KR101247725B1 - Ｓｏｄｉｕｍ-ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ-２ｂ유전자의 신규한 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자의 암치료 및 스크리닝 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 억제제와 이를 포함하는 암 치료용 조성물 및 상기 유전자 또는 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 항암물질 스크리닝용 조성물, 이를 이용한 항암물질 스크리닝 방법 및 암 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자는 AKT의 활성화를 통하여 암세포의 발생을 유도하고, 증식속도를 증가시키는 데 관여하기 때문에, sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자 및 단백질의 억제제를 사용하여 암의 발생 및 성장을 억제하는 효과를 얻을 수 있어 효과적인 암 치료용 조성물 및 항암물질 스크리닝용 조성물을 제공할 수 있다.
sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자, 폐암 치료, AKT, 에어로졸 방식 유전자 전달

Description

Ｓｏｄｉｕｍ-ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ-２ｂ유전자의 신규한 용도{Novel use of sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b gene}
본 발명은 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 억제제와 이를 포함하는 암 치료용 조성물 및 상기 유전자 또는 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 항암물질 스크리닝용 조성물, 이를 이용한 항암물질 스크리닝 방법 및 암 진단용 키트에 관한 것이다.
전 세계적으로 난치병인 암의 치료 방법 및 치료제에 대하여 활발한 연구가 이루어지고 있다. 과거에 사용되는 항암제는 세포독성제 및 면역자극제 중심이었으며, 화학요법제는 암세포 수를 감소시키는 면에서 효과가 있으나 독성과 부작용이 심한 문제점을 안고 있어, 많은 연구기관들은 표적치료(targeted therapy)제의 개발에 힘써왔다.
표적 치료제는 암의 생성, 증식, 전이와 관련된 유전자의 기능 연구를 통하여 치료용 표적을 발굴하고, 이들을 조절함으로써 암세포에만 작용하는 항암치료를 가능하게 한다. 암 특이적 유전자의 발굴시에는 이들을 저해할 수 있는 RNAi (RNA interference)를 통하여 표적 항암제로서의 가능성을 확인할 수 있다. RNAi는 대표적으로 microRNA (miRNA) 및 small interfering RNA (siRNA)를 통하여 세포 내에서 특이적으로 해당 염기서열의 mRNA의 분해를 유도하여 특정 유전자를 조절하는 시스템으로, 원하는 유전자의 억제를 통한 유전자의 기능을 확인하는데 널리 이용되고 있으며, 유전자의 기능 확인에 따른 신약후보물질 선별 도구로 유용하게 사용되고 있다.
게놈 연구의 활성화와 함께 인간 유전자 DNA 칩 또는 proteomics 분석 연구가 활발하게 이루어지고 암과 관련된 유전자가 대량 발굴됨에 따라 많은 유전자들의 목록과 관련 데이터베이스는 구축되어 있으나 대부분 이들 유전자들에 대한 세포 내에서의 구체적 생물학적 기능 및 암 관련성은 아직 연구되지 않았거나 불확실하여 실제 암 관련성 또는 진단 및 표적 유전자로 활용하기 어려운 실정이다. 또한 이들 유전자들의 세포 내 도입과 관련하여 안전하고도 효율적인 세포내 유전자 운반체에 관하여도 많은 연구가 필요하다.
이에 본 발명자들은 표적 항암제의 목적이 될 수 있는 유전자를 발견하고 이를 바탕으로 한 항암 물질 및 암 치료방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 가 AKT활성화를 통하여 암의 발생 및 증식에 영향을 미치는 것을 발견하고, 이들의 저해제가 효과적으로 체내에 도입되어 암의 치료용도로 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 억제제 및 이를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 또는 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물, 이를 이용한 항암제 스크리닝 방법 및 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자의 억제제, 보다 바람직하게는 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b유전자의 siRNA 또는 shRNA를 제공한다.
본 명세서에서, “sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자”란, NM_011402 : solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2 (Slc34a2); AF081499 : type IIb Na/phosphate-cotransporter (Npt2b); AK145599 : solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2를 의미한다.
