JP4274831B2 - シス・エレメントのデコイを用いる抗ガン剤 - Google Patents
シス・エレメントのデコイを用いる抗ガン剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4274831B2 JP4274831B2 JP2003087846A JP2003087846A JP4274831B2 JP 4274831 B2 JP4274831 B2 JP 4274831B2 JP 2003087846 A JP2003087846 A JP 2003087846A JP 2003087846 A JP2003087846 A JP 2003087846A JP 4274831 B2 JP4274831 B2 JP 4274831B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- seq
- pharmaceutical composition
- cell
- polynucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/13—Decoys
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的となる転写因子に対して競合的に結合するシス・エレメントのデコイ(decoy)としての合成オリゴヌクレオチドの組成物と、腫瘍生物学および抗腫瘍治療学の分野におけるその利用法とに関する。
【0002】
【従来の技術】
腫瘍細胞の特徴の1つは、がん原遺伝子の過剰発現または増幅である。例えば、C−MYCは、白血病、リンパ腫および肉腫で過剰な発現をし、白血病、乳ガン、胃ガン、小細胞肺ガン、大腸ガン、神経芽腫およびグリア芽細胞腫では程度は異なるが増幅される。他の例は、骨肉腫およびリンパ腫でのC−FOSの過剰発現を含み、C−JUNは小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、大腸ガンおよび直腸ガンで非常に過剰な発現をすることが知られている。さらに、C−MYCおよびC−JUNは、(腫瘍の出現と関連する)腫瘍のイニシエーションおよびインキュベーションの段階で過剰発現をすることが知られている。最後に、C−MYCの増幅は腫瘍発生の必要条件の1つであることが知られている。
【0003】
腫瘍細胞の別の特徴は、細胞周期の制御と細胞成長因子に対する適切な反応とができなくなることである。MYC/MAXヘテロ2量体は、それ自体の発現と、CYC25Aのようなその下流の遺伝子の発現とを活性化するために、E−ボックスと結合して、細胞成長の表現型を実現する。前記ヘテロ2量体は、E2Fとともに、サイクリンAおよびサイクリンEの活性化という、細胞周期のG1期からS期への移行のための鍵を握るできごとを引き起こすことができる。C―MYCは、テロメラーゼの発現を活性化し、腫瘍発生で重要な役割を果たすことが知られているが、C−JUNおよびC−FOSは、RAS経路の下流の核段階でのシグナル伝達において重要である。さらに、C−MYC、C−FOSおよびC−JUNは、細胞のアポトーシス、ゲノムの安定性および細胞の成熟において重要である。それゆえ、C−MYC、C−FOSおよびC−JUNは、薬物の標的となりうるのである。これら3つのがん原遺伝子の異常な発現を修正することにより、ガンのような過剰成長の表現型が、良性でかつ正常な表現型に変わることができる。
【0004】
がん原遺伝子と腫瘍抑制遺伝子とは、正常細胞および腫瘍細胞で共存している。正常細胞と腫瘍細胞との相違点は、前記2つのタイプの遺伝子の発現レベルにある。腫瘍細胞では、がん原遺伝子は2〜10倍の過剰発現をしているが、腫瘍抑制遺伝子は不活性化されている。これらの異常は、前記遺伝子の調節領域のシストロンの結合状態、タイプおよび量と密接に関係している。前記遺伝子調節の状態を変化させることによりこれらの異常を除去することは、がん遺伝子治療の新規なアプローチである。
【0005】
遺伝子発現レベルを変化させて細胞の表現型の変化を起こすために、転写因子と結合する特異的なDNA配列を利用する転写因子デコイは、有効な腫瘍治療薬として開発することができる。
【0006】
DNA−タンパク質相互作用の研究は、治療薬として核酸デコイを開発するための実験的な基礎である。試験管内で合成された特定配列のDNAの短い断片が、核から抽出されたある種のタンパク質因子と結合した後で、得られたDNA−タンパク複合体のバンドは、遊離DNAと比較すると、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、泳動度が移動、すなわちシフトする。Bielinska(1990)が、1990年代に、遺伝子発現を調節するために2本鎖オリゴヌクレオチドを応用することを提案して以来、核酸デコイは、最初、心臓血管系の薬剤開発に利用されてきた。例えば、E2F因子を標的とする、CABG(冠状動脈バイパスグラフト)後の内膜成長の治療のための核酸デコイ療法は、臨床治験に入っている(Mannら、1999)。NF−κβ(NF−κB)を標的とする、虚血の治療のための核酸デコイも報告されている(Sawa、1997、Tounita、1998)。