi verificado ser o maisefetivo neste ensaio pôde então servir como uma nova referência para aanálise comparativa de mais variantes de aptâmeros.
Exemplo 5: Determinação da Concentração Inibitória em um Ensaio deLiberação de Ca+*
As células THP-1 (DSMZ, Braunschweig) foram cultivadasdurante a noite, em uma densidade de células de 0,3 χ 106/ml, a 37°C e 5%de CO2, em meio RPMI 1640, com GIutaMAX (Invitrogen), que continha,além disso, 10% de soro de bezerro fetal, 50 unidades/ml de penicilina, 50μg/ml de estreptomicina e 50 μΜ de β-mercaptoetanol.
Os "spiegelmeros" foram incubados juntamente com a MCP-1humana recombinante (Bachem) em solução de sal balanceada de Hanks(HBSS), contendo 1 mg/ml de soro albumina bovina, 5 mM de probenecid e20 mM de HEPES (HBSS+), por 15 a 60 min., a 37°C, em uma placa de 96tubos, de baixo contorno, de 0,2 ml ("solução de estimulãção").
Para a carga com o corante indicador de cálcio, as células foramcentrifugadas a 300 χ g por 5 min., suspensas novamente em 4 ml desolução de corante indicador (10 μΜ de fluo-4 [Molecular Probes], 0,08% depluronic 127 [Molecular Probes] em HBSS+) e incubadas por 60 min., a 37°C.Após isso, 11 ml de HBSS+ foram adicionados e as células foramcentrifugadas conforme acima descrito, lavadas uma vez com 15 ml deHBSS+ e entãó suspensas novamente em HBSS+ para dar uma densidadede células de 1,1 χ 106/ml. 90 μΙ desta suspensão de células foramadicionados a cada cavidade de uma placa de 96 cavidades, preta.
A medição dos sinais de fluorescência foi feita em umcomprimento de ondas de excitação de 485 nm e um comprimento de ondasde emissão de 520 nm, em uma leitora de placas de multidetecção FluostarOptima (BMG). Para a medição em paralelo das diversas amostras, ascavidades de uma fileira (perpendicular) de uma placa de 96 cavidadesforam registrados juntos. As primeiras três leituras, com uma defasagem de4 s, foram feitas para a determinação da linha de base. Então, o registro foiinterrompido e a placa foi movida do instrumento. Usando uma pipeta demúltiplos canais, 10 μΙ da solução de estimulação foram adicionados aascavidades, então a placa foi movida para o instrumento novamente e amedição foi continuada. No total, foram efetuados 20 registros comintervalos de tempo de 4 segundos.
Para cada cavidade, a diferença entre a fluorescência máxima eo valor de linha de base foi determinada e representada graficamente contra1 a concentração de MCP-1 ou, nos experimentos sobre a inibição daliberação de cálcio pelos "spiegelmeros", contra a concentração de"spiegelmero".
Determinação da concentração semi-efetiva máxima (ECso) para a MCP-1 humana
Após a estimulação das células THP-1 com as diversasconcentrações de hMCP-1 e a representação gráfica da diferença entre ossinais máximos e da linha de base, uma curva de resposta à dose para aMCP-1 humana foi obtida, indicando uma concentração semi-efetiva (EC5o)de cerca de 2 - 4 nM (Figura 11). Esta concentração foi usada para osexperimentos adicionais sobre a inibição da liberação de Ca"1-1" pelos"spiegelmeros".Determinação da concentração semi-efetiva máxima (EC5o) para a MCP-1 de murino
Após a estimulação das células THP-1 com as diversasconcentrações de mMCP-1 e a representação gráfica da diferença entre ossinais máximos e da linha de base, uma curva de resposta à dose para aMCP-1 de murino foi obtida, indicando uma concentração semi-efetiva(EC50) de cerca de 5 nM (Figura 28). Esta concentração foi usada para osexperimentos adicionais sobre a inibição da liberação de Ca"1-1" pelos"spiegelmeros".
Exemplo 6: Determinação da Concentração Inibitória em um Ensaio deQuimiotaxia
As células THP-1, desenvolvidas conforme descrito acima, foramcentrifugadas, lavadas uma vez em HBH (HBSS, contendo 1 mg/ml de soroalbumina bovina e 20 mM de HEPES) e suspensas novamente a 3 χ 106células/ml. 100 μl desta suspensão foram adicionados aos insertosTranswell com poros de 5 μm (Corning, n2 3421). Nos compartimentosinferiores, a MCP-1 foi pré-incubada juntamente com os "spiegelmeros" emdiversas concentrações, em 600 μl de ΗΒΗ, a 37°C, por 20 a 30 min., antesda adição das células. As células foram deixadas migrar a 37°C por 3 horas.Após isso, os insertos foram removidos e 60 μl de resazurina a 440 μΜ(Sigma) em solução salina tamponada com fosfato foram adicionados aoscompartimentos inferiores. Após incubação a 37°C por 2,5 horas, afluorescência foi medida em um comprimento de ondas de excitação de 544nm e um comprimento de ondas de emissão de 590 nm, em uma leitora deplacas de multidetecção Fluostar Optima (BMG).
Determinação da concentração semi-efetiva máxima (EC5o) para a MCP-1 humana
Após 3 horas de migração das células THP-1 para as diversasconcentrações de MCP-1 humana, obteve-se uma curva de resposta à dosepara a MCP-1 humana, indicando uma concentração efetiva máxima decerca de 1 nM e ativação reduzida nas concentrações mais elevadas (Figura14). Para os experimentos adicionais sobre a inibição da quimiotaxia pelos"spiegelmeros", utilizou-se uma concentração de MCP-1 de 0,5 nM.
Determinação da concentração semi-efetiva máxima (EC5o) para a MCP-1 de murino
Após 3 horas de migração das células THP-1 para as diversasconcentrações de MCP-1 de murino, obteve-se uma curva de resposta àdose para a MCP-1 de murino, indicando uma concentração efetiva máximade cerca de 1 - 3 nM e ativação reduzida nas concentrações mais elevadas(Figura 30). Para os experimentos adicionais sobre a inibição da quimiotaxiapelos "spiegelmeros", utilizou-se uma concentração de MCP-1 de murino de0,5 nM.
Exemplo 7: Análise da Ligação por Medição da RessonânciaPlasmônica de Superfície
7.1 Avaliação da especificidade de NOX-E36. 181-A2-018 e mNOX-E36
O instrumento Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) foiusado para analisar a ligação dos ácidos nucléicos à MCP-1 humana eproteínas relacionadas. Quando o acoplamento era para ser atingido viagrupos amina, as proteínas foram dialisadas contra a água, por 1 - 2 h(ésteres de celulose mistos VSWP da Millipore; tamanho do poro, 0,025 μΜ),para remover as aminas interferentes. Os chips de sensor PioneerFI ouCM4 (Biacore AB) foram ativados antes do acoplamento da proteína poruma injeção de 35 μΙ de uma diluição a 1:1 de NHS a 0,4 M e EDC a 0,1 M,em um fluxo de 5 μΙ/min.. A quimiocina foi então injetada em concentraçõesde 0,1 - 1,5 μg/ml, em um fluxo de 2 μΙ/min., até que a resposta doinstrumento estivesse na faixa de 1000 - 2000 RU (unidades relativas). Osésteres de NHS não-reagidos foram desativados por injeção de 35 μΙ desolução de cloridrato de etanolamina (pH 8,5), em um fluxo de 5 μΙ/min.
O chip de sensor foi iniciado duas vezes com tampão de ligação eequilibrado a 10 μΙ/min., por 1 - 2 horas, até que a linha de base parecesseestável. Para todas as proteínas, os parâmetros cinéticos e as constantes dedissociação foram avaliados por uma série de injeções de "spiegelmeros",em concentrações de 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, e 0 nM em tampãode seleção (Tris-HCI, 20 mM; NaCI, 137 mM; KCI, 5 mM; CaCI2, 1 mM;MgCI2, 1 mM; Tween20, 0,1% [p/v]; pH 7,4). Em todos os experimentos, aanálise foi efetuada a 37°C, usando o comando Kinject que define um tempode associação de 180 e um tempo de dissociação de 360 segundos, em umfluxo de 10 μΙ/min.. A análise dos dados e o cálculo das constantes deissociação (Kd) foram feitos com o software BIAevaIuation 3.0 (BIACOREAP, Uppsala, Suécia), usando o algoritmo de adaptação estequiométricaLangmuir 1:1.
7.1.1 NOX-E36 e 181-A2-018 (ácidos nucléicos específicos para a MCP-1humana)
Somente para a MCP-1 humana, todos os sensorgramas sãorepresentados (Figuras 17 e 20, respectivamente); para as outras proteínas;somente o sensorgrama obtido com a concentração de "spiegelmero" de 125nM é mostrado no interesse de clareza (Figuras 18/19 e 21/22).
Análise da interação entre NOX-E36*hMCP-1: a MCP-1 humanarecombinante foi imobilizada sobre um chip de sensor PioneerFI, seguindoas recomendações do fabricante (procedimento de acoplamento de amina),até que uma resposta do instrumento de 1381 RU (unidades relativas) fosseestabelecida. A constante de dissociação (Kd) determinada para a ligação doNOX-E36 à MCP-1 humana foi cerca de 890 pM (Figura 17).
Análise da interação entre 181-A2-018*hMCP-1: a MCP-1humana recombinante foi imobilizada sobre um chip de sensor CM4,seguindo as recomendações do fabricante (procedimento de acoplamentode amina), até que uma resposta do instrumento de 3111 RU (unidadesrelativas) fosse estabelecida. A constante de dissociação (K0) determinadapara a ligação do 181-A2-018 à MCP-1 humana foi cerca de 370 pM (Figura20).
Para determinar a especificidade do NOX-E36 e do 181-A2-018,diversas proteínas da família de MCP-1 humana e também a eotaxinahumana foram imobilizadas sobre um chip de sensor PioneerFI e um CM4(hMCP-1, 1754 RU; hMCP-2, 1558 RU; hMCP-3, 1290 RU; eotaxina, 1523RU). A análise cinética revelou que o NOX-E36 se liga à eotaxina e à hMCP-2 com constantes de dissociação (K0) de 5 - 10 nM; a hMCP-3 não foireconhecida (Figuras 18 e 24A). O 181-A2-018, em contraste, liga a eotaxina,a hMCP-2 e a hMCP-3, porém com afinidade ligeiramente menor (10-20nM; Figuras 21 e 24A).
A rèatividade cruzada entre as espécies de NOX-E36 e 181-A2-018 foi avaliada usando MCP-1 imobilizada por acoplamento de amino deser humano (1460 RU), macaco (1218 RU), porco (1428 RU), cão (1224 RU),coelho (1244 RU), rato (1267 RU), e camundongo (1361 RU), sobre um chipde sensor PioneerFI e um CM4. A análise cinética revelou que o NOX-E36liga-se à MCP-1 humana, de macaco, de porco, e de cão com constantes dedissociação (Kd) comparáveis de 0,89 - 1,2 nM, enquanto que a MCP-1 decamundongo, de rato e de coelho não foi reconhecida (Figuras 19 e 24A).O 181-A2-018 se liga à MCP-1 humana e de macaco com constantes dedissociação (Kd) comparáveis de 0,5-0,6 nM, enquanto que a MCP-1 deporco, de coelho e de cão é ligada com afinidade muito menor. A MCP-1 derato e de camundongo não foi reconhecida pelo NOX-A2-018 (Figuras 22 e24A).
As seqüências e também o grau de homologia em por cento deaminoácidos idênticos entre a proteína MCP-1 de diferentes espécies e asproteínas humanas estreitamente relacionadas são representados na Figura23; os valores de KD calculados para o NOX-E36 e o 181-A2-018 são1 mostrados no formato de tabelas, na Figura 24A.
7.1.2 mNOX-E36 (ácido nucléico específico para a MCP-1 de murino)
Para analisar o comportamento de ligação do mNOX-E36, 3759RU da d-MCP-1 de murina biotinilada sintética (célula de fluxo 3) e 3326 RUde d-MCP-1 humana biotinilada (célula de fluxo 4) foram imobilizados sobreum chip de sensor conjugado à Estreptavidina (Biacore AB, Freiburg,Alemanha), respectivamente. As soluções de aptâmero mNOX-E36 (D-RNA)de 500, 250, 125, 62,5, 31,25, e 0 nM foram injetadas usando o comandoKinject que define um tempo de associação de 180 s e um tempo dedissociação de 360 s. A célula de fluxo 1 foi usada como tampão e controlede matriz de dextrana (Biacore superfície de SA-Chip), enquanto que sobrea célula de fluxo 2, um D-peptídeo não-específico foi imobilizado paradeterminar a ligação não-específica do aptâmero. A Figura 32 mostra umsensorgrama da cinética de d-NOX-E36 para a ligação à d-MCP-1 de murinocom uma constante de dissociação (Kd) calculada de 200 - 300 pM. OmNOX-E36 não liga a d-MCP-1 humana (Figura 33); no interesse de clareza,somente o sensorgrama obtido com 125 nM de "spiegelmero" é mostrado.
7.2 Avaliação da seletividade do NOX-E36
A seletividade do NOX-E36 foi avaliada por análise deressonância plasmônica de superfície, através de imobilização do ΝΟΧ-Ε365'biotinilado sobre uma Estreptavidina (SA-Chip). 352 RU de NOX-E36 sobrea célula de fluxo (FC) 1 e uma quantidade igual de "spiegelmero" de controlenão-funcional, biotinilado, 5' terminal (POC) sobre a FC 2 foram imobilizadospor ligação de estreptavidina/biotina. A FC3 foi usada como controle desuperfície para determinar a ligação não-específica à superfície do sensor dedextrana-SA.
100 nM de um painel de quimiocinas humanas a partir de todosos quatro subgrupos (CC, CXC1 CX3C1 e XC) foram injetados por 360 s e oscomplexos foram deixados dissociar por 360 s, em um fluxo de 10 μΙ/Γηίη. e37°C. As unidades de resposta após a associação (Resp. 1; grau deinteração) e após a dissociação (Resp. 2, afinidade de interação) foramrepresentadas graficamente. Após cada injeção, a superfície do chip foiregenerada com uns 240 s de cloreto de sódio a 1 M com 0,1% de Tween;os "spiegelmeros" imobilizados foram subseqüentemente deixados redobrarpor 2 minutos em condições fisiológicas (tampão de corrida). A injeção decada quimiocina foi repetida 3 vezes. A CXCL1, a CXCL2, a CXCL6 e aCXCL9 mostraram ligação não-específica aos ácidos ribonucléicos e àsuperfície de dextrana do chip. A ligação específica com alta afinidade aoNOX-E36 imobilizado somente pôde ser detectada para CCL2/MCP-1,CCL8/MCP-2, CCL11/eotaxina, CCL3/MIP1a, e CXCL7/NAP-2 (Figura 24B).
A verificação que a MCP-2 e a eotaxina estão ligadas pelo NOX-E36 não ésurpreendente, devido à homologia relativamente alta entre estasquimiocinas e a MCP-1 de 62 e 70%, para os positivos inesperadosCCL3/MIP-1a e CXCL7/NAP-2, os testes in vitro quanto à inibição funcionalforam efetuados ou estão atualmente sendo estabelecidos, respectivamente.
Finalmente, os parâmetros cinéticos da interação entre NOX-E36 e CCL2/MCP-1, CCL8/MCP-2, CCL11/eotaxina, CCL3/MIP1a,CXCL7/NAP-2, CCL7/MCP-3 e CCL13/MCP-4 foram determinados nosistema "invertido". Aqui, as quimiocinas foram imobilizadas e o NOX-E36livre foi injetado (quanto ao protocolo detalhado, vide 7.1). Os dadoscinéticos são resumidos na Figura 24C.
7.3 Avaliação da Funcionalidade anti-MIP-1a in vitro
As medições por Biacore mostraram reatividade cruzada doNOX-E36 com a MIP-1a. Empregando-se um ensaio in vitro à base decultura de células, funcional, deve ser checado se a mera ligação porBiacore do NOX-E36 à MIP-Ia também se traduz em funcionalidade, porexemplo, antagonismo.
Para obter isto, os experimentos de quimiotaxia com as célulasTHP-1 foram efetuados, que podem ser estimulados por MIP-1a. As célulasTHP-1, desenvolvidas conforme descrito acima, foram centrifugadas,lavadas uma vez em HBH (HBSS, contendo 1 mg/ml de soro albuminabovina e 20 mM de HEPES) e suspensas novamente a 3 χ 106 células/ml.100 μΙ desta suspensão foram adicionados aos insertos Transwell com porosde 5 μιτι (Corning, n- 3421). Nos compartimentos inferiores, a MIP-Ia foi• pré-incubada juntamente com os "spiegelmeros" em diversas concentrações,em 600 μΙ de ΗΒΗ, a 37°C, por 20 a 30 min., antes da adição das células. Ascélulas foram deixadas migrar a 37°C por 3 horas. Após isso, os insertosforam removidos e 60 μΙ de resazurina a 440 μΜ (Sigma) em solução salinatamponada com fosfato foram adicionados aos compartimentos inferiores.Após incubação a 37°C por 2,5 horas, a fluorescência foi medida em umcomprimento de ondas de excitação de 544 nm e um comprimento de ondasde emissão de 590 nm, em uma leitora de placas de multidetecção FluostarOptima (BMG).
Após 3 horas de migração das células THP-1 para as diversasconcentrações de MIP-Ia humana, obteve-se uma curva de resposta à dosepara a MIP-Ia humana, indicando uma concentração semi-efetiva máximade cerca de 1 nM e ativação reduzida nas concentrações mais elevadas(Figura 24D). Para os experimentos adicionais sobre a inibição daquimiotaxia pelos "spiegelmeros", utilizou-se uma concentração de MIP-Iade 0,5 nM.
Os experimentos para a determinação da inibição da quimiotaxiapelo NOX-E36 foram efetuados com um estímulo de 0,5 nM de MIP-loc.Pôde ser claramente mostrado que o NOX-E36 não inibe a quimiotaxiainduzida pela MIP-Ia até a concentração mais alta testada de 1 μΜ de MIP-1a. Como controle positivo, o experimento respectivo com a MCP-1 comoestímulo foi efetúado em paralelo (Figura 24E).