본 명세서에서, "sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자의 억제제"란, 생체 내(in vivo) 또는 생체 외에서(in vitro) 상기 유전자의 발현을 특이적으로 억제하는 화합물, 천연물, 단백질 또는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 올리고 뉴클레오타이드 및 이의 변형체의 개념을 포함한다.
sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자의 억제제는 바람직하게는 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자의 siRNA(Small Interfering RNA) 또는 shRNA(Small Hairpin RNA)일 수 있다.
siRNA(Small Interfering RNA)는 short interfering RNA 또는 silencing RNA로도 알려져 있으며, 20-25bp의 이중 리보핵산쇄 (double stranded RNA molecules)로 세포내 도입하면 RNA interference (RNAi) pathway를 통하여 비특이적 저해(non-specific inhibition) 없이 특정 유전자의 발현만을 억제하는 효과를 나타낸다.
shRNA(Small Hairpin RNA)는 헤어핀 구조의 shRNA (short hairpin RNA)를 만들 수 있는 RNA 시퀀스로, 역시 RNA interference (RNAi) pathway를 통하여 비특이적 저해(non-specific inhibition) 없이 특정 유전자의 발현만을 억제하는 효과를 나타낸다.
본 발명의 siRNA(Small Interfering RNA) 또는 shRNA(Small Hairpin RNA)는 생체 내 핵산 분해효소에 의한 빠른 분해를 막기 위해 화학적으로 변형된 형태일 수 있으며, 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 수식 방법(modification), 리보핵산의 종결 위치(3'말단 초과부위)에 화학적 변형을, 리보오스 2'-위치의 변이 등의 당업자에게 공지된 변형방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명은 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자의 억제제 또는 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 유전자를 억제하면 그에 따른 단백질의 발현이 억제되고, AKT Signalling을 비롯한 암의 발생 및 증식에 관여하는 세포내 신호전달에 영향을 미쳐 암의 발생 및 증식을 억제할 수 있다.
AKT는 세포 신호전달에 있어서, 중요한 역할을 하는 단백질 키나아제(protein kinases)의 일종으로, 혈소판성장인자(PDGF), 신경 성장 인자(NGF) 및 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1) 등의 성장 인자에 의해 활성화된 포스파티딜 이노시톨 3 키나아제(PI3K)에 의해 활성화되어(Kulik et al , Mol . Cell Biol ., 17: 1595-1606, 1997; Hemmings, B. A., Science , 275: 628-630, 1997) 인슐린 대사(Calera, M. R. et al , J. Biol.Chem., 273: 7201-7204, 1998), 세포분화 및/또는 증식, 및 단백질 합성 스트레스 반응(Alessi, D. R. et al , Curr . Opin . Genet. Dev., 8: 55-62, 1998) 등에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 또한, AKT 역시 여러 암에서 과발현되는 것으로 보고된 바 있다.(Khwaja, A., Nature , 401: 33-34, 1999; Yuan, Z.Q. et al , Oncogene , 19: 2324-2330, 2000; Namikawa, K., et al , J. Neurosci ., 20: 2875-2886, 2000).
본 발명의 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 억제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 대체 단백질, RNA Aptamer 등의 친화성 리간드를 모두 포함하는 개념으로, 이들 억제제는 상기 단백질에 결합하여 단백질의 활성을 억제할 수 있게 된다.
따라서 본 발명은 상기 유전자의 억제제 또는 상기 유전자로부터 발현된 단 백질에 대한 억제제의 암 치료 용도를 제공하며, 이를 환자에게 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물로 치료될 수 있는 암은 폐암, 위암, 간암, 전립선암, 대장암 등을 포함하는 개념으로 AKT Signalling이 관여하는 모든 암을 의미할 수 있으며, 본 발명에서 치료란, 암의 생성, 증식, 전이등을 예방 또는 개선하는 것을 포함하는 개념이다.
상기 억제제들 중 siRNA 또는 shRNA등을 포함하는 올리고 뉴클레오타이드의 세포 내 전달 효율을 높이기 위하여, 종래의 유전자 운반체로 이용되어온 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector), 아데노 연관 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector) 룰 포함하는 바이러스 성 벡터, 리포좀, 폴리리신 (polylysine), 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine (PEI)), 프로타민(protamine), 히스톤(histone), 폴리에스테르아민(Polyester amine) 및 이들 각각의 변형체를 포함하는 양이온성 고분자를 비롯하여, 미셀, 에멀젼, 나노입자 등의 비바이러스성 벡터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 아데노 연관 바이러스 벡터, 및 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine (PEI)) 또는 폴리에스테르아민(Polyester amine)의 양이온성 고분자와의 복합체 형태를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 폴리에스테르아민(Polyester amine)/올리고 뉴클레오타이드 복합체를 에어로졸 방식을 이용하여 올리고 뉴클레오타이드를 세포 내로 전달할 수 있다.