腫瘍治療における核酸デコイの応用は初期段階にある。CREB因子についての核酸デコイ(Cho−chong、1999)が複数の腫瘍細胞株および動物モデルで試験されている。ERについての核酸デコイは乳ガン細胞の成長を阻害するために使用されている(Piva R.ら、200)。NF−κβについての核酸デコイは試験管内および生体内の両方でマウスの腫瘍の成長を阻害することがわかっている。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、配列特異的な核酸デコイを含むがん遺伝子スイッチ停止療法(oncogene switching therapeutics)に関する。これらの種類の核酸は、ある種の転写因子と競合的に結合して、C−FOS、C−JUNおよびC−MYCのようながん原遺伝子の発現を制御して、腫瘍細胞の成長を阻害し、腫瘍治療という目的を達成することができる。
【0008】
本発明の第1の目的は、1または2以上の核酸デコイを含む医薬品組成物を提供することである。
【0009】
本発明の別の目的は、抗ガン剤としての前記核酸デコイの利用法を提供することである。
【0010】
【課題を解決するための手段】
これらのがん遺伝子スイッチ停止療法には、前記核酸デコイのコア配列として、転写因子と結合する特異的な配列を用いる。薬剤の安定性と薬剤の標的に対する親和性とを向上させるために、長くなった配列が3次元的な構造を形成するように、前記コア配列の両方向にヌクレオチドを付加して伸ばす。
【0011】
本発明は、AP−1、CREB、MYC/MAXおよびJUN/ATF転写機構のような転写因子の薬剤標的を特異的に狙い打ちする、核酸デコイ分子の複数の医薬品組成物を開示する。前記デコイは、細胞成長を阻害することが示され、抗ガン剤の候補として大きな将来性がある。前記医薬品組成物は、生理食塩水、緩衝液、リポソームおよびポリマーからなる担体と組み合わせることができ、前記ポリマーは、注射液と、経口のカプセル剤および錠剤と、丸塊と、坐薬と、皮膚塗布剤とからなる処方に加工される。前記医薬品組成物は、その効能を増強するために、化学療法および放射線療法と併用することができる。
【0012】
【発明の実施の形態】
1の好ましい実施態様では、K101Aシリーズの治療薬が、がん原遺伝子C−FOSの過剰発現を調節するために設計される。転写因子CREBは、がん原遺伝子C−FOSのエンハンサーであるCRE配列STGACGTMR(配列1、配列番号1)と結合するので、配列番号1が、CREBと競合的に結合してがん原遺伝子C−FOSの発現レベルを調節する核酸デコイのコア配列として用いられる。例えば、K101a(配列6、配列番号6)は、ヘアピン状構造を形成する1本鎖の23量体オリゴヌクレオチドである。K101a−1は、前記コア配列を含む配列7(配列番号7)および配列8(配列番号8)の配列の結合により、十字型をしている。K101a−2は、前記コア配列を含む配列9(配列番号9)の配列により形成された2本鎖の線状構造をしている。すなわち、K101Aシリーズの治療剤は、コア配列STGACGTMRを含み、長さがヌクレオチド15〜45個の1本鎖または2本鎖のDNAである。
【0013】
別の好ましい実施態様では、治療剤K101bおよびK101cが、複数のがん原遺伝子の発現を調節するために設計される。AP−1転写因子は、複数の遺伝子のシス・エレメントであり、かつ、これらの遺伝子の発現を活性化する配列STGASTMA(配列2、配列番号2)と結合する、JUN/FOSのヘテロ2量体である。前記配列は、前記AP−1エンハンサーを含む遺伝子の発現レベルを下向き調節することができる核酸デコイの中のコア配列として用いられている。例えば、K101bは、前記コア配列を含む20量体のオリゴヌクレオチドである配列10(配列番号10)によって形成される2本鎖DNA分子である。K101b−1(配列11、配列番号11)は、前記コア配列を含む1本鎖の21量体のオリゴヌクレオチドによって形成されるヘアピン構造である。K101b−2(配列12、配列番号12)は、コア配列を含む42量体のオリゴヌクレオチドである。リガーゼが、K101b−2の5’末端を3’末端と連結し、閉ループを形成するために用いられる。得られた亜鈴状の構造は、この薬剤の安定性を増強する。K101c1(配列13、配列番号13)およびK101c2(配列14、配列番号14)は、それぞれ22量体および21量体の1本鎖オリゴヌクレオチドである。K101c3(配列15、配列番号15)およびK101c4(配列16、配列番号16)は、それぞれ23量体および21量体の1本鎖のオリゴヌクレオチドである。4個の治療剤の全てが、セルフ・アニーリング(self−annealing)を通じて、ヘアピン構造を形成するか、あるいは2本鎖となり、全てが前記コア配列を含む。要約すると、治療剤K101bおよびK101cのシリーズは、STGASTMAという配列を含み、長さがヌクレオチド15〜45個の1本鎖または2本鎖のDNA分子である。
【0014】