Exemplo 8: Terapia da doença similar ao lúpus em camundongosMRL,pr/lpr com o "spiegelmero" anti-mMCP-1
O bloqueio dos mediadores pró-inflamatórios tornou-se umaabordagem bem-sucedida para o tratamento de inflamação crônica(Steinman 2004). Além do TNF e das interleucinas, as quimiocinas CC sãocandidatas importantes para o antagonismo específico, porque asquimiocinas CC mediam õ recrutamento de leucócitos a partir do espaçointravascular para os locais de inflamação (Baggiolini 1998, Luster 2005). Háuma evidência muito forte que a MCP-1 (= CCL2) e o seu receptor dequimiocina respectivo CCR2 desempenham uma função crucial na lesão dotecido auto-imune, tal como as manifestações clínicas de lúpus eritematososistêmico (Gerard e Rollins 2001). Por exemplo, os camundongos MRLlpr/lprdeficientes para o gene Cc/2 ou o Ccr2 são protegidos da auto-imunidadesimilar ao lúpus (Perez de Lema 2005, Tesch 1999). Portanto, o eixoCCL2/CCR2 pode representar um alvo terapêutico promissor, por exemplo,a nefrite por lúpus. Na realidade, a terapia de gene retardada ou atransferência de células transfectadas, ambas resultando na produção in situde uma MCP-1 truncada com NH2, marcadamente reduziram a lesão aotecido auto-imune nos camundongos MRLlpr/lpr. Entretanto, tais abordagensexperimentais não podem ser usadas em seres humanos por causa daprodução de antagonista irreprimível e da formação de tumor (Hasegawa2003, Shimizu 2004). Portanto, permanece necessário desenvolver novosantagonistas de CCL2 com perfis favoráveis de farmacocinética in vivo.Neste exemplo, mostra-se que o bloqueio da CCL2 de murino com o"spiegelmero" anti-mCCL2 mNOX-E36 ou mNOX-E36-3'PEG seriaadequado para a o tratamento de nefrite por lúpus e outras manifestaçõesde doença de lúpus eritematoso sistêmico. O início tardio da terapia com o"spiegelmero" mCCL2 efetivamente melhora a nefrite por lúpus, aperibronquite auto-imune, e a doença da pele similar ao lúpus emcamundongos MRLlpr/lpr, independente de qualquer problema anteriorassociado com o bloqueio de CCL2/CCR2 terapêutico.
Animais e Protocolo Experimental
Os camundongos MRLlpr/lpr fêmeos de dez semanas de idadeforam obtidos de Harlan Winkelmann (Borchen, Alemanha) e mantidos sobcondições normais de alojamento em um ciclo de luz e escuridão de 12horas. Água e comida padrão (Ssniff, Soest1 Alemanha) estavam disponíveisad libitum. Na idade de 14 semanas, os grupos de 12 camundongosreceberam injeções subcutâneas dos "spiegelmeros" em 5 % de glicose(volume de injeção, 4 ml/kg), três vezes por semana, como se segue:mNOX-E36, 1,5 pmol/kg; mNOX-E36-3'PEG, 0,9 pmol/kg; "spiegelmero" decontrole não-funcional PoC (5'-UAAGGAAACUCGGUCUGAUGCGGUAGCGCUGUGCAGAGCU-3'), 1,9 μπιοΙ/kg; PoC-PEG, 0,9 Mmol/kg; veículo(5 % de glicose). Os níveis no plasma de mNOX-E36 e mNOX-E36-3'PEGforam determinados a partir das amostras de sangue retiradassemanalmente do seio retroorbital, 3 ou 24 horas após a injeção,respectivamente. Os níveis de "spiegelmero" nas amostras de plasmasforam determinados por uma modificação do método de hibridização emsanduíche conforme descrito no Exemplo 8. Os camundongos foramsacrificados por deslocamento cervical no final de 24 semanas de idade.
Avaliação do lúpus sistêmico
As lesões da pele foram registradas por um escoresemiquantitativo (Schwarting 2005). A razão em peso de baço e o volumedos Iinfonodos mesentéricos para o peso total do corpo foram calculadoscomo marcadores da síndrome Iinfoproliferativa associada ao lúpus. Asamostras de sangue e urina foram coletadas de cada animal, no final doperíodo de estudo, por sangramento do plexo venoso retroorbital, sobanestesia geral com éter inalado. As amostras de sangue e urina foramcoletadas de cada animal no final do estudo e a razão de albumina/creatinae os títulos de isótipos de IgG de auto-anticorpos paraa dsDNA no soroforam determinados conforme anteriormente descrito (Pawar 2006). A taxade filtração glomerular (GFR) foi determinada em 24 semanas pela cinéticade depuração de FITC-inulina no plasma (Sigma-AIdrich, Steinheim,Alemanha), 5, 10, 15, 20, 35, 60, e 90 minutos após uma única injeção debolo (Qi 2004). A fluorescência foi determinada com excitação a 485 nm eleitura em emissão a 535 nm. A GFR foi calculada com base em um modelode dois compartimentos, usando um software de adaptação à curva deregressão não-linear (GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., San Diego,CA). Os níveis de citocinas no soro foram determinados usando kitscomerciais de ELISA para IL-6, IL-12p40 (OptEiA, BD Pharmingen), e IFN-a(PBL Biomedical Labs, EUA). A partir de todos os camundongos, os rins e ospulmões foram fixados em formalina tamponada a 10%, processados, eincrustados em parafina. As seções de 5 μιτι para as colorações com prata eácido periódico-Schiff foram preparadas seguindo protocolos de rotina(Anders 2002). A gravidade das lesões renais foi graduada usando osíndices para atividade e cronicidade, conforme descritos para a nefrite porlúpus humana (Austin 1984), e a morfometria da lesão intersticial renal foiconduzida conforme anteriormente descrito (Anders 2002). A gravidade dainflamação peribronquial foi graduada de modo semiquantitativo de 0-4. Paraa imunocoloração, as seções de tecidos fixados em formalina e incrustadosem parafina foram removidas da cera e hidratadas novamente. A peroxidaseendógena foi bloqueada por peróxido de hidrogênio a 3 % e a recuperaçãodo antígeno foi efetuada em Solução de Recuperação de Antígeno (Vector,Burlingame, CA) em um forno de autoclave. A biotina foi bloqueada usandoo Kit de bloqueio de Avidina/Biotina (Vector). As lâminas foram incubadascom os anticorpos primários por uma hora, seguidos pelos anticorpossecundários biotinilados (anti-lgG de rato, Vector), e o reagente ABC(Vector). As lâminas foram lavadas em solução salina tamponada comfosfato entre as etapas de incubação. A 3'3'Diaminobenzidina (DAB1 Sigma,Taufkirchen1 Alemanha) com reforço de metal foi usada como sistema dedetecção, resultando em um produto de cor preta. O verde de metila foiusado como um contracorante, as lâminas foram desidratadas e montadasem Histomount (Zymed Laboratories, San Francisco, CA). Os seguintesanticorpos primários foram usados: anti-Mac2 em rato (macrófagos,Cederlane, Ontario, Canadá, 1:50), anti-CD3 de camundongo (1:100, clone500A2, BD), anti-lgGi de camundongo (1:100, M32015, Caltag Laboratories,Burlingame, CA, EUA), anti-lgG2a de camundongo (1:100, M32215, Caltag),anti-C3 de camundongo (1:200, GAM/C3c/FITC, Nordic ImmunologicalLaboratories, Tilburg, Países Baixos). Os controles negativos incluíram aincubação com um anticorpo de isótipo respectivo. Para a análisequantitativa, as células glomerulares foram contadas em 15 gloméruloscorticais por secção. Os depósitos de Ig e C3c glomerulares foramclassificados de 0-3 sobre as 15 seções glomerulares corticais.
Preparação do RNA e RT-PCR quantitativa em tempo real (TaqMan)
O tecido renal de cada camundongo foi congelado rapidamenteem nitrogênio líquido e armazenado a -809C. A partir de cada animal, apreparação de RNA renal total e. a transcrição reversa foram efetuadasconforme descrito (Anders 2002). O iniciadores e as sondas eram da PEBiosystems, Weiterstadt, Alemanha. Os iniciadores usados (300 nM), usadospara a detecção de rRNA de Ccl2, Ccl5 e18S, eram o reagente do ensaioTaqMan pré-desenvolvido da PE Biosystems.
Citometria de fluxo
As amostras totais de sangue e medula óssea foram obtidas apartir dos camundongos de todos os grupos, no final do estudo. A citometriade fluxo foi efetuada usando uma máquina FACScaIibur e o anticorpo anti-mCCR2 MC21 anteriormente caracterizado (Mack 2001). O anticorpo anti-IgG de rato biotinilado (BD Biosciences) foi usado para a detecção. UmalgG2b de rato (BD Biosciences) foi usada como um controle de isótipo.Análise estatística
Os dados foram expressos como a média ± erro padrão damédia (SEM). A comparação entre os grupos foi efetuada usando ANOVAde apenas uma variável. A correção de Posthoc Bonferroni foi usada paracomparações múltiplas. Um valor de ρ < 0,05 foi considerado indicarsignificado estatístico.Ensaio de Hibridização em Sanduíche
A quantidade de "spiegelmero" nas amostras foi quantificada porum ensaio de hibridização em sanduíche, com base em um ensaio comodescrito por Droíet et al. 2000 (Pharm Res 17:1503). As amostras de sangueforam coletadas em paralelo para acompanhar a depuração de NOX-E36 noplasma. Os tecidos selecionados foram preparados para determinar asconcentrações de "spiegelmero".Preparação da placa de hibridização
O "spiegelmero" mNOX-E36 foi quantificado usando um ensaiode hibridização em sanduíche não-validado. Resumidamente, a sonda decaptura de mNOX-E36 (Seq.lD.: 281) foi imobilizada em placas de 96cavidades DNA-BIND brancas (Corning Costar, Wiesbaden, Alemanha), a0,75 mM, em fosfato de sódio a 0,5 M, EDTA a 1 mM, pH 8,5, durante a20 noite, a 4eG. As cavidades foram lavados duas vezes e bloqueados com0,5% p/v de BSA em fosfato de sódio a 0,25 M, EDTA a 1 mM, pH 8,5, por 3h, a 37°C, lavados novamente e armazenados a 49C até o uso. Antes dahibridização, as cavidades foram pré-aquecidos para 37°C e lavados duasvezes com tampão de lavagem pré-aquecido (3xSSC, 0,5% [p/v] de dodecil25 sarcosinato de sódio, pH 7,0; antecipadamente um estoque de 20x [NaCI a 3M, NasCitrato a 0,3 M] é preparado sem a Iauroilsarcosina de sódio e diluídode forma correspondente).Preparação da amostra
Todas as amostras foram testadas em duplicata. As amostras30 plasmáticas foram descongeladas sobre gelo, redemoinhadas e giradasbrevemente em uma centrífuga de tampo de mesa esfriada. Oshomogeneizados de tecido foram congelados na TA e centrifugados 5 min.em uma velocidade máxima e na TA. Somente 5 μl de cada amostra foramremovidos para o ensaio, e mais tarde retornados para o freezer para aarmazenagem. As amostras foram diluídas com tampão de hibridização(sonda de detecção de mNOX-E36 a 8 nM [Seq.ID:282] em tampão delavagem), na TA, de acordo com o seguinte esquema:
1:30 5 μl de amostra + 145 μl de tampão de hibridização1:300 20 μl 1:30 + 180 μl de tampão de hibridização1:3000 20 μl 1:300 + 180 μl de tampão de hibridização1:30000 20 μl 1:3000 + 180 μl de tampão de hibridização
Todas as diluições da amostra foram testadas. O padrão demNOX-E36 foi diluído em série até uma curva de calibração de ponto 8,alcançando a faixa de 0-4 nM. Nenhuma amostra de QC foi preparada etestada. O padrão de calibração era idêntico àquele das amostras em estudo.
Hibridização e detecção
As amostras foram aquecidas por 10 min. a 95-C e esfriadaspara 37°C. Os complexos de "spiegelmero"/sonda de detecção foramanelados às sondas de captura imobilizadas, por 30 min., a 37°C. Os"spiegelmeros" não-ligados foram removidos por lavagem duas vezes comtampão de lavagem e 1x TBST (Tris-CI a 20 mM, NaCI a 137 mM, 0,1%Tween 20, pH 7,5), respectivamente. Os complexos hibridizados foramdetectados por estreptavidina fosfatase alcalina diluídas 1:5000 em 1x TBST,por 1 h, na temperatura ambiente. Para remover o conjugado não-ligado, ascavidades foram lavados novamente com 1x TBST e Tris-Cl a 20 mM,MgCI2 a 1 mM, pH 9,8 (duas vezes cada). As cavidades foram finalmenteenchidos com 100 ml de substrato de CSDP (Applied Biosystems, Darmstadt,Alemanha) e incubados por 45 min. na temperatura ambiente.A quimioluminescência foi medida sobre uma leitora de microplacasFLUOstar Optima (BMG Labtechnologies, Offenburg, Alemanha).
Análise dos dados
Foram usadas as seguintes diluições das amostras testadaspara a análise quantitativa de dados:
plasma de EDTA de rato 1:2000O dado obtido a partir do grupo de veículo (não foi administradonenhum "spiegelmero") foi subtraído como sinal de fundo.
O ensaio de hibridização em sanduíche, conforme descrito nestedocumento, também funciona em um modo similar para os "spiegelmeros"NOX-36, NOX-E36-5'-PEG e NOX-E36-3'-PEG, pelo que a sonda de capturade NOX-E36 respectiva (Seq.lD:255) e a sonda de detecção de NOX-E36respectiva (Seq.lD:256) têm de ser usadas (dados não mostrados).
Resultados
O mNOX-E36-3'PEG melhora a sobrevivência e a doença do rim emcamundongos MRLlpr/lpr
Os camundongos MRLlpr7lpr fêmeos desenvolveram esubseqüentemente morreram de glomerulonefrite proliferativa de complexoimune com similaridades impressionantes à nefrite por lúpus proliferativadifusa em seres humanos. Neste projeto de estudo terapêutico, oscamundongos MRLlpr/lpr tratados foram tratados com "spiegelmero" anti-mCCL2 peguilado e não-peguilado, "spiegelmero" de controle ("PoC")peguilado e não-peguiladò ou veículo a partir da semana 14 até 24 de idade.Neste ponto de tempo, os camundongos MRLlpr7lpr tratados com veículo, PoCou PoC-PEG mostraram glomerulonefrite proliferativa difusa, caracterizadapor infiltração de macrófagos glomerulares e um infiltrado misto de célulasinflamatórias periglomerulares e intersticiais consistindo em macrófagospositivos para Mac2 glomerulares e intersticiais e linfócitos positivos paraCD3 intersticiais (Figuras 34 e 35). O mNOX-E36-3'PEG melhorou o índicede atividade e cronicidade da nefrite por lúpus e também os marcadoresantes mencionados da inflamação renal (Figura 35). A molécula não-peguilada mNOX-E36 foi menos efetiva sobre o índice de cronicidade e ascontagens de macrófagos e células T intersticiais (Figura 35). A doença dorim crônica avançada foi adicionalmente ilustrada por atrofia tubular e áreasconfluentes de fibrose intersticial nos camundongos tratados com veículo,PoC, e PoC-PEG (Figura 34). Aplicando-se a morfometria para quantificarestas alterações, verificou-se que o mNOX-E36 peguilado e não-peguiladoreduziu o volume intersticial, o dano da célula tubular, e a dilatação tubular,todos sendo marcadores da gravidade e do prognóstico de doença de rimcrônica (Figura 36). O mNOX-E36-3'PEG, porém não o mNOX-E36 não-peguilado, melhorou a mortalidade em 50% (Figura 37). Assim, o mNOX-E36-3'PEG pode reduzir o número de infiltrados de macrófagos e células Trenais e melhorar a nefrite por lúpus e a sobrevivência (renal) doscamundongos MRLlpr/lpr. Para estudar se o tratamento com mNOX-E36 emNOX-E36-3'PEG afeta a inflamação intra-renal nos camundongos MRLlpr/lpr,a RT-PCR em tempo real foi efetuada para avaliar os níveis de expressãodas quimiocinas pró-inflamatórias CCL2 e CCL5, as quais foramanteriormente mostradas serem progressivamente supra-reguladas nos rinsdos camundongos MRLlpr/lpr durante a progressão da doença renal (Perez deLema 2001). O tratamento com mNOX-E36 e mNOX-E36-3'PEG a partir dasemana 14 até 24 de idade reduziu a expressão renal do mRNA de CCL2 eCCL5, comparado aos controles tratados com veículo (Figura 38).Os "spiegelmeros" anti-CCL2 reduzem a lesão do tecido auto-imune extra-renal nos camundongos MRLlpr/lpr
A pele e os pulmões são também comumente afetados de lesãodo tecido auto-imune nos camundongos MRLlpr/lpr. Nos camundongostratados com veículo, a doença do pulmão auto-imune foi caracterizada porinfiltrados de células inflamatórias peribroquiolares e perivasculares1 moderados e as lesões da pele foram observadas em 60% doscamundongos (Figuras 39, 40 e 35). O mNOX-E36 e o mNOX-E36-3'PEGambos reduziram a· inflamação peribronquial e a doença da pele,comparados aos camundongos MRLlpr7lpr tratados com veículo, PoC, e PoC-PEG1 respectivamente (Figuras 39, 40 e 35). Portanto, os efeitos dos"spiegelmeros" específicos para CCL2 não estão limitados à nefrite por lúpus,porém estendem-se até outras manifestações de lesão do tecido auto-imunenos camundongos MRLlpr/lpr.
mNOX-E36 e a sfndrome Iinfoproliferatival auto-anticorpos para dsDNA, eníveis de citocina no soro nos camundongos MRlJprflpr
Os camundongos MRLlpr/lpr fêmeos desenvolvem uma síndromeIinfoproliferativa caracterizada por forte esplenomegalia e volumes delinfonodos cervicais, axilares, inguinais, e mesentéricos. O mNOX-E36 e omNOX-E36-3'PEG ambos não tiveram nenhum efeito sobre o peso dosbaços e dos Iinfonodos nos camundongos MRLlpr7lpr (Figura 41). A auto-imunidade nos camundongos MRLlpr/lpr é caracterizada pela produção deauto-anticorpos contra múltiplos antígenos nucleares, incluindo o dsDNA.Nos camundongos MRLlpr/lpr de 24 semanas de idade, os auto-anticorpos deIgG1 IgGi, IgG2a, lgG2b para dsDNA no soro estavam presentes em altosníveis. O mNOX-E36 e o mNOX-E36-3'PEG ambos não tiveram nenhumefeito sobre cada um destes auto-anticorpos para DNA (Figura 41). Adoença similar áo lúpus nos camundongos MRLlpr/lpr tratados com veículo foicaracterizada por níveis elevados no soro de IFN-α, IL-12p40, e IL-6. OmNOX-E36 e o mNOX-E36-3'PEG ambos não tiveram nenhum efeito sobrecada um destes mediadores inflamatórios (Figura 41). Assim, ambas asvariantes de mNOX-E36 não afetam a linfoproliferação, a produção de IgGanti-dsDNA, e os níveis de citocinas no soro nos camundongos MRLlpr7lpr.