본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약 제학적으로 허용되는 담체 또는 생리학적으로 허용되는 보조제를 1종 이상 포함할 수 있으며, 당업자에게 알려진 공지된 기술범위 내에서, 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 암 치료용 조성물은 하나 또는 그 이상의 항암제와 함께 사용될 수도 있다. 본 발명의 암 치료용조성물은 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 화학요법약제(chemotherapeutic agent), 예컨대, 사이클로포스파마이드, 아지리딘, 알킬알콘설포네이트, 나이트로소우레아, 다카르바진, 카르보플라틴, 시스플라틴 등과 같은 알킬화제(alkylating agent), 마이토마이신 C, 안트라사이클린, 독소루비신(아드리아마이신) 등과 같은 항생제, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라신, 시타라빈 등과 같은 항대사제(antimetabolitic agent), 빈카 알칼로이드와 같은 식물유래 약제 및 호르몬 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자 또는 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 항암물질 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 항암물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 조성물은 상기 단백질 외에도, 단백질의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 포함할 수 있다.
본 발명의 스크리닝용 조성물은 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b유전자 또는 이로부터 발현된 단백질을 포함함으로써 상기 유전자 및 단백질의 억제제를 스크리닝할 수 있으며, 일 실시예에서 상기 조성물을 표적물 질로 이용하여 시험대상물질과 접촉시키고, 반응을 확인하여, 시험대상물질이 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키는지 확인하는 방법으로 스크리닝을 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 조성물을 표적물질로 이용하여 시험대상물질과 접촉시키고, 반응을 확인하여, 시험대상물질이 AKT 활성화를 증가 또는 감소시키는지 확인하는 방법으로 스크리닝을 수행할 수도 있다.
sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자를 포함하는 스크리닝 조성물의 경우 DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질, DNA-화합물 간의 반응을 혼성화(hybridization) 시험, 노던 분석, PCR, 리포터 유전자 발현 등 당업계에서 사용되는 통상적인 방법을 통하여 반응물질을 스크리닝할 수 있다.
상기 단백질의 스크리닝 조성물을 포함하는 스크리닝 방법은 물질 활성 측정 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등 당업계에서 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다.
상기 방법으로 스크리닝 된 물질은 항암제 후보물질로서 암 치료용 조성물로 이용가능하다.
또한 본 발명은 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자 또는 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다. 상기 암 진단용 키트는 본 발명 의 진단용 조성물 외에도 상기 조성물과 시료 간의 반응을 파악하는데 사용되는 DNA 칩, 단백질 칩 등의 적용을 위한 재료를 포함할 수 있다.
본 발명의 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자, 이들에 대한 siRNA 또는 shRNA의 서열은 예시일 뿐 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 서열들에 대해 실질적인 구조적 또는 기능적 동일성을 나타내는, 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 서열 상동성을 지니는 서열들이 본 발명의 범주에 포함됨은 당업자에게 자명한 사실이다.
본 발명의 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자는 AKT의 활성화를 통하여 암세포의 발생을 유도하고, 증식속도를 증가시키는 데 관여하기 때문에, sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자 및 단백질의 억제제를 사용하여 암의 발생 및 성장을 억제하는 효과를 얻을 수 있어 효과적인 암 치료용 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 유전자 및 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 항암제 후보물질에 대한 스크리닝을 수행함으로써 신약개발에 활용될 수 있다.
본 발명은 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 억제제와 이를 포함하는 암 치료용 조성물 및 상기 유전자 또는 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 항암물질 스크리닝용 조성물, 이를 이용한 항암물질 스크리닝 방법 및 암 진단용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> sodium - dependent inorganic phosphate transporter -2b 유전자의 발견
sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b 유전자가 폐암과 관련되어 있음은 본 발명자들의 논문(Jin et al . Am . J. Respir . Crit . Care Med .. 179: 59-68, 2009)에 공개되어 있다. K-rasLA1 폐암 모델 쥐들에 고농도(1.0%)의 무기인산(Pi)을 4주 동안 섭취시킨 결과, 폐의 sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b (NPT-2b) 단백질 발현이 현저히 증가하였고, 이 단백질의 증가는 Akt pathway를 활성화시켜 폐에 종양이 더 많이 형성된 것을 확인하였다.