別の好ましい実施態様では、治療剤K102シリーズが、C−JUNのようながん原遺伝子の発現を調節するために、配列TTACCTCA(配列3、配列番号3)を核酸デコイのコア配列として用いるように設計される。前記配列は、C−JUNが、それ自体の発現を増強するために結合する、保存されたエンハンサー配列である。同時に、1個の転写因子としてのJUN/ATFタンパクヘテロ2量体も、前記配列をエンハンサーとして有する遺伝子の発現を調節するために、前記配列と結合する。例えば、K102(配列17、配列番号17)は、前記コア配列を含む23量体の1本鎖のオリゴヌクレオチドのヘアピン構造であり、K102−1(配列18、配列番号18)は、21量体のオリゴヌクレオチドのヘアピン構造であり、K102−2(配列19、配列番号19)は、22量体のオリゴヌクレオチドであり、K102−3(配列20、配列番号20)は、20量体の1本鎖オリゴヌクレオチドであり、K102−4(配列21、配列番号21)は、線状の20量体の2本鎖ヌクレオチドである。要約すると、治療剤K102シリーズは、配列TTACCTCAを含み、長さがヌクレオチド15〜45個の1本鎖または2本鎖のDNA分子である。
【0015】
別の好ましい実施態様では、治療剤K103aが、がん原遺伝子C−MYCの発現を調節するために設計される。C−MYCはそれ自体のエンハンサーTCTCTTA(配列4、配列番号4)と結合するので、核酸デコイ薬剤は、C−MYCの発現レベルを下向き調節するため、前記配列をコア配列として取り込むように設計されている。例えば、K103aは、配列22(配列番号22)を含む2本鎖DNAで、その両方が前記コア配列を含む。K103a−1(配列23、配列番号23)は、前記コア配列を含む25量体のオリゴヌクレオチドのヘアピン構造である。103a−2は、配列24(配列番号24)および配列25(配列番号25)を含む43量体のオリゴヌクレオチドのステム・ループ構造で、両方の配列が前記コア配列を含む。K103a−3は、配列26(配列番号26)および配列27(配列番号27)を含む36量体のオリゴヌクレオチドのハンマー構造で、両方が前記コア配列を含む。要約すると、治療剤K103aシリーズは、配列TCTCTTAを含む、長さがヌクレオチド15〜45個の1本鎖または2本鎖のDNA分子である。
【0016】
別の好ましい実施態様では、治療剤K103bが、細胞周期の調節に関連する遺伝子の発現レベルを調節するために設計される。ヘテロ2量体タンパクMYC/MAXは、配列RACCACGTGGTY(配列5、配列番号5)のシス・エレメントとの結合を通じて、細胞増殖を起こし、細胞周期の制御ができなくなる。核酸デコイ薬剤は、前記配列をコア配列として取り込むことにより設計される。前記薬剤は、試験管内で合成され、細胞内に導入された後、MYC/MAXヘテロ2量体との結合について、前記シス・エレメントと競合し、下流の遺伝子発現を抑制し、悪性成長の表現型の抑圧する。例えば、K103b(配列28、配列番号28)は、前記コア配列を含む24量体のオリゴヌクレオチドである。K103b−1(配列29)およびK103b−1(配列30)は、セルフ・アニーリングをして2本鎖の2量体を形成することができ、かつ、前記コア配列を含む、24量体の1本鎖オリゴヌクレオチドである。要約すると、治療剤K103bシリーズは、配列RACCACGTGGTYを含む、長さがヌクレオチド15〜45個の1本鎖または2本鎖のDNA分子である。
【0017】
前記の核酸デコイ薬剤は自動DNA合成機により合成される。フォスフォロチオエート化、脱保護化、精製および凍結乾燥の後、前記核酸デコイ薬剤は、定性的および定量的な分析のために、水に溶かされる。肺ガン細胞株NCI−H460が試験管内の機能的スクリーニングおよび効能試験に使用される。前記細胞は96穴ペトリディッシュに添加され、完全培養液RPMI1640で24時間培養される。この培養の後、リポソームと混合された核酸デコイ薬剤が添加され、前記細胞はさらに37°C、5%CO2で72時間培養される。細胞生存度は、SRB比色法により決定される。スクリーニングの結果は、核酸デコイ薬剤の6つのシリーズ全てが程度は異なるがNCI−H460の成長を阻害することができ、K101aおよびK102が最も強い阻害を示すことを表す。これら全ての核酸デコイが抗がん剤として開発することができる。
【0018】
本発明の医薬品組成物は、新規な腫瘍治療剤の標的としてのAP−1、CREB、MYC/MAXおよびJUN/ATFに作用する。これらのタンパク分子は、複数の遺伝子の発現レベルの調節に関与し、腫瘍発生と相関性が高いため、貴重な創薬の標的である。
【0019】
前記創薬の標的に対する治療剤を開発するために考えられる多数の方法のうち、本発明に用いる核酸転写調節デコイは、新規な作用機構と、特異的配列で明確に定義された特異的な機能上の標的という長所を有する。これらのデコイ薬剤は、試験管内の実験で、腫瘍細胞の成長を有効に阻害することが示されてきた。これらの核酸デコイは、遺伝子療法による腫瘍治療と比較すると、送達可能な薬剤として処方することが容易で、はるかに小さな分子である。本発明の薬剤がアンチセンス薬剤より優れている点はその2本鎖構造にあり、1本鎖のアンチセンス薬剤よりも生体内でより安定である。さらに、デコイ薬剤は、効能を発揮するための必要量が少なく、全く新規な標的に作用する。その結果、前記デコイ薬剤は新規な治療剤としての資格がある。
【0020】