Níveis de mNOX-E36 e mNOX-E36-3'PEG nõ plasma em camundongosMRllpmpr
Os níveis de mNOX-E36 e mNOX-E36-3'PEG no plasma foramdeterminados em intervalos semanais, para monitorar a exposição aofármaco durante a doença do rim progressiva dos camundongos MRLlpr7lpr.Os níveis médios no plasma de mNOX-E36 3 h após a injeção e de mNOX-E36-3'PEG 24 h após a injeção eram aproximadamente 300 nM e 1 μΜ portodo o estudo, respectivamente (Figura 42). Assim, a peguilação aumentouos níveis de mNOX-E36 no plasma e a doença do rim progressiva noscamundongos MRLlpr7lpr não modulou a farmacocinética de ambos os"spiegelmeros".
O mNOX-E36-3'PEG bloqueia a emigração de monócitos a partir da medulaóssea
A emigração de monócitos a partir da medula óssea durante ainfecção bacteriana foi mostrada envolver o receptor de quimiocina CCR2(Serbina 2006), porém a função da CCL2 no contexto de auto-imunidadepermanece hipotética. Portanto, examinou-se a população de monócitospositivos para CCR2 no sangue periférico e nas medulas ósseas emcamundongos dê grupos tratados com mNOX-E36-3'PEG e veículo decamundongos MRLlpr7lpr de 24 semanas de idade. O tratamento com mNOX-E36-3'PEG aumentou a porcentagem de células positivas para CCR2 namedula óssea de 13% para 26%, enquanto que ele reduziu esta populaçãono sangue periférico de 26 % para 11 % (Figura 43). Estes dados suportamuma função da CCL2 para a evasão de células positivas para CCR2 a partirda medula óssea, durante a doença auto-imune dos camundongos MRLlpr/lpr.
Sumário
Aplicando-se a tecnologia de "spiegelmeros", criou-se umantagonista de mCCL2 novo e específico, o qual bloqueia potentemente amCCL2 in vitro e in vivo. Na realidade, o início tardio do tratamento com o"spiegelmero" de CCL2 melhorou marcadamente a lesão avançada do tecidoauto-imune similar ao lúpus nos camundongos MRLlpr/lpr. Estes dadossuportam uma função central para a CCL2 no dano do tecido inflamatóriocrônico e identificam os "spiegelmeros" de CCL2 como uma nova substânciaterapêutieaparaalesãodoíecidoauto-imune.
Exemplo 9: Terapia da nefropatia diabética em camundongosdiabéticos nefrectomizados unilateralmente com o "spiegelmero" anti-mMCP-1
A nefropatia diabética permanece uma causa principal dedoença renal em estágio final, porque o alvejamento dos patomecanismosdependentes de angiotensina nem sempre impede a progressão da doença(Zimmet 2001; Ritz 1999; United States Renal Data System 2004; Svensson2003). Portanto, são requeridas outras estratégias de tratamento aacrescentar ao armamento terapêutico para a nefropatia diabética.
Os dados de estudos experimentais recentes relacionam aprogressão da nefropatia diabética à inflamação intra-renal (Galkina 2006;Mora 2005; Meyer 2003; Tuttle 2005). Por exemplo, o micofenolato mofetil, ometotrexato ou a irradiação reduz a excreção urinária de albumina, e aglomeruloesclerose em ratos com nefropatia diabética induzida porestreptozotocina (Yozai 2005; Utimura 2003). Mesmo assim, os mecanismosmoleculares e celulares da inflamação intra-renal na nefropatia diabéticapermanecem insatisfatoriamente caracterizados. Os pacientes comnefropatia diabética têm níveis aumentados no soro de marcadores de faseaguda da inflamação, porém isto pode não representar a inflamação intra-renal (Dalla Vestra 2005; Navarro 2003). Os pacientes com nefropatiadiabética excretam altos níveis da proteína quimiotática de monócitos 1quimiocina CC (MCP-1/CCL2) na urina, o que pode ser mais específico paraa inflamação intra-renal (Morii 2003; Tashiro 2002; Takebayashi 2006). Narealidade, a MCP-1/CCL2 é expressa pelas células mesangiais humanas,expostas a altas concentrações de glicose ou aos produtos finais de glicaçãoavançada (Ihm 1998; Yamagishi 2002). A CCL2 está envolvida no processocomplexo de múltiplas etapas de recrutamentos de leucócitos a partir doscompartimentos intravasculares para extravasculares, isto é, glomérulos e ointerstício renal (Baggiolini 1998). Na realidade, os infiltrados de macrófagossão uma verificação comum em glomeruloesclerose diabética e lesãotubulointersticial humanas e experimentais (Bohle 1991; Furuta 1993; Chow2007). Os-eamundongos-diabétieos-do tipo 1-ou-do tipo 2-deficientes àe~Gcl2têm contagens menores de macrófagos glomerulares, o que está associadoem menos lesão glomerular (Chow 2004; Chow 2006). Nestes estudos,demonstrou-se também o papel funcional da CCL2 para a patologiaglomerular de nefropatia diabética do tipo 1 e do tipo 2. Portanto, a CCL2pode representar um alvo terapêutico potencial para a nefropatia diabética, eos antagonistas de CCL2 adequados, com perfis farmacocinéticos favoráveis,devem ser validados neste contexto da doença. Neste exemplo, nósrelatamos os efeitos do "spiegelmero" anti-CCL2 PEGuiIado mNOX-E36-3'PEG em camundongos db/db diabéticos do tipo 2 com nefropatia diabéticaavançada. Nós mostramos que um "spiegelmero" anti-CCL2 seria adequadopara o tratamento de nefropatia diabética.
Animais e Protocolo Experimental
Os camundongos machos de 5 semanas de idade, C57BLKSdb/db ou C57BLKS do tipo selvagem, foram obtidos de Taconic (Ry,Dinamarca) e alojados em gaiolas de topo de filtro com um ciclo deescuridão/luz de 12 horas e acesso não limitado ao alimento e à água peladuração do estudo. As gaiolas, a fundação, os pequenos ninhos, o alimento,e a água foram esterilizados por autoclave antes do uso. Na idade de 6semanas, a uninefrectomia (camundongos "1K") ou a cirurgia simulada(camundongos "2K") foi efetuada através de uma incisão de 1 cm no flanco,conforme anteriormente descrito em camundongos db/db e do tipo selvagem(Bower 1980). Nos camundongos dos grupos de cirurgia simulada, o rim foideixado in situ. 10 semanas mais tarde, na idade de 4 meses, oscamundongos db/db 1K foram divididos em dois grupos que receberam, trêsvezes por semana, injeções subcutâneas com mNOX-E36-3'PEG ou PoC-PEG em 5% de glicose (dose, 0,9 μιτιοΙ/kg; volume de injeção, 1 ml/kg). Otratamento foi continuado por 8 semanas (até a idade de 6 meses), quandoos animais foram sacrificados e os tecidos foram obtidos para a avaliaçãohistopatológica. Todos os procedimentos experimentais tinham sidoaprovados pelas autoridades de governo locais.
Avaliação da nefropatia diabética
Todos- os-estudos- -imunoistológicos foram efetuados -sobreseções incrustadas em parafina, conforme descrito (Anders 2002). Osseguintes anticorpos foram usados como anticorpos primários: anti-Mac2 emrato (macrófagos glomerulares, Cederlane, Ontário, Canadá, 1:50), anti-Ki-67 (proliferação de células, Dianova, Hamburg, Alemanha, 1:25). Para aavaliação histopatológica, a partir de cada camundongo, as partes dos rinsforam fixadas em 10% de formalina em solução salina tamponada comfosfato e incrustadas em parafina. As seções de 3 μιτι foram coloridas comreagente de ácido periódico-Schiff ou prata seguindo as instruções dofornecedor (Bio-Optica, Milano, Itália). As lesões escleróticas glomerularesforam avaliadas usando um escore semiquantitativo, por um observador àscegas, como se segue: 0 = nenhuma lesão, 1 = < 25 % esclerótica, 2 = 25-49% esclerótica, 3 = 50-74 % esclerótica, 4 = 75-100% esclerótica,respectivamente. 15 glomérulos foram analisados por secção. Os índicespara o volume intersticial e a dilatação tubular foram determinados porsobreposição de uma grade de 100 pontos sobre 10 campos corticais denão-sobreposição, conforme descrito anteriormente (Anders 2002). Ascontagens de células intersticiais foram determinadas em 15 campos de altaenergia (hpf, 400 x) por um observador às cegas. A preparação de RNA e aRT-PCR quantitativa (TaqMan) em tempo real foram feitas a partir deglomérulos desparafinizados. Após incubação em tampão de lise (Tris-HCI a10 mM, EDTA a 0,1 mM, 2 % de SDS e 20 μg/ml de proteinase K), por 16 h,a 60SC, efetuou-se a extração de RNA à base de fenoL-clorofórmio. O RNAglomerular foi dissolvido em 10 μl de água sem RNAse. A transcriçãoreversa e a RT-PCR em tempo real a partir do RNA total do órgão eglomerular foram efetuadas conforme descrito (Anders 2002, Cohen 2002).
Os controles consistindo em ddH20 eram negativos para os genes-alvo e demanutenção. O iniciador de oligonucleotídeo (300 nM) e as sondas (100 nM)para o rRNA de mCcl2, Gapdh, e 18 S eram reagentes do ensaio TaqManpré-desenvolvidos da PE. Os iniciadores e as sondas eram da ABIBiosystems, Weiterstadt, Alemanha. A taxa de filtração glomerular (GFR) foideterminada por cinética de depuração de FITC-inulina no plasma (Sigma-Aldrich, Stêinheim, Alemanha), 5, 10, 15; 20, 35, 60, e 90 minutos após umaúnica injeção de bolo (Qi 2004). A fluorescência foi determinada comexcitação a 485 nm e leitura em emissão a 535 nm. A GFR foi calculada combase em um modelo de dois compartimentos, usando um software deadaptação à curva de regressão não-linear (GraphPad Prism, GraphPadSoftware Inc., San Diego, CA). Todos os dados são apresentados como amédia ± SEM. A comparação dos grupos foi efetuada usando ANOVA e acorreção de post-hoc Bonferroni foi usada para múltiplas comparações. Umvalor de ρ < 0,05 foi considerado indicar significado estatístico.
Resultados
O mNOX-E36-3'PEG reduz as contagens de macrófagos glomerulares e aglomeruloesclerose global em camundongos db/db nefrectomizadosunilateralmente
Quando a ausência de CCL2 funcional estiver associada com orecrutamento diminuído de macrófagos glomerulares nos camundongos db/db(Chow 2007) e o mNOX-E36-3'PEG for capaz de bloquear o recrutamento demacrófagos mediado pela CCL2 in vitro e in vivo, o mNOX-E36-3'PEG deveprejudicar o recrutamento de macrófagos renal nos camundongos db/db comnefropatia diabética do tipo 2 avançada. Para testar esta hipótese, foraminiciadas injeções subcutâneas com mNOX-E36-3'PEG ou PoC-PEG na idadede 4 meses em camundongos db/db unilateralmente nefrectomizados ("1K").O tratamento foi continuado por 8 semanas, quando os tecidos foramcoletados para a avaliação da nefropatia diabética. Durante este período, otratamento com mNOX-E36-3'PEG não afetou significativamente ascontagens de sangue branco ou plaquetas, os níveis de glicose no sangue ouo peso do corpo, que eram ambos marcadamente elevados em todos osgrupos de camundongos db/db em comparação com os camundongos BLKSnão-diabéticos (dados não mostrados). De modo interessante, o mNOX-E36-3'PEG aumentou os níveis no soro de CCL2 nos camundongos 1K db/db,indicando que o antagonista de CCL2 mantém a CCL2 na circulação (Figura44). Consistente com nossa hipótese, o mNOX-E36-3'PEG reduziusignificativamente o número de macrófagos glomerulares em 40%,comparado aos camundongos db/db tratados com PoC-PEG ou veículo,associado com menores números de células que se proliferam positivas paraKi-67 dentro do glomérulo nos camundongos db/db tratados com mNOX-E36-3'PEG (Figura 45). Estas verificações estavam associadas com uma melhorasignificativa da glomeruloesclerose diabética global nos camundongos 1Kdb/db (Figura 46). Na realidade, o tratamento com mNOX-E36-3'PEG reduziua glomeruloesclerose diabética nos camundongos 1K db/db até o grau deglomeruloesclerose presente nos camundongos db/db não-nefrectomizados("2K"), de idade correspondente (Figura 46). Estas verificações mostram queo bloqueio retardado do recrutamento de macrófagos glomerularesdependente de CCL2 com o mNOX-E36-3'PEG impede a glomeruloesclerosediabética global nos camundongos db/db diabéticos do tipo 2.O mNOX-E36-3'PEG melhora a GFR nos camundongos 1K db/db
Os efeitos benéficos do tratamento com mNOX-E36-3'PEGsobre a glomeruloesclerose diabética nos camundongos 1K db/db devemestar associados com uma GFR melhor. Foi analisada a cinética dedepuração de FITC-inulina como um marcador da GFR em camundongosdb/db (Qi 2004). Em comparação com uma GFR normal de cerca de 250ml/min. nos camundongos db/db (Qi 2004), foi verificado uma GFR reduzidade 112 ± 23 ml/min. nos camundongos 1K db/db de 6 meses de idade,injetados com PoC-PEG (Figura 47). O tratamento com mNOX-E36-3'PEGmelhorou significativamente a GFR para 231 ± 30 ml/min. nos camundongos1K db/db (p < 0,001), sugerindo que o bloqueio do recrutamento demacrófagos glomerulares dependente da CCL2 pode também melhorar afunção renal nos camundongos diabéticos do tipo 2.O mNOX-E36-3'PEG reduz as contagens de macrófagos intersticiais e alesão tubulointersticial em camundongos 1K db/db
A nefropatia diabética avançada em seres humanos estáassociada com números significativos de macrófagos intersticiais e lesãotubulointersticial (Bohle 1991). Nos camundongos 2K db/db, os infiltrados demacrófagos intersticiais e a lesão tubulointersticial significativa não ocorremantes de 8 meses de idade (Chow 2007). A uninefrectomia antecipadaacelera o desenvolvimento de patologia tubulointersticial nos camundongos-db/db (Ninichuk 2005), assim nós quantificamos os macrófagos intersticiais,a dilatação tubular e o volume intersticial como marcadores do danotubulointersticial em camundongos de todos os grupos, em 6 meses deidade. Neste ponto de tempo, os camundongos 1K db/db revelaram númerosaumentados de macrófagos intersticiais e elevações significativas dedilatação tubular e volume intersticial, comparados aos camundongos 2Kdb/db (Figura 45, Figura 48). O tratamento com mNOX-E36-3'PEG reduziuos números de macrófagos intersticiais em 53 % e também a dilataçãotubular e o volume intersticial nos camundongos 1K db/db (Figura 45, Figura48). Assim, o bloqueio do recrutamento de macrófagos renais dependenteda CCL2 também impede a lesão tubulointersticial nos camundongos db/dbdiabéticos do tipo 2.
O mNOX-E36-3'PEG reduz a expressão renal de Ccl2 nos camundongos 1Kdb/db
Os infiltrados de macrófagos aumentam as respostasinflamatórias na lesão do tecido, por exemplo, a expressão local da CCL2.Foi, portanto, formulada uma hipótese que a diminuição relacionada aomNOX-E36-3'PEG nos macrófagos renais estaria associada com menosexpressão da CCL2 renal. Foi usada a RT-PCR em tempo real paraquantificar a expressão do mRNA da CCL2 nos camundongos db/db.
O mNOX-E36-3'PEG reduziu os níveis de mRNA da CCL2 nos rins doscamundongos 1K db/db de 6 meses de idade, comparados aoscamundongos tratados com PoC-PEG de idade correspondente (Figura 49).Para avaliar adicionalmente a expressão espacial da CCL2, foi efetuada aimunocoloração para a proteína CCL2 sobre as seções renais. Noscamundongos 1K db/db, a expressão da CCL2 foi marcadamenteaumentada nos glomérulos, túbulos, e células intersticiais, comparados aoscamundongos 2K db/db ou 2K do tipo selvagem (Figura 50). O mNOX-E36-3'PEG reduziu marcadamente a coloração para a CCL2 em todos estescompartimentos, em comparação com os camundongos 1K db/db tratadoscom veículo ou PoC-PEG. Estes dados indicam que o bloqueio dorecrutamento de macrófagos renais dependente da CCL2 com o mNOX-E36-3'PEG reduz a expressão local da CCL2 nos camundongos 1K db/db.
Sumário
O conceito que a inflamação contribui para a progressão danefropatia diabética humana torna-se cada vez mais aceito (Tuttle 2005),levando a MCP-1/CCL2 como um alvo potencial para tratar esta doença nofoco. Neste exemplo* foi mostrado que o tratamento de camundongosdiabéticos nefrectomizados unilateralmente com o mNOX-E36-3'PEGreduziu os números de macrófagos glomerulares (e intersticiais) em 6 mesesde idade, associados com menos células glomerulares que se proliferam.
Além disso, a expressão renal/glomerular do mRNA da CCL2 foimarcadamente reduzida com o tratamento por mNOX-E36-3'PEG. Ademais,os números mais baixos de macrófagos glomerulares e células glomerularesque se proliferam no grupo de terapia estavam associados com a proteçãoda glomeruloesclerose global e com uma melhora significativa da taxa defiltração glomerular. Os efeitos benéficos do mNOX-E36-3'PEG sobre apatologia glomerular e a função renal nos camundongos diabéticos estãoconsistentes com aqueles estudos que usaram outros antagonistas de CCL2em outros modelos de lesão glomerular (Lloyd 1997, Hasegawa 2003, Tang1996, Wenzel 1997, Fujinaka 1997, Schneider 1999). Notadamente, o inícioretardado do bloqueio da CCL2 também reduziu os números de macrófagosintersticiais estando associados com menos patologia tubulointersticial noscamundongos 1K db/db.