< 실시예 2> sodium - dependent inorganic phosphate transporter -2b 유전자 shRNA 디자인 및 합성
Mus musculus를 위한 target sequence는 GCCCTCTGTTGATTATATATA (서열번호 1) 이며, Lentivirus system을 사용하기위한 cloning sequencefhm mNPT-IIb-Top strand oligo(서열번호 2) 및 mNPT-IIb-Bottom strand oligo(서열번호 3)을 사용하 였다.
서열번호 2 :5'-CACCG GCCCTCTGTTGATTATATATA CGAA TATATATAATCAACAGAGGGC-3'
서열번호 3 :5'-AAAA GCCCTCTGTTGATTATATATA TTCG TATATATAATCAACAGAGGGC C-3'
< 실시예 3> shRNA 의 암세포 억제 효과
shRNA 의 암세포 억제 효과를 관찰하기 위하여 본 발명자들은 종래 본 발명자들에 의한 논문(Am J Respir Crit Care Med.,178(1):60-73, 2008)에 개시된 방법을 사용하였다.
45 비율의 폴리에스테르 아민/shRNA 복합체는 유전자 전달을 위한 가장 효율적인 수단이다. 즉, 폴리에스테르 아민/shRNA 복합체는 증류수에서 1 mg의 플라스미드 DNA를 1방울씩, 약한 볼텍싱하에서 폴리에스테르 아민에 첨가하고, 최종 부피가 50 ml가 되도록 하여 제조하였다. 상기 복합체는 사용전에 실온에서 30분간 보관되었다.
유전자 전달을 위하여, K-rasLA1 폐암 모델 쥐들은 nose-only exposure chamber (NOEC; Dusturbo, Seoul, Korea)에 넣어, 에어로졸에 노출시켰다. 에어로졸은 쉬어링 포스 뿐만 아니라, 생플 손실을 최소화할 수 있는 특허받은 nebulizer(20304964; Dusturbo) 에 의하여 생성되었다. 복합체 솔루션은 1 mg 의 플라스미드 DNA를 포함하고 있으며, 쥐들은 챔버(NOEC)에서 30분간 폴리에스테르 아민/shRNA 복합체를 에어로졸 형태로 흡입하였다. 실험 2일 후, 쥐를 희생하여 폐 의 샘플을 채취한 결과, K-rasLA1 폐암 모델 쥐들에서 폐의 종양형성이 감소함을 관찰할 수 있었다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> NOVEL USE OF SODIUM DEPENDENT INORGANIC PHOSPHATE TRANSPORTER-2B GENE <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence for Mus musculus <400> 1 gccctctgtt gattatatat a 21 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mNPT-IIb-Top strand oligo <400> 2 caccggccct ctgttgatta tatatacgaa tatatataat caacagaggg c 51 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mNPT-IIb-Bottom strand oligo <400> 3 aaaagccctc tgttgattat atatattcgt atatataatc aacagagggc c 51

Claims (15)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. NPT-2b(sodium-dependent inorganic phosphate transporter-2b) 유전자의 siRNA 또는 shRNA 중 어느 하나인 NPT-2b 유전자의 발현 억제제를 포함하고, 상기 NPT-2b 유전자의 발현 억제제는 고분자와의 복합체를 형성하여 에어로졸 방식으로 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(in vitro)에서 세포에 전달되는 것을 특징으로 하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제3항에 있어서, 상기 고분자는 폴리리신 (polylysine), 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine (PEI)), 프로타민(protamine), 히스톤(histone) 및 폴리에스테르아민(Polyester amine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
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  15. 삭제
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Am J Respir Cell Mol Biol. 2006, Vol. 35, pp. 528-539 *
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Cancer Research. 2004. Vol. 64, pp. 7971-7976 *
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Toxicological Sciences. 2007. Vol. 100, No. 1, pp. 215-223 *
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