EA009376B1 - Нуклеиновые кислоты, специфично связывающие биоактивный грелин - Google Patents

Нуклеиновые кислоты, специфично связывающие биоактивный грелин Download PDF

Info

Publication number
EA009376B1
EA009376B1 EA200600735A EA200600735A EA009376B1 EA 009376 B1 EA009376 B1 EA 009376B1 EA 200600735 A EA200600735 A EA 200600735A EA 200600735 A EA200600735 A EA 200600735A EA 009376 B1 EA009376 B1 EA 009376B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
ghrelin
nucleic acids
bioactive ghrelin
sziziz
Prior art date
Application number
EA200600735A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200600735A1 (ru
Inventor
Свен КЛУССМАНН
Штеффен Хельмлинг
Дирк Эульберг
Кристиан Маш
Клаус БУХНЕР
Original Assignee
Нокссон Фарма Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Нокссон Фарма Аг filed Critical Нокссон Фарма Аг
Publication of EA200600735A1 publication Critical patent/EA200600735A1/ru
Publication of EA009376B1 publication Critical patent/EA009376B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, специфично связывающей биоактивный грелин, более предпочтительно н-октаноил-грелин, и к ее применению для диагностики заболеваний и расстройств, опосредованных грелином.

Description

Настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые связывают биоактивный грелин, и к применению такой нуклеиновой кислоты для связывания и обнаружения биоактивного грелина.
Грелин был идентифицирован как природный лиганд рецептора стимулятора секреции гормона роста 1а (СН8К1а). Этот рецептор наиболее распространен в гипофизе и в гипоталамических участках головного мозга, но также может быть обнаружен в других тканях в низких концентрациях. Начиная с конца 70-х годов, было показано, что синтетические пептиды и другие соединения, названные стимуляторами секреции, стимулируют высвобождение гормона роста. Однако природный лиганд, ответственный за высвобождение гормона роста, оставался неизвестным вплоть до открытия грелина в 1999 году. Грелин представляет собой высокоосновный пептидный гормон из 28 аминокислот с октано ильной кислотной боковой цепью по третьей аминокислоте его Ν-конца (серии 3). Эта необычная модификация требуется для взаимодействия при СН8-рецепторе и для его активности. Однако в биологических образцах присутствует смесь обеих форм, как октаноил-грелина, который представляет собой биологически активную форму грелина, так и немодифицированного или дезоктаноил-грелина. Аминокислотная последовательность очищенного грелина крысы была определена с помощью белкового секвенатора как С88ЕЕ8РЕНОКАООККЕ8ККРРАКЕОРК (8ЕО. ГО. Νο. 19). Соответствующая последовательность человека отличается только по двум положениям, несущим такую же н-октаноил-боковую цепь по положению аминокислоты серии 3 (С88ЕР8РЕНОРСООИКЕ8ККРРАКРОРИ (8ΕΩ. ГО. Νο. 16).
Кроме встречающегося в природе н-октаноильного остатка ненасыщенные или разветвленные октаноильные группы и более длинные алифатические цепи, включенные по положению 3 грелина, также опосредуют распознавание рецептора. Домен взаимодействия с рецептором расположен на самом Νконце грелина; исследования делеций указывают на то, что грелин (1-10) |С88ЕЕ8РЕНО. 8ЕО. ГО. Νο. 17] и даже минимальный мотив из аминокислот 1-5 (грелин (1-5) [С88ЕЬ, 8ЕО. ГО. Νο. 18]) являются достаточными для стимуляции СН8К1а, но в обоих случаях наблюдается строгое требование в отношении модификации пептида н-октаноильным остатком.
Показано, что грелин опосредует физиологические функции, имеющие отношение к анаболическому состоянию. Хотя он непосредственно стимулирует высвобождение гормона роста (СН) из гипофиза, эксперименты на грызунах также показали, что грелин индуцирует питание независимым от СН образом путем воздействия на нейроны гипоталамуса. Интересно, что первичным сайтом продуцирования грелина являются собственные железы желудка, подтверждая, что он служит в качестве гормональной связи между желудком, гипофизом и гипоталамусом. Наблюдение того факта, что введение грелина крысам приводило в результате к увеличению массы тела вследствие изменений в поглощении энергии и/или утилизации энергии, подтверждает такую роль. Кроме того, системное введение грелина людям вызывает ощущения голода у испытуемых субъектов и вызывает переедание. На основании этих открытий считают, что грелин играет решающую роль в регуляции аппетита и массы тела, являясь как острым, так и хроническим сигналом состояния недостаточного питания. Дополнительное подтверждение этой гипотезы следует из наблюдений того факта, что и уровни грелина, и аппетит снижены у индивидуумов после желудочного шунтирования, что вносит, по меньшей мере, частичный вклад в эффективность этой методики при осуществлении похудания. Клинические данные у пациентов с синдромом Прадера-Вилли также позволяют предположить, что гиперфагия и ожирение, ассоциированные с заболеванием, являются следствием огромной гипергрелинемии. Кроме того, обнаружено, что грелин индуцирует гипергликемию и ингибирование высвобождения инсулина, указывая на вовлечение в метаболизм глюкозы. В дополнение к этим функциям в энергетическом метаболизме грелин также вовлечен в ряд других процессов. Было обнаружено, что он экспрессируется в ряде нейроэндокринных опухолей и стимулирует, кроме высвобождения СН из гипофиза, высвобождение адренокортикотропного гормона (АСТН), пролактина (РКЬ) и кортизола. Было обнаружено, что однократные инъекции грелина здоровым индивидуумам повышают минутный сердечный выброс и снижают кровяное давление. Таким образом, действие грелина по-видимому вовлечено в ряд различных задач. Информация о предшествующем уровне техники может быть получена из М. Н. ^κούα, Υ. Эа!е, Μ. ΝαΡαζαΙο, Н. Ма!8и, К. Капдатеа, СНге1т 18 а дго\\'!НΙιοηηοηοϊΌΐοαδίηβ асу1а!еб рерйбе Гют 8!οтасΗ. №1!нге 402: 656-60, 1999; М. Т8сНбр, Э.Ь. 8тйеу, М.Ь. Не1тап, СНге1т тбнсе8 αάίροδίΐλ' ίη гобепй, №!нге 407: 908-13, 2000; А.М. \Угеп е! а1., СНгейп епНапсе8 арре1Ие апб тсгеакек Γοο6 ш!аке ίη Нитап8, Ιοιππαΐ οΓ Сйшса1 Εηάο^ηοίο^ Ме!^^!^ 86: 5992-6, 2001; М. Nакаζа!ο е! а1., А га1е Γογ дНге1т ίη !Не сеп!га1 гедн1а!юп οΓ Геебшд, №1!нге 409: 194-8, 2001; Ν. №дауа, е! а1., Ат 1 РНу8ю1 Кеди1 1п!едг Сотр РНу8ю1. 2001 Мау; 280(5): К.1483-7; Нетοбуηат^с апб Ηοηηοηα1 еГГес18 οΓ Питан дНгеНп ίη Неа1!Ну νο1ип!ее^8; УЫаШе М, е! а1., 1 С1т Εη6ο^ίηο1 Ме!аЬ. 2002 Маг; 87(3): 13008. Ехрге88юп οΓ дНгеНп аиб οΓ !Не СН 8ес^е!адοдие гесерЮг Ьу рапсгеайс 181е1 се118 апб ге1а!еб еηбοс^^ηе !ипюг8; 1еПсгу РЬ, е! а1., 1 Εΐ'Ηο^ίηοΡ 2002 Маг; 172(3):К7-11 Е.хрге88юп апб ас!юп οΓ !Не дго\\111 Ηοηηοικ ге1еа8шд рерйбе дНге1т апб ί!8 гесерЮг ίη рго8!а!е сапсег се11 11пе8; Εд^бο ЕМ, е! а1., Еиг 1 Εΐ'Ηο^ίηοΡ 2002 ЕеЬ; 146(2):241-4 1п1иЫЮгу еПсс! οΓ дНгеНп οη Ш8и1ш апб рапсгеабс 8οта!ο8!а!^п 8есге!юп; Вгод1ю Е, е! а1, 1 С1ш Εпбοс^^пο1 Ме!аЬ. 2001 Ос!; 86(10):5083-6, СНге1ш, а па1ига1 СН 8ес^е!адοдие ргобнсеб Ьу Ле 8!οтасΗ, 1пбисе8 Нурегд1усепиа апб гебисе8 Ш8и1ш 8есге!юп ίη Нитап8; Вебпагек МА, е! а1, 1 Меб СНет. 2000 Ос!.; 43:4370-6 δΙπκΙιιΐΌ-ΓιιικΙίοη 8!иб1е8 οη !Не пете дго\\'!Н Ηο^тοие-^е1еа8^ид рер!1бе, дНгеНп: т1шта1 8ес.|непсе οΓ дНгеНп песе88агу Γογ асйуа!юп οΓ дго\\'!Н 1югпюпе 8ес^е!адοдие гесерЮг 1а.
- 1 009376
Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, заключается в том, чтобы предложить средства для связывания биоактивного грелина, и более конкретно, предложить способ лечения заболеваний и расстройств, опосредованных биоактивным грелином, а также способы специфичного обнаружения биоактивного грелина.
Согласно настоящему изобретению эта задача решена посредством объектов, заявленных в независимых пунктах формулы изобретения, которая прилагается здесь. Предпочтительные воплощения следуют из зависимых пунктов.
Грелин человека представляет собой основный пептид, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии с 8Ер. ГО. Νο. 16, и модифицирован боковой цепью жирной кислоты. С учетом высокой степени гомологии пептидной последовательности между различными видами термин «грелин», используемый здесь, относится к любому грелину, включая грелин млекопитающих, но не ограничен им. Предпочтительно грелин млекопитающих выбран из группы, включающей грелин мышей, крыс, кроликов, хомяков и человека. Наиболее предпочтительно грелин представляет собой грелин человека.
Рассчитанная изоэлектрическая точка (р1) грелина равна 11,09. Несмотря на эту высокоосновную общую р1 грелина, мотив связывания рецептора С88РЬ [грелин (1-5)] представляет собой достаточно кислый домен, имеющий рассчитанную р1, равную 5,5. Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии того, что посредством полноразмерного грелина может быть отобрана нуклеиновая кислота, которая специфично распознает кислый домен связывания рецептора, но не распознает основные центральный и карбоксиконцевой домены этого пептида. Это является неожиданным в отношении электро статических эффектов как зарядов молекулы-мишени, то есть грелина, так и зарядов нуклеиновой кислоты. Связывание отрицательно заряженных нуклеиновых кислот с основным доменом молекулы-мишени должно обладать значительными преимуществами по сравнению со связыванием нуклеиновой кислоты с кислым доменом молекулы-мишени. Следовательно нужно подчеркнуть, что специалисты в данной области техники не ожидают обоснованного успеха в выборе нуклеиново-кислотного лиганда, который не связывается с основной частью грелина, но связывается с кислым доменом молекулы-мишени.
Кроме аминоконцевого мотива связывания рецептора биологически активный грелин, который также называют здесь биоактивным грелином, характеризуется его ацилированием группой н-октаноил при аминокислоте серии 3. Нуклеиново-кислотный лиганд аминоконцевого мотива С88РЬ, раскрытый здесь, дает возможность отличения биологически активной формы от биологически неактивной или не биоактивной формы грелина. Это является неожиданным, поскольку связывание строго зависит от присутствия двух группировок, октаноильной группы и пептида: связывание нуклеиновой кислоты с октаноил-грелином является специфичным в присутствии 1000-кратного избытка дезоктаноил-грелина, более предпочтительно в присутствии 100-кратного избытка дезоктаноил-грелина и наиболее предпочтительно в присутствии 10-кратного избытка дезоктаноил-грелина. Кроме того, характеристики связывания также специфичны для пептидной группировки с учетом того факта, что энантиомерный октаноил-грелин не распознается нуклеиновой кислотой; октаноильная группа не является достаточной для связывания.
Как используют здесь в предпочтительных воплощениях, биоактивный грелин представляет собой грелин, который проявляет в предпочтительном воплощении по существу все характеристики встречающегося в природе грелина. В частности, биоактивный грелин, как используют здесь в предпочтительных воплощениях, представляет собой любой грелин и производное грелина, который является ответственным за высвобождение или который может запускать высвобождение гормона роста, более предпочтительно посредством взаимодействия с рецептором СН8. В противоположность этому в предпочтительных воплощениях биологически неактивный грелин представляет собой грелин, который отличается от биоактивного грелина, более предпочтительно не запускает высвобождение гормона роста, более предпочтительно посредством взаимодействия с рецептором СН8.
Признаки нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, как описано здесь, могут быть реализованы в любом аспекте настоящего изобретения, где используют нуклеиновую кислоту, либо в отдельности, либо в комбинации.
Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению также включает нуклеиновые кислоты, которые являются по существу гомологичными конкретным последовательностям, раскрытым здесь. Термин «по существу гомологичный» следует понимать так, что гомология составляет по меньшей мере 75%, предпочтительно 85%, более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно более чем 95, 96, 97, 98 или 99%.
Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению также включает в одном из воплощений нуклеиновую кислоту, которая является производной от конкретных последовательностей, раскрытых здесь. Термин «производное» следует понимать так, что на основе 8Ер. ГО Νο. 1 локусы инсерции Ιη51-Ιη§4, показанные на фиг. 1А, могут быть представлены любой последовательностью длиной максимум 30 нуклеотидов, предпочтительно любой последовательностью максимум 20 нуклеотидов, более предпочтительно любой последовательностью максимум 10 нуклеотидов и наиболее предпочтительно любой последовательностью 0-3 нуклеотида для Ιη§1, 0-14 нуклеотидов для Ιη§2, 1-3 нуклеотида для Ιη§3 и 0-2 нуклеотида для 1из4. Внутреннюю петлю 1Ь 1а, представленную Ιη§2, считают наиболее важным сайтом модификации.
- 2 009376
Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть также представлена в предпочтительном воплощении следующей общей формулой: ΟΟυΟΥΟΝιη^ΑΟΟΥΑΝ^ι^ΑΑΑΑΟΝρ^) иААК№СС6АА6биААССА№иССиАСН(0-2)АС6 (ЗЕО, ПТ Νο. 1), где Υ означает υ или С, К означает А или С, V означает υ или А. В связи с этим следует отметить, что любой из индексов представляет собой любое целое число, начиная с первой указанной цифры до последней указанной цифры, и любое целое число между ними. Соответственно, например, 0-3 представляет собой 0, 1, 2 и 3.
Таким образом, консенсусная последовательность 8Ер. ГО. Νο. 1 содержит четыре области, где инсерции вариабельной длины наблюдают в различных воплощениях. Эти области называют локусами инсерции и отмечают как Ιπ81-Ιπ84. В соответствии с Ь-ΝΟΧ-ΒΙΙ, обозначенной как 8Ер. ΙΌ. Νο. 2 на фиг. 1А, 1иб1 локализован между нуклеотидами 6 и 7, 1пз2 локализован между нуклеотидами 13 и 14, 1пз3 локализован между нуклеотидами 18 и 20 и 1пз4 локализован между нуклеотидами 44 и 45. Длина соответствующих локусов инсерции, наблюдаемая в изображенных клонах, дана в 8Ер. ГО. Νο. 1 и в указанной выше общей формуле.
Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению также включает в одном из воплощений нуклеиновую кислоту, которая представляет собой структурный гомолог конкретных последовательностей, раскрытых здесь, предпочтительно до такой степени, что указанные участки вовлечены в связывание с октаноил-грелином и исключение дез-октаноил-грелина. Структурную гомологию, как она использована в отношении предпочтительных воплощений настоящего изобретения, следует понимать так, что эти последовательности укладываются в характеристическую модель вторичной структуры, содержащую основной стебель и внутреннюю петлю, а также концевую петлю на конце стебля, как изображено на фиг. 1В, предпочтительно укладываются в указанную структуру, где в областях стебля встречаются компенсаторные замены оснований, и предпочтительно укладываются в указанную структуру, где в однонитевых протяженных участках встречаются замены, делеции и/или инсерции, и наиболее предпочтительно укладываются в указанную структуру, соответствующую фиг. 1В по размеру и последовательности 8Ер. ГО. 1 по последовательности.
В термин «нуклеиновая кислота по изобретению» или «нуклеиновая кислота по настоящему изобретению» следует также включать те нуклеиновые кислоты, которые содержат участки последовательностей нуклеиновых кислот, раскрытых здесь, предпочтительно до такой степени, чтобы указанные участки были вовлечены в связывание с грелином и отличение биоактивного грелина от биологически неактивного грелина, то есть, в частности, октаноил-грелина от дезоктаноил-грелина. Такая нуклеиновая кислота может быть образована от раскрытых здесь, например, путем усечения. Усечение может относиться к любому концу или к обоим концам нуклеиновых кислот, как раскрыто здесь. Усечение может также относиться к внутренней последовательности нуклеотидов, то есть оно может относиться к нуклеотиду(ам) между 5'- и З'-концевым нуклеотидом, соответственно. Кроме того, усечение должно включать насколько возможно малую делецию, такую как делеция единственного нуклеотида из последовательности нуклеиновых кислот, раскрытых здесь. Усечение может также относиться к более чем одному участку нуклеиновой(ых) кислот(ы) по изобретению, где этот участок может иметь насколько возможно малую длину, такую как один нуклеотид.
Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут представлять собой либо Ό-нуклеиновые кислоты, либо Ь-нуклеиновые кислоты. Предпочтительно нуклеиновые кислоты по изобретению представляют собой Ь-нуклеиновые кислоты. Кроме того, возможно, чтобы один или несколько участков нуклеиновой кислоты присутствовали в виде Ό-нуклеиновых кислот, либо по меньшей мере один или несколько участков нуклеиновых кислот представляли собой Ь-нуклеиновые кислоты. Термином участок нуклеиновых кислот следует обозначать насколько возможно малый участок, такой как один нуклеотид. Такие нуклеиновые кислоты в целом называют здесь Ό- и Ь-нуклеиновые кислоты, соответственно.
В термин «нуклеиновая кислота по изобретению» или «нуклеиновая кислота по настоящему изобретению» следует также включать те нуклеиновые кислоты, которые содержат последовательности нуклеиновых кислот, раскрытые здесь, и другие последовательности, присоединенные к ним, предпочтительно до той степени, чтобы указанные участки или нуклеиновые кислоты были вовлечены в связывание с октаноил-грелином и отличение дезоктаноил-грелина. Удлинения, то есть дополнительные последовательности, присоединенные к специфичным последовательностям нуклеиновых кислот, раскрытым здесь, могут быть такими, чтобы последовательность удлинялась либо с 5'-конца, либо с З'-конца, либо с обоих концов, и она может содержать такое количество, как 100 нуклеотидов с каждой стороны, предпочтительно такое количество, как 50 нуклеотидов с каждой стороны, более предпочтительно такое количество, как 20 нуклеотидов с каждой стороны, и наиболее предпочтительно полноразмерную или частичную 5'-фланкирующую последовательность, которая раскрыта здесь как 8Ер. ГО. Νο. 20, и/или полноразмерную или частичную З'-фланкирующую последовательность, которая раскрыта здесь как 8Ер. ГО. Νο. 21. Термин «частично», как он использован здесь, означает в предпочтительном воплощении настоящего изобретения единственный нуклеотид соответствующей последовательности или последовательность из двух или более чем двух нуклеотидов такой последовательности, которые являются соседними друг с другом в последовательности, к которой они относятся, более предпочтительно к фланки
- 3 009376 рующим последовательностям в соответствии с любой из 8ЕО. ΙΌ. Νο. 20 и 21.
В объем настоящего изобретения также входит то, что нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению представляют собой участок более длинной нуклеиновой кислоты, где эта более длинная нуклеиновая кислота содержит несколько участков, где по меньшей мере один участок представляет собой нуклеиновую кислоту, либо ее участок, в соответствии с настоящим изобретением. Другой участок этих более длинных нуклеиновых кислот может представлять собой либо Ό-нуклеиновую кислоту, либо Ьнуклеиновую кислоту. Любую комбинацию можно использовать согласно настоящему изобретению. Этот другой участок (участки) этой более длинной нуклеиновой кислоты может проявлять функцию, которая отлична от связывания. Одной из возможных функций является обеспечение возможности взаимодействия с другими молекулами, такими как, например, молекулы для иммобилизации, перекрестного связывания, обнаружения или амплификации.
Ь-нуклеиновые кислоты, как они использованы здесь, представляют собой нуклеиновые кислоты, состоящие из Ь-нуклеотидов, предпочтительно состоящие полностью из Ь-нуклеотидов.
Ό-нуклеиновые кислоты, как они использованы здесь, представляют собой нуклеиновые кислоты, состоящие из Ό-нуклеотидов, предпочтительно состоящие полностью из Ό-нуклеотидов.
Независимо от того, состоит ли нуклеиновая кислота по изобретению из Ό-нуклеотидов, Ьнуклеотидов или комбинации обоих, где эта комбинация представляет собой, например, случайную комбинацию или определенную последовательность участков, состоящих по меньшей мере из одного Ьнуклеотида и по меньшей мере одной Ό-нуклеиновой кислоты, эта нуклеиновая кислота может состоять из дезоксирибонуклеотида(ов), рибонуклеотида(ов) или их комбинаций.
Конструирование нуклеиновых кислот по изобретению в виде Ь-нуклеиновой кислоты является предпочтительным по нескольким причинам. Ь-нуклеиновые кислоты представляют собой энантиомеры встречающихся в природе нуклеиновых кислот. Ό-нуклеиновые кислоты, однако, не очень стабильны в водных растворах и, в частности, в биологических системах или в биологических образцах из-за широкого распространения нуклеаз. Встречающиеся в природе нуклеазы, в частности нуклеазы из животных клеток, неспособны к разрушению Ь-нуклеиновых кислот. В связи с этим биологический период полувыведения Ь-нуклеиновой кислоты значительно увеличен в такой системе, включая организм животного и человека. Благодаря отсутствию разрушаемости Ь-нуклеиновой кислоты не образуются продукты нуклеазного распада и, следовательно, не наблюдается побочных эффектов, возникающих из-за них. Этот аспект разграничивает Ь-нуклеиновую кислоту и фактически все другие соединения, которые применяют в терапии заболеваний и/или расстройств, в которые вовлечено присутствие грелина.
В объем настоящего изобретения также входит то, что нуклеиновые кислоты по изобретению, независимо от того, присутствуют ли они в виде Ό-нуклеиновых кислот, Ь-нуклеиновых кислот или О,Ьнуклеиновых кислот, и от того, представляют ли они собой ДНК или РНК, могут быть представлены однонитевыми или двунитевыми нуклеиновыми кислотами. Типично нуклеиновые кислоты по изобретению представляют собой однонитевые нуклеиновые кислоты, которые проявляют определенные вторичные структуры благодаря первичной последовательности и могут, следовательно, также образовать третичные структуры. Нуклеиновые кислоты по изобретению, однако, могут быть также двунитевыми в том значении, что две нити, которые комплементарны друг другу, гибридизуются друг с другом. Это придает стабильность нуклеиновой кислоте, которая будет предпочтительна, если нуклеиновая кислота присутствует в природной Ό-форме, а не в Ь-форме.
Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть модифицированы. Такие модификации могут относиться к единственному нуклеотиду нуклеиновой кислоты и хорошо известны в данной области техники. Примеры такой модификации описаны среди прочего в Киззег, (2000) 1 Вю!есйио1, 74: 27-38; Аигир, Н. е! а1. (1994) М.1с1е1с Ас1бз Вез, 22, 20-4; Сишшшз, Ь.Ь. е! а1, (1995) №.1с1ею Ас1бз Вез, 23, 201924; Еа!оп, В.Е. е! а1. (1995) Сйеш Βίο1, 2, 633-8; Огееи, Ь.8. е! а1., (1995) Сйеш Βίο1, 2, 683-95; Ка\\азак1. А.М. е! а1., (1993) 1 Меб Сйеш, 36, 831-41; Ьезшк, Е.А. е! а1., (1993) Вюсйеш1з1гу, 32, 7832-8; МШег, Ь.Е. е! а1., (1993) 1 Рйузю1, 469, 213-43.
Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут представлять собой многокомпонентную нуклеиновую кислоту. Многокомпонентная нуклеиновая кислота, как она использована здесь, представляет собой нуклеиновую кислоту, которая состоит из по меньшей мере двух нитей нуклеиновой кислоты. Эти по меньшей мере две нити нуклеиновой кислоты образуют функциональную единицу, где эта функциональная единица является лигандом для молекулы-мишени. Эти по меньшей мере две нити нуклеиновой кислоты могут быть образованы из любой из нуклеиновых кислот по изобретению либо путем расщепления нуклеиновой кислоты с образованием двух нитей, либо путем синтеза одной нуклеиновой кислоты, соответствующей первой части нуклеиновой кислоты по изобретению, то есть всей нуклеиновой кислоты, и другой нуклеиновой кислоты, соответствующей второй части всей нуклеиновой кислоты. Следует признать, что как расщепление, так и синтез могут быть использованы для образования многокомпонентной нуклеиновой кислоты, где имеется более двух нитей, как проиллюстрировано выше. Иными словами, по меньшей мере две нити нуклеиновой кислоты обычно отличаются от двух нитей, являющихся комплементарными и гибридизующихся друг с другом, хотя некоторая степень комплементарности между различными участками нуклеиновой кислоты может существовать.
- 4 009376
Возможность определения константы связывания представляет собой использование так называемого устройства В1асоге, которое также известно специалистам в данной области техники. Аффинность, как используют здесь, также измеряли с использованием «анализов с помощью гранул», как описано в примере 5. Соответствующей мерой для выражения интенсивности связывания между нуклеиновой кислотой в соответствии с мишенью, которая в настоящем случае представляет собой грелин, является так называемая величина Кй, которая, как и способ ее определения, известна специалистам в данной области техники.
Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению характеризуются определенной величиной Кй. Предпочтительно величина Кй, проявляемая нуклеиновыми кислотами по настоящему изобретению, находится ниже 1 мкМ. Величину Кй примерно 1 мкМ считают характеристической для неспецифичного связывания нуклеиновой кислоты с мишенью. Как должно быть понятно специалистам в данной области техники, величина Кй группы соединений, таких как нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, находится в пределах определенного интервала. Вышеупомянутая Кй примерно 1 мкМ является предпочтительным верхним пределом для величины Кй. Предпочтительный нижний предел для Кй связывания нуклеиновых кислот с мишенью может составлять примерно 10 пикомоль или выше. В пределах настоящего изобретения величины Кй индивидуальных нуклеиновых кислот, отличающие биоактивный грелин от биологически неактивного грелина, то есть предпочтительно октаноил-грелин от дезоктаноилгрелина, находятся в пределах данного интервала от 10 пМ до 1 мкМ, более предпочтительно в пределах интервала от 100 пМ до 500 нМ и наиболее предпочтительно в пределах интервала от 1 нМ до 100 нМ.
Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут иметь любую длину, при условии, что они все еще способны связываться с молекулой-мишенью и отличать биоактивный грелин от биологически неактивного грелина, то есть предпочтительно октаноил-грелин от дезоктаноил-грелина. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что существуют предпочтительные длины нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Типично эта длина находится между 15 и 120 нуклеотидами. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что любое целое число между 15 и 120 составляет возможную длину нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Более предпочтительными интервалами для длины нуклеиновых кислот по настоящему изобретению являются длины примерно от 20 до 100 нуклеотидов, примерно от 20 до 80 нуклеотидов, примерно от 20 до 60 нуклеотидов, примерно от 20 до 50 нуклеотидов и примерно от 30 до 50 нуклеотидов.
Анализы по отличению биоактивного и биологически неактивного грелина согласно настоящему изобретению можно проводить, используя стандартные методики, как известно специалистам в данной области техники. В предпочтительном аспекте эти анализы можно проводить в 96-луночных планшетах, где компоненты иммобилизованы в реакционных сосудах, как раскрыто согласно формуле изобретения. Возможно, комплексы можно удалить из реакционных сосудов после образования комплексов.
В одном аспекте молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению анализируют с помощью вторичных средств обнаружения, где указанные средства обнаружения представляют собой молекулярный зонд. Методология молекулярного зонда известна специалистам в данной области техники. Кратко, нуклеиново-кислотные зонды, которые также называют молекулярными зондами, представляют собой обратный комплемент образца нуклеиновой кислоты, подлежащего обнаружению, и в связи с этим гибридизуются с участком образца нуклеиновой кислоты, подлежащего обнаружению. При связывании с образцом нуклеиновой кислоты отделяются флуорофорные группы молекулярного зонда, что приводит в результате к изменению сигнала флуоресценции, предпочтительно к изменению интенсивности. Это изменение коррелирует с количеством присутствующих нуклеиновых кислот в образце.
Нуклеиновые кислоты по изобретению, которые также называют здесь нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению и/или антагонисты по настоящему изобретению, могут быть использованы для изготовления или производства лекарства. Такое лекарство содержит по меньшей мере одну из нуклеиновых кислот по изобретению, возможно вместе с дополнительными фармацевтически активными соединениями, где сама нуклеиновая кислота по изобретению предпочтительно действует в качестве фармацевтически активного соединения. Такие лекарства содержат в предпочтительных воплощениях по меньшей мере фармацевтически приемлемый носитель. Такой носитель может представлять собой, например, воду, буфер, крахмал, сахар, желатин или любое другое приемлемое вещество-носитель. Такие носители в целом известны специалистам в данной области техники. Заболевания, и/или расстройства, и/или болезненные состояния, для лечения и/или предупреждения которых можно применять такое лекарство, включают, но не ограничены ими, ожирение, регуляцию энергетического баланса, аппетита и массы тела, расстройства питания, диабет, метаболизм глюкозы, опухоль, кровяное давление и сердечнососудистые заболевания. Как должно быть понятно специалистам в данной области техники, нуклеиновые кислоты по изобретению могут применяться фактически при любом заболевании, где антагонист грелина можно вводить пациенту, нуждающемуся в таком антагонисте, и такой антагонист подходит для элиминации случая заболевания или расстройства или по меньшей мере уменьшения воздействий в результате этого заболевания или расстройства. Такое воздействие включает, но не ограничено им, ожирение, регуляцию энергетического баланса, аппетита и массы тела, расстройства питания, диабет, метаболизм глюкозы, опухоль, кровяное давление и сердечно-сосудистые заболевания. Для. целей настоящего
- 5 009376 изобретения регуляцию энергетического баланса рассматривают как заболевание. Более конкретно, применение предназначено для лечения любого заболевания, где на регуляцию энергетического баланса оказывает влияние грелин, либо непосредственно, либо опосредованно, и где желательно уменьшение биодоступности грелина. То же самое применимо к обмену сахаров, кровяному давлению, а также аппетиту и массе тела. Дополнительными заболеваниями, которые можно лечить с использованием нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, возможно путем системного или местного введения, являются заболевания, которые могут быть выбраны из группы, включающей опухоли гипофиза, акромегалию, центральный синдром Кушинга, надпочечниковый синдром Кушинга, паранеопластический синдром Кушинга, эктопический синдром Кушинга, опухоль надпочечника, стресс, гиперкортицизм, сердечную недостаточность, инфаркт сердца, удар, адренокортикальную недостаточность, гипотонию, стеноз аорты, легочную гипертонию, констриктивный перикардит, инфекционные заболевания, инфекционную токсическую гипотонию, гиповолемию и гипонатриемию.
Следует понимать, что нуклеиновую кислоту, а также антагонисты по настоящему изобретению можно применять не только в качестве лекарства или для производства лекарства, но также в косметических целях, в частности, в отношении вовлечения грелина в ожирение. С той же целью нуклеиновую кислоту, а также антагонисты по настоящему изобретению можно применять в качестве пищевой добавки, средств для регуляции массы тела и/или средств для регуляции аппетита. Композицию, содержащую нуклеиновую кислоту, а также антагонисты по настоящему изобретению можно применять для любой из вышеупомянутых целей.
Нуклеиновую кислоту по изобретению можно, кроме того, использовать в качестве исходного вещества для разработки лекарств. В основном, существует два возможных подхода. Один подход представляет собой скрининг библиотек соединений, где такие библиотеки соединений предпочтительно представляют собой библиотеки низкомолекулярных соединений. Такие библиотеки известны специалистам в данной области техники. Альтернативно, нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению можно использовать для рациональной разработки лекарств.
Рациональная разработка лекарств может начинаться с любой из нуклеиновых кислот по настоящему изобретению и включает структуру, предпочтительно трехмерную структуру, которая подобна структуре нуклеиновых кислот по изобретению или идентична участкам, опосредующим связывание этой структуры нуклеиновыми кислотами по изобретению. В любом случае такая структура все еще проявляет такие же или подобные характеристики связывания, что и нуклеиновые кислоты по изобретению. Либо в качестве дополнительной стадии, либо в качестве альтернативной стадии в рациональной разработке лекарств предпочтительную трехмерную структуру этих участков нуклеиновых кислот, связывающихся с нейротрансмиттером, имитируют химическими группами, которые отличны от нуклеотидов и нуклеиновых кислот. С помощью этой имитации можно разработать соединение, отличное от нуклеиновых кислот. Такое соединение предпочтительно представляет собой малую молекулу или пептид.
В случае скрининга библиотек соединений, как, например, путем использования конкурентного анализа, который известен специалистам в данной области техники, могут быть обнаружены соответствующие аналоги грелина, агонисты грелина или антагонисты грелина. Такие конкурентные анализы могут быть поставлены следующим образом. Нуклеиновую кислоту по изобретению, предпочтительно шпигельмер (8р1еде1тег), которая представляет собой связывающую мишень Ь-нуклеиновую кислоту, пришивают к твердой фазе. Чтобы идентифицировать аналоги грелина, в этот анализ может быть добавлен меченный грелин. Потенциальный аналог будет конкурировать со связыванием молекул грелина со шпигельмером, и параллельно с этим будет происходить снижение сигнала, получаемого с помощью соответствующей метки. Скрининг на агонисты или антагонисты может включать использование анализа клеточной культуры, как известно специалистам в данной области техники.
Набор по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере одну или несколько нуклеиновых кислот по изобретению. Дополнительно этот набор может содержать по меньшей мере один или несколько положительных или отрицательных контролей. Положительный контроль может, например, представлять собой грелин, в частности грелин, против которого отобрана нуклеиновая кислота по изобретению, либо с которым она связывается, предпочтительно в жидкой форме. Отрицательный контроль может, например, представлять собой пептид, который определен в отношении биофизических свойств как подобный грелину, но который не распознается нуклеиновыми кислотами по изобретению. Кроме того, указанный набор может содержать один или несколько буферов. Различные ингредиенты могут содержаться в наборе в высушенной или лиофилизированной форме или быть растворены в жидкости. Этот набор может содержать один или несколько контейнеров, которые, в свою очередь, могут содержать один или несколько ингредиентов набора.
Следует понимать, что любая из последовательностей, раскрытая в примерах и графических материалах, соответственно, раскрыта как таковая, и любую такую последовательность можно применять в любом аспекте и воплощении настоящего изобретения.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано графическими материалами, примерами и перечнем последовательностей, на основании которых могут быть получены дополнительные признаки, воплощения и преимущества, где на фиг. 1А показаны члены группы Ь-ΝΟΧ-ΒΙΙ, их название,
- 6 009376 частота, с которой они были отобраны, и их усеченная последовательность, которую альтернативно можно удлинить 5'-фланкирующей последовательностью 5'-66А6СиСА6АСииСАСи-3' (8ЕЦ. ΙΌ. Νο. 20) и З'-фланкирующей последовательностью 5'-иАССАСибиС6СииССАС-3' (8ЕЦ. ГО. Νο. 21), и указаны локусы инсерции Ιηδ1-Ιηδ4;
на фиг. 1В показана модель вторичной структуры усеченного клона Ь-ΝΟΧ-Β11 и указаны области основного стебля, 5'- и 3'-участок внутренней петли (ГО Ια, ГБ 1Ь) и концевой стебель-петля;
на фиг. 2 показано зависимое от дозы высвобождение кальция, опосредованное октаноил- или дезоктаноил-грелином в полноразмерной или усеченной форме, в клеточном анализе с использованием клеток СНО, экспрессирующих человеческий рецептор грелина (титрование доза-ответ);
на фиг. 3 показано ингибирование высвобождения кальция, опосредованного полноразмерным и усеченным октаноил-грелином, шпигельмером Б-ΝΟΧ-ΒΠ (кривая ингибирования);
на фиг. 4 показаны результаты клеточного конкурентного анализа с октаноил-грелином, дезоктаноил-грелином и Б-ΝΟΧ-ΒΠ, где комбинации и концентрации компонентов суммированы ниже под полосами;
на фиг. 5 показаны результаты клеточного конкурентного анализа с октаноил-грелином (1-5), дезоктаноил-грелином (1-5) и Б-ΝΟΧ-ΒΠ, где комбинации и концентрации компонентов суммированы ниже под полосами;
на фиг. 6 показаны результаты анализа связывания ίη νίίτο, анализирующего связывание радиоактивно меченого Ό-ΝΟΧ-Β11 и Б-ΝΟΧ-Β11 с биотинилированным Ό-октаноил-грелином.
В приведенной ниже таблице объединены 8ЕЦ. ГО. Номера различных клонов и идентификаторов, соответственно, описаны здесь. Последовательности нуклеиновых кислот, если не указаны иным путем, представлены в виде (+) нитей и построены из 2'ОН-рибонуклеотидов.
Последовательность Тип последовательности 8ЕЦ. ГО. Νο
Группа консенсусной последовательности Б-ΝΟΧ-Β 11 Нуклеиновая кислота 1
Ь-ΝΟΧ-Β 11 Нуклеиновая кислота 2
Ь-ЧОХ-О2 Нуклеиновая кислота 3
Ε-ΝΟΧ-Ε12 Нуклеиновая кислота 4
1.-ΝΟΧ-Β7 Нуклеиновая кислота 5
Б-ΝΟΧ-Αβ Нуклеиновая кислота 6
Б-ΝΟΧ-Β 12 Нуклеиновая кислота 7
Б-ИОХ-ЕЗ Нуклеиновая кислота 8
Ь-ИОХ-СП Нуклеиновая кислота 9
Ε-ΝΟΧ-Ο11 Нуклеиновая кислота 10
ί-ΝΟΧ-АЗ Нуклеиновая кислота И
ΠΝΟΧ-Ρ5 Нуклеиновая кислота 12
Ι.-ΝΟΧ-Α12 Нуклеиновая кислота 13
Ι.-ΝΟΧ-Ε12 Нуклеиновая кислота 14
ί-ΝΟΧ-05 Нуклеиновая кислота 15
Грелин (человека) Пептид 16
Грелин человека (1-10) Пептид 17
Грелин человека (1-5) Пептид 18
Грелин (крысы) Пептид 19
5-фланкирующая последовательность Нуклеиновая кислота 20
3'-фланкирующая последовательность Нуклеиновая кислота 21
Пример 1. Связывающие грелин нуклеиново-кислотные лиганды.
В Европейской патентной заявке ЕР 02023627.8 и в Международной патентной заявке РСТ/ЕР03/08542 описано получение связывающих грелин нуклеиново-кислотных лигандов. Одна группа таких нуклеиново-кислотных лигандов, полученных в процессе отбора, показана на фиг. 1А. Клон БΝΟΧ-Β11 является наиболее распространенной последовательностью в этой группе и подобно всем другим членам этой группы является функциональным в длинном и усеченном варианте (Б-ΝΟΧ-Β 11 [86] и Б-ΝΟΧ-ΒΠ [47]). Для удлинения усеченных клонов 5'-фланкирующая и 3'-фланкирующая последовательности могут быть добавлены к показанной коровой последовательности.
5'-фланкирующая последовательность 5'-66А6СиСА6АСииСАСи-3' 8ЕЦ. ГО. Νο. 20, 3'-фланкирующая последовательность 5'-БАССАСиСБСССииССАС-3' 8ЕЦ. ГО. Νο. 21.
- 7 009376
На фиг. 1А суммированы только усеченные варианты, и в данной патентной заявке представлены только результаты, касающиеся этих усеченных клонов. Однако характеристики Ь-ΝΟΧ-ΒΙΙ [47], раскрытого здесь, также касаются всех удлиненных вариантов этих усеченных последовательностей.
Индивидуальные клоны в группе Ь-ΝΟΧ-ΒΙΙ являются высоко консервативными и проявляют идентичность длинных отрезков последовательности. Приведенная ниже консенсусная последовательность может быть получена на основе клонов, показанных на фиг. 1А: ΟΟϋΟΥΟΝ(0-3)ΑΟΟΥΑΝ(0-4) ΑΑΑΑΟΝ(ι-3)υΑΑΚ.νθΟ6ΑΑ66υΑΑΟΟΑνυθθυΑΟΝ(0-2)ΑΟ6(8Ερ. ΙΌ. Νο. 1), где Υ означает и или С, В означает А или О, V означает υ или А.
Как можно наблюдать, нуклеотидные замены обнаруживаются только в нескольких положениях. Кроме того, существует 4 определенные области, где встречается инсерция последовательности; эти локусы инсерции обозначены 1п51-1и54 и соответствуют буквам ’Ν(Χ-Υ)' в 8ΕΟ. ΙΌ. Νο.1. В этих положениях может быть вставлен любой нуклеотид в любом количестве, предпочтительно в количестве, указанном в скобках в 8ΕΟ. ΙΌ. Νο.1. В локусе инсерции 2 предпочтительным нуклеотидом вставки является аденозин.
Последовательность Ε-ΝΟΧ-Β11 укладывается в характеристическую вторичную структуру, показанную на фиг. 1В, включающую структуру основного стебля, внутренней петли и концевого стебляпетли. Подробный анализ всех последовательностей внутри этой группы показывает, что локусы инсерции последовательности главным образом попадают в область внутренней петли (1п§2). Концевой стебель-петля, а также основной стебель всегда идентичны и представляются высоко характеристическими для данного семейства молекул, связывающих грелин, и их специфичных признаков. Необходимо упомянуть, что некоторые замены последовательности, очевидные для специалиста в данной области техники, которые не нарушают или только слегка нарушают вторичную структуру, данную на фиг. 1В, могут быть сделаны без потери специфичной функции нуклеиновой кислоты, а именно в отличении биоактивного грелина от биологически неактивного грелина. В нескольких отборах, описанных в Европейской патентной заявке ЕР 02023627.8 и в Международной патентной заявке РСТ/ЕР03/08542, был найден этот вид модифицированных последовательностей. Признаки, описанные для Ε-ΝΟΧ-Β11, могут быть перенесены на те последовательности, которые являются достаточно консервативными в отношении последовательности и структуры.
Пример 2. Способ анализа индуцированного грелином высвобождения кальция.
Функциональную характеристику связывающего грелин шпигельмера проводят в системе клеточного анализа мониторинга взаимодействия грелина и рецептора стимулятора секреции гормона роста человека (ОН8-К.). Внутриклеточное высвобождение кальция, являющееся результатом взаимодействия рецептор-лиганд, визуализируют посредством флуоресцентного индикатора кальция.
Стабильно трансфицированные клетки СНО, экспрессирующие рецептор грелина человека (ОН8В1а) (получен от Еигоксгееп, Ооккейек, Βе1д^ит), высевают при концентрации 5-7х104 клеток на лунку в черный 96-луночный планшет с прозрачным дном (Огетег) и культивируют в течение ночи при 37°С и 5% СО2 в среде υΐΙπιί'ΉΟ (СатЬгех), которая содержит дополнительно 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 400 мкг/мл генетицина и 2,5 мкг/мл фунгизона.
Перед нанесением индикатора кальция красителя йио-4 клетки промывают один раз 200 мкл №Ο-υ+ (5 мМ пробенецид, 20 мМ НЕРЕ8 в среде υ11ηί'ΉΟ). Затем добавляют 50 мкл раствора индикаторного красителя (10 мкМ йио-4 (Мо1еси1аг РгоЬек), 0,08% р1игошс 127 (Мо1еси1аг РгоЬек) в ί.ΉΟ-υ+) и клетки инкубируют в течение 60 мин при 37°С. Затем клетки промывают три раза 180 мкл ΟΗΟ-υ+. Наконец добавляют 90 мкл ΟΗΟ-υ+ на лунку.
В анализе стимуляции полноразмерные или усеченные варианты человеческого или крысиного Ьгрелина либо в октаноил-, либо в дезоктаноил-форме используют, как указано [Ь-грелин и дезоктаноилЬ-грелин были получены от йасйет (На5е1. 8те11хег1апб). а Ь-грелин (1-5), Ь-грелин (1-10) и дезоктаноилЬ-грелин (1-5) были предоставлены Рйоешх Рйагтасеийса15 ^е^оШ, СΑ)].
Соответствующие пептиды инкубируют в ΟΗΟ-υ+ в течение 15-60 мин при комнатной температуре в 0,2 мл низкопрофильном 96-луночном планшете. В этих растворах стимуляции пептид находится в 10кратной концентрации по сравнению с анализом. Для обнаружения высвобождения кальция раствор стимуляции добавляют к клеткам (10 мкл/лунка) и проводят мониторинг изменения сигнала флуоресценции. Измерение сигналов флуоресценции проводят при длине волны возбуждения 485 нм и длине волны эмиссии 520 нм в многоканальном считывающем устройстве для планшетов Е1ио51аг Οрΐ^та (ΒΜΟ).
Для параллельного измерения нескольких образцов лунки одного (перпендикулярного) ряда 96луночного планшета считывают вместе. Первые три считывания с промежутком времени 4 с проводят для определения исходных данных. Затем считывание прерывают и планшет вынимают из аппарата. Используя многоканальную пипетку, в лунки добавляют 10 мкл раствора стимуляции, затем планшет снова помещают в аппарат и измерение продолжают. Всего проводят 20 считываний с интервалом времени 4 с.
Для каждой лунки определяют разность максимальной флуоресценции и исходного значения (ЕтахЕтт) и наносят на график против концентраций грелина. На фиг. 2 показаны кривые доза-ответ человече
- 8 009376 ского октаноил- и дезоктаноил-грелина (полноразмерного и усеченного пептида). Оказывается, что как полноразмерный, так и усеченный октаноил-грелин индуцируют высвобождение кальция, однако в различной степени: полноразмерный октаноил-грелин показывает максимальную активность при концентрации 30 нМ, тогда как октаноил-грелин 1-5 стимулирует только при более высоких концентрациях пептида и не достигает максимальной интенсивности сигнала в наблюдаемом интервале концентраций. Дезоктаноил-формы обоих пептидов не стимулируют человеческий рецептор грелина ни при какой концентрации, анализируемой в данном анализе. Эти эксперименты подтверждают, что пяти Ν-концевых аминокислот грелина достаточно для стимуляции человеческого рецептора грелина и что октаноилгруппа является существенной для биологической активности грелина.
Пример 3. Ингибирование индуцированного грелином высвобождения кальция связывающим грелин шпигельмером.
Ингибирование индуцированного грелином высвобождения кальция измеряли, используя клеточный анализ, описанный в примере 2. В качестве модификации этого способа в растворы стимуляции в анализе ингибирования добавляли варьирующие количества шпигельмера Ь-ΝΟΧ-ΒΙΙ. В качестве контроля анализировали образцы только с пептидом (максимальное высвобождение кальция) и образцы без пептида (минимальное высвобождение кальция). После инкубации в течение 15-60 мин при комнатной температуре к клеткам добавляли 10 мкл растворов стимуляции, получая в результате конечную концентрацию пептида 5 нМ. Обычно выбирали конечные концентрации шпигельмера 0,1, 1, 3, 10, 30 и 100 нМ.
Для каждой лунки определяют разность между максимальной флуоресценцией и исходным значением (Ртах-Ртт). Значения для 100% активности (отсутствие ингибирования) и 0% активности (полное ингибирование) могут быть определены на основании контрольных образцов (образцы «только пептид» и «без пептида»). Для всех других образцов соответствующую активность вычисляют в процентах и наносят на график против концентрации шпигельмера (кривая ингибирования), дающий возможность определить константу ингибирования, равную половине от максимума (1С50).
На фиг. 3 показаны кривые ингибирования, полученные на основании эксперимента, в котором анализируют ингибиторную активность Ε-ΝΟΧ-Β11 с полноразмерными и усеченными формами октаноил-грелина. Оказывается, что шпигельмер ингибирует активность всех протестированных форм октаноил-грелина: полноразмерного пептида, грелина 1-10 и грелина 1-5. Значения 1С50 не проявляют значительного отклонения для всех трех пептидов (полноразмерный грелин: 7 нМ, грелин 1-10: 9 нМ, грелин 1-5: 5 нМ). Можно сделать вывод, что область связывания шпигельмера локализована на Ν-конце грелина, включающем аминокислоты 1-5. Результатом связывания Ε-ΝΟΧ-Β11 с этим минимальным мотивом является эффективное ингибирование биологической активности грелина в клеточном анализе.
Пример 4. Отличение октаноил-грелина и дезоктаноил-грелина связывающими грелин шпигельмерами.
Характеристики связывания шпигельмера Ε-ΝΟΧ-Β11 с грелином далее анализировали в конкурентном анализе, основанном на способе, описанном в примере 3. В этих анализах шпигельмер инкубировали с различными комбинациями пептидов грелина в растворах стимуляции перед стимуляцией клеток.
Схема комбинаций пептидов и результаты эксперимента с полноразмерным грелином суммированы на фиг. 4 (полосы пронумерованы слева направо): без какого-либо грелина или с дезоктаноил-грелином в конечной концентрации 300 нМ никакой стимуляции клеток не обнаружили (полосы 1 и 2), тогда как октаноил-грелина уже в концентрации 10 нМ достаточно для опосредования высвобождения кальция (полоса 3); дополнительное добавление 300 нМ дезоктаноил-грелина (полоса 4) не препятствует стимуляции клеток, что указывает на то, что биологически неактивный дезоктаноил-грелин не является антагонистом рецептора. Высвобождение кальция, опосредованное 10 нМ октаноил-грелина, может быть ингибировано 3-кратным избытком Ε-ΝΟΧ-Β11 (полоса 5), и даже присутствие дезоктаноил-грелина в 30-кратном избытке (300 нМ) по отношению к октаноил-грелину недостаточно для ингибирования (полоса 6). Напротив, аналитическая концентрация 300 нМ октаноил-грелина и 30 нМ шпигельмера проявляет повышенное высвобождение кальция (полоса 7), свидетельствуя о том, что в условиях анализа может быть достигнуто усиление стимуляции октаноил-грелином. Данный эксперимент демонстрирует, что Ε-ΝΟΧ-Β11 специфично различает грелин в октаноил-форме и дезоктаноил-форме.
Эксперимент повторяли с грелином 1-5 вместо полноразмерного пептида, показав идентичные результаты (фиг. 5). Однако в зависимости от более слабой стимулирующей активности грелина 1-5 сигналы сравнительно ниже.
Пример 5. Требования к связыванию Ε-ΝΟΧ-Β11 с октаноил-грелином.
Сайт связывания для Ε-ΝΟΧ-Β11 на октаноил-грелине локализован на Ν-конце пептида (сравнительный пример 3) и включает октаноил-группу (сравнительный пример 4). Значимость и вовлечение обоих компонентов для акта связывания, пептида и группы жирной кислоты, показаны в приведенном ниже эксперименте.
Обоснованием данного эксперимента является то, что шпигельмеры связывают свои пептидные мишени с энантиомерной специфичностью, а сама по себе октаноил-группа является ахиральной группой. Если бы одного участка жирной кислоты грелина было достаточно для связывания шпигельмера,
- 9 009376 акт связывания не был бы энантиомерно-специфичным в отношении пептидного участка; тогда Ό-ΝΟΧΒ11 и Ь-ΝΟΧ-ΒΙΙ должны одинаковым образом связывать Ό-октаноил-грелин.
ΝΟΧ-Β11 синтезировали химическим путем в виде Ь- и Ό-РНК и вводили радиоактивную метку, используя Т4-полинуклеотидкиназу (1пуйгодеп, Кагкгийе) с у-32[Р]-АТР (Найтапп АпайЛе. Вгаипке11\\'сф). РНК очищали на 10% денатурирующем полиакриламидном геле и 0,5-5 пмоль РНК инкубировали с 5 мкМ биотинилированного Ό-грелина в связывающем буфере [20 мМ Трис/НС1, рН 7,4; 150 мМ №С1; 5 мМ КС1; 1 мМ МдС12; 1 мМ СаС12; 0,1% Твин-20] в течение 2 ч при 37°С. Сравнительно высокая концентрация пептида была выбрана, чтобы обеспечить возможность мониторинга даже слабых взаимодействий шпигельмера. Затем добавляли фиксированное количество конъюгированного со стрептавидином матрикса ИЙгаЫпк. Связанные с матриксом комплексы грелин-РНК отмывали связывающим буфером, считывали в сцинтилляционном счетчике (Весктап Ь86500) и наносили на график в виде процента суммарного связывания с Ό-грелином. Каждую экспериментальную группу анализировали в трех повторностях. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 6.
Оказалось, что Ό-ΝΟΧ-Β11 специфично связывается с Ό-октаноил-грелином (полосы 1 и 2), тогда как соответствующий Ь-энантиомер не связывается (полосы 3 и 4). Этот результат указывает на то, что октаноильный остаток главным образом служит в качестве гидрофобной группы, представляя Νконцевой мотив С88РЬ Ь-октаноил-грелина в конформации, где шпигельмер Ε-ΝΟΧ-Β11 эффективно связывается. Оба участка, пептидный и октаноил-участок Ь-октаноил-грелина, необходимы для связывания Ь-ΝΟΧ-ΒΠ.
Признаки настоящего изобретения, раскрытые в описании, формуле изобретения и/или графических материалах, могут как по отдельности, так и в любой их комбинации представлять материал для реализации изобретения в различных его формах.

Claims (24)

1. Нуклеиновая кислота, которая связывается с биоактивным грелином.
2. Нуклеиновая кислота по п.1, где эта нуклеиновая кислота специфично связывается с биоактивным грелином, и специфичное связывание выражено в виде величины Кб, где Кб нуклеиновой кислоты составляет от 10 пМ до 1 мкМ, более предпочтительно от 100 пМ до 500 нМ и наиболее предпочтительно от 1 до 100 нМ.
3. Нуклеиновая кислота по п.1 или 2, где биоактивный грелин представляет собой н-октаноилгрелин.
4. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-3, где нуклеиновая кислота представляет собой Ьнуклеиновую кислоту, предпочтительно шпигельмер (8р1еде1тег).
5. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-4, где эта нуклеиновая кислота имеет вторичную структуру, представленную на фиг. 1Β.
6. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-5, где эта нуклеиновая кислота содержит последовательность, соответствующую 8ЕО. ГО. Νο 1, предпочтительно состоит из нее.
7. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-6, где эта нуклеиновая кислота содержит последовательность, соответствующую от 8Ер. ГО. Νο. 2 до 8Ер. ГО. Νο. 15, предпочтительно состоит из нее.
8. Применение нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-7 для связывания биоактивного грелина.
9. Применение нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-7 для обнаружения биоактивного грелина.
10. Применение нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-7 для ингибирования биоактивного грелина.
11. Применение нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-7 для производства лекарства.
12. Применение по п.11, где лекарство предназначено для лечения и/или для предупреждения заболевания и/или расстройства, где заболевание и/или расстройство выбрано из группы, включающей ожирение, регуляцию энергетического баланса, аппетита, массы тела, расстройства питания, диабет, метаболизм глюкозы, опухоль, кровяное давление и сердечно-сосудистое заболевание.
13. Способ обнаружения биоактивного грелина, включающий следующие стадии:
а) получение образца, который подлежит тестированию на присутствие биоактивного грелина,
б) получение нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-7,
в) взаимодействие образца с нуклеиновой кислотой, где стадию (а) можно проводить перед стадией (б), либо стадию (б) можно проводить перед стадией (а).
14. Способ по п.13, включающий дополнительную стадию (г):
г) обнаружение взаимодействия образца с нуклеиновой кислотой.
15. Способ по п.14, при котором нуклеиновую кислоту стадии (б) иммобилизуют на поверхности.
16. Способ по п.14, где нуклеиновая кислота по любому из пп.1-7 содержит флуоресцентную группировку и где флуоресценция этой флуоресцентной группировки отличается при образовании комплекса между нуклеиновой кислотой и биоактивным грелином от свободного биоактивного грелина.
17. Способ по любому из пп.14-16, где нуклеиновая кислота представляет собой производное нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-7, где это производное нуклеиновой кислоты включает по меньшей
- 10 009376 мере одно флуоресцентное производное аденозина, замещающее аденозин.
18. Способ по п.17, где флуоресцентное производное аденозина представляет собой этеноаденозин.
19. Способ по любому из пп.16-18, при котором комплекс, состоящий из производного нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-7 и биоактивного грелина, обнаруживают с использованием флуоресценции.
20. Способ по любому из пп.13-19, где биоактивный грелин представляет собой н-октаноил-грелин.
21. Способ по любому из пп.13-20, где сигнал создается на стадии (в) или на стадии (г) и предпочтительно этот сигнал коррелирует с концентрацией биореактивного грелина в образце.
22. Способ по любому из пп.13-21, где образец выбран из группы, включающей кровь, плазму, сыворотку, жидкость и ткани.
23. Способ по любому из пп.13-22, где способ представляет собой диагностический способ или прогностический способ.
24. Способ по п.23, где способ предназначен для диагностики, определения стадии и/или прогнозирования заболевания и/или расстройства, где предпочтительно указанное заболевание и/или расстройство выбрано из группы, включающей ожирение, регуляцию энергетического баланса, аппетита, массы тела, расстройства питания, диабет, метаболизм глюкозы, опухоль, кровяное давление и сердечнососудистое заболевание.
название последовательность частота 8еЧ. ТО ВЦ сзизис-- -дззсдди- -...... ААддси- -йААзиссз;лзеиААссААиссидс - -дез 65 2 <32 сзизиз-- - -дзссдзи.....-......АДДАси- -иддзисгсдАзаиАдссАдиссиАС - -дса 1 3 Е12 сеиоиз —Аззсдди------------длдАси- -идАзиссадАззидАССАдиссизс- -асз 1 4 В7 сзизиз- - -дазсдди------------даааса- -идАзиссзААззидАССАдиссидс- -дса 2 5 А8 сзиаиа-- -дзссдди------------дадасз- -иААоиссзААззиАдссАдиссидс- -дса 2 6 В12 сзизиз—дзасдди------------ААААсииаиААзиссаААззиААССАдиссиАС--Аса 1 Ί ЕЗ сзизиз—Аззсддид-----------ддАдси- -иААзиссзААСзиддссдАиссидс- - дса 8 С12 сзизсозиздззсд--------------ААААС--аиААЗАСсоААзаидАссАииссиАсссАсо 1 9 С11 сзивзз- - - АззидзидАА- - -------аааас- -зиддАисссААзаидАССАдиссиАс- - дса 2 10 АЗ сзизиз- - - АЗзиАзиддАддА- ----ааадс- -зиААдисссААззиААССАдиссидс- -дсс 2 11 Е5 сзизиз- - - дзвиАзиддАДАДА*·----ааадс- -зиААдиссзААззидАССАзиссйдс- -дса 1 12 А12 сзизиз- - -АссидзилАДАДАДА----аааас- -зиААдиссзААЗсиААссддиссидс- -дсс 1 13 Р12 сзизиз - - - АссиАзиААДАДАДАД—аааас - - зиААдиссзААззиААССАдиссидс - - дез 2 14 □5 сзиаиз---АззиАзидАААААААААААААААС- - АиААдиссадАззиААССААЗссидс- - дез 1 15 1пв1 ----Хпв2---- 1пвЗ 1пэ4
EA200600735A 2003-11-10 2004-11-10 Нуклеиновые кислоты, специфично связывающие биоактивный грелин EA009376B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03025743 2003-11-10
PCT/EP2004/012739 WO2005049828A1 (en) 2003-11-10 2004-11-10 Nucleic acids specifically binding bioactive ghrelin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200600735A1 EA200600735A1 (ru) 2006-10-27
EA009376B1 true EA009376B1 (ru) 2007-12-28

Family

ID=34610046

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600735A EA009376B1 (ru) 2003-11-10 2004-11-10 Нуклеиновые кислоты, специфично связывающие биоактивный грелин

Country Status (19)

Country Link
US (2) US20070031840A1 (ru)
EP (1) EP1682662A1 (ru)
JP (1) JP4823067B2 (ru)
KR (1) KR20060125743A (ru)
CN (1) CN1894407A (ru)
AP (1) AP2006003618A0 (ru)
AU (1) AU2004291656A1 (ru)
BR (1) BRPI0415872A (ru)
CA (1) CA2544805A1 (ru)
CR (1) CR8388A (ru)
EA (1) EA009376B1 (ru)
EC (1) ECSP066559A (ru)
IL (1) IL175443A0 (ru)
MA (1) MA28153A1 (ru)
NO (1) NO20062663L (ru)
OA (1) OA13282A (ru)
TN (1) TNSN06132A1 (ru)
WO (1) WO2005049828A1 (ru)
ZA (1) ZA200603435B (ru)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE513041T1 (de) * 2002-08-01 2011-07-15 Noxxon Pharma Ag Ghrelin bindende nukleinsäuren
EP2290074B1 (en) 2004-05-28 2014-12-17 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving microRNA
EP2287303B1 (en) 2004-11-12 2014-07-02 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
AR052741A1 (es) 2005-04-08 2007-03-28 Noxxon Pharma Ag Acidos nucleicos de union a ghrelin
CA2663962A1 (en) * 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. Mir-15, mir-26, mir-31,mir-145, mir-147, mir-188, mir-215, mir-216, mir-331, mmu-mir-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
AU2007299828C1 (en) * 2006-09-19 2014-07-17 Interpace Diagnostics, Llc MicroRNAs differentially expressed in pancreatic diseases and uses thereof
AU2007333107A1 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. miR-21 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
CN101622350A (zh) * 2006-12-08 2010-01-06 奥斯瑞根公司 作为干预治疗靶标的miR-126调控基因和通路
CA2671299A1 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. Functions and targets of let-7 micro rnas
US20090175827A1 (en) * 2006-12-29 2009-07-09 Byrom Mike W miR-16 REGULATED GENES AND PATHWAYS AS TARGETS FOR THERAPEUTIC INTERVENTION
US20090131354A1 (en) * 2007-05-22 2009-05-21 Bader Andreas G miR-126 REGULATED GENES AND PATHWAYS AS TARGETS FOR THERAPEUTIC INTERVENTION
US20090232893A1 (en) * 2007-05-22 2009-09-17 Bader Andreas G miR-143 REGULATED GENES AND PATHWAYS AS TARGETS FOR THERAPEUTIC INTERVENTION
US20090227533A1 (en) * 2007-06-08 2009-09-10 Bader Andreas G miR-34 Regulated Genes and Pathways as Targets for Therapeutic Intervention
EP2198050A1 (en) 2007-09-14 2010-06-23 Asuragen, INC. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
WO2009052386A1 (en) * 2007-10-18 2009-04-23 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in lung diseases and uses thereof
US8071562B2 (en) * 2007-12-01 2011-12-06 Mirna Therapeutics, Inc. MiR-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20090192114A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-30 Dmitriy Ovcharenko miR-10 Regulated Genes and Pathways as Targets for Therapeutic Intervention
US20090263803A1 (en) * 2008-02-08 2009-10-22 Sylvie Beaudenon Mirnas differentially expressed in lymph nodes from cancer patients
EP2268832A2 (en) * 2008-03-06 2011-01-05 Asuragen, INC. Microrna markers for recurrence of colorectal cancer
EP2271757A2 (en) * 2008-03-26 2011-01-12 Asuragen, INC. Compositions and methods related to mir-16 and therapy of prostate cancer
US8258111B2 (en) 2008-05-08 2012-09-04 The Johns Hopkins University Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis
US20100179213A1 (en) * 2008-11-11 2010-07-15 Mirna Therapeutics, Inc. Methods and Compositions Involving miRNAs In Cancer Stem Cells
WO2011053821A1 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Tranzyme Pharma, Inc. Macrocyclic ghrelin receptor antagonists and inverse agonists and methods of using the same
JP2014504865A (ja) * 2011-01-10 2014-02-27 ノクソン ファーマ エージー 標的分子との結合親和性を有する核酸分子およびその生成方法
US9644241B2 (en) 2011-09-13 2017-05-09 Interpace Diagnostics, Llc Methods and compositions involving miR-135B for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004013274A2 (en) * 2002-08-01 2004-02-12 Noxxon Pharma Ag Ghrelin binding nucleic acids

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5614395A (en) * 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
ES2110444T3 (es) * 1990-06-11 1998-02-16 Nexstar Pharmaceuticals Inc Ligandos de acidos nucleicos.
US5780221A (en) * 1995-05-03 1998-07-14 Whitehead Institute For Biomedical Research Identification of enantiomeric ligands
CA2218083A1 (en) * 1995-05-03 1996-11-07 Antonius Nicolaas Maria Schumacher Identification of enantiomeric ligands
WO2001087335A2 (en) * 2000-05-17 2001-11-22 Eli Lilly And Company Method for selectively inhibiting ghrelin action
US20030211967A1 (en) * 2001-05-07 2003-11-13 Bryant Henry Uhlman Method for selectively inhibiting ghrelin action
US6967237B2 (en) * 2000-05-30 2005-11-22 Merck & Co., Inc. Ghrelin analogs
AR052741A1 (es) * 2005-04-08 2007-03-28 Noxxon Pharma Ag Acidos nucleicos de union a ghrelin

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004013274A2 (en) * 2002-08-01 2004-02-12 Noxxon Pharma Ag Ghrelin binding nucleic acids

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HELMLING STEFFEN ET AL.: "Inhibition of ghrelin action in vitro and in vivo by an RNA-Spiegelmer", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 101, no. 36, 7 September 2004 (2004-09-07), pages 13174-13179, XP002321448, ISSN: 0027-8424, the whole document *
LEVA S. ET AL.: "GnRH binding RNA and DNA Spiegelmers: A novel approach toward GnRH antagonism", CHEMISTRY AND BIOLOGY, CURRENT BIOLOGY, LONDON, GB, vol. 9, no. 3, March 2002 (2002-03), pages 351-359, XP002221140, ISSN: 1074-5521, the whole document *
RAGHAVAN M. ET AL.: "BIAcore: a microchip-based system for analyzing the formation of macromolecular complexes", STRUCTURE, CURRENT BIOLOGY LTD., PHILADELPHIA, PA, US, vol. 3, no. 4, April 1995 (1995-04), pages 331-333, XP004587855, ISSN: 0969-2126, the whole document *
WOOD S.J.: "DNA-DNA HYBRIDIZATION IN REAL TIME USING BIACORE", MICROCHEMICAL JOURNAL, NEW YORK, NY, US, vol. 47, no. 3, June 1993 (1993-06), pages 330-337, XP009004259, ISSN: 0026-265X, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
TNSN06132A1 (fr) 2007-11-15
OA13282A (en) 2007-01-31
JP2007513608A (ja) 2007-05-31
EP1682662A1 (en) 2006-07-26
NO20062663L (no) 2006-08-09
AP2006003618A0 (en) 2006-06-30
IL175443A0 (en) 2006-09-05
CA2544805A1 (en) 2005-06-02
EA200600735A1 (ru) 2006-10-27
CR8388A (es) 2006-10-17
MA28153A1 (fr) 2006-09-01
ZA200603435B (en) 2007-06-27
CN1894407A (zh) 2007-01-10
US20070031840A1 (en) 2007-02-08
BRPI0415872A (pt) 2007-01-09
WO2005049828A1 (en) 2005-06-02
US20100261291A1 (en) 2010-10-14
ECSP066559A (ru) 2006-11-24
JP4823067B2 (ja) 2011-11-24
AU2004291656A1 (en) 2005-06-02
KR20060125743A (ko) 2006-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA009376B1 (ru) Нуклеиновые кислоты, специфично связывающие биоактивный грелин
NL1031538C2 (nl) Ghrelinebindende nucleïnezuren.
AU2010243831B2 (en) Hepcidin binding nucleic acids
Wintgens et al. Plasma myostatin measured by a competitive ELISA using a highly specific antiserum
JP4274831B2 (ja) シス・エレメントのデコイを用いる抗ガン剤
US10160973B2 (en) Nucleic acid aptamers binding to vascular endothelial growth factor receptors
CN103958682A (zh) 结合胰高血糖素的核酸
JP5103187B2 (ja) バソプレッシン結合性のｌ体核酸
CN111991408B (zh) 槲皮素-3-o-刺槐糖苷作为钙离子通道的抑制剂的应用
Zhang et al. Cytokines increase CRE binding but decrease CRE‐mediated reporter activity in rat hepatocytes by increasing c‐Jun
KR101020005B1 (ko) 뼈 형성 촉진 기능을 가지는 퍼모파민 유도체를 함유한조성물
CN112972485B (zh) 槲皮素-3′-O-β-D-葡萄糖苷作为钙离子通道的抑制剂的应用
WO2023038027A1 (ja) セノリシス薬のスクリーニング方法及びセノリシス薬
EP1993561A2 (en) Trpm2-specific inhibitors
KR101671100B1 (ko) 대사성 질환 예방 또는 치료용 조성물
JP2004522449A (ja) 哺乳動物の中枢神経系におけるｔｏｂ遺伝子の機能と応用
Wu Control of Skeletal Muscle Fiber Types by Calcium Signaling Pathways
AU5086699A (en) Methods for inhibiting tef-3 activity
WO2006052510A2 (en) Methods for identifying novel modulators of insulin signaling
WO2003104454A1 (ja) 新規オキシダーゼ
KR20120098436A (ko) 신규한 암 치료 표적인 ｍａｐ７ｄ２ 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU