KR20060125743A

KR20060125743A - 생체 활성형 그렐린에 특이적으로 결합하는 핵산

Info

Publication number: KR20060125743A
Application number: KR1020067009024A
Authority: KR
Inventors: 스벤 클루스만; 스테펜 헬름링; 디르크 율베르그; 크리스티안 매쉬
Original assignee: 녹손 파르마 아게
Priority date: 2003-11-10
Filing date: 2004-11-10
Publication date: 2006-12-06
Also published as: US20070031840A1; JP4823067B2; IL175443A0; CA2544805A1; NO20062663L; EP1682662A1; CN1894407A; ZA200603435B; EA200600735A1; OA13282A; US20100261291A1; AU2004291656A1; MA28153A1; BRPI0415872A; TNSN06132A1; AP2006003618A0; JP2007513608A; WO2005049828A1; CR8388A; EA009376B1

Abstract

본 발명은 생체 활성형 그렐린, 보다 바람직하게는 n-옥타노일 그렐린과 특이적으로 결합하는 핵산 및 상기 핵산의 그렐린 매개성 질환 및 장애를 진단하기 위한 용도에 관한 것이다.

생체 활성형 그렐린, 핵산

Description

생체 활성형 그렐린에 특이적으로 결합하는 핵산 {NUCLEIC ACIDS SPECIFICALLY BINDING BIOACTIVE GHRELIN}

본 발명은 생체 활성형 그렐린에 결합하는 핵산 및 생체 활성형 그렐린에 결합하여 이를 탐지하기 위한 상기 핵산의 용도에 관한 것이다.

그렐린(Ghrelin)은 성장호르몬 분비촉진제 수용체 1a (growth hormone secretagogue receptor 1a; GHSR1a)의 천연 리간드로서 동정되었다. 상기 수용체는 뇌하수체 및 뇌의 시상하부 부위에 가장 많이 분포하나, 다른 조직에서는 낮은 농도로 관찰된다. 1970년대 후반부터 분비촉진제로 명명된 합성 펩티드 및 기타 화합물들이 성장호르몬의 분비를 촉진함이 알려져왔다. 그러나, 1999년 그렐린의 발견 전까지 성장호르몬의 분비에 필수적인 천연 리간드는 알려지지 않았다. 그렐린은 28개의 아미노산으로 구성된 고염기성의 펩티드 호르몬이며, N-말단의 3번째 아미노산 (세린)에 옥타노일산 측쇄를 가졌다. 상기의 통상적이지 않은 변형은 GHS-수용체 및 그 활성간의 상호 작용에 필수적인 것이다. 그러나, 생체 시료상에서는 생체 활성형 그렐린의 한 형태인 옥타노일 그렐린 및 변형되지 않은 또는 데스-옥타 노일 그렐린 (des-octanoyl ghreln)이 혼합물 형태로 존재한다. 정제된 랫트 (rat) 그렐린의 아미노산 서열은 단백질 서열판독기 (sequencer)를 통하여 그 서열 (서열번호 19: GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR)이 결정되었다. 상응하는 인간서열 (서열번호 16; GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR)은 3번째 아미노산인 세린기 위치에 동일한 엔-옥타노일-측쇄 (n-octanoyl-side chain)를 동반하며, 두개 위치의 아미노산만이 상이할 뿐이다.

자연발생적인 엔-옥타노일기 (n-octanoyl-residue) 외에, 그렐린의 3번 아미노산 위치에 도입된 불포화되거나 분지된 옥타노일기 및 비교적 긴 지방성 측쇄도 수용체 인식을 매개한다. 수용체 상호작용 도메인 (receptor interaction domain)은 그렐린의 N-말단에 위치하며; 결실 (deletion) 연구에 따르면, 그렐린 (1-10) [서열번호 17; GSSFLSPEHQ] 및 아미노산 1-5의 최소 모티프 (motif)인 그렐린(1-5)[서열번호 18; GSSFL]는 GHSR1a를 자극하기에 충분하나, 두 경우 모두는 엔-옥타노일 잔기의 펩티드 변형이 반드시 필요함이 관찰되었다.

그렐린은 동화 단계 (anabolic state)에 해당되는 생리기능을 매개하는 것으로 밝혀졌다. 그렐린이 뇌하수체에서 성장호르몬 (GH)의 분비를 직접적으로 촉진하기도 하나, 설치류 실험에서는 그렐린이 시상하부 뉴론 (hypothalamic neuron)에 작용하여 성장 호르몬-비의존적인 피딩 (feeding) 또한 유도함이 밝혀졌다. 흥미롭게도, 그렐린의 1차 생산지는 위의 산분비선 (oxyntic gland)으로서 이는 그렐린이 위, 뇌하수체 및 시상하부 간의 호르몬 연계작용을 수행함을 나타낸다. 랫트에 그렐린의 주입시 에너지 섭취 및/또는 연료 소모상의 변화 결과로서 나타나는 체중 증가 현상은 상기의 역할을 입증한다. 게다가, 그렐린의 인체 전신 투여실험은 시험객체의 공복감을 유발하여 과식을 유도한다. 상기와 같은 연구 결과, 그렐린은 급성 및 만성 영양부족 상태의 신호로 작용하여 식욕 및 체중 조절에 결정적인 역할을 하는 것으로 유추된다. 상기 가설에 대한 추가적 증거로서, 체중 감소에 영향을 미치는 과정의 효율에 대한 최소 원인으로 작용하는 위우회로 수술 (gastric bypass) 후, 그렐린 수치뿐만 아니라 식욕도 또한 감소됨이 밝혀졌다. 프레더-윌리 증후군 (Prader-Willi syndrome) 환자의 임상 자료는 또한 상기 질환과 수반되는 이상 식욕 항진증 (hyperphagia) 및 비만이 막대한 과그렐린혈증 (hyperghrelinemia)의 결과임을 암시한다. 게다가, 그렐린은 고혈당을 유발시키고 인슐린 분비를 억제하는 것으로 나타나 그렐린이 포도당 대사에도 관여함을 나타낸다. 이러한 에너지 대사에 관여하는 상기 기능들 외에도, 그렐린은 다른 일련의 과정들에도 관여함이 알려져 있다. 다수의 신경내분비 종양 (neuroendocrine tumors)에서 발현되며, 뇌하수체로부터의 성장호르몬 분비 작용외에도 ACTH, PRL 및 코티졸 (cortisol)의 분비에도 관여하는 것으로 밝혀졌다. 건강한 사람에게 그렐린의 단회 주입은 심박출량 (cardiac output) 증가 및 혈압 강하 효과를 나타낸다. 따라서, 그렐린은 다양한 대사에서 각기 다른 작용을 나타내는 것으로 보여진다. [Kojima M et al., “그렐린은 위에서 분리되는 성장호르몬을 분비하는 아실화 펩티드이다 (Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach)" Nature, 402(6762), pp656-660, 1999; Tschp M et al., “그렐린은 설치류에서 비만을 유도한다 (ghrelin induces adiposity in rodents)", Nature, 407(6806), pp908-913, 2000; Wren AM et al., "그렐린은 인체에서 식욕을 증진하며, 음식 섭취를 증대시킨다 (Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans)", J. Clin . Endocrinol . Metab ., 86(12), p5992, 2001; Nakazato M et al., "섭취의 중심 조절에 있어서의 그렐린의 역할 (A role for ghrelin in the central regulation of feeding)", Nature, 409(6817), pp194-198, 2001; Nagaya N et al., "건강한 지원자들의 사람 그렐린의 혈액동력학적 및 호르몬성 영향 (Hemodynamic and hormonal effects of human ghrelin in healthy volunteers)", Am. J. Physiol . Regul . Integr . Comp. Physiol ., 280(5), ppR1483-1487, 2001; Volante M et al., "췌장 랑게르한스섬 세포 및 관련 내분비선 암에 의한 그렐린 및 성장호르몬 촉진 수용체의 발현 (Expression of ghrelin and of the GH secretagogue receptor by pancreatic islet cells and related endocrine tumors)", J. Clin . Endocrinol . Metab ., 87(3), pp1300-1308. 2002; Jeffery PL et al., "성장호르몬 분비 펩티드인 그렐린의 발현 및 작용과 전립선 암세포주에서의 그 수용체(Expression and action of the growth hormone releasing peptide ghrelin and its receptor in prostate cancer cell lines)" J. Endocrinol ., 172(3), ppR7-11, 2002; Egido EM, et al., "인슐린 및 췌장 소마스타틴 분비에 대한 그렐린의 저해효과 (Inhibotory effect of ghrelin on insulin and pancreatic somastatin secretion)", Eur . J. Endocrinol ., 146(2), pp241-244, 2002; Broglio F et al., "위에서 생산되는 자연 성장호르몬 촉진제인 그렐린은 인체에서 고혈당증을 유도하고 인슐린 분비를 감소시킨다(Ghrelin, a natural GH secretagogue produced by the stomach, induces hyperglycemia and reduces insulin secretion in humans)", J. Clin . Endocrinol . Metab ., 86(10), pp5083-5086, 2001; Bednarek MA, et al., "신규 성장 호르몬 분비 펩티드인 그렐린에 대한 구조-기능 연구: 그렐린의 성장호르몬 촉진 작용을 활성화하기 위한 최소 서열 연구(Structure-function studies on the new growth hormone-releasing peptide, ghrelin: minimal seqence of ghrelin necessary for activation of growth hormone secretagogue)", J. Med . Chem ., 43(23), pp4370-4376, 2000).

본 발명의 기술적 과제는 생체 활성형 그렐린의 결합 수단을 제공하는 것이며, 더욱 구체적으로는 생체 활성형 그렐린에 의해 매개되는 질환 및 장애를 치료하기 위한 치료 방법 및 이 생체 활성형 그렐린을 특이적으로 탐지하기 위한 방법들을 제공하는 것이다.

본 발명에 따라, 상기 과제는 본원에 첨부되는 독립항의 주제에 의하여 해결된다. 바람직한 구현예는 종속항에 의한다.

인간 그렐린은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 염기성 펩티드이며, 지방산 측쇄로 변형되어 있다. 이종간의 높은 펩티드 서열 상동성을 고려하여, 본원에서 사용되는 용어 ‘그렐린’은 제한하고자 함은 아니나 포유동물의 그렐린을 포함한 모든 그렐린을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물의 그렐린은 마우스, 랫트, 토끼, 햄스터 및 사람 그렐린을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다. 더욱 바람직하게는 사람 그렐린이다.

그렐린의 등전점 (pI) 측정치는 11.09이다. 그렐린은 전반적으로 고염기성의 등전점을 가졌음에도 불구하고, 수용체 결합 모티프인 GSSFL [그렐린 (1-5)]은 등전점 측정치 5.5의 산성 도메인이다. 본 발명은 핵산이 전장 그렐린으로부터 선택되며, 산성 수용체 결합 도메인을 특이적으로 인지하나 펩티드의 염기성 중앙 및 카르복시 말단 도메인은 인지하지 않는다는 놀라운 사실에 기반을 두었다. 이는 목표 분자인 그렐린 및 핵산의 모든 전하의 정전 효과 (electrostatic effect)에 관한 놀라운 발견이다. 음전하성 핵산의 목표 분자 염기성 도메인으로의 결합은 핵산의 목표 분자 산성 도메인으로의 결합과 비교시 보다 유리해야 할 것이다. 따라서, 그렐린의 염기성 부분에 결합하는 것이 아닌 목표분자의 산성 도메인에 결합하는 핵산 리간드를 선택하는 것이 동업자라면 논리적으로 예상할 수 없음은 지적되어야 한다.

아미노-말단 수용체 결합 모티프 외에, 본원에서 생체 활성형 그렐린으로 언급한 생물학적으로 활성을 갖는 그렐린은 아미노산 세린 3번의 엔-옥타노일기를 아실화한 것으로 특징화된다. 본원에서 개시된 아미노-말단 모티프 GSSFL의 핵산 리간드는 그렐린의 생체 불활성형 (bio-inactive) 또는 생체 비활성형 (non-bioinactive) 형태와 생체 활성형 (biologically acitve)을 구분되게 한다. 이 결합이 옥타노일 그룹 및 펩티드의 두 부위의 존재에 엄격하게 의존되므로 옥타노일-그렐린 (octanoyl-ghrelin)에 대한 핵산의 결합이 데스옥타노일-그렐린 (desoctanoyl-ghrelin)이 1000배 이상 과잉 존재시, 보다 바람직하게는 데스옥타노일-그렐린이 100배 이상 과잉 존재시, 매우 바람직하게는 데스옥타노일-그렐린이 10배 이상 과잉 존재시에 특이적이라는 사실은 놀라운 발견이다.

게다가, 옥타노일 그룹은 결합에 관여하지 않으며, 옥타노일-그렐린 거울상 이성체는 핵산에 의해 인지되지 않고 옥타노일기가 결합에 불충분하다는 사실에 따르면 이 결합 특성도 또한 펩티드 부분에 특이적이다.

본원에서 사용되는 바람직한 구현예 (embodiment)로서, 본원의 생체 활성형 그렐린은 바람직한 구현예로서 필수적으로 자연발생 그렐린의 모든 특성을 나타내는 그렐린이다. 특히, 본원에서 바람직한 구현예로 사용되는 생체 활성형 그렐린은 성장 호르몬의 분비를 담당하거나 분비를 촉발, 보다 바람직하게는 GHS 수용체와의 상호작용을 통하여 작용하는 모든 그렐린 및 그 그렐린 유도체를 포함한다. 바람직한 구현예로서 이와 반대로, 생체 비활성형 그렐린은 생체 활성형 그렐린과는 다른, 보다 바람직하게는 성장 호르몬의 분비를 유발하지 않는, 매우 바람직하게는 GHS 수용체와의 상호작용을 통하지 않는 그렐린이다.

본원에 개시되는 본 발명에 따른 핵산의 특성은 핵산 단독 또는 어떠한 조합으로도 사용되는 본 발명의 모든 측면에서 구현 가능하게 될 것이다.

본 발명에 따른 핵산은 본원에 개시된 특정 서열과 실질적으로 상동성을 갖는 핵산들을 모두 포함한다. 본원에서 “실질적으로 상동성을 갖는"이라는 용어는 75 % 이상, 바람직하게는 85 %, 보다 바람직하게는 90 %, 보다 더 바람직하게는 95%, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 상동성을 갖는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명에 따른 핵산은 구현예로서 본원에 개시된 특정 서열로부터 유래되는 핵산을 또한 포함한다. 용어 “유래된 (derived)"은 도 1A에 도시된 서열번호 1의 삽입 유전자좌인 Ins1 내지 Ins4와 같은 근거에 기초하여, 최장 30 뉴클레오티드의 모든 서열, 바람직하게는 최장 20 뉴클레오티드의 모든 서열, 더욱 바람직하게는 최장 10 뉴클레오티드의 모든 서열, 가장 바람직하게는 Ins1에 대한 0-3 뉴클레오티드, Ins2에 대한 0-14 뉴클레오티드, Ins3에 대한 1-3 뉴클레오티드 및 Ins4에 대한 0-2 뉴클레오티드의 모든 서열로 표기 가능하다. Ins2로 표기되는 내부 고리 IL-Ia는 가장 중요한 변형 부위로 고려된다.

본 발명에 따른 핵산은 바람직한 구현예로서 하기 식으로 또한 표기될 수 있다.

CGUGYGN (0-3) AGGYAN (0-14) AAAACN (1-3) UAARWCCGAAGGUAACCAWUCCUACN (0-2) ACG (서열번호: 1)

상기 식에서,

Y는 U 또는 C를 나타내며,

R은 A 또는 G를 나타내고,

W는 U 또는 A를 나타낸다.

상기식과 연계하여 상기 지수는 특정화된 처음 숫자부터 최종 특정된 숫자 및 그 사이의 모든 정수를 나타내는 것으로 간주되어야 한다. 즉. 예를 들어, 0-3은 0, 1, 2 및 3을 나타낸다.

따라서, 공통 서열 (consensus sequence) 서열번호 1은 다양한 구현예로서 관찰되는 다양한 길이의 삽입물을 갖는 네 개의 부위를 포함한다. 이들 부위는 삽입 유전자좌 (insertion loci)로 불리우며, 또한 Ins1 내지 Ins4로 표지된다. 도 1A의 서열번호 2로 기재된 L-NOX-B11에 따르면, Ins1은 뉴클레오티드 6 및 7 사이에 위치하고, Ins2는 뉴클레오티드 13 및 14 사이에 위치하며, Ins3은 뉴클레오티드 18 내지 20 사이에 위치하고, Ins4는 뉴클레오티드 44 및 45 사이에 위치한다. 도식화된 클론에서 관찰되듯이 개개 유전자좌의 길이는 서열번호 1 및 상기의 특정된 일반식으로 나타내어 진다.

또한, 본 발명에 따른 핵산은 바람직한 구현예로서, 본원에서 개시된특정 서열, 바람직하게는 그 특정 부위가 옥타노일-그렐린과 결합하고 데스-옥타노일 그렐린과 구분되는 정도의 특정 서열과 “구조적으로 상동성을 갖는(structural homology)”모든 핵산을 포함한다. 본원 발명의 바람직한 구현예와 연관되어 사용된 “구조적으로 상동성을 갖는”이라는 용어는 도 1B에 도시된 바와 같이, 기저 줄기 (basal stem), 내부 고리(internal loop) 및 말단 줄기-고리(terminal stem-loop)를 포함하는 특징적인 이차원 형태로 접히는 서열, 바람직하게는 줄기 구역 보상 염기 치환 (stem region compensatory base exchange)이 일어나도록 접힌 구조, 바람직하게는 단일 가닥 스트레치 (single-stranded stretch), 치환 (substitution), 결실 (deletion) 및/또는 삽입 (insertion)이 일어나도록 접힌 구조, 가장 바람직하게는 도 1B의 크기, 서열번호 1의 서열과 상응하는 구조로 접히는 서열로 해석되어야 한다.

또한, 본 발명에 따른 용어 “본발명 핵산 (inventive nucleic acid)” 또는 “핵산 (nucleic acid)”은 본원에서 개시된 핵산 서열의 일부분, 바람직하게는 그렐린과 결합하고 생체 비활성형 그렐린으로부터 생체 활성형 그렐린이 구분될 정도, 특히, 데스옥타노일-그렐린으로부터 옥타노일-그렐린이 구분될 정도로 관여하는 일부분이 포함되어야 할 것이다. 상기 핵산은 본원에 개시된 바와 같이 핵산으로부터 예를 들어 절단 (truncation)과 같은 현상에 의해 유래될 수 있다. 이 절단은 본원에 개시된 바와 같이 핵산의 한쪽 또는 양 말단과 관련될 수 있다. 또한, 절단은 뉴클레오티드의 내부 서열과 관련될 수 있는데, 즉, 5’ 및 3’ 말단 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드(들)와 각각 관련될 수 있다. 게다가, 절단은 본원에 개시된 핵산 서열로부터 단일 뉴클레오티드만큼의 작은 결실을 포함할 수 있다. 또한, 본 절단은 그 스트레치가 한 개 뉴클레오티드 정도가 될 수 있는 본 발명 핵산의 하나 이상의 스트레치와 또한 관련될 수도 있다.

본 발명에 따른 핵산은 D-핵산 또는 L-핵산일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명 핵산은 L-핵산이다. 부가적으로 핵산의 한 부분 (part) 또는 여러 부분이 D-핵산으로 존재할 수 있거나 또는 핵산의 최소 한 부분 또는 여러 부분이 L-핵산으로 존재할 수 있다. 용어 핵산의 “부분 (part)”은 한 개의 뉴클레오티드 크기일 수 있다. 상기의 핵산은 본원에서 일반적으로 D- 및 L-핵산으로 각각 명명된다.

또한, 본 발명에 따른 용어 “본 발명 핵산” 또는 “핵산”은 본원에서 개시된 핵산 서열 및 이에 부착된, 바람직하게는 옥타노일-그렐린과 결합하고 데스옥타노일-그렐린과의 구분에 관여할 정도의 핵산에 부착된 다른 서열들을 포함할 수 있다. 신장 (extension), 즉 본원에 개시된 특정 핵산 서열에 부가적으로 부착된 서열은 5‘-말단 또는 3’-말단의 한 쪽 또는 두 말단 모두에서 신장될 수 있으며, 양 말단에 100개 정도의 뉴클레오티드, 바람직하게는 양쪽에 50개 정도의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 양쪽에 20개 정도의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 서열번호 20에 기재된 5‘-플랭크 서열(flank sequence)의 완전(complete) 또는 부분(partial) 서열 및/또는 서열번호 21에 기재된 3’-플랭크 서열의 완전 또는 부분 서열을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 구현예로서 용어 “부분적 (partially)”은 상기 상호 인접한 각 서열의 단일 뉴클레오티드 또는 상기 서열의 두 개 이상의 뉴클레오티드 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 20 및 21 중 선택되는 플랭크 서열을 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 핵산이 적어도 한 부분 또는 그 일부분이 핵산인 다수의 부분을 포함하는 비교적 긴 핵산 (longer nucleic acid)의 일부라는 사실도 본 발명의 범위 내이다. 이러한 비교적 긴 핵산의 다른 부분이 D-핵산 또는 L-핵산일 수 있다. 본 발명과 관련하여 어떠한 조합도 사용될 수 있다. 상기의 비교적 긴 핵산의 다른 부분은 결합과는 상이한 기능을 나타낼 수 있다. 하나의 가능한 기능으로는 예를 들어 부동화, 가교화, 탐지 또는 증폭과 같은 다른 분자와의 상호작용을 수행하게 할 수도 있다.

본원에서 사용되는 L-핵산은 L-뉴클레오티드로 구성된, 바람직하게는 오로지 L-뉴클레오티드로만 구성된 핵산이다.

본원에서 사용되는 D-핵산은 D-뉴클레오티드로 구성된, 바람직하게는 오로지 D-뉴클레오티드로만 구성된 핵산이다.

본 발명 핵산이 D-뉴클레오티드, L-뉴클레오티드 또는 상기 두 형태 뉴클레오티드의 조합, 예를 들면 하나 이상의 L-뉴클레오티드 및 하나 이상의 D-뉴클레오티드로 구성되는 무작위 조합 (random combination) 또는 하나 이상의 L-뉴클레오티드 및 하나 이상의 D-뉴클레오티드로 구성되는 스트레치의 한정된 서열을 포함하는가 여부에 상관없이, 본 발명의 핵산은 데스옥시리보뉴클레오티드 (desoxyribonucleotide(s)), 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide(s)) 또는 상기 핵산들과의 조합을 포함할 수도 있다.

L-핵산으로 본 발명 핵산을 고안하는 것은 여러 이유로 장점을 갖는다. L-핵산은 자연 발생 핵산들의 거울상 이성질체이다. 그러나, D-핵산은 수용액상, 특히 핵산 분해효소 (nucleases)의 광범위한 분포에 의해 생체 조직 (biological systems) 또는 생체 표본 (biological samples)에서 매우 불안정하다. 자연발생 핵산 분해효소, 특히 동물 세포 유래 핵산 분해 효소는 L-핵산에 대한 분해 능력이 없다. 상기와 같은 이유로 L-핵산의 생물학적 반감기 (biological half-life)는 동물체 및 인체를 포함한 상기 조직에서 두드러지게 증가한다. L-핵산의 분해능 결핍으로 인해 핵산 분해 효소의 분해산물이 발생되지 않으며, 상기 결과로 어떠한 부작용도 일어나지 않음을 관찰할 수 있다. 이러한 측면은 그렐린 존재와 관련된 질환 및/또는 장애의 치료를 위해 사용되고 있는 사실상 모든 기타 화합물의 L-핵산으로 한정하지 않는 것이다.

또한, 본 발명 핵산은 그 핵산이 D-핵산, L-핵산 또는 D-,L-핵산으로 존재하는가 여부 또는 DNA 또는 RNA인가 여부와 상관없이 단일 가닥 (single strand) 또는 이중 가닥 (double strand) 핵산으로 존재할 수도 있는 것도 본 발명의 범주 내이다. 전형적으로, 본 발명 핵산은 일차원 구조에 기인한 한정된 이차원 구조 (defined secondary structure)를 나타내는 단일 가닥 핵산으로서, 3차 구조 (tertiary structure)를 또한 형성할 수도 있다. 그러나 본 발명 핵산은 서로 상보적인 이중 가닥이 서로 혼성화된다는 의미에서 이중 가닥도 또한 포함된다. 이러한 특성은 핵산이 L-형보다는 자연 발생 D-형으로 존재한다면 유리할 것으로 생각되므로 핵산에 안정성을 부여한다.

본 발명 핵산은 변형될 수 있다. 상기 변형은 핵산의 단일 뉴클레오티드와 관련될 수 있으며, 당업계에 잘 알려져 있다 (Kusser W, J. Biotechnol ., 74(1), pp27-38, 2000; Aurup H et al., Nucleic Acids Res., 22(1), pp20-24, 1994; Cummins LL et al., Nucleic Acids Res., 23(11), pp2019-2024, 1995; Eaton BE et al., Chem . Biol ., 2(10), pp633-638, 1995; Green LS et al., Chem Biol ., 2(10), pp683-695, 1995; Kawasaki AM et al., J. Med . Chem ., 36(7), pp831-841, 1993; Lesnik EA et al., Biochemistry, 32(30), pp7832-7838, 1993; Miller LE et al., J. Physiol ., 469, pp213-243, 1993).

본 발명에 따른 핵산은 여러 부분으로 나뉜 핵산 (multipartite nucleic acid)일 수 있다. 본원 명세서에 사용된 “여러 부분으로 나뉜 핵산”은 두개 이상의 핵산 가닥으로 구성된 핵산이다. 상기 두 개 이상의 핵산 가닥은 목표 분자에 대한 리간드로 작용하는 기능 부위 (functional unit)를 형성한다. 이 두개 이상의 핵산 가닥은 본 발명의 임의의 핵산으로부터 핵산의 분할로 두개의 가닥을 생성하는 방법 또는 본 발명 핵산의 첫번째 부분에 상응하는 한 개의 핵산 합성, 즉 전체 핵산 (overall nucleic acid) 및 전체 핵산의 두 번째 부분에 상응하는 다른 한 개의 핵산을 합성하는 합성방법으로 유래될 수 있다. 상기 분할 (cleavage) 및 합성 (synthesis) 방법 모두는 상기에서 예시한 바로 두개 이상의 가닥을 갖는 다중 분할된 핵산을 제조함에도 적용될 수 있음도 알아야 한다. 환원하면, 두개 이상의 핵산 가닥은 비록 다양한 핵산의 일부들 사이에 어느 정도의 상보적 구역이 존재한다 할지라도 서로 상보성 및 혼성화를 갖는 이중 가닥과는 전형적으로 구별된다.

결합 상수 (binding constant) 측정은 당업계에 잘 알려진 바와 같은 소위, 비아코아 장치 (biacore device)로 불리는 장치의 사용으로 가능하다. 또한, 본원에서 사용되는 친화도 (affinity)는 실시예 5에 기재된 “비드 어세이 (bead assay)"의 사용으로 측정할 수 있다. 본 발명의 경우에 있어서, 그렐린인 목표 분자에 따른 핵산 간의 결합 강도 (intensity of the binding)를 나타내기 위한 적절한 측정치는 당업계에 잘 알려진 측정 방법과 같은 소위 “분해도 (Kd value)”이다

본 발명에 따른 핵산은 특정한 분해도에 의해 특정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산의 분해도는 1 μM 이하이다. 약 1 μM 정도의 분해도는 목표분자에 대한 핵산의 비특이적 결합 (non-specific binding)으로 특정되어 진다. 당업자라면, 본 발명에 따른 핵산과 같은 화합물군의 분해도가 일정 범위 내에 존재한다는 것을 인정할 것이다. 상기한 약 1μM 정도의 분해도는 바람직한 분해도의 상한치이다. 바람직한 목표 물질 결합 핵산의 분해도 하한선은 약 10 피코몰 (picomolar) 또는 그 이상일 수 있다. 본 발명에서 생체 비활성형 그렐린으로부터 생체 활성형 그렐린이 구별, 즉 바람직하게는 데스옥타노일-그렐린으로부터 옥타노일-그렐린이 구별되도록 하는 개별 핵산 (individual nucleic acid)의 분해도는, 10 pM 내지 1 μM의 범위, 보다 바람직하게는 100 pM 내지 500 nM, 그리고 가장 바람직하게는 1 nM 내지 100 nM의 범위이라는 점도 본 발명의 범주내이다.

본 발명에 따른 핵산 분자는 목표 분자에 결합할 수 있고, 생체 비활성형 그렐린으로부터 생체 활성형 그렐린을 구별, 바람직하게는 데스옥타노일-그렐린으로부터 옥타노일-그렐린을 구별할 정도를 유지된다면 어떠한 길이도 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산의 바람직한 길이도 당업계에 자명할 것이다. 전형적으로 그 길이는 15 내지 120 뉴클레오티드이다. 15 내지 120개 사이의 임의의 정수가 본 발명에 의한 핵산의 가능한 길이임은 당업계에 자명할 것이다. 본 발명에 따른 핵산 길이의 더욱 바람직한 범위는 약 20 내지 100 뉴클레오티드, 약 20 내지 80 뉴클레오티드, 약 20 내지 60 뉴클레오티드, 약 20 내지 50 뉴클레오티드 및 약 30 내지 50 뉴클레오티드들이다.

본 발명에 따른 생체 활성형 및 생체 불활성형 그렐린을 구별하기 위한 어세이는 당업계에 잘 알려진 표준 기술을 이용하여 실시될 수 있다. 바람직한 측면에서, 상기 어세이는 본 청구항에 기재된 바와 같이 반응 용기내에 그 구성요소가 고정화된 96-웰 플레이트 (96-well plate) 내에서 실시될 수 있다. 선택적으로, 이 복합체는 복합체 형성 후에 반응 용기로부터 제거될 수도 있다.

하나의 측면에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 두 번째 탐지 도구 (second detection means), 바람직하게는 탐지 수단인 분자 비콘 (molecular beacon)으로 분석될 수 있다. 분자 비콘 방법론 (methodology)은 당업계에 잘 알려져 있다. 요약하면, 또한 분자 비콘으로도 명명되는 핵산 프로브 (probe)는 탐지될 핵산 검체에 대해 역상보적 (reverse complement)이며, 이로 인해 탐지될 핵산 검체의 일부와 혼성화된다. 핵산 검체에 대한 결합에 있어서, 상기 분자비콘의 형광물질군 (fluorophoric group)들이 분리되어, 형광 신호상의 변화, 바람직하게는 형광강도가 변화된다. 이러한 변화는 존재하는 핵산 검체의 양과 관련된다.

본 발명에 따른 핵산으로 본원에서 사용되는 본 발명 핵산 및/또는 본 발명에 따른 길항제들은 약제의 생성 또는 제조 (manufacture)에 이용될 수 있다. 상기 약제는 적어도 하나 이상의 본 발명 핵산을 포함하는데, 추가적인 약학적 활성 화합물을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명 핵산 자체가 약학적 활성 화합물로서 작용하는 것이다. 바람직한 구현예에서 상기 약제는 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 물, 완충액, 전분, 당, 젤라틴 또는 기타 임의의 허용되는 담체 물질 (carrier substance) 등을 들 수 있다. 상기 담체는 일반적으로 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 약제가 사용될 수 있는 치료 및/또는 예방을 위한 질환 및/또는 장애 및/또는 질환으로는 이에 제한되지는 않으나, 비만증, 에너지 균형 조절, 식욕 및 체중, 섭식 장애, 당뇨, 포도당 대사, 종양, 혈압 및 심혈관계 질환을 들 수 있다. 당업자에 의해 인지될 수 있는 바와 같이, 본 발명 핵산은 그렐린에 대한 길항제를 필요로 하는 환자에게 상기 길항제가 투여되고 이러한 질환 및/또는 장애의 원인을 제거하는 데 적합하거나 적어도 상기 질환 및/또는 장애를 경감시킬 수 있는 모든 질환에 실질적으로 사용될 수 있다. 상기 효과는 이에 제한되지는 않으나, 비만증, 에너지 균형 조절, 식욕 및 체중, 섭식 장애, 당뇨, 포도당 대사, 종양 치료 , 혈압 및 심혈관계 질환을 들 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 ‘에너지 균형의 조절‘은 질환으로서 간주된다. 보다 상세하게는, 그 용도는 그렐린에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 받으며, 그렐린의 생물학적 이용가능성 (bioavailability)의 감소 (reduction)가 요구되는 에너지 균형의 조절과 관련된 모든 질환의 치료를 위함이다. 상기와 동일하게 당 대사, 혈압, 식욕 및 체중에도 적용할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산은 하기의 질환의 치료에도 적용될 수 있으며, 뇌하수체 종양 (pituitary tumors), 말단 비대증 (acromegaly), 중추 쿠싱 증후군 (central Cushing's syndrome), 부신 쿠싱 증후군 (adrenal Cushing's syndrome), 부종양 쿠싱 증후군 (paraneoplastic Cushing's syndrome), 부신피질 쿠싱 증후군 (ectopic Cushing's syndrome), 부신 종양 (adrenal tumor), 압박감 (stress), 고코티솔증 (hypercortisolism), 심장 기능 부전 (cardiac insufficiency), 심근경색 (cardiac infarction), 뇌졸중 (stroke), 부신피질 부전증 (adrenocortical insufficiency), 저혈압 (hypotonia), 대동맥판 협착증 (aortic stenosis), 폐 긴장항진 (pulmonal hypertonia), 수축성 심낭염 (constrictive pericarditis), 감염성 질환 (infectious diseases), 감염성 독성 저혈압 (infectious toxic hypotonia), 저혈량증 (hypovolemia) 및 저나트륨혈증 (hypronatriemia)을 포함한 군으로부터 선택될 수 있는 질환의 전신 투여 또는 국소 투여법에 의해 치료에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 길항제 뿐만 아니라 핵산은 약제 또는 약제 제조뿐만 아니라, 미용적 목적, 상세하게는 그렐린의 비만증과 관련성에 관해서도 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 길항제와 마찬가지로 핵산도 상기와 같은 목적으로 체중 조절제 및/또는 식욕 조절제로서의 도구인 식품첨가제로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 길항제와 마찬가지로 핵산을 포함하는 조성물은 상기 언급한 모든 목적을 위하여 사용될 수 있다.

본 발명의 핵산은 나아가 신약 설계를 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다. 기본적으로 두 가지 가능한 접근방법이 있다. 그 하나는 화합물 라이브러리 스크리닝법으로서, 저분자량 화합물 라이브러리가 바람직하다. 상기 라이브러리는 당업자들에게 공지되어 있다. 또 다른 접근법으로서, 본 발명에 따른 핵산을 이론적 신약 설계법 (rational design of drug)에 사용될 수 있다.

본 이론적 신약 설계법은 본 발명에 따른 임의의 핵산으로부터 시작될 수 있으며, 화학구조, 바람직하게는 본 발명 핵산 구조와 유사한 또는 본 발명 핵산 구조의 결합 매개 부위와 동일한 3차원 구조와 관여할 수 있다. 상기의 어떠한 구조라도 본 발명 핵산과 동일 또는 유사한 결합 특성을 나타낸다. 이론적 신약 설계법상의 추가적 단계 또는 대체 단계의 일환으로서, 신경전달물질에 결합하는 핵산의 일부 결합부위의 바람직한 3차원 구조는 뉴클레오티드 및 핵산들과는 상이한 화학물질 군에 의하여 모방 설계된다. 이러한 모방 설계법에 의해, 상기 핵산과 상이한 화합물이 설계될 수 있다. 상기 화합물들은 바람직하게는 저분자 물질 또는 펩티드이다.

화합물 라이브러리 스크리닝법의 경우에, 당업자에게 공지된 경쟁적 어세이법을 사용하는 바와 같이, 적당한 그렐린 유사체, 그렐린 효현제 (agonist) 또는 그렐린 길항제들이 발견될 수 있다. 상기 경쟁적 어세이법는 하기와 같이 수행될 수 있다. 본발명 핵산, 바람직하게는 L-핵산에 결합하는 목표물질인 스피에겔머 (spiegelmer)는 고체상(solid phase)에 결합된다. 그렐린 유사체를 동정하기 위하여 표지된 그렐린을 어세이에 첨가할 수 있다. 잠재적 효능을 갖는 유사체는 스피에겔머와 결합하는 그렐린 분자와 경쟁하여 개개 표지에 의해 획득되는 신호상의 감소를 수반할 것이다. 효현제 또는 길항제에 대한 스크리닝은 당업계에 공지된 세포 배양 어세이법을 이용할 수도 있을 것이다

본 발명에 따른 키트는 적어도 하나 이상의 본 발명 핵산을 포함할 수 있다. 추가적으로, 상기 키트는 적어도 하나 이상의 양성 또는 음성 대조군을 포함할 수 있다. 양성 대조군으로는 예를 들어, 그렐린, 특히, 본 발명 핵산이 바람직하게는, 액상 형태로 선택되거나 결합하는, 하나의 효현제일 수 있다. 음성대조군으로는 예를 들어, 그렐린과 유사한 생물리학적 특성을 갖으나, 본 발명 핵산에 의해 인식되지는 않는 펩티드일 수 있다. 게다가, 상기 키트는 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 건조, 동결건조 또는 액체에 용해된 형태로 다양한 성분들이 키트에 포함될 수 있다. 상기 키트는 상기 하나 이상의 성분이 번갈아 포함될 수 있는 하나 이상의 컨테이너를 포함할 수도 있다.

도 1A는 L-NOX-B11 군의 요소 (member), 그 명칭 및 선택 빈도 (frequency)를 나타내며, 이들은 5’-플랭크(flank) 5´-GGAGCUCAGACUUCACU-3´ (서열번호 : 20) 및 3’-플랭크 5´-UACCACUGUCGGUUCCAC-3´(서열번호 : 21)에 의해 선택되고, 호환가능하게 신장될 수 있는 상기 요소들의 절단 서열 및 삽입 유전자좌 (insertion loci)인 Ins1 내지 Ins4를 표시한 도이고;

도 1B는 절단된 클론 (clone) L-NOX-B11의 2차원 구조 모델을 나타낸 것으로, 기저 줄기(basal stem), 내부 고리(IL Ia 및 IL Ib)의 5’- 및 3’-부분 및 말단 줄기-고리(terminal stem-loop)를 나타낸 도이며;

도 2는 인간 그렐린 수용체를 발현하는 CHO 세포를 이용한 세포 어세이 (cellular assay)에서 전장 (full-length) 또는 절단 형태의 옥타노일-그렐린 또는 데스옥타노일-그렐린에 의해 매개되는 농도-의존적 칼슘 방출을 나타낸 도이고 (농도-반응 적정);

도 3은 스피에겔머 L-NOX-B11에 의한 전장 및 절단된 옥타노일-그렐린에 의해 매개되는 칼슘 방출에 대한 억제효과를 나타낸 도이며 (억제 곡선);

도 4는 바(bar) 하단에 요약된 구성요소들의 조합 및 농도로 옥타노일-그렐린, 데스옥타노일-그렐린 및 L-NOX-B11의 세포 경쟁 어세이 (cellular competition assay) 결과를 나타낸 도이고;

도 5는 바(bar) 하단에 요약된 구성요소들의 조합 및 농도로 옥타노일-그렐린(1-5), 데스옥타노일-그렐린(1-5) 및 L-NOX-B11의 세포 경쟁 어세이 (cellular competition assay) 결과를 나타낸 도이고;

도 6은 비오틴이 표지된 (biotinylated) D-옥타노일-그렐린에 대한 방사물질 표지된 D-NOX-B11 및 L-NOX-B11의 결합을 분석하는 시험관내 결합 어세이 (in vitro binding assay) 결과를 나타낸 도이다.

본원 실시예들 및 도들에 각각 개시된 임의의 서열은 개시된 바와 같고, 모든 임의의 서열도 본 발명의 임의 측면 및 구현예로 사용될 수 있는 것으로 해석되어져야 할 것이다.

본 발명의 구체적인 측면, 특징 및 장점은 하기한 도면, 실시예 및 서열목록에 의해 바람직한 구현예에 대한 상세한 기재로부터 명백해 질 것이다. 본 발명은 도면, 실시예 및 서열목록에 의해 하기와 같이 상세히 설명되고, 이로부터 하기의 특징, 구현예 및 장점을 확인할 수 있다.

본원에 개시된 다양한 클론 및 식별자 (identifier)에 대한 서열번호의 연계성을 하기 표에 나타내었다. 역으로 표시하지 않는 한 본 핵산 서열은 (+) 가닥을 나타내며 2’OH-리보뉴클레오티드에 의해 생성된다.

서 열	서열 형태	서열번호
공통배열 L-NOX-B11 군	핵산	1
L-NOX-B11	핵산	2
L-NOX-G2	핵산	3
L-NOX-E12	핵산	4
L-NOX-B7	핵산	5
L-NOX-A8	핵산	6
L-NOX-B12	핵산	7
L-NOX-E3	핵산	8
L-NOX-C12	핵산	9
L-NOX-C11	핵산	10
L-NOX-A3	핵산	11
L-NOX-F5	핵산	12
L-NOX-A12	핵산	13
L-NOX-F12	핵산	14
L-NOX-G5	핵산	15
인간 그렐린	펩티드	16
인간 그렐린 (1-10)	펩티드	17
인간 그렐린 (1-5)	펩티드	18
래트 그렐린	펩티드	19
5‘-플랭크 서열	핵산	20
3‘-플랭크 서열	핵산	21

하기의 예들은 단지 본 발명의 설명의 목적을 설명하고자 하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 제한하고자 함이 아니다.

실시예 1. 그렐린 -결합 핵산 리간드

유럽특허출원 EP 제020 23 627.8호 및 국제특허출원 PCT/EP03/08542호에 그렐린-결합 핵산 리간드의 생성법이 개시되어 있다. 선택과정에서 수득된 상기 핵산 리간드의 한 그룹을 도 1A에 나타내었다. L-NOX-B11 클론은 상기 그룹에서 가장 빈도가 높은 (abundant) 서열이며, 그룹 내 다른 모든 요소들과 같이, 길고 절단된 형태(L-NOX-B11[86] 및 L-NOX-B11[47])에서 작용하였다.

절단된 클론의 신장을 위하여 5´-플랭크(flank) 및 3´-플랭크 서열이 하기한 핵심 서열 (core sequence)에 추가될 수 있다.

5´-플랭크(flank) 5´-GGAGCUCAGACUUCACU-3´ (서열 번호 20)

3´-플랭크(flank) 5´-UACCACUGUCGGUUCCAC-3´ (서열 번호 21)

도 1A에는 절단된 형태만이 요약되었으며, 본 명세서에서는 상기 절단된 클론과 관련된 결과들만을 나타내었다. 그러나 본원에 개시된 L-NOX-B11의 특성은 모든 절단된 서열의 모든 신장된 형태와 관련있다.

L-NOX-B11-그룹의 각 클론들은 서열 보존도가 높으며, 서열 상동의 긴 스트레치 (stretch)를 나타낸다. 하기 식으로 표기되는 공통 서열 (consensus sequence)은 도 1A의 클론으로부터 수득될 수 있다:

CGUGYGN (0-3) AGGYAN (0-14) AAAACN (1-3) UAARWCCGAAGGUAACCAWUCCUACN (0-2) ACG (서열 번호 1)

여기서 Y는 U 또는 C를 의미하고, R은 A 또는 G를 의미하며, W는 U 또는 A를 의미한다.

상기에 나타난 바와 같이, 뉴클레오티드 치환은 일부 부위에서만 나타났다. 게다가, 서열 삽입이 일어나는 4개의 한정된 구획이 있다; 상기 삽입 유전자좌 (insertion loci)는 Ins1 내지 Ins 4로 표시되며, 서열번호 1의 글자 ‘N_(x-y)'에 해당한다. 이 위치에서 임의적 숫자, 바람직하게는 서열번호 1의 괄호 안에 주어진 숫자를 갖는 임의의 뉴클레오티드가 삽입될 수 있다. 삽입 유전자좌 2에서, 바람직하게 삽입되는 뉴클레오타이드는 아데노신 잔기이다.

L-NOX-B11 서열은 도 1B에 나타난 바와 같이 특징적인 2차 구조로 접히며, 상기 구조는 기저 줄기(basal stem), 내부 고리(internal loop) 및 말단 줄기-고리 (terminal stem-loop)를 포함한다. 그룹 내의 모든 서열에 대한 상세한 분석결과, 상기 서열상의 삽입 유전자좌가 주로 내부 고리의 구획 (Ins2)에 위치함을 나타낸다. 기저 줄기와 마찬가지로 말단 줄기-고리 는 항상 동일하며, 이는 그렐린-결합 분자의 상기 군 (family) 및 그들의 특징에 대하여 매우 특징적으로 보인다. 당업자에게 자명한, 도 1B에 주어진 2차원 구조가 미약하게 분해되거나 분해되지 않는 몇몇 서열 치환은 핵산의 특정 기능의 손실 없이, 즉 생체 불활성형 그렐린으로부터 생체 활성형 그렐린을 구별할 정도로 수행될 수 있다. 유럽특허출원 제 EP 020 23 627.8호 및 국제특허출원 PCT/EP03/08542호에 개시된 몇몇 발췌 부분에서, 상기 변형된 서열의 종류가 개시된 바 있다. L-NOX-B11에 대하여 기술된 특징은 관련 서열 및 구조가 충분히 보존된 서열들로 전달될 수도 있다.

실시예 2. 그렐린 -유도 칼슘-방출을 분석하기 위한 방법

그렐린-결합 스피에겔머의 기능적 특징은 그렐린과 인간 성장 호르몬 분비촉진제 수용체 (GHS-R)의 상호작용을 관찰하는 세포 어세이 시스템 법으로 수행되었다. 수용체-리간드 상호작용에 의한 세포내 칼슘 방출은 형광 칼슘 지시약에 의해 시각화될 수 있다.

인간 그렐린 수용체 (GHS-R1a; Euroscreen, Gosselies, Belgium)를 발현하는 안정된 형질전환 CHO 세포를 투명한 바닥 (Greiner)을 가진 검정 96 웰-플레이트에 5-7 ×10⁴ 세포수/웰의 농도로 분주하였으며, 100 단위/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 400㎍/㎖ 제네티신 (geneticin) 및 2.5㎍/㎖ 훈기존 (fungizone)을 함유한 UltraCHO 배지 (Cambrex사)에서 37 ℃, 5% CO₂의 환경에서 하룻밤 배양하였다.

칼슘 지시약인 염색시약 (dye fluo-4)을 로딩하기 전에 세포들을 200 ㎕의 CHO-U+ [5 mM 프로베네시드 (probenecid), 20mM HEPES를 함유한 ultraCHO 배지]로 한번 세척하였다. 그 후 50 ㎕의 지시약 염료액 [10 μM fluo-4 (Molecular Probe사), 0.08% 플루로닉 127(pluronic 127, Molecular Probe사)을 함유한 CHO-U+]을 첨가하였고, 세포들을 37℃에서 60분 동안 배양하였다. 그 후 세포들은 180 ㎕ CHO-U+로 3회 세척하였다. 마지막으로 90 ㎕ CHO-U+를 각 웰마다 첨가하였다.

자극 어세이법 (stimulation assay)에서, 옥타노일-형 (octanoyl-form) 또는 데스옥타노일-형 (desoctanoyl-form) 중 어느 한 쪽인 인간 또는 쥐의 L-그렐린의 전장 또는 절단된 변형 (version)은 표지하는데 사용하였다 [L-그렐린 및 데스옥타노일-L형 그렐린은 바켐사(Bachem, basel, 스위스)에서 구입하였고, L-그렐린(1-5), L-그렐린(1-10) 및 데스옥타노일-L-그렐린(1-5)은 피닉스 파마슈티칼사 (Phoenix Pharmaceuticals, Belmont, CA)에서 구입].

각각의 펩티드들은 CHO-U+가 담긴 0.2㎖의 낮은 96-튜브 플레이트에서 15 내지 60분간 실온에서 배양되었다. 상기의 자극 용액 (stimulation solution)에서, 펩티드는 10배 (10-fold) 농축되었으며, 어세이로 비교되었다. 칼슘 방출의 감지를 위하여, 자극 용액을 세포에 첨가하였고 (10 ㎕/웰), 형광 신호의 변화를 관찰하였다. 형광 신호의 측정은 다중탐지 플레이트 리더기 (Fluostar Optima multidetection plate reader, BMG)로 485nm의 여기 파장 (excitation wavelength) 및 520nm의 방출 파장 (emission wavelength)에서 측정되었다.

여러 시료의 동시 측정을 위하여, 96-플레이트의 수직 일렬 (perpendicular one row)로 이루어진 웰의 일렬을 동시에 기록하였다. 기저선 결정을 위하여 4초의 시간 간격으로 초기에 3회 측정하였다. 그런 후 기록을 중단하고, 플레이트를 기구 밖으로 이동하였다. 다채널피펫 (multi-channel pipette)을 이용하여 10 ㎕의 자극 용액을 상기 웰에 첨가한 후, 플레이트를 다시 기구 안으로 이동하였으며 측정을 계속하였다. 4초의 시간 간격으로 총 20회 기록이 수행되었다.

각 웰에 대하여, 최대 형광치 및 기저선 수치 간의 차이 (F_max-F_min)를 측정하고 그렐린 농도에 대하여 도식화하였다. 도 2에서 인간 옥타노일-그렐린 및 데스옥타노일-그렐린 (전장 및 절단된 펩티드)의 농도 구배 곡선을 나타내었다. 전장 길이 및 절단된 옥타노일-그렐린이 모두 칼슘 방출을 유도하였으나, 상이성을 나타냈다: 즉, 전장 길이의 옥타노일-그렐린은 30nM의 농도에서 최대치의 활성을 나타내는 반면, 옥타노일-그렐린 1-5는 고농도의 펩티드에서만 자극되며 관찰된 농도 범위에서 최대 강도의 신호에 도달하지 못했다. 양 펩티드의 데스옥타노일-형태는 상기 어세이에서 측정된 어떠한 농도에서도 인간 그렐린 수용체를 자극하지 못하였다. 상기 실험으로 그렐린의 N-말단 5개 아미노산은 인간 그렐린 수용체를 자극하기에 충분하고, 옥타노일-그룹은 그렐린의 생물학적 활성을 위해 필수적임을 확인하였다.

실험예 3. 그렐린 -결합 스피에겔머 ( spiegelmers )에 의한 그렐린 -유도 칼슘-분비 저해

그렐린-유도 칼슘 방출 저해 실험은 실시예 2에 기재된 세포 어세이 법을 이용하여 측정하였다. 상기 방법의 변형으로서, 저해 어세이법에서 자극 용액에 다양한 양의 스피에겔머 L-NOX-B11을 첨가하였다. 대조군으로서, 펩티드만 첨가한 시료 (최대 칼슘 분비) 및 펩티드 무첨가 시료 (최소 칼슘 분비)를 이용하여 분석하였다. 실온에서 15 내지 60분간 배양한 후, 10㎕의 자극 용액을 세포에 가했으며, 최종 펩티드의 농도가 5nM이 되도록 하였다. 통상적으로 스피에겔머의 최종 농도는 일반적으로 0.1nM, 1nM, 3nM, 10nM, 30nM 및 100nM로부터 선택되었다.

각 웰의 최대 형광치 및 기저선 수치 간의 차이 (F_max-F_min)를 측정하였다. 100 %활성 (저해 불능) 및 0% 활성 (완전 저해) 수치를 대조군 시료 (펩티드만 첨가한 시료 및 펩티드 무첨가 시료)로부터 얻을 수 있었다. 다른 모든 시료들에 대해서도 상응하는 활성도는 스피에겔머의 농도에 대비하여 퍼센트(%)로 계산하고 도식화하여 (저해 곡선) 최대 저해 농도의 반을 저해하는 농도 즉, IC₅₀값을 결정하였다.

도 3은 옥타노일-그렐린의 전장 및 절단 형태의 L-NOX-B11에 대한 저해 활성을 분석한 실험결과인 저해 곡선을 나타낸다. 상기 실험 결과, 스피에겔머는 실험에 사용된 모든 형태의 옥타노일-그렐린 (전장 펩티드, 그렐린 1-10 및 그렐린 1-5)의 활성을 저해하였다. IC₅₀값은 모든 세 종류의 펩티드 (전장 그렐린: 7nM, 그렐린 1-10: 9nM, 그렐린 1-5: 5nM)에서 유의적인 편차를 나타내지 않았다. 상기 결과들로부터 스피에겔머의 결합 구획 (binding region)은 그렐린의 N-말단에 위치하며, 아미노산 1-5번을 포함함이 결론지을 수 있다. 상기 최소의 모티프에 대한 L-NOX-B11의 결합은 세포 어세이상에서 그렐린의 생물학적 활성의 효과적인 억제를 나타내었다.

실시예 4. 스피에겔머와 결합하는 그렐린에 의한 옥타노일 - 그렐린과 데스옥타노일 -그렐린의 구별

그렐린에 대한 스피에겔머 L-NOX-B11의 결합상의 특징은 실시예 3에서 기술된 방법을 기초로 한 경쟁 어세이법으로 하기에서 분석되었다. 하기 어세이법에서, 스피에겔머는 세포의 자극 이전에 자극 용액 내에서 그렐린 펩티드의 다른 조합들과 같이 배양되었다.

펩티드 조합들의 구성 및 전장 그렐린을 이용한 실험 결과를 도 4에 요약하여 나타내었다 (막대는 왼쪽에서 오른쪽 방향으로 번호 매겨짐): 그렐린 무첨가군 또는 데스옥타노일-그렐린을 최종 농도 300nM으로 첨가하여 실험한 결과 세포의 자극은 검출되지 않았으며 (막대 1 및 막대 2), 10nM 농도의 옥타노일-그렐린은 이미 칼슘 분비를 매개하기에 충분한 반면에 (막대 3), 300nM의 데스옥타노일-그렐린은 세포자극을 저해하지 못하였으므로 (막대 4), 이는 생물학적으로 비활성인 데스옥타노일-그렐린은 수용체 길항제가 아님을 의미한다. 10nM의 옥타노일-그렐린에 의해 매개되는 칼슘 방출은 3배 과잉량의 L-NOX-B11에 의해 저해되며 (막대 5), 심지어 옥타노일 그렐린에 대해 30배 과잉 양 (300 nM)의 데스옥타노일-그렐린의 존재는 완벽하게 저해하지 못했다 (막대 6). 반면에, 300 nM의 옥타노일-그렐린 및 30 nM의 스피에겔머의 어세이 농도는 칼슘 방출을 증가시켰고 (막대 7), 이는 상기 어세이 조건상에서 옥타노일-그렐린에 의한 자극 증가가 성취될 수 있음을 입증하는 것이다.

본 실험은 전장 펩티드 대신 그렐린 1-5으로도 반복실험 되었으며, 동일한 실험결과를 나타내었다 (도 5 참조). 그러나 그렐린 1-5의 비교적 약한 자극 활성에 의존하여 신호는 상대적으로 낮게 나타났다.

실시예 5. 옥타노일 - 그렐린에 대한 L- NOX -B11의 결합을 위한 요건

옥타노일-그렐린에 대한 L-NOX-B11 결합 부위는 펩티드의 N-말단에 위치하며 (실시예 3 참조), 옥타노일-그룹을 포함한다 (실시예 4 참조). 결합 생성을 위한 양 구성요소인 펩티드 및 지방산 그룹과의 관련성 및 중요성은 하기 실험에서 나타낸다.

·본 실험의 원리는 스피에겔머가 그의 목표 펩티드와 이성체-특이적 (enantio-specific)으로 결합하며, 옥타노일-그룹 자체가 비이성체 그룹 (achiral group)이라는 것에 근거한다. 만약 그렐린의 지방산 부분이 단독으로 스피에겔머와의 결합에 충분하다면, 결합 생성은 펩티드 부위에 관하여 이성체-선택적 (enantio-selective)으로 일어나지 않을 것이고; D-NOX-B11 및 L-NOX-B11이 상호 유사한 방식으로 D-옥타노일-그렐린에 결합해야 할 것이다.

NOX-B11은 L- 및 D-RNA로 합성되고, γ-³²[P]-ATP (Hartmann Analytic, Braunschweig)로 T4-폴리뉴클레오티드키나제 (T4-Polynucleotidekinase, Invitrogen, Karlsruhe)를 이용하여 방사능 표지되었다. RNA는 10%의 변성된 폴리아크릴 아미드 겔 (denaturing polyacrylamide gel)상에서 정제되었으며, 0.5 내지 5 피코몰 (pmol)의 RNA는 5 μM의 비오틴이 결합된 D-그렐린을 함유한 결합 완충액 [20mM Tris/HCl, pH 7,4; 150mM NaCl; 5mM KCl; 1mM MgCl₂; 1mM CaCl₂; 0.1% Tween-20]에서 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 비교적 고농도의 펩티드가 한층 더 미약한 스피에겔머와의 상호작용의 관찰을 위해 선택되었다. 그 후, 일정한 양의 스트렙타비딘이 결합된 울트라 링크 매트릭스 (UltraLink matrix)를 첨가하였다. 매트릭스에 결합된 그렐린-RNA 복합체를 결합 완충액으로 세척하였고, 섬광 계수기 (scintillation counter, Beckman LS6500)를 사용하여 계수하였으며, D-그렐린과의 전체 결합에 대한 퍼센트 (%)로 도식화하였다. 각 실험 그룹 당 3번씩 측정하였으며, 그 실험결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, D-NOX-B11은 D-옥타노일-그렐린 (막대 1 및 막대 2)와 특이적으로 결합한데 반하여, 상응하는 L-거울상이성질체 (L-enantiomer)는 결합하지 못하였다 (막대 3 및 막대 4). 상기 실험결과는 옥타노일 잔기 대부분이 스피에겔머 L-NOX-B11가 효과적으로 결합하는 구조에서 L-옥타노일-그렐린의 N-말단 GSSFL 모티브 (motive)를 제공하는 친수성 (hydrophobic) 그룹으로서 제공됨을 나타낸다. L-옥타노일-그렐린 펩티드 자체 및 L-옥타노일 그렐린의 옥타노일-부위 모두 L-NOX-B11와의 결합에 필수적이다.

본 명세서, 청구항 및/또는 도면에 기재된 본 발명의 특징들은 이들의 다양한 형태로 본 발명을 실현하기 위한 물질로써 단독 및 이들의 어떠한 조합으로도 사용될 수 있다.

본 발명은 생체 활성형 그렐린, 보다 바람직하게는 n-옥타노일 그렐린과 특이적으로 결합하는 핵산 및 상기 핵산의 그렐린 매개성 질환 및 장애를 진단하기 위한 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명 핵산은 그렐린에 특이적으로 결합하여 생체 활성형 그렐린의 활성을 효과적으로 억제하므로, 그렐린의 생물학적 이용가능성 (bioavailability)의 감소 (reduction)가 요구되는 에너지 균형의 조절과 관련된 질환 및/또는 장애를 치료하기 위한 치료 방법 및 이 생체 활성형 그렐린을 특이적으로 탐지하는데 유용하게 활용될 수 있다.

<110> NOXXON Pharma AG <120> Nucleic acids specifically binding bioactive ghrelin <130> DIFI/PA06010/SY <150> PCT/EP04/012739 <151> 2004-11-10 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence L-NOX-B11 : ghrelin binder consensus sequence L-NOX-B11 <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n is any of a, g, c and u <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n is any of a, g, c and u <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is any of a, g, c and u <220> <221> misc_feature <222> (45) <223> n is any of a, g, c and u <400> 1 cgugygnagg yanaaaacnu aarwccgaag guaaccawuc cuacnacg 48 <210> 2 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ghrelin binder L-NOX-B11 <400> 2 cgugugaggc aauaaaacuu aaguccgaag guaaccaauc cuacacg 47 <210> 3 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ghrelin binder L-NOX-G2 <400> 3 cgugugaggc aguaaaacuu aaguccgaag guaaccaauc cuacacg 47 <210> 4 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ghrelin binder L-NOX-E12 <400> 4 cgugugaggc aauaaaacuu aaguccgaag guaaccaauc cugcacg 47 <210> 5 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ghrelin binder L-NOX-B7 <400> 5 cgugugaggc aauaaaacau aaguccgaag guaaccaauc cuacacg 47 <210> 6 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ghrelin binder L-NOX-A8 <400> 6 cgugugaggc aauaaaacgu aaguccgaag guaaccaauc cuacacg 47 <210> 7 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ghrelin binder L-NOX-B12 <400> 7 cgugugaggc aauaaaacuu guaaguccga agguaaccaa uccuacacg 49 <210> 8 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ghrelin binder L-NOX-E3 <400> 8 cgugugaggc aauaaaaacu uaaguccgaa gguaaccaau ccuacacg 48 <210> 9 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ghrelin binder L-NOX-C12 <400> 9 cgugcgguga ggcaaaaacg uaagaccgaa gguaaccauu ccuacccacg 50 <210> 10 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ghrelin binder L-NOX-C11 <400> 10 cgugugaggu aguaaaaaaa cguaaauccg aagguaacca auccuacacg 50 <210> 11 <211> 53 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ghrelin binder L-NOX-A3 <400> 11 cgugugaggu aguaaaaaaa aaacguaaau ccgaagguaa ccaauccuac acg 53 <210> 12 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ghrelin binder L-NOX-F5 <400> 12 cgugugaggu aguaaaaaaa aaaacguaaa uccgaaggua accaguccua cacg 54 <210> 13 <211> 55 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ghrelin binder L-NOX-A12 <400> 13 cgugugaggu aguaaaaaaa aaaaacguaa auccgaaggu aaccaauccu acacg 55 <210> 14 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ghrelin binder L-NOX-F12 <400> 14 cgugugaggu aguaaaaaaa aaaaaacgua aauccgaagg uaaccaaucc uacacg 56 <210> 15 <211> 59 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ghrelin binder L-NOX-G5 <400> 15 cgugugaggu aguaaaaaaa aaaaaaaaac auaaauccga agguaaccaa uccuacacg 59 <210> 16 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln 1 5 10 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gly Ser Ser Phe Leu 1 5 <210> 19 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 20 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' flank sequence <400> 20 ggagcucaga cuucacu 17 <210> 21 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' flank sequence <400> 21 uaccacuguc gguuccac 18

Claims

생체 활성형 그렐린과 결합하는 핵산.
생체 활성형 그렐린과 특이적으로 결합하는 핵산.
제 1항에 있어서,

상기 핵산은 생체 활성형 그렐린과 특이적으로 결합하지 않는 핵산.
제 2항 또는 제 3항에 있어서,

상기 특이적 결합은 분해도 (Kd value)로 표시되고, 핵산의 분해도가 10 pM 내지 1 μM의 범위, 보다 바람직하게는 100 pM 내지 500 nM, 그리고 가장 바람직하게는 1 nM 내지 100 nM의 범위인 핵산.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생체 활성형 그렐린은 n-옥타노일 그렐린인 핵산.
제 5항에 있어서,

상기 n-옥타노일 그렐린의 n-옥타노일 부위가 그렐린 3번 위치의 세린(Ser)과 에스테르 결합을 통하여 결합한 핵산.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 핵산은 L-핵산, 바람직하게는 스피에겔머인 핵산.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 핵산은 데옥시리보뉴클레익산, 리보뉴클레익산 및 이들의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된 핵산.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 핵산은 도 1B에 나타낸 이차원 구조인 핵산.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 핵산은 도 1B에 나타낸 이차원 구조의 내부 고리상 변형이 있는 핵산.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 핵산은 서열번호 1에 따른 서열을 포함, 바람직하게는 구성하는 핵산.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 핵산은 서열번호 2 내지 서열번호 15에 따른 서열을 포함, 바람직하게는 구성하는 핵산.
생체 활성형 그렐린과 결합하기 위한 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 용도.
제 13항에 있어서,

상기 결합은 핵산의 분해도가 10 pM 내지 1 μM의 범위, 보다 바람직하게는 100 pM 내지 500 nM, 그리고 가장 바람직하게는 1 nM 내지 100 nM의 범위로 생체 활성형 그렐린에 특이적으로 결합하는 결합인 용도.
제 13항 또는 제 14항에 있어서,

상기 결합은 생체 활성형 그렐린 대비 생체 불활성형 그렐린이 1000배 이상 과잉 존재시, 보다 바람직하게는 생체 활성형 그렐린 대비 생체 불활성형 그렐린이 100배 이상 과잉 존재시, 매우 바람직하게는 생체 활성형 그렐린 대비 생체 불활성형 그렐린이 10배 이상 과잉 존재시에 생체 활성형 그렐린과 다른 그렐린의 결합은 제외하는 용도.
제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생체 활성형 그렐린은 n-옥타노일 그렐린인 용도.
제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 결합은 생체내(in vivo) 또는 시험관내(in vitro) 결합인 용도.
생체 활성형 그렐린을 탐지하기 위한 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 용도.
제 18항에 있어서,

상기 생체 활성형 그렐린은 특이적으로 탐지되는 용도.
제 18항 또는 제19항에 있어서,

상기 생체 비활성형 그렐린은 핵산에 탐지되지 않는, 바람직하게는 특이적으로 탐지되지 않는 용도.
제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생체 활성형 및/또는 생체 비활성형 그렐린은 생체내(in vivo) 또는 시험관내(in vitro) 에서 탐지되는 용도.
생체 활성형 그렐린을 저해하기 위한 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 용도.
제 22항에 있어서,

상기 생체 활성형 그렐린은 특이적으로 저해되는 용도.
제 23항에 있어서,

상기 생체 비활성형 그렐린은 핵산에 의해 저해되지 않는, 바람직하게는 핵산에 의해 특이적으로 저해되지 않는 용도.
제 22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생체 활성형 그렐린은 n-옥타노일 그렐린인 용도.
제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 저해는 생체내(in vivo) 또는 시험관내(in vitro) 저해인 용도.
약제를 제조하기 위한 제 1항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 용도.
제 27항에 있어서,

상기 약제는 질병 및/또는 장애의 치료 및/또는 예방하기 위한 것인 용도.
제 28항에 있어서,

상기 질병 및/또는 장애는 비만증, 에너지 균형 조절, 식욕 및 체중, 섭식 장애, 당뇨, 포도당 대사, 종양, 혈압 및 심혈관계 질환을 포함하는 군으로부터 선택되는 용도.
제 28항 또는 제 29항에 있어서,

상기 질병 및/또는 장애는 생체 활성형 그렐린에 의하여 매개되는 용도.
(a) 생체 활성형 그렐린 존재를 시험하기 위한 검체를 제공하는 단계; (b) 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 제공하는 단계;(c) 상기 핵산을 검체와 반응시키는 단계, 여기에서 (a) 단계는 (b) 단계 전에 수행가능하고 (b) 단계는 (a) 단계 전에 수행 가능한 단계를 포함하는 생체 활성형 그렐린을 탐지하기 위한 탐지방법.
제 31항에 있어서,

상기 단계에 추가적으로 (d) 핵산과 검체의 반응을 탐지시키는 단계를 제공하는 방법.
제 32항에 있어서,

상기 (b) 단계의 핵산이 표면에 고정화되는 방법.
제 33항에 있어서,

상기 핵산이 핵산과 표면간의 화학적 공유 결합을 통해 표면에 고정화되는 방법.
제 34항에 있어서,

상기 핵산이 핵산의 상호반응 상대자 (Interaction Partner)에 의해 표면에 고정화되는 방법.
제 35항에 있어서,

상기 상호반응 상대자가 핵산, 폴리펩티드, 단백질 및 항체를 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
제 36항에 있어서,

상기 상호반응 상대자가 항체, 바람직하게는 단일클론 항체로서 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 핵산과 결합하는 항체인 방법.
제 36항에 있어서,

상기 상호반응 상대자가 핵산, 바람직하게는 기능적 핵산인 방법.
제 38항에 있어서,

상기 기능성 핵산이 적어도 상기 핵산과 부분적으로 상보적인 압타머, 스피에겔머, 및 핵산을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
제 33항에 있어서,

상기 핵산이 상호반응 상대자 한 쌍의 처음 멤버를 포함하고 상기 표면은 상호반응 상대자 한 쌍의 두번째 멤버를 포함하는 방법.
제 40항에 있어서,

상기 상호반응 상대자 쌍은 비오틴 및 아비딘, 비오틴 및 스트렙타비딘 및 비오틴 및 뉴트라비딘을 포함하는 상호반응 상대자 군으로부터 선택되는 방법.
제 41항에 있어서,

상기 상호반응 상대자 쌍의 처음 멤버가 비오틴인인 방법.
제 33항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생체 활성형 그렐린 및 핵산의 고정 복합체가 형성되는 방법.
제 43항에 있어서,

상기 복합체가 탐지되는 방법.
제 44항에 있어서,

상기 생체 활성형 그렐린이 탐지되는 방법.
제 45항에 있어서,

상기 생체 활성형 그렐린이 생체 활성형 그렐린에 특이적인 탐지 수단에 의해 탐지되는 방법.
제 46항에 있어서,

상기 생체 활성형 그렐린이 생체 활성형 그렐린 및 생체 비활성형 그렐린 모두를 탐지하는 탐지 수단에 의해 탐지되는 방법.
제 44항 내지 제 47항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 탐지 수단이 핵산, 폴리펩티드, 단백질 및 항체를 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
제 44항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 검체가 복합체 형성 후 반응 용기로부터 제거되는 방법
제 32항에 있어서,

상기 생체 활성형 및/또는 생체 비활성형 그렐린의 상호 반응 상대자가 표면에서 고정화되는 방법.
제 50항에 있어서,

상기 상호 반응 상대자가 핵산, 폴리펩티드, 단백질 및 항체를 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
제 51 항에 있어서,

상기 상호 반응 상대자가 생체 활성형 및/또는 생체 비활성형 그렐린과 결합 가능한 방법.
제 51항 또는 제 52항에 있어서,

상기 상호 반응 상대자가 항체, 바람직하게는 단일클론 항체인 방법.
제 51항 또는 제 52항에 있어서,

상기 상호 반응 상대자가 기능적 핵산인 방법.
제 54항에 있어서,

상기 기능적 핵산이 압타머 및 스피에겔머를 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
제 50항 내지 제 55항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 상호 반응 상대자가 생체 활성형 및/또는 생체 비활성형 그렐린과 복합체를 형성하는 방법.
제 50항 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생체 활성형 그렐린이 탐지 수단에 의해 탐지되는 방법.
제 57 항에 있어서,

상기 탐지 수단이 제 1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 핵산인 방법.
제 58항에 있어서,

상기 핵산을 두 번째 탐지 수단을 이용하여 탐지하는 방법.
제 59항에 있어서,

상기 두 번째 탐지 수단이 핵산, 폴리펩티드, 단백질 및 항체를 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
제 60항에 있어서,

상기 두 번째 탐지 수단이 항체, 바람직하게는 상기 핵산에 특이적인 항체인 방법.
제 60항에 있어서,

상기 두 번째 탐지 수단이 핵산, 바람직하게는 분자 비콘인 방법.
제 60 항에 있어서,

상기 핵산이 탐지 표지물을 포함하는 방법.
제 63항에 있어서,

상기 탐지 표지물이 비오틴, 불화-데스옥시우리딘 표지물, 디곡시게닌 표지물, 형광물질, UV-표지물, 방사성 표지물 및 킬레이트물을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
제 63항에 있어서,

상기 두 번째 탐지 수단이 탐지 표지물과 반응하는 방법.
제 65항에 있어서,

상기 탐지 표지물이 비오틴이고 두 번째 탐지 수단이 비오틴 결합성 항체이거나,

상기 탐지 표지물이 비오틴이고 두 번째 탐지 수단이 아비딘 또는 아비딘 운반 분자이거나,

상기 탐지 표지물이 비오틴이고 두 번째 탐지 수단이 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 운반 분자이거나,

상기 탐지 표지물이 비오틴이고 두 번째 탐지 수단이 뉴트라비딘 또는 뉴트라비딘 운반 분자이거나,

상기 탐지 표지물이 불화-데스옥시우리딘이고 두 번째 탐지 수단이 불화-데스옥시우리딘 결합성 항체이거나,

상기 탐지 표지물이 디곡시게닌이고 두 번째 탐지 수단이 디곡시게닌 결합성 항체이거나,

상기 탐지 표지물이 킬레이트이고 두 번째 탐지 수단이 방사성 뉴클리드인 방법.
제 50항 내지 제 66항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 두 번째 탐지 수단이 세 번째 탐지 수단을 이용하여 탐지, 바람직하게는, 상기 세 번째 탐지수단이 효소, 보다 바람직하게는 두 번째 탐지 수단을 탐지하는 효소반응을 나타내거나, 상기 세 번째 탐지 수단이 방사선을 탐지하기 위한 수단이거나, 보다 바람직하게는 방사성-뉴클리드에 의해 방출되는 방사선인 방법.
제 56항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 검체가 복합체 형성후 반응에서 제거, 보다 바람직하게는, (c) 단계 및 /또는 (d) 단계가 수행되는 반응 용기로부터 제거되는 방법.
제 32항에 있어서,

상기 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 핵산이 형광 부위를 포함하고 상기 형광 부위의 형광도가 핵산 및 생체 활성형 그렐린 및 유리 생체 활성형 그렐린 간의 복합체 형성과 상이한 방법.
제 32항 내지 제 69항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 핵산이 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 핵산 유도체이고, 상기 핵산 유도체가 적어도 하나 이상의 아데노신 치환 아데노신 유도체를 포함하는 방법.
제 70항에 있어서,

상기 아데노신 형광성 유도체가 에테노아데노신인 방법.
제 69항 내지 제 71항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 핵산 유도체로 구성되는 복합체 및 생체 활성형 그렐린이 형광법에 의해 탐지되는 방법.
제 31항 내지 제 72항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생체 활성형 그렐린이 n-옥타노일 그렐린인 방법.
제 31항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생체 비활성형 그렐린이 n-옥타노일 그렐린과 상이한 그렐린인 방법.
제 31항 내지 제 74항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 신호가 (c) 단계 또는 (d) 단계에서 생성되고 바람직하게는 상기 신호가 검체 상의 생체 활성형 그렐린 농도와 관련되는 방법.
제 31항 내지 제 75항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 검체가 혈액, 혈장, 혈청, 체액 및 조직을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
제 31항 내지 제 76항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 방법이 진단 방법 또는 예후 판정 방법인 방법.
제 77항에 있어서,

상기 방법이 질병 및/또는 장애, 바람직하게는 비만증, 에너지 균형 조절, 식욕 및 체중, 섭식 장애, 당뇨, 포도당 대사, 종양, 혈압 및 심혈관계 질환을 포함하는 군으로부터 선택되는 질병 및/또는 장애를 진단, 시기 결정 및/또는 예후 판정하는 방법인 방법.