前記核酸デコイ薬剤のコア配列は、長さがヌクレオチド6〜12個である。これらの短い配列は容易に分解される。前記コア配列が形成する2本鎖構造は、安定ではなく、室温で容易に変性する。さらに、2次構造がないので、タンパクと結合しにくい。これらの短所を克服するため、デコイ薬剤は、安定性と転写因子に対する親和性とを増大させる目的で、鎖を伸ばすためにヌクレオチドを付加することにより改良される。ヘアピン状、十字型、ステム・ループ状および亜鈴状の構造が有利な2次構造であることを考慮すると、前記核酸デコイ薬剤は、全長がヌクレオチド15〜45個で、前記コア配列を含むように設計される。得られた配列は、1本鎖のままでいることもでき、あるいは、セルフ・アニーリングするか、ハイブリダイゼーションをして、さまざまな2次構造を形成することもできる。リボヌクレアーゼによる生体内での分解を避けて安定性を増強するために、前記デコイ薬剤の配列は化学的に修飾され、フォスフォロチオエートは最もありふれた保護方法である。さらに、デコイ分子の膜通過性と生体利用率とを向上させるために、コレステロールのような親油性官能基が前記デコイ分子の一方または両方の末端に取り付けられる。リポソーム法を同一の目的のために用いることができる。さらに、腫瘍の内部に前記デコイを優占的に濃縮することにより効能を増強するために、抗体のような標的をねらい打ちする分子を取り付けることもできる。
【0021】
以上のとおり、薬剤標的としてのAP−1、CREB、MYC/MAXおよびJUN/ATFに対する核酸デコイ分子の医薬品組成物について説明した。前記医薬品組成物は、生理食塩水と、緩衝液と、リポソームと、ポリマーとからなる担体と組み合わせることができ、前記ポリマーは、注射液と、経口カプセル剤および錠剤と、丸塊と、坐薬と、皮膚塗布剤とからなる製剤に加工される。前記医薬品組成物は、その効能を増強するために、化学療法および放射線療法と併用することができる。
【0022】
【実施例】
実施例1
KGCDシリーズの6個の核酸デコイによる肺ガン細胞株NCI−H460の成長阻害
以下の6個の核酸デコイは合成の際にフォスフォロチオエート化処理を施した。K101a(配列6)、K101b(配列10)、K101c1(配列13)、K102(配列17)、K103(配列22)およびK103b(配列28)。陰性対照は、5’−TGTGGTCATGTGGTCATGTGTCA−3’であり、陽性対照は、5’−TGACGTCATGACGTCATGACGTCA−3’である。
【0023】
NCI−H460細胞は、陰性対照、陽性対照、ブランク対照および前記KGCDシリーズの6個の核酸デコイの実験群に分注される。前記細胞は、ウェルあたり2〜3x104個ずつ、10%ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培養液を入れた96穴ペトリディッシュに植え継がれる。24時間培養後、培養液を無血清のRPMI1640に交換する。ウェルあたり0.6μlのリポソームと、最終濃度200nMのさまざまな核酸デコイとが添加される。(ブランク対照には、ウェルあたり0.6μlのリポソームのみが添加される。)5時間後、前記培養液は、10%ウシ胎児血清を添加したRPMI1640に交換される。前記細胞は、37°C5%CO2の条件下で培養される。72時間後、前記細胞はSRBで染色され、分光光度計(colorimeter)を用いて510nmの波長(λ510nm)での吸光度(OD)を測定して、細胞生存度が決定される。細胞成長阻害活性のグラフは、前記ブランク対照を100%としてプロットされる。結果を図1に示す。CREが陽性の対照を表し、Cが陰性の対照を表し、残る6個がKGCDシリーズのデコイである。図1から、前記デコイはさまざまな程度でNCI−H460細胞の成長阻害が起こすが、K101aおよびK102が最も著しい成長阻害を示すことがわかる。
【0024】
実施例2
核酸デコイK101aおよびK102によるさまざまな腫瘍細胞株の成長阻害核酸デコイK101aとK102が、NCI−H460(肺ガン)、CNE(鼻咽頭ガン)、U251(神経グリア芽腫)、NCF−7(乳ガン)、BEL−7402(肝ガン)という腫瘍細胞株および正常細胞L−02(肝臓細胞)およびNIH3T3を処理するのに用いられる。図2の棒グラフの白抜きの棒(ミスマッチ配列)は陰性対照を表し、細胞成長への影響がほとんど無いことを示す。K101aおよびK102は、程度は異なるものの、全ての腫瘍細胞株の成長を阻害するが、U251およびNCI−H460の成長阻害が最も著しい。前記デコイは、正常細胞の成長にはほとんど効果がない。
【0025】
実施例3
核酸デコイK101aおよびK102のNCI−H460腫瘍細胞に対するIC50
腫瘍細胞株NCI−H460が異なる濃度のK101aおよびK102で処理される。一定時間の培養の後、細胞生存度を決定するために吸光度が測定される。図3に示すとおり、K101aおよびK102はNCI−H460の成長を比較的低濃度で阻害することができ、IC50は約30〜50nM、すなわち、30〜50μg/mlである。これは、抗ガン剤のスクリーニングにおける基準(IC50<10μg/ml)よりもはるかに高い。陰性対照のグループは細胞成長について濃度依存性の効果を示さない。