Juntos, estes dados validam a CCL2 como um alvo terapêuticopromissor para a nefropatia diabética e sugerem que iniciar o bloqueio daCCL2 com um "spiegelmero" - mesmo em um estágio avançado da doença -pode ainda ser protetor.
Referências
O dado bibliográfico completo dos documentos descritos aqui,cuja descrição é incorporada por referência, se não indicado ao contrário, écomo se segue.
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As características da presente invenção, descritas no relatóriodescritivo, nas reivindicações e/ou nos desenhos, podem tantoseparadamente quanto em qualquer combinação delas ser importantes paraa realização da invenção nas suas diversas formas.Listagem de Seqüência
<110> NOXXON Pharma AG<120> MCP-I binding nucleic acids<130> N 10056 PCT<160> 285
<170> PateritIn version 3.1<210> 1<211> 76<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 1
Gln Pro Asp Ala lie Asn Ala Pro vai Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr1 5 10 15
Asn Arg Lys Ile Ser VaT Gln Arg Leu Ala ser Tyr Arg Arg Ile Thr
20 25 30
Ser ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala vai Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala
35 40 45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp vai Gln Asp Ser Met
50 55 60
Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65 70 75
<210> 2<211> 125<212> PRT<213> Mus musculus<400> 2
Gln Pro Asp Ala vai Asn Ala Pro Leu Thr Cys Cys Tyr Ser Phe Thr15 10 15
Ser Lys Met Ile Pro Met Ser Arg Leu Glu ser Tyr Lys Arg lie Thr
20 25 30
ser ser Arg Cys Pro Lys Glu Ala vai Val Phe vai Thr Lys Leu Lys35 40 45Arg Glu vai Cys Ala Asp Pro Lys Lys Glu Trp vai Gln Thr Tyr Ile
50 55 60
Lys Asn Leu Asp Arg Asn Gln Met Arg ser Glu Pro Thr Thr Leu Phe65 70 75 80
Lys Thr Ala Ser Ala Leu Arg Ser Ser Ala Pro Leu Asn vai Lys Leu
85 90 95
Thr Àrg Lys ser Glu Ala Asn Ala Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Thr
100 105 110
ser ser Thr Ser vai Gly vai Thr ser vai Thr vai Asn115 120 125
<210> 3
<211> 76
<212> prt
<213> Maca mulatta
<400> 3
Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr15 10 15
Asn Arg Lys lie Ser vai Gln Arg Leu Ala ser Tyr Arg Arg Ile Thr
20 25 30
Ser ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala vai Ile Phe Lys Thr Ile vai Ala
35 40 45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp ser Met
50 · 55 60
Asp His Leu Asp Lys Gln Ile Gln Thr Pro Lys Pro65 70 75
<210> 4<211> 76<212> PRT<213> Sus scrofa<400> 4
Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ser Pro vai Thr Cys Cys Tyr Thr Leu Thr15 10 15Ser Lys Lys Ile Ser Met Gln Arg Leu Met Ser Tyr Arg Arg vai Thr
20 25 30
Ser ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala vai lie Phe Lys Thr lie Ala Gly
35 40 45
Lys Glu lie Cys Ala Glu Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser lie
50 55 60
Ser His Leu Asp Lys Lys Asn Gln Thr Pro Lys Pro65 70 75
<210> 5<211> 76<212> PRT
<213> canis familiaris<400> 5
Gln Pro Asp Ala Ile lie Ser Pro vai Thr Cys Cys Tyr Thr Leu Thr1 5 10 15
Asn Lys Lys lie Ser Ile Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Lys Arg vai Thr
20 25 30
Ser ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala vai He Phe Lys Thr vai Leu Asn
35 40 45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp vai Gln Asp ser Met
50 55 60
Ala His Leu Asp Lys Lys Ser Gln Thr Gln Thr Ala65 70 75
<210> 6<211> 102<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus<400> 6
Gln Pro Asp Ala vai Asn Ser Pro vai Thr Cys Cys Tyr Thr Phe Thr15 10 15
Asn Lys Thr Ile Ser Val Lys Arg Leu Met Ser Tyr Arg Arg lie Asn20 25 30Ser Thr Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Met Thr Lys Leu Ala
35 40 45
Lys Gly Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ala lie
50 55 60
Ala Asn Leu Asp Lys Lys Met Gln Thr Pro Lys Thr Leu Thr ser Tyr65 70 75 80
Ser Thr Thr Gln Glu His Thr Thr Asn Leu Ser Ser Thr Arg Thr Pro
85 90 95
Ser Thr Thr Thr ser Leu100
<210> 7
<211> 76
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Gln Pro vai Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile15 10 15
Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr
20 25 30
Ser ser His Cys Pro Arg Glu Ala VaT lie Phe Lys Thr Lys Leu Asp
35 40 45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp vai Gln Asp Phe Met
50 ■ 55 60
Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu65 70 75
<210> 8<211> 74<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 8
Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg15 10 15Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Lys Cys Pro Gln Lys Ala vai Ile Phe Lys Thr Lys Leu Ala Lys Asp
35 40 45
Ile Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp vai Gln Asp ser Met Lys Tyr
50 55 60
Leu Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys Pro65 70
<210> 9<211> 76<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 9
Gln Pro Asp Ser vai Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn vai Ile15 10 15
Asn Arg Lys lie Pro Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg lie Thr
20 25 30
Asn lie Gln Cys Pro Lys Glu Ala vai Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly
35 40 45
Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp vai Arg Asp Ser Met
50 55 60
Lys His Leu Asp Gln lie Phe Gln Asn Leu Lys Pro65 70 75
<210> 10<211> 47<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA<222> (1)..(47)<223> sintético<400> 10
agcgugcccg gaguggcagg gggacgcgac cugcaauaau gcacgcu<210> 11<211> 45<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA<222> (1)..(45)<223> sintético<400> 11
agcgugcccg gaguggcagg gggacgcgac cugcaauugc acgcu<210> 12<211> 47<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA<222> (1)..(47)<223> sintético<400> 12
agcgugcccg gaguggcagg gggacgcgac cuguaauaau gcacgcu<210> 13<211> 47<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220><223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA<222> (1)..(47)<223> sintético<400> 13
agcgugcccg guguggcagg gggacgcgac cugcaauaau gcgcgcu 47
<210> 14<211> 47<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220><221> L-RNA
<222> (1)..(47)<223> sintético<400> 14
agcgugcccg gaguagcagg ggggcgcgac cugcaauaau gcacgcu 47
<210> 15<211> 45<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA<222> (1)..(45)<223> sintético<400> 15
agcgugcccg gugugguagg ggggcgcgau cuacaauugc acgcu 45
<210> 16<211> 45
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> Cl)..(45)
<223> sintético
<400> 16
agcgugcccg gugugacagg ggggcgcgac cugcauuugc acgcu
<210> 17
<211> 45
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> Cl)..C45)
<223> sintético
<400> 17
agcgugcccg guguggcagg ggggcgcgac cuguauuugc acgcu
<210> 18
<211> 47
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> Cl)··(47)<223> sintético
<400> 18
agcgugcccg gaguggcagg ggggcgcgac cugcaauaau gcacgcu 47
<210> 19
<211> 45
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(45)
<223> sintético
<400> 19
agcgugcccg guguggcagg ggggcgcgac cugcaauugc acgcu 45
<210> 20
<211> 45
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> AglutinanteMCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> Cl)..(45)
<223> sintético
<400> 20
agcaugcccg guguggcagg ggggcgcgac cugcauuugc augcu 45
<210> 21
<211> 45
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220><223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(45)
<223> sintético
<400> 21
agcgugcccg gugugguagg ggggcgcgac cuacauuugc acgcu
<210> 22
<211> 44
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> Cl)..(44)
<223> sintético
<400> 22
agugugccag cugugauggg ggggcgcgac ccauuuuaca cacu
<210> 23
<211> 43
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(43)
<223> sintético
<400> 23
agugugccag cgugaugggg gggcgcgacc cauuuuacac acu
<210> 24<211> 43<212> rna
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> l-rna
<222> (1)..(43)
<223> sintético
<400> 24
agugugcgag cgugaugggg gggcgcgacc cauuuuacau acu 43
<210> 25
<211> 43
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> l-rna
<222> (1) .. (43)
<223> sintético
<400> 25
agugugccag cgugaugggg gggcgcgacc cauuuuacau acu 43
<210> 26<211> 42
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I
<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(42)<223> sintético<400> 26
aguaugccag cgugaugggg gggcgcgacc cauuuacaua cu 42
<210> 27<211> 43<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA<222> CD..C43)<223> sintético<400> 27
agugugccag ugugaugggg gggcgcgacc cauuuuacac acu 43
<210> 28<211> 43<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220><223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA<222> (1)..(43)<223> sintético<400> 28
agcgugccag ugugaugggg gggcgcgacc cauuuuacac gcu 43
<210> 29<211> 43<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220><223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (Ι)..(43)
<223> sintético
<400> 29
acgcacgucc cucaccggug caagugaagc cgcggcucug cgu
<210> 30
<211> 43
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> Cl)..C43)
<223> sintético
<400> 30
acgcaccucc cucaccggug caagugaagc cguggcucug cgc
<210> 31
<211> 43
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> Cl)··C43)
<223> sintético
<400> 31
acgcacgucc cucaccggug caagugaagc cguggcucug cgu
<210> 32<211> 41
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-I<220>
<221> L-rna
<222> (1)..(41)
<223> sintético<400> 32
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg u<210> 33<211> 41<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-i<220>
<221> l-rna
<222> (1)..(41)
<223> sintético
<400> 33
acgcacgucc cucaccggug caagugaagc cguggcucug c
<210> 34
<211> 39
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1
<220>
<221> l-rna<222> (1)..(39)<223> sintético
<4Ό0> 34
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugc 39
<210> 35
<211> 42
<212> rna
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> l-rna
<222> (1)..(42)
<223> sintético
<400> 35
cgcacguccc ucaccggugc aagugaagcc guggcucugc gu 42
<210> 36
<211> 41
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> l-rna
<222> (1)..(41)
<223> sintético
<400> 36
cgcacguccc ucaccggugc aagugaagcc guggcucugc g 41
<210> 37
<211> 40
<212> rna
<213> Seqüência artificial<220><223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA<222> (1)..(40)
<223> sintético
<400> 37
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg
<210> 38
<211> 49
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(49)
<223> sintético
<400> 38
gugcugcgua guggaagacu accuaaugac agccgaaugc uggcagcac
<210> 39
<211> 49
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(49)
<223> sintético
<400> 39
gugcugcgua guggaagacu accuaaugac agccuaaugc uggcagcac
<210> 40<211> 49<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> Cl)..(49)
<223> sintético
<400> 40
gugcugcgua guggaagacu accuuaugac agccgaaugc uggcagcac
<210> 41
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1) .. (48)
<223> sintético
<400> 41
gugcugcgua gugaaaaacu acugccagug ggucagagcu agcagcac
<210> 42
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(48)<223> sintético<400> 42
gugcugcgga guuaaaaacu cccuaagaca ggccagagcc ggcagcac<210> 43<211> 48<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> l-rna<222> (1)..(48)<223> sintético<400> 43
gugcugcgga guugaaaacu cccuaagaca ggccagagcc ggcagcac<210> 44<211> 48<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> l-rna<222> (1)..(48)<223> sintético<400> 44
gugcugcgua guggaagacu accuaugaca gccuaaugcu ggcagcac<210> 45<211> 48<212> rna
<213> Seqüência artificial<220><223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> l-rna<222> Cl)..(48)<223> sintético<400> 45
gugcugcgga guuaaaaacu cccuaagaca ggcuagagcc ggcagcac<210> 46<211> 50<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> l-rna<222> (1)..(50)<223> sintético<400> 46
gugcugcggc gugaaaaacg cccugcgacu gcccuuuaug caggcagcac<210> 47<211> 48<212> rna
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> l-rna<222> (1)..(48)<223> sintético<400> 47
gugcugcgua gugaaaaacu accaacgacu ggcuagagcc ggcagcac<210> 48<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> CD .. (48)
<223> sintético
<400> 48
gugcugcgua gugaaagacu accugugaca gccgaaugcu ggcagcac
<210> 49
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 49
guacugcgua guuaaaaacu accaacgacu ggcuagagcc ggcagcac
<210> 50
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..C48)<223> sintético
<400> 50
gugcugcgua guuaaaaacu accaacgacu ggcuagagcc ggcagcac 48
<210> 51
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> Cl)■.(48)
<223> sintético
<400> 51
gugcugcgua guuaaaaacu accagcgaca ggcuagagcc ggcagcac 48
<210> 52
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 52
gugcugcgua guuaaaaacu accagcgacu ggcuagagcc ggcagcac 48
<210> 53
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220><223> Agl uti.nante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 53
gugcugcgua gugagaaacu accaacgacu ggcuagagcc ggcagcac
<210> 54
<211> 46
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (D (46)
<223> sintético
<400> 54
ggcugcguag uuaaaaacua ccagcgacug gcuagagccg gcagcc
<210> 55
<211> 44
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(44)
<223> sintético
<400> 55
ggcgcguagu uaaaaacuac cagcgacugg cuagagccgg cgcc
<210> 56<211> 46<212> RNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Aglutinante MCP-I<220> <221> L-RNA<222> (1)..(46)<223> sintético<400> 56
gugcgcguag uuaaaaacua ccagcgacug gcuagagccg gcgcac
<210> 57
<211> 46
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> l-rna
<222> (1)..(46)
<223> sintético
<400> 57
gugcgcguag ugagaaacua ccaacgacug gcuagagccg gcgcac
<210> 58
<211> 44
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> l-rna
<222> (1)..(44)<223> sintético
<400> 58
gugccguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg gcac
<210> 59
<211> 44
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> l-rna
<222> (1)..(44)
<223> sintético
<400> 59
guggcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg ccac
<210> 60
<211> 44
<212> rna
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> l-rna
<222> (1)..(44)
<223> sintético
<400> 60
gucgcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cgac
<210> 61
<211> 44
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220><223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> l-rna<222> (1)..(44)<223> sintético<400> 61
ugcgcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cgca<210> 62<211> 44<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> l-rna<222> (1)..(44)<223> sintético<400> 62
gcugcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cagc<210> 63<211> 44<212> rna
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> l-rna<222> (1)..(44)<223> sintético<400> 63
gcugcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cagc<210> 64<211> 44
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-i<220>
<221> l-rna
<222> (1)..(44)
<223> sintético<400> 64
ggugcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cacc 44
<210> 65
<211> 42
<212> rna
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> l-rna
<222> (1)..(42)
<223> sintético
<400> 65
uggcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc ca 42
<210> 66
<211> 42
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I
<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(42)<223> sintético
<400> 66
gcgcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc gc
<210> 67
<211> 42
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(42)
<223> sintético
<400> 67
gugcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc ac
<210> 68
<211> 42
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(42)
<223> sintético
<400> 68
gggcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc cc
<210> 69
<211> 42
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220><223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(42)
<223> sintético
<400> 69
gagcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc uc
<210> 70
<211> 42
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(42)
<223> sintético
<400> 70
cggcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc cg
<210> 71
<211> 42
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(42)
<223> sintético
<400> 71
ccgcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc gg
<210> 72<211> 42
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> l-rna
<222> (1)..(42)
<223> sintéticol
<400> 72
cagcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc ug
<210> 73
<211> 42
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> l-rna
<222> (1)..(42)
<223> sintético
<400> 73
cugcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc ag
<210> 74
<211> 39
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> l-rna
<222> (1)..(39)<223> sintético<400> 74
agcguguuag ugaagugggu ggcagguaaa ggacacgcu<210> 75<211> 39<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA<222> Cl)..(39)<223> sintético<400> 75
agcgugguag cggugugggu gguagguaaa ggccacgcu<210> 76<211> 39<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA<222> (1)..(39)<223> sintético<400> 76
agcgugauag aagagcgggu gguagguaaa ggucaggcu<210> 77<211> 39<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220><223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA<222> (1)..(39)<223> sintético<400> 77
agcguguuag guaggguggu aguaaguaaa ggacacgcu<210> 78<211> 38<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA<222» Cl)(38)<223> sintético<400> 78
agcguguuag guggguggua guaaguaaag gacacgcu<210> 79<211> 38<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA<222> (1)..(38)<223> sintético<400> 79
agcguguuag guggguggua guaaguaaag ggcacgcu<210> 80<211> 34
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(34)
<223> sintético
<400> 80
ccgcuuaggu gggugguagu aaguaaaggg gcgg
<210> 81
<211> 39
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(39)
<223> sintético
<400> 81
gcgcgagcag guggguggua gaauguaaag acucgcguc
<210> 82
<211> 34
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(34)<223> sintético
<400> 82
cguguuaggu gggugguagu aaguaaagga cacg
<210> 83
<211> 32
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> l-rna
<222> CD..C32)
<223> sintético
<400> 83
guguuaggug ggugguagua aguaaaggac ac
<210> 84
<211> 34
<212> rna
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> l-rna
<222> Cl)..(34)
<223> sintético
<400> 84
cguguuaggu gggugguagu aaguaaaggg cacg
<210> 85
<211> 32
<212> rna
<213> Seqüência artificial<220><223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(32)
<223> sintético
<400> 85
guguuaggug ggugguagua aguaaagggc ac
<210> 86
<211> 30
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> CD.. (30)
<223> sintético
<400> 86
uguuaggugg gugguaguaa guaaagggca
<210> 87
<211> 52
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(52)
<223> sintético
<400> 87
ggacgagagu gacaaaugau auaaccuccu gacuaacgcu gcgggcgaca gg
<210> 88<211> 52<212> RNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Aglutinante MCP-I<220> <221> L-RNA<222> Cl)..(52)<223> sintético<400> 88
ggaccuaucg cuaagacaac gcgcagucua cgggacauuc uccgcggaca gg
<210> 89<211> 52
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> l-rna
<222> (1)..(52)
<223> sintético
<400> 89
ggacaauugu uacccccgag agagacaaau gagacaaccu ccugaagaca gg
<210> 90
<211> 51
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> l-rna
<222> Cl)■■C51)<223> sintético
<4Õ0> 90
ggacgaaagu gagaaaugau acaaccuccu guugcugcga auccggacag g
<210> 91
<211> 50
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> Cl)..(50)
<223> sintético
<400> 91
ggacguaaaa gacgcuaccc gaaagaaugu caggagggua gaccgacagg
<210> 92
<211> 50
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(50)
<223> sintético
<400> 92
ggacuagaaa cuacaauagc ggccaguugc accgcguuau caacgacagg
<210> 93
<211> 50
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220><223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(50)
<223> sintético
<400> 93
ggacuaguca gccagugugu auaucggacg cggguuuauu uacugacagg 50
<210> 94
<211> 50
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-i<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(50)
<223> sintético
<400> 94
ggacuguccg gagugugaaa cuccccgaga ccgccagaag cggggacagg 50
<210> 95
<211> 50
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(50)
<223> sintético
<400> 95
ggacuucuau ccaggugggu gguaguaugu aaagagauag aagugacagg 50
<210> 96<211> 50
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(50)
<223> sintético
<400> 96
ggacgagagc gaacaaugau auaaccuccu gacggaaaga gaucgacagg
<210> 97
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 97
ccugugcuac acgcaguaag aagugaacgu ucaguaugug ugcacagg
<210> 98
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(48)<223> sintético
<400> 98
cgugagccag gcaccgaggg cguuaacugg cugauuggac acgacacg 48
<210> 99
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 99
cgugaacaug caagcuaagc ggggcuguug guugcuuggc ccgccacg 48
<210> 100
<211> 48
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> -RNA
<222> Cl)··(48)
<223> sintético
<400> 100
cgugcagaga gagaccaacc acguaaaauc aaccuaaugg gccgcacg 48
<210> 101
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220><223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> CD.. (48)
<223> sintético
<400> 101
cgugcagaga gagaccaacc acguaaaauc aaccuaaugg gccgcacg 48
<210> 102
<211> 48
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 102
cgugaacauu caagcuaagc ggggcuguug guugcuuggc ccgccacg 48
<210> 103
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..C48)
<223> sintético
<400> 103
cgugccgagg cggcgaccag cguuacuuag agaggcuuug gcaccacg 48
<210> 104<211> 47<212> RNA<213> seqüência artificial<220> <223> Aglutinante MCP-I<220> <221> L-RNA<222> (1)..(47)<223> sintético<400> 104
cgugauaaca gccgucgguc aagaaaacaa aguucgggcg gcgcacg 47
<210> 105
<211> 47
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(47)
<223> sintético
<400> 105
cguggguggc gcaccgaggg cgaaaagcca ccaguaaaga uagaccg 47
<210> 106
<211> 45
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I
<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(45)<223> sintético
<400> 106
cgugugaucu ccuuuggggu gauuagcuua gagacuuccc acacg
<210> 107
<211> 45
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> CD · · (45)
<223> sintético
<400> 107
gcaccuucgc cuaauacacg ugccggcuag cuaauacucg uccgc
<210> 108
<211> 45
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> Cl)··(45)
<223> sintético
<400> 108
gcacgacuug ggcgaccagu gauacuuaga gagcaagucg ucggc
<210> 109
<211> 44
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220><223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(44)
<223> sintético
<400> 109
gcgcgcgcuc aguaagaaau ugaaaguuca gaaugucguc gcgc 44
<210> 110
<211> 39
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(39)
<223> sintético
<400> 110
aguguguggc aggcuaagga gauauuccga gaccacgcu 39
<210> 111
<211> 39
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(39)
<223> sintético
<400> 111
aguguguggc agacuaugga uagacuccga gaccacgcu 39
<210> 112<211> 39
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(39)
<223> sintético
<400> 112
agcgugaggc gaccagcgga uuacuuagag agucacgcu
<210> 113
<211> 39
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> Cl)..(39)
<223> sintético
<400> 113
agcgugaagg ggaccagcgu uacuuacaga guucacgcu
<210> 114
<211> 39
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> Cl)..(39)<223> sintético
<400> 114
agcgugugau guauguagca ccguaucaga ggacacgcu 39
<210> 115
<211> 37
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(37)
<223> sintético
<400> 115
agcgugaggc gacccguguu ucguagagag ucacgcu 37
<210> 116
<211> 40
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> NOX-E36-51PEG<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(40)
<223> sintético<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(1)
<223> 5' Peguil ação
<400> 116
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg 40
<210> 117<211> 40
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> ΝΟΧ-Ε36-3'PEG<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(40)
<223> sintético<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(40)
<223> 3' Peguil ação
<400> 117
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg 40
<210> 118
<211> 58
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(58)
<223> sintético
<400> 118
gagauggcga cauugguugg gcaugaggcg aggcccuuug augaauccgc ggccauuc 58
<210> 119
<211> 56
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220><223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(56)
<223> sintético
<400> 119
gauggcgaca uugguugggc augaggcgag gcccuuugau gaauccgcgg ccauuc 56
<210> 120
<211> 53
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(53)
<223> sintético
<400> 120
ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca uuc 53
<210> 121
<211> 52
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220><223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(52)
<223> sintético
<400> 121
ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca uu 52
<210> 122<211> 50
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> C1)..C50)
<223> sintético
<400> 122
ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca
<210> 123<211> 48<212> RNA<213> seqüência artificial<220> <223> Aglutinante MCP-I<220> <221> L-RNA<222> Cl) · · C48)<223> sintético<400> 123
gcugguuacc gagggggcgu cguuggaguu ugguugguug ucaccagc
<210> 124
<211> 46
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> Cl).·C46)<223> sintético
<400> 124
cugguuaccg agggggcguc guuggaguuu gguugguugu caccag 46
<210> 125
<211> 44
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(44)
<223> sintético
<400> 125
ugguuaccga gggggcgucg uuggaguuug guugguuguc acca 44
<210> 126
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> Cl)··(48)
<223> sintético
<400> 126
gccgguuacc gagggggcgu cguuggaguu ugguugguug ucaccggc 48
<210> 127
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220><223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 127
gccggcuacc gagggggcgu cguuggaguu ugguugguug ucgccggc
<210> 128
<211> 46
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> Cl)■■(46)
<223> sintético
<400> 128
gcgcguaccg agggggcguc guuggaguuu gguugguugu ccgcgc
<210> 129
<211> 46
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(46)
<223> sintético
<400> 129
gggccuaccg agggggcguc guuggaguuu gguugguugu cggccc
<210> 130<211> 76<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> humano biotinilado D MCP-I<220>
<221> Proteína D<222> (1)..(76)<223> sintético<220>
<221> Biotinilação<222> Cl) - · CD<223> sintético<400> 130
Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro vai Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr15 10 15
Asn Arg Lys Ile ser vai Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr
20 25 30
Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala vai Ile Phe Lys Thr Ile vai Ala
35 40 45
Lys Glu lie Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp vai Gln Asp ser Met
50 55 60
Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65 70 75
<210> 131<211> 76<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> rato biotinilado d mcp-1<220>
<221> Proteína D<222> (1)..(76)<223> sintético<220>
<221> Biotinilação<222> (1)..(1)<223> sintético<220>
<221> Biotinilação<222> (76)..(76)<223> sintético<400> 131
Gln Pro Asp Ala Val Asn Ala Pro Leu Thr Cys Cys Tyr Ser Phe Thr1 5 10 15
Ser Lys Met Ile Pro Met Ser Arg Leu Glu Ser Tyr Lys Arg Ile Thr
20 25 30
Ser Ser Arg Cys Pro Lys Glu Ala vai Val Phe Val Thr Lys Leu Lys
35 40 45
Arg Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Lys Glu Trp Val Gln Thr Tyr Ile
50 55 60
Lys Asn Leu Asp Arg Asn Gln Met Arg Ser Glu Pro65 70 75
<210> 132<211> 47<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA<222> (1)..(47)<223> sintético<400> 132agcgugcccg gaguggcagg gggacgcgac cugcaauaau gcacgcu 47
<210> 133
<211> 45
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (D..C45)
<223> sintético
<400> 133
agcgugcccg gaguggcagg gggacgcgac cugcaauugc acgcu 45
<210> 134
<211> 47
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I
<400> 134
agcgugcccg gaguggcagg gggacgcgac cuguaauaau gcacgcu 47
<210> 135
<211> 47
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(47)
<223> sintético
<400> 135agcgugcccg guguggcagg gggacgcgac cugcaauaau gcgcgcu
<210> 136
<211> 47
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(47)
<223> sintético
<400> 136
agcgugcccg gaguagcagg ggggcgcgac cugcaauaau gcacgcu
<210> 137<211> 45<212> RNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Aglutinante MCP-1<220> <221> D-RNA<222> (1)..(45)<223> sintético<400> 137
agcgugcccg gugugguagg ggggcgcgau cuacaauugc acgcu
<210> 138
<211> 45
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220><221> D-RNA
<222> Cl)··(45)
<223> sintético
<400> 138
agcgugcccg gugugacagg ggggcgcgac cugcauuugc acgcu 45
<210> 139
<211> 45
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(45)<223> sintético
<400> 139
agcgugcccg guguggcagg ggggcgcgac cuguauuugc acgcu 45
<210> 140
<211> 47
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(47)
<223> sintético
<400> 140
agcgugcccg gaguggcagg ggggcgcgac cugcaauaau gcacgcu 47
<210> 141
<211> 45
<212> RNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(45)
<223> sintético
<400> 141
agcgugcccg guguggcagg ggggcgcgac cugcaauugc acgcu
<210> 142
<211> 45
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(45)
<223> sintético
<400> 142
agcaugcccg guguggcagg ggggcgcgac cugcauuugc augcu
<210> 143
<211> 45
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(45)
<223> sintético
<400> 143agcgugcccg gugugguagg ggggcgcgac cuacauuugc acgcu 45
<210> 144
<211> 44
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl).. (44)
<223> sintético
<400> 144
agugugccag cugugauggg ggggcgcgac ccauuuuaca cacu 44
<210> 145
<211> 43
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I
<220>
<221> D-RNA
<222> Cl)..(43)
<223> sintético
<400> 145
agugugccag cgugaugggg gggcgcgacc cauuuuacac acu 43
<210> 146
<211> 43
<212> RNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220><221> D-RNA
<222> (Ι)..(43)
<223> sintético
<400> 146
agugugcgag cgugaugggg gggcgcgacc cauuuuacau acu 43
<210> 147
<211> 43
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(43)
<22 3> sintético
<400> 147
agugugccag cgugaugggg gggcgcgacc cauuuuacau acu 43
<210> 148
<211> 42
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I
<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(42)
<223> sintético
<400> 148
aguaugccag cgugaugggg gggcgcgacc cauuuacaua cu 42
<210> 149
<211> 43
<212> RNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl)..(43)
<223> sintético
<400> 149
agugugccag ugugaugggg gggcgcgacc cauuuuacac acu 43
<210> 150
<211> 43
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl)..(43)
<223> sintético
<400> 150
agcgugccag ugugaugggg gggcgcgacc cauuuuacac gcu 43
<210> 151
<211> 43
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> CD..C43)
<223> sintético
<400> 151acgcacgucc cucaccggug caagugaagc cgcggcucug cgu 43
<210> 152
<211> 43
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> CD..C43)
<223> sintético
<400> 152
acgcaccucc cucaccggug caagugaagc cguggcucug cgc 43
<210> 153
<211> 43
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I
<220>
<221> D-RNA
<222> C1)..C43)
<223> sintético
<400> 153
acgcacgucc cucaccggug caagugaagc cguggcucug cgu 43
<210> 154
<211> 41
<212> RNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220><221> D-RNA
<222> (1)..(41)
<223> sintético
<400> 154
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg
<210> 155
<211> 41
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(41)
<223> sintético
<400> 155
acgcacgucc cucaccggug caagugaagc cguggcucug
<210> 156
<211> 39
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(39)
<223> sintético
<400> 156
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugc
<210> 157
<211> 42
<212> RNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(42)
<223> sintético
<400> 157
cgcacguccc ucaccggugc aagugaagcc guggcucugc gu 42
<210> 158
<211> 41
<212> RNA
<213> Seqüênci a arti fi ci al<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(41)
<223> sintético
<400> 158
cgcacguccc ucaccggugc aagugaagcc guggcucugc g 41
<210> 159
<211> 40
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl)··(40)
<223> sintético
<400> 159gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg
<210> 160
<211> 49
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> CD (49)
<223> sintético
<400> 160
gugcugcgua guggaagacu accuaaugac agccgaaugc uggcagcac
<210> 161<211> 49<212> RNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Aglutinante MCP-I<220> <221> D-RNA<222> Cl)··C49)<223> sintético<400> 161
gugcugcgua guggaagacu accuaaugac agccuaaugc uggcagcac
<210> 162
<211> 49
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220><221> D-RNA
<222> (1)..(49)
<223> sintético
<400> 162
gugcugcgua guggaagacu accuuaugac agccgaaugc uggcagcac
<210> 163
<211> 48
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 163
gugcugcgua gugaaaaacu acugccagug ggucagagcu agcagcac
<210> 164<211> 48<212> RNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Aglutinante MCP-I<220> <221> D-RNA<222> (1)·.(48)<223> sintético<400> 164
gugcugcgga guuaaaaacu cccuaagaca ggccagagcc ggcagcac<210> 165<211> 48<212> RNA<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 165
gugcugcgga guugaaaacu cccuaagaca ggccagagcc ggcagcac
<210> 166
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 166
gugcugcgua guggaagacu accuaugaca gccuaaugcu ggcagcac
<210> 167
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 167gugcugcgga guuaaaaacu cccuaagaca ggcuagagcc ggcagcac
<210> 168
<211> 50
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> CD·· (50)
<223> sintético
<400> 168
gugcugcggc gugaaaaacg cccugcgacu gcccuuuaug caggcagcac
<210> 169
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..C48)
<223> sintético
<400> 169
gugcugcgua gugaaaaacu accaacgacu ggcuagagcc ggcagcac
<210> 170
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220><221> D-RNA
<222> Cl)..(48)
<223> sintético
<400> 170
gugcugcgua gugaaagacu accugugaca gccgaaugcu ggcagcac 48
<210> 171
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> CD-.C48)
<223> sintético
<400> 171
guacugcgua guuaaaaacu accaacgacu ggcuagagcc ggcagcac 48
<210> 172
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> D-RNA
<222> Cl)·■(48)
<223> sintético
<400> 172
gugcugcgua guuaaaaacu accaacgacu ggcuagagcc ggcagcac 48
<210> 173
<211> 48
<212> RNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1).. (48)
<223> sintético
<400> 173
gugcugcgua guuaaaaacu accagcgaca ggcuagagcc ggcagcac 48
<210> 174
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 174
gugcugcgua guuaaaaacu accagcgacu ggcuagagcc ggcagcac 48
<210> 175
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1) .. (48)
<223> sintético
<400> 175gugcugcgua gugagaaacu accaacgacu ggcuagagcc ggcagcac 48
<210> 176
<211> 46
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1) .. (46)
<223> sintético
<400> 176
ggcugcguag uuaaaaacua ccagcgacug gcuagagccg gcagcc 46
<210> 177
<211> 44
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl)..(44)
<223> sintético
<400> 177
ggcgcguagu uaaaaacuac cagcgacugg cuagagccgg cgcc 44
<210> 178
<211> 46
<212> RNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220><221> D-RNA
<222> (1)..(46)
<223> sintético
<400> 178
gugcgcguag uuaaaaacua ccagcgacug gcuagagccg gcgcac
<210> 179
<211> 46
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(46)
<223> sintético
<400> 179
gugcgcguag ugagaaacua ccaacgacug gcuagagccg gcgcac
<210> 180<211> 44<212> RNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Aglutinante MCP-I<220> <221> D-RNA<222> (1)..(44)<223> sintético<400> 180
gugccguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg gcac<210> 181<211> 44<212> RNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(44)
<223> sintético
<400> 181
guggcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg ccac
<210> 182
<211> 44
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(44)
<223> sintético
<400> 182
gucgcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cgac
<210> 183
<211> 44
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(44)
<223> sintético
<400> 183ugcgcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cgca 44
<210> 184
<211> 44
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1) .. (44)
<223> sintético
<400> 184
gcugcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cagc 44
<210> 185
<211> 44
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> CD ■ · (44)
<223> sintético
<400> 185
gcugcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cagc 44
<210> 186
<211> 44
<212> RNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220><221> D-RNA
<222> (1)..(44)
<223> sintético
<400> 186
ggugcguagu gagaaacuac caacgacugg cuagagccgg cacc 44
<210> 187
<211> 40
<212> RNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1).. (40)
<223> sintético
<400> 187
uggcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc 40
<210> 188
<211> 42
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(42)
<223> sintético
<400> 188
gcgcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc gc 42
<210> 189
<211> 42
<212> RNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl)--(42)
<223> sintético
<400> 189
gugcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc ac 42
<210> 190
<211> 42
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(42)
<223> sintético
<400> 190
gggcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc cc 42
<210> 191
<211> 42
<212> RNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)(42)
<223> sintético
<400> 191gagcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc uc
<210> 192
<211> 42
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<Í222> Cl) .. (42)
<223> sintético
<400> 192
cggcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc cg
<210> 193<211> 42<212> RNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Aglutinante mcp-1<220> <221> D-RNA<222> CD..C42)<223> sintético<400> 193
ccgcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc gg
<210> 194
<211> 42
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220><221> D-RNA<222> (1)..(42)<223> sintético<400> 194
cagcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc ug 42
<210> 195
<211> 42
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl)..(42)
<223> sintético
<400> 195
cugcguagug agaaacuacc aacgacuggc uagagccggc ag 42
<210> 196
<211> 39
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(39)<223> sintético<400> 196
agcguguuag ugaagugggu ggcagguaaa ggacacgcu 39
<210> 197
<211> 39
<212> RNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl)··(39)
<223> sintético
<400> 197
agcgugguag cggugugggu gguagguaaa ggccacgcu
<210> 198
<211> 39
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl) (39)
<223> sintético
<400> 198
agcgugauag aagagcgggu gguagguaaa ggucaggcu
<210> 199
<211> 39
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl)..(39)
<223> sintético
<400> 199agcguguuag guaggguggu aguaaguaaa ggacacgcu 39
<210> 200
<211> 38
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl).. (38)
<223> sintético
<400> 200
agcguguuag guggguggua guaaguaaag gacacgcu 38
<210> 201
<211> 38
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I
<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(38)
<223> sintético
<400> 201
agcguguuag guggguggua guaaguaaag ggcacgcu 38
<210> 202
<211> 34
<212> RNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220><221> D-RNA
<222> (1)..(34)
<223> sintético
<400> 202
ccgcuuaggu gggugguagu aaguaaaggg gcgg 34
<210> 203
<211> 39
<212> RNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1).. (39)
<223> sintético
<400> 203
gcgcgagcag guggguggua gaauguaaag acucgcguc 39
<210> 204
<211> 34
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> CD · · (34)
<223> sintético
<400> 204
cguguuaggu gggugguagu aaguaaagga cacg 34
<210> 205
<211> 32
<212> RNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Aglutinante mcp-1<220> <221> D-RNA<222> (1)..(32)<223> sintético<400> 205
guguuaggug ggugguagua aguaaaggac ac
<210> 206
<211> 34
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl)..(34)
<223> sintético
<400> 206
cguguuaggu gggugguagu aaguaaaggg cacg
<210> 207
<211> 32
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(32)
<223> sintético
<400> 207guguuaggug ggugguagua aguaaagggc ac
<210> 208
<211> 30
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> CD . ■ (30)
<223> sintético
<400> 208
uguuaggugg gugguaguaa guaaagggca
<210> 209<211> 52<212> RNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Aglutinante mcp-1<220> <221> D-RNA<222> (1)..(52)<223> sintético<400> 209
ggacgagagu gacaaaugau auaaccuccu gacuaacgcu gcgggcgaca gg
<210> 210
<211> 52
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220><221> D-RNA
<222> Cl)..(52)
<223> sintético
<400> 210
ggaccuaucg cuaagacaac gcgcagucua cgggacauuc uccgcggaca gg 52
<210> 211
<211> 52
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<22B> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> CD-.C52)
<223> sintético
<400> 211
ggacaauugu uacccccgag agagacaaau gagacaaccu ccugaagaca gg 52
<210> 212
<211> 51
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl)-.(51)
<223> sintético
<400> 212
ggacgaaagu gagaaaugau acaaccuccu guugcugcga auccggacag g 5i
<210> 213
<211> 50
<212> RNA<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(50)
<223> sintético
<400> 213
ggacguaaaa gacgcuaccc gaaagaaugu caggagggua gaccgacagg
<210> 214
<211> 50
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(50)
<223> sintético
<400> 214
ggacuagaaa cuacaauagc ggccaguugc accgcguuau caacgacagg
<210> 215
<211> 50
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(50)
<223> sintético
<400> 215227
ggacuaguca gccagugugu auaucggacg cggguuuauu uacugacagg 50
<210> 216
<211> 50
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> CD..C50)
<223> sintético
<400> 216
ggacuguccg gagugugaaa cuccccgaga ccgccagaag cggggacagg 50
<210> 217
<211> 50
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(50)
<223> sintético
<400> 217
ggacuucuau ccaggugggu gguaguaugu aaagagauag aagugacagg 50
<210> 218
<211> 50
<212> RNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220><221> D-RNA
<222> (1)..(50)
<223> sintético
<400> 218
ggacgagagc gaacaaugau auaaccuccu gacggaaaga gaucgacagg 50
<210> 219
<211> 48
<212> RNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1).. (48)
<223> sintético
<400> 219
ccugugcuac acgcaguaag aagugaacgu ucaguaugug ugcacagg 48
<210> 220
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 220
cgugagccag gcaccgaggg cguuaacugg cugauuggac acgacacg 48
<210> 221
<211> 48
<212> RNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 221
cgugaacaug caagcuaagc ggggcuguug guugcuuggc ccgccacg 48
<210> 222
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüênci a arti fi ci al<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl)·-C48)
<223> sintético
<400> 222
cgugcagaga gagaccaacc acguaaaauc aaccuaaugg gccgcacg 48
<210> 223
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl)C48)
<223> sintético
<400> 223cgugcagaga gagaccaacc acguaaaauc aaccuaaugg gccgcacg
<210> 224
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 224
cgugaacauu caagcuaagc ggggcuguug guugcuuggc ccgccacg
<210> 225<211> 48<212> RNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Aglutinante MCP-I<220> <221> D-RNA<222> Hj OO<223> sintético<400> 225
cgugccgagg cggcgaccag cguuacuuag agaggcuuug gcaccacg
<210> 226
<211> 47
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220><221> D-RNA
<222> (1)..(47)
<223> sintético
<400> 226
cgugauaaca gccgucgguc aagaaaacaa aguucgggcg gcgcacg
<210> 227
<211> 47
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> D-RNA
<222> Cl)·■(47)
<223> sintético
<400> 227
cguggguggc gcaccgaggg cgaaaagcca ccaguaaaga uagaccg
<210> 228
<211> 45
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(45)
<223> sintético
<400> 228
cgugugaucu ccuuuggggu gauuagcuua gagacuuccc acacg
<210> 229
<211> 45
<212> RNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(45)
<223> sintético
<400> 229
gcaccuucgc cuaauacacg ugccggcuag cuaauacucg uccgc
<210> 230
<211> 45
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(45)
<223> sintético
<400> 230
gcacgacuug ggcgaccagu gauacuuaga gagcaagucg ucggc
<210> 231
<211> 44
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(44)
<223> sintético
<400> 231gcgcgcgcuc aguaagaaau ugaaaguuca gaaugucguc gcgc 44
<210> 232
<211> 39
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl). .(39)
<223> sintético
<400> 232
aguguguggc aggcuaagga gauauuccga gaccacgcu 39
<210> 233
<211> 39
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(39)
<223> sintético
<400> 233
aguguguggc agacuaugga uagacuccga gaccacgcu 39
<210> 234
<211> 39
<212> RNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220><221> D-RNA
<222> (Ι)..(39)
<223> sintético
<400> 234
agcgugaggc gaccagcgga uuacuuagag agucacgcu 39
<210> 235
<211> 39
<212> RNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1).. (39)
<223> sintético
<400> 235
agcgugaagg ggaccagcgu uacuuacaga guucacgcu 39
<210> 236
<211> 39
<212> RNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(39)
<223> sintético
<400> 236
agcgugugau guauguagca ccguaucaga ggacacgcu 39
<210> 237
<211> 37
<212> RNA<213> Seqüência artificial<220> <223> Aglutinante MCP-I<220> <221> D-RNA<222> Cl).·(37)<223> sintético<400> 237
agcgugaggc gacccguguu ucguagagag ucacgcu
<210> 238
<211> 40
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
' <222> (1)..(40)
<223> sintético<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(40)
<223> 5' Peguilação
<400> 238
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg
<210> 239
<211> 40
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220><221> D-RNA
<222> Cl)..(40)
<223> sintético<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(40)
<223> 3'-Peguil ação
<400> 239
gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg 40
<210> 240
<211> 58
<212> RNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(58)
<223> sintético
<400> 240
gagauggcga cauugguugg gcaugaggcg aggcccuuug augaauccgc ggccauuc 58
<210> 241
<211> 56
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(56)
<223> sintético
<400> 241gauggcgaca uugguugggc augaggcgag gcccuuugau gaauccgcgg ccauuc 56
<210> 242
<211> 53
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1) . . (53)
<223> sintético
<400> 242
ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca uuc 53
<210> 243
<211> 52
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(52)
<223> sintético
<400> 243
ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca uu 52
<210> 244
<211> 50
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220><221> D-RNA<222> Cl)..(50)<223> sintético<400> 244
ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca 50
<210> 245 <211> 48 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Aglutinante MCP-I <220> <221> D-RNA <222> CD..C48) <223> sintético <400> 245 gcugguuacc gagggggcgu cguuggaguu <210> 246 <211> 46 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Aglutinante MCP-I <220> <221> D-RNA <222> Cl).. C46) <223> sintético <400> 246 cugguuaccg agggggcguc guuggaguuu <210> 247 <211> 44 <212> RNA<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> Cl)..(44)
<223> sintético
<400> 247
ugguuaccga gggggcgucg uuggaguuug guugguuguc acca
<210> 248
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 248
gccgguuacc gagggggcgu cguuggaguu ugguugguug ucaccggc
<210> 249
<211> 48
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(48)
<223> sintético
<400> 249gccggcuacc gagggggcgu cguuggaguu ugguugguug ucgccggc 48
<210> 250<211> 46<212> RNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA<222> (1).. (46)<223> sintético<400> 250
gcgcguaccg agggggcguc guuggaguuu gguugguugu ccgcgc 46
<210> 251<211> 46<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> D-RNA
<222> (1)..(46)<223> sintético<400> 251
gggccuaccg agggggcguc guuggaguuu gguugguugu cggccc 46
<210> 252<211> 76<212> PRT<213> Rattus rattus<400> 252
Gln Pro Asp Ala vai Asn Ala Pro Leu Thr Cys Cys Tyr Ser Phe Thr1 5 10 15Gly Lys Met Ile Pro Met Ser Arg Leu Glu Asn Tyr Lys Arg Ile Thr
20 25 30
Ser ser Arg Cys Pro Lys Glu Ala Val Val Phe vai Thr Lys Leu Lys
35 40 45
Arg Glu Ile Cys Ala Asp Pro Asn Lys Glu Trp vai Gln Lys Tyr lie
50 55 60
Arg Lys Leu Asp Gln Asn Gln Val Arg Ser Glu Thr65 70 75
<210> 253<211> 50<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante MCP-I<220>
<221> L-RNA<222> Cl)..(50)<223> sintético<220>
<221> L-RNA<222> (1)..(50)<223> 5'-Peguil ação<400> 253
ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca<210> 254<211> 50<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aglutinante mcp-1<220>
<221> L-RNA<222> (1)..(50)
<223> sintético<220>
<221> L-RNA
<222> CD .. C50)
<223> 3'-Peguil ação
<400> 254
ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca 50
<210> 255
<211> 11
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> sonda de captura NOX-E36<220>
<221> L-DNA
<222> CD . · Cll)
<223> sintético<220>
<221> L-DNA
' <222> Cl)..Cll)
<223> -CEspaçadorl8)2-nh4+ a 3' fim
<400> 255
gagggacgtg c 11
<210> 256
<211> 9
<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Sonda de detecção NOX-E36<220>
<221> L-DNA<222> Cl)..(9)<223> sintético<220>
<221> L-DNA
<222> (1)..(9)
<223> 5'- Biotina-(Espaçadorl8)
<400> 256cgcagagcc
<210> 257
<211> 73
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> CCL1/I-309
<220>
<221> L-Proteina<222> (1)..(73)<223> sintético<400> 257
Lys Ser Met Gln Val Pro Phe Ser Arg Cys Cys Phe Ser Phe Ala Glu1 5 10 15
Gln Glu Ile Pro Leu Arg Ala Ile Leu Cys Tyr Arg Asn Thr Ser Ser
20 25 30
Ile Cys Ser Asn Glu Gly Leu Ile Phe Lys Leu Lys Arg Gly Lys Glu35 40 45
Ala Cys Ala Leu Asp Thr Val Gly Trp Val Gln Arg His Arg Lys Met
50 55 60
Leu Arg His Cys Pro Ser Lys Arg Lys65 70
<210> 258<211> 69<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> CCL3/MIP-1?<220>
<221> L-Proteina<222> Cl)·69)<223> sintético<400> 258
Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser1 5 10 15
Arg Gln lie Pro Gln Asn Phe lie Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser
20 25 30
Gln Cys Ser Lys Pro Gly vai Ile Phe Leu Thr Lys Arg ser Arg Gln
35 40 45
Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp vai Gln Lys Tyr vai Ser Asp
50 55 60
Leu Glu Leu Ser Ala65
<210> 259<211> 69<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> CCL4/MIP-lbeta<220>
<221> L-Proteina<222> (1)..(69)<223> sintético<400> 259
Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr1 5 10 15Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val vai Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser
20 25 30
ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala vai vai Phe Gln Thr Lys Arg ser Lys
35 40 45
Gln vai Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser Trp vai Gln Glu Tyr vai Tyr
50 55 60
Asp Leu Glu Leu Asn65
<210> 260<211> 68<212> PRT
<213> seqüênci a arti fi ci al<220>
<223> CCL5/RANTES<220>
<221> L-Proteina<222> Cl)..(68)<223> sintético<400> 260
Ser Pro Tyr Ser ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala1 5 10 15
Arg Pro Leu Pro Arg Ala His lie Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly
20 25 30
Lys Cys Ser Asn Pro Ala vai vai Phe vai Thr Arg Lys Asn Arg Gln
35 40 45
vai Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser
50 55 60
Leu Glu Met Ser65
<210> 261<211> 82<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> CCL13/MCP-4<220>
<221> L-Proteina<222> (1)..(82)<223> sintético<400> 261
Phe Asn Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ala Leu Asn vai Pro Ser15 10 15
Thr Cys Cys Phe Thr Phe Ser Ser Lys Lys lie Ser Leu Gln Arg Leu
20 25 30
Lys ser Tyr vai lie Thr Thr Ser Arg Cys Pro Gln Lys Ala vai Ile
35 40 45
Phe Arg Thr Lys Leu Gly Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys
50 55 60
Trp vai Gln Asn Tyr Met Lys His Leu Gly Arg Lys Ala His Thr Leu65 70 75 80
Lys Thr
<210> 262
<211> 74
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> CCL14/HCC-1<220>
<221> L-Proteina
<222> (1)(74)
<223> sintético
<400> 262Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr His Pro Ser Glu Cys1 5 10 15
Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys Ile Pro Arg Gln Arg Ile Met Asp20 25 30
Tyr Tyr Glu Thr Asn ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly lie vai Phe Ile35 40 45
Thr Lys Arg Gly His Ser VaT Cys Thr Asn Pro Ser Asp Lys Trp vai
50 55 60
Gln Asp Tyr lie Lys Asp Met Lys Glu Asn65 70
<210> 263<211> 73<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> CXCLl/GROal pha<220>
<221> L-Proteina<222> Cl)·(73)<223> sintético<400> 263
Ala Ser vai Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln1 5 10 15
Gly lie His Pro Lys Asn Ile Gln Ser vai Asn Val Lys Ser Pro Gly20 25 30
Pro His Cys Ala Gln Thr Glu vai lie Ala Thr Leu Lys Asn Gly Arg
35 40 45
Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Ile Val Lys Lys Ile lie Glu50 55 60
Lys Met Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn65 70
<210> 264<211> 73<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> CXCL2/GR0beta<220>
<221> L-Proteina<222> (1)..(73)<223> sintético<400> 264
Ala Pro Leu Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln15 10 15
Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Lys vai Lys ser Pro Gly
20 25 30
Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Gln
35 40 45
Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met vai Lys Lys lie Ile Glu
50 55 60
Lys Met Leu Lys Asn Gly Lys Ser Asn65 70
<210> 265<211> 73<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> CXCL3/GR0gama<220>
<221> L-Proteina<222> C1)..C73)<223> sintético<400> 265Ala ser vai vai Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln1 5 10 15
Gly Ile His Leu Lys Asn lie Gln Ser vai Asn vai Arg Ser Pro Gly
20 25 30
Pro His Cys Ala Gln Thr Glu vai Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Lys
35 40 45
Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser pro Met Val Gln Lys lie Ile Glu
50 55 60
Lys Ile Leu Asn Lys Gly Ser Thr Asn65 70
<210> 266<211> 70<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> CXCL4/PF4<220>
<221> L-Proteina<222> (1)..(70)<223> sintético<400> 266
Glu Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gln Cys Leu Cys vai Lys Thr Thr1 5 10 15
Ser Gln Val Arg Pro Arg His Ile Thr Ser Leu Glu Val lie Lys Ala
20 25 30
Gly Pro His Cys Pro Thr Ala Gln Leu lie Ala Thr Leu Lys Asn Gly
35 40 45
Arg Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile
50 55 60
Lys Lys Leu Leu Glu ser65 70
<210> 267<211> 77<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> CXCL5/ENA-78<220>
<221> L-Proteina<222> (1)..(77)<223> sintético<400> 267
Gly Pro Ala Ala Ala Val Leu Arg Glu Leu Arg Cys Val Cys Leu Gln15 10 15
Thr Thr Gln Gly Val His Pro Lys Met Ile Ser Asn Leu Gln Val Phe
20 25 30
Ala Ile Gly Pro Gln Cys Ser Lys Val Glu Val Val Ala Ser Leu Lys
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Ile Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Phe Leu Lys Lys
50 55 60
Val Ile Gln Lys Ile Leu Asp Gly Gly Asn Lys Glu Asn65 70 75
<210> 268<211> 77<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> CXCL6/GCP-2<220>
<221> L-Proteina<222> (1)..(77)<223> sintético<400> 268Gly Pro vai Ser Ala vai Leu Thr Glu Leu Arg Cys Thr Cys Leu Arg1 5 10 15
Val Thr Leu Arg vai Asn Pro Lys Thr lie Gly Lys Leu Gln vai Phe
20 25 30
Pro Ala Gly Pro Gln Cys Ser Lys vai Glu Val vai Ala ser Leu Lys
35 40 45
Asn Gly Lys Gln vai Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Phe Leu Lys Lys
50 55 60
Val lie Gln Lys Ile Leu Asp Ser Gly Asn Lys Lys Asn65 70 75
<210> 269<211> 94<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> CXCL7/NAP-2<220>
<221> L-Proteina<222> (1)..(94)<223> sintético<400> 269
Ser Ser Thr Lys Gly Gln Thr Lys Arg Asn Leu Ala Lys Gly Lys Glu15 10 15
Glu Ser Leu Asp Ser Asp Leu Tyr Ala Glu Leu Arg Cys Met Cys Ile
20 25 30
Lys Thr Thr Ser Gly lie His Pro Lys Asn lie Gln Ser Leu Glu vai
35 40 45
Ile Gly Lys Gly Thr His Cys Asn Gln Val Glu vai lie Ala Thr Leu
50 55 60
Lys Asp Gly Arg Lys lie Cys Leu Asp Pro Asp Ala Pro Arg Ile Lys65 70 75 80Lys Ile Val Gln Lys Lys Leu Ala Gly Asp Glu Ser Ala Asp85 90
<210> 270<211> 79<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> CXCL8/IL-8<220>
<221> L-Proteina<222> (1)..(79)<223> sintético<400> 270
Glu Gly Ala vai Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys15 10 15
Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu
20 25 30
Arg vai Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr Glu lie lie vai
35 40 45
Lys Leu ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp
50 55 60
Val Gln Arg vai vai Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser65 70 75
<210> 271<211> 103<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> CXCL9/MIG<220>
<221> L-Proteina<222> (1)..(103)<223> sintético<400> 271
Thr Pro vai vai Arg Lys Gly Arg Cys ser Cys Ile Ser Thr Asn Gln1 5 10 15
Gly Thr lie His Leu Gln ser Leu Lys Asp Leu Lys Gln Phe Ala Pro
20 25 30
Ser Pro Ser Cys Glu Lys lie Glu lie Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly
35 40 45
vai Gln Thr Cys Leu Asn Pro Asp ser Ala Asp vai Lys Glu Leu Ile
50 55 60
Lys Lys Trp Glu Lys Gln vai Ser Gln Lys Lys Lys Gln Lys Asn Gly65 70 75 80
Lys Lys His Gln Lys Lys Lys vai Leu Lys vai Arg Lys Ser Gln Arg
85 90 95
Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr100
<210> 272<211> 77<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> CXCLlO/IP-lO<220>
<221> L-Proteina<222> (1)..(77)<223> sintético<400> 272
Val Pro Leu Ser Arg Thr vai Arg Cys Thr Cys lie Ser lie Ser Asn1 5 10 15
Gln Pro vai Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu Glu Ile lie Pro Ala20 25 30ser Gln Phe Cys Pro Arg vai Glu Ile Ile Ala Thr Met Lys Lys Lys
35 40 45
Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys Ala Ile Lys Asn Leu
50 55 60
Leu Lys Ala vai Ser Lys Glu Arg Ser Lys Arg ser Pro65 70 75
<210> 273<211> 73<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> CXCLll/I-TAC<220>
<221> L-Proteina<222> Cl)..(73)<223> sintético<400> 273
Phe Pro Met Phe Lys Arg Gly Arg Cys Leu Cys Ile Gly Pro Gly vai1 5 10 15
Lys Ala vai Lys vai Ala Asp Ile Glu Lys Ala Ser Ile Met Tyr Pro
20 25 30
Ser Asn Asn Cys Asp Lys lie Glu vai Ile Ile Thr Leu Lys Glu Asn
35 ·40 45
Lys Gly Gln Arg Cys Leu Asn Pro Lys Ser Lys Gln Ala Arg Leu Ile
50 55 60
Ile Lys Lys vai Glu Arg Lys Asn Phe65 70
<210> 274<211> 72<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220><223> CXCLl2alpha/SDF-lalpha<220>
<221> L-Proteina<222> Cl).. (.72)<223> sintético<400> 274
Lys Pro vai Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu ser1 5 10 15
His vai Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro20 25 30
Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln
35 40 45
vai Cys lie Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys50 55 60
Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met65 70
<210> 275<211> 72<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> cxÇLl2beta/SDF-lbeta<220>
<221> L-Proteina<222> (1)..(72)<223> sintético<400> 275
Lys Pro Val Ser Leu ser Tyr Arg cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser1 5 10 15
His vai Ala Arg Ala Asn vai Lys His Leu Lys lie Leu Asn Thr Pro20 25 30Asn Cys Ala Leu Gln Ile vai Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln
35 40 45
Val Cys lie Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys
50 55 60
Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met65 70
<210> 276<211> 76<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> CX3CLl/Fractalci na<220>
<221> L-Proteina<222> (1)..(76)<223> sintético<400> 276
Gln His His Gly vai Thr Lys Cys Asn Ile Thr Cys Ser Lys Met Thr15 10 15
Ser Lys lie Pro Val Ala Leu Leu Ile His Tyr Gln Gln Asn Gln Ala
20 25 30
Ser Cys Gly Lys Arg Ala Ile Ile Leu Glu Thr Arg Gln His Arg Leu
35 40 45
Phe Cys Ala Asp Pro Lys Glu Gln Trp vai Lys Asp Ala Met Gln His
50 55 60
Leu Asp Arg Gln Ala Ala Ala Leu Thr Arg Asn Gly65 70 75
<210> 277<211> 93<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220><223> XCLI/Linfotactina<220>
<221> L-Proteina<222> (1)..(93)<223> artificial<400> 277
Val Gly Ser Glu vai ser Asp Lys Arg Thr Cys vai Ser Leu Thr Thr1 5 10 15
Gln Arg Leu Pro vai Ser Arg Ile Lys Thr Tyr Thr lie Thr Glu Gly20 25 30
Ser Leu Arg Ala vai Ile Phe lie Thr Lys Arg Gly Leu Lys vai Cys
35 40 45
Ala Asp Pro Gln Ala Thr Trp vai Arg Asp vai vai Arg ser Met Asp50 55 60
Arg Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln Thr Lys Pro Thr Gly65 70 75 80
Thr Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala vai Thr Leu Thr Gly85 90
<210> 278<211> 40<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> biotinilado NOX-E36
<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(40)
<223> sintético<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(40)
<223> 5' Blotin<400> 278
gcàcgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg 40
<210> 279
<211> 40
<212> RNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> POC<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(40)
<223> sintético
<400> 279
uaaggaaacu cggucugaug cgguagcgcu gugcagagcu 40
<210> 280
<211> 40
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> POC-PEG<220>
<221> L-RNA
<222> (1)..(40)
<223> sintético<220>
<221> L-RNA
<222> CD · · C40)
<223> 5' Peguilação
<400> 280
uaaggaaacu cggucugaug cgguagcgcu gugcagagcu 40
<210> 281
<211> 11<212> DNA<213> Seqüência artificial<220> <223> mSonda de captura NOX-E36<220> <221> L-DNA<222> Cl) · · Cll)<223> sintético<220> <221> L-DNA<222> Cl). · Cll)<223> 3' -CEspaçadorl8)2-NH4+<400> 281
ccaatgtcgc c<210> 282
<211> 9<212> DNA<213> Seqüência artificial<220> <223> mSonda de detecção NOX-E36<220> <221> L-DNA<222> Cl) · · C9)<223> sintético<220> <221> L-DNA<222> Cl)··C9)<223> 5'- Biotina-CEspaçadorl8)2<400> 282
cgcagagcc<210> 283<211> 76<212> PRT
<213> Equus cabalIus<400> 283
Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ser Pro Val Thr Cys Cys Tyr Thr Phe Thr1 5 10 15
Gly Lys Lys Ile Ser Ser Gln Arg Leu Gly Ser Tyr Lys Arg Val Thr
20 25 30
Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Leu Ala
35 40 45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Glu Gln Lys Trp Val Gln Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gln Leu Asp Lys Lys Ala Gln Thr Pro Lys Pro65 70 75
<210> 284<211> 76<212> PRT<213> Bos Taurus<400> 284
Gln Pro Asp Ala He Asn Ser Gln Val Ala Cys Cys Tyr Thr Phe Asn1 5 10 15
Ser Lys Lys Ile Ser Met Gln Arg Leu Met Asn Tyr Arg Arg Val Thr
20 25 30
Ser Ser llys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Leu Gly
35 40 45
Lys Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Ile
50 55 60
Asn Tyr Leu Asn Lys Lys Asn Gln Thr Pro Lys Pro65 70 75
<210> 285<211> 125<212> PRT<213> Rattus norvegicus<400> 285
Gln Pro Asp Ala Val Asn Ala Pro Leu Thr Cys Cys Tyr Ser Phe Thr1 5 10 15
Gly Lys Met Ile Pro Met Ser Arg Leu Glu Asn Tyr Lys Arg Ile Thr5 20 25 30
Ser ser Arg Cys Pro Lys Glu Ala vai vai Phe vai Thr Lys Leu Lys
35 40 45
Arg Glu lie Cys Ala Asp Pro Asn Lys Glu Trp vai Gln Lys Tyr Ile50 55 60
10 Arg Lys Leu Asp Gln Asn Gln vai Arg ser Glu Thr Thr vai Phe Tyr65 70 75 80
Lys lie Ala Ser Thr Leu Arg Thr Ser Ala Pro Leu Asn vai Asn Leu
85 90 95
Thr His Lys Ser Glu Ala Asn Ala Ser Thr Leu Phe Ser Thr Thr Thr15 100 105 110
Ser ser Thr ser vai Glu vai Thr Ser Met Thr Glu Asn115 120 125

Claims (95)

1. Ácido riucléico, preferivelmente que se liga à MCP-1, selecio-nado a partir do grupo que compreende os ácidos nucléicos do tipo 1Â, osácidos nucléicòs do tipo 1B, os ácidos nucléicos do tipo 2, os ácidos nucléi-cos do tipo 3, os ácidos nucléicos do tipo 4 e os ácidos nucléicos tendo umaseqüência de ácidos nucléicos de acordo com quaisquer de SEQ. ID. Ns: 87a 115.
2. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, pelo que oácido nucléico do tipo 1A compreende, na direção 5'-»3\ uma primeira Caixade extensão B1A, uma segunda Caixa de extensão B2, uma terceira Caixade extensão B3, uma quarta Caixa de extensão B4, uma quinta Caixa deextensão B5, uma sexta Caixa de extensão B6 e uma sétima Caixa de ex-tensão B1B, pelo quea primeira Caixa de extensão B1A e a sétima Caixa de extensãoB1B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com a hibridiza-ção, forma-se uma estrutura de filamento duplo,a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüênciade nucleotídeos de AGCRUG,a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma seqüênciade nucleotídeos de CCCGGW,a terceira Caixa de extensão B3 compreende uma seqüência denucleotídeos de GUR,a quarta Caixa de extensão B4 compreende uma seqüência denucleotídeos de RYA,a quinta Caixa de extensão B5 compreende uma seqüência denucleotídeos de GGGGGRCGCGAYC,a sexta Caixa de extensão B6 compreende uma seqüência denucleotídeos de UGCAAUAAUG ou URYAWUUG, ea sétima Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência denucleotídeos de CRYGCU.
3. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 2, pelo que aprimeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüência de nucleotí-deos de AGCGUG.
4. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 2 ou 3, pelo quea segunda Caixa de extensão B2 compreende uma seqüência de nucleotí-deos de CCCGGU.
5. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 2a 4, pelo que a terceira Caixa de extensão B3 compreende uma seqüênciade nucleotídeos de GUG.
6. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 2a 5, pelo que a quarta Caixa de extensão B4 compreende uma seqüência denucleotídeos de GUA.
7. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 2a 6, pelo que a quinta Caixa de extensão B5 compreende uma seqüência denucleotídeos de GGGGGGCGCGACC.
8. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 2a 7, pelo que a sexta Caixa de extensão B6 compreende uma seqüência denucleotídeos de UACAUUUG.
9. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 2a 8, pelo que a sétima Caixa de extensão B1B compreende uma seqüênciade nucleotídeos de CACGCU.
10. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-2 a 9, pelo que o ácido nucléico compreende uma seqüência de ácidos nu-cléicos de acordo com SEQ. ID. Ne: 21.
11. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, pelo que oácido nucléico do tipo 1B compreende, na direção δ'-^1, uma primeira Caixade extensão B1A, uma segunda Caixa de extensão B2, uma terceira Caixade extensão B3, uma quarta Caixa de extensão B4, uma quinta Caixa deextensão B5, uma sexta Caixa de extensão B6 e uma sétima Caixa de ex-tensão B1B, pelo quea primeira Caixa de extensão B1A e a sétima Caixa de extensãoB1B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com a hibridiza-ção, forma-se uma estrutura de filamento duplo,a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüênciade nucleotídeos de AGYRUG,a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma seqüênciade nucleotídeos de CCAGCU ou CCAGY1a térceira Caixa de extensão B3 compreende uma seqüência denucleotídeos de GUG1a quarta Caixa de extensão B4 compreende uma seqüência denucleotídeos de AUG1a quinta Caixa de extensão B5 compreende uma seqüência denucleotídeos de GGGGGGCGCGACCa sexta Caixa de extensão B6 compreende uma seqüência denucleotídeos de CAUUUUA ou CAUUUA1 ea sétima Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência denucleotídeos de CAYRCU.
12. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 11, pelo que aprimeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüência de nucleotí-deos de AGCGUG.
13. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 11 ou 12, peloque a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma seqüência de nucle-otídeos de CCAG U.
14. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-11 a 13, pelo que a sexta Caixa de extensão B6 compreende uma seqüênciade nucleotídeos de CAUUUUA.
15. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-11 a 14, pelo que a sétima Caixa de extensão B1B compreende uma se-qüência de nucleotídeos de CACGCU.
16. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-11 a 15, pelo que o ácido nucléico compreende uma seqüência de ácidosnucléicos de acordo com SEQ. ID. N9: 28 e SEQ. ID. Ns: 27.
17. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, pelo que oácido nucléico do tipo 2 compreende, na direção 5'->3\ uma primeira Caixade extensão B1A, uma segunda Caixa de extensão B2, e uma terceira Caixade extensão B1B, pelo quea primeira Caixa de extensão B1A e a terceira Caixa de exten-são B1B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com a hibri-dização, forma-se uma estrutura de filamento duplo,a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüênciade nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende ACGCA,CGCAeGCA,a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma seqüênciade nucleotídeos de CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC, ea terceira Caixa de extensão B1B compreende uma seqüênciade nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende UGCGU,UGCG e UGC.
18. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 17, pelo que asegunda Caixa de extensão B2 compreende uma seqüência de nucleotídeosde CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC.
19. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-17 a 18, pelo quea) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de ACGCA, e a terceira Caixa de extensão B1Bcompreende uma seqüência de nucleotídeos de UGCGU; oub) a primeira Caixa de extensão BtA compreende umaseqüência de nucleotídeos de CGCA, e a terceira Caixa de extensão B1Bcompreende uma seqüência de nucleotídeos de UGCG; ouc) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de GCA, e a terceira Caixa de extensão B1Bcompreende uma seqüência de nucleotídeos de UGC ou UGCG.
20. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-17 a 19, pelo que a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma se-qüência de nucleotídeos de GCA.
21. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-17 a 20 e preferivelmente a reivindicação 20, pelo que a terceira Caixa deextensão B1B compreende uma seqüência de nucleotídeos de UGCG.
22. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-17 a 21, pelo que o ácido nucléioo compreende uma seqüência de ácidosnucléicos de acordo com SEQ. ID. Ns: 37, SEQ. ID. N9: 116, SEQ? ID. Ns:-117 e SEQ. ID. Ne: 278.
23. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, pelo que oácido nucléico do tipo 3 compreende, na direção 5'->3', uma primeira Caixade extensão B1A, uma segunda Caixa de extensão B2A, uma terceira Caixade extensão B3, uma quarta Caixa de extensão B2B, uma quinta Caixa deextensão B4, uma sexta Caixa de extensão B5A, uma sétima Caixa de ex-tensão B6, uma oitava Caixa de extensão B5B e uma nona Caixa de exten-são B1B, pelo quea primeira Caixa de extensão B1A e a nona Caixa de extensãoB1B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com a hibridiza-ção, forma-se uma estrutura de filamento duplo,a segunda Caixa de extensão B2A e a quarta Caixa B2B opcio-nalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com a hibridização, forma-se uma estrutura de filamento duplo,a sexta Caixa de extensão B5A e a oitava Caixa B5B opcional-mente hibridizam uma com a outra, pelo que, com a hibridização, forma-seuma estrutura de filamento duplo, a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüênciade nucleotídeos que é selecionada a partir do grupo que compreende GUR-CUGC, GKSYGC, KBBSC e BNGC,a segunda Caixa de extensão B2A compreende uma seqüênciade nucleotídeos de GKMGU,a terceira Caixa de extensão B3 compreende uma seqüência denucleotídeos de KRRAR,a quarta Caixa de extensão B2B compreende uma seqüência denucleotídeos de ACKMC,a quinta Caixa de extensão B4 compreende uma seqüência denucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende CURYGA, CU-WAUGA, CWRMGACW e UGCCAGUG,a sexta Caixa de extensão B5A compreende uma seqüência denucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende GGY e CWGC,a sétima Caixa de extensão B6 compreende uma seqüência denucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende YAGA, CKAAUe CCUUUAU,a oitava Caixa de extensão B5B compreende uma seqüência denucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende GCYR e GCWG1ea nona Caixa de extensão B1B compreende uma seqüência denucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende GCAGCAC,GCRSMC, GSVVM e GCNV.
24. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 23, pelo que aterceira Caixa de extensão B3 compreende uma seqüência de nucleotídeosde GAGAA ou UAAAA.
25. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 23 ou 24, peloque a quinta Caixa de extensão B4 compreende uma seqüência de nucleotí-deos de CAGCGACU ou CAACGACU.
26. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 23 a 25, pelo que a quinta Caixa de extensão B4 compreende uma seqüên-cia de nucleotídeos de CAGCGACU e a Caixa B3 compreende uma seqüên-cia de nucleotídeos de UAAAA.
27. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 23 a 25, pelo que a quinta Caixa de extensão B4 compreende uma seqüên-cia de nucleotídeos de CAACGACU e a terceira Caixa de extensão B3 com-preende uma seqüência de nucleotídeos de GAGAA.
28. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 23 a 27, pelo que a sétima Caixa de extensão B6 compreende uma seqüên-cia de nucleotídeos de UAGA.
29. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 23 a 28, pelo quea) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de GURCUGC, e a nona Caixa de extensão B1Bcompreende uma seqüência de nucleotídeos de GCAGCAC; oub) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de GKSYGC1 e a nona Caixa de extensão B1Bcompreende uma seqüência de nucleotídeos de GCRSMC; ouc) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de KBBSC, e a nona Caixa de extensão B1Bcompreende uma seqüência de nucleotídeos de GSVVM; oud) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de BNGC1 e a nona Caixa de extensão B1Bcompreende uma seqüência de nucleotídeos de GCNV.
30. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 29, pelo quea) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de GUGCUGC, e a nona Caixa de extensão B1Bcompreende uma seqüência de nucleotídeos de GCAGCAC; oub) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de GUGCGC, e a nona Caixa de extensão B1Bcompreende uma seqüência de nucleotídeos de GCGCAC; ouc) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de KKSSC, e a nona Caixa de extensão B1Bcompreende uma seqüência de nucleotídeos de GSSMM; oud) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de SNGC1 e a nona Caixa de extensão B1Bcompreende uma seqüência de nucleotídeos de GCNS.
31. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 30, pelo que aprimeira Caixa de extensão BIA compreende uma seqüência de nucleotí-deos de GGGC1 e a nona Caixa de extensão B1B compreende uma seqüên-cia de nucleotídeos de GCCC.
32. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-23 a 31, pelo que a segunda Caixa de extensão B2A compreende uma se-qüência de nucleotídeos de GKMGU e a quarta Caixa de extensão B2Bcompreende uma seqüência de nucleotídeos de ACKMC.
33. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 32, pelo que asegunda Caixa de extensão B2A compreende uma seqüência de nucleotí-deos de GUAGU e a quarta Caixa de extensão B2B compreende uma se-qüência de nucleotídeos de ACUAC.
34. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-23 a 33, pelo quea) a sexta Caixa de extensão B5A compreende uma se-qüência de nucleotídeos de GGY, e a oitava Caixa de extensão B5B com-preende uma seqüência de nucleotídeos de GCYR; oub) a sexta Caixa de extensão B5A compreende uma se-qüência de nucleotídeos de CWGC, e a oitava Caixa de extensão B5B com-preende uma seqüência de nucleotídeos de GCWG.
35. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 34, pelo que asexta Caixa de extensão B5A compreende uma seqüência de nucleotídeosde GGC, e a oitava Caixa de extensão B5B compreende uma seqüência denucleotídeos de GCCG.
36. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-23 a 35, preferivelmente 34 a 35, pelo que a sexta Caixa de extensão B5Ahibridiza com os nucleotídeos GCY da oitava Caixa de extensão B5B.
37. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-23 a 26 e 28 a 36, pelo que o ácido nucléico compreende uma seqüência deácidos nucléicos de acordo com SEQ. ID. N9: 56.
38. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-23 a 25 e 27 a 36, pelo que o ácido nucléico compreende uma seqüência deácidos nucléicos selecionada a partir do grupo que compreende as seqüên-cias de ácidos nucléicos de acordo com SEQ. ID. N9: 57 a 61, SEQ. ID. Ne:-67 a 71 e SEQ. ID. Ne: 73.
39. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, pelo que oácido nucléico do tipo 4 compreende, na direção 5'->3\ uma primeira Caixade extensão B1A, uma segunda Caixa de extensão B2, uma terceira Caixade extensão B1B, pelo quea primeira Caixa de extensão B1A e a terceira Caixa de exten-são B1B opcionalmente hibridizam uma com a outra, pelo que, com a hibri-dização, forma-se uma estrutura de filamento duplo,a primeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüênciade nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende AGCGUGDU,GCGCGAG, CSKSUU, GUGUU, e UGUU;a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma seqüênciade nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende AGN-DRDGBKGGURGYARGUAAAG, AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG eCAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGA, ea terceira Caixa de extensão B1B compreende uma seqüênciade nucleotídeos selecionada a partir do grupo que compreende GNCASGCU,CUCGCGUC, GRSMSG, GRCAC, e GGCA.
40. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 39, pelo quea) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de GUGUU, e a terceira Caixa de extensão B1Bcompreende uma seqüência de nucleotídeos de GRCAC;b) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de GCGCGAG, e a terceira Caixa de extensãoB1B compreende uma seqüência de nucleotídeos de CUCGCGUC; ouc) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de CSKSUU, e a terceira Caixa de extensão B1Bcompreende uma seqüência de nucleotídeos de GRSMSG, oud) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de UGUU, e a terceira Caixa de extensão B1Bcompreende uma seqüência de nucleotídeos de GGCA, oue) a primeira Caixa de extensão B1A compreende umaseqüência de nucleotídeos de AGCGUGDU, e a terceira Caixa de extensãoB1B compreende uma seqüência de nucleotídeos de GNCASGCU.
41. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 40, pelo que aprimeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüência de nucleotí-deos de CSKSUU e a terceira Caixa de extensão B1B compreende uma se-qüência de nucleotídeos de GRSMSG.
42. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 41, pelo que aprimeira Caixa de extensão B1A compreende uma seqüência de nucleotí-deos de CCGCUU e a terceira Caixa de extensão B1B compreende umaseqüência de nucleotídeos de GGGCGG.
43. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-39 a 42, pelo que a segunda Caixa de extensão B2 compreende uma se-qüência de nucleotídeos de AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG.
44. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-39 a 43, pelo que o ácido nucléico compreende uma seqüência de ácidosnucléicos de acordo com SEQ. ID. NQ: 80.
45. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-1 a 44, pelo que o ácido nucléico é capaz de ligar uma quimiocina, pelo quea quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina, aMCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
46. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-1 a 45, pelo que o ácido nucléico é capaz de ligar uma quimiocina, pelo quea quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxinahumana, a MCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
47. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-1 a 46, pelo que o ácido nucléico é capaz de ligar a MCP-1, pelo que a MCP--1 é preferivelmente selecionada a partir do grupo que compreende a MCP-1de macaco, a MCP-1 de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, aMCP-1 canina, a MCP-1 de porco e a MCP-1 humana.
48. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-1 a 47, pelo que o ácido nucléico é capaz de ligar a MCP-1 humana.
49. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-1 a 48, preferivelmente a reivindicação 48, pelo que a MCP-1 tem uma se-qüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID Ns: 1.
50. Ácido nucléico, preferivelmente que se liga à MCP-1 de mu-rino, pelo que o ácido nucléico compreende uma seqüência de ácidos nu-cléicos de acordo com SEQ. ID. Ns: 122, SEQ. ID. Ns: 253 e SEQ. ID. N9:-254.
51. Ácido nucléico, preferivelmente que se liga à MCP-1 de mu-rino, pelo que o ácido nucléico compreende uma seqüência de ácidos nu-cléicos de acordo com SEQ. ID. Ns: 127.
52. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 50 ou 51, peloque a MCP-1 de murino compreende uma seqüência de aminoácidos de a-cordo com a SEQ ID N9: 2.
53. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-1 a 52, em que o ácido nucléico compreende uma modificação, pelo que amodificação é preferivelmente uma porção de alto peso molecular e/ou peloque a modificação preferivelmente permite modificar as características doácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 52, em ter-mos de tempo de residência no corpo animal ou humano, preferivelmente nocorpo humano,
54. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 53, pelo que amodificação é selecionada a partir do grupo compreendendo uma porção deHES e uma porção de PEG.
55. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 54, pelo que amodificação é uma porção de PEG consistindo em um PEG reto ou ramifica-do, pelo que o peso molecular da porção de PEG é preferivelmente de cercade 20 a 120 kD, mais preferivelmente de cerca de 30 a 80 kD e mais preferi-velmente ainda cerca de 40 kD.
56. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 54, pelo que amodificação é uma porção de HES, pelo que preferivelmente o peso molecu-lar da porção de HES é de cerca de 10 a 130 kD, mais preferivelmente decerca de 30 a 130 kD e mais preferivelmente ainda cerca de 100 kD.
57. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-53 a 56, pelo que a modificação é acoplada ao ácido nucléico via um ligante.
58. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-53 a 57, pelo que a modificação é acoplada ao ácido nucléico em seu nucle-otídeo 5'-terminal e/ou seu nucleotídeo 3'-terminal e/ou a um nucleotídeo doácido nucléico entre o nucleotídeo 5'-terminal e o nucleotídeo 3'-terminal.
59. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-1 a 58, pelo que os nucleotídeos do, ou os nucleotídeos que formam o, ácidonucléico são L-nucleotídeos.
60. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-1 a 59, pelo que o ácido nucléico é um L-ácido nucléico.
61. Ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações-1 a 59, pelo que a porção do ácido nucléico capaz de ligar a MCP-1 consisteem L-nucleotídeos.
62. Composição farmacêutica compreendendo um ácido nucléi-co como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 61, e opcionalmenteum constituinte adicional, pelo que o constituinte adicional é selecionado apartir do grupo que compreende excipientes farmaceuticamente aceitáveis,veículos farmaceuticamente aceitáveis e agentes farmaceuticamente ativos.
63. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 62,pelo que a composição farmacêutica compreende um ácido nucléico comodefinido em quaisquer das reivindicações 1 á 61, e um veículo farmaceuti-camente aceitável.
64. Uso de um ácido nucléico como definido em quaisquer dasreivindicações 1 a 61, para a fabricação de um medicamento.
65. Uso de acordo com a reivindicação 64, pelo que o medica-mento é para uso na medicina humana ou para uso na medicina veterinária.
66. Uso de um ácido nucléico como definido em quaisquer das0 reivindicações 1 a 61, para a fabricação de um meio diagnóstico.
67. Uso de acordo com a reivindicação 64 ou 65, pelo que o me-dicamento é para o tratamento e/ou a prevenção de uma doença ou distúrbioselecionado a partir do grupo que compreende doenças inflamatórias, doen-ças auto-imunes, encefalomielite auto-imune, acidente vascular cerebral,esclerose múltipla aguda e crônica, inflamação crônica, artrite reumatóide,doenças renais, reestenose, reestenose pós-angioplastia, reações alérgicasagudas e crônicas, reações imunológicas ou alérgicas primárias e secundá-rias, asma, conjuntivite, bronquite, câncer, aterosclerose, insuficiência cardí-aca cardiovascular arteriosclerótica ou acidente vascular cerebral, psoríase,artrite psoriática, inflamação do sistema nervoso, dermatite atópica, colite,endometriose, uveíte, distúrbios da retina, incluindo a degeneração macular,o descolamento da retina, a retinopatia diabética, a retinopatia de prematuri-dade, a retinite pigmentosa, a vitreorretinopatia proliferativa, e a coriorretino-patia serosa central; fibrose pulmonar idiopática, sarcoidose, pojimiosite,dermatomiosite, anulação da imunossupressão, reduzindo o risco de infec-ção, sepse, inflamação renal, glomerulonefrite, glomerulonefrite progressivarápida, glomerulonefrite proliferativa, nefropatia diabética, nefropatia obstru-tiva, necrose tubular aguda, e glomeruloesclerose difusa, lúpus eritematososistêmico, bronquite crônica, doença de Behcet, esclerose lateral amiotrófica(ALS), aterosclerose prematura pós doença de Kawasaki, infarto do miocár-dio, obesidade, doença crônica do fígado, doença de Peyronie, lesão docordão espinhal aguda, transplante de pulmão ou rim, miocardite, mal deAlzheimer e neuropatia, carcinoma de mama, carcinoma gástrico, câncer debexiga, câncer ovariano, hamartoma, carcinoma colorretal, adenoma colôni-co, pancreatite, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e doenças in-flamatórias dos intestinos, tais como a doença de Crohn ou a colite ulcerati-va.
68. Complexo compreendendo uma quimiocina e um ácido nu-cléico como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 61, pelo que aquimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina, aMCP-1, a MCP-2 e a MCP-3, pelo que, de preferência, o complexo é um complexo cristalino.
69. Complexo de acordo com a reivindicação 68, pelo que aquimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina hu-mana, a MCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
70. Complexo de acordo com a reivindicação 68 ou 69, pelo quea quimiocina é a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada apartir do grupo que compreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, aMCP-1 de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e aMCP-1 de porco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
71. Uso de um ácido nucléico como definido em quaisquer dasreivindicações 1 a 61, para a detecção de uma quimiocina, pelo que a quimi-ocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina, a MCP-1,a MCP-2 e a MCP-3.
72. Uso de acordo com a reivindicação 71, pelo que a quimioci-na é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, aMCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
73. Uso de acordo com a reivindicação 71 ou 72, pelo que aquimiocina é a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada apartir do grupo que compreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, aMCP-1 de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e aMCP-1 de porco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
74. Método para a triagem de um antagonista de quimiocina ouum agonista de quimiocina, compreendendo as seguintes etapas:- proporcionar um antagonista de candidato à quimiocina e/ouum agonista de candidato à quimiocina,- proporcionar um ácido nucléicó como definido em quaisquerdas reivindicações 1 a 61,- proporcionar um sistema de teste que proporcione um sinal napresença de um antagonista de quimiocina e/ou um agonista de quimiocina,e- determinar se o antagonista de candidato à quimiocina é umantagonista de quimiocina e/ou se o agonista de candidato à quimiocina éum agonista de quimiocina,pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende aeotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
75. Método de acordo com a reivindicação 74, pelo que a quimi-ocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, aMCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
76. Método de acordo com a reivindicação 74 ou 75, pelo que aquimiocina é a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada apartir do grupo que compreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, aMCP-1 de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e aMCP-1 de porco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
77. Método para a triagem de um agonista de quimiocina e/ouum antagonista de quimiocina, compreendendo as seguintes etapas:- proporcionar uma quimiocina imobilizada a uma fase, preferi-velmente uma fase sólida,- proporcionar um ácido nucléico como definido em quaisquerdas reivindicações 1 a 61, preferivelmente um ácido nucléico como definidoem quaisquer das reivindicações 1 a 52, o qual está rotulado,- adicionar um agonista de candidato à quimiocina e/ou um an-tagonista de candidato à quimiocina, e- determinar se o agonista de candidato à quimiocina é um ago-nista de quimiocina e/ou se o antagonista de candidato à quimiocina é umantagonista de quimiocina,pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende aeotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
78. Método de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pe-lo fato de que a determinação é efetuada de modo tal que seja avaliado se oácido nucléico é substituído pelo agonista de candidato à quimiocina ou porum antagonista de candidato à quimiocina.
79. Método de acordo com a reivindicação 77 ou 78, pelo que aquimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina hu-mana, a MCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
80. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 77 a 79,pelo que a quimiocina é a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente sele-cionada a partir do grupo que compreende a MCP-1 humana, a MCP-1 demacaco, a MCP-1 de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1canina e a MCP-1 de porco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
81. Kit para a detecção de uma quimiocina, compreendendo umácido nucléico como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 61, peloque a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxi-na, a MCP-1, a MCP-2 e a MCP-3.
82. Kit de acordo com a reivindicação 81, pelo que a quimiocinaé selecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina humana, aMCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
83. Kit de acordo com a reivindicação 81 ou 82, pelo que a qui-miocina é a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmente selecionada a partirdo grupo que compreende a MCP-1 humana, a MCP-1 de macaco, a MCP-1de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, a MCP-1 canina e a MCP-1de porco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP-1 humana.
84. Antagonista de quimiocina, obtenível pelo método como de-finido em quaisquer das reivindicações 74 a 80, pelo que a quimiocina é se-lecionada a partir do grupo que compreende a eotaxina, a MCP-1, a MCP-2e a MCP-3.
85. Antagonista de quimiocina de acordo com a reivindicação 84,pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende aeotaxina humana, a MCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
86. Antagonista de quimiocina de acordo com a reivindicação 84ou 85, pelo que a quimiocina é a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmen-te selecionada a partir do grupo que compreende a MCP-1 humana, a MCP--1 de macaco, a MCP-1 de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, aMCP-1 canina e a MCP-1 de porco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP--1 humana.
87. Agonista de quimiocina, obtenível pelo método como definidoem quaisquer das reivindicações 74 a 80, pelo que a quimiocina é selecio-nada a partir do grupo que compreende a eotaxina, a MCP-1, a MCP-2 e aMCP-3.
88. Agonista de quimiocina de acordo com a reivindicação 87,pelo que a quimiocina é selecionada a partir do grupo que compreende aeotaxina humana, a MCP-1 humana, a MCP-2 humana e a MCP-3 humana.
89. Agonista de quimiocina de acordo com a reivindicação 87 ou-88, pelo que a quimiocina é a MCP-1, pelo que a MCP-1 é preferivelmenteselecionada a partir do grupo que compreende a MCP-1 humana, a MCP-1de macaco, a MCP-1 de cavalo, a MCP-1 de coelho, a MCP-1 bovina, aMCP-1 canina e a MCP-1 de porco, mais preferivelmente a MCP-1 é a MCP--1 humana.
90. Método para a detecção do ácido nucléico como definido emquaisquer das reivindicações 1 a 61, em uma amostra, pelo que o métodocompreende as etapas de:f) proporcionar uma amostra contendo o ácido nucléico de acor-do com a presente invenção;g) proporcionar uma sonda de captura, pelo que a sonda de cap-tura é pelo menos parcialmente complementar a uma primeira parte do ácidonucléico como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 61, e uma son-da de detecção, pelo que a sonda de detecção é pelo menos parcialmentecomplementar a uma segunda parte do ácido nucléico como definido emquaisquer das reivindicações 1 a 61, ou, alternativamente, a sonda de captu-ra é pelo menos parcialmente complementar a uma segunda parte do ácidonucléico como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 61, e a sondade detecção é pelo menos parcialmente complementar à primeira parte doácido nucléico como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 61;h) deixar que a sonda de captura e a sonda de detecção reajamsimultaneamente ou em qualquer ordem seqüencialmente com o ácido nu-cléico como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 61, ou parte dele;i) opcionalmente detectar se a sonda de captura é hibridizada ounão com o ácido nucléico de acordo com o ácido nucléico como definido emquaisquer das reivindicações 1 a 61, proporcionado na etapa a); ej) detectar o complexo formado na etapa c) consistindo no ácidonucléico como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 61, e na sondade captura e na sonda de detecção.
91. Método de acordo com a reivindicação 90, pelo que a sondade detecção compreende um meio de detecção, e/ou pelo que a sonda decaptura pode ser imobilizada a um suporte, preferivelmente um suporte sólido.
92. Método de acordo com a reivindicação 90 ou 91, em quequalquer sonda de detecção que não seja parte do complexo é removida dareação, de modo que na etapa e) somente uma sonda de detecção que sejaparte do complexo seja detectada.
93. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 90 a 92,em que a etapa e) compreende a etapa de comparar o sinal gerado pelomeio de detecção quando a sonda de captura e a sonda de detecção foremhibridizadas na presença do ácido nucléico como definido em quaisquer dasreivindicações 1 a 61, ou parte dele, e na ausência do dito ácido nucléico ouparte dele.
94. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 90 a 93,em que o ácido nucléico a ser detectado é o ácido nucléico tendo uma se-qüência de ácidos nucléicos de acordo com as SEQ. ID. N9s: 37, 116, 117 ou 278, e a sonda de captura ou a sonda de detecção compreende uma se-qüência de ácidos nucléicos de acordo com a SEQ. ID. Ne: 255 ou a SEQ. ID.Ne: 256.
95. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 90 a 93,em que o ácido nucléico a ser detectado é o ácido nucléico tendo uma se-qüência de ácidos nucléicos de acordo com as SEQ. ID. Nss: 122, 253 ou 254, e a sonda de captura ou a sonda de detecção compreende uma se-qüência de ácidos nucléicos de acordo com a SEQ. ID. N9: 281 e a SEQ. ID.N9: 282.
BRPI0707842A 2006-02-14 2007-02-14 Ácido nucleico capaz de se ligar à mcp-1, seus usos, seu método de detecção, bem como composição farmacêutica, complexo, método para a triagem de um antagonista de quimiocina ou um agonista de quimiocina e kit para a detecção de uma quimiocina BRPI0707842B8 (pt)

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