【0026】
実施例4
治療剤K102の抗ガン活性の生体内での効能
治療剤K102は生理食塩水およびリポソームとともに処方される。T細胞のないヌードマウスに腫瘍細胞株NCI−H460を皮下注射で移植してから24時間後、K102が、腫瘍の中に(into the tumor)、あるいは静注で(i.v.)、毎日投与される。投与量は、生理食塩水処方については、10mg/kg、5mg/kgおよび2mg/kgで、リポソーム処方については、2.5mg/kg、1mg/kgおよび0.5mg/kgである。生理食塩水および純粋なリポソームが対照実験に用いられた。腫瘍体積は動的に(dynamically)測定される。20日間連続して薬剤を投与した後、動物を安楽死させ、腫瘍を摘出して重量を計測する。生理食塩水処方のit X 20 bidグループでは、腫瘍の成長は、それぞれ、73.5%、67.57%および67.57%(V/V)阻害されるが、i.v. X 20 qdのグループは57.3%(V/V)の腫瘍阻害が達成される。リポソーム処方のit X 20 bidのグループでは、腫瘍成長は、それぞれ、77.84%、65.41%および68.65%(V/V)阻害されるが、i.v. X 20 qdグループは60.55%(V/V)の腫瘍阻害が達成される。図4は、ヒト肺ガン細胞株NCI−H460を移植したヌードマウスにおけるK102処理後の腫瘍体積の動的な変化を示す。図4は、異なる濃度および処方のデコイ薬剤のグループが、薬剤投与の7日後に、程度は異なるが腫瘍の成長を阻害することを示す。2.5mg/kgの濃度のリポソームのグループが、薬剤投与の20日後に、77%(V/V)という最高の成長阻害を示す。また、図4は、K102が処方に関係なく腫瘍成長について有効な阻害剤で有ることを示す。
【0027】
実施例5
ゲルシフトアッセイ
Dignaらの方法で核抽出液が調製される。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて[γ32P]ATPで32P標識される。0.5ngのプローブと、5μgの核抽出物と、K102と核タンパクとの非特異的な結合を阻害するための2μgのポリ(dI−dC)と、結合緩衝液[10mM トリス(pH7.5)、50mM NaCl、1mM DTTI、1mM EDTA、5% グリセロール]とを含む結合反応混合液が、室温で20分間インキュベーションされる。その後ゲルは乾燥され、増感スクリーンとともに−70°Cでオートラジオグラフィーに供される。図5において、パネル1および3は、32P標識されたK102と細胞核抽出物との間で形成された複合体を表し、パネル2および4は、32P標識されたK102と細胞核抽出物との間で(特異的競合剤として用いられる)無標識のK102の存在下で形成された複合体を表し、パネル5は、細胞核抽出物なしで32P標識されたK102のみを表す。図5に示す結果は、K102が核タンパク質と特異的な複合体を形成することを示し、K102の作用機序を裏付けるものである。
【図面の簡単な説明】
【図1】KGCDシリーズの核酸デコイによるNCI−H460腫瘍細胞の成長阻害を示すグラフである。
【図2】核酸デコイK101aおよびK102によるさまざまな腫瘍細胞株の成長阻害を表すグラフである。
【図3】核酸デコイK101aおよびK102によるNCI−H460のIC50を表す。
【図4】ヒト肺ガン細胞株NCI−H460を移植したヌードマウスにおけるK102処理後の腫瘍体積の変化を表す。
【図5】ポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるK102のゲルシフトアッセイを表す。
【配列表】
Claims (8)
- 宿主細胞内における転写因子との結合親和性を有する構造を有するポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの配列は、配列番号17のポリヌクレオチド配列からなる、抗ガン剤用単離医薬品組成物。
- 前記宿主細胞は哺乳類細胞である、請求項1に記載の抗ガン剤用医薬品組成物。
- 前記哺乳類細胞はヒト細胞である、請求項2に記載の抗ガン剤用医薬品組成物。
- 前記ヒト細胞はヒトガン細胞である、請求項3に記載の抗ガン剤用医薬品組成物。
- 前記ポリヌクレオチドは、2本鎖構造か、1本鎖構造か、いずれかの構造を形成することができ、前記1本鎖構造は、鎖内または鎖間の相互作用により、2本鎖構造を形成するか、あるいは、ヘアピン状、シュードノット状、ステム・ループ状、亜鈴状および/または十字型の構造からなる2次構造を形成することができる、請求項1に記載の抗ガン剤用医薬品組成物。
- 配列番号17のポリヌクレオチド配列からなり、フォスフォチオ−結合ヌクレオチドで作られる、ポリヌクレオチド。
- 配列番号17のポリヌクレオチド配列からなり、親油性基質と、標的特異的抗体と、その他の標的を狙い打ちする機能を有する分子と、これらの組み合わせとからなるグループから選択されるリガンド分子に取り付けられている、標識ヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドは、注射可能な処方と、経口的な処方と、経皮的な処方と、丸塊と、エアロゾルと、坐薬と、トランスフェクションによる処方と、トランスジェニックな処方と、これらの組み合わせとからなるグループから選択される医薬の処方として調剤される、請求項1に記載の抗ガン剤用医薬品組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB021128189A CN1240439C (zh) | 2002-03-28 | 2002-03-28 | 肿瘤基因开关药物 |
CN02112818.9 | 2002-03-28 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003306449A JP2003306449A (ja) | 2003-10-28 |
JP4274831B2 true JP4274831B2 (ja) | 2009-06-10 |
Family
ID=4742273
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003087846A Expired - Lifetime JP4274831B2 (ja) | 2002-03-28 | 2003-03-27 | シス・エレメントのデコイを用いる抗ガン剤 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1357184B1 (ja) |
JP (1) | JP4274831B2 (ja) |
CN (1) | CN1240439C (ja) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL286053B2 (en) | 2005-10-18 | 2023-03-01 | Nat Jewish Health | A process for making red blood cells using immortal hematopoietic stem cells and erythropoietin |
EP2583550A1 (en) | 2007-03-13 | 2013-04-24 | National Jewish Health | Methods for generation of antibodies |
ES2619314T3 (es) | 2007-05-11 | 2017-06-26 | Adynxx, Inc. | Expresión génica y dolor |
KR20170078862A (ko) | 2008-05-16 | 2017-07-07 | 타이가 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 | 항체 및 그 제조 방법 |
CA2731767C (en) | 2008-07-21 | 2016-12-06 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Differentiated anucleated cells and method for preparing the same |
EP3916010A1 (en) | 2008-08-28 | 2021-12-01 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Modulators of myc, methods of using the same and methods of identifying agents that modulate myc |
GB0906130D0 (en) * | 2008-10-03 | 2009-05-20 | Procrata Biosystems Ltd | Transcription factor decoys |
JP6251247B2 (ja) | 2012-05-10 | 2017-12-20 | エーダイニクス インコーポレイテッド | 活性成分の送達のための製剤 |
EP3868387A1 (en) | 2012-07-20 | 2021-08-25 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Enhanced reconstitution and autoreconstitution of the hematopoietic compartment |
US10272115B2 (en) | 2013-03-11 | 2019-04-30 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Production and use of red blood cells |
US9365825B2 (en) | 2013-03-11 | 2016-06-14 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Expansion of adult stem cells in vitro |
CN103405784B (zh) * | 2013-08-15 | 2014-10-22 | 山西大学 | c-Fos基因在制备抗癌药物中的应用 |
JP6705807B2 (ja) | 2014-08-15 | 2020-06-03 | エーダイニクス インコーポレイテッド | 疼痛を治療するためのオリゴヌクレオチドデコイ |
CN105255862B (zh) * | 2014-12-30 | 2018-05-22 | 南京艾德凯腾生物医药有限责任公司 | 一种用于制备抑制肿瘤生长药物的寡聚核酸及其应用 |
CN113786476A (zh) | 2016-12-02 | 2021-12-14 | 泰加生物工艺学公司 | 纳米颗粒调配物 |
US10149898B2 (en) | 2017-08-03 | 2018-12-11 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Methods and compositions for the treatment of melanoma |
WO2024036377A1 (en) * | 2022-08-17 | 2024-02-22 | Queensland University Of Technology | Hairpin oligonucleotides |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0580754A1 (en) * | 1991-04-18 | 1994-02-02 | The Salk Institute For Biological Studies | Oligodeoxynucleotides and oligonucleotides useful as decoys for proteins which selectively bind to defined dna sequences |
FR2675803B1 (fr) * | 1991-04-25 | 1996-09-06 | Genset Sa | Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications. |
US5512473A (en) * | 1993-01-29 | 1996-04-30 | Brent; Roger | Max-interacting proteins and related molecules and methods |
WO1995011687A1 (en) | 1993-10-29 | 1995-05-04 | Dzau Victor J | Therapeutic use of cis-element decoys in vivo |
US5641486A (en) * | 1994-03-18 | 1997-06-24 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Methods for inhibiting transcription of the cyclic AMP responsive element binding protein and the activating transcription factor 1 |
US6060310A (en) * | 1997-11-24 | 2000-05-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Transcription factor decoy and tumor growth inhibitor |
-
2002
- 2002-03-28 CN CNB021128189A patent/CN1240439C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-03-27 JP JP2003087846A patent/JP4274831B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-27 EP EP03007054.4A patent/EP1357184B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1357184B1 (en) | 2013-10-30 |
CN1240439C (zh) | 2006-02-08 |
CN1382448A (zh) | 2002-12-04 |
JP2003306449A (ja) | 2003-10-28 |
EP1357184A3 (en) | 2004-06-23 |
EP1357184A2 (en) | 2003-10-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4274831B2 (ja) | シス・エレメントのデコイを用いる抗ガン剤 | |
Cerchia et al. | Nucleic acid aptamers in cancer medicine | |
US7741308B2 (en) | DBAIT and uses thereof | |
PT1587926E (pt) | Derivados lipófilos de ácido ribonucleico de cadeia dupla | |
US10233447B2 (en) | Self-cleaving ribozymes and uses thereof | |
JP2008109935A (ja) | Hifオリコヌクレオチドデコイ分子 | |
KR101344084B1 (ko) | 암세포 특이적 세포증식 억제제 | |
CN108410878B (zh) | 一种lrpprc特异性核酸适配体及其应用 | |
KR101647521B1 (ko) | 트랜스펙션제 | |
US20090227661A1 (en) | Transcription factor decoy oligodeoxynucleotides having multiple cis elements | |
US6034234A (en) | Double-stranded oligonucleotide and anticancer agent containing the same as active ingredient | |
Rubenstein et al. | A review of antisense oligonucleotides in the treatment of human disease | |
KR101069521B1 (ko) | Hif-1 유전자 발현을 저해하는 안티센스올리고뉴클레오타이드 | |
US20040204374A1 (en) | Cis-element decoys useful as anti-tumor therapeutics | |
WO2023023536A1 (en) | Conditional double stranded antisense oligonucleotides | |
CN108866058A (zh) | 靶向KRAS的siRNA及其在制备胰腺癌治疗药物中的应用 | |
Higuchi et al. | Specific regulation of point-mutated K-ras-immortalized cell proliferation by a photodynamic antisense strategy | |
JP2005160464A (ja) | NF−κBオリゴヌクレオチドデコイ分子 | |
Orum | RNA antagonists-a new class of antisense drugs | |
WO2012020839A1 (ja) | 癌治療用医薬組成物 | |
US20050164240A1 (en) | E2F oligonucleotide decoy molecules | |
Lande et al. | Ribozyme-mediated gene knock down strategy to dissect the consequences of PDGF stimulation in vascular smooth muscle cells | |
KR101247725B1 (ko) | Sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b유전자의 신규한 용도 | |
Simons | Endogenous expression modification: antisense approaches | |
JP2002501370A (ja) | 改良蛋白質キナーゼa特性オリゴヌクレオチドおよびその利用方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060509 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060808 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060919 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061218 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081014 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090114 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090210 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090303 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4274831 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120313 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130313 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140313 Year of fee payment: 5 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |